KR20200050982A - pH 감수성 리포솜 및 그 제조 방법 - Google Patents

Abstract

pH 감수성 리포솜의 제조 방법은, 디올과, 3가 이상의 폴리올과, 리포솜 막 구성 성분을 가온 조건하에 혼합하고, 디올과 폴리올의 혼합물에 리포솜 막 구성 성분을 용해한 혼합물 용액을 조제하는 공정과, 이 혼합물 용액과 미리 가온한 수성 매체를 혼합하여 이들을 균질화하는 공정과, 균질화된 수성 매체를 급랭하여 리포솜을 생성하는 공정과, 생성한 리포솜을 회수하는 공정을 포함한다. 본 발명의 방법에 의해, 지금까지 불안정으로 조제가 어려웠던 pH 감수성 리포솜을 안정화하여, 간편한 방법에 의해 pH 감수성 리포솜을 조제할 수가 있다.

Description

pH 감수성 리포솜 및 그 제조 방법

본 발명은 pH 감수성 리포솜(liposome) 및 그 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 디올과 3가 이상의 폴리올의 혼합물에 리포솜의 막 구성 성분을 첨가 용해하여 얻어지는 pH 감수성 리포솜 및 그 제조 방법에 관한 것이다.

<관련출원의 상호참조>

본 출원은 2017년 9월 4일에 일본국에 있어서 출원된 특허출원 2017－169356호 및 특허출원 2017－169359호에 기초하는 우선권을 주장하는 것이고, 당해 출원에 기재된 내용은 모두 참조에 의해 그대로 본 명세서에 원용된다. 또, 본원에 있어서 인용한 모든 특허, 특허출원 및 문헌에 기재된 내용은 모두 참조에 의해 그대로 본 명세서에 원용된다.

리포솜은 생물학적으로 활성인 분자를 세포질 내로 송달하기 위한 캐리어(carrier)로서 주목되고 있다. 리포솜을 이용한 약제 송달에 있어서의 주된 과제는, 통상의 리포솜에서는 막융합성이 낮기 때문에, 세포질 내로 이행한 다음에 지질 이분자막에 내포된 약제의 방출이 늦다는 것이다. 이것을 해결하기 위해, 생리적 조건하에서는 안정하면서, 세포질 내로 이행한 후 산성 조건하에서 불안정화되는 pH 감수성 리포솜이 개발되어 있다. 예를 들면, 포스파티딜에탄올아민형 인지질을 이용한 리포솜은 포스파티딜에탄올아민형 인지질이 pH에 응답하여 집합 구조가 전이하고, 산성 환경(pH 5 이하)에서 내포물을 방출하는 것이 보고되어 있다(예를 들면 비특허문헌 1 참조).

한편, 양이온성 양쪽 친매성 분자와, 음이온성 양쪽 친매성 분자 및 양이온성 양쪽 친매성 분자의 적어도 1종을 구성 지질로서 포함하는 리포솜을 수성 매체 중에 분산시켰을 때, 산성 pH 환경하에서, 당해 리포솜이 플러스의 제타 전위를 가지고, 또한 알칼리성 pH 환경하에서, 당해 리포솜이 마이너스의 제타 전위를 가지고 있고, 당해 제타 전위가 당해 분산액의 pH의 증가에 수반하여, 플러스에서 마이너스로 변화하면, 보유하고 있던 목적 물질이 방출되는 것이 보고되어 있다(예를 들면 특허문헌 1 참조).

리포솜의 제법에는 초음파법, 익스트루젼(extrusion)법, 프렌치프레스(French press)법, 호모지나이제이션(homogenization)법, 에탄올 주입법 등의 여러 가지 방법이 있지만, 전형적인 리포솜의 공업적 제조법에 있어서, 수혼화성 유기용매에 용해된 인지질 등의 지질 성분을 교반하면서 수용액에 주입 첨가하는 방법이 있다. 이 방법은 수혼화성 유기용매로서 메탄올, 에탄올, 이소프로필 알코올, 부탄올 등의 알코올류를 이용할 수가 있지만, 지질의 용해 상태를 유지하기 위해 지질 용액을 가온하면서 수용액에 첨가 혼합할 필요가 있고, 온도나 첨가 속도 혹은 교반 속도를 정밀하게 제어할 필요가 있었다(특허문헌 2 참조).

또, 레시틴과 콜레스테롤과 트리글리세라이드를 소정의 중량비로 포함하는 리포솜은 균질 고압 처리 등의 공정을 행하지 않아도, 일반적인 혼합에 요하는 교반만으로 형성할 수 있다는 것이 보고되어 있다(특허문헌 3 참조).

일본국 특허 제5588619호 공보 일본국 특허공표 2006－517594호 공보 일본국 특허공개 2017－66059호 공보

Duzgunes N, Straubinger RM, Baldwin PA, Friend DS, Papahadjopoulos D. Proton－induced fusion of oleic acid－phosphatidylethanolamine liposomes. Biochemistry. 1985 24(13): 3091－3098.

그렇지만, 이러한 pH 감수성 리포솜은 일반적으로 불안정하기 때문에, 수성 매체 중에 있어서의 제타 전위가 0으로 되는 pH치를 소망의 범위로 설정하는 것, 즉 리포솜의 막융합성을 산성에서 알칼리성까지의 폭넓은 범위 내에서 임의로 설정하는 것이 어렵고, pH 감수성 리포솜이 가지는 잠재적인 용도에의 기대에 응할 수 없다고 하는 문제가 있었다. 또, pH 감수성 리포솜은 통상의 리포솜에 비해 불안정하기 때문에, 그 공업적인 제조가 어려워, 간편하고 또한 안정화된 pH 감수성 리포솜의 제조 방법이 요구되고 있다.

본 발명은 이러한 과제를 해결하기 위해 이루어진 것으로서, 리포솜을 구성하는 특정의 구성 성분의 함유 비율을 조정함으로써, 소정의 범위 내에 있어서의 임의의 pH 조건하에서 리포솜의 제타 전위를 플러스에서 마이너스로 이행시킬 수 있는 pH 감수성 리포솜을 제공하는 것에 있다. 또, 지금까지 불안정하여 조제가 어려웠던 pH 감수성 리포솜을 안정화하여, 간편한 방법에 의해 pH 감수성 리포솜의 조제를 가능하게 하는 것에 있다.

본 발명의 하나의 실시형태에 관한 pH 감수성 리포솜은, 인지질과, 스테로이드류와, 음이온성 물질과, 양쪽 이온성 물질을 리포솜 막 구성 성분으로서 포함하고, 리포솜 막 구성 성분 전체에 대해 음이온성 물질을 2.5~15질량%, 그리고 양쪽 이온성 물질을 5~20질량% 포함하는 것을 특징으로 한다. 그리고, 이하의 각 pH 조건의 수성 매체 중에 분산시켰을 때, 리포솜의 제타 전위가 pH 5 이하에서 플러스이고, pH 8 이상에서 마이너스이고, 그리고 pH 5~8 사이에서 pH치의 증가와 함께 플러스에서 마이너스로 이행하도록 하였다.

본 발명의 다른 실시형태에 관한 pH 감수성 리포솜의 제조 방법은, 디올과, 3가 이상의 폴리올과, 리포솜 막 구성 성분을 가온 조건하에 혼합하여, 상기 디올과 폴리올의 혼합물에 상기 리포솜 막 구성 성분을 용해한 혼합물 용액을 조제하는 공정과, 이 혼합물 용액과 미리 가온한 수성 매체를 혼합하여 이들을 균질화하는 공정과, 균질화된 수성 매체를 급랭하여 리포솜을 생성하는 공정과, 생성한 리포솜을 회수하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다. 리포솜 막 구성 성분은 적어도 양쪽 이온성 물질을 포함하고, 리포솜을 이하의 각 pH 조건에 있어서의 수성 매체 중에 분산시켰을 때, 그 제타 전위는 pH 5 이하에서 플러스이고, pH 8 이상에서 마이너스이고, 그리고 pH 5~8 사이에서 pH치의 증가와 함께 플러스에서 마이너스로 이행하도록 하였다.

본 발명에 의하면, 리포솜을 구성하는 특정의 구성 성분의 함유 비율을 조정함으로써, 폭넓은 범위의 임의의 pH 조건하에서 리포솜의 제타 전위를 플러스에서 마이너스로 이행시킬 수 있는 pH 감수성 리포솜을 제공할 수가 있다. 또, 디올과 3가 이상의 폴리올과, 리포솜 막 구성 성분을 혼합, 용해하여 수성 매체와 교반 및 혼합한다고 하는 간단한 조작에 의해, 안정한 pH 감수성 리포솜을 제조할 수가 있다.

도 1은 본 발명의 일실시형태에 관한 pH 감수성 리포솜의 제조 방법의 흐름도이다.
도 2는 본 발명의 다른 실시형태에 관한 pH 감수성 리포솜의 제조 방법의 흐름도이다.
도 3은 실시예 1~6에서 제조한 리포솜을 수성 매체에 분산하여 측정한 제타 전위의 pH 프로필(profile)이다.
도 4는 비교예 1 및 2에서 제조한 리포솜을 수성 매체에 분산하여 측정한 제타 전위의 pH 프로필이다.

이하, 본 발명의 매우 적합한 실시의 형태에 대해 도면을 참조하면서 이하의 순서에 의해 설명한다.

1. pH 감수성 리포솜의 성분 및 조성

2. pH 감수성 리포솜의 제조 방법

3. pH 감수성과 그 발현 기구

4. 형상, 용도 또는 사용 방법

［pH 감수성 리포솜의 성분 및 조성］

(디올)

본 실시형태에 있어서, 리포솜 막 구성 성분을 용해하는 디올로서는 1, 2－알칸디올 또는 1, 3－알칸디올이 바람직하다. 1, 2－알칸디올 또는 1, 3－알칸디올로서는 1, 2－프로판디올, 1, 2－부탄디올, 1, 2－펜탄디올, 1, 2－옥탄디올, 1, 2－헥산디올, 1, 2－데칸디올, 1, 3－부틸렌글리콜, 1, 3－프로판디올, 프로필렌글리콜 등을 들 수 있다. 1, 2－알칸디올 또는 1, 3－알칸디올은 1종 또는 2종 이상을 병용할 수가 있다. 1, 2－알칸디올 또는 1, 3－알칸디올은 바람직하게는 1, 2－프로판디올 및 1, 3－부틸렌글리콜이다. 1, 2－알칸디올 또는 1, 3－알칸디올의 사용량은 리포솜 막 구성 성분을 용해할 수 있는 한 특히 한정되지 않지만, 리포솜 막 구성 성분의 전질량에 대해 10~50배 정도, 바람직하게는 15~30배 정도 사용함으로써, 생성한 pH 감수성 리포솜을 안정화할 수가 있다.

(폴리올)

디올과 함께 리포솜 막 구성 성분을 용해하는 폴리올은 3가 이상의 폴리올이고, 예를 들면 트레할로스, 수크로스, 소르보스, 멜레지토스, 글리세롤, 프럭토스, 만노스, 말토스, 락토스, 아라비노스, 자일로스, 리보스, 람노스, 갈락토스, 글루코스, 만니톨, 자일리톨, 에리트리톨, 트레이톨, 소비톨, 라피노스 등을 들 수 있다. 바람직하게는 소비톨 및 글리세롤이다. 이들의 사용량은 리포솜 막 구성 성분을 용해할 수 있는 한 특히 한정되지 않지만, 리포솜 막 구성 성분의 전질량에 대해 10~50배 정도, 바람직하게는 15~30배 정도 사용함으로써, 생성한 pH 감수성 리포솜을 안정화할 수가 있다.

(수성 매체)

본 발명에 있어서 「수성 매체」란 유기용제를 포함하지 않는 수성 매체로서, 리포솜 막 구성 성분을 분산할 수 있는 매체를 말하고, 특히 한정되지 않지만, 예를 들면 물, 매우 적합하게는 주사용 증류수, 생리적 식염수, 이온교환수나, 이들의 용액에 등장화제나 완충액 등을 가해도 좋다. 혹은, 리포솜 내포 물질로서의 생리 활성 물질을 포함시켜 두어도 좋다.

(리포솜 막 구성 성분)

리포솜 막 구성 성분으로서는 인지질이나 콜레스테롤 등 외에, 리포솜에 pH 감수성을 부여하기 위한 음이온성 물질 및 양쪽 이온성 물질 등을 들 수 있다. 이하, 순서대로 설명한다.

(1) 인지질

인지질은 일반적으로 분자 내에 장쇄 알킬기로 구성되는 소수기와 인산기 등으로 구성되는 친수기를 가지는 양쪽 친매성 물질이다. 인지질로서는 예를 들면, 포스파티딜콜린(레시틴), 포스파티딜글리세롤, 포스파티드산, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린 및 포스파티딜이노시톨과 같은 글리세로인지질, 스핑고미엘린과 같은 스핑고인지질, 카디올리핀과 같은 천연 또는 합성의 디포스파티딜계 인지질 및 이들의 유도체, 또 이들을 통상의 방법에 따라 수소첨가한 것(예를 들면 수소첨가 대두포스파티딜콜린(HSPC)) 등을 이용할 수가 있다. 이들 중에서도 HSPC 등의 수소첨가된 인지질, 스핑고미엘린 등이 바람직하다. 인지질의 양은 리포솜 막 구성 성분 전체 중 통상 20질량% 이상이고, 바람직하게는 40질량% 이상이다. 또, 그 외의 리포솜 막 구성 성분의 양은 통상 80질량% 이하이고, 바람직하게는 60질량% 이하이다.

(2) 스테로이드류

리포솜 막의 구성 성분으로서 상기 인지질 외에 스테로이드류를 더 포함할 수가 있다. 스테로이드류로서는 스테롤, 담즙산, 프로비타민 D, 스테로이드 호르몬 등 퍼히드로시클로펜타노페난트렌을 가지는 모든 스테로이드를 들 수 있다. 그중에서 스테롤류를 이용하는 것이 바람직하다. 스테롤류로서는 예를 들면, 지질막 안정화제로서 작용하는 스테롤류, 예를 들면 콜레스테롤, 디히드로콜레스테롤, 콜레스테롤에스터, 피토스테롤, 시토스테롤, 스티그마스테롤, 캄페스테롤, 콜레스타놀, 또는 라노스테롤 등을 들 수 있다. 또 1－O－스테롤글루코시드, 1－O－스테롤말토시드 또는 1－O－스테롤갈락토시드라고 하는 스테롤 유도체도 리포솜의 안정화에 효과가 있다는 것이 나타나 있다(일본국 특허공개 1993－245357호 공보). 이들 중에서 특히 콜레스테롤이 바람직하다.

스테로이드류의 함유량은 특히 제한되는 것은 아니지만, 리포솜의 구성 성분 전체에 대해 0.01질량% 이상이 바람직하고, 0.05질량% 이상이 보다 바람직하고, 0.1질량% 이상이 더 바람직하다. 또, 30질량% 이하가 바람직하고, 10질량% 이하가 보다 바람직하고, 5질량% 이하가 더 바람직하다. 스테로이드류는 분자 집합체의 안정화제로서 작용할 수가 있다. 스테로이드류는 1종 단독으로도 2종 이상을 조합하여 사용해도 좋다.

(3) 음이온성 물질

리포솜에 pH 감수성을 부여하기 위한 음이온성 물질은 디아실글리세롤헤미숙시네이트, 디아실글리세롤헤미말로네이트, 디아실글리세롤헤미글루타레이트, 디아실글리세롤헤미아디페이트, 디아실글리세롤헤미시클로헥산－1, 4－디카복실산, 지방산, 예를 들면, 올레산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 네르본산, 베헨산 등을 들 수 있지만, 이들에 한정은 되지 않는다. 특히, 상온에서 고체인 포화 지방산이 바람직하고, 팔미트산이나 스테아르산이 특히 바람직하다. 본 명세서에 있어서 상온이란 10℃~30℃를 말한다. 리포솜 구성 성분의 전체량에 대한 상기 음이온성 물질의 함유 비율은 0~20질량%이고, 2.5질량% 이상이 바람직하고, 5질량% 이상이 더 바람직하다. 한편, 함유 비율의 상한은 20질량%가 좋고, 15질량%가 바람직하다. 음이온성 물질의 함유 비율이 20%를 초과하면 리포솜 막 구성 성분을 포함하는 수성 매체 중에서 유화 상태를 유지하는 것이 어렵고, 백탁, 응집이나 침전이 생겨 불균질한 리포솜 제제로 되어 버린다.

(4) 양쪽 이온성 물질

리포솜에 pH 감수성을 부여하기 위한 양쪽 이온성 물질로서는 라우릴베타인(라우릴디메틸아미노초산베타인) 등의 N－알킬－N, N－디메틸아미노산베타인； 코카미도프로필베타인, 라우라미도프로필베타인 등의 지방산아미도알킬－N, N－디메틸아미노산베타인； 코코암포초산나트륨, 라우로암포초산나트륨 등의 이미다졸린형 베타인； 알킬디메틸타우린 등의 알킬술포베타인； 알킬디메틸아미노에탄올황산에스터 등의 황산형 베타인； 알킬디메틸아미노에탄올인산에스터 등의 인산형 베타인을 들 수가 있다. 리포솜 구성 성분의 전체량에 대한 상기 양쪽 이온성 물질의 함유 비율은 5~20질량%이고, 7질량% 이상이 바람직하다. 한편, 함유 비율의 상한은 20질량%가 좋고, 15질량%가 바람직하다. 양쪽 이온성 물질의 함유 비율이 20질량%를 초과하면 리포솜(지질 이중막) 구조를 유지하는 것이 어렵다.

(5) 그 외의 첨가제

본 발명의 pH 감수성 리포솜은 필요에 따라 그 외의 첨가제를 포함할 수가 있다. 예를 들면, 산화 방지제로서 토코페롤 동족체, 즉 비타민 E 등을 들 수 있다. 또, 리포솜 표면을 수식(修飾)하는 친수성 고분자의 지질 유도체는 리포솜의 구조 안정을 손상시키는 것이 아니면 특히 한정되지 않고, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜, 덱스트란, 풀룰란, 피콜, 폴리비닐알코올, 합성 폴리아미노산, 아밀로스, 아밀로펙틴, 만난, 시클로덱스트린, 펙틴, 카라기난, 및 이들의 유도체를 들 수 있다. 그중에서 폴리에틸렌글리콜 및 폴리에틸렌글리콜 유도체가 바람직하다. 친수성 고분자의 지질 유도체의 분자량은 200~5만 정도인 것이 바람직하고, 1000~1만 정도인 것이 보다 바람직하다.

(내포 물질)

본 발명의 pH 감수성 리포솜은 수용성 또는 지용성의 여러 가지 목적 물질을 내포할 수가 있다. 리포솜에 목적 물질을 보유시키는 방법은 목적 물질의 종류 등에 따라 적당히 선택하면 좋다. 예를 들면 목적 물질이 수용성 약물인 경우에는 리포솜 제조 시에 약물을 수성 매체에 용해시켜 조제할 수가 있다. 보유되지 않은 수용성 약물은 겔 여과, 초원심분리 또는 한외여과막 처리 등에 의해 목적 물질을 보유한 리포솜과 분리할 수 있다. 한편, 지용성 약물의 경우에는 리포솜 막 구성 성분이 디올과 폴리올의 혼합물에 녹아 있는 상태에서 약물을 혼합하여 리포솜을 형성함으로써, 예를 들면 이분자막 소포체의 소수부에 목적 물질을 보유시킬 수가 있다.

［pH 감수성 리포솜의 제조 방법］

다음에 본 실시형태에 관한 pH 감수성 리포솜의 제조 방법을 도 1을 참조하면서 설명한다. 또한, 이하의 각 공정은 바람직한 예이고, 적당히 각 공정에 변형을 가하거나 또는 공지의 제조 방법을 더 추가해도 좋다. 예를 들면, 리포솜의 입자경을 조정하기 위해 초음파 조사법, 익스트루젼법, 프렌치프레스법, 호모지나이제이션법 등을 조합해도 좋다.

(디올 및 폴리올의 용해 공정)

도 1에 있어서, 스텝 S01에서는 적어도 1종의 디올과 적어도 1종의 폴리올을 가온 조건하에 혼합하고, 이들을 균질화하여 디올과 폴리올의 혼합물을 조제한다. 디올과 폴리올의 혼합 비율은 리포솜 막 구성 성분을 균일하게 용해할 수 있는 한 특히 한정되지 않지만, 1:5~5:1이 바람직하고, 1:2~2:1이 더 바람직하고, 거의 1:1이 가장 바람직하다. 이들의 혼합 방법은 수동에 의한 요동, 교반자, 교반날개를 이용한 교반 외에, 초음파 진동기 등을 이용하여 행할 수가 있다. 또, 혼합 시의 가온 조건은 이들의 혼합물이 용융하는 온도이면 특히 제한되지 않지만, 60℃~90℃가 바람직하고, 80℃~85℃가 보다 바람직하다.

가온 방법은 특히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 용기를 온수를 넣은 욕조 내에 넣는 온욕 외에, 용기 내에 혼합물을 넣은 상태에서 당해 용기를 직화로 가열하는 방법, 용기를 전열기 내에 넣는 방법 등을 채용할 수 있다.

(리포솜 막 구성 성분의 용해 공정)

다음에, 스텝 S02에 있어서, 균질화한 상태의 상기 혼합물에 리포솜 막 구성 성분을 첨가한다. 그리고, 첨가한 리포솜 막 구성 성분을 디올과 폴리올의 혼합물에 용해한 혼합물 용액을 조제한다. 인지질 등의 각 성분을 따로따로 첨가 혼합해도 좋지만, 미리 모든 리포솜 막 구성 성분을 혼합해 두고 이들을 상기 혼합물에 첨가하는 것이 가용화의 효율을 올리기 위해 바람직하다. 이때 각 성분의 함유량은 상술한 범위 내이면 특히 한정되지 않지만, 음이온성 물질과 양쪽 이온성 물질의 함유 비율이 1:1~1:3의 범위 내인 것이 바람직하다.

지질의 1종인 콜레스테롤은 통상 물에 녹기 어려워 리포솜 막 중의 농도를 조제하는 것이 어렵다. 그러나, 본 실시형태와 같이 미리 디올과 폴리올의 혼합물에 인지질을 공존시켜 콜레스테롤이 용해됨으로써, 리포솜 막에의 콜레스테롤의 도입량을 용이하게 조정할 수가 있다.

(균질화 공정)

스텝 S03에서는 스텝 S02에서 조제한 혼합물 용액과 미리 80℃~85℃로 가온해 둔 수성 매체를 혼합한다. 이때 이들 혼합물 전체에 대한 수성 매체의 첨가량은 리포솜 막 구성 성분이 리포솜을 형성하기 위한 적절한 농도 영역으로 되도록 조정해야 한다. 수성 매체의 양이 너무 많으면, 디올과 폴리올의 혼합물에 용해되어 있는 지질 성분이 갑자기 응집하여 리포솜을 형성할 수가 없다. 따라서, 본 공정에서 첨가하는 수성 매체의 양은, 디올과 폴리올의 혼합물 용액에 용해되어 있는 지질 성분이 수성 매체와 혼합했을 때에 용해될 수 있는 임계적인 농도로 되도록 하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 스텝 S02에서 조제한 혼합물 용액의 용량에 대해 2~6배량, 바람직하게는 3~5배량, 더 바람직하게는 약 4배량이다.

(리포솜 생성 공정)

스텝 S04에서는 80℃~85℃에서 리포솜 막 구성 성분이 용해되어 있는 수성 매체를 실온 부근까지 급랭함으로써 리포솜을 생성시킨다. 냉각 방법은 특히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 용기를 냉수를 넣은 욕조 내에 넣는 방법 외에, 용기 내에 혼합물을 넣은 상태에서 당해 용기를 냉장고 등에 넣는 방법 등을 채용할 수 있다. 냉각 온도는 리포솜이 생성되는 온도이면 한정되는 것은 아니다. 일례를 들면, 지질에 포스파티딜콜린과 콜레스테롤을 이용한 경우에는 냉각 온도로서는 62℃ 이하로 하는 것이 바람직하다. 또한 실온 부근까지 냉각해도 좋다. 또, 냉각 속도로서는 0.5℃／분 이상이 바람직하고, 또 1℃／분 이상이 바람직하다.

(회수 공정)

스텝 S05에서는 수성 매체 중에 존재하는 리포솜을 여과나 디캔테이션(decantation) 등 임의의 방법으로 회수할 수가 있다. 또한, 도 1에 나타낸 실시형태에 있어서, 스텝 S01에서 미리 디올과 폴리올을 혼합하여 균질화한 용액에, 스텝 S02에 있어서 리포솜 막 구성 성분을 첨가하고 있지만, 반드시 이러한 수순에 한정되지 않는다. 예를 들면, 미리 가온한 디올에 리포솜 막 구성 성분을 첨가 용해하고, 그 후 폴리올을 첨가하여 균질화하는 방법이나, 이와는 반대로, 먼저 폴리올과 리포솜 막 구성 성분을 혼합, 용해하고, 그 후 디올을 첨가하여 균질화하는 방법이라도 좋다. 따라서, 본 발명의 다른 실시형태로서는 도 2에 나타내듯이, 스텝 S11에 있어서, 디올과 폴리올과 리포솜 막 구성 성분을 임의의 순서로 혼합하고, 최종적으로 디올과 폴리올의 혼합물에 리포솜 막 구성 성분을 용해하도록 해도 좋다. 스텝 S11 이후의 공정은 도 1과 마찬가지다.

［pH 감수성과 그 발현 기구］

본 실시형태의 pH 감수성 리포솜은 pH 조건이 다른 여러 가지 수성 매체 중에 분산시켰을 때, 그 제타 전위가 pH 5 이하에서 플러스이고, pH 8 이상에서 마이너스이고, 그리고 pH 5~8 사이에서 pH치의 증가와 함께 플러스에서 마이너스로 이행한다고 하는 성질을 가진다.

여기서, 수성 매체 중에 분산된 리포솜 입자의 하전 상태의 지표로서 이용한 제타 전위는, 입자로부터 충분히 떨어져 전기적으로 중성인 영역의 전위를 0으로 정의하고, 이 0점을 기준으로 하여 측정한 경우의 「활면(滑面)」의 전위라고 정의되어 있다. 미립자의 경우 제타 전위의 절대치가 증가하면, 입자 간의 반발력이 강해져 입자의 안정성은 높아진다. 반대로, 제타 전위가 0에 가까워지면, 입자는 응집하기 쉬워진다. 그래서, 제타 전위는 분산된 입자의 분산 안정성의 지표로서 이용된다(키타하라 후미오, 후루사와 쿠니오, 오자키 마사타카, 오오시마 히로유키, 「Zeta Potential 제타 전위: 미립자 계면의 물리화학」, 사이언티스트사, 1995).

따라서, 본 실시형태의 pH 감수성 리포솜은 표면 전하가 pH 5~8 사이에서 pH치의 증가와 함께 플러스에서 마이너스로 이행한다고 하는 거동을 나타내기 때문에, 리포솜 분산액의 pH가 5 이하인 산성 조건하에서 목적 물질을 보유하여 안정하게 존재하고, 리포솜 분산액의 pH가 5~8 사이에서 제타 전위가 0으로 되는 pH 조건에서 불안정하게 되어 막융합을 일으켜 내포물을 방출한다고 생각된다. 제타 전위의 측정 방법으로서는 공지의 방법을 이용할 수가 있다. 예를 들면, 대전한 입자가 분산하고 있는 계에 외부로부터 전기장을 걸면, 입자는 전극을 향해 영동(이동)하는데, 그 속도는 입자의 하전에 비례하기 때문에, 그 입자의 영동 속도를 측정함으로써 제타 전위를 측정할 수가 있다. 전기영동 광산란 측정법은 별명 레이저 도플러법으로 불리고, 영동하고 있는 입자로부터의 산란광을 관측함으로써 제타 전위가 구해진다.

［형상, 용도 또는 사용 방법］

본 실시형태의 pH 감수성 리포솜은 수성 매체에 분산시켰을 때, 산성 pH 환경하에서 플러스의 제타 전위를 가지고, 또한 알칼리성 pH 환경하에서 마이너스의 제타 전위를 가진다고 하는 종래에 없는 pH 응답 거동을 나타낼 수가 있다. 근년, 유전자나 핵산 유도체 등의 마이너스로 하전한 물질을 세포 내로 도입하는 연구를 하고 있다. 본 실시형태의 pH 감수성 리포솜은 pH 5 이하의 산성 조건하에서 플러스의 표면 전하를 가지기 때문에, 이들 물질을 흡착할 수가 있고, pH 5~8의 약산성으로부터 중성 조건에서 이들 물질을 방출하여 세포 내로 도입하기 위해 이용할 수가 있다. 또, 형상에 대해서도 특히 제한은 없고, 입자경이 100nm~10㎛인 다중층 리포솜이라도 단층 리포솜이라도 좋다. 본 실시형태의 pH 감수성 리포솜은 그 용도에 따라 적당히 입자경을 조정하는 것도 가능하다. 예를 들면, 생체 내에의 투여를 목적으로 한다면, 200nm 이하의 입경으로 조정하는 것이 바람직하다. 구체적인 입자경의 조정 방법은 익스트루더(extruder)를 이용하여, 구멍 직경이 작은 필터를 통과시킴으로써 입자경의 조절이 가능하다. 입자경이 100nm 정도 또는 그것 이하인 작은 크기의 단층 리포솜은 그 크기가 균일하고 열역학적으로 안정하여, 화장료로서 이용한 경우에도 피부에의 침투성이 양호하다고 일컬어지고 있다.

본 실시형태의 pH 응답성 리포솜은 수성 매체에 분산시켰을 때, 산성 pH 환경하에서 플러스의 제타 전위를 가지고, 또한 알칼리성 pH 환경하에서 마이너스의 제타 전위를 가진다고 하는 종래에 없는 pH 응답 거동을 나타낼 수가 있다. 근년, 유전자나 핵산 유도체 등의 마이너스로 하전한 물질을 세포 내로 도입하는 연구를 하고 있다. 본 실시형태의 pH 응답성 리포솜은 pH 5 이하의 산성 조건하에서 플러스의 표면 전하를 가지기 때문에, 이들 물질을 세포 내로 도입하는 방법 등의 용도가 확대될 것으로 기대된다.

실시예

이하의 실시예는 본 발명의 하나의 태양 및 국면을 실증하고 또한 예시하기 위해 기재하는 것이고, 본 발명의 범위를 한정하고 있다고 해석해야 하는 것은 아니다.

［실시예 1］

프로판－1, 2－디올 10.0g에 소비톨 10.0g을 가하고 80℃~85℃에서 범용 교반기 350rpm으로 가온 교반 용해하여 균질화하였다. 가온 교반하고 있는 이 액에, 포스파티딜콜린을 포함하는 수첨 레시틴 0.41g, 콜레스테롤 0.09g, 팔미트산 0.05g, 라우릴디메틸아미노초산베타인 0.1g을 첨가하고, 마찬가지로 교반 용해하였다.

상기에서 조제한 혼합물 용액에, 미리 80℃~85℃로 가온한 정제수를 100g으로 되도록 가하여 교반하면서 혼합하고, 1~2시간 범용 교반기 350rpm으로 교반하였다. 가온을 정지하고, 교반하면서 급랭하여, 실온 정도까지 냉각하고 생성한 리포솜을 여과하여 회수하였다.

［실시예 2］

프로판－1, 2－디올 10.0g에 글리세린 10.0g을 가하고 80℃~85℃에서 범용 교반기 350rpm으로 가온 교반하여 균질화하였다. 가온 교반하고 있는 이 액에, 포스파티딜콜린을 포함하는 수첨 레시틴 0.82g, 콜레스테롤 0.18g, 스테아르산 0.1g, 라우릴디메틸아미노초산베타인 0.2g을 첨가하고, 마찬가지로 교반 용해하였다.

상기에서 조제한 혼합물 용액에, 미리 80℃~85℃로 가온한 정제수를 100g으로 되도록 가하여 교반하면서 혼합하고, 1~2시간 호모믹서로 8,000rpm으로 교반하였다. 가온을 정지하고, 교반하면서 급랭하여, 실온 정도까지 냉각하고 생성한 리포솜을 여과하여 회수하였다.

［실시예 3］

프로판－1, 2－디올 5.0g에 글리세린 10.0g을 가하고 80℃~85℃에서 범용 교반기 500rpm으로 가온 교반하여 균질화하였다. 가온 교반하고 있는 이 액에, 포스파티딜콜린을 포함하는 수첨 레시틴 0.41g, 콜레스테롤 0.09g, 라우릴디메틸아미노초산베타인 0.1g을 첨가하고, 마찬가지로 교반 용해하였다. 상기에서 조제한 혼합물 용액에, 미리 80℃~85℃로 가온한 정제수를 100g으로 되도록 가하여 교반하면서 혼합하고, 익스트루더로 처리하였다.

［실시예 4］

프로판－1, 2－디올 30.0g에 소비톨 10.0g을 가하고 80℃~85℃에서 범용 교반기 600rpm으로 가온 교반 용해하여 균질화하였다. 가온 교반하고 있는 이 액에, 포스파티딜콜린을 포함하는 수첨 레시틴 0.41g, 콜레스테롤 0.09g, 라우릴디메틸아미노초산베타인 0.2g을 첨가하고, 마찬가지로 교반 용해하였다. 상기에서 조제한 혼합물 용액에, 미리 80℃~85℃로 가온한 정제수를 100g으로 되도록 가하여 교반하면서 혼합하고, 익스트루더로 처리하였다.

［실시예 5］

1, 3－부틸렌글리콜 10.0g에 글리세린 10.0g을 가하고 80℃~85℃에서 범용 교반기 600rpm으로 가온 교반하여 균질화한다. 가온 교반하고 있는 이 액에, 포스파티딜콜린을 포함하는 수첨 레시틴 0.41g, 콜레스테롤 0.09g, 팔미트산 0.05g, 라우릴디메틸아미노초산베타인 0.1g을 첨가하고, 마찬가지로 교반 용해하였다. 상기에서 조제한 혼합물 용액에, 미리 80℃~85℃로 가온한 정제수를 100g으로 되도록 가하여 교반하면서 혼합하고, 익스트루더로 처리하였다.

［실시예 6］

1, 3－부틸렌글리콜 30.0g에 소비톨 10.0g을 가하고 80℃~85℃에서 범용 교반기 600rpm으로 가온 교반 용해하여 균질화하였다. 가온 교반하고 있는 이 액에, 포스파티딜콜린을 포함하는 수첨 레시틴 0.41g, 콜레스테롤 0.09g, 팔미트산 0.15g, 라우릴디메틸아미노초산베타인 0.3g을 첨가하고, 마찬가지로 교반 용해하였다. 상기에서 조제한 혼합물 용액에, 미리 80℃~85℃로 가온한 정제수를 100g으로 되도록 가하여 교반하면서 혼합하고, 익스트루더로 처리하였다.

［비교예 1］

1, 3－부틸렌글리콜 5.0g에 글리세린 15.0g을 가하고 80℃~85℃에서 범용 교반기 350rpm으로 가온 교반하여 균질화하였다. 가온 교반하고 있는 이 액에, 포스파티딜콜린을 포함하는 수첨 레시틴 0.41g, 콜레스테롤 0.09g, 팔미트산 0.05g을 첨가하고, 마찬가지로 교반 용해하였다. 상기에서 조제한 혼합물 용액에, 미리 80℃~85℃로 가온한 정제수를 100g으로 되도록 가하여 교반하면서 혼합하고, 1~2시간 후 익스트루더 처리하였다.

［비교예 2］

글리세린 10.0g을 가하고 80℃~85℃에서 범용 교반기 350rpm으로 가온 교반 용해하여 균질화하였다. 가온 교반하고 있는 이 액에, 포스파티딜콜린을 포함하는 수첨 레시틴 0.82g, 콜레스테롤 0.18g, 팔미트산 0.05g, 라우릴디메틸아미노초산베타인 0.1g을 첨가하고, 마찬가지로 교반 용해하였다. 상기에서 조제한 혼합물 용액에, 미리 80℃~85℃로 가온한 정제수를 100g으로 되도록 가하여 교반하면서 혼합하고, 1~2시간 범용 교반기 350rpm으로 교반하였다. 가온을 정지하고, 교반하면서 급랭하고, 실온 정도까지 냉각하여 여과하였다.

［비교예 3］

글리세린 10.0g을 가하고 80℃~85℃에서 범용 교반기 350rpm으로 가온 교반 용해하여 균질화하였다. 가온 교반하고 있는 이 액에, 포스파티딜콜린을 포함하는 수첨 레시틴 0.82g, 콜레스테롤 0.18g, 팔미트산 0.05g을 첨가하고, 마찬가지로 교반 용해하였다. 상기에서 조제한 혼합물 용액에, 미리 80℃~85℃로 가온한 정제수를 100g으로 되도록 가하여 교반하면서 혼합하고, 1~2시간 호모믹서를 이용하여 8,000rpm으로 교반하였다. 가온을 정지하고, 교반하면서 급랭하여, 실온 정도까지 냉각하였다. 본 비교예에서는 유지의 재석출이 많아(유화력 부족으로 생각된다) 리포솜 조제가 불능이었다.

［3］제타 전위의 측정

상기 실시예 및 비교예에서 조제한 리포솜의 수성 분산액을 수산화칼륨 수용액과 인산 수용액을 사용하여 여러 가지 pH로 조정하고, 26℃ 항온 조건하에서 맬번사제의 상품명 제타사이저 나노시리즈 ZSP를 이용하여 제타 전위를 측정하였다. 그 결과를 도 3 및 4에 나타낸다. 도 3에 나타낸 것처럼, 실시예 1~6에서 조제한 리포솜은 pH 5 이하의 수성 매체 중에서는 모두 플러스의 제타 전위를 가지고, pH 5.4 내지 pH 7.6 사이에서 pH치의 증가와 함께 제타 전위가 0에 가까워져 플러스에서 마이너스로 이행하는 것을 알 수 있었다. 이 범위보다 pH가 높아지면 제타 전위가 마이너스 값으로 변화하였다. 이에 반해, 도 4에 나타낸 것처럼, 비교예 1에서 조제한 리포솜은 pH 4 이하에서 약간 플러스의 제타 전위를 나타냈지만 제타 전위의 절대치가 작기 때문에 이 영역에서는 매우 불안정하다고 생각된다. 또, 비교예 2에서 조제한 리포솜은 모든 pH에서 마이너스의 제타 전위를 나타냈다. 이와 같이 실시예 1~6에서 조제한 리포솜은 pH 감수성을 나타냄과 아울러, pH 5 이하에서 제타 전위의 절대치가 크기 때문에 안정하게 존재할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

Claims (15)

1. 인지질과, 스테로이드류와, 음이온성 물질과, 양쪽 이온성 물질을 리포솜 막 구성 성분으로서 포함하는 pH 감수성 리포솜으로서,
   당해 리포솜은 상기 리포솜 막 구성 성분 전체에 대해 상기 음이온성 물질을 2.5~15질량%, 그리고 상기 양쪽 이온성 물질을 5~20질량% 포함하고,
   상기 리포솜을 이하의 각 pH 조건의 수성 매체 중에 분산시켰을 때, 상기 리포솜의 제타 전위가 pH 5 이하에서 플러스이고, pH 8 이상에서 마이너스이고, 그리고 pH 5~8 사이에서 pH치의 증가와 함께 플러스에서 마이너스로 이행하는 것을 특징으로 하는 pH 감수성 리포솜.
2. 제1항에 있어서,
   상기 음이온성 물질과 상기 양쪽 이온성 물질의 함유 비율이 1:1~1:3인 것을 특징으로 하는 pH 감수성 리포솜.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 음이온성 물질이 상온에서 고체인 포화 지방산인 것을 특징으로 하는 pH 감수성 리포솜.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 양쪽 이온성 물질이 라우릴베타인(라우릴디메틸아미노초산베타인)을 포함하는 N－알킬－N, N－디메틸아미노산베타인； 코카미도프로필베타인, 라우라미도프로필베타인을 포함하는 지방산아미도알킬－N, N－디메틸아미노산베타인； 코코암포초산나트륨, 라우로암포초산나트륨을 포함하는 이미다졸린형 베타인； 알킬디메틸타우린을 포함하는 알킬술포베타인； 알킬디메틸아미노에탄올황산에스터를 포함하는 황산형 베타인； 및 알킬디메틸아미노에탄올인산에스터를 포함하는 인산형 베타인으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 pH 감수성 리포솜.
5. 제3항에 있어서,
   상기 상온에서 고체인 포화 지방산이 팔미트산 또는 스테아르산인 것을 특징으로 하는 pH 감수성 리포솜.
6. 디올과, 3가 이상의 폴리올과, 리포솜 막 구성 성분을 가온 조건하에 혼합하고, 상기 디올과 폴리올의 혼합물에 상기 리포솜 막 구성 성분을 용해한 혼합물 용액을 조제하는 공정과,
   상기 혼합물 용액과 미리 가온한 수성 매체를 혼합하여 이들을 균질화하는 공정과,
   상기 균질화된 수성 매체를 급랭하여 리포솜을 생성하는 공정과,
   상기 리포솜을 회수하는 공정을 포함하고,
   상기 리포솜 막 구성 성분은 적어도 양쪽 이온성 물질을 포함하고,
   상기 리포솜을 이하의 각 pH 조건의 수성 매체 중에 분산시켰을 때, 상기 리포솜의 제타 전위는 pH 5 이하에서 플러스이고, pH 8 이상에서 마이너스이고, 그리고 pH 5~8 사이에서 pH치의 증가와 함께 플러스에서 마이너스로 이행하는 것을 특징으로 하는 pH 감수성 리포솜의 제조 방법.
7. 제6항에 있어서,
   상기 혼합물 용액은, 상기 디올과 상기 3가 이상의 폴리올을 미리 가온 조건하에 혼합하여 균질화한 용액에, 상기 리포솜 막 구성 성분을 첨가 및 교반하는 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 pH 감수성 리포솜의 제조 방법.
8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
   상기 양쪽 이온성 물질이 상기 리포솜 막 구성 성분 전체에 대해 5~20질량% 포함되는 것을 특징으로 하는 pH 감수성 리포솜의 제조 방법.
9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 리포솜 막 구성 성분 전체에 대해 2.5~15질량%의 비율로 음이온성 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 pH 감수성 리포솜의 제조 방법.
10. 제9항에 있어서,
    상기 음이온성 물질과 상기 양쪽 이온성 물질의 함유 비율이 1:1~1:3인 것을 특징으로 하는 pH 감수성 리포솜의 제조 방법.
11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 리포솜 막 구성 성분이 인지질과 콜레스테롤을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 pH 감수성 리포솜의 제조 방법.
12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 음이온성 물질이 상온에서 고체인 포화 지방산인 것을 특징으로 하는 pH 감수성 리포솜의 제조 방법.
13. 제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 양쪽 이온성 물질이 라우릴베타인(라우릴디메틸아미노초산베타인)을 포함하는 N－알킬－N, N－디메틸아미노산베타인； 코카미도프로필베타인, 라우라미도프로필베타인을 포함하는 지방산아미도알킬－N, N－디메틸아미노산베타인； 코코암포초산나트륨, 라우로암포초산나트륨을 포함하는 이미다졸린형 베타인； 알킬디메틸타우린을 포함하는 알킬술포베타인； 알킬디메틸아미노에탄올황산에스터를 포함하는 황산형 베타인； 및 알킬디메틸아미노에탄올인산에스터를 포함하는 인산형 베타인으로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나인 것을 특징으로 하는 pH 감수성 리포솜의 제조 방법.
14. 제6항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 디올이 프로판－1, 2－디올, 1, 3－부틸렌글리콜 또는 이들의 혼합물이고, 상기 폴리올이 소비톨, 글리세린 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 pH 감수성 리포솜의 제조 방법.
15. 제12항에 있어서,
    상기 상온에서 고체인 포화 지방산이 팔미트산 또는 스테아르산인 것을 특징으로 하는 pH 감수성 리포솜의 제조 방법.

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