KR20200061402A - 항-cd38 항체 및 항-cd3 및 항-cd28 항체와의 조합 - Google Patents

항-cd38 항체 및 항-cd3 및 항-cd28 항체와의 조합 Download PDF

Info

Publication number
KR20200061402A
KR20200061402A KR1020207013073A KR20207013073A KR20200061402A KR 20200061402 A KR20200061402 A KR 20200061402A KR 1020207013073 A KR1020207013073 A KR 1020207013073A KR 20207013073 A KR20207013073 A KR 20207013073A KR 20200061402 A KR20200061402 A KR 20200061402A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
amino acid
sequence
acid sequence
cdr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
KR1020207013073A
Other languages
English (en)
Inventor
란 우
링 쉬
에드워드 승
로니 웨이
개리 나벨
쯔-용 양
타릭 답두비
베아트리체 카메론
상드린 르모앙
카트린 프라드
Original Assignee
사노피
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=63963620&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20200061402(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 사노피 filed Critical 사노피
Publication of KR20200061402A publication Critical patent/KR20200061402A/ko
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 CD38 폴리펩티드, 예를 들어, 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드에 결합하는 결합 단백질을 제공한다. 예를 들어, 결합 단백질은 CD38 폴리펩티드에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 도메인을 갖는 1특이성, 2특이성 또는 3특이성 결합 단백질일 수 있다. 본 발명은 또한, CD38 폴리펩티드에 결합하는 결합 단백질의 제조 방법 및 이러한 결합 단백질의 용도를 제공한다.

Description

항-CD38 항체 및 항-CD3 및 항-CD28 항체와의 조합
관련 출원에 관한 상호 참조
본 출원은 2017년 10월 10일자 출원된 미국 가출원 제62/570,655호; 2017년 10월 11일자 출원된 미국 가출원 제62/570,660호; 2018년 5월 24일자 출원된 미국 가출원 제62/676,221호; 및 2018년 8월 3일자 출원된 유럽 출원 제EP18187186.4호의 우선권 상의 이득을 청구하며, 이들 모두는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
ASCII 텍스트 파일로의 서열 목록 제출
ASCII 텍스트 파일로의 하기 제출의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다: 컴퓨터 판독가능 형태(computer readable form; CRF)의 서열 목록(파일명: 183952029941seqlist.TXT, 기록된 날짜: 2018년 10월 8일, 크기: 158 KB).
본 발명은 CD38 폴리펩티드에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 도메인을 갖는 1특이성, 2특이성 또는 3특이성 결합 단백질을 포함하는, CD38 폴리펩티드 (예를 들어, 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드)에 결합하는 결합 단백질, 및 이와 관련된 폴리뉴클레오티드, 숙주 세포, 생성 방법 및 이용 방법에 관한 것이다.
단클론 항체 기반 생물치료제가 새로운 약물 개발을 위한 중요한 방안이 되어왔다. 단클론 항체 기술은 특정 세포 집단에 특이적인 표적화, 정확한 시그널링(signaling) 전달 및/또는 페이로드(payload)를 제공하며, 그의 Fc 기능을 통하여 장시간 지속되는 생물학적 효과를 제공한다. 항체 공학에서의 노력에 의해 다양한 생물학적 응용을 위한 다수의 단클론 항체의 특이성이 조합된 다중특이성 항체가 개발되어 항체 약물 개발의 범주가 확장되었다.
CD38은 그것이 다양한 림프 종양 세포의 세포 표면 상에서 발현되기 때문에, 매력적인 약물 표적이다(문헌[Stevenson, G.T. (2006) Mol. Med. 12:345-346] 참조). DARZALEX®(다라투무맙(daratumumab))는 다발성 골수종의 치료에 사용하기 위해 승인된 항-CD38 항체이다. 그러나, CD38에 대한 고 친화성 결합, 인간과 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드 간의 교차-반응성, 림프종 세포(예를 들어, 다발성 골수종 거대 B-세포 림프종 세포주)로의 결합 및 아폽토시스 및/또는 항체-의존성 세포-매개의 세포독성(ADCC) 및 T 세포 매개의 항-종양 활성의 유도 능력을 포함하지만, 이들에 제한되지 않는 상이한 작용 방식 및/또는 개선된 특성을 갖는 CD38을 표적화하는 치료제가 필요하다.
CD38 폴리펩티드에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위를 갖는 1특이성, 2특이성 또는 3특이성 결합 단백질을 포함하는, CD38 폴리펩티드(예를 들어, 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드)에 결합하는 결합 단백질이 본원에 제공된다. 유리하게는, 이들 결합 단백질은 T 세포를 암 세포의 부근에 동원하여, 이후에, T 세포를 활성화시키고, 그랜자임(Granzyme)/퍼포린(Perforin) 메커니즘을 통한 인접한 암 세포의 활성화된 T 세포 사멸을 촉진시키는 능력을 가져, 항-종양 활성에 있어서 항-CD38 항체, 예컨대 DARZALEX®(다라투무맙)과 상이한 작용 방식을 제공한다. 더욱이, 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드 둘 모두에 결합하는 능력은 예를 들어, 이후의 임상적 이용을 위해 그들의 안전성 프로파일을 평가하기 위하여, 결합 단백질이 예비임상 독성 연구에서 용이하게 시험되게 한다.
일부 구현예에서, 인간 CD38 폴리펩티드에 결합하는 1특이성 결합 단백질이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드와 교차-반응한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 인간 아이소폼 A 및 아이소폼 E CD38 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 (임의의 조합으로) 하기의 특징 중 하나 이상을 갖는다: SPR에 의해 분석시, 정제된 단백질로서의 (예를 들어, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는) 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; SPR에 의해 분석시 1.5 nM 이하의 KD로 (예를 들어, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는) 정제된 단백질로서의 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; 유세포분석에 의해 분석시, 세포의 표면 상에 발현되는 (예를 들어, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는) 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; 유세포분석에 의해 분석시, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM 이하의 겉보기 KD로 세포의 표면 상에 발현되는 (예를 들어, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는) 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; SPR에 의해 분석시, 정제된 단백질로서의 (예를 들어, 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는) 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; SPR에 의해 분석시 3.5 nM 이하의 KD로 (예를 들어, 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는) 정제된 단백질로서의 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; 유세포분석에 의해 분석시, 세포의 표면 상에 발현되는 (예를 들어, 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는) 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; 유세포분석에 의해 분석시, 7.5 nM 이하의 겉보기 KD로 세포의 표면 상에 발현되는 (예를 들어, 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는) 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; ELISA에 의해 분석시, 정제된 단백질로서의 (예를 들어, 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는) 인간 아이소폼 E CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; 유세포분석에 의해 분석시, 세포의 표면 상에 발현되는 (예를 들어, 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는) 인간 아이소폼 E CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; 세포 표면 상에 CD38을 발현하는 세포의 아폽토시스 또는 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)을 유도함; 및 하나 이상의 돌연변이가 없는 동일한 결합 단백질에 비하여, FcγRI 및/또는 FcγRII로의 결합을 감소시키는 (예를 들어, Fc 영역 내의) 하나 이상의 돌연변이를 가짐. 예시적인 분석에 대하여, 실시예 1, 3 및 4를 참조한다. 일부 구현예에서, KD는 4℃ 또는 25℃에서 측정된다.
일부 구현예에서, 인간 CD38 폴리펩티드에 결합하는 3특이성 결합 단백질이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 3특이성 결합 단백질은 (예를 들어, 세포의 표면 상에 발현되는) CD38 폴리펩티드 및 제2 세포의 표면 상에 발현되는 하나 이상의 다른 표적 항원에 (예를 들어, 동시에) 결합하여, 그에 의해, CD38 폴리펩티드를 발현하는 세포의 부근에 제2 세포를 동원한다. 일부 구현예에서, 3특이성 결합 단백질은 (예를 들어, 세포의 표면 상에 발현되는) CD38 폴리펩티드 및 T 세포의 표면 상에 발현되는 1개 또는 2개의 표적 항원에 (예를 들어, 동시에) 결합하여, 그에 의해, CD38 폴리펩티드를 발현하는 세포의 부근에 T 세포를 동원한다. 일부 구현예에서, 3특이성 결합 단백질은 T 세포를 활성화시키고/거나 CD28-매개의 동시자극 신호를 T 세포에 제공한다. 일부 구현예에서, 3특이성 결합 단백질은 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드와 교차-반응한다. 일부 구현예에서, 3특이성 결합 단백질은 인간 아이소폼 A 및 아이소폼 E CD38 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, 3특이성 결합 단백질은 (임의의 조합으로) 하기의 특징 중 하나 이상을 갖는다: SPR에 의해 분석시, 정제된 단백질로서의 (예를 들어, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는) 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; SPR에 의해 분석시, 1.5 nM 이하의 KD로 (예를 들어, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는) 정제된 단백질로서의 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; 유세포분석에 의해 분석시, 세포의 표면 상에 발현되는 (예를 들어, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는) 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; 유세포분석에 의해 분석시, 20 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM 이하의 겉보기 KD로 세포의 표면 상에 발현되는 (예를 들어, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는) 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; SPR에 의해 분석시, 정제된 단백질로서의 (예를 들어, 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는) 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; SPR에 의해 분석시, 3.5 nM 이하의 KD로 (예를 들어, 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는) 정제된 단백질로서의 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; 유세포분석에 의해 분석시, 세포의 표면 상에 발현되는 (예를 들어, 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는) 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; 유세포분석에 의해 분석시, 7.5 nM 이하의 겉보기 KD로 세포의 표면 상에 발현되는 (예를 들어, 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는) 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; ELISA에 의해 분석시 정제된 단백질로서의 (예를 들어, 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는) 인간 아이소폼 E CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; 유세포분석에 의해 분석시, 세포의 표면 상에 발현되는 (예를 들어, 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는) 인간 아이소폼 E CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; 세포 표면 상에 CD38을 발현하는 세포의 아폽토시스 또는 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)을 유도함; 및 하나 이상의 돌연변이가 없는 동일한 결합 단백질에 비하여, FcγRI 및/또는 FcγRII로의 결합을 감소시키는 (예를 들어, Fc 영역 내의) 하나 이상의 돌연변이를 가짐; T 세포(예를 들어, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포) 증식을 유도함; Bcl-xL의 T 세포(예를 들어, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포) 발현을 유도함; CD38+ 세포의 아폽토시스를 유도함; 세포의 표면 상에 발현되는 CD38 및 T 세포의 표면 상에 발현되는 하나 이상의 T 세포 표적 항원(들)에 결합함; 세포의 표면 상에 발현되는 CD38, T 세포의 표면 상에 발현되는 CD28 및 T 세포의 표면 상에 발현되는 CD3에 결합함; T 세포 수용체의 활성화를 자극함; (예를 들어, CD28에 의해 매개되는 바와 같은) T 세포 수용체 시그널링의 동시자극을 유도함; 및 하나 이상의 돌연변이가 없는 동일한 결합 단백질에 비하여, PBMC에 의한 사이토카인 방출(예를 들어, IFN-γ, IL-2 및/또는 TNF-α)의 유도를 감소시키는 (예를 들어, Fc 영역 내의) 하나 이상의 돌연변이를 가짐; CD38+ 표적 세포의 존재 하에 PBM에 의한 사이토카인 방출(예를 들어, IFN-γ 및/또는 IL-6)을 유도함. 예시적인 분석에 대하여, 실시예 1, 3 및 4를 참조한다. 일부 구현예에서, KD는 4℃ 또는 25℃에서 측정된다.
일부 구현예에서, CD38 폴리펩티드에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 결합 단백질이 본원에 제공되며, 항원 결합 부위는 하기를 포함한다: (a) GYTFTSFN(서열 번호 31) 또는 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32) 또는 IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인; 및/또는 (b) ESVDSYGNGF(서열 번호 34) 또는 QSVSSYGQGF(서열 번호 39)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35) 또는 GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인. 일부 구현예에서, 항원 결합 부위는 하기를 포함한다: (a) GYTFTSFN(서열 번호 31) 또는 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32) 또는 IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인; 및/또는 (b) ESVDSYGNGF(서열 번호 34) 또는 QSVSSYGQG(서열 번호 132)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35) 또는 GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인. 일부 구현예에서, 항원 결합 부위는 하기를 포함한다: (a) GYTFTSFN(서열 번호 31)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인; 및/또는 (b) ESVDSYGNGF(서열 번호 34)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인. 일부 구현예에서, VH 도메인은 N-말단에서 C-말단으로, 서열, FR1―CDR-H1―FR2―CDR-H2―FR3―CDR-H3―FR4를 포함하며; FR1은 서열 QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKAS(서열 번호 86), QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKAS(서열 번호 87) 또는 QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKAS(서열 번호 88)를 포함하며; FR2는 서열 MHWVKEAPGQRLEWIGY(서열 번호 90) 또는 MHWVKEAPGQGLEWIGY(서열 번호 91)를 포함하며; FR3은 서열 NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFC(서열 번호 93) 또는 NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFC(서열 번호 94)를 포함하며; FR4는 서열 WGQGTLVTVSS(서열 번호 96)를 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하고/거나 VL 도메인은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하고/거나 VL 도메인은 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하고/거나 VL 도메인은 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하고/거나 VL 도메인은 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 부위는 하기를 포함한다: (a) GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인; 및 (b) QSVSSYGQGF(서열 번호 39)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인. 일부 구현예에서, VH 도메인은 N-말단에서 C-말단으로, 서열, FR1―CDR-H1―FR2―CDR-H2―FR3―CDR-H3―FR4를 포함하며; FR1은 서열 QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKAS(서열 번호 86), QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKAS(서열 번호 87) 또는 QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKAS(서열 번호 88)를 포함하며; FR2는 서열 MHWVKEAPGQRLEWIGY(서열 번호 90) 또는 MHWVKEAPGQGLEWIGY(서열 번호 91)를 포함하며; FR3은 서열 NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFC(서열 번호 93) 또는 NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFC(서열 번호 94)를 포함하며; FR4는 서열 WGQGTLVTVSS(서열 번호 96)를 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하고/거나 VL 도메인은 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, CD38 폴리펩티드에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 결합 단백질이 본원에 제공되며, 항원 결합 부위는 하기를 포함한다: (a) GFTFSSYG(서열 번호 41)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IWYDGSNK(서열 번호 42)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARMFRGAFDY(서열 번호 43)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인; 및 (b) QGIRND(서열 번호 44)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, AAS(서열 번호 45)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 LQDYIYYPT(서열 번호 46)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인. 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하고/거나 VL 도메인은 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 및 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 부위는 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인 및 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인과 교차-반응한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 부위는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD38 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 부위는 2.1 nM 이하의 평형 해리 상수(KD)로 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD38 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 부위는 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 인간 아이소폼 E CD38 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 부위는 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 부위는 1.3 nM 이하의 평형 해리 상수(KD)로 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드에 결합한다.
상기 구현예 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 결합 단백질은 키메라 또는 인간화된 항체이다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 인간 항체이다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 단클론 항체이다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 Fc 영역을 포함하는 하나 이상의 전장 항체 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 Fc 영역의 Fc 수용체 결합 및/또는 이펙터 기능을 감소시키거나 제거하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 인간 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 인간 IgG1 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 인간 IgG1 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1의 위치 234, 235 및 329에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하며, 아미노산 치환은 L234A, L235A 및 P329A이다. 일부 구현예에서, 인간 IgG1 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1의 위치 298, 299 및 300에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하며, 아미노산 치환은 S298N, T299A 및 Y300S이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 인간 IgG4 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 인간 IgG4 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 228 및 409에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하며, 아미노산 치환은 S228P 및 R409K이다. 일부 구현예에서, 인간 IgG4 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 234 및 235에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하며, 아미노산 치환은 F234A 및 L235A이다. 일부 구현예에서, 인간 IgG4 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 233 내지 236에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하며, 아미노산 치환은 E233P, F234V, L235A, 및 236에서의 결실이다. 일부 구현예에서, 인간 IgG4 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 233 내지 237에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하며, 서열 EFLGG는 PVAG로 대체된다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 항체 F(ab), F(ab')2, Fab'-SH, Fv 또는 scFv 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 세포독성제 또는 표지에 컨쥬게이트된다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 CD38 폴리펩티드에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위를 포함하는 2특이성 결합 단백질이다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 CD38 폴리펩티드에 결합하는 제1 항원 결합 부위, 제2 항원 결합 부위 및 제3 항원 결합 부위를 포함하는 3특이성 결합 단백질이다. 일부 구현예에서, 제1 항원 결합 부위는 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합하며, 제2 및 제3 항원 결합 부위는 각각 T-세포 표면 단백질에 결합한다. 일부 구현예에서, 제1 항원 결합 부위는 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합하며, (a) 제2 항원 결합 부위는 인간 CD28 폴리펩티드에 결합하며, 제3 항원 결합 부위는 인간 CD3 폴리펩티드에 결합하거나, (b) 제2 항원 결합 부위는 인간 CD3 폴리펩티드에 결합하며, 제3 항원 결합 부위는 인간 CD28 폴리펩티드에 결합한다.
일부 구현예에서, 각각 하나 이상의 표적 단백질에 결합하는 3개의 항원 결합 부위를 포함하는 결합 단백질이 본원에 제공되며, 3개의 항원 결합 부위 중 적어도 하나는 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인 및 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인과 교차-반응한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 서열 번호 1 또는 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD38 폴리펩티드와 교차-반응한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드와 교차-반응한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인 및 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인과 교차-반응하는 항원 결합 부위 및 각각 T-세포 표면 단백질에 결합하는 2개의 항원 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인 및 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인과 교차-반응하는 항원 결합 부위, 인간 CD28 폴리펩티드에 결합하는 항원 결합 부위 및 인간 CD3 폴리펩티드에 결합하는 항원 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 3개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 제1 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 I:
[화학식 I]
Figure pct00001
로 표시되는 구조를 포함하며;
제2 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 II:
[화학식 II]
Figure pct00002
로 표시되는 구조를 포함하며;
제3 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 III:
[화학식 III]
Figure pct00003
로 표시되는 구조를 포함하며;
제4 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 IV:
[화학식 IV]
Figure pct00004
로 표시되는 구조를 포함하며;
VL1은 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VL2는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VL3은 제3 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VH1은 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
VH2는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
VH3은 제3 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이며;
CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 도메인이며;
CH2는 면역글로불린 CH2 중쇄 불변 도메인이며;
CH3은 면역글로불린 CH3 중쇄 불변 도메인이며;
힌지는 CH1 및 CH2 도메인을 연결하는 면역글로불린 힌지 영역이며;
L1, L2, L3 및 L4는 아미노산 링커이며;
화학식 I의 폴리펩티드와 화학식 II의 폴리펩티드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성하며,
(a) VH1 도메인은 GYTFTSFN(서열 번호 31) 또는 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32) 또는 IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, VL1 도메인은 ESVDSYGNGF(서열 번호 34) 또는 QSVSSYGQGF(서열 번호 39)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35) 또는 GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하거나;
(b) VH2 도메인은 GYTFTSFN(서열 번호 31) 또는 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32) 또는 IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, VL2 도메인은 ESVDSYGNGF(서열 번호 34) 또는 QSVSSYGQGF(서열 번호 39)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35) 또는 GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하거나;
(c) VH3 도메인은 GYTFTSFN(서열 번호 31) 또는 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32) 또는 IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, VL3 도메인은 ESVDSYGNGF(서열 번호 34) 또는 QSVSSYGQGF(서열 번호 39)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35) 또는 GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 3개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 제1 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 I:
[화학식 I]
Figure pct00005
로 표시되는 구조를 포함하며;
제2 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 II:
[화학식 II]
Figure pct00006
로 표시되는 구조를 포함하며;
제3 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 III:
[화학식 III]
Figure pct00007
로 표시되는 구조를 포함하며;
제4 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 IV:
[화학식 IV]
Figure pct00008
로 표시되는 구조를 포함하며;
VL1은 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VL2는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VL3은 제3 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VH1은 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
VH2는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
VH3은 제3 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이며;
CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 도메인이며;
CH2는 면역글로불린 CH2 중쇄 불변 도메인이며;
CH3은 면역글로불린 CH3 중쇄 불변 도메인이며;
힌지는 CH1 및 CH2 도메인을 연결하는 면역글로불린 힌지 영역이며;
L1, L2, L3 및 L4는 아미노산 링커이며;
화학식 I의 폴리펩티드와 화학식 II의 폴리펩티드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성하며,
(a) VH1 도메인은 GYTFTSFN(서열 번호 31) 또는 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32) 또는 IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, VL1 도메인은 ESVDSYGNGF(서열 번호 34) 또는 QSVSSYGQG(서열 번호 132)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35) 또는 GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하거나;
(b) VH2 도메인은 GYTFTSFN(서열 번호 31) 또는 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32) 또는 IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, VL2 도메인은 ESVDSYGNGF(서열 번호 34) 또는 QSVSSYGQG(서열 번호 132)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35) 또는 GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하거나;
(c) VH3 도메인은 GYTFTSFN(서열 번호 31) 또는 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32) 또는 IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, VL3 도메인은 ESVDSYGNGF(서열 번호 34) 또는 QSVSSYGQG(서열 번호 132)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35) 또는 GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH1 도메인은 GYTFTSFN(서열 번호 31)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, VL1 도메인은 ESVDSYGNGF(서열 번호 34)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하거나; VH1 도메인은 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, VL1 도메인은 QSVSSYGQGF(서열 번호 39)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하거나; VH2 도메인은 GYTFTSFN(서열 번호 31)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, VL2 도메인은 ESVDSYGNGF(서열 번호 34)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하거나; VH2 도메인은 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, VL2 도메인은 QSVSSYGQGF(서열 번호 39)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하거나; VH3 도메인은 GYTFTSFN(서열 번호 31)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, VL3 도메인은 ESVDSYGNGF(서열 번호 34)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하거나; VH3 도메인은 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, VL3 도메인은 QSVSSYGQGF(서열 번호 39)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH3 도메인은 GYTFTSFN(서열 번호 31)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, VL3 도메인은 ESVDSYGNGF(서열 번호 34)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하거나; 또는 VH3 도메인은 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, VL3 도메인은 QSVSSYGQGF(서열 번호 39)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH3 도메인은 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하며, VL3 도메인은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나; VH3 도메인은 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하며, VL3 도메인은 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하거나; VH3 도메인은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하며, VL3 도메인은 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하거나; VH3 도메인은 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하며, VL3 도메인은 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 VH3 도메인은 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하며, VL3 도메인은 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 3개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 제1 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 I:
[화학식 I]
Figure pct00009
로 표시되는 구조를 포함하며;
제2 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 II:
[화학식 II]
Figure pct00010
로 표시되는 구조를 포함하며;
제3 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 III:
[화학식 III]
Figure pct00011
로 표시되는 구조를 포함하며;
제4 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 IV:
[화학식 IV]
Figure pct00012
로 표시되는 구조를 포함하며;
VL1은 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VL2는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VL3은 제3 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VH1은 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
VH2는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
VH3은 제3 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이며;
CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 도메인이며;
CH2는 면역글로불린 CH2 중쇄 불변 도메인이며;
CH3은 면역글로불린 CH3 중쇄 불변 도메인이며;
힌지는 CH1 및 CH2 도메인을 연결하는 면역글로불린 힌지 영역이며;
L1, L2, L3 및 L4는 아미노산 링커이며;
화학식 I의 폴리펩티드와 화학식 II의 폴리펩티드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성하며,
(a) VH1 도메인은 GFTFSSYG(서열 번호 41)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IWYDGSNK(서열 번호 42)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARMFRGAFDY(서열 번호 43)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, VL1 도메인은 QGIRND(서열 번호 44)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, AAS(서열 번호 45)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 LQDYIYYPT(서열 번호 46)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하거나;
(b) VH2 도메인은 GFTFSSYG(서열 번호 41)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IWYDGSNK(서열 번호 42)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARMFRGAFDY(서열 번호 43)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, VL2 도메인은 QGIRND(서열 번호 44)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, AAS(서열 번호 45)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 LQDYIYYPT(서열 번호 46)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하거나;
(c) VH3 도메인은 GFTFSSYG(서열 번호 41)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IWYDGSNK(서열 번호 42)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARMFRGAFDY(서열 번호 43)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, VL3 도메인은 QGIRND(서열 번호 44)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, AAS(서열 번호 45)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 LQDYIYYPT(서열 번호 46)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH3 도메인은 GFTFSSYG(서열 번호 41)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IWYDGSNK(서열 번호 42)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARMFRGAFDY(서열 번호 43)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, VL3 도메인은 QGIRND(서열 번호 44)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, AAS(서열 번호 45)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 LQDYIYYPT(서열 번호 46)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH3 도메인은 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하며, VL3 도메인은 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH1 도메인은 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하며, VL1 도메인은 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하며, VH2 도메인은 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하며, VL2 도메인은 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하거나; VH2 도메인은 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하며, VL2 도메인은 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하며, VH1 도메인은 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하며, VL1 도메인은 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하거나; VH1 도메인은 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하며, VL1 도메인은 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하며, VH2 도메인은 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하며, VL2 도메인은 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하거나; VH2 도메인은 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하며, VL2 도메인은 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하며, VH1 도메인은 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하며, VL1 도메인은 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하거나, VH1 도메인은 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하며, VL1 도메인은 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하며, VH2 도메인은 서열 번호 84의 아미노산 서열을 포함하며, VL2 도메인은 서열 번호 85의 아미노산 서열을 포함하거나; VH2 도메인은 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하며, VL2 도메인은 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하며, VH1 도메인은 서열 번호 84의 아미노산 서열을 포함하며, VL1 도메인은 서열 번호 85의 아미노산 서열을 포함하거나; VH1 도메인은 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하며, VL1 도메인은 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하며, VH2 도메인은 서열 번호 84의 아미노산 서열을 포함하며, VL2 도메인은 서열 번호 85의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 VH2 도메인은 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하며, VL2 도메인은 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하며, VH1 도메인은 서열 번호 84의 아미노산 서열을 포함하며, VL1 도메인은 서열 번호 85의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH1 도메인은 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하며, VL1 도메인은 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하며, VH2 도메인은 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하며, VL2 도메인은 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하며, VH3 도메인은 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하며, VL3 도메인은 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 VH1 도메인은 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하며, VL1 도메인은 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하며, VH2 도메인은 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하며, VL2 도메인은 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하며, VH3 도메인은 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하며, VL3 도메인은 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, L1, L2, L3 또는 L4 중 적어도 하나는 독립적으로 길이가 0개 아미노산이다. 일부 구현예에서, L1, L2, L3 또는 L4는 각각 독립적으로 길이가 적어도 1개의 아미노산이다. 일부 구현예에서, (a) L1, L2, L3 및 L4는 각각 독립적으로 길이가 0개의 아미노산이거나, GGGGSGGGGS(서열 번호 55), GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 56), S, RT, TKGPS(서열 번호 57), GQPKAAP(서열 번호 58) 및 GGSGSSGSGG(서열 번호 59)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하거나; 또는 (b) L1, L2, L3 및 L4는 각각 독립적으로 GGGGSGGGGS(서열 번호 55), GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 56), S, RT, TKGPS(서열 번호 57), GQPKAAP(서열 번호 58) 및 GGSGSSGSGG(서열 번호 59)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, L1은 서열 GQPKAAP(서열 번호 58)를 포함하며, L2는 서열 TKGPS(서열 번호 57)를 포함하며, L3은 서열 S를 포함하며, L4는 서열 RT를 포함하거나; L1은 서열 GGGGSGGGGS(서열 번호 55)를 포함하며, L2는 서열 GGGGSGGGGS(서열 번호 55)를 포함하며, L3은 길이가 0개의 아미노산이며, L4는 길이가 0개의 아미노산이거나; L1은 서열 GGSGSSGSGG(서열 번호 59)를 포함하며, L2는 서열 GGSGSSGSGG(서열 번호 59)를 포함하며, L3은 길이가 0개의 아미노산이며, L4는 길이가 0개의 아미노산이거나; 또는 L1은 서열 GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 56)를 포함하며, L2는 길이가 0개의 아미노산이며, L3은 서열 GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 56)를 포함하며, L4는 길이가 0개의 아미노산이다. 일부 구현예에서, 제2 및 제3 폴리펩티드 사슬의 힌지-CH2-CH3 도메인은 인간 IgG4 힌지-CH2-CH3 도메인이며, 힌지-CH2-CH3 도메인은 각각 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 234 및 235에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하며, 아미노산 치환은 F234A 및 L235A이다. 일부 구현예에서, 제2 및 제3 폴리펩티드 사슬의 힌지-CH2-CH3 도메인은 인간 IgG4 힌지-CH2-CH3 도메인이며, 힌지-CH2-CH3 도메인은 각각 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 233 내지 236에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하며, 아미노산 치환은 E233P, F234V, L235A, 및 236에서의 결실이다. 일부 구현예에서, 제2 및 제3 폴리펩티드 사슬의 힌지-CH2-CH3 도메인은 인간 IgG4 힌지-CH2-CH3 도메인이며, 힌지-CH2-CH3 도메인은 각각 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 228 및 409에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하며, 아미노산 치환은 S228P 및 R409K이다. 일부 구현예에서, 제2 및 제3 폴리펩티드 사슬의 힌지-CH2-CH3 도메인은 인간 IgG1 힌지-CH2-CH3 도메인이며, 힌지-CH2-CH3 도메인은 각각 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1의 위치 234, 235 및 329에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하며, 아미노산 치환은 L234A, L235A 및 P329A이다. 일부 구현예에서, 제2 및 제3 폴리펩티드 사슬의 힌지-CH2-CH3 도메인은 인간 IgG1 힌지-CH2-CH3 도메인이며, 힌지-CH2-CH3 도메인은 각각 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1의 위치 298, 299 및 300에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하며, 아미노산 치환은 S298N, T299A 및 Y300S이다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 사슬의 힌지-CH2-CH3 도메인은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 349, 366, 368 및 407에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하며, 아미노산 치환은 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V이며; 제3 폴리펩티드 사슬의 힌지-CH2-CH3 도메인은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 354 및 366에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하며, 아미노산 치환은 S354C 및 T366W이다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 사슬의 힌지-CH2-CH3 도메인은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 354 및 366에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하며, 아미노산 치환은 S354C 및 T366W이며; 제3 폴리펩티드 사슬의 힌지-CH2-CH3 도메인은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 349, 366, 368 및 407에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하며, 아미노산 치환은 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V이다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하며, 제2 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함하며, 제3 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 62의 아미노산 서열을 포함하며, 제4 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하며, 제2 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하며, 제3 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하며, 제4 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하며, 제2 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하며, 제3 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하며, 제4 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하며, 제2 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함하며, 제3 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하며, 제4 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하며, 제2 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하며, 제3 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하며, 제4 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하며, 제2 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하며, 제3 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 71의 아미노산 서열을 포함하며, 제4 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 각각 하나 이상의 표적 단백질에 결합하는 3개의 항원 결합 부위를 포함하는 결합 단백질이 본원에 제공되며, 결합 단백질은 3개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 제1 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 I:
[화학식 I]
Figure pct00013
로 표시되는 구조를 포함하며;
제2 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 II:
[화학식 II]
Figure pct00014
로 표시되는 구조를 포함하며;
제3 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 III:
[화학식 III]
Figure pct00015
로 표시되는 구조를 포함하며;
제4 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 IV:
[화학식 IV]
Figure pct00016
로 표시되는 구조를 포함하며;
VL1은 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VL2는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VL3은 제3 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VH1은 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
VH2는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
VH3은 제3 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이며;
CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 도메인이며;
CH2는 면역글로불린 CH2 중쇄 불변 도메인이며;
CH3은 면역글로불린 CH3 중쇄 불변 도메인이며;
힌지는 CH1 및 CH2 도메인을 연결하는 면역글로불린 힌지 영역이며;
L1, L2, L3 및 L4는 아미노산 링커이며;
화학식 I의 폴리펩티드와 화학식 II의 폴리펩티드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성하며,
(a) 제2 및 제3 폴리펩티드 사슬의 힌지-CH2-CH3 도메인은 인간 IgG1 힌지-CH2-CH3 도메인이며, 힌지-CH2-CH3 도메인은 각각 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1의 위치 298, 299 및 300에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하며, 아미노산 치환은 S298N, T299A 및 Y300S이거나; 또는 (b) 제2 및 제3 폴리펩티드 사슬의 힌지-CH2-CH3 도메인은 인간 IgG4 힌지-CH2-CH3 도메인이며, 힌지-CH2-CH3 도메인은 각각 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 233 내지 236에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하며, 아미노산 치환은 E233P, F234V, L235A, 및 236에서의 결실이다. 일부 구현예에서, 인간 IgG4 힌지-CH2-CH3 도메인은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 233 내지 237에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하며, 서열 EFLGG는 PVAG로 대체된다. 일부 구현예에서, VH1 및 VL1, VH2 및 VL2, 및 VH3 및 VL3 중 적어도 하나의 쌍은 CD38 폴리펩티드에 결합하는 항원 결합 부위를 형성한다. 일부 구현예에서, VH1 및 VL1, VH2 및 VL2, 및 VH3 및 VL3 중 1개, 2개 또는 3개의 쌍은 A2AR, APRIL, ATPDase, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4, B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL15, CCL17, CCL19, CCL20, CCL21, CCL24, CCL25, CCL26, CCR3, CCR4, CD3, CD19, CD20, CD23, CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80, CD86, CD122, CD137, CD137L, CD152, CD154, CD160, CD272, CD273, CD274, CD275, CD276, CD278, CD279, CDH1, 키티나제, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1, CSF-2, CSF-3, CX3CL1, CXCL12, CXCL13, CXCR3, DNGR-1, 엑토뉴클레오시드 트리포스페이트 디포스포하이드롤라제 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNα, IgE, IGF1R, IL2R베타, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb, IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4, ITK, KIR, LAG3, LAMP1, 렙틴, LPFS2, MHC 부류 II, NCR3LG1, NKG2D, NTPDase-1, OX40, OX40L, PD-1H, 혈소판 수용체, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2, STEAP2, Syk 키나제, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP, TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM 및 XCR1로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원 표적에 결합하는 항원 결합 부위를 형성한다. 일부 구현예에서, VH1 및 VL1, VH2 및 VL2, 및 VH3 및 VL3 중 제1 쌍은 인간 CD3 폴리펩티드에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하며, VH1 및 VL1, VH2 및 VL2, 및 VH3 및 VL3 중 제2 쌍은 인간 CD28 폴리펩티드에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하며, VH1 및 VL1, VH2 및 VL2, 및 VH3 및 VL3 중 제3 쌍은 A2AR, APRIL, ATPDase, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4, B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL15, CCL17, CCL19, CCL20, CCL21, CCL24, CCL25, CCL26, CCR3, CCR4, CD3, CD19, CD20, CD23, CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80, CD86, CD122, CD137, CD137L, CD152, CD154, CD160, CD272, CD273, CD274, CD275, CD276, CD278, CD279, CDH1, 키티나제, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1, CSF-2, CSF-3, CX3CL1, CXCL12, CXCL13, CXCR3, DNGR-1, 엑토뉴클레오시드 트리포스페이트 디포스포하이드롤라제 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNα, IgE, IGF1R, IL2R베타, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb, IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4, ITK, KIR, LAG3, LAMP1, 렙틴, LPFS2, MHC 부류 II, NCR3LG1, NKG2D, NTPDase-1, OX40, OX40L, PD-1H, 혈소판 수용체, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2, STEAP2, Syk 키나제, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP, TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM 및 XCR1로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 항원 표적에 결합하는 항원 결합 부위를 형성한다.
일부 구현예에서, 하기를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 키트가 본원에 제공된다: (a) 서열 번호 73의 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 72의 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 74의 서열을 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 75의 서열을 포함하는 제4 폴리뉴클레오티드; (b) 서열 번호 73의 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 76의 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 77의 서열을 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 75의 서열을 포함하는 제4 폴리뉴클레오티드; (c) 서열 번호 73의 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 78의 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 79의 서열을 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 75의 서열을 포함하는 제4 폴리뉴클레오티드; (d) 서열 번호 73의 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 72의 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 80의 서열을 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 81의 서열을 포함하는 제4 폴리뉴클레오티드; (e) 서열 번호 73의 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 76의 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 82의 서열을 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 81의 서열을 포함하는 제4 폴리뉴클레오티드; 또는 (f) 서열 번호 73의 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 78의 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 83의 서열을 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 81의 서열을 포함하는 제4 폴리뉴클레오티드.
일부 구현예에서, 상기 구현예 중 어느 하나의 결합 단백질을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 구현예 중 어느 하나의 결합 단백질을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터가 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 상기 구현예 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드의 키트, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포가 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 결합 단백질의 생성 방법이 본원에 제공되며, 당해 방법은 상기 구현예 중 어느 하나의 숙주 세포를 배양하여, 결합 단백질이 생성되게 하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 당해 방법은 숙주 세포로부터 결합 단백질을 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 구현예 중 어느 하나의 결합 단백질 및 제약상 허용 가능한 담체를 포함하는 제약 조성물이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 치료적 유효량의 상기 구현예 중 어느 하나의 적어도 하나의 결합 단백질 또는 상기 구현예 중 어느 하나의 제약 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 환자에서의 암의 예방 및/또는 치료 방법이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 CD3에 결합하는 제1 항원 결합 부위, CD28에 결합하는 제2 항원 결합 부위 및 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합하는 제3 항원 결합 부위를 포함하는 3특이성 결합 단백질이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 결합 단백질은 화학치료제와 동시-투여된다. 일부 구현예에서, 암은 다발성 골수종이다. 일부 구현예에서, 암은 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 또는 B 세포 림프종이다. 일부 구현예에서, 환자는 인간이다. 일부 구현예에서, 환자는 암의 세포가 이의 세포 표면 상에 (예를 들어, 서열 번호 105에 제시된 바와 같은) 인간 CD38 아이소폼 E 폴리펩티드를 발현하기 때문에 치료를 위해 선택된다. 일부 구현예에서, 암 세포는 CD38 및 CD28을 발현한다. 일부 구현예에서, 암 세포는 CD38을 발현하며, CD28을 발현하지 않는다.
일부 구현예에서, 환자(예를 들어, 그를 필요로 하는 환자, 예컨대 암을 갖는 환자)에서 암의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 상기 구현예 중 어느 하나의 적어도 하나의 결합 단백질 또는 상기 구현예 중 어느 하나의 제약 조성물이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 환자(예를 들어, 그를 필요로 하는 환자, 예컨대 암을 갖는 환자)에서 암의 예방 및/또는 치료용 의약의 제조에 사용하기 위한 상기 구현예 중 어느 하나의 적어도 하나의 결합 단백질 또는 상기 구현예 중 어느 하나의 제약 조성물이 본원에 제공된다. 상기 구현예 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 결합 단백질은 CD3에 결합하는 제1 항원 결합 부위, CD28에 결합하는 제2 항원 결합 부위 및 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합하는 제3 항원 결합 부위를 포함하는 3특이성 결합 단백질이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 결합 단백질은 화학치료제와 동시-투여될 것이다. 일부 구현예에서, 암은 다발성 골수종이다. 일부 구현예에서, 암은 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 또는 B 세포 림프종이다. 일부 구현예에서, 환자는 인간이다. 일부 구현예에서, 환자는 암의 세포가 이의 세포 표면 상에 (예를 들어, 서열 번호 105에 제시된 바와 같은) 인간 CD38 아이소폼 E 폴리펩티드를 발현하기 때문에 치료를 위해 선택된다. 일부 구현예에서, 암 세포는 CD38 및 CD28을 발현한다. 일부 구현예에서, 암 세포는 CD38을 발현하며, CD28을 발현하지 않는다.
본원에 기술된 다양한 구현예의 특성 중 하나, 일부, 또는 전부는 본 발명의 다른 구현예를 형성하도록 조합될 수 있음이 이해되어야 한다. 본 발명의 이들 측면 및 다른 측면은 당업자에게 명백해질 것이다. 본 발명의 이들 구현예 및 다른 구현예는 하기 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용에 의해 추가로 설명된다.
본 특허 또는 출원 파일은 컬러로 작도된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)을 지닌 이러한 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 요청 및 필요한 수수료의 지불 시에 특허청에 의해 제공될 것이다.
도 1a는 유세포분석을 사용한 SU-DHL-8 인간 림프종 세포 또는 MOLP-8 인간 다발성 골수종 세포로의 항-CD38 항체 mAb1(상부) 및 이사툭시맙(isatuximab)(하부)의 결합을 보여준다.
도 1b는 표면 상에 시노몰구스 원숭이 CD38을 발현하는 세포로의 항-CD38 항체 mAb1 또는 이사툭시맙(결합이 관찰되지 않음)의 결합을 시험하는 유세포분석 결합 분석의 결과를 보여준다.
도 2a 내지 도 2i는 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드로의 항-CD38 항체의 결합을 특징화하는 분석의 결과를 보여준다. 도 2a는 ELISA에 의한 가용성 인간 CD38(상부, "hCD38::Histag") 또는 시노몰구스 원숭이 CD38(상부, "cynoCD38::Histag")로의 인간화된 항-CD38 항체 mAb2의 결합, 및 유세포분석에 의한 인간 CD83(하부, 표기된 바와 같음) 또는 시노몰구스 원숭이 CD38(하부, 표기된 바와 같음)을 발현하는 세포의 표면으로의 mAb2의 결합을 보여준다. 도 2b는 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의한 인간 CD38(상부) 또는 시노몰구스 원숭이 CD38(하부)로의 mAb2의 결합을 보여준다. 도 2c는 ELISA에 의한 가용성 인간 CD38(상부, "hCD38::Histag") 또는 시노몰구스 원숭이 CD38(상부, "cynoCD38::Histag")로의 인간화된 항-CD38 항체 mAb3의 결합 및 유세포분석에 의한 인간 CD83(하부, 표기된 바와 같음) 또는 시노몰구스 원숭이 CD38(하부, 표기된 바와 같음)을 발현하는 세포의 표면으로의 mAb3의 결합을 보여준다. 도 2d는 SPR에 의한 인간 CD38(상부) 또는 시노몰구스 원숭이 CD38(하부)로의 mAb3의 결합을 보여준다. 도 2e는 ELISA에 의한 가용성 인간 CD38(상부, "hCD38::Histag") 또는 시노몰구스 원숭이 CD38(상부, "cynoCD38::Histag")로의 인간화된 항-CD38 항체 mAb5의 결합, 및 유세포분석에 의한 인간 CD83(하부, 표기된 바와 같음) 또는 시노몰구스 원숭이 CD38(하부, 표기된 바와 같음)을 발현하는 세포의 표면으로의 mAb5의 결합을 보여준다. 도 2f는 SPR에 의한 인간 CD38(상부) 또는 시노몰구스 원숭이 CD38(하부)로의 mAb5의 결합을 보여준다. 도 2g는 ELISA에 의한 가용성 인간 CD38(상부, "hCD38::Histag") 또는 시노몰구스 원숭이 CD38(상부, "cynoCD38::Histag")로의 인간 항-CD38 항체 hhy1370의 결합, 및 유세포분석에 의한 인간 CD83(하부, 표기된 바와 같음) 또는 시노몰구스 원숭이 CD38(하부, 표기된 바와 같음)을 발현하는 세포의 표면으로의 hhy1370의 결합을 보여준다. 도 2h는 SPR에 의한 인간 CD38(상부) 또는 시노몰구스 원숭이 CD38(하부)로의 hhy1370의 결합을 보여준다. 도 2i는 ELISA, SPR 및 FACS 실험으로부터의 결합 데이터 및 인간 V 영역 서열에 대한 각 항체 VH("H") 또는 VL("L") 도메인의 동일성 백분율을 요약한 것이며, 상부에서 하부로, 그것은 mAb2, mAb3, mAb 4, mAb 5 및 mAb6 마지막 줄에 상응한다(1195 HHKK-3은 아래의 본문에 그의 VL/VH 아미노산 서열에 의해 기술되지 않는다).
도 2j는 37℃에서 72시간 동안의 인큐베이션 후에 mAb7 및 mAb1에 의한 SU-DHL-8 세포 아폽토시스의 농도-의존적 유도를 보여준다.
도 2k는 NK92 세포의 존재 하에서 SU-DHL-8 세포에 대한 이사툭시맙 및 mAb1의 항체-의존성 세포-매개의 세포독성(ADCC) 활성을 보여준다.
도 2l은 37℃에서 4시간 후에, NK92 세포의 존재 하에서 SU-DHL-8 세포에 대한 이사툭시맙(우측) 및 mAb1(좌측)의 농도-의존적 항체-의존적 세포-매개의 세포독성(ADCC) 활성을 보여준다.
도 2m 내지 도 2q는 SU-DHL-8 종양 세포에 대한 표기된 항-CD38 항체를 사용한 아폽토시스 유도 분석의 결과를 보여준다. 유세포분석을 통해 이중 아넥신(Annexin) V 및 프로피듐 요오드화물 흡수를 측정함으로써 아폽토시스를 정량화하였다. 도 2m은 각각의 항체에 의해 유도되는 아폽토시스 세포의 백분율을 보여준다. 도 2n 내지 도 2q는 항-CD38 항체 mAb2(도 2n), mAb3(도 2o), mAb4(도 2p) 및 mAb5(도 2q)에 의한 SU-DHL-8 림프종 세포에서의 아폽토시스의 용량-의존적 유도, 및 각각의 항체에 대한 IC50을 보여준다.
도 3a는 3개의 표적 단백질: CD28, CD3 및 CD38에 결합하는 3개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 3특이성 결합 단백질의 개략도를 제공한다. 제1 폴리펩티드 쌍은 CD3 및 CD28을 인식하는 2개의 항원 결합 부위를 형성하는 교차 배향(VH1-VH2 및 VL2-VL1)을 갖는 이중 가변 도메인을 가지며, 제2 폴리펩티드 쌍은 CD38을 인식하는 단일의 항원 결합 부위를 형성하는 단일의 가변 도메인(VH3 및 VL3)을 갖는다. 도 3a에 나타낸 3특이성 결합 단백질은 "놉-인투-홀(knobs-into-holes)" 돌연변이를 갖는 IgG4 불변 영역을 이용하며, 여기서, 놉은 단일의 가변 도메인을 갖는 제2 폴리펩티드 쌍 상에 있다.
도 3b는 항-CD38/항-CD28/항-CD3 3특이성 결합 단백질의 각각의 항원 결합 도메인이 그의 동족 항원에 결합하는 능력을 시험하기 위한 SPR-기반의 분석의 개략도를 제공한다.
도 3c는 항-CD38/항-CD28/항-CD3 3특이성 결합 단백질에 결합하는 CD38을 시험하기 위한 SPR-기반의 분석의 결과를 보여준다. 3특이성 결합 단백질로의 인간 CD38의 결합을 단독으로(상부 좌측), CD3과의 사전-결합 후에(상부 중앙), CD28과의 사전-결합 후에(상부 우측), CD3에 이어서 CD28로의 사전-결합 후에(하부 좌측) 또는 CD28에 이어서 CD3으로의 사전-결합 후에(하부 우측) 시험하였다.
도 4는 SPR에 의해 분석시, 항-CD38/항-CD28/항-CD3 3특이성 결합 단백질로의 인간 CD3, CD28 및 CD38 폴리펩티드의 순차적 결합을 보여준다.
도 5는 SPR에 의해 측정시, 그들의 동족 항원(인간 CD3, CD28 및 CD38)에 대한 표기된 3특이성 결합 단백질의 결합 친화도를 요약한 것이다.
도 6a는 유세포분석에 의해 분석시, 인간(상부) 또는 시노몰구스 원숭이(하부) CD38 폴리펩티드로의 결합에 대한 인간 IgG1 포맷(제2장), 또는 이사툭시맙, 항-CD28 및 항-CD3 항원 결합 도메인을 갖는 3특이성 결합 단백질 포맷(도 3a에 따른 포맷; 제1장)의 이사툭시맙 항원 결합 도메인의 겉보기 친화도를 비교한 것이다.
도 6b 내지 도 6d는 유세포분석에 의해 분석시, 인간 또는 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드를 발현하는 세포로의 결합에 대한 3특이성 결합 단백질 CD38VH1xCD28supxCD3mid, CD38VH1xCD28cvnxCD3mid, 또는 1특이성 항-CD38 항체 mAb2의 겉보기 친화도를 비교한 것이다. 도 6b는 인간(상부) 또는 시노몰구스 원숭이(하부) CD38 폴리펩티드를 발현하는 세포로의 3특이성 결합 단백질 CD38VH1xCD28supxCD3mid의 결합을 보여준다. 도 6c는 인간(상부) 또는 시노몰구스 원숭이(하부) CD38 폴리펩티드를 발현하는 세포로의 3특이성 결합 단백질 CD38VH1xCD28cvnxCD3mid의 결합을 보여준다. 도 6d는 인간(상부) 또는 시노몰구스 원숭이(하부) CD38 폴리펩티드를 발현하는 세포로의 1특이성 항-CD38 항체 mAb2의 결합을 보여준다.
도 6e는 유세포분석에 의해 분석시, 인간(상부) 또는 시노몰구스 원숭이(하부) CD38 폴리펩티드를 발현하는 세포로의 결합에 대한 3특이성 결합 단백질 CD38HHY1370xCD28supxCD3mid 또는 1특이성 항-CD38 항체 mAb6의 겉보기 친화도를 비교한 것이다.
도 6f는 SPR 또는 유세포분석(FACS)에 의해 측정시, 인간 CD38에 대한 표기된 항-CD38x항-CD28x항-CD3 3특이성 결합 단백질의 결합 친화도를 요약한 것이다.
도 6g는 유세포분석에 의해 분석시, 인간(상부) 또는 시노몰구스 원숭이(하부) CD38 폴리펩티드를 발현하는 세포로의 결합에 대한 항-CD38 항원 결합 도메인이 결여된 3특이성 결합 단백질 ΔCD38VH1xCD28supxCD3mid의 겉보기 친화도를 보여준다.
도 7a 및 도 7b는 인간 및 레서스 원숭이 CD3, CD28 및 CD38 폴리펩티드에 대한 다양한 항-CD38 x CD28 x CD3 IgG4 3특이성 결합 단백질, 또는 대조군 항체의 결합 친화도를 결정하는 ELISA 분석의 결과를 보여준다.
도 8a 내지 도 8d는 표기된 항-CD38 x CD28 x CD3 3특이성 결합 단백질 및 대조군 항체를 사용한 3명의 상이한 인간 공여자로부터의 PBMC에 의한 CD38+ 세포의 항체-매개 특이적 사멸의 결과를 보여준다. 다발성 골수종 세포주 RPMI8266(도 8a), NCI-H929(도 8b), KMS-26(도 8c) 및 KMS-11 세포주(도 8d)를 사용한 대표적인 결과가 나타나 있으며, EC50 값은 표 N에 제공되어 있다. NCI-H929, KMS-26 및 KMS-11 세포를 사용하여 수득되는 EC50 값은 표 O 내지 표 Q에 제공되어 있다.
도 8e 및 도 8f는 변이체 Fc 영역을 갖는 표기된 항-CD38 x CD28 x CD3 3특이성 결합 단백질과 대조군 항체를 사용한, 2명의 상이한 공여자로부터의 PBMC에 의한 CD38+ 세포의 항체-매개 특이적 사멸의 결과를 보여준다. CD38+ KMS-11(도 8d) 및 U266(도 8e) 세포주를 사용한 대표적인 결과가 나타나 있으며, EC50 값은 표 Q2 및 표 Q3에 제공되어 있다.
도 9a, 도 9b 및 도 10은 24시간 동안 다양한 항-CD38 x CD28 x CD3 3특이성 결합 단백질 또는 대조군 항체로 처리된 인간 T 세포의 활성화(CD69+)를 보여준다. 도 9a는 인간 CD3+ T 세포의 활성화(CD69+)를 보여준다. 도 9b는 인간 CD3+ CD4+ T 세포의 활성화(CD69+)를 보여준다. 도 10은 인간 CD3+ CD8+ T 세포의 활성화(CD69+)를 보여준다.
도 11a 내지 도 11b는 문헌[Stebbings, R. et al. (2007) J. Immunol. 179:3325-3331]에 기술된 바와 같은 건조된 플레이트 방법에 기초한 표기된 항-CD38 x CD28 x CD3 3특이성 결합 단백질 또는 대조군 항체로 처리된 인간 PBMC의 시험관내 사이토카인 방출 평가의 결과를 보여준다. 도 11a는 5 ㎍/㎖의 표기된 항체를 사용한 결과를 보여준다. 도 11b는 25 ng/㎖의 표기된 항체를 사용한 결과를 보여준다.
도 12a 내지 도 12e는 RPMI-8226 다발성 골수종 세포가 이식된 CD34+ 제대혈 세포 인간화된 NSG 마우스 모델에서의 항-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid) 3특이성 결합 단백질의 생체내 활성을 보여준다. 도 12a는 표기된 농도의 항-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid) 3특이성 결합 단백질로 처리된 마우스 대 항-CD3/CD38 2특이성 항체로 처리된 마우스에서의 종양 부피의 변화를 보여준다. 도 12b는 표기된 농도의 항-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid) 3특이성 결합 단백질로 처리된 마우스 대 항-CD3/CD38 2특이성 항체로 처리된 마우스에서의 제18일의 평균 종양 부피를 보여준다. 도 12c는 표기된 농도의 항-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid) 3특이성 결합 분자로 처리된 마우스 대 항-CD3/CD38 2특이성 항체로 처리된 마우스에서의 평균 최종 종양 중량을 보여준다. 도 12d는 표기된 농도의 항-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid) 3특이성 결합 단백질로 처리된 마우스 대 항-CD3/CD38 2특이성 항체로 처리된 마우스에서의 실험의 기간에 걸친 평균 종양 성장 곡선을 보여준다. 도 12e는 표기된 농도의 항- CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid) 3특이성 결합 단백질로 처리된 마우스 대 항-CD3/CD38 2특이성 항체로 처리된 마우스의 실험 기간에 걸친 다수의 시점에서의 체중의 평균 변화를 보여준다.
도 13a 내지 도 13f는 RPMI-8226 다발성 골수종 세포가 이식된 PBMC 인간화된 NSG 마우스 모델에서의 항-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid) 3특이성 결합 단백질의 생체내 활성을 보여준다. 도 13a는 표기된 농도의 항-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid) 3특이성 결합 단백질로 처리된 마우스 대 항-CD3/CD38 2특이성 항체로 처리된 마우스에서의 종양 부피의 변화를 보여준다. 도 13b는 표기된 농도의 항-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid) 3특이성 결합 단백질로 처리된 마우스 대 항-CD3/CD38 2특이성 항체로 처리된 마우스에서의 제4일의 종양 부피를 보여준다. 도 13c는 표기된 농도의 항-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid) 3특이성 결합 단백질로 처리된 마우스 대 항-CD3/CD38 2특이성 항체로 처리된 마우스에서의 제21일의 종양 부피를 보여준다. 도 13d는 표기된 농도의 항-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid) 3특이성 결합 단백질로 처리된 마우스 대 항-CD3/CD38 2특이성 항체로 처리된 마우스에서의 제21일의 평균 종양 부피를 보여준다. 도 13e는 표기된 농도의 항-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid) 3특이성 결합 단백질로 처리된 마우스 대 항-CD3/CD38 2특이성 항체로 처리된 마우스에서의 평균 최종 종양 중량을 보여준다. 도 13f는 표기된 농도의 항-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid) 3특이성 결합 단백질로 처리된 마우스 대 항-CD3/CD38 2특이성 항체로 처리된 마우스에서의 실험의 기간에 걸친 다수의 시점에서의 평균 종양 부피를 보여준다.
도 14a 내지 도 14u는 비-인간 영장류에서 항-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid), 항-CD38(VHI) x CD28(cvn) x CD3(mid), 항-CD38(hhy1370) x CD28(sup) x CD3(mid) 및 항-CD38(hhy1370) x CD28(cvn) x CD3(mid) 3특이성 결합 단백질을 사용한 용량 증가 연구(0.5, 2.5, 12.5 ㎍/㎏)의 결과를 보여준다. 도 14a는 상이한 용량의 항-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid) 3특이성 결합 단백질의 투여 후의 순환하는 CD3+ T 세포의 T 세포 활성화(CD69+)를 보여준다. 도 14b는 상이한 용량의 항-CD38(VHI) x CD28(cvn) x CD3(mid) 3특이성 결합 단백질의 투여 후의 순환하는 CD3+ T 세포의 T 세포 활성화(CD69+)를 보여준다. 도 14c는 상이한 용량의 항-CD38(hhy1370) x CD28(sup) x CD3(mid) 3특이성 결합 단백질의 투여 후의 순환하는 CD3+ T 세포의 T 세포 활성화(CD69+)를 보여준다. 도 14d는 상이한 용량의 항-CD38(hhy1370) x CD28(cvn) x CD3(mid) 3특이성 결합 단백질의 투여 후의 순환하는 CD3+ T 세포의 T 세포 활성화(CD69+)를 보여준다. 도 14e는 표기된 용량의 항-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid) 3특이성 결합 단백질의 투여 후의 순환하는 CD4+ T 세포의 백분율의 변화를 보여준다. 도 14f는 표기된 용량의 항-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid) 3특이성 결합 단백질의 투여 후의 순환하는 CD8+ T 세포의 백분율의 변화를 보여준다. 도 14g는 표기된 용량의 항-CD38(VHI) x CD28(cvn) x CD3(mid) 3특이성 결합 단백질의 투여 후의 순환하는 CD4+ T 세포의 백분율의 변화를 보여준다. 도 14h는 표기된 용량의 항-CD38(VHI) x CD28(cvn) x CD3(mid) 3특이성 결합 단백질의 투여 후의 순환하는 CD8+ T 세포의 백분율의 변화를 보여준다. 도 14i는 표기된 용량의 항-CD38(hhy1370) x CD28(sup) x CD3(mid) 3특이성 결합 단백질의 투여 후의 순환하는 CD4+ T 세포의 백분율의 변화를 보여준다. 도 14j는 표기된 용량의 항-CD38(hhy1370) x CD28(sup) x CD3(mid) 3특이성 결합 단백질의 투여 후의 순환하는 CD8+ T 세포의 백분율의 변화를 보여준다. 도 14k는 표기된 용량의 항-CD38(hhy1370) x CD28(cvn) x CD3(mid) 3특이성 결합 단백질의 투여 후의 순환하는 CD4+ T 세포의 백분율의 변화를 보여준다. 도 14l은 표기된 용량의 항-CD38(hhy1370) x CD28(cvn) x CD3(mid) 3특이성 결합 단백질의 투여 후의 순환하는 CD8+ T 세포의 백분율의 변화를 보여준다. 도 14m은 12.5 ㎍/㎏의 표기된 3특이성 결합 단백질의 투여 6, 24 및 48시간 후의 전체 CD4+ T 세포의 변화를 보여준다. 도 14n은 12.5 ㎍/㎏의 표기된 3특이성 결합 단백질의 투여 6, 24 및 48시간 후의 전체 NK 세포의 변화를 보여준다. 도 14o는 12.5 ㎍/㎏의 표기된 3특이성 결합 단백질의 투여 6, 24 및 48시간 후의 전체 CD8+ T 세포의 변화를 보여준다. 도 14p은 12.5 ㎍/㎏의 표기된 3특이성 결합 단백질의 투여 6, 24 및 48시간 후의 전체 B 세포의 변화를 보여준다. 도 14q는 3가지 상승 용량(0.5, 2.5, 12.5 ㎍/㎏)의 항-CD38(VH1) x CD28(sup) x CD3(mid) 3특이성 결합 단백질의 투여 6시간 후의 사이토카인 수준의 변화를 보여준다("117065" 및 "117066"으로 표지된 상이한 시험 동물로부터의 결과). 도 14r은 3가지 상승 용량(0.5, 2.5, 12.5 ㎍/㎏)의 항-CD38(VH1) x CD28(cvn) x CD3(mid) 3특이성 결합 단백질의 투여 6시간 후의 사이토카인 수준의 변화를 보여준다("117067" 및 "117068"로 표지된 상이한 시험 동물로부터의 결과). 도 14s는 3가지 상승 용량(0.5, 2.5, 12.5 ㎍/㎏)의 항-CD38(hhy1370) x CD28(sup) x CD3(mid) 3특이성 결합 단백질의 투여 6시간 후의 사이토카인 수준의 변화를 보여준다("117069" 및 "117070"로 표지된 상이한 시험 동물로부터의 결과). 도 14t는 3가지 상승 용량(0.5, 2.5, 12.5 ㎍/㎏)의 항-CD38(hhy1370) x CD28(cvn) x CD3(mid) 3특이성 결합 단백질의 투여 6시간 후의 사이토카인 수준의 변화를 보여준다("117071" 및 "117072"로 표지된 상이한 시험 동물로부터의 결과). 도 14u는 3가지 상승 용량(0.5, 2.5, 12.5 ㎍/㎏)의 표기된 3특이성 결합 단백질의 투여 24시간 후의 사이토카인 수준의 변화를 보여준다(모든 시험 동물로부터 나타낸 결과).
도 14v 및 도 14w는 항-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid) 및 항-CD38(VHI) x CD28(cvn) x CD3(mid) 3특이성 결합 단백질이 더 높은 용량에서 비-인간 영장류 혈액 중 생체내 T 세포의 고갈을 유도하였음을 보여준다(투여 후 6시간).
도 14x 및 도 14y는 항-CD38(HHY1370) x CD28(sup) x CD3(mid) 및 항-CD38(HHY1370 x CD28(cvn) x CD3(mid) 3특이성 결합 단백질이 더 높은 용량에서 비-인간 영장류 혈액 중 생체 내 T 세포의 고갈을 유도하였음을 보여준다(투여 후 6시간).
도 14z 및 도 14aa는 항-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid) 또는 항-CD38(VHI) x CD28(cvn) x CD3(mid) 3특이성 결합 단백질의 투여 이후 시간이 지남에 따른 비-인간 영장류에서의 혈액 T 세포의 양을 보여준다.
도 14ab 및 도 14ac는 항-CD38(HHY1370) x CD28(sup) x CD3(mid) 또는 항-CD38(HHY1370) x CD28(cvn) x CD3(mid) 3특이성 결합 단백질의 투여 이후 시간이 지남에 따른 비-인간 영장류에서의 혈액 T 세포의 양을 보여준다.
도 14ad 및 도 14ae는 비-인간 영장류에서의 100 ㎍/㎏ 용량의 투여 이후 3특이성 결합 단백질이 결합된 CD4+ T 세포의 양을 보여준다.
도 14af 및 도 14ag는 비-인간 영장류에서의 100 ㎍/㎏ 용량의 투여 이후 3특이성 결합 단백질이 결합된 CD8+ T 세포의 양을 보여준다.
도 15a 내지 도 15c는 인간 Fc 수용체 FcγR I(도 15a), FcγR IIa(도 15b) 및 FcγR IIIb/c(도 15c)로의 다양한 Fc 변이체의 결합 또는 그의 결여를 보여준다. 시험된 변이체는 인간 IgG1, 인간 IgG4 및 FALA 돌연변이를 갖는 인간 IgG4였다.
도 16은 FALA 돌연변이를 갖거나 이를 갖지 않는 인간 IgG4의 FcRn으로의 결합을 보여준다.
도 17은 NSG 마우스에서의 표기된 3특이성 결합 단백질(CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4, CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4 FALA, CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG1 LALA P329A 및 CD38HHY1370xCD28supxCD3mid IgG4 FALA)의 PK 파라미터를 요약한 것이다.
도 18a 내지 도 18c는 야생형 또는 FALA 변이체 Fc 영역을 갖는 3특이성 결합 단백질과 인큐베이션시킨 인간 PBMC에 의한 IFN-γ(도 18a), IL-2(도 18b), 또는 TNF-α(도 18c)의 Fc/FcR 상호작용-매개된(비-특이적인) 방출을 보여준다.
도 18d는 CD38VH1xCD28supxCD3mid 및 CD38HHY1370xCD28supxCD3mid 3특이성 결합 단백질, 및 그의 IgG1 및 IgG4 Fc 변이체에 의한 인간 PBMC의 시험관내 활성화를 보여준다.
도 19a 및 도 19b는 3특이성 결합 단백질 CD38VH1xCD28supxCD3mid에 의한 CD4+(도 19a) 또는 CD8+(도 19b) T 세포에서의 Bcl-xL의 유도가 CD3 및 CD28 항원 결합 도메인 둘 모두를 필요로 하는 것을 보여준다. 막대 그래프=3명의 PBMC 공여자로부터의 평균 및 표준편차. *p=≤0.009.
도 19c 및 도 19d는 IgG4 FALA 변이체 Fc를 갖는 CD38VH1xCD28xCD3이 CD4+(도 19c) 또는 CD8+(도 19d) T 세포에서 벤치마크 2특이성 항체보다 더 크게 Bcl-xL을 상향조절하는 것을 보여준다. 막대 그래프=3명의 PBMC 공여자로부터의 평균 및 표준편차. *p=≤0.045
도 19e는 Jurkat T 리포터 세포주 내의 IL-2 발현에 의해 분석시, 항-CD38x항-CD28x항-CD3 3특이성 결합 단백질에 의한 T 세포 활성화가 항-CD3 항원 결합 도메인에 좌우되는 것을 보여준다.
도 19f는 돌연변이된 항-CD28, 항-CD38, 또는 항-CD28, 항-CD38 및 항-CD3을 갖는 결합 단백질 및 벤치마크에 비하여, CD38VH1xCD28supxCD3mid 3특이성 결합 단백질에 의한 사이토카인 TNF, IFNg, IL-2, IL-6 및 IL-10의 방출을 보여준다.
도 19g는 IgG4 FALA 변이체 Fc를 갖는 항-CD38x항-CD28x항-CD3 3특이성 결합 단백질, 벤치마크 항-CD38x항-CD3 2특이성 항체 또는 이소타입 대조군(돌연변이된 결합 도메인을 갖는 IgG4 FALA 변이체 Fc가 있는 3특이성 결합 단백질)에 의해 활성화된 T 세포의 증식을 보여준다.
도 20은 IgG4 FALA 변이체 Fc를 갖는 항-CD38x항-CD28x항-CD3 3특이성 결합 단백질, IgG4 FALA 변이체 Fc 및 CD38, CD28, 또는 CD3 항원 결합 도메인 내의 돌연변이를 갖는 항-CD38x항-CD28x항-CD3 3특이성 결합 단백질 또는 이소타입 대조군(3개의 돌연변이된 결합 도메인을 갖는 IgG4 FALA 변이체 Fc가 있는 3특이성 결합 단백질)에 의해 활성화된 T 세포의 증식을 보여준다.
도 21은 PBMC 인간화된 NSG 마우스의 NCI-H929-Luc 파종성 종양 모델에서 표기된 용량으로 투여된 CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4 FALA 3특이성 결합 단백질의 생체내 항-종양 활성을 보여준다.
도 22는 PBMC 인간화된 NSG 마우스의 NCI-H929-Luc 파종성 종양 모델에서 표기된 용량으로 투여된 CD38HHY1370xCD28supxCD3mid IgG4 FALA 3특이성 결합 단백질의 생체내 항-종양 활성을 보여준다.
도 23a 및 도 23b는 생체내 연구에서 사용되는 인간 PBMC를 사용하여, CD38VH1xCD28supxCD3mid 및 CD38HHY1370xCD28supxCD3mid 3특이성 결합 단백질 및 벤치마크 항-CD38x항-CD3 2특이성 항체를 사용한 NCI-929-Luc 세포의 강력한 시험관내 종양 사멸 활성을 보여준다. 2명의 공여자로부터의 인간 PBMC 인간화된 NSG 마우스를 10:1의 이펙터:PBMC 비로 24시간 인큐베이션 후에 사용하였다.
도 23c는 PBMC 인간화된 NSG 마우스의 NCI-H929-Luc 파종성 종양 모델에서 표기된 용량으로 투여된, 벤치마크 항-CD38x항-CD3 2특이성 항체에 비한, CD38VH1xCD28supxCD3mid and CD38hhy1370xCD28supxCD3mid 3특이성 결합 단백질의 뛰어난 생체내 항-종양 활성을 보여준다. 결합 단백질을 주마다 30 ㎍/㎏의 복강내(IP) 주사에 의해 투여하였다.
도 24a는 10 nM 농도에서 CD38VH1/ CD28supxCD3mid 및 그의 단일의 결합 부위 KO 및 삼중 KO 돌연변이체에 의한 자극 후의 GloResponse™ IL2-luc2P Jurkat 세포(Promega)를 사용한 루시퍼라제 리포터 분석의 결과를 보여준다.
도 24b는 항-CD3xCD28 CODV-Fab 항체의 최적화를 보여준다. CODV 2특이성 Fab의 대안적인 위치에서의 α-CD3 및 α-CD28의 최적의 입체배치를 시험관내에서 인간 PBMC를 사용하여 사이토카인 방출 분석에 의해 평가하였다. 24시간 후에 상청액 중 IFN-γ 및 IL-2의 분비에 기초하여 원위-CD28 x 근위 CD3는 최적의 위치인 것으로서 확인되었다.
도 25는 일차 T 세포에서의 Bcl-2 과 구성원 Bcl-xL의 CD38VH1/ CD28supxCD3mid 유도된 상향조절이 CD28 의존성임을 보여준다.
도 26은 3특이성 Ab 내의 항-CD28이 시험관내에서 일차 T 세포 증식을 지원하는 데 필수적인 이차 시그널링을 제공하였음을 보여준다.
도 27은 모체 항체에 의한 컬러-코딩된 3특이성 항체의 입체배치를 보여준다(좌측). 진한 음영(보라색 또는 녹색)은 중쇄 펩티드를 나타내며; 연한 음영은 경쇄 펩티드를 나타낸다. 또한, 항-CD38 VH1 Fab 및 CD28sup/CD3mid CODV Fab의 결정 구조에 기초한 CD38VH1/CD28supxCD3mid 3특이성 Ab의 구조 모델이 나타나 있다(우측).
도 28a 및 도 28b는 높은(RPMI-8226; 도 28a) 및 낮은(KMS-11; 도 28b) CD38 표면 발현을 갖는 다발성 골수종(MM) 세포가 다양한 농도의 3특이성 Ab와 인큐베이션시킨 인간 PBMC(E:T=10:1)에 의해 효율적으로 용해되었음을 보여준다. 각각의 결합 부위에 의한 사멸 활성에 대한 기여는 나타낸 바와 같이 결합 부위 KO 돌연변이에 의해 입증되었다.
도 29a 내지 도 29c는 3특이성 Ab의 항-CD28supKO 돌연변이체가 시험관내에서 CD38high, CD38mid 및 CD38low MM 세포에 대하여 현저하게 감소된 항-종양 활성을 나타내었음을 보여준다. RPMI-8226(도 29a), U266(도 29b) 또는 KMS-11(도 29c) 세포를 사용한 분석이 나타나 있다.
도 30은 CD38VH1/ CD28supxCD3mid_FALA 3특이성 항체 처리군에서의 종양 부담의 감소가 시험관내 증폭된 인간 일차 T 세포로 재구성된 NSG 마우스를 사용한 파종성 인간 다발성 골수종 세포주 모델에서 용량-의존적이고 통계적으로 상이하였음을 보여준다.
도 31a 및 도 31b는 일차 인간 T 세포의 존재 하에 시험관내에서 CD38 3특이성 Ab에 의한 골수종 세포 용해의 생체 현미경 분석을 보여준다. 현미경 이미지의 타임 랩스 촬영을 CellTrackerTM 암적색 염료가 표지된 RPMI-8226 골수종 세포주와 인큐베이션시킨 인간 PBMC를 사용하여 음성 대조군(삼중 KO 3특이성; 도 31a) 또는 CD38/CD28xCD3 3특이성 Ab(도 31b)를 사용해 수행하였다. 제시된 이미지를 24시간 인큐베이션 후에 수집하였다. 기준자: 50 ㎛.
도 32는 Fc 수용체 결합 분석에서의 분석을 위해 제조된 IgG4의 Fc 영역 내의 대안적인 돌연변이를 보여준다. 서열 번호 111 내지 116이 나타나 있다(각각 상부에서 하부로).
도 33은 표기된 인간 Fc 수용체에 대한 특정 IgG4 Fc 변이체의 친화도를 측정하기 위한 SPR 분석의 결과를 보여준다.
도 34는 최소의 FcR 결합을 갖는 CD38 3특이성 결합 단백질이 시험관내에서 인간 PBMC에 의한 비-특이적인 사이토카인 방출을 감소시켰음을 보여준다. 상이한 FcR 불활성화 돌연변이(표기된 바와 같음)를 인간 IgG4 이소타입에서 그들의 염증유발 효과에 대하여 분석하였다. 인간 PBMC를 배지에서(비자극) 또는 골수종 세포, RPMI-8226의 존재 하에(자극) 인큐베이션시켰으며, 막대는 ELISA에 의해 측정되는 상청액 IFN-γ 수준을 나타낸다.
도 35는 최소의 FcR 결합을 갖는 CD38 3특이성 결합 단백질이 상이한 CD38 발현 수준을 갖는 인간 다발성 골수종 세포를 용해시켰음을 보여준다. IgG4 또는 표기된 Fc 돌연변이를 사용한 골수종 세포의 세포용해를 표기된 종양 표적과 함께 인간 PBMC를 사용하여 시험관내에서 평가하였다.
도 36은 세포주 RPMI-8226, U266 및 KMS-11에 대한 이펙터 세포(E:T=10:1)로서 인간 PBMC를 사용하여 측정된 3특이성 항-CD38/CD28/CD3 Ab 및 항-CD38 항체 다라투무맙(daratumumab)의 시험관내 세포용해 활성의 비교를 보여준다.
도 37a 내지 도 37d는 CD38/CD3xCD28에 반응하는 시험관내 T 세포 하위세트 증량의 특징화를 보여준다. 웰을 외인성 사이토카인의 부재 하에 350 ng/웰의 CD38 3특이성 Ab로 코팅함으로써 T 세포 하위세트 증량의 평가를 수행하였다. T 세포 집단을 표기된 시점에서 측정하였다. 3중 돌연변이체 3특이성 ab를 음성 대조군으로서 사용하였다. 실시예 12에 기술된 바와 같이, 유세포분석을 사용하여, 중심 및 이펙터 기억 CD4 T 세포(도 37a), T 헬퍼 세포(도 37b), 중심 및 이펙터 기억 CD8 T 세포(도 37c) 및 CMV pp65-특이적 CD8 세포(도 37d)를 결정하였다. CD38 3특이성 또는 3중 음성 대조군으로 처리된 HLA-A2 CMV+ 공여자로부터의 PBMC의 5량체 염색에 의해 CMV-특이적 pp65 이펙터 세포의 분석을 수행하였다.
도 38은 CD38/CD3xCD28에 의한 세포용해에 대한 감수성에 대한 표적 세포 상의 CD28 발현의 기여를 보여준다. CD28을 CRISPR/Cas 9 유전자 표적화를 사용하여 KMS-11 세포에서 낙아웃시켰으며, 시험관내에서 세포용해 표적으로서 사용하였다. 유세포분석에 의해 입증시, 모체 KMS-11에 비하여, CD38 발현이 보존되는 한편, CD28이 제거되었다(상부 패널 KMS-11 대 KMS-11(CD28KO). CD28 KO 세포의 세포용해를 야생형 또는 CD28 널(null) 3특이성을 사용하여 시험하였다(하부 패널; 3특이성 대 3특이성(CD28KO)).
도 39는 급성 골수구성 백혈병(AML(KG-1)), B 세포 림프종(OCI-Ly19), 급성 T 림프구성 백혈병(ALL(KOPN8)) 및 만성 림프구성 림프종(CLL(Z-138))을 포함하는 표기된 CD38+CD28- 세포주에 대한 CD38/CD28xCD3 3특이성 FALA 돌연변이체 Ab의 세포용해 활성을 보여준다.
도 40은 α-CD28 초효능제(superagonist)에 의한 인간 PBMC의 시험관내 활성화가 2가의 항체를 필요로 하는 것을 보여준다.
본 발명은 CD38 폴리펩티드에 결합하는 적어도 하나의 항원 결합 부위를 포함하는 결합 단백질을 제공한다.
1. 일반 정의
본 발명에 따라 이용되는 바와 같이, 하기 용어는, 달리 지시되지 않는 한, 하기 의미를 갖는 것으로 이해될 것이다. 문맥에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수형 용어는 복수형을 포함할 것이고, 복수형 용어는 단수형을 포함할 것이다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용되는 바와 같이, 단수형("하나의", "한" 및 "상기")은 내용이 명백하게 다르게 지시되지 않는 한, 복수의 참조대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "하나의 분자"에 대한 언급은 선택적으로 둘 이상의 이러한 분자의 조합을 포함하는 등이다.
본원에서 기술된 본 발명의 측면 및 구현예가 측면 및 구현예를 "포함하는", "이로 이루어진" 및 "본질적으로 이로 이루어진" 것을 포함하는 것이 이해된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 적어도 10개의 뉴클레오티드의 길이의 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산 중합체를 나타낸다. 특정 구현예에서, 폴리뉴클레오티드에 포함되는 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 어느 한 유형의 뉴클레오티드의 변형된 형태일 수 있다. 그러한 변형은 염기 변형체, 예컨대 브로모우리딘, 리보스 변형체, 예컨대 아라비노시드 및 2',3'-디데옥시리보스, 및 뉴클레오티드간 결합 변형체, 예컨대 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐라데이트 및 포스포로아미데이트를 포함한다. "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 구체적으로 단일 가닥 및 이중 가닥 형태의 DNA를 포함한다.
"단리된 폴리뉴클레오티드"는 게놈, cDNA, 또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 일부의 조합으로서, 이는 (1) 단리된 폴리뉴클레오티드가 자연에서 발견되는 폴리뉴클레오티드 전부와 또는 이의 일부분과 회합되지 않거나, (2) 자연에서는 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드에 연결되거나, 또는 (3) 자연에서는 더 큰 서열의 일부로서 존재하지 않는다.
"단리된 폴리펩티드"는 (1) 보통 함께 발견될 적어도 일부의 다른 폴리펩티드가 부재하는 것, (2) 동일한 공급원으로부터의, 예를 들어, 동일한 종으로부터의 다른 폴리펩티드가 본질적으로 부재하는 것, (3) 상이한 종들 유래의 세포에 의해 발현되는 것, (4) 그것이 자연에서 회합된 폴리뉴클레오티드, 지질, 탄수화물, 또는 다른 물질의 적어도 약 50%로부터 분리된 것, (5) 자연에서는 "단리된 폴리펩티드"가 회합되어 있는 폴리펩티드의 부분들과 (공유적 또는 비공유적 상호작용에 의해) 회합되어 있지 않은 것, (6) 자연에서는 단리된 폴리펩티드가 회합되지 않는 폴리펩티드와 (공유적 또는 비공유적 상호작용에 의해) 작동 가능하게 회합된 것, 또는 (7) 자연에서 존재하지 않는 것이다. 그러한 단리된 폴리펩티드는 게놈 DNA, cDNA, mRNA 또는 기타 RNA (합성 기원의 것), 또는 이들의 임의의 조합에 의해 코딩될 수 있다. 바람직하게는, 단리된 폴리펩티드에는 그의 천연 환경에서 발견되는 폴리펩티드 또는 기타 오염물질 (이는 그의 사용 (치료적 사용, 진단적 사용, 예방적 사용, 연구용 또는 다른 것)을 방해함)이 실질적으로 부재한다.
천연 발생 항체는 전형적으로 4량체를 포함한다. 각각의 이러한 4량체는 전형적으로 동일한 두 쌍의 폴리펩티드 사슬로 구성되며, 각 쌍은 하나의 전장 "경쇄" (전형적으로, 분자량이 약 25 kDa임)와 하나의 전장 "중쇄" (전형적으로, 분자량이 약 50 kDa 내지 70 kDa임)를 갖는다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "중쇄" 및 "경쇄"라는 용어는 표적 항원에 대한 특이성을 부여하기에 충분한 가변 도메인 서열을 갖는 임의의 면역글로불린 폴리펩티드를 나타낸다. 각각의 경쇄 및 중쇄의 아미노 말단 부분은 전형적으로 약 100개 내지 110개 또는 그 이상의 아미노산의 가변 도메인을 포함하며, 상기 가변 도메인은 전형적으로 항원 인식에 책임이 있다. 각 사슬의 카르복시 말단 부분은 전형적으로 이펙터 기능에 책임이 있는 불변 도메인을 정한다. 따라서, 천연 발생 항체에서, 전장 중쇄 면역글로불린 폴리펩티드는 하나의 가변 도메인 (VH) 및 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2, 및 CH3)을 포함하며, 여기서, VH 도메인은 폴리펩티드의 아미노 말단에 있고, CH3 도메인은 카르복실 말단에 있으며, 전장 경쇄 면역글로불린 폴리펩티드는 하나의 가변 도메인 (VL) 및 하나의 불변 도메인 (CL)을 포함하고, 여기서, VL 도메인은 폴리펩티드의 아미노 말단에 있으며, CL 도메인은 카르복실 말단에 있다.
인간 경사슬은 전형적으로 카파 및 람다 경쇄로 분류되며, 인간 중사슬은 전형적으로 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로 분류되고, 항체의 이소타입을 각각 IgM, IgD, IgG, IgA, 및 IgE로 정의한다. IgG는 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 몇몇 하위부류(subclass)를 갖는다. IgM은 IgM1 및 IgM2를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 하위부류를 갖는다. 이와 유사하게, IgA는 IgA1 및 IgA2를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 하위부류로 세분된다. 전장 경쇄 및 중쇄 내에서, 가변 도메인 및 불변 도메인은 전형적으로 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되며, 이때 중사슬은 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Fundamental Immunology (Paul, W., ed., Raven Press, 2nd ed., 1989)]을 참조하는데, 이는 그 전체가 모든 목적을 위하여 참고로 포함된다. 각 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역들은 전형적으로 항원 결합 부위를 형성한다. 전형적으로 천연 발생 항체의 가변 도메인은 상보성 결정 영역 또는 CDR로도 칭해지는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 상대적으로 보존된 프레임워크 영역(framework region; FR)의 동일 일반 구조를 나타낸다. 각 쌍의 두 사슬로부터의 CDR은 전형적으로 프레임워크 영역과 나란히 정렬되며, 이는 특정 에피토프에의 결합을 가능하게 할 수 있다. 아미노 말단으로부터 카르복실 말단으로, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 다는 전형적으로 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4를 포함한다.
"CDR 세트"라는 용어는 항원과 결합할 수 있는 단일 가변 영역에 존재하는 3개의 CDR의 군을 나타낸다. 이러한 CDR들의 정확한 경계부는 상이한 시스템에 따라 상이하게 정의되었다. 카바트(Kabat) (문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991)])에 의해 기술된 시스템은 항체의 임의의 가변 영역에 적용가능한 명백한 잔기 넘버링(numbering) 시스템을 제공할 뿐만 아니라 3개의 CDR을 정의하는 정확한 잔기 경계부도 제공한다. 이러한 CDR은 카바트 CDR로 칭해질 수 있다. 초티아(Chothia) 및 협력자 (문헌[Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-17]; 문헌[Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-83])는 카바트 CDR 내의 특정한 하위부분(sub-portion)이, 아미노산 서열 수준에서 큰 다양성을 가짐에도 불구하고, 거의 동일한 펩티드 골격 구조(backbone conformation)를 채용함을 발견하였다. 이러한 하위부분들은 L1, L2, 및 L3 또는 H1, H2, 및 H3으로 표기되었으며, 여기서, "L" 및 "H"는 각각 경쇄 영역 및 중쇄 영역을 표기한다. 이러한 영역들은 카바트 CDR과 중첩되는 경계부를 갖는 초티아 CDR로 칭해질 수 있다. 카바트 CDR과 중첩되는 CDR을 정의하는 다른 경계부는 문헌[Padlan, 1995, FASEBJ. 9: 133-39]; 문헌[MacCallum, 1996, J. Mol. Biol. 262(5): 732-45]; 및 문헌[Lefranc, 2003, Dev. Comp. Immunol. 27:55-77]에서 기술되었다. 또 다른 CDR 경계부 정의는 본원에서의 시스템들 중 하나를 엄격히 따르지 않을 수도 있지만, 그럼에도 불구하고, 특정 잔기 또는 잔기 군 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 유의하게 영향을 주지 않는다는 실험적인 발견 또는 예측을 고려하면 카바트 CDR이 짧아지거나 길어질 수 있기는 하지만 카바트 CDR과 중첩될 것이다. 본원에서 사용되는 방법에서는 이러한 시스템들 중 임의의 것에 따라 정의되는 CDR을 이용될 수 있지만, 특정 구현예에서 카바트 또는 초티아 정의된 CDR이 사용된다. 아미노산 서열을 이용한 예측 CDR의 확인은 본 기술 분야에서, 예컨대 문헌[Martin, A.C. "Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains,"In Antibody Engineering, Vol. 2. Kontermann R.,
Figure pct00017
eds. Springer-Verlag, Berlin, p. 33-51 (2010)]에 잘 알려져 있다. 또한 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열은 다른 통상적인 방법에 의해, 예를 들어 다른 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 공지된 아미노산 서열과의 비교에 의해 CDR의 서열을 확인하여 서열 초가변 영역을 결정하도록 점검될 수 있다. 넘버링된 서열들은 육안으로, 또는 정렬 프로그램, 예컨대 CLUSTAL 스위트(suite)의 프로그램들 중 하나의 이용에 의해 정렬될 수 있으며, 이는 문헌[Thompson, 1994, Nucleic Acids Res. 22:4673-80]에 기술된 바와 같다. 통상적으로 분자 모델을 이용하여 프레임워크 및 CDR 영역을 정확하게 묘사하고 그에 따라 서열-기반 배치를 보정한다.
일부 구현예에서, 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄에서의 CDR/FR 정의는 IMGT 정의(문헌[Lefranc et al. Dev. Comp. Immunol., 2003, 27(1):55-77]; www.imgt.org)에 기초하여 결정될 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "Fc"라는 용어는 단량체 형태이든지 다량체 형태이든지 간에, 항체의 분해로부터 생기거나 다른 수단에 의해 생성된 비-항원-결합 단편의 서열을 포함하는 분자를 나타내며, 이는 힌지 영역을 함유할 수 있다. 고유 Fc의 본래의 면역글로불린 공급원은 바람직하게는 인간 기원이며, 임의의 면역글로불린일 수 있다. Fc 분자는 공유적(즉, 디술피드 결합) 및 비-공유적 회합에 의해 이량체 또는 다량체 형태로 연결될 수 있는 단량체형 폴리펩티드로 이루어진다. 고유 Fc 분자의 단량체 서브유닛 사이의 분자간 디술피드 결합의 수는 부류 (예를 들어, IgG, IgA, 및 IgE) 또는 하위부류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgGA2 및 IgG4)에 따라 1개 내지 4개의 범위이다. Fc의 한 예로는 IgG의 파파인 분해로부터 생성되는 디술피드-결합된 이량체가 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "고유 Fc"는 단량체, 이량체 및 다량체 형태의 총칭이다.
F(ab) 단편은 전형적으로 하나의 경쇄와, 하나의 중쇄의 VH 및 CH1 도메인을 포함하며, 여기서, F(ab) 단편의 VH-CH1 중쇄 부분은 또 다른 중쇄 폴리펩티드와 디술피드 결합을 형성할 수 없다. 본원에서 사용되는 바와 같이, F(ab) 단편은 또한 아미노산 링커에 의해 분리된 2개의 가변 도메인을 포함하는 하나의 경쇄와, 아미노산 링커에 의해 분리된 2개의 가변 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는 하나의 중쇄를 포함할 수 있다.
F(ab') 단편은 전형적으로 하나의 경쇄와, (CH1 도메인과 CH2 도메인 사이에) 더 많은 불변 영역을 포함하는 하나의 중쇄의 일부분을 포함하여서, 사슬간 디술피드 결합이 2개의 중쇄 사이에서 형성되어 F(ab')2 분자를 형성할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "결합 단백질"이라는 용어는 적어도 하나의 표적 항원, 예를 들어, 본 발명의 CD38 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 비-천연 발생(또는 재조합 또는 조작된) 분자를 나타낸다
"재조합" 분자는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나, 단리된 것이다.
본 발명의 일 구현예는 1개 내지 3개의 표적 항원에 대한 생물학적 및 면역학적 특이성을 갖는 결합 단백질을 제공한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 그러한 결합 단백질을 형성하는 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 그러한 결합 단백질을 형성하는 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 본 발명의 또 다른 구현예는 그러한 결합 단백질을 발현하는 숙주 세포 (즉, 그러한 결합 단백질을 형성하는 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 핵산 분자 또는 벡터를 포함함)를 제공한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "스와프 능력(swapability)"이라는 용어는 결합 단백질 포맷 내에서의 가변 도메인들의 호환성(interchangeability)을 나타내며, 이때 폴딩 및 궁극적 결합 친화도는 유지된다. "전 스와프 능력(full swapability)"은 화학식 I의 폴리펩티드 사슬 또는 화학식 II의 폴리펩티드 사슬에서, 결합 친화도의 유지에 의해 입증되는 바와 같이 결합 단백질의 전 기능성(full functionality)을 유지하면서, VH1 및 VH2 도메인 둘 다의 순서, 및 그에 따라 VL1 및 VL2 도메인의 순서를 스와프하는 (즉, 상기 순서가 반대가 되도록) 능력을 나타낸다. 더욱이, VH 및 VL이라는 표기는 최종 포맷의 특정 단백질 사슬 상에서의 상기 도메인의 위치만을 나타낸다는 것이 주지되어야 한다. 예를 들어, VH1 및 VH2는 모 항체에서의 VL1 및 VL2 도메인으로부터 유래되고 결합 단백질에서의 VH1 및 VH2 위치에 배치될 수 있다. 이와 마찬가지로, VL1 및 VL2는 모 항체에서의 VH1 및 VH2 도메인으로부터 유래되고 결합 단백질에서의 VH1 및 VH2 위치에 배치될 수 있다. 따라서, VH 및 VL이라는 표기는 현재의 위치를 나타내며, 모 항체에서의 원래의 위치를 나타내는 것이 아니다. 따라서 VH 및 VL 도메인은 "스와프 가능하다".
본원에서 사용되는 바와 같이, "항원" 또는 "표적 항원" 또는 "항원 표적"이라는 용어는 결합 단백질이 결합할 수 있고, 추가로, 동물에서 사용되어 그 항원의 에피토프에 결합할 수 있는 항체를 생성할 수 있는 분자 또는 분자의 일부분을 나타낸다. 표적 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 결합 단백질에 의해 인식되는 각각의 표적 항원과 관련하여, 결합 단백질은 표적 항원을 인식하는 온전한 항체와 경쟁할 수 있다.
"CD38"은 분화 클러스터 38 폴리펩티드이며, 많은 면역 세포의 표면 상에서 발견되는 당단백질이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 하나 이상의 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합한다. 예시적인 CD38 세포외 도메인 폴리펩티드 서열은 (예를 들어, 서열 번호 1에 의해 나타낸 바와 같은) 인간 CD38의 세포외 도메인 및 (예를 들어, 서열 번호 30에 의해 나타낸 바와 같은) 시노몰구스 원숭이 CD38의 세포외 도메인을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
"T-세포 관여항체"라는 용어는 종양 표적 단백질에 대하여 유도된 결합 단백질뿐만 아니라 숙주의 면역계, 더 구체적으로 T 세포의 세포독성 활성에 대하여 유도된 결합 단백질도 나타낸다.
"1특이성 결합 단백질"이라는 용어는 하나의 항원 표적에 특이적으로 결합하는 결합 단백질을 나타낸다.
"1가 결합 단백질"이라는 용어는 하나의 항원 결합 부위를 갖는 결합 단백질을 나타낸다.
"2특이성 결합 단백질"이라는 용어는 2개의 상이한 항원 표적에 특이적으로 결합하는 결합 단백질을 나타낸다. 일부 구현예에서, 2특이성 결합 단백질은 2개의 상이한 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 2특이성 결합 단백질은 동일한 항원 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합한다.
"2가 결합 단백질"이라는 용어는 2개의 결합 부위를 갖는 결합 단백질을 나타낸다.
"3특이성 결합 단백질"이라는 용어는 3개의 상이한 항원 표적에 특이적으로 결합하는 결합 단백질을 나타낸다. 일부 구현예에서, 3특이성 결합 단백질은 3개의 상이한 항원에 결합한다. 일부 구현예에서, 3특이성 결합 단백질은 동일한 항원 상의 1, 2 또는 3개의 상이한 에피토프에 결합한다.
"3가 결합 단백질"이라는 용어는 3개의 결합 부위를 갖는 결합 단백질을 나타낸다. 특정 구현예에서, 3가 결합 단백질은 하나의 항원 표적에 결합할 수 있다. 다른 구현예에서, 3가 결합 단백질은 2개의 항원 표적에 결합할 수 있다. 다른 구현예에서, 3가 결합 단백질은 3개의 항원 표적에 결합할 수 있다.
"단리된" 결합 단백질은 그의 천연 환경의 성분으로부터 확인되고 분리된 및/또는 회수된 것이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 결합 단백질에 대한 진단적 또는 치료적 사용을 간섭하는 물질이며, 이는 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 (1) 로우리법(Lowry method)에 의해 결정할 경우 95 중량% 초과의, 그리고 가장 바람직하게는 99 중량% 초과의 항체까지, (2) 회전 컵 서열 분석기(spinning cup sequenator)의 사용에 의해 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 정도까지, 또는 (3) 쿠마시 블루(Coomassie blue), 또는 바람직하게는 은 염색제를 이용한 환원 또는 비환원 조건 하에서의 SDS-PAGE에 의한 균질성까지 정제될 것이다. 결합 단백질의 천연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 단리된 결합 단백질은 재조합 세포 내에서의 원위치에서의 결합 단백질을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "실질적으로 순수한" 또는 "실질적으로 정제된"이라는 용어는 존재하는 주된 종인 종 또는 화합물을 나타낸다(즉, 몰 기준으로, 이것은 조성물 중의 임의의 다른 개별 종보다 더 풍부하다). 일부 구현예에서, 실질적으로 정제된 분획물은 당해 종이 존재하는 모든 거대분자 종의 적어도 약 50%(몰 기준으로)로 포함된 조성물이다. 다른 구현예에서, 실질적으로 순수한 조성물은 조성물에 존재하는 모든 마크로몰(macromolar) 종의 약 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 초과를 포함할 것이다. 또 다른 구현예에서, 종은 필수적인 균질성까지 정제되며(오염 종은 통상적인 검출 방법에 의해서는 조성물에서 검출될 수 없음), 여기서, 조성물은 본질적으로 단일 거대분자 종으로 이루어진다.
"에피토프"라는 용어는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 결정자, 바람직하게는 폴리펩티드 결정자를 포함한다. 특정 구현예에서, 에피토프 결정자는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴기, 또는 술포닐기와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그루핑(grouping)을 포함하며, 특정 구현예에서, 특이적인 3-차원 구조 특성, 및/또는 특이적인 전하 특성을 가질 수 있다. 에피토프는 항체 또는 결합 단백질이 결합하는 항원의 영역이다. 특정 구현예에서, 결합 단백질은, 단백질들 및/또는 거대분자들의 복합 혼합물 중 그의 표적 항원을 우선적으로 인식할 때 항원에 특이적으로 결합한다고 한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 평형 해리 상수가 10-8 M 이하일 때, 더 바람직하게는 평형 해리 상수가 10-9 M 이하일 때, 그리고 가장 바람직하게는 상기 해리 상수가 10-10 M 이하일 때 항원에 특이적으로 결합한다고 한다.
결합 단백질의 해리 상수(KD)는, 예를 들어 표면 플라스몬 공명에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 표면 플라스몬 공명 분석에서는 BIAcore 시스템(Pharmacia Biosensor; 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 이용하여 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 리간드(바이오센서 매트릭스 상의 표적 항원)와 피분석물(용액 중 결합 단백질) 사이의 실시간 결합 상호작용이 측정된다. 표면 플라스몬 분석은 또한 피분석물(바이오센서 매트릭스 상의 결합 단백질)의 고정 및 리간드(표적 항원)의 제시에 의해 수행될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "KD"라는 용어는 특정 결합 단백질과 표적 항원 사이의 상호작용의 해리 상수를 나타낸다.
결합 단백질과 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같이, "결합하다"라는 용어는 적어도 약 1 x 10-6 M, 1 x 10-7 M, 1 x 10-8 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, 1 x 10-12 M의, 또는 이보다 더 큰 Kd로 에피토프 함유 항원에 결합하고/하거나, 비특이적 항원에 대한 친화성보다 적어도 2배 더 큰 친화성으로 에피토프에 결합하는 결합 단백질 또는 이의 항원-결합 단편의 능력을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 둘 이상의 항원, 예를 들어, 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드에 결합한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 항원 결합 도메인 및/또는 결합 단백질은 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드, 예를 들어, CD38 세포외 도메인, 예컨대 서열 번호 1(인간 CD38 아이소폼 A), 서열 번호 105(인간 CD38 아이소폼 E) 및 서열 번호 30(시노몰구스 원숭이 CD38)과 "교차 반응"한다. EC50이 두 항원 모두에 대하여 유사한 범위에 있는 경우, 항원 1(Ag1)에 결합하는 결합 단백질은 항원 2(Ag2)와 "교차-반응성"이다. 본 출원에서, Ag2의 친화도 대 Ag1의 친화도가 10(예를 들어, 5, 2, 1 또는 0.5) 이하이며 친화도가 둘 모두의 항원에 대하여 동일한 방법으로 측정되는 경우 Ag1에 결합하는 결합 단백질은 Ag2와 교차-반응성이다.
Ag1에 결합하는 결합 단백질은 친화도가 2개의 항원에 대하여 매우 상이한 경우에 Ag2와 "유의미하게 교차-반응성이 아니다". Ag2에 대한 친화도는 결합 반응이 너무 낮다면 측정 가능하지 않을 수 있다. 본 출원에서, Ag2에 대한 결합 단백질의 결합 반응이 동일한 실험 환경에서 그리고 동일한 항체 농도에서 Ag1에 대한 동일한 결합 단백질의 결합 반응의 5% 미만인 경우에, Ag1에 결합하는 결합 단백질은 Ag2와 유의미하게 교차-반응성이 아니다. 실시에서, 사용되는 결합 단백질 농도는 Ag1과 함께 수득되는 포화 안정기에 도달하기 위해 필요한 농도 또는 EC50일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "링커"라는 용어는 경쇄 및 중쇄의 도메인이 교차 이중 가변 영역 면역글로불린으로 폴딩되기에 충분한 이동성을 제공하도록 면역글로불린 도메인들 사이에 삽입되는 하나 이상의 아미노산 잔기를 나타낸다. 링커는 서열 수준에서 각각 가변 도메인들 사이 또는 가변 도메인과 불변 도메인 사이의 전환부(transition)에 삽입된다. 면역글로불린 도메인의 적절한 크기가 잘 이해되어 있기 때문에, 도메인들 사이의 전환부가 확인될 수 있다. 도메인 전환부의 정확한 위치는, 실험 데이터에 의해 입증되는 바와 같이 또는 2차 구조 예측 또는 모델링 기법에 의해 추정될 수 있는 바와 같이, 베타-시트(sheet) 또는 알파-나선과 같은 2차 구조의 요소를 형성하지 않는 펩티드 스트레치(stretch)의 위치화에 의해 결정될 수 있다. 본원에 기술된 링커는 VL2의 C-말단과 VL1 도메인의 N-말단 사이의 경쇄에 위치하는 L1; 및 VL1의 C-말단과 CL 도메인의 N-말단 사이의 경쇄에 위치하는 L2로 칭해진다. 중쇄 링커는 VH1의 C-말단과 VH2 도메인의 N-말단 사이에 위치하는 L3; 및 VH2의 C-말단과 CH1 도메인의 N-말단 사이에 위치하는 L4로 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "벡터"라는 용어는 코딩 정보를 숙주 세포에게 전하는 데 사용되는 임의의 분자(예를 들어, 핵산, 플라스미드, 또는 바이러스)를 나타낸다. "벡터"라는 용어는 이것이 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 포함한다. 하나의 유형의 벡터로는 "플라스미드"가 있으며, 이는 추가의 DNA 절편이 삽입될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 분자를 나타낸다. 또 다른 유형의 벡터로는 바이러스 벡터가 있으며, 여기서, 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 삽입될 수 있다. 특정 벡터(예를 들어, 박테리아 복제 원점을 가지는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터)는 그들이 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제가 가능하다. 기타 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포 내로의 도입시에 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있으며, 그에 의해, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 그들이 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히 "발현 벡터")로 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기법에 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다. "플라스미드" 및 "벡터"라는 용어는 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있으며, 그 이유는 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 형태의 벡터이기 때문이다. 그러나, 본 발명은, 동등한 기능을 수행하는 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-부속 바이러스)와 같은 다른 형태의 발현 벡터들도 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "재조합 숙주 세포"(또는 "숙주 세포")라는 어구는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 나타낸다. 재조합 숙주 세포 또는 숙주 세포는 특정한 해당 세포뿐만 아니라 그러한 세포의 자손도 나타내고자 한다. 특정 변형이 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인하여 후속 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 사실상 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 그러한 세포는 여전히 본원에서 사용되는 용어 "숙주 세포"의 범주 내에 포함된다. 박테리아, 효모, 바큘로바이러스 및 포유류 발현 시스템(뿐 아니라, 파지 디스플레이(phage display) 발현 시스템)을 포함하는 매우 다양한 숙주 세포 발현 시스템을 사용하여 결합 단백질을 발현시킬 수 있다. 적합한 박테리아 발현 벡터의 예로는 pUC19가 있다. 결합 단백질을 재조합적으로 발현시키기 위하여, 숙주 세포는 결합 단백질의 폴리펩티드 사슬이 숙주 세포 내에서 발현되도록, 그리고 바람직하게는 숙주 세포가 배양되는 배지 내로 분비되어, 상기 배지로부터 결합 단백질이 회수될 수 있도록, 상기 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 DNA 단편을 갖는 하나 이상의 재조합 발현 벡터로 형질전환되거나 트랜스펙션(transfection)된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "형질전환"이라는 용어는 세포의 유전적 특징의 변화를 나타내며, 세포는 새로운 DNA를 함유하도록 변형되었을 때 형질전환된 것이다. 예를 들어, 세포는 그의 고유 상태로부터 유전적으로 변형되었을 경우 형질전환된 것이다. 형질전환 후, 형질전환 DNA는 세포의 염색체 내로의 물리적 통합에 의해 세포의 DNA와 재조합될 수 있거나, 또는 복제되지 않고서 에피솜 요소로서 일시적으로 유지될 수 있거나, 또는 독립적으로 플라스미드로서 복제될 수 있다. 세포는 DNA가 세포 분열에 의해 복제될 때 안정하게 형질전환된 것으로 간주된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "트랜스펙션"이라는 용어는 세포에 의한 외래 또는 외인성 DNA의 흡수를 나타내며, 외인성 DNA가 세포막 내부로 도입된 경우에 세포는 "트랜스펙션"된 것이다. 다수의 트랜스펙션 기법이 본 기술 분야에 잘 알려져 있다. 그러한 기술은 하나 이상의 외인성 DNA 분자를 적합한 숙주 세포 내로 도입하는 데 사용될 수 있다.
본원에서 사용되고 대상에게 적용되는 바와 같이, "천연 발생"이라는 용어는 그 대상이 자연에서 발견될 수 있고 사람에 의해 조작되지 않은 사실을 나타낸다. 예를 들어, 자연에서 공급원으로부터 단리될 수 있고 사람에 의해 의도적으로 변형된 것이 아닌 유기체(바이러스를 포함함)에 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 천연 발생적인 것이다. 이와 유사하게, 본원에서 사용되는 바와 같이, "비-천연 발생"은 자연에서 발견되지 않거나, 사람에 의해 구조적으로 변형되거나 합성된 대상을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 20가지의 통상적인 아미노산 및 그의 약어는 통상적인 용법을 따른다. 20가지의 통상적인 아미노산의 입체이성질체(예를 들어, D-아미노산); 비천연 아미노산 및 유사체, 예컨대 α-, α-2치환 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산, 및 다른 비통상적인 아미노산이 또한 결합 단백질의 폴리펩티드 사슬에 적합한 성분일 수 있다. 비통상적인 아미노산의 예는 다음을 포함한다: 4-히드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트, ε-N,N,N-트리메틸라이신, ε-N-아세틸라이신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-포르밀메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-히드록시라이신, σ-N-메틸아르기닌, 및 기타 유사 아미노산 및 이미노산(예를 들어, 4-히드록시프롤린). 본원에서 사용되는 폴리펩티드 표기법에서, 표준 용법 및 관례에 따르면 왼손 방향은 아미노 말단 방향이며, 오른손 방향은 카르복실 말단 방향이다.
천연 발생 잔기는 통상적인 측쇄 특성에 따라 다음 부류로 분류될 수 있다:
(1) 소수성: Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Tyr, Pro;
(2) 극성 친수성: Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Lys, Ser, Thr;
(3) 지방족: Ala, Gly, Ile, Leu, Val, Pro;
(4) 지방족 소수성: Ala, Ile, Leu, Val, Pro;
(5) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(6) 산성: Asp, Glu;
(7) 염기성: His, Lys, Arg;
(8) 사슬 배향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(9) 방향족: His, Trp, Tyr, Phe; 및
(10) 방향족 소수성: Phe, Trp, Tyr.
보존적 아미노산 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 동일 부류의 또 다른 구성원으로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 비보존적 치환은 이러한 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류로부터의 구성원으로 대체하는 것을 포함할 수 있다.
당업자라면 잘 알려진 기법을 이용하여 결합 단백질의 폴리펩티드 사슬의 적합한 변이체를 결정할 수 있을 것이다. 예를 들어, 당업자라면 활성에 중요할 것으로는 생각되지 않는 영역의 표적화에 의해 활성을 파괴하지 않고서 변화될 수 있는 폴리펩티드 사슬의 적합한 영역을 확인할 수 있다. 대안적으로, 당업자라면 유사 폴리펩티드들 사이에서 보존된 분자의 잔기 및 부분을 확인할 수 있다. 게다가, 심지어 생물학적 활성에 또는 구조에 중요할 수 있는 영역도 생물학적 활성을 파괴하지 않고서 또는 폴리펩티드 구조에 악영향을 주지 않고서 보존적 아미노산 치환이 가해질 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "환자"라는 용어는 인간 및 동물 대상체(예를 들어, 포유동물, 예컨대, 개, 돼지, 말, 고양이, 소 등)를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "치료" 또는 "치료하다"라는 용어는 치료적 치료 및 예방적 또는 방지적 조치 둘 다를 나타낸다. 치료를 필요로 하는 것은 장애를 갖고 있는 것과, 장애를 갖기 쉬운 것 또는 장애가 예방되어야 하는 것을 포함한다. 특별한 구현예에서, 결합 단백질은 암에 걸린 인간 또는 암에 걸리기 쉬운 인간의 치료, 또는 인간 대상체에서의 암의 개선에 사용될 수 있다. 결합 단백질은 또한 인간 환자에서의 암의 예방에 사용될 수 있다. 특별한 구현예에서, 암은 다발성 골수종, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 림프종, 유방암, 예컨대 Her2+ 유방암, 전립선암, 배중심 B-세포 림프종 또는 B-세포 급성 림프모구성 백혈병이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "제약 조성물" 또는 "치료적 조성물"이라는 용어는 환자에게 적절하게 투여되는 경우, 원하는 치료 효과를 유도할 수 있는 화합물 또는 조성물을 나타낸다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "제약상 허용 가능한 담체" 또는 "생리학적으로 허용 가능한 담체"라는 용어는 결합 단백질의 전달을 성취하거나 향상시키기에 적합한 하나 이상의 제형화 물질을 나타낸다.
하나 이상의 결합 단백질을 포함하는 제약 조성물과 관련하여 사용될 때 "유효량" 및 "치료적 유효량"이라는 용어는 원하는 치료 결과를 생성하기에 충분한 양 또는 투여량을 나타낸다. 더 구체적으로, 치료적 유효량은 치료되는 병태와 연관된 임상적으로 정의된 병리학적인 과정들 중 하나 이상을 일부 시간 기간 동안 억제하기에 충분한 결합 단백질의 양이다. 유효량은 사용되고 있는 특정 결합 단백질에 따라 달라질 수 있으며, 또한 치료되는 환자와 관련된 다양한 요인 및 상태와 장애의 중증도에 달려 있다. 예를 들어, 결합 단백질을 생체 내에서 투여하려고 할 경우, 환자의 연령, 중량 및 건강과 같은 요인과, 전임상 동물 연구에서 얻어진 용량 반응 곡선 및 독성 데이터가 고려되는 요인에 속할 것이다. 주어진 제약 조성물의 유효량 또는 치료적 유효량의 결정은 충분히 당업자의 능력 내에 있다.
본 발명의 일 구현예는 제약상 허용 가능한 담체 및 치료적 유효량의 결합 단백질을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
II. 항-CD38 결합 단백질
본 발명의 특정 측면은 CD38 폴리펩티드(예를 들어, 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드)에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 결합 단백질에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 1특이성 및/또는 1가, 2특이성 및/또는 2가, 3특이성 및/또는 3가 또는 다중특이성 및/또는 다가이다.
예시적인 1특이성, 2특이성 또는 3특이성 결합 단백질의 다양한 특징은 본원에 기술된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 CD38(예를 들어, 인간 CD38 아이소폼 A 및/또는 아이소폼 E 폴리펩티드) 및 시노몰구스 원숭이 CD38과 교차-반응한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 CD38+ 세포의 아폽토시스를 유도한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 T 세포를 CD38+ 세포에 동원하고, 선택적으로 (예를 들어, TCR 자극 및/또는 동시자극을 통해) T 세포를 활성화시킨다.
일부 구현예에서, 결합 단백질은 하기를 포함하는 항원 결합 부위를 포함한다: GYTFTSFN(서열 번호 31) 또는 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32) 또는 IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인; 또는 ESVDSYGNGF(서열 번호 34) 또는 QSVSSYGQGF(서열 번호 39)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35) 또는 GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 하기를 포함하는 항원 결합 부위를 포함한다: GYTFTSFN(서열 번호 31) 또는 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32) 또는 IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인; 또는 ESVDSYGNGF(서열 번호 34) 또는 QSVSSYGQG(서열 번호 132)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35) 또는 GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 표 G, H 또는 I에 나타낸 바와 같은, mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5, mAb6, mAb2xCD28supxCD3mid IgG4 FALA, mAb2xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A, mAb2xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA, mAb6xCD28supxCD3mid IgG4 FALA, mAb6xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A 또는 mAb6xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA의 항체 VH 및/또는 VL 도메인 서열로부터의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR을 포함한다.
일부 구현예에서, 결합 단백질은 하기를 포함하는 항원 결합 부위를 포함한다: GYTFTSFN(서열 번호 31) 또는 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32) 또는 IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인; 및 ESVDSYGNGF(서열 번호 34) 또는 QSVSSYGQGF(서열 번호 39)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35) 또는 GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인.
일부 구현예에서, 결합 단백질은 하기를 포함하는 항원 결합 부위를 포함한다: GYTFTSFN(서열 번호 31)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인; 또는 ESVDSYGNGF(서열 번호 34)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 하기를 포함하는 항원 결합 부위를 포함한다: GYTFTSFN(서열 번호 31)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인; 및 ESVDSYGNGF(서열 번호 34)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인. 다른 구현예에서, 결합 단백질은 하기를 포함하는 항원 결합 부위를 포함한다: GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인; 또는 QSVSSYGQGF(서열 번호 39)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 하기를 포함하는 항원 결합 부위를 포함한다: GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인; 및 QSVSSYGQGF(서열 번호 39)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인.
일부 구현예에서, VH 도메인은 N-말단에서 C-말단으로, 서열, FR1―CDR-H1―FR2―CDR-H2―FR3―CDR-H3―FR4를 포함하며; FR1은 서열 QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKAS(서열 번호 86), QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKAS(서열 번호 87), 또는 QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKAS(서열 번호 88)를 포함하며; FR2는 서열 MHWVKEAPGQRLEWIGY(서열 번호 90) 또는 MHWVKEAPGQGLEWIGY(서열 번호 91)를 포함하며; FR3은 서열 NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFC(서열 번호 93) 또는 NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFC(서열 번호 94)를 포함하며; FR4는 서열 WGQGTLVTVSS(서열 번호 96)를 포함한다. 일부 구현예에서, VL 도메인은 N-말단에서 C-말단으로, 서열, FR1―CDR-L1―FR2―CDR-L2―FR3―CDR-L3―FR4를 포함하며; FR1은 서열 DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRAS(서열 번호 97)를 포함하며; FR2는 서열 MHWYQQKPGQPPRLLIY(서열 번호 99)를 포함하며; FR3은 서열 SRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYC(서열 번호 101)를 포함하며; FR4는 서열 FGGGTKLEIK(서열 번호 103)를 포함한다.
일부 구현예에서, VH 도메인은 서열 번호 5의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/거나; VL 도메인은 서열 번호 6의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열 번호 17의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/거나; VL 도메인은 서열 번호 18의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열 번호 21의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/거나; VL 도메인은 서열 번호 18의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열 번호 23의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/거나; VL 도메인은 서열 번호 18의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열 번호 13의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/거나; VL 도메인은 서열 번호 14의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, VH 도메인은 서열 번호 5의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고; VL 도메인은 서열 번호 6의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열 번호 17의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하며; VL 도메인은 서열 번호 18의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열 번호 21의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하며; VL 도메인은 서열 번호 18의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열 번호 23의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하며; VL 도메인은 서열 번호 18의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열 번호 13의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하며; VL 도메인은 서열 번호 14의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, VH 도메인은 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하며; VL 도메인은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하며; VL 도메인은 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하며; VL 도메인은 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하며; VL 도메인은 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하며; VL 도메인은 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 및/또는 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 및/또는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 및/또는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 및/또는 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 및/또는 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 결합 단백질은 하기를 포함하는 항원 결합 부위를 포함한다: GFTFSSYG(서열 번호 41)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IWYDGSNK(서열 번호 42)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARMFRGAFDY(서열 번호 43)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인; 또는 QGIRND(서열 번호 44)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, AAS(서열 번호 45)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 LQDYIYYPT(서열 번호 46)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 하기를 포함하는 항원 결합 부위를 포함한다: GFTFSSYG(서열 번호 41)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IWYDGSNK(서열 번호 42)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARMFRGAFDY(서열 번호 43)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인; 및 QGIRND(서열 번호 44)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, AAS(서열 번호 45)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 LQDYIYYPT(서열 번호 46)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인.
일부 구현예에서, VH 도메인은 N-말단에서 C-말단으로, 서열, FR1―CDR-H1―FR2―CDR-H2―FR3―CDR-H3―FR4를 포함하며; FR1은 서열 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS(서열 번호 89)를 포함하며; FR2는 서열 MHWVRQAPGKGLEWVAV(서열 번호 92)를 포함하며; FR3은 서열 YYADSVKGRFTISGDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC(서열 번호 95)를 포함하며; FR4는 서열 WGQGTLVTVSS(서열 번호 96)를 포함한다. 일부 구현예에서, VL 도메인은 N-말단에서 C-말단으로, 서열, FR1―CDR-L1―FR2―CDR-L2―FR3―CDR-L3―FR4를 포함하며; FR1은 서열 AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS(서열 번호 98)를 포함하며; FR2는 서열 GWYQQKPGKAPKLLIY(서열 번호 100)를 포함하며; FR3은 서열 SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDSATYYC(서열 번호 102)를 포함하며; FR4는 서열 WGQGTLVTVSS(서열 번호 104)를 포함한다.
일부 구현예에서, VH 도메인은 서열 번호 9의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고/거나; VL 도메인은 서열 번호 10의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, VH 도메인은 서열 번호 9의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하며; VL 도메인은 서열 번호 10의 아미노산 서열과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH 도메인은 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하며; VL 도메인은 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 또는 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 및 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 표 G에 나타낸 항체 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 표 H에 나타낸 항체 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR 서열, VH 도메인 서열 및/또는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 표 I에 나타낸 항체 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 CDR 서열, VH 도메인 서열 및/또는 VL 도메인 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 표 I에 나타낸 1, 2, 3 또는 4개의 폴리펩티드 서열을 포함한다.
[표 G]
Figure pct00018
[표 H]
Figure pct00019
[표 I]
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
[표 J]
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
`
Figure pct00045
Figure pct00046
CD38 폴리펩티드
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인 및 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합하는 항원 결합 부위를 포함한다. 항원 결합 부위가 항원에 결합하는지 여부를 결정하기 위한 예시적인 분석은 본원에 기술되어 있으며, 본 기술 분야에 알려져 있다. 일부 구현예에서, 결합은 예를 들어, 아래에 기술된 바와 같이 ELISA 분석에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 결합은 예를 들어, 아래에 기술된 바와 같이 SPR 분석에 의해 결정된다. 일부 구현예에서, 결합은 예를 들어, 아래에 기술된 바와 같이 이의 세포 표면 상에 CD38 폴리펩티드를 발현하는 세포를 사용하여 유세포 분석에 의해 결정된다. 예를 들어, 실시예 1, 3 및 4를 참조한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 (예를 들어, ELISA 또는 SPR에 의해 측정시) 서열 번호 1 및/또는 30의 아미노산 서열을 포함하는 정제된 폴리펩티드 또는 그의 단편에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 (예를 들어, 유세포분석에 의해 측정시) 세포의 표면 상에 발현되는 경우, 서열 번호 1 및/또는 30의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 결합한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 (예를 들어, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는) CD38 아이소폼 A 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 (예를 들어, 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 1의 전체 아미노산 서열을 포함하지 않는, 서열 번호 105의 아미노산 서열로 이루어진, 또는 서열 번호 105의 아미노산 서열로 본질적으로 이루어진) CD38 아이소폼 E 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 (예를 들어, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는) CD38 아이소폼 A 폴리펩티드 및 (예를 들어, 서열 번호 105의 아미노산을 포함하고, 서열 번호 1의 전체 아미노산 서열을 포함하지 않는, 서열 번호 105의 아미노산 서열로 이루어진 또는 서열 번호 105의 아미노산 서열로 본질적으로 이루어진) CD38 아이소폼 E 폴리펩티드에 결합한다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, CD38 아이소폼 E 폴리펩티드로의 결합이 예를 들어, CD38 아이소폼 E 폴리펩티드를 발현하는 세포(들)에 대한 본 발명의 결합 단백질의 표적화에 유리할 수 있는 것으로 여겨진다.
인간 CD38 아이소폼 A 세포외 도메인 폴리펩티드 서열
Figure pct00047
Figure pct00048
인간 CD38 아이소폼 E 폴리펩티드 서열
Figure pct00049
일부 구현예에서, 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인은 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함한다.
시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드 서열
Figure pct00050
CD38 폴리펩티드에 결합하는 다중특이성(예를 들어, 2특이성, 3특이성 또는 다중특이성) 결합 단백질
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 하나 이상의 CD38 폴리펩티드에 결합하는 항원 결합 부위 및 상이한 표적 항원에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 2특이성 결합 단백질이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 하나 이상의 CD38 폴리펩티드에 결합하는 항원 결합 부위 및 하나 이상의 CD38 폴리펩티드에 결합하는 제2 항원 결합 부위를 포함하는 2특이성 결합 단백질이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 하나 이상의 CD38 폴리펩티드에 결합하는 항원 결합 부위, 제2 항원 결합 부위 및 제3 항원 결합 부위를 포함하는 3특이성 결합 단백질이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 항원 결합 부위 중 하나는 하나 이상의 CD38 폴리펩티드(들)(예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인)에 결합하며, 항원 결합 부위 중 1개 또는 2개는 T-세포 표면 단백질에 결합한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 부위 중 하나는 하나 이상의 CD38 폴리펩티드(들)(예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인)에 결합하며, 항원 결합 부위 중 하나는 인간 CD3 폴리펩티드에 결합하며, 항원 결합 부위 중 하나는 인간 CD28 폴리펩티드에 결합한다. 인간 CD3 및 CD28 폴리펩티드는 본 기술 분야에 알려져 있다. 인간 CD3 및 CD28 폴리펩티드에 결합하는 예시적인, 비-제한적인 항체 가변 도메인의 아미노산 서열이 본원에 제공된다.
일부 구현예에서, 각각 하나 이상의 표적 단백질에 결합하는 3개의 항원 결합 부위를 포함하는 결합 단백질이 본원에 제공된다. 일부 구현예에서, 3개의 항원 결합 부위 중 적어도 하나는 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인 및 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합한다. 일부 구현예에서, 인간 CD38 폴리펩티드는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하고/거나 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드는 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인 및 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합하는 항원 결합 부위 및 각각 T-세포 표면 단백질(예를 들어, 인간 CD28 폴리펩티드 및/또는 인간 CD3 폴리펩티드)에 결합하는 2개의 항원 결합 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 하나 이상의 종양 표적 단백질(예를 들어, 하나 이상의 CD38 폴리펩티드(들)) 및 하나 이상의 T 세포 표적 단백질에 결합한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 하나의 종양 표적 단백질(예를 들어, 하나 이상의 CD38 폴리펩티드(들)) 및 단일의 T 세포 표적 단백질 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 하나의 종양 표적 단백질(예를 들어, 하나 이상의 CD38 폴리펩티드(들)) 및 2개의 상이한 T 세포 표적 단백질(예를 들어, CD28 및 CD3)에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 하나의 T 세포 표적 단백질 및 단일의 종양 표적 단백질(예를 들어, 하나 이상의 CD38 폴리펩티드(들)) 상의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 하나의 T 세포 표적 단백질 및 2개의 상이한 종양 표적 단백질(예를 들어, 하나 이상의 CD38 폴리펩티드(들) 및 또 다른 종양 표적 단백질)에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 결합 단백질의 제1 및 제2 폴리펩티드 사슬은 2개의 T 세포 표적 단백질을 표적화하는 2개의 항원 결합 부위를 형성하며, 결합 단백질의 제3 및 제4 폴리펩티드 사슬은 하나 이상의 CD38 폴리펩티드(들)에 결합하는 항원 결합 부위를 형성한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질의 제1 및 제2 폴리펩티드 사슬은 2개의 종양 표적 단백질(예를 들어, 하나 이상의 CD38 폴리펩티드(들) 및 또 다른 종양 표적 단백질)을 표적화하는 2개의 항원 결합 부위를 형성하며, 결합 단백질의 제3 및 제4 폴리펩티드 사슬은 T 세포 표적 단백질에 결합하는 항원 결합 부위를 형성한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 T 세포 표적 단백질은 CD3 및 CD28 중 하나 이상이다.
일부 구현예에서, 결합 단백질은 하나 이상의 CD38 폴리펩티드(들) 및 T 세포 수용체 복합체를 포함하는 T-세포 상의 하나 이상의 표적 단백질에 특이적으로 결합한다. 이들 T-세포 관여항체 결합 단백질은 T 세포를 일시적으로 표적 세포에 동원하고 이와 동시에 T 세포의 세포용해 활성을 활성화시킬 수 있다. T 세포 상의 표적 단백질의 예는 특히 CD3 및 CD28을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 그러한 항원 표적 또는 표적 단백질의 추가의 예가 위에 제공되어 있다. 일부 구현예에서, 3특이성 결합 단백질은 2가지 이상의 1특이성 항체(모 항체)의 항원 결합 도메인을 하나의 항체로 조합함으로써 생성될 수 있다.
2특이성 결합 단백질 포맷
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 (예를 들어, 국제 공보 제WO2012/135345호에 기술된 구조를 갖는) 1개 이상(예를 들어, 2개)의 상이한 항원 표적 또는 표적 단백질에 결합하는 4개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 2특이성 및/또는 2가 결합 단백질이다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 2가이고/거나 2특이성이다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 4가이고/거나 4특이성이다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 4가이고/거나 2특이성이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 부위 중 적어도 하나는 CD38 폴리펩티드(예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인)에 결합한다.
일부 구현예에서, 결합 단백질은 하기 화학식 I:
[화학식 I]
Figure pct00051
로 표시되는 구조를 갖는 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하며,
2개의 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 II:
[화학식 II]
Figure pct00052
로 표시되는 구조를 가지며,
VL1은 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VL2는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VH1은 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
VH2는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이며;
CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 도메인이며;
Fc는 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2, CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하며;
L1, L2, L3 및 L4는 아미노산 링커이며;
화학식 I의 폴리펩티드와 화학식 II의 폴리펩티드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성한다. 일부 구현예에서, VH1 및 VL1은 CD38 폴리펩티드에 결합하는 항원 결합 도메인을 형성하며, VH2 및 VL2는 또 다른 항원 표적에 결합하는 항원 결합 도메인을 형성한다. 일부 구현예에서, VH2 및 VL2는 CD38 폴리펩티드에 결합하는 항원 결합 도메인을 형성하며, VH1 및 VL1은 또 다른 항원 표적에 결합하는 항원 결합 도메인을 형성한다.
일부 구현예에서, 결합 단백질은 2개의 항원 결합 부위를 형성하는 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 제1 폴리펩티드 사슬은
Figure pct00053
를 포함하며,
제2 폴리펩티드 사슬은
Figure pct00054
를 포함하며,
VL1은 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VL2는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VH1은 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
VH2는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이며;
CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 도메인이며;
CH2는 면역글로불린 CH2 중쇄 불변 도메인이며;
CH3은 면역글로불린 CH3 중쇄 불변 도메인이며;
Fc는 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2, CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하며;
L1, L2, L3 및 L4는 아미노산 링커이며;
제1 및 제2 폴리펩티드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성한다. 일부 구현예에서, VH1 및 VL1은 CD38 폴리펩티드에 결합하는 항원 결합 도메인을 형성하며, VH2 및 VL2는 또 다른 항원 표적에 결합하는 항원 결합 도메인을 형성한다. 일부 구현예에서, VH2 및 VL2는 CD38 폴리펩티드에 결합하는 항원 결합 도메인을 형성하며, VH1 및 VL1은 또 다른 항원 표적에 결합하는 항원 결합 도메인을 형성한다.
일부 구현예에서, 결합 단백질은 2개의 항원 결합 부위를 형성하는 3개의 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 제1 폴리펩티드 사슬은
Figure pct00055
를 포함하며,
제2 폴리펩티드 사슬은
Figure pct00056
를 포함하며,
제3 폴리펩티드 사슬은 항체 Fc 영역을 포함하며,
VL1은 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VL2는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VH1은 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
VH2는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이며;
CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 도메인이며;
CH2는 면역글로불린 CH2 중쇄 불변 도메인이며;
CH3은 면역글로불린 CH3 중쇄 불변 도메인이며;
Fc는 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2, CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하며;
L1, L2, L3 및 L4는 아미노산 링커이며;
제1 및 제2 폴리펩티드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성한다. 일부 구현예에서, VH1 및 VL1은 CD38 폴리펩티드에 결합하는 항원 결합 도메인을 형성하며, VH2 및 VL2는 또 다른 항원 표적에 결합하는 항원 결합 도메인을 형성한다. 일부 구현예에서, VH2 및 VL2는 CD38 폴리펩티드에 결합하는 항원 결합 도메인을 형성하며, VH1 및 VL1은 또 다른 항원 표적에 결합하는 항원 결합 도메인을 형성한다.
일부 구현예에서, 결합 단백질은 하기 화학식 I:
[화학식 I]
Figure pct00057
로 표시되는 구조를 포함하는 제1 폴리펩티드 쇄, 및
하기 화학식 II:
[화학식 II]
Figure pct00058
로 표시되는 구조를 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 포함하며,
VL1은 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VL2는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VH1은 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
VH2는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이며;
CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 도메인이며;
L1, L2, L3 및 L4는 아미노산 링커이며;
화학식 I의 폴리펩티드 및 화학식 II의 폴리펩티드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성한다. 일부 구현예에서, VH1 및 VL1은 CD38 폴리펩티드에 결합하는 항원 결합 도메인을 형성하며, VH2 및 VL2는 또 다른 항원 표적에 결합하는 항원 결합 도메인을 형성한다. 일부 구현예에서, VH2 및 VL2는 CD38 폴리펩티드에 결합하는 항원 결합 도메인을 형성하며, VH1 및 VL1은 또 다른 항원 표적에 결합하는 항원 결합 도메인을 형성한다.
상기 기술된 2특이성 결합 단백질 중 임의의 것에서, CD38 이외의 표적 항원은 하기의 예시적인 항원 표적 중 임의의 것일 수 있다: A2AR, APRIL, ATPDase, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4(VTCN1로도 공지됨), B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2(MCP-1로도 공지됨), CCL3(MIP-1a로도 공지됨), CCL4(MIP-1b로도 공지됨), CCL5(RANTES로도 공지됨), CCL7(MCP-3으로도 공지됨), CCL8(mcp-2로도 공지됨), CCL11(에오탁신으로도 공지됨), CCL15(MIP-1d로도 공지됨), CCL17(TARC로도 공지됨), CCL19(MIP-3b로도 공지됨), CCL20(MIP-3a로도 공지됨), CCL21(MIP-2로도 공지됨), CCL24(MPIF-2/에오탁신-2로도 공지됨), CCL25(TECK로도 공지됨), CCL26(에오탁신-3으로도 공지됨), CCR3, CCR4, CD3, CD19, CD20, CD23(IgE의 수용체인 FCER2로도 공지됨), CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80(B7-1로도 공지됨), CD86(B7-2로도 공지됨), CD122, CD137(41BB로도 공지됨), CD137L, CD152(CTLA4로도 공지됨), CD154(CD40L로도 공지됨), CD160, CD272, CD273(PDL2로도 공지됨), CD274(PDL1로도 공지됨), CD275(B7H2로도 공지됨), CD276(B7H3으로도 공지됨), CD278(ICOS로도 공지됨), CD279(PD-1로도 공지됨), CDH1(E-카드헤린(cadherin)으로도 공지됨), 키티나제(chitinase), CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1(M-CSF로도 공지됨), CSF-2(GM-CSF로도 공지됨), CSF-3(GCSF로도 공지됨), CX3CL1(SCYD1로도 공지됨), CXCL12(SDF1로도 공지됨), CXCL13, CXCR3, DNGR-1, 엑토뉴클레오시드 트리포스페이트 디포스포하이드롤라제 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNα, IgE, IGF1R, IL2R베타, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb(IL25에 대한 수용체로도 공지됨), IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4(b4 인테그린으로도 공지됨), ITK, KIR, LAG3, LAMP1, 렙틴, LPFS2, MHC 부류 II, NCR3LG1, NKG2D, NTPDase-1, OX40, OX40L, PD-1H, 혈소판 수용체, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2(IL33에 대한 수용체로도 공지됨), STEAP2, Syk 키나제, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP(IL7Ra에 대한 공동-수용체로도 공지됨), TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM 및 XCR1(GPR5/CCXCR1로도 공지됨). 일부 구현예에서, 상기 항원 표적 중 하나 이상은 인간 항원 표적이다.
상기 기술된 2특이성 결합 단백질 중 임의의 것에서, 본원에 기술된 임의의 링커 또는 링커의 조합이 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, L1, L2, L3 또는 L4 중 적어도 하나는 독립적으로 길이가 0개 아미노산이다. 일부 구현예에서, L1, L2, L3 또는 L4는 각각 독립적으로 길이가 적어도 1개의 아미노산이다. 일부 구현예에서, L1, L2, L3 및 L4는 각각 독립적으로 길이가 0개 아미노산이거나, GGGGSGGGGS(서열 번호 55), GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 56), S, RT, TKGPS(서열 번호 57), GQPKAAP(서열 번호 58) 및 GGSGSSGSGG(서열 번호 59)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, L1, L2, L3 및 L4는 각각 독립적으로 GGGGSGGGGS(서열 번호 55), GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 56), S, RT, TKGPS(서열 번호 57), GQPKAAP(서열 번호 58) 및 GGSGSSGSGG(서열 번호 59)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, L1은 서열 GQPKAAP(서열 번호 58)를 포함하며, L2는 서열 TKGPS(서열 번호 57)를 포함하며, L3은 서열 S를 포함하며, L4는 서열 RT를 포함한다. 일부 구현예에서, L1은 서열 GGGGSGGGGS(서열 번호 55)를 포함하며, L2는 서열 GGGGSGGGGS(서열 번호 55)를 포함하며, L3은 길이가 0개 아미노산이며, L4는 길이가 0개 아미노산이다. 일부 구현예에서, L1은 서열 GGSGSSGSGG(서열 번호 59)를 포함하며, L2는 서열 GGSGSSGSGG(서열 번호 59)를 포함하며, L3은 길이가 0개 아미노산이며, L4는 길이가 0개 아미노산이다. 일부 구현예에서, L1은 서열 GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 56)를 포함하며, L2는 길이가 0개 아미노산이며, L3은 서열 GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 56)를 포함하며, L4는 길이가 0개 아미노산이다.
CD38 폴리펩티드에 결합하는 3특이성 결합 단백질
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 1개 이상(예를 들어, 3개)의 상이한 항원 표적 또는 표적 단백질에 결합하는 3개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 3특이성 및/또는 3가 결합 단백질이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 부위 중 적어도 하나는 CD38 폴리펩티드(예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인)에 결합한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 I:
[화학식 I]
Figure pct00059
로 표시되는 구조를 포함하며;
제2 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 II:
[화학식 II]
Figure pct00060
로 표시되는 구조를 포함하며;
제3 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 III:
[화학식 III]
Figure pct00061
로 표시되는 구조를 포함하며;
제4 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 IV:
[화학식 IV]
Figure pct00062
로 표시되는 구조를 포함하며;
VL1은 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VL2는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VL3은 제3 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VH1은 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
VH2는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
VH3은 제3 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이며;
CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 도메인이며;
CH2는 면역글로불린 CH2 중쇄 불변 도메인이며;
CH3은 면역글로불린 CH3 중쇄 불변 도메인이며;
힌지는 CH1 및 CH2 도메인을 연결하는 면역글로불린 힌지 영역이며;
L1, L2, L3 및 L4는 아미노산 링커이며;
화학식 I의 폴리펩티드와 화학식 II의 폴리펩티드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 1개 이상(예를 들어, 3개)의 상이한 항원 표적 또는 표적 단백질에 결합하는 3개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 3특이성 및/또는 3가 결합 단백질이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 부위 중 적어도 하나는 CD38 폴리펩티드(예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인)에 결합한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 I:
[화학식 I]
Figure pct00063
로 표시되는 구조를 포함하며;
제2 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 II:
[화학식 II]
Figure pct00064
로 표시되는 구조를 포함하며;
제3 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 III:
[화학식 III]
Figure pct00065
로 표시되는 구조를 포함하며;
제4 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 IV:
[화학식 IV]
Figure pct00066
로 표시되는 구조를 포함하며;
VL1은 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VL2는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VL3은 제3 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VH1은 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
VH2는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
VH3은 제3 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이며;
CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 도메인이며;
L1, L2, L3 및 L4는 아미노산 링커이며;
화학식 I의 폴리펩티드와 화학식 II의 폴리펩티드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성한다. 일부 구현예에서, 제2 및 제3 폴리펩티드 사슬은 CH1에 연결된 Fc 영역을 추가로 포함하며, Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역, 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬은 2개의 별개의 항원 결합 부위를 형성하는 교차 배향을 갖는다. 일부 구현예에서, VH1 및 VL1은 결합쌍을 형성하며, 제1 항원 결합 부위를 형성한다. 일부 구현예에서, VH2 및 VL2는 결합쌍을 형성하며, 제2 항원 결합 부위를 형성한다. 일부 구현예에서, 제1 항원 결합 부위는 CD3 폴리펩티드(예를 들어, 인간 CD3)에 결합하며, 제2 항원 결합 부위는 CD28 폴리펩티드(예를 들어, 인간 CD28)에 결합한다. 일부 구현예에서, 제2 항원 결합 부위는 CD3 폴리펩티드(예를 들어, 인간 CD3)에 결합하며, 제1 항원 결합 부위는 CD28 폴리펩티드(예를 들어, 인간 CD28)에 결합한다. 일부 구현예에서, 제3 폴리펩티드 및 제4 폴리펩티드는 제3 항원 결합 부위를 형성한다. 일부 구현예에서, VH3 및 VL3은 결합쌍을 형성하며, 제3 항원 결합 부위를 형성한다. 일부 구현예에서, 제3 항원 결합 부위는 CD38 폴리펩티드(예를 들어, 인간 및 선택적으로 시노몰구스 원숭이 CD38)에 결합한다. 본원에 사용하기 위해 고려되는 교차 배향을 갖는 예시적인 결합 단백질 포맷은 미국 특허 출원 제15/487,243호 및 국제 출원 제PCT/US2017/027488호에도 기술되어 있다.
본원에 기술된 2특이성, 3특이성 또는 다중특이성 결합 단백질 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 항원 결합 부위는 CD38 폴리펩티드(예를 들어, 인간 및 선택적으로 시노몰구스 원숭이 CD38)에 결합한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 2특이성, 3특이성 또는 다중특이성 결합 단백질 중 임의의 것의 다른(예를 들어, CD38에 결합하지 않는) 항원 결합 부위(들)는 CD28 또는 CD3에 결합한다. 일부 구현예에서, VH1 도메인은 GYTFTSFN(서열 번호 31) 또는 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32) 또는 IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, VL1 도메인은 ESVDSYGNGF(서열 번호 34) 또는 QSVSSYGQGF(서열 번호 39)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35) 또는 GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH2 도메인은 GYTFTSFN(서열 번호 31) 또는 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32) 또는 IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, VL2 도메인은 ESVDSYGNGF(서열 번호 34) 또는 QSVSSYGQGF(서열 번호 39)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35) 또는 GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH3 도메인은 GYTFTSFN(서열 번호 31) 또는 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32) 또는 IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, VL3 도메인은 ESVDSYGNGF(서열 번호 34) 또는 QSVSSYGQGF(서열 번호 39)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35) 또는 GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH1 도메인은 GYTFTSFN(서열 번호 31) 또는 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32) 또는 IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, VL1 도메인은 ESVDSYGNGF(서열 번호 34) 또는 QSVSSYGQG(서열 번호 132)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35) 또는 GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH2 도메인은 GYTFTSFN(서열 번호 31) 또는 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32) 또는 IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, VL2 도메인은 ESVDSYGNGF(서열 번호 34) 또는 QSVSSYGQG(서열 번호 132)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35) 또는 GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH3 도메인은 GYTFTSFN(서열 번호 31) 또는 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32) 또는 IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, VL3 도메인은 ESVDSYGNGF(서열 번호 34) 또는 QSVSSYGQG(서열 번호 132)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35) 또는 GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, VH1 도메인은 GFTFSSYG(서열 번호 41)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IWYDGSNK(서열 번호 42)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 및 ARMFRGAFDY(서열 번호 43)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하고/거나, VL1 도메인은 QGIRND(서열 번호 44)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, AAS(서열 번호 45)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 LQDYIYYPT(서열 번호 46)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH2 도메인은 GFTFSSYG(서열 번호 41)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IWYDGSNK(서열 번호 42)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 및 ARMFRGAFDY(서열 번호 43)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하고/거나, VL2 도메인은 QGIRND(서열 번호 44)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, AAS(서열 번호 45)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 LQDYIYYPT(서열 번호 46)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH3 도메인은 GFTFSSYG(서열 번호 41)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IWYDGSNK(서열 번호 42)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 및 ARMFRGAFDY(서열 번호 43)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하고/거나, VL3 도메인은 QGIRND(서열 번호 44)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, AAS(서열 번호 45)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 LQDYIYYPT(서열 번호 46)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, VH1 도메인은 GFTFSSYG(서열 번호 41)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IWYDGSNK(서열 번호 42)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 및 ARMFRGAFDY(서열 번호 43)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, VL1 도메인은 QGIRND(서열 번호 44)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, AAS(서열 번호 45)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 LQDYIYYPT(서열 번호 46)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH2 도메인은 GFTFSSYG(서열 번호 41)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IWYDGSNK(서열 번호 42)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 및 ARMFRGAFDY(서열 번호 43)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, VL2 도메인은 QGIRND(서열 번호 44)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, AAS(서열 번호 45)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 LQDYIYYPT(서열 번호 46)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH3 도메인은 GFTFSSYG(서열 번호 41)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IWYDGSNK(서열 번호 42)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 및 ARMFRGAFDY(서열 번호 43)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, VL3 도메인은 QGIRND(서열 번호 44)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, AAS(서열 번호 45)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 LQDYIYYPT(서열 번호 46)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, VH1 도메인은 GYTFTSFN(서열 번호 31)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하고/거나, VL1 도메인은 ESVDSYGNGF(서열 번호 34)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH1 도메인은 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하고/거나, VL1 도메인은 QSVSSYGQGF(서열 번호 39)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH2 도메인은 GYTFTSFN(서열 번호 31)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하고/거나, VL2 도메인은 ESVDSYGNGF(서열 번호 34)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH2 도메인은 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하고/거나, VL2 도메인은 QSVSSYGQGF(서열 번호 39)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH3 도메인은 GYTFTSFN(서열 번호 31)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하고/거나, VL3 도메인은 ESVDSYGNGF(서열 번호 34)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH3 도메인은 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하고/거나, VL3 도메인은 QSVSSYGQGF(서열 번호 39)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, VH1 도메인은 GYTFTSFN(서열 번호 31)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, VL1 도메인은 ESVDSYGNGF(서열 번호 34)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH1 도메인은 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, VL1 도메인은 QSVSSYGQGF(서열 번호 39)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH2 도메인은 GYTFTSFN(서열 번호 31)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, VL2 도메인은 ESVDSYGNGF(서열 번호 34)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH2 도메인은 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, VL2 도메인은 QSVSSYGQGF(서열 번호 39)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH3 도메인은 GYTFTSFN(서열 번호 31)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, VL3 도메인은 ESVDSYGNGF(서열 번호 34)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH3 도메인은 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, VL3 도메인은 QSVSSYGQGF(서열 번호 39)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, VH3 도메인은 GYTFTSFN(서열 번호 31)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하고/거나 VL3 도메인은 ESVDSYGNGF(서열 번호 34)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH3 도메인은 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하고/거나 VL3 도메인은 QSVSSYGQGF(서열 번호 39)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, VH3 도메인은 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 VL3 도메인은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH3 도메인은 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 VL3 도메인은 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH3 도메인은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 VL3 도메인은 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH3 도메인은 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 VL3 도메인은 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH3 도메인은 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 VL3 도메인은 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, VH3 도메인은 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하고/거나 VL3 도메인은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH3 도메인은 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하며, VL3 도메인은 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH3 도메인은 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하며, VL3 도메인은 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH3 도메인은 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하며, VL3 도메인은 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH3 도메인은 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하며, VL3 도메인은 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, VH3 도메인은 GFTFSSYG(서열 번호 41)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IWYDGSNK(서열 번호 42)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열, 및 ARMFRGAFDY(서열 번호 43)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하고/거나 VL3 도메인은 QGIRND(서열 번호 44)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, AAS(서열 번호 45)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열, 및 LQDYIYYPT(서열 번호 46)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, VH3 도메인은 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하고/거나 VL3 도메인은 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 3특이성 결합 단백질 중 임의의 것의 일부 구현예에서, 하나의 항원 결합 도메인은 CD3 폴리펩티드(예를 들어, 인간 CD3)에 결합하며, 하나의 항원 결합 도메인은 CD28 폴리펩티드(예를 들어, 인간 CD28)에 결합한다. 일부 구현예에서, VH1 도메인은 표 H에 나타낸 바와 같은 서열 번호 49 또는 51로부터의 3개의 CDR을 포함하며, VL1 도메인은 표 H에 나타낸 바와 같은 서열 번호 50 또는 52로부터의 3개의 CDR을 포함한다. 일부 구현예에서, VH2 도메인은 표 H에 나타낸 바와 같은 서열 번호 49 또는 51로부터의 3개의 CDR을 포함하며, VL2 도메인은 표 H에 나타낸 바와 같은 서열 번호 50 또는 52로부터의 3개의 CDR을 포함한다. 일부 구현예에서, VH1 도메인은 표 H에 나타낸 바와 같은 서열 번호 53 또는 84로부터의 3개의 CDR을 포함하며, VL1 도메인은 표 H에 나타낸 바와 같은 서열 번호 54 또는 85로부터의 3개의 CDR을 포함한다. 일부 구현예에서, VH2 도메인은 표 H에 나타낸 바와 같은 서열 번호 53 또는 84로부터의 3개의 CDR을 포함하며, VL2 도메인은 표 H에 나타낸 바와 같은 서열 번호 54 또는 85로부터의 3개의 CDR을 포함한다.
일부 구현예에서, VH1 도메인은 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하며, VL1 도메인은 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하며, VH2 도메인은 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하며, VL2 도메인은 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH2 도메인은 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하며, VL2 도메인은 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하며, VH1 도메인은 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하며, VL1 도메인은 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH1 도메인은 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하며, VL1 도메인은 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하며, VH2 도메인은 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하며, VL2 도메인은 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH2 도메인은 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하며, VL2 도메인은 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하며, VH1 도메인은 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하며, VL1 도메인은 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, VH1 도메인은 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하며, VL1 도메인은 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하며, VH2 도메인은 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하며, VL2 도메인은 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하며, VH3 도메인은 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하며, VL3 도메인은 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, VH1 도메인은 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하며, VL1 도메인은 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하며, VH2 도메인은 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하며, VL2 도메인은 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하며, VH3 도메인은 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하며, VL3 도메인은 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 61의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하며, 제2 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 60의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하며, 제3 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 62의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하며, 제4 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 63의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 61의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하며, 제2 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 64의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하며, 제3 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 65의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하며, 제4 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 63의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 61의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하며, 제2 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 66의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하며, 제3 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 67의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하며, 제4 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 63의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 61의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하며, 제2 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 60의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하며, 제3 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 68의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하며, 제4 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 69의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 61의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하며, 제2 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 64의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하며, 제3 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 70의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하며, 제4 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 69의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 61의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하며, 제2 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 66의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하며, 제3 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 71의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함하며, 제4 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 69의 아미노산 서열과 적어도 95% 동일한 폴리펩티드 서열을 포함한다.
특정 구현예에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하며, 제2 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함하며, 제3 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 62의 아미노산 서열을 포함하며, 제4 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하며, 제2 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하며, 제3 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하며, 제4 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하며, 제2 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하며, 제3 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하며, 제4 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하며, 제2 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함하며, 제3 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하며, 제4 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하며, 제2 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하며, 제3 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하며, 제4 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하며, 제2 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하며, 제3 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 71의 아미노산 서열을 포함하며, 제4 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함한다.
상기 기술된 3특이성 결합 단백질 중 임의의 것에서, CD38 이외의 표적 항원은 하기의 예시적인 항원 표적 중 임의의 것일 수 있다: A2AR, APRIL, ATPDase, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4(VTCN1로도 공지됨), B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2(MCP-1로도 공지됨), CCL3(MIP-1a로도 공지됨), CCL4(MIP-1b로도 공지됨), CCL5(RANTES로도 공지됨), CCL7(MCP-3으로도 공지됨), CCL8(mcp-2로도 공지됨), CCL11(에오탁신으로도 공지됨), CCL15(MIP-1d로도 공지됨), CCL17(TARC로도 공지됨), CCL19(MIP-3b로도 공지됨), CCL20(MIP-3a로도 공지됨), CCL21(MIP-2로도 공지됨), CCL24(MPIF-2/에오탁신-2로도 공지됨), CCL25(TECK로도 공지됨), CCL26(에오탁신-3으로도 공지됨), CCR3, CCR4, CD3, CD19, CD20, CD23(IgE의 수용체인 FCER2로도 공지됨), CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80(B7-1로도 공지됨), CD86(B7-2로도 공지됨), CD122, CD137(41BB로도 공지됨), CD137L, CD152(CTLA4로도 공지됨), CD154(CD40L로도 공지됨), CD160, CD272, CD273(PDL2로도 공지됨), CD274(PDL1로도 공지됨), CD275(B7H2로도 공지됨), CD276(B7H3으로도 공지됨), CD278(ICOS로도 공지됨), CD279(PD-1로도 공지됨), CDH1(E-카드헤린으로도 공지됨), 키티나제, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1(M-CSF로도 공지됨), CSF-2(GM-CSF로도 공지됨), CSF-3(GCSF로도 공지됨), CX3CL1(SCYD1로도 공지됨), CXCL12(SDF1로도 공지됨), CXCL13, CXCR3, DNGR-1, 엑토뉴클레오시드 트리포스페이트 디포스포하이드롤라제 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNα, IgE, IGF1R, IL2R베타, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb(IL25에 대한 수용체로도 공지됨), IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4(b4 인테그린으로도 공지됨), ITK, KIR, LAG3, LAMP1, 렙틴, LPFS2, MHC 부류 II, NCR3LG1, NKG2D, NTPDase-1, OX40, OX40L, PD-1H, 혈소판 수용체, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2(IL33에 대한 수용체로도 공지됨), STEAP2, Syk 키나제, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP(IL7Ra에 대한 공동-수용체로도 공지됨), TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM 및 XCR1(GPR5/CCXCR1로도 공지됨). 일부 구현예에서, 상기 항원 표적 중 하나 이상은 인간 항원 표적이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 단클론 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체이다.
본 발명의 결합 단백질은 예를 들어, 인간, 쥣과 또는 인간화 항체를 포함하는 임의의 인간 또는 비-인간 항체로부터 수득되거나 유래되는 도메인 또는 서열을 사용하여 제조될 수 있다.
링커
일부 구현예에서, 링커 L1, L2, L3 및 L4는 아미노산 없음(길이=0)으로부터 약 100개의 아미노산의 길이까지, 또는 100, 50, 40, 30, 20, 또는 15개 미만의 아미노산 또는 이보다 더 적은 아미노산까지의 범위이다. 링커는 또한 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산의 길이일 수 있다. 하나의 결합 단백질에서의 L1, L2, L3, 및 L4는 전부 동일 아미노산 서열을 가질 수 있거나 또는 전부 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다.
적합한 링커의 예는 단일 글리신(Gly) 잔기; 디글리신 펩티드(Gly-Gly); 트리펩티드(Gly-Gly-Gly); 4개의 글리신 잔기를 갖는 펩티드; 5개의 글리신 잔기를 갖는 펩티드; 6개의 글리신 잔기를 갖는 펩티드; 7개의 글리신 잔기를 갖는 펩티드; 및 8개의 글리신 잔기를 갖는 펩티드를 포함한다. 아미노산 잔기의 다른 조합, 예컨대 펩티드 GGGGSGGGGS(서열 번호 55), 펩티드 GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 56), 펩티드 TKGPS(서열 번호 57), 펩티드 GQPKAAP(서열 번호 58) 및 펩티드 GGSGSSGSGG(서열 번호 59)가 사용될 수 있다. 상기 열거된 예는 본 발명의 범주를 어떤 방식으로든 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 발린, 류신, 이소류신, 세린, 트레오닌, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르트산염, 글루탐산염, 아스파라긴, 글루타민, 글리신 및 프롤린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 무작위로 선택된 아미노산을 포함하는 링커가 결합 단백질에서 적합한 것으로 밝혀졌다. 링커 서열의 추가의 설명에 대해서는, 예를 들어 WO2012135345호 및 국제 출원 제PCT/US2017/027488호를 참조한다.
링커에서의 아미노산 잔기의 아이덴티티(identity) 및 서열은 링커에서 달성하는 데 필요한 이차 구조 요소의 유형에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 글리신, 세린 및 알라닌은 최대 유연성을 갖는 링커에 있어서 최적이다. 글리신, 프롤린, 트레오닌 및 세린의 일부 조합은, 더욱 경성(rigid)이고 연장된 링커가 필요한 경우에 유용하다. 원하는 특성에 따라 필요할 경우 더 큰 펩티드 링커가 구축되도록 임의의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기와 조합되어 링커로 간주될 수 있다.
일부 구현예에서, L1, L2, L3 또는 L4 중 적어도 하나는 독립적으로 길이가 0개 아미노산이다. 일부 구현예에서, L1, L2, L3 또는 L4는 각각 독립적으로 길이가 적어도 1개의 아미노산이다. 일부 구현예에서, L1의 길이는 L3의 길이의 적어도 2배이다. 일부 구현예에서, L2의 길이는 L4의 길이의 적어도 2배이다. 일부 구현예에서, L1의 길이는 L3의 길이의 적어도 2배이며, L2의 길이는 L4의 길이의 적어도 2배이다. 일부 구현예에서, L1은 길이가 3개 내지 12개 아미노산 잔기이며, L2는 길이가 3개 내지 14개 아미노산 잔기이며, L3은 길이가 1개 내지 8개 아미노산 잔기이며, L4는 길이가 1개 내지 3개 아미노산 잔기이다. 일부 구현예에서, L1은 길이가 5개 내지 10개 아미노산 잔기이며, L2는 길이가 5개 내지 8개 아미노산 잔기이며, L3은 길이가 1개 내지 5개 아미노산 잔기이며, L4는 길이가 1개 내지 2개 아미노산 잔기이다. 일부 구현예에서, L1은 길이가 7개 아미노산 잔기이며, L2는 길이가 5개 아미노산 잔기이며, L3은 길이가 1개 아미노산 잔기이며, L4는 길이가 2개 아미노산 잔기이다. 일부 구현예에서, L1은 길이가 10개 아미노산 잔기이며, L2는 길이가 10개 아미노산 잔기이며, L3은 길이가 0개 아미노산 잔기이며, L4는 길이가 0개 아미노산 잔기이다. 일부 구현예에서, L1, L2, L3 및 L4는 0개 내지 15개 아미노산(예를 들어, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개 아미노산)으로부터 각각 독립적으로 길이를 가지며, 링커 중 적어도 2개는 1개 내지 15개 아미노산(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개 아미노산)의 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, L1, L2, L3 및 L4는 각각 길이가 0개 아미노산이다.
일부 구현예에서, L1, L2, L3 및/또는 L4는 항체 가변 도메인과 항체 불변 도메인 사이의 접합부에서 천연 발생 서열로부터 유래된 서열을 포함한다(예를 들어, WO2012/135345호에 기술된 바와 같음). 예를 들어, 일부 구현예에서, 링커는 내인성 VH 도메인과 CH1 도메인 사이, 또는 내인성 VL 도메인과 CL 도메인(예를 들어, 카파 또는 람다) 사이의 전환부에서 발견되는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 내인성 인간 VH 도메인과 CH1 도메인 사이, 또는 내인성 인간 VL 도메인과 CL 도메인(예를 들어, 인간 카파 또는 람다) 사이의 전환부에서 발견되는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, L1, L2, L3 및 L4는 각각 독립적으로 길이가 0개 아미노산이거나, GGGGSGGGGS(서열 번호 55), GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 56), S, RT, TKGPS(서열 번호 57), GQPKAAP(서열 번호 58) 및 GGSGSSGSGG(서열 번호 59)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, L1, L2, L3 및 L4는 각각 독립적으로 GGGGSGGGGS(서열 번호 55), GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 56), S, RT, TKGPS(서열 번호 57), GQPKAAP(서열 번호 58) 및 GGSGSSGSGG(서열 번호 59)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, L1은 서열 GQPKAAP(서열 번호 58)를 포함하며, L2는 서열 TKGPS(서열 번호 57)를 포함하며, L3은 서열 S를 포함하며, L4는 서열 RT를 포함한다. 일부 구현예에서, L1은 서열 GGGGSGGGGS(서열 번호 55)를 포함하며, L2는 서열 GGGGSGGGGS(서열 번호 55)를 포함하며, L3은 길이가 0개 아미노산이며, L4는 길이가 0개 아미노산이다. 일부 구현예에서, L1은 서열 GGSGSSGSGG(서열 번호 59)를 포함하며, L2는 서열 GGSGSSGSGG(서열 번호 59)를 포함하며, L3은 길이가 0개 아미노산이며, L4는 길이가 0개 아미노산이다. 일부 구현예에서, L1은 서열 GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 56)를 포함하며, L2는 길이가 0개 아미노산이며, L3은 서열 GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 56)를 포함하며, L4는 길이가 0개 아미노산이다.
Fc 영역 및 불변 도메인
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 전장 항체 중쇄 또는 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 인간 Fc 영역, 예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 항체 힌지, CH1, CH2, CH3 및 선택적으로 CH4 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 인간 IgG1 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 인간 IgG4 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 아래에 기술된 돌연변이 중 하나 이상을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 1 또는 2개의 Fc 변이체를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "Fc 변이체"는 고유 Fc로부터 변형되지만 재생 수용체(salvage receptor)인 FcRn(신생아 Fc 수용체)에 대한 결합 부위를 여전히 포함하는 분자 또는 서열을 나타낸다. 예시적인 Fc 변이체, 및 그들과 재생 수용체의 상호작용이 본 기술 분야에 공지되어 있다. 따라서, 용어 "Fc 변이체"는 비-인간 고유 Fc 유래의 인간화된 분자 또는 서열을 포함할 수 있다. 더욱이, 고유 Fc는 본 발명의 항체-유사 결합 단백질에 요구되지 않는 구조적 특징 또는 생물학적 활성을 제공하기 때문에 제거될 수 있는 영역을 포함한다. 따라서, 용어 "Fc 변이체"는 하나 이상의 고유 Fc 부위 또는 잔기가 결여된, 또는 (1) 디술피드 결합 형성, (2) 선택된 숙주 세포와의 불화합성(incompatibility), (3) 선택된 숙주 세포에서의 발현시의 N-말단 이종성(heterogeneity), (4) 글리코실화, (5) 보체와의 상호작용, (6) 재생 수용체 이외의 Fc 수용체에의 결합, 또는 (7) 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)에 영향을 주거나 이들에 연루되는 하나 이상의 Fc 부위 또는 잔기가 변형된 분자 또는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, Fc 영역은 Fc 영역의 Fc 수용체 결합 및/또는 이펙터 기능(예를 들어, Fc 수용체-매개된 항체-의존성 세포 식작용(ADCP), 보체-의존성 세포독성(CDC), 및/또는 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC))을 감소시키거나 제거하는 하나 이상의 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1의 위치 234, 235 및/또는 329에 상응하는 위치에 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 L234A, L235A 및/또는 P329A이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1의 위치 298, 299 및/또는 300에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 S298N, T299A 및/또는 Y300S이다.
일부 구현예에서, Fc 영역은 FcγI 및/또는 FcγII 결합을 감소시키거나 제거하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 FcγI 및/또는 FcγII 결합을 감소시키거나 제거하지만, FcRn 결합에는 영향을 미치지 않는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 228 및/또는 409에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 S228P 및/또는 R409K이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 234 및/또는 235에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 F234A 및/또는 L235A이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 228, 234, 235 및/또는 409에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 S228P, F234A, L235A 및/또는 R409K이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 233 내지 236에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 E233P, F234V, L235A, 및 236에서의 결실이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 228, 233 내지 236 및/또는 409에 상응하는 치환에 아미노산 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 아미노산 돌연변이는 S228P; E233P, F234V, L235A, 및 236에서의 결실; 및/또는 R409K이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 예를 들어, 정제 시약에 대한 친화도를 조절함으로써 정제를 개선하기 위한 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 이종이량체형 결합 단백질은 상기 이종이량체 형태가 동종이량체 형태보다 단백질 A-기반의 정제에 대하여 중등의 친화성을 가질 것이고, 예를 들어 상이한 pH의 이용에 의해 단백질 A로부터 선택적으로 용출될 수 있기 때문에, 상기 이종이량체 형태의 2개의 Fc 영역 중 하나가 단백질 A에의 결합을 감소시키거나 없애는 돌연변이(들)를 포함할 경우 그들의 동종이량체 형태로부터 선택적으로 정제될 수 있음이 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Smith, E.J. et al. (2015) Sci. Rep. 5:17943] 참조). 일부 구현예에서, 돌연변이는 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 435 및 436에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하며, 여기서, 상기 아미노산 치환은 H435R 및 Y436F이다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 CH1에 연결된 제1 Fc 영역을 추가로 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬과 CH1에 연결된 제2 Fc 영역을 추가로 포함하는 제3 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 상기 제1 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하며, 상기 제2 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하며; 여기서, 제1 및 제2 Fc 영역 중 하나만이 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 435 및 436에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환은 H435R 및 Y436F이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 놉 및 홀 돌연변이 및 정제를 개선시키기 위한 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 Fc 영역은 인간 IgG1 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 Fc 영역은 인간 IgG4 Fc 영역이다.
일부 결합 단백질(예를 들어, 2특이성 또는 3특이성 결합 단백질)의 수율을 향상시키기 위하여, CH3 도메인은 예를 들어 국제 공개 제WO 96/027011호, 문헌[Ridgway et al., 1996, Protein Eng. 9: 617-21]; 및 문헌[Merchant et al., 1998, Nat. Biotechnol. 16: 677-81]에 몇몇 예를 이용하여 상세하게 설명된 "놉-인투-홀" 기술에 의해 변경될 수 있다. 구체적으로, 2개의 CH3 도메인의 상호작용 표면은 이러한 2개의 CH3 도메인을 포함하는 둘 다의 중쇄의 이종이량체화(heterodimerisation)를 증가시키도록 변경된다. (상기 2개의 중쇄의) 상기 2개의 CH3 도메인 각각은 "놉"일 수 있는 반면, 다른 것은 "홀"이다. 디술피드 가교체의 도입은 추가로 이종이량체를 안정화시키며(문헌[Merchant et al., 1998]; 문헌[Atwell et al., 1997, J. Mol. Biol. 270: 26-35]) 수율을 증가시킨다. 특정 구현예에서, 놉은 단일 가변 도메인을 갖는 제2 폴리펩티드 쌍 상에 있다. 다른 구현예에서, 놉은 교차 배향을 갖는 제1 폴리펩티드 쌍 상에 있다. 또 다른 구현예에서, CH3 도메인은 놉 인 홀(knob in hole)을 포함하지 않는다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질(예를 들어, 3특이성 결합 단백질)은 제2 폴리펩티드 사슬 상의 "놉" 돌연변이 및 제3 폴리펩티드 사슬 상의 "홀" 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 제3 폴리펩티드 사슬 상의 "놉" 돌연변이 및 제2 폴리펩티드 사슬 상의 "홀" 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, "놉" 돌연변이는 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 354 및/또는 366에 상응하는 위치에서의 치환(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 아미노산 치환은 S354C, T366W, T366Y, S354C 및 T366W, 또는 S354C 및 T366Y이다. 일부 구현예에서, "놉" 돌연변이는 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 354 및 366에 상응하는 위치에서의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 S354C 및 T366W이다. 일부 구현예에서, "홀" 돌연변이는 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 407, 및 선택적으로, 349, 366, 및/또는 368에 상응하는 위치에서의 치환(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 아미노산 치환은 Y407V 또는 Y407T 및 선택적으로 Y349C, T366S, 및/또는 L368A이다. 일부 구현예에서, "홀" 돌연변이는 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 349, 366, 368, 및 407에 상응하는 위치에서의 치환을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V이다.
일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 사슬은 CH1에 연결된 제1 Fc 영역을 추가로 포함하며, 상기 제1 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하고, 여기서, 제1 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 366 및 선택적으로 354에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환(들)을 포함하며, 상기 아미노산 치환은 T366W 또는 T366Y 및 선택적으로 S354C이고; 제3 폴리펩티드 사슬은 CH1에 연결된 제2 Fc 영역을 추가로 포함하며, 상기 제2 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하고, 여기서, 제2 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 407 및 선택적으로 349, 366, 및/또는 368에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환(들)을 포함하며, 상기 아미노산 치환은 Y407V 또는 Y407T 및 선택적으로 Y349C, T366S, 및/또는 L368A이다.
일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 사슬은 CH1에 연결된 제1 Fc 영역을 추가로 포함하며, 상기 제1 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하고, 여기서, 제1 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 407 및 선택적으로 349, 366, 및/또는 368에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환(들)을 포함하며, 상기 아미노산 치환은 Y407V 또는 Y407T 및 선택적으로 Y349C, T366S, 및/또는 L368A이고; 제3 폴리펩티드 사슬은 CH1에 연결된 제2 Fc 영역을 추가로 포함하며, 상기 제2 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하고, 여기서, 제2 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 366 및 선택적으로 354에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환(들)을 포함하며, 상기 아미노산 치환은 T366W 또는 T366Y 및 선택적으로 S354C이다.
일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 사슬은 CH1에 연결된 제1 Fc 영역을 추가로 포함하며, 상기 제1 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하고, 여기서, 제1 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 366에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환은 T366W이고; 제3 폴리펩티드 사슬은 CH1에 연결된 제2 Fc 영역을 추가로 포함하며, 상기 제2 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하고, 여기서, 제2 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 366, 368, 및/또는 407에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환(들)을 포함하며, 상기 아미노산 치환은 T366S, L368A, 및/또는 Y407V이다.
일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 사슬은 CH1에 연결된 제1 Fc 영역을 추가로 포함하며, 상기 제1 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하고, 여기서, 제1 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 366, 368, 및/또는 407에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환(들)을 포함하며, 상기 아미노산 치환은 T366S, L368A, 및/또는 Y407V이고; 제3 폴리펩티드 사슬은 CH1에 연결된 제2 Fc 영역을 추가로 포함하며, 상기 제2 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하고, 여기서, 제2 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 366에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환은 T366W이다.
일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 사슬은 CH1에 연결된 제1 Fc 영역을 추가로 포함하며, 상기 제1 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하고, 여기서, 제1 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 354 및 366에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환은 S354C 및 T366W이고; 제3 폴리펩티드 사슬은 CH1에 연결된 제2 Fc 영역을 추가로 포함하며, 상기 제2 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하고, 여기서, 제2 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 349, 366, 368, 및 407에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환은 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V이다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 사슬은 CH1에 연결된 제1 Fc 영역을 추가로 포함하며, 상기 제1 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하고, 여기서, 제1 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 349, 366, 368, 및 407에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환은 Y349C, T366S, L368A, 및 Y407V이고; 제3 폴리펩티드 사슬은 CH1에 연결된 제2 Fc 영역을 추가로 포함하며, 상기 제2 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하고, 여기서, 제2 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 354 및 366에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환은 S354C 및 T366W이다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 Fc 영역은 인간 IgG1 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 Fc 영역은 인간 IgG4 Fc 영역이다.
일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 사슬은 CH1에 연결된 제1 Fc 영역을 추가로 포함하며, 제1 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역이며, 제1 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 228, 354, 366 및 409에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 아미노산 치환은 S228P, S354C, T366W 및 R409K이며; 제3 폴리펩티드 사슬은 CH1에 연결된 제2 Fc 영역을 추가로 포함하며, 제2 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역이며, 제2 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 228, 349, 366, 368, 407 및 409에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하며, 아미노산 치환은 S228P, Y349C, T366S, L368A, Y407V 및 R409K이다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 사슬은 CH1에 연결된 제1 Fc 영역을 추가로 포함하며, 제1 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역이며, 제1 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 228, 349, 366, 368, 407 및 409에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 아미노산 치환은 S228P, Y349C, T366S, L368A, Y407V 및 R409K이며; 제3 폴리펩티드 사슬은 CH1에 연결된 제2 Fc 영역을 추가로 포함하며, 제2 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역이며, 제2 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 228, 354, 366 및 409에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하며, 아미노산 치환은 S228P, S354C, T366W 및 R409K이다.
일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 사슬은 CH1에 연결된 제1 Fc 영역을 추가로 포함하며, 제1 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역이며, 제1 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 234, 235, 354 및 366에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 아미노산 치환은 F234A, L235A, S354C 및 T366W이며; 제3 폴리펩티드 사슬은 CH1에 연결된 제2 Fc 영역을 추가로 포함하며, 제2 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역이며, 제2 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 234, 235, 349, 366, 368 및 407에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 아미노산 치환은 F234A, L235A, Y349C, T366S, L368A 및 Y407V이다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 사슬은 CH1에 연결된 제1 Fc 영역을 추가로 포함하며, 제1 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역이며, 제1 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 234, 235, 349, 366, 368 및 407에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 아미노산 치환은 F234A, L235A, Y349C, T366S, L368A 및 Y407V이며; 제3 폴리펩티드 사슬은 CH1에 연결된 제2 Fc 영역을 추가로 포함하며, 제2 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역이며, 제2 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 234, 235, 354 및 366에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 아미노산 치환은 F234A, L235A, S354C 및 T366W이다.
일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 사슬은 CH1에 연결된 제1 Fc 영역을 추가로 포함하며, 제1 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역이며, 제1 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 228, 234, 235, 354, 366 및 409에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 아미노산 치환은 S228P, F234A, L235A, S354C, T366W 및 R409K이며; 제3 폴리펩티드 사슬은 CH1에 연결된 제2 Fc 영역을 추가로 포함하며, 제2 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역이며, 제2 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 228, 234, 235, 349, 366, 368, 407 및 409에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 아미노산 치환은 S228P, F234A, L235A, Y349C, T366S, L368A, Y407V 및 R409K이다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 사슬은 CH1에 연결된 제1 Fc 영역을 추가로 포함하며, 제1 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역이며, 제1 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 228, 234, 235, 349, 366, 368, 407 및 409에 상응하는 위치에 아미노산 치환을 포함하며, 아미노산 치환은 S228P, F234A, L235A, Y349C, T366S, L368A, Y407V 및 R409K이며; 제3 폴리펩티드 사슬은 CH1에 연결된 제2 Fc 영역을 추가로 포함하며, 제2 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역이며, 제2 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 228, 234, 235, 354, 366 및 409에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 아미노산 치환은 S228P, F234A, L235A, S354C, T366W 및 R409K이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 혈청중 반감기를 개선시키기 위한 하나 이상의 돌연변이를 포함한다(예를 들어, 문헌[Hinton, P.R. (2006) J. Immunol. 176(1):346-56] 참조). 일부 구현예에서, 돌연변이는 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 428 및 434에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하며, 여기서, 상기 아미노산 치환은 M428L 및 N434S이다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 CH1에 연결된 제1 Fc 영역을 추가로 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬과, CH1에 연결된 제2 Fc 영역을 추가로 포함하는 제3 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 상기 제1 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하며, 상기 제2 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기서, 제1 및/또는 제2 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 428 및 434에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환은 M428L 및 N434S이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 놉 및 홀 돌연변이 및 혈청중 반감기를 향상시키기 위한 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 Fc 영역은 인간 IgG1 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 Fc 영역은 인간 IgG4 Fc 영역이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 예를 들어 IgG4의 이량체 계면 및/또는 힌지 영역의 안정성을 향상시키기 위한 하나 이상의 돌연변이를 포함한다(예를 들어, 문헌[Spiess, C. et al. (2013) J. Biol. Chem. 288:26583-26593] 참조). 일부 구현예에서, 돌연변이는 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 228 및 409에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하며, 여기서, 상기 아미노산 치환은 S228P 및 R409K이다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 CH1에 연결된 제1 Fc 영역을 추가로 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬과, CH1에 연결된 제2 Fc 영역을 추가로 포함하는 제3 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 상기 제1 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하며, 상기 제2 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하며; 여기서, 제1 및 제2 Fc 영역은 인간 IgG4 Fc 영역이며; 여기서, 제1 및 제2 Fc 영역은 각각 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 228 및 409에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환은 S228P 및 R409K이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 놉 및 홀 돌연변이 및 안정성을 향상시키기 위한 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 Fc 영역은 인간 IgG4 Fc 영역이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 예를 들어 정제 시약에 대한 친화도를 조정함으로써 정제를 개선시키기 위한 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 이종이량체형 결합 단백질은 상기 이종이량체 형태가 동종이량체 형태보다 단백질 A-기반의 정제에 대하여 중간 친화성을 가질 것이고, 예를 들어 상이한 pH의 이용에 의해 단백질 A로부터 선택적으로 용출될 수 있기 때문에, 상기 이종이량체 형태의 2개의 Fc 영역 중 하나가 단백질 A에의 결합을 감소시키거나 없애는 돌연변이(들)를 포함할 경우 동종이량체 형태로부터 선택적으로 정제될 수 있음이 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Smith, E.J. et al. (2015) Sci. Rep. 5:17943] 참조). 일부 구현예에서, 돌연변이는 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 435 및 436에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하며, 여기서, 상기 아미노산 치환은 H435R 및 Y436F이다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 CH1에 연결된 제1 Fc 영역을 추가로 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬과, CH1에 연결된 제2 Fc 영역을 추가로 포함하는 제3 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 상기 제1 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하며, 상기 제2 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하며; 여기서, 제1 및 제2 Fc 영역 중 하나만이 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 435 및 436에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환은 H435R 및 Y436F이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 놉 및 홀 돌연변이 및 정제를 개선시키기 위한 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 Fc 영역은 인간 IgG1 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 Fc 영역은 인간 IgG4 Fc 영역이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 혈청중 반감기를 개선시키기 위한 하나 이상의 돌연변이를 포함한다(예를 들어, 문헌[Hinton, P.R. (2006) J. Immunol. 176(1):346-56] 참조). 일부 구현예에서, 돌연변이는 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 428 및 434에 상응하는 위치에서의 치환을 포함하며, 여기서, 상기 아미노산 치환은 M428L 및 N434S이다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 CH1에 연결된 제1 Fc 영역을 추가로 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬과, CH1에 연결된 제2 Fc 영역을 추가로 포함하는 제3 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 상기 제1 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하며, 상기 제2 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하며, 여기서, 제1 및/또는 제2 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 428 및 434에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환은 M428L 및 N434S이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 놉 및 홀 돌연변이 및 혈청중 반감기를 향상시키기 위한 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 Fc 영역은 인간 IgG1 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 Fc 영역은 인간 IgG4 Fc 영역이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 이펙터 기능, 예를 들어 Fc 수용체-매개된 항체-의존성 세포 식작용(ADCP), 보체-의존성 세포독성(CDC), 및/또는 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)을 감소시키기 위한 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 사슬은 CH1에 연결된 제1 Fc 영역을 추가로 포함하며, 상기 제1 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하고; 제3 폴리펩티드 사슬은 CH1에 연결된 제2 Fc 영역을 추가로 포함하며, 상기 제2 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하고; 여기서, 제1 및 제2 Fc 영역은 인간 IgG1 Fc 영역이며; 상기 제1 및 제2 Fc 영역 각각은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1의 위치 234 및 235에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 L234A 및 L235A이다. 일부 구현예에서, 제2 및 제3 폴리펩티드 사슬의 Fc 영역은 인간 IgG1 Fc 영역이며, 상기 Fc 영역 각각은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1의 위치 234 및 235에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서, 상기 아미노산 치환은 L234A 및 L235A이다. 일부 구현예에서, 제2 폴리펩티드 사슬은 CH1에 연결된 제1 Fc 영역을 추가로 포함하며, 상기 제1 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하고; 제3 폴리펩티드 사슬은 CH1에 연결된 제2 Fc 영역을 추가로 포함하며, 상기 제2 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하고; 여기서, 제1 및 제2 Fc 영역은 인간 IgG1 Fc 영역이며; 상기 제1 및 제2 Fc 영역 각각은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1의 위치 234, 235 및 329에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하고, 상기 아미노산 치환은 L234A, L235A, 및 P329A이다. 일부 구현예에서, 제2 및 제3 폴리펩티드 사슬의 Fc 영역은 인간 IgG1 Fc 영역이며, 상기 Fc 영역 각각은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1의 위치 234, 235, 및 329에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서, 상기 아미노산 치환은 L234A, L235A, 및 P329A이다. 일부 구현예에서, 제2 및 제3 폴리펩티드 사슬의 Fc 영역은 인간 IgG4 Fc 영역이며, 상기 Fc 영역 각각은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 234 및 235에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서, 상기 아미노산 치환은 F234A 및 L235A이다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 CH1에 연결된 제1 Fc 영역을 추가로 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬과, CH1에 연결된 제2 Fc 영역을 추가로 포함하는 제3 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 상기 제1 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하며, 상기 제2 Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하며; 여기서, 제1 및 제2 Fc 영역 각각은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 234 및 235에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환은 F234A 및 L235A이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 놉 및 홀 돌연변이 및 이펙터 기능을 감소시키기 위한 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 Fc 영역은 인간 IgG1 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 Fc 영역은 인간 IgG4 Fc 영역이다. 위치 329에서의 Fc 돌연변이의 추가 설명에 대해서는, 예를 들어 문헌[Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604] 및 국제 공개 제WO1999051642호를 참조한다.
일부 구현예에서, 위에 설명된 돌연변이의 유형은 임의의 순서 또는 조합으로 조합될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 결합 단백질은 "놉" 및 "홀" 돌연변이, 혈청중 반감기를 개선시키기 위한 하나 이상의 돌연변이, IgG4 안정성을 향상시키기 위한 하나 이상의 돌연변이, 정제를 개선시키기 위한 하나 이상의 돌연변이, 및/또는 상기 기술된 이펙터 기능을 개선시키기 위한 하나 이상의 돌연변이 중 둘 이상을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 항체 F(ab), F(ab')2, Fab'-SH, Fv, 또는 scFv 단편을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 항체 단편을 포함한다.
분석
본 발명은 인간 및/또는 시노몰구스 CD38 폴리펩티드에 결합하고/거나 T 세포(예를 들어, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포) 증식을 유도하고/거나 CD38+ 세포의 아폽토시스를 유도하는 항원 결합 단백질을 제공한다. 이들 파라미터를 측정하고 이러한 결합 단백질을 확인하기 위한 예시적인 분석이 본원에 제공된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편과 정제된 CD38 폴리펩티드 간의 결합 친화도는 (예를 들어, 아래에 기술된 바와 같이) SPR에 의해 측정되며, 결합 단백질 또는 그의 항원-결합 단편과 세포의 표면 상에 발현되는 CD38 폴리펩티드 간의 결합 친화도는 (예를 들어, 아래에 기술된 바와 같이) 유세포분석에 의해 측정된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질의 항원 결합 부위는 예를 들어, 아래에 기술된 바와 같이, 세포 표면 상에 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD38 폴리펩티드를 발현하는 세포를 사용하여 유세포분석에 의해 측정시, 20 nM 이하, 15 nM 이하, 12 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 2 nM 이하, 1 nM 이하, 또는 0.8 nM 이하의 평형 해리 상수(KD)로 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD38 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 부위는 예를 들어, 아래에 기술된 바와 같이 세포 표면 상에 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드를 발현하는 세포를 사용하여 유세포분석에 의해 측정시, 20 nM 이하, 15 nM 이하, 12 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 2 nM 이하, 1 nM 이하, 또는 0.75 nM 이하의 평형 해리 상수(KD)로 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 부위는 예를 들어, 아래에 기술된 바와 같이, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD38 폴리펩티드를 사용하여 SPR 분석에 의해 측정시, 20 nM 이하, 15 nM 이하, 12 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 2 nM 이하, 1 nM 이하, 또는 0.83 nM 이하의 평형 해리 상수(KD)로 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD38 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, 항원 결합 부위는 예를 들어, 아래에 기술된 바와 같이 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드를 사용하여 SPR 분석에 의해 측정시, 20 nM 이하, 15 nM 이하, 12 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 3.5 nM 이하, 1.5 nM 이하, 또는 1.0 nM 이하의 평형 해리 상수(KD)로 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드에 결합한다. 본원에 입증된 바와 같이, 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 본원에 기술된 예시적인 결합 특성 중 하나 이상을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, KD는 4℃ 또는 25℃에서 측정된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 1특이성 결합 단백질은 하기의 특징 중 하나 이상을 갖는다: SPR 또는 ELISA에 의해 분석시, 정제된 단백질로서의 (예를 들어, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는) 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; SPR 또는 ELISA에 의해 분석시 20 nM 이하, 15 nM 이하, 12 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 2 nM 이하, 또는 1.5 nM 이하의 KD로 (예를 들어, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는) 정제된 단백질로서의 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; 유세포분석에 의해 분석시, 세포의 표면 상에 발현되는 (예를 들어, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는) 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; 유세포분석에 의해 분석시, 20 nM 이하, 15 nM 이하, 12 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 2 nM 이하, 또는 1 nM 이하의 겉보기 KD로 세포의 표면 상에 발현되는 (예를 들어, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는) 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; SPR 또는 ELISA에 의해 분석시 정제된 단백질로서의 (예를 들어, 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는) 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; SPR 또는 ELISA에 의해 분석시 20 nM 이하, 15 nM 이하, 12 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 2 nM 이하, 1 nM 이하의 KD로 (예를 들어, 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는) 정제된 단백질로서의 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; 유세포분석에 의해 분석시, 세포의 표면 상에 발현되는 (예를 들어, 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는) 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; 유세포분석에 의해 분석시, 20 nM 이하, 15 nM 이하, 12 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 2 nM 이하, 1 nM 이하의 겉보기 KD로 세포의 표면 상에 발현되는 (예를 들어, 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는) 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; SPR 또는 ELISA에 의해 분석시 정제된 단백질로서의 (예를 들어, 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는) 인간 아이소폼 E CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; 유세포분석에 의해 분석시, 세포의 표면 상에 발현되는 (예를 들어, 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는) 인간 아이소폼 E CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; 세포 표면 상에 CD38을 발현하는 세포의 아폽토시스 또는 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)을 유도함; 및 하나 이상의 돌연변이가 없는 동일한 결합 단백질에 비하여, FcγRI 및/또는 FcγRII로의 결합을 감소시키는 (예를 들어, Fc 영역 내의) 하나 이상의 돌연변이를 가짐. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 유세포분석에 의해 분석시 20 nM 이하, 15 nM 이하, 12 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 2 nM 이하, 또는 1 nM 이하의 EC50으로, 세포의 표면 상에 발현되는 CD38 폴리펩티드(예를 들어, 인간 또는 시노몰구스 원숭이)에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 ELISA에 의해 분석시 20 nM 이하, 15 nM 이하, 12 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 2 nM 이하, 또는 1 nM 이하의 EC50으로 정제된 단백질로서의 CD38 폴리펩티드(예를 들어, 인간 또는 시노몰구스 원숭이)에 결합한다. 일부 구현예에서, KD는 4℃ 또는 25℃에서 측정된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 3특이성 결합 단백질은 하기의 특징 중 하나 이상을 갖는다: T 세포(예를 들어, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포) 증식을 유도함; Bcl-xL의 T 세포(예를 들어, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포) 발현을 유도함; (예를 들어, 아넥신 V 염색 및/또는 프로피듐 요오드화물 흡수에 의해 측정시) CD38+ 세포의 아폽토시스를 유도함; 세포의 표면 상에 발현되는 CD38 및 T 세포의 표면 상에 발현되는 하나 이상의 T 세포 표적 항원(들)에 결합함; 세포의 표면 상에 발현되는 CD38, T 세포의 표면 상에 발현되는 CD28 및 T 세포의 표면 상에 발현되는 CD3에 결합함; (예를 들어, CD69 발현에 의해 측정시) T 세포 수용체의 활성화를 자극함; (예를 들어, CD28에 의해 매개되는 바와 같은) T 세포 수용체 시그널링의 동시자극을 유도함; 하나 이상의 돌연변이를 갖지 않는 동일한 결합 단백질에 비하여, PBMC에 의한 사이토카인 방출(예를 들어, IFN-γ, IL-2 및/또는 TNF-α)의 유도를 감소시키는 (예를 들어, Fc 영역 내의)하나 이상의 돌연변이를 가짐; (예를 들어, 면역분석에 의해 측정시) CD38+ 표적 세포의 존재 하에 PBMC에 의한 사이토카인 방출(예를 들어, IFN-γ 및/또는 IL-6)을 유도함; SPR 또는 ELISA에 의해 분석시, 정제된 단백질로서의 (예를 들어, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는) 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; SPR 또는 ELISA에 의해 분석시 1.5 nM 이하의 KD로 (예를 들어, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는) 정제된 단백질로서의 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; 유세포분석에 의해 분석시, 세포의 표면 상에 발현되는 (예를 들어, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는) 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; 유세포분석에 의해 분석시, 12 nM 이하의 겉보기 KD로 세포의 표면 상에 발현되는 (예를 들어, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는) 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; SPR 또는 ELISA에 의해 분석시 정제된 단백질로서의 (예를 들어, 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는) 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; SPR 또는 ELISA에 의해 분석시 3.5 nM 이하의 KD로 정제된 단백질로서의 (예를 들어, 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는) 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; 유세포분석에 의해 분석시, 세포의 표면 상에 발현되는 (예를 들어, 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는) 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; 유세포분석에 의해 분석시, 7.5 nM 이하의 겉보기 KD로 세포의 표면 상에 발현되는 (예를 들어, 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는) 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; SPR 또는 ELISA에 의해 분석시 정제된 단백질로서의 (예를 들어, 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는) 인간 아이소폼 E CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; 유세포분석에 의해 분석시, 세포의 표면 상에 발현되는 (예를 들어, 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는) 인간 아이소폼 E CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합함; 세포 표면 상에 CD38을 발현하는 세포의 아폽토시스 또는 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)을 유도함; 및 하나 이상의 돌연변이가 없는 동일한 결합 단백질에 비하여, FcγRI 및/또는 FcγRII로의 결합을 감소시키는 (예를 들어, Fc 영역 내의) 하나 이상의 돌연변이를 가짐. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 유세포분석에 의해 분석시 20 nM 이하, 15 nM 이하, 12 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 2 nM 이하, 또는 1 nM 이하의 EC50으로, 세포의 표면 상에 발현되는 CD38 폴리펩티드(예를 들어, 인간 또는 시노몰구스 원숭이)에 결합한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 ELISA에 의해 분석시 20 nM 이하, 15 nM 이하, 12 nM 이하, 10 nM 이하, 5 nM 이하, 2 nM 이하, 또는 1 nM 이하의 EC50으로 정제된 단백질로서의 CD38 폴리펩티드(예를 들어, 인간 또는 시노몰구스 원숭이)에 결합한다.
핵산
표준 재조합 DNA 방법은 결합 단백질을 형성하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 구축하고, 이러한 폴리뉴클레오티드를 재조합 발현 벡터 내에 포함시키고, 그러한 벡터를 숙주 세포 내에 도입하는 데 사용된다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd ed.)]을 참조한다. 효소 반응 및 정제 기법은 제조업자의 설명서에 따라 수행될 수 있으며, 이는 본 기술 분야에서 일반적으로 성취되는 바와 같거나 본원에 설명된 바와 같다. 특정한 정의가 제공되지 않으면, 본원에서 설명된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의약품 및 제약 화학과 관련하여 이용되는 명명법 및 이들의 검사실의 절차 및 기법으로는 본 기술 분야에서 잘 알려지고 일반적으로 사용되는 것이 있다. 이와 유사하게, 통상적인 기법이 화학 합성, 화학 분석, 제약 제제, 제형, 전달, 및 환자의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 본원에 기술된 결합 단백질 중 임의의 것을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 단리된 핵산 분자는 서열 번호 60 내지 83과 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일하고/거나 표 J에 나타낸 서열을 포함한다.
본 발명의 특정 측면은 폴리뉴클레오티드의 키트에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상은 벡터(예를 들어, 발현 벡터)이다. 키트는 특히, 본원에 기술된 결합 단백질, 예를 들어, 본 발명의 3특이성 결합 단백질 중 하나 이상을 생성하는 데 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 (예를 들어, mAb2xCD28supxCD3mid IgG4 FALA, mAb2xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A, mAb2xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA, mAb6xCD28supxCD3mid IgG4 FALA, mAb6xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A, 또는 mAb6xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA의) 표 J에 나타낸 1, 2, 3 또는 4개의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드의 키트는 하기를 포함한다: 서열 번호 73의 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 72의 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 74의 서열을 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드, 및 서열 번호 75의 서열을 포함하는 제4 폴리뉴클레오티드. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드의 키트는 하기를 포함한다: 서열 번호 73의 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 76의 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 77의 서열을 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 75의 서열을 포함하는 제4 폴리뉴클레오티드. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드의 키트는 하기를 포함한다: 서열 번호 73의 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 78의 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 79의 서열을 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 75의 서열을 포함하는 제4 폴리뉴클레오티드. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드의 키트는 하기를 포함한다: 서열 번호 73의 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 72의 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 80의 서열을 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 81의 서열을 포함하는 제4 폴리뉴클레오티드. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드의 키트는 하기를 포함한다: 서열 번호 73의 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 76의 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 82의 서열을 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 81의 서열을 포함하는 제4 폴리뉴클레오티드. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드의 키트는 하기를 포함한다: 서열 번호 73의 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 78의 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 83의 서열을 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 81의 서열을 포함하는 제4 폴리뉴클레오티드.
일부 구현예에서, 단리된 핵산은 결합 단백질-코딩 핵산 서열의 전사를 지시하기 위하여 이종 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 프로모터는 핵산의 전사를 지시하는 핵산 제어 서열을 나타낼 수 있다. 제1 핵산 서열은 제2 핵산 서열과 기능적으로 관련되어 배치되는 때 제2 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 것이다. 예를 들어, 프로모터는 결합 단백질의 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 줄 경우 상기 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 것이다. 프로모터의 예는 바이러스(예컨대 폴리오마 바이러스(polyoma virus), 계두 바이러스(fowlpox virus), 아데노바이러스(adenovirus)(예컨대 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 거대세포 바이러스(cytomegalovirus), 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 시미안 바이러스(Simian Virus) 40(SV40) 등)의 게놈으로부터, 이종성 진핵 프로모터(예컨대 액틴 프로모터, 면역글로불린 프로모터, 열충격(heat-shock) 프로모터 등), CAG-프로모터(문헌[Niwa et al., Gene 108(2):193-9, 1991]), 포스포글리세레이트 키나제(PGK)-프로모터, 테트라사이클린-유도성 프로모터(문헌[Masui et al., Nucleic Acids Res. 33:e43, 2005]), lac 시스템, trp 시스템, tac 시스템, trc 시스템, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, 3-포스포글리세레이트 키나아제에 대한 프로모터, 효모 산 포스파타제의 프로모터, 및 효모 알파-교배 인자의 프로모터로부터 수득되는 프로모터를 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 구성성(constitutive) 프로모터, 유도성 프로모터, 또는 본원에 기술된 임의의 다른 적합한 프로모터 또는 당업자에 의해 쉽게 인식될 다른 적합한 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다.
일부 구현예에서, 단리된 핵산은 벡터 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 벡터는 발현 벡터이다. 발현 벡터는 발현될 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 조절 서열을 포함할 수 있다. 용어 "조절 서열"은 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함한다. 적합한 인핸서의 예는 포유류 유전자(예컨대 글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-태아단백질, 인슐린 등)로부터의 인핸서 서열, 및 진핵 세포 바이러스로부터의 인핸서 서열(예컨대 복제 원점의 후기 쪽의 SV40 인핸서(bp 100-270), 거대세포 바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 원점의 후기 쪽의 폴리오마(polyoma) 인핸서, 아데노바이러스 인핸서 등)을 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합한 벡터의 예는 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 에피솜, 트랜스포존, 및 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 신드비스(Sindbis) 바이러스, 홍역 바이러스, 헤르페스 바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노-부속 바이러스 벡터 등)를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 예를 들어 박테리아 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 및 포유류 세포와 같은 숙주 세포의 트랜스펙션에 사용될 수 있다. 숙주에서의 발현 및 복제가 가능한 생물학적 기능성 바이러스 및 플라스미드 DNA 벡터가 본 기술 분야에 공지되어 있으며, 이는 관심 대상의 임의의 세포의 트랜스펙션에 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 본원에 기술된 결합 단백질들 중 임의의 것의 제1, 제2, 제3, 및 제4 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 벡터 시스템은 결합 단백질의 제1 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 제1 벡터, 결합 단백질의 제2 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 제2 벡터, 결합 단백질의 제3 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 제3 벡터, 및 결합 단백질의 제4 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 제4 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터 시스템은 결합 단백질의 제1 및 제2 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 제1 벡터, 및 결합 단백질의 제3 및 제4 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 제2 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터 시스템은 결합 단백질의 제1 및 제3 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 제1 벡터, 및 결합 단백질의 제2 및 제4 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 제2 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터 시스템은 결합 단백질의 제1 및 제4 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 제1 벡터, 및 결합 단백질의 제2 및 제3 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 제2 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터 시스템은 결합 단백질의 제1, 제2, 제3 및 제4 폴리펩티드 사슬을 코딩하는 제1 벡터를 포함한다. 벡터 시스템의 상기 하나 이상의 벡터는 본원에 기술된 벡터들 중 임의의 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 벡터는 발현 벡터이다.
단리된 숙주 세포
본 발명의 다른 측면은 본원에 기술된 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 키트, 벡터, 및/또는 벡터 시스템을 포함하는 단리된 숙주 세포에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 박테리아 세포(예를 들어, 이. 콜라이(E. coli) 세포)이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 효모 세포(예를 들어, 에스. 세레비지애(S. cerevisiae) 세포)이다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 곤충 세포이다. 곤충 숙주 세포의 예는 예를 들어 드로소필라(Drosophila) 세포(예를 들어, S2 세포), 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni) 세포(예를 들어, 하이 파이브(High Five)™ 세포), 및 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포(예를 들어, Sf21 또는 Sf9 세포)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 포유류 세포이다. 포유류 숙주 세포의 예는 예를 들어 인간 배아 신장 세포(예를 들어, 현탁 배양에서의 성장용으로 서브클로닝된 293 또는 293 세포), Expi293TM 세포, CHO 세포, 베이비 햄스터 신장 세포(baby hamster kidney cell)(예를 들어, BHK, ATCC CCL 10), 마우스 세르톨리(sertoli) 세포(예를 들어, TM4 세포), 원숭이 신장 세포(예를 들어, CV1 ATCC CCL 70), 아프리카 사바나 원숭이(African green monkey) 신장 세포(예를 들어, VERO-76, ATCC CRL-1587), 인간 자궁경부 암종 세포(예를 들어, HELA, ATCC CCL 2), 개 신장 세포(예를 들어, MDCK, ATCC CCL 34), 버팔로 래트(buffalo rat) 간세포(예를 들어, BRL 3A, ATCC CRL 1442), 인간 폐세포(예를 들어, W138, ATCC CCL 75), 인간 간세포(예를 들어, Hep G2, HB 8065), 마우스 유선 종양 세포(예를 들어, MMT 060562, ATCC CCL51), TRI 세포, MRC 5 세포, FS4 세포, 인간 간암 세포주(예를 들어, Hep G2), 및 골수종 세포(예를 들어, NS0 및 Sp2/0 세포)를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 본원에 기술된 결합 단백질들 중 임의의 것의 제조 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 방법은 a) 단리된 핵산, 벡터, 및/또는 벡터 시스템(예를 들어, 본원에 기술된 단리된 핵산, 벡터, 및/또는 벡터 시스템 중 임의의 것)을 포함하는 숙주 세포(예를 들어, 본원에 기술된 숙주 세포 중 임의의 것)를, 숙주 세포가 결합 단백질을 발현하도록 하는 조건 하에 배양하는 단계; 및 b) 결합 단백질을 숙주 세포로부터 단리하는 단계를 포함한다. 단백질을 발현시키는 조건 하에 숙주 세포를 배양하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 단백질을 배양된 숙주 세포로부터 단리하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 이는 예를 들어 친화성 크로마토그래피(예를 들어, 단백질 A 친화성 크로마토그래피, 이어서 크기 배제 크로마토그래피를 포함하는 2단계 친화성 크로마토그래피)에 의한 것을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 단백질 A 친화성 크로마토그래피, 카파 경쇄 친화성 크로마토그래피(예를 들어, 제조업자의 지시에 따라 KappaSelect 수지를 사용하여; GE Healthcare), 및 선택적으로 람다 경쇄 친화성 크로마토그래피(예를 들어, 제조업자의 지시에 따라 LambdaFabSelect 수지를 사용하여; GE Healthcare)에 의해 정제된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 단백질 A 친화성 크로마토그래피, 람다 경쇄 친화성 크로마토그래피(예를 들어, 제조업자의 지시에 따라 LambdaFabSelect 수지를 사용하여; GE Healthcare), 및 선택적으로 카파 경쇄 친화성 크로마토그래피(예를 들어, 제조업자의 지시에 따라 KappaSelect 수지를 사용하여; GE Healthcare)에 의해 정제된다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 2개의 Fc 영역을 포함하며, 각각은 CH3 도메인을 포함하며, 상기 CH3 도메인들 중 하나만이 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 435 및 436에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서, 상기 아미노산 치환은 H435R 및 Y436F이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 순서대로 단백질 A 친화성 크로마토그래피, 그 후 카파 경쇄 친화성 크로마토그래피(예를 들어, 제조업자의 지시에 따라 KappaSelect 수지를 사용하여; GE Healthcare), 그 후 선택적으로 람다 경쇄 친화성 크로마토그래피(예를 들어, 제조업자의 지시에 따라 LambdaFabSelect 수지를 사용하여; GE Healthcare)에 의해 정제된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 순서대로 단백질 A 친화성 크로마토그래피, 그 후 람다 경쇄 친화성 크로마토그래피(예를 들어, 제조업자의 지시에 따라 LambdaFabSelect 수지를 사용하여; GE Healthcare), 그 후 선택적으로 카파 경쇄 친화성 크로마토그래피(예를 들어, 제조업자의 지시에 따라 KappaSelect 수지를 사용하여; GE Healthcare)에 의해 정제된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 결합 단백질을 단백질 A와 접촉시키고, 상기 결합 단백질을 H435R 및 Y436F인 아미노산 치환을 포함하는 0개 또는 2개의 CH3 도메인을 포함하는 결합 단백질들로부터 단리하기에 적합한 조건 하에, 단백질 A로부터 용출시키고, 카파 경쇄 친화성 매질(예를 들어, KappaSelect 수지에서 사용되는 바와 같음; GE Healthcare)과 접촉시키고, 상기 결합 단백질을 람다 CL 도메인만을 포함하는 결합 단백질들로부터 단리하기에 적합한 조건 하에, 상기 결합 단백질을 카파 경쇄 친화성 매질로부터 용출시킨다(예를 들어, 제조업자의 지시에 따라). 단백질 A 용출에 적합한 조건은 본 기술 분야에 공지되어 있으며, 이는 제한 없이 pH 4.5 내지 pH 2.8로부터의 단계적 용출 구배를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 정제에 유용한 단백질 A 또는 단백질 A 변이체가 이용된다. 일부 구현예에서, 단백질 A는 예를 들어 크로마토그래피 매질의 일부로서 기재 또는 수지에 부착되어 있다. 일부 구현예에서, 카파 경쇄 친화성 매질로부터의 용출 후, 결합 단백질을 람다 경쇄 친화성 매질(예를 들어, LambdaFabSelect 수지에서 사용되는 바와 같음; GE Healthcare)과 접촉시키며, 상기 결합 단백질을 카파 CL 도메인만을 포함하는 결합 단백질들로부터 단리하기에 적합한 조건 하에, 람다 경쇄 친화성 매질로부터 용출시킨다(예를 들어, 제조업자의 지시에 따라). 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질을 HIC 크로마토그래피를 사용하여 검출한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 다음을 포함한다: 람다 CL 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드 사슬; EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 354 및 366에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬의 CH3 도메인(여기서, 상기 아미노산 치환은 S354C 및 T366W임); EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 349, 366, 368, 407, 435, 및 436에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하는 제3 폴리펩티드 사슬의 CH3 도메인(여기서, 상기 아미노산 치환은 Y349C, T366S, L368A, Y407V, H435R, 및 Y436F임); 및 카파 CL 도메인을 포함하는 제4 폴리펩티드 사슬. 일부 구현예에서, 결합 단백질이 숙주 세포에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 세포 배양 배지 또는 숙주 세포 추출물로부터 정제된다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 숙주 세포에 의해 분비되거나 또는 숙주 세포로부터 생성되어 추출된다(예를 들어, 단백질 A와의 접촉 전에). 일부 구현예에서, 결합 단백질은 단백질 A와 접촉될 때 세포 배양 배지 또는 숙주 세포 추출물에 있다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 다른 결합 단백질들, 폴리펩티드들, 및/또는 다른 세포 성분들로부터 정제된다.
III. 3특이성 결합 단백질
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 1개 이상(예를 들어, 3개)의 상이한 항원 표적 또는 표적 단백질에 결합하는 3개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 3특이성 및/또는 3가 결합 단백질이다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 I:
[화학식 I]
Figure pct00067
로 표시되는 구조를 포함하며;
제2 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 II:
[화학식 II]
Figure pct00068
로 표시되는 구조를 포함하며;
제3 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 III:
[화학식 III]
Figure pct00069
로 표시되는 구조를 포함하며;
제4 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 IV:
[화학식 IV]
Figure pct00070
로 표시되는 구조를 포함하며;
VL1은 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VL2는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VL3은 제3 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VH1은 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
VH2는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
VH3은 제3 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이며;
CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 도메인이며;
CH2는 면역글로불린 CH2 중쇄 불변 도메인이며;
CH3은 면역글로불린 CH3 중쇄 불변 도메인이며;
힌지는 CH1 및 CH2 도메인을 연결하는 면역글로불린 힌지 영역이며;
L1, L2, L3 및 L4는 아미노산 링커이며;
화학식 I의 폴리펩티드와 화학식 II의 폴리펩티드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 사슬 및 제2 폴리펩티드 사슬은 2개의 별개의 항원 결합 부위를 형성하는 교차 배향을 갖는다. 상기 기술된 바와 같이, 제2 및 제3 폴리펩티드 사슬은 (예를 들어, 힌지-CH2-CH3 도메인을 포함하는) Fc 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 또는 둘 모두의 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 233 내지 236에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 E233P, F234V, L235A, 및 236에서의 결실이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 228, 233 내지 236 및/또는 409에 상응하는 치환에 아미노산 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 아미노산 돌연변이는 S228P; E233P, F234V, L235A, 및 236에서의 결실; 및/또는 R409K이다. 일부 구현예에서, 하나 또는 둘 모두의 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1의 위치 234, 235 및/또는 329에 상응하는 위치에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 L234A, L235A 및/또는 P329A이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1의 위치 298, 299 및/또는 300에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 S298N, T299A 및/또는 Y300S이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 1개 이상(예를 들어, 3개)의 상이한 항원 표적 또는 표적 단백질에 결합하는 3개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 3특이성 및/또는 3가 결합 단백질이다. 일부 구현예에서, 항원 결합 부위 중 적어도 하나는 CD38 폴리펩티드(예를 들어, 인간 및/또는 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인)에 결합한다. 일부 구현예에서, 제1 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 I:
[화학식 I]
Figure pct00071
로 표시되는 구조를 포함하며;
제2 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 II:
[화학식 II]
Figure pct00072
로 표시되는 구조를 포함하며;
제3 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 III:
[화학식 III]
Figure pct00073
로 표시되는 구조를 포함하며;
제4 폴리펩티드 사슬은 하기 화학식 IV:
[화학식 IV]
Figure pct00074
로 표시되는 구조를 포함하며;
VL1은 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VL2는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VL3은 제3 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
VH1은 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
VH2는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
VH3은 제3 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
CL은 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이며;
CH1은 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 도메인이며;
L1, L2, L3 및 L4는 아미노산 링커이며;
화학식 I의 폴리펩티드와 화학식 II의 폴리펩티드는 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성한다. 일부 구현예에서, 제2 및 제3 폴리펩티드 사슬은 CH1에 연결된 Fc 영역을 추가로 포함하며, Fc 영역은 면역글로불린 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 또는 둘 모두의 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 233 내지 236에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 E233P, F234V, L235A, 및 236에서의 결실이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 228, 233 내지 236 및/또는 409에 상응하는 치환에 아미노산 돌연변이를 포함하는 인간 IgG4 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 아미노산 돌연변이는 S228P; E233P, F234V, L235A, 및 236에서의 결실; 및/또는 R409K이다. 일부 구현예에서, 하나 또는 둘 모두의 Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1의 위치 234, 235 및/또는 329에 상응하는 위치에서의 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 L234A, L235A 및/또는 P329A이다. 일부 구현예에서, Fc 영역은 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1의 위치 298, 299 및/또는 300에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역이다. 일부 구현예에서, 아미노산 치환은 S298N, T299A 및/또는 Y300S이다.
일부 구현예에서, VH1 및 VL1은 결합쌍을 형성하며, 제1 항원 결합 부위를 형성한다. 일부 구현예에서, VH2 및 VL2는 결합쌍을 형성하며, 제2 항원 결합 부위를 형성한다. 일부 구현예에서, VH3 및 VL3은 결합쌍을 형성하며, 제3 항원 결합 부위를 형성한다. 결합 단백질은 또한, 세포 활성화, 종양 표적화, 사이토카인 활성의 중화, 바이러스 감염의 중화, 다수의 시그널링 이벤트들의 조합에 사용되어 암, 관절염, 및/또는 염증성 장애를 치료할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 결합 단백질은 A2AR, APRIL, ATPDase, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4(VTCN1로도 공지됨), B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2(MCP-1로도 공지됨), CCL3(MIP-1a로도 공지됨), CCL4(MIP-1b로도 공지됨), CCL5(RANTES로도 공지됨), CCL7(MCP-3으로도 공지됨), CCL8(mcp-2로도 공지됨), CCL11(에오탁신으로도 공지됨), CCL15(MIP-1d로도 공지됨), CCL17(TARC로도 공지됨), CCL19(MIP-3b로도 공지됨), CCL20(MIP-3a로도 공지됨), CCL21(MIP-2로도 공지됨), CCL24(MPIF-2/에오탁신-2로도 공지됨), CCL25(TECK로도 공지됨), CCL26(에오탁신-3으로도 공지됨), CCR3, CCR4, CD3, CD19, CD20, CD23(IgE의 수용체인 FCER2로도 공지됨), CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80(B7-1로도 공지됨), CD86(B7-2로도 공지됨), CD122, CD137(41BB로도 공지됨), CD137L, CD152(CTLA4로도 공지됨), CD154(CD40L로도 공지됨), CD160, CD272, CD273(PDL2로도 공지됨), CD274(PDL1로도 공지됨), CD275(B7H2로도 공지됨), CD276(B7H3으로도 공지됨), CD278(ICOS로도 공지됨), CD279(PD-1로도 공지됨), CDH1(E-카드헤린으로도 공지됨), 키티나제, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1(M-CSF로도 공지됨), CSF-2(GM-CSF로도 공지됨), CSF-3(GCSF로도 공지됨), CX3CL1(SCYD1로도 공지됨), CXCL12(SDF1로도 공지됨), CXCL13, CXCR3, DNGR-1, 엑토뉴클레오시드 트리포스페이트 디포스포하이드롤라제 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNα, IgE, IGF1R, IL2R베타, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb(IL25에 대한 수용체로도 공지됨), IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4(b4 인테그린으로도 공지됨), ITK, KIR, LAG3, LAMP1, 렙틴, LPFS2, MHC 부류 II, NCR3LG1, NKG2D, NTPDase-1, OX40, OX40L, PD-1H, 혈소판 수용체, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2(IL33에 대한 수용체로도 공지됨), STEAP2, Syk 키나제, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP(IL7Ra에 대한 공동-수용체로도 공지됨), TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM 및 XCR1(GPR5/CCXCR1로도 공지됨)로부터 선택되는 1가지, 2가지 또는 3가지의 항원 표적에 특이적으로 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 항원 표적 중 하나 이상은 인간 항원 표적이다.
일부 구현예에서, 3개의 항원 결합 부위 중 하나는 CD3 폴리펩티드(예를 들어, 인간 CD3 폴리펩티드)에 결합하며, 3개의 항원 결합 부위 중 하나는 CD28 폴리펩티드(예를 들어, 인간 CD28 폴리펩티드)에 결합하며, 3개의 항원 결합 부위 중 하나는 제3 폴리펩티드에 결합한다. 일부 구현예에서, CD3 또는 CD28 이외의 항원 표적에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위는 A2AR, APRIL, ATPDase, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4(VTCN1로도 공지됨), B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2(MCP-1로도 공지됨), CCL3(MIP-1a로도 공지됨), CCL4(MIP-1b로도 공지됨), CCL5(RANTES로도 공지됨), CCL7(MCP-3으로도 공지됨), CCL8(mcp-2로도 공지됨), CCL11(에오탁신으로도 공지됨), CCL15(MIP-1d로도 공지됨), CCL17(TARC로도 공지됨), CCL19(MIP-3b로도 공지됨), CCL20(MIP-3a로도 공지됨), CCL21(MIP-2로도 공지됨), CCL24(MPIF-2/에오탁신-2로도 공지됨), CCL25(TECK로도 공지됨), CCL26(에오탁신-3으로도 공지됨), CCR3, CCR4, CD19, CD20, CD23(IgE의 수용체인 FCER2로도 공지됨), CD24, CD27, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80(B7-1로도 공지됨), CD86(B7-2로도 공지됨), CD122, CD137(41BB로도 공지됨), CD137L, CD152(CTLA4로도 공지됨), CD154(CD40L로도 공지됨), CD160, CD272, CD273(PDL2로도 공지됨), CD274(PDL1로도 공지됨), CD275(B7H2로도 공지됨), CD276(B7H3으로도 공지됨), CD278(ICOS로도 공지됨), CD279(PD-1로도 공지됨), CDH1(E-카드헤린으로도 공지됨), 키티나제, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1(M-CSF로도 공지됨), CSF-2(GM-CSF로도 공지됨), CSF-3(GCSF로도 공지됨), CX3CL1(SCYD1로도 공지됨), CXCL12(SDF1로도 공지됨), CXCL13, CXCR3, DNGR-1, 엑토뉴클레오시드 트리포스페이트 디포스포하이드롤라제 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNα, IgE, IGF1R, IL2R베타, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb(IL25에 대한 수용체로도 공지됨), IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4(b4 인테그린으로도 공지됨), ITK, KIR, LAG3, LAMP1, 렙틴, LPFS2, MHC 부류 II, NCR3LG1, NKG2D, NTPDase-1, OX40, OX40L, PD-1H, 혈소판 수용체, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2(IL33에 대한 수용체), STEAP2, Syk 키나제, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP(IL7Ra에 대한 공동-수용체로도 공지됨), TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM 및 XCR1(GPR5/CCXCR1로도 공지됨)로부터 선택되는 항원 표적에 결합한다. 일부 구현예에서, 상기 항원 표적 중 하나 이상은 인간 항원 표적이다.
상기 기술된 3특이성 결합 단백질 중 임의의 것에서, 본원에 기술된 임의의 링커 또는 링커의 조합이 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, L1, L2, L3 또는 L4 중 적어도 하나는 독립적으로 길이가 0개 아미노산이다. 일부 구현예에서, L1, L2, L3 또는 L4는 각각 독립적으로 길이가 적어도 1개의 아미노산이다. 일부 구현예에서, L1, L2, L3 및 L4는 각각 독립적으로 길이가 0개 아미노산이거나, GGGGSGGGGS(서열 번호 55), GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 56), S, RT, TKGPS(서열 번호 57), GQPKAAP(서열 번호 58) 및 GGSGSSGSGG(서열 번호 59)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, L1, L2, L3 및 L4는 각각 독립적으로 GGGGSGGGGS(서열 번호 55), GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 56), S, RT, TKGPS(서열 번호 57), GQPKAAP(서열 번호 58) 및 GGSGSSGSGG(서열 번호 59)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, L1은 서열 GQPKAAP(서열 번호 58)를 포함하며, L2는 서열 TKGPS(서열 번호 57)를 포함하며, L3은 서열 S를 포함하며, L4는 서열 RT를 포함한다. 일부 구현예에서, L1은 서열 GGGGSGGGGS(서열 번호 55)를 포함하며, L2는 서열 GGGGSGGGGS(서열 번호 55)를 포함하며, L3은 길이가 0개 아미노산이며, L4는 길이가 0개 아미노산이다. 일부 구현예에서, L1은 서열 GGSGSSGSGG(서열 번호 59)를 포함하며, L2는 서열 GGSGSSGSGG(서열 번호 59)를 포함하며, L3은 길이가 0개 아미노산이며, L4는 길이가 0개 아미노산이다. 일부 구현예에서, L1은 서열 GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 56)를 포함하며, L2는 길이가 0개 아미노산이며, L3은 서열 GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 56)를 포함하며, L4는 길이가 0개 아미노산이다.
IV. 결합 단백질에 대한 용도
결합 단백질은 임의의 공지된 분석 방법, 예컨대 경쟁적 결합 분석법, 직접적 및 간접적 샌드위치(sandwich) 분석법, 및 면역침전 분석법(하나 이상의 표적 항원의 검출 및 정량화를 위한 것임)에서 이용될 수 있다. 결합 단백질은 이용되는 분석 방법에 적절한 친화도로 상기 하나 이상의 표적 항원에 결합할 것이다.
진단 응용에 있어서, 특정 구현예에서, 결합 단백질은 검출 가능한 모이어티(moiety)로 표지될 수 있다. 검출 가능한 모이어티는 검출 가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 생성할 수 있는 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, 검출 가능한 모이어티는 방사성 동위 원소, 예컨대 3H, 14C, 32P, 35S, 125I, 99Tc, 111In, 또는 67Ga; 형광 또는 화학발광 화합물, 예컨대 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 또는 루시페린; 또는 효소, 예컨대 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 또는 서양 고추냉이 퍼옥시다제일 수 있다.
결합 단백질은 또한 생체 내 영상화에 유용하다. 검출 가능한 모이어티로 표지된 결합 단백질은 동물에게, 바람직하게는 혈류 내로 투여될 수 있으며, 숙주 내에서의 표지된 항체의 존재 및 위치가 분석될 수 있다. 결합 단백질은 핵 자기 공명에 의해서든지, 방사선 이용(radiology)에 의해서든지, 또는 본 기술 분야에 공지된 다른 검출 수단에 의해서든지 간에 동물에서 검출 가능한 임의의 모이어티로 표지될 수 있다.
임상 또는 연구 응용을 위하여, 특정 구현예에서, 결합 단백질은 세포독성제에 컨쥬게이트될 수 있다. 세포독성제에 커플링된 다양한 항체(즉, 항체-약물 컨쥬게이트)는 세포독성 페이로드를 특정 종양 세포에 표적화하기 위해 사용된 바 있다. 세포독성제 및 작용제를 항체에 컨쥬게이트시키는 링커는 본 기술 분야에 공지되어 있으며; 예를 들어, 문헌[Parslow, A.C. et al. (2016) Biomedicines 4:14] 및 문헌[Kalim, M. et al. (2017) Drug Des. Devel. Ther. 11:2265-2276]을 참조한다.
또한 본 발명은 생물학적 샘플 중 표적 항원 수준의 검출에 유용한 다른 시약 및 결합 단백질을 포함하는 키트에 관한 것이다. 그러한 시약은 검출 가능 표지체, 차단용 혈청, 양성 및 음성 대조 샘플, 및 검출 시약을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 본원에 기술된 임의의 결합 단백질, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 벡터 시스템, 및/또는 숙주 세포를 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 용기 및 용기 상의 또는 용기와 결부된 라벨 또는 패키지 인서트(insert)를 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지, IV 용액용 백 등을 포함한다. 용기는 다양한 재료, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 용기는 단독의, 또는 병태의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또 다른 조성물과 조합된 조성물을 수용하며, 살균 접근 포트(access port)를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통가능한 마개를 갖는 정맥내 용액용 백 또는 바이알일 수 있다). 일부 구현예에서, 라벨 또는 패키지 인서트는 조성물이 선택된 병태의 예방, 진단, 및/또는 치료에 사용됨을 표시한다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 제조 물품 또는 키트는 정균처리한 주사용수(bacteriostatic water for injection, BWFI), 인산염 완충 염수, 링거액(Ringer's solution) 및 덱스트로스 용액과 같은 제약상 허용 가능한 완충액을 포함하는 제2(또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 그것은 다른 완충액, 희석제, 필터, 주사바늘 및 주사기를 포함한, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 암의 치료 또는 예방을 위하여 암의 치료 또는 예방을 필요로 하는 환자에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본 발명은 증식성 질병 또는 장애(예를 들어, 암)의 예방 및/또는 치료 방법에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 치료적 유효량의 본원에 기재된 결합 단백질 또는 그와 관련된 제약 조성물 중 적어도 하나를 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 증식성 질병 또는 장애(예를 들어, 암)의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에서의 증식성 질병 또는 장애(예를 들어, 암)의 예방 및/또는 치료를 위한 본원에 기재된 결합 단백질 또는 그와 관련된 제약 조성물 중 적어도 하나의 용도에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 증식성 질병 또는 장애(예를 들어, 암)의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자에서의 증식성 질병 또는 장애(예를 들어, 암)의 예방 및/또는 치료용 의약의 제조에 사용하기 위한 본원에 기재된 결합 단백질 또는 그와 관련된 제약 조성물 중 적어도 하나에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 환자는 인간이다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 예를 들어, 상기 섹션 II에 기술된 바와 같이, T-세포 표면 단백질에 결합하는 하나의 항원 결합 부위 및 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합하는 또 다른 항원 결합 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, 결합 단백질은 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합하는 항원 결합 부위, 인간 CD28 폴리펩티드에 결합하는 항원 결합 부위 및 인간 CD3 폴리펩티드에 결합하는 항원 결합 부위를 포함한다.
일부 구현예에서, 암의 세포는 이의 세포 표면 상에 (예를 들어, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는) 인간 CD38 아이소폼 A 폴리펩티드를 발현한다. 일부 구현예에서, 암의 세포는 이의 세포 표면 상에 (예를 들어, 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는) 인간 CD38 아이소폼 E 폴리펩티드를 발현한다. 일부 구현예에서, 환자는 암의 세포가 이의 세포 표면 상에 (예를 들어, 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는) 인간 CD38 아이소폼 E 폴리펩티드를 발현하는 것에 기초하여 치료를 위해 선택된다. 일부 구현예에서, 암 세포는 CD38 및 CD28을 발현한다. 일부 구현예에서, 암 세포는 CD38을 발현하며, CD28을 발현하지 않는다.
일부 구현예에서, 암은 다발성 골수종, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 림프종, 유방암, 예컨대 Her2+ 유방암, 전립선암, 배중심 B-세포 림프종 또는 B-세포 급성 림프모구성 백혈병이다. 특정 구현예에서, 암은 다발성 골수종이다. 특정 구현예에서, 암은 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL) 또는 B 세포 림프종이다.
특정 구현예에서, 암은 다발성 골수종이다. 항-CD38 항체, 예컨대 다라투무맙 및 이사툭시맙은 다발성 골수종의 치료를 위해 시험된 바 있다. 그러나, 다발성 골수종은 치료 가능한 것으로 여겨지지만, 거의 모든 환자에서 재발이 불가피하여, 치료-불응성 질병의 발생을 야기한다. 일부 구현예에서, 암은 재발된 또는 불응성 다발성 골수종이다. 일부 구현예에서, 환자는 이전의 다발성 골수종 치료로 치료된 바 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 결합 단백질은 다발성 골수종을 위한 1차, 2차 또는 3차 치료로서 환자에게 투여된다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, 본 발명의 항-CD38x항-CD28x항-CD3 결합 단백질이 예를 들어, 항-CD38(또는 항-CD28/항-CD38)을 통한 T 세포의 종양 세포로의 동원, 항-CD3/항-CD28을 통한 관여된 T 세포의 활성화 및/또는 퍼포린/그랜자임-기반의 메커니즘을 통한 종양 세포의 사멸에 의해, 다발성 골수종을 치료하는 데 유용할 수 있는 것으로 여겨진다. CD28은 다발성 골수종에 대한 신규한 암 마커로서 보고된 바 있다. 문헌[Nair, J.R. et al. (2011) J. Immunol. 187:1243-1253]을 참조한다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 결합 단백질은 하나 이상의 항-암 치료법(예를 들어, 본 기술 분야에 공지된 임의의 항-암 치료법, 예컨대 화학치료제 또는 치료법)과 조합하여 투여된다(또는 투여될 것이다). 일부 구현예에서, 적어도 하나의 결합 단백질은 하나 이상의 항-암 치료법 이전에 투여된다(또는 투여될 것이다). 일부 구현예에서, 적어도 하나의 결합 단백질은 하나 이상의 항-암 치료법과 동시에 투여된다(또는 투여될 것이다). 일부 구현예에서, 적어도 하나의 결합 단백질은 하나 이상의 항-레트로바이러스 치료법 이후에 투여된다(또는 투여될 것이다).
V. 결합 단백질 치료용 조성물 및 그의 투여
결합 단백질을 포함하는 치료용 조성물 또는 제약 조성물은 본 발명의 범주 내에 있다. 그러한 치료용 조성물 또는 제약 조성물은 투여 양식과의 적합성을 위하여 선택된 제약상 또는 생리학적으로 허용 가능한 제형화제와 혼합된, 치료적 유효량의 결합 단백질, 또는 결합 단백질-약물 컨쥬게이트를 포함할 수 있다.
허용 가능한 제형화 물질은 바람직하게는 이용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이다.
제약 조성물은, 예를 들어 조성물의 pH, 오스몰 농도, 점도, 투명도, 색, 등장성, 냄새, 살균성, 안정성, 용해 또는 방출 속도, 흡착성, 또는 투과성을 변경시키거나, 유지하거나, 보존하기 위한 제형화 물질을 함유할 수 있다. 적합한 제형화 물질은 아미노산(예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 또는 라이신), 항미생물제, 산화방지제(예컨대 아스코르브산, 아황산나트륨, 또는 아황산수소나트륨), 완충제(예컨대 보레이트, 바이카르보네이트, 트리스-HCl, 시트레이트, 포스페이트, 또는 다른 유기 산), 벌킹제(bulking agent)(예컨대 만니톨 또는 글리신), 킬레이팅제(예컨대 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)), 복합체 형성제(complexing agent)(예컨대 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-시클로덱스트린, 또는 히드록시프로필-베타-시클로덱스트린), 충전제, 단당류, 이당류, 및 기타 탄수화물(예컨대 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린), 단백질(예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린), 착색제, 착향제 및 희석제, 유화제, 친수성 중합체(예컨대 폴리비닐피롤리돈), 저분자량 폴리펩티드, 염-형성 반대 이온(예컨대 나트륨), 방부제(예컨대 벤잘코늄 클로라이드, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 페네틸 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산, 또는 과산화수소), 용매(예컨대 글리세린, 프로필렌 글리콜, 또는 폴리에틸렌 글리콜), 당 알코올(예컨대 만니톨 또는 소르비톨), 현탁제, 계면활성제 또는 습윤제(예컨대 플루로닉(pluronic); PEG; 소르비탄 에스테르; 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80; 트리톤(triton); 트로메타민; 레시틴; 콜레스테롤 또는 틸록사팔), 안정성 향상제(예컨대 수크로스 또는 소르비톨), 장성 향상제(예컨대 알칼리 금속 할로겐화물 - 바람직하게는 염화나트륨 또는 염화칼륨 - 또는 만니톨 소르비톨), 전달 비히클, 희석제, 부형제 및/또는 의약 보조제(pharmaceutical adjuvant)(예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990)], 및 이의 후속판 참조, 임의의 목적을 위하여 본원에 참고로 포함됨)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
최적 제약 조성물은 예를 들어 의도된 투여 경로, 전달 포맷, 및 원하는 투여량에 따라 당업자에 의해 결정될 것이다. 그러한 조성물은 결합 단백질의 물리적 상태, 안정성, 생체 내 방출 속도, 및 생체 내 제거 속도에 영향을 줄 수 있다.
제약 조성물 중 일차 비히클 또는 담체는 성질이 수성 또는 비-수성 중 어느 하나일 수 있다. 예를 들어, 주사에 적합한 비히클 또는 담체는 가능하게는 비경구 투여용 조성물에서 일반적인 다른 물질이 보충된, 물, 생리 식염수 용액, 또는 인공 뇌척수액일 수 있다. 중성 완충 식염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 식염수가 추가의 예시적인 비히클이다. 다른 예시적인 제약 조성물은 대략 pH 7.0 내지 pH 8.5의 트리스 완충제, 또는 대략 pH 4.0 내지 pH 5.5의 아세테이트 완충제를 포함할 수 있는데, 이는 소르비톨 또는 적합한 대체재를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 결합 단백질 조성물은 원하는 정도의 순도를 갖는 선택된 조성물을 선택적 제형화제와 혼합함으로써 보관용으로, 동결건조 케이크 또는 수성 용액의 형태로 제조될 수 있다. 또한, 결합 단백질은 적절한 부형제, 예컨대 수크로스를 이용하여 동결건조물로서 제형화될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 비경구 전달 또는 피하용으로 선택될 수 있다. 대안적으로, 조성물은 흡입용으로 또는 소화관을 통한 전달용으로, 예컨대 경구용으로 선택될 수 있다. 그러한 제약상 허용 가능한 조성물의 제조는 본 기술 분야의 기술 내에 있다.
제형 성분은 투여 부위에 허용 가능한 농도로 존재한다. 예를 들어, 완충제는 조성물을 생리학적 pH에서 또는 약간 더 낮은 pH에서, 전형적으로 약 5 내지 약 8의 pH 범위 내에서 유지하는 데 사용된다.
비경구 투여가 고려될 때, 사용하기 위한 치료용 조성물은 제약상 허용 가능한 비히클 중 원하는 결합 단백질을 포함하는 무발열원성의 비경구용으로 허용 가능한 수성 용액의 형태로 존재할 수 있다. 비경구 주사에 특히 적합한 비히클은 적당하게 방부제 처리된, 결합 단백질이 살균, 등장 용액으로서 제형화되는 살균 증류수이다. 또 다른 제법은 생성물의 조절 방출 또는 지속 방출을 제공하는, 주사가능 미소구체, 생분해성(bio-erodible) 입자, 중합체성 화합물(예컨대 폴리락트산 또는 폴리글리콜산), 비드, 또는 리포좀과 같은 물질(agent)을 이용한 원하는 분자의 제형화를 포함할 수 있는데, 상기 생성물은 그 후 데포(depot) 주사를 통하여 전달될 수 있다. 히알루론산이 또한 사용될 수 있으며, 이것은 순환의 부단한 지속을 촉진하는 효과를 가질 수 있다. 원하는 분자의 도입에 적합한 다른 수단은 이식형 약물 전달 장치를 포함한다.
일 구현예에서, 제약 조성물은 흡입용으로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 결합 단백질은 흡입용 건조 산제로서 제형화될 수 있다. 결합 단백질 흡입 용액은 또한 에어로졸 전달을 위하여 분사제를 이용하여 제형화될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 용액은 분무될 수 있다.
특정 제형은 경구 투여될 수 있음이 또한 고려된다. 본 발명의 일 구현예에서, 이러한 방식으로 투여되는 결합 단백질은 고체 투여 형태, 예컨대 정제 및 캡슐의 배합에서 관례적으로 사용되는 담체를 이용하여 또는 이를 이용하지 않고서 제형화될 수 있다. 예를 들어, 캡슐은 생체이용률이 최대화되고 사전-전신적 분해가 최소화되는 때의 위장관에서의 지점에서 제형의 활성 부분을 방출하도록 설계될 수 있다. 추가의 물질을 포함시켜 결합 단백질의 흡수를 용이하게 할 수 있다. 희석제, 착향제, 저 융점 왁스, 식물유, 활택제, 현탁제, 정제 붕해제, 및 결합제가 또한 이용될 수 있다.
또 다른 제약 조성물은 정제의 제조에 적합한 비-독성 부형제와의 혼합물 형태의 유효한 양의 결합 단백질을 포함할 수 있다. 정제를 살균수, 또는 또 다른 적절한 비히클에 용해시킴으로써, 용액이 단위 용량 형태로 제조될 수 있다. 적합한 부형제는 불활성 희석제, 예컨대 탄산칼슘, 탄산나트륨 또는 중탄산나트륨, 락토스, 또는 인산칼슘; 또는 결합제, 예컨대 전분, 젤라틴, 또는 아카시아; 또는 활택제, 예컨대 스테아르산마그네슘, 스테아르산, 또는 활석을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
지속 전달형 또는 조절 전달형 제형 형태의 결합 단백질을 포함하는 제형을 비롯한 본 발명의 추가의 제약 조성물은 당업자에게 명백할 것이다. 다양한 다른 지속 전달 또는 조절 전달 수단, 예컨대 리포좀 담체, 생분해성 마이크로입자 또는 다공성 비드 및 데포 주사제의 제형화 기법이 또한 당업자에게 공지되어 있다. 지속 방출형 제제의 추가의 예는 성형 물품의 형태의 반투과성 중합체 매트릭스, 예를 들어 필름, 또는 마이크로캡슐을 포함한다. 지속 방출형 매트릭스는 폴리에스테르, 히드로겔, 폴리락티드, L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 에틸렌 비닐 아세테이트, 또는 폴리-D(-)-3-히드록시부티르산을 포함할 수 있다. 지속 방출형 조성물은 또한 리포좀을 포함할 수 있으며, 이는 본 기술 분야에 공지된 임의의 몇몇 방법에 의해 제조될 수 있다.
생체 내 투여에 사용될 제약 조성물은 전형적으로 살균성이어야 한다. 이는 살균 여과막을 통한 여과에 의해 달성될 수 있다. 조성물이 동결건조되는 경우, 이러한 방법을 이용한 살균은 동결건조 및 재구성 전에, 또는 동결건조 및 재구성 후에 행해질 수 있다. 비경구 투여용 조성물은 동결건조 형태로 또는 용액으로 보관될 수 있다. 게다가, 일반적으로 비경구 조성물은 살균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어 피하 주사 바늘에 의해 관통가능한 마개를 갖는 정맥내 용액용 백 또는 바이알 내에 배치된다.
일단 제약 조성물이 제형화되면, 그것은 용액, 현탁액, 겔, 에멀션, 고체 또는 탈수 또는 동결건조 분말로서 살균 바이알에 보관될 수 있다. 그러한 제형은 즉시 사용 가능한 형태 또는 투여 전에 재구성을 필요로 하는 형태(예를 들어, 동결건조됨)로 보관될 수 있다.
본 발명은 또한 단일 용량 투여 단위를 생성하기 위한 키트를 포함한다. 키트는 각각 건조 단백질을 갖는 제1 용기 및 수성 제형을 갖는 제2 용기 둘 다를 포함할 수 있다. 또한, 단일 및 다중-챔버형 사전-충전 주사기(예를 들어, 액체 주사기 및 동결주사기(lyosyringe))를 포함하는 키트가 본 발명의 범주 내에 포함된다.
치료적으로 이용될 결합 단백질 제약 조성물의 유효량은 예를 들어 치료적 맥락 및 목적에 따라 달라질 것이다. 따라서 당업자라면 치료에 적절한 투여 수준이 부분적으로는 전달되는 분자, 결합 단백질이 사용되는 적응증, 투여 경로, 및 환자의 크기(체중, 체표면적, 또는 기관 크기) 및 상태(연령 및 종합 건강)에 따라 달라질 것임을 알 것이다. 따라서, 임상의는 투여량을 적정하고 투여 경로를 변경시켜 최적의 치료 효과를 얻을 수 있다.
투약 빈도는 사용되는 제형 중 결합 단백질의 약동학적 파라미터에 따라 달라질 것이다. 전형적으로, 임상의는 원하는 효과를 달성하는 투여량에 도달될 때까지 조성물을 투여할 것이다. 따라서 조성물은 단회 용량으로서, 시간이 지남에 따른 2회 이상의 용량(이는 동일한 양의 원하는 분자를 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있음)으로서, 또는 이식 장치 또는 카테터를 통한 연속 주입물로서 투여될 수 있다. 적절한 투여량의 추가의 개량은 당업자에 의해 일상적으로 이루어지며, 당업자에 의해 일상적으로 수행되는 과제의 영역 내에 있다. 적절한 투여량은 적절한 용량-반응 데이터의 사용을 통하여 규명될 수 있다.
제약 조성물의 투여 경로는 공지된 방법, 예를 들어 경구적 방법에 따르거나; 정맥내, 복강내, 뇌내(뇌실질내), 뇌실내, 근육내, 안내, 동맥내, 문맥내, 또는 병변내 경로에 의한 것이거나; 지속 방출 시스템에 의한 것이거나; 또는 이식 장치에 의한 것이다. 원할 경우, 조성물은 볼루스 주사에 의해 또는 주입에 의해 계속적으로, 또는 이식 장치에 의해 투여될 수 있다.
조성물은 또한 원하는 분자가 흡수되었거나 봉지된 막, 스펀지, 또는 기타 적절한 물질의 이식을 통하여 국소 투여될 수 있다. 이식 장치가 사용될 경우, 상기 장치는 임의의 적합한 조직 또는 기관 내에 이식될 수 있으며, 원하는 분자의 전달은 확산, 정시 방출형 볼루스, 또는 연속 투여를 통한 것일 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 특정 구현예 및 이의 다양한 용도를 예시하는 것이다. 본 실시예는 단지 설명 목적을 위하여 개시되며, 어떠한 방식으로든지 본 발명의 범주를 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
하기의 용어는 특정 항-CD38 항원 결합 도메인 또는 항체를 나타내기 위하여 본원의 실시예 및 도면에서 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다:
항CD38_C2-CD38-1: mAb1
항CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 또는 CD38VH1: mAb2
항CD38_C2-CD38-1_VH3-VL3: mAb3
항CD38_C2-CD38-1_VH5-VL3: mAb4
항CD38_C2-CD38-1_VH6-VL3: mAb5
항CD38_1370 또는 CD38HHY1370: mAb6
항CD38_SB19 또는 이사툭시맙: mAb7.
실시예 1: 단클론 항-CD38 항체의 생성 및 특징화
하기의 실시예에는 단클론 항-CD38 항체의 생성 및 특징화가 기술되어 있다. 유리하게는, 본원에 제공되는 항체는 인간 및 원숭이 CD38 단백질과 교차-반응하여, 그에 의해, 안전성 및 임상 연구 둘 모두를 위해 사용될 수 있는 분자를 제공한다. 이들 항체는 또한, 아폽토시스 및 항체-의존성 세포-매개의 세포독성(ADCC)에 의해 CD38+ 세포를 사멸시킬 수 있다.
본 실시예에는 단일의 쥣과 B 세포로부터 CD38-특이성 및 교차-반응성 단클론 항체를 생성하기 위한 효율적인 작업흐름도가 기술되어 있다.
재료 및 방법
단클론 항체의 생성
인간 CD38에 대한 항체를 인간 CD38 세포외 도메인 R45-I300(서열 번호 1)을 사용하여 생성하였다. 문헌[Q. Liu, I. Krilksunov, R. Graeff, C. Munshi, H.C. Lee, and Q. Hao 2005 Structure 13:: 1331-1339]을 참조한다. 면역원을 면역 반응을 자극하기 위한 애쥬번트와 함께 정상의 BalbC 마우스 또는 인간 면역글로불린 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA를 포함하는 트랜스제닉 Trianni 마우스™(Trianni, 미국 캘리포니아주 샌프란시스코 소재)에 직접 투여하였다.
상이한 태그 및 점 돌연변이를 갖는 아이소폼 A로부터 유래된 다양한 재조합 CD38 단백질(서열 번호 2, 3, 4 및 28) 및 R45-P203으로부터의 CD38 세포외 도메인을 포함하는 태깅된 버전의 CD38 아이소폼 E(서열 번호 105)를 사용하였다. 단백질을 포유동물 세포에서의 일시적인 발현에 의해 생성하였다. 코딩 DNA 서열을 CMV 인핸서/프로모터 및 SV40 폴리A 신호 하에 포유류 발현 플라스미드 내로 클로닝하였다. HEK293 세포(Invitrogen; #K9000-10)를 제조업자의 지시에 따라 FeeStyle™ MAX 293 발현 시스템을 사용하여 발현 플라스미드로 일시적으로 트랜스펙션시켰다.
마우스의 면역화 및 단일의 B 세포 선택
항-CD38 항체를 또한 골수종 세포로의 융합 없이 항원-양성 B 세포로부터 직접 단리하였다. 이러한 방법을 사용하여, 몇몇의 항-CD38 항체, 예컨대 mAb1(각각 VH 및 VL 서열에 대하여 서열 번호 5 및 6, 및 각각 중쇄 및 경쇄 서열에 대하여 서열 번호 7 및 8 참조)을 수득하였다. 약술하면, 문헌[A. Wennerberg et al. (1993 Am. J. Pathol. 143:1050-1054)]에 기술된 바와 같은 종래의 방법을 사용하여 6주령 내지 8주령 암컷 BALB/c 마우스(S082342; Charles River Labs, 미국 메인주 바하버 소재)에게 41일에 걸쳐 각각 3회의 면역화를 제공하였다. 항원을 마우스의 배쪽 부위에 복강내 투여하였다. 마지막 주사 3일 후에, 마우스를 희생시키고, 비장을 무균으로 단리하고, 신선한 RPMI 배지로 세척하였다. 림프구를 비장으로부터 방출시키고, 단일-세포 현탁액을 RPMI 배지로 2회 세척한 후에, 형광 항체 및 이중 인간 및 원숭이 CD38 단백질의 패널을 포함하는 4색 분류 전략을 사용하여 분류한 다음, 유세포분석 세포 분류를 사용하여 분리하여, 인간/원숭이 교차 반응성 IgG-CD38 특이적 B 세포를 단리하였다. 단일의 세포를 PCR 튜브로 직접 분류하여, RT-PCR에 의해 VH 및 VL 유전자의 동족쌍을 증폭시켰다(문헌[T. Tiller, C. Busse and H. Wardemann 2009 J. Immunol. Methods 350:183-193]). 생성된 DNA를 시퀀싱하였다.
생성된 DNA를 제조업자의 지시에 따라 FreeStyle™ MAX 293 발현 시스템을 사용하여 HEK293 세포에서의 일시적인 발현을 위하여 각각 인간 IgG1 또는 인간 Ck 도메인을 코딩하는 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 회분을 단백질 A 친화성 크로마토그래피(MabSelect, GE Heathcare)에 의해 정제하였다. 용출물을 PBS에 대하여 투석한 후에, 멸균 여과하고 4℃에서 보관하였다.
인간 면역글로불린 트랜스제닉 마우스에서의 면역화 및 하이브리도마 기술을 사용한 선택에 의한 항체의 생성
문헌[Kilpatrick et al. 1997 Hybridoma 16: 381389]에 기술된 바와 같이 인간 CD38의 세포외 도메인을 갖는 P3X63-Ag8.653 골수종 세포를 사용하여 면역화, 융합 및 스크리닝을 수행하였다. 문헌[Kilpatrick et al.]에 의해 기술된 RIMMS 방법을 사용하여, 인간 면역글로불린 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역을 코딩하는 DNA를 포함하는 6주령 내지 8주령 암컷 트랜스제닉 Trianni 마우스™에게 각각 3 내지 4일의 간격으로 14일에 걸쳐 4회의 면역화를 제공하였다. RIBI의 애쥬번트(Sigma #T2684) 중에 유화된 CD38 단백질을 마우스의 등을 따라 배액 림프절 근처의 6개의 부위에, 그리고 복부를 따라 6개의 병치 부위에 피하 투여하였다. 마지막 주사 4일 후에, 마우스를 희생시켰다. 양측 슬와근, 표재 서혜, 겨드랑이 및 인두 림프절을 무균으로 단리하고, 신선한 RPMI 배지로 세척하였다. 림프구를 림프절로부터 방출시키고, 단일-세포 현탁액을 RPMI 배지로 2회 세척한 후에, 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 P3X63-AG8.653 골수종 세포와 융합시켰다. 융합 후에, 세포 혼합물을 인큐베이터에서 37℃에서 16시간 내지 24시간 동안 인큐베이션시켰다. 생성된 세포 제제를 선택적 반-고체 배지 내로 전달하고, 100 mm Petri 플레이트 내로 무균으로 플레이팅하고, 37℃에서 인큐베이션시켰다. 선택의 개시 10일 후에, 플레이트를 하이브리도마 성장에 대하여 시험하고, 가시적인 콜로니를 선택하고, 200 ㎕의 성장 배지를 함유하는 96-웰 플레이트에 배치하였다. 96-웰 플레이트를 37℃에서 2일 내지 4일 동안 인큐베이터에 유지하였다. 이러한 기법을 사용하여, 상기 기술된 면역원, 몇몇의 항-CD38 키메라 항체, 예컨대 mAb 6(각각 VH 및 VL 서열에 대하여 서열 번호 9 및 10, 및 각각 중쇄 및 경쇄 서열에 대하여 서열 번호 11 및 12 참조)을 수득하였다. VH 및 VL 서열을 RT-PCR에 의해 회수하고, mAb 6을 상기 기술된 바와 같이 일시적 발현에 의해 생성하였다.
가용성 CD38 세포외 도메인에 대한 결합 친화도
항-huCD38 mab의 결합 특성을 BIAcore 2000(BIAcore Inc., 미국 뉴저지주 웁살라 소재)을 사용하여 평가하였다. 약술하면, CM5 BIAcore 바이오센서 칩을 기기 내로 도킹하고, 실온에서 250 ㎕의 1:1 NHS/EDC로 활성화시켰다. 마우스 항-인간 Fc IgG1(GE Healthcare #BR-1008-39)(0.05M 아세트산염 완충액 중 13.5 ㎍/㎖(pH 5))을 유동 셀 1에서 활성화된 칩 상에 고정화시켰다. 면역화를 5 ㎕/분의 유속에서 수행하였다. 그 다음, 칩을 55 ㎕의 에탄올아민-HCl(pH 8.5)의 주입에 의해 블로킹한 후, 50 mM NaOH, 1 M NaCl로 5회 세척하였다. 인간 CD38 단백질 또는 시노몰구스 CD38 단백질로의 항-CD38 mab의 결합을 측정하기 위하여, 항체를 BIAcore 전개 완충액(HBS-EP) 중 2 ㎍/㎖로 사용하였다. 항원(인간 CD38-histag(ID2) 또는 시노몰구스 CD38-histag(ID3)) 3 nM 내지 1000 nM을 주입하였다. 주입 단계의 완료 후에, 동일한 유속에서 BIAcore 전개 완충액에서 360초 동안 해리를 모니터링하였다. 30 ㎕의 50 mM NaOH-1 M NaCl을 사용하여 주입과 주입 사이에 표면을 재생시켰다. 개별 센서그램을 BIAsimulation 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
인간 CD38-발현 프레-B 세포에 대한 결합 친화도
재조합 쥣과 preB::300.19 세포의 표면 상에 발현되는 CD38로의 항-CD38 항체의 결합을 유세포분석에 의해 결정하였다. 재조합 세포주는 문헌[J. Deckket et al. 2014 Clin. Cancer Res 20:4574-4583]에 기술되어 있다. 쥣과 preB::300.19 CD38-발현 세포를 96-웰 High Bind 플레이트(MSD L15XB-3) 상에 40,000개 세포/웰로 코팅하고, 100 ㎕/웰의 항-CD38 항체를 4℃에서 45분 동안 첨가하고 PBS 1% BSA로 3회 세척하였다. Alexa488(Jackson ImmunoResearch; # 109-545-098)과 컨쥬게이트된 염소 항-인간 IgG 컨쥬게이트 100 ㎕/웰을 4℃에서 45분 동안 첨가하고, PBS 1% BSA로 3회 세척하였다. 세포의 원심분리 및 재현탁화 후에, 200 ㎕/웰의 PBS 1% BSA를 첨가하고 Guava® easyCyte™ 8HT 유세포분석 시스템을 사용하여 판독함으로써 항체 결합을 평가하였다. 각각 BIOST@T-BINDING 및 BIOST@T-SPEED 소프트웨어를 사용하여 겉보기 KD 및 EC50 값을 추산하였다.
결과
인간 SU-DHL-8 또는 MOLP-8 세포로의 새로 단리된 mAb1의 결합을 유세포분석을 사용하여 이사툭시맙의 결합과 비교하였다(도 1a). 둘 모두의 항체는 두 세포주 모두에 대하여 고-친화성 결합을 나타내었다. 그러나, 오직 mAb1만이 표면 상에 시노몰구스 원숭이 CD38을 발현하는 세포에 결합할 수 있었다(도 1b).
인간 및 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 가용성 세포외 도메인으로의 결합을 표면 플라스몬 공명(SPR)을 사용하여 새로 단리된 항체 mAb1 및 mAb6에 대하여 시험하였다. SPR 결과는 표 A에 요약되어 있다.
[표 A]
Figure pct00075
또한, 유세포분석을 사용하여 세포 표면 상에 인간 또는 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드를 발현하는 쥣과 프레-B 세포에 대한 mAb1 및 mAb6 항-CD38 항체의 결합을 시험하였다. 결과는 표 B에 나타나 있다. 시험된 두 항체 모두는 preB::300.19 huCD38- 또는 cCD38-발현 세포로의 고 친화성 결합을 나타내었다.
[표 B]
Figure pct00076
이들 결과는 인간 및 시노몰구스 CD38 폴리펩티드 둘 모두에 고 친화성으로 결합하는 항체의 생성을 보여준다. 이들 항체는 다른 항-CD38 항체와 달리, 가용성 세포외 형태의 또는 포유동물 세포의 표면 상에 발현되는 인간 및 시노몰구스 CD38 폴리펩티드와 교차-반응한다.
실시예 2: 인간화된 항-CD38 변이체의 인 실리코 설계
본 실시예에는 실시예 1에서 생성된 항체의 인간화가 기술되어 있다.
mAb1 가변 도메인의 서열을 인-실리코 분석하였다. 면역글로불린에 대한 국제 ImMunoGeneTics 정보 시스템(IMGT) 정의를 사용하여 상보성 결정 영역(CDR)을 확인하였다.
먼저, 동시에, 검색을 행하여, 각 가변 사슬에 대한 가장 근접한 마우스 생식계열 및 인간 생식계열 단백질 서열 조합을 확인하였다. 이를 마우스 및 인간 생식계열 단백질 서열 데이터베이스에 대한 기본 국소 정렬 검색 툴(Basic Local Alignment Search Tool; BLAST)(문헌[Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]) 검색을 사용하여 수행하였다. 각 항체 사슬에 대하여, 가장 근접한 V 및 J 마우스 및 인간 단백질 서열을 찾아 내었다. 이러한 높은 단백질 서열 동일성의 적격성을 V 영역 동일성 백분율에 의해 측정하였다. mAb1 경쇄 및 중쇄에 대한 검색의 결과는 각각 표 C 및 D에 제시되어 있다.
[표 C]
Figure pct00077
[표 D]
Figure pct00078
다음으로, mAb1 가변 도메인 서열을 서열 라이어빌리티(liability), 예컨대 탈아미드화, 산성 절단, 산화 또는 이소-아스파르트산염 형성 부위에 대하여 스크리닝하였다. mAb1 구조를 상동성에 의한 3D 모델링에 의해 분석하여, 아미노산 잔기가 분자내 또는 분자간 방식으로 어떻게 상호작용하는지 정의된 바 있다. 이러한 단계는 CDR 입체형태 및 항원 결합과 같은 mAb1 기능을 위해 구조적으로 중요한 아미노산 잔기의 그룹이 확인되게 하였다. 이들 아미노산 잔기를 인간화된 mAb1 가변 서열 내에 존재하도록 선택하였다.
모체 쥣과 mAb1 유래의 CDR을 관련 프레임워크 상으로 이식하였다. 상기 분석에 기초하여, IGKJ1*01과 커플링된 인간 IGKV3-20*02 및 IGHJ4*01과 커플링된 인간 IGHV1-3*01을 각각 mAb1 가변 경쇄 및 가변 중쇄 면역화를 위한 기초가 되도록 선택하였다. mAb1 경쇄는 선택된 인간 IGKV3-20*02 생식계열과 V 영역에 걸쳐 64.52% 동일성을 나타내었다. mAb1 중쇄는 선택된 인간 IGHV1-3*01 생식계열과 V 영역에 걸쳐 69.39% 동일성을 나타내었다. 인간화 과정 동안, 모체 쥣과 mAb1 CDR을 선택된 생식계열 프레임워크 사이에 이식하여, 표준 항체 가변 서열을 개조하였다. 상기 언급된 바와 같이, 그의 기능에 구조적으로 중요한 이전에 확인된 mAb1 아미노산 잔기의 그룹에 주의를 기울였다. 필요하면, 그들 아미노산 잔기를 새로 생성된 서열에서 그들의 정확한 상응하는 mAb1 잔기에 의해 대체하였다. 이는 적당한 모체 서열 아미노산 잔기를 혼입하기 위한 복귀-돌연변이 단계에 상응한다. 모체 CDR에서 서열 라이어빌리티의 회피 및 인간화 둘 모두를 위하여 일부 CDR 돌연변이를 혼입하였다. 새로 생성된 경쇄 및 중쇄 가변 서열을 사용하여, 인간화된 mAb1 가변 영역의 3D 상동성 모델을 생성하였다. BIOVIA Discovery Studio suite로부터의 Model Antibody Framework를 사용하여 3D 모델을 구축하였다.
CDR 이식 접근법에 기초하여, 가변 경쇄에 대한 2개의 변이체(VL1 및 VL3) 및 가변 중쇄에 대한 4개의 변이체(VH1, VH3, VH5 및 VH6)를 생성하였다. mAb1 가변 경쇄 및 중쇄 서열과 그들의 인간화된 버전 간에 달라지는 아미노산 잔기의 특정 조합은 각각 표 E 및 표 F에 제시되어 있다.
[표 E]
Figure pct00079
[표 F]
Figure pct00080
서열 번호 14를 갖는 인간화된 VL1 변이체는 서열 번호 6을 갖는 mAb1 서열의 모체 VL에 비하여 총 22개의 돌연변이(FR 내에 18개 및 CDR 내에 4개)를 나타낸다. 이러한 변이체는 mAb 구조, CDR 입체형태 및 이에 따른 그의 표적으로의 결합에 대한 부정적인 영향의 위험으로 인하여 행해진, 8개의 복귀-돌연변이가 있는 IGKJ1*01과 커플링된 인간 생식계열 IGKV3-20*02의 프레임워크로부터 유래하였다. 모체 CDR의 4개의 위치를 돌연변이시켜, 인간화 비를 증가시키거나, 서열 라이어빌리티를 회피하였다.
서열 번호 18을 갖는 인간화된 VL3 변이체는 서열 번호 6을 갖는 mAb1 서열의 모체 VL에 비하여 총 18개의 돌연변이(FR 내에 18개)를 나타낸다. 이러한 변이체는 mAb 구조, CDR 입체형태 및 이에 따른 그의 표적으로의 결합에 대한 부정적인 영향의 위험으로 인하여 행해진, 8개의 복귀-돌연변이가 있는 IGKJ1*01과 커플링된 인간 생식계열 IGKV3-20*02의 프레임워크로부터 유래하였다.
서열 번호 13을 갖는 인간화된 VH1 변이체는 서열 번호 5를 갖는 mAb1 서열의 모체 VH에 비하여 총 17개의 돌연변이(FR 내에 14개 및 CDR 내에 3개)를 나타낸다. 이러한 변이체는 mAb 구조, CDR 입체형태 및 이에 따른 그의 표적으로의 결합에 대한 부정적인 영향의 위험으로 인하여 행해진, 11개의 복귀-돌연변이가 있는 IGHJ4*01과 커플링된 인간 생식계열 IGHV1-3*01의 프레임워크로부터 유래하였다. 모체 CDR의 3개의 위치를 돌연변이시켜, 인간화 비를 증가시키거나, 서열 라이어빌리티를 회피하였다.
서열 번호 17을 갖는 인간화된 VH3 변이체는 서열 번호 5를 갖는 모체 VH mAb1 서열에 비하여 총 14개의 돌연변이(FR 내에 14개)를 나타낸다. 이러한 변이체는 mAb 구조, CDR 입체형태 및 이에 따른 그의 표적으로의 결합에 대한 부정적인 영향의 위험으로 인하여 행해진, 11개의 복귀-돌연변이가 있는 IGHJ4*01과 커플링된 인간 생식계열 IGHV1-3*01의 프레임워크로부터 유래하였다.
서열 번호 21을 갖는 인간화된 VH5 변이체는 서열 번호 5를 갖는 mAb1 서열의 모체 VH에 비하여 총 11개의 돌연변이(FR 내에 11개)를 나타낸다. 이러한 변이체는 mAb 구조, CDR 입체형태 및 이에 따른 그의 표적으로의 결합에 대한 부정적인 영향의 위험으로 인하여 행해진, 14개의 복귀-돌연변이가 있는 IGHJ4*01과 커플링된 인간 생식계열 IGHV1-3*01의 프레임워크로부터 유래하였다.
서열 번호 23을 갖는 인간화된 VH6 변이체는 서열 번호 5를 갖는 mAb1 서열의 모체 VH에 비하여 총 12개의 돌연변이(FR 내에 12개)를 나타낸다. 이러한 변이체는 mAb 구조, CDR 입체형태 및 이에 따른 그의 표적으로의 결합에 대한 부정적인 영향의 위험으로 인하여 행해진, 13개의 복귀-돌연변이가 있는 IGHJ4*01과 커플링된 인간 생식계열 IGHV1-3*01의 프레임워크로부터 유래하였다.
생성된 경쇄 및 중쇄 인간화된 가변 서열을 Immune Epitope Data Base(IEDB) 데이터베이스((문헌[PLos Biol (2005) 3(3)e91]) www.iedb.org)에 대하여 서열 유사성에 대해 블라스팅하여, 서열 중 어느 것도 상기 문헌에 열거된 임의의 공지된 B- 또는 T-세포 에피토프를 함유하지 않았음을 보장하였다.
mAb1 및 인간화된 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 완전한 아미노산 가변 서열은 표 G에 제시되어 있다. 이들 인간화된 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 조합하여 몇몇의 인간화된 버전의 mAb1의 모체 가변 도메인을 생성한 바 있다. mAb2 가변 도메인은 인간화된 VL1과 조합된 인간화된 VH1의 회합물에 상응한다. mAb3 가변 도메인은 인간화된 VL3과 조합된 인간화된 VH3의 회합물에 상응한다. mAb4 가변 도메인은 인간화된 VL3과 조합된 인간화된 VH5의 회합물에 상응한다. mAb5 가변 도메인은 인간화된 VL3과 조합된 인간화된 VH6의 회합물에 상응한다. 표 G에 나타낸 3특이성 결합 단백질은 실시예 4에 더욱 상세하게 기술되어 있다.
상기 기술된 인간화된 VH 및 VL 변이체의 상응하는 코딩 DNA 서열을 실시예 1에 기술된 바와 같은 일시적인 발현 및 정제를 위하여 각각 인간 IgG1 또는 인간 Ck 도메인을 코딩하는 포유류 발현 벡터 내로 클로닝하였다. mAb1로부터 유래된 전장 인간화된 항-CD38 변이체의 아미노 서열은 mAb2(중쇄: HC1, 서열 번호 15; 경쇄: LC1, 서열 번호 16), mAb3(중쇄: HC3, 서열 번호 19; 경쇄: LC3, 서열 번호 20), mAb4(중쇄: HC5, 서열 번호 22; 경쇄: LC3, 서열 번호 20) 및 mAb5(중쇄: HC6, 서열 번호 24; 경쇄: LC3, 서열 번호 20)로서 열거되어 있다.
실시예 3: 항-CD38 항체의 교차-반응성 및 아폽토시스 유도
실시예 2에서 생성된 인간화된 항-CD38 변이체를 다음으로 인간 및 시노몰구스 CD38 폴리펩티드로의 결합 및 아폽토시스의 유도에 대하여 특징화하였다.
재료 및 방법
아폽토시스 유도 분석
세포를 1.5 ㎍/㎖(10 nM)의 표기된 항체와 함께 완전 배지(RPMI-1640, 10% FBS, 2 mM L-글루타민) 중에 2 x 105개의 세포/㎖에서 5% CO2와 함께 37℃에서 20시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 제조업자의 지시(Life Technologies)에 따라 아넥신V-FITC로 염색하였다. 샘플을 획득 제어 및 데이터 분석을 위하여 BD FACSDiva 소프트웨어를 사용하여 BD FACSAria™ 유세포분석기에서 유세포분석에 의해 분석하였다(둘 모두 BD Biosciences).
결과
상기 기술된 바와 같이 생성되는 선택된 항-인간 CD38 항체의 결합 특성을 시험하였다(도 2a 내지 도 2h). 가용성 인간 CD38 및 시노몰구스 원숭이 CD38로의 항체의 결합을 ELISA 및 SPR을 사용하여 시험하였다. ELISA 데이터를 사용하여 인간화된 항-CD38 항체 mAb2(도 2a), mAb3(도 2c), mAb4, mAb5(도 2e) 및 인간 항-CD38 항체 mAb6(도 2i)에 대하여 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD38에 결합하는 항체의 EC50을 결정하였다.
CD38로의 인간화된 항-CD38 변이체 또는 인간 항-CD38 mAb의 결합을 또한 상기 기술된 SPR 검정을 사용하여 평가하였다. SPR 데이터를 사용하여 인간화된 항-CD38 항체 mAb2(도 2b), mAb3(도 2d), mAb4, mAb5(도 2f) 및 인간 항-CD38 항체 mAb6(도 2h)에 대하여 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD38에 결합하는 항체의 KD 및 koff를 결정하였다. 결합 데이터는 표 K에 요약되어 있으며, 이는 모든 항-CD38 mAb가 유사한 결합 특징으로 CD38에 결합하는 것을 보여준다.
[표 K]
Figure pct00081
CD38-발현 세포에 결합하는 인간화된 항-CD38 변이체의 능력을 상기 기술된 FACS-기반의 결합 분석을 사용하여 평가하였다. FACS 데이터를 사용하여, 인간화된 항-CD38 항체 mAb2(도 2a), mAb3(도 2c), mAb4, mAb5(도 2e) 및 인간 항-CD38 항체 mAb6(도 2g)에 대하여 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD38에 결합하는 항체의 EC50을 결정하였다. 표 L에 제시된 결합 데이터는 모든 인간화된 항-CD38 변이체가 세포 표면 CD38에 대하여 유사한 결합 친화도를 나타내었음을 보여준다.
[표 L]
Figure pct00082
3개의 분석으로부터의 결합 데이터는 인간 V 영역에 대한 VH 및 VL 도메인의 서열 동일성과 함께 도 2i에 요약되어 있다.
다음으로, 아폽토시스를 유도하기 위한 모체 mAb1 항체 및 mAb7의 능력을 시험하였다. 두 항체는 모두 아넥신 V 염색 및 프로피듐 요오드화물(PI) 흡수를 증가시켰다. 세포의 40%는 mAb7로의 처리 후에 아넥신 V 및 PI에 대하여 이중-양성이되었으며, mAb1로 처리된 세포의 60%는 이중 양성이었다. 두 항체 모두는 SU-DHL-8 세포에서 유사한 농도-의존적 아폽토시스 효과를 나타내었다(도 2j). 유사하게, 두 항체 모두는 NK92 세포의 존재 하에 SU-DHL-8 세포에 대한 ADCC 활성을 촉진시켜(도 2k), 37℃에서 4시간 후에 최대 60% 세포독성 및 4 pM 내지 6 pM의 IC50을 야기하였다(도 2l).
CD38 아이소폼 E를 인 실리코 확인하고, 다발성 골수종 환자 유래의 NK 세포, PBMC 및 BMMC, 및 암 세포주(MOLP-8, CU1702 및 CU2332)로부터 전사물 수준에서 입증하였다. CD38 아이소폼 E를 인간 RefSeq 전사물 데이터베이스 공개 20131216에서 BLASTN 2.2.26(문헌[Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402.]) 프로그램을 사용하여 핵산 서열 데이터베이스 스크리닝에 의해 입증하였다. 서열 저 복잡성 영역을 차폐하지 않고, 최소 100개 핵산 잔기의 스트레치에서 인간 CD38 아이소폼 A 핵산 서열과 적어도 98.5% 동일성을 고려하여, BLASTN 프로그램을 적용하였다. 이러한 스크리닝으로부터 강조표시된 서열을 인간 CD38 유전자의 전사 형태인 것으로 입증되도록 CD38 유전자 좌와 재정렬시켰다(동일한 인트론-엑손 게놈 구조). CD38 아이소폼 E 핵산 서열은 인간 CD38 유전자의 전사 형태인 것으로서 입증된 서열 중 하나였다.
인간 CD38 아이소폼 A 및 E 둘 모두에 결합하는 항-CD38 항체의 능력도 또한 시험하였다. CD38 아이소폼 A 및 아이소폼 E로의 결합을 평가하기 위하여, 포획 항원으로서 (실시예 1에 기술된 바와 같이 제조된) 아이소폼 A 및 아이소폼 E 단백질을 사용함으로써 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA)을 수행하였다. 96-웰 플레이트를 PBS 중 0.5 ㎍/웰로 어느 하나의 아이소폼으로 코팅하고, 100 ㎕/웰의 항체를 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시키고, 0.05% Tween-20을 함유하는 PBS(PBS-T)로 5회 세척하였다. 그 다음, 서양고추냉이 퍼옥시다제(Jackson Ref: 109-035-098)와 컨쥬게이트된 항-인간 IgG의 1:25,000 희석액 100 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 37℃에서 1시간 동안 암소에서 인큐베이션시킨 후에, 플레이트를 PBS-T로 5회 세척하였다. TMB-H2O2 완충액을 첨가하고, 450 nm의 파장에서 판독함으로써 항체 결합을 가시화시켰다. EC50 값을 BIOST@T-SPEED 소프트웨어를 사용하여 추산하였다.
CD38 아이소폼 A(서열 번호 1) 및 아이소폼 E(서열 번호 105)에 대한 다양한 항체의 결합 친화도를 표 L2에 나타낸 바와 같이 결정하였다. 표 M은 다양한 항-CD38 항체에 대한 결합 특성의 비교를 제공한다.
[표 L2]
Figure pct00083
[표 M]
Figure pct00084
결론적으로, mAb7 및 mAb1은 둘 모두 MOLP-8 인간 다발성 골수종 세포에서 유사한 아폽토시스, SU-DHL-8 세포에 대한 유사한 농도-의존적 아폽토시스 효과, 및 SU-DHL-8 세포에 대한 유사한 농도-의존적 ADCC 활성을 유도한다. 그러나, 오직 mAb1만이 하위-나노몰 친화도로 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD38 둘 모두에 결합하였으며, CD38 아이소폼 A 및 E에 결합하였다.
아폽토시스를 유도하는 인간화된 항-CD38 변이체의 능력을 또한 상기 기술된 바와 같은 형광 활성화된 세포 분류기(FACS)에 의해 평가하였다. 다양한 기능적 특성을 갖는 몇몇의 항-CD38 항체가 이전에 확인된 바 있지만, 이들 중 일부가 세포 증식 또는 아폽토시스에 대한 직접적인 영향을 통하여 CD38+ 세포주의 시험관내 사멸을 매개할 수 있다. 아폽토시스 유도 분석의 결과는 도 2m에 나타낸 바와 같다. mAb6을 제외한, 실시예 1 및 2에서 생성된 모든 항체는 아폽토시스를 유도할 수 있었다. 항-CD38 항체 mAb2, mAb3, mAb4 및 mAb5는 SU-DHL-8 림프종 세포에서 아폽토시스의 용량-의존적 유도를 야기하였으며; 각 항체에 대한 IC50은 도 2n 내지 도 2q에 제공되어 있다.
실시예 4: 3특이성 항-CD38 결합 단백질의 생성
다음으로, 실시예 1 내지 실시예 3에 기술되는 선택된 항-CD38 항체의 항원 결합 도메인의 결합 특성을 도 3a에 나타낸 3특이성 포맷에서 분석하였다.
다른 항원 결합 도메인이 SPR을 사용하여 그들의 동족 리간드에 결합되는 경우, 항-CD38 항원 결합 도메인을 3특이성 포맷(항-CD38x항-CD28x항-CD3)에서 CD38에 결합하는 능력에 대하여 시험하였다. 순차적인 리간드 결합 분석은 도 3b에 나타나 있다. 각각의 3특이성 Ab로의 3개의 항원의 순차적인 결합을 위하여, 포화 농도(10 KD 초과)의 각 항원을 8분 동안 주입하고, 5분 해리로 이어졌다. 10 mM 글리신-HCl pH 2.5를 30 ㎕/분에서 60초 동안 주입함으로써 표면 재생을 행하였다. 데이터를 1:1 역학적 결합 모델로 핏팅시키고, Biacore S200 평가 소프트웨어 v 1.0을 사용하여 분석하였다. 평형 해리 상수(KD)를 회합 속도 상수(kon) 및 해리 속도 상수(koff)를 사용하여 계산하였다.
도 3c에 나타낸 바와 같이, 이러한 SPR-기반의 분석은 3특이성 결합 단백질은 CD3 및/또는 CD28 항원 결합 도메인이 그들의 동족 항원에도 또한 결합하는지 여부와 관계 없이, CD38에 결합할 수 있었음을 보여주었다. 예시적인 순차적 결합 분석의 결과는 도 4에 나타나 있다. SPR에 의해 측정되는 바와 같은 역학적 파라미터는 표 M2에 제공되어 있다.
[표 M2]
Figure pct00085
이들 결과는 모든 3개의 표적이 3특이성 결합 단백질에 동시에 결합할 수 있음을 보여준다. 3특이성 결합 단백질과 CD28, CD3 또는 둘 모두(어느 하나의 순서로)의 사전-결합은 CD38에 대한 결합 역학 또는 결합 친화도를 변경시키지 않았다.
다음으로, CD38SB19xCD28supxCD3mid 3특이성 결합 단백질의 각 항원 결합 도메인을 포화 상태에서 다른 2개의 항원 결합 도메인의 존재 및 부재 하에 동족 항원에 결합하는 능력에 대하여 SPR에 의해 평가하였다. 표 M3 및 M4는 이들 분석의 결과를 보여준다.
[표 M3]
Figure pct00086
[표 M4]
Figure pct00087
표 M3 및 표 M4에 입증된 바와 같이, 2개의 표적이 항원과의 사전-결합에 의해 포화되는 것은, CD38 또는 CD28에 대한 제3 표적의 반응속도 또는 결합 친화도에 영향을 미치지 않았다. CD3 결합의 경우에, 사전결합된 CD38 및/또는 CD28은 더 빠른 반응속도를 초래하였다(kon 및 koff 값에 대한 대략 4배의 영향).
항-CD38 항원 결합 도메인을 2개의 항-CD28 항원 결합 도메인(초효능제, "sup" 및 종래의 효능제, "cvn") 및 2개의 항-CD3 항원 결합 도메인("mid" 및 "low")을 갖는 3특이성 포맷에서 시험하였다. 이들 항원 결합 도메인에 대한 가변 도메인 서열은 하기로서 제공된다: 항-CD28sup: 서열 번호 49(VH) 및 서열 번호 50(VL); 항-CD28cvn: 서열 번호 51(VH) 및 서열 번호 52(VL); 항-CD3mid: 서열 번호 53(VH) 및 서열 번호 54(VL); 항-CD3low: 서열 번호 84(VH) 및 서열 번호 85(VL). 3특이성 결합 단백질의 결합을 시험하는 SPR 분석의 결과는 도 5에 나타나 있다. 3개의 항-CD38 결합 도메인은 3특이성 결합 단백질 포맷에서, 1특이성 포맷에서와 대략 동일한 결합 친화도를 가졌다. 둘 모두의 CD3 결합 도메인은 1-, 2- 및 3특이성 포맷에서 대략적으로 동일한 결합 친화도를 가졌다. CD28 결합 도메인은 1특이성과 비교하여 2- 또는 3특이성 포맷에서 약간 더 낮은(그러나 여전히 나노몰의) 결합 친화도를 가질 것이다. 다른 2개의 항원 결합 도메인이 포화되는 경우, 항-CD38SB19 및 항-CD28sup 결합 도메인은 다른 2개의 항원 결합 도메인이 항원에 결합되지 않는 경우와 비교하여 유사한 결합 친화도를 가졌다. 그러나, 항-CD3mid 결합 도메인은 다른 2개의 항원 결합 도메인이 포화되는 경우 더 빠른 반응속도를 보였다. 이들 결과는 항-CD38, 항-CD28 및 항-CD3 결합 도메인이 3특이성 결합 단백질 포맷으로 사용하기에 상용성임을 보여준다.
본원에서 생성된 항-CD38 항원 결합 도메인을 또한 mAb7의 기존의 항-CD38 항원 결합 도메인에 대하여 비교하였다(각각 VH에 대하여 서열 번호 47 및 VL 서열에 대하여 서열 번호 48 참조). 재조합 쥣과 preB::300.19 세포의 표면 상에 발현되는 CD38로의 3특이성 분자의 결합을 유세포분석에 의해 결정하였으며, 상응하는 항-CD38 1가 항체를 병행하여 분석하였다. 재조합 세포주는 문헌[J. Deckket et al. 2014 Clin. Cancer Res 20:4574-4583]에 기술되었다. 쥣과 preB::300.19 CD38-발현 세포를 40,000개 세포/웰로 96-웰 High Bind 플레이트(MSD L15XB-3) 상에 코팅하고, 100 ㎕/웰의 3특이성 분자를 4℃에서 45분 동안 첨가하고, PBS 1% BSA로 3회 세척하였다. Alexa488(Jackson ImmunoResearch; # 109-545-098)과 컨쥬게이트된 염소 항-인간 IgG 100 ㎕/웰을 4℃에서 45분 동안 첨가하고, PBS 1% BSA로 3회 세척하였다. 세포의 원심분리 및 재현탁화 후에, 200 ㎕/웰의 PBS 1% BSA를 첨가하고 Guava® easyCyte™ 8HT 유세포분석 시스템을 사용하여 판독함으로써 항체 결합을 평가하였다. 각각 BIOST@T-BINDING 및 BIOST@T-SPEED 소프트웨어를 사용하여 겉보기 KD 및 EC50 값을 추산하였다.
유세포분석을 상기 기술된 바와 같이 사용하여, 세포 표면 상에 인간 또는 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드를 발현하는 쥣과 pre-B 세포로의 mAb7 또는 mAb7 항-CD38 항원 결합 도메인을 갖는 3특이성 결합 단백질의 결합을 시험하였다. 도 6a에 나타낸 바와 같이, mAb7 항-CD38 항원 결합 도메인을 갖는 CD38xCD28supxCD3mid 3특이성 결합 단백질은 mAb7 1특이성 항체(상부 우측)보다 8배 더 낮은 겉보기 친화도로 인간 CD38을 발현하는 세포에 결합한다(상부 좌측). mAb7 1특이성 항체(하부 우측) 또는 mAb7 항-CD38 항원 결합 도메인을 갖는 3특이성 결합 단백질(하부 좌측) 중 어느 하나도 시노몰구스 CD38을 발현하는 세포에 결합하지 않았다.
인간화된 항-CD38 항체 mAb2의 결합 도메인을 또한 인간 또는 시노몰구스 CD38 폴리펩티드를 발현하는 세포로의 결합에 대하여 3특이성 포맷에서 시험하였다. 도 6b 내지 도 6d에 나타낸 바와 같이, 그리고 mAb7과 달리, mAb2 항-CD38 항원 결합 도메인을 갖는 CD38xCD28supxCD3mid 및 CD38xCD28cvnxCD3mid 3특이성 결합 단백질 및 mAb2 1특이성 항체는 인간 및 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드 둘 모두에 결합할 수 있었다. mAb2 항-CD38 항원 결합 도메인을 갖는 CD38xCD28cvnxCD3mid 3특이성 결합 단백질은 모체 mAb2 항체보다 9배 더 낮은 겉보기 친화도로 인간 CD38을 발현하는 세포에 결합하였다(도 6c 상부를 도 6d 상부와 비교). mAb2 항-CD38 항원 결합 도메인을 갖는 CD38xCD28cvnxCD3mid 3특이성 결합 단백질은 모체 mAb2 항체보다 7.5배 더 낮은 겉보기 친화도로 시노몰구스 CD38을 발현하는 세포에 결합하였다(도 6c 하부를 도 6d 하부와 비교). mAb2 항-CD38 항원 결합 도메인을 갖는 CD38xCD28supxCD3mid 3특이성 결합 단백질은 mAb2 항-CD38 항원 결합 도메인을 갖는 CD38xCD28cvnxCD3mid 3특이성 결합 단백질보다 2.5배 더 낮은 겉보기 친화도로 인간 CD38을 발현하는 세포에 결합하였다(도 6c 상부를 도 6b 상부와 비교).
인간화된 항-CD38 항체 mAb6의 결합 도메인을 또한 인간 또는 시노몰구스 CD38 폴리펩티드를 발현하는 세포로의 결합에 대하여 mAb6 1특이성 항체에 대해 비교하였다. mAb6 1특이성 항체는 nM 범위의 인간(상부 우측) 또는 시노몰구스 원숭이(하부 우측) CD38 폴리펩티드를 발현하는 세포에 결합하였지만(도 6e), mAb6 항-CD38 항원 결합 도메인을 갖는 CD38xCD28supxCD3mid 3특이성 결합 단백질은 포화 없이 인간(상부 좌측) 또는 시노몰구스 원숭이(하부 좌측) CD38 폴리펩티드를 발현하는 세포에 결합하였다.
결론적으로, 인간 CD38에 결합하는 CD38SB19xCD28supxCD3mid 3특이성 결합 단백질에 대한 친화도는 SPR에 의해 재조합 인간 CD38로의 결합을 시험하든지, 또는 유세포분석에 의해 세포 표면 상에 발현되는 인간 CD38로의 결합을 시험하든지, 동일한 범위인 것으로 밝혀졌다(도 6f). 유사하게, 인간 CD38로의 결합에 대한 CD38VH1xCD28supxCD3mid/low(mAb2 항-CD38 결합 도메인) 및 CD38VH1xCD28cvnxCD3mid/low 3특이성 결합 단백질(mAb2 항-CD38 결합 도메인)의 친화도는 또한 둘 모두의 분석에서 동일한 범위였다. CD38HHY1370xCD28supxCD3mid(mAb6 항-CD38 결합 도메인)에 있어서, 인간 CD38과의 결합에 대한 KD는 SPR에 의해 1 nM인 것으로 결정된 한편, 정확한 EC50 값이 유세포분석에 의해 추산될 수 없었다. (FACS 분석에 의해 수득되는) 다양한 항-CD38 결합 도메인을 갖는 3특이성 결합 단백질의 겉보기 KD 값의 요약은 표 M5에 제공되어 있다.
[표 M5]
Figure pct00088
Figure pct00089
예상되는 바와 같이, 항-CD38 결합 도메인이 결여된 ΔCD38xCD28supxCD3mid 3특이성 결합 단백질은 인간 또는 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드를 발현하는 세포에 결합하지 않았다(도 6g). 이는 이러한 분석에서 관찰되는 결합이 CD38 항원 결합 도메인에 대하여 특이적이었음을 나타낸다.
실시예 5: 항-CD38 mAb2 및 항-CD38 mAb6-함유 3특이성 결합 단백질의 시험관내 및 생체내 특징화
하기의 실시예에는 mAb2 및 mAb6 항체로부터 유래된 가변 도메인을 함유하는 신규한 T 세포 관여항체의 안정성, 결합 특성 및 활성을 특징화하는 실험이 기술되어 있다. 3특이성 결합 단백질의 항-CD38, CD3 및 CD28 아암(arm)의 변이체를 포함하는 추가의 항-CD38 x CD28 x CD3 항체를 생성하였다. 신규한 항-CD38/CD3/CD28 항체는: 1) 항-CD38 결합 도메인(mAb2 또는 mAb6); 2) 항-CD3 결합 도메인(CD3high 또는 CD3low; 항-CD3low VH 및 VL 서열에 대해서는 각각 서열 번호 84 및 85 참조); 3) 항-CD28 결합 도메인(CD28sup 또는 CD28cvn)이 상이하다. 가능한 조합 내에서, 항-CD38 x CD28 x CD3의 집합을 설계하고, 생성한 후에, 다양한 기능에 대하여 시험하였다.
재료 및 방법
3특이성 결합 단백질의 생성 및 정제
제조업자의 프로토콜에 따라 ExpiFectamine™ 293 트랜스펙션 키트(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 4가지의 발현 플라스미드로 Expi293 세포를 일시적으로 트랜스펙션시켜 3특이성 결합 단백질을 생성하였다. 간략하게는, 25% (w/w)의 각각의 플라스미드를 Opti-MEM으로 희석시키고, 사전 희석시킨 ExpiFectamine 시약과 실온(RT)에서 20분 내지 30분 동안 혼합하고, Expi293 세포(2.5x106개의 세포/㎖)에 첨가하였다. 종종 플라스미드의 최적의 비를 결정하기 위한 트랜스펙션의 최적화를 이용하여 수율 및 순도가 양호한 3특이성 결합 단백질을 생성하였다.
트랜스펙션한지 4일 내지 5일 후, 트랜스펙션된 세포로부터의 상청액을 수집하고, 0.45 ㎛ 필터 유닛(Nalgene)을 통하여 여과시켰다. 상청액 중 3특이성 결합 단백질을 3단계 절차를 이용하여 정제하였다. 첫째, 단백질 A 친화성 정제를 이용하였으며, 결합된 Ab를 "IgG 용출용 완충액"(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 용출시켰다. 둘째, 생성물을 PBS(pH 7.4)에 대하여 하룻밤 투석시켰으며, 이때 PBS 완충액을 2회 교환하였다. 다음 단계 전에 0.45 ㎛ 필터 유닛(Nalgene)을 통한 여과에 의해 임의의 침전물을 제거하였다. 셋째, 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 정제(Hiload 16/600 Superdex 200pg, 또는 Hiload 26/600 Superdex 200pg, GE Healthcare)를 이용하여 프렙(prep) 중 응집물 및 다른 종들을 제거하였다. 분획을 환원 및 비-환원 SDS-PAGE에서 분석하여 단량체형 3특이성 결합 단백질을 함유하는 분획들을 확인한 후 이들을 합하였다. 정제된 항체를 분취하여 -80℃에서 장시간 보관할 수 있다.
ELISA 분석
정제된 항체의 결합 특성을 ELISA법 또는 SPR법 중 어느 하나를 이용하여 분석하였다. ELISA에 있어서, 3특이성 결합 단백질에서의 각각의 결합 부위에 대하여 상응하는 항원을 이용하여, PBS(pH 7.4) 중 2 ㎍/㎖의 각각의 항원을 사용하여 96웰 Immuno Plate(Nunc 439454, Thermo Fisher Scientific)를 4℃에서 하룻밤 코팅하였다. 코팅된 플레이트를 5% 탈지유+2% BSA(PBS 중)를 사용하여 실온에서 1시간 동안 차단시키고, 이어서 PBS+0.25% Tween 20으로 3회 세척하였다(Aqua Max 400, Molecular Devices). 항체들(3특이성 및 대조 Ab)의 연속 희석물을 제조하고, ELISA 플레이트에 첨가하고(100 ㎕/웰, 이중으로), 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시키고, 이어서 PBS+0.25% 트윈 20으로 5회 세척하였다.
세척 후, HRP 컨쥬게이션된 이차 항-인간 Fab(1:5000, 카탈로그 번호 109-035-097, Jackson ImmunoResearch Inc)를 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. PBS+0.25% Tween 20으로 5회 세척한 후, 100 ㎕의 TMB 마이크로웰 퍼옥시다제 기질(미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재의 KPL)을 각각의 웰에 첨가하였다. 반응을 50 ㎕의 1 M H2SO4의 첨가에 의해 종료하고, OD450을 SpectraMax M5(Molecular Devices)를 사용하여 측정하고, SoftMax Pro6.3 소프트웨어(Molecular Devices)를 사용하여 분석하였다. 최종 데이터를 GraphPad Prism 소프트웨어(미국 캘리포니아주 소재의 GraphPad Software)로 전달하고, 나타낸 바와 같이 플로팅하였다. EC50을 동일한 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.
ELISA 분석을 사용하여, 인간 CD3(Cambridge Biologics LLC Cat#03-01-0051), CD28(Cambridge Biologics LLC Cat#03-01-0303) 및 CD38(Cambridge Biologics LLC Cat#03-01-0369)로의 항-CD38xCD28xCD3 3특이성 항체 또는 이소타입 대조군 항체(인간 IgG4)의 결합을 결정하였다. 결합된 항체를 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-컨쥬게이트된 항-Fab 이차 항체(Jackson ImmunoResearch Inc #109-035-097)를 사용하여 검출하였다.
시험관 내 세포 사멸 분석
상이한 3특이성 결합 단백질을 사용하여 다양한 암세포에 대한 시험관 내 사멸 분석을 위하여 정제된 인간 PBMC를 사용하였다. 간략하게는, 사멸 분석을 96웰 V자형 바닥 플레이트에서 준비하였다. 각각의 플레이트에 있어서, 각각의 공여자로부터의 40 ㎖의 PBMC를 2x10^6개의 세포/㎖로 플레이팅하고, 30 ㎖의 PKH26(Sigma #MINI26) 표지 표적 세포(2.5x10^5개의 세포/㎖)(1x10^7개까지의 세포를 염색하기 위한 4 ㎕의 염료)를 준비하였다. 처음에 20 ㎕/웰의 테스트용 단백질(다양한 농도) 또는 PMA를 각각의 웰에 첨가하고, 이어서 80 ㎕/웰의 표지된 표적 세포를 각각의 웰에 첨가하였다(2X10^4개의 세포/웰). 그 후 100 ㎕의 PBMC를 각각의 웰에 첨가하여, E:T=10:1의 웰에 도달하고(2x10^5개의 세포/웰), 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 스핀다운하고, 상청액을 사이토카인 방출량 측정용으로 수집하거나, 폐기했다. 세포를 Vivid LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Staining 완충액(Life Technology #L34955)을 이용하여 염색하였다(염색 완충액은 60 ㎕의 Vivid 시약을 60 ㎖의 PBS에 첨가함으로서 제조함). 암소에서 실온에서 15분 동안 인큐베이션함에 의해 100 ㎕ 염색 완충액에 세포를 재현탁시켰다. 세포를 1xPBS로 세척한 후, 세포를 0.5% 파라포름알데히드를 포함하는 200 ㎕ PBS에 재현탁시키고, PKH26+Vivid+ 암세포를 Fortessa 유세포 분석기(미국 캘리포니아주 새너제이 소재의 Beckton Dickinson)에 의해 수집하고, 이어서 Flowjo 소프트웨어를 이용하여 분석하였다. 사멸률을 특이적 사멸-자연 사멸/총 세포로 계산하고, 나타낸 바와 같이 플로팅하였다.
사이토카인 방출 분석
시험관 내 활성화 분석, 시험관 내 사멸 분석, CD34+ 제대 세포 인간화 NSG 마우스에서의 생체 내 활성화 분석, 및 독성 연구에서의 염증성 사이토카인 농도의 측정을 위하여, 세포 배양 상청액을 수집하고, 혈청 샘플을 Milliplex Human High Sensitivity T cell 13-plex 키트(EMD Millipore)를 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 희석시켰다. 상기 샘플을 후속적으로 EMD Millipore MAGPIX® System, 및 MILLIPLEX® Analyst 5.1 소프트웨어에 의해 분석하였다.
생체 내용 마우스 모델 및 효능 연구
인간 CD34+ 조혈 줄기 세포-생착된 NSG 마우스(hu-CD34)를 생체 내용 마우스 모델로서 사용하였다. 이러한 마우스는 다중-계열 인간 면역 세포가 발달하며, 면역-항암(immuno-oncology) 효능 연구를 위한 인증된 플랫폼(platform)이다(예를 들어, 문헌[Shultz, L.D. et al. (2014) Cold Spring Harb. Protoc. 2014:694-708] 참조). Hu-CD34+　NSG 마우스를 CD34+　조혈 줄기 세포의 주사에 의해 생성하며, 이는 T 세포, B 세포 및 일부 다른 집단을 포함하는 인간 면역 세포 집단의 효과적인 다중-계열 생착을 보여준다(문헌[McDermott, S.P. et al. (2010) Blood 116:193-200]). 다중-계열 조혈은 12주 내에 발생한다. 생착은 이식편 대 숙주 질환 없이 1년 넘게 안정하다.
hu-CD34 NSG 마우스를 이용한 효능 연구를 위하여, 마우스를 The Jackson Laboratory(미국 메인주 소재)로부터 구매하고, 인간 세포 집단을 인증한 후 사용하였다. 일반적으로, Matrigel(BD Biosciences)에서 혼합한 5x106개의 종양 세포(50% (v/v))를 각각의 마우스에서의 종양 접종에 사용하였다. 일단 종양 크기가 100 mm3 내지 150 mm3에 도달하면, 연구를 위하여 마우스를 선택하여 각각의 군으로 무작위화하였다. 항체를 주어진 용량으로 주 3회 정맥내로 제공하였다. 체중을 주 1회 내지 3회 모니터링하였다. 종양 크기를 캘리퍼 종양 측정에 의해 주 1회 내지 3회 측정하였다. 종양 크기가 1,500 mm3에 도달한 때, 또는 마지막으로 투약한지 24시간 후, 모든 마우스를 끝냈다. 최종 혈액 샘플(0.3 ㎖)을 혈청 분리기 튜브 내에 수집하고, 부드럽게 5회 뒤집음으로써 혼합하고, 튜브 랙에 넣었다. 최종 종양을 또한 수집하고 칭량한 후, 면역조직화학적 분석을 위하여 고정제에 넣었다.
인간 PBMC 인간화(hu-PBMC) NSG 마우스를 또 다른 생체 내용 마우스 모델로서 사용하였다. 이러한 마우스는 건강한 공여자 유래의 정제된 인간 PBMC의 주사에 의해 생성되는데, 이는 성인 말초 혈액 단핵 세포를 사용한 생착 속도가 가장 빨라서 강한 이펙터 및 기억 T 세포 및 NK 세포 기능을 요구하는 단기 연구를 가능하게 하고, 이식편 대 숙주 질환으로 인하여 단기 효능 연구(3주 내지 4주)에 적합하다.
hu-PBMC NSG 마우스를 이용한 효능 연구를 위하여, 8주령 내지 10주령 NSG 마우스(카탈로그 번호 005557, NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)를 The Jackson Laboratory(미국 메인주 소재)로부터 구매하였다. Matrigel(BD Biosciences) 중에 혼합한 5x106개의 종양 세포(50% (v/v))를 각각의 마우스에 피하로 접종하였다. 일단 종양 크기가 50 mm3 내지 100 mm3의 범위에 도달하면, 건강한 공여자들 유래의 10x106개의 인간 PBMC를 각각의 마우스에 대하여 복강내(IP)로 재구성하였다. 인간 세포 재구성을 다음날에 인증하였다. 일단 종양 크기가 100 mm3 내지 150 mm3의 범위에 도달하면, 연구를 위하여 마우스를 선택하여 각각의 군으로 무작위화하였다. 항체를 주어진 용량으로 주 3회 정맥내로 제공하였다. 체중을 주 1회 내지 3회 모니터링하였다. 종양 크기를 캘리퍼 종양 측정에 의해 주 1회 내지 3회 측정하였다. 종양 크기가 1,500 mm3에 도달한 때, 또는 마지막으로 투약한지 24시간 후, 모든 마우스를 끝냈다. 최종 혈액 샘플(0.3 ㎖)을 혈청 분리기 튜브 내에 수집하고, 부드럽게 5회 뒤집음으로써 혼합하고, 튜브 랙에 넣었다. 최종 종양을 또한 수집하고 칭량한 후, 면역조직화학적 분석을 위하여 고정제에 넣었다.
파종성 hu-PMBC NSG 마우스 모델에 있어서, 1개 내지 5x106개의 세포를 제0일에 각각의 마우스 내로 정맥내로 주입하였다. 제3일에, 무작위화를 위하여 기준선 발광 영상화를 행하였다. 제4일에, 건강한 공여자 유래의 10x106개의 인간 PBMC를 각각의 마우스로 복강내로(IP) 재구성하였다. 마우스를 제5일, 제12일, 제19일에 표기된 용량을 사용하여 주마다 처리하였다. 각 동물에서 종양 부피를 모니터링하기 위하여 제10일, 제17일, 제24일에 주마다 발광 신체 영상화를 행하였다. 연구의 종료 시에, 혈액, 비장, 골 및 골수를 조직병리학 연구를 위하여 수집하였다.
결과
모든 3개의 표적 항원에 결합하기 위한 항체의 능력을 ELISA 분석에 의해 시험하였다. CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4, CD38VH1xCD28supxCD3low IgG4, CD38VH1xCD28cvnxCD3mid IgG4, CD38VH1xCD28cvnxCD3low IgG4는 인간 및 원숭이 CD3 및 CD38에 대하여 유사한 결합 친화도를 보였으나, CD28에 대하여 가변적인 결합 친화도를 보였으며(인간 및 원숭이는 동일한 세포외 도메인을 갖는다), CD28sup은 더 나은 친화도를 보였다(도 7a). CD38VH1xCD28supxCD3mid 및 CD38HHY1370xCD28supxCD3mid IgG4 FALA 변이체 및 IgG1 LALA P329A 및 NNAS 변이체는 모두 인간 CD3, CD28 및 CD38에 대하여 유사한 결합을 보였다(도 7b).
다음으로, 3특이성 항-CD38xCD3xCD28 결합 단백질 변이체를 T 세포 활성화 및 항체-매개의 종양 세포 사멸을 유도하는 그들의 능력에 대하여 시험하였다(도 8a 내지 도 8d). 도 8a는 E:T=10에서 3명의 상이한 공여자 유래의 PBMC를 사용하여 인간 다발성 골수종 세포주 RPMI-8226에 대한 CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4, CD38hhy1370xCD28supxCD3mid IgG4, CD38VH1xCD28cvnxCD3mid IgG4, CD38hhy1370xCD28cvnxCD3mid IgG4의 시험관내 사멸 활성을 보여준다. 사멸 활성의 EC50을 계산하였으며, 표 N에 요약되어 있다. CD28sup를 함유하는 항-CD38xCD3xCD28 3특이성 결합 단백질은 둘 모두 더 나은 사멸 활성을 보였다. 이들 분자의 시험관내 사멸 활성을 또한 NCI-H929(도 8b), KMS-26(도 8c) 및 KMS-11 세포주(도 8d)를 사용하여 시험하였다.
IgG1 LALA P329A 및 NNAS 변이체 또는 IgG4 FALA 변이체를 갖는 항-CD38x항-CD3x항-CD28 3특이성 결합 단백질은 또한 다발성 골수종 KMS-11(도 8e) 및 U266(도 8f) 세포의 시험관내 사멸을 나타내었다. 각 세포주에 대하여 각 항체에 대한 EC50을 계산하였으며, 표 Q2(KMS-11) 및 Q3(U266)에 요약되어 있다.
도 9a, 도 9b 및 도 10은 CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4 및 CD38VH1xCD28supxCD3low IgG4의 시험관내 T 세포 활성화 프로파일을 보여준다. 둘 모두의 항체는 CD4 및 CD8 T 세포에 대하여 유사한 활성화 활성을 보였다. 각 세포주에 대하여 각 항체에 대한 EC50을 계산하였으며, 표 N(RPMI-8226), 표 O(NCI-H929), 표 P(KMS-26) 및 표 Q(KMS-11)에 요약되어 있다.
[표 N]
Figure pct00090
[표 O]
Figure pct00091
[표 P]
Figure pct00092
[표 Q]
Figure pct00093
[표 Q2]
Figure pct00094
[표 Q3]
Figure pct00095
3특이성 결합 단백질 변이체에 의해 유도되는 사이토카인 생성도 또한 플레이트를 표기된 항체로 코팅시킨 후, 2가지 농도의 시험 항체(5 ㎍/㎖ 및 25 ng/㎖)를 사용하여 24시간 동안 인간 PBMC와 인큐베이션시킴으로써 문헌[Stebbings, R. et al. (2007) (J. Immunol. 179:3325-3331)]에 기술된 방법을 사용하여 시험하였다(도 11a 및 도 11b). 24시간 배양 상청액을 수집하고, 이를 사용하여 상기 기술된 바와 같이 상청액 중 IL2, IL6, IL10, IL12 및 TNF-α, IFN-γ 농도를 측정하였다. CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4, CD38hhy1370xCD28supxCD3mid IgG4, CD38VH1xCD28cvnxCD3mid IgG4, CD38hhy1370xCD28cvnxCD3mid IgG4는 모두 5 ㎍/㎖에서 유의미한 수준의 IL2, TNF-α 및 IFN-γ의 생성을 자극하였지만, 2개의 인간화된 NSG 마우스 모델에서 생체내 효능을 보여주는 용량인 25 ng/㎖에서 측정 가능한 수준의 임의의 사이토카인을 유도하지 못하였다.
항-종양 활성을 상기 기술된 바와 같이 3특이성 결합 단백질 변이체에 대한 생체내 마우스 모델에서 시험하였다(도 12a 내지 도 13f). 도 12a 내지 도 12e는 인간 MM 세포주 RPMI-8226이 이식된 인간 CD34+ 조혈 줄기 세포-이식된 NSG 마우스(hu-CD34) 모델을 사용한 생체내 효능 연구의 결과를 보여준다. CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4 및 벤치 마커 대조군 CD38xCD3 2특이성 항체를 사용하여 표기된 용량에서 3QW(총 6회 용량)로 종양 함유 마우스를 처리하였다. 각 마우스에 대한 체중 및 종양 성장을 측정하였으며, 플롯팅하였다(도 12a 및 도 12e). 각 군에 대한 평균 종양 성장 곡선(도 12d), 제18일 종양 부피(도 12b) 및 제19일 최종 종양 중량(도 12c)도 또한 플롯팅하였다. CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4로 처리된 모든 군은 PBS 대조군에 비하여 통계적 효능을 보일 뿐 아니라, 1 ㎍/kg 용량에서 대조군 CD38xCD3 2특이성 항체에 비하여 통계적으로 더 나은 효능을 보였다.
도 13a 내지 도 13f는 인간 MM 세포주 RPMI-8226이 이식된 인간 PBMC 인간화된 NSG 마우스 모델을 사용한 생체내 효능 연구의 결과를 보여준다. CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4 및 벤치마크 대조군 CD38xCD3 2특이성 항체를 사용하여 종양 함유 마우스를 표기된 용량에서 3QW(총 8회 용량)로 처리하였다. 각 마우스에 대하여 종양 성장을 측정하고, 플롯팅하였다(도 13a). 각 군에 대한 평균 종양 성장 곡선(도 13f), 제4일 종양 부피(처리 시작일; 도 13b), 제21일 종양 부피(마지막 처리일; 도 13c), 제21일 평균 종양 부피(도 13d) 및 제22일 최종 종양 중량(도 13e)도 또한 플롯팅하였다. CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4로 처리된 모든 군은 PBS 대조군에 비하여 통계적 효능을 보일 뿐 아니라, 대조군 CD38xCD3 2특이성 항체에 비하여 다수의 용량에서 통계적으로 더 나은 효능을 보였으며, 이는 3특이성 항-CD38/CD3/CD28 항체에 의한 뛰어난 생체내 항-종양 활성을 나타낸다.
벤치마크 대조군 CD38xCD3 2특이성 항체는 하기의 서열을 포함하였다:
서열 번호 108: 벤치마크 중쇄 1(CD38에 결합)
Figure pct00096
서열 번호 109: 벤치마크 중쇄 2(CD3에 결합)
Figure pct00097
서열 번호 110: 벤치마크 경쇄(CD38에 결합)
Figure pct00098
실시예 6: 항-CD38 mAb2 및 mAb6-함유 3특이성 결합 단백질을 사용한 용량 상승 연구
재료 및 방법
모든 NHP 연구는 Covance(미국 뉴저지주 프린스턴 소재)에 의해 Covance ICUCA 프로토콜에 따라 실시되었다. 약물- 및 단백질-나이브 또는 단백질-나이브 수컷 시노몰구스 원숭이를 모든 연구에서 사용하였다. 연구 설계를 기반으로 하여, 각각의 3특이성 결합 단백질에 대하여 원숭이를 선택하여 나누었다. 항체를 복재 정맥을 통하여 1시간 동안 정맥내 주입함으로써 제공하였다. 관찰을 위해, 저용량(10 ㎍/kg 미만)의 경우 증가하는 용량을 연일 제공하였지만, 더 많은 용량(10 ㎍/kg 초과)의 경우 1일 내지 2일의 간격을 두었다. 명시된 바와 같이, 각각의 용량 후, 모든 동물에 있어서 주입 시작으로부터 0시간(단지 제1일), 0.5시간(주입 중간), 1시간 및 6시간에 혈액 샘플을 수집하였다. 추가의 일정외 혈액 샘플을 연구 책임자, 병리학자, 및/또는 임상 수의사의 재량에 따라 수집하였다. 모든 동물은 제60일에 군집으로 되돌아갔다. 혈액 샘플로부터의 혈청 및 PBMC를 표준 방법을 이용하여 준비하고, 미래의 분석을 위하여 보존하였다.
처리된 비-인간 영장류 유래의 혈액을 T 세포 마커 및 인간 IgG, Fcγ 단편에 대한 형광 컨쥬게이트된 항체로 염색하였으며, 유세포분석기에서 분석하였다.
결과
mAb2-함유 CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4, mAb6-함유 CD38hhy1370xCD28supxCD3mid IgG4, mAb2-함유 CD38VH1xCD28cvnxCD3mid IgG4 및 mAb6-함유 CD38hhy1370xCD28cvnxCD3mid IgG4 3특이성 결합 단백질을 사용한 용량 상승 독성 연구를 비-인간 영장류에서 수행하였다. 4개의 결합 단백질 내의 모든 3개의 결합 도메인은 시노몰구스 CD38/CD3/CD28 폴리펩티드와 교차-반응성이다. 분자의 잠재적인 독성 프로파일을 평가하기 위하여 연구를 고안하였다. 혈청 및 PBMC 단리를 위하여 혈액 샘플을 수집하였다. T 세포 하위집단 활성화(CD69+)(도 14a 내지 도 14d)와 함께, 순환 T 세포 집단(도 14e 내지 도 14h)을 각 투여 후에 조사하였다. 순환 중인 CD4 및 CD8 T 세포의 백분율은 용량 상승과 함께 감소하였다. 유의미한 CD4 및 CD8 T 세포 활성화는 2.5 ㎍/kg 용량에서 시작하여 현저하였으며, 이는 mAb2- 및 mAb6-함유 분자에 대한 강력한 활성화 능력을 뒷받침한다. 유의미한 순환 T 세포 고갈이 12.5 ㎍/kg에서 모든 단백질에서 관찰되었으며(도 14i 내지 도 14l), 이는 다시 효력과 연관성이 있다. 순환 T 세포의 고갈은 비교적 일시적이어서, 24시간 내지 48시간 후에 처리전 수준으로 복귀되었다(도 14m 내지 도 14p). 몇몇의 사이토카인의 혈청 수준도 또한 측정하였다. 유의미한 IL-6 및 IL-10 방출이 모든 분자를 사용하여 12.5 ㎍/kg에서 관찰되었으며, 이는 비교적 일시적이었으며, 제24시간에 기준선으로 복귀되었다(도 14u).
CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4(도 14v) 및 CD38VH1xCD28cvnxCD3mid IgG4(도 14w)는 둘 모두 더 높은 용량에서 혈중 T 세포의 고갈을 유도하였다. 유사하게, CD38hhy1370xCD28supxCD3mid IgG4(도 14x) 및 CD38hhy1370xCD28cvnxCD3mid IgG4(도 14y)는 또한 더 높은 용량에서 혈중 T 세포의 고갈을 유도하였다. 그러나, T 세포는 4가지 3특이성 결합 단백질 중 임의의 것으로의 처리 24시간 후에, 혈중에서 재출현하기 시작하였다(도 14z 내지 도 14ac). 도 14ad 및 도 14ae는 100 ㎍/kg 용량의 투여 후에 CD4+ T 세포에 결합된 CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4의 양을 보여준다. 도 14af 및 도 14ag는 100 ㎍/kg 용량의 투여 후에 CD8+ T 세포에 결합된 CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4의 양을 보여준다. 이들 데이터는 3특이성 Ab CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4가 연장된 시간(48시간 내지 72시간)에 생체 내에서 T 세포에 결합할 수 있음을 명백하게 보여준다.
실시예 7: Fc 변이체에 의한 약동학/약역학의 최적화
재료 및 방법
C-말단 6-His 태깅된 재조합 인간 Fcγ RI(R&D Systems #1257-FC-050), C-말단 10-His 태깅된 재조합 인간 Fcγ RIIA(R&D Systems #1330-CD-050/CF) 및 C-말단 HPC4 태깅된 재조합 인간 FcγRIII(V158 또는 F158)을 Biacore 칩에 포획하였다. 200, 100 및 50 nM의 항체를 2분 동안 주입한 후, Biacore 200을 사용하여 30 ㎕/분 유속에서 HBS-P+, 2mM CaCl2 pH 7.4 완충액 중 2분 해리로 이어졌다. 200 nM에서의 결합 곡선을 나타냈다.
C-말단 HPC4 태깅된 재조합 인간 신생아 Fc 수용체(FcRn)를 사용한 ELISA 분석을 사용하여 상이한 Fc 변형을 갖는 3특이성 결합 단백질의 결합 특성을 측정하였다. 약술하면, 재조합 인간 신생아 Fc 수용체(FcRn)를 사용하여, ELISA 플레이트(Nunc 80040LE)(PBS 중 2 ㎍/㎖)를 하룻밤 코팅하였다. 상이한 Fc 변형을 갖는 단계 희석된 3특이성 결합 단백질을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, 세척하고, HRP 표지된 항-인간 IgG 이차 항체와 인큐베이션시켰다.
결과
상기 기술된 3특이성 결합 단백질의 변이체를 다음으로 다양한 Fc 수용체로의 결합에 대하여 분석하여, 약동학(PK)/약력학(PD)을 최적화시켰다.
인간 Fc 변이체를 상기 기술된 바와 같이 FcγR I(도 15a), FcγR IIa(도 15b) 및 FcγR IIIb/c(도 15c)로의 결합에 대하여 특징화하였다. 시험한 변이체는 대조군 3특이성 결합 단백질과 함께 인간 IgG1, 인간 IgG4 및 FALA 돌연변이(EU 인덱스에 따른 F234A 및 L235A)를 갖는 인간 IgG4였다.
도 15a 내지 도 15c에 나타낸 바와 같이, 야생형 IgG1 및 IgG4는 이전에 보고된 바와 같이, FcγR I 및 FcγR IIa에 결합하지만 FcγR IIIb/c에 결합할 수 없었다. IgG4 FALA 돌연변이는 FcγR I 및 FcγR IIa 결합을 없앴다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니나, FcγR I 및 FcγR IIa 결합의 제거는 Fc/FcγR 상호작용을 통한 의도되지 않은 클러스터링을 제거함으로써 PK/PD를 개선시킬 수 있는 것으로 여겨진다.
다음으로, IgG4 FALA 변이체를 FcRn의 결합에 대하여 시험하였다. 변이체 및 야생형 IgG4는 FcRn에 결합하였다(도 16). 이들 결과는 IgG4 FALA 돌연변이가 IgG4 Fc와 FcRn 간의 상호작용에 영향을 미치지 않는 것을 보여주며, 이는 결합 단백질 반감기에 대한 최소의 영향을 암시한다.
NSG 마우스에서 결정되는 바와 같은 CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4, CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4 FALA, CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG1 LALA P329A 및 CD38HHY1370xCD28supxCD3mid IgG4 FALA의 PK 파라미터는 도 17에 요약되어 있다. IgG4 Fc 변형은 대식구에서 풍부한 NSG-특이적 FcγRI로의 결합을 제거함으로써 NSG 마우스에서 유의미하게 개선된 반감기 및 AUC를 보였다.
실시예 8: 항-CD38 3특이성 결합 단백질의 시험관내 활성화 및 생체내 항-종양 효능
재료 및 방법
인간 PBMC로부터의 사이토카인 방출
인간 PMBC를 24시간 동안 100 pM의 결합 단백질과 인큐베이션시켰다. 상청액을 수집하고, Drop Array 플레이트를 사용하여 Luminex에 의해 사이토카인을 측정하였다(3벌로). 종양 표적 세포를 사용한 실험을 위하여, 인간 PMBC를 100 pM의 항체와 RPMI-8226 표적 세포와 함께 또는 이것 없이 10:1 E:T 비로 24시간 동안 인큐베이션시켰다. PMBC를 3특이성 단백질과 인큐베이션시킨 후에 상청액을 수집하고 MILLIPLEX® MAP 키트를 사용하여 사이토카인에 대하여 분석하고, MAGPIX® 시스템에서 분석하였다.
Bcl-xL 분석
PBMC로부터 음성으로 분류된 T 세포(자성)를 1일 동안 100 nM 플레이트-결합된 Ab와 인큐베이션시켰다. 그 다음, T 세포를 세척하고, T 세포 마커 및 Bcl-xL에 특이적인 형광 컨쥬게이트된 항체로 염색하고, 유세포분석기에서 분석하였다.
T 세포 증식
PBMC로부터 음성으로 분류된 T 세포(자성 비드 세포 분리)를 1일 내지 6일 동안 플레이트-결합된 Ab(100 nM)와 인큐베이션시켰다. 총 세포를 인큐베이션을 시작한 후 특정일에, 계수 비드를 사용하여 유세포분석에 의해 계수하였다. 제0일 세포 계수(500개 세포/㎕)로부터 변화 배수를 계산하였다. 3명의 PBMC 공여자로부터의 결과.
IL-2 발현
GloResponse™ IL2-luc2P Jurkat 세포를 6시간 동안 3특이성 단백질과 인큐베이션시킨 다음, Bio-Glo™ 루시퍼라제 분석 시스템을 사용하여, 루시퍼라제 리포터 유전자 발현을 검출하였다.
PBMC 시험관내 활성화
항-CD38xCD28xCD3 3특이성 항체 또는 대조군 IgG4 결합 단백질로 처리된 인간 PBMC 세포의 활성화(CD69+)를 결정하였다.
파종성 종양 모델에서의 생체내 효능
파종성 hu-PMBC NSG 마우스 모델에 있어서, 1개 내지 5x106개 세포를 제0일에 각 마우스 내로 정맥내 주사하였다. 제3일에, 기준선 발광 영상화를 무작위화를 위해 행하였다. 제4일에, 건강한 공여자 유래의 10x106개의 인간 PBMC를 각각의 마우스로 복강내로(IP) 재구성하였다. 마우스를 제5일, 제12일, 제19일에 표기된 용량을 사용하여 주마다 처리하였다. 각 동물에서 종양 부피를 모니터링하기 위하여 제10일, 제17일, 제24일에 주마다 발광 신체 영상화를 행하였다. 연구의 종료 시에, 혈액, 비장, 골 및 골수를 조직병리학 연구를 위하여 수집하였다.
결과
IgG4 FALA 변이체 Fc 영역을 갖는 mAb2-함유 항-CD38x항-CD28x항-CD3 3특이성 결합 단백질은 야생형 Fc 영역을 갖는 유사한 결합 단백질과 비교하여, 인간 PBMC에서 현저하게 감소된 수준의 비-특이적인 IFN-γ 방출을 야기하였다(도 18a). IL-2(도 18b) 및 TNF-α(도 18c)의 방출에서 유사한 결과가 관찰되었다. 중요한 것은, 사이토카인 방출은 벤치마크 2특이성 항-CD38x항-CD3 2특이성 항체에 대해서보다 이들 Fc 변이체 3특이성 결합 단백질에 대해서 유의미하게 더 낮았다. 이들 결과는 비-특이적인 사이토카인 방출의 감소로 인하여, Fc 변이체를 갖는 3특이성 결합 단백질의 개선된 안전성 프로파일을 암시한다.
mAb2-함유 CD38VH1xCD28supxCD3mid 및 mAb6-함유 CD38HH71370xCD28supxCD3mid 둘 모두의 IgG1 및 IgG4 Fc 변이체는 또한 인간 PBMC의 시험관내 활성화를 야기하였다(도 18d).
CD28의 라이게이션에 의한 면역 동시자극은 T 세포 생존 및 증식에 필요하며; 단독의 TCR 시그널링은 T 세포 증식을 초래하지 않는다(문헌[Sharmee and Allison (2015) Science 348:56-61]). 3특이성 결합 단백질 CD38VH1xCD28supxCD3mid는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 모두에서 Bcl-xL의 유도를 야기하는 한편, CD28 또는 CD3 항원 결합 도메인 중 어느 하나의 제거는 이러한 효과를 제거하였다(도 19a 및 도 19b). 이들 결과는 예상되는 바와 같이, CD3 및 CD28 결합 아암이 항-CD38 3특이성 결합 단백질에 의한 T 세포에서의 Bcl-xL 유도와, 그에 의한, T 세포로의 생존-유발(pro-survival) 신호의 전달에 필요한 것을 보여준다. 3특이성 결합 단백질의 항-CD28 아암은 T 세포에서 생존-유발 Bcl-xL의 상향조절에 결정적이다. 벤치마크 항-CD38x항-CD3 2특이성 항체와 비교하는 경우, CD38VH1xCD28xCD3 3특이성 결합 단백질은 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 Bcl-xL의 더 큰 상향조절을 야기하였다(도 19c 및 도 19d).
CD38VH1xCD28supxCD3mid 3특이성 결합 단백질에 의한 T 세포 활성화의 일차 추진요인을 결정하기 위하여, 인간 IL2 프로모터 추진 루시퍼라제 리포터를 함유하는 Jurkat T 세포 리포터 Jurkat 세포주에서의 IL-2 발현을 사용하여 활성화를 측정하였다. 항-CD3 결합 도메인의 낙아웃 돌연변이는 T 세포 활성화의 제거를 야기하였으며, 이는 T 세포 활성화가 CD3 라이게이션의 특이적인 효과인 것을 보여준다(도 19e). 이들 결과는 항-CD3이 3특이성 결합 단백질에 의한 T 세포 활성화의 일차 추진요인이며, 항-CD28은 또한 T 세포 활성화 신호에 유의미하게 기여하는 것을 보여준다. 사이토카인 방출의 일차 추진요인을 또한 인간 PBMC를 사용하여 시험하였다(도 19f). TNF, IFNg, IL-2, IL-6 및 IL-10의 방출을 시험함으로써, CD3이 사이토카인 방출의 일차 결정요인인 것이 관찰되었다. CD28은 최소 기여를 갖는 것으로 관찰되었다. 항-CD38VH1을 갖는 3특이성 결합 단백질은 또한 벤치마크 비교자보다 더 적은 사이토카인 방출을 유도하는 것으로 관찰되었다.
T 세포 증식도 또한 시험하였다. IgG4 FALA 변이체 Fc를 갖는 항-CD38x항-CD28x항-CD3 3특이성 결합 단백질을 사용한 T 세포의 활성화는 벤치마크 또는 이소타입 대조군보다 더 큰 증식을 야기하였다(도 19g). 항-CD28 또는 항-CD3 항원 결합 도메인의 돌연변이 시에 이러한 활성화가 감소되었다(도 20).
생체내 고형 종양 성장 실험을 위하여, 인간화된 NSG 마우스 모델을 다음으로 사용하였다. 마우스에 RPMI8226 인간 골수종 세포를 제6주 내지 제8주에 이식하였다. 제9주에, 인간 PBMC를 복강내 주사에 의해 도입하고, hPBMC를 재구성하고, 제10주 내지 제13주에 항-종양 요법제를 투여하였다. 56마리의 PBMC 인간화된 NSG 암컷 마우스에 50% 매트리겔 중 500만개의 RPMI8226 세포를 이식하고, 이식 후 제5일 또는 제6일에 마우스를 선택하고, 연구로 무작위화시켰다. 이러한 모델은 인간 성숙 T 세포를 갖는 마우스에서 생체내 종양 모델로서 제공된다.
NCI-H929-Luc 인간 골수종 세포를 사용하고, 생물발광에 의해 종양 성장을 분석하여 3특이성 결합 단백질을 또한 파종성 종양 성장의 NSG 마우스 모델에서 분석하였다. IgG4 FALA Fc 변이체를 갖는 CD38VH1xCD28supxCD3mid 3특이성 결합 단백질은 이러한 파종성 종양 모델에서 30 ㎍/kg에서 통계적으로 유의미한, 용량-의존성 항-종양 효능을 보였다(도 21). IgG4 FALA Fc 변이체를 갖는 CD38HHY1370xCD28supxCD3mid 3특이성 결합 단백질은 또한, 이러한 파종성 종양 모델에서 30 ㎍/kg 및 10 ㎍/kg에서 통계적으로 유의미한, 용량-의존성 항-종양 효능을 보였다(도 22).
3특이성 결합 단백질 mAb2-함유 CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4 FALA 및 mAb6-함유 CD38hhy1370xCD28supxCD3mid IgG4 FALA는 2명의 공여자 인간화된 NSG 마우스로부터의 인간 PBMC를 사용하여 NCI-H929-Luc 골수종 세포에 대하여 강력한 시험관내 종양 사멸 활성을 보였다(도 23a 및 도 23b). CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4 FALA 3특이성 결합 단백질은 파종성 종양 모델에서 벤치마크 2특이성 항체에 비하여 뛰어난 생체내 종양 활성을 보였다(도 23c). 비히클 대조군(PBS)과의 비교의 P-값을 하기와 같이 결정하였다: CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4 FALA: p=0.0023; CD38HHY1370xCD28supxCD3mid IgG4 FALA: p=0.0088; 벤치마크 2특이성 CD38xCD3 Fab-scFv-Fc: p=0.6045.
종합하여, 이들 결과는 증가된 반감기, 감소된 비특이적인 사이토카인 방출 및 더 큰 생체내 항-종양 효능을 보여주는 변이체 Fc 영역을 갖는 개선된 항-CD38 후보물질을 보여준다.
실시예 9: 항-CD38 3특이성 결합 단백질의 추가의 특징화
최적의 이펙터 기능 및 지속적인 증식을 위하여 T 세포를 자극하는 데 2개의 신호가 필요하다. T 세포 수용체(TCR)-CD3 복합체에 의해 매개되는 활성화는 전사 활성화를 유도하여, 사이토카인 분비를 야기한다. 제2 표면 막 단백질, CD28의 관여는 대안적인 신호 전달 경로를 자극하며, 세포 예정사를 억제한다(문헌[Esensten JH, Helou YA, et al. Immunity 44:973-88(2016)]; 문헌[Hui E, Cheung J, et al. Science 355:1428-1433(2017)]). 제2 신호의 부재 하에, 단독의 CD3을 통한 T 세포 자극은 전형적으로 활성화-유도된 세포사를 야기한다(문헌[Chai JG, Lechler RI. Int Immunol. 9:935-44(1997)]). 이들 2개의 상이한 표적에 대한 특이성을 조합함으로써 T 세포 증식을 증가시킬 수 있는 것을 가정하였다.
도 24a는 10 nM 농도에서 CD38VH1/ CD28supxCD3mid, 그의 단일의 결합 부위 낙아웃 및 3중 낙아웃 돌연변이체에 의한 자극 후에 GloResponse™ IL2-luc2P Jurkat 세포(Promega)를 사용하여 행하였던 루시퍼라제 리포터 분석을 보여준다. 이들 데이터는 T 세포 자극(예를 들어, NFAT 시그널링)에 대한 CD28의 기여를 예시한다.
교차 이중 가변(CODV) 2특이성 Ab 포맷(문헌[Steinmetz A, et al. MAbs 8: 867-878(2016)])을 사용하여, α-CD3ε(신호 1) 및 α-CD28(신호 2) Fv의 조합을 평가하여, 이들 세포 표면 분자의 이중 관여가 T 세포 활성화를 자극하고 지속시킬 수 있는지 여부를 결정하였다(도 24b). 중간 친화도(KD~20 nM) 항-CD3ε Ab를 사용하여, 높은 수준의 사이토카인 방출을 야기하고, 사이토카인 방출 증후군의 위험을 증가시키는 고 친화도 T 세포 수용체 자극을 회피하였다. 이러한 CD3 효능제를 이전에 T 세포 증식을 지지하는 것으로 나타난 초효능제 CD28 Ab와 조합하여 이중 아암의 둘 모두의 위치에서 시험하였다(문헌[Waibler Z, Sender LY, et al. PLoS One 3:e1708(2008)]). 이들 1가 2특이성 항체를 시험관내에서 인간 PBMC와 인큐베이션시키고, T 세포 자극을 인터페론-γ 및 IL-2의 분비에 의해 측정하였다. 두 배향이 모두 활성이었지만, 근위의 C3 및 원위 위치의 CD28에서 이들 사이토카인의 최적의 방출이 관찰되었다(도 24b). 그 다음, 3특이성 Ab 포맷의 항-CD38 항체와의 쌍 형성을 위하여 이러한 이중 아암을 선택하였다(문헌[Xu L, Pegu A, et al. Science 358:85-90 (2017)]).
도 25는 CD38VH1/ CD28supxCD3mid에 의해 유도되는 일차 T 세포에서의 Bcl-2 과 구성원 Bcl-xL의 상향조절이 CD28-의존성임을 보여준다. 이들 데이터에 의해 T 세포 생존에 대한 CD28의 기여가 입증된다.
도 26은 3특이성 Ab에의 항-CD28이 시험관내에서 일차 T 세포 증식을 지지하는 데 필수적인 이차 시그널링을 제공하였음을 보여준다. 이들 데이터는 T 세포 증식에 대한 CD28의 기여를 보여준다.
종합하여, 이들 데이터는 CD38VH1/ CD28supxCD3mid 3특이성 항체에서 항-CD28sup이 시험관내에서 T 세포 활성화, 생존 및 증식에 유의미한 기능을 제공하는 것을 보여준다.
도 27은 모체 항체에 의해 코딩된 3특이성 항체의 입체배치를 보여준다. 항-CD38 VH1 Fab 및 CD28sup/CD3mid CODV Fab의 결정 구조(우측)에 기초하여 수득되는 CD38VH1/CD28supxCD3mid 3특이성 Ab의 구조 모델도 또한 나타나 있다.
도 28a 및 도 28b는 높은(RPMI-8226; 도 28a) 및 낮은(KMS-11; 도 28b) CD38 표면 발현을 갖는 다발성 골수종(MM) 세포가 다양한 농도의 3특이성 Ab와 인큐베이션시킨 인간 PBMC(E:T=10:1)에 의해 효율적으로 용해되었음을 보여준다. 각 결합 부위에 의한 사멸 활성에 대한 기여는 결합 부위 낙아웃 돌연변이에 의해 입증되었다. 이들 데이터에 의해, CD38 3특이성 항체가 CD38 및 CD28 둘 모두의 인식을 통해 인간 MM 세포를 용해시켰음이 입증된다. 다발성 골수종 세포 상에서 발현되는 CD28은 CD38VH1/ CD28supxCD3mid_FALA 3특이성 항체에 의한 이차 표적을 제공하여, 그의 사멸 활성을 유의미하게 증가시켰다.
도 29a 내지 도 29c는 3특이성 Ab의 항-CD28supKO 돌연변이체가 시험관내에서 CD38high, CD38mid 및 CD38low MM 세포에 대하여 현저하게 감소된 항-종양 활성을 나타내었음을 보여준다. RPMI-8226(도 29a), U266(도 29b), 또는 KMS-11(도 29c) 세포를 사용한 분석이 나타나 있다. MM 세포 상의 CD28 발현은 CD38 3특이성 항체에 의해 매개되는 세포용해에 대한 그들의 감수성을 증가시켰다.
도 30은 시험관내 증폭된 인간 일차 T 세포로 재구성된 NSG 마우스를 사용한 파종성 인간 다발성 골수종 세포주 모델에서의 생체내 효능 연구의 결과를 보여준다. CD38VH1/ CD28supxCD3mid_FALA 3특이성 항체 처리군에서의 종양 부담의 감소는 용량-의존적이었으며, 통계적으로 상이하였다. 따라서, CD38 3특이성 항체는 생체내에서 파종성 인간 MM 세포 종양 성장에 대한 보호를 부여하였다.
미시적 연구에 의해, 시험관내에서 3특이성 항체에 의해 매개되는 일차 인간 T 세포에 의한 암 세포 사멸이 추가로 입증된다. 도 31a 및 도 31b는 CD38VH1/ CD28supxCD3mid_FALA 3특이성 항체에 의해 매개되는 인간 PBMC에 의해 용해되는 RPMI-8226(인간 MM 세포, CellTracker 암적색 염료로 표지)을 보여주는 현미경 이미지를 보여준다. 도 31a는 대조군을 보여주는 한편, 도 31b는 CD38VH1/ CD28supxCD3mid_FALA 3특이성 항체에 의해 매개되는 용해를 보여준다. 24시간 인큐베이션과 함께 10:1 E:T 비를 사용하였다. 3중 널 돌연변이체 대조군 Ab로의 노출은 24시간에 걸쳐 종양 세포 생존력의 최소의 변화를 유도하였다(도 31a). 대조적으로, 활성 CD38 3특이성 Ab와의 인큐베이션은 종양 세포 주변의 T 세포의 실질적인 클러스터링을 유도하여, 그들의 거의 완전한 용해를 야기하였다(도 31b). 이들 데이터에 의해, CD38/CD3xCD28 3특이성 항체가 T 세포에 의한 골수종 세포의 세포용해를 매개하였음이 입증된다.
실시예 10: 항-CD38 3특이성 결합 단백질의 IgG4 Fc 영역 내의 Fc 수용체 결합 부위의 변형은 비-특이적인 염증을 감소시킨다
항체의 Fc 영역은 비-특이적인 염증을 유도하는 단핵구 및 NK 세포 상의 세포 수용체에 결합하며, 이는 처리 대상체를 사이토카인 방출 증후군에 취약하게 할 수 있다. FcγI, FcγIIa,b 및 FcγIII 결합을 제거하는 돌연변이체를 시험함으로써 사이토카인 방출의 자극에서의 Fc 수용체의 역할을 시험하였다. 이러한 목적을 위하여, 보체를 고정하지 않은 IgG4 이소타입을 사용하였다.
BIAcore 시스템(Pharmacia Biosensor, 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)을 사용하는 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석에서 결합을 사용하여 칩 상에 고정화된 표기된 인간 Fc 수용체에 대한 특정 IgG4 Fc 변이체의 친화도를 측정하였다. IgG4 Fc 변이체를 150 nM에서 사용하였다. 인간 FcRn 항원을 플레이트 상에 코팅함으로써 인간 FcRn에 대한 결합을 ELISA를 사용하여 수행하였다.
이전에 설명된 Fc 영역 내의 돌연변이("FALA")(문헌[Alegre ML, Peterson LJ, et al. Transplantation 57:1537-43(1994)]; 실시예 7 내지 실시예 9도 또한 참조)는 모든 Fc 수용체로의 결합을 제거하였다(도 32 및 도 33). 비-특이적인 사이토카인 방출에 대하여 시험하는 경우, 그것은 CD38을 발현하는 종양 표적의 존재 하에서 최대의 자극을 가능하게 하면서, 비자극된 PBMC에서 IFN-γ 방출을 없앴다(도 34, 좌측 대 우측, FALA). 이러한 Fc 돌연변이체는 상이한 수준의 CD38을 발현하는 세포에서 Fc 야생형 대조군과 유사한 골수종 종양 표적에 대한 그의 세포용해 활성을 유지하였다(도 35). 유사하게, FC 수용체로의 결합을 제거한 또 다른 돌연변이된 IgG4 Fc 영역("PVA", 도 32 참조)(도 33)은 또한 CD38을 발현하는 종양 표적의 존재 하에 최대의 자극을 가능하게 하면서 비자극된 PBMC에서 IFN-γ 방출을 없애고(도 34, 좌측 대 우측, PVA), 상이한 수준의 CD38을 발현하는 세포에서 Fc 야생형 대조군과 유사한 골수종 종양 표적에 대한 그의 세포용해 활성을 유지하였다(도 35).
실시예 11: 3특이성 결합 단백질의 세포용해 활성에 대한 항-CD38 및 항-CD28의 기여
각 결합 부위 또는 결합 부위의 조합에 대한 3특이성 Ab 돌연변이체를 생성하고, 높은(RPMI-8226) 또는 낮은(KMS-11) CD38 및 CD28 표면 발현을 갖는 다발성 골수종 세포주에 대한 그들의 세포용해 활성에 대하여 시험하였다.
도 28a 및 도 28b에 상기에 나타낸 바와 같이, CD3 특이적 결합의 돌연변이는 세포용해를 없애는 한편, 항-CD38 및 CD28 널 돌연변이가 현저하게 감소된 사멸을 보였지만, 일부 잔류 기능이 유지되었으며, 이는 항-CD38 및 CD28 둘 모두가 종양 세포 사멸에 기여하였음을 나타낸다.
다라투무맙(다발성 골수종의 치료를 위해 승인된 α-CD38 단클론 항체; 문헌[McKeage K. Drugs. 76:275-81(2016)] 참조)에 비하여, 3특이성 Ab는 CD38high 및 CD38low 다발성 골수종 세포 둘 모두를 포함하는 상이한 CD38 발현 세포주에 대하여 시험관내에서 현저한 3-4 log 더 높은 사멸 효력을 보였다(도 36).
실시예 12: CD38/CD3xCD28 Ab는 중심 기억 CD4 및 CD8, Th1 및 항원-특이적 반응을 자극한다
CD38/CD3xCD28 3특이성 Ab가 세포 면역 기능을 향상시킬 수 있는지 여부를 결정하기 위하여, 시험관내에서 증량된 T 세포의 표현형을 평가하였다.
재료 및 방법
말초 혈액 단핵 세포를 Research Blood Components, LLC(미국 매사추세츠주 보스톤 소재)에 의해 수집된 건강한 인간 공여자의 혈액으로부터 단리하였다. PBMC를 이전에 상기 기술된 바와 같이 항체-코팅된 플레이트(350 ng/웰)에 첨가하고(5 x 105개 세포/㎖), 37℃에서 3일 및 7일 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 특정 시점에 수집하고, T 세포 하위세트에 대하여 유세포분석에 의해 분석하였다: 나이브(CCR7+ CD45RO-), Tcm(CCR7+ CD45RO+), Tem(CCR7- CD45RO+), Tregs(CD4+ Foxp3+ CD25hi). 세포를 또한 적어도 6시간 동안 모넨신(GolgiStop)(BD Biosciences, 미국 캘리포니아주 소재)으로 처리한 후에, 유동 염색하여, 세포내 사이토카인 발현을 결정하였다: Th1(CD4+ IFN-γ+), Th2(CD4+ IL-4+) 및 Th17(CD4+ IL-17+). PBMC 공여자의 HLA(A*02:01/NLVPMVATV)(ProImmune, 영국 옥스포드 소재)에 제한된 형광-컨쥬게이트된 5량체를 사용하여 CMV pp65-특이적 CD8+ T 세포를 검출하였다. PBMC를 HemaCare(Van Nuys, 미국 캘리포니아주 소재)로부터 CMV 양성 집단 및 HLA 유형이 공지된 공여자로부터 수득하였다. 제한하는 HLA 유형에 대하여 음성인 공여자로부터의 PMBC를 음성 대조군으로서 사용하였다. 제조업자의 프로토콜에 따라 염색을 행하였다.
결과
인간 PBMC를 사이토카인의 부재 하에 3특이성 Ab 또는 3중 돌연변이체 음성 대조군과 7일 동안 인큐베이션시켰다. CD4 하위세트의 분석에 의해, 중심 기억 푸울에서의 가장 큰 증식과 함께 이펙터 기억 세포에서의 더 작은 증가가 드러났다(도 37a). CD4 하위세트의 분석에 의해, 또한 Th2 또는 Th17 세포에 비하여 Th1 세포의 가장 큰 증식(6배 초과)이 드러났다(도 37b). CD8 하위세트에서, 제7일에 중심 기억 CD8 하위세트의 150배 초과의 증가와 함께 이펙터 기억 세포의 더 적은 증가가 존재하였다(도 37c). 중요한 것은, 4량체 염색을 사용하여 혈청양성 HLA-A2 공여자 내의 pp65 에피토프에 대해 유도된, CMV에 대한 기존의 항원-특이적 CD8 반응(문헌[Gratama JW, van Esser JW, et al. Blood 98:1358-1364(2001)])이 음성 대조군에 비하여 CD38 3특이성의 존재 하에 44배 초과로 증가하였다는 점이다(도 37d).
종합하여, 이들 데이터는 CD38 3특이성 Ab가 생체내에서 항-종양 면역성을 향상시킬 가능성이 있는 Th1 기능 및 보호적 CD8 기억 T 세포 반응을 자극하는 것을 나타낸다.
실시예 13: 다발성 골수종 세포 상의 CD28은 T 세포 인식 및 세포용해를 증가시킨다
재료 및 방법
유세포분석
표기된 종양 세포주 상의 CD28 및 CD38의 수준을 기술된 바와 같이 QIFI 키트(Dako, 덴마크 소재, cat. # K007811)를 사용하여 유세포분석에 의해 결정하였다(S4). 약술하면, 마우스 항-인간 CD38(클론 AT13/5, 마우스 IgG1, Santa Cruz Biotech, cat#59028) 및 항-인간 CD28(클론 CD28.2, 마우스 IgG1, k, BioLegend, cat#3029123)을 제조업자의 프로토콜을 사용하여 세포주 상의 표면 CD38 및 CD28을 검출하기 위한 일차 항체(10 ㎍/㎖)로서 사용하였다. 키트에 의해 제공되는 QIFI 키트 보정 표준 및 포뮬레이션을 사용하여 표면 밀도를 계산하였다.
CRISPR-매개된 낙아웃을 사용한 CD28 낙아웃 인간 다발성 골수종 세포주의 생성
KMS-11 세포주에 있어서, CRISPR CD28 인간 낙아웃 키트(Origene)를 사용하여 CD28의 낙아웃을 수행하였다. 키트는 GFP-푸로마이신 기능적 카세트를 갖는 공여자 벡터 및 각각 상이한 사전설계된 가이드 RNA(각각 CD28 엑손 1 및 인트론 1을 표적화하는 gRNA 1: TACCTGTTACTTGAATTGAA(서열 번호 117) 및 gRNA 2: ATTTTTTGAGGTCTTCCAAT(서열 번호 118))를 갖는 2개의 별개의 Cas-9 벡터를 포함한다. 세포를 10% FBS가 보충된 RPMI 1640 GlutaMAX 배지 중 3.105개 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 씨딩하고, 24시간 후에 제조업자의 지시에 따라 Lipofectamine™ 3000 트랜스펙션 시약(ThermoFisher Scientific)을 사용하여 모든 3가지 벡터로 동시-트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션 48시간 후에 0.5 ㎍/㎖의 최종 농도로 푸로마이신을 첨가하였다. 6.25 ㎕/웰의 Lipofectamine™ 3000, 1.25 ㎍의 각각의 Cas-9/gRNA 벡터 및 2.5 ㎍의 GFP-푸로마이신 공여자 벡터를 사용하는 경우, 트랜스펙션 효율은 30%였다. RPMI 8226 세포주 상의 CD28의 낙아웃을 CD28 sgRNA CRISPR 올-인-원(All-in-One) 렌티바이러스(Lentivirus) 세트(Applied Biological Materials Inc.)를 사용하여 수행하였다. 그것은 Cas9 유전자, 푸로마이신 내성 유전자 및 상이한 sgRNA를 발현하는 3개의 렌티바이러스 올-인-원 벡터의 세트로 구성된다(CD28 엑손 2를 표적화하는 sgRNA 1: ATTGTCGTACGCTACAAGCA(서열 번호 119) 및 CD28 엑손 3을 표적화하는 sgRNA 2: CAAAAGGGCTTAGAAGGTCC(서열 번호 120) 및 sgRNA 3: CTATAGCTTGCTAGTAACAG(서열 번호 121)). 세포를 회전접종(spinoculation) 프로토콜을 사용하여, 렌티바이러스 입자(10UI/세포), 8 ㎍/㎖의 폴리브렌 및 1:100 ViralPlus Transduction Enhancer(Applied Biological Materials Inc.)와 혼합된 2.105개 세포로 감염시켰다. 믹스를 실온에서 20분 동안 사전-인큐베이션시킨 다음, 32℃ 및 800xg에서 30분 동안 원심분리하고, 12-웰 플레이트에 씨딩하였다. 감염 48시간 후에 푸로마이신을 0.25 ㎍/㎖의 최종 농도로 첨가하였다. 둘 모두의 세포주를 적어도 5회 동안 계대한 후에(또는 세포 생존력이 안정하게 될 때까지), 유세포분석(CD28 PE 클론 28.2 항체 - BioLegend)에 의해 단백질 수준에서 CD28 낙다운을 확인하였다. 그 다음, Sony SH800S 세포 분류기에서 CD28 음성 세포를 분류하고, 0.25 ㎍/㎖ 또는 0.5 ㎍/㎖의 푸로마이신, 100 유닛/㎖의 페니실린 및 100 ㎍/㎖의 스트렙토마이신(ThermoFisher Scientific)이 보충된 배지에서 배양하였다. 그 다음, 세포를 제한 희석에 의해 클로닝하고, CD28 낙아웃을 유세포분석에 의해 그리고 하기 열거된 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 PCR 및 Sanger 시퀀싱에 의해 입증하였다.
[표 R]
Figure pct00099
결과
CD28을 3특이성 Ab 내로 혼입시켜, T 세포 증식 및 생존을 개선하였지만; 세포 표면 마커를 다발성 골수종 세포에서 평가하는 경우, 대다수의 세포주(95% 초과)가 CD28 당단백질을 발현하는 것으로 관찰되었다(표 S).
[표 S]
Figure pct00100
CD28 발현은 정상의 원형질 세포 상에서 부재이지만(문헌[Almeida J, et al. British J. of Haematol. 107:121-131(1999)]), 새로 진단받은 환자의 대략 1/3에서의 원발성 골수종 원형질 세포 상에서 검출될 수 있는 것이 보고된 바 있다(문헌[Mateo G,et al. Clin. Cancer Res. 11:3661-3667(2005)]). 또한, 그것은 골수종 진행 동안 빈도가 증가되었으며, 골수종의 불량한 예후 및 공격적인 특징과 상호연관된다(문헌[Robillard N, Jego G, et al. Clin Cancer Res. 4:1521-6(1998)]; 문헌[Nair JR, Carlson LM, et al. J Immunol. 187:1243-53(2011)]).
표적 세포 상의 CD28 발현이 T 세포 인식 및 용해를 개선시킬 수 있는지 여부를 결정하기 위하여, 다양한 정도의 CD38 및 CD28 발현을 갖는 3개의 독립적인 골수종 세포주에서 야생형 대 CD28 널 3특이성 Ab의 활성을 비교하였다. 상기 실시예 9 및 도 29a 내지 도 29c에 언급된 바와 같이, CD38 3특이성 Ab에 의한 CD28 발현 수준과 상관 없이, 모든 3가지 세포주에서 세포용해가 관찰되었지만; 모든 세포주에 대하여, CD28 널 3특이성 Ab의 세포용해 활성은 30배 내지 100배 감소되었으며, 가장 낮은 CD38 발현을 보인 KMS-11 세포주에서 가장 큰 실질적인 감소가 존재하였다(야생형 대 ΔCD28, 도 29c 대 도 29a 또는 도 29b 참조).
종양 세포 인식 및 용해에 대한 CD28의 기여를 골수종 표적 세포 상의 CD28의 CRISPR-매개된 낙아웃을 사용하여 추가로 확인하였다. CD28 발현은 모체 세포주에 비하여 CD28KO KMS-11 세포에서 검출 가능하지 않았다(도 38, 상부 패널, 우측 대 좌측). T 세포 세포용해에 대한 CD28KO KMS-11 세포의 민감성은 부수적으로 10배 내지 100배 감소하였다(도 38, 하부 패널, 좌측). 이러한 효과와 일치하게, CD38 낙아웃 표적 세포 상의 CD28 널 돌연변이체 3특이성에 비하여 CD38 3특이성에서 세포용해의 차이가 관찰되지 않았다(도 38, 하부 패널, 우측).
실시예 14: CD38 + 혈액암 세포주에 대한 CD38 3특이성 Ab의 세포용해
이전의 실시예에 의해, 다발성 골수종 세포의 세포용해를 촉진시키는 3특이성 항-CD38/CD3/CD28 항체가 입증된다. 다른 암 세포주의 세포용해를 촉진시키는 이들 항체의 능력을 시험하였다.
도 39에 나타낸 바와 같이, CD38/CD28xCD3 3특이성 FALA 돌연변이체 Ab는 급성 골수구성 백혈병(AML(KG-1)), B 세포 림프종(OCI-Ly19), 급성 T 림프구성 백혈병(ALL(KOPN8)) 및 만성 림프구성 림프종(CLL(Z-138))을 포함하는 CD38+CD28- 세포주를 표적화하는 세포용해 활성을 가졌다. 이에 의해, 3특이성 항-CD38/CD3/CD28 항체가 CD28-인 것들을 포함하는 다른 CD38+ 혈액암 세포주에 대한 활성을 갖는 것이 입증된다.
실시예 15: α-CD28 초효능제에 의한 인간 PBMC의 시험관내 활성화는 항체의 2가를 필요로 한다
TGN1412(TGN), 단일의 결합 아암 TGN1412(TGNslg) 및 단일의 결합 아암 항-CD28sup(CD28supslg)에 의한 인간 PBMC의 시험관내 활성화를 기술된 바와 같이 수행하였다(문헌[Findlay L, Eastwood D, et al. J Immunol Methods 352:1-12 (2010)]). 105개의 인간 PBMC를 이전에 기술된 바와 같이 24시간 동안 표기된 항체(1 ㎍/웰)로 건식 코팅된 폴리프로필렌 96-웰 플레이트 상으로 씨딩하였다. 상청액 중 사이토카인, 예컨대 IFN-γ, TNF-α 및 IL2를 실시예 8에 기술된 바와 같이 Luminex에 의해 측정하였다.
CD28 초효능제의 단일의 특이성의 포함은 또한, 인간에서 고유 IgG로서의 그의 유해 효과와 이전에 연관된 CD28 초효능제 mAb에서 관찰되는 비-특이적인 사이토카인 방출을 감소시켰다(도 40)(문헌[Suntharalingam G, Perry MR,, et al. N Engl J Med 355:1018-1028(2006)]). 대신에, 3특이성 Ab에 의한 동시-자극은 종양을 용해시키고, 그에 대하여 보호하는 T 세포의 효력 및 생존을 증가시켰다. 더욱 흥미로운 점은, CD38 3특이성 Ab가 우선적으로 시험관내에서 Th1 및 Tcm 세포 집단을 증폭시킨다는 점이며, 이는 Treg를 증식시켜 관용을 유도하도록 사용되는 α-CD3 효능제 또는 α-CD28 초효능제 단클론 Ab와 상이한 중요한 특징을 나타낸다(문헌[Penaranda C1, Tang Q, Bluestone JA. J Immunol. 187:2015-22.(2011)]; 문헌[Tabares P, Berr S, et al. Eur J Immunol. 44:1225-36(2014)]).
종합하여, 실시예 1 내지 실시예 15에 제시된 데이터에 의해, 2개의 T 세포 시그널링 수용체에 관여하고, 표적 세포 인식을 향상시킴으로써 강력한 항-종양 면역성을 자극하는 3특이성 항-CD38/CD3/CD28 항체가 입증된다. CD3 및 CD28 결합은 T 세포 수용체 시그널링을 촉발시켰으며, 이는 Bcl-xl을 상향조절하고, T 세포 아폽토시스를 억제하여, T 세포 이펙터 기능 및 생존을 증가시켰다. 3특이성 Ab의 제3 아암은 다발성 골수종 세포 상에서 고도로 발현되는 CD38과 상호작용하였다. 동시에, CD28은 또한 대부분의 골수종 유래의 세포 상에서 발현되며; 그에 따라 3특이성 Ab는 표적화를 개선시킴과 동시에, T 세포 활성화 및 세포용해를 향상시켰다. 최적화된 3특이성 항체는 항-CD38 mAb 치료제인 다라투무맙보다 1000배를 초과하는 수준으로 더 효율적으로 골수종 세포를 용해시켰으며, 인간화된 마우스 모델에서 강력한 생체내 항-종양 활성을 보였다.
본 발명은 다양한 구현예를 포함하지만, 당업자는 변형 및 변경을 구상할 수 있을 것이다. 따라서, 첨부된 청구범위는 본 발명의 범주 내에 있는 모든 그러한 등가의 변형을 망라하는 것으로 의도된다. 게다가, 본원에 사용된 섹션의 제목들은 단지 구조적 목적을 위한 것으로서, 기술된 주제를 제한하는 것으로 해석되지는 않는다.
본원에 기술된 각각의 구현예는, 명백하게 반대로 지시되지 않는 한 임의의 다른 구현예 또는 구현예들과 조합될 수 있다. 특히, 바람직하거나 유리한 것으로 나타낸 임의의 특징 또는 구현예는, 명백하게 반대로 지시되지 않는 한, 바람직하거나 유리한 것으로 나타낸 임의의 다른 특징 똔 특징들 또는 구현예 또는 구현예들과 조합될 수 있다.
본 출원에 열거된 모든 참고문헌은 본원에 명시적으로 참조로서 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> SANOFI <120> ANTI-CD38 ANTIBODIES AND METHODS OF USE <130> 18395-20299.41 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/570,655 <151> 2017-10-10 <150> US 62/570,660 <151> 2017-10-11 <150> US 62/676,221 <151> 2018-05-24 <150> EP 18187186.4 <151> 2018-08-03 <160> 132 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 256 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CD38 extracellular domain (isoform A) <400> 1 Arg Trp Arg Gln Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg Phe Pro 1 5 10 15 Glu Thr Val Leu Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His Pro Glu 20 25 30 Met Arg His Val Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala 35 40 45 Phe Ile Ser Lys His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro 50 55 60 Leu Met Lys Leu Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile Leu Leu 65 70 75 80 Trp Ser Arg Ile Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg 85 90 95 Asp Met Phe Thr Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp 100 105 110 Leu Thr Trp Cys Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr Gln Ser 115 120 125 Cys Pro Asp Trp Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe 130 135 140 Trp Lys Thr Val Ser Arg Arg Phe Ala Glu Ala Ala Cys Asp Val Val 145 150 155 160 His Val Met Leu Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser 165 170 175 Thr Phe Gly Ser Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln 180 185 190 Thr Leu Glu Ala Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp 195 200 205 Leu Cys Gln Asp Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys 210 215 220 Arg Asn Ile Gln Phe Ser Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe 225 230 235 240 Leu Gln Cys Val Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Thr Ser Glu Ile 245 250 255 <210> 2 <211> 265 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CD38 extracellular domain containing a histag at the C-terminal <400> 2 Arg Trp Arg Gln Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg Phe Pro 1 5 10 15 Glu Thr Val Leu Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His Pro Glu 20 25 30 Met Arg His Val Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala 35 40 45 Phe Ile Ser Lys His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro 50 55 60 Leu Met Lys Leu Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile Leu Leu 65 70 75 80 Trp Ser Arg Ile Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg 85 90 95 Asp Met Phe Thr Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp 100 105 110 Leu Thr Trp Cys Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr Gln Ser 115 120 125 Cys Pro Asp Trp Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe 130 135 140 Trp Lys Thr Val Ser Arg Arg Phe Ala Glu Ala Ala Cys Asp Val Val 145 150 155 160 His Val Met Leu Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser 165 170 175 Thr Phe Gly Ser Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln 180 185 190 Thr Leu Glu Ala Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp 195 200 205 Leu Cys Gln Asp Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys 210 215 220 Arg Asn Ile Gln Phe Ser Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe 225 230 235 240 Leu Gln Cys Val Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Thr Ser Glu Ile 245 250 255 Ser Ala Ser His His His His His His 260 265 <210> 3 <211> 485 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CD38 extracellular domain fused to human Fc domain at the C-terminal <400> 3 Arg Trp Arg Gln Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg Phe Pro 1 5 10 15 Glu Thr Val Leu Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His Pro Glu 20 25 30 Met Arg His Val Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala 35 40 45 Phe Ile Ser Lys His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro 50 55 60 Leu Met Lys Leu Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile Leu Leu 65 70 75 80 Trp Ser Arg Ile Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg 85 90 95 Asp Met Phe Thr Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp 100 105 110 Leu Thr Trp Cys Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr Gln Ser 115 120 125 Cys Pro Asp Trp Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe 130 135 140 Trp Lys Thr Val Ser Arg Arg Phe Ala Glu Ala Ala Cys Asp Val Val 145 150 155 160 His Val Met Leu Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser 165 170 175 Thr Phe Gly Ser Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln 180 185 190 Thr Leu Glu Ala Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp 195 200 205 Leu Cys Gln Asp Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys 210 215 220 Arg Asn Ile Gln Phe Ser Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe 225 230 235 240 Leu Gln Cys Val Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Thr Ser Glu Ile 245 250 255 Gly Ala Leu Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 260 265 270 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 275 280 285 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 290 295 300 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 305 310 315 320 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 325 330 335 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 340 345 350 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 355 360 365 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 370 375 380 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 385 390 395 400 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 405 410 415 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 420 425 430 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 435 440 445 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 450 455 460 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 465 470 475 480 Ser Leu Ser Pro Gly 485 <210> 4 <211> 265 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <220> <223> CD38 extracellular domain containing a histag at the C-terminal <400> 4 Arg Trp Arg Gln Gln Trp Ser Gly Ser Gly Thr Thr Ser Arg Phe Pro 1 5 10 15 Glu Thr Val Leu Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Val His Pro Glu 20 25 30 Met Arg His Val Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala 35 40 45 Phe Ile Ser Lys Tyr Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro 50 55 60 Leu Val Lys Leu Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Thr Leu Leu 65 70 75 80 Trp Ser Arg Ile Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg 85 90 95 Asp Met Phe Thr Leu Glu Asp Met Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp 100 105 110 Leu Thr Trp Cys Gly Glu Phe Asn Thr Phe Glu Ile Asn Tyr Gln Ser 115 120 125 Cys Pro Asp Trp Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe 130 135 140 Trp Lys Thr Val Ser Arg Arg Phe Ala Glu Thr Ala Cys Gly Val Val 145 150 155 160 His Val Met Leu Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser 165 170 175 Thr Phe Gly Ser Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln 180 185 190 Ala Leu Glu Ala Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp 195 200 205 Leu Cys Gln Asp Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys 210 215 220 Arg Asn Ile Arg Phe Phe Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe 225 230 235 240 Leu Gln Cys Val Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Leu Ser Gly Ile 245 250 255 Ser Ala Ser His His His His His His 260 265 <210> 5 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH amino sequence of the mAb1 <400> 5 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Glu Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Ile Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL amino sequence of the mAb1 <400> 6 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Asn Gly Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Lys 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 7 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC amino sequence of the mAb1 <400> 7 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Glu Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Ile Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly 225 230 235 240 Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly <210> 8 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC amino sequence of the mAb1 <400> 8 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Asn Gly Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Lys 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 9 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH amino sequence of the mAb6 <400> 9 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Met Phe Arg Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL amino sequence of the mAb6 <400> 10 Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Ile Tyr Tyr Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 11 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC amino sequence of the mAb6 <400> 11 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Met Phe Arg Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly Pro Asp Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 12 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC amino sequence of the mAb6 <400> 12 Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Ile Tyr Tyr Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 13 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH1 amino sequence of the mAb2 <400> 13 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Gln Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 14 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL1 amino sequence of the mAb2 <400> 14 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Gln Gly Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Pro Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Lys 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 15 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC1 amino sequence of the mAb2 <400> 15 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Gln Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly 225 230 235 240 Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly <210> 16 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC1 amino sequence of the mAb2 <400> 16 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Gln Gly Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Pro Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Lys 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 17 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH3 amino sequence of the mAb3 <400> 17 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 18 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL3 amino sequence of the mAb3 and mAb4 and mAb5 <400> 18 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Asn Gly Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Pro Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Lys 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 19 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC3 amino sequence of the mAb3 <400> 19 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly 225 230 235 240 Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly <210> 20 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LC3 amino sequence of the mAb3 and mAb4 and mAb5 <400> 20 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Asn Gly Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Pro Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Lys 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 21 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH5 amino sequence of the mAb4 <400> 21 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Ser Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Ile Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 22 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC5 amino sequence of the mAb4 <400> 22 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Ser Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Ile Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly 225 230 235 240 Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly <210> 23 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH6 amino sequence of the mAb5 <400> 23 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Ile Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 24 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HC6 amino sequence of the mAb5 <400> 24 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Ile Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Ala Gly 225 230 235 240 Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly <210> 25 <400> 25 000 <210> 26 <400> 26 000 <210> 27 <400> 27 000 <210> 28 <400> 28 000 <210> 29 <400> 29 000 <210> 30 <211> 256 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <220> <223> CD38 extracellular domain <400> 30 Arg Trp Arg Gln Gln Trp Ser Gly Ser Gly Thr Thr Ser Arg Phe Pro 1 5 10 15 Glu Thr Val Leu Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Val His Pro Glu 20 25 30 Met Arg His Val Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala 35 40 45 Phe Ile Ser Lys Tyr Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro 50 55 60 Leu Val Lys Leu Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Thr Leu Leu 65 70 75 80 Trp Ser Arg Ile Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg 85 90 95 Asp Met Phe Thr Leu Glu Asp Met Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp 100 105 110 Leu Thr Trp Cys Gly Glu Phe Asn Thr Phe Glu Ile Asn Tyr Gln Ser 115 120 125 Cys Pro Asp Trp Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe 130 135 140 Trp Lys Thr Val Ser Arg Arg Phe Ala Glu Thr Ala Cys Gly Val Val 145 150 155 160 His Val Met Leu Asn Gly Ser Arg Ser Lys Ile Phe Asp Lys Asn Ser 165 170 175 Thr Phe Gly Ser Val Glu Val His Asn Leu Gln Pro Glu Lys Val Gln 180 185 190 Ala Leu Glu Ala Trp Val Ile His Gly Gly Arg Glu Asp Ser Arg Asp 195 200 205 Leu Cys Gln Asp Pro Thr Ile Lys Glu Leu Glu Ser Ile Ile Ser Lys 210 215 220 Arg Asn Ile Arg Phe Phe Cys Lys Asn Ile Tyr Arg Pro Asp Lys Phe 225 230 235 240 Leu Gln Cys Val Lys Asn Pro Glu Asp Ser Ser Cys Leu Ser Gly Ile 245 250 255 <210> 31 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb1/mAb3/mAb4/mAb5 CDR-H1 <400> 31 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Phe Asn 1 5 <210> 32 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb1/mAb3/mAb4/mAb5 CDR-H2 <400> 32 Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Gly Thr 1 5 <210> 33 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb1/mAb2/mAb3/mAb4/mAb5 CDR-H3 <400> 33 Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr 1 5 10 <210> 34 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb1/mAb3/mAb4/mAb5 CDR-L1 <400> 34 Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Gly Phe 1 5 10 <210> 35 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb1/mAb3/mAb4/mAb5 CDR-L2 <400> 35 Leu Ala Ser 1 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb1/mAb2/mAb3/mAb4/mAb5 CDR-L3 <400> 36 Gln Gln Asn Lys Glu Asp Pro Trp Thr 1 5 <210> 37 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb2 CDR-H1 <400> 37 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Ala 1 5 <210> 38 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb2 CDR-H2 <400> 38 Ile Tyr Pro Gly Gln Gly Gly Thr 1 5 <210> 39 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb2 CDR-L1 <400> 39 Gln Ser Val Ser Ser Tyr Gly Gln Gly Phe 1 5 10 <210> 40 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb2 CDR-L2 <400> 40 Gly Ala Ser 1 <210> 41 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb6 CDR-H1 <400> 41 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly 1 5 <210> 42 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb6 CDR-H2 <400> 42 Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys 1 5 <210> 43 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb6 CDR-H3 <400> 43 Ala Arg Met Phe Arg Gly Ala Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 44 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb6 CDR-L1 <400> 44 Gln Gly Ile Arg Asn Asp 1 5 <210> 45 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb6 CDR-L2 <400> 45 Ala Ala Ser 1 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb6 CDR-L3 <400> 46 Leu Gln Asp Tyr Ile Tyr Tyr Pro Thr 1 5 <210> 47 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb7 VH domain <400> 47 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Lys Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 48 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb7 VL domain <400> 48 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Leu Ser Met Ser Thr Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Pro Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Val 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Pro Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 49 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD28sup VH domain <400> 49 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Lys 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 50 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD28sup VL domain <400> 50 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Val Trp 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 51 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD28cvn VH domain <400> 51 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Ala Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Lys Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Lys Gly Tyr Ser Tyr Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 52 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD28cvn VL domain <400> 52 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Tyr Tyr 20 25 30 Val Thr Ser Leu Met Gln Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Phe Ala Ala Ser Asn Val Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asn Asp Val Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Arg 85 90 95 Lys Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 53 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD3mid VH domain <400> 53 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Arg Gly Val Tyr Tyr Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 54 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD3mid VL domain <400> 54 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Asn 20 25 30 Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Ser Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly 85 90 95 Thr Gln Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 55 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 55 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 56 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 56 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 57 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 57 Thr Lys Gly Pro Ser 1 5 <210> 58 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 58 Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro 1 5 <210> 59 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 59 Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Ser Gly Gly 1 5 10 <210> 60 <211> 570 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28supxCD3mid IgG4(hole) FALA Heavy1 polypeptide sequence <400> 60 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Lys 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 130 135 140 Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala Trp Met His Trp Val Arg Gln 145 150 155 160 Ala Pro Gly Lys Gln Leu Glu Trp Val Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser 165 170 175 Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 180 185 190 Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 195 200 205 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Arg Gly Val Tyr Tyr 210 215 220 Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser Arg Thr Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 245 250 255 Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 260 265 270 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 275 280 285 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 290 295 300 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 305 310 315 320 Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr 325 330 335 Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro 340 345 350 Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 355 360 365 Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 370 375 380 Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn 385 390 395 400 Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 405 410 415 Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val 420 425 430 Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 435 440 445 Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 450 455 460 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu 465 470 475 480 Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe 485 490 495 Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu 500 505 510 Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 515 520 525 Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly 530 535 540 Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 545 550 555 560 Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 565 570 <210> 61 <211> 338 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28supxCD3mid Light1 polypeptide sequence <400> 61 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Asn 20 25 30 Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Ser Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly 85 90 95 Thr Gln Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser 115 120 125 Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala 130 135 140 Ser Gln Asn Ile Tyr Val Trp Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 145 150 155 160 Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly 165 170 175 Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 180 185 190 Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 195 200 205 Gln Gly Gln Thr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu 210 215 220 Ile Lys Thr Lys Gly Pro Ser Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val 245 250 255 Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp 260 265 270 Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr 275 280 285 Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr 290 295 300 Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val 305 310 315 320 Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly 325 330 335 Glu Cys <210> 62 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD38VH1 IgG4(knob) FALA Heavy2 polypeptide sequence <400> 62 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Gln Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Cys Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 445 <210> 63 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD38VH1 Light2 polypeptide sequence <400> 63 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Gln Gly Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Pro Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Lys 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 64 <211> 573 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28supxCD3mid IgG1(hole) LALA P329A Heavy1 polypeptide sequence <400> 64 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Lys 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 130 135 140 Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala Trp Met His Trp Val Arg Gln 145 150 155 160 Ala Pro Gly Lys Gln Leu Glu Trp Val Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser 165 170 175 Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 180 185 190 Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 195 200 205 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Arg Gly Val Tyr Tyr 210 215 220 Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser Arg Thr Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 245 250 255 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 260 265 270 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 275 280 285 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 290 295 300 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 305 310 315 320 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 325 330 335 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 340 345 350 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe 355 360 365 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 370 375 380 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 385 390 395 400 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 405 410 415 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 420 425 430 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 435 440 445 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 450 455 460 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro 465 470 475 480 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val 485 490 495 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 500 505 510 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 515 520 525 Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 530 535 540 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 545 550 555 560 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 565 570 <210> 65 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD38VH1 IgG1(knob) LALA P329A Heavy2 polypeptide sequence <400> 65 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Gln Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly <210> 66 <211> 573 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28supxCD3mid IgG1(hole) NNSA Heavy1 polypeptide sequence <400> 66 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ser Ile Tyr Pro Gly Asn Val Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Ser His Tyr Gly Leu Asp Trp Asn Phe Asp Val Trp Gly Lys 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala 130 135 140 Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala Trp Met His Trp Val Arg Gln 145 150 155 160 Ala Pro Gly Lys Gln Leu Glu Trp Val Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser 165 170 175 Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 180 185 190 Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser 195 200 205 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Arg Gly Val Tyr Tyr 210 215 220 Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser Arg Thr Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 245 250 255 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 260 265 270 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 275 280 285 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 290 295 300 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 305 310 315 320 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 325 330 335 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 340 345 350 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 355 360 365 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 370 375 380 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 385 390 395 400 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 405 410 415 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Asn Ala Ser Arg Val Val Ser Val 420 425 430 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 435 440 445 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 450 455 460 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro 465 470 475 480 Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val 485 490 495 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 500 505 510 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 515 520 525 Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 530 535 540 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 545 550 555 560 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 565 570 <210> 67 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD38VH1 IgG1(knob) NNSA Heavy2 polypeptide sequence <400> 67 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Gly Gln Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Gly Gly Leu Arg Arg Ala Tyr Phe Thr Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Asn Ala Ser Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly <210> 68 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD38hhy1370 IgG4(knob) FALA P329A Heavy2 polypeptide sequence <400> 68 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Met Phe Arg Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Gln 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 435 440 <210> 69 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD38hhy1370 Light2 polypeptide sequence <400> 69 Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Tyr Ile Tyr Tyr Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 70 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD38hhy1370 IgG1(knob) LALA P329A Heavy2 polypeptide sequence <400> 70 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Met Phe Arg Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Ala Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 71 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD38hhy1370 IgG1(knob) NNSA Heavy2 polypeptide sequence <400> 71 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Met Phe Arg Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 210 215 220 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Asn Ala Ser Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 <210> 72 <211> 1710 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28supxCD3mid IgG4(hole) FALA Heavy1 polynucleotide sequence <400> 72 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgag gtcgtgaaac ctggcgcctc tgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctactaca tccactgggt gcgccaggcc 120 cctggacagg gactggaatg gatcggcagc atctaccccg gcaacgtgaa caccaactac 180 gcccagaagt tccagggcag agccaccctg accgtggaca ccagcatcag caccgcctac 240 atggaactga gccggctgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcac ccggtcccac 300 tacggcctgg attggaactt cgacgtgtgg ggcaagggca ccaccgtgac agtgtctagc 360 agccaggtgc agctggtgga atctggcggc ggagtggtgc agcctggcag aagcctgaga 420 ctgagctgtg ccgccagcgg cttcaccttc accaaggcct ggatgcactg ggtgcgccag 480 gcccctggaa agcagctgga atgggtggcc cagatcaagg acaagagcaa cagctacgcc 540 acctactacg ccgacagcgt gaagggccgg ttcaccatca gccgggacga cagcaagaac 600 accctgtacc tgcagatgaa cagcctgcgg gccgaggaca ccgccgtgta ctactgtcgg 660 ggcgtgtact atgccctgag ccccttcgat tactggggcc agggaaccct cgtgaccgtg 720 tctagtcgga ccgccagcac aaagggccca tcggtgttcc ctctggcccc ttgcagcaga 780 agcaccagcg aatctacagc cgccctgggc tgcctcgtga aggactactt tcccgagccc 840 gtgaccgtgt cctggaactc tggcgctctg acaagcggcg tgcacacctt tccagccgtg 900 ctccagagca gcggcctgta ctctctgagc agcgtcgtga cagtgcccag cagcagcctg 960 ggcaccaaga cctacacctg taacgtggac cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 1020 cgggtggaat ctaagtacgg ccctccctgc cctccttgcc cagcccctga agctgccggc 1080 ggaccctccg tgttcctgtt ccccccaaag cccaaggaca ccctgatgat cagccggacc 1140 cccgaagtga cctgcgtggt ggtggatgtg tcccaggaag atcccgaggt gcagttcaat 1200 tggtacgtgg acggcgtgga agtgcacaac gccaagacca agcccagaga ggaacagttc 1260 aacagcacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 1320 aaagagtaca agtgcaaggt gtccaacaag ggcctgccca gctccatcga gaaaaccatc 1380 agcaaggcca agggccagcc ccgcgagcct caagtgtgta ccctgccccc tagccaggaa 1440 gagatgacca agaaccaggt gtccctgagc tgtgccgtga aaggcttcta ccccagcgac 1500 attgccgtgg aatgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct 1560 gtgctggaca gcgacggctc attcttcctg gtgtccaagc tgaccgtgga caagagccgg 1620 tggcaggaag gcaacgtgtt cagctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1680 acccagaagt ccctgtctct gtccctgggc 1710 <210> 73 <211> 1014 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28supxCD3mid Light1 polynucleotide sequence <400> 73 gacatcgtga tgacccagac ccccctgagc ctgagcgtga cacctggaca gcctgccagc 60 atcagctgca agagcagcca gagcctggtg cacaacaacg ccaacaccta cctgagctgg 120 tatctgcaga agcccggcca gagcccccag tccctgatct acaaggtgtc caacagattc 180 agcggcgtgc ccgacagatt ctccggcagc ggctctggca ccgacttcac cctgaagatc 240 agccgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactattgtg gccagggcac ccagtacccc 300 ttcacctttg gcagcggcac caaggtggaa atcaagggcc agcccaaggc cgcccccgac 360 atccagatga cccagagccc cagcagcctg tctgccagcg tgggcgacag agtgaccatc 420 acctgtcagg ccagccagaa catctacgtg tggctgaact ggtatcagca gaagcccggc 480 aaggccccca agctgctgat ctacaaggcc agcaacctgc acaccggcgt gcccagcaga 540 ttttctggca gcggctccgg caccgacttc accctgacaa tcagctccct gcagcccgag 600 gacattgcca cctactactg ccagcagggc cagacctacc cctacacctt tggccagggc 660 accaagctgg aaatcaagac caagggcccc agccgtacgg tggccgctcc cagcgtgttc 720 atcttcccac ctagcgacga gcagctgaag tccggcacag cctctgtcgt gtgcctgctg 780 aacaacttct acccccgcga ggccaaagtg cagtggaagg tggacaacgc cctgcagagc 840 ggcaacagcc aggaaagcgt gaccgagcag gacagcaagg actccaccta cagcctgagc 900 agcaccctga cactgagcaa ggccgactac gagaagcaca aggtgtacgc ctgcgaagtg 960 acccaccagg gcctgtctag ccccgtgacc aagagcttca accggggcga gtgt 1014 <210> 74 <211> 1338 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD38VH1 IgG4(knob) FALA Heavy2 polynucleotide sequence <400> 74 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtcgtgaaac ctggcgcctc cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctacgcca tgcactgggt caaagaggcc 120 cctggccaga gactggaatg gatcggctac atctaccccg gccagggcgg caccaactac 180 aaccagaagt tccagggcag agccaccctg accgccgata caagcgccag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggat accgccgtgt acttctgtgc cagaacaggc 300 ggcctgaggc gggcctactt tacctattgg ggccagggca ccctcgtgac cgtgtctagc 360 gctagcacaa agggcccatc ggtgttccct ctggcccctt gcagcagaag caccagcgaa 420 tctacagccg ccctgggctg cctcgtgaag gactactttc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480 tggaactctg gcgctctgac aagcggcgtg cacacctttc cagccgtgct ccagagcagc 540 ggcctgtact ctctgagcag cgtcgtgaca gtgcccagca gcagcctggg caccaagacc 600 tacacctgta acgtggacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagcg ggtggaatct 660 aagtacggcc ctccctgccc tccttgccca gcccctgaag ctgccggcgg accctccgtg 720 ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatca gccggacccc cgaagtgacc 780 tgcgtggtgg tggatgtgtc ccaggaagat cccgaggtgc agttcaattg gtacgtggac 840 ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cccagagagg aacagttcaa cagcacctac 900 cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agagtacaag 960 tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgcccagc tccatcgaga aaaccatcag caaggccaag 1020 ggccagcccc gcgagcctca agtgtatacc ctgccccctt gccaggaaga gatgaccaag 1080 aaccaggtgt ccctgtggtg tctcgtgaaa ggcttctacc ccagcgacat tgccgtggaa 1140 tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggacagc 1200 gacggctcat tcttcctgta ctccaagctg accgtggaca agagccggtg gcaggaaggc 1260 aacgtgttca gctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1320 ctgtctctgt ccctgggc 1338 <210> 75 <211> 654 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD38VH1 Light2 polynucleotide sequence <400> 75 gacatcgtgc tgacacagag ccctgccacc ctgtctctga gccctggcga gagagccacc 60 atcagctgta gagccagcca gagcgtgtcc agctacggcc agggcttcat gcactggtat 120 cagcagaagc ccggccagcc ccccagactg ctgatctatg gcgccagcag cagagccaca 180 ggcatccccg ccagattttc tggctctggc agcggcaccg acttcaccct gacaatcagc 240 cccctggaac ccgaggactt cgccgtgtac tactgccagc agaacaaaga ggacccctgg 300 accttcggcg gaggcaccaa gctggaaatc aagcgtacgg tggccgctcc cagcgtgttc 360 atcttcccac ctagcgacga gcagctgaag tccggcacag cctctgtcgt gtgcctgctg 420 aacaacttct acccccgcga ggccaaggtg cagtggaagg tggacaatgc cctgcagagc 480 ggcaacagcc aggaaagcgt gaccgagcag gacagcaagg actccaccta cagcctgagc 540 agcaccctga ccctgtccaa ggccgattac gagaagcaca aggtgtacgc ctgcgaagtg 600 acccaccagg gcctgtctag ccccgtgacc aagagcttca accggggcga gtgc 654 <210> 76 <211> 1719 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28supxCD3mid IgG1(hole) LALA P329A Heavy1 polynucleotide sequence <400> 76 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgag gtcgtgaaac ctggcgcctc tgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctactaca tccactgggt gcgccaggcc 120 cctggacagg gactggaatg gatcggcagc atctaccccg gcaacgtgaa caccaactac 180 gcccagaagt tccagggcag agccaccctg accgtggaca ccagcatcag caccgcctac 240 atggaactga gccggctgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcac ccggtcccac 300 tacggcctgg attggaactt cgacgtgtgg ggcaagggca ccaccgtgac agtgtctagc 360 agccaggtgc agctggtgga atctggcggc ggagtggtgc agcctggcag aagcctgaga 420 ctgagctgtg ccgccagcgg cttcaccttc accaaggcct ggatgcactg ggtgcgccag 480 gcccctggaa agcagctgga atgggtggcc cagatcaagg acaagagcaa cagctacgcc 540 acctactacg ccgacagcgt gaagggccgg ttcaccatca gccgggacga cagcaagaac 600 accctgtacc tgcagatgaa cagcctgcgg gccgaggaca ccgccgtgta ctactgtcgg 660 ggcgtgtact atgccctgag ccccttcgat tactggggcc agggaaccct cgtgaccgtg 720 tctagtcgga ccgccagcac aaagggcccc agcgtgttcc ctctggcccc tagcagcaag 780 agcacatctg gcggaacagc cgccctgggc tgcctcgtga aggactactt tcccgagccc 840 gtgaccgtgt cctggaattc tggcgccctg accagcggcg tgcacacctt tccagctgtg 900 ctgcagtcca gcggcctgta cagcctgagc agcgtcgtga cagtgcccag cagctctctg 960 ggcacccaga cctacatctg caacgtgaac cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 1020 aaggtggaac ccaagagctg cgacaagacc cacacctgtc ccccttgtcc tgcccccgaa 1080 gccgccggag gcccttccgt gttcctgttc cccccaaagc ccaaggacac cctgatgatc 1140 agccggaccc ccgaagtgac ctgcgtggtg gtggatgtgt cccacgagga ccctgaagtg 1200 aagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa gtgcacaacg ccaagaccaa gccaagagag 1260 gaacagtaca acagcaccta ccgggtggtg tccgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg 1320 ctgaacggca aagagtacaa gtgcaaggtg tccaacaagg ccctggccgc ccccatcgag 1380 aaaaccatca gcaaggccaa gggccagccc cgcgaacccc aggtgtgcac actgccccca 1440 agcagggacg agctgaccaa gaaccaggtg tccctgagct gtgccgtgaa aggcttctac 1500 ccctccgata tcgccgtgga atgggagagc aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc 1560 accccccctg tgctggacag cgacggctca ttcttcctgg tgtccaagct gacagtggac 1620 aagtcccggt ggcagcaggg caacgtgttc agctgctccg tgatgcacga ggccctgcac 1680 aaccactaca cccagaagtc cctgagcctg agccccggc 1719 <210> 77 <211> 1347 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD38VH1 IgG1(knob) LALA P329A Heavy2 polynucleotide sequence <400> 77 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtcgtgaaac ctggcgcctc cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctacgcca tgcactgggt caaagaggcc 120 cctggccaga gactggaatg gatcggctac atctaccccg gccagggcgg caccaactac 180 aaccagaagt tccagggcag agccaccctg accgccgata caagcgccag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggat accgccgtgt acttctgtgc cagaacaggc 300 ggcctgaggc gggcctactt tacctattgg ggccagggca ccctcgtgac cgtgtctagc 360 gctagcacaa agggccccag cgtgttccct ctggccccta gcagcaagag cacatctggc 420 ggaacagccg ccctgggctg cctcgtgaag gactactttc ccgagcccgt gaccgtgtcc 480 tggaattctg gcgccctgac cagcggcgtg cacacctttc cagctgtgct gcagtccagc 540 ggcctgtaca gcctgagcag cgtcgtgaca gtgcccagca gctctctggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggaaccc 660 aagagctgcg acaagaccca cacctgtccc ccttgtcctg cccccgaagc cgccggaggc 720 ccttccgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccggaccccc 780 gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtcc cacgaggacc ctgaagtgaa gttcaattgg 840 tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc aagaccaagc caagagagga acagtacaac 900 agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa 960 gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctggccgccc ccatcgagaa aaccatcagc 1020 aaggccaagg gccagccccg cgaaccccag gtgtacacac tgcccccatg cagggacgag 1080 ctgaccaaga accaggtgtc cctgtggtgt ctggtgaaag gcttctaccc ctccgatatc 1140 gccgtggaat gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccctgtg 1200 ctggacagcg acggctcatt cttcctgtac tccaagctga cagtggacaa gtcccggtgg 1260 cagcagggca acgtgttcag ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1320 cagaagtccc tgagcctgag ccccggc 1347 <210> 78 <211> 1719 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28supxCD3mid IgG1(hole) NNSA Heavy1 polynucleotide sequence <400> 78 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgag gtcgtgaaac ctggcgcctc tgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctactaca tccactgggt gcgccaggcc 120 cctggacagg gactggaatg gatcggcagc atctaccccg gcaacgtgaa caccaactac 180 gcccagaagt tccagggcag agccaccctg accgtggaca ccagcatcag caccgcctac 240 atggaactga gccggctgag aagcgacgac accgccgtgt actactgcac ccggtcccac 300 tacggcctgg attggaactt cgacgtgtgg ggcaagggca ccaccgtgac agtgtctagc 360 agccaggtgc agctggtgga atctggcggc ggagtggtgc agcctggcag aagcctgaga 420 ctgagctgtg ccgccagcgg cttcaccttc accaaggcct ggatgcactg ggtgcgccag 480 gcccctggaa agcagctgga atgggtggcc cagatcaagg acaagagcaa cagctacgcc 540 acctactacg ccgacagcgt gaagggccgg ttcaccatca gccgggacga cagcaagaac 600 accctgtacc tgcagatgaa cagcctgcgg gccgaggaca ccgccgtgta ctactgtcgg 660 ggcgtgtact atgccctgag ccccttcgat tactggggcc agggaaccct cgtgaccgtg 720 tctagtcgga ccgccagcac aaagggcccc agcgtgttcc ctctggcccc tagcagcaag 780 agcacatctg gcggaacagc cgccctgggc tgcctcgtga aggactactt tcccgagccc 840 gtgaccgtgt cctggaattc tggcgccctg accagcggcg tgcacacctt tccagctgtg 900 ctgcagtcca gcggcctgta cagcctgagc agcgtcgtga cagtgcccag cagctctctg 960 ggcacccaga cctacatctg caacgtgaac cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 1020 aaggtggaac ccaagagctg cgacaagacc cacacctgtc ccccttgtcc tgcccccgaa 1080 ctgctgggag gcccttccgt gttcctgttc cccccaaagc ccaaggacac cctgatgatc 1140 agccggaccc ccgaagtgac ctgcgtggtg gtggatgtgt cccacgagga ccctgaagtg 1200 aagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa gtgcacaacg ccaagaccaa gccaagagag 1260 gaacagtaca acaatgcctc ccgggtggtg tccgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg 1320 ctgaacggca aagagtacaa gtgcaaggtg tccaacaagg ccctgcctgc ccccatcgag 1380 aaaaccatca gcaaggccaa gggccagccc cgcgaacccc aggtgtgcac actgccccca 1440 agcagggacg agctgaccaa gaaccaggtg tccctgagct gtgccgtgaa aggcttctac 1500 ccctccgata tcgccgtgga atgggagagc aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc 1560 accccccctg tgctggacag cgacggctca ttcttcctgg tgtccaagct gacagtggac 1620 aagtcccggt ggcagcaggg caacgtgttc agctgctccg tgatgcacga ggccctgcac 1680 aaccactaca cccagaagtc cctgagcctg agccccggc 1719 <210> 79 <211> 1347 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD38VH1 IgG1(knob) NNSA Heavy2 polynucleotide sequence <400> 79 caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtcgtgaaac ctggcgcctc cgtgaaggtg 60 tcctgcaagg ccagcggcta cacctttacc agctacgcca tgcactgggt caaagaggcc 120 cctggccaga gactggaatg gatcggctac atctaccccg gccagggcgg caccaactac 180 aaccagaagt tccagggcag agccaccctg accgccgata caagcgccag caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgcg gagcgaggat accgccgtgt acttctgtgc cagaacaggc 300 ggcctgaggc gggcctactt tacctattgg ggccagggca ccctcgtgac cgtgtctagc 360 gctagcacaa agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840 tatgttgacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900 aatgcctccc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatg ccgggatgag 1080 ctgaccaaga atcaagtcag cctgtggtgc ctggtaaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200 ctggactccg acggctcctt cttcctctac tcaaaactca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320 cagaagagcc tctccctgtc tccgggt 1347 <210> 80 <211> 1329 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD38hhy1370 IgG4(knob) FALA P329A Heavy2 polynucleotide sequence <400> 80 caggtgcagc tggtggaaag cggcggaggc gtggtgcagc ctggcaggtc tctgagactg 60 agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc agctacggaa tgcactgggt gcgccaggcc 120 cctggcaaag gactggaatg ggtggccgtg atttggtacg acggcagcaa caagtactac 180 gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agcggcgaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagaatgttc 300 agaggcgcct tcgactactg gggccagggc acactcgtga ccgtgtctag tgcgtcgacc 360 aagggcccat cggtgttccc tctggcccct tgcagcagaa gcaccagcga atctacagcc 420 gccctgggct gcctcgtgaa ggactacttt cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaactct 480 ggcgctctga caagcggcgt gcacaccttt ccagccgtgc tccagagcag cggcctgtac 540 tctctgagca gcgtcgtgac agtgcccagc agcagcctgg gcaccaagac ctacacctgt 600 aacgtggacc acaagcccag caacaccaag gtggacaagc gggtggaatc taagtacggc 660 cctccctgcc ctccttgccc agcccctgaa gctgccggcg gaccctccgt gttcctgttc 720 cccccaaagc ccaaggacac cctgatgatc agccggaccc ccgaagtgac ctgcgtggtg 780 gtggatgtgt cccaggaaga tcccgaggtg cagttcaatt ggtacgtgga cggcgtggaa 840 gtgcacaacg ccaagaccaa gcccagagag gaacagttca acagcaccta ccgggtggtg 900 tccgtgctga ccgtgctgca ccaggactgg ctgaacggca aagagtacaa gtgcaaggtg 960 tccaacaagg gcctgcccag ctccatcgag aaaaccatca gcaaggccaa gggccagccc 1020 cgcgagcctc aagtgtatac cctgccccct tgccaggaag agatgaccaa gaaccaggtg 1080 tccctgtggt gtctcgtgaa aggcttctac cccagcgaca ttgccgtgga atgggagagc 1140 aacggccagc ccgagaacaa ctacaagacc accccccctg tgctggacag cgacggctca 1200 ttcttcctgt actccaagct gaccgtggac aagagccggt ggcaggaagg caacgtgttc 1260 agctgctccg tgatgcacga ggccctgcac aaccactaca cccagaagtc cctgtctctg 1320 tccctgggc 1329 <210> 81 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD38hhy1370 Light2 polynucleotide sequence <400> 81 gccatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgtctgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgta gagccagcca gggcatccgg aacgacctgg gctggtatca gcagaagcct 120 ggcaaggccc ccaagctgct gatctacgcc gctagctctc tgcagtccgg cgtgcccagc 180 agattttctg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga caatctctgg cctgcagccc 240 gaggacagcg ccacctacta ctgtctgcaa gactacatct actaccccac cttcggccag 300 ggcaccaagg tggaaatcaa gcgtacggtg gccgctccca gcgtgttcat cttcccacct 360 agcgacgagc agctgaagtc cggcacagcc tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 420 ccccgcgagg ccaaagtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480 gaaagcgtga ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgaca 540 ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 600 ctgtctagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gt 642 <210> 82 <211> 1338 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD38hhy1370 IgG1(knob) LALA P329A Heavy2 polynucleotide sequence <400> 82 caggtgcagc tggtggaaag cggcggaggc gtggtgcagc ctggcaggtc tctgagactg 60 agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc agctacggaa tgcactgggt gcgccaggcc 120 cctggcaaag gactggaatg ggtggccgtg atttggtacg acggcagcaa caagtactac 180 gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agcggcgaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagaatgttc 300 agaggcgcct tcgactactg gggccagggc acactcgtga ccgtgtctag tgcgtcgacc 360 aagggcccca gcgtgttccc tctggcccct agcagcaaga gcacatctgg cggaacagcc 420 gccctgggct gcctcgtgaa ggactacttt cccgagcccg tgaccgtgtc ctggaattct 480 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttt ccagctgtgc tgcagtccag cggcctgtac 540 agcctgagca gcgtcgtgac agtgcccagc agctctctgg gcacccagac ctacatctgc 600 aacgtgaacc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aggtggaacc caagagctgc 660 gacaagaccc acacctgtcc cccttgtcct gcccccgaag ccgccggagg cccttccgtg 720 ttcctgttcc ccccaaagcc caaggacacc ctgatgatca gccggacccc cgaagtgacc 780 tgcgtggtgg tggatgtgtc ccacgaggac cctgaagtga agttcaattg gtacgtggac 840 ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag ccaagagagg aacagtacaa cagcacctac 900 cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agagtacaag 960 tgcaaggtgt ccaacaaggc cctggccgcc cccatcgaga aaaccatcag caaggccaag 1020 ggccagcccc gcgaacccca ggtgtacaca ctgcccccat gcagggacga gctgaccaag 1080 aaccaggtgt ccctgtggtg tctggtgaaa ggcttctacc cctccgatat cgccgtggaa 1140 tgggagagca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggacagc 1200 gacggctcat tcttcctgta ctccaagctg acagtggaca agtcccggtg gcagcagggc 1260 aacgtgttca gctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1320 ctgagcctga gccccggc 1338 <210> 83 <211> 1338 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD38hhy1370 IgG1(knob) NNSA Heavy2 polynucleotide sequence <400> 83 caggtgcagc tggtggaaag cggcggaggc gtggtgcagc ctggcaggtc tctgagactg 60 agctgtgccg ccagcggctt caccttcagc agctacggaa tgcactgggt gcgccaggcc 120 cctggcaaag gactggaatg ggtggccgtg atttggtacg acggcagcaa caagtactac 180 gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc agcggcgaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acagcctgcg ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagaatgttc 300 agaggcgcct tcgactactg gggccagggc acactcgtga ccgtgtctag tgcgtcgacc 360 aagggcccat cggtcttccc cctggcaccc tcctccaaga gcacctctgg gggcacagcg 420 gccctgggct gcctggtcaa ggactacttc cccgaaccgg tgacggtgtc gtggaactca 480 ggcgccctga ccagcggcgt gcacaccttc ccggctgtcc tacagtcctc aggactctac 540 tccctcagca gcgtggtgac cgtgccctcc agcagcttgg gcacccagac ctacatctgc 600 aacgtgaatc acaagcccag caacaccaag gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt 660 gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 720 ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 780 tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtatgttgac 840 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa caatgcctcc 900 cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 960 tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 1020 gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat gccgggatga gctgaccaag 1080 aatcaagtca gcctgtggtg cctggtaaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 1140 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 1200 gacggctcct tcttcctcta ctcaaaactc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 1260 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1320 ctctccctgt ctccgggt 1338 <210> 84 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD3low VH domain <400> 84 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Lys Ala 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Ile Lys Asp Lys Ser Asn Ser Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Arg Gly Val Tyr Tyr Ala Leu Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 85 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CD3low VL domain <400> 85 Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Asn 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gly Gln Gly 85 90 95 Thr Gln Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 86 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb2/mAb3 VH FW1 <400> 86 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 20 25 <210> 87 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb4 VH FW1 <400> 87 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Ser Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser 20 25 <210> 88 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb5 VH FW1 <400> 88 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser 20 25 <210> 89 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb6 VH FW1 <400> 89 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 20 25 <210> 90 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb2/mAb3/mAb5 VH FW2 <400> 90 Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 10 15 Tyr <210> 91 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb4 VH FW2 <400> 91 Met His Trp Val Lys Glu Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 1 5 10 15 Tyr <210> 92 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb6 VH FW2 <400> 92 Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 1 5 10 15 Val <210> 93 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb2/mAb3 VH FW3 <400> 93 Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr 1 5 10 15 Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Val Tyr Phe Cys 35 <210> 94 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb4/mAb5 VH FW3 <400> 94 Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr 1 5 10 15 Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu Ile Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Val Tyr Phe Cys 35 <210> 95 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb6 VH FW3 <400> 95 Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn 1 5 10 15 Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 20 25 30 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 35 <210> 96 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb2/mAb3/mAb4/mAb5/mAb6 VH FW4 <400> 96 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 97 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb2/mAb3/mAb4/mAb5 VL FW1 <400> 97 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser 20 25 <210> 98 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb6 VL FW1 <400> 98 Ala Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 20 25 <210> 99 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb2/mAb3/mAb4/mAb5 VL FW2 <400> 99 Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile 1 5 10 15 Tyr <210> 100 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb6 VL FW2 <400> 100 Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 101 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb2/mAb3/mAb4/mAb5 VL FW3 <400> 101 Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 10 15 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Pro Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala 20 25 30 Val Tyr Tyr Cys 35 <210> 102 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb6 VL FW3 <400> 102 Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 10 15 Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro Glu Asp Ser Ala 20 25 30 Thr Tyr Tyr Cys 35 <210> 103 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb2/mAb3/mAb4/mAb5 VL FW4 <400> 103 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 104 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb6 VL FW4 <400> 104 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 105 <211> 159 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD38 isoform E sequence <400> 105 Arg Trp Arg Gln Gln Trp Ser Gly Pro Gly Thr Thr Lys Arg Phe Pro 1 5 10 15 Glu Thr Val Leu Ala Arg Cys Val Lys Tyr Thr Glu Ile His Pro Glu 20 25 30 Met Arg His Val Asp Cys Gln Ser Val Trp Asp Ala Phe Lys Gly Ala 35 40 45 Phe Ile Ser Lys His Pro Cys Asn Ile Thr Glu Glu Asp Tyr Gln Pro 50 55 60 Leu Met Lys Leu Gly Thr Gln Thr Val Pro Cys Asn Lys Ile Leu Leu 65 70 75 80 Trp Ser Arg Ile Lys Asp Leu Ala His Gln Phe Thr Gln Val Gln Arg 85 90 95 Asp Met Phe Thr Leu Glu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr Leu Ala Asp Asp 100 105 110 Leu Thr Trp Cys Gly Glu Phe Asn Thr Ser Lys Ile Asn Tyr Gln Ser 115 120 125 Cys Pro Asp Trp Arg Lys Asp Cys Ser Asn Asn Pro Val Ser Val Phe 130 135 140 Trp Lys Thr Val Ser Arg Arg His Phe Trp Glu Cys Gly Ser Pro 145 150 155 <210> 106 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb7 light chain <400> 106 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Leu Ser Met Ser Thr Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Pro Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Val 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ile Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Pro Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 107 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb7 heavy chain <400> 107 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Thr Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Gly Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Lys Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Asn Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 108 <211> 445 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> benchmark heavy chain 1 (binds CD38) <400> 108 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Ser 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Asn Pro Gln Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Thr Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Gly Asn Trp Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 165 170 175 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asp Thr 195 200 205 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Lys His Glu Asp Pro Glu Val Lys 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Glu Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Asp Val Ser 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asp Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Glu 405 410 415 Gln Gly Asp Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 109 <211> 485 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> benchmark heavy chain 2 (binds CD3) <400> 109 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asp Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Lys Pro 115 120 125 Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Lys Pro Gly 130 135 140 Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly 145 150 155 160 Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr 165 170 175 Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg 180 185 190 Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg 195 200 205 Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ser Gly 210 215 220 Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser 225 230 235 240 Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Glu Pro 245 250 255 Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro 260 265 270 Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 275 280 285 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 290 295 300 Lys His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 305 310 315 320 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 325 330 335 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 340 345 350 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 355 360 365 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 370 375 380 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Gln Met Thr Lys Asn Gln 385 390 395 400 Val Lys Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 405 410 415 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 420 425 430 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 435 440 445 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 450 455 460 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 465 470 475 480 Leu Ser Pro Gly Lys 485 <210> 110 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> benchmark light chain (binds CD38) <400> 110 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Trp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 111 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 111 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 1 5 10 <210> 112 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 112 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser 1 5 10 <210> 113 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 113 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser 1 5 10 <210> 114 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 114 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser 1 5 10 <210> 115 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 115 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Val Ala Gly Pro Ser 1 5 10 <210> 116 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 116 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser 1 5 10 <210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 117 tacctgttac ttgaattgaa 20 <210> 118 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 118 attttttgag gtcttccaat 20 <210> 119 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 119 attgtcgtac gctacaagca 20 <210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 120 caaaagggct tagaaggtcc 20 <210> 121 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 121 ctatagcttg ctagtaacag 20 <210> 122 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 122 cacaacctgt ccccatccta tgaa 24 <210> 123 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 123 aagctgccat ccagatcgtt atcg 24 <210> 124 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 124 ccaaattaag ggccagctca ttcc 24 <210> 125 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 125 acctgtacat ccttgggcaa atcc 24 <210> 126 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 126 gtcaggatgc cttgtggttt gagt 24 <210> 127 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 127 cagagcttcc agagccaatc tac 23 <210> 128 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 128 ccatgtactg ccttctgggt gaaa 24 <210> 129 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 129 ccactgacca caacccagtt tt 22 <210> 130 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 130 aggccattgg aagtcaccgt tt 22 <210> 131 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 131 gccaacattg tccattggct tcag 24 <210> 132 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 132 Gln Ser Val Ser Ser Tyr Gly Gln Gly 1 5

Claims (92)

  1. CD38 폴리펩티드에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 결합 단백질로서, 상기 항원 결합 부위가 하기를 포함하는 결합 단백질:
    (a) GYTFTSFN(서열 번호 31) 또는 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32) 또는 IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인; 및
    (b) ESVDSYGNGF(서열 번호 34) 또는 QSVSSYGQGF(서열 번호 39)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35) 또는 GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항원 결합 부위가 하기를 포함하는 결합 단백질:
    (a) GYTFTSFN(서열 번호 31)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인; 및
    (b) ESVDSYGNGF(서열 번호 34)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 VH 도메인이 N-말단에서 C-말단으로, 서열, FR1―CDR-H1―FR2―CDR-H2―FR3―CDR-H3―FR4를 포함하며; FR1이 서열 QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKAS(서열 번호 86), QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKAS(서열 번호 87), 또는 QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKAS(서열 번호 88)를 포함하며; FR2가 서열 MHWVKEAPGQRLEWIGY(서열 번호 90) 또는 MHWVKEAPGQGLEWIGY(서열 번호 91)를 포함하며; FR3이 서열 NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFC(서열 번호 93) 또는 NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFC(서열 번호 94)를 포함하며; FR4가 서열 WGQGTLVTVSS(서열 번호 96)를 포함하는 결합 단백질.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 VH 도메인이 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL 도메인이 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 결합 단백질.
  5. 제4항에 있어서, 상기 결합 단백질이 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 및 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 포함하는 결합 단백질.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 VH 도메인이 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL 도메인이 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 결합 단백질.
  7. 제6항에 있어서, 상기 결합 단백질이 서열 번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 포함하는 결합 단백질
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 VH 도메인이 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL 도메인이 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 결합 단백질.
  9. 제8항에 있어서, 상기 결합 단백질이 서열 번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 포함하는 결합 단백질.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 VH 도메인이 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL 도메인이 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 결합 단백질.
  11. 제10항에 있어서, 상기 결합 단백질이 서열 번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 및 서열 번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 포함하는 결합 단백질.
  12. 제1항에 있어서, 상기 항원 결합 부위가 하기를 포함하는 결합 단백질:
    (a) GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인; 및
    (b) QSVSSYGQGF(서열 번호 39)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인.
  13. 제1항 또는 제12항에 있어서, 상기 VH 도메인이 N-말단에서 C-말단으로, 서열, FR1―CDR-H1―FR2―CDR-H2―FR3―CDR-H3―FR4를 포함하며; FR1이 서열 QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKAS(서열 번호 86), QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKAS(서열 번호 87), 또는 QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKAS(서열 번호 88)를 포함하며; FR2가 서열 MHWVKEAPGQRLEWIGY(서열 번호 90) 또는 MHWVKEAPGQGLEWIGY(서열 번호 91)를 포함하며; FR3이 서열 NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFC(서열 번호 93) 또는 NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFC(서열 번호 94)를 포함하며; FR4가 서열 WGQGTLVTVSS(서열 번호 96)를 포함하는 결합 단백질.
  14. 제1항 또는 제12항에 있어서, 상기 VH 도메인이 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL 도메인이 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 결합 단백질.
  15. 제14항에 있어서, 상기 결합 단백질이 서열 번호 15의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 및 서열 번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 포함하는 결합 단백질.
  16. CD38 폴리펩티드에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 결합 단백질로서, 상기 항원 결합 부위가 하기를 포함하는 결합 단백질:
    (a) GFTFSSYG(서열 번호 41)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IWYDGSNK(서열 번호 42)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARMFRGAFDY(서열 번호 43)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하는 항체 중쇄 가변(VH) 도메인; 및
    (b) QGIRND(서열 번호 44)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, AAS(서열 번호 45)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 LQDYIYYPT(서열 번호 46)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하는 항체 경쇄 가변(VL) 도메인.
  17. 제16항에 있어서, 상기 VH 도메인이 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL 도메인이 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 결합 단백질.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 결합 단백질이 서열 번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 항체 중쇄 및 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 항체 경쇄를 포함하는 결합 단백질.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 부위가 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인 및 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인과 교차-반응하는 결합 단백질.
  20. 제19항에 있어서, 상기 항원 결합 부위가 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD38 폴리펩티드에 결합하는 결합 단백질.
  21. 제20항에 있어서, 상기 항원 결합 부위가 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD38 폴리펩티드에 2.1 nM 이하의 평형 해리 상수(KD)로 결합하는 결합 단백질.
  22. 제19항에 있어서, 상기 항원 결합 부위가 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 인간 아이소폼 E CD38 폴리펩티드에 결합하는 결합 단백질.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 부위가 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드에 결합하는 결합 단백질.
  24. 제23항에 있어서, 상기 항원 결합 부위가 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드에 1.3 nM 이하의 평형 해리 상수(KD)로 결합하는 결합 단백질.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 키메라 또는 인간화된 항체인 결합 단백질.
  26. 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 인간 항체인 결합 단백질.
  27. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 단클론 항체인 결합 단백질.
  28. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 Fc 영역을 포함하는 하나 이상의 전장 항체 중쇄를 포함하는 결합 단백질.
  29. 제28항에 있어서, 상기 Fc 영역이 상기 Fc 영역의 Fc 수용체 결합 및/또는 이펙터 기능을 감소시키거나 제거하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 인간 Fc 영역인 결합 단백질.
  30. 제28항에 있어서, 상기 Fc 영역이 인간 IgG1 Fc 영역인 결합 단백질.
  31. 제30항에 있어서, 상기 인간 IgG1 Fc 영역이 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1의 위치 234, 235 및 329에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환이 L234A, L235A 및 P329A인 결합 단백질.
  32. 제30항에 있어서, 상기 인간 IgG1 Fc 영역이 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1의 위치 298, 299 및 300에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환이 S298N, T299A 및 Y300S인 결합 단백질.
  33. 제28항에 있어서, 상기 Fc 영역이 인간 IgG4 Fc 영역인 결합 단백질.
  34. 제33항에 있어서, 상기 인간 IgG4 Fc 영역이 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 228 및 409에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환이 S228P 및 R409K인 결합 단백질.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 인간 IgG4 Fc 영역이 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 234 및 235에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환이 F234A 및 L235A인 결합 단백질.
  36. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 인간 IgG4 Fc 영역이 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 233 내지 236에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환이 E233P, F234V, L235A, 및 236에서의 결실인 결합 단백질.
  37. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 항체 F(ab), F(ab')2, Fab'-SH, Fv 또는 scFv 단편을 포함하는 결합 단백질.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 세포독성제 또는 표지에 컨쥬게이트된 결합 단백질.
  39. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 CD38 폴리펩티드에 결합하는 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위를 포함하는 2특이성 결합 단백질인 결합 단백질.
  40. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 CD38 폴리펩티드에 결합하는 제1 항원 결합 부위, 제2 항원 결합 부위 및 제3 항원 결합 부위를 포함하는 3특이성 결합 단백질인 결합 단백질.
  41. 제40항에 있어서, 상기 제1 항원 결합 부위가 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합하며, 상기 제2 및 제3 항원 결합 부위가 각각 T-세포 표면 단백질에 결합하는 결합 단백질.
  42. 제41항에 있어서, 상기 제1 항원 결합 부위가 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합하며, (a) 상기 제2 항원 결합 부위가 인간 CD28 폴리펩티드에 결합하며, 상기 제3 항원 결합 부위가 인간 CD3 폴리펩티드에 결합하거나, 또는 (b) 상기 제2 항원 결합 부위가 인간 CD3 폴리펩티드에 결합하며, 상기 제3 항원 결합 부위가 인간 CD28 폴리펩티드에 결합하는 결합 단백질.
  43. 하나 이상의 표적 단백질에 각각 결합하는 3개의 항원 결합 부위를 포함하는 결합 단백질로서, 상기 3개의 항원 결합 부위 중 적어도 하나가 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인 및 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인과 교차-반응하는 결합 단백질.
  44. 제43항에 있어서, 상기 결합 단백질이 서열 번호 1 또는 서열 번호 105의 아미노산 서열을 포함하는 인간 CD38 폴리펩티드와 교차-반응하는 결합 단백질.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 상기 결합 단백질이 서열 번호 30의 아미노산 서열을 포함하는 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드와 교차-반응하는 결합 단백질.
  46. 제43항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인 및 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인과 교차-반응하는 항원 결합 부위 및 T-세표 표면 단백질에 각각 결합하는 2개의 항원 결합 부위를 포함하는 결합 단백질.
  47. 제46항에 있어서, 상기 결합 단백질이 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인 및 시노몰구스 원숭이 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인과 교차-반응하는 항원 결합 부위, 인간 CD28 폴리펩티드에 결합하는 항원 결합 부위 및 인간 CD3 폴리펩티드에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 결합 단백질.
  48. 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 3개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 제1 폴리펩티드 사슬이 하기 화학식 I:
    [화학식 I]
    Figure pct00101
    로 표시되는 구조를 포함하며;
    제2 폴리펩티드 사슬이 하기 화학식 II:
    [화학식 II]
    Figure pct00102
    로 표시되는 구조를 포함하며;
    제3 폴리펩티드 사슬이 하기 화학식 III:
    [화학식 III]
    Figure pct00103
    로 표시되는 구조를 포함하며;
    제4 폴리펩티드 사슬이 하기 화학식 IV:
    [화학식 IV]
    Figure pct00104
    로 표시되는 구조를 포함하며;
    VL1이 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
    VL2가 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
    VL3이 제3 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
    VH1이 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
    VH2가 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
    VH3이 제3 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
    CL이 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이며;
    CH1이 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 도메인이며;
    CH2가 면역글로불린 CH2 중쇄 불변 도메인이며;
    CH3이 면역글로불린 CH3 중쇄 불변 도메인이며;
    힌지가 CH1 및 CH2 도메인을 연결하는 면역글로불린 힌지 영역이며;
    L1, L2, L3 및 L4가 아미노산 링커이며;
    상기 화학식 I의 폴리펩티드와 상기 화학식 II의 폴리펩티드가 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성하며,
    (a) 상기 VH1 도메인이 GYTFTSFN(서열 번호 31) 또는 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32) 또는 IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, 상기 VL1 도메인이 ESVDSYGNGF(서열 번호 34) 또는 QSVSSYGQGF(서열 번호 39)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35) 또는 GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하거나;
    (b) 상기 VH2 도메인이 GYTFTSFN(서열 번호 31) 또는 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32) 또는 IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, 상기 VL2 도메인이 ESVDSYGNGF(서열 번호 34) 또는 QSVSSYGQGF(서열 번호 39)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35) 또는 GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하거나;
    (c) 상기 VH3 도메인이 GYTFTSFN(서열 번호 31) 또는 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32) 또는 IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, 상기 VL3 도메인이 ESVDSYGNGF(서열 번호 34) 또는 QSVSSYGQGF(서열 번호 39)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35) 또는 GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하는 결합 단백질.
  49. 제48항에 있어서,
    (a) 상기 VH1 도메인이 GYTFTSFN(서열 번호 31)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, 상기 VL1 도메인이 ESVDSYGNGF(서열 번호 34)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하거나;
    (b) 상기 VH1 도메인이 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, 상기 VL1 도메인이 QSVSSYGQGF(서열 번호 39)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하거나;
    (c) 상기 VH2 도메인이 GYTFTSFN(서열 번호 31)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, 상기 VL2 도메인이 ESVDSYGNGF(서열 번호 34)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하거나;
    (d) 상기 VH2 도메인이 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, 상기 VL2 도메인이 QSVSSYGQGF(서열 번호 39)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하거나;
    (e) 상기 VH3 도메인이 GYTFTSFN(서열 번호 31)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, 상기 VL3 도메인이 ESVDSYGNGF(서열 번호 34)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하거나; 또는
    (h) 상기 VH3 도메인이 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, 상기 VL3 도메인이 QSVSSYGQGF(서열 번호 39)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하는 결합 단백질.
  50. 제49항에 있어서,
    (a) 상기 VH3 도메인이 GYTFTSFN(서열 번호 31)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGNGGT(서열 번호 32)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, 상기 VL3 도메인이 ESVDSYGNGF(서열 번호 34)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, LAS(서열 번호 35)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하거나; 또는
    (b) 상기 VH3 도메인이 GYTFTSYA(서열 번호 37)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IYPGQGGT(서열 번호 38)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARTGGLRRAYFTY(서열 번호 33)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, 상기 VL3 도메인이 QSVSSYGQGF(서열 번호 39)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, GAS(서열 번호 40)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 QQNKEDPWT(서열 번호 36)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하는 결합 단백질.
  51. 제50항에 있어서,
    (a) 상기 VH3 도메인이 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL3 도메인이 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (b) 상기 VH3 도메인이 서열 번호 17의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL3 도메인이 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (c) 상기 VH3 도메인이 서열 번호 21의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL3 도메인이 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (d) 상기 VH3 도메인이 서열 번호 23의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL3 도메인이 서열 번호 18의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (e) 상기 VH3 도메인이 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL3 도메인이 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하는 결합 단백질.
  52. 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질이 3개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 제1 폴리펩티드 사슬이 하기 화학식 I:
    [화학식 I]
    Figure pct00105
    로 표시되는 구조를 포함하며;
    제2 폴리펩티드 사슬이 하기 화학식 II:
    [화학식 II]
    Figure pct00106
    로 표시되는 구조를 포함하며;
    제3 폴리펩티드 사슬이 하기 화학식 III:
    [화학식 III]
    Figure pct00107
    로 표시되는 구조를 포함하며;
    제4 폴리펩티드 사슬이 하기 화학식 IV:
    [화학식 IV]
    Figure pct00108
    로 표시되는 구조를 포함하며;
    VL1이 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
    VL2가 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
    VL3이 제3 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
    VH1이 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
    VH2가 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
    VH3이 제3 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
    CL이 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이며;
    CH1이 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 도메인이며;
    CH2가 면역글로불린 CH2 중쇄 불변 도메인이며;
    CH3이 면역글로불린 CH3 중쇄 불변 도메인이며;
    힌지가 CH1 및 CH2 도메인을 연결하는 면역글로불린 힌지 영역이며;
    L1, L2, L3 및 L4가 아미노산 링커이며;
    상기 화학식 I의 폴리펩티드와 상기 화학식 II의 폴리펩티드가 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성하며,
    (a) 상기 VH1 도메인이 GFTFSSYG(서열 번호 41)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IWYDGSNK(서열 번호 42)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARMFRGAFDY(서열 번호 43)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, 상기 VL1 도메인이 QGIRND(서열 번호 44)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, AAS(서열 번호 45)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 LQDYIYYPT(서열 번호 46)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하거나;
    (b) 상기 VH2 도메인이 GFTFSSYG(서열 번호 41)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IWYDGSNK(서열 번호 42)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARMFRGAFDY(서열 번호 43)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, 상기 VL2 도메인이 QGIRND(서열 번호 44)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, AAS(서열 번호 45)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 LQDYIYYPT(서열 번호 46)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하거나; 또는
    (c) 상기 VH3 도메인이 GFTFSSYG(서열 번호 41)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IWYDGSNK(서열 번호 42)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARMFRGAFDY(서열 번호 43)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, 상기 VL3 도메인이 QGIRND(서열 번호 44)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, AAS(서열 번호 45)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 LQDYIYYPT(서열 번호 46)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하는 결합 단백질.
  53. 제52항에 있어서, 상기 VH3 도메인이 GFTFSSYG(서열 번호 41)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1 서열, IWYDGSNK(서열 번호 42)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 서열 및 ARMFRGAFDY(서열 번호 43)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3 서열을 포함하며, 상기 VL3 도메인이 QGIRND(서열 번호 44)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1 서열, AAS(서열 번호 45)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 서열 및 LQDYIYYPT(서열 번호 46)의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3 서열을 포함하는 결합 단백질.
  54. 제53항에 있어서, 상기 VH3 도메인이 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL3 도메인이 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 결합 단백질.
  55. 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 상기 VH1 도메인이 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL1 도메인이 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VH2 도메인이 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL2 도메인이 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (b) 상기 VH2 도메인이 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL2 도메인이 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VH1 도메인이 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL1 도메인이 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (c) 상기 VH1 도메인이 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL1 도메인이 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VH2 도메인이 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL2 도메인이 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (d) 상기 VH2 도메인이 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL2 도메인이 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VH1 도메인이 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL1 도메인이 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하거나
    (e) 상기 VH1 도메인이 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL1 도메인이 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VH2 도메인이 서열 번호 84의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL2 도메인이 서열 번호 85의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (f) 상기 VH2 도메인이 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL2 도메인이 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VH1 도메인이 서열 번호 84의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL1 도메인이 서열 번호 85의 아미노산 서열을 포함하거나;
    (g) 상기 VH1 도메인이 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL1 도메인이 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VH2 도메인이 서열 번호 84의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL2 도메인이 서열 번호 85의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (h) 상기 VH2 도메인이 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL2 도메인이 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VH1 도메인이 서열 번호 84의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL1 도메인이 서열 번호 85의 아미노산 서열을 포함하는 결합 단백질.
  56. 제55항에 있어서,
    (a) 상기 VH1 도메인이 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL1 도메인이 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VH2 도메인이 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL2 도메인이 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VH3 도메인이 서열 번호 13의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL3 도메인이 서열 번호 14의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (b) 상기 VH1 도메인이 서열 번호 49의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL1 도메인이 서열 번호 50의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VH2 도메인이 서열 번호 53의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL2 도메인이 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VH3 도메인이 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 VL3 도메인이 서열 번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 결합 단백질.
  57. 제48항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, L1, L2, L3 또는 L4 중 적어도 하나는 독립적으로 길이가 0개 아미노산인 결합 단백질.
  58. 제48항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, L1, L2, L3 또는 L4는 각각 독립적으로 길이가 적어도 1개의 아미노산인 결합 단백질.
  59. 제48항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, (a) L1, L2, L3 및 L4는 각각 독립적으로 길이가 0개의 아미노산이거나, GGGGSGGGGS(서열 번호 55), GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 56), S, RT, TKGPS(서열 번호 57), GQPKAAP(서열 번호 58) 및 GGSGSSGSGG(서열 번호 59)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하거나; 또는 (b) L1, L2, L3 및 L4는 각각 독립적으로 GGGGSGGGGS(서열 번호 55), GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 56), S, RT, TKGPS(서열 번호 57), GQPKAAP(서열 번호 58) 및 GGSGSSGSGG(서열 번호 59)로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 결합 단백질.
  60. 제48항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) L1은 서열 GQPKAAP(서열 번호 58)를 포함하며, L2는 서열 TKGPS(서열 번호 57)를 포함하며, L3은 서열 S를 포함하며, L4는 서열 RT를 포함하거나;
    (b) L1은 서열 GGGGSGGGGS(서열 번호 55)를 포함하며, L2는 서열 GGGGSGGGGS(서열 번호 55)를 포함하며, L3은 길이가 0개의 아미노산이며, L4는 길이가 0개의 아미노산이거나;
    (c) L1은 서열 GGSGSSGSGG(서열 번호 59)를 포함하며, L2는 서열 GGSGSSGSGG(서열 번호 59)를 포함하며, L3은 길이가 0개의 아미노산이며, L4는 길이가 0개의 아미노산이거나; 또는
    (d) L1은 서열 GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 56)를 포함하며, L2는 길이가 0개의 아미노산이며, L3은 서열 GGGGSGGGGSGGGGS(서열 번호 56)를 포함하며, L4는 길이가 0개의 아미노산인 결합 단백질.
  61. 제48항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 및 제3 폴리펩티드 사슬의 힌지-CH2-CH3 도메인이 인간 IgG4 힌지-CH2-CH3 도메인이며, 상기 힌지-CH2-CH3 도메인이 각각 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 234 및 235에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환이 F234A 및 L235A인 결합 단백질.
  62. 제48항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 및 제3 폴리펩티드 사슬의 힌지-CH2-CH3 도메인이 인간 IgG4 힌지-CH2-CH3 도메인이며, 상기 힌지-CH2-CH3 도메인이 각각 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 233 내지 236에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환이 E233P, F234V, L235A, 및 236에서의 결실인 결합 단백질.
  63. 제48항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 및 제3 폴리펩티드 사슬의 힌지-CH2-CH3 도메인이 인간 IgG4 힌지-CH2-CH3 도메인이며, 상기 힌지-CH2-CH3 도메인이 각각 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 228 및 409에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환이 S228P 및 R409K인 결합 단백질.
  64. 제48항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 및 제3 폴리펩티드 사슬의 힌지-CH2-CH3 도메인이 인간 IgG1 힌지-CH2-CH3 도메인이며, 상기 힌지-CH2-CH3 도메인이 각각 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1의 위치 234, 235 및 329에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환이 L234A, L235A 및 P329A인 결합 단백질.
  65. 제48항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 및 제3 폴리펩티드 사슬의 힌지-CH2-CH3 도메인이 인간 IgG1 힌지-CH2-CH3 도메인이며, 상기 힌지-CH2-CH3 도메인이 각각 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1의 위치 298, 299 및 300에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환이 S298N, T299A 및 Y300S인 결합 단백질.
  66. 제48항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 폴리펩티드 사슬의 힌지-CH2-CH3 도메인이 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 349, 366, 368 및 407에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환이 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V이며; 상기 제3 폴리펩티드 사슬의 힌지-CH2-CH3 도메인이 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 354 및 366에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환이 S354C 및 T366W인 결합 단백질.
  67. 제48항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 폴리펩티드 사슬의 힌지-CH2-CH3 도메인이 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 354 및 366에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환이 S354C 및 T366W이며; 상기 제3 폴리펩티드 사슬의 힌지-CH2-CH3 도메인이 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1 또는 IgG4의 위치 349, 366, 368 및 407에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환이 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V인 결합 단백질.
  68. 제48항 또는 제52항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제3 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 62의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제4 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 결합 단백질.
  69. 제48항 또는 제52항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제3 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 65의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제4 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 결합 단백질.
  70. 제48항 또는 제52항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제3 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 67의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제4 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 63의 아미노산 서열을 포함하는 결합 단백질.
  71. 제48항 또는 제52항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 60의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제3 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 68의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제4 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 결합 단백질.
  72. 제48항 또는 제52항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 64의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제3 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 70의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제4 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 결합 단백질.
  73. 제48항 또는 제52항에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 61의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제2 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 66의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제3 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 71의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제4 폴리펩티드 사슬은 서열 번호 69의 아미노산 서열을 포함하는 결합 단백질.
  74. 하나 이상의 표적 단백질에 각각 결합하는 3개의 항원 결합 부위를 포함하는 결합 단백질로서, 상기 결합 단백질이 상기 3개의 항원 결합 부위를 형성하는 4개의 폴리펩티드 사슬을 포함하며, 제1 폴리펩티드 사슬이 하기 화학식 I:
    [화학식 I]
    Figure pct00109
    로 표시되는 구조를 포함하며;
    제2 폴리펩티드 사슬이 하기 화학식 II:
    [화학식 II]
    Figure pct00110
    로 표시되는 구조를 포함하며;
    제3 폴리펩티드 사슬이 하기 화학식 III:
    [화학식 III]
    Figure pct00111
    로 표시되는 구조를 포함하며;
    제4 폴리펩티드 사슬이 하기 화학식 IV:
    [화학식 IV]
    Figure pct00112
    로 표시되는 구조를 포함하며;
    VL1이 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
    VL2가 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
    VL3이 제3 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며;
    VH1이 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
    VH2가 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
    VH3이 제3 면역글로불린 중쇄 가변 도메인이며;
    CL이 면역글로불린 경쇄 불변 도메인이며;
    CH1이 면역글로불린 CH1 중쇄 불변 도메인이며;
    CH2가 면역글로불린 CH2 중쇄 불변 도메인이며;
    CH3이 면역글로불린 CH3 중쇄 불변 도메인이며;
    힌지가 CH1 및 CH2 도메인을 연결하는 면역글로불린 힌지 영역이며;
    L1, L2, L3 및 L4가 아미노산 링커이며;
    상기 화학식 I의 폴리펩티드와 상기 화학식 II의 폴리펩티드가 교차 경쇄-중쇄 쌍을 형성하며,
    (a) 상기 제2 및 제3 폴리펩티드 사슬의 힌지-CH2-CH3 도메인이 인간 IgG1 힌지-CH2-CH3 도메인이며, 상기 힌지-CH2-CH3 도메인이 각각 EU 인덱스에 따른 인간 IgG1의 위치 298, 299 및 300에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환이 S298N, T299A 및 Y300S이거나; 또는
    (b) 상기 제2 및 제3 폴리펩티드 사슬의 힌지-CH2-CH3 도메인이 인간 IgG4 CH3 도메인이며, 상기 힌지-CH2-CH3 도메인이 각각 EU 인덱스에 따른 인간 IgG4의 위치 233 내지 236에 상응하는 위치에서의 아미노산 치환을 포함하며, 상기 아미노산 치환이 E233P, F234V, L235A, 및 236에서의 결실인 결합 단백질.
  75. 제74항에 있어서, VH1 및 VL1, VH2 및 VL2, 및 VH3 및 VL3 중 적어도 하나의 쌍이 CD38 폴리펩티드에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하는 결합 단백질.
  76. 제74항에 있어서, VH1 및 VL1, VH2 및 VL2, 및 VH3 및 VL3 중 1개, 2개 또는 3개의 쌍이 A2AR, APRIL, ATPDase, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4, B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL15, CCL17, CCL19, CCL20, CCL21, CCL24, CCL25, CCL26, CCR3, CCR4, CD3, CD19, CD20, CD23, CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80, CD86, CD122, CD137, CD137L, CD152, CD154, CD160, CD272, CD273, CD274, CD275, CD276, CD278, CD279, CDH1, 키티나제, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1, CSF-2, CSF-3, CX3CL1, CXCL12, CXCL13, CXCR3, DNGR-1, 엑토뉴클레오시드 트리포스페이트 디포스포하이드롤라제 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNα, IgE, IGF1R, IL2R베타, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb, IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4, ITK, KIR, LAG3, LAMP1, 렙틴, LPFS2, MHC 부류 II, NCR3LG1, NKG2D, NTPDase-1, OX40, OX40L, PD-1H, 혈소판 수용체, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2, STEAP2, Syk 키나제, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP, TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM 및 XCR1로 이루어진 군으로부터 선택되는 항원 표적에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하는 결합 단백질.
  77. 제74항에 있어서, VH1 및 VL1, VH2 및 VL2, 및 VH3 및 VL3 중 제1 쌍이 인간 CD3 폴리펩티드에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하며, VH1 및 VL1, VH2 및 VL2, 및 VH3 및 VL3 중 제2 쌍이 인간 CD28 폴리펩티드에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하며, VH1 및 VL1, VH2 및 VL2, 및 VH3 및 VL3 중 제3 쌍이 A2AR, APRIL, ATPDase, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4, B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL15, CCL17, CCL19, CCL20, CCL21, CCL24, CCL25, CCL26, CCR3, CCR4, CD3, CD19, CD20, CD23, CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80, CD86, CD122, CD137, CD137L, CD152, CD154, CD160, CD272, CD273, CD274, CD275, CD276, CD278, CD279, CDH1, 키티나제, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1, CSF-2, CSF-3, CX3CL1, CXCL12, CXCL13, CXCR3, DNGR-1, 엑토뉴클레오시드 트리포스페이트 디포스포하이드롤라제 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNα, IgE, IGF1R, IL2R베타, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb, IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4, ITK, KIR, LAG3, LAMP1, 렙틴, LPFS2, MHC 부류 II, NCR3LG1, NKG2D, NTPDase-1, OX40, OX40L, PD-1H, 혈소판 수용체, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2, STEAP2, Syk 키나제, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP, TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM 및 XCR1로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 항원 표적에 결합하는 항원 결합 부위를 형성하는 결합 단백질.
  78. 하기를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 키트:
    (a) 서열 번호 73의 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 72의 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 74의 서열을 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 75의 서열을 포함하는 제4 폴리뉴클레오티드;
    (b) 서열 번호 73의 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 76의 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 77의 서열을 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 75의 서열을 포함하는 제4 폴리뉴클레오티드;
    (c) 서열 번호 73의 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 78의 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 79의 서열을 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 75의 서열을 포함하는 제4 폴리뉴클레오티드;
    (d) 서열 번호 73의 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 72의 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 80의 서열을 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 81의 서열을 포함하는 제4 폴리뉴클레오티드;
    (e) 서열 번호 73의 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 76의 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 82의 서열을 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 81의 서열을 포함하는 제4 폴리뉴클레오티드; 또는
    (f) 서열 번호 73의 서열을 포함하는 제1 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 78의 서열을 포함하는 제2 폴리뉴클레오티드, 서열 번호 83의 서열을 포함하는 제3 폴리뉴클레오티드 및 서열 번호 81의 서열을 포함하는 제4 폴리뉴클레오티드.
  79. 제1항 내지 제77항 중 어느 한 항의 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  80. 제79항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  81. 제78항의 폴리뉴클레오티드의 키트, 제79항의 폴리뉴클레오티드 또는 제80항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  82. 결합 단백질의 생성 방법으로서, 상기 결합 단백질이 생성되도록 제81항의 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법.
  83. 제82항에 있어서, 상기 숙주 세포로부터 상기 결합 단백질을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  84. 제1항 내지 제77항 중 어느 한 항의 결합 단백질 및 제약상 허용 가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
  85. 치료적 유효량의 제1항 내지 제73항 중 어느 한 항의 적어도 하나의 결합 단백질 또는 제84항의 제약 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 환자에서의 암의 예방 및/또는 치료 방법.
  86. 제85항에 있어서, 상기 결합 단백질이 T-세포 표면 단백질에 결합하는 하나의 항원 결합 부위 및 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합하는 또 다른 항원 결합 부위를 포함하는 방법.
  87. 제86항에 있어서, 상기 결합 단백질이 CD3에 결합하는 제1 항원 결합 부위, CD28에 결합하는 제2 항원 결합 부위 및 인간 CD38 폴리펩티드의 세포외 도메인에 결합하는 제3 항원 결합 부위를 포함하는 3특이성 결합 단백질인 방법.
  88. 제85항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 결합 단백질이 화학치료제와 동시-투여되는 방법.
  89. 제85항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 다발성 골수종인 방법.
  90. 제85항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 또는 B 세포 림프종인 방법.
  91. 제85항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자가 인간인 방법.
  92. 제85항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자는 암의 세포가 이의 세포 표면 상에 인간 CD38 아이소폼 E 폴리펩티드를 발현하기 때문에 치료를 위해 선택되는 방법.
KR1020207013073A 2017-10-10 2018-10-09 항-cd38 항체 및 항-cd3 및 항-cd28 항체와의 조합 Pending KR20200061402A (ko)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762570655P 2017-10-10 2017-10-10
US62/570,655 2017-10-10
US201762570660P 2017-10-11 2017-10-11
US62/570,660 2017-10-11
US201862676221P 2018-05-24 2018-05-24
US62/676,221 2018-05-24
EP18187186 2018-08-03
EP18187186.4 2018-08-03
PCT/US2018/055084 WO2019074973A2 (en) 2017-10-10 2018-10-09 ANTI-CD38 ANTIBODIES AND METHODS OF USE

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20200061402A true KR20200061402A (ko) 2020-06-02

Family

ID=63963620

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207013073A Pending KR20200061402A (ko) 2017-10-10 2018-10-09 항-cd38 항체 및 항-cd3 및 항-cd28 항체와의 조합

Country Status (20)

Country Link
US (3) US11186649B2 (ko)
EP (2) EP3694882B1 (ko)
JP (4) JP7036909B2 (ko)
KR (1) KR20200061402A (ko)
CN (4) CN120058938A (ko)
AR (1) AR116718A1 (ko)
AU (1) AU2018348093A1 (ko)
BR (1) BR112020007002A2 (ko)
CA (1) CA3078800A1 (ko)
ES (1) ES2986579T3 (ko)
IL (1) IL273871A (ko)
MA (1) MA50359A (ko)
MX (1) MX2020004129A (ko)
MY (1) MY199781A (ko)
PH (1) PH12020550408A1 (ko)
PY (1) PY1888702A (ko)
SG (1) SG11202003212PA (ko)
TW (4) TW202432580A (ko)
UY (1) UY37928A (ko)
WO (1) WO2019074973A2 (ko)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1914242A1 (en) * 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
TWI588156B (zh) * 2011-03-28 2017-06-21 賽諾菲公司 具有交叉結合區定向之雙重可變區類抗體結合蛋白
US12466897B2 (en) 2011-10-10 2025-11-11 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
CN105051069B (zh) 2013-01-14 2019-12-10 Xencor股份有限公司 新型异二聚体蛋白
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
CA2967426A1 (en) 2014-11-26 2016-06-02 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and tumor antigens
BR112017011166A2 (pt) 2014-11-26 2018-02-27 Xencor, Inc. anticorpos heterodiméricos que se ligam a cd3 e cd38
MY191964A (en) * 2015-01-23 2022-07-21 Sanofi Sa Anti-cd3 antibodies, anti-cd123 antibodies and bispecific antibodies specifically binding to cd3 and/or cd123
MX2018005048A (es) 2015-10-25 2018-09-06 Sanofi Sa Proteinas de union triespecificas y/o trivalantes para la prevencion o el tratamiento de la infeccion por vih.
BR112018070998A2 (pt) 2016-04-13 2019-02-26 Sanofi proteínas de ligação triespecíficas e/ou trivalentes
SI3443006T1 (sl) 2016-04-13 2024-01-31 Sanofi Trispecifični in/ali trivalentni vezni proteini
MX2018016265A (es) 2016-06-28 2019-07-04 Xencor Inc Anticuerpos heterodimericos que se unen al receptor 2 de somatostatina.
BR112019012354A2 (pt) 2016-12-21 2019-11-26 Teneobio, Inc. anticorpos apenas de cadeia pesada anti-bcma
CN110891971B (zh) 2017-06-20 2024-01-12 特尼奥生物股份有限公司 仅有重链的抗bcma抗体
CN120058938A (zh) * 2017-10-10 2025-05-30 赛诺菲 抗cd38抗体及与抗cd3和抗cd28抗体的组合
KR20200085828A (ko) 2017-11-08 2020-07-15 젠코어 인코포레이티드 신규의 항-pd-1 서열을 사용한 이중특이적 및 단일특이적 항체
EP3773911A2 (en) 2018-04-04 2021-02-17 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
MA52366A (fr) 2018-04-25 2021-03-03 Prometheus Biosciences Inc Anticorps anti-tl1a optimisés
MX2021004147A (es) * 2018-10-09 2021-09-08 Sanofi Sa Proteínas de unión triespecíficas anti-cd38, anti-cd28 y anti-cd3 y métodos de uso para tratar una infección viral.
AU2020252556B2 (en) 2019-04-05 2026-02-05 Teneobio, Inc. Heavy chain antibodies binding to PSMA
US11613576B2 (en) 2019-04-09 2023-03-28 Sanofi Trispecific binding proteins, methods, and uses thereof
CN113950484B (zh) * 2019-04-09 2025-07-29 赛诺菲 三特异性结合蛋白、其方法和用途
WO2021003074A1 (en) * 2019-07-03 2021-01-07 Crystal Bioscience Inc. Anti-cd38 antibody and methods of use thereof
CN118924895A (zh) * 2019-08-30 2024-11-12 蜻蜓疗法股份有限公司 用于癌症治疗的结合her2、nkg2d和cd16的多特异性结合蛋白的药物制剂和剂量方案
PH12022550978A1 (en) 2019-10-24 2023-10-09 Cedars Sinai Medical Center Humanized antibodies to tnf-like ligand 1a (tl1a) and uses thereof
EP4048690A1 (en) 2019-10-25 2022-08-31 Sanofi Methods for analyzing chain mispairing in multispecific binding proteins
CN112876563B (zh) * 2019-11-29 2022-08-16 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 药物组合物及其制备方法和应用
MX2022013453A (es) 2020-04-29 2022-11-16 Teneobio Inc Anticuerpos de cadena pesada multiespecificos con regiones constantes de cadena pesada modificadas.
UY40898A (es) * 2020-04-29 2024-10-15 Teneobio Inc Anticuerpos de cadena pesada multiespecíficos con regiones constantes de cadena pesada modificadas
US11919956B2 (en) 2020-05-14 2024-03-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (PSMA) and CD3
JP7773528B2 (ja) 2020-08-19 2025-11-19 ゼンコア インコーポレイテッド 抗ｃｄ２８組成物
CN116348495A (zh) * 2020-09-18 2023-06-27 瑞泽恩制药公司 结合cd38和/或cd28的抗原结合分子及其用途
CA3172530A1 (en) 2021-02-25 2022-09-01 Spencer PARK Ror1 targeting chimeric antigen receptor
CA3212665A1 (en) 2021-03-09 2022-09-15 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6
KR20230154311A (ko) 2021-03-10 2023-11-07 젠코어 인코포레이티드 Cd3 및 gpc3에 결합하는 이종이량체 항체
TW202325743A (zh) * 2021-07-14 2023-07-01 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 特異性結合ｃｄ３８、ｂｃｍａ和ｃｄ３的抗原結合分子及其醫藥用途
US20250277051A1 (en) * 2021-08-02 2025-09-04 Hangzhou Unogen Biotech, Ltd Anti-cd38 antibodies, anti-cd3 antibodies, and bispecific antibodies, and uses thereof
WO2023021477A1 (en) * 2021-08-20 2023-02-23 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor–expressing cells
US12365743B2 (en) 2022-02-23 2025-07-22 Xencor, Inc. Anti-CD28 x anti-PSMA antibodies
JP2025522482A (ja) 2022-06-17 2025-07-15 アポジー バイオロジクス， インコーポレイテッド インターロイキン１３に結合する抗体及び使用方法
CN119487071A (zh) * 2022-06-24 2025-02-18 北京可瑞生物科技有限公司 基于t细胞受体的双特异性多肽分子及其用途
EP4688860A2 (en) * 2023-03-28 2026-02-11 Nkarta, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for cd38
WO2025027003A1 (en) 2023-07-31 2025-02-06 Sanofi Methods and uses for anti-cd38 t cell engagers in treatment of peripheral t-cell lymphomas
WO2025209594A1 (zh) * 2024-04-06 2025-10-09 华深智药生物科技(苏州)有限公司 一种抗gucy2c抗体及其多特异性抗体的用途
WO2025209593A1 (zh) * 2024-04-06 2025-10-09 华深智药生物科技(苏州)有限公司 一种多特异性抗体t细胞衔接器
WO2026019667A1 (en) * 2024-07-17 2026-01-22 Jn Biosciences Llc Trispecific antibodies for activation of immune cells

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2058199T3 (es) 1987-09-23 1994-11-01 Bristol Myers Squibb Co Heteroconjugados de anticuerpos para la eliminacion de celulas infectadas por el vih.
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
DE69937291T2 (de) 1998-04-02 2008-07-10 Genentech, Inc., South San Francisco Antikörpervarianten und fragmente davon
CN1294148C (zh) 2001-04-11 2007-01-10 中国科学院遗传与发育生物学研究所 环状单链三特异抗体
EP2395016A3 (en) * 2003-05-30 2012-12-19 Merus B.V. Design and use of paired variable regions of specific binding molecules
US20050163782A1 (en) * 2003-06-27 2005-07-28 Biogen Idec Ma Inc. Modified binding molecules comprising connecting peptides
US9200061B2 (en) * 2004-02-06 2015-12-01 Morpho Sys AG Generation and profiling of fully human HuCAL gold®-derived therapeutic antibodies specific for human CD3i
NZ548990A (en) * 2004-02-06 2009-06-26 Morphosys Ag Anti-CD38 human antibodies and uses therefor
CN100376599C (zh) 2004-04-01 2008-03-26 北京安波特基因工程技术有限公司 基因工程重组抗cea抗cd3抗cd28线性单链三特异抗体
EP3312196B1 (en) * 2005-03-23 2019-07-17 Genmab A/S Antibodies against cd38 for treatment of multiple myeloma
US7612181B2 (en) * 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
EP1914242A1 (en) * 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
JP2011523853A (ja) 2008-06-03 2011-08-25 アボット・ラボラトリーズ 二重可変ドメイン免疫グロブリン及びその使用
EP2480572B1 (en) 2009-09-25 2019-01-30 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 and their use
EP3613774A1 (en) 2010-06-09 2020-02-26 Genmab A/S Antibodies against human cd38
JOP20210044A1 (ar) * 2010-12-30 2017-06-16 Takeda Pharmaceuticals Co الأجسام المضادة لـ cd38
TWI588156B (zh) 2011-03-28 2017-06-21 賽諾菲公司 具有交叉結合區定向之雙重可變區類抗體結合蛋白
WO2012154312A1 (en) 2011-05-09 2012-11-15 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 and their use
AU2012255266B2 (en) 2011-05-17 2017-05-25 California Institute Of Technology Human immunodeficiency virus neutralizing antibodies and methods of use thereof
RU2624046C2 (ru) 2011-11-07 2017-06-30 Дзе Юнайтед Стейтс Оф Америка, Эз Репрезентед Бай Дзе Секретэри, Департмент Оф Хелт Энд Хьюман Сервисиз Gp41-нейтрализующие антитела и их применение
CN104271597B (zh) 2011-12-08 2018-05-25 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) Hiv-1的中和抗体及其用途
EP2794658B1 (en) * 2011-12-19 2017-03-15 Synimmune GmbH Bispecific antibody molecule
WO2013163427A1 (en) 2012-04-25 2013-10-31 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Antibodies to treat hiv-1 infection
US9951106B2 (en) 2012-12-04 2018-04-24 University Of Maryland, Baltimore Recombinant fusion protein comprising HIV gp120 linked to an enhancing CD4 binding site mAb
US20140213772A1 (en) 2012-12-28 2014-07-31 Abbvie, Inc. Cross-over dual variable domain immunoglobulin constructs
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
WO2014116846A2 (en) 2013-01-23 2014-07-31 Abbvie, Inc. Methods and compositions for modulating an immune response
WO2014144299A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Abbvie Inc. DUAL SPECIFIC BINDING PROTEINS DIRECTED AGAINST TNFα
EP3066133A1 (en) * 2013-11-04 2016-09-14 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Production of t cell retargeting hetero-dimeric immunoglobulins
KR102497443B1 (ko) 2014-03-28 2023-02-08 젠코어 인코포레이티드 Cd38 및 cd3에 결합하는 이중특이적 항체
CN106687584B (zh) 2014-09-04 2021-08-13 干细胞技术公司 用于t细胞或nk细胞活化和扩增的可溶性抗体复合物
AR103268A1 (es) * 2014-12-23 2017-04-26 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos contra tigit
MY191964A (en) 2015-01-23 2022-07-21 Sanofi Sa Anti-cd3 antibodies, anti-cd123 antibodies and bispecific antibodies specifically binding to cd3 and/or cd123
WO2016196740A1 (en) 2015-06-02 2016-12-08 The Rockefeller University Tri-specific antibodies for hiv therapy
MX2018005048A (es) 2015-10-25 2018-09-06 Sanofi Sa Proteinas de union triespecificas y/o trivalantes para la prevencion o el tratamiento de la infeccion por vih.
CN105837688B (zh) 2015-11-20 2019-02-26 北京大学深圳研究生院 单域抗体及其编码基因，免疫毒素及其编码基因、制备方法、表达载体、应用，及宿主细胞
BR112018070998A2 (pt) * 2016-04-13 2019-02-26 Sanofi proteínas de ligação triespecíficas e/ou trivalentes
US12234479B2 (en) 2016-12-30 2025-02-25 Cytocares (Shanghai) Inc. Bifunctional molecule and use thereof
US10626169B2 (en) 2017-02-17 2020-04-21 Sanofi Multispecific binding molecules having specificity to dystroglycan and laminin-2
CN120058938A (zh) 2017-10-10 2025-05-30 赛诺菲 抗cd38抗体及与抗cd3和抗cd28抗体的组合
MX2021004147A (es) 2018-10-09 2021-09-08 Sanofi Sa Proteínas de unión triespecíficas anti-cd38, anti-cd28 y anti-cd3 y métodos de uso para tratar una infección viral.
US11613576B2 (en) 2019-04-09 2023-03-28 Sanofi Trispecific binding proteins, methods, and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US20220041746A1 (en) 2022-02-10
TW202432580A (zh) 2024-08-16
US20190106504A1 (en) 2019-04-11
TW201930338A (zh) 2019-08-01
AU2018348093A1 (en) 2020-05-28
US20220275102A1 (en) 2022-09-01
AR116718A1 (es) 2021-06-09
WO2019074973A2 (en) 2019-04-18
RU2020115450A (ru) 2021-11-15
TW202430563A (zh) 2024-08-01
PH12020550408A1 (en) 2021-04-12
TWI821202B (zh) 2023-11-11
CN117964758A (zh) 2024-05-03
JP2020536543A (ja) 2020-12-17
JP7733711B2 (ja) 2025-09-03
WO2019074973A3 (en) 2019-06-13
CA3078800A1 (en) 2019-04-18
MX2020004129A (es) 2020-08-20
SG11202003212PA (en) 2020-05-28
CN111788225B (zh) 2025-02-18
CN111788225A (zh) 2020-10-16
PY1888702A (es) 2020-02-07
EP4249068A3 (en) 2023-11-22
JP2025175288A (ja) 2025-12-01
JP2022071087A (ja) 2022-05-13
JP7387780B2 (ja) 2023-11-28
BR112020007002A2 (pt) 2020-11-17
ES2986579T3 (es) 2024-11-12
UY37928A (es) 2019-05-31
MA50359A (fr) 2020-08-19
IL273871A (en) 2020-05-31
EP3694882A2 (en) 2020-08-19
CN120058938A (zh) 2025-05-30
EP3694882B1 (en) 2024-06-19
MY199781A (en) 2023-11-23
TW202342544A (zh) 2023-11-01
US11365261B2 (en) 2022-06-21
JP7036909B2 (ja) 2022-03-15
JP2024020377A (ja) 2024-02-14
CN120058939A (zh) 2025-05-30
EP4249068A2 (en) 2023-09-27
US11186649B2 (en) 2021-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111788225B (zh) 抗cd38抗体及与抗cd3和抗cd28抗体的组合
CN109476732B (zh) 三特异性和/或三价结合蛋白
RU2739610C1 (ru) Антитело против PD-1 и его применение
US11945871B2 (en) Anti-BTN3A antibodies and their use in treating cancer or infectious disorders
KR20210075129A (ko) 삼중특이적 항-cd38, 항-cd28, 및 항-cd3 결합 단백질 및 바이러스 감염을 치료하기 위한 사용 방법
JP2021508676A (ja) 抗ｔｉｇｉｔ抗体並びに治療剤及び診断剤としてのその使用
KR20210149141A (ko) 삼중특이적 결합 단백질, 이의 방법 및 용도
KR20240036142A (ko) 3특이성 및/또는 3가 결합 단백질
RU2812910C2 (ru) Антитела к cd38 и комбинации с антителами к cd3 и cd28
RU2822200C2 (ru) Триспецифические связывающие белки, относящиеся к ним способы и варианты их применения
RU2820351C2 (ru) Триспецифические связывающие белки, связывающие cd38, cd28 и cd3, а также способы применения для лечения вирусной инфекции
HK40100622A (en) Anti-cd38 antibodies and combinations with anti-cd3 and anti-cd28 antibodies
WO2021175954A1 (en) Antibodies having specificity for btnl8 and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

Patent event date: 20200507

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

PG1501 Laying open of application
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20211008

Comment text: Request for Examination of Application

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20240321

Patent event code: PE09021S01D

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

Patent event code: PE07011S01D

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event date: 20241121