KR20170116196A

KR20170116196A - 혈액으로부터 인터-알파 저해 단백질의 제조 및 조성물

Info

Publication number: KR20170116196A
Application number: KR1020177027338A
Authority: KR
Inventors: 요우-핀 림; 에드워드 에스. 설야; 피터 브르네
Original assignee: 프로테라 바이오로직스, 인크.
Priority date: 2008-05-28
Filing date: 2009-05-28
Publication date: 2017-10-18
Also published as: EP2291654A4; JP6309915B2; DK2291654T3; CN102112876A; KR101828433B1; US9758570B2; AU2009260822A1; US10076559B2; BRPI0913949A2; US9139641B2; US20110190194A1; US20170157224A1; ES2673005T3; JP2011524343A; JP5793076B2; US20160145318A1; CN106928346A; CN102112876B; JP2018008941A; AU2009260822B2

Abstract

본 발명은 일반적으로 혈액으로부터 인터-알파 저해 단백질(IαIp)의 정제 방법 및 이의 조성물을 제공한다.

Description

혈액으로부터 인터-알파 저해 단백질의 제조 및 조성물{PREPARATION AND COMPOSITION OF INTER-ALPHA INHIBITOR PROTEINS FROM BLOOD}

본 발명은 IαIp의 정제 방법 및 패혈증, 급성 염증성 질환, 심각한 쇼크, 패혈성 쇼크, 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 암, 암의 전이, 감염성 질환, 및 조기 진통(preterm labor)과 같은 질병 또는 증상을 치료하는 이의 용도에 관한 것이다.

패혈증(Sepsis) 및 전신염증반응증후군(SIRS)는 모두 감염성 물질(예를 들면 안트락스(anthrax)와 같은 박테리아 톡신)에 노출되거나, 상해 또는 외상 후 나타나는 심각한 생화학적인 반응이다. 상기 전신 반응은 패혈성 쇼크를 수반할 수 있으며, 이는 급격한 혈압의 강하, 심혈관계의 붕괴, 및/또는 다발성 장기부전으로 특정될 수 있다. 50여 년 전 항생제의 소개에도 불구하고, 패혈성 쇼크로 진단된 환자의 사망률은 30-50%에 이르며, 이는 유방암, 대장암 또는 전립선암에 비해서도 높은 수치이다. 미국에는 연간 약 800,000 건의 패혈증이 존재하며, 그 비용은 170억 불에 달한다. 이는 전세계 나머지 숫자와도 동일한 수치이다. 패혈증 및 SIRS는 전 세계적으로 급속히 확산되고 있으며, 이는 항생제 내성 및 증가된 생물학적 위험에 따른 것이다. 잠재적인 전세계적 유행병(pandemics, 예를 들면 조류독감) 또는 생화학테러를 고려한다면 상기 "위험에 처한" 군집의 실질적인 규모는 더 확장된다. 생화학테러 또는 전장에서의 노출의 경우에는 사망률은 훨씬 더 높을 것으로 예상된다. 신속하고 믿을 수 있는 패혈증, SIRS 및 패혈성 쇼크의 치료는 통상적인 방법을 통해서는 용이하지 않았다.

인터-알파 저해 단백질(inter-alpha inhibitor protein, IαIp) 패밀리는 인체의 패혈증, 감염, 외상, 및 상해에 수반되는 심각한 전신성 염증에 대한 인체의 반응을 조절하는 플라스마-연관 세린 단백질분해효소 저해자 그룹의 하나이다.IαIp 는 패혈증에 걸린 테스트 동물: 안트락스, 에볼라 바이러스, 또는 뎅기열 바이러스(Dengue virus); 또는 독성 화학물질이나 이온화 방사선에 노출되어 폐의 부상을 앓고 있는 테스트 동물의 생존 또는 증상을 개선시키는 것으로 나타났다. IαIp 는 혈액에서 분리되는 거대 단백질이다. 패혈증과 SIRS를 치료하는 약학적 이용 때문에 IαIp 를 제조하고 정제하는 방법이 시급히 요구되고 있다.

본 발명은 일반적으로 IαIp 단백질을 혈장으로부터 정제하는 방법 및 패혈증, 심각한 쇼크, 패혈성 쇼크, 류마티스 관절염, 암, 암의 전이, 감염성 질환, 및 조기 진통으로 특정되는 질병, 이상, 또는 상해를 치료하는 약학적 조성물을 제공한다.

일 측면에 따르면, 본 발명은 IαIp 단백질의 정제 방법을 제공하며, 상기 방법은 IαIp 단백질이 약 4.0 또는 그 이하(예를 들어 3.7, 3.5, 3.4, 3.3, 3.1, 3.0, 2.9, 2.0)의 pH의 조건에 노출되는 단계를 포함한다.

일 측면에 따르면, 본 발명은 IαIp 단백질이 pH 4.0 또는 그 이하의 조건에 노출되는 단계를 포함하는 방법에 따라 정제된 IαIp 단백질을 포함하는 조성물을 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 IαIp 단백질이 pH 4.0 또는 그 이하의 조건에 노출되는 단계를 포함하는 방법에 따라 정제된 유효량의 IαIp 단백질 및 약학적으로 허용가능한 첨가제를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 IαIp 단백질이 pH 4.0 또는 그 이하의 조건에 노출되는 단계를 포함하는 방법에 따라 정제된 IαIp 단백질을 포함하는 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 환자의 질환 또는 질환 증상을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 pH 약 4.0 또는 그 이하인 적어도 하나의 완충액 및 사용설명서를 포함하는 IαIp 단백질 정제용 키트를 제공한다. 일 실시예에 따르면, 상기 키트는 pH 약 4.0 또는 그 이하의 세정액인 적어도 하나의 완충액을 포함한다. 다른 실시예에 따르면, 상기 키트는 pH가 약 4.0 또는 그 이하인 세정액인 적어도 두 개의 완충액을 포함한다. 구체적인 실시예에 따르면, 첫 번째 세정액은 pH가 약 4.0이며, 두 번째 세정액은 pH가 약 3.3이다. 다른 구체적인 실시예에 따르면, 첫 번째 세정액은 pH가 약 4.0이고, 두 번째 세정액은 pH가 약 2.9이다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 IαIp 단백질이 pH 4.0 또는 그 이하의 조건에 노출되는 단계를 포함하는 방법에 따라 정제된 IαIp 단백질을 포함하는 조성물의 약학적 용도를 위한 키트를 제공한다.

다른 측면에 따르면, 본 발명은 IαIp 단백질이 pH 4.0 또는 그 이하의 조건에 노출되는 단계를 포함하는 방법에 따라 정제된 IαIp 단백질을 포함하는 조성물의 분석적 용도를 위한 키트를 제공한다.

다른 연관된 측면에 따르면, 본 발명은 인터-알파 저해 단백질(IαIp 단백질)의 정제방법을 제공하며, 상기 정제 방법은: 혈액, 혈장분획(blood plasma fraction), 또는 크로마토그래피 칼럼에 중간 혈장 분획을 로딩하는 단계, 및 상기 칼럼을 pH 약 4.0 또는 그 이하의 세정액으로 처리하는 단계를 포함한다.

또 다른 관련 측면에 따르면, 본 발명은 IαIp 단백질이 pH 약 4.0 또는 그 이하의 조건에 노출되어 IαIp 단백질이 대조군에 비해 경쟁적 ELISA(competitice Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)에서 증가된 결합력을 갖는 단계를 포함하는 방법에 따라 정제된 IαIp 단백질을 제공한다. 일 실시예에 있어서, IαIp 단백질의 결합력은 대조군과 비교하여(예를 들어, 낮은 pH로 처리되지 않은 IαIp 단백질)과 비교할 때 1-, 1.5-, 2-, 3-, 4-, 5-, 또는 10-배 증가 된다.

본원에 나열된 상기 측면들 또는 다른 발명 중 어느 하나의 다양한 실시예에 있어서, 상기 방법은 IαIp 단백질이 pH 약 3.6 또는 그 이하인 조건에 노출되는 단계를 포함한다. 다양한 실시예에 있어서, 상기 방법은 IαIp 단백질이 pH 약 3.3 또는 그 이하인 조건에 노출되는 단계를 포함한다. 다양한 실시예에서 상기 방법은 IαIp 단백질이 pH 약 3.3 내지 약 3.1 사이인 조건에 노출되는 단계를 포함한다. 다양한 실시예에서 상기 방법은 IαIp 단백질이 pH 약 3.1 내지 약 2.9 사이인 조건에 노출되는 단계를 포함한다.

본원에 나열된 상기 측면들 또는 다른 발명 중 어느 하나의 다양한 실시예에 있어서, 상기 방법은 크로마토그래피 단계 또는 고체상 용리단계(Solid phase extraction)를 포함한다. 다양한 실시예에서, 상기 크로마토그래피 단계는 액체 크로마토그래피, 칼럼 크로마토그래피, 음이온-교환 크로마토그래피, 또는 이들의 조합을 포함한다. 다양한 실시예에서, 상기 크로마토그래피는 모놀리식 지지체(monolithic support) 또는 입자-기반 지지체(particle-based support)를 포함한다. 다양한 실시예에서, 상기 모놀리식 지지체 또는 입자-기반 지지체는 고정화된 음이온 교환 리간드를 포함한다. 다양한 실시예에서, 상기 고정된 음이온 교환 리간드는 디에틸아미노에탄(DEAE) 또는 4급 아민(Q)이다.

본원에 나열된 어떤 발명의 상기 어떤 측면에 따른 다양한 실시예에 있어서, 상기 방법은 적어도 하나의 세정단계를 가지며, 이때 적어도 하나의 용액 세정 단계의 세정액은 pH 약 4.0 또는 그 이하이다. 다양한 실시예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 세정단계를 가지며, 이때 적어도 하나의 용액 세정 단계의 세정액은 pH 약 3.6 또는 그 이하이다. 다양한 실시예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 세정단계를 가지며, 이때 적어도 하나의 용액 세정 단계의 세정액은 pH 약 3.3 또는 그 이하이다. 다양한 실시예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 세정단계를 가지며, 이때 적어도 하나의 용액 세정 단계의 세정액은 pH 약 3.1 또는 그 이하이다. 다양한 실시예에서, 상기 방법은 적어도 하나의 세정단계를 가지며, 이때 적어도 하나의 용액 세정 단계의 세정액은 pH 약 3.6 내지 약 2.9 사이이다. 다양한 실시예에 있어서, 상기 IαIp 단백질은 칼럼에 결합한다. 다양한 실시예에서, IαIp 단백질은 분리된다.

본원에 나열된 상기 측면들 또는 다른 발명들 중 다양한 실시예에 있어서, 상기 방법은 IαIp 단백질이 약 250mM NaCl 또는 그 이상(예를 들면, 260, 270, 280mM NaCl)의 염의 농도에 노출되는 단계를 포함한다. 본원에 나열된 상기 측면들의 다양한 실시예에 있어서, 상기 방법은 적어도 하나의 용액 세정 단계를 포함하며, 이때 상기 세정액은 250mM NaCl 또는 그 이상(예를 들면, 260, 270, 280, 290 mM NaCl)의 염의 농도를 갖는다.

본원에 나열된 상기 측면들 또는 다른 발명들 중 다양한 실시예에 있어서, IαIp 단백질은 혈액으로부터 정제된다. 다양한 실시예에서, 상기 IαIp 단백질은 혈장 또는 혈장 분획으로부터 정제된다. 다양한 실시예에 있어서, 상기 혈장은 cryo-poor 혈장(plasma) 이거나 혈장 분획은 중간 혈장 분획이다. 다양한 실시예에 있어서, 상기 중간 혈장 분획은 IαIp를 포함하는 분획이다. 다양한 실시예에 있어서, 혈액, 혈장분획, 또는 중간 혈장 분획은 인간, 영장류, 소류, 말류, 돼지류, 양류, 개류, 또는 이들의 조합으로부터 유래한 것이다.

본원에 나열된 상기 측면들 또는 다른 발명들 중 다양한 실시예에 있어서, IαIp 단백질은 약 60 내지 약 280kDa 사이의 분자량을 갖는다. 본원에 나열된 상기 측면들 또는 다른 발명들 중 다양한 실시예에 있어서, IαIp 단백질 또는 조성물은 약 85% 내지 약 100 % 의 순도범위를 갖는다. 본원에 나열된 상기 측면들 또는 다른 발명들 중 다양한 실시예에 있어서, IαIp 단백질 또는 조성물은 약 85% 내지 약 100%의 수율을 갖는다. 몇몇 실시예에서, IαIp 단백질 또는 조성물은 분석용도로 사용될 수 있다(예를 들면, 미지의 IαIp 단백질 농도를 갖는 샘플 내의 IαIp 단백질의 양을 정량). 몇몇 실시예에서, IαIp 단백질 또는 조성물은 생물학적 활성을 갖는다. 다양한 실시예에서, 상기 생물학적 활성은 사이토카인 저해 활성, 케모카인 저해 활성, 또는 세린 프로테아제 저해 활성이다. 다양한 실시예에서, 상기 방법은 크로마토그래피 단계의 이전 또는 이후 바이러스 불활성화 단계 또는 나노여과(nanofiltration) 단계를 포함한다.

본원에 나열된 상기 측면들 또는 다른 발명들 중 다양한 실시예에 있어서, 상기 조성물 또는 약학적 조성물은 이들을 필요로 하는 대상체의 치료를 위한 것이다. 다양한 실시예에서, 상기 대상체는 상기 조성물로 치료를 필요로 하는 것으로 구분된다. 다양한 실시예에서, 상기 대상체는 급성염증 질환, 패혈증, 심각한 쇼크, 패혈성 쇼크, 류마티스 관절염, 암, 암의 전이, 외상/상해, 감염성 질환, 또는 조기 진통의 치료를 필요로 하는 것으로 구분된다. 상기 어떤 측면의 다양한 실시예에서, 그것들을 필요로 하는 대상체는 인간, 영장류, 소류, 말류, 돼지류, 양류, 고양이류, 또는 개류이다.

도 1 A-1B는 인간의 혈장으로부터 단일 크로마토그래피 단계를 이용하여 IαIp 단백질을 정제하는 모식도이다. 도 1A는 인간의 혈장으로부터 낮은 pH 세정 단계를 이용하여 IαIp 단백질을 정제하는 것을 나타낸다. 도 1B는 인간의 혈장으로부터 염 용액 세정 단계 및 낮은 pH 세정 단계를 이용하여 IαIp 단백질을 정제하는 것을 나타낸다.
도 2A-2C는 혈장(분획 D 및 분획 C)으로부터 DEAE크로마토그래피를 이용하여 낮은 pH 세정 단계(pH4.0 또는 pH3.3)로 IαIp 단백질을 정제하는 것을 나타낸다. 도 2A는 DEAE 크로마토그래피(모노리식 지지체; 유속: 5 mL/min) 로 낮은 pH 세정액(25 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7.8)을 이용한 한 번의 세정단계를 거쳐 분리한 혈장(1 mL of 1:100 dilution in 25 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7.8) 및 용리액((100 mM Tris, 1000 mM NaCl, pH 7.6)으로 용리한 것의 자외선 흔적(UV trace) 데이터를 나타낸다.
도 2B는 DEAE 크로마토그래피(모노리식 지지체; 유속: 5 mL/min) 로 낮은 pH 세정액(150 mM Acetic Acid, pH 4.0)을 이용한 한 번의 세정단계를 거쳐 분리한 혈장(1 mL of 1:100 dilution in 25 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7.8) 및 용리액(100 mM Tris, 1000 mM NaCl, pH 7.6)으로 용리한 것의 자외선 흔적 데이터를 나타낸다.
도 2C는 DEAE 크로마토그래피(모노리식 지지체; 유속: 5 mL/min) 로 낮은 pH세정액(150 mM Acetic Acid, pH 3.3)을 이용한 한 번의 세정단계를 거쳐 분리한 혈장(1 mL of 1:100 dilution in 25 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7.8) 및 용리액(100 mM Tris, 1000 mM NaCl, pH 7.6)으로 용리한 것의 자외선 흔적 데이터를 나타낸다.
도 3은 DEAE 크로마토그래피(monolithic support)로 낮은 pH 세정액(Wash 완충액 "1: 150 mM Acetic Acid, pH 4.0; Wash 완충액 "2: 200 mM Acetic Acid, pH 3.3)으로 2번의 세정단계를 거쳐 분리된 크라이오-푸어 플라스마(cryo-poor plasma, 1 mL of 1:100 dilution in 25 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7.8) 및 100 mM Tris + 1000 mM NaCl, pH 7.6로 용리된 것의 자외선 흔적 데이터를 나타낸다.
도 4A-4D는 중간 혈장(분획 D 및 분획 C)을 낮은 pH 세정 단계(pH3.3)로 한 번 세정하거나, 두 번 세정(pH 4.0 and pH 3.3)한 DEAE 크로마토그래피의 분획을 나타낸다.
도 4A는 낮은 pH 세정액(세정액 #: 150 mM 아세트산, pH 4.0)를 사용하여 1회 세정단계 및 용리액(100 mM Tris, 1000 mM NaCl, pH 7.6)으로 용리하여 DEAE 크로마토그래피(모노리스 지지체; 유속: 5 mL/min)에 의해 분리된 중간 혈장(25 mM Tris 내의 분획물 D의 1:200 희석액의 1 mL, 200 mM NaCl, pH 7.8)의 UV 트레이스(trace)를 나타낸다. 도 4B는 낮은 pH 세정액(세정액 "1: 150 mM 아세트산, pH 4.0)을 사용하여 1회 세정 단계 및 용리액(100 mM Tris, 1000 mM NaCl, pH 7.6)으로 용리하여 DEAE 크로마토그래피(1 mL 모노리스 지지체; 유속: 5 mL/min)로 분리된 중간 혈장 분획물 (25 mM Tris 내의 분획물 C의 1:200 희석액의 1 mL, 200 mM NaCl, pH 7.8)의 자외선 흔적 데이터를 나타낸다. 도 4C는 2개의 낮은 pH 세정액(세정액 #1: 150 mM 아세트산, pH 4.0; 세정액 "2: 200 mM 아세트산, pH 3.3)을 사용하여 2회의 세정 단계 및 용리액(100 mM Tris, 1000 mM NaCl, pH 7.6)으로 용리하여 DEAE 크로마토그래피(1 mL 모노리스 지지체; 유속: 5 mL/min)에 의해 분리된 중간 혈장(25 mM Tris 내의 분획물 D의 1:200 희석액의 1 mL, 200 mM NaCl, pH 7.8) 의 자외선 흔적 데이터를 나타낸다. 도 4D는 2개의 낮은 pH 세정액(세정액 #1: 150 mM 아세트산, pH 4.0; 세정액 #2: 200 mM 아세트산, pH 3.3)을 사용하여 2회의 세정 단계 및 용리액(100 mM Tris, 1000 mM NaCl, pH 7.6)으로 용리하여 DEAE 크로마토그래피(1 mL 모노리스 지지체; 유속: 5 mL/min)에 의해 분리된 중간 혈장 분획물(25 mM Tris 내의 분획물 C의 1:200 희석액의 1 mL, 200 mM NaCl, pH 7.8) 의 자외선 흔적 데이터를 나타낸다.
도 5는 웨스턴 블롯(Western Blot)에 의해 분석된 DEAE 모노리스 컬럼 크로마토그래피에 의한 IαIp 단백질의 정제를 나타낸다. 중간 혈장 분획물(분획물 D 및 분획물 C)로부터의 2 개의 크로마토그래피 결과를 보여준다. 당량은 SDS-PAGE (6%; non-denaturing)에 의해 분리된 출발물질(SM), 세정 1회 분획물 (W#1), 세정 2회 분획물(W#2), 및 용리액(E)의 lane 마다 로드되었다. Cryo-poor 혈장의 크로마토그래피으로부터의 용리액(E)는 비교를 위해 나타내었다. SDS-PAGE 분리된 단백질은 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 이송되어 1차 항체로서 항-인간 IαIp (MAb 69.26)으로 검증되었다.
도 6A-6F는 cryo-poor 혈장으로부터의 IαIp 단백질 정제 또는 2 개의 낮은 pH 세정 단계를 사용한 DEAE 크로마토그래피에 의한 중간 혈장(분획물 D 및 분획물 C)이 확장 또는 축소가 가능(scalable)함을 나타낸다. 도 6A는 2개의 낮은 pH 세정액(세정액 #1: 150 mM 아세트산, pH 4.0; 세정액 #2: 200 mM 아세트산, pH 3.3)을 사용하여 2회 세정 단계 및 용리액(100 mM Tris, 1000 mM NaCl, pH 7.6)으로 용리하여 DEAE 크로마토그래피(8 mL 모노리스 지지체; 유속: 40 mL/min)에 의해 분리된 cryo-poor 혈장(출발물질: 25 mM Tris 내의 분획물 C의 1:10 희석액의 25 mL, 200 mM NaCl, pH 7.8)의 자외선 흔적 데이터를 나타낸다. 도 6B는 SDS-PAGE (4-20% gradient)에 의해 분석된 DEAE 모노리스 크로마토그래피(출발물질(SM), 세정 #1 (W#1), 세정 #2 (W#2), 및 용리액(EL))에 의한 cryo-poor 혈장 분리로부터의 분획물을 나타낸다. 도 6C는 2개의 낮은 pH 세정액(세정액 #1: 150 mM 아세트산, pH 4.0; 세정액 #2: 200 mM 아세트산, pH 3.3) 을 사용한 2회 세정 단계 및 용리액(100 mM Tris, 1000 mM NaCl, pH 7.6)으로 용리하여 DEAE 크로마토그래피(8 mL 모노리스 지지체; 유속: 40 mL/min)에 의해 분리된 중간 혈장(출발물질: 25 mM Tris 내의 분획물 D의 1:125 희석액의 2 mL, 200 mM NaCl, pH 7.8)의 UV 트레이스(trace)를 나타낸다. 도 6D는 SDS-PAGE (4-20% gradient)에 의해 분석된 DEAE 모노리스 크로마토그래피(출발물질 (SM), 세정 #1 (W#1), 세정 #2 (W#2), 및 용리액(EL))에 의한 중간 혈장(분획물 D) 분리로부터의 분획물을 나타낸다. 도 6E는 세정액 (세정액 #1: 150 mM 아세트산, pH 4.0; Wash Buffer #2: 200 mM Acetic Acid, pH 3.3)으로 2회 세정 및 용리액 (100 mM Tris, 1000 mM NaCl, pH 7.6)으로 용리하여 DEAE 크로마토그래피(8 mL 모노리스 지지체; 유속: 40 mL/min)로 분리된 중간 혈장 분획물(출발물질: 25 mM Tris 내의 분획물 C의 1:125 희석액의 2mL, 200 mM NaCl, pH 7.8)의 자외선 흔적 데이터를 나타낸다. 도 6F는 SDS-PAGE (4-20% gradient)에 의해 분석된 DEAE 모노리스 크로마토그래피(출발물질 (SM), 세정 #1 (W#1), 세정 #2 (W#2), 및 용리액(EL))에 의한 중간 혈장(분획물 C) 분리로부터의 분획물을 나타낸다.
도 7A 및 7B는 cryo-poor 혈장으로부터의 IαIp 단백질 정제 또는 염 완충액(250mM NaCl 보다 높은)의 세정단계 및 낮은 pH 세정 단계(pH 2.95)를 사용한 DEAE 크로마토그래피에 의한 중간 혈장 분획물을 나타낸다. 도 7A는 염 완충액(40mM Tris-HCl의 10 column volumes, 290mM NaCl pH 7.6) 및 낮은 pH 세정액(200mM Na-아세테이트의 10 column volumes, pH 2.95)을 사용한 2회 세정단계 및 고 염 용리액(40mM Na-시트르산염의 5 column volumes pH 6.50, 1000mM NaCl)으로 용리하여 DEAE 크로마토 그래피(모노리스 지지체)에 의해 분리된 cryo-poor 혈장(40 mM Tris 내 1:10 희석액의 12.5 column volumes, 200 mM NaCl, pH 7.6; 여과된 0.2 μM)의 자외선 흔적 데이터를 나타낸다. 도 7B는 염 완충액(40mM Tris-HCl의 10 column volumes, 290mM NaCl pH 7.6) 및 낮은 pH 세정액(200mM Na-아세트산염의 10 column volumes, pH 2.95)을 사용한 2회 세정단계 및 고 염 용리액(40mM Na-시트산염의 5 column volumes pH 6.50, 1000mM NaCl)으로 용리하여 DEAE 크로마토 그래피(모노리스 지지체)에 의해 분리된 중간 혈장 분획물(분획물 D)) (2.5 column volumes, 40 mM Tris 내의 1:10 희석액, 200 mM NaCl, pH 7.6; 여과된 0.2 μM)의 자외선 흔적 데이터를 나타낸다.
판매하고 있는 분(minute) 당 2.5 칼럼 부피(column volume) 유속의 8 mL DEAE 모노리스 컬럼(DEAE-CIM; BIA Separations)이 크로마토그래피 수행에 사용되었다. 추가적인 로딩 완충액은 결과물(flowthrough) 피크가 기준치로 되돌아갈 때까지 컬럼에 사용되었다(예를 들면, 도 7A 내, 7 칼럼 부피 25 mM Tris, 200 mM NaCl, pH 7.6). 세정에 의해 용리된 모든 피크들이 측정되었다. 고 염 용리액에 의해 용리된 피크가 측정되었으며 이 분획물은 매우 순수한 IαIp를 함유한다.
도 8은 염 세정 단계(290mM NaCl) 및 낮은 pH 세정 단계(pH 2.95)를 포함한 IαIp 단백질의 정제로부터 분획물과 낮은 pH 세정 단계(pH 2.95)를 사용한 IαIp 단백질의 정제로부터의 분획물을 비교한 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 분획물은 세정액 pH 2.95(pH 세정), 290 mM NaCl을 포함하는 세정액(염 세정), 및 1000 mM NaCl을 포함하는 용리액(용리액)에 의해 용리되고, SDS-PAGE (4-12% gradient; 비-변성)에 의해 분리됨. 2개의 크로마토그래피 과정에서 IαIp 단백질은 중간 혈장 분획물(분획물 D)에 의해 정제된다. 기준 분자량 단백질(Std MW)은 비교예로 도시하였다. 화살표-250 kDa 인터-알파 억제제 및 125 kDa 프리-알파 억제제.

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 2008년 5월 28일에 출원되어 그 내용이 본원에 참조로서 포함된 미국 가출원 일련번호 제61/130,269호의 우선권의 이익을 주장한다.

본 발명은 미국 국립 위생 연구소(NIH)/국립 의과학 보조금 허가 번호 2R44GM65667-02 및 1R43GM079071-01A1로 지원을 받았다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 갖는다.

하기에 기술한 바와 같이, 본 발명은 IαIp의 정제 방법 및 패혈증, 급성 염증성 질환, 심각한 쇼크, 패혈성 쇼크, 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 암, 암의 전이, 감염성 질환, 및 조기 진통(preterm labor)과 같은 질병 또는 증상을 치료하는 이의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 IαIp 단백질을 혈장으로부터 제조 또는 정제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 양태 또는 장점은 상세한 설명 및 청구항으로부터 자명할 것이다.

정의

본원에 사용된 "변동(변동)"은 수율(증가 또는 감소), 양, 농도, 활성, 순도, 또는 본원에 기재된 것과 같은 알려진 표준적인 방법을 이용한 검출에서의 IαIp 단백질의 레벨의 변화를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, 변화는 수율, 순도, 또는 활성의 10% 변화를 포함하고, 보다 바람직하게는 40%의 변화를 포함하며, 가장 바람직하게는 50% 또는 그 이상의 발현레벨의 변화를 포함한다.

본원의 "상동체(analog)"는 대조군 폴리펩티드 또는 핵산분자의 기능과 구조적으로 연관성을 갖는 폴리펩티드 또는 핵산분자를 의미한다.

"화합물"은 작은 분자 화합물, 항체, 핵산분자, 또는 폴리펩티드, 또는 이들의 절편을 의미한다.

"감소" 또는 "증가"는, 적어도 10, 25%, 50%, 75%, 또는 100%의 음성 또는 양성의 변화를 각각 의미한다.

"대상체"는 이에 국한되지는 않으나, 인간 또는 영장류, 소류, 말류, 돼지류, 양류, 고양이류, 또는 개류와 같은 비-인간 포유류를 포함하는 포유류를 의미한다.

본원에 사용된 "치료, 치료하다, 치료하기" 및 그와 유사한 말은 이상 및/또는 이들과 관련된 증상을 줄이거나 경감하는 것에 해당한다. 배제하는 것은 아니나, 이상 또는 증상을 치료하는 것은 그들과 관련된 이상 또는 증상 또는 상태가 이를 통해 완전히 제거되는 것을 요구하지는 않는다는 것이 적합하다.

본원에 사용된 "방지하다, 방지하기, 방지, 예방적 치료" 및 이와 유사한 말은 대상체의 이상 또는 증상의 진행 가능성을 낮추는 것을 의미하며, 상기 대상체는 이상 또는 증상을 갖고 있지는 않더라도, 이상 또는 증상의 진행에 취약하거나 이러한 위험이 있다.

"대조군"은 기준 또는 조절조건을 의미한다.

본원에서 "포함한다", "포함하는", "함유하는" 및 "갖는" 및 그와 유사한 말은 미국 특허법의 "포함한다", "함유한다" 및 그와 유사한 말과 상응하는 뜻을 가질 수 있고; "필수적으로 구성되는" 또는 "필수적으로 구성하는" 등도 마찬가지로 미국 특허법에 기술된 바의 의미를 가지며, 상기 용어는 제약을 두지 않고 있으므로, 본원에 나열된 바 이상의 것들을 허용할 수 있으며, 선행기술의 실시예들을 배제하며 기본적이고 신규한 이상, 본원의 특성들이 상기 그 이상의 것들로 인해 변질되지는 않는다.

본 발명은 일반적으로 IαIp 단백질을 혈장으로부터 정제하는 방법 및 패혈증, 심각한 쇼크, 패혈성 쇼크, 류마티스 관절염, 암, 암의 전이, 감염성 질환, 및 조기 진통으로 특정되는 질병, 이상, 또는 상해를 치료하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 방법은 정제과정에서 IαIp 단백질을 낮은 pH 용액에 노출시키는 것을 포함한다.

인터-알파 저해 단백질(Inter-alpha inhibitor protein (IαIp) )

본원에 사용된 바와 같이, "인터-알파 저해 단백질(Inter-alpha inhibitor proteins (IαIp))"은 큰 여러 개의 구성요소를 가진 폴리펩티드로서 세린 프로테아제 저해제와 구조적으로 연관된 패밀리에 속한다. "폴리펩티드"는 아미노산의 체인을 의미하며, 길이나 번역 후 변환(post-translational modification)의 여부와는 무관하다. 상기 복합체는 호중구엘라스타제(neutrophil elastase), 플라스민, 트립신, 키모트립신, 카셉신 G, 및 아크로신을 포함하는 일련의 프로테아제의 저해에 있어서 중요한 것으로 보고된 바 있다. 인간의 혈장에서 IαIp 단백질은 상대적으로 높은 농도(400-800mg/L)로 발견된다. 다른 저해 분자들과는 달리, 이 저해제의 패밀리는 콘트로이틴 설페이트 체인에 의해 독특하게 공유결합한 폴리펩티드 체인(경쇄 및 중쇄)의 조합으로 구성된다.

인터-알파 단백질(H1, H2, 및 H3)의 상기 중쇄는 히알루론산(HA) 결합 단백질로도 명명된다. 인간의 혈장에서 주로 발견되는 형태는 인터-알파-저해제(IαI)이며, 이는 두개의 중쇄(H1&H2) 및 하나의 경쇄(L), 및 프리-알파-저해제(PαI)로 구성되고, 이는 하나의 중쇄(H3) 및 하나의 경쇄(L)로 구성된다. 상기 경쇄는 (두개의 Kunitz 도메인을 갖는 bikunin(bi-kunitz inhibitor) 비쿠닌으로도 불림) 광범위하게 혈장의 세린 프로테아제를 저해하는 것으로 알려져 있다. 혈장에 존재하는 IαI 및 PαI는 약 60kDa 내지 약 280kDa 사이로 보이는 분자량을 갖는다. 분자량은 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)로 확인할 수 있다. IαI 및 PαI는 IαIp 단백질의 중쇄인 H4와도 복합체를 이루는 것으로 나타난 바 있다. 어떠한 특정의 과학적 이론에 제한되기를 바라지 않는 측면에서, IαIp 단백질의 중쇄는, 결합체로부터 이탈한 다음, HA가 그것의 수용체인 CD44에 결합하는 것을 막으며 HA(Hyaluronic acid)에 결합하는 것으로 알려져 있다. IαIp 단백질의 중쇄가 없으면, HA는 CD44에 결합하고 TNF-a와 같은 염증유발인자(pro-inflammatory factors)의 분비를 촉발할 것이다. 동시에, 상기 IαIp 단백질의 경쇄는 결합체로부터 일단 분리되면 항-프로테아제 활성을 나타낸다.

패혈증 및 전신성염증반응증후군(SIRS)

패혈증, 및 SIRS 모두 감염성 물질(예를 들어 안트락스와 같은 박테리아 톡신), 또는 외상/상해에 대한 노출에 따르는 심각한 생리학적 반응에 해당된다. 패혈증은 잠재적으로 생명을 위협하는 물질에 대한 개개인의 과-반응이며 일반적으로 상기 원인물질로부터 직접적으로 일어나지는 않는다. 패혈증은 치료되지 않으면 심각한 생체 장기에 손상을 초래하여 환자로 하여금 다발성 장기부전, 쇼크 및 궁극적으로는 죽음을 초래할 수 있다.

패혈증, SIRS, 및 패혈성 쇼크는 내재 면역(innate innate immunity) 및 응고체계의 활성화와 관련이 있다. 패혈증 및 패혈성 쇼크는 임상학적으로는 전신성염증, 응고장애, 저혈압 및 다발성 장기 부전으로 특정된다(J.-L. Vincent et al., Annuals of Medicine 34 (2002) 606-613). 심각한 패혈증 동안에는, 특정 프로테아제의 네트워크가 응혈인자(clotting factor), 섬유소용해성(fibrinolytic)인자 및 보조 인자를 활성화시킨다. 이들 프로테아제는 또한 조직 및 기관 손상을 촉발하고 비-특이적 응혈인자 및 보조인자의 분해를 혈장에서 촉진할 수 있다(J. Wite et al., Intensive Care Medicine 8 (1982) 215-222; S. J. Weiss, New England Journal of Medicine 320 (1989) 365-376). "패혈증-유사"증상은 주로 인체의 과도한 염증반응으로 인해 노출된 개인에서 관찰된다. 상기 과반응은 일반적으로 과도한 사이토카인의 생성을 포함하고(사이토카인 폭풍), 파괴적인 프로테아제 및 대사, 산화, 응고 및 다발성 장기 부전에 이르는 혈관계 기능의 교란을 포함한다.

IαIp 는 자연상태의 혈액 단백질이며 인체의 내재면역체계의 일부이다. IαIp는 패혈증, 감염, 외상 및 부상에 수반되는 인체의 심각한 전신성 염증에 대한 반응을 조절한다. IαIp는 응고, 염증 및 면역반응을 포함하는 다양한 생리학적 과정에 관여하는 단백질 분해 효소인 세린 프로테아제의 저해제이다. IαIp는 분비된 면역 반응 조절자(사이토카인)와 같은 염증성 물질, 부상 또는 염증부위의 백혈구를 공격하는 단백질(케모카인), 및 환자의 심각한 증상 및 과도한 사망을 초래하는 파괴적인 프로테아제의 순환수준을 조절하는 폭넓은 생물학적 반응 조절자로 기능한다. IαIp단백질은 순환하는 사이토카인, 케모카인 및 패혈성 증상을 유발하고 유지시키는 프로테아제에 결합한다. 심각한 염증 진행 과정에 있어서, 인체의 IαIp 레벨은 급격하게 소진되어 조절되지 않는 질병을 초래한다. 패혈증 환자에 있어서 매우 중요하고, 역상관관계가 혈장의 IαIp 레벨과 질병 및 사망률간에 존재한다(Lim et al., J Infect Dis 2003, 188: 919-926).

IαIp는 패혈증에 걸린 실험동물 및 독성 화학물질 또는 방사선에 노출되어 급성 폐 손상에 걸린 동물뿐만 아니라 안트락스에 감염된 동물의 생존율을 유의적으로 개선시키는 것으로 나타난 바 있다(Yang et al., Crit Care Med 2002, 30(3):617-622; Lim et al., J Infect Dis 2003, 188: 919-926; Wu et al., Crit Care Med 2004, 32(8):1747-1752; and Opal et al., Infect and Immun 2005, 73(8):5101-5105). 응고, 대사, 간의 손상, 염증성 사이토카인, 및 산화 기능은 자극 또는 원인물질에 대한 약학적 효과는 독립적이었다. 급성 염증의 심각한 경우에 있어서 IαIp 레벨이 심각하게 소진되면, 조절되지 않는 질병으로의 진행이 일부 또는 완전하게 외부의 IαIp 투여로 인해 방지될 수 있음이 보고된바 있다(Yang et al., Crit Care Med 2002, 30(3):617-622; Wu et al., Crit Care Med 2004, 32(8):1747-1752). 순환하는 사이토카인, 케모카인, 및 프로테아제는 IαIp의 투여로 제거되거나 불활성화될 수 있으며, 이러한 제거 또는 불활성화를 통해 보다 생존율을 높이고 사망률을 낮추면서 잠재해 있는 질병 증상 또는 감염을 치료할 수 있는 시간을 늘릴 수 있다. 소변으로부터 분리된 IαIp의 프로테아제 단편은 패혈증 환자의 사망률을 유의적으로 낮추는 효과가 있는 것으로 보고된 바 있다(Lin HY. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2007 Feb 13;87(7):451-7). 조건을 회복함으로써, IαIp을 이용한 대체 치료(Replacement therapy)는 생존율을 개선시키고, 사망률을 줄이고, 잠재한 질병 증상 또는 감염을 치료하는 시간을 제공하는 잠재력을 갖는다. 대체 치료는 매우 안전한데 이는 IαIp 이 평상시에도 혈장에 상대적으로 많은 양으로 존재하기 때문이다. IαIp 은 혈역학적 안정(hemodynamic stability)을 유지시키고, 장기손상 방지하며, 패혈증 환자 및 개선 및 "사이토카인 폭풍"에 노출된 환자의 생존율을 개선시키는데 유용하고 안전한 물질이다.

치료 방법

본원에는 급성염증질환, 패혈증, 심각한 쇼크, 패혈성 쇼크, 류마티스 관절염, 암, 암의 전이, 감염성 질환, 및 조기 진통을 치료하기 위해 대상체에 정제된 IαIp을 투여하는 약학적 방법이 공개된다. 본 발명은 대상체에서 인터-알파 저해 단백질(IαIp) 레벨의 감소와 연관되어 있는 어떠한 질병의 치료에도 사용될 수 있다. 상기 감소된 인터-알파 저해 단백질(IαIp) 레벨은 케모카인, 사이토카인, 또는 프로테아제의 원하지 않는 증가와 관련이 있을 수 있다. 예를 들면, 포유류는 케모카인, 사이토카인, 또는 프로테아제의 원하지 않는 증가를 초래하는 질병, 이상, 또는 증상을 나타낼 수 있다. 예시적인 치료된 상기 증상은 급성염증질환, 패혈증, 심각한 쇼크, 패혈성 쇼크, 류마티스 관절염, 암, 암의 전이, 외상/상해, 감염성 질환, 또는 조기 진통을 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 포유류는 질병, 이상, 또는 증상으로 진행될 수 있는 증가된 위험을 가지며, 이는 상기 방법을 통해 지연되거나 방지될 수 있다.

본 발명의 방법은 IαIp를 약학적인 유효량으로 투입하는 것을 포함한다. 다양한 실시예에서, 상기 방법은 대상체에서 IαIp의 레벨을 대조군에 비해 적어도 %, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 200%, 또는 심지어 300%, 400%, 또는 500%까지 증가시킨다. 다른 실시예에서, 상기 방법은 사이토카인, 케모카인 또는 프로테아제의 레벨을 적어도 5%, 10%, 20%, 보다 바람직하게는 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 또는 대조군에 비해 70%, 80%, 90 또는 100%나 감소시킨다. 상기 생물학적 화합물의 레벨을 측정하는 것은 통상적인 것이며, 숙련된 당업자에게 알려져 있다(예를 들면, Guyton et al., Textbook of Medical Physiology, Tenth edition, W.B. Saunders Co., 2000).

특정 이론에 제한되지 않더라도, 본원에 참조되는 병리학에 있어서는 사이토카인, 케모카인 및 프로테아제의 증가된 레벨은 결과적으로 조직의 손상을 초래할 국부 또는 전신 반응을 유발한다. 조직의 손상은 장기 부전으로 이어질 수 있다. 바람직한 실시예에서, 상기 방법은 조직 또는 기관의 생물학적 활성을 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 또는 상응하는, 자연적으로 형성되는 조직 또는 기관에 비하여 200%, 300%, 400%, 또는 500%나 증가시킨다. 측정이 용이한 조직이나 기관의 생물학적 기능은 소화, 노폐물의 배출, 분비, 전기적 활성, 근육 활성, 호르몬의 합성, 또는 기타 대사 활성을 포함한다. 상기 조직 및 기관의 생물학적 활성을 평가하는 방법은 통상적인 것이며, 숙련된 당업자에게 알려져 있다(예를 들면, Guyton et al., Textbook of Medical Physiology, Tenth edition, W.B. Saunders Co., 2000).

환자(예를 들어 사람 또는 포유류)의 조직 또는 기관에 영향을 미치는 증상, 질병, 또는 이상을 치료하거나 안정화시키는 데 있어서 본 발명의 방법은 유용하다. 약물학적 효능은 예를 들어 치료된 조직 또는 기관(예를 들어 콩팥, 뼈, 뇌, 가슴, 연골, 식도, 난관, 심장, 이자, 장, 담낭(Gallbladder), 신장, 간, 폐, 신경조직, 난소, 전립선, 골격근, 피부, 척수, 지라, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 기관(trachea), 수뇨관(ureter), 요도(urethra), 비뇨생식관, 및 자궁)의 생물학적 기능을 측정하여 선택적으로 평가된다. 그러한 방법은 당업계에서는 표준이다. 예를 들면, 방광의 기능은 소변의 저장 및 배출을 측정하여 평가된다. 뇌, 척수, 또는 신경 조직의 기능은 신경활성(예를 들어 전기적 활성)을 측정하여 평가된다. 식도의 기능은 식도가 음식물을 위로 전송하는 능력을 측정하여 평가한다. 심장의 기능은 심전도(electrocardiogram)로 평가된다. 이자의 기능은 인슐린 합성을 측정하여 평가한다. 장의 기능은 장 내용물 장을 통과하는 장 내용물의 활성을 측정하여 평가하고, 대장조영촬영(barium enema) 또는 위장관 조영술 검사(gastrointestinal series)를 이용하여 측정할 수 있다. 담낭의 기능은 담낭 방사성 핵종 스캔(radionuclide scan)으로 평가된다. 신장의 기능은 크레아티닌 레벨, 소변의 크레아티닌 레벨, 또는 크레아티닌 소거 또는 혈액의 요소질소에 대한 임상학적 테스트로 측정할 수 있다. 간의 기능은 간효소 레빌, 빌리루빈(bilirubin) 레벨 및 알부민 레벨을 측정하는 간 패널(liver panel) 또는 간기능 테스트를 통해 평가된다. 폐의 기능은 폐기능측정기(spirometry), 폐 용적, 및 확산능력 테스트를 통해 평가된다. 난소의 기능은 난소 호르몬(예를 들면, 여포 자극 호르몬)의 레벨을 측정하여 평가된다. 전립선의 비정상은 전립선 특이적 항원을 측정하여 평가된다. 비장(Spleen) 기능은 간-비장 스캔을 통해 평가된다. 위의 기능은 고환 호르몬(예를 들어 테스토스테론)의 레벨을 측정하여 평가된다. 기관의 기능을 평가하는 다른 방법들은 숙련된 당업자에게 알려져 있으며 예를 들면 의생리학 교과서 제10판(Guyton et al., W.B. Saunders Co., 2000)에 기재되어 있다.

IαIp 조성물

본원에 사용된 "IαIp 조성물"은 생리학적인 비율의 IαI 및 PαI를 포함하는 IαIp 단백질 제재를 의미한다. 본원에서 사용되는 생리학적인 비율은, 감염 또는 증상을 겪고 있지 않은 조성비, 및/또는 인간혈장에서 자연적으로 나타나는IαI 대지 PαI의 비율을 포함한다. 생리학적 조성은 통상적으로 약 60% 내지 약 80%의 IαI 및 약 40% 내지 약 20%의 PαI이다. 생리학적인 조성은 이 범위 내에서 대상체의 유전적 구성의 정상적인 변이에 따라 변동될 수 있다.

본원에서 사용되는 "IαIp 복합체(complex)"는 자연적으로 발생하는 IαIp 단백질의 모든 생물학적 활성 변이체를 포함하기 위한 것이며, 결실, 삽입, 부가 및 치환을 포함하는 단백질을 포함한다. IαIp 단백질의 "자연적인 변이체"는 하나 또는 그 이상의 아미노산이 변경된 서열을 갖는 혈장으로부터 얻어진 폴리펩티드로 정의된다. 상기 변이체는 "보존적" 변이를 가질 수도 있고, 이때는 치환된 아미노산이, 예를 들면 류신이 이소류신으로 치환되는 것과 같이 유사한 구조적, 화학적 특성을 가질 수 있다. 또 다른 실시예에서, 변이체는 "비보존적" 변이, 예를 들면 글리신이 트립토판으로 치환되는 것일 수 있다. 유사한 변이들이 아미노산의 결실 또는 삽입 또는 이 모두를 포함할 수 있다. 얼마나 많은 아미노산 잔기들이 생물학적 또는 면역학적 활성의 소실없이 치환, 삽입 또는 결실되었는지에 대한 결정은 당업계에서 잘 알려진, 예를 들면 DNASTAR 소프트웨어와 같은 컴퓨터 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 본원에서 사용되는 "기능적으로 동등한"이란 말은 예를 들어 패혈증의 감소에 효과를 미치는 것과 같은 IαIp 단백질의 생체 또는 시험관 상태에서의 실질적으로 유사한 어떠한 단백질을 지칭한다.

본원에서 사용되는 "인터-알파 저해자 단백질(IαI) 및 전(pre)-알파 단백질(PαI)의 혼합물"은 IαI 및 PαI 복합체 모두를 포함하는 조성물을 말한다. 상기 혼합물은 또한 용액, 염, 도는 기타 IαIp 복합체를 분리하기 위해 사용되는 요소를 포함할 수 있다. 어떤 측면에서, 상기 IαI 및 PαI는 생리학적인 조성으로 상기 혼합물에 존재한다.

혈장분획에 존재하는 IαI 및 PαI 는 약 60 내지 약 280kDa로 보이는 분자량을 갖는다. 분자량은 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)로 결정될 수 있다.

본 발명의 IαI 조성물은 높은 트립신 저해 특이적 활성(Trypsin inhibitory specific activity)을 갖는다. 본 발명에 따른 상기 IαIp 조성물의 트립신 저해 특이적 활성은 약 100 내지 약 200IU/mg의 범위일 수 있다. 바람직하게는 상기 트립신 저해 특이적 활성은 약 120IU/mg 및 보다 바람직하게는 150IU/mg 보다도 높을 수 있다. 상기 트립신 저해 특이적 활성은 예를 들어 L-BAPA를 기질로 이용하는 트립신 저해 분석을 통해 측정될 수 있다. 이는 H U Bergmeyer, ed: vol 5, 3rd ed. 119 (1984) Verlag Chemie, Weinheim: Chromogenic substrate for the assay of trypsin: R. Geiger, H. Fritz, Methods of Enzymatic Analysis를 참조하라.

IαIp 의 조성물은 IαI 및 PαI 의 혼합물일 수 있으며, 이때 IαI 및 PαI는 상기 혼합물에 세 개의 H1, H2 및 H3 중쇄 중 적어도 하나와 관련된 인터-알파 저해 단백질의 경쇄를 포함하는 생리학적 조성으로 존재한다. 본 발명에 따른 조성물은 또한 H1, H2, H3 및 H4의 중쇄 중 적어도 하나와 연관된 인터-알파 저해 단백질의 경쇄를 포함할 수 있다 IαIp 복합체의 각 단백질의 예는 다음과 같으며: 비쿠닌(Bikunin) GenBank 접속번호: AAB84031, P02760; H1 GenBank 접속번호: P19827, NP--002206; H2 GenBank 접속번호: NP--002207, P19823; H3 GenBank 접속번호: NP--002208; H4 GenBank 접속번호: Q14624, NP--002209이며, 각각은 본원에 그 전체로 삽입되어 있다.

인터-알파 저해 단백질 (IαIp)의 정제

IαIp는 크로마토그래피로 정제될 수 있다. 본원에 사용되는 "정제"는 정제된 IαIp 를 제조하기 위해 IαIp로부터 원하지 않는 물질 또는 오염 단백질 또는 물질을 제거하는 단계를 말한다. 예를 들면, IαI 및 PαI 을 생리학적 조성으로 포함하는 혈장분획은 IαIp를 정제하기 위해 적어도 하나의 크로마토그래피 단계를 거칠 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "크로마토그래피"는 액체 크로마토그래피 또는 칼럼크로마토그래피를 포함할 수 있다. 크로마토그래피가 서로 배타적이지 않은 많은 정의 및/또는 분류를 가짐은 업계에서 알려져 있다. 예를 들면, 액체 크로마토그래피는 칼럼에서 수행될 수 있다. 칼럼 크로마토그래피는 음이온-교환 크로마토그래피를 포함할 수 있다.

일반적으로, IαIp의 제조는 목표한 단백질을 포함하는 것으로 결정된 분획의 선택 및 샘플의 분리를 포함한다. 분리 방법은 예를 들면, 고체상태 용리, 크로마토그래피, 예를 들면 음이온-교환 크로마토그래피, 크기별 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 이온 교환 크로마토그래피, 헤파린 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 순차적 추출(sequential extraction), 젤 전기영동 및 액체 크로마토그래피를 포함한다. 제조는 예를 들어 이온 교환 크로마토그래피, 헤파린 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 순차적 추출, 젤 전기영동 및 액체 크로마토그래피의 단계를 포함하는 정제과정을 또한 포함할 수 있다.

"고체 지지체"는 캡쳐 물질로 유도체합성되거나, 그렇지 않다면 캡쳐물질에 부착될 수 있는 고체 물질을 말한다. 고체 지지체의 예시로는 모노리식 지지체, 입자-기반 지지체, 탐침자, 및 마이크로 타이터 플레이트를 포함한다. 본원에서 "모노리식 지지체"는 한 조각(piece)의 다공성 고체 지지체를 말한다. 본원에서 "입자-기반" 지지체는 크로마토그래피 수지를 포함하는 크로마토그래피 칼럼의 패킹을 위한 균질한 입자를 말한다.

"분석물(Analyte)"은 검출하고자 하는 샘플의 어떤 구성요소를 말한다. 상기 용어는 샘플의 단일 요소 또는 복수의 요소를 의미할 수 있다.

"흡착(Adsorption)"은 분석물이 흡착제 또는 캡쳐물질에 검출가능한 비-공유결합으로 결합한 것을 말한다. 흡착 표면은 흡착제(또한 "캡쳐물질" 또는 "친화 물질"로도 불림)가 결합한 표면을 말한다. 흡착제는 분석물(예를 들어 타겟 폴리펩티드 또는 핵산)이 결합할 수 있는 아무 물질을 의미한다.

크로마토그래피 흡착제는 크로마토그래피에 일반적으로 사용되는 물질을 말한다. 크로마토그래피 흡착제는 예를 들면 이온 교환 물질, 금속 킬레이트(예를 들면, 니트릴로아세트산 또는 이미노디아세트산), 고정화된 금속 킬레이트, 소수성 상호작용 흡착제(interaction adsorbents), 친수성 상호작용 흡착제, 염색제, 단순한 바이오분자(예를 들어 핵산, 아미노산, 단순 당류 및 지방산) 및 혼합된 형태의 흡착제(예를 들어 소수성 친화/정전기 반발 흡착제(hydrophobic attraction/electrostatic repulsion adsorbents))가 있다.

바이오특이적 흡착제는 예를 들어 핵산 분자(예를 들어 앱타머), 폴리펩티드, 다당류, 지질, 스테로이드 또는 이들과의 콘쥬게이트(예를 들어 당단백질, 지질단백질, 당지질, 핵산(예를 들어 DNA)-단백질 콘쥬게이트)와 같은 바이오분자를 포함하는 흡착제를 의미한다. 어떤 경우에 있어서 상기 바이오특이적 흡착제는 다중단백질 복합체와 같은 거대분자구조, 생물학적 막 또는 바이러스일 수 있다. 바이오특이적 흡착제의 예로는 항체, 수용체 단백질 및 핵산을 들 수 있다. 바이오특이적 흡착제는 일반적으로 크로마토그래피의 흡착제에 비해 타겟 분석물에 대해 높은 특이성을 갖는다.

"용리제(Eluant)" 또는 "세정액"은 물질, 일반적으로 용액을 의미하며, 이는 분석물이 흡착제의 표면에 결합하는 것을 조절하거나 영향을 주기 위해 및/또는 상기 표면에 결합하지 않은 물질을 제거하기 위해 사용된다. 상기 세정액 또는 용리제의 용리특성은 예를 들어 pH, 이온강도, 친수성, 카오트로피즘(chaotropism)의 정도, 계면활성 강도 및 온도 등에 의존적일 수 있다. 본 발명의 몇몇 실시예에서 상기 정제방법은 적어도 하나의 완충액 세정 단계를 포함한다. 본 발명의 방법에서 완충액 세정단계는 낮은 pH를 갖는 세정액(예를 들어 4.0, 3.7, 3.5, 3.4, 3.3, 3,1, 2.9, 2.0)을 칼럼에 적용하는 것을 포함한다. 일 실시예에서 상기 낮은 pH 세정액은 약 4.0 미만의 pH를 갖는다. 보다 바람직한 실시예에서, 상기 세정액은 약 3.6 미만의 pH를 갖는다. 보다 더 바람직한 실시예에서, 상기 세정액은 약 3.3 미만의 pH를 갖는다. 가장 바람직한 실시예에서, 상기 세정액은 3.3 내지 약 2.9 미만의 pH를 갖는다. 다른 실시예에서, 정제방법은 하나 이상의 용액 세정 단계를 포함한다. 차후의 세정액은 그 이전단계의 세정액보다 낮은 pH를 갖는 것이 바람직하다. 일 실시예에서, 첫 번째 세정액은 약 4.0의 pH를 가지며, 두 번째 세정액은 약 3.6의 pH를 갖는다. 다른 실시예에서, 첫 번째 세정액은 약 4.0의 pH를 가지며, 두 번째 세정액은 약 3.1의 pH를 갖는다. 또 다른 실시예에서, 첫 번째 세정액은 약 4.0의 pH를 가지며, 두 번째 세정액은 약 2.9의 pH를 갖는다. 본 발명의 실시예에서, 세정액은 아세트산 또는 소듐 아세테이트이다. 본 발명에 적합한 다른 세정액은 시트르산, 글리신 또는 인산용액을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 정제방법은 염을 포함하는 용액으로 세정하는 단계를 포함한다. 상기 염을 포함하는 용액의 염의 농도는 250mM NaCl보다 높은 것 (예를 들어, 260, 270, 280, 290 mM NaCl)이 바람직하다. 일 실시예에서, 첫 번째 세정액의 염농도는 290 mM NaCl 이고, 두 번재 세정액은 pH가 약 2.9이다. 낮은 pH 단계를 포함하는 정제단계의 프로토콜에 상기 염 세정 단계를 추가함으로써 염 세정 단계가 없는 경우에 비해 수율 및 IαIp 의 순도를 높일 수 있음이 발견되었다. 본 발명의 실시예에서, 염을 포함하는 세정액의 염은 염화나트륨(NaCl)이다. 본 발명의 용도에 적합한 다른 염은 염화칼륨(KCl)을 포함한다.

음이온-교환 크로마토그래피는 예를 들어 DEAE-CIM 또는 Q-CIM (BIA Separations)와 같은 고정화된 음이온-교환 리간드를 갖는 CIM과 같이 모노리식(monolithic support) 지지체에 의한 것일 수 있다. 음이온 교환 크로마토그래피는 예를 들어 DEAE 세파로스, DEAE Sephadex A50, Toyopearl DEAE, TMAE Fractogel, DEAE Fractogel, 또는Q-Sepharose 와 같이 입자-베이스(particle-based)인 것일 수 있다. SEPHAROSE 는 Pharmacia, Inc. (of New Jersey for a high molecular weight substance for the separation by gel filtration of macromolecules)의 상표이다. 음이온 교환 칼럼은 매티릭스 및 리간드 두 개의 구성요소를 갖는다. 상기 매트릭스는 예를 들어 셀룰로오스, 덱스트란, 아가로스 또는 폴리스티렌일 수 있다. 상기 고정화된 음이온-교환 리간드는 디에틸아미노에탄(DEAE), 폴리에틸렌이민(PEI), 또는 4차 아민 작용기(Q)일 수 있다. 상기 음이온 교환 칼럼의 강도는 리간드의 이온화 상태를 의미한다. 강한 음이온 교환 칼럼은 예를 들어 4차 암모늄 리간드를 갖는 것들로서, 넓은 pH범위에서도 영구적으로 양전기를 띄는 것을 말한다. DEAE 및PEI와 같은 약한 음이온 교환 칼럼은 양전기의 존재여부가 칼럼의 pH에 따라 다르다. Q Sepharose FF, 또는 금속-킬레이팅 Sepharose (예를 들어, Cu2+-chelating Sepharose)와 같은 강한 음이온 교환 칼럼이 바람직하다. 음이온 교환 칼럼은 일반적으로 낮은 염 용액으로 정제시킬 단백질의 pI 보다 높은 pH로 로딩된다. 상기 용액, 용액의 농도, 염의 농도, 및 용리제의 선택은 숙련된 당업자에게 알려져 있다(예를 들면, Scopes "Protein Purification:Principles and Practice" Springer; 3rd ed. edition (November 19, 1993)).

본 발명의 일 실시예에서, 샘플은 음이온 교환 크로마토그래피로 정제될 수 있다. 음이온 교환 크로마토그래피는 대체적으로 전기적 특성에 따라 샘플 내의 단백질을 정제할 수 있도록 한다. 예를 들면, Q 음이온-교환 수지 (예를 들어, Q HyperD F, Biosepra)가 사용될 수 있으며, 샘플은 순차적으로 다른 pH를 갖는 용리제로 용리될 수 있다. 음이온 교환 크로마토그래피는 다른 종류의 바이오분자 보다 더 음전기를 띄는 샘플에서 바이오분자를 분리할 수 있도록 한다. 높은 pH를 갖는 용리제로 용리된 단백질은 약한 음전기를 띌 가능성이 크며, 낮은 pH를 갖는 용리제로 용리된 분획은 강한 음전기를 띌 가능성이 크다. 따라서, 샘플의 복잡성을 줄이는 것 뿐만 아니라, 음이온 교환 크로마토그래피는 단백질을 그들의 결합특성에 따라 분리한다.

또 다른 실시예에서, 샘플은 헤파린 크로마토그래피로 정제될 수 있다. 헤파린 크로마토그래피는 샘플내의 IαIp 복합체를 헤파린과의 친화도 상호작용 및 전기적 특성에 근거하여 더 정제할 수 있도록 한다. 황화 뮤쿄다당류(sulfated mucopolysaccharide)인헤파린은 양전기를 띄는 모이어티를 갖는 IαIp 복합체에 결합하고, 샘플은 다른 pH 또는 염 농도를 갖는 용리제로 순차적으로 용리될 수 있다. 낮은 pH를 갖는 용리제로 용리된 IαIp 복합체는 보다 더 양전기를 띌 가능성이 높다. 높은 pH를 갖는 용리제로 용리된 IαIp 복합체는 강한 양전기를 띌 가능성이 보다 높다. 따라서, 헤파린 크로마토그래피는 또한 샘플의 복잡성을 줄이고 IαIp 복합체를 그들의 결합 특성에 따라 분리한다. 다른 실시예에서, 샘플은 수산화인회석(hydroxyapatite) 크로마토그래피로 더 정제될 수 있다. 또 다른 실시예에서 샘플은 소수성 상호작용 크로마토그래피(hydrophobic interaction chromatography )로 더 정제될 수 있다.

IαIp 복합체는 예를 들면 단백질의 존재에 대해 순차적으로 탐침될 바이오칩, 다중마이크로타이터 플레이트, 수지, 또는 니트로셀룰로스 막과 간이 기질에 고정화된 캡쳐 물질로 캡쳐될 수 있다. 특히, 본 발명의 IαIp 복합체 표면-증강 레이저 흡수/이완(SELDI) 단백질 바이오칩에 캡쳐될 수 있다. 캡쳐는 크로마토그래피 표면 또는 생체특이적 표면 상에서 이루어질 수 있다. 반응성의 표면을 포함하는 어떠한 SELDI 단백질 바이오칩도 본 발명의 IαIp 복합체를 캡쳐 및 검출하는데 사용될 수 있다. 이들 바이오칩은 IαIp 복합체를 특이적으로 캡쳐하는 항체 또는 면역글루불린에 결합하는 단백질 A 또는 단백질 G 와 같은 캡쳐물질로 유도체화될 수 있다. 그 후 상기 IαIp 복합체는 특이적 항체를 이용하는 용액에서 캡쳐되고, 캡쳐된 복합체는 칩 상에서 캡쳐물질로 분리된다.

IαIp 의 정제는 부피 및 양에 따라 스케일이 결정될 수 있다. 몇몇 실시예에서 1 mL 또는 8 mL 칼럼이 IαIp 정제에 사용된다. 다른 실시예에서 80 mL, 800 mL 칼럼, 또는 8 L 칼럼이 a를 정제하는데 사용된다.

일반적으로 정제된 IαIp는 칼럼으로부터 용리된 후에도 안정도 또는 활성을 유지하는 용액으로 교환된다. 상기 정제된 IαIp 는 낮은 분자량의 단백질 오염을 제거하기 위해 한외여과(ultrafiltration) 또는 정용여과(diafiltration)로 처리될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 정제에 바이러스 불활성화 단계가 삽입될 수 있다. 크로마토그래피 분리 단계에 앞서, 바이러스 입자를 불활성화시키기 위해 용액 및 계면활성제 처리가 있을 수 있다. 한외여과 또는 정용여과 후에는 정제된 IαIp는 나노여과(예를 들어, 바이러스 불활성화를 위해)를 통해 더 처리될 수 있다. 정제된 IαIp는 또한 장기간 보존(stock piled)을 위해 동결건조 및 패킹될 수 있다.

본 발명의 IαIp 조성물은 바람직하게 약 85% 내지 약 100% 순수하다. 본원에서 "순수"는 자연적인 환경에서 제거되어 분리 또는 동정된 IαIp 조성물을 의미하며, 원래 자연적으로 연관되어 있던 다른 구성요소가 약 85% 내지 약 100%, 바람직하게는 90%, 및 보다 바람직하게는 95% 없는 것을 의미한다. 바람직한 실시예에서, 실질적으로 정제된 단백질은 85%, 87.5%, 90%, 92.5%, 95%, 99% 이상 또는 그보다 훨씬 이상의 단백질로 조성물을 구성할 것이다.

펩티드, 폴리펩티드 또는 균질하게 정제된 단백질은 본원에 적용된 바와 같이 다른 단백질 및 생물학적 구성요소가 실질적으로 존재하지 않는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질인 정도의 순도 레벨을 갖는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 의미한다. 정제된 IαIp를 얻기 위해 어떠한 적합한 물질 및 방법이 분리단계 또는 혈장의 단계를 수행하는데 사용될 수 있다.

본원에 공개된 내용에 대하여 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 정제 정도를 정량하는 다양한 방법은 숙련된 당업자에게 알려질 것이다. 이는 예를 들어 분획의 특정단백질의 활성을 측정하거나 젤 전기영동으로 분획 내의 폴리펩티드의 수를 평가하는 것을 포함한다. "생물학적으로 활성을 갖는"은 자연적으로 발현되는 IαIp 복합체의 구조적, 조절적, 생화학적 기능을 갖는 것을 말한다. 유사하게, "면역학적으로 활성을 갖는"은 자연상태, 재조합 또는 합성의 IαIp 복합체, 또는 그들의 아무 올리고펩티드가 적당한 동물 또는 세포에서 특정 면역 반응을 유발할 수 있는 능력 및 특정 항체와 결합할 수 있는 능력을 말한다. IαIp 농도는 경쟁 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)를 이용하여 Lim et al, (J. of Infectious Diseases, 2003)에 기재된 바 대로 MAb 69.31을 통해 측정될 수 있다. 상기 경쟁 ELISA에서, IαIp 의 경쇄에 결합하는 항체, 예를 들면 MAb 69.26 및 MAb 69.31 (Lim et al, J. of Infectious Diseases, 2003)는 IαIp 의 활성부위가 노출되었는지를 감지하는데 사용될 수 있다. 상기 경쟁 ELISA에서 IαIp 의 경쇄에 결합하는 항체를 사용하는 경우, 단백질의 농도에 근거하여 예상보다 많은 측정물이 얻어진 경우는 IαIp 의 활성부위가 노출되었음을 나타내는 것일 수 있다. 항-IαIp 항체가 정제된 IαIp 에 결합하는 것은 경쟁 ELISA로 결정된 바와 같이, 1-, 1.5-, 2-, 3-, 4-, 5-, 또는 10-배 이상으로 증가될 수 있다. 단백질 농도 측정방법은 당업계에 알려져 있으며 또한 상업적으로 사용가능한 단백질 분석(Bicinchoninic acid (BCA) protein assays; BioRad protein assay) 방법도 가능하다. IαIp 산물의 구조 및 순도는 예를 들어 HPLC 또는 기타 당업계에 알려진 기술 중 하나의 크로마토그래피 기술로 확정될 수 있다. 정제된 IαIp 의 특이적인 저해 활성은 L-BAPA (N(alpha)-Benzoyl-L-arginine-4-nitroanilide hydrochloride (Fluka Chemicals)와 같이 색을 발하는 기질을 사용하여 트립신 저해 분석을 통해 측정될 수 있다. 이 분석은 IαIp 가 L-BAPA의 가수분해를 저해할 수 있는 능력에 기초한 것이다. 저해는 410nm에서 흡광도 변화율/분의 감소로 모니터링 될 수 있다.

정제된 IαIp 는 약 60 내지 약 280kDa 사이로 보이는 분자량을 갖는다. 분자량은 SDS-PAGE로 결정될 수 있다. 상기 정제된 IαIp 는 또한 본원 또는 당업계의 방법을 통해 결정될 수 있는 생물학적 활성(예를 들면 사이토카인 저해 활성, 케모카인 저해 활성, 또는 세린 프로테아제 저해 활성)을 갖는다. 정제된 IαIp 는 적어도 낮은 pH로 처리되지 않은 혈액, 혈장, 또는 혈장분획에 존재하는 IαIp, 또는 다른 방법으로 정제된 IαIp 보다는 높은 생물학적 활성을 나타낸다. 상기 방법은 미지의 IαIp 농도를 갖는 샘플에 있어서 IαIp 의 정량에도 사용될 수 있다. 상기 미지의 IαIp 농도를 갖는 샘플은 크로마토그래피 칼럼에 적용된다. 몇몇 실시예에서, 크로마토그래피 칼럼의 부피는 1mL보다 작다. 상기 샘플이 적용되는 칼럼은 낮은 pH 용액(예를 들어 4.0미만)으로 세정된다. 상기 칼럼은 그 다음으로 높은 염 용액(예를 들어 > 500 mM)로 용리된다. 실질적으로 IαIp (예를 들어 순도>90%)로 구성된 상기 용리된 단백질은 업계의 알려진 단백질 농도 결정법으로 측정될 수 있다. 그러한 방법은 본원에 기술된 바와 같이 UV 흡광도, 단백질 분석, 또는 IαIp 농도를 결정하기 위한 경쟁 ELISA를 포함한다. 샘플에 존재하는 IαIp 의 양은 하나 또는 그 이상의 대조군의 양과 비교하여 얻어질 수 있다. 그러한 대조군은 미지의 IαIp 농도를 갖는 샘플을 처리하는데 사용된 방법으로 처리된 바 있는 알려진 양의 IαIp 를 갖는 샘플을 포함한다.

혈액, 혈장 및 혈장 분획

IαIp 는 혈액내에 풍부하므로, IαIp 는 일반적으로 혈액, 혈장, 또는 혈장으로부터 분리된 혈장 분획에서 정제된다. 본원에서 "분리"는 혈장으로부터 혈장분획을 만드는 것을 말하며, 이는 IαI 및 PαI 를 생리학적 조성으로 포함한다. 예를 들면, 혈장 분호기의 분리는 본 발명에 따라 혈장 크로마토그래피로 얻어질 수 있다. 분리된은 원래의 환경(예를 들어 만약 그것이 자연적으로 발생하는 것이라면 그 자연적인 환경)으로부터 물질이 제거된 것을 말하며, 따라서 이는 자연 상태로부터 인간의 손에 의해 변경된 것이다. 예를 들면, 분리된 폴리펩티드 또는 단백질은 혈장의 구성요소일 수 있으며, 또는 세포에 포함되어 있을 수도 있어 "분리(isolate)"된 것으로 간주될 수 있으며 이는 혈장 또는 특정 세포는 상기 폴리펩티드의 원래 환경이 아닐 수 있기 때문이다.

본원에 사용된 "혈장-유래의"는 혈장으로부터 최초로 분리 또는 정제되는 것을 의미한다. 즉, 상기 조성물의 자연적인 환경은 혈장이다.

본원에 사용된 "혈장 분획"은 예를 들어 크로마토그래피와 같은 분리 또는 정제 단계의 분획이며, 혈장으로부터 최초로 유래된 것을 말한다. 본 발명의 혈장 분획은 예를 들어 응고인자 IX 의 정제로부터 얻어진 부-분획(side fraction), 프로 트롬빈 복합체 농축액의 정제로부터의 부-분획, 혈장의 한랭침강(cryoprecipitation)으로부터 유래된 한랭침강상층액(cryosupernatant, ( Hoffer et al., Journal of Chromatography B 669 (1995) 187-196)에 기술), 또는 크라이오-푸어 혈장일 수 있다. 본원에 사용된 "크라이오-푸어 혈장(cryo-poor plasma)" 또는 "한랭상층액(cryosupernatant)"은 혈장의 한랭침강으로부터 얻어진 상층액을 의미한다. 크라이오-푸어 혈장은 신선하게 냉동된 혈장을 해동하여 제조한 것일 수 있다(예를 들어 섭씨 4도 및 10k rpm으로 30분간 원심분리).

상기 프로토콜은 혈장 대신 IαIp 을 포함하는 어떠한 혈장 분획에도 사용될 수 있다. IαIp 함유 혈장 분획은 응고인자 및 기타 혈장 유래 인자의 산업적 처리 동안 또는 응고인자와 같은 다른 약학적 단백질의 정제과정에서 발생하는 중간 혈장 또는 부-분획을 포함한다. 본 발명에 따른 부-분획의 예는 응고인자 IX 의 정제물로부터 얻어진 것을 포함한다. IαI/PαI의 혼합물은 인자 IX(FIX)의 정제 동안 생성된 부-분획에 존재하는 것으로 나타난 바 있다. 응고인자 IX의 정제에서 부-분획을 얻는 방법은 Hoffer et al., Journal of Chromatography B 669 (1995) 187-196에 기술되어 있으며, 본원에 그 전체로서 삽입되어 있다. 다른 부-분획은 D. Josic et al., Thrombosis Research 100 (2000) 433-441에 기술된 바와 같이, FIX 정제로부터의 부-분획 또는 프로트롬빈 복합체 농축액의 정제로부터의 부-분획을 포함하며, 이는 본원에 그 전체로서 삽입되어 있다. 부-분획의 다른 예는 본원에서 분획 D 및 분획 C로 지칭되는 FIX 정제로부터의 부-분획을 포함한다. 분획 D 및 분획 C는 FIX 및 다른 응고인자, 등등의 정제 중에 얻어진 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 IαIp 함유 분획을 의미한다. 분획 D는 높은 염 조건(예를 들어, >500mM NaCl) 하에서 음이온 교환 칼럼으로 용출한 IαIp 함유 분획이다. 분획 C는 음이온 칼럼으로 혈장을 정제하여 25 mM 시트르산염, pH 6.0, 0.5 M NaCl로 용리하여 유래된 IαIp 함유 분획이다. 분획 C는 결합되지 않은 분획, 즉, 음이온 교환 컬럼(in 25 mM Citrate, pH 6.0, 0.5 M NaCl)으로부터의 용리제가 항-인자 IX 친화도 컬럼에 적용되는 항-인자IX 친화도 정제 단계로 부터의 결과물(flow through)이다.

혈장의 한랭침강으로부터 유래한 한랭침강상층액으로서 부-분획의 일 예. 예를 들면 적합한 한랭침강 방법은 Hoffer et al., Journal of Chromatography B 669 (1995) 187-196에 기술되어 있다.

혈액 및 혈장은 인간, 영장류, 소류, 말류, 돼지류, 양류, 고양이류 또는 개류 원천으로부터 얻어질 수 있다. 혈액은 예를 들어 혈액은행, 병원, 양육원(hospices), 사설회사, 연구재단, 또는 기타 혈액의 원천으로부터 수득 또는 구매될 수 있다.

혈장은 예를 들어 혈액은행, 병원, 양육원(hospices), 사설회사, 연구재단, 또는 기타 혈액의 원천으로부터 수득 또는 구매될 수 있다. 선택적으로, 혈장은 혈액이 한 번 수득된 혈액으로부터 얻어질 수 있다. 혈장을 분리하는 적합한 방법은 중력 및 원심분리를 포함한다. 본 발명에 따른 혈장 분획은 인간, 영장류, 소류, 말류, 돼지류, 양류, 고양이류 또는 개류의 원천으로부터 유래한 것일 수 있다.

부-분획으로부터의 몇몇 선행 IαIp 정제는 인자 X(FX)에 의한 오염을 포함하였으며, 이는 웨스턴 블롯에서의 80kDa 밴드와 응고분석(clotting assay)에서 확인되었다. FX의 제거는 중요한데, 이는 FX가 트롬보제닉(thrombogenic)하며 인간에게 투여될 경우 해로울 수 있기 때문이다. 본원의 IαIp 정제방법은 FX 오염을 제거한다. 추가적으로, 혈장을 크로마토그래피를 이용한 분리 전에 용매와 계면활성제로 처리하여 혈장 또는 혈장분획에 존재하는 바이러스를 불활성화 시킬 수 있다.

약학적 방법

본 발명은 IαIp 레벨의 감소 또는 케모카인, 사이토질병 및 사이토카인, 또는 프로테아제의 증가와 관련된 질병 또는 이상을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 많은 세포수와 관련된 질병 또는 증상은 케모카인, 사이토카인, 또는 프로테아제의 증가로 특정된다. 그러한 질병 또는 병리학적 증상은 이에 한정되는 것은 아니나, 염증, 외상/상해, 암의 침입(tumor invasion), 암의 전이, 패혈증, 패혈성 쇼크, 또는 감염성 질병을 포함한다. 본 발명의 방법은 상기 레벨의 감소 또는 케모카인, 사이토카인 또는 프로테아제의 활성에 의한 그러한 질병, 이상 또는 부상을 개선시킨다.

본 발명은 본원의 정제된 IαIp 단백질을 포함하는 약학적으로 유효량의 약학적 조성물을 대상체(예를 들어, 인간과 같은 포유류)에 투여하는 것을 포함하는 질병 및/또는 이상 또는 증상의 치료방법을 제공한다. 따라서, 일 실시예는 IαIp 의 부족에 의해 특정되는 그러한 질병 또는 이상 또는 증상에 취약하거나 이를 앓고 있는 대상체를 치료하는 방법이다. 상기 방법은 상기 포유류에 본 발명의 약학적인 양의 조성물을 상기 질병 또는 이상 또는 증상을 치료하기에 충분한 양으로 그러한 질병 또는 이상이 치료될 수 있는 조건으로 투여하는 단계를 포함한다.

다양한 실시예에서, 본 발명의 물질은 질병 또는 부상의 부위로 국부주사에 의해, 서방형 침투(sustained infusion)에 의해, 또는 외과적 조건하에서 미세주입에 의해 투여된다(Wolff et al., Science 247:1465, 1990). 다른 실시예에서, 상기 물질은 IαIp 이 부족한 환자의 조직 또는 기관으로 전신 투여된다.

본원의 방법은 대상체(그러한 치료를 필요로 하는 것으로 식별된 대상체를 포함하여)에 본원에 기술된 바와 같이 정제된 IαIp 단백질의 유효량, 또는 그러한 효과를 나타내는 것으로 본원에 기재된 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 그러한 치료를 필요로 하는 대상체를 식별하는 것은 대상체 또는 건강관리 전문가의 판단에 의할 수 있으며, 주관적(예를 들어, 의견) 또는 객관적(예를 들어 테스트 또는 분석 방법으로 측정)일 수 있다.

본 발명의 상기 약학적 방법(예방적 치료를 포함하는)은 일반적으로 본원의 제형의 화합물을 포유류, 특히 인간을 포함하여 이를 필요로 하는 대상체(예를 들면, 동물, 인간) 약학적으로 효과적인 양의 본 발명의 조성물을 투여하는 것을 포함한다. 상기 대상체는 영장류, 소류, 말류, 돼지류, 양류, 고양이류 또는 개류일 수 있다. IαIp 로 치료하기 적합한 대상체는 염증, 외상/상해, 암의 침투, 암의 전이, 패혈증, 패혈성 쇼크, 또는 감염성 질병을 갖는 것으로 식별된 것일 수 있다. 그러한 치료는 질병, 이상, 또는 증상의 위험에 처해있거나 취약하거나 이를 앓고 있는, 특히 인간과 같은 대상체에 적합하게 투여될 것이다. 그러한 대상체의 "위험"은 대상체 또는 건강관리제공자(예를 들어 유전자 테스트, 효소 또는 단백질 마커, 마커(본원에 기재된), 가족력, 및 그와 유사한 것들)에 의한 분석 테스트 또는 대상체의 의견을 통해 결정될 수 있다. 상기 대상체는 자가 진단 또는 의료 수행자의 분석에 의해 염증, 암의 침입, 암의 전이, 패혈증, 패혈성 쇼크, 또는 감염성 질환을 가지고 있는지 분석될 수 있다. 상기 대상체는 영장류, 인간, 또는 기타 동물일 수 있다. 본원의 상기 조성물은 세포수에 부족이 있는 기타의 질병을 치료하는데에도 사용될 수 있음이 나타나 있을 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명은 치료과정을 모니터링하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 IαIp 레벨이 부족하거나 케모카인, 사이토카인 또는 프로테아제가 증가한 것과 관련이 있는 이상 또는 증상을 겪고 있거나 이에 취약한 대상체에서 분석 마커(마커)(예를 들어 본원의 화합물, 단백질 또는 이들의 지시자(indicator) 등으로 조절되는 본원에 나열된 어떤 타겟) 또는 분석적 측정(예를 들어 탐색, 분석) 하는 단계를 포함한다. 상기 대상체에는 본원의 조성물을 그들의 질병 또는 증상을 치료하기에 충분한 약학적인 양의 화합물을 투여받았을 수 있다. 상기 방법에서 결정되는 마커의 레벨은 건강한 정상 상태 또는 다른 피해 환자에 있어서 대상체의 질병 상태를 측정하기 위해 알려진 마커의 레벨을 비교될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 대상체에서의 마커의 두 번째 레벨은 첫번째 레벨의 결정된 이후의 시점에서 결정되며, 두 개의 레벨은 질병 또는 치료의 효험을 모니터링하기 위해 서로 비교될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 대상체에서의 마커의 전 처리 레벨은 본 발명에 따른 치료 이전에 결정될 수 있으며; 이러한 마커의 전처리 레벨은 치료의 시작 이후에 대상체에서의 마커의 레벨과 비교되어 치료의 효험을 결정할 수 있다.

약학적 조성물

본 발명은 사이토카인, 케모카인, 및 프로테아제의 활성을 저해하거나 레벨을 낮출 수 있는 물질을 포함하는 약학적 제재에 관한 것이다. 그러한 제재는 약학적이면서도 예방적인 적용을 갖는다. 본원에 기재된 상기 방법에 유용한 물질은 사이토카인, 케모카인, 또는 프로테아제의 레벨을 감소시키는 것들을 포함한다. 원하는 경우, 본 발명의 조성물은 대상체의 순환에 존재하는 사이토카인, 케모카인 및 프로테아제의 레벨을 감소시키는 물질과 함께 제형화될 수 있다. 사이토카인 또는 케모카인 반응을 줄이는 물질은 이에 국한되는 것은 아니나, 항-TNF-알파 항체 또는 TNF 저해제를 포함한다.

본 발명의 화합물들은 약학적 조성물의 형태로 투여될 수 있다. 상기 조성물은 무균이어야 하며, 약학적으로 효과가 있는 양의 본 발명의 물질을 대상체에 투여하기에 적합한 유닛중량 또는 부피의 물질을 포함해야 한다. 상기 조성물 및 본 발명의 조합은 약학적 팩의 일부일 수 있으며, 이 경우 각 화합물 각각은 개인 투여형의 양으로 존재한다.

본 발명의 예방 또는 치료를 위한 투여용 조성물은 무균이어어야 한다. 무균은 무균 여과막(예를 들어 0.2 μm 막)으로 여과, 감마선 조사, 또는 기타 당업자에게 알려진 방법을 통해 용이하게 달성된다. 일반적으로 약학적 폴리펩티드 조성물은 예를 들면 피하주사 바늘로 뚫을 수 있는 정맥 용액 가방 또는 바이알과 같은 무균의 접근 장치를 갖는 용기에 존재한다. 이들 조성물은 예를 들면, 앰플 또는 바이알에 밀봉되거나, 재구성(reconstitution )을 위한 액상 용액 또는 동결건조된 제형으로 통상적으로 단일 또는 다중 용량의 용기에 보관된다.

상기 화합물은 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제와 조합될 수 있다. 상기본원에서 사용되는 "약학적으로 허용가능한 첨가제"는 사람에게 투여하기에 적합한 하나 또는 그 이상의 호환가능한 고체 또는 액체의 필러, 희석제 또는 캡슐화 기질을 의미한다. 상기 부형제는 바람직하게는 등장도(isotonicity) 및 화학적 안정도를 증가시키는 물질과 같이 적은 양의 첨가제를 포함한다. 그러한 물질은 수여자에게 그러한 용량 및 농도로는 비-독성이며, 인산염, 시트라산염, 숙신산염, 아세트산염, 젖산염, 주석산염(tartrate) 용액 및 기타 유기산 또는 그들의 염; TRIS(tris- hydroxymethylaminomethane), 중탄산염(bicarbonate), 탄산염(carbonate), 및 기타 유기염기 및 그들의 염; 아스코르브 산과 같은 항산화제; 예를 들어, 폴리아르기닌, 폴리라이신, 폴리글루타메이트 및 폴리아스파테이트와 같은 저분자량(예를 들어 약 10개의 잔기 미만인) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리프로필렌글리콜(PPGs), 및 폴리에틸렌 글리콜(PEGs)과 같은 친수성 고분자 ; 글리신, 글루탐산, 아스파르트산, 히스티딘, 라이신, 또는 아르기닌과 같은 아미노산; 단당류, 다당류 및 셀룰로스 또는 이의 유도체, 글루코스, 만노스, 슈크로스, 덱스트린을 포함하는 기타 탄수화물 또는 헤파린, 콘드로이틴 설페이트 또는 덱스트란 설페이트와 같은 황화 탄수화물; 칼슘이온, 마그네슘이온 및 망간이온을 포함하는 2가 금속이온과 같은 다가 금속 이온; EDTA(ethylenediamine tetraacetic acid)와 같은 킬레이팅 화합물; 만니톨 또는 솔비톨과 같은 당알콜; 나트륨 또는 암모늄과 같은 반대이온(counterions); 및/또는 폴리소르베이트 또는 폴록사머(poloxamers)와 같은 비이온성 계면활성제를 들 수 있다. 다른 첨가제는 또한 안정화제, 항-미생물제, 불활성 기체, 유체 및 영양분 보충제(즉, 링거의 덱스트로스), 전해질 보충제 및 그 유사제와 같은 것들도 포함될 수 있으며, 이들은 통상적인 양으로 존재할 수 있다.

본원에 기재된 바와 같이 상기 조성물은 유효량으로 투여될 수 있다. 상기 유효량은 투여의 양태, 치료될 특정 증상 및 원하는 결과에 따라 달라질 수 있다. 이는 또한 증상의 진행 정도, 대상체의 연력 및 생리적 상태, 공존하는 치료의 성질에도 의존적일 수 있고, 어떤 것이든 의료전문가에게 잘 알려진 인자들에 의존적일 수 있다. 약학적 적용을 위해서는, 그것은 의학적으로 원하는 결과를 달성하기에 충분한 양이다.

IαIp 의 감소로 특정되는 질병 또는 이상을 갖는 대상체에 관해서는, 유효량은 케모카인, 사이토카인 또는 프로테아제의 레벨 또는 활성을 줄이기에 충분하거나, 병리학과 연과된 증상을 안정화, 완화, 또는 저감시키기에 충분한 양이다.

본 발명의 조성물은 급성 염증 질병, 패혈증, 심각한 쇼크, 패혈성 쇼크, 류마티스 관절염, 암, 암의 전이, 감염성 질병에 사용될 수 있고, 또는 조기 진통은 간단하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 화합물의 양은 하루 약 0.01mg/kg 내지 하루 약 1000mg/kg 일 수 있다. 약 50 내지 약 2000mg/kg 범위의 양이 적합할 것으로 예상된다. 보다 낮은 양은 정맥 투여와 같은 형태의 투여에서 기인할 것이다. 최초 투여량으로 대상체의 반응이 충분하지 않은 경우에는, 보다 높은 양(또는 다른 국부적인 루트로 전달되는 효과적으로 보다 많은 양)이 환자의 내성이 허락하는 범위까지 적용될 수도 있다. 본 발명의 조성물의 적당한 전신 레벨에 도달하기 위해서 하루에 다중의 투여량도 고려될 수 있다.

다양한 투여루트가 이용될 수 있다. 본 발명의 방법은 일반적으로, 의학적으로 허용가능한 것이면 어떠한 투여방법도 수행될 수 있으며, 임상학적으로 허용할 수 없는 부작용을 일으키지 않는 활성물질의 효과적인 레벨을 만드는 어떠한 방식도 가능함을 의미한다. 다른 투여방법은 구강, 직장, 국부, 안구내, 구강, 질내, 낭내(intracisternal), 뇌실내(intracerebroventricular), 기관내(intratracheal), 비강, 경피(transdermal), 임플란트 내(within/on implants) 또는 비경구(parenteral)의 루트를 포함한다. 상기 "비경구"는 피하, 척추강내(intrathecal), 정맥(intravenous), 근육, 복강(intraperitoneal), 또는 투입(infusion)을 포함한다. 구강투여는 예방적 치료에서 더 바람직한데, 이는 투여 스케줄뿐만 아니라 환자에게 편리하기 때문이다.

본 발명의 약학적 조성물은 선택적으로 하나 또는 그 이상의 추가적인 단백질을 원하는 대로 더 포함할 수 있다. 표준적인 재조합 DNA 기술에 따라 도입된 사람 또는 포유류 단백질을 발현하는 유전자를 포함하는 재조합 조직 배양, 바이러스, 효모, 박테리아, 또는 그 유사물의 상층액, 추출액(extracts), 또는 용해물(lysates)로부터; 또는 인간의 생물학적인 유체(예를 들어 혈액, 모유, 림프, 소변 또는 그 유사물) 또는 일반적인 형질전환 기술에 따라 도입된 인간 단백질을 발현하는 유전자를 포함하는 형질전환 동물로부터 당업자에게 알려지고 이용가능한 방법을 통해 적합한 단백질 또는 생물학적 물질을 인간 또는 포유류의 혈장으로부터 얻을 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 하나 또는 그 이상의 약 5.0 내지 약 8.0의 범위와 같이 생리학적 pH를 반영하는 미리 결정된 레벨에 다른 제형의 pH를 유지할 수 있는 pH 조절 물질을 포함할 수 있다. 액상의 제형에 사용되는 상기 pH 조절 물질은 아미노산 또는 아미노산의 혼합물일 수 있으며, 히스티딘 또는 히스티딘과 글리신의 아미노산 혼합물일 수 있다. 선택적으로, 상기 pH 조절 물질은 미리 결정된 레벨인 약 5.0 내지 약 8.0의 범위와 같이 제형의 pH를 유지하는 물질인 것이 바람직하며, 칼슘 이온을 킬레이트하지 않는 것이 바람직하다. 그러한 pH 조절 물질의 도식적인 예는 이에 한정되지는 않으나, 이미다졸 및 아세테이트 이온을 포함한다. 상기 pH 조절 물질은 미리 결정된 레벨에서의 제형의 pH를 유지하기에 적합하다면 어떠한 양으로도 존재할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 또한 하나 또는 그 이상의 삼투 조절 물질, 즉, 제형의 삼투특성을 수여자의 혈류 및 혈액세포에 허용가능한 레벨로 조절할 수 있는 화합물(예를 들어 긴장성(tonicity), 삼투질농도(osmolality) 및/또는 삼투압)을 포함한다. 삼투 조절 물질은 칼슘 이온을 킬레이트 하지 않는 물질일 수 있다. 상기 삼투 조절 물질은 상기 제형의 삼투 특성을 조절하는 당업계의 숙련자에게 알려지거나 이용가능한 어떠한 화합물도 가능하다. 숙련된 당업자는 발명상의 제형의 용도를 위해 경험적으로 삼투 조절 물질의 적합성을 경험적으로 결정할 수 있다. 삼투 조절 물질의 적합한 형태의 도식적인 예는 이에 국한되는 것은 아니며, 염화나트륨 및 소듐 아세테이트와 같은 염;슈크로스, 덱스트로스, 및 만니톨과 같은 당; 글리신과 같은 아미노산; 및 이들 물질 및/또는 물질의 종류들의 하나 또는 그 이상의 혼합물을 포함한다. 상기 삼투 조절 물질은 제형의 삼투 특성의 조절에 충분한 정도라면 어떠한 농도로도 존재할 수 있다.

본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 칼슘이온, 마그네슘 이온 및/또는 망간 이온과 같은 다가의 금속 이온을 포함할 수 있다. 어떠한 금속이온이라도 상기 조성물을 안정화시키고 수여자 개인에게 부작용을 유발하지 않는 것이면 어떠한 다가 금속 이온도 사용이 가능하다. 숙련된 당업자는 이러한 두 가지 범주에 입각하여 적합한 금속 이온을 경험적으로 결정할 수 있으며, 그러한 금속 이온의 적합한 원천은 알려져 있으며, 무기와 유기의 염을 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물은 또한 비-수계 액상 제형일 수 있다. 조성물에 포함된 활성물질들의 안정성을 제공하는 것이면 어떠한 비-수계 액체도 적용이 가능하다. 바람직하게는 상기 비-수계 액상은 친수성 액체이다. 적합한 비-수계 액상의 도식적인 예는: 글리세롤;DMSO(dimethyl sulfoxide); PMS(polydimethylsiloxane); 에틸렌 글리콜, 디에틸렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 200, PEG 300, alc PEG 400과 같은 에틸렌 글리콜; 및 프로필렌 글리콜 디프로필렌글리콜, 트리프로필렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜(PPG) 425, PPG 725, PPG 1000, PPG 2000, PPG 3000 및 PPG 4000과 같은 프로필렌 글리콜들을 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물은 또한 수계/비-수계 액상 제형의 혼합물일 수 있다. 상기에 기술된 바와 같이 수계/비수계 혼합물의 액상 제형이 조성물에 포함된 화합물의 안정성을 제공하는 한 상기 기술된 바와 같이 어떠한 적합한 비-수계 액상 제형이 수계도 액상 제형과 함께 사용될 수 있다. 바람직하게는, 그러한 제형의 비-수계 액상은 친수성 액상이다. 적합한 비-수계 액상의 도식적인 예는 글리세롤; DMSO; PMS; PEG 200, PEG 300, 및 PEG 400과 같은 에틸렌 글리콜; PPG 425, PPG 725, PPG 1000, PPG 2000, PPG 3000 및 PPG 4000과 같은 프로필렌 글리콜을 포함한다.

적합하고 안정한 제형은 활성물질들이 냉동 또는 냉동되지 않은 액상으로 보관될 수 있도록 할 수 있다. 안정적인 액상 제형은 적어도 70℃의 온도에서 저장될 수 있으며, 적어도 0℃보다 높은 온도, 또는 약 0.1℃ 및 약 42℃ 사이에서 보관될 수 있으며, 조성물의 특성에 의존적이다. 숙련된 당업자에게는 단백질 및 폴리펩티드가 일반적으로 pH, 온도, 및 약학적 효험에 영향을 미칠 수 있는 다른 많은 요인의 변화에 민감하다는 것이 알려져 있다.

다른 전달계는 시간-방출, 지연 방출 또는 느린 방출 전단계가 이용가능하며 당업계의 숙련자에게 알려져 있다. 이들은 폴리락타이드(U.S. Pat. No. 3,773,919; European Patent No. 58,481), 폴리(락타이드-글리콜라이드), 코폴리옥살레이트, 폴리카프로락톤, 폴리에스테라마이드, 폴리오르토에스테르와 같은 고분자 기반의 시스템, 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르 산(유럽특허No. 133, 988)과 같은 폴리히드록시부티르 산, L-글루탐산 및 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체(Sidman, K.R. et al., Biopolymers 22: 547-556), 폴리 (2-히드록시에틸 메타크릴레이트) 또는 에틸렌 비닐 아세테이트(Langer, R. et al., J. Biomed. Mater. Res. 15:267-277; Langer, R. Chem. Tech. 12:98-105), 및 폴리안하이드리드를 포함한다.

느린 방출형 조성물의 다른 실시예는 예를 들어 필름, 또는 마이크로 캡슐과 같은 형체가 있는 반투과성 고분자 매트리스를 포함한다. 전달계는 또한 비-고분자 시스템을 포함하는데 이들은; 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르 및 지방상 또는 모노- 디- 및 트리-글리세리드와 같은 지질; 생물학적으로 유래된 생체흡수형 히드로겔(즉, 키틴 히드로겔 또는 키토산 히드로겔)과 같은 히드로겔 방출 시스템; 실라스틱(sylastic) 시스템; 펩티드 기반 시스템; 왁스 코팅; 일반적인 바인더 및 부형제를 이용한 압축된 타블렛;일부가 연결된 임플라트; 및 그와 유사한 것들을 포함한다. 특이적인 실시예는 이에 제한되는 것은 아니나, (a) 미국특허 4,452,775, 4,667,014, 4,748,034 및 5,239,660 에 기재된 것과 같이 매트릭스 내에 저장된 형태의 침식 시스템(erosional systems) 및 (b) 미국특허 3,832,253, 및 3,854,480에 기재된 것과 같이 고분자로부터 조절된 비율로 활성인자가 투과하는 확산 시스템을 포함한다.

본 발명의 상기 방법 및 조성물과 사용될 수 있는 다른 타입의 전달계는 콜로이드 분산 시스템이다. 콜로이드 분산 시스템은 수중유적형의 에멀젼, 마이셀, 혼합된 마이셀 및 리포좀을 포함하는 지질 기반의 시스템을 포함한다. 리포좀은 인공적인 막 용기로서 생체 또는 시험관 조건에서의 전달 벡터로서 유용하다. 크기가 0.2- 4.0μm 범위인 거대한 LUV(unilamellar vessels)는 거대분자들을 수계의 내부에 가둘 수 있으며 생물학적으로 활성을 띄는 형태로 세포로 전달될 수 있다(Fraley, R., and Papahadjopoulos, D., Trends Biochem. Sci. 6: 77-80).

리포좀은 단일클론 항체, 당, 당지질 또는 단백질과 같은 특정 리간드에 리포좀을 결부시켜 특정 조직으로 타겟팅될 수 있다. 리포좀은 Gibco BRL에서 예를 들어 LIPOFECTIN^TM 및 LIPOFECTACE^TM으로 구매가 가능하며, 이들은 N-[1-(2, 3 디올레일록시)-프로필]-N, N, N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA) 및 디메틸 디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB)과 같이 양이온의 지질로 형성된다. 리포좀을 만드는 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들면 DE 3,218,121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82:3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77:4030-4034 (1980); EP 52,322; EP 36,676; EP 88, 046; EP 143,949; EP 142,641; Japanese Pat. Appl. 83-118008; U.S. Pat. Nos. 4,485,045 and 4,544,545; and EP 102,324과 같이 많은 문헌에 기재되어 있다. 리포좀은 by Gregoriadis, G., Trends Biotechnol., 3: 235-241에 리뷰된 바 있다.

다른 종류의 수송체는 생체적합성을 갖는 미세입자 또는 포유류 수여자에게 이식이 적합한 임플란트이다. 이러한 방법과 상응하여 유용한 예시적인 생체흡수성 임플란트는 PCT 국제특허 PCT/US/03307 (공개번호. WO 95/24929, 제목:"Polymeric Gene Delivery System")에 기재되어 있다. PCT/US/0307는 생체적합하고, 바람직하게는 외부의 유전자를 적합한 프로모터의 조절 하에 포함하는 생분해성의 고분자 매트리스를 기재하고 있다. 상기 고분자 매트리스는 외부유전자 또는 유전자 산물을 대상체 내에서 느리게 방출되도록 하는 데 사용된다.

상기 고분자 매트리스는 바람직하게는 마이크로스피어(물질이 고형의 고분자 매트릭스 전체에 분산되는) 또는 마이크로캡슐(물질이 고분자 껍질의 중심에 저장되는) 미세입자의 형태이다. 약물을 포함하는 상기 고분자의 마이크로캡슐은 예를 들어 미국특허 5,075,109에 기재되어 있다. 약물을 포함하는 고분자 매트릭스의 다른 형태는 필름, 코팅, 젤, 임플란트 및 스텐트를 포함한다. 고분자 매트릭스 장치의 크기 및 조성은 상기 매트릭스가 도입될 조직 내에서 양호한 방출 역학을 나타내도록 선택된다. 고분자 매트릭스의 크기는 사용될 전달 방법에 따라 더 선택된다. 바람직하게는, 에어로졸 루트가 사용되는 경우 고분자 매트릭스 및 조성물은 계면활성제 수송체에 포함된다. 상기 고분자 매트릭스 조성물은 양호한 퇴화율을 갖도록 선택될 수 있으며, 전이의 효과를 더 증가시키기 위해 생부착성인 물질로 형성될 수 있다. 상기 매트릭스 조성물은 퇴화되지 않도록, 그러나 연장된 기간의 시간동안 확산에 의해 방출되도록 선택될 수 있다. 상기 전달 시스템은 또한 국부적인 부위 특이적 전달에 적합한 생체적합성의 마이크로스피어일 수 있다. 그러한 마이크로스피어는 Chickering, D.E., et al., Biotechnol. Bioeng., 52: 96-101; Mathiowitz, E., et al., Nature 386: 410-414에 공개되어 있다.

비-생분해성 및 생분해성 고분자 매트리스 모두 본 발명의 조성물을 대상체에 전달하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 고분자는 자연적 또는 합성의 고분자일 수 있다. 상기 고분자는 원하는 시간의 범위에 기반하여 방출이 일어나도록 선택되며, 일반적으로 몇 시간에서 1년 또는 그 이상일 수 있다. 일반적으로, 방출은 몇 시간 및 3 내지 12 달의 범위인 것이 가장 바람직하다. 선택적으로 상기 고분자는 물속에서 자신의 무게의 약 90%까지 흡수할 수 있는 히드로겔의 형태이며, 또한 선택적으로 다가의 이온 또는 다른 고분자로 교차결합된다.

생분해성 전달 시스템을 형성하기 위해 사용될 수 있는 예시적인 합성 고분자는: 폴리아미드, 폴리카보네이트, 폴리알킬렌, 폴리알킬렌 글리콜, 폴리알킬렌 옥사이드, 폴리알킬렌 테레프탈레이트(polyalkylene terepthalates), 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 에테르, 폴리비닐 에스테르, 폴리비닐 할라이드(poly-vinyl halides), 폴리비닐피롤리돈, 폴리글리콜리드(polyglycolides), 폴리실록산, 폴리우레탄 및 이들의 공중합체, 알킬 셀룰로스, 히드록시알킬 셀룰로스, 셀룰로스 에테르, 셀룰로스 에스테르, 니트로 셀룰로스, 아크릴 에스테르 및 메타크릴 에스테르의 고분자, 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시-프로필 메틸 셀룰로스, 히드록시부틸 메틸 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 프로피오네이트, 셀룰로스 아세테이트 부티레이트(cellulose acetate butyrate), 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트(cellulose acetate phthalate), 카르복실에틸 셀룰로스, 셀룰로스 트리아세테이트, 셀룰로스 설페이트 나트륨 염, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(에틸 메타크릴레이트), 폴리(부틸메타크릴레이트), 폴리(이소부틸 메타크릴레이트), 폴리(헥실메타크릴레이트), 폴리(이소데실 메타크릴레이트) poly(isodecyl methacrylate), 폴리(라우릴 메타크릴레이트), 폴리(페닐메타크릴레이트), 폴리(메틸 아크릴레이트), 폴리(이소프로필 아크릴레이트), 폴리(이소부틸 아크릴레이트), 폴리(옥타데실 아크릴레이트), 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 폴리(비닐 알코올), 폴리비닐 아세테이트, 폴리비닐 클로라이드, 폴리스티렌, 폴리비닐피롤리돈, 및 젖산 및 글리콜산의 고분자, 폴리안하이드리드, 폴리(오르토)에스테르, 폴리(부틱산)(poly(butic acid)), 폴리(발레르산)(poly(valeric acid)), 및 폴리(락타이드-코카프로락톤)(poly(lactide-cocaprolactone)), 및 알기네이트(alginate )와 같은 천연고분자 및 덱스트란 및 셀룰로스를 포함하는 기타 다당류, 콜라겐, 그들의 화학적 유도체(치환, 화학기의 부가, 예를 들어 알킬, 알킬렌, 수산화, 산화 및 기타 숙련된 당업자에 의한 일상적인 기타의 변형들), 알부민 및 기타 친수성 단백질, 제인 및 기타 프롤아민 및 소수성 단백질, 공중합체 및 이들의 혼합물을 포함한다. 일반적으로, 이들 물질은 효소 가수분해 또는 생체 환경의 물에 대한 노출, 표면 또는 벌크 침식에 의해 분해된다.

숙련된 당업자는 급성염증 질환, 패혈증, 심각한 쇼크, 패혈성 쇼크, 류마티스 관절염, 암, 암의 전이, 외상/상해, 감염성 질환, 또는 조기 진통을 치료하기 위한 본 발명의 화합물을 사용하는 가장 좋은 치료 요법이 간단히 결정될 수 있음을 인식할 것이다. 이는 실험의 문제가 아니고 최적화의 문제이며, 의료업게에서 일상적으로 수행되는 것이다. 누드 마우스를 이용한 시험관 연구는 투여량 및 전달 요법을 최적화하는 것의 출발점을 종종 제시한다. 몇몇 마우스 연구에서 수행된 바로는, 주사 빈도는 처음에는 주당 일회이다. 그러나 이러한 빈도는 하루에서부터 매 2주에서 월단위로 최초 임상 시도로부터 얻어진 결과 및 특정 환자의 요구에 따라 최적으로 조절될 것이다.

인간의 투여용량은 처음에는 쥐에서 사용된 화합물의 양으로부터 추론하여 결정될 수 있으며, 숙련된 당업자는 동물 모델과 비교하여 인간을 위한 투여량을 조절하는 것은 일상적인 것임을 인지할 것이다.

어떤 실시예에서 상기 투여량은 1mg 화합물/Kg 체중 내지 약 5000mg 화합물/Kg 체중; 또는 약 5mg/Kg 체중 내지 약 4000mg/kg 체중 또는 약 10mg/Kg 체중 내지 약 3000mg/Kg 체중; 또는 약 50mg/Kg 체중 내지 약 2000mg/kg 체중; 또는 약 100mg/Kg 체중 내지 약 1000mg/Kg 체중; 또는 약 150mg/Kg 체중 내지 약 500mg/kg 체중이다. 다른 실시예에서 이들 투여량은 약 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 mg/Kg 체중일 수 있다. 다른 실시예에서, 보다 높은 투여량이 사용될 수 있으며, 그러한 투여량은 약 5mg 화합물/Kg 체중 내지 약 20mg 화합물/Kg 체중의 범위일 수 있음이 예상된다. 다른 실시예에서 상기 투여량은 약 8, 10, 12, 14, 16 or 18 mg/Kg 체중일 수 있다. 물론, 이러한 투여량은 상향 또는 하향 조절될 수 있으며, 그러한 치료 프로토콜에서 일상적으로 행해지는 바와 같이, 최초 임상 시도의 결과 및 특정 환자의 요구에 따라 달라질 수 있다.

조합 치료(Combination Therapies)

본 발명의 조성물 및 방법은 당업계에 알려진 표준적인 치료법과 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 추가적인 치료제는 항암물질, 항염증물질, 항응고물질 또는 면역조절제일 수 있다. 예를 들어, 상기 추가적인 치료제는 지도부딘(zidovudine (AZT)), 2',3'-다이데옥시이노신 (ddI) and 2',3'-다이데옥시시티딘(ddC), 라미부딘(lamivudine (3TC)), 스타부딘(stavudine (d4T)), 및 트라지비르(TRIZIVIR (abacavir+zidovudine+lamivudine))의 예와 같은 다이데옥시뉴클레오시드(dideoxynucleosides), 예를 들어, 비-뉴클레오시드(nonnucleosides), 예를 들어, 에파비렌즈(efavirenz (DMP-266, DuPont Pharmaceuticals/Bristol Myers Squibb)), 네비라핀(nevirapine (Boehringer Ingleheim)), 및 델라비리딘(delaviridine (Pharmacia-Upjohn)), Ro 3-3335 및 Ro 24-7429와 TAT 길항제, 프로테아제 길항제, 예를 들어, 인디나비르(indinavir (Merck)), 리토나비르(ritonavir (Abbott)), 사퀴나비르(saquinavir (Hoffmann LaRoche)), 넬피나비르(nelfinavir (Agouron Pharmaceuticals)), 141 W94 (Glaxo-Wellcome), 아타타나비르(atazanavir (Bristol Myers Squibb)), 암프레나비르(amprenavir (GlaxoSmithKline)), 포삼프레나비르(fosamprenavir (GlaxoSmithKline)), 티프라나비르(tipranavir (Boehringer Ingleheim)), KALETRA (lopinavir+ritonavir, Abbott), 및 기타 other agents such as 9-(2-히드록시에톡시메틸) 구아닌(아시크로비르), hydroxyethoxymethyl)guanine (acyclovir), 인터페론interferon, 예를 들어, 알파-인터페론alpha-interferon, 인터류킨 II interleukin II, 및 포스포노포메이트(phosphonoformate (Foscarnet)), 또는 진입 저해제, 예를 들어, T20 (enfuvirtide, Roche/Trimeris) or UK-427,857 (Pfizer), 레바미솔(levamisol) 또는 티모신(thymosin), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 도세탁셀(docetaxel), 파클리탁셀(paclitaxel), 플루오로우라실(fluorouracil), 카페시타빈(capecitabine), 점시타빈(gemcitabine), 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan), 에토포시드(etoposide), 미토마이신(mitomycin), 게피티닙(gefitinib), 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 독소루비신(doxorubicin), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 셀레콕시브(celecoxib),로페콕시브(rofecoxib), 발데콕시브(valdecoxib), 이부프로펜(ibuprofen), 나프록센(naproxen), 케토프로펜(ketoprofen), 덱사메타손(dexamethasone), 프레드니손(prednisone), 프레드니솔론(prednisolone), 히드로코르티손(hydrocortisone), 아세트아미노펜(acetaminophen), 미소니다졸(misonidazole), 아미포스틴(amifostine), 탐술로신(tamsulosin), 페나조피리딘(phenazopyridine), 온단세트론(ondansetron), 그래니세트론(granisetron), 알로세트론(alosetron), 팔로노세트론(palonosetron), 프로메타진(promethazine), 프로클로르페라진(prochlorperazine), 트리메토벤자미드(trimethobenzamide), 아프레피탄트(aprepitant), 아트로핀을 갖는 디페녹실레이트(diphenoxylate with atropine), 및 또는 로페라미드 (loperamide). 안티-트롬빈 III와 같은 항-응고제, 활성화된 단백질 C 및 퓨린 저해제와 같은 프로테아제 저해 단백질일 수 있다.

원한다면 조직의 회복 또는 재생 또는 세포사멸의 방지를 유도하는 물질이 IαIp 단백질과 같이 투여될 수 있다. 그러한 물질은 줄기세포, 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 인테그린, 혈관생성 인자(angiogenic factors), 항-염증 인자, 글리코사미노글리칸, 비트로겐, 항체 및 그들의 절편, 이들 물질의 기능적 동등체, 및 그들의 조합을 포함한다. 본 발명의 조합은 같이, 또는 수시간, 수일, 또는 수주 내에 하나씩 투여될 수 있다. 어떤 시도에서, 조직 회복 또는 재생 또는 세포사멸을 방지하는 물질이 본원의 통상적인 약물의 투여 이전, 동시, 또는 그 후에 투여된 바 있다.

키트

본 발명은 IαIp 단백질을 정제하는 키트를 제공한다. 일 실시예에서, 상기 키트는 IαIp 단백질의 크로마토 그래피를 위한 시약들을 포함한다. 몇몇 실시예에서, 상기 키트는 낮은 pH 세정액(예를 들어 pH3.1-4.0)을 포함하는 무균의 용기를 포함하며; 그러한 용기는 앰플(ampules), 병, 바이알, 튜브, 가방, 포우치, 블리스터 팩, 또는 당업계에 알려진 다른 적합한 용기일 수 있다. 그러한 용기들은 시약을 붙잡고 있기에 적합한 기타의 플라스틱, 유리 또는 기타 물질로 이루어질 수 있다.

원하는 경우 본 발명의 키트는 IαIp 단백질의 정제를 위한 시약과 정제 프로토콜을 위한 지침을 함께 제공한다. 상기 지침은 일반적으로 정제 프로토콜에 사용되는 용액의 조성 및 부피에 관한 정보를 포함할 것이다. 다른 실시예에서, 상기 지침은 적어도 하나의 다음 사항을 갖는다: 시약 또는 시약의 조합에 대한 설명; 주의사항;경고;과학적 연구; 및/또는 참조문헌. 상기 지침은 분리된 종이, 팜플렛, 카드, 또는 폴더 또는 용기(있는 경우)에 직접 인쇄되거나 제공되는 용기 내 또는 키트의 라벨에 적용될 수 있다.

본 발명은 대상체에서 인터-알파 저해 단백질 (IαIp) 레벨의 증가 또는 사이토카인, 케모카인, 또는 프로테아제 레벨의 감소를 위한 키트를 제공한다. 본 발명은 또한 대상체에서 IαIp 레벨의 감소 또는 사이토카인, 케모카인, 또는 프로테아제 레벨의 증가와 연관이 있는 질병, 이상, 또는 증상을 치료 또는 예방하기 위한 키트를 제공한다. 그들의 질병, 이상, 또는 증상은 급성염증 질환, 패혈증, 심각한 쇼크, 패혈성 쇼크, 류마티스 관절염, 암, 암의 전이, 외상/상해, 감염성 질환, 또는 조기 진통을 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 키트는 정제된 IαIp 의 유효량을 포함하는 약학적 팩을 포함한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 투여형태의 유닛으로 존재한다. 몇몇 실시예에서, 상기 키트는 약학적 또는 예방적 조성물의 무균의 용기를 포함하며, 그러한 용기는 상자, 앰플, 병, 바이알, 튜브, 가방, 포우치, 블리스터-팩, 또는 당업계에 알려진 기타 적합한 용기일 수 있다. 그러한 용기는 플라스틱, 유리, 라미네이트 종이, 금속호일, 또는 약제를 보관하기에 적합한 기타 물질로 만들어진 것일 수 있다.

원하는 경우 본 발명의 조성물 또는 이의 조합이 이를 필요로 하는 대상체에 투여하기 위한 지침과 같이 제공될 수 있다. 상기 지침은 일반적으로 IαIp로 치료하기에 적합한 질병(예를 들어 급성염증 질환, 패혈증, 심각한 쇼크, 패혈성 쇼크, 류마티스 관절염, 암, 암의 전이, 외상/상해, 감염성 질환, 또는 조기 진통) 또는 이상의 치료 또는 예방을 위한 조성물의 용법에 관한 정보를 포함할 것이다. 다른 실시예에서, 상기 지침은 적어도 하나의 다음 사항을 포함한다: IαIp 레벨을 대상체에서 높이기 위한 및/또는 사이토카인, 케모카인, 또는 프로테아제 레벨을 대상체에서 낮추기 위한 투여 및 투여량 스케줄; 급성염증 질환, 패혈증, 심각한 쇼크, 패혈성 쇼크, 류마티스 관절염, 암, 암의 전이, 외상/상해, 감염성 질환, 또는 조기 진통 또는 그들의 증상의 치료를 위한 투여 및 투여 스케줄;주의;경고;지시;반대-지시;과용량 정보;부작용;동물 약리학;임상 연구; 및/또는 참조문헌. 상기 지침은 용기(존재하는 경우)에 직접 프린트되거나, 또는 용기에 적용된 라벨, 또는 별도의 용지, 팜플렛, 카드, 또는 용기의 내 또는 함께 제공되는 폴더에 적용될 수 있다.

본 발명은 또한 샘플 내의 인터-알파 저해 단백질(IαIp)를 분석하기 위한 키트를 제공한다. 일 실시예에서, 상기 키트는 알려진 양의 정제된 IαIp 을 포함한다. 상기 정제된 IαIp 의 알려진 양은 IαIp 의 농도가 알려지지 않은 샘플 내의 IαIp 의 측정을 위한 대조군으로 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 조성물은 부분표본(aliquots)으로 존재한다. 몇몇 실시예에서, 상기 키트는 상기 정제된 IαIp 의 부분표본을 포함하는 무균의 용기를 포함하며, 그러한 용기는 상자, 앰플, 병, 바이알, 튜브, 가방, 포우치, 블리스터-팩, 또는 당업계에 알려진 기타 적합한 용기일 수 있다. 그러한 용기는 플라스틱, 유리, 라미네이트 종이, 금속호일, 또는 화합물과 용액을 보관하기에 적합한 기타 물질로 만들어진 것일 수 있다.

다른 실시예에서, 상기 지침은 적어도 하나의 하기 사항을 포함한다: 화합물 또는 화합물 조합의 설명. 상기 지침은 용기(존재하는 경우)에 직접 프린트되거나, 용기에 적용된 라벨로서, 또는 별도의 용지, 팜플렛, 카드 또는 용기 내 또는 함께 제공되는 폴더에 적용될 수 있다.

실시예

실시예 1. IαIp는 낮은 pH 완충액으로 세정하는 것을 포함하는 단일 크로마토그래피 단계로 정제되었다.

단일 크로마토그래피 단계를 이용한 인간의 혈장으로부터 IαIp의 정제는 낮은pH 세정을 포함한다(도 1A). 낮은 pH 세정단계를 갖는IαIp 정제 프로토콜은 크라이오-푸어 혈장(Cryo-poor plasma)으로부터 IαIp를 정제하였다. 크라이오-푸어 혈장(Cryo-poor plasma)(25 mM Tris + 200 mM NaCl에 1:10 희석, pH 7.6; 0.2 μm 여과됨). 희석된 혈장(50 칼럼 부피)을 시판용 1 mL DEAE 모놀리식 칼럼 (DEAE-CIM; BIA 분리)에 1 분당 5 칼럼 부피 (cv)의 유동 속도로 도입하였다. 칼럼의 결합력은 1mL 칼럼 부피 당 약 50 mL 희석된 혈장으로 예상되었다. 칼럼을 통해 나온 결과물(flowthrough)은 수집하였다. 추가의 혈장 희석 완충액(200 mM NaCl, 25 mM Tris의 20 칼럼 부피, pH 7.6)을 시작 물질이 칼럼을 완전히 통과하도록 칼럼에 도입하였다. 칼럼을 통해 나온 결과물의 피크가 베이스라인이 되었을 때, 칼럼을 완충액으로 더 세정하여 용출을 위한 낮은 pH 세정 (100 mM NaCl, 100 mM Tris의 15 칼럼 부피, pH 7.6) 전의 pH로 증가시켰다. 결합된 단백질을 고염 용출 완충액 (1000 mM NaCl, 25 mM Tris의15 칼럼 부피, pH 7.6)으로 용출하였다. 피크는 수집되고 분획은 고순도의 IαIp을 함유하였다. 완충액을 교환하고 저분자량의 용질 및 염을 제거하기 위하여 30 kDa의 멤브레인 컷오프를 이용하여 초미세여과 또는 정용여과(diafiltration)를 수행하였다. 정제된 IαIp는 동결건조될 수도 있다.

3개 각각의 분리에서 3개의 상이한 세정액을 사용한 DEAE 모놀리식 크로마토그래피에 의한 동일한 양의 혈장의 분획을 IαIp 단백질의 정제에서 세정단계 동안에 pH를 낮추는 효과를 측정하기 위하여 사용되었다. 낮은 pH 세정 (pH 7.6)을 사용하지 않은 DEAE 모놀리식 크로마토그래피에 의한 혈장 분획은1000 mM NaCl (pH 7.6)로 용출되었을 때, 비교적 큰 피크의 용출을 나타내었다 (도 2A). 정제된 IαIp는 약 10-15% 순도 IαIp는 95% 이상의 수율을 가졌다. 낮은 pH 세정 (pH 4.0)을 적용한 경우는 1000 mM NaCl (pH 7.6)로 용출하기 전에 낮은 pH 세정에 의한 더 많은 오염물질의 분리를 나타내는 큰 피크를 나타내었다. 용출된 분획에서 약 95% IαIp 가40-50% 순도로 회수되었다 (도 2B). 세정단계에서 pH를 pH 3.3으로 낮춤으로써 pH 4.0에서의 피크와 비교할 때 용출 피크의 크기가 감소됨을 나타내었다 (도 2C). 용출액으로부터의 수율은 80-90%의 순도로 약 90% IαIp 이었다(도 2C). 상기 실험에서 세정단계에서 pH를 낮춤으로 수율에 있어서는 최소한의 감소로 고순도의 IαIp를 얻음을 보여준다.

크라이오-푸어 혈장(Cryo-poor plasma)은 두 번의 낮은 pH 세정액 (150 mM 아세트산, pH 4.0, 및 200 mM 아세트산, pH 3.3)을 사용하여 DEAE 모놀리식 크로마토그래피에 의해 분리되고 단백질 분획에 대한 효과를 측정하기 위하여 사용되었다 (도 3). 각각의 낮은 pH 세정은 칼럼으로부터 다량의 단백질을 제거하였다. 두 번의 낮은 pH 세정액에 상응하는 두 개의 피크를 관찰함으로 인해 두 번째의 pH 3.3에서의 낮은 pH 세정은 첫 번째 pH 4.0에서의 낮은 pH 세정에 의해 제거되지 않은 오염물질을 더 제거할 수 있음을 보여주었다. 두 번째의 낮은 pH 세정에 의한 단백질의 추가 제거를 보여주는 결과는 분획 D 및 분획 C가 시작물질로 사용되었을 때와 유사한 결과를 보여주었다 (도 4A-4D).

DEAE 모놀리식 칼럼 크로마토그래피에 의한 분획 D 시작물질로부터 IαIp 단백질 정제의 분획은 웨스턴 블롯(Western blot)에 의해 분석될 수도 있었다. 첫 번째 낮은 pH 세정에서(150 mM 아세트산, pH 4.0), IαIp (250 kDa)가 검출될 수 있었다. 두 번째 낮은 pH 세정 (200 mM 아세트산, pH 3.3), 몇몇의 IαIp (250 kDa 및 125 kDa)가 칼럼으로부터 결합이 풀어져 용출되었다. 그러나 두드러진 양의 정제된 IαIp 단백질이 용출액에서 검출되었다. 유사한 결과가 두 번의 낮은 pH 세정을 사용하는DEAE 모놀리식 칼럼 크로마토그래피에 의한 분획 C 시작물질로부터의 IαIp 단백질 정제에서도 보여주었다.

수율 및 순도의 정량분석에는 두 번의 낮은 pH 세정(pH 4.0 및 pH 3.3)을 사용하는DEAE 모놀리식 칼럼 크로마토그래피(DEAE-CIM; BIA 분리)에 의한 분획 D 시작물질의 분리로부터의 분획을 측정하였다 (표 1).

	총단백질 (mg)	총IαIp (mg)	% IαIp (순도)	% 총IαIp (수율)
시작물질	48.0	13.6	26%	-
칼럼을 통해 나온 결과물	3.1	0.1	0.05%	0.007%
세정 #1 (pH 4.0)	24.1	0.6	0.07%	4.4%
세정 #2 (pH 3.3)	9.1	2.1	25%	15%
용출	11.5	10.4	90%	76%

분획의 분석에서 25mM Tris, 200mM NaCl, pH 7.6에서 칼럼에 결합된 시작물질에서 99% 이상의 IαIp, 약 0.007%의 총 IαIp가 칼럼을 통해 나온 결과물에서 검출되었음을 보여주었다. 칼럼에 첫 번째 세정단계 (150 mM 아세트산, pH 4.0)를 수행하여 약간의 IαIp (4.4%의 총 IαIp)의 손실과 함께 많은 양의 오염물질(~50%의 총 단백질)을 제거하였다. 칼럼에 두 번째 세정단계(200 mM 아세트산, pH 3.3)를 수행하여 허용가능한 IαIp (15%의 총 IαIp)의 손실과 함께 많은 양의 오염물질(~19%의 총 단백질)을 추가로 제거하였다. 나머지 결합된 단백질을 고염(25 mM Tris + 1000 mM NaCl, pH 7.6)으로 용출하여 90% 순도인76%의 총 IαIp을 얻었다. 분획의 분석은 유사한 분획의 웨스턴 블롯 분석과 상관 관계가 있었다 (도 5). 상기 분석에서 IαIp는 낮은 pH 완충액으로 세정함으로써 단일 크로마토그래피 단계로 실질적으로 정제되었음을 보여준다.

실시예 2. 낮은 pH 세정단계로 IαIp 단백질의 크로마토그래피 정제는 스케일 업 될 수 있다.

낮은 pH 세정단계로 IαIp 정제 프로토콜을 더 큰 부피의 칼럼에 적용할 수 있는지를 측정하기 위하여 Cryo-poor plasma 및 중간 혈장 분획 (분획 D 및 분획 C)의 크로마토그래피를8ml DEAE 모놀리식 칼럼에 수행하였다. UV는 1 ml DEAE 모놀리식 칼럼에서 분리된 Cryo-poor plasma 및 중간 혈장 분획과 유사하였다(도 6A, 6C, 및 6E). 각 크로마토그래피 분리로부터의 분획은 비-변성 SDS-PAGE에 의해 분석되었다 (도 6B, 6D, 및 6F). 다양한 시작물질의 정제를 위한 용출된 분획은 IαIp 단백질의 분자량에 해당하는 250 kDa 및 125 kDa 밴드를 나타내었다. 따라서, IαIp 정제는 8배 더 큰 칼럼으로 스케일 업 될 수 있었다. 상기 결과는 IαIp 단백질이 낮은 pH 세정방법으로 더 큰 부피(예를 들어, 800 mL 칼럼 및 8 L 칼럼)로 정제될 수 있음을 보여준다.

실시예 3. 낮은 pH 세정단계로 정제된 IαIp 단백질은 경쟁적 ELISA 분석법에서 항체의 인간 IαIp에 대한 증가된 결합력을 보여준다.

낮은 pH 세정을 하지 않았을 때와 비교하여 낮은 pH 세정으로 DEAE 모놀리식 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제된 IαIp의 정성 및 정량을 측정하기 위하여 상기 두 조건에서 정제된 IαIp 농도를 Lim 등(J. of Infectious Diseases, 2003)에 의해 개시된 MAb 69.31을 사용하여 경쟁적 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 분석법에 의해 분석하였다. 정제된 분획을 정량적으로 시판되는 BCA(bicinchoninic acid) 단백질 분석에 의해 측정하여 총 단백질 농도를 측정하였다. 놀랍게도, 경쟁적 ELISA에 의해 측정된 IαIp 농도는 pH 3.3의 세정조건을 이용하여 정제된 IαIp에 대한 BCA 단백질 분석에 의해 측정된 총 단백질 농도 보다 더 높았다. 낮은 pH 세정을 이용하여 정제된 IαIp는, 칼럼에 채워진 동일한 양의 시작물질 또는 낮은 pH 세정조건을 이용하지 않고 정제된 동일한 양의 IαIp와 비교할 때, 경쟁적 ELISA에서 예상한 수치보다 300% 이상의 농도를 가짐을 관찰하였다. 경쟁적 ELISA에서 명백히 증가된 IαIp 농도는 pH 3.6 및 3.3의 낮은 pH 세정조건을 이용하여 정제된 IαIp에서는 관찰되었으나, pH 4.0의 세정조건을 이용하여 정제된 IαIp에서는 관찰되지 않았다.

총 단백질이 경쟁적 ELISA에서 분석된 샘플에 일정하게 남아 있기 때문에, 상기 결과는 정제 시 약간 변화 또는 심지어 활성이 수행될 수 있다. 어떤 특정 이론에 관계없이, IαIp의 활성 부위는 낮은 pH의 조건에 노출됨을 알 수 있다. 경쟁적 ELISA에 사용된 MAb 69.31 항체는 분자의 활성 부위에 위치하는 애피톱(epitope)를 인식한다. 활성 부위가 노출되는 경우, 측정될 단백질의 양을 조절할 때 경쟁적 ELISA의 농도는 낮은 pH 조건하에서 정제된 IαIp에 대해서 명백히 증가되었을 것이다. 따라서, 낮을 pH 농도는 IαIp의 저해활성을 막음으로 인해 활성을 증가시킬 수 있다.

IαIp의 저해활성이 pH 조건에 따라 달라지는 것을 확인하기 위하여 IαIp의 생리활성을 색소생산성 기재(chromogenic substrate) L-BAPA (N(알파)-벤조일-L-아르기닌-4-니트로아닐리드 히드로클로라이드, 프루카화학(Fluka Chemicals))를 이용하여 트립신 저해반응으로 측정하였다. 상기 분석은 IαIp의 L-BAPA의 가수분해를 억제할 수 있는 능력을 기반으로 한 고유 저해활성을 측정한다. 저해활성은 410 nm에서 흡광도 변화율/분(minute)의 감소에 의해 모니터링 될 수 있다. 낮은 pH 세정으로 정제된 IαIp의 고유저해활성은 계산되고 낮은 pH 세정 없이 정제된 IαIp의 고유저해활성과 비교되었다. 크로마토그래피 동안 낮은 pH 조건 (즉, 약 3.3 이상의 pH)은 낮은 pH 세정 없이 정제된 IαIp와 비교할 때, 정제된 IαIp의 저해활성을 비활성화시키거나 감소시키지 않았다. 상기 결과는 낮은 pH 세정으로 정제된 IαIp는 낮은 pH 세정 없이 정제된 IαIp 만큼의 생리학적 활성이 있음을 보여준다.

실시예 4. IαIp는 염을 포함하는 완충액 및 낮은 pH 완충액으로 세정하는 것을 포함하는 단일 크로마토그래피 단계에 의해 정제되었다.

단일 크로마토그래피 단계를 이용한 인간 혈장으로부터 IαIp의 정제과정은 염 완충액 세정단계 및 낮은 pH 세정단계를 포함한다(도 1B). 염 완충액 세정 및 낮은 pH 세정에 의한 IαIp 정제 프로토콜은 Cryo-poor plasma로부터 IαIp 의 정제에 사용되었다 (도 7A). Cryo-poor plasma (40 mM Tris + 200 mM NaCl 내의 1:10 희석의 12.5 칼럼 부피, pH 7.6; 0.2 μm 여과됨). 희석된 혈장(50 칼럼 부피)을 시판용 8 mL DEAE 모놀리식 칼럼 (DEAE-CIM; BIA 분리)에 1 분당 2.5 칼럼 부피 (cv)의 유동 속도로 도입하였다. 칼럼을 통해 나온 결과물(flowthrough)은 수집하였다. 추가의 완충액 (200 mM NaCl, 25 mM Tris의 7칼럼 부피, pH 7.6)을 시작 물질이 칼럼을 완전히 통과하도록 칼럼에 도입하였다. 칼럼을 통해 나온 결과물의 피크가 베이스라인이 되었을 때, 칼럼을 염을 포함하는 세정액(290 mM NaCl, 40 mM Tris의 10 칼럼 부피, pH 7.6)으로 세정하고 피크를 수집하였다. 염 세정 후, 칼럼을 낮은 pH 완충액 (200mM Na-아세테이트의 10 칼럼 부티, pH 2.95)으로 추가로 세정하고 피크를 수집하였다. 두 번째 세정 후, 결합된 단백질을 고염 용출 완충액 (40mM Na-시트레이트의 5 칼럼 부피, pH 6.50, 1000mM NaCl)으로 용출하였다. 피크를 수집하고 상기 분획은 고순도의 IαIp 를 함유하였다.

염 완충액 세정단계 및 낮은 pH 세정단계를 포함한 IαIp 정제 프로토콜은 중간 혈장 분획 (분획 D)으로부터 IαIp을 정제하기 위하여 사용되었다 (도 7B). 중간 혈장 분획 (2.5 칼럼 부피, 40 mM Tris + 200 mM NaCl 내의 1:10 희석, pH 7.6; 0.2μm 여과됨)을 시판용 8 mL DEAE 모놀리식 칼럼 (DEAE-CIM; BIA 분리)에 1 분당 2.5 칼럼 부피 (cv)의 유동 속도로 도입하였다. 칼럼을 통해 나온 결과물(flowthrough)은 수집하였다. 완충액을 시작 물질이 칼럼을 완전히 통과하도록 칼럼에 도입하였다. 칼럼을 통해 나온 결과물의 피크가 베이스라인이 되었을 때, 칼럼을 염을 포함하는 완충액 (290mM NaCl, 40mM Tris-HCl의 10 칼럼 부피, pH 7.6)으로 세정하여 피크를 수집하였다. 염 세정 후, 칼럼을 추가로 낮은 pH 완충액 (200mM Na-아세테이트의 10 칼럼 부피, pH 2.95)으로 세정하고 피크를 수집하였다. 두 번째 세정 후, 결합된 단백질을 고염 용출 완충액 (40mM Na-시트레이트의 5 칼럼 부피, pH 6.50, 1000mM NaCl)으로 용출하였다. 피크를 수집하고 상기 분획은 고순도의 IαIp을 함유하였다.

수율 및 순도의 정량분석은 염-포함 완충액 세정단계 (290mM NaCl) 및 낮은 pH 세정단계 (pH 2.95)을 사용하는 DEAE 모놀리식 칼럼 크로마토그래피(DEAE-CIM; BIA 분리)에 의한 분획 D 시작물질의 분리로부터의 분획을 측정하였다 (표 2).

	총 단백질 (mg)	총 IαIp (mg)	% IαIp (순도)	% 총 IαIp (수율)
시작물질	28.7	5.6	19.5%	-
칼럼을 통해 나온 결과물	0.2	n.d.	n.d.	-
염 완충액 Wash	9.0	0.38	4.2%	6.8%
낮은 pH 세정 (pH 2.95)	14.1	0.28	2.0%	5.0%
용출	5.4	5.0	91.8%	88.2%

(n.d = 검출되지 않음)

상기 분석에서 낮은 pH 완충액 세정단계를 포함하는 정제 프로토콜에 염 완충액 세정단계의 수행은 혈장 분획으로부터 88.2%의 정제된 IαIp을 얻음을 보여준다. 표 1의 결과와 비교할 때, 낮은 pH 완충액 세정단계를 포함하는 정제 프로토콜에 추가의 염 완충액 세정단계는 혈장 또는 혈장 분획으로부터 정제된 IαIp의 수율을 증가시킨다.

또한, 두 방법의 분획에 대한 SDS-PAGE 분석은 낮은 pH 세정단계 (pH 2.95)가 수행되었을 때 용출된 분획이 존재하는 ~75-80kDa 밴드를 나타내었으나, 염 세정단계 (290 mM NaCl) 및 낮은 pH 단계 (pH 2.95)을 수행하였을 때는 나타나지 않았다 (도 8). 염 세정단계 및 낮은 pH 단계로 IαIp 정제 프로토콜의 용출된 분획은 실질적으로 인터(inter)-알파 저해제 (250 kDa) 및 프리(pre)-알파 저해제 (125 kDa)에 해당하는 두 개의 단백질 밴드를 포함하였다. 따라서, 정제 프로토콜이 염 세정단계 및 낮은 pH 세정단계를 포함하는 경우, 상기 용출된 분획은 고순도의 IαIp를 포함하였다.

다른 실시예

상기의 기재로부터, 본 명세서에 기재된 발명에 다양한 사용 및 조건을 채택하여 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음은 당연할 것이다. 이러한 실시예는 하기의 특허청구범위의 범위 내이다.

본 발명의 다양한 변수의 정의에서 리스트 된 요소의 설명은 리스트 된 요소의 단일 요소 또는 이의 조합(또는 서브콤비네이션)으로써의 변수의 정의를 포함한다. 본 발명의 실시예의 설명은 단일 실시예 또는 다른 실시예와의 조합 또는 이의 부분의 조합의 실시예를 포함한다.

본 명세서에 언급된 모든 특허 및 문헌은 각각 독립적 특허 및 문헌이 특별히 및 독립적으로 참조로 포함되는 것과 같은 동일한 범위로 참조로 포함된다.

Claims

85% 내지 100%의 순도범위를 갖는 인터-알파 저해 단백질(IαIp)을 포함하는 조성물로서,
상기 조성물은 사람에게 투여되는 것이 적합하고, 상기 IαIp는 pH 3.6 또는 그 이하의 세정액에 노출되지 않는 IαIp인 대조군과 비교하여 경쟁적 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)에서 MAb 69.26 및 MAb 69.31에 대한 결합력을 증가시키는 낮은 pH-유도 구조적 변화(low pH-induced conformational change)를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 IαIp는 크로마토그래피 지지체에 IαIp를 부착하는 단계 및 세정단계에서 상기 IαIp를 상기 지지체로부터 IαIp를 분리(dissociate)시키지 않는 pH 2.0 내지 3.6의 세정액에 노출 시켜 상기 지지체에 부착된 상기 IαIp를 세정하는 세정단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 조성물.
제2항에 있어서, 상기 세정액의 pH가 2.0 내지 3.3인 조성물.
제2항에 있어서, 상기 세정액의 pH가 2.9 내지 3.3인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 IαIp는 대조군과 비교하여 경쟁적 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)에 있어서 1배 초과로 증가된 결합력을 나타내는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 IαIp는 인터-알파 저해자(IαI) 또는 전(pre)-알파 저해자(PαI)을 포함하는, 조성물.
제6항에 있어서, 상기 IαI는 조성물 중 60 중량% 내지 80 중량%의 IαIp를 구성하는, 조성물.
제6항에 있어서, 상기 PαI는 조성물 중 20 중량% 내지 40 중량%의 IαIp를 구성하는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 IαIp는 IαI 및 PαI를 포함하는, 조성물.
제9항에 있어서, 상기 IαI 및 PαI는 생리적 조성(physiological proportions)인, 조성물.
제9항에 있어서, 상기 IαI는 조성물 중 60 중량% 내지 80 중량%의 IαIp를 구성하고, 상기 PαI는 조성물 중 20 중량% 내지 40 중량%의 IαIp를 포함하는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 대상에게 1mg/kg 체중 내지 5000mg/kg 체중의 투여량으로 제공되도록 제제화되는, 조성물.
제12항에 있어서, 상기 조성물은 대상에게 1mg/kg 체중 내지 10mg/kg 체중의 투여량으로 제공되도록 제제화되는, 조성물.
제12항에 있어서, 상기 대상은 사람인, 조성물.
제1항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 첨가제(excipient)를 더 포함하는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 IαIp 및 1 이상의 약학적으로 허용가능한 첨가제(excipient)로 구성되는 조성물.
제1항에 있어서, 상기 IαIp는 60kDa 내지 280kDa의 분자량을 갖는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 IαIps 및 약학적으로 허용가능한 첨가제(excipient)로 구성되는 조성물.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 키트.
제19항에 있어서, 상기 키트는 급성염증성 질환, 패혈증(sepsis), 심각한 쇼크(severe shock), 패혈성쇼크(septic shock), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis), 암, 암의 전이, 외상/상해 감염성 질환, 또는 조기 진통(preterm labor)의 치료적 용도에 대한 지시(instructions)를 더 포함하는 키트.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 포함하는, 급성염증 질환, 패혈증, 심각한 쇼크, 패혈성 쇼크, 류마티스 관절염, 암, 암의 전이, 외상/상해, 감염성 질환, 또는 조기 진통의 치료용 약제.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 급성염증 질환, 패혈증, 심각한 쇼크, 패혈성 쇼크, 류마티스 관절염, 암, 암의 전이, 외상/상해, 감염성 질환, 또는 조기 진통의 치료를 필요로 하는 대상체의 치료용인, 조성물.
제22항에 있어서, 상기 대상체는 인간, 영장류, 소류, 말류, 돼지류, 양류, 고양이류, 또는 개류인, 조성물.
제23항에 있어서, 상기 대상체는 인간인 조성물.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 구강, 직장, 국부, 안구내, 구강, 낭내(intracisternal), 뇌실내(intracerebroventricular), 기관내(intratracheal), 비강, 경피(transdermal), 피하, 근육, 또는 복강(intraperitoneal), 투입(infusion), 또는 임플란트 내(within/on implants)의 적용(application)를 위하여, 제제화되는 조성물.
제25항에 있어서, 상기 조성물은 셀룰로오스를 더 포함하는 약학적 조성물.