KR20200049594A - 조작된 면역 세포 - Google Patents

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KR20200049594A KR1020190133306A KR20190133306A KR20200049594A KR 20200049594 A KR20200049594 A KR 20200049594A KR 1020190133306 A KR1020190133306 A KR 1020190133306A KR 20190133306 A KR20190133306 A KR 20190133306A KR 20200049594 A KR20200049594 A KR 20200049594A
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Abstract

본 발명은 T세포 수용체(TCR)가 불활성화된 조작된 면역 세포에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 면역 세포를 조작하기 위하여 TCR 하위 유닛과 상호작용하는 트래퍼 분자 및/또는 상기 트래퍼 분자를 포함하는 면역 세포, 바람직하게는 TCR 하위 유닛 중 적어도 하나의 세포 표면의 양이 감소되는 면역 세포에 관한 것이다.

Description

조작된 면역 세포 {Manipulated immune cell}
본 발명은 T세포 수용체(TCR)가 불활성화된 조작된 면역 세포에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 면역 세포를 조작하기 위하여 TCR 하위 유닛과 상호작용하는 트래퍼 분자 및/또는 상기 트래퍼 분자를 포함하는 면역 세포, 바람직하게는 TCR 하위 유닛 중 적어도 하나의 세포 표면의 양이 감소되는 면역 세포에 관한 것이다.
T cell adoptive 면역 요법은 암 치료를 위한 유망한 접근법이다. 이 접근법은 특정 종양 관련 항원에 대한 특이성을 향상시키기 위해 분리된 인간 T 세포를 조작하여 이용한다. 조작된 T 세포는 자연적으로 존재하지 않는 외래 핵산 또는 폴리펩타이드를 포함하거나 키메라 항원 수용체의 발현을 포함할 수 있다. 키메라 항원 수용체는 단일 클론항체의 가변 도메인으로부터 유도되어 암 세포의 항원을 특이적으로 인식할 수 있다. 키메라 항원 수용체가 암세포 항원을 직접 인식하므로, 주 조직 복합체에 비제한적인 방법으로 종양 면역 반응을 유도한다. 현재까지 T cell adoptive 면역 요법은 B 세포 악성 종양, 교모세포종, 신경아 교종, 난소암, 흑생종 및 췌장암 등 다수의 암의 임상 치료법으로 활용되어왔다.
한편, 암 치료법으로서 잠재적인 유용성에도 불구하고, CAR-T세포를 이용한 adoptive 면역 요법은 부분적으로 세포 표면의 내인성 T 세포 수용체의 발현에 의해 주로 자가 세포 치료로 제한되어왔다. 내인성 T 세포 수용체를 발현하는 타가 유래 CAR-T 세포는 동종 이식 환자에게 투여 한 후 주요 조직 적합성 항원 및 부 조직 적합성 항원을 인식함으로써 동종 이식편대 숙주 질환(GVHD)을 일으킬 수 있다. 그 결과, 여태까지 임상시험은 주로 환자로부터 T 세포를 분리하여, 키메라 항원 수용체가 발현되도록 분리된 T세포를 변형시킨 다음 다시 동일환자에게 주입하는 자가 조직 CAR-T 세포 사용에 초점을 맞추었다. 그러나 이 접근법은 환자가 암 진단을 받은 후에야 환자의 T세포를 조작하여 CAR-T를 생산해야하므로, 시간과 비용 모두에 의해 제약을 받는다.
따라서, 제3 공여자의 T세포를 사용하더라도 GVHD와 같은 질병을 유발하지 않는 non- alloreactive한 T 세포 개발이 필요한 실정이다. 이에 본 발명은 내인성 T 세포 수용체를 세포 내 가두어 세포 표면으로 노출되는 것을 방지함으로써, 내인성 T 세포 수용체가 불활성화 된 allogeneic CAR-T 세포를 제공하고자 한다. 이러한 non-alloreactive한 T세포는 암 환자가 진단 받기 전부터 미리 암 특이적 T세포를 생산할 수 있고 즉시, 필요로하는 암환자에게 제공될 수 있기 때문에 향후 암 치료에 더욱 유용할 것이다.
TCR 복합체를 포함하는 면역 활성화 수용체가 세포 표면에 도달하지 못하게 하는 방법을 개발할 수 있다면, 면역 활성화 수용체가 불활성화됨으로써 자가면역 측면에서 독성이 크게 개선된 면역 세포를 제조할 수 있다.
본 출원은 면역 활성화 수용체의 하위 유닛 중 적어도 하나에 대한 결합능을 갖는 gp41 유래 결합 도메인; 및 소포체 잔류 도메인, 골지체 잔류 도메인 및 가수분해 복합체(proteasome) 잔류 도메인 중 어느 하나 이상을 포함하는 트래퍼 펩타이드를 제공한다.
일 구체예에서, 상기 gp41 유래 결합 도메인은 FP(fusion protein 영역), NHR, Loop, CHR 및 TMD, 및 이들의 일부서열 중 어느 하나인 것을 특징으로 트래퍼 펩타이드를 제공한다.
일 구체예에서, 상기 gp41 유래 결합 도메인은 서열번호 27, 서열번호 34 및 서열번호 44 중 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 트래퍼 펩타이드를 제공한다.
일 구체예에서, 상기 소포체 및 골지체 잔류 도메인은 KDEL, KKX'X, KX'D/E, YQRL' 및 KX' 중에 어느 하나 이상을포함하는 것으로, 이때, 상기 X'는 임의의 아미노산인 것을 특징으로 하는 트래퍼 펩타이드를 제공한다. 더 나아가, 상기 KKX'X'를 포함하는 소포체 및 골지체 잔류 도메인은 KKMP 또는 LYKYKSRRSFIEEKKMP인 것을 특징으로 하는 트래퍼 펩타이드를 제공한다.
일 구체예에서, 상기 트래퍼 펩타이드는 연결 도메인, CD8α 막관통 도메인 및 CD8α신호서열 중 어느 하나 이상을 더 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 트래퍼 펩타이드를 제공한다. 일 예시에서 상기 연결 도메인은 (GGGGS)n이며, 이때 n은 임의의 정수인 것을 특징으로 하는 트래퍼 펩타이드를 제공한다. 다른 예시에서, 상기 CD8α 막관통 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 118의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 트래퍼 펩타이드를 제공한다. 또 다른 예시에서, 상기 CD8α신호서열은 서열번호 148의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 트래퍼 펩타이드를 제공한다.
일 구체예에서, 상기 트래퍼 펩타이드는 TCR-alpha, TCR-beta, CD3-gamma, CD3-delta, CD3-epsilon, CD3-zeta, CD4, CD8-beta 및 CD8-alpha 중 어느 하나 이상에 대한 결합능을 갖는 것을 특징으로 하는 트래퍼 펩타이드를 제공한다.
일 구체예에서,
SNKSLEQIWNHTTWMEWDGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL;
SNKSLEQIWNHTTWMEWDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEEKKMP;
KKVIGFRILLLKVAGFNLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL;
KKVIGFRILLLKVAGFNLIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEEKKMP;
LFIMIVGGLVGLRIVFAVLSIGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL;
LFIMIVGGLVGLRIVFAVLSIIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEEKKMP;
AVGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL;
AVGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQLIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEEKKMP;
ALPVTALLLPLALLLHAARPSNKSLEQIWNHTTWMEWDGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL;
ALPVTALLLPLALLLHAARPSNKSLEQIWNHTTWMEWDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEEKKMP 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 트래퍼 펩타이드를 제공한다.
또한 본 출원은 상기 트래퍼 펩타이드를 포함하고, 면역 활성화 수용체의 발현 형질이 야생 상태 세포와 상이한 것을 특징으로 하는 조작된 면역 세포를 제공한다.
일 구체예에서, 상기 면역 활성화 수용체의 발현 형질이 야생 상태 세포와 상이함은 상기 면역 활성화 수용체의 하위 유닛 중 적어도 하나의 세포 표면의 양이 감소함임을 특징으로 하는 조작된 면역 세포를 제공한다. 일 예시에서, 상기 면역 활성화 수용체의 발현 형질이 야생 상태 세포와 상이함은 상기 면역 활성화 수용체가 세포 내에 갇힘인 것을 특징으로 하는 조작된 면역 세포를 제공한다.
일 구체예에서, 상기 조작된 면역 세포는 T세포, NK세포 및 NKT세포로 구성된 군에서 선택된 1이상인 것을 특징으로 하는 조작된 면역 세포를 제공한다.
본 출원은 또한 상기 트래퍼 펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.
일 구체예에서, 상기 벡터는 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터를 제공한다. 일 예시에서, 상기 바이러스 벡터는 아데노 바이러스, 아데노-연관 바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스 바이러스, 헤르페스 바이러스, 레트로 바이러스 및 단순포진 바이러스로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상으로부터 유래된 벡터를 제공한다.
본 출원은 또한 상기 트래퍼 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 핵산을 면역 세포에 도입시킴을 포함하는 조작된 면역 세포의 제조 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 야생 상태 세포와 상이한 형질이 유도된 세포를 단리함을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 면역 세포의 제조 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 상기 도입시키는 단계는 전기천공법 (electroporation), 리포좀, 플라스미드, 바이러스 벡터, 나노파티클(nanoparticles) 및 PTD (Protein translocation domain)융합 단백질 방법 중 선택되는 1이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 면역 세포 생산 방법을 제공한다. 나아가, 상기 바이러스 벡터는 아데노 바이러스, 아데노-연관 바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스 바이러스, 헤르페스 바이러스, 레트로 바이러스 및 단순포진 바이러스로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상으로부터 유래된 것을 특징으로하는 면역 세포 생산 방법을 제공한다.
본 출원은 또한 상기 조작된 면역 세포를 포함하는 조성물을 대상에 주입하는 단계를 포함하는 암 치료 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 상기 조성물을 치료 대상에 투여하는 단계는 전신 투여인 것을 특징으로 하는 암 치료 방법을 제공한다. 나아가, 상기 전신 투여는 정맥 내 투여인 것을 특징으로 하는 암 치료 방법을 제공한다.
트래퍼 분자가 발현된 면역 세포에 있어, TCR 하위 유닛의 세포 표면의 양이 유의미하게 감소하는 것이 확인되었으므로 자가 면역 질환과 같은 독성 문제를 크게 개선할 수 있을 것이다.
도 1은 실험에 사용된 트래퍼 펩타이드들의 도메인 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 전기 천공법을 이용한 Jurkat 세포의 형질 전환 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 렌티바이러스를 이용한 Jurkat 세포의 형질 전환 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 유세포분석으로 확인된 렌티바이러스 용량에 따른 세포 표면의 TCR의 양의 분석 결과이다.
도 5는 유세포분석으로 확인된 렌티바이러스 용량에 따른 TCR negative 결과이다.
도 6은 Jurkat 세포 내 트래퍼 펩타이드의 발현과 세포 표면의 TCR 하위 유닛의 양의 연관 관계를 실험함에 있어 사용된 벡터의 모식도이다.
도 7은 Jurkat 세포 내 트래퍼 펩타이드의 발현과 세포 표면의 TCR 하위 유닛의 양의 연관 관계의 결과이다.
도 8은 Jurkat 세포 내 트래퍼 펩타이드의 양과 Jurkat 세포 표면의 TCR 하위 유닛의 양의 상관 관계를 실험함에 있어 사용된 벡터의 모식도이다.
도 9는 Jurkat 세포 내 트래퍼 펩타이드의 양과 Jurkat 세포 표면의 TCR 하위 유닛의 양의 상관 관계의 결과이다.
도 10은 렌티바이러스를 이용한 T 세포의 형질 전환에 사용된 벡터의 모식도이다.
도 11은 렌티바이러스를 이용한 T 세포의 형질 전환 결과이다.
도 12는 T 세포 내 트래퍼 펩타이드의 양과 T 세포 표면의 TCR 하위 유닛의 양의 상관 관계를 실험함에 있어 사용된 벡터의 모식도이다.
도 13은 T 세포 내 트래퍼 펩타이드의 양과 T 세포 표면의 TCR 하위 유닛의 양의 상관 관계의 결과이다.
1. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기재된 것과 유사 또는 동일한 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 이하에 기재된다. 본 명세서에 언급된 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시적이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 명세서에서 사용하는 용어 '친화성 (affinity)'은 효소-기질, 항원-항체, 호르몬-수용체, 단백질 복합체를 구성하는 구성요소 간의 관계 등과 같이 특정한 두 물질이 서로 특이적이거나 긴밀하게 결합하는 성질을 말한다.
본 명세서에서 사용하는 용어로서 단백질/펩타이드와 단백질/펩타이드 간의 '상호작용 (interaction)'은 두 분자 간의 정전기적 힘 (electrostatic force) 및/또는 소수성 상호작용 (hydrophobic effect)에 의하여 발생하는 생물화학적 및/또는 물리적 현상을 말한다. 또한 본 명세서에서 사용되는 용어 '결합'은 다른 언급이 없는 한 '상호작용'과 동등한 의미로 해석되어야 한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 '잔류 (retention)', '잔류하다 (retain)', 및 '잔류하는 (retaining)'은 임의의 생체 분자가 생물학적 공간, 예컨데 세포 내에 위치할 때 생물학적 공간 내의 특정 위치, 예컨데 소기관에 존재할 확률이 높은 경향성이 있는 것을 말한다.
본 명세서에서 사용하는 용어 '펩타이드' 또는 '펩타이드 서열' 및 이와 동등한 표현들은 단순히 아미노산으로 구성된 아미노산 서열 만이 아니라 이의 유도체 및 변형체를 포괄하기 위한 용어로서, 당단백질, 펩타이드 유도체, 및 펩타이드와 타물질의 결합체 (conjugate)를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 나아가, 본 용어는 지정된 아미노산 서열과 정확히 일치하는 서열 만을 적시하기 위한 것이 아니라, 지정된 아미노산 서열과 50 내지 100%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포괄하기 위한 용어이다. 또한, 본 용어는 이를 암호화하는 염기 서열을 포괄하는 개념으로 사용되었다.
본 명세서에서 사용하는 용어 '면역 활성화 수용체(immune activating receptor)'는 면역세포의 면역 반응 형성 및 수행이 가능하도록 면역 세포를 활성화시키는 내인성 수용체를 지칭한다. 면역 활성화 수용체는 면역 세포에 자연적으로 존재하는 야생형 또는 자연 발생적으로 돌연변이가 일어난 수용체를 모두 포함한다. 즉, 세포에서 특정 단백질이 다른 분자와 결합하여 면역 반응을 활성화시키는 시그널링을 발생시킬 수 있는 경우에, 그러한 단백질을 모두 포함한다.
본 출원에서 펩타이드의 아미노산 서열이 설명되고 별다른 언급이 없는 경우, 아미노산 잔기에 밑줄이 그어진 것은 해당 아미노산 잔기가 D형 아미노산인 것을 의미하고 별다른 표시가 없는 잔기는 L형 아미노산을 의미한다. 예를 들어 아미노산 서열 GALFLGFLG에 있어, 밑줄이 그어진 A, 알라닌 잔기는 D형 아미노산에 해당한다.
2. TCR 복합체의 구조 및 구성요소
본 부분은 명세서 전반으로 사용되는 용어 'TCR 복합체 (T-Cell Receptor complex)'의 이해를 돕기 위한 부분으로써 TCR 복합체의 구조 및 구성요소를 설명하는 것을 목적으로 한다. 본 부분에서 설명하는 TCR 복합체의 구조 및 구성요소는 야생 상태 TCR 복합체를 기준으로 한 것이며, 현재까지 기술적으로 알려진 내용에 의한 예시적 설명일 뿐이지 본 발명의 대상이 되는 TCR 복합체의 구조 및 구성요소를 이에 한정하기 위한 것이 아니다.
TCR 복합체는 T 세포의 표면에 발현되어 있는 수용체로서, 면역 반응 시 타세포 표면의 MHC를 인식하는 기능을 하는 것으로 알려져 있다. TCR 복합체는 구성요소로 MHC를 직접 인식하는 TCR, 신호 전달에 관여하는 CD3를 포함하고 있다. 이때, TCR은 헤테로다이머의 형태로 존재하며 1 개의 TCR-α 체인 및 1 개의 TCR-β 체인으로 구성될 수 있고 또는 1 개의 TCR-γ 체인 및 1 개의 TCR-δ 체인으로 구성될 수 있다. 이때 TCR은 TCR-α 체인/TCR-β 체인의 다이머 또는 TCR-γ 체인/TCR-δ 체인의 다이머 형태로 존재할 수 있으며, 각각의 다이머를 'TCR 헤테로다이머'로 통칭한다. 또한, CD3는 1 개의 CD3γ 체인, 1 개의 CD3δ 체인, 2 개의 CD3ε 체인 및 2 개의 zeta 체인으로 구성되어 있다. 구체적으로 CD3는 CD3γ 체인/CD3ε 체인의 다이머, CD3δ 체인/CD3ε 체인의 다이머 및 zeta 체인의 다이머의 형태로 존재한다. 이때 각각의 다이머를 'CD3 헤테로다이머'로 통칭한다. 이중 zeta 체인의 다이머는 'zeta 체인 다이머'로도 지칭한다. 본 명세서에서는 상기 TCR 복합체를 구성하는 개별적인 구성요소들을 'TCR 하위유닛'으로 통칭한다. 예시적인 각각의 TCR 하위 유닛의 단백질 서열 정보는 다음의 출처와 같으나, 이는 예시일 뿐이며 본 출원의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다 (TCR-α 체인: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6955; TCR-β 체인: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6957; TCR-γ 체인: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6965; TCR-δ 체인: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6964; CD3γ 체인: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/917; CD3δ 체인: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/915; CD3ε 체인: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/916; zeta 체인: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/919). 또한 필요한 경우, TCR 하위유닛 중 리간드를 인식하는 역할을 하는 것을 '리간드 인식 유닛'으로 명칭하며, 면역 시그널 발생에 관여하는 역할을 하는 것을 '시그널 활성화 유닛'으로 명칭한다. 리간드 인식 유닛은 TCR 및 이를 구성하는 체인들을 포함하고, 시그널 활성화 유닛은 CD3 및 이를 구성하는 체인들을 포함한다.
TCR 체인은 CD3와 상호작용하는 모티프를 포함하고 있다. TCR-α 체인의 경우, 9 개의 아미노산 잔기로 구성된 모티프에서 CD3와 안정적으로 상호작용하는 것으로 알려져 있다 [1]. 이러한 TCR 체인과 CD3 간의 상호작용이 일어나는 모티프를 본 명세서에서는 'TCR 체인-CD3 상호작용 모티프'로 명칭한다. 이외에도 임의의 제 1 TCR 하위유닛 상에 임의의 제 2 TCR 하위유닛과 상호작용하는 모티프가 있는 경우, 이러한 모티프를 '제 1 TCR 하위유닛-제 2 TCR 하위유닛 상호작용 모티프'로 통칭한다.
또한, TCR 체인은 '막통과 도메인'을 포함하고 있다. '막통과 도메인 (transmembrane domain)'은 세포막에 대한 결합성이 있는 단백질이 세포막 (transmembrane)을 통과하는 부분을 통칭하며, 더 광의적으로 표현하면 단백질의 서열 중 세포막에 걸치는 (membrane-spanning) 부분을 의미한다. TCR 체인 외의 TCR 서브유닛들 역시 막통과 도메인을 모두 포함하고 있다.
CD3 체인은 면역 시그널 발생에 중요한 역할을 하는 모티프들을 포함하고 있다. 이러한 기능을 하는 모티프를 '면역 시그널 활성화 모티프'로 통칭한다. 면역 시그널 활성화 모티프의 대표적인 예시로는 ITAM (immunoreceptor tyrosin-based activation motif)이 있다.
Zeta 체인은 면역 시그널 활성화 모티프를 포함하는 것으로 알려져 있다. 구체적으로, zeta 체인은 3 개의 ITAM을 포함하는 것으로 알려져 있다.
상기 각각의 TCR 하위 유닛은 하위 유닛들이 TCR 복합체로 조립되는 것에 관여하는 특징적인 아미노산 잔기를 포함하는 것으로 알려져있다 [2]. 이러한 TCR 복합체가 조립되는 것에 관여하는 특징적인 아미노산 잔기 및/또는 그 주변의 모티프를 'TCR 복합체 조립 관여 잔기/모티프'로 명칭한다. 구체적으로 연구된 바에 의하면, 각각의 TCR 서브유닛은 TCR 복합체 조립 관여 잔기를 포함하고 있다. 더욱 구체적으로, 각각의 TCR 하위 유닛에 있어 TCR 복합체 조립 관여 잔기는 막통과 도메인에 포함되어 있다. 더욱 구체적으로, 1 개의 TCR 헤테로다이머는 3개의 TCR 복합체 조립 관여 잔기를 포함하며, 나아가 TCR-α 체인 및 TCR-γ 체인은 2 개의 TCR 복합체 조립 관여 잔기를 포함하고, TCR-β 체인 및 TCR-δ 체인은 1 개의 TCR 복합체 조립 관여 잔기를 포함한다. 또한 CD3 헤테로다이머는 각각 2개의 TCR 복합체 조립 관여 잔기를 포함하며, 나아가 CD3γ 체인, CD3δ 체인 및 CD3ε 체인은 각각 하나의 TCR 복합체 조립 관여 잔기를 포함한다. 또한 zeta 체인은 1개의 TCR 복합체 조립 관여 잔기를 포함한다. 이때, 알려진 TCR 복합체 조립 관여 잔기는 극성 아미노산, 즉 산성 아미노산 또는 염기성 아미노산이라는 점에서 공통점을 갖는다. 즉, TCR 복합체 조립 관여 잔기는 TCR 막통과 도메인에 포함된 극성 잔기일 수 있다.
3. TCR 복합체의 형성 과정
본 부분은 명세서의 이해를 돕기 위해 TCR 복합체가 체내에서 형성되는 과정을 설명하는 것을 목적으로 한다. 본 부분에서 설명하는 과정은 정상적인 세포 내에서 야생 상태 TCR 복합체가 형성되는 과정을 기준으로 한 것이며, 현재까지 기술적으로 알려진 내용에 의한 예시적 설명일 뿐이지 본 발명의 대상이 되는 TCR 복합체의 형성 과정을 이에 한정하기 위한 것이 아니다.
TCR 복합체의 형성 과정은 TCR 하위유닛이 리보좀을 통하여 유전적으로 발현 (expressed genetically)되면서 시작된다. 발현된 TCR 하위유닛은 최초에 소포체 (Endoplasmic reticulum; ER)에 존재한다. TCR 하위유닛은 TCR 복합체로 조립되기 전 TCR 헤테로다이머, CD3 헤테로다이머, zeta 체인 다이머의 형태로 존재한다.
발현된 TCR 하위유닛은 소포체의 표면에 결합된 상태로 존재한다. 이때, 다른 TCR 서브유닛과 결합하지 않은 TCR 하위유닛은 펩타이드 분해 과정이 촉진되어 안정성이 떨어지며, 세포막으로 분비되지 못하고 소포체에 잔류하는 것으로 알려져 있다 [3]. 이는, TCR 복합체 조립 관여 잔기와 소포체 막 사이의 관계에 의한 것일 수 있다. 구체적으로 TCR 헤테로다이머의 경우, TCR 복합체 조립 관여 잔기가 극성을 띄어 소포체 막의 이중 인지질 구조 (lipid bilayer structure)와 평형을 이루지 못함으로써 TCR 헤테로다이머의 막통과 도메인이 소포체 막의 이중 인지질 구조에 안정적으로 정착되지 못하여 이러한 결과가 발생할 수 있다. 하지만 TCR 헤테로다이머가 CD3 헤테로다이머와 조립되면 TCR 복합체 조립 관여 잔기가 가려지는 (shielded) 결과를 가져오고, 극성이 낮아진 막통과 도메인이 이중 인지질 구조에 안정적으로 정착됨으로써 안정성이 높아지고 결과적으로 소포체로부터 분비되게 된다 [2, 4].
이를 다시 정리하면, 소포체에서 합성된 TCR 하위유닛은 먼저 소포체 막에서 임시적인 복합체를 형성하는 과정을 거치며, 임시적으로 복합체가 형성된 이후 소포체로부터 분비될 수 있다. 구체적으로 소포체 막에서 임시적인 복합체가 형성되는 과정은 알려져 있지 않다. TCR 헤테로다이머와 CD3 헤테로다이머는 복합체를 구성한 상태에서 소포체로부터 분비되는 것으로 연구되었다. 그러나 이것이 zeta 체인은 zeta 체인 다이머의 형태로 소포체로부터 분비된다는 것을 의미하는 것은 아니며, 임시적인 복합체가 TCR 헤테로다이머와 CD3 헤테로다이머의 복합체로만 한정되는 것도 아니다. 이때, 소포체 막에서 조립되는 상기 임시적인 복합체를 '중간 TCR 복합체 (intermediate TCR complex)'로 명칭한다. 이때 중간 TCR 복합체는 TCR 헤테로다이머 및 CD3 헤테로다이머를 포함할 수 있다. 예시적으로, 중간 TCR 복합체는 1 개의 TCR 헤테로다이머 및 1 개의 CD3 헤테로다이머로 구성된 것일 수 있다. 다른 예시에서, 중간 TCR 복합체는 1개의 TCR 헤테로다이머 및 2 개의 CD3 헤테로다이머로 구성된 것일 수 있다. 또 다른 예시에서, 중간 TCR 복합체는 1 개의 TCR 헤테로다이머, 2 개의 CD3 헤테로다이머, 및 1 개의 zeta 체인 다이머로 구성된 것일 수 있다.
소포체로부터 분비된 TCR 하위유닛 및/또는 중간 TCR 복합체는 세포막을 관통한 후 세포의 외부에 개시된다. 이때 중간에 골지체 (golgi apparatus)와 같은 소기관을 경유할 수 있다. 또한, 중간 TCR 복합체가 최종적인 TCR 복합체의 구성요소를 모두 갖추지 못한 경우에는, 중간 TCR 복합체가 최종적인 TCR 복합체로 조립되는 과정을 포함할 수 있을 것이다.
4. gp41 단백질의 구조
본 부분은 명세서의 이해를 돕기 위해 gp41 단백질의 구조를 설명하는 것을 목적으로 한다. 본 부분에서 설명하는 gp41의 구조는 HIV-1 (Human Immunodeficiency Virus-1)의 gp41을 기준으로 한 것이며, 현재까지 기술적으로 알려진 내용에 의한 예시적 설명일 뿐이지 본 발명의 대상이 되는 gp41 및 이로부터 유도된 펩타이드 서열을 이에 한정하기 위한 것이 아니다.
gp41은 레트로바이러스과에 속하는 바이러스의 표면에 발현되는 단백질 복합체 (protein complex)를 구성하는 하위유닛 중 하나이다. gp41은 일반적으로 3개의 gp41가 조립되어 있는 트라이머 (trimer)의 형태로 존재하며, 상기 트라이머는 6-나선 번들 구조 (six-helix bundle structure)를 갖는다. 상기 6-나선 번들 구조는 gp41에 포함된 알파 나선 구조를 갖는 도메인인 N36 및 C34에 의하여 형성된다 [5].
gp41의 펩타이드 서열은 크게 FP 도메인, NHR 도메인, Loop 도메인, CHR 도메인, 막통과 도메인으로 분류될 수 있다 [6] 예시적인 gp41 및 이의 도메인의 아미노산 서열은 다음과 같으나, 이는 균주 NCBI Reference Sequence: NC_001802.1에 의한 예시일 뿐이며, 본 출원의 기술적 범위가 다른 균주의 gp41 및 이의 도메인에 미치지 않음을 의미하지 않는 것은 자명하다 (gp41 전장 서열: 서열번호 1; FP 도메인: 서열번호 2; NHR 도메인: 서열번호 3; Loop 도메인: 서열번호 4; CHR 도메인: 서열번호 5; 막통과 도메인: 서열번호 6). 이중 NHR (N-heptad repeat) 도메인은 헵타드 모티프의 반복을 포함함으로써 알파 나선 구조를 갖는 도메인이며, N36 도메인 (서열번호 7)을 포함한다. 또한 CHR (C-heptad repeat) 도메인은 NHR 도메인 보다 C-말단에 위치하고 헵타드 모티프의 반복을 포함함으로써 알파 나선 구조를 갖는 도메인이며, C34 도메인 (서열번호 8)을 포함한다. 또한 Loop 도메인은 상기 NHR 도메인과 CHR 도메인 사이에 위치하여 두 개의 알파 헬릭스 구조를 연결하는 도메인이다. Loop 도메인과 CHR 도메인의 연결 부분은 면역 결핍 바이스 간에 있어 상동성이 높은 서열인 ISLAD (immunosuppressive loop-associated determinant) 모티프 (서열번호 9)를 포함하고 있다.
gp41은 레트로바이러스의 핵막과 숙주가 되는 면역 세포의 핵막 간의 융합을 유도하며, 숙주가 되는 면역 세포의 면역 기능의 억제에 관여하는 것으로 알려져 있다. gp41에 포함된 도메인 및/또는 모티프 중 다수가 TCR 하위유닛과 상호작용하는 특성이 있는 것으로 알려져 있다. 이들 도메인은 TCR 하위유닛과 상호작용함으로써 TCR 하위유닛 간의 정상적인 상호작용을 저해할 수 있고, 나아가 TCR 복합체가 정상적인 구조를 형성하는 것을 방해할 수 있다. 보다 구체적으로, gp41의 도메인 중 적어도 FP 도메인 [7], Loop 도메인 [8], CHR 도메인, 막통과 도메인 [9] 및 ISLAD 모티프 [8]는 TCR 하위유닛과의 결합 능력을 가지는 것으로 알려져 있다.
상기 면역 활성화 수용체가 세포 내 잔류하도록 면역 활성화 수용체와 결합하는 분자는 '트래퍼 분자'일 수 있다.
이하, 트래퍼 분자에 관하여 설명한다.
5. 트래퍼 분자
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 태양은 세포 내의 목적 분자와 상호작용함으로써 세포를 조작하기 위한 '트래퍼 분자'에 관한 것이다.'
"트래퍼 분자"는 면역 활성화 수용체또는 그밖의 목적 분자와 상호작용하는 분자를 지칭한다. 트래퍼 분자는 목적 분자와 상호작용하여 목적 분자를 세포 내에 가둘 수 있는 것이 바람직하다. 즉, 트래퍼 분자는 목적 분자와 상호작용하여 목적 분자가 세포 표면 밖으로 노출되는 것을 막을 수 있다면, 그러한 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질 등 다양한 형태의 분자일 수 있고, 또는 서로 상이한 도메인이 결합된 인공 재조합 폴리펩타이드일 수 있다. 트래퍼 분자가 펩타이드인 경우, 이를 '트래퍼 펩타이드'로 지칭한다.
일 실시예에서, 트래퍼 분자는 결합 도메인을 포함할 수 있다.
어떤 실시예에서, 트래퍼 분자는 잔류 도메인을 포함할 수 있다.
어떤 실시예에서, 트래퍼 분자는 연결 도메인을 포함할 수 있다.
어떤 실시예에서, 트래퍼 분자는 결합 도메인 및 잔류 도메인을 포함할 수 있다.
어떤 실시예에서, 트래퍼 분자는 결합 도메인, 잔류 도메인 및 연결 도메인을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 트래퍼 분자는 특정 입체 구조를 갖는 제 1 구조 도메인 및 제 1 구조 도메인과 구별되는 입체 구조를 갖는 제 2 구조 도메인으로 구성될 수 있다.
어떤 실시예에서, 트래퍼 분자는 특정 입체 구조를 갖는 제 1 구조 도메인, 제 1 구조 도메인과 구별되는 입체 구조를 갖는 제 2 구조 도메인, 및 제 1 구조 도메인 및 제 2 구조 도메인과 구별되는 입체 구조를 갖고 제 1 구조 도메인과 제 2 구조 도메인을 연결하는 루프 도메인을 포함할 수 있다.
상기 실시예들에서 제 1 구조 도메인은 결합 도메인 및/또는 잔류 도메인을 포함할 수 있다. 또한, 제 2 구조 도메인은 결합 도메인 및/또는 잔류 도메인을 포함할 수 있다. 또한, 루프 도메인은 연결 도메인을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 트래퍼 분자는 TCR 하위 유닛과 상호작용 (interaction)하는 성질을 가질 수 있다. 구체적으로, 트래퍼 분자는 TCR 하위 유닛과의 친화성 (affinity)을 가질 수 있다.
어떤 실시예에서, 트래퍼 분자는 TCR 하위 유닛을 암호화하는 유전 서열과 상호작용하는 성질을 가질 수 있다.
어떤 실시예에서, 트래퍼 분자는 세포 내에서의 반감기가 짧은 성질을 가질 수 있다. 구체적으로, 트래퍼 분자는 세포 내의 단백질 분해 과정에 관여하는 것으로 알려진 수용기에 대한 리간드일 수 있다.
어떤 실시예에서, 트래퍼 분자는 세포 내의 특정 소기관에서 잔류하는 성질을 가질 수 있다.
트래퍼 분자와 타겟 단백질사이에 결합은 공유결합 또는 비공유결합일 수 있다.
상기 트래퍼 분자가 핵산인 경우, DNA 및/또는 RNA일 수 있다. 이때, 핵산은 15 내지 3000개 이하의 뉴클레오타이드를 가질 수 있다.
상기 트래퍼 분자는 하나의 연속된 아미노산서열로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있다. 이때, 폴리펩타이드는 5 내지 1000개 이하의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 트래퍼 분자는 하나 이상의 기능적 도메인을 포함할 수 있다.
일 실시 태양에서, 상기 트래퍼 분자는 2 이상의 도메인이 결합된 인공 재조합 폴리펩타이드일 수 있다.
상기 트래퍼 분자는 2 이상의 서로 동일한 도메인을 가질 수 있다. 동일한 도메인이란, 동일한 기능을 가진 도메인을 말한다. 예를 들어, 2개의 도메인이 모두 결합 기능을 가진 도메인이라면, 이 두 도메인은 모두 동일한 도메인일 수 있다. 다만, 동일한 도메인은 서로 아미노산 서열이 동일하다는 의미는 아니며, 아미노산 서열이 상이하더라도, 기능적으로 동일한 기능을 수행하고 있으면 동일한 도메인이라고 할 수 있다.
상기 트래퍼 분자는 2 이상의 서로 상이한 도메인을 가질 수 있다.
일 실시 태양에서, 트래퍼 분자는 타겟 분자와 결합하는 결합도메인과, 세포 내 결합된 단백질을 가둘 수 있는 잔류 도메인이 융합된 인공 재조합 폴리펩타이드일 수 있다.
예를 들어, 상기 인공 재조합 폴리펩타이드는 결합도메인과 소포체 잔류 도메인이 결합된 폴리펩타이드일 수 있다.
다른 실시 태양에서, 상기 트래퍼 분자는 결합 도메인과 잔류 도메인 외에 다른 기능적 도메인이 추가된 형태일 수 잇다.
예를 들어, 상기 인공 재조합 폴리펩타이드는 결합 도메인, 잔류 도메인 및 막관통 도메인이 결합된 형태일 수 있다. 다른 예로, 상기 인공 재조합 폴리펩타이드는 결합 도메인, 잔류 도메인 및 신호 서열 도메인이 결합된 형태일 수 있다. 또는, 다른 예로 상기 인공 재조합 폴리펩타이드는 결합 도메인, 잔류 도메인, 막관통 도메인 및 신호 서열 도메인이 결합된 형태일 수 있다.
상기 트래퍼 분자는 타겟 분자와 결합하여, 타겟분자가 세포 내 특정기관 또는 특정 영역에 위치시킬 수 있다. 즉, 타겟 분자가 정상적으로 기능하기 위한 장소로 이동하는 것을 막을 수 있다.
예를 들어, 상기 트래퍼 분자의 결합도메인이 타겟분자와 결합하고, 트래퍼 분자의 잔류 도메인이 세포 내 특정 기관 또는 특정 영역에 타겟분자를 위치시킴으로써, 타겟 분자를 세포 내 가둘 수 있다.
상기 트래퍼 분자가 결합하여 세포 내 가둘 수 있는 타겟 분자는 면역 활성화 수용체일 수 있다.
이하, 기능적 도메인에 대해서 상세하게 설명한다.
5.1. 결합도메인
결합도메인은 표적, 예를 들어 리간드, 항체, 수용체, 펩타이드 등과 상호작용할 수 있는 폴리펩타이드, 재조합 폴리펩타이드, 합성된 폴리펩타이드 또는 비-펩타이드 서열일 수 있다.
일 예로 상기 결합 도메인은 항체와 결합하는 항체 결합도메인일 수 있다.
다른 예로, 상기 결합도메인은 리간드와 결합하는 리간드 결합도메인일 수 있다.
다른 예로, 상기 결합도메인은 수용체와 결합하는 수용체 결합도메인일 수 있다.
다른 예로, 상기 결합도메인은 펩타이드와 결합하는 펩타이드 결합도메인일 수 있다.
일 구체 예에서, 상기 결합도메인은 수용체 또는 수용체 리간드와 결합하는 결합도메인일 수 있다.
이때, 결합 도메인과 목적 물질 사이의 상호작용은 면역침강법 (immunoprecipitation), 및 BiFC (Bimolecular fluorescence complementation) 등을 포함하는 생물화학적 방법, SPR (surface plasmon resonance), DPI (dual polarization interferometry), DLS (dynamic light scattering), FRET (Fluorescence resonance energy transfer) 등을 포함하는 생물물리학적 방법 등의 수단으로 측정이 가능하며, 이에 제한되지 않고 통상의 기술자가 활용할 수 있는 수단에 의해 측정 가능하다.
예를 들어, 상기 리간드 결합도메인은 핵 수용체 리간드와 결합하는 도메인일 수 있다. 핵 수용체는 글루코코르티코이드 수용체(GR), 안드로겐에 대한 수용체(AR), 미네랄로코트티코이드에 대한 수용체(MR), 프로게스틴에 대한 수용체(PR), 에스트로젠에 대한 수용체(ER), 티로이드 호르몬에대한 수용체(TR), 비타민 D에 대한 수용체(VDR) 및 레티노이드에 대한 수용체(RAR)를 포함한다. 뿐만 아니라, 스테로이드 및 티로이드 수용체와 같은 수용체 및 수용체 리간드와 결합하는 결합도메인일 수 있다.
다른 예를 들어, 상기 결합도메인은 면역 세포에 존재하는 수용체와 결합하는 도메인일 수 있다.
바람직하게, 상기 결합도메인은 면역 세포에 존재하는 수용체 즉, 면역 활성화 수용체와 결합하는 결합 도메인일 수 있다.
상기 면역 활성화 수용체는 T 세포 수용체, B세포 수용체, 살생세포활성화수용체, 톨(toll) 유사 수용체(TLR), 예를 들어 TLR4 및 TLR9, 사이토카인, 케모카인, 사이토카인 수용체, 및 케모카인 수용체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
상기 결합 도메인은 면역 활성화 수용체의 전부 또는 일부 영역과 결합하는 폴리펩타이드일 수 있다.
상기 면역 활성화 수용체의 '일부 영역'은 면역 활성화 수용체의 필수적 구성요소에 해당하는 필수 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 도메인을 모두 포함한다. 또는, 면역 활성화 수용체와 복합체를 형성하는 다른 단백질에 필수 구성요소에 해당하는 필수 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 도메인도 포함될 수 있다.
상기 결합 도메인은 면역 활성화 수용체 중에 항원과 직접적으로 결합하는 영역의 일부 폴리펩타이드 또는 도메인일 수 있고, 세포 막 관통 도메인 중 일부일 수도 있고, 또는 세포 내부에 존재하는 일부 폴리펩타이드 또는 도메인일 수 있다.
상기 결합 도메인은 면역활성화 수용체의 일부 폴리펩타이드 또는 도메인과 공유결합 또는 비공유 결합을 할 수 있다.
상기 결합 도메인인 펩타이드는 약 5 내지 300개의 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
특정 실시양태에 따라, 상기 펩타이드는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 및 300로부터 선택되는 두 개의 수치의 사이의 갯수의 아미노산으로 구성될 수 있다.
또 다른 실시양태에 따라, 상기 펩타이드는 5개 이상의 아미노산, 6개 이상의 아미노산, 7개 이상의 아미노산, 8개 이상의 아미노산 또는 9개 이상의 아미노산으로 구성될 수 있다.
또 다른 실시양태에 따라, 상기 펩타이드는 50개 이상, 45개 이하, 40개 이하, 35개 이하, 30개 이하, 28개 이하의 아미노산, 26개 이하의 아미노산, 24개 이하의 아미노산, 22개 이하의 아미노산, 20개 이하의 아미노산 18개 이하의 아미노산, 16개 이하의 아미노산, 14개 이하의 아미노산, 12개 이하의 아미노산 또는 최대 10개를 포함하는 아미노산일 수 있다.
어떤 실시예에서, 상기 결합 도메인은 GLRLLMFIV (서열번호 10) 또는 GLRIVFAVL (서열번호 11) 를 포함할 수 있다.
어떤 실시 예에서, 상기 결합 도메인은 AVGIGALF (서열번호 12), GALFLGFLG (서열번호 13), GAVFLGFL (서열번호 14), GAMFLGFLG (서열번호 15), GAVLLGFLG (서열번호 16), GAFFLGFLG (서열번호 17), GAMIFGFLG (서열번호 18) 또는 GALLFGFLG (서열번호 19)을 포함한다. 에를 들어, 결합 도메인은 AVGIGALF를 포함하는 AVGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQL (서열번호 20)일 수 있다. 또는, 상기 펩타이드는 GALFLGFLG일 수 있다.
어떤 실시 예에서, 상기 결합 도메인은 AVGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQL 아미노산 서열과 적어도 70%이상, 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 결합도메인은 AEGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQL (서열번호 21)일 수 있다.
어떤 실시예에서, 상기 결합도메인은 EQIWNHTTWMEW (서열번호 22)를 포함할 수 있다.
어떤 실시 예에서, 상기 결합 도메인은 EQIWNHTTWMEW 아미노산 서열과 적어도 70%이상, 75%이상, 80%이상, 85%이상, 90%이상 또는 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 결합도메인은 EQLWNHTTWMEW (서열번호 23) 를 포함할 수 있다. 다른 예로, EEIWNHTTWMEW (서열번호 24)를 포함할 수 있다.
결합 도메인은 TCR 하위 유닛과 상호작용하는 성질을 갖는 펩타이드 서열일 수 있다. 이때, 결합 도메인과 상호작용하는 TCR 하위 유닛은 TCR-α 체인, TCR-β 체인, TCR-γ 체인, TCR-δ 체인, CD3γ 체인, CD3δ 체인, CD3ε 체인, zeta 체인 중 선택되는 하나 이상의 것일 수 있다. 일 예시로, 결합 도메인은 TCR 하위 유닛 중 리간드 인식 유닛과 상호작용할 수 있고, 바람직하게는 TCR 체인과 상호작용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 TCR- α 체인과 상호작용할 수 있다. 다른 예시로, 결합 도메인은 TCR 하위 유닛 중 시그널 활성화 유닛과 상호작용할 수 있고, 바람직하게는 CD3 체인과 상호작용할 수 있다.
나아가, 결합 도메인은 TCR 하위 유닛의 아미노산 서열 내의 일부 도메인/모티프와 상호작용할 수 있다. 예시적으로, 상기 도메인/모티프는 TCR 하위 유닛 간의 상호작용 모티프일 수 있다. 또 예시적으로, 상기 도메인/모티프는 TCR 하위 유닛의 막통과 도메인일 수 있다. 또 예시적으로, 상기 도메인/모티프는 TCR 복합체 조립 관여 잔기/모티프일 수 있다. 또 예시적으로, 상기 도메인/모티프는 시그널 활성화 유닛이 포함하는 면역 시그널 활성화 모티프일 수 있다.
결합 도메인의 아미노산 서열의 길이는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 및 300으로부터 선택되는 두 개의 수치 사이의 개수일 수 있다. 일 예시에서 결합 도메인의 아미노산 서열의 길이는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 및 300으로부터 선택되는 두 개의 수치 사이의 아미노산일 수 있다. 다른 예시에서 결합 도메인의 아미노산 서열의 길이는 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 및 300으로부터 선택되는 두 개의 수치 사이의 아미노산일 수 있다.
어떤 실시예에서, 결합 도메인은 gp41 단백질의 아미노산 서열과 상동성이 있는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 구체적으로 결합 도메인은 gp41의 전장 서열을 모두 포함하거나 또는 그 일부만을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 결합 도메인은 gp41 단백질의 아미노산 서열과 상동성이 있는 아미노산 서열로서, 서열의 길이가 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 및 200으로부터 선택되는 두 개의 수치 사이의 아미노산일 수 있다. 바람직한 일 예시에서 결합 도메인의 아미노산 서열의 길이는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 및 200으로부터 선택되는 두 개의 수치 사이의 아미노산일 수 있다. 다른 예시에서 결합 도메인의 아미노산 서열의 길이는 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 및 200으로부터 선택되는 두 개의 수치 사이의 아미노산일 수 있다. 또 다른 예시에서 결합 도메인의 아미노산 서열의 길이는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 및 200으로부터 선택되는 두 개의 수치 사이의 아미노산일 수 있다. 또 다른 예시에서 결합 도메인의 아미노산 서열의 길이는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 및 200으로부터 선택되는 두 개의 수치 사이의 아미노산일 수 있다. 또 다른 예시에서 결합 도메인의 아미노산 서열의 길이는 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 및 200으로부터 선택되는 두 개의 수치 사이의 아미노산일 수 있다. 또 다른 예시에서 결합 도메인의 아미노산 서열의 길이는 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 및 200으로부터 선택되는 두 개의 수치 사이의 아미노산일 수 있다. 또 다른 예시에서 결합 도메인의 아미노산 서열의 길이는 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 및 200으로부터 선택되는 두 개의 수치 사이의 아미노산일 수 있다. 또 다른 예시에서 결합 도메인의 아미노산 서열의 길이는 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 및 200으로부터 선택되는 두 개의 수치 사이의 아미노산일 수 있다. 다만 결합 도메인의 길이는 본 문단에서 언급된 수치에만 한정되는 것은 아니다.
이때, gp41 단백질의 아미노산 서열과 상동성이 있는 결합 도메인은 gp41의 FP 도메인, NHR 도메인, Loop 도메인, CHR 도메인, 막통과 도메인, N36, 및 C34로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 서열을 일부 또는 이를 전체로서 포함할 수 있다.
어떤 예시에서, gp41 단백질의 아미노산 서열과 상동성이 있는 결합 도메인은 gp41의 FP 도메인의 아미노산 서열의 일부 또는 이를 전체로서 포함할 수 있다. 이때 바람직하게는 결합 도메인의 길이는 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 및 40으로부터 선택되는 두 개의 수치 사이의 아미노산일 수 있다. 또 바람직하게는 결합 도메인의 길이는 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 및 40으로부터 선택되는 두 개의 수치 사이의 아미노산일 수 있다.
어떤 예시에서, gp41 단백질의 아미노산 서열과 상동성이 있는 결합 도메인은 gp41의 막통과 도메인의 아미노산 서열을 일부 또는 이를 전체로서 포함할 수 있다. 이때 바람직하게는 결합 도메인의 길이는 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 및 40으로부터 선택되는 두 개의 수치 사이의 아미노산일 수 있다. 또 바람직하게는 결합 도메인의 길이는 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 및 40으로부터 선택되는 두 개의 수치 사이의 아미노산일 수 있다.
어떤 예시에서, gp41 단백질의 아미노산 서열과 상동성이 있는 결합 도메인은 CHR 도메인, Loop 도메인, 및 ISLAD 모티프로부터 선택된 적어도 하나 이상의 아미노산 서열을 일부 또는 전체로서 포함할 수 있고, 바람직하게는 ISLAD 모티프의 아미노산 서열을 일부 또는 전체로서 포함할 수 있다. 이때 바람직하게는 결합 도메인의 길이는 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 및 40으로부터 선택되는 두 개의 수치 사이의 아미노산일 수 있다. 또 바람직하게는 결합 도메인의 길이는 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 및 40으로부터 선택되는 두 개의 수치 사이의 아미노산일 수 있다.
결합 도메인은 gp41 단백질과 50 내지 100으로부터 선택되는 두 개의 수치 사이의 백분율의 상동성을 가질 수 있고, 바람직하게는 60 내지 100으로부터 선택되는 두 개의 수치 사이의 백분율의 상동성을 가질 수 있고, 바람직하게는 70 내지 100으로부터 선택되는 두 개의 수치 사이의 백분율의 상동성을 가질 수 있고, 바람직하게는 80 내지 100으로부터 선택되는 두 개의 수치 사이의 백분율의 상동성을 가질 수 있고, 바람직하게는 90 내지 100으로부터 선택되는 두 개의 수치 사이의 백분율의 상동성을 가질 수 있다.
어떤 실시예에서, 결합 도메인은 TCR 하위 유닛의 아미노산 서열과 상동성이 있는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 구체적으로 결합 도메인은 TCR 하위 유닛의 전장 서열을 모두 포함하거나 또는 그 일부만을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 결합 도메인은 TCR 하위 유닛의 아미노산 서열과 상동성이 있는 아미노산 서열로서, 서열의 길이가 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 및 40 으로부터 선택되는 두 개의 수치 사이의 아미노산일 수 있다. 바람직한 일 예시에서 결합 도메인의 아미노산 서열의 길이는 18, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 및 40으로부터 선택되는 두 개의 수치 사이의 아미노산일 수 있다. 다만 결합 도메인의 길이는 본 문단에서 언급된 수치에만 한정되는 것은 아니다.
이때, TCR 하위 유닛의 아미노산 서열과 상동성이 있는 결합 도메인은 TCR-α 체인, TCR-β 체인, TCR-γ 체인, TCR-δ 체인, CD3γ 체인, CD3δ 체인, CD3ε 체인 및 zeta 체인으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 서열을 일부 또는 이를 전체로서 포함할 수 있다. 나아가, 결합 도메인은 TCR 하위 유닛이 포함하는 도메인/모티프의 아미노산 서열을 일부 또는 이를 전체로서 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 TCR 하위 유닛이 포함하는 도메인/모티프는 TCR 하위 유닛 간의 상호작용 모티프, 막통과 도메인 또는 TCR 복합체 조립 관여 모티프일 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
어떤 예시에서, TCR 하위 유닛의 아미노산 서열과 상동성이 있는 결합 도메인은 TCR 체인의 아미노산 서열을 일부 또는 이를 전체로서 포함할 수 있고, 이때 TCR 체인은 바람직하게는 TCR-α 체인이다. 이때 바람직하게는 결합 도메인의 길이는 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 및 40으로부터 선택되는 두 개의 수치 사이의 아미노산일 수 있다.
나아가, 결합 도메인은 TCR 체인과 이와 다른 TCR 하위 유닛 간의 상호작용 모티프의 아미노산 서열을 일부 또는 이를 전체로서 포함할 수 있다. 또는, 결합 도메인은 TCR 체인의 막통과 도메인의 아미노산 서열을 일부 또는 이를 전체로서 포함할 수 있다. 또는, 결합 도메인은 TCR 체인의 TCR 복합체 조립 관여 모티프의 아미노산 서열을 일부 또는 이를 전체로서 포함할 수 있다.
어떤 예시에서, TCR 하위 유닛의 아미노산 서열과 상동성이 있는 결합 도메인은 CD3γ 체인, CD3δ 체인 및 CD3ε 체인으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 서열을 일부 또는 이를 전체로서 포함할 수 있다.
나아가, 결합 도메인은 CD3 체인-TCR-α 체인 상호작용 모티프의 아미노산 서열을 일부 또는 이를 전체로서 포함할 수 있다. 또는, 결합 도메인은 CD3 체인의 막통과 도메인의 아미노산 서열을 일부 또는 이를 전체로서 포함할 수 있다. 또는, 결합 도메인은 CD3 체인의 TCR 복합체 조립 관여 모티프의 아미노산 서열을 일부 또는 이를 전체로서 포함할 수 있다.
결합 도메인은 TCR 하위 유닛과 50 내지 100으로부터 선택되는 두 개의 수치 사이의 백분율의 상동성을 가질 수 있고, 바람직하게는 60 내지 100으로부터 선택되는 두 개의 수치 사이의 백분율의 상동성을 가질 수 있고, 바람직하게는 70 내지 100으로부터 선택되는 두 개의 수치 사이의 백분율의 상동성을 가질 수 있고, 바람직하게는 80 내지 100으로부터 선택되는 두 개의 수치 사이의 백분율의 상동성을 가질 수 있고, 바람직하게는 90 내지 100으로부터 선택되는 두 개의 수치 사이의 백분율의 상동성을 가질 수 있다.
어떤 실시예에서, 결합 도메인은 TCR 하위 유닛을 암호화하는 유전 서열과 상호작용하는 성질을 가질 수 있다. 이때, 결합 도메인은 TCR-α 체인, TCR-β 체인, TCR-γ 체인, TCR-δ 체인, CD3γ 체인, CD3δ 체인, CD3ε 체인 및 zeta 체인으로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 서열을 암호화하는 서열의 일부 또는 전체와 상호작용할 수 있다. 바람직하게는, 결합 도메인은 TCR 하위 유닛을 암호화하는 유전 서열의 발현을 억제할 수 있다. 결합 도메인은 RNAi, siRNA, 화학적 억제제, 및 핵산과 결합하는 펩타이드 등 통상적으로 알려져 있는 유전 서열과 상호작용하는 수단을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 트래퍼 분자는 하나 이상의 결합 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 트래퍼 분자는 2이상의 결합 도메인을 포함할 수 있고, 결합도메인 각각 면역 활성화 수용체의 일부 도메인과 결합할 수 있다.
일 예로, 상기 2이상의 결합 도메인은 동일한 면역 활성화 수용체의 동일한 영역과 결합할 수 있다. 이때, 결합 도메인은 동일한 아미노산 서열을 가지거나 또는 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다.
다른 예로, 상기 2이상의 결합 도메인은 동일한 면역 활성화 수용체의 상이한 영역과 결합할 수 있다. 이때, 결합 도메인은 동일한 아미노산 서열을 가지거나 또는 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다.
일 예로, 상기 2이상의 결합 도메인은 상이한 면역 활성화 수용체의 일부 영역과 결합할 수 있다.
결합 도메인은 위 아미노산 서열뿐만아니라 이와 유사한 아미노산 서열로써, 결합도메인의 기능과 동일한 기능을 수행할 수 있다면, 그러한 아미노산 서열을 모두 포함한다.
상기 결합 도메인은 인위적으로 합성된 폴리펩타이드일 수 있다. 이때, 인위적으로 합성된 결합 도메인은 면역활성화 수용체와 공유결합 또는 비공유결합을 형성할 수 있다.
인위적으로 합성된 결합 도메인은 자연에서 존재하는 일부 폴리펩타이드와 일부 또는 완전한 상동성을 가질 수 있다.
상기 결합 도메인은 자연 유래 단백질의 일부 폴리펩타이드로부터 유래될 수 있다. 이?, 자연에 존재하는 종에 따라, 결합 도메인의 아미노산 서열에 차이가 존재할 수 있으며, 결합 도메인은 자연에서 유래한 일부 폴리펩타이드와 일부 또는 완전한 상동성을 가질 수 있다.
일 예로, 상기 결합 도메인은 인간 유래 펩타이드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 결합 도메인은 인간 면역 활성화 수용체의 펩타이드 서열 중 일부를 포함할 수 있다.
다른 예로, 상기 결합 도메인은 바이러스 유래 일부 도메인을 포함할 수 있다. 이때 이러한 결합도메인을 바이러스 유래 결합 도메인으로 지칭한다. 예를 들어, 결합도메인은 헤르페스 바이러스 유래, 거대세포 바이러스 유래, 라사 바이러스 유래, 레트로 바이러스 유래, 아데노 바이러스 유래, 아데노-연관 바이러스 유래, 백시니아 바이러스 유래, 폭스 바이러스 유래, 또는 단순 포진 바이러스 유래 결합 도메인 등이 있다.
바람직하게 상기 결합도메인은 레트로 바이러스로부터 유래한 폴리펩타이드일 수 있다.
예를 들어, 레트로 바이러스는 사람의 HIV (사람면역결핍 바이러스), SIV(원숭이면역결핍 바이러스), 말의 전염성 빈혈증바이러스(EIAV)등이 있다.
바람직하게, 상기 결합 도메인은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)로부터 유래한 폴리펩타이드일 수있다.
인간 면역결핍 바이러스 (HIV)는 일반적으로 그의 두문자 AIDS로 명명되는 후천성 면역결핍증의 병원체이다. HIV-1 및 HIV-2로 명명된 상기 바이러스의 2가지 주요한 균주가 있다.
상기 HIV로부터 유래한 결합도메인은 HIV-1 유래 또는 HIV-2 유래일 수도 있다.
HIV-1에서의 외피성 단백질(envelope proteins)은 gp160단백질로 합성되는 당단백질이며, 이후 gp160은 절단되어, 각각 gp120 및 gp41(HIV-1)를 형성한다. HIV-2에서의 외피성 단백질(envelope proteins)은 gp140단백질로 합성되는 당단백질이며, 이후 gp140은 절단되어, 각각 gp110 또는 gp36(HIV-2)를 형성한다.
일 예로, 결합 도메인은 HIV-1로부터 유래한 gp41, gp120 또는 gp160의 단백질 중 일부 또는 전부일 수 있다.
다른 예로, 결합 도메인은 HIV-2로부터 유래한 gp110, gp36 또는 gp140의 단백질 중 일부 또는 전부일 수 있다.
바람직하게, 상기 결합 도메인은 gp41 단백질 중 일부 도메인일 수 있다.
예를 들어, gp41단백질 중 일부 도메인은 T 세포 수용체의 일부 도메인과 결합할 수 있고, 따라서 gp41 단백질로부터 유래한 결합 도메인은 T 세포 수용체를 타겟으로 하는 결합 도메인일 수 있다.
이하, gp41 유래 결합도메인에 관하여 설명한다.
5.1.1. Gp41 유래 결합 도메인
'gp41'은 당 단백질의 한 종류에 해당하며, 인간 면역 바이러스 (HIV)를 포함하여 레트로 바이러스의 외피 단백질(envelop protein) 복합체의 하위 구성단위이다. gp41은 바이러스가 숙주 세포의 감염 시 필요한 세포 외 영역의 몇몇 부위를 포함한 막 투과성 단백질에 해당한다.
'gp41'단백질은 세포질(cytoplasmic), 막 횡단(transmembrane) 및 세포 외(extracellular) 도메인으로 구성된다 [14]. 상기 세포 외 도메인(extracellular domain)은 크게 4개의 주요 기능을 가진 영역과 그 외에 2개의 영역을 더 포함하고 있다.
상기 gp41의 세포 외 도메인은 i) 16개의 소수성 잔기로 이루어진 융합 펩타이드('FP'이라고 함)영역, ii) N-말단 헵타드 반복 부위 ('NHR'이라고 함) iii) C-말단 헵타드 반복 부위('CHR'이라고 함) iv) 트립토판이 풍부한 막 근위 세포 외 영역 v)루프(loop)영역을 포함한다.
상기 FP, NHR, CHR 및 Loop은 각각 T 세포 수용체와 특이적으로 결합할 수 있고, T 세포의 증식을 억제할 수 있다.
상기 FP는 T 세포 수용체와 특이적으로 결합하는 면역억제부위를 포함하고 있으며, 첫 번째 면역 억제 부위는 N말단의 소수성 영역을 포함한다.
상기 NHR영역은 세포 외 도메인에서 N말단에 위치하며, 아미노산 535-581영역에 위치한다. 또한, 상기 NHR영역은 면역억제 부위인 'ISU'부위를 포함하고 있으며, ISU는 아미노산 583-599영역에 포함된다 [15].
상기 CHR영역은 세포 외 도메인에서 C말단에 위치하며, 아미노산 628-662영역에 위치한다.
상기 Loop 영역은 세포 외 도메인의 일부분으로, gp41의 헤어핀 구조가 안정화되도록 이황화 결합을 형성할 수 있다. 상기 Loop 영역은 아미노산 584-628 영역에 위치한다. Loop 영역은 고도로 보존된 시퀀스영역인 면역 억제 루프 연관 결정기('ISLAD'라고 함)을 포함하고 있으며, ISLAD는 아미노산 605-641영역에 위치한다. 예를 들어, 상기 ISLAD는 T세포 수용체 막에 결합할 수 있어, T세포 수용체의 복합체와 상호작용할 수 있다.
상기 gp41의 막 횡단영역인 transmembrane('TMD'라고 함)영역은 T 세포 및 CD3/TCR복합체와 결합하여, T 세포의 증식을 억제할 수 있다. 상기 TMD 영역은 아미노산 서열 684-702에 위치한다. 막 횡단 영역의 일부 도메인(GLVGLRIVF)으로부터 유래된 펩타이드는 전체 길이의 막 횡단 도메인 보다 T세포 증식을 현저하게 억제시킬 수 있다.
상기 결합 도메인은 FP, NHR, CHR, Loop 또는 TMD 중 어느 하나 이상의 도메인의 아미노산 서열 일부를 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 결합 도메인은 FP 도메인의 일부 아미노산 서열, NHR 도메인의 일부 아미노산 서열, CHR 도메인의 일부 아미노산 서열, Loop 도메인의 일부 아미노산 서열 또는TMD 도메인의 일부 아미노산서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 결합 도메인은 FP 도메인과 NHR 도메인에 걸쳐 포함되는 일부 아미노산서열일 수 있다.
일 예로, 상기 결합 도메인은 NHR 도메인과 Loop 도메인에 걸쳐 포함되는 일부 아미노산서열일 수 있다.
다른 예로, 상기 결합 도메인은 Loop 도메인과 CHR 도메인에 걸쳐 포함되는 일부 아미노산서열일 수 있다.
일 예로, 상기 결합 도메인은 CHR 도메인과 TMD 도메인에 걸쳐 포함되는 일부 아미노산서열일 수 있다.
바람직하게, T 세포 수용체와 결합하는 결합 도메인은 FP, Loop 및 TMD 중 어느 하나일 수 있다.
더 바람직하게, T 세포 수용체와 결합하는 Loop의 영역은 ISLAD일 수 있다.
상기 결합 도메인은 FP 도메인 중 약 3 내지 50개의 아미노산을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 결합 도메인은 FP 도메인 중 5 내지 50개의 아미노산, 5 내지 45개의 아미노산, 5 내지 40개의 아미노산, 5 내지 35개의 아미노산, 5 내지 30개의 아미노산, 5 내지 28개의 아미노산, 5 내지 26개의 아미노산, 5 내지 24개의 아미노산, 5 내지 22개의 아미노산 또는 5 내지 18개의 아미노산을 포함할 수 있다.
다른 예로, 상기 결합 도메인은 FP 도메인 중 5개 이상의 아미노산, 6개 이상의 아미노산, 7개 이상의 아미노산, 8개 이상의 아미노산 또는 9개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 결합 도메인은 FP 도메인 중 50개 이상, 45개 이하, 40개 이하, 35개 이하, 30개 이하, 28개 이하의 아미노산, 26개 이하의 아미노산, 24개 이하의 아미노산, 22개 이하의 아미노산, 20개 이하의 아미노산 18개 이하의 아미노산, 16개 이하의 아미노산, 14개 이하의 아미노산, 12개 이하의 아미노산 또는 최대 10개를 포함하는 아미노산일 수 있다.
바람직하게, 상기 결합 도메인은 FP 도메인 중 10 내지 35개의 아미노산을 포함할 수 있고, 이때 5개 이상의 아미노산의 유사체 또는 유도체를 포함한다.
일 구현 예로, 상기 FP 도메인 유래 결합 도메인은 AVGIGALF, GALFLGFLG, GAVFLGFL, GAMFLGFLG, GAVLLGFLG, GAFFLGFLG, GAMIFGFLG 및 GALLFGFLG 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 결합 도메인은 AVGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQL일 수 있다.
다른 예로, 상기 FP 도메인 유래 결합 도메인은 AVGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQL이거나 또는 AVGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQL와 적어도 70% 이상 상동성을 가지는 아미노산서열일 수 있다.
상기 FP 도메인 유래 결합 도메인은 추가로 양 말단에 (X)n 및/또는 (Y)m을 포함, 즉, N'- (X)n AVGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQL (Y)m - C', 일 수 있다. 상기 (X)n는 N-말단의 blocking group에 해당하며, 적어도 아미노산의 50%이상은 소수성이다(X는 임의의 아미노산 서열이며, n은 임의의 정수 임). 또한, 상기 (Y)m는 C- 말단의 blocking group에 해당하며, 적어도 아미노산의 50%이상은 소수성이다(Y는 임의의 아미노산 서열이며, m은 임의의 정수 임).
상기 m 과 n은 5 내지 30이하의 정수, 6 내지 28 이하의 정수, 7 내지 26 이하의 정수, 8 내지 24 이하의 정수, 10 내지 22 이하의 정수 또는 12 내지 20 이하의 정수일 수 있다.
다른 실시 예로, 상기 결합 도메인은 FP 도메인 중 일부 돌연변가 일어난 아미노산 서열일 수 있다. 예를 들어, FP펩타이드는 V2E 변이체일 수 있다. V2E 변이체 펩타이드는 AEGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQL일 수 있다.
상기 결합 도메인은 Loop 도메인 중 약 3 내지 50개의 아미노산을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 결합 도메인은 loop 도메인 중 5 내지 50개의 아미노산, 5 내지 45개의 아미노산, 5 내지 40개의 아미노산, 5 내지 35개의 아미노산, 5 내지 30개의 아미노산, 5 내지 28개의 아미노산, 5 내지 26개의 아미노산, 5 내지 24개의 아미노산, 5 내지 22개의 아미노산 또는 5 내지 18개의 아미노산을 포함할 수 있다
다른 예로, 상기 결합 도메인은 loop 도메인 중 5개 이상의 아미노산, 6개 이상의 아미노산, 7개 이상의 아미노산, 8개 이상의 아미노산 또는 9개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 결합 도메인은 loop 도메인 중 50개 이상, 45개 이하, 40개 이하, 35개 이하, 30개 이하, 28개 이하의 아미노산, 26개 이하의 아미노산, 24개 이하의 아미노산, 22개 이하의 아미노산, 20개 이하의 아미노산 18개 이하의 아미노산, 16개 이하의 아미노산, 14개 이하의 아미노산, 12개 이하의 아미노산 또는 최대 10개를 포함하는 아미노산일 수 있다.
바람직하게, 상기 결합 도메인은 loop 도메인 중 10 내지 35개의 아미노산을 포함할 수 있고, 이때 5개 이상의 아미노산의 유사체 또는 유도체를 포함한다.
일 실시 예로, 상기 Loop 유래 결합 도메인은 TTAVPWNASWSNKSLEQI (서열번호 25), WNASWSNKSLEQIWNHT (서열번호 26), SNKSLEQIWNHTTWMEWD (서열번호 27) 또는 EQIWNHTTWMEWDREINN (서열번호 28) 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 결합 도메인은 TTAVPWNASWSNKSLEQTWNHTTWMEWDREINNYTSL (서열번호 29)이거나 또는 SNKSLEQIWNHTTWMEWD일 수 있다.
바람직하게, 상기 결합 도메인은 Loop 도메인 중 ISLAD 도메인에 해당하는 SNKSLEQIWNHTTWMEWD일 수 있다.
상기 결합 도메인은 ISLAD 도메인 중 일부 아미노산 서열이 변형된 유사체일 수 있다. 예를 들어, ISLAD 유사체는 SNKSLEQIGNHTTGMEGD (서열번호 30) 또는 SNKSLEQIWNHTTWMGWG (서열번호 31)일 수 있다.
상기 결합 도메인은 TMD 도메인 중 약 3 내지 50개의 아미노산을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 결합 도메인은 TMD 도메인 중 5 내지 50개의 아미노산, 5 내지 45개의 아미노산, 5 내지 40개의 아미노산, 5 내지 35개의 아미노산, 5 내지 30개의 아미노산, 5 내지 28개의 아미노산, 5 내지 26개의 아미노산, 5 내지 24개의 아미노산, 5 내지 22개의 아미노산 또는 5 내지 18개의 아미노산을 포함할 수 있다
다른 예로, 상기 결합 도메인은 TMD 도메인 중 5개 이상의 아미노산, 6개 이상의 아미노산, 7개 이상의 아미노산, 8개 이상의 아미노산 또는 9개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 결합 도메인은 TMD 도메인 중 50개 이상, 45개 이하, 40개 이하, 35개 이하, 30개 이하, 28개 이하의 아미노산, 26개 이하의 아미노산, 24개 이하의 아미노산, 22개 이하의 아미노산, 20개 이하의 아미노산 18개 이하의 아미노산, 16개 이하의 아미노산, 14개 이하의 아미노산, 12개 이하의 아미노산 또는 최대 10개를 포함하는 아미노산일 수 있다.
바람직하게, 상기 결합 도메인은 TMD 도메인 중 9 내지 30개의 아미노산을 포함할 수 있고, 이때 5개 이상의 아미노산의 유사체 또는 유도체를 포함한다.
일 실시 예로, 상기 TMD 유래 결합 도메인은 GLVGLAIVF (서열번호 32), GLLGLAIVF (서열번호 33), GGVGLAQF (서열번호 34), GGVGLAIVF (서열번호 35), 또는 GGLGLAIVF (서열번호 36) 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 TMD 유래 결합 도메인은 LFIMIVGGLVGLRIVFAVLSI (서열번호 37)일 수 있다.
상기 결합 도메인은 TMD 도메인 중 일부 아미노산 서열이 변형된 유사체일 수 있다. 예를 들어, 결합도메인은 LFIMIVGGLRLLMFIVFAVLSI (서열번호 38) 또는 LFIMIVGGLRIVFAVLSI (서열번호 39)일 수 있다.
상기 결합 도메인은 gp41로부터 유래한 도메인뿐만 아니라, gp41 유래 결합 도메인과 유사한 기능을 수행한다면, 다른 바이러스 유래 단백질의 일부 아미노산 서열도 포함한다.
상기 gp41 유래 결합도메인이 결합하는 면역활성화 수용체는 T 세포 수용체일 수 있다. 즉, 결합도메인은 T 세포 수용체의 전부 또는 일부와 결합할 수 있다. 이때, T세포 수용체는 이와 복합체를 형성하는 단백질도 포함한다.
상기 결합 도메인은 TCR 하위 유닛 중 적어도 어느 하나를 인식하고 결합할 수 있는 기능을 수행할 수 있다.
상기 트래퍼 분자는 결합된 면역 활성화 수용체를 세포 내 가두기 위한 잔류 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
이하, 면역 활성화 수용체를 세포 내 존재하게 하기 위한 잔류 도메인에 관하여 설명한다.
5.2. 잔류 도메인
상기 면역 활성화 수용체가 세포 내 존재하기 위한 트래퍼 분자는 잔류 도메인을 포함할 수 있다.
상기 잔류도메인은 세포 내에서 특정 소기관 또는 특정 부위에서 존재할 확률이 높은 경향성을 갖는 펩타이드 서열을 의미한다. 이때, 잔류도메인은 어떤 단백질을 처음부터 해당 소기관 또는 특정 부위에 잔류시키는 신호서열일 수 있고, 또는 외부 단백질을 다시 회수하여 세포 내 특정기관 또는 특정 영역에 잔류시키는 신호서열일 수 있다.
상기 특정 소기관은 TCR 복합체의 형성 과정에서 TCR 하위유닛, 중간 TCR 복합체, 또는 최종적인 TCR 복합체가 경유하는 소기관일 수 있다. 어떤 예시에서, 특정 소기관은 소포체일 수 있다. 어떤 예시에서, 특정 소기관은 골지체일 수 있다.
어떤 실시예에서, 잔류 도메인은 소포체에 존재할 확률이 높은 경향성을 갖는 펩타이드일 수 있다. 이때 잔류 도메인을 '소포체 잔류 도메인'으로 명칭한다. 일 예시에서 소포체 잔류 도메인은 소포체 표면 단백질/펩타이드의 신호 펩타이드 (signal peptide)일 수 있다. 다른 예시에서 소포체 잔류 도메인은 소포체 표면 단백질/펩타이드의 막통과 도메인일 수 있다. 구체적인 소포체 잔류 도메인에 관련된 예시들을 공지된 다양한 논문에서 확인할 수 있으며, 해당 예시들은 모두 본 발명의 범위에 포함된다 [10].
어떤 실시예에서, 잔류 도메인은 골지체에 존재할 확률이 높은 경향성을 갖는 펩타이드일 수 있다. 이때 잔류 도메인을 '골지체 잔류 도메인'으로 명칭한다. 일 예시에서 골지체 잔류 도메인은 골지체 표면 단백질/펩타이드의 신호 펩타이드일 수 있다. 다른 예시에서 골지체 잔류 도메인은 골지체 표면 단백질/펩타이드의 막통과 도메인일 수 있다. 구체적인 골지체 잔류 도메인에 관련된 예시들을 공지된 다양한 논문에서 확인할 수 있으며, 해당 예시들은 모두 본 발명의 범위에 포함된다 [11].
어떤 실시예에서, 잔류 도메인은 세포막에 존재할 확률이 높은 경향성을 갖는 펩타이드일 수 있다. 이때, 잔류 도메인은 N-말단이 세포질 방향 (cytoplasmic direction)으로 배열되도록 하는 특징을 가지는 C-말단 신호 서열 및/또는 막통과 도메인일 수 있다 [12]. 이러한 성질을 갖는 C-말단 신호 서열 및/또는 막통과 도메인을 '세포질 방향 발현 도메인 (cytoplasm-directing expression domain)'으로 명칭한다. 예시적으로, 상기 신호 서열 및 막통과 도메인은 시납토브레빈 또는 시토크롬 b5의 서열과 상동성이 있을 수 있다.
잔류 도메인이 특정 소기관에 존재할 확률이 높다는 경향성은 면역형광 염색법 (immunofluorescent staining) 등 통상적으로 알려져 있는 방법을 통해 확인할 수 있다 [13].
상기 잔류도메인은 트래퍼 분자의 N말단, C말단 또는 그 인접한 부위에 위치할 수 있다.
일 예로, 소포체 잔류 도메인은 트래퍼 분자의 N말단, C말단 또는 그 인접한 부위에 위치할 수 있다.
다른 예로, 리소좀 잔류 도메인은 트래퍼 분자의 N말단, C말단 또는 그 인접한 부위에 위치할 수 있다.
일 예로, 핵인 잔류 도메인은 트래퍼 분자의 N말단, C말단 또는 그 인접한 부위에 위치할 수 있다.
다른 예로, 골지체 잔류 도메인은 트래퍼 분자의 N말단, C말단 또는 그 인접한 부위에 위치할 수 있다.
일 예로, 프로테아좀 잔류도메인은 트래퍼 분자의 N말단, C말단 또는 그 인접한 부위에 위치할 수 있다.
다른 예로, 미토콘드리아 잔류도메인은 트래퍼 분자의의 N말단, C말단 또는 그 인접한 부위에 위치할 수 있다.
일 구현 예에서, 소포체 잔류 신호 서열은 KDEL (서열번호 40) 또는 KKXX(서열번호 41)를 포함하는 신호서열일 수 있다 (X는 임의의 아미노산)
일 예로, 소포체 잔류 신호 서열은 SEKDEL (서열번호 42)을 포함할 수 있다.
다른 예로, 소포체 잔류 신호 서열은 KKMP (서열번호 43) 또는 KKTN (서열번호 44)을 포함할 수 있다.
예를 들어, 소포체 잔류 신호 서열은 KYKSPRSFIEEKKMP (서열번호 45), LKYKSRRSFIEEKKMP (서열번호 46), LYKYKSRRSFIEEKKMP (서열번호 47), LYCKYKSRRSFIEEKKMP (서열번호 48), KYCNKYKSRRSFIEEKKMP (서열번호 49), LYKYKSRRSFIDEKKMP (서열번호 50), LYCNKYKSRRSFIDEKKMP (서열번호 51), LYEQKLISEEDLKYKSRRSFIEEKKMP (서열번호 52), LYCYPYDVPDYAKYKSRRSFIEEKKMP (서열번호 53), LYKKLETFKKTN (서열번호 54), 및 LYEQKLISEEDLKKLETFKKTN (서열번호 55) 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 소포체 잔류 서열은 단백질의 성질에 따라 신호서열 외에 일부 서열이 더 추가될 수 있다.
예를 들어, 수용성 단백질의 경우 소포체 잔류 서열의 왼쪽으로 5 및 6번째에 위치한 아미노산의 서열이 수용성 단백질을 소포체에 잔류시키기 위하여 중요한 서열에 해당한다. 따라서, TCR/ CD3복합체 구성 중에서 수용성 단백질에 해당하는 부분의 경우에는 소포체 잔류 서열뿐만 아니라 소포체 잔류서열의 왼쪽으로 5 및 6번째에 위치한 아미노산 서열도 잔류 도메인에 포함될 수 있다.
다른 구현 예에서, 기타 소포체 또는 골지체 잔류 신호 서열은 KXKXX (서열번호 56), KXD/E 및/또는 YQRL (서열번호 57)를 포함하는 신호서열일 수 있다(X는 임의의 아미노산).
일 예로, 소포체 잔류 신호 서열은 HDEF (서열번호 58), HDEL (서열번호 59), RDEF (서열번호 60), RDEL (서열번호 61), WDEL (서열번호 62), YDEL (서열번호 63), HEEF (서열번호 64), HEEL (서열번호 65), KEEL (서열번호 66), REEL (서열번호 67), KAEL (서열번호 68), KCEL (서열번호 69), KFEL (서열번호 70), KGEL (서열번호 71), KHEL (서열번호 72), KLEL (서열번호 73), KNEL (서열번호 74), KQEL (서열번호 75), KREL (서열번호 76), KSEL (서열번호 77), KVEL (서열번호 78), KWEL (서열번호 79), KYEL (서열번호 80), KEDL (서열번호 81), KIEL (서열번호 82), DKEL (서열번호 83), FDEL (서열번호 84), KDEF (서열번호 85), KKEL (서열번호 86), HADL (서열번호 87), HAEL (서열번호 88), HIEL (서열번호 89), HNEL (서열번호 90), HTEL (서열번호 91), KTEL (서열번호 92), HVEL (서열번호 93), NDEL (서열번호 94), QDEL (서열번호 95), REDL (서열번호 96), RNEL (서열번호 97), RTDL (서열번호 98), RTEL (서열번호 99), SDEL (서열번호 100), TDEL (서열번호 101) 및 SKEL (서열번호 102) 중 어느 하나 이상의 신호서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 기타 소포체 또는 골지체 잔류 신호 서열은 LYYQRL (서열번호 103), LYEQKLISEEDLYQRL (서열번호 104), LYKRKIIAFALEGKRSKVTRRPKASDYQRL (서열번호 105), LYRNIKCD (서열번호 106) 및 LYEQKLISEEDLRNIKCD (서열번호 107) 중에 어느 하나 이상일 수 있다.
다른 구현 예에서, 프로테아좀 잔류 신호 서열은 "PEST" 모티프 - SHGFPPEVEEQDDGTLPMSCAQESGMDRHPAACASARINV (서열번호 108)를 포함하는 프로테아좀 표적 서열일 수 있다.
상기 트래퍼 분자는 하나 이상의 잔류 도메인을 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 잔류 도메인이 2이상 존재할 경우, 2이상의 잔류 도메인은 동일한 세포 소기관 잔류 도메인일 수 있다. 이때 잔류 신호서열은 동일하거나 또는 상이할 수 있다.
다른 예로, 상기 잔류 도메인이 2이상 존재할 경우, 2이상의 잔류 도메인은 각각 상이한 세포 소기관 잔류 도메인일 수 있다.
상기 잔류 도메인은 트래퍼 분자의 결합도메인의 N말단 또는 C말단에 위치할 수 있다.
예를 들어, 상기 트래퍼 분자는 N' - 결합 도메인(n) - 잔류 도메인(m) - C'일 수 있다.
다른 예로, 상기 트래퍼 분자는 N' - 잔류 도메인(m) - 결합 도메인(n) - C'일 수 있다.
이때, n과 m은 정수를 가리킨다.
5.3. 연결 도메인
상기 트래퍼 분자는 추가 도메인을 더 포함할 수 있다. 트래퍼 분자에 추가적으로 더 포함되는 도메인은 트래퍼 분자의 기능을 수행하는데 있어서, 반드시 필요한 구성 도메인은 아니나, 기능 향상 내지 새로운 기능을 더할 수 있다
상기 트래퍼 분자에 추가되는 도메인은 연결 도메인일 수 있다.
상기 연결 도메인은 트래퍼 분자의 동일한 2 이상의 기능적 도메인 또는 상이한 2 이상의 기능적 도메인을 연결할 수 있다.
예를 들어, 연결도메인은 결합도메인과 하나 이상의 잔류 도메인을 연결하는 기능을 수행한다.
상기 연결 도메인의 아미노산 서열은 다음과 같다.
일 실시 태양에 있어서, 연결 도메인은 약 1 내지 약 100개의 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 이때, 연결 도메인은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 및 100으로부터 선택된 두 개의 수치 사이의 개수의 아미노산 길이를 가질 수 있다.
특정 실시 양태에 따라, 연결 도메인은 3 내지 20 개의 아미노산 길이를 가질 수있다. 특정 실시 양태에 따라, 연결 도메인은 약 20 내지 약 40개 아미노산 길이를 가질 수 있다.
특정 실시 양태에 따라, 연결 도메인은 적어도 3개의 아미노산, 적어도 5개의 아미노산, 적어도 10개의 아미노산, 적어도 15개의 아미노산, 적어도 20개의 아미노산, 적어도 25개의 아미노산, 적어도 30개의 아미노산, 적어도 35개의 아미노산 또는 적어도 40개의 아미노산 길이를 가질 수 있다. 다만 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 연결 도메인은 해당 분야에 공지되어 있는 다양한 연결 도메인을 사용하여 결합도메인과 잔류 도메인을 연결할 수 있다.
상기 연결 도메인은 다양한 길이의 친수성 잔기로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있다.
일 실시 태양에 따라, 상기 연결 도메인은 (GGGGS)n일 수 있다. 이때, n은 1 내지 12의 정수일 수 있다.
예를 들어, 연결 도메인의 아미노산 서열은 GGGGSGGGGS (서열번호 109) 또는, GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (서열번호 110)일 수 있다.
다른 실시 태양에 따라, 상기 연결 도메인은 (GGGXX)nGGGGS 및 GGGGS(XGGGS)n으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다. X는 아미노산 A, G, Q, P, S의 아미노산 서열중 어느 하나일 수 있으며 (GGGXX)n은 정수 n번만큼 반복될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 연결 도메인은 (GGGGA) nGGGGS, (GGGGQ) nGGGGS, (GGGPS) nGGGGS 및GGGGS(PGGGS)n, 중에 어느 하나일 수 이며, 여기서 n은 1보다 크거나 동일한 정수이다.
예를 들어, 상기 연결 도메인은(GGGGA) 2GGGGS, (GGGGQ) 2GGGGS, (GGGPS)2GGGGS 또는 GGGGS, (PGGGS)2일 수 있다.
이때, 상기 n은 1 내지 20이거나, n은 1 내지 10일 수 있다. 즉 n은 2, n은 3, n은 4, n은 5, n은 6, n은 7, n은 8, n은 9 또는 n은 10일 수 있다.
5.4. 막관통 도메인
상기 트래퍼 분자는 막관통 도메인(transmembrane domain)을 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 막 관통 도메인은 잔류도메인의 membrane anchoring에 도움을 주어, 잔류 도메인의 기능을 향상시킬 수 있다.
예를 들어, 막관통 도메인은 CD8α, CD8β, 4-1BB, CD28, CD34, CD4, FcεRIγ, CD16(예를 들어, CD16A 또는 CD16B), OX40, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, CD32(예를 들어, CD32A 또는 CD32B), CD64(예를 들어, CD64A, CD64B 또는 CD64C), VEGFR2, FAS 또는 FGFR2B의 막관통 도메인을 포함한다. 다만 이에 제한되지 않는다. 다양한 다른 잔류 신호 서열이 해당 분야에 공지되어 있으므로, 이용할 수 있다.
바람직하게, 상기 막관통 도메인은 CD8α 막관통 도메인일 수 있다.
*일 실시예에서, CD8α 막관통 도메인의 아미노산 서열은 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (서열번호 111)일 수 있다.
막관통 도메인은 잔류 도메인의 N말단, C말단 또는 N 말단, C말단과 인접한 부위에 위치할 수 있다.
예를 들어, 소포체 신호서열 및 이의 N말단 또는 N 말단과 인접한 부위에 위치한 막 관통 도메인은
N'-IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKYKSPRSFIEEKKMP-C'(서열번호 112);
N'-IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLKYKSRRSFIEEKKMP-C'(서열번호 113);
N'-IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEEKKMP-C'(서열번호 114);
N'-IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYCKYKSRRSFIEEKKMP-C'(서열번호 115);
N'-IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKYCNKYKSRRSFIEEKKMP-C'(서열번호 116);
N'-IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIDEKKMP-C'(서열번호 117);
N'-IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYCNKYKSRRSFIDEKKMP-C'(서열번호 118);
N'-IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYEQKLISEEDLKYKSRRSFIEEKKMP-C'(서열번호 119);
N'-IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYCYPYDVPDYAKYKSRRSFIEEKKMP-C'(서열번호 120);
N'-IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKKLETFKKTN-C' (서열번호 121); 및
N'-IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYEQKLISEEDLKKLETFKKTN-C' (서열번호 122)중에 어느 하나 이상일 수 있다 (밑줄은 막관통 도메인 서열을 의미함).
예를 들어, 소포체 신호서열 및 이의 C말단 또는 C말단과 인접한 부위에 위치한 막 관통 도메인은
N'-KYKSPRSFIEEKKMPIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC-C' (서열번호 123);
N'-LKYKSRRSFIEEKKMPIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC-C' (서열번호 124);
N'-LYKYKSRRSFIEEKKMPIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC-C' (서열번호 125);
N'-LYCKYKSRRSFIEEKKMPIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC-C' (서열번호 126);
N'-KYCNKYKSRRSFIEEKKMPIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC-C' (서열번호 127);
N'-LYKYKSRRSFIDEKKMPIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC-C' (서열번호 128);
N'-LYCNKYKSRRSFIDEKKMPIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC-C' (서열번호 129);
N'-LYEQKLISEEDLKYKSRRSFIEEKKMPIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC-C' (서열번호 130);
N'-LYCYPYDVPDYAKYKSRRSFIEEKKMPIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC-C' (서열번호 131);
N'-LYKKLETFKKTNIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC-C' (서열번호 132); 및
N'-LYEQKLISEEDLKKLETFKKTNIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC-C' (서열번호 133) 중에 어느 하나 이상일 수 있다 (밑줄은 막관통 도메인 서열을 의미함).
예를 들어, 프로테아좀 신호서열 및 이의 N말단 또는 N말단과 인접한 부위에 위치한 막 관통 도메인은 N'-IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCSHGFPPEVEEQDDGTLPMSCAQESGMDRHPAACASARINV-C' (서열번호 134)일 수 있다(밑줄은 막관통 도메인 서열을 의미함).
다른 구현예에서, 막관통 도메인은 결합 도메인의 N말단, C말단 또는 인접한 부위에 위치할 수 있다.
예를 들어, 결합 도메인 및 이의 N말단 또는 N 말단 인접한 부위에 위치한 막관통 도메인은
N'-IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLFIMIVGGLVGLRIVFAVLSI-C' (서열번호 135);
N'-IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCAVGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQL-C' (서열번호 136); 및
N'-IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCSNKSLEQIWNHTTWMEWD-C' (서열번호 137) 중에 어느 하나 이상일 수 있다 (밑줄은 막관통 도메인 서열을 의미함).
예를 들어, 결합 도메인 및 이의 C말단에 위치한 막관통 도메인은
N'-LFIMIVGGLVGLRIVFAVLSIIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC-C' (서열번호 138);
N'-AVGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQLIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC-C' (서열번호 139); 및
N'-SNKSLEQIWNHTTWMEWDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC-C' (서열번호 140) 중에 어느 하나 이상일 수 있다 (밑줄은 막관통 도메인 서열을 의미함).
5.5. 추가 신호 서열
상기 트래퍼 분자는 잔류 도메인 외에 신호서열을 추가로 더 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 추가 신호서열은 CD8α 신호서열일 수 있다.
CD8α 사슬은 면역 반응에 필수적인 역할을 하는 내장형 막 당단백질이며, T세포에서 주로 MHCI 분자에 대한 보조 수용체로서 작용한다. NK세포에서, 세포 표면에서의 CD8α 동종 이량체는 다중 표적 및 용해에 관여된 메커니즘을 제공하며, CD8α동종 이량체 분자는 또한 기억 CD8+T세포의 생존 및 분화를 촉진하는 기능을 한다. T- 림프구 분화 항원 T8 / Leu-2 또는 CD_antigen : CD8a라고도 칭한다.
상기 CD8α 신호서열은 N'-ALPVTALLLPLALLLHAARP-C' (서열번호 141)일 수 있다.
상기 CD8α 신호서열은 트래퍼 분자의 N말단, C말단 또는 양 끝과 인접한 부위에 위치할 수 있다.
일 구현 예에서, 상기 CD8α 신호서열은 트래퍼 분자의 N말단 또는 N말단과 인접한 부위에 위치할 수 있고, 결합 도메인과 연결될 수 있다. 이 경우에서, 예를 들어, 아미노산 서열은
N' - ALPVTALLLPLALLLHAARPLFIMIVGGLVGLRIVFAVLSI - C' (서열번호 142);
N' - ALPVTALLLPLALLLHAARPLFIMIVGGLVGLRIVFAVLSI -C' (서열번호 143); 및
N' - ALPVTALLLPLALLLHAARPLFIMIVGGLVGLRIVFAVLSI - C' (서열번호 144) 중에 어느 하나일 수 있다(밑줄은 CD8α 신호서열을 의미함).
다른 구현 예에서, 상기 CD8α 신호서열은 트래퍼 분자의 N말단 또는 N 말단과 인접한 부위에 위치할 수 있고, 잔류 도메인과 연결될 수 있다.
예를 들어, 상기 잔류 도메인이 소포체 신호서열인 경우에 CD8α 신호서열은 소포체 신호서열과 연결될 수 있다. 이 경우에서, 예를 들어, 아미노산 서열은
N' -ALPVTALLLPLALLLHAARPKYKSPRSFIEEKKMP- C' (서열번호 145);
N' -ALPVTALLLPLALLLHAARPLKYKSRRSFIEEKKMP- C' (서열번호 146);
N' -ALPVTALLLPLALLLHAARPLYKYKSRRSFIEEKKMP- C' (서열번호 147);
N' -ALPVTALLLPLALLLHAARPLYCKYKSRRSFIEEKKMP- C' (서열번호 148);
N' -ALPVTALLLPLALLLHAARPKYCNKYKSRRSFIEEKKMP- C' (서열번호 149);
N' -ALPVTALLLPLALLLHAARPLYKYKSRRSFIDEKKMP- C' (서열번호 150);
N' -ALPVTALLLPLALLLHAARPLYCNKYKSRRSFIDEKKMP- C' (서열번호 151);
N' -ALPVTALLLPLALLLHAARPLYEQKLISEEDLKYKSRRSFIEEKKMP- C' (서열번호 152);
N' -ALPVTALLLPLALLLHAARPLYCYPYDVPDYAKYKSRRSFIEEKKMP- C' (서열번호 153);
N' -ALPVTALLLPLALLLHAARPLYKKLETFKKTN- C' (서열번호 154); 및
N' -ALPVTALLLPLALLLHAARPLYEQKLISEEDLKKLETFKKTN-C' (서열번호 155) 중에 어느 하나 이상일 수 있다(밑줄은 CD8α 신호서열을 의미함).
일 구현 예에서, 상기 CD8α 신호서열은 트래퍼 분자의 N말단 또는 N말단과 인접한 부위에 위치할 수 있고, 막관통 도메인과 연결될 수 있다.
이 경우에서, 예를 들어, 상기 아미노산 서열은 N' -IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCALPVTALLLPLALLLHAARP- C' (서열번호 156)일 수 있다 (밑줄은 CD8α 신호서열을 의미함).
다른 구현 예에서, 상기 CD8α 신호서열은 트래퍼 분자의 C말단 또는 C말단과 인접한 부위에 위치할 수 있고, 결합 도메인과 연결될 수 있다.
이 경우에서, 예를 들어, 상기 아미노산 서열은,
N' -LFIMIVGGLVGLRIVFAVLSIALPVTALLLPLALLLHAARP - C' (서열번호 157);
N' - LFIMIVGGLVGLRIVFAVLSIALPVTALLLPLALLLHAARP -C' (서열번호 158); 및
N' -LFIMIVGGLVGLRIVFAVLSIALPVTALLLPLALLLHAARP - C' (서열번호 159) 중에 어느 하나일 수 있다(밑줄은 CD8α 신호서열을 의미함).
다른 구현 예에서, 상기 CD8α 신호서열은 트래퍼 분자의 C말단 또는 C말단과 인접한 부위에 위치할 수 있고, 잔류 도메인과 연결될 수 있다.
이 경우에서, 예를 들어, 상기 아미노산 서열은,
N' -KYKSPRSFIEEKKMPALPVTALLLPLALLLHAARP- C' (서열번호 160);
N' -LKYKSRRSFIEEKKMPALPVTALLLPLALLLHAARP- C' (서열번호 161);
N' -LYKYKSRRSFIEEKKMPALPVTALLLPLALLLHAARP- C' (서열번호 162);
N' -LYCKYKSRRSFIEEKKMPALPVTALLLPLALLLHAARP- C' (서열번호 163);
N' -KYCNKYKSRRSFIEEKKMPALPVTALLLPLALLLHAARP- C' (서열번호 164);
N' -LYKYKSRRSFIDEKKMPALPVTALLLPLALLLHAARP- C' (서열번호 165);
N' -LYCNKYKSRRSFIDEKKMPALPVTALLLPLALLLHAARP- C' (서열번호 166);
N' -LYEQKLISEEDLKYKSRRSFIEEKKMPALPVTALLLPLALLLHAARP- C' (서열번호 167);
N' -LYCYPYDVPDYAKYKSRRSFIEEKKMPALPVTALLLPLALLLHAARP- C' (서열번호 168);
N' -LYKKLETFKKTNALPVTALLLPLALLLHAARP- C' (서열번호 169); 및
N'-LYEQKLISEEDLKKLETFKKTNALPVTALLLPLALLLHAARP- C' (서열번호 170) 중에 어느 하나 이상일 수 있다(밑줄은 CD8α 신호서열을 의미함).
다른 구현 예에서, 상기 CD8α 신호서열은 트래퍼 분자의 C말단 또는 C말단과 인접한 부위에 위치할 수 있고, 막관통 도메인과 연결될 수 있다.
이 경우에서, 예를 들어, 상기 아미노산 서열은 N' -ALPVTALLLPLALLLHAARPIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC- C' (서열번호 171)일 수 있다 (밑줄은 CD8α 신호서열을 의미함).
5.6. [결합 도메인] - [잔류 도메인]을 포함하는 트래퍼 분자
본 명세서에 개시하는 내용의 일 태양은 [결합 도메인] - [잔류 도메인]을 포함하는 트래퍼 분자에 관한 것이다.
상기 트래퍼 분자는
i) 면역 활성화 수용체에 결합할 수 있는 gp41의 일부 도메인; 및
ii) 소포체 잔류 도메인, 골지체 잔류 도메인 및 가수분해 복합체(proteasome) 잔류 도메인 중 어느 하나를 포함하는,
면역 활성화 수용체 (immune activating receptor) 전부 또는 일부를 세포 내 가두기 위한 폴리펩타이드일 수 있다.
상기 결합 도메인 및 잔류 도메인에 관한 설명은 전술한 바와 같다.
일 구현예에서, 상기 트래퍼 분자는 N'- [gp41 유래 결합 도메인] - [잔류 도메인]-C' 일 수있다.
예를 들어, 상기 트래퍼 분자의 아미노산 서열은
N'-AVGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQLKDEL-C' (서열번호 172);
N'-SNKSLEQIWNHTTWMEWDKDEL-C' (서열번호 173); 및/또는
N'-LFIMIVGGLVGLRIVFAVLSIKDEL-C' (서열번호 174)
일 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 트래퍼 분자는 N'- [gp41 유래 결합 도메인] - [연결도메인] - [잔류 도메인] - C'일 수 있다.
예를 들어, 상기 트래퍼 분자의 아미노산 서열은
N'-AVGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL- C' (서열번호 175) 일 수 있다.
또는, 상기 트래퍼 분자의 아미노산 서열은
N'- TTAVPWNASWSNKSLEQIGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL-C' (서열번호 176);
N'- WNASWSNKSLEQIWNHTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL- C' (서열번호 177);
N'- SNKSLEQIWNHTTWMEWDGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL- C' (서열번호 178); 및/또는
N'- EQIWNHTTWMEWDREINNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL- C' (서열번호 179);
일 수 있다.
다른 예로, 상기 N'- [ISLAD] - [연결 도메인] - [잔류 도메인] - C'을 포함하는 트래퍼 분자의 아미노산 서열은 N'- SNKSLEQIWNHTTWMEWDGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL - C' (서열번호 180)일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 트래퍼 분자는 N'- [gp41 유래 결합 도메인] - [막관통 도메인] - [잔류 도메인] - C'일 수 있다.
예를들어, 상기 트래퍼 분자의 아미노산 서열은
N'- AVGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQLIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEEKKMP - C' (서열번호 181);
N'-LFIMIVGGLVGLRIVFAVLSIIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEEKKMP- C' (서열번호 182);
N'- TTAVPWNASWSNKSLEQIIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEEKKMP - C' (서열번호 183);
N'- WNASWSNKSLEQIWNHTIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEEKKMP - C' (서열번호 184); 및/또는
N'- SNKSLEQIWNHTTWMEWDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEEKKMP - C' (서열번호 185)
N'- EQIWNHTTWMEWDREINNIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEEKKMP - C' (서열번호 186)
중에 어느 하나를 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 트래퍼 분자는 N'- [gp41 유래 결합 도메인] - [막관통 도메인] - [연결 도메인] - [잔류 도메인] - C'일 수 있다.
예를들어, 상기 트래퍼 분자의 아미노산 서열은
예를들어, 상기 트래퍼 분자는 N'- AVGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQLIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEEGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL- C' (서열번호 187);
N'-TTAVPWNASWSNKSLEQIIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEEGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL- C' (서열번호 188);
N'- WNASWSNKSLEQIWNHTIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEEGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL- C' (서열번호 189);
N'- SNKSLEQIWNHTTWMEWDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEE GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL- C' (서열번호 190);
N'- EQIWNHTTWMEWDREINNIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEEGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL- C' (서열번호 191);
N'- AVGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQLIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL- C' (서열번호 192);
N'-TTAVPWNASWSNKSLEQIIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL- C' (서열번호 193);
N'- WNASWSNKSLEQIWNHTIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL- C' (서열번호 194);
N'- SNKSLEQIWNHTTWMEWDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL- C' (서열번호 195); 및/또는
N'- EQIWNHTTWMEWDREINNIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL- C' (서열번호 196)
일 수 있다.
이 때, 상기 막관통 도메인과 연결도메인은 서로 위치가 바뀔 수 있다. 예를 들어, N'- [gp41 유래 결합 도메인] - [연결 도메인] - [막관통 도메인] - [잔류 도메인] - C'일 수 있다.
다른 구현 예에서, 상기 트래퍼 분자는 N'- [막관통 도메인] - [gp41 유래 결합 도메인] - [연결도메인] - [잔류 도메인] - C'일 수 있다.
예를들어, 상기 트래퍼 분자는
N'-IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCAVGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL- C' (서열번호 197);
N'-IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCTTAVPWNASWSNKSLEQIGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL- C' (서열번호 198);
N'-IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCWNASWSNKSLEQIWNHTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL- C' (서열번호 199);
N'-IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCSNKSLEQIWNHTTWMEWDGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL- C' (서열번호 200); 및/또는
N'-IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCEQIWNHTTWMEWDREINNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL- C' (서열번호 201);
일 수 있다.
일 구현 예에서, 상기 트래퍼 분자는 N'- [gp41 유래 결합 도메인] - [연결도메인] - [잔류 도메인] - [막관통 도메인] - C'일 수 있다.
일 예로, 상기 트래퍼 분자는
N'-AVGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDELIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC- C' (서열번호 202);
N'-TTAVPWNASWSNKSLEQILGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDELIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEE- C' (서열번호 203);
N'-WNASWSNKSLEQIWNHTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDELIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEE- C' (서열번호 204);
N'-SNKSLEQIWNHTTWMEWDGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDELIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEE- C' (서열번호 205); 및/또는
N'-EQIWNHTTWMEWDREINNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDELIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEE- C' (서열번호 206);
일 수 있다.
상기 트래퍼 분자는 CD8α 신호서열을 더 추가할 수 있다.
상기 CD8α 신호서열에 관한 설명은 전술한 바와 같다.
CD8α 신호서열은 트래퍼 분자의 양 말단 중 어느 하나 이상에 추가될 수 있다.
일 구현 예에서, 상기 트래퍼 분자는 N'- [CD8α 신호서열] - [gp41 유래 결합 도메인] - [잔류 도메인] - C'일 수 있다.
예를 들어, 상기 트래퍼 분자는,
*N'-ALPVTALLLPLALLLHAARPAVGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQLKDEL- C' (서열번호 207);
N'-ALPVTALLLPLALLLHAARPTTAVPWNASWSNKSLEQIKDEL- C' (서열번호 208);
N'-ALPVTALLLPLALLLHAARPWNASWSNKSLEQIWNHTKDEL- C' (서열번호 209);
N'-ALPVTALLLPLALLLHAARPSNKSLEQIWNHTTWMEWKDEL- C' (서열번호 210); 및/또는
N'-ALPVTALLLPLALLLHAARPEQIWNHTTWMEWDREINNKDEL- C' (서열번호 211);
일 수 있다.
다른 구현 예에서, 상기 트래퍼 분자는 N'- [gp41 유래 결합 도메인] - [잔류 도메인] - [CD8α 신호서열] - C'일 수 있다.
예를들어, 상기 트래퍼 분자는
N'-AVGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQLKDELALPVTALLLPLALLLHAARP- C' (서열번호 212);
N'-TTAVPWNASWSNKSLEQIKDELALPVTALLLPLALLLHAAR- C' (서열번호 213);
N'-WNASWSNKSLEQIWNHTKDELALPVTALLLPLALLLHAAR- C' (서열번호 214);
N'-SNKSLEQIWNHTTWMEWDKDELALPVTALLLPLALLLHAAR- C' (서열번호 215); 및/또는
N'-EQIWNHTTWMEWDREINNKDELALPVTALLLPLALLLHAAR- C' (서열번호 216);
일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 트래퍼 분자는 N'- [CD8α 신호서열] - [gp41 유래 결합 도메인] - [연결도메인] - [잔류 도메인] - C'일 수 있다.
예를들어, 상기 트래퍼 분자는
N'-ALPVTALLLPLALLLHAARPAVGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL- C' (서열번호 217);
N'-ALPVTALLLPLALLLHAARPTTAVPWNASWSNKSLEQIGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL- C' (서열번호 218);
N'-ALPVTALLLPLALLLHAARPWNASWSNKSLEQIWNHTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL- C' (서열번호 219);
N'-ALPVTALLLPLALLLHAARPSNKSLEQIWNHTTWMEWDGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL- C' (서열번호 220); 및/또는
N'-ALPVTALLLPLALLLHAARPEQIWNHTTWMEWDREINNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL- C' (서열번호 221);
일 수 있다.
또는, 상기 트래퍼 분자는 N'- [gp41 유래 결합 도메인] - [연결도메인] - [잔류 도메인] - [CD8α 신호서열] - C'일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 트래퍼 분자는 N'- [CD8α 신호서열] - [gp41 유래 결합 도메인] - [막관통 도메인] - [잔류 도메인] - C'일 수 있다.
예를들어, 상기 트래퍼 분자는
N'-ALPVTALLLPLALLLHAARPAVGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQLIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEEKKMP- C' (서열번호 222);
N'-ALPVTALLLPLALLLHAARPTTAVPWNASWSNKSLEQIIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEEKKMP- C' (서열번호 223);
N'-ALPVTALLLPLALLLHAARPWNASWSNKSLEQIWNHTIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEEKKMP- C' (서열번호 224); 및/또는
N'-ALPVTALLLPLALLLHAARPTTAVPWNASWSNKSLEQIIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEEKKMP- C' (서열번호 225);
일 수 있다.
또는, 상기 트래퍼 분자는 N' - [gp41 유래 결합 도메인] - [막관통 도메인] - [잔류 도메인] - [CD8α 신호서열] - C'일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 트래퍼 분자는 N'- [CD8α 신호서열] - [gp41 유래 결합 도메인] - [막관통 도메인] - [연결도메인] - [잔류 도메인] - C'일 수 있다.
예를들어, 상기 트래퍼 분자는
N'-ALPVTALLLPLALLLHAARPAVGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQLIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEEGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL- C' (서열번호 226);
N'-ALPVTALLLPLALLLHAARPTTAVPWNASWSNKSLEQIIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL- C' (서열번호 227);
N'-ALPVTALLLPLALLLHAARPWNASWSNKSLEQIWNHTIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL- C' (서열번호 228); 및/또는
N'-ALPVTALLLPLALLLHAARPEQIWNHTTWMEWDREINNIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL- C' (서열번호 229);
일 수 있다.
또는, 상기 트래퍼 분자는 N' - [gp41 유래 결합 도메인] - [막관통 도메인] - [연결도메인] - [잔류 도메인] - [CD8α 신호서열] - C'일 수 있다.
상기 막관도메인과 연결도메인은 서로 위치가 바뀔 수 있다. 예를 들어, N'- [CD8α 신호서열] - [gp41 유래 결합 도메인] - [연결 도메인] - [막관통 도메인] - [잔류 도메인] - C'일 수 있다.
일 구현 예에서, 상기 트래퍼 분자는 N'- [CD8α 신호서열] - [막관통 도메인] - [gp41 유래 결합 도메인] - [연결도메인] - [잔류 도메인] - C'일 수 있다.
예를들어, 상기 트래퍼 분자는
N'-ALPVTALLLPLALLLHAARPIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCAVGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL- C' (서열번호 230);
N'-ALPVTALLLPLALLLHAARPIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCTTAVPWNASWSNKSLEQIGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL- C' (서열번호 231);
N'-ALPVTALLLPLALLLHAARPIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCWNASWSNKSLEQIWNHTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL- C' (서열번호 232);
N'-ALPVTALLLPLALLLHAARPIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCSNKSLEQIWNHTTWMEWDGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL- C' (서열번호 233); 및/또는
N'-ALPVTALLLPLALLLHAARPIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCEQIWNHTTWMEWDREINNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL- C' (서열번호 234);
일 수 있다.
또는, 상기 트래퍼 분자는 N' - [막관통 도메인] - [gp41 유래 결합 도메인] - [연결도메인] - [잔류 도메인] - [CD8α 신호서열] - C'일 수 있다.
일 구현 예에서, 상기 트래퍼 분자는 N'- [CD8α 신호서열] - [gp41 유래 결합 도메인] - [연결도메인] - [잔류 도메인] - [막관통 도메인] - C'일 수 있다.
예를들어, 상기 트래퍼 분자는
N'-ALPVTALLLPLALLLHAARPAVGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDELIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC- C' (서열번호 235);
N'-ALPVTALLLPLALLLHAARPTTAVPWNASWSNKSLEQIGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDELIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC- C' (서열번호 236);
N'-ALPVTALLLPLALLLHAARPWNASWSNKSLEQIWNHTGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDELIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC- C' (서열번호 237);
N'-ALPVTALLLPLALLLHAARPSNKSLEQIWNHTTWMEWDGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDELIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC- C' (서열번호 238); 및/또는
N'-ALPVTALLLPLALLLHAARPEQIWNHTTWMEWDREINNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDELIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC- C' (서열번호 239);
일 수 있다.
또는, 상기 트래퍼 분자는 N'- [gp41 유래 결합 도메인] - [연결도메인] - [잔류 도메인] - [막관통 도메인] - [CD8α 신호서열] - C'일 수 있다.
상기 트래퍼 분자의 구현 예의 N말단과 C말단은 서로 바뀔 수 있다.
6. 조작된 세포
자연적으로 존재하지 않는 외래 핵산 및/또는 폴리펩타이드를 포함하고 있는 세포를 '조작된 세포'로 지칭한다. 이때 상기 외래 핵산 및/또는 폴리펩타이드는 트래퍼 펩타이드인 것이 바람직하다. 본 발명의 다른 목적은 상기 트래퍼 펩타이드를 포함하는 조작된 세포를 제공하는 것에 있다.
일 실시예에서, 조작된 세포는 트래퍼 펩타이드를 펩타이드의 형태로 포함할 수 있다. 어떤 예시에서, 트래퍼 펩타이드는 조작된 세포의 세포질에 다량으로 분포될 수 있다. 어떤 예시에서, 트래퍼 펩타이드는 조작된 세포의 특정 세포 소기관에 다량으로 분포될 수 있다. 예를 들어, 트래퍼 펩타이드는 조작된 세포의 소포체, 골지체 또는 세포막에 다량으로 분포될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 트래퍼 펩타이드의 분포를 측정하기 위하여 면역형광 염색법 등 통상적으로 알려져 있는 방법을 통해 확인할 수 있다. 어떤 예시에서, 트래퍼 펩타이드는 전장 펩타이드 서열 (whole peptide sequence)의 형태로 존재할 수 있다.
어떤 실시예에서, 조작된 세포는 트래퍼 펩타이드 또는 이를 암호화하는 염기 서열을 포함할 수 있다. 이때, 상기 염기 서열은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 어떤 예시에서, 상기 염기 서열은 벡터에 포함된 상태일 수 있다. 어떤 예시에서, 트래퍼 펩타이드는 그 자체로서 조작된 세포에 포함될 수 있다. 어떤 예시에서, 트래퍼 펩타이드는 조작된 세포의 게놈과 분리된 염기 서열 (separated base sequence from the genome of the manipulated cell)의 상태로 존재할 수 있다. 어떤 예시에서, 트래퍼 펩타이드는 조작된 세포의 게놈에 삽입된 상태로 존재할 수 있다.
어떤 실시예에서, 조작된 세포는 트래퍼 펩타이드를 펩타이드 및 이를 암호화하는 염기 서열을 포함할 수 있다. 어떤 예시에서, 조작된 세포는 트래퍼 펩타이드의 펩타이드 서열 및 이를 암호화하는 염기 서열을 포함할 수 있다.
어떤 실시예에서, 조작된 세포는 야생 상태 세포와 형질이 동일할 수 있다. 어떤 예시에서, 조작된 세포는 야생 상태 세포와 목적 물질의 발현 형태에 있어 야생 상태 세포와 동일한 형질을 보일 수 있다.
어떤 실시예에서 조작된 세포는 야생 상태 세포와 형질이 다른 것일 수 있다.
이때, 조작된 세포는 목적 분자의 발현 형태에 있어 야생 상태 세포와 상이한 형질을 보일 수 있다.
또한, 상기 조작된 세포는 야생 상태 세포와 상이한 형질을 비영구적으로 보일 수 있다. 또는, 상기 조작된 세포는 야생 상태 세포와 상이한 형질을 영구적으로 보일 수 있다. 또는, 상기 조작된 세포는 야생 상태 세포와 상이한 형질을 반영구적으로 보일 수 있다.
조작된 세포가 될 수 있는 세포의 종류는 한정되지 않는다. 예컨데 조작된 세포는 체세포, 생식세포, 분비세포, 신경세포 등 그 종류가 한정되지 않는다. 다만 조작된 세포의 바람직한 예시는 면역 세포에 대한 것이다.
7. 조작된 세포를 제조하는 방법
본 발명의 또 다른 목적은 상기 트래퍼 펩타이드를 사용하여 조작된 세포를 제조하는 방법을 제공하는 것에 있다.
일 실시예에서 상기 조작된 세포의 제조 방법은
트래퍼 펩타이드 또는 이를 암호화하는 핵산을 세포에 도입함을 포함할 수 있다.
다른 실시예에서 상기 조작된 세포의 제조 방법은
트래퍼 펩타이드 또는 이를 암호화하는 핵산을 세포에 도입함; 및
야생 상태 세포와 상이한 형질을 유도함을 포함할 수 있다.
다른 실시예에서 상기 조작된 세포의 제조 방법은
트래퍼 펩타이드 또는 이를 암호화하는 핵산을 세포에 도입함; 및
야생 상태 세포와 상이한 형질이 유도된 세포를 단리함을 포함할 수 있다.
다른 실시예에서 상기 조작된 세포의 제조 방법은
트래퍼 펩타이드 또는 이를 암호화하는 핵산을 세포에 도입함;
야생 상태 세포와 상이한 형질을 유도함;
상기 상이한 형질이 유도된 세포를 단리함을 포함할 수 있다.
본 발명에서 트래퍼 펩타이드 또는 이를 암호화하는 핵산을 세포에 도입함에 있어 예시들을 부연한다. 일 예시에서, 트래퍼 펩타이드가 세포에 도입될 수 있다. 어떤 예시에서, 트래퍼 펩타이드를 암호화하는 핵산이 세포에 도입될 수 있다. 어떤 예시에서, 트래퍼 펩타이드 및 이를 암호화하는 핵산이 세포에 도입될 수 있다. 어떤 예시에서, 트래퍼 펩타이드를 암호화하는 핵산은 핵산을 세포 내로 전달할 수 있는 벡터에 도입된 상태로 세포에 도입될 수 있다. 어떤 예시에서, 트래퍼 펩타이드를 암호화하는 핵산을 세포 내로 전달하기 위하여 비벡터가 사용될 수 있다. 어떤 예시에서, 트래퍼 펩타이드 또는 이를 암호화하는 핵산은 조작된 세포를 제조하기 위한 조성물에 포함되어 세포에 도입될 수 있다. 그밖에 활용 가능한 다양한 전달 수단은 이하의 '전달 및 전달 방법'에 개시되어 있다.
본 발명에서 야생 상태 세포와 상이한 형질을 유도함에 있어 예시들을 부연한다. 일 예시에서, 상이한 형질은 세포의 배양을 통하여 유도될 수 있다. 이때, 상이한 형질은 TCR 하위 유닛 중 적어도 하나의 세포 표면의 양이 감소함일 수 있다.
본 발명에서 야생 사태와 상이한 형질이 유도된 세포를 단리함에 있어 예시들을 부연한다. 이때, 상이한 형질은 TCR 하위 유닛 중 적어도 하나의 세포 표면의 양이 감소함일 수 있다. 일 예시에서, 상기 상이한 형질이 유도된 세포를 상기한 형질이 유도되지 않은 세포로부터 단리할 수 있다. 이때, 세포를 단리함은 FACS, MACS, 압타머 센서 등 통상적으로 알려진 방법에 의하여 수행될 수 있다.
이때, 트래퍼 펩타이드 또는 이를 암호화하는 핵산을 세포에 도입함을 거친 조작된 세포는 야생 상태 세포와 형질이 동일할 수 있다. 이 경우 선택적으로, 상기 조작된 세포를 형질이 변화하지 않도록 통제함을 추가할 수 있다. 상기 조작된 세포를 형질이 변화하지 않도록 통제함은 예시적으로 동결보존 (cryopreservation) 등의 통상의 방법을 사용할 수 있다. 또는, 트래퍼 펩타이드 또는 이를 암호화하는 핵산을 세포에 도입함을 거친 조작된 세포는 야생 상태 세포와 형질이 상이할 수 있다.
상기 조작은 체내 (in-vivo)에서 수행될 수 있다. 또는, 상기 조작은 체외 (in-vitro)에서 수행될 수 있다.
바람직하게는, 상기 세포는 면역 세포일 수 있다.
8. 조작된 세포를 제조하기 위한 조성물
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조작된 세포를 제조하는 방법을 제공하기 위한 조성물을 제공하는 것에 있다.
이때, 상기 조성물은 트래퍼 펩타이드 및/또는 이를 암호화하는 염기 서열을 포함할 수 있다.
또는, 상기 조성물은 i) 트래퍼 펩타이드 및/또는 이를 암호화하는 염기 서열, 및 ii) 상기 트래퍼 펩타이드 및/또는 이를 암호화하는 염기 서열을 전달하기 위한 벡터를 포함할 수 있다. 이때, 트래퍼 펩타이드 및/또는 이를 암호화하는 염기 서열은 벡터 내부에 내포된 (enclosed) 상태일 수 있다. 또는, 트래퍼 펩타이드 및/또는 이를 암호화하는 염기 서열은 벡터의 외부에 결합된 (attached) 상태일 수 있다.
일 실시예에서, 조작된 세포는 트래퍼 펩타이드를 펩타이드의 형태로 포함할 수 있다. 어떤 예시에서, 트래퍼 펩타이드는 조작된 세포의 세포질에 다량으로 분포될 수 있다. 어떤 예시에서, 트래퍼 펩타이드는 조작된 세포의 특정 세포 소기관에 다량으로 분포될 수 있다. 예를 들어, 트래퍼 펩타이드는 조작된 세포의 소포체, 골지체 또는 세포막에 다량으로 분포될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 트래퍼 펩타이드의 분포를 측정하기 위하여 면역형광 염색법 등 통상적으로 알려져 있는 방법을 통해 확인할 수 있다.
9. 조작된 면역 세포
본 명세서에 의하여 개시되는 내용은 트래퍼 분자 및/또는 인공수용체를 포함하고 있는 조작된 면역 세포에 관한 것이다.
상기 조작된 면역 세포는 다음과 같은 특징들을 보일 수 있다:
i) 면역 활성화 수용체의 발현 형태에 있어 야생 상태 세포와 차이를 보이지 않음
ii) 면역 활성화 수용체의 발현 형태에 있어 야생 상태 세포와 상이한 형질을 보임
iii) 인공수용체를 포함함.
다만, 상기 특징들은 조작된 면역 세포가 가질 수 있는 예시적인 특징일 뿐이고, 이의 특징이 이에 한정되는 것은 아니다.
"조작된" 면역세포란, 자연적으로 존재하지 않는 외래 핵산 및/또는 폴리펩타이드를 포함하고 있는 면역세포를 말한다. 또한, 조작된 면역세포가 자연 그대로 존재하는 야생형 면역세포 또는 자연적 발생에 의한 돌연변이형 면역세포와 형상학적으로 상이하다면, 이는 조작된 면역세포에 해당한다.
이하 조작된 면역 세포가 가질 수 있는 특징에 대하여 상세히 분설한다.
9.1. 면역 활성화 수용체의 발현 형태에 있어 야생 상태 세포와 상이한 형질을 보임/보이지 않음
어떤 실시예에서, 조작된 면역 세포는 야생 상태 세포와 형질이 동일할 수 있다. 어떤 예시에서, 조작된 면역 세포는 야생 상태 세포와 TCR 복합체의 발현 형태에 있어 야생 상태 세포와 동일한 형질을 보일 수 있다.
어떤 실시예에서 조작된 면역 세포는 야생 상태 세포와 형질이 다른 것일 수 있다.
이때, 조작된 면역 세포는 TCR 복합체의 발현 형태에 있어 야생 상태 세포와 상이한 형질을 보일 수 있다. 이때, 조작된 면역 세포는 세포 내 및/또는 표면의 임의의 TCR 하위 유닛의 양이 야생 상태 세포와 상이해 질 수 있다.
세포 내 TCR 하위 유닛의 양은 세포를 용해 (lyse)한 후 용해액 (lysate) 내의 TCR 하위 유닛의 농도를 측정하여 측정하거나 그 밖의 통상적인 방법으로 측정할 수 있다. 예시적으로 세포 표면의 TCR 하위 유닛의 양은 유세포 분석 (cytometry)을 통해 측정하거나 그 밖의 통상적인 방법으로 측정할 수 있다.
일 예시에서, 조작된 면역 세포는 임의의 TCR 하위 유닛에 있어 세포 내 TCR 하위 유닛의 양과 세포 포면의 TCR 하위 유닛의 양의 합이 감소될 수 있다. 이때, 세포 내의 양과 세포 표면의 양의 합을 '세포 내외 총량 (net amount throughout cell)' 어느 경우, 조작된 면역 세포는 TCR-α 체인, TCR-β 체인, TCR-γ 체인, TCR-δ 체인, CD3γ 체인, CD3δ 체인, CD3ε 체인, zeta chain, 및 중간 TCR 복합체로부터 선택된 하나 이상에 대하여 세포 내외 총량이 감소될 수 있다. 어느 경우, 조작된 면역 세포는 TCR 하위 유닛의 세포 내의 양이 감소될 수 있다. 어느 경우, 조작된 면역 세포는 세포 내외 총량이 감소된 TCR 하위 유닛을 제외한 다른 TCR 하위 유닛의 세포 내외 총량이 야생 상태 세포와 동일/유사할 수 있다. 어느 경우, 조작된 면역 세포는 TCR 하위 유닛 중 적어도 하나의 유전적 발현량 (amount of genetic expression)이 감소될 수 있다. 어느 경우, 조작된 면역 세포는 TCR 하위 유닛 중 적어도 하나의 펩타이드 분해 과정 (peptide elimination process)이 촉진될 수 있다. 이때, 상기 펩타이드 분해 과정은 면역 반응 (immune response) 또는 가수분해 (hydrolysis)에 의한 것일 수 있으나 이에 국한되지 않는다.
어느 경우, 조작된 면역 세포는 TCR 하위 유닛의 세포 표면의 양이 감소될 수 있다. 예시적으로, 조작된 면역 세포는 TCR 하위 유닛 중 적어도 하나의 세포 내의 양이 야생 상태 세포 보다 증가될 수 있다. 즉, TCR 하위 유닛이 세포 내에 잔류 (retained)함으로써 세포 표면의 양이 감소될 수 있다. 또는 예시적으로, 조작된 면역 세포는 세포 표면의 TCR 하위 유닛의 양 대 세포 내의 TCR 하위 유닛의 양의 비가 야생 상태 세포에 비하여 감소될 수 있다.
이때, 조작된 면역 세포 내부의 구성요소 간 가능한 위치 관계에 관하여 설명한다. 구성요소 간 위치 관계는 면역형광 염색법 외의 통상적인 방법으로 확인할 수 있다. 설명의 편의를 위하여, TCR 하위 유닛이 조작된 면역 세포 내부의 특정 세포 소기관에 잔류하는 경우를 상정한다.
어떤 예시에서, 조작된 면역 세포는 트래퍼 펩타이드의 잔류 도메인이 상기 세포 소기관의 막에 결합되어 있고;
트래퍼 펩타이드의 결합 도메인이 TCR 하위 유닛과 상호작용하며 또한 상기 세포 소기관의 막에 결합되어 있고; 또한
상기 TCR 하위 유닛이 상기 세포 소기관의 막에 결합되어 있는 상태일 수 있다.
다른 예시에서, 조작된 면역 세포는 트래퍼 펩타이드의 잔류 도메인이 상기 세포 소기관의 막에 결합되어 있고;
트래퍼 펩타이드의 결합 도메인이 TCR 하위 유닛과 상호작용하며 또한 상기 세포 소기관의 막에 결합되어 있고; 또한
상기 TCR 하위 유닛이 상기 세포 소기관 내부에 존재하는 상태일 수 있다.
또 다른 예시에서, 조작된 면역 세포는 트래퍼 펩타이드의 잔류 도메인이 상기 세포 소기관의 막에 결합되어 있고;
트래퍼 펩타이드의 결합 도메인이 TCR 하위 유닛과 상호작용하며 또한 상기 세포 소기관의 막에 결합되어 있고; 또한
상기 TCR 하위 유닛이 상기 세포 소기관의 외부에 존재하는 상태일 수 있다.
또 다른 예시에서, 조작된 면역 세포는 트래퍼 펩타이드의 잔류 도메인이 상기 세포 소기관의 막에 결합되어 있고;
트래퍼 펩타이드의 결합 도메인이 TCR 하위 유닛과 상호작용하며 또한 상기 세포 소기관의 외부에 존재하고; 또한
상기 TCR 하위 유닛이 상기 세포 소기관의 외부에 존재하는 상태일 수 있다.
또 다른 예시에서, 조작된 면역 세포는 트래퍼 펩타이드의 잔류 도메인이 상기 세포 소기관의 막에 결합되어 있고;
트래퍼 펩타이드의 결합 도메인이 TCR 하위 유닛과 상호작용하며 또한 상기 세포 소기관의 외부에 존재하고; 또한
상기 TCR 하위 유닛이 상기 세포 소기관의 막에 결합되어 있는 상태일 수 있다.
또 다른 예시에서, 조작된 면역 세포는 트래퍼 펩타이드의 잔류 도메인이 상기 세포 소기관의 막에 결합되어 있고;
트래퍼 펩타이드의 결합 도메인이 TCR 하위 유닛과 상호작용하며 또한 상기 세포 소기관의 내부에 존재하고; 또한
상기 TCR 하위 유닛이 상기 세포 소기관의 막에 결합되어 있는 상태일 수 있다.
또 다른 예시에서, 조작된 면역 세포는 트래퍼 펩타이드의 잔류 도메인이 상기 세포 소기관의 막에 결합되어 있고;
트래퍼 펩타이드의 결합 도메인이 TCR 하위 유닛과 상호작용하며 또한 상기 세포 소기관의 내부에 존재하고; 또한
상기 TCR 하위 유닛이 상기 세포 소기관의 내부에 존재하는 상태일 수 있다.
또 다른 예시에서, 조작된 면역 세포는 트래퍼 펩타이드의 잔류 도메인이 상기 세포 소기관의 막에 결합되어 있고;
트래퍼 펩타이드의 결합 도메인이 TCR 하위 유닛과 상호작용하며 또한 상기 세포 소기관의 막에 결합하되 세포 소기관의 내부 방향으로 발현 (expressed toward organelle-interior direction)되어 있고; 또한
상기 TCR 하위 유닛이 상기 세포 소기관의 막에 결합하되 세포 소기관의 내부 방향으로 발현되어 있는 상태일 수 있다.
어떤 예시에서, 조작된 면역 세포는 세포 표면의 TCR 복합체의 양이 감소될 수 있다. 일 예시에서, 조작된 면역 세포는 세포 표면의 TCR 복합체의 양 대 세포 내의 TCR 복합체의 양의 비가 감소될 수 있다.
다른 추가적인 예시에서, 조작된 면역 세포는 정상적인 TCR 복합체의 비율 대비 비정상적인 TCR 복합체의 비율 (ratio of abnormal TCR complex to normal TCR complex)이 증가될 수 있다. 어떤 경우, 상기 비정상적인 TCR 복합체는 TCR 하위 유닛 중 적어도 하나의 펩타이드 서열이 야생 상태와 상이할 수 있다. 어떤 경우, 상기 비정상적인 TCR 복합체는 TCR 하위 유닛 중 적어도 하나를 포함하지 않는 것일 수 있다. 어떤 경우, 상기 비정상적인 TCR 복합체는 야생 상태의 TCR 하위 유닛이 아닌 외부 구성요소를 포함할 수 있다. 이때, 외부 구성요소는 트래퍼 펩타이드와 상동성이 있을 수 있다.
상기 상이한 형질에 관한 실시예/예시들은 상호 배타적인 것이 아니며, 조작된 면역 세포는 상기 변형된 형질 중 2 개 이상의 형질이 복합적으로 나타날 수도 있다.
또한, 상기 조작된 면역 세포는 야생 상태 세포와 상이한 형질을 비영구적으로 보일 수 있다. 또는, 상기 조작된 면역 세포는 야생 상태 세포와 상이한 형질을 영구적으로 보일 수 있다. 또는, 상기 조작된 면역 세포는 야생 상태 세포와 상이한 형질을 반영구적으로 보일 수 있다.
상기 조작된 면역 세포는 면역활성화 수용체가 세포 내 갇혀 있는 면역 세포를 포함한다.
상기 면역활성화 수용체가 세포 내 갇힌 면역 세포는 트래퍼 분자를 포함할 수 있다.
이때, 트래퍼 분자는 면역 활성화 수용체와 결합하여, 면역 활성화 수용체가 세포 내 갇힌 면역 세포일 수 있다.
상기 조작된 면역 세포는 조작된 T세포일 수 있다.
조작된 T 세포는 조작된 CD4+ T세포, 조작된 CD8+ T세포, 조작된 NK세포 및 조작된 조절 T 세포일 수 있다. 또한, 조작된 CD4+ T세포는 조작된 Th1, Th2, Th3, Th17 또는 Th9 T세포 중 어느 하나일 수 있다.
바람직하게 상기 T 세포는 CD8+ T세포 또는 CD4+ T세포일 수 있다.
상기 조작된 T세포는 T세포 수용체(TCR) 및/또는 TCR/CD3복합체가 세포 내 트랩된 세포일 수 있다. 이때, 상기 T세포 수용체 및/또는 TCR/CD3복합체는 정상적으로 발현하지만, T세포 표면에 위치하지 못하도록 인위적으로 조작될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 조작된 T세포는 세포 내에서 TCR 하위 유닛 중 적어도 어느 하나가 트래퍼 분자와 결합되어 있을 수 있다.
상기 조작된 T세포는 TCR/CD3복합체가 T세포 소기관, 세포질 및/또는 세포 막 사이에 존재할 수 있다. 즉, 면역 활성화 수용체와 트래퍼 분자가 결합하여 소포체 내 갇혀있는 T세포일 수 있다.
예를 들어, 상기 조작된 T세포는 AVGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL (서열번호 182); SNKSLEQIWNHTTWMEWDGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL (서열번호 185); SNKSLEQIWNHTTWMEWDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEEKKMP (서열번호 192); 또는 LFIMIVGGLVGLRIVFAVLSIGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL (서열번호 240)의 서열을 가진 트래퍼 분자가 면역활성화 수용체의 전부 및/또는 일부 도메인과 결합하여, 소포체 내에 면역활성화 수용체가 잔류되어 있다.
상기 조작된 T세포는 발현된 트래퍼 분자를 포함하지 않은 T세포와 비교하여, 세포 표면의 노출된 면역활성화 수용체가 감소된 효과를 가진다.
일 구현예에서, 상기 트래퍼 분자가 세포 내 발현되어 있는 조작된 T세포는, 그렇지 않은 T세포와 비교하여 볼 때, 세포 표면에 존재하는 T세포 수용체가 5% 이하, 7%이하, 10%이하, 15%이하, 17%이하, 20%이하, 25%이하, 27%이하, 30%이하, 35%이하, 40%이하, 45%이하, 50%이하, 60%이하, 70%이하, 80%이하, 또는 90% 이하로 존재할 수 있다.
어떤 실시예에서, 조작된 면역 세포는 야생 상태 세포와 형질이 동일할 수 있다. 어떤 예시에서, 조작된 면역 세포는 야생 상태 세포와 TCR 복합체의 발현 형태에 있어 야생 상태 세포와 동일한 형질을 보일 수 있다.
어떤 실시예에서 조작된 면역 세포는 야생 상태 세포와 형질이 다른 것일 수 있다.
이때, 조작된 면역 세포는 TCR 복합체의 발현 형태에 있어 야생 상태 세포와 상이한 형질을 보일 수 있다. 이때, 조작된 면역 세포는 세포 내 및/또는 표면의 임의의 TCR 하위 유닛의 양이 야생 상태 세포와 상이해질 수 있다.
세포 내 TCR 하위 유닛의 양은 세포를 용해 (lyse)한 후 용해액 (lysate) 내의 TCR 하위 유닛의 농도를 측정하여 측정하거나 그 밖의 통상적인 방법으로 측정할 수 있다. 예시적으로 세포 표면의 TCR 하위 유닛의 양은 유세포 분석 (cytometry)을 통해 측정하거나 그 밖의 통상적인 방법으로 측정할 수 있다.
일 예시에서, 조작된 면역 세포는 임의의 TCR 하위 유닛에 있어 세포 내 TCR 하위 유닛의 양과 세포 포면의 TCR 하위 유닛의 양의 합이 감소될 수 있다. 이때, 세포 내의 양과 세포 표면의 양의 합을 '세포 내외 총량 (net amount throughout cell)'으로 지칭한다. 어느 경우, 조작된 면역 세포는 TCR-α 체인, TCR-β 체인, TCR-γ 체인, TCR-δ 체인, CD3γ 체인, CD3δ 체인, CD3ε 체인, zeta chain, 및 중간 TCR 복합체로부터 선택된 하나 이상에 대하여 세포 내외 총량이 감소될 수 있다. 어느 경우, 조작된 면역 세포는 TCR 하위 유닛의 세포 내의 양이 감소될 수 있다. 어느 경우, 조작된 면역 세포는 세포 내외 총량이 감소된 TCR 하위 유닛을 제외한 다른 TCR 하위 유닛의 세포 내외 총량이 야생 상태 세포와 동일/유사할 수 있다. 어느 경우, 조작된 면역 세포는 TCR 하위 유닛 중 적어도 하나의 유전적 발현량 (amount of genetic expression)이 감소될 수 있다. 어느 경우, 조작된 면역 세포는 TCR 하위 유닛 중 적어도 하나의 펩타이드 분해 과정 (peptide degradation process)이 촉진될 수 있다. 이때, 상기 펩타이드 분해 과정은 면역 반응 (immune response) 또는 가수분해 (hydrolysis)에 의한 것일 수 있으나 이에 국한되지 않는다.
어느 경우, 조작된 면역 세포는 TCR 하위 유닛의 세포 표면의 양이 감소될 수 있다. 예시적으로, 조작된 면역 세포는 TCR 하위 유닛 중 적어도 하나의 세포 내의 양이 야생 상태 세포 보다 증가될 수 있다. 즉, TCR 하위 유닛이 세포 내에 잔류 (retained)함으로써 세포 표면의 양이 감소될 수 있다. 또는 예시적으로, 조작된 면역 세포는 세포 표면의 TCR 하위 유닛의 양 대 세포 내의 TCR 하위 유닛의 양의 비가 야생 상태 세포에 비하여 감소될 수 있다.
이때, 조작된 면역 세포 내부의 구성요소 간 가능한 위치 관계에 관하여 설명한다. 구성요소 간 위치 관계는 면역형광 염색법 외의 통상적인 방법으로 확인할 수 있다. 설명의 편의를 위하여, TCR 하위 유닛이 조작된 면역 세포 내부의 특정 세포 소기관에 잔류하는 경우를 상정한다.
어떤 예시에서, 조작된 면역 세포는 트래퍼 펩타이드의 잔류 도메인이 상기 세포 소기관의 막에 결합되어 있고;
트래퍼 펩타이드의 결합 도메인이 TCR 하위 유닛과 상호작용하며 또한 상기 세포 소기관의 막에 결합되어 있고; 또한
상기 TCR 하위 유닛이 상기 세포 소기관의 막에 결합되어 있는 상태일 수 있다.
다른 예시에서, 조작된 면역 세포는 트래퍼 펩타이드의 잔류 도메인이 상기 세포 소기관의 막에 결합되어 있고;
트래퍼 펩타이드의 결합 도메인이 TCR 하위 유닛과 상호작용하며 또한 상기 세포 소기관의 막에 결합되어 있고; 또한
상기 TCR 하위 유닛이 상기 세포 소기관 내부에 존재하는 상태일 수 있다.
또 다른 예시에서, 조작된 면역 세포는 트래퍼 펩타이드의 잔류 도메인이 상기 세포 소기관의 막에 결합되어 있고;
트래퍼 펩타이드의 결합 도메인이 TCR 하위 유닛과 상호작용하며 또한 상기 세포 소기관의 막에 결합되어 있고; 또한
상기 TCR 하위 유닛이 상기 세포 소기관의 외부에 존재하는 상태일 수 있다.
또 다른 예시에서, 조작된 면역 세포는 트래퍼 펩타이드의 잔류 도메인이 상기 세포 소기관의 막에 결합되어 있고;
트래퍼 펩타이드의 결합 도메인이 TCR 하위 유닛과 상호작용하며 또한 상기 세포 소기관의 외부에 존재하고; 또한
상기 TCR 하위 유닛이 상기 세포 소기관의 외부에 존재하는 상태일 수 있다.
또 다른 예시에서, 조작된 면역 세포는 트래퍼 펩타이드의 잔류 도메인이 상기 세포 소기관의 막에 결합되어 있고;
트래퍼 펩타이드의 결합 도메인이 TCR 하위 유닛과 상호작용하며 또한 상기 세포 소기관의 외부에 존재하고; 또한
상기 TCR 하위 유닛이 상기 세포 소기관의 막에 결합되어 있는 상태일 수 있다.
또 다른 예시에서, 조작된 면역 세포는 트래퍼 펩타이드의 잔류 도메인이 상기 세포 소기관의 막에 결합되어 있고;
트래퍼 펩타이드의 결합 도메인이 TCR 하위 유닛과 상호작용하며 또한 상기 세포 소기관의 내부에 존재하고; 또한
상기 TCR 하위 유닛이 상기 세포 소기관의 막에 결합되어 있는 상태일 수 있다.
또 다른 예시에서, 조작된 면역 세포는 트래퍼 펩타이드의 잔류 도메인이 상기 세포 소기관의 막에 결합되어 있고;
트래퍼 펩타이드의 결합 도메인이 TCR 하위 유닛과 상호작용하며 또한 상기 세포 소기관의 내부에 존재하고; 또한
상기 TCR 하위 유닛이 상기 세포 소기관의 내부에 존재하는 상태일 수 있다.
또 다른 예시에서, 조작된 면역 세포는 트래퍼 펩타이드의 잔류 도메인이 상기 세포 소기관의 막에 결합되어 있고;
트래퍼 펩타이드의 결합 도메인이 TCR 하위 유닛과 상호작용하며 또한 상기 세포 소기관의 막에 결합하되 세포 소기관의 내부 방향으로 발현 (expressed toward organelle-interior direction)되어 있고; 또한
상기 TCR 하위 유닛이 상기 세포 소기관의 막에 결합하되 세포 소기관의 내부 방향으로 발현되어 있는 상태일 수 있다.
어떤 예시에서, 조작된 면역 세포는 세포 표면의 TCR 복합체의 양이 감소될 수 있다. 일 예시에서, 조작된 면역 세포는 세포 표면의 TCR 복합체의 양 대 세포 내의 TCR 복합체의 양의 비가 감소될 수 있다.
다른 추가적인 예시에서, 조작된 면역 세포는 정상적인 TCR 복합체의 비율 대비 비정상적인 TCR 복합체의 비율 (ratio of abnormal TCR complex to normal TCR complex)이 증가될 수 있다. 어떤 경우, 상기 비정상적인 TCR 복합체는 TCR 하위 유닛 중 적어도 하나의 펩타이드 서열이 야생 상태와 상이할 수 있다. 어떤 경우, 상기 비정상적인 TCR 복합체는 TCR 하위 유닛 중 적어도 하나를 포함하지 않는 것일 수 있다. 어떤 경우, 상기 비정상적인 TCR 복합체는 야생 상태의 TCR 하위 유닛이 아닌 외부 구성요소를 포함할 수 있다. 이때, 외부 구성요소는 트래퍼 펩타이드와 상동성이 있을 수 있다.
상기 상이한 형질에 관한 실시예/예시들은 상호 배타적인 것이 아니며, 조작된 면역 세포는 상기 변형된 형질 중 2 개 이상의 형질이 복합적으로 나타날 수도 있다.
또한, 상기 조작된 면역 세포는 야생 상태 세포와 상이한 형질을 비영구적으로 보일 수 있다. 또는, 상기 조작된 면역 세포는 야생 상태 세포와 상이한 형질을 영구적으로 보일 수 있다. 또는, 상기 조작된 면역 세포는 야생 상태 세포와 상이한 형질을 반영구적으로 보일 수 있다.
9.1.1. 불활성화된 면역 활성화 수용체
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 태양은 불활성화된 면역 활성화 수용체(immune activating receptor)에 관한 것이다.
'불활성화'는 일반적으로 어떤 작용 또는 기능을 가지는 물질에 있어서, 주요 작용이 저하 내지 소실되는 현상을 말하거나, 또는 저하 내지 상실되도록 조작된 경우를 포함한다.
상기 '불활성화된 면역 활성화 수용체(immune activating receptor)'는 정상적으로 종양 세포, 바이러스 감염 세포 또는 항원 제시 세포(Antigen presenting cell)를 인식하지 못하거나 또는 결합하지 못하는 수용체이다. 즉, 면역 활성화 수용체의 본래 기능이 저하되거나 또는 상실되는 것을 말한다.
면역 활성화 수용체의 본래 기능은 자신의 세포와 타 세포를 구별하여, 타세포가 수용체에 결합할 경우는 면역 시그널링을 발생시켜 면역반응을 활성화하거나 분화를 유도하는 것이다. 그러나 면역 활성화 수용체의 기능이 저하되거나 상실된 경우에는 자신의 세포와 타세포를 구별할 수 없고, 이에 따라 타세포가 결합하더라도 면역 반응을 활성화시키거나 면역세포 분화를 유도할 수 없다.
일 예로, 기능이 저하되거나 또는 상실된 면역 활성화 수용체는 자세포와 타세포를 구별하여 인식할 수 없다.
예를 들어, 타세포 인식 도메인 부분이 변형된 면역 활성화 수용체는 세포 표면에서 타세포를 정상적으로 구별하여 정상적으로 면역 시그널링을 유도할 수 없다.
다른 예로, 기능이 저하 내지 상실된 면역 활성화 수용체는 타세포와 결합할 수 없을 수 있다.
예를 들어, 발현된 면역활성화 수용체가 세포 내에 갇혀있는 경우, 면역활성화 수용체는 타세포와 결합하여 면역 시그널링을 발생시킬 수 없다.
상기 불활성화된 면역 활성화 수용체는 면역 활성화 수용체가 트랩(trap)되어 세포 내 존재하는 수용체일 수 있다.
상기 면역 활성화 수용체는 원래부터 존재하는 특정 신호서열, 예를 들어 자연적으로 합성된 신호서열 폴리펩타이드에 의해 세포 표면 밖으로 이동하지 못하고 세포 내 잔류되어 있을 수 있다.
또는, 상기 면역 활성화 수용체는 인위적으로 합성된 폴리펩타이드와 결합하여, 세포 표면으로 이동하지 못하고, 세포 내에 갖혀 있을 수 있다.
상기 인위적으로 합성된 폴리펩타이드와 결합한 면역 활성화 수용체는 영구적으로 결합되어 있을 수 있다.
또는, 상기 인위적으로 합성된 폴리펩타이드와 결합한 면역 활성화 수용체는 일시적으로 결합되어 있을 수 있다.
이때, 결합은 면역 활성화 수용체를 구성하는 필수 영역, 도메인, 또는 일부 서열일 수 있다.
상기 불활성화된 면역 활성화 수용체는 동종이계 면역 세포(Allogeneic T cell)를 제공하기 위함이다.
'동종이계 면역 세포'란 기증자의 면역세포를 다른 수혜자에게 제공하더라도 동종간에는 면역 거부 반응이 일어나지 않는 면역 세포를 말한다. 일반적으로 면역 세포, 예를 들어, T 세포는 사람마다 다른 항원을 가지고 있기 때문에, 자신과 타인의 면역세포를 구별하여 면역 반응을 일으킬 수 있지만, 동종이계 면역 세포는 다른 사람의 면역세포를 이식하더라도 자신의 세포와 타 세포를 구별하지 않고, 또한 면역 거부반응을 일으키지 않는다.
따라서, 본 명세서에서는 항원을 인식하고 면역 반응을 활성화시키는 면역 세포의 수용체를 불활성화시켜 주 조직 복합성 항원을 인식하지 못하는 동종이계 면역세포를 제공하고자 한다.
본 명세서에 의해 개시되는 내용은 특정 목적을 위해 면역 활성화 수용체를 불활성화하여, 면역 세포의 면역반응을 억제하기 위한 물질, 방법, 용도를 제공하고자 한다.
상기 면역 활성화 수용체를 불활성화하기 위하여, 면역 활성화 수용체를 세포 내 특정 기관 또는 특정 부위에 가두기(trapping)위한 물질 및 방법 등을 제공하고자 한다.
보다 구체적으로, 상기 면역 활성화 수용체를 불활성화하기 위하여, 면역 활성화 수용체에 결합할 수 있는 물질, 방법을 제공하고자 한다.
나아가, 세포 내 갇힌 면역 활성화 수용체에 인공 수용체를 삽입하여, 새로운 용도를 제공하고자 한다. 예를 들어, 세포 내 갇힌 면역 활성화 수용체는 더이상 항원과 결합하여 면역 반응을 일으킬 수 없고, 인위적으로 조작된 인공 수용체를 통해 특정 항원을 발현하는 세포만을 인식할 수 있다. 이에 따라, 동종 간에는 구별 없이 동일하게 제공된 Allogeneic CAR-T를 이식하여, 면역거부반응 없이 특정 항원을 발현하는 암세포를 제거할 수 있을 것이다.
이하 '세포 내 갇힌 면역 활성화 수용체(trapped immune activating receptor)'에 관하여 설명한다.
9.1.2. 세포 내 갇힌 면역 활성화 수용체
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 태양은 '세포 내 갇힌 면역 활성화 수용체 (trapped immune activating receptor)'에 관한 것이다.
면역 활성화 수용체는 세포 내에서 정상적으로 '발현(expression)' 하고, 발현된 수용체가 세포 표면에 '위치(localization)'하여 병원체 내지 항원 등과 결합하여 면역 반응을 일으킬 수 있다.
발현(expression)이란, DNA가 전사 및 번역을 거쳐 아미노산 사슬을 만들어 단백질이 형성되는 전 과정을 의미한다. 이렇게 형성된 단백질은 세포 소기관을 형성하거나, 몸의 다른 곳에 쓰이기 위해 이동 또는 세포 밖으로 분비될 수 있다.
위치(localization)란, 어떤 단백질이 제대로 기능하기 위한 장소로 이동하는 것 또는 조작에 의해 특정 위치로 이동되는 것을 말한다.
상기 '세포 내 갇힌 면역 활성화 수용체(trapped immune activating receptor)'는 세포 내에서 발현된 수용체가 세포 표면에 정상적으로 위치하지 못하는 수용체를 말한다. 즉, 면역 활성화 수용체가 어떤 인위적 조작 내지 특정 분자 방해에 의하여 세포 내부에 트랩되어(trapped)있는 수용체를 말한다.
상기 세포 내 갇힌 면역 활성화 수용체는 세포 표면에 위치하는 것을 방해하는 특정 분자와 결합할 수 있다. 이때, 특정 분자가 결합되는 위치는 면역 활성화 수용체의 하나 이상의 도메인 또는 일부 폴리펩타이드 영역일 수 있다.
상기 세포 내 갇힌 면역 활성화 수용체는 세포 내 소기관에 잔류할 수 있다. 여기에서, 세포 내 갇힌 면역 활성화 수용체는 세포 표면에 존재하지 않기 때문에, 정상적으로 기능할 수 없다. 예를 들어, 세포 내 갇힌 면역 활성화 수용체는 세포 내 소기관 또는 특정 영역에 트랩되어 있거나 또는 방출된 단백질이 다시 회수되어 세포 내 잔류하는 수용체이다.
다른 예를 들어, 세포 내 갇힌 면역 활성화 수용체는, 세포 내부가 아닌 세포 막에 끼어진 경우일 수 있다. 이때, 면역 활성화 수용체가 세포 표면에 트랩된 경우라 하더라도, 항원 내지 외래 세포와 결합할 수 없다.
상기 면역 활성화 수용체가 트랩된(trapped) 세포는 면역 세포일 수 있다. 예를 들어, 면역 세포는 T 세포, B 세포, 자연 살해 세포, NKT세포, 단핵구, 대식구 또는 수지상세포를 포함한다. 다만 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 상기 T 세포는 CD4+ T세포, CD8+ T 세포, CD4+ 기억 세포, CD8+ 기억 세포, 중앙 기억 세포, 효과 기억 T 세포, 또는 조절 T 세포일 수 있다. CD4+ T 세포는 TH1, TH2, TH3, TH17, 또는 TH9 세포 중 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이때, 상기 면역 세포에 트랩된 면역 활성화 수용체는 T 세포 수용체, B세포 수용체, 살생세포활성화수용체, 톨(toll) 유사 수용체(TLR), 예를 들어 TLR4 및 TLR9, 사이토카인, 케모카인, 사이토카인 수용체, 및 케모카인 수용체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일 실시예에서, 상기 면역 활성화 수용체는 T세포 수용체(TCR)이고, 보다 구체적으로 TCR α/ β수용체, TCR γ /δ수용체 및/또는 T세포 보조수용체일 수 있다.
용어 'T 세포 수용체'는 T 세포가 항원 제시 세포(antigen presenting cell, APC)와 직접적으로 결합할 수 있는 단백질로서, T 세포를 활성화시키거나 분화를 유도시킬 수 있는 수용체를 일컫는다. 보다 구체적으로, T 세포 수용체는 T 세포 수용체와 더불어 공동 수용체 역할을 하는 막 단백질인 CD4 또는 CD8의 발현에 따라, 세포 내부 유래(MHC class I)의 펩티드 항원을 인식할지 세포 외부 유래(MHC class II)의 펩티드 항원을 인식할 지 결정하고, 그 이후 TCR의 신호전달을 시작하여 T세포를 활성화시킨다.
상기 '세포 내 갇힌 TCR/CD3복합체'는 MHC I 또는 MHC II와 결합하지 못할 수 있다.
상기 면역 활성화 수용체가 트랩되는 면역 세포의 특정 영역은 면역 세포의 면역 활성화 수용체를 가둘 수 있는 모든 영역이 될 수 있다.
일 실시 태양에서, 면역 세포 내 특정 영역은 면역 세포 내 존재하는 소기관 또는 세포질일 수 있다.
면역 세포 내 소기관은 이중막 세포 소기관인 핵(nucleus) 또는 미토콘드리아(mitochondria), 단일막 세포 소기관인 소포체(endoplasmic reticulum), 골지체(golgi apparatus), 리소좀(lysosome), 액포(vacuole), 퍼옥시좀(peroxisome) 또는 글리옥시좀(glyoxysome), 막을 가지지 않는 세포 소기관인 인(nucleolus), 중심립(centriole), 리보솜(ribosome)뿐만 아니라, 세포내 존재하는 거대 복합체, 예를 들어 가수분해 복합체(proteasome)등을 모두 포함할 수 있다. 다만 이에 제한되지 않는다.
다른 실시 태양에서, 면역 활성화 수용체가 트랩되는 특정 영역은 면역 세포내 존재하는 소기관 또는 세포질의 '일 특정 부분'일 수 있다. '일 특정 부분"은 예를 들어, 소포체 중에서 조면 소포체나 활면 소포체일 수 있고, 또는 소포체의 세포막과 근접한 영역이거나 핵막과 근접한 영역 등의 세포 소기관 내에서도 특정한 부분 또는 영역을 말한다.
일 실시 태양에서, 면역 세포 내 특정 영역은 면역 세포의 세포 막 사이일 수 있다. 예를 들어, 면역 활성화 수용체는 세포막 사이 영역에 존재하거나, 세포막 사이에 끼어진 채로 존재할 수 있다. 이때, 세포 막 사이에 끼어진 수용체는 세포 표면에 일부 노출된 경우라도, 외래 항원 등과는 결합할 수 없다.
상기 조작된 면역세포는 인공 수용체를 포함할 수 있다. 이때, 조작된 면역세포는 인공 수용체가 발현하여 세포 표면에 존재하는 면역세포 일 수 있다.
이하, 인공 수용체에 관하여 설명한다.
9.2. 인공 수용체
본 명세서에 개시된 내용의 일 태양은, 면역활성이 억제된 면역세포는 특정 항원을 특이적으로 인식하는 인공 수용체를 추가로 더 포함할 수 있다. 이때, 바람직하게는 특정 항원은 암세포에서 특이적으로 발현하는 항원일 수 있다.
"인공수용체(artificial receptor)는 야생형 수용체가 아닌 인위적으로 만들어진, 특정 항원에 대한 인식능력을 가지며 특정한 기능을 하는 기능체를 의미한다. 이러한 인공수용체는 특정 항원에 대한 인식능력이 개선되거나 증강된 면역 반응신호를 생성하여 면역반응이 향상에 기여할 수 있다.
인공수용체는 일 예로, 하기와 같은 구성을 가질 수 있다.
(ⅰ) 항원인식부(리간드 결합부)
인공수용체는 항원인식부(리간드 결합부)를 포함한다.
"항원인식부(antigen recognition part)"는 인공수용체의 일부로서 항원을 인식하는 부위를 의미한다.
항원인식부는 특정 항원에 대한 인식능력이 야생수용체보다 개선된 것일 수 있다. 이때, 특정 항원은 암세포의 항원일 수 있다. 또한, 특정 항원은 일반적인 체내 세포의 항원일 수 있다.
*항원인식부는 항원과의 친결합성을 가질 수 있다.
항원인식부는 항원과 결합하면서 신호를 생성할 수 있다. 상기 신호는 전기적 신호일 수 있다. 상기 신호는 화학적 신호일 수 있다.
항원인식부는 신호 서열을 포함할 수 있다.
상기 신호서열은 단백질이 합성되는 과정에서 단백질을 특정한 위치로 전달되도록 하는 펩타이드 서열을 의미한다.
신호 서열은 항원인식부의 N 말단에 가까운 위치에 있을 수 있다. 이때, N 말단으로부터의 거리는 100개 아미노산 내외일 수 있다. 신호서열은 항원인식부의 C말단에 가까운 위치에 있을 수 있다. 이때, C말단으로부터의 거리는 100개 아미노산 내외일 수 있다.
항원인식부는 제1신호발생부와 유기적인 기능 관계를 가질 수 있다.
항원인식부는 항체의 Fab(fragment antigen binding) 도메인과 상동성이 있을 수 있다.
항원인식부는 scFv(single-chain variable fragment)일 수 있다.
예를 들어, 항원인식부는 scFv, Fab, Fab', Fv, F(ab')2, 및 dAb, 및 이들의 임의의 단편 또는 조합으로부터 선택될 수 있다.
항원 인식부는 NKG2D, NKG2A, NKG2C, NKG2F, LLT1, AICL, CD26, NKRP1, NKp30 nNKp44, NKp46, CD244(2B4), DNAM-1, 및 NKp80 중 어느 하나일 수 있다.
항원인식부는 그 자체로서 항원을 인식하거나 또는 항원인식구조체를 형성하여 항원을 인식할 수 있다.
항원인식구조체는 특정 구조를 이루어야 항원을 인식할 수 있고, 이러한 특정 구조를 이루는 단위체 및 상기 단위체들의 결합은 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 쉽게 이해할 수 있다. 또한 항원인식구조체는 1개 또는 2이상의 단위체로 구성될 수 있다.
항원인식 구조체는 단위체가 일렬로 연결된 구조일 수 있거나, 또는 병렬적으로 연결된 구조일 수 있다.
일렬로 연결된 구조는 2이상의 단위체가 일 방향으로 이어서 연속적으로 결합되어 있는 형태를 의미하고, 병렬적으로 연결된 구조는 1개의 단위체의 말단부위에 2개 이상의 각 단위체가 동시에, 예를 들어 서로 다른 방향으로 결합되어 있는 형태를 의미한다.
예를 들어,
상기 단위체는 무기물일 수 있다.
상기 단위체는 생화학적 리간드일 수 있다.
상기 단위체는 야생형 수용체의 항원인식부와 상동성이 있을 수 있다.
상기 단위체는 항체 단백질과 상동성이 있을 수 있다.
상기 단위체는 이뮤노글로불린의 중쇄부(heavy chain) 또는 이와 상동성이 있을 수 있다.
상기 단위체는 이뮤노 글로불린의 경쇄부(light chain) 또는 이와 상동성이 있을 수 있다.
일 예로, 상기 항원 인식부는 CD19, CD20, ROR1, CD22, alpha 태아단백질, CA-125, 5T4, MUC-1, 상피종양항원, 전립선-특이적 항원, 흑생종-연관 항원, 돌연변이된 p53, 돌연변이된 ras, HER2/Neu, HIV-1 외피 당단백질 gp120, HIV-1 외피 당단백질 gp41, GD2, CD123, CD33, CD138, CD23, CD30, CD56, c-Met, 메소텔린, GD3, HERV-K, IL-11Ralpha, CSPG4, ERBB2, EGFRvIII, VEGFR2, HER2 와 HER3 및 HER1 와 HER2 중 어느 하나 이상을 표적으로 하는 항체의 ScFv영역 전부 또는 일부일 수 있다.
상기 단위체는 신호서열을 포함할 수 있다.
*
한편, 상기 단위체는 화학적 결합으로 결합되어 있거나, 특정 결합부를 통해 결합되어 있을 수 있다.
"항원인식구조단위체 결합부(antigen recognition unit combining part)"는 항원인식구조단위체가 서로 결합되는 부위로서, 두 개 이상의 항원인식구조단위체로 이루어진 항원인식구조체가 있을 때 존재하는 선택적인 구성일 수 있다.
항원인식구조단위체 결합부는 펩타이드일 수 있다. 이때, 결합부는 세린과 트레오닌의 비율이 높을 수 있다.
항원인식구조단위체 결합부는 화학적 결합일 수 있다.
항원인식구조단위체 결합부는 특정 길이를 가짐으로써 항원인식구조단위체의 입체구조 발현을 도울 수 있다.
항원인식구조단위체 결합부는 항원인식구조단위체 간에 특정한 위치 관계를 갖도록 하여 항원인식구조체의 기능을 도울 수 있다.
(ii) 수용체몸체부
인공수용체는 수용체몸체부를 포함한다.
"수용체몸체부"는 항원인식부와 신호발생부 간의 연결을 매개하는 부위로서, 항원인식부와 신호발생부를 물리적으로 연결하는 것일 수 있다.
수용체몸체부의 기능은 항원인식부 또는 신호발생부에서 생성한 신호를 전달하는 것일 수 있다.
수용체몸체부의 구조는 경우에 따라 신호발생부의 기능을 동시에 가질 수도 있다.
수용체몸체부의 기능은 인공수용기체가 면역세포에 고정되도록 하는 것일 수 있다.
수용체몸체부는 아미노산 나선 구조를 포함할 수 있다.
수용체몸체부의 구조는 체내에 존재하는 일반적인 수용체(receptor) 단백질의 일부와 상동성이 있는 부분을 포함할 수 있다. 상동성의 범위는 50 내지 100%일 수 있다.
수용체몸체부의 구조는 면역세포 상의 단백질과 상동성이 있는 부분을 포함할 수 있다. 상동성의 범위는 50 내지 100%일 수 있다.
예를 들어,
수용체몸체부는 CD8 막횡단 영역(transmembrane domain)일 수 있다.
수용체몸체부는 CD28 막횡단 영역일 수 있다. 이때 제2 신호발생부가 CD28인 경우, CD28은 동시에 제2 신호발생부와 수용체몸체부의 기능을 할 수 있다.
수용체몸체부는 CD3, 또는 CD19 막횡단 도메인일 수 있다.
(iii) 신호발생부(시그널링 도메인)
인공수용체는 신호발생부를 포함할 수 있다.
"제1 신호발생부"는 인공수용체의 일부로서 면역반응신호를 생성하는 부위를 말한다.
"제2 신호발생부"는 인공수용체의 일부로서 제1 신호발생부와 상호작용하여 또는 독립적으로 면역반응신호를 생성하는 부위를 말한다.
인공수용체는 제1 신호발생부 및/또는 제 2신호발생부를 포함할 수 있다.
제1 및/또는 제2 신호발생부를 각각 2개 이상 포함할 수 있다.
제1 및/또는 제2 신호발생부는 특정 서열모티프를 포함할 수 있다.
서열모티프는 CD(cluster of designition) 단백질의 모티프와 상동성이 있을 수 있다.
이때, CD 단백질은 CD3, CD247, CD79일 수 있다.
서열모티프는 YxxL/I의 아미노산 서열일 수 있다.
서열모티프는 제1 및/또는 제2 신호발생부에 다중적으로 포함될 수 있다.
이때, 첫 번째 서열모티프는 제1 신호발생부의 시작 위치로부터 1 내지 200 아미노산 갯수만큼 떨어진 위치에 있을 수 있다. 두 번째 서열모티프는 제2 신호발생부의 시작 위치로부터 1 내지 200 아미노산 갯수만큼 떨어진 위치에 있을 수 있다.
또한, 각 서열모티프 간의 이격은 1 내지 15 아미노산 갯수일 수 있다.
이 때, 바람직한 각 서열모티프 간의 이격은 6 내지 8 아미노산 갯수이다.
예를 들어,
*제1 및/또는 제2 신호발생부는 CD3 ζ일 수 있다.
제1 및/또는 제2 신호발생부는 FcεRIγ일 수 있다.
제1 및/또는 제2 신호발생부는 특정 조건이 만족 되어야만 면역반응 신호를 생성하는 것일 수 있다.
특정 조건은 항원인식부가 항원을 인식하는 것일 수 있다.
특정 조건은 항원인식부가 항원과 결합을 형성하는 것일 수 있다.
특정 조건은 항원인식부와 항원이 결합을 형성할 때 생성된 신호를 전달받는 것일 수 있다.
특정 조건은 항원인식부가 항원을 인식하거나 결합하다가 분리되는 것일 수 있다.
면역반응신호는 면역세포의 생장 및 분화와 관련된 신호일 수 있다.
면역반응신호는 면역세포의 사멸과 관련된 신호일 수 있다.
면역반응신호는 면역세포의 활성과 관련된 신호일 수 있다.
면역반응신호는 면역반응의 보조와 관련된 신호일 수 있다.
면역반응신호는 항원인식부에서 생성된 신호 특이적으로 활성화될 수 있다.
면역반응신호는 목적 유전자의 발현을 조절하는 신호일 수 있다.
면역반응신호는 면역반응을 억제하는 신호일 수 있다.
일 예에서, 상기 신호발생부는 부가적 신호발생부를 포함할 수 있다.
"부가적 신호발생부"는 인공수용체의 일부로서 제1 및/또는 제2 신호발생부가 생성하는 면역반응신호에 대하여 부가적인 면역반응신호를 생성하는 부위를 의미한다.
이하 부가적 신호발생부는 그 순서에 따라 제n 신호발생부로 호칭한다.
인공수용체는 제1 신호발생부 외에도 부가적 신호발생부를 포함할 수 있다.
부가적 신호발생부는 2개 이상이 인공수용체에 포함될 수 있다.
부가적 신호발생부는 4-1BB, CD27, CD28, ICOS, OX-40, Dap10, CD40, 2B4, ITAM motif, 유도성 T세포 공동자극인자(ICOS), CD3 감마, CD3델타, CD3엠실론, CD247, Ig알파(CD79a), Fc 감마 수용체의 신호전달 영역 혹은 그 외의 면역반응신호를 발생하는 구조일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
부가적 신호발생부가 면역반응신호를 생성하는 조건 및 생성하는 면역반응신호의 특성은 상기 제1 및/또는 제2 신호발생부의 면역반응신호와 상응하는 내용을 포함한다.
면역반응신호는 사이토카인의 합성을 촉진하는 것일 수 있다. 면역반응신호는 사이토카인의 분비를 촉진 또는 억제하는 것일 수 있다. 이때, 사이토카인은 바람직하게는 IL-2, TNFα 또는 IFN-γ일 수 있다.
면역반응신호는 다른 면역세포의 생장 또는 분화를 돕는 신호일 수 있다.
면역반응신호는 다른 면역세포의 활성을 조절하는 신호일 수 있다
면역반응신호는 다른 면역세포를 신호가 발생하는 위치로 유인하는 신호일 수 있다.
본 발명은 인공수용체의 모든 가능한 결합관계를 포함한다. 따라서, 본 발명의 인공수용체의 양태는 여기서 언급한 것들에만 한정되지 않는다.
인공수용체는 항원인식부-수용체몸체부-제1 신호발생부로 구성될 수 있다. 수용체몸체부는 선택적으로 포함될 수 있다.
인공수용체는 항원인식부-수용체몸체부-제2 신호발생부-제1 신호발생부로 구성될 수 있다. 수용체몸체부는 선택적으로 포함될 수 있다. 이때, 제1 신호발생부와 제2 신호발생부의 위치는 바뀔 수 있다.
인공수용체는 항원인식부-수용체몸체부-제2 신호발생부-제3 신호발생부-제1 신호발생부로 구성될 수 있다. 수용체몸체부는 선택적으로 포함될 수 있다. 이때, 제1 신호발생부 내지 제3 신호발생부의 위치는 바뀔 수 있다.
인공수용체에서 신호발생부의 갯수는 1 내지 3개에 한정되지 않고, 3개를 초과하여 포함될 수 있다.
상기 예들 외에도 인공수용체는 항원인식부-신호발생부-수용체몸체부의 구조를 가질 수 있다. 상기 구조는 인공수용체를 갖는 세포 외에서 작용하는 면역반응신호를 생성해야 하는 때에 유리할 수 있다.
인공수용체는 야생 수용체에 상응하는 기능을 할 수 있다.
인공수용체는 특정 항원과 결합을 형성하여 특정 위치관계를 형성하는 기능을 할 수 있다.
인공수용체는 특정 항원을 인식하여 특정 항원에 대한 면역반응을 촉진하는 면역반응신호를 생성하는 기능을 할 수 있다.
인공수용체는 일반적인 체내세포의 항원을 인식하여 체내세포에 대한 면역반응을 억제하는 기능을 할 수 있다.
(iv) 신호서열
일 예에서, 상기 인공수용체는 신호서열을 선택적으로 포함할 수 있다.
인공수용체가 특정 단백질의 신호서열을 포함한다면 인공수용체가 면역세포 막에 용이하게 위치하는 데 도움을 줄 수 있다. 바람직하게는, 면역세포 안에 있는 인공수용체가 막관통단백질의 신호서열을 포함한다면 인공수용체가 면역세포막을 통과하여, 면역세포의 외막에 위치하는 것을 도울 수 있다.
인공수용체는 하나 이상의 신호서열을 포함할 수 있다.
신호서열은 양전하 아미노산을 많이 포함할 수 있다.
신호서열은 N 또는 C 말단에 가까운 위치에 양전하 아미노산을 포함할 수 있다.
신호서열은 막관통단백질의 신호서열일 수 있다.
신호서열은 면역세포의 외막에 위치한 단백질의 신호서열일 수 있다.
상기 신호서열은 인공수용체가 갖는 구조, 즉 항원인식부, 수용체몸체부, 제1 신호발생부, 부가적 신호발생부에 포함될 수 있다.
이때, 신호서열은 각 구조의 N 또는 C 말단에 가까운 위치에 있을 수 있다.
이때, N 또는 C 말단으로부터의 거리는 100개 아미노산 내외일 수 있다.
일 예에서, 상기 조작된 세포는 특정 chimeric antigen receptor (CAR)를 포함하도록 조작된 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 CAR는 tumor associated antigen (e.g., CD 19, CD20, carbonic anhydrase IX (CAIX), CD 171, CEA, ERBB2, GD2, alpha-folate receptor, Lewis Y antigen, prostate specific membrane antigen (PSMA) 또는 tumor associated glycoprotein 72 (TAG72))에 대하여 결합 특이성을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
다른 예에서, 상기 조작된 세포는, 예컨대, CAR에 의하여 다음과 같은 종양 항원(tumor antigen) 중 하나 이상과 결합하도록 조작된 것일 수 있다.
종양 항원(Tumor antigen)은, 이에 제한되지 않지만, AD034, AKT1, BRAP, CAGE, CDX2, CLP, CT-7, CT8/HOM-TES-85, cTAGE-1, EGFR, EGFRvIII, Fibulin- 1, HAGE, HCA587/MAGE-C2, hCAP-G, HCE661, HER2/neu, HLA-Cw, HOM-HD-21/Galectin9, HOM-MEEL- 40/SSX2, HOM-RCC-3.1.3/CAXII, HOXA7, HOXB6, Hu, HUB 1, KM-HN-3, KM-KN- 1, KOC1, KOC2, KOC3, KOC3, LAGE-1, MAGE-1, MAGE-4a, MPPl 1, MSLN, NNP-1, NY-BR-1, NY-BR-62, NY-BR-85, NY-CO-37, NY-CO-38, NY-ESO-1, NY-ESO-5, NY-LU-12, NY-REN-10, NY-REN-19/LKB/STK1 1, NY-REN-21 , NY-REN-26/BCR, NY-REN-3/NY-CO-38, NY-REN-33/SNC6, NY- REN-43, NY-REN-65, NY-REN-9, NY-SAR-35, OGFr, PSMA, PSCA PLU-1, Rab38, RBPJkappa, RHAMM, SCP1, SCP- 1, SSX3, SSX4, SSX5, TOP2A, TOP2B, 또는 Tyrosinase 등을 포함하는 것일 수 있다.
10. CAR 세포
본 출원은 조작된 면역세포로서, allogeneic CAR 세포에 관하여 개시한다.
상기 조작된 면역세포는 트래퍼 분자 및 인공수용체를 모두 포함한다.
상기 allogeneic CAR세포는
A) 트래퍼 분자가 세포 내에서 면역 활성화 수용체와 결합하고
B) 키메라 항원 수용체가 발현하여 세표 표면에 위치한
것을 특징으로 한다.
상기 트래퍼 분자 및 키메라 항원 수용체는 전술한 바와 같다.
상기 세포는 면역 세포를 말하며, 상기 면역 세포는 전술한 바와 같다.
일 구현예에서, 상기 allogeneic CAR 세포는 allogeneic CAR-T세포일 수 있다.
어떤 예시에서, allogeneic CAR-T세포는 SNKSLEQIWNHTTWMEWDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEEKKMP (서열번호 192)의 아미노산 서열로 이루어진 트래퍼 분자와 T세포 수용체 및/또는 TCR/CD3복합체가 T세포 내에서 결합하여, 소포체에 트랩되어 있고, NKG2D의 리간드 결합 도메인과, CD3zeta 시그널링 도메인을 포함하고 있는 키메라 항원수용체는 T세포에서 발현하여 세포 표면에 존재할 수 있다.
어떤 예시에서, Allogeneic CAR-T세포는 SNKSLEQIWNHTTWMEWDGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL (서열번호 185)의 아미노산 서열로 이루어진 트래퍼 분자와 T세포 수용체 및/또는 TCR/CD3복합체가 T세포 내에서 결합하여, 소포체에 트랩되어 있고, NKG2D의 리간드 결합 도메인과, CD3zeta 시그널링 도메인을 포함하고 있는 키메라 항원수용체는 T세포에서 발현하여 세포 표면에 존재할 수 있다.
어떤 예시에서,
Allogeneic CAR-T세포는 LFIMIVGGLVGLRIVFAVLSIGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL (서열번호 247) 의 아미노산 서열로 이루어진 트래퍼 분자와 T세포 수용체 및/또는 TCR/CD3복합체가 T세포 내에서 결합하여, 소포체에 트랩될 수 있고, NKG2D의 리간드 결합 도메인과, CD3zeta 시그널링 도메인을 포함하고 있는 키메라 항원수용체는 T세포에서 발현하여 세포 표면에 존재할 수 있다.
상기 allogeneic CAR세포는 야생형 면역 세포, 즉 인공 수용체가 발현되지 않은 면역세포와 비교할 때, 인공 수용체가 발현된 조작된 T세포는 세포 표면에 5%이상, 7%이상, 10%이상, 15%이상, 17%이상, 20%이상, 25%이상, 27%이상, 30%이상, 35%이상, 40%이상, 45%이상, 50%이상, 60%이상 또는 70%이상 증가된 인공 수용체가 존재할 수 있다.
반면에, allgeneic CAR 세포는 야생형 면역 세포, 즉 트래퍼 분자가 세포 내에서 발현하지 않은 면역세포와 비교 할 때, 면역 활성 수용체가 5% 이하, 7%이하, 10%이하, 15%이하, 17%이하, 20%이하, 25%이하, 27%이하, 30%이하, 35%이하, 40%이하, 45%이하, 50%이하, 60%이하, 70%이하, 80%이하 또는 90%이하로 세포 표면에 존재할 수 있다.
상기 allogeneic CAR세포는 동종간에 구별없이 사용할 수 있다.
상기 allogeneic CAR T 세포는 T 세포의 수용체가 MHC I 또는 MHC II와 결합할 수 없기 때문에, 세포는 자신의 세포와 외래 항원을 구별하는 능력이 저하된다. 따라서, 다른 대상으로부터 분리된 T 세포를 조작하여 투여하더라도 면역반응을 일으키지 않을 수 있고, 동종간에는 구별없이 사용할 수 있다.
상기 allogeneic CAR-T세포는 특정 세포에만 특이적으로 결합하여 면역반응을 유발시킬 수 있다. 즉, allogeneic CAR 세포는 면역 활성화 수용체의 수가 감소 내지 전혀 존재하지 않는 경우라 하더라도, 면역 반응을 전달하는 시그널 pathway는 정상적으로 작동하기 때문에, 특정 세포에 대하여 면역 반응을 일으킬 수 있다.
예를 들어, 암세포 특이적 allogeneic CAR-T세포의 경우, 인공수용체가 T세포 수용체의 시그널 pathyway를 동일하게 사용하면서, 암세포만을 특이적으로 인식하고 결합할 수 있다. 이때, 세포 내 갇힌 T세포 수용체는 불활성화되어 있기 때문에, 그외 외래 항원에 대하여는 면역 반응은 유발하지 않을 수 있다.
상기 Allogeneic CAR-T세포는 인터페론 감마(IFN-gamma), 인터류킨-7(IL-7), 인터류킨-15(IL-15), 인터류킨-7 수용체(IL-7R), dominant negative TGFbeta 수용체(dnTGFbetaR) 및 인터류킨-2(IL-2) 중 어느 하나 이상을 발현한다.
11. CAR 세포 제조 방법
본 명세서에 의하여 개시되는 내용의 일 구현예는, 조작된 면역 세포로서 CAR 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다.
상기 방법은 생체 내, 생체 외 또는 시험관 내에서 이루어질 수 있다.
CAR 세포의 생산 방법에 있어, 전술한 '조작된 세포를 제조하는 방법'의 내용은 전체로서 본 항목에 포함된다.
일 실시예에서
상기 방법은
T세포를 활성화함;
트래퍼 분자 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR);
를 면역 세포에 도입함을 포함할 수 있다.
나아가 어떤 실시예에서 상기 방법은, 추가적으로
야생 상태 세포와 상이한 형질을 유도함을 포함할 수 있다.
다른 어떤 실시예에서 상기 방법은, 추가적으로
상이한 형질이 유도된 세포를 단리함을 포함할 수 있다.
또 다른 어떤 실시예에서 상기 방법은, 추가적으로
야생 상태 세포와 상이한 형질을 유도함;
상이한 형질이 유도된 세포를 단리함을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, allogeneic CAR-T를 생산하기위하여, i) T세포를 활성화(activation)시킬 수 있다.
"T세포 활성화"는 미접촉 T세포가 MHC: 항원 복합체와 결합하여, 세포 내에 탈인산화 및 인산화 과정을 통해 특정 전사인자를 활성화시킴으로서, T세포가 분열 및 분화되도록 하는 과정을 의미한다.
일 예로, T세포 활성화는TCR/CD3 복합체를 자극(stimulation)하여 T세포를 활성화시킬 수 있다.
용어 "자극(stimuatlion)"은 일차 활성화 신호(예: CD3/TCR 복합체 또는 CD2를 통한 자극) 및/또는 T세포의 보조 자극신호를 유발할 때 발생하는 T세포 반응을 말한다. T세포 반응은 림포킨(lymphokine) 생산 (예, IL-2)와 T세포 증식을 포함한다.
TCR/CD3복합체를 자극하기 위하여, 항원 혼합물이 처리되어있는 첨가물을 처리하여 T세포 활성을 유도 및 증식시킬 수 있다.
또는, CD3/CD28 Beads 및/또는 CD2/CD3/CD28 Beads를 사용하여 TCR/CD3복합체를 자극하여 T세포를 활성화시킬 수 있다.
예를 들어, Beads를 사용할 경우에는, 항-CD3/CD28 항체를 기능기로 가지는 Bead를 이용하여 T세포를 활성화시킬 수 있다.
상기 T세포를 활성화하기 위하여, 사이토카인을 추가로 더포함할 수 있다. "사이토카인"은 T세포가 분화 및 분열되도록 활성화를 유도하는 면역 활성화 사이토카인을 의미한다. 예를 들어, IL-2, IL-7, IL-15, 항 IL-4 및/또는 IL-21은 세포 증식 및 생존을 최적하 하기 위하여 상기 세포 배양에 추가될 수 있다.
일 구현예에서, allogeneic CAR-T를 생산하기위하여, ii) 트래퍼 분자 및/또는 키메라 항원 수용체(CAR)를 면역 세포에 도입시킴을 포함한다.
상기 ii)는,
*상기 트래퍼 분자를 면역 세포에 도입시킴을 포함한다.
상기 결합 도메인, 잔류 도메인, 연결도메인 및/또는 막관통 도메인과 면역세포에 도입시켜 도입 방법에 관한 설명은 전술한 바와 같다.
일 예로,
SNKSLEQIWNHTTWMEWDLYCLYKYKSRRSFIEEKKMP (서열번호 241);
LFIMIVGGLVGLRIVFAVLSILYCLYKYKSRRSFIEEKKMP (서열번호 242);
SNKSLEQIWNHTTWMEWDGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL (서열번호 178); 또는
LFIMIVGGLVGLRIVFAVLSIIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEEKKMP (서열번호 182);
등의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 면역 세포에 도입시킬 수 있다.
또한, 상기 ii) 는,
상기 키메라 항원 수용체를 면역 세포에 도입시킴을 포함한다. 이때 키메라 항원 수용체를 면역 세포에 도입시키는 방법은 당업자에 주지된 임의의 적합한 방법을 사용함으로써 수행가능하다.
예를 들어, CAR를 T세포 내 형질 주입은 바이러스 벡터를 이용하여 이루어 질 수 있다. 비-제한적인 바이러스 벡터의 예에는 레트로, 렌티, 아데노, 아데노-연고나 바이러스 벡터가 포함된다. 형질도입에는 플라스미드 및 트랜스포존/트랜스포사제 시스템의 전기이동 및 마이크로-인젝션이 포함되며, 이에 한정되지 않는다.
상기 키메라 항원수용체 및 키메리 항원수용체 세포 내 전달 방법은 전술한 바와 같다.
일 예로, 상기 NKG2D리간드 결합 도메인 및 CD3zeta시그널링 도메인을 암호화하는 핵산을 각각 포함하는 2이상의 벡터를 면역 세포에 도입시킬 수 있다.
다른 예로, 상기 NKG2D리간드 결합 도메인 및 CD3zeta시그널링 도메인을 암호화하는 핵산을 포함하는 하나의 벡터를 면역 세포에 도입시킬 수 있다.
추가적으로, 상기 트래퍼 분자 및/또는 키메라 항원 수용체가 세포 내 발현되었는지 여부 또는 세포 표면에 존재하는지 여부를 확인함을 추가할 수 있다.
상기 트래퍼 분자의 발현은 트래퍼 분자의 mRNA 또는 단백질의 발현으로 확인할 수 있다.
예를 들어, 트래퍼 분자의 mRNA 발현을 확인하는 방법은 PCR을 이용할 수 있다.
예를 들어, 트래퍼 분자의 단백질 발현을 확인하는 방법으로 웨스턴 블롯, ELISA, IP, Mass spectrometry 등을 이용할 수 있다.
일 예로, 트래퍼 분자가 발현하여 세포 내에서 면역 활성화 수용체를 가두어 두고 있는지 여부를 확인할 수 있다. 예를 들어, T세포 수용체를 형광 항체법을 이용하여 결합시킨후 유세포 분석기를 이용하여, 면역 세포 표면에 노출되었는지 여부를 통해 확인할 수 있다.
상기 키메라 항원 수용체가 면역 세포 내 발현되었는지 여부를 확인할 수 있다.
일 예로, 키메라 항원 수용체의 발현은 키메라 항원 수용체의 mRNA 또는 단백질의 발현으로 확인할 수 있다. 예를 들어, 키메라 항원 수용체의 mRNA 발현을 확인하는 방법은 PCR을 이용할 수 있다.
예를 들어, 키메라 항원 수용체의 단백질 발현을 확인하는 방법으로 웨스턴 블롯, ELISA, IP등을 이용할 수 있다.
상기 키메라 항원 수용체가 면역 세포 표면에 나타났는지 여부로 단백질 발현을 확인할 수 있으며, 형광 항체법을 이용하여 키메라 항원수용체와 결합시킨 후 유세포분석기를 이용하여 발현여부를 확인할 수 있다.
일 예로 트래퍼 분자가 발현하여 세포 내에서 면역 활성화 수용체를 가두어 두고 있는지 여부를 확인할 수 있다. 예를 들어, T세포 수용체를 형광 항체법을 이용하여 결합시킨후 유세포 분석기를 이용하여, 면역 세포 표면에 노출되었는지 여부를 통해 확인할 수 있다.
야생 상태 세포와 상이한 형질을 유도함에 있어 일 예시에서, 상이한 형질은 세포의 배양을 통하여 유도될 수 있다.
상이한 형질이 유도된 세포를 단리함에 있어 일 예시에서, 상기 상이한 형질이 유도된 세포를 상기한 형질이 유도되지 않은 세포로부터 단리할 수 있다. 이때, 세포를 단리함은 FACS, MACS, 압타머 센서 등 통상적으로 알려진 방법에 의하여 수행될 수 있다.
이때, 트래퍼 펩타이드 및/또는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 세포에 도입시킴을 거친 조작된 면역 세포는 야생 상태 세포와 형질이 동일할 수 있다. 이 경우 선택적으로, 상기 조작된 면역 세포를 형질이 변화하지 않도록 통제함을 추가할 수 있다. 상기 조작된 면역 세포를 형질이 변화하지 않도록 통제함은 예시적으로 동결보존 (cryopreservation) 등의 통상의 방법을 사용할 수 있다. 또는, 트래퍼 펩타이드 및/또는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 세포에 도입함을 거친 조작된 세포는 야생 상태 세포와 형질이 상이할 수 있다.
12. 전달 및 전달 방법
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 구현예에서, 트래퍼 분자 및/또는 인공수용체는 이를 암호화하는 서열을 함유하는 벡터 또는 비벡터에 의해 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다.
상기 트래퍼 분자 및/또는 인공수용체는 이를 암호화하는 DNA, RNA, 펩타이드, 폴리펩타이드, 및/또는 단백질의 형태로 대상 내에 전달 또는 도입될 수 있다.
상기 트래퍼 분자 및/또는 인공수용체는 다양한 형태로 대상 내에 전달 될수 있다.
상기 트래퍼 분자 및/또는 인공수용체는 벡터로 전달될 수 있다.
상기 트래퍼 분자 및/또는 인공수용체는 비벡터로 전달될 수 있다.
본 출원은 트래퍼 분자 및/또는 인공수용체를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터에 관하여 개시한다.
상기 트래퍼 분자에 관한 설명은 전술한 바와 같다.
상기 인공수용체에 관한 설명은 후술하는 바와 같다.
12.1. 벡터
상기 벡터는 바이러스 또는 비바이러스 벡터(예를 들어, 플라스미드)일 수 있다.
용어 "벡터"는 세포에 유전자를 전달할 수 있는 전달체이다. 전형적으로 "벡터 구조체", "발현 벡터", 및 "유전자 전달 벡터"는 관심의 유전자의 발현을 지시할 수 있고, 표적 세포에 유전자 서열을 전달할 수 있는 임의의 핵산 구조체를 의미한다. 따라서, 상기 용어는 클로닝, 및 발현 비히클뿐만 아니라 벡터를 통합하는 것을 포함한다.
상기 벡터는 바이러스 또는 비바이러스 벡터(예를들어, 플라스미드)일 수 있다.
상기 벡터는 트래퍼 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 벡터는 트래퍼 분자를 구성하는 결합 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 예를 들어, 벡터는 5'-CUUUUUAUUAUGAUUGUUGGUGGUCUUGUUGGUCUUCGUAUUGUUUUUGCUGUUCUUUCU-3' (서열번호 243)인 핵산서열을 포함한다. 이때, 결합 도메인에 해당하는 서열은 LFIMIVGGLVGLRIVFAVLS 아미노산 서열로 번역된다.
다른 실시예에서, 상기 벡터는 트래퍼 분자를 구성하는 잔류 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 5'-AAAGAUGAAUUA-3' (서열번호 244) 또는 5'-AAAAAGAUGCCU-3' (서열번호 245)인 핵산서열을 포함한다. 이때, 잔류 도메인은 KDEL 또는 KKMP를 암호화하는 소포체 신호서열이다.
또는, 상기 핵산 서열은 프로테아좀 잔류 신호 서열인 SHGFPPEVEEQDDGTLPMSCAQESGMDRHPAACASARINV (서열번호 108)를 암호화하는 핵산 서열일 수 있다. 예시적으로, 상기 벡터는 5'UCUCAUGGUUUUCCUCCUGAAGUUGAAGAACAAGAUGAUGGUACUUUACCUAUGUCUUGUGCUCAAGAAUCUGGUAUGGAUAGACAUCCUGCUGCUUGUUCCGCUAGAAUUAAUGUU-3' (서열번호 246)인 핵산서열을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 벡터는 트래퍼 분자에 추가되는 막관통 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열이 IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (서열번호 111)인 막관통 도메인을 포함하는 벡터는, 5'-AUUUAUAUUUGGGCUCCUUUAGCUCCUUUAGCUGGUACUUGUGGUGUUUUAUUAUUAAGUUUAGUUAUUACUUUAUAUUGU-3' (서열번호 247)인 핵산서열을 포함할 수 있다.
상기 벡터는 트래퍼 분자를 구성하는 연결 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 핵산 서열으 (GGGGS)n 및/또는 (GGUGGUGGUGGUUCU)n인 핵산서열을 포함한다.
상기 벡터는 트래퍼 분자를 구성하는 추가 기능적 도메인을 포함할 수 있다.
상기 트래퍼 분자 및/또는 인공 수용체는 하나 이상의 벡터로 전달 또는 도입될 수 있다.
일 예로, 상기 벡터는 트래퍼 분자 및/또는 인공 수용체를 동일 또는 상이한 벡터를 통해 면역 세포내 전달할 수 있다. 예를 들어, 트래퍼 분자와 인공 수용체는 동일한 바이러스 벡터에 의해 전달될 수도 있고, 또는 트래퍼 분자는 바이러스 벡터에 의해 전달되고, 인공 수용체는 비 바이러스 벡터에 의해 운반될 수 있다.
일 예로, 상기 트래퍼 분자 및/또는 인공 수용체는 동일한 하나의 벡터로 전달 또는 도입될 수 있다.
또는, 일 예로 다른 실시 태양에서, 상기 트래퍼 분자 및/또는 인공 수용체는 각각 상이한 벡터로 전달 또는 도입될 수 있다.
상기 트래퍼 분자는 하나 이상의 벡터를 통해 면역 세포 내 전달 또는 도입될 수 있다. 예를 들어, 트래퍼 분자에 포함되는 결합 도메인, 연결도메인 및 잔류 도메인이 하나의 동일한 벡터에 전달되거나, 또는 각각 상이한 벡터에 전달 또는 도입될 수 있다.
일 실시 태양에서, 상기 트래퍼 분자를 암호화하는 핵산은 하나의 바이러스 벡터로 전달 또는 도입될 수 있다.
상기 인공수용체는 하나 이상의 벡터를 사용하여 면역 세포 내 전달 또는 도입될 수 있다. 예를 들어, 항원인식부의 도메인, 수용체몸체부의 도메인 및 신호발생부의 도메인은 하나의 동일한 벡터에 전달될 수 있고, 또는 각각 상이한 벡터에 전달 또는 도입될 수 있다. 또한 두 가지 이상의 인공수용체를 동시에 면역 세포 내에 전달 또는 도입할 수 있다.
예를 들어, 인공수용체는 키메라항원수용체(CAR)일 수 있다.
상기 트래퍼 분자 및/또는 인공 수용체를 전달 또는 도입하기 위한 벡터는 하나 이상의 조절/제어 구성요소를 포함할 수 있다.
이때 상기 조절/제어 구성요소는 프로모터, 인핸서, 인트론, 폴리아데닐화 신호, 코작 공통(Kozak consensus)서열, 내부 리보솜 유입 부위(internal ribosome entry site, IRES), 스플라이스 억셉터 및/또는 2A 서열을 포함할 수 있다.
또한 벡터는 리포터 유전자(예를 들어, GFP) 또는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택마커(selection marker), 복제가능한 벡터의 경우 복제 기원을 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 벡터는 이식유전자 왼쪽, 오른쪽 또는 인접한 위치에 Splicing Acceptor (SA)시퀀스를 포함할 수 있다.
상기 프로모터는 표적 영역 내 내인성 프로모터 또는 외인성 프로모터 일수 있다.
상기 프로모터는 RNA 중합효소 II 또는 RNA 중합효소 III에 의해 인식되는 프로모터 일 수 있다.
상기 프로모터는 구성적 프로모터일 수 있다.
상기 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있다.
상기 프로모터는 대상 특이적 프로모터 일 수 있다.
상기 프로모터는 바이러스 또는 비바이러스 프로모터 일 수 있다.
상기 프로모터는 제어 영역(즉, 가이드핵산, 에디터단백질 또는 이식유전자)에 따라 적합한 프로모터를 이용할 수 있다. 예를 들어, 가이드핵산을 위해 유용한 프로모터는 H1, EF-1a, tRNA 또는 U6 프로모터일 수 있다.
벡터는 바이러스 벡터 또는 재조합 바이러스 벡터일 수 있다.
상기 바이러스는 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스일 수 있다.
이때, 상기 DNA 바이러스는 이중가닥 DNA(dsDNA) 바이러스 또는 단일가닥 DNA(ssDNA)바이러스 일 수 있다.
*이때 상기 RNA 바이러스는 단일가닥 RNA(ssRNA)바이러스 일 수 있다.
상기 바이러스 벡터는 레트로 바이러스 벡터, 렌티 바이러스 벡터 아데노 바이러스 벡터, 폭스 바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 단순 포진 바이러스, 백시니아바이러스 및 아데노 연관바이러스 벡터(AAV) 등을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.
바이러스를 이용하여 가이드핵산, 에디터 단백질 및/또는 공여체 분자를 대상 유기체에 도입할 경우, 대상체 내에서 일시적으로 발현될 수 있다. 또는 장기간 지속적으로 발현될 수 있다. 예를 들어 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 1년, 2년, 또는 영구적으로 발현될 수 있다.
바이러스 패키징 능력은 적어도 2kb 내지 50kb로 바이러스 종류에 따라 다를 수 있다. 이러한 패키징 능력에 따라 가이드핵산 또는 에디터단백질을 단독으로 포함하는 바이러스 벡터를 설계하거나 가이드핵산 및 에디터단백질을 모두 포함하는 바이러스 벡터를 설계할 수 있다. 또는 가이드핵산, 에디터단백질 및 추가 구성요소를 포함하는 바이러스 벡터를 설계할 수 있다.
예를 들어, 아데노 연관 바이러스 벡터는 세포분열 여부에 상관없이 다양한 세포(근육, 뇌, 간, 폐, 망막, 귀, 심장, 혈관)에 형질도입 효율이 매우 높고, 병원성이 없으며 바이러스 게놈 대부분이 치료유전자에 의해서 대치될 수 있고 비교적 낮은 면역 반응을 유도한다. 또한, AAV는 대상세포의 염색체 내로 삽입됨으로써 치료단백질이 장기간 안정적으로 발현된다. 예를 들어 핵산 및 펩타이드의 시험관 내 생성하여 생체 내 및 생체 외에서 표적 세포로 특정 형질을 도입하는데 유용하다. 다만, AAV는 크기가 작아 4.5kb이하의 패키징 능력을 가진다.
다른 예를 들어, 렌티바이러스 벡터는 레트로바이러스의 일종으로서, 인체 면역반응을 회피할 수 있을 뿐만 아니라, 망막, 신경, 근육 그리고 간세포와 같은 분열하지 않는 세포에도 8kb정도 크기의 유전자 전달이 가능하다.
일 예로, 트래퍼 분자 및/또는 인공 수용체를 암호화하는 핵산서열은 재조합 렌티바이러스에 의해 대상 내 전달 또는 도입될 수 있다.
다른 예로, 트래퍼 분자 및/또는 인공 수용체를 암호화하는 핵산서열은 재조합 아데노 바이러스에 의해 대상 내 전달 또는 도입될 수 있다.
상기 벡터는 핵산의 phosphorothioate linkage, locked nucleic acid(LNA), 2'-O-methyl 3'phosphorothioate(MS) 또는 2'-O-methyl 3'thioPACE(MSP) 변형되는 것을 포함할 수 있다.
12.2. 비벡터
상기 트래퍼 분자 및/또는 인공수용체는 비벡터 형태로 대상내 전달 또는 도입될 수 있다.
상기 트래퍼 분자 및/또는 인공수용체를 암호화하는 핵산서열은 비벡터로 대상 내 전달 또는 도입될 수 있다.
상기 비벡터는 네이키드 DNA, DNA 복합체, mRNA 또는 이의 혼합일 수 있다.
상기 비벡터는 전기천공법(Electroporation), 리포펙션, 미세주입법, 유전자총법, 비로좀, 리포좀(Liposome), 면역리포좀, 지질-매개 형질감염 또는 이의 조합에 의해 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있다.
일 예로, 표적 세포 유전체내로 핵산 서열의 도입을 효율적으로 하기 위해서 ZFN, TALEN, CRISPR/Cas9, Mega-TAL 등 표적 특이적 engineered nuclease를 동시에 전달할 수 있다.
일 예로, 양성 리포좀 방법에 의해 비벡터로 대상 내 전달될 수 있다. 이는 양성 amphiphile과 중성 helper 지질이 DPOE로 구성되어 안정한 리포좀을 형성한다. 이때 리포좀-DNA복합체는 + 전하를 띠고 있어 - 전하를 띠고 있는 세포표면에 결합하여 세포 흡수작용에 의해 세포내로 유입될 수 있다.
다른 일 예로, DNA를 금입자로 코팅하여 세포내로 주입할 수 있다.
추가적으로, 엔진아씨 전달 비히클(EnGeneIC delivery vehicles: EDV)로 전달될 핵산을 패키징하여 전달 또는 도입할 수 있다. 구체적으로, EDV는 하나의 팔은 표적 조직에 특이성을 가지고, 다른 팔은 EDV에 특이성을 가지는 이중 특이성 항체를 사용하여 표적조직으로 전달한다. 항체는 표적 세포 표면으로 EXV를 가져가고, 그 후 EDV는 엔도시토시스(endocytosis)에 의해 세포 내로 들어가 갈 수 있다.
상기 트래퍼 분자 및/또는 인공수용체는 각각 폴리펩타이드의 형태로 대상 내 전달 또는 도입될 수 있다.
상기 트래퍼 분자 및/또는 인공수용체는 DNA, RNA, 폴리펩타이드 또는 이의 혼합 형태일 수 있다.
12.3. 전달 방법
상기 트래퍼 분자 및/또는 인공수용체를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터는 생체외(ex vivo)방법으로 대상 내 전달될 수 있다.
12.3.1. 생체 외 전달 방법
상기 트래퍼 분자 및/또는 인공 수용체는 개별적인 대상으로부터 얻어진 면역세포 또는 보편적인 조혈 줄기세포로 전달 된 다음, 세포를 대상에 이식할 수 있다.
상기 전달 방법은 트래퍼 분자 및/또는 인공 수용체를 세포에 도입함; 및 상기 세포를 대상에 직접 투여함을 포함할 수 있다. 나아가, 트래퍼 분자 및/또는 인공 수용체를 세포에 도입함; 야생 상태 세포와 상이한 형질이 유도된 세포를 단리함; 및 상기 세포를 대상에 직접 투여함을 포함할 수 있다. 이때 상이한 형질은 TCR 하위 유닛 중 적어도 하나의 세포 표면의 양이 감소함일 수 있다.
일 구현 예로, 상기 세포 내 도입함은 트래퍼 분자 및/또는 인공수용체를 암호화하하는 핵산서열을 포함하는 벡터의 형태로 세포 내 도입될 수 있다. 벡터의 형태로 세포 내 도입되는 경우, 이는 비 바이러스 벡터인 플라스미드 또는 바이러스 벡터 중 선택되는 1이상의 방법으로 수행될 수 있다.
다른 구현 예로, 상기 세포 내 도입함은 트래퍼 분자 및/또는 인공수용체를 비벡터의 형태로 세포 내 도입될 수 있다. 예를 들어, 트래퍼 분자는 DNA, mRNA 또는 단백질의 형태로 세포 내 도입시킬수 있고, 이 경우에 상기 트래퍼 분자는 전기천공법, 리포펙션, 리포좀, 미세주입법 방법 등이 사용될 수 있다.
TCR 하위 유닛 중 적어도 하나의 세포 표면의 양이 감소한 세포를 효율적으로 제조하기 위해서 상기 트래퍼 분자 및/또는 인공수용체가 도입된 세포 중에서 TCR 하위 유닛 중 적어도 하나의 세포 표면의 양이 감소한 세포를 단리할 수 있다.
이때, 세포를 단리함은 FACS, MACS, 압타머 센서 등 통상적으로 알려진 방법에 의하여 수행될 수 있다.
예시적으로, 트래퍼 분자 및/또는 인공수용체를 도입한 세포에 형광 표지가 달린 TCR 하위 유닛 특이적 항체로 염색을 한 후에 염색이 되지 않은 세포를 유세포분리기를 통해서 수득할 수 있다. 또 다른 예시에서, 트래퍼 분자 및/또는 인공수용체를 도입한 세포에 자기(magnetic) 표지가 달린 TCR 하위 유닛 특이적 항체로 염색을 한 후에 염색이 되지 않은 세포를 MACS (magnetic activated cell sorting)를 통해서 수득할 수 있다. 또 다른 예시에서, 상기 트래퍼 분자를 포함하는 조작된 T 세포는, 세포 분리 방법을 통해서 세포 표면에 존재하는 TCR 하위 유닛의 수가 야생 상태 세포의 10% 이하, 5%이하, 3%이하, 1%이하, 0.5%이하, 0.1%이하일 수 있다.
세포를 대상에 직접 투여함은 조작된 세포를 직접 대상 내 투여하는 것으로서, 전신 투여 또는 국소 적용에 의해 대상 내로 전달 또는 도입될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 전신투여는 예를 들어 정막 내, 복강 내, 근육 내, 또는 피하 내 주입될 수 있다. 바람직하게 정맥 내 투여를 통한 전신 투여일 수 있다.
13. 용도
본 명세서에서 개시되는 내용의 일 태양은, 치료 대상에 조작된 면역세포를 포함한 조성물을 투여하는 방법을 이용한 질환 치료 용도이다.
보다 구체적으로, 상기 치료 대상체에 조작된 면역 세포, 즉 세포 내 갇힌 면역활성화 수용체를 포함하는 면역세포 또는 이를 포함하는 조성물의 투여함으로써, T cell adoptive 면역 요법을 통한 질환 치료 용도에 관한 것이다.
일 예로, 상기 질환은 암이다.
"암"은 신체 내에서 비정상적인 세포가 세포주기가 조절되지 않고 계속 세포분열 하는 것을 특징으로 하는 다양한 질환의 광범위한 군을 지칭한다. 조절되지 않은 세포 분열 및 성장은 림프계 또는 혈류를 통해 다른 조직에 전이될 수 있는 악성종양의 형성을 초래한다. "암" 또는 "암 조직"은 종양을 포함할 수 있다.
이때, 치료 대상은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등을 포함하는 포유동물일 수 있다.
13.1. 약학적 조성물
본 명세서의 일 구현예는 allogeneic CAR-T를 포함하는 조성물을 이용하여 질환 치료에 이용하고자한다.
일 구현예에서, 상기 allogeneic CAR-T를 포함하는 조성물은 이를 이용한 암 치료용 조성물일 수 있다.
상기 조성물에 포함되는 allogeneic CAR-T세포는 동종이계 면역 세포로서, 다른 사람의 T세포라도 면역 거부반응을 일으키지 않고 암 치료에 사용될 수 있다.
상기 CAR는 암 세포에만 특이적으로 인식하여 면역반응을 유발시킬 수 있으며, allogeneic CAR-T세포를 포함하는 조성물은 암 치료에 사용될 수 있다.
이때, 상기 조성물이 투여되는 대상은 치료 환자일 수 있다. 보다 구체적으로 암 환자일 수 있다
상기 allogeneic CAR-T 세포관련 설명은 상기 기술한 바와 같다.
.
일 구현예에서, 상기 암 치료용 조성물은 다음을 포함할 수 있다.
A) 결합도메인 및 잔류도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산; 및
B) 리간드 결합 도메인과 시그널링 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산
을 포함하는 벡터를 T세포와 도입시켜 생성된 allogeneic CAR-T세포를 포함하는 조성물일 수 있다.
예를 들어,
A) X- [결합 도메인] - [연결 도메인] - [잔류 도메인] - Y;
X- [결합 도메인] - [막관통 도메인] - [잔류 도메인] - Y;
X- [결합 도메인] - [연결 도메인] - [잔류 도메인] - Y; 및
X- [잔류 도메인] - [막관통 도메인] - [결합 도메인] - Y;
중에 어느 하나의 순서로 결합된 폴리펩타이드일 수 있고,
상기 X는 아미노산의 N말단 또는 C말단이고,
상기 Y는 아미노산 N말단 또는 C말단인 것을 특징으로 하는
폴리펩타이드를 암호화하는 핵산; 및
B) 리간드 결합 도메인은 및 시그널링 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산
을 포함하는 벡터를 포함하는 조성물을 T세포와 도입하여 생산된 allogeneic CAR-T세포를 포함하는 조성물일 수 있다.
상기 allogeneic CAR-T세포를 포함하는 암 치료용 조성물에서, 키메라 항원 수용체는 특정 종양 항원을 표적화하도록 조작할 수 있다.
일 실시태양에서, 종양 항원은 CD19, CD20, ROR1, CD22, alpha 태아단백질, CA-125, 5T4, MUC-1, 상피 종양하원, 전립선-특이적 항원, 흑생종-연관 항원, 돌연변이된 p53, 돌연변이된 ras, HER2/Neu, HIV-1 외피 당단백질 gp120, HIV-1 외피 당단백질 gp41, GD2, GD123, CD33, CD138, CD23, CD30, CD56, c-Met, 메소텔린, GD3, HERV-K, IL-11Ralpha, CSPG4, ERBB2, EGFRvIII, VEGFR2, 조합된 HER2-HER3, 조합된 HER1-HER2, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택될 수 있다.
특정 실시태양에서, 상기 종양항원은 CD19이다.
일 예로, 상기 암 치료용 조성물은 CD19에 결합하고, CD28 공동자극성 도메인 및 CD3-zeta 신호전달 영역을 추가로 포함하는 allogeneic CAR-T를 포함하는 조성물일 수 있다.
예를 들어,
A) SNKSLEQIWNHTTWMEWDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEEKKMP인 아미노산 서열을 포함하는 도메인을 암호화하는 핵산; 및
B) 리간드 결합 도메인은 NKG2D 및 시그널링 도메인은 CD3zeta를 포함하는 키메라 항원 수용체를 암호화하는 핵산
을 포함하는 벡터를 포함하는 조성물을 T세포에 도입하여 생산된 allogeneic CAR-T세포를 포함하는 조성물일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 부가적 요소를 추가로 더 포함할 수 있다.
조성물은 allogeneic CAR-T세포를 체내에 전달하기 위한 적절한 담체 또는 의약 첨가제를 포함할 수 있다. 예로는 물, 의약적으로 허용되는 유기 용제, 콜라겐(collagen), 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol), 폴리비닐 피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 카르복시 비닐 폴리머(carboxyvinyl polymers), 카르복시 메틸 셀룰로오스 나트륨(carboxymethylcellulose sodium), 폴리아크릴산 나트륨(sodium polyacrylate), 알긴산 나트륨(sodium alginate), 수용성 덱스트란(water-soluble dextran), 카르복시 메틸 스타치 나트륨(carboxymethyl starch sodium), 펙틴(pectin), 메틸셀룰로오스(methylcellulose), 에틸셀룰로오스(ethylcellulose), 잔탄검(xanthan gum), 아라비아 고무(gum arabic), 카제인(casein), 한천(agar), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 디글리세린(diglycerin), 글리세린(glycerin), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 바셀린(Vaseline), 파라핀(paraffin), 스테아릴 알코올(stearyl alcohol), 스테아르산(stearic acid), 사람 혈청 알부민(HSA), 만니톨(mannitol), 소르비톨(sorbitol), 락토스(lactose) 및 의약 첨가물로 허용되는 계면 활성제 등을 들 수 있다.
13.2. 암 치료 방법
본 명세서에 의해 개시되는 내용의 일 태양은, allogeneic CAR 세포를 포함한 조성물을 이용한 암 치료방법에 관한 것이다.
본 명세서에 의해 개시되는 일 구체예는, 치료 대상에 allogeneic한 CAR-T 세포를 투여하여 동종간에 면역 거부 반응 없이 암 세포 특이적으로 면역 반응을 활성화 시킴으로써 암을 치료하는 방법에 관한 용도이다.
상기 암 치료 방법은 대상체에서 암을 치료하고나, 종양 크기를 감소시키거나, 종양 세포를 사멸시키거나, 종양 세포 증식을 방지하거나, 종양 성장을 방지하거나, 환자로부터 종양을 제거하거나, 종양 재발을 방지하거나, 종양 전이를 방지하거나, 환자에서 완화를 유도하거나, 또는 이들의 임의의 조합을 위해 사용될 수 있다.
이때, 상기 치료 대상은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등을 포함하는 포유 동물일 수 있다.
상기 치료될 수 있는 암은 혈관화되지 않았거나, 아직 실질적으로 혈관화되지 않았거나, 또는 혈관화된 종양을 포함한다. 암은 또한 고형 또는 비-고형 종양을 포함할 수 있다.
일 실시 태양에서, 상기 방법은 예를 들어, 골종양, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구 내 악성 흑생종, 폐암, 유방암, 자궁암, 간암, 전립선암, 난소암, 결장암, 직장암, 항문부암, 위암, 고환암, 자궁암, 난관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 호지킨병, 비-호지킨 림프종(NHL), 원발성 종격동 거대 B 세포 림프종(PMBC), 미만성 거대 B세포 림프종(DLBCL), 여포성 림프종 (FL), 전환된 여포성 림프종, 비장변연부 림프종(SMZL), 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 만성 또는 급성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병 (비-T세포 모두 포함), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 소아기 고형 종양, 림프구성 림프종, 척수형성이상증, 다발성 골수종, 방광암, 신장 또는 요관암, 중추 신경계(CNS)의 신생물, 원발성 CNS 림프종, 종양 혈관신생, 척수축 종양, 뇌간 교종, 뇌하수체 선종, 카포시 육종, 표피양암, 편평 세포암, T-세포 림프종, B세포 악성종양 및 상기 암들의 조합으로부터 유래된 종양의 크기를 감소시키는데 사용될 수 있다. 상기 암은 일부는 화학요법 또는 방사선 요법에 의해 치료될 수 있는(반응 성) 암일 수 있고, 또는 다른 일부는 화학요법 또는 방사선 요법에 의해 치료될 수 없는(무반응성)일 수 있다.
다른 실시 태양에서, 상기 방법은 림프종 또는 백혈병인 종양을 치료하는데 사용될 수 있다. 림프종 및 백혈병은 림프구에 특이적으로 영향을 미치는 혈액 암이다. 혈액 내의 모든 백혈구는 골수에서 발견되는 단일 유형의 다능성 조혈 줄기 세포로부터 유래된다. 이러한 줄기 세포는 골수성 선조 세포 및 림프구성 선조 세포 둘 다를 생산하고, 그 후, 이들이 신체에서 발견되는 다양한 유형의 백혈구를 발생시킨다. 골수성 선조 세포로부터 발생하는 백혈구는 T 림프구 (T 세포), B 림프구 (B 세포), 천연 킬러 세포, 및 형질 세포를 포함한다. 림프구성 선조 세포로부터 발생하는 백혈구는 거대핵세포, 비만 세포, 호염기구, 호중구, 호산구, 단핵구, 및 대식세포를 포함한다. 림프종 및 백혈병은 환자 내의 이러한 세포 유형 중 하나 이상에 영향을 미칠 수 있다.
일부 실시양태에서, 림프종 또는 백혈병은 B-세포 만성 림프구성 백혈병/소세포 림프종, B-세포 전림프구성 백혈병, 림프형질세포성 림프종 (예를 들어, 발덴스트룀 마크로글로불린혈증), 비장 변연부 림프종, 모발상 세포 백혈병, 형질 세포 신생물 (예를 들어, 형질 세포 골수종 (즉, 다발성 골수종), 또는 형질세포종), 림프절외 변연부 B 세포 림프종 (예를 들어, MALT 림프종), 림프절 변연부 B 세포 림프종, 여포성 림프종 (FL), 전환된 여포성 림프종 (TFL), 원발성 피부 여포 중심 림프종, 외투 세포 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종 (DLBCL), 엡스타인-바르 바이러스-양성 DLBCL, 림프종성 육아종증, 원발성 종격동 (흉선) 거대 B-세포 림프종 (PMBCL), 혈관내 거대 B-세포 림프종, ALK+ 거대 B-세포 림프종, 형질모세포성 림프종, 원발성 삼출 림프종, HHV8-연관 다중심성 캐슬만병에서 발생하는 거대 B-세포 림프종, 버킷 림프종/백혈병, T-세포 전림프구성 백혈병, T-세포 거대 과립 림프구 백혈병, 공격성 NK 세포 백혈병, 성인 T-세포 백혈병/림프종, 림프절외 NK/T-세포 림프종, 장병증-연관 T-세포 림프종, 간비장 T-세포 림프종, 모구성 NK 세포 림프종, 균상 식육종 / 세자리 증후군, 원발성 피부 역형성 거대 세포 림프종, 림프종성 구진증, 말초 T-세포 림프종, 혈관면역모구성 T 세포 림프종, 역형성 거대 세포 림프종, B-림프모구성 백혈병/림프종, 재발성 유전적 이상이 있는 B-림프모구성 백혈병/림프종, T-림프모구성 백혈병/림프종, 및 호지킨 림프종으로부터 선택된다. 상기 암은 하나 이상의 선행 치료에 대해 불응성인 종양일 수 있고, 또는 하나 이상의 선행 치료 후에 재발된 종양일 수 있다. 예를 들어, 화학요법, 방사선요법, 면역요법(항체 또는 항체-약물 접합체를 포함함), 자가 줄기 세포 이식, 또는 이들의 임의의 조합 중 하나 이상에 대해 암이 불응성이거나 또는 그후에 암이 재발된 경우일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 CD19 항원을 표적화하는 암의 치료 방법은,
트래퍼 분자를 T세포에 도입함; 및
야생 상태 세포와 상이한 형질이 유도된 세포를 단리함; 에 의해 생산된
Allogeneic CAR-T를 포함한 조성물을 대상 내 투여함을 포함할 수 있다.
나아가, 상기 Allogeneic CAR-T는 그 생산 과정에서 CD19 결합하는 항원 인식부, CD28 공동자극성 도메인 및 CD3-zeta 신호전달 영역을 포함하는 CAR을 도입함을 추가적으로 포함할 수 있다.
이때, 야생 상태 세포와 상이한 형질은 면역 활성화 수용체의 발현 형태에 있어 야생 상태 세포와 상이한 형질을 보임 및/또는 인공수용체를 포함함일 수 있다. 이때, 인공수용체는 키메라 항원 수용체일 수 있다.
상기 암은 백혈병일 수 있다.
백혈병은 골수의 정상 혈액세포가 어떠한 원인으로 인해 암세포로 전환되어 증식하면서 생기는 질환이다. 백혈병 세포는 무한 증식하여 정상적인 백혈구, 적혈구 및 혈소판의 생성을 방해하하며, 골수에서 나온 백혈병 세포들이 혈액순환을 통해 간, 비장, 림프절, 중추신경계 및 여러 장기에 침착될 수 있다. 주로 급성의 진행양상을 보이며, 주로 림프구계 백혈구에 암세포 변화가 일어나 경우를 말한다. 급성 림프구성 백혈병 환자의 세포는 CD19, CD20이 과다 발현한다.
백혈병을 치료하기 위한 allogeneic CAR-T는 CD19항원 및/또는 CD20항원을 특이적으로 인식할 수 있는 CAR-T를 사용하여, 비정상적인 암세포에 면역반응을 유발함으로써, 치료용으로 사용될 수 있다.
예를 들어, 상기 혈액암을 치료하기 위한 방법은,
트래퍼 분자를 T세포에 도입함; 및
야생 상태 세포와 상이한 형질이 유도된 세포를 단리함; 에 의해 생산된
Allogeneic CAR-T를 포함한 조성물을 대상 내 투여함을 포함한다.
나아가, 상기 Allogeneic CAR-T는 그 생산 과정에서 백혈병에 특이적인 CAR를 도입함을 추가적으로 포함할 수 있다.
이때, 야생 상태 세포와 상이한 형질은 면역 활성화 수용체의 발현 형태에 있어 야생 상태 세포와 상이한 형질을 보임 및/또는 인공수용체를 포함함일 수 있다. 이때, 인공수용체는 키메라 인공 수용체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 암 치료방법은 allogeneic CAR세포를 포함한 조성물을 대상에게 투여하는 것을 포함한다.
예를 들어, 상기 allogeneic CAR세포를 포함한 조성물을 투여하는 방법은 주사(injection), 수혈(transfusion), 삽입(implantation) 또는 이식(transplantation)과 같은, 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 투여 경로는 피하(subcutaneously), 피내(intradermaliy), 종양내(intratumorally), 절내(intranodally), 골수내(intramedullary), 근육내(intramuscularly), 정맥내(intravenous), 림프액내(intralymphatic), 복막내(intraperitoneally) 등에서 선택될 수 있다.
바람직하게 정맥 내 전신 투여 일 수 있다.
다른 예로, 상기 투여는 상기 치료 대상의 신장, 위, 췌장, 십이지장 및/또는 결장을 포함하는 소화게통; 심장; 폐; 뇌; 망막 조직을 포함하는 눈; 내이를 포함하는 귀; 피부; 근육; 뼈; 및 또는 간' 중 어느 하나이상의 기관에 투여하는 것일 수 있다.
다른 예를 들어, 상기 allogeneic CAR 세포는 치료 유효량으로 투여될 수 있다.
예를 들어, allogeneic CAR T 세포의 치료 유효량은 적어도 약 104개의 세포, 적어도 약 105개의 세포, 적어도 약 106개의 세포, 적어도 약 107개의 세포, 적어도 약 108개의 세포, 적어도 약 109개, 또는 적어도 약 1010개의 세포일 수 있다. 또는
다른 예로, 약 104개의 세포, 약 105개의 세포, 약 106개의 세포, 약 107개의 세포 약 108개, 약 109개, 또는 약 1010개의 세포일 수 있다.
또 다른 예로, allogeneic CAR T 세포의 치료 유효량은 약 1 X 105개의 세포/kg, 2 X 105개의 세포/kg, 약 3 X 105개의 세포/kg, 약 4 X 105개의 세포/kg, 약 5 X 105개의 세포/kg, 약 6 X 105개의 세포/kg, 약 7 X 105개의 세포/kg, 약 8 X 105개의 세포/kg, 약9 X 105개의 세포/kg, 약 1 X 106개의 세포/kg, 2 X 106개의 세포/kg, 약 3 X 106개의 세포/kg, 약 4 X 106개의 세포/kg, 약 5 X 106개의 세포/kg, 약 6 X 106개의 세포/kg, 약 7 X 106개의 세포/kg, 약 8 X 106개의 세포/kg, 약 9 X 106개의 세포/kg, 약 1 X 107개의 세포/kg, 2 X 107개의 세포/kg, 약 3 X 107개의 세포/kg, 약 4 X 107개의 세포/kg, 약 5 X 107개의 세포/kg, 약 6 X 107개의 세포/kg, 약 7 X 107개의 세포/kg, 약 8 X 107개의 세포/kg 또는 약 9 X 107개의 세포/kg일 수 있다.
한 특정한 실시태양에서, 상기 allogeneic CAR T 세포의 치료 유효량은 약 2 X 106개의 세포/kg일 수 있다.
또 다른 예로, allogeneic CAR-T 세포의 치료 유효량은 약 1 X 105개의 세포/kg 내지 약 2 x 108개의 세포/kg, 약 2 X 105개의 세포/kg 내지 약 2 x 108개의 세포/kg, 약 3 X 105개의 세포/kg 내지 약 2 x 108개의 세포/kg, 약 4 X 105개의 세포/kg 내지 약 2 x 108개의 세포/kg, 약 5 X 105개의 세포/kg 내지 약 2 x 108개의 세포/kg, 약 6 X 105개의 세포/kg 내지 약 2 x 108개의 세포/kg, 약 7 X 105개의 세포/kg 내지 약 2 x 108개의 세포/kg, 약 8 X 105개의 세포/kg 내지 약 2 x 108개의 세포/kg, 약 9 X 105개의 세포/kg 내지 약 2 x 108개의 세포/kg, 약 1 X 106개의 세포/kg 내지 약 2 x 109개의 세포/kg, 약 2 X 106개의 세포/kg 내지 약 2 x 109개의 세포/kg, 약 3 X 106개의 세포/kg 내지 약 2 x 109개의 세포/kg, 약 4 X 106개의 세포/kg 내지 약 2 x 109개의 세포/kg, 약 5 X 106개의 세포/kg 내지 약 2 x 109개의 세포/kg, 약 6 X 106개의 세포/kg 내지 약 2 x 109개의 세포/kg, 약 7 X 106개의 세포/kg 내지 약 2 x 109개의 세포/kg, 약 8 X 106개의 세포/kg 내지 약 2 x 109개의 세포/kg, 약 9 X 106개의 세포/kg 내지 약 2 x 109개의 세포/kg일 수 있다. 한 특정한 실시양태에서, 조작된 CAR T 세포의 치료 유효량은 2.0 X 105개의 세포/kg이다.
일 구현예에서,
상기 Allogeneic CAR-T세포를 충분한 수로 수여자에게 투여하여 질병의 증상을 개선시킬 수 있다. 일 예로, 투여량은 107 내지 1010개, 예를 들어 109개 세포를 단일 환경에서 투여할 수 있다. 109 개의 세포는 분할하여 일정한 간격마다 투여할 수 있고, 주입량은 일반적으로 질환 증상이 개선될때까지 또는 일반적으로 용인되는 대로 주입할 수 있다. 바람직하게는 1회 이상의 주입이다. 이때 주입은 세포를 50 내지 250 ㎖/시간의 속도로 정맥내 주입할 수 있다, 다른 예로, 다른 적합한 투여방법은 동맥 내 주입, 종양 내로의 직접 주사 및/또는 수술 후의 종양 층의 관류, 척수강내 투여 및 안구내 투여 등이 포함된다. 다만 이에 제한되는 것은 아니고, 투여 대상의 연령, 건강 및 체중, 동시에 받는 치료의 종류, 다만 있다면 치료의 빈도, 원하는 효과의 특성을 고려하여 적절히 처방될 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물을 투여하는 시기는, 상기 질환의 임상 증상이 발생하는 전후를 불문하고 예방적 투여할 수 있거나 또는 치료적 투여할 수 있다.
14. 실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 자명할 것이다.
실시예 1. 실험에 사용된 트래퍼 펩타이드의 서열
실험에 사용된 트래퍼 펩타이드의 목록
트래퍼 펩타이드의 명칭 아미노산 서열
1 SNKSLEQIWNHTTWMEWDGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL (서열번호 178)
2 SNKSLEQIWNHTTWMEWDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEEKKMP (서열번호 185)
3 KKVIGFRILLLKVAGFNLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL (서열번호 248)
4 KKVIGFRILLLKVAGFNLIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEEKKMP (서열번호 249)
5 LFIMIVGGLVGLRIVFAVLSIGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL (서열번호 240)
6 LFIMIVGGLVGLRIVFAVLSIIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEEKKMP (서열번호 182)
7 AVGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL (서열번호 175)
8 AVGIGALFLGFLGAAGSTMGARSMTLTVQARQLIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEEKKMP (서열번호 181)
ERret1 ALPVTALLLPLALLLHAARPSNKSLEQIWNHTTWMEWDGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSAEKDEL (서열번호 220)
ERret2 ALPVTALLLPLALLLHAARPSNKSLEQIWNHTTWMEWDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCLYKYKSRRSFIEEKKMP (서열번호 250)
하기 실험에서 사용된 트래퍼 펩타이드의 아미노산 서열은 표 1과 같으며, 실험 결과를 나타낸 그래프 및 표에서 언급되는 트래퍼 펩타이드의 명칭은 표 1의 1열에 위치한 명칭을 지칭한다.
트래퍼 펩타이드 1 내지 8을 구성하는 도메인 간의 위치 관계는 도 ~와 같다. 또한, ERret1 및 ERret2를 구성하는 도메인 간의 위치 관계는 도 ~와 같다. ERret1 및 ERret2는 CD8a 신호 서열을 추가적으로 포함함으로써 1 내지 8에 비하여 개선된 효과를 보이는 것을 목적하였다.
실시예 2. 전기 천공법을 이용한 Jurkat 세포의 형질 전환 결과
Jurkat 세포주 (ATCC-TIB-152)를 10 % FBS 및 항생제를 포함하는 RPMI1640 배지 (GeneAll)에서 배양했다. 세포는 37 ℃ 5 % CO2 조건의 배양기에서 배양하였다.
표 1 중 1 내지 8에 해당하는 트래퍼 펩타이드를 암호화하는 서열을 코돈 최적화한 후 렌티 바이러스 벡터 pLVX-IRES-puro vector (clonetech)에 서브 클로닝 하였다. 대조군으로 서브클로닝하지 않은 PLVX 벡터 역시 준비하였다. 실시예 1 및 실시예 2에서 준비된 세포를 형질전환하기 위하여 Neon Transfection System (ThermoFisher Scientific, Grand Island, NY)의 10uL의 tip을 1,400 V, 20 ms, 2 pulses 조건하에 유전자 전달(gene transfer)하는데 사용하였다. 세포는 항생제가 없는 배지 500 μl에 도말하고 5 % CO2 배양기에서 37 ° C로 배양하였다.
세포 염색 (cell staining)은 1% FBS를 첨가한 4°C의 PBS에서 수행되었다. CD3 및 TRAC 발현의 평가를 위해, Jurkat 세포는 전기 천공 후 14 일 동안 배양되었다. 유동 세포 계측법 분석을 위해 세포를 1 % FBS가 보충 된 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척하고 FITC 마우스 항-인간 CD3 항체 (Myltenyi Biotec) 및 APC 항-인간 TCRα/β (Myltenyi Biotec)를 4 ° C에서 30분동안 염색하였다. 이어서 세포를 세척하고 PBS에 재부유(resuspension) 시켰다. 데이터를 Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer (Thermo Scientific)로 수득한 후 FlowJo (FlowJo, LLC)로 분석하였다.
분석된 결과가 표 2 및 도 2와 같다. 트래퍼 펩타이드를 형질 도입한 Jurkat 세포는 유의미하게 TCR 하위 유닛인 TCR 헤테로다이머와 CD3의 세포 표면의 양이 감소한 것을 확인할 수 있었다. 그 중 특히 2에 해당하는 트래퍼 펩타이드가 우수한 특성을 보였다.
전기 천공법으로 트래퍼 펩타이드를 형질 도입한 Jurkat 세포의 유세포 분석 결과
DNA transfection
　 TCR negative (%) CD3 negative (%)
pLVX 20.8 36.5
1 19 34.1
2 30.3 55.3
3 20.5 40.3
4 20.1 41.1
5 22 41.4
6 22.8 40.8
7 22.6 41.3
8 21.7 44.9
실시예 3. 렌티바이러스를 이용한 Jurkat 세포의 형질 전환 결과
Jurkat 세포주 (ATCC-TIB-152)를 10 % FBS 및 항생제를 포함하는 RPMI1640 배지 (GeneAll)에서 배양했다. 세포는 37℃ 5 % CO2 조건의 배양기에서 배양하였다.
표 1 중 ERret1 및 ERret2를 암호화하는 서열을 코돈 최적화한 후 렌티 바이러스 벡터 pLVX-IRES-puro vector (clonetech)에 서브 클로닝 하였다. 대조군으로 서브클로닝하지 않은 PLVX 벡터 역시 준비하였다. 바이러스는 Lipofectamine2000 (Thermo Scientific)을 사용하여 렌티 바이러스 벡터 및 헬퍼 플라스미드로 형질 감염된 293T 세포의 상등액으로부터 수집하였다. 상등액을 수확 한 후, 렌티 바이러스를 4: 1 비율로 20 % 수크로오스 - 함유 완충액 (100 mM NaCl, 0.5 mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 [EDTA], 50 mM Tris-HCl, pH 7.4)을 담구어 10000 x g로 4 °C에서 4 시간동안 원심 분리하였다. 원심 분리 후, 상등액을 제거하고, 다시 현탁액을 형성하기 위해 인산 버퍼 식염수 (phosphate buffered saline; PBS)를 첨가하였다. 상기 방법으로 준비된 렌티 바이러스를 Jurkat 세포의 배양 배지에 첨가하여 형질 도입시켰다. 이때, 첨가하는 렌티 바이러스 현탁액의 용량을 10, 100, 500 μl로 하여 비교 실험하였다.
세포 염색 (cell staining)은 1% FBS를 첨가한 4°C의 PBS에서 수행되었다. CD3 및 TRAC 발현의 평가를 위해, Jurkat 세포는 전기 천공 후 14 일 동안 배양되었다. 유동 세포 계측법 분석을 위해 세포를 1 % FBS가 보충 된 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척하고 FITC 마우스 항-인간 CD3 항체 (Myltenyi Biotec) 및 APC 항-인간 TCRα/β (Myltenyi Biotec)를 4 ° C에서 30분동안 염색하였다. 이어서 세포를 세척하고 PBS에 재부유(resuspension) 시켰다. 데이터를 Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer (Thermo Scientific)로 수득한 후 FlowJo (FlowJo, LLC)로 분석하였다.
분석된 결과가 표 3 및 도 3와 같다. 도 3의 pLVX 및 pLVX-ERret2의 결과를 비교하면, ERret2를 형질 도입한 Jurkat 세포가 야생 상태 세포에 비하여 TCR 및 CD3의 세포 표면의 양이 유의미하게 감소한 것을 확인할 수 있다. 이를 수치화하여 분석한 결과에서도 트래퍼 펩타이드를 형질 도입한 Jurkat 세포에서 유의미하게 TCR 하위 유닛인 TCR 헤테로다이머와 CD3의 세포 표면의 양이 감소한 것을 확인할 수 있었다 (표 3). 그 중 특히 ERret2는 해당하는 트래퍼 펩타이드는 우수한 특성을 보였다.
나아가, ERret2가 삽입된 렌티바이러스 현탁액의 용량을 증가시켜 투여한 결과 세포 표면의 TCR의 양이 유의미하게 감소하는 것으로 확인되었다 (도 4 및 5). 그래프의 'virus' 축의 수치는 투여한 현탁액의 용량 (μl)을 의미한다. 이 결과는 트래퍼 펩타이드가 면역 세포에 있어 TCR의 발현 형질에 영향을 미치는 것으로 해석된다.
렌티바이러스로 트래퍼 펩타이드를 형질 도입한 Jurkat 세포의 유세포 분석 결과
Lentiviral transduction
　 TCR negative (%) CD3 negative (%)
pLVX 13.2 14.6
ERret1 14.3 13.3
ERret2 54.6 54.1
실시예 4. Jurkat 세포 내 트래퍼 펩타이드의 발현과 세포 표면의 TCR 하위 유닛의 양의 연관 관계
Jurkat 세포주 (ATCC-TIB-152)를 10 % FBS 및 항생제를 포함하는 RPMI1640 배지 (GeneAll)에서 배양했다. 세포는 37 ℃ 5 % CO2 조건의 배양기에서 배양하였다.
표 1 중 ERret1 및 ERret2를 암호화하는 서열을 코돈 최적화한 후 렌티 바이러스 벡터 pLVX-IRES-puro vector (clonetech)에 서브 클로닝 하였다. 또한, 세포 내에서 발현되는 트래퍼 펩타이드의 양을 정량화하기 위해 EGFP를 서브 클로닝하였다. 이 경우, 트래퍼 펩타이드가 발현되면 EGFP 또한 발현되기 때문에 유세포분석을 통해 EGFP의 양을 측정하면 트래퍼 펩타이드의 양을 유추할 수 있다. 실험에 사용된 벡터의 설계는 도 6와 같다. 바이러스는 Lipofectamine2000 (Thermo Scientific)을 사용하여 렌티 바이러스 벡터 및 헬퍼 플라스미드로 형질 감염된 293T 세포의 상등액으로부터 수집하였다. 상등액을 수확 한 후, 렌티 바이러스를 4: 1 비율로 20 % 수크로오스 - 함유 완충액 (100 mM NaCl, 0.5 mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 [EDTA], 50 mM Tris-HCl, pH 7.4)을 담구어 10000 x g로 4 °C에서 4 시간동안 원심 분리하였다. 원심 분리 후, 상등액을 제거하고, 다시 현탁액을 형성하기 위해 인산 버퍼 식염수 (phosphate buffered saline; PBS)를 첨가하였다. 상기 방법으로 준비된 렌티 바이러스를 Jurkat 세포의 배양 배지에 첨가하여 형질 도입시켰다.
세포 염색 (cell staining)은 1% FBS를 첨가한 4°C의 PBS에서 수행되었다. CD3 및 TRAC 발현의 평가를 위해, Jurkat 세포는 전기 천공 후 14 일 동안 배양되었다. 유동 세포 계측법 분석을 위해 세포를 1 % FBS가 보충 된 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척하고 FITC 마우스 항-인간 CD3 항체 (Myltenyi Biotec) 및 APC 항-인간 TCRα/β (Myltenyi Biotec)를 4 ° C에서 30분동안 염색하였다. 이어서 세포를 세척하고 PBS에 재부유(resuspension) 시켰다. 데이터를 Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer (Thermo Scientific)로 수득한 후 FlowJo (FlowJo, LLC)로 분석하였다.
분석된 결과가 도 7과 같다. pLVX-EGFP와 pLVX-EGFP-ERret2의 EGFP MFI 값을 비교하면 ERret2와 같이 발현된 EGFP의 세포 표면의 양이 감소한 것을 확인할 수 있고, 이를 통해 트래퍼 펩타이드가 본 출원에서 의도한 것과 같이 세포막이 아닌 세포 소기관에 잔류한다는 것을 확인할 수 있다. 또한 TCR MFI 값을 비교하면 TCR 체인의 세포 표면의 양이 감소한 것을 확인할 수 있고, 이를 통해 트래퍼 펩타이드의 발현이 TCR의 세포 표면의 양을 감소시켰음을 확인할 수 있었다. 이를 종합할 때, 트래퍼 펩타이드가 세포 소기관에 잔류하면서 TCR 체인과 결합을 이루고 이를 통해 TCR이 세포 내에 갇힘으로써 세포 표면에 TCR이 노출되는 것을 막는다고 예상할 수 있었다.
실시예 5. Jurkat 세포 내 트래퍼 펩타이드의 양과 Jurkat 세포 표면의 TCR 하위 유닛의 양의 상관 관계
Jurkat 세포주 (ATCC-TIB-152)를 10 % FBS 및 항생제를 포함하는 RPMI1640 배지 (GeneAll)에서 배양했다. 세포는 37 ℃ 5 % CO2 조건의 배양기에서 배양하였다.
표 1 중 ERret1 및 ERret2를 암호화하는 서열을 코돈 최적화한 후 렌티 바이러스 벡터 pLVX-IRES-puro vector (clonetech)에 서브 클로닝 하였다. 또한, 세포 내에서 발현되는 트래퍼 펩타이드의 양을 정량화하기 위해 EGFP를 서브 클로닝하였다. 또한, 트래퍼 펩타이드가 발현되는 양을 조절하기 위하여 프로모터를 EF1a로부터 CMV2로 치환한 벡터를 제작하였다. 실험에 사용된 벡터의 설계는 도 8과 같다. 바이러스는 Lipofectamine2000 (Thermo Scientific)을 사용하여 렌티 바이러스 벡터 및 헬퍼 플라스미드로 형질 감염된 293T 세포의 상등액으로부터 수집하였다. 상등액을 수확 한 후, 렌티 바이러스를 4: 1 비율로 20 % 수크로오스 - 함유 완충액 (100 mM NaCl, 0.5 mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 [EDTA], 50 mM Tris-HCl, pH 7.4)을 담구어 10000 x g로 4 °C에서 4 시간동안 원심 분리하였다. 원심 분리 후, 상등액을 제거하고, 다시 현탁액을 형성하기 위해 인산 버퍼 식염수 (phosphate buffered saline; PBS)를 첨가하였다. 상기 방법으로 준비된 렌티 바이러스를 Jurkat 세포의 배양 배지에 첨가하여 형질 도입시켰다.
세포 염색 (cell staining)은 1% FBS를 첨가한 4°C의 PBS에서 수행되었다. CD3 및 TRAC 발현의 평가를 위해, Jurkat 세포는 전기 천공 후 14 일 동안 배양되었다. 유동 세포 계측법 분석을 위해 세포를 1 % FBS가 보충 된 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척하고 FITC 마우스 항-인간 CD3 항체 (Myltenyi Biotec) 및 APC 항-인간 TCRα/β (Myltenyi Biotec)를 4 ° C에서 30분동안 염색하였다. 이어서 세포를 세척하고 PBS에 재부유(resuspension) 시켰다. 데이터를 Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer (Thermo Scientific)로 수득한 후 FlowJo (FlowJo, LLC)로 분석하였다.
분석된 결과가 도 9와 같다. CMV2 프로모터는 EF1a 프로모터에 비하여 활성이 높은 프로모터이므로 트래퍼 펩타이드의 발현량이 많아질 것으로 기대되었다. 실제 실험 결과, CMV2 프로모터를 사용한 경우 트래퍼 펩타이드의 발현량이 증가하고 TCR 체인의 세포 표면의 양이 감소하는 것으로 확인되었다. 이는 면역 세포 내의 트래퍼 펩타이드의 양이 면역 세포의 TCR negative 형질과 양의 상관 관계가 있음을 의미한다.
실시예 6. 렌티바이러스를 이용한 T 세포의 형질 전환 결과
인간 말초 혈액 pan-T 세포 (STEMCELL Technologies)는 10 % FBS가 첨가된 RPMI에서 3:1의 비드 대 세포 비율로 Dynabeads Human T Activator anti-CD3/28 (Thermo Scientific)을 첨가하여 활성화되었다.
표 1 중 ERret1 및 ERret2를 암호화하는 서열을 코돈 최적화한 후 렌티 바이러스 벡터 pLVX-IRES-puro vector (clonetech)에 서브 클로닝 하였다. 또한, 세포 내에서 발현되는 트래퍼 펩타이드의 양을 정량화하기 위해 EGFP를 서브 클로닝하였다. 실험에 사용된 벡터의 설계는 도 10과 같다. 바이러스는 Lipofectamine2000 (Thermo Scientific)을 사용하여 렌티 바이러스 벡터 및 헬퍼 플라스미드로 형질 감염된 293T 세포의 상등액으로부터 수집하였다. 상등액을 수확 한 후, 렌티 바이러스를 4: 1 비율로 20 % 수크로오스 - 함유 완충액 (100 mM NaCl, 0.5 mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 [EDTA], 50 mM Tris-HCl, pH 7.4)을 담구어 10000 x g로 4 °C에서 4 시간동안 원심 분리하였다. 원심 분리 후, 상등액을 제거하고, 다시 현탁액을 형성하기 위해 인산 버퍼 식염수 (phosphate buffered saline; PBS)를 첨가하였다. 상기 방법으로 준비된 렌티 바이러스를 T 세포의 배양 배지에 첨가하여 형질 도입시켰다.
72 시간의 활성화 및 형질 도입 후, 비드를 세포 현탁액으로부터 제거하고 T 세포를 10 % FBS, hIL-2 (Peprotech, 50 U / mL), IL-15 (Peptrotech, 5ng / ml) 및 hIL-7 (Peprotech, 5 ng / mL)를 포함하는 RPMI 1640 배지에서 배양했다. 세포는 37 ℃ 5 % CO2 조건의 배양기에서 배양하였다.
세포 염색 (cell staining)은 1% FBS를 첨가한 4°C의 PBS에서 수행되었다. 유동 세포 계측법 분석을 위해 세포를 1 % FBS가 보충 된 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척하고 FITC 마우스 항-인간 CD3 항체 (Myltenyi Biotec) 및 APC 항-인간 TCRα/β (Myltenyi Biotec)를 4 ° C에서 30분동안 염색하였다. 이어서 세포를 세척하고 PBS에 재부유(resuspension) 시켰다. 데이터를 Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer (Thermo Scientific)로 수득한 후 FlowJo (FlowJo, LLC)로 분석하였다.
분석된 결과가 도 11과 같다. pLVX-EGFP와 pLVX-EGFP-ERret2의 EGFP MFI 값을 비교하면 ERret2와 같이 발현된 EGFP의 세포 표면의 양이 감소한 것을 확인할 수 있고, 이를 통해 트래퍼 펩타이드가 본 출원에서 의도한 것과 같이 세포막이 아닌 세포 소기관에 잔류한다는 것을 확인할 수 있다. 또한 TCR MFI 값을 비교하면 TCR 체인의 세포 표면의 양이 감소한 것을 확인할 수 있고, 이를 통해 트래퍼 펩타이드의 발현이 TCR의 세포 표면의 양을 감소시켰음을 확인할 수 있었다. 이를 종합할 때, 트래퍼 펩타이드가 세포 소기관에 잔류하면서 TCR 체인과 결합을 이루고 이를 통해 TCR이 세포 내에 갇힘으로써 세포 표면에 TCR이 노출되는 것을 막는다고 예상할 수 있었다. 이를 통해 T 세포에도 성공적으로 트래퍼 펩타이드가 형질 도입되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7. T 세포 내 트래퍼 펩타이드의 양과 T 세포 표면의 TCR 하위 유닛의 양의 상관 관계
인간 말초 혈액 pan-T 세포 (STEMCELL Technologies)는 10 % FBS가 첨가된 RPMI에서 3:1의 비드 대 세포 비율로 Dynabeads Human T Activator anti-CD3/28 (Thermo Scientific)을 첨가하여 활성화되었다.
표 1 중 ERret1 및 ERret2를 암호화하는 서열을 코돈 최적화한 후 렌티 바이러스 벡터 pLVX-IRES-puro vector (clonetech)에 서브 클로닝 하였다. 또한, 세포 내에서 발현되는 트래퍼 펩타이드의 양을 정량화하기 위해 EGFP를 서브 클로닝하였다. 또한, 트래퍼 펩타이드가 발현되는 양을 조절하기 위하여 프로모터를 각각 CMV2, CMV3로 치환한 벡터를 준비하였다. 실험에 사용된 벡터의 설계는 도 12와 같다. 바이러스는 Lipofectamine2000 (Thermo Scientific)을 사용하여 렌티 바이러스 벡터 및 헬퍼 플라스미드로 형질 감염된 293T 세포의 상등액으로부터 수집하였다. 상등액을 수확 한 후, 렌티 바이러스를 4: 1 비율로 20 % 수크로오스 - 함유 완충액 (100 mM NaCl, 0.5 mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 [EDTA], 50 mM Tris-HCl, pH 7.4)을 담구어 10000 x g로 4 °C에서 4 시간동안 원심 분리하였다. 원심 분리 후, 상등액을 제거하고, 다시 현탁액을 형성하기 위해 인산 버퍼 식염수 (phosphate buffered saline; PBS)를 첨가하였다. 상기 방법으로 준비된 렌티 바이러스를 T 세포의 배양 배지에 첨가하여 형질 도입시켰다.
72 시간의 활성화 및 형질 도입 후, 비드를 세포 현탁액으로부터 제거하고 T 세포를 10 % FBS, hIL-2 (Peprotech, 50 U / mL), IL-15 (Peptrotech, 5ng / ml) 및 hIL-7 (Peprotech, 5 ng / mL)를 포함하는 RPMI 1640 배지에서 배양했다. 세포는 37 ℃ 5 % CO2 조건의 배양기에서 배양하였다.
세포 염색 (cell staining)은 1% FBS를 첨가한 4°C의 PBS에서 수행되었다. 유동 세포 계측법 분석을 위해 세포를 1 % FBS가 보충 된 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척하고 FITC 마우스 항-인간 CD3 항체 (Myltenyi Biotec) 및 APC 항-인간 TCRα/β (Myltenyi Biotec)를 4 ° C에서 30분동안 염색하였다. 이어서 세포를 세척하고 PBS에 재부유(resuspension) 시켰다. 데이터를 Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer (Thermo Scientific)로 수득한 후 FlowJo (FlowJo, LLC)로 분석하였다.
분석된 결과가 도 13과 같다. CMV3, CMV2 프로모터의 순서대로 활성이 높은 프로모터이므로 트래퍼 펩타이드의 발현량이 많아질 것으로 기대되었다. 실제 실험 결과, pLVX-CMV3-EGFP-ERret2에 있어 pLVX-CMV3-EGFP-ERret3 보다 TCR 체인의 세포 표면의 양이 감소한 것을 확인할 수 있었다. 이는 면역 세포 내의 트래퍼 펩타이드의 양이 면역 세포의 TCR negative 형질과 양의 상관 관계가 있음을 의미한다.
<110> TOOLGEN <120> Allogeneic CAR-T <130> OPP18-032-PCT <150> US 62/749,928 <151> 2018-10-24 <160> 250 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 345 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 1 Ala Val Gly Ile Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly 1 5 10 15 Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser Met Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln 20 25 30 Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile 35 40 45 Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln 50 55 60 Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln 65 70 75 80 Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala 85 90 95 Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp 100 105 110 Asn His Thr Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr 115 120 125 Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys 130 135 140 Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn 145 150 155 160 Trp Phe Asn Ile Thr Asn Trp Leu Trp Tyr Ile Lys Leu Phe Ile Met 165 170 175 Ile Val Gly Gly Leu Val Gly Leu Arg Ile Val Phe Ala Val Leu Ser 180 185 190 Ile Val Asn Arg Val Arg Gln Gly Tyr Ser Pro Leu Ser Phe Gln Thr 195 200 205 His Leu Pro Thr Pro Arg Gly Pro Asp Arg Pro Glu Gly Ile Glu Glu 210 215 220 Glu Gly Gly Glu Arg Asp Arg Asp Arg Ser Ile Arg Leu Val Asn Gly 225 230 235 240 Ser Leu Ala Leu Ile Trp Asp Asp Leu Arg Ser Leu Cys Leu Phe Ser 245 250 255 Tyr His Arg Leu Arg Asp Leu Leu Leu Ile Val Thr Arg Ile Val Glu 260 265 270 Leu Leu Gly Arg Arg Gly Trp Glu Ala Leu Lys Tyr Trp Trp Asn Leu 275 280 285 Leu Gln Tyr Trp Ser Gln Glu Leu Lys Asn Ser Ala Val Ser Leu Leu 290 295 300 Asn Ala Thr Ala Ile Ala Val Ala Glu Gly Thr Asp Arg Val Ile Glu 305 310 315 320 Val Val Gln Gly Ala Cys Arg Ala Ile Arg His Ile Pro Arg Arg Ile 325 330 335 Arg Gln Gly Leu Glu Arg Ile Leu Leu 340 345 <210> 2 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 2 Ala Val Gly Ile Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly 1 5 10 15 Ser Thr Met Gly Ala Ala Ser Met Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln 20 25 30 Leu <210> 3 <211> 37 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 3 Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu 1 5 10 15 Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu 20 25 30 Gln Ala Arg Ile Leu 35 <210> 4 <211> 44 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 4 Ala Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly 1 5 10 15 Cys Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn Ala Ser 20 25 30 Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn His 35 40 <210> 5 <211> 33 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 5 Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His 1 5 10 15 Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu 20 25 30 Leu <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 6 Leu Phe Ile Met Ile Val Gly Gly Leu Val Gly Leu Arg Ile Val Phe 1 5 10 15 Ala Val Leu Ser Ile 20 <210> 7 <211> 36 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 7 Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala 1 5 10 15 Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln 20 25 30 Ala Arg Ile Leu 35 <210> 8 <211> 34 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 8 Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His 1 5 10 15 Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu 20 25 30 Leu Leu <210> 9 <211> 18 <212> PRT <213> Human immunodeficiency virus type 1 <400> 9 Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn His Thr Thr Trp Met Glu 1 5 10 15 Trp Asp <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 10 Gly Leu Arg Leu Leu Met Phe Ile Val 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 11 Gly Leu Arg Ile Val Phe Ala Val Leu 1 5 <210> 12 <211> 81 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 12 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 20 25 30 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 35 40 45 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 50 55 60 Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala 65 70 75 80 Ala <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 13 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly 1 5 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 14 Gly Ala Val Phe Leu Gly Phe Leu 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 15 Gly Ala Met Phe Leu Gly Phe Leu Gly 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 16 Gly Ala Val Leu Leu Gly Phe Leu Gly 1 5 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 17 Gly 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50 55 60 Ala Arg Ser Met Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu Gly Gly Gly 65 70 75 80 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 85 90 95 Ser Ala Glu Lys Asp Glu Leu 100 <210> 231 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 231 Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His 1 5 10 15 Ala Ala Arg Pro Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 20 25 30 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Thr Thr Ala Val 35 40 45 Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln Ile Gly Gly 50 55 60 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 65 70 75 80 Gly Ser Ala Glu Lys Asp Glu Leu 85 <210> 232 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 232 Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His 1 5 10 15 Ala Ala Arg Pro Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 20 25 30 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Trp Asn Ala Ser 35 40 45 Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn His Thr Gly Gly Gly 50 55 60 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 65 70 75 80 Ser Ala Glu Lys Asp Glu Leu 85 <210> 233 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 233 Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His 1 5 10 15 Ala Ala Arg Pro Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 20 25 30 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Ser Asn Lys Ser 35 40 45 Leu Glu Gln Ile Trp Asn His Thr Thr Trp Met Glu Trp Asp Gly Gly 50 55 60 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 65 70 75 80 Gly Ser Ala Glu Lys Asp Glu Leu 85 <210> 234 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 234 Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His 1 5 10 15 Ala Ala Arg Pro Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 20 25 30 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Glu Gln Ile Trp 35 40 45 Asn His Thr Thr Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Gly Gly 50 55 60 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 65 70 75 80 Gly Ser Ala Glu Lys Asp Glu Leu 85 <210> 235 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 235 Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His 1 5 10 15 Ala Ala Arg Pro Ala Val Gly Ile Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu 20 25 30 Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Ala Arg Ser Met Thr Leu Thr Val 35 40 45 Gln Ala Arg Gln Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 50 55 60 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Lys Asp Glu Leu Ile 65 70 75 80 Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser 85 90 95 Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 100 <210> 236 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 236 Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His 1 5 10 15 Ala Ala Arg Pro Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn 20 25 30 Lys Ser Leu Glu Gln Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Lys Asp Glu Leu 50 55 60 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 65 70 75 80 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 85 <210> 237 <211> 87 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 237 Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His 1 5 10 15 Ala Ala Arg Pro Trp Asn Ala Ser Trp Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln 20 25 30 Ile Trp Asn His Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 35 40 45 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Lys Asp Glu Leu Ile 50 55 60 Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser 65 70 75 80 Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 85 <210> 238 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 238 Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His 1 5 10 15 Ala Ala Arg Pro Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn His Thr 20 25 30 Thr Trp Met Glu Trp Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Lys Asp Glu Leu 50 55 60 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 65 70 75 80 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 85 <210> 239 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 239 Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His 1 5 10 15 Ala Ala Arg Pro Glu Gln Ile Trp Asn His Thr Thr Trp Met Glu Trp 20 25 30 Asp Arg Glu Ile Asn Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Lys Asp Glu Leu 50 55 60 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 65 70 75 80 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 85 <210> 240 <211> 47 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 240 Leu Phe Ile Met Ile Val Gly Gly Leu Val Gly Leu Arg Ile Val Phe 1 5 10 15 Ala Val Leu Ser Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 20 25 30 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Lys Asp Glu Leu 35 40 45 <210> 241 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 241 Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn His Thr Thr Trp Met Glu 1 5 10 15 Trp Asp Leu Tyr Cys Leu Tyr Lys Tyr Lys Ser Arg Arg Ser Phe Ile 20 25 30 Glu Glu Lys Lys Met Pro 35 <210> 242 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 242 Leu Phe Ile Met Ile Val Gly Gly Leu Val Gly Leu Arg Ile Val Phe 1 5 10 15 Ala Val Leu Ser Ile Leu Tyr Cys Leu Tyr Lys Tyr Lys Ser Arg Arg 20 25 30 Ser Phe Ile Glu Glu Lys Lys Met Pro 35 40 <210> 243 <211> 60 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 243 cuuuuuauua ugauuguugg uggucuuguu ggucuucgua uuguuuuugc uguucuuucu 60 60 <210> 244 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 244 aaagaugaau ua 12 <210> 245 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial 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25 30 Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Leu Tyr Lys Tyr Lys Ser 35 40 45 Arg Arg Ser Phe Ile Glu Glu Lys Lys Met Pro 50 55 <210> 250 <211> 78 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial Sequence <400> 250 Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His 1 5 10 15 Ala Ala Arg Pro Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn His Thr 20 25 30 Thr Trp Met Glu Trp Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr 35 40 45 Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Leu Tyr 50 55 60 Lys Tyr Lys Ser Arg Arg Ser Phe Ile Glu Glu Lys Lys Met 65 70 75

Claims (25)

  1. 면역 활성화 수용체의 하위 유닛 중 적어도 하나에 대한 결합능을 갖는 gp41 유래 결합 도메인; 및
    소포체 잔류 도메인, 골지체 잔류 도메인 및 가수분해 복합체(proteasome) 잔류 도메인 중 어느 하나 이상을 포함하는,
    트래퍼 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 gp41 유래 결합 도메인은 FP, NHR, Loop, CHR 및 TMD, 및 이들의 일부서열 중 어느 하나인 것을 특징으로 트래퍼 펩타이드.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 gp41 유래 결합 도메인은 서열번호 20, 27 및 37 중 선택된 어느 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 트래퍼 펩타이드.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 소포체 및 골지체 잔류 도메인은 KDEL, KKXX, KXD/E, YQRL 및 KX 중에 어느 하나 이상을 포함하는 것으로, 이때, 상기 X는 임의의 아미노산인 것을 특징으로 하는 트래퍼 펩타이드.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 KKXX를 포함하는 소포체 및 골지체 잔류 도메인은 서열번호 43 또는 47의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 트래퍼 펩타이드.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 트래퍼 펩타이드는 연결 도메인, CD8α 막관통 도메인 및 CD8α신호서열 중 어느 하나 이상을 더 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 트래퍼 펩타이드.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 연결 도메인은 (GGGGS)n이며, 이때 n은 임의의 정수인 것을 특징으로 하는 트래퍼 펩타이드.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 CD8α 막관통 도메인의 아미노산 서열은 서열번호 111의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 트래퍼 펩타이드.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 CD8α신호서열은 서열번호 141의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 트래퍼 펩타이드.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 트래퍼 펩타이드는 TCR-alpha, TCR-beta, CD3-gamma, CD3-delta, CD3-epsilon, CD3-zeta, CD4, CD8-beta 및 CD8-alpha 중 어느 하나 이상에 대한 결합능을 갖는 것을 특징으로 하는 트래퍼 펩타이드.
  11. 제1항에 있어서,
    서열번호 175, 178, 181, 182, 185, 220, 240, 248, 249, 250 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 트래퍼 펩타이드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 의한 트래퍼 펩타이드를 포함하고,
    면역 활성화 수용체의 발현 형질이 야생 상태 세포와 상이한 것을 특징으로 하는
    조작된 면역 세포.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 면역 활성화 수용체의 발현 형질이 야생 상태 세포와 상이함은 상기 면역 활성화 수용체의 하위 유닛 중 적어도 하나의 세포 표면의 양이 감소함임을 특징으로 하는 조작된 면역 세포.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 면역 활성화 수용체의 발현 형질이 야생 상태 세포와 상이함은 상기 면역 활성화 수용체가 세포 내에 갇힘인 것을 특징으로 하는 조작된 면역 세포.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 조작된 면역 세포는 T세포, NK세포 및 NKT세포로 구성된 군에서 선택된 1이상인 것을 특징으로 하는 조작된 면역 세포.
  16. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 의한 트래퍼 펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 벡터는 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 바이러스 벡터는 아데노 바이러스, 아데노-연관 바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스 바이러스, 헤르페스 바이러스, 레트로 바이러스 및 단순포진 바이러스로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상으로부터 유래된 벡터.
  19. 상기 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 의한 트래퍼 폴리펩타이드 또는 이를 암호화하는 핵산을 면역 세포에 도입시킴을 포함하는
    조작된 면역 세포의 제조 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    야생 상태 세포와 상이한 형질이 유도된 세포를 단리함을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조작된 면역 세포의 제조 방법.
  21. 제19항에 있어서,
    상기 도입시키는 단계는 전기천공법 (electroporation), 리포좀, 플라스미드, 바이러스 벡터, 나노파티클(nanoparticles) 및 PTD (Protein translocation domain)융합 단백질 방법 중 선택되는 1이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 면역 세포 생산 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 바이러스 벡터는 아데노 바이러스, 아데노-연관 바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스 바이러스, 헤르페스 바이러스, 레트로 바이러스 및 단순포진 바이러스로 구성된 군에서 선택된 어느 하나 이상으로부터 유래된 것을 특징으로하는 면역 세포 생산 방법.
  23. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 의한 조작된 면역 세포를 포함하는 조성물을 대상에 주입하는 단계를 포함하는 암 치료 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 조성물을 치료 대상에 투여하는 단계는 전신 투여인 것을 특징으로 하는 암 치료 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 전신 투여는 정맥 내 투여인 것을 특징으로 하는 암 치료 방법.
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