KR20200041377A - Strep-tag 특이적 결합 단백질 및 그 용도 - Google Patents

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링펑 리우
스탠리 알. 리델
벤자민 호프스트롬
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프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터
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Abstract

본 개시는 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩티드와 같은 strep tag 펩티드에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 결합 단백질 및 융합 단백질을 제공한다. 치료 세포가 tag 펩티드를 발현하는, 세포 면역요법에 개시된 조성물을 사용하는 방법이 또한 제공된다.

Description

STREP-TAG 특이적 결합 단백질 및 그 용도
관련 출원(들)에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 9월 6일자로 출원된 미국 특허 출원 제62/555,017호의 우선권 이익을 청구하며, 이는 본원에서 완전히 제시된 것처럼 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록에 관한 진술
본 출원과 관련된 서열 목록은 종이 카피 대신 텍스트 형식으로 제공되며, 본원에 참조로 포함된다. 서열 목록을 포함하는 텍스트 파일명은 360056_451WO_SEQUENCE_LISTING.txt이다. 텍스트 파일은 28.9KB이고 2018년 9월 3일에 작성되었으며 EFS-Web을 통해 전자적으로 제출되었다.
재조합 단백질 및 이를 발현하는 세포는 보통 재조합 단백질에 융합된 합성 태그 펩티드를 사용하여 검출, 분류 및 정제된다. 예를 들어, 합성 Strep®-Tag II 펩티드는 관심 단백질에 쉽게 융합될 수 있고 고 친화성으로 조작된 스트렙타비딘 유도체 Strep-Tactin®에 결합할 수 있다. Strep-Tag® 시스템은 Strep-Tactin® 함유 기질 (전형적으로 자성 나노비드 또는 수지임)에 결합하여 Strep-태그-표지 단백질 및 세포의 분리 및 친화성 정제를 허용한다.
그러나, 면역요법에 사용되는 태그 단백질 및 세포를 검출 및 조작하는 것과 같이 시험관 내 및 생체 내 적용을 위해 표적 분자의 태깅 (tagging) 잠재력을 보다 완전히 활용하기 위해서는 추가 기능을 갖는 Strep-Tag® 결합 시약이 필요하다. 본원에 개시된 구체예는 이러한 요구를 해결하고 다른 관련 이점을 제공한다.
도 1A 및 1B는 STII-태그된 CAR T 세포에 결합하는 뮤린 항-Strep® II (STII) 모노클로날 항체의 특성을 보여준다. (A) STII-태그된 CAR T 세포에 대한 항-STII 모노클로날 항체에 의한 특이적 결합을 나타내는 유세포 분석 데이터. (B) 5G2 mAb 및 4E2 mAb의 이소형을 나타내는 IsoStripTM.
도 2A 내지 2D는 STII-태그된 항-CD19 CAR T 세포를 수용하는 B 세포-결여 마우스에 본 개시의 항-STII 모노클로날 항체를 투여한 생체 내 실험으로부터의 데이터를 나타낸다. (A) 항-STII mAb를 사용한 B 세포 구조에 대한 실험 계획. (B) 주입 7일 전에 마우스 T 세포에 의한 STII-태그된 CAR의 발현을 나타내는 유세포 분석 데이터. 상단 열: 하나 (1)의 STII 태그를 포함하는 CAR 작제물의 발현. 중간 열: 세 개 (3)의 STII 태그를 포함하는 CAR. 하단 열: 형질도입되지 않은 세포. CD19, CD45.1, EGFR 및 STII에 대해 세포를 염색하였다. (C) 항-CD19-1STII CAR T 세포에 이어 항-STII mAb로 처리된 마우스에서 B 세포 회수를 나타내는 유세포 분석 데이터. (D) 항-CD19-3STII CAR T 세포에 이어 항-STII mAb로 처리된 마우스에서 B 세포 회수를 나타내는 유세포 분석 데이터.
도 3A는 (위에서 아래로) 대조군 마이크로비드; 0.1, 0.3 또는 0.5 μg 항-STII mAb로 코팅된 마이크로비드; 또는 항-STII mAb/항-CD28mAb (모두 0.3 μg)로 코팅된 마이크로비드를 사용하여 태그된 CAR T 세포의 확장을 보여주는 예시적인 유세포 분석 데이터를 제공한다. 도 3B는 지시된 양의 항체로 코팅된 마이크로비드와 접촉된 세포에 의한 IL-2 (상부) 및 IFN-γ (하부) 방출을 나타낸다.
도 4A는 메모에 지시된 바와 같이 코팅된 마이크로비드로 1, 2 또는 3회 (좌에서 우로) 라운드 자극 후 STII-태그된 CAR T 세포의 확장을 보여주는 데이터를 제공한다. 도 4B는 자극 전 및 1, 2 또는 3 라운드의 자극 후 태그된 CD8+ 및 CD4+ CAR T 세포에 의한 지시된 T 세포 마커의 발현을 보여준다. STII; CD45RO; CD62L; CD28L; CTLA4; 및 PD1에 대한 항체를 사용하여 세포를 염색하였다.
상세한 설명
본 개시는 Strep®-Tag II (WSHPQFEK, 서열 번호 19)를 포함하거나 발현하는 재조합 단백질 및 숙주 세포를 식별, 분류, 추적 및 선택적으로 조절하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 예를 들어, 입양 세포 요법을 위한 태그된 면역 세포를 조절하는데 유용한 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질 및 이를 발현하는 숙주 세포가 제공된다.
배경으로, 유전자 변형된 T 세포의 입양 전달은 다양한 악성 종양에 대한 강력한 치료법으로 등장했다. 가장 널리 사용되는 전략은 종양 관련 항원을 표적으로하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 환자 유래 T 세포의 주입이다. 이 접근법은 T 세포를 세포 표면 항원에 표적화하고, 종양 탈출 메커니즘으로서 주요 조직적합성 복합체의 손실을 피하고, 인간 백혈구 항원 (HLA) 반수체형에 관계없이 임의의 환자를 치료하기 위해 단일 벡터 작제물을 이용하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, B-세포 비호지킨 림프종 (NHL)에 대한 CAR 임상 시험은 현재까지 악성 림프계 세포뿐만 아니라 정상 B 세포에서도 발현되는 표적화된 CD19, CD20 또는 CD22 항원을 가지고 있다 (Brentjens et al., Sci Transl Med 2013;5(177):177ra38; Haso et al., Blood 2013;121(7):1165-74; James et al., J Immunol 2008;180(10):7028-38; Kalos et al., Sci Transl Med 2011;3(95):95ra73; Kochenderfer et al., J Clin Oncol 2015;33(6):540-9; Lee et al., Lancet 2015;385(9967):517-28; Porter et al., Sci Transl 25 Med 2015;7(303):303ra139; Savoldo et al., J Clin Invest 2011;121(5):1822-6; Till et al., Blood 2008;112(6):2261-71; Till et al., Blood 2012;119(17):3940-50; Coiffier et al., N Engl J Med 2002;346(4):235-42).
입양 세포 요법을 위한 도구는 PCT 공개 제WO 2015/095895호 (태그된 이펙터 분자가 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 것과 같은 태그된 키메라 이펙터 분자를 포함한다. 이 개시에서, 높은 특이성 및 충실도로 태그된 분자를 발현하는 세포를 식별 및 조절 (예를 들어, 활성화, 증식 유도, 손상 또는 사멸)할 수 있는 것으로 밝혀진 면역글로불린 결합 단백질이 생성되었다.
본 발명을 보다 상세히 기재하기에 앞서, 본원에서 사용될 특정 용어의 정의를 제공하는 것이 본원의 이해에 유용할 수 있다. 추가 정의는 본원 전반에 걸쳐 기재되어 있다.
본원에서, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위, 또는 정수 범위는 달리 표시되지 않는 한 기재된 범위 내의 임의의 정수값과, 필요하다면 이의 분수 (예컨대, 정수의 10분의 1과 100분의 1)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 물리적 특성, 예컨대 중합체 서브유닛, 크기 또는 두께와 관련하여 본원에 기재된 임의의 수치 범위는, 달리 표시되지 않는 한, 기재된 범위 내의 임의의 정수를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용된 "약"이란 용어는, 달리 표시되지 않는 한, 표시된 범위, 값 또는 구조의 ±20%를 의미한다. 본원에 사용된 용어 "하나"란 용어는 열거된 성분의 "하나 또는 그 이상"을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 대안 (예를 들어, "또는")의 사용은 대안 중 하나, 둘 다 또는 이의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포함한다", "갖는다" 및 "구성한다"는 동의적으로 사용되고, 이의 용어 및 변형태는 비제한적인 것으로 해석되도록 의도된다.
"임의적" 또는 "임의로"는 이후에 설명되는 요소, 구성 요소, 이벤트 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않을 수 있으며, 설명은 요소, 구성 요소, 이벤트 또는 상황이 발생하는 경우와 발생하지 않는 경우를 포함함을 의미한다.
또한, 본원에 기술된 구조 및 서브유닛의 다양한 조합으로부터 유래된 개별 작제물 또는 작제물 그룹은 각각의 작제물 또는 작제물 그룹이 개별적으로 기재된 것과 동일한 정도로 본 출원에 개시되어 있는 것으로 이해하여야 한다. 따라서, 특정 구조 또는 특정 서브유닛의 선택은 본 발명의 범위 내에 있다.
용어 "본질적으로 이루어지는"은 "포함하는"과 동등하지 않고, 청구항의 명시된 물질 또는 단계, 또는 청구 대상의 기본 특성에 실질적으로 영향을 주지 않는 것을 지칭한다. 예를 들어, 단백질 도메인, 영역 또는 모듈 (예를 들어, 결합 도메인, 힌지 영역, 링커 모듈) 또는 (하나 이상의 도메인, 영역 또는 모듈을 가질 수 있는) 단백질은 도메인, 영역, 모듈 또는 단백질의 아미노산 서열이 조합해서 도메인, 영역, 모듈 또는 단백질 길이의 최대 20% (예를 들어, 최대 15%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%)에 기여하고 도메인(들), 영역(들), 모듈(들) 또는 단백질의 활성도 (예를 들어, 결합 단백질의 표적 결합 친화도)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 (즉, 50%를 초과하여 활성도를 감소하지 않는, 예컨대 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 1% 이하) 연장, 결실, 돌연변이, 또는 이들의 조합 (예를 들어, 아미노- 또는 카복시-말단 또는 도메인 사이의 아미노산)을 포함할 경우 특정한 아미노산 서열로 "본질적으로 이루어진다".
본원에 사용된 "아미노산"은 자연 발생 및 합성 아미노산뿐만 아니라 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연 발생 아미노산은 유전자 코드에 의해 암호화되는 아미노산뿐만 아니라 나중에 변형된 아미노산, 예를 들어 하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 지연 발생 아미노산과 동일한 기본적 화학 구조, 즉 수소, 카복실기, 아미노기 및 R기와 결합한 α-탄소를 가지는 화합물, 예를 들어 호모세린, 노르류신, 메티오닌 설폭시드, 메티오닌 메틸설포늄을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R기 (예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 백본을 가지지만, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반적인 화학 구조와 다른 구조를 가지지만 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 화학적 화합물을 지칭한다.
본원에 사용된 "돌연변이"는 각각 참조 또는 야생형 핵산 분자 또는 폴리펩티드 분자와 비교하여 핵산 분자 또는 폴리펩티드 분자의 서열에서의 변화를 지칭한다. 돌연변이는 뉴클레오티드(들) 또는 아미노산(들)의 치환, 삽입 또는 결실을 포함하여 몇 가지 상이한 유형의 서열 변화를 야기할 수 있다.
"보존적 치환"은 특정 단백질의 결합 특성에 유의적으로 영향을 주지 않거나 변경시키지 않는 아미노산 치환을 의미한다. 일반적으로, 보존적 치환은 치환된 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 보존적 치환은 다음 그룹 중 하나에서 발견되는 치환을 포함한다: 그룹 1: 알라닌 (Ala 또는 A), 글리신 (Gly 또는 G), 세린 (Ser 또는 S), 트레오닌 (Thr 또는 T); 그룹 2: 아스파르트산 (Asp 또는 D), 글루탐산 (Glu 또는 Z); 그룹 3: 아스파라긴 (Asn 또는 N), 글루타민 (Gln 또는 Q); 그룹 4: 아르기닌 (Arg 또는 R), 리신 (Lys 또는 K), 히스티딘 (His 또는 H); 그룹 5: 이소류신 (Ile 또는 I), 류신 (Leu 또는 L), 메티오닌 (Met 또는 M), 발린 (Val 또는 V); 및 그룹 6: 페닐알라닌 (Phe 또는 F), 티로신 (Tyr 또는 Y), 트립토판 (Trp 또는 W). 부가적으로 또는 대안으로, 아미노산은 유사한 기능, 화학적 구조 또는 조성 (예를 들어, 산성, 염기성, 지방족, 방향족 또는 황 함유)에 의해 보존적 치환기 그룹들로 그룹화될 수 있다. 예를 들어, 지방족 그룹은 치환을 위해 Gly, Ala, Val, Leu 및 Ile을 포함할 수 있다. 다른 보존적 치환 그룹은 다음을 포함한다: 황 함유: Met 및 시스테인 (Cys 또는 C); 산성: Asp, Glu, Asn 및 Gln; 작은 지방족, 비극성 또는 약간 극성인 잔기: Ala, Ser, Thr, Pro 및 Gly; 음으로 하전된 극성 잔기 및 그들의 아미드: Asp, Asn, Glu 및 Gln; 양으로 하전된 극성 잔기: His, Arg 및 Lys; 큰 지방족, 비극성 잔기: Met, Leu, Ile, Val 및 Cys; 및 큰 방향족 잔기: Phe, Tyr 및 Trp. 추가 정보는 [Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company]에서 찾을 수 있다.
본원에서 사용된 "단백질" 또는 "폴리펩티드는 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 단백질은 자연 발생 아미노산 중합체뿐만 아니라 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산 및 비자연 발생 아미노산 중합체의 인공 화학 모방체인 아미노산 중합체에 적용된다. 폴리펩티드는 태그, 라벨, 생물활성 분자 또는 이들의 임의의 조합과 같은 다른 구성 요소 (예를 들어, 공유결합)을 추가로 함유할 수 있다. 특정 구체예에서, 폴리펩티드는 단편일 수 있다. 본원에 사용된 "단편"은 참조 서열에서 발견되는 하나 이상의 아미노산이 결여된 폴리펩티드를 의미한다. 단편은 참조 서열에서 발견되는 결합 도메인, 항원 또는 에피토프를 포함할 수 있다. 기준 폴리펩티드의 단편은 참조 서열의 아미노산 서열의 적어도 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 아미노산을 가질 수 있다.
본원에서 사용된 "융합 단백질"은 단쇄에 적어도 2개의 별개의 도메인을 가지며, 여기서 도메인은 단백질에서 함께 자연적으로 발견되지 않는 단백질을 지칭한다. 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 PCR, 재조합적으로 조작된 것 등을 사용하여 작제될 수 있거나 또는 이러한 융합 단백질은 합성될 수 있다. 융합 단백질은 태그, 링커 모듈 또는 형질도입 마커와 같은 다른 성분을 추가로 함유할 수 있다. 특정 구체예에서, 숙주 세포 (예를 들어, T 세포)에 의해 발현되거나 생성된 융합 단백질은 세포 표면에 위치하고, 이 경우 융합 단백질은 (예를 들어, 막관통 도메인을 통해) 세포막에 고정되고 세포 외 부분 (예를 들어, 결합 도메인 포함) 및 세포 내 부분 (예를 들어, 신호 도메인, 이펙터 도메인, 공동 자극 도메인 또는 이들의 조합 포함)을 포함한다.
"핵산 분자" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 천연 서브유닛 (예를 들어, 퓨린 또는 피리미딘 염기) 또는 비천연 서브유닛 (예를 들어, 모르폴린 고리)로 구성될 수 있는 공유 결합된 뉴클레오티드를 포함하는 중합 화합물을 지칭한다. 퓨린 염기는 아데닌, 구아닌, 하이포잔틴 및 잔틴을 포함하고, 피리미딘 염기는 우라실, 티민 및 시토신을 포함한다. 핵산 분자는 폴리리보핵산 (RNA), cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함하는 폴리데옥시리보핵산 (DNA)을 포함하며, 이 중 어느 하나는 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 단일 가닥일 경우, 핵산 분자는 암호화 가닥 또는 비-암호화 가닥 (안티-센스 가닥)일 수 있다. 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자는 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 뉴클레오티드 서열의 일부 버전은 또한 인트론(들)이 동시 또는 사후 전사 메카니즘을 통해 제거될 정도로 인트론(들)을 포함할 수 있다. 다른 말로 하면, 상이한 뉴클레오티드 서열은 스플라이싱 (splicing)에 의해, 또는 유전 코드의 중복 또는 축퇴의 결과로 동일한 아미노산 서열을 암호화할 수 있다.
본 개시의 핵산 분자의 변이체가 또한 고려된다. 핵산 분자 변이체는 약 65-68 ℃에서 0.015M 염화나트륨, 0.0015M 시트르산나트륨, 또는 약 42 ℃에서 0.015M 염화나트륨, 0.0015M 시트르산나트륨 및 50% 포름아미드의 엄격한 혼성화 조건하에서 폴리뉴클레오티드로 혼성화되거나, 본원에 정의된 핵산 분자 또는 기준 폴리뉴클레오티드와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 99.9% 동일하다. 핵산 분자 변이체는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 것과 같이, 본원에 기술된 기능성을 갖는 융합 단백질 또는 이의 결합 도메인을 암호화하는 능력을 보유한다.
"퍼센트 서열 동일성"은 서열을 비교함으로써 결정된 것으로 2 이상의 서열 간의 관계를 나타낸다. 서열 동일성을 결정하기 위한 바람직한 방법은 비교되는 서열 간에 최상의 일치를 제공하도록 설계된다. 예를 들어, 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다 (예를 들어, 갭은 최적의 정렬을 위해 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 모두에 도입될 수 있다). 또한, 비상동 서열은 비교 목적을 위해 무시될 수 있다. 본원에서 언급된 퍼센트 서열 동일성은 달리 언급되지 않는 한, 참조 서열의 길이에 대해 계산된다. 서열 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램에서 확인할 수 있다. 서열 정렬 및 퍼센트 동일성 계산은 BLAST 프로그램 (예를 들어, BLAST 2.0, BLASTP, BLASTN 또는 BLASTX)을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 프로그램에 사용된 수학적 알고리즘은 [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997]에서 확인할 수 있다. 본 개시의 문맥에서, 서열 분석 소프트웨어가 분석에 사용되는 경우, 분석 결과는 언급된 프로그램의 "디폴트 값"에 기초한다는 것을 이해할 것이다. "디폴트 값"은 최초 초기화시 소프트웨어에 처음 로드된 값 또는 매개 변수의 임의의 집합을 의미한다.
용어 "단리된"은 물질이 이의 본래 환경 (예를 들어, 자연 발생인 경우 자연 환경)으로부터 제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물 내에 존재하는 자연 발생 핵산 또는 폴리펩티드는 단리된 것이 아니지만, 자연계에서 존재하는 물질의 일부 또는 전부로부터 단리된 동일한 핵산 또는 폴리펩티드는 단리된 것이다. 이러한 핵산은 벡터의 일부일 수 있고/있거나, 이러한 핵산 또는 폴리펩티드는 조성물 (예를 들어, 세포 용해물)의 일부일 수 있고, 이러한 벡터 또는 조성물이 핵산 또는 폴리펩티드에 대한 자연 환경의 일부가 아니라는 점에서 여전히 단리된 것이다. 용어 "유전자"는 폴리펩티드 쇄의 생성에 관여되는 DNA 세그먼트를 의미하고; 이것은 개별 암호 세그먼트 (엑손) 사이의 개입 서열 (인트론)뿐만 아니라 암호 영역 ("리더 (leader) 및 트레일러 (trailer)") 앞 및 뒤 영역을 포함한다.
"기능성 변이체"는 본원의 모 또는 기준 화합물과 구조적으로 유사하거나, 실질적으로 구조적으로 유사하지만, 조성이 약간 상이해 (예를 들어, 하나의 염기, 원자 또는 작용기가 상이하거나, 첨가되거나, 제거된) 폴리펩티드 또는 암호화된 폴리펩티드가 적어도 50% 효율, 바람직하게는 모 폴리펩티드의 활성 수준의 적어도 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%로 암호화된 모 폴리펩티드의 적어도 하나의 기능을 수행할 수 있는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 달리 말하면, 본원의 폴리펩티드 또는 암호화된 폴리펩티드의 기능성 변이체는 기능성 변이체가 선택된 분석, 예컨대 결합 친화도를 측정하기 위한 분석법 (예를 들어, 결합 (Ka) 또는 해리 (KD) 상수를 측정하는 Biacore® 또는 테트라머 염색)에서 모 또는 기준 폴리펩티드와 비교하여 성능의 50% 이하의 감소를 나타내는 경우 "유사한 결합", "유사한 친화도" 또는 "유사한 활성"을 갖는다.
본원에서 사용된 "기능성 부분" 또는 "기능성 단편"은 모 또는 기준 화합물의 도메인, 부분 또는 단편만을 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭하며, 폴리펩티드 또는 암호화된 폴리펩티드는 모 또는 기준 화합물의 도메인, 부분 또는 단편과 관련된 활성을 적어도 50%, 바람직하게는 모 폴리펩티드 활성 수준의 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%를 보유하거나, 또는 생물학적 이익 (예를 들어, 이펙터 기능)을 제공한다. 본원의 폴리펩티드 또는 암호화된 폴리펩티드의 "기능성 부분" 또는 "기능성 단편"은 기능성 부분 또는 단편이 선택된 분석, 예컨대 이펙터 기능을 측정하기 위한 분석법 (예를 들어, 사이토카인 방출)에서 모 또는 기준 폴리펩티드와 비교하여 성능의 50% 이하 (바람직하게는 20% 이하 또는 10% 이하, 또는 친화도에 대해 모 또는 기준 폴리펩티드와 비교하여 로그 차이 이하)의 감소를 나타내는 경우 "유사한 결합" 또는 "유사한 활성"을 갖는다.
본원에 사용된 "이종" 또는 "비-내인성" 또는 "외인성"은 숙주 세포 또는 대상에 고유하지 않은 임의의 유전자, 단백질, 화합물, 핵산 분자 또는 활성, 또는 변경되지 않은 숙주 세포 또는 대상에 고유한 임의의 유전자, 단백질, 화합물, 핵산 분자 또는 활성을 지칭한다. 이종, 비-내인성 또는 외인성은 구조, 활성 또는 둘 모두가 자연 및 변경된 유전자, 단백질, 화합물 또는 핵산 분자 간에 차이가 있도록 돌연변이되거나 또는 달리 변형된 유전자, 단백질, 화합물 또는 핵산 분자를 포함한다. 특정 구체예에서, 이종, 비-내인성 또는 외인성 유전자, 단백질 또는 핵산 분자 (예를 들어, 수용체, 리간드 등)는 숙주 세포 또는 대상에 내인성이 아닐 수 있고, 대신에 그러한 유전자, 단백질, 화합물 또는 핵산 분자를 암호화하는 핵산이 접합, 형질전환, 형질감염, 일렉트로포레이션 등에 의해 숙주 세포에 첨가될 수 있으며, 이때 첨가된 핵산 분자는 숙주 세포 게놈에 통합되거나, 염색체 외의 유전 물질 (예를 들어 플라스미드 또는 다른 자가 복제 벡터)로서 존재할 수 있다. 용어 "동종" 또는 "동족체"는 숙주 세포, 종 또는 균주에서 발견되거나 유래된 유전자, 단백질, 화합물, 핵산 분자 또는 활성을 지칭한다. 예를 들어, 폴리펩티드를 암호화하는 이종 또는 외인성 폴리뉴클레오티드 또는 유전자는 천연 폴리뉴클레오티드 또는 유전자와 상동성일 수 있으며 동종성 폴리펩티드 또는 활성을 암호화할 수 있지만, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 변경된 구조, 서열, 발현 수준 또는 이들의 임의 조합을 가질 수 있다. 비-내인성 폴리뉴클레오티드 또는 유전자뿐만 아니라 암호화된 폴리펩티드 또는 활성은 동일한 종, 상이한 종 또는 이들의 조합으로부터 유래할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "내인성" 또는 "천연"은 숙주 세포 또는 대상에 정상적으로 존재하는 폴리뉴클레오티드, 유전자, 단백질, 화합물, 분자 또는 활성을 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "발현"은 핵산 분자, 예컨대 유전자의 암호화 서열에 기반하여 폴리펩티드가 생산되는 과정을 지칭한다. 상기 과정은 전사, 전사후 제어, 전사후 변형, 번역, 번역후 제어, 번역후 변형 또는 이들의 임의 조합을 포함할 수 있다. 발현된 핵산 분자는 전형적으로 발현 조절 서열 (예를 들어, 프로모터)에 작동 가능하게 연결된다.
용어 "작동 가능하게 연결된"은 하나의 기능이 다른 것에 의해 영향을 받도록 단일 핵산 단편 상에서의 2 이상의 분자의 회합을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는 해당 암호화 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있을 때 암호화 서열과 작동 가능하게 연결된다 (즉, 암호화 서열은 프로모터의 전사 제어 하에 있다). "연결되지 않은"은 회합된 유전자 요소가 서로 가깝게 회합되지 않고 하나의 기능은 다른 것에 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는, "발현 벡터"는 적합한 숙주에서 핵산 분자의 발현을 수행할 수 있는 적합한 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 핵산 분자를 함유하는 DNA 작제물을 지칭한다. 이러한 제어 서열은 전사를 달성하기 위한 프로모터, 이러한 전사를 제어하기 위한 선택적 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보솜 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 번역의 종결을 제어하는 서열을 포함한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 바이러스 또는 단순히 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 일단 적합한 숙주로 형질전환된다면, 벡터는 숙주 게놈과 독립적으로 복제하고 작용할 수 있거나, 또는 일부 예에서, 게놈 자체에 통합될 수 있다. 본원에서, "플라스미드", "발현 플라스미드", "바이러스" 및 "벡터"는 종종 상호 호환 가능하게 사용된다.
세포 내로 핵산 분자를 삽입하는 것과 관련하여 용어 "도입된"은 "형질감염", 또는 "형질전환" 또는 "형질도입"을 의미하며, 진핵 또는 원핵 세포 내로 핵산 분자의 혼입에 대한 언급을 포함하되, 핵산 분자는 세포의 게놈 (예를 들어, 염색체, 플라스미드, 플라스티드 또는 미토콘드리아 DNA)에 혼입되거나, 자율 복제로 전환되거나 또는 일시적으로 발현될 수 있다 (예를 들어, 형질감염된 mRNA). 본원에서 사용된 용어 "조작된", "재조합" 또는 "비-천연"은 적어도 하나의 유전자 변경을 포함하거나 외인성 핵산 분자의 도입에 의해 변형된 생물체, 미생물, 세포, 핵산 분자, 또는 벡터를 지칭하며, 여기서 변경 또는 변형은 유전 공학 (즉, 인간 개입)에 의해 도입된다. 유전적 변형은 예를 들어, 단백질, 융합 단백질 또는 효소를 암호화하는 발현가능한 핵산 분자, 또는 세포의 유전 물질의 다른 핵산 분자 첨가, 결실, 치환 또는 다른 기능성 파괴를 도입하는 변형을 포함한다. 추가의 변형은 예를 들어 변형이 폴리뉴클레오티드, 유전자 또는 오페론의 발현을 변경시키는 비-암호화 조절 영역을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "숙주"는 관심 대상의 폴리펩티드 (예를 들어, 본 개시의 융합 단백질)를 생산하기 위해 이종 핵산 분자로 유전자 변형에 대해 표적화된 세포 (예를 들어, T 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, HEK293 세포, B 세포 등) 또는 미생물을 지칭한다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 임의로 이종 단백질의 생합성과 관련된 또는 관련없는 목적하는 특성을 부여하는 다른 유전자 변형 (예를 들어, 검출 가능한 마커; 결실, 변경 또는 절단된 내인성 TCR; 증가된 공동 자극 인자 발현의 포함)을 이미 갖거나 또는 이들을 포함하도록 변형될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 복수의 이종 핵산 분자는 분리된 핵산 분자로서, 복수의 개별적으로 제어되는 유전자로서, 다시스트론성 핵산 분자로서, 융합 단백질을 암호화하는 단일 핵산 분자로서, 또는 이들의 임의의 조합물로서 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 2종 이상의 아종 핵산 분자가 숙주 세포 내로 도입되는 경우, 2종 이상의 이종 핵산 분자가 (예를 들어, 단일 벡터 상의) 단일 핵산 분자로서, 단일 부위 또는 다수의 부위 또는 이들의 임의의 조합물에서 숙주 염색체 내에 통합된, 분리된 벡터 상에 도입될 수 있는 것으로 이해된다. 언급된 이종 핵산 분자 또는 단백질 활성은 숙주 세포 내에 도입된 분리된 핵산 분자의 수가 아닌, 암호화 핵산 분자의 수 또는 단백질 활성물질의 수를 지칭한다.
용어 "작제물"은 재조합 핵산 분자를 함유하는 임의의 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 작제물은 벡터 (예를 들어, 박테리아 벡터, 바이러스 벡터) 내에 존재할 수 있거나 또는 게놈 내에 통합될 수 있다. "벡터"는 또 다른 핵산 분자를 수송할 수 있는 핵산 분자이다. 벡터는, 예를 들어, 염색체, 비염색체, 반합성 또는 합성 핵산 분자를 포함할 수 있는 플라스미드, 코스미드, 바이러스, RNA 벡터 또는 선형 또는 환형 DNA 또는 RNA 분자일 수 있다. 본 개시의 벡터는 또한 트랜스포손 시스템, 예를 들어, 슬리핑 뷰티 (Sleeping Beauty)를 포함한다 (예를 들어 Geurts et al., Mol. Ther. 8:108, 2003: M
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s et al., Nat. Genet. 41:753 (2009) 참조). 예시적인 벡터는 자기 복제가 가능한 것 (에피솜 벡터) 또는 연결되는 핵산 분자의 발현이 가능한 것 (발현 벡터)일 수 있다.
본원에서 사용된, 혼합물 중 세포 유형의 양에 대한 "농축된" 또는 "결여된"은 하나 이상의 농축 또는 결여 과정 또는 단계로 인한 세포 혼합물에서 "농축된" 유형의 수의 증가, "결여된" 세포 수의 감소, 또는 이 둘 다를 지칭한다. 따라서, 농축 과정을 거친 세포의 원래 집단의 기원에 따라, 혼합물 또는 조성물은 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 또는 그 이상의 (수 또는 개수에서) "농축된" 세포를 함유할 수 있다. 결여 과정을 거친 세포는 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 또는 그 이하의 (수 또는 개수에서) "결여된" 세포를 함유할 수 있다. 특정 구체예에서, 예컨대 CD4+ 세포는 농축되는 반면 CD8+ 세포는 결여되거나, 또는 CD62L+ 세포는 농축되는 반면 CD62L- 세포는 결여되거나, 또는 그 조합과 같이, 혼합물 중 특정 세포 유형의 양은 농축되고 상이한 세포 유형의 양은 결여될 것이다.
"치료하다" 또는 "치료" 또는 "개선"은 대상 (예를 들어, 영장류, 말, 고양이, 개, 염소, 마우스 또는 래트 등의 인간 또는 비인간 포유동물)의 질환, 장애 또는 상태의 의학적 관리를 지칭한다. 일반적으로, 본 개시의 융합 단백질을 발현하는 숙주 세포 및 임의로 애쥬번트를 포함하는 적절한 용량 또는 치료법이 치료적 또는 예방적 이점을 유도하기에 충분한 양으로 투여된다. 치료적 또는 예방적/방지적 이익에는 개선된 임상적 성과; 질환과 관련된 증상의 완화 또는 경감; 증상 발생의 감소; 삶의 질 향상; 질환이 없는 상태 연장; 질환 범위의 감소, 질환 상태의 안정화; 질환 진행의 지연; 차도; 생존; 장기 생존; 또는 이들의 임의 조합이 포함된다.
본 개시의 융합 단백질 또는 이 융합 단백질을 발현하는 숙주 세포의 "치료적 유효량" 또는 "유효량"은 개선된 임상적 성과; 질환과 관련된 증상의 완화 또는 경감; 증상 발생의 감소; 삶의 질 향상; 질환이 없는 상태 연장; 질환 범위의 감소, 질환 상태의 안정화; 질환 진행의 지연; 차도; 생존; 장기 생존을 비롯한 치료 효과를 통계적으로 유의적인 방식으로 유도하기에 충분한 융합 단백질 또는 숙주 세포의 양을 지칭한다. 단독 투여되는 개별 활성 성분 또는 단독 활성 성분을 발현하는 세포를 언급할 때, 치료적 유효량은 그 성분 또는 그 성분만을 발현하는 세포의 효과를 가리킨다. 조합을 지칭할 때, 치료적 유효량은 연속적으로 또는 동시에 투여되는지 여부에 상관없이, 치료적 효과로 이어지는 활성 성분의 조합된 양, 또는 조합된 보조 활성 성분과 활성 성분을 발현하는 세포의 조합된 양을 지칭한다. 조합은 또한 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 태그 펩티드에 특이적으로 결합하는 두 상이한 융합 단백질 (예를 들어, CAR)과 같은 하나 이상의 활성 성분을 발현하는 세포, 또는 본 개시의 융합 단백질과 같이, 복수의 활성 성분을 발현하는 세포일 수 있다.
용어 "약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체" 또는 "생리학적으로 허용되는 부형제 또는 담체"는 인간 또는 다른 비인간 포유동물 대상에 투여하기에 적합하고 일반적으로 안전하다고 인정되거나 중대한 이상 반응을 일으키지 않아야 하는 생물학적으로 상용성인 비히클, 예를 들어 생리 식염수를 지칭하며, 이들은 본원에서 보다 상세하게 설명된다.
본원에서 "통계적으로 유의하다"는 것은 스튜던트 t-검정을 사용하여 계산했을 때 0.050 이하의 p 값을 나타내며 측정되는 특정 사건이나 결과가 우연히 발생하지 않았음을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "양자 면역치료" 또는 "입양 면역요법"은 자연 발생 또는 유전자 조작된 질환 항원 특이적 면역 세포 (예를 들어, T 세포)의 투여를 지칭한다. 양자 세포 면역요법은 자가 (면역 세포는 수용자에게서 유래), 동종 (면역 세포는 같은 종의 기증자로부터 유래) 또는 동족 (면역 세포는 수용자와 유전적으로 동일한 기증자로부터 유래됨)일 수 있다.
면역글로불린 결합 단백질
특정 측면에서, 본 개시는 Strep-tag 펩티드에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 면역글로불린 결합 단백질을 제공한다. 본원에 사용된 용어 "Strep-tag 펩티드" (본원에서 "strep-tag", "strep tag", "ST" 및 "태그 펩티드"로도 지칭됨) (문맥이 명확하게 그 내용을 나타내며 관심 단백질 (예를 들어, Myc, His 또는 Flag)을 태그하는데 사용되는 다른 유형의 펩티드를 나타내지 않는 경우)는 스트렙타비딘 (스트렙타비딘 아비디니이 (Streptomyces avidinii)로부터 정제된 사량체 단백질이고 비오틴에 대한 높은 친화성으로 인해 분자 생물학 프로토콜에 널리 사용됨) 또는 스트렙타비딘의 조작된 뮤테인인 Streptactin®에 특이적으로 결합할 수 있는 펩티드를 의미한다. 본 개시의 예시적인 Strep-tag 펩티드는 스트렙타비딘 또는 이의 뮤테인 또는 변이체 (예를 들어, Streptactin®)에 결합하기 위해 비오틴과 경쟁하고, 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는, [Schmidt and Skerra, Nature Protocols, 2:1528-1535 (2007)], 미국 특허 제7,981,632호; 및 PCT 공개 WO 2015/067768호에 기재된 것, Strep-tag 펩티드, step-tag-펩티드 함유 폴리펩티드, 및 이의 서열을 포함해, Strep® 태그 (WRHPQFGG, 서열 번호 48); Strep® Tag II (본원에서 "STII"라고도 하고 아미노산 서열 WSHPQFEK (서열 번호 19)로 이루어짐); 및 이의 변이체를 포함한다.
특정 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질은 Strep-tag 펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 도메인을 포함하고, 여기서 결합 도메인은 모노클로날 항체 3E8, 5G2, 또는 4E2에 따른 CDR 또는 이의 변이체를 포함하는 VH 도메인 및 VL 도메인을 포함한다. 특정 구체예에서, 결합 도메인은 (a) (i) 서열 번호 25에 기재된 CDR1 아미노산 서열 또는 이의 변이체, 서열 번호 26에 기재된 CDR2 아미노산 서열 또는 이의 변이체, 및 서열 번호 27에 기재된 CDR3 아미노산 서열, 또는 이의 변이체; (ii) 서열 번호 31에 기재된 CDR1 아미노산 서열, 또는 이의 변이체, 서열 번호 32에 기재된 CDR2 아미노산 서열 또는 이의 변이체, 및 서열 번호 33에 기재된 CDR3 아미노산 서열 또는 이의 변이체; 또는 (iii) 서열 번호 37에 기재된 CDR1 아미노산 서열, 또는 이의 변이체, 서열 번호 38에 기재된 CDR2 아미노산 서열 또는 이의 변이체, 및 서열 번호에 39에 기재된 CDR3 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 VL 도메인 및 VH 도메인 (구체예에서, 서열 번호 2, 8 또는 14 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 99.9% 동일성을 가질 수 있음); 또는 (b) (i) 서열 번호 22에 기재된 CDR1 아미노산 서열, 또는 이의 변이체, 서열 번호 23에 기재된 CDR2 아미노산 서열 또는 이의 변이체, 및 서열 번호 24에 기재된 CDR3 아미노산 서열 또는 이의 변이체; (ii) 서열 번호 28에 기재된 CDR1 아미노산 서열, 또는 이의 변이체, 서열 번호 29에 기재된 CDR2 아미노산 서열, 또는 이의 변이체, 및 서열 번호 30에 기재된 CDR3 아미노산 서열 또는 이의 변이체; 또는 (iii) 서열 번호 34에 기재된 CDR1 아미노산 서열, 또는 이의 변이체, 서열 번호 35에 기재된 CDR2 아미노산 서열 또는 이의 변이체, 및 서열 번호 36에 기재된 CDR3 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하는 VL 도메인 및 VH 도메인 (구체예에서, 서열 번호 3, 10 또는 16 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 약 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 99.9% 동일성을 가질 수 있음); 또는 (c) (a)의 VL 도메인 및 (b)의 VH 도메인을 포함한다. 특정 구체예에서, VH 도메인은 (i) 서열 번호 22에 기재된 CDR1 아미노산 서열, (ii) 서열 번호 23에 기재된 CDR2 아미노산 서열, 및 (iii) 서열 번호 24에 기재된 CDR3 아미노산 서열을 포함하고; VL 도메인은 (iv) 서열 번호 25에 기재된 CDR1 아미노산 서열, (v) 서열 번호 26에 기재된 CDR2 아미노산 서열, 및 (vi) 서열 번호 27에 기재된 CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, VH 도메인은 (i) 서열 번호 28에 기재된 CDR1 아미노산 서열, (ii) 서열 번호 29에 기재된 CDR2 아미노산 서열, 및 (iii) 서열 번호 30에 기재된 CDR3 아미노산 서열을 포함하고; VL 도메인은 (iv) 서열 번호 31에 기재된 CDR1 아미노산 서열, (v) 서열 번호 32에 기재된 CDR2 아미노산 서열, 및 (vi) 서열 번호 33에 기재된 CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
다른 구체예에서, VH 도메인은 (i) 서열 번호 34에 기재된 CDR1 아미노산 서열, (ii) 서열 번호 35에 기재된 CDR2 아미노산 서열, 및 (iii) 서열 번호 36에 기재된 CDR3 아미노산 서열을 포함하고; VL 도메인은 (iv) 서열 번호 37에 기재된 CDR1 아미노산 서열, (v) 서열 번호 38에 기재된 CDR2 아미노산 서열, 및 (vi) 서열 번호 39에 기재된 CDR3 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 개시된 임의의 상기 구체예 또는 다른 구체예에서, Strep-tag 펩티드는 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
본원에 사용된 "결합 도메인" 또는 "결합 영역"은 표적 (예를 들어, 항원, 리간드)을 특이적으로 인식하고 이와 비공유적으로 회합하는 능력을 갖는 단백질, 폴리펩티드, 올리고펩티드 또는 펩티드 (예를 들어, 항체, 수용체) 또는 이의 부분 또는 단편을 지칭한다. 결합 도메인은 생물학적 분자 또는 다른 관심 대상에 대한 임의의 자연 발생, 합성, 반합성 또는 재조합적으로 생성된 결합 파트너를 포함한다. 예시적인 결합 도메인은 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 영역 (예를 들어, 도메인 항체, sFv, 단쇄 Fv 단편 (scFv), Fab, F(ab')2), 수용체 엑토도메인 또는 리간드를 포함한다. 면역글로불린 가변 도메인 (예를 들어, scFv, Fab)은 본원에서 "면역글로불린 결합 도메인"으로 지칭된다. 웨스턴 블롯, ELISA 및 Biacore® 분석을 비롯해 특정 표적에 특이적으로 결합하는 본 개시의 결합 도메인을 식별하기 위한 다양한 분석법이 공지되어 있다. 특정 구체예에서, 결합 도메인은 키메라, 인간 또는 인간화의 것이다.
특정 구체예에서, 결합 도메인은 더 큰 폴리펩티드 또는 단백질의 일부이고 "결합 단백질"로 지칭된다. "면역글로불린 결합 단백질" 또는 "면역글로불린 유사 결합 단백질"은 하나 이상의 면역글로불린 결합 도메인을 함유하는 폴리펩티드를 지칭하며, 여기서 폴리펩티드는 다양한 면역글로불린 관련 단백질 스캐폴드 또는 구조, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, scFv-Fc 융합 단백질, 또는 이러한 면역글로불린 결합 도메인 또는 다른 결합 도메인을 2 이상 포함하는 융합 단백질 중 임의 형태일 수 있다.
결합 도메인의 공급원은 인간, 설치류, 조류, 토끼 및 양을 포함한 다양한 종으로부터의 항체 가변 영역을 포함한다. 결합 도메인의 다른 공급원은 다른 종, 예컨대 카멜리드 (낙타, 단봉 낙타 또는 라마 유래; Ghahroudi et al., FEBSLett. 414:521, 1997; Vincke et al., J. Biol. Chem. 284:3273, 2009; Hamers-Casterman et al., Nature 363:446, 1993 및 Nguyen et al., J. Mol. Biol. 275:413, 1998), 널스 샤크 (nurse shark) (Roux et al, Proc. Natl Acad. Sci.(USA) 95:11804, 1998), 스팟티드 래트피쉬 (Nguyen et al., Immunogen. 54:39, 2002), 또는 칠성장어 (Herrin et al., Proc. Natl Acad. Sci.(USA) 105:2040, 2008 및 Alder et al. Nat. Immunol. 9:319, 2008) 유래의 항체 가변 영역을 포함한다. 이러한 항체는 중쇄 가변 영역만을 사용하는 항원-결합 영역을 형성할 수 있으며, 즉 이들 기능성 항체는 중쇄만의 호모이량체 ("중쇄 항체"라 칭함)이다 (Jespers et al., Nat. Biotechnol. 22:1161, 2004; Cortez-Retamozo et al, Cancer Res. 64:2853, 2004; Baral et al, Nature Med. 12:580, 2006; 및 Barthelemy et al, J. Biol. Chem. 283:3639, 2008).
항체 기술 분야의 업자가 이해하는 용어들은 각각 본원에서 다르게 정의되지 않는 한 당업계에서 인정하는 의미를 갖는다. 예를 들어, 용어 "항체"는 디설파이드 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 온전한 항체 (경쇄가 없는 중쇄 항체도 용어 "항체"에 포함된다) 뿐만 아니라, 온전한 항체에 의해 인식되는 항원 표적 분자, 예컨대 scFv, Fab 또는 Fab'2 단편에 결합하는 능력을 갖거나 보유하는 온전한 항체의 임의의 항원-결합 부분 또는 단편을 지칭한다. 따라서, 본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 온전한 항체 및 이의 기능성 (항원-결합) 항체 단편, 예컨대 단편 항원-결합 (Fab) 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fv 단편, 재조합 IgG (rIgG) 단편, 단쇄 가변 단편 (scFv)을 포함하는 단쇄 항체 단편, 및 단일 도메인 항체 (예를 들어, sdAb, sdFv, 나노바디) 단편을 포함하는 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 포함한다. 상기 용어는 유전자 조작 및/또는 달리 변형된 형태의 면역글로불린, 예컨대 인트라바디, 펩티바디, 키메라 항체, 완전 인간 항체, 인간화 항체 및 이종 접합체 항체, 다중특이성, 예를 들어 이중특이성 항체, 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디, 탠덤 디-scFv, 텐덤 트리-scFv를 포함한다. 달리 언급되지 않는 한, 용어 "항체"는 이의 기능적 항체 단편을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 상기 용어는 또한 IgG 및 이의 서브 클래스, IgM, IgE, IgA 및 IgD를 포함하는 임의의 클래스 또는 서브 클래스의 항체를 포함하는 온전한 항체 또는 전장 항체를 포함한다.
용어 "VL" 및 "VH"는 항체 경쇄 및 중쇄 각각에서 유래한 가변 결합 영역을 지칭한다. 가변 결합 영역은 "상보성 결정 영역" (CDR) 및 "프레임워크 영역" (FR)으로 알려진 별개의, 잘 규정된 서브영역으로 구성된다. "상보성 결정 영역" 및 "CDR"이라는 용어는 "초가변 영역" 또는 "HVR"과 동의어이며 TCR 또는 항체 가변 영역 내의 아미노산의 비연속적 서열을 지칭하는 것으로 당 업계에 공지되어 있으며, 이는 항원 특이성 및/또는 결합 친화성을 부여한다. 일반적으로, 면역글로불린 결합 단백질의 각 가변 영역에는 3개의 CDR이 있으며; 예를 들어, 항체의 경우, VH 및 VL 영역은 6개의 CDR HCDR1, HCDR2, HCDR3; LCDR1, LCDR2, LCDR3을 포함한다. 본원에 사용된, CDR의 "변이체"는 최대 1-3개의 아미노산 치환, 결실 또는 이들의 조합을 갖는 CDR 서열의 기능성 변이체를 지칭한다. 면역글로불린 서열은 넘버링 체계 (예를 들어, Kabat, EU, IMGT (International Immunogenetics Information System) 및 Aho)로 정렬될 수 있으며, 이는 동등한 잔기 위치에 주석을 달고 항원 수용체 넘버링 및 수용체 분류 (ANARCI) 소프트웨어 도구 (2016, Bioinformatics 15:298-300)를 사용하여 서로 다른 분자들을 비교할 수 있다.
본원에 사용된 "항원" 또는 "Ag"는 면역 반응을 유발하는 면역원성 분자를 지칭한다. 이 면역 반응은 항체 생산, 보체 경로의 활성화, 특이 면역학적 경쟁 세포 (예를 들어, T 세포)의 활성화, 또는 모두를 포함할 수 있다. 항원 (면역원성 분자)은 예를 들어 펩티드, 글리코펩티드, 폴리펩티드, 글리코폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 다당류, 지질 등일 수 있다. 항원은 합성되거나 재조합적으로 생성되거나 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있음이 명백하다. 하나 이상의 항원을 함유할 수 있는 예시적인 생물학적 샘플은 조직 샘플, 종양 샘플, 세포, 생물학적 유체 또는 이들의 조합을 포함한다. 항원은 항원을 발현하도록 변형되거나 유전자 조작된 세포에 의해 생성될 수 있다.
용어 "에피토프" 또는 "항원 에피토프"는 면역글로불린, T 세포 수용체 (TCR), 키메라 항원 수용체와 같은 동족 결합 분자 또는 다른 결합 분자, 도메인 또는 단백질에 의해 인식되고 특이적으로 결합되는 임의의 분자, 구조, 아미노산 서열 또는 단백질 결정 인자를 포함한다. 에피토프 결정 인자는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹을 함유하며, 특정의 3 차원 구조적 특성뿐만 아니라 특정 전하 특성을 가질 수 있다.
본원에 사용되는 "특이적으로 결합하는" 또는 "에 특이적인"은 105 M-1 이상인 (이 결합 반응에 대해 온-속도 (on-rate)[Kon] 대 오프-속도 (off-rate)[Koff]의 비는 동일함) 친화도 또는 Ka (즉, 1/M 단위의 특정 결합 상호작용의 평형 결합 상수)로 표적 분자 (예를 들어, WSHPQFEK, 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 태그 펩티드)에 결합 단백질 또는 결합 도메인 (또는 이의 융합 단백질)이 회합 또는 연합하는 한편, 샘플 내 임의의 다른 분자 또는 성분과 상당하게 회합 또는 연합하지 않는 것을 지칭한다. 결합 단백질 또는 결합 도메인 (또는 이의 융합 단백질)은 "고친화도" 결합 단백질 또는 결합 도메인 (또는 이의 융합 단백질)로서 또는 "저친화도" 결합 단백질 또는 결합 도메인 (또는 이의 융합 단백질)으로서 분류될 수 있다. "고친화도" 결합 단백질 또는 결합 도메인은 Ka가 적어도 107 M-1, 적어도 108 M-1, 적어도 109　M-1, 적어도 1010 M-1, 적어도 1011 M-1, 적어도 1012 M-1, 또는 적어도 1013 M-1인 해당 결합 단백질 또는 결합 도메인을 지칭한다. "저친화도" 결합 단백질 또는 결합 도메인은 107 M-1 이하, 106 M-1 이하, 105 M-1 이하인 Ka를 갖는 해당 결합 단백질 또는 결합 도메인을 지칭한다. 대안적으로, 친화도는 M의 단위 (예를 들어, 10-5 M 내지 10-13 M)를 갖는 특정 결합 상호작용의 평형 해리 상수 (Kd)로서 정의될 수 있다.
특정 표적에 특이적으로 결합하는 본 개시의 면역글로불린 결합 단백질 및 결합 도메인을 식별할뿐만 아니라 결합 도메인 또는 융합 단백질 친화도를 결정하기 위한 다양한 검정, 예컨대 웨스턴 블롯, ELISA, 분석 초원심분리, 분광학 및 표면 플라즈몬 공명 (Biacore®) 분석은 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌[Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660, 1949; Wilson, Science 295:2103, 2002; Wolff et al., Cancer Res. 53:2560, 1993]; 및 미국 특허 제5,283,173호, 제5,468,614호 또는 등가물 참조). 친화도 또는 겉보기 친화도 또는 상대적 친화도를 평가하기 위한 검정 또한 공지되었다. 특정 예에서, 면역글로불린 결합 단백질의 겉보기 친화도는 예를 들어, 다양한 농도의 사량체에 대한 결합을 평가함으로써, 예를 들어, 표지된 사량체를 이용하는 유세포 분석에 의해 측정된다. 일부 예에서, 면역글로불린 결합 단백질의 겉보기 KD는 다양한 농도에서 표지된 사량체의 2배 희석 다음에, 비선형 회귀에 의한 결합 곡선의 결정을 이용하여 측정되며, 겉보기 KD는 최대 절반의 결합을 산출한 리간드 농도로서 결정된다.
용어 "CL"은 "면역글로불린 경쇄 불변 영역" 또는 "경쇄 불변 영역", 즉 항체 경쇄로부터의 불변 영역을 지칭한다. 용어 "CH"는 "면역글로불린 중쇄 불변 영역" 또는 "중쇄 불변 영역"을 지칭하며, 이는 항체 이소형에 따라 CH1, CH2 및 CH3 (IgA, IgD, IgG), 또는 CH1, CH2, CH3 및 CH4 도메인 (IgE, IgM)으로 더 나뉠 수 있다. "Fab" (단편 항원 결합)은 항원에 결합하고 쇄 간 디설파이드 결합을 통해 경쇄에 연결된 중쇄의 가변 영역 및 CH1을 포함하는 항체의 일부이다.
특정 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질의 VL 도메인은 서열 번호 3, 10 및 16 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 99.9% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인은 서열 번호 2, 8 및 14 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 99.9% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질의 VL은 서열 번호 3, 10 및 16 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, VH 도메인은 서열 번호 2, 8 및 14 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
특정 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질은 (i) 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 VL 도메인, 및 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 VH 도메인; (ii) 서열 번호 10에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 VL 도메인, 및 서열 번호 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 VH 도메인; 또는 서열 번호 16에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 VL 도메인, 및 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 VH 도메인을 포함한다.
본원에서 사용된 "Fc 영역 부분"은 항체에서 유래한 Fc 단편의 중쇄 불변 영역 세그먼트 ("단편 결정화가능" 영역 또는 Fc 영역)를 지칭하고, 이것은 하나 이상의 불변 도메인, 예컨대 CH2, CH3, CH4, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, Fc 영역 부분은 IgG, IgA, 또는 IgD 항체 또는 이들의 임의 조합의 CH2 및 CH3 도메인, 또는 IgM 또는 IgE 항체 및 이들의 임의 조합의 CH3 및 CH4 도메인을 포함한다. 다른 구체예에서, CH2CH3 또는 CH3CH4 구조는 동일한 항체 이소형으로부터의 서브영역 도메인을 갖고, 인간, 예컨대 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, 또는 IgM (예를 들어, 인간 IgG1 유래의 CH2CH3)이다. 배경으로, Fc 영역은 면역글로불린의 이펙터 기능, 예컨대 ADCC (항체-의존성 세포-매개 세포독성), CDC (보체-의존성 세포독성) 및 보체 고정, Fc 수용체 (예를 들어, CD16, CD32, FcRn)와의 결합, Fc 영역이 결여된 폴리펩티드보다 더 큰 생체 내 반감기, 단백질 A 결합, 및 태반 전달 (placental transfer)까지 담당한다 (Capon et al., Nature 337:525, 1989 참조). 특정 구체예에서, 본 개시의 면역글로불린 유사 결합 단백질에서 발견된 Fc 영역 부분은 하나 이상의 이러한 이펙터 기능을 매개할 수 있거나, 예를 들어 당 업계에서 알려진 하나 이상의 돌연변이에 의해 이러한 활성의 하나 이상 또는 전부가 없을 것이다. 예를 들어, Fc 기능성을 변형 (예를 들어, 개선, 감소 또는 제거)하기 위한 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)은 T250Q/M428L; M252Y/S254T/T256E; H433K/N434F; M428L/N434S; E233P/L234V/L235A/G236+A327G/A330S/P331S; E333A; S239D/A330L/I332E; P257I/Q311; K326W/E333S; S239D/I332E/G236A; N297Q; K322A; S228P; L235E+E318A/K320A/K322A; L234A/L235A; 및 L234A/L235A/P329G 돌연변이를 포함하고, 이 돌연변이는 InvivoGen (2011)에 의해 공개되고 www. invivogen.com/PDF/review/review-Engineered-Fc-Regions-invivogen.pdf?utm_source=review&utm_medium=pdf&utm_ campaign=review&utm_content=Engineered-Fc-Regions에서 온라인으로 이용 가능한 "Engineered Fc Regions"에 요약되었고 주석이 달렸으며, 상기 내용은 본원에 참조로 포함된다.
또한, 항체는 (힌지의 하부 섹션이 Fc 영역의 아미노 말단 부분을 포함할 수 있으나) Fab와 Fc 영역 사이에 전형적으로 위치한 힌지 서열을 갖는다. 배경으로, 면역글로불린 힌지는 가요성 스페이서로 작용하여 Fab 부분이 공간 내에서 자유롭게 움직이도록 할 수 있다. 불변 영역에 비하여, 힌지는 구조적으로 다양하여 면역글로불린 부류 사이와 서브클래스 중에서도 서열과 길이가 다르다. 예를 들어, 인간 IgG1 힌지 영역은 자유롭게 휘기 쉬워서, Fab 단편이 그의 대칭축 주위를 회전하고 2개 중쇄간 디설파이드 가교의 처음 중심 스피어 내에서 움직일 수 있다. 그에 비해, 인간 IgG2 힌지는 상대적으로 짧고 4개의 중쇄간 디설파이드 가교에 의해 안정화된 견고한 폴리프롤린 이중나선을 함유하여 가요성을 제한한다. 인간 IgG3 힌지는 그의 독특한 연장된 힌지 영역 (IgG1 힌지의 약 4배 길이)에 의해 다른 서브클래스와는 구별되며, 62 아미노산을 함유하고 (21 프롤린 및 11 시스테인 함유), 비가요성 폴리프롤린 이중나선을 형성하고 Fab 단편이 비교적 Fc 단편과 멀리 떨어져 있기 때문에 더 큰 가요성을 제공한다. 인간 IgG4 힌지는 IgG1 보다는 짧지만 IgG2와 같은 길이를 가지며, 그의 가요성은 IgG1과 IgG2의 중간이다. 면역글로불린 구조 및 기능은 예를 들어 문헌[Harlow et al., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988)]에서 검토되었다.
특정 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함한다. 특정 구체예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 모노클로날 항체 3E8을 포함한다. 추가의 구체예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 모노클로날 항체 5G2를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항체 또는 이의 항원-결합 부분은 모노클로날 항체 4E2를 포함한다. 본원에 개시된 임의의 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질은 키메라, 인간화 또는 인간 항체 또는 이의 항원 결합 부분일 수 있다. 제공된 면역글로불린 결합 단백질 중에는 항체 단편이 있다. "항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예로서는 Fv; Fab; Fab'; Fab'-SH; F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv); 텐덤 scFv; scFv-Fc; 탠덤 scFv-Fc; scFv 이량체; scFv-지퍼; 디아바디-Fc; 디아바디-CH3; sc디아바디; sc디아바디-Fc; sc디아바디-CH3; 나노바디; TandAbs; 미니바디; 미니 항체; 트리아바디; 테트라바디; scFab; Fab-scFv; Fab-scFv-Fc; scFv-CH-CL-scFv; 및 F(ab')2-scFv2를 들 수 있으나 이들에 제한되지 않는다.
특정 구체예에서, 항체는 가변 중쇄 영역, 가변 경쇄 영역 또는 둘 다를 포함하는 단쇄 항체 단편, 예를 들어 scFv이다.
단일 도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 일부 또는 전부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 구체예에서, 단일 도메인 항체는 인간 단일 도메인 항체이다.
항체 단편은 다양한 기술, 예를 들어 온전한 항체의 단백질 분해 소화 및 재조합 숙주 세포에 의한 생산에 의해 제조될 수 있다. 일부 구체예에서, 항체는 재조합적으로 생성된 단편, 예컨대 자연적으로 발생하지 않는 배열을 포함하는 단편, 이를테면 합성 링커, 예를 들어 펩티드 링커에 의해 연결된 2 이상의 항체 영역 또는 쇄를 갖는 것, 및/또는 자연 발생 온전한 항체의 효소 소화에 의해 생산된 것이다. 일부 측면에서, 항체 단편 (예를 들어, 결합 도메인)은 scFv를 포함한다. 일부 구체예에서, scFv는 서열 번호 3, 10, 및 16 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 99.9% 동일한 VL 도메인 및 서열 번호 2, 8 및 14 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 99.9% 동일한 VH 도메인을 포함한다.
본 개시의 임의의 scFv는 VL 도메인의 C-말단이 짧은 펩티드 서열에 의해 VH 도메인의 N-말단에 연결되거나 또는 그 반대이도록 (즉, (N)VL(C)-링커-(N)VH(C) 또는 (N)VH(C)-링커-(N)VL(C)) 조작될 수 있다.
특정 구체예에서, 결합 도메인은 scFv를 포함하고, scFv는 모노클로날 항체 3E8의 VL 및 VH를 포함한다. 특정 구체예에서, scFv는 서열 번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
다른 구체예에서, 결합 도메인은 scFv를 포함하고, scFv는 모노클로날 항체 5G2의 VL 및 VH를 포함한다. 특정 구체예에서, scFv는 서열 번호 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다.
또 다른 구체예에서, 결합 도메인은 scFv를 포함하고, scFv는 모노클로날 항체 4E2의 VL 및 VH를 포함한다. 특정 구체예에서, scFv는 서열 번호 17 또는 18의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. 본 발명의 개시된 임의의 구체예에서, scFv 링커는 1 내지 10개의 GlyxSery 반복체 (여기서 x 및 y는 독립적으로 0 내지 10의 정수이되, 단 x 및 y가 모두 0은 아님)를 가지는 글리신-세린 아미노산 쇄 (예를 들어, (Gly4Ser)2 (서열 번호 20), (Gly3Ser)2 (서열 번호 21), Gly2Ser, 또는 이들의 조합, 예컨대 ((Gly3Ser)2Gly2Ser) (서열 번호 49))를 포함할 수 있다.
특정 측면에서, 면역글로불린 결합 단백질은 다중-특이적 결합 단백질을 포함하고, 여기서 다중-특이적 결합 단백질은 태그 펩티드에 특이적으로 결합하는 결합 도메인 및 태그 펩티드가 아닌 적어도 하나의 표적에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함한다. 특정 구체예에서, 다중-특이적 결합 단백질은 이중특이성 결합 단백질을 포함한다. 이중특이성 결합 단백질의 형식은 본원에 기술된 바와 같은 항체 단편을 포함하고, 예를 들어 이중특이성 T 세포 인게이저 (BiTE), DART, 노브-인투 홀 (Knobs-Into-Holes: KIH) 어셈블리, scFv-CH3-KIH 어셈블리, KIH 공통 경쇄 항체, TandAb, 트리플바디, 트리바이 (TriBi) 미니바디, Fab-scFv, scFv-CH-CL-scFv, F(ab')2-scFv2, 4가 HCab, 인트라바디, CrossMab, 이중 작용 Fab (DAF) (two-in-one 또는 four-in-one), DutaMab, DT-IgG, 전하 쌍, Fab-암 교환, 시드바디, 트리오맙, LUZ-Y 어셈블리, Fcab, κλ-바디, 직교 Fab, DVD-IgG, IgG(H)-scFv, scFv-(H)IgG, IgG(L)-scFv, scFv-(L)IgG, IgG(L,H)-Fv, IgG(H)-V, V(H)-IgG, IgG(L)-V, V(L)-IgG, KIH IgG-scFab, 2scFv-IgG, IgG-2scFv, scFv4-Ig, Zy바디 (Zybody) 및 DVI-IgG (four-in-one)를 포함한다. 이중특이성 항체 단편에 대한 형식은 당 업계에 공지되어 있고, 예를 들어 [Spiess et al., Mol. Immunol. 67(2):95 (2015) 및 Brinkmann and Kontermann, mAbs 9(2):182-212 (2017)]에 기재되어 있으며, 여기에서의 항체 및 항체-단편 포맷은 본원에 참조로 포함된다. 특정 구체예에서, 이중특이성 결합 단백질은 태그 펩티드에 결합하고, 태그 펩티드가 아닌 적어도 하나의 표적은 면역 세포 마커이다. 특정 구체예에서, 면역 세포 마커는 CD3 또는 CD16이다. 일부 구체예에서, 이중특이성 결합 단백질은 Strep-tag 펩티드에 결합하고, Strep-tag 펩티드가 아닌 적어도 하나의 표적은 질환 또는 장애와 관련된 항원, 예를 들어 CD19, CD20, CD22, ROR1, EGFR, EGFRvIII, EGP-2, EGP-40, GD2, GD3, HPV E6, HPV E7, Her2, L1-CAM, 루이스 A, 루이스 Y, MUC1, MUC16, PSCA, PSMA, CD56, CD23, CD24, CD30, CD33, CD37, CD44v7/8, CD38, CD56, CD123, CA125, c-MET, FcRH5, WT1, 엽산 수용체 α, VEGF-α, VEGFR1, VEGFR2, IL-13Rα2, IL-11Rα, MAGE-A1, MAGE-A3, MAGE-A4, SSX-2, PRAME, HA-1, PSA, 에프린 A2, 에프린 B2, NKG2D, NY-ESO-1, TAG-72, 메소텔린, NY-ESO, 5T4, BCMA, FAP, 탄산 탈수 효소 9, ERBB2, BRAFV600E, 또는 CEA 항원으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 본 개시의 면역글로불린 결합 단백질은 1가 (즉, 결합 도메인이 태그 펩티드에 특이적으로 결합하는 단일 결합 도메인을 가짐) 또는 다가 (즉, 복수의 결합 도메인을 갖고, 이들 중 적어도 하나는 태그 펩티드에 특이적으로 결합함) (이 경우 다중특이성일 수 있음)이다, 특정 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질은 다가이다. 특정 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질은 2가이다.
일부 측면에서, 본 개시의 면역글로불린 결합 단백질은 융합 단백질에 포함된다. 특정 구체예에서, 융합 단백질은 본원에 개시된 바와 같은 결합 도메인을 포함하는 세포 외 성분, 및 이펙터 도메인을 포함하는 세포 내 성분을 포함하고, 여기서 세포 외 성분 및 세포 내 성분은 막관통 도메인에 의해 연결된다. 추가의 구체예에서, 결합 도메인은 scFv를 포함하고 세포 외 성분은 힌지를 포함하는 커넥터 영역을 추가로 포함한다.
본원에 사용된 "이펙터 도메인"은 적절한 신호를 받을 때 세포에서 생물학적 또는 생리학적 반응을 직접적으로 또는 간접적으로 촉진할 수 있는 융합 단백질 또는 수용체의 세포 내 부분 또는 도메인이다. 특정 구체예에서, 이펙터 도메인은 결합 시, 또는 단백질 또는 그의 일부 또는 단백질 복합체가 표적 분자에 직접 결합하는 경우 신호를 받아 이펙터 도메인으로부터 신호를 촉발하는 단백질 또는 그의 일부 또는 단백질 복합체 유래이다.
이펙터 도메인은 공동 자극 분자에서 발견되는 세포 내 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)와 같은 하나 이상의 신호 전달 도메인 또는 모티프를 함유하는 경우 직접 세포 반응을 촉진할 수 있다. 이론에 구애 없이, ITAM은 T 세포 수용체 또는 T 세포 이펙터 도메인을 포함하는 융합 단백질에 의한 리간드 결합 후 T 세포 활성화에 중요하다고 여겨진다. 특정 구체예에서, 세포 내 성분은 ITAM을 포함한다. 예시적인 이펙터 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40 (CD134), CD3ε, CD3δ, CD3ζ, CD25, CD27, CD28, CD79A, CD79B, CARD11, DAP10, FcRα, FcRβ, FcRγ, Fyn, HVEM, ICOS, Lck, LAG3, LAT, LRP, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, Wnt, ROR2, Ryk, SLAMF1, Slp76, pTα, TCRα, TCRβ, TRIM, Zap70, PTCH2 또는 이들의 임의의 조합으로부터의 것이다. 특정 구체예에서, 이펙터 도메인은 림프구 수용체 신호 전달 도메인 (예를 들어, CD3ζ)을 포함한다.
추가의 구체예에서, 융합 단백질의 세포 내 성분은 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40 (CD134) 또는 이들의 조합으로부터 선택된 공동 자극 도메인 또는 이의 부분을 포함한다. 특정 구체예에서, 세포 내 성분은 CD28 공동 자극 도메인 또는 이의 일부 (임의로 나이브 CD28 단백질의 위치 186-187에서 LL→GG 돌연변이를 포함할 수 있음)(참조: Nguyen et al., Blood 102:4320, (2003)), 4-1BB 공동 자극 도메인 또는 이의 일부 또는 둘 다를 포함한다
특정 구체예에서, 이펙터 도메인은 CD3ζ 또는 이의 기능성 부분을 포함한다. 추가의 구체예에서, 이펙터 도메인은 CD27로부터의 일부 또는 도메인을 포함한다. 추가의 구체예에서, 이펙터 도메인은 CD28로부터의 일부 또는 도메인을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 이펙터 도메인은 4-1BB로부터의 일부 또는 도메인을 포함한다. 추가의 구체예에서, 이펙터 도메인은 OX40로부터의 일부 또는 도메인을 포함한다.
본 개시의 세포 외 성분 및 세포 내 성분은 막관통 도메인에 의해 연결된다. 본원에 사용된 "막관통 도메인"은 세포막에 삽입되거나 세포막에 걸칠 수 있는 막관통 단백질의 일부이다. 막관통 도메인은 세포막에서 열역학적으로 안정하고 일반적으로 약 15 개 아미노산 내지 약 30 개 아미노산 범위의 길이를 가지는 3 차원 구조를 갖는다. 막관통 도메인의 구조는 알파 나선, 베타 배럴, 베타 시트, 베타 나선 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 막관통 도메인은 공지된 막관통 단백질 (즉, CD4 막관통 도메인, CD8 막관통 도메인, CD27 막관통 도메인, CD28 막관통 도메인, 또는 이들의 임의의 조합)을 포함하거나 이로부터 유래된다.
특정 구체예에서, 융합 단백질의 세포 외 성분은 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 배치된 링커를 추가로 포함한다. 결합 및 막관통 도메인을 연결하는 융합 단백질의 성분을 언급할 때 본원에 사용된 "링커"는 약 2개의 아미노산 내지 약 500개의 아미노산을 갖는 아미노산 서열일 수 있으며, 링커에 의해 연결된 두 영역, 도메인, 모티프, 단편 또는 모듈 간의 유연성 및 구조적 이동을 위한 공간을 제공할 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 링커는 융합 단백질을 발현하는 숙주 세포의 표면으로부터 결합 도메인을 이격시켜 숙주 세포와 표적 세포 사이의 적절한 접촉, 항원 결합 및 활성화를 가능하게 할 수 있다 (Patel et al., Gene Therapy 6: 412-419, 1999). 선택된 표적 분자, 선택된 결합 에피토프, 또는 항원 결합 도메인 사이즈 및 친화도에 기초하여 항원 인식을 최대화하기 위해 링커 길이를 변화시킬 수 있다 (예를 들어, Guest et al., J. Immunother. 28:203-11, 2005; PCT 공개 WO 2014/031687호 참조). 예시적인 링커는 1 내지 10개의 GlyxSery 반복체 (여기서 x 및 y는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수이되, 단 x 및 y가 모두 0은 아님)를 가지는 글리신-세린 아미노산 쇄 (예를 들어, (Gly4Ser)2 (서열 번호 20), (Gly3Ser)2 (서열 번호 21), Gly2Ser, 또는 이들의 조합, 예컨대 ((Gly3Ser)2Gly2Ser) (서열 번호 49)를 가지는 것을 포함한다.
본 개시의 링커는 또한 면역글로불린 불변 영역 (즉, 임의의 이소형의 CH1, CH2, CH3 또는 CL) 및 이의 부분을 포함한다. 특정 구체예에서, 링커는 CH3 도메인, CH2 도메인 또는 둘 다를 포함한다. 특정 구체예에서, 링커는 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. 추가의 구체예에서, CH2 도메인 및 CH3 도메인은 각각 동일한 이소형이다. 특정 구체예에서, CH2 도메인 및 CH3 도메인은 IgG4 또는 IgG1 이소형이다. 다른 구체예에서, CH2 도메인 및 CH3 도메인은 각각 상이한 이소형이다. 특정 구체예에서, CH2는 N297Q 돌연변이를 포함한다. 이론에 구애 없이, N297Q 돌연변이를 갖는 CH2 도메인은 FcγR에 결합하지 않는 것으로 여겨진다 (예를 들어, Sazinsky et al., PNAS 105(51):20167 (2008) 참조). 특정 구체예에서, 링커는 인간 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 일부를 포함한다.
본원에 기재된 임의의 구체예에서, 링커는 힌지 영역 또는 이의 일부를 포함할 수 있다. 힌지 영역은 가변 길이 및 서열 (전형적으로 프롤린 및 시스테인 아미노산이 풍부함)의 가요성 아미노산 중합체이며, 면역글로불린 단백질의 더 크고 덜가요성인 영역을 연결한다. 예를 들어, 힌지 영역은 항체의 Fc 및 Fab 영역을 연결하고 TCR의 불변 및 막관통 영역을 연결한다. 특정 구체예에서, 링커는 면역글로불린 불변 영역 또는 이의 일부 및 힌지 영역 또는 이의 일부를 포함한다. 특정 구체예에서, 링커는 서열 번호 20, 21 또는 49에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 글리신-세린 링커를 포함한다.
특정 구체예에서, 세포 외 성분, 결합 도메인, 링커, 막관통 도메인, 세포 내 성분 또는 공동 자극 도메인 중 하나 이상은 접합 아미노산을 포함한다. "접합 아미노산" 또는 "접합 아미노산 잔기"는 단백질의 2개의 인접한 도메인, 모티프, 영역, 모듈 또는 단편 사이, 예컨대, 결합 도메인과 인접한 링커 사이, 막관통 도메인과 인접한 세포 외 또는 세포 내 도메인 사이, 또는 2개의 도메인, 모티프, 영역, 모듈 또는 단편을 연결하는 링커의 양 단부 사이 (예를 들어, 링커와 인접 링커 도메인 사이 또는 링커와 인접한 힌지 사이)의 하나 이상 (예를 들어, 2 내지 약 10개)의 아미노산 잔기를 지칭한다. 접합 아미노산은 융합 단백질의 작제물 설계 (예를 들어, 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 작제 동안 제한 효소 부위 또는 자가-절단 펩티드 서열의 사용으로 인한 아미노산 잔기)로부터 생성될 수 있다. 예를 들어, 융합 단백질의 막관통 도메인은 아미노-말단, 카복시-말단 또는 둘 다에서 하나 이상의 접합 아미노산을 가질 수 있다.
일부 구체예에서, 본 개시의 융합 단백질은 단백질 태그가 Strep-tag 펩티드가 아닌 한 단백질 태그 (본원에서 펩티드 태그 또는 태그 펩티드라고도 함)를 추가로 포함할 수 있다. 단백질 태그는 관심 단백질에 부착되거나 유전자적으로 융합되거나 이의 일부인 특유의 펩티드 서열이고, 예를 들어 이종 또는 비내인성 동족 결합 분자 또는 기질 (예를 들어, 수용체, 리간드, 항체, 탄수화물 또는 금속 매트릭스)에 의해 인식되고 결합될 수 있다. 단백질 태그는, 특히 태그된 단백질이 이종 세포 집단 (예를 들어, 말초 혈액과 같은생물학적 샘플)의 일부인 경우, 관심 태그된 단백질을 검출, 식별, 분리, 추적, 정제, 농축, 표적화 또는 생물학적 또는 화학적으로 변형시키는 데 유용하다. 제공된 융합 단백질에서, 동족 결합 분자에 의해 특이적으로 결합되는 태그(들)의 능력은 표적 분자(들)에 특이적으로 결합하는 결합 도메인(들)의 능력과 상이하거나 이에 부가된다 (즉, 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 태그 펩티드). 특정 구체예에서, 단백질 태그는 Myc 태그, His 태그, Flag 태그, Xpress 태그, Avi 태그, 칼모둘린 태그, 폴리글루타메이트 태그, HA 태그, Nus 태그, S 태그, X 태그, SBP 태그, Softag, V5 태그, CBP, GST, MBP, GFP, 티오레독신 태그 또는 이들의 조합이다.
특정 구체예에서, 융합 단백질은 키메라 항원 수용체 또는 T 세포 수용체를 포함한다. "키메라 항원 수용체" (CAR)는, 세포의 표면 상에 제시될 때 융합 단백질이 수용체로서 기능할 수 있는, 자연적으로 발생하지 않거나 숙주 세포에서 자연적으로 발생하지 않는 방식으로 함께 연결된 2개 이상의 자연 발생 아미노산 서열을 함유하도록 조작된 융합 단백질을 지칭한다. 본 개시의 CAR은 막관통 도메인 및 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인 (임의로 공동 자극성 도메인(들)을 함유함)에 연결된 항원 결합 도메인 (즉, 면역글로불린 또는 면역글로불린-유사 분자, 예컨대, 암 항원에 대해서 특이적인 항체 또는 TCR로부터 유래된 scFv, 또는 NK 세포로부터의 살해 면역수용체로부터 유래되거나 수득된 항원 결합 도메인으로부터 수득되거나 유래됨)을 포함하는 세포외 부분을 포함한다 (예를 들어, 문헌[Sadelain et al., Cancer Discov., 3(4):388 (2013)] 참고; 또한 문헌[Harris and Kranz, Trends Pharmacol. Sci., 37(3):220 (2016), 및 Stone et al., Cancer Immunol. Immunother., 63(11):1163 (2014)] 참고).
"T 세포 수용체" (TCR)는 MHC 수용체에 결합된 항원 펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 슈퍼패밀리 구성원을 지칭한다 (가변 결합 도메인, 불변 도메인, 막관통 영역, 및 짧은 세포질 꼬리를 가짐; 예를 들어, 문헌[Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed, Current Biology Publications, p 433, 1997] 참고). TCR은 세포의 표면 상에서 또는 가용성 형태로 발견될 수 있으며, 일반적으로 α 쇄 및 β 쇄 (또한 각각 TCRα와 TCRβ로 알려짐) 또는 γ 및 δ 쇄 의 이종이량체(또한 각각 TCRγ와 TCRδ로 알려짐)로 구성된다. 면역글로불린과 마찬가지로, TCR 쇄 (예를 들어, α-쇄, β-쇄)의 세포 외 부분은 N-말단에 2개의 면역글로불린 도메인, 가변 도메인 (예를 들어, α-쇄 가변 도메인 또는 Vα, β-쇄 가변 도메인 또는 Vβ; 전형적으로 카밧 넘버링 (Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed)을 기준으로 아미노산 1 내지 116개), 및 세포막에 인접한 하나의 불변 도메인 (예를 들어, α-쇄 불변 도메인 또는 Cα, 전형적으로 카밧을 기준으로 아미노산 117 내지 259개, β-쇄 불변 도메인 또는 Cβ, 전형적으로 카밧을 기준으로 아미노산 117 내지 295개)을 함유한다. 또한, 면역글로불린과 마찬가지로, 가변 도메인은 프레임워크 영역 (FR)에 의해 분리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 함유한다 (예를 들어, 문헌[Jores et al., Proc Nat'l Acad Sci USA 87:9138, 1990; Chothia et al., EMBO J. 7:3745, 1988; Lefranc et al., Dev Comp Immunol 27:55, 2003] 참고). 일반적으로, TCR 가변 도메인의 CDR3은 주로 펩티드 항원과 접촉하는 CDR이고, CDR 1 및 2는 주로 MHC와 접촉한다. 특정 구체예에서, TCR은 T 세포 (또는 T 림프구)의 표면에서 발견되고 CD3 복합체와 회합된다. 본 개시에 사용된 TCR의 공급원은 다양한 동물 종, 예컨대 인간, 마우스, 래트, 토끼 또는 다른 포유 동물로부터 유래될 수 있다.
"주요 조직적합성 복합체 분자 (MHC 분자)"는 세포 표면에 펩티드 항원을 전달하는 당단백질을 지칭한다. MHC 클래스 I 분자는 (3개의 α 도메인을 갖는) α 쇄를 스패닝 (spanning)하는 막과 비공유적으로 결합된 β2 마이크로글로불린으로 이루어진 이종이량체이다. MHC 클래스 II 분자는 2개의 막관통 당단백질, α와 β로 구성되고, 둘 다 막에 걸쳐 이어진다. 각각의 쇄는 2개의 도메인을 갖는다. MHC 클래스 I 분자는 사이토졸에서 기원하는 펩티드를 세포 표면에 전달하고, 여기서 펩티드:MHC 복합체는 CD8+ T 세포에 의해 인식된다. MHC 클래스 II 분자는 소포 시스템 (vesicular system)에서 기원하는 펩티드를 세포 표면에 전달하고, 이들은 CD4+ T 세포에 의해 인식된다. MHC 분자는 인간, 마우스, 래트, 고양이, 개, 염소, 말 또는 다른 포유동물을 포함한 다양한 동물 종에서 유래할 수 있다.
CAR을 포함한 융합 단백질의 제조 방법은 예를 들어 미국 특허 제6,410,319호; 미국 특허 제7,446,191호; 미국 특허 공개 제2010/065818호; 미국 특허 제8,822,647호; PCT 공개 제WO 2014/031687호; 미국 특허 제7,514,537호; Walseng et al., Scientific Reports 7:10713, 2017; 및 Brentjens et al., 2007, Clin. Cancer Res. 13:5426에 기술되어 있으며, 이들의 기술은 본원에 참고로 포함된다. 조작된 TCR을 제조하는 방법은 예를 들어 Bowerman et al., Mol. Immunol., 46(15):3000 (2009)에 기술되어 있으며, 이들의 기술은 본원에 참고로 포함된다.
특정 구체예에서, TCR의 항원-결합 단편은 단쇄 TCR (scTCR)을 포함하며, 이는 TCR Vα 및 Vβ 도메인 TCR 둘 다를 포함하지만 단일 TCR 불변 도메인 (Cα 또는 Cβ)만을 포함한다. 특정 구체예에서, TCR의 항원-결합 단편, 또는 키메라 항원 수용체는 키메라 (예를 들어, 복수 공여체 또는 종으로부터의 아미노산 잔기 또는 모티프를 포함)이며, 인간화 (예를 들어, 인간에서 면역원성의 위험을 감소시키기 위해 변경되거나 치환된, 비인간 유기체로부터의 잔기를 포함함) 또는 인간이다.
재조합적으로 생성된 가용성 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질을 단리 및 정제하는데 유용한 방법은 예로서 가용성 단백질을 배양 배지로 분비하는 적합한 숙주 세포/벡터 시스템으로부터 상등액을 수득한 후 시판 필터를 사용하여 배지를 농축시키는 것을 포함할 수 있다. 농축 후, 농축물을 단일 적합한 정제 매트릭스, 또는 친화성 매트릭스 또는 이온 교환 수지와 같은 일련의 적합한 매트릭스에 적용할 수 있다. 재조합 폴리펩티드를 추가로 정제하기 위해 하나 이상의 역상 HPLC 단계가 사용될 수 있다. 이들 정제 방법은 또한 자연 환경으로부터 면역원을 단리할 때 사용될 수 있다. 본원에 기재된 하나 이상의 단리/재조합 가용성 단백질의 대규모 생산 방법은 배치 세포 배양을 포함하며, 이는 적절한 배양 조건을 유지하도록 모니터링되고 제어된다. 가용성 단백질의 정제는 본원에 기술되고 당 업계에 공지된 방법 및 국내 및 외국 규제 기관의 법률 및 지침에 따라 행해지는 방법에 따라 수행될 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질은 하나 이상의 세포독성제 (예를 들어, 화학요법제 또는 박테리아 독소), 방사성 동위원소, 방사성 금속 또는 검출 가능한 제제를 추가로 포함한다. 예시적인 검출 가능한 제제는 효소 (예를 들어, 고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) 또는 알칼리성 포스파타제 (AP)와 같은 발색성 리포터 효소), 염료 (예를 들어, 시아닌 염료, 쿠마린, 로다민, 잔텐, 플루오레세인 또는 이의 설폰화 유도체, 및 형광 단백질, Shaner et al., Nature Methods (2005)에 의해 기재된 것 포함), 형광성 라벨 또는 모이어티 (예를 들어, PE, 퍼시픽 블루, Alexa fluor, APC 및 FITC), DNA 바코드 (예를 들어, 5 내지 75개 이하의 뉴클레오티드 길이) 및 펩티드 태그를 포함하되, 펩티드 태그는 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지지 않아야 한다. 본원에 사용된 "펩티드 태그" 또는 "단백질 태그" 또는 "비-Strep-tag 펩티드 태그" 또는 "비-Strep-tag 단백질 태그"는 관심 단백질 (예를 들어, 본 개시의 면역글로불린 결합 단백질)에 부착되거나, 융합되거나 또는 그 일부이고; Strep-tag 펩티드가 아니며; 특히, 태그된 펩티드 또는 단백질이 단백질 또는 다른 물질의 이종 집단의 일부이거나, 또는 태그된 펩티드 또는 단백질을 발현하는 세포가 이종 세포 집단 (예를 들어, 생물학적 샘플)의 일부인 경우, 결합 특성이 태그된 펩티드 또는 단백질 또는 태그된 펩티드 또는 단백질을 발현하는 세포를 검출, 식별, 단리 또는 정제, 추적, 농축 또는 표적화하는데 사용될 수 있는 이종 또는 비내인성 동족 결합 분자에 의해 특이적으로 결합되는 독특한 펩티드 서열을 지칭한다. 비 Strep-tag 펩티드 태그의 예로는 Myc 태그, His 태그, Flag 태그, Xpress 태그, Avi 태그, 칼로듈린 태그, 폴리글루타메이트 태그, HA 태그, Nus 태그, S 태그, X 태그, SBP 태그, Softag, V5 태그, CBP, GST, MBP, GFP, 티오레독신 태그 또는 이들의 임의의 조합 등을 들 수 있다.
다른 측면에서, 본 개시는 본원에 기재된 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 조성물을 제공한다. 진단 및 치료 용도를 위한 약학적으로 허용되는 담체는 약학 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro (Ed.), 18th Edition, 1990) 및 CRC Handbook of Food, Drug, 및 Cosmetic Excipients, CRC Press LLC (S.C. Smolinski, ed., 1992)에 기재되어 있다. 예시적인 약학적으로 허용되는 담체는 임의의 애쥬번트, 담체, 부형제, 활택제, 희석제, 보존제, 염료/착색제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 안정화제, 등장제, 용매, 유화제 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 예를 들어, 생리적 pH에서의 멸균 식염수 및 포스페이트 완충 식염수가 약학적으로 허용되는 적합한 담체일 수 있다. 보존제, 안정화제, 염료 등이 또한 약학적 조성물에 제공될 수 있다. 또한, 항산화제 및 현탁제가 사용될 수 있다. 약학적 조성물은 또한 희석제, 예컨대 물, 완충제, 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 저 분자량 폴리펩티드 (약 10 잔기 미만), 단백질, 아미노산, 탄수화물 (예를 들어, 글루코스, 수크로스, 덱스트린), 킬레이트제 (예를 들어, EDTA), 글루타티온 및 기타 안정화제 및 부형제를 포함할 수 있다. 비특이적 혈청 알부민과 혼합된 중성 완충 식염수 또는 식염수가 예시적인 희석제이다.
본원에는 (a) 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 태그 펩티드를 암호화하는 발현 벡터 또는 폴리뉴클레오티드, 및 벡터 또는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 형질도입시키기 위한 임의의 시약; 및 (b) 본 개시의 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질, 조성물, 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터, 및 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터를 숙주 세포, 및/또는 폴리뉴클레오티드 또는 발현 작제물을 포함하는 숙주 세포로 형질전환시키기 위한 임의의 시약 (여기서 숙주 세포는 암호화된 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질을 발현함)을 포함하는 키트가 제공된다.
다른 측면에서, (i) 본원에 개시된 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질을 포함하는 매트릭스 조성물, 및 (ii) 면역 공동 자극 분자에 특이적으로 결합하는 결합 폴리펩티드 (여기서 결합은 면역 공동자극 분자의 활성 수준을 증가시킴)를 포함하는 매트릭스 조성물이 제공된다. 특정 구체예에서, 매트릭스 조성물은 알기네이트, 기저막 매트릭스 또는 바이오폴리머, 또는 이들의 임의의 조합을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, (i) 본원에 개시된 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질; 및 (ii) 면역 공동 자극 분자에 특이적으로 결합하는 결합 폴리펩티드 (여기서 결합은 면역 공동 자극 분자의 활성 수준을 증가시킴)를 포함하는 장치가 제공된다. 장치의 특정 구체예에서, (i) 및 (ii) 중 하나 또는 둘 모두는 고체 표면, 아가로스 비드, 수지, 3D 패브릭 매트릭스 또는 비드 상에 배치된다.
폴리뉴클레오티드, 벡터 및 숙주 세포
특정 측면에서, 본원에 기재된 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질 중 임의의 하나 이상을 암호화하는 핵산 분자가 제공된다. 특정 구체예에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 (a) 서열 번호 1, 7, 및 13 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 (b) 서열 번호 4, 9 및 15 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 중 하나 또는 모두를 포함한다.
원하는 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 이를 포함하도록 공지된 벡터로부터 서열을 유도하거나, 이를 포함하는 세포 또는 조직으로부터 서열 또는 이의 일부를 직접 단리함으로써 목적하는 서열 또는 이의 일부를 발현하는 세포로부터의 라이브러리를 스크리닝하는 것과 같이, 표준 기술을 사용하여 당 업계에 공지된 재조합 방법으로 수득 또는 생산될 수 있다. 대안적으로, 관심 서열은 합성적으로 생성될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 구체예에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 숙주 세포에 대해 코돈-최적화될 수 있다 (예를 들어, Scholten et al., Clin. Immunol. 119:135-145 (2006) 참조). 본원에 사용된 "코돈-최적화된" 폴리뉴클레오티드는 존재하는 숙주 세포 tRNA 수준에 상응하는 침묵 돌연변이로 변형된 코돈을 갖는 이종 폴리뉴클레오티드이다.
추가의 측면에서, 발현 작제물이 제공되며, 상기 발현 작제물은 발현 조절 서열 (예를 들어, 프로모터)에 작동 가능하게 연결된 본 개시의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 구체예에서, 발현 작제물은 관심 숙주 세포 (예를 들어, B 세포, CHO 세포, HEK-293 세포, T 세포, NK 세포 또는 NK-T 세포)로 도입하기 위한 벡터에 포함된다. 예시적인 벡터는, 숙주 유기체에서 복제할 수 있거나 연결된 다른 폴리뉴클레오티드를 수송할 수 있는, 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 벡터의 일부 예는 플라스미드, 바이러스 벡터, 코스미드 및 기타를 포함한다. 일부 벡터는 그들이 도입된 숙주 세포에서 자율 복제를 할 수 있는 반면 (예를 들어, 박테리아 복제 기원 및 에피솜 포유동물 벡터를 갖는 박테리아 벡터), 다른 벡터는 숙주 세포의 게놈에 통합되거나 또는 숙주 세포 내로 도입 시 폴리뉴클레오티드 삽입물의 통합을 촉진시킴으로써, 숙주 게놈 (예를 들어, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터)과 함께 복제할 수 있다. 추가적으로, 일부 벡터는 그들이 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다 (이들 벡터는 "발현 벡터"로서 지칭될 수 있다). 관련 구체예에 따르면, 1종 이상의 제제 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드)가 대상에게 공동 투여된다면, 각각의 제제는 별개의 또는 동일한 벡터에 존재할 수 있으며, 다중 벡터 (각각 상이한 제제, 동일한 제제를 함유함)는 세포 또는 세포 집단에 도입되거나 또는 대상에 투여될 수 있다는 것이 추가로 이해된다.
특정 구체예에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드는 벡터의 특정 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 결찰된 암호화 서열의 발현 및 처리를 달성하는 데 필요한 폴리뉴클레오티드 서열은 작동 가능하게 연결될 수 있다. 발현 조절 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 효율적인 RNA 처리 신호, 예컨대 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호; 세포질 mRNA를 안정화하는 서열; 번역을 효율적으로 향상시키는 서열 (즉, 코작(Kozak) 공통 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 가능하게는 단백질 분비를 향상시키는 서열을 포함할 수 있다. 발현 조절 서열은, 관심 유전자 및 관심 유전자를 제어하기 위해 트랜스 또는 일정 거리에서 작용하는 발현 조절 서열과 인접한 경우 작동 가능하게 연결될 수 있다.
특정 구체예에서, 벡터는 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터를 포함한다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 파보바이러스 (예를 들어, 아데노-연관 바이러스), 코로나바이러스, 음성 가닥 RNA 바이러스, 예컨대 오르토-믹소바이러스 (예를 들어, 인플루엔자 바이러스), 라브도바이러스 (예를 들어, 광견병 및 수포성 구내염 바이러스), 파라믹소바이러스 (예를 들어, 홍역 및 센다이 (Sendai)), 양성 가닥 RNA 바이러스, 예컨대 피코나바이러스 및 알파바이러스, 및 이중-가닥 DNA 바이러스 (아데노바이러스, 헤르페스 (예를 들어, 단순포진 바이러스 1형 및 2형, 엡스타인-바르 바이러스, 거대세포바이러스) 및 폭스바이러스 (예를 들어, 백시니아, 계두 및 카나리아두창)를 포함)를 포함한다. 다른 바이러스는, 예를 들어, 노워크 바이러스, 토가바이러스, 플라비바이러스, 레오바이러스, 파보바이러스, 헤파드나바이러스 및 간염 바이러스를 포함한다. 레트로바이러스의 예는 조류 백혈증-육종, 포유동물 C-형, B-형 바이러스, D 형 바이러스, HTLV-BLV 그룹, 렌티바이러스, 스푸마바이러스를 포함한다 (Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996).
"레트로바이러스"는 역전사 효소를 사용하여 DNA로 역전사되고, 그 후 역전사된 DNA가 숙주 세포 게놈으로 통합되는 RNA 게놈을 갖는 바이러스이다. "감마레트로바이러스"는 레트로바이러스과 (retroviridae family) 속을 지칭한다. 감마레트로바이러스의 예는 마우스 줄기 세포 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스, 고양이 백혈병 바이러스, 고양이 육종 바이러스 및 조류 세망내피증 바이러스를 포함한다.
본원에 사용되는 "렌티바이러스 벡터"는 통합 또는 비통합일 수 있고, 상대적으로 거대한 패키징 능력을 가지며, 다양한 상이한 세포 유형을 형질도입할 수 있는, 유전자 전달을 위한 HIV-기반 렌티바이러스 벡터를 의미한다. 렌티바이러스 벡터는 보통 셋 (패키징, 외피 및 전달) 이상의 플라스미드의 생산자 세포 내로의 일시적 형질감염 후에 생성된다. HIV와 같이, 렌티바이러스 벡터는 세포 표면 상에서 수용체와 바이러스 표면 당단백질의 상호작용을 통해 표적 세포에 유입된다. 유입 시, 바이러스 RNA는 바이러스 역전사효소 복합체에 의해 매개되는 역전사를 겪는다. 역전사 산물은 감염 세포의 DNA 내로의 바이러스 통합을 위한 기질인, 이중 가닥 선형 바이러스 DNA이다.
특정 구체예에서, 바이러스 벡터는 감마레트로바이러스, 예를 들어 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV) 유래 벡터일 수 있다. 다른 구체예에서, 바이러스 벡터는 보다 복잡한 레트로바이러스-유래 벡터, 예를 들어 렌티바이러스-유래 벡터일 수 있다. HIV-1 유래 벡터가 이 범주에 속한다. 다른 예는 HIV-2, FIV, 말 감염성 빈혈 바이러스, SIV 및 Maedi-Visna 바이러스 (양 렌티바이러스)로부터 유래된 렌티바이러스 벡터를 포함한다. CAR 이식유전자를 함유하는 바이러스 입자로 포유동물 숙주 세포를 형질도입하기 위해 레트로바이러스 및 렌티바이러스 바이러스 벡터 및 패키징 세포를 사용하는 방법은 당 업계에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 제8,119,772호; Walchli et al., PLoS One 6:327930, 2011; Zhao et al., J. Immunol. 174:4415, 2005; Engels et al., Hum. Gene Ther. 14:1155, 2003; Frecha et al., Mol. Ther. 18:1748, 2010; 및 Verhoeyen et al., Methods Mol. Biol. 506:97, 2009에 기재되어 있다. 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터 작제물 및 발현 시스템 또한 상업적으로 이용 가능하다. DNA 바이러스 벡터, 예를 들어 아데노 바이러스 기반 벡터 및 아데노 관련 바이러스 (AAV) 기반 벡터; 앰플 리콘 벡터, 복제 결함 HSV 및 약독화 HSV를 포함하는 단순 포진 바이러스 (HSV)로부터 유래된 벡터를 포함하는 다른 바이러스 벡터가 또한 폴리뉴클레오티드 전달을 위해 사용될 수 있다 (Krisky et al., Gene Ther. 5:1517, 1998).
바이러스 벡터 게놈이 별개의 전사체로서 숙주 세포에서 발현되는 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 경우, 바이러스 벡터는 또한 2개 (또는 그 초과)의 전사체 사이에 추가적인 서열을 포함하여, 이시스트론성 또는 다시스트론성 발현이 가능할 수 있다. 바이러스 벡터에서 사용되는 이러한 서열의 예는 내부 리보솜 유입 부위 (IRES), 퍼린 절단 부위 (furin cleavage site), 바이러스 2A 펩티드 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 자가-절단 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 자가-절단 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 마커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 사이에 위치된다.
특정 구체예에서, 자가-절단 폴리펩티드는 돼지 테스코 바이러스-1 (P2A; 서열 번호 40 또는 41)로부터의 2A 펩티드, Thosea asigna 바이러스 (T2A; 서열 번호 42 또는 43), 말 비염 A 바이러스 (E2A; 서열 44 또는 45), 또는 구제역 바이러스 (F2A))를 포함한다. 추가의 예시적인 핵산 및 아미노산 서열은 2A 펩티드, 예를 들어 Kim et al. (PLOS One 6:e18556, 2011, 2A 핵산 및 아미노산 서열은 그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
유전자 치료 용도로 개발된 다른 벡터가 또한 본 개시의 조성물 및 방법과 함께 사용될 수 있다. 이러한 벡터는 바큘로바이러스 및 α-바이러스로부터 유래 된 것 (Jolly, D J. 1999. Emerging Viral Vectors. pp 209-40 in Friedmann T. ed. The Development of Human Gene Therapy. New York: Cold Spring Harbor Lab), 또는 플라스미드 벡터 (예를 들어, 슬리핑 뷰티 또는 다른 트랜스포손 벡터)를 포함한다.
유전자 조작 및 관심 폴리펩티드를 생산하기 위한 발현 벡터의 작제는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 적합한 분자 생물학 조작 기술을 사용함으로써 달성될 수 있다. 효율적인 전사 및 번역을 수득하기 위해서, 각 재조합 발현 작제물 내의 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 적절한 발현 제어 서열 (조절 서열이라고도 지칭됨), 예컨대, 리더 서열 및 특히 관심 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동 가능하게 (즉, 작동 방식으로) 연결된 프로모터를 포함한다.
마커는 때때로 이로 형질도입된 숙주 세포에 의한 이종 폴리뉴클레오티드의 발현을 확인 또는 모니터링하거나, 관심 융합 단백질을 발현하는 세포를 검출하기 위해 사용된다. 특정 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 마커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 마커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 3'에 위치한다. 다른 구체예에서, 마커를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 5'에 위치한다. 예시적인 마커는 녹색 형광 단백질, 인간 CD2의 세포 외 도메인, 절단된 인간 EGFR (huEGFRt; Wang et al., Blood 118:1255 (2011) 참조), 절단된 인간 CD19 (huCD19t), 절단된 인간 CD34 (huCD34t); 또는 절단된 인간 NGFR (huNGFRt)를 포함한다. 특정 구체예에서, 암호화된 마커는 EGFRt, CD19t, CD34t 또는 NGFRt를 포함한다.
본 개시의 면역글로불린 결합 단백질 및 융합 단백질은 특정 측면에서 숙주 세포의 표면에서 발현되거나 숙주 세포에 의해 분비되거나 그로부터 단리될 수 있다. 숙주 세포는 벡터를 받거나, 핵산 도입 또는 단백질을 발현할 수 있는 임의의 개개 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 상기 용어는 또한 유전적으로 또는 표현형적으로 동일하든 또는 상이하든 숙주 세포의 자손을 포함한다. 적합한 숙주 세포는 벡터에 의존할 수 있으며, 포유동물 세포, 동물 세포, 인간 세포, 유인원 세포, 곤충 세포, 효모 세포 및 박테리아 세포를 포함할 수 있다. 이들 세포는 바이러스 벡터, 인산칼슘 침전을 통한 형질전환, DEAE-덱스트란, 전기천공법, 미량주입법 또는 기타 방법의 사용에 의해 벡터 또는 다른 물질을 혼입하도록 유도될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2d ed. (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)] 참조.
따라서, 특정 구체예에서, 본 개시의 폴리뉴클레오티드 또는 발현 작제물을 포함하는 숙주 세포가 제공되며, 여기서 폴리뉴클레오티드 또는 발현 작제물은 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질을 암호화하고 숙주 세포는 암호화된 면역글로불린 결합 단백질 또는 암호화된 융합 단백질을 발현한다. 면역글로불린 결합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 클로닝/발현 작제물은 형질전환, 형질감염 및 형질도입을 비롯해 당 업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 적합한 세포에 도입된다. 숙주 세포는 예를 들어 생체 외 유전자 요법을 비롯하여 생체 외 세포 요법을 받는 대상의 세포 (예를 들어, T 세포 또는 다른 면역 세포) 및 세포 요법에 사용되는 동종 이계 또는 동계 세포를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 개시의 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질을 발현하도록 형질도입된 숙주 세포는 조혈 전구 세포 또는 인간 면역계 세포이다. 본원에 사용되는 "조혈 전구 세포"는 조혈모세포 또는 태아 조직으로부터 유래될 수 있고, 성숙 세포 유형 (예를 들어, 면역계 세포)으로 추가로 분화될 수 있는 세포이다. 예시적인 조혈 전구체 세포는 CD24Lo Lin- CD117+ 표현형 또는 흉선에서 발견되는 것을 갖는 것 (전구체 흉선세포로서 지칭됨)을 포함한다.
본원에 사용되는 "면역계 세포"는 (단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 거핵세포 및 과립구와 같은 골수 세포에서 발생하는) 골수 전구 세포 및 (T 세포, B 세포 및 자연 살해 (NK) 세포 및 NK-T 세포와 같은 림프계 세포에서 발생하는) 림프계 전구 세포의 두 가지 주요 계통에서 발생하는 골수 내 조혈 줄기세포로부터 기원한 면역계의 임의의 세포를 의미한다. 예시적인 면역계 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4- CD8- 이중 음성 T 세포, γδ T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 세포 (예를 들어 NK 세포 또는 NK-T 세포) 및 수지상 세포를 포함한다. 대식세포 및 수지상 세포는 펩티드와 복합체화된 APC 표면 상의 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 수용체가 T 세포 표면 상의 TCR과 상호작용하는 경우 T 세포를 활성화시킬 수 있는 특수화 세포인 "항원 제시 세포" 또는 "APC"로 지칭될 수 있다.
"T 세포" 또는 "T 림프구"는 흉선에서 성숙하고 T 세포 수용체 (T cell receptor: TCR)를 생산하는 면역계 세포이다. T 세포는 나이브 (항원에 노출되지 않음; TCM에 비해 CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD127 및 CD45RA의 발현 증가, 및 CD45RO의 발현 감소), 기억 T 세포 (TM) (항원-경험 및 긴 생존), 및 이펙터 세포 (항원-경험, 세포독성)일 수 있다. TM은 중추 기억 T 세포 (TCM, CD62L, CCR7, CD28, CD45RO를 발현함) 및 이펙터 기억 T 세포 (나이브 T 세포에 비해 CD62L, CCR7, CD28, CD127, CD45RO 및 CD95의 발현 증가, 및 CD54RA의 발현 감소), 줄기 세포 기억 T 세포 및 이펙터 기억 T 세포 (TEM, 나이브 T 세포 또는 (TCM에 비해 CD62L, CCR7, CD28, CD45RA 및 CD95의 발현 감소, 및 CD127의 발현 증가)의 하위세트로 추가로 분류될 수 있다.
이펙터 T 세포 (TE)는 TCM에 비해 CCD62L, CCR7 및 CD28의 발현 감소를 갖고, 그랜자임 및 퍼포린에 대해 양성인 항원-경험 CD8+ 세포독성 T 림프구를 지칭한다. 헬퍼 T 세포 (TH)는 사이토카인을 방출함으로써 다른 면역 세포의 활성도에 영향을 주는 CD4+ 세포이다. CD4+ T 세포는 적응 (adaptive) 면역 반응을 활성화 및 억제할 수 있는데, 이들 두 기능 중 어느 것이 의도될 것인지는 다른 세포 및 신호에 존재에 좌우될 것이다. T 세포는 공지된 기술을 사용하여 수집될 수 있고, 다양한 하위집단 또는 이의 조합물은 공지된 기술, 예컨대, 항체에 대한 친화도 결합, 유세포 분석법 또는 면역자성 선택에 의해서 풍부화되거나 또는 고갈될 수 있다. 다른 예시적인 T 세포는 조절 T 세포, 예컨대, CD4+ CD25+ (Foxp3+) 조절 T 세포 및 Treg17 세포, 뿐만 아니라 Tr1, Th3, CD8+CD28-, 및 Qa-1 제한 T 세포를 포함한다.
"T 세포 계통의 세포"는 다른 림프구 세포로부터의 세포, 및 적혈구 또는 골수 계통의 세포를 구별하는 T 세포 또는 그의 전구체 또는 선조체 (progenitor)의 적어도 하나의 표현형 특성을 나타내는 세포를 지칭한다. 이러한 표현형 특징은 T 세포 (예를 들어, CD3+, CD4+, CD8+)에 특이적인 하나 이상의 단백질의 발현, 또는 T 세포에 특이적인 생리학적, 형태학적, 기능학적 또는 면역학적 특징을 포함할 수 있다. 예를 들어, T 세포 계통의 세포는 T 세포 계통에 이어지는 선조체 또는 전구체 세포; CD25+ 미성숙 및 불활성화된 T 세포; CD4 또는 CD8 계통에 이어지는 세포; CD4+CD8+ 이중 양성인 흉선 전구세포; 단일 양성 CD4+ 또는 CD8+; TCRαβ 또는 TCRγδ; 또는 성숙 및 기능성 또는 활성화된 T 세포일 수 있다.
원하는 핵산으로 T 세포를 형질감염/형질도입하는 방법은 원하는 표적 특이성의 T 세포를 사용하는 입양 전달 절차 (예를 들어, Schmitt et al., Hum. Gen. 20:1240, 2009; Dossett et al., Mol. Ther. 17:742, 2009; Till et al., Blood 112:2261, 2008; Wang et al., Hum. Gene Ther. 18:712, 2007; Kuball et al., Blood 109:2331, 2007; US　2011/0243972; US 2011/0189141; Leen et al., Ann. Rev. Immunol. 25:243, 2007)를 가지는 것으로 기술되어 있으며 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제US 2004/0087025호), 여기에서의 교시에 기초하여, 본 개시의 면역글로불린 결합 단백질 및 융합 단백질에 관한 것을 포함해 본 발명의 개시된 구체예에 이러한 방법론의 적용이 고려된다.
본 개시에 따른 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 단백질을 보유하는 경우 본 개시의 측면으로서 고려되는 진핵 숙주 세포는 인간 면역 세포 (예를 들어, 인간 환자 자신의 면역 세포) 이외에, VERO 세포, HeLa 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (발현된 다가 결합 분자의 글리코실화 패턴을 변형시킬 수 있는 변형된 CHO 세포 포함, 미국 특허 출원 공개 제2003/0115614호 참조), COS 세포 (예컨대 COS-7), W138, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562, HEK293 세포, HepG2 세포, N 세포, 3T3 세포, 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포 (예를 들어, Sf9 세포), 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 세포 및 본 개시에 따른 단백질 또는 펩티드를 발현시키고, 임의로 단리하는데 유용할 수 있는 당 업계에 공지된 임의의 다른 진핵 세포를 포함한다. 또한, 대장균 (Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 스트렙토마이세트 (Streptomycete) 또는 본 개시에 따른 단백질 또는 펩티드를 발현하고 임의로 단리하기에 적합한 것으로 알려진 임의의 원핵 세포를 포함하는 원핵 세포가 고려된다. 원핵 세포로부터 단백질 또는 펩티드를 단리하는데, 특히, 봉입체로부터 단백질을 추출하기 위해 당 업계에 공지된 기술이 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 본 개시의 면역글로불린 결합 단백질 및 융합 단백질을 글리코실화하는 숙주 세포가 고려된다.
형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 선택된 숙주 세포의 성장에 필요한 영양소 및 기타 성분을 함유하는 배양 배지에서 통상적인 절차에 따라 배양될 수 있다. 한정 배지 및 복합 배지를 포함하는 다양한 적합한 배지가 당 업계에 공지되어 있으며 일반적으로 탄소원, 질소원, 필수 아미노산, 비타민 및 미네랄을 포함한다. 배지는 또한 필요에 따라 성장 인자 또는 혈청과 같은 성분을 함유할 수 있다. 성장 배지는 일반적으로, 예를 들어 숙주 세포로 공동 형질감염되거나 발현 벡터 상에 운반되는 선별 마커에 의해 보완되는 필수 영양소의 결핍 또는 약물 선택에 의해 외부적으로 첨가된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포를 선택할 것이다.
구체예에서, 본 개시의 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질은 태그 펩티드에 대한 결합이 숙주 세포로부터 활성 또는 반응을 유도하도록 숙주 세포의 표면에서 발현된다. 이러한 발현된 단백질은 T　세포 결합, 활성화 또는 유도의 결정을 포함하고 또한 항원-특이적인 T 세포 반응의 결정을 포함하는, 숙주 세포 (예를 들어 T 세포) 활성을 검정하기 위한 임의의 다수의 당업계에 허용되는 방법에 따라 기능적으로 특성규명될 수 있다. 예는 T 세포 증식, T 세포 사이토카인 방출, 항원-특이적 T 세포 자극, MHC 제한 T　세포 자극, CTL 활성 (예를 들어, 사전 부하된 표적 세포로부터 51Cr 방출을 검출함으로써), T 세포 표현형 마커 발현의 변화 및 T-세포 기능의 다른 측정의 결정을 포함한다. 이들 및 유사한 검정을 수행하는 절차는, 예를 들어, 문헌[Lefkovits (Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1998)]에서 찾을 수 있다. 또한 문헌[Current Protocols in Immunology; Weir, Handbook of Experimental Immunology, Blackwell Scientific, Boston, MA (1986); Mishell and Shigii (eds.) Selected Methods in Cellular Immunology, Freeman Publishing, San Francisco, CA (1979); Green and Reed, Science 281:1309 (1998)] 및 이에 인용된 참고문헌을 참조한다.
사이토카인의 수준은, 예를 들어, ELISA, ELISPOT, 세포내 사이토카인 염색, 및 유세포 분석 및 이들의 조합 (예를 들어, 세포내 사이토카인 염색 및 유세포 분석)을 포함하는 본원에 기재되고 당 업계에서 실행되는 방법에 따라 결정될 수 있다. 면역 반응의 항원-특이적 유발 또는 자극으로부터 초래되는 면역 세포 증식 및 클론 확장은 림프구를 단리시키는 것, 예컨대 말초 혈액 세포 또는 림프절로부터의 세포의 샘플에서 림프구를 순환시키는 것, 항원으로 세포를 자극하는 것 및 사이토카인 생산, 세포 증식 및/또는 세포 생존도를, 예컨대 삼중수소 티미딘의 혼입 또는 비방사성 분석, 예컨대 MTT 분석 등에 의해 측정하는 것에 의해 결정될 수 있다. Th1 면역 반응과 Th2 면역 반응 사이의 균형에 대한 본원에 기재된 면역원의 효과는, 예를 들어, Th1 사이토카인, 예컨대 IFN-γ, IL-12, IL-2 및 TNF-β 및 2형 사이토카인, 예컨대 IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 및 IL-13 수준을 결정함으로써 조사할 수 있다.
다른 측면에서, (a) 본원에 기재된 바와 같은 벡터 또는 발현 작제물 및 벡터 또는 발현 작제물을 숙주 세포로 형질전환시키기 위한 임의적인 시약, 및 (b) (i) 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질, 단리된 폴리뉴클레오티드, 또는 본원에 개시된 바와 같은 발현 벡터, 및 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터를 숙주 세포로 형질도입하기 위한 임의적인 시약, 및 (c) 본 개시의 숙주 세포를 포함하는 키트가 제공된다.
용도
추가 측면에서, 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 갖는 (즉, 이를 포함하거나 이로 이루어진) 태그 펩티드를 발현하는 세포 또는 세포 집단을 확인하기 위해 본 개시의 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질을 사용하는 방법이 제공된다. 이 방법은, 예를 들어, 입양 세포 요법에 사용된 태그된 세포가 이를 필요로하는 대상에게 성공적으로 전달되었는지, 또는 태그된 세포가 입양 세포 요법을 받은 대상에서 관심 부위로 증식, 지속 또는 국소화되는지를 결정하는데 유용할 수 있다. 특정 구체예에서, 방법은 (i) 하나 이상의 태그된 세포를 포함하는 대상으로부터의 샘플을 본 발명의 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질과 접촉시키고, (ii) 하나 이상의 태그된 세포에 대한 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질의 특이적 결합을 검출함으로써 태그 펩티드를 발현하는 하나 이상의 세포를 식별하는 단계를 포함한다.
다른 측면에서, 대상으로부터 태그된 세포 또는 태그된 세포 집단을 농축 또는 단리하기 위한 방법이 제공되며, 이 방법은 (i) 세포 표면 상에서 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 태그 펩티드를 발현하는 하나 이상의 세포를 포함하는 대상으로부터의 샘플을 본원에 개시된 바와 같은 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질과 접촉시키는 단계, 및 (ii) 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질에 의해 특이적으로 결합된 태그된 세포(들)를 선택 또는 분류하여 태그 펩티드를 발현하는 하나 이상의 세포를 풍부하게 하거나 단리시키는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 예를 들어 태그된 세포를 이용한 입양 세포 요법에 대한 정보를 제공하거나 개선하기 위한 분석 또는 조작을 위해 대상 또는 대상 샘플 (예를 들어, 전혈, PBMC 또는 종양 조직 또는 부위 유래)로부터 관심 태그된 세포를 효율적으로 분류하고 단리하는 데 유용하다.
특정 구체예에서, 태그 펩티드는 식별되거나 농축되거나 단리될 세포(들)에 의해 발현된 세포 표면 단백질에 함유되어 있다. 특정 구체예에서, 세포 표면 단백질은 CAR 또는 TCR (예컨대, CAR 또는 TCR을 발현하는 세포를 포함하는 입양 세포 요법에서 질환 관련 항원을 표적화하기 위해 사용될 수 있음), 마커 (예를 들어, 세포 표면 상에서 발현된 검출 가능한 마커, 예컨대 EGFRt, CD19t, CD34t 또는 NGFRt로부터 선택된 형질도입 마커, 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 구체예에서, 세포 표면 단백질은 마커를 포함한다. 추가의 구체예에서, 마커는 EGFRt, CD19t, CD34t 또는 NGFRt를 포함한다. 하나 이상의 태그 펩티드를 함유하는 CAR과 같은 대표적인 태그된 키메라 이펙터 분자는 PCT 공개 제WO 2015/095895호에 기재되어 있으며, 그의 태그 및 태그된 이펙터 분자는 본원에 참조로 포함된다. 예시적인 태그 펩티드는 박테리아 단백질 스트렙타비딘 및 이의 유도체 Strep-Tactin에 고 친화성으로 결합하는 Strep®-Tag (WRHPQFGG, 서열 번호 48) 및 이의 변이체 Strep®-Tag II (WSHPQFEK, 서열 번호 19)를 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제7,981,632호 (그에서의 strep 태그가 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다.
본 개시의 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질은 결합된 태그된 세포의 식별, 추적, 농축 또는 단리를 지원하거나 가능하게 하는 검출 가능한 모이어티를 포함할 수 있다. 예를 들어, 검출 가능한 모이어티는 펩티드 태그가 Strep-tag 펩티드를 포함하지 않는 (예를 들어, 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 펩티드 태그를 포함하지 않는) 조건으로, 효소, 염료, 형광 표지 또는 펩티드 태그 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 검출 가능한 모이어티는 효소를 포함하고, 효소는 고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼리 포스파타제와 같은 발색성 리포터 효소를 포함한다. 본 개시의 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질에 커플링될 수 있는 형광 표지는 시아닌 염료, 쿠마린, 로다민, 잔텐, 플루오레세인 또는 이의 설폰화 유도체, 형광 단백질 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 본 발명의 개시된 방법에 유용한 펩티드 라벨은 Myc 태그, His 태그, Flag 태그, Xpress 태그, Avi 태그, 칼모듈린 태그, 폴리글루타메이트 태그, HA 태그, Nus 태그, S 태그, X 태그, SBP 태그, Softag, V5 태그, CBP, GST, MBP, GFP, 티오레독신 태그 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 특정 구체예에서, 검출 가능한 모이어티는 펩티드 태그를 포함하고 펩티드 태그는 His-태그 또는 Myc-태그를 포함한다. 구체예에서, 형광 모이어티는 PE, 퍼시픽 블루, 알렉사 플루오로, APC 또는 FITC로부터 선택될 수 있다.
임의의 본 발명의 개시된 방법 및 조성물, 및 관련 태그 전략 및 이미징 기술 (예를 들어, PET, MRI, NIR)에 유용한 추가의 검출 가능한 모이어티는 Friese and Wu, Mol. Immunol. 67(200):142-152 (2015) 및 Moek et al., J. Nucl. Med. 58:83S-90S (2017)에 기재된 것을 포함하며, 이들 모두는 본원에 참고로 포함된다. 특정 구체예에서, 검출 가능한 모이어티는 방사성 핵종, 방사성 금속, MRI 조영제, 마이크로버블, 탄소 나노튜브, 금 입자, 플루오로데옥시글루코스, 발색단, 방사성 불투명 마커 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 구체예에서, 검출 가능한 모이어티는 68Ga, 64Cu, 86Y, 89Zr, 124I, 99mTc, 123I, 111In, 177Lu, 131I, 76Br, 78Zr, 18F, 및 124T로부터 선택된 방사성 핵종을 포함한다. 이러한 특정 구체예에서, 검출 가능하게 표지된 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질은 말레이미드-표지된 DOTA, N-하이드록시숙신이미드-DOTA 및 데스페리옥사민 (DFO)으로부터 선택된 방사성 핵종 킬레이터를 추가로 포함한다.
검출 가능하게 결합된 태그된 세포는 공지된 기술을 사용하여 식별, 선택, 분류, 농축 또는 단리될 수 있다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 세포 또는 세포 집단은 유세포 분석법을 사용하여 식별, 선택 또는 분류된다. 일부 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질에 의해 특이적으로 결합된 태그된 세포 또는 태그된 세포의 집단은 자기 컬럼 크로마토그래피에 의해 샘플의 다른 성분으로부터 농축되거나 단리된다.
일부 구체예에서, 식별될 태그된 세포는 대상으로부터의 샘플에 함유되어 있다. 특정 구체예에서, 샘플은 혈액 또는 조직이다. 본원에 개시된 임의의 구체예에서, 대상은 인간일 수 있다.
다른 측면에서, 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 태그 펩티드를 이의 세포 표면 상에 발현하도록 변형된 면역 세포를 활성화시키는 방법이 제공되며, 여기서 방법은 변형된 면역 세포를 변형된 면역 세포의 활성화를 유도하기에 충분한 조건 및 시간으로 본 개시의 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질과 접촉시키는 것을 포함한다. 간략하게, T 세포와 같은 면역 세포는 면역 반응 기능을 수행하기 위해 (예를 들어, 감염 또는 암성 세포를 사멸시키기 위해 사이토카인 및 세포독소를 방출하고, 다른 면역 세포를 모집하라는 신호를 제공하기 위해) 외부 자극에 의한 활성화를 필요로 한다. 입양 요법을 위한 CAR 또는 TCR을 발현하는 프라이밍 T 세포는 전형적으로 발현된 CAR 또는 TCR을 이의 동족 항원에 노출시키거나, 또는 T 세포를 세포 표면 상에 존재하는 공동자극 단백질 (예를 들어, CD3 또는 CD28)에 결합하는 마이크로비드-결합된 항체에 노출시킴으로써 수행된다.
본 개시의 면역글로불린 결합 단백질 및 융합 단백질은, 예를 들어, 면역 세포에 의해 발현된 CAR 또는 TCR에 함유된 태그 (예를 들어, 세포 외 힌지 부분과 같은 동족 항원에 특이적으로 결합하지 않는 CAR 또는 TCR의 일부에 함유된 태그)에 결합하여 항원-결합 이벤트를 모방함으로써 태그된 면역 세포를 활성화시키는 데 사용될 수 있다. 이는 유리하게는 발현된 CAR 또는 TCR에 의한 항원 인식과 무관하게 면역 세포가 활성화되도록 한다. 대안적으로, 본 개시의 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질은 (예를 들어, 본 개시의 항체를 포함하는 마이크로비드 및 공동 자극 분자, 예컨대 CD3 또는 CD28에 작용적으로 결합하는 항체를 사용하여) 태그된 면역 세포에 결합하여 태그된 면역 세포를 활성화시키는 다른 시약과 근접하게 하는데 사용될 수 있다. 이러한 접근법은 태그 펩티드가 활성화를 지시하는 단백질에 함유되지 않은 경우에 유용할 수 있다 (예를 들어, 태그 펩티드가 EGFRt와 같은 마커 단백질에 융합된 경우). 특정 구체예에서, 태그 펩티드는 변형된 면역 세포에 의해 발현된 세포 표면 단백질에 함유된다. 추가의 구체예에서, 세포 표면 단백질은 CAR, TCR, 마커 또는 이들의 조합을 포함하고; 임의로, 상기 마커는 EGFRt, CD19t, CD34t 또는 NGFRt로부터 선택된다. 일부 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질은 평면 표면, 아가로스, 수지, 3D 패브릭 매트릭스 또는 비드 (예를 들어, 마이크로비드 또는 나노비드)와 같은 고체 표면에 부착된다.
특정 구체예에서, 태그된 면역 세포는 시험관 내 또는 생체 외에서, 예를 들어, 입양 치료 요법에서 태그된 면역 세포의 초기 투여 전 또는 후에 활성화된다. 추가의 구체예에서, 태그된 면역 세포를 활성화하는 방법은 활성화 태그된 면역 세포의 집단 (예를 들어, 대상으로부터의 샘플 중의)을 농축 또는 단리하기 전에 확장시키는 추가 단계를 포함한다. 본원에 개시된 임의의 구체예에서, 태그 펩티드를 발현하는 세포는 인간 T 세포, NK 세포 또는 NK-T 세포이거나 이를 포함할 수 있다.
변형된 면역 세포의 국소 활성화를 위한 생체 내 방법이 본원에 또한 제공되며, 이 방법은 (i) (a) 본 개시의 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질, 및 (b) 공동 자극 분자 (예를 들어, CD3, CD27, CD28, OX40 또는 CD137)에 특이적인 결합 폴리펩티드를 포함하는 매트릭스 조성물 또는 장치, 및 (ii) 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 태그 펩티드를 세포 표면에서 발현하는 변형된 면역 세포를 대상에 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 태그 펩티드는 CAR, TCR, 마커 또는 이들의 조합에 함유되고; 임의로, 상기 마커는 EGFRt, CD19t, CD34t 또는 NGFRt로부터 선택되며, 여기서 서브파트 (i)의 매트릭스 조성물의 (a)와 세포 표면 태그 펩티드의 회합은 변형된 면역 세포를 활성화시킨다. 일부 구체예에서, 공동 자극 분자에 특이적인 결합 폴리펩티드는 매트릭스 조성물 또는 장치에서 다중특이성 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질에 포함된다. 이러한 생체 내 방법은 예를 들어, 종양 부위 또는 감염 부위에서 또는 근처에서와 같이 세포 활성을 위한 원하는 부위 또는 근처에서 태그된 면역 세포를 활성화시키는 데 유용할 수 있다. 특정 구체예에서, 매트릭스 조성물은 알기네이트, 기저막 매트릭스 또는 바이오폴리머를 포함한다. 본원에 개시된 임의의 구체예에서, 태그 펩티드를 발현하는 세포는 인간 T 세포, NK 세포 또는 NK-T 세포이거나 이를 포함할 수 있다. 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질, 결합 폴리펩티드 및 변형된 면역 세포의 투여는 임의의 순서로 수행될 수 있지만, 전형적으로 동반하여 또는 동시에 수행될 것이다.
또 다른 측면에서, 세포 증식을 촉진시키는 방법이 제공되며, 이 방법은 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 태그 펩티드를 발현하는 세포를 (a) 본 개시의 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질, 및 (b) 성장 인자 사이토카인과 태그된 세포의 증식을 허용하기에 충분한 조건 및 시간으로 접촉시키는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질은 세포를 직접적으로 (예를 들어, CAR, TCR 또는 세포에 의해 발현되는 공동 자극 분자에 함유된 태그 펩티드에 결합하여) 또는 간접적으로 (예를 들어, 면역글로불린 단백질 및 임의적인 항-CD3 또는 항-CD28 항체를 포함하는 비드 사용; 예를 들어, 도 3A-4B 참조) 활성화시킴으로써 증식을 촉진할 수 있다. 일부 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질은 평면 표면, 아가로스, 수지, 3D 패브릭 매트릭스 또는 비드 (예를 들어, 마이크로비드 또는 나노비드)와 같은 고체 표면에 부착된다. 성장 인자 사이토카인이 세포 증식을 자극한다는 조건으로, 임의의 성장 인자 사이토카인은 개시된 방법에 따라 세포 증식을 촉진하는데 사용될 수 있다. 이러한 사이토카인은 당 업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 IL-12, IL-15 등 및 이들의 조합을 포함한다.
추가의 구체예에서, 상기 방법은 태그된 세포를 세포에 의해 발현된 공동-자극 단백질에 작용적으로 결합시키는 작용제와 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 작용제는 하나 이상의 결합 단백질이 고체 표면에 부착된 항-CD27 결합 단백질, 항-CD28 결합 단백질, 항-CD137 결합 단백질, 항-OX40 결합 단백질 또는 이들의 임의의 조합이다. 추가의 구체예에서, 항-CD27 결합 단백질, 항-CD28 결합 단백질, 항-CD137 결합 단백질, 항-OX40 결합 단백질 또는 이들의 임의의 조합은 평면 표면, 아가로스, 수지, 3D 패브릭 매트릭스, 또는 비드에 부착된다.
본 발명의 개시된 방법은 예를 들어 T 세포, NK 세포 또는 NK-T 세포의 증식을 촉진하는데 유용하다. 특정 구체예에서, 세포는 기능성인 변형된 T 세포이다. 특정 구체예에서, 기능성인 변형된 T 세포는 바이러스-특이적 세포, 종양 항원 특이적 세포독성 T 세포, 기억 줄기 T 세포, 중추 기억 T 세포, 이펙터 T 세포 또는 CD4+ CD25+ 조절성 T 세포이다. 또 다른 구체예에서, 태그 펩티드는 세포 (예를 들어, CAR, TCR, 공동 자극 분자, 마커 또는 이들의 조합, 임의로 마커는 EGFRt, CD19t, CD34t 또는 NGFRt로부터 선택됨)에 의해 발현된 세포 표면 단백질에 포함될 수 있다.
태그된 세포의 증식은 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외에서 본 발명의 개시된 임의의 방법에 따라 촉진되거나 유도될 수 있다. 특정 구체예에서, 증식은 생체 내 또는 생체 외에서 촉진되거나 유도된다. 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질 및 성장 인자 사이토카인의 투여는 임의의 순서로 (예를 들어, 성장 인자 사이토카인이 먼저 투여) 발생할 수 있지만, 전형적으로 동시에 또는 동반하여 수행될 것이다.
또 다른 측면에서, (a) 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 태그 펩티드를 발현하는 변형된 세포를 받은 대상에게 본 개시의 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질의 하나 이상을 투여하는 단계 (여기서, 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질은 생체 내 이미징에 적합한 검출 가능한 모이어티를 추가로 포함함다), 및 (b) 대상의 이미징을 수행하는 단계를 포함하는 생체 내 이미징 방법이 제공된다. 이러한 방법은 예를 들어 생체 내에서 태그된 세포의 이동, 국소화, 증식 또는 지속성을 추적하는데 유용하다.
생체 내에서 양질의 유익한 세포 이미지를 얻는 것은, 예를 들어, 이미징제가 높은 보유력으로 세포에 선택적으로 결합하여 조직(들)을 신속하고 필요한 깊이까지 침투시키고, 혈액에서 빠르게 제거되는 능력을 비롯한 다수의 인자에 따른다. 구체예에서, 검출 가능하게 태그된 면역글로불린 결합 단백질은 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 결합 도메인을 포함하고, 여기서 항원-결합 단편은 생체 내 이미징이 가능한 형식 또는 구조를 갖는다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 항원-결합 단편은 scFv, 탠덤 scFv, scFv-Fc, scFv 이량체, scFv 지퍼, 디아바디, 미니바디, 트리아바디, 테트라바디, Fab, F(ab)'2, scFab, 미니항체, 나노바디, 나노바디-HSA, 이중특이성 T 세포 인게이저 (BiTE), DART, sc디아바디, sc디아바디-CH3 또는 scFv-CH3 KIH 어셈블리를 포함한다.
생체 내 이미징에 적합한 임의의 검출 가능한 모이어티가 본 발명의 개시된 방법에 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 검출 가능한 모이어티는 예를 들어 68Ga, 64Cu, 86Y, 89Zr, 124I, 99mTc, 123I, 111In, 177Lu, 131I, 76Br, 78Zr, 18F, 및 124T와 같은 방사성 추적자를 포함한다. 양전자 방출 단층 촬영술 (Positron Emission Tomography: PET)이 본 발명의 방법에 따라 방사성 태그된 표적을 이미징하기 위한 예시적인 기술이다. 생체 내 이미징에 유용한 추가의 이미징 기술은 자기 공명 이미징 (MRI) 및 근적외선 (NIR) 이미징을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 추가의 검출 가능한 모이어티는 예를 들어 자성 입자, 초상자성 산화철 (SPIO), 플루오로데옥시글루코스 (18F), 및 형광성 단백질 또는 모이어티와 같은 형광 화합물을 포함한다.
또 다른 측면에서, 태그된 면역요법 세포의 표적화된 제거를 위한 방법이 제공되며, 이 방법은 본 발명의 개시된 (a) 면역글로불린 결합 단백질, (b) 융합 단백질, 또는 (c) 조성물 중 하나 이상을 대상에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 대상은 태그 펩티드를 포함하는 세포 표면 단백질 (예를 들어, CAR, TCR, 또는 EGFRt와 같은 마커)을 발현하는 태그된 면역요법 세포를 이전에 투여받았으며, 여기서 태그 펩티드는 서열 번호 19의 아미노산을 포함하거나 이로 이루어지고, 상기 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질 또는 조성물은 태그된 면역요법 세포의 제거를 일으키기에 충분한 조건 및 시간으로 태그 펩티드에 결합되는 경우 세포 사멸을 직접적으로 또는 간접적으로 유도할 수 있다.
본원에 사용된 "표적화된 제거"는 (예를 들어, 유도된 아폽토시스, 용해, 식균 작용, 세포독성제의 전달, 항체-의존성 세포-매개 독성 (ADCC), 보체-지시적 세포독성 (CDC), 또는 다른 메카니즘에 의해) 표적 세포 (예를 들어, 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 갖는 태그 펩티드를 발현하는 세포)를 선택적으로 사멸시키는 것을 지칭한다. 본 발명의 개시된 표적화된 제거 방법은 이전에 투여된 태그된 면역요법 세포 (예를 들어, CAR 또는 TCR과 같은 항원-특이적 세포 표면 수용체를 발현하는 면역요법 세포)가 바람직하지 않게 많은 수이거나 바람직하지 않은 활성 (예를 들어, 대상에서 표적 외 세포 또는 조직에 대한 면역 반응을 인식하고 유발함) 또는 활성 수준 (예를 들어, CRS 사건과 같이 부적절하게 높은 강도, 지속 기간 또는 모두의 면역 반응을 유발함)인 경우에 유용할 수 있다. 특정 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질 또는 조성물은 태그된 면역요법 세포의 존재와 관련된 적어도 하나의 유해 사건 (adverse event)을 갖는 대상에게 투여된다.
특정 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질 또는 조성물은 화학독성제와 같은 세포독성제를 포함한다. 화학요법제는 크로마틴 기능의 억제제, 토포이소머라제 억제제, 미소관 억제 약물, DNA 손상제, 항대사체 (예컨대, 폴레이트 길항제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체 및 당-변형된 유사체), DNA 합성 억제제, DNA 상호작용제 (예컨대, 인터칼레이팅제), 및 DNA 수선 억제제를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 화학요법제는 하기 군을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다: 항대사물질/항암제, 예컨대, 피리미딘 유사체 (5-플루오로우라실, 플록수리딘, 카페시타빈, 젬시타빈, 시타라빈) 및 퓨린 유사체, 폴레이트 길항제 및 관련 억제제 (머캅토퓨린, 티오구아닌, 펜토스타틴, 2-클로로데옥시아데노신 (클라드리빈)); 항증식성/세포분열 방지제, 예컨대, 자연 산물, 예를 들자면 빈카 알칼로이드 (vinca alkaloid)(빈블라스틴, 빈크리스틴 및 비노렐빈), 미소관 파괴제, 예컨대, 탁산 (파클리탁셀, 도세탁셀), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 노코다졸, 에포틸론 및 나벨빈, 에피디포도필로톡신 (에토포시드, 테니포시드), DNA 손상제 (악티노마이신, 암사크린, 안트라사이클린, 블레오마이신, 부설판, 캄프토테신, 카보플라틴, 클로람부실, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 사이톡산, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 헥사메틸멜라민옥살리플라틴, 이포스파미드, 멜팔란, 머클로로에타민, 미토마이신, 미톡산트론, 니트로소우레아, 플리카마이신, 프로카바진, 탁솔, 탁소테레, 테모졸아미드, 테니포시드, 트리에틸렌티오포스포아미드 및 에토포사이드 (VP 16); 항생제, 예컨대, 닥티노마이신 (악티노마이신 D), 다우노루비신, 독소루비신 (아드리아마이신), 이다루비신, 안트라사이클린, 미톡산트론, 블레오마이신, 플리카마이신 (미트라마이신) 및 미토마이신; 효소 (L-아스파라긴을 전신에서 대사시키고 그 자체의 아스파라긴을 합성하는 능력이 없는 세포를 제거하는 L-아스파라기나아제); 항혈소판 작용제; 항증식성/세포분열방지 알킬화제, 예컨대, 질소 머스타드 (메클로에타민, 사이클로포스파미드 및 유사체, 멜팔란, 클로람부실), 에틸렌이민 및 메틸멜라민 (헥사메틸멜라민 및 티오테파), 알킬설포네이트-부설판, 니트로소우레아 (카르무스틴(BCNU) 및 유사체, 스트렙토조신), 트라젠-데카바지닌 (DTIC); 항증식성/세포분열방지 항대사물질, 예컨대, 엽산 유사체 (메토트렉세이트); 백금 배위 복합체 (시스플라틴, 카보플라틴), 프로카바진, 하이드록시우레아, 미토탄, 아미노글루테티미드; 호르몬, 호르몬 유사체 (에스트로겐, 타목시펜, 고세렐린, 비칼루타미드, 닐루타미드) 및 아로마타제 (aromatase) 억제제 (레트로졸, 아나스트로졸); 항응고제 (헤파린, 합성 헤파린 염 및 트롬빈의 다른 억제제); 섬유소 용해제 (예컨대, 조직 플라스미노겐 활성인자 (tissue plasminogen activator), 스트렙토키나제 및 우로키나제), 아스피린, 디피리다몰, 티클로피딘, 클로피도그렐, 압식시맙; 이동방지제; 분비억제제 (브레벨딘); 면역억제제 (사이클로스포린, 타크롤리무스 (FK-506), 시롤리무스 (라파마이신), 아자티오프린, 마이코페놀레이트 모페틸); 항-혈관신생 화합물 (TNP-470, 제니스테인) 및 성장 인자 억제제 (혈관 내피세포 성장 인자 (VEGF) 억제제, 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 억제제); 안지오텐신 수용체 차단제; 산화질소 공여자; 안티-센스 올리고뉴클레오티드; 항체 (트라스투주맙, 리툭시맙); 키메라 항원 수용체; 세포 주기 억제제 및 분화 유도인자 (트레티노인); mTOR 억제제, 토포이소머라제 억제제 (독소루비신 (아드리아마이신), 암사크린, 캄프토테신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 에니포시드, 에피루비신, 에토포시드, 이다루비신 및 이리노테칸 (CPT-11) 및 미톡산트론, 토포테칸, 이리노테칸), 코티코스테로이드 (코티손, 덱사메타손, 하이드로코티손, 메틸페드니솔론, 프레드니손 및 프레니솔론); 성장 인자 신호 전달 키나제 억제제; 미토콘드리아 기능장애 유도인자 및 독소, 예컨대, 콜레라 독소, 리신, 슈도모나스 엑소톡신, 보데텔라 백일해 아데닐레이트 사이클라제 독소 또는 디프테리아 독소 및 카스파제 활성인자; 및 염색질 파괴인자.
본 발명의 개시된 면역글로불린 결합 단백질 (예를 들어, 항체-약물 접합체 분자에서) 또는 융합 단백질을 사용하여 세포독성 또는 검출 가능한 제제를 제조하기 위한 시약 및 화학 물질, 및 관련된 메카니즘 및 방법은 [Nareshkumar et al., Pharm. Res. 32:3526-3540 (2015)]에 기술되어 있으며, 그의 조성물, 방법 및 기술은 전체가 본원에 참조로 포함된다. 단백질-약물 접합체를 생성하는데 유용한 클릭 화학은 [Meyer et al., Bioconjug. Chem. 27(12):2791-2807 (2016)]에 기술되어 있으며, 그 전체는 본원에 참조로 포함된다.
단백질-약물 접합체를 사용하여 전달될 수 있는 추가의 세포독성 및 검출 가능한 제제는 [Parslow et al., Biomedicines 4:14 (2016)]에 기재된 것들을 포함하며, 이들 작용제 및 단백질-약물 접합체 설계 원리는 본원에 참조로 포함된다.
추가의 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질은 태그 펩티드에 결합 시 다음 중 하나 이상을 유발할 수 있는 항체를 포함한다: (a) 옵소닌화; (b) 식균 작용; (c) 항체 지정 세포 매개 세포독성 (ADCC); 및 (d) 태그된 면역요법 세포에 대한 보체-지정 세포독성 (CDC).
또한, 면역글로불린 결합 단백질은 태그된 면역요법 세포에 대한 세포-매개 세포독성을 촉진하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질은 이중특이성이며 태그 펩티드에 결합할 때 (a) T 세포 마커 (예를 들어, CD3) 또는 (b) NK 세포 마커 (예를 들어, CD28)에 동시에 결합할 수 있어, 태그된 세포를 T 세포 또는 NK 세포와 근접하게 함으로써 태그된 세포에 대한 세포독성 활성을 촉진시킬 수 있다. 특정 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질은 이중특이성이며, 이중특이성 scFv, 이중특이성 T 세포 인게이저 (BiTE) 분자, 나노바디, 디아바디, DART, TandAb, sc디아바디, sc디아바디-CH3, 디아바디-CH3, 트리플바디, 미니항체, 미니바디, 트리바이 (TriBi) 미니바디, scFv-CH3 KIH, Fab-scFv, scFv-CH-CL-scFv, F(ab')2, F(ab')2-scFv2, scFv-KIH, Fab-scFv-Fc, 4가 HCab, sc디아바디-Fc, 디아바디-Fc, 탠덤 scFv-Fc, 인트라바디, Dock and Lock 융합 단백질, ImmTAC, HSA바디, sc디아바디-HSA, 텐덤 scFv, crossMab, DAF (two-in-one 또는 four-in-one), DutaMab, DT-IgG, KIH (Knobs-Into-Holes) 어셈블리, KIH 공통 경쇄 항체, 전하 쌍, Fab-암 교환, 시드바디, 트리오맙, LUZ-Y, Fcab, κλ-바디, 직교 Fab, DVD-IgG, IgG(H)-scFv, scFv-(H)IgG, IgG(L)-scFv, scFv-(L)IgG, IgG(L,H)-Fv, IgG(H)-V, V(H)-IgG, IgG(L)-V, V(L)-IgG, KIH IgG-scFab, 2scFv-IgG, IgG-2scFv, scFv4-Ig, Zy바디 (Zybody) 또는 DVI-IgG (four-in-one)를 포함한다.
특정 구체예에서, 태그된 면역요법 세포는 이식편 또는 이식물 (예를 들어, 기관 또는 조직 이식편 또는 이식물)로서, 또는 과증식성 장애와 같은 질환을 치료하기 위해 미리 투여되었다. 본원에 사용된 "과증식성 장애"는 정상 또는 무병 세포와 비교하여 과도한 성장 또는 증식을 지칭한다. 예시적인 과증식성 장애는 종양, 암, 신생물 조직, 암종, 육종, 악성 세포, 전암성 세포뿐만 아니라, 비-신생물성 또는 비악성 과증식성 장애 (예를 들어, 선종, 섬유종, 지방종, 평활근종, 혈관종, 섬유증, 재협착증 및 류마티스 관절염, 골관절염, 건선, 염증성 장 질환 등과 같은 자가 면역 질환)을 포함한다.
또한, "암"은 고형 종양, 복수 종양, 혈액 또는 림프 또는 다른 악성 종양; 결합 조직 악성 종양; 전이성 질환; 장기 또는 줄기 세포의 이식 후 최소 잔류 질환; 다제-내성 암, 원발성 또는 이차성 악성 종양, 악성 종양과 관련된 혈관신생 또는 다른 형태의 암을 포함하여 세포의 임의의 가속화된 증식을 지칭할 수 있다.
임의의 상기 구체예에서, 세포 표면 단백질은 키메라 항원 수용체 (CAR), T 세포 수용체 (TCR), 마커 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 구체예에서, 세포 표면 단백질은 마커를 포함한다. 특정 구체예에서, 마커는 EGFRt, CD19t, CD34t 또는 NGFRt를 포함한다.
태그된 면역요법 세포의 제거는 대상이 이식편 대 숙주 질환 (GvHD), 숙주 대 이식편 질환 (HvGD), 또는 태그된 면역요법 세포를 포함하는 이식 또는 치료 후 사이토카인 방출 증후군 (CRS)과 같이, 태그된 면역요법 세포와 관련된 하나 이상의 부작용이 두드러질 때 필요한 것으로 결정될 수 있다. 태그된 면역요법 세포의 제거를 필요로 할 수 있는 증상으로는, 예를 들어 염증, 열, 폐 또는 뇌 부종, 혈압 또는 심박수 변화, 바람직하지 않게 적은 수의 건강한 세포 (예를 들어, 백혈구), 바람직하지 않게 높은 수의 태그된 세포, 상승된 수준의 사이토카인, 발진, 물집, 황달, 설사, 구토, 복부 경련, 피로, 통증, 경직, 호흡 곤란, 체중 감소, 안구 건조 또는 시력 변화, 구강 건조, 질 건조 및 근력 저하를 포함한다.
태그된 면역요법 세포의 표적화 제거는 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질 또는 조성물로 처리한 후 직접 또는 간접적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 방법은 제거 후: (i) 대상의 생체 내 이미징을 수행하는 단계; (ii) 대상으로부터 얻은 샘플에서 검출 방법을 수행하는 단계; (iii) 대상에서 하나 이상의 사이토카인 (예를 들어, 전염증성 사이토카인, 예컨대 IL-12, IL-18 또는 IFN-γ)의 수준을 모니터링하는 단계; (iv) 태그된 면역요법 세포에 의해 표적화된 표적 세포 또는 조직 (예를 들어, 태그된 항-CD19 CAR T 세포에 의해 표적화된 B 세포)의 존재 및/또는 양을 대상 또는 대상으로부터 얻은 샘플에서 검출하는 단계; (v) 태그된 면역 요법 세포의 생체 내 추적을 수행하는 단계; 또는 (vi) 이들의 임의의 조합을 추가로 포함한다.
태그된 면역요법 세포의 생체 내 추적은 예를 들어 (i) 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질; 및 (ii) 자성 입자, 초상자성 산화철 (SPIO), 플루오로데옥시글루코스 (18F), 형광성 화합물; 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 접합체를 사용하여 수행할 수 있다. 일부 구체예에서, 생체 내 추적은 MRI, PET 또는 근적외선 이미징의 사용을 포함한다. 본 방법을 사용하여 생체 내에서 추적될 수 있는 태그된 면역요법 세포는 T 세포, NK 세포, NK-T 세포, 조혈 줄기 세포, 조직 세포, 중간엽 세포 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
본 발명에 의해 치료될 수 있는 대상은 일반적으로 인간 및 수의학적 목적의 원숭이와 유인원과 같은 다른 영장류 대상이다. 임의의 상기 구체예에서, 대상은 인간 대상일 수 있다. 대상은 남성 또는 여성일 수 있으며, 유아, 어린이, 청소년, 성인 및 노인 대상을 포함한 임의의 적합한 연령일 수 있다. 본 개시에 따른 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질 또는 조성물은 의학 분야의 숙련가에 의해 결정되는 바와 같이 치료될 질환, 상태 또는 장애에 적당한 방식으로 투여될 수 있다. 임의의 상기 구체예에서, 본원에 기재된 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질 또는 조성물은 정맥 내, 복강 내, 종양 내, 골수 내, 림프절 내 또는 뇌척수액 내로 투여되어 제거될 태그된 세포 또는 태그된 면역요법 세포와 접촉하게 된다. 조성물의 적절한 투여량, 적합한 지속 시간 및 투여 빈도는 환자의 상태; 질환, 상태 또는 장애의 크기, 유형 및 중증도; 원치 않는 유형 또는 수준 또는 활성의 태그된 면역요법 세포, 특정 형태의 활성 성분; 및 투여 방법과 같은 인자에 의해 결정될 것이다.
본원에 개시된 바와 같은 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질 또는 조성물 및 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 또한 고려된다. 적합한 부형제는 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤 등 및 이들의 조합을 포함한다. 구체예에서, 약학적 조성물은 적합한 주입 매질을 추가로 포함한다. 적합한 주입 매질로 임의의 등장성 매질 제형, 전형적으로 생리 식염수, Normosol R (Abbott) 또는 Plasma-Lyte A (Baxter), 수중 5% 덱스트로스, 링거 락 테이트가 사용될 수 있다. 주입 매질에는 인간 혈청 알부민 또는 다른 인간 혈청 성분이 보충될 수 있다.
약학적 조성물은 의학 분야 업자에 의해 결정되는 바와 같이 치료 (또는 예방)될 질환 또는 상태에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 조성물의 적절한 용량 및 적합한 지속 기간 및 투여 빈도는 환자의 건강 상태, 환자의 크기 (즉, 체중, 질량 또는 체표면적), 환자 상태의 유형 및 중증도, 태그된 면역요법 세포의 바람직하지 않은 유형 또는 수준 또는 활성, 활성 성분의 특정 형태 및 투여 방법과 같은 인자에 의해 결정될 것이다. 일반적으로, 적절한 용량 및 치료 요법은 치료적 및/또는 예방적 이점 (예컨대 개선된 임상 결과, 이를테면 더 빈번한 완전 또는 부분적 관해, 또는 더 긴 무 질환 및/또는 전반적 생존, 또는 증상 중증도의 감소를 포함하여, 본원에 기재된 바와 같이)을 제공하기에 충분한 양으로 조성물(들)을 제공한다. 예방적 사용을 위해, 용량은 질환 또는 장애와 관련된 질환을 예방하거나, 질환의 개시를 지연시키거나 또는 질환의 중증도를 감소시키는데 충분하여야 한다. 본원에 기재된 방법에 따라 투여되는 조성물의 예방적 이점은 전임상 (시험관 내 및 생체 내 동물 연구를 포함) 및 임상 연구를 수행함으로써 그리고 적절한 통계적, 생물학적 및 임상적 방법 및 기법으로부터 얻은 데이터를 분석함으로써 결정될 수 있으며, 이들 모두는 당업자에 의해 용이하게 실시될 수 있다.
본원에서 고려되는 특정 치료 또는 예방 방법은 세포의 염색체에 안정적으로 통합된 본원에 기재된 바와 같은 목적하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포 (자가, 동종 또는 동계일 수 있음)를 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 이러한 세포 조성물은 원하는 융합 단백질 발현 T-세포 조성물을 입양 면역요법으로 대상에게 투여하기 위해 자가, 동종 또는 동계 면역계 세포 (예를 들어, T 세포, 항원-제시 세포, 자연 살해 세포)를 사용하여 생체 외에서 생성될 수 있다. 특정 구체예에서, 숙주 세포는 조혈 전구 세포 또는 인간 면역 세포이다. 특정 구체예에서, 면역계 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4-CD8- 이중 음성 T 세포, γδ T 세포, 자연 살해 세포, 수지상 세포, 또는 이들의 임의 조합이다. 특정 구체예에서, 면역계 세포는 나이브 T 세포, 중추 기억 T 세포, 이펙터 기억 T 세포 또는 이들의 임의 조합이다. 특정 구체예에서, 세포는 CD4+ T 세포이다.
본원에서 사용되는 조성물의 투여는 전달 경로 또는 방식에 관계없이, 대상에게 이를 전달하는 것을 지칭한다. 투여는 연속적으로 또는 간헐적으로 그리고 비경구로 실시될 수 있다. 투여는 인식된 상태, 질환 또는 질환 상태를 갖는 것으로 이미 확인된 대상의 치료 또는 이러한 상태, 질환 또는 질환 상태의 발생에 취약하거나 발생 위험이 있는 대상의 치료를 위한 것일 수 있다. 보조 요법과의 공동 투여는 임의의 순서 및 임의의 투여 계획으로 다수 작용제의 동시 및/또는 순차적 전달을 포함할 수 있다 (예를 들어, 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질 또는 조성물과 1종 이상의 사이토카인; 면역억제 요법, 예컨대 칼시뉴린 억제제, 코티코스테로이드, 미소관 억제제, 저용량 마이코페놀산 전구약물 또는 이들의 임의 조합물).
특정 구체예에서, 복수 용량의 본원에 기재된 바와 같은 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질 또는 조성물이 대상에게 투여되며, 이는 약 2주 내지 약 4주의 투여 간격으로 투여될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 치료되는 대상은 칼시뉴린 억제제, 코르티코스테로이드, 미세소관 억제제, 저용량의 미코페놀산 프로드럭, 또는 이들의 임의 조합과 같은 면역 억제 요법을 추가로 받고 있다. 또 다른 구체예에서, 치료되는 대상은 비골수증식성 또는 골수증식성 조혈 세포 이식을 받았으며, 여기서 치료는 비골수증식성 조혈 세포 이식 후 적어도 2개월에서 적어도 3개월 투여될 수 있고 이식된 세포는 임의로 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 펩티드로 태그될 수 있다.
유효량의 약학적 조성물은 본원에 기술된 바와 같이, 목적하는 임상 결과 또는 이로운 치료를 달성하는 데 필요한 투여량 및 기간 동안에서의 충분한 양을 지칭한다. 유효량은 하나 이상의 투여로 전달될 수 있다. 투여가 질환 또는 질환 상태를 갖는 것으로 이미 알려졌거나 확인된 대상에 대한 것인 경우, 용어 "치료량"은 치료와 관련하여 사용될 수 있고, 반면에 "예방적 유효량"은 예방적 과정으로서 질환 또는 질환 상태의 발생 (예를 들어, 재발)에 취약하거나 발생 위험이 있는 대상에 대한 유효량의 투여를 기술하기 위해 사용될 수 있다.
CTL 면역 반응의 수준은 본원에 기재되고 당업계에서 일상적으로 실행되는 많은 면역학적 방법 중 어느 하나에 의해 결정될 수 있다. CTL 면역 반응의 수준은, 예를 들어, T 세포에 의해 발현된 본원에 기재된 융합 단백질 중 어느 하나의 투여 전, 후에 결정될 수 있다. CTL 활성을 결정하기 위한 세포독성 분석은 당업계에서 일상적으로 실행되는 몇몇 기법 및 방법 중 어느 하나를 이용하여 수행될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Henkart et al., "Cytotoxic T-Lymphocytes" in Fundamental Immunology, Paul (ed.) (2003 Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA), 페이지 1127-50, 및 이에 인용된 참고문헌 참조).
항원-특이적 T 세포 반응은 적절한 상황에서 동족 항원 (예를 들어, 면역적합성 항원-제시 세포에 의해 제시될 때 T 세포를 프라이밍하거나 또는 활성화하기 위해 사용되는 항원)에 노출되는 T 세포와 구조적으로 상이하거나 비관련 대조군 항원 대신에 노출되는 동일한 공급원 집단으로부터의 T 세포 사이에 만들어질 수 있는 본원에 기재된 임의의 T 세포 기능성 매개변수 (예를 들어, 증식, 사이토카인 방출, CTL 활성, 변경된 세포 표면 마커 표현형 등)에 따라 관찰된 T 세포 반응의 비교에 의해 전형적으로 결정된다. 대조군 항원에 대한 반응보다 통계학적 유의도가 더 큰 동족 항원에 대한 반응은 항원-특이성을 의미한다.
본원에 기재된 태그된 단백질 또는 세포에 대한 면역 반응의 존재 및 수준을 결정하기 위해 대상으로부터 생물학적 샘플을 얻을 수 있다. 본원에서 사용되는 "생물학적 샘플"은 혈액 샘플 (이로부터 혈청 또는 혈장이 준비될 수 있음), 생검 표본, 체액 (예를 들어, 폐 세척액, 복수, 점막 세척액, 활액), 골수, 림프절, 조직 외식편, 기관 배양물 또는 대상 또는 생물학적 공급원으로부터의 임의의 다른 조직 또는 세포 제제일 수 있다. 생물학적 샘플은 또한 임의의 면역원성 조성물을 받기 전에 대상으로부터 얻을 수 있는데, 이의 생물학적 샘플은 기준선 (즉, 사전 면역화) 데이터를 확립하기 위한 대조군으로서 유용하다.
본원에 기술된 약학적 조성물은 단위 용량 또는 다회-용량 용기, 예컨대, 밀봉 앰플 또는 바이알에 제공될 수 있다. 이러한 용기는 제형의 안정성을 유지하기 위해 냉동될 수 있다. 특정 구체예에서, 단위 용량은 본원에 기재된 바와 같은 조작된 숙주 세포를 약 107개 세포/㎡ 내지 약 1011개 세포/㎡의 용량으로 포함한다. 다양한 치료 요법에서 본원에 기재된 특정 조성물을 사용하기에 적합한 투여 및 치료 요법의 개발은 예를 들어, 비경구 또는 정맥내 투여 또는 제형을 포함한다.
대상 조성물이 비경구로 투여되는 경우, 조성물은 또한 멸균 수성 또는 유성 용액 또는 현탁액을 포함할 수 있다. 적합한 비경구적으로 허용 가능한 비독성 희석제 또는 용매는 물, 링거액, 등장성 염 용액, 1,3-부탄디올, 에탄올, 프로필렌 글리콜 또는 물과의 혼합물로의 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 수성 용액 또는 현탁액은 또한 1종 이상의 완충제, 예컨대, 아세트산나트륨, 시트르산나트륨, 붕산나트륨 또는 타르트산나트륨을 추가로 포함할 수 있다. 물론, 임의의 투여 단위 제형을 제조하는 데 사용되는 임의의 물질은 약학적으로 순수하고, 사용된 양에서 실질적으로 비독성이어야 한다. 또한, 활성 화합물은 서방형 제제 및 제형에 혼입될 수 있다. 본원에서 사용되는 투여 단위 형태는 치료하고자 하는 대상에 대해서 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하고; 각 단위는 적절한 약학적 담체와 함께 목적하는 효과를 생성하도록 계산된 재조합 세포 또는 활성 화합물의 미리 결정된 양을 함유할 수 있다.
일반적으로, 적절한 투여량 및 치료 요법은 치료 또는 예방적 이익을 제공하기에 충분한 양의 활성 분자 또는 세포를 제공한다. 이러한 반응은 비치료 대상과 비교할 때 치료 대상에서 개선된 임상적 결과 (예를 들어, 더 빈번한 완전 또는 부분적인 차도, 또는 장기간 무질환 생존)를 확립함으로써 모니터링될 수 있다. 종양 단백질에 대한 기존 면역 반응의 증가는 일반적으로 개선된 임상 결과와 상관 관계가 있다. 이러한 면역 반응은 일반적으로 일상적이며 처리 전 후 대상으로부터 수득한 샘플을 사용하여 수행될 수 있는 표준 증식, 세포독성 또는 사이토카인 검정을 사용하여 평가될 수 있다.
본 개시에 따른 방법은 1종 이상의 추가적인 작용제를 투여하여 병용 요법으로 질환 또는 장애를 치료하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 구체예에서, 병용 요법은 면역 체크포인트 억제제와 함께 (동시에, 함께, 또는 순차적으로) 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질 (또는 이를 발현하는 조작된 숙주 세포) 또는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 병용 요법은 자극성 면역 체크포인트제의 작용제와 함께 본 개시의 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질, 숙주 세포 또는 조성물 (또는 이를 발현하는 조작된 숙주 세포)을 투여하는 단계를 포함한다. 추가 구체예에서, 병용 요법은 2차 요법, 예컨대, 화학요법제, 방사선 요법, 수술, 항체 또는 이들의 임의 조합물과 함께 본 개시의 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질, 숙주 세포 또는 조성물 (또는 이를 발현하는 조작된 숙주 세포)을 투여하는 단계를 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "면역 억제 약제" 또는 "면역억제제"는 면역 반응을 제어하거나 억제하는 데 도움을 주기 위한 억제성 신호를 제공하는 하나 이상의 세포, 단백질, 분자, 화합물 또는 복합체를 지칭한다. 예를 들어, 면역 억제제는 면역 자극을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나; 면역 활성화를 감소, 예방 또는 지연시키거나; 면역 억제를 증가, 활성화 또는 상향조절하는 분자를 포함한다. (예를 들어, 면역 체크포인트 억제제와 함께) 표적에 대한 예시적인 면역 억제 약제는 PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG3, CTLA4, B7-H3, B7-H4, CD244/2B4, HVEM, BTLA, CD160, TIM3, GAL9, KIR, PVR1G (CD112R), PVRL2, 아데노신, A2aR, 면역억제성 사이토카인 (예를 들어, IL-10, IL-4, IL-1RA, IL-35), IDO, 아르기나제, VISTA, TIGIT, LAIR1, CEACAM-1, CEACAM-3, CEACAM-5, Treg 세포 또는 이들의 임의 조합물을 포함한다.
면역 억제 약제 (면역 체크포인트 억제제라고도 지칭됨)는 화합물, 항체, 항체 단편 또는 융합 폴리펩티드 (예를 들어, Fc 융합체, 예컨대, CTLA4-Fc 또는 LAG3-Fc), 안티센스분자, 리보자임 또는 RNAi 분자 또는 저분자량 유기 분자일 수 있다. 본원에 개시된 구체예 중 임의의 것에서, 방법은 단독으로 또는 임의의 조합으로 하기 면역 억제 성분 중 어느 하나의 1종 이상의 억제제와 함께 본 개시의 융합 단백질 (또는 이를 발현하는 조작된 숙주 세포)를 투여하는 것을 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질, 숙주 세포 또는 조성물은 PD-1 억제제, 예를 들어, PD-1-특이적 항체 또는 이의 결합 단편, 예컨대, 피딜리주맙, 니볼루맙 (케이트루다, 이전 MDX-1106), 펨브롤리주맙 (옵디보, 이전 MK-3475), MEDI0680 (이전 AMP-514), AMP-224, BMS-936558 또는 이들의 임의 조합물과 조합하여 사용된다. 추가 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질, 숙주 세포 또는 조성물은 PD-L1 특이적 항체 또는 이의 결합 단편, 예컨대, BMS-936559, 두르발루맙 (MEDI4736), 아테졸리주맙 (RG7446), 아벨루맙 (MSB0010718C), MPDL3280A 또는 이들의 임의 조합물과 조합하여 사용된다.
특정 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질, 숙주 세포 또는 조성물은 LAG525 억제제, 예컨대 LAG525, IMP321, IMP701, 9H12, BMS-986016 또는 이들의 임의 조합물과 조합하여 사용된다.
특정 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질, 숙주 세포 또는 조성물은 CTLA4의 억제제와 조합하여 사용된다. 특정 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질, 숙주 세포 또는 조성물은 CTLA4 특이적 항체 또는 이의 결합 단편, 예컨대, 이필리무맙, 트레멜리무맙, CTLA4-Ig 융합 단백질 (예를 들어, 아바타셉트, 벨라타셉트) 또는 이들의 임의 조합물과 조합하여 사용된다.
특정 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질, 세포 또는 조성물은 B7-H3 특이적 항체 또는 이의 결합 단편, 예컨대, 에노블리투주맙 (MGA271), 376.96, 또는 이들 둘 모두와 조합하여 사용된다, B7-H4 항체 결합 단편은 예를 들어, 문헌[Dangaj et al., Cancer Res. 73:4820, 2013]에 기술된 바와 같은 scFv 또는 이의 융합 단백질뿐만 아니라 미국 특허 제9,574,000호 및 PCT 특허 공개 제WO/201640724A1호 및 제WO 2013/025779A1호에 기술된 것일 수 있다.
특정 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질, 세포 또는 조성물은 CD244의 억제제와 조합하여 사용된다.
특정 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질, 세포 또는 조성물은 BLTA, HVEM, CD160의 억제제 또는 이들의 임의 조합물과 조합하여 사용된다. 항 CD-160 항체는 예를 들어, PCT 공개 제WO 2010/084158호에 기술되어 있다.
특정 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질, 세포 또는 조성물은 TIM3의 억제제와 조합하여 사용된다.
특정 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질, 세포 또는 조성물은 Gal9의 억제제와 조합하여 사용된다.
특정 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질, 세포 또는 조성물은 아데노신 신호전달의 억제제, 예컨대, 디코이 (decoy) 아데노신 수용체와 조합하여 사용된다.
특정 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질, 세포 또는 조성물은 A2aR의 억제제와 조합하여 사용된다.
특정 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질, 세포 또는 조성물은 KIR의 억제제, 예컨대 리릴루맙 (BMS-986015)과 조합하여 사용된다.
특정 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질, 세포 또는 조성물은 억제성 사이토카인 (전형적으로, TGFβ가 아닌 사이토카인) 또는 Treg 발달 또는 활성의 억제제와 조합하여 사용된다.
특정 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질, 세포 또는 조성물은 IDO 억제제, 예컨대, 레보-1-메틸 트립토판, 에파카도스타트 (INCB024360; Liu el al., Blood 115:3520-30, 2010), 엡셀렌 (Terentis et al., Biochem. 49:591-600, 2010), 인독시모드, NLG919 (Mautino el al., American Association for Cancer Research 104th Annual Meeting 2013; Apr 6-10, 2013), 1-메틸-트립토판 (1-MT)-티라-파자민 또는 이들의 임의 조합물과 조합하여 사용된다.
특정 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질, 세포 또는 조성물은 아르기나제 억제제, 예컨대, N(오메가)-니트로-L-아르기닌 메틸 에스테르 (L-NAME), N-오메가-하이드록시-노르-1-아르기닌 (노르-NOHA), L-NOHA, 2(S)-아미노-6-보로노헥산산 (ABH), S-(2-보로노에틸)-L-시스테인 (BEC) 또는 이들의 임의 조합물과 조합하여 사용된다.
특정 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질, 세포 또는 조성물은 VISTA의 억제제, 예컨대, CA-170 (큐리스 (Curis), 미국 매사추세츠주 렉싱톤 소재)과 조합하여 사용된다.
특정 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질, 세포 또는 조성물은 TIGIT의 억제제, 예를 들어, COM902 (콤푸젠(Compugen), 캐나다 온타리오주 토론토 소재) 등, CD155의 억제제, 예를 들어, COM701 (콤푸젠) 등, 또는 둘 모두와 조합하여 사용된다.
특정 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질, 세포 또는 조성물은 PVRIG의 억제제, PVRL2의 억제제 또는 이들 둘 모두와 조합하여 사용된다. 항-PVRIG 항체는 예를 들어, PCT 공개 제WO 2016/134333호에 기술되어 있다. 항-PVRL2 항체는 예를 들어, PCT 공개 제WO 2017/021526호에 기술되어 있다.
특정 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질, 세포 또는 조성물은 LAIR1 억제제와 조합하여 사용된다.
특정 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질, 세포 또는 조성물은 CEACAM-1의 억제제, CEACAM-3의 억제제, CEACAM-5의 억제제 또는 이들의 임의 조합물과 조합하여 사용된다.
특정 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질, 세포 또는 조성물은 자극성 면역 체크포인트 분자의 활성을 증가시키는 제제 (즉, 작용제)와 조합하여 사용된다. 예를 들어, 본 개시의 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질, 숙주 세포 또는 조성물은 CD137 (4-1BB) 작용제 (예를 들어, 우렐루맙 등), CD134 (OX-40) 작용제 (예를 들어, MEDI6469, MEDI6383, 또는 MEDI0562 등), 레날리도미드, 포말리도미드, CD27 작용제 (예를 들어, CDX-1127 등), CD28 작용제 (예를 들어, TGN1412, CD80, 또는 CD86 등), CD40 작용제 (예를 들어, CP-870,893, rhuCD40L, 또는 SGN-40 등), CD122 작용제 (예를 들어, IL-2 등), GITR의 작용제 (예를 들어, PCT 특허 공개 제WO 2016/054638호에 기술된 인간화된 모노클로날 항체), ICOS의 작용제 (CD278) (예를 들어, GSK3359609, mAb 88.2, JTX-2011, Icos 145-1, Icos 314-8 또는 이들의 임의 조합물 등)와 조합하여 사용될 수 있다.
본원에 개시된 구체예 중 임의의 것에서, 방법은 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질, 세포 또는 조성물을 단독으로 또는 상기 중 임의의 것을 비롯한, 하나 이상의 자극성 면역 체크포인트 분자의 작용제와 함께 임의의 조합물로 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 병용 요법은 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질, 세포 또는 조성물과 비염증성 고형 종양에 의해 발현되는 암 항원에 특이적인 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 방사선요법, 수술, 화학요법제, 사이토카인, RNAi, 또는 이들의 임의의 것 중 하나 이상을 포함하는 제2 요법을 포함한다.
특정 구체예에서, 병용 요법은 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질, 세포 또는 조성물의 투여를 포함하고, 방사선요법 또는 수술을 추가로 포함한다. 방사선 요법은 예를 들어 감마선 조사와 같은 X 선 요법, 및 방사성 의약품 요법을 포함한다. 대상에서 주어진 암 또는 비염증성 고형 종양을 치료하는 데 적합한 수술 및 수술 기법은 당업자에게 공지되어 있다.
특정 구체예에서, 병용 요법은 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질, 숙주 세포 또는 조성물을 투여하고, 화학요법제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 화학요법제는 크로마틴 기능의 억제제, 토포이소머라제 억제제, 미소관 억제 약물, DNA 손상제, 항대사물질 (예컨대, 폴레이트 길항제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체 및 당-변형된 유사체), DNA 합성 억제제, DNA 상호작용제 (예컨대, 인터칼레이팅제), 및 DNA 수선 억제제를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 화학요법제는 하기 군을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다: 항대사물질/항암제, 예컨대, 피리미딘 유사체 (5-플루오로우라실, 플록수리딘, 카페시타빈, 젬시타빈, 시타라빈) 및 퓨린 유사체, 폴레이트 길항제 및 관련 억제제 (머캅토퓨린, 티오구아닌, 펜토스타틴 및 2-클로로데옥시아데노신 (클라드리빈)); 항증식성/세포분열 방지제, 예컨대, 자연 산물, 이를테면, 빈카 알칼로이드 (빈블라스틴, 빈크리스틴 및 비노렐빈), 미소관 파괴제, 예컨대, 탁산 (파클리탁셀, 도세탁셀), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 노코다졸, 에포틸론 및 나벨빈, 에피디포도필로톡신 (에토포시드, 테니포시드), DNA 손상제 (악티노마이신, 암사크린, 안트라사이클린, 블레오마이신, 부설판, 캄프토테신, 카보플라틴, 클로람부실, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 사이톡산, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 헥사메틸멜라민옥살리플라틴, 이포스파미드, 멜팔란, 머클로로에타민, 미토마이신, 미톡산트론, 니트로소우레아, 플리카마이신, 프로카바진, 탁솔, 탁소테레, 테모졸아미드, 테니포시드, 트리에틸렌티오포스포아미드 및 에토포사이드 (VP 16); 항생제, 예컨대, 닥티노마이신 (악티노마이신 D), 다우노루비신, 독소루비신 (아드리아마이신), 이다루비신, 안트라사이클린, 미톡산트론, 블레오마이신, 플리카마이신 (미트라마이신) 및 미토마이신; 효소 (L-아스파라긴을 전신에서 대사시키고 그 자체의 아스파라긴을 합성하는 능력이 없는 세포를 제거하는 L-아스파라기나제); 항혈소판 작용제; 항증식성/세포분열방지 알킬화제, 예컨대, 질소 머스타드 (메클로에타민, 사이클로포스파미드 및 유사체, 멜팔란, 클로람부실), 에틸렌이민 및 메틸멜라민 (헥사메틸멜라민 및 티오테파), 알킬설포네이트-부설판, 니트로소우레아 (카르무스틴 (BCNU) 및 유사체, 스트렙토조신), 트라젠-데카바지닌 (DTIC); 항증식성/세포분열방지 항대사물질, 예컨대, 엽산 유사체 (메토트렉세이트); 백금 배위 복합체 (시스플라틴, 카보플라틴), 프로카바진, 하이드록시우레아, 미토탄, 아미노글루테티미드; 호르몬, 호르몬 유사체 (에스트로겐, 타목시펜, 고세렐린, 비칼루타미드, 닐루타미드) 및 아로마타제 (aromatase) 억제제 (레트로졸, 아나스트로졸); 항응고제 (헤파린, 합성 헤파린 염 및 트롬빈의 다른 억제제); 섬유소 용해제 (예컨대, 조직 플라스미노겐 활성인자 (tissue plasminogen activator), 스트렙토키나제 및 우로키나제), 아스피린, 디피리다몰, 티클로피딘, 클로피도그렐, 압식시맙; 이동방지제; 분비억제제 (브레벨딘); 면역억제제 (사이클로스포린, 타크롤리무스 (FK-506), 시롤리무스 (라파마이신), 아자티오프린, 마이코페놀레이트 모페틸); 항-혈관신생 화합물 (TNP-470, 제니스테인) 및 성장 인자 억제제 (혈관 내피세포 성장 인자 (VEGF) 억제제, 섬유아세포 성장 인자 (FGF) 억제제); 안지오텐신 수용체 차단제; 산화질소 공여체; 안티-센스 올리고뉴클레오티드; 항체 (트라스투주맙, 리툭시맙); 키메라 항원 수용체; 세포 주기 억제제 및 분화 유도인자 (트레티노인); mTOR 억제제, 토포이소머라제 억제제 (독소루비신 (아드리아마이신), 암사크린, 캄프토테신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 에니포시드, 에피루비신, 에토포시드, 이다루비신, 이리노테칸 (CPT-11) 및 미톡산트론, 토포테칸, 이리노테칸), 코티코스테로이드 (코티손, 덱사메타손, 하이드로코티손, 메틸페드니솔론, 프레드니손 및 프레니솔론); 성장 인자 신호 전달 키나제 억제제; 미토콘드리아 기능장애 유도인자 및 독소, 예컨대, 콜레라 독소, 리신, 슈도모나스 엑소톡신, 보데텔라 백일해 아데닐레이트 사이클라제 독소 또는 디프테리아 독소 및 카스파제 활성인자; 및 염색질 파괴인자.
사이토카인은 숙주 면역 반응을 항암 활성쪽으로 조작하기 위해서 사용된다 (예를 들어, 문헌[Floros & Tarhini, Semin. Oncol. 42(4):539-548, 2015]). 단독으로 또는 본 개시의 발현 결합 단백질 또는 이의 세포와 조합하여, 면역 항암 또는 항종양 반응을 촉진시키기에 유용한 사이토카인은 예를 들어, IFN-α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL- 21, IL-24, 및 GM-CSF를 포함한다.
실시예
실시예 1
항-STII 모노클로날 항체의 개발 및 특성규명
기존의 면역화 및 하이브리도마 방법을 사용하여 Strep®-tag II ("STII")-특이적 mAb를 개발하였다. 간략하게, 단일 STII 펩티드 또는 KLH 캐리어 단백질에 커플링된 STII 펩티드 서열 (Ac-C(dPEG4)NWSHPQFEK-아미드 (서열 번호 50), H2N-CGNWSHPQFEK-아미드 (서열 번호 51), H2N-CGNWSHPQFEKGC-OH (서열 번호 52)) 말레이미드의 조합으로 10-12 주령 암컷 마우스 (BALB/c 또는 CD1 또는 스위스 웹스터 또는 B57BL/6)를 면역화하여 항-STII 모노클로날 항체 하이브리도마 클론 4E2, 5G2 및 3E8을 생성하였다. 프로인트 완전/불완전 또는 Adjuplex 애쥬반트와 함께 12주의 부스팅 프로토콜에 따라, 비장 세포를 고역가 마우스에서 단리하여 FoxNY 골수종 (BTX, Harvard Apparatus)에 전기융합시켰다. 펩티드-특이적 항체를 분비하는 하이브리도마를 확인하고 ClonePix2 (Molecular Devices) 콜로니 피커를 사용하여 단리하였다. 픽킹된 클론으로부터의 항체를 STSA 펩티드, BSA 캐리어 단백질에 커플링된 말레이미드를 수반하는 혈구 계산 비드 어레이를 사용하여 유세포 분석에 의해 펩티드 결합에 대해 검증하였다. 선택된 하이브리도마 클론은 ClonePix2 피커를 사용하여 서브클로닝하고, 펩티드 결합에 대한 반복적인 검증이 이루어졌다. IgG를 암호화하는 DNA 서열을 각각의 클론 (4E2, 5G2 및 3E8)으로부터 유래된 다수의 서브클론으로부터 확인하였다. 이어서, 하이브리도마로부터 친화성 정제된 IgG를 시험관 내 및 생체 내에서 추가로 특성을 규명하였다.
먼저, 항체를 시험관 내에서 1개 (CD19-1ST-4-1BBζ), 3개 (CD19-3ST-4-1BBζ) 또는 0개 (CD19-4-1BBz) STII 태그를 함유하는 CAR T 세포에 대한 특이적인 결합에 대해 시험하였다. 별도의 면역화로부터 얻은 STII mAb 4C4 및 3C9를 또한 시험하였다. CD19 Strep-tag CAR T 세포 (1ST-4-1BBζ 및 3ST-41BBζ) 및 대조군 세포 (CD19-4-1BBζ)를 STII-특이적 mAb (5G2, 4E2, 3E8, 4C4, 3C9) 또는 상업적 STII-특이적 항체 (Genscript)에 이어, FITC-접합된 염소 항-마우스 이차 항체의 로 염색이 이어졌다. 도 1A를 참조한다. 이 결과는 본 개시의 STII mAb가 STII-태그된 CAR T 세포와 같은 STII-태그된 단백질을 특이적으로 표적화함을 보여준다.
마우스 이소형 키트 (IsoStripTM, Sigma-Aldrich)를 사용하여 5G2 및 4E2 mAb의 이소형을 결정하였다. 결과는 5G2 mAb가 IgG2b이고 4E2 mAb가 IgG2a임을 보여준다 (도 1B).
실시예 2
STII-태그된 CAR T 세포의 생체 내 표적화
STII-특이적 항체는 STII-태그된 CAR T 세포를 사용하는 요법을 개선하는 데 유용할 수 있다. CAR T 활성과 관련된 바람직하지 않은 부작용이 STII-특이적 항체에 의해 감소되거나 역전될 수 있는지를 시험하기 위해, CD45.2+ C57/BL6 마우스에 치사량 미만의 방사선 (6Gy TBI)과 B 세포 무형성을 유도하기 위해 5×106 CD45.1+ STII-태그 (1STII 또는 3STII) 항-CD19-CD28ζ_EGFRt CAR T 세포의 주입을 적용한 생체 내 B 세포 고갈 분석을 설계하였다 (도 2A). +37일 및 +42일에, 마우스를 항-STII 5G2 mAb 또는 세툭시맙 (STII-CAR 형질도입 마커 EGFRt를 표적으로 함)으로 마우스당 1 mg로 i.p. 처리하였다. 도 2B에 도시된 바와 같이, 형질도입된 세포를 수용자 마우스에 주입하기 전에 마우스 T 세포에서의 EGFRt 및 STII-CAR 발현을 유세포 측정법을 사용하여 형질도입 후 7일에 측정하였다. 이들 데이터는 1STII-CAR 및 3STII-CAR 작제물 둘 모두 T 세포에 의해 발현되었음을 보여준다.
이어서, 마우스를 도 2A에 나타낸 스케줄에 따라 처리하였다. 건강한 처리군 마우스로부터 PBMC의 T 및 B 세포의 수를 연구 과정 동안 유세포 분석에 의해 모니터링하였다. 방사선 및 항-CD19-1STII CAR T 세포 적용 후 항체 처리된 마우스에서의 B 세포 회수가 도 2C에 도시되어 있다. 방사선 및 항-CD19-3STII CAR T 세포 적용 후 항체 처리된 마우스에서의 B 세포 회수가 2D에 도시되어 있다.
간략하게, 모든 마우스 그룹은 1일째에 6Gy TBI를 받았다. 비처리 그룹: 마우스에게 조사만하고 어떠한 T 세포 주입도 하지 않았다; mCD19 CAR 그룹: 마우스에게 1일째에 mCD19-1STII-CD28z 또는 mCD193STII-CD28z CAR T 세포를 주입하고 항체 처리를 하지 않았다; 세툭시맙 그룹: 마우스에게 1일째에 mCD19II-1ST-CD28z 또는 항-CD3STII-CD28z CAR T 세포를, 35일 및 42일에 세툭시맙 (1 mg/마우스, i.p.)을 투여하였다; 5G2 그룹: 마우스에게 1일째에 mCD19-1STII-CD28z 또는 mCD19-3STII-CD28z CAR T 세포를, 35일 및 42일에 항-STII 5G2 mAb (1 mg/마우스, i.p.)를 투여하였다.
결과는 항-STII mAb가 CAR-T 세포상의 대용 마커 EGFRt를 표적으로 하는 세툭시맙만큼 효과적으로 mCD19-STII CAR-T 세포에 의해 유도된 B 세포 무형성증을 구제할 수 있음을 입증한다.
실시예 3
STII-태그된 CAR T 세포의 기능적 자극
항-STII mAb는 또한 예를 들어, 태그된 CAR T 세포를 면역요법으로서 환자에게 주입하기 전에 태그된 CAR T 세포를 자극하는 데 유용할 수 있다. 항원-발현 Raji 세포, 항체-코팅된 마이크로비드 (0.1 μg, 0.3 μg 또는 0.5 μg의 항-STII, 또는 항-STII 및 항-CD28, 둘 다 0.3 μg)를 사용하여 CD19-1STII CAR T 세포 (CD28z 또는 4-1BBz)를 자극하였다. 대조군은 항원이 없는 배지 단독 (CD)에서의 CD19-1STII CAR T 세포였다. 카복시플루오레세인 숙신이미딜 에스테르 (CFSE)를 사용하여 세포를 표지하였다. FACS에 의해 증식을 측정하였다. 도 3A에 도시된 바와 같이, 항-STII-코팅된 마이크로비드가 증식을 자극하였는데, 배지 단독과 비교하여 가장 낮은 수준의 항-STII mAb가 가장 큰 효과를 나타내었다. 자극된 CAR T 세포에 의한 사이토카인 생성을 측정하였다. 도 3B에 도시된 바와 같이, CAR T 세포에 의한 IL-2 및 IFN-γ 생성은 존재하는 항-STII mAb의 양에 따라 증가하였다. 사이토카인 생성의 최고 수준은 항-STII/항-CD28- 코팅된 마이크로비드를 사용하여 자극된 세포에 의한 것이었다.
실시예 4
STII-태그된 CAR T 세포의 확장
프라이밍 태그된 면역요법 세포에 대한 항-STII mAb의 유용성을 추가로 조사하기 위해, CD8+ 및 CD4+ STII-함유 CAR T 세포를 항-STII mAb 단독 또는 마이크로-CD28 항체와 조합하여 코팅된 마이크로비드를 사용하여 3× 자극하였다.
도 4A에 도시된 바와 같이, 각 자극 라운드는 T 세포 집단의 실질적인 확장으로 이어졌다. 항-STII 및 항-CD28로 코팅된 마이크로비드가 가장 큰 효과를 보였으며, CD4+ CAR T 세포가 CD8+ 세포보다 더 확장되었다.
실시예 5
자극된 STII-태그된 CAR T 세포의 특성규명
CAR T 세포 (자극 전, 또는 제1, 제2 또는 제3 자극 후; 실시예 4 참조)를 STII의 발현 및 T 세포 성숙, 활성화 또는 억제의 여러 마커 (CD45RO, CD62L, CD28, CTLA4 및 PD1)에 대해 조사하였다. 세포를 각 마커에 대한 항체를 사용하여 염색하고 유세포 분석을 수행하였다. 데이터를 도 4B에 나타내었다.
놀랍게도, 자극된 세포는 심지어 제2 및 제3 자극 후에도 자극 전 세포와 비교하여 모든 마커에 대해 유사하거나 심지어 감소된 발현을 나타냈다. 이들 데이터는 태그된 CAR T 세포가 T 세포 억제 또는 고갈의 위험 증가없이 본 개시의 항-STII mAb를 사용하여 시험관 내에서 효과적으로 확장 및 자극될 수 있음을 나타낸다.
상기 기재한 다양한 구체예는 추가 구체예를 제공하도록 조합될 수 있다. 미국 가출원 특허 제62/555,017호를 포함해 본 명세서에 언급되고/되거나 출원 데이터 시트에 열거된 미국 특허, 미국 특허 출원 공개, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비특허 간행물 모두는 이들의 전문이 참고로 본원에 포함된다. 구체예의 측면은 필요한 경우 다양한 특허, 출원 및 간행물의 개념을 사용하여 변형되어 추가의 구체예를 제공할 수 있다.
상기 상세한 설명에 비추어 이들 및 다른 변화가 구체예에 대해 행해질 수 있다. 일반적으로, 하기 청구범위에서, 사용된 용어는 청구범위가 본 명세서에 개시된 특정 구체예로 제한되는 것으로 해석되어서는 안되며, 이러한 청구범위로 주어지는 등가의 전 범위와 함께 모든 가능한 구체예를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 청구범위는 본 개시에 의해서 제한되지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Fred Hutchinson Cancer Research Center Liu, Lingfeng Riddell, Stanley R. Hoffstrom, Benjamin <120> STREP-TAG SPECIFIC BINDING PROTEINS AND USES THEREOF <130> 360056.451WO <140> PCT <141> 2018-09-06 <150> US 62/555,017 <151> 2017-09-06 <160> 52 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Anti-STII mAb 3E8 VH <400> 1 gaggtgcagc tggtggagac tgggggaggc tttgtgaagc ctggaggctc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agttatggca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcagcc atcaccagtg atggcggtgg cacccactat 180 ccagatactg tgaagggccg attcaccatc tccagagact ttgccaaaaa caccctgtac 240 ctgcagatga gcagtctgag gtctgaggac acagcctggt atttctgtgc aagacatgag 300 ccccgactga tagcctggtt tgctcactgg ggccaaggaa ctctggtcac tgtctctgca 360 <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Anti-STII mAb 3E8 VH <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Phe Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 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Arg His Glu Pro Arg Leu Ile Ala Trp Phe Ala His Trp Gly Gln Gly 225 230 235 240 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 245 <210> 7 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Anti-STII mAb 5G2 VH <400> 7 caggttcaac tgcagcagtc tggagctgag ctggcgaggc caggggcttc agtgaagctg 60 tcctgcacgg cttctggata caccttcaca agctatggta taacctgggt gaggcagaga 120 actggacagg gccttgagtg gattggagag atttttcctg gaagtggtga tacttcctac 180 ggtgagaaat tcaagggcca ggccacactg actacagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagacgctat 300 aggtacattt accatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360 <210> 8 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Anti-STII mAb 5G2 VH <400> 8 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Gly Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Tyr Arg Tyr Ile Tyr His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 9 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Anti-STII mAb 5G2 VL <400> 9 gatattttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagcattgta catagtaatg gcaacaccta tttagaatgg 120 tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 cgcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttccg 300 ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaa 336 <210> 10 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Anti-STII mAb 5G2 VL <400> 10 Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Arg Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 11 <211> 247 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Anti-STII 5G2 scFv <400> 11 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Gly Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Tyr Arg Tyr Ile Tyr His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu 130 135 140 Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser 145 150 155 160 Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr 165 170 175 Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser 180 185 190 Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 195 200 205 Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Arg Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly 210 215 220 Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala 225 230 235 240 Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 245 <210> 12 <211> 247 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Anti-STII 5G2 scFv <400> 12 Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Arg Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln 115 120 125 Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser 130 135 140 Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly 145 150 155 160 Ile Thr Trp Val Arg Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 165 170 175 Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Gly Glu Lys Phe Lys 180 185 190 Gly Gln Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 195 200 205 Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala 210 215 220 Arg Arg Tyr Arg Tyr Ile Tyr His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 225 230 235 240 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 245 <210> 13 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Anti-STII mAb 4E2 VH <400> 13 caggttcaac tgcagcagtc tggagctgag ctggcgaggc caggggcttc agtgaagctg 60 tcctgcacgg cttctggata caccttcaca agctatggta taacctgggt gaggcagaga 120 actggacagg gccttgagtg gattggagag atttttcctg gaagtggtga tacttcctac 180 ggtgagaaat taaagggcca ggccacactg actacagaca aatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcagtct atttctgtgc aagacgctat 300 aggtacattt accatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360 <210> 14 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Anti-STII mAb 4E2 VH <400> 14 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Gly Glu Lys Leu 50 55 60 Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Tyr Arg Tyr Ile Tyr His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211> 336 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Anti-STII mAb 4E2 VL <400> 15 gatattttga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60 atctcttgca gatctagtca gagcattgta catagtaatg gcaacaccta tttagagtgg 120 tacctgcaga aaccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180 tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240 agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tattactgct ttcaaggttc acatgttccg 300 ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaa 336 <210> 16 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Anti-STII mAb 4E2 VL <400> 16 Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 17 <211> 247 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Anti-STII 4E2 scFv <400> 17 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Thr Trp Val Arg Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Gly Glu Lys Leu 50 55 60 Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Tyr Arg Tyr Ile Tyr His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu 130 135 140 Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser 145 150 155 160 Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr 165 170 175 Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser 180 185 190 Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 195 200 205 Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly 210 215 220 Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala 225 230 235 240 Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 245 <210> 18 <211> 247 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Anti-STII 4E2 scFv <400> 18 Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln 115 120 125 Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser 130 135 140 Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly 145 150 155 160 Ile Thr Trp Val Arg Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 165 170 175 Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Gly Glu Lys Leu Lys 180 185 190 Gly Gln Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 195 200 205 Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala 210 215 220 Arg Arg Tyr Arg Tyr Ile Tyr His Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 225 230 235 240 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 245 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Strep-Tag II <400> 19 Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 1 5 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Gly4Ser)2 linker <400> 20 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 21 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Gly3Ser)2 linker <400> 21 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 22 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence 3E8 HCDR1 <400> 22 Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser 1 5 10 <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence 3E3 HCDR2 <400> 23 Ala Ile Thr Ser Asp Gly Gly Gly Thr His 1 5 10 <210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence 3E8 HCDR3 <400> 24 Ala Arg His Glu Pro Arg Leu Ile Ala Trp Phe Ala His 1 5 10 <210> 25 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence 3E8 LCDR1 <400> 25 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Tyr Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence 3E8 LCDR2 <400> 26 Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence 3E8 LCDR3 <400> 27 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr 1 5 <210> 28 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence 5G2 HCDR1 <400> 28 Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly Ile Thr 1 5 10 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence 5G2 HCDR2 <400> 29 Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ser 1 5 10 <210> 30 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence 5G2 HCDR3 <400> 30 Ala Arg Arg Tyr Arg Tyr Ile Tyr His Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 31 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence 5G2 LCDR1 <400> 31 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 32 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence 5G2 LCDR2 <400> 32 Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence 5G2 LCDR3 <400> 33 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr 1 5 <210> 34 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence 4E2 HCDR1 <400> 34 Thr Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly Ile Thr 1 5 10 <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence 4E2 HCDR2 <400> 35 Glu Ile Phe Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ser 1 5 10 <210> 36 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence 4E2 HCDR3 <400> 36 Ala Arg Arg Tyr Arg Tyr Ile Tyr His Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 37 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence 4E2 LCDR1 <400> 37 Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 10 15 <210> 38 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence 4E2 LCDR2 <400> 38 Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence 4E2 LCDR3 <400> 39 Phe Gln Gly Ser His Val Pro Leu Thr 1 5 <210> 40 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence P2A <400> 40 Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 41 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence P2A mod <400> 41 Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 42 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence T2A <400> 42 Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 1 5 10 15 Gly Pro <210> 43 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence T2A mod <400> 43 Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu 1 5 10 15 Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 44 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence E2A <400> 44 Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Ser Asp Val Glu 1 5 10 15 Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 45 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence E2A mod <400> 45 Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Ser 1 5 10 15 Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 46 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence F2A <400> 46 Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 47 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence F2A mod <400> 47 Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala 1 5 10 15 Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 25 <210> 48 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Strep-tag <400> 48 Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly 1 5 <210> 49 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence Gly3Ser)2Gly2Ser linker <400> 49 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 50 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence combination ST peptide <220> <221> ACETYLATION <222> 1 <220> <221> MOD_RES <222> 2 <223> dPEG4 <220> <221> AMIDATION <222> 10 <400> 50 Cys Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 1 5 10 <210> 51 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence combination ST peptide <220> <221> AMIDATION <222> 11 <400> 51 Cys Gly Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 1 5 10 <210> 52 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence combination ST peptide <400> 52 Cys Gly Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Cys 1 5 10

Claims (110)

  1. 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 태그 펩티드에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하고, 이 결합 도메인은 다음을 포함하는 면역글로불린 결합 단백질:
    (a) i. 서열 번호 31에 기재된 CDR1 아미노산 서열, 또는 이의 변이체, 서열 번호 32에 기재된 CDR2 아미노산 서열 또는 이의 변이체, 및 서열 번호 33에 기재된 CDR3 아미노산 서열, 또는 이의 변이체;
    ii. 서열 번호 25에 기재된 CDR1 아미노산 서열, 또는 이의 변이체, 서열 번호 26에 기재된 CDR2 아미노산 서열, 또는 이의 변이체, 및 서열 번호 27에 기재된 CDR3 아미노산 서열, 또는 이의 변이체; 또는
    iii. 서열 번호 37에 기재된 CDR1 아미노산 서열, 또는 이의 변이체, 서열 번호 38에 기재된 CDR2 아미노산 서열, 또는 이의 변이체, 및 서열 번호 39에 기재된 CDR3 아미노산 서열, 또는 이의 변이체 및 VH 도메인;
    을 포함하는 VL 도메인; 또는
    (b) i. 서열 번호 28에 기재된 CDR1 아미노산 서열, 또는 이의 변이체, 서열 번호 29에 기재된 CDR2 아미노산 서열, 또는 이의 변이체, 및 서열 번호 30에 서열 번호 에 기재된 CDR3 아미노산 서열, 또는 이의 변이체;
    ii. 서열 번호 22에 기재된 CDR1 아미노산 서열, 또는 이의 변이체, 서열 번호 23에 기재된 CDR2 아미노산 서열 또는 이의 변이체, 및 서열 번호 24에 기재된 CDR3 아미노산 서열, 또는 이의 변이체; 또는
    iii. 서열 번호 34에 기재된 CDR1 아미노산 서열 또는 이의 변이체, 서열 번호 35에 기재된 CDR2 아미노산 서열 또는 이의 변이체 및 서열 번호 36에 기재된 CDR3 아미노산 서열, 또는 이의 변이체 및 VL 도메인;
    을 포함하는 VH 도메인; 또는
    (c) (a)의 VL 도메인 및 (b)의 VH 도메인.
  2. 제1항에 있어서, VL 도메인이 서열 번호 3, 10 및 16 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, VH 도메인이 서열 번호 2, 8 및 14 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열과 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 포함하는, 면역글로불린 결합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, VL이 서열 번호 10, 3 및 16 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, VH가 서열 번호 8, 2 및 14 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 면역글로불린 결합 단백질.
  4. 제3항에 있어서, VL이 서열 번호 10에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, VH가 서열 번호 8에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 면역글로불린 결합 단백질.
  5. 제3항에 있어서, VL이 서열 번호 3에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, VH가 서열 번호 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 면역글로불린 결합 단백질.
  6. 제3항에 있어서, VL이 서열 번호 16에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지고, VH가 서열 번호 14에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 면역글로불린 결합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는, 면역글로불린 결합 단백질.
  8. 제7항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 모노클로날 항체 5G2를 포함하는, 면역글로불린 결합 단백질.
  9. 제7항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 모노클로날 항체 3E8을 포함하는, 면역글로불린 결합 단백질.
  10. 제7항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 모노클로날 항체 4E2를 포함하는, 면역글로불린 결합 단백질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라, 인간화 또는 인간 항체 또는 이의 항원 결합 부분인, 면역글로불린 결합 단백질.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 도메인이 scFv, 탠덤 scFv, scFv-Fc, 탠덤 scFv-Fc, scFv 이량체, scFv-지퍼, 디아바디, 디아바디-Fc, 디아바디-CH3, sc디아바디, sc디아바디-Fc, sc디아바디-CH3, 나노바디, 미니바디, 미니 항체, 트리아바디, 테트라바디, Fab, F(ab)'2, scFab, Fab-scFv, Fab-scFv-Fc, scFv-CH-CL-scFv, F(ab')2-scFv2, 이중특이성 T 세포 인게이저 (BiTE) 분자, DART, KIH (Knobs-Into-Holes) 어셈블리, scFv-CH3-KIH 어셈블리, KIH 공통 경쇄 항체, TandAb, 트리플바디, 트리바이 (TriBi) 미니바디, Fab-scFv, scFv-CH-CL-scFv, F(ab')2-scFv2, 4가 HCab, 인트라바디, CrossMab, 이중 작용 Fab (DAF) (two-in-one 또는 four-in-one), DutaMab, DT-IgG, 전하 쌍 Fab-암 교환, 시드바디, 트리오맙, LUZ-Y, Fcab, κλ-바디, 직교 Fab, DVD-IgG, IgG(H)-scFv, scFv-(H) IgG, IgG(L)-scFv, scFv-(L)IgG, IgG(L,H)-Fv, IgG(H)-V, V(H)-IgG, IgG(L)-V, V(L)-IgG, KIH IgG-scFab, 2scFv-IgG, IgG-2scFv, scFv4-Ig, Zy바디 (Zybody) 또는 DVI-IgG (four-in-one)를 포함하는, 면역글로불린 결합 단백질.
  13. 제12항에 있어서, 결합 도메인이 scFv를 포함하고, scFv가 모노클로날 항체 3E8의 VL 및 VH를 포함하는, 면역글로불린 결합 단백질.
  14. 제13항에 있어서, scFv가 서열 번호 5 또는 6의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 면역글로불린 결합 단백질.
  15. 제12항에 있어서, 결합 도메인이 scFv를 포함하고, scFv가 모노클로날 항체 5G2의 VL 및 VH를 포함하는, 면역글로불린 결합 단백질.
  16. 제15항에 있어서, scFv가 서열 번호 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 면역글로불린 결합 단백질.
  17. 제12항에 있어서, 결합 도메인이 scFv를 포함하고, scFv가 모노클로날 항체 4E2의 VL 및 VH를 포함하는, 면역글로불린 결합 단백질.
  18. 제17항에 있어서, scFv가 서열 번호 17 또는 18의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진, 면역글로불린 결합 단백질.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 다중특이성 결합 단백질을 포함하고, 여기서 다중특이성 결합 단백질은 태그 펩티드에 특이적으로 결합하는 결합 도메인 및 태그 펩티드가 아닌 적어도 하나의 표적에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는, 면역글로불린 결합 단백질.
  20. 제19항에 있어서, 다중특이성 결합 단백질이 이중특이성 결합 단백질을 포함하는, 면역글로불린 결합 단백질.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 태그 펩티드가 아닌 적어도 하나의 표적이 면역 세포 마커인, 면역글로불린 결합 단백질.
  22. 제21항에 있어서, 면역 세포 마커가 CD3 또는 CD16인, 면역글로불린 결합 단백질.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 도메인이 이중특이성 scFv를 포함하는, 면역글로불린 결합 단백질.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 다가인, 면역글로불린 결합 단백질.
  25. 제24항에 있어서, 2가인, 면역글로불린 결합 단백질.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 결합 도메인을 포함하는 세포 외 성분, 및 이펙터 도메인을 포함하는 세포 내 성분을 포함하고, 이들 세포 외 및 세포 내 성분은 막관통 도메인에 의해 연결되어 있는 융합 단백질.
  27. 제26항에 있어서, 결합 도메인이 scFv를 포함하고, 세포 외 성분이 힌지를 포함하는 커넥터 영역을 추가로 포함하는, 융합 단백질.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 융합 단백질이 키메라 항원 수용체를 포함하는, 융합 단백질.
  29. 세포독성제, 방사성 동위원소, 방사성 금속 또는 검출 가능한 제제를 추가로 포함하는, 제1항 내지 제25항 중 어느 한의 면역글로불린 결합 단백질, 또는 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항의 융합 단백질.
  30. (a) 제1항 내지 제25항 및 제29항 중 어느 한 항의 면역글로불린 결합 단백질, 또는 (b) 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 및 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물.
  31. (a) 제1항 내지 제25항 및 제29항 중 어느 한 항의 면역글로불린 결합 단백질 또는 (b) 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  32. 제31항에 있어서,
    (a) 서열 번호 1, 7, 및 13 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드; 및/또는
    (b) 서열 번호 4, 9 및 15 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는,
    폴리뉴클레오티드.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 폴리뉴클레오티드를 함유하는 숙주 세포에 대해 코돈-최적화된 폴리뉴클레오티드.
  34. 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 작제물.
  35. 제34항의 발현 작제물을 포함하는 벡터.
  36. 제35항에 있어서, 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터인 벡터.
  37. 제36항에 있어서, 바이러스 벡터이고 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터 또는 γ-레트로바이러스 벡터로부터 선택되는, 벡터.
  38. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 또는 제34항의 발현 작제물을 포함하고, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 발현 작제물은 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질을 암호화하며 숙주 세포는 암호화된 면역글로불린 결합 단백질 또는 암호화된 융합 단백질을 발현하는, 숙주 세포.
  39. 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 태그 펩티드를 세포 표면 상에서 발현하는 태그된 세포 또는 태그된 세포 집단을 식별하는 방법으로서,
    (i) 하나 이상의 태그된 세포를 포함하는 대상으로부터의 샘플을 제1항 내지 제25항 및 제29항 중 어느 한 항의 면역글로불린 결합 단백질, 또는 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항의 융합 단백질과 접촉시키고;
    (ii) 하나 이상의 태그된 세포에 대한 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질의 특이적 결합을 검출하여 태그 펩티드를 발현하는 하나 이상의 세포를 식별하는 단계를 포함하는 방법.
  40. 대상으로부터 태그된 세포 또는 태그된 세포 집단을 농축 또는 단리시키는 방법으로서,
    (i) 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 태그 펩티드를 세포 표면 상에서 발현하는 하나 이상의 세포를 포함하는 대상으로부터의 샘플을 제1항 내지 제25항 및 제29항 중 어느 한 항의 면역글로불린 결합 단백질 또는 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항의 융합 단백질과 접촉시키고;
    (ii) 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질에 의해 특이적으로 결합된 태그된 세포(들)를 선택 또는 분류하여 태그 펩티드를 발현하는 하나 이상의 세포를 풍부하게 하거나 단리하는 단계를 포함하는 방법.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 세포 표면 태그 펩티드가 세포 표면 단백질에 함유된, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 세포 표면 단백질이 키메라 항원 수용체 (CAR), T 세포 수용체 (TCR), 마커 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 세포 표면 단백질이 마커를 포함하는, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 마커가 EGFRt, CD19t, CD34t 또는 NGFRt를 포함하는, 방법.
  45. 제39항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질이 검출 가능한 모이어티를 포함하는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 검출 가능한 모이어티가 효소, 염료, 형광 표지 또는 펩티드 태그 중 하나 이상을 포함하되, 여기서 펩티드 태그는 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어지지 않은, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 검출 가능한 모이어티가 효소를 포함하고, 이 효소는 발색성 리포터 효소를 포함하는, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 발색성 리포터 효소가 고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제를 포함하는, 방법.
  49. 제46항에 있어서, 검출 가능한 모이어티가 염료를 포함하는, 방법.
  50. 제46항에 있어서, 검출 가능한 모이어티가 형광 표지를 포함하는, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 형광 표지가 시아닌 염료, 쿠마린, 로다민, 잔텐, 플루오레세인 또는 이의 설폰화된 유도체, 형광 단백질 또는 이들의 임의 조합을 포함하는, 방법.
  52. 제46항에 있어서, 검출 가능한 모이어티가 펩티드 태그를 포함하고 펩티드 태그는 His-태그 또는 Myc-태그를 포함하는, 방법.
  53. 제46항에 있어서, 검출 가능한 모이어티가 형광 모이어티를 포함하는, 방법.
  54. 제53항에 있어서, 형광 모이어티가 PE, 퍼시픽 블루, 알렉사 플루오르, APC 또는 FITC인, 방법.
  55. 제39항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 태그된 세포 또는 태그된 세포 집단이 유세포 분석법을 사용하여 식별, 검출 또는 분류되는, 방법.
  56. 제39항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질에 특이적으로 결합된 태그된 세포 또는 태그된 세포 집단이 자기 컬럼 크로마토그래피에 의해 샘플의 다른 성분으로부터 농축되거나 단리되는, 방법.
  57. 제39항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 혈액인, 방법.
  58. 제39항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 조직인, 방법.
  59. 제39항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 대상이 인간인, 방법.
  60. 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 태그 펩티드를 세포 표면에서 발현하도록 변형된 면역 세포를 활성화시키는 방법으로서, 변형된 면역 세포를 변형된 면역 세포의 활성화를 유도하기에 충분한 조건 및 시간으로 제1항 내지 제25항 및 제29항 중 어느 한 항의 면역글로불린 결합 단백질 또는 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항의 융합 단백질과 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
  61. 제60항에 있어서, 변형된 면역 세포의 활성화가 시험관 내 또는 생체 외에서 수행되는, 방법.
  62. 제60항 또는 제61항에 있어서, 농축 또는 단리 전에 샘플에서 활성화된 면역 세포 집단을 확장시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  63. 제60항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 태그 펩티드가 변형된 면역 세포에 의해 발현된 세포 표면 단백질에 함유된, 방법.
  64. 제63항에 있어서, 태그된 세포 표면 단백질이 CAR, TCR, 마커 또는 이들의 조합을 포함하고; 임의로, 상기 마커는 EGFRt, CD19t, CD34t 또는 NGFRt로부터 선택되는, 방법.
  65. 제60항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 태그 펩티드를 발현하는 세포가 인간 T 세포, NK 세포 또는 NK-T 세포를 포함하는, 방법.
  66. 제39항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질이 고체 표면에 부착된, 방법.
  67. 제39항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질이 평면 표면, 아가로스, 수지, 3D 패브릭 매트릭스 또는 비드에 부착된, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질이 마이크로비드 또는 나노비드에 부착된, 방법.
  69. 변형된 면역 세포의 국소 활성화를 위한 생체 내 방법으로서,
    (i) (a) 제1항 내지 제25항 및 제29항 중 어느 한 항의 면역글로불린 결합 단백질, 또는 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항의 융합 단백질, 및
    (b) 공동 자극 분자에 특이적인 결합 폴리펩티드,
    를 포함하는 매트릭스 조성물 또는 장치; 및
    (ii) 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 태그 펩티드를 세포 표면에서 발현하는 변형된 면역 세포로서, 여기서 태그 펩티드는 CAR, TCR, 마커, 또는 이들의 조합에 함유되고; 임의로 마커는 EGFRt, CD19t, CD34t 또는 NGFRt로부터 선택되는 것인 변형된 면역 세포;
    를 대상에게 투여하는 단계를 포함하고,
    상기 서브파트 (i)의 매트릭스 조성물의 (a)와 세포 표면 태그 펩티드의 회합으로 변형된 면역 세포가 활성화되는,
    방법.
  70. 제69항에 있어서, 매트릭스 조성물이 알기네이트, 기저막 매트릭스 또는 바이오폴리머를 포함하는, 방법.
  71. 제69항 또는 제70항에 있어서, 변형된 세포가 T 세포, NK 세포 또는 NK-T 세포인, 방법.
  72. 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 태그 펩티드를 발현하는 세포를 태그된 세포의 증식을 허용하기에 충분한 조건 및 시간으로
    (a) 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질, 및
    (b) 성장 인자 사이토카인과 접촉시키는 단계를 포함하는,
    세포 증식을 촉진하는 방법.
  73. 제72항에 있어서, 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질이 고체 표면에 부착된, 방법.
  74. 제72항 또는 제73항에 있어서, 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질이 평면 표면, 아가로스, 수지, 3D 패브릭 매트릭스 또는 비드에 부착된, 방법.
  75. 제72항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질이 마이크로비드 또는 나노비드에 부착된, 방법.
  76. 제72항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 성장 인자 사이토카인이 IL-12, IL-15 또는 둘 다를 포함하는, 방법.
  77. 제75항 또는 제76항에 있어서, 세포를 항-CD27 결합 단백질, 항-CD28 결합 단백질, 항-CD137 결합 단백질, 항-OX40 결합 단백질, 또는 이들의 임의 조합물과 배양하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 하나 이상의 결합 단백질은 고체 표면에 부착된, 방법.
  78. 제77항에 있어서, 항-CD27 결합 단백질, 항-CD28 결합 단백질, 항-CD137 결합 단백질, 항-OX40 결합 단백질 또는 이들의 임의 조합물이 평면 표면, 아가로스, 수지, 3D 패브릭 매트릭스 또는 비드에 부착된, 방법.
  79. 제72항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 증식이 생체 내 또는 생체 외에서 유도되는, 방법.
  80. 제72항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 T 세포, NK 세포 또는 NK-T 세포인, 방법.
  81. 제80항에 있어서, 세포가 기능성의 변형된 T 세포인, 방법.
  82. 제81항에 있어서, 기능성의 변형된 T 세포가 바이러스-특이적 세포, 종양 항원 특이적 세포독성 T 세포, 기억 줄기 T 세포, 중추 기억 T 세포, 이펙터 T 세포 또는 CD4+ CD25+ 조절 T 세포인, 방법.
  83. 제72항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 태그 펩티드가 세포에 의해 발현된 세포 표면 단백질에 함유된, 방법.
  84. 제83항에 있어서, 세포 표면 단백질이 CAR, TCR, 마커 또는 이들의 조합을 포함하고; 임의로, 상기 마커는 EGFRt, CD19t, CD34t 또는 NGFRt로부터 선택되는, 방법.
  85. 제72항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 증식이 시험관 내 또는 생체 외에서 유도되는, 방법.
  86. (a) 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 태그 펩티드를 발현하는 변형된 세포를 수여받은 대상에게
    (i) 제1항 내지 제25항 또는 제29항 중 어느 한 항의 면역글로불린 결합 단백질, 또는
    (ii) 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항의 융합 단백질,
    중 하나 이상을 투여하는 단계로서, 상기 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질은 생체 내 이미징에 적합한 검출 가능한 모이어티를 추가로 포함하는 단계; 및
    (b) 대상의 이미징을 수행하는 단계를 포함하는,
    생체 내 이미징 방법.
  87. 제86항에 있어서, 검출 가능한 모이어티가 방사성 추적자를 포함하는, 방법.
  88. 제87항에 있어서, 방사성 추적자가 68Ga, 64Cu, 86Y, 89Zr, 124I, 99mTc, 123I, 111In, 177Lu, 131I, 76Br, 78Zr, 18F, 또는 124T인, 방법.
  89. 제86항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 이미징이 PET (Positron Emission Tomography: 양전자 방사 단층 촬영)를 포함하는, 방법.
  90. 제86항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 도메인이 항체의 항원-결합 단편을 포함하고, 여기서 항원-결합 단편은 scFv, 탠덤 scFv, scFv-Fc, scFv 이량체, scFv 지퍼, 디아바디, 미니바디, 트리아바디, 테트라바디, Fab, F(ab)'2, scFab, 미니 항체, 나노바디, 나노바디-HSA, 이중특이성 T 세포 인게이저 (BiTE), DART, sc디아바디, sc디아바디-CH3 또는 scFv-CH3 노브-인투-홀 (KIH) 어셈블리인, 방법.
  91. 태그된 면역요법 세포의 표적화된 제거 방법으로서,
    (a) 제1항 내지 제25항 또는 제29항 중 어느 한 항의 면역글로불린 결합 단백질;
    (b) 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항의 융합 단백질; 또는
    (c) 제30항의 조성물을
    태그된 면역요법 세포의 제거를 야기하기에 충분한 조건 및 시간으로 대상에게 투여하는 단계를 포함하고,
    상기 대상은 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 태그 펩티드를 포함하는 세포 표면 단백질을 발현하는 태그된 면역요법 세포를 미리 투여 받았으며,
    상기 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질 또는 조성물은 태그 펩티드에 결합 시 세포 사멸을 직접 또는 간접적으로 유도할 수 있는, 방법.
  92. 제91항에 있어서, 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질 또는 조성물이 세포독성제를 포함하는, 방법.
  93. 제91항 또는 제92항에 있어서, 면역글로불린 결합 단백질이 태그 펩티드에 결합 시 태그된 면역요법 세포에 대해 다음 중 하나 이상을 유도할 수 있는 항체를 포함하는, 방법:
    (a) 옵소닌화;
    (b) 식균 작용;
    (c) 항체 지정 세포 매개 세포독성 (ADCC); 및
    (d) 보체 지정 세포독성 (CDC).
  94. 제93항에 있어서, 면역글로불린 결합 단백질이 이중특이성이고, (a) 태그 펩티드에 결합하는 것과 동시에 (a) T 세포 마커 또는 (b) NK 세포 마커에 결합할 수 있는, 방법.
  95. 제94항에 있어서, T 세포 마커가 CD3이거나, NK 세포 마커가 CD16인, 방법.
  96. 제94항 또는 제95항에 있어서, 면역글로불린 결합 단백질이 이중특이성 scFv, 이중특이성 T 세포 인게이저 (BiTE) 분자, 나노바디, 디아바디, DART, TandAb, sc디아바디, sc디아바디-CH3, 디아바디-CH3, 트리플바디, 미니 항체, 미니바디, 트리바이 (TriBi) 미니바디, scFv-CH3 KIH, Fab-scFv, scFv-CH-CL-scFv, F(ab')2, F(ab')2-scFv2, scFv-KIH, Fab-scFv-Fc, 4가 HCab, sc디아바디-Fc, 디아바디-Fc, 탠덤 scFv-Fc, 인트라바디, Dock and Lock 융합 단백질, ImmTAC, HSA바디, sc디아바디-HSA, 탠덤 scFv, crossMab, DAF (two-in-one 또는 four-in-one), 두타맙, DT-IgG, KIH 어셈블리, KIH 공통 경쇄 항체, 전하 쌍, Fab-암 교환, 시드바디, 트리오맙, LUZ-Y, Fcab, κλ-바디, 직교 Fab, DVD-IgG, IgG(H)-scFv, scFv-(H)IgG, IgG(L)-scFv, scFv-(L)IgG, IgG(L,H)-Fv, IgG(H)-V, V(H)-IgG, IgG(L)-V, V(L)-IgG, KIH IgG-scFab, 2scFv-IgG, IgG-2scFv, scFv4-Ig, Zy바디 (Zybody) 또는 DVI-IgG (four-in-one)를 포함하는, 방법.
  97. 제91항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 표면 단백질이 CAR, TCR, 마커 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  98. 제91항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 표면 단백질이 마커 단백질을 포함하는, 방법.
  99. 제98항에 있어서, 마커 단백질이 EGFRt, CD19t, CD34t 또는 NGFRt인, 방법.
  100. 제91항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 결합 단백질, 융합 단백질 또는 조성물이 태그된 면역요법 세포의 존재와 관련된 적어도 하나의 유해 사건 (adverse event)을 갖는 대상에게 투여되는, 방법.
  101. 제91항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 제거 후에,
    (i) 제86항 내지 제90항 중 어느 한 항에 따른 대상의 생체 내 이미징을 수행하는 단계;
    (ii) 대상으로부터 얻은 샘플에서 제39항 내지 제59항 중 어느 한 항의 검출 방법을 수행하는 단계;
    (iii) 대상에서 하나 이상의 사이토카인의 수준을 모니터링하는 단계;
    (iv) 대상 또는 대상으로부터 얻은 샘플에서 태그된 면역요법 세포에 의해 표적화된 표적 세포 또는 조직의 존재 및/또는 양을 검출하는 단계;
    (v) 태그된 면역 요법 세포의 생체 내 추적을 수행하는 단계; 또는
    (vi) 이들의 임의의 조합을 추가로 포함하는 방법.
  102. 제101항에 있어서, 생체 내 추적이 자성 입자; 초상자성 산화철 (SPIO); 플루오로데옥시글루코스 (18F); 형광성 화합물; 또는 이들의 임의의 조합물에 접합된 면역글로불린 결합 단백질 또는 융합 단백질의 사용을 포함하는 방법.
  103. 제101항 또는 제102항에 있어서, 생체 내 추적이 MRI, PET 또는 근적외선 이미징의 사용을 포함하는, 방법.
  104. 제91항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 태그된 면역요법 세포가 T 세포, NK 세포, NK-T 세포, 조혈 줄기 세포, 조직 세포, 중간엽 세포 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
  105. 제91항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 대상이 하나 이상의 태그된 면역요법 세포를 포함한 이식 후에, 이식편 대 숙주 질환 (GvHD), 숙주 대 이식편 질환 (HvGD) 또는 사이토카인 방출 증후군 (CRS)을 갖거나 갖는 것으로 의심되는, 방법.
  106. (a) 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 태그 펩티드를 암호화하는 발현 벡터 또는 폴리뉴클레오티드, 및 이들 벡터 또는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 형질도입하기 위한 임의의 시약; 및
    (b) (i) 제1항 내지 제25항 및 제29항 중 어느 한 항의 면역글로불린 결합 단백질,
    (ii) 제23항 내지 제29항 중 어느 한 항의 융합 단백질,
    (iii) 제30 항의 조성물,
    (iv) 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항의 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항의 발현 벡터, 및 상기 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터를 숙주 세포 내로 형질도입하기 위한 임의의 시약, 및/또는
    (v) 제38항의 숙주 세포;
    를 포함하는 키트.
  107. (i) 제1항 내지 제25항 및 제29항 중 어느 한 항의 면역글로불린 결합 단백질, 또는 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 포함하는 매트릭스 조성물; 및
    (ii) 면역 공동 자극 분자에 특이적으로 결합하여 면역 공동 자극 분자의 활성 수준을 증가시키는 결합 폴리펩티드;
    를 포함하는 매트릭스 조성물.
  108. 제107항에 있어서, 알기네이트, 기저막 매트릭스 또는 바이오폴리머, 또는 이들의 임의의 조합물을 추가로 포함하는 매트릭스 조성물.
  109. (i) 제1항 내지 제25항 및 제29항 중 어느 한 항의 면역글로불린 결합 단백질, 또는 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항의 융합 단백질; 및
    (ii) 면역 공동 자극 분자에 특이적으로 결합하여 면역 공동 자극 분자의 활성 수준을 증가시키는 결합 폴리펩티드;
    를 포함하는 장치.
  110. 제109항에 있어서, (i) 및 (ii) 중 하나 또는 둘 모두가 고체 표면, 아가로스 비드, 수지, 3D 패브릭 매트릭스 또는 비드 상에 배치된, 장치.
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