KR20200033223A - 히알루론산의 정제 공정 - Google Patents

Abstract

HA의 정제, 및 그렇게 정제된 HA를 함유하는 약제학적 조성물, 화장품 조성물, 및 영양 조성물을 위한 공정이 기재된다.

Description

히알루론산의 정제 공정

히알루론산(HA)은 D-글루쿠론산 및 N-아세틸-D-글루코사민의 교번하는 잔기로 구성된, 음이온성이고 설페이트 기가 없는 선형의 고분자량 다당류이다. 자연에서 그것은 세포주변 겔 내에, 척추동물 유기체의 결합 조직의 필수 물질 내에(이 중에서 그것은 주요 구성요소 중 하나를 대표함), 관절의 활액 내에, 유리체액 내에, 그리고 탯줄 내에 존재한다. 그러므로 HA는 특히 피부, 힘줄, 근육, 및 연골과 같은 다수의 조직의 세포를 위한 기계적 지지체로서 생물학적 유기체에서 중요한 역할을 담당한다.

HA는 그의 막 수용체, 특히 CD44, CD54, 및 CD168을 통해, 예를 들어 증식, 이동, 세포 분화, 및 혈관신생과 같은 세포의 생리학 및 생물학에 관련된 다수의 상이한 과정을 조절하며, 그것은 조직 수화 및 관절 윤활과 같은 다른 기능 또한 수행한다는 것 또한 알려져 있다. 그것은 전적으로 생체적합성이며, 그의 다수의 특이적 특징으로 인해, 조직 수복으로부터 점성보충 요법까지, 피부-미용 의약품으로부터 안구내 수술(endoocular surgery)까지, 조직 공학으로부터 세포 요법까지, 그리고 그 밖의 다수에 이르는 다양한 분야에서 수년간 널리 사용되어 왔다.

HA의 화학-물리적 특징 및 생물학적 특징은 극도로 가변적인 그의 분자량(MW - "고유 점도" 방법에 의해 계산되는 중량 평균 MW를 지칭함)과 강한 상관관계가 있으며: 일반적으로 HA의 중량 평균 MW는 대략 20,000 내지 13 x 10⁶ Da으로 변동되고, 그것을 단리하기 위해 사용된 생산 및 정제 방법 및 공급원에 따라 그것이 근본적으로 변화하므로 근사는 필수라고 할 수 있다.

HA를 얻기 위한 2개의 필수 방법이 기본적으로 존재한다:

동물 공급원으로부터의 생산: 역사적으로 HA는 탯줄, 유리체액, 또는 소 활액, 및 특히 닭 벼슬과 같은 동물 조직으로부터 추출된다. 동물 공급원으로부터의 생산은 다수의 한계가 있으며, 예를 들어, 다양한 종류의 불순물(시작 조직의 분해 후의 다량의 유기 잔류물로부터 시작됨)을 제거하기 위해 다수의 단계가 필요하므로 그것은 비용이 많이 들고, 시재료 내에 존재할 가능성이 있는 임의의 오염 요인(예컨대 바이러스)의 불활성화 및 제거를 보장하기 위한 단계가 필요하므로 그것은 상당한 양의 원료의 입수가능성을 필요로 하고 높은 수율을 제공하지 않는다;

미생물의 발효: 특히 스트렙토코커스(Streptococcus) 또는 파스테우렐라(Pasteurella) 속의 일부 미생물은, 적절하게 자극되고/되거나 개질될 경우, 배양 브로스 내에 분비되는 HA를 생산할 수 있으며, 당업자에게 알려진 상이한 공정을 통해 이로부터 그것이 단리된다. 이 경우에도, 예를 들어, 사용된 미생물의 세포 벽의 잔류물, 금속 이온, 핵산, 및 임의의 다른 목적하지 않는 단백질 재료와 같은 존재하는 "불순물"을 제거하기 위해 다수의 단계가 필요하다. 이들 한계에도 불구하고, 이는 여전히 HA의 생산을 위해 가장 많이 개발되고 널리 사용되는 방법이다.

바실러스(메가테리움(Megaterium) 및 서브틸리스(Subtilis))의 일부 속과 같은 적합한 숙주 세포에서, 그리고 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서 HA-신타제 효소를 발현하는 유전자의 형질감염을 통해, 생명공학에 의한 HA의 생산을 위해 새로운 방법 또한 연구되고 있다. 그러나 임의의 잠재적으로 해로운 잔류물을 제거하기 위해 필요한 모든 절차가 이들 생산 방법에도 필요하다.

어느 경우이든, 사용된 방법에 무관하게, HA를 얻는 핵심 단계는 분명하게 다당류의 추출 및 정제 단계이다. 다수의 공지 방법이 존재하며, 이들 모두는 HA를 얻기 위한 시작 공급원에 관련하여 극도로 연접되고 분명하게 조정된다.

우선, 공급원의 잔류물이 제거되어야 하며, 결과적으로, 동물 조직으로부터의 추출을 위해, 단백질의 분해 단계, 및 후속의 여과, 원심분리, 및 세척이 있고; 발효를 위해, 원심분리 및 점진적인 세척이 통상적으로 이루어진다. 어느 경우이든, 액체 분획이 얻어지며, 이어서 이로부터 다당류가 단리된다. 이 점에 있어서, 특히 동물 공급원으로부터의 HA의 경우, 가장 널리 알려지고 분명히 가장 통상적으로 적용되는 방법은 용매 침전법이며: 약술하면, 유기 용매(에탄올, 아세톤)의 농도를 증가시키는 단계를 상기 액체 분획에 사용하여 히알루론산을 침전시키고, 이어서 후속의 가용화 및 침전화에 의해 이를 정제할 것이다.

대안적인 시스템은 다당류를 복합체화하고 그의 침전을 유도하는 기능을 가진 4차 염, 예를 들어 세틸 피리디늄 또는 세틸트리메틸암모늄의 사용을 포함한다. 다시, 완성된 산물을 얻기 위해서는 후속의 가용화 및 침전화가 필요하다.

기술의 발달은 또한, 공정을 수율의 관점에서 효율적이고 순도의 관점에서 효과적이 되게 하기 위해 상기 기재된 핵심 단계를 조합하였다: 그러나, 지금까지 특히 HA를 기반으로 하는 약제학적 조성물의 주사 후에 발생한 여전히 많은 수백건 가량의 유해 사례가 시험 기관(예를 들어, FDA)에 매년 보고된다.

히알루론산은 보습 작용을 가진 화장품(국소 또는 경구 투여용)으로부터 진정 효과를 가진 국소 피부화장품(dermocosmetic)까지, 주름이든 반흔이든 피부 결함의 보정을 위한 주사 장치(피내)로부터 골관절 병리학에서의 관절내 사용, 유리체액에 대한 대체물로서의 안내 사용, 간질성 방광염을 위한 방광내 사용 등과 같은 더 엄격한 약리학적 응용까지, 매우 다양한 분야 및 병리학에 사용된다.

반면에 손상된 조직에 접촉되지 않는 화장품 응용의 경우에는 화장품-등급 HA(덜 순수함)이 충분하며, 약제학적 응용의 경우에, 특히 주사용 응용 및 폐쇄 공동(관절 및 눈) 내의 주사용은 더욱, 절대 순도의 정도가 필요하다는 것이 분명하며, 히알루론산이 추출된 재료의 성질로 인해, 사실상, 핵산, 단백질, 및/또는 그람-양성 박테리아(예를 들어 바실러스, 스트렙토코커스, 엔테로코커스(Enterococcus), 및 스타필로코커스(Staphylococcus) 속의)의 세포 벽의 잔류 박테리아 독소, 예컨대 리포테이코산 LTA 또는 그람-음성 박테리아(예를 들어, 에스케리키아 콜라이, 파스테우렐라, 및 살모넬라(Salmonella)와 같은 것), 예컨대 지질다당류 LPS가 완성된 산물 내에 잔류물 형태로 존재할 수 있다. 이들 다양한 종류의 오염물질은, 국소 및 전신 수준 양자 모두에서 사이토카인(특히 TNF 및 IL-1)의 결과적 방출을 동반하는 유의적인 염증 반응을 야기할 수 있으며, 결국 가장 심각한 경우에 패혈 쇼크의 형태에 도달하는 전체 유기체 내의 영향을 동반하는 전신성 염증 반응을 유도할 수 있다.

LTA 및 LPS는 사실상 강력한 면역 반응을 도출할 수 있고, 가장 심각한 상황에서는 관절염, 신장염, 수막염을 야기하거나 치명적이 될 수도 있는 결과를 동반하는 발열 및 쇼크를 야기하는 지질 부분 및 당류 부분으로 구성되는 중합체이다. 상기 나타낸 바와 같이, 이는 보고된 많은 수의 유해 사례를 설명한다.

이에 부가하여, 이전에 언급된 바와 같이, HA의 MW는 공급원 및 생산 방법에 관련하여 가변적이며 그의 응용 분야를 결정한다는 것 또한 고려해야 한다: 예를 들어, 낮은 MW는 피부과용 또는 피부화장품 제제(약 200 kDa, Connettivina®)에 응용되는 반면에, 관절내 응용의 경우에는, 더 높은 MW가 바람직하며(일반적으로 700 내지 1,800 kDa의 범위; Hyalgan®, Hyalubrix®, Orthovisc®), 미용 수술 또는 안내 응용에 사용되는 1,500 kDa 초과의 MW에 달한다. 그러나, 정제 공정에 관련하여, 30,000 Da 미만의 MW를 가진 HA의 분획을 제거하는 것이 필수적이며, 이에 대해서는 응용의 유형에 무관하게 전적으로 바람직하지 않은 강력한 염증 효과가 널리 입증되어 있다(EP0138572).

이는 HA의 산업적 정제 공정에서 다양한 인자를 평가하고 제어해야 함을 의미한다:

공정 수율: 선택된 생산 공급원으로부터 가능한 최대 양의 HA를 추출하는 것이 필수적이다;

산업적 편의성: 가능한 최소 양의 처분해야 할 잔류물을 생성시키면서 가능한 최단 시간 내에, 사용되는 재료(시약, 용매 등)의 최소 소비로 최상의 산물을 얻어야 한다;

순도의 정도: 얻어진 산물에는 임의의 오염물질, 및 또한 염증 연쇄반응을 촉발할 수 있는 것으로 알려진 30,000 Da 미만의 MW를 가진 HA의 분획이 없어야 한다.

순도의 정도는 정제 단계의 정확도에 분명하게 관련된다.

이들 요건을 요약하는 다수의 시도가 선행 기술에 알려져 있다. 개략적으로, 많은 것들 중에서 하기의 것들을 유념할 수 있다:

EP0138572: 특히, 한외여과 단계, 4차 염(세틸피리디늄) 및 화석 수지의 첨가, 에탄올을 이용하는 침전화를 사용하고, 염증성 분획이 없는 2개의 MW 분획(50-100 kDa 및 500-730 kDa)을 얻는, 닭 벼슬로부터의 HA의 정제; 이와 관련하여 한외여과는 30,000 미만의 MW를 가진 모든 염증성 분자를 제거하고 2개의 목적하는 HA 분획을 분리하기 위해 사용된다;

EP535200: 4차 아민을 이용하는 염화 및 용매(에탄올 또는 아세톤)를 이용하는 후속의 침전화에 의한, 닭 벼슬로부터의 HA의 정제. 750 내지 1,230 kDa 범위의 가변적인 MW를 가지며, 염증성 분획이 없고 구체적으로 안과 용도로 예정된 HA가 얻어진다;

US6489467: HCl을 이용하는 부스트 산성화(boost acidification), 후속의 pH 변동, 및 투석여과에 의해, 약 1,700 kDa의 MW를 가진 HA를 얻는, 스트렙토코커스로부터의 HA의 정제;

문헌[Choi et al, Biomaterials Research, 2014, 18, 1-10]: 한외여과 및 아세톤을 이용하는 침전에 의한, 스트렙토코커스 주에피데미쿠스(Streptococcus zooepidemicus)로부터의 HA의 정제. 900 내지 1100 kDa 범위의 MW를 가진 HA가 얻어진다;

EP2870255: 여과(불순물을 제거하기 위함), 한외여과(산물을 그것이 존재하는 용액 내에 농축하기 위함), pH 변동, 및 최종적으로 에탄올을 이용하는 침전화에 의해, 60 내지 2,400 kDa 범위의 MW를 얻는, 스트렙토코커스 주에피데미쿠스로부터의 HA의 정제;

EP1543103: 사전에 여과한 배양 브로스에 방향족 수지를 첨가하는 단계(이는 대부분의 불순물을 흡착함), 이어서 HA 용액을 농축하기 위한 한외여과, 및 최종적으로 에탄올을 이용하는 침전화에 의한, 스트렙토코커스 배양물로부터의 HA의 정제.

WO2018/020458: 열 처리에 의해 정밀한 분자량(92-230 kDa; 450-780 kDa; 920-1450 kDa)을 가진 분획으로 분리된, 스트렙토코커스 또는 바실러스 속의 미생물의 배양물로부터의 HA의 정제. 정제는, 다른 단계 중에서, 방향족 수지에서의 단계 후에 반복되는 여과 및 최종적으로 유기 용매를 이용하는 침전화 및 관련된 세척을 포함한다.

본 명세서에 인용된 공정 및 일반적으로 사용되는 통상적인 공정이 고품질의 히알루론산을 허용가능한 수율로 생산할 수 있지만, 시약, 용매, 필터 등의 사용의 관점에서, 시간의 관점에서, 그리고 최종적으로 가공 잔류물을 제거하기 위해 감당해야 할 비용의 관점에서, 그들은 극도로 복잡하므로 비용이 많이 든다.

본 발명은 히알루론산 나트륨 염의 극도로 단순화된 정제 공정을 이용해 공지 기술의 결점을 극복하며, 이는 재료 및 시간의 의외의 절감 및 100%에 매우 근접한 값에 도달하는 지금까지 알려진 산업적 수율의 현저한 증가와 함께 매우 높은 순도의 산물을 얻는 것을 가능하게 한다.

본 발명의 목적은

매우 높은 수율;

다수의 중간 단계의 제거로 인한 산업적 편의성;

임의의 종류의 오염물질이 완전히 없는 최종 산물의 매우 높은 순도의 정도를 특징으로 하는, 알칼리 및/또는 알칼리-토금속 염의 형태의, 바람직하게 나트륨 염의 형태의 히알루론산의 추출 및 그의 후속 정제를 위한 새로운 공정에 관한 것이다.

본 출원인에 의해 개발된 히알루론산의 추출 공정은, 그것이 최종 산물에 도달하기 위한 작업 단계의 엄격하게 제한된 갯수를 제공하므로 극도로 단순화되며; 이는 사용되는 재료(용매, 시약, 염, 화석 수지, 합성 수지, 필터 등)의 관점에서 뿐 아니라, 가공 잔류물의 처분에 관련해서도 절감을 의미하고: 예를 들어 유기 용매의 경우를 고려할 때, 화학 산업에 사용되는 재료는 안전 절차에 따라 처분되어야 한다는 것이 알려져 있다. 최종적으로, 이 경우에 단계의 적은 갯수는 또한 가공 시간의 감소에 상응하며; 이들 인자의 조합은 더 양호한 산업적 편의성을 유발한다. 본 공정은 당업자에게 알려진 다수의 기술 중 어느 하나에 따라 제조된 HA의 정제에 적용할 수 있으며: HA는 사실상 생물학적 공급원으로부터, 특히 갈루스(Gallus) 속의 조류 벼슬로부터(EP0138572), 스트렙토코커스의 발효로부터, 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 메가테리움으로부터의 분자 공학으로부터(EP2614088, EP2614087) 유래될 수 있고; 본 공정은 스트렙토코커스, 특히 스트렙토코커스 에퀴(Streptococcus equi) 아종 에퀴, 68222, 돌연변이체 H-1의 발효로부터 얻어진 HA(EP0716688)에 바람직하게 적용가능하다.

본 명세서에 청구된 공정은, 본 출원인이 추가로 입증하는 바와 같이, 유럽 약전(Ph. Eur. 5.0 1472)에 의해 요구되는 모든 화학적/물리적 규격에 부합할 뿐 아니라, 특히 박테리아 내독소, 단백질, 발열원의 함량의 관점에서 심지어 더 우수한, 극도로 높은 순도의 HA의 제조를 가능하게 한다.

사실상, 생산 공급원에 무관하게, 최종 산물이 완벽하게 정제되지 않은 경우, 그것은 다양한 종류의 오염물질, 예컨대 발열원, 단백질(시작 생물학적 재료로부터 유래됨), 핵산, 그람-양성 박테리아로부터(스트렙토코커스 또는 바실러스, 또는 엔테로코키(Enterococci) 및 스타필로코키(Staphylococci)로부터), 또는 그람-음성 박테리아, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이 또는 파스테우렐라 및 살모넬라로부터 유래되는 박테리아 기원의 독소를 함유할 수 있으며: 히알루론산 최종-산물 내의 이들 독소, 예를 들어 리포테이코산(LTA) 또는 지질다당류(LPS)의 존재는, 결국 치료하는 관절 또는 조직의 염증 및/또는 감염의 원인이고 가장 심각한 경우에는 그들의 완전한 파괴 또는 세포괴사를 야기하는 고도로 전염증성인 인자를 생성시키는 고위험으로 인해 사용하는 것을 불가능하게 할 것임을 유념해야 한다.

최종적으로, 본 발명에 따른 정제 공정의 수율은 극도로 높으며, 85 내지 100% 범위의 값으로 안정된다.

본 발명에 따라 얻어진 히알루론산은, 그것에 임의의 전염증성 및 발열원성 구성요소가 없으므로, 특히 모든 주사용 약제학적 조성물(관절내, 피내, 및 안내)에 완전히 안전하게 사용할 수 있다. 바람직하게 알칼리 또는 알칼리-토금속 염의 형태로, 그리고 더욱 더 바람직하게 나트륨 염의 형태로 얻어지는, 본 발명의 목적인 새로운 공정으로 정제한 HA는, 예를 들어, HA와 중금속의 염(EP0827514), 에스테르(EP0216453), 아미드(EP1095064), 설페이트화 산물(EP0940410), 및 HA의 자가-가교결합된 산물을 포함하는 가교결합된 산물(EP0341745)과 같은 당업자에게 알려진 모든 유도체의 제조에도 사용할 수 있다.

본 발명의 추가의 목적은 본 발명에 따른 정제 공정으로 얻어진 HA를 함유하는 약제학적 조성물, 화장품 조성물, 및 영양 조성물, 및 특히 하기의 것들에 관한 것이다:

- 관절염 관절(arthritic joint)의 점성보충, 외상성 관절 손상, 연골하 손상에 사용될 관절내 사용을 위한 약제학적 조성물;

- 안 질환의 치료를 위한 안내 사용 또는 안구 투여를 위한 약제학적 조성물;

- 수술후 유착의 방지에 사용하기 위한 약제학적 조성물;

- 피부 궤양, 욕창, 모든 정도의 화상, 반흔 및 피부 병변의 치료에서, 켈로이드 또는 위축성/비후성 반흔의 치료에서, 온전한 피부 또는 손상된 피부를 동반하는 모든 유형의 피부 결함의 치료에서, 그리고 습진 및 다양한 종류의 피부염, 특히 아토피 및 기저귀 피부염, 건선과 같은 피부 질환을 위한 치료 요법으로서 국소 및 주사 용도(피내 및/또는 근육내)를 위한 약제학적 조성물;

- 특히 간질성 방광염의 치료를 위한 방광내 사용을 위한 약제학적 조성물;

- 피부-미용에서 충전제로서, 또는 미용 수술에서 신체 성형으로서 주사 용도를 위한 약제학적 조성물;

- 국소 및 경구 사용을 위한 화장품 조성물;

- 관절염 관절의 경구 치료, 힘줄 영양(tendon trophism), 피부 영양, 및 위장관 점막의 영양을 위한 약제학적 조성물 또는 영양 조성물.

본 발명의 추가의 목적은, 패드, 직물 천, 부직포, 과립, 필름, 및 겔의 형태인 본 발명에 따라 정제된 HA로 제조된 유도체를 포함하며, 또한 다양한 기원의 세포 및/또는 혈액 유도체, 예를 들어 혈소판 유도체와 조합될 수 있는 2/3-차원 생물재료에 관한 것이다.

이미 나타낸 바와 같이, 일반적으로 모든 공정이 하기와 같이 요약될 수 있는 일부 공통 단계를 제공하므로, 본 발명에 따른 공정은 다양한 공지 기술에 따라 얻어진 HA의 정제에 적용될 수 있다:

생산:

선택된 공급원에 따라, 새롭게 개척된 생명공학적 절차를 이용하는 생물학적 재료의 분해 또는 적절하게 동정된 미생물의 발효가 이루어진다. 히알루론산 및 전혀 목적하지 않는 다양한 유형의 다수의 다른 물질을 용액 중에 함유하는, 고체 생물학적 재료(소위 바이오매스)에 의해 심하게 오염된 브로스가 기본적으로 얻어진다. 후속의 추출 단계를 적용하기 위해 HA를 함유하는 여과된 브로스에 도달하도록, 일반적으로 다양한 방법을 사용하여 바이오매스를 분리함으로써 각각의 방법은 또한 생산 잔류물(고체 및 가능한 한 용해된 것 양자 모두)을 제거하는 단계를 제공한다:

이 단계에서 HA가 단리되고 발효 브로스(fermentation broth)로부터 회수된다. 이는 작업 방법(시약, 용매, 필터, 계면활성제 등)의 관점에서, 그리고 단계의 갯수로서, 그리고 따라서 시간의 관점에서, 다양한 공지 공정과 가장 많이 상이한 단계이다. 구체적으로 추출 단계에서 최종-산물의 순도의 정도 및 산업적 공정의 수율을 위한 기초를 마련되므로, 그것은 분명히 공정의 가장 복잡하고 정교한 부분이다. 추출 단계의 결과는 일반적으로 HA의 농축된 용액이며, 여기에 소위 정제 단계가 적용되고:

정제 방법은 또한 히알루론산의 기원의 공급원에 따라 보정되지만, 일반적으로 그들은 당업자에게 알려진 바와 같은 공통의 방식에 따르며:

존재할 가능성이 있는 목적하지 않는 요소(단백질, 독소 등)를 제거하기 위해 용액 중에 히알루론산을 함유하는 액체상을 처리하고;

이어서 HA가 불용성인 유기 용매(예컨대 에탄올, 아세톤, 또는 그의 혼합물)에 의해 침전화가 이루어지며;

그 후에는 최종 산물이 얻어질 때까지, 수성 비히클에 침전을 용해시키는 단계 및 후속의 침전화, 가용화, 여과, 및 세척을 반복한 후에 이를 건조시킨다.

본 발명에 따른 넓은 의미의 정제 공정(발효 브로스로부터 시작하여 최종 산물로 이어지는 단계의 조합으로서 이해됨)은 추출 단계에 집중하며, 지금까지 알려진 다양한 공정에서 HA의 공급원에 무관하게 이는 다수의 통로에서 연접된다.

이 단계 중에, 사실상 브로스로부터 가능한 최대 양의 목적 산물(HA)을 단리함과 동시에 가능한 최대 양의 모든 종류의 불순물을 제거해야 하며, 이는 필요한 작업 단계의 많은 갯수를 설명한다.

그러므로 구체적으로 이 단계에서, 정제 공정을 평가할 하기 필수 파라미터가 정의된다:

수율, 즉, 얻어지는 산물의 양;

얻어지는 산물의 순도;

산업적 편의성, 즉, 목적하는 특징을 가진 목적 산물을 얻기 위한 재료 및 시간의 소비.

본 출원인은 생산 단계(이것이 무엇이든)로부터 나오는 브로스로 시작하여, 감소된 일련의 단계를 통해, 본 발명에 따른 추출 공정이 브로스 내에 존재하는 사실상 모든 히알루론산을 그로부터 추출하는 것을 가능하게 하며, 공지 기술에 따른 적절한 정제 단계 후에 상기 HA는 발열원, 단백질, 박테리아 내독소의 관점에서 극도로 순수한 것으로 입증된다는 것을 의외로 발견하였다.

그러므로 본 발명의 목적은, 하기 단계를 포함하거나 이로 구성된 추출 단계를 포함함을 특징으로 하는, 발효 브로스로부터, 바람직하게 스트렙토코커스 또는 바실러스 속의 미생물, 특히 S. 에퀴, B. 서브틸리스, 또는 B. 메가테리움, 더욱 바람직하게는 S. 에퀴의 발효 브로스로부터 HA를 추출 및 정제하는 공정에 관한 것이다:

a. 여과된 발효 브로스를 초기 부피에 대해 1.1 내지 3 부피, 바람직하게 1.5와 동일한 정제수로 희석하는 단계;

b. 5,000 내지 300,000 달톤, 바람직하게 50,000 내지 200,000 범위의, 더욱 더 바람직하게 100,000 달톤과 동일한 기공률(porosity)을 가진 아릴설폰계 중합체성 재료, 바람직하게 폴리에테르설폰으로 제조된 한외여과 막을 포함하는 접선 유동 필터(TFF: Tangential Flow Filter) 카세트 내부에 여과액(permeate) 및 농축액(retentate)을 연결함으로써 형성되며, 1 내지 6 시간의 범위, 바람직하게 3 시간과 동일한 시간 동안 반복되고, 외부로부터의 액체 도입 없이 일정한 부피로, 폐쇄된 시스템에서 일방향성 유동으로 수행되는, 단계 a로부터 나오는 브로스의 강제 재순환.

본 발명의 추가의 목적은, 하기 단계를 포함하거나 이로 구성된, 발효 브로스로부터의, 바람직하게 스트렙토코커스 또는 바실러스 속의 미생물, 특히 S. 에퀴, B. 서브틸리스, 또는 B. 메가테리움, 더욱 바람직하게는 S. 에퀴의 발효 브로스로부터의 HA의 추출 공정에 관한 것이다:

a. 여과된 발효 브로스를 초기 부피에 대해 1.1 내지 3 부피, 바람직하게 1.5와 동일한 정제수로 희석하는 단계;

b. 5,000 내지 300,000 달톤, 바람직하게 50,000 내지 200,000 범위의, 더욱 더 바람직하게 100,000 달톤과 동일한 기공률을 가진 아릴설폰계 중합체성 재료, 바람직하게 폴리에테르설폰으로 제조된 한외여과 막을 포함하는 접선 유동 필터(TFF) 카세트 내부에 여과액 및 농축액을 연결함으로써 형성되며, 1 내지 6 시간의 범위, 바람직하게 3 시간과 동일한 시간 동안 반복되고, 외부로부터의 액체 도입 없이 일정한 부피로, 폐쇄된 시스템에서 일방향성 유동으로 수행되는, 단계 a로부터 나오는 브로스의 강제 재순환.

본 출원인에 의해 개발된 추출 공정은, 95 내지 100% 범위의 수율에 도달하는, 초기 여과된 브로스 내에 존재하는 히알루론산의 거의 완전한 추출, 및 따라서 회수를 가능하게 한다.

이들 공정의 전형적인 후속의 침전화 및 세척 단계 중에, 정량적 관점에서 HA의 유일한 손실은 작업에 관련된 것들이므로(예를 들어, 사용된 장비에 최소 양의 HA가 부착되어 잔류함), 이러한 높은 추출 수율은 따라서 지금까지 알려진 것보다 훨씬 더 높은 완성된 산물의 수율을 유발하며; 따라서 추출 단계의 수율은 전체 정제 공정의 수율을 강력하게 예측한다는 것이 추정된다.

본 발명에 따른 HA의 추출 및 정제 공정은 강제 재순환 단계 b 후에 하기 단계가 이어지도록 규정할 수 있다:

c. 정제수 및 식염수 용액, 바람직하게 정제수로부터 선택된 투석여과 용액을 이용하는, 단계 b의 TFF 카세트 내에 함유된 농축액의 투석여과 I;

d. 단계 c로부터 유래하는 부피를 시작 브로스의 부피와 동일한 부피까지 농축하는 단계;

e. 정제수 및 식염수 용액, 바람직하게 정제수로부터 선택되는 투석여과 용액을 이용하며, 5 내지 15회, 바람직하게 6 내지 12회 반복되는, 단계 d로부터 유래하는 부피의 투석여과 II;

f. 시작 브로스의 부피의 1/3과 동일한 최종 부피가 얻어질 때까지 단계 e로부터 유래하는 부피를 최종 농축하는 단계;

g. 시작 브로스의 절반과 동일한 총 부피가 얻어질 때까지 정제수의 순환에 의해 TFF 카세트의 내부에 보류된 산물을 회수하는 단계.

본 발명에 따른 추출 공정은 한외여과 기술(UF)의 혁신적인 사용에 있어서 그의 강점을 가진다. 일반적으로, UF 기술은 구성요소가 함유된 액체상으로부터 여과 막의 기공에 의해 정의된 것(컷-오프)보다 높은 분자량을 가진 상기 구성요소를 단리하는 것을 가능하게 하는 공지 공정이다. 매우 개략적으로, 특이적 탱크 내에 함유된 액체상(공급물)을 정밀한 치수(컷-오프)를 가진 기공이 제공된 여과 막에 대해 펌프에 의해 밀어낸다. 필터 막을 통과하는 유체는 하류에 수집되고 여액 또는 여과액을 형성하며 처분되고; 회수될 구성요소는 막의 표면 상에 유지되고 관심 산물을 함유하는 농축액을 형성한다. 가능한 최대 양의 산물을 회수하기 위해, 농축액을 탱크 내로 재도입하고 그것을 공급물로서 UF 카세트에 전송하는 다중 UF 주기를 농축액에 적용하며, 매번 얻어지는 여과액을 제거한다. 여과액의 점진적 제거는 부피의 손실로 인한 농축을 분명하게 유발하며, 이는 이어서 적합한 액체를 탱크 내로 첨가함으로써 보상된다. 여과액의 점진적 제거는 UF 필터가 완전히 유지할 수 없는 히알루론산의 손실을 분명하게 유발한다.

가능한 한 순수한 최종 산물을 얻기 위해, 당업자에게 알려진 바와 같이, 농축액을 통해 유동시에 여전히 존재하는 불순물을 제거하는 것을 보조하는 세척 유동을 생성하기 위해 외부로부터 적합한 액체(투석여과 용액)를 도입하는 하나 이상의 투석여과 단계가 주기 후에 이어진다. 본 발명의 경우에서와 같이 일반적으로 분자량의 관점에서 유의적인 크기를 가진 생물학적 기원의 분자를 분리해야 하는 경우에, 채택되는 UF는 소위 접선 유동 여과(TFF)이다.

그러므로 본 출원인은, TFF 기술의 혁신적인 사용을 통해, 히알루론산이 함유된 브로스로부터 히알루론산의 거의 완전한 회수를 가능하게 하는, 발효 브로스로부터, 바람직하게 스트렙토코커스 또는 바실러스 속의 미생물, 특히 S. 에퀴, B. 서브틸리스, 또는 B. 메가테리움, 더욱 바람직하게는 S. 에퀴의 발효 브로스로부터 HA를 추출하는 혁신적인 공정을 개발했다.

본 출원인은 사실상, 희석 단계 및 가공되는 배양 브로스의 후속의 강제 재순환에 의해 TFF를 진행함으로써, 동일한 브로스 내에 존재하는 히알루론산의 사실상 완전한 회수가 얻어진다는 것을 의외로 발견했다. 하기 상세하게 설명하는 바와 같이, 이 강제 재순환은 배양 브로스를 적절한 TFF 카세트에 보내는 단계, 얻어진 여과액을 수집하는 단계(그리고 선행 기술에 의해 요구되는 바와 같이, 그것을 제거하지 않음) 및, 원래의 브로스가 유래되는 탱크 내부에 그것을 이송한 후, 그것을 동일한 TFF 카세트에 다시 전송하며, 그 안에서 그것은 공급물로서 거동하는 단계에 의해 실행되며: 이 방식으로, 재순환되는 공급물 내에 여전히 존재하는 HA는 추가의 농축액을 구성할 것이고, 점차 생성되는 여과액은 상기 기재된 주기를 반복할 것이다(강제 재순환). 그러므로 이 단계에서 농축액 및 여과액은 초기 공급물을 함유한 탱크 내에서 연결되고 일방향성 유동으로 재순환된다. 이는 모두 외부로부터의 액체 도입 없이 일어나며, 따라서 시스템 내부에서, 결과적으로 폐쇄된 시스템에서 부피를 일정하게 유지한다. 전체 시스템에는 유동 및 유출을 조절하는 일련의 밸브, 액체를 이송하기 위한 가변 압력 펌프, 압력 값의 제어를 위한 압력 게이지가 당연히 장착되어 있다.

이미 상기 언급된 바와 같이, 기재된 작업의 세트는 시작 브로스로부터의 HA의 거의 완전한 회수를 결정하며, 수율은 95 내지 100%의 범위이다.

그러므로 본 발명은 선행 기술을 실질적으로 개질하고, 공정의 수율(더 많은 히알루론산이 회수됨) 및 연쇄적으로 산업적 편의성(더 적은 단계는 사용되는 재료, 필터 등의 더 적은 양 및 처분해야 할 폐기물의 더 적은 양을 의미함)을 유의적으로 개선한다는 것이 분명하다.

더욱 구체적으로, 본 발명에 의해 기재된 공정이 실행되는 작업 흐름은, 이미 나타낸 바와 같이, HA를 함유하고 임의의 초기 생산 단계로부터, 바람직하게 스트렙토코커스로부터의 발효로부터, 특히 스트렙토코커스 에퀴 아종 에퀴, 68222, 돌연변이체 H-1(EP0716688)의 발효로부터 나오는 브로스로부터 시작된다. 이 특이적인 경우에, 강산의 산 용액, 바람직하게 HCl을 이용하여 브로스를 4.0 내지 5.0의 범위, 바람직하게 4.5의 pH로 조정한 후, 당업자에게 알려진 분리 기술 중 하나(원심분리 및/또는 미세여과 및/또는 규조토 패드 상의 여과)에 의해 바이오매스로부터 분리한다.

여과된 브로스의 부피는 산업적 공장의 용량에 따라 분명하게 변동되며; 이 특이적인 경우에, 부피는 2,000 리터 내지 4,000 리터로 변동될 수 있고; 본 방법은 바람직하게 3,000 리터의 배치 크기에 적용된다. 그 후에는 추출 단계가 이어진다:

그렇게 얻어진 브로스에 하기 단계를 연이어 적용한다:

a. 희석: 생산 단계로부터 나오고 상기 기재된 바와 같이 처리된 브로스를 적합한 탱크 내로 도입하고 초기 부피에 비교하여 1.1 내지 3 부피의 범위, 바람직하게 1.5 부피와 동일한 총 부피까지 정제수로 희석한다. 선행 기술에 따르면 더 작은 부피를 가공해야 하도록 시작 브로스를 농축하므로, 이는 완전히 혁신적인 접근법이다;

b. 강제 재순환: 그렇게 희석된 브로스(공급물)를, 펌프를 포함하는 시스템에 의해, 5,000 내지 300,000 달톤, 바람직하게 50,000 내지 200,000 범위의, 더욱 더 바람직하게 100,000 달톤과 동일한 가변적인 기공률(컷-오프)을 가진, 아릴설폰계 중합체성 재료, 바람직하게 폴리에테르설폰으로 제조된 UF 막을 포함하는 TFF 카세트 내부에서, 한외여과 용액의 도입 및 여과액의 방출 없이, 따라서 폐쇄된 시스템에서 순환시킨다. 브로스의 강제 재순환이 그렇게 생성되며, 여기에서 여과액은, 통상적인 경우에 그러하듯이 제거되는 대신에, 탱크 내로 재도입되고 점차 생성되는 농축액과 연결되며 필터 막에 추가로 보내진다. 사실상 여과액은, 적어도 제1 주기 동안, 용액 내에 미네랄 염 및 다양한 유형의 불순물 뿐 아니라 HA도 함유한다. 브로스의 강제 재순환은 또한 UF 카세트 내부에 HA의 젤라틴성 층을 생성하며, 이는 여과액 내에 여전히 존재하는 HA에 대한 추가의 필터로서 작용함과 동시에 시스템의 폐색을 방지한다. 강제 재순환 및 전체 추출 시스템은 액체상(공급물 및 다른 액체)의 일방향성 유동을 특징으로 한다는 것에 주목해야 한다. 강제 재순환은 1 내지 6 시간의 범위, 바람직하게 3 시간과 동일한 시간 동안 유지되며, 분말 형태의 NaCl을 이용하여 0.3 M의 NaCl 최종 몰농도가 되게 하고 2 부피의 에탄올을 첨가한 여과액의 샘플이 임의의 침전을 제공하지 않을 때까지(이미 언급된 바와 같이, 에탄올에 의한 침전화는 액체상으로부터 HA를 단리하기 위한 가장 단순하고 가장 즉각적인 기술 중 하나임) 30 분의 규칙적인 간격으로 시험한다. 이는 초기 브로스 내에 존재하는 실질적으로 모든 HA가 TFF 카세트 내에 농축액 내에 유지되었음을 의미하며: 혁신이 산물 손실을 사실상 제거하여 막대한 산업적 이점을 유발했음이 분명하다.

추출 단계의 수율은 카르바졸 방법(Ph. Eur. 5.0; 1472, 01/2011)으로 계산하였으며; 약술하면, 발효의 종점에서 브로스 내에 존재하는 HA의 농도, 및 추출 단계의 종점에서 얻어진 HA의 농도를 카르바졸 방법으로 결정한다. 더욱 구체적으로, 기재된 것에 따라 추출된 HA의 그램 단위의 양 대 발효의 종점에서 브로스의 초기 리터 사이의 비를 계산하며; 추출된 HA 대 브로스 내의 초기 HA의 백분율로서 표현된 수율 값을 단비례로 계산할 수 있다.

본 발명 내에 개발된 추출 단계의 그렇게 계산된 수율은 95 내지 100%의 범위이다. 이후에는 당업자에게 알려진 것이 이어지며; 특히, 본 출원인은 바람직하게 하기와 같은 투석여과 단계를 진행한다:

c. 투석여과 I: 이전의 단계 b로부터 유래된, 그의 HA 함량이 완전히 없는 여과액을, 방출 밸브의 개방을 통해 제거한다. 투석여과 용액의 보급을 개방하고 연속적으로 유지하여 농축액을 통해 투석여과 용액의 일정한 유동을 생성시키고, 점차 형성되는 여과액의 제거를 통해 탱크 내부에서 순환하는 부피를 일정하게 유지한다. 사용될 투석여과 용액은 정제수 또는 식염수 용액, 바람직하게 정제수일 수 있다. 강제 재순환 단계의 종점에서 탱크 내에 존재하는 것과 동일한 부피 내지 2배의 부피의 여과액을 제거하기 위해 필요한 시간 동안 이 절차를 유지한다.

d. 농도: 방출 개방을 유지하고 투석여과 용액의 보급을 차단하여, 탱크의 내용물이 초기 희석 전(따라서 단계 a 전)의 시작 브로스의 부피로 돌아갈 때까지 탱크의 내용물을 농축한다.

e. 투석여과 II: 단계 d로부터 유래되는 부피에 대해, 단계 c에 기재된 바와 같은 투석여과 단계를 5-15회, 바람직하게 6-12회 반복한다.

최종적으로, 공지 기술에 따라, 그리고 바람직하게 최종 농축을 통해 HA의 회수가 이루어진다:

초기 부피(단계 a 전)의 약 1/3과 동일한 최종 부피가 얻어질 때까지, 항목 d에 기재된 바와 동일한 절차를 채택한다,

및 후속의 회수:

초기 희석 전(따라서 단계 a 전)의 브로스의 부피의 절반과 동일한 부피가 얻어질 때까지 정제수의 순환에 의해 카세트 내부에 유지된 산물이 회수된다.

이 지점에서, 상기 기재된 공정으로부터 얻어진 용액 내에 존재하는 HA는, 공지 기술이므로 당업자에 의해 적절하게 선택된 특이적 정제 단계, 및 후속의 건조 단계로 진행한다.

약술하면, 본 발명의 목적은, 스트렙토코커스 또는 바실러스 속의 미생물, 특히 S. 에퀴로부터의 발효에 의해 생산된 HA의 전체 추출 및 정제 공정 내에서 적용될 경우에, 수율, 산물 순도, 및 산업적 편의성의 관점에서 고도로 효율적인 HA의 추출 절차에 관한 것이다.

그의 완전히 혁신적인 특징은 TFF 전에 가공되는 배양 브로스의 희석 단계 및 강제 재순환이 선행된다는 사실에 있으며; 이 절차는, HA의 공급원, 이 공급원을 처리하는 방식, 및 그것이 예정된 용도를 위해 준비된 건조된 형태의 최종 산물에 도달하는 방식에 무관하게, HA의 생산 및 정제를 위한 임의의 알려진 전반적 공정 내에서 성공적으로 적용될 수 있다.

더욱 구체적으로 본 출원인은, 하기 단계를 포함하거나 이로 구성되는, 공지 기술에 따라 얻어진, 특히 스트렙토코커스로부터의 발효에 의해, 더욱 바람직하게는 스트렙토코커스 에퀴 아종 에퀴, 68222, 돌연변이체 H-1(EP0716688)의 발효에 의해 얻어진 브로스로부터 시작하여 높은 수율을 가진 HA의 추출 절차를 청구한다:

추출:

a. 희석: 여과한 생산 브로스를 초기 부피에 대해 1.1 내지 3 부피의 범위, 바람직하게 1.5와 동일한 부피까지 정제수로 희석한다;

b. 강제 재순환: 농축액 및 여과액의 연결에 의해 형성된 단계 a로부터 나오는 브로스에, 5,000 내지 300,000 달톤, 바람직하게 50,000 내지 200,000 범위의, 더욱 더 바람직하게 100,000 달톤과 동일한 기공률을 가진, 아릴설폰계 중합체성 재료, 바람직하게 폴리에테르설폰으로 제조된 한외여과 막을 포함하는 접선 유동 필터(TFF) 카세트 내부에서의 강제 재순환을 적용한다. 농축액 내에 HA가 완전히 체류할 때까지, 1 내지 6 시간의 범위, 바람직하게 3 시간과 동일한 시간 동안 강제 재순환을 반복하며, 상기 재순환은 폐쇄된 시스템에서 일방향성 유동으로 외부로부터의 액체의 도입 없이 일정한 부피로 실행된다.

특히 바람직하게 하기와 같은 투석여과 단계와 함께, 당업자에게 알려진 것에 따른 절차가 이어서 채택된다:

c. 투석여과 I: 이는 정제수 및 식염수 용액, 바람직하게 정제수로부터 선택된 투석여과 용액으로 실행되며, 이전의 단계 b 후에 탱크 내에 존재하는 것의 2배와 동일한 부피의 여과액을 제거하기 위해 필요한 시간 동안 유지된다;

d. 농축: 탱크의 내용물을 시작 브로스(단계 a 전)의 부피까지 농축한다;

e. 투석여과 II: 단계 d로부터 유래되는 부피에 대해, 단계 c에 기재된 것에 따른 투석여과를 5-15회, 바람직하게 6-12회 반복한다;

f. 최종 농축: 단계 e로부터 유래되는 부피를 초기 부피(단계 a 전)의 1/3과 동일한 부피가 얻어질 때까지 농축한다;

g. 회수: 단계 a 전의 브로스의 절반과 동일한 총 부피가 얻어질 때까지 정제수의 순환에 의해 카세트 내부에 유지된 산물을 회수한다.

본 명세서에 기재된 모든 단계가 일단 완료되었으면, 당업자에게 알려진 기술을 사용하여 소위 정제 단계를 실행하며; 단지 예로서, 임의의 추가의 가능한 오염물질을 제거하기 위한 강한 알칼리 또는 알칼리-토 염기, 바람직하게 알칼리 및 특히 NaOH를 이용하는 처리에 이어서, 여과(예를 들어, 석탄 및/또는 여과 천 및/또는 폴리프로필렌 상의), 변동되는 희석을 동반하는, 예를 들어 에탄올과 같은 유기 용매 중의 침전화, 및 최종적으로 유기 용매(바람직하게 에탄올) 중의 세척을 언급할 수 있고; 다양한 정제 공정 중에서, 본 상세한 설명의 통합된 부분인 WO2018/020458의 실시예 3에 기재된 것이 특히 바람직하다.

선택된 정제 공정에 무관하게, 염화된 HA가, 바람직하게 나트륨 염의 형태로 얻어진다.

이어서, 그렇게 정제된 염화된 HA에 건조를 적용하며, 이는 그것이 예정된 용도에 채택되기 전에 그의 최적 보존을 가능하게 한다.

그렇게 얻어진 산물은 유럽 약전(Ph. Eur. 5.0; 1472)의 파라미터와 부합할 뿐 아니라, 박테리아 내독소 및 단백질의 함량의 관점에서 심지어 더 우수한 것으로 입증된다.

이전에 기재된 카르바졸 방법(Ph. Eur. 5.0; 1472)을 사용하여 계산한 최종 공정 수율은, 산물의 손실이 이 단계에서 최소이며 작업 한계로 인한 것이고; 수율이 사실상 85 내지 100%의 범위, 바람직하게 95 내지 100%의 범위 내에 안정됨을 확인한다.

실시예 1: 스트렙토코커스 에퀴의 발효 브로스로부터의 HA의 추출

스트렙토코커스 에퀴 아종 에퀴, 68222, 돌연변이체 H-1의 발효 브로스 3,000 리터에 1 N HCl 용액을 교반 하에 첨가하여 pH = 4.5가 되게 한 후, Celite 패드(규조토)로 여과함으로써 바이오매스를 제거한다.

이어서, 그렇게 처리한 브로스를 1,500 리터의 정제수로 4,500 리터의 최종 부피까지 희석하고, 적합한 용량(6,000 리터)을 가진 반응기에 넣는다.

100,000 달톤과 동일한 기공률(컷-오프)을 가진 폴리에테르설폰 막이 제공된 TFF 카세트(Pall, Omega model)를 사용하여, 얻어진 브로스의 부피에 강제 재순환 단계를 적용한다. 펌프에 의해 가해지는 2.5 바 이하의 입구 압력으로 공급물을 카세트 내로 도입한다. 강제 재순환을 3 시간 동안 유지하고, 30 분 간격으로, 여과액 내의 HA의 존재를 평가하기 위한 검정이 이루어진다: 32 ml의 NaCl 및 2 부피의 에탄올을 2 ml의 여과액에 첨가한다. 3 시간의 강제 재순환의 종점에서, 시험은 음성 결과(즉, 침전이 형성되지 않음)를 제공하며, 이는 HA가 농축액 내에 완전히 유지되었음을 의미한다.

강제 재순환을 차단하고 상기 기재된 카르바졸 방법으로 수율을 계산하며, 이는 98%와 동일하다. 이어서, 9,000 리터와 동일한, 따라서 탱크 내에 존재하는 부피의 2배와 동일한 양의 물이 UF 카세트를 통과하기 위해 필요한 시간 동안 정제수를 수집 탱크 내로 도입함으로써 일정한 부피로 제1 투석여과 단계를 시작한다. 이 단계에서, 방출 밸브를 개방하고 특이적 처분 용기를 향해 이송되는 9,000 리터의 여과액을 제거한다.

방출을 개방된 채 유지하면서 정제수의 보급을 폐쇄함으로써 이제 농축액의 부피를 시작 부피(3,000 리터)로 농축한다.

총 24,000 리터의 여과액이 제거될 때까지 정제수로 투석여과를 반복하며, 따라서 8회의 투석여과 주기를 완료한다.

이어서, 정제수의 보급을 최대 1,000 리터의 부피에서 폐쇄함으로써 용액의 최종 농도가 이루어진다. 이어서, 정제수로 산물을 회수한다: 방출 밸브를 폐쇄한 채로 유지하면서, 500 리터의 물을 연속적인 분획으로 탱크에 첨가한다. TFF 카세트 내에 함유되고 시스템의 벽에 부착되는 HA를 모두 탈착하기 위해, 농축액을 연속적으로 회수하고 그것을 공급물 내로 재도입하면서, 물을 시스템 내부에 순환시키며; 후속의 정제 단계를 위해 최적인 1,500 리터의 최종 부피가 그렇게 얻어지고, 나트륨 염의 형태인 최종 산물 히알루론산이 건조 분말로 얻어질 때까지, WO2018/020458의 실시예 3에 기재된 것에 따라 상기 정제를 실행한다.

더욱 구체적으로, 물 중의 0.2 M NaOH를 회수된 산물에 첨가한 후에 pH가 8.5가 될 때까지 전체 혼합물을 12 N HCl로 중화시키고 최종적으로 폴리프로필렌 필터를 통해 여과한다. 이제 나트륨 염의 형태인 HA 용액을 순수 에탄올로 침전화하고 30 분 동안 교반 하에 유지한다. 산물을 10 분 동안 안정시키고 사이포닝에 의해 상청액을 제거한다. 연속적인 교반 하에 30 분 동안 에탄올:물(80:20)의 혼합물로 산물을 세척한 후, 사이포닝에 의해 상청액을 제거한다. 여과에 의해 최종적으로 제거되는 순수 에탄올로 최종 세척이 이루어진다. 얻어진 산물을 특수 스테인리스강 쟁반에 넣고 적어도 22 시간 동안 25 ℃의 온도에서 진공 하에 건조시킨다.

최종 산물의 분석:

단백질 함량: <0.1%, Ph. Eur. 5.0, 1472와 부합함

박테리아 내독소의 함량: <0.05%, Ph. Eur. 5.0, 1472와 부합함

수율: 96.2%

본 명세서에 제공된 데이터는, 선행 기술에서 알려진 미생물의 발효에 의한 히알루론산의 생산, 추출, 및 정제를 위한 공정 내에 본 발명의 목적인 추출 공정을 삽입하는 것은 공정 수율을 전체적으로 의외로 증가시켜 선행 기술에서 지금까지 알려진 것보다 그의 효율의 훨씬 더 큰 증가를 가능하게 한다는 것을 명백하게 나타낸다. 이와 관련하여, 특히 효율적인 것으로 간주된 공지 공정의 수율은 일반적으로 60 내지 80%로 확립됨을 유념해야 한다.

추출 단계 또는 본 출원인에 의해 개발된 공정의 삽입은 또한 전체 공정을 산업적으로 더 편리하게 만들며; 복합체화 염 또는 흡착제 수지를 첨가하는 단계, 천 또는 필터 상의 여과, 반복된 가용화, 및 유기 용매를 이용하는 침전화 단계가 사실상 제거되므로, 가공 시간 및 재료의 사용 양자 모두의 관점에서, 그리고 최종적으로 또한 처분해야 할 폐기물의 관점에서 순 절감을 유발한다.

Claims (16)

1. 하기 단계를 포함하거나 이로 구성된 추출 단계를 포함함을 특징으로 하는, 발효 브로스(fermentation broth)로부터, 바람직하게는 스트렙토코커스(Streptococcus) 또는 바실러스(Bacillus) 속의 미생물, 특히 S. 에퀴(S. equi), B. 서브틸리스(B. subtilis), 또는 B. 메가테리움(B. megaterium), 더욱 바람직하게는 S. 에퀴의 발효 브로스로부터 HA를 추출 및 정제하는 공정:
   a. 여과된 발효 브로스를 초기 부피에 대해 1.1 내지 3 부피, 바람직하게 1.5와 동일한 정제수로 희석하는 단계;
   b. 5,000 내지 300,000 달톤, 바람직하게 50,000 내지 200,000 범위의, 더욱 더 바람직하게 100,000 달톤과 동일한 기공률(porosity)을 가진 아릴설폰계 중합체성 재료, 바람직하게 폴리에테르설폰으로 제조된 한외여과 막을 포함하는 접선 유동 필터(TFF: Tangential Flow Filter) 카세트 내부에 여과액(permeate) 및 농축액(retentate)을 연결함으로써 형성되며, 1 내지 6 시간의 범위, 바람직하게 3 시간과 동일한 시간 동안 반복되고, 외부로부터의 액체 도입 없이 일정한 부피로, 폐쇄된 시스템에서 일방향성 유동으로 수행되는, 단계 a로부터 나오는 브로스의 강제 재순환.
2. 제1항에 있어서,
   강제 재순환 단계 b 후에 하기 단계가 이어지는 공정:
   c. 정제수 및 식염수 용액, 바람직하게 정제수로부터 선택된 투석여과 용액을 이용하는, 단계 b의 TFF 카세트 내에 함유된 농축액의 투석여과 I;
   d. 단계 c로부터 유래하는 부피를 시작 브로스의 부피와 동일한 부피까지 농축하는 단계;
   e. 정제수 및 식염수 용액, 바람직하게 정제수로부터 선택되는 투석여과 용액을 이용하며, 5 내지 15회, 바람직하게 6 내지 12회 반복되는, 단계 d로부터 유래하는 부피의 투석여과 II;
   f. 시작 브로스의 부피의 1/3과 동일한 최종 부피가 얻어질 때까지 단계 e로부터 유래하는 부피를 최종 농축하는 단계;
   g. 시작 브로스의 절반과 동일한 총 부피가 얻어질 때까지 정제수의 순환에 의해 TFF 카세트의 내부에 유지된 산물을 회수하는 단계.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   공정 수율이 85 내지 100%, 바람직하게 95 내지 100%의 범위인 공정.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   정제된 HA가 0.1% 미만의 총 단백질 함량 및 0.05% 미만의 박테리아 내독소의 함량을 가지는 공정.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   발효 브로스가 스트렙토코커스 에퀴 아종 에퀴 68222, 돌연변이체 H-1의 발효 브로스인 공정.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   정제된 HA가 알칼리 또는 알칼리-토금속, 바람직하게 알칼리의 염의 형태, 더욱 더 바람직하게 나트륨 염의 형태인 공정.
7. 하기 단계를 포함하거나 이로 구성된, 발효 브로스로부터의, 바람직하게 스트렙토코커스 또는 바실러스 속의 미생물, 특히 S. 에퀴, B. 서브틸리스, 또는 B. 메가테리움, 더욱 바람직하게는 S. 에퀴의 발효 브로스로부터의 HA의 추출 공정:
   a. 여과된 발효 브로스를 초기 부피에 대해 1.1 내지 3 부피, 바람직하게 1.5와 동일한 정제수로 희석하는 단계;
   b. 5,000 내지 300,000 달톤, 바람직하게 50,000 내지 200,000 범위의, 더욱 더 바람직하게 100,000 달톤과 동일한 기공률을 가진 아릴설폰계 중합체성 재료, 바람직하게 폴리에테르설폰으로 제조된 한외여과 막을 포함하는 접선 유동 필터(TFF) 카세트 내부에 여과액 및 농축액을 연결함으로써 형성되며, 1 내지 6 시간의 범위, 바람직하게 3 시간과 동일한 시간 동안 반복되고, 외부로부터의 액체 도입 없이 일정한 부피로, 폐쇄된 시스템에서 일방향성 유동으로 수행되는, 단계 a로부터 나오는 브로스의 강제 재순환.
8. 제7항에 있어서,
   발효 브로스가 스트렙토코커스 에퀴 아종 에퀴, 68222, 돌연변이체 H-1의 발효 브로스인 공정.
9. 관절염 관절(arthritic joint), 외상성 관절 손상, 및 연골하 손상의 치료;
   안구 병리학의 치료;
   수술후 유착의 방지;
   피부 궤양, 욕창, 화상, 반흔 및 피부 병변, 켈로이드 또는 위축성/비후성 반흔, 온전한 피부 또는 손상된 피부를 동반하는 모든 유형의 피부 결함의 치료;
   습진 및 다양한 종류의 피부염, 특히 아토피 피부염 및 건선과 같은 피부 질환의 치료;
   간질성 방광염의 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따라 정제된 HA를 함유하는 약제학적 조성물, 화장품 조성물, 및 영양 조성물.
10. 피부미용 치료에, 또는 미용 수술에서 신체 성형으로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따라 정제된 HA를 함유하는 약제학적 조성물 및 화장품 조성물.
11. 국소 및 경구 사용을 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 화장품 조성물 및 영양 조성물.
12. 관절염 관절의 경구 치료, 힘줄 영양(tendon trophism), 피부 영양, 및 위장관 점막의 영양에 사용하기 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물 및 영양 조성물.
13. 0.1% 미만의 총 단백질 함량 및 0.05% 미만의 박테리아 내독소의 함량을 가지는, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따라 정제된 HA.
14. 알칼리 또는 알칼리-토금속 염, 바람직하게 알칼리의 형태, 더욱 더 바람직하게 나트륨 염의 형태인, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따라 정제된 HA.
15. HA의 유도체, 바람직하게 중금속과의 HA 염, 에스테르, 아미드, 설페이트화 산물, 및 가교결합된 산물, 바람직하게 자가-가교결합된 산물의 제조를 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따라 정제된 HA.
16. 패드, 직물, 부직포, 과립, 필름, 및 겔의 형태이며, 또한 다양한 기원의 세포 및/또는 혈액 유도체, 예를 들어 혈소판 유도체와 조합될 수 있는 2/3-차원 생물재료의 제조를 위한, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따라 정제된 HA.