KR20200042885A - 이중 특이성 단백질 및 이의 제조 방법 - Google Patents

이중 특이성 단백질 및 이의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 이중특이성 단백질 및 이의 제조방법에 관한 것으로 중쇄 및/또는 경쇄에 돌연변이를 도입함으로써, 중쇄(CH3 도메인 또는 Fc)와 중쇄(CH3 도메인 또는 Fc) 간에는 이종 이합체 형성률을 증가시키고 중쇄(CH1 도메인)와 경쇄 간에는 동일한 물질을 표적화하는 사슬끼리의 이합체 형성률을 증가시켜, 이종 이합체의 순도가 높은 이종 특이성 단백질 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 이종 특이성 단백질은 암치료, 신호조절, 진단 등의 다양한 분야에 활용이 가능하다.

Description

이중 특이성 단백질 및 이의 제조 방법{Bispecific protein and methods of preparation thereof}
본 발명은 이종 이합체 형성률이 높은 이중 특이성 단백질 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
이중 특이성 항체 (Bispecific antibodies; BsAbs)는 상이한 표적 항원을 인식하는 두 개 항원 결합 부위를 가진 항체로서, 상기 상이한 표적 항원에 동시에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 총칭한다. 이러한 특성은 통상적인 단일클론 항체로는 불가능한 치료 전략을 수립할 수 있게 한다. 이중특이성 항체는 자연적으로 생성되는 경우는 드물고, 두 개의 다른 생물학적 표적에 동시 결합하도록 인위적으로 제조되는 것이 많다. 이러한 BsAb의이중 표적화 능력은 단일특이성 항체(Monospecific antibodies; MsAbs)로는 적용할 수 없는 새로운 적용 분야를 제공할 수 있다. 치료적 목적의 측면에서, (1) 면역 세포를 표적 세포의 근접부로 확실하게 도입하는 것, (2) 표적 세포에서 떨어져서 각각 별개로 존재하는 두 개의 신호 전달 경로를 동시에 억제하거나 활성화시켜서 상승 효과를 일으키는 것, (3) 표적 세포로 치료 물질, 방사활성 물질, 의약, 독소 등을 특이적이고 조절가능하게 전달하는 것 등이 중요한 관심 사항으로 대두되고 있다.
다양한 (45개의 다른 포맷) 이중 특이성 항체관련 기술이 개발 되었다. 이들 기술은 구조를 기초로 하여 4개의 카테고리로 분류될 수 있다. 첫째로, 노브-인투-홀(Knob-into-Hole) 또는 간략히 KiH로 알려진 구조적 상보적 상태, 전하 극성 보완(전기적 스티어링 효과; electrostatic steering effect), 또는 CH3 도메인 서플링(SEEDbodyTM 으로 불리움)를 포함하는 다양한 방법을 통해 중쇄를 이종성 이중화 시키는 기술; 둘째로, DiabodyTM, BiTETM 및 DARTTM (Diabody: dimeric antibody fragments; BiTE : Bi-specific T-cell engagers; DART : dual affinity retargeting bispecific antibody)과 같은 여러 가지 항체 분절 포맷, 셋째로, Modular AntibodyTM, ZybodyTM, dAbsTM 및 DVD-IGTM (dAbs : Single domain antibodies; DVD-Ig : dual-variable-domain immunoglobulin) 과 같은 하나 또는 그 이상의 기능적 도메인을 사용하는 기술이 온전한 항체에 접합되는 기술; 및 넷째로, DuobodyTM (Fab-Arm Exchange), CrossMabTM, AzymetricTM, 및 kI bodyTM 같은 전장 길이의 IgG-유사 설계를 채용한 기술들이 개발 되었다.
예컨대, Zymeworks는 미국 특허출원 2013-892198호를 통하여, Fc 영역에서 돌연변이를 가진 면역글로블린 사슬의 이종성 다량체(heteropolymer) 구조체에 대해 기재하며, 구체적으로 이황화결합을 하는 시스테인 부분을 전하를 가진 아미노산으로 변형하여 전기적 상호작용에 의해서 이종성 다량체 구조의 항체를 만들 수 있다는 점을 개시하고 있다.
기존의 이중 특이성 항체를 제조하는 데에는 다음과 같은 문제점이 있었다:
첫번째로는 원하지 않은 중쇄의 결합의 생성을 들 수 있다. 상이한 에피토프를 갖는 2 개의 항체로부터 각각 기원하는 중쇄 (A 및 B) 간의 결합이 무작위적으로 이루어지는 경우, 2개의 동일기원의 중쇄 간의 결합(AA 및 BB)과 1개의 이종 기원 중쇄 간의 결합(AB 또는 BA)이 형성된다. 이중 특이성 항체를 제조하는데 있어서, 동일 기원의 중쇄 간 결합은 원하지 않는 불순물이 되어서, 이중 특이성 항체의 순도를 떨어뜨리고, 이를 제거하는 공정이 수반되어야 하므로 항체의 분리 정제에 어려움을 유발하며, 원하지 않는 면역반응 또는 신호전달을 야기해서 부작용을 유발하는 등의 불리한 효과를 일으킬 수 있다. 따라서 순수하게 이종기원의 중쇄 간 결합만을 형성하면서, 동일기원의 중쇄 간 결합이 형성이 되지 않거나 적어도 상당 수준의 이하로만 형성되도록 하는 기술이 필요하다.
둘째로는 경쇄와 중쇄의 결합에 있어서 동일 기원의 중쇄와 경쇄의 결합이 특이적으로 형성되어야 하는데, 이종 기원의 중쇄와 경쇄가 결합하는 경우가 발생하는 문제점을 들 수 있다. 이중 특이성 항체는 2종의 에피토프를 가지고 있다. 각각의 에피토프는 이를 인식하는 각각의 항체로부터 유래하는 동종 기원의 경쇄와 중쇄가 결합하는 경우에 인식 가능한데, 이종 기원의 중쇄와 경쇄가 결합하게 되면, 의도한 2종의 에피토프 이외의 새로운 에피토프를 인식하는 항체가 형성되어, 불순물로 작용하여 항체의 분리정제에 어려움을 유발하며, 부작용을 일으키는 원인이 될 수 있다. 따라서, 이중특이성 항체 생산에 있어서 정확히 2종류의 특이성 항체가 만들어지도록 제대로 된 짝으로만 중쇄와 경쇄의 결합이 일어나야 하고, 비특이적인 중쇄와 경쇄의 결합이 생성되지 않거나 미미한 수준으로 생성되어야 한다.
상기에서 살펴본 바와 같은 이중특이성 항체를 제공하는데 있어서의 문제점을 고려하여 이중 특이성 항체 제작에 필요한 요건을 요약하면, 서로 다른 2 개의 에피토프를 인식하는 2종의 항체로부터 유래하는 중쇄와 경쇄의 결합에 있어서, 도 1에 보여지는 바와 같이 총 10개 형태의 결합이 형성될 수 있는데, 이 중에서 (1) 중쇄 간 결합은 서로 다른 항체로부터 유래하는 중쇄 간에 형성되고, (2) 중쇄와 경쇄의 결합은 동일한 항체로부터 유래하는 중쇄와 경쇄 간 형성되어야 하며, 이러한 조합 형태는 도 1에서 점선 원으로 표시된 것이며, 이 외의 9가지 조합은 생성되지 않거나 최소한으로 생성되어야 한다.
본 발명자의 이전 특허인 WO2014142591호 "소수성 상호작용 부위내에 전기적 상호작용이 도입된 단백질 및 이의 제조방법"이 공개되어 있다. 상기 특허에는 단백질의 소수성 상호작용을 하는 부위내에서 선택된 한쌍의 소수성 아미노산에서, 하나의 소수성 아미노산이 포지티브 전하를 가진 물질로, 다른 소수성 아미노산이 네가티브 전하를 가진 물질로 변형되어 상기 포지티브 전하와 상기 네가티브 전하에 의해 단백질의 소수성 상호작용 부위내에 전기적 상호작용이 도입된 단백질 또는 항체가 개시되어 있다. 본 발명자들은 상기 특허에서 고려되지 않았던 소수성 상호작용을 하지 않은 부분의 정전기적 상호작용을 이용하여서도 이중특이성 항체를 형성할 수 있음을 발견하였고, 상기 정전기적 상호작용 이외에 사이즈 의존 결합 및/또는 결합 쌍 간 아미노산 교환(스와핑) 방법에 의해서도 이중 특이성 항체를 고효율로 형성할 수 있음을 밝혀서 본 발명을 완성하였다.
한국특허공개 제10-2014-0019385호 (2014.02.14 공개)
상기한 문제를 해결하고자 본 발명은 순도가 높은 이종 특이성 항체 및 이의 제조 방법을 제공한다.
일 예는 항체의 제1 CH3 도메인 및 제2 CH3 도메인을 포함하는 이합체에 있어서, 상기 제1 CH3 도메인과 제2 CH3 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 아미노산 쌍이 다음 중 하나 이상의 변이에 의하여 변이된 변이 CH3 도메인 또는 상기 변이 CH3 도메인을 포함하는 변이 Fc 영역을 포함하는 이합체를 제공한다:
(1) CH3 도메인 간의 하나 이상의 아미노산 쌍 중 어느 하나의 아미노산은 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되고, 다른 하나의 아미노산은 음전하를 갖는 아미노산으로 치환된 변이;
(2) CH3 도메인 간의 하나 이상의 아미노산 쌍의 아미노산이 서로 교환된 변이; 및
(3) CH3 도메인 간의 하나 이상의 아미노산 쌍 중 어느 하나의 아미노산은 크기가 큰 소수성 아미노산으로 치환되고, 다른 하나의 아미노산은 크기가 작은 소수성 아미노산으로 치환된 변이.
상기 제1 CH3 도메인과 제2 CH3 도메인은 서로 같거나 다른 종류의 항체(면역글로불린)로부터 유래한 것일 수 있다.
다른 예는 상기 변이 CH3 도메인 또는 이를 포함하는 변이 Fc 영역을 암호화하는 핵산 분자, 상기 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터, 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.
본 명세서에 사용된 바로서, "하나 이상의 아미노산 쌍 중 어느 하나의 아미노산.. 다른 하나의 아미노산.."은 하나 이상의 아미노산 쌍 중 각각의 아미노산 쌍을 이루는 2 개의 아미노산 중 어느 하나와 다른 하나의 아미노산을 지칭하기 위하여 사용된다 (이하 동일함).
다른 예는 제1 CH3 도메인 또는 이를 포함하는 제1 Fc 영역, 및 제2 CH3 도메인 또는 이를 포함하는 제2 Fc 영역을 포함하고,
상기 제1 CH3 도메인과 제2 CH3 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 아미노산 쌍이 다음 중 하나 이상의 변이에 의하여 변이된 변이 CH3 도메인 또는 상기 변이 CH3 도메인을 포함하는 변이 Fc 영역을 포함하는, 서로 다른 2종의 표적을 표적화하는 이중 특이성 단백질을 제공한다:
(1) CH3 도메인 간의 하나 이상의 아미노산 쌍의 각각의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산 중 어느 하나의 아미노산은 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되고, 다른 하나의 아미노산은 음전하를 갖는 아미노산으로 치환된 변이;
(2) CH3 도메인 간의 하나 이상의 아미노산 쌍의 각각의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산이 서로 교환된 변이; 및
(3) CH3 도메인 간의 하나 이상의 아미노산 쌍의 각각의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산 중 어느 하나의 아미노산은 크기가 큰 아미노산으로 치환되고, 다른 하나의 아미노산은 크기가 작은 아미노산으로 치환된 변이.
상기 단계 (1)의 서로 다른 전하를 갖는 아미노산으로 치환되는 아미노산 쌍은 소수성 상호작용을 하는 아미노산 쌍 및/또는 소수성 상호작용을 하지 않는 아미노산 쌍일 수 있으며, 일 예에서, 아미노산 쌍을 이루는 2 개의 아미노산 중 적어도 하나 이상이 소수성 아미노산이 아닌 아미노산 (예컨대, 친수성 아미노산)일 수 있다. 상기 단계 (1)의 서로 다른 전하를 갖는 아미노산으로 치환시키는 단계에 의하여 정전기적 상호작용이 도입되어 Fc 영역 간 이종 이합체 형성률을 증진시키는데 기여할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바로서, 이종 이합체 (heterodimer)는 서로 다른 두 개의 단백질이 결합된 것을 의미하는 것으로, 예컨대, 서로 다른 표적을 표적화하는 두 개의 단백질이 결합하여 형성된 이중 특이성 단백질 (예컨대, 이중 특이성 항체) 등을을 의미할 수 있다.
상기 단계 (2)의 아미노산 교환 (스와핑)은 Fc 영역 또는 CH3 도메인에서 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 모든 아미노산 쌍에서 수행될 수 있으며, 예컨대, 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용, 및 아미노산 크기 차이에 의한 상호작용 이외의 상호작용에 의하여 결합된 모든 아미노산 쌍 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 쌍일 수 있다. 이와 같이 서로 상호작용 (예컨대 결합)하는 각각의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산 잔기 (즉, 상호작용 하는 아미노산 쌍에 있어서, 제1 CH3 도메인 중의 하나의 아미노산 잔기 및 제2 CH3 도메인 중의 하나의 아미노산 잔기)를 서로 교환하면, 동종 유래의 CH3 도메인 간에 (즉 제1 CH3 도메인 간, 또는 제2 CH3 도메인 간)는 상기 아미노산 상호작용하는 파트너 위치에 동일한 아미노산이 존재하므로 이들 간 결합이 어렵게 함으로써, 동종 간 이합체 형성률을 낮추고 이종 이합체 형성률을 증진시키는데 기여할 수 있다 (예컨대, S364와 K370 아미노산 쌍의 경우, 제1 CH3 도메인에 S364K 변이, 제2 CH3 도메인에 K370S 변이가 도입된 경우, 제1 CH3에서는 잔기 364와 370이 모두 라이신(K)이고, 제2 CH3 도메인에서는 잔기 364와 370이 모두 세린(S)이므로, 동일 CH3 도메인 간에는 상호작용이 일어날 수 없어지므로 동종 이합체는 형성되지 않고, 이종 CH3 도메인간에만 상호작용이 일어나므로 이종 이합체만 형성됨).
상기 단계 (3)의 크기가 상이한 아미노산으로 치환하는 단계는 크기가 큰 아미노산과 크기가 작은 아미노산 간 구조적 교합 적합성을 증진시킴으로써(즉, 크기가 큰 아미노산이 크기가 작은 아미노산에 의하여 생성된 여분에 공간에 끼워짐으로써 결합 효율이 증가됨), 이종 이합체 형성률을 증진시키는데 기여할 수 있다. 특히, 서로 상호작용하는 아미노산 쌍의 한쪽 아미노산은 크기가 큰 소수성 아미노산으로, 나머지 한쪽 아미노산은 크기가 작은 소수성 아미노산으로 돌연변이화함으로써, 크기가 큰 아미노산끼리 또는 크기가 작은 아미노산끼리 결합이 잘 이루어지지 않도록 하여 동종 이합체 형성률을 최소화 시키는 한편 (양쪽 chain에 크기가 큰 아미노산이 존재하는 경우, 아미노산의 크기 때문에 두 chain 사이의 거리가 멀어지게 되어 이합체 형성(dimerization)에 방해를 받고, 양쪽 chain 모두에 크기가 작은 아미노산이 존재하게 되면 두 아미노산 사이의 거리가 멀어져서 상호작용 확률이 낮아지고 상호작용 자체가 어려워짐), 한쪽 CH3 도메인 또는 Fc의 크기가 큰 소수성 아미노산과 다른 쪽 CH3 도메인 또는 Fc의 크기가 작은 소수성 아미노산은 돌연변이 전과 비교하여 가까운 거리에서 소수성 상호작용을 할 수 있기 때문에 이종 이합체가 형성되기 좋은 조건이 된다. 따라서, 상기 크기가 상이한 아미노산으로 치환하는 단계에 있어서, 치환되는 크기가 큰 아미노산 및 크기가 작은 아미노산은 모두 소수성 아미노산 중에서 선택된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 크기가 큰 아미노산은 소수성 아미노산인 트립토판 및 페닐알라닌으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 또한, 상기 크기가 작은 아미노산은 소수성 아미노산인 알라닌, 글라이신, 및 발린으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일수 있다.
상기 변이 Fc 영역 또는 변이 CH3 도메인을 포함하는 이중 특이성 단백질은 서로 다른 2종의 표적을 표적화 (예컨대, 특이적으로 인식 및/또는 결합)하는 모든 형태의 단백질 중 선택될 수 있다. 표적화를 위하여, 상기 변이 Fc 영역 또는 변이 CH3 도메인을 포함하는 이중 특이성 단백질은 서로 다른 2종의 표적을 표적화 (특이적 인식 및/또는 결합) 가능한 표적화 도메인 (예컨대, 제1 표적을 표적화하는 제1 표적화 도메인 및 제2 표적을 표적화하는 제2 표적화 도메인)을 포함할 수 있으며, 상기 각각의 표적화 도메인은 각각 변이 Fc 영역 또는 변이 CH3 도메인에 공유적 또는 비공유적으로 직접 또는 간접 (예컨대, 링커 등을 통하여) 연결 (융합)된 것일 수 있다. 예컨대, 상기 변이 Fc 영역 또는 변이 CH3 도메인을 포함하는 이중 특이성 단백질은 서로 다른 2종의 표적을 동시에 표적화하는, 이중 특이성 항체, 이중 특이성 항체의 항원 결합 단편 (예컨대, scFv-Fc, (scFv-Fc)2 등), 이중 특이성 항체 유사체 (예컨대, 나노바디(nanobody), 펩티바디(peptibody), 펩타이드(peptide), 앱타이드(aptide) 등), 표적 특이적 결합 폴리펩타이드와 변이 Fc 영역 또는 변이 CH3 도메인의 융합 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 표적 특이적 결합 폴리펩타이드는 표적 생체 물질 (생체에 존재하는 단백질, 핵산 등을 포함하는 모든 화합물)에 특이적으로 결합하는 모든 폴리펩타이드들 중에서 선택될 수 있으며, 예컨대, 항원결합부위 (예컨대 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR 또는 가변영역), scFv (sing chain Fv), 막 단백질 (예컨대, 각종 수용체 등), 막 단백질의 엑토도메인(ectodomain), 리간드 (예컨대, 각종 성장인자, 사이토카인 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 폴리펩타이드일 수 있다. 일 예에서, 상기 표적 특이적 결합 폴리펩타이드와 변이 Fc 영역 또는 변이 CH3 도메인의 융합 단백질은, 막 단백질과 변이 Fc 영역 또는 변이 CH3 도메인의 융합 단백질, 막 단백질의 엑토도메인과 변이 Fc 영역 또는 변이 CH3 도메인의 융합 단백질, 리간드와 변이 Fc 영역 또는 변이 CH3 도메인의 융합 단백질, scFv와 변이 Fc 영역 또는 변이 CH3 도메인의 융합 단백질 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 변이 Fc 영역 또는 변이 CH3 도메인을 포함하는 이중 특이성 단백질이 항체, 항체의 항원 결합 단편, 또는 항체 유사체인 경우, 상기 표적화 도메인은 항원결합부위 (예컨대 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR 또는 가변영역)일 수 있고, 앞서 설명한 융합 단백질의 경우, 상기 표적 특이적 결합 폴리펩타이드는 막 단백질 (예컨대, 각종 수용체), 막 단백질의 엑토도메인, 리간드 (예컨대, 각종 성장인자, 사이토카인 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 서로 다른 2종의 표적은 서로 다른 2종의 생체 물질 (예컨대, 단백질) 또는 동일한 생체 물질 (예컨대, 단백질) 내의 서로 다른 영역을 의미할 수 있다. 상기 변이 Fc 영역 또는 변이 CH3 도메인을 포함하는 이중 특이성 단백질은 비변이(야생형) Fc 영역 또는 CH3 도메인을 포함하는 경우와 비교하여 증가된 이종 이합체 (heterodimer) 형성률, 감소된 동종 이합체(homodimer) 형성률, 및/또는 안정성을 갖는 것을 특징으로 한다.
다른 예는 제1 에피토프를 인식하는 항체의 중쇄 유래의 제1 CH1 도메인 및 경쇄 유래의 제1 CL (경쇄불변영역) 도메인, 및 제2 에피토프를 인식하는 항체 유래의 제2 CH1 도메인 및 경쇄 유래의 제2 CL 도메인을 포함하고, 다음의 변이 중 하나 이상을 포함하는 변이 CH1 도메인 및 변이 CL 도메인을 포함하는 이중 특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다:
제1 CH1 도메인 및 제1 CL 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 제1 아미노산 쌍 중의 각각의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산 중 어느 하나의 아미노산은 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되고, 다른 하나의 아미노산은 음전하를 갖는 아미노산으로 치환; 및
제2 CH1 도메인 및 제2 CL 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 제2 아미노산 쌍 중의 각각의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산 중 어느 하나의 아미노산은 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되고, 다른 하나의 아미노산은 음전하를 갖는 아미노산으로 치환.
상기 제1 에피토프와 제2 에피토프는 서로 다른 단백질(항원)이거나 동일한 단백질(항원)의 서로 다른 (서로 구분되는) 부위에 존재하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 이중 특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 제1 CH1 도메인과 제2 CH1 도메인은 서로 다른 전하를 갖는 아미노산으로 치환되고, 상기 제1 CL 도메인은 상기 제1 CH1 도메인과 상이한 전하를 갖는 아미노산으로 치환되며, 상기 제2 CL 도메인은 상기 제2 CH1 도메인과 상이한 전하를 갖는 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
예컨대, 상기 이중 특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
제1 CH1 도메인 및 제1 CL 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 제1 아미노산 쌍 중 제1 CH1 도메인에 위치하는 아미노산은 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되고,
상기 제1 아미노산 쌍 중 제1 CL 도메인에 위치하는 아미노산은 상기 제1 CH1 도메인에 치환된 아미노산과 상이한 전하를 갖는, 즉 음전하를 갖는 아미노산으로 치환되고,
제2 CH1 도메인 및 제2 CL 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 제2 아미노산 쌍 중 제2 CH1 도메인에 위치하는 아미노산은, 상기 제1 CH1 도메인에 치환된 아미노산과 상이한 전하를 갖는, 즉 음전하를 갖는 아미노산으로 치환되고,
상기 제2 아미노산 쌍 중 제2 CL 도메인에 위치하는 아미노산은 상기 제2 CH1 도메인에 치환된 아미노산과 상이한 전하를 갖는, 즉 양전하를 갖는 아미노산으로 치환된 것일 수 있다.
상기 변이 CH1 도메인 및 변이 CL 도메인을 포함하는 이중 특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 있어서, 상기 치환되는 제1 아미노산 쌍과 제2 아미노산 쌍은 서로 동일하거나 상이할 수 있으며, 상기 제1 아미노산 쌍과 제2 아미노산 쌍에서 치환되는 양전하를 갖는 아미노산과 음전하를 갖는 아미노산은 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 상기 변이 CH1 도메인 및 변이 CL 도메인을 포함하는 이중 특이성 항체의 항원 결합 단편은 예컨대, F(ab')2 단편일 수 있다. 상기 변이 CH1 도메인 및 변이 CL 도메인을 포함하는 이중 특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 비변이(야생형) CH1 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 경우와 비교하여 증가된 동일한 에피토프를 표적화하는 중쇄 (또는 중쇄가변영역-CH1)-경쇄 간 이합체 형성률 및/또는 안정성을 갖는 것을 특징으로 한다.
상기 변이 CH1 도메인 및 변이 CL 도메인을 포함하는 이중 특이성 항체는, CH3 도메인 또는 Fc 영역으로서, 제1 에피토프를 인식하는 항체 유래의 제1 CH3 도메인과 제2 에피토프를 인식하는 항체 유래의 제2 CH3 도메인이 다음 중 하나 이상의 변이에 의하여 변이된, 변이 CH3 도메인 또는 상기 변이 CH3 도메인을 포함하는 변이 Fc 영역을 포함하는 것일 수 있다:
(1) CH3 도메인 간의 하나 이상의 아미노산 쌍 중 어느 하나의 아미노산은 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되고, 다른 하나의 아미노산은 음전하를 갖는 아미노산으로 치환된 변이;
(2) CH3 도메인 간의 하나 이상의 아미노산 쌍의 아미노산이 서로 교환된 변이; 및
(3) CH3 도메인 간의 하나 이상의 아미노산 쌍 중 어느 하나의 아미노산은 크기가 큰 아미노산 (예컨대, 트립토판, 페닐알라닌 등과 같은 크기가 큰 소수성 아미노산)으로 치환되고, 다른 하나의 아미노산은 크기가 작은 아미노산 (예컨대, 알라닌, 글라이신, 발린 등과 같은 크기가 작은 소수성 아미노산)으로 치환된 변이.
상기 변이 CH1 도메인, 변이 CL 도메인, 및 변이 Fc 영역 또는 변이 CH3 도메인을 포함하는 이중 특이성 단백질 또는 이중 특이성 항체는, 비변이 CH1 도메인, CL 도메인, 및 Fc 영역 또는 CH3 도메인을 포함하는 이중 특이성 단백질 또는 항체와 비교하여, 증가된 이종 이합체 (heterodimer) 형성률, 증가된 동일한 에피토프를 표적화하는 중쇄 (또는 중쇄가변영역-CH1)-경쇄 간 이합체 형성률, 및/또는 안정성을 갖는 것일 수 있다.
다른 예는 다음 중 하나 이상의 단계를 포함하여 제1 CH3 도메인과 제2 CH3 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 아미노산 쌍에 다음 중 하나 이상의 변이를 도입시키는 단계를 포함하는, 변이 CH3 도메인 또는 상기 변이 CH3 도메인을 포함하는 변이 Fc 영역을 포함하는, 서로 다른 표적을 표적화하는 이중 특이성 단백질의 제조 방법 또는 서로 다른 표적을 표적화하는 이중 특이성 단백질의 이종 이합체 형성을 증가시키는 방법을 제공한다:
(1) 제1 CH3 도메인과 제2 CH3 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 아미노산 쌍의 각각의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산 중 어느 하나의 아미노산은 양전하를 갖는 아미노산으로, 다른 하나의 아미노산은 음전하를 갖는 아미노산으로 치환;
(2) 제1 CH3 도메인과 제2 CH3 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 아미노산 쌍의 각각의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산을 서로 교환; 및
(3) 제1 CH3 도메인과 제2 CH3 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 아미노산 쌍의 각각의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산 중 어느 하나의 아미노산은 크기가 큰 아미노산 (예컨대, 트립토판, 페닐알라닌 등과 같은 크기가 큰 소수성 아미노산)으로, 다른 하나의 아미노산은 크기가 작은 아미노산 (예컨대, 알라닌, 글라이신, 발린 등과 같은 크기가 큰 소수성 아미노산)으로 치환.
다른 예는 다음의 CH1 도메인 및 CL 도메인 변이 단계를 포함하는, 이중 특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법 또는 동일한 에피토프를 표적화하는 중쇄 (또는 중쇄가변영역-CH1)-경쇄 간 이합체 형성률을 증가시키는 방법을 제공한다:
제1 에피토프를 인식하는 항체의 중쇄 유래의 제1 CH1 도메인 및 제1 CL 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 제1 아미노산 쌍의 각각의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산 중 어느 하나의 아미노산은 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되고, 다른 하나의 아미노산은 음전하를 갖는 아미노산으로 치환; 및
제2 에피토프를 인식하는 항체의 중쇄 유래의 제2 CH1 도메인 및 제2 CL 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 제2 아미노산 쌍의 각각의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산 중 어느 하나의 아미노산은 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되고, 다른 하나의 아미노산은 음전하를 갖는 아미노산으로 치환.
상기 이중 특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법 또는 동일한 에피토프를 표적화하는 중쇄 (또는 중쇄가변영역-CH1)-경쇄 간 이합체 형성을 증가시키는 방법은, 상기 CH1 도메인 및 CL 도메인의 변이 단계에 더하여, 다음 중 하나 이상의 CH3 도메인 변이 단계를 추가로 포함할 수 있다:
(1) 제1 에피토프를 인식하는 항체의 중쇄 유래의 제1 CH3 도메인과 제2 에피토프를 인식하는 항체의 중쇄 유래의 제2 CH3 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 아미노산 쌍의 각각의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산 중 어느 하나의 아미노산은 양전하를 갖는 아미노산으로, 다른 하나의 아미노산은 음전하를 갖는 아미노산으로 치환;
(2) 제1 CH3 도메인과 제2 CH3 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 아미노산 쌍의 각각의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산을 서로 교환; 및
(3) 제1 CH3 도메인과 제2 CH3 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 아미노산 쌍의 각각의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산 중 어느 하나의 아미노산은 크기가 큰 아미노산 (예컨대, 트립토판, 페닐알라닌 등과 같은 크기가 큰 소수성 아미노산)으로, 다른 하나의 아미노산은 크기가 작은 아미노산 (예컨대, 알라닌, 글라이신, 발린 등과 같은 크기가 작은 소수성 아미노산)으로 치환.
다른 예는 다음 중 하나 이상의 단계를 포함하여 제1 CH3 도메인과 제2 CH3 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 아미노산 쌍에 다음 중 하나 이상의 변이를 도입시키는 단계를 포함하는, 이중 특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법 또는 서로 다른 표적을 표적화하는 이중 특이성 항체 또는 항원 결합 단편의 이종 이합체 형성을 증가시키는 방법을 제공한다:
(1) 제1 에피토프를 인식하는 중쇄 유래의 제1 CH3 도메인과 제2 에피토프를 인식하는 중쇄 유래의 제2 CH3 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 아미노산 쌍 중 어느 하나의 아미노산은 양전하를 갖는 아미노산으로, 다른 하나의 아미노산은 음전하를 갖는 아미노산으로 치환;
(2) 제1 CH3 도메인과 제2 CH3 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 아미노산 쌍의 아미노산을 서로 교환; 및
(3) 제1 CH3 도메인과 제2 CH3 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 아미노산 쌍 중 어느 하나의 아미노산은 크기가 큰 아미노산 (예컨대, 트립토판, 페닐알라닌 등과 같은 크기가 큰 소수성 아미노산)으로, 다른 하나의 아미노산은 크기가 작은 아미노산 (예컨대, 알라닌, 글라이신, 발린 등과 같은 크기가 작은 소수성 아미노산)으로 치환.
상기 이중 특이성 항체 또는 항원 결합 단편의 제조 방법은, 다음의 CH1 도메인 및 CL 도메인 변이 단계를 추가로 포함할 수 있다:
제1 에피토프를 인식하는 항체의 중쇄 유래의 제1 CH1 도메인 및 제1 CL 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 제1 아미노산 쌍 중 어느 하나의 아미노산은 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되고, 다른 하나의 아미노산은 음전하를 갖는 아미노산으로 치환; 및
제2 에피토프를 인식하는 항체의 중쇄 유래의 제2 CH1 도메인 및 제2 CL 도메인 간 아미노산-아미노산 결합을 형성하는 아미노산 쌍들 중 선택된 하나 이상의 제2 아미노산 쌍 중 어느 하나의 아미노산은 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되고, 다른 하나의 아미노산은 음전하를 갖는 아미노산으로 치환.
상기 이중 특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법은 서로 다를 에피토프를 인식하는 항체 유래의 CH3 도메인 또는 Fc 영역 간의 이종 이합체 (heterodimer) 형성을 증가시키고, 동시에 동일한 에피토프를 인식하는 항체 유래의 CH1 도메인 (중쇄)과 CL 도메인(경쇄) 간의 이합체 형성을 증가시킬 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 항체의 Fc 보존(불변) 영역 및/또는 Fab 보존(불변) 영역을 포함하는 상이한 표적을 표적화하는 이중 특이성 단백질 또는 그 제조 방법에 있어서,
서로 다른 표적화 도메인과 연결(융합)된 Fc 보존 영역 (CH3 도메인)에 아미노산 변이를 도입시킴으로써, 서로 다른 표적화 도메인과 연결된 Fc 보존 영역 간 결합률을 높여서 이종 이합체 형성률을 증가시키고, 동일한 표적화 도메인과 연결된 Fc 간 결합된 동종 이합체의 형성률을 감소시키거나; 및/또는
서로 다른 표적화 도메인과 연결된 Fab 보존 영역에 아미노산 변이를 도입시킴으로써, 동일한 표적화 도메인과 연결된 Fab 보존 영역 간 결합력을 높여서 동일한 표적화 도메인 및 이와 연결된 Fab 보존 영역 간 이합체 형성률을 증가시켜,
서로 다른 표적화 도메인을 갖는 이중 특이성 단백질 생성률을 증진시키는 기술을 제공한다.
본 명세서에 기재된 항체 (중쇄 및 경쇄), CH1 도메인, CL 도메인, Fc 영역, 및 CH3 도메인에서의 아미노산 위치는 모두 Eu 넘버링 시스템 ['Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)'에 기재된 EU-인덱스]에 따라 넘버링 되어 표기되며, 서열목록내의 서열의 위치를 나타내는 숫자와는 다르다.
상기 항체는 모든 종류의 포유류 또는 조류에서 유래하는 모든 종류의 면역글로불린 (immunoglobulin) 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 본 명세서에서 사용된 항체는 IgG (예컨대, IgG 타입 1 (IgG1), IgG 타입 2 (IgG2), IgG 타입 3 (IgG3), 및 IgG 타입 4 (IgG4)), IgA (예컨대, IgA 타입 1 (IgA1) 및 IgA 타입 2 (IgA2)), IgD, IgE, 및 IgM로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 항체는 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스, 래트 등을 포함하는 설치류 등과 같은 포유류 유래의 면역글로불린, 예컨대, 인간 유래의 면역글로불린 일 수 있다. 일 예에서, 상기 항체는 인간 IgG1 (constant region; 단백질: GenBank Accession No. AAC82527.1, 유전자: GenBank Accession No. J00228.1), 인간 IgG2 (constant region; 단백질: GenBank Accession No. AAB59393.1, 유전자: GenBank Accession No. J00230.1), 인간 IgG3 (constant region; 단백질: GenBank Accession No. P01860, 유전자: GenBank Accession No. X03604.1), 인간 IgG4 (constant region; 단백질: GenBank Accession No. AAB59394.1, 유전자: GenBank Accession No. K01316.1), 인간 IgA1 (constant region; 단백질: GenBank Accession No. AAT74070.1, 유전자: GenBank Accession No. AY647978.1), 인간 IgA2 (constant region; 단백질: GenBank Accession No. AAB59396.1, 유전자: GenBank Accession No. J00221.1), 인간 IgD (constant region; 단백질: GenBank Accession No. AAA52771.1, AAA52770.1), 인간 IgE (constant region; 단백질: GenBank Accession No. AAB59395.1, 유전자: GenBank Accession No. J00222.1), 및 인간 IgM (constant region; 단백질: GenBank Accession No. CAB37838.1, 유전자: GenBank Accession No. X57086.1) 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 예에서, 상기 항체는, 예컨대, 인간 유래의, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 돌연변이가 도입되는 제1 CH3 도메인과 제2 CH3 도메인, 제1 CH1 도메인과 제1 CL 도메인, 및 제2 CH1 도메인과 제2 CL 도메인은 각각 독립적으로 동일하거나 상이한 면역글로불린 타입에서 선택된 것일 수 있다.
인간 IgG1 중쇄불변영역 (서열번호 33)과 인간 IgA1 중쇄불변영역(서열번호 34)의 서열 정렬 결과를 보이는 도 33a 및 인간 면역글로불린 경쇄의 카파 불변영역(서열번호 35)과 람다 불변영역(서열번호 36)의 서열 정렬 결과를 보이는 도 33b에서 보여지는 바와 같이, 중쇄불변영역 및 경쇄불변영역의 아미노산 서열은 아형 간 보존도가 매우 높다.
또한, 면역글로불린은 그 것이 유래하는 종(species) 및 아형(subtype) 간의 서열 보존도가 매우 높다. 예컨대, 인간과 마우스와 래트의 IgG 아형들 간의 중쇄불변영역의 서열 정렬(sequence alignment) 결과를 보이는 도 33c (CH1 도메인 서열 정렬 결과) 및 도 33d (CH3 도메인 서열 정렬 결과)에서 보여지는 바와 같이, 면역글로불린의 중쇄불변영역의 아미노산 서열은 종간 보존도가 매우 높다.
따라서, 본 명세서에서 제공되는 CH1 도메인 및 CH3 도메인의 아미노산 위치는 인간 IgG1을 기준으로, CL 도메인은 인간 카파 불변영역을 기준으로 기재되며, 상기 인간 IgG1 및 인간 카파 불변영역을 기준으로 기재된 아미노산 위치는 통상적인 서열정렬 수단(예컨대, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)을 통하여 다른 아형의 면역글로불린 및 인간 이외의 종의 면역글로불린에서의 대응되는 아미노산 위치를 명확하게 알 수 있다 (표 1 참조).
또한, 본 명세서에서 제공되는 CH1 도메인, CL 도메인, 및 CH3 도메인의 아미노산 위치는 Eu 넘버링 시스템에 의하여 표현되며, 그 상세한 사항은 'http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html (중쇄불변영역)', 'http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGLCnber.html (경쇄 람다 영역)' 및 'http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGKCnber.html (경쇄 카파 영역)'를 통하여 확인할 수 있다.
상기 Eu 넘버링에 의하면, 인간 IgG1을 기준으로,
(1) CH1 도메인 (서열번호 1)은 첫 번째 아미노산 (Ala)을 118번 위치로 하여 일련번호로 넘버링되며 (즉, 서열번호 1의 CH1 도메인의 108개 아미노산은 IgG1의 118번부터 215번까지의 위치에 해당함);
(2) CH3 도메인 (서열번호 15)은 첫 번째 아미노산 (Lys)을 340번 위치로 하여 일련번호로 넘버링 된다 (즉, 서열번호 15의 CH3 도메인의 108개 아미노산은 IgG1의 340번부터 447번까지의 위치에 해당함 (이상, http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html 참조).
본 명세서에서의 CH1 및 CH3 도메인의 아미노산 위치 및 이에 해당하는 아미노산 종류는 인간 IgG1을 기준으로 기재한다.
또한, Eu 넘버링에 의하면,
인간 카파 불변 영역 (단백질: GenBank Accession No. AAA58989.1 유전자: GenBank Accession No. J00241.1)의 CL 도메인 (서열번호 10)은 첫 번째 아미노산 (Val)을 110번 위치로 하여 일련번호로 넘버링되며 (즉, 서열번호 10의 CL 도메인의 105개 아미노산은 110번부터 214번까지의 위치에 해당함; http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGKCnber.html 참조);
인간 람다 불변 영역 (서열번호 11 (Lambda1), 서열번호 12 (Lambda2), 서열번호 13 (Lambda3), 및 서열번호 14 (Lambda7))에서는 첫 번째 아미노산 (Lys)을 110번 위치로 하여 일련번호로 넘버링된다 (단, 람다 불변영역의 경우 일련번호에서 169, 201 및 202번이 누락됨; 즉, 서열번호 11 또는 서열번호 12의 CL 도메인의 103개 아미노산은 110번부터 168번, 170번부터 200번, 및 203번부터 215번까지의 위치에 해당함; http://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGLCnber.html 참조). 본 명세서에서의 CL 도메인의 아미노산 위치 및 이에 해당하는 아미노산 종류는 인간 카파 불변영역을 기준으로 기재한다.
상기 Fab 보존 영역은, IgG (IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG 4), IgA (IgA1 및 IgA2), IgD, IgE, 및 IgM의 Fab 단편의 중쇄불변영역 (즉, CH1 도메인)에서 선택된 어느 하나인 중쇄 Fab의 중쇄 불변영역 보존 영역 및 면역글로불린의 경쇄의 카파 타입 및 람다 타입 (예컨대, 람다 타입 1, 람다 타입 2, 람다 타입 3, 및 람다 타입 7)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 경쇄 불변영역 (즉, CL 도메인)을 포함할 수 있다.
예컨대, 상기 Fab 단편의 중쇄불변영역 (CH1 도메인)으로 사용 가능한 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, 및 IgM의 CH1 도메인은 각각 순서대로 서열번호 1 (Eu 넘버링으로 118번부터 215번까지에 해당함), 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 및 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 경쇄불변영역 (CL 도메인)로서 사용 가능한, 카파 타입, 람다 타입 1, 람다 타입 2, 람다 타입 3, 및 람다 타입 7의 CL 도메인일 수 있으며, 이들 CL 도메인은 각각 순서대로 서열번호 10 (Eu 넘버링으로 110번부터 214번까지에 해당함), 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 Fab 보존 영역은 IgG 타입 1의 CH1 도메인(서열번호 1) 및 카파 타입의 경쇄불변영역 (CL 도메인) (서열번호 10)을 포함할 수 있다. 동일한 표적을 표적화하는 분자 간 이합체 형성률을 증가시키기 위하여, CH1 도메인에서 음전하를 갖는 아미노산 또는 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되는 아미노산은, Eu 넘버링 시스템에 따라, IgG 타입 1 (서열번호 1)의 145번째 위치의 류신, 147번째 위치의 라이신, 170번째 위치의 페닐알라닌, 171번 위치의 프롤린, 183번째 위치의 세린, 및 185번째 위치의 발린으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상, 예컨대, 하나, 2개 이상 (예컨대 2 개), 3개 이상 (예컨대, 3개), 또는 4개 이상 (예컨대 4개)일 수 있다. 다른 예에서, CH1 도메인에서 음전하를 갖는 아미노산 또는 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되는 아미노산은 IgG의 다른 서브타입 (IgG2, IgG3, 및 IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE, 및 IgM의 CH1 도메인 (순서대로 서열번호 2 내지 9)에서 서열번호 1의 145번째 위치의 류신, 147번째 위치의 라이신, 170번째 위치의 페닐알라닌, 171번 위치의 프롤린, 183번째 위치의 세린, 및 185번째 위치의 발린에 대응하는 위치의 아미노산들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 명세서에 사용된 '대응하는 위치의 아미노산'은 서열번호 1의 아미노산 서열과 대상 아미노산 서열 (예컨대, 서열번호 2 내지 9)과의 통상적인 서열 정렬(sequence alignment)에 의하여 어렵지 않게 결정될 수 있다 (이하 동일함).
상기 양전하를 갖는 아미노산 (양전하로 하전되도록 하는 아미노산)은 염기성 아미노산 중에서 선택될 수 있으며, 예컨대, 라이신 또는 아르기닌일 수 있다. 따라서, CH1 도메인에 양전하를 갖는 아미노산이 도입되는 경우, 서열번호 1의 145번째 위치의 류신, 147번째 위치의 라이신, 170번째 위치의 페닐알라닌, 171번 위치의 프롤린, 183번째 위치의 세린, 및 185번째 위치의 발린, 및 이들과 대응되는 위치의 서열번호 2 내지 9의 아미노산들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상, 예컨대, 하나, 2개 이상 (예컨대 2 개), 3개 이상 (예컨대, 3개), 또는 4개 이상 (예컨대 4개)이 각각 독립적으로 염기성 아미노산, 예컨대, 라이신 또는 아르기닌으로 치환될 수 있다.
예컨대, CH1 도메인은 양전하를 갖는 아미노산을 도입하기 위하여, 다음 중 하나 이상, 예컨대, 하나, 2개 이상 (예컨대 2 개), 3개 이상 (예컨대, 3개), 또는 4개 이상 (예컨대 4개)의 돌연변이를 포함할 수 있다 (서열번호 1 기준; 서열번호 2 내지 9에서 대응하는 위치의 아미노산에도 적용됨):
145번째 위치의 류신을 라이신 또는 아르기닌으로 치환 (예컨대 라이신으로 치환);
183번째 위치의 세린을 라이신 또는 아르기닌으로 치환 (예컨대 라이신으로 치환);
147번째 위치의 라이신을 아르기닌으로 치환;
170번째 위치의 페닐알라닌을 라이신 또는 아르기닌으로 치환 (예컨대, 라이신으로 치환);
171번 위치의 프롤린을 라이신 또는 아르기닌으로 치환 (예컨대, 라이신으로 치환); 및
185번째 위치의 발린을 라이신 또는 아르기닌으로 치환 (예컨대, 아르기닌으로 치환).
상기 음전하를 갖는 아미노산은 산성 아미노산 중에서 선택될 수 있으며, 예컨대, 아스파르트산 또는 글루탐산일 수 있다. 따라서, CH1 도메인에 음전하를 갖는 아미노산이 도입되는 경우, 서열번호 1의 145번째 위치의 류신, 147번째 위치의 라이신, 170번째 위치의 페닐알라닌, 171번 위치의 프롤린, 183번째 위치의 세린, 및 185번째 위치의 발린, 및 이들과 대응되는 위치의 서열번호 2 내지 9의 아미노산들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상, 예컨대, 하나, 2개 이상 (예컨대 2 개), 3개 이상 (예컨대, 3개), 또는 4개 이상 (예컨대 4개)이 각각 독립적으로 산성 아미노산, 예컨대, 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환될 수 있다.예컨대, CH1 도메인은 음전하를 갖는 아미노산을 도입하기 위하여, 다음 중 하나 이상, 예컨대, 하나, 2개 이상 (예컨대 2 개), 3개 이상 (예컨대, 3개), 또는 4개 이상 (예컨대 4개)의 돌연변이를 포함할 수 있다 (서열번호 1 기준; 서열번호 2 내지 9에서 대응하는 위치의 아미노산에도 적용됨):
145번째 위치의 류신을 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환 (예컨대 글루탐산으로 치환);
147번째 위치의 라이신을 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환 (예컨대, 아스파르트산으로 치환);
183번째 위치의 세린을 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환 (예컨대 글루탐산으로 치환);
185번째 위치의 발린을 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환 (예컨대, 아스파르트산으로 치환);
170번째 위치의 페닐알라닌을 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환 (예컨대, 아스파르트산으로 치환); 및
171번 위치의 프롤린을 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환 (예컨대, 아스파르트산으로 치환).
동일한 표적을 표적화하는 분자 간 이합체 형성률을 증가시키기 위하여, 경쇄불변영역 (CL 도메인)에서 음전하를 갖는 아미노산 또는 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되는 아미노산은 카파 타입 (서열번호 10)의 131번째 위치의 세린, 133번째 위치의 발린, 135번째 위치의 류신, 162번째 위치의 세린, 및 180번째 위치의 트레오닌으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상, 예컨대, 하나, 2개 이상 (예컨대 2 개), 3개 이상 (예컨대, 3개), 또는 4개 이상 (예컨대 4개)일 수 있다. 다른 예에서, CL 도메인에서 음전하를 갖는 아미노산 또는 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되는 아미노산은 람다 타입 (람다 타입 1, 람다 타입 2, 람다 타입 3, 및 람다 타입 7)의 CL 도메인 (순서대로 서열번호 11 내지 14)에서 서열번호 10의 131번째 위치의 세린, 133번째 위치의 발린, 135번째 위치의 류신, 162번째 위치의 세린, 및 180번째 위치의 트레오닌에 대응하는 위치의 아미노산들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 양전하를 갖는 아미노산 (양전하로 하전되도록 하는 아미노산)은 염기성 아미노산 중에서 선택될 수 있으며, 예컨대, 라이신 또는 아르기닌일 수 있다. 따라서, CL 도메인에 양전하를 갖는 아미노산이 도입되는 경우, 서열번호 10의 131번째 위치의 세린, 133번째 위치의 발린, 135번째 위치의 류신, 162번째 위치의 세린, 및 180번째 위치의 트레오닌, 및 이들과 대응되는 위치의 서열번호 11 내지 14의 아미노산들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상, 예컨대, 하나, 2개 이상 (예컨대 2 개), 3개 이상 (예컨대, 3개), 또는 4개 이상 (예컨대 4개)이 각각 독립적으로 염기성 아미노산, 예컨대, 라이신 또는 아르기닌으로 치환될 수 있다.
예컨대, CL 도메인은 양전하를 갖는 아미노산을 도입하기 위하여, 다음 중 하나 이상, 예컨대, 하나, 2개 이상 (예컨대 2 개), 3개 이상 (예컨대, 3개), 또는 4개 이상 (예컨대 4개)의 돌연변이를 포함할 수 있다 (서열번호 10 기준; 서열번호 11 내지 14에서 대응하는 위치의 아미노산에도 적용됨):
131번째 위치의 세린을 라이신 또는 아르기닌으로 치환 (예컨대 라이신으로 치환);
133번째 위치의 발린을 라이신 또는 아르기닌으로 치환 (예컨대 라이신으로 치환);
135번째 위치의 류신을 라이신 또는 아르기닌으로 치환 (예컨대 아르기닌으로 치환);
162번째 위치의 세린을 라이신 또는 아르기닌으로 치환 (예컨대, 라이신으로 치환); 및
180번째 위치의 트레오닌을 라이신 또는 아르기닌으로 치환 (예컨대, 아르기닌으로 치환).
동형 이합체 형성률을 보다 높이기 위하여, 상기한 변이 CH1 도메인 및/또는 변이 CL 도메인은 2 가지 이상의 변이를 동시에 포함할 수 있다.
예컨대, CH1 도메인의 147번째 위치의 라이신과 185번째 위치의 발린이 양전하를 갖는 아미노산 또는 음전하를 갖는 아미노산으로 치환될 수 있다. 예컨대, 제1 CH1 도메인과 제2 CH1 도메인 중 어느 하나의 CH1 도메인의 147번째 위치의 라이신과 185번째 위치의 발린이 양전하를 갖는 아미노산 (예컨대, 라이신 또는 아르기닌)으로 치환되고, 다른 CH1 도메인의 147번째 위치의 라이신과 185번째 위치의 발린은 음전하를 갖는 아미노산 (글루탐산 또는 아스파르트산)으로 치환될 수 있다. 또한, CL 도메인의 135번째 위치의 류신과 180번째 위치의 트레오닌이 양전하를 갖는 아미노산 또는 음전하를 갖는 아미노산으로 치환될 수 있다. 예컨대, 제1 CL 도메인과 제2 CL 도메인 중 어느 하나의 CL 도메인의 135번째 위치의 류신과 180번째 위치의 트레오닌이 양전하를 갖는 아미노산 (예컨대, 라이신 또는 아르기닌)으로 치환되고, 다른 CL 도메인의 135번째 위치의 류신과 180번째 위치의 트레오닌은 음전하를 갖는 아미노산 (글루탐산 또는 아스파르트산)으로 치환될 수 있다.
다른 예에서, CH1 도메인의 170번째 위치의 페닐알라닌과 171번째 위치의 프롤린이 양전하를 갖는 아미노산 또는 음전하를 갖는 아미노산으로 치환될 수 있다. 예컨대, 제1 CH1 도메인과 제2 CH1 도메인 중 어느 하나의 CH1 도메인의 170번째 위치의 페닐알라닌과 171번째 위치의 프롤린이 양전하를 갖는 아미노산 (예컨대, 라이신 또는 아르기닌)으로 치환되고, 다른 CH1 도메인의 170번째 위치의 페닐알라닌과 171번째 위치의 프롤린은 음전하를 갖는 아미노산 (글루탐산 또는 아스파르트산)으로 치환될 수 있다. 또한, CL 도메인의 135번째 위치의 류신과 162번째 위치의 세린이 양전하를 갖는 아미노산 또는 음전하를 갖는 아미노산으로 치환될 수 있다. 예컨대, 제1 CL 도메인과 제2 CL 도메인 중 어느 하나의 CL 도메인의 135번째 위치의 류신과 162번째 위치의 세린이 양전하를 갖는 아미노산 (예컨대, 라이신 또는 아르기닌)으로 치환되고, 다른 CL 도메인의 135번째 위치의 류신과 162번째 위치의 세린은 음전하를 갖는 아미노산 (글루탐산 또는 아스파르트산)으로 치환될 수 있다.
상기 음전하를 갖는 아미노산은 산성 아미노산 중에서 선택될 수 있으며, 예컨대, 아스파르트산 또는 글루탐산일 수 있다. 따라서, CL 도메인에 음전하를 갖는 아미노산이 도입되는 경우, 서열번호 10의 131번째 위치의 세린, 133번째 위치의 발린, 135번째 위치의 류신, 162번째 위치의 세린, 및 180번째 위치의 트레오닌, 및 이들과 대응되는 위치의 서열번호 11 내지 14의 아미노산들로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상, 예컨대, 하나, 2개 이상 (예컨대 2 개), 3개 이상 (예컨대, 3개), 또는 4개 이상 (예컨대 4개)이 각각 독립적으로 산성 아미노산, 예컨대, 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환될 수 있다.예컨대, CL 도메인은 양전하를 갖는 아미노산을 도입하기 위하여, 다음 중 하나 이상, 예컨대, 하나, 2개 이상 (예컨대 2 개), 3개 이상 (예컨대, 3개), 또는 4개 이상 (예컨대 4개)의 돌연변이를 포함할 수 있다 (서열번호 10 기준; 서열번호 11 내지 14에서 대응하는 위치의 아미노산에도 적용됨):
131번째 위치의 세린을 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환 (예컨대 글루탐산으로 치환);
133번째 위치의 발린을 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환 (예컨대 글루탐산으로 치환);
135번째 위치의 류신을 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환 (예컨대 아스파르트산으로 치환);
162번째 위치의 세린을 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환 (예컨대, 아스파르트산으로 치환); 및
180번째 위치의 트레오닌을 아스파르트산 또는 글루탐산으로 치환 (예컨대, 아스파르트산으로 치환).
일 예에서, 상기와 같이 CH1 도메인와 CL 도메인 간 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산을 서로 다른 전하를 갖는 아미노산으로 치환하는 돌연변이가 도입되는 CH1 도메인과 CL 도메인 간 아미노산 쌍은, 서열번호 1 (CH1 도메인) 및 서열번호 10 (CL 도메인)의 아미노산 서열을 기준으로, CH1 도메인의 145번째 위치의 류신과 CL 도메인의 131번째 위치의 세린 쌍, CH1 도메인의 145번째 위치의 류신과 CL 도메인의 133번째 위치의 발린 쌍, CH1 도메인의 147번째 위치의 라이신과 CL 도메인의 180번째 위치의 트레오닌 쌍, CH1 도메인의 183번째 위치의 세린과 CL 도메인의 133번째 위치의 발린 쌍, CH1 도메인의 185번째 위치의 발린과 CL 도메인의 135번째 위치의 류신 쌍, CH1 도메인의 170번째 위치의 페닐알라닌과 CL 도메인의 135번째 위치의 류신 쌍, 및 CH1 도메인의 171번째 위치의 프롤린과 CL 도메인의 162번째 위치의 세린 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상, 예컨대, 하나, 2개 이상 (예컨대 2 개), 3개 이상 (예컨대, 3개), 또는 4개 이상 (예컨대 4개)일 수 있다. 예컨대, 상기 돌연변이가 도입되는 CH1 도메인과 CL 도메인 간 아미노산 쌍은, 서열번호 1 (CH1 도메인) 및 서열번호 10 (CL 도메인)의 아미노산 서열을 기준으로, CH1 도메인의 145번째 위치의 류신과 CL 도메인의 131번째 위치의 세린 쌍, CH1 도메인의 145번째 위치의 류신과 CL 도메인의 133번째 위치의 발린 쌍, CH1 도메인의 147번째 위치의 라이신과 CL 도메인의 180번째 위치의 트레오닌 쌍, CH1 도메인의 183번째 위치의 세린과 CL 도메인의 133번째 위치의 발린 쌍, 및 CH1 도메인의 185번째 위치의 발린과 CL 도메인의 135번째 위치의 류신 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 또는 2개 이상 (예컨대, 2개)일 수 있다.
상기 돌연변이가 도입되는 제1 CH1 도메인과 제1 CL 도메인 간 아미노산 쌍과, 제2 CH1 도메인과 제2 CL 도메인 간 아미노산 쌍은 서로 동일하거나 다를 수 있다.
일 예에서, 제1 CH1 도메인에 양전하를 갖는 아미노산이 도입된 경우 (제1 CL 도메인에는 음전하를 갖는 아미노산이 도입됨), 제2 CH1 도메인에는 음전하를 갖는 아미노산이 도입 (제2 CL 도메인에는 양전하를 갖는 아미노산이 도입됨)될 수 있다.
이종 이합체 형성률을 증가시키기 위하여, 중쇄의 Fc 영역, 구체적으로 Fc 영역 중 CH3 도메인에 다음으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상, 예컨대, 하나, 2개 또는 3개의 돌연변이를 도입할 수 있다:
(1) CH3 도메인 간의 하나 이상의 아미노산 쌍 (두 개의 아미노산 중 하나 이상은 소수성 아미노산이 아님) 중 어느 하나의 아미노산은 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되고, 다른 하나의 아미노산은 음전하를 갖는 아미노산으로 치환된 변이 (이하, "정전기적 상호작용 도입 변이");
(2) CH3 도메인 간의 하나 이상의 아미노산 쌍의 아미노산이 서로 교환된 변이 (이하, "스와핑 변이"); 및
(3) CH3 도메인 간의 하나 이상의 아미노산 쌍 중 어느 하나의 아미노산은 크기가 큰 아미노산 (예컨대, 트립토판, 페닐알라닌 등과 같은 크기가 큰 소수성 아미노산)으로 치환되고, 다른 하나의 아미노산은 크기가 작은 아미노산 (예컨대, 알라닌, 글라이신, 발린 등과 같은 크기가 작은 소수성 아미노산)으로 치환된 변이 (이하, "사이즈 변이").
이와 같이 변이가 도입되는 CH3 도메인은 인간 IgG1의 CH3 도메인 (서열번호 15; Eu 넘버링으로, 340번부터 447번까지에 해당함), 인간 IgG2의 CH3 도메인 (서열번호 16), 인간 IgG3의 CH3 도메인 (서열번호 17), 인간 IgG4의 CH3 도메인 (서열번호 18), 인간 IgA1의 CH3 도메인 (서열번호 19), 인간 IgA2의 CH3 도메인 (서열번호 20), 인간 IgD의 CH3 도메인 (서열번호 21), 인간 IgE의 CH3 도메인 (서열번호 22), 및 인간 IgM의 CH3 도메인 (서열번호 23)으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 변이가 도입되는 제1 CH3 도메인과 제2 CH3 도메인은 각각 독립적으로 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, 및 IgM로 이루어진 군에서 선택된 서로 같거나 다른 면역글로불린 타입으로부터 유래하는 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 제1 CH3 도메인과 제2 CH3 도메인은 모두 서열번호 15의 아미노산 서열을 갖는 인간 IgG1의 CH3 도메인일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하 기재되는 제1 CH3 도메인과 제2 CH3 도메인 간 아미노산 쌍은 서열번호 15의 인간 IgG1의 CH3 도메인을 기준으로 기재된 것이며, 이에 대응하는 위치의 IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, 및 IgM의 CH3 도메인 (순서대로, 서열번호 16 내지 23) 간의 아미노산 쌍에도 적용된다.
상기 기재된 변이가 도입되는 제1 CH3 도메인과 제2 CH3 도메인 간 아미노산 쌍은 아래의 표 1에 제시된 CH3 도메인 간 아미노산 쌍, 및 이에 대응하는 위치의 IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgE, 및 IgM의 CH3 도메인 (순서대로, 서열번호 16 내지 23) 간의 아미노산 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상, 예컨대, 하나, 2개 이상 (예컨대 2 개), 3개 이상 (예컨대, 3개), 또는 4개 이상 (예컨대 4개)일 수 있다.
아미노산 쌍 번호 IgG (1-4) IgA1 IgA2 IgE IgM
Chain A Chain B Chain A Chain B Chain A Chain B Chain A Chain B Chain A Chain B
1 Q347 K360 E347 L360 E347 L360 E444 R457 Q347 K360
2 Y349 S354 H349 P354 H349 P354 Y446 P451 Y349 S354
3 Y349 E357 H349 E357 H349 E357 Y446 P454 Y349 E357
4 Y349 K360 H349 L360 H349 L360 Y446 R457 Y349 K360
5 L351 L351 L351 L351 L351 L351 F448 F448 L351 L351
6 P352 P352 P352 P352 P352 P352 A449 A449 P352 P352
7 S354 Y349 P354 H349 P354 H349 P451 Y446 S354 Y349
8 D356 K439 E356 K439 E356 K439 W453 R539 D356 K439
9 E357 Y349 E357 H349 E357 H349 P454 Y446 E357 Y349
10 E357 K370 E357 R370 E357 R370 P454 Q467 E357 K370
11 K360 Q347 L360 E347 L360 E347 R457 E444 K360 Q347
12 K360 Y349 L360 H349 L360 H349 R457 Y446 K360 Y349
13 S364 L368 T364 L368 T364 L368 T461 L465 S364 L368
14 S364 K370 T364 R370 T364 R370 T461 Q467 S364 K370
15 T366 T366 T366 T366 T366 T366 A463 A463 T366 T366
16 T366 Y407 T366 T407 T366 T407 A463 F506 T366 Y407
17 L368 S364 L368 T364 L368 T364 L465 T461 L368 S364
18 L368 K409 L368 I409 L368 I409 L465 R508 L368 K409
19 K370 E357 R370 E357 R370 E357 Q467 P454 K370 E357
20 K370 S364 R370 T364 R370 T364 Q467 T461 K370 S364
21 K370 T411 R370 R411 R370 R411 Q467 E510 K370 T411
22 N390 S400 L390 S400 L390 S400 R489 K499 N390 S400
23 K392 L398 L392 Q398 L392 Q398 S491 K497 K392 L398
24 T394 T394 W394 W394 W394 W394 T493 T493 T394 T394
25 T394 V397 W394 R397 W394 R397 T493 R496 T394 V397
26 P395 P395 A395 A395 A395 A395 Q494 Q494 P395 P395
27 P395 V397 A395 R397 A395 R397 Q494 R496 P395 V397
28 V397 T394 R397 W394 R397 W394 R496 T493 V397 T394
29 V397 P395 R397 A395 R397 A395 R496 Q494 V397 P395
30 L398 K392 Q398 L392 Q398 L392 K497 S491 L398 K392
31 S400 N390 S400 K390 S400 K390 K499 R489 S400 N390
32 F405 K409 A405 I409 A405 I409 F504 R508 F405 K409
33 Y407 T366 T407 T366 T407 T366 F506 A463 Y407 T366
34 Y407 Y407 T407 T407 T407 T407 F506 F506 Y407 Y407
35 Y407 K409 T407 I409 T407 I409 F506 R508 Y407 K409
36 K409 L368 I409 L368 I409 L368 R508 L465 K409 L368
37 K409 F405 I409 A405 I409 A405 R508 F504 K409 F405
38 K409 Y407 I409 T407 I409 T407 R508 F506 K409 Y407
39 T411 K370 R411 R370 R411 R370 E510 Q467 T411 K370
40 K439 D356 K439 K439 K439 K439 R539 W453 K439 D356
(Chain A: 제1 CH3 도메인; Chain B: 제2 CH3 도메인)
보다 구체적으로,
(1) 정전기적 상호작용 도입 변이 (표 2 및 도 2에서 Charge (J)로 표시);
(2) 스와핑 변이 (표 2 및 도 2에서 Swap (O)로 표시); 및
(3) 사이즈 변이 (표 2 및 도 2에서 Size (B)로 표시)
중 어느 하나 이상이 도입되는 제1 CH3 도메인과 제2 CH3 도메인 간 아미노산 쌍은 아래의 표 2 및 도 2에 제시된 IgG1의 CH3 도메인 (서열번호 15) 간의 아미노산 쌍, 및 이에 대응하는 위치의 IgG2, IgG3 IgG4 IgA1 IgA2 IgD, IgE, 및 IgM의 CH3 도메인 (순서대로, 서열번호 16 내지 23) 간의 아미노산 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상, 예컨대, 하나, 2개 이상 (예컨대 2 개), 3개 이상 (예컨대, 3개), 또는 4개 이상 (예컨대 4개)일 수 있다:
아미노산 쌍 번호 Charge (J) Swap (O) Size (B)
Chain A Chain B Chain A Chain B Chain A Chain B
1 Q347 K360 Q347 K360　 Q347 K360
2 Y349 S354 Y349 S354
3 Y349 E357 Y349 E357
4 Y349 K360 Y349 K360
5 L351 L351 　 　 L351 L351
6 P352 P352 　 　 P352 P352
7 S354 Y349 S354 Y349 S354 Y349
8 D356 K439 　 　 D356 K439
9 E357 Y349 E357 Y349 E357 Y349
10 E357 K370 E357 K370 E357 K370
11 K360 Q347 K360 Q347
12 K360 Y349 K360 Y349 K360 Y349
13 S364 L368 S364 L368 S364 L368
14 S364 K370 S364 K370 S364 K370
15 T366 T366 　 　 T366 T366
16 T366 Y407 T366 Y407
17 L368 S364 L368 S364
18 L368 K409 L368 K409 L368 K409
19 K370 E357 K370 E357
20 K370 S364 K370 S364
21 K370 T411 K370 T411
22 N390 S400 N390 S400 N390 S400
23 K392 L398 K392 L398
24 T394 T394 　 　 T394 T394
25 T394 V397 T394 V397 T394 V397
26 P395 P395 　 　 P395 P395
27 P395 V397 　 　 P395 V397
28 V397 T394 V397 T394
29 V397 P395 V397 P395
30 L398 K392 L398 K392 L398 K392
31 S400 N390 S400 N390
32 F405 K409 F405 K409 F405 K409
33 Y407 T366 Y407 T366 Y407 T366
34 Y407 Y407 　 　 Y407 Y407
35 Y407 K409 　 　 Y407 K409
36 K409 L368 K409 L368
37 K409 F405 K409 F405
38 K409 Y407 K409 Y407
39 T411 K370 T411 K370 T411 K370
40 K439 D356
(Chain A: 제1 CH3 도메인; Chain B: 제2 CH3 도메인;
상기 표 2에 기재된 변이 위치는 IgG1을 기준으로 표시되었으나, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, 및 IgM의 CH3 도메인의 이에 대응되는 위치에도 적용됨)
본 명세서에 사용된 바로서, 예컨대, 'Q347'은 서열번호 15의 인간 IgG1의 CH3 도메인의 347번째 아미노산 위치의 글루타민을 의미하며, 이는 IgG2, IgG3 IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, 및 IgM의 CH3 도메인 (순서대로, 서열번호 16 내지 23)에서의 이에 대응하는 위치의 아미노산 잔기에도 적용된다 (이하 동일함).
이하 기재되는 CH3 도메인에 변이가 도입되는 아미노산 쌍은 서열번호 15를 기준으로 넘버링하여 표시되며, 별도의 반대 기재가 없는 한, IgG1의 표시된 위치의 아미노산뿐 아니라, 다른 타입의 면역글로불린(IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, 또는 IgM)의 CH3 도메인의 이에 대응하는 위치의 아미노산에도 적용되는 것으로 해석된다.
상기 정전기적 상호작용 도입 변이는 Fc 영역 또는 CH3 도메인 간의 하나 이상의 아미노산 쌍 (두 개의 아미노산 중 하나 이상은 소수성 아미노산이 아님) 중 어느 하나의 아미노산은 양전하를 갖는 아미노산으로 치환, 다른 하나의 아미노산은 음전하를 갖는 아미노산으로 치환에 의하여, 소수성 상호작용을 하지 않는 부분에 정전기적 상호작용을 도입하여 정전기적 상호작용에 의한 결합력 증가에 기여한다.
상기 소수성 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 및 트립토판으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 음전하를 갖는 아미노산은 산성 아미노산들 중에서 선택될 수 있으며, 에컨대, 아스파르트산 또는 글루탐산일 수 있다. 상기 상기 양전하를 갖는 아미노산은 염기성 아미노산들 중에서 선택될 수 있으며, 예컨대, 라이신 또는 아르기닌일 수 있다.
상기 정전기적 상호작용 도입 변이가 적용될 수 있는 제1 CH3 도메인과 제2 CH3 간 아미노산 쌍은 상기 표 2의 아미노산 쌍 번호 1 내지 39 중 선택된 하나 이상, 예컨대, 하나, 2개 이상 (예컨대 2 개), 3개 이상 (예컨대, 3개), 또는 4개 이상 (예컨대 4개)일 수 있으며, 예컨대, 364번째 위치의 세린과 368번째 위치의 류신, 394번째 위치의 트레오닌과 394번째 위치의 트레오닌, 357번째 위치의 글루탐산과 370번째 위치의 라이신, 357번째 위치의 글루탐산과 349번째 위치의 타이로신, 366번째 위치의 트레오닌과 407번째 위치의 타이로신, 및 394번째 위치의 트레오닌과 397번째 위치의 발린으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상, 예컨대, 하나, 2개 이상 (예컨대 2 개), 3개 이상 (예컨대, 3개), 또는 4개 이상 (예컨대 4개)일 수 있다.
즉, 상기 CH3 도메인의 정전기적 상호작용 도입 변이는, 상기 표 2의 아미노산 쌍 번호 1 내지 39 중 선택된 하나 이상, 예컨대, 하나, 2개 이상 (예컨대 2 개), 3개 이상 (예컨대, 3개), 또는 4개 이상 (예컨대 4개)의 아미노산 쌍 중 각각의 아미노산 쌍의 어느 하나의 아미노산을 양전하를 갖는 아미노산으로, 다른 하나의 아미노산을 음전하를 갖는 아미노산으로 치환을 포함할 수 있으며, 예컨대, 364번째 위치의 세린과 368번째 위치의 류신, 394번째 위치의 트레오닌과 394번째 위치의 트레오닌, 357번째 위치의 글루탐산과 370번째 위치의 라이신, 357번째 위치의 글루탐산과 349번째 위치의 타이로신, 366번째 위치의 트레오닌과 407번째 위치의 타이로신, 및 394번째 위치의 트레오닌과 397번째 위치의 발린으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상, 예컨대, 하나, 2개 이상 (예컨대 2 개), 3개 이상 (예컨대, 3개), 또는 4개 이상 (예컨대 4개)의 아미노산 쌍 중 각각의 아미노산 쌍의 어느 하나의 아미노산을 양전하를 갖는 아미노산으로, 다른 하나의 아미노산을 음전하를 갖는 아미노산으로 치환을 포함할 수 있다.
예컨대, 상기 CH3 도메인의 정전기적 상호작용 도입 변이는 다음 중 하나 이상, 예컨대, 하나, 2개 이상 (예컨대 2 개), 3개 이상 (예컨대, 3개), 또는 4개 이상 (예컨대 4개)의 변이를 포함할 수 있다:
364번째 위치의 세린을 양전하를 갖는 아미노산으로, 368번째 위치의 류신을 음전하를 갖는 아미노산으로 치환;
394번째 위치의 트레오닌을 양전하를 갖는 아미노산으로, 394번째 위치의 트레오닌을 음전하를 갖는 아미노산으로 치환;
357번째 위치의 글루탐산을 양전하를 갖는 아미노산으로, 370번째 위치의 라이신을 음전하를 갖는 아미노산으로 치환;
357번째 위치의 글루탐산을 양전하를 갖는 아미노산으로, 349번째 위치의 타이로신을 음전하를 갖는 아미노산으로 치환;
366번째 위치의 트레오닌을 양전하를 갖는 아미노산으로, 407번째 위치의 타이로신을 음전하를 갖는 아미노산으로 치환;
394번째 위치의 트레오닌을 양전하를 갖는 아미노산으로, 397번째 위치의 발린을 음전하를 갖는 아미노산으로 치환; 및
349번째 위치의 타이로신을 양전하를 갖는 아미노산으로, 357번째 위치의 글루탐산을 음전하를 갖는 아미노산으로 치환.
이와 같은 CH3 도메인의 정전기적 상호작용 도입에 의하여 이종 이합체 형성률이 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 73% 이상, 75% 이상, 78% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 100%일 수 있다.
상기 스와핑 변이는 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산을 서로 맞바꾼 (상호 교환한) 변이를 의미한다.
상기 CH3 도메인의 스와핑 변이가 적용될 수 있는 제1 CH3 도메인과 제2 CH3 간 아미노산 쌍은, 표 2 및 도 2에 나타난 바와 같이, 354번째 위치의 글루타민과 360번째 위치의 라이신, 357번째 위치의 세린과 349번째 위치의 타이로신, 357번째 위치의 글루탐산과 370번째 위치의 라이신, 360번째 위치의 라이신과 349번째 위치의 타이로신, 364번째 위치의 세린과 368번째 위치의 류신, 364번째 위치의 세린과 370번째 위치의 라이신, 368번째 류신과 409번째 라이신, 390번째 위치의 아스파라긴과 400번 위치의 세린, 394번째 위치의 트레오닌과 397번째 위치의 발린, 398번째 위치의 류신과 392번째 위치의 라이신, 405번째 위치의 페닐알라닌과 409번째 위치의 라이신, 407번째 위치의 타이로신과 366번째 위치의 트레오닌, 및 411번째 위치의 트레오닌과 370번째 위치의 라이신으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상, 예컨대, 하나, 2개 이상 (예컨대 2 개), 3개 이상 (예컨대, 3개), 또는 4개 이상 (예컨대 4개)일 수 있으며, 예컨대, 364번째 위치의 세린과 370번째 위치의 라이신, 407번째 위치의 타이로신과 366번째 위치의 트레오닌, 357번째 위치의 글루탐산과 370번째 위치의 라이신, 405번째 위치의 페닐알라닌과 409번째 위치의 라이신, 및 357번째 위치의 세린과 349번째 위치의 타이로신으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상, 예컨대, 하나, 2개 이상 (예컨대 2 개), 3개 이상 (예컨대, 3개), 또는 4개 이상 (예컨대 4개)일 수 있다.
즉, 상기 CH3 도메인의 스와핑 변이는, 354번째 위치의 글루타민과 360번째 위치의 라이신, 357번째 위치의 세린과 349번째 위치의 타이로신, 357번째 위치의 글루탐산과 370번째 위치의 라이신, 360번째 위치의 라이신과 349번째 위치의 타이로신, 364번째 위치의 세린과 368번째 위치의 류신, 364번째 위치의 세린과 370번째 위치의 라이신, 368번째 류신과 409번째 라이신, 390번째 위치의 아스파라긴과 400번 위치의 세린, 394번째 위치의 트레오닌과 397번째 위치의 발린, 398번째 위치의 류신과 392번째 위치의 라이신, 405번째 위치의 페닐알라닌과 409번째 위치의 라이신, 407번째 위치의 타이로신과 366번째 위치의 트레오닌, 및 411번째 위치의 트레오닌과 370번째 위치의 라이신으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상, 예컨대, 하나, 2개 이상 (예컨대 2 개), 3개 이상 (예컨대, 3개), 또는 4개 이상 (예컨대 4개)의 아미노산 쌍 중 각각의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산을 서로 맞바꾸어 치환(교환)된 것을 포함할 수 있으며, 예컨대, 364번째 위치의 세린과 370번째 위치의 라이신, 407번째 위치의 타이로신과 366번째 위치의 트레오닌, 357번째 위치의 글루탐산과 370번째 위치의 라이신, 405번째 위치의 페닐알라닌과 409번째 위치의 라이신, 및 357번째 위치의 세린과 349번째 위치의 타이로신으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상, 예컨대, 하나, 2개 이상 (예컨대 2 개), 3개 이상 (예컨대, 3개), 또는 4개 이상 (예컨대 4개)의 아미노산 쌍 중 각각의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산을 서로 맞바꾸어 치환(교환)된 것을 포함할 수 있다.
예컨대, 상기 CH3 도메인의 스와핑 변이는 다음 중 하나 이상, 예컨대, 하나, 2개 이상 (예컨대 2 개), 3개 이상 (예컨대, 3개), 또는 4개 이상 (예컨대 4개)의 변이를 포함할 수 있다:
364번째 위치의 세린을 라이신으로, 370번째 위치의 라이신을 세린으로 치환;
405번째 위치의 페닐알라닌을 라이신으로, 409번째 위치의 라이신을 페닐알라닌으로 치환;
407번째 위치의 타이로신을 트레오닌으로, 366번째 위치의 트레오닌을 타이로신으로 치환;
357번째 위치의 글루탐산을 라이신으로, 370번째 위치의 라이신을 글루탐산으로 치환; 및
357번째 위치의 세린을 타이로신으로, 349번째 위치의 타이로신을 세린으로 치환.
이와 같은 CH3 도메인의 스와핑 변이에 의하여 이종 이합체 형성률이 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 73% 이상, 75% 이상, 78% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 100%일 수 있다.
상기 사이즈 변이는 CH3 도메인 간의 하나 이상의 아미노산 쌍 중 어느 하나의 아미노산은 크기가 큰 소수성 아미노산 (예컨대, 트립토판, 페닐알라닌 등과 같은 크기가 큰 소수성 아미노산)으로 치환되고, 다른 하나의 아미노산은 크기가 작은 소수성 아미노산 (예컨대, 알라닌, 글라이신, 발린 등과 같은 크기가 작은 소수성 아미노산)으로 치환된 변이를 의미하는 것으로, 큰 아미노산이 작은 아미노산에 의하여 형성된 공간에 끼워 맞춰질 수 있으므로, 헤테로 이합체 형성에 기여할 수 있다.
상기 큰 아미노산은 고리형 잔기를 포함하는 것일 수 있으며, 트립토판 및 페닐알라닌으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있고, 예컨대, 트립토판일 수 있다. 상기 작은 아미노산은 알라닌, 글라이신, 및 발린으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 예컨대, 알라닌일 수 있다.
상기 사이즈 변이가 적용될 수 있는 제1 CH3 도메인과 제2 CH3 간 아미노산 쌍은 상기 표 2의 아미노산 쌍 번호 1 내지 40 중 선택된 하나 이상, 예컨대, 하나, 2개 이상 (예컨대 2 개), 3개 이상 (예컨대, 3개), 또는 4개 이상 (예컨대 4개)일 수 있으며, 예컨대, 409번째 위치의 라이신과 407번째 위치의 타이로신, 409번째 위치의 라이신과 405번째 위치의 페닐알라닌, 또는 이들의 조합일 수 있다.
즉, 상기 사이즈 변이는, 상기 표 2의 아미노산 쌍 번호 1 내지 40 중 선택된 하나 이상, 예컨대, 하나, 2개 이상 (예컨대 2 개), 3개 이상 (예컨대, 3개), 또는 4개 이상 (예컨대 4개)의 아미노산 쌍 중 각각의 아미노산 쌍의 어느 하나의 아미노산을 크기가 큰 소수성 아미노산 (예컨대, 트립토판, 페닐알라닌 등과 같은 크기가 큰 소수성 아미노산), 예컨대 트립토판으로 치환, 다른 하나의 아미노산을 크기가 작은 소수성 아미노산 (예컨대, 알라닌, 글라이신, 발린 등과 같은 크기가 작은 소수성 아미노산), 예컨대 알라닌으로 치환을 포함할 수 있으며, 예컨대, 409번째 위치의 라이신과 407번째 위치의 타이로신, 409번째 위치의 라이신과 405번째 위치의 페닐알라닌, 또는 이들 모두 중 각각의 아미노산 쌍의 어느 하나의 아미노산을 크기가 큰 소수성 아미노산, 예컨대 페닐알라닌 또는 트립토판으로 치환, 다른 하나의 아미노산을 크기가 작은 소수성 아미노산, 예컨대 알라닌, 글라이신, 또는 발린으로 치환을 포함할 수 있다.
예컨대, 상기 CH3 도메인의 사이즈 변이는 다음 중 하나 이상의 변이를 포함할 수 있다:
409번째 위치의 라이신을 트립토판으로, 407번째 위치의 타이로신을 알라닌으로 치환; 및
409번째 위치의 라이신을 트립토판으로, 405번째 위치의 페닐알라닌을 알라닌으로 치환.
상기 변이 CH3 도메인은 앞서 설명한 3가지 변이, 즉 정전기적 상호작용 도입 변이, 스와핑 변이, 및 사이즈 변이 중 하나 이상, 예컨대, 하나 또는 2 개의 변이를 모두 포함할 수 있다.
상기한 바와 같은 변이 CH3 도메인에 있어서, 이합체 형성에 가장 유리한 효과를 발휘하도록, 364번째 위치의 세린과 368번째 위치의 류신 중 어느 하나는 양전하를 갖는 아미노산으로, 다른 하나는 음전하를 갖는 아미노산으로 치환 (정전기적 상호 작용 도입 변이), 364번째 위치의 세린과 370번째 위치의 라이신의 교환 (스와핑 변이), 및 405번째 위치의 페닐알라닌과 409번째 위치의 라이신의 교환 (스와핑 변이)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상, 예컨대, 하나, 2개 또는 3개의 변이를 포함할 수 있다.
예컨대, 변이 CH3 도메인은 다음의 변이 중 하나 이상, 예컨대 하나, 2개 또는 3개의 변이를 포함하는 것일 수 있다:
(a) 364번째 위치의 세린을 양전하를 갖는 아미노산으로, 368번째 위치의 류신을 음전하를 갖는 아미노산으로 치환;
(b) 364번째 위치의 세린을 라이신으로, 370번째 위치의 라이신을 세린으로 치환; 및
(c) 405번째 위치의 페닐알라닌을 라이신으로, 409번째 위치의 라이신을 페닐알라닌으로 치환.
단량체 생성률을 낮추고 이합체 형성률을 보다 증가시키기 위하여, 상기 선택된 3개의 변이 ((a)-(c)) 도입 후, 추가의 아미노산 변이가 도입될 수 있다. 이와 같이 추가의 아미노산 변이가 도입될 수 있는 아미노산은 364번째 위치의 세린, 405번째 위치의 페닐알라닌, 및/또는 409번째 위치의 라이신일 수 있으며, 예컨대,
정전기적 상호작용 도입 변이가 일어나는 아미노산 쌍인 364번째 위치의 세린과 368번째 위치의 류신의 아미노산 쌍에서, 368번째 위치의 류신을 음전하를 갖는 아미노산 (아스파르트산 또는 글루탐산, 예컨대 아스파르트산)으로 치환하는 경우, 364번째 위치의 세린은 양전하를 갖는 아미노산 (라이신 또는 아르기닌)으로 치환되거나(S364K 또는 S364R; 정전기적 상호작용 도입 변이), 아스파라긴으로 치환 (S364N)될 수 있다. 또한, 스와핑 변이가 일어나는 아미노산 쌍인 370번째 위치의 라이신과 364번째 위치의 세린의 아미노산 쌍에서, 370번째 위치의 라이신을 세린으로, 364번째 위치의 세린은 라이신으로 치환되거나 (S364K; 스와핑 변이), 아르기닌 또는 아스파라긴으로 치환 (S364R 또는 S364N)될 수 있다.
또한, 스와핑 변이가 일어나는 아미노산 쌍인 409번째 위치의 라이신과 405번째 위치의 페닐알라닌의 아미노산 쌍에 있어서, 409번째 위치의 라이신을 페닐알라닌으로 치환되거나 (스와핑 변이), 트립토판으로 치환될 수 있고, 405번째 위치의 페닐알라닌은 라이신으로 치환되거나 (F405K; 스와핑 변이), 아르기닌, 글루타민, 또는 아스파라긴으로 치환 (F405R, F405Q, 또는 F405N)될 수 있다.
일 예에서, 변이 CH3 도메인은 다음에서 선택된 하나 이상의 변이를 포함하는 것일 수 있다:
364번째 위치의 세린의 라이신으로의 치환과 368번째 위치의 류신의 아스파르트산으로의 치환;
364번째 위치의 세린의 라이신으로의 치환과 370번째 위치의 라이신의 세린으로의 치환;
405번째 위치의 페닐알라닌의 라이신으로의 치환과 409번째 위치의 라이신의 페닐알라닌으로의 치환;
405번째 위치의 페닐알라닌의 아르기닌으로의 치환과 409번째 위치의 라이신의 페닐알라닌으로의 치환;
405번째 위치의 페닐알라닌의 라이신으로의 치환과 409번째 위치의 라이신의 트립토판으로의 치환; 및
405번째 위치의 페닐알라닌의 아르기닌으로의 치환과 409번째 위치의 라이신의 트립토판으로의 치환.
일 예에서, 변이 CH3 도메인은 다음에서 선택된 이중 변이를 포함하는 것일 수 있다:
제1 CH3 도메인의 364번째 위치의 세린의 라이신으로 치환과 제2 CH3 도메인의 368번째 위치의 류신의 아스파르트산으로의 치환, 및 제1 CH3 도메인의 409번째 위치의 라이신의 페닐알라닌으로의 치환과 제2 CH3 도메인의 405번째 위치의 페닐알라닌의 라이신으로의 치환;
제1 CH3 도메인의 364번째 위치의 세린의 라이신으로 치환과 제2 CH3 도메인의 368번째 위치의 류신의 아스파르트산으로의 치환, 및 제1 CH3 도메인의 409번째 위치의 라이신의 페닐알라닌으로의 치환과 제2 CH3 도메인의 405번째 위치의 페닐알라닌의 아르기닌으로의 치환;
제1 CH3 도메인의 364번째 위치의 세린의 라이신으로 치환과 제2 CH3 도메인의 370번째 위치의 라이신의 세린으로의 치환, 및 제1 CH3 도메인의 409번째 위치의 라이신의 페닐알라닌으로의 치환과 제2 CH3 도메인의 405번째 위치의 페닐알라닌의 라이신으로의 치환;
제1 CH3 도메인의 364번째 위치의 세린의 라이신으로 치환과 제2 CH3 도메인의 370번째 위치의 라이신의 세린으로의 치환, 및 제1 CH3 도메인의 409번째 위치의 라이신의 페닐알라닌으로의 치환과 제2 CH3 도메인의 405번째 위치의 페닐알라닌의 아르기닌으로의 치환;
제1 CH3 도메인의 364번째 위치의 세린의 라이신으로 치환과 제2 CH3 도메인의 368번째 위치의 류신의 아스파르트산으로의 치환, 및 제1 CH3 도메인의 409번째 위치의 라이신의 트립토판으로의 치환과 제2 CH3 도메인의 405번째 위치의 페닐알라닌의 라이신으로의 치환;
제1 CH3 도메인의 364번째 위치의 세린의 라이신으로 치환과 제2 CH3 도메인의 368번째 위치의 류신의 아스파르트산으로의 치환, 및 제1 CH3 도메인의 409번째 위치의 라이신의 트립토판으로의 치환과 제2 CH3 도메인의 405번째 위치의 페닐알라닌의 아르기닌으로의 치환;
제1 CH3 도메인의 364번째 위치의 세린의 라이신으로 치환과 제2 CH3 도메인의 370번째 위치의 라이신의 세린으로의 치환, 및 제1 CH3 도메인의 409번째 위치의 라이신의 트립토판으로의 치환과 제2 CH3 도메인의 405번째 위치의 페닐알라닌의 라이신으로의 치환; 또는
제1 CH3 도메인의 364번째 위치의 세린의 라이신으로 치환과 제2 CH3 도메인의 370번째 위치의 라이신의 세린으로의 치환, 및 제1 CH3 도메인의 409번째 위치의 라이신의 트립토판으로의 치환과 제2 CH3 도메인의 405번째 위치의 페닐알라닌의 아르기닌으로의 치환.
상기와 같이 CH3 도메인이 이중 변이를 포함하는 경우의 이종 이합체 형성률은 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상 또는 96% 이상일 수 있다.
다른 예는 서열번호 27의 중쇄가변영역 및 서열번호 31의 경쇄가변영역을 포함하는 항-인플루엔자 B 항체 또는 이의 항원결합단편을 제공한다. 다른 예는 서열번호 29의 중쇄가변영역 및 서열번호 31의 경쇄가변영역을 포함하는 항-인플루엔자 A 항체 또는 이의 항원결합단편을 제공한다.
다른 예는 서열번호 27의 중쇄가변영역 및 서열번호 31의 경쇄가변영역을 포함하는 항-인플루엔자 B 항체, 및 서열번호 29의 중쇄가변영역 및 서열번호 31의 경쇄가변영역을 포함하는 항-인플루엔자 A 항체를 포함하는, 항-인플루엔자 A/ 항-인플루엔자 B 이중 특이성 항체 또는 이의 항원결합단편을 제공한다. 상기 항-인플루엔자 A/ 항-인플루엔자 B 이중 특이성 항체는, 앞서 설명한 (1) 변이 CH3 도메인 (즉, 앞서 설명한 CH3-CH3의 돌연변이쌍 도입); (2) 변이 CH1 도메인 및 변이 CL 도메인 (즉, 앞서 설명한 CH1-CL의 돌연변이쌍 도입); 또는 (2) 변이 CH3 도메인과 변이 CH1 도메인 및 변이 CL 도메인을 모두 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 이중 특이성 단백질 또는 이중 특이성 항체는 단백질 소단위간 연관되고 조화로운 경계 돌연변이(Correlated and Harmonious Interfacial Mutation between Protein Subunits; 이하 Chimps라 한다)에 따라 생성된 이종 특이성 물질이다.
용어 "항체"는 4개 모두가 디설파이드 결합에 의해 상호연결된 한 쌍의 저분자량 경쇄 (L) 및 한 쌍의 중쇄 (H)의 2쌍의 폴리펩티드 사슬로 이루어지는, 구조상 관련된 당단백질의 클래스를 나타낸다. 항체의 구조는 특징이 잘 결정되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., 2nd ed. Raven Press, N. Y. (1989)] 참조). 간단히 설명하면, 각각의 중쇄는 대개 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭함) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 대개 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2, 및 CH3으로 이루어진다. 중쇄는 소위 "힌지 영역"에서 디설파이드 결합을 통해 상호연결된다. 각각의 경쇄는 대개 경쇄가변 영역 (본원에서 VL로 약칭함) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 대개 1개의 도메인 CL로 이루어진다. 일반적으로, 상기 불변 영역 내에서 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]에 기재된 EU-인덱스에 따라 수행된다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역 (CDR)으로도 불리는 초가변 영역 (또는 서열이 초가변성이고/이거나 구조적으로 규정된 루프를 형성할 수 있는 초가변 영역)으로 추가로 세분될 수 있고, 이들 영역에는 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 보다 보존된 영역이 산재되어 있다. 각각의 VH 및 VL은 대개 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어지고, 이들은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 다음 순서로 배열되어 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (또한, 문헌 [Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987)] 참조).
본 명세서에서, 용어 "Fab, 또는 Fab-arm"은 하나의 중쇄-경쇄쌍을 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "Fc 영역"은 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 항체 영역을 의미하며, 경우에 따라서 힌지 영역을 추가로 포함할 수 있다.
용어 "이중 특이성 항체"는 적어도 2개의 상이한 에피토프, 일반적으로 비-중복 에피토프에 대해 특이성을 갖는 항체를 의미한다.
용어 "전장 항체"는 본원에서 사용될 때 이소형의 항체에서 통상적으로 발견되는 모든 중쇄 및 경쇄의 불변 및 가변 도메인을 함유하는 항체를 의미한다. 일 예에서 전장 항체는 2 개의 전장 중쇄와 2개의 전장 경쇄를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 클래스 (예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, 또는 IgM)를 의미한다.
용어 "항원 결합 단편"은 항체의 가변 도메인을 포함하는 항체의 일부를 의미하는 것으로, Fab, F(ab')2, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, (scFv-Fc) 등에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정자를 의미한다. 에피토프는 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자들의 표면 군으로 일반적으로 이루어지고, 일반적으로 특이적인 3차원 구조 특성뿐만 아니라 특이적인 전하 특성을 갖는다.
이중 특이성 항체는 서로 다른 두 개의 항원 또는 하나의 항원 중의 구분되는 (비중복되는) 서로 다른 두 개의 에피토프를 인식 및/또는 결합하는 항체를 총칭한다. 일 예에서, 상기 이중 특이성 항체는 종양 세포 항원에 대한 하나의 항원 결합 부위 및 세포 독성 개시 분자에 대한 다른 항원 결합 부위를 포함하는 것일 수 있으며, 예컨대, 이중특이성 항체는 항-FcγRI/항-CD15, 항-p185HER2/FcγRIII (CD16) 항-CD3/항-악성 B-세포 (1D10), 항-CD 3/항-p185HER2, 항-CD3/항-p97, 항-CD3/항-신장 세포암, 항-CD3/항-OVCAR-3, 항-CD3/L-D1 (항-대장암), 항-CD3/항-멜라닌세포 자극 호르몬 유사체, 항-EGF 수용체/항-CD3, 항-CD3/항-CAMA1, 항-CD3/항-CD19, 항-CD3/MoV18, 항-중성 세포 부착 분자 (NCAM)/항-CD3, 항-폴레이트 결합 단백질 (FBP)/항-CD3, 항-범 암종 연관 항원 (AMOC-31)/항-CD3 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 예에서, 종양 항원에 특이적으로 결합하는 하나의 항원 결합 부위 및 독소에 결합하는 하나의 항원 결합 부위를 지니는 이중특이성 항체는 예를 들어, 항-사포린/항-Id-1, 항-CD22/항-사포린, 항-CD7/항-사포린, 항-CD38/항-사포린, 항-CEA/항-리신 A 사슬, 항-인터페론-α (IFN-α)/항-하이브리도마 이디오타입, 항-CEA/항-빈카 알카로이드 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 다른 예에서, 이중특이성 항체는 항-CD30/항-알카라인 포스파타제 (미토마이신 포스페이트 전구약물을 미토마이신 알코올로 전환을 촉매하는)과 같이, 전환 효소 활성화 전구약물용에 사용되는 것들 중에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 다른 예에 있어서, 이중특이성 항체는 항-피브린/항-조직 플라스미노겐 활성인자 (tPA), 항-피브린/항-유로키나제 유형 플라스미노겐 활성인자 (uPA)와 같이, 피브린분해 제제로서 사용될 수 있는 것들 중에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 다른 예에서, 이중특이성 항체는 항-저밀도 지단백질 (LDL)/항-Fc 수용체 (예를 들어, FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII)등과 같은 세포 표면 수용체에 면역 복합체를 표적화시키는 것들 중에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 다른 예에서, 이중특이성 항체는 항-인플루엔자A/항-인플루엔자 B, 항-CD3/항-단순성 포진 바이러스 (HSV), 항-T-세포 수용체:CD3 복합체/항-인플루엔자, 항-FcγR/항-HIV 등과 같이 감염성 질환 (예컨대, 바이러스성 감염 질환)의 치료에 사용되는 것들 중에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 다른 예에서, 이중특이성 항체는 시험관 내 또는 생체내 종양 검출용 이중특이성 항체일 수 있으며, 예컨대, 항-CEA/항-EOTUBE, 항-CEA/항-DPTA, 항-p185HER2/항-합텐 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 다른 예에서, 이중특이성 항체는 항-토끼 IgG/항-페리틴, 항-겨자무 페록시다제 (HRP)/항-호르몬, 항-소마토스타틴/항-서브스탄스 P, 항-HRP/항-FITC, 항-CEA/항-β-갈락토시다제 등과 같이, 진단 수단으로 사용 가능한 것일 수 있다. 또 다른 예에서, 이중특이성 항체는 CD30와 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 erbB2와 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 것; CD30와 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 슈도모나스 외독소 (PE)와 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 것; CD30와 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 스트렙타비딘과 결합하는 제2 항원 결합 부위을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예에서, 이중 특이성 단백질은, 상기 표적화 도메인으로, 각종 막 단백질, 예컨대, 각종 수용체 (예컨대, 수용체 티로신 카이네이즈 (RTKs) 등), 상기 수용체의 엑토도메인 (세포외 도메인), 각종 리간드 (예컨대, 각종 성장인자, 사이토카인 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 표적 특이적 결합 폴리펩타이드을 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 수용체는, 종양괴사인자 수용체 (tumor necrosis factor receptor; TNFR) (예컨대, TNFR1, TNFR2 등), 상피세포 성장인자 수용체 (예컨대, Her1(epidermal growth factor receptor; EGFR), Her2 (human epidermal growth factor receptor 2), Her3 (human epidermal growth factor receptor 3)), 앤지오포이에틴 리셉터 (angiopoietin receptor) (예컨대, Tie1, Tie2 등), 형질전환성장인자 수용체 (transforming growth factor receptor) (예컨대, TGFbR1, TGFbR2, TGFbR3, TGFaR1 등), 골형성단백질 수용체 (Bone Morphogenetic Protein Receptor; 예컨대, BMPR1b), 인터류킨 수용체 (예컨대, IL-12R-b1 (interleukin 12 receptor subunit beta 1), IL-4Ra, IL-12A, IL-4, IL-1R1L, IL-17RA, IL-17A, IL-12R-b2, IL-13Ra1, IL-12B, IL-13, IL-1RAP, IL-17RC, IL-17F 등), 인테그린 (예컨대, ITGA4 (integrin alpha 4), ITGA2B (integrin subunit alpha 2b), ITGB1, ITGB3 등), 인터페론 수용체 (예컨대, IFNAR1 (interferon-alpha/beta receptor 1), IFNAR2, IFNGR 등), Fas (tumor necrosis factor receptor superfamily　member 6; TNFRSF6), VEGF 수용체 (예컨대, Flt1 (fms related tyrosine kinase 1) 등), 간세포 성장인자 수용체 (에컨대, Met 등), IFNGR (Interferon gamma receptor) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 리간드는 종양괴사인자 (tumor necrosis factor; TNF), 상피세포 성장인자 (EGF), 혈관내피세포 성장인자 (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, 등), 앤지오포이에틴 (예컨대, Ang1, Ang2 등), 형질전환 성장인자 (transforming growth factor; TGF), 간세포 성장인자 (HGF), 뼈형성단백질 (bone morphogenetic protein) (예컨대, BMP2, BMP7 등), 인터류킨, 인터페론 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 사용되는 용어 "숙주 세포"는 발현 벡터, 예를 들어 본 발명의 항체를 코딩하는 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭하도록 의도된다. 재조합 숙주 세포는 예를 들어, 트랜스펙토마 (transfectoma), 예컨대 CHO 세포, HEK293 세포, NS/0 세포, 및 림프구성 세포를 포함한다.
본 발명의 항체들의 CL 도메인, CH1 도메인, Fc 부위 (예컨대, CH3 도메인)들은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 아형, IgA, IgE, IgD 또는 IgM와 같이 임의의 항체로부터 얻을 수 있다. 상기 항체들은 인간, 원숭이 등의 영장류, 또는 마우스, 래트 등의 설치류 등과 같은 포유류 유래의 것일 수 있다. 포유류 유래의 항체는, 특히 불변부위에 있어서, 각 종간 높은 서열 상동성 및 구조 상동성을 보이므로, 본 명세서에서 설명된 CL 도메인, CH1 도메인, 및 CH3 도메인에 설명은 포유류 유래 항체에 일반적으로 적용될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 CL 도메인, CH1 도메인, 및 CH3 도메인은 IgG (예컨대, IgG1)에서 유래된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 언급한 바와 같이, 본 발명에서 기술된 항체들의 Fc 부위는 두 개 동일하지 않은 중쇄들 (예를 들어, 가변 도메인들의 서열에서 상이한)을 포함하는 데, 상기 두 개 동일하지 않은 중쇄들 중 적어도 하나는 상기 동일하지 않은 중쇄들의 안정한 이종이합체를 형성하는 확률을 높이고 동일한 중쇄들의 안정한 동종이합체를 형성할 확률을 낮추기 위해, 아미노산 변이를 포함한다.
본 명세서에서 제공되는 이중 특이성 단백질, 이중 특이성 항체 및 이의 항원결합단편은 통상적인 모든 수단에 의하여 제조될 수 있으며, 예컨대 화학적 합성 또는 재조합적인 방법에 의하여 생산될 수 있다. 상기 단백질, 항체 및 단편은 자연적으로 얻어지지 않은 것 (non-naturally occurring)일 수 있다.
본 발명에서 Fc의 이종이중화를 위해서 돌연변이화 위치를 도 2에 나타내었다. 정전기적 상호작용 도입 변이의 경우는 39개의 위치를 대상으로 하였고, 스와핑을 위해서는 14개의 위치를 대상으로 하였으며, 사이즈 변이는 40개의 위치를 대상으로 하였다. 도 2에서는 아미노산은 통상의 방법에 따라 영문자 대문자로 나타내었고, 상기 불변 영역 내에서 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]에 기재된 EU-인덱스에 따라 나타내었다.
다른 예는 앞서 설명한 이중 특이성 단백질 또는 이중 특이성 항체, 및 임의로, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 다른 예는 앞서 설명한 이중 특이성 단백질 또는 이중 특이성 항체를 약학 조성물의 제조에 사용하는 용도를 제공한다. 다른 예는 앞서 설명한 이중 특이성 단백질 또는 이중 특이성 항체를 함유하는 약학조성물의 제조방법을 제공한다.
항체 및 이를 포함하는 조성물 (예, 약학 조성물)을 진단 및 치료 적용에 사용될 수 있고, 그러한 것으로서 치료 또는 진단 키트에 포함될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "약학적으로 허용가능한 담체"는 생리적으로 양립되는 임의의 및 모든 용매, 분산매, 코팅물, 항균, 항진균제, 등장제, 흡수 지연제, 기타 약물 제조에 통상적으로 사용되는 담체, 부형제, 첨가제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 바람직하게는, 상기 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여에 적합한 담체일 수 있다 (예, 주사 또는 주입에 의해).
본 발명의 조성물은 당 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 숙련자에게 이해되는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 양상은 원하는 결과에 따라 변한다. 본 발명의 화합물을 특정 투여 방법으로 투여하기 위해, 상기 화합물을 이의 불활성화를 방지하는 물질로 코팅하거나 같이 투여하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 상기 화합물을 적합한 담체, 예를 들어, 리포좀이나 희석제 내에서 대상체에 투여될 수 있다. 약학적 허용 희석제는 식염수 및 수성 완충액을 포함한다. 약학 담체는 멸균 수성액이나 분산액, 및 멸균 주사액이나 분산액의 임시적인 제조물용 멸균 분말을 포함한다. 그러한 약학적 활성 물질용 배지와 제제의 사용은 당해분야에 공지되어 있다.
용어 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여되는"은 본 발명에서 사용되는 바와 같이, 장관 및 국소외의 투여 방식을 지치하는 것으로 통상 주사에 의한 것으로, 정맥내, 근육내, 동맥내, 수막내, 관절강내, 안내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관내, 피하, 각피하, 관절내, 관절강하, 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사와 주입을 포함한다.
이러한 조성물은 또한 보존제, 습윤제, 에멀젼제, 및 분산제와 같은 보조제를 포함한다. 미생물 존재의 방지는 상기 멸균 과정에 의해, 및 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 등과 같은 다양한 항균 및 항진균제를 포함함으로써 수행될 수 있다. 당, 염화 나트륨 등과 같은 등장제를 상기 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 주사용 약학 형태를 장기간 흡수하게 하는 것은 알루미늄 모노스테아레이트와 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 제제를 포함함으로써 수행될 수 있다. 선택된 투여 경로와 무관하게, 본 발명의 화합물은 적절한 수화 형태 및/또는 본 발명의 약학 조성물에서 사용될 수 있는 데, 당해 분야의 숙련자에게 공지된 통상적인 방법으로 약학 허용 투약형태로 제제화된다.
본 발명의 약학 조성물에서 활성 성분의 실제 투약 수준은 특정 환자의 원하는 치료적 반응을 달성하는데 효과적인 양, 조성 및 투여 양상을 환자에 독성적이지 않게 얻기 위해서 변할 수 있다. 선택된 투여 수준은 사용되는 본 발명의 특정 조성물의 활성, 투여 경과, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 사용되는 특정 조성물과 조합 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 나이, 성별, 몸무게, 상태, 일반적 건강 및 이전 의학 이력, 및 의학 분야에 공지된 다른 요소를 포함하는 다양한 약동학적 요소에 달려 있다.
상기 투여 대상 환자는 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등과 같은 포유류, 및 이들로부터 분리된 세포, 조직, 체액 (예컨대, 혈액 등), 및 이들의 배양물로부터 선택된 것일 수 있다.
본 발명은 Chimps 단백질 (예컨대, 항체)는 동종이합체 또는 모노머에 의한 오염이 적은 높은 순도의 이종 이중화된 단백질 및 이의 제조 기술을 제공한다. 본 발명의 또 다른 이점은 천연의 항체에 도입되는 변이 개수를 최소한으로 하면서 이중 특이성 항체의 순도를 높일 수 있어서, 천연 항체의 구조에 어떠한 의미 있는 구조적 변화를 일으키지 않으며, 이를 통하여 항체의 기능 상실 또는 이상, 및/또는 면역 거부 반응이 일어난 위험성을 줄일 수 있다.
도 1은 일 실시예에 따른 이중 특이성 항체의 항체를 제조하는데 만들어질 수 있는 다양한 형태의 항체(총 10개)중에서 단 하나의 항체(원 내부의 항체)만이 완전한 이종 이합체 형태의 이중 특이성 항체임을 보이는 모식도이다. A와 B는 각각 다른 중쇄를 나타내고, a와b는 각각 다른 경쇄를 나타낸다.
도 2은 일 실시예에서 Fc 불변영역에서 이종 특이적 결합을 유도하기 위해 사용된 정전기적 상호작용, 스와핑, 사이즈 방법에 사용된 항체의 잔기 위치 및 이와 연관된 잔기의 위치를 나타내었다.
도 3은 표 4에서 기재된 바와 같이 정전기적 상호작용에 의한 돌연변이에 의한 이종이합체 형성 결과를 SDS-PAGE 수행후 비교한 것이다.
도 4는 표 5에서 기재된 바와 같이 스와핑에 의한 연관 돌연변이에 의한 이종이합체 형성 결과를 SDS-PAGE 수행후 수행후 비교한 것이다.
도 5는 표 6에서 기재된 바와 같이 사이즈에 의한 돌연변이에 의한 이종이합체 형성 결과를 SDS-PAGE 수행후 비교한 것이다.
도 6a는 표 7에 기재된 단일 돌연변이 중에서 우수하게 이종 이중화가 일어나는 돌연변이 12개를 비교한 것이다.
도 6b는 일 실시예에서 선택된 2개의 키 돌연변이 중 S364K를 다른 아미노산으로 치환시켜 얻어진 이종이합체 형성 결과를 보여준다.
도 6c는 일 실시예에서 선택된 2개의 키 돌연변이 중 F405K를 다른 아미노산으로 치환시켜 얻어진 이종이합체 형성 결과를 보여준다.
도 6d는 일 실시예에서 선택된 3가지 key-lock 돌연변이 쌍인 S364K-L368D, S364K-K370S, 및 F405K-K409F에 추가 돌연변이를 도입하여 얻어진 이종이합체 형성 결과를 보여주며, 세로축의 수치는 분자량 (kD)를 나타낸다.
도 7은 단일 돌연변이 S364K-L368D, S364K-K370S, F405K-K409F의 이종이합체화(heterodimerization)의 효율을 종래의 기술(KiH, CPC, AzS 대조군)과 비교하여 효율을 확인한 것이다. 각 키에 해당하는 아미노산을 각각 다른 아미노산으로 바꾸어 본 경우 S364의 경우 K가 최선이었고, F405의 경우 K와 R (아르기닌)이 거의 유사한 효과를 보인다. A 사슬 및 B 사슬에서 단일 돌연변이가 일어나는 부분을 나타내었고, 이종이합체화 정도를 수치로 나타내었다.
도 8은 S364K-L368D, S364K-K370S, F405K-K409F세 가지 돌연변이 쌍들을 조합하여 두 가지 이중 돌연변이 쌍을 얻었고, 각각의 쌍에서 F405를 K와 R 두 종류로 만들어서 도합 4가지의 이중 돌연변이 쌍의 이종이합체화의 효율을 종래의 기술(KiH, CPC, AzS 대조군)과 비교하여 효율을 확인한 것이다.
도 9a 내지 9c는 열쇠(Lock) 돌연변이에 해당하는 아미노산을 다른 돌연변이로 바꾸었을 경우 더 나은 효과가 있을지를 확인하기 위해, 이중 돌연변이 쌍들에서 열쇠(lock)에 해당하는 L368, K370, K409를 다른 아미노산들로 표 6에 따라 돌연변이시켜 SDS-PAGE을 수행한 결과이다.
도 10은 항체의 Fab에서 정전기적 상호 작용 연관된 돌연변이, 사이즈 연관 돌연변이, 스와핑 연관 돌연변이를 위치를 보인다.
도 11은 Competitive Pairing (CPP) Assay 과정을 모식적으로 보여준다.
도 12는 4D9과 2B9을 이용하여 기존에 효과적인 것으로 보고되어 있는 C1, DuetMab, V23의 중쇄와 경쇄 사이의 돌연변이 쌍을 클론닝하여 공동-발현하여서 도 11의 과정을 통하여 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 13은 중쇄와 경쇄 사이에 정전기 상호작용에 의한 연관 돌연변이의 하나로 A 사슬(2B9 중쇄)의 해당 아미노산을 K (리신)으로, B 사슬(4D9 중쇄)의 경우에는 D (아스파트산)으로 바꾼 돌연변이가 도입된 경우의 짝지음 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과를 보인다.
도 14는 4D9 및 2B9 항체를 이용한 돌연변이 쌍의 리스트중 SDS-PAGE상에서 비교한 결과, 비교적 정확하게 짝지음이 잘 일어난 30번 돌연변이를 중쇄의 L145와 경쇄 V133을 R 과 D로 바꾼 경우의 짝지음 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 15와 도 16은 중쇄의 L145와 경쇄 V133을 각각 E 또는 D 과 R로 바꾼 것에 경쇄에 29번 돌연변이 S131D 및/또는 S131K 를 더한 돌연변이가 도입된 경우의 짝지음 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 17은 48번 돌연변이 쌍(중쇄의 S183과 경쇄의 V133을 각각 K(R) 과 D(E)로 바꾼 것)의 짝지음 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 18은 표 19에 나타난 돌연변이쌍 c29c30c48FΦ29f30f48, 및 이의 변형 돌연변이쌍이 도입된 경우의 짝지음 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 19는 표 20의 돌연변이쌍이 도입된 경우의 짝지음 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 20은 표 21의 돌연변이쌍이 도입된 경우의 짝지음 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다.
도 21은 일 실시예에 따른 중쇄와 경쇄쌍 돌연변이 중 34번 돌연변이와 51번 돌연변이를 조합하여 도입시킨 경우의 짝지음 정도를 보여주는 결과이다.
도 22는 일 실시예에 따른 중쇄와 경쇄쌍 돌연변이 중 c34Фf51 돌연변이 쌍을 도입시킨 경우의 짝지음 정도를 보여주는 결과이다.
도 23은 일 실시예에 따른 중쇄와 경쇄쌍 돌연변이 중 c40Фf44 돌연변이 쌍을 도입시킨 경우의 짝지음 정도를 보여주는 결과이다.
도 24는 일 실시예에 따라 중쇄 및 경쇄가 돌연변이화된 이중 특이성 항체의 모식도이다.
도 25는 일 실시예에 따라 제조된 항체의 중쇄 A사슬 및 B사슬, 및 경쇄 a 사슬 및 b 사슬의 열적안정성을 보여주는 그래프이다.
도 26은 pcDNA3의 개열지도이다.
도 27은 일 실시예에 따라 제조된 c`29c`30c48Фf`29f`30f`48 돌연변이쌍과 AWBB 돌연변이쌍이 도입된 이중항체 Trabev 및 Adabev의 Hydrophobic Interaction Chromatography(HIC) 결과를 보여주는 그래프이다.
도 28은 일 실시예에 따라 제조된 c`29c`30c48Фf`29f`30f`48 돌연변이쌍과 AWBB 돌연변이쌍이 도입된 이중항체 Trabev의 Size exclusion Chromatography (SEC) Analysis) 결과를 보여주는 그래프이다.
도 29는 일 실시예에 따라 제조된 c`29c`30c48Фf`29f`30f`48 돌연변이쌍과 AWBB 돌연변이쌍이 도입된 이중항체 Adabev의 Size exclusion Chromatography (SEC) Analysis 결과를 보여주는 그래프이다.
도 30은 일 실시예에 따라 제조된 c`29c`30c48Фf`29f`30f`48 돌연변이쌍과 AWBB 돌연변이쌍이 도입된 이중항체 Trabev 및 Adabev의 이합체 형성 양상을 보여주는 결과이다.
도 31은 일 실시예에 따라 제조된 c`29c`30c48Фf`29f`30f`48 돌연변이쌍과 AWBB 돌연변이쌍이 도입된 이중항체 Trabev의 항원 (Her2 및 VEGF)에 대한 결합력을 보여주는 그래프이다.
도 32은 일 실시예에 따라 제조된 c`29c`30c48Фf`29f`30f`48 돌연변이쌍과 AWBB 돌연변이쌍이 도입된 이중항체 Adabev의 항원 (TNF-alpha 및 VEGF)에 대한 결합력을 보여주는 그래프이다.
도 33a는 인간 IgG1 중쇄불변영역과 인간 IgA1 중쇄불변영역의 서열 정렬 결과를 보여준다 (인간 IgG1 중쇄불변영역: 서열번호 33; 인간 IgA1 중쇄불변영역: 서열번호 34).
도 33b는 인간 면역글로불린 경쇄의 카파 불변영역과 람다 불변영역의 서열 정렬 결과를 보여준다 (인간 면역글로불린 경쇄의 카파 불변영역: 서열번호 35; 인간 면역글로불린 경쇄의 람다 불변영역: 서열번호 36).
도 33c 및 도 33d는 인간과 마우스와 래트의 IgG 아형들 간의 중쇄불변영역의 서열 정렬(sequence alignment) 결과를 보여주는 것으로, 도 33c는 CH1 도메인 서열 정렬 결과를, 도 33d는 CH3 도메인 서열 정렬 결과를 각각 보여준다(도 33c에서 (CH1 domain), Human IgG1: 서열번호 1, Human IgG2: 서열번호 2, Human IgG3: 서열번호 3, Human IgG4: 서열번호 4, Mouse IgG1: 서열번호 37, Mouse IgG2ab: 서열번호 38, Mouse IgG2aa: 서열번호 39, Mouse IgG2b: 서열번호 40, Mouse IgG3: 서열번호 41, Rat IgG1: 서열번호 42, Rat IgG2a: 서열번호 43, Rat IgG2b: 서열번호 44, Rat IgG2c: 서열번호 45; 도 33d에서 (CH3 domain), Human IgG1: 서열번호 15, Human IgG2: 서열번호 16, Human IgG3: 서열번호 17, Human IgG4: 서열번호 18, Mouse IgG1: 서열번호 46, Mouse IgG2ab: 서열번호 47, Mouse IgG2aa: 서열번호 48, Mouse IgG2b: 서열번호 49, Mouse IgG3: 서열번호 50, Rat IgG1: 서열번호 51, Rat IgG2a: 서열번호 52, Rat IgG2b: 서열번호 53, Rat IgG2c: 서열번호 54).
도 34는 일 실시예에 따라 제조된 c34Фf51 돌연변이쌍이 도입된 항체의 경쇄와 중쇄 간 짝지음 정도를 보여주는 결과이다.
도 35는 일 실시예에 따라 제조된 c34Фf51 돌연변이쌍과 AWBB 돌연변이쌍이 도입된 이중항체 Trabev의 HIC 결과를 보여주는 그래프이다.
도 36은 일 실시예에 따라 제조된 c34Фf51 돌연변이쌍과 AWBB 돌연변이쌍이 도입된 이중항체 Adabev의 HIC 결과를 보여주는 그래프이다.
도 37은 일 실시예에 따라 제조된 c34Фf51 돌연변이쌍과 AWBB 돌연변이쌍이 도입된 이중항체 Trabev 및 Adabev의 이합체 형성 양상을 보여주는 결과이다.
도 38은 일 실시예에 따라 제조된 c40Фf44 돌연변이쌍이 도입된 항체의 경쇄와 중쇄 간 짝지음 정도를 보여주는 결과이다.
도 39는 일 실시예에 따라 제조된 c40Фf44 돌연변이쌍과 AWBB 돌연변이쌍이 도입된 이중항체 Trabev의 HIC 결과를 보여주는 그래프이다.
도 40은 일 실시예에 따라 제조된 c40Фf44 돌연변이쌍과 AWBB 돌연변이쌍이 도입된 이중항체 Adabev의 HIC 결과를 보여주는 그래프이다.
도 41은 일 실시예에 따라 제조된 c40Фf44 돌연변이쌍과 AWBB 돌연변이쌍이 도입된 이중항체 Trabev 및 Adabev의 이합체 형성 양상을 보여주는 결과이다.
도 42는 비교예에 따른 Enb-Fc와 Fas-Fc를 각각 single transfection시킨 경우에 SDS-PAGE로 동종 이합체 형성 정도를 비교한 결과이다.
본 발명을 하기 실시예를 들어 더욱 자세히 설명할 것이나, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다.
본 발명의 실시를 위해서 모든 시료는 다음과 같은 과정을 거쳐서 준비되었다.
단백질 발현
1. 타겟이 되는 유전자를 발현 벡터 (pcDNA3 (Invitrogen; 도 )에 클론닝하였다.
2. Hek293E (ATCC) 세포를 습윤화된 CO2 인큐베이터에서 5% FBS(Fetal bovine serum)이 보충된 고농도 포도당 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium)에서 배양하였다.
3. 준비된 플라스미드 DNA를 풀 컨플러언시로 Hek293E세포로 일시적 주입(transient transfection) 한다. 전이전에 배양 배지를 PBS (phosphate-buffered saline)로 세척한 후 혈청이 없는 고농도 DMEM으로 교체하여 준다.
4. 1 주일 인큐베이션 후에, 컨디션된 배지(conditioned medium)르 수확하여 여과하였다. Fc-융합 단백질 및 항체를 프로테인 A 크로마토그래피에 의해 분리하였다.
5. 정제된 단백질의 농도의 정량은 280nm 파장을 관측하여 측정하였다.
< 실시예 1> 2개의 Fc 영역의 이종이중화의 돌연변이의 선택
2개의 Fc 영역 (CH3 도메인; 서열번호 15) (IgG1 기준)의 이종이합체화(heterodimerization)를 위한 돌연변이 위치는 도 2에 나타내었다. 정전기적 상호작용에 의한 연관 돌연변이 (정전기적 상호작용 도입 변이)를 위해서 39개의 위치가 선정되었으며 ("Charge J"로 표시), 스와핑에 의한 연관 돌연변이 (스와핑 변이)를 위하여 14개의 위치가 선정되었고 ("Swap O"로 표시), 사이즈에 의한 연관 돌연변이 (사이즈 변이)를 위하여 40개의 위치가 선정되었다 ("Size B"로 표시). 최종적으로 선정된 CH3 도메인의 위치 및 돌연변이된 아미노산을 표 3에 나타내었다. 각 돌연변이 쌍을 서로 다른 항체로부터 유래하는 두 개의 Fc 영역 (각각 A 사슬과 B 사슬로 표현)에 적용하여 클론닝하여 공동-발현하였다. 정전기 상호작용에 의한 연관 돌연변이의 경우는 A 사슬의 해당 아미노산을 양전하를 포함하는 아미노산을 대표하여 K (라이신)으로, B 사슬의 경우에는 음전하를 포함하는 아미노산을 대표하여 D (아스파트산)으로 바꾸었다. 스와핑에 의한 연관 돌연변이의 경우에는 A 사슬과 B 사슬의 아미노산을 서로 바꾸었다. 사이즈에 의한 연관 돌연변이의 경우에는 A 사슬은 W (트립토판)으로, B 사슬은 사이즈가 작은 A (알라닌)으로 바꾸었다.
아미노산 쌍 번호 Charge (J) Swap (O) Size (B)
Chain A Chain B Chain A Chain B Chain A Chain B
1 Q347K K360D Q347K K360Q　 Q347W K360A
2 Y349K S354D Y349W S354A
3 Y349K E357 Y349W E357A
4 Y349K K360D Y349W K360D
5 L351K L351D 　 　 L351W L351A
6 P352K P352D 　 　 P352W P352A
7 S354K Y349D S354Y Y349S S354W Y349A
8 D356K K439D 　 　 D356W K439A
9 E357K Y349D E357Y Y349E E357W Y349A
10 E357K K370D E357K K370E E357W K370A
11 K360K Q347D K360W Q347A
12 K360K　 Y349D　 K360Y Y349K K360W　 Y349A　
13 S364K L368D S364L L368S S364W L368A
14 S364K K370D S364K K370S S364W K370A
15 T366K T366D 　 　 T366W T366A
16 T366K Y407D T366W Y407A
17 L368K S364D L368W S364A
18 L368K K409D L368K K409L L368W K409A
19 K370 E357D K370W E357A
20 K370 S364D K370W S364A
21 K370 T411D K370W T411A
22 N390K S400D N390S S400N N390W S400A
23 K392 L398D K392W L398A
24 T394K T394D 　 　 T394W T394A
25 T394K V397D T394V V397T T394W V397A
26 P395K P395D 　 　 P395W P395A
27 P395K V397D 　 　 P395W V397A
28 V397K T394D V397W T394A
29 V397K P395D V397W P395A
30 L398K K392D L398K K392L L398W K392A
31 S400K N390D S400W N390A
32 F405K K409D F405K K409F F405W K409A
33 Y407K T366D Y407T T366Y Y407W T366A
34 Y407K Y407D 　 　 Y407W Y407A
35 Y407K K409D 　 　 Y407W K409A
36 K409 L368D K409W L368A
37 K409 F405D K409W F405A
38 K409 Y407D K409W Y407A
39 T411K K370D T411K K370T T411W K370A
40 K439W D356A
Fc-융합 단백질에서 동종이합체(homodimer)와 이종이합체(heterodimer)를 SDS-PAGE를 통해 쉽게 구별하기 위해서, pcDNA3 vector (도 26 참조; Invitrogen)을 백본으로 사용하여, 한 쪽 사슬(사슬 A: Enbrel)에는 TNF-알파 수용체(TNFRSF1B: NP_001057.1 (암호화 유전자: NM_001066.2의 CDS; 서열번호 24))의 세포외 도메인(서열번호 24의 1-771 부위의 암호화 서열)을 Fc(암호화 유전자: 서열번호 26)에 융합시켰고, 다른 한쪽(사슬 B: Fas)에는 Fas 수용체 (NP_000034.1 (암호화 유전자: NM_000043.5의 CDS; 서열번호 25))의 세포외 도메인 (서열번호 25의 1-519 부위의 암호화 서열)을 Fc(암호화 유전자: 서열번호 26)에 융합시켰다. A 사슬의 모노머는 53 kD이며, B 사슬의 모노머는 약 44 kD이다. 상기 Fc-세포외 도메인이 융합되어 있는 사슬 A와 B의 사이즈가 상이하기 때문에, SDS-PAGE에서 2개의 동형결합(AA 및 BB) 및 이종 결합(AB)이 쉽게 구별될 수 있다.
A 사슬과 A 사슬의 결합(동형 결합) 수치(%)를 SAA로 나타내었고, A사슬과 B사슬의 결합(이종 결합) 수치(%)를 SAB로 나타내었고, B 사슬과 B 사슬 사이의 결합 수치(%)를 SBB로 나타내었다.
표 3에 표시된 바와 같은 돌연변이가 도입된 A 사슬과 B 사슬의 접합 양상을 SDS-PAGE로 관찰한 동형결합(AA 및 BB) 및 이종 결합(AB) 비율(%)을 변이가 일어나지 않은 A 사슬과 B 사슬 (각각 WT로 표시)의 결과와 비교하였으며, 이 중에서 정전기적 상호작용에 의한 돌연변이가 도입된 경우의 결과를 표 4 및 도 3에 나타내었고, 사이즈에 의한 돌연변이가 도입된 경우의 결과를 표 5 및 도 4에 나타내었고, 스와핑에 의한 연관 돌연변이가 도입된 경우의 결과를 표 6 및 도 5에 나타내었다.
A WT Y349K Y349K S354K E356K E357K E357K S364K T366K T394K T394K T411K
B WT E357D K360D Y349D K439D Y349D K370D L368D Y407D T394D V397D K370D
S AA 28 11 5 27 10 15 12 0 0 11 10 15
S AB 46 70 60 63 64 75 78 100 75 79 73 67
S BB 26 19 35 10 26 10 10 0 25 10 17 18
A E357Y E357K S364L S364K F405K Y407T T411K
B Y349E K370E L368S K370S K409F T366Y K370T
S AA 8 4 8 0 0 10 13
S AB 71 80 61 90 70 83 60
S BB 21 16 31 10 30 7 27
A WT K409W K409W
B WT F405A Y407A
S AA 22 3 2
S AB 56 60 85
S BB 23 37 13
상기 표 4 내지 6에서 이종이합체 (heterodimer) 형성률(%; SAB)이 70%가 넘는 돌연변이를 굵은 글씨로 표시하였다. 상기 표 4 내지 6에서 확인되는 바와 같이, 시험된 돌연변이 쌍들은 60% 이상의 이종이합체 형성률을 보였다.
위의 결과를 통하여 동종이합체(homodimer) 보다 이종이합체(heterodimer) 형성률이 높고, 이종이합체 형성률이 70% 이상인 12쌍 (Y349K-E357D, E357K-Y349D, E357K-K370D, S364K-L368D, T366K-Y407D, T394K-T394D, T394K-V397D; 이상 정전기적 상호작용 도입 변이, E357Y-Y349E, E357K-K370E, S364K-K370S, F405K-K409F, Y407T-T366Y; 이상 스와핑 변이)의 돌연변이가 선택되었다 (표 4 및 5에서 굵은 글씨로 표시).
상기 선택된 12쌍의 아미노산 쌍에 포함된 12개의 아미노산 잔기 변이를 Fas-Fc 융합 단백질에 각각 도입시켜 상기 아미노산 위치에서 단일 변이를 포함하는 변이 Fas-Fc 융합 단백질을 발현시킴으로써, 동등한 조건에서의 동종이합체 및 단량체 잔존률(S sm ; 1=100%)을 비교하여, 그 결과를 표 7 및 도 6a에 나타내었다.
SM S SM
E357Y 0.03
Y349D 0.03
K370D 0.06
L368D 0.06
S364K 0.77
K370S 0.05
S400N 0.05
T394D 0.11
F405K 0.67
K409F 0.05
T366A 0.09
T366Y 0.46
표 7 및 도 6a에서 동종이합체 형성률이 낮고 단량체 잔존률이 높은(50% 이상)인 2개의 돌연변이 S364K, F405K를 선택하였다.
선택된 2가지 돌연변이를 "키(key)" 돌연변이로 하였고, 이와 상호작용하는 다른 사슬의 CH3 도메인 부분을 "열쇠(lock)" 돌연변이를 보고 이를 조합하여 S364K-L368D, S364K-K370S, F405K-K409F의 3가지 key-lock 돌연변이 쌍을 선택하였다. 이 돌연변이 쌍들을 A 사슬 (키 돌연변이) 및 B 사슬 (열쇠 돌연변이)에 도입하여, 세 종류의 단일 돌연변이 쌍을 얻었다 (표 8 참조).
돌연변이 종류 샘플명 Key Single Mutation Lock Single Mutation
정전기적 상호작용 도입 J13 S364K L368D
스와핑 O14 S364K K370S
스와핑 O32 F405K K409F
각각의 키 돌연변이가 일어나는 위치의 아미노산을 다른 아미노산으로 바꾸어 앞서 설명한 바와 같은 단일 변이에 의한 이종이합체화(heterodimerization) 효과를 시험하여, 상기 위치에서 이종이합체화에 효과가 좋은 돌연변이 종류를 확인하였다. S364에 있어서, K(라이신)로 치환되는 경우 이종이합체화 효과가 가장 좋게 나타났으며, N(아스파라긴)과 R(아르기닌)으로 치환된 경우에도 이종이합체화 효과가 우수하게 나타났다 (도 6b 참조). F405에 있어서는, K와 R로 치환되는 경우 유사한 정도의 우수한 이종이합체화 효과를 보였으며, N과 Q(글루타민)으로 치환되는 경우에도 우수한 이종이합체화 효과를 보였다(도 6c 참조).
상기 선택된 3가지 key-lock 돌연변이 쌍인 S364K-L368D, S364K-K370S, 및 F405K-K409F에 도 6b 및 도 6c에서 확인된 추가 돌연변이 S364N, S364R, F405R, F405N, 및 F405Q를 적용하여, lock 돌연변이를 A chain (TNFR2-Fc)에 도입시키고, key 돌연변이를 B chain (Fas-Fc)에 도입시켜, SDS-PAGE 상에서 이종이합체화 효과를 시험하였다.
상기 얻어진 결과를 표 9 및 도 6d에 나타내었다:
샘플 A (TNFR2) B (Fas) SAA SAB SBB
Key Single Mutation Lock Single Mutation
J13(K:D) S364K L368D 8 92 0
J13(N:D) S364N L368D 8 82 9
J13(R:D) S364R L368D 20 79 1
O14(K:S) S364K K370S 25 65 9
O14(N:S) S364N K370S 13 84 3
O14(R:S) S364R K370S 23 76 1
O32(K:F) F405K K409F 0 75 25
O32(N:F) F405N K409F 21 62 17
O32(Q:F) F405Q K409F 5 68 27
O32(R:F) F405R K409F 5 89 6
(SAA: AA 동종 이합체 형성률 (%);
SAB: AB 이종 이합체 형성률 (%);
SBB: BB 동종 이합체 형성률 (%))
< 실시예 2> 단일 돌연변이에 의한 Fc 영역의 이종이합체화 시험
상기 실시예 1에서 선택된 3가지 key-lock 돌연변이 쌍인 S364K-L368D, S364K-K370S, 및 F405K-K409F와, key 돌연변이 위치의 F405를 K 대신 R로 변이시킨 F405RK409F 돌연변이쌍의 이종이합체화 효과를 SDS-PAGE 상에서 측정하여, 기존에 알려진 이종이합체 Fc 돌연변이 쌍 대조군 KiH, CPC, 및 AzS의 결과와 비교하였다.
본 실시예를 포함하여 하기의 모든 실시예에서의 SDS-PAGE 결과의 정량화는 GelQuant.NET Software를 사용하여 밴드 강도 (band intensity)를 수치화한 것이다.
상기 얻어진 결과를 표 10 및 도 7에 나타내었다:
샘플 Chain A (eTNFR2) Chain B (eFas) S AB S A S B S M T m
J13 S364K L368D 0.93 0.86 0.10 0.48 66.8
O14 S364K K370S 0.87 0.86 0.07 0.47 67.6
O32 F405K K409F 0.72 0.91 0.08 0.49 65.2
O32' F405R K409F 0.72 0.91 0.08 0.49 65.2
KiH T366S/L368A/Y407V T366W 0.90 0.68 0.64 0.66 67.4
CPC K392D/K409D E356K/D399K 0.74 0.85 0.30 0.58 66.4
AzS T350V/T366L/K392L/T394W T350V/L351Y/F405A/Y407V 0.84 0.84 0.64 0.74 69.2
(SAB: AB 이종 이합체 형성률(%); SA; AA 동종 이합체 형성률(%);
SB: BB 동종 이합체 형성률(%); SM: 단량체 잔존률(%))
상기 Tm은 다음의 방법으로 측정하였다:
Reagent: Invitrogen 4461146 "Protein Thermal ShiftTM" Dye Kit
Instrument: Chromo4-PTC200 (MJ Research)
Reaction mixture: 20 ㎕ in total
Protein 10 ㎕
DW 3 ㎕
Protein Thermal ShiftTM Buffer 5 ㎕
1/100 diluted Protein Thermal ShiftTM Dye 2 ㎕
Protocol:
1. Incubate at 50.0℃ for 30sec;
2. Melting Curve from 50.0℃ to 90.0℃, read every 0.2℃, hold for 2 sec;
3. Incubate at 90.0℃ for 2 min
4. Incubate at 10.0℃ forever
5. End
표 10 및 도 7에서와 같이, A 사슬과 B 사슬을 각각 단일 발현 하였을 경우, 키(key)가 들어있는 A 사슬은 동종이합체(homodimer)를 거의 형성하지 않고 모노머로 발현되며 공동-발현된 시료에서도 동종이합체 (homodimer)는 거의 없이 이종이합체(heterodimer)로만 존재하는 것이 확인되었다 (도 7 참조).
< 실시예 3> 이중 돌연변이에 의한 Fc 영역의 이종이합체화
키 돌연변이가 A, B 사슬 중 한쪽에만 존재하는 것보다 양쪽 모두에 존재할 경우 동종이합체(homodimer)화 가능성을 낮출 수 있을 것으로 보아서, 실시예 1에서 선택된 세 가지 돌연변이 쌍들을 조합하여 두 가지 이중 돌연변이 쌍을 얻었고, 각각의 쌍에서 F405를 K와 R 두 종류로 만들어서 총 4가지의 이중 돌연변이 쌍을 얻었다. 이들 4 가지 이중 돌연변이 쌍의 이종이합체화 효과를 SDS-PAGE 상에서 측정하여 대조군 KiH, CPC, AzS의 결과와 비교하였다.
상기 얻어진 결과를 표 11 및 도 8에 나타내었다:
DMP Chain A (eTNFR2) Chain B ( eFas ) S AB S A S B S M T m
J13/O32 S364K/K409F L368D/F405K 0.96 1.00 0.74 0.87 58.2
J13/O32' S364K/K409F L368D/F405R 0.95 1.00 0.73 0.87 61.5
O14PO32 S364K/K409F K370S/F405K 0.95 1.00 0.72 0.86 64.1
O14/O32' S364K/K409F K370S/F405R 0.93 1.00 0.71 0.86 64.4
KiH T366S/L368A/Y407V T366W 0.91 0.64 0.61 0.63 67.4
CPC K392D/K409D E356K/D399K 0.73 0.81 0.30 0.58 66.4
AzS T350V/T366L/K392L/T394W T350V/L351Y/F405A/Y407V 0.84 0.82 0.62 0.72 69.2
표 11 및 도 8에서와 같이, 네 가지 돌연변이 쌍들 모두, 양쪽 사슬에 들어 있는 키 돌연변이로 인해 단일 발현하였을 경우 동종이합체(homodimer)가 별로 형성되지 않고, 공동-발현된 시료에서 거의 모든 단백질이 이종이합체(heterodimer)로만 발현되는 것이 확인되었다(도 8 참조). 또한, F405K보다 F405R이 도입된 이중 돌연변이 쌍이 더 높은 열적 안정성를 보였다(표 11).
열쇠(Lock) 돌연변이에 해당하는 아미노산을 다른 돌연변이로 바꾸었을 경우 더 나은 효과가 있을지를 확인하기 위해, 이중 돌연변이 쌍들에서 열쇠(lock)에 해당하는 L368, K370, 및 K409를 다른 아미노산들로 돌연변이시켜 보았다. L368, K370, 및 K409를 다양하게 돌연변이시킨 돌연변이 조합을 표 12에 정리하였으며, 이들 조합의 이종이합체화 효과를 SDS-PAGE 상에서 측정하여 (NR: 8% SDS-PAGE gel; Sample : 24ul Loading), 그 결과를 도 9a 내지 9c에 나타내었다.
Lock variants
X Chain A Chain B Y Chain A Chain B Z Chain A Chain B
UA S364K/K409F L368A/F405R XA S364K/K409F K370A/F405R ZA S364K/K409A K370S/F405R
UC S364K/K409F L368C/F405R XC S364K/K409F K370C/F405R ZC S364K/K409C K370S/F405R
UD S364K/K409F L368D/F405R XD S364K/K409F K370D/F405R ZD S364K/K409D K370S/F405R
UE S364K/K409F L368E/F405R XE S364K/K409F K370E/F405R ZE S364K/K409E K370S/F405R
UF S364K/K409F L368F/F405R XF S364K/K409F K370F/F405R ZF S364K/K409F K370S/F405R
UG S364K/K409F L368G/F405R XG S364K/K409F K370G/F405R ZG S364K/K409G K370S/F405R
UH S364K/K409F L368H/F405R XH S364K/K409F K370H/F405R ZH S364K/K409H K370S/F405R
UI S364K/K409F L368I/F405R XI S364K/K409F K370I/F405R ZI S364K/K409I K370S/F405R
UK S364K/K409F L368K/F405R XK S364K/K409F K370/F405R ZK S364K/K409K K370S/F405R
UL S364K/K409F L368/F405R XL S364K/K409F K370L/F405R ZL S364K/K409L K370S/F405R
UM S364K/K409F L368M/F405R XM S364K/K409F K370M/F405R ZM S364K/K409M K370S/F405R
UN S364K/K409F L368N/F405R XN S364K/K409F K370N/F405R ZN S364K/K409N K370S/F405R
UQ S364K/K409F L368Q/F405R XQ S364K/K409F K370Q/F405R ZQ S364K/K409Q K370S/F405R
UR S364K/K409F L368R/F405R XR S364K/K409F K370R/F405R ZR S364K/K409R K370S/F405R
US S364K/K409F L368S/F405R XS S364K/K409F K370S/F405R ZS S364K/K409S K370S/F405R
UT S364K/K409F L368T/F405R XT S364K/K409F K370T/F405R ZT S364K/K409T K370S/F405R
UV S364K/K409F L368V/F405R XV S364K/K409F K370V/F405R ZV S364K/K409V K370S/F405R
UW S364K/K409F L368W/F405R XW S364K/K409F K370W/F405R ZW S364K/K409W K370S/F405R
UY S364K/K409F L368Y/F405R XY S364K/K409F K370Y/F405R ZY S364K/K409Y K370S/F405R
이들 조합에 대한 열적안정성을 측정(실시예 2 참조)하여 그 결과를 표 13에 나타내었다.
　 Chain A Chain B Tm
UC S364K/K409F L368C/F405R 63.8
UD S364K/K409F L368D/F405R 60.8
UL S364K/K409F L368/F405R 63.0
UW S364K/K409F L368W/F405R 61.2
UY S364K/K409F L368Y/F405R 61.2
ZF S364K / K409F K370S / F405R 65.6
ZH S364K/K409H K370S/F405R 64.4
ZI S364K/K409I K370S/F405R 62.4
ZN S364K/K409N K370S/F405R 61.0
ZR S364K/K409R K370S/F405R 62.8
ZT S364K/K409T K370S/F405R 65.4
ZV S364K/K409V K370S/F405R 66.0
ZW S364K / K409W K370S / F405R 67.0
ZY S364K/K409Y K370S/F405R 63.8
열적안정성을 분석한 결과, K409를 트립토판(W)로 돌연변이시키는 경우에 K409F보다 더 높은 열적안정성을 보였다.
위 결과를 참조하여, 하기의 Fc 이종이합체 시험을 위한 CH3 도메인에 도입되는 돌연변이로서 A 사슬에는 S364K, K409W이 들어가고 B 사슬에는 K370S, F405R이 들어간 이중 돌연변이를 선택하여 AWBB 돌연변이쌍으로 명명하였다.
< 실시예 4> 항체의 Fab에서 중쇄와 경쇄에 대한 돌연변이 선택
항체의 중쇄와 경쇄의 돌연변이을 선택하기 위해서 정전기적 상호 작용 연관된 돌연변이, 사이즈 연관 돌연변이, 스와핑 연관 돌연변이를 수행하였다. 중쇄와 경쇄에서의 상호작용의 위치를 도 10에 나타내었다.
중쇄와 경쇄의 돌연변이를 용이하게 확인하기 위하여 동일한 경쇄를 가지는 항체를 클로닝하였다. 4D9 항체 (anti-Influenza A antibody)와 2B9 항체(anti-Influenza B antibody)는 모두 항-인플루엔자 항체로서 동일한 경쇄(common light chain: CLC)를 가진다. 이들은 동일한 경쇄를 가지고 있기 때문에 SDS-PAGE를 통해 중쇄와 경쇄간의 상호작용을 쉽게 파악할 수 있다. 4D9과 2B9 두 항체는 경쇄의 아미노산 서열은 동일하지만 중쇄의 서열도 다르고 크기도 차이가 나기 때문에(2B9의 중쇄가 4D9의 중쇄보다 아미노산 6개가 더 많고, 단백질 크기도 2B9의 중쇄(50130.62 Daltons)가 4D9의 중쇄(49499.98 Daltons)보다 큼: SDS-PAGE 상에서 뚜렷이 식별 가능함), 둘 중 어느 중쇄가 경쇄와 상호작용하는지 환원 조건에서 SDS-PAGE상에서 사이즈로 구별이 가능하다.
4D9과 2B9 두 항체의 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역의 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 핵산 서열을 아래의 표 14에 나타내었다:
아미노산 서열 핵산 서열
2B9 중쇄 가변영역 EVQLVESGGGLVQPGKSLRLSCAATGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSSLNWKGNSVDYADSVRGRFTMSRDNAKKLVYLQMNGLRGDDTAVYFCAKDNKADASMDYYYHHGMDVWGQGTTVTVSS (서열번호 27) GAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAAGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCACTGGATTCACATTTGACGATTACGCCATGCACTGGGTCCGCCAAGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAAGTCTTAATTGGAAGGGAAATAGTGTAGACTACGCGGACTCTGTGAGGGGCCGATTCACCATGTCCAGAGACAACGCCAAGAAACTAGTGTATCTGCAAATGAACGGTCTGAGAGGTGACGACACGGCCGTCTATTTTTGTGCAAAAGATAATAAAGCGGATGCATCTATGGACTACTACTACCACCACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCG (서열번호 28)
4D9 중쇄 가변 영역 QVTLRESGPGLVKPSETLSLTCTISGASINTDYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYRGRTNYNPSLRSRVTISVDTSKNQFSL
QMTSMTAADTAVYYCARDVTGISRENAFDIWGQGTLVTVSS (서열번호 29)		 CAGGTCACCTTGAGGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTATCTCCGGTGCCTCCATCAATACTGACTACTGGAGCTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGCTATATCTATTACAGAGGGCGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAGGAGCCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAATCAATTCTCCCTG
CAGATGACGTCTATGACCGCTGCTGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGAGATGTGACTGGCATCAGTCGAGAAAATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCG (서열번호 30)
경쇄 (CLC) 가변 영역 AIRMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISGYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSIPTTFGQGTRLEIK (서열번호 31) GCCATCCGGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCGGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCTTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAGAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGCTACAGTATCCCCACCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA (서열번호 32)
4D9과 2B9 두 항체의 중쇄 불변영역은 IgG1의 불변 영역을, 경쇄 불변영역은 카파 불변 영역을 각각 사용하였다.
경쇄에 돌연변이를 도입하고, 그 돌연변이와 상호작용하는 돌연변이를 가진 중쇄 사슬만이 이 경쇄와 결합하는지 확인하기 위해 경쇄, 그 경쇄와 짝지는 중쇄와 잘못된 결합(mispair)를 이루는 중쇄를 공동-발현하여 만들어진 항체를 환원 조건에서 SDS-PAGE하면 짝지음이 얼마나 정확하게 이루어졌는지 확인할 수 있다. 편의상 4D9 중쇄를 A 사슬로, 이와 짝지음하는 경쇄를 a 사슬로, 그리고 2B9 중쇄를 B 사슬로, 이와 짝지음하는 경쇄를 b 사슬로 부르기로 한다 (아래 그림 참조).
Figure pat00001
먼저, 4D9과 2B9을 이용하여 기존에 효과적인 것으로 보고되어 있는 종래 중쇄와 경쇄 사이의 돌연변이 쌍을 클로닝하여 공동-발현하여, 변이시킨 2개의 중쇄와 1개의 경쇄의 competition을 통해 형성된 짝지음 양상을 SDS-PAGE로 확인하였다 (Competitive Pairing (CPP) Assay). 상기 Competitive Pairing (CPP) Assay 과정을 도 11에 모식적으로 나타내었으며, 얻어진 결과를 도 12에 나타내었다. 도 12에서와 같이, 기존에 보고된 모든 돌연변이 쌍이 정상 짝지음(pair)와 비정상 짝지음(mispair)의 같이 일어나는 것으로 확인되었다.
중쇄와 경쇄 사이에 정전기 상호작용에 의한 연관 돌연변이의 경우는 B 사슬(2B9 중쇄)의 해당 아미노산을 K (라이신)으로, A 사슬(4D9 중쇄)의 경우에는 D (아스파트산)으로 바꾸면서, 다양한 돌연변이 쌍들이 도입된 항체에 대하여 SDS-PAGE 상에서의 CPP assay (도 11 참조)를 수행하였다.
그 결과, 정전기적 상호작용에 의한 연관 돌연변이 그룹에서 비교적 정확하게 짝지음이 일어나는 것으로 확인된 7개의 후보 돌연변이쌍을 스크리닝하였다. 스크리닝된 7개 돌연변이 쌍이 도입된 항체의 SDS-PAGE 상에서의 CPP assay 결과를 표 15 및 도 13에 나타내었다.
No SOP
(Symmetric Orthogonal Pairs) 		A ( 4D9 ) B ( 2B9 ) a b a CPP b CPP S CPP
c cΦf L145 L145 S131 S131
1 c29Φf29 L145D L145K S131K S131D 58 50 54
2 c30Φf30 L145D L145K V133K V133D 50 79 65
3 c34Φf34 K147D K147K T180K T180D 49 87 68
4 c40Φf40 F170D F170K L135K L135D 59 61 60
5 c44Φf44 P171D P171K S162K S162D 59 51 55
6 c48Φf48 S183D S183K V133K V133D 62 80 72
7 c51Φf51 V185D V185K L135K L135D 67 73 70
(CPP Score (S CPP) = ½(a CPP + b CPP)
a CPP = 100(C aA)/(C aA+C aB) = 100(C A)/(C A+C B)
b CPP = 100(C bB)/(C bB+C bA) = 100(C B)/(C A+C B))
4D9 (A 사슬) 및 2B9 (B 사슬) 항체를 이용한 돌연변이 쌍의 리스트중 SDS-PAGE 상에서 비교한 결과, 비교적 정확하게 짝지음이 일어나는 돌연변이 쌍 몇 가지를 발견할 수 있었다(표 15에서 굵은 글씨로 표시). 이에 대한 추가 연구를 하기 위해서 위 30번 돌연변이(c30Φf30로 표시)를 표 16과 같이 변형하여 보았다.
변형 c30Φf30
중쇄 경쇄 짝지음 정확도
Aa (4D9) L145D V133R 75%
Bb (2B9) L145R V133D 60%
30번 돌연변이는 중쇄의 L145와 경쇄 V133을 각각 K 과 D로 바꾼 것이며, 상기 표 16과 같이, 중쇄의 L145와 경쇄 V133을 R 과 D로 바꾼 변형 형태의 경우도 효과(짝지음 정확도: Aa 짝지음 또는 Bb 짝지음 비율)가 좋았다(도 14 참조 (Aa 짝지음 정확도 75%, Bb 짝지음 정확도: 60%)).
상기 30번 돌연변이 또는 그 변형 (중쇄의 L145와 경쇄 V133을 각각 K 또는 R 과 D 또는 E로 치환)에, 경쇄에 돌연변이 S131D (29번 돌연변이로 칭함)을 더하자 짝지음의 정확도가 보다 향상되었다(표 17 및 도 15 (c29cR30ΦfR30 결과; Aa 짝지음 정확도: 80%, Bb 짝지음 정확도: 70%) 및 도 16 (cR29cRE30ΦfR29fRE30 결과; Aa 짝지음 정확도: 90%, Bb 짝지음 정확도: 80%) 참조).
중쇄 경쇄 짝지음 정확도
c29c R 30Φf R 30
Aa (4D9) L145D V133R 80%
Bb (2B9) L145R S131D/V133D 70%
c R 29c RE 30Φf R 29f RE 30
Aa (4D9) L145E S131K/V133R 90%
Bb (2B9) L145R S131D/V133E 80%
도 14 및 도 15에서 확인되는 바와 같이, 중쇄의 L145와 경쇄 V133을 각각 K 과 D로 바꾼 30번 돌연변이뿐 아니라, 중쇄의 L145와 경쇄 V133을 각각 R 과 D로 치환한 경우와 중쇄의 L145를 R 또는 E로, 경쇄의 S131 및 V133을 각각 K와 R, 또는 D와 E로 치환한 경우도 짝지음 정확도가 우수하게 나타났다.
또한, 중쇄의 S183과 경쇄의 V133을 각각 K(또는 R)과 D(또는 E)로 바꾼 돌연변이 쌍 (48번 돌연변이로 칭함) 역시 효과적인 것으로 확인되었다(표 18 및 도 17 (Aa 짝지음 정확도 (아래쪽 밴드): 45%, Bb 짝지음 정확도 (위쪽 밴드): 95%).
LC V133K (a) V133D (b)
2B9 중쇄 (B) S183K
4D9 중쇄 (A) S183D
mg/L 2.6 2.4
앞서 설명한 29번 돌연변이, 30번 돌연변이, 및 48번 돌연변이를 조합한 돌연변이쌍(c29c30c48FΦ29f30f48) 또는 이의 변형 돌연변이쌍을 포함하는 항체를 제작하고 (표 19 참조), 이들의 짝지음 정확도를 시험하여 그 결과를 도 18에 나타내었다 (도 18에서 아래쪽 밴드가 Aa 짝지음을, 위쪽 밴드가 Bb 짝지음을 나타냄):
중쇄 경쇄 짝지음 정확도
c R 29c RE 30c48Φf R 29f RE 30f48
Aa (4D9) L145E/S183D S131K/V133R 100%
Bb (2B9) L145R/S183K S131D/V133E 90%
변형 1
Aa (4D9) L145D/S183D S131K/V133K 85%
Bb (2B9) L145K/S183K S131D/V133D 90%
변형 2
Aa (4D9) L145D/S183D S131D/V133K 95%
Bb (2B9) L145K/S183K S131K/V133D 95%
Figure pat00002
또한, 앞서 설명한 29번 돌연변이, 30번 돌연변이, 및 48번 돌연변이 중 하나 이상을 조합한 변형 돌연변이 쌍(표 20 참조)를 포함하는 항체에 대하여 짝지음 정확도를 측정하여 도 19에 나타내었다 (도 19에서 아래쪽 밴드가 Aa 짝지음을, 위쪽 밴드가 Bb 짝지음을 나타냄):
번호 1 2 3 4 5
C c30Φf30 c R 30Φf R 30 c29c R 30Φf R 30 c R 29c RE 30Φ
f R 29f RE 30 		c R 29c RE 30f48Φ
f R 29f RE 30f48
LC V133K
(a)		 V133D
(b)		 V133R V133D V133R S131D/
V133D		 S131K/
V133R		 S131D/
V133E		 S131K/
V133R		 S131D/
V133E
4D9
(A)		 L145D L145D L145D L145E L145E/S183D
2B9
(B)		 L145K L145R L145R L145R L145R/S183K
Aa 79% 67% 80% 90% 100%
Bb 50% 62% 70% 80% 90%
(Aa: Aa 짝지음 정확도; Bb: Bb 짝지음 정확도)
또한, 앞서 설명한 29번 돌연변이, 30번 돌연변이, 및 48번 돌연변이 조합에서, D와 E를 서로 바꾸면서 비교적 정확한 짝지음이 가능하게 하는 조합을 얻어내었다(표 21 및 도 20).
Code A B a b Aa Bb
0 L145K/S183K L145D/S183D S131D/V133D S131K/V133K 65% 100%
ab L145K/S183K L145E/S183E S131D/V133D S131K/V133K 95% 95%
gh L145K/S183K L145D/S183D S131E/V133E S131K/V133K 100% 100%
abgh L145K/S183K L145E/S183E S131E/V133E S131K/V133K 100% 100%
(Aa: Aa 짝지음 정확도; Bb: Bb 짝지음 정확도)
상기 표 21과 도 20에서 보여지는 바와 같이, 시험된 돌연변이쌍 ab, gh, 및 abgh 모두 65% 이상 또는 95% 이상의 짝지음 정확도를 나타내었다. 이 중에서 abgh를 선택하여 이를 c`29c`30c48Φf`29f`30f`48 돌연변이쌍으로 명명하였다.
또한, 표 15에서 확인된 돌연변이쌍들 중 34번 돌연변이 쌍과 51번 돌연변이 쌍을 조합하여 도입시킨 경우의 짝지음 정도를 시험하여 아래의 표 22 및 도 21에 나타내었다.
LC L135K/T180K (a) L135D/T180D (b)
4D9 중쇄 (A) K147D/V185D
2B9 중쇄 (B) K147/V185K
Aa(%) 95%
Bb(%) 62%
또한, 표 15의 34번 돌연변이 쌍과 51번 돌연변이 쌍에서 K를 R로, D를 E로 치환하여 짝지음 정도를 시험하여, 짝지음 정확도가 개선된 조합을 찾았다. 그 조합은 경쇄의 L135와 T180을 각각 E로 바꾼 돌연변이 쌍으로, 이를 c34Φf51 돌연변이 쌍으로 명명하였다 (표 23 및 도 22 참조).
LC L135K/T180K (a) L135E/T180E (b)
4D9 중쇄 (A) K147D/V185D
2B9 중쇄 (B) K147/V185K
Aa(%) 95%
Bb(%) 86%
또한, 표 15에서 발견한 여러 돌연변이 쌍 중에서, 40번 돌연변이에 44번 돌연변이를 더해주었을 때 짝지음의 정확도가 향상됨을 확인하였다.
또한, 앞선 실시예와 동일하게 돌연변이 쌍의 모든 K와 R을 서로 바꾸고 모든 D와 E를 서로 바꾸어 보아 가장 정확한 짝지음을 가능하게 하는 조합을 찾았다. 그 조합은 경쇄의 L135을 각각 R과 E로 바꾼 돌연변이 쌍으로, 이를 c40Φf44 돌연변이 쌍이라 명명하였다 (표 24 및 도 23 참조):
LC L135R/S162K (a) L135E/S162D (b)
4D9 중쇄 (A) F170D/P171D
2B9 중쇄 (B) F170K/P171K
Aa(%) 95%
Bb(%) 84%
<실시예 5> 중쇄 간 및 중쇄 및 경쇄 간의 결합에 의한 이중 항체 형성
5.1. c`29c`30c48Φf`29f`30f`48 돌연변이쌍이 도입된 이중 항체
5.1.1. 4D9/2B9 항체를 이용한 중쇄 및 경쇄 간 결합 시험
상기 시험된 c`29c`30c48Φf`29f`30f`48 돌연변이쌍을 포함하는 중쇄와 경쇄를 결합하여 항체를 제작하였다 (표 25 참조):
항체 중쇄불변영역(HC: CH1) 경쇄불변영역(LC)
4D9 (Aa) L145E/S183E S131K/V133K
2B9 (Bb) L145K/S183K S131E/V133E
상기 이중 항체의 A사슬, B사슬, a 사슬 및 b 사슬의 짝지음의 정확도를 확인하기 위해, 각각의 중쇄와 경쇄를 제대로짝지음 및 비정상적 짝지음의 형태로 가능한 모든 조합으로 공동-발현한 후 발현 정도를 SDS-PAGE로 확인한 결과를 아래의 표 26에 나타내고, 열적 안정성(Tm)을 측정하여 그 결과를 표 27 및 도 25에 나타내었다:
HC A B
LC a b a b
발현량 89.8mg/l 18.8 mg/l 24.5 mg/l 68.5 mg/l
Pairs Tm
4D9 WT 69.9 ±2.00
2B9 WT 69.1 ±1.50
Aa 70.3 ±1.70
Ab 58.5 ±11.96
Bb 68.7 ±0.92
Ba 58.6 ±0.53
열적 안정성(Tm)은 실시예 2에 기재된 방법을 참조하여 측정하였다.
상기 표 26, 표 27, 및 도 25에 나타난 바와 같이, c`29c`30c48Φf`29f`30f`48 돌연변이쌍이 도입된 이중 항체의 경우, 정상적인 짝지음 (Aa/Bb)의 경우, 비정상적 짝지음 (Ab/Ba)에 비해, 발현 수준이 높고, 열적안정성도 매우 우수한 것으로 확인되었다.
5.1.2. Trastuzumab / Bevacizumab 이중항체 또는 Adalimumab / Bevacizumab 이중항체
Trastuzumab (Herceptin®; Roche), Bevacizumab (AvastinTM; Roche), 및 Adalimumab (Humira®; Abbvie)를 구입하여 아미노산 서열을 시퀀싱하고(기초과학지원센터(KBSI); 한국), 이에 해당하는 cDNA를 합성하였으며, 이를 사용하여 아래의 표 28의 조합으로 c`29c`30c48Φf`29f`30f`48 돌연변이쌍과 실시예 3에서 선택된 CH3 도메인의 AWBB 돌연변이쌍이 도입된 이중항체를 제작하였다 (pcDNA3 vector (도 26 참조) 사용).
항체 중쇄불변영역(HC) 경쇄불변영역(LC)
CH1 CH3
Trabev
Trastuzumab (Aa) L145E/S183E S364K/K409W S131K/V133K
Bevacizumab (Bb) L145K/S183K K370S/F405R S131E/V133E
Adabev
Adalimumab (Aa) L145E/S183E S364K/K409W S131K/V133K
Bevacizumab (Bb) L145K/S183K K370S/F405R S131E/V133E
상기 얻어진 이중항체 Trabev와 Adabev에 대하여 다음의 조건으로 Hydrophobic Interaction Chromatography(HIC)를 수행하여, 그 결과를 도 27 (y축: Value (mAU), x축: 시간 (min))에 각각 나타내었다:
장비: HPLC-U3000
컬럼: MAbPac Hic-20
Flow rate: 0.2mL/min
Detection: UV, 280nm
Mobile Phase: 0.10 M Ammonium acetate, pH7.0
상기 얻어진 단백질을 HIC Column에 통과시켜주면 단백질의 소수성 정도에 따라 서로 다른 시간대에 피크가 생성되며, 이를 통하여 이중 항체가 잘 만들었는지 확인할 수 있다. 도 27에 나타난 바와 같이, 두 개의 동종 이합체 항체(Trastuzumab와 Bevacizumab 또는 Adalimumab와 Bevacizumab)의 피크 가운데 이종 이합체의 이중항체 (Trabev와 Adabev)의 피크가 뚜렷하게 관찰된다. 이는 각각의 항체의 half antibody로 만들어진 이중항체가 잘 생성되어 있음을 의미한다.
또한, 상기 얻어진 이중항체 Trabev와 Adabev에 대하여 다음의 조건으로 Size exclusion Chromatography (SEC) Analysis 를 수행하여, 그 결과를 표 29, 도 28 및 도 29 (x축: 시간(min))에 나타내었다:
장비: HPLC-U3000
컬럼: Size-exclusion chromatography T SKgel G3000SWXL Tosoh Bioscience
Flow rate: 1.0mL/min
Detection: UV, 280nm
Mobile Phase: 25mM Tris-HCl (pH 8.5), 150 mM NaCl
WT (단일항체) BsAb (이중항체)
1A.Trastuzumab 8.007min. 1'' Trabev 7.847 min.
1B.Bevacizumab 7.743 min. 2'' Adabev 7.833 min.
2A.Adalimumab 7.987 min.
상기 SEC 분석에서 단백질의 크기에 따라서 peak가 나오며, 단백질 간 응집 상태 등을 알 수 있다. 표 29, 도 28 및 도 29에 나타난 바와 같이, 이중항체의 피크가 두 단일 항체 피크의 가운데 시간대에 위치하는 것을 확인할 수 있다. 이는 이중항체가 잘 생성되어 있음을 의미한다.
또한, 상기 얻어진 이중항체 Trabev와 Adabev에 대하여 SDS-PAGE 상에서 이합체 형성 양상을 도 30에 나타내었다. 도 30에서 확인되는 바와 같이, 이종이합체인 이중항체 Trabev는 Trastuzumab과 Bevacizumab의 중간 size에, Adabev는 Adalimumab과 Bevacizumab의 중간 size에 단일 band로 나타났다. 이는 동종 이합체가 형성되지 않고 오직 제대로 짝지음된 이중 특이성 항체들만 만들어졌음을 의미한다.
ELISA를 통해서 BsAb가 각각의 항원 (Trastuzumab: Her2), Bevacizumab (VEGF), 및 Adalimumab (TNF-alpha)에 잘 결합하는지 시험하였다.
항원 결합력 측정은 다음을 참조하여 수행하였다:
Reagent
Detection antibody: goat anti-human kappa-HRP (southern biotech, 2060-05)
TMB single solution (LIFE TECHNOLOGY, 002023)
Instrument
Emax precision microplate reader (Molecular devices)
Protocol
Coating buffer: Carbonate buffer pH 9.6
Blocking buffer: protein-free(TBS) blocking buffer (Thermo scientific)
Wash buffer: 0.05%(w/v) Tween20 in TBS, pH7.4 (TBST)
Diluent: 0.05%(w/v) Tween20 in TBS, pH7.4
Stop buffer: 1N Hydrochloric acid solution (HCl)
과정
Coating: antigen을 coating buffer에 희석하여 well당 100ul씩 loading, 4 overnight incubation (Her2, VEGF: 50ng/well, TNF-alpha: 100ng/well);
Washing 3 times with washing buffer;
Blocking: blocking buffer 300ul 분주, incubation at room temperature (RT) for 1 hour;
Washing 3 times with washing buffer;
Binding: antibodies 100ng/well로 loading, incubation RT 1hr;
Washing 3 times with washing buffer;
Detection Antibody: goat anti-human kappa-HRP를 TBST에 1:4000으로 희석, incubation RT 1hr;
Washing 3 times with washing buffer
Detection: TMB solution 100ul씩 loading, incubation RT 3 min in the dark;
Stop solution: 1N HCl 100ul씩 loading;
Reading: optical density 450nm에서 측정
상기 얻어진 결과를 표 30과 도 31 (이상, Trabev에 대한 결과), 및 표 31와 도 32 (이상, Adabev에 대한 결과)에 각각 나타내었다:
Antigen Her2 VEGF
Antibody Trastuzumab Bevacizumab Trabev Trastuzumab Bevacizumab Trabev
O.D 2.50 0.05 2.54 0.65 2.89 2.04
2.96 0.05 2.60 0.70 2.88 2.25
2.58 0.04 2.49 0.60 3.12 2.36
평균 2.68 0.05 2.54 0.65 2.96 2.22
blank 0.05 0.05
Antigen TNF-alpha VEGF
Antibody Adalimumab Bevacizumab Adabev Adalimumab Bevacizumab Adabev
O.D 1.24 0.23 0.93 0.07 2.24 2.37
1.26 0.22 1.16 0.06 2.27 2.28
1.19 0.27 1.09 0.07 2.60 2.47
평균 1.23 0.24 1.06 0.07 2.37 2.37
blank 0.06 0.06
표 29 및 도 31에 나타난 바와 같이, 이중항체 Trabev는 Trastuzumab의 항원인 Her2와, Bevacizumab의 항원인 VEGF 모두에 결합함이 확인되었으며, 표 30 및 도 32에 나타난 바와 같이, 이중항체 Adabev 역시 Adalimumab의 항원인 TNF-alpha와 Bevacizumab의 항원인 VEGF 모두에 결합함이 확인되었다. 이러한 결과는 의도한 기능을 정상적으로 발휘하는 두 이중항체가 성공적으로 생성되었음을 다시 한번 확인시켜주는 것이다.
5.2. c34Φf51 돌연변이 쌍이 도입된 이중 항체
실시예 5.1.1을 참조하여, 4D9(Aa)와 2B9(Bb)에 c34Φf51 돌연변이쌍 (표 23 참조)이 도입된 항체를 제작하였다. 각 중쇄 별로 경쇄 a와 b를 함께 발현시켜, SDS-PAGE 상에서 경쇄와 중쇄 간 짝지음 정도를 측정하고 (중쇄 A 및 B에 대하여 각각 실시함), 실시예 2를 참조하여 Tm을 측정하여, 그 결과를 아래의 표 32 및 도 34에 나타내었다.
시험 1 시험 2
HC A (K147D/V185D) B (K147/V185K)
LC a
(L135K/T180K) 		b (L135E/T180E) b
(L135E/T180E) 		a
(L135K/T180K)
q 90% 10% 89% 11%
Tm 65.8 N/A 65.8 N/A
(q: 경쇄/중쇄 짝지음 정도 (%);
N/A: not available)
표 32 및 도 34에 나타난 바와 같이, 정상적인 중쇄/경쇄 쌍 (Aa 또는 Bb)의 형성률이 각각 90% 및 89%로 매우 높게 나타났으며, 열적 안정성도 우수한 것으로 확인되었다.
또한, 실시예 5.1.2의 이중항체 제작 과정을 참조하여, Trastuzumab (Herceptin®; Roche), Bevacizumab (AvastinTM; Roche), 및 Adalimumab (Humira®; Abbvie)를 사용하여 c34Φf51 돌연변이 쌍 및 실시예 3에서 선택된 CH3 도메인 AWBB 돌연변이 쌍 (Aa: S364K/K409W; Bb: K370S/F405R)이 도입된 이중항체 Trabev (Aa: Trastuzumab; Bb: Bevacizumab)와 Adabev (Aa: Adalimumab; Bb: Bevacizumab)를 각각 제작하였다.
실시예 5.1.2의 Hydrophobic Interaction Chromatography(HIC) 방법을 참조하여, 상기 제작된 c34Φf51 돌연변이쌍 및 AWBB 돌연변이쌍이 도입된 이중 항체 Trabev와 Adabev를 분석하였다.
상기 얻어진 분석 결과를 표 33과 도 35 (이상 Trabev) 및 표 34와 도 36 (이상, Adabev)에 나타내었다.
# Set1 Antibody Time (min.)
Aa Trastuzumab 23.41
Bb Bevacizumab 38.05
1AB Trabev 29.13
# Set2 Antibody Time (min.)
Aa Adalimumab 22.07
Bb Bevacizumab 38.05
2AB Adabev 30.21
표 33과 도 35 및 표 34와 도 36에 나타난 바와 같이, 두 개의 동종 이합체 항체(Trastuzumab와 Bevacizumab 또는 Adalimumab와 Bevacizumab)의 피크 가운데 이종 이합체의 이중항체 (Trabev와 Adabev)의 피크가 뚜렷하게 관찰된다. 이는 c34Φf51 돌연변이쌍 및 AWBB 돌연변이쌍이 도입된 각각의 항체의 half antibody로 만들어진 이중항체가 잘 생성되어 있음을 의미한다.
또한, 상기 c34Φf51 돌연변이 쌍 및 AWBB 돌연변이쌍이 도입된 이중항체의 이합체 형성 양상을 시험하여 도 37에 나타내었다 (SDS-PAGE gel 6%, Non-Reducing condition). 도 37에 나타난 바와 같이, 기존에 알려진 항체에 c34Φf51 돌연변이 쌍과 AWBB 돌연변이 쌍을 동시에 도입시켰을 때, 순수한 이종이합체 밴드가 형성됨을 확인할 수 있다.
4.3. c40Φf44 돌연변이 쌍이 도입된 이중 항체
실시예 5.1.1을 참조하여, 4D9(Aa)와 2B9(Bb)에 c40Φf44 돌연변이쌍 (표 24 참조)이 도입된 항체를 제작하였다. 각 중쇄 별로 경쇄 a와 b를 함께 발현시켜, SDS-PAGE 상에서 경쇄와 중쇄 간 짝지음 정도를 측정하고 (중쇄 A 및 B에 대하여 각각 실시함), 실시예 2를 참조하여 Tm을 측정하여, 그 결과를 아래의 표 35 및 도 38에 나타내었다.
HC A (F170D/P171D) B (F170K/P171K)
LC a
(L135R/S162K) 		b (L135E/S162D) b
(L135E/S162D) 		a
(L135R/S162K)
q 99% 1% 99% 1%
Tm 65.0 N/A 63.4 N/A
(q: 경쇄/중쇄 짝지음 정도 (%);
N/A: not available)
표 35 및 도 38에 나타난 바와 같이, 정상적인 중쇄/경쇄 쌍 (Aa 또는 Bb)의 형성률이 모두 99% 로 매우 높게 나타났으며, 열적 안정성도 우수한 것으로 확인되었다.
또한, 실시예 5.1.2의 이중항체 제작 과정을 참조하여, Trastuzumab (Herceptin®; Roche), Bevacizumab (AvastinTM; Roche), 및 Adalimumab (Humira®; Abbvie)를 사용하여 c40Φf44 돌연변이 쌍 및 AWBB 돌연변이 쌍 (A: S364K/K409W; B: K370S/F405R)이 도입된 이중항체 Trabev (Aa: Trastuzumab; Bb: Bevacizumab)와 Adabev (Aa: Adalimumab; Bb: Bevacizumab)를 각각 제작하였다.
실시예 5.1.2의 Hydrophobic Interaction Chromatography(HIC) 방법을 참조하여, 상기 제작된 c40Φf44 돌연변이쌍 및 AWBB 돌연변이 쌍이 도입된 이중 항체 Trabev와 Adabev를 분석하였다.
상기 얻어진 분석 결과를 표 36과 도 39 (이상 Trabev) 및 표 37과 도 40 (이상, Adabev)에 나타내었다.
# Set1 Antibody Time (min.)
Aa Trastuzumab 23.41
Bb Bevacizumab 38.05
1AB Trabev 26.11
# Set2 Antibody Time (min.)
Aa Adalimumab 22.07
Bb Bevacizumab 38.05
2AB Adabev 31.97
표 36과 도 39 및 표 37과 도 40에 나타난 바와 같이, 두 개의 동종 이합체 항체(Trastuzumab와 Bevacizumab 또는 Adalimumab와 Bevacizumab)의 피크 가운데 이종 이합체의 이중항체 (Trabev와 Adabev)의 피크가 뚜렷하게 관찰된다. 이는 c40Φf44 돌연변이 쌍 및 AWBB 돌연변이 쌍이 도입된 각각의 항체의 half antibody로 만들어진 이중항체가 잘 생성되어 있음을 의미한다. 또한, 두 개의 동종 이합체 항체 사이에 뚜렷한 peak가 단 한 개만 나타나는 것으로 보아, 두 개의 중쇄 사이, 그리고 각각의 중쇄와 경쇄 사이에 잘못된 짝지음이 일어나지 않고 오직 한 종류의 제대로 짝지음된 이중 특이성 항체만이 만들어졌음을 알 수 있다.
또한, 상기 c40Φf44 돌연변이 쌍 및 AWBB 돌연변이쌍이 도입된 이중항체의 이합체 형성 양상을 시험하여 도 41에 나타내었다 (SDS-PAGE gel 6%, Non-Reducing condition). 도 41에 나타난 바와 같이, 기존에 알려진 항체에 c40Φf44 돌연변이 쌍과 AWBB 돌연변이 쌍을 동시에 도입시켰을 때, 순수한 이종이합체 밴드가 형성됨을 확인할 수 있다.
<비교예 1>
본 명세서에서 제시되는 CH3 도메인의 돌연변이에 있어서, 동일한 아미노산 쌍이라도 실시예 1 내지 3에서 제시되는 돌연변이와 상이한 돌연변이가 도입되는 경우의 이종 이합체 형성률을 시험하였다.
비교예로서, 실시예 1을 참조하여, 하기의 표 38의 돌연변이가 도입된 TNFRSF1B-Fc 융합 단백질 (Enbrel; Enb)과 Fas-Fc 융합 단백질 (Fas)을 제조하였다 (표 38에서 BEAT-A 및 BEAT-B로 표시).
Enb Fas
AW/BB AW
(S364K/K409W)		 BB
(K370S/F405R)
BEAT-A S364K/K409W K370T/F405A
BEAT-B S364T/K409R K370T/F405S
본 명세서에서 제시되는 CH3 도메인의 돌연변이를 대표하기 위하여, 실시예 3에서 선택된 CH3 도메인 돌연변이를 포함하는 TNFRSF1B-Fc 융합 단백질 (A 사슬)과 Fas-Fc 융합 단백질 (즉, S364K 및 K409W이 도입된 A 사슬 및 K370S 및 F405R이 도입된 B 사슬) (표 38에서 AW/BB로 표시됨)을 준비하였다.
또한, 상기 표 38에 기재된 돌연변이 쌍을 포함하는 Enb-Fc와 Fas-Fc를 각각 single transfection시킨 경우의 동종 이합체 형성 양상을 SDS-PAGE 상에서 관찰하여, 도 42에 나타내었다.
도 42에 나타난 바와 같이, AW/BB에서는 monomer의 비율이 높은 데 비해, BEAT-A 및 BEAT-B에서는 monomer보다는 homodimer의 비율이 더 높게 나타났다. 이러한 결과에 근거하여, A chain과 B chain의 expression 양에 차이가 있을 경우, homodimer를 형성할 확률은 AW/BB보다 BEAT-A 및 BEAT-B가 더 높다고 할 수 있다. 또한, 이중항체를 만들기 위해 heavy chain과 light chain을 조합하였을 때, homodimer가 많이 만들어진다면 이 homodimer는 제대로 만들어진 heterodimer와 물성에 차이가 거의 없기 때문에, 제대로 만들어진 heterodimer를 분리하기가 매우 어렵게된다. 따라서, homodimerization을 최소화하는 것은 순도가 높은 이중항체를 제조하는 데 있어 매우 중요하다고 할 수 있으며, 가능한 한 homodimer를 형성하지 않는 돌연변이 조합이 이중 특이성 이중항체의 제작에 유리하다고 할 수 있다.
이러한 결과로 볼 때, BEAT-A 및 BEAT-B의 경우, AW/BB와 비교하여, 동종 이합체의 형성률이 높으므로, heterodimerization potential이 낮다고 할 수 있고, 제대로 형성된 이종 이합체의 분리에 어려움이 있다.
<110> Ibentrus, Inc. <120> Bispecific protein and methods of preparation thereof <130> DPP20171013KR <150> KR10-2016-0091157 <151> 2016-07-19 <160> 54 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens The CH1 domain of human IgG1 <400> 1 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 100 105 <210> 2 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens The CH1 domain of human IgG2 <400> 2 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu 100 105 <210> 3 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens The CH1 domain of human IgG3 <400> 3 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr 100 105 110 <210> 4 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens The CH1 domain of human IgG4 <400> 4 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Ser Pro Asn Met Val Pro His Ala His His Ala Gln 100 105 110 <210> 5 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens The CH1 domain of human IgA1 <400> 5 Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Cys Ser Thr 1 5 10 15 Gln Pro Asp Gly Asn Val Val Ile Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe 20 25 30 Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Gly Val 35 40 45 Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr 50 55 60 Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Leu Ala Gly 65 70 75 80 Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp 85 90 95 Val Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro 100 105 <210> 6 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens The CH1 domain of human IgA2 <400> 6 Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Asp Ser Thr 1 5 10 15 Pro Gln Asp Gly Asn Val Val Val Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe 20 25 30 Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Asn Val 35 40 45 Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr 50 55 60 Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Pro Asp Gly 65 70 75 80 Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp 85 90 95 Val Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Pro Pro Pro Pro 100 105 <210> 7 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens The CH1 domain of human IgD <400> 7 Ala Pro Thr Lys Ala Pro Asp Val Phe Pro Ile Ile Ser Gly Cys Arg 1 5 10 15 His Pro Lys Asp Asn Ser Pro Val Val Leu Ala Cys Leu Ile Thr Gly 20 25 30 Tyr His Pro Thr Ser Val Thr Val Thr Trp Tyr Met Gly Thr Gln Ser 35 40 45 Gln Pro Gln Arg Thr Phe Pro Glu Ile Gln Arg Arg Asp Ser Tyr Tyr 50 55 60 Met Thr Ser Ser Gln Leu Ser Thr Pro Leu Gln Gln Trp Arg Gln Gly 65 70 75 80 Glu Tyr Lys Cys Val Val Gln His Thr Ala Ser Lys Ser Lys Lys Glu 85 90 95 Ile Phe Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser 100 105 110 <210> 8 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens The CH1 domain of human IgE <400> 8 Ala Ser Thr Gln Ser Pro Ser Val Phe Pro Leu Thr Arg Cys Cys Lys 1 5 10 15 Asn Ile Pro Ser Asn Ala Thr Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Ala Thr 20 25 30 Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Met Val Thr Cys Asp Thr Gly Ser Leu 35 40 45 Asn Gly Thr Thr Met Thr Leu Pro Ala Thr Thr Leu Thr Leu Ser Gly 50 55 60 His Tyr Ala Thr Ile Ser Leu Leu Thr Val Ser Gly Ala Trp Ala Lys 65 70 75 80 Gln Met Phe Thr Cys Arg Val Ala His Thr Pro Ser Ser Thr Asp Trp 85 90 95 Val Asp Asn Lys Thr Phe Ser Val Cys Ser Arg Asp Phe Thr 100 105 110 <210> 9 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens The CH1 domain of human IgM <400> 9 Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn 1 5 10 15 Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp 20 25 30 Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Leu Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser 35 40 45 Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys 50 55 60 Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln 65 70 75 80 Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn 85 90 95 Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val Ile Ala Glu Leu Pro 100 105 110 <210> 10 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens The CL domain of human kappa chain <400> 10 Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu 1 5 10 15 Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro 20 25 30 Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly 35 40 45 Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr 50 55 60 Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His 65 70 75 80 Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val 85 90 95 Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 11 <211> 103 <212> PRT <213> Homo sapiens The CL domain of human lambda 1 chain <400> 11 Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu 1 5 10 15 Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro 20 25 30 Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys Ala 35 40 45 Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala 50 55 60 Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg 65 70 75 80 Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr 85 90 95 Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 <210> 12 <211> 103 <212> PRT <213> Homo sapiens The CL domain of human lambda 2 chain <400> 12 Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu 1 5 10 15 Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro 20 25 30 Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala 35 40 45 Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala 50 55 60 Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg 65 70 75 80 Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr 85 90 95 Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 <210> 13 <211> 103 <212> PRT <213> Homo sapiens The CL domain of human lambda 3 chain <400> 13 Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu 1 5 10 15 Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro 20 25 30 Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala 35 40 45 Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala 50 55 60 Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Lys 65 70 75 80 Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr 85 90 95 Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 <210> 14 <211> 103 <212> PRT <213> Homo sapiens The CL domain of human lambda 7 chain <400> 14 Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu 1 5 10 15 Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Val Ser Asp Phe Tyr Pro 20 25 30 Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys Val 35 40 45 Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala 50 55 60 Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg 65 70 75 80 Ser Tyr Ser Cys Arg Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr 85 90 95 Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 <210> 15 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens The CH3 domain of human IgG1 <400> 15 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 1 5 10 15 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 20 25 30 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 35 40 45 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 50 55 60 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 65 70 75 80 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 85 90 95 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 16 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens The CH3 domain of human IgG2 <400> 16 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 1 5 10 15 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 20 25 30 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 35 40 45 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser 50 55 60 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 65 70 75 80 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 85 90 95 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 17 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens The CH3 domain of human IgG3 <400> 17 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 1 5 10 15 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 20 25 30 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro 35 40 45 Glu Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser 50 55 60 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 65 70 75 80 Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg 85 90 95 Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 18 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens The CH3 domain of human IgG4 <400> 18 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 1 5 10 15 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 20 25 30 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 35 40 45 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 50 55 60 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 65 70 75 80 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 85 90 95 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 100 105 <210> 19 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens The CH3 domain of human IgA1 <400> 19 Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu 1 5 10 15 Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly 20 25 30 Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu 35 40 45 Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser 50 55 60 Gln Gly Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala 65 70 75 80 Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu 85 90 95 Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly 100 105 110 Lys Pro Thr His Val Asn Val Ser 115 120 <210> 20 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens The CH3 domain of human IgA2 <400> 20 Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu 1 5 10 15 Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly 20 25 30 Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu 35 40 45 Leu Pro Gln Glu Pro Ser Gln Gly Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser 50 55 60 Ile Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser 65 70 75 80 Cys Met Val Gly His Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr 85 90 95 Ile Asp Arg Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly 100 105 110 Lys Pro Thr His Val Asn Val Ser 115 120 <210> 21 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens The CH3 domain of human IgD <400> 21 Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser 1 5 10 15 Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe 20 25 30 Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val 35 40 45 Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Arg Ser 50 55 60 Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser 65 70 75 80 Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg 85 90 95 Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp 100 105 110 His Gly Pro Met Lys Val Lys 115 <210> 22 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens The CH4 domain of human IgE <400> 22 Ala Ala Pro Glu Val Tyr Ala Phe Ala Thr Pro Glu Trp Pro Gly Ser 1 5 10 15 Arg Asp Lys Arg Thr Leu Ala Cys Leu Ile Gln Asn Phe Met Pro Glu 20 25 30 Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu His Asn Glu Val Gln Leu Pro Asp Ala 35 40 45 Arg His Ser Thr Thr Gln Pro Arg Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe 50 55 60 Val Phe Ser Arg Leu Glu Val Thr Arg Ala Glu Trp Glu Gln Lys Asp 65 70 75 80 Glu Phe Ile Cys Arg Ala Val His Glu Ala Ala Ser Pro Ser Gln Thr 85 90 95 Val Gln Arg Ala Val Ser Val Asn Pro Gly Lys Glu Leu Asp Val Cys 100 105 110 Val Glu Glu Ala Glu Gly Glu Ala 115 120 <210> 23 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens The CH3 domain of human IgM <400> 23 Lys Gly Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala 1 5 10 15 Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu Val 20 25 30 Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Gln Trp Met Gln Arg Gly 35 40 45 Gln Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu 50 55 60 Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His Ser Ile Leu Thr Val Ser 65 70 75 80 Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Ala His Glu 85 90 95 Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr Gly 100 105 110 Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser 115 120 <210> 24 <211> 1386 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDS of TNFRSF1B (Enbrel : NM_001066), wherein 1-771 region encodes ectodomain <400> 24 atggcgcccg tcgccgtctg ggccgcgctg gccgtcggac tggagctctg ggctgcggcg 60 cacgccttgc ccgcccaggt ggcatttaca ccctacgccc cggagcccgg gagcacatgc 120 cggctcagag aatactatga ccagacagct cagatgtgct gcagcaaatg ctcgccgggc 180 caacatgcaa aagtcttctg taccaagacc tcggacaccg tgtgtgactc ctgtgaggac 240 agcacataca cccagctctg gaactgggtt cccgagtgct tgagctgtgg ctcccgctgt 300 agctctgacc aggtggaaac tcaagcctgc actcgggaac agaaccgcat ctgcacctgc 360 aggcccggct ggtactgcgc gctgagcaag caggaggggt gccggctgtg cgcgccgctg 420 cgcaagtgcc gcccgggctt cggcgtggcc agaccaggaa ctgaaacatc agacgtggtg 480 tgcaagccct gtgccccggg gacgttctcc aacacgactt catccacgga tatttgcagg 540 ccccaccaga tctgtaacgt ggtggccatc cctgggaatg caagcatgga tgcagtctgc 600 acgtccacgt cccccacccg gagtatggcc ccaggggcag tacacttacc ccagccagtg 660 tccacacgat cccaacacac gcagccaact ccagaaccca gcactgctcc aagcacctcc 720 ttcctgctcc caatgggccc cagcccccca gctgaaggga gcactggcga cttcgctctt 780 ccagttggac tgattgtggg tgtgacagcc ttgggtctac taataatagg agtggtgaac 840 tgtgtcatca tgacccaggt gaaaaagaag cccttgtgcc tgcagagaga agccaaggtg 900 cctcacttgc ctgccgataa ggcccggggt acacagggcc ccgagcagca gcacctgctg 960 atcacagcgc cgagctccag cagcagctcc ctggagagct cggccagtgc gttggacaga 1020 agggcgccca ctcggaacca gccacaggca ccaggcgtgg aggccagtgg ggccggggag 1080 gcccgggcca gcaccgggag ctcagattct tcccctggtg gccatgggac ccaggtcaat 1140 gtcacctgca tcgtgaacgt ctgtagcagc tctgaccaca gctcacagtg ctcctcccaa 1200 gccagctcca caatgggaga cacagattcc agcccctcgg agtccccgaa ggacgagcag 1260 gtccccttct ccaaggagga atgtgccttt cggtcacagc tggagacgcc agagaccctg 1320 ctggggagca ccgaagagaa gcccctgccc cttggagtgc ctgatgctgg gatgaagccc 1380 agttaa 1386 <210> 25 <211> 1008 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDS of Fas Receptor (NM_000043), wherein 1-519 region encodes ectodomain <400> 25 atgctgggca tctggaccct cctacctctg gttcttacgt ctgttgctag attatcgtcc 60 aaaagtgtta atgcccaagt gactgacatc aactccaagg gattggaatt gaggaagact 120 gttactacag ttgagactca gaacttggaa ggcctgcatc atgatggcca attctgccat 180 aagccctgtc ctccaggtga aaggaaagct agggactgca cagtcaatgg ggatgaacca 240 gactgcgtgc cctgccaaga agggaaggag tacacagaca aagcccattt ttcttccaaa 300 tgcagaagat gtagattgtg tgatgaagga catggcttag aagtggaaat aaactgcacc 360 cggacccaga ataccaagtg cagatgtaaa ccaaactttt tttgtaactc tactgtatgt 420 gaacactgtg acccttgcac caaatgtgaa catggaatca tcaaggaatg cacactcacc 480 agcaacacca agtgcaaaga ggaaggatcc agatctaact tggggtggct ttgtcttctt 540 cttttgccaa ttccactaat tgtttgggtg aagagaaagg aagtacagaa aacatgcaga 600 aagcacagaa aggaaaacca aggttctcat gaatctccaa ctttaaatcc tgaaacagtg 660 gcaataaatt tatctgatgt tgacttgagt aaatatatca ccactattgc tggagtcatg 720 acactaagtc aagttaaagg ctttgttcga aagaatggtg tcaatgaagc caaaatagat 780 gagatcaaga atgacaatgt ccaagacaca gcagaacaga aagttcaact gcttcgtaat 840 tggcatcaac ttcatggaaa gaaagaagcg tatgacacat tgattaaaga tctcaaaaaa 900 gccaatcttt gtactcttgc agagaaaatt cagactatca tcctcaagga cattactagt 960 gactcagaaa attcaaactt cagaaatgaa atccaaagct tggtctag 1008 <210> 26 <211> 684 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDS of Human Fc (from Human Immunoglobulin G) <400> 26 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 420 aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540 gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 660 ctctccctgt ctccgggtaa atga 684 <210> 27 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain Variable Region of anti-Influenza B antibody, 2B9 <400> 27 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Lys 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Thr Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Leu Asn Trp Lys Gly Asn Ser Val Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Met Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Leu Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Gly Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Asn Lys Ala Asp Ala Ser Met Asp Tyr Tyr Tyr His His 100 105 110 Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 28 <211> 381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic Acid Sequence Encoding Heavy Chain Variable Region of 2B9 <400> 28 gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaagtc cctgagactc 60 tcctgtgcag ccactggatt cacatttgac gattacgcca tgcactgggt ccgccaagct 120 ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaagt cttaattgga agggaaatag tgtagactac 180 gcggactctg tgaggggccg attcaccatg tccagagaca acgccaagaa actagtgtat 240 ctgcaaatga acggtctgag aggtgacgac acggccgtct atttttgtgc aaaagataat 300 aaagcggatg catctatgga ctactactac caccacggta tggacgtctg gggccaaggg 360 accacggtca ccgtctcctc g 381 <210> 29 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain Variable Region of anti-Influenza A antibody, 4D9 <400> 29 Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Ile Ser Gly Ala Ser Ile Asn Thr Asp 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Tyr Arg Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Arg 50 55 60 Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Gln Met Thr Ser Met Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Val Thr Gly Ile Ser Arg Glu Asn Ala Phe Asp Ile Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 30 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic Acid Sequence Encoding Heavy Chain Variable Region of anti-Influenza A antibody, 4D9 <400> 30 caggtcacct tgagggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcacta tctccggtgc ctccatcaat actgactact ggagctggat ccggcagccc 120 ccagggaagg gactggagtg gattggctat atctattaca gagggcgcac caactacaac 180 ccctccctca ggagccgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaatca attctccctg 240 cagatgacgt ctatgaccgc tgctgacacg gccgtatatt actgtgcgag agatgtgact 300 ggcatcagtc gagaaaatgc ttttgatatc tggggccaag gcaccctggt caccgtctcc 360 tcg 363 <210> 31 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Common Light Chain for 4D9 and 2B9 <400> 31 Ala Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 32 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic Acid Sequence Encoding Common Light Chain for 4D9 and 2B9 <400> 32 gccatccgga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc ggctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctctt gatctatgct gcatccagtt tgcagagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agctacagta tccccaccac cttcggccaa 300 gggacacgac tggagattaa a 321 <210> 33 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IgG1 Heavy Constant Region <400> 33 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 34 <211> 335 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IgA1 Heavy Constant Region <400> 34 Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Cys Ser Thr 1 5 10 15 Gln Pro Asp Gly Asn Val Val Ile Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe 20 25 30 Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Gly Val 35 40 45 Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr 50 55 60 Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Leu Ala Gly 65 70 75 80 Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp 85 90 95 Val Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro 100 105 110 Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Cys Cys His Pro Arg Leu Ser 115 120 125 Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn 130 135 140 Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly Val Thr Phe 145 150 155 160 Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu 165 170 175 Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys 180 185 190 Ala Glu Pro Trp Asn His Gly Lys Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr 195 200 205 Pro Glu Ser Lys Thr Pro Leu Thr Ala Thr Leu Ser Lys Ser Gly Asn 210 215 220 Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu 225 230 235 240 Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser 245 250 255 Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro 260 265 270 Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly 275 280 285 Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp 290 295 300 Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu Ala Leu 305 310 315 320 Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly Lys 325 330 335 <210> 35 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Immunoglobulin Light chain (Kappa) <400> 35 Val Leu Met Leu Leu Leu Leu Trp Val Ser Gly Thr Cys Gly Asp Ile 1 5 10 15 Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg 20 25 30 Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Phe Val Gly Ser Ser Ile His 35 40 45 Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr 50 55 60 Ala Ser Glu Ser Met Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly 65 70 75 80 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Thr Val Glu Ser Glu Asp 85 90 95 Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Trp Pro Phe Thr Phe 100 105 110 Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Val Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 115 120 125 Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala 130 135 140 Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 145 150 155 160 Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser 165 170 175 Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr 180 185 190 Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys 195 200 205 Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 210 215 220 Arg Gly Glu Cys 225 <210> 36 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Immunoglobulin Light chain (Lambda) <400> 36 Leu Phe Leu Gly Val Leu Ala Tyr Cys Thr Gly Ser Val Ala Ser Tyr 1 5 10 15 Glu Leu Thr Gln Pro Pro Leu Val Ser Val Ser Pro Gly Gln Thr Ala 20 25 30 Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Asn Tyr Ala Cys Trp 35 40 45 Tyr Gln Leu Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr Gln Asp 50 55 60 Asn Arg Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Ile Ser Gly Ser Asn Ser 65 70 75 80 Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu 85 90 95 Ala Glu Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Ser Trp Val Phe 100 105 110 Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro 115 120 125 Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys 130 135 140 Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr 145 150 155 160 Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr 165 170 175 Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr 180 185 190 Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys 195 200 205 Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr 210 215 220 Glu Cys 225 <210> 37 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1 domain of mouse IgG1 <400> 37 Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala 1 5 10 15 Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu 50 55 60 Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Pro Arg Pro Ser Glu Thr Val 65 70 75 80 Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys 85 90 95 Ile <210> 38 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1 domain of mouse IgG2ab <400> 38 Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly 1 5 10 15 Gly Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Leu 50 55 60 Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Asn Thr Trp Pro Ser Gln Thr Ile 65 70 75 80 Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys 85 90 95 Ile <210> 39 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1 domain of mouse IgG2aa <400> 39 Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu 50 55 60 Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys 85 90 95 Ile <210> 40 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1 domain of mouse IgG2b <400> 40 Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Ser Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser 35 40 45 Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Met 50 55 60 Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val 65 70 75 80 Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Thr Val Asp Lys Lys 85 90 95 Leu <210> 41 <211> 96 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1 domain of mouse IgG3 <400> 41 Thr Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Val Pro Gly Cys Ser Asp 1 5 10 15 Thr Ser Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe 20 25 30 Pro Glu Pro Val Thr Val Lys Trp Asn Tyr Gly Ala Leu Ser Ser Gly 35 40 45 Val Arg Thr Val Ser Ser Val Leu Gln Ser Gly Phe Tyr Ser Leu Ser 50 55 60 Ser Leu Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Ile 65 70 75 80 Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Lys Thr Glu Leu Ile Lys Arg Ile 85 90 95 <210> 42 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1 domain of rat IgG1 <400> 42 Ala Glu Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Thr Ala 1 5 10 15 Leu Lys Ser Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Ser Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Leu 50 55 60 Thr Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Ser Ser Gln Ala Val 65 70 75 80 Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys 85 90 95 Ile <210> 43 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1 domain of rat IgG2a <400> 43 Ala Glu Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Thr Ala 1 5 10 15 Leu Lys Ser Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Ser Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Leu 50 55 60 Thr Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val 65 70 75 80 Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys 85 90 95 Ile <210> 44 <211> 95 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1 domain of rat IgG2b <400> 44 Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly 1 5 10 15 Asp Thr Thr Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Ser Ser 35 40 45 Asp Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Leu 50 55 60 Thr Ser Ser Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys 65 70 75 80 Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 85 90 95 <210> 45 <211> 97 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH1 domain of rat IgG2c <400> 45 Ala Thr Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Val Pro Gly Cys Ser 1 5 10 15 Gly Thr Ser Gly Ser Leu Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Lys Trp Asn Ser Gly Ala Leu Ser Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Leu 50 55 60 Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Ser Ser Gln Thr Val 65 70 75 80 Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Thr Lys Ser Asn Leu Ile Lys Arg 85 90 95 Ile <210> 46 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH3 domain of mouse IgG1 <400> 46 Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu 1 5 10 15 Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe 20 25 30 Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala 35 40 45 Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr 50 55 60 Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His 85 90 95 Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 47 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH3 domain of mouse IgG2ab <400> 47 Gly Pro Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Ala Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Lys Glu Phe Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Gly Phe 20 25 30 Leu Pro Ala Glu Ile Ala Val Asp Trp Thr Ser Asn Gly Arg Thr Glu 35 40 45 Gln Asn Tyr Lys Asn Thr Ala Thr Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr 50 55 60 Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Gln Lys Ser Thr Trp Glu Arg Gly 65 70 75 80 Ser Leu Phe Ala Cys Ser Val Val His Glu Val Leu His Asn His Leu 85 90 95 Thr Thr Lys Thr Ile Ser Arg Ser Leu Gly Lys 100 105 <210> 48 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH3 domain of mouse IgG2aa <400> 48 Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe 20 25 30 Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu 35 40 45 Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr 50 55 60 Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg 65 70 75 80 Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His 85 90 95 Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys 100 105 <210> 49 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH3 domain of mouse IgG2b <400> 49 Gly Leu Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Pro Ala Glu 1 5 10 15 Gln Leu Ser Arg Lys Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Val Gly Phe 20 25 30 Asn Pro Gly Asp Ile Ser Val Glu Trp Thr Ser Asn Gly His Thr Glu 35 40 45 Glu Asn Tyr Lys Asp Thr Ala Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr 50 55 60 Phe Ile Tyr Ser Lys Leu Asn Met Lys Thr Ser Lys Trp Glu Lys Thr 65 70 75 80 Asp Ser Phe Ser Cys Asn Val Arg His Glu Gly Leu Lys Asn Tyr Tyr 85 90 95 Leu Lys Lys Thr Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 50 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH3 domain of mouse IgG3 <400> 50 Gly Arg Ala Gln Thr Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Arg Glu 1 5 10 15 Gln Met Ser Lys Lys Lys Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Thr Asn Phe 20 25 30 Phe Ser Glu Ala Ile Ser Val Glu Trp Glu Arg Asn Gly Glu Leu Glu 35 40 45 Gln Asp Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Ile Leu Asp Ser Asp Gly Thr Tyr 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Thr Asp Ser Trp Leu Gln Gly 65 70 75 80 Glu Ile Phe Thr Cys Ser Val Val His Glu Ala Leu His Asn His His 85 90 95 Thr Gln Lys Asn Leu Ser Arg Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 51 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH3 domain of rat IgG1 <400> 51 Gly Arg Thr Gln Val Pro His Val Tyr Thr Met Ser Pro Thr Lys Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Gln Asn Glu Val Ser Ile Thr Cys Met Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Pro Asp Ile Tyr Val Glu Trp Gln Met Asn Gly Gln Pro Gln 35 40 45 Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Thr Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn Val Lys Lys Glu Lys Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His 85 90 95 Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 52 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH3 domain of rat IgG2a <400> 52 Gly Thr Pro Arg Gly Pro Gln Val Tyr Thr Met Ala Pro Pro Lys Glu 1 5 10 15 Glu Met Thr Gln Ser Gln Val Ser Ile Thr Cys Met Val Lys Gly Phe 20 25 30 Tyr Pro Pro Asp Ile Tyr Thr Glu Trp Lys Met Asn Gly Gln Pro Gln 35 40 45 Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Thr Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn Val Lys Lys Glu Thr Trp Gln Gln Gly 65 70 75 80 Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His 85 90 95 Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 100 105 <210> 53 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH3 domain of rat IgG2b <400> 53 Gly Leu Val Arg Lys Pro Gln Val Tyr Val Met Gly Pro Pro Thr Glu 1 5 10 15 Gln Leu Thr Glu Gln Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Thr Ser Gly Phe 20 25 30 Leu Pro Asn Asp Ile Gly Val Glu Trp Thr Ser Asn Gly His Ile Glu 35 40 45 Lys Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Met Asp Ser Asp Gly Ser Phe 50 55 60 Phe Met Tyr Ser Lys Leu Asn Val Glu Arg Ser Arg Trp Asp Ser Arg 65 70 75 80 Ala Pro Phe Val Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His 85 90 95 Val Glu Lys Ser Ile Ser Arg Pro Pro Gly Lys 100 105 <210> 54 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CH3 domain of rat IgG2c <400> 54 Gly Lys Ala Arg Thr Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Arg Glu 1 5 10 15 Gln Met Ser Lys Asn Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Val Thr Ser Phe 20 25 30 Tyr Pro Ala Ser Ile Ser Val Glu Trp Glu Arg Asn Gly Glu Leu Glu 35 40 45 Gln Asp Tyr Lys Asn Thr Leu Pro Val Leu Asp Ser Asp Glu Ser Tyr 50 55 60 Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Thr Asp Ser Trp Met Arg Gly 65 70 75 80 Asp Ile Tyr Thr Cys Ser Val Val His Glu Ala Leu His Asn His His 85 90 95 Thr Gln Lys Asn Leu Ser Arg Ser Pro Gly Lys 100 105

Claims (9)

  1. 제1 에피토프를 인식하는 항체의 중쇄 유래의 제1 CH1 도메인 및 경쇄 유래의 제1 CL 도메인, 및 제2 에피토프를 인식하는 항체의 중쇄 유래의 제2 CH1 도메인 및 경쇄 유래의 제2 CL 도메인을 포함하고,
    다음 중 선택된 하나 이상의 아미노산 쌍 중의 각각의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산 중 어느 하나의 아미노산은 라이신 및 아르기닌 중에서 선택된 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되고, 다른 하나의 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산 중에서 선택된 음전하를 갖는 아미노산으로 치환된 변이 CH1 도메인 및 변이 CL 도메인을 포함하는 것인, 이중 특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 CH1 도메인 및 카파 타입의 CL 도메인을 기준으로 (Eu 넘버링),
    (1) CH1 도메인의 145번째 위치의 류신과 CL 도메인의 131번째 위치의 세린 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산;
    (2) CH1 도메인의 145번째 위치의 류신과 CL 도메인의 133번째 위치의 발린 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산;
    (3) CH1 도메인의 183번째 위치의 세린과 CL 도메인의 133번째 위치의 발린 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산;
    (4) CH1 도메인의 147번째 위치의 라이신과 CL 도메인의 180번째 위치의 트레오닌 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산;
    (5) CH1 도메인의 185번째 위치의 발린과 CL 도메인의 135번째 위치의 류신 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산;
    (6) CH1 도메인의 170번째 위치의 페닐알라닌과 CL 도메인의 135번째 위치의 류신 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산; 및
    (7) CH1 도메인의 171번째 위치의 프롤린과 CL 도메인의 162번째 위치의 세린 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제1 CH1 도메인과 제2 CH1 도메인은 서로 다른 전하를 갖는 아미노산으로 치환되고,
    상기 제1 CL 도메인은 상기 제1 CH1 도메인과 상이한 전하를 갖는 아미노산으로 치환되며,
    상기 제2 CL 도메인은 상기 제2 CH1 도메인과 상이한 전하를 갖는 아미노산으로 치환된 것인,
    이중 특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서,
    다음의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산 중 어느 하나의 아미노산은 라이신 및 아르기닌 중에서 선택된 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되고, 다른 하나의 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산 중에서 선택된 음전하를 갖는 아미노산으로 치환된 변이 CH1 도메인 및 변이 CL 도메인을 포함하는 것인, 이중 특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 CH1 도메인 및 카파 타입의 CL 도메인을 기준으로 (Eu 넘버링),
    (1) CH1 도메인의 145번째 위치의 류신과 CL 도메인의 131번째 위치의 세린 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산;
    (2) CH1 도메인의 145번째 위치의 류신과 CL 도메인의 133번째 위치의 발린 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산;
    (3) CH1 도메인의 183번째 위치의 세린과 CL 도메인의 133번째 위치의 발린 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산;
    (4) CH1 도메인의 147번째 위치의 라이신과 CL 도메인의 180번째 위치의 트레오닌 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산;
    (5) CH1 도메인의 185번째 위치의 발린과 CL 도메인의 135번째 위치의 류신 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산;
    (6) CH1 도메인의 170번째 위치의 페닐알라닌과 CL 도메인의 135번째 위치의 류신 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산; 또는
    (7) CH1 도메인의 171번째 위치의 프롤린과 CL 도메인의 162번째 위치의 세린 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산.
  4. 제1항에 있어서,
    다음의 아미노산 쌍들의 각각의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산 중 어느 하나의 아미노산은 라이신 및 아르기닌 중에서 선택된 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되고, 다른 하나의 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산 중에서 선택된 음전하를 갖는 아미노산으로 치환된 변이 CH1 도메인 및 변이 CL 도메인을 포함하는, 이중 특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
    IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 CH1 도메인 및 카파 타입의 CL 도메인을 기준으로 (Eu 넘버링),
    CH1 도메인의 145번째 위치의 류신과 CL 도메인의 131번째 위치의 세린 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산, 및 CH1 도메인의 145번째 위치의 류신과 CL 도메인의 133번째 위치의 발린 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산;
    CH1 도메인의 145번째 위치의 류신과 CL 도메인의 131번째 위치의 세린 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산, 및 CH1 도메인의 183번째 위치의 세린과 CL 도메인의 133번째 위치의 발린 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산;
    CH1 도메인의 147번째 위치의 라이신과 CL 도메인의 180번째 위치의 트레오닌 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산, 및 CH1 도메인의 185번째 위치의 발린과 CL 도메인의 135번째 위치의 류신 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산; 또는
    CH1 도메인의 170번째 위치의 페닐알라닌과 CL 도메인의 135번째 위치의 류신 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산, 및 CH1 도메인의 171번째 위치의 프롤린과 CL 도메인의 162번째 위치의 세린 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 에피토프를 인식하는 항체는 서열번호 27의 중쇄가변영역 및 서열번호 31의 경쇄가변영역을 포함하는 항-인플루엔자 B 항체이고,
    상기 제2 에피토프를 인식하는 항체는 서열번호 29의 중쇄가변영역 및 서열번호 31의 경쇄가변영역을 포함하는 항-인플루엔자 A 항체인, 이중 특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1 에피토프를 인식하는 항체의 중쇄 유래의 제1 CH1 도메인 및 경쇄 유래의 제1 CL 도메인, 및 제2 에피토프를 인식하는 항체의 중쇄 유래의 제2 CH1 도메인 및 경쇄 유래의 제2 CL 도메인을 포함하는 이중 특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법으로,
    다음 중 선택된 하나 이상의 아미노산 쌍 중의 각각의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산 중 어느 하나의 아미노산을 라이신 및 아르기닌 중에서 선택된 양전하를 갖는 아미노산으로, 다른 하나의 아미노산을 아스파르트산 및 글루탐산 중에서 선택된 음전하를 갖는 아미노산으로 치환하는 CH1 도메인 및 CL 도메인 변이 단계를 포함하는, 이중 특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법:
    IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 CH1 도메인 및 카파 타입의 CL 도메인을 기준으로 (Eu 넘버링),
    (1) CH1 도메인의 145번째 위치의 류신과 CL 도메인의 131번째 위치의 세린 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산;
    (2) CH1 도메인의 145번째 위치의 류신과 CL 도메인의 133번째 위치의 발린 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산;
    (3) CH1 도메인의 183번째 위치의 세린과 CL 도메인의 133번째 위치의 발린 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산;
    (4) CH1 도메인의 147번째 위치의 라이신과 CL 도메인의 180번째 위치의 트레오닌 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산;
    (5) CH1 도메인의 185번째 위치의 발린과 CL 도메인의 135번째 위치의 류신 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산;
    (6) CH1 도메인의 170번째 위치의 페닐알라닌과 CL 도메인의 135번째 위치의 류신 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산; 및
    (7) CH1 도메인의 171번째 위치의 프롤린과 CL 도메인의 162번째 위치의 세린 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산.
  7. 제6항에 있어서,
    제1 CH1 도메인과 제2 CH1 도메인은 서로 다른 전하를 갖는 아미노산으로 치환하고,
    제1 CL 도메인은 상기 제1 CH1 도메인과 상이한 전하를 갖는 아미노산으로 치환하며,
    제2 CL 도메인은 상기 제2 CH1 도메인과 상이한 전하를 갖는 아미노산으로 치환하는 것을 특징으로 하는,
    이중 특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 CH1 도메인 및 CL 도메인 변이 단계는,
    다음의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산 중 어느 하나의 아미노산은 라이신 및 아르기닌 중에서 선택된 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되고, 다른 하나의 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산 중에서 선택된 음전하를 갖는 아미노산으로 치환하는 단계를 포함하는 것인, 이중 특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법:
    IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 CH1 도메인 및 카파 타입의 CL 도메인을 기준으로 (Eu 넘버링),
    (1) CH1 도메인의 145번째 위치의 류신과 CL 도메인의 131번째 위치의 세린 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산;
    (2) CH1 도메인의 145번째 위치의 류신과 CL 도메인의 133번째 위치의 발린 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산;
    (3) CH1 도메인의 183번째 위치의 세린과 CL 도메인의 133번째 위치의 발린 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산;
    (4) CH1 도메인의 147번째 위치의 라이신과 CL 도메인의 180번째 위치의 트레오닌 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산;
    (5) CH1 도메인의 185번째 위치의 발린과 CL 도메인의 135번째 위치의 류신 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산;
    (6) CH1 도메인의 170번째 위치의 페닐알라닌과 CL 도메인의 135번째 위치의 류신 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산; 또는
    (7) CH1 도메인의 171번째 위치의 프롤린과 CL 도메인의 162번째 위치의 세린 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산.
  9. 제6항에 있어서, 상기 CH1 도메인 및 CL 도메인 변이 단계는,
    다음의 아미노산 쌍들의 각각의 아미노산 쌍을 이루는 두 개의 아미노산 중 어느 하나의 아미노산은 라이신 및 아르기닌 중에서 선택된 양전하를 갖는 아미노산으로 치환되고, 다른 하나의 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산 중에서 선택된 음전하를 갖는 아미노산으로 치환하는 단계를 포함하는 것인, 이중 특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법:
    IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 CH1 도메인 및 카파 타입의 CL 도메인을 기준으로 (Eu 넘버링),
    CH1 도메인의 145번째 위치의 류신과 CL 도메인의 131번째 위치의 세린 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산, 및 CH1 도메인의 145번째 위치의 류신과 CL 도메인의 133번째 위치의 발린 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산;
    CH1 도메인의 145번째 위치의 류신과 CL 도메인의 131번째 위치의 세린 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산, 및 CH1 도메인의 183번째 위치의 세린과 CL 도메인의 133번째 위치의 발린 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산;
    CH1 도메인의 147번째 위치의 라이신과 CL 도메인의 180번째 위치의 트레오닌 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산, 및 CH1 도메인의 185번째 위치의 발린과 CL 도메인의 135번째 위치의 류신 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산; 또는
    CH1 도메인의 170번째 위치의 페닐알라닌과 CL 도메인의 135번째 위치의 류신 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산, 및 CH1 도메인의 171번째 위치의 프롤린과 CL 도메인의 162번째 위치의 세린 또는 이에 대응되는 위치의 람다 타입의 CL 도메인의 아미노산.
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