KR20200037258A - 생물학적 약물로 치료받은 피험자에서 중화 항체 수준 평가용 분석법 및 맞춤 의료에서 이의 사용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생물학적 약물로 치료받은 면역-매개 장애를 앓고 있는 피험자의 시료에서 중화 항체 수준의 정확한 측정 및 이들 환자에서 약물에 대한 반응성의 예측을 위한 분석법, 장치 및 키트에 관한 것이다.

Description

생물학적 약물로 치료받은 피험자에서 중화 항체 수준 평가용 분석법 및 맞춤 의료에서 이의 사용

본 발명은 맞춤 의료(personalized medicine)에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 생물학적 약물로 치료받은 면역-매개 장애를 앓고 있는 피험자에서 중화 항체 수준의 정확한 측정을 위한 분석법, 장치 및 키트를 제공한다.

지난 10년 동안 면역계의 특정 성분을 목표로 하는 생물학적 제제의 도입으로 치료의 실질적인 변화가 입증되었다. 주요 돌파구는 항-종양 괴사 인자 알파 (TNFα) 제제, 즉 인플릭시맙의 도입이었다.

항-TNF 요법의 치료 약물 모니터링(Therapeutic drug monitoring, TDM)은 전세계 많은 임상의의 표준 치료(standard of care)가 되었다. 인플릭시맙 및 아달리무맙 혈청 최저 수준(trough levels)은 임상 반응과 긍정적으로 관련이 있다 [1, 2]. 또한, 적당한 최저 수준은 더 높은 점막 치유율 및 UC와 CD 모두에서 장기 합병증(long-term complications)의 발생률 감소와 관련이 있었다 [3-4].

IBD 환자에서 TNFα 또는 다른 생물학적 표적을 표적하는 생물학적 약물의 사용은 종종 약물의 효능을 감소시키는 항-약물 항체 (ADA)의 출현에 의해 방해받는다. 항-TNF 약물 수준의 측정과 함께 질환 활성의 평가는 반응 상실 관리, 유지 요법 동안 질환 관리의 최적화 및 가능한 치료 중단에 대한 합리적인 결정을 용이하게 한다. 항-약물 항체 측정은 이러한 임상 상황에 도움이 되며, 다음 단계 개입을 선택하기 위한 반응 상실 환자에게 주로 유용하다 [5].

약물 활성에 대한 간섭은 ADA-매개 제거율(clearance)의 증가에 기인할 수 있거나, 또는, ADA가 약물의 결합 부위에 대해 특이적으로 발생하여 표적에 결합하는 능력을 중화시키는 경우, 임상적 반응 상실을 야기할 수 있다. 면역억제제와의 공동-치료는 항체의 외관을 제거할 수 있으나, 상당한 부작용과 관련이 있다. 또한, 최근에 중화 항체와 비-중화 항체를 구별하는 것이 중요하며, 표적 결합 부위와 경쟁하는 특이적 중화 항체의 검출이 적어도 항-TNFα 치료를 받는 IBD 환자에서 임상적 반응 상실 및 후속 반응 상실의 예측과의 상관 관계와 관련하여 현재의 항체 검출 방법보다 우수하다는 것이 밝혀졌다 [6].

병원에서 ADA 검출에 사용되는 현재의 방법은 항체의 이가(bivalent) 구조 및 이들의 검출을 위해 ADA의 람다 경쇄를 이용한 항-람다 쇄 기반 효소-결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)에 의존하는, 가교 분석법 (bridging assay)의 몇 가지 변형을 포함한다 [7]. 균질 이동성-변동 분석법 (homogenous mobility-shift assay, HMSA)과 같은 다른 방법은, 크기-배제 고성능 액체 크로마토그래피 (size-exclusion high-performance liquid chromatography, SE-HPLC)를 사용하여 표지된 약물로 스파이킹된(spiked) 혈청에서 약물-항체 복합체를 정량적으로 측정한다 [8]. 이들 분석법의 한계는 중화 항체 및 비-중화 항체의 구별없이 임의의 항-약물 결합 활성의 검출이다 [9]. 이들은 시간이 걸리고, 어렵고, 혈청 약물에 민감하므로, 치료 시점 분석법으로서 적당하지 않다.

다른 유형의 ADA 분석법은 리포터 유전자 분석법이다 [10]. 중화 항체를 식별하는 이 세포 기반 분석법은 TNFα-민감성 리포터 유전자의 활성화에 의존한다. 활성 약물의 존재 하에 리포터 유전자 발현이 감소할 것이고, 반면에 중화 ADA가 혈청에 존재할 때 이의 발현이 다시 증가할 것이다. 이 경우, 세포 배양 시설 및 숙련된 실험실 요원이 필요하다는 것 이외에, 중요한 한계는 이 분석법이 혈청 내 과량의 약물에도 민감하다는 것이다.

G. R. Gunn III 등은 생물학적 약물로 치료받은 환자에서 중화 항체의 수준을 평가하기 위한 ELISA-기반 분석법을 검토한다 [11].

따라서, 항-약물 면역원성의 적시 예측(timely prediction) 및 모니터링을 위한 효과적이고 민감한 도구는 미충족 의료 요구(unmet medical needs)이다.

현재 개시된 주제에 대한 배경으로서 관련된 것으로 간주되는 참고 문헌은 하기에 열거되어 있다:

[1] Baert F, Noman M, Vermeire S, et al. Influence of immunogenicity on the long-term efficacy of infliximab in Crohn's disease. N Engl J Med 2003;348:601-8. [2] Ordas I, Feagan BG, Sandborn WJ. Therapeutic drug monitoring of tumor necrosis factor antagonists in inflammatory bowel disease. Clin Gastroenterol Hepatol 2012;10:1079-87; quiz e85-6. [3] Yanai H, Lichtenstein L, Assa A, et al. Levels of drug and antidrug antibodies are associated with outcome of interventions after loss of response to infliximab or adalimumab. Clin Gastroenterol Hepatol 2015;13:522-530 e2. [4] Ungar B, Levy I, Yavne Y, et al. Optimizing Anti-TNF-alpha Therapy: Serum Levels of Infliximab and Adalimumab Are Associated With Mucosal Healing in Patients With Inflammatory Bowel Diseases. Clin Gastroenterol Hepatol 2016;14:550-557 e2. [5] Ben-Horin, S. & Chowers, Y. Tailoring anti-TNF therapy in IBD: drug levels and disease activity. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 11, 243-255 (2014). [6] Weisshof, R. et al. Anti-infliximab Antibodies with Neutralizing Capacity in Patients with Inflammatory Bowel Disease: Distinct Clinical Implications Revealed by a Novel Assay. Inflamm. Bowel Dis. (2016). [7] Kopylov, U. et al. Clinical utility of antihuman lambda chain-based enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) versus double antigen ELISA for the detection of anti-infliximab antibodies. Inflamm. Bowel Dis. 18, 1628-1633 (2012). [8] Wang, S.-L. et al. Development and validation of a homogeneous mobility shift assay for the measurement of infliximab and antibodies-to-infliximab levels in patient serum. J. Immunol. Methods 382, 177-188 (2012). [9] Bendtzen, K. Immunogenicity of anti-TNF-α biotherapies: II. Clinical relevance of methods used for anti-drug antibody detection. B Cell Biol. 6, 109 (2015). [10] Lallemand, C. et al. Reporter gene assay for the quantification of the activity and neutralizing antibody response to TNFα antagonists. J. Immunol. Methods 373, 229-239 (2011). [11] G. R. Gunn III et al., From the bench to clinical practice: understanding the challenges and uncertainties in immunogenicity testing for biopharmaceuticals. Clinical and Experimental Immunology, 184: 137-146 (2016). [12] Ungar B, Chowers Y, Yavzori M, et al. The temporal evolution of antidrug antibodies in patients with inflammatory bowel disease treated with infliximab. Gut 2014;63:1258-64.

본 명세서에서 상기 참고 문헌의 확인은 이들이 현재 개시된 주제의 특허성과 어떤 식으로든 관련이 있다는 것을 의미하는 것으로 추론되어서는 안된다.

제 1 측면에 따르면, 본 발명은 생물학적 약물로 치료받은 피험자의 생물학적 시료에서 중화 항-약물 항체 (nADA)의 수준을 측정하는 방법에 관한 것이다. 일 실시예에서, 본 발명의 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:

먼저, 단계 (a)에서, 생물학적 시료를 고체 지지체 상에 직접적으로 또는 간접적으로 고정된 생물학적 약물과 함께 배양하는 단계. 단계 (b)는 단계 (a)의 배양된 시료를 생물학적 약물의 표적과 함께 제공하고, 표적을 고정된 약물과 함께 배양하는 단계를 포함한다.

단계 (c)에서, 고정된 약물에 결합된 표적의 양을 측정하는 단계. 일 실시예에서, 표적의 양의 측정은 표적과 직접적으로 또는 대안적으로, 간접적으로 관련된 적어도 하나의 검출가능한 부분(moiety)을 검출함으로써, 예를 들어 검출가능한 부분과 직접적으로 또는 간접적으로 관련된 특이적 항체를 이용하여 결합된 표적을 검출함으로써 수행될 수 있다. 측정된 표지된 표적의 양은 생물학적 시료에 존재하는 중화 항-약물 항체의 수준을 나타낸다는 점에 유의해야 한다. 보다 구체적인 실시예에서, 중화 항체의 수준은 검출된 표적의 수준과 역 상관 관계에 있다.

추가 측면에서, 본 발명은 질환 진행 및 질환 재발의 조기 예후를 모니터링하기 위해, 생물학적 약물로 치료받은 피험자의 반응성을 평가(evaluating) 및/또는 평가(assessing)하기 위한 예후 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 이러한 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:

먼저, 단계 (a)에서, 피험자의 적어도 하나의 생물학적 시료에서 nADA의 수준을 측정함으로써, 시료의 nADA 값을 얻는 단계.

다음으로, 단계 (b)에서, 단계 (a)에서 얻은 nADA 값이 미리측정된 표준 nADA 값 또는 적어도 하나의 대조군 시료에서의 nADA 값에 대해 양성 또는 음성 중 어느 하나인지를 결정하는 단계.

단계 (c)는 피험자를 비-응답자 또는 응답자로 분류하는 단계를 포함한다. 보다 구체적으로, 시료의 양성 nADA 값은, 피험자가 생물학적 약물 치료에 대한 비-반응성과 관련된 미리-확립된(pre-established) 집단에 속한다는 것을 나타낼 수 있다. 그러나, 시료의 음성 nADA 값은, 피험자가 생물학적 약물 치료에 대한 반응성과 관련된 미리-확립된 집단에 속함으로써, 치료 요법에 대한 피험자의 반응성을 예측, 평가 및 모니터링한다는 것을 나타낼 수 있다.

일 실시예에서, 피험자의 적어도 하나의 생물학적 시료에서 nADA의 수준은 (a) 생물학적 시료를 고체 지지체 상에 직접적으로 또는 간접적으로 고정된 생물학적 약물과 함께 배양하는 단계; (b) 단계 (a)의 배양된 시료를 상기 생물학적 약물의 표적과 함께 제공하고, 표적을 고정된 약물과 함께 배양하는 단계; 및 (c) 상기 고정된 약물에 결합된 표적의 양을 측정하는 단계에 의해 측정될 수 있다. 양은 생물학적 시료에 존재하는 nADAs의 수준을 나타낸다, 그리고, 일 실시예에서, 양은 결합된 표적의 수준과 역 상관 관계에 있다.

추가 측면에서, 본 발명은 면역-매개 장애를 앓고 있는 피험자의 치료 요법을 결정하는 방법에 관한 것이다. 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:

먼저, 단계 (a)에서, 피험자의 적어도 하나의 생물학적 시료에서 nADAs의 수준을 측정함으로써, 시료의 nADA 값을 얻는 단계.

단계 (b)에서, 단계 (a)에서 얻은 nADA 값이 미리측정된 표준 nADA 값 또는 적어도 하나의 대조군 시료에서의 nADA 값에 대해 양성 또는 음성 중 어느 하나인지를 결정하는 단계.

단계 (c)에서, 피험자의 치료 요법을 결정하는 단계로서,

(i) 시료의 양성 nADA 값은, 피험자가 생물학적 약물 치료에 대한 반응 상실 (LOR), 부적절한 반응 및 불내증(intolerance) 중 적어도 하나와 관련된 미리-확립된 집단에 속한다는 것을 나타내며, 피험자는 치료를 유지하지 않는 것이 권장된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 피험자는 적어도 하나의 면역억제제와 함께 투여되는 것이 권장될 수 있다;

(ii) 시료의 음성 nADA 값은, 피험자가 생물학적 약물 치료에 대한 반응성과 관련된 미리-확립된 집단에 속한다는 것을 나타낸다. 일 실시예에서, 피험자는 치료를 유지하는 것이 권장될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 생물학적 약물로 치료받은 피험자의 생물학적 시료에서 nADAs 검출용 장치에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 장치는 하기의 요소 또는 성분을 포함할 수 있다:

제 1 요소 (a)에서, 생물학적 약물의 생물학적 표적을 포함하는 표지 조성물. 표적은 생물학적 약물을 특이적으로 인식하고 결합한다. 일 실시예에서, 표적은 적어도 하나의 검출가능한 부분과 직접적으로 또는 간접적으로 관련될 수 있음에 유의해야 한다. 일부 대안적인 실시예에서, 표적의 검출은 검출가능한 부분과 직접적으로 또는 간접적으로 관련된 특이적 항체를 이용하여 달성될 수 있다.

제 2 요소 (b)에서, 본 발명의 장치는 고체 지지체 상에 직접적으로 또는 간접적으로 고정된 생물학적 약물을 포함하는 포획-조성물을 포함할 수 있다;

마지막으로, 제 3 요소 (c)로서, 장치는 생물학적 시료의 수용(reception) 및 수송(transport)에 적합한 고체 지지체를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 측면은

(a) 고체 지지체 상에 직접적으로 또는 간접적으로 고정된 생물학적 약물;

(b) (임의로, 검출가능한 부분과 관련된) 생물학적 약물의 생물학적 표적; 및 임의로

(c) 사용 설명서; (d) 표준 곡선 및/또는 대조군 시료; (e) 임의로 제 2의 검출가능한 부분과 관련된, 적어도 하나의 항-람다 쇄 항체 (또는 대안적으로, 항-카파 쇄 항체); 및 (f) 상기 생물학적 약물에 특이적인 적어도 하나의 비-중화 항체 (여기서, 상기 비-중화 항체는 고체 지지체에 고정된다); 중 적어도 하나를

포함하는 키트에 관한 것이다.

일 실시예에서, 본 발명의 키트는 질환 진행 및 질환 재발의 조기 예후를 모니터링하기 위해, 생물학적 약물로 치료받은 피험자의 반응성을 예측 및 평가하는데 적합할 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 생물학적 약물로 치료받은 피험자의 생물학적 시료에서 활성 생물학적 약물의 수준을 측정하는 방법에 관한 것이다. 일 실시예에서, 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:

먼저, 단계 (a)에서, 시료를 상기 생물학적 약물에 특이적인 적어도 하나의 비-중화 항체와 함께 배양하는 단계. 비-중화 항체는 고체 지지체에 고정될 수 있다.

단계 (b)에서, 단계 (a)의 배양된 시료를 생물학적 약물의 표적과 함께 제공하는 단계. 일 실시예에서, 표적은 검출가능한 부분과 (직접적으로 또는 간접적으로) 관련될 수 있다.

다음 단계 (c)는 검출가능한 부분을 검출하여 표적의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 이 양은 고정된 비-중화 항체에 부착된 생물학적 시료에 존재하는 활성 약물의 수준을 나타낼 수 있다.

본 발명의 이들 및 추가 측면은 하기의 도면에 의해 명백해질 것이다.

예를 들어, IBD와 같은 면역 매개 장애의 치료를 위한 단일클론 항체의 도입 때문에, 이들 제제의 사용은 기하 급수적으로 증가하였다. 이들의 입증되고 종종 임상적으로 현저한 효능에도 불구하고, 생물학적 제제는 치료 실패에 대해 면역이 없으며, 이는 약물에 이전에 노출된 환자에서 원발성 비반응, 이차 반응 상실 또는 재-유도 후 반응 회복 실패로 나타날 수 있다. 반대로, 잠재적인 치료-매개 부작용에 대한 우려와 함께 이들 제제의 상당한 비용은, 임상의 및 일부 국가 보건 기관이 특정 치료 목표를 달성한 후 이러한 치료의 중단을 고려하거나 또는 특정 환자 또는 임상 상황에서, 예를 들어 수술 후 환경에서 종래의 투여량을 감소시킬 수 있는지 여부를 조사하도록 이끌었다. 이러한 과제를 해결하기 위해, 일부 환자에서 유발되는 활성 약물 및 항-약물 항체, 특히 중화 항-약물 항체의 수준의 측정은 반응 상실의 메커니즘을 설명하고 환자의 상당 부분에서 치료를 안내하는 잠재적으로 강력한 도구로 부상하였다. 그 다음, 이러한 측정은 비응답 환자를 위한 최적의 전략을 선택하고 및/또는 유지 요법을 잘 수행하는 환자의 지속적인 치료 또는 중단을 조정하기 위해 변환된다. 이러한 시험 기반 방법은 IBD와 같은 면역-매개 장애의 개별화된 치료를 향한 중요한 도약이다.

따라서, 본 명세서에 개시된 발명은, 제 1 측면에서 본 발명은 생물학적 약물로 치료받은 피험자의 생물학적 시료에서 중화 항-약물 항체 (nADAs)의 수준을 측정하는 방법에 관한 것이므로, 특히 임상적 관련성이 있다. 일 실시예에서, 본 발명의 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:

먼저, 단계 (a)에서, 생물학적 시료를 고체 지지체 상에 직접적으로 또는 간접적으로 고정된 생물학적 약물과 함께 배양하는 단계. 단계 (b)는 단계 (a)의 배양된 시료를 생물학적 약물의 표적과 함께 제공하고, 표적을 고정된 약물과 함께 배양하는 단계를 포함한다. 본 발명의 방법에 의해 사용된 표적은 검출가능한 부분과 (직접적으로 또는 간접적으로) 관련될 수 있거나, 또는 대안적으로, 상기 표적에 특이적인 특이적 항체 또는 임의의 다른 친화도 분자 (구체적으로, 고정된 약물에 결합될 때)는 표적을 검출하는데 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 또 다른 일부 대안적인 실시예에서, 표적은 검출가능한 부분과 직접적으로 또는 간접적으로 관련되지 않을 수 있다.

단계 (c)에서, 고정된 약물에 결합된 표적의 양을 측정하는 단계. 상기에 나타난 바와 같이, 이 단계는 표적과 관련된 검출가능한 부분을 검출함으로써, 또는 대안적으로, 고정된 약물에 부착된 표적을 인식하고 결합하는 특이적 항체 (또는 임의의 친화도 분자)를 이용함으로써 수행될 수 있다. 측정된 표지된 표적의 양은 생물학적 시료에 존재하는 중화 항-약물 항체의 수준을 나타낸다는 점에 유의해야 한다. 특정 실시예에서, 시료 내 nADAs의 수준 또는 양은 고정된 약물에 결합된 표적의 수준 또는 양과 역 상관 관계에 있을 수 있음에 유의해야 한다. 보다 구체적으로, 결합된 표적의 높은 수준은 시료에서 낮은 수준의 nADAs를 나타내고, 표지 된 표적의 낮은 결합은 고정된 약물에 결합하여 표적의 결합을 방지하는 시료에서 높은 수준의 nADAs를 나타낸다. 일 실시예에서, 본 발명의 방법의 비-제한적인 예시는 도 1 및 실시예 1에 의해 제시된다. 또한, 일부 특정 및 비-제한적인 실시예에서, 시료 내 nADAs의 수준은 활성 약물의 수준과 관련되는 일부 간접 정보를 나타내거나 또는 가릴 수 있고, 여기서 높은 수준의 nADAs는 일반적으로 감소된 활성 약물 수준을 나타내고 표시할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 " 약물 ", " 생물학적 약물 " 및 이들의 복수형은 통용되며, 생물학적 분자 또는 물질, 즉 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 다당류, 올리고당 및 이의 단편, 및 세포, 조직, 생물학적 유체 또는 이의 추출물로 이루어지거나 또는 포함하는 약물을 나타내며, 이는 피험자에서 항체를 유도한다. 일 실시예에서, 생물학적 약물은 단일클론 항체, 사이토카인, 가용성 수용체, 성장 인자, 호르몬, 효소, 접착 분자 및 질환 메커니즘을 조절하는 것으로 알려진 특정 표적에 특이적인 융합 단백질 및 펩티드와 같은 단백질을 포함할 수 있다. 또 다른 일 실시예에서, 생물학적 약물은 세포주기, 세포 생존, 아폽토시스, 면역 등과 같은 분자 및/또는 세포 과정에 참여하는 임의의 성분을 포함하거나 또는 표적할 수 있다. 보다 구체적인 실시예에서, 생물학적 약물은 임의의 체크포인트 단백질(checkpoint protein) 또는 이의 임의의 조절제 또는 저해제, 또는 이의 임의의 조합물일 수 있다. 또 다른 일 실시예에서, 생물학적 약물 (또는 이들의 전구체 또는 성분)은 살아있는 공급원인 인간, 동물, 식물, 진균 또는 미생물로부터 분리될 수 있다.

또한, 일 실시예에서, "생물학적 약물" 또는 "생물학적 제제(biologics)"는 일반적으로 하기의 3가지 유형 중 하나인 재조합 DNA 기술을 포함하는 생물학적 과정에 의해 제조되는 치료제의 종류를 나타낸다: (a) 자연적으로 발생하는 단백질과 유사한 물질; (b) 단일클론 항체; 및 (c) 면역글로불린 골격(frame)에 결합된 자연적으로 발생하는 수용체에 일반적으로 기반한 수용체 구조체 또는 융합 단백질. 주요 종류의 생물학적 제제는 혈액 인자 (예를 들어, 인자 VIII 및 인자 IX), 혈전용해제 (예를 들어, 조직 플라스미노겐 활성제), 호르몬 (예를 들어, 인슐린, 글루카곤, 성장 호르몬, 성선 자극 호르몬(gonadotrophins)), 조혈 성장 인자 (예를 들어, 에리트로포이에틴, 콜로니 자극 인자), 인터페론 (예를 들어, 인터페론-α, -β, -γ), 인터루킨-기반 제품 (예를 들어, 인터루킨-2), 백신 (예를 들어, B형 간염 표면 항원) 및 단일클론 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 재조합 DNA 기술로 제조된 생물학적 약물의 비-제한적인 예는, T 세포의 면역 활성을 방해함으로써, 류마티스 관절염과 같은 자가면역 질환을 치료하는데 사용되는, CTLA-4의 세포외 도메인에 융합된 면역글로불린 IgG1의 Fc 영역으로 구성된 융합 단백질인 아바타셉트(abatacept) (Orencia®); 만성 신부전 및 암 화학요법과 일반적으로 관련된, 적혈구 생성(erythropoiesis)을 자극하고 빈혈 치료에 사용되는, 재조합 DNA 기술을 이용하여 세포 배양물에서 제조된 인간 에리트로포이에틴인 에리트로포이에틴(erythropoietin) 또는 에포에틴 알파(Epoetin alfa) (Epogen®); 장기 이식 환자에서 급성 거부를 감소시키기 위해 제공된 면역억제제 약물로서 작용하는 단일클론 항체인 뮤로모나브(Muromonab)-CD3 (Orthoclone OKT3®)로서, 이는 순환 T 세포의 표면에서 T 세포 수용체-CD3-복합체에 결합하여 T 세포의 폐색(blockage) 및 아폽토시스를 유도함; 관상 동맥 시술 동안 및 후에 주로 사용되는 당단백질 IIb/IIIa 수용체 길항제인 압식시맙(Abciximab) (ReoPro®); 즉각적인 이식 거부를 방지하기 위해 면역억제제로 사용되는, IgG1 동형(isotype)의 키메라 CD25 단일클론 항체인 바실릭시맙(Basiliximab) (Simulect®); 및 호흡기 세포융합 바이러스 (respiratory syncytial virus, RSV)의 F 단백질의 A 항원성 부위에서 에피토프에 대한 인간화 단일클론 항체 (IgG)인 팔리비주맙(Palivizumab) (Synagis®) 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.

상기에 상세히 설명된 바와 같이, 생물학적 약물은 경우에 따라 항-약물 항체 (ADAs)의 in vivo 형성을 유도하는 것으로 알려져 있으며, 이들의 검출은 일반적으로 면역원성의 척도로서 동등해졌다. 약리학적 폐지(pharmacological abrogation), 치료적 노출에 대한 영향, 또는 과민성 반응과 같은 ADA 형성에 따른 대부분의 부작용은, ADA와 치료용 단백질 사이의 면역 복합체의 형성의 결과이다. 이들의 수준, 상호 작용의 동역학, 크기, 다클론 다양성, 분포 및 Fc-매개 생리학적 효과는 잠재적으로 임상적으로 관찰가능한 부작용으로 변환될 수 있다. ADAs는 일반적으로 다클론이고, 상이한 동형 [면역글로불린 (Ig)G, IgA, IgM 또는 IgE]을 포함할 수 있으며, 약물 분자의 상이한 영역 ('도메인')에 결합하고, 친화도 (결합 강도)가 다양하며, 환자마다 다를 수 있으므로, 매우 복잡한 분석물 세트를 나타낸다. 본 명세서에 명시된 nADAs는 이후 본 명세서에 개시된 본 발명의 임의의 다른 측면에도 적용될 수 있음을 이해해야 한다.

ADA는 2가지 주요 유형이 있다: 중화 항체 (NAb) 및 비-중화 항체 (non-NAb). 중화 항체 (NAb)는 약물에 결합하고 표적 결합을 방지함으로써 이의 약리학적 기능을 저해하는 결합 ADA의 부분 집합이다. 따라서, 비-중화 항체 (non-NAb)는 표적 결합에 영향을 미치지 않아 약물의 약력학적 활성(pharmacodynamic activity)에 일반적으로 영향을 미치지 않는 약물 분자 상의 부위에 결합하는 ADA이다. 일단 ADA ('결합' ADA)가 검출되면, 특히 짧은 반감기 (몇분에서 며칠)를 갖는 약물 또는 동일한, 내인성 대응물을 갖는 약물의 중화 능력을 결정하는 것이 유용하다.

NAbs는 약물이 투여된 직후 약물 활성을 저해할 수 있으나, 비-NAb는 약물의 약력학적 활성을 저해하지 않는다. 따라서, 본 발명의 방법은 중화 항체 (NAb)의 검출을 가능하게 하기 때문에 특히 임상적 관심이 있으며, 이와 같이, 일 실시예에서, 활성 생물학적 약물의 평가를 허용할 수 있고, 또한 치료받은 환자의 생물학적 치료에 반응할 가능성, 보다 구체적으로, 원하는 표적에서 생물학적 약물의 원하는 활성을 저해할 수 있는 중화 항체의 양을 허용할 수 있다. 이와 관련하여, 중화 항체는 생물학적 약물의 활성, 예를 들어 생물학적 약물의 표적에의 결합 및 이에 의해 이와 관련된 활성을, nADAs의 부재 하에 생물학적 약물의 활성과 비교하여, 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 약 100% 또는 그 이상으로 저해, 감소, 예방 또는 제거할 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명의 방법의 단계 (a)는 약물-표적의 인식 및 결합에 적합한 조건, 또는 대안적으로 또는 추가적으로, 시료에서 nADAs의 고정된 약물에 결합하기에 적합한 조건 하에서 수행될 수 있다. 또 다른 일 실시예에서, 이 단계 다음에 세척 단계 또는 적어도 시료의 제거가 뒤따를 수 있다. 세척 단계는 일 실시예에서 대부분의 비-특이적 결합을 제거하기에 충분히 엄격한 임의의 적당한 세척 완충제의 사용을 포함할 수 있으나, 고정된 생물학적 약물에 대한 표지된 표적의 특이적 결합만을 유지한다. 이러한 임의의 세척 단계는 1회 또는 그 이상, 예를 들어, 필요한 경우 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 또는 그 이상 수행될 수 있다.

일부 대안적인 또는 임의의 실시예에서, 본 발명의 방법은 추가의 해리 (dissociation) 단계를 더 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 이러한 해리 단계는 단계 (a) 전에 수행될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 해리 단계는 시험의 성능 또는 정확도를 방해할 수 있는 임의의 복합체를 방출 및/또는 해리하기에 적합한 조건에서 수행되는, 단계 (a)의 배양 전에 생물학적 시료에 적용되는 전처리 단계에 관한 것이다. 일부 구체적인 실시예에서, 이러한 해리 단계는 약물/항-약물 항체 복합체를 방출 또는 해리하여, 고정된 약물에 대한 nADAs의 결합을 용이하게 할 수 있다.

일부 특정 및 비-제한적인 실시예에서, 해리 단계는 시료를 적어도 하나의 해리제(dissociating agent)로 약 1 내지 30분, 구체적으로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30분 또는 그 이상, 보다 구체적으로, 15분 동안 전처리하는 단계를 포함할 수 있다. 적당한 해리제의 비-제한적인 예는 임의의 산성 물질, 예를 들어, 아세트산과 같은 임의의 산, 글리신-HCl 또는 임의의 등가 산(equivalent acid)에 이어 중화 완충제를 포함한다. 일부 특정 실시예에서, 해리제로서 사용되는 산은 약 10mM 내지 약 1000mM 또는 그 이상의 양으로 존재할 수 있다. 보다 구체적으로, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000mM 또는 그 이상의 양으로 존재할 수 있다. 또 다른 일부 구체적인 실시예에서, 사용된 해리제는 약 300 내지 600 mm의 양의 아세트산일 수 있다. 또 다른 일부 구체적인 실시예에서, 사용된 아세트산은 300mM의 양일 수 있다. 또 다른 일 실시예에서, 글리신-HCl은 해리제로 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, 100mM 글리신-HCl의 양이 사용될 수 있다. 상기에 나타난 바와 같이, 해리 단계 후에, 해리제는 Tris 1M과 같은 중성 완충제의 첨가에 의해 중화될 수 있다.

일 실시예에서, 생물학적 약물은 상이한 농도로 고체 지지체 상에 직접적으로 또는 간접적으로 고정될 수 있다 (코팅 단계라고도 함). 보다 구체적인 실시예에서, 이러한 약물 농도는 약 1ng/ml 내지 약 10000ng/ml, 구체적으로, 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100ng/ml 또는 그 이상, 구체적으로, 약 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500ng/ml 또는 그 이상, 구체적으로, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000ng/ml 또는 그 이상, 구체적으로, 2000, 1500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10000ng/ml 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 또 다른 일부 구체적인 실시예에서, 고정된 생물학적 약물은 100 ng/ml 내지 500 ng/ml의 범위의 양일 수 있다. 보다 구체적인 실시예에서, 생물학적 약물 농도는 250 ng/ml 일 수 있다.

또한, 본 발명의 방법의 다음 단계 (b)는, 단계 (a)의 배양된 시료를 생물학적 약물의 표적과 함께 제공하고, 표적을 고정된 약물과 함께 배양하는 단계를 포함한다. 특정 실시예에서, 검출가능한 부분을 검출함으로써 단계 (c)에서 표지된 표적의 수준의 측정은, 고정된 약물에 결합된 표지된 표적의 수준과 상관 관계가 있는 표지된 표적의 검출가능한 부분으로부터의 신호를 임의의 적당한 방법에 의해 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다. 고정된 약물에 결합된 표지된 표적의 양은 피험자의 시료에서 중화 ADA의 양과 상관 관계 (예를 들어, 역 상관 관계)에 있다. 일 실시예에 따르면, 본 명세서에서 아래에 상세히 설명된 실험 방법 중 어느 하나에 의해 시료로부터 검출된 신호는 결합된 표적의 양과 상관 관계에 있으므로 중화 ADA의 양을 나타낸다. 특정 실시예에서, 이러한 신호-대-수준 자료는 표준 곡선 으로부터 계산되고 도출될 수 있음에 유의해야 한다.

따라서, 특정 실시예에서, 본 발명의 방법은 임의로 생물학적 시료에서 중화 ADA의 수준을 나타내는, 표지된 생물학적 표적의 미리-측정된 농도를 증가시키는 각각에 대한 신호를 검출함으로써 생성된 표준 곡선 의 사용을 더 포함할 수 있다. 이러한 표준 곡선을 얻는 단계는 검출된 표지된 결합된 표적의 수준이 생물학적 시료에 존재하는 중화 ADA의 농도와 반비례하는 범위를 평가하는 것을 나타낼 수 있다. 이와 관련하여, 검출된 표지된 표적의 수준의 변화가 관찰되지 않을 때, 측정된 수준이 포화 유형 곡선을 나타내지 않을 가능성, 즉 증가하는 농도가 동일한 신호를 나타내는 범위를 배제하기 위하여, 표준 곡선을 평가해야 함을 유의해야 한다.

특정 실시예에서, 상기 기재된 바와 같은 이러한 표준 곡선은 이후 본 명세서에 기재된 바와 같이 본 발명에 의해 제공된 임의의 키트의 일부 또는 성분일 수도 있음을 이해해야 한다. 상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법 및 이후 본 명세서에 개시된 장치 및 키트는, 생물학적 약물이 고체 지지체 상에 직접적으로 또는 간접적으로 고정될 수 있음을 개시한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "고정된"은 생물학적 약물 (또는 비-중화 항체)과 고체 지지체의 표면의 안정된 회합(stable association)을 나타낸다. "안정된 회합"은 생리학적 조건 하에서 6개월 이상을 포함하여, 회합의 평균 반감기가 1일 이상, 2일 이상, 1주일 이상, 1개월 이상인 두 개체(entities) 사이의 물리적 회합을 의미한다. 특정 실시예에 따르면, 안정된 회합은 두 개체 사이의 공유 결합, 두 개체 사이의 비-공유 결합 (예를 들어, 이온 결합 또는 금속 결합), 또는 다른 형태의 화학적 인력(chemical attraction), 예를 들어 수소 결합, 반데르 발스 힘 등으로부터 발생한다. 본 발명의 방법, 장치 및 키트에 사용하기에 적합한 고체 지지체는 일반적으로 액상에서 실질적으로 불용성이다. 본 발명의 고체 지지체는 특정 유형의 지지체로 제한되지 않는다. 오히려, 다수의 지지체가 이용가능하고 통상의 기술자에게 알려져 있다. 따라서, 유용한 고체 지지체는 고체 및 반-고체 매트릭스, 예를 들어 에어로겔 및 히드로겔, 수지, 비드, 바이오칩 (박막 코팅된 바이오칩 포함), 미세유체 칩 (microfluidic chip), 실리콘 칩, 나노입자, 고분자, 다중-웰 플레이트 (마이크로타이터 플레이트(microtiter plates) 또는 마이크로플레이트(microplates)라고도 함), 막, 여과기, 전도성 및 비-전도성 금속, 유리 (현미경 슬라이드 포함) 및 자성 지지체를 포함한다. 유용한 고체 지지체의 보다 구체적인 예는 실리카겔, 니트로셀룰로오스와 같은 고분자 막, 입자, 유도체화된 플라스틱 필름, 유리 비드, 면, 플라스틱 비드, 알루미나겔, 세파로오스와 같은 다당류, 나일론, 라텍스 비드, 자성 비드, 상자성 비드, 초상자성 비드, 전분 등을 포함한다. 또 다른 일 실시예에서, 전기화학적 분석법이 본 발명의 방법, 장치 및 키트에 의해 적용되는 경우, 고체 지지체는 나노-크기 물질 및 마이크로-크기 물질, 예를 들어 금 나노입자 (GNPs), 탄소 나노튜브 (CNTs), 그래핀 (GR), 자성 입자 (MBs), 양자점 (QDs) 및 전도성 고분자를 더 포함할 수 있다. 또 다른 일 실시예에서, 고체 지지체로 사용된 이러한 나노-크기 물질 및 마이크로-크기 물질은 전극 표면을 개질하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 일 실시예에서, 특히 전기화학적 분석법이 본 발명에 의해 적용될 때, 고체 지지체는 전도성 물질, 예를 들어 전극 또는 고정된 약물 및 이의 표적의 인식 및 결합에 의해 형성된 전기화학적 신호를 변환시키기에 적합할 수 있는 임의의 다른 개질된 전기 표면에 직접적으로 또는 간접적으로 포함되거나 또는 연결될 수 있다. 보다 구체적으로, 이러한 전극 표면은 표지 (검출가능한 부분)에서 전극으로 전자 전달을 가능하게 하고, 전극 표면에서 발생하는 결합 결과에 의해 영향을 받는다. 또 다른 일 실시예에서, 이러한 용도에 적합한 전극은 고체 지지체에 의해 더 개질될 수 있는 유리질(glassy) 탄소 전극, 및 스크린 인쇄 전극 (SPE)을 포함할 수 있다.

실시예에 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법은 이의 일 실시예에서 항체로 치료받은 피험자에서 유도된 nADAs의 검출에 특히 적합할 수 있다. 따라서, 일 실시예에서, 본 발명의 방법에 적합한 생물학적 약물은 생물학적 표적에 대한 항체일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "항체"는, 특정 항원에 특이적으로 결합하거나 또는 상호 작용하는 임의의 항원-결합 분자 또는 분자 복합체를 의미한다. 용어 "항체"는 이황화 결합에 의해 상호-연결된 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)인 4개의 폴리펩티드 쇄를 포함하는 면역글로불린 분자, 및 이의 다량체 (예를 들어, IgM)를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본 명세서에서 HCVR 또는 V_H로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역 (CH)을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본 명세서에서 LCVR 또는 V_L로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 (CL1)을 포함한다. V_H 및 V_L 영역은 골격 영역 (FR)으로 불리는 보다 보존된 영역으로 산재된, 상보성 결정 영역 (CDRs)으로 불리는 초가변 영역으로 더 세분될 수 있다. 각각의 V_H 및 V_L은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 아미노-말단에서 카복시-말단으로 배열된, 3개의 CDRs 및 4개의 FRs로 구성된다.

일반적으로, 항체는 2개의 면역글로불린 (Ig) 중쇄 및 2개의 Ig 경쇄로 구성된다. 인간에서, 항체는 3개의 독립적인 유전자좌, 즉 경쇄에 대한 카파 (κ) 쇄 (Igκ) 및 람다 (λ) 쇄 (Igλ) 유전자 및 중쇄에 대한 IgH 유전자에 의해 인코딩되고, 각각 염색체 2, 염색체 22 및 염색체 14에 위치한다.

본 발명의 방법에 의해 사용되는 항체는 다클론, 단일클론 또는 인간화 항체 또는 이의 임의의 항원-결합 단편 중 어느 하나일 수 있다. 용어 "항원-결합 단편"은 항원에 대한 결합을 유지하는 항체의 임의의 부분을 나타낸다. 항체 기능성 단편의 예는 완전 항체 분자, 항체 단편, 예를 들어 Fv, 단일쇄 Fv (scFv), 상보성 결정 영역 (CDRs), V_L (경쇄 가변 영역), V_H (중쇄 가변 영역), Fab, F(ab)₂' 및 표적 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 펩티드의 이들 또는 임의의 다른 기능성 부분의 임의의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이, 다양한 항체 단편은 다양한 방법, 예를 들어, 펩신과 같은 효소로 온전한 항체의 소화, 또는 신규(de novo) 합성에 의해 얻어질 수 있다. 항체 단편은 종종 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법론을 이용하여 신규로 합성된다. 따라서, 본 명세서에서 사용된 용어 항체는 전체 항체의 변형에 의해 생성된 항체 단편, 또는 재조합 DNA 방법론 (예를 들어, 단일쇄 Fv)을 이용하여 신규로 합성된 항체 단편 또는 파지 디스플레이 라이브러리를 이용하여 동정된 항체 단편을 포함한다. 또한, 용어 항체는 이가(bivalent) 분자, 이체 (diabodies), 삼체(triabodies) 및 사체(tetrabodies)를 포함한다.

"V_H" 또는 "VH"에 대한 언급은 Fv, scFv, 이황화-안정화 Fv (dsFv) 또는 Fab를 포함하는 면역글로불린 중쇄의 가변 영역을 나타낸다. "V_L" 또는 "VL"에 대한 언급은 Fv, scFv, dsFv 또는 Fab를 포함하는 면역글로불린 경쇄의 가변 영역을 나타낸다.

보다 구체적으로, 문구 "단일쇄 Fv" 또는 "scFv"는 종래의 2개의 쇄 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인이 결합되어 하나의 쇄를 형성한 항체를 나타낸다. 일반적으로, 링커 펩티드는 2개의 쇄 사이에 삽입되어 활성 결합 부위의 적절한 접힘 (folding) 및 생성을 방해하지 않으면서 가변 도메인의 안정화를 허용한다. 본 발명에 적용가능한 단일쇄 항체는, 예를 들어 단량체로서 결합할 수 있다. 다른 예시적인 단일쇄 항체는 이체, 삼체 및 사체를 형성할 수 있다.

일 실시예에서, 생물학적 약물 또는 비-중화 항체로서 본 발명의 방법, 장치 및 키트에 의해 사용된 임의의 항체는 자연적으로 발생하는 항체가 아님을 이해해야 한다. 구체적으로, 본 명세서에서 사용된 임의의 항체는 천연 생성물로 간주될 수 없다. 또 다른 일 실시예에서, 고정된 약물 또는 고정된 비-중화 항체를 생성하는데 사용된 임의의 항체의 고정화는 사용된 생성물을 이의 천연 대응물과 명확히 구별한다.

따라서, 본 발명의 방법의 생물학적 약물이 항체인 일 실시예에서, 단계 (b)에서 제공된 생물학적 표적은 에피토프를 나타내고 포함한다. 용어 "에피토프"는 그 항체에 의해 인식될 수도 있는 항체에 의해 결합될 수 있는 임의의 분자의 부분을 나타내는 것을 의미한다. 에피토프 또는 "항원 결정인자(antigenic determinants)"는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 기로 구성되며 특이적 3차원 구조적 특성 및 특이적 전하 특성을 가진다.

본 명세서에 명시된 항체 및 항원은 이후 본 명세서에 개시된 본 발명의 임의의 다른 측면에도 적용될 수 있음을 이해해야 한다.

또한, 특정 실시예에서, 본 발명의 방법에 의해 사용된 생물학적 약물의 생물학적 표적은 사이토카인일 수 있다.

용어 "사이토카인"은 일반적으로 다른 세포의 거동에 영향을 미치는 광범위한 조혈 및 비-조혈 세포에 의해 생성된 단백질을 나타낸다. 이들은 수용체를 통해 작용하며, 특히 면역계에서 중요하다; 사이토카인은 체액성(humoral) 및 세포-기반 면역 반응 사이의 균형을 조절하고, 특정 세포 집단의 성숙, 성장 및 반응성을 조절한다. 면역 반응의 조절에서 이들의 특별한 중요성은 이들을 특이적으로 표적하는 생물학적 약물의 생산을 자극하였다. 사이토카인은 예를 들어 아실화 자극 단백질, 아디포카인(Adipokine), 알비인터페론(Albinterferon), CCL1, CCL2, CCL3, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, 세르베루스(Cerberus), 단백질, 케모카인(Chemokine), 콜로니-자극 인자 (Colony-stimulating factor), CX3CL1, CX3CR1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL17, 에리트로포이에틴(Erythropoietin), FMS-유사 티로신 키나제 3 리간드, GcMAF, 과립구 콜로니-자극 인자(Granulocyte colony-stimulating factor) (또는 CSF 3), 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor) (또는 CSF2), IL 17 과(family), IL-10 과, 인터페론, 인터페론 베타-1a, 인터페론 베타-1b, 인터페론 감마, 인터페론 제 I 형, 인터페론 제 II 형, 인터페론 제 III 형, 인터페론-자극 유전자, 인터루킨 1 수용체 길항제, 인터루킨 8, 인터루킨 12, 인터루킨-18, 백혈병 저해 인자(Leukemia inhibitory factor), 백혈구-촉진 인자(Leukocyte-promoting factor), 림포카인(Lymphokine), 림포톡신 (Lymphotoxin), 림포톡신 알파, 림포톡신 베타, 대식세포 콜로니-자극 인자 (CSF1), 대식세포 염증성 단백질, 대식세포-활성 인자, 모노카인(Monokine), 미오카인(Myokine), 미오넥틴(Myonectin), 니코틴아미드 포스포리보실트랜스퍼라제 (Nicotinamide phosphoribosyltransferase) (NAmPRTase 또는 Nampt) (전-B-세포 콜로니-향상 인자 1 (pre-B-cell colony-enhancing factor 1, PBEF1)로도 알려짐), 온코스타틴(Oncostatin) M, 오프렐베킨(Oprelvekin), 혈소판 인자 4, RANKL (Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand) (TNFSF11(tumor necrosis factor ligand superfamily member 11)로도 알려짐), SDF1(stromal cell-derived factor 1) (CXCL12 (C-X-C motif chemokine 12)로도 알려짐), 종양 괴사 인자 알파와 같은 종양 괴사 인자 (TNF) 상과(superfamily), 림포톡신-알파, T 세포 항원 gp39 (CD40L), CD27L, CD30L, FASL, 4-1BBL, OX40L, TRAIL(TNF-related apoptosis inducing ligand), VEGI(Vascular endothelial growth inhibitor) (TL1A (TNF-like ligand 1A)로도 알려짐), XCL1, XCL2, XCR1 일 수 있다. 본 명세서에 명시된 사이토카인은 이후 본 명세서에 개시된 본 발명의 임의의 다른 측면에도 적용될 수 있음을 이해해야 한다.

보다 구체적으로, 일 실시예에서, 종양 괴사 인자 (TNF, 종양 괴사 인자 알파, TNFα 카케신(cachexin) 또는 카케틴(cachectin))는 특히 관심있는 사이토카인이다. 이것은 전신 염증에 관여하며, 급성기 반응을 구성하는 사이토카인 중 하나이다. 이것은 CD4+ 림프구, NK 세포, 호중구(neutrophils), 비만 세포, 호산구 (eosinophils) 및 뉴런과 같은 많은 다른 세포 유형에 의해 생성될 수 있지만, 주로 활성화된 대식세포에 의해 생성된다.

일부 구체적인 실시예에서, 생물학적 표적은 사이토카인일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명에서 특히 관심있는 적어도 하나의 사이토카인은 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)일 수 있다. 보다 구체적인 실시예에서, 생물학적 표적은 인간 TNFα 일 수 있다. 또 다른 일 실시예에서, TNFα는 수탁번호 NP_000585.2로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 일 실시예에서, 본 발명에 의해 사용된 생물학적 표적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간 TNFα 일 수 있다. 또 다른 일 실시예에서, 이러한 인간 TNFα는 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있다. TNF-α에 기인한 생물학적 활성은 전-염증성 사이토카인 (예를 들어, 인터루킨 IL-1 및 IL-6)의 유도, (혈관의 내피층(endothelial layer)의 투과도를 증가시킴으로써) 혈관에서 조직으로의 백혈구 움직임 또는 이동의 향상, 및 접착 분자의 방출의 증가를 포함한다. 일 실시예에서, 본 발명에 의해 사용될 수 있는 TNF-α (이러한 약물의 표적으로 제공됨)에 관한 생물학적 약물은, 본 명세서에 개시된 상기 TNF-α 활성 중 적어도 하나를 차단 및 저해할 수 있음에 유의해야 한다. 따라서, 또 다른 일 실시예에서, 본 발명의 방법에 의해 검출된 nADAs는 본 명세서에서 논의된 TNF-α 활성에 대한 생물학적 약물의 차단 효과를 방지하는 임의의 항체일 수 있다.

따라서, 일부 추가 실시예에서, 본 발명의 방법에 의해 사용된 표적이 적어도 하나의 사이토카인, 구체적으로, TNFα 일 수 있는 경우, 약물은 TNFα에 특이적인 항체일 수 있다. 보다 구체적으로, 약물은 TNFα에 특이적인 단일클론 항체일 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 이러한 항체의 비-제한적인 예는, 인플릭시맙(infliximab), 에타너셉트(etanercept), 아달리무맙(adalimumab), 세르톨리주맙 페골(certolizumab pegol), 골리무맙(golimumab), 이들의 임의의 바이오시밀러 및 이들의 임의의 조합 중 적어도 하나를 포함한다.

보다 구체적인 실시예에서, 이러한 바이오시밀러는 Remsima/INFLECTRA^® (인플릭시맙-dyyb), SB4 에타너셉트, SB2 인플릭시맙 및 SB5 아달리무맙을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

TNF 저해제는 염증 반응의 일부인 종양 괴사 인자 (TNF)에 대한 생리학적 반응을 억제하는 의약품이다. TNF 효과의 저해는 단일클론 항체, 예를 들어 인플릭시맙 REMICADE®, 에타너셉트 ENBREL®, 아달리무맙 HUMIRA®, 세르톨리주맙 페골 CIMZIA®, 골리무맙 SIMPONI®, 및 이들의 임의의 바이오시밀러, 몇 가지만 예를 들면, Remsima/INFLECTRA^® (인플릭시맙-dyyb), SB4 에타너셉트, SB2 인플릭시맙 및 SB5 아달리무맙을 이용하여 달성될 수 있다. 탈리도마이드(Thalidomide) (임뮤노프린(Immunoprin)) 및 이의 유도체인 레날리도마이드(lenalidomide) (레블리미드 (Revlimid)) 및 포말리도마이드(pomalidomide) (포말리스트(Pomalyst), 임노비드 (Imnovid))도 TNF에 대해 활성이다.

일부 구체적인 실시예에서, 본 발명의 방법에 의해 사용된 생물학적 약물은 인플릭시맙일 수 있다. 용어 "인플릭시맙"은 FDA 고유 성분 식별자 (Unique Ingredient Identifier, UNII): B72HH48FLU 및 DRUG BANK 수탁번호 DB00065를 갖는, REMICADE^®로서 시판되는 항-TNF 항체를 나타낸다. 이것은 이량체인, 인간-마우스 단일클론 cA2 경쇄를 갖는 이황화물인, (인간-마우스 단일클론 cA2 중쇄), 면역글로불린 G이다. 보다 구체적으로, 인플릭시맙은 면역-매개 질환, 예를 들어 크론병, 궤양성 대장염, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염(ankylosing spondylitis) 및 류마티스 관절염뿐만 아니라 베체트병 및 기타 질병을 치료하는데 사용된다. 인플릭시맙은 일반적으로 6 내지 8주 간격으로 정맥 내 주입에 의해 투여되지만, 경구로 제공될 수는 없다.

인플릭시맙은 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역과 조합된 마우스 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로 구성되는 정제된 재조합 DNA-유래 키메라 인간-마우스 IgG 단일클론 항체이다. 혈청 반감기는 9.5일이며, 주입 치료 후 8주에 혈청에서 검출될 수 있다.

인플릭시맙은 TNF-α의 가용성 및 막횡단(transmembranal) 형태 둘 다에 높은 친화도로 결합함으로써 TNF-α의 생물학적 활성을 중화시켜 TNF-α와 이의 수용체의 효과적인 결합을 저해한다.

인플릭시맙은 TNF-α에 대해 높은 특이도를 가지며, TNF-α와는 다른 수용체를 사용하는 관련이 없는 사이토카인인 TNF-베타 (TNF-β, 림프톡신 α라고도 함)를 중화시키지 않는다.

TNF-α의 차단된 작용은 추가로 국소 및 전신 전-염증성 사이토카인 (즉, IL-1, IL-6)의 하향 조절, 염증 부위로의 림프구 및 백혈구 이동의 감소, TNF-생산 세포의 아폽토시스의 유도 (즉, 활성화된 단핵구 및 T 림프구), 증가된 수준의 핵 인자-κB 저해제, 및 내피 부착 분자 및 급성기 단백질의 감소를 야기한다. 또한, 인플릭시맙은 활막세포(synoviocytes) 및/또는 연골세포(chondrocytes)에 의해 합성된 조직 분해 효소의 생성을 감쇠시킨다.

또 다른 일부 구체적인 실시예에서, 본 발명의 방법에 의해 사용된 생물학적 약물은 에타너셉트일 수 있다. 용어 "에타너셉트"는 FDA 고유 성분 식별자 (UNII): OP401G7OJC 및 DRUG BANK 수탁번호 DB00005를 갖는, ENBREL^®로서 시판되는 항-TNF 항체를 나타낸다. 에타너셉트는 재조합 DNA에 의해 생성된 융합 단백질이다. TNF 수용체는 하기와 같이 IgG1 항체의 불변 말단에 융합한다: 잔기 1-235는 잔기 236-467-면역글로불린 G1 (인간 γ1-쇄 Fc 단편)을 갖는 종양 괴사 인자 수용체 (인간) 융합 단백질이다. 이것은 150 kDa의 분자량을 갖는 큰 분자이다.

또 다른 구체적인 실시예에서, 본 발명의 방법에 의해 사용된 생물학적 약물은 아달리무맙일 수 있다. 용어 "아달리무맙"은 FDA 고유 성분 식별자 (UNII): FYS6T7F842 및 DRUG BANK 수탁번호 DB00051를 갖는, HUMIRA^®로서 시판되는 항-TNF 항체를 나타낸다. 이것은 이량체인, 인간 단일클론 D2E7 경쇄를 갖는 이황화물인, (인간 단일클론 D2E7 중쇄), 면역글로불린 G1 이다.

또 다른 일부 구체적인 실시예에서, 본 발명의 방법에 의해 사용된 생물학적 약물은 세르톨리주맙 페골일 수 있다. 용어 "세르톨리주맙 페골"은 FDA 고유 성분 식별자 (UNII): UMD07X179E를 갖는, CIMZIA^®로서 시판되는 항-TNF 항체를 나타낸다. 이것은 TNFα에 특이적으로 결합하고 용량-의존적 방식으로 중화시키는 종양 괴사 인자 항체의 폴리에틸렌-글리콜화(polyethylene-glycolated) Fab' 단편이다.

일부 다른 구체적인 실시예에서, 본 발명의 방법에 의해 사용된 생물학적 약물은 골리무맙일 수 있다. 용어 "골리무맙"은 FDA 고유 성분 식별자 (UNII): 91X1KLU43E를 갖는, SIMPONI^®로서 시판되는 항-TNF 항체를 나타낸다. 이것은 이량체인, 인간 단일클론 CNTO 148 카파-쇄를 갖는 이황화물인, (인간 단일클론 CNTO 148 감마1-쇄), 면역글로불린 G1 이다. 이의 분자량은 약 147 kDa 이다.

또 다른 구체적인 실시예에서, 본 발명의 방법에 의해 사용된 생물학적 약물은 우스테키누맙(Ustekinumab)일 수 있다. 용어 "우스테키누맙"은 FDA 고유 성분 식별자 (UNII): FU77B4U5Z0를 갖는, STELARA^®로서 시판되는 IL-12 및 IL-23에 결합하는 인간화 단일클론 항체를 나타낸다. 이것은 이량체인, 인간 단일클론 CNTO 1275 카파-쇄를 갖는 이황화물인, 항-(인간 인터루킨 12 p40 아단위(subunit)) (인간 단일클론 CNTO 1275 감마1-쇄), 면역글로불린 G1 이다. 특정 실시예에서, 본 발명의 방법에 의해 사용된 약물 표적은 임의의 바이오시밀러, 구체적으로, 상기 언급된 기원 생물학적 제제의 임의의 승인된 바이오시밀러일 수 있음을 이해해야 한다.

또 다른 구체적인 실시예에서, 본 발명의 방법에 의해 사용된 생물학적 약물은 에트롤리주맙(Etrolizumab)일 수 있다. 용어 "에트롤리주맙" 또는 "rhuMAb Beta7"은 FDA 고유 성분 식별자 (UNII): I2A72G2V3J를 갖는, 인테그린 α4β7 및 αEβ7의 β7 아단위에 대한 인간화 단일클론 항체를 나타낸다. 이것은 이량체인, 인간-랫트 단일클론 rhuMAb Beta7 경쇄를 갖는 이황화물인, 항-(인간 인테그린 alpha47/인테그린 alphaE7) (인간-랫트 단일클론 rhuMAb Beta7 중쇄), 면역글로불린 G1 이다. 특정 실시예에서, 상기의 임의의 바이오시밀러, 구체적으로, 임의의 승인된 바이오시밀러는 표적으로서 본 발명의 방법에 의해 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 또 다른 일 실시예에서, 본 발명의 방법에 의해 사용된 약물은 인터루킨 23A를 표적하고 중등증 내지 중증(Moderate-to-Severe)의 궤양성 대장염과 같은 염증성 질병을 치료하는데 임상적으로 사용되는 미리키주맙(Mirikizumab) (LY3074828) 일 수 있다. 또 다른 일 실시예에서, 본 발명의 방법은 건선, 크론병 및 건선성 관절염을 포함하여 다수의 염증성 질환의 치료에 임상적으로 사용되는 항-IL-23 항체인 리산키주맙(Risankizumab) (ABBV-066)을 사용할 수 있다.

보다 구체적인 실시예에서, 바이오시밀러는 상기 언급된 기원 생물학적 제제의 임의의 승인된 바이오시밀러일 수 있다.

용어 "바이오시밀러"는 임상적으로 비활성인 성분의 작은 차이에도 불구하고 미국 인가 기준 생물학적 제품과 매우 유사하고, 제품의 안전성, 순도 및 효능의 면에서 생물학적 제품과 기준 제품 간에 임상적으로 의미있는 차이가 없는 생물학적 제품을 의미한다. 또한, 유사한 생물학적 또는 "바이오시밀러" 의약품은 유럽 의약청(European Medicines Agency)에 의해 이미 사용이 허가된 다른 생물학적 의약품과 유사한 생물학적 의약품이다. 용어 "바이오시밀러"는 다른 국가 및 지역 규제 기관에서도 동의어로 사용된다. 생물학적 제품 또는 생물학적 의약품은 박테리아 또는 효모와 같은 생물학적 공급원에 의해 만들어지거나 또는 유래된 의약품이다. 예를 들어, 기준 항-TNF 단일클론 항체가 인플릭시맙인 경우, 인플릭시맙과 관련하여 약물 규제 당국(drug regulatory authorities)에 의해 승인된 항-TNF 바이오시밀러 단일클론 항체는 인플릭시맙의 "바이오시밀러" 또는 인플릭시맙의 "이의 바이오시밀러"이다.

유럽에서, 유사한 생물학적 또는 "바이오시밀러" 의약품은 유럽 의약청 (EMA)에서 이미 사용이 허가된 다른 생물학적 의약품과 유사한 생물학적 의약품이다. 유럽에서 유사한 생물학적 적용에 대한 관련 법적 근거는 규정 (EC) No 726/2004의 제 6 조 및 지침(Directive) 2001/83/EC의 제 10(4) 조이며, 따라서 개정에 따라 유럽에서, 바이오시밀러는 규정 (EC) No 726/2004의 제 6 조 및 지침 2001/83/EC의 제 10(4) 조에 따라 허가되거나, 허가를 위해 승인되거나, 또는 허가 신청의 대상이 될 수 있다. 이미 허가된 최초의 생물학적 의약품은 유럽에서 "기준 의약품"이라고 할 수 있다. 바이오시밀러로 간주되는 제품에 대한 요구 사항 중 일부는 유사 생물학적 의약품에 대한 CHMP 지침에 요약되어 있다. 또한, 단일클론 항체 바이오시밀러에 관한 지침을 포함한 제품별 지침은 EMA에 의해 제품별로 제공된다. 본 명세서에 기재된 바이오시밀러는 품질 특성, 생물학적 활성, 작용 메커니즘, 안전성 프로파일 및/또는 효능, 또는 이들의 임의의 조합에 의해 기준 의약품과 유사할 수 있다. 또한, 바이오시밀러는 기준 의약품과 동일한 질병을 치료하기 위해 사용되거나 또는 사용되도록 의도될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 바이오시밀러는 기준 의약품과 유사하거나 또는 매우 유사한 품질 특성을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 본 명세서에 기재된 바이오시밀러는 기준 의약품과 유사하거나 또는 매우 유사한 생물학적 활성을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 본 명세서에 기재된 바이오시밀러는 기준 의약품과 유사하거나 또는 매우 유사한 안전성 프로파일을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 본 명세서에 기재된 바이오시밀러는 기준 의약품과 유사하거나 또는 매우 유사한 효능을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 유럽에서 바이오시밀러는 EMA에 의해 허가된 기준 의약품과 비교된다. 그러나, 경우에 따라, 바이오시밀러는 특정 연구에서 유럽 경제 지역의 외부에서 허가된 생물학적 의약품과 비교될 수 있다 (비-EEA는 "비교기(comparator)"로 허가됨). 이러한 연구는 예를 들어 특정 임상 연구 및 in vivo 비-임상 연구를 포함한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "바이오시밀러"는 또한 비-EEA 허가된 비교기와 비교되었거나 또는 비교될 수 있는 생물학적 의약품에 관한 것이다. 특정 바이오시밀러는 항체, 항체 단편 (예를 들어, 항원 결합 부분) 및 융합 단백질과 같은 단백질이다. 단백질 바이오시밀러는 폴리펩티드의 기능에 크게 영향을 미치지 않는 아미노산 구조에서 약간의 변형 (예를 들어, 아미노산의 결실, 첨가 및/또는 치환 포함)을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다. 바이오시밀러는 이의 기준 의약품의 아미노산 서열과 97% 이상, 예를 들어 97%, 98%, 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바이오시밀러는, 만일 차이가 의약품의 안전성 및/또는 효능의 변화를 야기하지 않는다면, 하나 이상의 번역-후 변형, 예를 들어 기준 의약품의 번역-후 변형과는 다른 글리코실화, 산화, 탈아미드화 및/또는 절단을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 바이오시밀러는 기준 의약품과 동일하거나 또는 상이한 글리코실화 패턴을 가질 수 있다. 특히, 배타적이지는 않지만, 바이오시밀러는 차이가 기준 의약품과 관련된 안전성 문제를 해결하거나 또는 해결하도록 의도된 경우, 상이한 글리코실화 패턴을 가질 수 있다. 추가로, 바이오시밀러는 만일 의약품의 안전성 및 효능이 손상되지 않는다면, 예를 들어 이의 강도, 제약 형태, 제형, 부형제 및/또는 제시물에서 기준 의약품으로부터 벗어날 수 있다. 바이오시밀러는 기준 의약품과 비교하여 예를 들어 약동학 (PK) 및/또는 약력학 (PD) 프로파일의 차이를 포함할 수 있으나, 여전히 허가되거나 또는 허가에 적합한 것으로 간주되는 기준 의약품과 충분히 유사하다고 간주된다. 특정 상황에서, 바이오시밀러는 기준 의약품과 비교하여 상이한 결합 특성을 나타내며, 상이한 결합 특성은 EMA와 같은 규제 당국에 의해 유사한 생물학적 제품으로서의 허가에 대한 장벽이 아닌 것으로 간주된다. 용어 "바이오시밀러"는 다른 국가 및 지역 규제 기관에서도 동의어로 사용된다.

일부 구체적인 실시예에서, 상기 언급된 생물학적 약물은 염증성 장 질환 (IBD)과 같은 면역-매개 장애의 치료를 위해 개발되었다.

또 다른 일부 구체적인 실시예에서, 본 발명의 방법은 면역-매개 장애를 앓고 있는 피험자에 적용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "면역-관련 장애" 또는 "면역-매개 장애"는 면역계의 활성화 또는 저해를 통해 피험자의 면역계와 관련되거나, 또는 후천적 (adaptive) 또는 선천적 면역 반응과 같은 피험자에서 면역 반응의 특정 성분을 표적함으로써 치료, 예방 또는 진단될 수 있는 임의의 질병을 포함한다. 면역-관련 장애는 만성 염증성 질병, 구체적으로, 염증성 질환, 바이러스 감염, 자가면역 질환, 대사 장애 및 증식성 장애 중 어느 하나, 구체적으로, 암일 수 있다. 일 실시예에서, 면역-매개 장애는 염증성 질환, 자가면역 질환 및 증식성 장애 중 적어도 하나 (구체적으로, 암)일 수 있다. 따라서, 보다 구체적인 실시예에서, 본 발명의 방법은 염증성 장애, 자가면역 질환 및 증식성 질환 중 적어도 하나에 적합하다.

일반적인 용어 "염증성 장애"는 염증이 병원체, 손상된 세포 또는 자극제와 같은 유해한 자극에 대한 주요 반응인 장애와 관련이 있다. 염증은 면역 세포, 혈관 및 분자 매개자뿐만 아니라 장기(long-term) 산화적 스트레스의 최종 결과와 관련된 보호 반응이다.

"염증성 장애"는 광범위한 인간 질환의 기초가 되는 장애의 큰 군이다. 또한, 면역계는 자체의 물질에 대한 유기체의 비정상적인 면역 반응, 또는 알려지지 않은 이유로 염증 과정의 개시에 기인한 염증성 장애, 즉, 각각 자가면역 및 자가-염증성 장애에 관여할 수 있다. 염증 과정에서 병인학적 기원(etiological origin)의 비-면역 질환은 암, 죽상 동맥경화증 및 허혈성 심장 질환을 포함한다.

염증의 목적은 세포 손상의 초기 원인을 제거하고, 괴사 세포와 조직을 제거하며, 조직 복구를 개시하는 것이다. 급성 염증의 전형적인 생리학적 징후는 통증, 열, 발적(redness), 부종(swelling) 및 기능 상실이다. 일련의 생화학적 결과는 국소 혈관계, 면역계 및 손상된 조직 내의 다양한 세포를 포함하는 염증 반응을 전파시키고 성숙시킨다. "만성 염증"으로 알려진 장기간(Prolonged) 염증은 염증 부위에 존재하는 세포 유형의 점진적인 이동을 야기하고, 염증 과정으로부터 조직의 동시 파괴 및 치유를 특징으로 한다. 또한, 염증은 IL-1α, IL-6, IL-8, IFN-γ, TNF-α, IL-17 및 IL-18을 포함하는 전-염증성 사이토카인으로 지정된 높은 전신 수준의 특이적 사이토카인을 유도한다. 염증 반응은 조직에 불필요한 "방관자 (bystander)" 손상을 방지하기 위해 더 이상 필요하지 않을 때 적극적으로 종료되어야 한다. 그렇게 하지 않으면, 만성 염증 및 세포 파괴를 야기한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "염증과 관련된 병리학적 질병"은 하기 중 적어도 하나에 관한 것이나, 이에 한정되지 않는다: 염증성 장 질환 (예를 들어, 크론병, 궤양성 대장염), 관절염 (강직성 척추염, 전신 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus), 류마티스 관절염, 건선성 관절염), 천식, 죽상 동맥경화증, 피부염 및 건선.

보다 구체적인 실시예에서, 본 발명의 방법과 관련된 면역-매개 장애는 염증성 장 질환 (IBD)일 수 있다.

염증성 장 질환 (IBD)은 흔한 위장 장애이며, 점막 면역계의 부적절한 활성화의 결과로 장 손상 및 관련된 장외 증상(extra intestinal manifestations)을 야기하는 것으로 인식될 수 있다. IBD는 대장 및 소장의 염증성 질병의 군이다. IBD의 주요 유형은 크론병 및 궤양성 대장염 (UC)이다. 다른 형태의 IBD는 훨씬 적은 사례를 차지한다. 크론병을 궤양성 대장염과 구별하는 확진(definitive diagnosis)이 불가능한 경우, 이들은 교원성 대장염(collagenous colitis), 림프구성 대장염, 허혈성 대장염, 전환성 대장염(diversion colitis) 및 불확정 대장염 (indeterminate colitis)이다.

크론병과 UC의 주요 차이점은 염증 변화의 위치와 특성이다. 크론병은 대부분의 경우 말단 회장(terminal ileum)에서 시작되지만, 입에서 항문까지 (구역성 병변(skip lesions)), 위장관의 모든 부분에 영향을 미칠 수 있다. 반대로, 궤양성 대장염은 대장 및 직장으로 제한된다. 미시적으로, 궤양성 대장염은 점막 (장의 상피 내벽)으로 제한되는 반면, 크론병은 장 벽 전체에 영향을 미친다. 마지막으로, 크론병 및 궤양성 대장염은 장외 증상 (예를 들어, 간 문제, 관절염, 피부 증상 및 눈 문제)을 다른 비율로 나타낸다. 크론병 및 궤양성 대장염은 설사, 구토, 체중 감량, 발열 및 복통과 같은 동일한 증상을 공유한다.

최근의 가설은 IBD가 기생충 및 벌레와 같은 종래의 표적이 없기 때문에, 소화관의 다양한 조직을 공격하는 과민성(over-active) 면역계에 의해 유발될 수 있다고 가정한다.

IBD와 함께 몇 가지 장외 증상이 있다: 예를 들어, 자가면역 현상, 여기서 면역 복합체는 표적 장기 손상(target organ damage)에 역할을 한다. IBD 환자 (UC만)는 대장 세포의 성분 및 여러 가지 다른 박테리아 항원 (주로 CD)에 대한 항체를 가진다. 이들 항원은 상피 손상의 결과로서 면역계에 접근할 수 있어야 한다.

일부 구체적인 실시예에서, 본 발명의 진단 및 예후 방법에 적용가능한 면역-매개 장애는 염증성 장 질환, 구체적으로, 궤양성 대장염 (UC), 크론병 (CD) 및 불확정 대장염 (IC) 또는 미분류된 IBD (IBDU) 중 어느 하나일 수 있다.

많은 다른 만성 염증성 질환과 마찬가지로, 크론병은 다양한 전신 증상을 야기할 수 있다. 어린이들 사이에서 성장 장애는 흔하다. 많은 어린이들은 성장을 유지할 수 없다는 점에서 먼저 크론병 (소아 크론병)으로 진단받는다. 크론병은 전신 및 위장관 침범 이외에도, 많은 다른 장기계(organ systems)에 영향을 미칠 수 있다. 포도막염(uveitis)으로 알려진 눈의 내부 부분의 염증은, 특히 빛에 노출될 때 (눈부심(photophobia)) 눈의 통증을 야기할 수 있다. 또한, 염증은 상공막염 (episcleritis)이라고 불리는 질병인, 눈의 흰 부분 (공막(sclera))을 포함할 수 있다. 치료하지 않으면, 상공막염 및 포도막염 모두 시력 상실로 이어질 수 있다.

크론병은 혈청음성 척추관절증(seronegative spondyloarthropathy)으로 알려진 류마티스 질환의 유형과 관련이 있다. 이 질환군은 하나 이상의 관절 염증 (관절염) 또는 근육 삽입 염증 (부착부위염(enthesitis))을 특징으로 한다. 관절염은 무릎 또는 어깨와 같은 큰 관절에 영향을 미칠 수 있거나 또는 오로지 손 및 발의 작은 관절과 관련될 수 있다. 또한, 관절염은 척추와 관련될 수 있으며, 전체 척추가 관련된 경우 강직성 척추염을 야기할 수 있고, 하부 척추만 관련된 경우 단순히 천장관절염(sacroiliitis)을 야기할 수 있다. 관절염의 증상은 고통스러운, 화끈거리는, 부어 오른, 뻣뻣한 관절 및 관절 이동성 또는 기능의 상실을 포함한다.

궤양성 대장염은 위장관 내벽의 또 다른 만성 염증이다. 궤양성 대장염은 미국에서 100,000 명당 또는 인구의 0.1% 미만인 35-100 명에서 발생한다. 60년 동안 발생하는 발병률이 두 번째로 높은, 발병 연령에 양봉 분포(bimodal distribution)가 있는 것으로 생각된다. 질환은 남성보다 여성에게 더 많은 영향을 미친다.

궤양성 대장염의 임상 표현(clinical presentation)은 질환 과정의 정도에 달려 있다. 환자는 일반적으로 혈액과 점액이 혼합된 설사를 점진적으로 발병한다. 또한, 이들은 체중 감량, 및 직장 검사시 혈액의 징후가 있을 수 있다. 질환은 일반적으로 가벼운 불편함에서 심하게 고통스러운 경련에 이르기까지, 다양한 정도의 복통을 동반한다.

궤양성 대장염은 일반적으로 대장 (큰 장(large bowel))에 국한되며, 직장은 거의 보편적으로 관여한다. 침범된 대장의 내벽에 염증이 생기고, 고름(pus)을 흘리거나 또는 생성하는 아물지 않은 상처(open sores) 또는 궤양으로 특징지어진다. 또한, 대장에서의 염증은 대장을 자주 비워서 혈액과 혼합된 설사를 야기한다. 궤양성 대장염은 증상이 악화된 기간과 비교적 증상이 없는 기간을 갖는, 간헐적인 질환이다. 궤양성 대장염의 증상은 때때로 저절로 사라질 수 있지만, 질환은 일반적으로 완화(remission)에 들어가기 위해 치료가 필요하다.

궤양성 대장염은 신체의 많은 부분을 침범하는 일반적인 염증 과정과 관련이 있다. 때때로 이러한 관련 장외 증상은 십대의 고통스러운 관절염 무릎과 같은 질환의 초기 징후이다. 그러나, 장 증상이 나타날 때까지, 질환의 존재를 확인할 수 없다.

궤양성 대장염으로 진단된 사람들의 약 절반은 가벼운 증상을 나타낸다. 다른 사람들은 잦은 발열, 혈성 설사(bloody diarrhea), 구역(nausea), 및 중증 복부 경련을 겪는다. 또한, 궤양성 대장염은 관절염 (혈청음성 관절염, 강직성 척추염, 천장관절염), 눈의 염증 (홍채염(iritis), 포도막염, 상공막염), 간 질환 및 골다공증과 같은 문제를 야기할 수 있다. 궤양성 대장염 환자는 면역계에 이상이 있기 때문에, 이러한 합병증은 면역계에 의해 유발된 염증의 결과일 수 있다.

관절염의 경우, 관련된 질병은 예로서, 모든 유형의 원발성 염증성 관절염, 예를 들어, 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염 (이전에 벡테로병 (Bechterew's disease) 또는 벡테로 증후군(Bechterew syndrome)으로 알려짐), 소아 특발성 관절염(juvenile idiopathic arthritis, JIA) 및 통풍 (대사성 관절염)을 포함할 수 있다. 표시된 모든 원발성 형태의 관절염 이외에도, 본 발명의 방법에 의해 진단되고 생물학적 약물에 의해 치료되는 질병은, 모든 이차 형태의 관절염, 예를 들어, 홍반성 낭창, 헤노흐 쉰라인 자반증(Henoch-Schonlein purpura), 혈색소증(haemochromatosis), 간염, 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis) (및 많은 다른 혈관염 증후군(vasculitis syndromes)), 라임병(Lyme disease) 및 가족성 지중해열(familial mediterranean fever)을 포함할 수 있다.

또 다른 일 실시예에서, 본 발명의 방법은 관절염을 앓고 있고 생물학적 약물로 치료받은 피험자와 관련될 수 있다.

다양한 형태의 관절염은 일반적으로 각각 상이한 원인을 갖는 2가지 주요 범주인, 염증성 관절염 및 퇴행성 관절염으로 분류될 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 일부 구체적인 실시예에 따르면, 본 발명의 예후 방법은 구체적으로 염증성 장애, 예를 들어, 염증성 관절염을 앓고 있는 환자, 구체적으로, 적어도 하나의 생물학적 약물로 치료받은 환자의 진단 및/또는 예후를 위해 의도될 수 있다.

염증성 관절염은 활막염(synovitis), 골 침식(bone erosions), 골감소증 (osteopenia), 연조직 부종(soft-tissue swelling) 및 균일한 관절 공간 협착 (uniform joint space narrowing)을 특징으로 한다. 보다 구체적으로, 관절 염증의 특징은 활막염 및 골의 침식이다. 후자는 초기에 얇은 흰색의 연골하 골판 (subchondral bone plate)의 초점 불연속으로 나타난다. 정상적으로, 이 연골하 골판은 중증 골감소증의 경우에도 볼 수 있지만, 이의 불연속성은 침식을 나타낸다. 관절주위 골감소증(periarticular osteopenia) 및 국소 연골하 골감소증(focal subchondral osteopenia)이 진정한 골 침식 전에 나타날 수 있는 것은 사실이지만, 확실한 관절 염증을 나타내는 것은 골 침식의 존재이다. 골 침식이 커짐에 따라, 골성 파괴(osseous destruction)가 골수 공간(medullary space) 내에서 골소주 (trabeculae)로 확장된다. 염증성 관절염의 한가지 중요한 특징은 한계(marginal) 골 침식의 개념과 관련이 있다. 이 용어는 염증이 있는 활막 관절의 가장자리에 위치한 골 침식에 사용된다. 이 특정 위치는 관절 내(intra-articular)이지만 유리질 연골(hyaline cartilage)로 덮여 있지 않은 관절 부분을 나타낸다. 따라서, 초기 관절 염증은 관절면 아래에 연골하 골판의 침식 전에 한계 침식을 일으킬 것이다. 골 침식을 찾을 때, 다양한 골 표면을 프로파일링하기 위해 관절의 다중 보기 (multiple views)가 필수적이다. 염증성 관절 과정의 두 번째 중요한 특징은 균일한 관절 공간 협착이다. 이는 관절 연골의 파괴가 관절 내 공간에서 균일하기 때문에 발생한다. 염증성 관절 질환의 세 번째 결과는 연조직 부종이다.

전신 관절염은 다발성 관절의 침범을 특징으로 하며, 2가지 주요 범주인 류마티스 관절염 및 혈청음성 척추관절증을 포함한다.

또한, 일 실시예에서 본 발명에 적용될 수 있는 류마티스 관절염 (RA)은, 빈혈과 함께 관절 (관절염) 및 건초(tendon sheaths)에 염증 및 조직 손상을 가장 흔하게 야기하는 만성, 전신 자가면역 장애이다. 또한, 폐, 심낭(pericardium), 흉막 (pleura) 및 눈의 공막에서 광범위 염증(diffuse inflammation)을 야기할 수 있으며, 피하 조직에서 가장 흔한 결절성 병변(nodular lesions)도 야기할 수 있다. 이것은 무능하고(disabling), 고통스러운 질병일 수 있으며, 이는 기능성 (functioning) 및 이동성의 실질적인 손실로 이어질 수 있다. 류마티스 인자와 같은 혈청학적 마커(Serologic markers) 및 고리형 시트룰린화 펩티드(cyclic citrullinated peptide)에 대한 항체는 류마티스 관절염의 중요한 지표이다. 류마티스 관절염의 방사선 특징은 관절 염증의 특징이며, 특정 골감소증, 균일한 관절 공간 손실, 골 침식 및 연조직 부종을 포함한다. 염증의 만성적 특성 때문에, 관절 아탈구(joint subluxation) 및 연골하 낭종(subchondral cysts)과 같은 추가 소견이 명백할 수도 있다.

혈청음성 척추관절증 범주에는 건선성 관절염, 반응성 관절염 및 강직성 척추염을 포함하며, 골 증식의 추가된 특징과 함께 염증의 징후, 다발성 관절 침범 및 손과 발의 원위부 침범(distal involvement)으로 특징지어진다.

건선성 관절염은 피부 (건선) 및 관절 (관절염)의 염증을 특징으로 하는 만성 질환이다.

남성과 여성은 건선을 앓을 가능성이 동일하다. 건선성 관절염의 경우, 남성은 (척추가 침범된) 척추염성 형태(spondylitic form)를 가질 가능성이 높으며, 여성은 (많은 관절이 침범될 수 있는) 류마티스 형태를 가질 가능성이 높다. 건선성 관절염은 일반적으로 35-55세의 사람들에게서 발생한다. 그러나, 거의 모든 연령대의 사람들에게서 발생할 수 있다. 건선성 관절염은 여러 다른 관절염 질병, 예를 들어 강직성 척추염, 반응성 관절염, 및 크론병 및 궤양성 대장염과 관련된 관절염과 함께 많은 특징을 공유한다. 모든 이러한 질병은 척추와 관절, 눈, 피부, 입 및 다양한 장기에서 염증을 야기할 수 있다.

강직성 척추염 (AS, 이전에 벡테로병, 벡테로 증후군, 마리-스트럼펠 병 (Marie-Strumpell disease) 및 척추관절염(spondyloarthritis)의 형태로 알려짐)은, 일반적으로 다발성 관절, 특징적으로 척추후관절(spinal facet joints) 및 척추 기저부의 천장골 관절(sacroiliac joints)의 염증으로 인해 야기된, 만성 및 진행성 형태의 관절염이다. 강직성 척추염은 이러한 관절과 척추 주변의 연조직에 침범하는 경향이 있는 반면, 관절을 둘러싼 조직 (힘줄(tendons) 및 인대(ligaments)가 골에 붙어있는 곳인 부착부(entheses))뿐만 아니라 다른 관절에도 침범할 수 있다. 또한, 강직성 척추염은 관절 이외의 신체 부위, 예를 들어 눈, 심장 및 폐를 포함할 수 있다. 이 장애는 종종 골성강직증(bony ankylosis) (또는 융합)을 야기하므로, 용어 강직성(ankylosing)은 그리스어 단어 ankylos에서 유래하여 관절의 뻣뻣함을 의미한다. Spondylos는 척추골(vertebra) (또는 척추(spine))을 의미하며, 하나 이상의 척추골의 염증을 나타낸다.

강직성 척추염은 주로 젊은 남성을 침범한다. 남성은 여성보다 강직성 척추염에 걸릴 확률이 4-10배 더 높다. 이 질환에 걸린 대부분의 사람들은 15-35세에 발병하며, 평균 26세에 발병한다.

또 다른 유형의 혈청음성 척추관절증인 반응성 관절염 (ReA)은 신체의 다른 부분의 감염에 반응하여 발병하는 자가면역 질병이다. 박테리아와 접촉하여 감염이 발생하면, 반응성 관절염을 유발할 수 있다. 류마티즘과 같은 "관절염"으로 통칭되는 다양한 다른 질병과 유사한 증상이 있다. 이것은 다른 감염에 의해 야기되므로, "반응성"이다, 즉 다른 질병에 의존한다. "유발(trigger)" 감염은 종종 만성 질환에서 치료되거나 또는 완화되어 초기 원인을 결정하기 어렵다.

반응성 관절염의 증상은 때때로 연결되지 않은 것처럼 보이는 3가지 증상인, 큰 관절의 염증성 관절염, 눈의 염증 (결막염(conjunctivitis) 및 포도막염) 및 요도염(urethritis)의 조합을 포함한다. ReA는 라이터 증후군(Reiter's syndrome)으로도 알려져 있으며, 요도염성 관절염(arthritis urethritica), 성병성 관절염 (venereal arthritis) 및 다발동맥염성 장염(polyarteritis enterica)으로도 알려져 있음을 나타내어야 한다.

소아 특발성 관절염, 통풍 및 가성통풍(pseudo gout), 및 대장염 또는 건선과 관련된 관절염을 포함한 많은 다른 형태의 염증성 관절염이 있음을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명의 방법은 이러한 질병을 앓고 있는 환자, 특히 생물학적 약물로 치료받은 환자에게도 적용될 수 있음을 이해해야 한다.

보다 구체적으로, 일 실시예에서, 본 발명의 방법은 생물학적 약물로 치료받은, 소아 특발성 관절염 (JIA)을 앓고 있는 피험자에 적용될 수 있다. JIA는 어린이에게서 가장 흔한 형태의 지속성 관절염(persistent arthritis)이다 (이 문맥에서 소아는 16세 이전의 발병을 나타내며, 특발성은 명확한 원인이 없는 질병을 나타내고, 관절염은 관절의 활막의 염증이다). JIA는 어린 시절에 볼 수 있는 관절염의 부분 집합으로, 일시적이고 자기-한정적(self-limited)이거나 또는 만성적일 수 있다. 성인에서 흔히 볼 수 있는 관절염 (류마티스 관절염), 및 만성 질병 (예를 들어, 건선성 관절염 및 강직성 척추염)인 어린 시절에 나타날 수 있는 다른 유형의 관절염과는 크게 다르다.

본 발명의 방법은 임의의 단계 또는 유형의 질환의 상기 논의된 임의의 면역-매개 장애 또는 상기에 상세히 설명된 임의의 증상을 앓고 있는 피험자에 적용될 수 있음을 이해해야 한다.

본 발명의 방법, 장치 및 키트에 사용될 수 있는 생물학적 약물은 본 발명에 의해 개시된 임의의 장애를 치료하는데 사용되는 임의의 생물학적 약물일 수 있음을 더 이해해야 한다.

상기에 나타난 바와 같이, 본 발명에 적용가능한 면역-매개 질환의 부분 집합은 자가면역 질환으로 알려져 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 자가면역 질환은 신체에 정상적으로 존재하는 물질 및 조직에 대한 신체의 부적절한 면역 반응으로부터 발생한다. 다시 말해서, 면역계는 신체의 일부를 병원체로 착각하여 자체 세포를 공격한다. 이는 특정 장기 (예를 들어, 자가면역 갑상선염)으로 제한되거나 또는 다른 장소 (예를 들어, 폐와 신장의 기저막에 침범할 수 있는 굿파스쳐 질환(Goodpasture's disease))의 특정 조직과 관련될 수 있다. 자가면역 질환은 비테브스키의 가설(Witebsky's postulates)에 의해 분류되며, (i) 병원성 항체 또는 병원성 T 세포의 전이로부터의 직접적인 증거, (ii) 실험 동물에서 자가면역 질환의 재생산에 기초한 간접적인 증거 및 (iii) 임상적 단서로부터의 정황 증거 (circumstantial evidence)를 포함한다. 몇 가지만 예를 들면, 본 발명의 방법에 적용가능한 자가면역 질환은 이튼-람베르트 증후군(Eaton-Lambert syndrome), 굿파스쳐 증후군(Goodpasture's syndrome), 그레이브스병(Greave's disease), 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 자가면역 용혈 빈혈(autoimmune hemolytic anemia, AIHA), 간염 (hepatitis), 인슐린-의존성 당뇨병(insulin-dependent diabetes mellitus, IDDM) 및 NIDDM, 전신 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus, SLE), 다발성 경화증 (multiple sclerosis, MS), 중증 근무력증 (myasthenia gravis), 신경총 장애 (plexus disorders) (예를 들어, 급성 완신경염 (acute brachial neuritis)), 다분비선 결핍 증후군(polyglandular deficiency syndrome), 원발성 담즙성 간경변증(primary biliary cirrhosis), 피부경화증 (scleroderma), 혈소판감소증(thrombocytopenia), 갑상선염(thyroiditis) (예를 들어, 하시모토병(Hashimoto's disease)), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 알러지성 자반증(allergic purpura), 건선, 소아 특발성 관절염, 통풍 및 가성통풍 혼합 결합 조직 질환(pseudo gout mixed connective tissue disease), 다발성 근염 (polymyositis), 피부근염(dermatomyositis), 혈관염(vasculitis), 결절성 다발성 동맥염(polyarteritis nodosa), 류마티스성 다발근통(polymyalgia rheumatica), 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis), 베체트 증후군, 천포창(pemphigus), 물집유사천포창(bullous pemphigoid), 포진성 피부염(dermatitis herpetiformis) 및 지방간 질환을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

또 다른 일 실시예에서, 본 발명의 방법은 증식성 장애, 구체적으로, 암일 수 있는 면역-매개 장애를 앓고 있는 피험자에 적용될 수 있다. 본 발명을 기재하기 위해 본 명세서에서 사용된 "암", "종양" 및 "악성 종양"은 모두 조직 또는 장기의 과형성(hyperplasia)과 동등하게 관련된다. 조직이 림프계 또는 면역계의 일부인 경우, 악성 세포는 순환 세포의 비-고형 종양을 포함할 수 있다. 다른 조직 또는 장기의 악성 종양은 고형 종양을 생성할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 방법은 비-고형 종양 및 고형 종양에 적용될 수 있다.

본 발명에서 고려되는 바와 같이, 악성 종양은 암종, 흑색종, 림프종 및 육종으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명에서 유용성을 찾을 수 있는 악성 종양은 혈액학적 악성 종양 (백혈병, 림프종 및 골수증식성 장애 포함), 저형성(hypoplastic) 및 재생 불량성(aplastic) 빈혈 (바이러스 유발 및 특발성), 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndromes), 모든 유형의 부신생물 증후군 (paraneoplastic syndromes) (면역 매개 및 특발성) 및 고형 종양 (폐, 간, 유방, 대장, 전립선, GI 관, 췌장 및 카포시)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 보다 구체적으로, 악성 장애는 간세포 암종, 대장암, 흑색종, 골수종, 급성 또는 만성 백혈병일 수 있다.

일부 다른 실시예에서, 본 발명의 방법이 암을 앓고 있는 피험자에 사용되는 경우, 암 치료에 사용되는 생물학적 약물이 본 명세서에 적용될 수 있음을 이해해야 한다. 암 치료에 사용되는 생물학적 약물의 몇 가지 예는 체크포인트 저해제인 베바시주맙(Bevacizumab) (UNII: 2S9ZZM9Q9V), 세툭시맙(Cetuximab) (UNII: PQX0D8J21J), 파니투무맙(Panitumumab) (UNII: 6A901E312A), 리툭시맙(Rituximab) (UNII: 4F4X42SYQ6), 알렘투주맙(Alemtuzumab) (UNII: 3A189DH42V), 이필리무맙 (Ipilimumab) (UNII: 6T8C155666, Yervoy)과 같은 단일클론 항체, 구체적으로, CTLA-4를 표적하여 면역계를 활성화시키는 단일클론 항체인, 체크포인트 저해제인, CTLA-4에 대한 완전 인간 단일클론 항체인 트라스투주맙(Trastuzumab) (UNII: P188ANX8CK, 이전에 티실리무맙(ticilimumab), CP-675,206), 이브리투모맙 티욱세탄(ibritumomab tiuxetan) (UNII: 4Q52C550XK), 람브롤리주맙(lambrolizumab) (이전에 MK-3475, 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), Keytruda® UNII: DPT0O3T46P), 구체적으로, 예정된 세포 사멸 (PD-1)을 표적하는 인간화 항체인, 체크포인트 저해제인, PD-1의 세포외 도메인을 결합하는 항체의 Fab 단편인 니볼루맙(Nivolumab) (Opdivo® UNII: 31YO63LBSN), 단백질 예정된 세포 사멸-리간드 1 (PD-L1)에 대한 IgG1 동형의 완전 인간화, 조작된 단일클론 항체인 아테졸리주맙(Atezolizumab) (상품명(trade name) Tecentriq), PD-L1을 표적하는 완전 인간 단일클론 항체인 아벨루맙(Avelumab) (상품명 Bavencio), PD-L1과 PD-1 및 CD80 (B7.1) 분자의 상호 작용을 차단하는 인간 면역글로불린 G1 카파 (IgG1κ) 단일클론 항체인 두르발루맙 (Durvalumab), 트레멜리무맙(Tremelimumab) (이전에 티실리무맙; UNII: QEN1X95CIX) 및 아도-트라스투주맙 엠탄신(ado-trastuzumab emtansine) (UNII: SE2KH7T06F); 인터페론 ct-2b (Intron A® UNII: 43K1W2T1M6) 또는 인터페론 P-lb (Betaseron® UNII: TTD90R31WZ)와 같은 치료용 펩티드; 사그라모스팀 (Sargramostim) (Leukine® UNII: 5TAA004E22)과 같은 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자; 알데스류킨(Aldesleukin) (Proleukin® UNII: M89N0Q7EQR)과 같은 IL-2 제품을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

일 실시예에서, 본 발명에 의해 개시된 방법, 장치 및 키트는 본 발명에 의해 개시된 임의의 면역-관련 장애에 적용될 수 있고, 임의의 표시된 장애를 앓고 있고 본 명세서에서 논의된 임의의 면역-관련 장애에 사용되는 생물학적 약물, 구체적으로, 본 발명에 의해 나타낸 임의의 약물로 치료받은 환자의 시료에서 nADAs의 양을 측정하는데 적용될 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본 발명은 본 발명에 의해 개시된 임의의 면역-관련 장애를 앓고 있는 환자의 치료 요법을 결정하는데 적용될 수 있는 예후 방법을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "질환", "장애", "질병" 등은 피험자의 건강과 관련하여 통용되며, 이러한 용어 각각 및 모두에 속하는 의미를 가진다.

통용되는 용어 "연관된" 및 "관련된"은, 본 명세서에서 병리를 언급할 때, 또는 적어도 하나의 질환, 장애, 질병 또는 병리가 이차 질환, 장애, 질병 또는 병리를 야기하는 경우, 질환, 장애, 질병 또는 동시발생 빈도(coincidental frequency)보다 높게 공존하는 공유 인과관계들(share causalities) 중 적어도 하나인 임의의 병리를 의미하는 것으로 이해된다.

본 명세서에 명시된 모든 면역-관련 장애는 이후 본 명세서에 개시된 본 발명의 임의의 다른 측면에도 적용될 수 있음을 이해해야 한다.

본 발명은 적어도 하나의 생물학적 약물로 치료받은 면역-매개 장애를 앓고 있는 피험자에서 수행되는 예후 방법에 관한 것이다. "환자", "개체" 또는 "피험자"는 상기 언급된 질병에 의해 침범될 수 있고, 인간을 포함하여 본 명세서에 기재된 예후 방법이 요구되는 임의의 유기체를 의미한다. 보다 구체적으로, 이후 본 명세서에 기재된 본 발명의 방법, 장치 및 키트는 포유류를 위한 것이다. "포유류 피험자"는 인간, 말(equine), 개(canine) 및 고양이(feline) 피험자, 가장 구체적으로 인간을 포함하여, 제안된 요법이 요구되는 임의의 포유류를 의미한다.

상기 언급된 바와 같이, 피험자는 적어도 하나의 생물학적 약물로 치료된다. 용어 "치료"는 생물학적 약물, 예를 들어 본 명세서에 상세히 기재된 면역-매개 장애로 치료되는 것으로 알려진 질병의 저해, 감소, 완화 및 경감을 포함하여 피험자에게 투여하는 치료적으로 긍정적인 효과의 전체 범위를 나타낸다. 보다 구체적으로, 질환의 재발(relapse) 또는 재현(recurrence)의 치료 또는 예방은 질환의 발병의 예방 또는 연기(postponement), 증상의 발병의 예방 또는 연기 및/또는 발병하거나 또는 발병할 것으로 예상되는 이러한 증상의 중증도의 감소를 포함한다. 이들은 기존 증상의 개선, 추가 증상의 예방 및 증상의 근본적인 대사 원인의 개선 또는 예방을 더 포함한다. 본 명세서에서 언급된 용어 "저해(inhibition)", "절제 (moderation)", "감소(reduction)" 또는 "감쇠(attenuation)"는 약 1% 내지 99.9%, 구체적으로, 약 1% 내지 약 5%, 약 5% 내지 10%, 약 10% 내지 15%, 약 15% 내지 20%, 약 20% 내지 25%, 약 25% 내지 30%, 약 30% 내지 35%, 약 35% 내지 40%, 약 40% 내지 45%, 약 45% 내지 50%, 약 50% 내지 55%, 약 55% 내지 60%, 약 60% 내지 65%, 약 65% 내지 70%, 약 75% 내지 80%, 약 80% 내지 85% 약 85% 내지 90%, 약 90% 내지 95%, 약 95% 내지 99%, 또는 약 99% 내지 99.9% 중 어느 하나에 의한 방법의 지연, 제한 또는 감소와 관련이 있음을 이해해야 한다.

상기와 관련하여, 제공되는 경우, 예를 들어 10%, 50%, 120%, 500% 등과 같은 백분율 값은, 각각 "배수 변화(fold change)" 값, 즉 0.1, 0.5, 1.2, 5 등와 상호 교환 가능하다는 것을 이해해야 한다.

또한, 특정 실시예에 따르면, 본 발명의 방법은 임의의 적당한 생물학적 시료를 사용한다. 본 명세서 및 청구범위에서 용어 " 생물학적 시료 "는 포유류 피험자로부터 얻은 시료를 포함하는 것을 의미한다.

특정 실시예에서, 본 발명의 방법에 적합한 생물학적 시료는 혈청 및 전혈 시료 중 어느 하나, 또는 이의 임의의 분획물 또는 제제일 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명의 방법, 장치 및 키트에 적용가능한 시료는 혈청 시료일 수 있다. 또 다른 일 실시예에서, 본 발명에 의해 사용된 혈청 시료는 시험 대상으로부터 자연적으로 얻어지거나 또는 조작 및 제조될 수 있다. 일 실시예에서, 혈청 시료는 농축된 시료일 수 있다. 또 다른 일 실시예에서, 혈청 시료는 희석될 수 있고, 따라서 상이한 혈청 농도가 사용될 수 있다. 일부 다른 실시예에서, 혈청 농도는 약 0.01 % 내지 100%의 범위, 보다 구체적으로, 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.2%, 0.2%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% or 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85, 90%, 95%, 100% 이상일 수 있다. 보다 구체적인 실시예에서, 혈청 농도는 약 1% 내지 약 20%의 범위일 수 있고, 또 다른 일부 특정 실시예에서, 시료의 혈청 농도는 5% 일 수 있다.

특정 실시예에서, 생물학적 시료는 예를 들어, 혈액 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 골수, 림프액, 소변, 가래(sputum), 타액, 대변, 정액, 척수 또는 CSF; 피부, 호흡기, 장 및 비뇨생식관(genitourinary tracts)의 외부 분비물; 눈물, 우유, 임의의 인간 장기 또는 조직, 세척(lavage)에 의해 얻어진 임의의 시료, 임의로 유방 도관계(breast ductal system), 흉막 삼출액(pleural effusion), in vitro 또는 ex vivo 세포 배양물 및 세포 배양물 성분의 시료일 수 있음을 인식해야 한다. 일부 구체적인 실시예에서, 특히 관심있는 시료는 수유부의 모유(breast milk of nursing mother)일 수 있다. 또 다른 일부 구체적인 실시예에서, 본 발명의 방법에 의해 검사된 생물학적 시료는 타액 시료일 수 있다. 또 다른 일부 구체적인 실시예에서, 생물학적 시료는 소변 시료일 수 있다.

상기에 나타난 바와 같이, 본 발명의 방법의 단계 (b)는 적어도 하나의 표적과 함께 고정된 생물학적 약물의 배양을 포함한다. 일부 구체적인 실시예에서, 그 표적은 검출가능한 부분으로 직접적으로 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 또 다른 일 실시예에서, 표적은 친화도 분자, 예를 들어, 고정된 약물과 관련될 때 표적을 특이적으로 인식하고 결합하는 항체를 이용하여 검출될 수 있다. 이러한 항체 또는 본 명세서에 적용가능한 임의의 다른 친화도 분자는 검출가능한 부분과 직접적으로 또는 간접적으로 관련될 수 있음을 이해해야 한다.

일부 다른 실시예에서, 본 발명의 방법에 의해 사용된 표적과 관련된, 또는 대안적으로, 상기 표적에 특이적인 항체와 관련된 검출가능한 부분은, 검출가능한 신호를 제공하는데 사용될 수 있는, 및 공유 결합 또는 비공유 상호 작용을 통해 (예를 들어, 이온 결합 또는 수소 결합을 통해, 또는 고정화, 흡착 등을 통해) 핵산 또는 단백질에 부착될 수 있는, 임의의 화학적 부분을 나타낼 수 있다. 표지는 일반적으로 형광, 화학 발광, 방사성, 비색법(colorimetry), 질량 분석법, X- 선 회절 또는 흡수, 자성, 효소 활성, 전기화학적 활성 화합물 등 중 적어도 하나에 의해 검출가능한 신호를 제공한다. 일부 구체적인 실시예에서, 검출가능한 부분은 전도성, 전기화학적, 형광성, 화학 발광, 효소적, 방사성, 자성, 금속 및 비색 표지(colorimetric label) 중 적어도 하나, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 본 발명과 관련하여 유용한 표지의 예는, 합텐, 효소, 효소 기질, 조효소, 효소 저해제, 형광단(fluorophores), 소광제(quenchers), 발색단(chromophores), 자성 입자 또는 비드, 산화환원 민감성 부분 (예를 들어, 전기화학적 활성 부분), 발광 마커, 방사성 동위 원소 (방사성 뉴클레오티드 포함), 전도성 물질, 또는 일 실시예에서 전기화학적 검출, 구체적으로, 나노-크기 물질 및 마이크로-크기 물질, 예를 들어 금 나노입자 (GNPs), 탄소 나노튜브 (CNTs), 그래핀 (GR), 자성 입자 (MBs), 양자점 (QDs) 및 전도성 고분자, 바이오바코드(biobarcodes) 및 결합 쌍의 구성원에 적합할 수 있는 전기화학적 물질 중 적어도 하나를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 보다 구체적인 예는 플루오레세인(fluorescein), 피코빌리단백질 (phycobiliprotein), 테트라에틸 로다민(tetraethyl rhodamine) 및 베타-갈락토시다제 중 적어도 하나를 포함한다. 결합 쌍은 비오틴/스트렙타비딘, 비오틴/아비딘, 비오틴/뉴트라비딘(neutravidin), 비오틴/캅타비딘(captavidin), GST/글루타티온, 말토오스 결합 단백질/말토오스, 칼모듈린(calmodulin) 결합 단백질/칼모듈린, 효소-효소 기질, 수용체-리간드 결합 쌍, 및 결합 쌍의 유사체 및 돌연변이체를 포함할 수 있다. 표적 또는 고정된 약물에 결합된 표적을 인식하는 임의의 친화도 분자를 표지하기 위한 태그의 사용도 본 발명에 포함된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 일 실시예에서, 표적은 융합 단백질로서 항체 또는 임의의 다른 친화도 분자에 의해 인식되는 태그를 포함할 수 있다. 이러한 태그의 비-제한적인 예는 His-tag, Flag, HA, myc 등을 포함할 수 있다. 추가 태그는 본 발명의 다른 측면 및 실시예와 관련하여 이후에 본 명세서에 개시된다. 본 명세서에 개시된 검출가능한 부분은 본 발명의 임의의 측면에 적용가능하다는 것을 더 이해해야 한다.

보다 구체적인 실시예에서, 본 발명의 방법의 표적과 관련된 검출가능한 부분은 금 또는 라텍스 표지일 수 있다.

상기에 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명은 사용된 표지에 의해, 및/또는 전극에 전기화학적 신호를 변환 및 임의로 증폭 또는 향상시키기에 적합한 전도성 물질을 더 제공하는 고체 지지체에 의해 제공된, 전기화학적 신호에 기초한 방법, 장치 및 키트를 포함한다. 따라서, 일 실시예에서, 이 시스템은 전기화학적 바이오센서로 정의될 수 있다. 따라서, 일 실시예에서, 본 발명의 방법, 키트 및 장치는 전기화학적 바이오센서에 기초할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "전기화학적 바이오센서"는, 관심있는 분석물 (전도성 물질을 포함하는 검출가능한 부분으로 직접적으로 또는 간접적으로 표지된 표적) 및 인식 과정을 전류측정(amperometric) 또는 전위차(potentiometric) 신호로 변환하기 위한 변환 요소를 표적하는, 이 경우 고정된 약물인 민감성 생물학적 인식 물질로 구성된 분석 장치를 의미한다.

또한, 전기화학적 면역센서는 면역화학적 반응이 변환기(transducer) 표면에서 발생하여 전기화학적 신호를 생성하는 고체-상태 장치에 기초한 친화도 리간드 바이오센서이다. 면역센서 방법론의 개념은 기존의 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)와 유사하지만, 이러한 면역분석법과는 달리, 현대 변환기 기술은 상이한 방식으로 면역 복합체 (항체-항원, 구체적으로, 생물학적 약물 및 이의 표적)의 매우 민감한 측정을 허용한다. 표지-기반 전기화학적 면역센서는 항원 (Ag) 또는 항체 (Ab)에 부착된 검출가능한 부분 또는 마커 (표지)를 필요로 하며, 이 경우는 전자 전달을 달성하기 위한 표적을 필요로 한다. 판독하는 동안, 표지의 양을 검출하고 표적 분석물의 농도에 상응하는 것으로 가정한다.

검출가능한 부분은 그 자체가 전기활성이거나 또는 변환기 표면에 직접 전기활성 생성물을 생성할 수 있다. 또한, 금 나노입자 (GNPs)는 종종 작업 전극 표면을 개질하기 위해 사용된다. 다양한 제제로 분자를 표지하는 것은 결합 결과의 효율에 영향을 미칠 수 있고, 분자-표지 커플링 반응의 수율이 매우 가변적이기 때문에, 표지가 없는 전기화학적 면역센서의 사용은 수년에 걸쳐 점점 인기를 얻고 있으며, 본 발명의 일 실시예에도 포함된다. 전기화학적 임피던스 분광법 (Electrochemical impedance spectroscopy, EIS)은 일반적으로 외부 산화환원 프로브의 추가를 필요로 하는 가장 널리 사용되는 검출 기법이다. 검출가능한 부분으로부터 전극으로의 전자 전달은 전극 표면에서 발생하는 결합 결과에 의해 영향을 받는다.

상이한 종류의 전기화학적 바이오센서는 2가지 주요 하위 부류(subclasses)인 표지-기반(label-based) 및 표지 없는(label free)으로 나눌 수 있다. 이들은 본질적으로 전극 표면을 개질하기 위해 및/또는 고성능 분석 도구를 생성하기 위한 표지로서 사용된, 나노-크기 물질 및 마이크로-크기 물질, 예를 들어 금 나노입자 (GNPs), 탄소 나노튜브 (CNTs), 그래핀 (GR), 자성 입자 (MBs), 양자점 (QDs) 및 전도성 고분자와 결합된 스크린-인쇄 전극 (SPEs)의 사용을 기반으로 한다.

상기에 나타난 바와 같이, 전기화학적-기반 적용에서 본 발명의 방법에 의해 사용된 전도성 물질은 검출가능한 부분 및/또는 고체 지지체로서 사용될 수 있다. 일부 구체적인 실시예에서, GNPs는 본 발명의 방법, 키트 및 장치에서 표지 부분 (검출가능한 부분) 및/또는 고체 지지체로서 사용될 수 있다.

따라서, 일부 구체적인 실시예에서, GNPs는 예를 들어 키토산 하이드로겔 (chitosan hydrogel)과 조합하여 고체 지지체로서 사용될 수 있고, 유리질 탄소 전극을 개질하기 위해 적용되어 복합 필름 (GNPs/Chi)을 형성할 수 있다. 이러한 실시예에서, 생체고분자 키토산은 (양극 전위를 전극에 적용함으로써) 산화될 수 있고, 본 발명의 약물을 고정시키기 위한 플랫폼으로서 사용될 수 있다. 개질된 전극을 시료와 함께 배양한 후, 생물학적 약물 (예를 들어, TNF)의 표적은 본 발명의 방법의 단계 (b)에서 첨가된다. 이러한 표적은 검출가능한 부분, 예를 들어 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)와 같은 효소적 표지로 직접적으로 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 일부 대안적인 실시예에서, HRP는 표적에 대한 항체에 연결될 수 있음에 유의해야 한다. HRP 함유 용액을 첨가할 때, 샌드위치 전기화학적 면역센서가 구축되고, GNPs/Chi의 전도도는 전극, 예를 들어, 유리질 탄소 전극으로의 전자 전달을 촉진시킨다.

또 다른 일부 대안적인 실시예에서, GNPs는 신호를 향상시키기 위해 항체, 즉 고정된 생물학적 약물을 포획하기 위해 탄소-기반 SPE의 표면 상에 전착될 (electrodeposited) 수 있다. 또한, (활성 및 안정성의 관점에서) 약물의 유리한 미세환경(microenvironment)을 생성하기 위해, 이온성 액체가 전극 표면을 개질하는데 사용될 수 있다. 과산화수소 및 티오닌 (환원형)은 HRP 기질로 사용될 수 있으며, 효소적 생성물 (티오닌 산화형)은 환원 피크를 측정하는 순환 전압전류법 (Cyclic Voltammetry, CV)을 통해 검출될 수 있다.

보다 구체적인 실시예에서, 본 발명의 방법, 키트 및 장치에 적합한 생물학적 약물은 DNA 사면체(tetrahedron) (DNATH)로 나노구조화된 금 전극 상에 고정될 수 있고, 표적은 검출기로서 페로센(ferrocene)과 결합될 수 있다 (FeC-Ab). 표적의 농도에 이어 FeC-AbC에서 Fc의 산화에 상응하는 네모파 전압전류 (square wave voltammetric, SWV) 신호의 증가를 측정할 수 있다.

또 다른 일 실시예에서, 항체-변형된 자성 입자와 함께 면역-자성 분리를 이용한 표지-기반 전기화학적 면역-센서에 속하는 몇몇 바이오센서가 본 발명의 방법, 키트 및 장치에 사용될 수 있다.

일 실시예에서, 자성 입자 (MBs)는 생물학적 약물 (즉, TNF)의 표적과 결합 된 GNPs가 검출가능한 부분 (표지)로서 사용될 수 있는, 샌드위치 면역학적 복합체의 고체 지지체로서 사용될 수 있다. 모든 면역학적 단계의 말미에서, 변형된 MBs는 그 아래에 영구 자석을 포함하는 탄소-기반 SPE의 작업 전극 상에 포획될 수 있고; 금의 전기-환원은 차동 펄스 전압전류법(Differential pulse voltammetry, DPV)을 이용하여 측정될 수 있다.

다른 구체적인 실시예에서, 1-5 μm 범위의 마이크로-크기 자성 비드 (MMBs) 또는 100-500 nm 범위의 나노-크기 자성 비드 (MMBs)는, 본 발명의 방법, 키트 및 장치에 적합한 고체 지지체를 코팅하는데 사용될 수 있다.

일부 다른 실시예에서, HRP 검출가능한 부분 (표지)은 GNPs 대신에, 전기화학적 리포터로서 사용될 수 있다. 따라서, 일 실시예에서, 생물학적 약물의 표적은 검출가능한 부분, 예를 들어 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)와 같은 효소적 표지로 직접적으로 또는 간접적으로 표지될 수 있다.

일부 다른 실시예에서, 전기화학적 신호를 증폭시키기 위해 면역-자성 사전-농축 및 산화환원 순환을 포함하는 2 단계 전략이, 본 발명의 방법, 키트 및 장치에 채택될 수 있다. 특히, (고정된 약물에 대한 고체 지지체로서 사용되는) 생물학적 약물로 변형된 MBs는 표적의 분리 및 사전-농축을 위해 사용될 수 있다. 그 다음, 알칼리성 포스파타제 (alkaline phosphatase, ALP)와 결합된 표적을 사용하여 샌드위치 복합체를 형성할 수 있다. 일단 결합 단계가 완료되면, 아스코르브산 2-포스페이트 (ascorbic acid 2-phosphate, AAP) 및 트리(2-카복시에틸) 포스핀 (tri(2-carboxyethyl) phosphine, TCEP)의 혼합물을 MBs에 첨가할 수 있다. ALP는 AAP의 전기활성 아스코르브산 (AA)으로의 전환을 촉매하였고, 효소적 반응 후, 용액을 금 SPE로 옮기고 AA의 산화를 일으킬 수 있다. 그 다음, 산화된 AA는 환원제 TCEP에 의해 다시 환원될 수 있으며, 전극 표면에서 추가적인 신호 생성을 허용한다.

또 다른 일 실시예에서, MBs에 의해 지지되는 샌드위치 면역학적 복합체 및 휴대용 기기에 연결된 (웰의 바닥에 국한된) 몇몇 자화된 SPEs의 스트립의 형성을 포함하고 다중 동시 전류 측정의 측정(multiple simultaneous amperometric measurements)을 허용하는 ELIME (Enzyme-Linked-Immuno-Magnetic-Electrochemical) 분석법은, 본 발명의 방법, 키트 및 장치에서 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 자화된 SPEs의 수는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18 또는 20일 수 있다.

또 다른 일 실시예에서, 생물학적 약물은 이산화 규소-코팅된 자성 Fe₃O₄ 나노입자 상에 고정될 수 있으며, 표적은 금 나노콜로이드 상에 고정될 수 있고 표적에 부착된 검출가능한 부분으로서 EnVision 시약 (EV, 100개 이상의 HRP 및 표적의 분자를 고정시키는 덱스트린 아민 골격)의 공중합체로 검출될 수 있다. DPV 신호는 SPCE (Surface Plasmon Coupled Emission) 표면에서 MNPs-면역복합체를 자성적으로 포획한 후에 모니터링될 수 있다.

일부 다른 실시예에서, 바이오바코드는 본 발명의 방법, 키트 및 장치에 사용될 수 있다. 나노-크기 입자 및 마이크로-크기 입자는 입자를 "판독"할 수 있게 하는 비특이적 올리고뉴클레오티드 가닥으로 기능화될 수 있다. 일 실시예에서, 라텍스 구체(spheres)는 강자성(ferromagnetic) Fe₃O₄ 입자로 변형될 수 있다. 바이오-바코드는 생물학적 약물 및 단일 가닥-DNA 서열로, 고체 지지체로서 사용된 각각의 구체를 변형시킴으로써 형성될 수 있다. 생물학적 약물의 표적은 표적 및 표적에 대한 비오틴-결합된 다클론 항체를 함유하는 웰 플레이트에 바이오-바코드를 첨가함으로써 검출될 수 있다. 샌드위치형 구조의 형성 후, 바이오-바코드는 아비딘-변형된 SPE에서 세척 및 수집될 수 있으며, 전극-국한된 아비딘과 비오틴-태그된 다클론 항체 사이의 상호 작용을 이용함으로써 이들을 SPE 표면에 공유결합될 수 있게 한다. (표적이 없고 비오티닐화된 샌드위치 복합체가 없는) 과량의 바이오-바코드는 씻어낼 수 있다. 마지막으로, Ag 인핸서 용액(enhancer solution)이 SPE 상에 로딩될 수 있고, (항원 농도에 비례하여) 전극 표면에 남아있는 바이오-바코드의 양은 산성 용액에서 Ag+의 차동 펄스 양극 스트립핑 전압전류법 (Differential Pulse Anodic Stripping Voltammetry, DPASV) 측정에 의해 정량화될 수 있다.

일부 다른 실시예에서, 양자점 (QDs)은 본 발명의 방법, 키트 및 장치에서 표지 전략으로서 사용될 수 있다.

일부 특정 실시예에서, CdS, PbS, CuS와 같은 상이한 양자점이 사용될 수 있다. 용해 단계 후, QDs의 금속 성분이 방출될 수 있고, 전류 피크는 높은 민감도 금속 분석을 위해 매우 효과적이고 널리 채택된 기법인 SWASV (Square Wave Anodic Stripping Voltammetry)를 이용하여 얻을 수 있다.

일부 다른 실시예에서, 생물학적 약물은 본 명세서에서 고체 지지체로서 IBM Research에서 처음 개발된 음성 에폭시-기반 감광제를 사용하며 노출된 에폭시 기의 존재로 인해 임의의 전처리 없이 생체분자로 기능화하기에 이상적인, SU-8 기질에 공유결합될 수 있다. 표적은 알칼리성 포스파타제-결합된 이차 항체로 표지될 수 있으며, AP에 의한 p-아미노페닐 포스페이트의 가수분해에 의해 생성된 p-아미노페놀의 산화는 차동 펄스 전압전류법 (DPV)에 의해 측정될 수 있다.

본 발명의 방법은 생물학적 약물로 치료받은 피험자에서 중화 ADAs를 평가하고 측정하기 위한 명확한 전략을 제공한다. 그러나, 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명은 ADAs (피험자에서 중화 및 비-중화 ADAs)의 총량을 평가하는 방법도 제공한다. 따라서, 일 실시예에서, 본 발명의 방법은 시료에서 총 ADAs를 측정하기 위한 추가 단계를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 고체 지지체에 고정된 약물을 갖는, 본 발명의 방법은 특정 실시예에서 항체인 ADAs를 특이적으로 인식하고 결합하나 고정된 약물이 아닌 검출가능한 표지로 표지된 항체를 이용하여 고정된 약물을 결합하는 시료에서 ADAs를 직접 측정할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에서 사용된 약물이 2개의 카파 경쇄를 포함하는 단일클론 항체인 경우, ADAs는 적어도 하나의 람다 경쇄를 포함하는 ADAs에 특이적으로 유도된 항체에 의해 검출될 수 있다. 이러한 경우, 본 발명의 방법은, 임의로 제 2의 검출가능한 부분과 관련된, 항-람다 쇄 항체와 함께 단계 (a) 또는 단계 (b)에 의해 얻어진 배양된 시료를 제공하는 단계, 표지된 항-람다 쇄 항체를 고정된 약물과 함께 배양하는 단계, 및 제 2의 검출가능한 부분의 양을 측정하는 단계에 의해, 생물학적 시료에서 중화 및 비-중화 항-약물 항체의 수준을 측정하는 단계를 더 포함한다. 상기 양은 생물학적 시료에 존재하는 중화 및 비-중화 람다 쇄 ADAs의 수준, 구체적으로, 적어도 하나의 람다 경쇄를 포함하는 ADAs의 수준을 나타낸다. 그러나, 고정된 약물이 2개의 람다 경쇄를 포함하는 단일클론 항체인 경우, 이러한 추가 단계는 적어도 하나의 카파 경쇄를 포함하는 ADAs를 특이적으로 인식하고 결합하는 검출가능한 표지로 표지된 항-카파 항체의 사용을 포함한다.

상기에 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명은 시료에서 nADAs의 측정 이외에, 동일한 피험자의 동일한 시료 또는 다른 시료에서 활성 생물학적 약물의 양을 평가하는 방법도 제공한다. 일 실시예에서, 이러한 추가 평가는 본 발명의 방법에서 사용된 성분들 중 일부, 예를 들어 동일한 표지된 표적을 이용하여 수행될 수 있다. 따라서, 일 실시예에서, 본 발명의 예후 방법은 상기 생물학적 약물로 치료받은 피험자의 생물학적 시료에서 활성 생물학적 약물의 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.

보다 구체적으로, 방법은 하기의 단계를 포함한다:

제 1 단계 (a), 시료를 생물학적 약물에 특이적인 적어도 하나의 비-중화 항체와 함께 배양하는 단계. 비-중화 항체는 고체 지지체에 고정됨에 유의해야 한다. 일 실시예에서, 사용된 시료는 상기 본 명세서에서 논의된 본 발명의 방법에 의해 검사된 동일한 시료일 수 있고, 따라서 본 발명의 방법의 다음 단계일 수 있다. 대안적으로, 동일한 피험자로부터 채취한 임의의 다른 시료 또는 시료의 분취량을 이 추가 분석에 사용할 수 있다. 제 2 단계 (b)는 단계 (a)의 배양된 시료를 상기 생물학적 약물의 표적과 함께 제공하는 단계를 포함한다. 표적은 적어도 하나의 검출가능한 부분과 직접적으로 또는 간접적으로 관련되어 있음에 유의해야 한다. 일 실시예에서, 본 명세서에서 사용된 표적은 본 발명의 방법에서 사용된 동일한 표적, 또는 대안적으로, 새로 추가된 표적일 수 있다.

다음 단계 (c), 검출가능한 부분을 검출하여 표적의 양을 측정하는 단계. 양 또는 표적은 생물학적 시료에 존재하고 고정된 비-중화 항체에 결합된 활성 약물의 수준을 나타내는 것임을 유의해야 한다.

또한, 일부 다른 실시예에서, 본 발명의 방법에 적합한 생물학적 약물은 항-약물 항체, 항-Fc 단편 항체 및 면역글로불린-결합 박테리아 단백질인 단백질 A, G, L 및 이들의 임의의 조합 중 적어도 하나를 통해 고체 지지체 상에 간접적으로 고정될 수 있다.

박테리아 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 세포벽에서 원래 발견된 42 kDa 단백질인, 단백질 A; 단백질 A와 유사하게 군 C 및 G 스트렙토코컬(Streptococcal) 박테리아에서 발현된, 단백질 G; 박테리아 펩토스트렙토코쿠스 마그누스(Peptostreptococcus magnus)의 표면으로부터 분리된, 단백질 L; 및 박테리아 마이코플라스마 제니탈리움(Mycoplasma genitalium)의 세포 표면에서 발견된, 단백질 M.

일부 구체적인 실시예에서, 생물학적 약물은 고체 지지체 상에 직접 고정될 수 있다.

예시에 의해 나타난 바와 같이, 본 발명은 적은 양의 nADAs를 검출하는 민감한 방법을 제공한다. 또 다른 일 실시예에서, 본 발명의 방법은 환자의 혈청에서 약 0.1 내지 약 1000ng/ml, 구체적으로, 약 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100ng/ml 또는 그 이상, 구체적으로, 약 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500ng/ml, 또는 그 이상, 구체적으로, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000ng/ml, 또는 그 이상의 범위의 nADA 농도의 검출을 허용할 수 있다. 보다 구체적인 실시예에서, 본 발명의 방법은 환자의 혈청에서 약 10 내지 500 ng/ml의 범위의 nADA 농도의 검출을 허용할 수 있다. 보다 구체적인 실시예에서, nADA 농도는 환자의 혈청에서 100-200 ng/ml 일 수 있다.

피험자에서 활성 생물학적 약물의 수준을 측정하는 단계는, 생물학적 약물로의 치료의 임상 결과를 예측할 수 있기 때문에, 임상적으로 중요하다. 하기에 기재되는 바와 같이, 본 명세서에서 본 발명은 피험자에서 활성 약물의 수준의 측정에 기초한 예후 방법을 제공한다.

따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 질환 진행 및 질환 재발의 조기 예후를 모니터링하기 위해, 생물학적 약물로 치료받은 피험자의 반응성을 평가 (evaluating) 및/또는 평가(assessing)하기 위한 예후 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 이러한 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:

먼저, 단계 (a)에서, 피험자의 적어도 하나의 생물학적 시료에서 nADA의 수준을 측정함으로써, 시료의 nADA 값을 얻는 단계.

다음으로, 단계 (b)에서, 단계 (a)에서 얻은 nADA 값이 미리측정된 표준 nADA 값 또는 적어도 하나의 대조군 시료에서의 nADA 값에 대해 양성 또는 음성 중 어느 하나인지를 결정하는 단계.

단계 (c)는 피험자를 비-응답자 또는 응답자로 분류하는 단계를 포함한다. 보다 구체적으로, 시료의 양성 nADA 값은, 피험자가 생물학적 약물 치료에 대한 비-반응성과 관련된 미리-확립된 집단에 속한다는 것을 나타낼 수 있다. 그러나, 시료의 음성 nADA 값은, 피험자가 생물학적 약물 치료에 대한 반응성과 관련된 미리-확립된 집단에 속함으로써, 치료 요법에 대한 포유류 피험자의 반응성을 예측, 평가 및 모니터링한다는 것을 나타낼 수 있다.

따라서, 일 실시예에서, 본 발명은 질환 진행 및 질환 재발의 조기 예후를 모니터링하기 위해, 치료 요법에 대한 피험자의 반응성을 평가하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 치료에 대한 반응으로 시료에서 중화 ADA의 값의 변화율을 계산하는 단계를 더 포함할 수 있음에 유의해야 한다. 피험자를 모니터링하는 단계는 이후 본 명세서에서 상세히 설명될 바와 같이, 피험자의 적어도 2 또는 그 이상의 시료에서 nADAs의 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있음에 유의해야 한다.

따라서, 일부 구체적인 실시예에서, 적어도 하나의 생물학적 시료에서 nADA의 수준을 측정하기 위한 본 발명의 예후 방법은 하기의 단계에 의해 수행될 수 있다:

먼저, 단계 (a)에서, 생물학적 시료를 고체 지지체 상에 직접적으로 또는 간접적으로 고정된 생물학적 약물과 함께 배양하는 단계.

다음 단계 (b)에서, 단계 (a)의 배양된 시료를 생물학적 약물의 표적과 함께 제공하고, 표적을 고정된 약물과 함께 배양하는 단계. 상기 언급된 바와 같이, 검출가능한 부분과 관련된 표적은 본 발명의 일 실시예에 있을 수 있음을 이해해야 한다. 또 다른 대안적인 실시예에서, 고정된 약물에 결합된 표적에 특이적으로 결합하는 항체 또는 임의의 다른 친화도 분자가 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 이러한 항체는 적어도 하나의 검출가능한 부분과 직접적으로 또는 간접적으로 관련될 수 있다.

마지막으로, 단계 (c)에서, 고정된 약물에 결합된 표적의 양을 측정하는 단계. 상기 언급된 바와 같이, 이 단계는 표적과 관련된 검출가능한 부분을 검출함으로써, 또는 대안적으로 고정된 약물에 부착될 때 표적을 인식하고 결합하는 임의의 다른 친화도 분자 또는 항체와 관련된 검출가능한 부분을 검출함으로써 완료될 수 있다. 양은 생물학적 시료에 존재하는 nADAs의 수준을 나타낼 수 있다. 일 실시예에서, 결합된 표적의 양은 nADAs의 양과 역 상관 관계에 있다.

표준값 또는 대조값에 대한 "양성" 또는 대안적으로 "음성" nADA 값의 측정은, 일 실시예에서 단계 (a)에서 측정되거나 또는 얻어진 검사된 시료의 nADA 값과, 대조군 시료에 대해 얻어지거나 또는 측정된 nADA 값, 또는 알려진 대조군 (건강한 대조군 또는 동일한 면역-관련 장애를 앓고 있는 피험자 (응답자 또는 비-응답자))으로부터 얻어진 임의의 확립되거나 또는 미리측정된 nADA 값 (예를 들어, 표준값)의 비교를 포함할 수 있음을 이해해야 한다. 일 실시예에서, 생물학적 약물로 치료를 시작하기 전에, 동일한 시험 대상으로부터 얻어진 시료가 대조군 시료로서 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 일 실시예에서, "양성"은 건강한 또는 응답자 대조군, 임의의 다른 적당한 대조군 또는 임의의 다른 미리측정된 표준의 nADA 값과 비교할 때, 약 5% 내지 100% 또는 그 이상, 구체적으로, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%의 높은, 증가된, 상승된, 과생성된 nADA 값을 의미한다. 또한, 일 실시예에서, "음성" nADA 값은 비-응답자 대조군, 임의의 다른 적당한 대조군 또는 임의의 다른 미리측정된 표준의 nADA 값과 비교할 때, 약 5% 내지 100% 또는 그 이상, 구체적으로, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%의 감소된, 낮은, 비-존재(non-existing) 또는 결여의 nADA일 수 있다. 치료 개시 전에 동일한 시험 대상의 시료가 대조군으로 사용될 때, "음성" 결과는 일 실시예에서 치료 개시 전에 (nADAs의 생성이 예상되지 않는 경우) 동일한 피험자의 수준과 비교할 때 감소된, 또는 이러한 대조군에서 nADA 수준의 범위 내의 nADA 수준을 나타낼 수 있음에 유의해야 한다. 대부분의 실시예에서, 치료 개시 전에 nADA가 없음 (또는 거의 없음)이 확인되었다. 즉, 생물학적 약물로 치료할 때, nADA 수준에서 변화가 발생하지 않았다. 따라서, 이러한 피험자는 응답자로 분류될 수 있다. 또 다른 대안적인 실시예에서, 치료 전 동일한 피험자의 수준과 비교할 때 시험된 시료가 "양성"인 경우, 이는 대조군 (예를 들어, 치료 개시 전에 동일한 환자)과 비교할 때 nADA의 수준 (nADA 값)이 상승, 증가 및 향상됨을 의미한다. 이러한 경우, 시험 대상은 비-응답자로 분류될 수 있다.

따라서, 일 실시예에서, 본 발명의 방법의 단계 (b)는 단계 (a)에서 측정되고 얻어진 nADA 값을 적당한 대조군 또는 표준의 nADA 값과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 검사된 시료에서 얻은 nADA 값이 건강한 또는 응답자 대조군과 비교할 때 "양성", 구체적으로, 더 높고, 향상되고, 상승되는 경우, 피험자는 비-반응성인 피험자로 분류된다. nADAs가 존재하는 경우, "양성" nADA 값은 비-응답자로 분류된 대조군 환자의 nADA 값, 또는 비-반응성 환자의 집단에 대해 얻은 임의의 다른 컷오프 값(cut off value)의 범위 내에 있어야 함에 유의해야 한다. 또한, 검사된 시료에서 얻은 nADA 값이 비-응답자 대조군과 비교할 때 "음성", 구체적으로, 더 낮은, 감소된, 비-존재 nADAs 수준, 또는 비-응답자 환자의 집단에 대해 얻은 임의의 다른 컷오프 값으로 측정되고, 피험자는 생물학적 약물 치료에 반응할 수 있는 피험자로 분류된다.

일부 대안적인 또는 임의의 실시예에서, 본 발명의 방법은 추가 해리 단계를 더 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 이러한 해리 단계는 단계 (a) 전에 수행될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 해리 단계는 시험의 성능 또는 정확도를 방해할 수 있는 임의의 복합체를 방출 및/또는 해리하기에 적합한 조건에서 수행되는, 단계 (a)의 배양 전에 생물학적 시료에 적용되는 전처리 단계에 관한 것이다. 일부 구체적인 실시예에서, 이러한 해리 단계는 약물/항-약물 항체 복합체를 방출 또는 해리하여, 고정된 약물에 대한 nADAs의 결합을 용이하게 할 수 있다. 일부 특정 및 비-제한적인 실시예에서, 해리 단계는 시료를 적어도 하나의 해리제로 약 1 내지 30분, 구체적으로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30분 또는 그 이상, 보다 구체적으로, 15분 동안 전처리하는 단계를 포함할 수 있다. 적당한 해리제의 비-제한적인 예는 임의의 산성 물질, 예를 들어 아세트산과 같은 임의의 산, 글리신-HCl 또는 임의의 등가 산에 이어 중화 완충제를 포함한다. 일부 특정 실시예에서, 해리제로서 사용되는 산은 약 10mM 내지 약 1000mM 또는 그 이상의 양으로 존재할 수 있다. 또 다른 일부 구체적인 실시예에서, 사용된 해리제는 약 300 내지 600 mm의 양, 구체적으로, 300mM의 양의 아세트산일 수 있다. 또 다른 일 실시예에서, 글리신-HCl은 구체적으로, 100mM 글리신-HCl의 양의 해리제로서 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 해리 단계 후에, 해리제는 Tris 1M과 같은 중성 완충제의 첨가에 의해 중화될 수 있다.

임의의 분석된 시료는 인적 오류(human error) 및 장비 고장(equipment failures)으로 인해, 의도한 것보다 많거나 또는 적은 생물학적 물질을 함유할 수 있음을 이해해야 한다. 중요한 것은 생물학적 시료와 사용된 모든 대조군에 동일한 오차 또는 편차가 적용된다는 것이다. 따라서, 대조군에 의해 중화 ADA 값의 수준의 나누기는 본질적으로 임의의 기술적 실패 또는 부정확성이 없는 몫(quotient)을 산출하며 (시험 목적으로 시료를 파괴하는 주요 오류는 제외), nADA 수준의 정규화된 식 값(expression value)을 구성한다.

따라서, 일 실시예에서, 표지된 표적 또는 대안적으로 상기 논의된 임의의 다른 성분의 수준을 측정함으로써 시료에서 nADAs의 수준의 측정을 포함하는 본 발명에 의해 기재된 모든 진단 방법은, 정규화 단계를 더 포함할 수 있다. 따라서, 특정 및 구체적인 실시예에서, 본 발명의 방법에 의해 중화 ADA 수준 값을 얻기 위해 생물학적 시료에서 검출가능한 생물학적 약물-표적의 수준을 측정하는 단계는 추가적인 및 임의의 정규화 단계를 더 포함할 수 있다. 일 실시예에 따르면, 본 발명의 중화 ADA 수준의 측정 이외에, 검출가능한 생물학적 표적의 수준은 생물학적 시료와 함께 배양하지 않고, 또는 대안적으로 고체 지지체에 부착된 무관한 (irrelevant) 약물과 함께 배양시 측정될 수 있다.

이러한 실시예에 따르면, 단계 (c)에서 얻은 본 발명의 검출가능한 생물학적 표적의 수준은, 생물학적 시료와 함께 배양하지 않거나, 또는 이러한 추가적인 임의의 단계에서 얻은 고체 지지체에 부착된 비-관련(non-relevant) 약물과 함께 시료의 배양 없이, 검출가능한 생물학적 표적과 같은 음성 대조군에 따라 정규화됨으로써, 정규화된 값을 얻을 수 있다.

임의로, 적용가능한 경우, 미리측정된 표준을 이용하여 유사한 정규화가 수행될 수 있다.

또한, 일 실시예에서, nADA의 수준 (정규화되거나 또는 되지 않음)을 측정한 후, 본 측면에 의해 정의된 것과 같은 임상적 적용성(clinical applicability)을 갖는 예후 방법에서 중요한 단계는, 시험된 시료의 nADA의 값이 표준 집단의 nADA 값 또는 이러한 집단에 대해 미리측정된 컷오프 값의 범위 내에 있는지 여부를 결정할 수 있음을 이해해야 한다. 이 단계는 피험자를 분류하는 단계를 가능하게 한다. 보다 구체적으로, 이 단계는 시료에 대해 계산된 nADA 값이 응답자 집단에 대해 컷오프 값 또는 미리측정된 표준값의 범위 내 (예를 들어, +/- 10%), 또는 대안적으로, 비-응답자 집단의 컷오프 값의 범위 내에 있는지를 결정하는 단계를 포함한다.

보다 구체적으로, 시험된 시료의 nADA 값의 수준은 확립된 집단에 대해 미리측정된 컷오프 값과 비교될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "비교"는 적어도 2개의 상이한 시료 사이의 유사성 또는 차이점을 발견하기 위하여 본 명세서에서 상세하게 설명된 바와 같이 본 발명의 시료에서 얻어진 수준 및/또는 값의 임의의 검사를 의미한다.

본 발명에 따른 비교는 컴퓨터 기반 방법을 사용할 가능성을 포함한다는 점에 유의해야 한다.

상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법은 미리측정된 컷오프 값을 나타낼 수 있다. 본 명세서에서 때때로 간단히 "컷오프"라고 불리는 "컷오프 값"은, 높은 진단 민감도 (진 양성률(true positive rate)) 및 높은 진단 특이도 (진 음성률 (true negative rate)) 둘 다에 대한 요건을 충족시키는 값이라는 점에 유의해야 한다.

일부 특정한 비-제한적인 실시예에서, 진 양성 측정, 즉 nADA를 나타내는 환자 혈청에 상응하는 컷오프 값은 약 50ng/ml 내지 약 100ng/ml, 구체적으로, 약 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 ng/ml, 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 보다 구체적으로, 일 실시예에서, 컷오프는 약 70ng/ml 내지 약 90ng/ml의 범위일 수 있다. 보다 구체적인 실시예에서, 이러한 컷오프는 80 ng/ml 일 수 있다.

보다 구체적으로, 용어 " 민감도 " 및 " 특이도 "는 본 발명의 방법에 의해 검출된 시료에서 nADA 수준의 능력과 관련하여 본 명세서에서 사용되어, 이 시료를 특정 생물학적 약물로의 치료에 대한 반응성 또는 대안적으로, 비-반응성과 관련된 미리-확립된 집단에 속하는 것으로 정확하게 분류한다.

간단히 말해서, 본 명세서에서 사용된 "양성" nADA 값은 향상된 nADA, 상승된 nADA, 높은 nADA 수준 및 심지어 일 실시예에서, 적당하나 기존의 식 nADA 값을 나타내는 높은 nADA 값을 나타낸다. "음성" nADA 값은 억제된(repressed), 낮은, 감소된 또는 비-존재 nADA (nADA의 결여)를 나타낸다. 따라서, 일 실시예에서, nADAs가 생성될 때, 검사된 시료의 "양성" nADA 값은 비-응답자로 분류된 환자로부터 채취한 시료의 nADA 값의 범위 내 또는 그보다 높은 값일 수 있거나, 또는 비-응답자에 대해 계산된 표준 컷오프 값일 수 있다. "음성" 값은 비-응답자 환자의 nADA 값 (또는 표준값, 또는 대조군 시료의 값)보다 낮은 nADA 값일 것이다. 이러한 값은 건강한 또는 응답자 대조군 시료의 값 또는 약물로 치료받았거나 또는 치료받은 피험자 또는 피험자들의 건강한 또는 응답자 집단의 표준값의 범위 내에 있을 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "대조군 시료"는 적어도 하나의 피험자 (건강한, 동일한 면역-관련 장애에 의해 침범되지 않은 피험자, 또는 대안적으로, IBD 환자), 바람직하게는 적어도 6명 이상의 환자의 혼합의 시료를 나타낼 수 있음을 이해해야 한다.

본 발명의 특성은 추가 환자 자료의 축적이 임의의 컷오프 값의 정확도를 개선시킬 수 있으며, 이는 분석용 소프트웨어 프로그램을 이용하여 상기 환자 자료에 따라 생성된 ROC (Receiver Operating Characteristic) 곡선에 기초할 수 있다는 점을 강조해야 한다. 중화 ADA 값의 수준은 가능한 한 100%에 가까운 진단 민감도 및 진단 특이도의 최적의 조합을 위해 ROC 곡선을 따라 선택되며, 결과 값은 치료에 반응하는 피험자, 비-응답자 피험자, 완화 피험자 또는 재발 피험자를 구별하는 컷오프 값으로 사용된다. ROC 곡선은 점점 더 많은 자료 값이 기록되고 고려될 때 변할 수 있으며, 최적의 컷오프 값을 변경하고 민감도 및 특이도를 개선시킨다. 따라서, 임의의 초기 컷오프 값은 더 많은 자료가 보다 정확한 컷오프 값 계산을 허용함에 따라 이동될 수 있는 시작점으로 간주되어야 한다는 것을 이해해야 한다. 또 다른 일 실시예에서, 컷오프 값은 특정 장치로 측정된 음성 혈청에서 발견된 배경에 의존할 수 있다. 또 다른 일 실시예에서, 컷오프 값은 특정 피험자에서 발견된 배경에 의존할 수 있으므로, 동일한 피험자로부터 채취한 이전 시료와 비교될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "표준" 또는 "미리측정된 표준"은 시험된 시료로부터의 중화 ADA의 수준이 비교되는 단일 표준값 또는 다수의 표준을 나타낸다는 것을 이해해야 한다. 표준은, 예를 들어, 이산 수치 값의 형태로 제공되거나, 또는 상이한 양의 결합된 표지된 표적에 대한 상이한 색 또는 음영을 갖는 차트의 형태로 열량 측정될 수 있으며; 또는 이들은 이러한 표준 (표준 곡선)에 기초하여 만들어진 비교 곡선의 형태로 제공될 수 있다.

특정 대안적인 실시예에서, (미리-측정된 컷오프 값 또는 표준 곡선 대신에 또는 이외에) 대조군 시료가 사용될 수 있다. 따라서, 시험 시료에서 본 발명에 의해 검출된 nADA의 값은 대조군 시료의 값과 비교된다. 특정 실시예에서, 이러한 대조군 시료는 건강한 피험자, 동일한 병리학적 장애를 앓고 있는 피험자, 상기 약제로의 치료에 반응하는 피험자 및 비-응답자 피험자 중 적어도 하나로부터 얻어질 수 있다. 일 실시예에서, 동일한 생물학적 약물로 치료를 개시하기 전 또는 치료의 다른 시점으로부터 동일한 시험 대상의 시료도 대조군으로 사용될 수 있음에 유의해야 한다.

따라서, "반응성" 또는 대안적으로 "비-반응성" 피험자에 속하는 것으로 시료의 분류는, 본 발명의 방법에 의해 측정된 nADAs의 값이 반응성 피험자 또는 비-반응성 피험자의 집단의 미리측정된 컷오프 값의 범위 내에 있는지 여부를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 일 실시예에서, 높은 수준의 nADAs는 시험 대상이 비-반응성을 나타낼 수 있음을 나타낼 수 있다. 따라서, 일 실시예에서, 본 명세서에서 정의된 "양성"은, 비-응답성 집단에 대해 측정된 컷오프 값의 범위 내에 있는 (본 발명의 방법에 의해) 계산된 nADAs 값을 갖는 피험자에 대해 측정될 수 있다. 동일한 방식으로, 본 명세서에서 사용된 "음성"은, 응답자 집단에 대해 미리측정된 컷오프 범위 내에 있는 nADA 값을 갖는 피험자이다.

상기에 언급된 바와 같이, 본 발명의 예후 방법은 피험자에서 생물학적 약물로의 치료에 대한 반응성 또는 비-반응성을 예측하는데 사용될 수 있다.

특정 치료에 대한 용어 "반응" 또는 "반응성"은 동일한 병리 (예를 들어, 동일한 유형, 단계, 정도 및/또는 분류의 병리)로 진단된 치료받지 않은 피험자에 비해, 또는 상기 생물학적 약물로 치료하기 전에 동일한 피험자의 임상적 매개변수에 비해, 적어도 하나의 관련 임상적 매개변수의 개선을 나타낸다.

특정 생물학적 약물로의 치료에 대한 용어 "비-응답자"는 임상적 매개변수 중 적어도 하나의 개선을 경험하지 않고 동일한 병리 (예를 들어, 동일한 유형, 단계, 정도 및/또는 분류의 병리)로 진단된 치료받지 않은 피험자와 동일한 질병으로 진단된, 또는 특정 약제로 치료하기 전에 동일한 피험자의 임상적 매개변수를 경험한 환자를 나타낸다. 또 다른 일 실시예에서, 비-응답자는 질환의 진행을 경험하고 따라서 임상적 매개변수가 악화되는 피험자일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "재발"은 과거에 사람에게 침범한 질병, 질환 또는 장애의 재-발생에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 용어는 생물학적 약물, 구체적으로, 본 명세서에서 논의된 인플릭시맙과 같은 단일클론 항체로 치료되는 질환의 재-발생에 관한 것이다. 일 실시예에서, IBD 환자의 경우 재발은 임상 증상, 구체적으로, 설사, 구토, 체중 감량, 발열, 복통, 또는 본 발명에 의해 개시된 임의의 임상 증상 중 적어도 하나의 징후를 포함할 수 있다.

본 발명의 방법이 질환 진행을 모니터링하기 위해 사용되는 경우, 피험자로부터 적어도 2개의 시료가 얻어질 수 있다. 이들 시료는 상이한 시점으로부터, 예를 들어 치료 전 및 후에, 또는 치료 동안 두 시점 사이에서 얻어질 수 있다. 상이한 시점의 이러한 시료는 본 명세서에서 " 일시적으로 분리된 시료 "로 정의될 수 있다.

따라서, 특정 실시예에서, 질환 진행을 모니터링하기 위해 본 발명의 예후 방법은 추가적인 하기의 단계를 포함할 수 있다:

단계 (d)에서, 단계 (a) 내지 (c)를 반복하여 적어도 하나 이상의 일시적으로 분리된 시료에 대한 nADA 값을 얻는 단계.

단계 (e)는 일시적으로 분리된 시료들 사이의 nADA 값의 변화율을 계산하는 단계를 포함한다.

마지막으로 단계 (f)에서, 단계 (e)에서 얻은 변화율 값이 미리측정된 표준 변화율 값 또는 적어도 하나의 대조군 시료에서 nADA에 대해 계산된 변화율 값에 대해 양성 또는 음성인지를 결정하는 단계. 다시 말해서, 적어도 2개의 시점에서 채취한 적어도 2개의 시료를 비교할 때, 치료 동안 nADA 값의 임의의 변화가 있는지를 결정하는 단계.

일 실시예에서, 양성 변화율 값은, 피험자가 치료 또는 재발에 대한 반응 상실 (LOR), 부적절한 반응, 불내증 중 적어도 하나와 관련된 미리-확립된 비-반응성 집단에 속함으로써, 질환 진행을 모니터링하거나 또는 질환 재발에 대한 조기 예후를 제공함을 나타낼 수 있다. 보다 구체적으로, "양성" 변화율은 치료 동안 상이한 시점들 사이에서 비교될 때, 시료에 대해 측정된 nADA 값의 약 5% 내지 100% 또는 그 이상, 구체적으로, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 또는 그 이상의 증가, 상승 또는 향상을 나타낼 수 있다. 이러한 증가, 또는 다시 말해서, "양성" 변화율은 치료 또는 재발에 대한 비-반응성, LOR, 부적절한 반응, 불내증을 나타낼 수 있다. 일 실시예에서, 계산된 변화율은 건강한 또는 응답자 대조군, 또는 대안적으로, 비-응답자 대조군 또는 임의의 다른 미리측정된 표준에 대해 계산된 변화율과도 비교될 수 있음에 유의해야 한다. 양성 변화율의 경우, 일 실시예에서, 이러한 변화율은 비-응답성 대조군 또는 표준값에 대해 측정된 변화율의 범위 내에 있거나 또는 높을 수 있다. 또 다른 일 실시예에서, "음성" 변화율은 치료 (일시적으로 분리된 시료) 사이에서 nADA 값의 약 5% 내지 100% 또는 그 이상, 구체적으로, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 또는 그 이상의 감소를 나타낼 수 있으므로, 피험자의 반응성을 나타낼 수 있다. 이러한 음성 변화율은 건강한 또는 응답자 피험자로부터 얻은 대조군 시료의 변화율, 또는 응답자에 대한 표준값의 범위보다 낮거나 또는 그 범위 내일 수 있다.

상기에 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 특정 생물학적 약물로 치료시 본 발명의 중화 ADA의 반응을 평가하고 수준의 변화율을 측정하기 위하여, 적어도 2개의 "일시적으로-분리된" 시험 시료를 치료받은 환자로부터 수집하고, 이후 중화 ADA의 수준의 변화율을 얻기 위하여 비교되어야 한다. 실제로, 중화 ADA의 수준의 변화를 검출하기 위해, 적어도 2개의 "일시적으로-분리된" 시험 시료, 바람직하게는 더 많은 시료를 환자로부터 수집해야 한다.

그 다음, 중화 ADA의 수준은 각 시료에 적용된 본 발명의 방법을 이용하여 측정된다. 상기에 상세히 설명된 바와 같이, 변화율은 상이한 시점 또는 시간 간격으로 동일한 환자로부터 얻은 2개의 값 사이의 비를 측정함으로써 계산된다.

" 시간 간격 "이라고도 하는, 이 기간 또는 시점 간의 차이 (각 시점은 특정 시료가 수집된 때의 시간임)는 의료진에 의해 적절하다고 간주되고 환자의 특정 요구 사항 및 환자의 임상 상태에 따라 필요에 따라 변경되는 임의의 기간일 수 있다. 본 발명에 관련된 시간 간격에 대한 비-제한적인 예는 실시예 2에 개시되어 있다 (표 2 참조). 예를 들어, 이 간격은 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4주, 적어도 5주, 적어도 6주, 적어도 7주, 적어도 8주, 적어도 9주, 적어도 10주, 적어도 11주, 적어도 12주, 적어도 13주, 적어도 14주, 적어도 15주, 적어도 16주, 적어도 17주, 적어도 18주, 적어도 19주, 적어도 20주, 적어도 21주, 적어도 22주, 적어도 23주, 적어도 24주, 적어도 25주, 또는 그 이상일 수 있다. 또 다른 일 실시예에서, 시간 간격은 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년, 또는 그 이상의 기간을 포함할 수 있다.

보다 구체적으로, 특정 약제로 치료하기 전에 검사 대상으로부터 하나의 시료를 수득해야 한다. 본 명세서에 사용되기 전은 제 1 시점이 치료 개시 전의 임의의 시점, 이상적으로 치료 개시 전 몇 초 또는 몇 분임을 의미한다. 그러나, 시간, 일, 주, 개월 또는 년을 포함하여, 치료 개시 전의 임의의 시점은 이 방법에 유용할 수 있고 따라서 본 발명에 포함된다는 점에 유의해야 한다. 제 2 시점은 치료 개시 후 초, 분, 시간, 일, 주, 개월 또는 심지어 년 후에 동일한 환자로부터 수집된다. 보다 구체적으로, 치료 개시 후 적어도 1초, 적어도 1분, 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 3시간, 적어도 4시간, 적어도 6시간, 적어도 10시간, 적어도 12시간, 적어도 24시간, 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일, 적어도 11일, 적어도 12일, 적어도 13일, 적어도 14일, 적어도 15일, 적어도 16일, 적어도 17일, 적어도 18일, 적어도 19일, 적어도 20일, 적어도 21일, 적어도 22일, 적어도 23일, 적어도 24일, 적어도 25일, 적어도 26일, 적어도 27일, 적어도 28일, 적어도 29일, 적어도 30일, 적어도 31일, 적어도 32일, 적어도 33일, 적어도 40일, 적어도 50일, 적어도 60일, 적어도 70일, 적어도 78일, 적어도 80일, 적어도 90일, 적어도 100일, 적어도 110일, 적어도 120일, 적어도 130일, 적어도 140일 또는 적어도 150일 또는 그 이상 일에 동일한 환자로부터 수집된다.

일 실시예에서, 제 2 시점은 치료 개시 후 1시간 내지 30개월 사이에 얻어질 수 있다. 일부 다른 실시예에서, 제 2 시점은 치료 개시 후 1주 내지 54주이다. 다른 실시예에서, 제 2 시점은 치료 개시 후 2주 내지 22주 사이에 얻어질 수 있다. 또 다른 일 실시예에서, 상이한 시점은 치료 개시 후 2, 6, 14, 22 및 54주를 포함할 수 있다.

또한, 일 실시예에서, 제 1 시료는 처리 개시시 (시간 "0"), 생물학적 약물의 적용 직전 또는 치료 개시 직후에 얻어질 수 있으며, 여기서 적어도 하나의 시료는 상기 논의된 바와 같이 치료 개시 후에 얻어질 수 있다. 일 실시예에서, 시점 "0"의 시료는 임의의 치료 요법에 노출되지 않았던 순수한 환자로부터 얻어질 수 있다. 다른 실시예에서, 시점 "0"의 시료는 과거에 치료되었지만 동일한 치료법으로 치료되지 않은 환자로부터 얻어질 수 있다. 또한, 시점 "0" 시료는 동일한 치료 요법으로 과거에, 예를 들어, 현재 치료 1년 전, 6개월 전, 5개월 전, 4개월 전, 3개월 전, 2개월 전, 1개월 전, 3주 전, 2주 전, 또는 모니터링된 치료 1주 전에 치료되었던 환자로부터 얻어질 수 있다.

실제로, 특정 치료에 대한 반응을 평가하기 위해, 예를 들어, 치료 개시 후 2개의 상이한 시점에서 적어도 2개의 시험 시료, 바람직하게는 더 많은 시험 시료를 치료받은 환자로부터 수집해야 한다. 중화 ADA의 수준은 각 시료에 적용된 본 발명의 방법을 이용하여 측정된다. 중화 ADA의 수준의 변화율은 상이한 시점 또는 시간 간격으로 동일한 환자로부터 얻은 2개의 값을 나눠서 계산하고 측정한다.

치료 시작 값을 치료 후의 값으로 나누는 것 및 그 반대도 가능함을 유의해야 한다. 명확성을 위해, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 변화율은 시간 간격의 후반 시점에서 얻은 값을 초기 시점 (예를 들어, 치료 개시 전)에서 얻은 값으로 나눌 때 얻어진 비로 나타낸다.

예를 들어, 이 간격은 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 1년, 또는 그 이상일 수 있다. 아마도, 제 2 시점은 생물학적 약물 치료에 대한 환자의 반응 평가에 관한 유용한 정보를 제공할 수 있는 초기 시점에서 얻어진다.

이해되는 바와 같이, 예를 들어 상기에 상세히 설명된 미리-확립된 집단에 대해 계산된 미리측정된 변화율은 건강한 대조군, 상기 약제, 구체적으로, 생물학적 약물에 대한 응답자 및 비-응답자를 포함하여 개체의 집단으로부터 얻어진, 낮은 값 및 높은 값을 갖는 변화율의 범위를 포함한다. 따라서, 전체 시험된 집단으로부터 반응성 환자의 하위 군(subgroup)을 얻을 수 있다. 이러한 미리-확립된 반응성 집단에서, 낮은 값은 낮은 반응을 특징으로 할 수 있는 반면, 높은 값은 규칙적인 임상 평가에 의해 나타난 바와 같이 높은 반응과 관련될 수 있다. 따라서, 치료에 대한 반응성을 평가하는 것 이외에, 변화율은 반응성의 정도에 대한 통찰력을 제공할 수 있다. 예를 들어, 그 값이 높은 값에 가까울수록 계산된 변화율은 낮은 반응을 나타낼 수 있으므로 환자가 반응성이 있는 것으로 간주되지만, 투여량 또는 투여 빈도의 증가가 고려될 수 있다. 대안적으로, 그 값이 낮은 값에 가까울수록 계산된 변화율은 때때로 완화로 이어지는 경우에도 높은 응답을 나타낼 수 있으므로, 치료의 유지가 고려될 수 있다.

명확성을 위해, 반응성과 관련된 미리-확립된 집단을 언급할 때, 특정 약제, 구체적으로, 본 발명의 생물학적 약물로 치료받은 통계적으로 의미있는 환자군이 본 명세서에 개시된 바와 같이 분석되었고, 중화 ADA 값 (및 임의로 다른 환자 임상적 매개변수)의 수준 및 이러한 치료에 대한 반응성 사이의 상관 관계가 계산되었음을 의미한다. 집단은 임의로 다른 환자 매개변수, 예를 들어 성별 및 연령에 따라 하위-집단으로 더 나뉠 수 있다.

또 다른 일 실시예에서, 본 발명의 예후 방법에 의해 사용된 생물학적 약물은 생물학적 표적에 대한 항체일 수 있다.

특정 실시예에서, 본 발명의 예후 방법의 생물학적 표적은 사이토카인일 수 있다.

보다 구체적인 실시예에서, 본 발명의 예후 방법에 의해 사용된 생물학적 약물의 생물학적 표적은 적어도 하나의 사이토카인, 구체적으로, TNFα 일 수 있다. 이러한 경우, 일 실시예에서, 약물은 TNFα에 특이적인 적어도 하나의 항체일 수 있다. 일부 특정 실시예에서, 본 발명의 예후 방법에 의해 사용된 생물학적 약물은 TNFα에 특이적인 단일클론 항체, 구체적으로, 인플릭시맙, 에타너셉트, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골, 골리무맙, 및 이들의 임의의 바이오시밀러 및 이들을 포함하는 임의의 조합 중 적어도 하나일 수 있다.

다른 측면과 관련하여 본 발명에 의해 개시된 임의의 생물학적 약물 또는 임의의 바이오시밀러가 현재 측면에도 적용될 수 있음을 이해해야 한다.

다른 실시예에서, 본 발명의 예후 방법의 피험자는 면역-매개 장애를 앓을 수 있다. 일 실시예에서, 면역-매개 장애는 염증성 질환, 자가면역 질환 및 증식성 장애 중 적어도 하나 (구체적으로, 암)일 수 있다. 일 실시예에서, 본 발명의 예후 방법의 면역-매개 장애는 IBD 일 수 있다. 또 다른 일 실시예에서, 본 발명의 예후 방법은 IBD에 관한 것이며, 여기서 IBD는 UC, CD 및 IC (또는 IBDU) 중 어느 하나를 나타낼 수 있다. 다른 측면과 관련하여 본 발명에 의해 개시된 임의의 면역-관련 장애가 현재 측면에도 적용할 수 있음을 이해해야 한다.

일 실시예에서, 본 발명의 방법에 의해 사용된 표적은 적어도 하나의 검출가능한 부분과 직접적으로 또는 간접적으로 관련된다. 또 다른 일 실시예에서, 검출가능한 부분은 형광성, 화학 발광, 효소적, 방사성, 자성 및 비색 표지 중 적어도 하나일 수 있다. 보다 구체적인 실시예에서, 본 발명의 방법에 의해 사용된 검출가능한 부분은, 합텐, 효소, 효소 기질, 조효소, 효소 저해제, 형광단, 소광제, 발색단, 자성 입자 또는 비드, 산화환원 민감성 부분 (예를 들어, 전기화학적 활성 부분), 발광 마커, 방사성 동위 원소 (방사성 뉴클레오티드 포함), 전도성 물질, 구체적으로, 나노-크기 물질 및 마이크로-크기 물질, 예를 들어 금 나노입자 (GNPs), 탄소 나노튜브 (CNTs), 그래핀 (GR), 자성 입자 (MBs), 양자점 (QDs) 및 전도성 고분자, 바이오바코드 및 결합 쌍의 구성원일 수 있다.

또 다른 일 실시예에서, 본 발명의 예후 방법에 적합한 생물학적 시료는 혈청 및 전혈 시료 중 어느 하나 또는 이의 임의의 분획물 또는 제제, 또는 본 발명의 이전 측면과 관련하여 상기 본 명세서에 개시된 임의의 시료일 수 있다.

특정 실시예에서, 본 발명의 예후 방법의 단계 (b)에서 사용된 표적과 관련된 검출가능한 부분은 금, 라텍스 표지 또는 대안적으로 상기 본 명세서에 개시된 임의의 다른 검출가능한 부분일 수 있다. 그러나, 본 발명은 표적을 특이적으로 인식하고 결합하는 항체 또는 임의의 다른 친화도 분자의 사용을 더 포함한다는 것을 이해해야 한다. 이들 항체 또는 임의의 다른 친화도 분자는 금, 라텍스 표지 또는 상기 본 명세서에 개시된 임의의 다른 검출가능한 부분으로 직접적으로 또는 간접적으로 표지될 수 있다.

상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 방법은 생물학적 약물로 치료받은 피험자에서 중화 ADAs의 평가를 제공한다. 그러나, 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명은 ADAs (피험자에서 중화 및 비-중화 ADAs)의 총량을 평가하는 방법을 더 제공할 수 있다. 따라서, 일 실시예에서, 본 발명의 방법은 시료에서 총 ADAs를 측정하기 위한 추가 단계를 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 고체 지지체에 고정된 약물을 갖는, 본 발명의 방법은 ADAs를 특이적으로 인식하고 결합하나 고정된 약물이 아닌 검출가능한 표지로 표지된 항체를 이용하여 고정된 약물을 결합하는 시료에서 ADAs를 직접 측정할 수 있다.

따라서, 일 실시예에서, 본 발명의 예후 방법의 약물이 2개의 카파 경쇄를 포함하는 단일클론 항체인 경우, 상기 방법은 적어도 하나의 람다 경쇄를 포함하는 임의의 ADA의 검출을 더 허용할 수 있다. 이러한 실시예에서, 본 발명은 임의로 제 2의 검출가능한 부분과 관련된, 항-람다 쇄 항체와 함께 단계 (a) 또는 단계 (b)의 배양된 시료를 제공하는 단계, 표지된 항-람다 쇄 항체를 고정된 약물과 함께 배양하는 단계, 및 제 2의 검출가능한 부분의 양을 측정하는 단계에 의해, 생물학적 시료에서 중화 및 비-중화 항-약물 항체의 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 항-람다 쇄 항체는 고정된 약물에 결합된 (적어도 하나의 람다 경쇄를 갖는) 임의의 ADA를 인식하고 결합할 것이다. 검출가능한 표지의 양은 생물학적 시료에 존재하는 중화 및 비-중화 람다 쇄 ADAs의 수준을 나타낸다. 그러나, 고정된 약물이 2개의 람다 경쇄를 포함하는 단일클론 항체인 경우, 이러한 추가 단계는 적어도 하나의 카파 경쇄를 포함하는 ADAs를 특이적으로 인식하고 결합하는 검출가능한 표지로 표지된 항-카파 항체의 사용을 포함한다. 본 명세서에서 언급된 카파 경쇄 또는 람다 경쇄는 면역글로불린 경쇄에 관한 것으로 이해되어야 한다.

또 다른 일 실시예에서, 본 발명의 예후 방법의 생물학적 약물은 항-약물 항체, 항-Fc 단편 항체 및 면역글로불린-결합 박테리아 단백질인 단백질 A, G, L 및 이들의 임의의 조합 중 적어도 하나를 통해 고체 지지체 상에 간접적으로 고정될 수 있다.

일부 다른 대안적인 구체적인 실시예에서, 생물학적 약물은 고체 지지체 상에 직접 고정될 수 있다. 다른 측면과 관련하여 본 발명에 의해 개시된 고체 지지체 및 검출가능한 부분의 임의의 조합뿐만 아니라 임의의 고체 지지체는 현재 측면에도 적용할 수 있다는 것을 이해해야 한다.

시료에서 nADAs에 관한 정보를 제공함에 따라, 본 발명은 시료에서 결합된 활성 생물학적 약물이 측정되는 경우, 본 발명은 이의 일 실시예에서 고정된 표적에 기초한 예후 방법의 대안적인 또는 추가적인 버전을 더 제공할 수 있다. 두 버전에서 얻은 정보를 비교하고 임상적 의의(clinical significance)를 개선시킬 수도 있다.

따라서, 특정 실시예에서, 본 발명의 예후 방법은 생물학적 약물로 치료받은 피험자의 생물학적 시료에서 활성 생물학적 약물의 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 이러한 추가 평가는 본 발명의 방법에서 사용된 성분들 중 일부, 예를 들어 동일한 표지된 표적을 이용하여 수행될 수 있다. 보다 구체적으로, 이러한 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다: 제 1 단계 (a), 시료를 생물학적 약물에 특이적인 적어도 하나의 비-중화 항체와 함께 배양하는 단계. 비-중화 항체는 고체 지지체에 고정됨에 유의해야 한다. 일 실시예에서, 사용된 시료는 상기 본 명세서에서 논의된 본 발명의 방법에 의해 검사된 동일한 시료일 수 있고, 따라서 본 발명의 방법의 다음 단계일 수 있다. 대안적으로, 동일한 피험자로부터 채취한 임의의 다른 시료 또는 시료의 분취량을 이 추가 분석에 사용할 수 있다. 제 2 단계 (b)는 단계 (a)의 배양된 시료를 상기 생물학적 약물의 표적과 함께 제공하는 단계를 포함한다. 표적은 적어도 하나의 검출가능한 부분과 직접적으로 또는 간접적으로 관련되어 있음에 유의해야 한다. 일 실시예에서, 본 명세서에서 사용된 표적은 본 발명의 방법에서 사용된 동일한 표적, 또는 대안적으로, 새로 추가된 표적일 수 있다.

다음 단계 (c), 검출가능한 부분을 검출하여 표적의 양을 측정하는 단계. 양 또는 표적은 생물학적 시료에 존재하고 고정된 비-중화 항체에 결합된 활성 약물의 수준을 나타내는 것임을 유의해야 한다.

또 다른 일 실시예에서, 본 발명의 예후 방법의 생물학적 약물은 생물학적 표적에 대한 항체일 수 있고, 생물학적 표적은 본 발명에 의해 개시된 임의의 분자일 수 있으며, 일부 구체적인 실시예에서, 생물학적 표적은 적어도 하나의 사이토카인일 수 있다. 또 다른 일부 구체적인 실시예에서, 이러한 표적은 종양 괴사 인자 알파 (TNFα) 중 적어도 하나일 수 있다.

특정 실시예에서, 본 발명의 예후 방법의 약물은 사이토카인, 구체적으로, TNFα에 특이적인 항체일 수 있다. 보다 구체적인 실시예에서, 이러한 약물은 TNFα에 특이적인 단일클론 항체일 수 있다. 이러한 약물의 비-제한적인 예는 인플릭시맙, 에타너셉트, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골, 골리무맙, 임의의 바이오시밀러 및 이들의 조합 중 적어도 하나일 수 있다.

특정 실시예에서, 바이오시밀러는 상기 언급된 기원 생물학적 제제의 임의의 승인된 바이오시밀러일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 질환 진행 및 질환 재발의 조기 예후를 모니터링하기 위해, 생물학적 약물로 치료받은 피험자의 반응성을 예측하고 평가하기 위한 예후 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:

단계 (a)에서, 피험자의 적어도 하나의 생물학적 시료에서 적어도 하나의 생물학적 약물의 적어도 하나의 생물학적 표적의 수준을 측정하는 단계. 일 실시예에서, 생물학적 시료는 생물학적 약물로 치료 개시 전에 얻어질 수 있다. 이 단계에서, 생물학적 표적의 수준을 계산하여 시료의 표적 값을 얻는다.

다음 단계 (b)에서, 단계 (a)에서 얻은 표적의 값이 미리측정된 표준 표적 값 또는 적어도 하나의 대조군 시료에서의 표적 값에 대해 양성 또는 음성 중 어느 하나인지를 결정하는 단계.

단계 (c)는 피험자를 비-응답자 또는 응답자로 분류하는 단계를 포함한다. 보다 구체적으로, 시료의 양성 표적 값은, 피험자가 생물학적 약물 치료에 대한 반응성과 관련된 미리-확립된 집단에 속한다는 것을 나타낸다. 그러나, 시료의 음성 표적 값은, 피험자가 생물학적 약물 치료에 대한 비-반응성과 관련된 미리-확립된 집단에 속함으로써, 치료 요법에 대한 포유류 피험자의 반응성을 예측, 평가 및 모니터링한다는 것을 나타낸다. 따라서, 일 실시예에서, "양성"은 건강한 또는 응답자 대조군, 임의의 다른 적당한 대조군 또는 임의의 다른 미리측정된 표준의 표적 값 또는 nADA 값과 비교할 때, 약 5% 내지 100% 또는 그 이상, 구체적으로, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%의 높은, 증가된, 상승된, 과발현된 표적 값 또는 계산된 결과의 nADA 값을 의미한다. 대조군은 본 명세서에서 미리-확립된 응답자 집단, 구체적으로, 임상적 매개변수를 이용하여 응답자로 분류된 알려진 응답자 집단이라고도 함에 유의해야 한다. 또한, 일 실시예에서, "음성" 표적 또는 nADA 값은 비-응답자 대조군, 임의의 다른 적당한 대조군 또는 (알려진 비-응답자의 미리-확립된 집단으로부터 채취한) 임의의 다른 미리측정된 표준의 표적 또는 nADA 값과 비교할 때, 약 5% 내지 100% 또는 그 이상, 구체적으로, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%의 감소된, 낮은, 비-존재 또는 결여의 결합된 표적 또는 계산된 nADA일 수 있다. 치료 개시 전에 동일한 시험 대상의 시료가 대조군으로 사용될 때, "음성" 결과는 일 실시예에서 치료 개시 전에 (nADAs의 생성이 예상되지 않는 경우) 동일한 피험자의 수준과 비교할 때 감소된, 또는 이러한 대조군에서 nADA 수준의 범위 내의 표적 및 nADA 수준을 나타낼 수 있음에 유의해야 한다. 대부분의 실시예에서, 치료 개시 전에 nADA가 없음 (또는 거의 없음)이 확인되었다.

또한, 피험자에서 활성 생물학적 약물의 수준을 측정하는 단계는 피험자에 대해 가장 적절한 요법에 관하여 보다 정확하고 맞춤 의사결정을 의료진에게 안내할 수 있게 한다.

따라서, 추가 측면에서, 본 발명은 면역-매개 장애를 앓고 있는 피험자의 치료 요법을 결정하는 방법에 관한 것이다. 방법은 하기의 단계를 포함할 수 있다:

먼저, 단계 (a)에서, 피험자의 적어도 하나의 생물학적 시료에서 nADA의 수준을 측정함으로써, 시료의 nADA 값을 얻는 단계;

단계 (b)에서, 단계 (a)에서 얻은 nADA 값이 미리측정된 표준 nADA 값 또는 적어도 하나의 대조군 시료에서의 nADA 값에 대해 양성 또는 음성 중 어느 하나인지를 결정하는 단계;

단계 (c)에서, 피험자의 치료 요법을 결정하는 단계로서,

(i) 시료의 양성 nADA 값은, 피험자가 생물학적 약물 치료에 대한 LOR, 부적절한 반응 및 불내증 중 적어도 하나와 관련된 미리-확립된 집단에 속한다는 것을 나타내고, 피험자는 치료를 유지하지 않는 것이 권장되거나, 또는 대안적으로 또는 추가적으로, 적어도 하나의 면역억제제를 투여하는 것이 권장되며;

(ii) 시료의 음성 nADA 값은, 피험자가 생물학적 약물 치료에 대한 반응성과 관련된 미리-확립된 집단에 속한다는 것을 나타내고, 피험자는 치료를 유지하는 것이 권장되는, 단계.

다시 말해서, "양성"은 건강한 또는 응답자 대조군, 임의의 다른 적당한 대조군 또는 임의의 다른 미리측정된 표준의 nADA 값과 비교할 때, 약 5% 내지 100% 또는 그 이상, 구체적으로, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%의 높은, 증가된, 상승된, 과발현된 nADA 값을 의미한다. 따라서, 이러한 피험자는 생물학적 약물 치료에 대한 LOR, 부적절한 반응 및 불내증을 나타내는 것으로 분류된다. 추가 실시예에서, 이러한 피험자는 치료를 유지하지 않는 것이 권장되거나, 또는 대안적으로 또는 추가적으로, 적어도 하나의 면역억제제를 투여하는 것이 권장된다. 또한, 일 실시예에서, "음성" nADA 값은 비-응답자 대조군, 임의의 다른 적당한 대조군 또는 임의의 다른 미리측정된 표준의 nADA 값과 비교할 때, 약 5% 내지 100% 또는 그 이상, 구체적으로, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%의 감소된, 낮은, 비-존재 또는 결여의 nADA일 수 있다. 이러한 피험자는 생물학적 약물 치료에 대한 응답자로 분류될 것이며, 일 실시예에서, 피험자는 치료를 유지하는 것이 권장된다.

일부 다른 실시예에서, 적어도 하나의 생물학적 시료에서 nADA의 수준을 측정하기 위한 본 발명의 방법의 단계는 하기의 단계에 의해 수행될 수 있다:

단계 (a)는 생물학적 시료를 고체 지지체 상에 직접적으로 또는 간접적으로 고정된 생물학적 약물과 함께 배양하는 단계를 포함한다.

단계 (b)에서, 단계 (a)의 배양된 시료를 생물학적 약물의 표적과 함께 제공하고 표적을 고정된 약물과 함께 배양하는 단계. 상기 언급된 바와 같이, 표적은 (직접적으로 또는 간접적으로) 검출가능한 부분과 관련될 수 있거나, 또는 대안적으로, 항체 또는 임의의 다른 친화도 분자가 사용될 수 있다.

단계 (c), 검출가능한 부분을 검출하여 고정된 약물에 결합된 표지된 표적의 양을 측정하는 단계로서, 상기 양은 생물학적 시료에 존재하는 중화 항-약물 항체의 수준을 나타낸다.

일 실시예에서, 본 발명의 방법은 해리 단계를 포함할 수 있다. 또 다른 일 실시예에서, 이러한 해리 단계는 시료를 고정된 약물과 함께 배양하는 단계의 단계 (a) 전에 수행될 수 있다. 보다 구체적인 실시예에서, 시료는 해리 단계를 거쳐 환자의 시료에 존재하는 nADAs 및 약물의 복합체를 감소시키거나 또는 제거할 수 있다. 일부 특정 및 비-제한적인 실시예에서, 해리 단계는 시료를 적어도 하나의 해리제로 약 1 내지 30분, 구체적으로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30분 이상, 보다 구체적으로, 15분 동안 전처리하는 단계를 포함할 수 있다. 적당한 해리제의 비-제한적인 예는 임의의 산성 물질, 예를 들어 아세트산과 같은 임의의 산, 글리신-HCl 또는 임의의 등가 산(equivalent acid)에 이어 중화 완충제를 포함한다. 일부 특정 실시예에서, 해리제로서 사용되는 산은 약 10mM 내지 약 1000mM 또는 그 이상의 양으로 존재할 수 있다. 또 다른 일부 구체적인 실시예에서, 사용된 해리제는 약 300 내지 600 mm의 양의 아세트산일 수 있으며, 구체적으로, 사용된 아세트산은 300mM의 양일 수 있다. 또 다른 일 실시예에서, 글리신-HCl은 해리제로 사용될 수 있다. 특정 실시예에서, 100mM 글리신-HCl의 양이 사용될 수 있다. 상기에 나타난 바와 같이, 해리 단계 후에, 해리제는 Tris 1M과 같은 중성 완충제의 첨가에 의해 중화될 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명의 방법에 의해 사용된 생물학적 약물은 생물학적 표적에 대한 항체일 수 있다. 또 다른 일 실시예에서, 생물학적 표적은 사이토카인일 수 있으며, 보다 구체적인 실시예에서, 이러한 사이토카인은 TNFα 일 수 있다. 따라서, 일 실시예에서, 본 발명의 방법에 의해 사용된 약물은 인플릭시맙, 에타너셉트, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골, 골리무맙, 우스테키누맙, 임의의 바이오시밀러 및 이들의 임의의 조합 중 적어도 하나일 수 있다.

또 다른 일 실시예에서, 본 발명의 방법에 의해 사용된 표적은 적어도 하나의 검출가능한 부분과 직접적으로 또는 간접적으로 관련될 수 있다. 보다 구체적인 실시예에서, 이러한 검출가능한 부분은 전도성, 형광성, 화학 발광, 효소적, 방사성, 자성, 및 비색 표지 중 적어도 하나, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 다른 측면과 관련하여 본 발명에 의해 개시된 검출가능한 부분 중 어느 것도 본 방법에 적용될 수 있음을 유의해야 한다.

또한, 일 실시예에서, 본 발명의 방법은 특히 면역-매개 장애를 앓고 있는 피험자의 치료 요법을 결정하는 단계에 적용될 수 있으며, 구체적으로, 면역-매개 장애는 염증성 질환, 자가면역 질환 및 증식성 장애 중 적어도 하나 (구체적으로, 암)일 수 있다. 또 다른 일부 구체적인 실시예에서, 면역-매개 장애는 염증성 장애, 구체적으로, IBD 일 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명의 방법은 상기 생물학적 약물로 치료받은 피험자의 생물학적 시료에서 활성 생물학적 약물의 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 방법은 하기의 단계를 더 포함할 수 있다. 제 1 단계 (a), 시료를 생물학적 약물에 특이적인 적어도 하나의 비-중화 항체와 함께 배양하는 단계. 비-중화 항체는 고체 지지체에 고정됨에 유의해야 한다. 일 실시예에서, 사용된 시료는 상기 본 명세서에서 논의된 본 발명의 방법에 의해 검사된 동일한 시료일 수 있고, 따라서 본 발명의 방법의 다음 단계일 수 있다. 대안적으로, 동일한 피험자로부터 채취한 임의의 다른 시료 또는 시료의 분취량을 이 추가 분석에 사용할 수 있다. 제 2 단계 (b)는 단계 (a)의 배양된 시료를 상기 생물학적 약물의 표적과 함께 제공하는 단계를 포함한다. 표적은 적어도 하나의 검출가능한 부분과 직접적으로 또는 간접적으로 관련되어 있음에 유의해야 한다. 일 실시예에서, 본 명세서에서 사용된 표적은 본 발명의 방법에서 사용된 동일한 표적, 또는 대안적으로, 새로 추가된 표적일 수 있다.

다음 단계 (c), 검출가능한 부분을 검출하여 표적의 양을 측정하는 단계. 양 또는 표적은 생물학적 시료에 존재하고 고정된 비-중화 항체에 결합된 활성 약물의 수준을 나타내는 것임을 유의해야 한다.

또한, 본 발명은 생물학적 약물로 치료받은 피험자의 생물학적 시료에서 nADAs 수준의 검출을 가능하게 하는 장치 또는 키트와 같은 시판될 수 있는 적용에 관한 것이다.

따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 생물학적 약물로 치료받은 피험자의 생물학적 시료에서 nADAs 검출용 장치에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 장치는 하기의 성분을 포함할 수 있다:

제 1 성분 (a)에서, 생물학적 약물의 생물학적 표적을 포함하는 표지 조성물, 표적은 생물학적 약물을 특이적으로 인식하고 결합한다. 일 실시예에서, 제공된 표적은 검출가능한 부분과 직접적으로 또는 간접적으로 관련될 수 있음을 이해해야 한다. 또 다른 일 실시예에서, 고정된 약물에 결합될 때 이러한 표적을 인식하는 특이적 항체가 더 사용될 수 있다.

본 발명의 장치의 제 2 성분 (b)는 고체 지지체 상에 직접적으로 또는 간접적으로 고정된 생물학적 약물을 포함하는 포획-조성물일 수 있으며, 제 3 성분 (c)는 생물학적 시료의 수용 및 수송에 적합한 고체 지지체를 포함한다.

생물학적 시료에서 nADAs의 검출 및 정량화를 위해 "사용하기 쉬운(easy to use)" 형식으로 상업용에 특히 적합한 장치는, "스트립 시험"으로도 알려진, 측면 유동 시스템(lateral flow system)과 같은 것일 수 있다.

따라서, 보다 구체적인 실시예에서, 본 발명의 장치는 일 실시예에서 하기를 포함하는 측면 유동 장치의 형태일 수 있다:

a. 생물학적 시료의 수용 및 수송에 적합한 고체 지지체;

b. 생물학적 약물의 생물학적 표적을 포함하는 표지 조성물. 표적은 생물학적 약물을 특이적으로 인식하고 결합한다. 일 실시예에서, 제공된 표적은 검출가능한 부분과 관련된 "표지된 표적"일 수 있음을 이해해야 한다. 또 다른 일 실시예에서, 고정된 약물에 결합될 때 이러한 표적을 인식하는 특이적 항체가 더 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, 표지 조성물은 고체 지지체에서 시료 적용 구역(zone)으로부터 포획 구역으로의 유동 경로에서 미리측정된 특정 개시 구역에 위치할 수 있다;

c. 고체 지지체 상에 직접적으로 또는 간접적으로 고정된 생물학적 약물을 포함하는 포획-조성물, 포획-조성물은 고체 지지체의 말단 구역(termination zone)의 미리측정된 위치에서 고체 지지체에 부착된다.

"측면 유동"의 경우, 검사된 시료는 흡수성(bibulous), 크로마토그래피 또는 기타 다공성 물질로 이루어진 시험 스트립에 배치될 수 있으며, 시료는 스트립에서 다양한 시약과 동시적으로 반응하는 모세관 작용에 의해 시험 스트립을 통해 측면으로 심지됨(wicked)을 의미한다. 본 발명의 범위는 시험 스트립을 통한 시료 이동의 방향에 대하여 제한되지 않는다.

측면 유동 시험은 시료 (매트릭스)에서 표적 분석물의 존재 (또는 부재)를 검출 및/또는 정량하기 위한 장치이다. 본 발명에서, 생물학적 약물의 표지된 표적은 정량화되고, 포획 조성물로서 작용하는 고정된 약물에 이들의 결합은 시험된 시료에서 nADAs의 양에 의존한다. 구체적으로, 시료에서 많은 양의 nADAs는 고정된 약물에 대한 표지된 생물학적 표적의 결합을 감소시킬 것이다. 상용되는 많은 측면 유동 시험은 가정용 검사, 현장 검사(point of care testing) 또는 실험실용의 의료 진단에 적합하다. 종종 딥스틱(dipstick) 형식으로 생성되는 측면 유동 시험은 시험 시료가 모세관 작용을 통해 고체 다공성 기질을 따라 흐르는 면역분석의 한 형태이다. 경우에 따라, 시료를 시험에 적용한 후, 시료와 혼합되어 기질에서 시료와 함께 이동하는 착색 시약(colored reagent)을 만나, 포획 분자로 전처리된 선 (lines) 또는 구역(zones)을 만나게 된다.

본 발명에서, 착색 시약은 착색되거나 또는 다른 방법으로 검출가능한 표지로 직접적으로 또는 간접적으로 표지될 수 있는 약물-표적일 수 있다. 상기 표적을 인식하는 특이적 항체를 이용하는 대안이 본 발명에도 포함된다. 시료에 존재하는 분석물, 구체적으로, nADAs에 따라, 착색 시약은 시험 선 또는 구역에서 고정된 약물에 결합될 수 있다. 시험 선은 양성 시료에서 착색 밴드 또는 반점(spot)으로 표시될 것이다. 이 경우, 본 발명의 이러한 측면에서 정의된 "양성" 시료는 표지된 표적을 고정된 약물에 결합시킬 수 있는 낮거나 또는 검출할 수 없는 양의 nADAs를 나타내는 시료이며, 따라서 검출가능한 신호이다. 이러한 시료는 반응성 피험자를 나타낼 수 있다. 대부분의 시험은 순전히 질적 기준으로 작동하기 위한 것이다. 그러나, 시험 선의 강도를 측정하여 시료에서 분석물의 양을 측정할 수 있다. 측면 유동 판독기로 알려진 핸드헬드(Handheld) 진단 장치는 완전한 정량 분석 결과를 제공하기 위해 여러 회사에서 사용된다. CMOS 또는 CCD 검출 기술과 함께 조명에 고유한 파장의 빛을 이용함으로써, 실제 시험 선의 신호 풍부 영상을 생성할 수 있다. 특정 시험 유형 및 매체를 위해 명확하게 설계된 영상 처리 알고리즘을 이용하여, 선 강도(line intensities)를 분석물 농도와 상관시킬 수 있다. 이러한 핸드헬드 측면 장치 플랫폼 중 하나는 Detekt Biomedical L.L.C.에 의해 만들어졌으며, 대안적인 비-광학 기법도 정량 분석 결과를 보고할 수 있다. 또한, 한가지 이러한 예는 측면 유동 시험 형태에서 정량화된 결과를 얻을 수 있는 자성 면역분석법 (MIA)이다. 또한, 표지된 약물-표적에 의해 방출된 신호를 표준 곡선에서 관찰된 신호의 강도 또는 임의의 알려진 양과 비교함으로써 반-정량적 결과를 얻을 수 있다.

상기 측면 유동 분석법의 표지를 위해, 원칙적으로, 임의의 착색 입자가 사용될 수 있지만, 일반적으로 라텍스 (청색) 또는 나노미터 크기의 금 입자 (적색)가 사용된다. 형광 또는 자성 표지 입자도 사용될 수 있지만, 이들은 시험 결과를 평가하기 위해 전자 판독기의 사용을 필요로 한다.

보다 구체적으로, 본 발명은 전기화학적 신호의 적용을 더 포함하므로, 이의 일 실시예에서, 본 발명의 장치는 전기화학적-기반 신호에 적합한 장치일 수 있다. 따라서, 일 실시예에서, 본 발명에 의해 제공되는 장치는 전기화학적 측면 유동 바이오센서 (electrochemical lateral flow biosensor, ELFB)의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 일 실시예의 ELFB는 ELFB 스트립 및 전자 검출기 유닛을 포함할 수 있다. 스트립은 플라스틱 하우징 내부에 배치되고 외부 전자 검출기 유닛 (수신기)에 연결될 수 있으며, 이는 ELFB 스트립으로부터 전류 측정 신호를 판독한다. 전자 검출기 유닛은 전기화학적 센서 인터페이스를 갖는 임의의 시판되는 정전압기 (potentiostat) 또는 정전류기(galvanostat), 예를 들어 Ivium PocketStat, DropSense micro STAT 400, Metrohm Autolab PGSTAT204 및 910 PSTAT mini, Palm|Sense 및 EmiStat (Palm|Sense에 의해), SP series 및 SensorStat (BioLogic에 의해), EZStat 및 PowerStat (NuVant Systems에 의해) 및 small hand-held PG581 (Uniscan Instruments에 의해), 또는 더 적절하게 휴대폰 또는 임의의 다른 적당한 모바일 장치에 대한 전자 어댑터 칩을 포함하는 독점 장치일 수 있다.

또 다른 일 실시예에서, 본 발명의 장치는 (포획 조성물 내) 본 발명의 고정된 약물일 수 있는 생체-인식 요소, 및 전기화학적 신호를 발생시키거나 또는 전송할 수 있는 검출가능한 표지와 직접적으로 또는 간접적으로 관련될 수 있는 표지 조성물의 사용을 포함할 수 있다. 본 발명의 장치에 적용할 수 있는 검출가능한 부분은 전도성, 형광성, 화학 발광, 효소적, 방사성, 자성 및 비색 표지 중 적어도 하나, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 보다 구체적인 실시예에서, 나노-크기 물질 및 마이크로-크기 물질, 예를 들어 금 나노입자 (GNPs), 탄소 나노튜브 (CNTs), 그래핀 (GR), 자성 입자 (MBs), 양자점 (QDs) 및 전도성 고분자는, 또한 고체 지지체를 변형시키기 위해 본 발명의 장치에서 검출가능한 부분으로서 특히 적용될 수 있다. 본 발명의 다른 측면과 관련하여 본 발명에 의해 개시된 임의의 검출가능한 부분도 본 측면에 적용될 수 있음을 이해해야 한다.

또한, 본 발명의 장치는 일 실시예에서 고체 지지체에 부착되거나 또는 결합될 수 있는 적어도 하나의 전극의 사용을 포함할 수 있다. 이러한 전극의 비-제한적인 예는 스크린-인쇄 전극 (SPE)을 포함할 수 있다. SPE는 하나 이상의 작업 전극을 포함할 수 있다. DropSense에서 개발한 2개의 타원 작업 전극(elliptic working electrodes) (상대 전극(counter electrode) 및 기준 전극(reference electrode))이 있는 이중 스크린-인쇄 전극 (DSPE)은, 2개의 상이한 유형의 항체의 동시 검출 및 이들의 비의 정량화를 허용한다. 대안적으로, 작업 전극들 중 하나는 대조군으로 사용되고, 다른 하나는 시험 전극으로 사용될 수 있다.

또 다른 일 실시예에서, 전류 측정 신호를 얻기 위해, ELFB 장치는 전기화학적 활성 성분 (EAC)을 포함한다. 전기화학적 시스템에서 EAC의 역할은 이의 산화환원 전위에 해당하는 전극으로 전자를 전달하는 것이다. 다양한 EACs가 시판되고 있다. 바이오센서 적용에 적합한 EAC 화합물을 선택하기 위하여, 하기 사항을 고려해야 한다. 첫째, 작업 전극 전위는 대부분의 생물학적 시스템에서 비교적 낮다. 둘째, 적은 양의 시료로 측정을 수행한다 (즉, EAC가 적은 양으로 반응해야 함을 의미한다). 셋째, EAC는 금 나노입자 또는 고분자 입자와 같은 공액 입자(conjugate particles)에 결합할 수 있어야 한다. 전기화학적 매개체로서 상용되는 EAC의 예는 페로센(Ferrocene), 티오닌(Thionine) 및 메틸렌 블루(Methylene Blue)이다.

EAC가 전자를 전극, 예를 들어, 이의 환원 전위 하에서 스크린-인쇄 전극 (SPE)으로 전달함에 따라, SPE의 검출 효율은 EAC와 작업 전극 사이의 거리에 의존한다. 따라서, EAC 환원 반응 전위의 측정은 고정된 포획 약물 또는 포획 조성물을 통해 분석물 복합체의 검출 및 정량화를 가능하게 한다. 이와 같이, 분석물 검출이 연결된 산화환원 효소에 의해 생성된 전류 측정 신호를 기초로 하는 본 발명의 일 실시예에 의해 포함되는 산화환원 효소 기반 분석법과 비교하여, 본 발명의 다른 대안적인 실시예는 생성된 전류를 측정하기 위해 EAC를 작업 전극에 충분히 가깝게 한 결과로서 전류 측정 신호의 측정에 기초한다. 후자는 시료에서 분석물 (구체적으로, 표지된 표적)의 양에 비례한다.

측면 유동 시험은 본 발명에서와 같이 직접 또는 경쟁적 샌드위치 분석법으로 작동할 수 있다.

일부 특정 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 장치는 본 발명에 따른 임의의 방법을 수행하는데 특히 적합할 수 있다.

특정 실시예에서, 본 발명의 장치와 관련된 생물학적 약물은 생물학적 표적에 대한 항체일 수 있고, 보다 구체적으로, 생물학적 표적은 사이토카인 중 적어도 하나일 수 있다. 보다 구체적인 실시예에서, 이러한 표적은 사이토카인, 구체적으로, 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)일 수 있다.

다른 구체 예에서, 본 발명의 장치의 약물은 사이토카인, 구체적으로, TNFα에 특이적인 항체일 수 있다. 이러한 경우, 약물은 TNFα에 특이적인 단일클론 항체일 수 있다. 일부 특정 실시예에서, 이러한 약물은 TNFα에 특이적인 항체일 수 있으며, 상기 약물은 REMICADE^® (인플릭시맙), ENBREL^® (에타너셉트), HUMIRA^® (아달리무맙), CIMZIA^® (세르톨리주맙 페골), SIMPONI^® (골리무맙), 이들의 임의의 바이오시밀러, 및 이들의 임의의 조합 중 적어도 하나이다.

또 다른 일 실시예에서, 본 발명의 장치는 고체 지지체 상에 직접적으로 또는 간접적으로 고정된 생물학적 약물에 특이적인 적어도 하나의 비-중화 항체를 포함하는 제 2 포획-조성물을 더 포함할 수 있다. 이러한 추가 포획 조성물은 시료에 존재하는 생물학적 약물을 포획하는데 사용될 수 있음에 유의해야 한다. 본 발명의 장치의 동일한 표지 조성물, 구체적으로, 표지된 표적은 제 2 포획 조성물에 결합된 포획된 약물을 검출하기 위해 본 명세서에서 사용될 수도 있다.

따라서, 일 실시예에서, 2개의 상이한 포획 조성물 및 단일 표지 조성물을 이용함으로써 본 발명의 장치는 시료 내 nADAs 및 시료 내 활성 생물학적 약물 둘 모두의 검출 및 측정을 허용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명은 하기를 포함하는 키트, 구체적으로, 예후 키트에 관한 것이다:

(a) 고체 지지체 상에 직접적으로 또는 간접적으로 고정된 생물학적 약물;

(b) (임의로, 검출가능한 부분과 관련된) 생물학적 약물의 생물학적 표적. 일 실시예에서, 본 발명의 키트는 임의로 (c) 사용 설명서; (d) 표준 곡선 또는 대조군 시료; (e) 임의로 제 2의 검출가능한 부분과 관련된, 적어도 하나의 항-람다 쇄 항체 및 (f) 생물학적 약물에 특이적인 적어도 하나의 비-중화 항체 중 적어도 하나일 수 있다. 비-중화 항체는 고체 지지체 상에 직접적으로 또는 간접적으로 고정됨에 유의해야 한다.

일 실시예에서, 본 발명의 키트에 사용된 생물학적 약물은 생물학적 표적에 대한 항체를 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 생물학적 표적은 사이토카인일 수 있다. 또 다른 일부 구체적인 실시예에서, 사이토카인은 TNFα일 수 있다.

이러한 약물에 대한 보다 특정한 실시예는 인플릭시맙, 에타너셉트, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골, 골리무맙, 임의의 바이오시밀러 및 이들의 임의의 조합 중 적어도 하나를 포함할 수 있다.

또 다른 일 실시예에서, 본 발명의 키트의 표적은 적어도 하나의 검출가능한 부분과 직접적으로 또는 간접적으로 관련될 수 있다. 또한, 이러한 검출가능한 부분은 전도성, 형광성, 화학 발광, 효소적, 방사성, 자성, 금속, 및 비색 표지 중 적어도 하나, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명의 예후 키트는 본 발명의 임의의 장치를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 본 발명은 질환 진행 및 질환 재발의 조기 예후를 모니터링하기 위해, 생물학적 약물로 치료받은 피험자의 반응성을 예측 및 평가하는데 사용하기 위한, 본 명세서에 기재된 본 발명의 임의의 키트를 더 포함한다. 일 실시예에서, 본 발명의 키트는 상기 기재된 생물학적 시료에서 nADAs를 검출하기 위한 본 발명의 임의의 방법을 수행하기에 적합한 임의의 시약, 물질 또는 성분을 더 포함할 수 있음에 유의해야 한다. 본 발명의 임의의 방법 및 키트에 포함된 임의의 시약, 물질 또는 성분은 상기 기재된 임의의 고체 지지체 물질에 끼워 넣은 (embedded), 연결된, 결합된, 부착된, 배치된 또는 융합된 시약으로서 제공될 수 있음을 더 이해해야 한다. 이들 시약 및 화합물은 별도의 용기에 더 제공될 수 있다.

또한, 본 발명은 활성 생물학적 약물의 수준을 측정할 수 있는 추가 방법을 제공한다. 상기에 나타난 바와 같이, 일 실시예에서, 이러한 방법은 본 발명의 방법 또는 장치 및 키트에 의해 추가의 단계로서 포함되거나, 또는 동시에 수행될 수 있고, 치료받은 환자와 관련된 추가 정보를 제공할 수 있다.

따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 생물학적 약물로 치료받은 피험자의 생물학적 시료에서 활성 생물학적 약물의 수준을 측정하는 방법을 제공한다. 보다 구체적으로, 방법은 하기의 단계를 포함한다:

먼저, 단계 (a)에서, 시료를 생물학적 약물에 특이적인 적어도 하나의 비-중화 항체와 함께 배양하는 단계. 비-중화 항체는 고체 지지체에 고정됨에 유의해야 한다. 다른 측면과 관련하여 본 발명에 의해 논의된 임의의 고체 지지체가 이 방법에도 적용될 수 있음을 이해해야 한다. 다음 단계 (b)에서, 단계 (a)의 배양된 시료를 생물학적 약물의 표적과 함께 제공하는 단계. 일 실시예에서, 표적은 적어도 하나의 검출가능한 부분과 직접적으로 또는 간접적으로 관련되어 있음에 유의해야 한다. 다른 측면과 관련하여 본 발명에 의해 논의된 모든 검출가능한 부분도 본 측면에 적용될 수 있음을 이해해야 한다.

다음 단계 (c)에서, 검출가능한 부분을 검출하여 표적의 양을 측정하는 단계. 이 양은 생물학적 시료에 존재하고 고정된 비-중화 항체에 부착된 활성 약물의 수준을 나타내는 것임을 유의해야 한다.

상기 언급된 바와 같이, 비-중화 항체는 약물의 생물학적 표적에 대한 이의 결합을 예방, 감소, 축소 또는 제거할 수 없어 생물학적 약물의 활성을 감쇠시키거나 또는 영향을 줄 수 없는, 생물학적 약물에 대한 임의의 항체이다.

일부 구체적인 실시예에서, 본 발명의 방법에 의해 사용된 표적은 전도성, 형광성, 화학 발광, 효소적, 방사성, 자성, 금속, 및 비색 표지 중 적어도 하나, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있는 적어도 하나의 검출가능한 부분과 직접적으로 또는 간접적으로 표지될 수 있다.

특정 실시예에서, 본 발명의 방법과 관련된 생물학적 약물은 생물학적 표적이 사이토카인인 생물학적 표적에 대한 항체일 수 있다.

다른 실시예에서, 본 발명의 방법의 사이토카인은 TNFα일 수 있고, 약물은 TNFα에 특이적인 단일클론 항체일 수 있으며, 보다 구체적으로, 약물은 인플릭시맙, 에타너셉트, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골, 골리무맙, 이들의 임의의 바이오시밀러 및 이들을 포함하는 임의의 조합 중 적어도 하나일 수 있다.

보다 구체적인 실시예에서, 이러한 바이오시밀러는 인플릭시맙-dyyb, SB4 에타너셉트, SB2 인플릭시맙 및 SB5 아달리무맙을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

일부 구체적인 실시예에서, 본 발명의 방법은 면역-매개 장애를 앓고 있는 피험자에 적용될 수 있다. 본 발명의 방법은 본 발명의 다른 측면과 관련하여 본 발명에 의해 개시된 임의의 면역-매개 장애를 앓고 있는 피험자에 적용될 수 있음을 이해해야 한다. 일 실시예에서, 면역-관련 장애는 염증성 질환, 바이러스 감염, 자가면역 질환, 대사 장애 및 증식성 장애 중 어느 하나, 구체적으로, 염증성 질환, 자가면역 질환 및 증식성 장애 중 적어도 하나일 수 있다.

또 다른 일부 구체적인 실시예에서, 특히 관심있는, 본 발명의 방법에 의해 언급된 면역-매개 장애는 염증성 질환, 자가면역 질환 및 증식성 장애 중 적어도 하나 (구체적으로, 암)일 수 있다. 일부 구체적인 실시예에서, 면역-매개 장애는 IBD와 같은 염증성 장애일 수 있다. 다른 구체적인 실시예에서, IBD는 UC, CD 및 IC, 또는 미분류된 IBD (IBDU) 중 어느 하나일 수 있다.

특정 실시예에서, 본 발명의 방법과 관련된 생물학적 시료는 혈청 및 전혈 시료 중 어느 하나 또는 이의 임의의 분획물 또는 제제일 수 있다.

본 발명의 측면을 더 완전히 이해하고 인정할 수 있도록 본 발명은 이제 하기의 예에서 특정 바람직한 실시예와 관련하여 기재될 것이지만, 본 발명을 이들 특정 실시예로 제한하려는 것은 아니다. 반대로, 첨부된 청구범위에 의해 정의된 바와 같이 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있는 모든 대안, 변형 및 등가물을 포함하기 위한 것이다. 따라서, 바람직한 실시예를 포함하는 하기 실시예는 본 발명의 실시를 예시하기 위해 제공될 것이며, 나타낸 세부 사항은 단지 예로서 및 본 발명의 바람직한 실시예의 예시적인 논의를 목적으로 하며, 제형화 과정 및 본 발명의 원리 및 개념적인 측면의 가장 유용하고 쉽게 이해되는 기재로 여겨지는 것을 제공하는 원인으로 제시됨을 이해해야 한다.

따라서, 본 발명은 이러한 공정 단계 및 물질이 다소 다를 수 있으므로, 본 명세서에 개시된 특정 예, 공정 단계 및 물질에 한정되지 않는 것으로 이해된다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시예를 설명하기 위한 목적으로만 사용되며 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위 및 이의 등가물에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 이에 한정하려는 것이 아님을 이해해야 한다.

본 발명을 수행함에 있어서, 달리 표시되지 않는 한, 화학, 분자 생물학, 생화학, 단백질 화학 및 재조합 DNA 기술의 통상적인 기법이 사용될 수 있으며, 이들 모두는 통상의 기술자의 기술 내에 있다.

명확성을 위해, 별도의 실시예들과 관련하여 기재된 본 발명의 특정 특징들은 단일 실시예에서 조합하여 제공될 수도 있음을 이해해야 한다. 반대로, 간결성을 위해, 단일 실시예와 관련하여 기재된 본 발명의 다양한 특징은, 별도로 또는 임의의 적당한 하위 조합으로 또는 본 발명의 임의의 다른 기재된 실시예에서 적합한 것으로도 제공될 수 있다. 다양한 실시예들과 관련하여 기재된 특정 특징들은, 실시예가 이러한 요소없이 작동하지 않는 한, 이들 실시예의 필수 특징으로 간주되지 않아야 한다.

상기에 기술되고 하기의 청구범위에 청구된 본 발명의 다양한 실시예 및 측면은 하기 예에서 실험적 지지를 찾는다.

본 명세서에서 사용된 모든 과학 기술 용어는, 달리 명시되지 않는 한, 당해 기술분야에서 상용되는 의미를 가진다. 본 명세서에서 제공된 정의는 본 명세서에서 자주 사용되는 특정 용어의 이해를 돕기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어 "약"은 연속 범위를 구성하는, 정수 값, 및, 가능한 경우, 비-정수(non-integer) 값도 포함하는 편차 범위인, 언급된 값보다 최대 1%, 보다 구체적으로 5%, 보다 구체적으로 10%, 보다 구체적으로 15%, 및 경우에 따라 최대 20% 더 높거나 또는 더 낮게 벗어날 수 있는 값을 나타낸다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 ± 10%를 나타낸다.

용어 "포함하다(comprises)", "포함하는(comprising)", "포함하다 (includes)", "포함하는(including)", "갖는(having)" 및 이들의 컨쥬게이트는, "포함하나 이에 한정되지 않는"을 의미한다. 이 용어는 용어 "이루어진" 및 "본질적으로 이루어진"을 포함한다. 문구 "본질적으로 이루어진"은 방법, 장치 및 키트가 추가 성분 및/또는 단계를 포함할 수 있으나, 추가 성분 및/또는 단계가 청구된 방법, 장치 또는 키트의 기본 및 신규 특성을 실질적으로(materially) 변경하지 않는 경우만을 의미한다. 본 명세서 및 하기 실시예 및 청구범위 전체에서, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)", 및 "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은, 언급된 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 군을 포함하나 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 군을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다.

본 발명의 다양한 실시예는 범위 형식으로 제시될 수 있음에 유의해야 한다. 범위 형식의 기재는 단지 편의 및 간결성을 위한 것이며, 본 발명의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 기재는 가능한 모든 하위 범위 및 그 범위 내의 개별 수치 값을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 기재는 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등, 및 그 범위 내의 개별 숫자, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 및 6과 같은 구체적으로 개시된 하위 범위를 갖는 것으로 간주되어야 한다. 이것은 범위의 폭에 관계없이 적용된다. 수치 범위가 본 명세서에서 표시될 때마다, 표시된 범위 내에서 임의의 인용된 숫자 (분수 또는 정수)를 포함하는 것을 의미한다. 문구 제 1 표시 숫자와 제 2 표시 숫자 "의 범위에 이르는/사이의 범위(ranging/ranges between)" 및 제 1 표시 숫자 "내지" 제 2 표시 숫자 "의 범위에 이르는/의 범위(ranging/ranges from)"는 본 명세서에서 통용되며, 제 1 표시 숫자 및 제 2 표시 숫자와 그 사이의 모든 분수 및 정수를 포함하는 것을 의미한다.

개시되고 기재된 바와 같이, 본 발명은 이러한 방법 단계 및 장치 또는 키트가 다소 다를 수 있으므로, 본 명세서에 개시된 특정 예, 방법 단계, 및 장치 또는 키트에 한정되지 않는 것으로 이해된다. 또한, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위 및 이의 등가물에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시예를 설명하기 위한 목적으로만 사용되며 이를 한정하려는 것이 아님을 이해해야 한다.

본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는, 그 내용이 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다.

본 명세서에 개시된 주제를 더 잘 이해하고 이것이 실제로 어떻게 수행될 수 있는지를 예시하기 위하여, 이제 첨부된 도면을 참조하여 비-제한적인 예로서만, 실시예를 기재할 것이다:
도 1. 신규한 항-약물 중화 항체 분석법
생물학적 약물은 먼저 고체 매트릭스 상에 직접적으로 또는 간접적으로 고정된다. ADAs-의심 혈청을 첨가하여, 항-약물 항체가 고정된 약물에 결합할 수 있게 한다. 임의의 세척 단계 후, 표지된 형태의 표적을 첨가하고 고정된 약물에 결합할 수 있다. 과량의 비결합된 표적을 임의로 씻어내고 결합된 표적을 측정한다. 도면의 하부 패널 (lower panel)에 나타난 바와 같이, 중화 항체 (A)의 부재 하에서 약물의 항-항원 결합 부위는 표지된 표적에 자유롭게 결합하는 반면, 중화 항체 (B 및 C)의 존재 하에서, 비-중화 항체 (D)와 달리, 결합 부위는 차단되어 표적이 약물에 결합하는 것을 방지하여 감소된 신호가 측정된다.
도 2. 인플릭시맙 중화 또는 비-중화 항체의 존재 하에 TNFα 결합
유리 인플릭시맙 (흰색 막대) 또는 표시된 농도의 중화 (회색 막대) 또는 비-중화 (점선 막대) 항체를 인플릭시맙 코팅된 웰에서 30분 동안 배양하였다. 결과는 항체의 부재 하에서 얻은 기준치 치수 (흑색 막대)와 비교하여, 측정된 결합된 TNFα의 백분율로 표시된다.
도 3. 혈청의 존재 하에 인플릭시맙에 결합하는 TNFα의 중화
혈청의 존재가 결과를 방해하지 않도록 하기 위해, PBS 내 1% BSA에서 1:20으로 희석된 풀링된 음성 혈청(pooled negative sera)으로 분석을 수행하였다. 표준 ELISA 플레이트를 밤새도록 250ng/ml 인플릭시맙으로 코팅하고, 중화 항체의 연속 희석액 (20ng/ml 내지 2.5ng/ml)을 PBS 내 1% BSA 또는 1% BSA 용액에서 희석된 5% (1:20) 풀링된 음성 혈청에서 제조하였다. 혈청의 첨가는 결합된 TNF의 신호에 영향을 미치지 않는 것으로 보인다.
도 4. 최적의 혈청 농도 정의
PBS 내 1% BSA에서 희석된 2, 5 또는 10% 풀링된 음성 혈청에서 제조된 연속 항체 희석액으로, 상기 기재된 바와 같은 분석을 수행하였다.
도 5. 약물 수준 측정, 표지된 표적을 판독값으로 이용, 및 환자의 혈청에서 이를 시험
시판용 비-중화 항-약물 항체는 고체 매트릭스 상에 고정된다. 그 다음, 혈청을 첨가하여, 고정된 항체가 시료에 존재하는 약물을 포획할 수 있게 한다. 표지된 형태의 표적을 첨가하고, 포획된 활성 약물에 결합하여, 시료 내 활성 약물의 양을 나타낸다.
도 6a-6b. 검출을 위해 TNF를 이용한 인플릭시맙 혈청 수준 분석의 검증 (validation)
도 6a. 3.125 내지 200ng/ml의 인플릭시맙 농도를 이용한 표준 곡선에 맞는 4가지 매개변수 로지스틱 회귀 모델. R²=0.9973.
도 6b. 32명의 환자로부터의 혈청 시료는 인플릭시맙 검출을 위한 항-Fc를 이용한 일상적인 분석법 및 새로운 분석법에 의해 약물 수준을 평가하였다. 두 방법 사이에 높은 상관 계수가 확인되었다.

하기 실시예는 본 발명의 측면을 수행하는데 본 발명자들에 의해 사용된 기법을 대표한다. 이들 기법은 본 발명의 실시를 위한 바람직한 실시예의 예시이지만, 본 발명에 비추어 통상의 기술자는, 본 발명의 사상 및 의도된 범위를 벗어나지 않고 수많은 변형이 이루어질 수 있다는 것을 인식할 것임을 이해해야 한다.

실시예

상기 기재와 함께 본 발명을 비-제한적인 방식으로 예시하는 하기의 실시예를 이제 참조한다.

실험 과정

환자 집단

이전에 보고된 인플릭시맙 약동학 및 면역원성의 전향적 연구(prospective study)에 포함된 IBD 환자에 대해 인플릭시맙 약동학에 관한 비교 자료를 검색하였으며, 인플릭시맙 수준은 유사한 시점에서 유사한 ELISA 기법을 이용하여 측정하였다 [12].

이 연구는 의료 센터의 윤리위원회의 승인을 받았으며, 모든 환자는 서면 사전동의서를 제출하였다.

환자 정보 (표 3에 제시된 시료를 제공하는 환자의 정보)

환자 수		36
연령, 년 - 중간값 (IQR)		37 (25-49)
유병 기간, 년 - 중간값 (IQR)		5 (1-13)
진단시 연령 - 중간값 (IQR)		26 (20-36.5)
남성 / 여성 비		0.8
표본화 시간(sampling time)에서의 치료 기간, 월 - 중간값 (IQR)		4 (1-14)
생물학적 제제로 사전 치료, n (%)		3 (8.3)
크로병 (CD), n (%)		24 (67)
궤양성 대장염 (UC), n (%)		12 (33)
CD 거동	염증성 n (%)	11 (46)
	협착성(Stricturing) n (%)	3 (13)
	침투성 n (%)	11 (46)
CD 위치	회장(Ileal) n (%)	6 (25)
	회장-대장(Ileo-colonic) n (%)	13 (54)
	대장 n (%)	3 (13)
UC 위치	좌측 대장염 n (%)	7 (58)
	직장염(Proctitis) n (%)	2 (17)
	전대장염(Pancolitis) n (%)	3 (25)
표본화 시간에서의 인플릭시맙 최저 혈청 수준 μg/mL (중간값, IQR)		3.45 (0.6-12.5)

환자 정보 (표 4에 제시된 시료를 제공하는 환자의 정보)

환자 수		8
연령, 년 - 중간값 (IQR)		36.5 (30.5-55)
유병 기간, 년 - 중간값 (IQR)		14.5 (8.5-20.5)
진단시 연령 - 중간값 (IQR)		23 (17-32)
남성 / 여성 비		1.7
생물학적 제제로 사전 치료, n (%)		3 (38)
CD, n (%)		5 (63)
UC, n (%)		3 (37)
CD 거동	협착성 n (%)	4 (80)
	침투성 n (%)	1 (20)
CD 위치	회장 n (%)	1 (20)
	회장-대장 n (%)	4 (80)
UC 위치	좌측 대장염 n (%)	2 (67)
	전대장염 n (%)	1 (33)
인플릭시맙 2주 최저 혈청 수준 μg/mL (중간값, IQR)		13.45 (7.2-20)

임상 점수

임상적 상태는 크론병 (CD) 환자에 대해 HBI (Harvey-Bradshaw index) 및 궤양성 대장염 (UC) 환자에 대해 SCCAI (Simple Clinical Colitis Activity Index)로 측정하였다 (Higgins PD, et al. Gut 2005;54:782-8; Harvey RF, et al. Lancet 1980;1:514). 임상적 완화는 CD 환자에 대해 HBI <5, UC 환자에 대해 SCCAI≤3으로 정의되었다. 임상적 반응은 CD 및 UC 환자에 대해 각각 HBI 점수의 ≥3점의 감소 및 SCCAI 점수의 ≥3점의 감소로 정의되었다. 원발성 비-반응은 상기 정의된 임상적 반응의 결여로 인해, 14주까지 베돌리주맙 요법의 중단으로 정의되었다 (Papamichael K, et al. J Crohns Colitis 2016;10:1015-23).

중화 항-약물 항체 (ADA) 농도만의 특이적 검출에 대한 ELISA 분석법

표준 ELISA 플레이트를 4℃에서 밤새도록 250 ng/ml 인플릭시맙으로 코팅한 다음, 실온 (RT)에서 1시간 동안 PBS 내 1% BSA에서 차단하였다. 상이한 농도의 중화 항체 (HCA233, BioRad) 또는 비-중화 항체 (HCA234, BioRad)를 RT에서 1시간 배양 동안 플레이트에 첨가하였다. 세척 후, 플레이트를 RT에서 1시간 동안 차단 완충액에서 1 μg/ml TNFα와 함께 배양하였다. 검출을 위해, HRP 표지된 항-TNFα 항체 (ab24473, abcam)를 RT에서 1시간 동안 플레이트에 첨가한 다음, TMB 기질을 첨가하였다. 항체와 함께 배양한 후 TNF 결합은 항체의 부재 하에서 기준치 결합과 비교하였다.

혈청의 존재 하에 중화 ADA 농도의 특이적 검출

표준 ELISA 플레이트를 4℃에서 밤새도록 250 ng/ml 인플릭시맙으로 코팅한 다음, 실온 (RT)에서 1시간 동안 PBS 내 1% BSA에서 차단하였다. 중화 항체 (HCA-233, BioRad)의 연속 희석액 (20ng/ml 내지 2.5ng/ml)을 PBS 내 1% BSA 또는 1% BSA 용액에서 희석된 5% 풀링된 음성 혈청에서 제조하고, RT에서 1시간 배양 동안 플레이트에 첨가하였다. 세척 후, 플레이트를 RT에서 1시간 동안 1% BSA 내 1ug/ml TNFα와 함께 배양하였다. 검출을 위해, HRP 표지된 항-TNFα 항체를 RT에서 1시간 동안 플레이트에 첨가한 다음, TMB 기질을 첨가하였다.

검출을 위해 TNF를 이용한 인플릭시맙 혈청 수준 분석의 특이적 검출에 대한 ELISA 분석법

항-인플릭시맙 결합 항체 HCA-216 (clone AbD19376_hIgG, Bio-Rad Laboratories, Inc.)을 사용하여 표준 ELISA 플레이트 (카보네이트 완충액에서 희석된 100 μl의 1ug/ml 항체를 웰당 사용함)를 4℃에서 밤새도록 코팅하였다. 세척 후, 플레이트를 실온에서 60분 동안 150μl의 PBS 내 1% BSA를 이용하여 차단하고, 1% BSA에서 1:50으로 희석된, 100μl의 표준 농도의 인플릭시맙 또는 혈청 시료를 실온에서 60분 동안 2회 배양하였다. 그 다음, 플레이트를 세척하고 실온에서 추가 60분 동안 100μl의 1.5ug/ml TNFα (PeproTech, Inc)와 함께 배양하였다. 마지막으로, 100μl의 HRP-표지된 항-TNF 항체 (ab24473, abcam, UK)를 실온에서 60분 동안 70ng/ml의 농도로 첨가하였다. 최종 세척 단계 후, 플레이트를 테트라메틸벤지딘 (TMB) 기질과 반응시켰다. 32명의 환자로부터의 혈청 시료를 인플릭시맙 검출을 위해 항-Fc를 이용한 일상적인 분석법 및 본 발명의 새로운 분석법으로 약물 수준에 대해 평가하였다. ELISA 판독기에 의해 결과를 판독하고, 3.125-200ng/ml 인플릭시맙의 등급화된 농도 대 정규화 후 μg/ml로 표시되었다.

실시예 1

특이적 중화 항-약물 항체만의 수준을 측정하는 방법의 개발

혈청에서 활성 약물의 수준을 검출하기 위한 대안적인 분석법을 개발하기 위해, 본 발명자들은 고정된 표적 (TNFα)에 결합하기 위한 외인성 첨가 약물 인플릭시맙 (IFX)의 이용가능성을 감소시키는 중화 항체의 능력에 기초하여, 변형된 ELISA-기반 항체 분석법 [6]을 이전에 개발하였다. 환자의 혈청을 외인성 약물로 스파이킹하고, TNFα로 코팅된 ELISA 플레이트에 로딩한 다음, 결합된 약물을 정량화하였다. 그러나, 이 ELISA-기반 분석법은 항-TNFα 약물에 대한 반응 상실의 예측과 관련하여 가치가 있는 것으로 나타났지만, 이들 분석법은 환자의 혈청 내 유리 약물이 플레이팅된 TNFα에 결합하여 ADA 중화 활성을 차폐시킬 수도 있기 때문에 높은 약물 혈청 수준에 민감한 것으로 밝혀졌다.

따라서,이 경고(caveat)를 극복하기 위한 시도로, 혈청의 중화능을 직접적인 방식으로 측정하는 개선된 분석법이 개발되었다 (도 1 참조). 새로운 기법에서, 생물학적 약물은 먼저 고체 매트릭스 상에 직접적으로 또는 간접적으로 고정된다. 그 다음, 혈청을 첨가하여, 항-약물 항체가 고정된 약물에 결합할 수 있게 한다. 표적은 직접적으로 또는 간접적으로 표지될 수 있음에 유의해야 한다. 임의의 비결합된 약물이 제거되는 동안 세척 단계 후에, 고정된 약물에 결합하여 표지된 형태의 표적 (예를 들어, 항-TNFα에 대한 ADA를 검출하는 경우 TNFα)이 첨가된다. 이후, 과량의 비결합된 표적을 씻어내고 결합된 표적을 측정한다. 중화 항체의 부재 하에서, 약물의 항-항원 결합 부위는 표지된 표적에 자유롭게 결합하는 반면, 중화 항체의 존재 하에서, (비-중화 항체와 달리) 표적 결합 부위는 차단되어 표적이 약물에 결합하는 것을 방지하여 감소된 신호가 측정된다. 이 방법은 시판용 중화 및 비-중화 항체를 이용하여, ELISA 설정에서 먼저 시험되었다. 도 2에 나타난 바와 같이, 증가하는 양의 중화 항체의 존재를 나타내는 TNFα- 결합 곡선이 입증되었지만, 유리 약물 또는 비-중화 항체의 존재는 TNFα 결합에 영향을 미치지 않았다. 따라서, 약물 민감도 과제를 명백히 극복할 수 있는 본 발명의 새로운 제안된 분석법은, 혈청 약물에 내성이 있으며, 빠르고 쉽게 사용할 수 있는 이점을 가진다.

분석의 민감도의 최적화

상기 기재된 실험에서, 희석제로서 PBS 내 1% BSA로 분석을 수행하였다. 혈청의 존재가 TNF의 결합 또는 플레이팅된 인플릭시맙과 중화 항체의 상호 작용을 방해하지 않도록 하기 위해, 항체 희석제로서 PBS 내 1% BSA에서 1:20으로 희석된 풀링된 음성 혈청을 이용하여 분석을 수행하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, 혈청의 첨가는 결합된 TNF의 신호에 영향을 미쳤으나, 그럼에도 불구하고 표준 곡선이 여전히 관찰되었다.

FDA는 스크리닝 및 확증적인(confirmatory) ADA 분석법이 밀리리터 당 적어도 100 나노그램 (ng/mL)의 민감도를 달성할 것을 권장한다. 전통적으로 FDA는 적어도 250-500 ng/mL의 민감도를 권장하였지만, 최근 자료는 100 ng/mL 만큼 낮은 농도가 임상적 결과와 관련될 수 있음을 시사한다. 또한, 중화 항체는 이미 낮은 농도에서 약물 활성에 더 큰 영향을 미칠 수 있다. 그러나, 중화 분석법이 항상 그 수준의 민감도를 달성하지 못할 수 있다는 것을 이해해야 한다.

따라서, 본 발명자들은 분석법의 방법론의 몇 가지 변형을 평가하였다:

- 플레이트에 결합된 인플릭시맙의 양을 낮추는 단계 - 도입된 항체에 더 큰 영향을 주기 위해, 결합된 TNF 신호는 검출가능해야 한다.

- 혈청의 농도를 증가시키는 단계 - 항체의 희석을 피함으로써 항체를 검출하는 능력이 증가된다; 그러나 측정된 신호를 갖는 다른 혈청 단백질의 가능한 간섭을 평가하고 피해야 한다.

플레이트에 결합된 인플릭시맙의 양을 낮추는 단계.

96 웰 플레이트에서 웰당 100ul의 부피로 100ng/ml 내지 500ng/ml 범위의 상이한 농도의 플레이트-결합된-인플릭시맙을 시험하였다. 동일한 중화 항체 표준을 이용하여, 100ng/ml로의 코팅이 TNF 결합에서 가장 높은 감소를 나타내었지만, 250ng/ml로의 코팅은 10ng/ml의 중화 항체를 검출할 수 있는 반면, 곡선의 전체적인 일관성은 100ng/ml로의 코팅으로 얻은 것보다 더 우수하였음을 나타내었다. 후속 인플릭시맙 코팅은 250ng/ml 이었다. TNF 결합의 최적의 차단 및 포화를 보장하기 위해 추가 조건을 평가하였다.

혈청 농도를 증가시키는 단계.

분석의 배경을 증가시키고 이의 재현성에 영향을 미치지 않으면서, 사용될 수 있는 혈청 농도의 한계를 결정하기 위해 상이한 혈청 희석 비를 시험하였다. 2% 내지 10% 사이의 혈청 농도를 시험하였고, 동일한 농도의 시판용 중화 항체로 스파이킹하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, 혈청 농도의 증가는 중화 정도에 크게 영향을 미치지 않으면서 결과의 재현성을 감소시켰다.

따라서, 하기의 실험은 1:20 희석액 (5%)에서 수행되었다. 스파이킹된 중화 항체의 5-10ng/ml의 농도가 이미 감소된 TNF 결합을 나타내는 관찰에 기초하여, 1:20 희석액은 환자의 혈청에서 100-200ng/ml의 농도에서 중화 항체의 검출을 가능하게 하는 것으로 가정되었다.

순수한 혈청에서 중화 활성에 대한 컷오프의 측정 단계

중화 활성 배경을 평가하고 진 양성 측정을 위한 컷오프를 측정하기 위해, 15명의 건강한 공여자의 혈청 시료를 시험하였고 결코 약물에 노출되지 않았다. 이들 시료에서 측정된 평균 항체 농도는 29ng/ml 이었고, 표준 편차는 16.3 이었다. 따라서, 원하는 신뢰 수준이 99.7% (정규 분포를 가정할 때, 평균 +/- 3 표준 편차)인 경우, 컷오프는 약 80ng/ml 이다.

실시예 2

특이적 중화 항-약물 항체만의 수준을 측정하는 단계: 환자의 혈청에서 검증 단계 및 약물에 대한 이후의 반응 상실의 예측

적당한 대조군과 함께 인플릭시맙으로 치료받은 환자의 혈청 시료에서 시험을 수행하였다. 시험은 환자의 혈청에 존재하는 중화 항체의 범위에서 가장 잘 수행되도록 미세 조정되었다. 상이한 방법 사이의 비교, 및 현재 치료된 환자로부터의 추가 시료를 허용하기 위하여, 환자의 집단은 상기에 나타난 바와 같이 본 발명자들에 의해 이전에 설계된 다른 중화 시험으로 이미 시험된 환자를 포함한다. 또한, 총 항체 수준의 면역 검출은 비교를 위해 람다 쇄 ELISA를 이용하여 수행된다. 혈청 약물 수준에 대한 방법의 내성을 시험하기 위해, 혈청의 일부를 스파이킹된 약물의 존재 하에 다시 시험하여, 결과에 미치는 영향을 평가한다.

결과는 초기 치료 시점으로부터 환자 혈청을 이용하여 이전 면역 분석법으로 생성된 결과와 비교된다. 환자들에서 높은 항체 역가의 후속 반응 상실 및 출현을 예측하기 위한 방법들과 새로운 분석법의 능력 사이의 일치성을 평가하기 위해 통계적 분석을 수행한다.

또한, 본 발명의 신규한 방법은 항-약물 항체가 항체의 람다 경쇄에 대한 항체를 이용하여 검출된 통상적인 "항-람다" 방법에 의해 분석될 때 항-약물 항체에 대해 모두 음성인, 하기에 나타낸 3가지 유형의 시료를 포함하는 혈청의 제 1 집단을 이용하여 다음에 평가되었다. 그러나, 이 방법은 카파 경쇄를 함유하는 항-약물 항체를 검출할 수 없다:

1. 중간에서 높은 수준의 인플릭시맙을 가진 환자의 시료 - 표 3에서 굵은 체로 표시된 혈청 번호.

2. 이들의 다음 방문에서 항-람다 방법 (결합 항체)에 의해 검출가능한 항체를 개발한 환자로부터의 시료 - 표 3에서 밑줄친 혈청 번호.

3. 검출가능한 항체를 개발하지 않은 감소하는 수준의 인플릭시맙 (중앙 컬럼에 이탤릭체로 표시된 1ug/ml 이하의 인플릭시맙 수준)을 갖는 환자로부터의 시료 - 표 3에서 이탤릭체로 표시된 혈청 번호.

시료의 중화 항체 측정값에 기초하여 시료를 분류하였다. 표 3에서 관찰될 수 있는 바와 같이, 중화 항체를 측정하는 단계는 항-람다 분석법에 의해 검출가능한 항체의 출현보다 항상 선행하는 것으로 보이지 않는다. 이 결과는 측정가능한 항체의 발달과 중화 항체의 초기 출현 사이에 관련이 없음을 나타낼 수 있다. 그러나, 이러한 항체의 검출을 방지하는 기계적 저해가 있을 수 있다. 이 단계에서, 적은 양의 항체는 이들 혈청 시료에서 여전히 이용가능한 약물에 결합될 수 있다. 이러한 경우, 항체는 시험된 시점에 존재하지만, 분석 약물에 자유롭게 결합하고 중화하지 않는다.

환자의 혈청에서 항-인플릭시맙 중화 항체의 측정

혈청 번호	인플릭시맙 수준	중화 항체 ng/ml
3105	MAX	0
4465	MAX	0
2566	MAX	0
408	18.2	0
3162	16.5	0
3234	16.4	0
2659	16.2	0
3586	11.4	0
1992	7.0	0
4386	6.4	0
1855	6.1	0
4460	4.1	0
4186	2.8	0
1039	2.8	0
4171	2.6	0
3661	0.3	0
1449	max	25
3753	0.9	25
4883	0.6	32
1564	1.6	33
3555	0.4	43
1619	0.6	49
1534	5.4	70
752	4.6	77
1285	0.2	77
1427	0.0	81
3526	1.0	93
1617	4.3	96
5118	0.0	100
1018	11.8	109
678	0.4	119
2093	0.6	123
3267	14.5	136
528	0.2	152
1308	0.0	186
1323	0.0	323

표 글꼴: 굵은: 높은 약물 수준, 다음 방문에서 Ab 개발 없음; 밑줄친: 항-람다 분석법에 의한 항체의 검출 전의 마지막 시점; 및 이탤릭체: 이후 항체 검출없이 약물 수준의 감소.

중화 활성의 출현은 항-람다 분석법 (표 3에서 이탤릭체)에 의해 측정된 항체의 이후의 출현없이 약물 수준이 떨어지기 시작한 대부분의 시료를 설명할 수 있다. 이것은 이들 환자가 기존의 이용가능한 분석법으로 치료에 고려되지 않을 면역 조절 약물의 첨가로부터 이익을 얻을 수 있는 유해한 항체를 개발한다는 것을 시사한다.

해리 단계의 추가

약물로부터 항체를 방출하고 이들을 플레이트-결합된 약물 중화에 이용가능하게 하는, 해리 단계의 추가가 평가된다. 이들의 중화 능력을 평가하기 전에 임의의 약물-항-약물-항체 복합체를 해리시키기 위하여, 시료를 300mM 아세트산으로 15분 동안 처리한다. 또한, 최근에 만들어진 항체가 중화 항체인지를 결정하기 위하여, 동일한 환자로부터의 하기 혈청 시료에서 중화 활성을 검사한다.

본 발명자들은 항-람다 분석법에 의해 측정가능한 항체를 개발하지만 반응이 느슨하지 않은 환자가 있는지를 분석한다. 이들 항체는 약물 활성 및 효율에 약간의 영향을 미쳐 중화되지 않을 수 있다. 이러한 환자는 이들의 치료 요법에 면역조절 약물의 첨가로부터 이익을 얻지 못할 수도 있다.

환자의 혈청에서 중화 활성의 연속 측정

각 환자의 혈청의 기준치 중화능(neutralizing capacity)이 다를 수 있기 때문에, 환자-대-환자 이종성(heterogeneity)이 중화 항체의 외관 및 상승을 모호하게 할 수 있다는 가설을 세웠으므로, 음성 혈청에 의한 표준화는 덜 적절할 수 있다. 따라서, 반응을 잃은 환자의 일련의 시료를 시험하였다. 환자는 람다 분석법에 의해 검출가능한 항-약물 항체를 개발하지 않았다. 표 4에 나타난 바와 같이, (치료 전) 기준치 수준과 비교하여, 중화 항체의 증가 추세는 반응을 잃은 환자에서 명백하였다. 따라서, 이들 결과는 생물학적 약물로 치료받은 환자에서 비-반응성을 예측하기 위해 본 발명의 방법을 이용하는 가능성을 확립한다.

여기에도, 이들의 혈청에 여전히 높은 수준의 인플릭시맙이 있을 때, 중화 활성이 조기에 검출될 수 있는지를 알아보기 위하여 해리 단계의 사용의 필요성을 조사한다.

환자의 혈청에서 중화 활성의 연속 측정

반응을 잃은 환자 치료 개시로부터의 주(week)	중화 항체	레미케이드(Remicade)	람다 분석법 측정 약물
0	-12.78	NA	NA	응급 수술
2	41.36	7	0
6	25.81	7.9	0
0	61.31	NA	NA	중단된 IFX
2	88.21	Max	0
6	70.61	9.2	0
14	159.91	3.3	0
22	11.06	1.8	0
35	46.07	0	0
0	92.77	NA	NA	단축된 간격
2	72.77	6.7	0
13	107.77	0	0
19	170.97	0	0.4
25	156.77	0	0
0	NA	NA	NA	35주 전 용량 상승
2	18.86	5.8	0
21	57.12	2.5	0
35	83.12	1.1	0
43	310.62	0	4.6
0	110.02	NA	NA	중단된 IFX. 임상적 반응 없음
2	172.22	7.4	0
14	208.12	0	0
0	-14.61	NA	NA	부작용 - 알러지
2	8.33	Max	0
6	52.61	4.2	0
14	51.41	1.1	0
22	191.71	0	0
0	92.61	NA	NA	중단된 IFX. 임상적 반응 없음
2	172.51	7.7	0
6	0.3	5.5	0
14	18	0.7	0
25	57.5	0.3	0
44	126.5	0.1	0
0	-15.3	NA	NA
2	-17.4	Max	0
14	-12.7	0.55	0.8

실시예 3

병렬 약물 수준 분석 설정, 표지된 표적을 판독값으로 이용, 및 환자의 혈청에서 이를 시험

혈청에서 중화 항체 분석의 시험과 동시에, 동일한 표지된 표적, 즉 표지된 TNFα를 갖는 유사한 형식이 혈청 약물 수준을 더 정확하게 정량하기 위해 사용된다. 측정된 수준은 사용된 약물 수준 측정 방법, 즉 표적 (TNFα) 코팅된 ELISA 플레이트에 결합하는 약물을 검출하기 위해 항-Fc를 이용한 약물 수준 측정 방법과의 일치에 대해 평가한다.

본 발명의 새로운 약물-수준 분석법에서, 시판용 항-약물 항체를 먼저 고체 매트릭스 상에 고정시킨다. 그 다음, 혈청을 첨가하여, 고정된 항체가 약물을 포획할 수 있게 한다. 세척 단계 후, 표지된 형태의 표적 (예를 들어, 인플릭시맙을 검출하는 경우 TNFα)을 첨가하여, 포획된 약물에 결합한다. 이후, 과량의 비결합된 표적을 씻어내고, 결합된 표적은 도 5에 나타난 바와 같이 측정한다.

ELISA에 의해 제 1 단계로서 수행되는 이 분석에서, 항-약물 결합 항체 (중화 항체와 대조적으로)가 코팅에 사용된다. 혈청 시료를 플레이트에 첨가하여 순환 약물을 결합된 항체에 결합시킬 수 있다. 알려진 표준 약물을 사용하여 표준 곡선을 만들고 정확한 혈청 약물 농도를 결정한다. 세척 단계 후, TNF는 포획된 약물에 의해 첨가 및 결합된 다음, HRP-표지된 항-TNF 항체에 의해 검출된다.

환자의 혈청에서 일반적으로 측정된 농도 범위에서 결과의 민감도 및 선형성 (linearity)을 보장하기 위해 상이한 조건을 시험하였다 (도 6a). 이 새로운 분석법 및 인플릭시맙 검출을 위한 항-Fc를 이용한 분석법을 이용하여 환자의 혈청에서 약물 수준을 측정하였다. 결과는 0.96의 상관 계수와 매우 일치하는 것으로 밝혀졌습니다 (도 6b).

실시예 4

중화 항체 및 약물 농도의 검출을 위한, ELISA 설정에 기초한 빠른 측면 유동 키트용 시제품(prototypes)의 개발

시판용 키트는 실험실의 빠른 측면 유동 분석법을 설정하는데 사용된다. 이러한 목적을 위해, TNFα는 금 또는 라텍스 표지와 결합하여 판독값으로 사용되며, 약물에 결합하는 표지된 분자의 능력을 먼저 ELISA 설정에서 및 그 다음에 빠른 측면 유동 설정에서 평가한다. 시판용 중화 항체, 또는 반응을 잃은 환자의 혈청으로부터 얻은 항체가 측면 유동 플랫폼에서 고정된 약물에 결합하기 위한 표지된 표적과 경쟁하기 위해 음성의 노출되지 않은 혈청으로 스파이킹된 능력을 검사한다. 약물 수준 측정에 대한 분석의 정확도는 음성 혈청으로 스파이킹된 상이한 농도의 약물을 이용하여 시험된다. 결과는 ELISA 설정 또는 환자의 약물 수준을 측정하기 위해 상용되는 방법과 비교된다.

실시예 5

환자의 혈청 및 전혈에서 빠른 측면 유동 설정 시험

빠른 측면 유동 분석법은 먼저 이의 중화 결합능에 대해 알려진 환자의 혈청으로 시험하고, 그 결과를 ELISA 기반 설정 결과와 비교한다. 또한, 이 방법은 전혈을 이용하여 직접 검사된다. 알려진 혈청 수준의 약물 및 중화 항체가 상이한 농도 및 항체-약물 비로 약물 및 시판용 중화 항체와 스파이킹된 신선한 전혈에 의해 응결된, 환자로부터의 혈액 시료에 대한 모델이, 모델로 사용된다. 결과는 음성 혈청에서 스파이킹하는 동일한 것과 비교된다. 시판용 항체로 키트를 검증한 후, 중화 항체가 생긴 것으로 확인된 환자의 신선한 혈액 시료를 사용한다 (사전동의 후).

SEQUENCE LISTING <110> RAMBAM MED-TECH LTD. <120> ASSAYS FOR ASSESSING NEUTRALIZING ANTIBODIES LEVELS IN SUBJECTS TREATED WITH A BIOLOGICAL DRUG AND USES THEREOF IN PERSONALIZED MEDICINE <130> 2565151 <150> US 62/530,310 <151> 2017-07-10 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> TNF-alpha Accession number NP_000585.2 <400> 1 Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala 1 5 10 15 Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe 20 25 30 Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe 35 40 45 Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro 50 55 60 Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser 65 70 75 80 Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro 85 90 95 Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu 100 105 110 Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser 115 120 125 Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly 130 135 140 Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala 145 150 155 160 Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro 165 170 175 Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu 180 185 190 Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu 195 200 205 Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly 210 215 220 Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 225 230 <210> 2 <211> 702 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> TNF-alpha Accession number NM_000594.3 <400> 2 atgagcactg aaagcatgat ccgggacgtg gagctggccg aggaggcgct ccccaagaag 60 acaggggggc cccagggctc caggcggtgc ttgttcctca gcctcttctc cttcctgatc 120 gtggcaggcg ccaccacgct cttctgcctg ctgcactttg gagtgatcgg cccccagagg 180 gaagagttcc ccagggacct ctctctaatc agccctctgg cccaggcagt cagatcatct 240 tctcgaaccc cgagtgacaa gcctgtagcc catgttgtag caaaccctca agctgagggg 300 cagctccagt ggctgaaccg ccgggccaat gccctcctgg ccaatggcgt ggagctgaga 360 gataaccagc tggtggtgcc atcagagggc ctgtacctca tctactccca ggtcctcttc 420 aagggccaag gctgcccctc cacccatgtg ctcctcaccc acaccatcag ccgcatcgcc 480 gtctcctacc agaccaaggt caacctcctc tctgccatca agagcccctg ccagagggag 540 accccagagg gggctgaggc caagccctgg tatgagccca tctatctggg aggggtcttc 600 cagctggaga agggtgaccg actcagcgct gagatcaatc ggcccgacta tctcgacttt 660 gccgagtctg ggcaggtcta ctttgggatc attgccctgt ga 702

Claims (50)

1. 생물학적 약물로 치료받은 피험자의 생물학적 시료에서 중화 항-약물 항체 (nADA)의 수준을 측정하는 방법으로서,
   상기 방법은
   a. 상기 생물학적 시료를 고체 지지체 상에 직접적으로 또는 간접적으로 고정된 상기 생물학적 약물과 함께 배양하는 단계;
   b. 단계 (a)의 배양된 시료를 상기 생물학적 약물의 표적과 함께 제공하고, 표적을 상기 고정된 약물과 함께 배양하는 단계;
   c. 상기 고정된 약물에 결합된 상기 표적의 양을 측정하는 단계로서, 상기 양은 생물학적 시료에 존재하는 중화 항-약물 항체의 수준을 나타내는 것을 특징으로 하는, 단계;를
   포함하는, 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 생물학적 약물은 생물학적 표적에 대한 항체인 것을 특징으로 하는, 방법.
3. 제 1항 내지 제 2항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 표적은 사이토카인인 것을 특징으로 하는, 방법.
4. 제 3항에 있어서, 상기 사이토카인은 종양 괴사 인자 알파 (TNFα)인 것을 특징으로 하는, 방법.
5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물은 인플릭시맙, 에타너셉트, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골, 골리무맙, 임의의 바이오시밀러 및 이들의 임의의 조합 중 적어도 하나인 것을 특징으로 하는, 방법.
6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적은 적어도 하나의 검출가능한 부분과 직접적으로 또는 간접적으로 관련되는 것을 특징으로 하는, 방법.
7. 제 6항에 있어서, 상기 검출가능한 부분은 전도성, 전기화학적, 형광성, 화학 발광, 효소적, 방사성, 자성, 금속 및 비색 표지(colorimetric label) 중 적어도 하나, 또는 이들의 임의의 조합인 것을 특징으로 하는, 방법.
8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험자는 면역-매개 장애를 앓고 있는 것을 특징으로 하는, 방법.
9. 제 8항에 있어서, 상기 면역-매개 장애는 염증성 질환, 자가면역 질환 및 증식성 장애 중 적어도 하나인 것을 특징으로 하는, 방법.
10. 제 9항에 있어서, 상기 염증성 질환은 염증성 장 질환 (IBD)인 것을 특징으로 하는, 방법.
11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈청 및 전혈 시료 중 어느 하나, 또는 이의 임의의 분획물 또는 제제인 것을 특징으로 하는, 방법.
12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물은 2개의 카파 경쇄를 포함하는 단일클론 항체이고, 상기 방법은 제 2의 검출가능한 부분과 관련된 항-람다 쇄 항체와 함께, 단계 (a) 또는 단계 (b)에 의해 얻어진 상기 배양된 시료를 제공하는 단계, 상기 표지된 항-람다 쇄 항체를 고정된 약물과 함께 배양하는 단계, 및 상기 제 2의 검출가능한 부분의 양을 측정하는 단계에 의해, 상기 생물학적 시료에서 중화 및 비-중화 항-약물 항체의 수준을 측정하는 단계를 더 포함하며, 상기 양은 생물학적 시료에 존재하는 중화 및 비-중화 람다 쇄 ADAs의 수준을 나타내는 것을 특징으로 하는, 방법.
13. 질환 진행 및 질환 재발의 조기 예후를 모니터링하기 위해, 생물학적 약물로 치료받은 피험자의 반응성을 평가하기 위한 예후 방법으로서,
    상기 방법은
    a. 상기 피험자의 적어도 하나의 생물학적 시료에서 nADA의 수준을 측정함으로써, 시료의 nADA 값을 얻는 단계;
    b. 단계 (a)에서 얻은 nADA 값이 미리측정된 표준 nADA 값 또는 적어도 하나의 대조군 시료에서의 nADA 값에 대해 양성 또는 음성 중 어느 하나인지를 결정하는 단계;
    c. 상기 피험자를 비-응답자 또는 응답자로 분류하는 단계로서, 상기 시료의 양성 nADA 값은, 상기 피험자가 상기 생물학적 약물 치료에 대한 비-반응성과 관련된 미리-확립된(pre-established) 집단에 속한다는 것을 나타내고, 상기 시료의 음성 nADA 값은, 상기 피험자가 상기 생물학적 약물 치료에 대한 반응성과 관련된 미리-확립된 집단에 속함으로써, 상기 치료 요법에 대한 포유류 피험자의 반응성을 예측, 평가 및 모니터링한다는 것을 나타내는 것을 특징으로 하는, 단계;를
    포함하는, 예후 방법.
14. 제 13항에 있어서, 상기 적어도 하나의 생물학적 시료에서 nADA의 수준을 측정하는 단계는
    a. 상기 생물학적 시료를 고체 지지체 상에 직접적으로 또는 간접적으로 고정된 생물학적 약물과 함께 배양하는 단계;
    b. 단계 (a)의 배양된 시료를 상기 생물학적 약물의 표적과 함께 제공하고, 표적을 고정된 약물과 함께 배양하는 단계;
    c. 상기 고정된 약물에 결합된 상기 표적의 양을 측정하는 단계로서, 상기 양은 생물학적 시료에 존재하는 nADAs의 수준을 나타내는 것을 특징으로 하는, 단계;에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 예후 방법.
15. 제 14항에 있어서, 질환 진행을 모니터링하기 위해, 방법은
    d. 단계 (a) 내지 (c)를 반복하여 적어도 하나 이상의 일시적으로 분리된 시료에 대한 nADA 값을 얻는 단계;
    e. 상기 일시적으로 분리된 시료들 사이의 상기 nADA 값의 변화율을 계산하는 단계;
    f. 단계 (e)에서 얻은 변화율 값이 미리측정된 표준 변화율 값 또는 적어도 하나의 대조군 시료에서 nADA에 대해 계산된 변화율 값에 대해 양성 또는 음성인지를 결정하는 단계;를 포함하고,
    양성 변화율 값은, 상기 피험자가 상기 치료 또는 재발에 대한 반응 상실 (LOR), 부적절한 반응, 불내증 중 적어도 하나와 관련된 미리-확립된 비-반응성 집단에 속함으로써, 질환 진행을 모니터링하거나 또는 질환 재발에 대한 조기 예후를 제공함을 나타내는 것을 특징으로 하는, 예후 방법.
16. 제 13항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 약물은 생물학적 표적에 대한 항체인 것을 특징으로 하는, 예후 방법.
17. 제 13항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 표적은 사이토카인인 것을 특징으로 하는, 예후 방법.
18. 제 17항에 있어서, 상기 사이토카인은 TNFα인 것을 특징으로 하는, 예후 방법.
19. 제 18항에 있어서, 상기 약물은 인플릭시맙, 에타너셉트, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골, 골리무맙, 임의의 바이오시밀러 및 이들의 임의의 조합 중 적어도 하나인 것을 특징으로 하는, 예후 방법.
20. 제 13항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적은 적어도 하나의 검출가능한 부분과 직접적으로 또는 간접적으로 관련되는 것을 특징으로 하는, 예후 방법.
21. 제 20항에 있어서, 상기 검출가능한 부분은 전도성, 전기화학적, 형광성, 화학 발광, 효소적, 방사성, 자성, 금속 및 비색 표지 중 적어도 하나, 또는 이들의 임의의 조합인 것을 특징으로 하는, 예후 방법.
22. 제 13항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험자는 면역-매개 장애를 앓고 있는 것을 특징으로 하는, 예후 방법.
23. 제 22항에 있어서, 상기 면역-매개 장애는 IBD인 것을 특징으로 하는, 예후 방법.
24. 제 13항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물은 2개의 카파 경쇄를 포함하는 단일클론 항체이고, 상기 방법은 제 2의 검출가능한 부분과 관련된 항-람다 쇄 항체와 함께, 단계 (a) 또는 단계 (b)의 상기 배양된 시료를 제공하는 단계, 상기 표지된 항-람다 쇄 항체를 고정된 약물과 함께 배양하는 단계, 및 상기 제 2의 검출가능한 부분의 양을 측정하는 단계에 의해, 상기 생물학적 시료에서 중화 및 비-중화 항-약물 항체의 수준을 측정하는 단계를 더 포함하며, 상기 양은 생물학적 시료에 존재하는 중화 및 비-중화 람다 쇄 ADAs의 수준을 나타내는 것을 특징으로 하는, 예후 방법.
25. 제 13항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 약물로 치료받은 피험자의 생물학적 시료에서 활성 생물학적 약물의 수준을 측정하는 단계를 더 포함하며, 활성 약물의 수준을 측정하는 단계는
    a. 상기 시료를 상기 생물학적 약물에 특이적인 적어도 하나의 비-중화 항체와 함께 배양하는 단계로서, 상기 비-중화 항체는 고체 지지체에 고정되는 것을 특징으로 하는, 단계;
    b. 단계 (a)의 배양된 시료를 상기 생물학적 약물의 표적과 함께 제공하는 단계로서, 상기 표적은 적어도 하나의 검출가능한 부분과 직접적으로 또는 간접적으로 관련되는 것을 특징으로 하는, 단계;
    c. 상기 검출가능한 부분을 검출하여 상기 표적의 양을 측정하는 단계로서, 상기 양은 생물학적 시료에 존재하는 활성 약물의 수준을 나타내는 것을 특징으로 하는, 단계;를
    포함하는 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 예후 방법.
26. 면역-매개 장애를 앓고 있는 피험자의 치료 요법을 결정하는 방법으로서,
    상기 방법은
    a. 상기 피험자의 적어도 하나의 생물학적 시료에서 nADA의 수준을 측정함으로써, 시료의 nADA 값을 얻는 단계;
    b. 단계 (a)에서 얻은 nADA 값이 미리측정된 표준 nADA 값 또는 적어도 하나의 대조군 시료에서의 nADA 값에 대해 양성 또는 음성 중 어느 하나인지를 결정하는 단계;
    c. 상기 피험자의 치료 요법을 결정하는 단계로서,
    (i) 상기 시료의 양성 nADA 값은, 상기 피험자가 상기 생물학적 약물 치료에 대한 반응 상실 (LOR), 부적절한 반응 및 불내증 중 적어도 하나와 관련된 미리-확립된 집단에 속한다는 것을 나타내며, 피험자는 상기 치료 및/또는 면역억제제의 투여를 유지하지 않는 것이 권장되고;
    (ii) 상기 시료의 음성 nADA 값은, 상기 피험자가 상기 생물학적 약물 치료에 대한 반응성과 관련된 미리-확립된 집단에 속한다는 것을 나타내며, 피험자는 상기 치료를 유지하는 것이 권장되는, 단계;를
    포함하는, 방법.
27. 제 26항에 있어서, 상기 적어도 하나의 생물학적 시료에서 nADA의 수준을 측정하는 단계는
    a. 상기 생물학적 시료를 고체 지지체 상에 직접적으로 또는 간접적으로 고정된 상기 생물학적 약물과 함께 배양하는 단계;
    b. 단계 (a)의 배양된 시료를 상기 생물학적 약물의 표적과 함께 제공하고 표적을 고정된 약물과 함께 배양하는 단계;
    c. 상기 고정된 약물에 결합된 상기 표적의 양을 측정하는 단계로서, 상기 양은 생물학적 시료에 존재하는 중화 항-약물 항체의 수준을 나타내는 것을 특징으로 하는, 단계;에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
28. 생물학적 약물로 치료받은 피험자의 생물학적 시료에서 nADAs 검출용 장치로서, 장치는
    a. 상기 생물학적 약물의 생물학적 표적을 포함하는 표지 조성물로서, 상기 표적은 상기 생물학적 약물을 특이적으로 인식하고 결합하는, 표지 조성물;
    b. 고체 지지체 상에 직접적으로 또는 간접적으로 고정된 상기 생물학적 약물을 포함하는 포획-조성물; 및
    c. 상기 생물학적 시료의 수용 및 수송에 적합한 고체 지지체를 포함하는, 장치.
29. 제 28항에 있어서, 상기 장치는
    a. 상기 생물학적 시료의 수용 및 수송에 적합한 고체 지지체;
    b. 상기 생물학적 약물의 생물학적 표적을 포함하는 표지 조성물로서, 상기 표적은 상기 생물학적 약물을 특이적으로 인식하고 결합하며, 상기 표지 조성물은 상기 고체 지지체에서 시료 적용 구역(zone)으로부터 포획 구역으로의 유동 경로에서 미리측정된 특정 개시 구역에 위치하는, 표지 조성물; 및
    c. 고체 지지체 상에 직접적으로 또는 간접적으로 고정된 상기 생물학적 약물을 포함하는 포획-조성물로서, 상기 포획-조성물은 상기 고체 지지체의 말단 구역(termination zone)의 미리측정된 위치에서 상기 고체 지지체에 부착되는, 포획-조성물;을 포함하는 측면 유동 장치인 것을 특징으로 하는, 장치.
30. 제 28항 및 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 약물은 생물학적 표적에 대한 항체인 것을 특징으로 하는, 장치.
31. 제 28항 내지 제 30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 표적은 TNFα인 것을 특징으로 하는, 장치.
32. 제 31항에 있어서, 상기 약물은 TNFα에 특이적인 항체이고, 상기 약물은 인플릭시맙, 에타너셉트, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골, 골리무맙, 이들의 임의의 바이오시밀러 및 이들의 임의의 조합 중 적어도 하나인 것을 특징으로 하는, 장치.
33. 제 28항 내지 제 32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적은 적어도 하나의 검출가능한 부분과 직접적으로 또는 간접적으로 관련되는 것을 특징으로 하는, 장치.
34. 제 33항에 있어서, 상기 검출가능한 부분은 전도성, 전기화학적, 형광성, 화학 발광, 효소적, 방사성, 자성, 금속 및 비색 표지 중 적어도 하나, 또는 이들의 임의의 조합인 것을 특징으로 하는, 장치.
35. 제 28항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장치는 고체 지지체 상에 직접적으로 또는 간접적으로 고정된 상기 생물학적 약물에 특이적인 적어도 하나의 비-중화 항체를 포함하는 제 2 포획-조성물을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 장치.
36. a. 고체 지지체 상에 직접적으로 또는 간접적으로 고정된 생물학적 약물;
    b. 상기 생물학적 약물의 생물학적 표적; 및
    임의로
    c. 사용 설명서;
    d. 표준 곡선 또는 대조군 시료;
    e. 임의로 제 2의 검출가능한 부분과 관련된, 적어도 하나의 항-람다 쇄 항체;
    f. 상기 생물학적 약물에 특이적인 적어도 하나의 비-중화 항체로서, 상기 비-중화 항체는 고체 지지체 상에 직접적으로 또는 간접적으로 고정되는, 비-중화 항체; 중 적어도 하나를 포함하는, 키트.
37. 제 36항에 있어서, 상기 생물학적 약물은 생물학적 표적에 대한 항체인 것을 특징으로 하는, 키트.
38. 제 37항에 있어서, 상기 생물학적 표적은 사이토카인인 것을 특징으로 하는, 키트.
39. 제 38항에 있어서, 상기 사이토카인은 TNFα인 것을 특징으로 하는, 키트.
40. 제 36항 내지 제 39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약물은 인플릭시맙, 에타너셉트, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골, 골리무맙, 임의의 바이오시밀러 및 이들의 임의의 조합 중 적어도 하나인 것을 특징으로 하는, 키트.
41. 제 36항 내지 제 40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적은 적어도 하나의 검출가능한 부분과 직접적으로 또는 간접적으로 관련되는 것을 특징으로 하는, 키트.
42. 제 41항에 있어서, 상기 검출가능한 부분은 전도성, 전기화학적, 형광성, 화학 발광, 효소적, 방사성, 자성, 금속 및 비색 표지 중 적어도 하나, 또는 이들의 임의의 조합인 것을 특징으로 하는, 키트.
43. 제 36항 내지 제 42항 중 어느 한 항에 있어서, 제 28항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 따른 장치를 포함하는, 키트.
44. 제 36항 내지 제 43항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 진행 및 질환 재발의 조기 예후를 모니터링하기 위해, 생물학적 약물로 치료받은 피험자의 반응성을 예측 및 평가하는데 사용하기 위한, 키트.
45. 생물학적 약물로 치료받은 피험자의 생물학적 시료에서 활성 생물학적 약물의 수준을 측정하는 방법으로서,
    방법은
    a. 상기 시료를 상기 생물학적 약물에 특이적인 적어도 하나의 비-중화 항체와 함께 배양하는 단계로서, 상기 비-중화 항체는 고체 지지체에 고정되는 것을 특징으로 하는, 단계;
    b. 단계 (a)의 배양된 시료를 상기 생물학적 약물의 표적과 함께 제공하는 단계로서, 상기 표적은 적어도 하나의 검출가능한 부분과 직접적으로 또는 간접적으로 관련되는 것을 특징으로 하는, 단계;
    c. 상기 검출가능한 부분을 검출하여 상기 표적의 양을 측정하는 단계로서, 상기 양은 생물학적 시료에 존재하고 고정된 비-중화 항체에 부착된 활성 약물의 수준을 나타내는 것을 특징으로 하는, 단계;를 포함하는, 방법.
46. 제 45항에 있어서, 상기 검출가능한 부분은 전도성, 전기화학적, 형광성, 화학 발광, 효소적, 방사성, 자성, 금속 및 비색 표지 중 적어도 하나, 또는 이들의 임의의 조합인 것을 특징으로 하는, 방법.
47. 제 45항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 약물은 생물학적 표적에 대한 항체이고, 상기 생물학적 표적은 사이토카인인 것을 특징으로 하는, 방법.
48. 제 47항에 있어서, 상기 사이토카인은 TNFα이고, 상기 약물은 TNFα에 특이적인 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는, 방법.
49. 제 45항 내지 제 48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험자는 면역-매개 장애를 앓고 있는 것을 특징으로 하는, 방법.
50. 제 49항에 있어서, 상기 면역-매개 장애는 IBD인 것을 특징으로 하는, 방법.

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