KR20200007740A

KR20200007740A - 핵산 증폭용 기판 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20200007740A
Application number: KR1020190084698A
Authority: KR
Inventors: 권오석; 하태환; 김경호; 김진영; 박선주; 서성은
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2018-07-12
Filing date: 2019-07-12
Publication date: 2020-01-22
Anticipated expiration: 2039-07-12
Also published as: EP3821982A4; CN112423887A; EP3821982A1; CN112423887B; WO2020013664A1; EP3821982B1; US20210268468A1; KR102348158B1; US12280351B2

Abstract

본 발명은 신속하고 정밀한 PCR 분석을 위한 투광성 기재, 상기 투광성 기재 상에 형성된 금속층, 상기 금속층의 표면에 일 말단이 결합된 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물 및 상기 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물의 타 말단에 고정화된 프라이머를 포함하는 것인 핵산 증폭용 기판 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

핵산 증폭용 기판 및 이의 제조방법{Substrate for Nucleic Acid Amplification and Method for Manufacturing Thereof}

본 발명은 핵산 증폭용 기판 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)법은 DNA 또는 RNA의 특정영역을 시험관 내에 대량으로 증폭하는 기술이다. 위와 같은 기술을 이용한 PCR 장비는 병원, 연구소 등에서 혈액에 들어 있는 적은 양의 DNA를 증폭시키기 위해 사용되며, 말라리아, 결핵, 간염 등의 다양한 질병의 진단을 위해서도 PCR 장비가 사용된다.

PCR은 변성, 결합, 신장의 3가지 단계를 1 사이클로 진행이 되는데, 각 단계에 적합한 온도에 맞추어 온도를 신속하게 상승 및 하강하도록 하는 것이 PCR 반응 시간을 단축시키는데 매우 중요하다. 즉, PCR에서는 각 단계의 설정 온도에 맞추어 온도를 순간적으로 이동하는 것이 요구되는데, 만약 설정 온도로 변화하는 과정에서 시간 지연이 발생하면 반응 속도가 저하되어 전체 PCR 반응 시간이 길어지는 것은 물론이고, 불필요한 반응이 진행되어 부산물이 생성되는 문제가 발생한다. 특히, PCR의 시간을 단축하는 것은 최근 급속하게 전염되는 전염병을 현장에서 신속하게 진단할 수 있게 하여 조기 방역을 가능케 하는 중요한 역할을 한다.

그러나, 기존에 이용되는 PCR 장치는 전기에너지를 열에너지원으로 사용하여, 핵산 증폭 반응을 완료하는데 있어 1시간 이상의 긴 시간이 소요되고, 발열 장비, 히트 싱크(heat sink) 등의 부속품들이 필요하기 때문에, 장비가 부피를 많이 차지하게 되는 불편함이 있는 문제점이 있어, 신속한 질병의 진단을 요하는 현장에 적용하기에는 다소 불편함이 있었다. 또한, 한국 공개특허공보 제2017-0106995호에는, 광에너지 기반의 PCR 시스템이 개시되어 있으나, 액체상에서 PCR 반응을 수행하는 것으로서, 하나의 챔버 내에서 다중 진단이 불가능하고, 사용된 프라이머의 회수가 불가능한 문제점이 있다. 특히, 기존의 PCR 장치는 높은 가격, 장비의 거대화, 오랜 검출 시간(1시간 이상)으로 인해 휴대가 불편하고, 현장에서 즉각적인 진단에 있어 한계가 있다.

따라서, 고온 및 급격한 온도 변화에도 불구하고, 안정적이고 신속하며 정밀한 진단을 위한 PCR에 대한 연구가 꾸준히 진행되고 있다.

한국 공개특허공보 제2017-0106995호

본 발명은 위와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 광에너지를 조사하여 발생하는 열에너지를 이용한 핵산 증폭시에, 금속층 표면에 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물을 링커로 하여 프라이머를 고정화함으로써, 안정적이면서도 신속한 다중 PCR 반응이 가능한 핵산 증폭용 기판을 제공하고자 한다.

본 발명은 투광성 기재, 상기 투광성 기재 상에 형성된 금속층, 상기 금속층의 표면에 일 말단이 결합된 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물 및 상기 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물의 타 말단에 고정화된 프라이머를 포함하는 것인 핵산 증폭용 기판을 제공한다.

또한, 본 발명은 투광성 기재 상에 금속층을 형성하는 단계, 상기 금속층의 표면에 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물의 일 말단을 도입하는 단계 및 상기 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물의 타 말단에 프라이머를 고정화 하는 단계를 포함하는 것인 핵산 증폭용 기판의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 핵산 증폭용 기판을 중합효소 연쇄반응(PCR)에 이용하는 경우, 금속층 표면(고체상)에 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물을 링커로 부착한 후, 프라이머를 고정화함으로써, 금속과 티올(-SH) 간의 결합에 의한 링커보다 고온에서의 안정성이 우수하면서도 매우 빠른 시간 내에 PCR 반응을 완료할 수 있다.

또한, 고체상(투광성 기재/금속층)에서의 PCR 반응에 따라 PCR 반응 후에 프라이머의 회수가 용이하고, 각 금속층 표면의 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물에 여러 종류의 프라이머를 고정화 할 수 있어서, 동시에 다양한 핵산의 증폭이 가능하여 다중 PCR 반응이 가능한 이점이 있다.

도 1은 본 발명의 핵산 증폭용 기판을 이용한 광 기반 PCR 반응의 일련의 과정을 개략적으로 나타낸 도시이다.
도 2는 본 발명의 핵산 증폭용 기판을 이용한 고체상의 광 기반 PCR 장치를 개략적으로 나타낸 도시이다.
도 3은 본 발명의 핵산 증폭용 기판에 포함되는 투광성 기재 상에 형성된 금(Au)층을 나타낸 도시이다.
도 4는 본 발명의 제조예 1에 따라 제조된 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물 1의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 도시이다.
도 5는 본 발명의 제조예 2에 따라 제조된 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물 2의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 도시이다.
도 6은 본 발명의 제조예 3에 따라 제조된 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물 3의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 도시이다.
도 7은 본 발명의 제조예 4에 따라 제조된 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물 4의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 도시이다.
도 8은 본 발명의 제조예 5에 따라 제조된 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물 5의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 도시이다.
도 9는 본 발명의 실시예 1 및 2에 따른 PCR 반응 40 사이클을 수행하는데 걸리는 시간을 나타낸 도시이다.
도 10은 본 발명의 실시예 1에 따라 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물 4가 결합된 금(Au)층의 XPS 원소 분석 결과를 나타낸 도시이다.
도 11은 본 발명의 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물 4를 이용하여 금(Au)층에 프라이머를 고정화하는 일련의 과정을 개략적으로 나타낸 도시이다.
도 12는 본 발명의 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물 4를 이용하여 금(Au)층에 프라이머를 고정화하는 일련의 과정을 개략적으로 나타낸 도시이다.
도 13은 본 발명의 일 실시형태에 따른 투광성 기재와 상기 투광성 기재 상에 형성된 금속층을 나타낸 도시이다.
도 14는 본 발명의 일 실시형태에 따른 투광성 기재와 상기 투광성 기재 상에 형성된 금속층을 나타낸 도시이다.
도 15는 본 발명의 실시예 3에 따른 PCR 반응 40 사이클을 수행하는데 걸리는 시간을 나타낸 도시이다.
도 16은 본 발명의 실시예 1에 따라 PCR 반응을 수행한 후, 형광 물질을 이용하여 검출 결과를 나타낸 도시이다.
도 17은 본 발명의 실시예 2에 따라 PCR 반응을 수행한 후, 형광 물질을 이용하여 검출 결과를 나타낸 도시이다.
도 18은 본 발명의 실시예 3에 따라 PCR 반응을 수행한 후, 형광 물질을 이용하여 검출 결과를 나타낸 도시이다.
도 19는 본 발명의 비교예 1에 따라 PCR 반응을 수행한 후, 형광 물질을 이용하여 검출 결과를 나타낸 도시이다.
도 20은 본 발명의 일 실시형태에 따라 금속 메쉬을 포함하는 투광성 기재를 나타낸 도시이다.
도 21은 도 20과 같이 금속 메쉬를 포함하는 경우에 PCR 반응 40 사이클을 수행하는데 걸리는 시간을 나타낸 도시이다.
도 22는 본 발명의 실시예 1에 따라 PCR 반응을 수행한 후, PCR 반응이 완료되었음을 확인한 전기영동 결과를 나타낸 도시이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 투광성 기재; 상기 투광성 기재 상에 형성된 금속층; 상기 금속층의 표면에 일 말단이 결합된 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물; 및 상기 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물의 타 말단에 고정화된 프라이머;를 포함하는 핵산 증폭용 기판을 제공한다.

상기 핵산 증폭용 기판은 DNA 또는 RNA의 원하는 부분을 복제 및 증폭시키는 분자생물학적인 기술인 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)에 이용될 수 있다.

상기 PCR의 첫 번째 단계는 DNA(또는 RNA)를 변성(Denaturation)시키는 단계이다. 두 가닥의 DNA는 가열함으로써 분리시킬 수 있고, 분리된 각각의 DNA는 주형(Template)으로서 역할을 하게 된다. 변성 온도는 일반적으로 90℃ 내지 96℃이나, DNA 내에 있는 염기 G+C의 양과 DNA의 길이에 따라 달라진다. PCR의 두 번째 단계는 결합(Annealing)하는 단계이다. 이 단계에서는 2 종류의 프라이머(Primer)를 각각 상보적인 주형 DNA에 결합시킨다. 결합 온도는 반응의 정확성을 결정하는 중요한 요소인데, 만약 온도를 너무 높게 하면 프라이머가 주형 DNA에 너무 약하게 결합되어서 증폭된 DNA의 산물이 매우 적어진다. 만약 온도를 너무 낮게 하면 프라이머가 비특이적으로 결합하기 때문에 원하지 않는 DNA가 증폭될 수 있다. 일반적인 결합 온도는 50℃ 내지 65℃이다. PCR의 세 번째 단계는 신장(Elongation) 단계이다. 이 단계에서는 열에 강한 DNA 중합효소(polymerase)가 주형 DNA에서 새로운 DNA를 만들게 된다. 이 때 신장 온도는 70℃ 내지 75℃이다. 위와 같이, PCR 반응은 일련의 세 단계가 있고, 위 세 단계를 1 사이클(cycle)로 하여 약 30 내지 40 사이클 정도 반복하여 PCR 반응이 수행된다.

상기 핵산 증폭용 기판은 위와 같은 PCR 중에서도, 광에너지 조사에 의해 발생하는 열에너지를 이용하는 광 기반 PCR에 이용될 수 있다.

상기 광 기반 PCR은 금속 표면의 광자(photon), 전자(electron), 포논(phonon)의 상호작용에 의한 플라즈몬 광열 변환을 이용할 수 있다. 구체적으로, 여기된(excited) 에너지원으로부터 광자가 금속층의 표면에 도달하면, 광 흡수가 일어나고, 표면 근처에서 전자를 더 높은 상태로 여기하여 고온의 전자를 형성하게 된다. 이러한 고온의 전자가 금속층 전체에 빠르게 확산되어 균일하게 분포됨에 따라, 고온의 금속층으로 인하여 주변 용액의 가열이 가능하다. 또한 고온의 전자는 격자 포논과의 에너지 교환에 의해 다시 냉각될 수 있다.

위와 같이 플라즈몬 여기된 금속층은 최대 500℃까지 승온하고, 금속층 주변의 PCR 시료 용액을 150℃이상까지 빠른 시간 내에 가열할 수 있다.

상기 투광성 기재는 상기 금속층이 형성된 반대 면의 하부에 위치한 광원으로부터 조사된 광을 상기 금속층에 손실 없이 전달하고, 상기 금속층과의 부착력이 우수하도록 제조될 수 있다.

상기 광원은 자외선, 가시광선 또는 적외선을 발생할 수 있는 것이면 이에 제한되지 않으며, 할로겐 램프, LED 램프, 형광등, 백열 램프, 아크 램프(arc source lamp), 적외선 램프, HMI 램프, UV 램프 등을 이용할 수 있으며, 전력효율, 경제적인 측면에서 LED 램프가 바람직하다.

상기 투광성 기재는 조사된 광을 투과시킬 수 있도록 투명한 소재로 이루어질 수 있고, 광 또는 열에 의해 변형이 거의 일어나지 않는 소재로 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 유리 기재, 플라스틱 기재 또는 실리콘 기재 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 투광성 기재는 일정한 두께를 가지며, 상기 투광성 기재의 두께는 0.1 ㎜ 내지 10 ㎜일 수 있고, 바람직하게는 0.5 ㎜ 내지 5 ㎜일 수 있고, 더 바람직하게는 0.5 mm 내지 1.5 mm일 수 있다. 상기 투광성 기재의 두께가 상기 범위를 만족하는 경우에 광원에서 조사된 광에너지에 의한 열에너지가 효율적으로 전달되어 PCR 반응 사이클을 최적화할 수 있다.

상기 투광성 기재는 평면형의 2차원 기재; 구형, 반구형, 다면체형, 다각기둥형, 또는 원기둥형 등의 3차원 기재; 또는 이들을 혼합한 형태의 기재를 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 13 및 도 14와 같이 상기 투광성 기재는 다면체형 기재의 적어도 하나의 면의 일부가 반구형 기재를 포함하는 3차원 기재가 혼합된 형태의 기재를 포함할 수 있다.

상기와 같이 투광성 기재가 3차원 기재를 포함하는 경우에는 다면에서 PCR 반응을 수행할 수 있어서, 동시에 다양한 핵산의 증폭이 가능함에 따라 다중 진단이 가능한 이점이 있다.

상기 핵산 증폭용 기판은 광에너지 조사에 의한 열에너지를 이용하기 위하여 금속층을 이용할 수 있다. 상기 금속층을 이용하는 경우, 순간적으로 온도가 최고 500℃ 이상 상승할 수 있기 때문에, PCR 사이클의 온도 범위(약 50℃ 내지 95℃ 내의 온도 변화를 신속하게 수행할 수 있다.

상기 금속층은 금속 박막을 포함할 수 있다.

상기 금속층은 금속 메쉬를 더 포함할 수 있다. 상기 금속층이 금속 메쉬를 더 포함하는 경우에는 상기 투광성 기재 상에 금속 메쉬를 먼저 형성한 후에, 상기 금속 메쉬 상에 금속층이 형성될 수 있다. 상기 금속층이 금속 메쉬를 더 포함하는 경우에는 금속층만을 이용하는 경우보다도 신속한 가열과 냉각이 가능함에 따라 PCR 사이클의 온도 변화를 신속히 수행할 수 있어서, 더욱 효율적인 PCR 반응이 가능하다.

도 20와 같이 금속 메쉬가 있는 경우에는 PCR 사이클의 온도 범위(약 50℃ 내지 95℃ 내의 온도 변화를 신속하게 수행할 수 있어서, 도 21과 같이 PCR 반응 40 사이클을 수행하는데 걸리는 시간이 약 7분 정도로 상당히 짧은 것을 확인할 수 있다.

상기 금속층이 투광성 기재 상에 형성되는 경우에, 상기 금속층은 상기 투광성 기재의 적어도 하나의 면에 형성될 수 있다. 이 때 상기 금속층은 상기 투광성 기재의 적어도 하나의 면 전체에 형성될 수 있고, 또는 상기 투광성 기재의 적어도 하나의 면의 일부에만 형성될 수도 있다. 즉 상기 투광성 기재 상에는 하나의 금속층이 형성될 수도 있으나, 복수개의 금속층이 형성될 수도 있다.

상기 금속 메쉬는 2차원 또는 3차원 구조를 가질 수 있으며, 이 때 메쉬는 삼각형, 사각형, 오각형, 육각형 등의 다각형 패턴을 포함할 수 있고, 또는 원형 패턴을 포함할 수도 있다.

상기 메쉬가 다각형 패턴을 포함하는 경우에는 메쉬의 한 변의 길이가 50 내지 200 ㎛일 수 있고, 상기 메쉬가 원형 패턴을 포함하는 경우에는 메쉬의 직경이 50 내지 200 ㎛일 수 있다. 또한 상기 메쉬 간의 간격은 1 내지 5 ㎛일 수 있고, 구체적으로는 1 내지 2 ㎛일 수 있다. 상기 금속 메쉬의 두께는 10 ㎚ 내지 200 ㎚일 수 있고, 구체적으로는 100 내지 200 ㎚일 수 있다. 상기 금속 메쉬의 두께, 메쉬 크기가 상기 범위를 만족하는 경우에, 신속한 가열과 냉각이 가능하여서, 금속층만 이용하는 경우보다 PCR 사이클의 온도 변화를 신속히 수행할 수 있다.

상기 금속층은 구리(Cu), 은(Ag), 금(Au), 팔라듐(Pd), 백금(Pt), 로듐(Rh) 및 이들의 조합(예를 들어, 두 금속나노입자(bimetallic nanoparticles))으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 후술할 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물과의 결합성 및 안정성이 우수하고, 광 흡수가 빠른 금(Au)을 포함할 수 있다.

상기 금속층을 상기 투광성 기재의 일면에 코팅하는 방법은 코팅 또는 증착 기술이라면 이에 제한되지 않고 이용할 수 있으며, 화학적 기상 증착(Chemical Vapor Deposition, CVD), 물리적 기상 증착(Physical Vapor Deposition, PVD), 열증발 진공 증착(Thermal evaporation deposition), 스퍼터링 증착(Sputtering deposition) 또는 원자층 증착(Atomic Layer Deposition, ALD) 등의 방법에 의하여 상기 투광성 기재에 균일한 두께로 형성될 수 있다.

상기 금속층의 두께는 10 ㎚ 내지 200 ㎚일 수 있다. 상기 금속층의 두께가 상기 범위를 초과하는 경우에, 링커를 고정화하는 단계에서 금속층이 훼손되거나 링커가 불균일하게 형성되는 문제가 있다.

상기 투광성 기재 상에 형성된 금(Au)층을 도 3에 도시하였다.

상기 금속층의 표면에 상기 프라이머를 고정화시키기 위한 링커로, N-헤테로사이클릭 카벤 화합물을 이용할 수 있다. 상기 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물은 상기 금속층의 표면에 금속-카벤 결합을 통해 도입될 수 있다.

특히, 기존의 고체상 PCR에 이용되는 티올(Thiol: -SH)기를 가진 링커는, 금속-황 결합의 고온(약 90℃ 이상)에서의 불안정성(금속-황 결합의 깨짐)때문에 PCR 반응 결과의 재현성이 떨어지는 문제가 있다. 이와 대조적으로, 상기 프라이머를 금속층에 고정화시키기 위한 링커로, N-헤테로사이클릭 카벤 화합물을 이용하는 경우에는, 광원에 의한 상기 금속층의 표면 온도가 일시적으로 최고 500℃까지 상승하게 되더라도, 금속-카벤 결합으로 인하여 고온에서 안정성을 획득할 수 있어서, 광에너지를 이용한 PCR 장치에도 적용이 가능한 장점이 있다.

상기 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물은 하기 화학식 1 또는 2로 표시될 수 있다.

[화학식 1]

[화학식 2]

상기 화학식 1 및 2에 있어서,

R1, R2, R5 및 R6은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 탄소수 1 내지 20의 알킬기, 탄소수 3 내지 20의 시클로알킬기, 탄소수 6 내지 30의 아릴기 또는 탄소수 2 내지 30의 헤테로아릴기이거나,

R3, R4, R7, R8, R9 및 R10은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 탄소수 1 내지 20의 알킬기, 탄소수 3 내지 20의 시클로알킬기, 탄소수 6 내지 30의 아릴기, 탄소수 2 내지 30의 헤테로아릴기 또는 하기 화학식 3으로 표시되는 구조이거나, R7 내지 R10 중 서로 인접한 두 개 이상의 치환기가 결합하여 탄화수소 고리를 형성하고,

R3 및 R4 중 적어도 하나는 하기 화학식 3으로 표시되는 구조이고,

R7 내지 R10 중 적어도 하나는 하기 화학식 3으로 표시되는 구조로 치환되거나, R7 내지 R10 중 서로 인접한 두 개 이상의 치환기가 결합하여 탄화수소 고리를 형성하는 경우 상기 탄화수소 고리를 형성하는 탄소 중 적어도 하나는 하기 화학식 3으로 표시되는 구조로 치환되고,

[화학식 3]

상기 화학식 3에 있어서,

n은 괄호 내 단위의 반복 수로 1 내지 30의 정수이고,

A는 질소(N) 원자를 포함하는 탄소수 1 내지 20의 알킬기 또는 질소(N) 원자를 포함하는 탄소수 2 내지 30의 헤테로아릴기이다.

상기 R1, R2, R5 및 R6은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 탄소수 1 내지 20의 알킬기 또는 탄소수 6 내지 30의 아릴기일 수 있다.

상기 R1, R2, R5 및 R6은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 탄소수 1 내지 10의 알킬기 또는 탄소수 6 내지 10의 아릴기일 수 있다.

상기 R1, R2, R5 및 R6은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소 또는 탄소수 1 내지 10의 알킬기일 수 있다.

상기 R1, R2, R5 및 R6은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 이소프로필 또는 벤질일 수 있다.

상기 R1 및 R2 중 적어도 하나 및 상기 R5 및 R6 중 적어도 하나는 서로 같거나 상이하며 각각 독립적으로 탄소수 1 내지 20의 알킬기 또는 탄소수 6 내지 30의 아릴기일 수 있다.

상기 R1 및 R2 중 적어도 하나 및 상기 R5 및 R6 중 적어도 하나는 서로 같거나 상이하며 각각 독립적으로 이소프로필 또는 벤질일 수 있다.

상기 R3, R4, R7, R8, R9 및 R10은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 탄소수 1 내지 20의 알킬기, 탄소수 3 내지 20의 시클로알킬기, 탄소수 6 내지 30의 아릴기, 탄소수 2 내지 30의 헤테로아릴기 또는 상기 화학식 3으로 표시되는 구조이거나, R7 내지 R10 중 서로 인접한 두 개 이상의 치환기가 결합하여 탄화수소 고리를 형성할 수 있다.

상기 R3, R4, R7, R8, R9 및 R10은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소 또는 상기 화학식 3으로 표시되는 구조이거나, R7 내지 R10 중 서로 인접한 두 개 이상의 치환기가 결합하여 탄화수소 고리를 형성할 수 있다.

상기 R7 내지 R10 중 서로 인접한 두 개 이상의 치환기가 결합하여 탄화수소 고리를 형성하는 경우 상기 탄화수소 고리를 형성하는 탄소 중 적어도 하나는 상기 화학식 3으로 표시되는 구조로 치환될 수 있다.

상기 R3 및 R4 중 적어도 하나는 상기 화학식 3으로 표시되는 구조일 수 있다. 또한, 상기 R7 내지 R10 중 적어도 하나는 상기 화학식 3으로 표시되는 구조일 수 있다.

상기 n은 괄호 내 단위의 반복 수로 1 내지 30의 정수일 수 있고, 바람직하게는 1 내지 10일 수 있다. 더 바람직하게는 1 내지 3일 수 있다.

상기 A는 질소(N) 원자를 포함하는 탄소수 1 내지 20의 알킬기 또는 질소(N) 원자를 포함하는 탄소수 2 내지 30의 헤테로아릴기이다. 구체적으로 상기 A는 아자이드(azide), 프탈이미드(phthalimide), 또는 아민(amine)일 수 있다.

본 발명에 있어서, "인접한" 기는 해당 치환기가 치환된 원자와 직접 연결된 원자에 치환된 치환기, 해당 치환기와 입체구조적으로 가장 가깝게 위치한 치환기, 또는 해당 치환기가 치환된 원자에 치환된 다른 치환기를 의미할 수 있다. 예컨대, 벤젠고리에서 오쏘(ortho)위치로 치환된 2개의 치환기 및 지방족 고리에서 동일 탄소에 치환된 2개의 치환기는 서로 "인접한"기로 해석될 수 있다.

상기 알킬기는 직쇄 또는 분지쇄일 수 있고, 탄소수 1 내지 20일 수 있고, 바람직하게는 탄소수 1 내지 10일 수 있다. 더 바람직하게는 탄소수 1 내지 6일 수 있다. 상기 알킬기의 구체적인 예로는 메틸, 에틸, 프로필, n-프로필, 이소프로필, 부틸, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, sec-부틸, 1-메틸부틸, 1-에틸부틸, 펜틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, tert-펜틸, 헥실, n-헥실, 1-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 4-메틸-2-펜틸, 3,3-디메틸 부틸, 2-에틸부틸, 헵틸, n-헵틸, 1-메틸헥실, 시클로펜틸메틸, 시클로헥실메틸, 옥틸, n-옥틸, tert-옥틸, 1-메틸헵틸, 2-에틸헥실, 2-프로필펜틸, n-노닐, 2,2-디메틸헵틸, 1-에틸프로필, 1,1-디메틸프로필, 이소헥실, 4-메틸헥실, 5-메틸헥실, 벤질 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 시클로알킬기는 탄소수 3 내지 20일 수 있고, 바람직하게는 탄소수 3 내지 10일 수 있다. 상기 시클로알킬기의 구체적인 예로는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 3-메틸시클로펜틸, 2,3-디메틸시클로펜틸, 시클로헥실, 3-메틸시클로헥실, 4-메틸시클로헥실, 2,3-디메틸시클로헥실, 3,4,5-트리메틸시클로헥실, 4-tert-부틸시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 아릴기는 탄소수 6 내지 30일 수 있고, 바람직하게는 탄소수 6 내지 10일 수 있다. 상기 아릴기는 단환식 아릴기 또는 다환식 아릴기일 수 있다. 상기 단환식 아릴기의 구체적인 예로는 페닐기, 바이페닐기, 터페닐기 등이 있고, 상기 다환식 아릴기의 구체적인 예로는 나프틸기, 안트라세닐기, 페난트릴기, 파이레닐기, 페릴레닐기, 크라이세닐기, 플루오레닐기, 트리페닐렌기 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 헤테로아릴기는 이종원자로 N, O, P, S, Si 및 Se 중 선택되는 1개 이상을 포함하는 방향족 고리기로서, 탄소수는 2 내지 30일 수 있고, 바람직하게는 탄소수 2 내지 20일 수 있다. 상기 헤테로아릴기의 구체적인 예로는 티오펜기, 퓨란기, 피롤기, 이미다졸기, 티아졸기, 옥사졸기, 옥사디아졸기, 트리아졸기, 피리딜기, 피리미딜기, 트리아진기, 트리아졸기, 아크리딜기, 퀴놀리닐기, 퀴나졸린기, 퀴녹살리닐기, 프탈라지닐기, 이소퀴놀린기, 인돌기, 카바졸기, 벤즈옥사졸기, 벤즈이미다졸기, 벤조티아졸기, 벤조카바졸기, 벤조티오펜기, 디벤조티오펜기, 벤조퓨라닐기 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 알킬기, 시클로알킬기, 아릴기, 헤테로아릴기 또는 탄화수소 고리는 다시 알킬기, 시클로알킬기, 아릴기 또는 헤테로아릴기로 치환 또는 비치환될 수 있다.

상기 금속층의 표면에는 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물의 일 말단이 결합될 수 있고, 이 때, 화학적 기상 증착(Chemical Vapor Deposition, CVD), 물리적 기상 증착(Physical Vapor Deposition, PVD), 열증발 진공 증착(Thermal evaporation deposition), 스퍼터링 증착(Sputtering deposition), 원자층 증착(Atomic Layer Deposition, ALD), 화학용액 증착(Chemical-bath deposition, CBD) 등의 방법에 의하여 금속-카벤 결합이 형성될 수 있다.

본 발명의 일 실시형태에 따라, 화학적 기상 증착 방법으로 금속층의 표면에 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물의 일 말단을 결합하는 일련의 메커니즘을 도 11에 나타내었고, 화학용액 증착 방법으로 금속층의 표면에 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물의 일 말단을 결합하는 일련의 메커니즘을 도 12에 나타내었다.

상기 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물의 타 말단에는 프라이머가 결합되어 고정화 될 수 있다.

상기 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물의 타 말단은 아자이드(azide), 프탈이미드(phthalimide), 또는 아민(amine)으로 기능화 된 것일 수 있다.

상기 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물의 타 말단이 상기 아자이드, 프탈이미드, 또는 아민으로 기능화되는 경우, 도 11 및 12에 나타낸 바와 같이 클릭 반응(click reaction)을 이용하여 아자이드, 프탈이미드, 또는 아민에 프라이머가 결합될 수 있다. 이에 따라, 일반적으로 프라이머가 금속층과 정전기적 인력에 의하여 결합되는 것과는 대비하여, 프라이머가 금속층에 더 단단한 화학적 결합으로 고정화될 수 있기 때문에, 이를 고온의 고체상의 PCR 반응에 이용하는 경우 우수한 안정성, 저장성 및 보관 용이성이 향상되는 효과가 있다.

상기 프라이머는 적어도 한 종류의 프라이머일 수 있다. 적어도 한 종류의 프라이머란, 서로 상이한 증폭 대상 주형 DNA(또는 RNA)에 상보적으로 결합될 수 있는 프라이머 중에서 선택된 어느 하나를 의미할 수 있다.

상기 프라이머는 서로 상이한 두 종류 이상의 프라이머일 수 있다. 상기 프라이머가 서로 상이한 두 종류 이상의 프라이머인 경우, 증폭 대상 제1 주형 DNA(또는 RNA)에 상보적으로 결합할 수 있는 한 쌍의 프라이머 중 어느 하나와, 증폭 대상 제2 주형 DNA(또는 RNA)에 상보적으로 결합할 수 있는 한 쌍의 프라이머 중 어느 하나를 의미할 수 있다. 여기서, 상기 제1 주형 DNA(또는 RNA)와 상기 제2 주형 DNA(또는 RNA)는 서로 상이한 염기 서열을 가진 DNA(또는 RNA)를 의미할 수 있다.

위와 같이, 금속층의 표면에 결합된 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물의 타 말단에 서로 상이한 주형 DNA(또는 RNA)의 신장(elongation)이 가능한 프라이머를 고정화 함으로써, 동시에 다양한 DNA(또는 RNA)를 증폭할 수 있어서, 하나의 챔버 내에서 다중 PCR 반응에 의한 진단이 가능하다.

본 발명은 또한, 투광성 기재 상에 금속층을 형성하는 단계; 상기 금속층의 표면에 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물의 일 말단을 도입하는 단계; 및 상기 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물의 타 말단에 프라이머를 고정화 하는 단계;를 포함하는 것인 핵산 증폭용 기판의 제조방법을 제공한다.

도 1은 본 발명의 핵산 증폭용 기판을 이용한 광 기반 PCR 반응의 일련의 과정을 개략적으로 나타낸 도시이다.

본 발명의 핵산 증폭용 기판을 이용하여 광에너지 기반의 PCR 반응을 수행하는 과정을 개략적으로 설명하면 아래와 같으나, 반드시 아래에 서술한 방법으로만 PCR 반응이 한정되는 것은 아니다.

증폭 대상 주형 DNA, dNTP, Taq 중합효소(polymerase) 등을 포함하는 PCR 시료를 준비한다. 상기 주형 DNA에 상보적으로 결합하는 두 종류의 프라이머(정방향 프라이머, 역방향 프라이머)를 준비한다. 상기 정방향 프라이머 중 일부를 본 발명의 핵산 증폭용 기판인 투광성 기재/금속층/N-헤테로사이클릭 카벤 화합물 링커의 말단에 결합시켜 고정화 하고, 나머지 정방향 프라이머와 역방향 프라이머는 상기 PCR 반응 시료에 포함시킨다. 이어서, 상기 투광성 기재 하부에 위치한 광원(LED 등)에 의해 광에너지를 조사하여, PCR 반응을 수행한다.

기존의 금속층에 티올(Thiol: -SH)기를 링커로 이용하여 금속-황 결합에 의해 프라이머를 금속층의 표면에 고정화한 PCR 기판의 경우, 금속-황 결합은 고온(약 90℃ 이상)에서 불안정하여 쉽게 링커가 떨어지는 문제가 있어, 광에너지에 의해 표면 온도가 500℃까지 상승하는 광에너지 기반의 PCR에는 적용이 불가능하고, 전기에너지로부터 변환된 열에너지를 이용한 PCR 장치에만 이용할 수 있다.

그러나, 본 발명의 핵산 증폭용 기판을 이용하여 PCR 반응을 수행하는 경우에는, 금속층 표면(고체상)에 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물을 링커로 부착한 후 프라이머를 고정화함으로써, 금속과 티올(-SH) 간의 결합에 의한 링커보다 고온에서의 안정성이 우수하여, 광에너지로부터 변환된 열에너지를 이용한 PCR 장치에도 이용이 가능하며, 금속층의 경우 광에너지 조사에 따른 신속한 온도 조절이 가능함에 따라, PCR 반응 40 사이클(cycle)을 수행하는데 약 12분 내지 15분의 매우 빠른 시간 내에 PCR 반응을 완료할 수 있다.

또한, 전술한 바와 같이, 적어도 한 종류의 프라이머(혹은 서로 상이한 두 종류 이상의 프라이머)를 이용하여, 동시에 다양한 핵산의 증폭이 가능함에 따라, 다중 PCR 반응을 수행하여 보다 정밀한 진단이 가능한 장점이 있다. 또한, 액체상에서만 반응하는 PCR과는 달리, PCR 반응 후 상기 핵산 증폭용 기판을 쉽게 회수할 수 있어서, 프라이머의 보관이 용이하고 재생이 가능한 장점이 있다.

이하에서, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이에 의하여 한정되는 것은 아니다.

<제조예>

<제조예 1>

위와 같은 반응식에 따라, N-헤테로사이클릭 카벤 화합물 1을 제조하였다.

도 4에 상기 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물 1의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타내었다.

<제조예 2>

위와 같은 반응식에 따라, N-헤테로사이클릭 카벤 화합물 2를 제조하였다.

도 5에 상기 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물 2의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타내었다.

<제조예 3>

위와 같은 반응식에 따라, N-헤테로사이클릭 카벤 화합물 3을 제조하였다.

도 6에 상기 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물 3의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타내었다.

<제조예 4>

위와 같은 반응식에 따라, N-헤테로사이클릭 카벤 화합물 4를 제조하였다.

도 7에 상기 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물 4의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타내었다.

<제조예 5>

위와 같은 반응식에 따라, N-헤테로사이클릭 카벤 화합물 5를 제조하였다.

도 8에 상기 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물 5의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타내었다.

<실시예>

<실시예 1>

주형 DNA로 폐암 세포주인 A549의 cDNA를 이용하였고, dNTP, Taq polymerase, 아래의 역방향 프라이머 및 정방향 프라이머가 포함된 액상의 PCR 반응물을 준비하였다.

제조예 4에서 제조된 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물 4를 이용하여, 평면형 유리 기재 상에 CVD로 증착된 금(Au)층 표면에 아래와 같은 정방향 프라이머를 고정하였다. 상기와 같이 정방향 프라이머가 고정된 기판을, 정방향 프라이머가 상대적으로 적게 포함된 액상의 PCR 반응물에 넣고, 도 2의 장치를 이용하여 40 사이클의 PCR 반응을 수행하였다. 상기 PCR 반응 40 사이클을 수행하는데 걸리는 시간을 도 9에 나타내었고, PCR 반응 결과물 5 ㎕을 1 wt%의 아가로스 겔에 로딩한 뒤 100V, 20분의 조건으로 전기영동(제노믹베이스사의 Mupid 2Plus)을 수행하였고, 기존의 RT PCR 반응 결과물과 비교하여, 실시예 1의 PCR 반응이 완료되었음을 도 22를 통해 확인하였다.

[고체상의 기판에 고정된 프라이머]

- 정방향 프라이머: 5'-Amino(C12)-TTTTTTTTTTGACCCAATCATGAGCACTGCTTT-3'

[액상의 PCR 반응물 내 프라이머]

- 정방향 프라이머: 5'-GACCCAATCATGAGCACTG-3'

- 역방향 프라이머: 5'-TGAAGCGACCCTCTGATG-3'

<실시예 2>

상기 실시예 1에 있어서, 주형 DNA로 폐암 세포주인 A549의 cDNA 대신에 변이 폐암 세포주인 NCI-H-1975의 cDNA를 이용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 PCR 반응을 수행하였다.

<실시예 3>

상기 실시예 1에 있어서, 평면형 유리 기재 대신에, 도 13 및 도 14와 같은 육면체형 유리 기재를 이용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 PCR 반응을 수행하였다. 상기 PCR 반응 40 사이클을 수행하는데 걸리는 시간을 도 15에 나타내었다.

<비교예 1>

주형 DNA 없이 PCR 반응을 수행하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 PCR 반응을 수행하였다.

실시예 1 내지 3 및 비교예 1과 같이 수행된 PCR 산물에 EtBr을 처리하여 형광을 측정한 결과를 도 16 내지 도 19에 나타내었다.

상기 도 19에 따르면, 주형 DNA가 없어 PCR 반응이 일어나지 않은 비교예 1에서는 형광이 발생하지 않은 반면, 도 9, 도 16 및 17에 따르면, 각각 A549 세포주와 NCI-H-1975 세포주의 cDNA를 주형으로 이용한 실시예 1 및 2의 경우에는 모두 약 15분이라는 짧은 시간 안에 충분한 PCR 산물이 생성되어 형광이 발생함을 확인하였다.

또한 도 15 및 도 18에 따르면 육면체형 유리 기재를 이용하는 실시예 3의 경우에는 약 8 내지 9분 이내에 충분한 PCR 산물이 생성되어 형광이 발생함을 확인하였다.

이상에서 본 발명은 기재된 실시예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 청구범위에 속함은 당연한 것이다.

10: 투광성 기재
20: 금속층
30: 서모커플(Thermocouple)

Claims

투광성 기재;
상기 투광성 기재 상에 형성된 금속층;
상기 금속층의 표면에 일 말단이 결합된 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물; 및
상기 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물의 타 말단에 고정화된 프라이머;
를 포함하는 것인 핵산 증폭용 기판.
청구항 1에 있어서, 상기 투광성 기재는 평면형의 2차원 기재; 구형, 반구형, 다면체형, 다각기둥형, 및 원기둥형 중에서 선택되는 적어도 하나의 3차원 기재; 및 이들을 혼합한 형태의 기재 중에서 선택되는 적어도 하나의 기재를 포함하는 것인 핵산 증폭용 기판.
청구항 1에 있어서, 상기 금속층은 금속 메쉬를 더 포함하는 것인 핵산 증폭용 기판.
청구항 1에 있어서, 상기 금속층은 금(Au)을 포함하는 것인 핵산 증폭용 기판.
청구항 1에 있어서, 상기 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물의 타 말단은 아자이드(azide), 프탈이미드(phthalimide), 또는 아민(amine)으로 기능화 된 것인 핵산 증폭용 기판.
청구항 1에 있어서, 상기 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물은 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 것인 핵산 증폭용 기판:
[화학식 1]

[화학식 2]

상기 화학식 1 및 2에 있어서,
R1, R2, R5 및 R6은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 탄소수 1 내지 20의 알킬기, 탄소수 3 내지 20의 시클로알킬기, 탄소수 6 내지 30의 아릴기 또는 탄소수 2 내지 30의 헤테로아릴기이거나,
R3, R4, R7, R8, R9 및 R10은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 탄소수 1 내지 20의 알킬기, 탄소수 3 내지 20의 시클로알킬기, 탄소수 6 내지 30의 아릴기, 탄소수 2 내지 30의 헤테로아릴기 또는 하기 화학식 3으로 표시되는 구조이거나, R7 내지 R10 중 서로 인접한 두 개 이상의 치환기가 결합하여 탄화수소 고리를 형성하고,
R3 및 R4 중 적어도 하나는 하기 화학식 3으로 표시되는 구조이고,
R7 내지 R10 중 적어도 하나는 하기 화학식 3으로 표시되는 구조로 치환되거나, R7 내지 R10 중 서로 인접한 두 개 이상의 치환기가 결합하여 탄화수소 고리를 형성하는 경우 상기 탄화수소 고리를 형성하는 탄소 중 적어도 하나는 하기 화학식 3으로 표시되는 구조로 치환되고,
[화학식 3]

상기 화학식 3에 있어서,
n은 괄호 내 단위의 반복 수로 1 내지 30의 정수이고,
A는 질소(N) 원자를 포함하는 탄소수 1 내지 20의 알킬기 또는 질소(N) 원자를 포함하는 탄소수 2 내지 30의 헤테로아릴기이다.
청구항 1에 있어서, 상기 프라이머는 적어도 한 종류의 프라이머인 것인 핵산 증폭용 기판.
투광성 기재 상에 금속층을 형성하는 단계;
상기 금속층의 표면에 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물의 일 말단을 도입하는 단계; 및
상기 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물의 타 말단에 프라이머를 고정화 하는 단계;
를 포함하는 것인 핵산 증폭용 기판의 제조방법.
청구항 8에 있어서, 상기 투광성 기재는 평면형의 2차원 기재; 구형, 반구형, 다면체형, 다각기둥형, 및 원기둥형 중에서 선택되는 적어도 하나의 3차원 기재; 및 이들을 혼합한 형태의 기재 중에서 선택되는 적어도 하나의 기재를 포함하는 것인 핵산 증폭용 기판의 제조방법.
청구항 8에 있어서, 상기 금속층은 금속 메쉬를 더 포함하는 것인 핵산 증폭용 기판의 제조방법.
청구항 8에 있어서, 상기 금속층의 표면에 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물의 일 말단이 금속-카벤 결합을 통해 도입되는 것인 핵산 증폭용 기판의 제조방법.
청구항 8에 있어서, 상기 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물의 타 말단은 아자이드(azide), 프탈이미드(phthalimide), 또는 아민(amine)으로 기능화 된 것인 핵산 증폭용 기판의 제조방법.
청구항 8에 있어서, 상기 프라이머는 상기 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물의 타 말단과 클릭 반응(click reaction)으로 고정화되는 것인 핵산 증폭용 기판의 제조방법.
청구항 8에 있어서, 상기 금속층은 금(Au)을 포함하는 것인 핵산 증폭용 기판의 제조방법.
청구항 8에 있어서, 상기 N-헤테로사이클릭 카벤 화합물은 하기 화학식 1 또는 2로 표시되는 것인 핵산 증폭용 기판의 제조방법:
[화학식 1]

[화학식 2]

상기 화학식 1 및 2에 있어서,
R1, R2, R5 및 R6은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 탄소수 1 내지 20의 알킬기, 탄소수 3 내지 20의 시클로알킬기, 탄소수 6 내지 30의 아릴기 또는 탄소수 2 내지 30의 헤테로아릴기이거나,
R3, R4, R7, R8, R9 및 R10은 서로 같거나 상이하고 각각 독립적으로 수소, 탄소수 1 내지 20의 알킬기, 탄소수 3 내지 20의 시클로알킬기, 탄소수 6 내지 30의 아릴기, 탄소수 2 내지 30의 헤테로아릴기 또는 하기 화학식 3으로 표시되는 구조이거나, R7 내지 R10 중 서로 인접한 두 개 이상의 치환기가 결합하여 탄화수소 고리를 형성하고,
R3 및 R4 중 적어도 하나는 하기 화학식 3으로 표시되는 구조이고,
R7 내지 R10 중 적어도 하나는 하기 화학식 3으로 표시되는 구조로 치환되거나, R7 내지 R10 중 서로 인접한 두 개 이상의 치환기가 결합하여 탄화수소 고리를 형성하는 경우 상기 탄화수소 고리를 형성하는 탄소 중 적어도 하나는 하기 화학식 3으로 표시되는 구조로 치환되고,
[화학식 3]

상기 화학식 3에 있어서,
n은 괄호 내 단위의 반복 수로 1 내지 30의 정수이고,
A는 질소(N) 원자를 포함하는 탄소수 1 내지 20의 알킬기 또는 질소(N) 원자를 포함하는 탄소수 2 내지 30의 헤테로아릴기이다.
청구항 8에 있어서, 상기 프라이머는 적어도 한 종류의 프라이머인 것인 핵산 증폭용 기판의 제조방법.