RS61223B1

RS61223B1 - Označeni himerni efektorski molekuli i njihovi receptori

Info

Publication number: RS61223B1
Application number: RS20201392A
Authority: RS
Inventors: Stanley R Riddell; Lingfeng Liu
Original assignee: Hutchinson Fred Cancer Res
Priority date: 2013-12-20
Filing date: 2014-12-22
Publication date: 2021-01-29
Also published as: KR20160101947A; PT3083671T; AU2021204475A1; AU2019229438B2; US11993652B2; NZ759969A; WO2015095895A1; US11046766B2; HRP20201906T1; JP6942467B2; CY1123747T1; CA2933707A1; US20170267756A1; DK3083671T3; AU2019229438A1; MY178233A; BR112016014156A8; KR102483822B1; MX2016007927A; KR20230007559A

Description

Opis

IZJAVA KOJA SE TIČE DRŽAVNIH INTERESA

[0001] Ovaj pronalazak izrađen je uz podršku države pod Odobrenjem/Ugovorom Br. CA136551 nagrađenim od strane Nacionalnih Istituta za Zdravlje. Država uživa određena prava ovog pronalaska.

IZJAVA U VEZI LISTE SEKVENCI

[0002] Lista sekvenci povezana sa ovom prijavom obezbeđena je u tekstualnom formatu umesto štampane kopije, i na taj način čini deo ove specifikacije. Naziv tekstualnog formata koji sadrži listu sekvenci je 360056_426WO_SEQUENCE_LISTING.txt. Tekstualni fajl iznosi 32.3 KB, izrađen je 22 Decembra, 2014. godine, i elektronski je podnet putem EFS-Web.

POZADINA

Oblast tehnike

[0003] Ovo otkrivanje odnosi se na fuzione proteine koji sadrže označenu kasetu i, određenije, na označene himerne efektorske molekule (Ključ-ChEMs) i označene himerne antigen receptorske molekule (T-ChARMs), i rekombinantne ćelije domaćine koje proizvode ovakve fuzione proteine, pri čemu te rekombinantne ćelije domaćini mogu biti identifikovane, izolovane, sortirane, indukovane da proliferuju, praćene, eliminisane, i/ili primenjene kao terapeutik (npr., u adoptivnoj imunoterapiji).

Opis povezanog stanja tehnike

[0004] Na T ćelijama zasnovane imunoterapije počinju da se razvijaju kada su otkrivene tumor-reaktivne T ćelije među populacijom tumor-infiltrirajućih limfocita (TILs) (Clark et al., Cancer Res.29:705, 1969). Jedna strategija, poznata kao adoptivni T ćelijski transfer, uključuje izolovanje tumor infiltrirajućih limfocita prethodno određenih za tumorsku reaktivnost, širenje klonova tumor-reaktivnih T ćelija indukovanih putem anti-CD3 i anti-CD28 antitela u prisustvu IL-2, i konačno uvođenje putem infuzije proširene ćelijske populacije nazad u pacijenta koji nosi tumor (zajedno sa hemoterapijom i ponovljenim davanjem IL-2) (Dudley et al., Science 298:850, 2002). Ovaj oblik adoptivne T ćelijske terapije sa tumor infiltrirajućim limfocitima je tehnički glomazan i dovodi do potpune remisije samo kod malog dela pacijenata sa melanomom, a retko je efektivan kod drugih kancera (Besser et al., Clin. Cancer Res. 16:2646, 2010).

[0005] Izolovanje klonova tumor-reaktivnih T ćelija dovodi do razvijanja još jednog imunoterapeutskog pristupa - generisanje rekombinantnih T ćelijskih receptora (TCRs) specifičnih za određene antigene, koji se uvode u T ćelije primenom vektorskog sistema isporuke radi dodeljivanja specifičnosti za tumorpovezan peptid uveden putem MHC molekula koji je eksprimiran na ćeliji tumora. Sličan pristup uvodi sintetički receptor, nazvan himerni antigen receptor (CAR), koji sadrži antigen-vezujući domen, koji, npr., u kontekstu anti-tumor terapije može da se veže za tumor-specifičan ili povezan antigen, povezan sa jednom ili više intracelularnih komponenti koje obuhvataju efektorske domene, kao što je TCR i/ili kostimulativni signalizirajući domeni. Za razliku od TILs, osnovna procedura za TCR ili CAR T ćelijku imunoterapiju je da genetski modifikuje humane T ćelije putem transgena koji kodira tumor ciljajuću grupu, ex vivo širenje rekombinantnih T ćelija, i transfuzijom uvede proširene rekombinantne T ćelije nazad u pacijente. U slučaju adoptivne terapije sa CAR T ćelijama, kompozicija sintetičke CAR strukture, kao i kvalitet i čistoća genetski konstruisanih T ćelija, odrediće terapeutsku efikasnost protiv tumora in vivo. Međutim, postoje izazovi u vidu proširivanja i odabira rekombinantnih ćelijskih populacija, kao i da se obezbedi da su ćelije efektivne i dovoljno specifične in vivo kako bi se izbegli ozbiljni autoimuni sporedni efekti.

[0006] Trenutno, ostaje potreba u oblasti imunoterapija za kompozicijama i postupcima za identifikovanje, efikasno izolovanje/sortiranje, selektivno proširivanje, in vivo praćenje i kontrolisanje ili eliminisanje konstruisanih ćelija, kao što su konstruisane imune ćelije (npr., T ćelije).

[0007] Bowdish i Gordon, 2009. Imunol Rev.227(1):19-31 opisuje ponovnu klasifikaciju klase A receptora skupljača na bazi nedavnih otkrića.

[0008] Jensen i Riddell, 2014. Imunol Rev.257(1):127-44 predstavlja članak koji razmatra ispitivačke teme kojima je fokus na dizajniranju i implementaciji adoptivne T-ćelijske terapije sa CAR-modifikovanim T-ćelijama.

[0009] WO 2008/045437 A2 opisuje nukleinske kiseline, vektore i ćelije povezane sa proizvodnjom himernog membranskog proteina, kao i postupke za tretiranje tumora koji nose EGFRvIII, mutantni receptor epidermalnog faktora rasta.

[0010] Darcy et al., 1998. Eur J Immunol.28(5):1663-72 opisuje ekspresiju himernog receptora koji se sastoji od jednolančanih varijabilnih domena anti-karcinom embrionskog antigen mAb povezanog sa Fcgama receptorskim lancem putem CD8 zgloba u MD45 mišjoj citotoksičnoj T limfocitnoj ćelijskoj liniji hibridoma.

[0011] Dotti et al., 2014. Imunol Rev.257(1):107-26 je članak koji opisuje osnovne dizajne za CARs, kako se biraju antigenske mete i prvobitno kliničko iskustvo sa CAR-T ćelijama.

[0012] WO 2013/123061 A1 usmeren je na bispecifičan himerni antigen receptor, koji obuhvata: (a) najmanje dva antigen-specifična ciljajuća regiona; (b) ekstracelularni spejser domen; (c) transmembranski domen; (d) najmanje jedan kostimulativni domen; i (e) intracelularni signalizirajući domen, pri čemu svaki antigen-specifičan ciljajući region obuhvata antigen-specifičan jednolančani Fv fragment, i vezuje se za različiti antigen, i pri čemu je bispecifičan himerni antigen receptor koeksprimiran sa terapeutskom kontrolom.

[0013] WO 2011/041093 A1 opisuje CARs koji obuhvataju antigen vezujući domen KDR-1121 ili DC 101 antitela, ekstracelularni zglobni domen, T ćelijski receptor transmembranski domen, i intracelularni domenski T ćelijski receptor signalizirajući domen.

[0014] WO 2012/127464 A2 opisuje himerne proteine koji obuhvataju konstitutivno aktivan TLR4, konstitutivno aktivan član T ćelijskog kostimulativnog receptora familije receptora faktora nekroze tumora ili za membranu vezan citokin.

[0015] WO 2013/044225 A1 opisuje rekombinantne T ćelije koje eksprimiraju univerzalni imuni receptor koji obuhvata ekstracelularni obeleživački vezujući domen, transmembranski domen, i citoplazmatski domen.

[0016] Liu et al., 2014. Molecular therapy.22: S164 (https://doi.org/10.1016/S1525-0016(16)35441-7) opisuje višestruko-funkcionalan CAR koji uključuje jednu ili više 8 aminokiselinskih StrepOznaka II (ST II) sekvenci u ekstracelularnom delu CAR (Oznaka/CAR), i pokazuje da ove sekvence omogućavaju in vitro odabir, aktivaciju/širenje, i in vivo praćenje CAR+ T ćelija primenom StrepTactin ili anti-STII mAb obeleženih fluorofora ili perlica.

[0017] U Hudeck et al., 2015. Cancer Imunol Res.3(2):125-35, autori analiziraju uticaj dužine i kompozicija IgG-izvedenih ekstracelularnih spejser domena na funkciju CARs.

KRATAK PREGLED

[0018] Ovaj pronalazak obezbeđuje jednolančani fuzioni protein, koji obuhvata hidrofobni deo raspoređen između ekstracelularne komponente i intracelularne komponente, pri čemu ekstracelularna komponenta obuhvata veći broj označenih kaseta i konektorski region koji obuhvata zglob, pri čemu intracelularna komponenta obuhvata efektorski domen, i pri čemu svaka od većeg broja označenih kaseta obuhvata Strep oznaku, pri čemu svaka Strep oznaka ima streptavidin, streptactin, ili oba kao srodni vezujući partner.

[0019] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje molekul nukleinske kiseline koji kodira fuzioni protein u skladu sa ovim pronalaskom.

[0020] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje vektor koji obuhvata molekule nukleinske kiseline ovog pronalaska.

[0021] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje ćeliju domaćina koja obuhvata molekul nukleinske kiseline koji kodira fuzioni protein u skladu sa ovim pronalaskom. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata ćeliju domaćina ovog pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač, ili ekscipijens.

[0022] Ovaj pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina ovog pronalaska za upotrebu u tretiranju neke bolesti ili stanja. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje ćeliju domaćina ovog pronalaska za upotrebu u postupku za iscrpljivanje ćelija radi tretiranja kancera ili infektivne bolesti, koji obuhvata dovođenje u kontakt ćelije koja obuhvata molekul nukleinske kiseline ovog pronalaska ili fuzioni protein ovog pronalaska sa vezujućim domenom specifičnim za označenu kasetu, pri čemu vezivanje vezujućeg domena specifičnog za označenu kasetu dovodi do ćelijske smrti ćelija domaćina koje eksprimiraju fuzioni protein.

[0023] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje in vitro postupak za aktiviranje ćelije, koji obuhvata dovođenje u kontakt ćelije koja obuhvata fuzioni protein u skladu sa ovim pronalaskom i/ili molekul nukleinske kiseline ovog pronalaska sa vezujućim domenom specifičnim za jednu ili više od jedne ili više označenih kaseta.

[0024] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje in vitro postupak za promovisanje ćelijske proliferacije, koji obuhvata dovođenje u kontakt neprirodne ćelije koja obuhvata fuzioni protein ovog pronalaska i/ili molekul nukleinske kiseline ovog pronalaska sa vezujućim domenom specifičnim za jednu ili više od jedne ili više označenih kaseta i faktorom rasta citokinom tokom vremena dovoljnog da se omogući rast ćelija.

[0025] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje in vitro postupak za identifikovanje ćelije, pri čemu taj postupak obuhvata: dovođenje u kontakt uzorka koji obuhvata ćeliju koja obuhvata fuzioni protein ovog pronalaska i/ili molekul nukleinske kiseline ovog pronalaska sa vezujućim domenom specifičnim za jednu ili više od jedne ili više označenih kaseta, pri čemu vezujući domen specifičan za označenu kasetu obuhvata detektabilnu grupu, i detektovanje prisustva te ćelije u uzorku.

[0026] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje in vitro postupak za sortiranje i odabir ćelije ili populacije ćelija, pri čemu taj postupak obuhvata: dovođenje u kontakt uzorka koji obuhvata T ćeliju koja obuhvata fuzioni protein ovog pronalaska i/ili molekul nukleinske kiseline ovog pronalaska, sa vezujućim domenom specifičnim za jednu ili više od jedne ili više označenih kaseta, i odabir ili sortiranje od drugih ćelija ćelije(a) koje su specifično vezane vezujućim domenom, čime se bira ili sortira od drugih ćelija ta ćelija ili populacija ćelija.

[0027] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje in vitro postupak za obogaćivanje ili izolovanje ćelije ili njene populacije, pri čemu taj postupak obuhvata dovođenje u kontakt uzorka koji obuhvata ćeliju koja obuhvata molekul nukleinske kiseline ovog pronalaska i/ili fuzioni protein ovog pronalaska sa vezujućim domenom specifičnim za jednu ili više od jedne ili više označenih kaseta i obogaćivanje ili izolovanje te ćelije od drugih ćelija koje ne eksprimiraju fuzioni protein ili receptor u uzorku.

[0028] Dalji aspekti ovog pronalaska obezbeđeni su u patentnim zahtevima.

[0029] U određenim aspektima, ovo otkrivanje usmereno je na jednolančani fuzioni protein, koji obuhvata ekstracelularnu komponentu i intracelularnu komponentu povezanu hidrofobnim delom, pri čemu ekstracelularna komponenta obuhvata vezujući domen koji specifično vezuje metu, označenu kasetu, i konektorski region koji obuhvata zglob, i pri čemu intracelularna komponenta obuhvata efektorski domen.

[0030] U nekim aspektima, ovo otkrivanje usmereno je na himerni antigen receptorski molekul, koji obuhvata fuzioni protein koji ima jednu ili više ekstracelularnih označenih kaseta (a) locirane na aminoterminusu ekstracelularnog vezujućeg domena, (b) ugrađene u ekstracelularni vezujući domen, ili (c) raspoređene između i koje spajaju ekstracelularni vezujući domen i intracelularnu komponentu koja obuhvata efektorski domen.

[0031] U daljim aspektima, ovo otkrivanje usmereno je na jednolančani fuzioni protein, koji obuhvata hidrofobni deo raspoređen između i koji spaja ekstracelularnu komponentu i intracelularnu komponentu, pri čemu ekstracelularna komponenta obuhvata označenu kasetu i konektorski region koji obuhvata zglob, i pri čemu intracelularna komponenta obuhvata efektorski domen.

[0032] U još daljim aspektima, ovo otkrivanje usmereno je na postupak za aktiviranje ćelije, kao što je T ćelija (npr., neprirodna T ćelija), koji obuhvata dovođenje u kontakt ćelije sa vezujućim domenom specifičnim za označenu kasetu, pri čemu ta ćelija obuhvata molekul nukleinske kiseline koji kodira fuzioni protein u skladu sa ovim otkrivanjem, a vezujući domen specifičan za označenu kasetu je vezan za čvrstu površinu.

[0033] U još daljim aspektima, ovo otkrivanje usmereno je na postupak za promovisanje ćelijske proliferacije, kao što je T ćelijska proliferacija, koji obuhvata dovođenje u kontakt ćelije (npr., neprirodna T ćelija) sa vezujućim domenom specifičnim za označenu kasetu i faktorom rasta citokinom tokom vremena dovoljnog da se omogući rast ćelija, pri čemu ta ćelija obuhvata molekul nukleinske kiseline koji kodira fuzioni protein u skladu sa ovim otkrivanjem, a vezujući domen specifičan za označenu kasetu je vezan za čvrstu površinu.

[0034] U određenim drugim aspektima, ovo otkrivanje usmereno je na postupak za identifikovanje ćelije, kao što je T ćelija, koji obuhvata dovođenje u kontakt uzorka koji obuhvata ćeliju, kao što je T ćelija (npr., neprirodna T ćelija) sa vezujućim domenom specifičnim za označenu kasetu, pri čemu ta ćelija obuhvata molekul nukleinske kiseline koji kodira fuzioni protein u skladu sa ovim otkrivanjem i vezujući domen specifičan za označenu kasetu koji obuhvata detektabilnu grupu, i detektovanje prisustva ćelije koje eksprimiraju fuzioni protein u uzorku.

[0035] U određenim daljim aspektima, ovo otkrivanje usmereno je na postupak za sortiranje T ćelije, koji obuhvata dovođenje u kontakt uzorka koji obuhvata neprirodnu T ćeliju sa vezujućim domenom specifičnim za označenu kasetu, pri čemu ta neprirodna T ćelija obuhvata molekul nukleinske kiseline koji kodira fuzioni protein u skladu sa ovim otkrivanjem, i vezujući domen specifičan za označenu kasetu koji obuhvata detektabilnu grupu, i sortiranje te neprirodne T ćelije koja eksprimira fuzioni protein od drugih ćelija koje ne eksprimiraju fuzioni protein u uzorku.

[0036] U određenim aspektima, ovo otkrivanje usmereno je na postupak za obogaćivanje ili izolovanje T ćelije, koji obuhvata dovođenje u kontakt uzorka koji obuhvata neprirodnu T ćeliju sa vezujućim domenom specifičnim za označenu kasetu, pri čemu ta neprirodna T ćelija obuhvata molekul nukleinske kiseline koji kodira fuzioni protein u skladu sa ovim otkrivanjem i vezujući domen specifičan za označenu kasetu koji obuhvata detektabilnu grupu, i obogaćivanje ili izolovanje te neprirodne T ćelije koja eksprimira fuzioni protein od drugih ćelija koje ne eksprimiraju fuzioni protein u uzorku.

[0037] U daljim aspektima, ovo otkrivanje usmereno je na postupak za iscrpljivanje određenih T ćelija, koji obuhvata dovođenje u kontakt neprirodne T ćelije sa vezujućim domenom specifičnim za označenu kasetu, pri čemu ta neprirodna T ćelija obuhvata molekul nukleinske kiseline koji kodira fuzioni protein u skladu sa ovim otkrivanjem i pri čemu vezivanje vezujućeg domena specifičnog za označenu kasetu dovodi do ćelijske smrti T ćelija koje eksprimiraju fuzioni protein.

[0038] Ovi i drugi aspekti ovog otkrivanja postaće jasni nakon pozivanja na prateći detaljan opis i priložene crteže.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0039]

FIG.1A - 1H prikazuju ilustracije raznih jednolančanih himernih efektorskih molekula koji sadrže jedan ili više afinitetno označenih kaseta (A-D, ovde označeni kao Ključ-ChEMs), i opciono koji sadrže jedan ili više specifičnih vezujućih domena (E-G, ovde označeni kao T-ChARMs). Jednolančani ChEMs i ChARMs sadrže intracelularni domen. Označene kasete mogu biti bilo koja vrsta afinitetne oznake, kao što je Strep oznaka® II (SEQ ID NO.:1), Myc oznaka (SEQ ID NO.:7), V5 oznaka (SEQ ID NO.:8), Flag® oznaka (SEQ ID NO.:3), His oznaka, ili drugi peptidi ili molekuli, koji se prepoznaju sa ne-endogenim srodnim vezujućim partnerom (npr., receptor, protein, antitelo). Kao što je poznato, Ključ-ChEM može da sadrži (A, B) jednu označenu kasetu, (C) dve označene kasete (Ključ-ChEM<2>), (D) tri označene kasete (Ključ-ChEM<3>), ili više. Pored toga, himerni molekuli mogu da imaju više efektorskih domena (npr., molekuli od A i C-G imaju dva, dok molekul prikazani na B imaju tri efektorska domena), a označene kasete mogu biti smeštene u raznim različitim oblastima Ključ-ChEM ili T-ChARM molekula. U ovim konkretnim primerima, T-ChARMs imaju jednu označenu kasetu lociranu između specifičnog vezujućeg domena i efektorskog domena (E), na udaljenom kraju (npr., amino-terminusu) specifičnog vezujućeg domena (F), integrisan u specifičan vezujući domen (G) (npr., lociran u fleksibilnom vezniku između VH i VL lanaca od scFv), i da imaju dve različite oznake – jedna za C-terminal vezujućeg domena i jedna za N-terminal vezujućeg domena (H). T-ChARMs mogu takođe da imaju dve, tri ili više označenih kaseta kako je prikazano za Ključ-ChEMs. Kao što je očigledno u ovim ilustracijama, označena kaseta može biti povezana sa još jednom Ključ-ChEM ili T-ChARM komponentom ili još jednom oznakom putem veznog modula (npr., fleksibilan (GlyxSer)nvezni modul). Dužina veznika može biti ukrojena da bude duža ili kraća da bi se postigla najbolja interakcija specifičnog vezujućeg domena sa ciljanim veznikom ili antigenom, i da bi se postigla najbolja interakcija između ćelije koja eksprimira ChEM ili T-ChARM i ciljane ćelije.

FIG.2A - 2D pokazuju citolitičku aktivnost humanih efektorskih T ćelija koje eksprimiraju razne vrste anti-CD 19 T-ChARMs i konvencionalne anti-C19 CARs (kojima nedostaje označena kaseta i sa kratkim, srednjim, i dugim spejser domenima) protiv ćelija K562 leukemije transfektovane da eksprimiraju CD19 ili ROR1 (kontrola), CD19<+>/ROR1<+>Raji limfom ćelije, i EBV transformisane B ćelije koje eksprimiraju za membranu vezano anti-CD3 mAb jednolančano antitelo (OKT3 scFv) radi aktiviranja svih efektorskih T ćelija.

FIG.3A - 3F pokazuju rezultate ispitivanja složenog citokina (Luminex®) supernatanata dobijenih 24 sata pošto su T ćelije koje eksprimiraju razne anti-CD 19 T-ChARMs (A-C) i konvencionalne anti-C19 CARs (D-F) zajednički uzgajane sa K562 ćelijama koje eksprimiraju ili CD19 (A i D) ili ROR1 (negativna kontrola; B i E), i sa PMA/jonomicinom (pozitivna kontrola; C i F).

FIG.4A i 4B pokazuju rezultate ispitivanja složenog citokina (Luminex®) supernatanata dobijenih 24 sata pošto su T ćelije koje eksprimiraju razne anti-CD 19 T-ChARMs (A) i CD19 CARs (B) zajednički uzgajane sa CD19+ Raji ćelijama.

FIG.5 pokazuje rezultate ispitivanja T ćelijske proliferacije, pri čemu razblaženje karboksifluoroscein boje ukazuje da su anti-CD 19 CD8<+>T ćelije koje eksprimiraju T-ChARMs (koji sadrži jednu, dve ili tri označene kasete) ili konvencionalni CAR (CD19 (Dug)) proliferovale u odgovoru na tumor ćelije koje eksprimiraju CD19 (plavo), dok nisu proliferovale u prisustvu tumor ćelija koja eksprimira ROR1 (crveno).

FIG.6A - 6E pokazuju da anti-CD 19 humane T ćelije koje eksprimiraju ili T-ChARM (koji sadrži jednu, dve ili tri označene kasete) ili konvencionalni CARs (koji sadrže kratke ili srednje konektorske regione) mogu da iskorene utvrđene Raji tumore kod NSG miševa. U ovim eksperimentima, Raji ćelije su transfektovane da eksprimiraju gene luciferaze svica, a rast tumora meren je injektovanjem u miševe radi luciferinskog i bioluminescencionog slikanja.

FIG.7 pokazuje da anti-CD 19 CAR i T-ChARM eksprimirajuće humane T ćelije mogu da se održe u krvi posle adoptivnog transfera u NSG miševe koji su inokulisani sa Raji limfomom. Humane T ćelije izdvajaju se bojenjem monoklonalnim antitelima specifičnim za humane CD8 i CD45 molekule ćelijske površine.

FIG.8A - 8D pokazuju da T-ChARM eksprimirajuće T ćelije mogu biti identifikovane protočnom citometrijom primenom za oznaku specifičnog vezujućeg agensa. U primerima, prečišćene T-ChARM T ćelije detektovane su ekspresionim markerom tEGFR (A), detektovane anti-Strep oznakom II (STII) (B), ili putem StrepTactin APC (C, D).

FIG.9 pokazuje da T-ChARM eksprimirajuće T ćelije mogu biti sortirane protočnom citometrijom od niske čistoće (15% u primeru) do visoke ćistoće (99% u primeru) sa za oznaku specifičnim vezujućim agensom povezanim sa fluorohromom. U primeru, oznaka je StrepOznaka II, a za oznaku specifičan vezujući agens je anti STII mAb povezan sa fluorohromom.

FIG.10 pokazuje direktno obogaćivanje T-ChARM eksprimirajućih T ćelija (koje sadrže tri Strep-oznaka označene kasete) primenom Strep-Tactin® perlica raznih veličina. Paneli na levoj strani pokazuju bojenje obogaćenog dela, a paneli na desnoj strani pokazuju efluent (neobogaćen deo).

FIG.11 pokazuje svetlosne fotomikrografe za T-ChARM (koji sadrži jednu, dve ili tri označene kasete) ili konvencionalni anti-CD 19 CAR koji eksprimira T ćelije (CD19 Dug) koje su zajednički uzgajane sa perlicama povezanim sa vezujućim veznikom (Strep-Tactin®) za označenu sekvencu. Fotomikrografi pokazuju selektivno klasterovanje i proliferaciju T-ChARM T ćelija.

FIG.12 pokazuje krivu rasta za T-ChARM eksprimirajuće T ćelije (koje sadrže jednu, dve ili tri označene kasete) tokom 10 dana uzgajanja sa Strep-Tactin® mikroperlicama.

FIG.13A i 13B pokazuju aktivaciju T-ChARM eksprimirajućih T ćelija kako je određeno povišenom regulacijom CD25 i CD69 posle vezivanja označene kasete ili putem Streptactin mikroperlica, nanoperlica ili anti-StrepOznake II mAb samo ili u kombinaciji sa anti-CD28 mAb. Podaci su pokazani posle (A) 24 sata i (B) 48 sati stimulacije.

FIG.14A i 14B pokazuju selektivno širenje T-ChARM eksprimirajućih T ćelija. Nesortirane T-ChARM<1>/4-1BB i T-ChARM<1>/CD28 transduktovane T ćelije (CD8+ i CD4+) uzgajane sa anti-Strep oznakom/anti-CD28-MB tokom 9 dana. Procenat T-ChARM ćelija određen je putem (A) protočne detekcije ekspresije Strep oznake na T ćelijama pre i posle uzgajanja. Kulture ćelije tretirane sa anti-CD3/anti-CD28-MB samim upotrebljene su kao kontrola. (B) FACS sortirane EGFR+ anti-CD 19 ChARM T ćelije posle širenja CD19+ obesmrtljene B ćelijske linije (TM-LCL). Obojene sa anti-EGFR (gornji red) i anti-StrepOznaka II (donji red) antitelima, respektivno.

FIG.15 pokazuje proliferaciju anti-CD 19 T-ChARM eksprimirajućih T ćelija (koje sadrže jednu, dve ili tri označene kasete) kako je izmereno putem nivoa Ki-67 proteina 7 dana posle stimulacije sa varirajućim količinama Strep-Tactin® perlica. U donjim panelima, pokazana je ekspresija Ki-67 u T-ChARM eksprimirajućim T ćelijama posle stimulacije kroz anti-CD 19 vezujuću komponentu T-ChARM sa CD19<+>EBV-LCL (TM-LCL).

FIG.16 pokazuje krivu rasta T-ChARM eksprimirajućih T ćelija uzgajanih na različitim vrstama Streptactin, anti-StrepOznaka II ili antiCD3/anti-CD28 konjugovanim perlicama.

FIG.17A i 17B pokazuju selektivno širenje anti-CD 19 T-ChARM eksprimirajućih T ćelija na Strep-Tactin perlicama (A). Anti-CD 19 T-ChARM eksprimirajuće T ćelije mogu naknadno biti proširene stimulacijom kroz anti-CD 19 himerni receptor sa CD19<+>LCL (B).

FIG.18A - 18D pokazuju da T ćelije mogu biti transduktovane sa dva tipa T-ChARM (efektorski domen 4-1BB/CD3ζ (A i B), ili CD28/CD3ζ (C i D)) posle uzgajanja u prisustvu IL-7 i IL-15 bez prethodne aktivacije sa anti-CD3/anti-CD28 perlicama. Transduktovane T-ChARM eksprimirajuće T ćelije mogu biti selektivno proširene i obogaćene dodavanjem anti-Strep oznaka II perlica u kulture (B i D) (čak i u odsustvu stimulacije anti-CD3/anti-CD28 perlicama), ali nisu proširene kada se anti-Strep oznaka II perlice ne dodaju kulturama (A i C).

FIG.19A - 19D pokazuju da anti-CD 19 T-ChARM<1>T ćelije koje su proširene stimulacijom sa Strep-Tactin® mikroperlicama zadržavaju uporedivu ili superiornu sposobnost da proizvedu citokine (GM-CSF, interferon-γ, IL-2, i TNF-α) nakon ponovljene stimulacija sa CD19 pozitivnim tumor ćelijama (A.

K562/CD19; B- Raji) kao kontrolne T ćelije koje eksprimiraju anti-CD 19 CAR(kratak) (CD19-S). K562 ćelije (C) i PMA-jonomicin (D) služile su kao negativne i pozitivne kontrole, respektivno.

FIG.20 pokazuje da T-ChARM eksprimirajuće T ćelije mogu biti indukovane da obrazuju klastere i da proliferuju sa anti-Strep oznaka perlicama samim ili sa perlicama koje sadrže anti-Strep oznaku i anti-CD27 antitela ili koje sadrže anti-Strep oznaku i anti-CD28 antitela.

FIG.21 pokazuje analizu protočne citometrije (MFI) za FACS sortirane EGFR+ anti-CD 19 ChARM T ćelije posle širenja CD19+ obesmrtljene B ćelijske linije (TM-LCL). Obojene sa anti-EGFR (gornji red) i anti-StrepOznaka II (donji red) antitelima, respektivno.

FIG.22 pokazuje rezultate ispitivanje oslobađanja hroma radi ispitivanja citolitičkog efekta raznih anti-CD19 ChARM transduktovanih T ćelija (efektori) protiv K562 ćelija transduktovanih sa CD19 (K562/CD19), ili ROR1 (K562/ROR1) ili CD19+ Raji tumor ćelijama (mete). E/T = Efektor/meta odnos. FIG.23A i 23B pokazuju citolitičku aktivnost T ćelija koje eksprimiraju (A) anti-CD19 kratak, T-ChARM<1>, T-ChARM<2>, T-ChARM<3>sa CD28/CD3ζ efektorskim domenom, i (B) koje imaju anti-RORl R12 kratak i T-ChARM<1>sa 41BB/CD3ζ efektorskim domenom. Ćelije su ispitane na citolitičku aktivnost protiv K562 ćelija transduktovanih sa CD19 (K562/CD19), ili ROR1 (K562/ROR1) ili CD19+ Raji tumor ćelijama (mete). E/T = Efektor/meta odnos.

FIG.24 pokazuje IL2/IFN-γ proizvodnju raznih anti-CD 19 T-ChARM transduktovanih T ćelija (Efektora) protiv K562 ćelija transduktovanih sa CD19 (K562/CD19), ili ROR1 (K562/ROR1) ili CD19+ Raji tumor ćelijama (Meta).

FIG.25A-25C pokazuju luminex-ove složene analize citokina triplikata ko-kulture supernatanata ChARM transduktovanih T ćelija sa CD19+ Raji ćelijama (1:4 odnos) posle 24h. Ovi podaci su izvedeni iz tri nezavisna eksperimenta primenom T ćelija iz različitih donora, i svi podaci su prikazani kao proseci ± SD. Student-ov t test je izveden. *P<0.01. (A) Poređenje proizvodnje citokina od strane CD8+ T ćelija koje eksprimiraju anti-CD19 CAR sa dugim (CH3-CH2-zglob), srednjim (CH3-zglob), i kratkim (samo zglob) spejserima. Podaci složenog citokina iz 3 nezavisna eksperimenta su normalizovani (oslobađanje citokina od strane CD19-CAR 'dug/41BB' = 1); (B) poređenje proizvodnje citokina od strane CD8+ T ćelija koje eksprimiraju anti-CD19 T-ChARM<1>(1ST), T-ChARM<2>(2ST), T-ChARM<3>(3ST) sa 4-1BB/CD3ζ efektorskim domenom u poređenju sa anti-CD19 CAR-Kratak sa 4-1BB/CD3ζ efektorskim domenom. Podaci složenog citokina iz 3 nezavisna eksperimenta su normalizovani (oslobađanje citokina od strane ;;;1 ;CD19-CAR-Kratak: Hi/4-1BB = 1); i (C) poređenje proizvodnje citokina od strane CD8+ T ćelija koje eksprimiraju anti-CD19 T-ChARM<1>(1ST), T-ChARM<2>(2ST), T-ChARM<3>(3ST) sa CD28/CD3ζ efektorskim domenom u poređenju sa anti-CD19 CAR-Kratak sa CD28/CD3ζ efektorskim domenom. Podaci složenog citokina iz 3 nezavisna eksperimenta su normalizovani (oslobađanje citokina od strane CD19-CAR-Kratak: Hi/CD28 = 1). ;FIG.26 pokazuje CFSE razblaženje boje koja se koristi za merenje proliferacije anti-CD 194-1BB ili CD28 ChARM eksprimirajućih T ćelija 5 dana posle stimulacije sa CD19+ Raji tumor ćelijama (puna siva) ili samo podlogom (sive linije) bez dodavanja egzogenih citokina. ;FIG.27A-27D pokazuju FACS sortirane EGFR+ anti-CD 19 ChARM (A) CD8+ T ćelije (CD19-Hi/4-1BB, ST-CD19/4-1BB, CD19(VH-ST-VL)/4-1BB; CD19-1ST/4-1BB, CD19-2ST/4-1BB, CD19-3ST/4-1BB CAR); (B) CD4+T ćelije (CD19-Hi/4-1BB, ST-CD19/4-1BB, CD19(VH-ST-VL)/4-1BB; CD19-1ST/4-1BB, CD19-2ST/4-1BB, CD19-3ST/4-1BB CAR); (C) anti-CD19 ChARM CD8+ T ćelije (CD19-Hi/CD28, CD19-1ST/CD28, CD19-2ST/CD28, CD19-3ST/CD28 CAR); i (D) anti-RORl R12 ChARM T ćelije (R12-Hi/4-1BB, R12-1ST/4-1BB), koje su stimulisane StrepTactin obloženim mikroperlicama (StrepTactin-MB), anti-StrepOznaka antitelo ili anti-StrepOznaka/anti-CD28 antitelo obloženim mikroperlicama (αStrep oznaka-MB i αStrep oznaka/CD28-MB) u kulturi sa IL2. Posle 48 sati stimulacije, ćelije su sakupljene, a marker CD25 T ćelijske aktivacije određen je protočnom citometrijom. Netretirane ćelije (podloga) upotrebljene su kao kontrole. ;FIG.28 pokazuje reprezentativne mikroskopske slike FACS sortiranih EGFR+ anti-CD194-1BB ChARM T ćelija (CD8+) koje su stimulisane sa StrepTactin-MB, αStrep oznaka-MB i αStrep oznaka/CD28-MB u prisustvu IL2. Netretirane ćelije (podloga) upotrebljene su kao kontrola. Mikroskopske slike zabeležene su posle 48h stimulacije. ;FIG.29A i 29B pokazuju krive rasta za ChARM T ćelije. FACS sortirane EGFR+ anti-CD19 ChARM (A) CD8+ i (B) CD4+ T ćelije uzgajane su u CTL podlozi sa StrepTactin-MB, αStrep oznaka-MB i αStrep oznaka/CD28-MB u prisustvu IL2. ;FIG.30A-30F pokazuju anti-CD3/anti-CD28 mikroperlicama-stimulisane CD8+ T ćelije transduktovane sa anti-CD19-1ST/4-1BB ili CD19-1ST/CD28 CAR; posle EGFR bojenja i sortiranja, čiste CAR T ćelije proširene su sa TM-LCL ili αStrep oznaka-MB ili αStrep oznaka/CD28-MB tokom 8 dana. In vitro testovi funkcionalnosti izvedeni su radi evaluacije CAR T ćelijske funkcije pre (αCD3/CD28-MB) ili posle širenje (TM-LCL ili αStrep oznaka-MB ili αStrep oznaka/CD28-MB). (A) ispitivanja oslobađanja hroma izvedena su radi ispitivanja citolitičkog efekta ChARM T ćelija protiv ciljanih ćelija (K562/CD19) ili kontrolnih ćelija (K562/ROR1). E/T: Efektor/meta odnos; (B) proizvodnja citokina koja je izmerena putem ELISA radi evaluacije IFN-γ i IL2 u supernatantima dobijenim posle 24 sata iz ko-kultura za 5 × 10<4>anti-CD 19 ChARM T ćelije sa ciljanim ćelijama (K562/CD19), ili kontrolnim ćelijama (K562/ROR1). PMA/Jonomicin stimulisane T ćelije upotrebljene su kao pozitivna kontrola. (n=3; * P<0.05); (C) CFSE proliferaciono ispitivanje ChARM T ćelija 5 dana posle stimulacije sa ciljanim ćelijama (K562/CD19) (puna siva), ili kontrolnim ćelijama (K562/ROR1) (sive linije) bez dodavanja egzogenih citokina. Za analizu, bunaričići u triplikatu su pulovani i proliferacija živih (PI-), EGFR-pozitivnih CAR T ćelija je analizirana.; (D) protočne detekcije CD45RO, CD62L, CD28 i CD27 ekspresije na ChARM T ćelijama pre (αCD3/CD28-MB) ili posle širenje (TM-LCL ili αStrep oznaka-MB ili αStrep oznaka/CD28-MB); (E) kohorte miševa su inukolisane sa Raji-ffluc injektovanjem u repnu venu na dan 1, a zatim su 5 x 10<6>CD8+ ChARM T ćelije (CD19-Hi/4-1BB i CD19-1ST/4-1BB), koje su proširene na ili CD19+ B LCL ili αStrep oznaka/CD28-MB, date 7 dana posle usađivanja tumora. Napredak tumora i distribucija procenjena je serijom bioluminescencionog slikanja posle injektovanja supstrata luciferina; i (F) istrajnost anti-CD 19 ChARM T ćelija posle adoptivnog transfera u NSG/Raji miševe. Protočna citometrična analiza ChARM T ćelija u perifernoj krvi (krvarenje oka) kohorte miševa tretiranih raznim ChARM transduktovanim T ćelijama u različitim vremenskim tačkama posle uvođenja T ćelija infuzijom. Frekvencija CD8+ tEGFR+ i ChARM+ T ćelija upotrebljena je kao procenat živih ćelija periferne krvi.

FIG.31 pokazuje CFSE razblaženje boje koje se koristi za merenje proliferacije anti-CD 19 CAR-Kratak, T-ChARM<1>, T-ChARM<3>, i Myc-ChARM sa 4-1BB T ćelijama 5 dana posle stimulacije sa CD19 (K562/CD19), ROR1 (K562/ROR1), samo podlogom, ili CD19+ Raji tumor ćelijama bez dodavanja egzogenih citokina.

FIG.32 pokazuje ispitivanja oslobađanja hroma izvedena radi ispitivanja citolitičkog efekta anti-CD19 CAR-Kratak, T-ChARM<1>, T-ChARM<3>, i Myc-ChARM sa 4-1BB T ćelijama protiv ciljanih ćelija (K562/CD19) ili kontrolnih ćelija (K562/ROR1). E/T: Efektor/meta odnos.

DETALJAN OPIS

[0040] Predmetno otkrivanje obezbeđuje kompozicije i postupke za generisanje razni fuzionih proteina koji sadrže jednu ili više afinitetnih označenih kaseta, koji su himerni efektorski molekuli (ChEMs) koji funkcionišu kao "ključ" za pristup i upravljanje (tj., uključivanje ili isključivanje ili modulisanje) bilo kojim od različitih bioloških puteva. Ovi himerni efektorski molekuli ovde su označeni kao Ključ-ChEMs.

Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju takve fuzione proteine mogu se primeniti za generisanje modifikovanih ćelija domaćina u kojima se specifični celularni odgovori, kao što je proliferacija ili ubijanje, izazivaju, kontrolišu, ili oba. Na primer, određene vrste progenitorskih ćelija mogu se dobiti od subjekta, modifikovati da eksprimiraju fuzioni protein koji obuhvata označenu kasetu, indukovati da proliferuju, a zatim infuzijom vratiti nazad u subjekta za poseban terapeutski efekat (npr., da rekonstituišu iscrpljen imuni sistem subjekta). Alternativno, takvi fuzioni proteini koji sadrže oznaku mogu dalje da imaju vezujući domen specifičan za određenu metu (npr., tumorski antigen). U takvim primerima, ovi fuzioni proteini su označeni himernim antigen receptorskim molekulima (T-ChARMs) koji se mogu uvesti u određenu ćeliju, a zatim primeniti da se identifikuje, sortira, aktivira, ili proširi ta modifikovana ćelija. Takvi označeni himerni molekuli mogu biti transduktovani u i eksprimirani u ćelijama, kao što su imune ćelije (npr. T ćelije).

[0041] U određenim aspektima, ovo otkrivanje dalje obezbeđuje postupke za selektivno aktiviranje, promovisanje proliferacije, identifikovanje, sortiranje, obogaćivanje, izolovanje, praćenje, ili iscrpljivanje ćelija (npr., T ćelija) koje obuhvataju molekul nukleinske kiseline koji kodira fuzioni protein koji ima jednu ili više označenih kaseta (Ključ-ChEMs ili T-ChARMs). Dodatno, ovo otkrivanje obezbeđuje Ključ-ChEMs ili T-ChARMs, kao i ćelije, kompozicije i postupke za primenu Ključ-ChEMs ili T-ChARMs ovog otkrivanja u raznim terapeutskim primenama, uključujući tretiranje bolesti kod subjekta (npr., kancer, infektivna bolest, zapaljenska bolest, imuna bolest, bolest povezana sa starenjem).

[0042] Pre detaljnijeg navođenja ovog otkrivanja i u cilju njegovog boljeg razumevanja, korisno je obezbediti definicije određenih termina koji će biti ovde korišćeni. Dodatne definicije navedene su kroz ovo otkrivanje.

[0043] U ovom opisu, bilo koje pozivanje na opseg, opseg procenta, opseg odnosa, ili opseg celih brojeva treba shvatiti da uključuje vrednost bilo kog celog broja unutar navedenog opsega i, kada je to pogodno, njegove delove (kao što je jedna desetina ili jedna stotina tog celog broja), ukoliko nije drugačije naznačeno. Takođe, bilo koji opseg brojeva koji je ovde naveden koji se odnosi na neku fizičku karakteristiku, kao što su polimerne podjedinice, veličina ili debljina, treba shvatiti kao da uključuje bilo koji ceo broj unutar navedenog opsega, ukoliko nije drugačije naznačeno. Kako se ovde koristi, pojam "oko" znači ± 20% navedenog opsega, vrednosti, ili strukture, ukoliko nije drugačije naznačeno.

Podrazumeva se da pojmovi "jedan" i "neki" kako se ovde koristi, odnose na "jedan ili više" navedenih komponenti. Upotreba alternativa (npr., "ili") treba da se shvati ili kao jedan, oba, ili bilo koja njihova kombinacija alternativa. Kako se ovde koristi, pojmovi "uključuju," "imaju" i "obuhvataju" upotrebljeni su kao sinonimi, pri čemu su ti pojmovi i njihove varijante obezbeđene kao neograničavajući.

[0044] Pored toga, podrazumeva se da su pojedinačna jedinjenja, ili grupe jedinjenja, izvedena iz raznih kombinacija struktura i supstituenata opisanih ovde, obuhvaćena ovom prijavom do istih razmera kao i svako jedinjenje ili grupa jedinjenja koja je navedena pojedinačno. Prema tome, odabir određenih struktura ili određenih supstituenata je u okvirima ovom otkrivanja.

[0045] Pojam "koji se sastoji suštinski od' ograničava obim patentnih zahteva na navedene materijale ili faze, ili na one koje ne utiču na materiju osnovnih karakteristika zaštićenog pronalaska. Na primer, proteinski domen, region, modul ili kaseta (npr., vezujući domen, region zgloba, vezni modul, označena kaseta) ili protein (koji može da ima jedan ili više domena, regiona, modula ili kaseta) "se sastoji suštinski od' određene aminokiselinske sekvence kada ta aminokiselinska sekvenca domena, regiona, modula, kasete ili proteina uključuje proširenja, brisanja, mutacije, ili njihovu kombinaciju (npr., aminokiseline na amino- ili karboksi-terminusu ili između domena) koja, u kombinaciji, doprinosi do najviše 20% (npr., najviše 15%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ili 1%) dužine domena, regiona, modula,

1

kasete ili proteina i suštinski ne utiče na (tj., ne redukuje aktivnost za više od 50%, kao što je ne više od 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, ili 1%) aktivnost domena(a), regiona(a), modula(a), kasete(a) ili proteina (npr., ciljani vezujući afinitet vezujućeg proteina ili označene kasete).

[0046] "Vezujući domen" (takođe označen kao "vezujući region" ili "vezujuća grupa"), kako se ovde koristi, odnosi se na molekul, kao što je peptid, oligopeptid, polipeptid, ili protein koji poseduje sposobnost da se specifično i nekovalentno pridruži, ujedini, ili kombinuje sa ciljanim molekulom (npr., CD19, CD20, CD22, ROR1, mezotelin, PD-L1, PD-L2, PSMA). Vezujući domen uključuje bilo koji prirodni, sintetički, polusintetički, ili rekombinantno proizveden vezujući partner za biološki molekul ili drugu metu od interesa. U nekim načinima ostvarivanja, vezujući domen je antigen-vezujući domen, kao što je antitelo ili T ćelijski receptor (TCR) ili funkcionalan vezujući domen ili njegov antigen-vezujući fragment. Primerni vezujući domeni uključuju jednolančane varijabilne regione antitela (npr., domen antitela, sFv, scFv, Fab), receptorske ektodomene (npr., TNF-α), veznike (npr., citokini, hemokini), antigen-vezujuće regione T ćelijskih receptora (TCRs), kao što su jednolančani TCRs (scTCRs), ili sintetičke polipeptide odabrane zbog specifične sposobnosti da se vežu za biološki molekul.

[0047] Kako se ovde koristi, "specifično se vezuje" odnosi se na vezivanje ili spajanje vezujućeg domena, ili njegovog fuzionog proteina, sa ciljanim molekulom sa afinitetom ili Ka(tj., konstanta uravnoteženog vezivanja određene vezujuće interakcije sa jedinicama od 1/M) jednakim ili većim od 10<5>M<-1>, dok se u isto vreme ne vezuje ili spaja u značajnoj meri sa bilo kojim drugim molekulima ili komponentama u uzorku. Vezujući domeni (ili njegovi fuzioni proteini) mogu se klasifikovati kao "visoko afinitetni" vezujući domeni (ili njihovi fuzioni proteini) ili "nisko afinitetni" vezujući domeni (ili njihovi fuzioni proteini). "Visoko afinitetni" vezujući domeni odnose se na one vezujuće domene sa Kaod najmanje 10<7>M<-1>, najmanje 10<8>M<-1>, najmanje 10<9>M<-1>, najmanje 10<10>M<-1>, najmanje 10<11>M<-1>, najmanje 10<12>M<-1>, ili najmanje 10<13>M<-1>. "Nisko afinitetni" vezujući domeni odnose se na one vezujuće domene sa Kaod do 10<7>M<-1>, do 10<6>M<-1>, do 10<5>M<-1>. Alternativno, afinitet se može definisati kao uravnotežena konstanta disocijacije (Kd) određene vezujuće interakcije sa jedinicama M (npr., 10<-5>M to 10<-13>M). U određenim načinima ostvarivanja, vezujući domen može da ima "osnažen afinitet," koji se odnosi na odabran ili konstruisan vezujući domen sa snažnijim vezivanjem za ciljani antigen vezujućeg domena divljeg tipa (ili roditeljskog). Na primer, osnažen afinitet može biti zbog Ka (konstanta uravnoteženog vezivanja) za ciljani antigen koja je viša od one za vezujući domen divljeg tipa, ili zbog Kd(konstanta disocijacije) za ciljani antigen koja je niža od one za vezujući domen divljeg tipa, ili zbog vremena mirovanja (Koff) za ciljani antigen koje je manje od onog za vezujući domen divljeg tipa. Poznata su razna ispitivanja za identifikovanje vezujućih domena ovog otkrivanja koji se specifično vezuju za određenu metu, kao i određivanje afiniteta vezujućeg domena ili fuzionog proteina, kao što su Western blot, ELISA, i Biacore® analiza (videti takođe, npr., Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci.51:660, 1949; i U.S. Patent Br.

5,283,173, 5,468,614, ili ekvivalenti).

[0048] Kako se ovde koristi, "heterologni" ili "ne-endogeni" ili "egzogeni" odnosi se na bilo koji gen, protein, jedinjenje, molekul ili aktivnost koja nije nativna za ćeliju domaćina ili subjekta, ili je bilo koji gen, protein, jedinjenje, molekul ili aktivnost nativna za domaćina ili ćeliju domaćina, ali izmenjena ili mutirana tako da su struktura, aktivnost ili oba različite kao između nativnih i mutiranih molekula. U određenim načinima ostvarivanja, heterologni, ne-endogeni ili egzogeni molekuli (npr., receptori, veznici) ne moraju biti endogeni za ćeliju domaćina ili subjekta, već umesto nukleinskih kiselina koje kodiraju takve molekule mogu da se dodaju ćeliji domaćinu konjugacijom, transformacijom, transfekcijom, elektroporacijom, ili slično, pri čemu dodati molekul nukleinske kiseline može da se integriše u genom ćelije domaćina ili može da egzistira kao ekstra-hromozomalni genetski materijal (npr., kao plazmid ili drugi samo-replicirajući vektor). Pojam "homologni" ili "homolog" odnosi se na molekul ili aktivnost koja je otkrivena ili izvedena iz ćelije domaćina, vrste ili soja. Na primer, heterologni ili egzogeni molekul ili gen koji kodira molekul može biti homologan za nativni molekul domaćina ili ćelije domaćina ili gen koji kodira taj molekul, respektivno, ali može da ima izmenjenu strukturu, sekvencu, ekspresiju nivo ili njihove kombinacije. Ne-endogeni molekul može biti iz iste vrste, različite vrste ili njihove kombinacije.

[0049] Kako se ovde koristi, pojam "endogeni" ili "nativni" odnosi se na gen, protein, jedinjenje, molekul ili aktivnost koja je uobičajeno prisutna kod domaćina ili ćelije domaćina.

[0050] Kako se ovde koristi, "označena kaseta" odnosi se na jedinstvenu peptidnu sekvencu povezanu sa, fuzionisanu sa, ili koja je deo proteina od interesa, za koju je heterologni ili ne-endogeni srodni vezujući molekul (npr., receptor, veznik, antitelo, ili drugi vezujući partner) sposoban da se specifično veže gde se vezujuća osobina može primeniti za detektovanje, identifikovanje, izolovanje ili prečišćavanje, praćenje, obogaćivanje, ili ciljanje označenog proteina ili ćelije koja eksprimira označen protein, određenije kada je označeni protein deo heterogene populacije proteina ili drugog materijala, ili kada su ćelije koje eksprimiraju označen protein deo heterogene populacije ćelija (npr., biološki uzorak poput periferne krvi). U određenim načinima ostvarivanja, ćelija koja eksprimira označen protein može biti dovedena u kontakt sa heterolognim ili ne-endogenim srodnim vezujućim molekulom i da indukuje biološki odgovor, kao što je promovisanje ćelijske aktivacije, ćelijske proliferacije ili ćelijske smrti. U obezbeđenim fuzionim proteinima, sposobnost označene kasete(a) da se specifično veže srodnim vezujućim molekulom(ima) razlikuje se od ili je dodata sposobnosti vezujućeg domena(a) da se specifično veže za ciljani molekul(e). Označena kaseta generalno nije antigen-vezujući molekul, na primer, nije antitelo ili TCR ili njihov antigen-vezujući deo.

[0051] Kako se ovde koristi, "region zgloba" ili "zglob" odnosi se na (a) sekvencu imunoglobulinskog zgloba (sačinjenu od, na primer, gornjih i jezgarnih regiona) ili njen funkcionalan fragment ili varijantu, (b) tip II C-lektin interdomenski (stabla) region ili njegov funkcionalan fragment ili varijanta, ili (c) region stabla klastera diferencijacionog (CD) molekula ili njegovu funkcionalnu varijantu. Kako se ovde koristi,

1

"imunoglobulinski region zgloba divljeg tipa" odnosi se na prirodnu gornju i srednju aminokiselinsku sekvencu zgloba umetnute između i koje spajaju CH1 i CH2 domene (za IgG, IgA, i IgD) ili umetnute između i koje spajaju CH1 i CH3 domene (za IgE i IgM) pronađene u teškom lancu antitela. U određenim načinima ostvarivanja, region zgloba je human, a u određenim načinima ostvarivanja, obuhvata humani IgG region zgloba.

[0052] Kako se ovde koristi, "konektorski region" odnosi se na jedan ili više proteina, polipeptida, oligopeptida, peptida, domena, regiona, modula, kaseta, motiva ili bilo koju njihovu kombinaciju koja spaja dva ili više proteina, polipeptida, oligopeptida, peptida, domena, regiona, modula, kaseta, motiva ili bilo koju njihovu kombinaciju u fuzionom proteinu. Na primer, konektorski region može da obezbedi spejser funkciju da bi omogućio interakciju dva jednolančana fuziona proteina, ili pozicioniranje jednog ili više vezujućih domena, tako da dobijena polipeptidna struktura zadrži specifičan vezujući afinitet prema ciljanom molekulu ili održi signalizirajuću aktivnost (npr., aktivnost efektorskog domena) ili oba. U određenim načinima ostvarivanja, konektorski region može da obuhvata "vezni modul" koji je neka aminokiselinska sekvenca sa oko dve do oko 500 aminokiselina, koji može da obezbedi fleksibilnost i prostor za prostorno pomeranje između dva regiona, domena, motiva, kaseta ili modula povezanih veznikom. Primerni vezni moduli uključuju one sa jedan do oko deset ponavljanja GlyxSery, pri čemu x i y nezavisno predstavljaju ceo broj od 0 do 10 pod uslovom da x i y nisu oba 0 (npr., (Gly4Ser)2(SEQ ID NO: 67), (Gly3Ser)2(SEQ ID NO: 68), Gly2Ser, ili njihovu kombinaciju kao što je (Gly3Ser)2Gly2Ser)(SEQ ID NO: 69). U određenim drugim načinima ostvarivanja, konektorski region može da ima vezni modul koji obuhvata jedan ili više konstantnih regiona imunoglobulinskog teškog lanca, kao što je CH3 sam ili CH2CH3. U daljim načinima ostvarivanja, konektorski region može da obuhvata region zgloba ili označenu kasetu. Svaka takva konektorska komponenta nije međusobno isključiva. Na primer, konektorski region može da obuhvata zglob i jedan ili više veznih modula, ili konektorski region može da obuhvata zglob, jedan ili više veznih modula, i jednu ili više označenih kaseta. Primerni konektorski regioni mogu da variraju u dužini, primera radi, od oko pet do oko 500 aminokiselina, ili od oko deset do oko 350 aminokiselina, ili od oko 15 do oko 100 aminokiselina, ili od oko 20 do oko 75 aminokiselina, ili od oko 25 do oko 35 aminokiselina.

[0053] "Hidrofobni deo," kako se ovde koristi, označava bilo koju aminokiselinsku sekvencu sa trodimenzionalnom strukturom koja je termodinamički stabilna u ćelijskoj membrani, i generalno varira u dužini od oko 15 aminokiselina do oko 30 aminokiselina. Struktura hidrofobnog domena može da obuhvata alfa spiralu, beta barel, beta list, beta spiralu, ili bilo koju njihovu kombinaciju.

[0054] Kako se ovde koristi, "efektorski domen" je intracelularni deo fuzionog proteina ili receptora koji može direktno ili indirektno da promoviše biološki ili fiziološki odgovor u ćeliji kada primi pogodan signal. U određenim načinima ostvarivanja, efektorski domen je deo proteina ili proteinskog kompleksa koji prima signal kada je povezan, ili se vezuje direktno za ciljani molekul, što izaziva signal iz efektorskog

1

domena. Efektorski domen može direktno da promoviše celularni odgovor kada sadrži jedan ili više signalizirajućih domena ili motiva, kao što je imunoreceptorski tirozinski aktivacioni motiv (ITAM). U drugim načinima ostvarivanja, efektorski domen indirektno promoviše celularni odgovor udruživanjem sa jednim ili više drugih proteina koji direktno promovišu celularni odgovor.

[0055] "Veznik varijabilnih regiona" specifično se odnosi na pet do oko 35 aminokiselinskih sekvenci koje povezuju imunoglobulinski varijabilni region teškog lanca za imunoglobulinski varijabilni region lakog lanca ili povezuje T ćelijske receptorske Vα/βi Cα/βlance (npr., Vα-Cα, Vβ-Cβ, Vα-Vβ) ili povezuje svaki Vα-Cα, Vβ-Cβ, Vα-Vβpar za zglob ili hidrofobni domen, što obezbeđuje spejser funkciju i fleksibilnost dovoljnu za interakciju dva pod-vezujuća domena tako da dobijeni jednolančani polipeptid zadržava specifičan vezujući afinitet prema istom ciljanom molekulu kao antitelo ili T ćelijski receptor. U određenim načinima ostvarivanja, veznik varijabilnih regiona obuhvata od oko deset do oko 30 aminokiselina ili od oko 15 do oko 25 aminokiselina. U određenim načinima ostvarivanja, vezni peptid varijabilnih regiona obuhvata od jednog do deset ponavljanja GlyxSery, pri čemu x i y nezavisno predstavljaju ceo broj od 0 do 10 pod uslovom da x i y nisu oba 0 (npr., Gly4Ser (SEQ ID NO: 10), Gly3Ser (SEQ ID NO: 71), Gly2Ser, ili (Gly3Ser)n(Gly4Ser)1(SEQ ID NO: 72), (Gly3Ser)n(Gly2Ser)n, (SEQ ID NO: 73) (Gly3Ser)n(Gly4Ser)n(SEQ ID NO: 72), ili (Gly4Ser)n(SEQ ID NO: 10), pri čemu n je neki ceo broj od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10) i pri čemu vezani varijabilni regioni obrazuju vezujući domen nalik funkcionalnom imunoglobulinu (npr., scFv, scTCR). Primerni veznici varijabilnih regiona uključuju one aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO.:44, 65-69, i 71-73, i (Gly4Ser)n(SEQ ID NO: 10), pri čemu n je 3, kao i kod T-ChARM koji imaju aminokiselinsku sekvencu navedena u SEQ ID NO.:57.

[0056] "Spojne aminokiseline" ili "ostaci spojnih aminokiselina" odnose se na jedan ili više (npr., oko 2-20) aminokiselinskih ostataka između dva susedna motiva, regiona ili domena polipeptida, kao što je između vezujućeg domena i susednog veznog regiona ili između hidrofobnog domena i susednog efektorskog domena ili na jednom ili oba kraja veznog regiona koji spaja dva motiva, regiona ili domena (npr., između veznika i susednog vezujućeg domena i/ili između veznika i susednog zgloba). Spojne aminokiseline mogu se dobiti iz dizajna konstrukta fuzionog proteina (npr., aminokiselinski ostaci koji se dobijaju iz upotrebe mesta restrikcije enzima tokom izgradnje molekula nukleinske kiseline koja kodira fuzioni protein). Na primer, jedna spojna aminokiselina, asparagin, kodira se AAT kodonom koji se nalazi između sekvence nukleinske kiseline koja kodira sekretornu signalnu sekvencu (SEQ ID NO.:63) i sekvence koja kodira označenu kasetu (SEQ ID NO.:38) u T-ChARM kodiran sekvencom nukleinske kiseline navedenom u SEQ ID NO.:58. Slično, asparaginska (N) spojna aminokiselina može se naći između fleksibilne vezne aminokiselinske sekvence iz GGSGSG (SEQ ID NO.:65) i aminokiselinske označene sekvence WSHPQFEK (SEQ ID NO.:1) koja se nalazi u T-ChARM koji imaju aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO.:54.

1

[0057] Pojmovima koji se podrazumevaju u oblasti tehnologije antitela su svakom data značenja koja su stečena u toj oblasti, ukoliko nije isključivo drugačije naznačeno. Pojam "antitelo" odnosi se netaknuto antitelo koje obuhvata najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama, kao i antigen-vezujući deo netaktnutog antitela koje ima ili zadržava kapacitet da se veže za ciljani molekul. Monoklonalno antitelo ili njegov antigen-vezujući deo može biti nehumano, himerno, humanizovano, ili humano, poželjno humanizovano ili humano. Imunoglobulinska struktura i funkcija su objašnjeni, na primer, u Harlow et al., Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988).

[0058] Na primer, pojmovi "VL" i "VH" odnose se na varijabilni vezujući region iz lakog i teškog lanca antitela, respektivno. Varijabilni vezujući regioni sačinjeni su od odvojenih, dobro definisanih podregiona poznati kao "regioni određivanja komplementarnosti" (CDRs) i "regioni okvira" (FRs). Pojam "CL" odnosi se na "imunoglobulinski konstantni region lakog lanca" ili "konstantni region lakog lanca," tj., a konstantni region iz lakog lanca antitela. Pojam "CH" odnosi se na "imunoglobulinski konstantni region teškog lanca" ili "konstantni region teškog lanca," koji je dalje deljiv, zavisno od izotipa antitela na CH1, CH2, i CH3 (IgA, IgD, IgG), ili CH1, CH2, CH3, i CH4 domene (IgE, IgM). "Fab" (vezivanje fragmenta za antigen) je deo antitela koji se vezuje za antigene i uključuje varijabilni region i CH1 teškog lanca povezan sa lakim lancem putem među-lančane disulfidne veze.

[0059] Kako se ovde koristi, "Deo Fc regiona" odnosi se na segment konstantnog regiona teškog lanca Fc fragmenta ("fragment kristalizujući" region ili Fc region) iz antitela, koji može da uključuje jedan ili više konstantnih domena, kao što je CH2, CH3, CH4, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U određenim načinima ostvarivanja, deo Fc regiona uključuje CH2 i CH3 domene od IgG, IgA, ili IgD antitela ili bilo koju njihovu kombinaciju, ili CH3 i CH4 domene od IgM ili IgE antitela i bilo koju njihovu kombinaciju. U drugim načinima ostvarivanja, CH2CH3 ili CH3CH4 struktura ima pod-regionske domene iz istog izotipa antitela i oni su humani, kao što je humani IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, ili IgM (npr., CH2CH3 iz humanog IgG1). Kao što je prethodno poznato, Fc region je zadužen za efektorske funkcije imunoglobulina, kao što je ADCC (antitelo-zavisna T ćelijski-posredovana citotoksičnost), CDC (komplement-zavisna citotoksičnost) i komplement fiskiranje, koji se vezuju za Fc receptore (npr., CD16, CD32, FcRn), veći polu-život in vivo u odnosu na polipeptid kojem nedostaje Fc region, protein A vezivanje, i možda čak i transfer preko placente (videti Capon et al., Nature 337:525, 1989). U određenim načinima ostvarivanja, deo Fc regiona koji se može naći u fuzionim proteinima ovog otkrivanja može biti sposoban za posredovanje jedne ili više od ovih efektorskih funkcija, ili će mu nedostajati jedna ili više ili sve ove aktivnosti putem, na primer, jedne ili više mutacija poznatih u struci.

[0060] Pored toga, antitela imaju sekvencu zgloba koja je uobičajeno smeštena između Fab i Fc regiona (ali niži delovi zgloba mogu da uključuju amino-terminalni deo Fc regiona). Kao što je prethodno poznato, imunoglobulinski zglob dejstvuje kao fleksibilan spejser radi omogućavanja da se Fab deo

1

slobodno pomera u prostoru. Nasuprot konstantnim regionima, zglobovi su strukturalno različiti, variraju i u sekvenci i u dužini između imunoglobulinskih klasa i čak među podklasama. Na primer, humani IgG1 region zgloba je slobodno fleksibilan, što omogućava da se Fab fragmenti rotiraju oko svojih osa simetrije i pomeraju unutar sfere centrirane na prvom od dva disulfidna mosta između teških lanaca. Poređenjem, humani IgG2 zglob je relativno kratak i sadrži krutu poli-prolinsku dvostruku spiralu stabilizovanu putem četiri disulfidna mosta između teških lanaca, koji smanjuju fleksibilnost. Humani IgG3 zglob razlikuje se od drugih podklasa svojim jedinstvenim proširenim regionom zgloba (oko četiri puta duži u odnosu na IgG1 zglob), koji sadrži 62 aminokiseline (uključujući 21 prolin i 11 cisteina), koje formiraju nefleksibilnu poli-prolinsku dvostruku spiralu i koje obezbeđuju veću fleksibilnost jer su Fab fragmenti relativno udaljeniji od Fc fragmenta. Humani IgG4 zglob je kraći od IgG1, ali ima istu dužinu kao IgG2, i njegova fleksibilnost je sredina između one od IgG1 i IgG2.

[0061] "T ćelijski receptor" (TCR) odnosi se na molekul koji se može naći na površini T ćelija (ili T limfocita) koji je, u vezivanju sa CD3, generalno odgovoran za prepoznavanje antigena vezanih za glavne molekule kompleksa histokompatibilnosti (MHC). TCR ima disulfidno-vezan heterodimer veoma varijabilnih α i β lanaca (takođe poznati kao TCRα i TCRβ, respektivno) u većini T ćelija. U malom podskupu T ćelija, TCR je sačinjen od heterodimera varijabilnih γ i δ lanaca (takođe poznati kao TCRγ i TCRδ, respektivno). Svaki lanac TCR je član imunoglobulinske superfamilije i poseduje jedan N-terminalni imunoglobulinski varijabilni domen, jedan imunoglobulinski konstantan domen, transmembranski region, i kratak citoplazmatski rep na C-terminalnom kraju (videti Janeway et al., Imunobiology: The Imune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p.4:33, 1997). TCR, kako se koristi u ovom otkrivanju, može poticati od raznih životinjskih vrsta, uključujući čoveka, miša, pacova, mačku, psa, kozu, konja, ili druge sisare. TCRs mogu biti ćelijski povezani (tj., imaju transmembranski region ili domen) ili u rastvorivom obliku.

[0062] "Glavni molekuli kompleksa histokompatibilnosti" (MHC molekuli) odnose se na glikoproteine koji dostavljaju peptidni antigeni do ćelijske površine. MHC klasa I molekula su heterodimeri koji se sastoje od α lanca koji obavija membranu (sa tri α domena) i nekovalentno povezanog β2 mikroglobulina. MHC klasa II molekula je ukomponovana od dva transmembranska glikoproteina, α i β, od kojih oba obavijaju membranu. Svaki lanac ima dva domena. MHC klasa I molekuli dostavljaju peptide koji potiču u citozolu do ćelijske površine, gde se kompleks peptid:MHC prepoznaje od strane CD8<+>T ćelija. MHC klasa II molekuli dostavljaju peptide koji potiču u vezikularnom sistemu do ćelijske površine, gde se prepoznaju od strane CD4<+>T ćelija. MHC molekul mogu da potiču iz raznih životinjskih vrsta, uključujući čoveka, miša, pacova, ili druge sisare.

[0063] "Vektor" je molekul nukleinske kiseline koji može da transportuje drugu nukleinsku kiselinu. Vektori mogu biti, na primer, plazmidi, kozmidi, virusi, ili fage. "Ekspresioni vektor" je vektor koji može

1

da direktno eksprimira protein kodiran jednim ili više gena koje nosi vektor kada je prisutan u pogodnom okruženju.

[0064] "Retrovirusi" su virusi koji imaju RNK genom. "Gamaretrovirus" odnosi se na genus retroviridae familije. Primerni gamaretrovirusi uključuju virus mišje matične ćelije, virus leukeme glodara, virus leukemie mačaka, virus sarkoma mačaka, i avian retikuloendotelioza viruse.

[0065] "Lentivirus" odnosi se na genus retrovirusa koji može da inficira deljive i nedeljive ćelije. Nekoliko primera lentivirusa uključuju HIV (virus humane imunodeficijencije: uključujući HIV tip 1, i HIV tip 2); virus infektivne anemije konja; virus imunodeficijencije mačaka (FIV); virus imunodeficijencije goveda (BIV); i virus imunodeficijencije majmuna (SIV).

[0066] "Hematopoietična progenitorska ćelija" je ćelija izvedena iz hematopoietičnih matičnih ćelija koje mogu dalje da diferenciraju u zrele ćelijske vrste (npr., ćelije T ćelijske linije). U određenim načinima ostvarivanja, CD24<lo>Lin<->CD117<+>hematopoietične progenitorska ćelije su korisne. Hematopoietične progenitorske ćelije mogu biti iz raznih životinjskih vrsta, uključujući čoveka, miša, pacova, ili druge sisare. "Timocitna progenitorska ćelija" ili "timocit" je hematopoietična progenitorska ćelija prisutna u timusu.

[0067] "Hematopoietične matične ćelije" odnose se na nediferencirane hematopoietične ćelije koje mogu da se samo-obnove ili in vivo, suštinski neograničene propagacije in vitro, i mogu da diferenciraju u druge ćelijske vrste uključujući ćelije T ćelijske linije. Hematopoietične matične ćelije mogu biti izolovane, na primer, ali bez ograničavanja, iz jetre fetusa, koštane srži, pupčane krvi.

[0068] "Embrionske matične ćelije" ili "ES ćelije" ili "ESCs" odnose se na nediferencirane embrionske matične ćelije koje imaju sposobnost da se integrišu i postanu deo germinativne linije embriona u razvoju. Embrionske matične ćelije mogu da diferenciraju u hematopoietične progenitorske ćelije, i bilo koje tkivo ili organ. Embrionske matične ćelije uključuju ćelije iz J1 ES ćelijske linije, 129J ES ćelijske linije, glodarske matične ćelijske linije D3 (American Type Culture Collection), R1 ili E14K ćelijske linije izvedene iz 129/Sv miševa, ćelijske linije izvedene iz Balb/c i C57B1/6 miševa, i humane embrionske matične ćelije.

[0069] "Ćelije T ćelijske linije" odnose se na ćelije koje pokazuju najmanje jednu fenotipsku karakteristiku T ćelije ili njenog pekursora ili progenitora koji razlikuju ćelije od drugih limfoidnih ćelija, i ćelije od eritroidne ili mijeloidne linije. Takve fenotipske karakteristike mogu da uključuju ekspresiju jednog ili više proteina specifičnih za T ćelije (npr., CD3<+>, CD4<+>, CD8<+>), ili fiziološku, morfološku, funkcionalnu, ili imunološku osobinu specifičnu za T ćeliju. Na primer, ćelije T ćelijske linije mogu biti progenitorske ili pekursorske ćelije posvećene T ćelijskoj liniji; CD25<+>nezrele i inaktivirane T ćelije; ćelije koje imaju u toku CD4 ili CD8 linijsku posvećenost; timocitne progenitorske ćelije koje su CD4<+>CD8<+>dvostruko pozitivne; jednostruko pozitivne CD4<+>ili CD8<+>; TCRαβ ili TCRγδ; ili zrele i funkcionalne ili aktivirane T ćelije.

2

[0070] "Molekul nukleinske kiseline", ili polinukleotidi, mogu biti u obliku RNK ili DNK, koje uključuju cDNK, genomsku DNK, i sintetičku DNK. Molekul nukleinske kiseline može biti dvolančani ili jednolančani, a ako je jednolančani, može biti kodirajući lanac ili ne-kodirajući (anti-sense lanac).

Kodirajući molekul može da ima kodirajuću sekvencu identičnu kodirajućoj sekvenci poznatoj u struci ili može da ima različitu kodirajuću sekvencu koja, kao rezultat redudance ili degeneracije genetskog koda, ili splajsovanjem, može da kodira isti polipeptid.

[0071] "Lečenje" ili "tretiranje" ili "ublažavanje" odnosi se na medicinsko upravljanje bolešću, poremećajem, ili stanjem subjekta (npr., humani ili ne-humani sisar, kao što je primat, konj, pas, miš, pacov). Uopšteno, pogodna doza ili režim tretiranja koji obuhvata ćeliju domaćina koja eksprimira Ključ-ChEM ili T-ChARM ovog otkrivanja, i opciono adjuvans, daje se u količini dovoljnoj da izazove terapeutski ili profilaktički benefit. Terapeutski ili profilaktički/preventivni benefit uključuje poboljšan klinički ishod; umanivanje ili ublažavanje simptoma povezanih sa bolešću; smanjeno pojavljivanje simptoma; poboljšan kvalitet života; duži status bez bolesti; umanjivanje stepena bolesti, stabilizaciju stanja bolesti; odlaganje progresije bolesti; remisiju; preživljavanje; produženo preživljavanje; ili bilo koju njihovu kombinaciju.

[0072] "Terapeutski efektivna količina" ili "efektivna količina" fuzionog proteina ili ćelije koja eksprimira fuzioni protein ovog otkrivanja (npr., Ključ-ChEM, T-ChARM) odnosi se na onu količinu jedinjenja ili ćelije dovoljnu da rezultuje u ublažavanju jednog ili više simptoma bolesti koja se tretira na statistički značajan način. Kada se poziva na pojedinačan aktivan sastojak ili ćeliju koja eksprimira jedan aktivan sastojak, koji se daje sam, terapeutski efektivna doza odnosi se na efekte sastojka ili ćelije koja eksprimira taj sam sastojak. Kada se poziva na kombinaciju, terapeutski efektivna doza odnosi se kombinovane količine aktivnih sastojaka ili kombinovani dodatni aktivan sastojak sa ćelijom koja eksprimira aktivan sastojak što rezultuje u terapeutskom efektu, bilo da se daje serijski ili simultano. Još jedna kombinacija može biti ćelija koja eksprimira više od jednog aktivnog sastojka, kao što su dva različita T-ChARMs, T-ChARM i TCR, T-ChARM i CAR, ili njihove kombinacije.

[0073] Dodatne definicije obezbeđene su kroz ovo otkrivanje.

Kev-ChEMs i T-ChARMs

[0074] U određenim aspektima, ovo otkrivanje obezbeđuje jednolančani fuzioni protein, označen kao Ključ-ChEM, koji obuhvata ekstracelularnu komponentu i intracelularnu komponentu povezanu hidrofobnim delom, pri čemu ekstracelularna komponenta obuhvata označenu kasetu i konektorski region koji obuhvata zglob, i pri čemu intracelularna komponenta obuhvata efektorski domen. U određenim slučajevima, konektorski region dalje obuhvata vezni modul, ili su jedna ili više označenih kaseta locirane unutar konektorskog regiona. U nekim drugim slučajevima, jedna ili više označenih kaseta povezane su sa konektorskim regionom putem veznog modula.

[0075] U nekim slučajevima, fuzioni protein obuhvata od amino-terminusa do karboksi-terminusa: označenu kasetu, konektorski region koji obuhvata zglob, hidrofobni deo, i intracelularnu komponentu koja obuhvata efektorski domen (videti, npr., FIG.1A i IB). U daljim slučajevima, fuzioni protein obuhvata od amino-terminusa do karboksi-terminusa: prvi konektorski region, označenu kasetu, drugi konektorski region koji obuhvata zglob, hidrofobni deo, i intracelularnu komponentu koja obuhvata efektorski domen. U određenim slučajevima fuzioni protein obuhvata od amino-terminusa do karboksiterminusa: prvu označenu kasetu, prvi konektorski region, drugu označenu kasetu, drugi konektorski region koji obuhvata zglob, hidrofobni deo, i intracelularnu komponentu koja obuhvata efektorski domen (videti, npr., FIG.1C). U još daljim slučajevima, fuzioni protein obuhvata od amino-terminusa do karboksi-terminusa: prvu označenu kasetu, prvi konektorski region, drugu označenu kasetu, drugi konektorski region, treću označenu kasetu, treći konektorski region koji obuhvata zglob, hidrofobni deo, i intracelularnu komponentu koja obuhvata efektorski domen (videti, npr., FIG.1D).

[0076] U nekim drugim slučajevima, fuzioni protein dalje obuhvata nekovalentno povezan vezujući domen, kao što je vezujući domen povezan sa označenom kasetom (tj., višelančani T-ChARM). U još daljim slučajevima, nekovalentno povezan vezujući domen je bispecifičan, pri čemu je prvi vezujući kraj specifičan za označenu kasetu, a drugi vezujući kraj je specifičan za metu koja je različita od označene kasete, ili su prvi i drugi vezujući kraj oba specifična za označenu kasetu. U drugim slučajevima, nekovalentno povezan vezujući domen je multispecifičan, pri čemu prvi se prvi kraj vezuje za označenu kasetu, a drugi kraj je specifičan za jednu ili više meta koja je različita od označene kasete. U takvim slučajevima, Ključ-ChEM obuhvata multimerni protein. U nekim slučajevima, takvi Ključ-ChEMs koji obuhvataju jedan ili više nekovalentno povezanih vezujućih domena obuhvataju heteromultimere.

[0077] U drugim aspektima, ovo otkrivanje obezbeđuje jednolančani fuzioni protein, označen kao T-ChARM, koji obuhvata ekstracelularnu komponentu i intracelularnu komponentu povezanu hidrofobnim delom, pri čemu ekstracelularna komponenta obuhvata vezujući domen koji specifično vezuje metu, označenu kasetu, i konektorski region koji obuhvata zglob, i pri čemu intracelularna komponenta obuhvata efektorski domen. U određenim slučajevima, T-ChARM vezujući domen predstavlja scFv, scTCR, receptorski ektodomen, ili veznik.

[0078] U nekim slučajevima ovih načinima ostvarivanja, fuzioni protein obuhvata od amino-terminusa do karboksi-terminusa: ekstracelularni vezujući domen, označenu kasetu, konektorski region koji obuhvata zglob, hidrofobni deo, i intracelularnu komponentu koja obuhvata efektorski domen (videti, npr., FIG. IE). U daljim slučajevima, fuzioni protein obuhvata od amino-terminusa do karboksi-terminusa: ekstracelularni vezujući domen, prvi konektorski region, označenu kasetu, drugi konektorski region koji obuhvata zglob, hidrofobni deo, i intracelularnu komponentu koja obuhvata efektorski domen. U daljim slučajevima, fuzioni protein obuhvata od amino-terminusa do karboksi-terminusa: ekstracelularni vezujući domen, prvu označenu kasetu, prvi konektorski region, drugu označenu kasetu, drugi konektorski region koji obuhvata zglob, hidrofobni deo, i intracelularnu komponentu koja obuhvata efektorski domen. U još daljim slučajevima, fuzioni protein obuhvata od amino-terminusa do karboksiterminusa: ekstracelularni vezujući domen, prvu označenu kasetu, prvi konektorski region, drugu označenu kasetu, drugi konektorski region, treću označenu kasetu, treći konektorski region koji obuhvata zglob, hidrofobni deo, i intracelularnu komponentu koja obuhvata efektorski domen.

[0079] U nekim drugim slučajevima, fuzioni protein obuhvata od amino-terminusa do karboksiterminusa: označenu kasetu, ekstracelularni vezujući domen, konektorski region koji obuhvata zglob, hidrofobni deo, i intracelularnu komponentu koja obuhvata efektorski domen (videti, npr., FIG. IF). U još daljim slučajevima, fuzioni protein obuhvata od amino-terminusa do karboksi-terminusa: ekstracelularni scFv ili scTCR vezujući domen koji obuhvata veznik varijabilnih regiona koji sadrži označenu kasetu raspoređenu između varijabilnih regiona (npr., na ili bliže N-terminalnom kraju veznika varijabilnih regiona, na ili bliže C-terminalnom kraju veznika varijabilnih regiona, ili ugrađena bliže sredini veznika varijabilnih regiona), konektorski region koji obuhvata zglob, hidrofobni deo, i intracelularnu komponentu koja obuhvata efektorski domen. Primerna označena kaseta ugrađena u veznik varijabilnih regiona obuhvata GGSGSG(X)nWSHPQFEKGSGSG (SEQ ID NO.:45), pri čemu X je opcono, mogu biti bilo koja aminokiselina, a n je 0, 1, 2, 3, 4 ili 5. U SEQ ID NO.:54, takav veznik varijabilnih regiona koji ima ugrađenu oznaku je prisutan, pri čemu n je 1, a X je asparagin (N).

[0080] Ključ-ChEM ili T-ChARM mogu biti vezani za ćeliju (npr., eksprimirani na ćelijskoj površini) ili u rastvorivom obliku. U određenim slučajevima, molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju Ključ-ChEM ili T-ChARM fuzione proteine mogu biti kodon optimizovani da ojačaju ili maksimizuju ekspresiju u određenim vrstama ćelija, kao što su T ćelije (Scholten et al., Clin. Immunol.119:135, 2006).

[0081] U drugim slučajevima, Ključ-ChEM ili T-ChARM mogu dalje da obuhvataju citotoksičnu komponentu (npr., hemoterapeutski lekovi kao što su anti-mitotici (npr., vindezin), antifolati, agensi alkilacije (npr., temozolomid), bakterijski toksini, ricin, anti-virali, radioizotopi, radiometali), koji su korisni za specifično ubijanje ili ometanje kancer ćelija, inficiranih ćelija ili drugih obolelih ćelija. U daljim slučajevima, Ključ-ChEM ili T-ChARM mogu dalje da obuhvataju detektujuću komponentu (npr., biotin, fluorescentna grupa, radionuklid), koji su korisni za praćenje ili snimanje kancer ćelija, inficiranih ćelija, ili drugih tkiva (npr., tkivo pod autoimunim napadom). U daljim slučajevima, Ključ-ChEM ili T-ChARM mogu dalje da obuhvataju funkcionalnu komponentu (npr., imunostimulatorna grupa, citokin, imunološki modulator, imunoglobulinski protein, ili slično).

[0082] Sastavni delovi fuzionog proteina ovog otkrivanja detaljnije su opisani u nastavku.

Označena kaseta

[0083] Označena kaseta sadržana u jednolančanom fuzionom proteinu u skladu sa ovim otkrivanjem (npr., Ključ-ChEM ili T-ChARM) biće ekstracelularna komponenta koja se specifično vezuje za srodni

2

receptor ili vezujući partner (npr., antitelo) sa visokim afinitetom ili težnjom, pri čemu je taj srodni receptor ili vezujući partner heterologan ili ne-endogen za domaćina ili ćeliju koja eksprimira Ključ-ChEM ili T-ChARM. Unutar strukture jednolančanog fuzionog proteina, označena kaseta može biti locirana (a) neposredno amino-terminalno za konektorski region, (b) umetnuta između i koja spaja vezne module, (c) neposredno karboksi-terminalno za vezujući domen, (d) umetnuta između i koja spaja vezujući domen (npr., scFv) za efektorski domen, (e) umetnuta između i koja spaja podjedinice vezujućeg domena, ili (f) na amino-terminusu jednolančanog fuzionog proteina ovog otkrivanja. U određenim slučajevima, jedna ili više spojnih aminokiselina mogu biti raspoređene između i koje spajaju označenu kasetu sa hidrofobnim delom, ili raspoređene između i koje spajaju označenu kasetu sa konektorskim regionom, ili raspoređene između i koje spajaju označenu kasetu sa veznim modulom, ili raspoređene između i koje spajaju označenu kasetu sa vezujućim domenom.

[0084] Primerne označene kasete uključuju Strep oznaku (koja je ovde označena kao original Strep® oznaka, Strep® oznaka II, ili bilo koja njihova varijanta; videti, npr., U.S. Patent Br.7,981,632,), His oznaku, Flag oznaku (SEQ ID NO.:3), Xpress oznaku (SEQ ID NO.:4), Avi oznaku (SEQ ID NO.:5), Kalmodulin oznaku (SEQ ID NO.:19), Poliglutamat oznaku, HA oznaku (SEQ ID NO.:6), Myc oznaku (SEQ ID NO.:7), Nus oznaku, S oznaku, SBP oznaku, Soft oznaku 1 (SEQ ID NO.:9), Soft oznaku 3 (SEQ ID NO.:32), V5 oznaku (SEQ ID NO.:8), CREB-vezujući protein (CBP), glutation S-transferazu (GST), maltoza vezujući protein (MBP), zeleno fluorescentni protein (GFP), Tioredoksin oznaku, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U određenim načinima ostvarivanja, označena kaseta je Strep oznaka koja ima aminokiselinsku sekvencu od Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO.:1) ili Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (SEQ ID NO.:2). Ovde je opisana označena kaseta koja može biti genetski konstruisano afinitetno mesto, kao što je mesto minimanlne helacije (npr., HGGHHG, SEQ ID NO.:33).

[0085] Označene kasete mogu biti prisutne u više primeraka u fuzionim proteinima ovog otkrivanja. Na primer, fuzioni protein ovog otkrivanja može da ima jednu, dve, tri, četiri ili pet označenih kaseta (npr., Strep oznaku). U određenim slučajevima, konektorski region za Ključ-ChEM ili T-ChARM uključuje jednu označenu kasetu, dve označene kasete, tri označene kasete, četiri označene kasete, ili pet označenih kaseta. Svaka od većeg broja označenih kaseta može biti ista ili različita. Ovde je opisan Ključ-ChEM ili T-ChARM koji ima Strep oznaku i Strep označenu kasetu, ili His oznaku i Strep označenu kasetu, ili HA oznaku i Strep označenu kasetu, ili Myc oznaku i Strep označenu kasetu. Alternativno, Ključ-ChEM ili T-ChARM imaju višestruko označene kasete istog tipa ili istu aminokiselinsku sekvencu, kao što je dve, tri, četiri ili pet Strep označenih kaseta (npr., Strep oznaka II).

[0086] Na primer, Ključ-ChEM ili T-ChARM mogu da imaju najmanje dve različite označene kasete. U nekim slučajevima, prva označena kaseta može da obezbedi stimulacioni signal, a različita druga označena kaseta može se primeniti da se poveže sa detektujućim reagensom ili poveže sa antitelotoksin konjugatom ili sa antitelo-agens za slikanje konjugatom. U daljim slučajevima, dve ili više prvih označenih kaseta mogu biti locirane u različitim oblastima Ključ-ChEM ili T-ChARM. U određenim slučajevima, prva označena kaseta je locirana u konektorskom regionu, a druga označena kaseta je locirana na amino-terminusu ili karboksi terminusu ili oba Ključ-ChEM ili T-ChARM (videti, npr., FIG.1H).

[0087] U određenim načinima ostvarivanja, označena kaseta obuhvata od oko pet do oko 500 aminokiselina, ili od oko šest do oko 100 aminokiselina, ili od oko sedam do oko 50 aminokiselina, ili od oko osam do oko 20 aminokiselina. U nekim načinima ostvarivanja, označena kaseta ima sedam do deset aminokiselina. Poželjno, označena kaseta je ne-imunogena ili minimalno imunogena. Suštinski, označena kaseta može da funkcioniše kao ručka ili svetionik radi omogućavanja identifikacije, obogaćivanja, izolovanja, promovisanja proliferacije, aktivacije, praćenja, ili eliminisanja ćelija koje eksprimiraju Ključ-ChEM ili T-ChARM.

[0088] U određenim načinima ostvarivanja, označena kaseta je locirana unutar konektorskog regiona fuzionog proteina ovog otkrivanja. Na primer, konektorski region može dalje da obuhvata vezni modul susedan sa označenom kasetom, pri čemu vezni modul sa označenom kasetom ima aminokiselinsku sekvencu od (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO.:20), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2(SEQ ID NO.:21), (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO.:22), Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2(SEQ ID NO.:23), (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQID NO.:24), ili Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2(SEQ ID NO.:25).

[0089] Jednolančani fuzioni protein koji obuhvata jednu ili više označenih kaseta kako je ovde opisano mogao bi da se udruži sa srodnim vezujućim partnerom, pri čemu je taj srodni vezujući partner heterologan sa domaćinom ili ćelijom koja eksprimira fuzioni protein koji obuhvata označenu kasetu kako je ovde opisano. Označena kaseta prisutna u jednolančanim Ključ-ChEM ili T-ChARM ovog otkrivanja je Strep oznaka, koja ima streptavidin, streptactin ili oba kao srodni vezujući partner.

[0090] U određenim načinima ostvarivanja, srodni vezujući partner (npr., receptor, protein, antitelo) može biti rastvoriv, deo matriksa kompozicije, ili konjugovan za čvrstu površinu (npr., ploča, perlica). Primerne čvrste površine uključuju perlice i čestice (npr., mikro i nano), kao što su magnetske perlice i čestice.

[0091] U načinima ostvarivanja jednolančanog T-ChARM fuzionog proteina, proteinski kompleks može se formirati između fuzionog proteina i srodnog vezujućeg partnera označene kasete, što je rezultat vezivanja između označene kasete i vezujućeg partnera. U određenim načinima ostvarivanja, T-ChARM obuhvata scFv ili scTCR vezujući domen u kojem je označena kaseta locirana unutar veznika varijabilnih regiona (između podjedinica vezujućih domena). U drugim načinima ostvarivanja, T-ChARM ima

2

označenu kasetu lociranu na amino-terminusu vezujućeg domena. U takvim proteinskim kompleksima ili strukturama fuzionog proteina, T-ChARM vezujući domen zadržava svoju ciljanu specifičnost ili svoj specifičan ciljni vezujući afinitet.

Konektorski region i Zglob

[0092] Konektorski region koji obuhvata zglob u jednolančanom fuzionom proteinu u skladu sa ovim otkrivanjem može biti lociran (a) neposredno amino-terminalno za hidrofobni deo, (b) umetnut između i koji spaja označenu kasetu (npr., Strep oznaka) i efektorski domen, (c) neposredno karboksi-terminalno za vezujući domen, ili (d) umetnut između i koji spaja vezni modul i efektorski domen. Jednolančani fuzioni protein koji obuhvata konektorski region sa zglobom kako je ovde opisano može da se udruži sa još jednim jednolančanim fuzionim proteinom radi obrazovanja dimera (npr., homodimer ili heterodimer), pri čemu Ključ-ChEM ili T-ChARM dimer sadrži jednu ili više označenih kaseta koje mogu da se vežu za srodni vezujući partner, a T-ChARM dimer dalje obuhvata vezujući domen koji zadržavaju njegovu ciljnu specifičost ili njegov specifičan ciljani vezujući afinitet.

[0093] Konektorski region može biti sačinjen samo od zgloba, samo od veznih modula, zgloba i veznih modula, ili zgloba, jednog ili više veznih modula i jedne ili više označenih kaseta. U određenim načinima ostvarivanja, vezni moduli uključuju od oko dva do oko 20 aminokiselina koje obrazuju fleksibilnu strukturu. Primerni vezni moduli uključuju imunoglobulinski CH2CH3, imunoglobulinski CH3, ili jedan ili više GlyxSery, pri čemu x i y nezavisno predstavljaju ceo broj od 0 do 10 pod uslovom da x i y nisu oba 0 (npr., (Gly4Ser)2(SEQ ID NO: 67), (Gly3Ser)2(SEQ ID NO: 68), Gly2Ser, ili njihova kombinacija kao što je (Gly3Ser)2Gly2Ser) (SEQ ID NO: 69). U daljim načinima ostvarivanja, konektorski region obuhvata označenu kasetu. Na primer, konektorski region sadrži od jedan do pet označenih kaseta, pri čemu je svaka označena kaseta povezana sa jednim ili dva vezna modula koji obuhvataju (GlyxSery)n, pri čemu n predstavlja ceo broj od 1 do 10, a x i y nezavisno predstavljaju ceo broj od 0 do 10 pod uslovom da x i y nisu oba 0. Primerni vezni moduli imaju aminokiselinsku sekvencu od Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO.:10), (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2(SEQ ID NO.:11), (Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO.:12), koje mogu biti prisutne u bio kojoj kombinaciji unutar konektorskog regiona.

[0094] U određenim slučajevima, zglob prisutan u jednolančanim Ključ-ChEM ili T-ChARM ovog otkrivanja može biti imunoglobulinski region zgloba, kao što je imunoglobulinski region zgloba divljeg tipa ili njegov izmenjen imunoglobulinski region zgloba. U određenim načinima ostvarivanja, zglob je humimunoglobulinski region zgloba divljeg tipa. U određenim drugim načinima ostvarivanja, jedan ili više aminokiselinskih ostataka može biti dodat na amino- ili karboksi-terminusu imunoglobulinskog region zgloba divljeg tipa kao deo dizajna konstrukta fuzionog proteina. Na primer, jedan, dva ili tri dodatna ostatka spojnih aminokiselina može biti prisutno na zglobnom amino-terminusu ili karboksi-

2

terminusu, ili zglob može da sadrži terminalno ili unutrašnje brisanje i može mu se dodati jedan, dva ili tri dodatna ostatka spojnih aminokiselina.

[0095] U određenim načinima ostvarivanja, zglob je izmenjeni imunoglobulinski zglob u kojem je jedan ili više cisteinskih ostataka u imunoglobulinskom regionu zgloba divljeg tipa supstituisano jednim ili više od drugih aminokiselinskih ostataka. Primerni izmenjeni imunoglobulinski zglobovi uključuju imunoglobulinski humani IgG1, IgG2 ili IgG4 region zgloba koji ima jedan, dva ili tri cisteinska ostatka pronađena u humanom IgG1, IgG2or IgG4 zglobu divljeg tipa supstituisana jednim, dva ili tri različita aminokiselinska ostatka (npr., serin ili alanin). U određenim načinima ostvarivanja, polipeptid zgloba obuhvata ili je sekvenca koja je najmanje 80%, najmanje 81%, najmanje 82%, najmanje 83%, najmanje 84%, najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% identična imunoglobulinskom regionu zgloba divljeg tipa, kao što je humani IgG1 zglob divljeg tipa, humani IgG2 zglob divljeg tipa, ili humani IgG4 zglob divljeg tipa.

[0096] U nekim slučajevima, zglob prisutan u jednolančanim Ključ-ChEM ili T-ChARM ovog otkrivanja može biti zglob koji nije na bazi ili izveden iz imunoglobulinskog zgloba (tj., nije imunoglobulinski zglob divljeg tipa ili izmenjen imunoglobulinski zglob). Primeri takvih zglobova uključuju peptide od oko pet do oko 150 aminokiselina regiona stabla tipa II C-lektinskih ili CD molekula, uključujući peptide od oko osam do oko 25 aminokiselina ili peptide od oko sedam do oko 18 aminokiselina, ili njihove varijante.

[0097] "Region stabla" tipa II C-lektinskih ili CD molekula odnosi se na deo ekstracelularnog domena tipa II C-lektinskih ili CD molekula koji je lociran između C-tipa lektinskog domena (CTLD; npr., nalik CTLD receptorima prirodnih ćelija ubica) i hidrofobnog dela (transmembranski domen). Na primer, ekstracelularni domen humanog CD94 (GenBank Pristupni Br. AAC50291.1) odgovara aminokiselinskim ostacima 34-179, ali CTLD odgovara aminokiselinskim ostacima 61-176, tako da region stabla humanog CD94 molekula obuhvata aminokiselinske ostatke 34-60, koji su locirani između hidrofobnog dela (transmembranski domen) i CTLD (videti Boyington et al., Immunity 10:75, 1999; za opise drugih regiona stabla, videti takođe Beavil et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89:753, 1992; i Figdor et al., Nat. Rev.

Immunol.2:77, 2002). Ovi tip II C-lektinski ili CD molekuli takođe mogu da imaju spojne aminokiseline između regiona stabla i transmembranog regiona ili CTLD. U još jednom primeru, 233 aminokiselinski humani NKG2A protein (GenBank Pristupni Br. P26715.1) ima hidrofobni deo (transmembranski domen) koji se kreće od aminokiselina 71-93 i ekstracelularni domen koji se kreće od aminokiselina 94-233. CTLD obuhvata aminokiseline 119-231, a region stabla obuhvata aminokiseline 99-116, koje mogu biti flankirane dodatnim spojnim aminokiselinama. Drugi tip II C-lektinski ili CD molekuli, kao i njihovi ekstracelularni veznik-vezujući domeni, regioni stabla, i CTLDs poznati su u struci (videti, npr., GenBank Pristupni Br. NP_001993.2; AAH07037.1; NP_001773.1; AAL65234.1; CAA04925.1; za sekvence humanih CD23, CD69, CD72, NKG2A i NKG2D i njihovi opisi, respektivno).

2

[0098] "Derivat" stabla regiona zgloba, ili njegovog fragmenta, tipa II C-lektinskog ili CD molekula uključuje oko osam do oko 150 aminokiselinskih sekvenci u kojima jedan, dva, ili tri aminokiselinska regiona stabla tipa II C-lektinskog ili CD molekula divljeg tipa imaju brisanje, umetanje, supstituciju, ili bilo koju njihovu kombinaciju. Primera radi, derivat može da obuhvata jednu ili više aminokiselinskih supstitucija i/ili aminokiselinskog brisanja. U određenim načinima ostvarivanja, derivat regiona stabla je otporniji na proteolitičko cepanje u poređenju sa sekvencom regiona stabla divljeg tipa, kao što su one izvedene iz oko osam do oko 20 aminokiselina iz NKG2A, NKG2D, CD23, CD64, CD72, ili CD94.

[0099] U određenim načinima ostvarivanja, zglobovi regiona stabla mogu da obuhvataju od oko sedam do oko 18 aminokiselina i mogu da formiraju α-spiralno namotanu kalem strukturu. U određenim načinima ostvarivanja, zglobovi regiona stabla sadrže 0, 1, 2, 3, ili 4 cisteina. Primerni zglobovi regiona stabla uključuju fragmente regiona stabla, kao što su oni delovi koji obuhvataju od oko deset do oko 150 aminokiselina regiona stabla iz CD69, CD72, CD94, NKG2A i NKG2D.

[0100] Alternativni zglobovi koji se mogu primeniti u jednolančanim Ključ-ChEMs ili T-ChARMs ovog otkrivanja su iz delova receptora ćelijske površine (interdomenski regioni) koji povezuju imunoglobulinski V-nalik ili imunoglobulinske C-nalik domene. Regioni između Ig V-nalik domena u kojima receptor ćelijske površine sadrži više Ig V-nalik domena u tandemu i između Ig C-nalik domena gde receptor ćelijske površine sadrži više tandem Ig C-nalik regiona takođe se smatraju zglobovima korisnim u jednolančanim Ključ-ChEMs ili T-ChARMs ovog otkrivanja. U određenim načinima ostvarivanja, zglob sekvence sastavljene od interdomenskih regiona receptora ćelijske površine mogu dalje da sadrže prirodni ili dodat motiv, kao što je IgG jezgarna sekvenca zgloba da bi se obezbedile jedna ili više disulfidnih veza za stabilisanje formiranja Ključ-ChEM ili T-ChARM dimera. Primeri zglobova uključuju interdomenske regione između Ig V-nalik i Ig C-nalik regiona od CD2, CD4, CD22, CD33, CD48, CD58, CD66, CD80, CD86, CD150, CD166, ili CD244.

[0101] U određenim načinima ostvarivanja, zglob sekvence imaju od oko 5 do oko 150 aminokiselina, oko 5 do oko 10 aminokiselina, oko 10 do oko 20 aminokiselina, oko 20 do oko 30 aminokiselina, oko 30 do oko 40 aminokiselina, oko 40 do oko 50 aminokiselina, oko 50 do oko 60 aminokiselina, oko 5 do oko 60 aminokiselina, oko 5 do oko 40 aminokiselina, primera radi, oko 8 do oko 20 aminokiselina ili oko 10 do oko 15 aminokiselina. Zglobovi mogu biti primarno fleksibilni, ali takođe mogu da obezbede kruće karakteristike ili mogu da sadrže primarno α-spiralnu strukturu sa minimalnom β-listastom strukturom.

[0102] U određenim načinima ostvarivanja, sekvenca zgloba je stabilna u plazmi i serumu, i otporna je na proteolitičko cepanje. Na primer, prvi lizin u IgG1 gornjem regionu zgloba može biti mutiran ili obrisan da bi se smanjilo proteolitičko cepanje, a zglobovi mogu da uključuju spojne aminokiseline. U nekim načinima ostvarivanja, sekvenca zgloba može da sadrži prirodni ili dodati motiv, kao što je jezgarna struktura imunoglobulinskog zgloba CPPCP (SEQ ID NO.:26) koja dodeljuje kapacitet da se obrazuje disulfidna veza ili više disulfidnih veza radi stablizacije formiranja dimera.

2

Hidrofobni Deo

[0103] Hidrofobni deo sadržan u jednolančanom fuzionom proteinu ovog otkrivanja (npr., Ključ-ChEM ili T-ChARM) omogućava da se fuzioni protein ovog otkrivanja poveže sa celularnom membranom tako da je deo fuzionog proteina lociran ekstracelularno (npr., označena kaseta, konektorski domen, vezujući domen), a deo je lociran intracelularno (npr., efektorski domen). Hidrofobni deo generalno je raspoređen unutar fosfolipidnog dvosloja celularne membrane. U određenim načinima ostvarivanja, jedna ili više spojnih aminokiselina mogu biti raspoređene između i koje spajaju hidrofobni deo sa efektorskim domenom, ili raspoređene između i koje spajaju hidrofobni deo sa konektorskim regionom, ili raspoređene između i koje spajaju hidrofobni deo sa označenom kasetom.

[0104] U određenim načinima ostvarivanja, hidrofobni domen predstavlja transmembranski domen, kao što je onaj izveden iz integralnog proteina membrane (npr., receptor, molekul klastera diferencijacije (CD), enzim, transporter, molekul ćelijske adhezije, ili slično). U određenim načinima ostvarivanja, hidrofobni deo predstavlja transmembranski domen iz CD4, CD8, CD27, ili CD28. U određenim načinima ostvarivanja, transmembranski domen predstavlja CD28 transmembranski domen koji ima aminokiselinu kakva je navedena u SEQ ID NO.:16.

Efektorski Domen

[0105] Efektorski domen sadržan u jednolančanom fuzionom proteinu ovog otkrivanja (npr., Ključ-ChEM ili T-ChARM) biće intracelularna komponenta i može da transmituje funkcionalne signale do ćelije. U određenim slučajevima, jednolančani Ključ-ChEM ili T-ChARM dimerišu sa drugim jednolančanim Ključ-ChEM ili T-ChARM, respektivno, pri čemu ta dimerizacija omogućava da intracelularna komponenta koja obuhvata efektorske domene bude u velikoj blizini i da promoviše signalnu transdukciju kada je izložena odgovarajućem signalu. Pored obrazovanja takvih dimernih proteinskih kompleksa, efektorski domeni mogu dalje da se povežu sa drugim signalizirajućim faktorima, kao što su kostimulativni faktori, da obrazuju multiproteinske komplekse koji proizvode intracelularni signal. U određenim načinima ostvarivanja, efektorski domen indirektno promoviše celularni odgovor udruživanjem sa jednim ili više drugih proteina koji direktno promovišu celularni odgovor. Efektorski domen može da uključuje jedan, dva, tri ili više receptor signalizirajućih domena, kostimulativnih domena, ili njihove kombinacije. Bilo koja intracelularna komponenta koja obuhvata efektorski domen, kostimulativni domen ili oba od bilo kojeg od različitih signalizirajućih molekula (npr., receptori signalne transdukcije) mogu se primeniti u fuzionim proteinima ovog otkrivanja.

[0106] Efektorski domen koristan u fuzionim proteinima ovog otkrivanja može biti iz proteina Wnt signalizirajućeg puta (npr., LRP, Ryk, ROR2), NOTCH signalizirajućeg puta (npr., NOTCH1, NTOCH2, NOTCH3, NOTCH4), Hedgehog signalizirajućeg puta (npr., PTCH, SMO), receptor tirozin kinaza (RTKs)

2

(npr., familija receptora epidermalnog faktora rasta (EGF), familija receptora faktora rasta fibroblasta (FGF), familija receptora hepatocitnog faktor rasta (HGF), insulin receptorska (IR) familija, familija receptora faktora rasta (PDGF) izvedenih iz trombocita, familija receptora vaskularnog endotelijalnog faktora rasta (VEGF), familija receptora tropomicin receptor kinaze (Trk), efrinska (Eph) familija receptora, AXL familija receptora, familija receptora leukocitne tirozin kinaze (LTK), familija receptora tirozin kinaze sa imunoglobulinski-nalik i EGF-nalik domenima 1 (TIE), familija receptora receptor tirozin kinaza-nalik orfana (ROR), familija receptora diskoidin domena (DDR), familija receptora ponovo raspoređena tokom transfekcije (RET), tirozin-protein kinaza-nalik (PTK7) familija receptora, familija receptora povezana sa receptor tirozin kinazom (RYK), familija receptora za mišiće specifične kinaze (MuSK)); G-protein-kuplovani receptori, GPCRs (Frizzled, Smoothened); serin/treonin kinaza receptori (BMPR, TGFR); ili citokin receptori (IL1R, IL2R, IL7R, IL15R).

[0107] U određenim načinima ostvarivanja, efektorski domen obuhvata limfocit receptor signalizirajući domen ili obuhvata aminokiselinske sekvence koje imaju jedan ili veći broj imunoreceptor tirozinskih aktivacionih motiva (ITAMs). U još daljim načinima ostvarivanja, efektorski domen obuhvata citoplazmatski deo koji je povezan sa citoplazmatskim signalizirajućim proteinom, pri čemu taj citoplazmatski signalizirajući protein predstavlja limfocitni receptor ili njegov signalizirajući domen, protein koji obuhvata veći broj ITAMs, kostimulativni faktor, ili bilo koju njihovu kombinaciju.

[0108] Primerni efektorski domeni uključuju one iz 4-1BB (npr., SEQ ID NO.:17), CD3ε, CD3δ, CD3ζ (npr., SEQ ID NO.:18), CD27, CD28 (npr., SEQ ID NO.:35), CD79A, CD79B, CARD11, DAP10, FcRα, FcRβ, FcRγ, Fyn, HVEM, ICOS, Lck, LAG3, LAT, LRP, NOTCH1, Wnt, NKG2D, OX40, ROR2, Ryk, SLAMF1, Slp76, pTα, TCRα, TCRβ, TRIM, Zap70, PTCH2, ili bilo koju njihovu kombinaciju.

[0109] U određenim slučajevima, efektorski domen Ključ-ChEM ili T-ChARM predmetnog otkrivanja je CD3ζ i CD28, is CD3ζ i 4-1BB, ili is CD3ζ, CD28 i 4-1BB.

Vezujući Domen

[0110] Kako je ovde opisano, T-ChARM jednolančani fuzioni protein ovog otkrivanja obuhvata vezujući domen koji specifično vezuje metu. Vezivanjem mete vezujućim domenom može da blokira interakciju između mete (npr., receptora ili veznika) i još jednog molekula i, na primer, da utiče na, redukuje ili eliminiše određen funkcije mete (npr., signalnu transdukciju), ili vezivanje mete može da indukuje određene biološke puteve ili identifikuje metu za eliminisanje.

[0111] Vezujući domen može biti bilo koji peptid koji specifično vezuje metu od interesa. Izvori vezujućih domena uključuju varijabilne regione antitela iz raznih vrsta (koje mogu biti u obliku antitela, sFvs, scFvs, Fabs, scFv-baziran grabatela, ili rastvorivog VH domena ili domena antitela), uključujući humane, glodarske, avijan, ili ovčije. Dodatni izvori vezujućih domena uključuju varijabilne regione antitela iz drugih vrsta, kao što je kamelid (iz kamila, dromedara, ili lama; Ghahroudi et al., FEBS Lett.414:521, 1997; Vincke et al., J. Biol. Chem.284:3273, 2009; Hamers-Casterman et al., Nature 363:446, 1993 i Nguyen et al., J. Mol. Biol.275:413, 1998), peščane ajkule (Roux et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 95:11804, 1998), tačkaste ribe pacov (Nguyen et al., Immunogen.54:39, 2002), ili zmijuljice (Herrin et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 105:2040, 2008 i Alder et al. Nat. Immunol.9:319, 2008). Ova antitela mogu formirati antigen-vezujući regione primenom samo varijabilnog regiona teškog lanca, tj., ova funkcionalna antitela su homodimeri samo teških lanaca (označena kao "antitela teškog lanca") (Jespers et al., Nat. Biotechnol.22:1161, 2004; Cortez-Retamozo et al., Cancer Res.64:2853, 2004; Baral et al., Nature Med.12:580, 2006; i Barthelemy et al., J. Biol. Chem.283:3639, 2008).

[0112] Alternativni izvor vezujućih domena ovog otkrivanja uključuje sekvence koje kodiraju nasumične peptidne biblioteke ili sekvence koje kodiraju konstruisanu različitost aminokiselina u regionima petlje alternativnih skfaolda bez antitela, kao što je scTCR (videti, npr., Lake et al., Int. Immunol.11:745, 1999; Maynard et al., J. Immunol. Methods 306:51, 2005; U.S. Patent Br.8,361,794), fibrinogen domeni (videti, npr., Weisel et al., Science 230:1388, 1985), Kunitz domeni (videti, npr., US Patent Br.6,423,498), dizajnirani proteini ankirinskog ponavljanja (DARPins) (Binz et al., J. Mol. Biol.332:489, 2003 i Binz et al., Nat. Biotechnol.22:575, 2004), fibronektin vezujući domeni (adnektini ili monotela) (Richards et al., J. Mol. Biol.326:1475, 2003; Parker et al., Protein Eng. Des. Selec.18:435, 2005 i Hackel et al. (2008) J. Mol. Biol.381:1238-1252), miniproteini cisteinskog čvora (Vita et al. (1995) Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 92:6404-6408; Martin et al. (2002) Nat. Biotechnol.21:71, 2002 i Huang et al. (2005) Structure 13:755, 2005), domeni tetratrikopeptidnog ponavljanja (Main et al., Structure 11:497, 2003 i Cortajarena et al., ACS Chem. Biol.3:161, 2008), domeni bogati leucinskim ponavljanjem (Stumpp et al., J. Mol. Biol.

332:471, 2003), lipokalinski domeni (videti, npr., WO 2006/095164, Beste et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 96:1898, 1999 i Schönfeld et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 106:8198, 2009), V-nalik domeni (videti, npr., US Objava patentne prijave Br.2007/0065431), C-tip lektinski domeni (Zelensky i Gready, FEBSJ.272:6179, 2005; Beavil et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 89:753, 1992 i Sato et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA) 100:7779, 2003), mAb<2>ili Fcab™ (videti, npr., PCT Objava patentne prijave Br. WO 2007/098934; WO 2006/072620), proteini armadilo ponavljanja (videti, npr., Madhurantakam et al., Protein Sci.21: 1015, 2012; PCT Objava patentne prijave Br. WO 2009/040338), afilin (Ebersbach et al., J. Mol. Biol.372: 172, 2007), afitelo, avimeri, knotini, finomeri, atrimeri, citotoksični T-limfocit povezan protein-4 (Weidle et al., Cancer Gen. Proteo.10:155, 2013) ili slično (Nord et al., Protein Eng.8:601, 1995; Nord et al., Nat. Biotechnol.15:772, 1997; Nord et al., Euro. J. Biochem.268:4269, 2001; Binz et al., Nat. Biotechnol.23:1257, 2005; Boersma i Pluckthun, Curr. Opin. Biotechnol.22:849, 2011).

[0113] Vezujući domeni ovog otkrivanja mogu biti generisani kako je ovde opisano ili različitim postupcima poznatim u struci (videti, npr., U.S. Patent Br.6,291,161 i 6,291,158). Na primer, vezujući domeni ovog otkrivanja mogu biti identifikovani skriningom biblioteke Fab faga za Fab fragmente koji se specifično vezuju za metu od interesa (videti Hoet et al., Nat. Biotechnol.23:344, 2005). Dodatno,

1

tradicionalne strategije za razvoj hibridoma primenom mete od interesa kao imunogena u pogodnim sistemima (npr., miševi, HuMAb miš®, TC miš™, KM-miš®, lame, pilići, pacovi, hrčci, zečevi, itd.) mogu se primeniti za razvijanje vezujućih domena ovog otkrivanja.

[0114] U nekim načinima ostvarivanja, vezujući domen je jednolančani Fv fragment (scFv) koji obuhvata VH i VL regione specifične za metu od interesa. U određenim načinima ostvarivanja, VHi VLregioni su humani. Primerni VHi VLregioni uključuju segmente anti-CD 19 specifičnog monoklonalnog antitela FMC63 (videti, npr., SEQ ID NO.:51 i 52, respektivno).

[0115] U određenim načinima ostvarivanja, vezujući domen obuhvata ili je sekvenca koja je najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, najmanje 99.5%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci varijabilnog regiona lakog lanca (VL) (npr., iz FMC63, SEQ ID NO.:52; iz R12, SEQ ID NO.:56) ili varijabilnog regiona teškog lanca (VH) (npr., iz FMC63, SEQ ID NO.:51; iz R12, SEQ ID NO.:55), ili oba, pri čemu svaka CDR obuhvata nula promena ili najviše jednu, dve, ili tri promene, iz monoklonalnog antitela ili njegovog fragmenta ili derivata koji se specifično vezuje za metu od interesa (npr., CD19, ROR1).

[0116] U određenim načinima ostvarivanja, VHregion vezujućeg domena ovog otkrivanja može biti izveden iz ili na bazi VHpoznatog monoklonalnog antitela i sadrži jedno ili više (npr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) umetanja, jedno ili više (npr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) brisanja, jednu ili više (npr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) aminokiselinskih supstitucija (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije ili ne-konzervativne aminokiselinske supstitucije), ili kombinaciju prethodno navedenih promena, kada se uporedi sa VHpoznatog monoklonalnog antitela. Umetanje, brisanje ili supstitucija mogu biti bilo gde u VHregionu, uključujući na amino- ili karboksi-terminusu ili oba kraja ovog regiona, pod uslovom da svaki CDR obuhvata nula promena ili najviše jednu, dve, ili tri promene i pod uslovom da vezujući domen koji sadrži modifikovani VHregion može i dalje da specifično veže svoju metu sa afinitetom sličnim onom kod vezujućeg domena divljeg tipa.

[0117] U daljim načinima ostvarivanja, VLregion u vezujućem domenu ovog otkrivanja izveden je iz ili je na bazi VLpoznatog monoklonalnog antitela i sadrži jedno ili više (npr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) umetanja, jedno ili više (npr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) brisanja, jednu ili više (npr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) aminokiselinskih supstitucija (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije), ili kombinaciju prethodno navedenih promena, kada se uporedi sa VLpoznatog monoklonalnog antitela. Umetanje, brisanje ili supstitucija mogu biti bilo gde u VLregionu, uključujući na amino- ili karboksi-terminusu ili oba kraja ovog regiona, pod uslovom da svaki CDR obuhvata nula promena ili najviše jednu, dve, ili tri promene i pod uslovom da vezujući domen koji sadrži modifikovani VLregion može i dalje da specifično veže svoju metu sa afinitetom sličnim onom kod vezujućeg domena divljeg tipa.

[0118] VHi VLdomeni mogu biti raspoređeni ili orijentisani (tj., od amino-terminusa do karboksilnog terminusa, VH-VLili VL-VH) i mogu biti spojeni aminokiselinskom sekvencom (npr., koji ima dužinu od oko

2

pet do oko 35 aminokiselina) koja može da obezbedi spejser funkciju tako da dva pod-vezujuća domena mogu međusobno da dejstvuju da obrazuju funkcionalan vezujući domen. U određenim načinima ostvarivanja, veznik varijabilnih regiona koji spaja VHi VLdomene uključuje one koji pripadaju (GlynSer) familiji, kao što je (Gly3Ser)n(Gly4Ser)1(SEQ ID NO: 72), (Gly3Ser)1(Gly4Ser)n(SEQ ID NO: 72), (Gly3Ser)n(Gly4Ser)n(SEQ ID NO: 72), ili (Gly4Ser)n(SEQ ID NO: 10), pri čemu n je neki ceo broj od 1 do 5. U određenim načinima ostvarivanja, veznik je (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3(SEQ ID NO.:13) ili Gly-Gly-Gly-Ser)4(SEQ ID NO.:14). U određenim načinima ostvarivanja, ovi (GlynSer)-bazirani veznici upotrebljeni su za spajanje VHi VLdomena u vezujućem domenu, i ovi veznici takođe se mogu primeniti da spoje vezujući domen za konektorski region ili za označenu kasetu, ili da spoje označenu kasetu za efektorski domen. U određenim drugim načinima ostvarivanja, označena kaseta je deo ili je locirana unutar (GlynSer)-baziranog veznika koji se primenjuje da spoji VHi VLdomene vezujućeg domena. U nekim slučajevima, (GlynSer)-baziran veznik može se primeniti za poveže jednu ili više označenih kaseta sa N-terminalnim krajem T-ChARM vezujućeg domena.

[0119] U nekim načinima ostvarivanja, vezujući domen je jednolančani T ćelijski receptor (scTCR) koji obuhvata Vα/βi Cα/βlance (npr., Vα-Cα, Vβ-Cβ, Vα-Vβ) ili koji obuhvata Vα-Cα, Vβ-Cβ, Vα-Vβpar specifičan za metu od interesa (npr., peptid-MHC kompleks).

[0120] U određenim načinima ostvarivanja, vezujući domen obuhvata ili je sekvenca koja je najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, najmanje 99.5%, ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci od TCR Vα, Vβ, Cα, ili Cβ, pri čemu svaki CDR obuhvata nula promena ili najviše jednu, dve, ili tri promene, iz TCR ili njegovog fragmenta ili derivata koji se specifično vezuje za metu od interesa.

[0121] U određenim načinima ostvarivanja, vezujući domen Vα, Vβ, Cα, ili Cβregion ovog otkrivanja mogu biti izveden iz ili na bazi Vα, Vβ, Cα, ili Cβpoznatog TCR (npr., visoko-afinitetan TCR) i sadrže jedno ili više (npr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) umetanja, jedno ili više (npr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) brisanja, jednu ili više (npr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10) aminokiselinskih supstitucija (npr., konzervativne aminokiselinske supstitucije ili ne-konzervativne aminokiselinske supstitucije), ili kombinaciju prethodno navedenih promena, kada se uporedi sa Vα, Vβ, Cα, ili Cβpoznatog TCR. Umetanje, brisanje ili supstitucija mogu biti bilo gde u Vα, Vβ, Cα, ili Cβregionu, uključujući na amino- ili karboksi-terminusu ili oba kraja ovih regiona, pod uslovom da svaki CDR obuhvata nula promena ili najviše jednu, dve, ili tri promene i pod uslovom da vezujući domen koji sadrži modifikovani Vα, Vβ, Cα, ili Cβregion može i dalje da specifično veže svoju metu sa afinitetom sličnim onom kod divljeg tipa.

[0122] Ciljani molekul, koji je specifično vezan vezujućim domenom sadržanim u T-ChARM jednolančanom fuzionom proteinu ovog otkrivanja, može biti onaj koji se može naći na ili u vezi sa ćelijom od interesa ("ciljna ćelija"). Primerne ciljane ćelije uključuju kancer ćeliju, ćeliju povezanu sa autoimunom bolešću ili poremećajem ili sa zapaljenskom bolešću ili poremećajem, i infektivni organizam ili ćeliju (npr., bakterija, virus, virus-inficirana ćelija). Ćelija infektivnog organizma, kao što je sisarski parazit, takođe se razmatra kao ciljna ćelija.

[0123] U određenim slučajevima, vezujući domeni T-ChARM jednolančanog fuzionog proteina ovog otkrivanja prepoznaju metu odabranu od grupe koju čine tumor antigen, B-ćelijska meta, član TNF receptor superfamilije, član Hedgehog familije, receptor tirozin kinaza, proteoglikan-povezan molekul, član TGF-β superfamilije, Wnt-povezan molekul, T-ćelijska meta, dendritska ćelijska meta, NK ćelijska meta, monocit/makrofaga ćelijska meta, ili meta angiogeneze. U daljim slučajevima, vezujući domeni T-ChARM jednolančanog fuzionog proteina ovog otkrivanja vezuju receptor protein, kao što su periferni membranski receptor proteini ili transmembranski receptor proteini.

[0124] U određenim slučajevima, T-ChARM jednolančani fuzioni protein ovog otkrivanja specifično vezuje metu, kao što je CD3, CEACAM6, c-Met, EGFR, EGFRvIII, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EphA2, IGF1R, GD2, O-acetil GD2, O-acetil GD3, GHRHR, GHR, FLT1, KDR, FLT4, CD44v6, CD151, CA125, CEA, CTLA-4, GITR, BTLA, TGFBR2, TGFBR1, IL6R, gp130, Lewis A, Lewis Y, TNFR1, TNFR2, PD1, PD-L1, PD-L2, HVEM, MAGE-A, mezotelin, NY-ESO-1, PSMA, RANK, ROR1, TNFRSF4, CD40, CD137, TWEAK-R, HLA, iz tumora ili patogena izvedeni peptidi vezani za HLA (kao što je iz hTERT, tirozinaza, ili WT-1), LTβR, LIFRβ, LRP5, MUC1, OSMRβ, TCRα, TCRβ, CD19, CD20, CD22, CD25, CD28, CD30, CD33, CD52, CD56, CD80, CD81, CD86, CD123, CD171, CD276, B7H4, TLR7, TLR9, PTCH1, PTCH1, Robo1, α-fetoprotein (AFP), Frizzled, OX40 (takođe označen kao CD134), ili CD79b. U određenim slučajevima, T-ChARM jednolančani fuzioni protein ovog otkrivanja specifično se vezuje za patogen specifičan molekul eksprimiran na inficiranim ćelijama, kao što su molekuli iz adenovirusa, buniavirusa, herpesvirusa (npr., Epstein Barr Virus, citomegalocvirus), papovavirusa, papilomavirusa (npr., humani papiloma virus, HPV), paramiksovirusa, pikornavirusa, rabdovirusa (npr., Rabies), otromiksovirusa (npr., influenca), poksvirusa (npr., Vaccinia), reovirusa, retrovirusa, lentivirusa (npr., virus humane imunodeficijencije, HIV), flavivirusa (npr., Hepatitis C virus, HCV; Hepatitis B virus, HBV).

Ćelije domaćini i Nukleinske kiseline

[0125] U određenim aspektima, ovo otkrivanje obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koji ili više od ovde opisanih Ključ-ChEM ili T-ChARM. Takvi molekuli nukleinske kiseline mogu biti umetnuti u pogodan vektor (npr., virusni vektor ili ne-virusni plazmidni vektor) za uvođenje u ćeliju domaćina od interesa (npr., hematopoietična progenitorska ćelija, T ćelija).

[0126] Kako se ovde koristi, pojam "rekombinantni" ili "neprirodni" odnosi se na organizam, mikroorganizam, ćeliju, molekul nukleinske kiseline, ili vektor koji uključuje najmanje jednu genetsku izmenu ili je modifikovan uvođenjem egzogenog molekula nukleinske kiseline, pri čemu se takve izmene ili modifikacije uvode genetskim inženjeringom. Genetske izmene uključuju, na primer, modifikacije koje uvode ekspresibilne molekule nukleinske kiseline koji kodiraju proteine, fuzione proteine ili enzime, ili

4

druga dodavanja, brisanja, supstitucije molekula nukleinske kiseline ili druga funkcionalna remećenja genetskog materijala ćelija. Dodatne modifikacije uključuju, na primer, ne-kodirajuće regulatorne regione u kojima modifikacije menjaju ekspresiju gena ili operona. U određenim slučajevima, ćelija, kao što je T ćelija, dobijena iz subjekta, može biti konvertovana u neprirodnu ili rekombinantnu ćeliju (npr., neprirodna ili rekombinantna T ćelija) uvođenjem nukleinske kiseline koja kodira Ključ-ChEM ili T-ChARM kako je ovde opisano i čime ta ćelija eksprimira ćelijsku površinu lociranu na Ključ-ChEM ili T-ChARM.

[0127] Vektor koji kodira jezgarni virus ovde je označen kao "virusni vektor." Postoji veliki broj dostupnih virusnih vektora pogodnih za primenu sa kompozicijama predmetnog otkrivanja, uključujući one identifikovane za primene u humanoj genskoj terapiji (videti Pfeifer i Verma, Ann. Rev. Genomics Hum. Genet.2:177, 2001). Pogodni virusni vektori uključuju vektore na bazi RNK virusa, kao što su retrovirus-izvedeni vektori, npr., Moloney virus glodarske leukemie (MLV)-izvedeni vektori, i uključuju kompleksnije retrovirus-izvedene vektore, npr., lentivirus-izvedeni vektori. HIV-1-izvedeni vektori pripadaju ovoj kategoriji. Drugi primeri uključuju lentivirus vektore izvedene iz HIV-2, FIV, virus infektivne anemije konja, SIV, i Maedi-Visna virus (ovčiji lentivirus). Postupci primene retrovirusnih i lentivirusnih virusnih vektora i ćelije pakovanja za transdukovanje sisarskih ćelija domaćina sa virusnim česticama koje sadrže himerni antigen receptor transgene, poznati su u struci i prethodno su opisani, na primer, u U.S. Patentu 8,119,772; Walchli et al., PLoS One 6:327930, 2011; Zhao et al., J. Immunol. 174:4415, 2005; Engels et al., Hum. Gene Ther.14:1155, 2003; Frecha et al., Mol. Ther.18:1748, 2010; Verhoeyen et al., Methods Mol. Biol.506:97, 2009. Retrovirusni i lentivirusni vektorski konstrukti i ekspresioni sistemi takođe su komercijalno dostupni.

[0128] U određenim načinima ostvarivanja, virusni vektor koristi se za uvođenje ne-endogene sekvence nukleinske kiseline koja kodira Ključ-ChEM ili ne-endogene sekvence nukleinske kiseline koja kodira T-ChARM specifičan za metu. Virusni vektor može biti retrovirusni vektor ili lentivirusni vektor. Virusni vektor takođe može da uključuje sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju marker za transdukciju. Transdukcioni markeri za virusne vektore poznati su u struci i uključuju markere odabira, koji mogu da dodele otpornost na lek, ili detektujuće markere, kao što je fluorescentni markeri ili proteine ćelijske površine koji mogu biti detektovani postupcima kao što je protočna citometrija. U određenim načinima ostvarivanja, virusni vektor dalje obuhvata genski marker za transdukciju koji obuhvata zeleno fluorescentni protein, ekstracelularni domen humanog CD2, ili okrnjeni humani EGFR

(huEGFRt; videti Wang et al., Blood 118:1255, 2011). Kada genom virusnog vektora obuhvata veći broj sekvenci nukleinske kiseline koje se eksprimiraju u ćeliji domaćina kao odvojeni transkripti, virusni vektor takođe može da obuhvata dodatne sekvence između dva (ili više) transkripta koji omogućavaju bicistroničnu ili multicistroničnu ekspresiju. Primeri takvih sekvenci koje se primenjuju u virusnim vektorima uključuju unutrašnja mesta ulaska ribozoma (IRES), mesta cepanja furina, virusni 2A peptid, ili bilo koju njihovu kombinaciju.

[0129] Drugi vektori takođe se mogu primeniti za dostavu polinukleotida uključujući DNK virusne vektore, uključujući, na primer adenovirus-bazirane vektore i adeno-povezane virusne (AAV)-bazirane vektore; vektore izveden iz herpes simpleks virusa (HSVs), uključujući amplikon vektore, replikacionodefektivne HSV i ateunisane HSV (Krisky et al., Gene Ther.5: 1517, 1998).

[0130] Drugi vektori nedavno razvijeni za primene u genskoj terapiji takođe se mogu primeniti sa kompozicijama i postupcima ovog otkrivanja. Takvi vektori uključuju one izvedene iz bakulovirusa i αvirusa. (Jolly, D J.1999. Emerging Viral Vectors. pp 209-40 in Friedmann T. ed. The Development of Human Gene therapy. New York: Cold Spring Harbor Lab), ili plazmidne vektore (kao što su vektori uspavane lepotice ili drugog transpozona). U nekim načinima ostvarivanja, virusni ili plazmidni vektor dalje obuhvata genski marker za transdukciju (npr. zeleno fluorescentni protein, huEGFRt).

[0131] U određenim slučajevima, hematopoietične progenitorske ćelije ili embrionske matične ćelije modifikovane su da obuhvataju ne-endogeni molekul nukleinske kiseline koji kodira Ključ-ChEM ili T-ChARM ovog otkrivanja. Hematopoietične progenitorske ćelije mogu da obuhvataju timocitne progenitorske ćelije ili indukovane pluripotentne matične ćelije, koje mogu biti izvedene ili potiču iz tkiva jetre fetusa, koštane srži, pupčane krvi, ili periferne krvi. Hematopoietične progenitorske ćelije mogu biti iz čoveka, miša, pacova, ili drugih sisara. U određenim načinima ostvarivanja, upotrebljene su CD24<lo>Lin<->CD117<+>timocitne progenitorske ćelije.

[0132] U određenim načinima ostvarivanja, uslovi uzgajanja zahtevaju uzgajanje hematopoietičnih progenitorskih ćelija koje eksprimiraju fuzione proteine ovog otkrivanja tokom dovoljnog vremena da se indukuje proliferacija ili diferencijacija. Ćelije se održavaju u kulturi generalno tokom oko 3 dana do oko 5 dana, ili oko 4 do oko 10 dana, ili oko 5 do oko 20 dana. Podrazumeva se da ćelije mogu biti održavane tokom pogodnog vremenskog trajanja potrebnog da bi se postigao željeni rezultat, tj., željena celularna kompozicija ili nivo proliferacije. Na primer, za generisanje celularne kompozicije koja obuhvata primarno nezrele i inaktivirane T ćelije, ćelije mogu biti održavane u kulturi tokom oko 5 do oko 20 dana. Ćelije mogu biti održavane u kulturi tokom oko 20 do oko 30 dana za generisanje celularne kompozicije koja obuhvata primarno zrele T ćelije. Ne-adherentne ćelije se takođe mogu sakupiti iz kulture u različitim vremenskim tačkama, kao što je od oko nekoliko dana do oko 25 dana. U određenim načinima ostvarivanja, hematopoietične matične ćelije zajednički su uzgajane na stromalnim ćelijskim linijama (U.S. Patent Br.7,575,925; Schmitt et al., Nat. Immunol.5:410, 2004; Schmitt et al., Immunity 17:749, 2002).

[0133] Jedan ili više citokina koji promovišu privrženost ili diferencijaciju hematopoietičnih progenitorskih ćelija mogu biti dodate kulturi. Citokini mogu biti humani ili ne-humani. Reprezentativni primeri citokina koji se mogu primeniti uključuju sve članove FGF familije, uključujući FGF-4 i FGF-2; Flt3-veznik, faktor matične ćelije (SCF), trombopoietin (TPO), i IL-7. Citokini se mogu primeniti u kombinaciji sa glikozaminoglikanom, kao što je heparin sulfat.

[0134] U nekim načinima ostvarivanja, ćelije koje mogu da eksprimiraju fuzioni protein ovog otkrivanja na ćelijskim površinama su T ćelije, uključujući primarne ćelije ili ćelijske linije izvedene iz čoveka, miša, pacova, ili drugih sisara. Ako je dobijena iz sisara, T ćelija može biti dobijena iz brojnih izvora, uključujući krv, koštane srži, limfni čvor, timus, ili druga tkiva ili tečnosti. T ćelija može biti obogaćena ili prečišćena. T ćelijske linije su dobro poznate u struci, od kojih su neke opisane u Sandberg et al., Leukemia 21:230, 2000. U određenim načinima ostvarivanja, upotrebljene su T ćelije kojima nedostaje endogena ekspresija TCRα i β lanaca. Takve T ćelije mogu prirodno da nemaju endogenu ekspresiju TCRα i β lanaca ili mogu da da budu modifikovane da blokiraju ekspresiju (npr., T ćelije iz transgenog miša koje ne eksprimiraju TCR α i β lance ili ćelije koje su izmenjene da inhibiraju ekspresiju TCR α i β lanaca) ili na knockout TCRα lancu, TCRβ lancu, ili oba gena. U određenim načinima ostvarivanja, ćelije koje mogu da eksprimiraju fuzioni protein ovog otkrivanja na ćelijskoj površini nisu T ćelije ili ćelije T ćelijske linije, već ćelije koje su progenitorske ćelije, matične ćelije ili ćelije koje su modifikovane da eksprimiraju ćelijske površinske anti-CD3.

[0135] U određenim slučajevima, domaćinska T ćelija transfektovana da eksprimira Ključ-ChEM ili T-ChARM ovog otkrivanja je funkcionalna T ćelija, kao što je virus-specifična T ćelija, tumor antigen specifična citotoksična T ćelija, naivna T ćelija, T ćelija memorijskog stabla, T ćelija centralne ili efektorske memorije, ili CD4+ CD25+ regulatorna T ćelija.

[0136] Jedan ili više citokina faktora rasta koji promovišu proliferaciju T ćelija koje eksprimiraju Ključ-ChEM ili T-ChARM ovog otkrivanja mogu biti dodati kulturi. Ti citokini mogu biti humani ili ne-humani. Primerni citokini faktora rasta koji se mogu primeniti da promovišu T ćelijsku proliferaciju uključuju IL2, IL15, ili slično.

Primene

[0137] Bolesti koje mogu biti tretirane ćelijama koje eksprimiraju Ključ-ChEM ili T-ChARM kakvi su opisani u ovom otkrivanju uključuju one odabrane iz grupe koju čine kancer, infektivne bolesti (virusne, bakterijske, protozoan infekcije), imune bolesti (npr., autoimuna), ili sa starenjem povezane bolesti (npr., starenje). Adoptivna imuna i genska terapija su obećavajuća tretiranja za razne vrste kancera (Morgan et al., Science 314:126, 2006; Schmitt et al., Hum. Gene Ther.20:1240, 2009; June, J. Clin. Invest.117:1466, 2007) i infektivne bolesti (Kitchen et al., PLoS One 4:38208, 2009; Rossi et al., Nat. Biotechnol.25:1444, 2007; Zhang et al., PLoS Pathog.6:e1001018, 2010; Luo et al., J. Mol. Med.89:903, 2011).

[0138] Širok spektar kancera, uključujući čvrste tumore i leukemije podložni su ovde opisanim kompozicijama i postupcima. Primerne vrste kancera koje mogu biti tretirane uključuju adenokarcinom dojke, prostate, i debelog creva; svi oblici bronhogenog karcinoma pluća; mijelodina leukemija; melanom; hepatom; neuroblastom; papilom; apudom; horistom; branhiom; maligni karcinoidni sindrom; karcinoidna srčana bolest; i karcinom (npr., Walker, bazalnih ćelija, bazoskvamoznih, Brown-Pearce, duktalni, Ehrlich tumor, Krebs 2, Merkel ćelija, mucinzni, ne-malih ćelija pluća, ovsenih ćelija, papilarni, scirozni, bronhiolarni, bronhogeni, skvamoznih ćelija, i tranzicionih ćelija). Dodatne vrste kancera koje mogu biti tretirane uključuju grupu koju čine histiocitni poremećaji; maligna histiocitoza; leukemija; Hočkinova bolest; imunoproliferativni mali; ne-Hočkinov limfom; plazmacitom; retikuloendotelioza; melanom; hondroblastom; hondrom; hondrosarkom; fibrom; fibrosarkom; tumori velikih ćelija; histiocitom; lipom; liposarkom; mezoteliom; miksom; miksosarkom; osteom; osteosarkom; hordom; kraniofaringiom; disgerminom; hamartom; mezenhimom; mezonefrom; miosarkom; ameloblastom; cementom; odontom; teratom; timom; tropoblastični tumor. Dalje, sledeće vrste kancera takođe su obuhvaćene kao podložne tretiranju: adenom; holangiom; holesteatom; ciklindrom; cistadenokarcinom; cistadenom; tumor granuloznih ćelija; ginandroblastom; hepatom; hidradenom; tumor ćelija ostrvaca; tumor Leydig ćelija; papilom; tumor sertoli ćelija; tumor teka ćelija; leimiom; leiomiosarkom; mioblastom; mioma; miosarkom; rabdomiom; rabdomiosarkom; ependimom; ganglioneurom; gliom; meduloblastom; meningiom; neurilemom; neuroblastom; neuroepiteliom; neurofibrom; neurom; paragangliom; paragangliom nehromafin. Vrste kancera koje mogu biti tretirane takođe uključuju angiokeratom; angiolimfoidnu hiperplaziu sa eozinofilijom; sklerozni angiom; angiomatozu; glomangiom; hemangioendoteliom; hemangiom; hemangiopericitom; hemangiosarkom; limfangiom; limfangiomiom; limfangiosarkom; pinealom; karcinosarkom; hondrosarkom; cistosarkom filode; fibrosarkom; hemangiosarkom; leiomiosarkom; leukosarkom; liposarkom; limfangiosarkom; miosarkom; miksosarkom; karcinom jajnika; rabdomiosarkom; sarkom; neoplazme; nerofibromtozu; i cervikalnu displaziju.

[0139] Primeri različitih hiperproliferativnih poremećaja podložnih Ključ-ChEM ili T-ChARM terapiji su kanceri B-ćelija, uključujući grupu koju čine limfomi B-ćelija (kao što su razni oblici Hočkinove bolest, ne-Hočkinov limfom (NHL) ili limfomi centralnog nervnog sistema), leukemije (kao što je akutna limfoblastična leukemija (ALL), hronična limfocitična leukemija (CLL), leukemija Hairy ćelija, transformacija B ćelijskog blastocita hronične mijelodine leukemije) i mijelomi (kao što je višestruki mijelom). Dodatnih kanceri B ćelija uključuju grupu koju čine mali limfocitični limfom, prolimfocitična leukemija B-ćelija, limfoplazmacitični limfom, limfom marginalne zone slezine, mijelom plazma ćelija, usamljeni plazmacitom kostiju, vankoštani plazmacitom, B-ćelijski limfom van-nodalne marginalne zone (MALT) limfoidnog tkiva, B-ćelijski limfom nodalne marginalne zone, folikularni limfom, limfom mantle ćelija, limfom difuznih velikih B-ćelija, limfom mediastinalnih (timičnih) velikih B-ćelija, intravaskularni limfom velikih B-ćelija, primarni efuzioni limfom, Burkitt-ov limfom/leukemija, B-ćelijska proliferacije neodređenog malignog potencijala, limfomtoidna granulomatoza, i post-transplantni limfoproliferativni poremećaj.

[0140] Zapaljenske i autoimune bolesti uključuju grupu koju čine artritis, reumatoidni artritis, juvenilni reumatoidni artritis, osteoartritis, polihondritis, psoriatični artritis, psoriaza, dermatitis, polimiozitis/dermatomiozitis, inkluzioni miozitis tela, zapaljenski miozitis, toksična epidermalna nekroliza, sistemska skleroderma i skleroza, CREST sindrom, zapaljenska bolest creva, Kronova bolest, ulcerativni kolitis, respiratorni distresni sindrom, respiratorni distresni sindrom kod odraslih (ARDS), meningitis, encefalitis, uveitis, kolitis, glomerulonefritis, alergijska stanja, ekcem, astma, stanja koja uključuju infiltriranje T ćelija i hronični zapaljenski odgovori, ateroskleroza, autoimuni miokarditis, deficijencija leukocitne adhezije, sistemski lupus eritematozus (SLE), subakutni kutani lupus eritematozus, diskoidni lupus, lupus mijelitis, lupus cerebritis, juvenilni dijabetes, višestruka skleroza, alergijski encefalomijelitis, neuromijelitis optika, reumatična groznica, Sydenham-ova horea, imuni odgovori povezani sa akutnom i odloženom hiperosetljivošću posredovana citokinima i T-limfocitima, tuberkuloza, sarkoidoza, granulomatoza uključujući Wegener-ovu granulomatozu i Churg-Strauss bolest, agranulocitoza, vaskulitis (uključujući hiperosetljivi vaskulitis/angiitis, ANCA i reumatoidni vaskulitis), aplastična anemija, Diamond Blackfan anemija, imuna hemolitička anemija uključujući autoimunu hemolitičku anemiju (AIHA), perniciozna anemija, aplazija čistih crvenih ćelija (PRCA), Faktor VIII deficijencija, hemofilija A, autoimuna neutropenija, pancitopenija, leukopenija, bolesti koje uključuju leukocitnu diapedezu, zapaljenska poremećaji centralnog nervnog sistema (CNS), sindrom povređenih više organa, mijastenia gravis, antigen-antitelo kompleks posredovane bolesti, bolest anti-glomerularne bazalne membrane, sindrom anti-fosfolipidnog antitela, alergijski neuritis, Behcet-ova bolest, Castleman-ov sindrom, Goodpasture-ov sindrom, Lambert-Eaton Miasenični Sindrom, Reynaud-ov sindrom, Sjorgen-ov sindrom, Stevens-Johnson sindrom, odbacivanje translpantacije čvrstog organa, bolest kalem protiv domaćina (GVHD), bulozbi pemfigoid, pemfigus, autoimuna poliendokrinopatije, seronegativne spondiloartropatije, Reiter-ova bolest, stiff-man sindrom, arteritis velikih ćelija, imuni kompleks nefritis, IgA nefropatija, IgM polineuropatije ili IgM posredovana neuropatija, idiopatska trombocitopenična purpura (ITP), trombotična trobocitopenična purpura (TTP), Henoch-Schonlein purpura, autoimuna trombocitopenija, autoimuna bolest testisa i jajnika uključujući autoimuni orhitis i ooforitis, primarni hipotiroidizam; autoimune endokrine bolesti koje uključuju grupu koju čine autoimuni tiroiditis, hronični tiroiditis (Hashimoto-ov Tiroiditis), subakutni tiroiditis, idiopatski hipotiroidizam, Addison-ova bolest, Grave-ova bolest, autoimuni poliglandularni sindromi (ili sindromi poliglandularne endokrinopatije), Tip I dijabetes takođe označen kao insulin-zavisni dijabetes melitus (IDDM) i Sheehan-ov sindrom; autoimuni hepatitis, limfoidni intersticijalni pneumonitis (HIV), bronholitis obliterans (ne-transplantni), ne-specifična intersticijalna pneumonija (NSIP), Guillain-Barré Sindrom, vaskulitis velikih sudova (uključujući polimijalgiju reumatiku i arteritis velikih ćelija (Takayasuov)), vaskulitis srednjih sudova (uključujući Kawasaki-ovu bolest i poliarteritis nodoza), poliarteritis nodoza (PAN) ankilozni spondilitis, Berger-ova bolest (IgA nefropatija), rapidno progresivni glomerulonefritis, primarna bilijarna ciroza, Celijakijski spru (glutenska enteropatija), krioglobulinemija, krioglobulinemija povezana sa hepatitisom, amiotrofična lateralna skleroza (ALS), koronarna arterijska bolest, nasledna Mediteranska groznica, mikroskopski poliangiitis, Cogan-ov sindrom, Whiskott-Aldrich sindrom i tromboangiitis obliterans.

[0141] U određenim slučajevima, postupak tretiranja subjekta sa Ključ-ChEM ili T-ChARM kakvi su ovde opisani uključuju akutnu mijelocitičnu leukemiju, akutnu limfocitičnu leukemiju, i hroničnu mijelocitičnu leukemiju.

[0142] Infektivne bolesti uključuju one povezane sa infektivnim agensima i uključuju bilo koju od različitih bakterija (npr., patogena E. coli, S. typhimurium, P. aeruginosa, B. anthracis, C. botulinum, C. difficile, C. perfringens, H. pylori, V. cholerae, Listeria spp., Rickettsia spp., Chlamydia spp., i slično), mikobakterija, i paraziti (uključujući bilo koji poznati parazitski član Protozoa-e). Infektivni virusi uključuju eukariotske viruse, kao što je adenovirus, bunijavirus, herpesvirus, papovavirus, papilomavirus (npr., HPV), paramiksovirus, pikornavirus, rabdovirus (npr., Rabies), otromiksovirus (npr., influenca), poksvirus (npr., Vaccinia), reovirus, retrovirus, lentivirus (npr., HIV), flavivirus (npr., HCV, HBV) ili slično. U određenim slučajevima, infekcija citozolnim patogenima čiji su antigeni obrađeni i prikazani sa MHC Klasom I molekula, tretiraju se Ključ-ChEM ili T-ChARM ovog otkrivanja.

[0143] Ključ-ChEM ili T-ChARM ovog otkrivanja mogu da se daju subjektu u obliku vezanom za ćeliju (npr., genska terapija populacije ciljnih ćelija (zrele T ćelije (npr., CD8<+>ili CD4<+>T ćelije) ili druge ćelije T ćelijske linije)). U određenom načinu ostvarivanja, ćelije T ćelijske linije koje eksprimiraju Ključ-ChEM ili T-ChARM koje se daju subjektu su singene, alogene, ili autologne ćelije. U drugim slučajevima, Ključ-ChEM ili T-ChARM mogu da se daju subjektu u rastvorivom obliku. Rastvorivi TCRs poznati su u struci (videti, npr., Molloy et al., Curr. Opin. Pharmacol.5:438, 2005; U.S. Patent Br.6,759,243).

[0144] Farmaceutske kompozicije koje uključuju Ključ-ChEM ili T-ChARM ovog otkrivanja mogu se davati na način pogodan za bolest ili stanje koje se tretira (ili sprečava) kako je određeno od strane lekara. Pogodna doza, pogodno trajanje, i učestalost davanja kompozicija određuju se takvim faktorima kao što je stanje pacijenta, veličina, tip i težina bolesti, određenog oblika aktivnog sastojka, i postupka davanja. Ovo otkrivanje obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje obuhvataju ćelije koje eksprimiraju Ključ-ChEM ili T-ChARM kakvi su ovde opisani i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživače, ili ekscipijens. Pogodni ekscipijensi uključuju vodu, slani rastvor, dekstrozu, glicerol, ili slično i njihove kombinacije.

[0145] Prednost predmetnog otkrivanja je što se Ključ-ChEM ili T-ChARM eksprimirajuće ćelije koje se daju pacijentu mogu biti iscrpljene primenom srodnog vezujućeg partnera sa označenom kasetom. Ovo otkrivanje obezbeđuje postupak za iscrpljivanje T ćelija koje eksprimiraju Ključ-ChEM ili T-ChARM primenom antitela specifičnog za označenu kasetu, primenom srodnog vezujućeg partnera specifičnog

4

za označenu kasetu, ili primenom drugih T ćelija koje eksprimiraju CAR i koje imaju specifičnost za označenu kasetu. U određenim slučajevima, označena kaseta omogućava imunoiscrpljivanje T ćelija koje eksprimiraju Ključ-ChEM ili T-ChARM ovog otkrivanja. Eliminisanje konstruisanih T ćelija može se postići primenom agenasa za iscrpljivanje specifičnih za označenu kasetu. Na primer, ako se Strep oznaka koristi, tada se mogu primeniti anti-Strep oznaka antitelo, anti-Strep oznaka scFv, ili Streptactin svaki fuzionisan za ili konjugovan za ćelija-toksični reagens (kao što je toksin, radiometal), ili se mogu primeniti anti-Strep oznaka /anti-CD3 bispecifičan scFv, ili anti-Strep oznaka CAR T ćelija.

[0146] U nekim drugim slučajevima, ćelije koje eksprimiraju Ključ-ChEM ili T-ChARM ovog otkrivanja mogu biti identifikovane, sortirane, obogaćene ili izolovane vezivanjem za antitela koja imaju specifičnost sa označenom kasetom (npr., anti-oznaka antitela), ili drugim proteinima koji se specifično vezuju za označenu kasetu (npr., Streptactin koji se vezuje za Strep oznaku), koji su konjugovani za perlice, ploče ćelijske kulture, agarozu, ili neki drugi matriks čvrste površine. U određenim slučajevima, takve ćelije su sortirane, obogaćene ili izolovane primenom afinitetne kolone.

[0147] Ovo otkrivanje obezbeđuje postupak za selektivno aktiviranje T ćelija dovođenjem u kontakt neprirodne ili rekombinantne T ćelije koja eksprimira Ključ-ChEM ili T-ChARM sa vezujućim domenom specifičnim za označenu kasetu i pričvršenom za čvrstu površinu ili kao deo biokompatiblnog matriksa (npr., alginat, matriks bazalne membrane (Matrigel®), biopolimer). Rekombinantna T ćelija obuhvata egzogeni molekul nukleinske kiseline koji kodira Ključ-ChEM ili T-ChARM fuzioni protein ovog otkrivanja. Na primer, T ćelija koja eksprimira Ključ-ChEM ili T-ChARM može biti aktivirana perlicama obloženim ili konjugovanim sa srodnim vezujućim partnerom (npr., antitelo) specifičnim za označenu kasetu. Na primer, ako je označena kaseta Strep oznaka, tada se StrepTactin obložene perlice ili anti-Strep oznaka antitelo konjugovane perlice mogu primeniti da indukuju T ćelijsku aktivaciju. U određenim slučajevima, postupak obuhvata aktiviranje ex vivo rekombinantnih T ćelija koje eksprimiraju Ključ-ChEM ili T-ChARM ovog otkrivanja i koje opciono dalje eksprimiraju himerni antigen receptor (CAR). Takve aktivirane T ćelije su korisne u u ovde opisanim postupcima za tretiranje bolesti.

[0148] Ovo otkrivanje obezbeđuje postupak za selektivno promovisanje proliferacije rekombinantne T ćelije koja eksprimira Ključ-ChEM ili T-ChARM ovog otkrivanja. U određenim slučajevima, postupak obuhvata selektivnu ex vivo proliferaciju T ćelije koja eksprimira Ključ-ChEM ili T-ChARM primenom partnera koji vezuju oznake, kao što je antitelo. U daljim slučajevima, postupak obuhvata proširivanje funkcionalnih T ćelija (npr., virus-specifični, TAA (tumor-povezan antigen) specifične CTL, ili specifične T ćelijske podskupove, kao što su naivne T ćelije, T ćelije memorijskog stabla, T ćelije centralne ili efektorske memorije, CD4+ CD25+ regulatorne T ćelije) sa partnerom koji vezuje oznaku, kao što je antitelo, što se opciono može izvesti u prisustvu kostimulativnog partnera koji vezuje molekul (kao što je anti-CD27 ili antiCD28 antitelo). U određenim slučajevima, anti-oznaka vezujući partneri mogu se primeniti radi aktiviranja Ključ-ChEM (npr., Wnt ili Notch Ključ-ChEM) transduktovane hematopoietične matične ćelije, embrionske matične ćelije, ili matične ćelije tkiva (npr., neuronska matična ćelija) radi samo-obnavljanja, proliferacije ili diferencijacije u u jedan ili više željenih fenotipova u terapeutskim primenama.

[0149] U daljim slučajevima, Ključ-ChEM ili T-ChARM omogućava selektivno promovisanje T ćelijske proliferacije in vivo kada eksprimiraju Ključ-ChEM ili T-ChARM ovog otkrivanja. U određenim slučajevima, T ćelija koja eksprimira CAR koji obuhvata označenu kasetu omogućava širenje CAR T ćelije in vivo kada se dovode u kontakt ćelije koje eksprimiraju veznik (npr., uključujući T ćelijske supresorske ćelijske veznike PD-L1, PD-L2). Takve proširene T ćelije su korisne u ovde opisanim postupcima za tretiranje bolesti. U određenim slučajevima, proliferacija ili širenje ćelija koje eksprimiraju Ključ-ChEM ili T-ChARM kako je ovde opisano, indukovana je in vivo, što može biti indukovano sa vezujućim partnerom označene kasete (kao što je anti-oznaka antitelo) i opciono vezujućim partnerom kostimulativnog molekula (kao što je anti-CD27 ili antiCD28 antitelo).

[0150] U određenim daljim slučajevima, ćelije koje eksprimiraju Ključ-ChEM ili T-ChARM kakvi ovde su opisani aktivirane su in vivo, kao što je na mestu tumora. Na primer, kompozicija (npr., alginat, matriks bazalne membrane (Matrigel®), biopolimer, ili drugi matriks) ili nosač (npr., mikroperlice, nanočestica, ili druga čvrsta površina) koji obuhvataju vezujući partner označene kasete (kao što je anti-oznaka antitelo) i vezujući partner kostimulativnog molekula (kao što je anti-CD27 ili antiCD28 antitelo) mogu se primeniti za lokalno aktiviranje na mestu tumora (npr., čvrstog tumora) T ćelije koja eksprimira Ključ-ChEM ili T-ChARM kakvi su ovde opisani.

[0151] U određenim načinima ostvarivanja, rekombinantne ćelije koje eksprimiraju Ključ-ChEM ili T-ChARM mogu biti detektovane ili praćene in vivo primenom antitela koje se vezuju sa specifičnošću sa označenom kasetom (npr., anti-oznaka antitela), ili drugim srodnim vezujućim proteinima koji se specifično vezuju za sekvencu označene kasete (npr., Streptactin koji se vezuje za Strep oznaku), pri čemu su vezujući partneri za označenu kasetu konjugovani sa fluorescentom bojom, radio-agensom za praćenje, nanočesticama železo-oksida ili drugim agensom za slikanje poznatim u struci za detektovanje X-zracima, CT-skenerom, MRI-skenerom, PET-skenerom, ultrazvukom, protočnom citometrijom, sistemima za blisko infracrveno snimanje, ili drugim modalitetima za snimanje (videti, npr., Yu et al., Theranostics 2:3, 2012).

[0152] U daljim načinima ostvarivanja, ćelije koje eksprimiraju Ključ-ChEM ili T-ChARM predmetnog otkrivanja mogu se primeniti u dijagnostičkim postupcima ili postupcima snimanja, uključujući postupke koji su primenjuju u vezi sa indikacijama ili ovde identifikovanim stanjima.

PRIMERI PRIMER 1

KLJUČ-HIMERNI EFEKTORSKI MOLEKULI (KLJUČ-CHEMS) I OZNAČENI HIMERNI ANTIGEN RECEPTOR MOLEKULI (T-CHARMS), I NJIHOVI DERIVATI

[0153] Primerni himerni fuzioni proteini koji sadrže jedan ili više afinitetno označenih kaseta prikazani su na FIG.1. Označene kasete su generalno male (tj., minimalno imunogene ili ne-imunogene) i ne povezuju se sa ili vezuju za bilo koji od molekula endogenih za domaćina ili ćeliju domaćina. Oznake se specifično vezuju za heterologni srodni receptor (npr., veznik, antitelo, ili drugi vezujući partner), koje vezivanje se može primeniti u kontekstu ovih himernih efektorskih molekula (ChEMs) kao "ključ" za pristup i upravljanje (tj., uključivanje ili isključivanje ili modulisanje) bilo kojim od različitih celularnih puteva (ovde označeno kao Ključ-ChEMs). Ovi označen himerni fuzioni proteini mogu dalje da obuhvataju vezujući domen specifičan za određenu metu (npr., tumor antigen). Na primer, označeni himerni fuzioni proteini uključuju himerne antigen receptor molekule (ovde označene kao T-ChARMs).

[0154] Primerni molekul nukleinske kiseline koji kodira Ključ-ChEM (FIG.1A) obuhvata sledeće elemente (5' to 3'): Strep oznaka® II (SEQ ID NO.:38 koja kodira peptid Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys kako je navedeno u SEQ ID NO.:1), konektorski deo uključujući vezni modul (SEQ ID NO.:42 koji kodira peptid (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2kako je navedeno u SEQ ID NO.:11) i modifikovani IgG4 zglob (SEQ ID NO.:27 koji kodira peptid Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro-Cys-Pro kako je navedeno u SEQ ID NO.:15), CD28 transmembranski domen (SEQ ID NO.:27 koji kodira peptid kako je navedeno u SEQ ID NO.:16), i intracelularnu komponentu koja obuhvata efektorski domen koji obuhvata 4-1BB deo (SEQ ID NO.:29 koji kodira peptid kako je navedeno u SEQ ID NO.:17) i CD3ζ deo (SEQ ID NO.:30 koji kodira peptid kako je navedeno u SEQ ID NO.:18; Kowolik et al., Cancer Res.66:10995, 2006). Ovaj Ključ-ChEM (jedna oznaka) koji kodira molekul nukleinske kiseline kloniran je u epHIV7 lentivirusni vektor, kako je opisano od strane Yam et al. (Mol. Ther.5:479, 2002) i Wang et al. (Blood 118:1255, 2011).

[0155] epHIV7 lentivirusni vektor izveden je iz pHIV7 vektora zamenjivanjem citomegalovirusnog promotera za pHIV7 sa EF-1 promoterom (Wang et al., 2011; Yam et al., 2002). Lentivirusni vektor takođe kodira okrnjeni humani EGFR polipeptid (huEGFRt) koji je lišen ekstracelularnih N-terminalnih veznih vezujućih domena i intracelularne receptor tirozin kinaza aktivnosti, ali koji zadržava nativnu aminokiselinsku sekvencu, tip I transmembransku ćelijsku površinsku lokalizaciju, i prostorno netaknut vezujući epitop za anti-EGFR monoklonalno antitelo, cetuksimab (Wang et al., 2011). Lentivirusni vektori koordinatno eksprimiraju Ključ-ChEM i huEGFRt odvojene samo-cepajućom T2A sekvencom (Szymczak et al., Nat. Biotechnol.22:589, 2004), pri čemu huEGFRt služi kao epitop alternativnog odabira za Ključ-ChEM pozitivne ćelije primenom biotinilovanog cetuksimaba u zajedničkom spajanju sa anti-biotin imunomagnetskim mikroperlicama.

[0156] Primerni molekul nukleinske kiseline koji kodira T-ChARM (FIG.1E) obuhvata sledeće elemente: scFv koji sadrži VH i VL genske segmente CD19-specifičnog FMC63 monoklonalnog antitela (SEQ ID NO.:36; Wang et al., 2011), Strep oznaka® II (SEQ ID NO.:38, koja kodira peptid Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-

4

Glu-Lys kako je navedeno u SEQ ID NO.:1), konektorski deo uključujući vezni modul (SEQ ID NO.:39, 40, ili 41, koji kodira peptid (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2kako je navedeno u SEQ ID NO.:11) i IgG4 zglob (SEQ ID NO.:27), CD28 transmembranski domen (SEQ ID NO.:28), i intracelularnu komponentu koja obuhvata efektorski domen koji obuhvata 4-1BB deo (SEQ ID NO.:29) i CD3ζ deo (SEQ ID NO.:30). Primerni T-ChARM koji obuhvata dve oznake (T-ChARM<2>) razlikuje se od jedne oznake T-ChARM (T-ChARM<1>) uključujućvanjem drugog veznog modula (koji kodira peptid (Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser kako je navedeno u SEQ ID NO.:12) između prve i druge Strep oznake. Primerni T-ChARM koji obuhvata tri oznake (T-ChARM<3>) razlikuje se od dvostruke oznake T-ChARM uključivanjem trećeg veznog modula (koji kodira peptid (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2kako je navedeno u SEQ ID NO.:11) između druge i treće Strep oznake. U određenim slučajevima, scFv uključuje VH i VL regione ROR1-specifičnog R12 monoklonalnog antitela (Yang et al., PLoS One 6:e21018, 2011) kako je navedeno u SEQ ID NO.:57) i veznik varijabilnih domena kako je navedeno u SEQ ID NO.:13. Pored toga, oba anti-CD 19 i anti-RORl T-ChARMs su alternativno konstruisani sa intracelularnom komponentom koja obuhvata efektorski domen koji obuhvata CD28 deo (SEQ ID NO.:35) na mestu 4-1BB dela.

[0157] U određenim slučajevima, bilo koji od fuzionih proteina opisanih ovde obuhvataju od aminoterminusa do karboksi-terminusa: ekstracelularni scFv ili scTCR vezujući domen, označenu kasetu, konektorski region koji obuhvata IgG zglob, transmembranski domen, i intracelularnu komponentu koja obuhvata efektorski domen. U nekim slučajevima, efektorski domen obuhvata uparivanje 4-1BB i CD3ζ, CD27 i CD3ζ, CD28 i CD3ζ, OX40 i CD3ζ, CD28, 4-1BB i CD3ζ, OX40, 4-1BB i CD3ζ, ili CD28, OX40 i CD3ζ. Kako je ovde definisano, efektorski domen za bilo koji od ovih molekula može biti u potpunosti intracelularni deo ili može da uključuje samo efektorski deo odabranog molekula.

[0158] Primerni molekul nukleinske kiseline koji kodira T-ChARM (<N1>ChARM; FIG.1F; SEQ ID NO.:58) koji ima N-terminalnu oznaku obuhvata sledeće elemente: sekretornu signalnu sekvencu (SEQ ID NO.:63, koji kodira peptid MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP kako je navedeno u SEQ ID NO.:47, koja je pocepana od zrelog proteina), asparaginsku spojnu aminokiselinu, Strep oznaku® II (SEQ ID NO.:38, koja kodira peptid Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys kako je navedeno u SEQ ID NO.:1), vezni modul (SEQ ID NO.:42, koji kodira peptid (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2kako je navedeno u SEQ ID NO.:11), scFv VH i VL genskih segmenata CD19-specifičnog FMC63 monoklonalnog antitela (SEQ ID NO.:36; Wang et al., 2011), IgG4 zglob (SEQ ID NO.:27), CD28 transmembranski domen (SEQ ID NO.:28), i intracelularnu komponentu koja obuhvata efektorski domen koji obuhvata 4-1BB deo (SEQ ID NO.:29) i CD3ζ deo (SEQ ID NO.:30).

[0159] Primerni molekul nukleinske kiseline koji kodira T-ChARM (Ch<1>ARM; FIG.1G; SEQ ID NO.:59) koji ima oznaku ugrađenu u veznik varijabilnih regiona obuhvata sledeće elemente: sekretornu signalnu sekvencu (SEQ ID NO.:63, koja kodira peptid MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP kako je navedeno u SEQ ID NO.:47, koja je pocepana od zrelog proteina), VH genski segment CD19-specifičnog FMC63 monoklonalnog antitela (koje kodira aminokiselinsku sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO.:51), prvi vezni modul (koji kodira peptid Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly kako je navedeno u SEQ ID NO.:65), asparaginsku spojnu aminokiselinu, Strep oznaka® II (SEQ ID NO.:38, koja kodira peptid Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys kako je navedeno u SEQ ID NO.:1), drugi vezni modul (koji kodira peptid Gly-Ser-Gly-Ser-Gly kako je navedeno u SEQ ID NO.:66), VL genski segment CD19-specifičnog FMC63 monoklonalnog antitela (koje kodira aminokiselinsku sekvencu kako je navedeno u SEQ ID NO.:52), IgG4 zglob (SEQ ID NO.:27), CD28 transmembranski domen (SEQ ID NO.:28), i intracelularnu komponentu koja obuhvata efektorski domen koji obuhvata 4-1BB deo (SEQ ID NO.:29) i CD3ζ deo (SEQ ID NO.:30).

[0160] Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju svaki od ovih primernih T-ChARM (npr., jednostruko, dvostruko ili trostruko označen, N-terminalno označen, sa ugrađenom oznakom, indikovani scFvs) pojedinačno su klonirani u epHIV7 lentivirusni vektor, kako je opisano od strane Yam et al. (Mol. Ther.

5:479, 2002), i upotrebljeni da transdukuju T ćelije kako je opisano u ovde navedenim primerima. U određenim slučajevima, molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju Ključ-ChARMs predmetnog otkrivanja su za kodon optimizovani pre kloniranja u epHIV7 lentivirusni vektor. T-ChARM-kodirajući lentivirusni supernatanti proizvedeni su u 293T ćelijama zajednički transfektovane sa svakim od plazmida lentivirusnih vektora i pakujućim vektorima pCHGP-2, pCMV-Rev2 i pCMV-G primenom Calphos transfekcionog reagensa (Clontech, Mountain View, CA). Podloga je promenjena 16 sati posle transfekcije, a lentivirus sakupljen posle 24, 48 i 72 sata.

PRIMER 2

PROIZVODNJA REKOMBINANTNIH T ĆELIJA I EKSPRESIJA T-CHARMS

[0161] CD8+ i CD4+ izolovane su iz PBMC normalnih donora primenom kompleta za izolovanje CD8+/CD4+ T ćelija (Miltenyi Biotec), aktivirane anti-CD3/CD28 perlicama (Life Technologies) u skladu sa instrukcijama proizvođača, i transduktovane sa lentivirusnim supernatantom (kako je indikovano u svakom Primeru) (MOI = 3) dopunjenim sa 0.8 µg/mL polibrena (Millipore, Bedford, MA) na dan 3 posle aktivacije centrifugiranjem pri 2,100 o/min tokom 45 min na 32°C. T ćelije su proširene u RPMI, 10% humanom serumu, 2 mM L-glutaminu i 1% penicilin-streptomicinu (CTL podloga), dopunjenim sa rekombinantnim humanim (rh) IL-2 do konačne koncentracije od 50 U/mL svakih 48 sati. Posle širenje, alikvot svake transduktovane T ćelijske linije obojen je biotin-konjugovanim anti-EGFR antitelom i streptavidin-PE (Miltenyi, Auburn, CA). tEGFR+ T ćelije izolovane su sortiranjem na FACS-Aria ćelijskom sorteru (Becton Dickinson). tEGFR+ T ćelijski podskup zatim je stimulisan ozračenim (8,000 rad) CD19+ B-LCL u T ćelija:LCL odnosu od 1:7, i proširen tokom 8 dana u CTL podlozi uz dodavanje 50 U/mL rh IL-2 svakih 48 sati ili primenom protokola za rapidno širenje za R12 T-ChARMs (Riddell i Greenberg, J.

Immunol. Methods 128:189, 1990).

[0162] Sledeća konjugovana antitela upotrebljena su za protočno citometrično fenotipovanje i analizu: CD4, CD8, CD25, CD137, CD45, Annexin V, CD62L, CD27, CD28 (BD Biosciences), anti-StrepOznaka II

4

antitelo (Genscript), EGFR antitelo (ImClone Systems Incorporated, Branchburg, NJ); strepTavidin-PE (BD Biosciences, San Jose, CA). Bojenje propidijum jodidom (PI, BD Biosciences) je izvedeno za razlikovanje živih/mrtvih ćelija kako je navedeno od strane proizvođača. Protočne analize izvedene su na FACS Canto II, sortirajuće prečišćavanje na FACS AriaII (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), a podaci su analizirani primenom FlowJo softvera (Treestar, Ashland, OR).

[0163] Radi ispitivanja ćelijske površine ekspresije T-ChARMs, transduktovane T ćelije sortirane su na EGFRt ekspresiju i procenjene bojenjem fluorohromom obeleženim anti-StrepOznaka mAb. Srednji intenzitet fluorescencije (MFI) za EGFR bojenje bilo je slično na T ćelijama transduktovanim sa svakim od T-ChARMs i CD19-Kratak CAR, što ukazuje da uvođenje oznake u CAR radi proizvodnje ChARM nije uticalo na ekspresiju transgena (FIG.21). Anti-StrepOznaka mAb specifično obojene T ćelija transduktovane su sa raznim T-ChARMs, nezavisno od položaja ili broja označenih sekvenci u svakom ChARM. MFI anti-StrepOznaka bojenja bila je viša za T ćelije transduktovane sa T-ChARM<2>i T-ChARM<3>u poređenju sa T-ChARM<1>, verovatno zbog više mesta na svakom T-ChARM<2>i T-ChARM<3>za vezivanje antitelo-fluorohrom konjugata (FIG.21).

PRIMER 3

CITOLITIČKA AKTIVNOST T ĆELIJA KOJE EKSPRIMIRAJU T-CHARMS

[0164] in vitro efektorska funkcija CD8+ gomile T ćelija konstruisane da eksprimiraju anti-CD19 (scFv) T-ChARM<1>, T-ChARM<2>, ili T-ChARM<3>upoređena je sa efektorskom funkcijom T ćelija konstruisanih da eksprimiraju anti-CD 19 CARs koji sadrže konektorske regione različitih dužina - IgG4 samo zglob (kratak), IgG4 CH3 i zglob (srednji), i IgG4 CH2CH3 i zglob (dug), respektivno - u ispitivanju oslobađanja hroma. Ukratko, ciljane ćelije su obeležene sa<51>Cr (PerkinElmer, Norwalk, CT) tokom noći, oprane i inkubirane u triplikatu pri 1-2 x 10<3>ćelije/bazenčić sa efektorskim T ćelijama pri različitim odnosima efektor prema meti (E:T). Supernatanti su sakupljeni za γ-brojanje posle inkubiranja tokom 4 sata, a specifična liza izračunata je primenom standardne formule. Ciljane ćelije koje su primenjene bile su Raji/ROR1 (prirodne CD19+, transduktovane da eksprimiraju nepovezan antigen ROR1) i K562/CD19 (transduktovane da eksprimiraju CD19), sa K562/ROR1 (prirodne CD19-, transduktovane da eksprimiraju nepovezan antigen ROR1) koje se upotrebljene kao negativna kontrola i LCL-OKT3 ćelije (transduktovane da eksprimiraju ćelijski površinski anti-CD3) upotrebljene kao pozitivna kontrola. Ćelije limfoblastoidne ćelijske linije (LCL) konstruisane da eksprimiraju za membranu vezan anti-CD3 scFv (LCL-OKT3) upotrebljene su kao referentni standard za maksimalni potencijal aktivacije T ćelijske linije budući da OKT3 koji eksprimiraju ćelije aktiviraju T ćelije vezivanjem CD3 kompleksa.

[0165] T ćelije koje eksprimiraju svaki od različitih anti-CD 19 T-ChARM i CAR konstrukata nisu bile citotoksične za K562/ROR1 ćelije (FIG.2C), ali su bile aktivirane da budu citolitičke u prisustvu anti-CD3 koje eksprimiraju LCL/OKT3 ćelije (FIG.2D). Šta više, T-ChARM ili CAR eksprimirajuće T ćelije potvrđuju

4

specifičnu citolitičku aktivnost protiv CD19+ ćelija, Raji ćelija (FIG.2B) i K562/CD19 (FIG.2A). Slični rezultati dobijeni su kada je oznaka locirana na amino-terminusu T-ChARM (<N1>ChARM) ili ugrađena u scFv (VH-oznaka-VL; Ch<1>ARM) (videti FIG.22). Pored toga, na efikasnost lize nije uticao upotrebljen efektorski domen (CD28 umesto 4-1BB; videti FIG.23A), vezujući domen (anti-ROR1 umesto anti-CD19; videti FIG.23B), ili oznaka (FIG.32 pokazuje citolitički efekat sa Myc označenog ChARM). T-ChARM eksprimirajuće ćelije ubijaju tumor ćelije efikasno kao i CARs koje sadrže kratke, srednje i duge IgG4 Fc spejsere.

PRIMER 4

OSLOBAĐANJE CITOKINA OD STRANE T ĆELIJA KOJE EKSPRIMIRAJU T-CHARMS ZAJEDNIČKI UZGAJANE SA K562 ĆELIJAMA

[0166] Za analizu sekrecije citokina, efektorske (E) ćelije (T ćelije koje eksprimiraju anti-CD19 T-ChARMs i CARs) i ciljane (T) ćelije (K562/CD19 i K562/ROR1, negativna kontrola) zajednički su uzgajane u triplikatu pri E:T odnosu od 4:1, inkubirane 24 sata, a zatim su supernatanti izmereni na GM-CSF,IFN-γ, IL-2, i TNF-α nivoe primenom imunoispitivanja složenog citokina (Luminex®).

[0167] Rezultati (FIG.3D) pokazuju da ćelije koje eksprimiraju anti-CD 19 CARs sa kratkim konektorskim regionom proizvode veće količine citokina posle korišćenja ciljanih ćelija u odnosu na T ćelije koje eksprimiraju anti-CD 19 CARs sa srednjim ili dugim konektorskim regionima. Sličan obrazac primećen je sa anti-CD 19 T-ChARM eksprimirajućim ćelijama, pri čemu (FIG.3A) T-ChARM<1>ćelije koji imaju kraći veznik i jednu oznaku proizvode veće količine citokina posle korišćenja ciljanih ćelija u odnosu na T-ChARM<2>ili T-ChARM<3>ćelije koji imaju dve oznake i tri oznake, respektivno. Nivoi proizvedenog citokina bili su slični za anti-CD 19 T-ChARM i anti-CD 19 CAR ćelije, iako su T-ChARM eksprimirajuće ćelije indukovale značajno viši nivo IFN-γ proizvodnje u odnosu na CAR eksprimirajuće ćelije. FIG.3B i 3E pokazuju da proizvodnja citokina nije indukovana u K562 ćelijama koje ne eksprimiraju CD19. FIG.3C i 3F pokazuju rezultate pozitivne kontrole, koja je stimulisana sa PMA / Jonomicinom. Slični rezultati zapaženi su kada su ispitivani<N1>ChARM i Ch<1>ARM konstrukti (videti FIG.24). Pored toga, hijerarhija proizvodnje citokina i proliferacije T ćelija transduktovanih sa anti-CD 19 ChARM bila je nezavisna od kostimulativnog domena (4-1BB ili CD28) upotrebljenog u ChARM (FIG.25).

PRIMER 5

OSLOBAĐANJE CITOKINA OD STRANE T ĆELIJA KOJE EKSPRIMIRAJU T-CHARM MOLEKULE ZAJEDNIČKI UZGAJANE SA ĆELIJAMA RAJI B ĆELISKOG LIMFOMA

[0168] T ćelije koje eksprimiraju razne anti-CD19 T-ChARMs ili CARs zajednički su uzgajane sa CD19+ Raji ćelijama tokom 24 sata, a supernatanti su ispitani u ispitivanjima složenog citokina (Luminex®). Za analizu sekrecije citokina, efektorske (E) ćelije (T ćelije koje eksprimiraju anti-CD 19 T-ChARMs i CARs) i

4

ciljane (T) ćelije (Raji) zajednički su uzgajane u triplikatu pri E:T odnosu od 2:1, inkubirane 24 sata, a zatim su supernatanti izmereni na GM-CSF,IFN-γ, IL-2, i TNF-α nivoe primenom imunoispitivanja složenog citokina (Luminex®).

[0169] Rezultati ukazuju da su T ćelije koje eksprimiraju anti-CD 19 T-ChARMs sa jednom, dve ili tri označene kasete mogle da proizvedu znatno više nivoe IFN-γ i GM-CSF kada su zajednički uzgajane sa Raji ćelijama (FIG.4A) u poređenju sa T ćelijama koje eksprimiraju bilo koji od konvencionalnih anti-CD 19 CARs (FIG.4B).

PRIMER 6

PROLIFERACIJA T ĆELIJA KOJE EKSPRIMIRAJU T-CHARM MOLEKULE

[0170] Za analizu proliferacije ćelija, T ćelije koje eksprimiraju anti-CD 19 T-ChARMs ili CARs su obeležene sa 0.2 µM estra karboksifluorescein sukcinimidila (CFSE, Invitrogen), koji se vezuje za intracelularne proteine i čini ćelije vidljivim u protočnoj citometriji u FITC kanalu. Posle obeležavanja, ćelije su oprane i prenete na ploču u triplikatu sa stimulatornim ćelijama pri odnosu od 4:1 (K562/CD19 ili K562/ROR1, negativna kontrola) u CTL podlozi bez egzogenih citokina. Posle inkubiranja 72 sata, ćelije su obeležene sa PI da bi se isključile mrtve ćelije iz analize. Uzorci su analizirane protočnom citometrijom, a deoba ćelija živih CD3+ T ćelija određena je putem stepena CFSE razblaženja (tj., razblaženje boje je pokazatelj proliferacije budući da je jačina obeležja razblažena na pola svakom deobom ćelija).

[0171] Za analizu, bunaričići u triplikatu su pulovani i proliferacija živih CD8+ T ćelija je izmerena.

Najlevlja kolona je plot naprednog raspršivanja/bočnog raspršivanja ukupnog broja ćelija, srednja kolona je plot vođen na CD8+ T ćelijama, a najdesnija kolona je histogram koji pokazuje CFSE razblaženje u CD8<+>T ćelijskom podskupu (povišeno razblaženje na levo). Crveni pik u najdesnijoj koloni ukazuje da nema deobe ćelija, a plavi pikovi predstavljaju indikovanje ≥3, 2, ili 1 deobe ćelija, a tri broje u svakom od histograma ukazuju na procenat ćelija koje imaju razblažene CFSE i za više od 3, 2, ili 1 deoba ćelija, respektivno. Histogram pokazuje da T-ChARM i CAR eksprimirajuće T ćelije proliferuju snažno tokom 72 sata posle stimulacije ko-kultura sa K562/CD19 ćelijama (plavo), ali ne i sa negativnim kontrolnim ćelijama K562/ROR1 (crveno) (FIG.5). Prosečan broj deoba ćelija bio je viši kod T-ChARM<1>i T-ChARM<2>eksprimirajućih T ćelija u poređenju sa ili T-ChARM<3>ili CAR(dug) eksprimirajućim T ćelijama. Slično, nivo proliferacije bio je nezavisan od kostimulativnog domena (4-1BB ili CD28) koji je primenjen u ChARM (FIG.26), i nezavisan od upotrebljene oznake (FIG.31 pokazuje jednaku proliferaciju kada se primenjuje Myc oznaka).

PRIMER 7

IN VIVO ADOPTIVNI TRANSFER T ĆELIJA KOJE EKSPRIMIRAJU T-CHARM MOLEKULE

4

[0172] Šest- do osam-nedelja stare ženke NOD.CB17-Prkdcscid/J (NOD/SCID) ili NOD.Cg-Prkdc<scid>Il2rg<tm1Wjl>/SzJ (NSG) miševa dobijene su od Jackson Laboratory ili odgajane in-house. Miševima su intravenozno (i.v.) ubrizgane 0.5x10<6>Raji tumor ćelije limfoma transfektovane sa luciferazom svica (Raji-ffluc) putem repne vene, i usađenom tumoru omogućeno je da se razvije tokom 6 dana. Na dan 7, miševi su primili jedno intravenozno (i.v.) injektovanje 5 x 10<6>T ćelija transduktovanih sa jednim od anti-CD 19 (scFv) T-ChARM<1>, T-ChARM<2>, T-ChARM<3>, CAR (kratak), CAR (podloga), i CAR (dug) humanih T ćelija. Da bi se potvrdilo usađivanje tumora, bioluminescenciono slikanje je izvedeno na dan 6 posle Raji-ffluc inokulacije (FIG.6A). Da bi se pratila anti-tumor aktivnost adoptivne T ćelijske terapije, bioluminescenciono slikanje je izvedeno na dan 7 (FIG.6B), dan 11 (FIG.6C), dan 18 (FIG.6D), i dan 26 (FIG.6E) posle davanje T ćelija.

[0173] Za bioluminescenciono slikanje tumor ćelija, miševi su primili intraperitonealna (i.p.) injektovanja supstrata luciferina (CaliperLife Sciences, Hopkinton, MA) resuspendovanog u PBS (15 µg/g telesne mase). Miševi su anestezirani izofluranom u indukcionoj komori i slikani primenom Xenogen IVIS In Vivo sistema za slikanje (Caliper Life Sciences) 10, 12 i 14 minuta posle injektovanja luciferina u režimu malog binovanja pri vremenu sticanja od 1 sekunde -1 minuta da bi se dobile nesaturovane slike. Aktivnost luciferaze je analizirana primenom Living Image Softvera (Caliper Life Sciences), a fluks fotona je analiziran unutar regiona od interesa koji obuhvataju celo telo svakog pojedinačnog miša.

[0174] Bioluminescencione slike pokazuju da T ćelije koje eksprimiraju anti-CD 19 T-ChARM<1>, T-ChARM<2>, ili T-ChARM<3>iskorenjuju tumor efikasno kao i T ćelije koje eksprimiraju anti-CD 19 CAR (kratak) ili CAR (srednji), dok T ćelije koje eksprimiraju CAR (dug) nisu bile veoma efektivne za ovaj određen konstrukt i/ili metu (FIG.6).

PRIMER 8

IN VIVO ISTRAJNOST T ĆELIJA KOJE EKSPRIMIRAJU T-CHARM MOLEKULE

[0175] Kohorta NSG miševa koji nose Raji tumore tretirani su sa 5 x 10<6>anti-CD 19 CAR/huEGFRt ili T-ChARM/huEGFRt koje eksprimiraju humane T ćelije, i 3 nedelje kasnije periferna krv (krvarenje oka) je analizirana protočnom citometrijom primenom anti-huEGFR, anti-humanog CD8, i anti-humanog CD45 monoklonalnog antitela. Frekvencija CD8+ huEGFRt+ (Wang et al., 2011) T ćelija je pokazana kao procenat živih ćelija periferne krvi na FIG.7. Nivo detektujućih huEGFRt u korelaciji je sa nivoom T-ChARM eksprimirajućih T ćelija.

[0176] Iako anti-CD 19 CAR (dug) eksprimirajuće T ćelije nisu konzistentno istaknute posle 3 nedelje, sve druge anti-CD 19 CAR i T-ChARM eksprimirajuće T ćelije lako su detektovane u perifernoj krvi NSG miševa tokom najmanje 3 nedelje posle adoptivnog transfera i eradikacije tumora. Ovi rezultati ukazuju da anti-CD 19 CAR i T-ChARM eksprimirajuće T ćelije mogu da se održe tokom produženog vremenskog perioda in vivo i posreduju antitumor aktivnost.

4

PRIMER 9

IDENTIFIKACIJA T ĆELIJA KOJE EKSPRIMIRAJU T-CHARM MOLEKULE

[0177] Anti-CD 19 T-ChARM/huEFRt eksprimirajuće T ćelije obojene su sa EGFR Abiotin/StrepTavidin-PE, anti-Strep oznaka II-FITC, Strep-Tactin®-APC (alofikocijanin), a zatim analizirane protočnom citometrijom. Anti-CD 19 CAR(kratak) transduktovane T ćelije upotrebljene su kao kontrola. Sve transduktovane T-ChARM i anti-CD 19 CAR (kratak) T ćelije obojene pozitivno sa anti-EGFR mAb indikovale su da su transduktovane i eksprimirale huEGFRT (FIG.8A).

[0178] Rezultati pokazuju da se T-ChARM<2>i T-ChARM<3>transduktovane T ćelije mogu lako razlikovati od ne-transduktovanih ćelija sa reagensima koji boje označenu sekvencu eksprimiranu u T-ChARM ćelijama (FIG.8B,C). T-ChARM<1>, T-ChARM<2>i T-ChARM<3>transduktovane T ćelije, ali ne i anti-CD 19 CAR (kratak), obojene su pozitivno sa anti-Strep oznaka II-FITC antitelom (FIG.8B). One sa više kopija označene sekvence imale su povišen signal bojenja. T-ChARM ćelije takođe su obojene Streptactin APC (FIG.8C), što pokazuje da u slučaju Strep oznake, više od jednog reagensa bojenja može biti primenjeno za detektovanje T ćelija.

PRIMER 10

SORTIRANJE T ĆELIJA KOJE EKSPRIMIRAJU T-CHARM MOLEKULE

[0179] T-ChARM<2>transduktovane T ćelije obojene su sa anti-Strep oznaka-FITC obeleženim antitelom, a zatim sortirane primenom benchtop FACS ćelijskog sortera (BD FACSAria II ćelijski sorter, BD Biosciences, San Jose, CA). FIG.9 pokazuje ćelijske populacije pre sortiranje (gornji red) i posle sortiranje (donji red). Najdesniji panel (posle sortiranje) pokazuje da su T-ChARM<2>eksprimirajuće T ćelije obogaćene od ćelijske populacije od 15.8% do ćelijske populacije koja je veća od 99% T-ChARM<2>T ćelija.

PRIMER 11

OBOGAĆIVANJE T ĆELIJA KOJE EKSPRIMIRAJU T-CHARM MOLEKULE PRIMENOM IMUNOMAGNETSKOG ODABIRA

[0180] Ćelije su inkubirane sa Streptactin-mikroperlicama ili Nanoperlicama (IBA, Goettingen, Germany), zatim uvedene u MACS kolonu (Miltenyi Biotec) u Magnetskom separatoru. Kolona je oprana 3 puta sa 3 ml MACS pufera. Kolona je zatim uklonjena iz separatora, a Streptactin® magnetske perlice sa pričvršenim T ćelijama koje eksprimiraju Strep oznaku su izbačene čvrstim guranjem klipa u kolonu. T-ChARM<3>transduktovane T ćelije pomešane sa kontrolim T ćelijama su obeležene sa jednom od sledećih vrsta perlica: Strep-Tactin Mikroperlice 1# (generalno se koriste za prečišćavanje proteina, veličina od oko 0.5 do 1.5 µm); Strep-Tactin Mikroperlice 2# (generalno se koriste za izolovanje ćelija sa Fab Streptamers® [Strep-označen Fab fragment], veličina od oko 0.5 µm); Strep-Tactin Nanoperlice 3# (generalno se koriste za izolovanje ćelija sa MHC I Streptamerima [Strep-označen MHCI monomer], veličina od oko 100 nm); uvedene u MACS® kolonu (Miltenyi) i umetnute u magnetski separator.

Direktan efluent i zadržani delovi pojedinačno su obojeni sa anti-Strep oznaka-FITC obeleženim antitelom i analizirane protočnom citometrijom.

[0181] Prvi red sa FIG.10 pokazuje ćelijske populacije pre nanošenja na kolonu sa Strep-Tactin perlicama, dok drugi, treći i četvrti red sa FIG.10 pokazuju ćelijske populacije iz svakog uzorka posle prolaska kroz kolonu sa perlicama 1#, 2#, i 3#, respektivno. Drugi red pokazuje da je bilo nešto gubitka u ćelijama, što može biti zbog veličine Strep-Tactin Mikroperlica 1# koje ne dozvoljavaju nekim ćelijama da prođu kroz kolonu. Sve ukupno, ovi podaci pokazuju da je bilo koji tip Strep-Tactin perlica koji testiran koristan za direktno obogaćivanje T-ChARM eksprimirajućih T ćelija.

PRIMER 12

AKTIVACIJA T ĆELIJA KOJE EKSPRIMIRAJU ĆELIJSKE POVRŠINSKE T-CHARMS SA REAGENSIMA KOJI VEZUJU OZNAKE

[0182] T ćelijska aktivacija i proliferacija zahteva dva signala posredovana kroz angažovanje T ćelijskog antigen-specifičnog receptora (TCR) i kostimulativnog signala, koji se najuobičajenije vezuju CD28 putem CD80 i CD86 (Ledbetter et al., Blood 75:1531, 1990). U skladu sa tim, anti-CD3/CD28 mAb obložene mikroperlice razvijene su da bi se obezbedila oba neophodna signala, i ne-specifično aktivirale i proširile T ćelije za kliničke primene (Riddell i Greenberg, 1990). Anti CD3/CD28 stimulacija T ćelija takođe omogućava transdukciju sa retrovirusnim ili lentivirusnim vektorima koji kodiraju CARs, ali selektivno ne proširuju transduktovane T ćelije.

[0183] T ćelije transduktovane sa anti-CD 19 T-ChARM<3>uzgajane su tokom 48h u CTL podlozi sa ili bez tretiranja (negativna kontrola) ili sa sledećim tretiranjima: (a) Strep-Tactin® Mikroperlice 1#; (b) Strep-Tactin Mikroperlice 2#; (c) Strep-Tactin Nanoperlice 3#; (d) anti-Strep oznaka antitelo konjugovano za perlice proteina G (veličina od oko 2 µm); (e) anti-Strep oznaka antitelo /anti-CD28 antitelo dvostruko konjugovane perlice proteina G, ili (f) zajednički uzgajane ozračene TM-LCL ćelije plus 50 U/ml IL2 (pozitivna kontrola). Da bi se odredilo da su ćelije aktivirane posle uzgajanja tokom 24h i 48h, ćelije su ispitane na prisustvo CD25/CD69 primenom imunofluorescencionog bojenja i protočne citometrije. T ćelije eksprimiraju de novo aktivacione molekule, uključujući CD69 i CD 25, posle aktivacije kroz T ćelijski površinski receptor ili signalizirajući kroz CAR koje eksprimiraju CD3ζ. CD69 je jedan od najranijih markera površinske aktivacije T ćelija i može biti uključen sa tekućim procesom aktivacije. CD25 sinteza (α lanac IL2 receptora), zajedno sa samim IL2, indukovan je T ćelijskom aktivacijom pri inicijalnom susretanju sa antigenom.

1

[0184] Ovi podaci neočekivano pokazuju da Strep oznaka koja vezuje T-ChARM eksprimirajuće T ćelije kroz ili perlice obložene Strep-Tactin ili anti-Strep oznaka antitelo značajno aktiviraju ove T ćelije, a dalje pokazuju da veličina perlica takođe može da ima efekat na nivo T ćelijske aktivacije (FIG.13).

[0185] U daljim eksperimentima sa dodatnim konstruktima, Strep-Tactin mikroperlice indukovale su CD25 povišenu regulaciju na CD8+ (FIG.27A) i CD4+ (FIG.27B) T ćelijama koje eksprimiraju ChARM<2>i ChARM<3>, ali ne i T ćelijama koje eksprimiraju ChARM<1>ili CARs kojima nedostaje oznaka, što ukazuje da ChARM<1>afinitet za vezivanje Strep-Tactin mikroperlica je podoptimalan u ChARM-baziranoj T ćelijskoj aktivaciji. Ali, anti-Strep oznaka antitelo-obložene mikroperlice, koje imaju vezujući afinitet prema Strep oznaci (KD= ∼10nm) 100 puta veći od Strep-Tactin (KD= ∼1uM), aktiviraju razne ChARM T ćelije, nezavisno od broja kopija ili lokacije oznake u ChARM (FIG.27A i B). Značajno, Strep-oznaka vezivanjemposredovana aktivacija može se pronaći i kod 4-1BB i CD28 ChARM T ćelija (FIG.27C) i kod ne-CD 19 ciljajući ChARM T ćelija (FIG.27D, ROR1-ciljajuća R12 ChARM<1>).

PRIMER 13

PROLIFERACIJA T ĆELIJA KOJE EKSPRIMIRAJU ĆELIJSKE POVRŠINSKE T-CHARMS SA REAGENSIMA KOJI VEZUJU OZNAKE

[0186] Anti-CD19 T-ChARM<1>, T-ChARM<2>, T-ChARM<3>i CAR (duge) (negativna kontrola) transduktovane T ćelije koje su pojedinačno uzgajane u CTL podlozi sa StrepTactin® mikroperlicama i 50 U/ml IL2.

Mikroskopsko slikanje na dan 5 otkriva da T-ChARM<2>i T-ChARM<3>eksprimirajuće T ćelije začuđujuće razvijaju velike klastere oko perlica, što ukazuje na proliferaciju ćelija na Strep-Tactin perlicama, što nije bilo očigledno sa anti-CD 19 CAR (dug) eksprimirajućim T ćelijama (FIG.11). T-ChARM<1>eksprimirajuće T ćelije pokazuju manje proširive klastere, ali je jasno da je došlo do širenja čelija budući da je bilo više vidljivijih ćelija na ploči u poređenju sa negativnom kontrolom. U daljim eksperimentima, razne različite ChARM eksprimirajuće T ćelije (uključujući<N1>ChARM i Ch<1>ARM) imale su proliferacione klastere koji su se pojavili unutar samo 48 sati posle stimulacije ili sa StrepTactin mikroperlicama ili sa anti-StrepOznaka antitelo mikroperlicama (FIG.28). Konvencionalne CAR T ćelije sa kratkim spejserom (CD19-Hi) upotrebljene su kao negativna kontrola.

[0187] Određena je kriva rasta T-ChARM eksprimirajućih T ćelija uzgajanih na Strep-Tactin® mikroperlicama (videti FIG.12 i 29). Ukupno od oko 1 x 10<6>anti-CD19 T-ChARM<1>, T-ChARM<2>, i T-ChARM<3>transduktovanih T ćelija pojedinačno je zasejano u CTL podlogu sa Strep-Tactin mikroperlicama, anti-Strep oznaka mAb, ili anti- Strep oznaka/anti-CD28 mAb obloženim mikroperlicama (FIG.28) u prisustvu 50 U/ml IL2 i 5ng/ml IL15, i uzgajane tokom 10 dana. Broj ćelija za svaki bazenčić izbrojan je na dan 3, 6 i 9. Ovi podaci pokazuju da T-ChARM<3>transduktovane T ćelije imaju najveću brzinu rasta tokom 9 dana kada su stimulisane Strep-Tactin perlicama. Sa stimulacijom Strep-Tactin perlicama, CD8<+>ili CD4<+>anti-CD 19 ChARM-T ćelije proširene su oko 20 do oko 100-puta, a najveće širenje primećeno je

2

kod ChARM<3>T ćelija (FIG.29A i B). Anti-Strep oznaka i anti-Strep oznaka /anti-CD28 mAb obložene perlice indukovale su čak i veće širenje (100 do 250-puta) u ukupnim brojevima ChARM T ćelija, a za razliku od stimulacije StrepTactin perlicama, CD8<+>i CD4<+>T ćelije koje eksprimiraju ChARM<1>pokazale su trend ka većem širenju od T ćelija koje eksprimiraju ChARM<2>ili ChARM<3>. T ćelije koje eksprimiraju CD28 ChARM ili anti-ROR1 ChARM takođe su efikasno proširene anti-Strep oznaka/anti-CD28 perlicama, što pokazuje da primenjivost ovog pristupa za proširivanje ChARM T ćelija sa različitim kostimulativnim domenima i specifičnošću za različite tumor mete (podaci nisu prikazani).

[0188] U još jednom ispitivanju krive rasta, ukupno od oko 5 x 10<5>anti-CD 19 T-ChARM<3>transduktovanih T ćelija zasejano je u CTL podlozi sa 50 U/ml IL2; jednim od sledećih perlica: (a) Strep-Tactin Mikroperlice 1#, (b) Strep-Tactin Mikroperlice 2#, (c) Strep-Tactin Nanoperlice 3#, (d) anti-Strep oznaka antitelo konjugovano za perlice proteina G, (e) anti-Strep oznaka antitelo / anti-CD28 antitelo dvostruko konjugovane perlice proteina G, ili (f) anti-CD3 / anti-CD28 dvostruko antitelo perlice (pozitivna kontrola); i uzgajane tokom 7 dana. Brojevi ćelija za svaki bazenčić izbrojani su na dan 3, dan 5 i dan 7. Ovi podaci pokazuju da anti-Strep oznaka antitelo/anti-CD28 antitelo dvostruko konjugovane perlice proteina G promovišu maksimalni proliferaciju T-ChARM<3>eksprimirajućih T ćelija do dana 5, što je značajno bolje od anti-CD3/anti-CD28 pozitivne kontrole (FIG.16). Reagensi koji angažuju Strep oznaku, različiti od Strep-Tactin Mikroperlica 2#, promovišu proliferaciju T-ChARM eksprimirajućih T ćelija do oko istog nivoa kao i anti-CD3/anti-CD28 pozitivna kontrola.

[0189] Da bi se dalje potvrdila proliferacija T-ChARM eksprimirajućih T ćelija, nivo Ki-67 proteina je izmeren kao surogatno merenje proliferacije. Ki-67 je nuklearni protein povezan sa i moguće potreban za celularnu proliferaciju. T ćelije transduktovane sa anti-CD 19 T-ChARM<3>uzgajane su tokom 5 dana u CTL podlozi u prisustvu jednog od sledećih tretiranja: (a) Strep-Tactin® Mikroperlice 1#; (b) Strep-Tactin Mikroperlice 2#; (c) Strep-Tactin Nanoperlice 3#; (d) anti-Strep oznaka antitelo konjugovano za perlice proteina G; (e) anti-Strep oznaka antitelo /anti-CD28 antitelo dvostruko konjugovane perlice proteina G, ili (f) anti-CD3/anti-CD28 dvostruko antitelo perlice (pozitivna kontrola). Posle uzgajanja tokom 5 dana, ćelije su fiksirane, permeabilizovane, obojene anti-Ki-67-FITC konjugovanim antitelom, i analizirane protočnom citometrijom.

[0190] Ovi podaci pokazuju da Strep-Tactin perlice ili anti-Strep oznaka perlice mogu da promovišu selektivnu ćelijsku proliferaciju, a proliferacija koja je izmerena putem Ki-67 bojenje bila je bolja od one zapažene sa anti-CD3/anti-CD28 pozitivnom kontrolom (FIG.14).

[0191] Dalji nivo Ki-67 proteina kakav je izveden na T ćelijama transduktovanim sa anti-CD19 T-ChARM<1>, T-ChARM<2>, ili T-ChARM<3>i uzgajane tokom 7 dana u CTL podlozi u prisustvu: (a) bez tretiranja; (b) Strep-Tactin® Mikroperlice 1# u dozi od 15µg, 50µg, ili 150µg na 1 x 10<6>ćelija; ili (c) zajednički uzgajane ozračene TM-LCL ćelije plus 50 U/ml IL2 (pozitivna kontrola). Posle uzgajanja tokom 7 dana, ćelije su fiksirane, permeabilizovane, obojene anti-Ki-67-FITC konjugovanim antitelom, i analizirane protočnom citometrijom. Ovi rezultati takođe pokazuju da Strep-Tactin perlice mogu da promovišu proliferaciju kod T-ChARM eksprimirajućih T ćelija bez obzira na količinu upotrebljenih perlica, određenije za T-ChARM<2>i T-ChARM<3>ćelije (FIG.15). Šta više, svaka od T-ChARM eksprimirajućih T ćelija proliferovala je u prisustvu Strep-Tactin perlica kao i ili bolje od stimulacije TM-LCL pozitivnom kontrolom.

PRIMER 14

SELEKTIVNO ŠIRENJE T ĆELIJA KOJE EKSPRIMIRAJU T-CHARM MOLEKULE

[0192] Ukupno od oko 5 x 10<5>humanih CD8+ T ćelija stimulisano je anti-CD3/anti-CD28 perlicama. Na dan 2, tretirane ćelije transduktovane su sa lentivirusom koji sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira anti-CD 19 T-ChARM<1>/huEGFRt. Na dan 5, anti-CD3/anti-CD28 perlice su uklonjene. U tom trenutku, tretirane ćelije su podeljene na dve grupe, jedna grupa nije više tretirana, a druga grupa je tretirana sa Strep-Tactin® mikroperlicama (oko 0.5 µm do oko 1.5 µm). Na dan 10, ćelije iz svake grupe su sakupljene, obojene imunofluorescentno anti-Strep označenim antitelom i analizirane protočnom citometrijom. Kriva rasta pokazuje da, posle uklanjanja anti-CD3/anti-CD28 perlica, dodavanje Strep-Tactin mikroperlica nastavlja da promoviše značajnu proliferaciju T ćelija (FIG.17A). Analiza protočne citometrije pokazuje da ćelije koje su proliferovale zapravo T-ChARM eksprimirajuće T ćelije budući da je postojao značajno veći procenat T-ChARM eksprimirajućih T ćelija (kako je izmereno putem huEGFRt bojenja) u grupi tretiranoj Strep-Tactin mikroperlicama (donji panel) u poređenju sa kontrolom grupom (gornji panel) (FIG.17B). Ćelije iz svake grupe zatim su dalje sortirane primenom huEGFRt markera, zatim je 5.0 x 10<5>ćelija prošireno stimulacijom sa CD19+ TM-LCL. Ćelije koje su prethodno tretirane StrepTactin mikroperlicama prošle su kroz značajnu i brzu proliferaciju do nivoa od oko 8.0 x 10<7>ćelija za 7 dana u poređenju sa samo 4.0 x 10<6>ćelija u kontroloj grupi. To pokazuje da je posle stimulacije Strep-Tactin mikroperlicama kroz označenu sekvencu T-ChARM, naknadna ponovna stimulacija kroz anti-CD 19 scFv komponentu T-ChARM veoma efektivna.

[0193] Da bi se odredilo da li je stimulacija anti-CD3/anti-CD28 perlicama uopšte potrebna da bi se proširile T-ChARM eksprimirajuće T ćelije, ispitano je da T ćelije mogu biti transduktovane da eksprimiraju T-ChARM samo uz stimulaciju citokinom, a zatim selektivno proširene tretiranjem samo sa anti-Strep oznaka perlicama. Ukupno od oko 5 x 10<5>humanih CD8+ T ćelija uzgajane su sa 5ng/mL IL-7 i 10 ng/mL IL-15 tokom 24 h, a zatim transduktovane u istom titru virusa koji kodira dve vrste anti-CD 19 T-ChARM<3>(41BB ili CD28 efektorski domeni). Transduktovane ćelije tretirane su sa anti-Strep oznaka antitelom konjugovanim za perlice proteina G na dan 2, a zatim na dan 7 su sakupljene, obojene imunofluorescentnim anti-Strep oznaka II antitelom, i analizirane protočnom citometrijom.

[0194] Ovi podaci pokazuju da anti-Strep oznaka antitelo konjugovano za perlice proteina G promovišu proliferaciju T-ChARM eksprimirajućih T ćelija za više od 60% ćelija u kulturi (FIG.18B i 18D) u odsustvu

4

stimulacije anti-CD3/anti-CD28 perlicama. Kada transduktovane ćelije nisu izložene anti-Strep oznaka antitelo perlicama, manje od 1% transduktovanih ćelija je proliferovalo (FIG.18A i 18C).

[0195] Funkcionalnost ChARM T ćelija posle širenje na anti-Strep oznaka sama ili anti-Strep oznaka/anti-CD28 mAb obloženim mikroperlicama ispitana je da bi se potvrdilo da stimulacija kroz ChARM nema štetne efekte na prepoznavanje tumora in vitro ili in vivo. Nezavisno od kostimulativnog domena u dizajnu, ChARM T ćelije proširene na anti-Strep oznaka mikroperlicama pokazale su potentnu citolitičku aktivnost, efikasno oslobađanje citokina i zadržale su obimam kapacitet proliferacije među antigen stimulaciji u poređenju sa ćelijama pre širenja ili posle antigenom-vođenog širenja (TM-LCL) (FIG.30A-30C). Posle selektivnog širenja, ChARM T ćelije imale su visoku vijabilnost (>90%), velika proporcija zadržava ekspresiju kostimulativnih receptora (CD27/CD28), a markeri T ćelija centralne memorije CD45RO i CD62L (FIG.30D), sposobni su da eliminišu Raji tumore kod NSG miševa (FIG.30E), i sposobni su da se održe kao i CAR T ćelije proširene stimulacijom sa CD19<+>B ćelijama (FIG.30F).

PRIMER 15

EFEKAT ANGAŽOVANJA REAGENASA KOJI VEZUJU OZNAKE NA OSLOBAĐANJE CITOKINA OD STRANE T ĆELIJA KOJE EKSPRIMIRAJU T-CHARMS

[0196] Anti-CD 19 CAR (kratak) (proširen TM-LCL stimulacijom) ili T-ChARM<1>eksprimirajuće T ćelije (proširene stimulacijom TM-LCL ili StrepTactin mikroperlicama) zajednički su uzgajane tokom 24 sata sa Raji ćelijama (FIG.19C) ili K562 ćelijama koje eksprimiraju ili CD19 (FIG.19A) ili ROR1 (negativna kontrola) (FIG.19B). PMA / Jonomicin upotrebljeni su kao pozitivna kontrola (FIG.19D). Supernatanti su sakupljeni i analizirani primenom ispitivanja složenog citokina (Luminex®). Nivo oslobađanja citokina od strane anti-CD 19 T-ChARM<1>eksprimirajućih T ćelija uzgajane na Strep-Tactin mikroperlicama bio je viši (osim za IFN-γ) od onog zapaženog za T-ChARM<1>eksprimirajuće T ćelije stimulisane TM-LCL ćelijama (FIG.19A, C, i D). Bez obzira na uslove, grupa K562/ROR1 ćelijske ko-kulture (negativna kontrola) nije proizvela bilo koje detektujuće citokine (FIG.19B). Zanimljivo, postojao je značajno viši nivo IL2 proizvodnje u kulturama indukovanim Strep-Tactin perlicama (više od 10-struko povećanje) u poređenju sa grupom stimulisanom sa TM-LCL.

PRIMER 16

PROLIFERACIJA OSNAŽENA SA ANTI-STREP OZNAKA ANTITELOM KOMBINOVANIM SA ANTI-CD27 ILI ANTI-CD28 ANTITELIMA

[0197] Prečišćene anti-CD 19 T-ChARM<3>eksprimirajuće T ćelije (5 x 10<5>) smeštene su u CTL podlogu plus 50U/ml IL2 na dan 0, a zatim je 2 µg G proteinskih Magnetskih Perlica (NEB), anti-Strep oznaka II (0.5µg)/ anti-CD27 antitelo (0.5µg) konjugovanih G protein perlica, ili anti-Strep oznaka II (0.5µg)/ anti-CD28 antitelo (0.5µg) konjugovanih G protein perlica, dodato ćelijskim kulturama. Ćelije u kulturama samo sa podlogom upotrebljene su kao negativna kontrola. Na dan 5, ćelije su ispitane pod mikroskopom.

[0198] FIG.20 pokazuje da anti- Strep oznaka II antitelo konjugovane perlice proteina G promovišu širenje T-ChARM eksprimirajućih T ćelija, i da kombinovanje anti- Strep oznaka II sa ili anti-CD28 ili anti-CD27 antitelima promoviše širenje T-ChARM eksprimirajućih T ćelija još efikasnije.

1

2

4

1

2

4

Claims

Patentni zahtevi 1. Jednolančani fuzioni protein, koji obuhvata hidrofobni deo raspoređen između ekstracelularne komponente i intracelularne komponente, pri čemu ekstracelularna komponenta obuhvata veći broj označenih kaseta i konektorski region koji obuhvata zglob, pri čemu intracelularna komponenta obuhvata efektorski domen, i pri čemu svaka od većeg broja označenih kaseta obuhvata Strep oznaku, pri čemu svaka Strep oznaka ima streptavidin, streptactin, ili oba kao srodni vezujući partner.
2. Jednolančani fuzioni protein prema zahtevu 1, pri čemu konektorski region dalje obuhvata: (a) vezni modul; i/ili (b) vezni modul, pri čemu vezni modul obuhvata jedan ili više GlyxSery, pri čemu x i y nezavisno predstavljaju ceo broj od 0 do 10 pod uslovom da x i y nisu oba 0; i/ili (c) vezni modul, pri čemu vezni modul predstavlja (GlyxSer)n, pri čemu x predstavlja ceo broj od 1 do 5, a n predstavlja ceo broj od 1 do 10; i/ili (d) vezni modul, pri čemu vezni modul predstavlja imunoglobulinski CH2CH3 ili imunoglobulinski CH3.
3. Jednolančani fuzioni protein prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu konektorski region obuhvata: (a) od jedan do pet od većeg broja označenih kaseta; i/ili (b) od jedan do pet od većeg broja označenih kaseta, pri čemu je svaka označena kaseta povezana sa jednim ili dva vezna modula koji obuhvataju (GlyxSery)n, pri čemu n predstavlja ceo broj od 1 do 10, a x i y nezavisno predstavljaju ceo broj od 0 do 10 pod uslovom da x i y nisu oba 0; i/ili (c) od jedan do pet od većeg broja označenih kaseta, pri čemu je svaka označena kaseta povezana sa jednim ili dva vezna modula koji imaju aminokiselinsku sekvencu od Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO.:10), (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)2(SEQ ID NO.:11), (Gly-Gly-Gly-Ser)2-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO.:12), ili bilo koju njihovu kombinaciju.
4. Jednolančani fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1-3, pri čemu jednolančani fuzioni protein dalje obuhvata His oznaku, Flag oznaku, Xpress oznaku, Avi oznaku, Kalmodulin oznaku, Poliglutamat oznaku, HA oznaku, Myc oznaku, Nus oznaku, S oznaku, SBP oznaku, Soft oznaku, V5 oznaku, CBP, GST, MBP, GFP, Tioredoksin oznaku, ili bilo koju njihovu kombinaciju.
5. Jednolančani fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1-4, pri čemu Strep oznaka obuhvata aminokiselinsku sekvencu od Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO.:1) ili Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (SEQ ID NO.:2).
6. Jednolančani fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1 do 5, pri čemu hidrofobni deo predstavlja transmembranski domen iz CD4, CD8, CD28 ili CD27.
7. Jednolančani fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1-6, pri čemu: (a) efektorski domen je iz CD3ε, CD3δ, CD3ζ, CD27, CD28, CD79A, CD79B, CD137, CARD11, DAP10, FcRα, FcRβ, FcRγ, Fyn, HVEM, ICOS, Lck, LAG3, LAT, LRP, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, ROR2, Ryk, SLAMF1, Slp76, pTα, TCRα, TCRβ, TRIM, Zap70, PTCH2, ili bilo koje njihove kombinacije, pri čemu je, opciono, efektorski domen iz LRP, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, ROR2, ili Ryk; ili (b) efektorski domen je iz (i) CD3ζ i (ii) jednog ili više od 4-1BB (CD137), CD27, CD28, i OX40 (CD134).
8. Jednolančani fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1-7, pri čemu fuzioni protein obuhvata od amino-terminusa do karboksi-terminusa: (a) označenu kasetu, konektorski region koji obuhvata zglob, hidrofobni deo, i intracelularnu komponentu koja obuhvata efektorski domen; ili (b) prvi konektorski region, označenu kasetu, drugi konektorski region koji obuhvata zglob, hidrofobni deo, i intracelularnu komponentu koja obuhvata efektorski domen; ili (c) prvu označenu kasetu, prvi konektorski region, drugu označenu kasetu, drugi konektorski region koji obuhvata zglob, hidrofobni deo, i intracelularnu komponentu koja obuhvata efektorski domen; ili (d) prvu označenu kasetu, prvi konektorski region, drugu označenu kasetu, drugi konektorski region, treću označenu kasetu, treći konektorski region koji obuhvata zglob, hidrofobni deo, i intracelularnu komponentu koja obuhvata efektorski domen; ili (e) dve do pet označenih kaseta, konektorski region koji obuhvata zglob, hidrofobni deo, i intracelularnu komponentu koja obuhvata efektorski domen; ili (f) označenu kasetu, konektorski region koji obuhvata IgG zglob, transmembranski domen, i intracelularnu komponentu koja obuhvata efektorski domen iz 4-1BB i CD3ζ; CD27 i CD3ζ; CD28 i CD3ζ; ili CD28, 4-1BB i CD3ζ; ili (g) označenu kasetu, konektorski region koji obuhvata zglob, hidrofobni deo, i intracelularnu komponentu koja obuhvata efektorski domen iz LRP, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, ROR2, ili Ryk.
9. Jednolančani fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1-8, pri čemu ekstracelularna komponenta dalje obuhvata vezujući domen koji specifično vezuje metu.
10. Jednolančani fuzioni protein prema zahtevu 9, pri čemu vezujući domen predstavlja scFv, scTCR, receptorski ektodomen, ili veznik.
11. Jednolančani fuzioni protein ili receptor prema zahtevu 9 ili 10, pri čemu fuzioni protein obuhvata od amino-terminusa do karboksi-terminusa: (a) ekstracelularni vezujući domen, označenu kasetu, konektorski region koji obuhvata zglob, hidrofobni deo, i intracelularnu komponentu koja obuhvata efektorski domen; ili (b) ekstracelularni vezujući domen, prvi konektorski region, označenu kasetu, drugi konektorski region koji obuhvata zglob, hidrofobni deo, i intracelularnu komponentu koja obuhvata efektorski domen; ili (c) ekstracelularni vezujući domen, prvu označenu kasetu, prvi konektorski region, drugu označenu kasetu, drugi konektorski region koji obuhvata zglob, hidrofobni deo, i intracelularnu komponentu koja obuhvata efektorski domen; ili (d) ekstracelularni vezujući domen, prvu označenu kasetu, prvi konektorski region, drugu označenu kasetu, drugi konektorski region, treću označenu kasetu, treći konektorski region koji obuhvata zglob, hidrofobni deo, i intracelularnu komponentu koja obuhvata efektorski domen; ili (e) označenu kasetu, ekstracelularni vezujući domen, konektorski region koji obuhvata zglob, hidrofobni deo, i intracelularnu komponentu koja obuhvata efektorski domen; ili (f) ekstracelularni scFv ili scTCR vezujući domen koji obuhvata veznik varijabilnih regiona koji sadrži označenu kasetu raspoređenu između varijabilnih regiona, konektorski region koji obuhvata zglob, hidrofobni deo, i intracelularnu komponentu koja obuhvata efektorski domen; ili (g) ekstracelularni scFv ili scTCR vezujući domen, označenu kasetu, konektorski region koji obuhvata IgG zglob, transmembranski domen, i intracelularnu komponentu koja obuhvata efektorski domen, pri čemu je efektorski domen iz: (A) 4-1BB i CD3ζ, (B) CD27 i CD3ζ, (C) CD28 i CD3ζ, (D) OX40 i CD3ζ, (E) CD28, 4-1BB i CD3ζ, (F) OX40, 4-1BB i CD3ζ, ili (G) CD28, OX40 i CD3ζ; ili (h) ekstracelularni vezujući domen koji obuhvata receptorski ektodomen, označenu kasetu, konektorski region koji obuhvata zglob, hidrofobni deo, i intracelularnu komponentu koja obuhvata efektorski domen, pri čemu je efektorski domen iz 4-1BB, CD27, CD28, ili OX40. 1
12. Jednolančani fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1-8, pri čemu fuzioni protein dalje obuhvata: (a) nekovalentno povezan vezujući domen; i/ili (b) nekovalentno povezan vezujući domen, pri čemu je nekovalentno povezan vezujući domen povezan sa označenom kasetom; i/ili (c) nekovalentno povezan vezujući domen, pri čemu nekovalentno povezan vezujući domen predstavlja scFv, scTCR, receptorski ektodomen, ili veznik; i/ili (d) nekovalentno povezan bispecifičan vezujući domen, , pri čemu je prvi vezujući kraj specifičan za označenu kasetu, a drugi vezujući kraj je specifičan za metu koja je različita od označene kasete; i/ili (e) nekovalentno povezan bispecifičan vezujući domen, pri čemu su prvi i drugi vezujući kraj specifični za označenu kasetu; i/ili (f) nekovalentno povezan multi-specifičan vezujući domen, pri čemu se prvi kraj vezuje za označenu kasetu, a drugi vezujući kraj je specifičan za jednu ili više meta koje su različite od označene kasete.
13. Jednolančani fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 9-12, pri čemu meta obuhvata CD3, CEACAM6, c-Met, EGFR, EGFRvIII, ErbB2, ErbB3, ErbB4, EphA2, IGF1R, GD2, O-acetil GD2, O-acetil GD3, GHRHR, GHR, FLT1, KDR, FLT4, CD44v6, CD151, CA125, CEA, CTLA-4, GITR, BTLA, TGFBR2, TGFBR1, IL6R, gp130, Lewis A, Lewis Y, TNFR1, TNFR2, PD1, PD-L1, PD-L2, HVEM, MAGE-A, mezotelin, NY-ESO-1, PSMA, RANK, ROR1, TNFRSF4, CD40, CD137, TWEAK-R, HLA, sa tumorom ili patogenom povezan peptid vezan za HLA, hTERT peptid vezan za HLA, tirozinaza peptid vezan za HLA, WT-1 peptid vezan za HLA, LTβR, LIFRβ, LRP5, MUC1, OSMRβ, TCRα, TCRβ, CD19, CD20, CD22, CD25, CD28, CD30, CD33, CD52, CD56, CD80, CD81, CD86, CD123, CD171, CD276, B7H4, TLR7, TLR9, PTCH1, WT-1, Robo1, α-fetoprotein (AFP), Frizzled, OX40, ili CD79b.
14. Molekul nukleinske kiseline koji kodira fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1-13.
15. Vektor koji obuhvata molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 14.
16. Vektor prema zahtevu 15, pri čemu taj vektor predstavlja virusni vektor; opciono retrovirusni vektor ili lentivirusni vektor. 2
17. Ćelija domaćin, koja obuhvata molekul nukleinske kiseline koji kodira fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1-13, opciono pri čemu ćelija domaćin predstavlja T ćeliju.
18. In vitro postupak za aktiviranje ćelije, koji obuhvata dovođenje u kontakt ćelije koja obuhvata fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1-13 i/ili molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 14 sa vezujućim domenom specifičnim za jednu ili više od jedne ili više označenih kaseta.
19. In vitro postupak za promovisanje ćelijske proliferacije, koji obuhvata dovođenje u kontakt neprirodne ćelije koja obuhvata fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1-13 i/ili molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 14 sa vezujućim domenom specifičnim za jednu ili više od jedne ili više označenih kaseta i faktorom rasta citokinom tokom vremena dovoljnog da se omogući rast ćelija.
20. In vitro postupak za identifikovanje ćelije, pri čemu taj postupak obuhvata: dovođenje u kontakt uzorka koji obuhvata ćeliju koja obuhvata fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1-13 i/ili molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 14 sa vezujućim domenom specifičnim za jednu ili više od jedne ili više označenih kaseta, pri čemu vezujući domen specifičan za označenu kasetu obuhvata detektabilnu grupu, i detektovanje prisustva ćelije u uzorku.
21. In vitro postupak za sortiranje i odabir ćelije ili populacije ćelija, pri čemu taj postupak obuhvata: dovođenje u kontakt uzorka koji obuhvata T ćeliju koja obuhvata fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1-13 i/ili molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 14, sa vezujućim domenom specifičnim za jednu ili više od jedne ili više označenih kaseta, i odabir ili sortiranje od drugih ćelija, ćelije(a) koje su specifično vezane vezujućim domenom, čime se bira ili sortira od drugih ćelija ta ćelija ili populacija ćelija.
22. In vitro postupak za obogaćivanje ili izolovanje ćelije ili njene populacije, pri čemu taj postupak obuhvata dovođenje u kontakt uzorka koji obuhvata ćeliju koja obuhvata molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 14 i/ili fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1-13 sa vezujućim domenom specifičnim za jednu ili više od jedne ili više označenih kaseta i obogaćivanje ili izolovanje ćelije od drugih ćelija koje ne eksprimiraju fuzioni protein ili receptor u uzorku.
23. Ćelija domaćin prema zahtevu 17 za upotrebu u postupku za iscrpljivanje ćelija radi tretiranja kancera ili infektivne bolesti, koji obuhvata dovođenje u kontakt ćelije koja obuhvata molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 14 ili fuzioni protein prema bilo kom od zahteva 1-13 sa vezujućim domenom specifičnim za označenu kasetu, pri čemu vezivanje vezujućeg domena specifičnog za označenu kasetu dovodi do ćelijske smrti ćelija domaćina koje eksprimiraju fuzioni protein, opciono pri čemu taj postupak dalje obuhvata praćenje nivoa citokina kod subjekta posle primenjivanja vezujućeg domena specifičnog za jednu ili više od jedne ili više označenih kaseta.
24. Ćelija domaćin prema zahtevu 17 za upotrebu u tretiranju bolesti ili stanja.
25. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata ćeliju domaćina prema zahtevu 17 i farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač, ili ekscipijens. 4