KR20170138436A - 골 형성 단백질 (bpm)의 정제 - Google Patents

골 형성 단백질 (bpm)의 정제 Download PDF

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레오나르도 시빌리오
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이스티튜토 바이오키미코 이탈리아노 지오바니 로렌치니 에스.피.에이.
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Abstract

본 발명은 TGF-β (transforming growth factor-β) 슈퍼패밀리에 속하는 단백질을 정제하는 방법에 관한 것으로, 단백질을 포함하는 세포 배양 배지를 소수성 전하 상호작용 크로마토그래피 (HCIC)에 적용시키는 단계를 포함한다.

Description

골 형성 단백질 (BPM)의 정제
본 발명은 TGF-β (transforming growth factor-β) 슈퍼패밀리에 속하는 단백질, 바람직하게는 BMP (bone morphogenetic protein), 그리고 더욱 바람직하게는 BMP-4 (bone morphogenetic protein 4)를 정제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 포유류 세포로부터 BMP를 정제하는 것에 중점을 둔다.
BMP가 골 형성 세포 등의 세포의 성장 및 분화를 조절하며, 특히 BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7 및 BMP-8은 단독으로 인비트로와 인비보에서 이소성 골 형성을 유도할 수 있는 성장 및 분화 인자임이 보고되어 왔다. 또한, BMP-2는 신경 능선 세포를 신경 표현형으로 발달시키도록 할 수 있고, BMP-4와 BMP-7는 교감 아드레날린성 표현형을 유도할 수 있다. BMP-4와 BMP-7로 구성된 이형이량체는 중배엽의 유도체가 될 수 있음이 보고되어 왔다 (참조: A. Suzuki, E. Kaneko, J. Maeda and N. Ueno, "Mesoderm induction by BMP-4 and -7 heterodimers," Biochem. Biophys. Res. Commun., vol. 232, pp. 153-156, March 1997).
특히, TGF-β 슈퍼패밀리 단백질에 속하는 BMP가 골 및 연골의 발달에 중요한 역할을 하며, 다양한 세포 타입으로의 골아세포 분화를 유도할 가능성이 있다는 것이 업계에 알려져 있다. 또한, BMP는 골 생성을 촉진하는 기능을 하며, BMP-2를 콜라겐 스폰지에 주입함으로써 새로운 골 형성을 유도하는 산물이 시판되고 있다.
골 형성 단백질 (Bone morphogenetic protein, BMP)은 해당되는 DNA를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 배양물 (효모, 대장균, 및 포유류 세포)로부터 제조될 수 있다. 전환성장인자-β (transforming growth factor-β)의 클로닝 및 발현은 이전 여러 특허에서 보고된 바 있다 (예: US5700911, US2004/0009916 및 US5618924).
숙주 세포에서의 재조합 단백질의 제조는 생산 수준을 높일 수 있으며, 많은 경우 단백질을 분비하는 것이 가능하다. 이러한 이유로, 정제 프로토콜의 목표는, 배양 배지로부터 해당 단백질을 분리하는 것이다. 일반적으로, 배양 배지는 영양성분 (비타민, 아미노산, 보조인자, 미네랄)과 추가적인 성장인자 및 인슐린과 같은 보충 성분을 포함한다. 나아가, 단백질이 높은 수준으로 발현되더라도, 숙주 세포 단백질로 알려진 내재 단백질 또한 발현되어 배양 배지로 분비된다. 이런 이유로, 재조합 단백질의 농도는 일반적으로 매우 낮다.
내재 단백질은 표적 단백질과 매우 유사한 등전점(pI), 분자량, 아미노산 조성 면에서 동일한 특성을 가질 수 있으며, 이는 오염물로부터 원하는 단백질을 분리하기 위하여 드는 노력을 매우 증가시킨다.
상기한 어려움 밖에도, 배양 배지에는 번역 후 변형 또는 산물의 분해를 유도하여, 독성을 가질 뿐만 아니라 산물의 생물학적 활성을 감소시킬 수 있는 첨가제들이 존재할 수 있다. 이러한 변형된 단백질들은 제거되어야 하나, 이들의 특성은 원하는 산물의 특성과 매우 유사하며, 이는 정제에서 가장 어려운 점이다.
정제가 매우 어려운 경우, 상기 단백질은 친화 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 이러한 종류의 크로마토그래피가 높은 정제 산물을 수득하는데 강력한 수단임에도 불구하고, 임의의 임상 시험에서 요구되는 순도의 사양은 절대 만족시킬 수 없다. 이러한 이유로, 친화 크로마토그래피는 1 이상의 크로마토그래피 또는 물리적 단계와 함께 수행되어야 한다.
많은 경우에, 일부 영역에 순전하를 나타내는 단백질들이 일부 숙주 세포 단백질에 이온 결합을 통해 결합할 수 있다는 것이 관찰되었다. 이러한 결합들은 합동하여 전체 결합 강도를 매우 증가시키며, 단백질들이 분리될 가능성을 방지하고, 최종 산물의 순도를 매우 감소시킨다.
US2003/0036629는 용액 (즉, 덱스트란 설페이트로 처리된 세포 배양 배지)으로부터 TGF-β 슈퍼패밀리 단백질을 정제하는 방법으로서, 상기 용액을 헤파린 류 수지에 적용시키고, 제1 용출액을 형성하기 위하여 상기 헤파린 류 수지를 제1 용리액으로 용출시킨 후, 상기 제1 용출액을 부틸 세파로오스 류 수지에 적용시키고, 상기 TGF-β 슈퍼패밀리 단백질을 포함하는 제2 용출액을 형성하기 위하여 상기 부틸 세파로오스 류 수지를 제2 용리액으로 용출시키는 방법에 대하여 기술하고 있다.
EP2407477은 전환성장인자-β (TGF-β) 슈퍼패밀리에 속하는 단백질의 정제 방법으로서,
a) TGF-β 슈퍼패밀리에 속하는 단백질을 포함하며 차수막 여과를 이용하여 농축된 용액을 전처리하는 단계;
b) 상기 단계 a)에서 수득한 용액을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용시키는 단계;
c) 상기 단계 b)에서 수득한 용액을 투석여과하는 단계; 및
d) 상기 단계 c)에서 수득한 용액을 크기 배제 크로마토그래피에 적용시키는 단계를 포함하는 방법에 대하여 기술하고 있다.
이에 따라, 해당 업계에서는 이러한 어려움을 효과적으로 극복한 단백질 정제 방법에 대한 수요가 지속적으로 나타나고 있다. 따라서 본 발명의 목적은 제약 품질정도의 순도를 가지도록 하기 위하여 전환성장인자-β (TGF-β) 슈퍼패밀리에 속하는 단백질을 정제하는 방법으로서, 향상되지 않았더라도 적어도 대체가 가능하며, 대량 규모로 수행할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 요지는 분비된 TGF-β 슈퍼패밀리 단백질의 정제 방법으로, 상기 방법은 분비된 TGF-β 슈퍼패밀리 단백질을 포함하는 용액을 소수성 전하 상호작용 크로마토그래피 (Hydrophobic Charge Interaction Chromatography: HCIC) 수지와 접촉시키는 단계를 포함한다.
놀랍게도, 상기 HCIC 단계는 TGF-β 슈퍼패밀리 단백질을 고수율 및 고순도로 얻을 수 있도록 한다. 본 발명에 따른 상기 단계는 산업적 규모에서 쉽게 확장 가능하다.
상기 HCIC 단계는 이전에 문헌에서 보고된 방법과 비교할 때 2가지 중요한 이점을 나타낸다.
첫번째 이점은, BMP가 일반적으로 매우 안정한 산성 환경에서 해당 산물이 용출된다는 것이다.
나아가, 단백질이 이미 산성 환경에 존재하기 때문에, pH를 추가로 감소시키는 것이 쉽게 가능하며, 이는 바이러스 불활성화 (MuLV)의 측면에서 매우 이점을 가진다.
두번째 이점은, 브래드포드 어세이 (Bradford assay) 및 280nm에서의 크로마토그래피 피크의 적분에 의해 나타나는 것과 같이, 제1 크로마토그래피 단계라는 이러한 단계를 통해, 회수물 중 총 숙주 단백질의 98% 이상을 제거하는 것이 가능하다는 것이다.
도 1은 본 발명의 방법에 대해 선호되는 일 실시양태를 나타낸다.
본 발명에 따르면, 분비된 TGF-β 슈퍼패밀리 단백질은 분비된 BMP인 것이 바람직하다. 여기서 사용되는, 용어 “BMP”는 임의의 종류의 세포 (포유류, 효모, 및 세균), 바람직하게는 포유류 세포로부터 배양 배지에 분비된 모든 BMP를 의미한다. 본 발명에 따르면, 상기 BMP는 BMP-4인 것이 바람직하다.
바람직하게, 본 발명의 방법은 분비된 TGF-β 슈퍼패밀리 단백질을 포함하는 제2 용출액을 수득하기 위하여, 분비된 TGF-β 슈퍼패밀리 단백질을 포함하는 제1 용출액을 양이온 교환 크로마토그래피 수지와 접촉시키는 단계 (ii)를 추가로 포함한다.
바람직하게, 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 따른 방법은, 정제된 분비된 TGF-β 슈퍼패밀리 단백질을 수득하기 위하여, 분비된 TGF-β 슈퍼패밀리 단백질을 포함하는 제2 용출액을 음이온 교환 크로마토그래피 수지와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명에 따르면, 분비된 TGF-β 슈퍼패밀리 단백질을 포함하는 용액, 즉 HCIC 단계에 적용되는 상기 용액은, 원하는 단백질을 포함하는 세포 배양 배지 회수물로부터 수득되며, 여과되어 pH 7.0 내지 9.5, 염 농도 250 내지 800mM, 바람직하게는 pH 7.4 내지 9.0, 염 농도 400 내지 600mM로 조정된 것이다.
pH는 NaOH 0.5 내지 1.5M, 바람직하게는 1.0M의 여과된 배양 배지의 첨가에 따라 조정되는 것이 바람직하다.
염 농도는, 2M 내지 5M의 분말 또는 용액 상, 바람직하게는 5M의 용액 상의 NaCl 또는 KCl, 바람직하게는 NaCl의 첨가에 따라 조정되는 것이 바람직하다.
HCIC는 이온화될 수 있는 이중 모드 리간드의 pH-의존성 작용에 기초한다. 흡착은 약한 소수성 상호작용에 기초하며, 이액성 염 또는 다른 염의 첨가 없이도 흡착이 일어난다. 탈착은 전하 반발에 기초한다. 이는 pH 감소에 의해 일어난다. HCIC를 수행하기에 적합한 수지는 혼합-모드 수지로 알려져 있다. 여기서 사용되는, 용어 “혼합-모드 수지”는 소수성 상호작용에 의해 작용하여 단백질에 결합하며, 양전하-양전하 반발 상호작용에 의해 작용하여 단백질과 해리되는 기능기를 포함하는 모든 수지를 포함한다. 본 발명은 소수성 상호작용에 의해 배양 배지 상의 원하는 단백질이 결합하고, 용출이 이온 상호작용 (양전하-양전하 반발 상호작용)에 의해 발생하는 수지를 이용하여 수행될 수 있다. 본 발명에 따른 HCIC를 수행하기에 적합한 수지는 리간드로 n-헥실아민 (n-hexylamine, HEA) 또는 페닐프로필아민 (phenylpropylamine, PPA) 또는 4-메르캅토-에틸-피리딘 (4-Mercapto-Ethyl-Pyridine, 4-MEP)를 가지는 혼합-모드 수지, 예를 들어 PALL 사에서 현재 상업적으로 입수 가능한 것들이다. PALL 사의 제품 중 가장 선호되는 수지는 PPA HyperCelTM, HEA HyperCelTM, 및 MEP HyperCelTM 으로 이루어지는 군에서 선택되는 것들이며, PPA HyperCelTM 이 가장 바람직하다.
분비된 TGF-β 슈퍼패밀리 단백질을 포함하는 용액을 로딩하기 전에, 상기 HCIC 수지는 pH 7.4 내지 9.5, 바람직하게는 8.8 내지 9.0, 및 염 농도 50 내지 800mM의 평형 버퍼로 조절되는 것이 바람직하다. pH는 포스페이트 버퍼, 글리신 버퍼, 트리스(히드록시메틸)아미노에탄 [tris(hydroximethyl)aminoethane, TRIS], 메틸디에탄올아민 버퍼, bis-트리프로판 버퍼 및 피페라진 버퍼로 이루어지는 군에서 선택되는 10 내지 250mM 농도의 버퍼; 바람직하게는 TRIS 버퍼에 의해 나타난다. 염 농도는 NaCl 또는 KCl, 바람직하게는 NaCl에 의한 것이다. 염 농도는 바람직하게는 500mM이다.
로딩 후 HCIC 수지에 pH를 감소시키는 세척이 이루어졌고, 추가적인 pH 감소에 의해 단백질 용출물이 도출되었다.
로딩 후 HCIC 수지는 50mM 내지 250mM에 포함되는 농도의, 중성 pH 6.5 내지 7.5의 세척 버퍼 (A)와 pH 3.0 내지 4.5의 세척 버퍼 (B)에 의해 각각 수행되는 적어도 2회의 세척 단계를 거치는 것이 바람직하다. 용출 단계는 글리신을 50mM 내지 200mM의 농도로 포함하는 pH 2.5 내지 3.5의 용출 버퍼 (E1)에 의해 수행된다. 상기 세척 버퍼 (A)는 바람직하게는 소듐 포스페이트 버퍼, 포타슘 포스페이트 버퍼, TRIS 버퍼, bis-TRIS, HEPES 버퍼 또는 MES 버퍼; 바람직하게는 소듐 포스페이트 버퍼의 용액이다.
상기 세척 버퍼 (B)는 바람직하게는 10mM 내지 500mM의 소듐 아세테이트 버퍼, 소듐 포스페이트 버퍼, 포타슘 포스페이트 버퍼, 락트산 및 시트르산의 용액이고, 바람직하게는 100mM의 소듐 아세테이트 버퍼의 용액이다.
상기 용출 글리신 버퍼 (E1)는 바람직하게는 글리신을 100mM의 농도로 포함하며 pH는 2.7이다.
용출 글리신 버퍼 (E1)를 이용하여, 원하는 분비된 TGF-β 슈퍼패밀리 단백질을 포함하는 제1 용출액이 얻어진다.
본 발명에 있어서 1 이상의 중요한 새로운 그리고 유리한 이점은, HCIC 수지 공급자에 의해 제안되는 버퍼, 일반적으로 아세테이트 및 시트레이트 대신에 글리신 버퍼를 사용한다는 것이다. 이러한 종류의 수지에 대하여 이러한 버퍼를 사용하는 것에 대한 문헌 데이터는 없다. 글리신 버퍼는, pH가 감소되고, 단백질의 순전하 뿐만 아니라 고정상의 순전하가 양의 값이 되기 시작하며, 그에 따른 반발 상호작용이 분비된 단백질이 방출되도록 하는 작용기작을 가지는 전형적인 방법으로 작동하지 않기 때문에, 글리신 버퍼의 사용은 매우 중요하다.
반면, 글리신 버퍼는 고정상과 상호작용을 나타내며, 반발 상호작용이 생길 수 있을 정도로 pH가 낮아지기 전에도, 이때 용출되는 단백질을 대체한다.
본 발명에서 보고되는 데이터는 전형적인 버퍼를 매우 낮은 pH에서 사용하더라도, 그 수율이 매우 낮으며 방법 또한 경제적, 공정 측면에서 편리하지 않음을 보여준다.
이때 제1 용출액은 바람직하게는 양이온 교환 컬럼에 적용된다.
여기서 사용되는 용어, 양이온 교환 컬럼은 PALL, Toyopearl, POROS, Fractogel 및 GE Healthcare에서 제조되는 컬럼들을 포함하여, 음전하 모이어티를 가지는 모든 컬럼을 포함하며, GE Healthcare의 CM 세파로오스 (Sepharose)가 보다 바람직하다. 본 발명에 따르면, 상기 양이온 교환 수지는 약한 양이온 교환 수지가 바람직하다.
바람직하게는, 제1 용출액이 양이온 교환 수지에 접촉되기 전, 0.5% 내지 2% v/v의 HCl를 이용하여 pH 2.0 내지 2.5까지 pH를 낮추고 1분 내지 120분 동안 HCl에 그 용액을 보관하는 바이러스 불활성화 단계, 및 상기 바이러스 불활성화된 제1 용출액 (즉, 원하는 분비된 TGF-β 슈퍼패밀리 단백질을 포함하는 용액)을 20mM 내지 50mM의 포스페이트 용액 또는 계면활성제를 포함하는 pH 7.2 내지 7.6의 설페이트 용액에 가하여 pH를 변화시키는 것을 포함하는 그 이후의 단계를 포함하는 공정을 거친다.
상기 계면활성제는 공지된 임의의 계면활성제일 수 있으며, 바람직하게는 Tween 20 및 Tween 80와 같은 폴리소르베이트, 더욱 바람직하게는 Tween 20일 수 있다. 상기 바이러스 불활성화된 제1 용출액을 첨가하기 전, 포스페이트 또는 설페이트 용액의 pH는 8.0 내지 9.4에 포함되어야 한다. 상기 바이러스 불활성화된 제1 용출액은 바람직하게는 200 내지 400rpm, 더욱 바람직하게는 300rpm의 교반 조건 하에서 포스페이트 용액에 첨가되며, 이때 0.5 내지 1.2M의 NaOH 용액 또한 pH를 조절하기 위해 첨가된다. 최종 pH는 7.2 내지 7.6인 것이 바람직하다.
바람직하게는 상술한 것과 같이 가공된 제1 용출액은 양이온 교환 컬럼에 로딩될 수 있다.
양이온 교환 컬럼에 로딩된 후, 분비된 TGF-β 슈퍼패밀리 단백질이 용출되지 않도록 pH 7.2 내지 9.0의 세척 버퍼 (C)를 이용하여 세척될 수 있다. 상기 세척 버퍼 (C)는 10mM 내지 200mM 농도의 소듐 또는 포타슘 포스페이트, 소듐 또는 포타슘 클로라이드 또는 소듐 설페이트, HEPES, 비신 (Bicine) 또는 TRIS를 포함하는 용액이다. 상기 세척 버퍼 (C)는 또한 바람직하게 0.001% 내지 0.1%의 계면활성제, 및 농도 250mM 미만의 양 순전하의 아미노산 (바람직하게는 아르기닌 또는 글리신)을 포함할 수 있다. 상기 세척 버퍼 (C)는 25mM의 소듐 포스페이트 (pH7.4) 및 150mM 아르기닌을 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 보다 고순도가 필요할 경우, 부분적으로 BMP를 용출하는 10mM 내지 100mM의 TRIS 버퍼 (pH 8.9)로 세척하는 것이 가능하다. 상기 세척 버퍼 (C)는 전도도가 2mS/cm 내지 15mS/cm 범위에 포함될 수 있도록 소듐 클로라이드 또는 포타슘 클로라이드 등의 기타 염, 또는 아르기닌 또는 글리신 등의 기타 분자를 포함할 수 있다. pH 8.9인 것이 가능하나, 이 경우 전도도는 반드시 5mS/cm 미만이어야 한다.
바람직하게, pH 8.8 내지 9.1로 완충된 용출 버퍼 (E2)에 의해, 분비된 TGF-β 슈퍼패밀리 단백질이 양이온 교환 컬럼으로부터 용출될 수 있다. 용출 버퍼 (E2)로 적합한 버퍼는, 예를 들어 전도도가 10mS/cm 초과, 80mS/cm 미만으로, TRIS, 비신, N-메틸 디에탄올아민, 디에탄올아민, 더욱 바람직하게는 예를 들어 NaCl, KCl 등의 임의의 염, 바람직하게는 NaCl을 포함하는 TRIS일 수 있다. 용출 버퍼 (E2)는 소듐 클로라이드 또는 포타슘 클로라이드 등의 염, 또는 아르기닌 등의 분자를 포함할 수 있다. 상기 버퍼의 전도도는 10mS/cm과 50mS/cm 사이의 범위에 포함되어야 한다. 더욱 바람직하게, “용출 용액 3”은 50mM TRIS (pH 8.9) 및 200mM 소듐 클로라이드를 포함한다.
용출 버퍼 (E2)를 이용하여, 분비된 TGF-β 슈퍼패밀리 단백질을 포함하는 제2 용출액이 이렇게 수득된다.
제2 용출액은 이후 pH 8.5 내지 9.0에서 임의의 용액 완충을 이용하여, 전도도가 8mS/cm 이하가 될 때까지 희석 또는 투석여과 방식에 의해 가공되는 것이 바람직하다. 희석 용액은 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 아르기닌, 및 글리신 등의 임의의 염 또는 분자를 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게, 상기 버퍼는 50mM TRIS (pH 8.9) 및 100mM 아르기닌이다. 상기 희석 이후 제2 용출액 용액의 전도도는 10mS/cm 미만이어야 한다.
바람직하게는 상술한 것과 같이 가공된 제2 용출액은 임의의 공급자에 의한 모든 수지 중에서 선택되는, 양전하 그룹의 음이온 교환 컬럼에 접촉될 수 있다.
여기서 사용되는 용어, 음이온 교환 컬럼은 PALL, TOSOH (Toyopearl® 등), POROS®, Fractogel® 및 GE Healthcare에서 제조되는 컬럼들을 포함하여, 양전하 모이어티를 가지는 모든 컬럼을 포함하며, GE Healthcare의 Capto Q가 보다 바람직하다. 본 발명에 따르면, 상기 음이온 교환 수지는 강한 음이온 교환 수지가 바람직하다.
음이온 교환 수지에 로딩된 후, 소듐 포스페이트, 포타슘 포스페이트, 히스티딘, HEPES, 비신 및 TRIS를 포함하는 군에서 선택되는 20 내지 100mM의 버퍼를 포함하는, pH 6.0 내지 9.0으로 완충된 임의의 용액에 의해 세척 단계가 수행되어야 한다. 상기 세척 버퍼는 전도도가 2mS/cm 내지 10mS/cm의 범위에 포함될 수 있도록 소듐 클로라이드 또는 포타슘 클로라이드 등의 기타 염, 또는 아르기닌 또는 글리신 등의 임의의 분자를 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게, 상기 세척 버퍼 (D)는 다음 3가지이다: 첫번째 버퍼 (D1)는 50mM TRIS (pH8.9) 및 100mM 아르기닌을 포함하고, 두번째 버퍼 (D2)는 25mM 소듐 포스페이트 (pH 7.4)를 포함하고, 세번째 버퍼 (D3)는 25mM 소듐 포스페이트 (pH 6.5) 및 75mM 소듐 클로라이드를 포함한다.
바람직하게, 분비된 TGF-β 슈퍼패밀리 단백질이 음이온 교환 수지로부터 용출되는 것은 전도도가 20 내지 26mS/cm에 포함되는 pH 7.2 내지 7.6의 용출 버퍼 (E3); 바람직하게는 소듐 및 포타슘 포스페이트 및 HEPES에 의해 수행될 수 있으며, 상기 버퍼는 약전에 기술된 것과 같이 제조된 PBS 1.5x (pH 7.4)인 것이 더욱 바람직하다. 용출 버퍼 (E3)를 이용한 용출을 이용하여 원하는 분비된 TGF-β 슈퍼패밀리 단백질을 포함하는 제3 용출액이 제공된다.
제3 용출액은 추가적으로 Planova 20N 나노필터(nano-filter)로 여과되어 -80℃에서 냉동 보관되는 것이 바람직하다. 선택적으로, 분자량 컷오프가 10KDa인 중공 섬유 카트리지 또는 카세트를 이용하여 접선유동여과 (tangential flow filtration)에 의해 이를 농축하는 것도 가능하다.
본 발명의 방법은 BMP 정제를 고수율 및 고순도로 가능하게 한다. 본 방법의 효과는 RP-HPLC에서 SEC-HPLC에 이르기까지, SDS-PAGE에서 HCP ELISA에 이르기까지 여러 분석방법에 의해 입증되었다. 본 발명의 선호되는 실시양태에 따르면, CHO 세포에 의해 생산된 BMP-4는 0 내지 2%의 응집체를 가지며, 다른 숙주 세포 단백질을 5000ppm 미만으로 가져, 99%의 HPLC 순도로 분리, 수득된다.
도 1은 본 발명의 방법에 대해 선호되는 실시양태에 대한 개요도를 제공한다. 상기 단계의 순서는 현재 선호되나, 예를 들어 단계의 순서에 대한 다양한 변형과 수정이 가능하다. 이러한 수정은 본 발명의 범위 내이다.
TGF-β 슈퍼패밀리 단백질을 생산할 수 있는 임의의 세포는 본 발명의 방법에서 시작 용액으로 사용되는 세포 배양 배지를 생산하기 위해 사용될 수 있다. CHO 세포가 BMP, 특히 BMP4 생산에서 선호된다. 배지에 FBS가 보충될 수 있다고 하더라도, 바이러스와 다른 제거되어야 하는 물질을 유도하지 않기 위하여 무혈청 배지를 사용하는 것이 선호된다.
CHO 세포는 C형 입자 (결함있는 레트로바이러스-유사 입자) 뿐만 아니라 지질, 탄수화물, 핵산, 및 단백질을 분비하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 정제 공정은 염, 아미노산, 당, 그리고 특히 큰 고분자 등의 배지 성분을 제거할 뿐만 아니라 상기 오염물을 제거하거나 불활성화 시키는데 중요한 역할을 한다. 전체 공정은 고순도의 단백질을 수득할 수 있도록 개발되었다. 이러한 의미에서, HCIC 단계에 이은 기타 단계 또한 상당한 이점을 보인다.
배치 (batch) 공정에서, 양이온 교환 크로마토그래피 단계 전에 Tween 20를 사용하는 것은 2가지 이점이 있다: 첫번째 이점은, 거의 중성 pH (7.2 내지 7.6)에서 단백질의 용해도를 증가시킬 수 있다는 것이다. 이는 중성 pH에서 BMP의 용해도가 매우 낮기 때문에 매우 중요하다.
두번째 이점은, Tween 20이 바이러스 불활성화 (MuLV)에 역할을 한다는 것이다.
약한 양이온 교환 크로마토그래피는 매우 잘 알려진 수지이나, BMP 정제에 대한 현재의 기술 측면에서 볼 때, 매우 염기성 조건에서는 절대 사용되지 않는다. 사실 BMP는 중성 pH보다 그 용해도가 더 높은 pH 8.9에서 용출된다.
상기 단계 이후, BMP의 순도는 약 98% 이상이다.
마지막으로, 음이온 교환 단계는 BMP의 순도를 99.5% 이상으로 증가시키는 다듬는 단계이다.
이러한 결과를 얻기 위하여, 제2 용출액은 염기성 pH에서 TRIS-아르기닌 버퍼로 처리된다. 염기성 pH는 아르기닌의 사용을 유지시킬 뿐만 아니라, 단백질이 용해되어 있도록 한다. 나아가, 아르기닌은 응집체가 형성되는 것을 방지하며, BMP 그리고 잔여 HCP (숙주 세포 단백질)에 의한 임의의 결합과 경쟁한다.
세번째 크로마토그래피 단계의 마지막 이점은, 상기 최종 용출 버퍼가 제형 및/또는 희석 후 비경구 투여량에 거의 바로 사용될 수 있는, PBS 1.5x (pH 7.4)라는 점이다.
기존 문헌에 보고된 공정과 비교할 때, 상기 공정은 하나 이상의 이점을 가진다. 이는, 8 이상의 MMV 바이러스의 로그 감소 뿐만 아니라, 20 이상의 총 로그 감소 값으로 MuLV 바이러스를 제거하기에 매우 강력하다는 것이다.
BMP4 정제에 대하여 본 발명을 수행한 예시들이 아래에 기술되어 있으나, 모든 TGF-β 단백질 슈퍼패밀리, 특히 골 형성 단백질 패밀리에 대하여 유사한 결과를 위하여 동일한 공정이 이용될 수 있다. 하기 실시예들은 본 발명의 절차를 예시하는 것이며, 예시적인 목적만을 위한 것이다.
실시예
실시예: 혼합-모드 컬럼
단백질은 거의 중성 pH에서 배양 배지로 분비된다. 세포 제거 이후, 배지는 필요한 경우 pH와 염 농도를 조정하기 위하여 가공되어야 한다.
실시예 1
MEP HyperCel은 3CV (컬럼 부피)의 50mM 소듐 포스페이트 버퍼 pH 7.4 및 500M NaCl로 300cm/h에서 조절되었다. 배양 배지 (20 내지 30CV)를 추가로 152cm/h에서 로딩하였다. 이후 상기 컬럼을 평형 버퍼 (5CV)로 세척하고, 곧바로 100mM 소듐 아세테이트 pH 4.5 (5CV), 100mM 소듐 아세테이트 pH 4.0 (5CV), 100mM 소듐 아세테이트 pH 3.5 (5CV), 100mM 소듐 아세테이트 pH 3.0 (5CV)으로 300cm/h에서 세척하였다. 상기 산물을 100mM 글리신·HCl 버퍼 pH 2.7로 300cm/h에서 용출시켰다.
실시예 2
MEP HyperCel은 3CV (컬럼 부피)의 50mM TRIS 버퍼 pH 8.2 및 500M NaCl로 300cm/h에서 조절되었다. 배양 배지 (20 내지 30CV)를 추가로 152cm/h에서 로딩하였다. 이후 상기 컬럼을 평형 버퍼 (5CV)로 세척하고, 곧바로 100mM 소듐 아세테이트 pH 4.5 (5CV), 100mM 소듐 아세테이트 pH 4.0 (5CV), 100mM 소듐 아세테이트 pH 3.5 (5CV), 100mM 소듐 아세테이트 pH 3.0 (5CV)으로 300cm/h에서 세척하였다. 상기 산물을 200mM 글리신·HCl 버퍼 pH 2.7로 300cm/h에서 용출시켰다.
실시예 3
MEP HyperCel은 3CV (컬럼 부피)의 50mM TRIS 버퍼 pH 8.8 및 500M NaCl로 300cm/h에서 조절되었다. 배양 배지 (20 내지 30CV)를 추가로 152cm/h에서 로딩하였다. 이후 상기 컬럼을 평형 버퍼 (5CV)로 세척하고, 곧바로 100mM 소듐 아세테이트 pH 4.5 (5CV), 100mM 소듐 아세테이트 pH4.0 (5CV), 100mM 소듐 아세테이트 pH 3.5 (5CV), 100mM 소듐 아세테이트 pH 3.0 (5CV)으로 300cm/h에서 세척하였다. 상기 산물을 200mM 글리신·HCl 버퍼 pH 2.7로 300cm/h에서 용출시켰다.
실시예 4
MEP HyperCel은 3CV (컬럼 부피)의 50mM TRIS 버퍼 pH 8.8 및 500M NaCl로 300cm/h에서 조절되었다. 배양 배지 (20 내지 30CV)를 추가로 300cm/h에서 로딩하였다. 이후 상기 컬럼을 평형 버퍼 (5CV)로 세척하고, 곧바로 100mM 소듐 아세테이트 pH 4.5 (5CV), 100mM 소듐 아세테이트 pH 4.0 (5CV), 100mM 소듐 아세테이트 pH 3.5 (5CV), 100mM 소듐 아세테이트 pH 3.0 (5CV)으로 300cm/h에서 세척하였다. 상기 산물을 200mM 글리신·HCl 버퍼 pH 2.7로 300cm/h에서 용출시켰다.
실시예 5
MEP HyperCel은 3CV (컬럼 부피)의 50mM 소듐 포스페이트 버퍼 pH 7.4 및 500M NaCl로 300cm/h에서 조절되었다. 배양 배지 (20 내지 30CV)를 추가로 300cm/h에서 로딩하였다. 이후 상기 컬럼을 평형 버퍼 (5CV)로 세척하고, 곧바로 100mM 소듐 아세테이트 pH 4.0 (5CV), 100mM 소듐 아세테이트 pH 3.0 및 1000mM NaCl (5CV)로 300cm/h에서 세척하였다. 상기 산물을 200mM 글리신·HCl 버퍼 pH 2.7로 300cm/h에서 용출시켰다.
실시예 1 내지 5의 요약
MEP HyperCel 컬럼에 대해 적용된 파라미터
정제 공정 실시예 파라미터 표적 범위 % 회수된 BMP [VAL1]
평형 1, 2, 3, 4, 5 유속 ≤ 300cm/h
1, 2, 3, 4, 5 전도도 ≤ 50mS/cm
1, 5 pH 7.4 ± 0.2
2 pH 8.2 ± 0.2
3, 4 pH 8.8 ± 0.2
로딩 1, 2, 3 유속 ≤ 152cm/h
4, 5 유속 ≤ 300cm/h
1, 5 pH 7.4 ± 0.2
2 pH 8.2 ± 0.2
3, 4 pH 8.8 ± 0.2
1, 5 < 10
2, 3, 4 < 5
세척 1, 2, 3, 4, 5 유속 ≤ 300cm/h
1, 2, 3, 4, 5 < 5
용출 1, 2, 3, 4, 5 유속 ≤ 300cm/h
1 ≤ 50
2, 3, 4, 5 ≥ 85
실시예 6
HEA HyperCel은 3CV (컬럼 부피)의 50mM TRIS 버퍼 pH 8.8 및 500M NaCl로 300cm/h에서 조절되었다. 배양 배지 (20 내지 30CV)를 추가로 152cm/h에서 로딩하였다. 이후 상기 컬럼을 평형 버퍼 (5CV)로 세척하고, 곧바로 100mM 소듐 아세테이트 pH 4.5 (5CV), 50mM 소듐 아세테이트 pH 4.0 (5CV), 50mM 소듐 아세테이트 pH 3.5 (5CV), 50mM 소듐 아세테이트 pH 3.0 (5CV)으로 300cm/h에서 세척하였다. 상기 산물을 100mM 글리신·HCl 버퍼 pH 2.7로 300cm/h에서 용출시켰다. 실시예 6은 표 2에 기술되었다.
실시예 6의 요약
HEA HyperCel 컬럼에 대해 적용된 파라미터
정제 공정 실시예 파라미터 표적 범위 % 회수된 BMP
평형 6 유속 ≤ 300cm/h
6 전도도 ≤ 50mS/cm
6 pH 8.8 ± 0.2
로딩 6 유속 ≤ 152cm/h
6 pH 8.8 ± 0.2
6 < 2
세척 6 유속 ≤ 300cm/h
6 < 20
용출 6 유속 ≤ 300cm/h
6 ≥ 78
실시예 7
PPA HyperCel은 3CV (컬럼 부피)의 50mM TRIS 버퍼 pH 8.8 및 500M NaCl로 300cm/h에서 조절되었다. 배양 배지 (20 내지 30CV)를 추가로 152cm/h에서 로딩하였다. 이후 상기 컬럼을 평형 버퍼 (5CV)로 세척하고, 곧바로 100mM 소듐 아세테이트 pH 4.5 (5CV), 50mM 소듐 아세테이트 pH 4.0 (5CV), 50mM 소듐 아세테이트 pH 3.5 (5CV), 50mM 소듐 아세테이트 pH 3.0 (5CV)으로 300cm/h에서 세척하였다. 상기 산물을 100mM 글리신·HCl 버퍼 pH 2.7로 300cm/h에서 용출시켰다.
실시예 8
PPA HyperCel은 3CV (컬럼 부피)의 50mM TRIS 버퍼 pH 8.8 및 500M NaCl로 300cm/h에서 조절되었다. 배양 배지 (20 내지 30CV)를 추가로 300cm/h에서 로딩하였다. 이후 상기 컬럼을 평형 버퍼 (5CV)로 세척하고, 곧바로 100mM 소듐 아세테이트 pH 4.5 (5CV), 50mM 소듐 아세테이트 pH 4.0 (5CV), 50mM 소듐 아세테이트 pH 3.5 (5CV), 50mM 소듐 아세테이트 pH 3.0 (5CV)으로 300cm/h에서 세척하였다. 상기 산물을 100mM 글리신·HCl 버퍼 pH 2.7로 300cm/h에서 용출시켰다.
실시예 9
PPA HyperCel은 3CV (컬럼 부피)의 50mM TRIS 버퍼 pH 8.8 및 500M NaCl로 300cm/h에서 조절되었다. 배양 배지 (20 내지 30CV)를 추가로 152cm/h에서 로딩하였다. 이후 상기 컬럼을 평형 버퍼 (5CV)로 세척하고, 곧바로 100mM 소듐 아세테이트 pH 4.0 (10CV)으로 300cm/h에서 세척하였다. 상기 산물을 100mM 글리신·HCl 버퍼 pH 2.7로 300cm/h에서 용출시켰다.
실시예 7 내지 9의 요약
PPA HyperCel 컬럼에 대해 적용된 파라미터
정제 공정 실시예 파라미터 표적 범위 % 회수된 BMP
평형 7, 8, 9 유속 ≤ 300cm/h
7, 8, 9 전도도 ≤ 50mS/cm
7, 8, 9 pH 8.8 ± 0.2
로딩 7, 9 유속 ≤ 152cm/h
8 유속 ≤ 300cm/h
7, 8, 9 pH 8.8 ± 0.2
7, 8, 9 < 2
세척 7, 8, 9 유속 ≤ 300cm/h
7, 8 < 20
9 < 2
용출 7, 8, 9 유속 ≤ 300cm/h
7, 8 ≥ 75
9 ≥ 98
실시예 10
PPA HyperCel은 3CV (컬럼 부피)의 50mM TRIS 버퍼 pH 8.8 및 500M NaCl로 300cm/h에서 조절되었다. 배양 배지 (20 내지 30CV)를 추가로 214cm/h에서 로딩하였다. 이후 상기 컬럼을 평형 버퍼 (10CV)로 세척하고, 곧바로 100mM 소듐 아세테이트 pH 4.0 (10CV)으로 300cm/h에서 세척하였다. 상기 산물을 200mM 글리신·HCl 버퍼 pH 3.5로 300cm/h에서 용출시켰다.
실시예 11
PPA HyperCel은 3CV (컬럼 부피)의 50mM TRIS 버퍼 pH 8.8 및 500M NaCl로 300cm/h에서 조절되었다. 배양 배지 (20 내지 30CV)를 추가로 214cm/h에서 로딩하였다. 이후 상기 컬럼을 평형 버퍼 (10CV)로 세척하고, 곧바로 100mM 소듐 아세테이트 pH 4.0 (10CV)으로 300cm/h에서 세척하였다. 상기 산물을 125mM 글리신·HCl 버퍼 pH 3.5로 300cm/h에서 용출시켰다.
실시예 12
PPA HyperCel은 3CV (컬럼 부피)의 50mM TRIS 버퍼 pH 8.8 및 500M NaCl로 300cm/h에서 조절되었다. 배양 배지 (20 내지 30CV)를 추가로 214cm/h에서 로딩하였다. 이후 상기 컬럼을 평형 버퍼 (10CV)로 세척하고, 곧바로 100mM 소듐 아세테이트 pH 4.0 (10CV)으로 300cm/h에서 세척하였다. 상기 산물을 75mM 글리신·HCl 버퍼 pH 3.5로 300cm/h에서 용출시켰다.
실시예 13
PPA HyperCel은 3CV (컬럼 부피)의 50mM TRIS 버퍼 pH 8.8 및 500M NaCl로 300cm/h에서 조절되었다. 배양 배지 (20 내지 30CV)를 추가로 214cm/h에서 로딩하였다. 이후 상기 컬럼을 평형 버퍼 (10CV)로 세척하고, 곧바로 100mM 소듐 아세테이트 pH 4.0 (10CV)으로 300cm/h에서 세척하였다. 상기 산물을 100mM 글리신·HCl 버퍼 pH 3.5로 300cm/h에서 용출시켰다.
실시예 14
PPA HyperCel은 3CV (컬럼 부피)의 50mM TRIS 버퍼 pH 8.8 및 500M NaCl로 300cm/h에서 조절되었다. 배양 배지 (20 내지 30CV)를 추가로 214cm/h에서 로딩하였다. 이후 상기 컬럼을 평형 버퍼 (10CV)로 세척하고, 곧바로 100mM 소듐 아세테이트 pH 4.0 (10CV)으로 300cm/h에서 세척하였다. 상기 산물을 75mM 글리신·HCl 버퍼 pH 3.3으로 300cm/h에서 용출시켰다.
실시예 15
PPA HyperCel은 3CV (컬럼 부피)의 50mM TRIS 버퍼 pH 8.8 및 500M NaCl로 300cm/h에서 조절되었다. 배양 배지 (20 내지 30CV)를 추가로 214cm/h에서 로딩하였다. 이후 상기 컬럼을 평형 버퍼 (10CV)로 세척하고, 곧바로 100mM 소듐 아세테이트 pH 4.0 (10CV)으로 300cm/h에서 세척하였다. 상기 산물을 50mM 글리신·HCl 버퍼 pH 3.3으로 300cm/h에서 용출시켰다.
실시예 16
PPA HyperCel은 3CV (컬럼 부피)의 50mM TRIS 버퍼 pH 8.8 및 500M NaCl로 300cm/h에서 조절되었다. 배양 배지 (20 내지 30CV)를 추가로 214cm/h에서 로딩하였다. 이후 상기 컬럼을 평형 버퍼 (10CV)로 세척하고, 곧바로 100mM 소듐 아세테이트 pH 4.0 (10CV)으로 300cm/h에서 세척하였다. 상기 산물을 100mM 글리신·HCl 버퍼 pH 3.1로 300cm/h에서 용출시켰다.
실시예 17
PPA HyperCel은 3CV (컬럼 부피)의 50mM TRIS 버퍼 pH 8.8 및 500M NaCl로 300cm/h에서 조절되었다. 배양 배지 (20 내지 30CV)를 추가로 214cm/h에서 로딩하였다. 이후 상기 컬럼을 평형 버퍼 (10CV)로 세척하고, 곧바로 100mM 소듐 아세테이트 pH 4.0 (10CV)으로 300cm/h에서 세척하였다. 상기 산물을 50mM 글리신·HCl 버퍼 pH 3.1로 300cm/h에서 용출시켰다.
실시예 10 내지 17에서 적용된 파라미터 요약
PPA HyperCel 컬럼에 대해 적용된 파라미터
정제 공정 실시예 파라미터 표적 범위 % 회수된 BMP
평형 10 - 17 유속 ≤ 300cm/h
10 - 17 전도도 ≤ 50mS/cm
10 - 17 pH 8.9 ± 0.2
로딩 10 - 17 유속 ≤ 214cm/h
10 - 17 전도도 ≤ 50mS/cm
10 - 17 pH 8.9 ± 0.2
세척 10 - 17 유속 ≤ 300cm/h
용출 10 - 17 유속 ≤ 300cm/h
실시예 10 내지 17의 용출 결과 요약
PPA HyperCel 컬럼에서의 용출 결과
실시예 글리신 농도 (mM) pH 수율
(RP-HPLC)		 순도
(RP-HPLC)
10 200 3.5 50 81
11 125 3.5 44 90
12 75 3.5 30 100
13 100 3.3 86 84
14 75 3.3 81 84
15 50 3.3 60 89
16 100 3.1 64 83
17 50 3.1 44 92
실시예 18
PPA HyperCel은 3CV (컬럼 부피)의 50mM TRIS 버퍼 pH 8.9 및 500M NaCl로 152cm/h에서 조절되었다. 배양 배지 (12.5CV)를 추가로 152cm/h에서 로딩하였다. 이후 상기 컬럼을 평형 버퍼 (5CV)로 세척하고, 곧바로 25mM 소듐 포스페이트 pH7.4 (5CV), 추가로 100mM 소듐 아세테이트 pH 4.0 (10CV)으로 152cm/h에서 세척하였다. 상기 산물을 100mM 글리신·HCl 버퍼 pH 2.7로 152cm/h에서 용출시켰다.
실시예 19
PPA HyperCel은 3CV (컬럼 부피)의 50mM TRIS 버퍼 pH 8.9 및 500M NaCl로 152cm/h에서 조절되었다. 배양 배지 (25CV)를 추가로 152cm/h에서 로딩하였다. 이후 상기 컬럼을 평형 버퍼 (5CV)로 세척하고, 곧바로 25mM 소듐 포스페이트 pH7.4 (5CV), 추가로 100mM 소듐 아세테이트 pH 4.0 (10CV)으로 152cm/h에서 세척하였다. 상기 산물을 100mM 글리신·HCl 버퍼 pH 2.7로 152cm/h에서 용출시켰다.
실시예 20
PPA HyperCel은 3CV (컬럼 부피)의 50mM TRIS 버퍼 pH 8.9 및 500M NaCl로 152cm/h에서 조절되었다. 배양 배지 (50CV)를 추가로 152cm/h에서 로딩하였다. 이후 상기 컬럼을 평형 버퍼 (5CV)로 세척하고, 곧바로 25mM 소듐 포스페이트 pH7.4 (5CV), 추가로 100mM 소듐 아세테이트 pH 4.0 (10CV)으로 152cm/h에서 세척하였다. 상기 산물을 100mM 글리신·HCl 버퍼 pH 2.7로 152cm/h에서 용출시켰다.
실시예 21
PPA HyperCel은 3CV (컬럼 부피)의 50mM TRIS 버퍼 pH 8.9 및 500M NaCl로 152cm/h에서 조절되었다. 배양 배지 (100CV)를 추가로 152cm/h에서 로딩하였다. 이후 상기 컬럼을 평형 버퍼 (5CV)로 세척하고, 곧바로 25mM 소듐 포스페이트 pH7.4 (5CV), 추가로 100mM 소듐 아세테이트 pH 4.0 (10CV)으로 152cm/h에서 세척하였다. 상기 산물을 100mM 글리신·HCl 버퍼 pH 2.7로 152cm/h에서 용출시켰다.
실시예 18 내지 21에서 적용된 파라미터 요약
PPA HyperCel 컬럼에 대해 적용된 파라미터
정제 공정 실시예 파라미터 표적 범위 % 회수된 BMP
평형 18 - 21 유속 ≤ 152cm/h
18 - 21 전도도 ≤ 50mS/cm
18 - 21 pH 8.9 ± 0.2
로딩 18 - 21 유속 ≤ 152cm/h
18 - 21 전도도 ≤ 50mS/cm
18 - 21 pH 8.9 ± 0.2
세척 18 - 21 유속 ≤ 152cm/h
용출 18 - 21 유속 ≤ 152cm/h
실시예 18 내지 21의 용출 결과 요약
PPA HyperCel 컬럼에서의 용출 결과
실시예 글리신 농도 (mM) pH CV 배양 배지 % 용출액 에서 회수된 BMP
18 100 2.7 12.5 ≥ 98
19 100 2.7 25 ≥ 98
20 100 2.7 50 ≥ 98
21 100 2.7 100 ≥ 80
실시예 22
PPA HyperCel을 2L 컬럼으로 규모를 확대하고, 3CV (컬럼 부피)의 50mM TRIS 버퍼 pH 8.9 및 500M NaCl로 150cm/h에서 조절하였다. 세포 및 찌꺼기를 제거하기 위하여 배양 배지 (25L)를 추가로 가공하고, pH와 전도도를 조정하였다. 상기 배양 배지를 150cm/h에서 로딩하였다. 이후 상기 컬럼을 평형 버퍼 (3CV)로 세척하고, 곧바로 25mM 소듐 포스페이트 pH7.4 (3CV), 추가로 100mM 소듐 아세테이트 pH 4.0 (8CV)로 150cm/h에서 세척하였다. 상기 산물을 100mM 글리신·HCl 버퍼 pH 2.7 (6CV)로 150cm/h에서 용출시켰다. 상기 산물을 2.3CV 제1 용출물에 수집하였다.
실시예 22의 요약
PPA HyperCel 컬럼에 대해 적용된 파라미터
정제 공정 실시예 파라미터 표적 범위 % 회수된 BMP
평형 22 유속 150cm/h
22 전도도 ≤ 50mS/cm
22 pH 8.9 ± 0.2
22 부피 1600-2200ml
로딩 22 유속 150cm/h
22 pH 8.9 ± 0.2
22 배양 배지 부피 25L
22 < 2
세척 22 유속 150cm/h
22 < 2
용출 22 유속 150cm/h
22 pH 2.7 ± 0.2
22 2.3CV ≥ 92
22 3.7CV ≤ 4
실시예: 제1 용출액 가공
실시예 23
상기 혼합-모드 컬럼으로부터 얻은 제1 용출액을 HCl 1.2% v/v로 pH를 낮추어 불활성화시켰다. 최종 pH 수치는 2.60 내지 2.80에 포함되어야 한다. MLV (쥐 백혈병 바이러스(Murine Leukemia Virus), 이는 retro-virus임)의 감소는 로그 감소로 표시되는 VRF (바이러스 감소값, Viral Reduction Factor)으로 pH 2.70에서 확인되었다.
실시예 23의 요약
pH 불활성화에 의한 MLV 로그 감소
실시예 잔류 시간 (min) Titre/ml
Run 1		 Titre/ml
Run 2		 VRF (log10)
Run 1		 VRF (log10)
Run 2
23 1 1.73* 1.73* 6.63 ± 0.38 ≥ 6.42 ± 0.33
23 30 1.73* 1.73*
23 60 -0.52 -0.05*
23 120 1.73* 1.73*
(*) 바이러스가 샘플에서 검출되지 않았을 때 적정농도 (titre)를 계산하기 위하여 푸아송 분포가 사용되었다.
실시예 24
상기 용액을 양이온 교환 컬럼에 로딩시키기 전 추가로 가공하였다. 상기 BMP 용액을, 교반 조건 (300rpm) 하에서 25mM 이가산 소듐 포스페이트 pH 8.5 내지 9.4 및 0.24% w/v의 Tween 20 (polysorbate 20)의 용액의 일 부피에 첨가하였다. 첨가하는 동안 pH를 조절하고 1M NaOH 용액으로 조정하였다. 최종 pH 수치는 7.2 내지 7.6에 포함된다. 최종 Tween 20 농도는 약 0.12% w/v이다. BMP 회수율은 98%보다 높다.
실시예 25
상기 용액을 양이온 교환 컬럼에 로딩시키기 전 추가로 가공하였다. 상기 BMP 용액을, 교반 조건 (300rpm) 하에서 25mM 이가산 소듐 포스페이트 pH 8.5 내지 9.4 및 0.5% w/v의 Tween 20 (polysorbate 20)의 용액의 일 부피에 첨가하였다. 첨가하는 동안 pH를 조절하고 1M NaOH 용액으로 조정하였다. 최종 pH 수치는 7.2 내지 7.6에 포함된다. 최종 Tween 20 농도는 약 0.25% w/v이다. BMP 회수율은 98%보다 높다.
실시예 26
상기 용액을 양이온 교환 컬럼에 로딩시키기 전 추가로 가공하였다. 상기 BMP 용액을, 교반 조건 (300rpm) 하에서 25mM 이가산 소듐 포스페이트 pH 8.5 내지 9.4 및 1.0% w/v의 Tween 20 (polysorbate 20)의 용액의 일 부피에 첨가하였다. 첨가하는 동안 pH를 조절하고 1M NaOH 용액으로 조정하였다. 최종 pH 수치는 7.2 내지 7.6에 포함된다. 최종 Tween 20 농도는 약 0.5% w/v이다. BMP 회수율은 98%보다 높다.
Tween 20은 MLV에 대하여 불활성화 효과를 나타내는 계면활성제이다. 이러한 불활성화는 실시예 24에 대하여 VRF와 표 10에 보고된 결과와 같이 확인되었다.
Tween 20 불활성화에 의한 MLV 로그 감소
실시예 잔류 시간 (min) Titre/ml
Run 1		 Titre/ml
Run 2		 VRF (log10)
Run 1		 VRF (log10)
Run 2
24 1 5.93 6.02 4.88 ± 0.41 4.34 ± 0.34
24 50 4.10 4.27
24 100 3.25 3.00
24 260 1.14 1.59
실시예: 양이온 교환 컬럼
실시예 27
CM 세파로오스(Sepharose) (부피 = 5ml)는 3CV (컬럼 부피)의 25mM 소듐 포스페이트 버퍼 pH 7.4로 230cm/h에서 조절되었다. 가공된 제1 용출액을 230cm/h에서 로딩하였다. 이후 상기 컬럼을 평형 버퍼 (3CV)로 세척하고, 곧바로 25mM 소듐 포스페이트 pH7.0 및 300mM 소듐 클로라이드 (10CV)로 230cm/h에서 세척하였다. 상기 산물을 50mM TRIS·HCl 버퍼 pH 8.9 및 500mM 소듐 클로라이드 (6CV)로 230cm/h에서 용출시켰다. 상기 산물을 2CV 제1 용출물에 수집하였다.
실시예 28
CM 세파로오스 (부피 = 5ml)는 3CV (컬럼 부피)의 25mM 소듐 포스페이트 버퍼 pH 7.4로 230cm/h에서 조절되었다. 가공된 제1 용출액을 230cm/h에서 로딩하였다. 이후 상기 컬럼을 평형 버퍼 (3CV)로 세척하고, 곧바로 25mM 소듐 포스페이트 pH 7.4 및 150mM 소듐 클로라이드 (10CV)로 230cm/h에서 세척하였다. 상기 산물을 50mM TRIS·HCl 버퍼 pH 8.9 및 500mM 소듐 클로라이드 (6CV)로 230cm/h에서 용출시켰다. 상기 산물을 2CV 제1 용출물에 수집하였다.
실시예 29
CM 세파로오스 (부피 = 5ml)는 3CV (컬럼 부피)의 25mM 소듐 포스페이트 버퍼 pH 7.4로 230cm/h에서 조절되었다. 가공된 제1 용출액을 230cm/h에서 로딩하였다. 이후 상기 컬럼을 평형 버퍼 (3CV)로 세척하고, 곧바로 50mM TRIS·HCl 버퍼 pH 8.9 및 150mM 소듐 클로라이드 (10CV)로 230cm/h에서 세척하였다. 상기 산물을 50mM TRIS·HCl 버퍼 pH 8.9 및 500mM 소듐 클로라이드 (6CV)로 230cm/h에서 용출시켰다. 상기 산물을 2CV 제1 용출물에 수집하였다.
실시예 27 내지 29의 요약
CM 세파로오스 컬럼에 대해 적용된 파라미터
정제 공정 실시예 파라미터 표적 범위 % 회수된 BMP
평형 27, 28, 29 유속 230cm/h
27, 28, 29 전도도 ≤ 5mS/cm
27, 28, 29 pH 7.4 ± 0.2
27, 28, 29 부피 3CV
로딩 27, 28, 29 유속 230cm/h
27, 28, 29 pH 7.4 ± 0.2
27, 28, 29 부피 200CV
27, 28, 29 < 5
세척 27 유속 230cm/h < 5
28 유속 230cm/h < 5
29 유속 230cm/h < 10
용출 27, 28, 29 유속 230cm/h
27, 28, 29 pH 8.9 ± 0.2
27, 28 > 90
29 2CV > 80
실시예 30
CM 세파로오스 (부피 = 5ml)는 3CV (컬럼 부피)의 25mM 소듐 포스페이트 버퍼 pH 7.4로 230cm/h에서 조절되었다. 가공된 제1 용출액을 230cm/h에서 로딩하였다. 이후 상기 컬럼을 평형 버퍼 (3CV)로 세척하고, 곧바로 50mM TRIS·HCl 버퍼 pH 8.9 (10CV)로 230cm/h에서 세척하였다. 상기 산물을 50mM TRIS·HCl 버퍼 pH 8.9 및 200mM 소듐 클로라이드 (6CV)로 230cm/h에서 용출시켰다. 상기 산물을 4CV 제1 용출물에 수집하였다.
실시예 30의 요약
CM 세파로오스 컬럼에 대해 적용된 파라미터
정제 공정 실시예 파라미터 표적 범위 % 회수된 BMP
평형 30 유속 230cm/h
30 전도도 ≤ 5mS/cm
30 pH 7.4 ± 0.2
30 부피 3CV
로딩 30 유속 230cm/h
30 pH 7.4 ± 0.2
30 부피 800CV
30 < 5
세척 30 유속 230cm/h < 10
용출 30 유속 230cm/h
30 pH 8.9 ± 0.2
30 4CV > 80
30 RP-HPLC 순도 99%
30 응집체 5-15%
실시예 31
CM 세파로오스 (부피 = 500ml)는 3CV (컬럼 부피)의 25mM 소듐 포스페이트 버퍼 pH 7.4로 230cm/h에서 조절되었다. 가공된 제1 용출액을 230cm/h에서 로딩하였다. 이후 상기 컬럼을 평형 버퍼 (10CV)로 세척하고, 곧바로 50mM TRIS·HCl 버퍼 pH 8.9 (10CV)로 230cm/h에서 세척하였다. 상기 산물을 50mM TRIS·HCl 버퍼 pH 8.9 및 200mM 소듐 클로라이드 (6CV)로 230cm/h에서 용출시켰다. 상기 산물을 4CV 제1 용출물에 수집하였다.
실시예 32
CM 세파로오스 (부피 = 300ml)는 3CV (컬럼 부피)의 25mM 소듐 포스페이트 버퍼 pH 7.4로 230cm/h에서 조절되었다. 가공된 제1 용출액을 230cm/h에서 로딩하였다. 이후 상기 컬럼을 평형 버퍼 (10CV)로 세척하고, 곧바로 25mM 소듐 포스페이트 버퍼 pH 7.4 및 150mM 아르기닌 (10CV)로 230cm/h에서 세척하였다. 상기 산물을 50mM TRIS·HCl 버퍼 pH 8.9 및 200mM 소듐 클로라이드 (6CV)로 230cm/h에서 용출시켰다. 상기 산물을 4CV 제1 용출물에 수집하였다.
실시예 31 내지 32의 요약
CM 세파로오스 컬럼에 대해 적용된 파라미터
정제 공정 실시예 파라미터 표적 범위 % 회수된 BMP
평형 31, 32 유속 245cm/h
31, 32 전도도 ≤ 5mS/cm
31, 32 pH 7.4 ± 0.2
31, 32 부피 3CV
로딩 31, 32 유속 245cm/h
31, 32 pH 7.4 ± 0.2
31, 32 부피 800CV
31, 32 < 5
세척 31 유속 245cm/h
31 pH 8.9 ± 0.2 < 40
31 유속 245cm/h
32 pH 7.4 ± 0.2 < 10
용출 31, 32 유속 245cm/h
31, 32 pH 8.9 ± 0.2
31 4CV > 50
32 4CV > 80
31 RP-HPLC 순도 99%
31 응집체 5-15%
31 숙주 세포 단백질 < 20000 ppm
32 RP-HPLC 순도 99%
32 응집체 5-25%
32 숙주 세포 단백질 < 20000 ppm
실시예: 제2 용출액 가공
실시예 33
40mM 농도의 소듐 클로라이드를 얻기 위하여, 상기 양이온 교환 컬럼으로부터 얻은 제2 용출액을 5 부피의 주사용수로 희석하였다.
실시예 34
99%의 소듐 클로라이드를 제거하기 위하여, 상기 양이온 교환 컬럼으로부터 얻은 제2 용출액을 TFF 카세트 (cassette) (MWCO = 30000Da)로 투석여과하였다.
실시예 34의 실험 조건 요약
TFF 투석여과에 적용된 파라미터
실시예 파라미터 표적범위
34 가압 1.4 -1.6 bar
34 가압 농축액 0.8 -1.0 bar
34 가압 투과액 0.0 bar
34 TMP 1.0-1.3bar
34 유속 농축액 3.9 ± 0.2 L/h
34 유속 농축액 0.8 ± 0.1 L/h
실시예 35
약 60mM 농도의 소듐 클로라이드 및 70mM 농도의 아르기닌을 얻기 위하여, 상기 양이온 교환 컬럼으로부터 얻은 제2 용출액을 3.5 부피의 50mM TRIS pH 8.9 및 100mM 아르기닌으로 희석하였다.
실시예: 음이온 교환 컬럼
실시예 36
DEAE 세파로오스(Sepharose) (부피 = 5ml)는 3CV (컬럼 부피)의 50mM TRIS 버퍼 pH 8.9로 230cm/h에서 조절되었다. 실시예 33에서와 같이 가공된 제2 용출액을 230cm/h에서 로딩하였다. 이후 상기 컬럼을 230cm/h에서 평형 버퍼 (10CV)로 추가 세척하였다. 상기 산물을 50mM TRIS·HCl 버퍼 pH 8.9 및 150mM 소듐 클로라이드 (6CV)로 230cm/h에서 용출시켰다.
실시예 37
DEAE 세파로오스(Sepharose) (부피 = 5ml)는 3CV (컬럼 부피)의 50mM TRIS 버퍼 pH 8.9로 230cm/h에서 조절되었다. 실시예 33에서와 같이 가공된 제2 용출액을 230cm/h에서 로딩하였다. 이후 상기 컬럼을 230cm/h에서 평형 버퍼 (10CV)로 추가 세척하고 동일한 선형 유속에서 25mM 소듐 포스페이트 pH 7.4 (5CV)으로 세척하였다. 상기 산물을 25mM 소듐 포스페이트 pH 7.4 및 100mM 소듐 클로라이드 (6CV)로 230cm/h에서 용출시켰다.
실시예 38
DEAE 세파로오스(Sepharose) (부피 = 5ml)는 3CV (컬럼 부피)의 50mM TRIS 버퍼 pH 8.9로 230cm/h에서 조절되었다. 실시예 34에서와 같이 가공된 제2 용출액을 230cm/h에서 로딩하였다. 이후 상기 컬럼을 230cm/h에서 평형 버퍼 (10CV)로 추가 세척하였다. 상기 산물을 50mM TRIS·HCl 버퍼 pH 8.9 및 150mM 소듐 클로라이드 (6CV)로 230cm/h에서 용출시켰다.
실시예 36 내지 38에 적용된 파라미터의 요약
DEAE Sepharose 컬럼에 대해 적용된 파라미터
정제 공정 실시예 파라미터 표적 범위 % 회수된 BMP
평형 36, 37, 38 유속 230m/h
36, 37, 38 전도도 ≤ 10mS/cm
36, 38 pH 8.9 ± 0.2
37 pH 7.4 ± 0.2
36, 37, 38 부피 3CV
로딩 36, 37, 38 유속 230cm/h
36, 38 pH 8.9 ± 0.2
37 pH 7.4 ± 0.2
36, 37, 38 부피 15CV
36, 37, 38 < 5
세척 36, 37, 38 유속 230cm/h
36, 38 pH 8.9 ± 0.2 < 40
37 pH 7.4 ± 0.2
36, 37, 38 전도도 ≤ 5mS/cm < 10
용출 36, 37, 38 유속 230cm/h
36, 38 pH 8.9 ± 0.2
37 pH 7.4 ± 0.2
36, 37, 38 6CV
36 < 40
36 RP-HPLC 순도 99%
36 응집체 0-2%
36 숙주 세포 단백질 < 5000 ppm
37 < 40
37 RP-HPLC 순도 99%
37 응집체 0-2%
37 숙주 세포 단백질 < 5000 ppm
38 < 25
38 RP-HPLC 순도 99%
38 응집체 0-2%
38 숙주 세포 단백질 < 5000 ppm
실시예 39
CaptoQ는 3CV (컬럼 부피)의 50mM TRIS 버퍼 pH 8.9 및 100mM 아르기닌으로 245cm/h에서 조절되었다. 실시예 35에서와 같이 가공된 제2 용출액을 245cm/h에서 로딩하였다. 이후 상기 컬럼을 245cm/h에서 평형 버퍼 (10CV), 25mM 소듐 포스페이트 pH 7.4 (7CV), 25mM 소듐 포스페이트 pH 6.5 및 75mM 소듐 클로라이드 (7CV)로 추가 세척하고, 다시 25mM 소듐 포스페이트 pH 7.4 (7CV)로 세척하였다. 상기 산물을 PBS 1.5x 버퍼 pH 7.4 (5CV)로 245cm/h에서 용출시켰다.
실시예 39의 요약
captoQ 컬럼에 대해 적용된 파라미터
정제 공정 실시예 파라미터 표적 범위 % 회수된 BMP
평형 39 유속 230m/h
39 전도도 ≤ 10mS/cm
39 pH 8.9 ± 0.2
39 부피 3CV
로딩 39 유속 230cm/h
39 pH 8.9 ± 0.2
39 부피 15CV
39 < 5
세척 39 유속 230cm/h
50mM TRIS pH8.9, 100mM 아르기닌 39 pH 8.9 ± 0.2 < 1
25mM 소듐 포스페이트 pH7.4 39 pH 7.4 ± 0.2 < 1
25mM 소듐 포스페이트 pH7.4, 75mM NaCl 39 pH 6.5 ± 0.2 < 1
25mM 소듐 포스페이트 pH7.4 39 pH 7.4 ± 0.2 < 1
용출 39 유속 230cm/h
39 pH 7.4 ± 0.2
39 CV02: 0 내지 2 < 30
39 CV25: 2 내지 5 < 60
39 (CV02) RP-HPLC 순도 99%
39 (CV02) 응집체 0-5%
39 (CV02) 숙주 세포 단백질 < 25000 ppm
39 (CV25) RP-HPLC 순도 99%
39 (CV25) 응집체 0-1%
39 (CV25) 숙주 세포 단백질 < 5000 ppm

Claims (11)

  1. 분비된 TGF-β 슈퍼패밀리 단백질을 포함하는 제1 용출액을 수득하기 위하여, 분비된 TGF-β 슈퍼패밀리 단백질을 포함하는 용액을 소수성 전하 상호작용 크로마토그래피 (HCIC) 수지와 접촉시키는 단계 (i)을 포함하는, 분비된 TGF-β 슈퍼패밀리 단백질의 정제 방법.
  2. 제1항에 있어서, 분비된 TGF-β 슈퍼패밀리 단백질을 포함하는 제2 용출액을 수득하기 위하여, 분비된 TGF-β 슈퍼패밀리 단백질을 포함하는 상기 제1 용출액을 양이온 교환 크로마토그래피 수지와 접촉시키는 단계 (ii)를 추가로 포함하는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 정제된 분비된 TGF-β 슈퍼패밀리 단백질을 수득하기 위하여, 분비된 TGF-β 슈퍼패밀리 단백질을 포함하는 상기 제2 용출액을 음이온 교환 크로마토그래피 수지와 접촉시키는 단계 (iii)을 추가로 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분비된 TGF-β 슈퍼패밀리 단백질은 BMP, 바람직하게는 BMP-4인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HCIC 수지는 리간드로 n-헥실아민 (HEA) 또는 페닐프로필아민 (PPA) 또는 4-메르캅토-에틸-피리딘 (4-MEP)를 갖는 혼합-모드 수지인, 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 분비된 TGF-β 슈퍼패밀리 단백질을 포함하는 용액은, 원하는 단백질을 포함하고, 여과되고 pH 7.0 내지 9.5 및 NaCl 농도 250 내지 800mM로 조정된, 회수된 세포 배양 배지로부터 수득된 것인, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 세포는 포유류 세포인, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 분비된 TGF-β 슈퍼패밀리 단백질을 포함하는 제1 용출액은 용출 글리신 버퍼를 이용하여 HCIC 수지로부터 용출되는 것인, 방법.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 분비된 TGF-β 슈퍼패밀리 단백질을 포함하는 용액을 HCIC 수지에 로딩한 다음, 상기 HCIC 수지는 50mM 내지 250mM로 포함되는 농도의 중성 pH 6.5 내지 7.5의 세척 버퍼 (A)와 pH 3.0 내지 4.5의 세척 버퍼 (B)에 의해 각각 수행되는 적어도 2회의 세척 단계를 거치며, 용출 단계는 pH 2.5 내지 3.5에서 버퍼 농도 50mM 내지 200mM의 글리신 버퍼로 수행되는, 방법.
  10. 제2항에 있어서, 상기 양이온 교환 수지는 약한 양이온 교환 수지인, 방법.
  11. 제3항에 있어서, 상기 양이온 교환 수지는 강한 양이온 교환 수지인, 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6150328A (en) 1986-07-01 2000-11-21 Genetics Institute, Inc. BMP products
US5013649A (en) 1986-07-01 1991-05-07 Genetics Institute, Inc. DNA sequences encoding osteoinductive products
US5043431A (en) 1989-09-11 1991-08-27 Codon Method and apparatus for the production of TGF-β
BR9406715A (pt) 1993-05-12 1996-02-06 Genetics Inst Molécula de DNA isolada célula hospedeira vetor método para produzir uma proteina (BMP-11) polipeptideo de proteina-11 morfogenética de osso purificada (BMP-11) e molécula de DNA quimérica
DK0716610T3 (da) * 1993-08-26 2006-09-04 Genetics Inst Llc Humane knogle-morfogenetiske proteiner til anvendelse ved neural regenerering
US20030036629A1 (en) 1997-12-12 2003-02-20 Barry Foster Novel tgf-beta protein purification methods
US7208585B2 (en) * 2002-09-18 2007-04-24 Genencor International, Inc. Protein purification
KR100991203B1 (ko) 2010-05-10 2010-11-01 심영복 골형성 단백질의 정제 방법

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