KR20200055801A - 시간적 및 일시적 플라스미드 벡터 발현 시스템을 사용한 세포 재프로그래밍 - Google Patents

시간적 및 일시적 플라스미드 벡터 발현 시스템을 사용한 세포 재프로그래밍 Download PDF

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Abstract

수명이 짧은 이식 유전자의 일시적 및 시간적 발현을 제공하는 벡터 시스템을 이용하여 요망되는 성질을 갖는 iPSC로의 비-만능성의 재프로그래밍을 유도하기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 또한, 제공된 재프로그래밍 방법 및 조성물을 사용한 재프로그래밍 세포 및 iPSC 집단 또는 클론 세포주가 제공된다. 또한, 하나 이상의 선택된 게놈 유전자좌에서의 삽입 및 결실을 포함하는 타깃화된 편집을 포함하기 위해 게놈-조작된 iPSC 및 이로부터 재분화된 유도된 세포가 제공된다.

Description

시간적 및 일시적 플라스미드 벡터 발현 시스템을 사용한 세포 재프로그래밍
관련 출원
본 출원은 2017년 10월 11일자로 출원된 미국 가출원 제62/571,105호를 우선권으로 주장하며, 이러한 문헌의 개시내용은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조
본 출원은 참고로 13601-187-228_SEQ_LISTING.txt의 명칭을 가지고, 2018년 10월 9일자로 생성되고 크기가 9,600 바이트인, 본 출원과 함께 제출된 ASCII 텍스트 포맷의 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능한 형태(Computer Readable Form: CRF)를 포함한다.
발명의 분야
본 개시내용은 대체로, 인간 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell)(iPSC 또는 iPS 세포)를 생성시키는 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시내용은 높은 효능을 갖는 요망되는 성질을 갖는 무-풋-프린트(foot-print free) iPSC를 얻기 위한 플라스미드 벡터들의 조합물의 용도에 관한 것이다.
iPSC는 본래 중요한 전사 인자를 발현시키기 위해 통합 바이러스 시스템을 이용하여 생성되었다. 폴리시스트론성 및 유도성 시스템을 포함하는 레트로바이러스 및 렌티바이러스 시스템은 현재 iPSC 생성에서 성공적으로 이용되고 있다. 그러나, 삽입 돌연변이유발로 인한 영구 게놈 변화 및 iPSC 분화 후 외인성 유전자 재활성화에 대한 가능성은 이러한 방법에 의해 생성된 세포의 후속 약물 스크리닝 및 치료학적 적용에 대해 잠재적인 문제를 나타낼 수 있다. 실제로, 동일한 바이러스 시스템을 사용하여 생성된 iPSC 클론들 간의 유의미한 차이가 보고되었으며, 분화된 신경구로서 이식될 때 설치류에서 대량의 클론이 종양을 형성한다. 연구에서는, 동일한 바이러스 방법을 이용하여 생성된 iPSC가 분화 직후에 상이하게 거동할 수 있다는 것을 제시한다. 이소성 유전자 통합 부위에서의 차이는 이식 유전자 발현의 상이한 삽입 돌연변이유발 및 후성유전학적 조절을 야기시킬 수 있다. 통합 시스템을 포함하는 iPSC 생성 방법을 위하여, 만능성 및 분화된 상태 둘 모두에서 안정한 클론을 식별하기 위해 많은 클론이 유도되고 스크리닝되어야 할 수 있다.
바이러스 및 비-바이러스 방법을 포함하는 iPSC 생성을 위한 다양한 비-통합 시스템이 입증되었다. 재프로그래밍(reprogramming)을 위한 비-통합 바이러스 시스템은 아데노바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터 및 엡스타인-바 바이러스 기반 에피솜 벡터를 포함한다. 재프로그래밍을 위한 비-통합 비-바이러스 시스템의 예는 미니사이클 벡터(최소 DNA 벡터), PiggyBac(트랜스포손), RNA(mRNA 또는 miRNA) 및 단백질(재조합 폴리펩타이드)을 포함한다.
당해 분야에서 바람직하게는, "나이브(naive)" 또는 "기저(grounded)" 상태의 만능성에서, 그리고 바람직하게는, 규정된 배양 조건에서, 무-풋-프린트 iPSC의 동종 집단의 효율적인 생성이 실질적으로 요구된다. "나이브" 또는 "기저" 상태의 만능성은 iPSC에 높은 클론 형성능, 지속 가능한 자기-재생, 최소 자연 분화 및 게놈 이상, 및 해리된 단일 세포로서의 높은 생존 가능성을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 특성을 부여한다. 본 발명의 방법 및 조성물, 및 구체적으로, 신규한 플라스미드 벡터 시스템은 이러한 필요성을 해결하고, 세포 재프로그래밍 분야에서 다른 관련된 장점을 제공한다.
숙주 게놈 통합의 확률을 감소시키기 위해 외인성 유전자의 존재를 최소화하는 효율적이지만 일시적 및 시간적 발현 시스템을 이용함으로써, 본 개시의 목적은 재프로그래밍의 유도를 위해 비-만능 세포에 도입된 외인성 DNA를 포함하지 않으면서 iPSC를 생성시키는데 효율적인 방법 및 조성물을 제공하는 것이다. 본 개시의 목적은 "나이브" 또는 "기저" 상태의 만능성 및/또는 높은 클론 형성능을 갖는 iPSC를 효율적으로 생성시키기 위한 조합 플라스미드 시스템을 제공하는 것이다. 기저 상태 만능성을 갖는 iPSC는 단일 세포 해리된 iPSC의 장기간 생존 및 유전적 안정성을 가능하게 하고, 이에 따라, iPSC의 동종 집단의 단일 세포 분류 및/또는 결실, 클론 iPSC 타깃화된 게놈 편집, 및 지향된 재분화와 같은 뱅킹(banking) 및 조작을 위해 적합한 클론 iPSC 라인을 생성시키는 것을 가능하게 만든다. 이에 따라, 또한, 본 개시의 목적은 폴리뉴클레오타이드 삽입, 결실, 및 치환을 포함하고 변형이 분화, 탈분화, 재프로그래밍, 확장, 계대배양 및/또는 이식 후 후속하여 유도된 세포에서 보유되고 여전히 기능성인, 선택된 부위에서 하나 또는 수 개의 유전적 변형을 포함하는, 단일 세포 유래 iPSC 클론 라인, 또는 이로부터의 유도체 세포를 생성시키기 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 일 양태는 만능 세포 또는 이의 집단을 생성시키기 위해 비-만능 세포를 재프로그래밍하는 방법으로서, 비-만능 세포를 하나 이상의 제1 플라스미드로 트랜스펙션시키는 단계로서, 제1 플라스미드는 복제 기점(replication origin), 및 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 암호화하지만 EBNA 또는 이의 유도체를 암호화하지 않는 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 하나 이상의 제1 플라스미드 중 적어도 하나는 OCT4를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하며; 하나 이상의 제1 플라스미드의 도입은 재프로그래밍 과정을 유도하는, 상기 트랜스펙션시키는 단계; 및 선택적으로, 비-만능 세포에, EBNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 복제 기점 또는 재프로그래밍 인자(들)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(들)를 포함하지 않는 제2 플라스미드; EBNA mRNA; 및 EBNA 단백질 중 하나를 도입하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 트랜스펙션된 세포는 이후에, 출발 비-만능 세포로부터의 형태학적 변화를 포함하고, EBNA가 본질적으로 존재하지 않고, 만능 세포 모폴로지가 결여되어 있고, 내인성 OCT4 발현을 포함하지 않는 재프로그래밍 세포를 생성하기 위해 배양된다. 재프로그래밍 세포가 충분한 시간 동안 추가로 배양될 때, 하나 이상의 만능 세포가 생성된다. 본 명세서에 제공된 재프로그래밍 방법은 세포 게놈 내에 통합시키고 유도체 세포를 생성시킬 때 탈분화를 이끌어 내거나 임상 환경에서 사용될 때 종양형성에 대한 경향을 증가시키기 위해 재활성화시킬 가능성을 갖는 외인성 이식 유전자의 발현에 대한 만능 세포의 노출을 최소화한다.
일 실시형태에서, 재프로그래밍 방법은 먼저 비-만능 세포에 플라스미드의 조합물을 도입하여 재프로그래밍을 유도하는 단계를 포함한다. 상기 플라스미드의 조합물은 하나 이상의 제1 플라스미드를 포함하되, 여기서, 제1 플라스미드는 복제 기점, 및 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 암호화하지만 EBNA 또는 이의 유도체를 암호화하지 않는 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 적어도 하나의 제1 플라스미드는 OCT4를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 하나 이상의 제1 플라스미드를 포함하는 상기 플라스미드의 조합물은 EBNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하지만, 복제 기점 또는 재프로그래밍 인자(들)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(들)를 포함하지 않는 제2 플라스미드를 더 포함한다. 재프로그래밍을 유도하기 위해 비-만능 세포에 플라스미드 시스템을 도입한 후에, 세포는 플라스미드의 조합물이 도입된 출발 비-만능 세포로부터의 형태학적 변화를 포함하는 재프로그래밍 세포를 생성하기 위해 배양된다. 형태학적 변화를 나타낸 재프로그래밍 세포에는 EBNA가 본질적으로 존재하지 않고, 만능 세포 모폴로지가 결여되어 있고, 내인성 OCT4 발현을 포함하지 않는다. 제공된 재프로그래밍의 방법에서, 상기 재프로그래밍 세포는 하나 이상의 만능 세포를 생성하기 위해 충분한 시간 동안 추가로 배양된다. 일부 실시형태에서, 재프로그래밍 세포의 배양은 TGFβ 억제제, GSK3 억제제, MEK 억제제 및 ROCK 억제제 중 적어도 하나를 포함하는 소분자 화합물의 존재하에서 이루어진다. 일부 실시형태에서, 소분자 화합물은 TGFβ 억제제, GSK3 억제제, MEK 억제제 및 ROCK 억제제의 조합물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 일반적인 방법은 만능 세포를 해리시켜 단일 세포 해리된 만능 세포를 얻는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 세포 해리된 만능 세포는 배지 중에 현탁된다. 일부 실시형태에서, 단일 세포 해리된 만능 세포는 선택된 마커(들)를 발현시키는 만능 세포를 풍부화시키기 위해 하나 이상의 만능성 마커를 발현시키는 세포를 선택하고 단리시킴으로써 분류된다. 일부 다른 실시형태에서, 만능 세포, 또는 이로부터 현탁되거나 분류되거나 풍부화된 단일 해리된 세포는 GSK3 억제제, MEK 억제제 및 ROCK 억제제 중 적어도 하나를 포함하는 소분자 화합물의 존재하에서 만능성을 유지시키기 위해 배양된다. 일부 실시형태에서, 장기간 만능성 유지는 적어도 5, 10, 15 또는 20회 계대, 또는 그 이상 동안 이루어진다.
일부 실시형태에서, 상기 방법은 체세포, 전구체 세포, 또는 다능성 세포의 재프로그래밍을 유도하기 위해 이용된다. 본 방법의 일부 실시형태에서, 재프로그래밍을 위한 비-만능 세포는 인간 세포이다. 본 방법의 일부 실시형태에서, 재프로그래밍을 위한 비-만능 세포는 면역 세포이다. 일부 다른 실시형태에서, 재프로그래밍을 위한 면역 세포는 환자-특이적, 약물 반응-특이적, 또는 질환 상태-특이적일 수 있다. 일 실시형태에서, 본 방법을 이용하여 재프로그래밍하기 위한 비-만능 세포가 개시될 때, 재프로그래밍 세포에 의해 제시된 형태학적 변화는 MET(mesenchymal to epithelial transition: 간엽-상피 이행)의 형태학적 변화이다.
상기 방법의 일 실시형태에서, 재프로그래밍 세포에는 제2 플라스미드에 의해 운반되는 EBNA가 본질적으로 존재하지 않는다. 일 실시형태에서, 재프로그래밍 세포에는 제2 플라스미드가 본질적으로 존재하지 않는다. 본 방법의 일부 실시형태는 약 4 내지 10일(즉, 플라스미드의 트랜스펙션 후 4 내지 10일), 5 내지 10일, 6 내지 10일 동안, 또는 이들 사이의 임의의 일자 동안 유도된, 플라스미드 조합물의 재프로그래밍 세포를 제공한다. 본 방법의 일부 실시형태는 트랜스펙션 후 4 내지 12일, 또는 이들 사이의 임의의 일자에 재프로그래밍 세포를 제공한다. 본 방법의 다른 일부 실시형태는 트랜스펙션 후 4 내지 14일, 또는 이들 사이의 임의의 일자 동안 유도된 재프로그래밍 세포를 제공한다. 본 방법의 또 다른 일부 실시형태는 트랜스펙션 후 4 내지 21 또는 4 내지 25일 동안, 또는 이들 사이의 임의의 일자의 재프로그래밍 세포를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 예를 들어, oriP 및 EBNA 둘 모두를 포함하는 추가적인 플라스미드가 도입된 세포와 비교하여, 감소된 만능성 복귀 또는 자연 분화를 갖는 만능 세포를 생성한다. 일부 다른 실시형태에서, 상기 방법은 플라스미드 조합물의 폴리뉴클레오타이드가 본질적으로 존재하지 않는 만능 세포를 생성한다. 일부 실시형태에서, 만능 세포에는, 만능 세포의 선택 또는 광범위한 계대배양에 대한 필요 없이, 생성된 플라스미드의 폴리뉴클레오타이드가 본질적으로 존재하지 않는다. 일 실시형태에서, 본 방법은 높은 클론 형성능, 유전적 안정성, 및 기저 상태 만능성의 성질들 중 적어도 하나를 갖는 만능 세포를 생성한다. 일부 실시형태에서, 본 방법은 배아외 세포와 관련된 재활성화된 유전자를 포함하는 만능 세포를 생성시킨다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 높은 손실률을 갖는 제2 플라스미드의 용도를 포함하며, 이에 따라, 제2 플라스미드에 의한 EBNA의 발현은, EBNA가 빠르게 손실되고 세포질에서 그리고 iPSC 모폴로지 또는 내인성 만능성 유전자 발현의 출현 전에 발현된다는 측면에서, 수명이 짧고, 일시적 및 시간적이다. 본 방법의 일부 실시형태에서, 제1 및 제2 플라스미드에 각각 포함된 복제 기점 및/또는 EBNA는 EBV-기반이다. 본 방법의 일부 실시형태에서, 재프로그래밍 과정은 무-피더 조건(feeder-free condition) 하에서, 즉, 무-피더인 배지에서 수행된다. 본 방법의 일부 다른 실시형태에서, 배지에 포함된 ROCK 억제제는 티아조비빈(thiazovivin)이다.
본 출원의 다른 양태는 비-만능 세포를 하나 이상의 제1 플라스미드로 트랜스펙션시킨 후 얻어진 재프로그래밍 세포 또는 이의 집단을 제공하되, 여기서, 제1 플라스미드는 복제 기점, 및 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 암호화하지만 EBNA 또는 이의 유도체를 암호화하지 않는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고; 하나 이상의 제1 플라스미드 중 적어도 하나는 OCT4를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및 선택적으로, EBNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고 복제 기점 또는 재프로그래밍 인자(들)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(들)를 포함하지 않는 제2 플라스미드, EBNA mRNA, 및 EBNA 단백질 중 하나를 포함하며, 재프로그래밍 세포는 플라스미드의 조합물의 도입 전에 비-만능 세포로부터의 형태학적 변화를 포함하고, EBNA 또는 이의 유도체가 본질적으로 존재하지 않으며, 재프로그래밍 세포는 (i) 만능 세포 모폴로지; 및 (ii) 내인성 OCT4 발현을 포함하지 않으며, 재프로그래밍 세포는 만능 세포를 생성하기 위해 충분한 시간을 제공한 경우 안정한 만능성을 확립시킬 수 있다. 일 실시형태에서, EBNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 플라스미드는 재프로그래밍 세포 및 iPSC를 생성시키기 위해 사용되며, 여기서, 제2 플라스미드는 복제 기점, 또는 재프로그래밍 인자(들)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(들)를 포함하지 않는다. 일 실시형태에서, 제2 플라스미드 대신에, EBNA mRNA는 재프로그래밍을 유도하고 개시된 바와 같은 성질들을 갖는 재프로그래밍 세포 및 iPSC를 생성하기 위해 하나 이상의 제1 플라스미드와 함께 사용된다. 다른 실시형태에서, EBNA 단백질 또는 폴리펩타이드는 재프로그래밍을 유도하고 개시된 바와 같은 성질들을 갖는 재프로그래밍 세포 및 iPSC를 생성하기 위해 하나 이상의 제1 플라스미드와 함께 사용된다.
재프로그래밍 세포 또는 이의 집단의 일부 실시형태에서, 세포는 약 4 내지 10, 내지 12, 내지 14, 내지 21, 내지 25일, 또는 이들 사이의 임의의 일자 동안 유도된 것이다. 일부 실시형태에서, 재프로그래밍 세포 또는 이의 집단은 TGFβ 억제제, GSK3 억제제, MEK 억제제 및 ROCK 억제제의 존재하에 배양된다. 일부 다른 실시형태에서, 재프로그래밍 세포 또는 이의 집단은 섬유아세포로부터 유도되며, 이와 같이, 재프로그래밍의 형태학적 변화는 MET(간엽-상피 이행)의 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 재프로그래밍 세포 또는 이의 집단에는 제1 및 제2 플라스미드가 본질적으로 존재하지 않는다. 일부 실시형태에서, 재프로그래밍 세포는 만능 세포의 선택 또는 광범위한 계대배양에 대한 필요 없이, 플라스미드의 폴리뉴클레오타이드가 본질적으로 존재하지 않는 만능 세포를 생성시킨다. 일부 다른 실시형태에서, 재프로그래밍 세포 또는 이의 집단은 예를 들어, oriP 및 EBNA 둘 모두를 포함하는 추가적인 플라스미드가 도입된 세포와 비교하여, 감소된 만능성 복귀 또는 자연 분화를 갖는 만능 세포를 생성시킨다. 또 다른 일부 실시형태에서, 재프로그래밍 세포 또는 이의 집단은 높은 클론 형성능; 유전적 안정성, 및 기저 상태 만능성의 성질들 중 적어도 하나를 갖는 만능 세포를 생성시킨다. 또 다른 실시형태에서, 재프로그래밍 세포 또는 이의 집단은 배아외 세포와 관련된 재활성화된 유전자를 포함하는 만능 세포를 생성시킨다.
이에 따라, 본 출원의 다른 양태는 상기에 기술된 바와 같은 재프로그래밍 세포 또는 이의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 TGFβ 억제제, GSK3 억제제, MEK 억제제 및 ROCK 억제제를 포함하는 배지를 더 포함한다. 일 실시형태에서, 조성물의 배지에 포함된 ROCK 억제제는 티아조비빈이다. 다른 실시형태에서, 배지는 무-피더이다. 본 출원의 추가 양태는 본 명세서에 개시된 상기 방법에 의해 생성된 단리된 만능 세포 또는 만능 세포주를 제공한다. 일부 실시형태에서, 이에 따라 생성된 단리된 만능 세포 또는 만능 세포주는 비-천연 유래 세포로 추가로 게놈 조작되고/되거나 재-분화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단리된 만능 세포 또는 만능 세포주로부터 재분화된 비-천연 유래 세포는 CD34 세포, 혈구 내피 세포, 조혈 줄기 또는 전구체 세포, 조혈 다능성 전구체 세포, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NKT 세포, NK 세포, B 세포, 및 면역 조절 세포를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 면역 세포이다. 일부 실시형태에서, 만능 세포 또는 만능 세포주로부터 유래된 비-천연 세포는 이의 천연 세포 대응물과 비교하여, 이질염색질의 전체적 증가; 미토콘드리아성 기능 개선; DNA 손상 반응 증가; 텔로미어 신장 및 짧은 텔로미어 백분율의 감소; 노쇠화 세포의 분율의 감소; 및 증식, 생존, 지속, 또는 기억 유사 기능에 대한 더 높은 가능성의 성질들 중 적어도 하나를 포함하는 회춘 세포이다.
본 출원의 추가 양태는 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법에 의해 얻어진 만능 세포, 및 선택적으로, 하나 이상의 추가의 치료제를 포함하는 치료적 용도를 위한 조성물을 제공한다. 또한, 본 명세서에 기술된 바와 같은 방법에 의해 얻어진 청구항의 게놈 조작된 만능 세포 또는 유도된 비-천연 세포, 및 선택적으로, 하나 이상의 추가의 치료제를 포함하는 치료적 용도를 위한 조성물이 제공된다. 일부 실시형태에서, 치료적 용도를 위한 이러한 조성물은 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 본 출원은 또한, 세포-기반 치료법에서 적용하기 위한 만능 세포를 제조하는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 만능 세포는 동종이계, 즉, 세포-기반 치료법을 수용하는 대상체와는 다른 대상체로부터의 세포로부터 재프로그래밍되이거나, 자연 발생적인(autologous), 즉, 세포-기반 치료법을 수용한 동일한 대상체로부터의 세포로부터 재프로그래밍된다.
기술된 바와 같은 상기 방법에 의해 얻어진 만능 세포를 포함하는 키트가 제공된다. 일부 실시형태에서, 키트에 포함된 만능 세포는 게놈 조작된다. 또한, 기술된 바와 같은 상기 방법에 의해 얻어진 만능 세포로부터 유래된 비-천연 세포를 포함하는 키트가 제공된다.
본 출원의 또 다른 양태는 비-만능 세포에서 재프로그래밍을 개시하기 위한 시험관내 시스템을 제공하는데, 여기서, 본 시스템은 (1) 제1 플라스미드가 복제 기점, 및 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 암호화하지만 EBNA 또는 이의 유도체를 암호화하지 않는 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 하나 이상의 제1 플라스미드 중 적어도 하나는 OCT4를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 하나 이상의 제1 플라스미드; 및 선택적으로, (2) EBNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 복제 기점 또는 재프로그래밍 인자(들)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(들)를 포함하지 않는 제2 플라스미드, (ii) EBNA mRNA, 및 (iii) EBNA 단백질 중 하나를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시스템의 제2 플라스미드는 높은 손실률을 가지며, 여기서, 제2 플라스미드에 의한 EBNA의 발현은 수명이 짧고, 일시적 및 시간적이다. 일부 다른 실시형태에서, 시스템은 핵에서 EBNA 복제 및/또는 연속 발현을 제공하지 않는다. 일 실시형태에서, 시스템은 단기간 동안, 및 만능성 세포 모폴로지의 출현 및 내인성 만능성 유전자의 유도된 발현 이전에, EBNA의 일시적/세포질 발현을 가능하게 할 수 있다. 일부 실시형태에서, EBNA 발현에 대한 단기간은 트랜스펙션 후 약 4, 5, 6, 7 또는 8일이지만, 트랜스펙션 후 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 22, 23, 24 또는 25일 이하이다. 일부 다른 실시형태에서, 시스템은 또한, 단기간 동안, 및 만능성 세포 모폴로지의 출현 및 내인성 만능성 유전자의 유도된 발현 이전에, 제1 플라스미드(들)에 포함된 하나 이상의 재프로그래밍 인자의 일시적/세포질 발현을 가능하게 한다.
시스템의 일 실시형태에서, 제1 플라스미드(들)의 복제 기점은 폴리오마비리네 바이러스, 파필로마비리네 바이러스, 및 감마헤르페스비리네 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다. 일부 실시형태에서, 복제 기점은 SV40, BK 바이러스(BKV), 소 유두종 바이러스(BPV), 또는 엡스타인-바 바이러스(EBV)로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다. 하나의 특정 실시형태에서, 복제 기점은 EBV의 야생형 복제 기점에 상응하거나, 이로부터 유래된다. 일부 다른 실시형태에서, 시스템에서 제2 플라스미드의 EBNA는 EBV-기반이다. 일부 실시형태에서, 시스템은 OCT4, SOX2, NANOG, KLF, LIN28, c-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1 중 하나 이상을 포함하는 재프로그래밍 인자(들)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 총괄적으로 포함하는 하나 이상의 제1 플라스미드를 제공한다. 일부 실시형태에서, 재프로그래밍 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 제1 플라스미드에서 폴리시스트론성 작제물 또는 비-폴리시스트론성 작제물에 포함된다. 폴리시스트론성 작제물의 일 실시형태에서, 이는 단일 오픈 리딩 프레임 또는 다수의 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 시스템이 둘 이상의 제1 플라스미드를 포함하는 실시형태에서, 각 제1 플라스미드는 폴리뉴클레오타이드의 적어도 하나의 카피에 의해 암호화된 동일하거나 상이한 재프로그래밍 인자를 포함할 수 있다. 그러한 실시형태에서, 시스템이 둘 이상의 제1 플라스미드를 포함하는 경우에, 시스템은 재프로그래밍 인자 화학량론의 제어를 제공한다.
시스템의 일부 실시형태에서, 제1 플라스미드는 재프로그래밍 인자를 암호화하는 하나 초과의 폴리뉴클레오타이드를 포함하되, 여기서, 인접한 폴리뉴클레오타이드는 자가-절단 펩타이드 또는 IRES를 암호화하는 링커 서열에 의해 작동되게 연결된다. 일 실시형태에서, 자가-절단 펩타이드는 F2A, E2A, P2A 및 T2A를 포함하는 군으로부터 선택된 2A 펩타이드이다. 다른 실시형태에서, 제1 플라스미드 작제물에 포함된 2A 펩타이드는 동일하거나 상이할 수 있다. 시스템의 플라스미드가 다수의 2A를 포함하는 또 다른 실시형태에서, 이웃하는 위치에서의 2개의 2A 펩타이드는 상이하다. 시스템의 일부 다른 실시형태에서, 제1 및 제2 플라스미드 각각은 재프로그래밍 인자 및 EBNA의 발현을 위한 하나 이상의 프로모터를 포함하며, 하나 이상의 프로모터는 CMV, EF1α, PGK, CAG, UBC, 및 구성적, 유도성, 내인성으로 조절되거나, 시간적-, 조직- 또는 세포 타입-특이적인 다른 적합한 프로모터 중 적어도 하나를 포함한다. 일 실시형태에서, 제1 및 제2 플라스미드 각각은 CAG 프로모터를 포함한다.
또한, 본 명세서에 기술된 바와 같은 시험관내 시스템을 포함하는 키트가 제공된다.
본 방법 및 조성물의 사용의 다양한 목적 및 장점은 예시 및 예로서, 본 발명의 특정 실시형태를 기술하는 첨부된 도면과 함께 하기 설명으로부터 명백하게 될 것이다.
본 특허 또는 출원 파일은 칼라로 작성된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 칼라 도면(들)을 갖는 이러한 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 필요한 수수료의 요청 및 지불 시에 특허청에 의해 제공될 것이다.
도 1은 STTR(Short-lived Transient and Temporal Reprogramming) 시스템에서 사용되는 벡터 1 및 벡터 2, 및 EmTTR(EBNA-매개 일시적 및 시간적 재프로그래밍) 시스템을 위한 벡터 1 및 2와 함께 사용되는 추가적인 벡터 3의 DNA 작제물의 다이아그램을 도시한 것이다.
도 2는 EmTTR 시스템을 이용하여 섬유아세포의 트랜스펙션 후 15일에 SSEA4+/TRA181+ 만능성 마커 발현에 대한 유세포 분석을 도시한 것이다.
도 3은 EmTTR 시스템을 이용하여 iPSC 마커를 발현시키는 콜로니의 출현을 확인하기 위해 트랜스펙션 후 30일에 만능성 마커 OCT4, NANOG, TRA181, 및 SSEA4 염색을 도시한 것이다.
도 4는 STTR 시스템을 이용하여 섬유아세포의 트랜스펙션 후 15일에 SSEA4+/TRA181+ 만능성 마커 발현에 대한 유세포 분석을 도시한 것이다.
도 5는 STTR 시스템을 이용하여 iPSC 마커를 발현시키는 콜로니의 출현을 확인하기 위해 트랜스펙션 후 30일에 만능성 마커 OCT4, NANOG, TRA181, 및 SSEA4 염색을 도시한 것이다.
도 6은 STTR로부터 유래된 대부분의 집단이 만능성의 모두 3개의 마커의 발현을 유지하였으며, EmTTR 유래 집단이 트랜스펙션 후 25일에 CD30 발현의 큰 감소에 의해 명시된 바와 같이 만능성을 잃는 것으로 나타남을 도시한 것이다.
도 7A 및 도 7B는, 만능성의 안정성이 D28에서 일련의 계대배양 후 EmTTR 및 STTR로부터 얻어진 iPSC 콜로니에서 상이함을 도시한 것이다. A: 두 집단 모두에서 배양물 중의 iPSC 콜로니 및 분화된 클러스터의 모폴로지; B: STTR 집단은 최소 자연 분화를 갖는 iPSC 콜로니를 유지하였으며, EmTTR 집단은 단지 수 개의 iPSC 콜로니의 존재와 함께 높은 수준의 자연 분화를 나타내었다.
도 8은 STTR 시스템을 이용하여 섬유아세포의 세포 재프로그래밍 동안 세포 집단에서의 벡터 2 및 내인성 OCT4 발현에서 운반된 EBNA의 유전자 발현 분석을 도시한 것이다.
도 9A 내지 도 9D는 마우스에서 만능성 발현 및 기형종 형성의 입증을 위해 STTR을 사용하여 얻어진 iPSC의 특징분석을 도시한 것이다. A. iPSC 클론의 위상 이미지. B. SSEA4+/TRA181+ 만능성 마커 발현의 흐름 분석. C. 만능성 마커 OCT4, NANOG, TRA181, 및 SSEA4에 대한 클론의 면역형광 염색. D. 3개의 배엽층, 즉, 내배엽, 중배엽 및 외배엽으로 분화하는 iPSC 클론의 능력.
도 10은 추가적인 재프로그래밍 인자를 갖는 STTR 시스템을 이용하여 섬유아세포의 트랜스펙션 후 15일에 SSEA4+/TRA181+ 만능성 마커 발현에 대한 유세포 분석을 도시한 것이다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명의 목적을 위해, 다음의 용어를 이하에서 정의한다. 단수의 용어는 문법적 대상의 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)를 지칭하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
대안의(예를 들어, "또는")의 사용은 대안 중 하나, 둘 다 또는 이들의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 용어 "및/또는"은 대안 중 하나, 또는 둘 다를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약" 또는 "대략"은 기준 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 비해 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1%만큼 많이 변하는 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다. 일 실시형태에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 관해 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이 ± 15%, ± 10%, ± 9%, ± 8%, ± 7%, ± 6%, ± 5%, ± 4%, ± 3%, ± 2% 또는 ± 1%의 범위를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "실질적으로" 또는 "본질적으로"는 기준 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 비해 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 또는 더 높은 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 지칭한다. 일 실시형태에서, 용어 "본질적으로 동일한" 또는 "실질적으로 동일한"은 기준 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이와 거의 동일한 기준 양, 수준, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이의 범위를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "실질적으로 존재하지 않는" 및 "본질적으로 존재하지 않는"은 상호 호환적으로 사용되고, 조성물, 예를 들어, 세포 집단 또는 배양 배지를 기재하기 위해 사용될 때, 특정된 물질 또는 그의 공급원이 없는, 예를 들어, 구체화된 물질 또는 그의 공급원이 95% 없는, 96% 없는, 97% 없는, 98% 없는, 99% 없거나, 또는 통상적인 수단에 의해 측정하여 검출 불가능한 조성물을 지칭한다. 조성물 중의 특정 성분 또는 물질이 "존재하지 않는" 또는 "본질적으로 존재하지 않는"이라는 용어는 또한 이러한 성분 또는 물질이 (1) 임의의 농도로 조성물 중에 포함되지 않거나, 또는 (2) 기능적으로 비활성이지만, 저농도인 조성물 중에 포함되지 않는다는 것을 의미한다. 조성물의 특정 물질 또는 그의 공급원의 부재를 지칭할 때, 용어 "의 부재"에 유사한 의미가 적용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단리된" 등은 이의 본래 환경으로부터 분리된 세포, 또는 세포의 집단을 지칭하며, 즉, 단리된 세포의 환경은 "비-단리된" 기준 세포가 존재하는 환경에서 발견되는 바와 같은 적어도 하나의 성분이 실질적으로 존재하지 않는다. 이러한 용어는 이의 천연 환경에서 발견되는 바와 같은 일부 또는 모든 성분, 예를 들어, 조직, 생검으로부터 제거된 세포를 포함한다. 이러한 용어는 또한, 비-자연 발생 환경, 예를 들어, 배양물, 세포 현탁액에서 발견된 세포로서 적어도 하나, 일부 또는 모든 성분으로부터 제거된 세포를 포함한다. 이에 따라, 단리된 세포는 자연에서 발견된 바와 같이, 또는 비-천연 발생 환경에서 성장되거나, 저장되거나, 존속될 때, 다른 물질, 세포 또 집단을 포함하는 적어도 하나의 성분들로부터 일부 또는 전부 분리된다. 단리된 세포의 특정 예는 일부 순수한 세포, 실질적으로 순수한 세포, 및 비-자연적으로 발생하는 배지에서 배양된 세포를 포함한다. 단리된 세포는 환경에서 다른 물질 또는 세포로부터, 요망되는 세포, 또는 이의 집단을 분리시키는 것으로부터, 또는 환경으로부터 하나 이상의 다른 세포 집단 또는 하위집단을 제거하는 것으로부터 얻어질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "정제하다" 등은 순도를 증가시키는 것을 지칭한다. 예를 들어, 순도는 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 또는 100%까지 증가될 수 있다.
본 명세서 전체적으로, 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단어 "포함한다(comprise)", "포함한다(comprises)" 및 "포함하는"은 단계들 또는 요소들의 언급된 단계 또는 요소의 포함을 나타내지만, 단계들 또는 요소들의 임의의 다른 단계 또는 요소 또는 그룹의 제외를 나타내는 것으로 이해될 것이다. 특정 실시형태에서, 용어 "포함하다(include)", "가지다(has)", "함유한다(contain)" 및 "포함하다(comprise)"는 동의어로 사용된다.
"이루어진"은 어구 "이루어진"에 따르는 것은 무엇이든 포함하지만, 이것으로 제한되지 않는다는 것을 의미한다. 따라서, 어구 "이루어진"은 열거된 요소가 필요하거나 또는 필수적인 것, 다른 요소가 존재하지 않을 수도 있다는 것을 나타낸다.
"필수적으로 포함하는(consisting essentially of)"은 어구 다음에 열거된 임의의 요소를 포함하고, 열거된 요소에 대해 개시내용에서 구체화된 활성 또는 작용을 방해하지 않거나 또는 기여하지 않는 다른 요소로 제한된다는 것을 의미한다. 따라서, 어구 "본질적으로 이루어진"은 열거된 요소가 필요하거나 또는 필수적인 것이지만, 다른 요소가 선택적이지는 않고, 그들이 열거된 요소의 활성 또는 작용에 영향을 미치는지의 여부에 따라 제공될 수도 있고 제공되지 않을 수도 있다는 것을 나타낸다.
본 명세서 전체적으로 "일 실시형태", "실시형태", "특정 실시형태", "관련된 실시형태", "특정 실시형태", "추가적인 실시형태" 또는 "추가 실시형태" 또는 이들의 조합에 대한 언급은 실시형태와 관련하여 기재된 특정 특성, 구조 또는 특징이 본 발명의 적어도 하나의 실시형태에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체적으로 다양한 곳에서 앞서 언급한 어구의 출현은 반드시 동일한 실시형태를 모두 언급할 필요는 없다. 더 나아가, 특정 특성, 구조 또는 특징은 하나 이상의 실시형태에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다.
용어 "생체외"은 일반적으로 유기체 밖, 예를 들어, 바람직하게는 천연 조건의 최소 변형을 갖는 유기체 밖의 인공 환경에서의 살아있는 조직 내 또는 살아있는 조직 상에서 행해지는 실험 또는 측정에서 일어나는 활성을 지칭한다. 특정 실시형태에서, "생체외" 절차는 유기체로부터 취해지고, 보통 멸균 조건 하에 실험 장치에서, 그리고 전형적으로 환경에 따라서 몇 시간 동안 또는 약 24시간까지(48시간 또는 72시간 또는 그 이상을 포함))배양되는 살아있는 세포 또는 조직을 수반한다. 특정 실시형태에서, 이러한 조직 또는 세포는 수집되고, 냉동될 수 있고, 이후에 생체밖 처리를 위해 해동될 수 있다. 살아있는 세포 또는 조직을 이용하여 며칠보다 더 길게 지속되는 조직 배양 실험 또는 절차는 전형적으로 "시험관내"가 (특정 실시형태에서, 이 용어가 생체밖과 상호호환적으로 사용될 수는 있지만) 되는 것으로 고려된다.
용여 "생체내"는 일반적으로 유기체 내에서 일어나는 활동을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "재프로그래밍" 또는 "탈분화" 또는 세포 효능의 증가" 또는 "발생 효능의 증가"는 세포의 효능을 증가시키거나 또는 세포를 덜 분화된 상태로 분화시키는 방법을 지칭한다. 예를 들어, 증가된 세포 효능을 갖는 세포는 비-재프로그래밍 상태에서의 동일 세포에 비해 더 발생된 가소성을 갖는다(즉, 더 많은 세포 타입으로 분화할 수 있음). 다시 말해서, 재프로그래밍된 세포는 비-재프로그래밍 상태에서의 동일 세포보다 덜 분화된 상태의 것이다. "재프로그래밍 세포"는 재프로그래밍된 세포와 상반되게, OCT4, NANOG, SOX2, SSEA4, TRA181, CD30 및/또는 CD50와 같은 만능 줄기세포 모폴로지 또는 안정한 내인성 만능성 유전자 발현을 포함하는, 만능 세포의 특징을 가지지 않고 변화 모폴로지(즉, 모폴로지의 변형)를 나타내는, 만능성 상태로의 재프로그래밍/탈분화를 겪은 비-만능 세포를 지칭한다. 재프로그래밍 세포의 변화 모폴로지는 재프로그래밍 유도 전에 출발 비-만능 세포뿐만 아니라 배아 줄기세포 특징 모폴로지를 갖는 재프로그래밍된 세포와 이러한 세포를 구별한다. 예를 들어, 섬유아세포를 재프로그래밍할 때, 재프로그래밍 세포의 형태학적 변화는 MET(간엽-상피 이행)를 포함한다. 당업자는, 다양한 타입의 체세포에 대한 이러한 변화 모폴로지를 용이하게 이해하고 식별한다. 일부 실시형태에서, 재프로그래밍 세포는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8일 이상, 그리고 21, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 35, 40일 이하, 또는 이들 사이의 임의의 일수 동안 재프로그래밍하기 위해 유도된 중간 세포이며, 세포는 자기-유지 또는 자기-지속 만능성 상태 상태로 진입하지 못한다. 비-만능 세포는 세포가 하나 이상의 재프로그래밍 인자로 도입될 때 재프로그래밍하도록 유도된다. 1, 2, 3, 또는 4일 동안 재프로그래밍하기 위해 유도된 재프로그래밍 세포는 재프로그래밍 인자의 형질 도입 후 1, 2, 3, 또는 4일에서의 세포이다(형질 도입의 일자는 0일임). 재프로그래밍 인자의 외인성 발현에 노출 전의 체세포와는 달리, 재프로그래밍 세포는 안정한 만능성 상태로 도달하기 위해 재프로그래밍 과정을 진행시키고, 충분한 시간이 제공되는 한, 심지어 외인성 발현 재프로그래밍 인자의 부재 하에서도 재프로그래밍된 세포가 될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유도 만능 줄기세포" 또는 "iPSC"는 줄기세포가 유도 또는 변화된, 즉, 모두 3가지의 배아 또는 진피층(중배엽, 내배엽 및 외배엽)으로 분화할 수 있는 세포로 유도되거나 변경된(즉, 재프로그래밍된) 성인, 신생아 또는 태아 세포로부터 생성된다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "배아 줄기세포"는 배아 배반포의 내부 세포 덩어리의 천연 유도 만능 줄기세포를 지칭한다. 배아 줄기세포는 만능성이며, 3가지의 1차 배엽(외배엽, 내배엽 및 중배엽)의 모든 유도체로의 발생 동안 생기게 한다. 그들은 배아외막 또는 태반에 기여하지 않으며, 즉, 전능성이 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "다능성 줄기세포"는 하나 이상의 배엽(외배엽, 중배엽 및 내배엽)(그러나 3가지 모두는 아님)의 세포로 분화하는 발생 가능성을 갖는 세포를 지칭한다. 따라서, 다능성 세포는 또한 "부분적으로 분화된 세포"로 지칭될 수 있다. 다능성 세포는 당업계에 잘 공지되어 있고, 다능성 세포의 예는 성체 줄기세포, 예를 들어, 조혈 줄기세포 및 신경 줄기세포를 포함한다. "다능성"은 세포가 주어진 계통에서 다수 타입의 세포(그러나 다른 계통의 세포는 아님)를 형성할 수 있다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 다능성 조혈 세포는 다수의 상이한 타입의 혈액 세포(적혈구, 백혈구, 혈소판 등)를 형성할 수 있지만, 뉴런을 형성할 수 없다. 따라서, 용어 "다능성"은 전능성 및 만능성보다 더 적은 발생 가능성 정도를 갖는 세포 상태를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "만능성"은 신체 또는 체세포의 모든 계통(즉, 배아 적합)을 형성하는 세포의 능력을 지칭한다. 예를 들어, 배아 줄기세포는 각각 3개의 배층, 즉, 외배엽, 중배엽 및 내배엽으로부터 세포를 형성할 수 있는 만능 줄기세포의 타입이다. 만능성은 완전한 유기체를 더 원시적으로 발생되게 할 수 없는 불완전하게 또는 부분적으로 만능 세포(예를 들어, 원외배엽 줄기세포 또는 EpiSC), 완전한 유기체(예를 들어, 배아 줄기세포)가 생기게 할 수 있는 더 만능 세포의 범위에 있는 발생 효능의 연속체이다.
만능성은 부분적으로 세포의 만능성 특징을 평가함으로써 결정될 수 있다. 만능성 특징은 (i) 만능 줄기세포 형태; (ii) 비제한적 자기-재생을 위한 가능성; (iii) SSEA1(마우스 단독), SSEA3/4, SSEA5, TRA1-60, TRA1-81, TRA1-85, TRA2-54, GCTM-2, TG343, TG30, CD9, CD29, CD133//프로미닌, CD140a, CD56, CD73, CD90, CD105, OCT4, NANOG, SOX2, CD30 및/또는 CD50을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 만능 줄기세포 마커의 발현; (iv) 모두 3가지의 체세포 계통(외배엽, 중배엽 및 내배엽)으로 분화하는 능력; (v) 3가지 체세포 계통으로 이루어진 기형종 형성; 및 (vi) 3가지 체세포 계통으로부터의 세포로 이루어진 배상체의 형성을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
2가지 타입의 만능성이 이전에 기재되었다: 후기 배반포의 원외배엽 줄기세포(EpiSC)와 유사한 만능성의 "프라이밍된" 또는 "전이성" 상태, 및 초기/이식전 배반포의 내부 세포 덩어리와 유사한 만능성의 "나이브" 또는 "기저" 상태. 만능성 상태는 둘 다 상기 기재한 바와 같은 특징을 나타내지만, 나이브 또는 기저 상태는 추가로 다음을 나타낸다: (i) 여성 세포에서 X-염색체의 사전-비활성화 또는 재활성화; (ii) 단일-세포 배양 동안 개선된 클론성 및 생존; (iii) DNA 메틸화에서의 전반적 감소; (iv) 발생 조절 유전자 프로모터에 대한 H3K27me3 억제염색질 마크 침착의 감소; 및 (v) 만능 세포의 프라이밍된 상태에 비해 분화 마커의 감소된 발현. 외인성 만능성 유전자가 체세포에 도입되고, 발현되며, 이어서 얻어진 만능 세포로부터 침묵되거나 제거된 세포 프로그래밍의 표준 방법은 일반적으로 만능성의 프라이밍-상태의 특징을 갖는 것으로 보인다. 표준 만능 세포 배양 조건하에서, 외인성 이식유전자 발현이 유지되지 않는 한 이러한 세포는 프라이밍된 상태로 남아있되, 기저 상태의 특징이 관찰된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "만능 줄기세포 형태"는 배아 줄기세포의 고전적 형태 특징을 지칭한다. 정상 배아 줄기세포 형태는 높은 핵-대-세포질 비, 핵소체의 주목할 만한 존재 및 전형적인 세포내 간격과 함께 형상이 둥글고 작은 것을 특징으로 한다.
"만능 인자" 또는 "재프로그래밍 인자"는 단독으로 또는 다른 제제와 조합하여, 세포의 발생 효능을 증가시킬 수 있는 제제를 지칭한다. 만능 인자는 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및 소분자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 예시적인 만능 인자는, 예를 들어, 전사 인자 및 소분자 재프로그래밍 제제를 포함한다. 예시적인 만능성 인자는 예를 들어, 전사 인자 OCT4 및 SOX2, 및 소분자 재프로그래밍 제제, 예를 들어, TGFβ 억제제, GSK3 억제제, MEK 억제제 및 ROCK 억제제를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "분화"는 비전문화된("관련되지 않은") 또는 덜 전문화된 세포가 전문화된 세포, 예를 들어, 혈액 세포 또는 근육 세포의 특징을 획득하는 과정이다. 분화된 또는 분화-유도 세포는 세포 계통 내에서 더 전문화된("수임된(committed)") 위치 상에서 취해진 것이다. 용어 "수임된"은 분화 과정에 적용될 때, 정상 환경 하에서 그것이 특정 세포 타입 또는 세포 타입의 서브세트로 분화를 계속할 수 있는 지점으로 분화 경로에서 진행하고, 정상 환경 하에서 상이하나 세포 타입으로 분화하거나 또는 덜 분화된 세포 타입으로 되돌아가는 지점까지 분화 경로에서 진행되는 세포를 지칭한다.
만능 줄기세포의 분화는 배양 시스템의 변화, 예를 들어, 배양 배지 또는 세포의 물리적 상태에서 자극제의 변화를 필요로 한다. 가장 통상적인 전략은 계통-특이적 분화를 개시하기 위해 통상적이고 중요한 중간체로서 배상체(EB)의 형성을 이용한다. EB는 그들의 3차원 면적 내에서 수많은 계통을 생기게 하기 때문에 배아 발생을 모방하는 것으로 나타난 3차원 클러스터이다. 분화 과정, 전형적으로 몇 시간 내지 며칠을 통해, 단순한 EB(예를 들어, 응집된 만능 줄기세포는 분화하도록 유발됨)는 성숙을 계속하고, 그들이 추가로 분화를 계속하도록 진행되는 시간, 전형적으로 며칠 내지 몇 주에 낭포성 EB로 발생된다. 세포의 3차원 다층 클러스터에서 만능 줄기세포가 서로 근접하게 함으로써 EB 형성이 개시되며, 전형적으로 이는 만능 세포가 액적 중의 침전을 허용하는 단계, 세포를 "U"형 바닥 웰-플레이트 내로 또는 기계적 교반에 의해 침전시키는 단계를 포함하는 몇몇 방법 중 하나에 의해 달성된다. EB 발생을 촉진시키기 위해, 만능 줄기세포 응집물은 추가적인 분화 신호가 필요한데, 만능성 배양물 유지 배지 내에 유지된 응집물이 적절한 EB를 형성하지 않기 때문이다. 이렇게 해서, 만능 줄기세포 응집물은 선택 계통에 대한 유발 신호를 제공하는 분화 배지로 전달될 필요가 있다. 만능 줄기세포의 EB-기반 배양물은 전형적으로 EB 세포 클러스터 내에서 보통의 증식을 갖는 분화된 세포 집단(외배엽, 중배엽 및 내배엽의 배엽)의 생성을 초래한다. 세포 분화를 용이하게 하는 것으로 증명되었지만, 그러나 EB는 3차원 구조에서 세포의 환경으로부터의 분화 신호에 대한관 일치되지 않는 노출 때문에 가변성 분화 상태로 이종성 세포가 생기게 한다. 추가로, EB는 생성 및 유지하는데 힘이 든다. 또한, EB를 통한 세포 분화는 보통 세포 확장을 수반하는데, 이는 또한 낮은 분화 효율에 기여한다.
비교하면, "EB 형성"과 별개인 "응집물 형성"은 만능 줄기세포 유래 세포의 집단을 확장시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 응집물-기반 만능 줄기세포 확장 동안, 배양물 배지는 증식 및 만능성을 유지하도록 선택된다. 세포 증식은 일반적으로 응집물의 크기를 증가시켜 더 큰 응집물을 형성하고, 이들 응집물은 배양물 내의 세포 증식을 유지시키기 위해 그리고 세포 수를 증가시키기 위해 더 작은 응집물로 일상적으로 기계적으로 또는 효소적으로 해리될 수 있다. EB 배양물과 별개로, 유지 배양물 중의 응집물 내에서 배양된 세포는 만능성 마커를 유지한다. 만능 줄기세포 응집물은 분화를 유도하기 위한 추가적인 분화 신호를 필요로 한다.
본 명세서에서 사용되는 "단일층 분화"는 세포의 3차원 다층 클러스터, 즉, "형성"을 통한 분화와 별개인 분화 방법을 지칭하는 용어이다. 단일층 분화, 본 명세서에 개시된 이점 중에서, 분화 개시를 위한 EB 형성에 대한 필요를 회피한다. 단일층 배양은 배아 발생, 예를 들어, EB 형성을 모방하지 않기 때문에, 특정 계통에 대한 분화는 EB에서의 모두 3가지 배엽 분화에 비해 최소인 것으로 여겨진다.
본 명세서에서 사용되는 "해리된" 세포는 다른 세포로부터 또는 표면(예를 들어, 배양 플레이트 표면)으로부터 실질적으로 분리되거나 또는 정제된 세포를 지칭한다. 예를 들어, 세포는 기계적 또는 효소적 방법에 의해 동물 또는 조직으로부터 해리될 수 있다. 대안적으로, 시험관내에서 응집하는 세포는 서로로부터, 예를 들어, 클러스터, 단일 세포 또는 단일 세포와 클러스터의 혼합물의 현탁액으로 해리에 의해 효소적으로 또는 기계적으로 해리될 수 있다. 또 다른 대안의 실시형태에서, 부착 세포는 배양 플레이트 또는 다른 표면으로부터 해리된다. 따라서 해리는 세포외 기질(ECM) 및 기질(예를 들어, 배양 표면)과의 세포 상호작용을 파괴하는 것 또는 세포 사이의 ECM을 파괴하는 것을 수반할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "피더 세포" 또는 "피더"는 피더 세포가 제2 세포 타입의 지지체에 대한 성장 인자 및 영양소를 제공하기 때문에 제2 타입의 세포가 성장할 수 있는 환경을 제공하는 제2 타입의 세포와 함께 공동배양되는 한 가지 타입의 세포를 기재하는 용어이다. 피더 세포는 그들의 지지하는 세포와 상이한 종으로부터 선택적으로 유래된다. 예를 들어, 줄기세포를 포함하는 특정 타입의 인간 세포는 마우스 배아 섬유아세포, 또는 불멸 마우스 배아 섬유아세포의 1차 배양물에 의해 지지될 수 있다. 피더 세포는 그들이 지지하는 세포보다 더 커지는 것을 방지하기 위해 방사선 조사 또는 항-유사분열제, 예를 들어, 미토마이신에 의한 처리에 의해 다른 세포와 함께 공동배양시킬 때 전형적으로 비활성화될 수 있다. 피더 세포는 내피세포, 기질 세포(예를 들어, 상피 세포 또는 섬유아세포) 및 백혈병 세포를 포함할 수 있다. 앞서 언급한 것으로 제한하는 일 없이, 한 가지의 특정 피더 세포 타입은 인간 피더, 예를 들어, 인간 피부 섬유아세포일 수 있다. 다른 피더 세포 타입은 마우스 배아 섬유아세포(MEF)일 수 있다. 일반적으로, 다양한 피더 세포는 특정 계통에 대한 만능성, 직접적 분화를 유지하기 위해 그리고 전문화된 세포 타입, 예를 들어, 이펙터 세포로의 성숙을 촉진시키기 위해 부분적으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "무-피더"(FF) 환경은 피더 또는 기질 세포가 본질적으로 없고, 그리고/또는 피더 세포의 배양에 의해 사전 조건화되지 않은 배양 조건, 세포 배양물 또는 배양 배지와 같은 환경을 지칭한다. "사전 조건화된" 배지는 피더 세포가 시간 기간 동안, 예를 들어, 적어도 1일 동안 배지 내에서 배양된 후에 채취된 배지를 지칭한다. 사전 조건화된 배지는 배지에서 배양된 피더 세포에 의해 분화된 성장 인자 및 사이토카인을 포함하는 다수의 매개체 물질을 함유한다. 일부 실시형태에서, 무-피더 환경은 두 피더 세포 모두가 존재하지 않고 또한, 피더 세포의 배양에 의해 사전-조건화되지 않는다. 피더 세포는 간질 세포, 마우스 배아 섬유아세포, 인간 섬유아세포, 케라티노사이트, 및 배아 줄기세포를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
"배양물" 또는 "세포 배양물"은 시험관내 환경에서 세포의 유지, 성장 및/또는 분화를 지칭한다. "세포 배양물 배지", "배양물 배지"(각각의 경우에 단수 "배지"), "보충물" 및 "배지 보충물"은 세포 배양물을 배양하는 영양 조성물을 지칭한다.
"배양하다" 또는 "유지하다"는, 예를 들어 멸균 플라스틱(또는 코팅된 플라스틱)세포 배양물 접시 또는 플라스크에서 조직 또는 신체 밖에서 세포를 지속하고/하거나, 증식(성장)시키고/시키거나 분화시키는 것을 지칭한다. "배양" 또는 "유지하는"은 세포를 증식시키고/시키거나 지속시키는 데 도움이 되는 영양소, 호르몬 및/또는 다른 인자의 공급원으로서 배양 배지를 이용할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "계대" 또는 "계대배양"은 세포가 요망되는 정도까지 증식될 때 다수의 세포 배양물 표면 또는 용기 내에 세포를 분할하고 플레이팅함으로써 배양된 세포를 나누는 행위를 지칭한다. 일부 실시형태에서, "계대" 또는 "계대배양"은 세포를 분할하고, 희석시키고, 플레이팅하는 것을 지칭한다. 세포가 1차 배양물 표면 또는 용기로부터 후속 세트의 표면 또는 용기로 계대배양되기 때문에, 후속 배양물은 본 명세서에서 "2차 배양물" 또는 "제1 계대" 등으로서 지칭될 수 있다. 새로운 배양 용개 내로 분할하고 플레이팅하는 각 행위는 하나의 계대로 여겨진다. 일부 실시형태에서, 배양된 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 이상 마다 계대배양된다. 일부 실시형태에서, 재프로그래밍 후 초기에 선택된 iPSC는 3 내지 7일마다 1회 계대배양된다.
iPSC, 및 이로부터 분화된 유도된 비-만능 세포의 게놈 편집 또는 변형, 또는 비-만능 세포 및 이로부터 재프로그래밍된 유도된 iPSC의 게놈 편집 또는 변형의 문맥에서 사용되는 "기능성"은 (1) 유전자 수준에서는-성공적인 녹-인, 녹-아웃, 녹-다운 유전자 발현, 유전자 이식된 또는 제어된 유전자 발현, 예를 들어, 요망되는 세포 발생 스테이지에서 유도성 또는 일시적 발현(이는 직접적인 게놈 편집 또는 변형을 통해서 또는 초기에 게놈 조작된 출발 세포로부터의 분화 또는 출발 세포의 재프로그래밍을 통한 "패싱-온(passing-on)"을 통해서 달성됨)을 지칭하거나; (2) 세포 수준에서는 - (i) 직접적인 게놈 편집을 통해서 상기 세포에서 수득된 유전자 발현 변형, (ii) 초기에 게놈 조작된 출발 세포로부터의 분화 또는 출발 세포의 재프로그래밍을 통한 "패싱-온"을 통해서 상기 세포에서 유지된 유전자 발현 별형; (iii) 상기 세포의 초기 발달 단계에서만 보이거나, 또는 분화 또는 재프로그래밍을 통해서 상기 세포를 생성시키는 출발 세포에서만 보이는 유전자 발현 변형의 결과로서의 상기 세포에서의 하류 유전자 조절; 또는 (iv) iPSC, 전구체 또는 탈분화된 세포 기원에서 수행된 게놈 편집 또는 변형으로부터 초기에 유래된, 성숙 세포 산물 내에 나타난 향상되거나 또는 새로 성취된 세포 기능 또는 속성을 통해서 세포 기능/특징을 성공적으로 제거, 부가 또는 변경한 것을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유전자 각인"은 소스 세포 또는 iPSC에서 우선적 치료적 속성에 기여하는 유전적 또는 후성적 정보를 지칭하고, 소스 세포 유래 iPSC 및/또는 iPSC-유래 조혈 계통 세포에서 보유 가능하다. 본 명세서에서 사용되는 "소스 세포"는 재프로그래밍을 통해 iPSC를 생성하기 위해 사용될 수 있는 비-만능 세포이고, 소스 세포 유래 iPSC는 임의의 조혈 계통 세포를 포함하는 특정 세포 타입으로 추가로 분화될 수 있다. 소스 세포 유래 iPSC, 및 그것으로부터의 분화 세포는 때때로 내용에 따라서 "유래 세포"로 총괄적으로 불린다. 우선적 치료 속성을 부여하는 본 명세서에 사용되는 바와 같은 유전자 각인(들)은 공여자-, 질환- 또는 치료 반응-특이적인 선택된 소스 세포의 재프로그래밍을 통해 또는 게놈 편집을 이용하여 유전자 변형된 양상을 iPSC에 도입하는 것을 통해 iPSC 내에 혼입된다. 구체적으로 선택된 공여자, 질환 또는 치료 내용으로부터 얻은 소스 세포의 양상에서, 우선적 치료적 속성에 기여하는 유전자 각인은 동정되든 아니든 근본적인 분자 사건과 상관없이 선택된 소스 세포의 유도체 세포 상에서 통과된 보유 가능한 표현형, 즉, 우선적 치료 속성을 나타내는 임의의 내용 특이적인 유전적 또는 후성적 변형을 포함할 수 있다. 공여자-, 질환- 또는 치료 반응- 특이적 소스 세포는 iPSC에서 보유 가능한 유전자 각인 및 유래된 조혈 계통 세포를 포함할 수 있으며, 이 유전자 각인은, 예를 들어, 바이러스 특이적 T 세포 또는 비변이체 자연 살해 T(iNKT) 세포로부터의 사전 배열된 단일 특이적 TCR; 추적할 수 있는 그리고 바람직한 유전적 다형성, 예를 들어, 선택된 공여자에서 고친화도 CD16 수용체를 암호화하는 점 돌연변이에 대한 동형접합성; 및 사전 결정된 HLA 필요, 즉, 증가된 집단을 갖는 단상형을 나타내는 선택된 HLA-매칭된 공여자 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 우선적 치료적 속성은 유래된 세포의 개선된 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정, 생존 및 세포독성을 포함한다. 우선적 치료 속성은 또한 항원 타깃화 수용체 발현; HLA 제시 또는 이의 결여; 종양 미세환경에 대한 내성; 방관자 면역 세포 및 면역 조정의 유도; 종양을 벗어난 효과가 감소된 개선된 타깃에 대한 특이성; 화학요법과 같은 치료에 대한 내성에 관한 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "유전적 변형"은 (1) 재배열, 돌연변이, 유전자 각인 및/또는 후성적 변형으로부터 천연 유래되거나, (2) 또는 세포 게놈에서 삽입, 결실 또는 치환을 통한 게놈 조작을 통해 얻는 것을 포함하는 게놈 편집을 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 게놈 변형은 또한 공여자-, 질환- 또는 치료 반응-특이적인 공급원 특이적 면역 세포의 한 가지 이상의 보유 가능한 치료적 속성을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "향상된 치료적 특성"은 동일한 일반적 세포 타입의 전형적 면역 세포에 비해 향상된 세포의 치료적 특성을 지칭한다. 예를 들어, "치료적 특성"을 갖는 NK 세포는 전형적, 비변형 및/또는 천연 유래 NK 세포에 비해 향상된, 개선된 그리고/또는 증가된 치료적 특성을 가질 것이다. 면역 세포의 치료적 특성은 세포 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정, 생존 및 세포독성을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 면역 세포의 치료적 특성은 또한 항원 타깃화 수용체 발현; HLA 제시 또는 이의 결여; 종양 미세환경에 대한 내성; 방관자 면역 세포 및 면역 조정의 유도; 종양을 벗어난 효과가 감소된 개선된 타깃에 대한 특이성; 화학요법과 같은 치료에 대한 내성에 의해 나타낸다.
"통합"은 작제물의 하나 이상의 뉴클레오타이드가 세포 게놈 내로 안정하게 삽입되는 것, 즉 세포의 염색체 DNA 내의 핵산 서열에 공유 연결되는 것을 의미한다. "타깃화된 통합"은 작제물의 뉴클레오타이드(들)이 미리-선택된 부위 또는 "통합 부위"에서 세포의 염색체 또는 미토콘드리아 DNA에 삽입되는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "통합"은 통합 부위에서 내인성 서열 또는 뉴클레오타이드의 결실이 있거나 또는 결실이 없는, 작제물의 1종 이상의 외인성 서열 또는 뉴클레오타이드의 삽입에 관련된 과정을 추가로 지칭한다. 이러한 경우, 삽입 부위 내에 결실이 존재하는 경우, "통합"은 하나 이상의 삽입된 뉴클레오타이드가 결실된 내인성 서열 또는 뉴클레오타이드의 대체를 더 포함할 수 있다.
"작제물"은 시험관내 또는 생체내에서 숙주 세포에 전달될 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 거대분자 또는 분자의 복합체를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 "벡터"는 외부 유전 물질의 타깃 세포로의 전달 또는 이송을 안내할 수 있는 임의의 핵산 작제물을 지칭하고, 여기서 그것은 복제 및/또는 발현될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "벡터"는 전달될 작제물을 포함한다. 벡터는 선형 또는 원형 분자일 수 있다. 벡터는 통합 또는 비통합될 수 있다. 벡터의 주요 타입은 플라스미드, 에피솜 벡터, 바이러스 벡터, 코스미드 및 인공 염색체를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 센다이 바이러스 벡터 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "암호화"는 뉴클레오타이드(즉, rRNA, tRNA 및 mRNA)의 정의된 서열 또는 아미노산의 정의된 서열 중 어느 하나 및 그로부터 생성된 생물학적 특성을 갖는 생물학적 과정에서 다른 폴리머 및 거대분자의 합성을 위한 템플레이트로서 기능하는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, 유전자, cDNA, 또는 mRNA에서의 뉴클레오타이드의 특이적 서열의 고유 특성을 지칭한다. 따라서, 유전자는, 그 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물계에서 단백질을 생산하는 경우 단백질을 암호화한다. 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 템플레이트로서 사용되는, 뉴클레오타이드 서열이 mRNA 서열과 동일하고, 통상적으로 서열 목록으로 제공되는 암호화 가닥, 및 비-암호화 가닥 둘 모두는 그 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 산물을 암호화한다고 지칭될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "외인성"은 언급된 분자 또는 활성이 숙주 세포에 도입되는 것을 의미하도록 의도된다. 분자는 예를 들어, 암호화 핵산을 숙주 유전 물질에 도입함으로써, 예를 들어, 숙주 염색체에 또는 비-염색체 유전 물질, 예를 들어 플라스미드로서 통합시킴으로써 도입될 수 있다. 이에 따라, 암호화 핵산의 발현과 관련하여 사용되는 바와 같이 이 용어는 발현성 형태의 암호화 핵산의 세포로의 도입을 지칭한다. 용어 "내인성"은 숙수 세포에 존재하는 언급된 분자 또는 활성을 지칭한다. 유사하게, 암호화 핵산의 발현과 관련하여 사용되는 경우 이러한 용어는 외인성으로 도입된 것이 아닌 세포 내에 함유된 암호화 핵산의 발현을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "고려되는 유전자" 또는 "고려되는 폴리뉴클레오타이드 서열"은 RNA로 전사되고, 일부 예에서는 적절한 조절 서열의 제어 하에서 일어나는 경우 생체내에서 폴리펩타이드로 번역되는 DNA 서열이다. 고려되는 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드는 원핵생물 서열, 진핵생물 mRNA로부터의 cDNA, 진핵생물(예를 들어 포유동물) DNA로부터의 게놈 DNA 서열 및 합성 DNA 서열을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 예를 들어, 고려되는 유전자는 miRNA, shRNA, 네이티브 폴리펩타이드(즉, 자연에서 발견되는 폴리펩타이드) 또는 이의 단편; 변이체 폴리펩타이드(즉, 네이티브 폴리펩타이드과 100% 미만의 서열 동일성을 갖는 네이티브 폴리펩타이드의 돌연변이) 또는 이의 단편; 조작된 폴리펩타이드 또는 펩타이드 단편, 치료 펩타이드 또는 폴리펩타이드, 영상화 마커, 선택성 마커 등을 암호화할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 또는 이들의 유사체인, 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 폴리머 형태를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드의 서열은 4개의 뉴클레오타이드 염기: 아데닌(A); 사이토신(C); 구아닌(G); 티민(T); 및 폴리뉴클레오타이드가 RNA인 경우 티민에 대해서 우라실(U)으로 구성된다. 폴리뉴클레오타이드는 유전자 또는 유전자 단편(예를 들어, 프로브, 프라이머, EST 또는 SAGE 태그), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 트랜스퍼 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지형 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 이중-가닥 분자 및 단일-가닥 분자 둘 모두를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "펩타이드," "폴리펩타이드," 및 "단백질"은 상호 호환적으로 사용되고, 펩타이드 결합에 의해서 공유 연결된 아미노산 잔기를 갖는 분자를 지칭한다. 폴리펩타이드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하고, 폴리펩타이드의 아미노산의 최대 수에는 제한이 없다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 또한 일반적으로 관련 기술 분야에서 예를 들어, 펩타이드, 올리고펩타이드 및 올리고머라 지칭되는 단쇄, 및 일반적으로 관련 기술 분야에서 폴리펩타이드 또는 단백질이라 지칭되는 장쇄 둘 모두를 지칭한다. "폴리펩타이드"는 예를 들어, 특히 생물학적 활성 단편, 실질적으로 상동성인 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 호모다이머, 헤테로다이머, 폴리펩타이드의 변이체, 변형된 폴리펩타이드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩타이드는 자연 폴리펩타이드, 재조합 폴리펩타이드, 합성 폴리펩타이드 또는 이들의 조합물을 포함한다.
"작동 가능하게-연결된"은 하나의 기능이 서로에 의해서 영향을 받도록 하는 단일 핵산 단편 상에서의 핵산 서열의 회합을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는 그것이 그 암호 서열 또는 기능성 RNA의 발현에 영향을 줄 수 있는 경우(즉, 암호화 서열 또는 기능성 RNA가 프로모터의 전사 제어 하에 있는 경우) 암호 서열 또는 기능성 RNA와 작동 가능하게-연결된다. 암호화 서열은 센스 또는 안티센스 방향으로 조절 서열에 작동 가능하게-연결될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "관여자"는 면역 세포, 예를 들어, T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포, 호중구 및 종양 세포 사이에 연결을 형성할 수 있고; 면역 세포를 활성화시킬 수 있는 분자, 예를 들어 융합 폴리펩타이드를 지칭한다. 관여자의 예는 이중 특이적 T 세포 관여자(bi-specific T cell engager: BiTE), 이중 특이적 살해 세포 관여자(bi-specific killer cell engager: BiKE), 삼중 특이적 살해 세포 관여자 또는 다중 특이적 살해 세포 관여자 또는 다수 면역 세포 유형과 적합한 보편적 관여자(universal engager)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "표면 촉발 수용체"는 면역 반응, 예를 들어, 세포독성 반응을 촉발시키거나 또는 개시할 수 있는 수용체를 지칭한다. 표면 촉발 수용체는 조작될 수 있고, 이펙터 세포, 예를 들어, T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포, 호중구 상에서 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표면 촉발 수용체는 이펙터 세포의 자연적 수용체 및 세포 타입과 독립적인 이펙터 세포와 특정 타깃 세포 예를 들어, 종양 세포 사이의 이중- 또는 다중-특이적 항체 관여를 용이하게 한다. 이 접근을 사용하여, 보편적 표면 촉발 수용체를 포함하는 iPSC를 생성할 수 있고, 이어서, 이러한 iPSC를 보편적 표면 촉발 수용체를 발현시키는 다양한 이펙터 세포 타입의 집단으로 분화시킬 수 있다. "보편적"은 표면 촉발 수용체가 세포 타입과 상관없이 임의의 이펙터 세포에서 발현되고, 활성화시킬 수 있으며, 보편적 수용체를 발현시키는 모든 이펙터 세포는 관여자의 종양 결합 특이성과 상관없이 표면 촉발 수용체에 의해 인식될 수 있는 동일한 에피토프를 갖는 관여자에 결합되거나 또는 연결될 수 있다는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, 동일한 종양 타깃화 특이성을 갖는 관여자는 보편적 표면 촉발 수용체와 결합하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 상이한 종양 타깃화 특이성을 갖는 관여자는 보편적 표면 촉발 수용체와 결합하기 위해 사용된다. 이렇게 해서, 하나 또는 다중 이펙터 세포 타입은 일부 경우에 종양 세포의 하나의 특정 타입을 사멸시키기 위해 그리고 일부 다른 경우에 2 이상의 타입의 종양을 사멸시키기 위해 관련될 수 있다. 표면 촉발 수용체는 일반적으로 이펙터 세포 활성화를 위한 공자극 도메인 및 관여자의 에피토프에 특이적인 항-에피토프를 포함한다. 이중 특이적 관여자는 한 말단 상에서 표면 촉발 수용체의 항-에피토프에 특이적이고, 다른 말단 상에서 종양 항원에 특이적이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "안전 스위치 단백질"은 세포 요법의 잠정적인 독성 또는 다른 유해 효과를 방지하도록 설계된 조작 단백질을 지칭한다. 일부 상황에서, 안전 스위치 단백질 발현은 안전 스위치 단백질을 그의 게놈으로 암호화하는 유전자 내에 영구적으로 혼입된 이식 조작 세포에 대한 안전 문제를 처리하기 위해 조건적으로 제어된다. 이 조건적 조절은 가변적일 수 있고, 소분자-매개 번역 후 활성화 및 조직-특이적 및/또는 일시적 전사 조절을 통한 제어를 포함할 수 있다. 안전 스위치는 세포자멸사의 저해, 단백질 합성의 저해, DNA 복제, 성장 저지, 전사 및 전사 후 유전적 조절 및/또는 항체-매개 고갈을 매개할 수 있었다. 일부 예에서, 안전 스위치 단백질은 활성화될 때 치료 세포의 세포자멸사 및/또는 세포사를 촉발시키는 외인성 분자, 예를 들어, 프로드러그에 의해 활성화된다. 안전한 스위치 단백질의 예는, 자살 유전자, 예를 들어, 카스파제 9(또는 카스파제3 또는 7), 티미딘 키나제, 사이토신 탈아미나제, B-세포 CD20, 수정된 EGFR, 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 이 전략에서, 유해 사건이 있는 경우에 투여되는 프로드러그는 자살-유전자 산물에 의해 활성화되고, 형질도입 세포를 사멸시킨다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적으로 활성인 단백질 또는 펩타이드"는 유기체에 대한 생물학적 및/또는 약제학적 효과를 달성할 수 있는 단백질 또는 펩타이드를 지칭한다. 약제학적으로 활성인 단백질은 질환에 대한 치유하는 근치적 또는 고식적 특성을 가지며, 질환의 중증도를 개선시키거나, 경감시키거나, 완화시키거나, 반전시키거나 또는 줄이기 위해 투여될 수 있다. 약제학적으로 활성인 단백질은 또한 예방적 특성을 가지며, 질환의 개시를 방지하기 위해 또는 그것이 생길 때 이러한 질환 또는 병리적 병태의 중증도를 줄이기 위해 사용된다. 약제학적으로 활성인 단백질은 전체 단백질 또는 펩타이드 또는 이의 약제학적으로 활성인 단편을 포함한다. 또한 단백질 또는 펩타이드의 약제학적으로 활성인 유사체 또는 단백질 또는 펩타이드의 단편의 유사체를 포함한다. 용어 약제학적으로 활성인 단백질은 또한 치료적 이점을 제공하기 위해 협력적으로 또는 상승적으로 작용하는 복수의 단백질 또는 펩타이드를 지칭한다. 약제학적으로 활성인 단백질 또는 펩타이드의 예는 수용체, 결합 단백질, 전사 및 번역 인자, 종양 성장 억제 단백질, 항체 또는 이의 단편, 성장 인자 및/또는 사이토카인을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "신호전달 분자"는 세포 신호 형질도입을 조절하거나, 이에 참여하거나, 저해하거나, 활성화시키거나, 감소시키거나 또는 증가시키는 임의의 분자를 지칭한다. 신호 형질도입은 세포에서 생화학적 사건을 궁극적으로 촉발시키는 경로를 따라서 단백질 복합체의 동원에 의한 화학적 변형의 형태로 분자 신호의 전달을 지칭한다. 신호 형질도입 경로는 당업계에 잘 공지되어 있고, G 단백질 결합 수용체 신호전달, 타이로신 키나제 수용체 신호전달, 인테그린 신호전달, 톨 게이트 신호전달, 리간드-개폐 이온 통로 신호전달, ERK/MAPK 신호전달 경로, Wnt 신호전달 경로, cAMP-의존적 경로, 및 IP3/DAG 신호전달 경로를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "타깃화 양상"은 i) 독특한 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR) 또는 T 세포 수용체(T cell receptor: TCR)와 관련된 항원 특이성, ii) 단클론성 항체 또는 이중특이적 관여자와 관련된 관여자 특이성, iii) 형질전환 세포의 타깃화, iv) 암 줄기세포의 타깃화, 및 v) 특정 항원 또는 표면 분자의 부재 하에서의 다른 타깃화 전략을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 항원 및/또는 에피토프 특이성을 촉진시키기 위해 세포 내에 유전적으로 혼입된 분자, 예를 들어, 폴리펩타이드를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "특이적" 또는 "특이성"은 비특이적 또는 비선택적 결합과 대조적으로 타깃 분자에 선택적으로 결합하는 분자, 예를 들어 수용체 또는 관여자의 능력을 지칭하기 위해 사용될 수 있다.
HLA-부류 I 결핍, 또는 HLA-부류 II 결핍, 또는 둘 모두를 비롯한, "HLA 결핍"은 HLA 부류 I 단백질 헤테로다이머 및/또는 HLA 부류 II 헤테로다이머를 포함하는 완전한 MHC 복합체의 표면 발현이 결여되거나 또는 더이상 유지되지 않거나 또는 감소되어, 줄어들거나 또는 감소된 수준이 다른 세포에 의해서 또는 합성 방법에 의해서 자연적으로 검출 가능한 수준보다 낮은, 세포를 지칭한다. HLA 부류 I 결핍은 HLA 부류 I 유전자좌(염색체 6p21)의 임의의 영역의 기능성 결실, 또는 베타-2 마이크로글로불린(B2M) 유전자, TAP 1 유전자, TAP 2 유전자 및 타파신을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 HLA 부류-I 연관된 유전자의 결실 또는 이의 발현 수준의 감소에 의해서 달성될 수 있다. HLA 부류 II 결핍은 RFXANK, CIITA, RFX5 및 RFXAP를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 HLAII 연관된 유전자의 기능성 결실 또는 감소에 의해서 달성될 수 있다. 본 발명 이전에는 HLA 복합체 결핍 또는 변경된 iPSC가 조절된 활성을 보유하면서, 발달하고, 성숙하고, 기능성 분화된 세포를 생성시키는 능력을 가지는 지의 여부가 명확하지 않았다. 또한, 본 발명 이전에는, HLA 복합체 결핍 분화된 세포가 HLA 복합체 결핍을 가지면서, iPSC로 재프로그래밍될 수 있고, 만능 줄기세포로서 유지될 수 있는지의 여부가 명확하지 않았다. 세포 재프로그래밍, 만능성의 유지 및 분화 동안의 예상치 못한 실패는 발달 단계 특이적 유전자 발현 또는 이의 부족, HLA 복합체 제시에 대한 요구, 도입된 표면 발현 양상의 단백질 셰딩, 적절하고 효율적인 클론성 재프로그래밍에 대한 필요성, 및 분화 프로토콜의 재구성에 대한 필요성을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 양상에 관련될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "변형된 HLA 결핍 iPSC"는 개선된 분화 가능성, 항원 타깃화, 항원 제시, 항체 인식, 지속성, 면역 회피, 억제에 대한 내성, 증식, 공자극, 사이토카인 자극, 사이토카인 생산(오토크린 또는 파라크린), 주화성, 및 세포 세포독성, 예를 들어 비-고전적 HLA 부류 I 단백질(예를 들어, HLA-E 및 HLA-G), 키메라 항원 수용체(CAR), T 세포 수용체(TCR), CD16 Fc 수용체, BCL11b, NOTCH, RUNX1, IL15, 41BB, DAP10, DAP12, CD24, CD3z, 41BBL, CD47, CD113 및 PDL1로 제한되지 않는 관련된 단백질을 발현하는 유전자를 도입함으로써 추가로 변형된 HLA 결핍 iPSC를 지칭한다. "변형된 HLA 결핍"된 세포는 iPSC가 아닌 세포를 또한 포함한다.
FcR로 약칭되는 "Fc 수용체"는 그것이 인식한 항체의 타입을 기반으로 분류된다. 예를 들어, 항체의 가장 일반적인 부류, IgG에 결합하는 것은 Fc-감마 수용체(FcγR)라 지칭되며, IgA에 결합하는 것은 Fc-알파 수용체(FcαR)라 지칭되고, IgE에 결합하는 것은 Fc-엡실론 수용체(FcεR)라 지칭된다. FcR의 부류는 또한 이를 발현하는 세포(대식세포, 과립구, 자연 살해 세포, T 및 B 세포) 및 각각의 수용체의 신호전달 특성에 의해서 구별된다. Fc-감마 수용체(FcγR)는 몇몇 구성원, FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32), FcγRIIB(CD32), FcγRIIIA(CD16a), FcγRIIIB(CD16b)를 포함하는데, 이것은 이의 상이한 분자 구조로 인해서 이이의 항체 친화도가 상이하다.
CD16은 두 아이소폼, Fc 수용체 FcγRIIIa(CD16a) 및 FcγRIIIb(CD16b)로서 식별되어 있다. CD16a는 타깃 세포에 부착된 단량체 IgG에 결합하여 NK 세포를 활성화시켜 항체-의존적인 세포-매개된 세포독성(ADCC)을 가능하게 하는, NK 세포에 의해서 발현된 막관통 단백질이다. "고 친화도 CD16", "비-절단성 CD16", 또는 "고 친화도 비-절단성 CD16"은, 본 명세서에 사용되는 바와 같이, CD16의 변이체를 지칭한다. 야생형 CD16은 낮은 친화도를 갖고, NK 세포 활성화 시 백혈구 상의 다양한 세포 표면 분자의 세포 표면 밀도를 조절하는 단백질분해 절단 과정인, 엑토도메인(extodomain) 셰딩되는 경향이 있다. F176V 및 F158V는 높은 친화도를 갖는 예시적인 CD16 변이체인 반면; S197P 변이체는 CD16의 비-절단성 버전의 예이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "입양 세포 요법"은 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 상기 형질도입 전에 생체외에서 확장된, 유전적으로 변형되거나 변형되지 않은, CD34 세포, 혈구 내피 세포, 조혈 줄기 또는 전구체 세포, 조혈 다능성 전구체 세포, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NKT 세포, NK 세포, B 세포, 또는 면역 조절 세포와 같은 자가 또는 동종이계 림프구의 형질도입에 관한 세포-기반 면역요법을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 "치료적으로 충분한 양"은 그의 의미 내에서 비독성이지만 충분하고 그리고/또는 유효한 양의 특정 치료적 및/또는 약제학적 조성물을 포함하며, 목적으로 하는 치료 효과를 제공하는 것을 언급한다. 필요한 정확한 양은 환자의 일반적 건강상태, 환자의 연령 및 병기 및 병태의 중증도와 같은 인자에 따라서 대상체에 따라 다를 것이다. 특정 실시형태에서, 치료적으로 충분한 양은 치료 중인 대상체의 질환 또는 병태와 관련된 적어도 하나의 증상을 개선시키고/시키거나, 감소시키고/시키거나 좋아지게 하는데 충분하고/하거나 효과적이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "대상체"는 임의의 동물, 바람직하게는, 인간 환자, 가축 또는 다른 집에서 기르는 동물을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료하는", "치료" 등은 치료학적 치료를 필요로 하는 대상체와 관련하여 사용될 때, 질환의 증상의 개선 또는 제거를 달성하는 것을 포함하지만 이로 제한되지 않는 요망되는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 지칭한다. 이러한 효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 일부 예방한다는 면에서 예방적일 수 있고/있거나, 증상의 개선 또는 제거를 달성하거나 질환 및/또는 질환에 기여할 수 있는 부작용에 대한 부분적 또는 완전한 치유의 면에서 치료적일 수 있다. 용어 "치료"는 포유동물, 특히, 인간에서 질환의 임의의 치료를 포함하고, (a) 질환의 성향이 있을 수 있지만, 아직 그것이 있는 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질환이 생기는 것을 방지하는 것; (b) 질환을 저해하는 것, 즉, 그의 발생을 저지하는 것; (c) 질환을 경감시키거나 질환의 퇴행을 야기시키거나, 질환의 증상을 완전히 또는 부분적으로 제거하는 것; 및 (d) 조혈 시스템을 재구성하는 것과 같은, 질환전 상태로 개체를 회복시키는 것을 포함한다.
I. 신규한 재프로그래밍 시스템 및 이로부터 생성된 세포
일반적으로, 본 개시내용은 비-만능 세포를 적어도 하나의 재프로그래밍 인자와, 및 선택적으로, TGFβ 수용체/ALK 억제제, MEK 억제제, GSK3 억제제 및 ROCK 억제제의 조합물의 존재하에서 접촉시킴으로써 개시된 재프로그래밍 과정을 제공한다(FRM; 표 1).
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본 발명의 일 양태는 일시적 및 시간적 이식 유전자 발현을 매개하는 플라스미드 시스템을 이용하여 무-풋프린트 iPSC를 수득하는 방법을 제공한다. 플라스미드 시스템은 복제 기점 및 재프로그래밍 인자(들)을 암호화하지만 EBNA를 갖지 않는 폴리뉴클레오타이드를 운반하는 하나 이상의 제1 플라스미드(V1), 및 폴리뉴클레오타이드를 암호화하지만 복제 기점 또는 재프로그래밍 인자 암호화 서열을 갖지 않는 EBNA를 포함하는 제2 플라스미드(V2)를 포함한다.
플라스미드의 조합물은 형질 도입 시에 세포에서 일시적으로 이식 유전자(EBNA 및 외인성 재프로그래밍 인자)의 세포질 발현을 가능하게 하고, 변화 모폴로지, 또는 형태학적 변화(예를 들어, 간엽-상피 이행(MET))를 나타내는 무-EBNA 중간 세포의 집단을 생성하지만, OCT4와 같은 임의의 만능 세포 모폴로지 또는 내인성 만능성 유전자 발현이 결여되고, 또한, 안정한 자기-유지 만능성 상태로 들어갈 수 있다. 이에 따라, 이러한 구별되는 세포 집단은 "재프로그래밍 세포"로 언급된다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 재프로그래밍 세포는 또한, 재프로그래밍 과정(예를 들어, FMM)을 지지하는 배양 조건하에 충분한 시간 동안 제공된 만능성 상태로 재프로그래밍할 수 있다는 점에서, 재프로그래밍 인자의 도입 전에, 모폴로지적으로 뿐만 아니라 기능적으로 체세포와 다르다. 이와 같이, 본 개시의 일 양태는 변화 모폴로지를 가지고 안정한 만능성 상태를 확립시키기 위해 재프로그래밍 과정을 수행할 수 있는 EBNA-부재 재프로그래밍 세포를 제공한다. 일부 실시형태에서, EBNA-부재 재프로그래밍 세포는 무-이식 유전자이다. 이에 따라, 얻어진 iPSC 집단 및 iPSC는 EBNA에 대한 선택, 또는 에피솜 재프로그래밍에서 요구되는 바와 같은 EBNA 및 이식 유전자의 제거를 위한 연속 계대배양을 필요로 하지 않는 무-풋프린트이다. 또한, 이러한 일시적 및 시간적인 수명이 짧은 플라스미드 시스템을 이용하여 생성된 iPSC는 개선된 클론 형성능 및 유전적 안정성, 높은 동질성, 높은 비율의 정상 핵형, 최소 복귀 또는 자연 분화를 포함하는 성질들 중 하나를 가지고, 피더 조건과 함께 또는 이의 없이, 단일 세포 생존 및 분류, 장기간 확장 및 자기-재생, 및 단일층 분화를 가능하게 한다.
일반적으로, 본 분야에서, 외인성으로 도입된 재프로그래밍 인자가 iPSC를 생성시키기 위해 적어도 10 내지 12일 동안 발현되어야 한다는 것이 허용된다[Okita et al., Science (2008); 322:949-953; Brambrink et al., Cell Stem Cell (2008); 2(2):151-159; Stadtfeld et al., Cell Stem Cell (2008); 2(3):230-240]. 외인성 전사 인자의 아데노바이러스 형질 도입은 비-통합 바이러스 벡터에 의해 매개된 유전자 발현의 일시적 특성으로 인하여, 때때로, 반복된 트랜스펙션을 필요로 한다. 또한, 아데노바이러스 방법을 이용한 재프로그래밍 효능은 단지 마우스에서 0.001 내지 0.0001%[Stadtfeld et al., Science (2008); 322:945-946], 및 인간 세포에서 0.0002%[Zhou et al., Stem Cells (2009); 27:2667-2674]이다. 센다이 바이러스 벡터 매개 재프로그래밍의 경우에, 다수의 형질 도입은, 이러한 바이러스 벡터가 긴 기간에 걸쳐 대량의 외인성 단백질을 연속적으로 형성하여 만능성을 유지시키기 위해 이식 유전자 발현의 특정 의존성을 생성시킬 수 있기 때문에 필요한 것은 아니다. 센다이 바이러스는 0.1% 내지 1%의 더 높은 효능에서 약 25일에 혈액 세포뿐만 아니라 신생아 및 성인 섬유아세포를 재프로그래밍할 수 있다. 그러나, 이는 바이러스가 최근에 재프로그래밍된 iPSC로부터 완전히 손실되는데 약 10회 계대 소요되며, 이는 만능성 유전자의 내인성 회로가 아닌 이식 유전자 발현에 의해 지지되는 iPSC-유사 클론의 DNA 통합 또는 선택의 증가된 기회를 포함하는 센다이-기반 재프로그래밍의 단점으로서 간주된다[Fusaki et al., Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. (2009); 85:348-362; Seki et al., Cell Stem Cell (2010); 7:11-14; Ban et al., PNAS (2011); 108:14234-14239].
프로모터 및 이식 유전자(들)를 함유한, 플라스미드는 불량한 핵 흡수를 가지고, 복제 가능하지 않고, 트랜스펙션된 세포로부터 빠르게 손실된다. iPS 세포를 생성시키기 위해 사용될 때, 미니서클 DNA 벡터(박테리아 DNA가 존재하지 않는 최소 플라스미드)를 포함하는, 플라스미드 벡터는 허용 가능하지 않게 낮은 효능으로 피더 조건하에 재프로그래밍된 세포를 야기시키는 것으로 나타났고, 반복된 일일 트랜스펙션에 의해서만, 효율적인 재프로그래밍을 나타내지만, 종종 트랜스펙션된 이식 유전자의 숙주 게놈 통합을 야기시킨다[Okita et al., Science (2008); 322:949-953: 반복된 일일 트랜스펙션과 함께 표준 플라스미드를 사용하고, 게놈 통합을 관찰하였으며, 10E6개의 세포로부터 1 내지 4 무통합 클론을 수득함; Narsinh et al., Nat Protoc. (2011); 6(1): 78-88: 효율 대략 0.005%].
플라스미드와 비교하여, 에피솜은 세포질에서 자율적으로 또는 분할 숙주 세포의 염색체와 함께 유지 및 복제할 수 있다. 에피솜 벡터 매개 세포 재프로그래밍은 엡스타인-바 바이러스(EBV) 기반 에피솜 벡터의 적용으로 주로 나타났다. 고려되는 외인성 유전자(들) 이외에, EBV-기반 에피솜 벡터는 엡스타인-바 핵 항원-1(EBNA1)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, EBV로부터 유래된 복제의 기원(oriP)을 운반한다. EBNA는 세포 염색체에 결합하여, 벡터의 핵 국소화 및 자매 염색분체에 대한 oriP의 테더링(tethering)을 가능하게 한다. 이에 따라, 안정하게 발현된 EBNA는 분열 세포의 핵에서 에피솜 벡터를 복제하고 유지하기 위해 oriP와 공동으로 작용하는데, 이는 세포에서 EBNA를 포함하는 외인성 유전자의 안정한 및 장기간 발현을 제공하여, 에피솜 벡터가 통상적으로 대략 4 내지 8주 동안 지속하기 때문에 이식 유전자 통합의 가능성을 증가시킨다[Yates et al., 1984, 1985; Reisman et al., 1985; Sugden et al.,1985]. 그러나, oriP/EBNA 에피솜 벡터가 플라스미드 재프로그래밍에서 재프로그래밍 효능을 개선시키지만, 이는 여전히 0.006% 내지 0.1%의 대략 만족스럽지 않은 범위이다[Malik et al., Methods Mol Biol. (2013); 997:23-33].
oriP와 동일한 벡터에서 연속적으로 발현하는 EBNA 이외에, EBNA가 복제할 뿐만 아니라 전사되는 경우에, 안정하게 발현된 EBNA는 또한, oriP 및 이식 유전자를 함유한 벡터의 트랜스펙션 속도를 개선시키기 위해 숙주 세포의 게놈에서 EBNA 암호화 서열을 통합함으로써 제공될 수 있다[Mazda et al., 1997, J. Immunol. methods; 204:143-151]. 그러나, 이러한 디자인은, 세포의 추가적인 조작 없이, 궁극적으로, 무-풋프린트 만능 세포를 얻을 목적을 실패한다.
본 재프로그래밍 시스템은, 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 제1 플라스미드 및 적어도 하나의 제2 플라스미드를 포함하며, 여기서, 제1 플라스미드는 oriP 및 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 제공하지만 EBNA를 제공하지 않는 작제물을 가지며; 제2 플라스미드는 EBNA를 제공하지만 oriP 또는 재프로그래밍 인자를 제공하지 않는 작제물을 갖는다. 일부 실시형태에서, 재프로그래밍 시스템은 하나 초과의 제1 플라스미드를 포함하며, 여기서, 각 제1 플라스미드는 동일하거나 상이한 재프로그래밍 인자 또는 이들의 조합물을 제공한다. 이러한 플라스미드 시스템을 이용한 재프로그래밍은 새포의 다수의 트랜스펙션의 불필요, 이식 유전자의 게놈 통합의 없음, 및 훨씬 더 높은 재프로그래밍 효능이 존재한다는 점에서 본 분야에 공지된 통상적인 플라스미드 재프로그래밍 방법과는 상이하다. EBNA 및 재프로그래밍 인자(들)가 동일한 발현 카세트에 그리고 동일한 벡터에 존재하는 oriP와 함깨 배치되는 에피솜 재프로그래밍과 비교하여, 일부 실시형태의 플라스미드 시스템은 핵에서 EBNA 복제 및/또는 EBNA 및 이식 유전자의 연속 발현을 제공하지 않고, 단지 단기간 동안 그리고 만능성 세포 모폴로지의 출현 및 OCT4와 같은 내인성 만능성 유전자의 유도된 발현 전에 일시적/세포질 발현을 가능하게 한다. 이에 따라, 본 개시내용은 에피솜 재프로그래밍에서 무-풋프린트 iPSC를 얻기 위해 iPSC의 달리 필수적인 포지티브 선택 또는 연속 계대배양을 제거하는, 초기 스테이지에서(예를 들어, 통상적인 21 내지 32일 재프로그래밍 과장의 트랜스펙션 후 대략 4 내지 6일) EBNA 발현이 존재하지 않는 재프로그래밍 세포로부터 생성된 무-풋프린트 iPSC를 제공한다. 일부 실시형태에서, EBNA 발현에 대한 단기간은 트랜스펙션 후 약 4, 5, 6, 7 또는 8일이고 트랜스펙션 후 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21, 22, 22, 23, 24 또는 25일 이하이다.
복제 기점(oriP)은 DNA 복제가 개시하고 2개의 시스-작용 서열을 포함하는 부위이거나 그 부근의 부위이며, FR(반복부의 패밀리)은 EBNA(엡스타인-바 핵 항원)-결합 부위 및 또한 시스에서 프로모터에 대한 전사 향상제로서 역할을 하며, DS(dyad 대칭 요소)는 FR의 EBNA 결합 시에 DNA 합성의 개시를 위한 것이고 숙주 세포 복제 시스템에 의해 조절된다. FR 부위에 대한 EBNA 결합은 세포당 1회 주기 복제 후 oriP 플라스미드의 효율적인 분할을 가져오며, 이는 oriP 플라스미드를 핵으로 국소화시키고, 부모 세포 분열 시에 두 딸 세포 모두에서 플라스미드 보유를 유지한다. 일 실시형태에서, oriP는 파포바비리데 바이러스, 또는 헤르페스비리데 바이러스의 복제 기점일 수 있다. 일부 실시형태에서, oriP는 폴리오마비리네 바이러스, 파필로마비리네 바이러스, 또는 감마헤르페스비리네 바이러스의 복제 기점일 수 있다. 일부 다른 실시형태에서, oriP는 SV40, BK 바이러스(BKV), 소 유두종 바이러스(BPV), 또는 엡스타인-바 바이러스(EBV)의 복제 기점일 수 있다. 일 실시형태에서, oriP는 EBV의 야생형 복제 기점에 해당하거나, 이로부터 유도된다. 일 실시형태에서, EBNA는 EBV의 EBNA-1에 해당하는 야생형 단백질 또는 이의 유도체에 해당하는 폴리펩타이드이다(UniProtKB/Swiss-Prot Accession No: P03211; 서열번호 1). EBNA-1의 유도체는 상응하는 야생형 폴리펩타이드에 대해, EBNA-1의 하나 이상의 아미노산의 결실, 삽입 또는 치환을 포함하는 변형된 아미노산 서열을 갖는다. 일 실시형태에서, EBNA의 유도체는 야생형 EBNA와 비교하여 절단을 포함한다. 일 실시형태에서, 절단된 EBNA 단백질은 서열번호 2의 폴리펩타이드를 갖는다. 다른 실시형태에서, EBNA-1의 유도체는 EBNA-1에서 잔기 약 1 내지 약 90, 잔기 1 내지 약 40, 잔기 약 41 내지 약 90, 잔기 약 91 내지 약 324(GA 풍부 반복 영역), 잔기 약 325 내지 약 377, 잔기 약 378 내지 약 386, 잔기 약 451 내지 약 608, 및/또는 잔기 약 609 내지 약 641에 대해 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 단백질을 암호화한다.
본 분야에서 줄기세포 재프로그래밍을 위해 알려진 재프로그래밍 인자는 모두 본 재프로그래밍 시스템 및 방법과 함께 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 재프로그래밍 인자는 OCT4, SOX2, NANOG, KLF, LIN28, c-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 이러한 재프로그래밍 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 oriP를 함유하지만 EBNA를 함유하지 않은 동일한 플라스미드 작제물(즉, 동일한 제1 플라스미드)에 포함될 수 있다. 이러한 재프로그래밍 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 각각 oriP를 함유하지만 EBNA를 함유하지 않는 적어도 2개의 플라스미드 작제물(즉, 다수의 제1 플라스미드)에 포함될 수 있다. 이러한 재프로그래밍 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 폴리시스트론성 작제물(즉, 하나의 프로모터에 의해 조절된 다수의 암호화 서열) 또는 비-폴리시스트론성 작제물(일부는 하나의 프로모터에 의해 조절되고 일부가 상이한 프로모터에 의해 조절된 다수의 암호화 서열)에 포함될 수 있다. 프로모터는 예를 들어, CMV, EF1α, PGK, CAG, UBC, 및 구성적, 유도성, 내인성으로 조절되거나, 시간적-, 조직- 또는 세포 타입-특이적인 다른 적합한 프로모터일 수 있다. 일 실시형태에서, 프로모터는 CAG이다. 다른 실시형태에서, 프로모터는 EF1α이다. 일부 실시형태에서, 폴리시스트론성 작제물은 단일 오픈 리딩 프레임(예를 들어, 다수의 암호화 서열은 2A와 같은 자가-절단 펩타이드 암호화 서열에 의해 작동되게 연결됨) 또는 다수의 오픈 리딩 프레임(예를 들어, 내부 리보솜 진입 부위, 또는 IRES에 의해 연결된 다수의 암호화 서열)을 제공할 수 있다.
본 출원의 플라스미드 시스템의 일부 실시형태에서, 하나 이상의 플라스미드 작제물(제1 플라스미드)은 총괄적으로, OCT4, SOX2, NANOG, KLF, LIN28, c-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단지 하나의 제1 플라스미드 작제물이 시스템에 존재하고, 모든 선택된 재프로그래밍 인자를 제공한다. 일부 다른 실시형태에서, 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 제공하는 시스템에 둘 이상의 제1 플라스미드 작제물이 존재하며, 각 작제물은 폴리뉴클레오타이드의 적어도 하나의 카피에 의해 암호화된 동일하거나 상이한 재프로그래밍 인자를 포함한다. 일 실시형태에서, 시스템에서 하나 이상의 제1 플라스미드 작제물은 OCT4를 암호화하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 제1 플라스미드 작제물은 총괄적으로, OCT4를 암호화하는 적어도 2개의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 제1 플라스미드 작제물은 총괄적으로, OCT4 및 SOX2를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 제1 플라스미드 작제물은 총괄적으로, OCT4를 암호화하지만 c-MYC를 암호화하지 않는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 제1 플라스미드 작제물은 총괄적으로, OCT4를 암호화하는 적어도 2개의 폴리뉴클레오타이드, 및 ECAT1, UTF1, ESRRB, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1 중 적어도 하나를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
제1 플라스미드 작제물이 재프로그래밍 인자를 암호화하는 하나 초과의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 때, 인접한 폴리뉴클레오타이드는 자가-절단 펩타이드 또는 IRES를 암호화하는 링커 서열에 의해 작동되게 연결된다. 자가-절단 펩타이드는 2A 펩타이드일 수 있다. 2A 펩타이드는 FMDV(구제역 바이러스), ERAV(말 비염 A 바이러스), PTV-1(돼지 테스코 바이러스-1), 또는 TaV(극동 아시그나 바이러스)로부터 유래될 수 있으며, 이는 각각 F2A, E2A, P2A 및 T2A로서 지칭된다. 제1 플라스미드 작제물에서 다수의 2A 펩타이드는 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 실시형태에서, 2개의 가장 가까운 이웃하는 2A 펩타이드는 상이하며, 예를 들어, RF-2A1-RF-2A2-RF-2A1인 경우에, 2A1 및 2A2는 상이하다.
제1 플라스미드 작제물의 라이브러리는 사전-작제화될 수 있으며, 각 작제물은 다양한 수, 타입 및/또는 조합의 재프로그래밍 인자를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 함유한다. 재프로그래밍은 지연 시간이 긴 비효율적이고 확률적 과정인 것으로 알려져 있다. 발현의 타이밍 및 수준, 및 재프로그래밍 인자의 화학량론은 상이한 재프로그래밍 시기 및 재프로그래밍을 겪은 세포의 중간 상태에서 재프로그래밍 동력학을 유도하고, 재프로그래밍의 완료를 결정한다. 재프로그래밍 인자 화학량론은 또한, 재프로그래밍 효능에 영향을 미치고, iPSC의 클론 형성능, 자기-재생, 동질성, 및 만능성 유지(자연 분화와는 상반됨)를 포함하는 관련된 생물학적 성질, 및 프라이밍된 대 기저 상태 만능성과 같은 다양한 특성을 갖는 iPSC를 생성한다. 화학량론은 반응 과정에서 시약들 간의 정량적 관계를 측정하고, 제공된 반응에서 요구되는 시약의 양, 및 때때로 생성된 생성물의 양을 결정하기 위해 사용된다. 화학량론은 시약의 화학량론적 양 또는 시약의 화학량론적 비율 둘 모두를 고려하는데, 이는 반응을 완료하기 위한 시약(들)의 최적의 양 또는 비율이다. 본 출원의 일 양태는 하나 이상의 제1 플라스미드가 라이브러리로부터 보편적으로 선택되고, 혼합- 및 매칭되고, 투약량-조정되고, 공동-트랜스펙션되게 함으로써 재프로그래밍 인자 화학량론을 평가하거나 사용하는 시스템 및 방법을 제공한다.
본 재프로그래밍 시스템의 제2 플라스미드는 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 EBNA 및 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 제공하며, 여기서, 발현 카세트 및 제2 플라스미드는 재프로그래밍 인자를 암호화하는 어떠한 폴리뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. 제2 플라스미드에 포함된 프로모터는 예를 들어, CMV, EF1α, PGK, CAG, UBC, 및 구성적, 유도성, 내인성으로 조절되거나, 시간적-, 조직- 또는 세포 타입-특이적인 다른 적합한 프로모터일 수 있다. 일 실시형태에서, 프로모터는 CAG이다. 다른 실시형태에서, 프로모터는 EF1α이다. 비-만능 세포를 적어도 하나의 제1 플라스미드 및 제2 플라스미드의 전술한 조합물과 함께 공동-트랜스펙션시킴으로써, 가닥-단독 EBNA 및 oriP는 적어도 하나의 재프로그래밍 인자와 함께, 재프로그래밍을 개시하기 위해 비-만능 세포에 도입된다.
일부 실시형태에서, 재프로그래밍은 TGFβ 수용체/ALK 억제제, MEK 억제제, GSK3 억제제 및 ROCK 억제제를 포함하는 소분자 화합물들의 조합물의 존재하에서 개시되며, iPSC는 충분한 기간 후에 생성된다. 일부 실시형태에서, 재프로그래밍은 무-피더 조건하에 수행된다. 특정 실시형태에서, 무-피더 환경에는 인간 피더 세포가 본질적으로 존재하지 않고, 비제한적으로, 마우스 배아 섬유아세포, 인간 섬유아세포, 케라티노사이트, 및 배아 줄기세포를 포함하는 피더 세포에 의해 사전-컨디셔닝되지 않는다.
일부 실시형태에서, 약 7 내지 35, 10 내지 32, 15 내지 31일, 약 17 내지 29일, 약 19 내지 27일, 또는 약 21 내지 약 25일 동안 유도된 후의 세포는 세포가 효소 또는 기계적 수단에 의해 단일 세포 현탁액으로 해리되도록, 선택적으로 해리된다. 해리된 세포는 세포를 유지시키거나 세포 분류를 수행하기 위한 임의의 적합한 용액 또는 배지에 재현탁될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단일 해리된 세포 현탁액은 ROCK 억제제를 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 단일 해리된 세포 현탁액은 GSK3 억제제, MEK 억제제 및 ROCK 억제제를 포함한다. 특정 실시형태에서, 단일 세포 현탁액은 GSK3 억제제, MEK 억제제 및 ROCK 억제제를 함유하고, TFGβ 억제제가 결여되어 있다. 특정 실시형태에서, GSK3 억제제는 CHIR99021이고/이거나, MEK 억제제는 PD0325901이고/이거나, Rock 억제제는 티아조비빈이다.
일부 실시형태에서, 단일 해리된 세포 현탁액은 추가로 분류될 수 있다. 일 실시형태에서, 농축은 비교적 짧은 시간에 클론 iPSC 콜로니를 유도하여 iPSC 생성의 효능을 개선시키는 방법을 제공한다. 농축은 만능성의 세포 발현 마커를 식별하고 얻어서, 농축된 만능 세포의 집단을 수득함으로써 세포의 집단을 분류하는 것을 포함할 수 있다. 추가적인 농축 방법은 분화, 비-프로그래밍된 또는 비-만능 세포의 세포 발현 마커의 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 분류를 위한 세포는 만능 세포이다. 일부 실시형태에서, 분류를 위한 세포는 재프로그래밍 세포이다. 일부 실시형태에서, 분류를 위한 세포는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8일 이상, 그러나 25, 26, 28, 30, 32, 35, 40일 이하, 또는 이들 사이의 임의의 일수 동안 프로그래밍하도록 유도되었다. 일부 실시형태에서, 분류를 위한 세포는 약 21 내지 25일, 약 19 내지 23일, 약 17 내지 21일, 약 15 내지 약 19, 또는 약 16 내지 약 18일 동안 재프로그래밍하도록 유도되었다.
세포는 세포를 분류하는 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 자기 비드 또는 유세포 분석(FACS) 분류에 의해 분류될 수 있다. 세포는 SSEA3/4, TRA1-60/81, TRA1-85, TRA2-54, GCTM-2, TG343, TG30, CD9, CD29, CD133/프로미닌, CD140a, CD56, CD73, CD105, OCT4, NANOG, SOX2, KLF4, SSEA1(마우스), CD30, SSEA5, CD90 및/또는 CD50의 발현을 포함하지만, 이로 제한되지 않는, 만능성의 하나 이상의 마커를 기반하여 분류될 수 있다. 다양한 실시형태에서, 세포는 만능성 또는 분화의 적어도 2, 적어도 3, 또는 적어도 4개의 마커에 기반하여 분류된다. 특정 실시형태에서, 세포는 SSEA4의 발현에 기반하여, 그리고 특정 실시형태에서 TRA1-81 및/또는 TRA1-60과 조합한 SSEA4의 발현에 기반하여 분류된다. 특정 실시형태에서, 세포는 SSEA4, TRA1-81 또는 TRA1-60 및/또는 CD30 발현에 기반하여 분류된다. 일 실시형태에서, 세포는 SSEA4, TRA1-81 및 CD30에 기반하여 분류된다. 다른 실시형태에서, 세포는 SSEA4, TRA1-60 및 CD30에 기반하여 분류된다. 특정 실시형태에서, 세포는 CD13, CD26, CD34, CD45, CD31, CD46 및 CD7를 포함하지만, 이로 제한되지 않는 세포를 분화시키는 하나 이상의 표면 마커를 이용하는 비-재프로그래밍된 세포에 대해 초기에 결여되고, 이후에, 만능성 마커, 예를 들어, SSEA4, TRA1-81 및/또는 CD30가 풍부하다.
재프로그래밍 후에, iPSC는 유지되고, 계대배양되고, 확장된다. 일부 실시형태에서, iPSC는 유지 배지, 예를 들어, 표 1에 나타낸 바와 같은 FMM에서 연장된 기간 동안 단일 세포로서, 배양되고, 즉, 유지되고, 계대배양되고, 확장된다. FMM에서 배양된 iPSC는 이의 미분화된, 및 기저 또는 나이브, 프로파일; 배양 세정 또는 선택을 필요로 하지 않는 게놈 안정성; 및 모드 3개의 체세포 계통을 용이하게 일으킴, 배아체 또는 단일층(배아체 형성되지 않음)을 통한 시험관내 분화; 및 기형종 형성에 의한 생체내 분화를 계속 유지시키는 것으로 나타났다[예를 들어, 미국 특허 출원 제61/947,979호 및 미국 특허 출원 공개 제20170073643호 참조, 이러한 문헌의 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함됨]. 본 재프로그래밍 시스템 및 방법을 이용하여 재프로그래밍하기에 적합한 세포는 일반적으로, 임의의 비-만능 세포를 포함한다. 비-만능 세포는 말단 분화된 세포; 또는 다능성 또는 전구체 세포를 포함하지만, 이로 제한되지 않으며, 이는 모든 3가지 타입의 배엽층 계통 세포를 발생시키지 못한다. 일부 실시형태에서, 재프로그래밍을 위한 비-만능 세포는 1차 세포, 즉, 인간 또는 동물 조직으로부터 직접적으로 단리된 세포이다. 일부 실시형태에서, 재프로그래밍을 위한 비-만능 세포는 소스 특이적 세포, 예를 들어, 공여자-, 질환-, 또는 치료 반응-특이적이다. 일부 실시형태에서, 재프로그래밍을 위한 비-만능 세포는 1차 면역 세포이다. 일부 실시형태에서, 재프로그래밍을 위한 비-만능 세포 자체는 배아 줄기세포 및 유도된 만능 줄기세포를 포함하는, 만능 세포로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 재프로그래밍을 위한 비-만능 세포는 유래된 면역 세포, 예를 들어, iPSC-유래 비-천연 T- 또는 NK-유사 세포이다.
일부 다른 실시형태에서, 재프로그래밍을 위한 비-만능 세포는 게놈적으로 변형된 1차 또는 유도된 세포이다. 비-만능 세포에 포함된 유전적 변형은 게놈에서 삽입, 결실, 또는 치환을 포함하며, 이는 유전자 발현의 녹-인, 녹-아웃 또는 녹-다운을 초래한다. 재프로그래밍을 위한 비-만능 세포에서의 변형된 발현은 구성적이거나 유도성일 수 있다(예를 들어, 발달 단계-, 조직-, 세포-, 또는 유도자-특이적). 일부 실시형태에서, 삽입 또는 치환은 유전자좌 특이적 타깃화된 통합이다. 일부 실시형태에서, 통합을 위한 선택된 유전자좌는 안전한 하버 유전자좌 또는 고려되는 내인성 유전자좌이다. 안전한 하버 유전자좌는 AAVS1, CCR5, ROSA26, 콜라겐, HTRP, H11, 베타-2 마이크로글로불린, GAPDH, TCR 또는 RUNX1, 및 게놈 안전 하버의 기준을 충족하는 다른 유전자좌를 포함할 수 있다. 잠재적인 안전한 하버 유전자좌이기 위한 통합 부위에 대하여, 이는 이상적으로 서열 주석에 의해 판단하는 경우에, 조절 요소 또는 유전자의 파괴의 부재를 포함하지만 이로 제한되지 않는 기준을 충족시켜야 하고, 유전자 조밀 구역에서 유전자간 영역 또는 반대 방향으로 전사되는 2개의 유전자 사이의 수렴하는 위치이고, 인접한 유전자, 특히, 암-관련 및 microRNA 유전자의 프로모터와 벡터-암호화된 전사 활성자 간의 장거리 상호작용의 가능성을 최소화하기 위해 거리를 유지시키고, 유비쿼터스 전사 활성을 나타내는, 넓은 공간 및 시간 표현 서열 태그(expressed sequence tag: EST)에 의해 반영한 경우에, 명백한 유비쿼터스 전사 활성을 갖는다. 이러한 후자 특징은 만능 세포와 관련하여 특히 중요하며, 여기서, 분화 동안, 크로마틴 리모델링은 통상적으로, 일부 유전자좌의 침묵 및 다른 것의 잠재적인 활성화를 초래한다. 외인성 삽입에 적합한 영역 내에서, 삽입을 위해 선택된 정밀한 유전자좌는 반복 요소 및 보존 서열이 없어야 하며, 여기에 상동성의 증폭을 위한 프라이머가 용이하게 설계될 수 있다. 일 예에서, 본 시스템 및 방법을 이용하여 재프로그래밍하기 위한 비-만능 세포는 내인성 TCR 유전자좌에서 CAR을 포함하는 T 세포이며, TCR 발현은 CAR 통합의 결과로서 파괴된다.
일 실시형태에서, 유전적으로 변형된 비-만능 세포의 재프로그래밍은 동일한 유전적 변형(들)을 포함하는 게놈 조작된 iPSC를 수득하는 것이다. 이와 같이, 일부 다른 실시형태에서, 하나 이상의 이러한 게놈 편집은 다른 게놈-조작된 iPSC를 얻기 위해 재프로그래밍 후 iPSC에 도입될 수 있다. 일 실시형태에서, 게놈 편집을 위한 iPSC는 클론 iPS 세포의 클론 라인 또는 집단이다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 타깃화된 유전자 편집을 포함하는 게놈-조작된 iPSC는 MEKi, GSKi, 및 ROCKi를 포함하지만, TGFβ 수용체/ALK5 억제제가 존재하지 않거나 본질적으로 존재하지 않는 배지에서 유지되고, 계대배양되고, 확장되며, 여기서, iPSC는 선택된 부위에서 온전한 및 기능성 타깃화 편집을 유지한다. 일부 실시형태에서, 유전자 편집은 안전 스위치 단백질, 타깃화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적 활성 단백질 또는 펩타이드, 약물 타깃 후보물질, 및 만능 세포 및/또는 이의 유도체 세포의 단백질 증진 생착, 수송, 귀소, 종양 침입, 생존력, 자기-재생, 지속성, 및/또는 생존 중 하나 이상을 도입한다. 일 실시형태에서, 게놈 조작된 iPSC는 비제한적으로, 카스파제 9(또는 카스파제 3 또는 7), 티미딘 키나제, 시토신 데아미나제, B-세포 CD20, 변형된 EGFR, 및 이들의 임의의 조합을 포함하는 하나 이상의 자살 유전자 매개 안전 스위치를 포함한다. 일부 실시형태에서, 게놈 조작된 iPSC는 키메라 수용체, 귀소 수용체, 항-염증 분자, 면역 체크포인트 단백질, 사이토카인/케모카인 디코이 수용체, 성장 인자, 변형된 전-염증성 사이토카인 수용체, CAR, 또는 바이- 또는 멀티-특이적 또는 보편적 관여자와 커플링하기 위한 표면 촉발 수용체의 도입되거나 증가된 발현; 또는 공동-자극 유전자의 감소된 또는 침묵된 발현을 포함하는 적어도 하나의 게놈 변형을 갖는다. 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC는 타깃화 양상으로서 높은 친화력 및/또는 비-절단 가능한 CD16을 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC에 포함된 타깃화 양상은 T 세포 특이적, 또는 NK 세포 특이적이거나 T 세포 및 NK 세포 둘 모두에 대해 양립 가능한 키메라 항원 수용체(CAR)이다.
일부 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC는 하나 이상의 내인성 유전자에서 in/del 또는 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 내인성 유전자에 포함된 in/del은 유전자 발현의 파괴를 야기시킨다. 일부 실시형태에서, 내인성 유전자에 포함된 in/del은 편집된 유전자의 녹-아웃을 야기시킨다. 일부 실시형태에서, 내인성 유전자에 포함된 in/del은 편집된 유전자의 녹-아웃을 야기시킨다. 일부 실시형태에서, 선택된 부위(들)에서 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 게놈-조작된 iPSC는 선택된 부위(들)에서 in/del을 포함하는 하나 이상의 타깃화된 편집을 더 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, in/del은 면역 반응 조절 및 매개와 관련된 하나 이상의 내인성 유전자에 포함된다. 일부 실시형태에서, in/del은 하나 이상의 내인성 체크 포인트 유전자에 포함된다. 일부 실시형태에서, in/del은 하나 이상의 내인성 T 세포 수용체 유전자에 포함된다. 일부 실시형태에서, in/del은 하나 이상의 내인성 MHC 부류 I 억제제 유전자에 포함된다. 일부 실시형태에서, in/del은 주요 조직접합성 복합물과 관련된 하나 이상의 내인성 유전자에 포함된다. 일 실시형태에서, 변형된 iPS 세포는 B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, RFXANK, CIITA, RFX5, RFXAP, 및 염색체 6p21 영역에서의 임의의 HLA 유전자 중 적어도 하나에서 결실 또는 감소된 발현을 포함한다. 다른 실시형태에서, 변형된 iPS 세포는 HLA-E 또는 HLA-G의 도입된 또는 증가된 발현을 포함한다. 또 다른 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 iPS 세포는 중단된 TCR 유전자좌를 포함한다.
특히, 다중-유전자좌 타깃화 전략에서 다중-유전자를 갖는 단일 세포 수준에서 iPSC를 효과적으로 조작하기 위한 iPSC의 다양한 타깃화된 유전적 편집 방법은 예를 들어, 국제출원공개 WO 2017/079673호에 기술된 것을 포함하며, 이러한 문헌의 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명은 또한, 체세포를 덜 분화된 상태로 재프로그래밍하는 제제를 식별하는 방법뿐만 아니라, 이에 따라 식별된 제제를 제공한다. 일 실시형태에서, 본 방법은 본 명세서에 개시된 바와 같은 재프로그래밍 조성물 및 방법을 이용하여 체세포를 재프로그래밍하되, 적어도 하나의 벡터가 후보 제제를 포함하고; 만능성 세포 모폴로지의 출현 및 OCT4와 같은 적어도 하나의 내인성 만능성 유전자의 유도된 발현을 갖는 세포를 선택하는 것을 포함한다. 적절한 선택 가능한 마커를 발현시키는 세포의 존재는 제제가 체세포를 재프로그래밍하는 것을 지시한다. 이러한 제제는 본 출원의 목적을 위한 재프로그래밍 제제로서 간주된다. 추가 실시형태에서, 본 방법은 본 명세서에 개시된 바와 같은 재프로그래밍 조성물 및 방법을 이용하여 체세포를 후보 제제와 접촉시키고, 적절한 선택 가능한 마커를 발현시키는 세포를 선택하고, 만능성 특징에 대해 이에 따라 선택된 세포를 평가하는 것을 포함한다. 만능성 특징의 완전한 세트의 존재는 제제가 만능성이 되도록 체세포를 재프로그래밍하는 것을 지시한다. 본 발명에서 사용되는 후보 제제는 여러 화학 물질 부류를 포함하지만, 통상적으로, 이는 작은 유기 화합물을 포함하는 유기 분자이다. 후보 제제는 또한, 펩타이드, 사카라이드, 지방산, 스테로이드, 퓨린, 피리미딘, 핵산 및 유도체, 이의 구조적 유사체 또는 조합물을 포함하는 생체분자 중에서 발견된다. 후보 제제는 자연적으로 재조합을 일으키거나 실험실에서 설계될 수 있다. 후보 제제는 미생물, 동물 또는 식물로부터 단리될 수 있거나, 재조합으로 생성되거나 당해 분야에 공지된 화학적 방법에 의해 합성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 후보 제제는 본 발명의 방법을 이용하여 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리로부터 단리된다. 예를 들어, 랜덤화된 올리고뉴클레오타이드 및 올리고펩타이드의 발현을 포함하는, 매우 다양한 유기 화합물 및 생체분자의 랜덤 및 유도된 합성을 위한 여러 수단이 이용 가능하다. 대안적으로, 박테리아, 진균, 식물 및 동물 추출물 형태의 천연 화합물의 라이브러리는 입수 가능하거나 용이하게 생성된다. 추가적으로, 천연 또는 합성적으로 생성된 라이브러리 및 화합물은 통상적인 화학적, 물리적 및 생화학적 수단을 통해 용이하게 변경되고, 조합 라이브러리를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 공지된 약리학적 제제는 구조적 유사체를 생성하기 위해 아실화, 알킬화, 에스테르화, 아미드화를 포함하는, 유도된 또는 랜덤 화학적 변형으로 수행될 수 있다. 예를 들어, ChemBridge DIVERSetTM를 포함하는 여러 상업적으로 입수 가능한 화합물 라이브러리가 존재한다.
상기에 언급된 스크리닝 방법은 세포 상에서 수행된 검정을 기초로 한 것이다. 이러한 세포-기반 검정은 고속 대량 스크리닝(HTS) 포맷으로 수행될 수 있으며, 이는 당해 분야에 기술되어 있다. 예를 들어, Stockwell 등은 번역후 변형을 포함하는 소형화된 포유동물 세포-기반 검정에서 소분자의 고속 대량 스크리닝을 기술하였다[Stockwell et al., 1999]. 마찬가지로, Qian 등은 항암제에 대한 고속 대량 스크리닝을 위한 백혈병 세포-기반 검정을 기술하였다[Qian et al., 2001]. 두 참고문헌 모두는 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다.
II. 시험관내에서 수득된 iPSC 유도체 세포
본 발명은 또한, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 시스템 및 방법을 이용하여 얻어진 iPSC로부터 유래된 비-만능 세포를 제공한다. 일부 실시형태에서, 유도체 비-만능 세포를 생성시키기 위한 iPSC는 iPSC의 타깃화된 편집을 통해, 부위 특이적 통합 또는 in/del을 갖는 재프로그래밍 게놈-조작된 비-만능 세포를 통해, 게놈-조작된다. 일부 실시형태에서, iPSC-유도된 비-만능 세포는 전구체 세포 또는 완전-분화된 세포이다. 일부 실시형태에서, 게놈-조작된 iPSC에 포함된 동일한 타깃화된 편집을 유지하는 iPSC-유래 세포는 비-천연 중배엽 세포, CD34 세포, 혈구 내피 세포, 조혈 줄기 또는 전구체 세포, 조혈 다능성 전구체 세포, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NKT 세포, NK 세포, B 세포, 면역 조절 세포 또는 임의의 배엽층 계통의 임의의 요망되는 세포이다. 일부 실시형태에서, iPSC-유래 비-천연 면역 조절 세포는 골수성-유래 억제제 세포(myeloid-derived suppressor cell: MDSC), 조절 대식세포, 조절 수지상 세포 또는 중간엽 간질 세포를 포함하며, 이는 NK, B, 및 T 세포의 강력한 면역 조절제이다.
공여자 소스로부터 단리를 통해 얻기 어려운 특정 타입 또는 하위타입의 무한한 수의 세포를 생성하는 것 이외에, 재프로그래밍 과정이 세포 운명(특이적인/만능으로의 분화로부터)뿐만 아니라 초기 체세포 공여자의 연령과 독립적인 공여자 세포 집단의 대기적 연령 특징을 재설정하도록, 인간 iPSC 유래 계통이 운명-스테이지 세포의 성질을 나타낸다는 것을 나타낸다. 신경, 심장, 또는 췌장 세포를 포함하는 iPSC-유래 계통에서 관찰된 태아-유사 성질 이외에, 노화의 세포 특징은 재프로그래밍 과정 후에 iPSC로부터 재분화된 세포의 회춘을 나타내는 측정 가능한 변화를 나타내었다. 나이든 공여자 섬유아세포 집단에서 발현된 연령-관련된 파라미터는 iPSC 유도 및 iPSC-유래 섬유아세포-유사 세포로의 분화 후에 재설정되었다[Miller et al., 2013]. T-세포 클론으로부터 재프로그래밍된 iPSC로부터 분화된 iPSC-유래 항원-특이적 T 세포는 본래 T 세포 클론에서의 것에 비해 긴 텔로미어를 통해 회춘을 나타낸다. 회춘 과정을 나타내는 완전히 분화된 세포에서의 추가적인 변화는 이질염색질의 전체적인 증가, 개선된 미토콘드리아성 기능(ROS 감소, 감소된 mtDNA 돌연변이, 초구조체의 존재), 증가된 DNA 손상 반응, 텔로미어 신장 및 짧은 텔로미어의 백분율의 감소, 및 노쇠화 세포 분율의 감소를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다[Nishimura et al., 2013]. 이러한 다양한 연령-관련 양태에서의 긍정적인 재설정은 증식, 생존, 지속성, 및 기억 유사 기능에 대해 더 높은 잠재력을 갖는 비-천연 세포를 초래한다. 이에 따라, 재프로그래밍 및 재분화 매개 회춘은 완전 분화된 iPSC-유래 세포에서 여러 분자, 표현형 및 기능적 성질을 부여하며, 이의 비-천연 성질은 세포 계통에서 이의 유사성에도 불구하고 이의 1차-세포 대응물과 구별된다.
iPSC-유래된 조혈 세포 계통을 얻기 위한 적용 가능한 분화 방법 및 조성물은 예를 들어, 국제출원 PCT/US2016/044122호에 기술된 것을 포함하며, 이러한 문헌의 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함된다. 제공된 바와 같이, 조혈 세포 계통을 생성하기 위한 방법 및 조성물은 무-혈청, 무-피더, 및/또는 무-기질 조건하에 그리고 EB 형성을 필요로 하지 않는 확장 가능하고 단일층 배양 플랫폼에서 iPSC를 포함하는, 만능 줄기세포로부터 유래된 확정적 혈구 내피(hemogenic endothelium: HE)를 통하는 것이다. 제공된 방법에 따라 분화될 수 있는 세포는 만능 줄기세포로부터 특정 말기에 분화되는 세포 및 교차분화되는(transdifferentiated) 세포로 구속된 전구체 세포, 만능 중간체를 통하는 일 없이 조혈 운명으로 직접 이행되는 다양한 계통의 세포의 범위에 있다. 유사하게, 줄기세포의 분화에 의해 생성된 세포는 다능성 줄기 또는 전구체 세포로부터 말기에 분화되는 줄기세포, 및 모든 사이에 오는 조혈 세포 계통까지의 범위에 있다.
단일층 배양에서 만능 줄기세포로부터 조혈 계통의 세포를 분화 및 확장시키는 방법은 만능 줄기세포를 BMP 경로 활성자, 및 선택적으로, bFGF와 접촉시키는 것을 포함한다. 제공되는 바와 같이, 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포는 만능 줄기세포로부터 배아체를 형성하지 않으면서 얻어지고 확장된다. 중배엽 세포는 이후에, 만능 줄기세포로부터 배아체를 형성하지 않으면서, 확정적 혈구 내피(HE) 가능성을 갖는 확장된 중배엽 세포를 얻기 위해 BMP 경로 활성자, bFGF, 및 WNT 경로 활성자와 접촉한다. bFGF, 및 선택적으로, ROCK 억제제, 및/또는 WNT 경로 활성자와의 후속 접촉에 의해, 확정적 HE 가능성을 갖는 중배엽 세포는 확정적 HE 세포로 분화되며, 이는 또한, 분화 동안 확장된다.
조혈 계통의 세포를 얻기 위한 본 명세서에 제공된 방법은 EB-매개 만능 줄기세포 분화보다 우수한데, 왜냐하면, EB 형성은 중간 내지 최소 세포 확장을 야기시키고, 집단 내 세포의 균일한 확장 및 균일한 분화를 필요로 하는 다수의 적용분야에 중요한 단일층 배양을 허용하지 않고, 힘이 들며, 효율이 낮기 때문이다.
제공된 단일층 분화 플랫폼은 조혈 줄기세포 및 분화된 자손, 예를 들어, T, B, NKT, NK 세포, 및 조절 세포의 유도를 초래하는 확정적 혈구 내피로의 분화를 용이하게 한다. 단일층 분화 전략은 다양한 치료적 적용을 위해 치료적으로 관련된 수의 만능 줄기세포-유래된 조혈 세포의 전달을 가능하게 하는 대규모 확장과 향상된 분화 효능을 조합한다. 또한, 본 명세서에 제공된 방법을 이용한 단일층 배양은 시험관내 분화, 생체외 조절, 및 생체내 장기간 조혈 자기-재생, 재구성 및 생착의 완전한 범위를 가능하게 하는 기능성 조혈 계통 세포를 야기시킨다. 제공되는 바와 같이, iPSC 유래 조혈 계통 세포는 확정적 혈구 내피, 조혈 다능성 전구체 세포, 조혈 줄기 및 전구체 세포, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NK 세포, NKT 세포, B 세포, 대식세포, 호중구, 골수성-유래 억제제 세포(MDSC), 조절 대식세포, 조절 수지상 세포, 및 중간엽 간질 세포를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
만능 줄기세포의 확정적 조혈 계통의 세포로의 분화를 유도하는 방법으로서, 본 방법은 (i) 만능 줄기세포로부터 중배엽 세포의 분화 및 확장을 개시하기 위해, 만능 줄기세포를 BMP 활성자, 및 선택적으로, bFGF를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; (ii) 중배엽 세포로부터 확정적 HE 가능성을 갖는 중배엽 세포의 분화 및 확장을 개시하기 위해, 중배엽 세포를 BMP 활성자, bFGF, 및 GSK3 억제제를 포함하지만 선택적으로 TGFβ 수용체/ALK 억제제가 존재하지 않는 조성물과 접촉시키는 단계; (iii) 확정적 혈구 내피 가능성을 갖는 만능 줄기세포-유래 중배엽 세포로부터 확정적 혈구 내피의 분화 및 확장을 개시하기 위해, 확정적 HE 가능성을 갖는 중배엽 세포를 ROCK 억제제; bFGF, VEGF, SCF, IGF, EPO, IL6, 및 IL11로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로, Wnt 경로 활성자를 포함하지만, 선택적으로, TGFβ 수용체/ALK 억제제가 존재하지 않는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 방법은 만능 줄기세포를 시딩하고 팽창시키기 위해, MEK 억제제, GSK3 억제제, 및 ROCK 억제제를 포함하지만, TGFβ 수용체/ALK 억제제가 존재하지 않는 조성물과 만능 줄기세포를 접촉시키는 것을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포는 iPSC, 또는 나이브 iPSC, 또는 하나 이상의 유전자 각인을 포함하는 iPSC이며; iPSC에 포함된 하나 이상의 유전자 각인은 이로부터 분화된 조혈 세포에 유지된다. 만능 줄기세포의 조혈 계통 세포로의 분화를 유도하기 위한 방법의 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포의 조혈 계통 세포로의 분화는 배아체를 생성하지 않고, 단일층 배양 형태를 갖는다.
상기 방법의 일부 실시형태에서, 얻어진 만능 줄기세포-유래 확정적 혈구 내피 세포는 CD34+이다. 일부 실시형태에서, 얻어진 확정적 혈구 내피 세포는 CD34+CD43-이다. 일부 실시형태에서, 확정적 혈구 내피 세포는 CD34+CD43-CXCR4-CD73-이다. 일부 실시형태에서, 확정적 혈구 내피 세포는 CD34+ CXCR4-CD73-이다. 일부 실시형태에서, 확정적 혈구 내피 세포는 CD34+CD43-CD93-이다. 일부 실시형태에서, 확정적 혈구 내피 세포는 CD34+ CD93-이다. 일부 실시형태에서, 확정적 혈구 내피 세포는 CD34+CD93-CD73-이다.
상기 방법의 일부 실시형태에서, 본 방법은 (i) 확정적 혈구 내피의 전-T 세포 전구체로의 분화를 개시하기 위해 만능 줄기세포-유래 확정적 혈구 내피를 ROCK 억제제; VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO, 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로, BMP 활성자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 및 선택적으로, (ii) 전-T 세포 전구체의 T 세포 전구체 또는 T 세포로의 분화를 개시하기 위해 전-T 세포 전구체를 SCF, Flt3L, 및 IL7로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하지만 VEGF, bFGF, TPO, BMP 활성자 및 ROCK 억제제 중 하나 이상이 존재하지 않는 조성물과 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 본 방법의 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포-유래 T 세포 전구체는 CD34+CD45+CD7+이다. 본 방법의 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포-유래 T 세포 전구체는 CD45+CD7+이다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포-유래 T 세포는 공여자 소스로부터 단리된 1차 T 세포보다 훨씬 더 높은 분율의 γδT 세포를 포함한다.
만능 줄기세포의 조혈 계통의 세포로의 분화를 유도하기 위한 상기 방법의 다른 일부 실시형태에서, 본 방법은 (i) 확정적 혈구 내피의 전-NK 세포 전구체로의 분화를 개시하기 위해 만능 줄기세포-유래 확정적 혈구 내피를 ROCK 억제제; VEGF, bFGF, SCF, Flt3L, TPO, IL3, IL7, 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인; 및 선택적으로, MBP 활성자를 포함하는 조성물을 접촉시키는 단계; 및 선택적으로, (ii) 전-NK 세포 전구체의 NK 세포 전구체 또는 NK 세포로의 분화를 개시하기 위해 만능 줄기세포-유래 전-NK 세포 전구체를 SCF, Flt3L, IL3, IL7, 및 IL15로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인을 포함하지만, VEGF, bFGF, TPO, BMP 활성자 및 ROCK 억제제 중 하나 이상이 존재하지 않는 조성물과 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포-유래 NK 전구체는 CD3-CD45+CD56+CD7+이다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포-유래 NK 세포는 CD3-CD45+CD56+이다. 일부 실시형태에서, 만능 줄기세포-유래 NK 세포는 선택적으로, NKp46(CD335), NKp30(CD337), DNAM-1(CD226), 2B4(CD244), CD57 및 CD16 중 하나 이상에 의해 추가로 규정된다.
본 방법의 다른 실시형태에서, 본 방법은 ROCK 억제제, MCSF, GMCSF, 및 IL1b, IL3, IL6, IL4, IL10, IL13, TGFβ, bFGF, VEGF, SCF, 및 FLT3L로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성장 인자 및 사이토카인, 및 선택적으로, AhR 길항제 및 프로스타글란딘 경로 효능제 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 배지와 만능 줄기세포-유래 확정적 HE를 접촉시키는 것으로부터 면역 조절 세포를 생성할 수 있다.
일부 실시형태에서, 유래된 면역 조절 세포는 골수성 유래 억제제 세포(MDSC)를 포함한다. 일 실시형태에서, 유래된 면역 조절 세포의 집단은 CD45+CD33+ 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유래된 면역 조절 세포의 집단은 단핵구를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단핵구는 CD45+CD33+CD14+ 세포를 포함한다. 또 다른 일부 실시형태에서, 유래된 면역 조절 세포의 집단은 CD45+CD33+PDL1+ 세포를 포함한다. 본 발명의 일 양태는 CD45+CD33+, CD45+CD33+CD14+, 또는 CD45+CD33+PDL1+ 세포를 포함하는 iPSC-유래 면역 조절 세포의 농축된 세포 집단 또는 하위집단을 제공한다. 일부 다른 실시형태에서, 유래된 면역 조절 세포의 집단은 CD33+CD15+CD14-CD11b- 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, iMDSC를 포함하는 유래된 면역 조절 세포의 집단은 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 2%, 1%, 0.1% 미만의 적혈구, 림프구, 과립구, CD45-CD235+ 세포, CD45+CD7+ 세포, 또는 CD45+CD33+CD66b+ 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유래된 면역 조절 세포의 집단에는 적혈구, 림프구, 과립구, CD45-CD235+ 세포, CD45+CD7+ 세포, 또는 CD45+CD33+CD66b+ 세포가 본질적으로 존재하지 않는다.
III. iPSC 및 이로부터의 유도체 면역 세포의 치료적 용도
본 발명은 일부 실시형태에서, 개시된 바와 같은 방법 및 조성물을 이용하여 iPSC 및/또는 iPSC로부터 유래된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, iPSC는 iPSC-유래 면역 세포에서 보유될 수 있는 하나 이상의 타깃화된 유전자 편집을 포함하며, 여기서, 유전적으로 조작된 iPSC 및 이의 유도체 세포는 세포 기반 입양 치료법을 위해 적합하다. 일 실시형태에서, 유전적으로 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 iPSC 유래 HSC 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전적으로 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 iPSC 유래 HSC 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전적으로 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 iPSC 유래 proT 또는 T 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전적으로 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 iPSC 유래 proNK 또는 NK 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 유전적으로 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 iPSC 유래 면역 조절 세포 또는 골수성 유래 억제제 세포(MDSC)를 포함한다. 일부 실시형태에서, iPSC 유래 유전적으로 조작된 면역 세포는 생체외에서 개선된 치료 가능성을 위해 추가로 조절된다. 일 실시형태에서, iPSC로부터 유래된 유전적으로 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 증가된 수 또는 비율의 나이브 T 세포, 줄기세포 기억 T 세포, 및/또는 중심 기억 T 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, iPSC로부터 유래된 유전적으로 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 증가된 수 또는 비율의 타입 I NKT 세포를 포함한다. 다른 실시형태에서, iPSC로부터 유래된 유전적으로 조작된 면역 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 증가된 수 또는 비율의 적응성 NK 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, iPSC로부터 유래된 유전적으로 조작된 CD34 세포, HSC 세포, T 세포, NK 세포, 또는 골수성 유래 억제제 세포의 단리된 집단 또는 하위집단은 동종이계이다. 일부 다른 실시형태에서, iPSC로부터 유래된 유전적으로 조작된 CD34 세포, HSC 세포, T 세포, NK 세포, 또는 MDSC의 단리된 집단 또는 하위집단은 자연 발생적이다.
일부 실시형태에서, 분화를 위한 iPSC는 이펙터 세포에서 요망되는 치료적 t속성을 전달하는 유전자 각인을 포함하며, 이는 유전자 각인은 상기 iPSC로부터 유래된 분화된 조혈 세포에서 유지되고 기능성이다.
일부 실시형태에서, 만능 줄기세포의 유전자 각인은 (i) 비-만능 세포를 iPSC로 재프로그래밍한 동안에 또는 후에 만능 세포 게놈에서 게놈 삽입, 결실 또는 치환을 통해 얻은 하나 이상의 유전자 변형된 양상; 또는 (ii) 공여자-, 질환- 또는 치료 반응-특이적인 공급원 특이적 면역 세포의 하나 이상의 보유 가능한 치료적 속성을 포함하되, 상기 만능 세포는 공급원 특이적 면역 세포로부터 재프로그래밍되고, iPSC는 공급원 치료적 속성을 보유하는데, 이는 또한 iPSC 유래 조혈 계통 세포에 포함된다.
일부 실시형태에서, 유전자 변형된 양상은 안전한 스위치 단백질, 타깃화 양상, 수용체, 신호전달 분자, 전사 인자, 약제학적으로 활성인 단백질 및 펩타이드, 약물 타깃 후보; 또는 iPSC 또는 이의 유도체 세포의 생착, 수송, 귀소, 생존도, 자기-재생, 지속성, 면역 반응 조절 및 조정, 및/또는 생존을 촉진시키는 단백질 중 하나 이상을 포함한다. 일부 다른 실시형태에서, 유전자 변형된 양상은 (i) B2M, TAP1, TAP2, 타파신, NLRC5, PD1, LAG3, TIM3, RFXANK, CITTA, RFX5 또는 RFXAP 및 염색체 6p21 영역에서의 임의의 HLA 유전자의 결실 또는 감소된 발현; (ii) 이중- 또는 다중-특이적 또는 보편적 관여자와의 결합을 위한 HLA-E, HLA-G, HACD16, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, TCR 또는 표면 촉발 수용체의 도입된 또는 증가된 발현 중 하나 이상을 포함한다.
일부 또 다른 실시형태에서, 조혈 계통 세포는 (i) 항원 타깃화 수용체 발현; (ii) HLA 제시 또는 이의 결여; (iii) 종양 미세환경에 대한 내성; (iv) 방관자 면역 세포 및 면역 조정의 유도; (iv) 종양을 벗어난 효과가 감소된 개선된 타깃에 대한 특이성; (v) 화학요법과 같은 치료에 대한 내성; 및 (vi) 개선된 귀소, 지속성 및 세포독성 중 하나 이상에 관한 공급원 특이적 면역 세포의 치료적 속성을 포함한다.
일부 실시형태에서, iPSC 및 그의 유도체 조혈 세포는 B2M 널(null) 또는 그 이하, HLA-E/G, PDL1, A2AR, CD47, LAG3 널 또는 그 이하, TIM3 널 또는 그 이하, TAP1 널 또는 그 이하, TAP2 널 또는 그 이하, 타파신 널(Tapasin) 또는 그 이하, NLRC5 널 또는 그 이하, PD1 널 또는 그 이하, RFKANK 널 또는 그 이하, CITTA 널 또는 그 이하, RFX5 널 또는 그 이하 및 RFXAP 널 또는 그 이하 중 하나 이상을 포함한다. 변형된 HLA 클래스 I 및/또는 II를 갖는 이들 세포는 면역 검출에 대한 증가된 내성을 가지며, 따라서 개선된 생체내 지속성을 제공한다. 또한, 이러한 세포는 입양 세포 요법에서 HLA 매칭에 대한 필요를 회피할 수 있고, 따라서, 보편적, 기성품의 치료 요법의 공급원을 제공한다.
일부 실시형태에서, iPSC 및 그의 유도체 조혈 세포는 hnCD16(고친화도 비절단성 CD16), HLA-E, HLA-G, 41BBL, CD3, CD4, CD8, CD47, CD113, CD131, CD137, CD80, PDL1, A2AR, CAR, 또는 TCR 중 하나 이상을 포함한다. 이러한 세포는 개선된 이펙터 능력을 갖는다.
일부 실시형태에서, iPSC 및 이의 유도체 조혈 세포는 항원 특이적이다.
다양한 질환은 입양 세포 요법에 적합한 대상체에게 본 발명의 면역 세포를 도입함으로써 개선될 수 있다. 질환의 예는 원형 탈모증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 간염, 피부근육염, 당뇨병(1형), 일부 형태의 소아 특발성 관절염, 사구체신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 중증 근무력증, 일부 형태의 심근염, 다발성 경화증, 천포창/유사천포창, 악성빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발근육염, 원발성 담즙성 간병변, 건선, 류마티스 관절염, 피부경화증/전신 경화증, 쇼그렌 증후군, 전신성 홍반성 낭창, 일부 형태의 갑상선염, 일부 형태의 포도막염, 백반증, 다발혈관염 육아종증(베게너 육아종증)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 다양한 자가면역 장애; 급성 및 만성 백혈병, 림프종, 다발성 골수종 및 골수 이형성 증후군을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 혈액학적 악성 종양; 뇌, 전립선, 유방, 폐, 결장, 자궁, 피부, 간, 뼈, 췌장, 난소, 고환, 방광, 신장, 머리, 목, 위, 자궁경부, 직장, 후두 또는 식도의 종양을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 고형 종양; 및 HIV-(인간 면역결핍 바이러스), RSV-(호흡기 세포융합 바이러스), EBV-(엡스타인-바 바이러스), CMV-(거대세포바이러스), 아데노바이러스- 및 BK 폴리오마 바이러스-관련 장애를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 감염을 포함한다.
일부 실시형태에 따르면, 본 발명은 또한, 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에 의해 제조된 만능 세포 유래된 조혈 계통 세포를 포함하는 치료적 용도를 위한 조성물을 제공하며, 여기서, 약제 조성물은 약제학적으로 허용되는 배지를 더 포함한다. 일 실시형태에서, 치료적 용도를 위한 조성물은 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에 의해 제조된 만능 세포 유래 T 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 치료적 용도를 위한 조성물은 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에 의해 제조된 만능 세포 유래 NK 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 치료적 용도를 위한 조성물은 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에 의해 제조된 만능 세포 유래 CD34+ HE 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 치료적 용도를 위한 조성물은 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에 의해 제조된 만능 세포 유래 HSC를 포함한다. 일 실시형태에서, 치료적 용도를 위한 조성물은 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에 의해 제조된 만능 세포 유래 MDSC를 포함한다.
추가적으로, 본 발명은 입양 세포 요법에 적합한 대상체에게 조성물을 도입하는 것에 의한 상기 치료 조성물의 치료적 용도를 제공하되, 대상체는 자가면역 장애; 혈액 악성종양; 고형 종양; 또는 HIV, RSV, EBV, CMV, 아데노바이러스 또는 BK 폴리오마 바이러스와 관련된 감염을 갖는다.
단리된 만능 줄기세포 유래된 조혈 계통 세포는 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% T 세포, NK 세포, NKT 세포, proT 세포, proNK 세포, CD34+ HE 세포, HSC, B 세포, 골수성-유래 억제제 세포(MDSC), 조절 대식세포, 조절 수지상 세포 또는 중간엽 간질 세포를 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 단리된 만능 줄기세포 유래된 조혈 계통 세포는 약 95% 내지 약 100% T 세포, NK 세포, NKT 세포, proT 세포, proNK 세포, CD34+ HE 세포, HSC, B 세포, 골수성-유래 억제제 세포(MDSC), 조절 대식세포, 조절 수지상 세포 또는 중간엽 간질 세포를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 세포 치료법을 필요로 하는 대상체를 치료하기 위해 정제된 T 세포, NK 세포, NKT 세포, CD34+ HE 세포, proT 세포, proNK 세포, HSC, B 세포, 골수성-유래 억제제 세포(MDSC), 조절 대식세포, 조절 수지상 세포, 또는 중간엽 간질 세포를 갖는 치료 조성물, 예를 들어, 약 95% T 세포, NK 세포, NKT 세포, proT 세포, proNK 세포, CD34+ HE 세포, HSC, B 세포, 골수성-유래 억제제 세포(MDSC), 조절 대식세포, 조절 수지상 세포 또는 중간엽 간질 세포의 단리된 집단을 갖는 조성물을 제공한다.
본 명세서에 개시된 실시형태의 유래된 조혈 계통 세포를 사용한 치료는 증상 시에, 또는 재발 방지를 위해 수행될 수 있다. 용어 "치료하는," "치료" 등은 일반적으로 목적으로 하는 약학적 및/또는 생리적 효과를 얻는 것을 의미한다. 효과는 질환을 완전히 또는 부분적으로 방지한다는 면에서 예방적일 수 있고/있거나 질환 및/또는 질환에 기여하는 유해 효과에 대한 부분적 또는 완전한 치유의 면에서 치료적일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "치료"는 포유류에서 질환의 임의의 치료를 아우르며, 질환의 성향이 있을 수 있지만, 아직 그것이 있는 것으로 진단되지 않은 대상체에서 질환이 생기는 것을 방지하는 것; 질환을 저해하는 것, 즉, 그의 발생을 저지하는 것; 또는 질환을 없애는 것, 즉, 질환의 질환의 퇴행을 야기하는 것을 포함한다. 치료제 또는 조성물은 질환 또는 손상의 개시 전에, 동안에 또는 후에 투여될 수 있다. 진행 중인 질환의 치료는, 치료가 환자의 요망되지 않는 임상 증상을 안정화시키거나 감소시키는 경우에, 또한 특정 관심 대상이다. 특정 실시형태에서, 치료를 필요로 하는 대상체는 세포 치료법에 의해 적어도 하나의 관련된 증상을 치료, 완화 및/또는 개선시킬 수 있는 질환, 병태 및/또는 손상을 갖는다. 특정 실시형태는, 세포 치료법을 필요로 하는 대상체가 골수 또는 줄기세포 이식을 위한 후보, 화학요법 또는 방사선 조사 요법을 받은 대상체, 과증식성 장애 또는 암, 예를 들어, 조혈 시스템의 과증식성 장애 또는 암을 갖거나 가질 위험이 있는 대상체, 종양, 예를 들어, 고형 종양을 갖거나 발병할 위험이 있는 대상체, 바이러스 감염 또는 바이러스 감염과 관련된 질환을 갖거나 가질 위험이 있는 대상체를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다는 것을 고려한다.
개시된 바와 같은 유래된 조혈 계통 세포를 포함하는 치료 조성물은 치료 전, 동안, 및/또는 후에 대상체에 투여될 수 있다. 이와 같이, 병용 치료법의 방법은 추가의 치료제의 사용 전, 동안, 및/또는 후에 iPSC 유래 면역 세포의 투여 또는 제조를 포함할 수 있다. 상기에 제공된 바와 같이, 하나 이상의 추가의 치료제는 펩타이드, 사이토카인, 미토겐, 성장 인자, 작은 RNA, dsRNA(이중 가닥 RNA), 단핵 혈액 세포, 피더 세포, 피더 세포 성분 또는 이의 대체 인자, 고려되는 하나 이상의 폴리핵산을 포함하는 벡터, 항체, 화학치료제, 또는 방사성 모이어티, 또는 면역조절 약물(IMiD)을 포함한다. iPSC 유래 면역 세포의 투여는 추가적인 치료 투여로부터 수 시간, 수 일 또는 심지어 수 주 시간적으로 분리될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 투여는 항신생물제, 비-약물 치료법, 예를 들어, 수술과 같은, 그러나 비제한적으로, 다른 생물학적 활성자 또는 양상과 병용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 추가의 치료제는 항체, 또는 항체 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항체는 모노클론 항체이다. 일부 실시형태에서, 항체는 인간화된 항체, 인간화된 모노클론 항체, 또는 키메라 항체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항체, 또는 항체 단편은 바이러스 항원에 특이적으로 결합한다. 다른 실시형태에서, 항체, 또는 항체 단편은 종양 또는 항원에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 종양 또는 바이러스 특이적 항원은 이의 사멸 능력을 향상시키기 위해 투여된 iPSC 유래 조혈 계통 세포를 활성화시킨다. 일부 실시형태에서, 투여된 iPSC 유래 조혈 계통 세포에 추가의 치료제로서 병용 치료에 적합한 항체는 항-CD20(레툭시맙, 벨투주맙, 오파투무맙, 우블리툭시맙, 오카라투주맙, 오비누투주맙), 항-Her2(트라스투주맙), 항-CD52(알렘투주맙), 항-EGFR(세르툭시맙), 및 항-CD38(다라투무맙, 이사툭시맙, MOR202), 및 이의 인간화된 및 Fc 변형된 변이체를 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 추가의 치료제는 하나 이상의 화학치료제 또는 방사성 모이어티를 포함한다. 화학치료제는 세포독성 항신생물제, 즉, 우선적으로 신생 세포를 사멸시키거나 빠르게 증식하는 세포의 세포 주기를 파괴하거나 줄기 암 세포를 퇴치하고, 신생 세포의 성장을 예방하거나 감소시키기 위해 치료학적으로 사용되는 화학제를 지칭한다. 화학치료제는 또한, 때때로 항신생 또는 세포독성 약물 또는 제제로서 지칭되고, 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
일부 실시형태에서, 화학치료제는 안트라사이클린, 알킬화제, 알킬 설포네이트, 아지리딘, 에틸렌이민, 메틸렌아민, 질소 머스터드, 나이트로소유레아, 항생제, 항대사물질, 엽산 유사체, 퓨린 유사체, 피리미딘 유사체, 효소, 포도필로톡신, 백금-함유제, 인터페론 및 인터류킨을 포함한다. 예시적인 화학치료제는 알킬화제(사이클로포스포아마이드, 메클로르에타민, 메팔린, 클로람부실, 헤아메틸멜라민, 티오테파, 부설판, 카무스틴, 로무스틴, 세무스틴), 항대사물질(메토트렉세이트, 플루오로유라실, 플록수리딘, 사이타라빈, 6-머캅토퓨린, 티오구아닌, 펜토스타틴), 빈카 알칼로이드(빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신), 에피도필로톡신(에토포사이드, 에토포사이드 오쏘퀴논, 및 테니포사이드), 항생제(다우노루비신, 독소루비신, 미톡산트론, 비산트렌, 악티노마이신 D, 플리카마이신, 퓨로마이신 및 그라미시딘 D), 파클리탁셀, 콜히친, 사이토칼라신 B, 에메틴, 메이탄신 및 암사크린을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 추가적인 제제는 아민글루테티미드, 시스플라틴, 카보플라틴, 미토마이신, 알트레타민, 사이클로포스포아마이드, 로무스틴(CCNU), 카무스틴(BCNU), 이리노테칸(CPT-11), 알렘투자맙, 알트레타민, 아나스트로졸, L-아스파라기나제, 아자시티딘, 베바시주맙, 벡사로텐, 블레오마이신, 보르테조밉, 부설판, 칼루스테론, 카페시타빈, 셀레콕십, 세툭시맙, 클라드리빈, 클로푸라빈, 사이타라빈, 다카르바진, 데니류킨 디프티톡스, 다이에틀스틸베스트롤, 도세탁셀, 드로모스타놀론, 에피루비신, 에를로티닙, 에스트라무스틴, 에토포사이드, 에티닐 에스트라다이올, 엑셈스탄, 플록수리딘, 5-플루오로유라실, 플루다라빈, 플루타마이드, 풀베스트란트, 게피티닙, 겜시타빈, 고세렐린, 하이드록시유레아, 이브리투모맙, 이다루비신, 이포스파마이드, 이마티닙, 인터페론 알파(2a, 2b), 이리노테칸, 레트로졸, 류코보린, 류플로라이드, 레바미졸, 메클로르에타민, 메게스트롤, 멜팔린, 머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 메톡스살렌, 미토마이신 C, 미토탄, 미톡산트론, 난드롤론, 노페투모맙, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파미드로네이트, 페메트렉세드, 페가데마제, 페가스파라가제, 펜토스타틴, 피포브로만, 플리카마이신, 폴리페프로산, 포르피머, 프로카바진, 퀴나크린, 리툭시맙, 사르그라모스팀, 스트렙토조신, 타목시펜, 테모졸로마이드, 테니포사이드, 테스톨락톤, 티오구아닌, 티오테파, 토페테칸, 토레미펜, 토시투모맙, 트라스투주맙, 트레티노인, 유라실 머스터드, 발루비신, 비노렐빈, 및 졸레드로네이트를 포함한다. 다른 적합한 제제는 화학치료제 또는 방사선치료제로서 인간 용도로 승인된 것(승인될 것을 포함) 및 당업계에 공지된 것이다. 이러한 제제는 다수의 표준 의사 및 종양학자 문헌을 통해(예를 들어 문헌[Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition, McGraw-Hill, N.Y., 1995]) 또는 국립 암 연구소 웹사이트(fda.gov/cder/cancer/druglistfrarne.htm)를 통해(둘 다 시간에 따라 업데이트됨) 언급될 수 있다.
염증조절 약물(IMiD), 예를 들어, 탈리도마이드, 레날리도마이드 및 포말리도마이드는 NK 세포와 T 세포를 둘 다 자극한다. 본 명세서에서 제공되는 바와 같은, IMiD는 암 치료를 위해 조정된 치료적 면역 세포를 이용하여 사용될 수 있다.
당업자는, 본 명세서의 방법 및 조성물을 기초로 하여 iPSC로부터 유래된 자가 및 동종이계 조혈 계통 세포 둘 모두가 전술한 바와 같은 세포 치료법에서 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 자가 이식에 대하여, 유래된 조혈 계통 세포의 단리된 집단은 환자와 완전 또는 부분 HLA-매칭된다. 다른 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포는 대상체와 HLA-매칭되지 않는다.
일부 실시형태에서, 치료 조성물에서 유래된 조혈 계통 세포의 수는 용량당 적어도 0.1×105개의 세포, 적어도 1×105개의 세포, 적어도 5×105개의 세포, 적어도 1×106개의 세포, 적어도 5×106개의 세포, 적어도 1×107개의 세포, 적어도 5×107개의 세포, 적어도 1×108개의 세포, 적어도 5×108개의 세포, 적어도 1×109개의 세포, 또는 적어도 5×109개의 세포이다. 일부 실시형태에서, 치료 조성물에서 유래된 조혈 계통 세포의 수는 용량당 약 0.1×105개의 세포 내지 약 1×106개의 세포; 용량당 약 0.5×106개의 세포 내지 약 1× 107개의 세포; 용량당 약 0.5×107개의 세포 내지 약 1×108개의 세포; 용량당 약 0.5×108개의 세포 내지 약 1×109개의 세포; 용량당 약 1×109개의 세포 내지 약 5×109개의 세포; 용량당 약 0.5×109개의 세포 내지 약 8×109개의 세포; 용량당 약 3×109개의 세포 내지 약 3×1010개의 세포, 또는 이들 사이의 임의의 범위이다. 일반적으로, 1×108개의 세포/용량은 60 kg 환자에 대해 1.67×106개의 세포/kg으로 변환된다.
일 실시형태에서, 치료 조성물에서 유래된 조혈 계통 세포의 수는 부분 또는 단일 코드의 혈액에서 면역 세포의 수이거나, 적어도 0.1×105개의 세포/kg 체중, 적어도 0.5×105개의 세포/kg 체중, 적어도 1×105개의 세포/kg 체중, 적어도 5×105개의 세포/kg 체중, 적어도 10×105개의 세포/kg 체중, 적어도 0.75×106개의 세포/kg 체중, 적어도 1.25×106개의 세포/kg 체중, 적어도 1.5×106개의 세포/kg 체중, 적어도 1.75×106개의 세포/kg 체중, 적어도 2×106개의 세포/kg 체중, 적어도 2.5×106개의 세포/kg 체중, 적어도 3×106개의 세포/kg 체중, 적어도 4×106개의 세포/kg 체중, 적어도 5×106개의 세포/kg 체중, 적어도 10×106개의 세포/kg 체중, 적어도 15×106개의 세포/kg 체중, 적어도 20×106개의 세포/kg 체중, 적어도 25×106개의 세포/kg 체중, 적어도 30×106개의 세포/kg 체중, 1×108개의 세포/kg 체중, 5×108개의 세포/kg 체중, 또는 1×109 세포/kg 체중이다.
일 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포의 용량은 대상체로 전달된다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 대상체에 제공되는 세포의 유효량은 적어도 2×106개의 세포/kg, 적어도 3×106개의 세포/kg, 적어도 4×106개의 세포/kg, 적어도 5×106개의 세포/kg, 적어도 6×106개의 세포/kg, 적어도 7×106개의 세포/kg, 적어도 8×106개의 세포/kg, 적어도 9×106개의 세포/kg, 또는 적어도 10×106개의 세포/kg, 또는 그 이상의 세포/kg이고, 모든 개재 용량의 세포를 포함한다.
다른 예시적인 실시형태에서, 대상체에 제공되는 세포의 유효량은 약 2×106개의 세포/kg, 약 3×106개의 세포/kg, 약 4×106개의 세포/kg, 약 5×106개의 세포/kg, 약 6×106개의 세포/kg, 약 7×106개의 세포/kg, 약 8×106개의 세포/kg, 약 9×106개의 세포/kg, 또는 약 10×106개의 세포/kg, 또는 그 이상의 세포/kg이고, 모든 개재 용량의 세포를 포함한다.
다른 예시적인 실시형태에서, 대상체에 제공되는 세포의 유효량은 약 2×106개의 세포/kg 내지 약 10×106개의 세포/kg, 약 3×106개의 세포/kg 내지 약 10×106개의 세포/kg, 약 4×106개의 세포/kg 내지 약 10×106개의 세포/kg, 약 5×106개의 세포/kg 내지 약 10×106개의 세포/kg, 2×106개의 세포/kg 내지 약 6×106개의 세포/kg, 2×106개의 세포/kg 내지 약 7×106개의 세포/kg, 2×106개의 세포/kg 내지 약 8×106개의 세포/kg, 3×106개의 세포/kg 내지 약 6×106개의 세포/kg, 3×106개의 세포/kg 내지 약 7×106개의 세포/kg, 3×106개의 세포/kg 내지 약 8×106개의 세포/kg, 4×106개의 세포/kg 내지 약 6×106개의 세포/kg, 4×106개의 세포/kg 내지 약 7×106개의 세포/kg, 4×106개의 세포/kg 내지 약 8×106개의 세포/kg, 5×106개의 세포/kg 내지 약 6×106개의 세포/kg, 5×106개의 세포/kg 내지 약 7×106개의 세포/kg, 5×106개의 세포/kg 내지 약 8×106개의 세포/kg, 또는 6×106세포/kg 내지 약 8×106개의 세포/kg이며, 모든 개재 용량의 세포를 포함한다.
투여량의 일부 변화는 반드시 치료되는 대상체의 상태에 따라 일어날 것이다. 투여에 책임이 있는 사람은 임의의 사건에서, 개개 대상체에 대해 적절한 용량을 결정할 것이다.
일부 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포의 치료적 용도는 단일-용량 치료이다. 일부 실시형태에서, 유래된 조혈 계통 세포의 치료적 용도는 다중-용량 치료이다. 일부 실시형태에서, 다중-용량 치료는 매일, 3일마다, 7일마다, 10일마다, 15일마다, 20일마다, 25일마다, 30일마다, 35일마다, 40일마다, 45일마다, 또는 50일마다, 또는 이들 사이의 임의의 일수마다 1회 용량이다.
본 발명의 유래된 조혈 계통 세포의 집단을 포함하는 조성물은 멸균성일 수 있고, 인간 환자에게 투여하기에 적합하고 준비될 수 있다(즉, 임의의 추가 가공 없이 투여될 수 있다). 투여를 위해 준비된 세포 기반 조성물은, 조성물이 대상체에 이식 또는 투여 전에 임의의 추가 처리 또는 조작을 필요로 하지 않음을 의미한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 제제와 함께 투여하기 전에 확장되고/되거나 조절되는 유래된 조혈 계통 세포의 단리된 집단을 제공한다. 재조합 TCR 또는 CAR을 발현시키기 위해 유전적으로 조작된 유래된 조혈 계통 세포에 대하여, 세포는 예를 들어, 미국 특허 제6,352,694호에 기술된 바와 같은 방법을 이용하여 활성화되고 확장될 수 있다.
특정 실시형태에서, 유래된 유전자 조작된 조혈 계통 세포에 대한 1차 자극 신호 및 공자극 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 각각의 신호를 제공하는 제제는 용액 중에 있을 수 있거나 또는 표면에 결합될 수 있다. 표면에 결합될 때, 제제는 동일한 표면(즉, "시스" 형성)에 또는 별개의 표면(즉, "트랜스" 형성)에 결합될 수 있다. 대안적으로, 하나의 제제는 표면에 결합될 수 있고, 다른 제제는 용액 중에 있다. 일 실시형태에서, 공자극 신호를 제공하는 신호는 세포 표면에 결합될 수 있고, 1차 활성화 신호를 제공하는 제제는 용액 중에 있거나 또는 표면에 결합된다. 특정 실시형태에서, 제제는 둘 다 용액 중에 있을 수 있다. 다른 실시형태에서, 제제는 가용성 형태일 수 있고, 이어서, 세포 발현 Fc 수용체 또는 본 발명에서 T 림프구를 활성화 및 확장시킴에 있어서 사용하기 위해 상정되는 인공 항원 제시 세포(aAPC)에 대해 미국 특허 출원 공개 제20040101519호 및 제20060034810호에 개시된 것과 같은 제제에 결합하는 다른 결합제와 같이 표면에 가교된다.
환자에 투여하기에 적합한 치료 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체(첨가제) 및/또는 희석제(예를 들어, 약제학적으로 허용되는 배지, 예를 들어, 세포 배양 배지), 또는 다른 약제학적으로 허용되는 성분들을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제는 부분적으로, 투여되는 특정 조성물뿐만 아니라, 치료 조성물을 투여하기 위해 이용되는 특정 방법에 의해 결정된다. 이에 따라, 본 발명의 치료 조성물의 매우 다양한 적합한 제형이 존재한다[예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985] 참조, 이러한 문헌의 개시내용은 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨.
특정 실시형태에서, iPSC 유래 조혈 계통 세포의 단리된 집단을 갖는 치료 세포 조성물은 또한 약제학적으로 허용되는 세포 배양 배지, 또는 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 갖는다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 iPSC 유래 조혈 계통 세포의 집단을 포함하는 치료 조성물은 정맥내, 복강내, 장관, 또는 기관 투여 방법에 의해 별도로, 또는 요망되는 치료 목적을 달성하기 위한 다른 적합한 화합물과 조합하여 투여될 수 있다.
이러한 약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제는 치료 조성물의 pH를 약 3 내지 약 10으로 유지하는데 충분한 양으로 존재할 수 있다. 이렇게 해서, 완충제는 총 조성물을 기준으로 중량에 따라 약 5%만큼일 수 있다. 전해질, 예를 들어, 그러나 비제한적으로, 염화나트륨 및 염화칼륨은 또한 치료 조성물 중에 포함될 수 있다. 일 양태에서, 치료 조성물의 pH는 약 4 내지 약 10의 범위이다. 대안적으로, 치료 조성물의 pH는 약 5 내지 약 9, 약 6 내지 약 9, 또는 약 6.5 내지 약 8의 범위이다. 다른 실시형태에서, 치료 조성물은 상기 pH 범위 중 하나의 pH를 갖는 완충제를 포함한다. 다른 실시형태에서, 치료 조성물은 pH가 약 7이다. 대안적으로, 치료 조성물은 pH 범위가 약 6.8 내지 약 7.4이다. 또 다른 실시형태에서, 치료 조성물은 pH가 약 7.4이다.
본 발명은 또한, 부분적으로, 본 발명의 특정 조성물 및/또는 배양물에서의 약제학적으로 허용되는 세포 배양 배지의 용도를 제공한다. 이러한 조성물은 인간 대상체에 투여하기에 적합하다. 일반적으로 말하면, 본 발명의 실시형태에 따른 iPSC 유래 면역 세포의 유지, 성장, 및/또는 건강을 지지하는 임의의 배지는 약제학적 세포 배양 배지로서 사용하기에 적합하다. 특정 실시형태에서, 약제학적으로 허용되는 세포 배양 배지는 무혈청 및/또는 무-피더 배지이다. 다양한 실시형태에서, 무-혈청 배지는 무 동물이고, 선택적으로, 무 단백질일 수 있다. 선택적으로, 배지는 생약제학적으로 허용되는 재조합 단백질을 함유할 수 있다. 무 동물 배지는 성분들이 비-동물 소소로부터 유도된 배지를 지칭한다. 재조합 단백질은 무 동물 배지에서 천연 동물 단백질을 대체하며, 영양소는 합성, 식물 또는 미생물 소스로부터 얻어진다. 대조적으로, 무 단백질 배지는 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 것으로서 규정된다. 당업자는, 상기 배지의 예가 예시적이고 어떠한 방식으로도 본 발명에서 사용하기에 적합한 배지의 제형을 제한하지 않는다는 것을 인식할 것이다.
서열목록
서열번호 1
길이: 641
타입: PRT
유기체: 인간 헤르페스바이러스 4
MSDEGPGTGPGNGLGEKGDTSGPEGSGGSGPQRRGGDNHGRGRGRGRGRGGGRPGAPGGSGSGPRHRDGVRRPQKRPSCIGCKGTHGGTGAGAGAGGAGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGAGGGAGGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGAGGGAGGAGGAGAGGGAGAGGAGGAGGAGAGGAGAGGGAGGAGGAGAGGAGAGGAGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGGAGGAGAGGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGGAGAGGAGAGGGGRGRGGSGGRGRGGSGGRGRGGSGGRRGRGRERARGGSRERARGRGRGRGEKRPRSPSSQSSSSGSPPRRPPPGRRPFFHPVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVFVYGGSKTSLYNLRRGTALAIPQCRLTPLSRLPFGMAPGPGPQPGPLRESIVCYFMVFLQTHIFAEVLKDAIKDLVMTKPAPTCNIRVTVCSFDDGVDLPPWFPPMVEGAAAEGDDGDDGDEGGDGDEGEEGQE
서열번호 2
길이: 422
타입: PRT
유기체: 인간 헤르페스바이러스 4
MSDEGPGTGPGNGLGEKGDTSGPEGSGGSGPQRRGGDNHGRGRGRGRGRGGGRPGAPGGSGSGPRHRDGVRRPQKRPSCIGCKGTHGGTGAGAGAGGAGAGGAGAGGGGRGRGGSGGRGRGGSGGRGRGGSGGRRGRGRERARGGSRERARGRGRGRGEKRPRSPSSQSSSSGSPPRRPPPGRRPFFHPVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVFVYGGSKTSLYNLRRGTALAIPQCRLTPLSRLPFGMAPGPGPQPGPLRESIVCYFMVFLQTHIFAEVLKDAIKDLVMTKPAPTCNIRVTVCSFDDGVDLPPWFPPMVEGAAAEGDDGDDGDEGGDGDEGEEGQE
실시예
하기 실시예는 예시의 방법에 의해, 그리고 제한적이지 않은 방법에 의해 제공된다.
실시예 1 - 물질 및 방법
단일 세포 해리. 모든 재프로그래밍 배양물을 트랜스펙션 후 14일에 FMM으로 교체하였다. FMM으로 교체한 직후에, 모든 재프로그래밍 배양물을 Accutase에서 유지시키고 해리시켰다. 이후에, 단일 세포를 마트리겔 또는 비트로넥틴 코팅된 표면 상에서 계대배양하였다. 이후에, 단일 세포 해리된 세포를 유세포 분류 분석까지 FMM에서 확장시키고, 유지시켰다.
유세포 분석 및 분류. 단일 세포 해리된 재프로그래밍 풀을 냉각된 염색 완충제에 재현탁시켰다. SSEA4-FITC, TRA181-Alexa Fluor-647 및 CD30-PE(BD Biosciences)를 포함하는 컨주게이션된 1차 항체를 세포 용액에 첨가하고, 15분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 모든 항체를 1백만개의 세포당 100㎕ 염색 완충제 중 7 내지 10㎕로 사용하였다. 염색 완충제 중 재현탁된 해리된 단일 세포를 스핀 다운시키고, ROCK 억제제를 함유한 염색 완충제 중에 재현탁시키고, 유세포 분류 분석을 위해 얼음 상에 유지시켰다. 유세포 분류 분석을 결과 섹션에 기술된 게이팅 전략을 이용하여 FACS Aria II(BD Biosciences) 상에서 수행하였다. 분류된 세포를 웰당 3 및 9 이벤트의 농도로 96-웰 플레이트에 직접 방출시켰다. 각 웰을 FMM으로 사전충전하였다. 분류의 완료 시에, 96-웰 플레이트를 콜로니 형성 및 확장을 위해 인큐베이션하였다. 분류 후 7 내지 10일 후에, 세포를 계대배양하였다. FMM에서의 후속 계대배양은 대략 75 내지 90% 컨플루언시로 수행되었다. 유세포 분석을 Guava EasyCyte 8 HT(Millipore) 상에서 수행하고, FCS Express 4(De Novo Software)를 이용하여 분석하였다.
이식 유전자 존재 시험. 게놈 DNA를 QIAamp® DNA 미니 키트 및 프로테아나제 K 소화(Qiagen)를 이용하여 단리시켰다. 100 ng의 게놈 DNA를 Taq PCR 마스터 믹스 키트(Qiagen)를 이용하여 재프로그래밍 인자 및 EBNA1을 포함하는 이식 유전자에 대해 특이적인 프라이머 세트를 사용하여 증폭시켰다. PCR 반응을 하기와 같이 35회 사이클 동안 수행하였다: 30초 동안 94℃(변성), 30초 동안 60 내지 64℃(어닐링) 및 1분 동안 72℃(확장). 렌티바이러스 방법을 이용하여 생성된 hiPSC 및 섬유아세포로부터의 게놈 DNA를 음성 대조군으로서 사용하였다. 에피솜 작제물의 DNA를 양성 대조군으로서 사용하였다.
알칼리 포스파타제 염색. 세포를 4% v/v 파라포름알데하이드(Alfa Aesar)에서 고정시키고, PBS로 3회 세척하고, 알칼리 포스파타제 키트(Millipore)로 염색하였다. 간단하게, 2부의 Fast Red Violet, 1부의 Naphtol AS-BI Phosphaste 및 1부의 물을 혼합하고, 고정된 세포에 첨가하고, 25℃에서 15분 동안 인큐베이션한 후에 PBS로 세척하였다.
핵형 분석. 세포유전학적 분석을 WiCell Research Institute(위스콘신주 매디슨 소재)에 의해 G-밴드 중기 세포에 대해 수행하였다. 각 핵형 분석은 최소 20 스프레드(spread) 계수치를 포함하며, 분석은 비클론 수차가 최초 20에서 식별될 때 40 스프레드 계수치로 확장하였다.
기형종 형성. 200㎕ 용액(100㎕ FMM 및 100㎕ 마트리겔)당 0.5 내지 3백만개의 세포의 농도의 단일 세포 해리된 hiPSC를 NOD/SCID/γ눌 마우스 내에 피하 주사하였다. 5 내지 6주(3백만개 세포 주사) 및 7 내지 8주(5십만개의 세포 주사) 후에, 기형종을 수확하고, 고정시키고, 처리를 위해 유지시켰다. 샘플을 섹션화, 염색 및 검사를 위해 UCSD Histology Core Facility에 제공하였다.
통계학적 분석. 적어도 3회의 독립적 실험을 수행하였다. 값은 평균 + SEM으로서 보고된다. 통계학적 분석을 ANOVA로 수행하였으며, p < 0.05가 유의미한 것으로 고려된다.
배양 배지. 통상적인 hESC 배양물은 20% 넉아웃 혈청 보충물, 0.1mM(또는 1% v/v) 비-필수 아미노산, 1 내지 2mM L-글루타민, 0.1mM ß-머캅토에탄올 및 10 내지 100 ng/㎖ bFGF가 보충된 DMEM/F12 배양 배지를 함유한다. 비교하여, 다단계 배양 배지는 ROCK 억제제; 및 GSK3 억제제, MEK 억제제 및 TGFβ 억제제 중 하나 이상을 추가적으로 포함한다. 이러한 단계-특이적 배양 플랫폼은, 또한, 무-피더 재프로그래밍 및 유지를 지지한다.
특정 적용에서, 통상적인 배양물을 위한 구성성분 이외에, 재프로그래밍 배지(FRM)는 SMC4: ROCK 억제제, GSK3 억제제, MEK 억제제 및 TGFβ 억제제의 조합물을 함유하며, 유지 배지(FMM)는 SMC3: ROCK 억제제, GSK3 억제제 및 MEK 억제제의 조합물을 함유한다.
실시예 2 - 일시적 및 시간적 재프로그래밍 시스템을 이용한 재프로그래밍
플라스미드 및 에피솜 벡터 둘 모두는 비-통합 염색체외 DNA이다. 표준 플라스미드는 단지 프로모터 및 발현되는 폴리뉴클레오타이드(들)를 함유하고, 자율적으로 또는 숙주 세포 염색체와 함께 복제할 수 없다. 이에 따라, 플라스미드에 의해 매개된 이식 유전자 발현은 연속적이거나 안정적이지 않고 일시적(세포질)이고 시간적(단기간)이고, 트랜스펙션 효능, 카피 수 및 플라스미드의 손실률에 영향을 받을 수 있는 생존한 입력 벡터 DNA에 의해 지시된다. 플라스미드 벡터의 반복된 일일 트랜스펙션에 의해서만 재프로그래밍이 허용되지 않게 낮은 효능으로 달성되었다는 것이 나타났다[Okita et al., Science (2008); 322:949-953].
플라스미드 벡터와 비교하여, 에피솜 벡터는 자율적으로 세포질에 또는 염색체의 일부로서 존재하고 복제할 수 있다. 이에 따라, 에피솜 벡터에 의해 매개된 이식 유전자 발현은 벡터의 복제로 인해 연속적이고 안정적이다. 예를 들어, 고려되는 이식 유전자(들) 이외에, EBV-기반 에피솜 벡터는 엡스타인-바 핵 항원-1(EBNA1) 단백질 및 EBV로부터 유래된 복제 기점(oriP) 둘 모두를 암호화하며, 이는 분열하는 세포의 핵에서 에피솜 벡터를 복제하고 유지하기 위해 공동으로 작용한다. 에피솜 벡터에서 발현된 EBNA는 oriP를 결합시키고 숙주 세포 염색체 복제와 함께 oriP가 벡터 DNA의 복제를 개시할 수 있게 하기 위해 세포 DNA 복제 복합물 성분을 모집한다. 이후에, EBNA-1은 S 단계 동안에 생성된 딸 에피솜을 oriP를 통해 숙주 딸 염색제에 테더링하여, 에피솜의 핵 보유를 유지하고, 이에 따라, 연속 이식 유전자(들) 및 EBNA 발현을 유지한다[Gil et al., Gene Ther 2010 17(10):1288-1293]. EBNA-매개 에피솜 테더링은 유사분열 동안 에피솜의 각 딸 에피솜으로의 분리를 부여하여, 세포당 일정한 수의 에피솜을 보장한다[Gil et al., 2010]. oriP 및 EBNA-1 발현 카세트 둘 모두를 함유한 에피솜 플라스미드는 선택 없이 세포 주기당 약 95% 에피솜 보유로 배양된 인간 세포를 복제하는데 지속할 수 있다[Gil et al., 2010]. EBV-기반 에피솜 벡터는 적어도 12일 동안 외인성 재프로그래밍 인자의 연속 발현을 제공한다[자기-유지 만능성 상태를 확립하기 위해 요구되는 시간[문헌[Okita et al., Science (2008); 322:949-953] 참조]; 또는 미국 특허 제8,5546,140호에는 적어도 8일 내지 적어도 30일이 기술됨].
본 출원의 일시적 및 시간적 재프로그래밍 시스템을 이용하여 재프로그래밍을 수행하기 위하여, 수 개의 벡터는 표 1 및 도 1에 나타낸 바와 같이 작제화되었다. 벡터 1(V1)은 선택된 재프로그래밍 인자(들)(RF) 및 oriP의 발현을 유도하는 프로모터를 함유한 플라스미드 벡터이다. 벡터 1은 EBNA 암호화 서열을 가지지 않고, 결과적으로, 숙주 세포에서 짧아진 체류 시간을 갖는다. 벡터 1은 또한, oriP/RF 플라스미드로서 지칭된다. 벡터 1이 하나 초과의 재프로그래밍 인자를 암호화하는 경우에, 인자는 자가-절단 2A 펩타이드, IRES에 의해 분리될 수 있다. 다수의 V1은 다수의 재프로그래밍 인자의 상이한 조합이 요망되는 경우인 공동-트랜스펙션을 위해 사용될 수 있으며, 재프로그래밍 인자의 화학량론은 V1과 조합하여 각 재프로그래밍 인자의 상대적 카피 수를 조절함으로써 사전결정될 수 있다. 벡터 2(V2)는 프로모터 및 발현이 프로모터에 의해 유도되는 EBNA 암호화 서열을 함유한 플라스미드이다. 더욱 중요하게, V2는 트랜스펙션된 숙주 세포 집단에서 유의미하게 감소된 V2 체류 시간을 야기시키는 oriP가 결여되어 있다. 벡터 2는 또한, EBNA 플라스미드로 불리워진다. V2는 또한, EBNA mRNA 또는 단백질/펩타이드로 대체될 수 있다. mRNA 매개 재프로그래밍을 위한 방법 및 물질은 예를 들어, 문헌[Warren et al. (Cell Stem Cell (2010):7, 618-630)]에 기술되어 있으며, 재조합 단백질 매개 재프로그래밍을 위해, 예를 들어, 문헌[Zhou et al. (Cell Stem Cell (2009):4, 381-384)]에 기술되어 있으며, 이러한 문헌 모두는 본 명세서에 참고로 포함된다. 벡터 3(V3)은 oriP 및 EBNA 둘 모두를 발현시키는 벡터이지만, 임의의 재프로그래밍 인자 암호화 서열을 갖지 않는다. 이러한 벡터가 재프로그래밍을 지지하는 지의 여부를 시험하기 위해, V1, V2 및 V3을 단독으로 또는 상이한 조합물로 인간 섬유아세포에 형질도입하였다(표 2 참조).
Figure pct00002
EBNA의 장기간 발현, 지속적인 이식 유전자 보유 및 효과적인 재프로그래밍을 유도하기 위해 먼저 V1, V2 및 V3(EmTTR, EBNA-매개 일시적 및 시간적 재프로그래밍 시스템)의 조합물을 시험하였다. 이러한 조합물에서 사용되는 재프로그래밍 인자는 OCT4, NANOG 및 SOX2(V1A 및 V1B)를 포함하였다. 트랜스펙션 후 15일(D15) 후에, 재프로그래밍 풀을 만능성 상태를 지시하는, SSEA4 및 TRA181 둘 모두를 발현시키는 세포에 대해 유세포 분석에 의해 분류하였다. 이러한 만능성 마커에서 세포의 현저한 21.4%는 이중 양성이다(도 2), 트랜스펙션 후 30일(D30) 후에, 재프로그래밍 풀을 iPSC 만능성 마커 TRA181, SSEA4 및 CD30(NANOG에 대한 대용 마커)에 대해 염색하였다(도 3). OCT4 및 NANOG에 대한 면역형광 염색은 성공적인 재프로그래밍을 지시하는 iPSC 만능성 마커를 발현시키는 콜로니의 출현을 확인한다.
V3이 트랜스에서(in trans) EmTTR 시스템에서 이식 유전자 발현의 과-생리학적 양을 생성시켜 재프로그래밍을 유도하는데 내인성 만능성 인자로 시기 적절하게 전환시키기보다 오히려 이식 유전자 발현에 과잉 의존적인 세포를 생성시킬 가능성을 제거하기 위해, 본 발명자는 조성물로부터 V3을 제거하였고, STTR(수명이 짧은 일시적 및 시간적 재프로그래밍)로서 명명되는 단지 V1(V1A+V1B) 및 V2만으로 섬유아세포를 트랜스펙션시켰다. 놀랍게도, V1 및 V2 조합물은 재프로그래밍을 초래하고, V1 및 V2의 반복된 트랜스펙션을 필요로 하지 않고 보통의 효능을 갖는다. 트랜스펙션 후 D15에서 2.35% SSEA/TRA181 이중 양성 세포가 존재하였다(도 4). 트랜스펙션 후 27일 후에, 재프로그래밍 풀을 iPSC 만능성 마커 TRA181, SSEA4 및 CD30에 대해 염색하였다. 면역형광 염색은 STTR 시스템(단지 V1 및 V2)을 이용하여 성공적인 재프로그래밍을 지시하는, iPSC 만능성 마커를 발현시키는 콜로니의 출현을 확인한다(도 5).
이는 전혀 예상치 못한 결과였다. 수명이 짧은 이식 유전자 발현이 기간 또는 타이밍에서 충분치 않은 것으로 추정되었기 때문에, STTR 시스템이 재프로그래밍을 지지하지 않을 것이라는 것이 인식되었다.
Figure pct00003
또한, EmTTR 시스템에 의한 초기 재프로그래밍이 이중 양성 세포의 백분율을 기초로 하여 STTR 재프로그래밍과 비교하여 훨씬 더 효율적인 것으로 나타나지만, STTR은 자기-유지 만능성을 갖고 장기간 동안 유지될 수 있는 갖는 iPSC를 생성시키기 위한 세포 재프로그래밍을 잘 지지한다. EmTTR 및 STTR 시스템을 이용하여 재프로그래밍하기 위해 유도된 섬유아세포 세포를 각각 25일 동안 유지시키고, 만능성 마커 SSEA4, TRA181 및 CD30의 발현에 대해 평가하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, D25에서 STTR로부터 유도된 대부분의 집단이 만능성의 모두 3가지 마커의 발현을 유지시켰지만, D25에 EmTTR 유도된 집단은 CD30 발현의 주요 감소에 의해 명시되는 바와 같이 만능성을 손실시키는 것으로 나타나는데, 이는 비-지속 가능한 또는 불안정한 만능성 상태와 관련된 복귀를 지시하는 것이다. 두 집단 모두를 이후에, 계대배양하였으며, 배양물에서 iPSC 콜로니 및 분화된 클러스터의 모폴로지를 후속하여 관찰하고 D28에 비교하였다(도 7A). SSEA4, TRA181 및 CD30의 공동발현을 유지하는 것으로 초기에 주지되었지만, STTR 집단은 주로 최소 자연 분화를 갖는 iPSC 콜로니로서 유지되었으며, EmTTR 집단은 높은 자연 분화 수준을 나타내었다(도 7B).
STTR 시스템의 일시적 및 시간적 특성을 분석하기 위하여, 본 발명자는 정량적 RT-PCR을 이용하여 트랜스펙션 후 세포 집단에서 EBNA 발현을 분석하였다. 또한, 세포 집단에서 만능성 상태의 출현을 나타내는 내인성 OCT4 발현을 모니터링하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, EBNA 발현은 트랜스펙션 후에 나타났고, D2에서 가장 높은 포인트에 도달하였고, 이후에, D4에 의해 1% 미만까지 급격하게 감소하여, 세포 분열당 90% 이상 V2 플라스미드의 손실률을 반영한다(EBV-기반 에피솜 벡터의 약 5% 손실률과 비교함). 통상적인 검정은 실험의 개시 시에 플라스미드에 대한 선택을 제거하고, 장기간 집단 성장에 걸쳐 무-플라스미드 세포의 출현에 대해 스크리닝한다. D6에 의해, 집단에서 EBNA 발현은 본질적으로, 검출 가능하지 않은데, 이는 일시적인 발현 시스템을 특징화한다. 이러한 EBNA 발현의 빠른 손실은 이의 극도의 단기 및 시산적 특징을 결정하였는데, 이는 핵 흡수 및 염색체 테더링 또는 게놈 통합의 이점 없이 세포질에서 V2 플라스미드의 일시적 보유를 가장 잘 지시한다. 더욱 중요하게, EBNA는 배양물에서 임의의 iPSC 모폴로지가 나타나기 전에 및 확실하게, 자기-유지 만능성 상태가 형성되기 전에 손실되었다. 본 명세서에 제공된 방법은 EBNA-매개 플라스미드 체류 시간을 감소시켰고, 에피솜 매개 재프로그래밍에서 안정한 EBNA 발현에 대한 필요성과는 명백히 상반된다[예를 들어, US 8,546,140호, 이는 적어도 8일 내지 적어도 30일 동안 안정한 EBNA 발현을 필요로 하거나, 문헌[Mazda et al., 1997]에서 호스팅 세포에서 구성적 발현을 필요로 함].
문헌[Howden et al., 2006 (Human Gene Therapy; 17:833-844)]에서는 EBV 기반 에피솜 벡터와 EBNA mRNA의 공동-트랜스펙션이 핵 흡수를 증가시키며, 이에 따라, EBV-기반 에피솜 벡터의 염색체 테더링을 증가시키고, 이에 따라, 트랜스펙션 효능을 10배 증가시킴을 나타내었다. 본 출원에서, STTR 시스템에서 V2 플라스미드 트랜스펙션에 의한 EBNA 발현의 일시적인 스파이크는 EBNA mRNA와 형태에 있어서 유사할 수 있지만, oriP만을 함유하고 EBNA를 발현시키지 않는, 본 명세서의 V1 플라스미드는 트랜스펙션률에 의미있게 영향을 미치게 하기 위해 벡터 DNA을 장기간 보유하고 복제하기 위해 연속 EBNA 발현에 의존하는 EBV-기반 에피솜의 테더링 메커니즘이 없다. 세포질로부터 핵으로 V1과 같은 oriP 함유 플라스미드의 운반이 2개의 플라스미드의 공동-트랜스펙션의 경우에 일시적으로 발현된 EBNA 플라스미드 V2에 의해 증가되더라도, V1은 여전히 V1과 V2 사이에 유사한 손실률에 의해 명시된 바와 같이 재프로그래밍 인자 이식 유전자의 장기간 발현을 지지하지 못한다.
이에 따라, V1 및 V2를 이용한 STTR 재프로그래밍은 비교되는 핵 위치 및 장기적인 에피솜 재프로그램과는 상이한, 완전히 일시적(염색체외 및 세포질) 시간적(기간적으로 매우 짧음) 것으로서 특징되는 플라스미드의 메커니즘을 통한 것이다. 다수의 트랜스펙션을 필요로 하지 않으면서, V1 및 V2 매기 플라스미드 재프로그래밍은 놀랍게도 효율적이다. 또한, 플라스미드 재프로그래밍은 D6에 의해 모든 EBNA 플라스미드를 손실시키는 것으로 나타났으며, 이러한 시점에 iPSC, 또는 만능성 상태가 형성되지 않았다. EBNA 검출을 통해, STTR 시스템은, 이식 유전자 손실이 빠르고, 일반적으로, 마커 중 하나로서 강조된 내인성 OCT4 발현과 함께 대략 D21 내지 D32인 만능성 상태를 설정하기 전에 유의미한 것으로 나타났다.
흥미롭게도, EmTTR 시스템과는 달리, STTR 시스템을 이용한 재프로그래밍 효능이 EmTTR 시스템에 비해 더 낮았지만(대략 2% 대 21%), 본 발명자는, STTR 시스템에서 대부분의 생성된 iPSC가 이의 iPSC 상태를 유지하고 모두 3개의 배엽층, 즉, 내배엽, 중배엽 및 외배엽으로 분화할 수 있기 때문에, STTR 시스템에서 iPSC의 만능성 복귀 및/또는 자연 분화를 검출하지 못하였다(도 9). 이는 부분적으로, 재프로그래밍이 EmTTR에서 나타난 바와 같이 EBNA의 장기간 발현에 의해 존재가 지속될 수 있는 외인성 재프로그래밍 인자에 의해 크게 유도되게보다는, 유도된 내인성 발달 시스템 및 동력학을 이용하는데 더욱 기울이도록 세포 집단에 대한 단기간의 이식 유전자 노출에 기여할 수 있다.
새로이 형성된 iPSC에서 V1 DNA의 부재에 대한 추가 증거를 제공하기 위해, 본 발명자는 하이그로마이신의 존재하에서 생존을 위해 다수의 iPSC 라인(D25-D30)에서 기능 시험을 수행하였다. 모든 시험된 hiPSC 라인은 STTR의 임의의 유전 성분이 없는 것으로 나타났고, STTR 시스템에서 V1 DNA의 완전한 손실의 추가 증거인 하이그로마이신에 대해 내성적인 것으로 나타났다. 선택된 클론을 무-피더 환경에서 단일 세포로서 연속적으로 계대배양하였고, 3개의 체세포 계통으로 효율적으로 분화하는 능력을 나타내면서, 미분화된 세포의 균일한 집단을 유지하는 것으로 나타났다. 핵형 및 카피 수 변이 분석은 FMM에서 유지된 장기간 배양 동안에 게놈적으로 안정한 hiPSC 라인을 나타내었다. 또한, 선택된 클론은, 3개의 배엽층의 세포를 생성시키는 능력을 나타내었고, 유도될 때, CD34+ 세포, NK 세포 및 T 세포를 포함하는 조혈 세포에 대한 균일한 방식으로 분화되었다.
STTR 시스템은 또한, 다른 V1 벡터에 의해 운반되는 다양한 재프로그래밍 인자 조합물과는 무관하게 재프로그래밍을 개시하는데 효과적인 것으로 나타났다[도 10 및 표 3].
Figure pct00004
본 STTR 시스템을 이용한 재프로그래밍 및 EBV-기반 에피솜 벡터를 사용한 재프로그래밍은 외인성 DNA 함량을 측면에서 상이한 iPSC를 생성한다. EBV-기반 에피솜 재프로그래밍은 무-풋-프린트 iPSC를 생성시키는데 찬사를 받았지만, 세포 분열당 약 3 내지 5%의 느린 에피솜 DNA 손실률에 크기 의존적이다[Leight et al., Mol Cell Biol (2001); 21:4149-4161]. 이에 따라, 에피솜 벡터가 재프로그래밍을 위해 사용될 때, 무-풋프린트 iPSC 집단은 다수의 라운드의 iPS 세포 계대배양 후에만 가능하다. 본질적으로 무-풋프린트인 만능 줄기세포 집단을 얻기 위해 초기에 얻어진 iPSC의 적어도 12 내지 15회 계대배양을 선택없이 취하는 것으로 나타났다(4 내지 7일마다 분할되는 각 배양은 1회 계대배양으로서 계수됨)[Cheng et al., Cell Stem Cell (2012); 10:337-344]. 그때까지, 이에 따라 생성된 iPSC 집단은 이의 외인성 DNA 함량의 측면에서 매우 불균질하다. 하나의 연구에서는, 트랜스펙션후 약 20일에 집단에서 iPSC의 약 2/3이 oriP/EBNA 에피솜 벡터를 함유함을 나타내었다[Leight et al., Mol Cell Biol (2001); 21:4149-4161; Yu et al., Science (2009); 324(5928): 797-801]. 뚜렷한 또는 높은 자연 분화율을 갖는 재프로그래밍된 세포에 대하여, 장기간의 자연 계대배양 과정을 통해 무-풋프린트 iPSC를 얻는 것은 훨씬 더 불충분하다.
총괄적으로, 데이터는 무-풋프린트 hiPSC가 본 명세서에 제공된 수명이 짧은 플라스미드 벡터 조합물을 이용하여 재프로그래밍 유전자를 일시적으로 및 시간적으로 발현시킴으로써 용이하게 생성될 수 있으며, 플랫폼은 실질적으로 균질한 무-풋-프린트 iPSC 집단의 효율적이고 신속한 생성을 지지한다. 일부 실시형태에서, 무-풋-프린트 iPSC 집단은 광범위한 계대배양에 대한 필요성 없이, 및 선택적으로, 완전히 무-피더 환경에서 생성된다.
실시예 3 - 치료적 용도를 위한 유도체 세포의 소스로서 단일 세포-유래 iPSC 뱅크를 생성시키기 위한 일시적 및 시간적 재프로그래밍 시스템
STTR 재프로그래밍 조성물 및 방법은 상용 면역요법을 위한 재생 가능하고 신뢰성 있는 세포 소스로서 사용하기 위해 클론 마스터 iPSC 라인을 생성하는데 사용되었다. 공여자-동의 섬유아세포를 개시된 바와 같이 플라스미드 조합물로 트랜스펙션하였다. 재프로그래밍 세포를 96-웰 플레이트 내로 클론 밀도로 분류하고, 단일 세포-유래 iPSC 클론을 만능성, 재프로그래밍 플라스미드의 손실, 게놈 안정성 및 분화 가능성을 포함하는 요망되는 특성에 대해 확장하고 스크리닝하였다. 선택된 클론 iPSC 라인을 엄격한 제조 및 공정 품질 관리하에 제조하고 냉동보존하고, 라인을 관련 규제 하에서 요망되는 바와 같이 "마스터 세포 뱅크"로서 자격을 얻기 위해 또한 광범위한 특징분석 및 시험하였다. 제조된 iPSC 뱅크를 현재 양호한 제조 실무에 따라 임상적으로 적절한 규모로 자연 킬러(NK) 세포로 분화하였다. 유도체 세포를 관련 규제 하에서 요망되는 "약물 물질 및 약물 제품"으로서 자격을 얻기 위해 또한 광범위한 특징분석 및 시험을 하였다. iPSC-유래 NK 세포를 냉동보존하여 단일 치료법 또는 면역 체크포인트 억제제와 조합하여 혈액 및 고형 암에 대한 입양 세포 요법에서 사용하기 위해 약 1×108개의 세포/용량의 다수의 용량으로 생성하였다. 일반적으로, 1×108개의 세포/용량은 60 kg 환자에 대하여 1.67×106개의 세포/kgh 변환된다. 각 적응증에 대한 투약 형태, 투여 경로 및 투약 요법을 시험관내 및 생체내의 GLP(우수 실험실 관리기준(Good Laboratory Practice)) 및 비-GLP 연구로부터의 전임상 데이터에 따라 설계하고 결정하였다.
암 및 면역 질환을 치료하기 위해 iPSC-유래 면역 세포를 지지하는 것 이외에, STTR 재프로그래밍 플랫폼에 의해 생성된 무-풋프린트 및 무-피더 세포 마스터 iPSC 라인은 황반 변성, 당뇨병, 파킨슨병, 혈액 장애 내지 심혈관 질환의 범위의 퇴행성 장애에 대한 기성 세포 치료법을 가능하는 가능성을 갖는다.
관련 기술 분야의 통상의 기술자는 본 명세서에 기술된 방법, 조성물 및 생성물이 예시적인 구체예를 대표하고, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다는 것을 쉽게 인식할 것이다. 다양한 치환 및 변형은 본 발명의 범주 및 사상으로부터 벗어나지 않으면서 본 명세서에 개시된 본 개시에 행해질 수 있음은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 쉽게 자명할 것이다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 간행물은 본 발명이 속한 기술 분야의 통상의 기술자의 수준을 나타낸다. 모든 특허 및 간행물은 각각의 개별 간행물이 구체적으로 그리고 개별적으로 참고로 포함된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 명세서에 예시적으로 기술된 본 개시내용은 본 명세서에 구체적으로 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재 하에서 적합하게 실시될 수 있다. 이에 따라, 예를 들어, 각각의 예에서 본 명세서에서 용어 "포함하는", "본질적으로 이루어진" 및 "이루어진" 중 임의의 것은 다른 2개의 용어 중 어느 하나에 의해 대체될 수 있다. 사용된 용어 및 표현은 제한이 아니라 설명의 관점에서 사용되고, 도시되고 기술된 특징의 임의의 등가물 또는 이의 부분을 배제하는 이러한 용어 및 표현의 사용에서 의도가 없지만, 다양한 변형이 청구된 개시의 범주 내에서 가능하다는 것이 인식된다. 이에 따라, 본 개시가 바람직한 구체예 및 선택적인 특징에 의해 구체적으로 개시되어 있지만, 본 명세서에 개시된 개념의 변형 및 변경은 관련 기술 분야의 통사의 기술자에 의해서 분류될 수 있고, 이러한 변형 및 변경은 첨부된 청구범위에 의해서 정의되는 바와 같은 본 발명의 범주에 포함되는 것으로 간주되는 것으로 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> FATE THERAPEUTICS, INC. <120> CELLULAR REPROGRAMMING USING TEMPORAL AND TRANSIENT PLASMID VECTOR EXPRESSION SYSTEM <130> WO2019/075057 <140> PCT/US2018/055208 <141> 2018-10-10 <150> 62/571,105 <151> 2017-10-11 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 641 <212> PRT <213> Homo sapiense <220> <223> Human herpesvirus 4 <400> 1 Met Ser Asp Glu Gly Pro Gly Thr Gly Pro Gly Asn Gly Leu Gly Glu 1 5 10 15 Lys Gly Asp Thr Ser Gly Pro Glu Gly Ser Gly Gly Ser Gly Pro Gln 20 25 30 Arg Arg Gly Gly Asp Asn His Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly 35 40 45 Arg Gly Gly Gly Arg Pro Gly Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ser Gly Pro 50 55 60 Arg His Arg Asp Gly Val Arg Arg Pro Gln Lys Arg Pro Ser Cys Ile 65 70 75 80 Gly Cys Lys Gly Thr His Gly Gly Thr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly 85 90 95 Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly 100 105 110 Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly 115 120 125 Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala 130 135 140 Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly 145 150 155 160 Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly 165 170 175 Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly 180 185 190 Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly 195 200 205 Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala 210 215 220 Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala 225 230 235 240 Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly 245 250 255 Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly 260 265 270 Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly 275 280 285 Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly 290 295 300 Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly 305 310 315 320 Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Ser Gly Gly 325 330 335 Arg Gly Arg Gly Gly Ser Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Ser Gly Gly 340 345 350 Arg Arg Gly Arg Gly Arg Glu Arg Ala Arg Gly Gly Ser Arg Glu Arg 355 360 365 Ala Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Glu Lys Arg Pro Arg Ser Pro 370 375 380 Ser Ser Gln Ser Ser Ser Ser Gly Ser Pro Pro Arg Arg Pro Pro Pro 385 390 395 400 Gly Arg Arg Pro Phe Phe His Pro Val Gly Glu Ala Asp Tyr Phe Glu 405 410 415 Tyr His Gln Glu Gly Gly Pro Asp Gly Glu Pro Asp Val Pro Pro Gly 420 425 430 Ala Ile Glu Gln Gly Pro Ala Asp Asp Pro Gly Glu Gly Pro Ser Thr 435 440 445 Gly Pro Arg Gly Gln Gly Asp Gly Gly Arg Arg Lys Lys Gly Gly Trp 450 455 460 Phe Gly Lys His Arg Gly Gln Gly Gly Ser Asn Pro Lys Phe Glu Asn 465 470 475 480 Ile Ala Glu Gly Leu Arg Ala Leu Leu Ala Arg Ser His Val Glu Arg 485 490 495 Thr Thr Asp Glu Gly Thr Trp Val Ala Gly Val Phe Val Tyr Gly Gly 500 505 510 Ser Lys Thr Ser Leu Tyr Asn Leu Arg Arg Gly Thr Ala Leu Ala Ile 515 520 525 Pro Gln Cys Arg Leu Thr Pro Leu Ser Arg Leu Pro Phe Gly Met Ala 530 535 540 Pro Gly Pro Gly Pro Gln Pro Gly Pro Leu Arg Glu Ser Ile Val Cys 545 550 555 560 Tyr Phe Met Val Phe Leu Gln Thr His Ile Phe Ala Glu Val Leu Lys 565 570 575 Asp Ala Ile Lys Asp Leu Val Met Thr Lys Pro Ala Pro Thr Cys Asn 580 585 590 Ile Arg Val Thr Val Cys Ser Phe Asp Asp Gly Val Asp Leu Pro Pro 595 600 605 Trp Phe Pro Pro Met Val Glu Gly Ala Ala Ala Glu Gly Asp Asp Gly 610 615 620 Asp Asp Gly Asp Glu Gly Gly Asp Gly Asp Glu Gly Glu Glu Gly Gln 625 630 635 640 Glu <210> 2 <211> 422 <212> PRT <213> Homo sapiense <220> <223> Human herpesvirus 4 <400> 2 Met Ser Asp Glu Gly Pro Gly Thr Gly Pro Gly Asn Gly Leu Gly Glu 1 5 10 15 Lys Gly Asp Thr Ser Gly Pro Glu Gly Ser Gly Gly Ser Gly Pro Gln 20 25 30 Arg Arg Gly Gly Asp Asn His Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly 35 40 45 Arg Gly Gly Gly Arg Pro Gly Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ser Gly Pro 50 55 60 Arg His Arg Asp Gly Val Arg Arg Pro Gln Lys Arg Pro Ser Cys Ile 65 70 75 80 Gly Cys Lys Gly Thr His Gly Gly Thr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Gly 85 90 95 Gly Ala Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Arg Gly Arg 100 105 110 Gly Gly Ser Gly Gly Arg Gly Arg Gly Gly Ser Gly Gly Arg Gly Arg 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Arg Arg Gly Arg Gly Arg Glu Arg Ala Arg Gly 130 135 140 Gly Ser Arg Glu Arg Ala Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Glu Lys 145 150 155 160 Arg Pro Arg Ser Pro Ser Ser Gln Ser Ser Ser Ser Gly Ser Pro Pro 165 170 175 Arg Arg Pro Pro Pro Gly Arg Arg Pro Phe Phe His Pro Val Gly Glu 180 185 190 Ala Asp Tyr Phe Glu Tyr His Gln Glu Gly Gly Pro Asp Gly Glu Pro 195 200 205 Asp Val Pro Pro Gly Ala Ile Glu Gln Gly Pro Ala Asp Asp Pro Gly 210 215 220 Glu Gly Pro Ser Thr Gly Pro Arg Gly Gln Gly Asp Gly Gly Arg Arg 225 230 235 240 Lys Lys Gly Gly Trp Phe Gly Lys His Arg Gly Gln Gly Gly Ser Asn 245 250 255 Pro Lys Phe Glu Asn Ile Ala Glu Gly Leu Arg Ala Leu Leu Ala Arg 260 265 270 Ser His Val Glu Arg Thr Thr Asp Glu Gly Thr Trp Val Ala Gly Val 275 280 285 Phe Val Tyr Gly Gly Ser Lys Thr Ser Leu Tyr Asn Leu Arg Arg Gly 290 295 300 Thr Ala Leu Ala Ile Pro Gln Cys Arg Leu Thr Pro Leu Ser Arg Leu 305 310 315 320 Pro Phe Gly Met Ala Pro Gly Pro Gly Pro Gln Pro Gly Pro Leu Arg 325 330 335 Glu Ser Ile Val Cys Tyr Phe Met Val Phe Leu Gln Thr His Ile Phe 340 345 350 Ala Glu Val Leu Lys Asp Ala Ile Lys Asp Leu Val Met Thr Lys Pro 355 360 365 Ala Pro Thr Cys Asn Ile Arg Val Thr Val Cys Ser Phe Asp Asp Gly 370 375 380 Val Asp Leu Pro Pro Trp Phe Pro Pro Met Val Glu Gly Ala Ala Ala 385 390 395 400 Glu Gly Asp Asp Gly Asp Asp Gly Asp Glu Gly Gly Asp Gly Asp Glu 405 410 415 Gly Glu Glu Gly Gln Glu 420

Claims (65)

  1. 만능 세포(pluripotent cell), 세포주 또는 이의 집단을 생성하기 위해 비-만능 세포를 재프로그래밍하는 방법으로서,
    (a) 비-만능 세포인 제1 세포에,
    복제 기점(replication origin), 및 하나 이상의 재프로그래밍 인자(reprogramming factor)를 암호화하지만 EBNA 또는 이의 유도체를 암호화하지 않는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 제1 플라스미드로서, 상기 하나 이상의 제1 플라스미드 중 적어도 하나는 OCT4를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 하나 이상의 제1 플라스미드의 도입은 재프로그래밍 과정을 유도하는, 상기 하나 이상의 제1 플라스미드; 및 선택적으로,
    (1) EBNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 플라스미드로서, 복제 기점, 또는 재프로그래밍 인자(들)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(들)를 포함하지 않는, 상기 제2 플라스미드; (2) EBNA mRNA; 및 (3) EBNA 단백질 중 하나
    를 도입하는 단계;
    (b) 제2 세포를 생성하기 위해 단계 (a)로부터 상기 세포를 배양하는 단계로서, 상기 제2 세포는 재프로그래밍 세포이며, 상기 재프로그래밍 세포는 상기 제1 세포로부터의 형태학적 변화(morphological change)를 포함하고, EBNA가 본질적으로 존재하지 않으며; 상기 재프로그래밍 세포는,
    (1) 만능 세포 모폴로지(pluripotent cell morphology); 및
    (2) 내인성 OCT4 발현
    을 포함하지 않는, 상기 세포를 배양하는 단계; 및
    (c) 만능 세포를 생성하기에 충분한 시간 동안 단계 (b)에서 얻어진 상기 제2 세포를 추가로 배양하는 단계를 포함하는, 비-만능 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (a)가 상기 제1 세포에, EBNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 플라스미드를 도입하는 것을 포함하고, 상기 제2 플라스미드는 복제 기점 또는 재프로그래밍 인자(들)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(들)를 포함하지 않는, 비-만능 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 만능 세포를 해리시켜 단일 세포 해리된 만능 세포를 얻는 단계를 더 포함하는, 비-만능 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단일 세포 해리된 만능 세포를 현탁시키는 단계를 더 포함하는, 비-만능 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    마커(들)를 발현시키는 만능 세포를 풍부화시키기 위해 하나 이상의 만능성 마커(pluripotency marker)를 발현시키는 세포를 선택하고 단리시킴으로써 상기 단일 세포 해리된 만능 세포를 분류하는 단계를 더 포함하는, 비-만능 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    만능성을 유지하기 위해 GSK3 억제제, MEK 억제제 및 ROCK 억제제의 존재하에서 상기 만능 세포를 배양하는 단계를 더 포함하되, 상기 만능 세포는 적어도 5, 10, 15 또는 20회 계대(passage) 동안 만능성을 유지하는, 비-만능 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 단계 (b)에서의 배양이 TGFβ 억제제, GSK3 억제제, MEK 억제제 및 ROCK 억제제 중 적어도 하나의 존재하에서의 배양을 포함하는, 비-만능 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 제1 세포가 체세포, 전구체 세포(progenitor cell), 또는 다능성 세포(multipotent cell)인, 비-만능 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 제1 세포가 섬유아세포이고, 상기 제2 세포의 형태학적 변화가 MET(mesenchymal to epithelial transition)(간엽-상피 이행)를 포함하는, 비-만능 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 제2 세포에는 단계 (a)의 플라스미드가 본질적으로 존재하지 않는, 비-만능 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 제2 세포가 단계 (a)에서 하나 이상의 제1 플라스미드의 도입 후 약 4 내지 10, 12, 14, 21, 25일, 또는 이들 사이의 임의의 일수의 재프로그래밍 세포를 포함하는, 비-만능 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 만능 세포가 감소된 만능성 복귀(pluripotency reversion) 또는 자연 분화(spontaneous differentiation)를 갖는, 비-만능 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 만능 세포에는, 상기 만능 세포의 선택 또는 광범위한 계대배양에 대한 필요 없이 단계 (a)의 플라스미드의 폴리뉴클레오타이드가 본질적으로 존재하지 않는, 비-만능 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 만능 세포가,
    (1) 높은 클론 형성능(clonality);
    (2) 유전적 안정성; 및
    (3) 기저 상태 만능성
    의 성질들 중 적어도 하나를 갖는, 비-만능 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 만능 세포가 배아외 세포(extraembryonic cell)와 관련된 재활성화된 유전자를 포함하는, 비-만능 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  16. 제2항에 있어서, 상기 제2 플라스미드가 높은 손실률을 갖고/갖거나, 상기 EBNA의 발현이 일시적(transient) 및 시간적(temporal)인, 비-만능 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 복제 기점 및/또는 EBNA가 EBV-기반인, 비-만능 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 무-피더 조건(feeder-free condition) 하에 있는, 비-만능 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ROCK 억제제가 티아조비빈(thiazovivin)인, 비-만능 세포를 재프로그래밍하는 방법.
  20. 비-만능 세포 내에,
    복제 기점, 및 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 암호화하지만 EBNA 또는 이의 유도체를 암호화하지 않는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 하나 이상의 제1 플라스미드로서, 상기 하나 이상의 제1 플라스미드 중 적어도 하나는 OCT4를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 상기 하나 이상의 제1 플라스미드; 및 선택적으로,
    (1) EBNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 플라스미드로서, 복제 기점 또는 재프로그래밍 인자(들)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(들)를 포함하지 않는, 상기 제2 플라스미드; (2) EBNA mRNA; 및 (3) EBNA 단백질 중 하나
    를 도입한 후에 얻어진 재프로그래밍 세포 또는 이의 집단으로서,
    상기 재프로그래밍 세포는 플라스미드의 조합물의 도입 전에 상기 비-만능 세포로부터의 형태학적 변화를 포함하고, EBNA 또는 이의 유도체가 본질적으로 존재하지 않으며;
    상기 재프로그래밍 세포는 (1) 만능 세포 모폴로지; 및 (2) 내인성 OCT4 발현을 포함하지 않고;
    상기 재프로그래밍 세포는 만능 세포를 생성하기 위해 충분한 시간 동안 안정한 또는 자기-유지(self-sustaining) 만능성을 확립시킬 수 있는, 재프로그래밍 세포 또는 이의 집단.
  21. 제20항에 있어서, 상기 재프로그래밍 세포가 하나 이상의 제1 플라스미드의 도입 후 약 4 내지 10, 12, 14, 21, 25일, 또는 이들 사이의 임의의 일수인, 재프로그래밍 세포 또는 이의 집단.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 재프로그래밍 세포가 TGFβ 억제제, GSK3 억제제, MEK 억제제 및 ROCK 억제제 중 적어도 하나의 존재하에 배양된, 재프로그래밍 세포 또는 이의 집단.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-만능 세포가 섬유아세포이며, 상기 재프로그래밍 세포의 형태학적 변화가 MET(간엽-상피 이행)를 포함하는, 재프로그래밍 세포 또는 이의 집단.
  24. 제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재프로그래밍 세포에는 제1 플라스미드 및/또는 제2 플라스미드가 본질적으로 존재하지 않는, 재프로그래밍 세포 또는 이의 집단.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 세포에는 상기 만능 세포의 선택 또는 광범위한 계대배양에 대한 필요 없이 상기 플라스미드의 폴리뉴클레오타이드가 본질적으로 존재하지 않는, 재프로그래밍 세포 또는 이의 집단.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 세포가 감소된 만능성 복귀 또는 자연 분화를 갖는, 재프로그래밍 세포 또는 이의 집단.
  27. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 세포가,
    (1) 높은 클론 형성능;
    (2) 유전적 안정성; 및
    (3) 기저 상태 만능성
    의 성질들 중 적어도 하나를 갖는, 재프로그래밍 세포 또는 이의 집단.
  28. 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만능 세포가 배아외 세포와 관련된 재활성화된 유전자를 포함하는, 재프로그래밍 세포 또는 이의 집단.
  29. 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항의 재프로그래밍 세포 또는 이의 집단을 포함하는, 조성물.
  30. 제29항에 있어서, TGFβ 억제제, GSK3 억제제, MEK 억제제 및 ROCK 억제제를 포함하는 배지를 더 포함하는, 조성물.
  31. 제29항에 있어서, 상기 ROCK 억제제가 티아조비빈인, 조성물.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 배지가 무-피더인, 조성물.
  33. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생성된, 단리된 만능 세포 또는 만능 세포주.
  34. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생성된 상기 단리된 만능 세포 또는 세포주를 사용하는, 게놈 조작된 만능 세포 또는 이의 세포주.
  35. 제33항의 상기 단리된 만능 세포 또는 세포주로부터 또는 제34항의 상기 게놈 조작된 만능 세포 또는 세포주로부터 재-분화된, 유도된 비-천연 세포.
  36. 제35항에 있어서, 상기 세포가 면역-세포 유사 세포이고, 상기 세포는 CD34 세포, 혈구 내피 세포, 조혈 줄기 또는 전구체 세포, 조혈 다능성 전구체 세포, T 세포 전구체, NK 세포 전구체, T 세포, NKT 세포, NK 세포, B 세포, 또는 면역 조절 세포를 포함하는, 유도된 비-천연 세포.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 세포가 이의 천연 세포 대응물과 비교하여, 이질염색질의 전체적 증가; 미토콘드리아성 기능 개선; DNA 손상 반응 증가; 텔로미어 신장 및 짧은 텔로미어 백분율의 감소; 노쇠화 세포 분율을 감소; 및 증식, 생존, 지속, 또는 기억 유사 기능에 대한 더 높은 가능성의 성질들 중 적어도 하나를 포함하는 회춘 세포(rejuvenated cell)인, 유도된 비-천연 세포.
  38. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻어진 만능 세포, 및 선택적으로, 하나 이상의 추가의 치료제를 포함하는, 치료적 용도(therapeutic use)를 위한 조성물.
  39. 제34항의 게놈 조작된 만능 세포 또는 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항의 유도된 비-천연 세포, 및 선택적으로, 하나 이상의 추가의 치료제를 포함하는, 치료적 용도를 위한 조성물.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는데 사용하기 위한, 치료적 용도를 위한 조성물.
  41. 세포-기반 치료법에서 적용하기 위한 만능 세포를 제조하는데 사용하기 위한 조성물로서, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 생성된 만능 세포를 포함하는, 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 상기 만능 세포가 동종이계(allogeneic) 또는 자연 발생적(autologous)인, 조성물.
  43. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻어진 만능 세포를 포함하는, 약제 사용(medicament use)을 위한 키트.
  44. 제34항의 게놈 조작된 만능 세포 또는 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항의 유도된 비-천연 세포를 포함하는, 약제 사용을 위한 키트.
  45. 비-만능 세포에서 재프로그래밍을 개시하기 위한 시험관내 시스템(in vitro system)으로서, 상기 시스템은
    복제 기점, 및 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 암호화하지만 EBNA 또는 이의 유도체를 암호화하지 않는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 하나 이상의 제1 플라스미드로서, 상기 하나 이상의 제1 플라스미드 중 적어도 하나는 OCT4를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 상기 하나 이상의 제1 플라스미드; 및 선택적으로,
    (1) EBNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2 플라스미드로서, 복제 기점, 또는 재프로그래밍 인자(들)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(들)를 포함하지 않는, 상기 제2 플라스미드; (2) EBNA mRNA; 및 (3) EBNA 단백질 중 하나를 포함하는, 시험관내 시스템.
  46. 제44항에 있어서, 상기 제2 플라스미드가 높은 손실률을 갖고, 상기 EBNA의 발현이 일시적 및 시간적인, 시험관내 시스템.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 시스템이 핵에서 EBNA 복제 및/또는 연속 발현을 제공하지 않는, 시험관내 시스템.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템이 단기간 동안, 및 만능성 세포 모폴로지의 출현 및 내인성 만능성 유전자의 유도된 발현 전에, EBNA의 일시적/세포질 발현을 가능하게 하는, 시험관내 시스템.
  49. 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템이 단기간 동안, 및 만능성 세포 모폴로지의 출현 및 내인성 만능성 유전자의 유도된 발현 전에, 제1 플라스미드(들)에 포함된 하나 이상의 재프로그래밍 인자의 일시적/세포질 발현을 가능하게 하는, 시험관내 시스템.
  50. 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 기점이 폴리오마비리네 바이러스, 파필로마비리네 바이러스 및 감마헤르페스비리네 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택된, 시험관내 시스템.
  51. 제45항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 기점이 SV40, BK 바이러스(BKV), 소 유두종 바이러스(BPV) 또는 엡스타인-바 바이러스(EBV)로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 시험관내 시스템.
  52. 제45항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 복제 기점이 EBV의 야생형 복제 기점에 상응하거나, 이로부터 유도된, 시험관내 시스템.
  53. 제45항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EBNA가 EBV-기반인, 시험관내 시스템.
  54. 제45항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 제1 플라스미드가 총괄적으로, OCT4, SOX2, NANOG, KLF, LIN28, c-MYC, ECAT1, UTF1, ESRRB, HESRG, CDH1, TDGF1, DPPA4, DNMT3B, ZIC3 및 L1TD1 중 하나 이상을 포함하는 재프로그래밍 인자(들)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 시험관내 시스템.
  55. 제45항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재프로그래밍 인자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 폴리시스트론성 작제물 또는 비-폴리시스트론성 작제물에 포함되어 있는, 시험관내 시스템.
  56. 제45항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리시스트론성 작제물이 단일 오픈 리딩 프레임 또는 다수의 오픈 리딩 프레임을 포함하는, 시험관내 시스템.
  57. 제45항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템이 둘 이상의 제1 플라스미드를 포함하되, 각 제1 플라스미드는 폴리뉴클레오타이드의 적어도 하나의 카피(copy)에 의해 암호화된 동일하거나 상이한 재프로그래밍 인자를 포함하는, 시험관내 시스템.
  58. 제56항에 있어서, 둘 이상의 제1 플라스미드를 포함하는 시스템이 재프로그래밍 인자 화학량론의 제어를 제공하는, 시험관내 시스템.
  59. 제45항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 플라스미드가 재프로그래밍 인자를 암호화하는 하나 초과의 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 인접한 폴리뉴클레오타이드는 자가-절단 팹타이드(self-cleaving peptide) 또는 IRES를 암호화하는 링커 서열에 의해 작동되게 연결되는, 시험관내 시스템.
  60. 제45항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자가-절단 펩타이드가 F2A, E2A, P2A 및 T2A를 포함하는 군으로부터 선택된 2A 펩타이드인, 시험관내 시스템.
  61. 제45항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 플라스미드 작제물에 포함된 상기 2A 펩타이드가 동일하거나 상이할 수 있는, 시험관내 시스템.
  62. 제45항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 이웃하는 위치의 2개의 2A 펩타이드가 상이한 것인, 시험관내 시스템.
  63. 제45항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 플라스미드 각각이 재프로그래밍 인자 및 EBNA의 발현을 위한 하나 이상의 프로모터를 포함하며, 상기 하나 이상의 프로모터는 구성적, 유도성, 내인성으로 조절되거나, 시간적-, 조직- 또는 세포 타입-특이적인 다른 적합한 프로모터 중 적어도 하나를 포함하는, 시험관내 시스템.
  64. 제45항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 플라스미드 각각이 CAG 프로모터를 포함하는, 시험관내 시스템.
  65. 제45항 내지 제64항 중 어느 한 항의 시스템을 포함하는, 키트.
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