KR20200032244A

KR20200032244A - 폼페병의 치료를 위한 고농도 알파-글루코시다제 조성물

Info

Publication number: KR20200032244A
Application number: KR1020207007487A
Authority: KR
Inventors: 케네스 조셉 발렌자노; 존 크라울리; 리치 칸나; 존 플라나간
Original assignee: 아미쿠스 세라퓨틱스, 인코포레이티드
Priority date: 2012-03-07
Filing date: 2013-03-07
Publication date: 2020-03-25
Also published as: US9404100B2; JP2018027945A; KR20230164207A; KR20210062731A; US12419937B2; MX349992B; US11278599B2; US20150044194A1; US10512677B2; US20180360928A1; CA2866683A1; KR20140135222A; US20140193390A1; US20170056483A1; US20260083829A1; JP2022008596A; JP2024105244A; JP2015509542A; KR20230066482A; WO2013134530A1

Abstract

본 출원은 산성 α-글루코시다제에 대한 활성 부위-특이적 샤페론과 조합된 높은 농도의 산성 α-글루코시다제를 포함하는 조성물, 및 상기 조성물을 피검체에 투여하는 방법을 포함하는 폼페병을 치료할 필요가 있는 피검체에서 폼페병을 치료하는 방법을 제공한다. 본 출원은 또한 산성 α-글루코시다제 효소 제형의 시험관내 및 생체내 안정성을 증가시키는 방법을 제공한다.

Description

폼페병의 치료를 위한 고농도 알파-글루코시다제 조성물{HIGH CONCENTRATION ALPHA-GLUCOSIDASE COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF POMPE DISEASE}

관련 출원의 전후-참조

본 출원은 2012년 3월 7일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/607,920호 및 2013년 1월 9일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/750,718호의 이익을 주장하고, 상기 출원 각각에 대해 우선권이 주장되며, 상기 출원 각각은 이들의 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.

1. 서론

본 발명은 폼페병을 치료하고/하거나, 예방하고/하거나, 개선시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 폼페병의 치료에서 사용하기 위해 표지될 수 있는 조성물 및 약제에 관한 것이다.

2. 발명의 배경

폼페병(산성 말타제 결핍)은 효소 산성 α-글루코시다제(GAA)의 결핍에 의해 야기된다. GAA는 에너지에 사용되는 당의 저장 형태인 글리코겐을 글루코스로 대사시킨다. 글리코겐의 축적은 다양한 신체 조직, 특히 심장, 골격근, 간, 및 신경계에 악영향을 미치는 신체 전체에 걸친 진행성 근육병증을 초래한다. 미국 국립신경질환뇌졸중연구소(National Institute of Neurological Disorders and Stroke)에 따르면, 폼페병은 40,000명의 출생 중 약 1명에서 발생하는 것으로 추정된다.

영아, 소아, 및 성인 발병의 3개의 인지된 유형의 폼페병이 존재한다(예를 들어, Hirschhorn and Reuser, In: Scriver CR, Beaudet AL, Sly W, Valle D, editors; The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, Vol. III, New York: McGraw-Hill; 2001. p. 3389-420., 2001:3389-3420 참조). 영아-발병 폼페병이 가장 심각하며, 근육 긴장의 심각한 결핍, 무력, 비대 간 및 심장, 및 심근병증을 포함하는 증상을 나타낸다. 연하(swallowing)가 어려워질 수 있으며, 혀가 돌출되고 비대해질 수 있다. 대부분의 아동은 2세의 연령 전에 호흡기 또는 심장 합병증으로 사망하나, 영아-발병 환자의 일부는 더 오래 생존한다(통상적이지 않은 영아 환자). 소아 발병 폼페병은 먼저 초기 내지 후기 아동기에서 나타나고, 동맥, 횡경막, 및 하지에서의 호흡근의 진행성 무력, 뿐만 아니라 운동 불내성을 포함한다. 대부분의 소아 발병 폼페 환자는 20세 또는 30세를 넘어 생존하지 못한다. 성인 발병 증상은 동맥, 하지, 및 횡경막에서의 전신 근육 무력 및 호흡근의 쇠약을 수반한다. 일부 성인 환자는 주요 증상 또는 운동 제한이 없다.

출생전 스크리닝 동안 확인되지 않는 경우, 폼페병의 진단은 난제이다. 성인-발병 폼페의 진단은 환자가 경험하는 증상의 수, 중증도, 및 유형이 매우 다양하기 때문에 더욱 더 어려우며, 이는 근육퇴행위축과 같은 더욱 흔한 장애를 나타낼 수 있다. 진단은 생물학적 샘플로부터 α-글루코시다제 활성을 측정하고/하거나 글리코겐의 병리학적 수준을 검출함으로써 확인된다. 현재, 유일하게 승인된 요법은 재조합 α-글루코시다제를 이용한 효소 대체 요법이다.

폼페병은 여러 글리코겐 병리 중 하나이다. 다른 병리는 가지제거 결핍(코리-포브병; 글리코겐증 유형 III); 분지 결핍(글리코겐증 유형 IV; 안데르센병); 근육인산분해효소(맥아들병, 글리코겐축적병 V); 포스포프룩토키나제 결핍-M 이소형(타우리병; 글리코겐증 유형 VII); 포스포릴라제 b 키나제 결핍(글리코겐증 유형 VIII); 포스포글리세레이트 키나제 A-이소형 결핍(글리코겐증 IX); 포스포글리세레이트 M-뮤타제 결핍(글리코겐증 유형 X)을 포함한다.

3. 발명의 개요

본 발명은 산성 α-글루코시다제(GAA) 효소에 대한 활성 부위-특이적 샤페론(ASSC)(예를 들어, 1-데옥시노지리마이신(DNJ, 1-DNJ))과 조합된 GAA 효소(예를 들어, 재조합 인간 GAA(rhGAA))를 폼페병(예를 들어, 영아-발병 폼페병)의 치료를 필요로 하는 개체로의 투여에 의해 폼페병(예를 들어, 영아-발병 폼페병)을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 생체내 및 시험관 내에서 적절한 입체형태의 GAA 효소의 안정성을 증가시키는 방법을 제공한다. 한 구현예에서, 산성 α-글루코시다제(GAA) 효소에 대한 ASSC(예를 들어, 1-데옥시노지리마이신 또는 1-데옥시노지리마이신-HCl)와 조합된 GAA 효소(예를 들어, 재조합 인간 GAA(rhGAA))는 상기 치료를 필요로 하는 개체에 투여된다. GAA 효소는 ASSC와 조합되는 경우에 입체형태적으로 안정화되며, 예를 들어, 열 및 pH 공격에 저항하도록 충분히 적합화된다.

특정 구현예에서, GAA 효소는 높은 농도, 예를 들어, 약 5 내지 약 250 ㎎/㎖ 사이의 농도로 ASSC와 조합된다.

특정 구현예에서, GAA 효소는 높은 농도, 예를 들어, 약 25 ㎎/㎖, 약 80 ㎎/㎖, 약 115 ㎎/㎖, 약 160 ㎎/㎖, 약 200 ㎎/㎖ 및 약 240 ㎎/㎖로 구성된 군으로부터 선택된 농도로 ASSC와 조합된다.

특정 구현예에서, GAA 효소는 ASSC와 조합되며, 상기 ASSC는 약 5 ㎎/㎖ 내지 약 200 ㎎/㎖의 농도로 존재한다.

특정 구현예에서, GAA 효소는 ASSC와 조합되며, 상기 ASSC는 약 32 ㎎/㎖ 내지 약 160 ㎎/㎖로 구성된 군으로부터 선택된 농도로 존재한다.

특정 구현예에서, GAA 효소는 ASSC와 조합되며, 상기 ASSC는 약 0.5 mM 내지 약 20 mM 사이의 농도로 존재한다.

특정 구현예에서, GAA 효소는 공동-제형으로서 ASSC와 조합된다.

특정 구현예에서, GAA 효소는 공동-제형으로서 ASSC와 조합되며, 상기 공동-제형은 부형제를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 부형제는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), PEG-400, 아르기닌, 아르기닌 및 글루탐산, 프롤린, 감마-사이클로덱스트린 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된다.

특정 구현예에서, 본 발명의 제형은 높은 단백질 농도에도 불구하고 연장된 기간에 걸쳐 물리적 및 화학적 안정성을 유지하며, 피하 투여에 적합한 점도를 갖는다. 본 발명의 제형은 적어도 부분적으로는 ASSC와 조합된 GAA 효소가 높은 농도(예를 들어, 25 ㎎/㎖)에서 가용성이 남아 있고, 주사(예를 들어, 피하 투여)에 적합한 점도를 유지하면서 응집되지 않은 채로 남아있을 수 있다는 놀라운 발견에 근거하여 확립된다.

특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약 5 ㎎/㎖ 초과의 GAA 효소를 포함한다.

특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약 25 ㎎/㎖의 GAA 효소 및 약 10 mM의 DNJ를 포함한다.

특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 약 25 ㎎/㎖의 GAA 효소 및 약 1 mM의 DNJ를 포함한다.

본 발명의 제형의 장점은 상기 제형이 증가된 단백질 농도를 이용하는 경우에 일반적으로 발생하는 증가된 단백질 응집 없이 높은 농도의 단백질을 제공한다는 점이다. 한 구현예에서, 본 발명의 제형은 약 1% 미만의 응집 단백질을 갖는다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 폼페병을 갖는 개체의 조직, 예를 들어, 근육 조직으로의 GAA의 전달을 향상시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 ASSC와 조합된 GAA를 개체에 피하 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, ASSC와 조합된 GAA는 용량의 투여 후 약 24시간 이내에 피검체의 조직에서 GAA의 피크 농도를 발생시키기에 충분한 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, ASSC와 조합된 GAA는 용량의 투여후 약 10 내지 약 50 시간, 또는 약 45, 40, 35, 30, 25, 또는 그 미만의 시간 이내에 피검체의 조직에서 GAA의 피크 농도를 발생시키기에 충분한 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 용량은 개체의 간에서 독성 수준의 GAA를 발생시키지 않는다.

다양한 비제한적인 구현예에서, GAA 효소에 대한 ASSC는 GAA 효소의 가역적인 경쟁적 억제제를 포함하는 GAA 효소의 소분자 억제제이다.

한 구현예에서, ASSC는 하기 화학식에 의해 표현되고, 이의 약학적으로 허용되는 염, 에스테르 및 프로드러그를 포함한다:

상기 식에서, R₁은 H, 또는 -OH, -COOH, -Cl, -F, -CF₃, -OCF₃, -O-C(=O)N-(알킬)₂로 임의로 치환되는 1 내지 12개의 탄소 원자를 함유하는 선형 또는 분지형 알킬, 사이클로알킬, 알콕시알킬 또는 아미노알킬이고; R₂는 H, 또는 1 내지 9개의 탄소 원자를 함유하는 선형 또는 분지형 알킬, 사이클로알킬, 또는 알콕시알킬이다. 한 구현예에서, ASSC는 상기 정의된 바와 같고, R₁은 H이다. 또 다른 구현예에서, ASSC는 상기 정의된 바와 같고, R₂는 H이다.

한 특정한 비제한적인 구현예에서, ASSC는 하기 화학식에 의해 표현되는 1-데옥시노지리마이신(1-DNJ) 또는 1-데옥시노지리마이신의 약학적으로 허용되는 염, 에스테르 또는 프로드러그이다:

한 구현예에서, 상기 염은 하이드로클로라이드 염(즉, 1-데옥시노지리마이신-HCl)이다.

한 특정한 비제한적인 구현예에서, ASSC는 하기 화학식에 의해 표현되는 N-부틸-데옥시노지리마이신(NB-DNJ; Zavesca®, Actelion Pharmaceuticals Ltd, Switzerland) 또는 NB-DNJ의 약학적으로 허용되는 염, 에스테르 또는 프로드러그이다:

한 특정한 비제한적인 구현예에서, ASSC는 하기 화학식에 의해 표현되는 C₁₀H₁₉NO₄ 또는 C₁₀H₁₉NO₄의 약학적으로 허용되는 염, 에스테르 또는 프로드러그이다:

한 구현예에서, 상기 염은 하이드로클로라이드 염이다.

한 특정한 비제한적인 구현예에서, ASSC는 하기 화학식에 의해 표현되는 C₁₂H₂₃NO₄, 또는 C₁₂H₂₃NO₄의 약학적으로 허용되는 염, 에스테르 또는 프로드러그이다:

한 구현예에서, 상기 염은 하이드로클로라이드 염이다.

4. 도면의 간단한 설명
도 1은 열 안정성 검정에서 결정되는 바와 같은 100 μM의 1-데옥시노지리마이신 하이드로클로라이드(1-DNJ-HCl)의 존재 또는 부재하에서 ER pH(7.4) 또는 리소솜 pH(5.2)에서의 재조합 인간 GAA(Myozyme^®, Genzyme Corp.)의 안정성을 도시한다. 열 안정성 검정은 단백질 변성을 유도하기 위해 열을 이용하며, 이는 소수성 아미노산(폴딩된 단백질에서 노출되지 않음)으로의 결합시 형광을 발하는 SYPRO Orange 염료를 이용하여 모니터된다. 변성을 위해 더 많은 열을 필요로 하는 단백질 구조는 정의상 더욱 안정적인 구조이다. 상기 제시된 바와 같이, Myozyme®은 보통 ER pH(7.4)보다 리소솜 pH(5.2)에서 훨씬 더 안정적이다. 그러나, pH 7.4에서의 효소 안정성은 Myozyme® 단독에 비해 100 μM의 1-데옥시노지리마이신의 첨가시 유의하게 증가된다.
도 2a는 37℃에서 혈장 pH(7.4) 또는 리소솜 pH(5.2)에서의 재조합 인간 GAA(Myozyme^®, Genzyme Corp.) 효소 활성에 대한 1-DNJ-HCl의 효과를 도시한다. GAA 활성은 시간 경과에 따라 rhGAA의 활성을 연장시키는 GAA의 ASSC의 능력을 판단하기 위해 평가되었다. Myozyme®(45 nM)은 24시간에 걸쳐 37℃에서 50 μM 1-DNJ와 함께 또는 50 μM 1-DNJ 없이 pH 7.4 또는 pH 5.2 완충액에서 인큐베이션되었다. 샘플은 0, 3, 6 및 24시간에서 4-MU-α-글루코스를 이용하여 GAA 효소 활성에 대해 검정되었고, 잔여 GAA 활성이 최초 활성의 %로 표현되었다. 이들 결과는 1-DNJ가 혈장 pH(7.4)에서 GAA 효소 활성의 손실을 개선시키는 것을 나타낸다.
도 2b는 도 2a에 제시된 효소 활성의 손실, 특히 ER pH(7.4)에서의 Myozyme® 활성의 손실이 단백질 언폴딩(unfolding) 및 변성과 관련이 있는지 결정하기 위한 병행 SYPRO Orange 열 안정성 실험을 도시한다. Myozyme®(0.9 μM)은 37℃에서 100 μM 1-DNJ-HCl과 함께 또는 100 μM 1-DNJ-HCl 없이 pH 7.4 또는 pH 5.2 완충액에서 인큐베이션되었고, 단백질 폴딩이 24시간에 걸쳐 매시간 모니터되었다. 도 2a 및 2b는 GAA 변성이 효소 활성의 손실(2개의 도면의 다이아몬드 곡선을 갖는 곡선과 비교함)과 상관 관계가 있는 것을 나타낸다. 더욱 중요하게는, 이들 결과는 1-DNJ가 혈장 pH에서 GAA 변성 및 효소 활성의 손실을 방지할 수 있는 것을 나타낸다.
도 3은 1-DNJ-HCl의 동반 경구 투여와 함께 및 동반 경구 투여 없이 ERT를 투여받은 GAA KO 마우스에 대한 GAA 활성 시험의 결과를 도시한다. Myozyme®은 Myozyme® 투여 30분 전, 및 투여 8, 16, 및 24시간 후에 단독으로 또는 10, 100, 또는 1000 ㎎/㎏의 1-DNJ-HCl과 조합되어, 3주 이하 동안 매주 1회로 10 ㎎/㎏의 용량으로 IV 주입을 통해 투여되었다. 이들 결과는 Myozyme® 조직 흡수(GAA 활성의 척도로서)가 주사 7일 후에 감소된 것을 나타낸다. 1-DNJ-HCl과 Myozyme®의 공동투여는 주사후 7일 이하 동안 Myozyme® 흡수에서 용량-의존적 증가를 촉진하였다. 1-DNJ-HCl의 효과는 Myozyme®의 1, 2, 또는 3회의 매주 주입의 주사 후 4 및 7일에 더욱 현저하고 유의(Myozyme® 단독에 비한 p<0.05 t-검정)하였다.
도 4는 1-DNJ-HCl이 약 1 μM의 IC₅₀으로 GAA를 억제하는 것을 나타낸다.
도 5는 단백질 변성을 유도하기 위해 열을 이용하는 열 안정성 검정의 결과를 도시하며, 이는 소수성 아미노산(폴딩된 단백질에서 노출되지 않음)으로의 결합시 형광을 발하는 SYPRO Orange 염료를 이용하여 모니터된다. 1-DNJ-HCl은 용량-의존적 방식으로 GAA의 융해 온도에서의 증가로 나타나는 바와 같이 GAA 열안정성을 증가시킨다.
도 6은 3 ㎎/㎏ 또는 30 ㎎/㎏의 경구 투여되는 1-DNJ-HCl와 함께 및 상기 1-DNJ-HCl 없이 10 ㎎/㎏의 rhGAA 또는 염수의 IV 투여후 24시간에 걸친 래트에서의 GAA 활성의 결과를 도시한다. rhGAA 또는 염수는 1-DNJ-HCl의 투여 30분 후에 투여되었다. 이러한 예에서, 1-DNJ-HCl은 투여후 효소 활성의 손실을 억제함으로써 rhGAA의 생체내 반감기를 증가시켰다. rhGAA의 생체내 반감기는 1.4 ± 0.2시간(0 ㎎/㎏의 1-DNJ-HCl)으로부터 2.1 ± 0.2시간(3 ㎎/㎏의 1-DNJ-HCl) 및 3.0 ± 0.4시간(30 ㎎/㎏의 1-DNJ-HCl)으로 증가하였다.
도 7은 GAA KO 마우스에 투여되는 경우 ERT 단일요법 및 ERT/ASSC 공동-요법(rhGAA + 1-DNJ-HCl)에 대한 심장 및 횡경막 조직에서의 GAA 활성을 도시한다. 심장 및 횡경막에서의 rhGAA 흡수는 1-DNJ-HCl과 함께 공동 투여되는 경우에 증가된다.
도 8은 1-DNJ-HCl이 혈액에서 rhGAA 효소 비활성화를 방지하는 것을 나타낸다. Myozyme®(0.5 μM)은 50 μM 1-DNJ-HCl의 존재 또는 부재하에서 시트레이트 항-응고된 전혈에서 37℃에서 인큐베이션되었다. 분취액은 0, 2, 4, 8 및 24시간에서 수거되었고, 원심분리되어 혈장을 수득하였다. 이들 혈장 샘플은 이후 포타슘 아세테이트 완충액(pH 4.0)에서 희석되었고, 4-메틸움벨리페릴-α-글루코스(4-MUG) 형광원(fluorogenic) 기질을 이용하여 GAA 활성에 대해 검정되었다. 각 시점에서 개별적 샘플에 대해 측정된 GAA 활성은 0시간으로 표준화되었고, 최초 활성의 %로 표현되었다. 4개의 독립적 실험으로부터의 데이터는 평균(및 표준 편차)를 수득하기 위해 분석되었고, 상기 시간 경과에 걸친 효소 활성의 손실을 평가하기 위해 시간에 대해 작도되었다.
도 9는 낮은 1-DNJ-HCl 농도가 혈액에서 rhGAA 효소 비활성화를 방지하는 것을 나타낸다. Myozyme®(0.5 μM)은 다양한 1-DNJ-HCl 농도(0 내지 100 μM)와 함께 시트레이트 항-응고된 전혈에서 37℃에서 인큐베이션되었다. 분취액이 0, 3 및 6시간에서 수거되었고, 원심분리되어 혈장을 수득하였다. 이들 혈장 샘플은 이후 포타슘 아세테이트 완충액(pH 4.0)에서 희석되었고, 4-메틸움벨리페릴-α-글루코스(4-MUG) 형광원 기질을 이용하여 GAA 활성에 대해 검정되었다. 각 시점에서 개별적 샘플에 대해 측정된 GAA 활성은 0시간으로 표준화되고, 최초 활성의 %로 표현되었다. 잔여 GAA 효소 활성이 시간에 대해 작도되어, 상기 시간 경과에 따른 1-DNJ-HCl 농도와 관련된 효소 활성의 손실을 평가하였다.
도 10은 실시예 9에 대한 실험 계획을 나타낸다.
도 11은 1-DNJ-HCl과 공동-투여된 Myozyme®이 Myozyme® 단독에 비해 GAA KO 마우스에서 유의하게 더 큰 조직 글리코겐 감소를 발생시킨 것을 나타낸다. Myozyme® 단독을 이용한 글리코겐 감소는 미처리된 마우스에 비해 심장, 횡경막, 가자미근, 및 네갈래근 각각에서 93±1%, 41±4%, 69±3%, 및 18±4%였다. 1-DNJ-HCl과 공동-투여된 Myozyme®을 이용한 글리코겐 감소는 각각 96±0.6%, 66±5%, 82±3%, 및 23±3%였다.
도 12는 1 mM DNJ와 25 ㎎/㎖ Myozyme®을 조합시키는 것이 중성 pH 7.4 및 37℃에서 Myozyme®의 응집을 감소시키는 것을 나타낸다. 응집은 4주의 인큐베이션 기간 후에 평가되었다.
도 13은 꼬리 정맥 주사를 통해 10 ㎎/㎏ Myozyme®과 동등한 양과 공동-제형화된 30 ㎎/㎏ DNJ를 투여하는 것이 네갈래근에서 Myozyme®의 순환 혈장 반감기 및 조직 흡수를 증가시킨 것을 나타낸다.
도 14는 20 ㎎/㎏ Myozyme®과 공동-제형화된 DNJ의 피하 투여가 DNJ가 없는 20 ㎎/㎏ Myozyme®의 투여에 비해 rhGAA의 순환 수준을 증가시킨 것을 나타낸다.
도 15는 실시예 13에 기재된 바와 같은 마우스로의 rhGAA 또는 rhGAA 및 1-DNJ의 공동-제형의 마지막 피하 투여 3일 후의 주사 부위의 피부에서의 rhGAA 활성을 나타낸다.
도 16a-b는 실시예 13에 기재된 바와 같은 마우스로의 rhGAA 또는 rhGAA 및 1-DNJ의 공동-제형의 마지막 피하 투여 3일 후(A) 및 14일 후(B)의 배쪽 피부에서의 rhGAA 활성(A) 및 글리코겐 수준(B)을 나타낸다.
도 17a-b는 실시예 13에 기재된 바와 같은 마우스로의 rhGAA 또는 rhGAA 및 1-DNJ의 공동-제형의 마지막 피하 투여 3일 후(A) 및 14일 후(B)의 심장에서의 rhGAA 활성(A) 및 글리코겐 수준(B)을 나타낸다.
도 18a-b는 실시예 13에 기재된 바와 같은 마우스로의 rhGAA 또는 rhGAA 및 1-DNJ의 공동-제형의 마지막 피하 투여 3일 후(A) 및 14일 후(B)의 혀에서의 rhGAA 활성(A) 및 글리코겐 수준(B)을 나타낸다.
도 19a-b는 실시예 13에 기재된 바와 같은 마우스로의 rhGAA 또는 rhGAA 및 1-DNJ의 공동-제형의 마지막 피하 투여 3일 후(A) 및 14일 후(B)의 횡경막에서의 rhGAA 활성(A) 및 글리코겐 수준(B)을 나타낸다.
도 20a-b는 실시예 13에 기재된 바와 같은 마우스로의 rhGAA 또는 rhGAA 및 1-DNJ의 공동-제형의 마지막 피하 투여 3일 후(A) 및 14일 후(B)의 두갈래근에서의 rhGAA 활성(A) 및 글리코겐 수준(B)을 나타낸다.
도 21a-b는 실시예 13에 기재된 바와 같은 마우스로의 rhGAA 또는 rhGAA 및 1-DNJ의 공동-제형의 마지막 피하 투여 3일 후(A) 및 14일 후(B)의 세갈래근에서의 rhGAA 활성(A) 및 글리코겐 수준(B)을 나타낸다.
도 22a-b는 실시예 13에 기재된 바와 같은 마우스로의 rhGAA 또는 rhGAA 및 1-DNJ의 공동-제형의 마지막 피하 투여 3일 후(A) 및 14일 후(B)의 장딴지근에서의 rhGAA 활성(A) 및 글리코겐 수준(B)을 나타낸다.
도 23a-b는 실시예 13에 기재된 바와 같은 마우스로의 rhGAA 또는 rhGAA 및 1-DNJ의 공동-제형의 마지막 피하 투여 3일 후(A) 및 14일 후(B)의 네갈래근에서의 rhGAA 활성(A) 및 글리코겐 수준(B)을 나타낸다.
도 24는 실시예 13에 기재된 바와 같은 마우스로의 rhGAA 또는 rhGAA 및 1-DNJ의 공동-제형의 마지막 피하 투여 3일 후의 가자미근에서의 rhGAA 활성을 나타낸다.
도 25는 실시예 13에 기재된 바와 같은 마우스로의 rhGAA 또는 rhGAA 및 1-DNJ의 공동-제형의 마지막 피하 투여 3일 후의 간에서의 rhGAA 활성을 나타낸다.
도 26은 실시예 13에 기재된 바와 같은 마우스로의 rhGAA 또는 rhGAA 및 1-DNJ의 공동-제형의 마지막 피하 투여 3일 후에 시험된 다양한 조직에서의 rhGAA 활성의 비교를 나타낸다.
도 27은 실시예 13에 기재된 바와 같은 마우스로의 rhGAA 또는 rhGAA 및 1-DNJ의 공동-제형의 마지막 피하 투여 2시간 후(A) 및 4시간 후(B)의 혈장 rhGAA 활성을 나타낸다.
도 28은 실시예 13에 기재된 바와 같은 마우스로의 rhGAA 또는 rhGAA 및 1-DNJ의 공동-제형의 마지막 피하 투여 2시간 후의 혈장 rhGAA 활성 및 혈장 GAA 단백질 수준(웨스턴 블롯에 의해 측정됨)을 나타낸다.
도 29는 실시예 13에 기재된 바와 같은 마우스로의 rhGAA 또는 rhGAA 및 1-DNJ의 공동-제형의 마지막 피하 투여 4시간 후의 혈장 rhGAA 활성 및 혈장 GAA 단백질 수준(웨스턴 블롯에 의해 측정됨)을 나타낸다.

5. 상세한 설명

본 발명은 적어도 부분적으로 산성 α-글루코시다제(GAA) 효소(예를 들어, 재조합 인간 GAA(rhGAA))와 GAA 효소에 대한 ASSC(예를 들어, 1-데옥시노지리마이신)를 조합시키는 것이 어느 하나의 단독 처리에 비해 생체내에서 GAA 활성을 놀랍게도 증가시킨다는 발견을 기초로 한다. 본 발명은 또한 적어도 부분적으로 GAA 효소(예를 들어, rhGAA)가 GAA 효소에 대한 ASSC의 첨가시 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 적절한 입체형태를 안정화시킨다는 발견을 기초로 한다. 본 발명은 또한 적어도 부분적으로 ASSC와 높은 농도의 GAA를 조합시키는 것이 증가된 GAA 농도를 이용하는 경우에 일반적으로 발생하는 GAA 응집을 감소시킨다는 발견을 기초로 한다.

명료함을 위한 것으로, 이로 제한하고자 하는 것은 아닌, 본 상세한 설명은 하기 하위부분으로 나뉘어진다:

(i) 정의;

(ii) 폼페병;

(iii) GAA 및 ASSC 수득;

(iv) ERT 및 ASSC를 이용한 폼페병의 치료;

(v) 약학적 조성물;

(vi) 시험관내 안정성; 및

(vii) 생체내 안정성.

5.1 정의

본 명세서에서 사용되는 용어는 일반적으로 본 발명의 상황 내 및 각각의 용어가 사용되는 특정 상황에서 이들의 당 분야에서의 통상적인 의미를 갖는다. 특정 용어는 본 발명의 조성물 및 방법 및 이들을 제조하고 사용하는 방법을 기재하는데 있어서 진료의에게 추가 지침을 제공하기 위해 하기, 또는 본 명세서의 다른 곳에 논의되어 있다.

본 발명에 따르면, "피검체" 또는 "환자"는 인간 또는 비-인간 동물이다. 동물 피검체는 바람직하게는 인간이나, 본 발명의 화합물 및 조성물은 또한 수의 의약, 예를 들어, 길들여진 종, 예를 들어, 개, 고양이, 및 다양한 다른 애완동물; 농장 동물 종, 예를 들어, 소, 말, 양, 염소, 돼지 등; 야생 동물, 예를 들어, 야생 또는 동물원 내의 야생 동물; 및 조류 종, 예를 들어, 닭, 칠면조, 메추라기, 명금(songbird) 등의 치료를 위한 수의 의약에서 적용성을 갖는다.

용어 "효소 대체 요법" 또는 "ERT"는 상기 효소에서 결핍을 갖는 개체로 비-자연의 정제된 효소의 도입을 나타낸다. 투여된 효소는 자연원 또는 재조합 발현에 의해 수득될 수 있다. 상기 용어는 또한 정제된 효소의 투여를 달리 필요로 하거나 이로부터 이익을 얻는, 예를 들어, 단백질 부족으로 고통받는 개체에서의 정제된 효소의 도입을 나타낸다. 도입된 효소는 정제된, 시험관내에서 생성된 재조합 효소, 또는 분리된 조직 또는 유체, 예를 들어, 태반 또는 동물 밀크, 또는 식물로부터 정제된 효소일 수 있다.

용어 "적절한 입체형태를 안정화시킴"은 야생형 단백질과 회합하는 화합물 또는 펩티드 또는 다른 분자의 능력, 또는 야생형 또는 돌연변이체 단백질의 구조가 이의 자연 또는 적절한 형태로서 유지될 수 있도록 하는 방식으로 시험관내 및 생체내에서 이의 야생형 기능을 수행할 수 있는 돌연변이체 단백질을 나타낸다. 이러한 효과는 실제적으로 (i) 단백질의 증가된 저장 기간; (ii) 단백질의 단위/양 당 더 높은 활성; 또는 (iii) 더 큰 생체내 효능 중 하나 이상을 통해 자체적으로 나타날 수 있다. 이는 발현 동안 ER로부터 증가된 생성; 온도 증가로 인한 언폴딩에 대한 더 큰 내성(예를 들어, 열 안정성 검정에서 결정될 수 있음), 또는 무질서 작용제(chaotropic agent)의 존재를 통해, 그리고 유사한 수단에 의해 실험적으로 관찰될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "활성 부위"는 일부 특정한 생물학적 활성을 갖는 단백질의 영역을 나타낸다. 예를 들어, 이는 기질 또는 다른 결합 파트너에 결합하고, 화학 결합을 만들고 파괴하는데 있어서 직접 관여하는 아미노산 잔기에 기여하는 부위일 수 있다. 본 발명의 활성 부위는 효소의 촉매 부위, 항체의 항원 결합 부위, 수용체의 리간드 결합 도메인, 조절인자의 결합 도메인, 또는 분비된 단백질의 수용체 결합 도메인을 포함할 수 있다. 활성 부위는 또한 전이활성, 단백질-단백질 상호작용, 또는 전사 인자 및 조절인자의 DNA 결합 도메인을 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "활성 부위-특이적 샤페론"은 단백질의 활성 부위와 가역적으로 특이적으로 상호작용하고, 안정적인 분자 입체형태의 형성을 향상시키는 단백질, 펩티드, 핵산, 탄수화물 등을 포함하는 임의의 분자를 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "활성 부위-특이적 샤페론"은 세포의 ER에 존재하는 내생성의 일반적인 샤페론, 예를 들어, Bip, 칼넥신(calnexin) 또는 칼레티큘린(calreticulin), 또는 일반적인 비특이적 화학 샤페론, 예를 들어, 중수소화된 물, DMSO, 또는 TMAO를 포함하지 않는다.

본원에서 사용되는 용어 "정제된"은 관련되지 않은 물질, 즉, 상기 물질이 수득되는 자연 물질을 포함하는 오염물질의 존재를 감소시키거나 제거하는 조건하에서 분리된 물질을 나타낸다. 예를 들어, 정제된 단백질은 바람직하게는 세포 내에서 회합되는 다른 단백질 또는 핵산을 실질적으로 함유하지 않고; 정제된 핵산 분자는 바람직하게는 세포 내에서 발견될 수 있는 단백질 또는 다른 관련되지 않은 핵산 분자를 실질적으로 함유하지 않는다. 본원에서 사용되는 용어 "실질적으로 함유하지 않는"은 물질의 분석 시험 상황에서 작업적으로 사용된다. 바람직하게는, 오염물질을 실질적으로 함유하지 않는 정제된 물질은 적어도 95% 순수하고; 더욱 바람직하게는 적어도 97% 순수하고, 더욱 더 바람직하게는 적어도 99% 순수하다. 순도는 크로마토그래피, 젤 전기영동, 면역검정, 조성 분석, 생물학적 검정, 및 당 분야에 공지된 다른 방법에 의해 평가될 수 있다. 특정 구현예에서, 정제된은 오염물질의 수준이 인간 또는 비-인간 동물로의 안전한 투여를 위해 규제 당국에 의해 허용가능한 수준 미만이다.

본원에서 사용되는 용어 "돌연변이주" 및 "돌연변이"는 유전 물질, 예를 들어, DNA에서의 임의의 검출가능한 변화, 또는 상기 변화의 임의의 과정, 메커니즘 또는 결과를 의미한다. 이는 유전자의 구조(예를 들어, DNA 서열)가 변경된 유전자 돌연변이, 임의의 돌연변이 과정으로부터 발생한 임의의 유전자 또는 DNA, 및 변형된 유전자 또는 DNA 서열에 의해 발현된 임의의 발현 생성물(예를 들어, RNA, 단백질 또는 효소)을 포함한다.

본원에서 사용되는 용어 "돌연변이체 단백질"은 변경된 단백질 서열을 발생시키는 유전적 돌연변이를 함유하는 유전자로부터 번역된 단백질을 나타낸다. 특정 구현예에서, 상기 돌연변이는 ER에서 일반적으로 존재하는 조건하에서 단백질이 이의 자연 입체형태를 달성할 수 없다. 상기 입체형태를 달성하는데 있어서의 실패는 이들 단백질이 단백질 수송 시스템 내의 이들의 정상적인 경로를 통해 이들의 세포 내의 적절한 위치로 수송되는 것이 아니라 분해되도록 하는 것이다. 다른 돌연변이는 감소된 활성 또는 더욱 신속한 회전(turnover)을 발생시킬 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "야생형 유전자"는 생체내에서 정상적인 생물학적 기능적 활성을 가질 수 있는 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 나타낸다. 야생형 핵산 서열은 누클레오티드 변화가 생물학적 활성에 대해 효과를 거의 갖지 않거나 효과를 전혀 갖지 않는 아미노산 치환을 발생시키는 한 공지된 공개된 서열과 상이한 누클레오티드 변화를 함유할 수 있다. 용어 야생형은 또한 내생성 또는 자연 단백질에 비해 증가되거나 향상된 활성을 가질 수 있는 단백질을 인코딩하도록 조작된 핵산 서열을 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "야생형 단백질"은 생체내에서 발현되거나 도입되는 경우 기능적인 생물학적 활성을 가질 수 있는 야생형 유전자에 의해 인코딩된 임의의 단백질을 나타낸다. 용어 "정상적인 야생형 활성"은 세포에서의 단백질의 정상적인 생리학적 기능을 나타낸다. 이러한 기능성은 단백질의 기능성을 확립하는 것으로 공지된 임의의 수단에 의해 시험될 수 있다.

용어 "유전적으로 변형된"은 코딩 서열의 발현을 조절하는 조절 요소와 함께 유전자 생성물을 인코딩하는 코딩 서열을 포함하는 핵산의 도입 후에 특정 유전자 생성물을 발현하는 세포를 나타낸다. 핵산의 도입은 유전자 표적화 및 상동성 재조합을 포함하는 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어는 또한, 예를 들어, 유전자 활성화 기술에 의해 상기 세포에 의해 일반적으로 발현되지 않는 내생성 유전자 또는 유전자 생성물을 발현하거나 과발현하도록 조작된 세포를 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물과 관련하여 사용되거나 아닌지 간에 구 "약학적으로 허용되는"은 생리학적으로 내성이 있고, 인간에게 투여되는 경우 통상적으로 부적합한 반응을 생성시키지 않는 분자 존재물 및 조성물을 나타낸다. 바람직하게는, 본원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용되는"은 연방 또는 주 정부의 규제 당국에 의해 승인되거나, 동물, 및 더욱 특히 인간에서 사용하기 위한 미국 약전 또는 다른 일반적으로 승인된 약전에 나열된 것을 의미한다. 용어 "담체"는 화합물과 함께 투여되는 희석제, 애쥬번트, 부형제, 또는 비히클을 나타낸다. 이러한 약학적 담체는 멸균 액체, 예를 들어, 물 및 오일일 수 있다. 물 또는 수용액 염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 바람직하게는 담체, 특히 주사용 용액으로 사용된다. 적합한 약학적 담체는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin, 18th Edition]에 기재되어 있다.

용어 "치료적 유효 용량" 및 "유효량"은 치료 반응을 발생시키기에 충분한 화합물의 양을 나타낸다. ASSC 및 GAA가 복합체로 투여되는 구체예에서, 용어 "치료적 유효 용량" 및 "유효량"은 치료 반응을 발생시키기에 충분한 복합체의 양을 나타낸다. 치료 반응은 사용자(예를 들어, 임상의)가 요법에 대한 효과적인 반응으로서 인지할 임의의 반응일 수 있다. 따라서, 치료 반응은 일반적으로 질병 또는 장애의 하나 이상의 증상 또는 징후의 개선일 것이다.

생체내에서의 투여시 ASSC의 희석(및 이후의 평형에서의 변화로 인해 결과로 발생하는 결합에서의 변화), 생체이용률 및 대사로 인해 정제된 치료 단백질의 시험관내 생성, 수송, 또는 저장 동안 억제성인 ASSC의 농도가 본 발명의 목적상 "유효량"을 여전히 구성할 수 있음이 인지되어야 한다.

용어 '알킬'은 오로지 탄소 및 수소 원자로 구성되고, 불포화를 함유하지 않고, 단일 결합에 의해 분자의 나머지에 부착된 선형 또는 분지형 탄화수소기, 예를 들어, 메틸, 에틸, n-프로필, 1-메틸에틸(이소프로필), n-부틸, n-펜틸, 1,1-디메틸에틸(t-부틸)을 나타낸다.

용어 "알케닐"은 적어도 하나의 탄소-탄소 이중결합을 함유하고, 선형 또는 분지형 사슬일 수 있는 C₂-C₂₀ 지방족 탄화수소기, 예를 들어, 에테닐, 1-프로페닐, 2-프로페닐(알릴), 이소-프로페닐, 2-메틸-1-프로페닐, 1-부테닐, 2-부테닐을 나타낸다.

용어 "사이클로알킬"은 불포화, 비-방향족 모노사이클릭 또는 멀티사이클릭 탄화수소 고리 시스템, 예를 들어, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실을 나타낸다. 멀티사이클릭 사이클로알킬기의 예는 퍼하이드로나프틸, 아다만틸 및 노르보르닐기 브릿징된 사이클릭기 또는 스프리로바이사이클릭기, 예를 들어, 스피로 (4,4) 논-2-일을 포함한다.

용어 "아릴"은 약 6 내지 약 14개의 탄소 원자 범위를 갖는 방향족 라디칼, 예를 들어, 페닐, 나프틸, 테트라하이드로나프틸, 인다닐, 바이페닐을 나타낸다.

용어 "헤테로사이클릭"은 탄소 원자, 및 질소, 산소 및 황으로 구성된 군으로부터 선택된 1 내지 5개의 헤테로원자로 구성된 안정적인 3 내지 15원의 고리 라디칼을 나타낸다. 본 발명의 목적상, 헤테로사이클릭 고리 라디칼은 융합되거나 브릿징된 고리 시스템을 포함할 수 있는 모노사이클릭 또는 바이사이클릭 고리 시스템일 수 있고, 헤테로사이클릭 고리 라디칼 내의 질소, 탄소, 산소 또는 황 원자는 다양한 산화 상태로 임의로 산화될 수 있다. 또한, 존재시 질소 원자는 임의로 4원화될 수 있고, 고리 라디칼은 부분적 또는 완전히 포화될 수 있다(즉, 헤테로방향족 또는 헤테로아릴 방향족).

헤테로사이클릭 고리 라디칼은 안정적인 구조를 생성시키는 임의의 헤테로원자 또는 탄소 원자에서 주요 구조에 부착될 수 있다.

용어 "헤테로아릴"은 고리가 방향족인 헤테로사이클릭 고리를 나타낸다.

'치환된 알킬', '치환된 알케닐', '치환된 사이클로알킬', '치환된 아릴' 및 '치환된 헤테로아릴' 내의 치환기는 동일하거나 상이할 수 있고, 수소, 할로겐, 아세틸, 니트로, 카르복실, 옥소(=0), CF₃, -OCF₃, NH₂, -C(=0)-알킬₂, OCH₃, 또는 알킬, 알콕시 및 아릴로부터 선택된 임의로 치환된 기의 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 기를 갖는다.

용어 "할로겐"은 플루오르, 염소, 브롬 및 요오드의 라디칼을 나타낸다.

5.2 폼페병

폼페병은 리소솜 글리코겐 대사를 손상시키는 불충분한 산성 알파 글루코시다제(GAA) 활성을 특징으로 하는 보통염색체 열성 LSD이다. 효소 결핍은 리소솜 글리코겐 축적을 발생시키고, 진행성 골격근 쇠약, 감소된 심장 기능, 호흡기능부전, 및/또는 질병의 후기 단계에서의 CNS 장애를 발생시킨다. GAA 유전자에서의 유전적 돌연변이는 낮은 발현을 발생시키거나, 질병을 궁극적으로 발생시키는 변경된 안정성, 및/또는 생물학적 활성을 갖는 효소의 돌연변이체 형태를 생성시킨다(일반적으로, Hirschhorn R, 1995, Glycogen Storage Disease Type II: Acid α-Glucosidase (Acid Maltase) Deficiency, The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, Scriver et al., eds., McGraw-Hill, New York, 7th ed., pages 2443-2464를 참조하라). 폼페병의 3개의 인정된 임상 형태(영아, 소아 및 성인)는 잔여 α-글루코시다제 활성의 수준과 관련된다(Reuser A J et al., 1995, Glycogenosis Type II (Acid Maltase Deficiency), Muscle & Nerve Supplement 3, S61-S69). ASSC(또한 "약리학적 샤페론"으로 다른 곳에서 언급됨)는 유전 질병, 예를 들어, 리소솜 축적병(예를 들어, 폼페병)의 치료를 위한 가망있는 새로운 치료 접근법이다.

영아 폼페병(타입 I 또는 A)은 가장 흔하고, 가장 중증이며, 생애 2년 내에 성장장애, 전신 근육긴장저하, 심장 비후, 및 심장호흡 부족을 특징으로 한다. 소아 폼페병(타입 II 또는 B)은 중증도에서 중간이며, 심장비대 없이 근육 증상의 우세를 특징으로 한다. 소아 폼페 개체는 보통 호흡 부전으로 인해 20세의 연령에 도달하기 전에 사망한다. 성인 폼페병(타입 III 또는 C)은 종종 10대에서 천천히 진행성 근병증으로 또는 60대와 같이 늦게 나타난다(Felice K J et al., 1995, Clinical Variability in Adult-Onset Acid Maltase Deficiency: Report of Affected Sibs and Review of the Literature, Medicine 74, 131-135).

폼페에서, α-글루코시다제는 당화, 인산화, 및 단백질분해성 가공에 의해 번역후에 광범위하게 변형된다. 리소솜에서 단백질분해에 의한 110 킬로달톤(kDa) 전구체의 76 및 70 kDa 성숙 형태로의 전환이 최적 글리코겐 촉매작용에 필요하다.

본원에서 사용되는 용어 "폼페병"은 폼페병의 모든 유형을 나타낸다. 본 출원에 개시된 제형 및 투여 요법은, 예를 들어, 타입 I, 타입 II 또는 타입 III 폼페병을 치료하는데 사용될 수 있다.

5.3 GAA 및 ASSC 수득

GAA는 GAA를 내생적으로 발현하는 세포로부터 수득될 수 있거나, GAA는 본원에 기재된 바와 같은 재조합 인간 GAA(rhGAA)일 수 있다. 한 비제한적인 구현예에서, rhGAA는 전장 야생형 GAA이다. 다른 비제한적인 구현예에서, rhGAA는 야생형 GAA에 존재하는 아미노산 잔기의 서브셋을 포함하며, 상기 서브셋은 기질 결합 및/또는 기질 환원에 대한 활성 부위를 형성하는 야생형 GAA의 아미노산 잔기를 포함한다. 이와 같이, 본 발명은 기질 결합 및/또는 기질 환원에 대한 야생형 GAA 활성 부위 뿐만 아니라 야생형 GAA에 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 다른 아미노산 잔기를 포함하는 융합 단백질인 rhGAA를 고려한다.

GAA는 상업적 공급원으로부터 수득될 수 있거나, 당업자에게 공지된 합성 기술에 의해 수득될 수 있다. 야생형 효소는 재조합 세포 발현 시스템(예를 들어, 포유동물 세포 또는 곤충 세포 - 일반적으로 미국 특허 번호 5,580,757호(Desnick et al.); 미국 특허 번호 6,395,884호 및 6,458,574호(Selden et al.); 미국 특허 번호 6,461,609(Calhoun et al.); 미국 특허 번호 6,210,666호(Miyamura et al); 미국 특허 번호 6,083,725호(Selden et al.); 미국 특허 번호 6,451,600호(Rasmussen et al.); 미국 특허 번호 5,236,838호(Rasmussen et al.); 및 미국 특허 번호 5,879,680호(Ginns et al.) 참조), 인간 태반, 또는 동물 밀크(미국 특허 번호 6,188,045호(Reuser et al.) 참조)으로부터 정제될 수 있다. 주입 후, 외생성 효소는 비특이적 또는 수용체-특이적 메커니즘을 통해 조직에 의해 수득되는 것으로 예상된다. 일반적으로, 흡수 효율(ASSC의 사용 없음)은 높지 않고, 외생성 단백질의 순환 시간은 짧다(Ioannu et al., Am. J. Hum. Genet. 2001; 68:14-25). 또한, 외생성 단백질은 불안정하고, 시험관내에서 신속히 세포내 분해된다.

제약에 적합한 GAA를 수득하기 위한 다른 합성 기술은, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,560,424호 및 미국 특허 번호 7,396,811호(Lebowitz et al), 미국 공개 출원 번호 2009/0203575호, 2009/0029467호, 2008/0299640호, 2008/0241118호, 2006/0121018호, 및 2005/0244400호(Lebowitz et al), 미국 특허 번호 7,423,135호, 6,534,300호, 및 6,537,785호; 국제 공개 출원 번호 2005/077093호 및 미국 공개 출원 번호 2007/0280925호, 및 2004/0029779호에서 발견될 수 있다. 이들 참고문헌은 이들의 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.

한 구현예에서, GAA는 상기 유전자의 가장 우세한 9개의 관찰된 일배체형에 의해 인코딩되는 인간 효소 산성 α-글루코시다제(GAA)로 구성되고, 차이니즈 햄스터 난소 세포주에서 재조합 DNA 기술에 의해 생성되는 알글루코시다제 알파이다. 알글루코시다제 알파는 Genzyme Corporation(Cambridge, MA)으로부터 Myozyme® 및 Lumizyme®로 이용가능하다.

ASSC는 당업자에게 공지된 합성 기술을 이용하여 수득될 수 있다. 예를 들어, 본 출원에서 사용될 수 있는 ASSC, 예를 들어, 1-DNJ는 각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 6,274,597호 및 6,583,158호, 및 미국 공개 출원 번호 2006/0264467호에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.

본 출원의 한 구현예에서, ASSC는 α-호모노지리마이신이고, GAA는 hrGAA(예를 들어, Myozyme® 또는 Lumizyme®)이다. 대안적 구현예에서, ASSC는 카스타노스퍼민(castanospermine)이고, GAA는 hrGAA(예를 들어, Myozyme® 또는 Lumizyme®)이다. ASSC(예를 들어, α-호모노지리마이신 및 카스타노스퍼민)는 본 발명에 따른 잠재적 ASSC의 공급원을 제공하는 합성 라이브러리(예를 들어, Needels et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90:10700-4; Ohlmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1993; 90:10922-10926; Lam et al., PCT Publication No. WO 92/00252; Kocis et al., PCT Publication No. WO 94/28028 참조)로부터 수득될 수 있다. 합성 화합물 라이브러리는 Maybridge Chemical Co.(Trevillet, Cornwall, UK), Comgenex(Princeton, N.J.), Brandon Associates(Merrimack, N.H.), 및 Microsource(New Milford, Conn.)로부터 상업적으로 이용가능하다. 드문 화학적 라이브러리가 Aldrich(Milwaukee, Wis.)로부터 이용가능하다. 대안적으로, 박테리아, 진균, 식물 및 동물 추출물 형태의 자연 화합물의 라이브러리는, 예를 들어, Pan Laboratories(Bothell, Wash.) 또는 MycoSearch(NC)로부터 이용가능하거나, 용이하게 생산가능하다. 추가로, 자연 및 합성적으로 생성된 라이브러리 및 화합물은 문헌[Res. 1986; 155:119-29]를 통해 용이하게 변형된다.

한 구현예에서, 본 발명에 유용한 ASSC는 리소솜 효소의 억제제이며, 이는 문헌[Asano et al., J. Med. Chem. 1994; 37:3701-06; Dale et al, Biochemistry 1985; 24:3530-39; Goldman et al., J. Nat. Prod. 1996; 59:1137-42; Legler et al, Carbohydrate Res. 1986; 155:119-29]에 기재된 바와 같이 글루코스 및 갈락토스 이미노-당 유도체를 포함한다. 이러한 유도체는 Toronto Research Chemicals, Inc.(North York, On. Canada) 및 Sigma와 같은 상업적 공급원으로부터 구입될 수 있는 것을 포함한다.

5.4 ERT 및 ASSC를 이용한 폼페병의 치료

본 발명에 따르면, GAA에 대해 ASSC와 조합된 GAA(예를 들어, rhGAA)를 이용한 방법이 제공된다. 본 발명의 한 구현예는 GAA(예를 들어, hrGAA ERT) 및 ASSC의 조합 요법을 제공한다. 예를 들어, ASSC 샤페론 1-데옥시노지리마이신-HCl은 돌연변이체 GAA에 결합하고, 적절한 입체형태로 안정화시키는 GAA의 능력을 증가시킨다.

본 발명의 한 구현예는 ASSC 및 hrGAA 효소 대체 요법을 이용한 IVS 1(-13 T>G) 스플라이싱 결함을 갖는 폼페 서브셋 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 공통의 스플라이싱 돌연변이를 갖는 후기-발병 폼페 환자로부터 유래된 세포주에서, 1-데옥시노지리마이신-HCl은 단독으로 및 hrGAA와 조합하여 GAA 수준을 증가시켰다.

본 발명의 한 비제한적인 구현예에서, 1-데옥시노지리마이신-HCl 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 약 10 ㎎/㎏ 내지 1000 ㎎/㎏의 용량으로 피검체에 투여될 수 있고, 바람직하게는 GAA의 투여 전, GAA의 투여와 동시에, 또는 GAA의 투여 후에 경구 투여될 수 있다. 한 비제한적인 구현예에서, 1-데옥시노지리마이신-HCl 및 재조합 인간 GAA는 세포 효소 활성, 글리코겐 감소 및 폼페병의 치료에 대해 놀라운 효능을 나타낸다. 래트에서, 1-데옥시노지리마이신-HCl(30 ㎎/㎏ p.o.)이 rhGAA 주사 30분 전의 투여를 포함하는 투여 요법으로 투여된 경우 재조합 인간 GAA(rhGAA)의 혈장 반감기는 2배 증가하였다. GAA KO 마우스에서, 1-데옥시노지리마이신-HCl(100 ㎎/㎏ p.o.)이 rhGAA 주사 전의 투여를 포함하는 투여 요법으로 투여된 경우 rhGAA의 흡수는 심장 및 횡경막에서 약 2배 증가되었다. 이들 결과는 ASSC와 rhGAA의 공동-투여가 놀라운 양으로 생체내에서 효소의 노출 및 조직 흡수를 증가시키는 것을 나타낸다.

예를 들어, 본 발명의 한 구현예는 GAA 주입 전 및 GAA 주입 후의 일정 간격으로 약 1 내지 약 5000 ㎎/㎏의 ASSC(예를 들어, 1-DNJ-HCl)와 조합하여, 약 10주 이하 동안 격주, 매주 또는 2주마다 1회로 GAA(예를 들어, rhGAA)를 투여하는 것을 포함하는 폼페병을 치료하는 방법을 제공한다. 예를 들어, ASSC는 주입 2시간 이내에 투여될 수 있고, 이후 주입후 24시간 이내에 일정 간격으로 1회, 2회, 3회, 4회, 5회 또는 6회 투여될 수 있다.

한 특정한 구현예에서, GAA는 Myozyme®이고, 주 당 1회 주입을 통해 투여되고, ASSC(예를 들어, 1-DNJ-HCl)은 주입 30분 전, 및 이후 각각의 Myozyme® 주입 8, 16, 및 24시간 후에 10 ㎎/㎏, 100 ㎎/㎏ 또는 1000 ㎎/㎏으로 투여된다.

다른 특정한 구현예에서, GAA는 Lumizyme®이고, 주 당 1회 주입을 통해 투여되고, ASSC(예를 들어, 1-DNJ-HCl)는 주입 30분 전, 및 이후 각각의 Lumizyme® 주입 8, 16, 및 24시간 후에 10 ㎎/㎏, 100 ㎎/㎏ 또는 1000 ㎎/㎏으로 투여된다.

임의의 특정한 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 산성 α-글루코시다제(GAA)는 리소솜 글리코겐으로부터 말단 글루코스 잔기를 제거하는 기능을 하는 것으로 생각된다. 일부 유전적 돌연변이는 GAA 트래피킹(GAA trafficking) 및 성숙을 감소시킨다. 약리학적 샤페론 1-DNJ는 리소솜으로의 적절한 단백질 트래피킹을 회복시키는 적절한 입체형태로 효소에 선택적으로 결합하고 이를 안정화시킴으로써 GAA 수준을 증가시킨다.

대안적 구현예에서, ASSC는 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 국제 공개 번호 2008/134628호에 기재된 바와 같이 투여된다.

일부 구현예에서, 투여 경로는 피하 투여이다. 다른 투여 경로는 경구 또는 정맥내, 동맥내, 복막내, 안구, 근내, 협측, 직장, 질내, 안와내, 뇌내, 피내, 두개내, 척수내, 뇌실내, 수막강내, 수조내, 관절낭내, 폐내, 비내, 경점막, 경피를 포함하는 비경구 투여이거나, 흡입을 통할 수 있다. 폐내 전달 방법, 장치 및 약물 제조물이, 예를 들어, 각각이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 5,785,049호, 5,780,019호, 및 5,775,320호에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 피내 전달 방법은 패치(patch)를 통한 이온삼투적(iontophoretic) 전달에 의한 것이며, 이러한 전달의 한 예는 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 5,843,015호에 교시되어 있다.

투여는 제조물의 볼루스의 주기적 주사에 의하거나, 장기간에 걸친 지속 방출 투여 형태로서, 또는, 예를 들어, 외부(예를 들어, IV 백) 또는 내부(예를 들어, 생체내 부식가능한 이식물, 생체인공 기관, 또는 이식된 GAA 생성 세포 집단)에 존재하는 저장소로부터의 정맥내 또는 복막내 투여에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 각각이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 4,407,957호 및 5,798,113호를 참조하라. 폐내 전달 방법 및 장치는, 예를 들어, 각각이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 5,654,007호, 5,780,014호, 및 5,814,607호에 기재되어 있다. 다른 유용한 비경구 전달 시스템은 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체 입자, 삼투 펌프, 이식가능한 주입 시스템, 펌프 전달, 캡슐화된 세포 전달, 리포솜 전달, 바늘-전달되는 주사, 바늘이 없는 주사, 네뷸라이저, 에어로졸라이저(aeorosolizer), 전기천공, 및 경피 패치를 포함한다. 바늘이 없는 주사기 장치는 명세서들이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 5,879,327호; 5,520,639호; 5,846,233호 및 5,704,911호에 기재되어 있다. 본원에 기재된 GAA 제조물 중 임의의 GAA 제조물이 상기 방법으로 투여될 수 있다.

제형의 전달은 수시간, 1 내지 수주, 1 내지 수개월, 또는 1년 이하 또는 그 초과의 범위의 미리 선택된 투여 기간에 걸쳐 지속될 수 있다. 특정 구현예에서, 투여 형태는 연장된 기간에 걸쳐 GAA의 전달에 적합화된 형태이다. 이러한 전달 장치는 수시간(예를 들어, 2시간, 12시간, 또는 24시간 내지 48시간 또는 그 초과) 내지 수일(예를 들어, 2 내지 5일 또는 그 초과, 약 100일 또는 그 초과), 내지 수개월 또는 수년 동안의 GAA의 투여에 적합화될 수 있다. 상기 구현예 중 일부에서, 장치는 약 1개월 내지 약 12개월 또는 그 초과의 범위의 기간 동안의 전달에 적합화된다. GAA 전달 장치는, 예를 들어, 약 2시간 내지 약 72시간, 약 4시간 내지 약 36시간, 약 12시간 내지 약 24시간; 약 2일 내지 약 30일, 약 5일 내지 약 20일, 약 7일 내지 약 100일 또는 그 초과, 약 10일 내지 약 50일; 약 1주 내지 약 4주; 약 1개월 내지 약 24개월 또는 그 초과, 약 2개월 내지 약 12개월, 약 3개월 내지 약 9개월; 또는 필요에 따라 상기 범위 내의 증분 범위를 포함하는 다른 범위의 시간의 기간 동안 개체에 GAA를 투여하기 위해 적합화된 장치일 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 방법은 약 0.1 내지 약 50 ㎎/㎏의 GAA의 용량을, 예를 들어, 피하 투여로 개체에 투여하는 것을 포함하며, 상기 용량은 하루에 1회, 2일에 1회, 3일에 1회, 4일에 1회, 5일에 1회, 또는 6일에 1회로 투여된다. 특정 구현예에서, 본 출원의 제형은 1주일에 1회, 1주일에 2회, 1주일에 3회, 1주일에 4회, 1주일에 5회, 1주일에 6회 또는 1주일에 7회로 투여된다.

특정 구현예에서, 본 출원의 방법은 GAA 및 ASSC를 포함하는 공동-제형을 개체에 투여하는 것을 포함하며, 상기 공동-제형은 피하 투여된다. 특정 구현예에서, 공동-제형 내의 GAA의 용량은 약 0.1 내지 약 5000 ㎎/㎏, 또는 약 10 내지 약 4000 ㎎/㎏, 또는 약 25 내지 약 3000 ㎎/㎏, 또는 약 50 내지 약 2000 ㎎/㎏, 또는 약 100 내지 약 1000 ㎎/㎏, 또는 약 200 내지 약 500 ㎎/㎏이다.

특정 구현예에서, 공동-제형 내의 GAA의 용량은 약 0.1 내지 약 100 ㎎/㎏, 또는 약 1 내지 약 80 ㎎/㎏, 또는 약 5 내지 약 50 ㎎/㎏, 또는 약 10 내지 약 40 ㎎/㎏, 또는 약 15 내지 약 25 ㎎/㎏이다.

특정 구현예에서, 공동-제형 내의 rhGAA의 용량은 약 20 ㎎/㎏이다.

특정 구현예에서, 공동-제형 내의 ASSC의 용량은 약 0.1 내지 약 5000 ㎎/㎏, 또는 약 10 내지 약 4000 ㎎/㎏, 또는 약 25 내지 약 3000 ㎎/㎏, 또는 약 50 내지 약 2000 ㎎/㎏, 또는 약 100 내지 약 1000 ㎎/㎏, 또는 약 200 내지 약 500 ㎎/㎏이다.

특정 구현예에서, 공동-제형 내의 ASSC의 용량은 약 0.1 내지 약 100 ㎎/㎏, 또는 약 1 내지 약 80 ㎎/㎏, 또는 약 5 내지 약 50 ㎎/㎏, 또는 약 10 내지 약 40 ㎎/㎏, 또는 약 15 내지 약 25 ㎎/㎏이다.

특정 구현예에서, 공동-제형 내의 ASSC의 용량은 약 30 ㎎/㎏이다.

특정 구현예에서, 용량은 개체의 간에서 독성 수준의 GAA를 발생시키지 않는다. 일부 구현예에서, GAA는 용량의 투여후 약 24시간 이내에 피검체의 조직, 예를 들어, 근육 조직에서 피크 농도의 GAA를 발생시키기에 충분한 용량으로 투여된다. 특정 구현예에서, GAA는 용량의 투여후 약 10 내지 약 50시간, 또는 약 45, 40, 35, 30, 25, 또는 그 미만의 시간 이내에 피검체의 조직에서 피크 농도의 GAA를 발생시키기에 충분한 용량으로 투여된다. 일부 구현예에서, GAA의 제형은 단일-용량 제형이다. 일부 구현예에서, GAA의 제형은 다중-용량 제형이다.

본 발명의 GAA 제조물은 전체 필요한 용량이 1 또는 그 초과의 밀리리터, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과의 밀리리터의 단일 피하 주사로 투여될 수 있도록 제형화될 수 있다. 제조물은 여러 상이한 주사 부위에서 피하 투여되도록 제형화될 수 있다. 1 또는 2 밀리리터의 주사 부피를 가능케 하기 위해, 본 발명의 GAA 제조물은 바람직한 용량이 1 내지 2 밀리리터의 부피로 전달되는 농도로 제형화될 수 있다. GAA 제조물의 피하 주사는, 예를 들어, 정맥내 투여와 비교하여 연장된 혈장 반감기를 또한 발생시키면서, 특히 자가-투여를 가능케 함으로써 환자에 대한 편의성의 장점을 갖는다. 혈장 반감기의 연장은 주사된 GAA에 대한 임상적으로 병에 걸린 조직의 노출을 증가시켜, 결과로서 상기 조직으로의 GAA의 흡수를 증가시킬 수 있는 이점인 더 긴 기간에 걸친 효과적인 혈장 GAA 수준의 유지를 발생시킨다. 이는 환자에 대한 더욱 이로운 효과 및/또는 투여 빈도의 감소를 가능케 한다. 더욱이, 환자 편의를 위해 설계된 다양한 장치, 예를 들어, 재충전가능한 주사기 펜 및 바늘이 없는 주사 장치가 본원에 논의된 바와 같은 본 발명의 GAA 제조물과 함께 사용될 수 있다. ASSC와 공동-제형화된 GAA는 연장된 기간 동안 실온에서 안정적이므로, 제조물은 환자의 신체로부터 떨어진 카트리지에 유지되어, 반복적인 낮은 용량의 투여 또는 연속적인 낮은 부피 투여를 가능케 하여, 효소 투여의 안정적 상태를 제공할 수 있다. 이러한 투여는 정맥내 주입 동안 투여된 높은 용량의 효소 대체 요법(ERT)의 잠재적 부작용을 회피할 수 있다.

5.5 약학적 조성물

본 발명의 화합물 및 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와의 혼합에 의해 약학적 조성물로 제형화될 수 있다.

한 구현예에서, ASSC 및 GAA는 단일 조성물(즉, 공동-제형)으로 제형화된다. 이러한 조성물은 피검체로의 투여 후 저장(즉, 시험관내) 동안 및 생체내 둘 모두에서 GAA의 안정성을 향상시킴으로써 순환 반감기, 조직 흡수를 증가시키고, GAA의 치료 효능을 증가시킨다. 제형은 바람직하게는 정맥내, 피하, 및 복막내 투여를 포함하는 비경구 투여에 적합하나, 경구, 비내, 또는 경피와 같은 다른 투여 경로에 적합한 제형이 또한 고려된다.

본 발명은 종래-인지된 제형과 비교하여 개선된 특성을 갖는 액체 약학적 제형(예를 들어, GAA 및 ASSC를 포함하는 제형)을 특징으로 한다. 본 발명은 ASSC와 GAA를 조합시킴으로써 제형 내의 GAA의 농도가 ASSC의 부재하에서 GAA 응집물의 형성을 보통 발생시키는 양으로 증가될 수 있다는 놀라운 발견을 기초로 한다. GAA의 높은 농도에도 불구하고, 본 발명의 제형은, 예를 들어, 제조, 저장, 및/또는 반복된 동결/해동 공정 단계 또는 증가된 공기-액체 계면에 대한 연장된 노출 동안 GAA의 용해도 및 안정성을 유지시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 제형은 높은 농도의 GAA를 가짐에도 불구하고 낮은 수준의 단백질 응집(예를 들어, 약 5%, 4%, 3%, 2% 미만, 또는 약 1% 미만)을 유지한다. 본 발명의 제형은 또한 놀랍게도 높은 농도의 GAA를 가짐에도 불구하고 피하 주사에 적합한 범위 내에서 낮은 점도를 유지한다.

본 발명은 또한 GAA와 ASSC를 조합시킴으로써 적은 부피로 GAA를 용해시킴으로써 달성될 수 있는 매우 효능있고 농축된 GAA 제형을 제공한다. 본 발명의 제형은 전달 장치가 비교적 소형(예를 들어, 이식가능한 시스템)이거나, 전달이 비교적 장기간 동안 필요하거나, 요망되는 치료 효과를 달성하기 위해 많은 유효 용량의 GAA가 필요한 경우에 특히 사용된다. 따라서, 전달 장치를 재충전하거나 대체할 필요 없이 연장된 기간(예를 들어, 수일, 수주, 수개월 등)에 걸쳐 일정한 양의 GAA를 전달함으로써, 감염 및 조직 손상의 위험을 감소시키고, 환자 순응성을 증가시키고, 일정하고 정확한 투여를 달성하는 것이 가능하다.

본 발명의 특정한 구현예에서, 치료량의 GAA(심지어 높은 용량)는 단지 매우 적은 부피의 GAA(예를 들어, 하루에 거의 마이크로리터 또는 하루에 나노리터)를 이용함으로써 피검체에 전달될 수 있다. 특정 신체 조직, 예를 들어, 피하 공간에서, 적은 부피의 전달은 국소 조직에 의한 GAA의 더 나은 흡수를 촉진하고, 국소 조직 장애, 외상, 또는 부종을 최소화시킨다.

특정 구현예에서, 본 발명의 제형은 액체 제형이 유의한 단백광, 응집, 또는 침전을 나타내지 않도록 하는 높은 농도의 GAA를 포함한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명의 제형은 동통(예를 들어, 시각통증등급(visual analog scale, VAS) 스코어에 의해 결정됨)을 유의하게 느끼지 않고, 예를 들어, 피하 투여에 적합하도록 하는 높은 농도의 GAA를 포함한다.

특정 구현예에서, 본 발명의 제형은, 예를 들어, 약 25 ㎎/㎖, 또는 약 50 ㎎/㎖, 또는 약 80 ㎎/㎖, 또는 약 100 ㎎/㎖, 또는 약 115 ㎎/㎖, 또는 약 150 ㎎/㎖, 또는 약 160 ㎎/㎖ 또는 약 200 ㎎/㎖, 또는 약 240 ㎎/㎖, 또는 약 250 ㎎/㎖의 GAA 농도를 포함하는 높은 GAA 농도를 포함한다. 예를 들어, 하기 실시예 10에 기재되는 바와 같이, 본 발명의 한 양태에서, 액체 약학적 제형은 약 25 ㎎/㎖의 인간 재조합 야생형 GAA 농도를 포함한다. 본 발명의 제형은 약 1 ㎎/㎖ 내지 약 500 ㎎/㎖, 또는 약 5 ㎎/㎖ 내지 약 500 ㎎/㎖, 또는 약 5 ㎎/㎖ 내지 약 250 ㎎/㎖, 또는 약 10 ㎎/㎖ 내지 약 200 ㎎/㎖, 또는 약 20 ㎎/㎖ 내지 약 100 ㎎/㎖, 또는 약 1 ㎎/㎖ 내지 약 60 ㎎/㎖의 GAA 농도를 포함할 수 있는 것이 또한 고려된다. 상기 열거된 농도에 중간인 농도 및 범위가 또한 본 발명의 일부인 것으로 의도된다(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 또는 200 ㎎/㎖).

특정 구현예에서, 본 발명의 제형은 이후에 5 ㎎/㎖를 초과하는 농도로 GAA를 포함한다.

특정 구현예에서, 본 발명의 제형은 제형 내의 GAA의 응집을 감소시키거나 억제하는데 효과적인 양으로 ASSC를 포함한다. ASSC의 이러한 양은, 예를 들어, 약 0.005 mM 내지 100 mM, 또는 약 0.05 mM 내지 약 90 mM, 또는 약 0.1 mM 내지 약 80 mM, 또는 약 0.5 mM 내지 약 70 mM, 또는 약 1 mM 내지 약 60 mM, 또는 약 2 mM 내지 약 50 mM, 또는 약 3 mM 내지 약 40 mM, 또는 약 4 mM 내지 약 30 mM, 또는 약 5 mM 내지 약 20 mM을 포함한다. 특정 구현예에서, ASSC는 약 0.5 내지 약 20 mM의 농도로 본 발명의 제형에 존재한다. 특정 구현예에서, ASSC는 약 1 mM의 농도로 본 발명의 제형에 존재한다. 특정 구현예에서, ASSC는 약 10 mM의 농도로 본 발명의 제형에 존재한다.

특정 구현예에서, 본 발명의 제형은 제형 내에서 GAA의 응집을 감소시키거나 억제하는데 효과적인 양으로 ASSC를 포함한다. ASSC의 이러한 양은, 예를 들어, 약 5 내지 약 500 ㎎/㎖, 또는 약 10 내지 약 250 ㎎/㎖, 또는 약 20 내지 약 200 ㎎/㎖, 또는 약 30 내지 약 150 ㎎/㎖, 또는 약 40 내지 약 100 ㎎/㎖, 또는 약 50 내지 약 75 ㎎/㎖를 포함한다. 특정 구현예에서, ASSC는 약 5 내지 약 200 ㎎/㎖의 양으로 존재한다.

특정 구현예에서, ASSC는 약 32 ㎎/㎖ 또는 약 160 ㎎/㎖의 농도로 제형에 존재한다.

본 발명의 특정 구현예에서, DNJ 및 GAA를 포함하는 액체 제형은 물에 DNJ를 용해시켜 10 mM DNJ의 농도를 달성함으로써 제조된다. GAA는 1.8 ㎖ 물에서 재구성될 수 있고, 포스페이트 완충-염수(pH 7.4) 중에서 밤새 투석될 수 있다. 이후, 4.4 마이크로리터의 DNJ(10 mM)가 400 마이크로리터의 GAA에 첨가될 수 있어, GAA는 25 ㎎/㎖의 농도가 된다.

또 다른 구현예에서, GAA 및 ASSC는 별개의 조성물로 제형화된다. 이러한 구현예에서, 샤페론 및 대체 단백질(replacement protein)은 동일 경로, 예를 들어, 정맥내 주입에 따라 투여될 수 있거나, 상이한 경로, 예를 들어, 대체 단백질에 대해 정맥내 주입, 및 ASSC에 대해 경구 투여로 투여될 수 있다.

주사 사용에 적합한 약학적 제형은 멸균 수용액(수용성) 또는 분산액 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에, 상기 형태는 멸균되어야 하고, 용이한 주사성(syringability)이 존재할 정도까지의 유체여야 한다. 이는 제조 및 저장의 조건하에서 안정적이어야 하고, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우에서 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 방지는 다양한 항박테리아 및 항진균 작용제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 벤질 알코올, 소르브산 등에 의해 발생될 수 있다.

많은 경우에, 등장성 작용제, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테레이트 및 젤라틴의 조성물에서의 사용에 의해 발생될 수 있다. 멸균 주사 용액은 필요에 따라 상기 열거된 다양한 다른 성분을 갖는 적절한 용매 중에 필요한 양의 GAA 및 ASSC를 혼입시킨 후, 필터 또는 최종 멸균에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것으로부터 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 다양한 멸균된 활성 성분을 혼입시킴으로써 제조될 수 있다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분에 더하여 이전의 멸균-여과된 용액으로부터의 임의의 추가의 요망되는 성분의 분말을 생성시키는 진공 건조 및 동결-건조 기술이다.

바람직하게는, 제형은 하나 이상의 부형제를 함유할 수 있다. 제형에 포함될 수 있는 약학적으로 허용되는 부형제는 시트레이트 완충액, 포스페이트 완충액(예를 들어, 일염기 소듐 포스페이트, 이염기 소듐 포스페이트 및 이들의 조합물), 아세테이트 완충액, 바이카보네이트 완충액, 아미노산, 우레아, 알코올, 아스코르브산, 인지질; 단백질, 예를 들어, 혈청 알부민, 콜라겐, 및 젤라틴; 염, 예를 들어, EDTA 또는 EGTA, 및 소듐 클로라이드; 리포솜; 폴리비닐피롤리돈; 당, 예를 들어, 덱스트란, 만니톨, 소르비톨, 및 글리세롤; 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜(예를 들어, PEG-4000, PEG-6000); 글리세롤; 글리신 또는 다른 아미노산; 및 지질과 같은 완충액이다. 제형과 함께 사용하기 위한 완충액 시스템은 시트레이트; 아세테이트; 바이카보네이트; 및 포스페이트 완충액을 포함한다.

특정 구현예에서, 본 출원의 제형은 폴리에틸렌 글리콜(PEG), PEG-400, 아르기닌, 아르기닌 및 글루탐산, 프롤린, 감마-사이클로덱스트린 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 부형제를 추가로 포함한다.

특정 구현예에서, 완충액 및/또는 부형제는 약 1 내지 약 50% 중량/부피(w/v), 또는 약 2 내지 약 40% w/v, 또는 약 3 내지 약 30% w/v, 또는 약 4 내지 약 20% w/v, 또는 약 5 내지 약 10% w/v의 농도로 제형에 존재한다.

특정 구현예에서, 완충액 및/또는 부형제는 약 1 내지 약 500 mM, 또는 약 10 내지 약 400 mM, 또는 약 20 내지 약 300 mM, 또는 약 30 내지 약 250 mM, 또는 약 40 내지 약 200 mM, 또는 약 50 내지 약 150 mm, 또는 약 60 내지 약 100 mM의 농도로 제형에 존재한다.

특정 구현예에서, 제형은 약 26 mM의 농도로 존재하는 포스페이트 완충액을 포함한다.

특정 구현예에서, 제형은 약 150 mM의 농도로 존재하는 시트레이트 완충액을 포함한다.

특정 구현예에서, 제형은 약 5% w/v의 농도로 존재하는 PEG-400을 포함한다.

특정 구현예에서, 제형은 약 100 mM의 농도로 존재하는 아르기닌을 포함한다.

특정 구현예에서, 제형은 약 50 mM의 농도로 존재하는 아르기닌 및 약 50 mM의 농도로 존재하는 글루탐산을 포함한다.

특정 구현예에서, 제형은 약 250 mM의 농도로 존재하는 프롤린을 포함한다.

특정 구현예에서, 제형은 약 10% w/v의 농도로 존재하는 감마-사이클로덱스트린을 포함한다.

제형은 또한 비-이온성 세제를 함유할 수 있다. 바람직한 비-이온성 세제는 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 트리톤 X-100, 트리톤 X-114, Nonidet P-40, 옥틸 α-글루코시드, 옥틸 β-글루코시드, Brij 35, 플루로닉(Pluronic), 및 트윈 20을 포함한다.

단백질 및 샤페론 제조물의 동결건조를 위해, 단백질 농도는 0.1 내지 10 ㎎/㎖일 수 있다. 충전제(bulking agent), 예를 들어, 글리신, 만니톨, 알부민, 및 덱스트란이 동결건조 혼합물에 첨가될 수 있다. 또한, 가능한 동결방지제(cryoprotectant), 예를 들어, 이당류, 아미노산, 및 PEG가 동결건조 혼합물에 첨가될 수 있다. 상기 나열된 완충액, 부형제, 및 세제 중 임의의 완충액, 부형제, 및 세제가 또한 첨가될 수 있다.

투여 경로는 정맥내, 피하, 동맥내, 복막내, 안구, 근내, 협측, 직장, 질, 안구내, 뇌내, 피내, 두개내, 척수내, 뇌실내, 수막강내, 수조내, 관절낭내, 폐내, 비내, 경점막, 경피를 포함하는 경구 또는 비경구 투여이거나, 흡입을 통한 것일 수 있다.

상기 기재된 비경구 제형의 투여는 제조물의 볼루스의 주기적 주사에 의해 이루어질 수 있거나, 외부(예를 들어, i.v. 백) 또는 내부(예를 들어, 생체내 부식가능한 이식물, 생체인공 기관, 또는 대체 단백질을 생성시키는 이식된 세포의 집단)에 존재하는 저장소로부터의 정맥내 또는 복막내 투여에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 각각이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 4,407,957호 및 5,798,113호를 참조하라. 폐내 전달 방법 및 장치는, 예를 들어, 각각이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 5,654,007호, 5,780,014호, 및 5,814,607호에 기재되어 있다. 다른 유용한 비경구 전달 시스템은 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체 입자, 삼투 펌프, 이식가능한 주입 시스템, 펌프 전달, 캡슐화된 세포 전달, 리포솜 전달, 바늘-전달되는 주사, 바늘이 없는 주사, 네뷸라이저, 에어로졸라이저(aeorosolizer), 전기천공, 및 경피 패치를 포함한다. 바늘이 없는 주사 장치는 명세서들이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 5,879,327호; 5,520,639호; 5,846,233호 및 5,704,911호에 기재되어 있다. 상기 기재된 제형 중 임의의 제형은 상기 방법으로 투여될 수 있다.

5.6 시험관내 안정성

저장 기간 동안의 GAA 제형의 안정성을 보장하는 것은 큰 난제이다. 예를 들어, Myozyme® 및 Lumizyme®에 대한 환자 설명서에는 바이얼(vial)이 오직 일회용이며, 쓰지 않는 제품은 폐기되어야 하는 것이 기재되어 있다. 설명서에는 Myozyme® 및 Lumizyme®이 건강 관리 전문가에 의해 재구성되고, 희석되고, 투여되어야 하며, 지연이 없이 투여되어야 한다고 추가로 언급되어 있다. Myozyme® 및 Lumizyme®은 2 내지 8℃에서 저장되어야 하고, 제품은 이들 온도에서 24시간까지만 안정적이다.

ASSC 및 GAA가 동일 조성물에 존재하는 경우, 본 발명의 제형화된 조성물은 더욱 안정적인 조성물을 제공한다. 생체내에서 투여된 단백질을 안정화시키는 것에 더하여, ASSC는 시험관내에서 GAA에 가역적으로 결합하여 GAA의 입체형태를 안정화시킴으로써, 응집 및 분해를 방지하고, 제형의 저장 기간을 연장시킨다. ASSC/대체 단백질 상호작용의 분석은 당 분야에 널리 공지된 기술, 예를 들어, 시차 주사 열량측정법, 또는 원평광 이색성을 이용하여 평가될 수 있다.

예를 들어, 조성물의 수성 주사 제형이 바늘 및 주사기를 이용한 내용물의 회수에 적합한 마개가 달린 바이얼 내에 공급되는 경우, ASSC의 존재는 GAA의 응집을 억제한다. 바이얼은 단일 용도 또는 다용도를 위한 것일 수 있다. 제형은 또한 미리 충전된 주사기, 자가주사기 펜(autoinjector pen), 또는 바늘이 없는 투여 장치로 공급될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 제형은 표준, 또는 공급된 생리학적 희석제를 이용한 액체 상태로의 재구성을 필요로 하는 건조 또는 동결건조된 상태로 존재한다. 이러한 예에서, ASSC의 존재는 재구성 동안 및 재구성 후에 GAA를 안정화시켜 응집을 방지한다. 정맥내 투여 라인 또는 카테터로의 연결을 위한 멸균 백에서와 같이 제형이 정맥내 투여를 위한 액체인 구현예에서, ASSC의 존재는 동일한 이점을 부여한다.

투여되는 대체 단백질을 안정시키는 것에 더하여, ASSC의 존재는 GAA 제형이 약 7.0 내지 7.5의 중성 pH에서 저장되는 것을 가능케 한다. 이는 안정성을 보존하기 위해 낮은 pH에서 일반적으로 저장되어야 하는 단백질에 이점을 부여한다. 예를 들어, 리소솜 효소, 예를 들어, GAA는 통상적으로 낮은 pH(예를 들어, 5.0 또는 그 미만)에서 안정적인 입체형태를 유지한다. 그러나, 낮은 pH에서 대체 효소의 연장된 저장은 효소 및/또는 제형의 분해를 촉진할 수 있다.

상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 액체 제형은 이로운 안정성 및 저장 특성을 갖는다. 액체 제형의 안정성은 저장 형태에 좌우되지 않으며, 이는 동결되고, 동결건조되고, 분무-건조되는 제형, 또는 활성 성분이 현탁되는 제형을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 안정성은 선택된 기간 동안 선택된 온도에서 측정될 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 액체 제형 내의 단백질은 적어도 약 1주; 적어도 약 2주; 적어도 약 3주; 적어도 약 1개월; 적어도 약 2개월; 적어도 약 3개월; 적어도 약 4개월, 적어도 약 5개월; 적어도 약 6개월; 적어도 약 12개월; 적어도 약 18개월 동안 액체 형태로 안정적이다. 상기 열거된 기간에 대해 중간의 값 및 범위, 예를 들어, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 약 24개월이 본 발명의 일부인 것으로 의도된다. 또한, 상한 및/또는 하한과 같은 상기 열거된 값 중 임의의 값의 조합을 이용한 값의 범위가 포함되는 것으로 의도된다. 특정 구현예에서, 제형은 적어도 약 1개월 동안 실온(약 30℃) 또는 약 37℃, 또는 약 40℃, 또는 약 45℃에서 안정적이고/이거나, 적어도 약 1년 동안 약 2 내지 8℃에서 안정적이거나, 더욱 바람직하게는 적어도 약 2년 동안 약 2 내지 8℃에서 안정적이다. 더욱이, 제형은 바람직하게는 이하 "동결/해동 주기"로 언급되는 제형의 동결(예를 들어, -80℃로의 동결) 및 해동 후에 안정적이다.

액체 제형에서의 단백질의 안정성(예를 들어, 단백질 안정성 및/또는 오염의 감소)은 또한 제형 내의 단백질의 단량체, 응집물, 또는 단편 또는 이들의 조합물의 백분율로 정의될 수 있다. 단백질은 색 및/또는 투명도의 시각적 시험 후, 또는 UV 광 분산 또는 크기 배제 크로마토그래피, 비-변성 PAGE, 또는 크기 등을 결정하기 위한 다른 방법에 의해 측정시 응집, 침전 및/또는 변성의 징후를 실질적으로 나타내지 않는 경우 제형에서 "이의 물리적 안정성을 보유한다". 본 발명의 한 양태에서, 안정적인 액체 제형은 제형 내의 응집물로 존재하는 약 10% 미만, 또는 약 5% 미만, 또는 약 1% 미만의 단백질을 갖는 제형이다.

한 구현예에서, 액체 제형의 물리적 안정성은 교반 스트레스 검정, 예를 들어, 24시간 또는 48시간의 교반-스트레스 검정에 따라 제형의 혼탁도를 결정함으로써 결정된다. 예를 들어, 교반 스트레스 검정은 자기 교반기, 예를 들어, (multipoint HP, 550 rpm)를 갖는 비커에 적합한 부피의 액체 제형을 배치하고, 임의의 적합한 시간, 예를 들어, T0 내지 T48(시간)에서 분취액을 분리하고, 분취액에 대해 요망되는 바에 따라 적합한 검정을 수행함으로써 수행될 수 있다. 동일한 조건이나 교반이 없는 조건하에서의 제형의 샘플을 대조군으로 제공한다.

혼탁도 측정은 Hach(Germany)로부터의 실험실 혼탁도 측정을 이용하여 수행될 수 있고, 혼탁 단위(nephelometric units, NTU)로 보고된다.

조성물의 안정성(예를 들어, 단백질 안정성 및/또는 오염의 감소)가 또한, 예를 들어, 단백질 분해 또는 오염 성장 또는 존재를 측정함으로써 측정될 수 있다. 단백질 분해는, 예를 들어, 역상 HPLC, 비-변성 PAGE, 이온-교환 크로마토그래피, 펩티드 맵핑, 또는 유사한 방법에 의해 결정될 수 있다.

본원에 기재된 농도에서 ASSC의 존재하에서 GAA의 안정성은, 예를 들어, 소정의 시간에서 응집 또는 분해 백분율로 측정될 수 있고, 하나 이상의 표준과 비교될 수 있다. 예를 들어, 적합한 표준은 GAA가 ASSC와 접촉하지 않는 것을 제외하고는 시험 조건과 유사한 조성물이다. 농도에서의 GAA의 안정성이 비교된다. 적합도는 ASSC의 부재와 동등하거나 이보다 더 나은 안정성을 갖는 ASSC와 조합된 특정 농도의 GAA에 의해 제시될 수 있다.

5.7 생체내 안정성

시험관내 제형에 대해 상기 기재된 바와 같이, GAA에 대한 ASSC의 존재는 외생성 GAA의 혈장내 반감기를 연장시킴으로써, 더 긴 기간에 걸쳐 효과적인 대체 단백질 수준을 유지시켜, GAA에 대한 임상적으로 병에 걸린 조직의 증가된 노출, 및 이에 따라 조직으로의 단백질의 증가된 흡수를 발생시키는 이점을 갖는다. 이는 향상된 안심, 빈도의 감소, 및/또는 투여되는 양의 감소와 같은 상기 이로운 효과를 환자에게 부여한다. 이는 또한 치료 비용을 감소시킬 것이다.

야생형 대체 GAA를 안정화시키는 것에 더하여, ASSC는 또한 폼페병과 같은 입체형태적 장애에서와 같이 ER 내에서의 적절한 폴딩 및 가공을 방지하는 돌연변이의 결과로서 결함이 존재하는 내생성 돌연변이체 GAA의 발현을 안정화시키고 향상시킬 것이다.

본 발명은 본원에 기재된 특정 구현예 및 후속되는 실시예에 의한 범위로 제한되지 않는다. 또한, 본원에 기재된 것에 더하여 본 발명의 다양한 변형이 전술한 기재 및 수반되는 실시예 및 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.

실시예

실시예 1: rhGAA 및 100 μM 1-DNJ-HCl의 시험관내 열 안정성

100 μM의 ASSC 1-데옥시노지리마이신 하이드로클로라이드(1-DNJ-HCl)을 이용하거나 이용하지 않은 재조합 인간 GAA(Myozyme^®, Genzyme Corp.)의 안정성을 단백질 변성을 유도하기 위해 열을 이용한 열 안정성 검정을 통해 결정하였다. 변성은 소수성 아미노산(폴딩된 단백질에서 노출되지 않음)에의 결합시 형광을 발하는 SYPRO Orange 염료를 이용하여 모니터된다.

열 안정성을 2개의 제형에 대해 pH 7.4에서 수행하였고, 상기 pH는 ER의 pH에 해당한다. 도 1에 제시된 바와 같이, pH 7.4에서 100 μM 의 1-DNJ-HCl을 함유하는 제형은 변성을 위해 유의하게 더 많은 열을 필요로 하며, 이에 따라 pH 7.4에서 ASSC가 없는 제형에 비해 더욱 안정적이다.

실시예 2: rhGAA 및 50 μM 1-DNJ-HCl의 GAA 잔여 활성 및 열 안정성

잔여 GAA 활성을 4개의 제형에 대해 결정하였다:

(1) pH 7.4에서 Myozyme® 단독;

(2) pH 7.4에서 Myozyme® + 50 μM 1-DNJ-HCl;

(3) pH 5.2에서 Myozyme® 단독;

(4) pH 5.2에서 Myozyme® + 50 μM 1-DNJ-HCl.

활성을 24시간에 걸쳐 최초 활성의 %(t=0)를 기초로 하여 측정하였다. 샘플을 0, 3, 6 및 24시간에서 형광원 기질 4-MU-α-글루코스의 가수분해를 기초로 한 GAA 효소 활성에 대해 검정하였다. GAA 활성을 최초 활성의 %, 즉, 잔여 활성으로 표현하였다.

도 2a에 제시된 바와 같이, 상기 제형 (1)(ASSC가 없음)은 시간 경과에 따라 활성을 잃으며, 투여 24시간 후에 이의 최초 활성의 약 20% 만을 갖는다. 대조적으로, 제형 (2)는 24시간에 걸쳐 이의 최초 활성의 전부는 아니지만 대부분을 유지하였다. pH 5.2에서 둘 모두의 제형(상기 제형 (3) 및 (4))은 24시간에 걸쳐 이들의 최초 활성 대부분을 유지하였다.

최초 효소 활성의 상실이 적절한 입체형태를 유지시키는 것의 실패와 관련되어 있는지의 여부를 결정하기 위해, 실시예 1에 일반적으로 기재된 바와 같이 SYPRO Orange 열 안정성 실험을 상기 샘플에 대해 수행하였다. 그러나, 이러한 열 안정성 실험에서, 1-DNJ-HCl의 농도를 제형 (2) 및 (4)에서 100 μM로 증가시켰다. 이러한 실험을 기초로 하여, 폴딩된 GAA의 %를 평가하고, 도 2b에서 플로팅하였다. 제형 (1)에 대한 도 2b에서의 24시간에 걸친 폴딩된 GAA의 양의 감소는 상기 동일한 일반적인 제형에 대한 도 2a에서 제시된 활성의 상실과 관련이 있다.

실시예 3: 1-DNJ-HCl의 경구 투여를 이용한 및 이용하지 않은 GAA KO 마우스에서의 Myozyme®의 생체내 흡수.

GAA KO 마우스의 5개의 그룹에 하기 제형 중 하나를 투여하였다:

(1) 미처리 대조군;

(2) 3주 이하 동안 주당 1회 10 ㎎/㎏의 Myozyme® IV;

(3) (2)에서와 같은 Myozyme® 주입, + 10 ㎎/㎏의 1-DNJ-HCl;

(4) (2)에서와 같은 Myozyme® 주입, + 100 ㎎/㎏의 1-DNJ-HCl;

(5) (2)에서와 같은 Myozyme® 주입, + 1000 ㎎/㎏의 1-DNJ-HCl.

조직 균질액을 분석을 위해 생성시켰다. 효소 활성을 4-MUG 형광원 기질 검정을 이용하여 결정하였다. 결과는 도 3에 제시된다.

이들 결과는 Myozyme® 조직 흡수(GAA 활성의 척도)가 모든 그룹에 대해 주사 7일 후에 감소한 것을 나타낸다. 1-DNJ-HCl과 Myozyme®의 공동투여는 주사후 7일 이하 동안 Myozyme® 흡수에서 용량-의존적 증가를 촉진시켰다. 1-DNJ-HCl의 효과는 1, 2, 또는 3 용량의 주사 후 4 및 7일에서 더욱 현저하고 유의(Myozyme® 단독에 비한 p<0.05 t-시험)하였다.

실시예 4: 1-DNJ-HCl의 경구 투여를 이용한 및 이용하지 않은 GAA KO 마우스에서의 Myozyme®의 생체내 흡수

실시예 1에 일반적으로 기재된 바와 같은 열 안정성 실험을 4개의 조성물에 대해 수행하였다:

(1) Myozyme® 단독 조성물;

(2) Myozyme® + 1 μM의 1-DNJ-HCl;

(3) Myozyme® + 10 μM의 1-DNJ-HCl;

(4) Myozyme® + 100 μM의 1-DNJ-HCl;

도 5에 제시된 바와 같이, DNJ-HCl은 용량-의존적 방식으로 GAA의 융해 온도에서의 증가로 나타나는 바와 같이 GAA 열안정성을 증가시킨다.

실시예 5: 단일요법으로 투여되거나, 1-DNJ-HCl와 조합되는 경우 래트에서의 rhGAA의 생체내 반감기.

4개 그룹의 래트에 하기 투여 요법 중 하나를 투여하였다:

(1) 염수 + 물;

(2) 10 ㎎/㎏의 rhGAA + 물;

(3) 10 ㎎/㎏의 rhGAA + 3 ㎎/㎏의 1 DNJ-HC1;

(4) 10 ㎎/㎏의 rhGAA + 30 ㎎/㎏의 1 DNJ-HC1;

rhGAA 또는 염수를 1-DNJ-HCl의 투여 30분 후에 투여하였다. GAA 활성을 실시예 3에 일반적으로 기재된 바와 같이 결정하였다. 24시간에 걸친 결과가 도 6에 제시되어 있다. 1-DNJ-HCl은 투여후 효소 활성의 손실을 억제하였고, 이에 의해 rhGAA의 생체내 반감기를 증가시켰다. rhGAA의 생체내 반감기는 1.4 ± 0.2시간(0 ㎎/㎏의 1-DNJ-HCl)으로부터 2.1 ± 0.2시간(3 ㎎/㎏의 1-DNJ-HCl) 및 3.0 ± 0.4시간(30 ㎎/㎏의 1-DNJ-HCl)으로 증가하였다.

실시예 6: GAA KO 마우스에서의 GAA 효소 활성

3개 그룹의 GAA KO 마우스에 하기 제형 중 하나를 투여하였다:

(1) 대조군(처리 없음);

(2) 10 ㎎/㎏의 rhGAA;

(3) rhGAA 주입 30분 전, 및 48시간 동안 주입 후 8시간 마다 10 ㎎/㎏의 rhGAA 및 100 ㎎/㎏의 1-DNJ-HCl.

심장 및 횡경막 조직 균질액을 수거하고, rhGAA 활성을 형광원 기질(4-MUG)을 이용하여 측정하였다. 결과는 도 7에 제시된다.

실시예 7: 1-DNJ-HCl은 혈액에서 rhGAA를 안정화시키고, 효소 비활성화를 방지한다.

1-DNJ-HCl을 ERT가 수시간 주입 동안 노출되는 환경을 모방하기 위해 37℃에서 전체(소듐 시트레이트 항-응고된) 혈액에서 rhGAA(예를 들어, Myozyme®)를 안정화시키는 능력에 대해 평가하였다. 결과는 rhGAA가 도 8에 제시(적색 다이아몬드 선 플롯)된 바와 같이 4시간까지 효소의 약 40%가 비활성화되고, 8시간까지 ~70%가 비활성화되고, 24시간까지 거의 100%가 비활성화되도록 하는 상기 조건하에서 불안정한 것을 나타낸다. 이들 결과는 rhGAA 투여량의 유의한 분획이 비활성일 가능성이 있음을 암시하는데, 이는 이들 주입이 통상적으로 6시간 초과이고, 일부 경우에 12시간이기 때문이다. 또한, Myozyme®은 긴 혈장 반감기(3시간 초과인 것으로 보고됨)를 가지므로, 비활성화의 경향이 또한 있는 주입 후 많은 시간 동안 인지가능한 양의 효소가 순환되고 있을 가능성이 높다. 대조적으로, rhGAA가 동일 실험 조건하에서 50 μM 1-DNJ-HCl과 함께 인큐베이션되는 경우, 효소는 연구 전체에 걸쳐 완전히 활성인 채로 유지되었다(청색 사각형 선 플롯). 이들 결과는 1-DNJ-HCl이 전체 혈액에서 rhGAA를 안정화시키고, 효소 비활성화를 방지한 것을 나타낸다. 중요하게는, 이들 데이터는 또한 혈액에 존재하는 혈장 단백질이 rhGAA 효소 활성의 손실을 방지하기에 충분하지 않은 반면, 1-DNJ-HCl과 같은 약리학적 샤페론이 효소 비활성화를 방지할 수 있는 것을 나타낸다.

실시예 8: 1-DNJ-HCl은 혈액에서 rhGAA를 안정화시키고, 효소 비활성화를 방지한다.

rhGAA 효소 비활성화를 방지하는 1-DNJ-HCl의 최소 농도를 결정하기 위해 다양한 농도의 1-DNJ-HCl(0 내지 100 μM)로 전체 혈액에서 rhGAA를 측정하였다(도 9). 예상된 바와 같이, 높은 1-DNJ-HCl 농도(50 및 100 μM)가 rhGAA를 안정화시키고 효소 비활성화를 방지하는데 최적이었다. 그러나, 흥미롭게도, 낮은 1-DNJ-HCl 농도(2.5 μM 만큼 낮음)가 또한 6시간의 시간 경과에 걸쳐 ~20%의 손실과 함께 rhGAA 활성을 유지하였다. 이들 결과는 중간 1-DNJ-HCl 농도(예를 들어, 10 내지 25 μM)가 주입 동안 혈액에서 rhGAA를 안정화시키는데 적당할 수 있음을 암시한다. 인간 혈장 PK 데이터를 기초로 하여, 이들 농도는 임상에서 용이하게 수득가능하다.

실시예 9: 1-DNJ-HCl과 공동 투여된 Myozyme®은 Myozyme® 단독에 비해 GAA KO 마우스에서 유의하게 큰 조직 글리코겐 감소를 발생시켰다.

20주령의 수컷 GAA KO 마우스에 8주 동안 격주로 볼루스 꼬리 정맥 주사를 통해 단일 용량의 Myozyme®(40 ㎎/㎏)을 투여하였다. 아나필락시스를 방지하기 위해, 세번째 및 네번째 Myozyme® 주사 전, 디펜히드라민(10 ㎎/㎏ 복막내)을 Myozyme® 주사 10분 전에 투여하였다. 또한, 마우스에 Myozyme® 투여 30분 전에 경구 위관을 통해 투여되는 물 또는 30 ㎎/㎏의 1-DNJ-HCl을 투여하였다. 마우스를 마지막 Myozyme® 투여 14일 후에 안락사시켰다. 실험 계획은 도 10에 제시되어 있다.

이후, 심장, 횡경막, 가자미근, 및 네갈래근에서의 글리코겐 수준을 측정하였다. 1-DNJ-HCl과 함께 공동 투여된 Myozyme®은 Myozyme® 단독에 비해 GAA KO 마우스에서 유의하게 더 큰 조직 글리코겐 감소를 발생시켰다(도 11). 간단히, 200 ㎕의 탈이온수에 마이크로호모게나이저(microhomogenizer)를 이용하여 얼음 상에서 3 내지 5초 동안 ~50 ㎎의 조직을 균질화시킴으로써 균질액을 제조하였다. 상층액을 내생성 아밀로글루코시다제 활성을 제거하기 위해 열 변성시켰다(10분 동안 99℃). 이후, 변성된 용해질(4 ㎕)을 10 ㎕의 800 U/㎖의 아밀로글루코시다제(Sigma Aldrich, St. Louis, MO)와 함께 그리고 상기 아밀로글루코시다제 없이 36 ㎕의 물의 첨가에 의해 이중으로 분석하였고, 50℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 반응을 10분 동안 100℃에서의 비활성화에 의해 중지시켰다. 최종적으로, 200 ㎕의 글루코스 시약(Sigma)을 첨가하고, 흡광도를 Spectramax에서 340 nm에서 판독하였다. 5 ㎍/㎖ 내지 400 ㎍/㎖의 타입 III 토끼 간 글리코겐(Sigma) 범위의 표준 곡선을 절대 글리코겐 단위로의 흡광도의 전환을 위해 매일 작업하였다. 동시에, 단백질의 양을 제조업체의 설명서에 따라 Micro BCA Protein Assay(Pierce, Rockford, IL)을 이용하여 조직 균질액에서 결정하였다. 각각의 샘플의 글리코겐 함량을 단백질로 표준화시키고, 데이터를 단백질의 밀리그램 당 글리코겐의 마이크로그램(㎍/㎎ 단백질)으로 최종적으로 표현하였다.

실시예 10: DNJ는 높은 농도의 Myozyme®을 포함하는 조성물에서 Myozyme®의 응집을 감소시킨다.

10 mM DNJ의 농도를 달성하도록 물에 DNJ를 용해시킴으로써 DNJ 및 GAA를 포함하는 액체 제형을 제조하였다. GAA를 1.8 ㎖의 물에 재구성시키고, 포스페이트 완충-염수(pH 7.4) 중에서 밤새 투석시켰다. 이후, 4.4 마이크로리터의 DNJ(10 mM)를 400 마이크로리터의 GAA에 첨가하여, GAA를 25 ㎎/㎖의 농도로 만들었다.

25 ㎎/㎖ Myozyme®을 pH 7.4에서 포스페이트-완충 염수 중에서 1 mM DNJ와 함께 또는 1 mM DNJ 없이 인큐베이션하였다. Myozyme®의 응집을 37℃에서 4주 동안 인큐베이션 후에 평가하였다. 도 12에 제시된 바와 같이, 1 mM DNJ와 25 ㎎/㎖ Myozyme®을 조합시키는 것은 Myozyme®의 응집을 감소시켰다.

실시예 11: DNJ는 Myozyme®의 순환 반감기 및 조직 흡수를 증가시킨다.

스프라그-돌리 래트에 꼬리 정맥을 통해 10 ㎎/㎏ Myozyme® 또는 10 ㎎/㎏ Myozyme®과 혼합된 30 ㎎/㎏ DNJ를 투여하였다. GAA 활성을 혈장 및 네갈래근 조직에서 측정하였다. 네갈래근에서의 기준선 GAA 활성을 GAA 또는 DNJ 및 GAA 투여 후에 측정된 GAA로부터 공제(~16 nmol/㎎ 단백질/hr)하였다.

도 13에 제시된 바와 같이, 꼬리 정맥을 통해 30 ㎎/㎏ DNJ와 10 ㎎/㎏ Myozyme®을 투여하는 것은 네갈래근에서 Myozyme®의 순환 혈장 반감기 및 조직 흡수를 증가시켰다.

실시예 12: 1-DNJ의 존재하에서의 Lumizyme®의 용해도.

1-DNJ 및 다양한 부형제의 존재하에서의 Lumizyme®(알글루코시다제 알파)의 용해도를 시험하였다.

방법

52.5 ㎎의 단백질, 210 ㎎의 만니톨, 0.5 ㎎의 폴리소르베이트 80, 9.9 ㎎의 Na₂HP0₄ x 7H₂0, 및 31.2 ㎎의 NaH₂P0₄ x H₂0를 함유하는 Lumizyme®의 바이얼을 최소 부피의 물(1 ㎖ 첨가됨)에 용해시켜, 1.2 ㎖의 단백질 용액을 생성시켰다. 5개의 240-㎕ 분취액(각각 10.5 ㎎ 단백질 함유)을 Amicon Ultra 0.5 ㎖ 30 kDa 컷오프(cutoff) 원심분리 필터 장치로 옮기고, Eppendorf 원심분리기에서 14,000 x g에서 10분 동안 원심분리시켜, 약 50 ㎕의 보전물을 수득하였다.

조성물에 존재하는 본래의 부형제, 즉, 만니톨 및 폴리소르베이트 80을 단백질 용해도를 시험(동일한 완충액 조건을 유지)하기 위해 새로운 부형제로 교환하였다. 하기 부형제 용액을 본래의 포스페이트 완충액을 이용한 교환을 위해 제조하였다:

1. PEG 400(5% w/v)

2. 아르기닌(100 mM)

3. 아르기닌(50 mM) + 글루탐산(50 mM)

4. 프롤린(250 mM)

5. 감마-사이클로덱스트린(10%)

모든 샘플은 감소된 1:5(w/w)의 리간드 대 단백질 비로 리간드를 함유한 샘플 2(100 mM 아르기닌)를 제외하고는 1:1(w/w) 비의 리간드 대 단백질로 소분자 리간드 1-데옥시노지리마이신 하이드로클로라이드(1-DNJ-HCl, AT2220 HCl, 2220 HCl)를 함유하였다.

부형제를 교환하기 위해, 5.2 ㎎의 Na₂HPO₄ 및 27.1 ㎎의 NaH₂PO₄를 10.3 ㎖의 물에 용해시켜, 약 26 mM의 세척/부형제 교환 포스페이트 완충액을 제조하였다. 8 ㎖ 부피의 부형제 교환을 위한 완충액에 160 ㎎/㎖의 소분자 리간드(부형제 1, 3, 4 및 5 용액을 제조하기 위한 것)를 보충한 반면, 2 ㎖에는 부형제 2(100 mM 아르기닌)를 위해 32 ㎎/㎖ 리간드를 보충하였다. 각각의 부형제를 상기 나열된 농도로 2 ㎖의 상기 완충액에 용해시켰다.

부형제 용액을 각각의 분리 필터 장치에 첨가하여 0.5 ㎖의 전체 부피를 달성하였다. 각각의 필터 장치를 벤치 탑(bench top) Eppendorf 원심분리기에서 14,000 x g에서 15분 동안 원심분리하여, 약 25 ㎕를 유지시켰다. 유닛을 동일한 부형제 용액을 이용하여 0.5 ㎖까지 재충전시키고, 다시 원심분리(이러한 과정을 2회 반복함)하였다. 이러한 절차는 만니톨 및 폴리소르베이트 80을 상기 기재된 부형제로 효율적으로 대체하여, 본래의 구성을 약 1:1000까지 희석시켰다. 각각의 부형제에 대한 모든 여과액을 수거하고, 필터를 통해 임의의 단백질 누출에 대해 시험하였다.

각각의 원심분리 필터 장치를 깨끗한 튜브에서 뒤집고, 원심분리된 단백질 용액을 1000 x g에서 2분 동안 원심분리에 의해 각각의 필터 장치로부터 수거하였다. 각각의 샘플의 부피를 결정하였고(66 ㎕, 160 ㎎/㎖의 표적 단백질 농도에 해당함), 눈에 보이는 침전물이 각각의 샘플에서 관찰가능하지 않은 것을 확인하였다. 샘플을 다시 이들의 각각의 필터 장치로 옮기고, 추가 5분 동안 원심분리하였다. 이후, 깨끗한 튜브로 필터를 뒤집어 샘플을 수거하고, 1000 x g에서 2분 동안 원심분리하여, 약 37 ㎕의 보전물(10.5 ㎎ 단백질의 전체 최초 농도를 기초로 하여 >280 ㎎/㎖ 단백질에 해당함)을 생성시켰다.

샘플을 볼텍싱(vortexing)시키고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하여, 액체 및 고체상을 평형화시킨 후, 14,000 x g에서 10분 동안 원심분리시켰다. 다시, 보이는 침전물이 관찰되지 않았다. 2 내지 3개의 10 ㎕의 분취액을 각각의 샘플의 상층액(이용가능한 부피의 액체상에 의존함)으로부터 수거하고, 2 단계로 1:1000 희석시켰다. 단백질 농도를 280 nm에서의 UV 흡광도에 의해 측정하고, 최대 단백질 용해도를 고도로 재현가능한 교정 곡선에 따라 계산하였다. 6.8 ㎎의 Myozyme®(알글루코시다제 알파) 동결건조된 분말(1.16 ㎎의 단백질을 함유함)을 1.16 ㎖의 물에 용해시킨 후, 탈이온수에서의 연속 희석에 의해 교정 곡선을 제조하였다. 흡광도를 0.5 ㎖ 분취액을 이용하여 1 cm 광-투과 석영 세미-마이크로 큐벳에서 280 nm에서 측정하였다.

결과;

표 1에 제시된 바와 같이, 본 연구에서 시험된 부형제는 소분자 리간드 1-DNJ-HCl의 존재하에서 단백질의 용해도를 증가시켰다. 관찰된 가장 높은 값은 아르기닌 및 글루탐산의 혼합물(242 ㎎/㎖)에 대한 것이고, 가장 낮은 값은 감마-사이클로덱스트린(114 ㎎/㎖)에 대한 것이었다. 첨가된 부형제가 없는 단백질의 용해도는 약 80 ㎎/㎖인 것으로 결정되었다. 임의의 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 용해도의 증가는 단백질-단백질 회합을 경쟁적으로 차단하는 단백질 표면 소수성 및 친수성 부위와 아미노산 부형제의 효과적인 상호작용으로 기인될 것일 수 있다.

표 1. 리간드 1-DNJ-HCl 및 선택된 부형제의 존재하에서의 Lumizyme®(알글루코시다제 알파)의 용해도.

실시예 13: GAA KO 마우스에서의 조직 흡수 및 글리코겐 감소에 대한 공동-제형화된 rhGAA 및 1-DNJ의 반복 피하 용량의 효과

본 연구에서 GAA 넉아웃 마우스(GAA KO)가 rhGAA 또는 rhGAA 및 1-DNJ의 공동-제형의 반복 피하(SQ) 주사에 내성이 있는지의 여부, rhGAA의 반복된 SQ 주사가 GAA KO 마우스에서 rhGAA의 조직 흡수를 증가시키고, 글리코겐 수준을 감소시키는지의 여부, 및 rhGAA 및 1-DNJ의 공동-제형의 반복된 SQ 주사가 rhGAA 단독의 SQ 주사에 비해 rhGAA의 조직 흡수를 증가시키고, 글리코겐 수준을 감소시키는지의 여부를 시험하였다.

방법

7개 그룹의 12주령 수컷 GAA KO 마우스를 본 연구에 사용하였다. 각 그룹의 마우스에 하기 처리 중 하나를 투여하였다:

(1) 염수 단독(약물 대조군 없음);

(2) 피하(SQ) 전달되는 Lumizyme® 단독(20 ㎎/㎏); 또는

(3) 공동-제형화된 Lumizyme®(20 ㎎/㎏) 및 1-DNJ(30 ㎎/㎏) SQ.

각각의 처리를 2주의 기간 동안 이들의 각각의 처리 그룹에 투여하였다. 처리를 각 주의 월요일 및 목요일에 투여하였다. SQ 주사를 처리를 받는 각각의 마우스의 어깨뼈 사이에 투여하였다. 전체 4 용량을 각각의 연구 동물에 투여하였다. 디펜히드라민을 세번째 및 네번째 용량 투여 전에 복막내(IP) 투여하였다.

rhGAA 및 글리코겐 수준을 하기 샘플링 프로토콜에 따라 결정하였다. 혈액을 혈장 약동학 분석을 위해 네번째 용량 투여 후에 각각의 연구 동물로부터 수집하였다. GAA 활성, 웨스턴 블롯, 및 1-DNJ 수준을 마지막 SQ 용량 2 및 4시간 투여 후에 수집된 혈장 샘플에 대해 결정하였다.

연구의 마지막 용량 투여 3일 후(즉, 용량 4 투여 후 3일)의 rhGAA 흡수를 결정하기 위해 조직 샘플을 수거하였다. 조직 샘플은 심장, 횡경막, 혀, 뇌, 비장, 간, 두갈래근, 세갈래근, 네갈래근, 가자미근, 장딴지근, SQ 주사 부위로부터의 배쪽 피부 및 등쪽 피부를 포함하였다. 연구의 마지막 용량 14일 투여 후(즉, 용량 4 투여 후 14일)의 글리코겐 농도를 결정하기 위해 조직 샘플을 또한 수거하였다. 시험 피검체에 투여된 처리의 요약, 및 샘플 수거 타이밍이 표 2에 제시되어 있다.

표 2. 본 연구의 투여된 처리 및 샘플 수거 시간.

용량을 전체 4개의 투여에 대해 2주 동안 각각의 월요일 및 목요일에 투여하였다. 어떠한 그룹에서도 사망이 없었다.

결과

조직 rhGAA 및 글리코겐

도 15 내지 25는 3개의 처리 중 하나를 투여받은 동물로부터 수거된 조직 샘플에서 최종 처리 용량 3일 후의 GAA 활성, 및 최종 처리 용량 14일 후의 글리코겐 수준을 나타낸다. 시험된 조직 대부분에 대해, rhGAA와 1-DNJ의 공동-제형화는 rhGAA 단독 투여에 비해 시험된 조직에서 rhGAA 흡수 및 활성을 유의하게 증가시켰다. 또한, rhGAA, 또는 rhGAA 및 1-DNJ의 공동-제형을 이용한 처리 후, rhGAA 활성은 최종 처리 용량 3일 후 배쪽 피부 및 앞다리 근육내의 SQ 주사 부위에서 높았다. rhGAA 활성은 앞다리를 제외하고는 시험된 모든 근육에서 보다 간에서 더 높았다.

더욱이, 표 3에 기재된 바와 같이, SQ 투여된 1-DNJ 및 rhGAA(Lumizyme®)의 공동-제형으로 달성된 rhGAA 수준은 rhGAA(Myozyme®)를 단독으로 정맥내 투여함으로써 달성된 수준과 비교하여 (대부분의 조직에서) 이와 같이 높거나 더 높았다.

표 3. 정맥내(IV)로 단독으로 투여된 rhGAA(Myozyme®) 및 SQ로 단독으로 투여된 Lumizyme®과 비교한 SQ로 투여된 rhGAA(Lumizyme®) 및 1-DNJ의 공동-제형의 rhGAA 활성 흡수(nmol/㎎/hr).

조직 샘플에서 검출된 글리코겐 수준과 관련하여, 글리코겐에서의 감소의 정도는 일부 조직에서 rhGAA 흡수와 관련이 있었다. 심장, 혀, 및 배쪽 피부는 rhGAA 단독에 비해 rhGAA + 1-DNJ 공동-제형을 이용하여 개선된 rhGAA의 흡수와 개선된 글리코겐 감소 사이에 상관관계를 나타내었다. 임의의 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 일부 조직 용해질에서의 높은 rhGAA 효소 활성은 조직(예를 들어, 지방, 림프, 혈관) 내에 존재하나, 세포 및 리소솜으로 아직 진입하지 않은 효소로부터 유래된 것일 수 있다. 또한, 임의의 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 리소솜 효소에 대해 이용가능하지 않지만, 전체 세포 용해질에서 검출가능한 많은 세포질 글리코겐이 존재할 수 있다.

혈장 rhGAA

공동-제형으로 처리된 동물로부터의 혈장 샘플에 존재하는 1-DNJ가 샘플에서 rhGAA를 억제하였는지의 여부를 결정하기 위해, 1시간 동안 혈장 샘플로부터의 rhGAA와 GAA 기질을 인큐베이션시키고, 기질 대사를 기초로 하여 효소 활성을 결정함으로써 rhGAA 활성을 결정하였다. 이후, 샘플을 3시간 동안 기질과 함께 샘플을 인큐베이션하여 효소로부터 1-DNJ를 해리시키고, 이에 의해 1-DNJ에 의해 야기된 임의의 효소 억제를 역전시킴으로써 샘플을 재검정하였다. 2개의 검정 포맷 사이의 결과에서 실질적 변화가 관찰되지 않았다.

도 26 내지 28은 최종 처리 용량 투여 2 및 4시간 후에 수거된 샘플에서의 혈장 rhGAA 활성 및 단백질 농도를 제시한다. 최종 SQ 처리 용량 투여 2시간 후, rhGAA가 단독으로 투여되는 경우보다 공동-제형으로 1-DNJ가 rhGAA와 함께 투여되는 경우 혈장에서 더 높은 rhGAA 활성 및 단백질 농도(즉, 활성 검정 및 웨스턴 블롯 각각)가 검출가능하였다. 최종 SQ 처리 용량 투여 4시간 후, 혈장 rhGAA 수준은 공동-제형으로 처리된 마우스에서 상승된 채로 유지된 반면, rhGAA 단독으로 처리된 마우스로부터의 혈장 rhGAA 수준은 2시간 샘플에서의 수준에 비해 증가하였다.

본 발명은 본원에 기재된 특정 구체예에 의해 범위가 제한되지 않는다. 또한, 본원에 기재된 것에 더하여 본 발명의 다양한 변형이 전술한 설명 및 수반하는 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구항의 범위 내에 해당되는 것으로 의도된다.

특허, 특허 출원, 간행물, 제품 설명, GenBank 등록 번호, 및 프로토콜이 본 출원 전체에 걸쳐 인용되며, 이들의 개시는 모든 목적상 이들의 전체내용이 참조로서 포함된다.

Claims

피검체에서의 폼페병을 치료하기 위한 제1 조성물 및 제2 조성물을 포함하는 조합 치료제로서,
제1 조성물은 1-데옥시노지리마이신 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 및 n-부틸-데옥시노지리마이신 또는 이의 약학적으로 허용되는 염으로 구성된 군으로부터 선택된 활성 부위-특이적 샤페론을 포함하고, 제2 조성물은 산성 α-글루코시다제를 포함하고,
산성 α-글루코시다제는 제2 조성물 내에 약 5 ㎎/㎖ 내지 약 80 ㎎/㎖의 농도로 제형화되고,
활성 부위-특이적 샤페론은 약 1 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏의 양으로 투여하기 위해 제형화되고, 산성 α-글루코시다제는 폼페병을 치료하는데 효과적인 양으로 투여하기 위해 제형화되는 것인, 조합 치료제.
제1항에 있어서, 산성 α-글루코시다제가 제2 조성물 내에 약 15 ㎎/㎖의 농도로 제형화되는 것인, 조합 치료제.
제1항에 있어서, 산성 α-글루코시다제가 약 5 ㎎/㎏ 내지 약 50 ㎎/㎏의 양으로 투여하기 위해 제형화되는 것인, 조합 치료제.
제3항에 있어서, 산성 α-글루코시다제가 약 10 ㎎/㎏ 내지 약 40 ㎎/㎏의 양으로 투여하기 위해 제형화되는 것인, 조합 치료제.
제4항에 있어서, 산성 α-글루코시다제가 약 15 ㎎/㎏ 내지 약 25 ㎎/㎏의 양으로 투여하기 위해 제형화되는 것인, 조합 치료제.
제5항에 있어서, 산성 α-글루코시다제가 약 20 ㎎/㎏의 양으로 투여하기 위해 제형화되는 것인, 조합 치료제.
제1항에 있어서, 제1 조성물 및 제2 조성물 중 적어도 하나가 부형제를 추가로 포함하는 것인, 조합 치료제.
제1항에 있어서, 제2 조성물이 완충액을 추가로 포함하는 것인, 조합 치료제.
제8항에 있어서, 완충액이 시트레이트 완충액, 아세테이트 완충액, 바이카보네이트 완충액, 포스페이트 완충액 및 이들의 조합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 조합 치료제.
제1항에 있어서, 활성 부위-특이적 샤페론이 n-부틸-데옥시노지리마이신 또는 이의 약학적으로 허용되는 염인, 조합 치료제.
제1항에 있어서, 활성 부위-특이적 샤페론이 1-데옥시노지리마이신 또는 이의 약학적으로 허용되는 염인, 조합 치료제.
제1항에 있어서, 제1 조성물은 경구 투여를 위해 제형화되고, 제2 조성물은 정맥내 투여를 위해 제형화되는 것인, 조합 치료제.
피검체에서의 폼페병을 치료하기 위한 제1 조성물 및 제2 조성물을 포함하는 조합 치료제로서,
제1 조성물은 n-부틸-데옥시노지리마이신 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하고, 제2 조성물은 산성 α-글루코시다제를 포함하고,
산성 α-글루코시다제는 제2 조성물 내에 약 15 ㎎/㎖의 농도로 제형화되고,
n-부틸-데옥시노지리마이신 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 약 1 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏의 양으로 투여하기 위해 제형화되고, 산성 α-글루코시다제는 약 5 ㎎/㎏ 내지 약 50 ㎎/㎏의 양으로 투여하기 위해 제형화되는 것인, 조합 치료제.
제13항에 있어서, 산성 α-글루코시다제가 약 10 ㎎/㎏ 내지 약 40 ㎎/㎏의 양으로 투여하기 위해 제형화되는 것인, 조합 치료제.
제14항에 있어서, 산성 α-글루코시다제가 약 15 ㎎/㎏ 내지 약 25 ㎎/㎏의 양으로 투여하기 위해 제형화되는 것인, 조합 치료제.
제15항에 있어서, 산성 α-글루코시다제가 약 20 ㎎/㎏의 양으로 투여하기 위해 제형화되는 것인, 조합 치료제.
제13항에 있어서, 제1 조성물 및 제2 조성물 중 적어도 하나가 부형제를 추가로 포함하는 것인, 조합 치료제.
제13항에 있어서, 제2 조성물이 완충액을 추가로 포함하는 것인, 조합 치료제.
제18항에 있어서, 완충액이 시트레이트 완충액, 아세테이트 완충액, 바이카보네이트 완충액, 포스페이트 완충액 및 이들의 조합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 조합 치료제.
제13항에 있어서, 제1 조성물은 경구 투여를 위해 제형화되고, 제2 조성물은 정맥내 투여를 위해 제형화되는 것인, 조합 치료제.