[36] 이하, 본 발명의 특정 비제한적 양태 및/또는 구현형태를 상세하게 설명한다.
[37] 제1 양태로서, 본 발명은 임신여성에 수태된 태아의 염색체 이수성(chromosomal aneuploidy)을 검출하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은
(a) 모체에서 유래한 상이하게 메틸화된 DNA와 혼합된, 태아의 세포 및/또는 태아의 태반으로부터 유래된 DNA를 포함하는, 상기 임신여성으로부터 채취한 시료를 제공하는 단계;
(b) 메틸화 및 비메틸화된 DNA를 상이하게 변형(modify)시키는 시약으로 상기 시료에 존재하는 DNA를 처리하는 단계;
(c) 상기 시료에서 염색체 이수성과 관련된 염색체인 제1 표적 DNA 종(target species of DNA)의 양(amount)을 결정하되, 상기 염색체에 위치하는 둘 이상의 제1 표적의 상이한 메틸화 영역(제1 표적 DMR)에 메틸화가 존재하는지를 상기 시료에서 검출함으로써 결정하는 단계; 여기서, 상기 제1 표적 DMR은 태아의 세포 및/또는 태아의 태반에서 유래한 DNA와 모체 유래 DNA 간에 상이하게 메틸화된 영역이고, 제1 표적 DMR의 DNA의 상기 시약에 의한 변형은 DNA의 메틸화에 감응한다. 그리고 상기 제1 표적 DMR 중 하나 이상에서의 메틸화 DNA의 검출량은 상기 시료 내의 상기 제1 표적 DNA 종의 양을 나타낸다.
(d) 상기 시료에서 하나 이상의 기준 염색체인 기준 DNA 종의 양을 결정하되, 상기 기준 염색체(들)에 위치하는 둘 이상의 기준 DMR에 메틸화가 존재하는지를 상기 시료에서 검출함으로써 결정하는 단계; 여기서, 상기 기준 DMR은 태아의 세포 및/또는 태아의 태반에서 유래한 DNA와 모체 유래 DNA 간에 상이하게 메틸화된 영역이고 상기 기준 DMR의 DNA의 상기 시약에 의한 변형은 DNA의 메틸화에 감응한다. 그리고 상기 기준 DMR 중 하나 이상에서의 메틸화 DNA의 검출량은 상기 시료 내의 상기 기준 DNA 종의 양을 나타낸다.
(e) 단계 (c)에서 결정된 양과 단계 (d)에서 결정된 양의 상대적 양(들), 바람직하게는 비율(들)을 결정하는 단계; 여기서, 상기 하나 이상의 상대적 양(들)은 태아 내의 염색체 이수성의 존재 또는 부존재를 지시한다(indication).
상기 방법에서 바람직하게는, 단계 (c) 및 단계 (d)에서의 상기 검출은 상기 시료의 동일한 DNA 분취량(aliquot)을 사용하여, 그리고 동일 용기에서, 그리고 상기 제1 표적 DMR 및 상기 기준 DMR에 대해 유효하게 동시에 수행되며, 그리고 선택사항(옵션)으로서 (x) 상기 기준 DMR의 적어도 두 개에 대해 동일한 검출 표지(들)를 사용하여서 그리고/또는 (y) 상기 제1 표적 DMR의 적어도 두 개에 대해 상이한 검출 표지를 사용하여서 수행된다.
[38] 본 명세서에 사용된 용어들은 다른 명시가 없는 한 그들의 일반적인 의미로 이해되어야 한다. 여기서 사용된 용어 '포함하는'(comprising, comprising of)은 다른 구성요소들을 배제하지 않는다는 의미이다. 본 발명의 목적상, '구성되는'(consisting of)이라는 용어는 위 '포함하는'이라는 용어의 특정 구현형태로 간주한다. 이하에서 하나의 그룹이 특정 개수 이상의 구현형태를 포함하도록 정의된 경우에, 이는 또한 이들 구현형태 모두 그리고/또는 오직 이들 구현형태로만 구성되는 그룹을 개시한다는 것으로 이해해야 할 것이다. 본 명세서에서 사용된 '및/또는' 또는 '그리고/또는'은 어떠한 두 개의 특징 또는 구성요소의 어느 하나가 다른 하나와 함께 하거나 함께 하지 않는 것으로 취급되어야 한다. 예를 들어, 'A 및/또는(그리고/또는) B'는 (i) A, (ii) B, (iii) A 및 B와 같이 각각이 모두 개별적으로 개시된 것과 동일하게 취급된다. 본 발명의 맥락에서, '약(about)' 및 '대략(approximately)'은 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자(당업자)가 해당 특징의 기술적 효과의 보장을 위해서 이해할 정도의 정확도 간극을 나타낸다. 이 용어는 일반적으로, 예를 들어 ±20%, ±15%, ±10%, ±5%와 같이 적시된 수치값의 편차를 나타낸다. 특정 기술 효과에 대한 이러한 수치값의 특정 편차는 해당 기술 효과의 속성에 의존할 것임을 당업자는 알 것이다. 예를 들어, 자연 또는 생물에서의 기술 효과는 일반적으로, 인공적인 또는 엔지니어링적인 기술 효과의 편차보다 더 큰 편차를 가질 수 있다. 단수 명사 언급시에 부정관사 또는 정관사, 예를 들어 'a', 'an', 'the'를 사용한 경우에, 여기에는 특별히 명기되지 않은 한 해당 명사의 복수형도 포함된다.
[39] 본 발명의 특정 구현형태에서, '임신여성(pregnant female)'은 인간이거나 비인간 동물이며, 이 비인간 동물은 특정 구현형태에서 말, 양, 소, 돼지, 닭, 마우스, 및 랫으로 구성된 그룹 중에서 선택할 수 있다. 보다 구체적인 구현형태에서, 임신여성은 의학적 증상(예를 들어, 본 명세서에 개시된 하나 이상의 의학적 증상)을 앓고 있는 위험 또는 그 발병의 위험이 증가하는 것으로 의심될 수 있다. 이러한 본 발명 방법은 인간 또는 동물의 신체에서 실시하는 것으로 의도된 것은 아니다. 예를 들어, 체외(in-vitro) 방식으로도 실시할 수 있도록 의도된 것이다.
[40] 본 발명의 특정 구현형태에서, 전술한 DNA 종(species of DNA) 및/또는 상기 상이하게 메틸화된 DNA는 무세포 DNA이고, 특히 이 구현형태에서는 순환 무세포 DNA(circulating cell-free DNA)이다. 한 특정 구현형태에서, 상기 DNA 종 및 이와 혼합된 상이한 메틸화 DNA는 순환 무세포 DNA이다. '무세포 DNA'(cfDNA) 란 용어는 기술계에서 인정되어 있으며 개체의 체액(예를 들어, 혈액 또는 혈액성분)과 같이, 세포 밖에서 발견되는 DNA라는 의미를 포함한다. '순환(circulating)'도 또한 기술적으로 인정되는 용어이며, 개체의 순환계(혈액 시스템 또는 림프 시스템)에 실체 또는 물질(예를 들어, cfDNA)이 존재하거나 검출 또는 확인되거나 이로부터 분리되어 있다는 의미를 포함한다. 특히, cfDNA가 '순환'하는 경우에는 cfDNA가 세포 내에 위치하지 않고, 따라서, 혈장이나 혈청에 존재하거나 림프액의 림프 내에 존재할 수 있다.
[41] 용어 '상이한 메틸화 영역' 또는 'DMR(differentially(또는 differently) methylated region)'을 당업자는 알고 있을 것이며, 또한, 이 용어는 시료 내에 혼합된 상기 (태아의) DNA 종과 그 외 (모체의) DNA 간에 상이하게 메틸화된(예를 들어, CpG 모티프에서) 염색체 DNA 내의 영역을 의미하는 것으로 의도된 것이다. 예를 들어, 본 발명에서 DMR은 태아 및 모체 DNA 간에 상이하게 메틸화되는데, 본 발명의 특정 구현형태에서 DMR은 태아 DNA에서 과다 메틸화되고(hypermethylated) 모체 DNA에서는 저도 메틸화된다(hypomethylated). 즉, 이러한 영역에서 상기 (태아의) DNA 종에서의 메틸화 정도가 다른 (모체) DNA와 비교하여 더 큰데(즉, 더 높은데), 예를 들어, 주어진 DMR에서, 다른 (모체) DNA 내의 메틸화 가능 부위에 비교하여 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100% 이상의 해당 부위가 상기 (태아의) DNA 종에서 메틸화된다. 특정 구현형태에서, 상기 영역은 모체 DNA에서는 약 10% 미만 메틸화되고, 태아 DNA에서는 약 30% 초과(예를 들어, 약 50% 초과) 메틸화된다.
[42] 당업자가 이해할 수 있는 바, 용어 '양(amount)'은 농도, 게놈 당량, 몰수, 질량 등의 변수, 그리고 이들 변수의 대체값을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 아날로그 또는 디지털의 (계수) 정량화 기술로 생성된 것과 같은 (정량적인) 신호 또는 측정치도 또한 '양'으로 간주할 수 있다. 특히, 정량화 PCR(quantitative PCR)을 사용하는 본 발명 방법의 구현형태에서, '양'은 qPCR 장치에 의해 취합된 측정치, 예를 들어 Ct(Threshold cycle)로 나타낼 수 있다. 여기서 Ct는 qPCR로부터의 (형광) 신호가 문턱값을 넘어가는 싸이클(주기)의 수를 나타낸다. (Ct는 LightCycler에서 사용하는 용어로 Cp(크로스포인트 사이클(cross point cycle))라고도 부름) 당업자가 이해할 수 있는 바, 이 Ct(또는 Cp) 수는 정량화된 DNA 템플릿(예를 들어, 상이하게 메틸화된 DNA 종)의 초기 농도(양)와 역상관(inversely correlate)된다.
[43] 본 발명 방법의 단계 (e)에서, 단계 (c)에서 결정된 양과 단계 (d)에서 결정된 양의 상대적 양(relative amount)은 태아 내의 염색체 이수성(aneuploidy)의 존재 또는 부존재를 지시(indicate)한다. 예를 들어, 정배수체(euploid) 시료에서 예상되는 것에 비해 (염색체 이수성에 연관된 염색체인) (제1) 표적 DNA 종의 양이 과다하거나 또는 증가하였다는 것은(예를 들어 하나 이상의 기준 염색체인 기준 DNA 종과의 비교시) 이 표적 DNA 종의 양이 과다하게 존재한다는 것을 나타내고 이는 염색체 이수성에 연관된 염색체의 부분적인 또는 완전한 복사본(copy)이 태아에 있음을 나타낸다. 특히, 이러한 표적 DNA 종의 과다한 양은 인간의 21번 삼염색체(trisomy 21; T21)와 같은 부분적인 또는 완전한 삼염색체를 지시하는 것일 수 있다. 이에 대조적인 예로, 정배수체 시료에서 예상되는 것에 비해 (염색체 이수성에 연관된 염색체인) (제1) 표적 DNA 종의 양이 결핍되거나 또는 감소하였다는 것은(예를 들어 하나 이상의 기준 염색체인 기준 DNA 종의 양과 비교시) 이 표적 DNA 종의 양이 줄어들어 존재한다는 것을 보여주고 이는 염색체 이수성에 연관된 염색체의 적어도 하나의 복사본(copy)의 전부 또는 일부가 태아에 존재하지 않음을 나타낸다. 특히, 표적 DNA 종의 이러한 감소된 양은 터너증후군(45,X)과 같은 부분적 또는 완전한 염색체 손실(예를 들어, 단염색체(monosomy))을 나타낼 수 있다.
[44] 단계 (c)에서 결정된 양 및 단계 (d)에서 결정된 양은 이론적 측면에서 비교할 수 있다. 예를 들어, 인간 삼염색체(예를 들어, T21, T18, 및/또는 T13)의 경우 제1 표적 DNA 종(염색체 이수성과 관련된 염색체임)의 양은 이론적으로 기준 DNA 종(하나 이상의 기준 염색체)의 양에 대해 3:2의 비율을 갖는다. 그러나 표적 염색체 및/또는 기준 염색체의 상이한 영역(및/또는 DMR)에 대한 검출 감도 및 정량화의 차이로 인해, 이러한 이론적 비율은 실제로 일어나지 않을 수도 있다. 따라서, 단계 (c)에서 결정된 양이 단계 (d)에서 결정된 양과 동등(equvalent)하지 않은 경우에 태아에 염색체 이수성이 존재함이 지시될 수 있는데, 이 경우 양이 동등하다고 하여 동일한 값을 가짐을 의미하는 것은 아니다. 실제로, 태아 내의 염색체 이수성의 존재는, 정수배체 태아에 대해서 예상되는 양(가령, 단계 (d)에서 결정된 양)과 단계 (c)에서 결정된 양의 차이, 왜곡, 또는 그 밖의 편차에 의해서도 지시될 수 있는 것이다.
[45] 당업자가 알 수 있듯이, 태아에의 염색체 이수성의 존재(또는 부존재)를 모든 상황 또는 시료에서 명확하게 지시하는 것이 가능하지 않을 수도 있다. 따라서, 본 발명은 또한, 단계 (e)에서 태아 내의 염색체 이수성의 존재(또는 부존재)를 지시하는 것이 결정적인 것이 아닌, 있을 법한 또는 가능성 있는 존재(또는 부존재)를 지시하는 방법을 상정하고자 한다. 이렇게 상정되는 본 방법은, 더 확실하거나 신뢰성있거나 결정적인 진단 결과를 얻기 위해 추가 진단 검사를 수행하기 위한 신호전송 또는 플래그설정 단계를 추가로 포함하는 구현형태를 포함한다. 이러한 후속 검사는 태아의 이수성 검출을 위한 다른 NIPT(실시예 1에 기재된 바와 같은 NGS 기반의 NIPT)를 포함하거나 CVS 또는 양수천자를 포함할 수 있다.
[46] 본 발명 방법의 특정 구현형태에서, 단계 (c) 및 단계 (d)에서의 상기 검출은 (x) 적어도 두 개의 상기 기준 DMR에 대해 동일한 검출 표지(들)를 사용하여서 그리고 (y) 적어도 두 개의 상기 제1 표적 DMR에 대해 상이한 검출 표지를 사용하여서 수행된다. 특히 이 구현형태에서, 단계 (c) 및 단계 (d)에서의 상기 검출은 (x) 상기 적어도 두 개의 기준 DMR의 각각에 대해 동일한 검출 표지(들)를 사용하여서 그리고 (y) 상기 적어도 두 개의 제1 표적 DMR에 대해 상이한 검출 표지를 사용하여서 수행된다.
[47] 위와 같은 본 발명 방법의 대안적 구현형태로서, 단계 (c) 및 단계 (d)에서의 상기 검출은 (x) 적어도 두 개의 상기 제1 표적 DMR에 대해 동일한 검출 표지(들)를 사용하여서 그리고 (y) 적어도 두 개의 상기 기준 DMR에 대해 상이한 검출 표지를 사용하여서 수행된다. 특히 이 구현형태에서, 단계 (c) 및 단계 (d)에서의 상기 검출은 (x) 상기 적어도 두 개의 제1 표적 DMR의 각각에 대해 동일한 검출 표지(들)를 사용하여서 그리고 (y) 상기 적어도 두 개의 기준 DMR에 대해 상이한 검출 표지를 사용하여서 수행된다.
[48] 위와 같은 본 발명 방법의 다른 대안적 구현형태에서, 단계 (c) 및 단계 (d)에서의 상기 검출은 (x) 적어도 두 개의 상기 기준 DMR에 대해(바람직하게는 각각에 대해) 동일한 검출 표지(들)를 사용하여서 그리고 (y) 적어도 두 개의 상기 제1 표적 DMR에 대해(바람직하게는 각각에 대해) 동일한 검출 표지를 사용하여서 수행된다. 여기서 (x)에 사용된 검출 표지(들)는 (y)에 사용된 검출 표지(들)와 상이하다.
[49] 위와 같은 본 발명 방법의 또다른 대안적 구현형태에서, 단계 (c) 및 단계 (d)에서의 상기 검출은 (x) 적어도 두 개의 상기 제1 표적 DMR에 대해(바람직하게는 각각에 대해) 상이한 검출 표지(들)를 사용하여서 그리고/또는 (y) 적어도 두 개의 상기 기준 DMR에 대해(바람직하게는 각각에 대해) 상이한 검출 표지를 사용하여서 수행된다.
[50] 특정 구현형태에서, 상이한 검출 표지(들)는, 기준 DMR에 대해 사용되는 것처럼 ― 만일 본 방법에 OR(들)이 이용되는 경우에는, 이 OR(들)에 대해 사용되는 것처럼 ― 상기 제1 표적 DMR에 대해 사용된다.
[51] 본 발명의 특정 구현형태에서, 단계 (c)에서는 2개보다 많은 제1 표적 DMR이 이용될 수 있다. 예를 들어, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 9개보다 많은 제1 표적 DMR을 이용할 수 있다(예를 들어, 약 10개, 15개, 20개, 30개, 50개, 또는 50개보다 많은 제1 표적 DMR). 적어도 2개의 상기 제1 표적 DMR에 대해 상이한 검출 표지(들)가 사용되는 발명의 구현형태들에서는, 하나 이상의(바람직하게는 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 5개 초과의) 다른 제1 표적 DMR을 다른 검출 표지(들)를 사용하여 검출할 수 있다. 이와 다른 대안적 구현형태에서는, 적어도 2개의 상기 제1 표적 DMR에 대해서는 상이한 검출 표지(들)를 사용하고, 하나 이상의(바람직하게는 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개의, 또는 8개 초과의) 다른 제1 표적 DMR에 대해서는 상기 두 개의 제1 표적 DMR 중 하나에 대해 동일한 검출 표지(들)를 사용할 수 있다. 예를 들어, 2개의 제1 표적 DMR에는 동일한 검출 표지(들)를 사용할 수 있고, 2개의 다른 제1 표적 DMR에는 상이한 검출 표지(들)를 사용할 수 있다. 이러한 구현형태는 검출 표지(들)를 추가하지 않고도 특정도와 감도를 더 증가시킬 수 있으며, 표지 개수를 다중 채널 검출 장비의 주어진 비용 및 기술적 요구 그리고 예를 들어 형광 표지의 경우의 검출 스펙트럼 및 탈색의 중첩을 실제적으로 제한할 수 있어서, 본 발명에 추가적인 이점을 제공할 수 있다.
[52] 본 발명에서는, 메틸화되지 않은 DNA에 비해 메틸화된 DNA를 상이하게(예를 들어, 선택적으로) 변형(modify)시키는 시약이 사용된다. 예를 들어, 바이설파이트(bisulphite 또는 bisulfite)가 포함된 시약으로 DNA를 처리하여 시토신 잔기(cytosine residues)를 우라실로 전환시키되, 5-메틸시토신 잔기에는 영향을 주지 않도록 한다. 따라서, 바이설파이트 처리는 개별적인 시토신 잔기의 메틸화 상태에 의존하는 DNA 서열에서의 특이적인 변화를 유도하고, 이로써 DNA 세그먼트의 메틸화 상태에 관한 단일 뉴클레오티드 해상도 정보를 낳게 한다. 이 정보를 검색하기 위해 변경된 서열에 대한 다양한 분석(상기 단일 뉴클레오티드의 변화를 구별할 수 있는 PCR 프라이머 및/또는 프로브의 사용이 포함됨)을 수행할 수 있다.
[53] 이러한 시약은 대안적으로(또는 부가적으로) DNA 메틸화의 상태에 감응성있는 제한효소를 포함할 수 있다. 이러한 제한효소의 인식 서열(recognition sequence)의 분할(cleavage)은 효소의 인식 부위의 특정 염기가 변형될 때(예를 들어, 메틸화) 차단(block)되거나 손상(impair)될 수 있다. 본 발명의 모든 양태의 특정 구현형태에서, 시약은 본 명세서에 개시된 메틸화에 감응하는(methylation-sensitive) 제한효소와 같은 메틸화 감응성 제한효소를 포함한다. 본 발명에는 이러한 메틸화 감응성 제한효소를 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상 포함하는 구현형태가 포함된다.
[54] 단계 (b) 이전에, 시료 내 존재하는 DNA를 분리, 농축, 및/또는 정제하기 위해 시료 가공이 이루어질 수 있다. 예를 들어, 혈장 시료를 cfDNA 분리 공정 또는 키트를 사용해 처리하여서 전술한 DNA 종과 태아 및/또는 태아의 태반에서 온 것이 아닌 (예를 들어, 모체 유래의) 상이한 메틸화 DNA의 혼합물을 포함하는 (비자연적인) 후속 용액을 만들 수 있다. (b)의 처리 단계는 상기 시약(예를 들어, 메틸화 감응성 제한효소)을 포함하는 별도의 용액을, 시료의 혼합된 DNA(예를 들어, 상기 혼합된 DNA를 포함하는 비자연적 용액)에 첨가하는 단계를 포함할 수 있으며, 그리고/또는 특정 상태를 유지(또는 특정 상태로 변경)하는 것을 포함할 수 있다. 특히, 상기 시약이 하나 이상의 메틸화 감응성 제한효소를 포함하는 경우, (b)에서의 처리 단계는 DNA 및 효소를 함께 약 37℃에서 약 5분 내지 300분 동안, 가령, 약 30분 내지 90분(또는 60분) 동안 인큐베이팅하는 것을 포함할 수 있다. 그리고, 선택적 임의사항으로서, 효소(들)를 비활성화시키기 위해 더 고온(예를 들어, 약 50℃ 내지 90℃, 예컨대 약 80℃)에서 상기 혼합물을 인큐베이팅하는 것을 포함한다. 특정 구현형태에서, (b)의 처리 단계에서 형성된 조성물은 비자연적으로 형성될 수 있다. 예를 들어, 용액(또는 완충액)의 성분 중의 특정 염 및/또는 하나 이상의 세균 유래 제한효소(또는 그의 비자연적 돌연변이체)와 cfDNA(예를 들어 인간의)의 혼합물은 비자연적 조성물 또는 혼합물일 수 있다. 또한, 본 발명 방법들 중 어느 하나는 체외에서 생성된 핵산 분자, 예를 들어 PCR 반응의 DNA 산물(예를 들어, 'PCR 산물')을 생산할 수 있다(따라서 본 발명의 조성물은 상기 체외에서 생성된 핵산 분자를 포함할 수 있다). 상기 체외에서 생성된 핵산 분자 중 하나 이상은, 적어도 하나의 검출 표지를 포함하는 뉴클레오티드 프라이머 및/또는 프로브를 포함하기 때문에 비자연적일 수 있는데, 여기서, 상기 핵산 분자는 상기 표지처리된 프라이머 및/또는 프로브의 폴리머라제 확장(또는 부분적 핵산 분해(partial nuclease digestion))에 의해 생성된 것으로, 검출 표지를 포함하는 상기 핵산 분자의 적어도 일부분을 제공한다. 이로써 핵산 분자의 핵산 서열이 자연적으로 발생된 서열(또는 그 단편)일지라도, 상기 체외 생성 핵산 분자는 여기에 포함된 (적어도) 비자연적인 검출 표지로 인해서 비자연적이다. 특정 구현형태에서, 단계 (b) 전에, 상기 임신여성으로부터 채취한 시료를 처리하여 상기 시료에 존재하는 DNA를 추출할 수 있다. 예를 들어, 이 처리 단계에서는 상기 시료로부터 전체 무세포 DNA를 추출할 수 있거나, 또는 상기 처리 단계는 태아 무세포 DNA를 추출 및/또는 농축할 수 있다.
[55] 본 발명 방법의 특정 구현형태들에서, 단계 (e)에서 결정된 상대적 양(들) 또는 비율(들)은 임계값(들) 및/또는 기준 분포(들)와 비교되는데, 여기서 상기 임계값 및/또는 기준 분포(들)보다 높거나 낮은 하나 이상의(바람직하게는 둘 이상의) 상기 상대적 양(들) 또는 비율(들)은 태아 내의 염색체 이수성의 존재를 지시한다. 상기 임계값(들) 및/또는 기준 분포(들)는 대조 시료 연구 등 선행 연구로부터 얻거나, 본 발명 방법에 의해 분석된 다수의 시료로부터 생성가능하다. 예를 들어, 다수의 다른 시료들(가령, 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 90, 100, 120, 150, 175, 200, 250, 500개, 또는 500개 초과의 시료, 특히 약 60개의 시료, 더 특별히는 500개 이상의 시료)을 분석하여 하나 또는 다른 개별 시료가 단계 (c)로부터 결정된 양 또는 (e)로부터 결정된 상대적 양이 다른 대부분의 시료들로부터의 유사한 양의 모집단에 대하여 이탈값(outlier)을 보이면, 이는 각 시료가 채취된 임신여성이 수태한 태아가 염색체 이수성을 가지고 있음을 나타내는 것이다. 전술한 바와 같이, 단계 (e)에서 결정된 상대적 양(들) 또는 비율(들)을 임계값(들) 및/또는 기준 분포(들)와 비교하더라도, 태아 내의 염색체 이수성의 존재(또는 부존재)가 모든 상황이나 모든 시료에서 명확하게 지시될 수 있는 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 상기 구현형태들에서는 또한, 염색체 이수성의 존재(또는 부존재)를 명확하게 지시하기 보다는 있을 법한 또는 가능성 있는 존재(또는 부존재)를 지시하는 구현형태가 포함된다. 여기에는 더 확실하거나 명확한 진단 결과를 내기 위해 추가적인 진단 검사를 수행하는 신호전송(signalling) 또는 플래그설정(flagging) 단계를 추가로 포함하는 구현형태가 포함된다. 이러한 추가적 진단 검사는 실시예 1에 기재된 바와 같은 NGS 기반의 NIPT와 같이 본 명세서의 다른 곳에서 설명하고 있다.
[56] 이에 대신하여 또는 부가적으로, 염색체 이수성이 태아에 존재함의 지시(indication)는 (i) 기준 DNA 종의 양(예를 들어, 기준 DMR에서 결정된 양)을 나타내는 척도 또는 신호와 관련하여 예상되는 양 대비, 제1 표적 DNA 종의 양(예를 들어, 하나의 제1 표적 DMR 또는 다른 제1 표적 DMR로부터 결정된 양)을 나타내는 척도 또는 신호의 증가(또는 감소)를 고려하여서, 그리고/또는 (ⅱ) 시료에서 결정된 제1 표적 DNA 종의 양(예를 들어, 예를 들어, 기준 분포를 고려하여서 하나의 제1 표적 DMR 또는 다른 제1 표적 DMR로부터 결정된 양)이 감소하였는지를 판단해서 평가할 수 있다.
[57] 특정 구현형태에서, 임계값(들)은 표준 대조군을 이용해 설정할 수 있다. 예를 들어, 기지의 알고 있는 시료(또는 다수의 기지의 시료들)로부터 한 번의(또는 개별적인) 실험을 통해 설정할 수 있으며, 그리고/또는 임계값(들)은 피검 시료(또는 피검 시료들)와 대략 동일한 시간에, (예컨대, 하나의 시료 또는 다수의 기지의 시료들로부터) 설정할 수 있다. 예를 들어, 이러한 임계값(들)의 설정은 동일한 실행(run)에서 가능한데, 구체적으로, 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)의 웰에 시료를 담을 때 하나 이상의 기지의 시료는 하나 이상의(별개의) 웰(well)에 담고 하나 이상의 피검 시료는 다른 웰에 담아서 본 발명 방법을 실시함으로써 가능하다. 본 발명의 다른 구현형태에서, 임계값의 양 및/또는 기준 분포 양과의 비교는 기준 DNA 종(즉, 기준 염색체)의 양에 대한 제1 표적 (또는 제2 표적) DNA 종(즉, 염색체 이수성에 관련된 염색체)의 상대적 양(가령, 비율)으로 얻어진다. 예를 들어, 이론적인 관점에서 볼 때 인간 염색체 21번의 정상적인 이배체(diploid) 군에서 유래한 제1 표적 DNA 종의 양은, 예를 들어 염색체 2번의 기준(이배체) 군에서 유래한 기준 DNA 종의 양에 대해 약 2:2(즉, 1:1)의 비율을 나타낼 것으로 예상된다. 그러나 21번 삼염색체의 경우에 상기 비율은 약 3:2일 것으로 예상된다. 당업자라면 이제 이해할 수 있는 바, 다른 염색체(또는 부분 염색체) 이수성은, 완전한 염색체 손실의 경우에는, 또는 제2 DNA 종의 위치를 포함하는 기준 염색체에 비해 제1 DNA 종의 위치가 부분적으로 삭제되는 부분 손실의 경우에는, 다른 이론비, 가령 1:2를 보일 것으로 예상된다. 특정 구현형태에서, 예를 들어 메틸화의 차이로 인해 상이하게 되지 않는 한, 이수성의 태아 cfDNA와 혼합된 정배수성의 모체 cfDNA와 같은 다른 DNA의 존재(즉, 다른 DNA와의 혼합물에서의 존재)는, (정배수성의) 모체 cfDNA와 (이수성의) 태아 cfDNA의 상대적 양에 따라 상기 비율을 변형시키는 결과를 낳을 수 있다. 당업자가 또한 이해할 수 있는 바, 상기 비율 변형은 각 앰플리콘(amplicon)의 상대적 반응(예를 들어, PCR 반응) 효율과 같은 다른 요인으로부터 일어날 수도 있다. 따라서, 상기 특정 구현형태에서, 임계값은 약 3:2(150%), 약 2:3(66%), 약 1:2(50%), 또는 약 2:1(200%) 등과 같이 (검출가능하게 그리고/또는 중요하게) 2:2(100%)보다 크거나 작은 비율이며, 또한, 이 구현형태에는, 약 200% 초과의, 약 50% 미만의, 또는 약 190%, 180%, 170%, 160%, 150%, 140%, 130%, 120%, 110%, 105%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 및 55% 중에서 선택된 하나의 임계값 및/또는 비율이 포함된다. 대안적으로, 특정 구현형태에서, 임계값은 터너증후군(완전 정배수성 '46,XX' 핵형보다는 '45,X' 핵형을 갖는 인간 여성)에서와 같이 오직 제1 표적(또는 제2 표적) DNA 종의 검출 가능한 양이 존재하지 않는 것으로써만 결정할 수도 있다. 그러나, 전술한 바와 같이, 표적 염색체 및/또는 기준 염색체(및/또는 DMR)의 상이한 영역에 대한 검출 감도 및 정량화의 차이인 상기 이론적 비율은 실제로는 일어날 수 없다. 따라서, 태아에서의 염색체 이수성의 존재는, 단계 (c)에서 결정된 양이 단계 (d)에서 결정된 양과 동등하지 않은 경우에 지시될 수 있다. 여기서, 상기 양의 동등성은 동일한 값을 갖는다는 것을 의미하는 것이 아니다. 실제로, 태아에서의 염색체 이수성의 존재는, 이수성 태아에게서 예상되는 양(가령, 단계 (d)에서 결정된 양으로부터 예상되는 양)과 비교하여 단계 (c)에서 결정된 양의 차이, 왜곡, 또는 다른 편차에 의해 지시될 수 있다.
[58] 특정 구현형태에서는, 평균, 중앙값, 표준 편차, 중앙 절대 편차, 또는 z-스코어 등의 파라미터가 각 실행, 플레이트, 또는 검출/분석 데이터 세트 내에서 일군의 시료에 대해서 계산된다. 이러한 특정 구현형태에서, 이와 같이 계산된 파라미터는 상기 실행, 플레이트, 또는 데이터 세트에서 검출/분석(예를 들어, '실행 특화(run-specific)' 분석)된 해당 피검 시료로부터 이탈값(outlier)(예를 들어, 삼염색체 시료)를 식별하는 데 사용된다. 특정 구현형태에서, 이러한 파라미터는 임의의 이탈값의 식별에 관한 지식없이 모든 피검 시료로부터 계산된다(예를 들어, '마스크(masked)' 분석). 다른 특정 구현형태에서, 이러한 파라미터는 (이탈값이 없는) 표준으로 알고 있는 기준 시료(예를 들어, 이수성 태아로부터의 cfDNA를 함유하는 것으로 알고 있는 시료) 또한 이러한 표준으로 추측되는(또는 아닐 수도 있는) 피검 시료들의 세트로부터 계산된다.
[59] 시료 분포와 기준 분포 간의 차이, 또는 기준 분포로부터의 이탈값(outlier)을 비교 및 검출하는 것은 당업자에게 알려져 있을 것이고, (one-tailed 또는 two-tailed의) t-테스트, Mann-Whitney Rank Sum 테스트, 및 기타 테스트(중앙 절대 편차 기반 z스코어(가령, Stumm 외 2014, Prenat Diagn 34:185에서 사용한 것)와 같은 z스코어의 사용이 포함됨). 본 발명의 특정 구현형태에서, 분포를 기준 분포와 비교(또는 기준분포로부터의 이탈값과 비교) 할 때에, 평균, 중앙값, 또는 개별 시료의 분리(separatiopn)가 기준 분포의 표준 분포(SD: standard distribution)보다 약 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 1.95, 1.97, 2.0보다 크거나 2.0을 초과하는 경우에, 그리고/또는 개별 시료가 기준 분포로부터 약 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.5, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.5, 3.75, 4.0, 4.5, 5.0보다 크거나 약 5.0을 초과하는 z스코어로 분리되는 경우에 이 비교결과가 판정된다(그리고/또는 현저하게 다르다고 확인된다).
[60] 특정 구현형태에서, 데이터 세트의 맥락에서 z스코어(또는 파라미터 반복의 분포패턴에 기초한 동등한 통계치)는 이탈값 데이터의 포인트(들)(예를 들어, 자간전증(preeclampsia)을 앓고 있는 또는 발병할 위험이 증가할 것으로 예상되는 임신여성을 식별하기 위한 검사의 경우에서와 같이 DNA 종의 양이 과다한 것을 나타내거나, 염색체 이수성을 갖는 태아를 식별하기 위한 검사의 경우에서와 같이 기준 염색체를 넘는 과다한 양의 염색체를 나타내는 데이터)를 확인하기 위해 계산될 수 있다. 데이터 세트로부터 상기 데이터 포인트(표시점)를 제외시키고 나서 이 데이터 세트에 대해서 후속적으로 z스코어 분석을 행하여 추가 이탈값을 찾는다. 이러한 반복적인 z스코어 분석은, 때로는 한 번의 실행에서 2개 이상의 이수성 시료를 취급시에 단일의 z스코어 분석 결과를 왜곡할 수 있고/또는 거짓양성(false positive)을 확인하기 위해 추적 검사가 가능하며 따라서 거짓음성을 회피하는 것이 (초기의) 거짓양성을 식별하는 것보다 잠재적으로 더 중요한 본 발명 방법을 이용하여 태아 염색체 이수성을 검출하는 데 특히 유용할 수 있다.
[61] 본 발명 방법의 실시는 제1 (또는 제2) 표적 DNA 종(예를 들어, 인간의 21번 염색체와 같이 염색체 이수성과 관련된 염색체 또는 그의 일부로부터의)과 기준 DNA 종(예를 들어, 12번, 5번, 또는 2번 염색체와 같은 기준 염색체 또는 그 일부로부터의)의 상대적 검출(또는 양 측정)을 가능하게 하며, 따라서, 태아의 염색체 이수성의 신속하고 간단하며 비용효율적인 검출, 식별, 또는 진단을 돕는다. 이 접근법은, 예를 들어 비교적 간단하고 신뢰성 있고 비용효율적인 qPCR 장비를 필요로 하며 비싸고 전문적인 고처리량의 차세대 시퀀싱 머신을 필요로 하지 않는 많은 실험실에서 더 용이하게 구축하고 실시할 수 있다. 실제로, 본 발명의 이러한 특정 구현형태에서, 상기 제1 표적 DMR의 단계 (c)에서의 검출 및 전술한 기준 DMR의 단계 (d)에서의 검출은, 상기 시료의 동일한 분취량의 DNA를 사용하여 그리고 동일한 반응/검출 용기에서, 그리고 상기 DMR에 대하여 유효하게 동시에 이루어지며, (x) 상기 기준 DMR 2개 이상에 대해 (바람직하게는 각각에 대해) 동일한 검출 표지(들)를 사용하고, (y) 상기 제1 표적 DMR 2개 이상에 대해 (바람직하게는 각각에 대해) 상이한 검출 표지(들)를 사용하여 이루어진다. 이들 구현형태에서 (표적 DMR 및 기준 DMR을 통하여) 제1 (또는 제2) 표적 DNA 종 및 기준 DNA 종을 상대적 검출, 식별, 또는 정량화는 것은, 동일한 반응/검출 용기에서 유효하게 동시에 실시되며, 유리하게는, 기준 DMR로부터 적어도 두 개의 제1 (또는 제2) 표적 DMR을 구별할 수 있는 검출 표지(들)를 사용하여 실시되고, 만일 옵션 단계 (f)가 적용된다면 이 단계에서 검출된 상응하는 OR들을 이용하여 실시된다. 상기 구현형태의 또다른 구현형태에서, 검출 단계 (c) 및 (d)는 동일한 반응/검출 용기에서 효율적으로 동시에 수행되며, 단계 (c)에서의 상기 검출 및 단계 (d)에서의 상기 검출은 다중형(멀티플렉스)의 실시간 정량적 프로브 기반 PCR을 써서 상기 DMR들 각각에 대해 특화된 적어도 하나의 표지처리된 프로브(및 OR 이용시에는 각 OR)를 사용하여 이루어진다.
[62] 본 발명의 모든 양태에는, 염색체 이수성의 존재가 태아 이상 및/또는 선천적 장애와 관련된 염색체 이상에 대한 이수성의 전부 또는 일부인 경우의 구현형태들이 포함된다. 예를 들어, 이러한 염색체 이상은 삼염색체(trisomy 21, trisomy 18, 또는 trisomy 13 등), 성염색체 이상(터너증후군, 클라인펠터 증후군, 누난 증후군, 트리플 X 증후군, XXY 증후군, 또는 취약한 X 증후군 또는 XYY 증후군 또는 XXYY 증후군 등), 염색체 결실(Prader-Willi 증후군, Cris-du-Chat 증후군, Wolf-Hirschhorn 증후군, 또는 22qll 결실 증후군, Duchene 근이영양증 등), Beckwith-Wiedemann 증후군, Canvan 증후군, 및 신경 섬유종증 중에서 선택된 하나일 수 있다. 이러한 이상의 확산 및 그에 따른 의학적, 사회적 중요성 측면에서 염색체 이상은, trisomy 21, trisomy 18, 또는 trisomy 13과 같은 삼염색체이다.
[63] 본 발명의 임신여성이 인간인 구현형태에서, 염색체 이수성과 관련된 염색체는 21번 염색체, 18번 염색체, 13번 염색체, X 염색체, 및 Y 염색체로 구성된 목록, 바람직하게는 21번 염색체, 18번 염색체, 13번 염색체로 구성된 목록에서 선택된 인간 염색체일 수 있다. 특히, 이들 구현형태에서 염색체 이수성과 관련된 염색체는 인간의 21번 염색체이다. 이러한 구현형태 중 특정의 것에서, 상기 염색체 이수성은 상기 염색체의 이(배)수체일 수 있다. 본 발명의 모든 양태에서, 염색체 이수성은 상기 염색체의 단염색체(monosomy) 또는 삼염색체(trisomy)인데, 이는, 당업자에게 공지되어 있겠지만, 상기 염색체의 부분적인 또는 완전한 단염색체 또는 삼염색체 같은 부분 이수성 또는 완전 이수성일 수 있다. 여기서 '부분' 이수성은 염색체의 일부분의 손실 또는 증가로 인한 유전 물질의 불균형이라는 의미를 포함한다. 예를 들어, 부분 이수성은 개체가 두 개의 다른 염색체의 파손과 융합을 통해 형성된 파생 염색체를 가지고 있는 불균형 전위(unbalanced translocation) 상황을 포함할 수 있다. 이 예에서 개체는 한 염색체의 일부의 복사본 3개(2본의 정상 복사본, 1본의 파생 염색체에 존재하는 부분)와, 파생 염색체에 포함된 다른 염색체의 부분에 대한 복사본 1개만 가질 수 있다.
[64] 이에 따라, 임신여성이 인간인 구현형태에서, 하나 이상의 기준 염색체(들)는 인간 염색체 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12번, 인간 염색체 14, 15, 16, 17번, 인간 염색체 19번, 인간 염색체 20번, 인간 염색체 22번, 및 인간 염색체 23번으로 구성된 목록에서 선택된 하나일 수 있다. 이 구현형태에서는 특히, 기준 염색체는 인간 염색체 5번 또는 인간 염색체 12번이다.
[65] 본 발명의 특정 구현형태에서, 상기 2개 이상의 기준 DMR은 상이한 기준 염색체에 위치한다. 예를 들어, 특정 구현형태에서, 상기 기준 DMR 중 하나는 인간 염색체 5번에 위치하고, 상기 기준 DMR의 다른 하나는 인간 염색체 12번에 위치한다.
[66] 그러나, 기준 염색체로서 사용되는 염색체 중 하나(또는 그 이상)의 염색체가 염색체 이수성과 관련될 수 있는 염색체이지만 염색체 이수성과 관련된 염색체와는 상이한 염색체인 구현형태도 본 검출 방법이 적용되는 경우에 본 발명의 범위 내에 포함된다. 예를 들어, 임신한 인간 여성에 의해 임신된 태아에서 21번 삼염색체를 검출하기 위해 본 발명 방법을 실시한다면, 예를 들어 인간 18번 염색체 또는 인간 13번 염색체, 특히 13번 염색체를 '기준' 염색체로 사용할 수 있다. 이러한 예에서, 태아가 21번 삼염색체와 13번 삼염색체 모두를 가지고 있을 가능성을 무시할 만하다면, 염색체 13번에 비해 염색체 21번이 과다하다는 것은 21번 염색체의 삼염색체를 나타내는 것일 것이다. 마찬가지로, 동일한 검사법을 사용하지만 대신에 13번 염색체가 본 검출 방법이 적용되는 염색체 이수성에 관련된 염색체인 것이라고 하면, 염색체 21번에 비해 13번 염색체가 과다하면(이는 염색체 13에 비하여 21번 염색체가 감소된 것과 동등함) 13번 염색체의 삼염색체를 나타내는 것이 될 것이다. 이러한 '기준' 염색체의 선택 및 본 발명 방법의 실행/고려는, 단일 분석에서의 염색체 이수성에 관련된 2 이상의 염색체에서 이수성이 존재(또는 부존재)하는지를 검출할 수 있는 가능성을 제공하는 특별한 이점을 갖게 될 것이다. 이러한 분석은 시간과 비용을 절약할 뿐만 아니라 하나의 시료에서 2 이상의 염색체 이수성의 존재를 검출할 수 있도록 할 것이다. 이에, 모체 시료에 일반적으로 존재하는 비교적 낮은 수준의 태아 유래 DNA가 주어지면, 임신여성에게서 시료를 채취하는 횟수를 줄이거나 더 적은 시료를 필요로 할 수 있게 될 것이다.
[67] 특정 구현형태에서, 본 발명 방법은 다음의 단계를 더 포함한다.
(f) 태아의 세포 및/또는 태아의 태반으로부터 온(유래된) DNA와 모체 유래의 DNA 간에 상이하게 메틸화되지 않은 적어도 하나의 타영역(OR: other region)을 검출함으로써 상기 시료에서 전체 DNA의 양을 결정하는 단계 ― 여기서 상기 시약에 의한 OR(들)의 변형은 DNA의 메틸화에 감응성이 없음.
여기서 바람직하게는 단계 (c) 및 단계 (d) 및 단계 (f)에서의 상기 검출은 상기 시료의 동일한 분취량의 DNA를 사용하여 그리고 동일한 용기에서, 그리고 상기 기준 DMR 및 상기 타영역에 대하여 유효하게 동시에 실시되며, 한 구현형태에서는, (x) 상기 기준 DMR 2개 이상에 대해 (바람직하게는 각각에 대해) 동일한 검출 표지(들)를 사용하고, 그리고/또는 (y) 상기 제1 표적 DMR 2개 이상에 대해 (바람직하게는 각각에 대해) 그리고 상기 OR(들) 하나 이상에 대해 (바람직하게는 각각에 대해) 상이한 검출 표지(들)를 사용하여 실시된다. 다른 대안적 실시예에서, 단계 (c) 및 단계 (d) 및 단계 (f)에서의 검출은 상기 기준 DMR의 2개 이상에 대해 (바람직하게는 각각에 대해), 상기 제1 표적 DMR의 2개 이상에 대해 (바람직하게는 각각에 대해), 그리고 상기 OR(들) 하나 이상에 대해 (바람직하게는 각각에 대해) 상이한 검출 표지(들)를 사용하여 실시될 수 있다.
[68] 본 발명에서 OR이 이용되는 경우에는, DMR과 다르게 '타영역' OR은 태아의 세포 및/또는 태아의 태반으로부터 유래된 DNA 종과 시료 속에서 이와 혼합되어 있는 모체 유래 DNA 간에 (상당량으로) 상이하게 메틸화되지 않는다. 예를 들어, 사용되는 시약의 조건 및 성질에 따라 다르지만, 상기 (태아) DNA 종의 타영역과 이에 혼합된 (모체) DNA의 타영역 간의 시약에 의한 변형에 거의 차이가 없다. 이러한 차이 없음은, 타영역이 메틸화 부위를 포함하지 않는 경우에, 또는 메틸화 부위가 존재한다면 메틸화의 정도에 차이가 없는 경우에, 또는 타영역에 존재하는 메틸화 부위를 인식하지 못하는 시약을 사용함으로써, 달성될 수 있다. 따라서, 본 발명의 대안적인 구현형태에서, 선택적(옵션) 단계 (f)에서 이용되는 적어도 하나의 타영역 OR은 상기 (태아) DNA 종과 다른 (모체) DNA 종 간의 메틸화에 (큰) 차이가 없는 것을, 상기 시약으로써 인식하거나 검출하지 못하는(또는 인식 또는 검출할 수 없는) 영역인 것이다.
[69] 본 발명 방법의 특정 구현형태에서, 상기 OR(들)은 하나 이상의 기준 염색체(들)에 위치한다. 임신여성이 인간인 경우에 상기 하나 이상의 기준 염색체(들)는 인간 염색체 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12번, 인간 염색체 14, 15, 16, 17번, 인간 염색체 19번, 인간 염색체 20번, 인간 염색체 22번, 및 인간 염색체 23번으로 구성된 목록에서 선택된 하나일 수 있다. 이 구현형태에서 특히, 기준 염색체는 인간 염색체 5번 또는 인간 염색체 12번이다. 본 발명의 특정 구현형태에서, 상기 2개 이상의 OR은 상기 2개 이상의 DMR처럼 동일한 기준 염색체(들)에 위치한다. 예를 들어, 상기 기준 DMR 중 하나와 상기 OR 중 하나는 모두 인간 염색체 5번 또는 인간 염색체 12번에 위치할 수 있다. 다른 구현형태에서, 상기 OR(들)은 염색체 이수성과 관련된 염색체(들)에 위치한다.
[70] OR(들)(즉, 상이하게 메틸화되지 않은 영역)은, 만일 이들이 본 발명에서 이용되는 경우, 본 발명에 이용되는 하나 이상의 DMR(예를 들어, 기준 DMR)과 중첩되지 않을 수 있다. 예를 들어, OR은 DMR(예를 들어, 기준 DMR) 중 하나(또는 전부)로부터 약 10bp, 20bp, 50bp, 또는 100bp, 500bp, 1kb, 또는 10kb보다 멀리 떨어져 위치할 수 있다(상기 DMR과 동일한 유전자 내에 위치하는 구현형태를 포함함). 예를 들어, 상기 DMR(예를 들어, 기준 DMR)의 상류(upstream) 또는 하류로(downstream) 약 20bp 내지 20kb 사이에 위치할 수 있다. 특히, 본 발명에서 OR이 이용되는 경우 OR의 게놈 위치는 일반적으로 게놈의 동일한 부분에 위치할 수 있다(상기 DMR과 동일한 유전자 내에 위치하는 구현형태를 포함함). 예를 들어 여기에 이용된 적어도 하나의 DMR(예를 들어, 기준 DMR)의 게놈 위치의 상류 또는 하류로 약 20bp 내지 약 20kb 사이에 위치할 수 있다. 특히 cfDNA의 태아분(foetal fraction)의 맥락에서, 이러한 DNA 종의 검출(및 특히 정량화)은 OR이 기준 DMR 중 하나와 동일한 게놈의 부분에 위치하는 경우에 향상된다(예를 들어, 감도, 정확도, 및/또는 정밀도의 향상). 이론을 따지지 않더라도, 이와 같은 유사하게 위치하는 DMR 및 OR이 특히 상기 상황에서 이용될 때에는, 게놈을 통과하는 크로마틴/뉴클레오좀 묶음의 변화의 효과 ― 따라서 게놈 DNA의 상이한 영역의 안정성/열화 ― 가 완화된다. 이로써, OR(전체 DNA를 검출함)에 비해 DMR(예를 들어 기준 DMR)(예를 들어, 태아 DNA의 기준 염색체 종을 검출함)의 안전성/열화의 차이가 적고, 따라서 상기 DMR과 OR 사이의 게놈을 통과하는 (크게) 상이한 크로마틴/뉴클레오좀 묶음에 의해 야기되는 정량적 차이에 의해 (크게) 어려움 없이 상대적(그리고 절대적) 정량화를 할 수 있게 된다.
[71] 본 발명에는 혼합체 중의 총 DNA 양의 검출을 위한 선택적 임의 단계 (f)에서 하나의 OR을 선택적으로 이용하는 것이 포함되지만, 또한, 하나보다 많은 OR을 이용하는 구현형태도 포함된다. 예를 들어, 본 발명에는 단계 (f)에서의 상기 검출시에 적어도 2개(가령, 2개, 3개, 또는 4개)의 상기 OR을 이용하는 구현형태가 포함된다. 본 발명의 모든 양태의 특정 구현형태에서, 선택적 임의 단계 (f)에서 이용되는 상기 OR의 수는 단계 (d)에서 이용되는 기준 DMR의 수와 동일하다. 예를 들어, 2개의 기준 DMR이 이용되는 구현형태에서는 2개의 타영역이 이용되며, 3개의 기준 DMR이 이용되면(도 1 참조) 3개의 타영역이 이용된다.
[72] 명세서의 다른 곳에서도 설명된 바, 본 발명은, 옵션으로 이용된 OR이 본 발명에서 이용된 적어도 하나의 DMR(예를 들어, 기준 DMR)의 게놈의 동일한 부분(예를 들어, DMR의 게놈 위치의 상류 또는 하류로 약 20bp 내지 20kb 사이)에 위치하는 구현형태(DMR의 게놈 위치와 동일한 유전자 내 위치에 위치하는 구현형태도 포함)를 포함한다. 본 발명은, 옵션으로 이용된 OR이 본 발명에서 이용된 적어도 하나의 DMR(예를 들어, 표적 DMR)의 게놈의 동일한 부분(예를 들어, DMR의 게놈 위치의 상류 또는 하류로 약 20bp 내지 20kb 사이)에 위치하는 구현형태(DMR의 게놈 위치와 동일한 유전자 내 위치에 위치하는 구현형태도 포함)를 포함한다. 특정 구현형태에서 OR은 DMR과 겹치지 않는다. 따라서, 다수의 OR이 본 발명에서 이용되는 경우의 구현형태에서는 둘 이상의 OR은 둘 이상의 DMR(예를 들어, 기준 DMR)과 유사하게 게놈에 위치하게 된다. 예를 들어, 전술한 OR 중 하나는 단계 (d)에서 이용되는 기준 DMR의 상류 또는 하류로 약 20bp 내지 20kb 사이에 위치하고(기준 DMR과 동일한 유전자 내에 위치하는 구현형태도 포함됨), 상기 OR의 서로 다른 하나(예를 들어, 제2 OR)는 상기 (예를 들어, 겹치지지 않는) 다른 DMR(예를 들어, 제2 기준 DMR)의 상류 또는 하류로 약 20bp 내지 20kb 사이에 위치한다(제2 기준 DMR과 동일한 유전자 내에 위치하는 구현형태도 포함됨). 특정 구현형태에서, 추가로 이용되는 OR은 DMR(예를 들어, 기준 DMR)과 중첩될 수 있다.
[73] 본 발명에서 이용되는 OR이 DMR(예를 들어, 기준 DMR)의 게놈과 동일한 부분에 위치할 때에, OR이 상기 DMR의 상류 또는 하류로 위치하게 되는 거리는, 약 16kb~20bp, 14kb~20bp, 12kb~20bp, 10kb~20bp, 8kb~20bp, 6kb~20bp, 5kb~20bp, 4kb~20bp, 3kb~2bp, 16kb~20bp, 1kb~20bp, 500bp~20bp, 200bp~20bp, 20kb~15kb, 15kb~10kb, 12kb~8kb, 10kb~8kb, llkb~7kb, llkb~10kb, 9kb~8kb, 8kb~6kb, 6kb~4kb, 4kb~2kb, 2kb~500bp, lkb~100bp, 500bp~50bp, 400bp~200bp, 500bp~100bp, 그리고 500bp~300bp 중에서 선택될 수 있다. 특정 구현형태에서, 이용되는 각 OR은 이용된 DMR(예를 들어, 기준 DMR)과 상이하게 위치하는 것이 일반적이다.
[74] 다수의 OR이 이용되는 경우, 본 발명은 선택적 임의 단계 (f)에서의 검출을 위해 상기 OR 각각에 대해 동일한 검출 표지(들)를 사용하는 구현형태를 포함하고, 그리고/또는 적어도 2개의 표지처리된(표지처리된) 프로브(각각 상기 하나의 OR에 특정됨)를 사용하는 다중 실시간 정량화 PCR을 포함하는 구현형태를 포함한다.
[75] 본 발명 방법의 특정 구현형태에서, 단계 (f)에서의 검출이 수행되는 경우에, 단계 (f)에 적어도 두 개의 OR을 이용하는 것이 포함된다. 특히 이러한 구현형태에서, 상기 OR의 수는 단계 (d)에서 이용된 기준 DMR의 수와 동일할 수 있다. 이 구현형태의 추가 형태로서, 상기 기준 DMR 중의 하나 및 상기 OR 중의 하나는 모두 하나의 기준 염색체(예를 들어, 인간 염색체 5번)에 위치할 수 있고, 제2 기준 DMR 및 제2 기준 OR은 모두 다른 기준 염색체(예를 들어, 인간 염색체 12번)에 위치할 수 있다. 특히 이러한 추가 구현형태에서, 상기 OR의 하나는 단계 (d)에서 이용되는 기준 DMR의 상류 또는 하류에 약 20bp 내지 약 20kb 사이에 위치하며, 상기 OR의 다른 것은 상기 기준 DMR의 상류 또는 하류에 약 20bp 내지 약 20kb 사이에 위치한다.
[76] 본 발명의 구현형태에서, 다양한 DNA 영역, 즉 DMR(들)(및 이용된다면 OR(들)도))의 검출은 단순한 과정으로 수행될 수 있다. 따라서 다양한 DNA 영역들, 즉 DMR(및 이용된다면 OR(들)도)의 검출을 단순한 과정으로 수행할 수 있다는 것이 본 발명의 한 특징이 될 수 있다. 예를 들어, 시료로부터의 DNA의 단일 분취량을 사용하여, 이 DNA 영역을 단일 용기에서 검출할 수 있다. 이러한 특징은 본 방법(들)을 단순화할 수 있고, 더 효율적이고 정확한 검출을 제공할 수 있다(특히 정량적 검출의 구현형태에서). 용어 '용기(vessel)'는 당업계에서 인정되어 있을 것이며, 이 방법에 포함된 공정 또는 절차, 가령 본 발명 방법의 반응 및/또는 검출 과정 또는 단계가 일어나는 용기(튜브, 마이크로타이터 플레이트의 웰, 나노웰, 모세관 반응 용기 등)로 구현된다. 다른 용기로는 오일/물 에멀젼 방울, 나노 입자, 또는 하이브리다이제이션 챔버가 포함될 수 있는데, 이는 이용된 검출 기술에 적절하게 사용된다. 거의 동시에 검출될 때에 기준 DMR(들)에(그리고 이용된다면 OR들에도) 사용되는 검출 표지(들)(detectable label)은 표적 DMR에(이용되는 경우에는 OR에도) 사용되는 표지(들)과 상이하다(즉, 별도로 검출될 수 있다)는 조건 하에서, 본 발명의 특정 구현형태에 사용되는 검출 표지는 각 표적 DMR마다 상이할 수 있고, 그리고/또는 각 기준 DMR마다 동일할 수도 있고/또는 각 OR(포함되는 경우)마다 동일할 수 있다. 대안으로서, 본 발명의 특정 구현형태에서, 사용되는 검출 표지(들)는 각 DMR마다 상이(예를 들어, 동일하지 않음)할 수 있고/있거나 각 OR(포함되는 경우)마다 상이할 수 있다(예를 들어, 동일하지 않음). 표적 DMR(들)에 사용되는 검출 표지(들)가 기준 DMR에 사용되는 표지(들)와 상이하고(즉, 별도로 검출될 수 있고) OR(이용시)에 사용되는 표지(들)와 상이하다는 조건 하에서, 본 발명 방법에서 사용되는 검출 표지는 각 기준 DMR마다 동일할 수 있고, 특정의 구현형태에서는 각 OR(포함되는 경우)마다 동일할 수 있다. 사용된 검출 기술에 의해 크게 차별화될 수 없는바, '동일'한 검출 표지들에는 구조적으로 다르지만 기능적으로(본질적으로) 유사한 표지가 포함될 수 있다. 예를 들어, 구조적으로 상이한 형광 염료는, 여기(excitation) 및 방출(emission) 스펙트럼이 (실질적으로 또는 본질적으로) 유사하거나 동일한 파장(들)(예를 들어, 동일한 파장)으로 동시에 여기 및 검출될 수 있을 정도로 중첩된다면 '동일'하다고 간주할 수 있다. 적절한 표지(및 검출 양상들(modalities))에 대해서는 명세서의 다른 곳에 더 기술되어 있다. 바람직하게는, DMR(들) 및 OR(들)(포함된 경우)의 검출은 유효하게 동시에 수행될 수 있다. 예를 들어, 동일한 (반응/검출) 용기 내에서, 모든 이들 영역(및 그에 따른 전술한 DNA 및 총 DNA 종)을 각각 약 5초, 1초, 0.5초, 100ms, 10ms, 1ms, 100us, 10us, 또는 1us 등보다 짧은 시간 내에 검출할 수 있다(특정적으로는, 각각 약 0.5초 미만, 보다 특정적으로는 약 100ms 미만). 그리고 용기 또는 반응/혼합물을 다른 후속 용기, 분석, 또는 장비로 옮기지 않아도 되는 경우, 또는 DMR(들) 중 하나나 모두 또는 OR(들)별로 검출 프로세스를 별도로 조절하거나 재교정하지 않아도 되는 경우가 그 예이다. 검출 표지(들)의 사용 ― 예를 들어, 상기 제1 표적 DMR(들)에 적어도 하나, 기준 DMR(들)에 적어도 하나 ― 에는 비자연적 성분, 공정, 및/또는 단계를 이용한다. 예를 들어, 특정 DNA 영역을 갖는 두 개의 특정 표지 구성은 (일반적으로) 자연에서는 발견되지 않는 것이다. 특히, 정량적 프로브 기반 PCR에서 사용되는 짧은 프로브는, 하나 이상의 표지(예를 들어, 형광 염료)에 연결될 때, 자연 게놈에서 발견되는 DNA 단편(fragment)인 DNA 서열을 포함할 수는 있지만, 비자연적인 특정 표지가 적용된 단편을 형성한다.
[77] 도면을 통한 설명을 위해, 본 발명의 일 구현형태에 이용된 바와 같은 제1 표적 DMR(들), 기준 DMR들, OR(들)(이용되는 경우), 및 검출 표지(들)의 개괄적인 배치를 도 6에 도시하였다. (la) 염색체 이수성과 관련된 염색체에 위치한 하나의 제1 표적 DMR(DMR1)에서의 DNA 메틸화의 존재가 검출 표지(들)를 사용하여 검출된다. (1b) 염색체 이수성과 관련된 동일한 염색체에 위치한 두 번째 제1 표적 DMR(DMR2)에서의 DNA 메틸화는 다른 검출 표지(들)를 사용하여 검출된다. (1') 두 개의 기준 DMR에서의 DNA 메틸화의 존재는 동일한(단, 제1 표적 DMR을 검출하는 데 사용된 것과는 다른) 검출 표지(들)로 검출된다. (3') 기준 DMR의 검출은, 동일한 검출 표지(들)를 사용하여(그러나 DMR을 검출하기 위해 사용된 것과는 다른) 선택적 임의사항인 두 개의 타영역(OR1 및 OR2)에 연관지어 검출될 수 있다. (2) 상기 OR 중 하나 이상은 기준 DMR과 동일한 염색체에 위치할 수 있다. 특히, (4) OR은 기준 DMR의 게놈의 동일한 부분(예를 들어, 상류 또는 하류로 약 20bp~20kb 사이)에 있을 수 있다.
[78] 본 발명의 맥락에서, 본 발명 방법에서 이용되는 임의의 특정 DMR(예를 들어, 제1 표적 DMR 또는 기준 DMR)에서의 메틸화의 검출은 적어도 하나의 OR에 연관지어 수행될 수 있다. 도면을 통한 설명을 위해, 상기 DMR 검출의 한 구현형태에 이용된 바와 같은 상기 DMR(들), OR(들), 및 검출 표지(들)의 대략적인 배치 개략도가 도 1(a)에 도시되어 있다. (1) DMR1에서의 DNA 메틸화의 존재는 DMR1의 게놈의 동일 부분(예를 들어, 상류 또는 하류로 약 20bp~20kb 사이) 내에 위치한 타영역(OR1)의 맥락에서 검출된다. (2) 선택적 임의사항으로서, 추가 DMR들 및/또는 OR들(예를 들어, DMR2 및/또는 OR2, 그리고 DMRn 및 ORn까지)이 검출될 수 있으며, 이러한 추가 DMR들 및 OR들의 쌍은 서로 게놈의 동일 부분(예를 들어, 상류 또는 하류로 약 20bp~20kb 사이)에 함께 위치할 수 있다. 선택적 임의사항으로서, (3) 다수의 DMR에서의 DNA 메틸화의 존재는 ― 동일한 표적 염색체에 위치하거나 또는 하나 이상의 기준 염색체에 위치할 때 ― 동일한 검출 표지(들)를 사용하여 검출된다. 그리고/또는 (4) 적어도 하나의 OR(OR1)를 이용하여(그리고/또한 옵션으로 OR2, ..., ORn을 이용) 검출된 총 DNA의 양은, DMR(들)에서의 메틸화를 검출하는 데 사용된 것과 상이한 검출 표지(들)를 사용하여 검출된다(선택적 임의사항(옵션)으로서, 사용된 검출 표지(들)는 모든 OR들 ― 동일한 표적 염색체에 위치하거나 하나 이상의 기준 염색체 상에 있을 때 ― 에 대해서 동일하다.
[79] 또한, 본 발명의 맥락에서, 이용된 둘 이상의 DMR(예를 들어, 제1 표적 DMR 또는 기준 DMR)에서의 메틸화는 ― 동일한 표적 염색체에 위치하거나 하나 이상의 기준 염색체에 위치할 때 ― 동일한 검출 표지(들)를 사용하여 검출 가능하다. 도면을 통한 설명을 위해, 상기 DMR 검출의 한 구현형태에 이용된 바와 같은 상기 DMR(들), OR(들)(이용되는 경우), 및 검출 표지(들)의 대략적인 배치 개략도를 도 1(b)에 도시하였다. (1) 두 개 이상의 DMR, DMR1, DMR2(그리고 옵션으로 DMRn까지)에서의 DNA 메틸화는 ― 동일한 표적 염색체에 있거나 하나 이상의 기준 염색체에 위치할 때 ― 각각의 경우에, 동일한 검출 표지(들)로 검출된다. (2) 선택사항으로, 타영역 OR은 DMR 중 하나의 게놈의 동일한 부분(예를 들어, 상류 또는 하류에 약 20bp와 약 20kb 사이)에 위치할 수 있다. (3) 적어도 하나의 OR(OR1)(선택적 임의사항으로서, OR2 또는 ORn까지)을 이용하여 검출된 총 DNA의 양은 DMR에서의 메틸화를 검출하는 데 사용된 것과 다른 검출 표지(들)를 사용하여 검출된다(선택적 임의사항으로서, 사용된 검출 표지(들)는 모두 OR들에 대해서 ― 동일한 표적 염색체에 위치하거나 하나 이상의 기준 염색체에 위치하는 때 ― 동일하다. (4) 선택적 임의사항으로, 2개보다 많은 DMR에서의 메틸화도 상기와 같이 검출되고/또는 총 DNA의 양은 하나보다 많은 OR에서 검출된다.
[80] 본 발명에서 상기 특징들의 조합을 사용하면 효율 개선 및/또는 결과 상승효과(시너지)의 기회를 얻게 된다. 예를 들어, 이러한 조합의 사용에 의해, 전술한 (태아) DNA 종, 특히 기준 염색체의 검출(예를 들어, 정량적 양의 검출) 감도(sensitivity) 및/또는 정확성(accuracy) 및/또는 특정도(specificity) 및/또는 정밀도가 향상될 수 있다. 향상의 정도는 각 특징만 단독으로 사용했을 때와 비교할 때 시너지 효과를 갖는다. 예를 들어, 특징들을 결합하여 얻은 향상은 각 특징을 개별로 사용하여 얻은 각각의 향상 정도의 합보다 크다. 본 발명의 특정 구현형태에서, 분석 또는 검사로부터 이러한 시험에 대해 요구되는 총체적인 감도(참양성 율: true positive rate), 특정도(참음성 율: true negative rate), 및/또는 보고불요 율(non-reportable rate)의 결과를 제공받는다. 예를 들어, 감도는 100%, 거의 100%, 97% 초과(특히 97.5% 초과), 또는 95% 초과이고, 특정도는 95% 초과, 특히 96% 초과이고, 그리고/또는 보고불요 율은 10% 미만(특히 7% 미만), 가령, 6% 또는 5% 미만인 결과가 얻어진다. 특정 구현형태에서, 본 발명의 분석 또는 검사로부터 95% 초과의 감도, 90% 초과의 특정도, 및 10% 미만의 보고불요 율을 얻을 수 있으며, 보다 특정적으로는 97% 초과의 감도, 95% 초과의 특정도, 7% 미만의 보고불요 율을 얻을 수 있다.
[81] 이제 본 발명의 개시에 따라 당업자에게 명백한 바, 이 방법에서는 메틸화를 검출하고, 제2 표적 염색체의 양(예를 들어, 기준 염색체(들)에 상대적인)을 결정/정량화/비교하기 위하여 단계 (c)에 부가하여 이와 유사한 단계가 추가로 수행될 수 있다. 여기서, 제2 표적 염색체도 또한 (예컨대 상이한) 염색체 이수성에 관련된 (예컨대 상이한) 염색체이다. 임신여성이 수태한 태아에서의 두 가지(또는 그 이상) 다른 염색체 이수성의 존재를 검출할 수 있는 이러한 방법은 비용, 속도, 및 편리성의 관점에서 특히 이점을 갖는다.
[82] 따라서, 본 발명의 특정 구현형태에서, 이 방법은 다음의 단계를 더 포함한다.
(c)' 상기 시료에서, 태아의 세포 및/또는 태아의 태반에서 유래한 DNA와 모체 유래 DNA 간에 상이하게 메틸화되고 상기 시약에 의한 제2 표적 DMR의 DNA의 변형은 DNA의 메틸화에 감응하는, 다른 염색체 이수성과 관련된 염색체인 제2 표적 DNA 종의 양을 결정하되, 상기 다른 염색체 이수성에 관련된 염색체에 위치하는 둘 이상의 제2 표적 DMR에 메틸화가 존재하는지를 상기 시료에서 검출함으로써 결정하는 단계;
여기서 상기 제2 표적 DMR 중 하나 이상에서 메틸화된 DNA의 검출량은 상기 시료 내의 상기 제2 표적 DNA 종의 양을 나타냄.
(e)' 단계 (c)'에서 결정된 양과 단계 (d)에서 결정된 양의 상대적 양(들), 바람직하게는 비율(들)을 결정하는 단계;
여기서, 상기 하나 이상의 상대적 양(들)은 태아 내의 다른 염색체 이수성의 존재 또는 부존재를 지시함(indication).
바람직하게는, 상기 단계 (c) 및 단계 (c)' 및 단계 (d)에서의 상기 검출은 상기 시료의 DNA의 동일 분취량(aliquot)을 사용하여, 그리고 동일 용기에서, 그리고 상기 제1 표적 DMR 및 제2 표적 DMR 그리고 상기 기준 DMR에 대해 유효하게 동시에 수행되며, 그리고 옵션사항으로서 (x) 적어도 두 개의 상기 기준 DMR에 대해 동일한 검출 표지(들)를 사용하여서(바람직하게는 각각에 대해 사용) 그리고/또는 (y) 적어도 두 개의 상기 제1 표적 DMR마다(바람직하게는 각각에 대해) 그리고 적어도 두 개의 상기 제2 표적 DMR마다(바람직하게는 각각에 대해), 그리고 선택적 임의사항인 OR(들)마다 상이한 검출 표지를 사용하여서 수행된다.
[83] 제2 표적 DMR과 관련하여, 제2 표적 DMR에 대해 사용된 검출 표지(들)의 여러가지 가능한 설정은 제1 표적 DMR에 대해 기술된 것과 같을 수 있다. 하지만, 특정 구현형태에서는 제1 표적 DMR에 사용되는 것과 기준 DMR에 사용되는 것, 그리고 OR(들)이 이용될 경우에는 이 OR(들)에 이용되는 것과 상이한 검출 표지(들)가 제2 표적 DMR에 사용된다.
[84] 본 발명의 이러한 구현형태에서 임신여성이 수태한 태아에서 둘 이상의 염색체 이수성을 검출하고자 이 방법을 실시할 때, 다른 염색체 이수성에 관련된 염색체는 인간의 21번 염색체, 18번 염색체, 13번 염색체, X 염색체, 및 Y 염색체로 구성된 목록 중 선택된 인간 염색체일 수 있는데, 여기서 특히 이러한 염색체는 제1 표적 염색체와 다른 것이다. 예를 들어, 다른 염색체 이수성에 관련된 염색체는 인간의 18번 염색체 또는 13번 염색체, 특히 인간의 18번 염색체일 수 있는데, 여기서 상기 다른 염색체 이수성은 상기 상이한 염색체의 이수성, 예를 들어 상기 상이한 염색체의 삼염색체이다.
[85] 특히, 본 발명의 이러한 구현형태에서, 임신여성이 수태한 태아에서 둘 이상의 염색체 이수성을 검출하고자 이 방법을 실시할 때, 염색체 이수성에 관련된 상기 염색체 및 다른 염색체 이수성에 관련된 상기 상이한 염색체는 인간의 21번과 18번 염색체, 21번과 13번 염색체, 18번과 13번 염색체로 구성된 목록 중에서 선택된 인간 염색체 쌍일 수 있는데, 여기서 상기 염색체 이수성 및 상기 다른 염색체 이수성은 각 염색체의 이수성, 바람직하게는 각 염색체의 삼염색체이다.
[86] 보다 특히, 본 발명의 이러한 구현형태에서, 임신여성이 수태한 태아에서 둘 이상의 염색체 이수성을 검출하고자 이 방법을 실시할 때, 상기 제1 표적 DMR 각각은 인간의 21번 염색체, 18번 염색체, 또는 13번 염색체 상에, 바람직하게는 21번 염색체에 위치할 수 있고, 선택적 임의사항으로서, 상기 제2 표적 DMR이 있는 경우에 이들 각각은 인간의 18번 염색체 또는 13번 염색체에 위치할 수 있다.
[87] 본 발명은 또한 단계 (c)(및 단계 (e))에 유사한 추가 단계가 더 실시되는 경우를 포함하는데, 이 추가 유사 단계는 다른 염색체 이수성(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 또는 그 이상의 염색체 이수성)이 태아에 존재하는지를 지시하기 위해 추가적 표적 DMR을 사용한다. 예를 들어 인간 염색체 21번에서의 이수성을 검출하도록 하나의 단계 (c)(및 단계 (e))를 구성할 수 있으며, 인간 염색체 18번에서 이수성을 검출하도록 제1 추가 단계 (c)(및 단계 (e))를 구성할 수 있으며, 인간 염색체 13번에서 이수성을 검출하도록 제2 추가 단계 (c)(및 단계 (e))를 구성할 수 있다.
[88] 단계 (c)(또는 단계 (e))에 적용 가능한 것으로 명세서에 기술된 모든 구현형태에는, 상기 유사하고 추가적인 단계 (c)(또는 단계 (e)), 예컨대, 단계 (c)'(또는 단계 (e)') 중 어느 것에도 동등하게 적용가능하다. 예를 들어, 단계 (e)'를 갖는 본 발명의 구현형태에서 특히, 본 방법에는 단계 (e)'에서 상기 상대적 양(들) 또는 비율(들)을 임계값(들) 및/또는 기준 분포(들)와 비교하여, 하나 이상의 상기 상대적 양(들) 또는 비율(들)이 상기 임계값(들) 및/또는 기준 분포(들)보다 크거나 낮은 것으로 태아에 다른 염색체 이수성이 존재하는지를 지시하는 것이 추가로 포함될 수 있다.
[89] 특정 구현형태에서, 본 발명의 방법들 중의 단계 (c) 및/또는 단계 (d) 및/또는 옵션 단계 (c)' 및/또는 옵션 단계 (f)의 일부로서 수행되는 검출 단계 이전에 또는 그 일부로서, 각 DNA 영역에는 상기 DMR(들) 및/또는 상기 옵션 OR(들)이 각각 증폭(amplify)된다. DNA의 증폭은 임의의 적합한 복제 과정을 통해 수행될 수 있으며, 특히 이러한 구현형태에서, DMR(들) 및/또는 옵션으로 이용된 OR(들)의 각각은 각 DMR 및/또는 OR에 대해 적절하게 설계된 프라이머를 사용하여 중합 효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭된다. 당업자는 본 발명 방법에 사용하기 위한 상기 PCR 프라이머를, 예를 들어 프라이머 설계 알고리즘 및 프로그램(예를 들어, 'Clone Manager Professional 9'(Sci-Ed Software), 'Vector NTI'(Life Technologies), 또는 www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ 또는 molbiol-tools.ca/PCR.htm에 소개된 '웹 기반 툴')을 사용하여 용이하게 설계할 수 있을 것이다. PCR 증폭이 포함된 본 발명의 상기 구현형태는 본 명세서에 기재된 해당 내용과 같은 PCR 실시에 관련된 특정 단계들, 또는 구체적으로는, (A) 이중가닥(double-stranded)의 표적 DNA와 이 DNA의 영역(예를 들어, 본 명세서에 기재된 DMR 또는 옵션으로 이용된 OR)을 증폭하도록 설계된 한 쌍의 프라이머(예를 들어, 본 명세서에 개시된 한 쌍의 프라이머) ― 제1 프라이머는 표적 DNA의 제1 가닥의 서열에 상보적이고 제2 프라이머는 표적 DNA의 제2 가닥, Taq 폴리머라제(Taq polymerase), 및 아데닌 티민 시토신 구아닌을 포함하는 다수의 유리(free) 뉴클레오타이드의 서열에 상보적임 ― 를 포함하는 반응 혼합물을 제공하는 단계; (B) 상기 반응 혼합물을 제1 소정 시간 동안 제1 소정 온도로 가열하여 상기 표적 DNA의 가닥들을 서로 분리시키는 단계; (C) 상기 제1 및 제2 프라이머가 표적 DNA의 제1 및 제2 가닥의 상보적 서열과 하이브리드화(hybridise)되도록 하는 조건 및 상기 Taq 폴리머라제가 프라이머들을 확장하도록 하는 조건 하에서, 상기 반응 혼합물을 제2 소정 시간 동안 제2 소정 온도로 냉각하는 단계; 및 (D) 단계 (B) 및 (C)를 적어도 20 회 반복하는 단계들을 추가로 포함할 수 있다.
[90] 용어 '프로브 기반' 정량화 PCR은 당업계에서 인정된 것이며, 다양한 상표명(예를 들어, Roche의 'TaqMan' PCR)으로 기술되고 출시되는 다양한 구현형태를 포함하며, 특정 앰플리콘(amplicon)(예를 들어, DMR 또는 타영역)의 검출에 특화된 (예를 들어, 형광의) 리포터 프로브(reporter probe)를 사용한다. 프로브 기반 정량화 PCR은, 이중가닥 DNA에 결합하는(binding) 염료(예를 들어, SYBR Green)를 리포터로 사용하는 정량화 PCR과는 구별되는데, 그 이유는 이 이중가닥 DNA 결합 염료는 이중가닥의 앰플리콘에만 특별하게 결합되지 않으며 예를 들어 DMR(들)(즉, 전술한 DNA 종)의 검출과 타영역의 검출(즉, 전체 DNA의 검출)을 구별하는 데 사용할 수 없기 때문이다. 당업자라면 알 수 있듯이, 앰플리콘에 대해 하나의 프로브를 사용하거나 또는 복수의 프로브(예를 들어, 2개 또는 3개의 프로브)를 사용하여 PCR의 특정 앰플리콘을 검출할 수 있다. 특히, 프로브 기반의 정량화 PCR은 어닐링(annealed) 표지처리된(labelled) 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 프로브)를 잡종화 듀플렉스로부터 절단(cleave)하고 표지처리된 올리고뉴클레오타이드 단편을 검출을 위해 방출하기 위하여, 핵산 중합효소의 5' 내지 3' 뉴클레아제 활성을 이용하는 표지처리된 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 표적 핵산을 검출하는 프로세스가 통합되어 있는 증폭 반응을 포함할 수 있다. 이러한 접근법 및 프로세스는 당업계에 공지되어 있으며, Gelfand 등(US5804375, EP0543942, 및 관련 패밀리 특허) 및/또는 Livak 등(US6258569, EP 0792374, 및 관련 패밀리 특허)에 의해 더 일반적인 용어로 기술되어 있다. 또한 이러한 접근법 및 프로세스는, 결합(bound)시에 표지의 검출성을 소광하는 소광 분자(quencher molecule)와 검출 표지가 결합된 것이 프로브에 포함되어서, 5' 내지 3' 뉴클레아제(및 그에 따른 증폭)를 발생시킨 다음에 검출 표지가 (소거제로부터 떨어져) 반응 혼합물 내로 방출되어 결과적으로 검출될 수 있도록 하는 것을 포함한다. 또한, '프로브 기반' 정량화 PCR 접근법은 Reed 등의 US6727356, EP1235938, 및 관련 패밀리 특허에 기술된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드-형광체-소거제- 마이너 그루브 바인더 접합체(oligonucleotide-flourophore-quencher-minor groove binder conjugates)가 포함된 프로브를 사용함으로써 대안적으로 또는 추가적로 강화될 수 있다. 예시적인 소광 분자는 BHQ1, BHQ3, Eclipse, BHQ2, BBQ650 등이다.
[91] 이러한 프로브 기반의 정량화 PCR은, 신호 강도(예를 들어, 시간 경과에 따른 신호 강도)를 측정하여 정량적으로 검출하는 LightCycler 같은 장치를 사용하여 아날로그 방식으로 실시할 수 있다. 이러한 검출을 위한 시스템 및 접근법은 Woudenberg 등(US6929907, EP0706649, 및 관련 패밀리 특허) 및/또는 Higuchi(US5994056, EP0512334, 및 관련 패밀리 특허)에 기술되어 있다. 대안으로, 디지털 PCR(dPCR), 즉, 검출된 DNA의 양을 정량하는 방법으로서 증폭 이벤트의 수를 판정하기 위한 다중 이벤트로 수행되는 PCR이 제공된다. 예를 들어, 나노웰(nano-well) 또는 드롭플렛(droplet)에서 수행되는 dPCR이 제공된다(ddPCR). 상업적으로 이용 가능한 ddPCR 기술 공급 업체로 Bio-Rad와 Rain Dance가 있다.
[92] 당업자는 DMR 및/또는 OR(들)의 프로브 기반 정량화 PCR 검출을 위해 적절한 프라이머 및 프로브를 (염료와 같은 적절한 표지와 함께) 설계할 수 있을 것이다. 예를 들어 본 명세서의 다른 곳에서 설명한 프라이머/프로브 설계 소프트웨어를 사용하여 설계할 수 있다. 알게 될 바, PCR 프라이머는 이 방법에 사용되는메틸화-특화 변형 시약에 특화된 메틸화 부위(들)와 겹칠 수 있는데, 이는 특히, 시약이 하나 이상의 메틸화 감응성 제한효소(명세서에 기재된 것과 같은 것 또는 그 조합)를 포함할 때에 그러하다. 특히, 이러한 구현형태에서, 주어진 DMR에 대한 PCR 프라이머 중 하나 또는 다른 하나(또는 함께 고려되는 경우에는 둘 다)는 2개 또는 3개의 메틸화 부위(예를 들어, 메틸화 감응성 제한효소별 2개 또는 3개의 제한 부위. 이들 각각에는 메틸화 부위가 포함될 수 있음)와 중첩될 수 있다. 대안으로서 또는 부가적으로, DMR에 대한 프라이머는, 1개, 2개, 3개, 또는 그 이상, 예를 들어, 10, 15, 20, 25, 또는 50개까지의 메틸화 부위를 플랭크(flank)하도록, 특히, 1개, 2개, 3개, 또는 그 이상의(더 구체적으로는 2개~4개의) 메틸화 부위, 예를 들어, 10, 15, 20, 25, 또는 50개까지의 메틸화 감응성 제한효소에 대한 제한 부위(이들 각각에 메틸화 부위가 포함될 수 있음)를 플랭크하도록 설계할 수 있다.
[93] 다른 구현형태에서, 본 발명 방법의 단계 (c) 및/또는 단계 (d) 및/또는 선택적 임의 단계 (c)' 및/또는 선택적 임의 단계 (f)에서 사용되는 검출 표지(들)는, 형광체, 단백질, 소분자, 또는 방사성 표지 중에서 독립적으로 선택된다. 예를 들어, 동일한 형광 표지(유사하거나 겹치는 여기 및/또는 방출 스펙트럼을 갖는 것을 포함)를 DMR에 사용할 수 있고, 여기 및/또는 방출 스펙트럼(특히, 상이한 방출 스펙트럼)을 갖는 형광 표지를 선택이용 OR(들)의 검출에 사용할 수 있다. 당업자는 예를 들어 FAM, TET, JOE, VIC, HEX, NED, PET, ROX, TAMRA, Quasar 및 Texas Red 및 LCCyan500, 6FAM, Cy5, 및 LCRed610 및 LCRed640으로 구성된 군으로부터 본 발명에 사용하기에 적절한 형광 표지를 선택할 수 있을 것이다. 형광 표지는 상응하는 소거제와 함께 사용할 수 있는데, 이러한 표지-소거제 쌍은 당업계에 주지되어 있으며, LCCyan500/BHQ1, Cy5/BHQ3, 6FAM/Eclipse, LCRed610/BBQ650, 및 LCRed640/BHQ3로 구성된 목록으로부터 선택될 수 있다.
[94] 다른 구현형태에서, 검출 표지(들)는 예를 들어 특정 항체 및 ELISA 유형의 검출 접근법을 사용하여 검출할 수 있는 단백질 또는 소분자 태그일 수 있다. 동일한 또는 상이한 표지에 적용 가능한 그리고 다양한 DMR 및/또는 옵션으로 이용된 OR(들)의 검출에 적절한 동일 단백질 또는 소분자 또는 검출가능한 정도로 상이한 단백질 또는 소분자를 또한 검출 표지(들)에 사용할 수 있다. 다른 방사성 표지들은 그들의 방출 에너지, 침투/여기 특성, 및 입자 유형에 의해(예를 들어, 알파 입자와 베타 입자에 의해 구별함)로 구별될 수 있다. 다른 검출 표지(들)(예를 들어, 핵산 코딩된 태그)가 또한 본 발명에 사용될 수 있다.
[95] 본 발명의 특정 구현형태에서, 이 방법의 단계 (c) 및/또는 단계 (c)'에서의 검출은 실시간 정량적 프로브 기반 PCR을 포함하는데, 이는, 예를 들어, 제1 표적 DMR(들) 및/또는 임의의(옵션으로 이용되는) 제2 표적 DMR(들) 중 하나에 특이적인 적어도 하나의 표지처리된 프로브를 사용한다. 다수의 DMR 및/또는 옵션으로 이용되는 OR(들)의 PCR 증폭이 동일한 반응으로 이루어지는 상기 구현형태에서 이러한 PCR은 '다중(multiplex) PCR'로 (또는 단 2개의 DMR 및/또는 OR(들)이 그렇게 증폭된다면 '이중(duplex) PCR'로) 간주될 수 있다. 마찬가지로, 본 발명의 방법에서 단계 (d)에서의 검출에는, 예를 들어 상기 기준 DMR 중 하나에 특이적인 적어도 하나의 표지처리된 프로브를 사용하는 실시간 정량적 프로브 기반 PCR을 부가적으로 또는 대안으로서 포함될 수 있다. 또한 마찬가지로, 본 발명 방법에서 선택적 임의 단계 (f)에서의 검출에는, 예를 들어, 전술한 OR(들) 중 하나에 특이적인 적어도 하나의 표지처리된 프로브를 사용하는 실시간 정량적 프로브 기반 PCR이 부가적으로 또는 대안으로서 포함될 수 있다.
[96] 본 발명 방법에서 사용되는 프라이머 및/또는 프로브는, 예를 들어 메틸화된 CpG를 우라실로 전환시키는 바이설파이트 변환(bisulphite conversion) 후의 서열 특이적 검출시에 하나 이상의 DMR에서 메틸화를 검출하도록 구성 또는 설계할 수 있다. 한정적이지 않은 예로서, 이러한 검출은 본 명세서의 다른 곳에서 기술된 바와 같이 MSP 또는 MethyLight에 의해 실시될 수 있다.
[97] 본 발명의 특정 구현형태에서, 본 발명 방법의 단계 (c)에서의 검출은 예를 들어, 적어도 2개의 표지처리된 프로브(각각 상기 두 개 이상의 제1 표적 DMR의 하나에 특화됨)를 사용하는 실시간 정량적 프로브 기반 PCR을 포함한다. 그리고/또는 상기 단계 (d)에서의 상기 검출은 상기 기준 DMR들 중 하나에 각각 특화된 적어도 2개의 표지처리된 프로브를 사용하는 다중 실시간 프로브에 기반한 정량적 프로브 기반 PCR을 포함한다.
[98] 본 발명의 다른 구현형태에서, 단계 (f)에서의 상기 검출은 상기 OR(들) 중 하나에 특화된 적어도 하나의 표지처리된 프로브를 사용하는 실시간 정량화 PCR을 포함한다.
[99] 둘 이상의 전술한 OR(들)이 이용될 때, 본 발명은 임의(옵션) 단계 (f)에서의 검출이 다음과 같이 이루어지는 구현형태를 포함한다 ― (x) 상기 OR 각각에 대해 동일한 검출 표지(들)를 사용. 그리고/또는 상기 단계 (f)에서의 상기 검출은 상기 OR 중 하나에 각각 특화된 적어도 2개의 표지처리된 프로브를 사용하는 다중 실시간 정량적 프로브 기반 PCR을 포함한다.
[100] 특정 구현형태에서, 다중 정량적 프로브 기반(예를 들어, TaqMan) PCR을 사용하여 하나 이상의(바람직하게는 모두) 검출 단계(즉, DMR(들) 및 OR(들)에 요구되는 단계들)가 하나의 공정 단계 또는 반응으로 효율적이고 유효하게 수행된다. 예를 들어, 본 발명의 특정 구현형태에서, 상기 검출 단계 (c) 및 단계 (d), 그리고 선택적 임의 단계 (c)' 및 선택적 임의 단계 (f)는 상기 시료의 동일한 분취량의 DNA를 사용하여, 동일한 반응/검출 용기에서, 그리고 서로 유효하게 동시에, 그리고 상기 DMR들 및 옵션으로 이용된 OR(들)의 각각에 특화된 적어도 하나의 표지처리된 프로브를 사용하는 다중 실시간 정량화 프로브 기반 PCR에 의해 수행될 수 있다. 특히 이러한 구현형태에서, 시약은 본 명세서에 개시된 바와 같은(또는 이들의 조합) 하나 이상의 메틸화 감응성 제한효소를 포함한다.
[101] 본 발명은 또한 하나 이상의 대조군(control) 절차와 같은 추가적 절차를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 변형 단계를 위한 대조군(예를 들어, 제한효소 분리(digestion)를 위한 대조군)으로서 작용하는 DNA 영역의 제3 부류의 검출에 관한 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. 이러한 구현형태는, 예를 들어, 이러한 영역 부류에 추가적 검출 표지(들)과 함께 프라이머/프로브(들)의 추가 세트가 사용되어 대조군 영역이 증폭 및 검출되는 다중(멀티플렉스) 실시간 정량적 프로브 기반 PCR을 사용하여 수행될 수 있다.
[102] 본 발명에서, 상기 표적 및 기준 DNA 종은 태아의 세포 및/또는 태아의 태반에서 온 것이고(유래), 상기 시료는 임신여성으로부터 수득된 것이다. 특정 구현형태에서, 시료는 비침습적인 방식으로 수득될 수 있다. 예를 들어, 상기 DNA 종은 채혈관 같은 통상적인 수단에 의해 임신여성으로부터 채취한 혈액 또는 부분혈(혈장 또는 혈청)인 시료로부터 검출된 순환 무세포 DNA(circulating cell-free DNA)이다. 이러한 구현형태에서, 시료는 모체 유래의 DNA를 포함할 수 있는데, 이것은 임신여성의 세포(따라서 임신여성의 게놈)에서 비롯된 것이다.
[103] 본 발명의 모든 양태에는, 시료는 조직 시료 또는 생물학적 유체 시료인 구현형태가 포함된다. 특히, 시료는 전혈 또는 부분혈(예를 들어, 혈장 또는 혈청)이다. 대안적 구현형태에서, 시료는 소변, 타액, 땀, 눈물, 가래, 젖(밀크), 유방 흡인물, 질 분비물, 질 세척물, 및 결장 세척물 중의 군에서 선택된 생물학적 유체이다. 보다 특정적인 구현형태에서, 시료는 임신여성의 혈장 또는 혈청 시료, 또는 임신여성의 소변이다. 다른 구현형태에서, 시료는 세포와 거의(또는 본질적으로) 무관하며, 그리고/또는 전체 혈액(전혈) 시료가 아니다.
[104] 본 발명의 모든 양태의 특정 구현형태에서, 태아의 세포 및/또는 태아의 태반으로부터 유래된 전술한 DNA 종은 순환 무세포 DNA이고 상기 시료는 혈장 또는 혈청과 같은 부분혈이다.
[105] 본 발명은 DMR(예를 들어, 제1 또는 제2 표적 DMR 및/또는 기준 DMR)이 태아 DNA에서 크게 메틸화되고 모체 DNA에서 적게 메틸화된 구현형태를 포함한다. 특정 구현형태에서, 이러한 DMR은 유전자(예를 들어, 본 명세서에 개시된 유전자)의 프로모터(promoter), 인핸서(enhancer) 영역, 또는 엑손(exon)에 위치하거나, 또는 상기 영역 및/또는 유전자로부터의 상류 및/또는 하류에 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp를 넘지 않는 DNA 서열에 위치할 수 있다. 대안으로, DMR은 이러한 유전자의 인트론(intron)에, 또는 게놈의 넌코딩 영역에 위치할 수 있다. 본 발명의 모든 양태의 특정 구현형태에서, 상기 게놈 및/또는 유전자는 인간 게놈 또는 유전자이다.
[106] 본 발명은 특히, 상기 DMR(들)에 상기 시약에 특이적인 적어도 하나의, 바람직하게는 적어도 두 개의 메틸화 부위가 포함되는 구현형태를 포함한다. 예를 들어, 상기 시약에 특이적으로 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 초과, 예를 들어, 약 15, 20, 25, 50개, 또는 그 초과의 메틸화 부위가 포함된다.
[107] 염색체 이수성과 관련된 염색체에 위치한 DMR과 관련하여, 본 발명은 본 명세서에 기술된 것들과 같은 염색체에 위치하는 모든 적절한 DMR을 포함한다.
[108] 본 발명의 특정 구현형태에서, 예를 들어 이 방법을 인간의 21번 염색체의 이수성 검출을 실시하도록 구성할 때, 상기 제1 표적 DMR 및/또는 상기 선택적 제2 표적 DMR은 각각, WO 2011/092592에 개시된 것들 중에서 독립적으로 선택된 영역 및/또는 유전자에 위치한다. 또한 상기 제1 표적 DMR 및/또는 상기 선택적 제2 표적 DMR이 WO 2011/092592의 EP1, EP2, EP3, EP4, EP5, EP6, EP7, EP8, EP9, EP10, EP11, 및 EP12(WO 2011/092592의 서열번호 33~44)에서 선택된 것에 위치하는 것도 포함된다. 더 상세한 연구는 Lim 외 2014, BMC Medical Genomics 7:1에 있다.
[109] 본 발명의 다른 특정 구현형태에서, 상기 제1 표적 DMR 및/또는 상기 선택적인 제2 표적 DMR은 각각, AIRE (ENSG00000160224; 인간의 자가 면역 조절 유전자; Chr21:44,285,838~44,298,648 정방향 가닥(forward strand), GRCh38:CM000683.2), SIM2 (ENSG00000159263; 인간 Single-minded homolog 2; Chr21:36,699,133~36,749,917 정방향 가닥, GRCh38:CM000683.2), 및 ERG (ENSG00000157554; 인간 ETS 관련 유전자; Chr21:38,380,027~38,661,780 역방향 가닥(reverse strand), GRCh38:CM000683.2) 중에서 독립적으로 선택된 영역 및/또는 유전자에 위치하거나, 상기 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류로 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp를 넘지 않는 DNA 서열에 위치한다.
[110] 본 발명의 다른 특정 구현형태에서, 상기 제1 표적 DMR 및/또는 상기 선택적인 제2 표적 DMR은 각각, 특히 WO 2007/132176에 개시된 PDE9A (ENSG00000160191; 인간 포스포디에스테라제 9A; Chr21:35,887,195~35,887,807 정방향 가닥; GRCh38:CM000683.2), PPP1R2P2 (ENSG00000234008; 인간 단백질 포스파타제 1, 조절성 (억제제) 서브유닛 2 유사유전자 2; Chr21:35,887,195~35,887,807 정방향 가닥, GRCh38:CM000683.2), CBR1 (ENSG00000159228; 인간 카보닐 환원효소 1 유전자; Chr 21:36,069,941~36,073,166 정방향 가닥, GRCh38:CM000683.2), DSCAM (ENSG00000171587; 인간 다운증후군 세포접착분자 유전자; 염색체 21: 40,010,999~40,847,139 역방향 가닥, GRCh38:CM000683), C21orf29 (ENSG00000175894; 인간 트롬보스폰틴형 라미닌 G 도메인 및 EAR 반복 유전자; 염색체 21: 44,497,892~44,711,580 역방향 가닥, GRCh38:CM000683.2), HLCS (ENSG00000159267; 인간 홀로카르복실라제 틴타제 유전자; 염색체 21: 36,750,888~36,990,236 역방향 가닥, GRCh38:CM000683.2) 중에서 독립적으로 선택된 영역 및/또는 유전자에 위치하거나, 또는, 상기 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류로 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp를 넘지 않는 DNA 서열에 위치한다. 또는, 상기 제1 표적 DMR 및/또는 상기 선택적 제2 표적 DMR은 각각, WO 2007/132176에 개시된 CGI137, 유사성(C.elegans), CGI009, 및 CGI132 중에서 독립적으로 선택된 영역 및/또는 유전자에 위치하거나, 또는, 상기 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류로 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp를 넘지 않는 DNA 서열에 위치한다. 또는, 상기 제1 표적 DMR 및/또는 상기 선택적 제2 표적 DMR은 각각 C21orf57 (ENSG00000182362; ybeY metallopeptidase; 염색체 21: 46,286,337~46,297,751 정방향 가닥, GRCh38:CM000683.2)인 영역 및/또는 유전자 내에 위치하거나, 상기 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류로 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp를 넘지 않는 DNA 서열에 위치한다. 또는, 상기 제1 표적 DMR 및/또는 상기 선택적 제2 표적 DMR은 각각 C21orf57 (ENSG00000175894; 염색체 21: 44,497,892~44,711,580 역방향 가닥, GRCh38:CM000683.2)인 영역 및/또는 유전자 내에 위치하거나, 상기 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류로 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp를 넘지 않는 DNA 서열에 위치한다. 또는, 상기 제1 표적 DMR 및/또는 상기 선택적 제2 표적 DMR은 각각 CGI149 (ENSG00000115561; Charged Multivesicular Body 단백질 3, CHMP3, HGNC:29865; 염색체 2: 86,503,431~86,563,479 역방향 가닥, GRCh38:CM000664.2)인 영역 및/또는 유전자 내에 위치하거나, 상기 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류로 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp를 넘지 않는 DNA 서열에 위치한다(Chim at al. 2008; Yin 외, 2014; Prenat Diagn 34:63). 이러한 구현형태 중에서 특히, 상기 제1 표적 DMR의 적어도 하나(또는 적어도 하나의 선택적 제2 표적 DMR)는 DSCAM 또는 C21orf57 또는 C21orf29 또는 CGI149에 위치하거나, 또는 상기 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류로 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp 를 넘지 않는 DNA 서열에 위치한다. 예를 들어, 상기 제1(또는 선택적인 제2) 표적 DMR들 중 하나는 DSCAM에 위치하고 상기 제1(또는 선택적인 제2) 표적 DMR들 중 다른 것은 C21orf57(또는 C21orf29 또는 CGI149)에 위치할 수 있거나, 또는 상기 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류로 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp를 넘지 않는 DNA 서열에 위치할 수 있다.
[111] 본 발명의 다른 특정 구현형태에서, 상기 제1 표적 DMR 및/또는 상기 선택적 제2 표적 DMR은 각각, WO 2011/034631의 서열번호(Seq ID No.) 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 176, 179, 180, 184, 188, 189, 190, 191, 193, 195, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 221, 223, 225, 226, 231, 232, 233, 235, 239, 241, 257, 258, 259, 및 261로 구성된 목록에서 독립적으로 선택된 영역 및/또는 유전자에 위치하는데, 예를 들어, 모체 DNA에 비해 태아 DNA에서 크게 메틸화되는 것으로 특히 WO 2011/034631에 개시된 상기 영역 및/또는 유전자에서의 서열번호 37, 257, 258, 및 259로 이루어진 목록에서 독립적으로 선택된 영역 및/또는 유전자에 위치한다. 본 발명의 상기 특정 구현형태들의 어떤 형태에서는 특히, 상기 제1 표적 DMR 중 하나는 WO 2011/034631의 서열번호 37(본 출원의 서열번호 51)인 영역 및/또는 유전자 내에 위치하고, 상기 제1 표적 DMR 중 다른 것은 WO 2011/034631의 서열번호 258(본 출원의 서열번호 185) 인 영역 및/또는 유전자에 위치하거나, 또는 상기 제1 표적 DMR 중 다른 것은 WO 2011/034631의 서열번호 239(본 출원의 서열번호 182)인 영역 및/또는 유전자에 위치하거나, 또는 상기 제1 표적 DMR 중 다른 것은 영역 및/또는 유전자에 위치한다 WO 2011/034631의 서열번호 39(본 출원의 서열번호 125)인 영역 및/또는 유전자에 위치하거나, 상기 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류에 약 100bp, 50bp, 40bp, 30bp, 20bp, 또는 10bp 이내에 위치한다.
[112] 본 발명의 다른 구현형태에서, 예를 들어 이 방법이 인간 18번 염색체 이수성의 검출을 하도록 구성될 때, 상기 제1 표적 DMR 및/또는 상기 선택적 제2 표적 DMR은 각각, VAPA-APCDDI (ENSG00000101558; VAMP(vesicle-associated membrane)에 연계된 단백질 A; 염색체 18: 9,914,002~9,960,021 정방향 가닥, GRCh38:CM000680.2) 및 maspin (ENSG00000206075; 다른 말로 SERPINB5; 세르핀 펩티다제 저해제(serpin peptidase inhibitor), clade B(ovalbumin), member 5; 염색체 18: 63,476,761~63,505,085 정방향 가닥, GRCh38:CM000680.2)으로부터 독립적으로 선택된 영역 및/또는 유전자에 위치하거나, 상기 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류에 약 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp를 넘지 않는 DNA 서열에 위치한다. 이러한 특정 구현형태에서, 상기 제1 표적 DMR 및/또는 상기 선택적인 제2 표적 DMR은 각각, EP 1 751 307에 태아 및 그 모체 간에 상이하게 메틸화되는 것으로 기재된 maspin(다른 말로 'SERPINB5') 유전자의 영역에 위치하거나, 상기 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류에 약 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp를 넘지 않는 DNA 서열에 위치한다. 또는 상기 제1 표적 DMR 및/또는 상기 선택적 제2 표적 DMR은 각각, 활성화된 T 세포의 핵 인자, 세포질 1(NFATC1; ENSG00000131196; 염색체 18: 79,395,856~79,529,325 정방향 가닥, GRCh38:CM000680.2)인 영역 및/또는 유전자에 위치하거나, 상기 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류에 약 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp를 넘지 않는 DNA 서열에 위치한다. 또는, 상기 제1 표적 DMR 및/또는 상기 선택적 제2 표적 DMR은 각각, WO 2011/034631의 chr188r00094인 영역 및/또는 유전자에 위치하거나, 상기 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류에 약 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp를 넘지 않는 DNA 서열에 위치한다.
[113] 본 발명의 다른 대안적인 구현형태에서, 상기 제1 표적 DMR 및/또는 상기 선택적인 제2 표적 DMR은 각각, WO 2011/034631의 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32(예를 들어, WO 2011/034631의 서열번호 31/본 출원의 서열번호 17, 또는 WO 2011/034631의 서열번호 23/본 출원의 서열번호 9)로 이루어진 목록으로부터 독립적으로 선택된 영역 및/또는 유전자에 위치하거나(여기서 특히, 상기 영역 및/또는 유전자는 WO 2011/034631에 모체 DNA와 비교하여 태아 DNA에서 많이 메틸화(hypermethylate)된 것으로 기재되어 있다), 상기 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류에 약 100bp, 50bp, 40bp, 30bp, 20bp, 10bp, 또는 5bp 이내에, 특정적으로는, 상기 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류에 20bp 이내에, 더 특정적으로는, 상기 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류에 10bp 이내에 위치한다.
[114] 본 발명의 다른 구현형태에서, 예를 들어 이 방법이 인간 13번 염색체 이수성을 검출하도록 구성될 때, 상기 제1 표적 DMR 및/또는 상기 선택적 제2 표적 DMR은 각각, WO 2011/034631의 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 및 20으로 이루어진 목록으로부터 독립적으로 선택된 영역 및/또는 유전자에 위치한다. 여기서 특히 상기 영역 및/또는 유전자는 WO 2011/034631에 모체 DNA와 비교하여 태아 DNA에서 많이 메틸화되는 것으로 기재되어 있다.
[115] 기준 염색체에 위치하는 DMR과 관련하여, 본 발명은 본 명세서에 기술된 것과 같이, 상기 염색체에 위치하는 임의의 적합한 DMR을 포함한다.
[116] 본 발명의 특정 구현형태에서, 예를 들어 이 방법이 기준 염색체의 검출을 실시도록 구성되는 경우, 상기 기준 DMR의 적어도 하나는(바람직하게는 상기 기준 DMR의 둘 이상의 각각), RASSDF1A (ENSG00000068028; Ras association(RalGDS/AF-6) 도메인 패밀리 멤버 1; 염색체 3: 50,329,782~50,340,980 역방향 가닥, GRCh38:CM000665.2), TBX3 (ENSG00000135111; T-박스 3; 염색체 12: 114,670,254~114,684,164 역방향 가닥, GRCh38:CM000674.2), CDC42EP1 (ENSG00000128283; CDC42 effector protein(Rho GTPase binding) 1; 염색체 22: 37,560,447~37,569,405 정방향 가닥, GRCh38:CM000684.2), PCDHGA1 (ENSG00000204956; protocadherin gamma subfamily A, 1; 염색체 5: 141,330,571~141,512,981 정방향 가닥, GRCh38:CM000667.2), 및 SPN (ENSG00000197471; salophorin; 염색체 16: 29,662,979~29,670,876 정방향 가닥, GRCh38:CM000678.2)으로 이루어진 목록으로부터 독립적으로 선택된 영역 및/또는 유전자에, 또는 SOX14(ENSG00000168875; SRY (sex determining region Y)-box 14; 염색체 3: 137,764,284~137,766,338 정방향 가닥, GRCh38:CM000665.2) 및 ZFY (ENSG00000067646; zinc finger protein, Y-linked; 염색체 Y: 2,935,281~2,982,506 정방향 가닥, GRCh38:CM000686.2)로부터 선택된 영역 및/또는 유전자에 위치하거나, 또는 상기 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류에 약 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp를 넘지 않는 DNA 서열에 위치한다. 또는 MGC15523 (ENSG00000157637; 다른 말로 'SLC38A10', 용질 캐리어 계열 A 10; 염색체 17: 81,245,000~81,295,547 역방향 가닥, GRCh38:CM000679.2)에, 또는 상기 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류에 약 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp를 넘지 않는 DNA 서열에 위치한다. 상기 구현형태들 중에서 특히, 상기 기준 DMR의 적어도 하나는 TBX3 또는 PCDHGA1에 위치하거나, 또는 상기 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류에 약 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp를 넘지 않는 DNA 서열에 위치하는데, 이는 예를 들어, 상기 기준 DMR의 하나는 TBX3에 위치하고 상기 기준 DMR의 다른 것은 PCDHGA1에 위치하거나 상기 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류에 약 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp를 넘지 않는 DNA 서열에 위치하는 경우이다.
[117] 본 발명의 다른 특정 구현형태에서, 상기 기준 DMR은 각각, WO 2011/034631의 SEQ ID NO(서열번호) 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 및 163으로 이루어진 목록으로부터 독립적으로 선택된, 예를 들어, WO 2011/034631의 서열번호 52, 118, 및 142로 이루어진 목록으로부터 독립적으로 선택된 영역 및/또는 유전자에 위치하는데, 여기서 특히 상기 영역 및/또는 유전자는 WO 2011/034631에 모체 DNA에 비해 태아 DNA에서 과량 메틸화(hypermethylate)된다고 개시되어 있다. 본 발명의 상기 특정 구현형태들 중 어떤 형태에서, 상기 기준 DMR들의 하나는 WO 2011/034631의 서열번호 52(본 출원의 서열번호 66)인 영역 및/또는 유전자 에 위치하고, 상기 기준 DMR들의 다른 것은 WO 2011/034631의 서열번호 118(본 출원의 서열번호 102)인 영역 및/또는 유전자에 위치한다.
[118] 표 C는 WO 2011/034631 및 WO 2011/092592에서 사용된 서열번호를 본 발명에서 사용된 서열번호로 변환하는 표이다.
[119] 동일한 염색체에 위치하는 2개의 DMR이 이용되는 경우, 본 발명의 모든 양태의 특정 구현형태에서 이들은 게놈 및/또는 유전자의 동일한 부분에 위치하지 않는다. 예를 들어, 이들 DMR은 약 20kb보다 많이, 또는 약 15kb, 10kb, 8kb, 6kb, 4kb, 2kb, 1kb, 500bp, 또는 200bp보다 많이 분리될 수 있다. 이와 달리, 동일한 염색체에 위치하는 2개(또는 그 이상)의 DMR이 본 발명에서 이용될 때, 특정 구현형태에서 이들은 동일한 영역 또는 유전자(본 명세서에 기재된 것과 같은 것)에 위치할 수 있으며, 또한, 서로 중첩될 수도 있다.
표 C: 서열번호(SEQ ID NO) 변환표
[120] 본 발명의 특정 구현형태에서, 상기 기준 DMR이 2개가 이용되는 경우(또는 2개 이상의 기준 DMR이 이용되는 경우), 상기 기준 DMR의 적어도 하나(바람직하게는 각각)는 RASSF1A 및/또는 TBX3 및/또는 PCDHGA1인 게놈 및/또는 유전자(바람직하게는 인간의)의 부분에, 또는 상기 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류에 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp를 넘지 않는 DNA 서열에 위치하고, 그리고/또는, 상기 기준 DMR의 적어도 하나(바람직하게는 각각)는 RASSF1A(NCBI 기준 서열: NG_023270.1: Homo sapiens Ras association(RalGDS/AF-6) 도메인 패밀리 멤버 1(RASSF1), 염색체 3의 RefSeqGene; 서열번호 13)의 약 4,700bp 내지 5,600bp의 지점에 위치하고, 그리고/또는 TBX3(NCBI 기준 서열: NG_008315.1: Homo sapiens T-box 3(TBX3), 염색체 12의 RefSeqGene; 서열번호 14)의 약 1,660bp 내지 2,400bp의 지점에 위치하고, 그리고/또는 PCDHGA1(NCBI 기준 서열 Homo sapiens 염색체 5, GRCh38.p2 프라이머리 어셈블리: NC_000005.10 GI:568815593; 서열번호 217)의 141,330,571 내지 141,512,981 사이에, 또는 이 서열의 약 141,492,450 내지 141,492,750 또는 141,492,550 내지 141,492,700 또는 141,492,580 내지 141,492,7690 사이에 위치한다. 보다 더 특정한 구현형태에서, (i) 하나의 기준 DMR은 RASSF1A의 약 4,700bp 내지 5,600bp 사이의 지점에 위치하는 것을 포함하고, 제2의 기준 DMR은 TBX3의 약 1,660bp 내지 2,400bp 사이의 지점에 위치하는 것을 포함한다. 또는 (ii) 하나의 기준 DMR은 PCDHGA1(NCBI 기준 서열 Homo sapiens 염색체 5, GRCh38.p2 프라이머리 어셈블리: NC_000005.10 GI:568815593)의 약 141,492,450 내지 141,492,750 또는 141,492,550 내지 141,492,700 또는 141,492,580 또는 141,492,5690 사이의 지점에 위치하는 것을 포함하고, 제2의 기준 DMR은 TBX3의 약 1,660bp 내지 2,400bp 사이의 지점에 위치하는 것을 포함한다.
[121] 특정 구현형태에서, 기준 DMR은 RASSF1A의 약 4,900bp 내지 5,500bp, 5,000bp 내지 5,400bp, 또는 5,100bp 내지 5,300bp 위치 사이의 RASSF1A에 위치한다. 그리고/또는 TBX3(예를 들어, 서열번호 203)의 약 1,800bp 내지 2,260bp, 1,920bp 내지 2,160bp, 또는 1,920bp 내지 2,080bp 위치 사이의 TBX3에 위치한다. 그리고/또는 대략 40,841,600bp 내지 40,841,900bp, 40,841,625bp 내지 40,841,840bp, 또는 40,841,650bp 내지 40,841,790bp 위치 사이의 DSCAM에 위치한다. 그리고/또는 예를 들어, 서열번호 221의 PCDHGA1다(NCBI 기준 서열 Homo sapiens 염색체 5, GRCh38.p2 프라이머리 어셈블리: NC_000005.10 GI:568815593)의 약 141,492,450 내지 141,492,750, 141,492,550 내지 141,492,700 또는 141,492,585 내지 141,492,690 사이 위치에 위치한다.
[122] 본 발명의 특정 구현형태들에서, 상기 제1(또는 제2) 표적 DMR의 2개가 이용되는 경우(또는 두 개보다 많은 제1 또는 제2 표적 DMR이 이용되는 경우), 상기 제1(또는 제2) 표적 DMR들의 적어도 하나(바람직하게는 각각)는 DSCAM 및/또는 C21orf57인 게놈 및/또는 유전자 부분(바람직하게는 인간의)에, 또는 상기 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류에 약 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp를 넘지 않는 DNA 서열에 위치한다. 그리고/또는 상기 제1 (또는 제2) 표적 DMR의 적어도 하나(바람직하게는 각각)는 DSCAM(다운증후군 세포 부착 분자; NCBI 기준 서열 Homo sapiens 염색체 21, GRCh38.p2 프라이머리 어셈블리: NC_000021.9 GI:568815577, 영역 40,010,999~40,847,113, 서열번호 200)의 대략 40,841,584 내지 40,842,020 사이 위치에 위치한다. 그리고/또는 C21orf57(YBEY; 염색체 21: 46,286,337~46,297,751 정방향 가닥, GRCh38:CM000683.2; 250bp 상류/하류 lanking 영역을 포함하는 상기 유전자, 서열번호 218)로부터 상류 및/또는 하류에 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp 이내에 위치한다. 그리고/또는 C21orf29(트롬보스폰틴 유형의 라미닌 G 도메인 및 EAR 반복, TSPEARM; HGNC:1268; 염색체 21: 44,497,892~44,711,580 역방향 가닥, GRCh38:CM000683.2)로부터 상류 및/또는 하류로 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp 이내에 위치한다. 그리고/또는 CGI149(charged multivesicular body 단백질 3, CHMP3; HGNC:29865; 염색체 2: 86,503,431~86,563,479 역방향 가닥, GRCh38:CM000664.2)로부터 상류 및/또는 하류로 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp 이내에 위치한다.
[123] 특정 구현형태에서, 제1 (또는 제2) 표적 DMR은, 예를 들어 서열번호 201인 DSCAM(참조: Homo sapiens 염색체 21, GRCh38.p2 프라이머리 어셈블리: NC_000021.9 GI:568815577, 영역)의 약 40,841,600bp 내지 40,841,900bp, 40,841,625bp 내지 40,841,840bp, 또는 40,841,650bp 내지 40,841,790bp 위치 사이에 위치한다. 그리고/또는 C21orf57의 상류 또는 하류로 약 200bp, 150bp, 또는 100bp 이내에 위치하는데, 예를 들어, 서열번호 219와 같은 염색체 21 정방향 가닥 GRCh38:CM000683.2의 약 46,297,700 내지 46,297,940 46,297,750 내지 46,297,900, 또는 46,297,790 내지 46,297,890 이내에 위치한다. 그리고/또는 C21orf29의 상류 또는 하류로 약 200bp, 150bp, 또는 100bp 이내에, 예를 들어, 서열번호 231과 같은 염색체 21 정방향 가닥 GRCh38:CM000683.2의 약 44,709,100 내지 44,709,900, 44,709,300 내지 44,709,700. 또는 44,709,400 내지 44,709,600 위치 사이에 위치한다. 그리고/또는 CGI149의 상류 또는 하류로 약 200bp, 150bp, 또는 100bp 이내에, 예를 들어, 서열번호 232와 같은 염색체 21 정방향 가닥, GRCh38:CM000683.2의 약 46,667,100 내지 46,667,950, 46,667,300 내지 46,667,750, 또는 46,667,400 내지 46,667,650 위치 사이에 위치한다.
[124] 하나의 한정적이지 않은 예를 들면, 본 발명의 일 구현형태에서,(i) 상기 제1 표적 DMR들의 하나는 DSCAM에 위치되고 제1 표적 DMR들의 다른 것은 C21orf57(또는 C21orf29 또는 CGI149)에, 또는 상기 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류로 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp을 넘지 않는 DNA 서열에 위치하고, (ⅱ) 상기 기준 DMR들 중 하나는 TBX3에 위치하고 상기 기준 DMR 중 다른 것은 PCDHGA1에, 또는 상기 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류로 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp을 넘지 않는 DNA 서열에 위치한다. 상기 구현형태에서는 특히, (i) 상기 제1 표적 DMR 중 하나는 서열번호 201을 포함하고, 상기 제1 표적 DMR 중 다른 것은 서열번호 219(또는 서열번호 231 또는 232)를 포함하며, (ii) 상기 기준 DMR 중 하나는 서열번호 203을 포함하고 상기 기준 DMR 중 다른 것은 서열번호 220을 포함한다.
[125] 실시예 1에서 이용된 상이한 메틸화 기반의 DNA 검출의 DMR 및 타영역 OR 의 개괄적인 배열을 도 2에 나타내었다. (1a) DMR1은 RASSF1A의 엑손(exon) 2에서 발견되며 OR1은 RASS1A의 엑손 4에 위치하는데, 여기서 DMR1은 50,340,672bp 내지 50,340,784bp 사이에 위치하고 OR1은 RASSF1A 게놈 서열(NCBI 기준 서열: NC_000003.12 Homo sapiens 염색체 3, GRCh38 프라이머리 어셈블리)의 50,331,604bp 내지 50,331,702bp 위치 사이에 위치한다. OR1 및 DMR1의 이격 거리는 8,969bp이다. (lb) DMR2는 TBX3의 프로모터(promoter) 영역에서 발견되는바 114,687,095bp 내지 114,687,189bp 사이에 위치하며, OR2는 TBX3 게놈 서열(NCBI 기준 서열: NC_000012.12 Homo sapiens 염색체 12, GRCh38 프라이머리 어셈블리)의 114,676,384bp 내지 114,676,454bp 위치 사이에 위치하며, DMR2와 OR2는 10,640bp의 거리만큼 떨어져 있다. (2) 2개의 DMR에서 DNA 메틸화는, 각각 정방향(F) 및 역방향(R)의 PCR 프라이머 및 영역특화 프로브를 써서 프로브 기반 정량화 PCR을 사용하여 검출된다. 각 프로브는 동일한 표지(P*)로 표지처리된다. (3) 2개의 OR에서 총 DNA는, 각각의 순방향(F) 및 역방향(R)의 PCR 프라이머와 영역특화 프로브를 써서 프로브 기반 정량화 PCR을 사용하여 검출된다. 각 프로브는 OR에 대해 동일한 표지(P**)로 표지처리되는데, 이는 두 DMR에 사용된 표지와 다른 표지이다. 프라이머와 프로브 서열 그리고 프로브 표지의 세부 사항은 표 1에 제시되어 있다.
[126] 본 발명의 비한정적인 구현형태에 이용되는 DMR 및 타영역(OR)의 개괄적 배치가 도 6에 도시되어 있다. (1a) 하나의 제1 표적 DMR(DMR1)은 예를 들어 서열번호 51에 위치하는 것과 같은 예컨대 DSCAM(다운증후군 세포 부착 분자; NCBI 기준 서열 Homo sapiens 염색체 21, GRCh38.p2 프라이머리 어셈블리: NC_000021.9 GI:568815577, 영역 40,010,999 내지 40,847,113, 서열번호 200)에서 발견되고, (lb) 다른 제1 표적 DMR(DMR2)은 예를 들어 서열번호 185에 위치하는 것과 같은 예컨대 C21orf57(YBEY; 염색체 21: 46,286,337~46,297,751 정방향 가닥, GRCh38:CM000683.2; 250bp 상류/하류 flaking 영역을 포함하는 상기 유전자, 서열번호 218)의 상류 또는 하류로 250bp를 넘지 않는 영역에서 발견된다. (1') 제1 기준 DMR(DMR1')은 TBX3(예를 들어, 서열번호 66에 위치하는)의 프로모터 영역에서 발견되고, OR1'은 TBX3(인간 염색체 12)에 위치하는데(2a'), 여기서 DMR1'은 114,687,093bp 내지 114,687,191bp 위치 사이에 위치하고 OR1'은 TBX3 게놈 서열(NCBI 기준 서열: NC_000012.12 Homo sapiens 염색체 12, GRCh38 프라이머리 어셈블리)의 114,676,384bp 내지 114,676,454의 위치 사이에 위치한다. DMR1'과 OR1'은 약 10,600bp 내지 10,810bp의 거리만큼 이격된다(4a'). 그리고 제2 기준 DMR(DMR2')은 PCDHGA1(예를 들어, 서열번호 102에 위치)에서 발견되며, OR2'는 PCDHGA1(인간 염색체 5)에 위치하는데(2b'), 여기서 DMR2'는 위치 141,492,593~141,492,687 사이에 위치하고 OR2'는 PCDHGA1 게놈 서열(NCBI 기준 서열 Homo sapiens 염색체 5, GRCh38.p2 프라이머리 어셈블리: NC_000005.10 GI:568815593)의 141,492,918~141,493,009 위치 사이에 위치하고, DMR2'과 OR2'은 300pb의 거리로 이격된다(4b'). 이와 달리, (1a) DMRl 및/또는 (1b) DMR2는, (x) 예를 들어 서열번호 231에 위치하는 것과 같은 예컨대 C21orf29(TSPEARM; HGNC: 1268; 염색체 21: 44,497,892~44,711,580 역방향 가닥, GRCh38:CM000683.2)의 상류 또는 하류로 250pb를 넘지 않는 영역, 또는 (y) 예를 들어 예를 들어, 서열번호 232에 위치하는 것과 같은 예컨대 CGI149(CHMP3; HGNC:29865; 염색체 2: 86,503,431~86,563,479 역방향 가닥, GRCh38:CM000664.2)의 상류 또는 하류로 250pb를 넘지 않는 영역에서 발견될 수 있다.
[127] 도 6에 도시한 본 발명의 구현형태에서, 두 개의 제1 표적 DMR의 각각은 상이한 검출 표지(들) (1a) 및 (1b)로 검출되고, 2개의 기준 DRM(DRM1' 및 DMR 2')은 동일한 검출 표지(들) (1')로 검출되고, 선택적으로 이용된 2개의 OR(OR1' 및 OR2')은 동일한 검출 표지(들)(3')로 검출된다.
[128] 본 발명의 특정 구현형태는, 방법, 조성물, 키트(또는 그 구성품), 및/또는 이들의 컴퓨터 프로그램 제품의 맥락에서, 특히 표 1, 표 D 또는 표 5, 또는 표 E, 표 8 또는 표 10에 제시된 하나 이상의 전술한 DMR, OR, 프라이머의 서열, 및/또는 프로브를 포함하거나 이들의 사용을 포함한다. 상기 구현형태의 특정한 형태로, 소정의 프로브는 표 1, 표 D 또는 표 5, 또는 표 E, 표 8 또는 표 10에 기재된 서열을 포함하고, 표 1, 표 D 또는 표 5, 또는 표 E, 표 8 또는 표 10에 기재된 것과 같은 표지(label) 및 소거제(quencher) 쌍 중 어느 하나를 포함한다(선택적 임의사항으로, minor binding groove moiety를 부가). 특히, 프로브는 표 1, 표 D 또는 표 5, 또는 표 E, 표 8 또는 표 10에 제시된 바와 같은 표지와 표지-소거제 쌍(선택적 임의사항으로, minor binding groove moiety를 부가함)을 갖는 서열의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 구현형태는, 특히 방법, 조성물, 키트(또는 그 구성품), 및/또는 이들을 위한 컴퓨터 프로그램 제품의 맥락에서, 둘 이상의(예를 들어 모든) 전술한 DMR, OR, 프라이머의 서열, 및/또는 프로브의 특정한 조합, 특히, 표D의 프라이머 또는 프로브를 포함하여 표 1에 기재된 바와 같은 프라이머/프로브의 조합 및/또는 표 5에 제시된 바와 같은 프라이머/프로브의 조합, 보다 구체적으로는, 분석 버전 V10.3에 대한 표 E에 기재된 바와 같은 프라이머/프로브의 조합을 포함하거나 이들 조합의 사용을 포함한다. .
[129] '메틸화 부위(methylation site)'라는 용어는 당업계에서 인정될 것이며, 예를 들어 본원의 다른 곳에 개시된 것과 같이 메틸화 감응성 제한효소에 의해 인식되는 것이 바람직한 짧은 염기 서열(예를 들어, 길이가 4, 6, 8, 10, 또는 12bp 인 것) 내의 CpG 모티프(motif)를 포함하는 의미를 갖는다
[130] 이와 유사하게, 특히, 하나 이상의 OR을 이용하는 본 발명의 구현형태의 맥락에서, OR이 게놈의 특정 부분 및/또는 유전자에 위치할 경우 이 OR은 유전자의 프로모터, 인핸서 영역, 또는 엑손에 위치할 수 있고, 또는 이와 달리 이러한 유전자의 인트론에 또는 게놈의 비암호화(넌코딩) 영역에 위치할 수 있다. 본 발명의 모든 양태의 특정 구현형태에서, 상기 게놈 및/또는 유전자는 인간의 게놈 또는 유전자이다. 특정 구현형태에서, OR이 본 발명에서 이용되고 하나 이상의 DMR을 특징짓는 게놈 및/또는 유전자의 동일한 부분에(바람직하게는 본 발명에서 이용되는 DMR과 중첩되지 않게) 위치하는 경우에, 그것이 위치하는 게놈 및/또는 유전자의 부분은, RASSF1A 및/또는 TBX3 및/또는 PCDHGA1인 유전자(예를 들어 인간 및/또는 특히 상기 DNA 종이 태아 cfDNA인 경우) 또는 상기 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류로 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp를 넘지 않는 DNA 서열, 또는 RASSF1A, TBX3, HLCS, ZFY, CDC42EP1, PCDHGA1, MGC15523, SOX14, 및 SPN 및 DSCAM 및 C21orf57 및 C21orf29 및 CGI149 또는 상기 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류로 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp를 넘지 않는 DNA 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 예로 들 수 있다. 타영역이 DMR과 함께 위치하지 않을 때(예를 들어, 제2 또는 다수의 타영역이 이용될 때), 특정 구현형태에서 타영역은 (예를 들어, 인간의) 하우스키핑 유전자(예를 들어, GAPDH, 베타-액틴, ALB, APOE, 또는 RNASEP)에 위치할 수 있다. 이와 유사하게, 특히 하나 이상의 OR을 이용하는 본 발명의 다른 구현형태의 맥락에서, OR은 게놈의 특정 부분 및/또는 유전자에 위치할 수 있으며, 유전자의 프로모터, 인핸서 영역, 또는 엑손에 위치할 수 있고, 또는 이와 달리 이러한 유전자의 인트론에 또는 게놈의 비암호화(넌코딩) 영역에 위치할 수 있다. 본 발명의 모든 양태의 특정 구현형태에서, 상기 게놈 및/또는 유전자는 인간의 게놈 또는 유전자이다. 특정 구현형태에서, 본 발명에 이용되는 OR은 (예를 들어, 인간의) 하우스키핑 유전자(GAPDH, 베타-액틴, ALB, APOE, 또는 RNASEP) 또는 상기 영역 및/또는 유전자의 상류 및/또는 하류로 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp를 넘지 않는 DNA 서열에 위치할 수 있다. 이와 달리, 상기 OR은 하나 이상의 DMR을 특징짓는 게놈 및/또는 유전자의 동일한 부분(예를 들어, RASSF1A, TBX3, HLCS, ZFY, CDC42EP1, PCDHGA1, MGC15523, SOX14, 또는 SPN 또는 DSCAM 또는 PCDHGA1 또는 상기 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류로 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp를 넘지 않는 DNA 서열)에 위치할 수 있고, 본 발명에 이용된 DMR과 중첩되지 않는 것이 바람직하다.
[131] 하나 이상의 OR을 이용하는 본 발명의 모든 양태의 특정 구현형태에서, 상기 OR은 상기 시약(reagent)에 특이적인 메틸화 부위가 없는 게놈 부분을 포함하고, 상기 OR은 (예를 들어 인간의) 유전자 RASSF1A 또는 TBX(예를 들어, 각각 서열번호 13 및 14) 또는 DSCAM(서열번호 200) 또는 PCDHGA1(서열번호 217) 또는 C21orf57(서열번호 218, 250bp 상류/하류 flaking 영역을 포함하는 유전자) 또는 C21orf29 또는 CGI149 또는 상기 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류로 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp를 넘지 않는 DNA 서열에 위치한다. 그리고 둘 이상의 상기 타영역이 검출 단계 (c)에서 이용되고, 제1 의 타영역은 상기 RASSF1A의 약 14,220bp 내지 13,350bp 사이에 위치하고, 제2의 타영역은 상기 TBX3의 약 12,400bp 내지 13,000bp 사이에 위치하는 보다 특정적인 구현형태가 포함된다. 특정 구현형태에서, 타영역은 RASSF1A에 약 14,230bp 내지 14,340bp, 14,230bp 내지 14,330bp, 14,230bp 내지 14,320bp, 또는 14,230bp 내지 14,310bp 사이의 위치에 위치한다. 그리고/또는 상기 TBX3(예를 들어, 서열번호 204)에 약 12,400bp 내지 12,940bp, 12,700bp 내지 12,850bp 또는 12,710bp 내지 12,790bp 위치 사이에 TBX3에 위치한다. 그리고/또는 예를 들어 서열번호 202와 같은 DSCAM(Homo sapiens 염색체 21, GRCh38.p2 프라이머리 어셈블리: NC_000021.9 GI:568815577, 영역)의 약 40,841,150bp 내지 40,841,525bp, 40,841,200bp 내지 40,841,475bp 또는 40,841,250bp 내지 40,841,425bp 위치 사이의 DSCAM에 위치한다. 그리고/또는 예를 들어 서열번호 221와 같은 PCDHGA1(NCBI 기준 서열 Homo sapiens 염색체 5, GRCh38.p2 프라이머리 어셈블리: NC_000005.10)의 141,492,800 내지 141,493,100, 141,492,850 내지 141,493,050, 141,492,900 내지 141,493,020, 141,492,918 내지 141,493,009 위치 사이의 PCDHGA1에 위치한다. 이와 달리, OR는 예를 들어, 상기 RASSF1A의 약 13,790bp 내지 13,880bp 또는 14,490bp 내지 14,600bp 위치 사이, 또는 상기 TBX3의 약 8,040bp 내지 8,180bp 또는 6,230bp 내지 6,350bp 위치 사이의 엑손에 위치할 수 있다. 또는 OR은 예를 들어 상기 RASSF1A의 약 10,500bp 내지 11,90bp 사이의, 또는 상기 TBX3의 약 10,000bp 내지 11,000bp 사이의 인트론에 위치할 수 있다. 이와 달리, OR은 예를 들어 아래 서열
와 같이 DSCAM에 위치할 수 있는데, 위 서열은 아래와 같은 프로브 및 프라이머로 증폭 및 검출될 수 있다.
표 D: DSCAM 타영역(OR)을 위한 프라이머 및 프로브
* 염료/소거제 없이 뉴클레오티드 서열만 제시함
** 각 프로브에 사용된 염료/소거제는 '[ ]' 안에 표시함
표 E: 실시예 10의 분석법의 시연을 위해 사용된 프라이머 및 프로브
* 염료/소거제 없이 뉴클레오티드 서열만 제시함
** 각 프로브에 사용된 염료/소거제는 '[ ]' 안에 표시함
[132] 현재 임신여성의 순환물(예를 들어, 혈장)에 존재하는 태아 cfDNA(및/또는 총 cfDNA)의 레벨은 조기발병 자간전증(preeclampsia), 경증 및/또는 중증의 자간전증과 같은 한 가지 이상 형태의 자간전증에 대한 지표(marker)라는 강력한 증거가 있다(Hahn 외 2011, Placenta 32(Supl):S17 참조). 본 발명은 임신여성의 혈장에 존재하는 태아 cfDNA의 효율적이며 유효하고 감도가 높고 그리고/또는 변동성이 적은 검출/정량화에 특별한 유용성을 보여 주며, 본 발명은 이에 대한 특별한 유용성을 갖는다. 따라서, 본 발명의 특정 구현형태에서, 개체는 임신과 관련된 의학적 증상을 앓고 있는 데 대한 또는 그 발병에 대한 감수성이 있는(susceptible to) 임신여성(예를 들어, 인간)이다. 특히 여기서 상기 임신과 관련된 의학적 증상은 자간전증이다. 본 명세서에서, 의학적 증상에 '감수성이 있는(susceptible to)' 개체는, 의학적 증상을 앓고 있는 것으로 또는 발병될 것으로 '의심이 간다(is suspected to) 또는 의학적 증상을 앓고 있는 또는 그 발병의 '위험에 처해 있는 것으로 간주된다'로 다르게 표현할 수 있다. 그리고 특정 구현형태에서, 본 발명은 의학적 증상에 대한 감수성이 있는 개체, 또는 의학적 증상을 앓고 있는 또는 발병할 위험이 있는 개체, 또는 의학적 증상을 앓고 있거나 발병될 개체를 선별 및/또는 진단하는 데 이용된다.
[133] 대안적인 구현형태에서, 개체는 조기 진통(preterm labor), 자궁내 성장 지연(intratererine growth retardation), 그리고 쌍태아 소실(vanishing twin) 중에서 선택된 임신관련 의학적 증상을 겪는 데에 또는 그 발병에 감수성이 있는(또는 이러한 위험에 처해 있는 것으로 간주되는) 임신여성(예를 들어, 인간)이다. 특히, 실시예 1과 비교하면, 본 발명의 감도(sensitivity)는, 본 발명 방법에 의해 결정된 cfDNA 레벨과 대용량 병렬처리 시퀀싱법에 의해 결정된 Y 염색체 서열 카운트 사이의 불일치가, 쌍태아 임신(혼합 성별)시 과거에는 단생아 임신으로 여겨졌었던 쌍태아소멸의 한 가지 이상의 사례를 식별하는 데에 그리고/또는 이러한 (혼합 성별) 쌍태아 임신시의 쌍태아들의 상대적 발달 및 건강을 추적하는 데에 유용하도록 한다. 본 발명은 또한, cfDNA로부터 결정된 Y 염색체 서열의 카운트 대비, 태아 cfDNA의 상대 값을 고려함으로써(예를 들어, 병렬처리 시퀀싱법을 이용) 쌍태 임신의 성별 결정에 이용될 수 있다. 이와 관련하여, 모체 혈액에서 무작위 cfDNA 대규모 병렬처리 시퀀싱을 이용하는 접근법은 일반적으로 항상, 특정 Y 염색체의 짧은 서열의 다른 염색체에 대한 상동성(homology) 때문에 모든 여성 임신부에 있는 'Y 염색체' 서열의 매우 낮은 빈도를 계산한다(예를 들어, 모든 서열의 약 0.003% 내지 0.004%, 또는 모든 서열의 약 0.0015% 내지 0.01% 또는 0.002% 내지 0.005%). 그러므로, 여성 시료에 대해서 'Y 염색체' 서열 카운트를 약 0.005%, 또는 약 0.003%, 0.004%, 0.006%, 또는 0.007% 사이로 컷오프할 수 있다.
[134] 본 발명의 모든 양태에서, 메틸화 DNA 및 비메틸화 DNA를 상이하게 변형시키는 시약(reagent)은 바이설파이트(bisulphite) 및/또는 메틸화 DNA보다 비메틸화 DNA를 선택적으로 분해(digest)시키는 제제를 포함할 수 있다(예를 들어, 이 제제는 비메틸화 DNA는 분해시킬 수 있으나 메틸화 DNA는 분해시킬 수 없음). 특정 구현형태에서, 이 시약은, 적어도 하나의 메틸화 감응성 효소; 적어도 하나의 메틸화 감응성 제한효소; 그리고/또는 AatII, AciI, AclI, AfeI, AgeI, AgeI-HF, AscI, AsiSI, AvaI, BceAI, BmgBI, BsaAI, BsaHI, BsiEI, BsiWI, BsmBI, BspDI, BsrFI, BssHII, BstBI, BstUI, ClaI, EagI, FauI, FseI, FspI, HaeII, HgaI, HhaI, HinPlI, HpaI, Hpy99I, HpyCH4IV, KasI, MluI, NaeI, NarI, NgoMIV, NotI, NotI-HF, NruI, Nt.BsmAI, Nt.CviPII, PaeR7I, PluTI, PmlI, PvuI, PvuI-HF, RsrII, SacII, SalI, SalI-HF, SfoI, SgrAI, SmaI, SnaBI, TspMI 및 ZraI, 및 Cac8I 및 PhoI로 이루어진 군에서 선택된 제제를 포함할 수 있다. 특정 구현형태에서, 상기 시약은 BstUI, HhaI 및 HpaII 및 AciI로 이루어진 군으로부터 선택된다.
[135] 관련된 구현형태에서, 시약은 본 명세서에 개시된 임의의 2개 이상의 시약을 포함할 수 있다. 예를 들어, BstUI, HhaI, 및 HpaII로 구성된 그룹에서 선택된 2개 또는 3개의 메틸화 감응성 제한효소를 포함(comprising)하거나 필수적으로 이들로써 구성되는(essentially consisting) 시약을 포함하여 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 그 이상의(예를 들어, 7개, 8개, 또는 10개까지) 메틸화 감응성 제한효소를 포함할 수 있다.
[136] 상이한 메틸화를 연구하기 위한 바이설파이트 또는 메틸화 감응성 제한효소의 용도는 표준 교과서의 교시 또는 Poon 외(2002), Nygren 외(2010), 또는 Yegnasubramanian 외(2006, Nuc Acid Res 34:el9)과 같은 공개된 방법을 적용할 수 있는 당업자가 잘 알 것이다. 본 발명자들은 메틸화 및 비메틸화 DNA를 상이하게 변형시키는 시약으로서 메틸화 감응성 제한효소를 사용하는 예를 여기서 설명하여 제공한다. 바이설파이트를 시약으로서 사용하는 추가적 설명의 경우에, 예를 들어 바이설파이트에 의해 변형되는 DNA 메틸화 부위를, 예를 들어 메틸화 특이적(methylation-specific) PCR을 사용하여(예를 들어, 바이설파이트에 의해 변형된 서열에 선택적으로 결합하는 프라이머 및/또는 프로브를 사용하여) 그리고/또는 후속으로 제한효소를 사용하여서(그 인식 부위(recognition site)는 상기 바이설파이트에 의한 변형시에 생성됨) 검출할 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 메틸화 특이적 PCR('MSP')은 Herman 등(US6200756, EP0954608, 및 관련 패밀리 특허)에 기술되어 있고, 프로브 기반 PCR을 이용한 MSP('메틸라이트(MethylLight)'로 알려져 있음)의 추가 개발은 Laird 등(US6331393, EP1185695, 및 관련 패밀리 특허)에 기술되어 있다.
[137] 본 발명의 모든 양태의 특정 구현형태에서, 제1 또는 제2 DNA 종 및/또는 기준 DNA 종 (및/또는 상기 총 DNA)의 정량적 양(amount)을 검출 및/또는 결정해야 한다. 따라서, 이러한 구현형태에서, 상기 검출 및/또는 결정 단계 중 하나 이상(예를 들어, 각각)에는 정량적 검출 단계가 포함되고, 상기 DNA 종의 검출량은 상기 시료에 존재하는 총 DNA 대비 상기 DNA 종들의 상대 농도로서 표시된다. 예를 들어, 본 발명의 특정 구현형태에서, 전술한 각각의 결정 단계에서, 상기 제1 표적 DNA 종의 상기 결정된 양 및 상기 선택적인 제2 표적 DNA 종의 상기 결정된 양의 각각은, 상기 시료 내의 총 DNA에 대한 상기 제1 표적 DNA 종의 상대 농도 그리고 총 DNA에 대한 상기 선택적인 제2 표적 DNA 종의 상대 농도로 표시된다. 제3(또는 제4) 표적 DNA 종을 검출하는 구현형태에서도 본 발명은 또한 제3(또는 제4) 표적종 DNA의 양을 상대 농도로 표시한다.
[138] 총 DNA의 절대적 양을 안다면 이에 따라 상기 상대 농도로부터 임의의 DNA 종의 절대적 양(예를 들어, μg/mL와 같은 농도로 또는 Eg/mL와 같은 게놈 등가물로 나타냄)을 결정할 수 있다. 특정 구현형태의 경우에, 단계 (c)에서 이용된 것과 동일한 타영역(들)을 이용하여, DNA 양을 알고 있는 표준 시료에서 총 DNA의 양을 검출 및/또는 결정하는 단계; 그리고 상기 표준 DNA 시료로부터 검출된 신호를 단계 (c)에서 검출된 신호와 비교하는 단계를 추가로 포함함으로써, 시료에 대한 총 DNA의 절대적 양을 결정할 수 있다. 이러한 표준 DNA 시료(양/농도를 알고 있음)는 상업적으로 쉽게 구할 수 있으며, 특히 딜루션 시리즈(dilution series)를 사용하여 준비하고 분석한다면 시료에 존재하는 총 DNA의 절대적 양을 (표준 곡선으로부터의 보간/추정에 의해서) 결정하는 데 용이하고 효율적으로 사용할 수 있다. 실제적으로, 이러한 표준 곡선은 선택적 임의사항인 OR에 대해 설명한 것처럼 실질적으로 준비 및 분석할 수 있는데, 이는 DMRs/OR(들)의 검출과 동일한 실행(run)으로(그러나 별개의 표준 용기/반응 세트에서) 행하는 것이 바람직하며, 동일한 반응 마스터믹스(reaction master-mix)를 사용할 수도 있다. 따라서, DNA 대조군의 'DMR(들)'은 상기 표준 DNA에 대해 검출할 수 있지만, 상기 신호는 표준 곡선을 생성하는 데 필요하지 않다. 따라서, 이러한 표준 DNA 시료로부터의 신호를 사용하여 비교하는 경우, 상기 각각의 검출 및/또는 결정 단계에 정량적 검출 단계가 포함되는 특정 구현형태에서는, 상기 DNA 종의 상기 검출량을 상기 시료에 있는 상기 DNA 종들의 절대적 양으로 표시할 수 있게 된다.
[139] 따라서, 본 발명 방법의 일 구현형태에는 다음과 같은 단계들이 추가로 포함된다.
- 단계 (c) 및/또는 단계 (d), 그리고/또는 선택적 임의 단계 (c)' 및/또는 선택적 임의 단계 (f)에서 이용된 동일한 DMR에 대해서, 양을 알고 있는 표준 DNA 시료에서의 DNA 양을 결정하는 단계; 그리고
- 상기 표준 DNA 시료로부터 검출된 각 신호를 단계 (c) 및/또는 단계 (d), 그리고/또는 선택적 임의 단계 (c)' 및/또는 선택적 임의 단계 (f)에서 검출된 각 신호와 비교하는 단계.
[140] 표준 DNA 시료를 활용하는 본 발명의 모든 구현형태들에는, 이 표준 DNA 시료는 기지(알고 있는) 농도의 인간 게놈 DNA 시료인 특정 구현형태가 포함된다. 예를 들어, 이러한 기지 농도의 인간 게놈 DNA는 염색체의 정배수체(euploid) 또는 이수성(aneuploidy)(예를 들어, T21) 보체(complement) 중 하나를 갖는 것으로 알려진 것같은 체외 배양된 인간 세포로부터 얻어진다(예를 들어, 분리 또는 정제). 본 발명의 다른 구현형태에서, 표준 DNA 시료는 합성(synthetic) 또는 가공(engineered)된 기지 농도의 DNA 시료이다.
[141] 당업자에게 명백한 바, 표준 DNA 시료는 (특히 인간 세포 배양으로부터 분리된 경우) 균일하게, 적절하게, 상이하게, 또는 달리 메틸화되지 않을 수 있다. 따라서, 본 발명은 메틸화 및 비메틸화 DNA를 상이하게 변형시키는 시약(본 명세서에 기재된 시약과 같은)으로 표준 DNA 시료를 처리하지 않는 구현형태를 포함한다.
[142] 본 발명의 하나의 특정 구현형태에서, 상기 각 결정 단계에서, 상기 제1 표적 DNA 종 및 상기 선택적인 제2 표적 DNA 종 그리고 상기 기준 DNA 종의 각각의 상기 결정량은, 상기 시료 내의 상기 DNA 종의 절대적 양으로 표시된다. 그러나, 본 발명의 일 양태가, 하나 이상의(예를 들어 2개) 제1 표적 DNA 종(즉, 염색체 이수성와 관련된 염색체)의 결정량을 기준 DNA 종(즉, 기준 염색체)의 결정량과 비교(또는, 상대적 양이나 비율의 고려)하는 것에 관계되기 때문에, 이러한 비교를 수행할 수는 있지만 절대적 양을 고려할 필요는 없다. 설명에 있어서, '기준염색체 신호(signal-Reference-Chromosome)'/'총 DNA 신호(signal-Total-DNA)'에 대한 '표적염색체 신호(signal-Target-Chromosome)'/'총 DNA 신호'의 비율은, 여기서 수학적으로 '총 DNA 신호' 항을 삭제할 수 있기 때문에, '기준염색체 신호'에 대한 '표적염색체 신호'의 비율과 같다. 따라서, 본 발명은 또한, 단계 (e)에서 시료에 존재하는 총 DNA의 양을 모르거나 고려하지 않고 태아에 존재하는 염색체 이수성의 존재(또는 부존재)의 식별이 수행되는 구현형태를 포함한다. 예를 들어, 단계 (e)에서의 결정은 qPCR로부터 생성된 Ct(또는 Cp) 번호들로부터 직접적으로 이루어질 수 있다. 왜냐하면 이들은 정량화되는 DNA 종의 초기 농도(양)에 역관계(inversely correlate)이기 때문이다.
[143] 본 발명의 특정 구현형태에서, 단계 (c) 및/또는 단계 (d), 그리고 선택적 임의 단계 (c)' 및 선택적 임의 단계 (f)에서 다수의 결정 세트(군)가 행해진다. 각 결정 세트는 상기 시료의 DNA의 상이한 분취량(aliquot)을 사용하여 행해지는데, 예를 들어 상이한 용기에서, 그리고 다수 결정 세트의 각 결정과 유효하게 동시에 행해진다. 이러한 다수 결정 세트에 속하는 각 결정은 동일한 시료(예를 들어, 동일한 임신여성에게서 채취한 시료)에 대한 분석(assay)의 '복제본/복제(replicate)'로 취급할 수 있다. 복제본들은, 상이한 용기(vessel)에서(예를 들어 본 발명의 qPCR 구현형태에서 사용되는 것과 같은 동일한(또는 상이한) 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)의 상이한 웰(well)에서) 복제본들에 대한 분석을 수행하도록 이 방법을 구성함으로써, 이 분석 방법에 효율적으로 결합될 수 있다.
[144] 시료의 복제본을 사용하는 본 발명의 구현형태에서, 상기 시료 복제본의 수(다수 결정 세트)는 2 내지 약 50(세트), 예를 들면 2 내지 약 20, 2 내지 약 10, 또는 약 5 내지 약 15(세트)이다. 바람직하게는 상기 결정의 복제 수(결정의 세트수)는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 및 12(세트) 중에서 선택되고, 특정적으로는 약 3 내지 10 세트의 결정, 더 특정적으로는 약 6 세트의 결정이다. 예를 들어, 마이크로타이터 플레이트를 사용하는 분석 구현형태에 있어서 결정 복제의 수는, 본 발명 방법이 마이크로타이터 플레이트의 해당 수의 (상이한) 웰에서 동일한 시료의 여러 분취량들에 대해 실시되는 것으로 대변될 수 있다.
[145] 이 방법에 복제본을 포함시키으로써, 그리고 선택적 임의사항으로서 그것들을 분석함으로써, 예를 들어 이 방법의 강인성, 오류, 또는 기타 변동성에 관한 부가적인 정보를 제공할 수 있고, 따라서 이로부터 결정되는 하나 이상의 DNA 양을 제공할 수 있다. 실제로, 상기 복제본을 사용하는 본 발명의 특정 구현형태에서, 단계 (e) 및/또는 선택적 임의 단계 (e)'에서 결정된 상대적 양(들) 또는 비율(들)은, 단계 (c) 및/또는 단계 (d), 그리고/또는 선택적 임의 단계 (c)' 및/또는 선택적 임의 단계 (f)에서 행해지는 다수 세트의 결정 단계에 의해 결정된다. 이러한 구현형태에서는 각 (복제된) 세트에서 결정된 DNA의 평균(average)(예를 들어, 각 (복제된) 세트별로 결정된 DNA 양의 평균값(mean), 중앙값(median), 또는 최빈값(mode); 바람직하게는 각 (복제된) 세트별로 결정된 DNA 평균값)을 이용하여 DNA 양을 정할 수 있다.
[146] 대안으로서 또는 부가적으로, 본 발명 방법은 상이한 임신여성(예를 들어, 인간)으로부터 각각 채취한 다수의 상이한 시료에 대해 (복제본의 유무에 관계없이) 실시할 수 있다. 이러한 구현형태에서, 특히, 분자 태깅 절차(molecular tagging methodology)가 없을 경우에, 이 방법은 상이한 임신여성으로부터 각각 취한 다수의 시료에 대해 수행되는데, 이 때 각 방법은 별도의 용기에서 수행되며, 다수 시료의 각 시료에 대해 유효하게 동시에 수행된다. 당업자라면 이제 이해할 수 있는 바, 이 방법은 예를 들어 마이크로타이터 플레이트의 다른 웰에서 각 시료에 대해 실시될 수 있다.
[147] 상이한 임신여성에게서 채취된 다수의 시료에 대해 본 발명 방법을 실시하는 경우, 본 방법은 2 내지 약 500개(또는 500개 초과)의 시료, 예를 들어, 2 내지 약 200, 2 내지 약 100, 또는 약 5 내지 약 150 개의 시료에 대해서 실시될 수 있다. 여기서 상기 다수 시료의 개수는 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 및 140개(또는 150개 초과) 중 선택되는 것이 바람직하며, 특정적으로는, 각각 다른 임신여성에게서 채취된 약 60개이다.
[148] 특히, 본 발명의 개시에 따르면, 이제, 다수의 임신여성(예를 들어, 인간)으로부터 다수 시료를 채취하는 방법의 실시가 당업자에게 가능할 것인데, 예를 들어, Roche의 LightCycler 같은 마이크로타이터 플레이트 기반 qPCR 시스템을 사용할 수 있다. 이들 다수 시료는 동일한 마이크로타이터 플레이트의 상이한 웰에 투입할 수 있고, 또는 상이한 마이크로타이터 플레이트에 투입할 수 있다. 이렇게 다수 시료를 포함시키고 분석하는 것은, 특히, 각 시료별로 다수의 복제본을 조합하게 되면, 염색체 이수성의 존재(또는 부존재)의 확인을 보다 더 확실하고 신뢰성있게 할 수 있다. 예를 들어, 모든 (상이한) 시료들에 대해 결정된 양의 상대적 변동량(예를 들어, 표준 편차) 대비, 주어진 시료의 여러 복제본에 대해 결정된 양의 상대적 변동량은, 염색체 이수성 검사를 위한 단계 (e)(또는 선택적 임의 단계 (e)')에서 추가 정보를 줄 수 있다. 예를 들어, 복제본들 간에 양의 차이가 크되 상대적 변동량이 적은 경우, 다른 시료들로부터 온 양의 차이가 존재한다는 더 강한 확신을 줄 것이다.
[149] 또한, 한 번의 실행(run)(예를 들어, 마이크로타이터 플레이트)에 여러 개의 시료(및/또는 복제본)을 포함시킴으로써 각 실행에 적어도 여러 개의 상이한 시료가 포함되어 하나의 실행을 다른 실행과 비교할 수 있는 이익을 얻을 수 있다. 또한 실행들 사이의 비교는 여러 실행들에 공통적인 대조군 또는 표준 시료의 사용에 의해 도움을 받을 수 있으며, 이로써 실행 간에 또는 실행 동안에 측정값 또는 계산값의 정규화(normalisation)를 행할 수 있게 된다. 그러나 각 실행마다 여러 가지 많은 시료(예를 들어, 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 130, 140, 150, 또는 150 초과), 특정적으로, 각 실행에서 약 60가지의 상이한 시료를 사용하므로, 한 번의 실행에서 결정된 양을, 당업자에게 공지되어 있거나 본 명세서의 다른 곳에서 기술된 것과 같은 정규화 방법을 써서 다른 실행과 비교하게 될 것이다.
[150] 본 발명의 특정 구현형태의 한 특징은, 염색체 이수성에 관련된 염색체의 양을 이 염색체에 위치한 2개(또는 그 이상)의 제1 (또는 제2) 표적 DMR을 이용하여 추정하거나 결정한다는 것이다. 이러한 두(또는 그 이상의) DMR 각각으로부터 결정된 양을 사용 및/또는 고려하므로, 태아에 염색체 이수성이 존재(또는 부존재)하는지를 지시하는(indicate) 데의 추가적인 확실성 또는 확신(신뢰성)을 가질 수 있다. 예를 들어, 단 하나의 표적 DMR에 대해서 결정된 양이 염색체 이수성이 존재함을 지시하는 경우, 이는 2개(또는 그 이상)의 표적 DMR에 대해서 결정된 양이 염색체 이수성의 존재를 지시하는 결과보다 확실성 또는 신뢰성이 더 적다고 간주될 수 있는 것이다.
[151] 따라서, 본 발명은, 제1 표적 DNA 종의 양이 제1 표적 DMR 중 하나에서의 메틸화의 검출량으로부터 결정되고, 제1 표적 DNA 종의 양이 제1 표적 DMR 중 다른 것에서의 메틸화의 검출량으로부터 결정되는 구현형태를 포함한다. 이제, 2개(또는 그 이상)의 선택적인 제2 표적 DMR으로부터 결정된 양에 대해 위와 유사한 구현형태를 사용할 수 있음이 명백해질 것이다.
[152] 이러한 구현형태에서 특히, 단계 (e)(및/또는 선택적 임의 단계 (e)')에서 제1 표적 DNA 종의 둘 이상의 양(각각이 상기 하나 이상의 제1 표적 DMR에 대한 양임)별로 둘 이상의 상대적 양(들), 바람직하게는 비율(들)을 결정할 수 있다.
[153] 특정 구현형태에서, 이들 2개 (또는 그 이상의) 양의 조합된 분석, 예를 들어, 2개 이상의 양의 평균값 또는 중앙값을 고려할 수 있다. 또는 이와 달리, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 특정 구현형태에서는, 단계 (e)(및/또는 선택적 임의 단계 (e)')에서 결정된 둘 이상의(바람직하게는 각각의) 상대적 양(들) 또는 비율들을 독립적으로 또는 개별적으로 사용하여, 태아에 염색체 이수성이 존재하는지 아닌지를 고려하거나 결정하거나 나타낼 수 있다. 이러한 '2차원적' 고려 또는 분석은, 도 7에 도시된 바와 같은 산포도를 사용하여 그리고/또는 도 8에 나타낸 것과 같이 대량의 상이한 시료 및 복제본을 사용(선택사항으로서, 실행 간의 정규화를 이용)한 후에 표현하거나 시각화할 수 있다. 이제 명백해질 바, 표적 DMR로서 3개 이상의(가령, 제3의) DMR을 이용하면 더욱 더 확실성이나 신뢰성을 얻게 될 것이며, 특히 본 발명은 더 추가적인 표적 DMR을 이용함으로써, 예를 들어 염색체 이수성의 확인을 더욱 보조하기 위한 '3차원적' 분석을 제공할 수 있을 것이다.
[154] 제1(또는 제2) 표적 DMR에서 각각 결정된 표적 염색체의 양은 임계값 또는 양의 기준 분포과 비교할 수 있다. 특히, 본 발명의 특정 구현형태는, 단계 (e)에서 전술한 상대적 양(들) 또는 비율(들) 중 2개 이상(바람직하게는 각각)을 임계값(들) 및/또는 기준 분포(들)과 비교할 수 있다. 여기서 상기 상대적 양(들) 또는 비율(들) 중 둘 이상(바람직하게는 각각)이 상기 임계값 및/또는 기준 분포(들)보다 큰지 낮은지가 태아내 염색체 이수성의 존재, 부존재를 지시한다.
[155] 본 명세서에 기술된 바, 임계값(들) 및/또는 양의 기준 분포(들)은 외부 기록 또는 정보로부터 지정되거나 제공받을 수 있으며, 또는, 본 발명 방법에 따라 분석된 다수의 시료 및/또는 결정된 양을 사용, 고려, 및/또는 분석하여 정할 수 있다. 따라서, 특정 구현형태에서, 임계값 및/또는 기준 분포는 여러 임신여성으로부터 채취된 다수의 시료로부터 정해질 수 있는데, 전술한 바와 같은 방법을 시료에 대해 실시함으로써 정해질 수 있다. 여기서 선택적 임의사항으로서 (다수 세트의) 결정의 복제는, 예를 들어 명세서에서 제시된 방법을 각 시료에 대해 실시함으로써, 단계 (c) 및/또는 단계 (d), 그리고 선택적 임의 단계 (c)' 및 단계 (f)에 대해서 행해진다.
[156] 본 발명 방법에서 다수의 시료 및/또는 복제본을 분석할 때, 시료들(및/또는 복제본들)은 상이한 그룹 또는 실행(run)(예를 들어, qPCR 실험에서 사용되는 상이한 마이크로타이터 플레이트)에 배치할 수 있다. 이러한 구현형태에서, 상기 다수의 시료/복제본들의 2개 이상의 그룹을 그룹별로(group-by-group) 분석할 수 있는데, 예컨대, 각 그룹을 별도의 실행, 분석, 또는 마이크로타이터 플레이트에서 분석한다. 그리고 각 그룹의 시료에서 결정된 양(들) 또는 비율(들)을 정규화하여 임계값 및/또는 기준 분포를 정한다. '정규화'(normalisation)는 한 그룹의 시료/복제본으로부터 결정된 결과(예를 들어, 양)를 다른 그룹의 결과와 비교하거나 비교가능하게 할 수 있는 임의의 적절한 방법으로 간주할 수 있다. 예를 들어, 하나의 실행(또는 마이크로타이터 플레이트)에서 수행된 분석결과를 다른 실행(또는 마이크로타이터 플레이트)의 분석결과와 비교할 수 있도록 하는 방법이다. 당업자는 다양한 정규화 접근법을 이용할 수 있는데, 여기서 시료 그룹들 간의 상기 정규화는 시료에 특정된(sample-specific) 양 또는 비율(예를 들어, 시료에 대해 여러 세트 행해진 결정의 평균값) 및 상기 특정 시료가 속한 동일 그룹 내의 모든 시료에 대해 결정된 양 또는 비율의 평균(예를 들어, 중앙값) 간의 차이를 고려함으로써 수행될 수 있다. 이에 대해서는 특히 실시예 4에 기술되어 있고 도 8에 도시되어 있다.
[157] 이러한 시료 특이적 양을 감안하면, 태아 내의 염색체 이수성의 존재는, 임계값(들) 및/또는 기준 분포(들)와 비교된 하나 이상의 제1 표적 DMR(바람직하게는 2개 또는 각각)에 대해 결정된 양(들) 또는 비율(들)의 이탈값(outlier)인 해당 태아에 대한 시료 특이적 양 또는 비율에 의해 지시(indicate)될 수 있다. 이러한 구현형태에서 특히, 태아에서의 염색체 이수성의 존재는 아래 (a) 및/또는 (b)에 제시된 위치에 모여있는 수치집단(numerical cluster) 내에 위치하는 해당 태아에 대한 시료 특이적 양 또는 비율에 의해 지시될 수 있다. 즉, (a) 정배수체(euploid)인(또는 추정되는) 다수의 다른 태아에 대한 시료 특이적 양 또는 비율이 모여 있는 수치집단의 외부, 및/또는 (b) 염색체 이수성을 갖는 태아들을 나타내는 다수의 다른 시료들에 대한 시료 특이적 양 또는 비율이 모인 수치집단의 내부 ― 여기서 바람직하게는, 상기 태아들을 나타내는 상기 다수의 다른 시료들은 약 2~10, 12~15, 16~25, 26~30, 32~40, 42~50, 52~75, 78~100 , 105-125, 130-150, 155-175, 180-200, 205-250, 255-300, 305-350, 355-400, 405-450, 455-500개, 및 500개 초과일 수 있다. 관련된 구현형태에서, 이 수치집단은 결정량의 산포도에 원형 또는 난형으로 모여있을 수 있는데, 이 원형 또는 난형 집단의 좌표는 본 방법에서 분석된 시료로부터 사전정의되거나 계산될 수 있다. 따라서 둘 이상의 표적 DMR에서 기준 염색체와 비교하여 결정된 표적 염색체의 양(들)을 이러한 좌표에 대해서, 경계 안에 존재하는 양들을 갖는 시료는 이 시료가 채취된 임신여성이 수태한 태아에 염색체 이수성이 존재한다는 것을 지시한다는 것을 고려할 수 있다. 다양한 정도의 확실성 또는 신뢰도를 갖는 이수성 시료를 정하기 위해 여러 상이한 경계를 설정할 수 있음은 명백할 것이다. 예를 들어, 경계에 가깝게 있는 것들, 또는 경계의 외부에 있지만 제2의 경계 내(소위 '회색 지대')에 있는 것들은 추가 분석 또는 검사의 대상이 될 수 있다. 실제로, 본 발명 방법은 선행 기술의 NIPT 분석법(예를 들어, 차세대 시퀀싱 기반 NIPT 이수성 검사)에서 검사되어야 할 시료의 수를 현저하게 감소시키는 수단으로서 종래의 NIPT 분석 전에 걸러내는(사전차단) 용도로 실시할 수 있다. 예를 들어, 경계의 구획(definition)(예를 들어, '회색 지대'의 시작이 되는 지점)을 이용하여 다수의 음성(negative) 시료를 찾아낼 수 있고(즉, 임신부가 정배수체 태아를 수태하고 있음을 알 수 있음), 따라서 음성이 아닌 것이 확실한 훨씬 더 적은 수의 시료만 종래의 MIPT 분석을 사용하여 검사하면 된다. 수 퍼센트의 거짓양성율을 갖는 이러한 사전차단 작용을 하는 진단 분석법을 사용하여서도, 특히 이러한 분석법의 거짓음성율이 낮은 경우에는 매우 효율적인 사전차단 효과를 얻을 수 있다.
[158] 다른 구현형태에서, 상기 수치집단/원형/난형 분석과 z스코어 분석을 조합할 수 있다. 예를 들어, 수치집단/원형/난형 분석은 정배수체 시료를 식별하기 위해 수행될 수 있고, z스코어 분석(예를 들어, 명세서에 기술된 것)은 이수성 시료를 식별하기 위해 수행될 수 있다. 따라서 이와 같은 상이한 분석 기법의 일치도를 보여주는 시료의 경우에 염색체 이수성의 식별에 대한 확실성은 더 커질 것이다.
[159] 이러한 분석에 앞서 또는 그 일부로서, 하나 이상의 시료, 측정치, 신호, 및/또는 본 방법에서 결정된 양은 하나 이상의 품질 관리 절차 또는 단계의 적용을 받는다. 예를 들어, 시료에 존재하고/존재하거나 시료로부터 추출된 DNA의 농도 및/또는 단편화(fragmentation)의 패턴을 단계 (b) 이전에 고려할 수 있고, 시료를 분석에 포함시키지 않거나 또는 (고농도의 경우에는) DNA를 희석시킬 수 있다.
[160] 특히, 본 발명의 이러한 구현형태에서, 단계 (b) 전에, DNA의 농도는 예를 들어, 단편 분석기(Advances Analytical Technologies 사의 Ankeny, 미국)를 사용하여 예를 들어 DNF-474 고감도 NGS 키트(Advances Analytical Technologies 사의 Ankeny, 미국)로 측정할 수 있다. 80~220bp의 크기에 위치할 수 있으며 평균적으로 165bp에 위치하는 첫 번째 현저한 DNA 농도 피크(peak)를 판정할 수 있는데, 이 피크는 분리된 무세포 DNA를 나타내는 것일 수 있다. 특정 구현형태에서, 이 DNA 농도 피크가 약 0.3 ng/uL보다 높은 것으로 보이는 시료는 약 0.3 ng/uL로 희석한다. 이러한 희석은 저농도 시료와 비교하여 너무 높은 DNA 농도로 인한 시료의 거짓양성 예측을 피할 수 있게 해준다. 이러한 단편 분석을 적용할 수 있는 또 다른 QC(품질관리) 기준에는, (예를 들어, 약 100bp 미만의 크기에서 일어나는 톱니 모양의 피크로 표현되는) 무세포 DNA가 단편화되고/또는 게놈 DNA에 의해 오염된 시료를 검출(예를 들어, 배제)하는 것이 포함된다.
[161] 본 발명의 모든 양태에 포함시킬 수 있는 그 밖의 품질관리 기준에는, 다음의 것들 중 하나 이상이 사실인 경우에만 시료에서 취득한 데이터를 분석에 포함시키는 것이 포함된다.
- 데이터 생성시 복제본의 수가 약 4, 5, 6, 7, 또는 8보다 많다, 그리고/또는
- 이용된 하나 이상의 DMR 또는 옵션으로 이용된 OR에 대한 qPCR 채널에서의 평균값 Cp가 약 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 미만이다, 그리고/또는
- 이용된 하나 이상의 DMR 또는 옵션으로 이용된 OR에 대한 qPCR 채널에서의 Cp 평균값의 표준편차가 약 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 또는 1.0 미만이거나 약 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 또는 1.5 미만이다, 그리고/또는
- 모든 복제본은 이용된 DMR 및 옵션으로 이용된 OR에 대한 모든 qPCR 채널에서 유효한 값을 갖는다, 그리고/또는
- 단편 분석에서, 시료는 약 100bp 아래에서 톱니 모양의 피크를 보이지 않고 및/또는 게놈 DNA로부터의 오염을 보이지 않는다, 그리고/또는
- cfDNA의 농도는 약 0.05, 0.1, 0.15, 0.2 ng/uL보다 크고 및/또는 약 0.3, 0.4, 또는 0.5ng/uL보다 작다, 그리고/또는
- 총 DNA를 측정하는 qPCR 채널에서의 평균값 Cp는 약 22, 24, 25, 26, 27, 또는 28보다 크다.
[162] 시료에 존재하는 총 DNA(및 그에 따라 예를 들어, cfDNA의 태아분(fraction))이 결정되며 또 태아 내의 염색체 이수성의 식별이 이루어지는 본 발명의 구현형태에서, 본 발명 방법은 임신여성이 임신관련 의학적 증상으로 고통 받거나 또는 발병의 위험의 증가를 감지하는 데 적용될 수 있다.
[163] 따라서, 본 발명의 다른 양태는 임신여성이 임신관련 의학적 증상을 앓고 있을 위험 또는 발병의 위험 증가를 감지하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은,
(i) 전술한 본 발명 방법을 수행하는 단계;
(ii) 시료에 존재하는 태아 DNA의 적어도 하나의 양(예를 들어, 절대적 양 또는 상대적 양)을 결정하는 단계, 그리고
(ⅲ) 결정된 태아 DNA의 양을 임계값 및/또는 기준 분포와 비교하는 단계, 여기서 상기 임계값 및/또는 기준 분포로부터 상기 태아 DNA의 양이 증가 또는 이탈(outlying)을 보이는 것은 임신여성이 상기 임신관련 의학적 증상을 앓고 있는 또는 발병할 위험이 증가하는 것을 지시한다.
[164] 상기 위험은 다음의 경우들을 고려하여 대체적으로 또는 추가적으로 평가할 수 있다. 즉, (i) 태아 cfDNA(해당 여성에 대하여 임계값과 비교하여 결정된 양)의 배수 증가(예를 들어, 1.5, 3, 3.5배, 또는 4배 증가)를 고려하되, 후기 임신의 경우에 태아 cfDNA의 배수 증가가 더 크다는 것을 결정 요소로 넣을 수 잇다(Zeybek 외, 2013, J Obstet Gynaecol Res 39:632), 그리고/또는 (ii) 저 위험 여성 또는 자간전증을 겪지 않았거나 발병하지 않은 여성에게서 결정할 수 있는 양의 기준 분포를 고려할 때 여성에서 결정된 것같은 cfDNA의 양의 백분위수(percentile)가 감소하는지를 고려하여서 평가할 수 있다. 예를 들어, 만일 태아분의 cfDNA가 이 양의 기준 분포의 90번째 백분위수(90th percentile) 이내에 있다면 이 여성은 경증 또는 중증의 자간전증을 앓고 있을 위험이 증가한 것으로 간주될 수 있다(Jakobsen 외, 2013, Transfusion 53:1956). 적정 임계값을 정할 때에는 그 외의 관련 인자를 고려할 수 있다. 예를 들어, 유방암을 앓는 임신여성의 경우, 혈장 내에 존재하는 RASSF1A에서의 메틸화의 편향이 두 가지 요인 모두로 인해 더 높을 수 있다.
[165] 이와 유사하게, 본 발명의 이러한 양태의 특정 구현형태는, 검출된 상기 DNA 종의 양을 양의 임계값 및/또는 기준 분포과 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 여기서 상기 DNA 종의 양이 상기 임계값보다 많은 경우(또는 상기 모집단과 비교하여 이탈값이 아닌 경우)는 상기 시료에 존재하는 상기 DNA 종의 이상(abnormality)에 대한 진단을 (바람직하게는 상기 DNA의 별도의 분취량에 대해) 수행할 수 있음을 나타낸다, 예를 들어, 태아분의 cfDNA가 모체 혈장에 존재하는 총 cfDNA의 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 0.5%를 초과(특정적으로는 약 4% 초과, 보다 특정적으로는 약 3% 초과의 태아분 cfDNA)한다면, 태아 cfDNA의 하나 이상의 특성을 조사하기 위해 후속 검사, 예를 들어, 이러한 태아 cfDNA 내에 포함된 돌연변이 염색체 변이의 가능성 또는 존재의 검사(대용량 병렬 시퀀싱에 기초한 NIPT 사용)를 유효하게 수행하기에 충분한 태아분 또는 태아 cfDNA가 있는 것일 것이다. 쌍태 임신의 경우, 본 발명자들은 쌍태 임신의 NIPT를 위한 최소 cfDNA 태아분은 8%, 또는 약 5%, 6%, 7%, 9% 또는 10%로 간주할 수 있다고 결정하였다. 그리고 일치 유전자형(concordant genotype)을 가진 단발성 쌍태 임신의 경우에는(희귀한 예외를 제외하고, Chen 외, 2013, Am J Med Genet A, 161A:1817 참조), cfDNA 태아분은 4%, 또는 약 2%, 3% 또는 5%면 충분할 것이다.
[166] 본 발명의 추가적 양태는 특정 조성물(예를 들어, 본 발명 방법에 유용하거나, 본 발명 방법의 일부로서 사용되거나 생성되는 조성물)에 관한 것이다. 조성물은 다양한 성분의 혼합물 또는 다른 조합일 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 둘(또는 그 이상의) 표지처리된 프로브(예를 들어 qPCR을 위한 핵산 프로브)를 포함하는 조성물을 제공한다. 여기서 각 프로브는 상기 둘 이상의 제1 표적 DMR 중 하나를 검출하기 위한 것이다(예를 들어, 서열번호 51에 위치한 DMR을 검출하기 위한 하나의 프로브, 및 서열번호 185에 위치한 DMR을 검출하기 위한 다른 프로브). 특히 이러한 구현형태에서, 조성물에 존재하는 둘 이상의 상기 프로브는 상이한 검출 표지(들)로 표지처리된다. 프로브(및 표지)는 본 명세서에 개시된 제1 표적 DMR들 중 하나를 위한 것일 수 있다. 특히, 표 1 및/또는 표 5 및/또는 표 E 및/또는 표 8 및/또는 표 10에 나타낸 것일 수 있다. 조성물은 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 5개 초과의 제1 표적 DMR을 검출하기 위한 프로브를 포함할 수 있고, 본 명세서의 다른 곳에서 설명된 바와 같은 검출 표지(들)로 표지처리될 수 있다.
[167] 이러한 양태의 특정 구현형태에서, 조성물은 하기 추가 성분 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
- 두 쌍 이상의 PCR 프라이머. 각 쌍은 상기 2개 이상의 제1 표적 DMR 중 하나를 증폭하기 위한 것으로, 예를 들어 조성물 내의 프로브 검출을 위한 제1 표적 DMR을 증폭하기 위한 것이다(예를 들어, 서열번호 51에 위치하는 DMR을 증폭시키는 하나의 프라이머쌍, 그리고 서열번호 185에 위치하는 DMR을 증폭하기 위한 다른 프라이머쌍), 그리고/또는
- 둘 이상의 표지처리된 프로브(예를 들어, qPCR을 위한 핵산 프로브). 각 프로브는 상기 둘 이상의 기준 DMR 중 하나를 검출하기 위한 것이다(예를 들어, 서열번호 66에 위치한 DMR을 검출하기 위한 하나의 프로브, 그리고 서열번호 102에 위치하는 DMR을 검출하기 위한 다른 프로브). 특히 상기 구현형태에서, 조성물에 존재하는 두 개 이상의 또는 상기와 같은 프로브는 동일한 검출 표지(들)로 표지처리된다. 프로브(및 표지)는 본 명세서에 개시된, 특히 표 1 및/또는 표 5 및/또는 표 E에 개시된 기준 DMR들 중 하나에 대한 것일 수 있다, 그리고/또는
- 두 쌍 이상의 PCR 프라이머. 각 쌍은 상기 둘 이상의 기준 DMR 중 하나를 증폭하기 위한 것으로, 예를 들어, 조성물 내의 프로브 검출을 위한 기준 DMR을 증폭하기 위한 것이다(예를 들어, 서열번호 66에 위치하는 DMR을 증폭시키는 하나의 프라이머쌍, 그리고 서열번호 102에 위치하는 DMR을 증폭하기 위한 다른 프라이머쌍).
[168] 이러한 양태의 대안적 또는 추가적 구현형태에서, 조성물은 하기의 추가 성분 중 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
- 적어도 한 쌍의 추가 프라이머(바람직하게는 두 쌍의 추가 프라이머쌍). 각 쌍은 상기 적어도 하나의 OR들 중 하나를 증폭하기 윗한 것이다, 그리고/또는
- 적어도 하나의 추가 표지처리 프로브(바람직하게는 2개의 추가 표지처리 프로브). 각 프로브가 전술한 OR의 적어도 하나를 검출한다. 특히 이러한 구현형태에서, 조성물에 존재하는 두 개 이상의 또는 이와 같은 프로브는 동일한 검출 표지(들)로 표지처리된다. 프로브(및 표지)는 본 명세서에 개시된, 특히 표 1 및/또는 표 D 및/또는 표 5 및/또는 표 E에 개시된 OR들 중 하나를 위한 것일 수 있다.
[169] 이러한 양태의 또다른 대안적인 또는 추가적인 구현형태에서, 조성물은, 특히 제1 표적 DMR보다 제2 표적 DMR이 염색체 이수성과 관련된 다른 염색체에 위치하는 경우에, 하나의, 둘의, 또는 셋 이상의 제2 표적 DMR을 증폭 및/또는 검출하기 위한 하나 이상의 추가 성분을 더 포함할 수 있다.
[170] 본 발명의 또다른 추가적인 양태는 키트이다(예를 들어, 분리된 성분들의 키트 ― 여러 성분을 보유하고 있는 홀더나 용기인 키트). 이러한 키트는 프라이머 및/또는 프로브의 조합을 포함하는데, 이 조합은 본 발명의 조성물에 관련하여 기술된 바와 같다. 예를 들어, 본 발명의 키트는 두 개의(또는 그 이상의) 표지처리된 프로브(예를 들어, qPCR용의 핵산 프로브)를 포함할 수 있다(묶음으로 또는 별도로 또는 혼합하여). 여기서 각 프로브는 상기 둘 이상의 제1 표적 DMR 중 하나를 검출하기 위한 것이다(예를 들어, 서열번호 51에 위치한 DMR을 검출하기 위한 하나의 프로브, 및 서열번호 185에 위치한 DMR을 검출하기 위한 또 다른 프로브). 예를 들어, 키트에 존재하는 2개 이상의 프로브는 상이한 검출 표지(들)로 표지처리된다. 추가적인 프로브 및/또는 프라이머(본 발명의 조성물의 맥락에서 기술된 것과 같은)가 선택사항(옵션)으로 본 발명의 키트에 포함될 수 있다(예를 들어, 서열번호 51에 위치하는 DMR을 증폭하기 위한 하나의 프라이머쌍 및 서열번호 185에 위치한 DMR을 증폭하기 위한 또 다른 프라이머쌍, 및/또는 서열번호 66에 위치한 DMR을 검출하기 위한 하나의 프로브 및 서열번호 102에 위치한 DMR을 검출하기 위한 또 다른 플포브, 및/또는 서열번호 66에 위치한 DMR을 증폭하기 위한 하나의 프라이머쌍 및 서열번호 102에 위치한 DMR을 증폭하기 위한 또 다른 프라이머쌍).
[171] 특정 구현형태에서, 키트 또는 조성물에 존재하는 프로브 및/또는 프라이머의 서열은, 서열 특이적 방식으로, 바이설페이트 변환된 DNA를 검출하도록 변형될 수 있다. 예를 들어 이러한 서열 변형된 프라이머 또는 프로브는 본 발명 방법의 MSP 또는 메틸라이트(MethylLight) 구현형태를 위해 사용되거나 이에 유용할 수 있다.
[172] 본 발명의 키트는 임신여성에 수태된 태아의 염색체 이수성의 검출 및/또는 임신여성이 의학적 증상을 앓고 있는 또는 발병할 위험이 증가하는 것을 감지하는 데 사용될 수 있거나 이에 유용할 수 있다.
[173] 또다른 구현형태에서, 본 발명의 키트는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트는 추가로, (i) 본 발명 방법을 실시하기 위한 그리고/또는 본 발명 조성물을 제조 또는 사용하기 위한 상기 프라이머 및/또는 프로브의 사용 지침이 담긴 인쇄 매뉴얼 또는 컴퓨터 판독가능 메모리, 및/또는 (ii) 본 발명 방법의 실시 및/또는 본 발명 조성물의 제조 또는 사용에 유용한 하나 이상의 다른 품목, 구성품, 또는 시약, 그리고 이러한 실시 또는 제조에 유용한 본 명세서에 기재된 모든 품목, 구성품, 또는 시약을 더 포함한다. 예를 들어, 상기 키트는 상술한 메틸화 및 비메틸화 DNA를 상이하게 변형시키는 시약, Taq 폴리머라제, 및/또는 반응 완충액 등을 추가로 포함할 수 있다.
[174] 다른 비한정적 예시로, 본 발명의 키트는 하기 구성품 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
- 상기 임신여성으로부터 채취된 혈액 등의 조직 시료를 수집 및/또는 저장하는 수단. 바람직하게 이 수단은 채혈 튜브임. 및/또는
- 상기 임신여성으로부터 채취된 시료로부터 DNA(바람직하게는 무세포 DNA)를 추출하는 수단. 바람직하게 이 수단은 무세포 DNA 추출 키트임, 및/또는
- 본 발명 방법의 맥락에서 기술된 상기 수단들 중 하나 또는 모두를 식별, 취득, 및/또는 사용하기 위한 지침이 포함된 인쇄된 매뉴얼 또는 컴퓨터 판독가능 메모리, 및/또는
- 본 발명의 컴퓨터 프로그램 제품, 또는 이러한 컴퓨터 프로그램 제품에 액세스하거나 그 결과를 생성하는 방법에 관한 지침.
[175] 조성물 또는 키트의 특정 구현형태에서, 여기에 포함되는 프라이머 또는 프로브 중 하나 이상은 표 1, 표 D 및/또는 표 5 및/또는 표 E 및/또는 표 8 및/또는 표 10에 기재된 것 중에서 선택된 프라이머 또는 프로브 서열을 포함한다(또는 이 서열로 구성된다). (선택사항으로서, 상기 표에 프로브에 대해서 제시된 검출 표지(들)이 사용된다.) 이러한 특정 구현형태에서, 조성물 또는 키트는 표 5에 기재된 바와 같은(또는 표 E에 제시된 각 분석 버전 V10.1, V10.2, V10.3, V10.4, V10.5, 및 V10.6, 특히, 분석 버전 V10.3과 관련된) 프라이머쌍 및 프로브를 포함하는데, 이 프라이머쌍 및 프로브는 (x) 두 제1 표적 DMR의 각각, (y) 두 기준 DMR의 각각에 사용되며, 그리고 선택적(옵션)으로, (z) 하나 또는 두 개의 OR과 함께 사용된다. 특히, 제1 표적 DMR을 위한 프로브는 상이하게 표지처리되고, 2개의 기준 DMR을 위한 프로브는 동일한 검출 표지(들)로 표지처리되고, 2개의 OR을 이용한다면 이들을 위한 프로브는 동일한 검출 표지(들)로 표지처리된다.
[176] 특정 구현형태에서, 프로브는 이러한 프로브에 대해 표에 기재된 바와 같이 표지/소거제(및 선택적으로 minor groove binding moiety)로 표지처리될 수 있다.
[177] 다른 양태에서, 본 발명은 명세서에서 정의된 프라이머 또는 프로브 중 하나의 서열, 또는 증폭된 DMR의 서열로 구성되는(또는 이를 포함하는) 핵산(nucleic acid)을 제공하는데, 이 핵산은 합성된(synthetic), 분리된(isolated), 및/또는 정제된(purified) 핵산인 것이 바람직하다. 특정 구현형태에서, 프라이머는 검출 표지에 공유 결합된다. 특정 구현형태에서, 이러한 프로브 및/또는 프라이머의 서열은 서열 특이적 방식으로 바이설페이트 변환된 DNA(bisulphite converted DNA)를 검출하기 위해 변형(modify)시킬 수 있다. 예를 들어 이러한 서열 변형된 프라이머 또는 프로브는 본 발명 방법의 MSP 또는 메틸라이트 구현형태에 유용할 수 있다.
[178] 다른 양태로, 본 발명의 키트는 하나 이상의 상기 핵산과 함께 다음의 것들을 포함할 수 있다. 즉, (i) 상기 핵산을 본 방법에 관련하여 식별, 취득, 및/또는 사용하기 위한 지침이 포함된 인쇄 매뉴얼 또는 컴퓨터 판독가능 메모리, 및/또는 (ii) 본 발명의 컴퓨터 프로그램 제품, 또는 이러한 컴퓨터 프로그램 제품에 액세스하거나 그 결과를 생성하는 방법에 관한 지침. 이러한 키트는 본 명세서에 기재된 모든 품목, 구성품, 또는 시약을 포함하여, 본 발명 방법의 실시에 유용한 그리고/또는 이러한 실시 또는 제조에 유용한 하나 이상의 다른 품목, 구성품, 또는 시약 등의 추가 구성품을 더 포함할 수 있다.
[179] 본 발명의 또 다른 양태는, 임신여성에 의해 임신되는 태아의 염색체 이수성을 검출하기 위해 이 임신여성에게서 채취한 시료에 대한 검출 연산(operation)을 수행 및/또는 관리하도록 컴퓨팅 시스템을 제어하기 위한 다수의 명령어로 인코딩된 컴퓨터 판독가능 매체를 포함하는 컴퓨터 프로그램 제품에 관한 것이다. 상기 시료는 모체에서 유래한 상이하게 메틸화된 DNA와 혼합된 태아 및/또는 태아 태반에서 유래한 DNA를 포함하고 있고, 상기 시료에 존재하는 DNA를 본 발명 방법에서 일어나는 메틸화된 DNA 및 메틸화되지 않은 DNA를 상이하게 변형시키는 시약으로 처리한다. 상기 검출 연산은 아래의 단계를 포함한다.
- (i) 본 발명의 방법의 단계 (c)에서 설명한 바와 같이 상기 시료에 존재하는, 염색체 이수성에 관련된 염색체인 제1 표적 DNA종의 양을 각각 나타내는 2개(또는 그 이상)의 신호, 및 (ii) 본 발명의 방법의 단계 (d)에서 설명한 바와 같이, 상기 시료에 존재하는, 하나 이상의 기준 염색체인 기준 DNA 종의 양을 나타내는 하나의 신호를 수신하는 단계;
- (ii)에서 수신된 신호가 나타내는 기준 염색체의 양 대비 (i)에서 수신된 적어도 하나의 신호(바람직하게는 두 신호)가 나타내는 염색체 이수성에 관련된 염색체의 적어도 하나의(바람직하게는 둘) 상대적 양(들)에 기초하여, 상기 임신여성이 수태한 태아에 염색체 이수성이 존재할 가능성이 있는지의 유형(classification)을 정하는 단계. 여기서 적어도 하나(바람직하게는 적어도 둘)는 태아 내의 염색체 이수성의 존재 또는 부존재를 지시한다.
[180] 본 발명의 컴퓨터 프로그램 제품의 특정 구현형태에서, 상대적 양은 위 (i)에서 수신된 2개(또는 그 이상)의 신호로부터 계산되거나 생성될 수 있다. 예를 들어, 평균값, 중앙값, 및/또는 z스코어가 계산 또는 생성된다.
[181] 컴퓨터 프로그램 제품의 다른 특정 구현형태에서, 단계 (c) 및 단계 (d)에서 결정된 상기 DNA의 양을 나타내는 신호들은, 상기 시료의 동일 분취량을 사용하여, 그리고 동일한 용기에서 만들어질 수 있고, 또 상기 제1 표적 DMR들 및 상기 기준 DMR들에 대해 유효하게 동시에 만들어질 수 있다. 그리고 선택사항으로, (x) 상기 기준 DMR의 적어도 2개(바람직하게는 각각)에 대해 동일한 검출 표지(들)를 사용하여서, 그리고 (y) 상기 제1 표적 DMR의 적어도 둘(바람직하게는 각각)에 대해 상이한 검출 표지(들)를 사용하여서 만들어질 수 있다.
[182] 컴퓨터 프로그램 제품에 의해 제어되는 상기 연산은 임계값(들) 및/또는 기준 분포(들)와 비교함으로써 상기 유형을 정할 수 있는데, 여기서 상기 상대적 양(들) 또는 비율(들) 중 하나 이상(바람직하게는 2 이상)이 상기 임계값(들) 및/또는 기준 분포(들)보다 높거나 낮은 것은 태아에 염색체 이수성이 존재하는지를 지시한다. 특히, 상기 연산은, 상이한 임신여성로부터 각각 채취한 다수의 시료에 관련된 상기 (ⅰ) 및 (ⅱ)의 다수의 신호를 수신함으로써 상기 다수의 시료로부터 상기 임계값(들) 및/또는 기준 분포(들)을 계산하는데, 여기서 선택사항으로 상기 다수의 시료는 본 발명 방법에 의해 하나 이상의 시료 그룹에서 분석된다. 그리고 상기 방법은 별도의 용기에서 특정 그룹에 속하는 각 시료에 대해 수행되며, 해당 그룹 내 다수 시료들의 다른 구성 시료와 유효하게 동시에 수행된다.
[183] 컴퓨터 프로그램 제품의 특정 구현형태들에서, 상기 연산은 이하 단계들을 하나 이상 추가로 포함한다.
- 현재의 상기 태아 DNA의 양을 상기 임계값 및/또는 기준 분포와 비교하여 임신여성이 임신관련 의학적 증상을 앓고 있는 또는 발병할 위험이 증가하는지의 유형을 정하는 단계. 여기서 상기 임계값 및/또는 기준 분포로부터 상기 태아 DNA의 양이 증가하거나 이탈값을 보이는 것은 임신여성이 상기 임신관련 의학적 증상을 앓고 있는 또는 발병할 위험이 증가한 것을 지시한다. 그리고/또는
- 예를 들어 본 명세서에 개시된 것과 같은 품질관리 계산, 품질관리 프로세스, 또는 품질관리 단계.
[184] 본 발명의 특정 구현형태에서, 품질관리 계산, 품질관리 프로세스, 또는 품질관리 단계는 모든 결정 단계 전에 수행되도록 할 수 있다. 이렇게 할 경우에, 요구되는 QC(품질관리) 기준을 통과하지 못하는 시료/분석은 더 이상의 단계, 프로세스, 또는 분석에 포함시키지 않는다.
[185] 특정 문제 또는 환경에 본 발명의 교시를 적용하고 본 발명의 변형예 또는 추가 특징(예를 들어, 추가 양태 및 구현형태들)을 특정 문제 또는 환경에 포함시키는 것은 본 명세서에 포함된 교시에 비추어 당해 분야의 통상의 기술을 가진 자(당업자)의 능력에 속할 것이다.
[186] 문맥상 달리 의미하지 않는 한, 전술한 특징들에 대한 설명 및 정의는 본 발명의 특정 양태 또는 구현형태에 한정되지 않으며 설명된 모든 양태 및 구현형태에 동등하게 적용된다.
[187] 본원에 인용된 모든 참고문헌, 특허, 및 출판물은 그 전체적으로 본원의 인용문헌으로서 여기에 포함된다.
[188] 이제, 이상에서 제시한 내용, 도면, 표를 참조하여 본 발명의 특정 양태(aspect) 및 구현형태(embodiment)의 실시예(example)를 설명하기로 한다. 본 발명의 방법, 용도, 및 기타 다른 측면에 대하여 이하의 실시예들은 대표적인 것일 뿐, 본 발명의 범위를 이 대표 실시예로 한정하여서는 아니 된다.
[189] 실시예 1(비교예): 쌍태아소멸의 경우를 포함한 다태 임신에서의 MGS 기반 NIPT 수행 전의 정량화 단계에서 상이한 메틸화 기반 DNA 검출법을 사용함.
[190] 시료 채취, 가공, 및 DNA 추출:
[191] 연구 개발(R&D) 목적 및 일상적인 비침습성 출산전 검사(NIPT) 연구실 절차의 일환으로 2012년 11월 6일부터 2013년 11월 16일까지의 다태 임신(단융모막, 2융모막, 3융모막 쌍태아(mono-, di-, trichorionic twin), 및 세쌍둥이 임신)을 한 임신여성에서 36개의 혈액 시료를 수집했다. 혈액 시료 한 개는 세쌍둥이 임신여성에게서 채취하였고 나머지 35개 시료는 쌍둥이 임신부에서 채취했다. 다태 임신을 한 임신여성 각인으로부커 각각 7~10ml의 정맥혈 시료 2개를 Streck 무세포 DNA 채혈 튜브(Streck)를 사용하여 채집했다. 혈액 시료는 진단 실험실로 최장 이송 기간 4일로 이송하였다. 본원에서 분석된 임신여성으로부터의 다른 혈액 시료도 이와 유사하게 채집되었다.
[192] 원심 분리(4℃에서 10분 동안 1600g)에 의해 혈장을 준비하였고 두 번째 원심 분리 단계(4℃에서 10 분 동안 16000g)에 의해 혈장을 분리하였다. 최종 용리부피(elution volume) 60ul의 AVE-완충액(Qiagen)과 함께 3.0~4.0 ml의 혈장을 사용하는 제조자 프로토콜에 따라 QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(Qiagen)를 사용하여 전체 무세포 DNA(cfDNA)를 추출하였다.
[193] DNA 정량화:
[194] 상이한 메틸화 기반 DNA 검출법을 사용하여 태아분 cfDNA를 상대 농도와 절대적 양으로 결정하기 위해 태아 무세포 DNA(태아 cfDNA)를 전체 무세포 DNA(총 cfDNA)에 대해서 검출하고 정량화하였다. 용리된(eluted) 무세포 DNA로부터, CutSmartTM Buffer(New England Biolabs)를 사용하여 22ul 반응에서 CpG 메틸화 감응성 효소 HhaI(0.4U/ul), HpaII(0.3U/ul), 및 BstUI(0.3U/ul)를 써서 11ul를 분해하였다(digest). 반응물을 37℃에서 60분간, 60℃에서 60 분간 배양(incubate)하였다. Digest 반응으로부터의 10ul를 정량적 프로브 기반 PCR을 위한 템플릿 DNA로 사용하였다(반응은 중복해서 수행하였음). 이에 대해서는 이하에서 간략히 설명한다.
[195] 2배 농축된 PCR 마스터믹스(QuantiFast Multiplex PCR Kit, Qiagen)를 사용하여 25ul PCR 반응을 수행하였다. 태아 및 모체 DNA 간에 상이하게 메틸화된 각 영역(DMR)의 CpG 메틸화 감수성 제한효소 부위에 걸쳐있는(span) 프라이머를 상기 DMR을 위한 FAM 표지처리된 프로브와 조합하여 사용하였고, 어떠한 제한효소 부위 ― 태아와 모체 DNA 간에 상이하게 메틸화되지 않은 타영역(OR) ― 에도 걸쳐있지 않은 프라이머는 이들 OR에 대한 VIC 표지처리된 프로브와 조합하여 사용하였다. 이 실시예에서 사용된 프라이머 및 표지처리된 프로브의 서열은 표 1에 기재되어 있으며, 정량적 프로브 기반(TaqMan) PCR(LightCycler 480II Instrument; Roche)에 사용된 열순환기의 제원은 표 2에 기재되어 있다. 이 실시예에서, 두 DMR의 존재를 검출하는 데 사용한 프로브들은 각각, 동일한 검출가능 FAM(fluorescein amidite) 형광 모이어티(moiety)로 표지처리하고, 또 각각, 동일한 MGB(minor binding grover) 비형광 소거제(NFQ) 모이어티로 표지처리하였고, 두 OR의 존재를 검출하는 데 사용한 프로브들은 각각, 동일한 검출가능 VIC(Life Technologies) 형광 모이어티로 표지처리하고, 또 각각, 동일한 MGBNFQ 모이어티로 표지처리하였다.
표 1: 정량적 (프로브 기반) PCR 구성품
* 염료/소거제 없이 뉴클레오티드 서열만 제시함
** 각 프로브에 사용된 염료/소거제는 '[ ]' 안에 표시함
표 2: 열순환기(Thermocycler) 제원
[196] 이 실시예에서 사용된 상이한 메틸화 기반 DNA 검출 분석안은, 모체 DNA에서 저도 메틸화되고 태아 DNA에서 과다 메틸화되는 것으로 기술된 2개의 마커 DMR에 기초하며(Nygren 외, 2010: Clin Chem 56, 1627; Chan 외, 2006:Clin Chem 42, 2211; Chiu 외, 2007:Am J Pathol 170, 941), 아울러 그들의 DMR의 약 20bp 내지 20kb 사이에 위치하는 모체 및 태아의 DNA 사이에 상이하게 메틸화되지 않는 두 개의 타영역(OR)에 기초한다. 특히, RASSF1A에 있는 메틸화 불감응 유전자좌위(locus)는 RASSF1A에 있는 메틸화 감응 유전자좌위의 하류로 8kb 내지 9kb 사이(8.97 kb)에 위치하며, TBX3에 있는 메틸화 불감응 유전자좌위는 TBX3에 있는 메틸화 감응 유전자좌위의 하류로 10kb 내지 llkp 사이(10.64 kb)에 위치한다. 도 2는 이 실시예에서 이용된 2개의 DMR 및 2개의 타영역의 각각의 배치 및 검출 양식을 도시한다.
[197] 표준으로서 농도를 알고 있는 남성 게놈 DNA(Promega)의 시리얼 딜루션(serial dilution)을 템플릿으로 사용하여 병렬 프로브(parallel probe) 기반의 정량화 PCR 반응을 수행하였다(동일한 PCR 실행(run) 내에서 별도로 반응시킴). VIC 채널(OR들. 즉 총 cfDNA 검출) 대비, FAM 채널(DMR. 즉 태아 cfDNA 검출)에서의 신호들을 상대적 정량화하여 cfDNA의 태아분을 계산하였고, 기지 농도의 표준 DNA의 딜루션 시리즈에서 얻은 VIC 채널에 비교하여 시료에서 얻은 VIC 채널의 신호들을 절대적 정량화하여서 총 cfDNA의 절대적 양을 계산하였다. 이러한 상대적 및 절대적 정량화는 LightCycler 480 소프트웨어 릴리스 1.5.0(Roche)을 사용하여 수행하였다.
[198] 태아 이수성의 확인을 위한 모체 혈장 DNA 시퀀싱 및 데이터 분석:
[199] Illumina의 NEBNext Ultra™ DNA 라이브러리 준비 키트를 사용하여 DNA 시퀀싱 라이브러리를 준비했다. 라이브러리는 Hamilton STARplus 로봇에 자동화된 제조자 프로토콜에 따라 준비하였다. 라이브러리의 질(quality) 및 양(quantity)은 Bioanalyzer 장비(Agilent) 및 Qbit 형광측정기(Invitrogen)를 사용하여 측정하였다. 라이브러리에 기초하여 정량화 딜루션 및 동몰의(equimolar) 시료 풀(pool)(풀당 시료 12개)을 준비하였다. 시료 풀의 시료들을 Illumina HiSeq2000 시퀀서의 Illumina v3 플로우 셀의 한 레인에서 시퀀싱했다. 제조자 프로토콜에 따라 cBot 클러스터 생성 시스템에서 TruSeq SR 클러스터 키트 v3-cBot-HS를 사용하여 클론 클러스터를 생성하였다. 이전에 설명한대로 태아 염색체 이수성을 확인하기 위한 생물 정보학 분석을 수행하였는데, 여기서 z스코어≥3이면 태아의 21번 삼염색체가 존재함을 지시하는 것이다(Stumm 외 2014, Prenat Diag 34:185). 이러한 NGS 기반의 방법으로 태아 이수성의 양성 결과가 나온 경우, 이 결과를 침습적 진단법으로 재확인하였다.
[200] 결과:
[201] 특징, 본 실시예의 방법에 의해 결정된 cfDNA의 % 태아분, 및 NGS에 기초한 방법에 의해 혈액 시료에 대해 결정된 이수성 검사 결과가 표 3에 제시되어있다. 태아의 21번 삼염색체를 나타내는 2가지 양성의 NGS 기반 검사 결과가 나와 있다. 두 결과 모두를 양수천자 후에 핵형 검사(karyotyping)로 확인한 결과, NGS 기반 연구에서의 거짓양성율은 0%였다. 단융모막 쌍태아를 나타내는 하나의 혈액 시료는 일치 핵형(concordant karyotypes) [47, XY, +21]을 갖고 2융모막 쌍태아를 나타내는 다른 시료는 불일치 핵형(discordant karyotypes) [47, XY, +21 및 46, XX]을 갖는다. 두 시료에서 태아분은 각각 18.0 및 24.8%이었다. 다른 모든 NGS 기반 NIPT 결과는 21번, 18번, 13번 삼염색체 대해 음성이었다. 지금까지 본 연구에 포함된 임신에서 거짓음성 NIPT 결과의 증거는 없다.
표 3: 채집된 혈액 시료의 특징 및 NIPT 결과
[202] 선행 기술의 NGS 기반 NIPT에 의한 쌍태 임신에서의 태아 이수성의 신뢰성있는 검출은 각 태아로부터의 충분한 양의 태아 cfDNA가 모체 혈액 내에 있을 것에 의존한다. 태아분 cfDNA의 하한치를 각 쌍태아의 기여분이 검출 임계값을 초과하지 않도록 보장하도록 정의하는 방법에 대한 여러 데이터 및 고려 사항이 발표된 바 있다(Leung 외, Prenat Diag 33:675; Qu 외 2007, Am J Pathol 170:941; Struble 외 2013, Fetal Diagn Ther 12월 7일 Epub 발행). 이는 불일치 핵형을 가진 2융모막 쌍태 임신에 특히 중요한다. 위에서 설명한 연구에서는 두 태아 중 하나만이 남자인 경우 Y 염색체 재현(Y-chromosomal representation)에 의해 도출된 쌍태 임신에 대한 최소 태아분 cfDNA의 정의를 뒷받침하는 정보가 사용되었다. 본 실시예의 방법을 이용하여, 두 태아로부터 유래된 태아 cfDNA의 요약을 반영하는 총 태아분 cfDNA를 결정할 수 있다. 차세대 시퀀싱의 Y 염색체 재현을 사용하여, 태아 cfDNA 양을 남자 태아에 대해 결정할 수 있다(Stumm 외 2014에서 설명). 따라서, 혼성 태아의 경우, 각 태아의 기여 정도는, 본 실시예의 방법으로 측정된 태아분 cfDNA에서 Y 염색체 재현에 의해 결정된 태아 cfDNA의 양을 뺌으로으로써 결정될 수 있다. 본 실시예의 방법에 의해 결정된 태아분 cfDNA를 성별이 알려진 경우의 차세대 시퀀싱의 Y 염색체 독출(reads)에 의해 얻어진 값과 비교하였다(도 3 참조). 본 실시예의 방법에 의해 측정된 태아분 cfDNA(x축)에 대한, 남성 특이적 cfDNA의 양(y축)은 상관 관계가 있다. 따라서, 남/남 성별의 쌍태 임신의 경우에 [y=x]는 거의 사실이고, 여/남 성별의 경우에는 [y=0.5x]가 거의 사실이고, 여/여의 경우에는 [y=1]이 거의 사실이다. 비슷한 값을 갖는 경우의 성별은 남/남이고, 낮은 Y 염색체 재현을 갖는 값이 다른 경우에 성별은 여/여이다. Y 염색체 재현보다 태아분의 %가 절반 정도를 나타내는 중간 경우는 혼합 성별이다. 도 3에 제시된 데이터는, 쌍태 임신의 경우에 선행 기술인 NGS 기반 NIPT 결과를 사용하여 태아 성별을 판단하는 것이 가능할뿐 아니라 본 실시예 방법에 의해 결정된 cfDNA 태아 분의 측정량이 Y 염색체 서열의 빈도수에 비하여 정확하다는 것을 나타내준다. 한편, 이들 데이터는 쌍태 임신의 각 태아가 총 태아분 cfDNA의 대략 절반에 기여한다는 가설을 뒷받침한다. 이것은 쌍태 임신의 경우에 태아 cfDNA 양의 두 배가 필요할 것이며, 따라서 쌍태 임신에 대한 선행 기술의 NGS 기반 NIPT를 위해서 권장되어야 할 최소의 cfDNA 태아분은 8%로 간주될 수 있을 것이라는 결론을 이끌어 낸다.
[203] 일치 유전자형 단융모막 쌍태 임신의 경우에는 (드물게 예외적인 경우를 제외하고는)(Chen 외, 2013, Am J Med Genet A 161A:1817 참조), 4%의 cfDNA 태아분이면 단태 임신과 마찬가지로 태아 이수성을 검출하기에 충분할 것이다. 그러나 일상적인 실험실 NIPT의 경우, 한 가지 주요 쟁점은 단융모막 및 2융모막 임신에 대한 상이한 질적 기준의 함의에 대한 것이다. 융모막 임신의 판정은 재태연령(gesdtational age)과 초음파검사 수행 의사의 실제 경험에 좌우된다. 융모막 임신 여부는 다태 임신의 최초 3분기(1/3분기)에는 명확하게 감지할 수 있지만 이후 단계에서의 감지는 더 어려워진다(Sperling 외 2001, Acta Obstet Gynecol Scand 80:287). 따라서 쌍태 임신의 경우에는 최소 태아분 cfDNA를 포괄적으로 정의하는 것이 더 안전한 전략이며, 이는 단융모막 및 2융모막 다태 임신에 적용가능하다.
[204] 쌍태아 소실의 확인:
[205] 본 실시예의 방법을 이용하여 태아분 cfDNA를 측정한 NIPT 이수성 검사의 2가지 사례에서 21번 삼염색체가 확인되었지만(각각 z스코어 13.5 및 3.4),아울러, 본 실시예 방법에 의해 측정된 총 태아분 cfDNA와 Y 염색체 재현에 의해 측정된 태아 cf-DNA 양 사이에 큰 불일치가 관찰되었다.
[206] 사례 A의 경우, 두 가지 혈액 시료(제1시료 및 백업 시료)의 분석 결과, 본 실시예의 방법에 의해 각각 20.7% 및 24.8%로 총 태아분 cfDNA가 추정된 반면, 차세대 시퀀싱에서의 Y 염색체 재현에 따른 태아 cfDNA는 각각 9.2% 및 9.3%였다. 임신이 혼성의 쌍태 임신일 수 있다고 추측되었고, 이는 임신 10주에 행한 초음파 스캔 중에 쌍태아의 사망이 관찰되었다고 확인한 의사에게 보고되었다. 임신 3기(3/3분기)에 채취한 추가 혈액 시료(38+2)는 21번 삼염색체에 대해 음성으로 밝혀졌고, Y 염색체 시료에 의해 측정된 태아의 cfDNA 양은 QuantYfeX로 측정한 양과 상관 관계가 있어서(21.7% 및 21.4), 살아 있는 태아의 핵형에 의해 판정된 남성 성별과 일치하였다. 출산시 태반 조직에서 지상 태아(foetus papyraceous)가 발견되었는데, 이로부터 충분한 양의 세포를 분리하여 세포 배양하였고 GTG 밴딩을 수행하여서 21번 삼염색체가 양성이며 여성 핵형이 확인되었다(47, XX, +21).
[207] 사례 B의 경우, 약간 증가된 Y 염색체 재현이 모니터링되었는데, 이는 남성 특이적 태아 cf-DNA가 각각 3.0% 및 2.7%임을 나타낸다. 본 실시예의 방법으로 측정한 태아분 cfDNA의 추정치가, 태아분의 측정 불일치로 인해 우리가 가정했던 것(13.4% 및 10.0%)을 훨씬 상회했기 때문에, 이들 불일치한 성별을 갖는 두 태아가 태아분에 영향을 주고 남자 태아가 21번 삼염색체의 영향을 받게 된다. 이러한 논제는 대략 3%의 Y 염색체 특이적 태아 cfDNA 양과, 3.0의 차단값(cut-off value) 주변에서의 증가된 z스코어와의 상관관계로부터 도출된 것이었다. 단태 임신에 대해서 이 검사가 분명하게 요구되었기 때문에, 남성 특이적 태아 cfDNA가 소실 쌍태아 ― 어쩌면 21번 삼염색체의 보유자 ― 에서 유래한 것으로 의심되었는데, 이는 인지하지 못하였고 NIPT 동의서 양식에 표시되어 있지도 않았다. 따라서 결과가 염색체 21번에 대해서는 결정적이지 못하다고 보고하였고, 이 상충하는 데이터를, 잠재적 쌍태아 소실에 관한 고지를 포함하여, 담당 의사에게 보고하여서 초음파를 통한 추가적 확인을 할 수 있도록 하였다. 이후에 담당 의사는, 임신이 쌍태아 임신으로 시작되어 나중에 단태 임신으로 계속되었음을 확인하였다. 생존해 있으며 확연하게 건강한 태아의 성별은 여자이며 따라서 21번 삼염색체에 대해 z스코어를 증가시킨 태아 cfDNA는 분명히 사망한 남자 태아에게 할당될 수 있음이 확인되었다.
[208] 실시예 2(비교예): 2개의 상이한 메틸화 영역을 이용하되 각 상이한 메틸화 영역에 대해 동일한 검출가능 모이어티(moiety)를 사용하여 기준 염색체의 검출 감도를 향상시켰다.
[209] 본 발명자들은 두 DMR(및 상이하게 메틸화되지 않은 2개의 타영역(OR)) 각각에 동일한 검출가능 모이어티를 사용하여 이들 DMR을 검출하는 복합적다중 반응이, 각각 별도의 PCR 반응에서 하나의 DMR(및 하나의 OR)을 검출하는 종전의 검출 반응보다도 태아에서 유도된 기준 염색체를 검출하는 데 더 민감하다는 것을 관찰하였다(도 4 참조).
[210] 상이한 메틸화 기반 DNA 검출의 또다른 방법에서, 인간 염색체 3 및 12번에 각각 위치하는 2개의 DMR(실시예 1에 기술된 바와 같이 RASSF1A 및 TBX3에서 발견된 것)이, 동일한 DNA 분취량 및 반응으로 ― (정량적 프로브 기반(TaqMan)의 PCR을 사용하여서) 유효하게 동시에 ― 검출되었다. 그리고 2개의 OR(실시예 1에 기술된 바와 같이 RASSF1A 및 TBX3에서 발견된 것)도 동일한 검출가능 모이어티를 상기 각 DMR에 사용하여(그리고 적어도 하나의 OR에 사용된 검출가능 모이어티는 상기 DMR에 사용된 검출가능 모이어티와 다른 것임)함께 검출되었다. 비교하자면, 태아에 의해 유도된 기준 염색체의 cfDNA에서의 검출은, 각 DMR(및 상응하는 OR)이 별개의 반응에서 독립적으로 검출되는 경우에, 더 높은 사이클 수(Cp)에서의 검출이 나타내는 바와 같이 감도가 더 약했다. 영역/마커, 프라이머/프로브, 및 검출 방법은 실시예 1에서 기술된 것과, 단일 유전자좌위 반응의 경우에 특정 유전자(RASSF1A 또는 TBX3)로부터의 DMR(및 상응하는 OR)만이 단일 반응에서 동시에 검출된 것을 제외하고는, 실질적으로 같았다.
[211] 반면에, 다른 검출가능 모이어티(예를 들어, RASSF1A 좌위에 대한 FAM 및 TBX3 좌위에 대한 VIC)를 사용한 두 DMR의 다중 반응을 이용한, 태아 유도된 기준 염색체의 cfDNA에서의 검출은 한층 더 감도가 낮고(그리고 임의의 OR과 동시에 검출되는 것은 어렵다고) 판명되었는바, 이는, 이론적인 것을 따를 것도 없이, 색상 보정의 높은 복잡성, 개별적으로 검출 가능한 형광성 마커 개수의 제한성, 그리고/또는 동일한 반응에 존재하는 많은 형광성 마커들로부터의 '표백' 효과 때문인 것으로 여겨진다.
[212] 정량화 PCR 검출의 지수함수적 성질을 감안할 때, 높은 검출 감도(즉, 낮은 싸이클 수)는, 표준 곡선에 대한 보정과 같이, 높은 정량화 정확도와 동일시할 수 있을 것이다. 그리고 데이터 포인트들 간의 보간(interpolation)은 높은 싸이클 수에서의 검출과 관련이 있는, DNA의 양(즉, 기준 염색체의 정량화 양)에 의해 증가하는 오류보다 더 오류가 적게 될 것이다.
[213] 실시예 3(비교예): 자간전증을 앓거나 발병할 임신여성의 위험 증가를 감지하기 위한 상이한 메틸화 기반 DNA 정량화 방법의 사용(예언적 실시예. prophetic example).
[214] 비교예의 방법을 사용하여 임신여성이 자간전증을 앓고 있는 또는 발병할 위험을 다음과 같이 평가한다. 우선, 실시예 1에 기술된 절차를 실질적으로 따라, 상기 위험성 평가 대상 여성에게서 혈액 시료를 채취하고 이 시료의 혈장으로부터 총 cfDNA를 추출한다. 둘째, 실질적으로 실시예 1에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여, 혈장에 존재하는 태아 cfDNA 및 총 cfDNA의 상대적 양 및/또는 절대적 양을 결정한다. 여기서 태아 및/또는 총 cfDNA의 절대적 양은 게놈 등가량('Eq')으로 표현될 수 있다. 셋째, 태아 cfDNA 및/또는 총 cfDNA의 상기 결정량을 임계값 또는 양의 기준 분포과 비교하여, 태아 cfDNA 또는 총 cfDNA의 양이 임계값을 넘고/넘거나 기준 분포 밖의 이탈값인 경우에 해당 여성이 자간전증을 앓고 있는 또는 발병할 위험이 증가하고 있다고 판단한다.
[215] 예를 들어, 공개된 임계값(Papantoniou 외, 2013, Prenat Diag 33:682)을 사용하여, 만약 총 cfDNA가 약 7,500Eg/mL 혈장의 양을 초과하거나 태아분 cfDNA가 약 500Eg/mL 혈장의 양을 초과하면, 해당 여성은 상기 위험이 증가하는 것으로 판정된다. 이 대신에 또는 이에 추가적으로 상기 위험은 아래와 같은 방법으로 평가할 수도 있다. 즉, (i) 태아 cfDNA(해당 여성에 대하여 임계값과 비교하여 결정된 양)의 배수 증가(예를 들어, 1.5, 3, 3.5배, 또는 4배 증가)를 고려하되, 후기 임신의 경우에 태아 cfDNA의 배수 증가가 더 크다는 것을 결정 요소로 넣는다(Zeybek 외, 2013, J Obstet Gynaecol Res 39:632), 그리고/또는 (ii) 저 위험 여성 또는 자간전증을 겪지 않았거나 발병하지 않은 여성에게서 결정되는 양의 기준 분포를 고려할 때 여성에서 결정된 cfDNA의 양의 백분위수(percentile)가 감소하는지를 고려하여서 평가할 수 있다. 예를 들어, 만일 태아분 cfDNA가 이 양의 기준 분포의 90번째 백분위수(90th percentile) 이내에 있다면 이 여성은 경증 또는 중증의 자간전증을 앓을 위험이 증가한 것으로 간주될 수 있다(Jakobsen 외, 2013, Transfusion 53:1956).
[216] 이 예에서, 이러한 위험의 감지는 도 5에 나타낸 연산을 실행하는 컴퓨터 프로그램 제품을 사용하여 수행된다. 연산 (A)에서는 컴퓨터 프로그램 제품을 사용하여 각각 태아 cfDNA 및 총 cfDNA를 나타내는 신호 (1) 및 (2)를 수신하여 여성의 혈장에 존재하는 태아(또는 총) cfDNA의 상대적 양 및/또는 절대적 양을 나타내는 파라미터(4)를 결정한다. 이 연산은 선택사항으로서, 표준 DNA의 절대적 양을 나타내는 신호(3)를 수신할 수 있다. 두번째 연산 (B)에서는 임계값(5) 및/또는 기준 모집단의 양(6)에 대해 상기 결정된 파라미터(4)를 비교하여, 해당 여성이 자간전증을 앓고 있는 또는 발병할 위험이 증가하는 것이 판단되는지를 결정하고 보고한다(7).
[217] 실시예 4: 21번 삼염색체를 검출하기 위한 직접적이고 효율적인 NIPT 검사법으로서 본 발명 방법을 이용
[218] 본 발명은 21번 삼염색체의 태아를 수태한 임신여성으로부터 얻은 cfDNA 시료를 식별할 수 있었다.
[219] 본 발명 방법의 1회의 다중 PCR 반응에서, 58명의 임신여성으로부터 수득한 cfDNA 시료에 존재하는 태아 염색체 21번 DNA 종의 양을 2개의 표적 DMR 각각에서 측정하였고, cfDNA 시료에 존재하는 태아 염색체 5 및 12번(기준 염색체임)의 기준 DNA 종의 양을 두 개의 기준 DMR을 이용하여 각 임신여성에 대해 측정하였다(도 6 참조). 태아 염색체 21번 종(두 표적 DMR 각각에서 추정됨)과 상기 태아 염색체 기준 종(두 기준 DMR 모두에 의해 추정됨)의 상대적 양을 비율값으로 계산하였고, 각 비율값을 사용하여 각 임신여성 인간별로 두 비율값 각각의 시료 특이적 평균값(n = 6개의 복제본)을 나타내는 산포도를 그렸다(도 7). 이 산포도에서는 21번 삼염색체('T21')가 있는 태아를 임신한 것으로 알고 있는 여성에게서 취한 시료를 나타내는 세 개의 '+' 점이 이탈값(outlier)으로서 표시되어 있음을 쉽게 알 수 있다. 이 산포도는 또한 염색체 21번 상의 하나의 표적 DMR(다른 표적 DMR은 아님)에 대한 이탈값으로서 하나의 Non-T21 시료가 관찰된다는 점에서 본 발명 방법의 하나의 유리한 특징을 증명해준다. 적어도 두 개의 이러한 마커를 분석할 수 있는 방법 및 분석법(가령, 본 발명 방법) 만을 사용함으로써, 이 시료가 T21 시료가 아닌 Non-T21 모집단 중의 이탈값이라는 것을 정확하게 식별할 수 있을 것이다. 예를 들어, x축에 나타낸 표적 DMR만을 고려하였거나 두 표적 DMR의 평균을 고려(즉, 표적 DMR을 함께 고려)하였다면, 그 시료는 T21 시료인 것으로 잘못 식별되었을 것이다.
[220] 도 7에 도시된 데이터는 단일 qPCR 실행시에 58명의 임신여성으로부터 취한 모든 58개의 시료로부터 만들어졌다. 그러나, 110명의 임신여성에서 채취한 추가분 110개의 시료를 2회의 추가 qPCR에서 동일한 본 발명 방법으로 분석하되, 각회의 qPCR에서 각각 54명과 56명의 임신여성의 시료를 분석하였다. 세 번의 검사 실행에서 생성된 데이터를 정규화하여서, 총 168개의 시료 모두를 하나의 산포도로 표시할 수 있었다(도 8). Non-T21 시료로부터 9개의 T21 시료들 무리(예를 들어 점선 표시 곡선 경계로 구분)가 분리되어 있음이 명확하게 보여진다. 검사 실행들 간의 정규화는, 각 시료에 대한 각 비율값의 평균값으로부터, 이후에 설명한 것과 같이 단일 실행으로부터의 모든 복제본에 걸쳐 적용 가능한 비율의 중앙값을 뺌으로써 수행하였다. 정규화 결과값은 2를 더하여 양수 값으로 변환한 후에 로그 스케일을 사용하여 표시하였다.
[221] 도 9에서, 다수의 실행(이 실시예 3에서의)에 걸쳐서 다수의 시료(이 실시예에서는 168개)를 분석하는 데 있어서의 본 발명 방법의 강인성은, 실행 1 내지 실행 3 각각의 경우에, 전체 Non-T21 시료(도 9에서 '+'로 표시됨)로부터 9개의 T21 시료(도 9에서 'o'로 표시됨)가 실행에 관계없이 분리되는 것, 도 8에서 곡선 구획선의 중심점에서부터 각 포인트의 거리(이 실시예에서는 0.5, 0.55))가 실행에 관계없이 분리되는 것을 고려함으로써 증명된다. 9개의 시료 모두가 거짓음성이나 거짓양성의 결과없이 성공적으로 유형분류되었다.
[222] 태아 염색체 21 DNA 종의 양은 2개의 표적 DMR을 이용하여 결정하였다. 즉, (ⅰ) 인간 염색체 21q22.2에 위치한 DSCAM 유전자(다운증후군 세포 접착 분자; NCBI 기준 서열 Homo sapiens 염색체 21, GRCh38.p2 프라이머리 어셈블리: NC_000021.9 GI:568815577, 영역 40010999~40847113; 서열번호 200)에 위치한 상기 제1 DMR, 및 (ii) 인간 염색체 21q22.2에 위치한 C21orf57(YBEY; 염색체 21: 46,286,337~46,297,751 정방향 가닥, GRCh38:CM000683.2; 250bp의 상류/하류 flaking 영역을 포함한 유전자, 서열번호 218)의 상류/하류로 약 250bp 이내에 위치한 제2 DMR.
[223] 태아 기준 염색체 DNA 종의 양은 2개의 기준 DMR을 이용하여 결정되었다. 즉, (i) 인간 염색체 12q24.21에 위치한 TBX3 유전자(전술함)에 존재하는 제1 DMR. 및 (ii) 염색체 5q31.3에 위치한 PCDHGA1 유전자(protocadherin gamma 서브패밀리 A, 1; NCBI 기준 서열 Homo sapiens 염색체 5, GRCh38.p2 프라이머리 어셈블리: NC_000005.10 GI:, 영역 141,330,571 내지 141,512,981 서열번호 217)에 존재하는 제2 DMR. 또한 각각의 다중 반응에서 TBX3(전술함)에 있는 DMR로부터 약 10kb에 위치하는 제1 OR과 PCDHGA1에 있는 DMR로부터 약 300bp에 위치하는 제2 OR이 증폭되었다. 사용된 각 DMR(및 OR)의 서열은 표 4에 기재되어 있다.
표 4: 염색체 21번, 5번, 및 12번의 DMR과 OR
메틸화 감응 부위에 밑줄 표시하였으며 기지의 SNP의 위치는 소문자로 표시하였음
[224] 168명의 임신여성 인간으로부터의 cfDNA 시료(T21을 갖는 태아를 임신한 것으로 알고 있는 9개를 포함)를 수집 및 준비하고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 CpG 메틸화 감응성 효소 HhaI, HpaI, 및 BstUI로 분해(digest)시켰다. PCR 완충액이 PerfeCTa MultiPlex qPCR ToughMix(Quanta Biosciences)인 것을 제외하고는 실시예 1에 기재된 바와 같은 시료 각각의 복제본(n=6)에 대해서 표 4에 기재된 4개의 개별 유전자좌위의 다중 정량화 프로브 기반 PCR 반응을 수행하였다. 이때 표 5에 기재된 PCR 프라이머 및 표지처리된 프로브(소거제와 함께)를 사용하였고, 시료들을 각각 58개, 54개, 및 56개로 나누어서 3회 실행하였다. 본 발명의 분석법으로 구성된 각 실행(run)은 LightCycler 480II(Roche)가 포함된 384개 웰이 있는 마이크로타이터 플레이트(Roche) 하나에서 수행하였다.
표 5: 프라이머와 프로브
* 염료/소거제 없이 뉴클레오티드 서열만 제시함
** 각 프로브에 사용된 염료/소거제는 '[ ]' 안에 표시함
[225] 이러한 분석법의 형식은 전반적으로 도 6에 도시된 바와 같은데, 이 도 6의 DMR1은 인간 21번 염색체의 DSCAM 유전자에 위치하고, DMR2는 인간 21번 염색체의 C21orf57 유전자의 상류/하류로 약 250bp 내에 위치하고, DMR1'은 인간 12번 염색체의 TBX3 유전자에 위치하며, DMR2'는 인간 5번 염색체의 PCDHGA1 유전자 에 위치한다. 염색체 21의 표적 DMR과 염색체 5와 12의 기준 DMR 간의 상대적 양 또는 비율을 계산하는 목적상, OR은 마치 각 염색체의 태아분을 계산하는 데 사용하는 것처럼 필요치는 않으며, 그 값은 수학 공식에서 상쇄될 것이다. 따라서 OR의 사용으로부터 추정될 수 있는 총 DNA 양은 태아의 T21 상태를 분석하는 데는 필요하지 않지만 총 DNA에서 태아분의 cfDNA를 계산하는 데는 사용할 수 있다. 예를 들어 실시예 6 및/또는 7에 기술된 목적을 위해, 그리고/또는 가능한 또는 부가적인 품질 관리 수단(예, 실시예 6)으로서, 또는 실시예 7에 기술된 바와 같은 다른 진단의 목적으로는 사용할 수 있다. 표 5로부터 관찰되는바, DSCAM에 위치한 21번 염색체 표적 DMR에 대한 프로브는 C21orf57의 상류/하류로 약 250bp 내에 위치한 21번 염색체 표적 DMR에 대한 프로브와 다르게 표지처리한다. 또한 TBX3에 위치한 기준 염색체 12번 상의 기준 DMR과 PCDHGA1에 위치한 5번 염색체 상의 기준 DMR은 동일한 표지(표적 DMR에 대한 것과는 상이함)로 표지처리한다. 마지막으로, 총 DNA의 추정에 필요한 경우, 두 개의 OR은 모두 동일한 표지로 표지처리하는데, 이 표지 역시도 다중 표지 분석에 사용된 다른 표지와는 다른 것이다. 전체적으로, 4개의 표지가 사용되는데, 이로써, 예를 들어, 각 qPCR 플레이트의 (실행)에 피검 시료로 제공될 수 있는 (실시예 1에서 기술된 바와 같은) 기지 농도의 표준 DNA의 딜루션시리즈로부터 수득된 각 DMR(또는 OR)에 대한 신호와, 시료로부터 온 각 DMR(또는 OR)에 대한 각 신호를 비교하여 21번 염색체의 양을 각 표적 DMR에 대해 독립적으로 추정할 수 있게 되고 기준 염색체의 양을 보다 감도높게 검출할 수 있다(실시예 2 참조). 이러한 상대적 및 절대적 정량화는 Roche의 LightCycler 480 소프트웨어 1.5.0판을 사용하여 수행되었다. 염색체 21번 표적 DNA의 + 종들의 %태아 cfDNA 각각과 두 기준 염색체 기준 DNA 종의 %태아 cfDNA의 시료 특이적 비율의 평균값(n= 6개 복제본)을 각 시료에 대해 계산하였고, 각 플레이트별로 모든 복제본의 전체 중앙값을 계산하였다. 분석결과는 상기한 바와 같았다.
[226] 실시예 5: 알고 있는 내부 정배수체 표준(internal euploid standards)을 참조하지 않고, NIPT에서 21번 삼염색체를 검출하기 위한 z스코어 분석의 반복.
[227] 반복적 z스코어 접근법을 적용하여 발명자는 z스코어 분석에서의 평균 및 표준편차의 추정시에 기지의 정배수체 시료를 참조하지 않고 피검 시료로부터 모든 알려진 21번 삼염색체 시료를 확인할 수 있었다.
[228] 실시예 4에서 분석된 시료의 각 실행(qPCR 플레이트)으로부터의 데이터를 하기와 같이 재분석하였다. 먼저, 시료의 각 복제본의 기준 염색체 DMR에 대한 각 염색체 21번 표적 DMR의 평균 비율(n=6)을 계산하였고, 이 실행(플레이트)에 존재하는 모든 시료에 대해 각 비율의 전체 평균 및 표준편차를 계산하되 시료가 정배수체인지 또는 삼염색체인지의 여부가 알려졌는지를 참조하지 않고 계산하였다. 두 번째로, 이러한 실행에 특화된 수단 및 표준편차에 기초하여, 실행시 존재하는 각 시료에 대한 각 표적 DMR과 연관된 각각의 비율에 대한 (실행에 특유한: run-specific) 별도의 z스코어들을 계산하였다. 세 번째로, 각 DMR에 대해 이들 비율이 1.95와 같거나 큰지를 확인하고, z스코어를 이탈하는 것으로 나타난 시료를, 두 표준 DMR 각각에 독립적으로, 후속해서 z스코어 계산 인자(실행에 특유한 평균 비율 및 표준편차)를 정하는 데 사용되는 각 기준 시료 세트에서 제외시켰다. 기준 데이터 세트 내의 나머지 시료들에 관한 데이터에 대해서, 각 표적 DMR에 독립적으로, 각 비율에 대한 두 번째 평균 및 표준편차를 계산하였고, 이를 사용하여 이들 데이터 세트 내의 모든 시료별로 각 비율의 두 번째 z스코어 분석을 수행하였다. 네 번째로, 결과로 나온 z스코어(즉, 첫 번째 제외 단계 이후 계산된 스코어)를 상기 세 번째 단계에서처럼 각 표적 DMR에 대해 독립적으로 이탈값을 확인하였고, z스코어가 1.95와 같거나 큰 시료들을 각 DMR에 대해 z스코어를 계산하는 데 사용한 기준 데이터 세트에서 제외시켰다. 그리고 세 번째 평균 및 표준편차를, 기준 데이터 세트 내의 나머지 시료에 관한 데이터에 대한 각 비율마다 각 표적 DMR에 대해 독립적으로 계산하였고, 이를 사용하여 상기 데이터 세트 내의 모든 시료의 각 비율별로 세 번째 z스코어 분석을 수행하였다. 이러한 반복 과정을 20회 반복하였고, 비록 한 번의 반복적 제외 단계 후에 각 시료의 z스코어가 다시 1.95 아래로 바뀌게 될 경우에도 각 DMR 기준 세트에서 한번 제외시켰던 시료는 기준 데이터 세트에 다시 포함시키지 않았다. 각각의 비율 및 시료에 대한 결과적인 시료 z스코어를 도 10에 나타내었는바, 이는 정배수체 및 T21 시료의 완전한 분리를 표시한다(두 비율 각각에 대한 약 3.0보다 큰 z스코어, 그리고/또는 약 3.0보다 큰 z스코어의 평균값, 그리고/또는 실시예 4와 도 9에 기재된 것과 유사한 데이터 무리 또는 거리 근접도에 의해 나타내어짐). 평균 z스코어 3보다 큰 값을 얻는 이배체(diploid) 이탈값은 규칙을 정하여서 제외시켰다. 즉, 불일치 결과들(마커 1 및 2)는 차이의 범위를 위해 조절하였다. 차이가 4.0 이상이라면, 이들은 양성이 아니며 보고필요성이 없다.
[229] 실시예 6: 태아분 cfDNA을 추정하기 위한 본 발명 방법의 사용.
[230] 임신여성으로부터 분리된 총 cfDNA에서 태아 DNA의 % 분율(태아분)을, 2개의 기준 염색체 상에 존재하는 2개의 (통상적으로 표지처리된) 기준 DMR 및 2개의 (통상적으로 표지처리된) OR(각 OR은 자신의 DMR과 동일한 유전자 내에 있음)을 사용하여 측정된 DNA 양의 비율을 계산하여 추정하였다. cfDNA의 태아분에 대한 정보는, 실시예 1에서 설명한 NGS 기반 분석법과 같은 후속 분석이 가능하도록 하기 위해 충분한 태아 DNA가 시료에 존재하는지 여부를 결정하는 등, 품질 관리 목적으로 사용될 수 있다.
[231] 실시예 7: 임신여성이 자간전증을 앓고 있는 또는 발병할 위험의 증가를 감지하기 위한 본 발명 방법의 사용(예언적 실시예)
[232] 임신여성에 수태된 태아가 이수성인지 여부를 결정하는 것 이외에, 실시예 4에 기재된 본 발명 분석의 포맷(즉, 총 DNA를 측정하기 위해 적어도 OR에 대해서 실시되는 포맷)은 또한, 임신여성이 자간전증을 앓고 있는 또는 발병할 위험을 판정하는 데도 사용된다.
[233] 실질적으로 실시예 4에서 기술된 바와 같은 방법을 사용하여, 혈장에 존재하는 태아 cfDNA 및 총 cfDNA의 상대적 양 및/또는 절대적 양을 결정하는데, 여기서 태아 및/또는 총 cfDNA의 절대적 양은 게놈 등가량(Eq)으로 표현될 수 있다 세 번째로, cfDNA 및/또는 총 cfDNA의 결정된 양을 임계값 또는 양의 기준 분포와 비교하여, 태아 cfDNA 또는 총 cfDNA의 양이 임계값을 초과하거나 기준 분포에서 이탈값인 경우에, 해당 여성이 자간전증을 앓고 있는 또는 발병할 위험이 증가한 것으로 판단한다. 공개된 값, 그리고 이러한 위험을 평가하는 다른 방법은 실시예 3에 기술된 것을 포함한다. 본 발명의 이러한 방법은 실시예 3에 기술된 (그릭 도 5로 나타내지는) 컴퓨터 프로그램 제품을 이용하여 이러한 위험을 감지하기 위한 신호를 생성하는 데 사용될 수 있다.
[234] 실시예 8: 본 발명의 키트의 제조 및 배포(예언적 실시예)
[235] 본 발명의 키트는 표 5에 기재된 프라이머 및 프로브 각각에 대한 완충액을 형성하여 제조한다. 각 완충액의 분취량(aliquot)(예를 들어, 200ul)을 별도의 에펜도르프 튜브에 넣고, 이 튜브를 카드보드 용기에 담는다.
[236] 이와 다른 키트로서, 표 5에 열거된 프라이머 및 프로브의 혼합물을 포함하는 단일 완충 용액을 제조한다.
[237] 또 다른 키트로서, 카드보드 용기에 표 5에 설명된 두 개의 제1 표적 DRM을 검출하는 데 사용되는 프로브의 분취량을 추가로 포함시킨다.
[238] 키트의 카드보드 용기는 또한 인쇄된 사용 설명서를 더 포함하여, 사용자에게 (다른 구성품과 함께) 해당 구성품을 사용하여 태아의 염색체 이수성을 검출하는 본 발명 방법의 실시를 위한 지침을 제공한다.
[239] 실시예 9: 수집된 시료를 사용한 시험(예언적 실시예)
[240] 이수성 또는 정배수성 태아를 지닌 것으로 알고 있는 다수의 임신여성으로부터 수집된 다수의 시료를 (실시예 4에 기술된 바와 같은 분석법을 사용함으로써) 본 발명 방법에 의해 분석하여 염색체 이수성(예를 들어, 21번 삼염색체)을 갖는 태아를 임신한 것으로 여겨지는 시료를 (예를 들어 정확하게) 찾는다. 단, 블라인드 검사 방식(즉, 검사자는 어느 시료가 어느 부류의 임신여성에서 채취된 것인지 모름)을 사용한다. 분석 수행 후, 시료를 공개하고(즉, NGS 및/또는 다른 검사에 의해 판단된 것과 같이 삼염색체 태아를 실제로 임신했는지를 공개), 이 정보를 비교하여 본 발명 방법에 대한 감도(sensitivity) 및 특정도(specificity)의 추정치 또는 척도를 생성한다.
[241] 실시예 10: 21번 삼염색체를 검출하기 위한 NIPT에 대한 직접적이고 효율적인 본 발명 방법의 그 밖의 구현형태들.
[242] DMR, OR, 및 형광 표지/소거제의 특정 조합을 사용하는 본 발명 방법의 유용성은 실시예 4에서 입증된다. 그러나, 본 발명자들은 이 방법이 DMR, OR, 및/또는 형광 표지/소거제의 다른 조합과 같은 특정 조합에 한정되지 않고 본 발명 방법이 NIPT에 의해서 21번 삼염색체를 직접적으로 그리고 효율적으로 검출할 수 있음을 보여준다는 것을 입증하였다. 표 6은 이러한 증명을 수행하기 위해 사용된 다양한 순열(permutation) 및/또는 조합을 나타낸다.
표 6: 본 발명 방법의 그 밖의 구현형태들의 요약(이들에 한정되지 않음)
* C21orf57 프로브를 위한 표지/소광제 쌍으로서 Cy5/BBQ650을 사용하는, 프로브의 제2 공급자
** 실시예 4와 비교하여 C21orf57 프로브를 위한 표지/소광제 쌍으로서 Cy5/BHQ3을 사용하는 것을 제외함
[243] 56 또는 58명의 임신여성에게서 각각 얻은 cfDNA 시료 세트를, 개별적인 qPCR 테스트 실행을 위해 많은 시료들 모음 중에서 선택하였다. 이때 각 검사 실행(run)에 21번 삼염색체를 가진 것으로 알고 있는(상용 차세대 시퀀싱 기반 NIPT 방법: PRENATEST®, LifeCodexx AG, 독일 콘스탄츠에 의해 미리 판정 및 확인된) 임신부로부터 채취한 2~4개의 cfDNA 시료를 포함시켰다.
[244] 실시예 4에 기술된 바와 같은 방법을 각 qPCR 검사 실행에 대해 실시하였고, 각 실행에서 얻은 검사 데이터를 분석하여 DMR 비율을 계산하고, 보정하고, 그리고 도 8에 도시된 것과 유사하게 제시하였다. 다만, 실시예 10에서 사용된 다양한 분석 구현형태의 경우에 표지(및 상응하는 소거제)의 상이한 순열을 사용한 것과, 두 경우에 제2의 Chr(염색체) 21번 DMR을 이용한 것은 제외하였다. 각각의 분석에 있어서, 표 6에 나타낸 것과 같은 DMR/OR을 이용하였다. 두 번째 컬럼에 기재된 분석법의 경우에는, 프라이머 서열, 프로브 서열, 및 프로브-표지/소거제의 조합은 실시예 4에서 사용했던 것 그리고 표 5에 제시한 것과 동일한 조합이다.
V10.1 내지 V10.4로 기술된 분석의 경우에, 실시예 4의 사용 및 표 5 기재와 동일한 프라이머 서열 및 프로브 서열을 사용하였지만, 프로브-라벨(및 이에 상응하는 소거제)은 표 6에 제시된 것을 사용하였다. V10.5 및 V10.6으로 기술된 분석의 경우에는 V10.1/10.4에서와 동일한 프라이머 서열, 프로브 서열, 및 프로브-표지/소거제를 사용하였지만, 단, C21orf57에 위치한 DMR 대신에 다른 제2 (표적) Chr 21 DMR을 이용하였다 ― V10.5의 경우 C21orf29, V2.6의 경우 CGI149. 이들 두 대안적인 제2 (표적) Chr21 DMR 각각의 서열을 표 7에 나타내었고, 이에 상응하는 프라이머 및 프로브 서열, 그리고 V10.5 및 V10.6에서 사용된 표지/소거제를 표 8에 나타내었다.
표 7: 다른 대안적인 염색체 21번 DMR
메틸화 감응 부위에 밑줄 표시하였으며 기지의 SNP의 위치는 소문자로 표시하였음
표 8: 대안적 염색체 DMR을 위한 프라이머와 프로브
* 염료/소거제 없이 뉴클레오티드 서열만 제시함
** 각 프로브에 사용된 염료/소거제는 '[ ]' 안에 표시함
[245] 도 11 내지 도 17(각각의 경우, x축은 DSCAM을 하나의 Chr21 DMR로 나타내고, y축은 다른 Chr21 DMR을 나타낸다)과 같이, 이들 상이한 구현형태 각각은, 각 실행에서 Non-T21 시료로부터 구별 가능하게 무리져 있는 바와 같이, 21번 삼염색체를 검출하는 NTPT를 위하여 본 발명이 직접적이고 효율적인 방법이 된다는 것을 증명하고 있다. 단지 하나의 분석 버전(V10.1)에서, 모든 분석에 적용된 동일한 사전정의된 원형의 컷오프 경계 외부에 있는 진정양성 시료에 의해 '거짓음성'이 일어난 것이 발견되었으며, 그리고 두 거짓음성 결과 중의 하나는 두 마커에 대해 상당히 높은 마커 비율을 가짐으로써 용이하게 미상인 것으로 확인되었다. 소수의 거짓양성이 일부 분석 실행시 정량화된 진정음성의 0% (V10.4 및 V10.5 경우) 내지 4% (V2.1 경우)까지 나타났지만, 당업자가 이해할 수 있는 바, 예컨대 이수성에 대한 진단 검사에서는 거짓양성보다 거짓음성이 최소일 것이 훨씬 더 중요하다. 이 실시예에서 사용된 사전정의 원형 컷오프 경계는 이전에 정의하였던 것으로, 실시예 4에서 설명한 분석 포맷에서 15개의 T21 시료를 포함한 700개가 넘는 시료를 사용한 대규모의 랜덤 블라인드 qPCR 검사 실행 세트로부터 얻어진 데이터를 분석한 후에, 이러한 검사에 대해 요구되는 총체적인 감도(진정양성 율), 특정도(진정음성 율), 및 보고불요 율(non-reportable rate) ― 예를 들어, 100%, 거의 100%, 97% 초과(바람직하게는 97.5% 초과), 또는 95% 초과의 감도; 95% 초과, 바람직하게는 96% 초과의 특정도; 및/또는 10% 미만(바람직하게는 7% 미만), 예를 들어 6% 또는 5% 미만의 보고불요 율 ― 을 제공하기 위해 정의했던 것이다.
[246] 실시예 11: 18번 삼염색체를 검출하기 위한 직접적이고 효율적인 NIPT 방법으로서의 본 발명 방법의 사용(예언적 실시예)
[247] 실시예 10에 기술된 하나 이상의 이수성-DMR/표지의 조합을, 하기에 간략히 기술한 것과 같이, 18번 삼염색체(T18)를 검출하기 위한 NIPT의 기초로 사용한다. T18 임신(희귀한 이수성) 여성으로부터 채취한 한정된 수의 시료를 사용하여, 예컨대 2개의 염색체 21 DMR 대신에 1개(또는 2개)의 18번 염색체 DMR을 이용한다는 것을 제외하고는 실시예 4 또는 실시예 10에 기술된 방법을 사용한다(또는 예를 들어 V10.3과 유사한 방법을 사용함). 예를 들어, 표 9에 기재된 두 염색체 18번 DMR을 이 분석에 이용할 수 있고, 상응하는 프라이머 및 프로브 서열, 그리고 사용되는 표지/소거제는 표 10에 기재되어 있다.
[248] 당업자라면 이제 알 수 있는 바, 이러한 분석에 사용될 수 있는 NFATC2 및/또는 chrl8-gr00094 유전자/영역의 정확한 영역, 그리고 상응하는 프라이머/프로브의 정확한 위치/서열을 추가적으로 최적화할 수 있다(예를 들어, 아래에서 설명할 영역 및 서열의 상류 및/또는 하류로 약 350bp, 300bp, 250bp, 200bp, 150bp, 100bp, 50bp, 20bp, 10bp, 또는 5bp 이내의 영역을 이용, 바람직하게는 약 350bp 내지 200bp, 또는 200bp 및 5bp 사이의 영역을 이용). 또한, 실시예 10에 기재된 것에 추가하여, 예를 들어 비메틸화된 cfDNA의 분해(digestion)를 향상시키기 위해 메틸화 감응성 제한효소를 추가로 사용할 수 있다. 이러한 추가적인 메틸화 감응성 제한효소에는 AciI, Cac8I, 및/또는 PhoI가 포함될 수 있다.
표 9: 염색체 18번 DMR
메틸화 감응 부위에 밑줄 표시하였으며 기지의 SNP의 위치는 소문자로 표시하였음
표 10: 대안적 염색체 DMR을 위한 프라이머와 프로브
* 염료/소거제 없이 뉴클레오티드 서열만 제시함
** 각 프로브에 사용된 염료/소거제는 '[ ]' 안에 표시함
[249] 이상에서와 같이, 본 발명은 또한 다음과 같은 사항들에 관련된 것임을 알 수 있을 것이다.
1. 임신여성에 수태된 태아의 염색체 이수성을 검출하는 방법으로서,
(a) 모체에서 유래한 상이하게 메틸화된 DNA와 혼합된, 태아의 세포 및/또는 태아의 태반으로부터 유래된 DNA를 포함하는, 상기 임신여성으로부터 채취한 시료를 제공하는 단계;
(b) 메틸화 및 비메틸화 DNA를 상이하게 변형시키는 시약으로 상기 시료에 존재하는 DNA를 처리하는 단계;
(c) 상기 시료에서 염색체 이수성과 관련된 염색체인 제1 표적 DNA 종의 양을 결정하되, 상기 염색체에 위치하는 둘 이상의 제1 표적의 상이한 메틸화 영역(제1 표적 DMR)에 메틸화가 존재하는지를 상기 시료에서 검출함으로써 결정 ― 여기서, 상기 제1 표적 DMR은 태아의 세포 및/또는 태아의 태반에서 유래한 DNA와 모체 유래 DNA 간에 상이하게 메틸화된 영역이고, 제1 표적 DMR의 DNA의 상기 시약에 의한 변형은 DNA의 메틸화에 감응하고, 상기 제1 표적 DMR 중 하나 이상에서의 메틸화 DNA의 검출량은 상기 시료 내의 상기 제1 표적 DNA 종의 양을 나타냄 ― 하는 단계;
(d) 상기 시료에서 하나 이상의 기준 염색체인 기준 DNA 종의 양을 결정하되, 상기 기준 염색체(들)에 위치하는 둘 이상의 기준 DMR에 메틸화가 존재하는지를 상기 시료에서 검출함으로써 결정 ― 여기서, 상기 기준 DMR은 태아의 세포 및/또는 태아의 태반에서 유래한 DNA와 모체 유래 DNA 간에 상이하게 메틸화된 영역이고, 상기 기준 DMR의 DNA의 상기 시약에 의한 변형은 DNA의 메틸화에 감응하고, 상기 기준 DMR 중 하나 이상에서의 메틸화 DNA의 검출량은 상기 시료 내의 상기 기준 DNA 종의 양을 나타냄 ― 하는 단계;
(e) 단계 (c)에서 결정된 양과 단계 (d)에서 결정된 양의 상대적 양(들), 바람직하게는 비율(들)을 결정 ― 여기서, 상기 하나 이상의 상대적 양(들)은 태아 내의 염색체 이수성의 존재 또는 부존재를 지시함 ― 하는 단계를 포함하되,
상기 단계 (c) 및 단계 (d)에서의 상기 검출은 상기 시료의 동일한 DNA 분취량(aliquot)을 사용하여, 그리고 동일 용기에서, 그리고 상기 제1 표적 DMR 및 상기 기준 DMR에 대해 유효하게 동시에 수행되며, 그리고 (x) 상기 기준 DMR의 적어도 두 개에 대해 동일한 검출 표지(들)를 사용하여서 그리고/또는 (y) 상기 제1 표적 DMR의 적어도 두 개에 대해 상이한 검출 표지(들)를 사용하여서 수행되는, 임신여성에 수태된 태아의 염색체 이수성을 검출하는 방법.
2. 제1항목에서, 상기 기준 DMR 중 2개 이상은 상이한 기준 염색체에 위치하는, 임신여성에 수태된 태아의 염색체 이수성을 검출하는 방법.
3. 제1항목 또는 제2항목에서,
(f) 상기 시료에서 총 DNA의 양을 결정하되, 태아의 세포 및/또는 태아의 태반으로부터 유래한 DNA와 모체 유래 DNA 간에 상이하게 메틸화되지 않은 적어도 하나의 타영역(OR)을 검출함으로써 결정 ― 여기서 상기 시약에 의한 OR(들)의 변형은 DNA 메틸화에 감응성이 없음 ― 하는 단계를 추가로 포함하되, 여기서 상기 단계 (c) 및 단계 (d) 및 단계 (f)에서의 상기 검출은 상기 시료의 동일한 분취량의 DNA를 사용하여 그리고 동일한 용기에서, 그리고 효율적으로는 상기 기준 DMR 및 상기 타영역에 대하여 동시에 이루어지며, 그리고 (x) 상기 기준 DMR의 적어도 2개 이상에 대해 동일한 검출 표지(들)가 사용되고, (y) 상기 제1 표적 DMR의 적어도 두 개에 대해 그리고 상기 OR의 적어도 하나에 대해 상이한 검출 표지(들)가 사용되며,
선택적으로(옵션사항으로), (A) 상기 OR은 하나 이상의 기준 염색체에 위치하되, 바람직하게는 상기 기준 DMR의 적어도 하나와 동일한 기준 염색체에 위치하는 상기 OR의 적어도 하나에 위치하고, 그리고/또는 (B) 상기 OR은 상기 기준 DMR 중 적어도 하나의 상류 또는 하류로 약 20bp 내지 20kb 사이에, 그리고/또는 상기 상기 기준 DMR 중 적어도 하나와 동일한 유전자 내에 위치하는, 임신여성에 수태된 태아의 염색체 이수성을 검출하는 방법.
4. 제3항목에서,
(A) 단계 (f)에서의 상기 검출은 상기 OR들의 적어도 2개를 이용하는 것을 포함하되, 여기서, 바람직하게는, 상기 OR의 수는 단계 (d)에서 사용된 기준 DMR의 수와 동일하고, 보다 바람직하게는, 상기 OR들 중 하나는 단계 (d)에서 사용된 기준 DMR과 동일한 염색체에(특히, 이 기준 DMR의 상류 또는 하류로 약 20bp 내지 약 20kb 사이에) 위치하며, 상기 각각의 OR은 상기 기준 DMR 중의 다른 하나와 동일한 염색체에(특히, 이 기준 DMR의 상류 또는 하류로 약 20bp 내지 약 20kb 사이에) 위치하고, 그리고/또는
(B) 단계 (f)에서의 상기 검출은 (x) 상기 OR 각각에 대해 동일한 검출 표지(들)을 사용하여 수행되는, 임신여성에 수태된 태아의 염색체 이수성을 검출하는 방법.
5. 제1항목 내지 제4항목 중 한 항목에서, 상기 검출 단계 (c) 및 단계 (d), 및 선택적 임의 단계 (f)는 상기 시료의 DNA의 동일 분취량을 사용하여 그리고 동일한 반응/검출 용기에서, 그리고 유효하게 서로 동시에, 그리고 상기 DMR 및 옵션으로 사용된 OR(들) 각각에 특화된 적어도 하나의 표지처리된 프로브를 사용하는 다중형 실시간 정량화 프로브 기반 PCR에 의해 수행되는, 임신여성에 수태된 태아의 염색체 이수성을 검출하는 방법.
6. 제1항목 내지 제5항목 중 한 항목에서, 태아의 세포 및/또는 태아의 태반으로부터 유래된 상기 DNA 종은 순환 무세포 DNA이고, 상기 시료는 혈장 또는 혈장과 같은 부분혈인, 임신여성에 수태된 태아의 염색체 이수성을 검출하는 방법.
7. 제1항목 내지 제6항목 중 한 항목에서, 메틸화 및 비메틸화 DNA를 상이하게 변형시키는 상기 시약은 (A) 바이설파이트, 또는 (B) 메틸화 DNA보다 비메틸화 DNA를 선택적으로 분해(digest)시키는 제제를 포함하되, 바람직하게, 이 제제는,
- 적어도 하나의 메틸화 감응성 효소.
- 적어도 하나의 메틸화 감응성 제한효소. 및/또는
- AatII, AciI, AclI, AfeI, AgeI, AgeI-HF, AscI, AsiSI, AvaI, BceAI, BmgBI, BsaAI, BsaHI, BsiEI, BsiWI, BsmBI, BspDI, BsrFI, BssHII, BstBI, BstUI, ClaI, EagI, FauI, FseI, FspI, HaeII, HgaI, HhaI, HinPlI, HpaI, Hpy99I, HpyCH4IV, KasI, MluI, NaeI, NarI, NgoMIV, NotI, NotI-HF, NruI, Nt.BsmAI, Nt.CviPII, PaeR7I, PluTI, PmlI, PvuI, PvuI-HF, RsrII, SacII, SalI, SalI-HF, SfoI, SgrAI, SmaI, SnaBI, TspMI, 및 ZraI로 이루어진 군에서 선택된 제제를 포함하는, 임신여성에 수태된 태아의 염색체 이수성을 검출하는 방법.
8. 제1항목 내지 제7항목 중 한 항목에서, 하나의 기준 DMR은 인간 염색체 5번에 위치하고 또 다른 기준 DMR은 인간 염색체 12번에 위치하며; 바람직하게는, 상기 제1 표적 DMR의 각각은 인간 염색체 21번, 염색체 18번, 또는 염색체 13번에 위치하되, 바람직하게는 염색체 21번에 위치하고; 선택사항으로, (A) 상기 DMR은 태아 DNA에서 과다 메틸화되고 모체 DNA에서 저도 메틸화되며, 그리고/또는 상기 DMR은 상기 시약에 특이적인 적어도 하나의, 바람직하게는 적어도 둘의 메틸화 부위를 포함하는, 임신여성에 수태된 태아의 염색체 이수성을 검출하는 방법.
9. 제1항목 내지 제8항목 중 한 항목에서,
(A) 상기 제1 표적 DMR들은 각각,
- WO 2011/092592의 EP1, EP2, EP3, EP4, EP5, EP6, EP7, EP8, EP9, EP10, EP11, 및 EP12(서열번호 33~44)로 이루어진 목록 중에서 선택된 것을 포함하여, WO 2011/092592에 개시된 영역 및/또는 유전자; 또는
- AIRE, SIM2, 및 ERG 중에서 선택된 영역 및/또는 유전자, 또는 이 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류로 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp를 넘지 않는 DNA 서열; 또는
- PDE9A, PPP1R2P2, CBR1, DSCAM, C21orf29, 및 HLCS 중에서 선택된 영역 및/또는 유전자, 또는 이 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류로 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp를 넘지 않는 DNA 서열; 또는
- C21orf57의 영역 및/또는 유전자, 또는 상기 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류로 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp를 넘지 않는 DNA 서열; 또는
- WO 2011/034631의 서열번호 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 176, 179, 180, 184, 188, 189, 190, 191, 193, 195, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 221, 223, 225, 226, 231, 232, 233, 235, 239, 241, 257, 258, 259, 및 261 중에서 독립적으로 선택된 영역 및/또는 유전자에 위치하고, 또는,
(B) 상기 제1 표적 DMR들은 각각,
- VAPA-APCDDI의 영역 및/또는 유전자 또는 이 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류로 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp를 넘지 않는 DNA 서열; 또는
- maspin의 영역 및/또는 유전자 또는 이 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류로 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp를 넘지 않는 DNA 서열; 또는 -WO 2011/034631의 서열번호 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 및 32 중에서 독립적으로 선택된 영역 및/또는 유전자에 위치하고, 또는,
(C) 상기 제1 표적 DMR들은 각각, WO 2011/034631의 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 및 20 중에서 독립적으로 선택된 영역 및/또는 유전자에 위치하는, 임신여성에 수태된 태아의 염색체 이수성을 검출하는 방법.
10. 제1항목 내지 제9항목 중 한 항목에서, 상기 기준 DMR들은 각각,
- RASSF1A, TBX3, ZFY, CDC42EP1, PCDHGA1, SOX14, 및 SPN 중에서 선택된 영역 및/또는 유전자, 또는 이 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류로 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp를 넘지 않는 DNA 서열; 또는
- WO 2011/034631의 서열번호 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 및 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 및 163 중에서 독립적으로 선택된 영역 및/또는 유전자에 위치하는, 임신여성에 수태된 태아의 염색체 이수성을 검출하는 방법.
11. 제1항목 내지 제10항목 중 한 항목에서,
(A) 상기 제1 표적 DMR들의 하나는 DSCAM에 위치되고 제1 표적 DMR들의 다른 것은 C21orf57에, 또는 상기 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류로 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp을 넘지 않는 DNA 서열에 위치하고,
(B) 상기 기준 DMR들 중 하나는 TBX3에 위치하고 상기 기준 DMR 중 다른 것은 PCDHGA1에, 또는 상기 영역 및/또는 유전자로부터 상류 및/또는 하류로 10kbp, 5kbp, 1kbp, 500bp, 250bp, 150bp, 100bp, 또는 50bp을 넘지 않는 DNA 서열에 위치하고; 바람직하게는, (i) 상기 제1 표적 DMR 중 하나는 서열번호 201을 포함하고, 상기 제1 표적 DMR 중 다른 것은 서열번호 219를 포함하며, (ii) 상기 기준 DMR 중 하나는 서열번호 203을 포함하고 상기 기준 DMR 중 다른 것은 서열번호 220을 포함하는, 임신여성에 수태된 태아의 염색체 이수성을 검출하는 방법.
12. 제1항목 내지 제11항목 중 한 항에서,
(A) 단계 (c) 및 단계 (d), 및 선택적 임의 단계 (f)에서 다수의 결정 세트가 수행되되, 이 결정 세트에 속하는 각 결정은 상기 시료의 DNA의 상이한 분취량을 사용하여 상이한 용기에서 그리고 다수 결정 세트에 속하는 각 결정에 대해 유효하게 동시에 수행되고,
(B) 단계 (e)에서 결정되는 상대적 양(들) 또는 비율(들)은 단계 (c) 및 단계 (d) 그리고 선택적 임의 단계 (f)에서 수행된 다수의 결정 세트에 의해 결정되되, 바람직하게는 각 세트에서 결정된 DNA의 평균 양, 특히, 각 세트에서 결정된 DNA 양의 평균값, 중앙값, 또는 최빈값, 바람직하게는 각 세트에서 결정된 DNA 양의 평균값을 사용하여 결정되는, 임신여성에 수태된 태아의 염색체 이수성을 검출하는 방법.
13. 제1항목 내지 제12항목 중 한 항목에서,
(A) 제1 표적 DNA 종의 양은 제1 표적 DMR 중 하나에서의 메틸화 검출량으로부터 결정되고, 제1 표적 DNA 종의 양은 제1 표적 DMR 중 다른 것에서의 메틸화 검출량으로부터 결정되고,
(B) 단계 (e)에서 둘 이상의 상대적 량(들), 바람직하게는 비율(들)은 제1 표적 DNA 종의 둘 이상의 양에 대해 결정되되, 각각은 하나 이상의 상기 제1 표적 DMR에 대하여 결정되고,
(C) 상기 둘 이상의 상대적 양(들) 또는 비율은 태아 내 염색체 이수성의 존재 또는 부존재를 지시하되; 바람직하게는, 상기 단계 (e)에서, 상기 둘 이상의 상대적 양(들) 또는 비율(들)을 임계값(들) 및/또는 기준 분포(들)와 비교시에, 상기 둘 이상의 상대적 양(들) 또는 비율(들)이 상기 임계값(들) 및/또는 기준 분포(들)보다 높거나 낮은 것은 태아 내의 염색체 이수성의 존재를 지시하는, 임신여성에 수태된 태아의 염색체 이수성을 검출하는 방법.
14. 제1항목 내지 제13항목 중 한 항목에서, 상기 단계 (e)에서, 상기 상대적 양(들) 또는 비율(들)을 임계값(들) 및/또는 기준 분포(들)와 비교시에, 상기 상대적 양(들) 또는 비율(들)이 상기 임계값(들) 및/또는 기준 분포(들)보다 높거나 낮은 것은 태아 내의 염색체 이수성의 존재를 지시하되, 임계값 및/또는 기준 분포는 상이한 임신여성으로부터 각각 채취된 다수의 시료로부터, 특히, 제1항목 내지 제12항목 중 한 항목에 기재된 방법의 실행에 의해 결정되고, 상기 방법은 상이한 임신여성에서 채취한 다수의 시료에 대해서 수행되되 별도의 용기에서 그리고 다수 시료들 가각에 대해 유효하게 동시에 수행되며; 선택적으로, 단계 (c) 및 단계 (d), 그리고 선택적 임의 단계 (f)에서 다수의 결정 세트가 각 시료에 대해 수행되되, 특히 제12항목에 기재된 방법의 실행에 의해 수행되되, 선택적으로,
(A) 상기 다수의 시료들의 둘 이상의 그룹이 그룹별로 분석되되, 특히, 각 그룹을 별도의 실행, 분석, 또는 마이크로타이터 플레이트에서 분석되고, 상기 임계값 및/또는 기준 분포는 각 시료들의 그룹으로부터 결정된 양(들) 또는 비율(들)의 정규화에 의해 결정되되, 바람직하게는, 시료 그룹들 간의 상기 정규화는 시료 특이적 양 또는 비율(특히, 시료에 대해 여러 세트 행해진 결정의 평균값) 및 상기 특정 시료가 속한 동일 그룹 내의 모든 시료에 대해 결정된 양 또는 비율의 평균(예를 들어, 중앙값) 간의 차이를 고려하여 수행되고, 그리고/또는
(B) 태아 내의 염색체 이수성의 존재는 해당 태아에 대한 시료 특이적 양 또는 비율에 의해 지시되는데, 여기서, 태아에의 염색체 이수성의 존재는 다음의 (a) 및/또는 (b)에 제시된 위치, 즉, (a) 정배수체인(추정되는) 다수의 다른 태아에 대한 시료 특이적 양 또는 비율이 모여 있는 수치집단의 외부; 및/또는 (b) 염색체 이수성을 갖는 태아들을 나타내는 다수의 다른 시료들 ― 바람직하게, 여기서 상기 태아들을 나타내는 상기 다수의 다른 시료들은 약 2~10, 12~15, 16~25, 26~30, 32~40, 42~50, 52~75, 78~100 , 105-125, 130-150, 155-175, 180-200, 205-250, 255-300, 305-350, 355-400, 405-450, 455-500, 및 500개 초과 중에서 선택된 다른 시료들임 ― 에 대한 시료 특이적 양 또는 비율이 모인 수치집단의 내부에 위치하는 수치집단에 위치하는, 임신여성에 수태된 태아의 염색체 이수성을 검출하는 방법.
15. 임신여성이 수태한 태아의 염색체 이수성을 검출하기 위한 그리고/또는 의학적 증상을 앓거나 발병할 위험의 증가를 감지하기 위한 키트로서, 프라이머 및/또는 프로브의 조합을 포함하는 키트. ― 여기서 이 조합은 둘 이상의 표지처리된 프로브를 포함하며, 선택사항으로서, 각 프로브는 상이한 검출 표지를 갖고, 각 프로브는 상기 둘 이상의 제1 표적 DMR 중 하나를 검출(예를 들어, 실시간 정량화 PCR을 이용하여)하기 위한 것으로 이에 특화된 것임. 이 조합은 또한 아래의 (A) 및/또는 (B) 요소를 더 포함함.
(A):
ㆍ제1항목 내지 제14항목 중 한 항목에 기재된 상기 둘 이상의 제1 표적 DMR 중 하나를 증폭시키기 위한 2쌍 이상의 PCR 프라이머쌍(각 쌍이 하나를 증폭시킴); 및/또는
ㆍ둘 이상의 표지처리된 프로브 ― 선택사항으로서, 각 프로브는 동일한 검출 표지를 갖고, 각 프로브는 상기 둘 이상의 기준 DMR 중 하나를 검출(예를 들어, 실시간 정량화 PCR을 이용하여)하기 위한 것으로 이에 특화된 것임; 및/또는
ㆍ제1항목 내지 제14항목 중 한 항목에 기재된 상기 둘 이상의 기준 DMR 중 하나를 증폭시키기 위한 2쌍 이상의 PCR 프라이머쌍(각 쌍이 하나를 증폭시킴); 및/또는
(B):
ㆍ제3항목 내지 제14항목 중 한 항목에 기재된 상기 적어도 하나의 OR 중 하나를 증폭시키기 위한 적어도 한 쌍의(바람직하게는 두 쌍의) 다른 PCR 프라이머쌍(각 쌍이 하나를 증폭시킴); 및/또는
ㆍ상기 적어도 하나의 OR을 검출하기 위한 제12항에 기재된 적어도 하나의(바람직하게는 2개의) 표지처리된 다른 프로브(각 프로브가 하나를 검출함), 선택사항으로서, 각 프로브는 동일한 검출 표지를 갖고, 각 프로브는 상기 둘 이상의 OR 중 하나를 검출(예를 들어, 실시간 정량화 PCR을 이용하여)하기 위한 것으로 이에 특화된 것임.
또한, 선택적으로, (i) 제1항목 내지 제14항목 중 한 항목의 방법을 실시하기 위한 상기 프라이머 및/또는 프로브의 사용 지침이 포함된 인쇄 매뉴얼 또는 컴퓨터 판독가능 메모리; 및/또는 (ii) 제1항목 내지 제14항목 중 한 항목의 방법을 실시하는 데 유용한 하나 이상의 다른 품목, 구성품, 또는 시약을 추가로 포함하는 키트.
16. 제1항목 내지 제14항목 중 한 항목에 기재된 바와 같이 임신여성에 수태된 태아의 염색체 이수성을 검출하기 위해 임신여성에게서, 모체에서 유래한 상이하게 메틸화된 DNA와 혼합된 태아 및/또는 태아 태반에서 유래한 DNA를 포함하는 시료를 채취하고, 이 시료에 존재하는 DNA를 본 발명 방법에서 일어나는 메틸화된 DNA 및 메틸화되지 않은 DNA를 상이하게 변형시키는 시약으로 처리하는 검출하기 위한 연산을 수행 및/또는 관리하도록 컴퓨팅 시스템을 제어하기 위한 다수의 명령어로 인코딩된 컴퓨터 판독가능 매체를 포함하는 컴퓨터 프로그램 제품. 여기서 상기 연산은
- 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항의 단계 (c)에 기재된 것과 같이 상기 시료에 존재하는 염색체 이수성에 관련된 염색체인 제1 표적 DNA종의 양을 각각 나타내는 2개의 신호 (i), 및 제1항 내지 제53항 중 어느 한 항의 단계 (d)에 기재된 것과 같이 상기 시료에 존재하는 하나 이상의 기준 염색체인 기준 DNA 종의 양을 나타내는 하나의 신호 (ii)를 수신하는 단계;
- 수신된 신호 (ii)가 나타내는 기준 염색체의 양에 대한, 수신된 적어도 하나의 신호 (i)이 나타내는 염색체 이수성에 관련된 염색체의 적어도 하나의 상대적 양(들)에 기초하여, 상기 임신여성이 수태한 태아에 염색체 이수성의 존재여부의 유형을 정하는 단계 ― 여기서 적어도 하나는 태아 내의 염색체 이수성의 존재 또는 부존재를 지시함 ― 를 포함함; 그리고 선택사항으로서,
(A) 단계 (c) 및 단계 (d)에서 결정된 상기 DNA의 양을 나타내는 신호들은 상기 시료의 동일 분취량을 사용하여 그리고 동일한 용기에서 생성되고, 또 상기 제1 표적 DMR들 및 상기 기준 DMR들에 대해 유효하게 동시에 생성되며; 선택적으로, (x) 상기 적어도 두 개의 기준 DMR에 대해 동일한 검출 표지(들)를 사용하여서, 그리고 (y) 상기 적어도 두 개의 제1 표적 DMR에 대해 상이한 검출 표지(들)를 사용하여 생성되고, 그리고/또는
(B) 상기 연산은 임계값(들) 및/또는 기준 분포(들)와 비교함으로써 상기 유형을 정하되, 여기서 상기 상대적 양(들) 또는 비율(들) 중 하나 이상이 상기 임계값(들) 및/또는 기준 분포(들)보다 높거나 낮은 것은 태아에 염색체 이수성이 존재하는지를 지시하는데; 바람직하게는 상기 연산은, 상이한 임신여성로부터 각각 채취한 다수의 시료에 관련된 상기 (ⅰ) 및 (ⅱ)의 다수의 신호를 수신함으로써 상기 다수의 시료로부터 상기 임계값(들) 및/또는 기준 분포(들)을 계산하되, 여기서 선택사항으로 상기 다수의 시료는 제1항목 내지 제14항목 중 어느 한 항목의 방법에 의해 하나 이상의 시료 그룹에서 분석되고, 상기 방법은 별도의 용기에서 특정 그룹에 속하는 각 시료에 대해 수행되며, 해당 그룹 내 다수 시료들의 다른 구성 시료와 유효하게 동시에 수행됨; 그리고/또는
(C) 상기 연산은, 추가적으로,
- 제3항목에 기재된 상기 시료 내의 전체 DNA 양을 나타내는 다른 신호 (iii)을 수신하는 단계; 그리고
- 적어도 하나의 수신 신호 (i) 및/또는 (ii)와 함께 상기 수신된 신호 (iii)을 고려하여 시료 내에 존재하는 태아 DNA의 양 ― 특히, 절대적 양 또는 상대적 양 ― 을 결정하는 단계를 더 포함함;
- 그리고 바람직하게, 상기 연산은, 현재의 상기 태아 DNA의 양을 임계값 및/또는 기준 분포와 비교하여 임신여성이 임신관련 의학적 증상을 앓고 있는 또는 발병할 위험이 증가하는지의 유형을 정하는 단계를 추가로 포함함 ― 여기서 상기 임계값 및/또는 기준 분포로부터 상기 태아 DNA의 양이 증가하거나 이탈값을 보이는 것은 임신여성이 상기 임신관련 의학적 증상을 앓고 있는 또는 발병할 위험이 증가하는 것을 지시함