KR20200061368A - 펩타이드 결정의 분리, 세척 및 건조를 위한 통합된 자동 여과 - Google Patents

펩타이드 결정의 분리, 세척 및 건조를 위한 통합된 자동 여과 Download PDF

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Abstract

본 발명은 가압 여과를 사용하여 예비 결정화, 결정 분리, 결정 세척 및 동결-건조 공정을 단일 연속 공정으로 통합하는 것을 기술한다. 상기 공정은 시간 단축을 촉진하고, 흡수된 물을 제거하기 위해 다중 유기 용매 세척 및 질소 가스 퍼지를 사용하는 새로운 설계를 개괄하고, 품질 사양을 충족시키는 최종 약물을 달성한다.

Description

펩타이드 결정의 분리, 세척 및 건조를 위한 통합된 자동 여과
본 발명은 생물학적 제제의 하류 공정(downstream process)에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인슐린 및 이의 유사체의 하류 공정에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인슐린 및 이의 유사체의 정제를 위한 단일 연속 공정으로 결정 분리에 이은 결정 세척 및 동결-건조의 통합에 관한 것이다.
종래의, 예비 단백질 결정화(preparative protein crystallization)는 일련의 세척 (침전된 결정의) 및 중력 침전 단계를 포함한다. 상기 예비 단백질 결정화의 최종 생성물은 건조 분말 형태의 약물 (DS)을 수득하기 위해, 진공 보조 동결-건조에 의해 추가 처리된다. 상기 결과로 생긴 약물은 보편적인 품질 및 규제 사양에 따라 잔류물(RS) 분석, 수분 함량(LOD-건조시 손실), 황화회분 함량(ROI) 및 잔류 용매 한계에 의한 순도를 따라야한다. 상기 예비 결정화, 탱크 내 결정의 침전 및 원하는 품질 요구 사항 및 동결 건조를 위한 세척의 전체 공정은 상업적 규모로 최소 7일이 소요된다. 분명히 상기 공정은 불연속적이고 모듈적인 특성으로 인해 에너지, 비용 및 시간이 많이 소요된다.
인슐린 또는 인슐린 유사체의 결정화 및 정제 방법은 WO2015084694, US8769841, WO1996040730, CN103512318 및 US6408536에 개시되어있다.
WO2015084694는 결정성 인슐린 또는 인슐린 유사체 결정 조성물을 생성하기 위해, 알칼리성 조건 하에서 인슐린 또는 인슐린 유사체를 결정화하고, 필터를 통해 여과하고, 상기 필터 상에 포획된 결정을 건조시키는 방법을 개시한다. 결정화 후, 이동된(decanted) 결정 현탁액의 총 부피는 이후 여과 장치로 옮겨진다. 상기 WO2015084694에 기술된 여과 장치는 교반식 누체 필터(agitated Nutsche filter)로서 약 5 μm 공극 크기를 갖는 스테인리스강 스크린을 가진다.
US8769841은 첫번째 온도 및 압력 수준을 갖는 적어도 하나의 첫번째 단계(즉, 1차 건조 단계) 및 첫번째 단계에 이어 두번째 온도 및 압력 수준을 갖는 적어도 하나의 두번째 단계(즉, 2차 건조 단계)를 포함하는 본질적으로 수용액의 동결 건조 공정을 개시한다.
WO1996040730은 분말로서 침전 또는 결정화에 의한 회수 및 이후 수용액으로부터의 여과에 저항하는 아실화된 단백질을 회수하는 방법을 개시하고 있다. 아실화 단백질은 특정 아실화 프로인슐린, 인슐린 및 인슐린 유사체이다. 상기 방법은 단백질의 등전점 pH 근처로 수용액을 조절하고 조절된 pH에서 여과 가능한 입자 형태의 단백질의 침전을 야기시키기에 적합한 알코올 농도를 제공하는 단계를 포함한다.
CN103512318은 인슐린의 동결 건조 공정과 관련된 약물 정제 건조 공정을 개시하며, 상기 공정은 인슐린의 동결-건조 공정을 개시한다. 상기 불순물의 함량은 종래 기술보다 낮다. 이 공정은 유기 용매의 사용을 피함으로써 인간과 환경에 대한 잠재적인 악영향을 제거하고, 건조 시간을 2-3일 절약하고 산업 생산성을 향상시킨다.
US6408536은 수성 단백질 결정 현탁액으로부터 단백질 결정을 건조하는 공정을 개시한다. 상기 공정은 수성 현탁액으로부터 결정을 여과 제거하고, 필터 케이크를 세척하고, 탈수 건조하며, 상기 유동층 내의 결정을 함습(moistened) 질소의 흐름으로 건조시키고, 질소 압력서지(pressure surge)를 사용하여 플랜지형(flanged) 용기 내로 건조된 결정을 비우는 단계를 포함한다.
비록, 인슐린 및 이의 유사체를 결정화할 수 있는 방법이 일부 존재하나, 동일한 원리로 작동하는 더 큰 규모의 설비산업에서 활용될 수 있는 결정의 건조 뿐만 아니라, 결정의 결정화, 세척 및 분리의 단순하고 최적화된 공정을 갖기 위한 다른 방법을 개발할 필요가 있다.
본 발명은 인슐린 및 이의 유사체의 분리 및 건조를 위한 통합된 간단한 공정을 제공한다.
본 발명의 목적은 핵심 품질 속성 및 공정 수행 속성의 유사한 표준을 달성하면서 결정화, 결정 세척 및 동결 건조로 분리된 공정을 가압 여과를 이용하여 단일 연속 공정으로 통합하는 것이다.
본 발명은 예비 인슐린 및 인슐린 유사체 결정화, 결정 분리 및 동결-건조 공정의 가압 여과를 이용한 단일 연속 공정으로의 통합을 기술한다. 상기 공정은 시간 단축을 촉진하고, 흡수된 물을 제거하기 위해 다중 유기 용매 세척 및 질소 가스 퍼지를 사용하는 새로운 설계를 개괄하고, 주요 품질 사양을 충족시키는 최종 약물을 달성한다.
도 1은 인슐린 및 인슐린 유사체 정제를 위한 가압 여과 공정의 흐름도를 나타낸 것이다.
도 2는 실험실 규모 가압-여과장치의 대표 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은 기존 (왼쪽) 및 새로운 (오른쪽) 공정의 약물을 나타낸 것이다.
도 4는 생성물 손실/회수에 대한 변동성 차트를 손실 %로 나타낸 것이다.
도 5는 LOD(건조시 손실)%로서 약물 내 잔류 수분 함량에 대한 변동성 차트를 나타낸 것이다.
도 6은 고분자량 생성물(HMWP) %에 대한 변동성 차트를 나타낸 것이다.
도 7은 순도 %에 대한 변동 차트를 나타낸 것이다.
정의
상기 용어 '결정 현탁액(crystal suspension)'은 인슐린 또는 인슐린 유사체에 염화아연(ZnCl2)을 첨가한 후 산/알칼리를 사용하여 4.5-8.5 범위로 pH를 조정하여 제조된 용액의 부피를 지칭한다. 아연의 첨가는 다량체화를 통해 인슐린의 물리적 안정성을 향상시킨다.
상기 용어 '여과(filter)'는 어떤 원심력도 수반하지 않는 '1-15 μm' 사이의 다양한 여과 막의 공극 크기를 가진 '부크너 깔때기(Buchner funnel)'와 유사한 간단한 설정을 의미한다.
상기 용어 '가압 여과(pressure filtration)'는 상기 (유기 용매)모액이 투과액(permeate)을 통과하는 동안 고체 물질(결정질 인슐린 및 인슐린 유사체)이 케이크로 유지되도록 압력을 제어하여 필터 막에 용액을 밀어 넣는 고체 액체 여과를 지칭한다. 이러한 외인성 압력은 유효 유속 증가, 막 전체의 고압 구배 및 불활성 기체의 사용으로 완제품의 안정성을 보장한다. 가압 여과는 실험실 규모에서 2-5분, 산업 규모에서 45-60분의 작동시간을 갖는 즉각적인 공정이다.
상기 용어 '인슐린(Insulin)' 또는 '인슐린 유사체(Insulin analogue)'는 당뇨병 치료에 사용되는 51개의 아미노산 펩타이드 호르몬을 지칭한다. 또한 하류 공정(downstream process) 동안 수득된 인슐린 전구체 또는 인슐린 유사체 전구체, 중간 인슐린 또는 인슐린 유사체 분자와 같은 다른 인슐린 관련 형태를 지칭한다.
발명의 설명
인슐린 및 인슐린 유사체는 재조합 피키아(Pichia) 기반 발효 공정을 사용하여 세포 밖으로 발현되었다. 형질 전환된 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 효모 균주는 배지에서 발효되었다. 상기 분비된 인슐린 또는 인슐린 유사체는 크로마토그래피 방법으로 회수하였다.
인슐린 및 인슐린 유사체를 크로마토그래피 용리 풀로부터 결정화하였다. 염화아연(ZnCl2)의 존재 및 산 또는 알칼리의 첨가에 의한 적절한 pH(4.5 내지 8.5 범위의)에서 추가로 결정 현탁액을 만들었다. 결정 현탁액의 프로파일 (고체 비율, 순도)을 결정하였다. 상기 결과로 생긴 인슐린 또는 인슐린 유사체 결정은 고(high) 순도를 가졌다. 전체 부피의 결정 현탁액을 물로 세척하여 결정화에 사용된 유리 침전제를 제거하였으며, 동결건조의 추가 공정을 진행하였다. 상기 결정 현탁액은 분리를 위해 먼저 가압 여과 공정을 통해 처리하였다. 이 분리 공정에는 중력 및 원심력이 없다.
상기 건조된 케이크는 물을 흡수하였고, 흡수된 물은 유기 용매로 세척하고 질소 가스로 퍼지하는 단계에 의해 제거된다.
상기 단일 연속 공정은 다음 4 단계로 기술될 수 있다.
1. 결정 현탁액의 가압 여과 (결정의 초기 분리)
2. 건조: 흡수된 물의 제거를 위한 유기 용매로의 세척
3. 건조: 잔류 유기 용매 제거를 위한 질소의 최종 퍼지
4. cGMP 환경에서 건조된 분말의 자동 분배
결정 분리, 세척 및 건조의 유사 통합은 인슐린 및 인슐린 유사체의 하류 공정(downstream process) 동안 다수의 선행 결정화 단계에서 수행될 수 있다. 원료(들), 시약(들) 및 장비(들)은 각각 하기 표 1, 2 및 3에 열거된 바와 같이 사용되었다.
표 1: 원료 리스트
일련 번호 원료
(Raw Materials) 		등급
(Grade) 		제조사
(Manufacturer)
1. 아세트산
(Acetic acid)		 HPLC 란켐(Rankem)
2. 아세토니트릴
(Acetonitrile, ACN)		 HPLC 란켐(Rankem)
3. 아세토니트릴
(Acetonitrile, ACN)		 상용 등급 아사히 카세이(ASAHI KASEI)
4. L-아르기닌
(L-Arginine)		 시약 등급 시그마 알드리치(Sigma-Aldrich)
5. 1-부탄올
(1-butanol)		 상용 등급 디팍 비료(Deepak fertilizers)
6. 에탄올(Ethanol) 상용 등급 창수 양원 화학
(Changshu Yangyuan Chemicals)
7. 에틸 아세테이트
(Ethyl acetate)		 상용 등급 락쉬미 유기농 산업
(Lakshmi Organic Industries)
8. 필터 막 해당 사항 없음 세파르 여과 (인도) 개인 유한 회사Sefar Filtration (India) Pvt. Ltd
9. 염산
(HCl)		 ACS 시약 시그마 알드리치(Sigma-Aldrich)
10. 메탄올
(Methanol)		 상용 등급 디팍 비료(Deepak fertilizers)
11. 2-프로판올
(2-propanol)		 상용 등급 디팍 비료(Deepak fertilizers)
12. 트리플루오로 아세트산
(Trifluoroacetic acid)		 크로마솔브
(Chromasolv)		 시그마 알드리치(Sigma-Aldrich)
13. 주사 용수(Water for injection) 해당 사항 없음 바이오콘
(Biocon)
표 2: 버퍼/시약 및 준비 리스트
일련 번호 버퍼/시약 준비
1. MilliQ 물에서 0.1 % TFA MilliQ 물 1000 mL를 측정하기. 1 mL의 물을 피펫팅하고 1 mL의 HPLC 등급 TFA를 첨가하기
2. 1 N HCl 70 mL의 물을 측정한 후 8.212 mL의 농축 HCl (HPLC 등급)을 첨가하기. 부피 플라스크에서 MilliQ 물을 사용하여 최종 부피를 100 mL로 채우기
3. 0.01 N HCl 물 245 mL를 측정하기. 2.5 mL의 1 N HCl (HPLC 등급)을 첨가하기. MilliQ 물로 부피 250 mL 채우기
4. HMWP 버퍼(고분자량 트랜스퍼 완충제) MilliQ 물 600 mL를 측정하기. 교반하면서 시약 등급 L-아르기닌 0.65 g을 첨가하기. 650 mL로 부피 채우기. 아세트산 150 mL 및 아세토니트릴 200 mL를 첨가하기. 0.45 μm 및 0.2 μm 필터를 사용하여 용액을 여과하고 20 분 동안 초음파 처리하기
표 3: 장비/기기 리스트
일련 번호 이름 모델/제작
1. 분석용 HPLC 애질런트 HPLC- 1200/애질런트 테크놀로지스
애질런트 HPLC- 1100/애질런트 테크놀로지스
LC-2010CHT/시마즈(Shimadzu)
2. 칼럼 고급 크로마토그래피 기술: ACE 300-C18, 5 μm; 4.6 × 250 mm
물: 인슐린 HMWP 7.8 x 300 mm
3. 가압 여과장치 BHS 손토펜(BHS Sonthofen)의 원형
4. 진공 오븐 서브웰(Servewell)
5. 저울 메틀러 토레도(Mettler Toledo)
6. 수조 줄라보(Julabo)
7. 수조 이퀴트론(Equitron)
8. 초음파 처리기 서브웰(Servewell)
9. 볼텍스 믹서 샬롬(Shalom)
10. 질소 가스 실린더 바이오콘(Biocon)
11. 냉장실 블루 스타(Blue star)
12. 냉동고 베스트프로스트(Vestfrost)
상기 시험은 대략 80 cm2 내지 100 cm2 의 필터 단면적으로 설정된 실험실 규모 가압 여과장치에서 수행되었다. 가압 여과장치는 또한 압축 불활성 기체 (질소)의 압력 주입구, 압력 측정기 및 안전 방출 밸브, 샘플 주입구 및 배출구 포트 및 워터 재킷 (도 2)을 포함한다.
가변 파라미터는 세척 용매, 용매 부피, 세척 횟수, 각각 세척에 대한 질소 퍼지 시간 및 선택적인 여과재의 변화이며, 이는 처리되는 결정의 크기에 의존한다. 수득된 약물의 공정 성능 및 품질 특성은 투과액에서의 결정 손실율 및 건조 손실 (LOD), 순도 및 분자량(HMWP)를 분석함으로써 측정되었다. 상기 설정 온도는 25°C 내지 35°C 범위로 유지되었다.
상기 인슐린 및 인슐린 유사체 결정 현탁액의 가압 여과 공정에 의해 형성된 케이크는 필요한 두께 및 조직(구조)를 가졌다. 그러나, 목표는 상기 케이크를 건조시켜 수용 가능한 LOD 표준을 달성하고 매우 중요하게는 종래 공정의 결정화-동결 건조를 단일 연속 공정으로 통합하는 것이다. 필터 케이크로부터 흡수된 잔류수를 충분히 제거하기 위해, 상이한 유기 용매를 갖는 단일 또는 다중 세척 전략들이 연구되었다. 상기 세척 단계는 또한 침전제 및 역상(크로마토그래피) 용출 풀에 존재하는 잔류 용매를 효과적으로 제거하고 범용 품질 및 규제 사양을 준수하는 약물 물질을 얻도록 설계되었다.
상기 연속적이고 자동화된 방식으로 건조된 분말을 달성하기 위한 기기(들)의 조립은 다음과 같다:
ⅰ. 상기 장치는 필요한 내부 온도를 유지하고 (불활성) 가스를 공급하기 위한 자캣을 갖춘 SS 원통형 조립체이다. 이 실험에는 질소 가스 실린더와 줄라보 물 칠러(Julabo water chiller)를 사용하였다. 상기 온도는 25-35°C 범위로 유지되었다.
ⅱ. 80 cm2 내지 100 cm2 면적의 여과 직물을 SS 메시(mesh) 지지대 위에 놓고 조립체 안에 넣었다. 여과 직물은 PET 1703 (폴리 에스테르 직물) 및 SK-011 (폴리 프로필렌 직물)로부터 선택되었다.
ⅲ. 상기 실리콘 가스켓(silicon gasket)으로 메워진 SS 디스크로 조립체를 밀봉하고, 클램프를 조여 구획을 밀폐시킨 다음 용기 상단에서 균질의 깔끔한 현탁액(neat suspension)을 부어 가압 여과를 시작하였다.
ⅳ. 1 바(bar) 내지 2.5 바 범위의 압력에서 질소 가스를 NRV/입구 포트를 통해 적용하였다.
ⅴ. 바닥의 샘플 배출구 포트를 통해 여과액/투과액을 수집하였다.
ⅵ. 유기 용매를 이용한 단일 또는 다중 케이크 세척을 위해 'ⅲ' 및 'ⅳ' 단계를 반복하였다.
ⅶ. 유기 용매를 첨가하고 약 3분 동안 질소 가스(N2)를 추가로 통과시켜 건조를 수행한 후, 상기 조립체를 풀었다.
ⅷ. 상기 케이크를 포함한 직물을 조심스럽게 제거하고, 가볍게 두드려 케이크를 회수한 후 멸균 밀폐 된 호박색 용기로 옮기고 추가 분석 때까지 -20°C에서 보관하였다.
두 번의 시험을 수행하였다. 첫 번째는 예비 스크리닝 (시험 I)이고 두 번째 (시험 II)는 실험 계획 (design of experiment, DOE)이다.
예비 스크리닝 시험 (시험 1)은 표 4에 기술된 설계를 사용하여 상이한 유기 용매를 갖는 산업용 가압 필터 (도 2)의 실험실 규모 프로토타입에서 수행하였다. 바람직한 실시 양태에서, 아세토니트릴은 최고의 작용 유기 용매로 간주되었다. 공극 크기, 즉 결정의 보유, 질감, 상업적 규모에서의 작업성 및 공정의 pH 및 온도 조건에 대한 탄력성/불활성성에 대해 여과 직물을 연구하고 스크리닝하였다. 두 종류의 필터 직물 즉, 폴리 에스테르 직물 및 폴리 프로필렌 직물을 사용하였다. 상기 케이크에서 물을 제거하는 능력 및 휘발성 특성에 기초하여 유기 용매를 선택하였다 (표 4). 허용되는 용매에 대한 FDA 가이드 라인과 최종 약물의 잔류 한계 또한 용매 선택을 위해 고려되었다.
표 4: 용매 스크리닝 계획
시험 번호 용매 결정 현탁액 부피를 기준으로 한 용매 부피% 세척
1. 아세토니트릴
(Acetonitrile, ACN)		 5 1
2. 5 2
3. 10 1
4. 부탄올
(Butanol)		 5 1
5. 5 2
6. 10 1
7. 에탄올
(Ethanol)		 5 1
8. 5 2
9. 10 1
10. 에틸 아세테이트
(Ethyl acetate)		 5 1
11. 5 2
12. 10 1
13. 이소프로판올
(Isopropanol)		 5 1
14. 5 2
15. 10 1
16. 물
(Water)		 5 1
17. 5 2
18. 10 1
상기 설계에서 높은 비율의 LOD (건조시 손실) 값을 산출하는 용매 및 세척 조합물은 제거하였다. 데이터 세트는 표 5 및 표 6에 나타내었다.
상기 표 5 및 표 6에 수집된 데이터 세트는 생성된 인슐린 및 인슐린 유사체 약물이 최적의 생성물 회수율을 갖는 종래의 결정화-동결 건조 공정으로 제조된 약물과 유사한 품질 속성을 가지고 있음을 제안하였다 (도 3).
시험 I에서 계획된 아세토니트릴의 2회 세척은 LOD 비율에 대해 만족스러운 결과를 제공한다. 그러나, 규제 요건에 부합하기 위해서는 LOD를 더욱 감소시키는 것이 바람직하다. 이 실험 설정에서 연구된 파라미터는 다음을 포함한다: a) 세척 횟수; b) 건조 시간 및 c) 상기 여과 케이크에 남아있던 잔류 유기 용매의 증발을 촉진시키는 온도의 개연성 조사를 위한 여과 중의 온도.
시험 II (DOE)의 경우, HMWP도 결정되었다.
표 5: 용매 스크리닝 결과
세척 용매 % 결정화 3 깔끔한 현탁액 (Neat suspension, NS) 세척 1 (W1) 세척 2 (W2) - - -
NS 농도 (g/L) NS
부피 (mL) 		NS
투과액 (mL) 		W1
부피 (mL) 		W1
투과액 (mL) 		W2
부피 (mL) 		W2
투과액
(mL) 		건조시간
(min) 		DS
무게
(g) 		LOD %
16/01/2017
LP1-5%-W1 14.65 300 285 15 21 NAP NAP 1.5 5.52 26
LP1-5%-W 1 & 2 14.65 300 290 15 13 15 17.5 1.5 5.26 20.46
LB1-5%-W1 14.65 300 280 15 18 NAP NAP 1.5 6.33 35.14
LB1-5%-W 1 & 2 14.65 300 290 15 13.5 15 20 1.5 5.88 36.22
LA-5%-W1 14.65 300 290 15 14.3 NAP NAP 1.5 4.96 15.99
LA-5%-W 1 & 2 14.65 300 295 15 12.5 15 13.5 1.5 4.88 9.34
LA-10%-W1 14.65 300 290 30 29 NAP NAP 2 5.3 21.25
LP1-10%-W1 14.65 300 290 30 31.5 NAP NAP 2 5.43 21.14
LB1-10%-W 1 14.65 290 275 30 30 NAP NAP 2 5.5 25.1
LP1-5%-W1 14.65 200 190 10 9.7 NAP NAP 1.5 3.81 NAV
19/01/2017
LE-5%-W 1 & 2 14.65 300 290 15 9.8 15 18 2 5.66 22.35
LEA-5%-W1 14.65 300 290 15 21.5 NAP NAP 2 7.07 37.84
LEA-5%-W 1 & 2 14.65 300 290 15 9 15 9.6 2 6.67 34.11
LEA 10% W1 & 2 14.65 300 280 30 25.5 30 28 2 6.87 36.03
LE-5%-W 1 & 2 T1 14.65 300 290 15 18.5 15 16 2 5.44 15.75
LE-5%-W 1 & 2 T2 14.65 300 285 15 13 15 16.5 2 6.06 16.43
LA-5%-W 1 & 2 T1 14.65 300 300 15 15 15 14 2 5.38 10.52
LA-5%-W 1 & 2 T2 14.65 300 305 15 10 15 9.5 2 5.7 11.53
BOLD 의 LOD 값은 실제 값이고, 나머지는 깔끔한 현탁액(neat suspension) 제품 농도를 기준으로 이론적인 값이다.
LA: 아세토니트릴, LP1: 이소프로판올
LB1: 부탄올, LEA: 에틸 아세테이트, NS: 깔끔한 현탁액(Neat suspension), W1/2: 세척 1 및 세척 2, T1/2: 시험 1 및 시험 2; LOD: 건조시 손실; NAP: 해당사항 없음, NAV: 자료 없음
상기 반응 데이터와 함께 전체 요인 실험 설계를 표 6에 나타내었다. 하기와 같이 50개의 실험은 개별적으로 수행되었다 (표 6).
표 6: 반응 데이터를 이용한 실험 설계
일련 번호 세척 I
(% V/V) 		세척 II
(% V/V) 		세척 III
(% V/V) 		건조온도
(°C) 		건조시간(min) % LOD %
순도 		% HMWP % 손실
1 5 10 5 35 3 19.18 99.20 0.158 1.41
2 10 10 0 35 2 22.23 99.25 0.163 1.89
3 10 5 10 35 2 17.66 99.18 0.159 4.50
4 10 10 5 35 3 16.38 99.22 0.162 1.59
5 10 10 10 25 2 12.77 99.06 0.167 0.19
6 5 5 0 25 2 18.70 98.86 0.173 0.49
7 7.5 7.5 5 30 2.5 13.90 99.25 0.156 1.58
8 10 10 10 35 3 16.37 99.24 0.165 1.54
9 5 10 10 35 3 13.06 99.17 0.158 2.62
10 5 10 10 25 2 14.60 98.72 0.162 0.17
11 5 5 10 25 2 11.99 99.00 0.163 0.24
12 10 10 5 25 2 9.14 98.71 0.158 0.13
13 10 10 5 35 2 13.25 99.26 0.164 3.25
14 5 5 0 35 2 14.01 99.35 0.225 0.23
15 10 5 5 35 3 21.74 99.11 0.218 1.11
16 5 5 5 25 3 15.66 98.89 0.171 0.31
17 10 5 5 25 3 14.60 99.19 0.164 0.25
18 10 5 0 25 3 20.36 99.06 0.169 0.18
19 10 10 0 35 3 16.58 99.20 0.172 1.78
20 5 5 0 25 3 12.13 98.95 0.176 0.34
21 5 5 10 25 3 14.58 98.84 0.181 0.33
22 10 10 10 35 2 14.47 99.22 0.152 1.78
23 10 5 10 25 3 9.56 99.04 0.164 0.15
24 10 10 0 25 2 15.70 99.03 0.158 0.16
25 5 10 0 25 3 15.35 98.97 0.164 0.19
26 10 5 5 35 2 15.54 99.18 0.157 1.99
27 5 10 0 35 3 16.10 99.37 0.159 2.61
28 5 10 0 35 2 12.93 99.19 0.157 1.66
29 10 10 0 25 3 12.66 99.06 0.165 0.18
30 5 5 10 35 2 18.12 99.20 0.160 1.42
31 5 5 0 35 3 15.35 99.27 0.159 5.10
32 10 5 5 25 2 16.88 99.05 0.166 0.28
33 5 5 5 25 2 17.11 98.53 0.170 0.30
34 10 10 10 25 3 9.33 99.14 0.166 0.28
35 10 5 10 25 2 20.35 98.73 0.162 0.22
36 5 10 5 35 2 13.63 99.19 0.161 2.02
37 10 5 0 35 2 18.68 99.35 0.159 1.57
38 10 5 0 25 2 23.54 99.13 0.164 0.16
39 5 5 5 35 3 17.18 99.19 0.158 1.83
40 5 10 10 25 3 15.21 99.08 0.169 0.24
41 5 10 5 25 2 13.80 98.85 0.165 0.27
42 5 10 5 25 3 11.79 99.08 0.168 0.25
43 10 5 10 35 3 18.13 99.25 0.157 1.87
44 5 10 10 35 2 17.66 99.20 0.158 1.39
45 5 10 0 25 2 15.81 98.92 0.171 0.33
46 5 5 10 35 3 19.76 99.21 0.161 1.60
47 7.5 7.5 5 30 2.5 13.81 99.23 0.159 1.32
48 10 10 5 25 3 12.42 99.15 0.162 0.16
49 10 5 0 35 3 20.44 99.22 0.158 5.33
50 5 5 5 35 2 13.68 99.25 0.225 0.83
상기 시험 12, 23 및 34의 약물은 최저 LOD 값, 즉 10% 미만 (표 7)인 반면, 시험 11 및 42의 약물은 12% 미만의 LOD 값을 가졌다. 순도 및 HMWP 프로파일에서 유의한 변화는 없었으며, 단계별 손실은 범위 내에 있는 것으로 나타났다.
상기 변동성의 결과는 생성물 손실 비율, LOD 비율, HMWP 비율 및 순도 비율에 대해 도 4, 5, 6, 및 7에 각각 나타내었다.
표 7 : DOE (시험 II) 결과의 요약
시험 번호 세척 (% V/V) % LOD
W I W II W III
12 10 10 5 9.14
23 10 5 10 9.56
34 10 10 10 9.33
상기 다변량 연구에서, 유기 용매 (3>2>1>)로의 더 많은 세척이 필터 케이크로부터 흡수된 물의 충분한 제거를 초래한다는 것이 밝혀졌다. 10%의 세척 1, 5% 또는 10%의 세척 2 및 5% 또는 10%의 세척 3을 포함한 3회의 세척이 LOD 감소에 가장 효과적인 것으로 밝혀졌다. 세척량은 공정 요구 사항에 따라 추가로 미세 조정할 수 있다. 건조 시간이 길어지면 세척 후 케이크에 흡수된 일부 용매를 제거하는데 도움이 된다. 여과 동안 온도를 증가시키는 것은 약물 물질의 LOD를 감소시키지 않았지만, 약물 물질의 프로파일에도 크게 영향을 미치지는 않았다. 따라서, 상기 온도는 25°C 내지 35°C의 범위로 유지되었다. 이 다변량 연구를 기반으로 LOD를 4% 미만으로 낮추기 위해 추가 실험을 설계하고 실행할 수 있다.
상기 다변량 연구 결과는 만족스러웠으며 짧고, 지속적이며 자원 집약적이고 자동화된 새로운 공정에 즉각적인 관심을 끌었다

Claims (10)

  1. 하기 단계를 포함하는 가압 여과에 의해 보조되는 인슐린 또는 인슐린 유사체 결정 분리, 세척 및 건조의 단일 연속 공정:
    a) ZnCl2 및 4.5 내지 8.5 사이의 pH 조정을 이용하여 인슐린 및 인슐린 유사체의 결정 현탁액을 제조하는 단계;
    b) 단계 a)로부터 수득된 현탁액을 가압 여과 장치(unit) 80 cm2 내지 100 cm2 범위의 영역에 배치된 필터 직물에 붓는 단계;
    c) 가압 여과 장치의 입구 포트를 통해 질소 가스를 퍼지(purge)하는 단계;
    d) 가압 여과 장치의 출구 포트를 통해 여과액을 수집하는 단계;
    e) 다수의 케이크(cake) 세척을 위해 100% 유기 용매를 이용하여 단계 'b' 및 'c'를 반복하는 단계;
    f) 1 바(bar) 내지 2.5 바의 압력 범위에서 질소 가스를 통과시켜 건조시키는 단계;
    g) 건조 분말 형태의 건조 케이크를 제거하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 인슐린 또는 인슐린 유사체의 결정 크기는 1-40 μm 범위인 단일 연속 공정.
  3. 제1항에 있어서,
    조립체(assemblage) 내부의 온도가 25°C 내지 35°C의 범위로 유지되는 것인 단일 연속 공정.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 가압 여과 장치는 1-15 μm 범위의 기공 크기(size)를 가진 여과막을 갖는 것인 단일 연속 공정.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 인슐린 또는 인슐린 유사체의 결정화의 단일 연속 가압 여과 공정은 5 내지 10분 이내로 완료되는 것인 단일 연속 공정.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 직물 필터는 가압 여과 장치의 SS 메시(mesh) 지지체 상에 배치되는 것인 단일 연속 공정.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 직물 필터는 폴리에스테르 직물 및 폴리프로필렌 직물로부터 선택되는 것인 단일 연속 공정.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 100% 유기 용매는 아세토니트릴, 부탄올, 에탄올, 에틸 아세테이트 및 이소프로판올로부터 선택되는 것인 단일 연속 공정.
  9. 제1항 및 제9항에 있어서,
    상기 100% 유기 용매의 부피는 결정 현탁액 부피의 5-10%인 공정.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 바람직한 100% 유기 용매는 아세토니트릴인 것인 공정.
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