KR20200070405A - 암 관련 단백질로부터의 면역원성 불규칙변화성 펩타이드 및 그것의 사용 방법 - Google Patents

암 관련 단백질로부터의 면역원성 불규칙변화성 펩타이드 및 그것의 사용 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20200070405A
KR20200070405A KR1020207015786A KR20207015786A KR20200070405A KR 20200070405 A KR20200070405 A KR 20200070405A KR 1020207015786 A KR1020207015786 A KR 1020207015786A KR 20207015786 A KR20207015786 A KR 20207015786A KR 20200070405 A KR20200070405 A KR 20200070405A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
encoded
cancer
related protein
peptides shown
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
KR1020207015786A
Other languages
English (en)
Inventor
로버트 페티트
마이클 에프. 프린시오타
브랜든 코더
데이빗 발리
Original Assignee
어드박시스, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 어드박시스, 인크. filed Critical 어드박시스, 인크.
Publication of KR20200070405A publication Critical patent/KR20200070405A/ko
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001148—Regulators of development
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001148—Regulators of development
    • A61K39/00115—Apoptosis related proteins, e.g. survivin or livin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001152—Transcription factors, e.g. SOX or c-MYC
    • A61K39/001153—Wilms tumor 1 [WT1]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001154—Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001154—Enzymes
    • A61K39/001157—Telomerase or TERT [telomerase reverse transcriptase]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001166—Adhesion molecules, e.g. NRCAM, EpCAM or cadherins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001184—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001184—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A61K39/001186—MAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001184—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A61K39/001188—NY-ESO
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001184—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A61K39/001189—PRAME
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001193—Prostate associated antigens e.g. Prostate stem cell antigen [PSCA]; Prostate carcinoma tumor antigen [PCTA]; PAP or PSGR
    • A61K39/001194—Prostate specific antigen [PSA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001193—Prostate associated antigens e.g. Prostate stem cell antigen [PSCA]; Prostate carcinoma tumor antigen [PCTA]; PAP or PSGR
    • A61K39/001195—Prostate specific membrane antigen [PSMA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/07—Bacillus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y206/00—Transferases transferring nitrogenous groups (2.6)
    • C12Y206/01—Transaminases (2.6.1)
    • C12Y206/01021—D-Amino-acid transaminase (2.6.1.21), i.e. D-alanine aminotransferase/transaminase or D-aspartic aminotransferase/transaminase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y501/00—Racemaces and epimerases (5.1)
    • C12Y501/01—Racemaces and epimerases (5.1) acting on amino acids and derivatives (5.1.1)
    • C12Y501/01001—Alanine racemase (5.1.1.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본원에는 불규칙변화성 돌연변이를 포함하는 종양-관련 항원 펩타이드 및 이러한 불규칙변화성 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드가 제공된다. 또는 이러한 펩타이드 및 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 이러한 펩타이드, 융합 폴리펩타이드, 또는 핵산을 포함하는 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주, 및 이러한 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주를 포함하는 세포 은행이 제공된다. 또한 본원에는 이러한 펩타이드, 융합 폴리펩타이드, 핵산, 및 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주를 생성하는 방법이 제공된다. 또한 이러한 펩타이드, 융합 폴리펩타이드, 핵산, 또는 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 및 백신이 제공된다. 또한 대상체에서 항-종양-관련-항원 면역 반응을 유도하는 방법, 대상체에서 항-종양 또는 항-암 면역 반응을 유도하는 방법, 대상체에서 종양 또는 암을 치료하는 방법, 대상체에서 종양 또는 암을 예방하는 방법, 및 이러한 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 핵산, 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주, 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신을 사용하여 종양 또는 암에 대해 대상체를 보호하는 방법이 제공된다.

Description

암 관련 단백질로부터의 면역원성 불규칙변화성 펩타이드 및 그것의 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 11월 8일에 출원된 미국 출원 번호 62/583,292호, 및 2017년 11월 30일에 출원된 미국 출원 번호 62/592,884호의 이익을 주장하며, 이들 출원은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
EFS 웹을 통해 텍스트 파일로 제출된 서열 목록에 대한 참조
522598SEQLIST.txt 파일로 쓰여진 서열 목록은 2018년 11월 3일에 생성되었고, 본원에 참조로 포함된다.
종양발생은 제어되지 않은 성장, 사멸에 대한 내성, 멀리 떨어진 부위로의 이동 및 그곳에서의 성장 가능성, 및 새로운 혈관의 성장을 유도하는 능력을 포함한, 필수 능력 세트의 획득을 포함한다. 이들 특징의 기저에 있는 것은 게놈 불안정성으로, 그것은 그것들의 획득을 가속화하는 유전자 변이를 생성한다. 암 정소 항원(cancer testis antigen)과 같은 종양-관련 항원은 암세포에 몇몇 이들 능력을 부여하며, 이는 이것들이 종양발생에 직접적으로 연루되는 것을 시사하고 그것들을 면역요법에 대한 잠재적 표적으로 만든다. 그러나, T 세포 내성, MHC 또는 TCR에 대한 자가 항원의 낮은 친화도, 및 종양의 면역억압 환경을 포함한 많은 인자가 암환자를 치료하기 위해 사용된 펩타이드 백신에 대한 반응으로 종양-특이적 T 세포의 최소한의 팽창에 기여할 수 있다.
암 면역요법을 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 한 측면으로, 본원에는 암 관련 단백질의 면역원성 단편을 포함하는 분리된 펩타이드가 제공되며, 여기서 단편은 불규칙변화성 돌연변이(heteroclitic mutation)를 포함한다. 다른 측면으로, 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 오픈 리딩 프레임을 포함하는 핵산을 포함하는 재조합 리스테리아 균주(Listeria 균주)가 제공되며, 여기서 융합 폴리펩타이드는 암 관련 단백질의 하나 이상의 면역원성 단편에 융합된 PEST-함유 펩타이드를 포함하고, 단편은 불규칙변화성 돌연변이를 포함한다. 또한 이러한 융합 폴리펩타이드 및 이러한 분리된 펩타이드 및 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 그러한 핵산이 제공된다. 또한 이러한 핵산을 포함하는 재조합 박테리아 균주가 제공된다.
또 다른 측면으로, 이러한 분리된 펩타이드, 핵산, 융합 폴리펩타이드, 재조합 박테리아 균주, 또는 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신이 제공된다.
또 다른 측면으로, 본원에는 이러한 분리된 펩타이드, 핵산, 융합 폴리펩타이드, 재조합 박테리아 균주, 또는 재조합 리스테리아 균주를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양 또는 암에 대해 면역 반응을 유도 또는 증강시키는 방법이 제공된다. 또한 이러한 분리된 펩타이드, 핵산, 융합 폴리펩타이드, 재조합 박테리아 균주, 또는 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양 또는 암에 대해 면역 반응을 유도 또는 증강시키는 방법이 제공된다.
또 다른 측면으로, 본원에는 이러한 분리된 펩타이드, 핵산, 융합 폴리펩타이드, 재조합 박테리아 균주, 또는 재조합 리스테리아 균주를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양 또는 암을 예방 또는 치료하는 방법이 제공된다. 또한 이러한 분리된 펩타이드, 핵산, 융합 폴리펩타이드, 재조합 박테리아 균주, 또는 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양 또는 암을 예방 또는 치료하는 방법이 제공된다.
또 다른 측면으로, 본원에는 하나 이상의 이러한 재조합 박테리아 또는 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 세포 은행이 제공된다.
도 1A 및 1B는 WT1 미니유전자 구성물의 개략도를 도시한다. 도 1A는 단일 WT1 키메라 폴리펩타이드 항원을 발현하도록 설계된 WT1 미니유전자 구성물을 도시한다. 도 1B는 3개의 별도의 WT1 키메라 폴리펩타이드 항원을 발현하도록 설계된 WT1 미니유전자 구성물을 도시한다.
도 2A 및 2B는 Lmdda-WT1-tLLO-FLAG-Ub-불규칙변화성 페닐알라닌 미니유전자 구성물 (도 2A) 및 Lmdda-WT1-tLLO-P1-P2-P3-FLAG-Ub-불규칙변화성 티로신 미니유전자 구성물 (도 2B)의 웨스턴 블롯을 도시한다. 도 2A에서, 레인 1은 사다리(ladder)이고, 레인 2는 Lmdda-WT1-tLLO-P1-P2-P3-FLAG-Ub-불규칙변화성 티로신 미니유전자 구성물 (68 kDa)이며, 레인 3은 네거티브 대조군이다. 도 2B에서, 레인 1은 사다리이고, 레인 2는 네거티브 대조군이며, 레인 3은 WT1- tLLO-FLAG-Ub-불규칙변화성 페닐알라닌 미니유전자 구성물 (구성물 #1)이다.
도 3은 불규칙변화성 돌연변이 WT1 펩타이드를 발현하는 몇몇 Lm-미니유전자 구성물에 대한 콜로니 PCR 결과를 도시한다. 돌연변이된 잔기가 굵고 밑줄로 표시된다.
도 4는 생체외에서 WT1 펩타이드 RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 197) 및 FMFPNAPYL (SEQ ID NO: 160)로 자극된 비장세포에서의 ELISPOT 검정을 도시한다. 비장세포는 WT1-F 미니유전자 구성물로 면역화된 HLA2 트랜스제닉 마우스로부터 유래된다. PBS 및 Lmdda274가 네거티브 대조군으로서 사용되었다.
도 5는 생체외에서 WT1 펩타이드 RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 197) 및 YMFPNAPYL (SEQ ID NO: 169)로 자극된 비장세포에서의 ELISPOT 검정을 도시한다. 비장세포는 WT1-AH1-Tyr 미니유전자 구성물로 면역화된 HLA2 트랜스제닉 마우스로부터 유래된다. PBS 및 Lmdda274가 네거티브 대조군으로서 사용되었다.
도 6A 및 6B는 생체외에서 WT1 펩타이드 RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 197; 도 6A) 및 FMFPNAPYL (SEQ ID NO: 160; 도 6B)로 자극된 백만개의 비장세포당 IFN-γ 스팟 형성 세포 (SFC)를 도시한다. 비장세포는 WT1-F 미니유전자 구성물로 면역화된 HLA2 트랜스제닉 마우스로부터 유래된다. PBS 및 Lmdda274가 네거티브 대조군으로서 사용되었다.
도 7A 및 7B는 생체외에서 WT1 펩타이드 RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 197; 도 7A) 및 YMFPNAPYL (SEQ ID NO: 169; 도 7B)로 자극된 백만개의 비장세포당 IFN-γ 스팟 형성 세포 (SFC)를 도시한다. 비장세포는 WT1-AH1-Tyr 미니유전자 구성물로 면역화된 HLA2 트랜스제닉 마우스로부터 유래된다. PBS 및 Lmdda274가 네거티브 대조군으로서 사용되었다.
도 8은 PBS 대조군 또는 Lm AH1_HC로 처리된 마우스에서의 CT26 종양 부피를 도시한다.
정의
본원에서 상호교환적으로 사용된 용어 "단백질", "폴리펩타이드", 및 "펩타이드"는 코딩된 및 코딩되지 않은 아미노산 및 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된 또는 유도체화된 아미노산을 포함한, 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 나타낸다. 용어는 변형된 중합체, 예컨대 변형된 펩타이드 골격을 가지는 폴리펩타이드를 포함한다.
단백질은 "N-말단" 및 "C-말단"을 가지는 것으로 말한다. 용어 "N-말단"은 단백질 또는 폴리펩타이드의 시작과 관련되며, 자유 아민기 (-NH2)를 가진 아미노산에 의해 종결된다. 용어 "C-말단"은 단백질 또는 폴리펩타이드의 끝과 관련되며, 자유 카르복실기 (-COOH)를 가진 아미노산에 의해 종결된다.
용어 "융합 단백질"은 펩타이드 결합 또는 다른 화학적 결합에 의해 함께 연결된 둘 이상의 펩타이드를 포함하는 단백질을 나타낸다. 펩타이드는 펩타이드 결합 또는 다른 화학적 결합에 의해 직접적으로 함께 연결될 수 있다. 예를 들어, 키메라 분자는 단일 사슬 융합 단백질로서 재조합에 의해 발현될 수 있다. 대안으로, 펩타이드는 하나 이상의 아미노산 또는 둘 이상의 펩타이드 사이의 또 하나의 적합한 링커와 같은 "링커"에 의해 함께 연결될 수 있다.
본원에서 상호교환적으로 사용된 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 또는 그것의 유사체 또는 변형된 버전을 포함한, 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 나타낸다. 그것들은 단일-, 이중-, 및 다중-가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 및 퓨린 염기, 피리미딘 염기, 또는 다른 자연적인, 화학적으로 변형된, 생화학적으로 변형된, 비자연적인, 또는 유도체화된 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 중합체를 포함한다.
핵산은 모노뉴클레오타이드가 반응하여 하나의 모노뉴클레오타이드 펜토오스 고리의 5' 포스페이트가 포스포다이에스테르 결합을 통해 한 방향으로 그것의 이웃한 3' 산소에 부착되는 방식으로 올리고뉴클레오타이드를 만들기 때문에 "5' 단부" 및 "3' 단부"를 가진다고 말한다. 올리고뉴클레오타이드의 단부는 그것의 5' 포스페이트가 모노뉴클레오타이드 펜토오스 고리의 3' 산소에 연결되지 않으면 "5' 단부"로서 언급된다. 올리고뉴클레오타이드의 단부는 그것의 3' 산소가 또 하나의 모노뉴클레오타이드 펜토오스 고리의 5' 포스페이트에 연결되지 않으면 "3' 단부"로서 언급된다. 핵산 서열은, 더 큰 올리고뉴클레오타이드의 내부에 있을지라도, 또한 5' 및 3' 단부를 가지는 것으로 말할 수 있다. 선형 또는 원형 DNA 분자에서, 별개의 요소가 "하류" 또는 3' 요소의 "상류" 또는 5'에 있는 것으로 언급된다.
"코돈 최적화"는 천연 서열의 적어도 한 코돈을 천연 아미노산 서열을 유지하는 한편 숙주 세포의 유전자에서 보다 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체함으로써 특정 숙주 세포에서의 증강된 발현을 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 나타낸다. 예를 들어, 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 자연적으로 발생하는 핵산 서열과 비교하여 주어진 리스테리아 세포 또는 임의의 다른 숙주 세포에서 더 높은 빈도의 용법을 가지는 코돈을 치환하기 위해 변형될 수 있다. 코돈 용법 표는, 예를 들어, "코돈 용법 데이터베이스"에서 쉽게 이용 가능하다. 각 아미노산에 대해 리스테리아 모노사이토게네스(L. monocytogenes)에 의해 활용된 최적 코돈은 US 2007/0207170 (모든 목적에 대해 그 전문이 참조로 본원에 포함됨)에서 제시된다. 이들 표는 여러 방법으로 적응될 수 있다. Nakamura et al. (2000) Nucleic Acids Research 28:292 (모든 목적에 대해 그 전문이 참조로 본원에 포함됨)를 참조한다. 특정 숙주에서의 발현을 위한 특정 서열의 코돈 최적화를 위한 컴퓨터 알고리즘이 또한 이용 가능하다 (예컨대, Gene Forge 참조).
용어 "플라스미드" 또는 "벡터" 박테리아 전달 벡터, 바이러스 벡터 전달 벡터, 펩타이드 면역요법 전달 벡터, DNA 면역요법 전달 벡터, 에피솜성 플라스미드, 통합성 플라스미드, 또는 파지 벡터를 포함한 임의의 공지의 전달 벡터를 포함한다. 용어 "벡터"는 숙주 세포에서 하나 이상의 융합 폴리펩타이드를 전달, 및, 선택적으로, 발현할 수 있는 구성물을 나타낸다.
용어 "에피솜성 플라스미드" 또는 "염색체외 플라스미드"는 염색체 DNA로부터 물리적으로 떨어져 있고 (즉, 에피솜성이거나 또는 염색체 외에 있고 숙주 세포의 게놈에 통합되지 않는) 염색체 DNA와 무관하게 복제하는 핵산 벡터를 나타낸다. 플라스미드는 선형 또는 원형일 수 있고, 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있다. 에피솜성 플라스미드는 선택적으로 다수의 복사물로 숙주 세포의 세포질에서 지속적으로 있을 수 있어서 (예컨대, 리스테리아), 에피솜성 플라스미드 내에서 관심의 임의의 유전자의 증폭을 초래한다.
용어 "게놈상으로 통합된"은 뉴클레오타이드 서열이 세포의 게놈으로 통합되고 그것의 자손에 의해 유전될 수 있도록 세포에 도입된 핵산을 나타낸다. 핵산의 세포의 게놈으로의 안정적인 통합을 위해 임의의 프로토콜이 사용될 수 있다.
용어 "안정적으로 유지된"은 검출 가능한 손실 없이 적어도 10 세대 동안 선택 (예컨대, 항생물질 선택)의 부재 하에 핵산 분자 또는 플라스미드가 유지되는 것을 나타낸다. 예를 들어, 기간은 적어도 15 세대, 20 세대, 적어도 25 세대, 적어도 30 세대, 적어도 40 세대, 적어도 50 세대, 적어도 60 세대, 적어도 80 세대, 적어도 100 세대, 적어도 150 세대, 적어도 200 세대, 적어도 300 세대, 또는 적어도 500 세대일 수 있다. 안정적으로 유지된은 시험관내에서 (예컨대, 배양 중에) 세포에서 안정적으로 유지되는, 생체내에서 안정적으로 유지되는, 또는 둘 다의 핵산 분자 또는 플라스미드를 나타내는 것일 수 있다.
"오픈 리딩 프레임" 또는 "ORF"는 잠재적으로 단백질을 암호화할 수 있는 염기의 서열을 함유하는 DNA의 부분이다. 한 예로서, ORF는 유전자의 시작 코드 서열 (개시 코돈)과 중단 코돈 서열 (종결 코돈) 사이에 위치할 수 있다.
"프로모터"는 보통 특정 폴리뉴클레오타이드 서열에 대한 적절한 전사 개시 부위에서 RNA 합성을 개시하기 위해 RNA 중합효소 II를 지시할 수 있는 TATA 박스를 포함하는 DNA의 조절 영역이다. 프로모터는 전사 개시 속도에 영향을 미치는 다른 영역을 추가적으로 포함할 수 있다. 본원에서 개시된 프로모터 서열은 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드의 전사를 조절한다. 프로모터는 본원에 개시된 세포 유형 (예컨대, 진핵 세포, 비인간 포유류 세포, 인간 세포, 설치류 세포, 만능 세포, 1세포기 배아, 분화된 세포, 또는 이것들의 조합) 중 하나 이상의 유형에서 활성일 수 있다. 프로모터는, 예를 들어, 구성적으로 활성인 프로모터, 조건부 프로모터, 유도성 프로모터, 일시적으로 제한된 프로모터 (예컨대, 발달상 조절된 프로모터), 또는 공간적으로 제한된 프로모터 (예컨대, 세포-특이적 또는 조직-특이적 프로모터)일 수 있다. 프로모터의 예는, 예를 들어, WO 2013/176772 (본원에 그 전문에 참조로 포함됨)에서 찾을 수 있다.
"작동 가능한 연결" 또는 "작동 가능하게 연결되는"은 두 구성요소가 정상적으로 기능하고 구성요소 중 적어도 하나가 다른 구성요소 중 적어도 하나에 대해 발휘된 기능을 매개할 가능성을 허용하도록 하는 둘 이상의 구성요소 (예컨대, 프로모터 및 또 다른 서열 요소)의 병치상태를 나타낸다. 예를 들어, 프로모터는 만약 프로모터가 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 대한 반응으로 코딩 서열의 전사 수준을 제어한다면 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 작동 가능한 연결은 서로 연속적인 또는 트랜스로 작용하는 그러한 서열을 포함할 수 있다 (예컨대, 조절 서열은 코딩 서열의 전사를 제어하기 위하여 멀리서 작용할 수 있다).
2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 맥락에서 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 명시된 비교 창에 걸쳐 최대 상응성을 위해 정렬될 때 동일한 두 서열에서의 잔기를 언급하는 것이다. 서열 동일성의 백분율이 단백질과 관련하여 사용될 때, 동일하지 않은 잔기 위치는 종종 보존성 아미노산 치환에 의해 상이한 것으로 인식되며, 이때 아미노산 잔기는 유사한 화학적 특성 (예컨대, 전하 또는 소수성(hydrophobicity))을 가진 다른 아미노산 잔기에 대해 치환되며 따라서 분자의 기능적 특성은 변경되지 않는다. 서열이 보존성 치환에서 상이할 때, 퍼센트 서열 동일성은 치환의 보존성 성질을 교정하기 위하여 상향 조정될 수 있다. 그러한 보존성 치환에 의해 상이한 서열은 "서열 유사성" 또는 "유사성"을 가지는 것으로 말할 수 있다. 이러한 조정을 만드는 수단은 기술분야의 숙련된 사람들에게 잘 알려져 있다. 전형적으로, 이것은 보존성 치환을 전체 미스매치보다는 부분적인 것으로서 채점하고, 그로써 백분율 서열 동일성을 증가시키는 것을 포함한다. 그러므로, 예를 들어, 동일한 아미노산에 1의 점수가 주어지고 비보존성 치환에 0의 점수가 주어지면, 보존성 치환에는 0과 1 사이의 점수가 주어진다. 보존성 치환의 채점은, 예컨대, 프로그램 PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California)에서 실행되는 것과 같이 계산된다.
"서열 동일성의 백분율"은 비교창에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정된 값 (완벽하게 매치된 잔기의 가장 큰 수)을 나타내며, 여기서 비교창에서의 폴리뉴클레오타이드 서열 부분은 두 서열의 최적 정렬을 위해 참조 서열 (첨가 또는 삭제를 포함하지 않은 서열)과 비교하여 첨가 또는 삭제 (즉, 갭)를 포함할 수 있다. 백분율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 매치된 위치의 수를 산출하기 위해 두 서열에서 발생하는 위치의 수를 측정하고, 매치된 위치의 수를 비교창의 위치의 총 수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율 구함으로써 계산된다. 다르게 명시되지 않는 한 (예컨대, 더 짧은 서열이 연결된 이종성 서열을 포함함), 비교창은 비교되는 두 서열 중 더 짧은 쪽의 전체 길이이다.
다르게 진술되지 않는 한, 서열 동일성/유사성 값은 다음의 파라미터를 사용하는 GAP 버전 10을 사용하여 얻어진 값을 나타낸다: 50의 GAP 무게 및 3의 길이 무게, 및 nwsgapdna.cmp 채점 매트릭스를 사용하는 뉴클레오타이드 서열에 대한 % 동일성 및 % 유사성; 8의 GAP 무게 및 2의 길이 무게, 및 BLOSUM62 채점 매트릭스를 사용하는 아미노산 서열에 대한 % 동일성 및 % 유사성; 또는 이것들의 임의의 동등한 프로그램. "동등한 프로그램"은, 문제의 임의의 두 서열에 대해, GAP 버전 10에 의해 생성된 상응하는 정렬에 비교할 때 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기 및 동일한 퍼센트 서열 동일성을 가지는 정렬을 생성하는 임의의 서열 비교 프로그램을 포함한다.
용어 "보존성 아미노산 치환"은 유사한 크기, 전하, 또는 극성을 가진 상이한 아미노산으로 서열에 정상적으로 존재하는 아미노산을 치환하는 것을 나타낸다. 보존성 치환의 예는 아이소류신, 발린, 또는 류신과 같은 비극성 (소수성) 잔기의 또 다른 비극성 잔기에 대한 치환을 포함한다. 마찬가지로, 보존성 치환의 예는 아르기닌과 리신 사이, 글루타민과 아스파라긴 사이, 또는 글리신과 세린 사이와 같이 한 극성 (친수성) 잔기의 또 다른 것에 대한 치환을 포함한다. 추가적으로, 리신, 아르기닌, 또는 히스티딘과 같은 염기성 잔기의 또 다른 것에 대한 치환, 또는 아스파르트산 또는 글루탐산과 같은 한 산성 잔기의 또 다른 산성 잔기에 대한 치환이 보존성 치환의 추가적인 예이다. 비보존성 치환의 예로는 아이소류신, 발린, 류신, 알라닌, 또는 메티오닌과 같은 비극성 (소수성) 아미노산 잔기의 시스테인, 글루타민, 글루탐산 또는 리신과 같은 극성 (친수성) 잔기에 대한 치환 및/또는 비극성 잔기에 대한 극성 잔기의 치환을 들 수 있다. 전형적인 아미노산 분류를 하기에 요약한다.
Figure pct00001
"상동성" 서열 (예컨대, 핵산 서열)은 공지의 참조 서열에 동일하거나 실질적으로 유사하여서, 예를 들어, 공지의 참조 서열에 대해 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일하게 되는 서열을 나타낸다.
용어 "야생형"은 정상 (돌연변이, 병에 걸린, 변경된, 등과 대조적임) 상태 또는 맥락에서 발견되는 것과 같은 구조 및/또는 활성을 가지는 실체를 나타낸다. 야생형 유전자 및 폴리펩타이드는 종종 다수의 상이한 형태 (예컨대, 대립유전자)로 존재한다.
단백질 및 핵산과 관련하여 용어 "분리된"은 제자리에서 정상적으로 존재할 수 있는 다른 박테리아, 바이러스 또는 세포의 구성요소와 관련하여 상대적으로 정제되고, 단백질 및 폴리뉴클레오타이드의 실질적으로 순수한 조제물을 포함하는 단백질 및 핵산을 나타낸다. 용어 "분리된"은 또한 자연적으로 발생하는 대응물이 없고, 화학적으로 합성되었으며 따라서 다른 단백질 또는 핵산에 의해 실질적으로 오염되지 않은, 또는 그것들이 자연적으로 수반되는 가장 많은 다른 세포 구성요소 (예컨대, 세포의 다른 단백질, 폴리뉴클레오타이드, 또는 세포의 구성요소)로부터 분리되었거나 정제된 단백질 및 핵산을 포함한다.
"외인성" 또는 "이종성" 분자 또는 서열은 세포에서 정상적으로 발현되지 않거나 그 형태로는 세포에서 정상적으로 존재하지 않는 분자 또는 서열이다. 정상적 존재는 세포의 특정 발달 단계 및 환경적 조건과 관련된 존재를 포함한다. 외인성 또는 이종성 분자 또는 서열은, 예를 들어, 세포 내부의 상응하는 내인성 서열의 돌연변이된 서열을 포함하거나 또는 세포 내부에 있지만 상이한 형태의 (즉, 염색체 내에 있지 않은) 내인성 서열에 상응하는 서열을 포함할 수 있다. 특정 세포에서 외인성 또는 이종성 분자 또는 서열은 또한 세포의 참조 종과 상이한 종으로부터 또는 동일 종 내의 상이한 유기체로부터 유래된 분자 또는 서열일 수 있다. 예를 들어, 이종성 폴리펩타이드를 발현하는 리스테리아 균주의 경우에, 이종성 폴리펩타이드는 리스테리아 균주에 대해 천연 또는 내인성이 아닌, 리스테리아 균주에 의해 정상적으로 발현되지 않은, 리스테리아 균주 이외의 공급원으로부터, 동일한 종 내의 상이한 유기체로부터 유래된, 폴리펩타이드일 수 있다.
대조적으로, "내인성" 분자 또는 서열 또는 "천연" 분자 또는 서열은 특정 환경 조건 하에서 특정 발달 단계에서 특정 세포에서 그 형태로 정상적으로 존재하는 분자 또는 서열이다.
용어 "변이체"는 집단의 대부분과 상이그러나 여전히 그것들 중 하나인 것으로 간주될 공통 방식과 충분히 유사한 아미노산 또는 핵산 서열 (또는 유기체 또는 조직)을 나타낸다 (예컨대, 스플라이스 변이체).
용어 "이소형태"는 또 다른 이소형태, 또는 버전 (예컨대, 동일한 단백질의)과 비교하여 단지 약간의 차이만이 있는 분자 (예컨대, 단백질)의 버전을 나타낸다. 예를 들어, 단백질 이소형태는 상이그러나 관련된 유전자로부터 생성될 수 있고, 그것들은 교대 스플라이싱에 의해 동일한 유전자로부터 발생할 수 있거나, 또는 단일 뉴클레오타이드 다형태로부터 발생할 수 있다.
용어 "단편"은 단백질을 언급할 때, 전장 단백질보다 더 짧거나 더 적은 수의 아미노산을 가지는 단백질을 의미한다. 용어 "단편"은 핵산을 언급할 때, 전장 핵산보다 더 짧거나 더 적은 수의 뉴클레오타이드를 가지는 핵산을 의미한다. 단편은, 예를 들어, N-말단 단편 (즉, 단백질의 C-말단부 부분의 제거), C-말단 단편 (즉, 단백질의 N-말단부 부분의 제거), 또는 내부 단편일 수 있다. 단편은 또한, 예를 들어, 기능성 단편 또는 면역원성 단편일 수 있다.
용어 "유사체"는 단백질을 언급할 때 보존성 아미노산 차이에 의해, 아미노산 서열에 영향을 미치지 않는 변형에 의해, 또는 둘 다에 의해 자연적으로 발생하는 단백질과 상이한 단백질을 의미한다.
용어 "기능성"은 생물학적 활성 또는 기능을 나타내는 단백질 또는 핵산 (또는 그것의 단편, 이소형태, 또는 변이체)의 선천적인 능력을 나타낸다. 이러한 생물학적 활성 또는 기능은, 예를 들어, 대상체에 투여될 때 면역 반응을 이끌어내는 능력을 포함할 수 있다. 이러한 생물학적 활성 또는 기능은 또한, 예를 들어, 상호작용 파트너에 대한 결합을 포함할 수 있다. 기능성 단편, 이소형태, 또는 변이체의 경우에, 이들 생물학적 기능은 실제로 변경될 수 있지만 (예컨대, 그것들의 특이성 또는 선택성과 관련하여), 기본적인 생물학적 기능은 보유된다.
용어 "면역원성" 또는 "면역원성의"는 대상체에게 투여될 때 대상체에서 면역 반응을 이끌어내는 분자 (예컨대, 단백질, 핵산, 항원, 또는 유기체)의 선천적인 능력을 나타낸다. 면역원성은, 예를 들어, 분자에 대한 항체의 더 큰 수, 분자에 대한 항체의 더 큰 다양성, 분자에 특이적인 T-세포의 더 큰 수, 분자에 대한 더 큰 세포독성 또는 헬퍼 T-세포 반응, 등에 의해 측정될 수 있다.
용어 "항원"은 본원에서, 대상체 또는 유기체와 접촉하게 될 때 (예컨대, 대상체 또는 유기체에 존재하거나 대상체 또는 유기체에 의해 검출될 때), 대상체 또는 유기체로부터 검출 가능한 면역 반응을 초래하는 물질을 나타내기 위해 사용된다. 항원은, 예를 들어, 지질, 단백질, 탄수화물, 핵산, 또는 이것들의 조합 및 변형물일 수 있다. 예를 들어, "항원성 펩타이드"는 대상체 또는 유기체에 존재하거나 대상체 또는 유기체에 의해 검출될 때 대상체 또는 유기체에서 면역 반응의 설치(mounting)로 이어지는 펩타이드를 나타낸다. 예를 들어, 이러한 "항원성 펩타이드"는 숙주 세포 표면 상의 MHC 클래스 I 및/또는 클래스 II 분자 위로 로딩되고 제공되며 숙주의 면역 세포에 의해 인식 또는 검출될 수 있음으로써, 단백질에 대한 면역 반응의 설치로 이어지는 단백질을 포함할 수 있다. 이러한 면역 반응은 또한 동일한 단백질을 발현하는 숙주 내의 다른 세포, 예컨대 병든 세포 (예컨대, 종양 또는 암 세포)로 확장될 수 있다.
용어 "에피토프"는 면역 체계에 의해 인식되는 항원 상의 부위 (예컨대, 그곳에 항체가 결합하는 부위)를 나타낸다. 에피토프는 하나 이상의 단백질의 삼차 접힘에 의해 병치된 연속 아미노산 또는 비연속 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 연속 아미노산으로부터 형성된 에피토프 (또한 선형 에피토프로도 알려짐)는 전형적으로 변성 용매에 대한 노출시 보유되는 반면 삼차 접힘에 의해 형성된 에피토프 (또는 형태적 에피토프로도 알려짐)는 전형적으로 변성 용매로 처리될 때 손실된다. 에피토프는 전형적으로 적어도 3개, 보다 일반적으로, 적어도 5개 또는 8-10개 아미노산을 독특한 공간적 형태에 포함한다. 에피토프의 공간적 형태를 측정하는 방법은, 예를 들어, x-선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명을 포함한다. 예컨대, Epitope Mapping Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed. (1996) (모든 목적에 대해 그 전문이 참조로 본원에 포함됨)을 참조한다.
용어 "돌연변이"는 유전자 또는 단백질의 구조의 임의의 변화를 나타낸다. 예를 들어, 돌연변이는 염색체 또는 단백질의 삭제, 치환, 또는 재배열로부터 유발될 수 있다. "삽입"은 유전자에서 뉴클레오타이드의 수 또는 단백질에서 아미노산의 수를 하나 이상의 추가적인 뉴클레오타이드 또는 아미노산을 첨가함으로써 변화시킨다. "삭제"는 유전자에서 뉴클레오타이드의 수 또는 단백질에서 아미노산의 수를 하나 이상의 추가적인 뉴클레오타이드 또는 아미노산을 감소시킴으로써 변화시킨다.
"프레임시프트" 돌연변이는 DNA에서 뉴클레오타이드의 첨가 또는 상실이 유전자의 리딩 프레임을 변화시킬 때 발생한다. 리딩 프레임은 각각 한 아미노산을 암호화하는 3개의 염기의 그룹으로 이루어진다. 프레임시프트 돌연변이는 이들 염기의 그룹화를 변동시키고 아미노산에 대한 코드를 변화시킨다. 그 결과로 얻어지는 단백질은 보통 비기능성이다. 삽입 및 삭제는 각각 프레임시프트 돌연변이일 수 있다.
"미스센스" 돌연변이 또는 치환은 단백질의 한 아미노산의 변화 또는 암호화된 아미노산의 변화를 초래하는 단일 뉴클레오타이드의 점 돌연변이를 나타낸다. 한 아미노산에서의 변화를 초래하는 단일 뉴클레오타이드의 점 돌연변이는 DNA 서열에서의 "비동의(nonsynonymous)" 치환이다. 비동의 치환은 또한 코돈이 결과적으로 생성되는 단백질의 절단을 초래하는 조기 중단 코돈으로 변경되는 "넌센스" 돌연변이를 초래할 수 있다. 대조적으로, DNA에서 "동의(synonymous)" 돌연변이는 (코돈 축퇴성으로 인하여) 단백질의 아미노산 서열을 변경시키지 않는 돌연변이이다.
용어 "체세포성 돌연변이"는 생식 세포 (예컨대, 정자 또는 난(egg)) 이외의 세포에 의해 획득된 유전자 변경을 포함한다. 이러한 돌연변이는 세포 분할의 과정에서 돌연변이된 세포의 자손에게 계대될 수 있지만 유전적인 것은 아니다. 대조적으로, 생식선 돌연변이는 생식선에서 발생하며 자손의 다음 세대로 계대될 수 있다.
용어 "시험관내"는 인공적인 환경 및 인공적인 환경 (예컨대, 시험관) 내에서 발생하는 과정 또는 반응을 나타낸다.
용어 "생체내"는 자연적인 환경 (예컨대, 세포 또는 유기체 또는 신체) 및 자연적인 환경 내에서 발생하는 과정 또는 반응을 나타낸다.
하나 이상의 인용된 요소를 "포함하는" 조성물 또는 방법은 구체적으로 인용되지 않은 다른 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질을 "포함하는" 조성물은 단백질을 단독으로 또는 다른 성분과 조합하여 함유할 수 있다.
값의 범위의 표시는 그 범위 내의 또는 그 범위를 규정하는 모든 정수, 및 그 범위 내의 정수들에 의해 규정된 모든 하위범위를 포함한다.
맥락으로부터 다르게 나타나지 않는 한, 용어 "약"은 표시된 값의 측정 오차의 표준 마진 (예컨대, SEM) 내의 값 또는 명시된 값으로부터 ± 0.5%, 1%, 5%, 또는 10%의 변동을 포함한다.
물품의 단수 형태는 맥락이 분명하게 다른 것을 가리키지 않는 한 복수의 대상물을 포함한다. 예를 들어, 용어 "항원" 또는 "적어도 한 항원"은 그것들의 혼합물을 포함하여, 복수의 항원을 포함할 수 있다.
통계학적으로 유의미한 것은 p≤0.05를 의미한다.
상세한 설명
I. 개요
본원에는 암 관련 단백질의 면역원성 단편을 포함하는 펩타이드가 제공되며, 여기서 단편은 불규칙변화성 돌연변이(heteroclitic mutation)를 포함한다. 일부 이러한 펩타이드는 암 관련 단백질의 하나 이상의 면역원성 단편을 포함하는 재조합 융합 폴리펩타이드이고, 이때 각 단편은 불규칙변화성 돌연변이를 포함한다 (예컨대, PEST-함유 펩타이드에 융합됨). 또한 본원에는 이러한 펩타이드를 암호화하는 핵산; 이러한 펩타이드 또는 핵산을 포함하는 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신; 이러한 펩타이드 또는 핵산을 포함하는 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주; 이러한 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신; 및 이러한 펩타이드, 이러한 핵산, 및 이러한 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주의 제조 방법이 제공된다. 또한 대상체에서 항-종양-관련-항원 면역 반응을 유도하는 방법, 대상체에서 항-종양 또는 항-암 면역 반응을 유도하는 방법, 대상체에서 종양 또는 암을 치료하는 방법, 대상체에서 종양 또는 암을 예방하는 방법, 및 이러한 펩타이드, 핵산, 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주, 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신을 사용하여 종양 또는 암에 대해 대상체를 보호하는 방법이 제공된다.
종양-관련 항원 유전자로부터 (예컨대, 암 정소 항원 (CTA) 또는 종양태아 항원 (OFA)으로부터) 불규칙변화성 서열 (즉, 서열-최적화된 펩타이드)의 설계 및 사용은 MHC 클래스 I 대립유전자에 의한 제공을 증가시킬 수 있다. 불규칙변화성 서열은 중추 관용을 극복하기 위하여, 그리고 야생형 펩타이드에 대한 성공적인 교차 반응성 면역 반응을 이끌어내기 위하여, T 세포 반응을 프라이밍하기에 충분한 것으로 나타났다. OFA 및 CTA는 암 적응증 내 환자의 최대 100%에서 발현되지만, 성인의 건강한 조직에서는 발현되지 않는다 (예컨대, 배아 조직에서만 정상적으로 발현됨). 많은 OFA/CTA가 종양발생에서 중심 역할을 한다. OFA/CTA가 암에서 고도로 제한된 조직 발현을 하기 때문에, 그것들은 면역요법에 대한 매력적인 표적이다.
이러한 불규칙변화성 서열은 암 유형 내의 총 환자 범위가 100%에 접근할 수 있도록 조합될 수 있다. 다중 서열-최적화를 사용하면, 독점 면역원성 OFA/CTA 펩타이드 또는 종양-관련 항원 펩타이드 (즉, 면역원성을 개선하기 위하여 서열-최적화됨)는 강력한 T 세포 반응을 생성할 수 있는 추가적인 표적을 제공할 수 있어서, 환자가 본 발명자들이 가장 널리 퍼진 HLA (HLA-A0201, HLA-A0301, HLA-A2402, 및 HLA-B0702)를 커버하도록 불규칙변화성 펩타이드를 설계했던 종양-관련 항원을 발현할 것으로 추정될 수 있기 때문에 치료 전 환자를 서열분석할 필요가 없게 만든다.
본원에 기술된 일부 조성물에서, 불규칙변화성 펩타이드는 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes, Lm) 벡터에서 발현된다. Lm 기술은 강력한 선천성 면역 자극인 표적 펩타이드의 전달을 직접적으로 수지상 세포 및 항원 제공 세포의 시토졸에 통합시키는 작용 메커니즘, 표적화된 T 세포 반응의 생성, 및 종양 미세환경에서 조절 T 세포 및 골수-유래 억압 세포에 의한 감소된 면역 억압을 가진다. 다중 치료가 중화 항체 없이 제공 및/또는 조합될 수 있다. Lm 기술은 종양 세포를 잠재적으로 박테리아-감염 세포로서 생각하고 그것을 제거하기 위해 표적으로 하기 위하여 면역 체계를 자극하기 위하여, 예를 들어, 살아있는, 약독화된, 생체공학적 Lm 박테리아를 사용할 수 있다. 기술 과정은 리스테리아의 살아있는, 약독화된 균주로 시작할 수 있고, 예를 들어, 관심의 항원에 연결된 LLO (리스테리오리신 O) 분자의 단편을 포함하는 융합 단백질 서열을 암호화하는 플라스미드의 다수의 복사물을 첨가할 수 있다. 이 융합 단백질은 항원 제공 세포 내부에서 리스테리아에 의해 분비된다. 이것은 종양 방어 메커니즘을 감소시키는 면역 체계의 선천성 및 적응성 팔 둘 다의 자극을 초래하여 면역 체계가 암세포를 공격하고 파괴하는 것을 더 쉽게 만든다.
면역학적으로, Lm-기반 벡터는 펩타이드 백신과 비교하여 CD8+ 우세 T 세포 반응의 생성을 위한 훨씬 월등한 플랫폼이다. 첫째, 필그라스팀(filgrastim) 주사의 보조제를 첨가할 필요가 없다. 이것은 살아있는 약독화된 박테리아 벡터가 본질적으로, 여러 TLR, PAMP, 및 DAMP 수용체를 포함하고 항원 제공 세포의 시토졸 내에서 STING 수용체를 작용시키는 강력한 능력을 가지는 수많은 선천적인 면역 활성화 계기를 촉발시키기 때문이다. 이것은 적응성 면역 반응에 대해 환자의 면역 체계를 프라이밍하는 면역학적 미세환경의 훨씬 더 폭넓은 변경이다. 둘째, Lm 벡터는 정맥내로 주입된다. 이것은 그것이 피하 조직의 한정된 구역에 상주할 수 있는 것보다 상당히 더 많은 항원 제공 세포에 도달하는 것을 허용한다. 그것은 또한 피하 주사에 대한 필요성, 필그라스팀의 사용, 및 지연형 과민반응의 위험을 제거한다. 그것은 또한 최적의 CD8+ T 세포 수가 전형적으로 3회 치료 후에, 그러나 10회 이하에서 피크를 보이기 때문에 높은 T 세포 역가를 생성할 가능성이 있다. 셋째, Lm은 T 세포 도움에 대해 CD4+ 교차 반응성을 가지는 우세한 CD8+ T 세포 반응을 촉진한다. CD8+ T 세포는 암세포를 사멸시키는 데 가장 효과적이고 Lm 벡터가 APC의 세포질에 그들의 항원을 제공하기 때문에, 이들 펩타이드는 처리를 위해 프로테아좀으로 신속하게 이동되고, MHC 클래스 1와 복합체를 형성하고 대부분 CD8+ T 세포에 제공되기 위해 APC 표면에 수송된다. 이것은 항원 펩타이드의 피하 몬타나이드(Montanide) 제시보다 더 많은 CD8+ T 세포가 생성되는 장점을 유발할 것이다. 넷째, Lm 벡터는 종양 및 주변의 림프절에서 케모카인 및 케모카인 수용체의 발현을 증가시킨다. 이것은 고체 종양 가까이에 활성화된 T 세포의 유인을 용이하게 한다. 다섯째, Lm 벡터는 T 세포 공격으로부터 종양을 보호할 수 있는 면역억압 세포의 상대적인 수 및 억압 기능을 감소시켜서, T 세포가 암세포를 사멸하는 것을 더 좋게 가능하게 한다. 조절 T 세포 및 골수 유래 억압 세포의 면역억압 능력의 이런 감소는 이들 펩타이드에 대해 생성된 T 세포가 고체 종양에서 더 나은 활성을 갖는 것을 더욱 가능하게 할 것이다. 여섯째, Lm 벡터는 중화 항체를 생성하지 않는다. 이런 이유로, 이들 벡터는 중화 항체로부터의 효능의 손실 및 아나필락시스를 포함할 수 있는 지연형 과민반응 또는 급성 과민반응의 발생 없이 연장된 기간 동안 반복적으로 투여될 수 있다.
Lm 벡터는 다중 면역요법 메커니즘: toll-유사 수용체 (TLR) 및 인터페론 유전자 (STING) 수용체를 포함한 병원체-관련 분자 패턴 (PAMP)을 통한 강력한 선천성 면역 자극, 강력한 CD8+ 및 CD4+ T 세포 반응, 에피토프 확산, 및 종양 미세환경에서 Treg 및 골수 유래 억압 세포 (MDSC)를 무능력화함에 의한 면역 억압을 통해 작용한다. 이에 더불어, 리스테리아의 독특한 세포내 라이프 사이클은 중화 항체를 피하여, 반복적인 투약을 허용한다. Lm은 또한 그것이 체크포인트 억제자, 동시자극성 작용물질, 및 다른 작용제와의 시너지를 갖기 때문에 유익하다. 그것은 또한 큰 용량을 가지며 많은 상이한 종양 유형을 표적으로 하기 위해 적응될 수 있다. 예로서, Lm의 살아있는, 약독화된 균주가 보조제 특성을 가지는 리스테리오리신 O의 절단된 단편 (tLLO), 및 하나 이상의 종양-관련 항원을 포함하는, 본질적으로 그것으로 이루어지는, 또는 그것으로 이루어지는 항원-보조제 융합 단백질을 분비하기 위해 생체조작될 수 있다. 환자에게 주입될 때, 생체조작된 Lm은 항원 제공 세포에 의해 식세포화될 수 있고, 이때 융합 단백질이 Lm에 의해 분비되며, 처리되고, 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 클래스 I 및 II 분자 상으로 제공된다. 항원 제공 세포의 표면에 제공된 표적 펩타이드는 종양-관련-항원-특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 자극한다. 그런 후 활성화된 CD8+ T 세포는 종양-관련-항원-발현 암세포를 찾아 사멸할 수 있고 면역 억압을 극복하기 위해 종양 미세환경을 조절할 수 있다.
Lm 벡터는 몇가지 임상적 장점을 가진다. 치료와 관련된 임의의 부작용이 주입 후 즉시 수시간 내에 나타나는 한편 환자는 여전히 진료소에 있고, 거의 집중적으로 경미하거나 중간 정도이고 치료에 쉽게 반응하며, 지연된 개시, 누적 독성, 또는 지속적인 후유증의 증거 없이 투약 일에 투약이 진행된다. 실제적인 장점은 다중 작용제를 투여할 필요가 없고 후속 투여를 위해 교대의 투약 부위로 전환할 필요가 없다는 사실을 포함한다.
제조 관점에서 볼 때, 몇 가지 장점이 있다. 첫째, 개별적인 펩타이드를 고농도로 및 고순도로 제조할 필요가 없다. Lm 박테리아는 박테리아 내부에서 DNA 플라스미드의 다중 복사물에서 동시에 DNA를 전사하고 이들 펩타이드를 직접 APC의 세포질에 분비하며, 거기에서 거의 즉시 처리를 위해 프로테아좀으로 수송된다. 본질적으로, 펩타이드는 항원 처리에 대한 사용 지점에서 박테리아 권리에 의해 제조된다. 둘째, Lm 벡터는 고도로 확장가능하다. 유전자 조작이 완료된 후에, 박테리아는 액체배지 배양에서 자체적으로 복제한다. 배양은 상품의 비용을 크게 줄이기 위해 규모가 확대될 수 있다. 셋째, 몬타나이드와 같은 복합체 담체에서 제제화되거나 에멀션을 생성할 필요가 없다. 넷째, 박테리아는 펩타이드 제제의 효능의 손실로 이어질 수 있는 펩타이드 분해 또는 붕괴 생성물 오염의 걱정 없이 매우 안정적이고, 일부는 5년 이상 안정적이다.
본원에 개시된 일부 Lm 벡터에서, 미니유전자 구성물은 본원의 다른 곳에서 보다 상세하게 기술되는 것과 같이 사용된다. 특이적 MHC 클래스 I 결합 항원 결정기의 발현을 위한 본원에서 개시된 미니유전자 구성물 접근법의 사용은 전문적인 항원 제공 세포 (pAPC)의 항원 제시 경로로의 짧은 펩타이드 서열의 고도로 효율적인 전달을 허용한다. 미니유전자 기술의 특정 장점은 그것이 MHC 클래스 I 분자 상에 결합되고 제공될 수 있는 짧은 펩타이드 서열을 이탈시키기 위하여 더 큰 단백질의 프로테아좀 매개된 분해에 대한 필요조건을 우회한다는 것이다. 이것은 pAPC의 표면 상에 훨씬 더 높은 효율의 펩타이드-MHC 클래스 I 항원 제공을 초래하고, 따라서 항원 특이적 T 세포 반응의 프라이밍을 위한 훨씬 더 높은 수준의 항원 발현을 초래한다.
II. 불규칙변화성 돌연변이를 포함하는 종양-관련 항원 펩타이드 및 이러한 펩타이드를 암호호하는 핵산
본원에서 암 관련 단백질의 면역원성 단편을 포함하는 펩타이드가 개시되며, 이때 단편은 불규칙변화성 돌연변이를 포함한다.
용어 "불규칙변화성"은 불규칙변화성 펩타이드가 유래되는 천연 펩타이드 (예컨대, 앵커 잔기 돌연변이를 함유하지 않는 펩타이드)를 인식하는 면역 반응을 생성하는 펩타이드를 나타낸다. 예를 들어, YLMPVNSEV (SEQ ID NO: 130)는 잔기 2의 메티오닌으로의 돌연변이에 의해 YMMPVNSEV (SEQ ID NO: 131)로부터 생성되었다. 불규칙변화성 펩타이드는 불규칙변화성 펩타이드가 유래되는 천연 펩타이드를 인식하는 면역 반응을 생성할 수 있다. 예를 들어, 불규칙변화성 펩타이드로의 예방접종에 의해 생성된 천연 펩타이드에 대한 면역 반응은 천연 펩타이드로의 예방접종에 의해 생성된 면역 반응보다 크기에 있어 동일하거나 더 클 수 잇다. 면역 반응은, 예를 들어, 2배, 3배, 5배, 7배, 10배, 15배, 20배, 30배, 50배, 100배, 150배, 200배, 300배, 500배, 1000배, 또는 그 이상 증가될 수 있다.
본원에 개시된 불규칙변화성 펩타이드는 하나 이상의 인간 백혈구 항원 (HLA) 분자에 결합할 수 있다. 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자로도 알려져 있는 HLA 분자는 펩타이드에 결합하여 그것을 면역 세포에 제공한다. 펩타이드의 면역원성은 부분적으로는 그것의 HLA 분자에 대한 친화도에 의해 결정될 수 있다. HLA 클래스 I 분자는 일반적으로 세포독성 T 림프구 (CTL) 상에 존재하는 CD8 분자와 상호작용한다. HLA 클래스 II 분자는 일반적으로 헬퍼 T 림프구 상에 존재하는 CD4 분자와 상호작용한다. 예를 들어, 본원에서 개시된 불규칙변화성 펩타이드는 T 세포 전구체를 활성화하기에 충분한 친화도로 또는 T 세포에 의한 인식을 매개하기에 충분한 친화도로 HLA 분자에 결합할 수 있다.
본원에서 개시된 불규칙변화성 펩타이드는 하나 이상의 HLA 클래스 II 분자에 결합할 수 잇다. 예를 들어, 불규칙변화성 펩타이드는 HLA-DRB 분자, HLA-DRA 분자, HLA-DQA1 분자, HLA-DQB1 분자, HLA-DPA1 분자, HLA-DPB 1 분자, HLA-DMA 분자, HLA-DMB 분자, HLA-DOA 분자, 또는 HLA-DOB 분자에 결합할 수 있다.
본원에서 개시된 천연 또는 불규칙변화성 펩타이드는 하나 이상의 HLA 클래스 I 분자에 결합할 수 있다. 예를 들어, 불규칙변화성 펩타이드는 HLA-A 분자, HLA-B 분자, HLA-C 분자, HLA-A0201 분자, HLA A1, HLA A2, HLA A2.1, HLA A3, HLA A3.2, HLA A11, HLA A24, HLA B7, HLA B27, 또는 HLA B8에 결합할 수 있다. 마찬가지로, 불규칙변화성 펩타이드는 HLA 클래스 I 분자의 수퍼패밀리, 예컨대 A2 수퍼패밀리, A3 수퍼패밀리, A24 수퍼패밀리, B7 수퍼패밀리, B27 수퍼패밀리, B44 수퍼패밀리, C1 수퍼패밀리, 또는 C4 수퍼패밀리에 결합할 수 있다. 특정 예에서, 불규칙변화성 펩타이드 또는 단편은 다음의 HLA 유형 중 하나 이상에 결합한다: HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02.
불규칙변화성 펩타이드는 상응하는 천연 펩타이드와 관련하여 HLA 클래스 II 분자에 대한 펩타이드의 결합을 증강시키는 돌연변이를 포함할 수 있다. 대안으로, 또는 추가적으로, 불규칙변화성 펩타이드는 상응하는 천연 펩타이드와 관련하여 HLA 클래스 I 분자에 대한 펩타이드의 결합을 증강시키는 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이된 잔기는 HLA 클래스 II 모티프 앵커 잔기일 수 있다. "앵커 모티프" 또는 "앵커 잔기"는, 다른 구체예에서는, HLA-결합 서열 (예컨대, HLA 클래스 II 결합 서열 또는 HLA 클래스 I 결합 서열)에서 특정 위치에 있는 바람직한 잔기 중 하나 또는 세트를 나타낸다.
야생형 에피토프에 대한 교차 반응성 면역원성 반응을 이끌어내는 잠재력을 가진 예측된 불규칙변화성 에피토프를 생성하기 위한 다양한 방법이 잘 알려져 있다. 예를 들어, 야생형 에피토프에 대한 교차 반응성 면역원성 반응을 이끌어내는 잠재력을 가진 불규칙변화성 에피토프를 설계하기 위하여, 야생형 에피토프의 기준선 예측된 펩타이드-MHC 결합 친화도가 NetMHCpan 3.0 서버 (www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)를 사용하여 결정될 수 있다. 1.0 이하의 펩타이드-MHC 결합 친화도 퍼센트 순위가 면역 반응을 이끌어낼 가능성이 있는 강력한 결합제로서 간주된다. 잠재적인 불규칙변화성 에피토프는, 한정하는 것은 아니지만, 강력한 결합제일 것으로 예측되는 야생형 에피토프의 위치 1, 2, 3, 또는 C-말단 위치에서 하나 이상의 아미노산의 무작위 치환에 의해 새성된다. 잠재적인 불규칙변화성 에피토프의 펩타이드-MHC 결합 친화도는 그런 후 NetMHCpan 3.0 서버를 사용하여 추정된다. 야생형 에피토프와 유사하고 1.0 백분율 순위 이하의 백분율 순위 결합 친화도를 가진 불규칙변화성 에피토프는 추후 확인을 위한 잠재적 항원으로 간주될 수 있다.
HLA 클래스 I 및 클래스 II 잔기를 확인하기 위한, 및 잔기를 돌연변이시킴으로써 HLA 결합을 개선하기 위한 다른 방법이 잘 알려져 있다. 예컨대, US 8,765,687, US 7,488,718, US 9,233,149, 및 US 7,598,221 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문에 참조로 본원에 포함됨)을 참조한다. 예를 들어, MHC 클래스 II 에피토프를 예측하는 방법이 잘 알려져 있다. 한 예로서, MHC 클래스 II 에피토프는 TEPITOPE (Meister et al. (1995) Vaccine 13:581-591 (모든 목적에 대해 그 전문이 참조로 본원에 포함됨))를 사용하여 예측될 수 있다. 다른 예로서, MHC 클래스 II 에피토프는 EpiMatrix (De Groot et al. (1997) AIDS Res. Hum. Retroviruses 13:529-531 (모든 목적에 대해 그 전문이 참조로 본원에 포함됨))를 사용하여 예측될 수 있다. 또 다른 예로서, MHC 클래스 II 에피토프는 예측 방법 (Yu K et al. (2002) Mol. Med. 8:137-148 (모든 목적에 대해 그 전문이 참조로 본원에 포함됨))을 사용하여 예측될 수 있다. 또 다른 예로서, MHC 클래스 II 에피토프는 SYFPEITHI 에피토프 예측 알고리즘을 사용하여 예측될 수 있다. SYFPEITHI는 클래스 I 및 클래스 II MHC 분자에 결합하는 것으로 알려진 4500개 이상의 펩타이드 서열을 포함하는 데이터베이스이다. SYFPEITHI는 MHC-결합 홈을 따라 특정 위치에서 특정 아미노산의 존재를 기반으로 한 점수를 제공한다. 이상적인 아미노산 앵커는 10 포인트로 값이 정해지고, 특이한 앵커는 6-8 포인트로 정해지며, 보조 앵커는 4-6 포인트로 정해지고, 바람직한 잔기는 1-4 포인트로 정해지며; 결합 점수에 대한 음성 아미노산 효과는 -1 내지 -3이다. HLA-A*0201에 대한 최대 점수는 36이다. 또 다른 예로서, MHC 클래스 II 에피토프는 Rankpep을 사용하여 예측될 수 있다. Rankpep는 위치 특이적 채점 매트릭스 (PSSM) 또는 MHC-펩타이드 결합의 예측자로서 주어진 MHC 분자에 결합하는 것으로 알려져 있는 정렬된 펩타이드의 세트로부터의 프로파일을 사용한다. Rankpep는 펩타이드의 점수 및 최대 점수를 생산하는 공통 서열의 그것과 관련하여 예측된 펩타이드의 % 최적 또는 백분위수 점수에 대한 정보를, 선택된 프로파일과 함께 포함한다. Rankpep는 MHC I 및 MHC II 분자 각각에 대한 펩타이드 결합의 예측을 위해 102 및 80 PSSM의 선택을 포함한다. 상이한 크기의 펩타이드 결합제의 예측을 위한 여러 PSSM이 일반적으로 각각의 MHC I 분자에 대해 이용 가능하다. 또 다른 예로서, MHC 클래스 II 에피토프는 SVMHC (Donnes and Elofsson (2002) BMC Bioinformatics 11; 3:25 (모든 목적에 대해 그 전문이 참조로 본원에 포함됨))를 사용하여 확인될 수 있다.
MHC 클래스 I 에피토프를 확인하는 방법 또한 잘 알려져 있다. 한 예로서, MHC 클래스 I 에피토프는 BIMAS 소프트웨어를 사용하여 예측될 수 있다. BIMAS 점수는 펩타이드-결합 친화도의 척도인 MHC-I/β2-마이크로글로불린/펩타이드 복합체의 이론적 반감기의 계산을 토대로 한다. 프로그램은 길이가 8 내지 10개의 아미노산인 HLA-I 펩타이드에 대한 정보를 사용한다. 펩타이드의 MHC에 대한 결합 친화도가 높을수록, 이 펩타이드가 에피토프를 대표할 가능성은 더 높다. BIMAS 알고리즘은 펩타이드의 각각의 아미노산이 클래스 I 분자에 대한 결합에 독립적으로 기여하는 것으로 추정한다. 결합에 중요한 우세한 앵커 잔기는 표에서 1보다 상당히 높은 계수를 가진다. 바람직하지 못한 아미노산은 1 미만의 양의 계수를 가진다. 만약 아미노산이 결합에 바람직하거나 또는 바람직하지 못한 기여를 하는 것으로 알려지지 않으면, 그것에 값 1이 배정된다. 아미노산에 배정된 모든 값이 곱해지고 그 결과의 런닝 점수는 상수와 곱해져서 분해의 반감기의 추정값이 산출된다. 다른 예로서, MHC 클래스 I 에피토프는 SYFPEITHI를 사용하여 확인될 수 있다. 또 다른 예로서, MHC 클래스 I 에피토프는 SVMHC를 사용하여 확인될 수 있다. 또 다른 예로서, MHC 클래스 I 에피토프는 NetMHC-2.0 (Buus et al. (2003) Tissue Antigens 62:378-384 (모든 목적에 대해 그 전문이 참조로 본원에 포함됨))을 사용하여 확인될 수 있다.
HLA 결합 모티프에서의 상이한 잔기들이 MHC 결합을 증강시키기 위해 돌연변이될 수 있다. 한 예로, MHC 결합을 증강시키는 돌연변이는 HLA 클래스 I 결합 모티프의 위치 1의 잔기에 있다 (예컨대, 티로신, 글리신, 트레오닌, 또는 페닐알라닌으로의 돌연변이). 다른 예로서, 돌연변이는 HLA 클래스 I 결합 모티프의 위치 2에 있을 수 잇다 (예컨대, 류신, 발린, 아이소류신, 또는 메티오닌으로의 돌연변이). 또 다른 예로서, 돌연변이는 HLA 클래스 I 결합 모티프의 위치 6에 있을 수 있다 (예컨대, 발린, 시스테인, 글루타민, 또는 히스티딘으로의 돌연변이). 또 다른 예로서, 돌연변이는 HLA 클래스 I 결합 모티프의 위치 9에 또는 C-말단 위치에 있을 수 있다 (예컨대, 발린, 트레오닌, 아이소류신, 류신, 알라닌, 또는 시스테인으로의 돌연변이). 돌연변이는 일차 앵커 잔기에 또는 이차 앵커 잔기에 있을 수 있다. 예를 들어, HLA 클래스 I 일차 앵커 잔기는 위치 2 및 9에 있을 수 있고, 이차 앵커 잔기는 위치 1 및 8 또는 위치 1, 3, 6, 7, 및 8에 있을 수 있다. 다른 예에서, 점 돌연변이가 위치 4, 5, 및 8로부터 선택된 위치에 있을 수 있다.
마찬가지로, HLA 클래스 II 결합 부위의 상이한 잔기가 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, HLA 클래스 II 모티프 앵커 잔기가 변형될 수 있다. 예를 들어, P1 위치, P2 위치, P6 위치, 또는 P9 위치가 돌연변이될 수 있다. 대안으로, P4 위치, P5 위치, P10 위치, P11 위치, P12 위치, 또는 P13 위치가 돌연변이될 수 있다.
개별적인 불규칙변화성 돌연변이가 본원의 다른 곳에서 추가로 상세하게 논의되는 바와 같은 임의의 기준을 토대로 선택될 수 있다. 예를 들어, 개별적인 불규칙변화성 돌연변이 또는 불규칙변화성 펩타이드는 그것들이 CD8+ T 림프구 반응을 생성하는 것으로 알려지면 선택될 수 있다.
가능한 불규칙변화성 돌연변이의 세트의 확인 후에, 각각의 불규칙변화성 돌연변이를 포함하는 불규칙변화성 면역원성 펩타이드에 대한 서열이 선택될 수 있다. 본원의 다른 곳에서 논의되는 것과 같이, 상이한 크기의 펩타이드가 사용될 수 있다. 예를 들어, 불규칙변화성 돌연변이 또는 불규칙변화성 면역원성 펩타이드는, 예를 들어, 9개 아미노산으로 이루어진 MHC 클래스 I 에피토프 상에서 집중될 수 있다.
그런 후 불규칙변화성 면역원성 펩타이드의 서열은 MHC 클래스 I 분자에 대한 결합을 증강시키기 위하여 최적화될 수 있다. 각각의 HLA에 대한 결합을 최적화하기 위하여, 펩타이드 MHC 결합 모티프 및 아미노산 결합 챠트가 면역 에피토프 데이터베이스 및 분석 공급원 (예를 들어: iedb.org/MHCalleleid/143)으로부터 평가될 수 있다. 앵커 위치에 있는 바람직한 아미노산은 불규칙변화성 항원성 펩타이드 서열에 삽입될 수 있다 (예컨대, NUF2 - 야생형: YMMPVNSEV (SEQ ID NO: 131); 및 NUF2 - 불규칙변화성: YLMPVNSEV (SEQ ID NO: 130)).
그런 다음 서열-최적화된 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 결합 친화도는, 예를 들어, 다음의 알고리즘 중 하나를 사용하여 평가될 수 있다: NetMHC4.0 서버; NetMHCpan4.0 서버; 및 mhcflurry v0.2.0. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, 만약 특정 HLA에 대한 예측 결합 친화도가 상응하는 천연 서열과 동등하거나 더 강력하다면 고려될 수 있다. 선택된 서열-최적화된 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 그런 후에 특정 HLA에 대한 시험관내 결합에 대해 ProImmune의 REVEAL 검정을 사용하여 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, REVEAL 검정의 양성 대조군 펩타이드의 45% 이상인 결합 친화도를 가진 불규칙변화성 항원성 펩타이드가 결합제로서 간주될 수 있다.
서열-최적화된 불규칙변화성 항원성 펩타이드에 대한 결합 친화도 (예컨대, IC50)는, 예를 들어, 1000, 500, 400, 300, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 nM 미만일 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도 (예컨대, IC50)는 약 0.5-500, 0.5-300, 0.5-200, 0.5-100, 0.5-50, 0.5-40, 0.5-30, 0.5-20, 0.5-10, 또는 0.5-5 nM일 수 있다.
불규칙변화성 항원성 펩타이드의 RNA 발현 수준 또한 The Cancer Genome Atlas (TCGA) RNAseqV2 데이터세트에서 특정 적응증에서 측정될 수 있다. 0보다 큰 표준화된 RNA 발현 판독을 가진 TCGA 샘플의 백분율이 계산될 수 있다. 샘플의 대부분에서 TCGA 발현을 가진 불규칙변화성 항원성 펩타이드가 우선순위가 매겨질 수 있다.
특정 예에서, 잠재적 TAA의 후보 명단을 생성하기 위하여 적응증-특이적 종양-관련 항원의 게놈 풍경을 조사하기 위한 문헌 검토가 실시될 수 있다. 후보 명단 TAA가 CD8+ T 림프구 반응을 생성하는 알려진 면역원성 펩타이드를 함유하는지를 결정하기 위하여 두 번째 문헌 검토가 실시될 수 있다. 이 접근법은, 예를 들어, TAA로부터 9개 아미노산으로 이루어진 MHC 클래스 I 에피토프 (9mer)에 주로 집중될 수 있다. 이것은, 예를 들어, 4개의 HLA 유형 (HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02) 중 하나에 결합하는 9mer 포맷의 잠재적 표적 펩타이드를 확인할 수 있다.
표적 펩타이드는 그런 후 MHC 클래스 I 분자 (불규칙변화성 펩타이드로도 알려짐)에 대한 결합을 증강시키기 위하여 서열 최적화될 수 있다. 각각의 HLA에 대한 결합을 최적화하기 위하여, 펩타이드 MHC 결합 모티프 및 아미노산 결합 챠트가 면역 에피토프 데이터베이스 및 분석 공급원 (예를 들어: iedb.org/MHCalleleid/143)으로부터 평가될 수 있다. 앵커 위치에 있는 바람직한 아미노산이 표적 펩타이드 서열 (예컨대, NUF2 - 야생형: YMMPVNSEV (SEQ ID NO: 131); 및 NUF2 - 불규칙변화성: YLMPVNSEV (SEQ ID NO: 130))에 삽입될 수 있다. 그런 다음 결합 친화도 of 서열-최적화된 표적 펩타이드 및 야생형 표적 펩타이드의 결합 친화도가, 예컨대, 다음의 알고리즘 중 하나를 사용하여 평가될 수 있다: NetMHC4.0 서버; NetMHCpan4.0 서버; 및 mhcflurry v0.2.0. 서열-최적화된 표적 펩타이드는, 예를 들어, 특정 HLA에 대한 예측 결합 친화도가 야생형 표적 펩타이드 서열과 동일하거나 더 강력하다면 고려될 수 있다. 선택된 서열-최적화된 표적 펩타이드는 그런 후 ProImmune의 REVEAL 검정을 사용하여 특정 HLA에 대한 시험관내 결합에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, REVEAL 검정의 양의 대조군 펩타이드의 45% 이상의 결합 친화도를 가진 표적 펩타이드가 결합제로서 간주될 수 있다. 마지막으로, 표적 펩타이드의 RNA 발현 수준은 TCGA RNAseqV2 데이터세트에서 특이적-적응증에서 측정될 수 있다. 예를 들어, 0보다 큰 표준화된 RNA 발현 판독을 가진 TCGA 샘플의 백분율이 계산될 수 있다. 예를 들어, 샘플의 대부분에서 TCGA 발현을 가진 표적 펩타이드에 우선순위가 매겨질 수 있다.
용어 "암 관련 단백질"은 다중 유형의 암에서 발생하거나, 특정 유형의 암을 가진 다중 대상체에서 발생하거나, 또는 하나 이상의 유형의 암의 발생 또는 진행과 상관이 있는 돌연변이를 가진 단백질을 포함한다. 예를 들어, 암 관련 단백질은 발암성 단백질 (즉, 암 진행에 기여할 수 있는 활성을 가진 단백질, 예컨대 세포 성장을 조절하는 단백질)일 수 있거나, 또는 그것은 종양-억압 단백질 (즉, 예컨대 세포 사이클의 음성 조절을 통해 또는 세포자멸사를 촉진함으로써 전형적으로 암 형성에 대한 잠재력을 경감시키는 작용을 하는 단백질)일 수 있다.
불규칙변화성 펩타이드의 맥락에서 용어 "암 관련 단백질"은 그것의 발현이 하나 이상의 유형의 암의 발생 또는 진행과 상관이 있는 단백질을 나타낸다. 선택적으로, 이러한 단백질은 다중 유형의 암에서 발생하거나, 특정 유형의 암을 가진 다중 대상체에서 발생하거나, 또는 하나 이상의 유형의 암의 발생 또는 진행과 상관이 있는 돌연변이를 가진 단백질을 포함한다. 예를 들어, 암 관련 단백질은 발암성 단백질 (즉, 암 진행에 기여할 수 있는 활성을 가진 단백질, 예컨대 세포 성장을 조절하는 단백질)일 수 있거나, 또는 그것은 종양-억압 단백질 (즉, 예컨대 세포 사이클의 음성 조절을 통해 또는 세포자멸사를 촉진함으로써 전형적으로 암 형성에 대한 잠재력을 경감시키는 작용을 하는 단백질)일 수 있다. 바람직하게, 그것으로부터 불규칙변화성 펩타이드가 유래되는 암 관련 단백질은 특정 유형의 암에서 발현되지만 정상적으로는 건강한 성인 조직에서 발현되지 않는 단백질 (즉, 암-특이적 발현, 암-한정 발현, 종양-특이적 발현, 또는 종양-한정 발현을 가진 단백질)이다. 그러나, 암 관련 단백질은 암-특이적, 암-한정, 종양-특이적, 또는 종양-한정 발현을 가질 필요는 없다. 암-특이적 또는 암-한정적인 것으로 간주되는 단백질의 예는 암 정소 항원 또는 종양태아 항원이다. 암 정소 항원 (CTA)은 남성 생식 세포를 제외하고, 상이한 조직학적 기원의 인간 종양에서 발현되지만 정상 조직에서는 그렇지 않은 종양-관련 항원의 큰 패밀리이다. 암에서, 이들 발달상의 항원은 재발현될 수 있고 면역 활성화의 유전자좌로서 작용할 수 있다. 종양태아 항원 (OFA)은 전형적으로 태아 발달 동안에만 존재그러나 암의 특정 종류를 가진 성인에게서 발견되는 단백질이다. CTA 및 OFA의 발현의 종양-한정 패턴은 그것들을 종양-특이적 면역요법에 대한 이상적인 표적으로 만든다. 대부분의 OFA/CTA 단백질은 종양발생에서 중요한 역할을 한다.
예를 들어, 암 관련 단백질은 본원의 다른 곳에서 열거된 암 관련 단백질 중 임의의 것일 수 있다. 예를 들어, 암 관련 단백질은 다음 유전자 중 하나에 의해 암호화될 수 있다: CEACAM5, GAGE1, hTERT, KLHL7, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA6, NUF2, NYESO1, PAGE4, PRAME, PSA, PSMA, RNF43, SART3, SSX2, STEAP1, 및 SURVIVIN.
Figure pct00002
Figure pct00003
각각의 불규칙변화성 면역원성 펩타이드는 불규칙변화성 돌연변이를 포함하는 암 관련 단백질의 단편 (즉, 암 관련 단백질로부터의 아미노산의 연속 서열)일 수 있다. 각각의 불규칙변화성 면역원성 펩타이드는 면역 반응을 유도하기에 충분한 임의의 길이의 것일 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 불규칙변화성 면역원성 펩타이드는 길이가 5-100개, 15-50개, 또는 21-27개의 아미노산이거나, 또는 15-100개, 15-95개, 15-90개, 15-85개, 15-80개, 15-75개, 15-70개, 15-65개, 15-60개, 15-55개, 15-50개, 15-45개, 15-40개, 15-35개, 15-30개, 20-100개, 20-95개, 20-90개, 20-85개, 20-80개, 20-75개, 20-70개, 20-65개, 20-60개, 20-55개, 20-50개, 20-45개, 20-40개, 20-35개, 20-30개, 11-21개, 15-21개, 21-31개, 31-41개, 41-51개, 51-61개, 61-71개, 71-81개, 81-91개, 91-101개, 101-121개, 121-141개, 141-161개, 161-181개, 181-201개, 8-27개, 10-30개, 10-40개, 15-30개, 15-40개, 15-25개, 1-10개, 10-20개, 20-30개, 30-40개, 1-100개, 5-75개, 5-50개, 5-40개, 5-30개, 5-20개, 5-15개, 5-10개, 1-75개, 1-50개, 1-40개, 1-30개, 1-20개, 1-15개, 1-10개, 8-11개, 또는 11-16개의 아미노산일 수 있다. 예를 들어, 불규칙변화성 면역원성 펩타이드는 길이가 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60개의 아미노산일 수 있다. 예를 들어, 불규칙변화성 면역원성 펩타이드는 길이가 8-100개, 8-50개, 8-30개, 8-25개, 8-22개, 8-20개, 8-15개, 8-14개, 8-13개, 8-12개, 8-11개, 7-11개, 또는 8-10개의 아미노산일 수 있다. 한 예에서, 불규칙변화성 면역원성 펩타이드는 길이가 9개의 아미노산일 수 있다.
일부 경우에, 불규칙변화성 면역원성 펩타이드는 친수성이거나 또는 특정 수치요법 한계값까지 또는 그 아래로 기록될 수 있으며, 그것으로 리스테리아 모노사이토게네스 또는 관심의 또 다른 박테리아에서 분비 가능성이 예측될 수 있다. 예를 들어, 불규칙변화성 면역원성 펩타이드는 카이트와 둘리틀 수치요법 지수 (Kyte and Doolittle hydropathy index) 21 아미노산 창에 의해 채점될 수 있고, 컷오프 (약 1.6)보다 큰 모든 채점은 리스테리아 모노사이토게네스에 의해 분비 가능하지 않은 것으로서 배제될 수 있다.
불규칙변화성 면역원성 펩타이드는 단일 불규칙변화성 돌연변이를 포함할 수 있거나 또는 둘 이상의 불규칙변화성 돌연변이 (예컨대, 2개의 불규칙변화성 돌연변이)를 포함할 수 있다. 예시의 불규칙변화성 돌연변이 펩타이드는, 또한 상응하는 야생형 (천연) 펩타이드를 제공하는 다음의 표의 불규칙변화성 펩타이드 서열로 이루어지거나, 본질적으로 이루어지거나, 포함한다. 상응하는 불규칙변화성 펩타이드에서 변형되는 야생형 펩타이드의 잔기는 굵고 밑줄이 그어져 있다.
Figure pct00004
Figure pct00005
이러한 불규칙변화성 펩타이드를 암호화하는 핵산이 또한 개시된다. 핵산은 임의의 형태로 있을 수 있다. 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함하거나 그것으로 이루어질 수 있고, 단일 가닥이거나 이중 가닥일 수 있다. 핵산은 플라스미드, 예컨대 에피솜성 플라스미드, 다중복사 에피솜성 플라스미드, 또는 통합형 플라스미드의 형태로 있을 수 있다. 대안으로, 핵산은 바이러스 벡터, 파지 벡터의 형태로, 또는 박테리아 인공 염색체에 있을 수 있다. 이러한 핵산은 한 개의 오픈 리딩 프레임을 가지거나 둘 이상의 오픈 리딩 프레임을 가질 수 있다. 한 예에서, 이러한 핵산은 각각의 오픈 리딩 프레임 사이의 샤인-달가노 리보솜 결합 부위 핵산 서열에 의해 연결된 둘 이상의 오픈 리딩 프레임을 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산은 각 오픈 리딩 프레임 사이의 샤인-달가노 리보솜 결합 부위 핵산 서열에 의해 연결된 2 내지 4개의 오픈 리딩 프레임을 포함할 수 있다. 각각의 오픈 리딩 프레임은 상이한 펩타이드를 암호화할 수 있다. 일부 핵산에서, 융합 폴리펩타이드의 카르복시 말단을 암호화하는 코돈에 단백질 합성의 종결을 보장하기 위해 두 개의 중단 코돈이 뒤따른다.
핵산은 코돈 최적화될 수 있다. 핵산은 핵산의 적어도 한 코돈이 그 아미노산에 대해 원래의 서열에서의 코돈보다 특정 유기체에 의해 보다 빈번하게 사용되는 코돈 (예컨대, 인간 또는 리스테리아 모노사이토게네스에서 발현에 최적화된 코돈)으로 대체된다면 코돈-최적화된다. 본원에 개시된 불규칙변화성 펩타이드를 암호화하는 핵산의 예는 SEQ ID NO: 223-977에 제공된다.
III. 재조합 융합 폴리펩타이드
본원에는 본원의 다른 곳에서 개시된 것과 같이 불규칙변화성 돌연변이를 포함하는 (즉, 하나 이상의 암 관련 단백질의 면역원성 단편에 융합된, 이때 각 단편은 불규칙변화성 돌연변이를 포함함) 하나 이상의 종양-관련 항원 펩타이드에 융합된 PEST-함유 펩타이드를 포함하는 재조합 융합 폴리펩타이드가 개시된다.
또한 본원에는 본원의 다른 곳에서 개시된 것과 같이 불규칙변화성 돌연변이를 포함하는 (즉, 하나 이상의 암 관련 단백질의 면역원성 단편에 융합된, 이때 각 단편은 불규칙변화성 돌연변이를 포함함) 하나 이상의 종양-관련 항원 펩타이드를 포함하는 재조합 융합 폴리펩타이드가 개시되며, 여기서 융합 폴리펩타이드는 PEST-함유 펩타이드를 포함하지 않는다.
또한 본원에는 N-말단 단부로부터 C-말단 단부로 박테리아 분비 서열, 유비퀴틴 (Ub) 단백질, 및 본원의 다른 곳에서 개시된 것과 같이 불규칙변화성 돌연변이를 포함하는 (즉, 하나 이상의 암 관련 단백질의 면역원성 단편에 융합된, 이때 각 단편은 불규칙변화성 돌연변이를 포함함) 하나 이상의 종양-관련 항원 펩타이드를 포함하는 재조합 융합 폴리펩타이드 (즉, 나란히, 예컨대 Ub-펩타이드1-펩타이드2)가 제공된다. 대안으로, 각각의 항원성 펩타이드가 그 자체의 분비 서열 및 Ub 단백질에 융합되어 있는 별개의 융합 폴리펩타이드의 조합 (예컨대, Ub1-펩타이드1; Ub2-펩타이드2)이 사용될 수 있다.
이러한 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 (미니유전자 구성물이라고 불림)이 또한 개시된다. 이러한 미니유전자 핵산 구성물은 각각의 오픈 리딩 프레임 사이의 샤인-달가노 리보솜 결합 부위 핵산 서열에 의해 결합된 둘 이상의 오픈 리딩 프레임을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 미니유전자 핵산 구성물은 각각의 오픈 리딩 프레임 사이의 샤인-달가노 리보솜 결합 부위 핵산 서열에 의해 결합된 2 내지 4개의 오픈 리딩 프레임을 추가로 포함할 수 있다. 각각의 오픈 리딩 프레임은 상이한 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다. 일부 핵산 구성물에서, 융합 폴리펩타이드의 카르복시 말단을 암호화하는 코돈에 이어 단백질 합성의 종결을 보장하기 위해 두 개의 중단 코돈이 뒤따른다.
박테리아 신호 서열은 리스테리아 신호 서열, 예컨대 Hly 또는 ActA 신호 서열, 또는 임의의 다른 공지된 신호 서열일 수 있다. 다른 경우에, 신호 서열은 LLO 신호 서열일 수 있다. 예시의 LLO 신호 서열은 SEQ ID NO: 97에서 제시된다. 신호 서열은 박테리아의 것일 수 있거나, 숙주 박테리아에 고유한 것일 수 있거나 (예컨대, 리스테리아 모노사이토게네스, 예컨대 secA1 신호 펩타이드), 또는 숙주 박테리아에 대해 외래의 것일 수 있다. 신호 펩타이드의 특정 예는 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis)로부터의 Usp45 신호 펩타이드, 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis)로부터의 보호 항원 신호 펩타이드, 리스테리아 모노사이토게네스로부터의 secA2 신호 펩타이드, 예컨대 p60 신호 펩타이드, 및 Tat 신호 펩타이드, 예컨대 바실루스 서브틸리스 Tat 신호 펩타이드 (예컨대, PhoD)를 포함한다. 특정 예에서, 분비 신호 서열은 리스테리아 단백질로부터 유래되며, 예컨대 ActA300 분비 신호 또는 ActA100 분비 신호이다. 예시의 ActA 신호 서열은 SEQ ID NO: 98에서 제시된다.
유비퀴틴은, 예를 들어, 전장 단백질일 수 있다. 예시의 유비퀴틴 서열은 SEQ ID NO: 188에 제시된다. 본원에서 제공된 핵산 구성물로부터 발현된 유비퀴틴은 숙주 세포 시토졸로의 진입시 하이드롤라아제의 작용을 통해 핵산 구성물로부터 발현된 재조합 융합 폴리펩타이드의 나머지로부터 카르복시 말단에서 절단될 수 있다. 이것은 융합 폴리펩타이드의 아미노 말단을 해방시켜서, 숙주 세포 시토졸에서 펩타이드를 생성한다.
융합 폴리펩타이드 내에서 항원성 펩타이드의 선택, 변화, 및 배열은 본원의 다른 곳에서 보다 상세하게 논의되고, 불규칙변화성 돌연변이를 포함하는 종양-관련 항원 펩타이드는 본원의 다른 곳에서 보다 상세하게 논의된다.
재조합 융합 폴리펩타이드는 하나 이상의 태그를 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 융합 폴리펩타이드는 그 하나 이상의 항원성 펩타이드에 대한 N-말단 및/또는 C-말단에 하나 이상의 펩타이드 태그를 포함할 수 있다. 태그는 항원성 펩타이드에 직접적으로 융합될 수 있거나 또는 링커 (그 예는 본원의 다른 곳에서 개시됨)를 통해 항원성 펩타이드에 결합될 수 있다. 태그의 예는 FLAG 태그; 2xFLAG 태그; 3xFLAG 태그; His 태그, 6xHis 태그; 및 SIINFEKL 태그를 포함한다. 예시의 SIINFEKL 태그는 SEQ ID NO: 16에서 제시된다 (SEQ ID NO: 1-15에서 제시된 핵산 중 어느 하나에 의해 암호화됨). 예시의 3xFLAG 태그는 SEQ ID NO: 32에서 제시된다 (SEQ ID NO: 17-31에서 제시된 핵산 중 어느 하나에 의해 암호화됨). 예시의 변이체 3xFLAG 태그는 SEQ ID NO: 99에서 제시된다. 둘 이상의 태그, 예컨대 2xFLAG 태그 및 SIINFEKL 태그, 3xFLAG 태그 및 SIINFEKL 태그, 또는 6xHis 태그 및 SIINFEKL 태그가 함께 사용될 수 있다. 둘 이상의 태그가 사용되면, 그것들은 재조합 융합 폴리펩타이드 내 어떤 곳에도 및 어떤 순서로도 위치할 수 있다. 예를 들어, 두 개의 태그는 재조합 융합 폴리펩타이드의 C-말단에 있을 수 있거나, 두 개의 태그는 재조합 융합 폴리펩타이드의 N-말단에 있을 수 있거나, 두 개의 태그는 재조합 융합 폴리펩타이드 내부에 위치할 수 있거나, 하나의 태그는 재조합 융합 폴리펩타이드의 C-말단에, 하나의 태그는 N-말단에 있을 수 있거나, 하나의 태그는 재조합 융합 폴리펩타이드의 C-말단에, 하나의 태그는 그 내부에 있을 수 있거나, 또는 하나의 태그는 재조합 융합 폴리펩타이드의 N-말단에, 하나의 태그는 그 내부에 있을 수 있다. 다른 태그로는 키틴 결합 단백질 (CBP), 말토오스 결합 단백질 (MBP), 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST), 티오레독신 (TRX), 및 폴리(NANP)를 포함한다. 특정 재조합 융합 폴리펩타이드는 C-말단 SIINFEKL 태그를 들 수 있다. 이러한 태그는 재조합 융합 단백질의 용이한 검출, 재조합 융합 단백질의 분비의 확인, 또는 이들 "태그" 서열 펩타이드에 대한 면역 반응에 따라 분비된 융합 폴리펩타이드의 면역원성을 따르는 것을 허용할 수 있다. 이러한 면역 반응은, 예를 들어, 이들 태그에 특이적인 단클론성 항체 및 DNA 또는 RNA 프로브를 포함한 많은 시약을 사용하여 모니터링될 수 있다.
본원에 개시된 재조합 융합 폴리펩타이드는 재조합 리스테리아 균주에 의해 발현될 수 있거나 또는 단백질 발현 및 분리에 사용된 다른 벡터 및 세포 시스템으로부터 발현되고 분리될 수 있다. 이러한 항원성 펩타이드를 발현하는 것을 포함하는 재조합 리스테리아 균주는, 예를 들어, 이러한 재조합 리스테리아를 포함하는 면역원성 조성물에 및 재조합 리스테리아 균주 및 보조제를 포함하는 백신에 사용될 수 있다. 리스테리아 균주의 숙주 세포 시스템 및 리스테리아 이외의 숙주 세포 시스템에서 비용혈성 절단된 형태의 LLO, ActA, 또는 PEST-유사 서열을 가진 융합 폴리펩타이드로서 하나 이상의 항원성 펩타이드의 발현은 항원성 펩타이드의 증강된 면역원성을 초래할 수 있다.
이러한 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산이 또한 개시된다. 핵산은 임의의 형태로 있을 수 있다. 핵산은 DNA 또는 RNA를 포함하거나 이것들로 이루어질 수 있고, 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 핵산은 플라스미드, 예컨대 에피솜 플라스미드, 다중복사 에피솜성 플라스미드, 또는 통합형 플라스미드의 형태로 있을 수 있다. 대안으로, 핵산은 바이러스 벡터, 파지 벡터의 형태로 있거나, 또는 박테리아 인공적인 염색체 내에 있을 수 있다. 이러한 핵산은 하나의 오픈 리딩 프레임을 가질 수 있거나 또는 둘 이상의 오픈 리딩 프레임 (예컨대, 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 오픈 리딩 프레임 및 대사 효소를 암호화하는 제2 오픈 리딩 프레임)을 가질 수 있다. 한 예에서, 이러한 핵산은 각각의 오픈 리딩 프레임 사이의 샤인-달가노 리보솜 결합 부위 핵산 서열에 의해 결합된 둘 이상의 오픈 리딩 프레임을 포함할 수 있다. 예를 들어, 핵산은 각각의 오픈 리딩 프레임 사이의 샤인-달가노 리보솜 결합 부위 핵산 서열에 의해 결합된 2 내지 4개의 오픈 리딩 프레임을 포함할 수 있다. 각각의 오픈 리딩 프레임은 상이한 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다. 일부 핵산에서, 융합 폴리펩타이드의 카르복시 말단을 암호화하는 코돈에 이어 단백질 합성의 종결을 보장하기 위해 두 개의 중단 코돈이 뒤따른다.
A. 항원성 펩타이드
본원에서 개시된 재조합 융합 폴리펩타이드는 본원의 다른 곳에서 개시된 것과 같이 불규칙변화성 돌연변이 (즉, 암 관련 단백질의 면역원성 단편, 여기서 각 단편은 불규칙변화성 돌연변이를 포함함)를 포함하는 하나 이상의 종양-관련 항원성 펩타이드를 포함한다. 융합 폴리펩타이드는 단일 항원성 펩타이드를 포함할 수 있거나 또는 둘 이상의 항원성 펩타이드를 포함할 수 있다. 각각의 항원성 펩타이드는 면역 반응을 유도하기에 충분한 임의의 길이의 것일 수 있고, 각각의 항원성 펩타이드는 동일한 길이일 수 있거나 또는 항원성 펩타이드는 상이한 길이를 가질 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드에 대한 적합한 길이의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다.
각각의 항원성 펩타이드는 또한 친수성일 수 있거나 또는 특정 수치요법 한계값 이하로 점수링할 수 있으며, 이것은 리스테리아 모노사이토게네스 또는 관심 있는 또 다른 박테리아에서의 분비 능력을 예측할 수 있다. 예를 들어, 항원성 펩타이드는 카이트 및 둘리틀 수치요법 지수 21 아미노산 창에 의해 점수링될 수 있고, 컷오프 (대략 1.6)보다 높은 모든 채점은 그것들이 리스테리아 모노사이토게네스에 의해 분비 가능한 것일 가능성이 작기 때문에 배제될 수 있다. 마찬가지로, 항원성 펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드의 조합은 친수성일 수 있거나 또는 특정 수치요법 한계값 이하로 채점될 수 있으며, 이것은 리스테리아 모노사이토게네스 또는 관심 있는 또 다른 박테리아에서의 분비 능력을 예측할 수 있다.
항원성 펩타이드는 임의의 방식으로 함께 결합될 수 있다. 예를 들어, 항원성 펩타이드는 개재 서열 없이 서로 직접적으로 융합될 수 있다. 대안으로, 항원성 펩타이드는 하나 이상의 링커, 예컨대 펩타이드 링커를 통해 서로 간접적으로 결합될 수 있다. 일부 경우에, 일부 인접한 항원성 펩타이드의 쌍은 서로 직접적으로 융합될 수 있고, 다른 항원성 펩타이드의 쌍은 하나 이상의 링커를 통해 서로 간접적으로 결합될 수 있다. 동일한 링커가 각각의 인접한 항원성 펩타이드의 쌍 사이에서 사용될 수 있거나, 또는 임의의 수의 상이한 링커가 상이한 인접한 항원성 펩타이드의 쌍 사이에서 사용될 수 있다. 이에 더불어, 하나의 링커가 인접한 항원성 펩타이드의 쌍 사이에서 사용될 수 있거나, 또는 다수의 링커가 인접한 항원성 펩타이드의 쌍 사이에서 사용될 수 있다.
임의의 적합한 서열이 펩타이드 링커에 사용될 수 있다. 예로서, 링커 서열은 길이가, 예를 들어, 1 내지 약 50개의 아미노산일 수 있다. 일부 링커는 친수성일 수 있다. 링커는 다양한 목적으로 역할을 할 수 있다. 예를 들어, 링커는 박테리아 분비를 증가시키거나, 항원 처리를 용이하게 하거나, 융합 폴리펩타이드의 유연성을 증가시키거나, 융합 폴리펩타이드의 강성을 증가시키거나, 또는 임의의 다른 목적으로 역할을 할 수 있다. 특정 예로서, 유연성 링커, 강성 링커, 및 면역프로테아좀 처리 링커 중 하나 이상 또는 전부가 사용될 수 있다. 이러한 링커의 예들은 하기에 제공된다. 일부 경우에, 반복부를 최소화하기 위해 상이한 아미노산 링커 서열이 항원성 펩타이드 사이에 분포되거나 또는 동일한 아미노산 링커 서열을 암호화하는 상이한 핵산이 항원성 펩타이드 사이에 분포된다 (예컨대, SEQ ID NO: 84-94). 이것은 또한 2차 구조를 감소시켜, Lm 재조합 벡터 균주 집단 내에서 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 (예컨대, 플라스미드)의 효율적인 전사, 번역, 분비, 유지, 또는 안정화를 허용하는 역할을 할 수 있다. 다른 적합한 펩타이드 링커 서열이, 예를 들어, 다음 요인들 중 하나 이상을 토대로 선택될 수 있다: (1) 유연한 연장된 입체구조를 채택할 수 있음; (2) 항원성 펩타이드 상의 기능적 에피토프와 상호작용할 수 있는 2차 구조를 채택할 수 없음; 및 (3) 기능성 에피토프와 반응할 수 있는 소수성 또는 대전된 잔기의 부족. 예를 들어, 펩타이드 링커 서열은 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 함유할 수 있다. 다른 거의 중성의 아미노산, 예컨대 Thr 및 Ala가 또한 링커 서열에 사용될 수 있다. 링커로서 유용하게 이용될 수 있는 아미노산 서열은 Maratea et al. (1985) Gene 40:39-46; Murphy et al. (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83:8258-8262; US 4,935,233; 및 US 4,751,180 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 것들을 포함한다. 링커의 특정 예는 다음 표의 것들을 포함그러나 (이것들의 각각은 링커로서 그 자체로, 서열의 반복부위를 포함하는 링커에서, 또는 표의 다른 서열 중 하나 이상을 더 포함하는 링커에서 사용될 수 있음), 다른 것들이 또한 구상될 수 있다 (예컨대, Reddy Chichili et al. (2013) Protein Science 22:153-167 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 참조). 명시되지 않으면, "n"은 나열된 링커 내에서 결정되지 않은 반복부위의 수를 나타낸다.
Figure pct00006
VGKGGSGG 링커 (SEQ ID NO: 37)는, 예를 들어, 유연성을 제공하고 융합 단백질의 전하 균형을 맞추기 위해 사용될 수 있다. EAAAK 링커 (SEQ ID NO: 39)는, 예를 들어, 융합 단백질이 다른 방식으로 자체적으로 접혀진다면 발현 및 분비를 용이하게 하기 위해 사용될 수 있는 강성/견고한 링커이다. GGGGS 링커 (SEQ ID NO: 36)는 예를 들어, 발현 및 분비를 용이하게 하는 것을 보조하기 위해 융합 단백질에 증가된 유연성을 부가하기 위해 사용될 수 있는 유연성 링커이다. "i20" 링커 (예컨대, SEQ ID NO: 209-217)는, 예를 들어, 면역프로테아좀에 의한 융합 단백질의 절단을 용이하게 하는 것을 돕고 본원에서 설계되고 개시된 불규칙변화성 9mer를 사용할 때와 같이 바람직한 정확한 최소 결합 단편을 얻을 횟수를 증가시키기 위해 설계된 면역프로테아좀 링커이다. GGGGS 및 EAAAK 링커의 조합 (각각 SEQ ID NO: 36 및 39)은, 예를 들어, 개선된 발현 및 분비를 위해 구성물의 균형을 맞추는 것을 돕고 선택을 위해 보다 독특한 코돈을 제공함으로써 DNA 합성을 용이하게 하는 것을 돕기 위해 유연성 및 강성을 대체하기 위해 사용될 수 있다.
융합 폴리펩타이드는 임의의 수의 불규칙변화성 항원성 펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 융합 폴리펩타이드는 융합 폴리펩타이드가 재조합 리스테리아 균주로부터 생성되고 분비될 수 있도록 임의의 수의 불규칙변화성 항원성 펩타이드를 포함한다. 예를 들어, 융합 폴리펩타이드는 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 불규칙변화성 항원성 펩타이드, 또는 2-50, 2-45, 2-40, 2-35, 2-30, 2-25, 2-20, 2-15, 2-10, 2-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 또는 45-50개의 불규칙변화성 항원성 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 융합 폴리펩타이드는 단일 불규칙변화성 항원성 펩타이드를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 융합 폴리펩타이드는 약 1-100, 1-5, 5-10, 10-15, 15-20, 10-20, 20-30, 30-40,40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 5-15, 5-20, 5-25, 15-20, 15-25, 15-30, 15-35, 20-25, 20-35, 20-45, 30-45, 30-55 ,40-55, 40-65, 50-65, 50-75, 60-75, 60-85, 70-85, 70-95, 80-95, 80-105, 95-105, 50-100, 1-100, 5-100, 5-75, 5-50, 5-40, 5-30, 5-20, 5-15, 5-10, 1-100, 1-75, 1-50, 1-40, 1-30, 1-20, 1-15, 또는 1-10개의 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 범위의 많은 불규칙변화성 항원성 펩타이드를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 융합 폴리펩타이드는 최대 약 100, 10, 20, 30, 40, 또는 50개의 불규칙변화성 항원성 펩타이드를 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 융합 폴리펩타이드는 약 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100개의 불규칙변화성 항원성 펩타이드를 포함할 수 있다.
이에 더불어, 융합 폴리펩타이드는 동일한 암 관련 단백질로부터의 임의의 수의 불규칙변화성 항원성 펩타이드 (즉, 동일한 암 관련 단백질로부터의 임의의 수의 비연속 단편)를 포함할 수 있다. 대안으로, 융합 폴리펩타이드는 둘 이상의 상이한 암 관련 단백질, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 암 관련 단백질로부터의 임의의 수의 불규칙변화성 항원성 펩타이드을 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 폴리펩타이드는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 암 관련 단백질, 또는 2-5, 5-10, 10-15, 또는 15-20개의 암 관련 단백질로부터의 불규칙변화성 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 둘 이상의 암 관련 단백질은 약 2-30, 약 2-25, 약 2-20, 약 2-15, 또는 약 2-10개의 암 관련 단백질일 수 있다. 예를 들어, 융합 폴리펩타이드는 동일한 암 관련 단백질로부터의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 불규칙변화성 항원성 펩타이드, 또는 동일한 암 관련 단백질로부터의 2-50, 2-45, 2-40, 2-35, 2-30, 2-25, 2-20, 2-15, 2-10, 2-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 또는 45-50개의 불규칙변화성 항원성 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 융합 폴리펩타이드는 동일한 암 관련 단백질로부터의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 불규칙변화성 항원성 펩타이드, 또는 둘 이상의 상이한 암 관련 단백질로부터의 2-50, 2-45, 2-40, 2-35, 2-30, 2-25, 2-20, 2-15, 2-10, 2-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 또는 45-50개의 불규칙변화성 항원성 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 이에 더불어, 융합 폴리펩타이드는 동일한 암 관련 단백질로부터의 임의의 수의 비연속 불규칙변화성 항원성 펩타이드 (즉, 동일한 암 관련 단백질로부터의 임의의 수의 비연속 단편)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 폴리펩타이드는 동일한 암 관련 단백질로부터의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30개의 비연속 불규칙변화성 항원성 펩타이드, 또는 동일한 암 관련 단백질로부터의 2-50, 2-45, 2-40, 2-35, 2-30, 2-25, 2-20, 2-15, 2-10, 2-5, 5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-35, 35-40, 40-45, 또는 45-50개의 비연속 불규칙변화성 항원성 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 전부는 동일한 암 관련 단백질로부터의 비연속 불규칙변화성 항원성 펩타이드이거나, 또는 단일한 암 관련 단백질로부터 유래되는 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 전부는 그 암 관련 단백질로부터의 비연속 불규칙변화성 항원성 펩타이드이다.
각각의 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 상이한 (즉, 특유한) 불규칙변화성 돌연변이를 포함할 수 있다. 대안으로, 융합 폴리펩타이드에서 둘 이상의 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 동일한 불규칙변화성 돌연변이이다. 예를 들어, 동일한 불규칙변화성 항원성 폴리펩타이드의 둘 이상의 복사물이 융합 폴리펩타이드에 포함될 수 있다 (즉, 융합 폴리펩타이드는 동일한 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 둘 이상의 복사물을 포함한다). 일부 융합 폴리펩타이드에서, 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%는 임의의 다른 불규칙변화성 항원성 펩타이드에는 존재하지 않는 상이한 (즉, 특유한) 불규칙변화성 돌연변이를 포함한다.
일부 경우에, 적어도 2개의 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 동일한 암 관련 단백질의 중복 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, 둘 이상의 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 암 관련 단백질의 동일한 아미노산 잔기에서 상이한 불규칙변화성 돌연변이를 포함할 수 있다.
일부 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 적어도 2개의 상이한 불규칙변화성 돌연변이, 적어도 3개의 상이한 불규칙변화성 돌연변이, 또는 적어도 4개의 상이한 불규칙변화성 돌연변이를 포함할 수 있다.
임의의 조합의 불규칙변화성 돌연변이가 융합 폴리펩타이드에 포함될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 상이한 HLA 유형에 결합하는 불규칙변화성 항원성 펩타이드가 포함될 수 있다. 예를 들어, 다음의 HLA 유형 중 하나 이상 또는 전부에 결합하는 불규칙변화성 항원성 펩타이드가 확인될 수 있다: HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02.
융합 폴리펩타이드에서 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 동일한 암 관련 단백질로부터의 불규칙변화성 돌연변이를 포함할 수 있거나, 또는 융합 폴리펩타이드에서 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 조합은 둘 이상의 암 관련 단백질로부터의 불규칙변화성 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합 폴리펩타이드는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개의 암 관련 단백질, 또는 2-5, 5-10, 10-15, 또는 15-20개의 암 관련 단백질로부터의 불규칙변화성 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 둘 이상의 암 관련 단백질은 약 2-30, 약 2-25, 약 2-20, 약 2-15, 또는 약 2-10개의 암 관련 단백질일 수 있다. 일부 예에서, 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%는 동일한 암 관련 단백질로부터의 불규칙변화성 돌연변이를 포함한다. 다른 예에서, 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 어느 것도 동일한 암 관련 단백질로부터의 불규칙변화성 돌연변이를 포함하지 않는다.
불규칙변화성 항원성 펩타이드의 예시의 서열은 본원의 다른 곳에서 개시된다. 예로서, 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 본원에 개시된 임의의 항원성 펩타이드 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일한 서열을 포함하거나, 본질적으로 그것으로 이루어지거나, 그것으로 이루어질 수 있다.
한 예로서, 재조합 융합 폴리펩타이드는 다음 유전자 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 또는 전부에 의해 암호화된 불규칙변화성 펩타이드를 포함할 수 있다: CEACAM5, MAGEA6, MAGEA4, GAGE1, NYESO1, STEAP1, 및 RNF43. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상 또는 전부와 결합할 수 있다. 이러한 암 관련 단백질은, 예를 들어, 비-소세포 폐암 (NSCLC)과 관련된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 임의의 순서로 있을 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 직접 함께 융합되어 있거나 또는 링커에 의해 함께 결합될 수 있으며, 링커의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 특정 예에서, 불규칙변화성 항원성 펩타이드 중 하나 이상 또는 전부는 9-mer (예컨대, 링커에 의해 함께 결합된 9-mer)일 수 있다. 이러한 항원성 펩타이드의 예는 실시예 2에서 제공된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 표 3의 불규칙변화성 항원성 펩타이드 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 또는 11개 전부, 또는 예를 들어, 표 3의 서열 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 또는 11개 전부를 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다.
다른 예로서, 재조합 융합 폴리펩타이드는 다음 유전자 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 또는 전부에 의해 암호화된 불규칙변화성 펩타이드를 포함할 수 있다: CEACAM5, MAGEA4, STEAP1, RNF43, SSX2, SART3, PAGE4, PSMA, 및 PSA. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상 또는 전부에 결합할 수 있다. 이러한 암 관련 단백질은, 예를 들어, 전립선암과 관련된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 임의의 순서로 있을 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 직접적으로 함께 융합되거나 링커에 의해 함께 결합될 수 있고, 이것들의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 특정 예에서, 항원성 펩타이드 중 하나 이상 또는 전부는 9-mer (예컨대, 링커에 의해 함께 결합된 9-mer)일 수 있다. 이러한 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 예는 실시예 2에서 제공된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 표 5의 불규칙변화성 항원성 펩타이드 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 전부, 또는 예를 들어, 표 5의 서열 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 전부를 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, 재조합 융합 폴리펩타이드는 다음 유전자 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 전부에 의해 암호화된 불규칙변화성 펩타이드를 포함할 수 있다: CEACAM5, STEAP1, MAGEA3, PRAME, hTERT, 및 SURVIVIN. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는는, 예를 들어, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상 또는 전부와 결합할 수 있다. 이러한 암 관련 단백질은, 예를 들어, 췌장암과 관련이 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 임의의 순서로 있을 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 직접적으로 함께 융합되거나 링커에 의해 함께 결합될 수 있고, 이것들의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 특정 예에서, 항원성 펩타이드 중 하나 이상 또는 전부는 9-mer (예컨대, 링커에 의해 함께 결합된 9-mer)일 수 있다. 이러한 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 예는 실시예 2에서 제공된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 표 7의 불규칙변화성 항원성 펩타이드 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 또는 12개 전부, 또는 예를 들어, 표 7의 서열 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 또는 12개 전부를 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, 재조합 융합 폴리펩타이드는 다음 유전자 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 또는 전부에 의해 암호화된 불규칙변화성 펩타이드를 포함할 수 있다: CEACAM5, GAGE1, NYESO1, RNF43, NUF2, KLHL7, MAGEA3, 및 PRAME. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상 또는 전부와 결합할 수 있다. 이러한 암 관련 단백질은, 예를 들어, 방광암과 관련이 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 임의의 순서로 있을 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 직접적으로 함께 융합되거나 링커에 의해 함께 결합될 수 있고, 이것들의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 특정 예에서, 항원성 펩타이드 중 하나 이상 또는 전부는 9-mer (예컨대, 링커에 의해 함께 결합된 9-mer)일 수 있다. 이러한 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 예는 실시예 2에서 제공된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 표 9의 불규칙변화성 항원성 펩타이드 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 또는 14개 전부, 또는 예를 들어, 표 9의 서열 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 또는 13개 전부를 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, 재조합 융합 폴리펩타이드는 다음 유전자 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 전부에 의해 암호화된 불규칙변화성 펩타이드를 포함할 수 있다: CEACAM5, STEAP1, RNF43, MAGEA3, PRAME, 및 hTERT. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상 또는 전부와 결합할 수 있다. 이러한 암 관련 단백질은, 예를 들어, 유방암 (예컨대, ER+ 유방암)과 관련이 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 임의의 순서로 있을 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 직접적으로 함께 융합되거나 링커에 의해 함께 결합될 수 있고, 이것들의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 특정 예에서, 항원성 펩타이드 중 하나 이상 또는 전부는 9-mer (예컨대, 링커에 의해 함께 결합된 9-mer)일 수 있다. 이러한 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 예는 실시예 2에서 제공된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 표 11의 불규칙변화성 항원성 펩타이드 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 또는 11개 전부, 또는 예를 들어, 표 9의 서열 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 또는 11개 전부를 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, 재조합 융합 폴리펩타이드는 다음 유전자 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 또는 전부에 의해 암호화된 불규칙변화성 펩타이드를 포함할 수 있다: CEACAM5, PRAME, hTERT, STEAP1, RNF43, NUF2, KLHL7, 및 SART3. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상 또는 전부와 결합할 수 있다. 이러한 암 관련 단백질은, 예를 들어, 자궁암과 관련이 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 임의의 순서로 있을 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 직접적으로 함께 융합되거나 링커에 의해 함께 결합될 수 있고, 이것들의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 특정 예에서, 항원성 펩타이드 중 하나 이상 또는 전부는 9-mer (예컨대, 링커에 의해 함께 결합된 9-mer)일 수 있다. 이러한 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 예는 실시예 2에서 제공된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 표 13의 불규칙변화성 항원성 펩타이드 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 또는 14개 전부, 또는 예를 들어, 표 13의 서열 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 또는 14개 전부를 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, 재조합 융합 폴리펩타이드는 다음 유전자 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 또는 전부에 의해 암호화된 불규칙변화성 펩타이드를 포함할 수 있다: CEACAM5, STEAP1, RNF43, SART3, NUF2, KLHL7, PRAME, 및 hTERT. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상 또는 전부와 결합할 수 있다. 이러한 암 관련 단백질은, 예를 들어, 난소암과 관련이 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 임의의 순서로 있을 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 직접적으로 함께 융합되거나 링커에 의해 함께 결합될 수 있고, 이것들의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 특정 예에서, 항원성 펩타이드 중 하나 이상 또는 전부는 9-mer (예컨대, 링커에 의해 함께 결합된 9-mer)일 수 있다. 이러한 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 예는 실시예 2에서 제공된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 표 15의 불규칙변화성 항원성 펩타이드 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 또는 14개 전부, 또는 예를 들어, 표 15의 서열 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 또는 14개 전부를 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, 재조합 융합 폴리펩타이드는 다음 유전자 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 또는 전부에 의해 암호화된 불규칙변화성 펩타이드를 포함할 수 있다: CEACAM5, MAGEA6, STEAP1, RNF43, SART3, NUF2, KLHL7, 및 hTERT. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상 또는 전부와 결합할 수 있다. 이러한 암 관련 단백질은, 예를 들어, 저등급 신경교종과 관련이 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 임의의 순서로 있을 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 직접적으로 함께 융합되거나 링커에 의해 함께 결합될 수 있고, 이것들의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 특정 예에서, 항원성 펩타이드 중 하나 이상 또는 전부는 9-mer (예컨대, 링커에 의해 함께 결합된 9-mer)일 수 있다. 이러한 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 예는 실시예 2에서 제공된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 표 17의 불규칙변화성 항원성 펩타이드 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 전부, 또는 예를 들어, 표 17의 서열 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 전부를 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, 재조합 융합 폴리펩타이드는 다음 유전자 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 또는 전부에 의해 암호화된 불규칙변화성 펩타이드를 포함할 수 있다: CEACAM5, MAGEA6, MAGEA4, GAGE1, NYESO1, STEAP1, RNF43, 및 MAGEA3. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상 또는 전부와 결합할 수 있다. 이러한 암 관련 단백질은, 예를 들어, 대장암 (예컨대, MSS 대장암)과 관련이 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 임의의 순서로 있을 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 직접적으로 함께 융합되거나 링커에 의해 함께 결합될 수 있고, 이것들의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 특정 예에서, 항원성 펩타이드 중 하나 이상 또는 전부는 9-mer (예컨대, 링커에 의해 함께 결합된 9-mer)일 수 있다. 이러한 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 예는 실시예 2에서 제공된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 표 19의 불규칙변화성 항원성 펩타이드 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 전부, 또는 예를 들어, 표 19의 서열 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 전부를 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, 재조합 융합 폴리펩타이드는 다음 유전자 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 전부에 의해 암호화된 불규칙변화성 펩타이드를 포함할 수 있다: CEACAM5, MAGEA4, STEAP1, NYESO1, PRAME, 및 hTERT. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상 또는 전부와 결합할 수 있다. 이러한 암 관련 단백질은, 예를 들어, 두경부암과 관련이 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 임의의 순서로 있을 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 직접적으로 함께 융합되거나 링커에 의해 함께 결합될 수 있고, 이것들의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 특정 예에서, 항원성 펩타이드 중 하나 이상 또는 전부는 9-mer (예컨대, 링커에 의해 함께 결합된 9-mer)일 수 있다. 이러한 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 예는 실시예 2에서 제공된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 표 21의 불규칙변화성 항원성 펩타이드 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 전부, 또는 예를 들어, 표 21의 서열 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 전부를 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다.
B. PEST-함유 펩타이드
본원에 개시된 재조합 융합 단백질은 PEST-함유 펩타이드를 포함한다. PEST-함유 펩타이드는 융합 폴리펩타이드의 아미노 말단 (N-말단) 단부 (즉, 항원성 펩타이드에 대해 N-말단)에 있을 수 있거나, 융합 폴리펩타이드의 카르복시 말단 (C-말단) 단부 (즉, 항원성 펩타이드에 대해 C-말단)에 있을 수 있거나, 또는 항원성 펩타이드 내에 내포될 수 있다. 일부 재조합 리스테리아 균주 및 방법에서, PEST 함유 펩타이드는 융합 폴리펩타이드의 일부가 아니며 이것과 별개이다. PEST-유사 서열, 예컨대 LLO 펩타이드로의 항원성 펩타이드의 융합은 항원성 펩타이드의 면역원성을 증강시킬 수 있고 세포-매개된 및 항종양 면역 반응을 증가시킬 수 있다 (즉, 세포-매개된 및 항-종양 면역력을 증가시킨다). 예를 들어, Singh et al. (2005) J Immunol 175(6):3663-3673 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
PEST-함유 펩타이드는 PEST 서열 또는 PEST-유사 서열을 포함하는 것이다. 진핵생물 단백질에서 PEST 서열이 오랫동안 확인되었다. 항상 그러한 것은 아니지만, 일반적으로는, 여러 양으로 대전된 아미노산을 함유하는 클러스터에 의해 플랭킹된(flanked), 예를 들어, 프롤린 (P), 글루탐산 (E), 세린 (S) 및 트레오닌 (T)이 풍부한 아미노산 서열을 함유하는 단백질은 빠른 세포 내 반감기를 가진다 (Rogers et al. (1986) Science 234:364-369 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)). 또한, 이들 서열은 분해를 위해 단백질을 유비퀴틴-프로테오좀 경로로 표적화한다는 것이 보고되었다 (Rechsteiner and Rogers (1996) Trends Biochem. Sci. 21:267-271 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)). 이 경로는 또한 진핵생물 세포에 의해 MHC 클래스 I에 결합하는 면역원성 펩타이드를 생성하는데 사용되고 면역원성 펩타이드를 발생시키는 진핵생물 단백질 사이에서 PEST 서열이 풍부하다는 가설이 세워졌다 (Realini et al. (1994) FEBS Lett. 348:109-113 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)). 원핵생물 단백질은 일반적으로 PEST 서열을 함유하지 않는데 그것들이 이 효소 경로를 가지고 있지 않기 때문이다. 그러나, 아미노산 프롤린 (P), 글루탐산 (E), 세린 (S) 및 트레오닌 (T)이 풍부한 PEST-유사 서열은 LLO의 아미노 말단에서 보고되었고 리스테리아 모노사이토게네스 병원성에 필수적인 것으로 보고되었다 (Decatur and Portnoy (2000) Science 290:992-995 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)). LLO에서 이런 PEST-유사 서열의 존재는 숙주 세포의 단백질 가수분해 기계에 의한 파괴를 위해 단백질을 표적화하며 이로 인해 LLO가 그것의 기능을 수행하고 파고솜 또는 파고리소솜 액포로부터 리스테리아 모노사이토게네스의 탈출을 촉진하면, 그것은 세포를 손상시키기 전에 파괴된다.
PEST 및 PEST-유사 서열의 확인은 기술 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어, Rogers et al. (1986) Science 234(4774):364-378 및 Rechsteiner and Rogers (1996) Trends Biochem. Sci. 21:267-271 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있다. PEST 또는 PEST-유사 서열은 PEST-발견 프로그램을 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, PEST-유사 서열은 프롤린 (P), 글루탐산 (E), 세린 (S), 및 트레오닌 (T) 잔기가 풍부한 영역일 수 있다. 선택적으로, PEST-유사 서열은 여러 양으로 대전된 아미노산을 함유하는 하나 이상의 클러스터에 의해 플랭킹될 수 있다. 예를 들어, PEST-유사 서열은 프롤린 (P), 아스파테이트 (D), 글루타메이트 (E), 세린 (S), 및/또는 트레오닌 (T) 잔기의 높은 국소 농도를 가진, 길이가 적어도 12개의 아미노산인 친수성 구간으로서 정의될 수 있다. 일부 경우에, PEST-유사 서열은 양으로 대전된 아미노산, 즉 아르기닌 (R), 히스티딘 (H), 및 리신 (K)을 함유하지 않는다. 일부 PEST-유사 서열은 하나 이상의 내부 인산화 부위를 함유할 수 있고, 이들 부위에서 인산화는 단백질 분해에 선행한다.
한 예에서, PEST-유사 서열은 Rogers 등의 문헌에서 개시된 알고리즘에 적합하다. 또 다른 예에서, PEST-유사 서열은 Rechsteiner and Rogers의 문헌에서 개시된 알고리즘에 적합하다. PEST-유사 서열은 또한 명시된 단백질 서열 내에서 양으로 대전된 아미노산 R, H, 및 K에 대한 초기 스캔에 의해 확인될 수 있다. 양으로 대전된 플랭크 사이의 모든 아미노산이 계수되고, 창-크기 파라미터와 같거나 이보다 높은 많은 아미노산을 함유하는 그런 모티프만이 추가로 고려된다. 선택적으로, PEST-유사 서열은 적어도 하나의 P, 적어도 하나의 D 또는 E, 및 적어도 하나의 S 또는 T를 함유해야 한다.
PEST 모티프의 품질은 중요 아미노산의 국소적 풍부함, 뿐만 아니라 모티프 소수성에 기초한 채점 파라미터에 의해 정제될 수 있다. D, E, P, S, 및 T의 풍부함은 질량 퍼센트 (w/w)로 표시되고 D 또는 E의 한 동등물, P의 한 동등물, 및 S 또는 T의 한 동등물에 대해 교정된다. 소수성의 계산은 또한 원칙적으로 Kyte and Doolittle (1982) J. Mol. Biol. 157:105 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)의 방법을 따른다. 단순화된 계산을 위해, 원래 아르기닌에 대한 -4.5 내지 아이소류신에 대한 +4.5의 범위에 있는 카이트-둘리틀 수치요법 지수는 다음 1차 변환을 사용하여 양의 정수로 전환되며, 아르기닌에 대한 0 내지 아이소류신에 대한 90의 값을 수득하였다: 수치요법 지수 = 10 * 카이트-둘리틀 수치요법 지수 + 45.
잠재적인 PEST 모티프의 소수성은 또한 각각의 아미노산 종에 대한 몰 퍼센트 및 소수성 지수의 곱에 대한 합으로서 계산될 수 있다. 원하는 PEST 점수는 다음 방정식으로 표시된 바와 같이 국소 풍부 항 및 소수성 항의 배합으로서 얻어진다: PEST 점수 = 0.55 * DEPST - 0.5 * 소수성 지수.
그러므로, PEST-함유 펩타이드는 상기 알고리즘을 사용하여 적어도 +5의 점수를 가진 펩타이드를 나타낼 수 있다. 대안으로, 그것은 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 32, 적어도 35, 적어도 38, 적어도 40, 또는 적어도 45의 점수를 가진 펩타이드를 나타낼 수 있다.
기술분야에 알려져 있는 임의의 다른 이용 가능한 방법 또는 알고리즘이 또한 PEST-유사 서열을 확인하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, CaSPredictor (Garay-Malpartida et al. (2005) Bioinformatics 21 Suppl 1:i169-76 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨))를 참조한다. 사용될 수 있는 또 다른 방법은 다음과 같다: PEST 지수는 아미노산 Ser, Thr, Pro, Glu, Asp, Asn, 또는 Gln에 1의 값을 배정함으로써 적절한 길이의 각각의 구간 (예컨대, 30-35개의 아미노산 구간)에 대해 계산된다. PEST 잔기 각각에 대한 계수 값 (CV)은 1이고 다른 AA (비-PEST) 각각에 대한 CV는 0이다.
PEST-유사 아미노산 서열의 예는 SEQ ID NO: 43-51에서 제시된 것들이다. PEST-유사 서열의 한 예는 KENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDK (SEQ ID NO: 43)이다. PEST-유사 서열의 또 다른 예는 KENSISSMAPPASPPASPK (SEQ ID NO: 44)이다. 그러나, 임의의 PEST 또는 PEST-유사 아미노산 서열이 사용될 수 있다. PEST 서열 펩타이드는 공지되어 있고, 예를 들어, US 7,635,479; US 7,665,238; 및 US 2014/0186387 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있다.
PEST-유사 서열은 리스테리아 종, 예컨대 리스테리아 모노사이토게네스로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 리스테리아 모노사이토게네스 ActA 단백질은 적어도 네 개의 이러한 서열 (SEQ ID NO: 45-48)을 함유하며, 이것들 중 어느 것도 본원에 개시된 조성물 및 방법에서의 사용에 적합하다. 다른 유사한 PEST-유사 서열은 SEQ ID NO: 52-54를 포함한다. 스트렙토코쿠스 종의 스트렙토리신 O 단백질은 또한 PEST 서열을 함유한다. 예를 들어, 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 스트렙토리신 O는 아미노산 35-51에서 PEST 서열 KQNTASTETTTTNEQPK (SEQ ID NO: 49)를 포함하고 스트렙토코쿠스 에퀴시밀리스 (Streptococcus equisimilis) 스트렙토리신 O는 아미노산 38-54에서 PEST-유사 서열 KQNTANTETTTTNEQPK (SEQ ID NO: 50)를 포함한다. PEST-유사 서열의 또 다른 예는 리스테리아 실리게리(Listeria seeligeri) 시톨리신으로부터 유래되고, lso 유전자: RSEVTISPAETPESPPATP (예컨대, SEQ ID NO: 51)에 의해 암호화된다.
대안으로, PEST-유사 서열은 다른 원핵생물 유기체로부터 유래될 수 있다. PEST-유사 아미노산 서열이 예상되는 다른 원핵생물 유기체는, 예를 들어, 다른 리스테리아 종을 포함한다.
(1) 리스테리오리신 O (LLO)
본원에 개시된 조성물 및 방법에 이용될 수 있는 PEST-함유 펩타이드의 한 예는 리스테리오리신 O (LLO) 펩타이드이다. LLO 단백질의 예는 GenBank 수탁 번호 P13128이 배정된 단백질이다 (SEQ ID NO: 55; 핵산 서열은 GenBank 수탁 번호 X15127에서 제시됨). SEQ ID NO: 55는 신호 서열을 포함하는 프로단백질이다. 프로단백질의 처음 25개의 아미노산은 신호 서열이고 박테리아에 의해 분비될 때 LLO로부터 절단되며, 이로써 신호 서열이 없는 504개의 아미노산의 전장 활성 LLO 단백질을 발생시킨다. 본원에 개시된 LLO 펩타이드는 신호 서열을 포함할 수 있거나 또는 신호 서열을 포함하지 않는 펩타이드를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 예시의 LLO 단백질은 SEQ ID NO: 55에서 제시된 서열 또는 SEQ ID NO: 55의 상동체, 변이체, 이소형태, 유사체, 단편, 상동체의 단편, 변이체의 단편, 유사체의 단편, 및 이소형태의 단편을 포함하거나, 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 이것들로 이루어진다. LLO 단백질의 단편 또는 LLO 단백질의 상동체, 변이체, 이소형태, 유사체, 상동체의 단편, 변이체의 단편, 또는 유사체의 단편을 암호화하는 임의의 서열이 사용될 수 있다. 상동성 LLO 단백질은 참조 LLO 단백질과, 예를 들어, 70%, 72%, 75%, 78%, 80%, 82%, 83%, 85%, 87%, 88%, 90%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%보자 큰 서열 동일성을 가질 수 있다.
LLO 단백질의 또 다른 예는 SEQ ID NO: 56에서 제시된다. 사용될 수 있는 LLO 단백질은 SEQ ID NO: 56에서 제시된 서열 또는 SEQ ID NO: 56의 상동체, 변이체, 이소형태, 유사체, 단편, 상동체의 단편, 변이체의 단편, 유사체의 단편, 및 이소형태의 단편을 포함하거나, 근본적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 이것들로 이루어질 수 있다.
LLO 단백질의 또 다른 예는 리스테리아 모노사이토게네스 10403S 균주로부터의 LLO 단백질이며, GenBank 수탁 번호: ZP_01942330 또는 EBA21833에서 제시된 것과 같거나, 또는 GenBank 수탁 번호: NZ_AARZ01000015 또는 AARZ01000015.1에서 제시된 핵산 서열에 의해 암호화된 것과 같다. LLO 단백질의 또 다른 예는 리스테리아 모노사이토게네스 4b F2365 균주 (예컨대, GenBank 수탁 번호: YP_012823 참조), EGD-e 균주 (예컨대, GenBank 수탁 번호: NP_463733 참조), 또는 리스테리아 모노사이토게네스의 임의의 다른 균주로부터의 LLO 단백질이다. LLO 단백질의 또 다른 예는 플라보박테리아 박테리아 HTCC2170 (예컨대, GenBank 수탁 번호: ZP_01106747 또는 EAR01433 참조, 또는 GenBank 수탁 번호: NZ_AAOC01000003에 의해 암호화됨)로부터의 LLO 단백질이다. 사용될 수 있는 LLO 단백질은 상기 LLO 단백질 또는 상기 LLO 단백질의 상동체, 변이체, 이소형태, 유사체, 단편, 상동체의 단편, 변이체의 단편, 유사체의 단편, 및 이소형태의 단편 중 어느 것을 포함하거나, 근본적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 이것들로 이루어질 수 있다.
LLO에 상동성인 단백질, 또는 그것의 상동체, 변이체, 이소형태, 유사체, 단편, 상동체의 단편, 변이체의 단편, 유사체의 단편, 및 이소형태의 단편이 또한 사용될 수 있다. 하나의 이러한 예는 알베오리신이며, 예를 들어, 패니바실루스 알베이(Paenibacillus alvei) (예컨대, GenBank 수탁 번호: P23564 또는 AAA22224 참조, 또는 GenBank 수탁 번호: M62709에 의해 암호화됨)에서 발견될 수 있다. 다른 이러한 상동성 단백질이 알려져 있다.
LLO 펩타이드는 전장 LLO 단백질 또는 절단된 LLO 단백질 또는 LLO 단편일 수 있다. 마찬가지로, LLO 펩타이드는 천연 LLO 단백질의 하나 이상의 기능성을 유지하거나 또는 천연 LLO 단백질의 하나 이상의 기능성이 없는 것일 수 있다. 예를 들어, 유지된 LLO 기능성은 박테리아 (예컨대, 리스테리아)를 파고솜 또는 파고리소솜으로부터 탈출시키거나, 또는 그것이 융합되는 펩타이드의 면역원성을 증강시킬 수 있다. 유지된 기능성은 또한 용혈성 기능 또는 항원성 기능일 수 있다. 대안으로, LLO 펩타이드는 비-용혈성 LLO일 수 있다. LLO 기능성을 평가하기 위한 방법 및 검정에서와 같이 LLO의 다른 기능이 알려져 있다.
LLO 단편은 PEST-유사 서열일 수 있거나 또는 PEST-유사 서열을 포함할 수 있다. LLO 단편은 내부 삭제, C-말단 단부로부터의 절단, 및 N-말단 단부로부터의 절단 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 경우에, LLO 단편은 하나 이상의 내부 삭제를 포함할 수 있다. 다른 LLO 펩타이드는 하나 이상의 돌연변이를 가진 전장 LLO 단백질일 수 있다.
일부 LLO 단백질 또는 단편은 야생형 LLO에 비해 용혈성 활성이 감소되었거나 비-용혈성 단편이다. 예를 들어, LLO 단백질은 카르복시 말단에서 활성화 도메인의 삭제 또는 돌연변이에 의해, 시스테인 484의 삭제 또는 돌연변이에 의해, 또는 또 다른 위치에서의 삭제 또는 돌연변이에 의해 비-용혈성이 될 수 있다.
다른 LLO 단백질은 US 8,771,702 (모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 상세히 설명된 바와 같이 콜레스테롤 결합 도메인 (CBD)의 삭제 또는 돌연변이에 의해 비-용혈성이 된다. 돌연변이는, 예를 들어, 치환 또는 삭제를 포함할 수 있다. 전체 CBD가 돌연변이될 수 있거나, CBD의 일부가 돌연변이될 수 있거나, 또는 CBD 내 특정 잔기가 돌연변이될 수 있다. 예를 들어, LLO 단백질은 SEQ ID NO: 55의 잔기 C484, W491, 및 W492 중 하나 이상 (예컨대, C484, W491, W492, C484 및 W491, C484 및 W492, W491 및 W492, 또는 세 개의 잔기 전부) 또는 SEQ ID NO: 55와 최적으로 정렬될 때 상응하는 잔기 (예컨대, 상응하는 시스테인 또는 트립토판 잔기)의 돌연변이를 포함할 수 있다. 예로서, LLO의 잔기 C484, W491, 및 W492가 알라닌 잔기로 치환된 돌연변이 LLO 단백질이 생성될 수 있으며, 이것은 야생형 LLO에 비해 실질적으로 용혈성 활성이 감소될 것이다. C484A, W491A, 및 W492A 돌연변이를 가진 돌연변이 LLO 단백질은 "mutLLO"라고 불린다.
또 다른 예로서, 돌연변이 LLO 단백질은 콜레스테롤-결합 도메인을 포함하는 내부 삭제로 생성될 수 있다. SEQ ID NO: 55의 콜레스테롤-결합 도메인의 서열은 SEQ ID NO: 74에서 제시된다. 예를 들어, 내부 삭제는 1-11개의 아미노산 삭제, 11-50개의 아미노산 삭제, 또는 그 이상일 수 있다. 마찬가지로, 돌연변이된 영역은 1-11개의 아미노산, 11-50개의 아미노산, 또는 그 이상일 수 있다 (예컨대, 1-50개, 1-11개, 2-11개, 3-11개, 4-11개, 5-11개, 6-11개, 7-11개, 8-11개, 9-11개, 10-11개, 1-2개, 1-3개, 1-4개, 1-5개, 1-6개, 1-7개, 1-8개, 1-9개, 1-10개, 2-3개, 2-4개, 2-5개, 2-6개, 2-7개, 2-8개, 2-9개, 2-10개, 3-4개, 3-5개, 3-6개, 3-7개, 3-8개, 3-9개, 3-10개, 12-50개, 11-15개, 11-20개, 11-25개, 11-30개, 11-35개, 11-40개, 11-50개, 11-60개, 11-70개, 11-80개, 11-90개, 11-100개, 11-150개, 15-20개, 15-25개, 15-30개, 15-35개, 15-40개, 15-50개, 15-60개, 15-70개, 15-80개, 15-90개, 15-100개, 15-150개, 20-25개, 20-30개, 20-35개, 20-40개, 20-50개, 20-60개, 20-70개, 20-80개, 20-90개, 20-100개, 20-150개, 30-35개, 30-40개, 30-60개, 30-70개, 30-80개, 30-90개, 30-100개, 또는 30-150개의 아미노산). 예를 들어, SEQ ID NO: 55의 잔기 470-500, 470-510, 또는 480-500으로 이루어진 돌연변이된 영역은 CBD (SEQ ID NO: 55의 잔기 483-493)를 포함하는 삭제된 서열을 발생시킬 것이다. 그러나, 돌연변이된 영역은 또한 CBD의 단편일 수 있거나 또는 CBD의 일부와 중복될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이된 영역은 SEQ ID NO: 55의 잔기 470-490, 480-488, 485-490, 486-488, 490-500, 또는 486-510으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, CBD (잔기 484-492)의 단편은 이종성 서열로 대체될 수 있으며, 이것은 야생형 LLO에 비해 용혈성 활성을 실질적으로 감소시킨다. 예를 들어, CBD (ECTGLAWEWWR; SEQ ID NO: 74)는 항원 NY-ESO-1 (ESLLMWITQCR; SEQ ID NO: 75)의 CTL 에피토프로 대체될 수 있으며, 이것은 NY-ESO-1의 HLA-A2 제한된 에피토프 157-165를 함유한다. 결과로 생성된 LLO는 "ctLLO"라고 불린다.
일부 돌연변이된 LLO 단백질에서, 돌연변이된 영역은 이종성 서열에 의해 대체될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이된 영역은 같은 수의 이종성 아미노산, 더 적은 수의 이종성 아미노산, 또는 더 많은 수의 아미노산 (예컨대, 1-50개, 1-11개, 2-11개, 3-11개, 4-11개, 5-11개, 6-11개, 7-11개, 8-11개, 9-11개, 10-11개, 1-2개, 1-3개, 1-4개, 1-5개, 1-6개, 1-7개, 1-8개, 1-9개, 1-10개, 2-3개, 2-4개, 2-5개, 2-6개, 2-7개, 2-8개, 2-9개, 2-10개, 3-4개, 3-5개, 3-6개, 3-7개, 3-8개, 3-9개, 3-10개, 12-50개, 11-15개, 11-20개, 11-25개, 11-30개, 11-35개, 11-40개, 11-50개, 11-60개, 11-70개, 11-80개, 11-90개, 11-100개, 11-150개, 15-20개, 15-25개, 15-30개, 15-35개, 15-40개, 15-50개, 15-60개, 15-70개, 15-80개, 15-90개, 15-100개, 15-150개, 20-25개, 20-30개, 20-35개, 20-40개, 20-50개, 20-60개, 20-70개, 20-80개, 20-90개, 20-100개, 20-150개, 30-35개, 30-40개, 30-60개, 30-70개, 30-80개, 30-90개, 30-100개, 또는 30-150개의 아미노산)으로 대체될 수 있다. 다른 돌연변이된 LLO 단백질은 하나 이상의 점 돌연변이 (예컨대, 1개의 잔기, 2개의 잔기, 3개의 잔기, 또는 그 이상의 점 돌연변이)를 가진다. 돌연변이된 잔기는 인접하거나 인접하지 않을 수 있다.
한 예시의 구체예에서, LLO 펩타이드는 신호 서열에서 삭제 및 CBD에서 돌연변이 또는 치환을 가질 수 있다.
일부 LLO 펩타이드는 N-말단 LLO 단편 (즉, C-말단 삭제를 가진 LLO 단백질)이다. 일부 LLO 펩타이드는 길이가 적어도 494개, 489개, 492개, 493개, 500개, 505개, 510개, 515개, 520개, 또는 525개의 아미노산 또는 길이가 492-528개의 아미노산이다. 예를 들어, LLO 단편은 LLO 단백질의 처음 440 또는 441개의 아미노산 (예컨대, SEQ ID NO: 55 또는 56의 처음 441개의 아미노산, 또는 SEQ ID NO: 55 또는 56과 최적으로 정렬될 때 또 다른 LLO 단백질의 상응하는 단편)으로 이루어질 수 있다. 다른 N-말단 LLO 단편은 LLO 단백질의 처음 420개의 아미노산 (예컨대, SEQ ID NO: 55 또는 56의 처음 420개의 아미노산, 또는 SEQ ID NO: 55 또는 56과 최적으로 정렬될 때 또 다른 LLO 단백질의 상응하는 단편)으로 이루어질 수 있다. 다른 N-말단 단편은 LLO 단백질의 대략 아미노산 20-442 (예컨대, SEQ ID NO: 55 또는 56의 아미노산 20-442, 또는 SEQ ID NO: 55 또는 56과 최적으로 정렬될 때 또 다른 LLO 단백질의 상응하는 단편)로 이루어질 수 있다. 다른 N-말단 LLO 단편은 시스테인 484를 포함하는 활성화 도메인이 없고, 특히 시스테인 484가 없는 임의의 ΔLLO를 포함한다. 예를 들어, N-말단 LLO 단편은 LLO 단백질의 처음 425개, 400개, 375개, 350개, 325개, 300개, 275개, 250개, 225개, 200개, 175개, 150개, 125개, 100개, 75개, 50개, 또는 25개의 아미노산 (예컨대, SEQ ID NO: 55 또는 56의 처음 425개, 400개, 375개, 350개, 325개, 300개, 275개, 250개, 225개, 200개, 175개, 150개, 125개, 100개, 75개, 50개, 또는 25개의 아미노산, 또는 SEQ ID NO: 55 또는 56과 최적으로 정렬될 때 또 다른 LLO 단백질의 상응하는 단편)에 상응할 수 있다. 바람직하게, 단편은 하나 이상의 PEST-유사 서열을 포함한다. LLO 단편 및 절단된 LLO 단백질은 상기 특정 아미노산 범위 중 어느 하나에 상응하는 상동성 LLO 단백질의 잔기를 함유할 수 있다. 잔기 수는 상기 열거된 잔기 수와 정확하게 상응할 필요는 없다 (예컨대, 상동성 LLO 단백질이 본원에 개시된 특이적 LLO 단백질에 대해 삽입 또는 삭제를 가지는 경우). N-말단 LLO 단편의 예는 SEQ ID NO: 57, 58, 및 59를 포함한다. 사용될 수 있는 LLO 단백질은 SEQ ID NO: 57, 58, 또는 59에서 제시된 서열 또는 SEQ ID NO: 57, 58, 또는 59의 상동체, 변이체, 이소형태, 유사체, 단편, 상동체의 단편, 변이체의 단편, 유사체의 단편, 및 이소형태의 단편을 포함하거나, 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 이것들로 이루어질 수 있다. 일부 조성물 및 방법에서, SEQ ID NO: 59에서 제시된 N-말단 LLO 단편이 사용된다. SEQ ID NO: 59에서 제시된 N-말단 LLO 단편을 암호화하는 핵산의 예는 SEQ ID NO: 60이다.
(2) ActA
본원에 개시된 조성물 및 방법에 이용될 수 있는 PEST-함유 펩타이드의 또 다른 예는 ActA 펩타이드이다. ActA는 표면-관련된 단백질이고 리스테리아 모노사이토게네스를 세포질을 통해 몰아가기 위해 감염된 숙주 세포에서 숙주 액틴 폴리머의 폴리머화, 조립, 및 활성화를 촉진하기 위한 스캐폴드(scaffold)로서 작용한다. 포유류 세포 시토졸로의 진입 직후, 리스테리아 모노사이토게네스는 숙주 액틴 필라멘트의 폴리머화를 유도하고 액틴 폴리머화에 의해 생성된 힘을 먼저 세포 내에서, 그 다음에 세포에서 세포로 이동시키는데 사용한다. ActA는 액틴 핵 형성 및 액틴-기반 운동성을 매개하는 데 기여한다. ActA 단백질은 숙주 세포 골격 구성요소에 대한 다수의 결합 부위를 제공하며, 이로써 세포 액틴 폴리머화 기계를 조립하기 위한 스캐폴드로서 작용한다. ActA의 N-말단은 모노머 액틴에 결합하고 내재적 액틴 핵 형성 활성을 자극함으로써 구성적으로 활성인 핵 형성 촉진 인자로서 작용한다. actA 및 hly 유전자는 둘 다 전사 활성화 물질 PrfA에 의해 조절되는 10-kb 유전자 클러스터의 구성원이고, actA는 포유류 시토졸에서 대략 226배 상향조절된다. ActA 단백질 또는 ActA 단백질의 상동체, 변이체, 이소형태, 유사체, 상동체의 단편, 변이체의 단편, 또는 유사체의 단편을 암호화하는 임의의 서열이 사용될 수 있다. 상동성 ActA 단백질은 참조 ActA 단백질과, 예를 들어, 70%, 72%, 75%, 78%, 80%, 82%, 83%, 85%, 87%, 88%, 90%, 92%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%보다 큰 서열 동일성을 가질 수 있다.
ActA 단백질의 한 예는 SEQ ID NO: 61에서 제시된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 이것들로 이루어진다. ActA 단백질의 또 다른 예는 SEQ ID NO: 62에서 제시된 서열을 포함하거나, 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 이것들로 이루어진다. 이들 서열 중 하나에 상응하는 프로단백질의 처음 29개의 아미노산은 신호 서열이고 그것이 박테리아에 의해 분비될 때 ActA 단백질로부터 분열된다. ActA 펩타이드는 신호 서열 (예컨대, SEQ ID NO: 61 또는 62의 아미노산 1-29)을 포함할 수 있거나, 또는 신호 서열을 포함하지 않는 펩타이드를 포함할 수 있다. ActA 단백질의 다른 예는 SEQ ID NO: 61 또는 62의 상동체, 변이체, 이소형태, 유사체, 단편, 상동체의 단편, 이소형태의 단편, 또는 유사체의 단편을 포함하거나, 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 이것들로 이루어진다.
ActA 단백질의 또 다른 예는 리스테리아 모노사이토게네스 10403S 균주 (GenBank 수탁 번호: DQ054585), NICPBP 54002 균주 (GenBank 수탁 번호: EU394959), S3 균주 (GenBank 수탁 번호: EU394960), NCTC 5348 균주 (GenBank 수탁 번호: EU394961), NICPBP 54006 균주 (GenBank 수탁 번호: EU394962), M7 균주 (GenBank 수탁 번호: EU394963), S19 균주 (GenBank 수탁 번호: EU394964), 또는 리스테리아 모노사이토게네스의 임의의 다른 균주로부터의 ActA 단백질이다. 사용될 수 있는 LLO 단백질은 상기 LLO 단백질 중 어느 것 또는 상기 LLO 단백질의 상동체, 변이체, 이소형태, 유사체, 단편, 상동체의 단편, 변이체의 단편, 유사체의 단편, 및 이소형태의 단편을 포함하거나, 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 이것들로 이루어질 수 있다.
ActA 펩타이드는 전장 ActA 단백질 또는 절단된 ActA 단백질 또는 ActA 단편 (예컨대, C-말단 부분이 제거된 N-말단 ActA 단편)일 수 있다. 바람직하게, 절단된 ActA 단백질은 적어도 하나의 PEST 서열 (예컨대, 하나 이상의 PEST 서열)을 포함한다. 이에 더불어, 절단된 ActA 단백질은 선택적으로 ActA 신호 펩타이드를 포함할 수 있다. 절단된 ActA 단백질에 함유된 PEST-유사 서열의 예는 SEQ ID NO: 45-48을 포함한다. 일부 이러한 절단된 ActA 단백질은 SEQ ID NO: 45-48에서 제시된 PEST-유사 서열 또는 그것의 상동체 중 적어도 2개, SEQ ID NO: 45-48에서 제시된 PEST-유사 서열 또는 그것의 상동체 중 적어도 3개, 또는 SEQ ID NO: 45-48에서 제시된 PEST-유사 서열 또는 그것의 상동체의 4개 전부를 포함한다. 절단된 ActA 단백질의 예는 전장 ActA 단백질 서열 (예컨대, SEQ ID NO: 62)의 대략 잔기 30-122, 대략 잔기 30-229, 대략 잔기 30-332, 대략 잔기 30-200, 또는 대략 잔기 30-399를 포함하거나, 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 이것들로 이루어진 것들을 포함한다. 절단된 ActA 단백질의 다른 예는 전장 ActA 단백질 서열 (예컨대, SEQ ID NO: 62)의 대략 처음 50개, 100개, 150개, 200개, 233개, 250개, 300개, 390개, 400개, 또는 418개의 잔기를 포함하거나, 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 이것들로 이루어진 것들을 포함한다. 절단된 ActA 단백질의 다른 예는 전장 ActA 단백질 서열 (예컨대, SEQ ID NO: 62)의 대략 잔기 200-300 또는 잔기 300-400을 포함하거나, 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 이것들로 이루어진 것들을 포함한다. 예를 들어, 절단된 ActA는 US 7,655,238 (모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 기재된 바와 같이 야생형 ActA 단백질의 처음 390개의 아미노산으로 이루어진다. 또 다른 예로서, 절단된 ActA는 ActA-N100 또는 그것의 변형된 버전 (ActA-N100*로도 불림)일 수 있으며 여기서 PEST 모티프는 US 2014/0186387 (모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 기재된 바와 같이 삭제되었고 비보존적 QDNKR (SEQ ID NO: 73) 치환을 함유한다. 대안으로, 절단된 ActA 단백질은 상기 아미노산 범위 또는 본원에 개시된 ActA 펩타이드 중 어느 것의 아미노산 범위 중 하나에 상응하는 상동성 ActA 단백질의 잔기를 함유할 수 있다. 잔기 수가 본원에 열거된 잔기 수와 정확하게 상응할 필요는 없다 (예컨대, 상동성 ActA 단백질이 본원에 이용된 ActA 단백질에 대해 삽입 또는 삭제를 가지면, 잔기 수는 그에 따라 조정될 수 있다).
절단된 ActA 단백질의 예는, 예를 들어, SEQ ID NO: 63, 64, 65, 또는 66에서 제시된 서열 또는 SEQ ID NO: 63, 64, 65, 또는 66의 상동체, 변이체, 이소형태, 유사체, 변이체의 단편, 이소형태의 단편, 또는 유사체의 단편을 포함하거나, 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 이것들로 이루어진 단백질을 포함한다. SEQ ID NO: 63은 ActA/PEST1이라고 불리고 SEQ ID NO: 62에서 제시된 전장 ActA 서열의 아미노산 30-122으로 이루어진다. SEQ ID NO: 64는 ActA/PEST2 또는 LA229라고 불리고 SEQ ID NO: 62에서 제시된 전장 ActA 서열의 아미노산 30-229로 이루어진다. SEQ ID NO: 65는 ActA/PEST3이라고 불리고 SEQ ID NO: 62에서 제시된 전장 ActA 서열의 아미노산 30-332로 이루어진다. SEQ ID NO: 66은 ActA/PEST4라고 불리고 SEQ ID NO: 62에서 제시된 전장 ActA 서열의 아미노산 30-399로 이루어진다. 특정 예로서, SEQ ID NO: 64에서 제시된 서열로 이루어진 절단된 ActA 단백질이 사용될 수 있다.
절단된 ActA 단백질의 예는, 예를 들어, SEQ ID NO: 67, 69, 70, 또는 72에서 제시된 서열 또는 SEQ ID NO: 67, 69, 70, 또는 72의 상동체, 변이체, 이소형태, 유사체, 변이체의 단편, 이소형태의 단편, 또는 유사체의 단편을 포함하거나, 본질적으로 이것들로 이루어지거나, 또는 이것들로 이루어진 단백질을 포함한다. 특정 예로서, SEQ ID NO: 67에서 제시된 서열로 이루어진 (SEQ ID NO: 68에서 제시된 핵산에 의해 암호화된) 절단된 ActA 단백질이 사용될 수 있다. 또 다른 특정 예로서, SEQ ID NO: 70에서 제시된 서열로 이루어진 (SEQ ID NO: 71에서 제시된 핵산에 의해 암호화된) 절단된 ActA 단백질이 사용될 수 있다. SEQ ID NO: 71은 리스테리아 모노사이토게네스 10403S 균주에서 ActA를 암호화하는 처음 1170개의 뉴클레오타이드이다. 일부 경우에, ActA 단편은 이종성 신호 펩타이드에 융합될 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NO: 72는 Hly 신호 펩타이드에 융합된 ActA 단편을 제시한다.
C. 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 면역요법 구성물의 생성
또한 본원에 개시된 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 면역요법 구성물을 생성하는 방법 또는 본원에 개시된 재조합 융합 폴리펩타이드를 포함하는 조성물이 본원에서 제공된다. 예를 들어, 이러한 방법은 면역요법 구성물에 포함되도록 항원성 펩타이드를 선택하고 디자인하는 단계 (그리고, 예를 들어, 각각의 항원성 펩타이드의 수치요법을 테스트하고, 그것이 선택된 수치요법 지수 한계값보다 높게 채점되면 항원성 펩타이드를 변형시키거나 선택 해제하는 단계), 각각의 선택된 항원성 펩타이드를 포함하는 하나 이상의 융합 폴리펩타이드를 디자인하는 단계, 및 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 구성물을 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
항원성 펩타이드는 소수성 또는 친수성에 대해 스크리닝될 수 있다. 항원성 펩타이드는, 예를 들어, 그것들이 친수성이거나 또는 관심 있는 특정 박테리아 (예컨대, 리스테리아 모노사이토게네스)에서 분비력을 예상할 수 있는 특정 수치요법 한계값 이하로 채점되면 선택될 수 있다. 예를 들어, 항원성 펩타이드는 21 아미노산 창을 이용한 카이트 및 둘리틀 수치요법 지수에 의해 채점될 수 있고, 컷오프 (대략 1.6)보다 높은 모든 채점은 그것들이 리스테리아 모노사이토게네스에 의해 분비 가능할 가능성이 작기 때문에 배제된다. 예를 들어, Kyte-Doolittle (1982) J Mol Biol 157(1):105-132 (모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 대안으로, 선택된 컷오프에 대한 항원성 펩타이드 채점은 변경될 수 있다 (예컨대, 항원성 펩타이드의 길이를 변화시킨다). 사용될 수 있는 다른 슬라이딩 창 크기는, 예를 들어, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27개 또는 그 이상의 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 슬라이딩 창 크기는 9-11개의 아미노산, 11-13개의 아미노산, 13-15개의 아미노산, 15-17개의 아미노산, 17-19개의 아미노산, 19-21개의 아미노산, 21-23개의 아미노산, 23-25개의 아미노산, 또는 25-27개의 아미노산일 수 있다. 사용될 수 있는 다른 컷오프는, 예를 들어, 다음 범위 1.2-1.4, 1.4-1.6, 1.6-1.8, 1.8-2.0, 2.0-2.2 2.2-2.5, 2.5-3.0, 3.0-3.5, 3.5-4.0, 또는 4.0-4.5를 포함하거나, 또는 컷오프는 1.4, 1.5, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.3, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 또는 4.5일 수 있다. 컷오프는, 예를 들어, 융합 폴리펩타이드를 전달하기 위해 사용되는 박테리아의 속 또는 종에 따라 달라질 수 있다.
다른 적합한 수치요법 플롯 또는 다른 적절한 척도는, 예를 들어, Rose et al. (1993) Annu Rev Biomol Struct 22:381-415; Biswas et al. (2003) Journal of Chromatography A 1000:637-655; Eisenberg (1984) Ann Rev Biochem 53:595-623; Abraham and Leo (1987) Proteins: Structure, Function and Genetics 2:130-152; Sweet and Eisenberg (1983) Mol Biol 171:479-488; Bull and Breese (1974) Arch Biochem Biophys 161:665-670; Guy (1985) Biophys J 47:61-70; Miyazawa et al. (1985) Macromolecules 18:534-552; Roseman (1988) J Mol Biol 200:513-522; Wolfenden et al. (1981) Biochemistry 20:849-855; Wilson (1981) Biochem J 199:31-41; Cowan and Whittaker (1990) Peptide Research 3:75-80; Aboderin (1971) Int J Biochem 2:537-544; Eisenberg et al. (1984) J Mol Biol 179:125-142; Hopp and Woods (1981) Proc Natl Acad Sci USA 78:3824-3828; Manavalan and Ponnuswamy (1978) Nature 275:673-674; Black and Mould (1991) Anal Biochem 193:72-82; Fauchere and Pliska (1983) Eur J Med Chem 18:369-375; Janin (1979) Nature 277:491-492; Rao and Argos (1986) Biochim Biophys Acta 869:197-214; Tanford (1962) Am Chem Soc 84:4240-4274; Welling et al. (1985) FEBS Lett 188:215-218; Parker et al. (1986) Biochemistry 25:5425-5431; 및 Cowan and Whittaker (1990) Peptide Research 3:75-80 (이들은 각각 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 보고된 것들을 포함한다.
선택적으로, 항원성 펩타이드는 대상체 인간 백혈구 항원 (HLA) 유형에 결합할 수 있는 능력에 대해 채점되고 (예컨대, netMHCpan, ANN, SMMPMBEC. SMM, CombLib_Sidney2008, PickPocket, 및 netMHCcons를 포함하는, www.iedb.org에서 이용 가능한 Immune Epitope Database (IED)를 사용하여) 각각의 항원성 펩타이드로부터의 최고의 MHC 결합 점수에 의해 순위가 정해질 수 있다. 다른 공급원은 TEpredict (tepredict.sourceforge.net/help.html) 또는 다른 이용 가능한 MHC 결합 측정 척도를 포함한다. 컷오프는 살모넬라와 같은 상이한 발현 벡터에 대해서 상이할 수 있다.
선택적으로, 항원성 펩타이드는 항원성 펩타이드를 선택 해제하거나 면역억압 영향을 막기 위해 면역억압 에피토프 (예컨대, T-reg 에피토프, IL-10-유도성 T 헬퍼 에피토프, 등)에 대해 스크리닝될 수 있다.
선택적으로, 에피토프의 면역원성에 대한 예측 알고리즘은 항원성 펩타이드를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 그러나, 이들 알고리즘은 어떤 펩타이드가 T 세포 반응을 생성하는지를 예측하는데 있어서 최대 20% 정확하다. 대안으로, 스크리닝/예측 알고리즘이 사용되지 않는다. 대안으로, 항원성 펩타이드가 면역원성에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 이것은 하나 이상의 T 세포를 항원성 펩타이드와 접촉시키고, 면역원성 펩타이드로서 펩타이드를 확인하는 면역원성 T 세포 반응에 대해 분석하는 것을 포함할 수 있다. 이것은 또한 하나 이상의 T 세포를 펩타이드와 접촉시킬 때 CD25, CD44, 또는 CD69 중 적어도 하나의 분비를 측정하기 위한 또는 IFN-γ, TNF-α, IL-1, 및 IL-2를 포함하는 군으로부터 선택된 사이토카인의 분비를 측정하기 위한 면역원성 검정을 사용하는 것을 포함할 수 있으며, 이때 증가된 분비는 펩타이드를 하나 이상의 T 세포 에피토프를 포함하는 것으로 확인한다.
선택된 항원성 펩타이드는 잠재적인 융합 폴리펩타이드에 대한 하나 이상의 후보 순서로 배열될 수 있다. 단일 플라스미드에 적합할 수 있는 것보다 더 유용한 항원성 펩타이드가 존재한다면, 상이한 항원성 펩타이드가 필요에 따라/원하는 대로 우선 순위를 할당하고 및/또는 상이한 융합 폴리펩타이드로 분할될 수 있다 (예컨대, 상이한 재조합 리스테리아 균주에 포함시키기 위해). 우선 순위는 상대적인 크기, 전사 우선 순위, 및/또는 번역된 폴리펩타이드의 전체적인 소수성과 같은 인자들에 의해 결정될 수 있다. 항원성 펩타이드는 본원의 다른 곳에서 더 상세히 개시된 바와 같이, 임의의 수의 항원성 펩타이드의 쌍 사이에 링커, 또는 링커의 임의의 조합 없이 직접 함께 결합되도록 배열될 수 있다. 포함되어야 하는 선형 항원성 펩타이드의 수는 돌연변이 부담에 대비한 필요한 구성물의 수, 단일 플라스미드로부터의 다수의 에피토프의 번역 및 분비 효율, 및 플라스미드를 포함하는 각각의 박테리아 또는 Lm에 필요한 MOI를 고려하여 결정될 수 있다.
항원성 펩타이드 또는 전체 융합 폴리펩타이드 (즉, 항원성 펩타이드 및 PEST-함유 펩타이드 및 임의의 태그를 포함함)의 조합은 또한 소수성에 대해 채점될 수 있다. 예를 들어, 융합된 항원성 펩타이드 전부 또는 전체 융합 폴리펩타이드는 수치요법에 대해 슬라이딩 21 아미노산 창을 이용한 카이트 및 둘리틀 수치요법 지수에 의해 채점될 수 있다. 임의의 영역이 컷오프 (예컨대, 대략 1.6)보다 높게 채점되면, 항원성 펩타이드는 항원성 펩타이드의 허용 가능한 순서 (즉, 컷오프보다 높게 채점되는 영역이 없는 것)가 발견될 때까지 융합 폴리펩타이드 내에서 재정리되거나 섞일 수 있다. 대안으로, 임의의 문제의 항원성 펩타이드는 제거되거나 상이한 크기로 재설계될 수 있다. 대안으로 또는 추가적으로, 항원성 펩타이드 사이의 하나 이상의 링커는 본원의 다른 곳에서 개시된 바와 같이 소수성을 변화시키도록 추가되거나 변형될 수 있다. 개개의 항원성 펩타이드에 대한 수치요법 테스트와 같이, 다른 창 크기가 사용될 수 있거나, 또는 다른 컷오프가 사용될 수 있다 (예컨대, 융합 폴리펩타이드를 전달하기 위해 사용되는 박테리아의 속 또는 종에 따라). 이에 더불어, 다른 적합한 수치요법 플롯 또는 다른 적절한 척도가 사용될 수 있다.
선택적으로, 항원성 펩타이드 또는 전체 융합 폴리펩타이드의 조합은 항원성 펩타이드를 선택 해제하거나 또는 면역억압 영향을 피하기 위해 면역억압 에피토프 (예컨대, T-reg 에피토프, IL-10-유도성 T 헬퍼 에피토프, 등)에 대해 추가로 스크리닝될 수 있다.
항원성 펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드의 후보 조합을 암호화하는 핵산이 설계되고 최적화될 수 있다. 예를 들어, 서열은 증가된 번역 수준, 발현 기간, 분비 수준, 전사 수준, 및 이것들의 임의의 조합에 대해 최적화될 수 있다. 예를 들어, 증가는 대조군, 비-최적화된 서열에 비해 2배 내지 1000배, 2배 내지 500배, 2배 내지 100배, 2배 내지 50배, 2배 내지 20배, 2배 내지 10배, 또는 3배 내지 5배일 수 있다.
예를 들어, 융합 폴리펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 아마도 올리고뉴클레오타이드 서열에서 형성된 2차 구조의 감소된 수준에 대해 최적화되거나, 또는 대안으로 서열을 변형시킬 수 있는 임의의 효소의 부착을 방지하기 위해 최적화될 수 있다. 박테리아 세포에서 발현은, 예를 들어, 전사 침묵, 낮은 mRNA 반감기, 2차 구조 형성, 억압물질 및 억제자와 같은 올리고뉴클레오타이드 결합 분자의 부착 부위, 및 희귀 tRNA 풀(pool)의 이용 가능성에 의해 방해될 수 있다. 박테리아 발현에서 많은 문제의 공급원은 원래의 서열 내에서 발견된다. RNA의 최적화는 씨스(cis) 작용 요소의 변형, GC-함량의 적응, 박테리아 세포의 비-제한적 tRNA 풀에 관한 코돈 편향의 변형, 및 내부 상동성 영역 회피를 포함할 수 있다. 그러므로, 서열을 최적화하는 것은, 예를 들어, 매우 높은 (> 80%) 또는 매우 낮은 (< 30%) GC 함량의 영역을 조정하는 것을 수반할 수 있다. 서열을 최적화하는 것은 또한, 예를 들어, 다음 씨스-작용 서열 모티프 중 하나 이상의 회피를 수반할 수 있다: 내부 TATA-상자, 카이(chi)-부위, 및 리보솜 진입 부위; AT-풍부 또는 GC-풍부 서열 구간; 반복 서열 및 RNA 2차 구조; (은폐) 스플라이스 도너 및 억셉터 부위; 분지점; 또는 이것들의 조합. 발현을 최적화하는 것은 또한 유전자의 플랭킹 영역 및/또는 플라스미드의 다른 곳에 서열 요소를 추가하는 것을 수반할 수 있다.
서열을 최적화하는 것은 또한, 예를 들어, 숙주 유전자 (예컨대, 리스테리아 모노사이토게네스 유전자)의 코돈 편향에 코돈 사용을 적응시키는 것을 수반할 수 있다. 예를 들어, 하기의 코돈이 리스테리아 모노사이토게네스에 사용될 수 있다.
Figure pct00007
융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산이 생성되고 박테리아 균주 또는 리스테리아 균주와 같은 전달 비히클로 도입될 수 있다. 다른 전달 비히클, 예컨대 백시니아 바이러스 또는 바이러스-유사 입자가 DNA 면역요법 또는 펩타이드 면역요법에 적합할 수 있다. 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 플라스미드가 생성되어 박테리아 균주 또는 리스테리아 균주로 도입된 후, 박테리아 또는 리스테리아 균주는 항원성 펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드의 발현 및 분비를 확인하기 위해 배양되고 특성화될 수 있다.
IV. 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주
또한 본원에는 본원에서 개시된 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드 또는 본원의 다른 곳에서 개시된 바와 같이 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 박테리아 균주, 예컨대 리스테리아 균주가 제공된다. 바람직하게, 박테리아 균주는 리스테리아 균주, 예컨대 리스테리아 모노사이토게네스 (Lm) 균주이다. 그러나, 다른 박테리아 균주, 예컨대, 살모넬라, 예르시니아(Yersinia), 시겔라(Shigella), 또는 미코박테리움(Mycobacterium) 균주가 또한 사용될 수 있다. Lm은 백신 벡터로서 많은 내재성 장점을 가진다. 박테리아는 시험관내에서 특수한 필요조건 없이 매우 효율적으로 성장하며, 그람 음성균, 예컨대 살모넬라에서의 주요 독성 인자인 LPS가 없다. 유전자적으로 약독화된 Lm 벡터는 또한 그것이 심각한 부작용의 경우에 항생물질로 쉽게 제거될 수 있고, 일부 바이러스 벡터와 달리 숙주 게놈 안으로 유전자 물질의 통합이 일어나지 않기 때문에 추가적인 안전성을 제공한다.
재조합 리스테리아 균주는 임의의 리스테리아 균주일 수 있다. 적합한 리스테리아 균주의 예로는 리스테리아 실리게리, 리스테리아 그레이(grayi), 리스테리아 이바노비(ivanovii), 리스테리아 무라이(murrayi), 리스테리아 벨시메리(welshimeri), 리스테리아 모노사이토게네스(Lm), 또는 기술분야에 알려져 있는 임의의 다른 리스테리아 종을 들 수 있다. 바람직하게, 재조합 리스테리아 균주는 리스테리아 모노사이토게네스 종의 균주이다. 리스테리아 모노사이토게네스의 예로는 다음을 포함한다: 리스테리아 모노사이토게네스 10403S 야생형 (예컨대, Bishop and Hinrichs (1987) J Immunol 139:2005-2009; Lauer et al. (2002) J Bact 184:4177-4186 참조); 파지 치료된 리스테리아 모노사이토게네스 DP-L4056 (예컨대, Lauer et al. (2002) J Bact 184:4177-4186 참조); 파지 치료되고 hly 유전자가 삭제된 리스테리아 모노사이토게네스 DP-L4027 (예컨대, Lauer et al. (2002) J Bact 184:4177- 4186; Jones and Portnoy (1994) Infect Immunity 65:5608-5613 참조); 파지 치료되고 actA 유전자가 삭제된 리스테리아 모노사이토게네스 (예컨대, Lauer et al. (2002) J Bact 184:4177-4186; Skoble et al. (2000) J Cell Biol 150:527- 538 참조); 리스테리아 모노사이토게네스 DP-L4042 (델타 PEST) (예컨대, Brockstedt et al. (2004) Proc Natl Acad Sci. USA 101:13832-13837 및 지원 정보 참조); 리스테리아 모노사이토게네스 DP-L4097 (LLO-S44A) (예컨대, Brockstedt et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:13832-13837 및 지원 정보 참조); 리스테리아 모노사이토게네스 DP- L4364 (델타 lplA; 피로에이트 단백질 결찰효소) (예컨대, Brockstedt et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:13832-13837 및 지원 정보 참조); 리스테리아 모노사이토게네스 DP-L4405 (델타 inlA) (예컨대, Brockstedt et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:13832-13837 및 지원 정보 참조); 리스테리아 모노사이토게네스 DP-L4406 (델타 inlB) (예컨대, Brockstedt et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:13832-13837 및 지원 정보 참조); 리스테리아 모노사이토게네스 CS-LOOOl (델타 actA; 델타 inlB) (예컨대, Brockstedt et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:13832-13837 및 지원 정보 참조); 리스테리아 모노사이토게네스 CS-L0002 (델타 actA; 델타 lplA) (예컨대, Brockstedt et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:13832-13837 및 지원 정보 참조); 리스테리아 모노사이토게네스 CS-L0003 (LLO L461T; 델타 lplA) (예컨대, Brockstedt et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:13832-13837 및 지원 정보 참조); 리스테리아 모노사이토게네스 DP-L4038 (델타 actA; LLO L461T) (예컨대, Brockstedt et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:13832-13837 및 지원 정보 참조); 리스테리아 모노사이토게네스 DP-L4384 (LLO S44A; LLO L461T) (예컨대, Brockstedt et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101:13832-13837 및 지원 정보 참조); lplA1가 삭제된 리스테리아 모노사이토게네스 균주 (피로에이트 단백질 결찰효소 LplA1을 암호화함) (예컨대, O'Riordan et al. (2003) Science 302:462-464 참조); 리스테리아 모노사이토게네스 DP-L4017 (LLO L461T를 가진 10403S) (예컨대, US 7,691,393 참조); 리스테리아 모노사이토게네스 EGD (예컨대, GenBank 수탁 번호 AL591824 참조). 다른 구체예에서, 리스테리아 균주는 리스테리아 모노사이토게네스 EGD-e (GenBank 수탁 번호 NC_003210; ATCC 수탁 번호 BAA-679 참조); 리스테리아 모노사이토게네스 DP-L4029 (actA 삭제, 선택적으로 uvrAB 삭제와 조합됨 (DP-L4029uvrAB) (예컨대, US 7,691,393 참조); 리스테리아 모노사이토게네스 actA-/inlB - 이중 돌연변이 (예컨대, ATCC 수탁 번호 PTA-5562 참조); 리스테리아 모노사이토게네스 lplA 돌연변이 또는 hly 돌연변이 (예컨대, US 2004/0013690 참조); 리스테리아 모노사이토게네스 dal/dat 이중 돌연변이 (예컨대, US 2005/0048081 참조)이다. 다른 리스테리아 모노사이토게네스 균주는 다음 유전자: hly (LLO; 리스테리오리신); iap (p60); inlA; inlB; inlC; dal (알라닌 라세마제(racemase)); dat (D-아미노산 아미노트랜스퍼라제); plcA; plcB; actA; 중 하나, 또는 임의의 유전자 조합을 암호화하는 핵산 또는 단일 벽 소포의 성장, 확산, 파괴, 이중벽 소포의 파괴, 숙주 세포에의 결합, 또는 숙주 세포에 의한 흡수를 매개하는 임의의 핵산을 함유하도록 변형된 (예컨대, 플라스미드에 의해 및/또는 게놈 통합에 의해) 것들을 포함한다. 상기 참고문헌의 각각은 모든 복적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
재조합 박테리아 또는 리스테리아는 야생형 병독성을 가질 수 있거나, 약독화된 병독성을 가질 수 있거나, 또는 독성이 없을 수 있다. 예를 들어, 재조합 리스테리아는 파고솜 또는 파고리소솜을 벗어나 시토졸에 들어가기에 충분히 독성일 수 있다. 이러한 리스테리아 균주는 또한 본원의 다른 곳에서 개시된 것과 같이 적어도 하나의 약독화 돌연변이, 삭제, 도는 비활성화를 포함하는 살아 있는-약독화된 리스테리아 균주일 수 있다. 바람직하게, 재조합 리스테리아는 약독화된 영양요구성 균주이다. 영양요구성 균주는 그것의 성장에 필요한 특정 유기 화합물을 합성할 수 없는 것이다. 이러한 균주의 예는 US 8,114,414 (모든 목적에 대해 그 전문이 참조로 본원에 포함됨)에서 기술되어 있다.
바람직하게, 재조합 리스테리아 균주는 항생물질 내성 유전자가 없다. 예를 들어, 이러한 재조합 리스테리아 균주는 항생물질 내성 유전자를 암호화하지 않는 플라스미드를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 제공된 일부 재조합 리스테리아 균주는 항생물질 내성 유전자를 암호화하는 핵산을 포함하는 플라스미드를 포함한다. 항생물질 내성 유전자는 분자 생물학 및 백신 제조에 흔히 사용되는 종래의 선택 및 클로닝 과정에 사용될 수 있다. 예시의 항생물질 내성 유전자로 암피실린, 페니실린, 메티실린, 스트렙토마이신, 에리트로마이신, 카나마이신, 테트라사이클린, 클로람페니콜 (CAT), 네오마이신, 하이그로마이신, 및 겐타마이신에 대한 내성을 부여하는 유전자 생성물을 들 수 있다.
A. 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드 또는 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 박테리아 또는 리스테리아 균주
본원에 개시된 재조합 박테리아 균주 (예컨대, 리스테리아 균주)는 본원에 개시된 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드 또는 본원의 다른 곳에서 개시된 것과 같은 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함한다.
불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 박테리아 또는 리스테리아 균주에서, 핵산은 코돈 최적화될 수 있다. 각 아미노산에 대해 리스테리아 모노사이토게네스에 의해 이용된 최적 코돈의 예는 US 2007/0207170 (모든 목적에 대해 그 전문이 참조로 본원에 포함됨)에서 제시된다. 핵산은 핵산에서 적어도 한 코돈이 그 아미노산에 대해 리스테리아 모노사이토게네스에 의해 원래의 서열에서의 코돈보다 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체된다면 코돈-최적화된 것이다.
핵산은 박테리아 또는 리스테리아 균주 내의 에피솜성 플라스미드에 존재할 수 있고 및/또는 핵산은 박테리아 또는 리스테리아 균주에 게놈상으로 통합될 수 있다. 일부 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주는 본원에서 개시된 2개의 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 2개의 별도의 핵산을 포함한다: 에피솜성 플라스미드의 한 핵산, 및 박테리아 또는 리스테리아 균주에 게놈상으로 통합된 다른 하나.
에피솜성 플라스미드는 시험관내에서 (세포 배양 중에), 생체내에서 (숙주에서), 또는 시험관내 및 생체내 둘 다에서 안정적으로 유지되는 것이다. 만약 에피솜성 플라스미드에 있다면, 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 오픈 리딩 프레임은 풀라스미드에서 프로모터/조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 만약 박테리아 또는 리스테리아 균주에 게놈상으로 통합된다면, 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 오픈 리딩 프레임은 외인성 프로모터/조절 서열에 또는 내인성 프로모터/조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 유전자의 구성성 발현을 구동하기에 유용한 프로모터/조절 서열의 예는 잘 알려져 있고, 예를 들어, 리스테리아의 hly, hlyA, actA, prfA, 및 p60 프로모터, 스트렙토코쿠스 bac 프로모터, 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) sgiA 프로모터, 및 바실루스 투링기엔시스(B. thuringiensis) phaZ 프로모터를 포함한다. 일부 경우에, 삽입된 관심의 유전자는 방해받지 않거나 종종 게놈 DNA로의 통합으로부터 발생하는 조절 제한의 대상이 되지 않고, 일부 경우에, 삽입된 이종성 유전자의 존재는 세포 자체의 중요한 영역의 재배열 또는 중단으로 이어지지 않는다.
이러한 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주는 박테리아 또는 리스테리아 균주 또는 본원의 다른 곳에서 기술된 약독화된 박테리아 또는 리스테리아 균주를 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 플라스미드 또는 벡터로 형질전환함으로써 만들어질 수 있다. 플라스미드는 숙주 염색체로 통합되지 않는 에피솜성 플라스미드일 수 있다. 대안으로, 플라스미드는 박테리아 또는 리스테리아 균주의 염색체로 통합되는 통합형 플라스미드일 수 있다. 본원에서 사용된 플라스미드는 또한 다중복사 플라스미드일 수 있다. 박테리아를 형질전환시키는 방법은 잘 알려져 있고, 염화 칼슘 경합 세포-기반 방법, 전기천공법, 박테리오파지-매개 변환, 화학적 형질전환 기법, 및 물리적 형질전환 기법을 포함한다. 예컨대, de Boer et al. (1989) Cell 56:641-649; Miller et al. (1995) FASEB J. 9:190-199; Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York; Ausubel et al. (1997) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Gerhardt et al., eds., 1994, Methods for General and Molecular Bacteriology, American Society for Microbiology, Washington, D.C.; 및 Miller, 1992, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문에 참조로 본원에 포함됨)를 참조한다.
게놈상으로 통합된 이종성 핵산을 가진 박테리아 또는 리스테리아 균주는, 예를 들어, 부위-특이적 통합 벡터를 사용함으로써 만들어질 수 있고, 그로써 통합된 유전자를 포함하는 박테리아 또는 리스테리아는 상동성 재조합을 사용하여 생성된다. 통합 벡터는 박테리아 또는 리스테리아 균주를 감염시킬 수 있는 임의의 부위-특이적 통합 벡터일 수 있다. 이러한 통합 벡터는, 예를 들어, PSA attPP' 부위, PSA 인테그라제(integrase)를 암호화하는 유전자, U153 attPP' 부위, U153 인테그라제를 암호화하는 유전자, A118 attPP' 부위, A118 인테그라제를 암호화하는 유전자, 또는 임의의 다른 알려져 있는 attPP' 부위 또는 임의의 다른 파지 인테그라제를 포함할 수 있다.
통합된 유전자를 포함하는 이러한 박테리아 또는 리스테리아 균주는 또한 이종성 핵산을 박테리아 또는 리스테리아 염색체에 통합시키기 위한 임의의 다른 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 상동성 재조합을 위한 기법들은 잘 알려져 있고, 예를 들어, Baloglu et al. (2005) Vet Microbiol 109(1-2):11-17); Jiang et al. 2005) Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) 37(1):19-24), 및 US 6,855,320 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문에 참조로 본원에 포함됨)에서 기술된다.
박테리아 또는 리스테리아/염색체에의 통합은 또한 트랜스포존 삽입을 사용하여 달성될 수 있다. 트랜스포존 삽입을 위한 기법을 잘 알려져 있고, 예를 들어, DP-L967의 구성에 대해 Sun et al. (1990) Infection and Immunity 58: 3770-3778 (모든 목적에 대해 그 전문이 참조로 본원에 포함됨)에 기술되어 있다. 트랜스포존 돌연변이생성은 안정적인 게놈 삽입을 달성할 수 있지만, 이종성 핵산이 삽입되어 있는 게놈에서의 위치는 알려져 있지 않다.
박테리아 또는 리스테리아/염색체에의 삽입은 또한 파지 통합 부위를 사용하여 달성될 수 있다 (예컨대, Lauer et al. (2002) J Bacteriol 184(15):4177-4186 (모든 목적에 대해 그 전문이 참조로 본원에 포함됨) 참조). 예를 들어, 인테그라제 유전자 및 박테리오파지 (예컨대, U153 또는 PSA 리스테리오파지)의 부착 부위는 상응하는 부착 부위에 이종성 유전자를 삽입하기 위해 사용될 수 있으며, 그것은 게놈에서 임의의 적절한 부위일 수 있다 (예컨대 comK 또는 arg tRNA 유전자의 3' 단부). 내인성 프로파지는 이종성 핵산의 통합 전에 이용된 부착 부위로부터 치료될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 단일 복사물 통합물을 유발할 수 있다. "파지 치료 단계"를 피하기 위하여, PSA 파지를 기반으로 한 파지 통합 시스템이 사용될 수 있다 (예컨대, Lauer et al. (2002) J Bacteriol 184:4177-4186 (모든 목적에 대해 그 전문이 참조로 본원에 포함됨) 참조). 통합된 유전자를 유지하는 것은, 예를 들어, 항생물질에 의한 연속적인 선택을 필요로 할 수 있다. 대안으로, 항생물질로의 선택을 필요로 하지 않는 파지-기반 염색체 통합 시스템이 확립될 수 있다. 대신, 영양요구성 숙주 균주가 보충될 수 있다. 예를 들어, D-알라닌 라세마제를 포함한, 필수 효소에 대해 영양요구성인 숙주 균주 (예컨대, Lm dal(-)dat(-))가 사용되는 것과 같이 임상 적용을 위한 파지-기반 염색체 통합 시스템이 사용될 수 있다.
컨쥬게이션이 또한 유전자 물질 및/또는 플라스미드를 박테리아에 도입하기 위해 사용될 수 있다. 컨쥬게이션 방법은 잘 알려여 있고, 예를 들어, Nikodinovic et al. (2006) Plasmid 56(3):223-227 및 Auchtung et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA 102(35):12554-12559 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문에 참조로 본원에 포함됨)에서 기술되어 있다.
특정 예에서, 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주는 내인성 actA 서열 (ActA 단백질을 암호화함) 또는 내인성 hly 서열 (LLO 단백질을 암호화함)을 가지는 오픈 리딩 프레임으로서 박테리아 또는 리스테리아 게놈에 게놈상으로 통합된 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 불규칙변화성 펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드의 발현 및 분비는 내인성 actA 프로모터 및 ActA 신호 서열의 제어 하에 있을 수 있거나 또는 내인성 hly 프로모터 및 LLO 신호 서열의 제어 하에 있을 수 있다. 다른 예로서, 불규칙변화성 펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 ActA 단백질을 암호화하는 actA 서열 또는 LLO 단백질을 암호화하는 hly 서열을 대체할 수 있다.
재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주의 선택은 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 항생물질 선택이 사용될 수 있다. 항생물질 내성 유전자는 분자 생물학 및 백신 제조에서 통상적으로 사용되는 종래의 선택 및 클로닝 과정에 사용될 수 있다. 예시의 항생물질 내성 유전자로 암피실린, 페니실린, 메티실린, 스트렙토마이신, 에리트로마이신, 카나마이신, 테트라사이클린, 클로람페니콜 (CAT), 네오마이신, 하이그로마이신, 및 겐타마이신에 대한 내성을 부여하는 유전자 생성물을 들 수 있다. 대안으로, 영양요구성 균주가 사용될 수 있고, 항생물질 내성 유전자 대신 또는 그것에 더불어 선택을 위해 외인성 대사 유전자가 사용될 수 있다. 예로서, 본원에 제공된 대사 효소 또는 보완 유전자를 암호화하는 플라스미드를 포함하는 영양요구성 박테리아를 선택하기 위하여, 형질전환된 영양요구성 박테리아가 대사 효소 (예컨대, 아미노산 대사 유전자) 또는 보완 유전자를 암호화하는 유전자의 발현에 대해 선택할 배지에서 성장될 수 있다. 대안으로, 온도-민감성 플라스미드가 재조합 또는 재조합을 선택하기 위한 임의의 다른 공지된 수단을 선택하기 위하여 사용될 수 있다.
B. 박테리아 또는 리스테리아 균주의 약독화
본원에 개시된 재조합 박테리아 균주 (예컨대, 재조합 리스테리아 균주)는 약독화될 수 있다. 용어 "약독화"는 숙주 동물에서 질환을 유발하는 박테리아의 능력의 감소를 포함한다. 예를 들어, 약독화된 리스테리아 균주의 병원성 특징은, 비록 약독화된 리스테리아가 배양 중에 성장하고 유지될 수 있긴 하지만, 야생형 리스테리아와 비교하여 줄어들 수 있다. 예로서 약독화된 리스테리아로의 BALB/c 마우스의 정맥내 접종을 사용할 때, 접종된 동물의 50%가 생존하는 치사량 (LD50)은 바람직하게는 야생형 리스테리아의 LD50을 초과하여 적어도 약 10배, 보다 바람직하게는 적어도 약 100배, 보다 바람직하게는 적어도 약 1,000배, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 10,000배, 가장 바람직하게는 적어도 약 100, 000배 증가된다. 그러므로 리스테리아의 약독화된 균주는 그것이 투여될 때 동물을 죽이지 않는 것이거나, 또는 투여된 박테리아의 수가 동일한 동물을 죽이기 위해 필요할 야생형 비-약독화 박테리아의 수보다 월등히 클 때에만 동물을 죽이는 것이다. 약독화된 박테리아는 또한 일반적인 환경에서는 그것의 성장에 필요한 영양소가 그 안에 존재하지 않기 때문에 복제할 수 없는 것을 의미하는 것으로 해석되어야 한다. 그러므로, 박테리아는 필요한 영양소가 제공되는 제어된 환경에서의 복제에 한정된다. 약독화된 균주는 그것이 제어되지 않는 복제를 할 수 없다는 점에서 환경적으로 안전하다.
(1) 박테리아 및 리스테리아 균주의 약독화 방법
약독화는 임의의 공지된 수단에 의해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 이러한 약독화된 균주는 하나 이상의 내인성 병독성 유전자 또는 하나 이상의 내인성 대사 유전자가 결핍될 수 있다. 이러한 유전자의 예는 본원에서 개시되며, 약독화는 본원에 개시된 임의의 한 유전자 또는 유전자의 임의의 조합의 비활성화에 의해 달성될 수 있다. 비활성화는, 예를 들어, 삭제를 통해 또는 돌연변이 (예컨대, 비활성화 돌연변이)를 통해 달성될 수 있다. 용어 "돌연변이"는 서열 (핵산 또는 아미노산 서열)에 대한 임의의 유형의 돌연변이 또는 변형을 포함하며 삭제, 절단, 삽입, 치환, 파괴, 또는 전좌(translocation)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 프레임시프트 돌연변이, 단백질의 조기 종결을 유발하는 돌연변이, 또는 유전자 발현에 영향을 미치는 조절 서열의 돌연변이를 포함할 수 있다. 돌연변이생성은 재조합 DNA 기법을 사용하여 또는 화학물질 또는 방사선과 후속적인 돌연변이 선택을 사용하는 전통적인 돌연변이생성 기술을 사용하여 이루어질 수 있다. 삭제 돌연변이가 수반되는 낮은 반전 가능성 때문에 바람직할 수 있다. 용어 "대사 유전자"는 숙주 박테리아에 포함된 또는 숙주 박테리아에 의해 이용되거나 요구되는 영양소의 합성에 필요한 효소를 암호화하는 유전자를 나타낸다. 예를 들어, 효소는 숙주 박테리아에 포함되거나 숙주 박테리아의 지속적인 성장에 필요한 영양소의 합성에 필요할 수 있다. 용어 "병독성" 유전자는 유기체의 게놈에서의 그것의 존재 또는 활성이 유기체의 병원성에 기여하는 (예컨대, 유기체가 숙주에서 적소(niche)의 식민지화 (세포에의 부착을 포함함), 면역회피 (숙주의 면역 반응의 회피), 면역억압 (숙주의 면역 반응의 억제), 세포 안으로의 유입 및 세포 밖으로의 유출, 또는 숙주로부터의 영양분 섭취를 달성하는 것을 가능하게 하는) 유전자를 포함한다.
이러한 약독화된 균주의 특정 예는 리스테리아 모노사이토게네스 (Lm) dal(-)dat(-) (Lmdd)이다. 이러한 약독화된 균주의 다른 예는 Lm dal(-)dat(-)△actA (LmddA)이다. 예컨대, US 2011/0142791 (모든 목적에 대해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. LmddA는 내인성 병독성 유전자 actA의 삭제로 인해 약독화된 리스테리아 균주를 기반으로 한다. 이러한 균주는 dal 유전자의 보충에 의해 생체내에서 및 시험관내에서 항원 발현에 대한 플라스미드를 함유할 수 잇다. 대안으로, LmddA는 내인성 dal, dat, 및 actA 유전자에 돌연변이를 가진 dal/dat/actA 리스테리아일 수 있다. 이러한 돌연변이는, 예를 들어, 삭제 또는 다른 비활성화 돌연변이일 수 있다.
약독화된 균주의 또 다른 특정 예는 Lm prfA(-) 또는 prfA 유전자에 부분적인 삭제 또는 비활성화 돌연변이를 가지는 균주이다. PrfA 단백질은 그것의 척추동물 숙주를 식민지화하기 위해 Lm이 필요호 하는 필수 병독성 유전자를 포함하는 레귤론(regulon)의 발현을 제어한다; 따라서 prfA 돌연변이는 PrfA-의존성 병독성 유전자의 발현을 활성화하는 PrfA 능력을 크게 손상시킨다.
약독화된 균주의 또 다른 특정 예는 박테리아의 자연적인 병독성에 중요한 두 유전자 - 인터날린 B 및 act A -가 삭제되어 있는 Lm inlB(-)actA(-)이다.
약독화된 박테리아 또는 리스테리아 균주의 또 다른 예는 하나 이상의 내인성 병독성 유전자가 결핍된 박테리아 또는 리스테리아 균주를 포함한다. 이러한 유전자의 예는 리스테리아의 actA, prfA, plcB, plcA, inlA, inlB, inlC, inlJ, 및 bsh를 포함한다. 약독화된 리스테리아 균주는 또한 상기 언급된 균주 중 임의의 것의 이중 돌연변이 또는 삼중 돌연변이일 수 있다. 약독화된 리스테리아 균주는 각각의 한 유전자의 돌연변이 또는 삭제를 포함할 수 있거나, 또는, 예를 들어, 본원에 제공된 유전자 (예컨대, actA, prfA, 및 dal/dat 유전자를 포함함) 중 임의의 것의 열개까지의 돌연변이 또는 삭제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 약독화된 리스테리아 균주는 내인성 인터날린 C (inlC) 유전자의 돌연변이 또는 삭제 또는 내인성 actA 유전자의 돌연변이 또는 삭제를 포함할 수 있다. 대안으로, 약독화된 리스테리아 균주는 내인성 인터날린 B (inlB) 유전자의 돌연변이 또는 삭제 또는 내인성 actA 유전자의 돌연변이 또는 삭제를 포함할 수 있다. 대안으로, 약독화된 리스테리아 균주는 내인성 inlB, inlC, 및 actA 유전자의 돌연변이 또는 삭제를 포함할 수 있다. 리스테리아의 인접한 세포로의 전좌는 프로세스에 포함된 내인성 actA 유전자 및/또는 내인성 inlC 유전자 또는 내인성 inlB 유전자의 삭제에 의해 억제되고, 그로써 증가된 면역원성 및 균주 백본으로서의 이용성을 포함한 고수준의 약독화를 초래한다. 약독화된 리스테리아 균주는 또한 plcA 및 plcB 둘 다의 돌연변이 또는 삭제를 포함하는 이중 돌연변이일 수 있다. 일부 경우에, 균주는 EGD 리스테리아 백본으로부터 구성될 수 있다.
박테리아 또는 리스테리아 균주는 또한 대사 유전자에서 돌연변이를 가지는 영양요구성 균주일 수 있다. 한 예로서, 균주는 하나 이상의 내인성 아미노산 대사 유전자가 결핍될 수 있다. 예를 들어, D-알라닌이 결핍된 리스테리아의 영양요구성 균주는, 예를 들어, 삭제 돌연변이, 삽입 돌연변이, 프레임시프트 돌연변이, 단백질의 조기 종결을 유발하는 돌연변이질, 또는 유전자 발현에 영향을 미치는 조절 서열의 돌연변이를 포함한, 잘 알려져 있는 많은 방법으로 이루어질 수 있다. 삭제 돌연변이가 수반되는 영양요구성 표현형의 반전의 낮은 가능성으로 인해 바람직할 수 있다. 예로서, 본원에 제시된 프로토콜에 따라 생성되는 D-알라닌의 돌연변이는 간단한 실험실 배양 검정으로 D-알라닌의 부재 하에 성장하는 능력에 대해 테스트될 수 있다. 이 화합물의 부재 하에 성장할 수 없는 그런 돌연변이가 선택될 수 있다.
내인성 아미노산 대사 유전자의 예로는 비타민 합성 유전자, 병원성 산 합성효소를 암호화하는 유전자, D-글루탐산 합성효소 유전자, D-알라닌 아미노 트랜스퍼라제 (dat) 유전자, D-알라닌 라세마제 (dal) 유전자, dga, 다이아미노피멜산 (DAP)의 합성에 관여하는 유전자, 시스테인 합성효소 A (cysK)의 합성에 관여하는 유전자, 아미노트랜스퍼라제-B12 무관한 메티오닌 합성효소, trpA, trpB, trpE, asnB, gltD, gltB, leuA, argG, 및 thrC를 들 수 있다. 리스테리아 균주는 둘 이상의 이러한 유전자가 결핍될 수 있다 (예컨대, dat 및 dal). D-글루탐산 합성은 D-glu + pyr의 알파-케토글루타레이트 + D-ala로의 변환, 및 역반응에 관여하는 dal 유전자에 의해 부분적으로 제어된다.
또 다른 예로서, 약독화된 리스테리아 균주는 내인성 합성효소 유전자, 예컨대 아미노산 합성유전자가 결핍될 수 있다. 이러한 유전자의 예로는 folP, 다이하이드로우리딘 합성효소 패밀리 단백질을 암호화하는 유전자, ispD, ispF, 포스포에놀피루베이트 합성효소를 암호화하는 유전자, hisF, hisH, fliI, 리보솜 큰 하위유닛 슈도우리딘 합성효소를 암호화하는 유전자, ispD, 이중기능성 GMP 합성효소/글루타민 아미도트랜스퍼라제 단백질을 암호화하는 유전자, cobS, cobB, cbiD, 유로포르피린-III C-메틸트랜스퍼라제/유로포르피리노겐-III 합성효소를 암호화하는 유전자, cobQ, uppS, truB, dxs, mvaS, dapA, ispG, folC, 시트레이트 합성효소를 암호화하는 유전자, argJ, 3-데옥시-7-포스포헵툴로네이트 합성효소를 암호화하는 유전자, 인돌-3-글리세롤-포스페이트 합성효소를 암호화하는 유전자, 안트라닐레이트 합성효소/글루타민 아미도트랜스퍼라제 구성요소를 암호화하는 유전자, menB, 메나퀴논-특이적 아이소코리스메이트 합성효소를 암호화하는 유전자, 포스포리보실포르밀글리신아미딘 합성효소 I 또는 II를 암호화하는 유전자, 포스포리보실아미노이미다졸-석시노카르복사미드 합성효소를 암호화하는 유전자, carB, carA, thyA, mgsA, aroB, hepB, rluB, ilvB, ilvN, alsS, fabF, fabH, 슈도우리딘 합성효소를 암호화하는 유전자, pyrG, truA, pabB, 및 atp 합성효소 유전자 (예컨대, atpC, atpD-2, aptG, atpA-2, 등)를 들 수 있다.
약독화된 리스테리아 균주는 내인성 phoP, aroA, aroC, aroD, 또는 plcB가 결핍될 수 있다. 또 다른 예로서, 약독화된 리스테리아 균주는 내인성 펩타이드 트랜스포터가 결핍될 수 있다. 예로는 ABC 트랜스포터/ATP-결합/투과효소 단백질, 올리고펩타이드 ABC 트랜스포터/올리고펩타이드-결합 단백질, 올리고펩타이드 ABC 트랜스포터/투과효소 단백질, 아연 ABC 트랜스포터/아연-결합 단백질, 당 ABC 트랜스포터, 포스페이트 트랜스포터, ZIP 아연 트랜스포터, EmrB/QacA 패밀리의 약물 내성 트랜스포터, 설페이트 트랜스포터, 프로톤-의존성 올리고펩타이드 트랜스포터, 마그네슘 트랜스포터, 포름산염/아질산염 트랜스포터, 스퍼미딘/푸트레신 ABC 트랜스포터, Na/Pi-동시트랜스포터, 당 포스페이트 트랜스포터, 글루타민 ABC 트랜스포터, 주요 퍼실리테이터 패밀리 트랜스포터, 글리신 베타인/L-프롤린 ABC 트랜스포터, 몰리브덴 ABC 트랜스포터, 테코산 ABC 트랜스포터, 코발트 ABC 트랜스포터, 암모늄 트랜스포터, 아미노산 ABC 트랜스포터, 세포 분할 ABC 트랜스포터, 망간 ABC 트랜스포터, 철 화합물 ABC 트랜스포터, 말토오스/말토덱스트린 ABC 트랜스포터, Bcr/CflA 패밀리의 약물 내성 트랜스포터, 및 상기 단백질 중 하나의 하위유닛을 암호화하는 유전자를 들 수 있다.
다른 약독화된 박테리아 및 리스테리아 균주는 박테리아 성장 과정, 복제 과정, 세포벽 합성, 단백질 합성, 지방산 대사를 위해, 또는 임의의 다른 성장 또는 복제 과정을 위해 사용되는 아미노산을 대사하는 내인성 대사 효소가 결핍될 수 있다. 마찬가지로, 약독화된 균주는 세포벽 합성에 사용된 아미노산의 형성을 촉매할 수 있거나, 세포벽 합성에 사용된 아미노산의 합성을 촉매할 수 있거나, 또는 세포벽 합성에 사용된 아미노산의 합성에 관여할 수 있는 내인성 대사 효소가 결핍될 수 있다. 대안으로, 아미노산은 세포벽 생물생성에 사용될 수 있다. 대안으로, 대사 효소는 세포벽 구성요소인 D-글루탐산에 대한 합성 효소이다.
다른 약독화된 리스테리아 균주는 D-글루탐산 합성유전자, dga, alr (알라닌 라세마제) 유전자에 의해 암호화된 대사 효소, 또는 알라닌 합성에 관여하는 임의의 다른 효소가 결핍될 수 있다. 리스테리아 균주에서 결핍될 수 있는 대사 효소의 또 다른 예로는 serC (a 포스포세린 아미노트랜스퍼라제), asd (아스파테이트 베타세미알데하이드 탈수소효소; 세포벽 구성요소 다이아미노피멜산의 합성에 관여함), gsaB- 글루타메이트-1-세미알데하이드 아미노트랜스퍼라제 ((S)-4-아미노-5-옥소펜타노에이트로부터 5-아미노레불리네이트의 형성을 촉매함)를 암호화하는 유전자, hemL ((S)-4-아미노-5-옥소펜타노에이트로부터 5-아미노레불리네이트의 형성을 촉매함), aspB (L-아스파테이트 및 2-옥소글루타레이트로부터 옥살로아세테이트 및 L-글루타메이트의 형성을 촉매하는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제), argF-1 (아르기닌 생합성에 관여함), aroE (아미노산 생합성에 관여함), aroB (3-데하이드로퀴네이트 생합성에 관여함), aroD (아미노산 생합성에 관여함), aroC (아미노산 생합성에 관여함), hisB (히스티딘 생합성에 관여함), hisD (히스티딘 생합성에 관여함), hisG (히스티딘 생합성에 관여함), metX (메티오닌 생합성에 관여함), proB (프롤린 생합성에 관여함), argR (아르기닌 생합성에 관여함), argJ (아르기닌 생합성에 관여함), thil (티아민 생합성에 관여함), LMOf2365_1652 (트립토판 생합성에 관여함), aroA (트립토판 생합성에 관여함), ilvD (발린 및 아이소류신 생합성에 관여함), ilvC (발린 및 아이소류신 생합성에 관여함), leuA (류신 생합성에 관여함), dapF (리신 생합성에 관여함), 및 thrB (트레오닌 생합성에 관여함) (전부 GenBank 수탁 번호 NC_002973)에 의해 암호화된 효소를 들 수 있다.
약독화된 리스테리아 균주는 다른 대사 효소, 예컨대 tRNA 합성효소의 돌연변이에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 대사 효소는 트립토판일tRNA 합성효소를 암호화하는 trpS 유전자에 의해 암호화될 수 있다. 예를 들어, 숙주 균주 박테리아는 △(trpS aroA)일 수 있고, 통합 벡터에 두 마커가 모두 함유될 수 있다.
약독화된 리스테리아 균주를 생성하기 위해 돌연변이될 수 있는 대사 효소의 다른 예로는 murE (다이아미노피멜산의 합성에 관여함; GenBank 수탁 번호: NC_003485), LMOf2365_2494 (테이코산 생합성에 관여함), WecE (리포다당 생합성 단백질 rffA; GenBank 수탁 번호: AE014075.1), 또는 amiA (N-아세틸무라모일-L-알라닌 아미다제)에 의해 암호화된 효소를 들 수 있다. 대사 효소의 또 다른 예로는 아스파테이트 아미노트랜스퍼라제, 히스티디놀-포스페이트 아미노트랜스퍼라제 (GenBank 수탁 번호 NP_466347), 또는 세포벽 테이코산 글리코실화 단백질 GtcA를 들 수 있다.
약독화된 리스테리아 균주를 생성하기 위해 돌연변이될 수 있는 대사 효소의 다른 예로는 펩티도글리칸 구성요소 또는 전구체에 대한 합성 요소를 들 수 있다. 구성요소는, 예를 들어, UDP-N-아세틸무라밀펜타펩타이드, UDP-N-아세틸글루코사민, MurNAc-(펜타펩타이드)-피로포스포릴-운데카프레놀, GlcNAc-p-(1,4)-MurNAc-(펜타펩타이드)-피로포스포릴운데카프레놀, 또는 임의의 다른 펩티도글리칸 구성요소 또는 전구체일 수 있다.
약독화된 리스테리아 균주를 생성하기 위해 돌연변이될 수 있는 대사 효소의 또 다른 예로는 murG, murD, murA-1, 또는 murA-2 (전부 GenBank 수탁 번호 NC_002973에 제시됨)에 의해 암호화된 대사 효소를 들 수 있다. 대안으로, 대사 효소는 펩티도글리칸 구성요소 또는 전구체에 대한 임의의 다른 합성 효소일 수 있다. 대사 효소는 또한 트랜스-글리코실라제, 트랜스-펩티다제, 카르복시-펩티다제, 임의의 다른 클래스의 대사 효소, 또는 임의의 다른 대사 효소일 수 있다. 예를 들어, 대사 효소는 임의의 다른 리스테리아 대사 효소 또는 임의의 다른 리스테리아 모노사이토게네스 대사 효소일 수 있다.
다른 박테리아 균주는 리스테리아에 대해 상기 기술된 것과 같이 다른 박테리아 균주에서 상응하는 병렬상동 유전자를 돌연변이시킴으로써 약독화될 수 있다
(2) 약독화된 박테리아 및 리스테리아 균주의 보완 방법
본원에서 개시된 약독화된 박테리아 또는 리스테리아 균주는 보완 유전자를 포하하거나 또는 약독화 돌연변이를 보완하는 (예컨대, 영양요구성 리스테리아 균주의 영양요구성을 보완하는) 대사 효소를 암호화하는 핵산을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 개시된 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 오픈 리딩 프레임을 갖는 핵산은 보완 유전자를 포함하거나 또는 보완 대사 효소를 암호화하는 제2 오픈 리딩 프레임을 추가로 포함할 수 있다. 대안으로, 제1 핵산은 융합 폴리펩타이드를 암호화할 수 있고 별개의 제2 핵산은 보완 유전자를 포함하거나 또는 보완 대사 효소를 암호화할 수 있다.
보완 유전자는 염색체 외에 있을 수 있거나 또는 박테리아 또는 리스테리아 게놈에 통합될 수 있다. 예를 들어, 영양요구성 리스테리아 균주는 대사 효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 에피솜성 플라스미드를 포함할 수 있다. 이러한 플라스미드는 에피솜성 또는 염색체외 방식으로 리스테리아에 함유될 것이다. 대안으로, 영양요구성 리스테리아 균주는 대사 효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 통합형 플라스미드 (즉, 통합 벡터)를 포함할 수 있다. 이러한 통합형 플라스미드는 리스테리아 염색체에의 통합을 위해 사용될 수 있다. 바람직하게, 에피솜성 플라스미드 또는 통합형 플라스미드는 항생물질 내성 마커가 없다.
대사 유전자는 항생물질 내성 유전자 대신 또는 그것에 더불어 선택을 위해 사용될 수 있다. 예로서, 본원에 제공된 대사 효소를 암호화하는 플라스미드 또는 보완 유전자를 포함하는 영양요구성 박테리아를 선택하기 위하여, 형질전환된 영양요구성 박테리아는 대사 효소를 암호화하는 유전자 (예컨대, 아미노산 대사 유전자) 또는 보완 유전자의 발현에 대해 선택할 배지에서 성장될 수 있다. 예를 들어, D-글루탐산 합성에 대한 박테리아 영양요구성은 D-글루탐산 합성에 대한 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환될 수 있고, 영양요구성 박테리아는 D-글루탐산의 부재 하에 성장할 것인 반면, 플라스미드로 형질전환되지 않은, 또는 D-글루탐산 합성에 대한 단백질을 암호화하는 플라스미드를 발현하지 않는 영양요구성 박테리아는 성장하지 않을 것이다. 유사하게, D-알라닌 합성에 대해 영양요구성인 박테리아는 D-알라닌 합성에 대한 아미노산 대사 효소를 암호화하는 핵산을 포함하는 플라스미드로 형질전환되고 발현할 때 D-알라닌의 부재 하에서 성장할 것이다. 필요산 성장 인자, 보충물, 아미노산, 아미노트랜스퍼라제, 항생물질, 등을 포함하거나 이것들이 결핍된 적절한 배지를 만들기 위한 그런 방법은 잘 알려져 있고 상업적으로 이용 가능하다.
본원에서 제공된 대사 효소를 암호화하는 플라스미드 또는 보완 유전자를 포함하는 영양요구성 박테리아가 적절한 배지에서 선택된 후에, 박테리아는 선택성 압력의 존재 하에 증식될 수 있다. 이러한 증식은 영양요구성 인자 없이 배지에서 박테리아를 성장시키는 것을 포함할 수 있다. 영양요구성 박테리아에서 대사 효소 또는 보완 유전자를 발현하는 플라스미드의 존재는 플라스미드가 박테리아와 함께 복제할 것이고, 그로써 플라스미드를 은닉하는 박테리아를 계속해서 선택하는 것을 보장한다. 박테리아 또는 리스테리아 균주의 생성은 플라스미드를 포함하는 영양요구성 박테리아가 성장하는 배지의 부피를 조정함으로써 쉽게 확대될 수 있다.
한 특정 예에서, 약독화된 균주는 dal 및 dat가 삭제되었거나 이것들에 비활성화 돌연변이를 가지는 균주 (예컨대, 리스테리아 모노사이토게네스 (Lm) dal(-)dat(-) (Lmdd) 또는 Lm dal(-)dat(-)△actA (LmddA))이고, 보완 유전자는 알라닌 라세마제 효소 (예컨대, dal 유전자에 의해 암호화됨) 또는 D-아미노산 아미노트랜스퍼라제 효소 (예컨대, dat 유전자에 의해 암호화됨)를 암호화한다. 예시의 알라닌 라세마제 단백질은 SEQ ID NO: 76에 제시된 서열 (SEQ ID NO: 78에 의해 암호화됨; GenBank 수탁 번호: AF038438)을 가지거나 또는 SEQ ID NO: 76의 상동체, 변이체, 이소형태, 유사체, 단편, 상동체의 단편, 변이체의 단편, 유사체의 단편, 또는 이소형태의 단편일 수 있다. 알라닌 라세마제 단백질은 또한 임의의 다른 리스테리아 알라닌 라세마제 단백질일 수 있다. 대안으로, 알라닌 라세마제 단백질은 임의의 다른 그람-양성 알라닌 라세마제 단백질 또는 임의의 다른 알라닌 라세마제 단백질일 수 있다. 예시의 D-아미노산 아미노트랜스퍼라제 단백질은 SEQ ID NO: 77에 제시된 서열 (SEQ ID NO: 79에 의해 암호화됨; GenBank 수탁 번호: AF038439)을 가지거나 또는 SEQ ID NO: 77의 상동체, 변이체, 이소형태, 유사체, 단편, 상동체의 단편, 변이체의 단편, 유사체의 단편, 또는 이소형태의 단편일 수 있다. D-아미노산 아미노트랜스퍼라제 단백질은 또한 임의의 다른 리스테리아 D-아미노산 아미노트랜스퍼라제 단백질일 수 있다. 대안으로, D-아미노산 아미노트랜스퍼라제 단백질은 임의의 다른 그람-양성 D-아미노산 아미노트랜스퍼라제 단백질 또는 임의의 다른 D-아미노산 아미노트랜스퍼라제 단백질일 수 있다.
다른 특정 예에서, 약독화된 균주는 prfA가 삭제되었거나 이것에 비활성화 돌연변이를 가지는 균주 (예컨대, Lm prfA(-))이고, 보완 유전자는 PrfA 단백질을 암호화한다. 예를 들어, 보완 유전자는 부분적인 PrfA 기능을 복원하는 돌연변이 PrfA (D133V) 단백질을 암호화할 수 있다. 야생형 PrfA 단백질의 예는 SEQ ID NO: 80 (SEQ ID NO: 81에 제시된 핵산에 의해 암호화됨)에 제시되고, D133V 돌연변이 PrfA 단백질의 예는 SEQ ID NO: 82 (SEQ ID NO: 83에 제시된 핵산에 의해 암호화됨)에 제시된다. 보완 PrfA 단백질은 SEQ ID NO: 80 또는 82의 상동체, 변이체, 이소형태, 유사체, 단편, 상동체의 단편, 변이체의 단편, 유사체의 단편, 또는 이소형태의 단편일 수 있다. PrfA 단백질은 또한 임의의 다른 리스테리아 PrfA 단백질일 수 있다. 대안으로, PrfA 단백질은 임의의 다른 그람-양성 PrfA 단백질 또는 임의의 다른 PrfA 단백질일 수 있다.
다른 예에서, 박테리아 균주 또는 리스테리아 균주는 actA 유전자가 삭제되거나 이것에 비활성화 돌연변이를 가질 수 있고, 보완 유전자는 리스테리아 균주에 대한 돌연변이를 보완하고 기능을 복원하기 위해 actA 유전자를 포함할 수 있다.
다른 영양요구 균주 및 보완 시스템이 또한 본원에 제공된 방법 및 조성물과함께 사용하기 위하여 채택될 수 있다.
C. 박테리아 또는 리스테리아 균주의 제조 및 보관
재조합 박테리아 균주 (예컨대, 리스테리아 균주)는 선택적으로 동물 숙주를 통해 계대될 수 있다. 이러한 계대는 백신 벡터로서의 리스테리아 균주의 효능을 최대화할 수 있거나, 리스테리아 균주의 면역원성을 안정화시킬 수 있거나, 리스테리아 균주의 병독성을 안정화시킬 수 있거나, 리스테리아 균주의 면역원성을 증가시킬 수 있거나, 리스테리아 균주의 병독성을 증가시킬 수 있거나, 리스테리아 균주의 불안정한 하위균주를 제거할 수 있거나, 또는 리스테리아 균주의 불안정한 하위균주의 만연을 감소시킬 수 있다. 동물 숙주를 통해 재조합 리스테리아 균주를 계대시키는 방법은 기술 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어, US 2006/0233835 (모든 목적에 대해 그 전문이 참조로 본원에 포함됨)에서 기술된다.
재조합 박테리아 균주 (예컨대, 리스테리아 균주)는 냉동 세포 은행에 보관되거나 또는 동결건조 세포 은행에 보관될 수 있다. 이러한 세포 은행은, 예를 들어, 비만 세포 은행, 작업 세포 은행, 또는 우수 의약품 제조 및 품질 관리 기준 (GMP) 세포 은행일 수 있다. "우수 의약품 제조 및 품질 관리 기준"의 예로는 미국 연방 규정(United States Code of Federal Regulations)의 21 CFR 210-211에 의해 규정된 것들을 포하한다. 그러나, "우수 의약품 제조 및 품질 관리 기준"은 또한 임상 등급의 물질의 제조를 위한 또는 인간 소비를 위한 다른 기준, 예컨대 미국 이외의 나라의 기준에 의해 규정될 수 있다. 이러한 세포 은행은 임상 등급의 물질의 제조를 위해 의도되거나 인간 사용을 위한 규제 관행에 따를 수 있다.
재조합 박테리아 균주 (예컨대, 리스테리아 균주)는 또한 백신 용량 배치로부터, 냉동 스톡으로부터, 또는 동결건조된 스톡으로부터 유래될 수 있다.
이러한 세포 은행, 냉동 스톡, 또는 백신 용량 배치는, 예를 들어, 해동시 90% 이상의 생존력을 나타낼 수 있다. 해동은, 예를 들어, 24시간 동안 냉동보존 또는 냉동 보관을 위한 보관에 이어질 수 있다. 대안으로, 보관은, 예를 들어, 2일, 3일, 4일, 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 5개월, 6개월, 9개월, 또는 1년 동안 지속될 수 있다.
세포 은행, 냉동 스톡, 또는 백신 용량 배치는, 예를 들어, 박테리아 균주 (예컨대, 리스테리아 균주)의 배양을 영양 배지에서 성장시키고, 그 배양을 글리세롤을 포함하는 용액에서 냉동시키고, 리스테리아 균주를 -20℃ 아래에서 보관하는 것을 포함하는 방법에 의해 냉동보존될 수 있다. 온도는, 예를 들어, 약 -70℃ 또는약 -70 내지 약 -80℃일 수 있다. 대안으로, 세포 은행, 냉동 스톡, 또는 백신 용량 배치는 리스테리아 균주의 배양을 합성 배지에서 성장시키고, 그 배양을 글리세롤을 포함하는 용액에서 냉동시키고, 리스테리아 균주를 -20℃ 아래에서 보관하는 것을 포함하는 방법에 의해 냉동보존될 수 있다. 온도는, 예를 들어, 약 -70℃ 또는약 -70 내지 약 -80℃일 수 있다. 임의의 합성 미생물학적 배지가 이 방법에 사용될 수 있다.
배양 (예컨대, 리스테리아 백신 용량 배치를 생성하기 위해 사용되는 리스테리아 백신 균주의 배양)은, 예를 들어, 세포 은행으로부터, 냉동 스톡으로부터, 스타터(starter) 배양으로부터, 또는 콜로니로부터 접종될 수 있다. 배양은, 예를 들어, 중간-로그 성장기에, 대략 중간-로그 성장기에, 또는 또 다른 성장기에 접종될 수 있다.
냉동에 사용된 용액은 선택적으로 글리세롤 대신 또는 글리세롤에 더불어 또 다른 총괄성(colligative) 첨가제 또는 냉동 방지 특성을 가진 첨가제를 함유한다. 이러한 첨가제의 예로는, 예를 들어, 만니톨, DMSO, 수크로오스, 또는 임의의 다른 총괄성 첨가제 또는 냉동 방지 특성을 가진 첨가제를 들 수 있다.
박테리아 균주 (예컨대, 리스테리아 균주)의 배양을 성장시키기 위해 이용된 영양 배지는 임의의 적합한 영양 배지일 수 있다. 적합한 배지의 예는, 예를 들어, LB; TB; 변형된, 동물성 제품이 없는 훌륭한 브로스; 또는 합성 배지를 포함한다.
성장 단계는 박테리아를 성장시키는 임의의 공지된 수단에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 성장 단계는 진동 플라스크 (예컨대 칸막이가 달린 진동 플라스크), 배치 발효기, 교반 탱크 또는 플라스크, 공기부양 발효기, 급식 배치, 연속식 세포 반응기, 고정된 세포 반응기, 또는 임의의 다른 박테리아 성장 수단 으로 수행될 수 있다.
선택적으로, (예컨대 배치 발효기에서) 배양의 성장 중에 일정한 pH가 유지된다. 예를 들어, pH는 약 6.0에서, 약 6.5에서, 약 7.0에서, 약 7.5에서, 또는 약 8.0에서 유지될 수 있다. 마찬가지로, pH는, 예를 들어, 약 6.5 내지 약 7.5, 약 6.0 내지 약 8.0, 약 6.0 내지 약 7.0, 약 6.0 내지 약 7.0, 또는 약 6.5 내지 약 7.5일 수 있다.
선택적으로, 일정한 온도가 배양의 성장 중에 유지될 수 있다. 예를 들어, 온도는 약 37℃에서 또는 37℃에서 유지될 수 있다. 대안으로, 온도는 25℃, 27℃, 28℃, 30℃, 32℃, 34℃, 35℃, 36℃, 38℃, 또는 39℃에서 유지될 수 있다.
선택적으로, 일정한 용존 산소 농도가 배양의 성장 중에 유지될 수 있다. 예를 들어, 용존 산소 농도는 포화의 20%로, 포화의 15%로, 포화의 16%로, 포화의 18%로, 포화의 22%로, 포화의 25%로, 포화의 30%로, 포화의 35%로, 포화의 40%로, 포화의 45%로, 포화의 50%로, 포화의 55%로, 포화의 60%로, 포화의 65%로, 포화의 70%로, 포화의 75%로, 포화의 80%로, 포화의 85%로, 포화의 90%로, 포화의 95%로, 포화의 100%로, 또는 포화의 거의 100%로 유지될 수 있다.
재조합 박테리아 균주 (예컨대, 리스테리아 균주)의 동결건조 및 냉동보존 방법은 알려져 있다. 예를 들어, 리스테리아 배양은 액체 질소에서 순간 냉동된 후, 최종 냉동 온도에서 보관될 수 있다. 대안으로, 배양은 보다 점진적인 방식으로 (예컨대, 최종 보관 온도에 배양 바이알을 놓아둠으로써) 냉동될 수 있다. 배양은 또한 박테리아 배양을 냉동시키기 우한 임의의 다른 공지된 방법에 의해 냉동될 수 있다.
배양의 보관 온도는, 예를 들어, -20 내지 -80℃일 수 있다. 예를 들어, 온도는 -20℃보다 상당히 아래이거나 -70℃보다 높지 않을 수 있다. 대안으로, 온도는 약 -70℃, -20℃, -30℃, -40℃, -50℃, -60℃, -80℃, -30 내지 -70℃, -40 내지 -70℃, -50 내지 -70℃, -60 내지 -70℃, -30 내지 -80℃, -40 내지 -80℃, -50 내지 -80℃, -60 내지 -80℃, 또는 -70 내지 -80℃일 수 있다. 대안으로, 온도는 - 70℃보다 저온이거나 -80℃보다 저온일 수 있다.
V. 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 및 백신
또한 본원에서 개시된 불규칙변화성 펩타이드를 포함하는 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신, 본원에서 개시된 재조합 융합 폴리펩타이드, 본원에서 개시된 불규칙변화성 펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 또는 본원에서 개시된 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주가 제공된다. 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물은 그것이 리스테리아 균주를 포함함으로써 본질적으로 면역원성일 수 있고 및/또는 조성물은 또한 추가로 보조제를 포함할 수 있다. 다른 면역원성 조성물은 DNA 면역요법 또는 펩타이드 면역요법 조성물을 포함한다.
용어 "면역원성 조성물"은 조성물에 노출될 때 대상체에서 항원에 대한 면역 반응을 이끌어내는 항원을 함유하는 임의의 조성물을 나타낸다. 면역원성 조성물에 의해 발생된 면역 반응은 특정 항원에 대한 것이거나 항원 상의 특정 에피토프에 대한 것일 수 있다.
면역원성 조성물은 본원에 개시된 단일 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드, 본원에 개시된 불규칙변화성 펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 또는 본원에 개시된 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주를 포함할 수 있거나, 또는 그것은 본원에 개시된 다수의 상이한 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드, 본원에 개시된 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 또는 본원에 개시된 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주를 포함할 수 있다. 제1 재조합 융합 폴리펩타이드는, 예를 들어, 그것이 한 항원성 펩타이드를 함유하고 제2 재조합 융합 폴리펩타이드는 그렇지 않다면 제2 재조합 융합 폴리펩타이드와 상이하다. 2개의 재조합 융합 폴리펩타이드는 동일한 항원성 펩타이드의 일부를 포함할 수 있고 여전히 상이한 것으로 간주될 수 있다. 이러한 상이한 불규칙변화성 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 또는 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주는 대상체에게 동시에 또는 대상체에게 순차적으로 투여될 수 있다. 순차적 투여는 본원에 개시된 재조합 리스테리아 균주 (또는 불규칙변화성 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 또는 핵산)를 포함하는 약물 물질이 상이한 투여 형태로 있고 (예컨대, 한 작용제는 정제 또는 캡슐이고 다른 작용제는 멸균 액체임) 및/또는 상이한 투약 스케줄로 투여될 때 (에컨대, 혼합물로부터의 한 조성물은 적어도 매일 투여되고 다른 것은 덜 빈번하게, 예컨대 주 1회, 2주마다 1회, 또는 3주마다 1회 투여됨) 특히 유용할 수 있다.
다수의 불규칙변화성 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 또는 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주는 각각 상이한 세트의 항원성 펩타이드를 포함할 수 있다. 대안으로, 불규칙변화성 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 불규칙변화성 펩타이드를 암호화하는 핵산, 재조합 융합 폴리펩타이드, 또는 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주 중 둘 이상은 동일한 세트의 항원성 펩타이드를 (예컨대, 동일한 세트의 항원성 펩타이드를 상이한 순서로) 포함할 수 있다.
다수의 불규칙변화성 펩타이드 또는 단편 또는 재조합 융합 폴리펩타이드는 다수의 상이한 HLA 유형에 결합할 수 있다. 예를 들어, 그것들은 다음 HLA 유형 중 하나 이상 또는 전부에 결합할 수 있다: HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02.
한 예로서, 면역원성 조성물은 다음 유전자: CEACAM5, MAGEA6, MAGEA4, GAGE1, NYESO1, STEAP1, 및 RNF43 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 또는 전부에 의해 암호화된 불규칙변화성 펩타이드 (예컨대, 펩타이드, 핵산, 또는 박테리아 벡터의 형태임)를 포함할 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상 또는 전부와 결합할 수 있다. 이러한 암 관련 단백질은, 예를 들어, 비-소세포 폐암 (NSCLC)과 관련된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 임의의 순서로 있을 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 직접적으로 함께 융합되거나 링커에 의해 함께 결합될 수 있고, 이것들의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 특정 예에서, 불규칙변화성 항원성 펩타이드 중 하나 이상 또는 전부는 9-mer (예컨대, 링커에 의해 함께 결합된 9-mer)일 수 있다. 이러한 항원성 펩타이드의 예는 실시예 2에서 제공된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, 표 3의 불규칙변화성 항원성 펩타이드 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 또는 11개 전부, 또는 예를 들어, 표 3의 서열 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 또는 11개 전부를 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다.
다른 예로서, 면역원성 조성물은 다음 유전자: CEACAM5, MAGEA4, STEAP1, RNF43, SSX2, SART3, PAGE4, PSMA, 및 PSA 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 또는 전부에 의해 암호화된 불규칙변화성 펩타이드 (예컨대, 펩타이드, 핵산, 또는 박테리아 벡터의 형태임)를 포함할 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상 또는 전부와 결합할 수 있다. 이러한 암 관련 단백질은, 예를 들어, 전립선암과 관련된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 임의의 순서로 있을 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 직접적으로 함께 융합되거나 링커에 의해 함께 결합될 수 있고, 이것들의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 특정 예에서, 항원성 펩타이드 중 하나 이상 또는 전부는 9-mer (예컨대, 링커에 의해 함께 결합된 9-mer)일 수 있다. 이러한 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 예는 실시예 2에서 제공된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, 표 5의 불규칙변화성 항원성 펩타이드 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 전부, 또는 예를 들어, 표 5의 서열 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 전부를 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, 면역원성 조성물은 다음 유전자: CEACAM5, STEAP1, MAGEA3, PRAME, hTERT, 및 SURVIVIN 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 전부에 의해 암호화된 불규칙변화성 펩타이드 (예컨대, 펩타이드, 핵산, 또는 박테리아 벡터의 형태임)를 포함할 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상 또는 전부와 결합할 수 있다. 이러한 암 관련 단백질은, 예를 들어, 췌장암과 관련된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 임의의 순서로 있을 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 직접적으로 함께 융합되거나 링커에 의해 함께 결합될 수 있고, 이것들의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 특정 예에서, 항원성 펩타이드 중 하나 이상 또는 전부는 9-mer (예컨대, 링커에 의해 함께 결합된 9-mer)일 수 있다. 이러한 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 예는 실시예 2에서 제공된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, 표 7의 불규칙변화성 항원성 펩타이드 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 또는 12개 전부, 또는 예를 들어, 표 7의 서열 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 또는 12개 전부를 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, 면역원성 조성물은 다음 유전자: CEACAM5, GAGE1, NYESO1, RNF43, NUF2, KLHL7, MAGEA3, 및 PRAME 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 또는 전부에 의해 암호화된 불규칙변화성 펩타이드 (예컨대, 펩타이드, 핵산, 또는 박테리아 벡터의 형태임)를 포함할 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상 또는 전부와 결합할 수 있다. 이러한 암 관련 단백질은, 예를 들어, 방광암과 관련된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 임의의 순서로 있을 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 직접적으로 함께 융합되거나 링커에 의해 함께 결합될 수 있고, 이것들의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 특정 예에서, 항원성 펩타이드 중 하나 이상 또는 전부는 9-mer (예컨대, 링커에 의해 함께 결합된 9-mer)일 수 있다. 이러한 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 예는 실시예 2에서 제공된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, 표 9의 불규칙변화성 항원성 펩타이드 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 또는 14개 전부, 또는 예를 들어, 표 9의 서열 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 또는 14개 전부를 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, 면역원성 조성물은 다음 유전자: CEACAM5, STEAP1, RNF43, MAGEA3, PRAME, 및 hTERT 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 전부에 의해 암호화된 불규칙변화성 펩타이드 (예컨대, 펩타이드, 핵산, 또는 박테리아 벡터의 형태임)를 포함할 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상 또는 전부와 결합할 수 있다. 이러한 암 관련 단백질은, 예를 들어, 유방암 (예컨대, ER+ 유방암)과 관련된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 임의의 순서로 있을 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 직접적으로 함께 융합되거나 링커에 의해 함께 결합될 수 있고, 이것들의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 특정 예에서, 항원성 펩타이드 중 하나 이상 또는 전부는 9-mer (예컨대, 링커에 의해 함께 결합된 9-mer)일 수 있다. 이러한 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 예는 실시예 2에서 제공된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, 표 11의 불규칙변화성 항원성 펩타이드 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 또는 11개 전부, 또는 예를 들어, 표 11의 서열 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 또는 11개 전부를 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, 면역원성 조성물은 다음 유전자: CEACAM5, PRAME, hTERT, STEAP1, RNF43, NUF2, KLHL7, 및 SART3 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 또는 전부에 의해 암호화된 불규칙변화성 펩타이드 (예컨대, 펩타이드, 핵산, 또는 박테리아 벡터의 형태임)를 포함할 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상 또는 전부와 결합할 수 있다. 이러한 암 관련 단백질은, 예를 들어, 자궁암과 관련된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 임의의 순서로 있을 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 직접적으로 함께 융합되거나 링커에 의해 함께 결합될 수 있고, 이것들의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 특정 예에서, 항원성 펩타이드 중 하나 이상 또는 전부는 9-mer (예컨대, 링커에 의해 함께 결합된 9-mer)일 수 있다. 이러한 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 예는 실시예 2에서 제공된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, 표 13의 불규칙변화성 항원성 펩타이드 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 또는 14개 전부, 또는 예를 들어, 표 13의 서열 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 또는 14개 전부를 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, 면역원성 조성물은 다음 유전자: CEACAM5, STEAP1, RNF43, SART3, NUF2, KLHL7, PRAME, 및 hTERT 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 또는 전부에 의해 암호화된 불규칙변화성 펩타이드 (예컨대, 펩타이드, 핵산, 또는 박테리아 벡터의 형태임)를 포함할 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상 또는 전부와 결합할 수 있다. 이러한 암 관련 단백질은, 예를 들어, 난소암과 관련된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 임의의 순서로 있을 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 직접적으로 함께 융합되거나 링커에 의해 함께 결합될 수 있고, 이것들의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 특정 예에서, 항원성 펩타이드 중 하나 이상 또는 전부는 9-mer (예컨대, 링커에 의해 함께 결합된 9-mer)일 수 있다. 이러한 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 예는 실시예 2에서 제공된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, 표 15의 불규칙변화성 항원성 펩타이드 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 또는 14개 전부, 또는 예를 들어, 표 15의 서열 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 또는 14개 전부를 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, 면역원성 조성물은 다음 유전자: CEACAM5, MAGEA6, STEAP1, RNF43, SART3, NUF2, KLHL7, 및 hTERT 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 또는 전부에 의해 암호화된 불규칙변화성 펩타이드 (예컨대, 펩타이드, 핵산, 또는 박테리아 벡터의 형태임)를 포함할 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상 또는 전부와 결합할 수 있다. 이러한 암 관련 단백질은, 예를 들어, 저등급 신경교종과 관련된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 임의의 순서로 있을 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 직접적으로 함께 융합되거나 링커에 의해 함께 결합될 수 있고, 이것들의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 특정 예에서, 항원성 펩타이드 중 하나 이상 또는 전부는 9-mer (예컨대, 링커에 의해 함께 결합된 9-mer)일 수 있다. 이러한 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 예는 실시예 2에서 제공된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, 표 17의 불규칙변화성 항원성 펩타이드 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 전부, 또는 예를 들어, 표 17의 서열 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 전부를 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, 면역원성 조성물은 다음 유전자: CEACAM5, MAGEA6, MAGEA4, GAGE1, NYESO1, STEAP1, RNF43, 및 MAGEA3 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 또는 전부에 의해 암호화된 불규칙변화성 펩타이드 (예컨대, 펩타이드, 핵산, 또는 박테리아 벡터의 형태임)를 포함할 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상 또는 전부와 결합할 수 있다. 이러한 암 관련 단백질은, 예를 들어, 대장암 (예컨대, MSS 대장암)과 관련된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 임의의 순서로 있을 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 직접적으로 함께 융합되거나 링커에 의해 함께 결합될 수 있고, 이것들의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 특정 예에서, 항원성 펩타이드 중 하나 이상 또는 전부는 9-mer (예컨대, 링커에 의해 함께 결합된 9-mer)일 수 있다. 이러한 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 예는 실시예 2에서 제공된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, 표 19의 불규칙변화성 항원성 펩타이드 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 전부, 또는 예를 들어, 표 19의 서열 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 전부를 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, 면역원성 조성물은 다음 유전자: CEACAM5, MAGEA4, STEAP1, NYESO1, PRAME, 및 hTERT 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 전부에 의해 암호화된 불규칙변화성 펩타이드 (예컨대, 펩타이드, 핵산, 또는 박테리아 벡터의 형태임)를 포함할 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상 또는 전부와 결합할 수 있다. 이러한 암 관련 단백질은, 예를 들어, 두경부암과 관련된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 임의의 순서로 있을 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 직접적으로 함께 융합되거나 링커에 의해 함께 결합될 수 있고, 이것들의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 특정 예에서, 항원성 펩타이드 중 하나 이상 또는 전부는 9-mer (예컨대, 링커에 의해 함께 결합된 9-mer)일 수 있다. 이러한 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 예는 실시예 2에서 제공된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, 표 21의 불규칙변화성 항원성 펩타이드 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 전부, 또는 예를 들어, 표 21의 서열 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 전부를 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다.
면역원성 조성물은 추가적으로 보조제 (예컨대, 둘 이상의 보조제), 사이토카인, 케모카인, 또는 이것들의 조합을 포함할 수 있다. 선택적으로, 면역원성 조성물은 추가적으로 항원 제공 세포 (APC)를 포함할 수 있으며, 이것은 대상체에 대해 자가조직일 수 있거나 또는 동종이계일 수 있다.
용어 보조제는 항원에 대한 면역 반응을 증강시키는 화합물 또는 혼합물을 포함한다. 예를 들어, 보조제는 면역 반응의 비-특이적 자극물질 또는 대상체에서 디포(depot)의 생성을 허용하는 물질일 수 있으며, 이것은 본원에 개시된 면역원성 조성물과 조합될 때 훨씬 더 증강된 및/또는 연장된 면역 반응을 제공한다. 보조제는, 예를 들어, 주로 Th1-매개된 면역 반응, Th1형 면역 반응, 또는 Th1-매개된 면역 반응을 선호할 수 있다. 마찬가지로, 보조제는 항체-매개된 반응보다 세포-매개된 면역 반응을 선호할 수 있다. 대안으로, 보조제는 항체-매개된 반응을 선호할 수 있다. 일부 보조제는 항원을 서서히 방출함으로써 면역 반응을 증강시킬 수 있는 한편, 다른 보조제는 다음 메커니즘 중 어느 것에 의해 그 효과를 매개할 수 있다: 특히 항원-제공 세포 (APC)에 대한 세포 침윤, 염증, 및 주사 부위로의 트래피킹(trafficking)의 증가; 동시자극 신호 또는 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 발현의 상향조절에 의한 APC의 활성화 상태 촉진; 항원 제공 증강; 또는 간접적인 효과에 대해 사이토카인 방출 유도.
보조제의 예는 사포닌 QS21, CpG 올리고뉴클레오타이드, 메틸화되지 않은 CpG-함유 올리고뉴클레오타이드, MPL, TLR 작용물질, TLR4 작용물질, TLR9 작용물질, Resiquimod®, 이미퀴모드, 사이토카인 또는 그것을 암호화하는 핵산, 케모카인 또는 그것을 암호화하는 핵산, IL-12 또는 그것을 암호화하는 핵산, IL-6 또는 그것을 암호화하는 핵산, 및 리포다당류를 포함한다. 적합한 보조제의 또 다른 예는 몬타나이드 ISA 51이다. 몬타나이드 ISA 51은 천연 대사 가능한 오일 및 정제 유화제를 함유한다. 적합한 보조제의 다른 예는 과립구/대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 또는 그것을 암호화하는 핵산 및 키홀 림펫(keyhole limpet) 헤모시아닌 (KLH) 단백질 또는 그것을 암호화하는 핵산을 포함한다. GM-CSF는, 예를 들어, 효모 (사카로미세스 세레비시애(S. cerevisiae)) 벡터에서 성장된 인간 단백질일 수 있다. GM-CSF는 조혈성 전구 세포, 항원 제공 세포 (APC), 수지상세포, 및 T 세포의 클론 확장 및 분화를 촉진한다.
적합한 보조제의 또 다른 예는 해독된 리스테리오리신 O (dtLLO) 단백질이다. 해독은 LLO의 콜레스테롤에의 결합 및 최종적인 막 공극 형성에 중요한 3개의 선택된 아미노산에 대한 점 돌연변이를 도입함으로써 달성될 수 있다. 3개의 표적화된 아미노산은 LLO의 콜레스테롤 결합 도메인 (ECTGLAWEWWR; SEQ ID NO: 74)에 존재하고 서열 (EATGLAWEAAR; SEQ ID NO: 96)에서 PCR에 의해 DNA 서열로 도입된 점 돌연변이에 의해 변형될 수 있다. 보조제로서 사용에 적합한 dtLLO의 하나의 예는 SEQ ID NO: 95에 의해 암호화된다. 해독된, 비용혈성 형태의 LLO (dtLLO)는 종양 면역요법에서 효과적인 보조제이고 PAMP로서 작용함으로써 선천성 및 세포 면역 반응을 활성화시킬 수 있다. SEQ ID NO: 95와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열에 의해 암호화된 dtLLO가 또한 보조제로서 사용에 적합하다.
보조제의 또 다른 예는 성장 인자 또는 그것을 암호화하는 핵산, 세포 집단, 프로인트 불완전 보조제(Freund's incomplete 보조제), 알루미늄 포스페이트, 알루미늄 하이드록사이드, BCG (결핵 예방 접종(bacille Calmette-Guerin)), 백반, 인터류킨 또는 그것을 암호화하는 핵산, 퀼(quill) 글리코시드, 모노포스포릴 지질 A, 리포솜, 박테리아 미토겐, 박테리아 독소, 또는 임의의 다른 유형의 공지된 보조제를 포함한다 (예컨대, Fundamental Immunology, 5th ed. (August 2003): William E. Paul (Editor); Lippincott Williams & Wilkins Publishers; Chapter 43: Vaccines, GJV Nossal (모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함됨) 참조).
면역원성 조성물은 하나 이상의 면역조절 분자를 추가로 포함할 수 있다. 예로는 인터페론 감마, 사이토카인, 케모카인, 및 T 세포 자극물질을 들 수 있다.
면역원성 조성물은 백신 또는 제약학적 조성물의 형태로 되어있을 수 있다. 용어 "백신" 및 "제약학적 조성물"은 교환 가능하고 대상체로의 생체 내 투여를 위한 제약학적으로 허용되는 담체 중의 면역원성 조성물을 나타낸다. 백신은, 예를 들어, 펩타이드 백신 (예컨대, 본원에서 개시된 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 포함함), 또는 세포 (예컨대, 본원에 개시된 재조합 리스테리아) 내에 함유되거나 그것에 의해 전달되는 백신일 수 있다. 백신은 대상체가 질환을 축소하거나 발달시키는 것을 방지할 수 있고 및/또는 백신은 질환 또는 상태를 가진 대상체에 대해 치료적일 수 있다. 펩타이드 백신의 제조 방법은 잘 알려져 있고, 예를 들어, EP 1408048, US 2007/0154953, 및 Ogasawara et al. (1992) Proc. Natl Acad Sci USA 89:8995-8999 (이들은 각각 모든 목적에 대해 그 전문에 참조로 본원에 포함됨)에서 기술된다. 선택적으로, 펩타이드 진화 기법이 더 높은 면역원성을 가진 항원을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 펩타이드 진화를 위한 기법은 잘 알려져 있고, 예를 들어, US 6,773,900 (모든 목적에 대해 그 전문이 참조로 본원에 포함됨)에서 기술된다.
"제약학적으로 허용되는 담체"는 큰 역효과 없이 및 면역원성 조성물에 대해 해로운 효과 없이 대상체에 도입될 수 있는 면역원성 조성물을 함유하는 비히클을 나타낸다. 즉, "제약학적으로 허용되는"은 안전하고, 본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 적어도 하나의 면역원성 조성물의 유효량의 원하는 투여 경로에 적절한 전달을 제공하는 임의의 제제를 나타낸다. 제약학적으로 허용되는 담체 또는 비히클 또는 부형제는 잘 알려져 있다. 적합한 제약학적으로 허용되는 담체, 및 그것들의 선택에 수반되는 요인들의 설명은 다양한 쉽게 이용 가능한 공급원, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., 1990 (모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 찾아볼 수 있다. 이러한 담체는 임의의 투여 경로 (예컨대, 비경구, 장내 (예컨대, 경구), 또는 국부적 적용)에 적합할 수 있다. 이러한 제약학적 조성물은 완충될 수 있으며, 예를 들어, pH는 면역원성 조성물의 안정성 및 투여 경로에 따라 pH 4.0 내지 pH 9.0의 범위에 있는 특정 원하는 값으로 유지된다.
적합한 제약학적으로 허용되는 담체는, 예를 들어, 멸균수, 염 용액, 예컨대 식염수, 글루코오스, 완충 용액, 예컨대 포스페이트 완충 용액 또는 중탄산염 완충 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 오일, 벤질 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 탄수화물 (예컨대, 락토오스, 아밀로오스 또는 전분), 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 규산, 점성 파라핀, 백색 파라핀, 글리세롤, 알기네이트, 히알루론산, 콜라겐, 향수 오일, 지방산 모노글리세리드 및 다이글리세리드, 펜타에리트리톨 지방산 에스테르, 하이드록시 메틸셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 등을 포함한다. 제약학적 조성물 또는 백신은 또한, 예를 들어, 면역원성 조성물과 유해하게 반응하지 않는 희석제, 안정화제 (예컨대, 당 및 아미노산), 보존제, 습윤제, 유화제, pH 완충제, 점성 증강 첨가제, 윤활제, 삼투압에 영향을 미치는 염, 완충제, 비타민, 착색제, 착향 물질, 방향 물질, 등을 포함하는 보제를 포함할 수 있다.
액체 제제의 경우, 예를 들어, 제약학적으로 허용되는 담체는 수성 또는 비-수성 용액, 현탁액, 에멀젼, 또는 오일일 수 있다. 비-수성 용매는, 예를 들어, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 및 주사 가능 유기 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트를 포함한다. 수성 담체는, 예를 들어, 물, 알코올성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함하며, 식염수 및 완충 배지를 포함한다. 오일의 예는 석유, 동물성, 식물성, 또는 합성 기원의 오일, 예컨대 땅콩 오일, 대두 오일, 미네랄 오일, 올리브 오일, 해바라기 오일, 및 어류 간 오일을 포함한다. 고체 담체/희석제는, 예를 들어, 검, 전분 (예컨대, 옥수수 전분, 사전 젤라틴화된 전분), 당 (예컨대, 락토오스, 만니톨, 수크로오스, 또는 덱스트로오스), 셀룰로오스 재료 (예컨대, 미세결정성 셀룰로오스), 아크릴레이트 (예컨대, 폴리메틸아크릴레이트), 탄산 칼슘, 산화 마그네슘, 탈크, 또는 이것들의 혼합물을 포함한다.
선택적으로, 서방출 또는 지시된 방출 제약학적 조성물 또는 백신이 제제화될 수 있다. 이것은, 예를 들어, 리포솜 또는 조성물의 사용을 통해 통해 달성될 수 있으며 이때 활성 화합물은 차등적으로 분해 가능한 코팅 (예컨대, 마이크로캡슐화, 다수의 코팅, 등에 의해)으로 보호된다. 이러한 조성물은 즉시 또는 느린 방출을 위해 제형화될 수 있다. 또한 조성물을 냉동-건조시키고 얻어진 동결건조물을 사용하는 것이 가능하다 (예컨대, 주사를 위한 제품의 제조의 경우에).
본원에 개시된 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신은 또한 암을 예방하거나 치료하는데 효과적인 하나 이상의 추가적인 화합물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가적인 화합물은 화학요법에 유용한 화합물, 예컨대 암사크린, 블레오마이신, 부술판, 카페시타빈, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로람부실, 씨스플라틴, 클라드리빈, 클로파라빈, 크리산타스파제, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 다카르바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 에토포시드, 플루다라빈, 플루오로우라실 (5-FU), 젬시타빈, 글리아델림플란츠, 하이드록시카바마이드, 이다루비신, 이포스파미드, 이리노테칸, 류코보린, 리포소말독소루비신, 리포소말다우노루비신, 로무스틴, 멜팔란, 메르캅토퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미토크산트론, 옥사리플라틴, 파클리탁셀 (탁솔), 페메트렉세드, 펜토스타틴, 프로카르바진, 랄티트렉세드, 사트라플라틴, 스트렙토조신, 테가푸르-우라실, 테모졸로미드, 테니포시드, 티오테파, 티오구아닌, 토포테칸, 트레오술판, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈, 또는 이것들의 조합을 포함할 수 있다. 추가적인 화합물은 또한 HER2 항원에 대한 Herceptin® (트라스투주맙), VEGF에 대한 Avastin® (베바시주맙), 또는 EGF 수용체에 대한 항체, 예컨대 Erbitux® (세툭시맙), 및 Vectibix® (파니투무맙)을 포함하는, 다른 생물의약품을 포함할 수 있다. 추가적인 화합물은 또한, 예를 들어, 추가적인 면역요법을 포함할 수 있다.
추가적인 화합물은 또한 면역 체크포인트 억제자 길항물질, 예컨대 PD-1 신호전달 경로 억제자, CD-80/86 및 CTLA-4 신호전달 경로 억제자, T 세포 막 단백질 3 (TIM3) 신호전달 경로 억제자, 아데노신 A2a 수용체 (A2aR) 신호전달 경로 억제자, 림프구 활성화 유전자 3 (LAG3) 신호전달 경로 억제자, 킬러 면역글로불린 수용체 (KIR) 신호전달 경로 억제자, CD40 신호전달 경로 억제자, 또는 임의의 다른 항원-제공 세포/T 세포 신호전달 경로 억제자를 포함할 수 있다. 면역 체크포인트 억제자 길항물질의 예는 항-PD-L1/PD-L2 항체 또는 그것의 단편, 항-PD-1 항체 또는 그것의 단편, 항-CTLA-4 항체 또는 그것의 단편, 또는 항-B7-H4 항체 또는 그것의 단편을 포함한다. 추가적인 화합물은 또한 T 세포 자극물질, 예컨대 T-세포 수용체 동시 자극 분자에 결합하는 항체 또는 그것의 기능적 단편, 동시 자극 분자에 결합하는 항원 제공 세포 수용체, 또는 TNF 수용체 슈퍼패밀리의 구성원을 포함할 수 있다. T-세포 수용체 동시 자극 분자는, 예를 들어, CD28 또는 ICOS를 포함할 수 있다. 동시 자극 분자에 결합하는 항원 제공 세포 수용체는, 예를 들어, CD80 수용체, CD86 수용체, 또는 CD46 수용체를 포함할 수 있다. TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원은, 예를 들어, 글루코코르티코이드-유도된 TNF 수용체 (GITR), OX40 (CD134 수용체), 4-1BB (CD137 수용체), 또는 TNFR25를 포함할 수 있다. 예컨대, WO2016100929, WO2016011362, 및 WO2016011357 (이들은 각각 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다.
VI. 치료 방법
본원에서 개시된 불규칙변화성 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 불규칙변화성 펩타이드를 암호화하는 핵산, 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주, 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 및 백신은 다양한 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 이것들은 대상체에서 항-암-관련-단백질 또는 항-종양-관련-항원 면역 반응을 유도 또는 증강시키는 방법에, 대상체에서 항-종양 또는 항-암 면역 반응을 유도 또는 증강시키는 방법에, 대상체에서 종양 또는 암을 치료하는 방법에, 대상체에서 종양 또는 암을 예방하는 방법에, 또는 종양 또는 암에 대해 대상체를 보호하는 방법에 사용될 수 있다. 이것들은 또한 대상체의 비장 및 종양에서 T 이펙터 세포 대 조절 T 세포 (Treg)의 비율을 증가시키는 방법에 사용될 수 있고, 이때 T 이펙터 세포는 종양-관련 항원에 대해 표적화된다. 이것들은 또한 대상체에서, 종양-관련-항원 T 세포를 증가시키거나, 종양 또는 암을 가진 대상체의 생존 시간을 증가시키거나, 대상체에서 암의 발병을 지연시키거나, 또는 대상체에서 종양 또는 전이 크기를 감소시키는 방법에 사용될 수 있다.
대상체에서 항-종양-관련-항원 면역 반응을 유도 또는 증강시키는 방법은, 예를 들어, 본원에서 개시된 불규칙변화성 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주, 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신 (불규칙변화성 펩타이드 또는 불규칙변화성 펩타이드를 포함하는 재조합 융합 폴리펩타이드 또는 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함함)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 그로써 항-종양-관련-항원 면역 반응이 대상체에서 유도 또는 증강될 수 있다. 예를 들어, 재조합 리스테리아 균주의 경우에, 리스테리아 균주는 융합 폴리펩타이드를 발현하고, 그로써 대상체에서 면역 반응을 발생시킬 수 있다. 면역 반응은, 예를 들어, T-세포 반응, 예컨대 CD4+FoxP3- T 세포 반응, CD8+ T 세포 반응, 또는 CD4+FoxP3- 및 CD8+ T 세포 반응을 포함할 수 있다. 이러한 방법은 또한 대상체의 비장 및 종양 미세환경에서 T 이펙터 세포 대 조절 T 세포 (Treg)의 비율을 증가시킬 수 있어서, 대상체에서 보다 뚜렷한 항-종양 반응을 허용할 수 있다.
대상체에서 항-종양-관련-항원 면역 반응을 유도 또는 증강시키는 방법은, 예를 들어, 본원에서 개시된 불규칙변화성 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주, 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 그로써 항-종양 또는 항-암 면역 반응이 대상체에서 유도 또는 증강될 수 있다. 예를 들어, 재조합 리스테리아 균주의 경우에, 리스테리아 균주는 융합 폴리펩타이드를 발현하고, 그로써 대상체에서 항-종양 또는 항-암 반응을 발생시킬 수 있다.
대상체에서 종양 또는 암을 치료하는 방법 (예컨대, 이때 종양 또는 암은 본원의 다른 곳에서 개시된 것과 같이 특정 종양-관련 항원 또는 암 관련 단백질을 발현함)은, 예를 들어, 본원에서 개시된 불규칙변화성 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주, 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 그런 후 대상체는 종양-관련 항원을 발현하는 종양 또는 암에 대한 면역 반응을 시작할 수 있고, 그로 인해 대상체에서 종양 또는 암이 치료된다.
대상체에서 종양 또는 암을 예방하는 방법 또는 종양 또는 암 발생에 대해 대상체를 보호하는 방법 (예컨대, 이때 종양 또는 암은 본원의 다른 곳에서 개시된 것과 같이 특정 종양-관련 항원 또는 암 관련 단백질의 발현과 관련됨)은, 예를 들어, 본원에서 개시된 불규칙변화성 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주, 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 그런 후 대상체는 종양-관련 항원에 대한 면역 반응을 시작할 수 있고, 그로 인해 종양 또는 암을 예방하거나 종양 또는 암 발생에 대해 대상체를 보호한다.
상기 방법의 일부에서, 둘 이상의 불규칙변화성 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주, 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신이 투여된다. 다중 불규칙변화성 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주, 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신은 임의의 순서 또는 조합으로 순차적으로 투여될 수 있거나, 또는 임의의 조합으로 동시에 투여될 수 있다. 예로서, 만약 4개의 상이한 리스테리아 균주가 투여된다면, 그것들은 순차적으로 투여되거나, 동시에 투여되거나, 또는 임의의 조합으로 투여될 수 있다 (예컨대, 제1 및 제2 균주가 동시에 투여되고 계속해서 제3 및 제4 균주가 동시에 투여됨). 선택적으로, 순차적 투여의 경우에, 조성물은 동일한 면역 반응 중에, 바람직하게 서로 0 내지 10일 또는 3 내지 7일 이내에 투여될 수 있다. 다중 불규칙변화성 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주, 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신은 각각 상이한 세트의 항원성 펩타이드를 포함할 수 있다. 대안으로, 둘 이상이 동일한 세트의 항원성 펩타이드를 포함할 수 있다 (예컨대, 동일한 세트의 항원성 펩타이드를 상이한 순서로).
다중 불규칙변화성 펩타이드 또는 단편 또는 재조합 융합 폴리펩타이드는 다중 상이한 HLA 유형에 결합할 수 있다. 예를 들어, 이것들은 다음 HLA 유형: HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상 또는 전부에 결합할 수 있다.
한 예로서, 다중 불규칙변화성 펩타이드 (예컨대, 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 핵산, 또는 박테리아 벡터의 형태임)는 다음 유전자: CEACAM5, MAGEA6, MAGEA4, GAGE1, NYESO1, STEAP1, 및 RNF43 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 또는 전부에 의해 암호화될 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상 또는 전부와 결합할 수 있다. 이러한 암 관련 단백질은, 예를 들어, 비-소세포 폐암 (NSCLC)과 관련된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 임의의 순서로 있을 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 직접적으로 함께 융합되거나 링커에 의해 함께 결합될 수 있고, 이것들의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 특정 예에서, 불규칙변화성 항원성 펩타이드 중 하나 이상 또는 전부는 9-mer (예컨대, 링커에 의해 함께 결합된 9-mer)일 수 있다. 이러한 항원성 펩타이드의 예는 실시예 2에서 제공된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, 표 3의 불규칙변화성 항원성 펩타이드 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10 이상, 또는 11개 전부, 또는 예를 들어, 표 3의 서열 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 또는 11개 전부를 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다.
다른 예로서, 다중 불규칙변화성 펩타이드 (예컨대, 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 핵산, 또는 박테리아 벡터의 형태임)는 다음 유전자: CEACAM5, MAGEA4, STEAP1, RNF43, SSX2, SART3, PAGE4, PSMA, 및 PSA 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 또는 전부에 의해 암호화될 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상 또는 전부와 결합할 수 있다. 이러한 암 관련 단백질은, 예를 들어, 전립선암과 관련된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 임의의 순서로 있을 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 직접적으로 함께 융합되거나 링커에 의해 함께 결합될 수 있고, 이것들의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 특정 예에서, 항원성 펩타이드 중 하나 이상 또는 전부는 9-mer (예컨대, 링커에 의해 함께 결합된 9-mer)일 수 있다. 이러한 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 예는 실시예 2에서 제공된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, 표 5의 불규칙변화성 항원성 펩타이드 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 전부, 또는 예를 들어, 표 5의 서열 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 전부를 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, 다중 불규칙변화성 펩타이드 (예컨대, 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 핵산, 또는 박테리아 벡터의 형태임)는 다음 유전자: CEACAM5, STEAP1, MAGEA3, PRAME, hTERT, 및 SURVIVIN 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 전부에 의해 암호화될 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상 또는 전부와 결합할 수 있다. 이러한 암 관련 단백질은, 예를 들어, 췌장암과 관련된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 임의의 순서로 있을 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 직접적으로 함께 융합되거나 링커에 의해 함께 결합될 수 있고, 이것들의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 특정 예에서, 항원성 펩타이드 중 하나 이상 또는 전부는 9-mer (예컨대, 링커에 의해 함께 결합된 9-mer)일 수 있다. 이러한 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 예는 실시예 2에서 제공된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, 표 7의 불규칙변화성 항원성 펩타이드 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 또는 12개 전부, 또는 예를 들어, 표 7의 서열 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 또는 12개 전부를 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, 다중 불규칙변화성 펩타이드 (예컨대, 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 핵산, 또는 박테리아 벡터의 형태임)는 다음 유전자: CEACAM5, GAGE1, NYESO1, RNF43, NUF2, KLHL7, MAGEA3, 및 PRAME 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 또는 전부에 의해 암호화될 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상 또는 전부와 결합할 수 있다. 이러한 암 관련 단백질은, 예를 들어, 방광암과 관련된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 임의의 순서로 있을 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 직접적으로 함께 융합되거나 링커에 의해 함께 결합될 수 있고, 이것들의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 특정 예에서, 항원성 펩타이드 중 하나 이상 또는 전부는 9-mer (예컨대, 링커에 의해 함께 결합된 9-mer)일 수 있다. 이러한 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 예는 실시예 2에서 제공된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, 표 9의 불규칙변화성 항원성 펩타이드 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 또는 14개 전부, 또는 예를 들어, 표 9의 서열 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 또는 14개 전부를 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, 다중 불규칙변화성 펩타이드 (예컨대, 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 핵산, 또는 박테리아 벡터의 형태임)는 다음 유전자: CEACAM5, STEAP1, RNF43, MAGEA3, PRAME, 및 hTERT 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 전부에 의해 암호화될 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상 또는 전부와 결합할 수 있다. 이러한 암 관련 단백질은, 예를 들어, 유방암 (예컨대, ER+ 유방암)과 관련된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 임의의 순서로 있을 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 직접적으로 함께 융합되거나 링커에 의해 함께 결합될 수 있고, 이것들의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 특정 예에서, 항원성 펩타이드 중 하나 이상 또는 전부는 9-mer (예컨대, 링커에 의해 함께 결합된 9-mer)일 수 있다. 이러한 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 예는 실시예 2에서 제공된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, 표 11의 불규칙변화성 항원성 펩타이드 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 또는 11개 전부, 또는 예를 들어, 표 11의 서열 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 또는 11개 전부를 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, 다중 불규칙변화성 펩타이드 (예컨대, 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 핵산, 또는 박테리아 벡터의 형태임)는 다음 유전자: CEACAM5, PRAME, hTERT, STEAP1, RNF43, NUF2, KLHL7, 및 SART3 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 또는 전부에 의해 암호화될 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상 또는 전부와 결합할 수 있다. 이러한 암 관련 단백질은, 예를 들어, 자궁암과 관련된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 임의의 순서로 있을 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 직접적으로 함께 융합되거나 링커에 의해 함께 결합될 수 있고, 이것들의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 특정 예에서, 항원성 펩타이드 중 하나 이상 또는 전부는 9-mer (예컨대, 링커에 의해 함께 결합된 9-mer)일 수 있다. 이러한 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 예는 실시예 2에서 제공된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, 표 13의 불규칙변화성 항원성 펩타이드 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 또는 14개 전부, 또는 예를 들어, 표 13의 서열 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 또는 14개 전부를 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, 다중 불규칙변화성 펩타이드 (예컨대, 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 핵산, 또는 박테리아 벡터의 형태임)는 다음 유전자: CEACAM5, STEAP1, RNF43, SART3, NUF2, KLHL7, PRAME, 및 hTERT 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 또는 전부에 의해 암호화될 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상 또는 전부와 결합할 수 있다. 이러한 암 관련 단백질은, 예를 들어, 난소암과 관련된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 임의의 순서로 있을 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 직접적으로 함께 융합되거나 링커에 의해 함께 결합될 수 있고, 이것들의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 특정 예에서, 항원성 펩타이드 중 하나 이상 또는 전부는 9-mer (예컨대, 링커에 의해 함께 결합된 9-mer)일 수 있다. 이러한 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 예는 실시예 2에서 제공된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, 표 15의 불규칙변화성 항원성 펩타이드 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 또는 14개 전부, 또는 예를 들어, 표 15의 서열 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 10개 이상, 11개 이상, 12개 이상, 13개 이상, 또는 14개 전부를 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, 다중 불규칙변화성 펩타이드 (예컨대, 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 핵산, 또는 박테리아 벡터의 형태임)는 다음 유전자: CEACAM5, MAGEA6, STEAP1, RNF43, SART3, NUF2, KLHL7, 및 hTERT 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 또는 전부에 의해 암호화될 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상 또는 전부와 결합할 수 있다. 이러한 암 관련 단백질은, 예를 들어, 저등급 신경교종과 관련된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 임의의 순서로 있을 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 직접적으로 함께 융합되거나 링커에 의해 함께 결합될 수 있고, 이것들의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 특정 예에서, 항원성 펩타이드 중 하나 이상 또는 전부는 9-mer (예컨대, 링커에 의해 함께 결합된 9-mer)일 수 있다. 이러한 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 예는 실시예 2에서 제공된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, 표 17의 불규칙변화성 항원성 펩타이드 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 전부, 또는 예를 들어, 표 17의 서열 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 전부를 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, 다중 불규칙변화성 펩타이드 (예컨대, 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 핵산, 또는 박테리아 벡터의 형태임)는 다음 유전자: CEACAM5, MAGEA6, MAGEA4, GAGE1, NYESO1, STEAP1, RNF43, 및 MAGEA3 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 또는 전부에 의해 암호화될 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상 또는 전부와 결합할 수 있다. 이러한 암 관련 단백질은, 예를 들어, 대장암 (예컨대, MSS 대장암)과 관련된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 임의의 순서로 있을 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 직접적으로 함께 융합되거나 링커에 의해 함께 결합될 수 있고, 이것들의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 특정 예에서, 항원성 펩타이드 중 하나 이상 또는 전부는 9-mer (예컨대, 링커에 의해 함께 결합된 9-mer)일 수 있다. 이러한 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 예는 실시예 2에서 제공된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, 표 19의 불규칙변화성 항원성 펩타이드 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 전부, 또는 예를 들어, 표 19의 서열 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 전부를 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다.
또 다른 예로서, 다중 불규칙변화성 펩타이드 (예컨대, 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 핵산, 또는 박테리아 벡터의 형태임)는 다음 유전자: CEACAM5, MAGEA4, STEAP1, NYESO1, PRAME, 및 hTERT 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 또는 전부에 의해 암호화될 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상 또는 전부와 결합할 수 있다. 이러한 암 관련 단백질은, 예를 들어, 두경부암과 관련된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 임의의 순서로 있을 수 있다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 직접적으로 함께 융합되거나 링커에 의해 함께 결합될 수 있고, 이것들의 예는 본원의 다른 곳에서 개시된다. 특정 예에서, 항원성 펩타이드 중 하나 이상 또는 전부는 9-mer (예컨대, 링커에 의해 함께 결합된 9-mer)일 수 있다. 이러한 불규칙변화성 항원성 펩타이드의 예는 실시예 2에서 제공된다. 불규칙변화성 항원성 펩타이드는, 예를 들어, 표 21의 불규칙변화성 항원성 펩타이드 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 전부, 또는 예를 들어, 표 21의 서열 중 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상, 또는 10개 전부를 포함하는 펩타이드를 포함할 수 있다.
암은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장 및 증식을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 병태이다. 암은 조혈성 악성종양 또는 고체 종양 (즉, 전암성 병소를 포함한 과도한 세포 성장 또는 증식으로부터 발생한 세포의 덩어리)일 수 있다. 전이성 암은 신체의 처음 시작한 위치에서 다른 위치로 확산되는 암을 나타낸다. 전이성 암 세포에 의해 형성된 종양은 전이성 종양 또는 전이라고 불리며, 이것은 또한 암 세포가 신체의 다른 부분으로 확산되는 과정을 나타내는데 사용되는 용어이다. 일반적으로, 전이성 암은 원래의, 또는 원발성 암과 동일한 명칭 및 동일한 유형의 암 세포를 가진다. 고체 종양의 예로는 흑색종, 암종, 모세포종, 및 육종을 들 수 있다. 혈액학적 악성 종양으로는, 예를 들어, 백혈병 또는 림프성 악성 종양, 예컨대 림프종을 들 수 있다. 암의 예시의 범주는 뇌암, 유방암, 위장암, 비뇨생식기암, 부인과암, 두경부암, 헴(heme)암, 피부암 및 흉부암을 포함한다. 뇌 악성 종양은, 예를 들어, 교모세포종, 고등급 뇌교 신경교종, 저등급 신경교종, 수모세포종, 신경모세포종, 및 모양세포성 성상세포종을 포함한다. 위장암은, 예를 들어, 대장암, 담낭암, 간세포암, 췌장암, PNET, 위암, 및 식도암을 포함한다. 비뇨생식기 암은, 예를 들어, 부신피질암, 방광암, 신장 색소혐성(chromophobe) 암, 신장암 (투명 세포 암), 신장암 (유두암), 간상소체암, 및 전립선암을 포함한다. 부인과 암은, 예를 들어, 자궁 암육종, 자궁내막암, 장액 난소암, 및 자궁경부암을 포함한다. 두경부암은, 예를 들어, 갑상선암, 비인두암, 두경부암, 및 선낭암을 포함한다. 헴암은, 예를 들어, 다발성 골수종, 척수이형성증, 맨틀 세포 림프종, 급성 림프모세포성 백혈병 (ALL), 비-림프종, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 및 급성 골수성 백혈병 (AML)을 포함한다. 피부암은, 예를 들어, 피부 흑색종 및 편평 세포 암종을 포함한다. 흉부암은, 예를 들어, 편평 세포 폐암, 소세포 폐암, 및 폐 선암종을 포함한다.
이러한 암의 더 구체적인 예는 편평 세포 암 또는 암종 (예컨대, 구강 편평 세포 암종), 골수종, 구강암, 청소년 비인두 혈관섬유종, 신경내분비 종양, 폐암, 복막암, 간세포암, 위암 또는 위암, 예컨대 위장암, 췌장암, 신경교종, 교모세포종, 신경교 종양, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 간세포 암종, 유방암, 삼중-음성 유방암, 결장암, 직장암, 대장암, 자궁내막암 또는 자궁암 또는 암종, 침샘 암종, 신장암 또는 신장암 (예컨대, 신장 세포 암종), 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 섬유육종, 담낭암, 골육종, 중피종, 뿐만 아니라 두경부암을 포함한다. 암은 또한 뇌암 또는 또 다른 유형의 CNS 또는 두개내 종양일 수 있다. 예를 들어, 대상체는 성상세포 종양 (예컨대, 성상세포종, 악성 성상세포종, 교모세포종, 모양세포성 성상세포종, 뇌실막하 거대 세포 성상세포종, 다형성 황색 성상세포종), 핍지교세포 종양 (예컨대, 핍지교종, 악성 핍지교종), 뇌실막세포 종양 (예컨대, 뇌실막세포종, 악성 뇌실막세포종, 점액유두 뇌실막세포종, 뇌실막하세포종), 잡종 신경교종 (예컨대, 잡종 올리고성상세포종, 악성 올리고성상세포종), 불특정 기원의 신경상피 종양 (예컨대, 극성 해면모세포종, 성상모세포종, 대뇌신경 아교종), 맥락망막 종양 (예컨대, 맥락망막 유두종, 맥락망막 암종), 신경 또는 잡종 신경-신경교 종양 (예컨대, 절신경종, 소뇌 이형성 절신경종, 신경절신경교종, 악성 신경절신경교종, 섬유조직형성 유아 신경절종, 중추 신경세포종, 배엽부전성 신경 상피 종양, 후각신경모세포종), 송과체 조직실질 종양 (예컨대, 송과체종, 송과체모세포종, 잡종 송과체종/송과체모세포종), 또는 혼합형 신경모세포 또는 교모세포 요소를 가진 종양 (예컨대, 수질상피종, 수모세포종, 신경모세포종, 망막아종, 뇌실막모세포종)을 가질 수 있다. 암의 다른 예는 저등급 신경교종, 비-소세포 폐암 (NSCLC), 에스트로겐-수용체-양성 (ER+) 유방암, 및 DNA 미스매치 수복 결핍성 암 또는 종양을 들 수 있다. 암은 그것이 에스트로겐에 대한 수용체를 가지면 에스트로겐-수용체-양성으로 불린다. 암의 또 다른 예는 현미부수체 안정성 (MSS) 대장암이다.
특정 예에서, 암은 비-소세포 폐암, 전립선암, 췌장암, 방광암, 유방암, 자궁암, 난소암, 저등급 신경교종, 대장암, 또는 두경부암이다.
용어 "치료하다" 또는 "치료하는"은 치료적 처치 및 예방 또는 방지 수단 둘 다를 나타내며, 이때 목적은 표적화된 종양 또는 암을 방지하거나 줄이는 것이다. 치료하는 것은 종양 또는 암에 직접적으로 영향을 미치거나 또는 치유하거나, 억압하거나, 억제하거나, 방지하거나, 그것의 중증도를 감소시키거나, 그것의 발병을 지연시키거나, 그것의 진행을 늦추거나, 그것의 진행을 안정화시키거나, 그것의 차도를 유도하거나, 그것의 전이를 방지 또는 지연시키거나, 그것과 관련된 증상을 감소시키고/개선하는 것, 또는 이것들의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 치료하는 것은 예상되는 생존 시간을 증가시키는 것 또는 종양 또는 전이 크기를 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 효과 (예컨대, 억압, 억제, 방지, 그 중증도의 감소, 그 발병의 지연, 그 진행의 둔화, 그 진행의 안정화, 그 차도의 유도, 그 전이의 방지 또는 지연, 그 증상의 감소/개선, 등)은 치료를 받지 않거나 플라시보(placebo) 치료를 받은 대조군 대상체에 상대적인 것일 수 있다. 용어 "치료하다" 또는 "치료하는"은 또한 종양 또는 암을 가진 대상체에 대한 생존율의 퍼센트 기회를 증가시키거나 예상 생존 시간을 증가시키는 것을 나타낼 수 있다 (예컨대, 치료를 받지 않거나 플라시보 치료를 받은 대조군 대상체에 비해). 한 예에서, "치료하는"은 진행 지연, 차도 촉진, 차도 유도, 차도 증대, 빠른 회복, 대체 치료제의 효능의 증가, 대체 치료제에 대한 저항성 감소, 또는 이것들의 조합을 나타낸다 (예컨대, 치료를 받지 않거나 플라시보 치료를 받은 대조군 대상체와 관련하여). 용어 "방지하는" 또는 "방해하는"은, 예를 들어, 증상의 발병 지연, 종양 또는 암의 재발 방지, 재발성 에피소드의 횟수 또는 빈도의 감소, 증상성 에피소드 사이에서의 잠복 증가, 종양 또는 암의 전이 방지, 또는 이것들의 조합을 나타낼 수 있다. 용어 "억압하는" 또는 "억제하는"은, 예를 들어, 증상의 중증도 감소, 급성 에피소드의 중증도 감소, 증상의 횟수 감소, 질환-관련 증상의 발생률 감소, 증상의 잠복 감소, 증상 개선, 2차 증상 감소, 2차 감염 감소, 환자 생존 연장, 또는 이것들의 조합을 나타낼 수 있다.
용어 "대상체"는 종양 또는 암에 대한 요법이 필요하거나, 종양 또는 암의 발달에 민감한 포유동물 (예컨대, 인간)을 나타낸다. 용어 대상체는 또한 예방 또는 치료적 처치 중 하나를 받은 포유동물 (예컨대, 인간)을 나타낸다. 대상체는 개, 고양이, 돼지, 소, 양, 염소, 말, 래트, 마우스, 비-인간 포유동물, 및 인간을 포함할 수 있다. 용어 "대상체"는 반드시 모든 점에 있어서 건강하고 종양 또는 암에 걸리거나 그 징후를 나타내지 않는 개체를 배제하는 것은 아니다.
개체는 대상체를 위험 요소가 없는 개체보다 종양 또는 암에 걸릴 위험이 통계적으로 유의하게 큰 위험에 처하게 하는 적어도 하나의 공지된 위험 인자 (예컨대, 유전적, 생화학적, 가족력, 및 상황에 따른 노출)를 가진 경우 종양 또는 암에 걸릴 위험이 크다.
"증상" 또는 "징후"는 의사에 의해 관찰되는 질환의 객관적인 증거 또는 대상체에 의해 인지되는 질환의 주관적인 증거, 예컨대 변화된 걸음걸이를 나타낸다. 증상 또는 징후는 질환의 임의의 소견일 수 있다. 증상은 1차 또는 2차적일 수 있다. 용어 "1차"는 특정 질환 또는 장애 (예컨대, 종양 또는 암)의 직접적인 결과인 증상을 나타내는 한편, 용어 "2차"는 1차적인 원인으로부터 유래되거나 그 결과로 일어나는 증상을 나타낸다. 본원에 개시된 불규칙변화성 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 및 백신은 1차 또는 2차적인 증상 또는 2차적인 합병증을 치료할 수 있다.
불규칙변화성 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주, 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신은 종양 또는 암의 발병을 지연시키고, 중증도를 감소시키며, 추가의 악화를 억제하고, 및/또는 적어도 한 징후 또는 증상을 개선하는 투여량, 투여 경로, 및 투여 빈도를 의미하는 유효한 양생법으로 투여된다. 대안으로, 불규칙변화성 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주, 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신은, 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드 (또는 핵산에 의해 암호화된), 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주, 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신에서 이종성 항원에 대한 면역 반응을 유도하는, 또는 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주의 경우 박테리아 또는 리스테리아 균주 자체에 대한 면역 반응을 유도하는 투여량, 투여 경로, 및 투여 빈도를 의미하는 유효한 양생법으로 투여된다. 대상체가 이미 종양 또는 암으로 고통받고 있으면, 양생법은 치료적으로 유효한 양생법이라고 언급될 수 있다. 대상체가 아직 증상을 겪은 것은 아니지만 일반적인 집단에 비해 종양 또는 암에 걸릴 위험이 높은 경우에, 양생법은 예방적으로 유효한 양생법이라고 불릴 수 있다. 일부 경우에, 치료적 또는 예방적 효능은 과거 대조군과 비교하여 개별 환자에서 또는 동일한 환자에서 과거 경험과 비교하여 관찰될 수 있다. 다른 경우에, 치료적 또는 예방적 효능은 미치료 환자의 대조군 집단에 관련하여 치료된 환자의 집단에서 전임상 또는 임상 시험에서 입증될 수 있다. 예를 들어, 양생법은 개별적인 치료된 환자가 본원에 기술된 방법에 의해 치료되지 않은 비슷한 환자의 대조군 집단의 평균 결과보다 더 선호하는 결과를 달성한 경우, 또는 제어된 임상 시험 (예컨대, 단계 II, 단계 II/III 또는 단계 III 시험)에서 0.05 미만 또는 0.01 또는 심지어 0.001 미만의 p 수준에서 대조군 환자에 비해 치료된 환자에서 더 선호하는 결과가 입증된 경우 치료적으로 또는 예방적으로 유효한 것으로 간주될 수 있다.
펩타이드에 대한 예시의 투여량은, 예를 들어, 1일에 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 10-20, 20-40, 30-60, 40-60, 40-80, 50-100, 50-150, 60-80, 80-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-600, 500-800, 600-800, 800-1000, 1000-1500, 또는 1500-1200 μg 펩타이드이다. 펩타이드의 예시의 투여량은, 예를 들어, 1일에 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 10-20, 20-40, 30-60, 40-60, 40-80, 50-100, 50-150, 60-80, 80-100, 100-200, 200-300, 300-400, 400-600, 500-800, 600-800, 800-1000, 1000-1500, 또는 1500-1200 mg 펩타이드이다.
재조합 리스테리아 균주에 대한 예시의 투여량은, 예를 들어, 1x106 - 1x107 CFU, 1x107 - 1x108 CFU, 1x108 - 3.31x1010 CFU, 1x109 - 3.31x1010 CFU, 5-500x108 CFU, 7-500x108 CFU, 10-500x108 CFU, 20-500x108 CFU, 30-500x108 CFU, 50-500x108 CFU, 70-500x108 CFU, 100-500x108 CFU, 150-500x108 CFU, 5-300x108 CFU, 5-200x108 CFU, 5-15x108 CFU, 5-100x108 CFU, 5-70x108 CFU, 5-50x108 CFU, 5-30x108 CFU, 5-20x108 CFU, 1-30x109 CFU, 1-20x109CFU, 2-30x109 CFU, 1-10x109 CFU, 2-10x109 CFU, 3-10x109 CFU, 2-7x109 CFU, 2-5x109 CFU, 및 3-5x109 CFU이다. 재조합 리스테리아 균주에 대한 다른 예시의 투여량은, 예를 들어, 1x107개의 유기체, 1.5x107개의 유기체, 2x108개의 유기체, 3x107개의 유기체, 4x107개의 유기체, 5x107개의 유기체, 6x107개의 유기체, 7x107개의 유기체, 8x107개의 유기체, 10x107개의 유기체, 1.5x108개의 유기체, 2x108개의 유기체, 2.5x108개의 유기체, 3x108개의 유기체, 3.3x108개의 유기체, 4x108개의 유기체, 5x108개의 유기체, 1x109개의 유기체, 1.5x109개의 유기체, 2x109개의 유기체, 3x109개의 유기체, 4x109개의 유기체, 5x109개의 유기체, 6x109개의 유기체, 7x109개의 유기체, 8x109개의 유기체, 10x109개의 유기체, 1.5x1010개의 유기체, 2x1010개의 유기체, 2.5x1010개의 유기체, 3x1010개의 유기체, 3.3x1010개의 유기체, 4x1010개의 유기체, 및 5x1010개의 유기체이다. 투여량은 치료가, 존재한다면, 예방적이든 또는 치료적이든, 치료 전 환자의 상태 및 반응, 및 다른 요인에 따라 달라질 수 있다.
투여는 임의의 적합한 수단으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 투여는 비경구, 정맥내, 경구, 피하, 동맥내, 두개내, 척추강내, 뇌실내, 복강내, 국부, 비강내, 근육내, 안내, 직장내, 결막, 경피, 피내, 질, 직장, 종양내, 경암(parcanceral), 경점막, 혈관내, 심실내, 흡입 (에어로졸), 비강 흡인 (스프레이), 혀 밑, 에어로졸, 좌제, 또는 이것들의 조합일 수 있다. 흡입에 의한 비강내 투여 또는 적용을 위해, 불규칙변화성 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주, 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 적절한 담체의 존재 하에 혼합되고 에어로졸화 또는 분무화된 백신의 용액 또는 현탁액이 적합하다. 이러한 에어로졸은 본원에 기술된 임의의 불규칙변화성 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주, 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신을 포함할 수 있다. 투여는 또한 좌제 (예컨대, 직장 좌제 또는 요도 좌제)의 형태, 피하 이식용 펠릿의 형태 (예컨대, 일정 기간에 걸쳐 제어된 방출을 제공함), 또는 캡슐의 형태로 이루어질 수 있다. 투여는 또한 종양 부위로의 또는 종양으로의 주사를 통해 이루어질 수 있다. 투여 양생법은 치료되는 종양 또는 암의 정확한 성질 및 유형, 종양 또는 암의 중증도, 대상체의 나이 및 일반적인 신체 상태, 대상체의 체중, 개별적인 대상체의 반응, 등과 같은 요인들을 기반으로 쉽게 결정될 수 있다.
투여 빈도는 다른 요인들 중에서도 대상체에서의 불규칙변화성 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주, 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신의 반감기, 대상체의 상태, 및 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 빈도는, 예를 들어, 매일, 매주, 매월, 분기별이거나, 또는 치료되는 대상체의 상태의 변화 또는 종양 또는 암의 진행에 대한 반응하여 불규칙적인 간격으로 이루어질 수 있다. 치료 과정은 대상체의 상태 및 다른 요인에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, 치료 과정은 수주, 수개월, 또는 수년 (예를 들어, 최대 2년)일 수 있다. 예를 들어, 반복 투여 (용량)는 종양 퇴행 또는 종양 성장의 억압을 달성하기 위해 제1 치료 과정 직후 또는 일, 주 또는 월 간격 이후 착수될 수 있다. 평가는 영상화 기법, 혈청 바이오마커의 분석, 생검, 또는 종양-관련 증상의 존재, 부재, 또는 개선과 같은 진단 방법을 포함한, 임의의 공지된 기법에 의해 결정될 수 있다. 특정 예로서, 불규칙변화성 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주, 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신은 최대 2년 동안 3주 마다 투여될 수 있다. 한 예에서, 본원에 개시된 불규칙변화성 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주, 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신은 T-이펙터 세포 대 조절 T 세포 비율을 증가시키고 더 강력한 항-종양 면역 반응을 생성하기 위해 증가하는 용량으로 투여된다. 항-종양 면역 반응은 대상체에게, 예를 들어, IFN-γ, TNF-α, 및 세포 면역 반응을 향상시키는 것으로 알려져 있는 다른 사이토카인을 포함한, 사이토카인을 제공함으로써 더 강화될 수 있다. 예컨대, US 6,991,785 (모든 목적에 대해 그 전문이 참조로 본원에 포함됨)를 참조한다.
일부 방법은 대상체를 추가적인 불규칙변화성 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주, 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신으로 "부스팅"하는 단계 또는 불규칙변화성 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주, 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신을 여러 번 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다. "부스팅"은 대상체에게 추가적인 용량을 투여하는 것을 말한다. 예를 들어, 일부 방법에서, 2회의 부스팅 (또는 총 3회 접종)이 투여되거나, 3회의 부스팅이 투여되거나, 4회의 부스팅이 투여되거나, 5회의 부스팅이 투여되거나, 또는 6회 이상의 부스팅이 투여된다. 투여되는 투약 횟수는, 예를 들어, 치료에 대한 종양 또는 암의 반응에 따라 다를 수 있다.
선택적으로, 부스터 접종에 사용된 불규칙변화성 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 불규칙변화성 펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주, 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신은 초기 "프라이밍(priming)" 접종에 사용된 불규칙변화성 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 불규칙변화성 펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주, 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신과 동일하다. 대안으로, 부스터 불규칙변화성 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 핵산, 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주, 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신은 프라이밍 불규칙변화성 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 핵산, 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주, 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신과 상이하다. 선택적으로, 프라이밍 및 부스팅 접종에 동일한 투여량이 사용된다. 대안으로, 더 큰 투여량이 부스터에 사용되거나, 또는 더 적은 투여량이 부스터에 사용된다. 프라이밍 접종과 부스팅 접종 사이의 기간은 실험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 프라이밍 접종과 부스팅 접종 사이의 기간은 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6-8주, 또는 8-10주일 수 있다.
이종성 프라이밍 부스팅 계획은 많은 병원체에 대한 면역 반응 및 보호를 증강시키는데 효과적이었다. 예컨대, Schneider et al. (1999) Immunol. Rev. 170:29-38; Robinson (2002) Nat. Rev. Immunol. 2:239-250; Gonzalo et al. (2002) Vaccine 20:1226-1231; 및 Tanghe (2001) Infect. Immun. 69:3041-3047 (이들은 각각 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 프라이밍 및 부스팅 주사에 상이한 형태의 항원을 제공하는 것은 항원에 대한 면역 반응을 최대화할 수 있다. DNA 백신 프라이밍에 뒤따르는 보조제 중의 단백질로의 부스팅 또는 항원을 암호화하는 DNA의 바이러스 벡터 전달은 항원-특이적 항체 및 CD4+ T-세포 반응 또는 CD8+ T-세포 반응을 개선하는 하나의 효과적인 방법이다. 예컨대, Shiver et al. (2002) Nature 415: 331-335; Gilbert et al. (2002) Vaccine 20:1039-1045; Billaut-Mulot et al. (2000) Vaccine 19:95-102; 및 Sin et al. (1999) DNA Cell Biol. 18:771-779 (이들은 각각 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 한 예로서, CRL1005 폴록사머 (12 kDa, 5% POE)를 항원을 암호화하는 DNA에 추가하는 것은 대상체가 DNA 프라이밍에 뒤따른 항원을 발현하는 아데노바이러스 벡터로의 부스팅으로 예방접종될 때 T-세포 반응을 증강시킬 수 있다. 예컨대, Shiver et al. (2002) Nature 415:331-335 (모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 또 다른 예로서, 항원의 면역원성 부분을 암호화하는 벡터 구성물 및 항원의 면역원성 부분을 포함하는 단백질이 투여될 수 있다. 예컨대, US 2002/0165172 (모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다. 유사하게, 핵산 예방접종의 면역 반응은 관심 있는 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 동시 투여 (예컨대, 동일한 면역 반응 동안, 바람직하게는 서로 0-10일 또는 3-7일 이내에)에 의해 증강될 수 있다. 예컨대, US 6,500,432 (모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다.
본원에 개시된 치료적 방법은 또한 암을 예방하거나 치료하는데 효과적인 하나 이상의 추가적인 화합물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가적인 화합물은 화학요법에 유용한 화합물, 예컨대 암사크린, 블레오마이신, 부술판, 카페시타빈, 카르보플라틴, 카르무스틴, 클로람부실, 씨스플라틴, 클라드리빈, 클로파라빈, 크리산타스파제, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 다카르바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 에토포시드, 플루다라빈, 플루오로우라실 (5-FU), 젬시타빈, 글리아델림플란츠, 하이드록시카바마이드, 이다루비신, 이포스파미드, 이리노테칸, 류코보린, 리포소말독소루비신, 리포소말다우노루비신, 로무스틴, 멜팔란, 메르캅토퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미토크산트론, 옥사리플라틴, 파클리탁셀 (탁솔), 페메트렉세드, 펜토스타틴, 프로카르바진, 랄티트렉세드, 사트라플라틴, 스트렙토조신, 테가푸르-우라실, 테모졸로미드, 테니포시드, 티오테파, 티오구아닌, 토포테칸, 트레오술판, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈, 또는 이것들의 조합을 포함할 수 있다. 대안으로, 추가적인 화합물은 또한 다른 생물의약품, 예컨대 HER2 항원에 대한 Herceptin® (트라스투주맙), VEGF에 대한 Avastin® (베바시주맙), 또는 EGF 수용체에 대한 항체, 예컨대 Erbitux® (세툭시맙), 및 Vectibix® (파니투무맙)를 포함할 수 있다. 대안으로, 추가적인 화합물은 다른 면역치료제를 포함할 수 있다. 대안으로, 추가적인 화합물은 인돌아민 2,3-디옥시게나아제 (IDO) 경로 억제자, 예컨대 1-메틸트립토판 (1MT), 1-메틸트립토판 (1MT), 네크로스타틴(Necrostatin)-1, 피리독살 아이소니코티노일 하이드라존, 엡셀렌(Ebselen), 5-메틸인돌-3-카르복스알데하이드, CAY10581, 항-IDO 항체, 또는 소분자 IDO 억제자일 수 있다. IDO 억제는 화학치료제의 효능을 증강시킬 수 있다. 본원에 개시된 치료 방법은 또한 방사선, 줄기 세포 치료, 수술, 또는 임의의 다른 치료와 조합될 수 있다.
이러한 추가적인 화합물 또는 치료는 본원에서 개시된 불규칙변화성 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 불규칙변화성 펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주, 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신의 투여에 선행하거나, 본원에서 개시된 불규칙변화성 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 불규칙변화성 펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주, 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신의 투여 후에 이루어지거나, 또는 본원에서 개시된 불규칙변화성 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 불규칙변화성 펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주, 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신의 투여와 동시에 이루어질 수 있다.
표적화된 면역조절 요법은 주로, 예를 들어, 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리의 구성원을 표적화하는 작용물질 항체, 예컨대 4-1BB, OX40, 및 GITR (글루코코르티코이드-유도된 TNF 수용체-관련)을 사용함으로써 동시자극 수용체의 활성화에 초점을 맞춘다. GITR의 조절은 항종양 및 백신 설정 둘 다에서 잠재적인 것으로 입증되었다. 작용물질 항체에 대한 또 다른 표적은 T 세포 활성화에 대한 동시 자극 신호 분자이다. 동시자극 신호 분자를 표적화하는 것은 T 세포 활성화 증강 및 더 강한 면역반응의 촉진으로 이어질 수 있다. 동시자극은 또한 체크포인트 억제로부터의 억제 영향을 방지하고 항원-특이적 T 세포 증식을 증가시키는 것을 도울 수 있다.
리스테리아-기반 면역요법은 종양에 침투하여 파괴하는 종양 항원-특이적 T 세포의 데 노보(de novo) 생성을 유도하고 종양 미세환경에서 면역억제 조절 T 세포 (Treg) 및 골수-유래된 억압자 세포 (MDSC)의 수 및 활성을 감소시킴으로써 작용한다. T 세포 동시자극 또는 동시 자극 수용체에 대한 항체 (또는 그것의 기능적 단편) (예컨대, 체크포인트 억제자 CTLA-4, PD-1, TIM-3, LAG3 및 동시자극물질 CD137, OX40, GITR, 및 CD40)는 리스테리아-기반 면역요법과 시너지 작용할 수 있다.
그러므로, 일부 방법은 면역 체크포인트 억제자 길항물질, 예컨대 PD-1 신호전달 경로 억제자, CD-80/86 및 CTLA-4 신호전달 경로 억제자, T 세포막 단백질 3 (TIM3) 신호전달 경로 억제자, 아데노신 A2a 수용체 (A2aR) 신호전달 경로 억제자, 림프구 활성화 유전자 3 (LAG3) 신호전달 경로 억제자, 킬러 면역글로불린 수용체 (KIR) 신호전달 경로 억제자, CD40 신호전달 경로 억제자, 또는 임의의 다른 항원-제공 세포/T 세포 신호전달 경로 억제자를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 면역 체크포인트 억제자 길항물질의 예는 항-PD-L1/PD-L2 항체 또는 그것의 단편, 항-PD-1 항체 또는 그것의 단편, 항-CTLA-4 항체 또는 그것의 단편, 또는 항-B7-H4 항체 또는 그것의 단편을 포함한다. 예를 들어, 항 PD-1 항체는 2주마다 5-10 mg/kg, 3주마다 5-10 mg/kg, 3주마다 1-2 mg/kg, 매주 1-10 mg/kg, 2주마다 1-10 mg/kg, 3주마다 1-10 mg/kg, 또는 4주마다 1-10 mg/kg으로 대상체에게 투여될 수 있다.
마찬가지로, 일부 방법은 T 세포 자극물질, 예컨대 T-세포 수용체 동시 자극 분자, 동시 자극 분자에 결합하는 항원 제공 세포 수용체, 또는 TNF 수용체 슈퍼패밀리의 구성원에 결합하는 항체 또는 그것의 기능적 단편을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. T-세포 수용체 동시 자극 분자는, 예를 들어, CD28 또는 ICOS를 포함할 수 있다. 동시 자극 분자에 결합하는 항원 제공 세포 수용체는, 예를 들어, CD80 수용체, CD86 수용체, 또는 CD46 수용체를 포함할 수 있다. TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원은, 예를 들어, 글루코코르티코이드-유도된 TNF 수용체 (GITR), OX40 (CD134 수용체), 4-1BB (CD137 수용체), 또는 TNFR25를 포함할 수 있다.
예를 들어, 일부 방법은 T-세포 수용체 동시 자극 분자에 결합하는 항체 또는 그것의 기능적 단편 또는 동시 자극 분자에 결합하는 항원 제공 세포 수용체에 결합하는 항체 또는 그것의 기능적 단편을 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 항체는, 예를 들어, 항-TNF 수용체 항체 또는 그것의 항원-결합 단편 (예컨대, TNF 수용체 슈퍼패밀리 구성원 글루코코르티코이드-유도된 TNF 수용체 (GITR), OX40 (CD134 수용체), 4-1BB (CD137 수용체), 또는 TNFR25), 항-OX40 항체 또는 그것의 항원-결합 단편, 또는 항-GITR 항체 또는 그것의 항원 결합 단편일 수 있다. 대안으로, 다른 작용물질 분자가 투여될 수 있다 (예컨대, GITRL, GITRL의 활성 단편, GITRL을 함유하는 융합 단백질, GITRL의 활성 단편을 함유하는 융합 단백질, 항원 제공 세포 (APC)/T 세포 작용물질, CD134 또는 리간드 또는 그것의 단편, CD137 또는 리간드 또는 그것의 단편, 또는 유도성 T 세포 동시자극 (ICOS) 또는 리간드 또는 그것의 단편, 또는 작용물질 소분자).
특정 예에서, 일부 방법은 항-CTLA-4 항체 또는 그것의 기능적 단편 및/또는 항-CD137 항체 또는 그것의 기능적 단편을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 항-CTLA-4 항체 또는 그것의 기능적 단편 또는 항-CD137 항체 또는 그것의 기능적 단편은 불규칙변화성 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주, 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신의 최초 투여 후 약 72시간에, 또는 불규칙변화성 펩타이드, 재조합 융합 폴리펩타이드, 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주, 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신의 최초 투여 후 약 48시간에 투여될 수 있다. 항-CTLA-4 항체 또는 그것의 기능적 단편 또는 항-CD137 항체 또는 그것의 기능적 단편은, 예를 들어, 약 0.05 mg/kg 내지 약 5 mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 재조합 리스테리아 균주 또는 재조합 리스테리아 균주를 포함하는 면역원성 조성물은, 예를 들어, 약 1x109 CFU의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 이러한 방법은 항-PD-1 항체 또는 그것의 기능적 단편의 유효량을 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
암 면역치료제의 효능을 평가하는 방법은 잘 알려져 있고, 예를 들어, Dzojic et al. (2006) Prostate 66(8):831-838; Naruishi et al. (2006) Cancer Gene Ther. 13(7):658-663, Sehgal et al. (2006) Cancer Cell Int. 6:21), 및 Heinrich et al. (2007) Cancer Immunol Immunother 56(5):725-730 (이들은 각각 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있다. 한 예로서, 전립선암에 대하여, 전립선암 모델, 예컨대 TRAMP-C2 마우스 모델, 178-2 BMA 세포 모델, PAIII 선암종 세포 모델, PC-3M 모델, 또는 임의의 다른 전립선암 모델은 본원에 개시된 방법 및 조성물을 테스트하기 위한 것일 수 있다.
대안으로 또는 추가적으로, 면역요법은 인간 대상체에서 테스트될 수 있고, 효능은 공지된 것들을 사용하여 모니터링될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, CD4+ 및 CD8+ T 세포 반응을 직접적으로 측정하거나, 또는 질환 진행을 측정하는 단계 (예컨대, 종양 전이의 수 또는 크기를 측정하거나, 또는 기침, 흉통, 체중 감소, 등과 같은 질환 증상을 모니터링함으로써)를 포함할 수 있다. 인간 대상체에서 암 면역요법의 효능을 평가하는 방법은 잘 알려져 있고, 예를 들어, Uenaka et al. (2007) Cancer Immun. 7:9 및 Thomas-Kaskel et al. (2006) Int J Cancer 119(10):2428-2434 (이들은 각각 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기술되어 있다.
VII. 키트
본원에 개시된 방법을 수행하는데 이용되는 시약을 포함하는 키트 또는 본원에 개시된 조성물, 도구, 또는 기구를 포함하는 키트가 또한 제공된다.
예를 들어, 이러한 키트는 본원에 개시된 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드, 본원에 개시된 불규칙변화성 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 본원에 개시된 재조합 박테리아 또는 리스테리아 균주, 본원에 개시된 면역원성 조성물, 본원에 개시된 제약학적 조성물, 또는 본원에 개시된 백신을 포함할 수 있다. 이러한 키트는 추가적으로 본원에 개시된 방법을 수행하기 위해 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 재조합 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, 재조합 리스테리아 균주, 면역원성 조성물, 제약학적 조성물, 또는 백신의 사용을 기술한 교육용 재료를 포함할 수 있다. 이러한 키트는 선택적으로 도포용 도구를 추가로 포함할 수 있다. 모델 키트가 하기 기술되지만, 다른 유용한 키트의 내용물은 본 발명의 관점에서 드러날 것이다.
상기 또는 하기 인용된 모든 특허 출원, 웹사이트, 다른 간행물, 수탁 번호 등은 각각의 개별적인 항목이 구체적으로 및 개별적으로 참조로 포함되는 것으로 나타난 것과 동일한 정도로 모든 목적에 대해 그 전문이 참조로 포함된다. 상이한 버전의 서열이 다른 시점에 수탁 번호와 관련이 있는 경우, 본 출원의 유효 출원일에 수탁 번호와 관련된 버전을 의미한다. 유효 출원일은 실제 출원일 또는 적용 가능한 경우 수탁 번호를 언급하는 우선권 출원의 출원일 중 빠른 것을 의미한다. 마찬가지로, 상이한 버전의 간행물, 웹사이트 등이 상이한 시점에 공개된 경우, 달리 표시되지 않는 한 본 출원의 유효 출원일의 가장 최근에 공개된 버전을 의미한다. 본 발명의 임의의 특징, 단계, 요소, 구체예, 또는 측면은 달리 구체적으로 표시되지 않는 한 임의의 다른 것과 조합하여 사용될 수 있다. 본 출원은 명료성 및 이해의 목적으로 예시 및 예의 방식으로 어느 정도 상세하게 기술되었지만, 특정 변경 및 변형이 첨부된 청구범위의 범위 내에서 실시될 수 있다는 것은 분명할 것이다.
구체예의 목록
본원에 개시된 주제는 다음 구체예를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
1. 암 관련 단백질의 면역원성 단편을 포함하는 분리된 펩타이드로서, 단편은 불규칙변화성 돌연변이를 포함한다.
2. 구체예 1의 분리된 펩타이드로서, 불규칙변화성 돌연변이는 앵커 위치에서 바람직한 아미노산에 대한 돌연변이이다.
3. 구체예 1 또는 2의 분리된 펩타이드로서, 단편은 길이가 약 7 내지 약 11개의 아미노산, 길이가 약 8 내지 약 10개의 아미노산, 또는 길이가 약 9개의 아미노산이다.
4. 구체예 1-3 중 어느 하나의 분리된 펩타이드로서, 암 관련 단백질은 암 정소 항원 또는 종양태아 항원이다.
5. 구체예 1-4 중 어느 하나의 분리된 펩타이드로서, 암 관련 단백질은 다음 유전자: CEACAM5, GAGE1, TERT, KLHL7, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA6, NUF2, NYESO1, PAGE4, PRAME, PSA, PSMA, RNF43, SART3, SSX2, STEAP1, 및 SURVIVIN 중 하나에 의해 암호화된다.
6. 구체예 5의 분리된 펩타이드로서, (a) 암 관련 단백질은 CEACAM5에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 100, 102, 104, 106, 및 108 중 어느 하나를 포함하거나; (b) 암 관련 단백질은 GAGE1에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 110 및 112 중 어느 하나를 포함하거나; (c) 암 관련 단백질은 TERT에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 114를 포함하거나; (d) 암 관련 단백질은 KLHL7에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 116을 포함하거나; (e) 암 관련 단백질은 MAGEA3에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 118, 120, 122, 및 124 중 어느 하나를 포함하거나; (f) 암 관련 단백질은 MAGEA4에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 126을 포함하거나; (g) 암 관련 단백질은 MAGEA6에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 128을 포함하거나; (h) 암 관련 단백질은 NUF2에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 130 및 132 중 어느 하나를 포함하거나; (i) 암 관련 단백질은 NYESO1에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 134 및 136 중 어느 하나를 포함하거나; (j) 암 관련 단백질은 PAGE4에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 138을 포함하거나; (k) 암 관련 단백질은 PRAME에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 140을 포함하거나; (l) 암 관련 단백질은 PSA에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 142를 포함하거나; (m) 암 관련 단백질은 PSMA에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 144를 포함하거나; (n) 암 관련 단백질은 RNF43에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 146을 포함하거나; (o) 암 관련 단백질은 SART3에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 148을 포함하거나; (p) 암 관련 단백질은 SSX2에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 150을 포함하거나; (q) 암 관련 단백질은 STEAP1에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 152 및 154 중 어느 하나를 포함하거나; 또는 (r) 암 관련 단백질은 SURVIVIN에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 156 및 158 중 어느 하나를 포함한다.
7. 구체예 6의 분리된 펩타이드로서, (a) 암 관련 단백질은 CEACAM5에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 100, 102, 104, 106, 및 108 중 어느 하나로 이루어지거나; (b) 암 관련 단백질은 GAGE1에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 110 및 112 중 어느 하나로 이루어지거나; (c) 암 관련 단백질은 TERT에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 114로 이루어지거나; (d) 암 관련 단백질은 KLHL7에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 116으로 이루어지거나; (e) 암 관련 단백질은 MAGEA3에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 118, 120, 122, 및 124 중 어느 하나로 이루어지거나; (f) 암 관련 단백질은 MAGEA4에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 126으로 이루어지거나; (g) 암 관련 단백질은 MAGEA6에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 128로 이루어지거나; (h) 암 관련 단백질은 NUF2에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 130 및 132 중 어느 하나로 이루어지거나; (i) 암 관련 단백질은 NYESO1에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 134 및 136 중 어느 하나로 이루어지거나; (j) 암 관련 단백질은 PAGE4에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 138로 이루어지거나; (k) 암 관련 단백질은 PRAME에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 140으로 이루어지거나; (l) 암 관련 단백질은 PSA에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 142로 이루어지거나; (m) 암 관련 단백질은 PSMA에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 144로 이루어지거나; (n) 암 관련 단백질은 RNF43에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 146으로 이루어지거나; (o) 암 관련 단백질은 SART3에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 148로 이루어지거나; (p) 암 관련 단백질은 SSX2에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 150으로 이루어지거나; (q) 암 관련 단백질은 STEAP1에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 152 및 154 중 어느 하나로 이루어지거나; 또는 (r) 암 관련 단백질은 SURVIVIN에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 156 및 158 중 어느 하나로 이루어진다.
8. 구체예 7의 분리된 펩타이드롯서, (a) 암 관련 단백질은 CEACAM5에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 100, 102, 104, 106, 및 108 중 어느 하나로 이루어지거나; (b) 암 관련 단백질은 GAGE1에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 110 및 112 중 어느 하나로 이루어지거나; (c) 암 관련 단백질은 TERT에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 114로 이루어지거나; (d) 암 관련 단백질은 KLHL7에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 116으로 이루어지거나; (e) 암 관련 단백질은 MAGEA3에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 118, 120, 122, 및 124 중 어느 하나로 이루어지거나; (f) 암 관련 단백질은 MAGEA4에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 126으로 이루어지거나; (g) 암 관련 단백질은 MAGEA6에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 128로 이루어지거나; (h) 암 관련 단백질은 NUF2에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 130 및 132 중 어느 하나로 이루어지거나; (i) 암 관련 단백질은 NYESO1에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 134 및 136 중 어느 하나로 이루어지거나; (j) 암 관련 단백질은 PAGE4에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 138로 이루어지거나; (k) 암 관련 단백질은 PRAME에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 140으로 이루어지거나; (l) 암 관련 단백질은 PSA에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 142로 이루어지거나; (m) 암 관련 단백질은 PSMA에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 144로 이루어지거나; (n) 암 관련 단백질은 RNF43에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 146으로 이루어지거나; (o) 암 관련 단백질은 SART3에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 148로 이루어지거나; (p) 암 관련 단백질은 SSX2에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 150으로 이루어지거나; (q) 암 관련 단백질은 STEAP1에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 152 및 154 중 어느 하나로 이루어지거나; 또는 (r) 암 관련 단백질은 SURVIVIN에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 156 및 158 중 어느 하나로 이루어진다.
9. 구체예 1-8 중 어느 하나의 분리된 펩타이드로서, 단편은 다음 HLA 유형: HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상에 결합한다.
10. 구체예 1-9 중 어느 하나의 분리된 펩타이드를 암호화하는 핵산.
11. 구체예 10의 핵산으로서, 핵산은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다.
12. 구체예 10의 핵산으로서, 핵산은 리스테리아 모노사이토게네스에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다.
13. 구체예 10-12 중 어느 하나의 핵산으로서, 핵산은 DNA를 포함한다.
14. 구체예 10-12 중 어느 하나의 핵산으로서, 핵산은 RNA를 포함한다.
15. 구체예 10-14 중 어느 하나의 핵산으로서, 핵산은 SEQ ID NO: 223-977 중 어느 하나로부터 선택된 서열 및 동이한 아미노산 서열을 암호화하는 그것의 축퇴성 변이체를 포함한다.
16. 구체예 15의 핵산으로서, 핵산은 SEQ ID NO: 223-977 중 어느 하나로부터 선택된 서열 및 동이한 아미노산 서열을 암호화하는 그것의 축퇴성 변이체로 이루어진다.
17. (a) 구체예 1-9 중 어느 하나의 하나 이상의 분리된 펩타이드 또는 구체예 10-16 중 어느 하나의 하나 이상의 핵산; 및 (b) 보조제를 포함하는 제약학적 조성물.
18. 구체예 17의 제약학적 조성물로서, 보조제는 독성이 제거된 리스테리오리신 O (dtLLO), 과립구/대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 단백질, GM-CSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 분자, 사포닌 QS21, 모노포스포릴 지질 A, 메틸화되지 않은 CpG-함유 올리고뉴클레오타이드, 또는 몬타나이드 ISA 51을 포함한다.
19. 구체예 17 또는 18의 제약학적 조성물로서, 제약학적 조성물은 다음 HLA 유형: HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02의 각각에 결합하는 펩타이드 또는 펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함한다.
20. 구체예 17-19 중 어느 하나의 제약학적 조성물로서, 제약학적 조성물은: (a) 표 3에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 3에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산; (b) 표 5에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 5에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산; (c) 표 7에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 7에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산; (d) 표 9에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 9에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산; (e) 표 11에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 11에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산; (f) 표 13에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 13에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산; (g) 표 15에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 15에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산; (h) 표 17에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 17에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산; (i) 표 19에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 19에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산; 또는 (j) 표 21에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 21에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산을 포함한다.
21. 구체예 20의 제약학적 조성물로서, 제약학적 조성물은: (a) 표 3에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 3에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산; (b) 표 5에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 5에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산; (c) 표 7에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 7에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산; (d) 표 9에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 9에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산; (e) 표 11에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 11에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산; (f) 표 13에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 13에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산; (g) 표 15에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 15에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산; (h) 표 17에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 17에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산; (i) 표 19에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 19에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산; 또는 (j) 표 21에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 21에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함한다.
22. 구체예 1-9의 분리된 펩타이드 중 어느 하나를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 박테리아 균주.
23. 구체예 1-9의 분리된 펩타이드 중 둘 이상을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 재조합 박테리아 균주..
24. 구체예 23의 재조합 박테리아 균주로서, 둘 이상의 펩타이드는: (a) 표 3에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 3에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산; (b) 표 5에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 5에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산; (c) 표 7에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 7에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산; (d) 표 9에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 9에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산; (e) 표 11에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 11에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산; (f) 표 13에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 13에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산; (g) 표 15에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 15에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산; (h) 표 17에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 17에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산; (i) 표 19에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 19에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산; 또는 (j) 표 21에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 21에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산을 포함한다.
25. 구체예 24의 재조합 박테리아 균주로서, 둘 이상의 펩타이드는: (a) 표 3에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 3에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산; (b) 표 5에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 5에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산; (c) 표 7에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 7에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산; (d) 표 9에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 9에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산; (e) 표 11에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 11에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산; (f) 표 13에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 13에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산; (g) 표 15에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 15에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산; (h) 표 17에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 17에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산; (i) 표 19에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 19에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산; 또는 (j) 표 21에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 21에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함한다.
26. 구체예 23-25 중 어느 하나의 재조합 박테리아 균주로서, 둘 이상의 펩타이드의 조합은 다음 HLA 유형: HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02의 각각에 결합한다.
27. 구체예 22-26 중 어느 하나의 재조합 박테리아 균주로서, 박테리아 균주는 살모넬라, 리스테리아, 예르시니아, 시겔라, 또는 미코박테리움 균주이다.
28. 구체예 27의 재조합 박테리아 균주로서, 박테리아 균주는 리스테리아 균주이고, 선택적으로 리스테리아 균주는 리스테리아 모노사이토게네스 균주이다.
29. 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 오픈 리딩 프레임을 포함하는 핵산을 포함하는 재조합 리스테리아 균주로서, 융합 폴리펩타이드는 암 관련 단백질의 면역원성 단편에 융합된 PEST-함유 펩타이드를 포함하며, 단편은 불규칙변화성 돌연변이를 포함한다.
30. 구체예 29의 재조합 리스테리아 균주로서, 불규칙변화성 돌연변이는 앵커 위치의 바람직한 아미노산에 대한 돌연변이이다.
31. 구체예 29 또는 30의 재조합 리스테리아 균주로서, 단편은 길이가 약 7 내지 약 11개의 아미노산, 길이가 약 8 내지 약 10개의 아미노산, 또는 길이가 약 9개의 아미노산이다.
32. 구체예 29-31 중 어느 하나의 재조합 리스테리아 균주로서, 암 관련 단백질은 암 정소 항원 또는 종양태아 항원이다.
33. 구체예 29-32 중 어느 하나의 재조합 리스테리아 균주로서, 암 관련 단백질은 다음 인간 유전자: CEACAM5, GAGE1, TERT, KLHL7, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA6, NUF2, NYESO1, PAGE4, PRAME, PSA, PSMA, RNF43, SART3, SSX2, STEAP1, 및 SURVIVIN 중 하나에 의해 암호화된다.
34. 구체예 33의 재조합 리스테리아 균주로서, (a) 암 관련 단백질은 CEACAM5에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 100, 102, 104, 106, 및 108 중 어느 하나를 포함하거나; (b) 암 관련 단백질은 GAGE1에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 110 및 112 중 어느 하나를 포함하거나; (c) 암 관련 단백질은 TERT에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 114를 포함하거나; (d) 암 관련 단백질은 KLHL7에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 116을 포함하거나; (e) 암 관련 단백질은 MAGEA3에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 118, 120, 122, 및 124 중 어느 하나를 포함하거나; (f) 암 관련 단백질은 MAGEA4에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 126을 포함하거나; (g) 암 관련 단백질은 MAGEA6에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 128을 포함하거나; (h) 암 관련 단백질은 NUF2에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 130 및 132 중 어느 하나를 포함하거나; (i) 암 관련 단백질은 NYESO1에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 134 및 136 중 어느 하나를 포함하거나; (j) 암 관련 단백질은 PAGE4에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 138을 포함하거나; (k) 암 관련 단백질은 PRAME에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 140을 포함하거나; (l) 암 관련 단백질은 PSA에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 142를 포함하거나; (m) 암 관련 단백질은 PSMA에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 144를 포함하거나; (n) 암 관련 단백질은 RNF43에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 146을 포함하거나; (o) 암 관련 단백질은 SART3에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 148을 포함하거나; (p) 암 관련 단백질은 SSX2에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 150을 포함하거나; (q) 암 관련 단백질은 STEAP1에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 152 및 154 중 어느 하나를 포함하거나; 또는 (r) 암 관련 단백질은 SURVIVIN에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 156 및 158 중 어느 하나를 포함한다.
35. 구체예 34의 재조합 리스테리아 균주로서, (a) 암 관련 단백질은 CEACAM5에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 100, 102, 104, 106, 및 108 중 어느 하나로 이루어지거나; (b) 암 관련 단백질은 GAGE1에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 110 및 112 중 어느 하나로 이루어지거나; (c) 암 관련 단백질은 TERT에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 114로 이루어지거나; (d) 암 관련 단백질은 KLHL7에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 116으로 이루어지거나; (e) 암 관련 단백질은 MAGEA3에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 118, 120, 122, 및 124 중 어느 하나로 이루어지거나; (f) 암 관련 단백질은 MAGEA4에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 126으로 이루어지거나; (g) 암 관련 단백질은 MAGEA6에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 128로 이루어지거나; (h) 암 관련 단백질은 NUF2에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 130 및 132 중 어느 하나로 이루어지거나; (i) 암 관련 단백질은 NYESO1에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 134 및 136 중 어느 하나로 이루어지거나; (j) 암 관련 단백질은 PAGE4에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 138로 이루어지거나; (k) 암 관련 단백질은 PRAME에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 140으로 이루어지거나; (l) 암 관련 단백질은 PSA에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 142로 이루어지거나; (m) 암 관련 단백질은 PSMA에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 144로 이루어지거나; (n) 암 관련 단백질은 RNF43에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 146으로 이루어지거나; (o) 암 관련 단백질은 SART3에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 148로 이루어지거나; (p) 암 관련 단백질은 SSX2에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 150으로 이루어지거나; (q) 암 관련 단백질은 STEAP1에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 152 및 154 중 어느 하나로 이루어지거나; 또는 (r) 암 관련 단백질은 SURVIVIN에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 156 및 158 중 어느 하나로 이루어진다.
36. 구체예 29-35 중 어느 하나의 재조합 리스테리아 균주로서, 단편은 다음 HLA 유형: HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상에 결합한다.
37. 구체예 29-36 중 어느 하나의 재조합 리스테리아 균주로서, PEST-함유 펩타이드는 박테리아 분비 신호 서열을 포함하고, 융합 폴리펩타이드는 단편에 융합된 유비퀴틴 단백질을 추가로 포함하며, PEST-함유 펩타이드, 유비퀴틴, 및 카르복시-말단 항원성 펩타이드는 융합 폴리펩타이드의 아미노-말단 단부로부터 카르복시-말단 단부로 나란히 배열된다.
38. 구체예 29-37 중 어느 하나의 재조합 리스테리아 균주로서, 융합 폴리펩타이드는 암 관련 단백질의 둘 이상의 면역원성 단편에 융합된 PEST-함유 펩타이드를 포함하고, 둘 이상의 단편의 각각은 불규칙변화성 돌연변이를 포함한다.
39. 구체예 38의 재조합 리스테리아 균주로서, 둘 이상의 면역원성 단편은 개재 서열 없이 서로에 대해 직접적으로 융합된다.
40. 구체예 38의 재조합 리스테리아 균주로서, 둘 이상의 면역원성 단편은 펩타이드 링커를 통해 서로에 결합된다.
41. 구체예 40의 재조합 리스테리아 균주로서, SEQ ID NO: 209-217에 제시된 링커 중 하나 이상이 둘 이상의 면역원성 단편을 결합시키기 위해 사용된다.
42. 구체예 38-41 중 어느 하나의 재조합 리스테리아 균주로서, 융합 폴리펩타이드에서 둘 이상의 면역원성 단편의 조합은 다음 HLA 유형: HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02의 각각에 결합한다.
43. 구체예 38-42 중 어느 하나의 재조합 리스테리아 균주로서, 둘 이상의 면역원성 단편은: (a) 표 3에 제시된 펩타이드의 둘 이상; (b) 표 5에 제시된 펩타이드의 둘 이상; (c) 표 7에 제시된 펩타이드의 둘 이상; (d) 표 9에 제시된 펩타이드의 둘 이상; (e) 표 11에 제시된 펩타이드의 둘 이상; (f) 표 13에 제시된 펩타이드의 둘 이상; (g) 표 15에 제시된 펩타이드의 둘 이상; (h) 표 17에 제시된 펩타이드의 둘 이상; (i) 표 19에 제시된 펩타이드의 둘 이상; 또는 (j) 표 21에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 포함한다.
44. 구체예 43의 재조합 리스테리아 균주로서, 둘 이상의 면역원성 단편은: (a) 표 3에 제시된 모든 펩타이드; (b) 표 5에 제시된 모든 펩타이드; (c) 표 7에 제시된 모든 펩타이드; (d) 표 9에 제시된 모든 펩타이드; (e) 표 11에 제시된 모든 펩타이드; (f) 표 13에 제시된 모든 펩타이드; (g) 표 15에 제시된 모든 펩타이드; (h) 표 17에 제시된 모든 펩타이드; (i) 표 19에 제시된 모든 펩타이드; 또는 (j) 표 21에 제시된 모든 펩타이드를 포함한다.
45. 구체예 29-44 중 어느 하나의 재조합 리스테리아 균주로서, PEST-함유 펩타이드는 융합 폴리펩타이드의 N-말단 단부 상에 있다.
46. 구체예 45의 재조합 리스테리아 균주로서, PEST-함유 펩타이드는 LLO의 N-말단 단편이다.
47. 구체예 46의 재조합 리스테리아 균주로서, LLO의 N-말단 단편은 SEQ ID NO: 59에 제시된 서열을 가진다.
48. 구체예 29-47 중 어느 하나의 재조합 리스테리아 균주로서, 핵산은 에피솜성 플라스미드이다.
49. 구체예 29-48 중 어느 하나의 재조합 리스테리아 균주로서, 핵산은 재조합 리스테리아 균주에 대해 항생물질 내성을 부여하지 못한다.
50. 구체예 29-49 중 어느 하나의 재조합 리스테리아 균주로서, 재조합 리스테리아 균주는 약독화된, 영양요구성 리스테리아 균주이다.
51. 구체예 50의 재조합 리스테리아 균주로서, 약독화된, 영양요구성 리스테리아 균주는 하나 이상의 내인성 유전자를 비활성화하는 하나 이상의 내인성 유전자에서의 돌연변이를 포함한다.
52. 구체예 51의 재조합 리스테리아 균주로서, 하나 이상의 내인성 유전자는 actA, dal, 및 dat를 포함한다.
53. 구체예 29-52 중 어느 하나의 재조합 리스테리아 균주로서, 핵산은 대사 효소를 암호화하는 제2 오픈 리딩 프레임을 포함한다.
54. 구체예 53의 재조합 리스테리아 균주로서, 대사 효소는 알라닌 라세마제 효소 또는 D-아미노산 아미노트랜스퍼라제 효소이다.
55. 구체예 29-54 중 어느 하나의 재조합 리스테리아 균주로서, 융합 폴리펩타이드는 hly 프로모터로부터 발현된다.
56. 구체예 29-55 중 어느 하나의 재조합 리스테리아 균주로서, 재조합 리스테리아 균주는 재조합 리스테리아 모노사이토게네스 균주이다.
57. 구체예 29-56 중 어느 하나의 재조합 리스테리아 균주로서, 재조합 리스테리아 균주는 actA, dal, 및 dat가 삭제되었거나 그것에 비활성화 돌연변이를 포함한 약독화된 리스테리아 모노사이토게네스 균주이고, 핵산은 에피솜성 플라스미드에 있으며 알라닌 라세마제 효소 또는 D-아미노산 아미노트랜스퍼라제 효소를 암호화하는 제2 오픈 리딩 프레임을 포함하고, 및 PEST-함유 펩타이드는 LLO의 N-말단 단편이다.
58. (a) 구체예 22-28 중 어느 하나의 재조합 박테리아 균주 또는 구체예 29-57 중 어느 하나의 재조합 리스테리아 균주; 및 (b) 보조제를 포함하는 면역원성 조성물.
59. 구체예 58의 면역원성 조성물로서, 보조제는 독성이 제거된 리스테리오리신 O (dtLLO), 과립구/대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 단백질, GM-CSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 분자, 사포닌 QS21, 모노포스포릴 지질 A, 또는 메틸화되지 않은 CpG-함유 올리고뉴클레오타이드를 포함한다.
60. 대상체에서 종양 또는 암에 대한 면역 반응을 유도 또는 증강시키는 방법으로서, 구체예 1-9 중 어느 하나의 분리된 펩타이드, 구체예 10-16 중 어느 하나의 핵산, 구체예 17-21 중 어느 하나의 제약학적 조성물, 구체예 22-28 중 어느 하나의 재조합 박테리아 균주, 구체예 29-57 중 어느 하나의 재조합 리스테리아 균주, 또는 구체예 58-59 중 어느 하나의 면역원성 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
61. 대상체에서 종양 또는 암을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 구체예 1-9 중 어느 하나의 분리된 펩타이드, 구체예 10-16 중 어느 하나의 핵산, 구체예 17-21 중 어느 하나의 제약학적 조성물, 구체예 22-28 중 어느 하나의 재조합 박테리아 균주, 구체예 29-57 중 어느 하나의 재조합 리스테리아 균주, 또는 구체예 58-59 중 어느 하나의 면역원성 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
62. 구체예 60 또는 61의 방법으로서, 암ㅇ,S 비-소세포 폐암, 전립선암, 췌장암, 방광암, 유방암, 자궁암, 난소암, 저등급 신경교종, 대장암, 또는 두경부암이다.
서열의 간략한 설명
첨부된 서열 목록에서 나열된 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 뉴클레오타이드 염기에 대한 표준 문자 약어, 및 아미노산에 대한 3문자 암호를 사용하여 제시된다. 뉴클레오타이드 서열은 서열의 5' 단부에서 시작하여 3' 단부로 정방향으로 진행하는 (즉, 각 라인의 왼쪽에서 오른쪽으로) 표준 관례를 따른다. 각각의 뉴클레오타이드 서열의 한 가닥만이 제시되지만, 나타난 가닥을 임의로 참조하여 상보적 가닥이 포함되는 것으로 이해된다. 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 제공될 때, 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 그것의 코돈 축퇴성 변이체가 또한 제공되는 것으로 이해된다. 아미노산 서열은 서열의 아미노 말단에서 시작하여 카르복시 말단으로 정방향으로 진행하는 (즉, 각 라인의 왼쪽에서 오른쪽으로) 표준 관례를 따른다.
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
실시예
실시예 1. 불규칙변화성 펩타이드의 설계를 위한 인실리코 방법론
암 관련 단백질로부터 유래된 불규칙변화성 펩타이드 (즉, 서열-최적화된 펩타이드)를 MHC 클래스 I 대립유전자에 의한 제공을 증가시키도록 설계하였다. 종양-관련 항원 유전자가 종양 조직에서 발현되지만, 정상적인, 건강한 조직에서 최소한으로 발현되는 유전자를 대표하기 때문에, 이들에 의해 발현된 펩타이드를 변경시킴으로써 불규칙변화성 펩타이드를 파생시켰다. 특히, 불규칙변화성 펩타이드를 암 정소 항원 또는 종양태아 항원으로부터 설계하였다 (즉, 종양-관련 항원으로부터 설계함). 암 정소 항원 (CTA)은 상이한 조직학적 기원의 인간 종양에서 발현되지만 남성 생식 세포를 제외한 정상 조직에서는 발현되지 않는 종양-관련 항원의 큰 패밀리이다. 암에서, 이들 발달상의 항원은 재발현될 수 있고 면역 활성화의 유전자좌로서 작용할 수 있다. 종양태아 항원 (OFA)은 전형적으로 태아 발달 중에만 존재하지만 특정 종류의 암을 가진 성인에게서 발견되는 단백질이다. CTA 및 OFA의 발현의 종양-한정 패턴은 그것을 종양-특이적 면역요법에 대한 이상적인 표적으로 만든다. 다중 OFA/CTA의 조합은 환자 포함범위를 최대화시킬 수 잇다. 대부분의 OFA/CTA 단백질은 종양발생에 중요한 역할을 하므로, 그것들을 표적화하는 것은 암 증식을 상당히 손상시킬 수 있다. 다중 OFA/CTA 펩타이드를 조합하는 것은 한 치료에서 표적 질환을 가진 잠재적으로 모든 환자에서 발현되는 다중 고결합력 표적을 제공한다.
불규칙변화성을 암 유형에서 최대 100% 발현되는 유전자로부터 북아메리카에서 가장 우세한 4개의 HLA에 대해 설계하였다. 선택된 HLA 유형은 A0201, A0301, A2402, 및 B0702를 포함하였고, 이것들은 북아메리카의 백인에서 각각 47.8%, 20.6%, 20.6%, 및 28.7%의 빈도를 가지며, 북아메리카의 아프리카계 미국인에서 16.8%, 23.8%, 8.9%, 및 16.0%의 빈도를 가진다. 이것은 환자당 적어도 하나의 펩타이드-MHC 조합의 확률을 증가시킨다. 불규칙변화성 서열은 T 세포 반응을 프라이밍하고, 중추 관용을 극복하며, 야생형 펩타이드에 대한 성공적인 교차 반응성 면역 반응을 이끌어내기에 충분한 것으로 나타났다. 불규칙변화성 에피토프의 조합은 암 유형 내에서의 총 환자 포함범위를 100%에 가까운 수준으로 가져올 수 있다. 그러므로 본 발명자들은 그것들이 본 발명자들이 가장 우세한 HLA (HLA-A0201, HLA-A0301, HLA-A2402, 및 HLA-B0702)를 커버하기 위해 그것에 대한 불규칙변화성 펩타이드를 설계했던 종양-관련 항원을 발현할 것으로 추정하기 때문에 치료 전에 환자의 서열분석을 할 필요가 없다.
잠재적인 종양-관련 항원 (TAA)의 후보 명단을 작성하기 위해 적응증-특이적 종양-관련 항원의 게놈 풍경을 조사하기 위한 문헌 검토를 실시하였다. 문헌으로부터 면역원성 정보를 가진 HLA-A0201에 대한 불규칙변화성 펩타이드를 선택하였다. HLA-A2402에 대한 불규칙변화성 펩타이드 또한 선택하였다.
후보 명단 TAA가 CD8+ T 림프구 반응을 생성하는 알려져 있는 면역원성 펩타이드를 함유하였는지를 규정하기 위하여 두 번째 문헌 검토를 실시하였다. 이 접근법은 주로 TAA로부터의 9개 아미노산 (9mer)으로 이루어진 MHC 클래스 I 에피토프에 집중되었다. 이 단계에서 4개의 HLA 유형 (HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02) 중 하나에 결합하는 9mer 포맷의 잠재적 종양-관련 항원 펩타이드 (TAAP)를 확인하였다.
TAAP를 MHC 클래스 I 분자 (달리 말하면 불규칙변화성 펩타이드)에 대한 결합을 증강시키기 위해 서열 최적화하였다. 각 HLA에 대한 결합을 최적화하기 위하여, 펩타이드 MHC 결합 모티프 및 아미노산 결합 챠트를 면역 에피토프 데이터베이스 및 분석 공급원 (예를 들어: iedb.org/MHCalelleid/143)으로부터 평가하였다. 앵커 위치에서 바람직한 아미노산을 TAAP 서열 (예컨대, NUF2 - 야생형: YMMPVNSEV (SEQ ID NO: 131); 및 NUF2 - 불규칙변화성: YLMPVNSEV (SEQ ID NO: 130))에 삽입하였다.
그런 후 서열-최적화된 TAAPs 및 야생형 TAAP 서열의 결합 친화도를 다음 알고리즘 중 하나를 사용하여 평가하였다: NetMHC4.0 서버; NetMHCpan4.0 서버; 및 mhcflurry v0.2.0.
만약 특정 HLA에 대한 예측 결합 친화도가 야생형 TAAP 서열과 동등하거나 그것보다 강력하다면 서열-최적화된 TAAP로 간주하였다.
그런 후 선택한 서열-최적화된 TAAP를 ProImmune의 REVEAL 검정을 사용하여 특정 HLA에 대한 시험관내 결합에 대해 스크리닝하였다. REVEAL 검정의 양성 대조군 펩타이드의 45% 이상의 결합 친화도를 가진 TAAP를 결합제로 간주하였다.
마지막으로, TAAP의 RNA 결합 수준을 TCGA RNAseqV2 데이터세트에서의 특정-적응증에서 측정하였다. 0보다 큰 표준화된 RNA 발현 판독을 가진 TCGA 샘플의 백분율을 계산하였다. 대부분의 샘플에서 TCGA 발현을 가진 TAAP를 우선시하였다.
각각의 불규칙변화성 항원성 펩타이드는 단일 불규칙변화성 돌연변이를 포함하거나 또는 둘 이상의 불규칙변화성 돌연변이 (예컨대, 2개의 불규칙변화성 돌연변이)를 포함할 수 있다. 예시의 불규칙변화성 돌연변이 펩타이드는 상응하는 야생형 (천연) 펩타이드과 함께 다음 표에서 제공한다. 상응하는 불규칙변화성 펩타이드에서 변형된 야생형 펩타이드의 잔기는 진하고 밑줄로 표시한다.
불규칙변화성 항원성 펩타이드 및 상응하는 천연 펩타이드.
펩타이드
(GENE_HLA 유형) 		불규칙변화성 펩타이드 천연 펩타이드
CEACAM5_A0201 ILIGVLVGV (SEQ ID NO: 100) I M IGVLVGV (SEQ ID NO: 101)
CEACAM5_A0201 ILMGVLVGV (SEQ ID NO: 102) I MI GVLVGV (SEQ ID NO: 103)
CEACAM5_A0301 HVFGYSWYK (SEQ ID NO: 104) H L FGYSWYK (SEQ ID NO: 105)
CEACAM5_A2402 IYPNASLLF (SEQ ID NO: 106) IYPNASLL I (SEQ ID NO: 107)
CEACAM5_B0702 IPQVHTQVL (SEQ ID NO: 108) IPQ Q HTQVL (SEQ ID NO: 109)
GAGE1_A0301 SLYYWPRPR (SEQ ID NO: 110) S T YYWPRPR (SEQ ID NO: 111)
GAGE1_B0702 WPRPRRYVM (SEQ ID NO: 112) WPRPRRYV Q (SEQ ID NO: 113)
hTERT_A0201_A2402 IMAKFLHWL (SEQ ID NO: 114) I L AKFLHWL (SEQ ID NO: 115)
KLHL7_A2402 VYILGGSQF (SEQ ID NO: 116) VYILGGSQ L (SEQ ID NO: 117)
MAGEA3_A0201_A2402 KVPEIVHFL (SEQ ID NO: 118) KV A ELVHFL (SEQ ID NO: 119)
MAGEA3_A0301 YMFPVIFSK (SEQ ID NO: 120) Y F FPVIFSK (SEQ ID NO: 121)
MAGEA3_A2402 IMPKAGLLF (SEQ ID NO: 122) IMPKAGLLF I (SEQ ID NO: 123)
MAGEA3_B0702 LPWTMNYPL (SEQ ID NO: 124) LP T TMNYPL (SEQ ID NO: 125)
MAGEA4_B0702 MPSLREAAL (SEQ ID NO: 126) Y PSLREAAL (SEQ ID NO: 127)
MAGEA6_A0301 YLFPVIFSK (SEQ ID NO: 128) Y F FPVIFSK (SEQ ID NO: 129)
NUF2_A0201 YLMPVNSEV (SEQ ID NO: 130) Y M MPVNSEV (SEQ ID NO: 131)
NUF2_A2402 VWGIRLEHF (SEQ ID NO: 132) V Y GIRLEHF (SEQ ID NO: 133)
NYESO1_A0201 RLLEFYLAV (SEQ ID NO: 134) RLLEFYLA M (SEQ ID NO: 135)
NYESO1_B0702 APRGPHGGM (SEQ ID NO: 136) APRGPHGG A (SEQ ID NO: 137)
PAGE4_A0201 MAPDVVAFV (SEQ ID NO: 138) E APDVVAFV (SEQ ID NO: 139)
PRAME_A0201 NMTHVLYPL (SEQ ID NO: 140) N L THVLYP V (SEQ ID NO: 141)
PSA_A0301 GMAPLILSR (SEQ ID NO: 142) G A APLILSR (SEQ ID NO: 143)
PSMA_A2402 TYSVSFFSW (SEQ ID NO: 144) TYSVSF D S L (SEQ ID NO: 145)
RNF43_B0702 NPQPVWLCL (SEQ ID NO: 146) N S QPVWLCL (SEQ ID NO: 147)
SART3_A0201 LMQAEAPRL (SEQ ID NO: 148) L L QAEAPRL (SEQ ID NO: 149)
SSX2_A0201 RLQGISPKV (SEQ ID NO: 150) RLQGISPK I (SEQ ID NO: 151)
STEAP1_A0201 LLLGTIHAV (SEQ ID NO: 152) LLLGTIHA L (SEQ ID NO: 153)
STEAP1_A2402 KYKKFPWWL (SEQ ID NO: 154) KYKKFP H WL (SEQ ID NO: 155)
SURVIVIN_A0201 KMSSGCAFL (SEQ ID NO: 156) K H SSGCAFL (SEQ ID NO: 157)
SURVIVIN_A2402 SWFKNWPFF (SEQ ID NO: 158) S T FKNWPF L (SEQ ID NO: 159)
실시예 2. 불규칙변화성 펩타이드의 설계 및 결합 친화도
몇몇 암 유형을 그것에 대해 불규칙변화성 면역원성 펩타이드 (서열-최적화된 종양-관련 항원 펩타이드)를 발생시키기 위해 선택하였다. 이것들은 비-소세포 폐암, 전립선암, 췌장암, 방광암, 유방암 (예컨대, ER+ 유방암), 자궁암, 난소암, 저등급 신경교종, 대장암 (예컨대, MSS 대장암), 및 두경부암을 포함한다. 표 2는 각 유형의 암에 대해 펩타이드를 유래한 종양-관련 유전자의 요약이다. 마지막 열은 그 적응증에 대해 The Cancer Genome Atlas (TCGA) 환자의 적어도 90%에서 발현된 이전의 열에 있는 종양-관련 항원 (예컨대, CTA/OFA) 유전자의 수를 나타낸다. 예를 들어 NSCLC 환자의 90% 이상에서 3개의 TAA 유전자가 발현되었다. TAA 유전자의 나머지는 TCGA NSCLC 환자 집단의 90% 미만에서 발현되었다.
불규칙변화성 펩타이드가 유래되는 종양-관련 유전자의 요약.
질환 서열-최적화된 종양-관련 항원 (TAA) 펩타이드
(예컨대, CTA/OFA 유전자) 		환자의 90% 이상에서 발현된 TAA 유전자의 수
NSCLC CEACAM5, MAGE-A6, NY-ESO1, MAGE-A3, MAGE-A4, GAGE1 3
전립선 PSA, PSMA, STEAP1, SART3, TARP, PAGE-4, SSX2, MAGE-A4 7
유방 (ER+) STEAP1, RNF53, CEACAM5, PRAME, TERT, MAGE-A3 4
CRC (MSS) CEACAM5, MAGE-A6, MAGE-A3, MAGE-A4, NY-ESO1, GAGE1 2
두경부 CEACAM5, STEAP1, TERT, PRAME, MAGE-A4, NY-ESO1 4
췌장 STEAP1, SURVIVN, CEACAM5, PRAME, TERT, MAGE-A3 3
방광 NUF2, KLHL7, MAGE-A3, NY-ESO1, GAGE1 4
난소 STEAP1, RNF43, SART3, KLHL7, NUF2, PRAME, TERT, CEACAM5, MAGE-A6 6
신경교 KLHL7, NUF2, RNF43, SART3, STEAP1, TERT, MAGE-A6, CEACAM5 4
자궁 STEAP1, RNF43, SART3, KLHL7, NUF2, PRAME, TERT, CEACAM5, MAGE-A6 4
비-소세포 폐암 (NSCLC) 불규칙변화성 펩타이드
7개의 유전자에 걸쳐 불규칙변화성 돌연변이를 가진 총 11개의 펩타이드를 NSCLC 불규칙변화성 펩타이드에 대해 선택하였다. 각각의 불규칙변화성 돌연변이에 대해, 길이가 9개 아미노산인 펩타이드를 실시예 1 및 본원의 다른 곳에서 기술한 것과 같이 설계하였다. 펩타이드를 표 3에 나타낸다. 각각의 불규칙변화성 돌연변이는 표 1에서 나타낸 것과 같다.
예시의 NSCLC 불규칙변화성 9-Mer.
NSCLC 불규칙변화성 9-Mer
유전자 HLA 유형 서열 SEQ ID NO 대표적인 핵산 SEQ ID NO
CEACAM5 A0301 HVFGYSWYK 104 223-241
MAGEA6 A0301 YLFPVIFSK 128 242-260
CEACAM5 B0702 IPQVHTQVL 108 261-279
MAGEA4 B0702 MPSLREAAL 126 280-298
GAGE1 B0702 WPRPRRYVM 112 299-317
CEACAM5 A2402 IYPNASLLF 106 318-336
NYESO1 A0201 RLLEFYLAV 134 337-355
CEACAM5 A0201 ILIGVLVGV 100 356-374
STEAP1 A0201 LLLGTIHAV 152 969
STEAP1 A2402 KYKKFPWWL 154 970
RNF43 B0702 NPQPVWLCL 146 971
불규칙변화성 9-mer 펩타이드의 인실리코 예측 결합 친화도 및 시험관내 결합 친화도를 표 4에 제고한다. 인실리코 예측 결합 친화도는 NetMHC4.0 알고리즘을 토대로 하는데, 그것은 50% 억제 농도(IC50) 값 (nM)의 면에서 MHC 클래스 I 분자에 대한 펩타이드 결합을 예측하고; 더 낮은 숫자는 더 강력한 예측 결합 친화도를 반영한다. 시험관내 결합 친화도를 표시된 MHC 클래스 I 대립유전자에 결합하고 MHC-펩타이드 복합체를 안정화시키는 각 후보 펩타이드의 능력을, 그 결합을 높은 친화도 T 세포 에피토프의 결합과 비교함으로써 규정하는 결합 검정을 통해 측정하였다. 간단히 설명하면, 각 펩타이드를 그것의 특이적 HLA 분자와 함께 시험관내 검정에서 인큐베이션한다. 결합 강도를 양성 대조군 결합 점수를 100%로 설정하고 양성 대조군으로서 동일한 HLA 분자에 대해 공지된, 면역원성 펩타이드에 대해 비교한다. 서열-최적화된 결합 점수를 대조군 펩타이드에 대해 표준화한다. 즉, 각각의 펩타이드에 매우 강력한 결합 특성을 가진 공지된 T 세포 에피토프인 양성 대조군 펩타이드에 관련한 점수를 주었다. 불규칙변화성 테스트 펩타이드의 점수를 양성 대조군 펩타이드에 의해 생성된 신호의 백분율로서 정량적으로 기록한다. 양성 대조군의 45% 이상의 점수를 가진 펩타이드를 결합제로서 간주한다. 또한 표 4에 테스트되는 HLA 대립유전자인 NSCLC (The Cancer Genome Atlas (TCGA) 데이터베이스)를 가진 환자에서의 각 유전자의 퍼센트 발현, 및 각각의 불규칙변화성 펩타이드에 상응하는 야생형 펩타이드가 면역원성인 것으로 알려져 있는지의 여부가 제공된다. 표 4의 각각의 불규칙변화성 펩타이드를 포함하는 구성물에 대해, HLA 유형 A*02:01을 가진 NSCLC 환자의 100%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현하고, HLA 유형 A*03:01을 가진 NSCLC 환자의 100%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현하며, HLA 유형 A*24:02를 가진 NSCLC 환자의 100%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현하고, HLA 유형 B*07:02를 가진 NSCLC 환자의 100%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현한다.
불규칙변화성 9-Mer의 HLA에 대한 결합 친화도.
TAA 유전자 TCGA에서의 % 발현 HLA
대립유전자 		인실리코 예측 결합 친화도 IC50 # 시험관내 결합 친화도 ^ 야생형 펩타이드 면역원성?
CEACAM5 100 A*02:01 6.92 170.7 예
CEACAM5 100 A*24:02 6.22 77.2 예
CEACAM5 100 A*03:01 9.69 85.4 예
CEACAM5 100 B*07:02 8.36 88.3 예
STEAP1 100 A*02:01 5.77 188.4 예
STEAP1 100 A*24:02 47.48 104.7 모름
RNF43 100 B*07:02 161.95 65.4 예
MAGE-A6 53 A*03:01 12.83 103.7 모름
NY-ESO1 50 A*02:01 4.61 212.9 모름
MAGE-A4 35 B*07:02 7.67 49.5 모름
GAGE1 10 B*07:02 2.58 58.5 모름
추가적인 불규칙변화성 9-Mer
MAGE-A3 & 50 A*02:01 50.31 168.7 예
MAGE-A3 & 50 A*24:02 2966 102.4 모름
# - NetMHC4.0
^ - 양성 대조군 펩타이드 결합에 관련한 %
& - SEQ ID NO: 118
구성물을 하나 이상의 불규칙변화성 펩타이드에 융합된 tLLO를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 암호화하도록 설계하였고, 이때 C-말단 불규칙변화성 펩타이드는 유비퀴틴 펩타이드 뒤에 있다 (즉, 불규칙변화성 펩타이드 및 "미니유전자"). 융합 폴리펩타이드의 tLLO, 불규칙변화성 펩타이드, 및 유비퀴틴/불규칙변화성 펩타이드 구성요소를 본원의 다른 곳에서 개시된 링커들로부터 선택된 다양한 링커에 의해 연결하였다. 예시의 융합 폴리펩타이드 삽입 서열 (즉, tLLO의 하류에 있는 펩타이드 서열)은 NSCLC HC + MG (SEQ ID NO: 218)이다. NSCLC HC + MG를 암호화하는 예시의 핵산은 SEQ ID NO: 220에 제시된다.
구성물을 또한 임의의 유비퀴틴 펩타이드 없이 하나 이상의 불규칙변화성 펩타이드에 융합된 tLLO를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 암호화하도록 설계하였다 (즉, "미니유전자" 없는 불규칙변화성 펩타이드). 융합 폴리펩타이드의 tLLO 및 불규칙변화성 펩타이드 구성요소를 본원의 다른 곳에서 개시된 링커들로부터 선택된 다양한 링커에 의해 연결하였다. 예시의 융합 폴리펩타이드 삽입 서열 (즉, tLLO의 하류에 있는 펩타이드 서열)은 NSCLC HC 단독 (SEQ ID NO: 219)이다. NSCLC HC 단독을 암호화하는 예시의 핵산은 SEQ ID NO: 221 및 222에 제시된다.
각각의 구성물에서 개별적인 구성요소의 아미노산 위치의 붕괴가 하기에 제공된다.
Figure pct00013
Figure pct00014
전립선암 불규칙변화성 펩타이드
9개의 유전자에 걸친 불규칙변화성 돌연변이를 가진 총 10개의 펩타이드를 전립선암 불규칙변화성 펩타이드에 대해 선택하였다. 각각의 불규칙변화성 돌연변이에 대해, 길이가 9개 아미노산의 펩타이드를 실시예 1 및 본원의 다른 곳에서 기술된 것과 같이 설계하였다. 펩타이드를 표 5에 나타낸다. 각각의 불규칙변화성 돌연변이는 표 1에서 기술된 것과 같다.
예시의 전립선암 불규칙변화성 9-Mer.
전립선암 불규칙변화성 9-Mer
유전자 HLA 유형 서열 SEQ ID NO 대표적인 핵산 SEQ ID NO
CEACAM5 B0702 IPQVHTQVL 108 972
MAGEA4 B0702 MPSLREAAL 126 375-392
STEAP1 A0201 LLLGTIHAV 152 393-410
STEAP1 A2402 KYKKFPWWL 154 411-428
RNF43 B0702 NPQPVWLCL 146 973
SSX2 A0201 RLQGISPKV 150 429-446
SART3 A0201 LMQAEAPRL 148 447-464
PAGE4 A0201 MAPDVVAFV 138 465-482
PSMA A2402 TYSVSFFSW 144 483-500
PSA A0301 GMAPLILSR 142 501-518
불규칙변화성 9-mer 펩타이드의 인실리코 예측 결합 친화도 및 시험관내 결합 친화도를 표 6에 나타낸다. 인실리코 예측 결합 친화도는 NetMHC4.0 알고리즘을 토대로 하며, 이것은 50% 억제 농도 (IC50) 값 (nM)의 면에서 MHC 클래스 I 분자에 대한 펩타이드 결합을 예측하고; 더 낮은 숫자는 더 강력한 예측 결합 친화도를 반영한다. 시험관내 결합 친화도를 표시된 MHC 클래스 I 대립유전자에 결합하고 MHC-펩타이드 복합체를 안정화시키는 각 후보 펩타이드의 능력을, 그 결합을 높은 친화도 T 세포 에피토프의 결합과 비교함으로써 규정하는 결합 검정을 통해 측정하였다. 간단히 설명하면, 각 펩타이드를 그것의 특이적 HLA 분자와 함께 시험관내 검정에서 인큐베이션한다. 결합 강도를 양성 대조군 결합 점수를 100%로 설정하고 양성 대조군으로서 동일한 HLA 분자에 대해 공지된, 면역원성 펩타이드에 대해 비교한다. 서열-최적화된 결합 점수를 대조군 펩타이드에 대해 표준화한다. 즉, 각각의 펩타이드에 매우 강력한 결합 특성을 가진 공지된 T 세포 에피토프인 양성 대조군 펩타이드에 관련한 점수를 주었다. 불규칙변화성 테스트 펩타이드의 점수를 양성 대조군 펩타이드에 의해 생성된 신호의 백분율로서 정량적으로 기록한다. 양성 대조군의 45% 이상의 점수를 가진 펩타이드를 결합제로서 간주한다. 또한 표 6에 테스트되는 HLA 대립유전자인 전립선암 (The Cancer Genome Atlas 데이터베이스)을 가진 환자에서의 각 유전자의 퍼센트 발현, 및 각각의 불규칙변화성 펩타이드에 상응하는 야생형 펩타이드가 면역원성인 것으로 알려져 있는지의 여부가 제공된다. 표 6의 각각의 불규칙변화성 펩타이드를 포함하는 구성물에 대해, HLA 유형 A*02:01을 가진 전립선암 환자의 100%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현하고, HLA 유형 A*03:01을 가진 전립선암 환자의 100%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현하며, HLA 유형 A*24:02를 가진 전립선암 환자의 100%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현하고, HLA 유형 B*07:02를 가진 전립선암 환자의 100%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현한다.
불규칙변화성 9-Mer의 HLA에 대한 결합 친화도.
TAA 유전자 TCGA에서의 % 발현 HLA
대립유전자 		인실리코 예측 결합 친화도 IC50 # 시험관내 결합 친화도 ^ 야생형 펩타이드 면역원성?
PSA 100 A*03:01 179.39 103.5 예
PSMA 100 A*24:02 20.45 96.2 예
STEAP1 100 A*02:01 5.77 188.4 예
STEAP1 100 A*24:02 47.48 104.7 모름
SART3 100 A*02:01 235.57 160.0 예
RNF43 100 B*07:02 161.95 65.4 예
PAGE4 99 A*02:01 39.32 126.6 모름
CEACAM5 95 B*07:02 8.36 88.3 예
SSX2 13 A*02:01 31.02 179.5 예
MAGE-A4 6 B*07:02 7.67 49.5 모름
# - NetMHC4.0
^ - 양성 대조군 펩타이드 결합에 관련한 %
췌장암 불규칙변화성 펩타이드
6개의 유전자에 걸친 불규칙변화성 돌연변이를 가진 총 12개의 펩타이드를 췌장암 불규칙변화성 펩타이드에 대해 선택하였다. 각각의 불규칙변화성 돌연변이에 대해, 길이가 9개 아미노산의 펩타이드를 실시예 1 및 본원의 다른 곳에서 기술된 것과 같이 설계하였다. 펩타이드를 표 7에 나타낸다. 각각의 불규칙변화성 돌연변이는 표 1에서 기술된 것과 같다.
예시의 췌장암 불규칙변화성 9-Mer.
췌장암 불규칙변화성 9-MER
유전자 HLA 유형 서열 SEQ ID NO 대표적인 핵산 SEQ ID NO
CEACAM5 A0301 HVFGYSWYK 104 809-818
CEACAM5 B0702 IPQVHTQVL 108 819-828
CEACAM5 A2402 IYPNASLLF 106 829-838
CEACAM5 A0201 ILIGVLVGV 100 839-848
STEAP1 A0201 LLLGTIHAV 152 849-858
STEAP1 A2402 KYKKFPWWL 154 859-868
MAGEA3 A0301 YMFPVIFSK 120 869-878
PRAME A0201 NMTHVLYPL 140 879-888
hTERT A0201_A2402 IMAKFLHWL 114 889-898
MAGEA3 A0201_A2402 KVPEIVHFL 118 899-908
SURVIVIN A0201 KMSSGCAFL 156 909-918
SURVIVIN A2402 SWFKNWPFF 158 919-928
불규칙변화성 9-mer 펩타이드의 인실리코 예측 결합 친화도 및 시험관내 결합 친화도를 표 8에 나타낸다. 인실리코 예측 결합 친화도는 NetMHC4.0 알고리즘을 토대로 하며, 이것은 50% 억제 농도 (IC50) 값 (nM)의 면에서 MHC 클래스 I 분자에 대한 펩타이드 결합을 예측하고; 더 낮은 숫자는 더 강력한 예측 결합 친화도를 반영한다. 시험관내 결합 친화도를 표시된 MHC 클래스 I 대립유전자에 결합하고 MHC-펩타이드 복합체를 안정화시키는 각 후보 펩타이드의 능력을, 그 결합을 높은 친화도 T 세포 에피토프의 결합과 비교함으로써 규정하는 결합 검정을 통해 측정하였다. 간단히 설명하면, 각 펩타이드를 그것의 특이적 HLA 분자와 함께 시험관내 검정에서 인큐베이션한다. 결합 강도를 양성 대조군 결합 점수를 100%로 설정하고 양성 대조군으로서 동일한 HLA 분자에 대해 공지된, 면역원성 펩타이드에 대해 비교한다. 서열-최적화된 결합 점수를 대조군 펩타이드에 대해 표준화한다. 즉, 각각의 펩타이드에 매우 강력한 결합 특성을 가진 공지된 T 세포 에피토프인 양성 대조군 펩타이드에 관련한 점수를 주었다. 불규칙변화성 테스트 펩타이드의 점수를 양성 대조군 펩타이드에 의해 생성된 신호의 백분율로서 정량적으로 기록한다. 양성 대조군의 45% 이상의 점수를 가진 펩타이드를 결합제로서 간주한다. 또한 표 8에 테스트되는 HLA 대립유전자인 췌장암 (The Cancer Genome Atlas 데이터베이스)을 가진 환자에서의 각 유전자의 퍼센트 발현, 및 각각의 불규칙변화성 펩타이드에 상응하는 야생형 펩타이드가 면역원성인 것으로 알려져 있는지의 여부가 제공된다. 표 8의 각각의 불규칙변화성 펩타이드를 포함하는 구성물에 대해, HLA 유형 A*02:01을 가진 췌장암 환자의 100%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현하고, HLA 유형 A*03:01을 가진 췌장암 환자의 98%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현하며, HLA 유형 A*24:02를 가진 췌장암 환자의 100%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현하고, HLA 유형 B*07:02를 가진 췌장암 환자의 98%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현한다.
불규칙변화성 9-Mer의 HLA에 대한 결합 친화도.
TAA 유전자 TCGA에서의 % 발현 HLA
대립유전자 		인실리코 예측 결합 친화도 IC50 # 시험관내 결합 친화도 ^ 야생형 펩타이드 면역원성?
STEAP1 100 A*02:01 5.77 188.4 예
STEAP1 100 A*24:02 47.48 104.7 모름
SURVIVIN 100 A*02:01 11.66 149.0 예
SURVIVIN 100 A*24:02 12.86 144.0 예
CEACAM5 98 A*02:01 6.92 170.7 예
CEACAM5 98 A*03:01 9.69 85.4 예
CEACAM5 98 B*07:02 8.36 88.3 예
CEACAM5 98 A*24:02 6.22 77.2 예
PRAME 87 A*02:01 11.72 139.4 예
TERT 80 A*02:01 7.04 123.3 예
TERT 80 A*24:02 2197.84 142.3 모름
MAGE-A3 11 A*02:01 50.31 168.7 예
MAGE-A3 11 A*24:02 2966 102.4 모름
MAGE-A3 11 A*03:01 9.40 85.4 모름
# - NetMHC4.0
^ - 양성 대조군 펩타이드 결합에 관련한 %
방광암 불규칙변화성 펩타이드
8개의 유전자에 걸친 불규칙변화성 돌연변이를 가진 총 14개의 펩타이드를 방광암 불규칙변화성 펩타이드에 대해 선택하였다. 각각의 불규칙변화성 돌연변이에 대해, 길이가 9개 아미노산의 펩타이드를 실시예 1 및 본원의 다른 곳에서 기술된 것과 같이 설계하였다. 펩타이드를 표 9에 나타낸다. 각각의 불규칙변화성 돌연변이는 표 1에서 기술된 것과 같다.
예시의 방광암 불규칙변화성 9-Mer.
방광암 불규칙변화성 9-Mer
유전자 HLA 유형 서열 SEQ ID NO 대표적인 핵산 SEQ ID NO
CEACAM5 A0301 HVFGYSWYK 104 974
GAGE1 B0702 WPRPRRYVM 112 519-536
NYESO1 A0201 RLLEFYLAV 134 537-554
CEACAM5 A0201 ILIGVLVGV 100 975
RNF43 B0702 NPQPVWLCL 146 976
NUF2 A0201 YLMPVNSEV 130 555-572
NUF2 A2402 VWGIRLEHF 132 573-590
KLHL7 A2402 VYILGGSQF 116 591-608
MAGEA3 A2402 IMPKAGLLF 112 609-626
GAGE1 A0301 SLYYWPRPR 110 627-644
MAGEA3 A0301 YMFPVIFSK 120 645-662
NYESO1 B0702 APRGPHGGM 136 663-680
MAGEA3 B0702 LPWTMNYPL 124 681-698
PRAME A0201 NMTHVLYPL 140 977
불규칙변화성 9-mer 펩타이드의 인실리코 예측 결합 친화도 및 시험관내 결합 친화도를 표 10에 나타낸다. 인실리코 예측 결합 친화도는 NetMHC4.0 알고리즘을 토대로 하며, 이것은 50% 억제 농도 (IC50) 값 (nM)의 면에서 MHC 클래스 I 분자에 대한 펩타이드 결합을 예측하고; 더 낮은 숫자는 더 강력한 예측 결합 친화도를 반영한다. 시험관내 결합 친화도를 표시된 MHC 클래스 I 대립유전자에 결합하고 MHC-펩타이드 복합체를 안정화시키는 각 후보 펩타이드의 능력을, 그 결합을 높은 친화도 T 세포 에피토프의 결합과 비교함으로써 규정하는 결합 검정을 통해 측정하였다. 간단히 설명하면, 각 펩타이드를 그것의 특이적 HLA 분자와 함께 시험관내 검정에서 인큐베이션한다. 결합 강도를 양성 대조군 결합 점수를 100%로 설정하고 양성 대조군으로서 동일한 HLA 분자에 대해 공지된, 면역원성 펩타이드에 대해 비교한다. 서열-최적화된 결합 점수를 대조군 펩타이드에 대해 표준화한다. 즉, 각각의 펩타이드에 매우 강력한 결합 특성을 가진 공지된 T 세포 에피토프인 양성 대조군 펩타이드에 관련한 점수를 주었다. 불규칙변화성 테스트 펩타이드의 점수를 양성 대조군 펩타이드에 의해 생성된 신호의 백분율로서 정량적으로 기록한다. 양성 대조군의 45% 이상의 점수를 가진 펩타이드를 결합제로서 간주한다. 또한 표 10에 테스트되는 HLA 대립유전자인 방광암 (The Cancer Genome Atlas 데이터베이스)을 가진 환자에서의 각 유전자의 퍼센트 발현, 및 각각의 불규칙변화성 펩타이드에 상응하는 야생형 펩타이드가 면역원성인 것으로 알려져 있는지의 여부가 제공된다. 표 10의 각각의 불규칙변화성 펩타이드를 포함하는 구성물에 대해, HLA 유형 A*02:01을 가진 방광암 환자의 100%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현하고, HLA 유형 A*03:01을 가진 방광암 환자의 100%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현하며, HLA 유형 A*24:02를 가진 방광암 환자의 100%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현하고, HLA 유형 B*07:02를 가진 방광암 환자의 100%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현한다.
불규칙변화성 9-Mer의 HLA에 대한 결합 친화도.
TAA 유전자 TCGA에서의 % 발현 HLA
대립유전자 		인실리코 예측 결합 친화도 IC50 # 시험관내 결합 친화도 ^ 야생형 펩타이드 면역원성?
NUF2 100 A*02:01 2.79 160.0 예
NUF2 100 A*24:02 149.07 88.4 모름
KLHL7 100 A*24:02 60.84 97.4 예
RNF43 99 B*07:02 161.95 65.4 예
CEACAM5 93 A*02:01 6.92 170.7 예
CEACAM5 93 A*03:01 9.69 85.4 예
PRAME 77 A*02:01 11.72 139.4 예
MAGE-A3 72 B*07:02 12.52 112.2 모름
MAGE-A3 72 A*24:02 28.11 92.8 모름
MAGE-A3 72 A*03:01 9.40 86.9 모름
NY-ESO1 58 A*02:01 4.61 212.9 모름
NY-ESO1 58 B*07:02 3.32 109.7 모름
GAGE1 14 B*07:02 2.58 58.5 모름
GAGE1 14 A*03:01 60.49 93.1 모름
# - NetMHC4.0
^ - 양성 대조군 펩타이드 결합에 관련한 %
유방암 불규칙변화성 펩타이드
6개의 유전자에 걸친 불규칙변화성 돌연변이를 가진 총 11개의 펩타이드를 유방암 불규칙변화성 펩타이드에 대해 선택하였다. 각각의 불규칙변화성 돌연변이에 대해, 길이가 9개 아미노산의 펩타이드를 실시예 1 및 본원의 다른 곳에서 기술된 것과 같이 설계하였다. 펩타이드를 표 11에 나타낸다. 각각의 불규칙변화성 돌연변이는 표 1에서 기술된 것과 같다.
예시의 유방암 불규칙변화성 9-Mer.
유방암 불규칙변화성 9-MER
유전자 HLA 유형 서열 SEQ ID NO 대표적인 핵산 SEQ ID NO
CEACAM5 A0301 HVFGYSWYK 104 699-708
CEACAM5 B0702 IPQVHTQVL 108 709-718
CEACAM5 A2402 IYPNASLLF 106 719-728
CEACAM5 A0201 ILIGVLVGV 100 729-738
STEAP1 A0201 LLLGTIHAV 152 739-748
STEAP1 A2402 KYKKFPWWL 154 749-758
RNF43 B0702 NPQPVWLCL 146 759-768
MAGEA3 A2402 IMPKAGLLF 122 769-778
MAGEA3 A0301 YMFPVIFSK 120 779-788
PRAME A0201 NMTHVLYPL 140 789-798
hTERT A0201_A2402 IMAKFLHWL 114 799-808
불규칙변화성 9-mer 펩타이드의 인실리코 예측 결합 친화도 및 시험관내 결합 친화도를 표 12에 나타낸다. 인실리코 예측 결합 친화도는 NetMHC4.0 알고리즘을 토대로 하며, 이것은 50% 억제 농도 (IC50) 값 (nM)의 면에서 MHC 클래스 I 분자에 대한 펩타이드 결합을 예측하고; 더 낮은 숫자는 더 강력한 예측 결합 친화도를 반영한다. 시험관내 결합 친화도를 표시된 MHC 클래스 I 대립유전자에 결합하고 MHC-펩타이드 복합체를 안정화시키는 각 후보 펩타이드의 능력을, 그 결합을 높은 친화도 T 세포 에피토프의 결합과 비교함으로써 규정하는 결합 검정을 통해 측정하였다. 간단히 설명하면, 각 펩타이드를 그것의 특이적 HLA 분자와 함께 시험관내 검정에서 인큐베이션한다. 결합 강도를 양성 대조군 결합 점수를 100%로 설정하고 양성 대조군으로서 동일한 HLA 분자에 대해 공지된, 면역원성 펩타이드에 대해 비교한다. 서열-최적화된 결합 점수를 대조군 펩타이드에 대해 표준화한다. 즉, 각각의 펩타이드에 매우 강력한 결합 특성을 가진 공지된 T 세포 에피토프인 양성 대조군 펩타이드에 관련한 점수를 주었다. 불규칙변화성 테스트 펩타이드의 점수를 양성 대조군 펩타이드에 의해 생성된 신호의 백분율로서 정량적으로 기록한다. 양성 대조군의 45% 이상의 점수를 가진 펩타이드를 결합제로서 간주한다. 또한 표 12에 테스트되는 HLA 대립유전자인 유방암 (The Cancer Genome Atlas 데이터베이스)을 가진 환자에서의 각 유전자의 퍼센트 발현, 및 각각의 불규칙변화성 펩타이드에 상응하는 야생형 펩타이드가 면역원성인 것으로 알려져 있는지의 여부가 제공된다. 표 12의 각각의 불규칙변화성 펩타이드를 포함하는 구성물에 대해, HLA 유형 A*02:01을 가진 유방암 환자의 100%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현하고, HLA 유형 A*03:01을 가진 유방암 환자의 95%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현하며, HLA 유형 A*24:02를 가진 유방암 환자의 100%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현하고, HLA 유형 B*07:02를 가진 유방암 환자의 100%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현한다.
불규칙변화성 9-Mer의 HLA에 대한 결합 친화도.
TAA 유전자 TCGA에서의 % 발현 HLA
대립유전자 		인실리코 예측 결합 친화도 IC50 # 시험관내 결합 친화도 ^ 야생형 펩타이드 면역원성?
STEAP1 100 A*02:01 5.77 188.4 예
STEAP1 100 A*24:02 47.48 104.7 모름
RNF43 100 B*07:02 161.95 65.4 예
CEACAM5 95 A*02:01 6.92 170.7 예
CEACAM5 95 A*03:01 9.69 85.4 예
CEACAM5 95 A*24:02 6.22 77.2 예
CEACAM5 95 B*07:02 8.36 88.3 예
PRAME 92 A*02:01 11.72 139.4 예
TERT 87 A*02:01 7.04 123.3 예
TERT 87 A*24:02 2197.84 142.3 모름
MAGE-A3 31 A*03:01 9.40 85.4 모름
MAGE-A3 31 A*24:02 28.11 92.8 모름
# - NetMHC4.0
^ - 양성 대조군 펩타이드 결합에 관련한 %
자궁암 불규칙변화성 펩타이드
8개의 유전자에 걸친 불규칙변화성 돌연변이를 가진 총 14개의 펩타이드를 자궁암 불규칙변화성 펩타이드에 대해 선택하였다. 각각의 불규칙변화성 돌연변이에 대해, 길이가 9개 아미노산의 펩타이드를 실시예 1 및 본원의 다른 곳에서 기술된 것과 같이 설계하였다. 펩타이드를 표 13에 나타낸다. 각각의 불규칙변화성 돌연변이는 표 1에서 기술된 것과 같다.
예시의 자궁암 불규칙변화성 9-Mer.
자궁암 불규칙변화성 9-MER
유전자 HLA 유형 서열 SEQ ID NO
CEACAM5 A0201 ILMGVLVGV 102
CEACAM5 A0301 HVFGYSWYK 104
CEACAM5 B0702 IPQVHTQVL 108
CEACAM5 A0201 ILIGVLVGV 100
PRAME A0201 NMTHVLYPL 140
hTERT A0201_A2402 IMAKFLHWL 114
STEAP1 A0201 LLLGTIHAV 152
CEACAM5 A2402 IYPNASLLF 106
RNF43 B0702 NPQPVWLCL 146
NUF2 A0201 YLMPVNSEV 130
NUF2 A2402 VWGIRLEHF 132
KLHL7 A2402 VYILGGSQF 116
SART3 A0201 LMQAEAPRL 148
STEAP1 A2402 KYKKFPWWL 154
불규칙변화성 9-mer 펩타이드의 인실리코 예측 결합 친화도 및 시험관내 결합 친화도를 표 14에 나타낸다. 인실리코 예측 결합 친화도는 NetMHC4.0 알고리즘을 토대로 하며, 이것은 50% 억제 농도 (IC50) 값 (nM)의 면에서 MHC 클래스 I 분자에 대한 펩타이드 결합을 예측하고; 더 낮은 숫자는 더 강력한 예측 결합 친화도를 반영한다. 시험관내 결합 친화도를 표시된 MHC 클래스 I 대립유전자에 결합하고 MHC-펩타이드 복합체를 안정화시키는 각 후보 펩타이드의 능력을, 그 결합을 높은 친화도 T 세포 에피토프의 결합과 비교함으로써 규정하는 결합 검정을 통해 측정하였다. 간단히 설명하면, 각 펩타이드를 그것의 특이적 HLA 분자와 함께 시험관내 검정에서 인큐베이션한다. 결합 강도를 양성 대조군 결합 점수를 100%로 설정하고 양성 대조군으로서 동일한 HLA 분자에 대해 공지된, 면역원성 펩타이드에 대해 비교한다. 서열-최적화된 결합 점수를 대조군 펩타이드에 대해 표준화한다. 즉, 각각의 펩타이드에 매우 강력한 결합 특성을 가진 공지된 T 세포 에피토프인 양성 대조군 펩타이드에 관련한 점수를 주었다. 불규칙변화성 테스트 펩타이드의 점수를 양성 대조군 펩타이드에 의해 생성된 신호의 백분율로서 정량적으로 기록한다. 양성 대조군의 45% 이상의 점수를 가진 펩타이드를 결합제로서 간주한다. 또한 표 14에 테스트되는 HLA 대립유전자인 자궁암 (The Cancer Genome Atlas (TCGA) 데이터베이스)을 가진 환자에서의 각 유전자의 퍼센트 발현, 및 각각의 불규칙변화성 펩타이드에 상응하는 야생형 펩타이드가 면역원성인 것으로 알려져 있는지의 여부가 제공된다. 표 14의 각각의 불규칙변화성 펩타이드를 포함하는 구성물에 대해, HLA 유형 A*02:01을 가진 자궁암 환자의 100%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현하고, HLA 유형 A*03:01을 가진 자궁암 환자의 83%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현하며, HLA 유형 A*24:02를 가진 자궁암 환자의 100%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현하고, HLA 유형 B*07:02를 가진 자궁암 환자의 100%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현한다.
불규칙변화성 9-Mer의 HLA에 대한 결합 친화도.
TAA 유전자 TCGA에서의 % 발현 HLA
대립유전자 		인실리코 예측 결합 친화도 IC50 # 시험관내 결합 친화도 ^ 야생형 펩타이드 면역원성?
CEACAM5 1 84 A*02:01 6.92 170.7 예
CEACAM5 2 84 A*02:01 3.47 TBD 예
CEACAM5 84 A*03:01 9.69 85.4 예
CEACAM5 84 B*07:02 8.36 88.3 예
STEAP1 100 A*02:01 5.77 188.4 예
PRAME 99 A*02:01 11.72 139.4 예
TERT 92 A*02:01 7.04 123.3 예
TERT 92 A*24:02 2197.84 142.3 모름
STEAP1 100 A*24:02 47.48 104.7 모름
CEACAM5 84 A*24:02 6.22 77.2 예
RNF43 100 B*07:02 161.95 65.4 예
NUF2 99 A*02:01 2.79 160.0 예
KLHL7 100 A*24:02 60.84 97.4 예
SART3 100 A*02:01 235.57 160.0 예
NUF2 99 A*24:02 149.07 88.4 예
# - NetMHC4.0
^ - 양성 대조군 펩타이드 결합에 관련한 %
1 - SEQ ID NO: 100
2 - SEQ ID NO: 102
난소암 불규칙변화성 펩타이드
8개의 유전자에 걸친 불규칙변화성 돌연변이를 가진 총 14개의 펩타이드를 난소암 불규칙변화성 펩타이드에 대해 선택하였다. 각각의 불규칙변화성 돌연변이에 대해, 길이가 9개 아미노산의 펩타이드를 실시예 1 및 본원의 다른 곳에서 기술된 것과 같이 설계하였다. 펩타이드를 표 15에 나타낸다. 각각의 불규칙변화성 돌연변이는 표 1에서 기술된 것과 같다.
예시의 난소암 불규칙변화성 9-Mer.
난소암 불규칙변화성 9-MER
유전자 HLA 유형 서열 SEQ ID NO
CEACAM5 A0301 HVFGYSWYK 104
CEACAM5 B0702 IPQVHTQVL 108
CEACAM5 A2402 IYPNASLLF 106
CEACAM5 A0201 ILIGVLVGV 100
STEAP1 A0201 LLLGTIHAV 152
STEAP1 A2402 KYKKFPWWL 154
RNF43 B0702 NPQPVWLCL 146
SART3 A0201 LMQAEAPRL 148
NUF2 A0201 YLMPVNSEV 130
NUF2 A2402 VWGIRLEHF 132
KLHL7 A2402 VYILGGSQF 116
PRAME A0201 NMTHVLYPL 140
hTERT A0201_A2402 IMAKFLHWL 114
CEACAM5 A0201 ILMGVLVGV 102
불규칙변화성 9-mer 펩타이드의 인실리코 예측 결합 친화도 및 시험관내 결합 친화도를 표 16에 나타낸다. 인실리코 예측 결합 친화도는 NetMHC4.0 알고리즘을 토대로 하며, 이것은 50% 억제 농도 (IC50) 값 (nM)의 면에서 MHC 클래스 I 분자에 대한 펩타이드 결합을 예측하고; 더 낮은 숫자는 더 강력한 예측 결합 친화도를 반영한다. 시험관내 결합 친화도를 표시된 MHC 클래스 I 대립유전자에 결합하고 MHC-펩타이드 복합체를 안정화시키는 각 후보 펩타이드의 능력을, 그 결합을 높은 친화도 T 세포 에피토프의 결합과 비교함으로써 규정하는 결합 검정을 통해 측정하였다. 간단히 설명하면, 각 펩타이드를 그것의 특이적 HLA 분자와 함께 시험관내 검정에서 인큐베이션한다. 결합 강도를 양성 대조군 결합 점수를 100%로 설정하고 양성 대조군으로서 동일한 HLA 분자에 대해 공지된, 면역원성 펩타이드에 대해 비교한다. 서열-최적화된 결합 점수를 대조군 펩타이드에 대해 표준화한다. 즉, 각각의 펩타이드에 매우 강력한 결합 특성을 가진 공지된 T 세포 에피토프인 양성 대조군 펩타이드에 관련한 점수를 주었다. 불규칙변화성 테스트 펩타이드의 점수를 양성 대조군 펩타이드에 의해 생성된 신호의 백분율로서 정량적으로 기록한다. 양성 대조군의 45% 이상의 점수를 가진 펩타이드를 결합제로서 간주한다. 또한 표 16에 테스트되는 HLA 대립유전자인 난소암 (The Cancer Genome Atlas (TCGA) 데이터베이스)을 가진 환자에서의 각 유전자의 퍼센트 발현, 및 각각의 불규칙변화성 펩타이드에 상응하는 야생형 펩타이드가 면역원성인 것으로 알려져 있는지의 여부가 제공된다. 표 16의 각각의 불규칙변화성 펩타이드를 포함하는 구성물에 대해, HLA 유형 A*02:01을 가진 난소암 환자의 100%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현하고, HLA 유형 A*03:01을 가진 난소암 환자의 83%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현하며, HLA 유형 A*24:02를 가진 난소암 환자의 100%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현하고, HLA 유형 B*07:02를 가진 난소암 환자의 100%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현한다.
불규칙변화성 9-Mer의 HLA에 대한 결합 친화도.
TAA 유전자 TCGA에서의 % 발현 HLA
대립유전자 		인실리코 예측 결합 친화도 IC50 # 시험관내 결합 친화도 ^ 야생형 펩타이드 면역원성?
CEACAM5 1 93 A*02:01 6.92 170.7 예
CEACAM5 2 93 A*02:01 3.47 TBD 예
CEACAM5 93 A*03:01 9.69 85.4 예
CEACAM5 93 B*07:02 8.36 88.3 예
STEAP1 100 A*02:01 5.77 188.4 예
PRAME 100 A*02:01 11.72 139.4 예
TERT 94 A*02:01 7.04 123.3 예
TERT 94 A*24:02 2197.84 142.3 모름
STEAP1 100 A*24:02 47.48 104.7 모름
CEACAM5 93 A*24:02 6.22 77.2 예
RNF43 100 B*07:02 161.95 65.4 예
NUF2 100 A*02:01 2.79 160.0 예
KLHL7 100 A*24:02 60.84 97.4 예
SART3 100 A*02:01 235.57 160.0 예
NUF2 100 A*24:02 149.07 88.4 예
# - NetMHC4.0
^ - 양성 대조군 펩타이드 결합에 관련한 %
1 - SEQ ID NO: 100
2 - SEQ ID NO: 102
저등급 신경교종 (LGG) 불규칙변화성 펩타이드
8개의 유전자에 걸친 불규칙변화성 돌연변이를 가진 총 10개의 펩타이드를 LGG 불규칙변화성 펩타이드에 대해 선택하였다. 각각의 불규칙변화성 돌연변이에 대해, 길이가 9개 아미노산의 펩타이드를 실시예 1 및 본원의 다른 곳에서 기술된 것과 같이 설계하였다. 펩타이드를 표 17에 나타낸다. 각각의 불규칙변화성 돌연변이는 표 1에서 기술된 것과 같다.
예시의 LGG 불규칙변화성 9-Mer.
LGG 불규칙변화성 9-MER
유전자 HLA 유형 서열 SEQ ID NO
CEACAM5 A0301 HVFGYSWYK 104
MAGEA6 A0301 YLFPVIFSK 128
STEAP1 A0201 LLLGTIHAV 152
STEAP1 A2402 KYKKFPWWL 154
RNF43 B0702 NPQPVWLCL 146
SART3 A0201 LMQAEAPRL 148
NUF2 A0201 YLMPVNSEV 130
NUF2 A2402 VWGIRLEHF 132
KLHL7 A2402 VYILGGSQF 116
hTERT A0201_A2402 IMAKFLHWL 114
불규칙변화성 9-mer 펩타이드의 인실리코 예측 결합 친화도 및 시험관내 결합 친화도를 표 18에 나타낸다. 인실리코 예측 결합 친화도는 NetMHC4.0 알고리즘을 토대로 하며, 이것은 50% 억제 농도 (IC50) 값 (nM)의 면에서 MHC 클래스 I 분자에 대한 펩타이드 결합을 예측하고; 더 낮은 숫자는 더 강력한 예측 결합 친화도를 반영한다. 시험관내 결합 친화도를 표시된 MHC 클래스 I 대립유전자에 결합하고 MHC-펩타이드 복합체를 안정화시키는 각 후보 펩타이드의 능력을, 그 결합을 높은 친화도 T 세포 에피토프의 결합과 비교함으로써 규정하는 결합 검정을 통해 측정하였다. 간단히 설명하면, 각 펩타이드를 그것의 특이적 HLA 분자와 함께 시험관내 검정에서 인큐베이션한다. 결합 강도를 양성 대조군 결합 점수를 100%로 설정하고 양성 대조군으로서 동일한 HLA 분자에 대해 공지된, 면역원성 펩타이드에 대해 비교한다. 서열-최적화된 결합 점수를 대조군 펩타이드에 대해 표준화한다. 즉, 각각의 펩타이드에 매우 강력한 결합 특성을 가진 공지된 T 세포 에피토프인 양성 대조군 펩타이드에 관련한 점수를 주었다. 불규칙변화성 테스트 펩타이드의 점수를 양성 대조군 펩타이드에 의해 생성된 신호의 백분율로서 정량적으로 기록한다. 양성 대조군의 45% 이상의 점수를 가진 펩타이드를 결합제로서 간주한다. 또한 표 18에 테스트되는 HLA 대립유전자인 저등급 신경교종(LGG) (The Cancer Genome Atlas (TCGA) 데이터베이스)을 가진 환자에서의 각 유전자의 퍼센트 발현, 및 각각의 불규칙변화성 펩타이드에 상응하는 야생형 펩타이드가 면역원성인 것으로 알려져 있는지의 여부가 제공된다. 표 18의 각각의 불규칙변화성 펩타이드를 포함하는 구성물에 대해, HLA 유형 A*02:01을 가진 LGG 환자의 100%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현하고, HLA 유형 A*03:01을 가진 LGG 환자의 43%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현하며, HLA 유형 A*24:02를 가진 LGG 환자의 100%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현하고, HLA 유형 B*07:02를 가진 LGG 환자의 100%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현한다.
불규칙변화성 9-Mer의 HLA에 대한 결합 친화도.
TAA 유전자 TCGA에서의 % 발현 HLA
대립유전자 		인실리코 예측 결합 친화도 IC50 # 시험관내 결합 친화도 ^ 야생형 펩타이드 면역원성?
NUF2 100 A*02:01 2.79 160.0 예
MAGE-A6 43 A*03:01 12.83 103.7 모름
CEACAM5 27 A*03:01 9.69 85.4 예
STEAP1 99 A*02:01 5.77 188.4 예
STEAP1 99 A*24:02 47.48 104.7 모름
RNF43 100 B*07:02 161.95 65.4 예
hTERT 100 A*02:01 7.05 123.3 예
hTERT 100 A*24:02 2197.85 142.3 모름
NUF2 100 A*24:02 149.07 88.4 모름
KLHL7 100 A*24:02 60.84 97.4 예
SART3 100 A*02:01 235.57 160.0 예
# - NetMHC4.0
^ - 양성 대조군 펩타이드 결합에 관련한 %
대장암 (CRC) 불규칙변화성 펩타이드
8개의 유전자에 걸친 불규칙변화성 돌연변이를 가진 총 10개의 펩타이드를 CRC 불규칙변화성 펩타이드에 대해 선택하였다. 각각의 불규칙변화성 돌연변이에 대해, 길이가 9개 아미노산의 펩타이드를 실시예 1 및 본원의 다른 곳에서 기술된 것과 같이 설계하였다. 펩타이드를 표 19에 나타낸다. 각각의 불규칙변화성 돌연변이는 표 122에서 기술된 것과 같다.
예시의 CRC 불규칙변화성 9-Mer.
CRC 불규칙변화성 9-Mer
유전자 HLA 유형 서열 SEQ ID NO 대표적인 핵산 SEQ ID NO
CEACAM5 A0301 HVFGYSWYK 104 929-932
MAGEA6 A0301 YLFPVIFSK 128 933-936
CEACAM5 B0702 IPQVHTQVL 108 937-940
MAGEA4 B0702 MPSLREAAL 126 941-944
GAGE1 B0702 WPRPRRYVM 112 945-948
CEACAM5 A2402 IYPNASLLF 106 949-952
NYESO1 A0201 RLLEFYLAV 134 953-956
STEAP1 A0201 LLLGTIHAV 152 957-960
RNF43 B0702 NPQPVWLCL 146 961-964
MAGEA3 A0201_A2402 KVPEIVHFL 118 965-968
불규칙변화성 9-mer 펩타이드의 인실리코 예측 결합 친화도 및 시험관내 결합 친화도를 표 20에 나타낸다. 인실리코 예측 결합 친화도는 NetMHC4.0 알고리즘을 토대로 하며, 이것은 50% 억제 농도 (IC50) 값 (nM)의 면에서 MHC 클래스 I 분자에 대한 펩타이드 결합을 예측하고; 더 낮은 숫자는 더 강력한 예측 결합 친화도를 반영한다. 시험관내 결합 친화도를 표시된 MHC 클래스 I 대립유전자에 결합하고 MHC-펩타이드 복합체를 안정화시키는 각 후보 펩타이드의 능력을, 그 결합을 높은 친화도 T 세포 에피토프의 결합과 비교함으로써 규정하는 결합 검정을 통해 측정하였다. 간단히 설명하면, 각 펩타이드를 그것의 특이적 HLA 분자와 함께 시험관내 검정에서 인큐베이션한다. 결합 강도를 양성 대조군 결합 점수를 100%로 설정하고 양성 대조군으로서 동일한 HLA 분자에 대해 공지된, 면역원성 펩타이드에 대해 비교한다. 서열-최적화된 결합 점수를 대조군 펩타이드에 대해 표준화한다. 즉, 각각의 펩타이드에 매우 강력한 결합 특성을 가진 공지된 T 세포 에피토프인 양성 대조군 펩타이드에 관련한 점수를 주었다. 불규칙변화성 테스트 펩타이드의 점수를 양성 대조군 펩타이드에 의해 생성된 신호의 백분율로서 정량적으로 기록한다. 양성 대조군의 45% 이상의 점수를 가진 펩타이드를 결합제로서 간주한다. 또한 표 20에 테스트되는 HLA 대립유전자인 대장암 (The Cancer Genome Atlas 데이터베이스)을 가진 환자에서의 각 유전자의 퍼센트 발현, 및 각각의 불규칙변화성 펩타이드에 상응하는 야생형 펩타이드가 면역원성인 것으로 알려져 있는지의 여부가 제공된다. 표 20의 각각의 불규칙변화성 펩타이드를 포함하는 구성물에 대해, HLA 유형 A*02:01을 가진 대장암 환자의 100%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현하고, HLA 유형 A*03:01을 가진 대장암 환자의 98%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현하며, HLA 유형 A*24:02를 가진 대장암 환자의 100%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현하고, HLA 유형 B*07:02를 가진 대장암 환자의 98%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현한다.
불규칙변화성 9-Mer의 HLA에 대한 결합 친화도.
TAA 유전자 TCGA에서의 % 발현 HLA
대립유전자 		인실리코 예측 결합 친화도 IC50 # 시험관내 결합 친화도 ^ 야생형 펩타이드 면역원성?
STEAP1 100 A*02:01 5.77 188.4 예
CEACAM5 100 B*07:02 8.36 88.3 예
CEACAM5 100 A*03:01 9.69 85.4 예
CEACAM5 100 A*24:02 6.22 77.2 예
RNF43 100 B*07:02 161.95 65.4 예
MAGE-A6 38 A*03:01 12.83 103.7 모름
MAGE-A3 35 A*02:01 50.31 168.7 예
MAGE-A3 35 A*24:02 2966 102.4 모름
MAGE-A4 25 B*07:02 7.67 49.5 모름
NY-ESO1 21 A*02:01 4.61 212.9 모름
GAGE1 3 B*07:02 2.58 58.5 모름
# - NetMHC4.0
^ - 양성 대조군 펩타이드 결합에 관련한 %
두경부암 불규칙변화성 펩타이드
6개의 유전자에 걸친 불규칙변화성 돌연변이를 가진 총 10개의 펩타이드를 두경부암 불규칙변화성 펩타이드에 대해 선택하였다. 각각의 불규칙변화성 돌연변이에 대해, 길이가 9개 아미노산의 펩타이드를 실시예 1 및 본원의 다른 곳에서 기술된 것과 같이 설계하였다. 펩타이드를 표 21에 나타낸다. 각각의 불규칙변화성 돌연변이는 표 1에서 기술된 것과 같다.
예시의 두경부암 불규칙변화성 9-Mer.
두경부암 불규칙변화성 9-Mer
유전자 HLA 유형 서열 SEQ ID NO
CEACAM5 A0301 HVFGYSWYK 104
CEACAM5 B0702 IPQVHTQVL 108
MAGEA4 B0702 MPSLREAAL 126
CEACAM5 A2402 IYPNASLLF 106
CEACAM5 A0201 ILIGVLVGV 100
STEAP1 A0201 LLLGTIHAV 152
STEAP1 A2402 KYKKFPWWL 154
N예O1 B0702 APRGPHGGM 136
PRAME A0201 NMTHVLYPL 140
hTERT A0201_A2402 IMAKFLHWL 114
불규칙변화성 9-mer 펩타이드의 인실리코 예측 결합 친화도 및 시험관내 결합 친화도를 표 22에 나타낸다. 인실리코 예측 결합 친화도는 NetMHC4.0 알고리즘을 토대로 하며, 이것은 50% 억제 농도 (IC50) 값 (nM)의 면에서 MHC 클래스 I 분자에 대한 펩타이드 결합을 예측하고; 더 낮은 숫자는 더 강력한 예측 결합 친화도를 반영한다. 시험관내 결합 친화도를 표시된 MHC 클래스 I 대립유전자에 결합하고 MHC-펩타이드 복합체를 안정화시키는 각 후보 펩타이드의 능력을, 그 결합을 높은 친화도 T 세포 에피토프의 결합과 비교함으로써 규정하는 결합 검정을 통해 측정하였다. 간단히 설명하면, 각 펩타이드를 그것의 특이적 HLA 분자와 함께 시험관내 검정에서 인큐베이션한다. 결합 강도를 양성 대조군 결합 점수를 100%로 설정하고 양성 대조군으로서 동일한 HLA 분자에 대해 공지된, 면역원성 펩타이드에 대해 비교한다. 서열-최적화된 결합 점수를 대조군 펩타이드에 대해 표준화한다. 즉, 각각의 펩타이드에 매우 강력한 결합 특성을 가진 공지된 T 세포 에피토프인 양성 대조군 펩타이드에 관련한 점수를 주었다. 불규칙변화성 테스트 펩타이드의 점수를 양성 대조군 펩타이드에 의해 생성된 신호의 백분율로서 정량적으로 기록한다. 양성 대조군의 45% 이상의 점수를 가진 펩타이드를 결합제로서 간주한다. 또한 표 22에 테스트되는 HLA 대립유전자인 두경부암 (The Cancer Genome Atlas 데이터베이스)을 가진 환자에서의 각 유전자의 퍼센트 발현, 및 각각의 불규칙변화성 펩타이드에 상응하는 야생형 펩타이드가 면역원성인 것으로 알려져 있는지의 여부가 제공된다. 표 22의 각각의 불규칙변화성 펩타이드를 포함하는 구성물에 대해, HLA 유형 A*02:01을 가진 두경부암 환자의 100%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현하고, HLA 유형 A*03:01을 가진 두경부암 환자의 100%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현하며, HLA 유형 A*24:02를 가진 두경부암 환자의 100%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현하고, HLA 유형 B*07:02를 가진 두경부암 환자의 100%가 TAA 유전자 중 적어도 하나를 발현한다.
불규칙변화성 9-Mer의 HLA에 대한 결합 친화도.
TAA 유전자 TCGA에서의 % 발현 HLA
대립유전자 		인실리코 예측 결합 친화도 IC50 # 시험관내 결합 친화도 ^ 야생형 펩타이드 면역원성?
CEACAM5 100 A*02:01 6.92 170.7 예
CEACAM5 100 B*07:02 8.36 88.3 예
CEACAM5 100 A*03:01 9.69 85.4 예
CEACAM5 100 A*24:02 6.22 77.2 예
STEAP1 99 A*02:01 5.77 188.4 예
STEAP1 99 A*24:02 47.48 104.7 모름
TERT 94 A*02:01 7.04 123.3 예
TERT 94 A*24:02 2197.84 142.3 모름
PRAME 91 A*02:01 11.72 139.4 예
MAGE-A4 78 B*07:02 7.67 49.5 모름
NY-ESO1 44 B*07:02 3.32 109.7 모름
# - NetMHC4.0
^ - 양성 대조군 펩타이드 결합에 관련한 %
실시예 3. 개념의 증명: Lm 불규칙변화성 WT1 미니유전자 융합 단백질 구성물의 효능.
펩타이드 미니유전자 발현 시스템을 사용하여 빌름 종양 단백질을 표적화하는 특유한 불규칙변화성 미니유전자를 평가하였다. 이 발현 시스템을 카르복시 말단에서 구별되는 펩타이드 모이어티를 함유하는 재조합 단백질의 패널의 클로닝을 용이하게 하기 위하여 설계하였다. 이것을 주형으로서 신호 서열 (SS)-유비퀴틴 (Ub)-항원성 펩타이드 구성물 중 하나를 암호화하는 서열을 이용하는 간단한 PCR 반응에 의해 달성한다. Ub 서열의 카르복시 말단 영역으로 연장하는 프라이머를 사용하여 프라이머늬 3' 단부에서 원하는 펩타이드 서열에 대한 코돈을 도입함으로써, 새로운 SS-Ub-펩타이드 서열을 단일 PCR 반응으로 생성할 수 있다. 박테리아 프로모터 및 신호 서열 (예컨대, LLO 또는 ActA1-100 분비 신호)의 처음 몇개의 뉴클레오타이드를 암호화하는 5' 프라이머는 모든 구성물에 대해 동일할 수 있다. 이 전략을 사용하여 생성된 구성물을 도 1A 및 1B에 개략적으로 나타낸다.
미니유전자 시스템의 장점 중 하나는 단일 리스테리아 벡터 구성물을 사용하여 다중 펩타이드를 가진 세포를 로딩하는 것이 가능할 것이란 것이다. 다중 펩타이드는 상기에서 기술된 단일 펩타이드 발현 시스템을 변용하여 재조합 약독화된 리스테리아 (예컨대, Lmdda)에 도입될 수 있다. 순차적인 SS-Ub-펩타이드 서열로부터의 다중 별개 펩타이드를 암호화하는 키메라 단백질이 한 삽입물에 암호화될 수 있다. 예컨대, 도 1B를 참조한다. 샤인-달가노 리보솜 결합 부위를 각 펩타이드 구성물의 별도의 번역을 가능하게 하기 위해 각각의 SS-Ub-펩타이드 코딩 서열 전에 도입할 수 있다. 도 1B는 재조합 리스테리아의 한 균주로부터 3개의 별도의 펩타이드 항원을 발현하도록 설계한 구성물의 개략적인 표시를 나타낸다.
ADXS Lmdda 리스테리아 구성물에 의한 tLLO-WT1-불규칙변화성 융합 단백질의 발현을 평가하기 위하여, 빌름 종양 1 단백질을 표적화하는 특유한 불규칙변화성 미니유전자를 pAdv134 플라스미드에서 생성하고 Lmdda에 형질전환하였다. pAdv134 tLLO 플라스미드는 SEQ ID NO: 59에 제시된 N-말단 LLO 단편을 암호화한다. tLLO-WT1 불규칙변화성 융합 단백질은 N-말단 단부로부터 C-말단 단부 방향으로: SEQ ID NO: 59에 제시된 N-말단 LLO 단편, 이어서 SEQ ID NO: 99에 제시된 FLAG 태그, 이어서 SEQ ID NO: 188에 제시된 유비퀴틴 서열, 이어서 하기 표 23에 열거한 불규칙변화성 WT1 9-mer를 포함한다.
불규칙변화성 WT1 펩타이드.
구성물
# 		WT1 9-Mer
(불규칙변화성 AA 진하고 밑줄로 표시됨) 		SEQ ID NO
1 F MFPNAPYL 160
2 Y LGEQQYSV 161
3 Y LLPAVPSL 162
4 Y LNALLPAV 163
5 ALLLRTPY V 164
6 Y LGATLKGV 165
7 K L YFKLSHL 166
8 Y MTWNQMNL 167
9 G LR RGIQDV 168
10 Y MFPNAPYL 169
조합된 WT1-tLLO-FLAG-Ub-불규칙변화성 페닐알라닌 구성물 (구성물 #1)을 SEQ ID NO: 189에 제시한다 (tLLO = 1-441; FLAG = 442-462; 유비퀴틴 = 463-537; 불규칙변화성 페닐알라닌 펩타이드 = 538-546). 3개의 WT1 펩타이드 (P1-P2-P3; 각각 SEQ ID NO: 190 (RSDELVRHHNMHQRNMTKL), 191 (PGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTG), 및 192 (SGQAYMFPNAPYLPSCLES))를 표적으로 하는 하나의 추가적인 구성물 (Lmdda-WT1-tLLO-P1-P2-P3-FLAG-UB-불규칙변화성 티로신 미니유전자 구성물)을 생성하였다. 각각의 'P' 펩타이드는 추가적인 CD4 T 헬퍼 에피토프를 제공하기에 충분한 길이인 19-22개 아미노산으로 구성된다. 3개의 펩타이드는 링커에 의해 분리된다. P3 펩타이드는 SGQARMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 193)를 SGQAYMFPNAPYLPSCLES (SEQ ID NO: 192)로 전환시키는 불규칙변화성 돌연변이를 함유한다. 불규칙변화성 P3 펩타이드에 더불어, Lmdda-WT1-tLLO-P1-P2-P3-FLAG-UB-불규칙변화성 티로신 미니유전자 구성물은 C-말단에 유비퀴틴-YMFPNAPYL (SEQ ID NO: 169) 모이어티를 함유한다. 조합된 WT1-tLLO-P1-P2-P3-FLAG-UB-불규칙변화성 티로신 미니유전자 구성물은 SEQ ID NO: 194에 제시한다 (tLLO = 1-441; 야생형 WT1 펩타이드 v14―WT1-427 길이 = 442-460; 야생형 WT1 펩타이드 v15―WT1-331 길이 = 466-487; 불규칙변화성 WT1 펩타이드 v1B―WT1-122A1-길이 = 493-511; FLAG = 512-532; 유비퀴틴 = 533-607; 불규칙변화성 티로신 펩타이드 = 608-616). 각각의 개별적인 Lmdda 구성물을 특유한 불규칙변화성 WT1 미니유전자 생성물의 tLLO-융합 단백질 발현에 대해 웨스턴 블롯에 의해 검정하였다.
구성물 #1 (Lmdda-WT1-tLLO-FLAG-Ub-불규칙변화성 페닐알라닌 미니유전자 구성물) 및 Lmdda-WT1-tLLO-P1-P2-P3-FLAG-UB-불규칙변화성 티로신 미니유전자 구성물을 특유한 불규칙변화성 WT1 미니유전자 생성물의 tLLO-융합 단백질 발현에 대해 웨스턴 블롯에 의해 검정하였다. Lm WT1 미니유전자 구성물을 함유한 플레이트로부터의 단일 콜로니를 사용하여 37℃에서 건식 진동 인큐베이터에서 6 mL의 뇌 심장 주입 (BHI) 브로스 중의 밤샘 배양을 접종하였다. 다음날, 원래의 밤샘 배양의 1:10 희석을 9 mL의 신선한 BHI에 재현탁하고 OD600=0.6에 도달할 때까지 37℃에서 건식 진동 인큐베이터에서 성장시켰다. 세포를 13000 RPM에서의 2분 원심분리에 의해 펠릿화하였다. 샘플 상층액을 수집하여 SDS-PAGE 상에서 이동하도록 하였다. 샘플을 75 μL의 샘플을 with 25 μL의 4X LDS 샘플 완충액 (Cat#161-0747)으로 희석하고, 98℃에서 10분 동안 끓인 후, 얼음에 놓았다가 최대 속대에서 10분 동안 4℃에서 원심분리함으로써 제조하였다. 13 μL의 샘플을 4-15% 프리캐스트(precast) 단백질 겔 (BioRad Cat#4561086) 상에서 이동하도록 하였다. 단백질 겔을 트랜스-블롯 터보 (Trans-Blot Turbo) 이송 장치 (Cat#170-4155) 및 PVDF Midi 이송 팩 (Bio-Rad #170-4157)을 사용하여 이송시켰다. 블롯을 일차 항체로서 항-FLAG 단클론성 항체 (Sigma F1804) 또는 항-LLO (Abcam ab200538) 및 이차 항체로서 염소 항-마우스 IgG-HRP 컨쥬게이티드 (sc2005)와 함께 인큐베이션하였다. 그런 후 블롯을 iBind Flex (Invitrogen cat#1772866) 상에서 인큐베이션하고, 세척한 후, 슈퍼 시그널 웨스트 튜라 (Super Signal West Dura) 연장 기간 기질 (ThermoFisher #34076)에 의해 전개하고; 이미지를 Amersham 영상기 600 (GE) 상에서 전개시켰다.
특유한 tLLO-WT1-불규칙변화성 미니유전자 융합 단백질의 발현 및 분비를 확인하였다. 구성물 #1 및 Lmdda-WT1-P1-P2-P3-YMFPNAPYL (SEQ ID NO: 169) 불규칙변화성 티로신 + 미니유전자 구성물로부터의 배양 상층액의 항-Flag 태그 항체 웨스턴 블롯을 도 2A 및 2B에 각각 나타낸다. 본 발명자들은 각각의 개별적인 tLLO-WT1-불규칙변화성 미니유전자 융합 단백질에 대해 정확한 크기 및 동일성에 상응하는 단백질 밴드를 검출할 수 있었다. 이들 데이터는 WT1 단백질 내에서 다중 펩타이드 단편을 표적화하는 불규칙변화성 펩타이드의 능력이 pAdv134 플라스미드 및 Lmdda 리스테리아 균주를 사용하여 생성될 수 있음을 입증한다.
표 23의 구성물 #2-9에 대해, 각각의 개별적인 Lmdda 구성물을 불규칙변화성 WT1 미니유전자를 함유한 각각의 특유한 tLLO-융합 단백질로부터의 플라스미드 DNA를 검출하기 위해 콜로니 PCR에 의해 검정하였다.
물질.
물질 공급업체 카탈로그 # / 서열
DreamTaq DNA 중합효소 ThermoFisher EP0702
Forward Primer (Adv16 f)* ThermoFisher 5'-catcgatcactctgga-3' (SEQ ID NO: 195)
Reverse Primer (Adv295 r)* ThermoFisher 5'-ctaactccaatgttacttg-3' (SEQ ID NO: 196)
10 mM dNTPs NEB N0447S
TrackIt 1 kB 플러스 DNA 사다리 ThermoFisher 10488085
과정
사용한 일반적인 콜로니 PCR 과정은 다음과 같다. 큰 콜로니를 가진 플레이트를 얻는다 (일반적으로, 37℃에서 24시간 동안 성장한 플레이트가 이 과정에 아주 적합하다. PCR을 위해 생성된 마스터 혼합물은 다음과 같다.
Figure pct00015
부분표본화한 20 μL의 마스터 혼합물을 각각의 PCR 튜브에 넣었다. 피펫 팁 (10-20 μL 부피가 가장 적합함)을 사용하여, 한 콜로니로부터 넉넉한 부피를 덜어냈다. 피펫 팁을 PCR 튜브 안에서 여러 번 톡톡 치고 박테리아가 떨어지도록 사방으로 빙글빙글 돌렸다. 다음의 PCR 프로그램을 사용하여 열순환기에서 PCR 반응(들)을 작동시켰다.
Figure pct00016
열순환기로부터 PCR 튜브를 제거하고, 4 μL의 6X 로딩 염료를 첨가하였다. 10 μL의 각각의 PCR 반응을 1% 아가로오스 겔 상에서, 그 옆에서 10 μL의 1 kb+ DNA 사다리와 함께 이동하게 하였다. 프라이머가 추가적인 163개의 염기쌍을 생성물에 첨가시켰다. 전방향 프라이머는 tLLO의 3' 단부의 상류에 70개 염기쌍을 결합시켰다 (XhoI 부위를 포함함). 역방향 프라이머는 중단 부위의 하류에 93개의 염기쌍을 결합시켰다 (XmaI 부위를 포함함).
표 23으로부터의 pAdv134 WT1-불규칙변화성 플라스미드 #2-9를 함유한 Lmdda 균주를 보여주는 대표적인 콜로니 PCR 결과를 도 3에 나타낸다. 본 발명자들은 각각의 개별적인 tLLO-WT1-불규칙변화성 미니유전자 플라스미드에 대한 정확한 크기 및 동일성에 상응하는 DNA 밴드를 검출할 수 있었다. 이들 데이터는 WT1 단백질 내에서 다중 펩타이드 단편을 표적화하는 불규칙변화성 펩타이드의 능력이 pAdv134 플라스미드 및 Lmdda 리스테리아 균주를 사용하여 생성될 수 있음을 입증하고, 이러한 구성물이 WT1 및 WT1-발현 암 및 종양에 대한 면역 반응을 생성 또는 증강시키기 위해 WT1을 표적으로 하기 위한 치료 조성물로서 사용될 수 있음을 나타낸다.
2개의 상이한 WT1 구성물을 사용하여 AAD 마우스에서 WT1-특이적 T 세포 반응의 생성을 평가하기 위하여, 원하는 백신-유도된 Ag-특이적 반응을 측정하기 위해 ELISpot을 수행하였다. AAD 마우스 (B6.Cg-Tg(HLA-A/H2-D)2Enge/J; The Jackson Laboratory - Stock No.: 004191)는 인간 HLA-A2.1 프로모터의 지시 하에서 인간 HLA-A2.1 유전자의 알파-1 및 알파-2 도메인 및 마우스 H-2Dd　유전자의 알파-3 경막 및 세포질 도메인을 함유한, 종간 하이브리드 클래스 I MHC 유전자, AAD를 발현하는 트랜스제닉 마우스이다. 이 트랜스제닉 스트레인은 HLA-A2 제공된 항원에 대한 인간 T 세포 면역 반응의 모델링을 가능하게 하고, 감염성 질환 또는 암 치료법을 위한 백신의 테스트에 유용할 수 있다. 면역화 스케줄을 표 25에 제공한다. 사용한 마우스는 생후 8-10주령의 암컷 C57BL/6 마우스였다.
면역화 스케줄.
백신/그룹 역가-CFU/mL 마우스/
그룹 		용량 1
(IP/200 μL/
마우스) 		용량 2
(IP/200 μL/
마우스) 		수득
1- PBS N/A 5마리 0일 12일 18일
2- LmddaA274 ~1x109 5마리 0일 12일 18일
3- WT1Fm-FLAG-Ub-9(WT1-F 미니유전자) ~1x109 5마리 0일 12일 18일
4- LmddA+pAdv134-WT1m:Ub-9(WT1-AH1-Tyr 미니유전자) ~1x109 5마리 0일 12일 18일
백신 제조 . 간단히 설명하면, 각각의 글리세롤 스톡을 필요항 영양소 플레이트 위에 스트리킹하고 밤새 성장시켰다. 단일 콜로니를 항생물질 선택 하에서 뇌 심장 주입 (BHI) 브로스의 밤샘 배양에서의 성장을 위해 사용하였다. 밤샘 배양을 1:10 (부피/부피) 희석으로 사용하여 신선한 BHI 브로스를 접종하였다. 박테리아를 궤도 진동기에서 1-3시간 동안 37℃에서 OD가 ~0.6-0.7인 중간-로그기까지 인큐베이션하였다. 마우스를 PBS 중의 1x109 CFU Lm으로 복강내 접종에 의해 감염시켰다.
ELISPOT . 제18일에, 마우스를 IACUC 프로토콜에 따라 CO2 질식에 의해 희생시키고, 비장을 수득하여, 비장세포 단일-세포 현탁액을 96-웰 플레이트 상에 플레이팅하고 야생형 또는 불규칙변화성 펩타이드로 자극하였다 (표 26). 유사한 실험을 다른 야생형 및 불규칙변화성 펩타이드 쌍으로 시행하였다 (표 27). ELISPOT 검정을 사용하여 야생형 또는 불규칙변화성 펩타이드에 반응하는 항원 특이적 CD8 T 세포를 계수하였다. 전체 ELISPOT 프로토콜은 CTL 면역스팟 (www.immunospot.com/resources/protocols/ELISPOT-protocol.htm)을 따랐다.
야생형 및 불규칙변화성 WT1 펩타이드.
야생형 펩타이드 네거티브 대조군 불규칙변화성 펩타이드
RMFPNAPYL
(SEQ ID NO: 197) 		RPMI 빈 배지 FMFPNAPYL (SEQ ID NO: 160)
YMFPNAPYL (SEQ ID NO: 169)
야생형 및 불규칙변화성 WT1 펩타이드.
야생형 불규칙변화성
SLGEQQYSV (SEQ ID NO: 198) YLGEQQYSV (SEQ ID NO: 161)
ALLPAVPSL (SEQ ID NO: 199) YLLPAVPSL (SEQ ID NO: 162)
DLNALLPAV (SEQ ID NO: 200) YLNALLPAV (SEQ ID NO: 163)
ALLLRTPYS (SEQ ID NO: 201) ALLLRTPYV (SEQ ID NO: 164)
NLGATLKGV (SEQ ID NO: 202) YLGATLKGV (SEQ ID NO: 165)
KRYFKLSHL (SEQ ID NO: 203) KLYFKLSHL (SEQ ID NO: 166)
CMTWNQMNL (SEQ ID NO: 204) YMTWNQMNL (SEQ ID NO: 167)
GVFRGIQDV (SEQ ID NO: 205) GLRRGIQDV (SEQ ID NO: 168)
일반적인 ELISPOT 프로토콜을 하기에 제공한다.
제0일 (멸균 상태). 포획 용액을 특정 프로토콜에 따라 포획 항체를 희석함으로써 제조하였다. PVDF 막을 70% 에탄올로 30초 동안 사전 습윤시키고 150 μL의 PBS로 3회 세척한 후 80 μL의 포획 용액을 각 웰에 첨가함으로써 많은 사이토카인이 혜택을 받는다. 플레이트를 밤새 가습 챔버에서 4℃에서 인큐베이션하였다.
제1일 (멸균 상태). CTL-TestTM 배지를 1% 신선한 L-글루타민을 첨가함으로써 제조하였다. CTL-TestTM 배지에 2X 최종 농도의 항원/미토겐 용액을 제조하였다. 제0일로부터의 코팅 항체를 플레이트에 붓고 150 μL PBS로 1회 세척하였다. 항원/미토겐 용액을 100 μL/웰로 플레이팅하였다. PBMC를 해동하거나 백혈구를 밀도 구배로 분리한 후에, PBMC를 CTL-TestTM 배지에서 원하는 농도, 예컨대 300,000 세포/웰에 상응하는 3백만개/mL로 조정하였다 (그러나, 세포 수는 100,000-800,000개 세포/웰이 선형 결과를 제공할 것이기 때문에 에상된 반점 수에 따라 조정할 수 있다). PBMC를 가공하는 동안, 그리고 플레이팅할 때까지 세포를 가습 인큐베이터, 5-9% CO2에서 37℃에서 유지하였다. 큰 구멍 팁을 사용하여 PBMC를 100 μL/웰로 플레이팅하였다. 완료 후, 플레이트 측면을 가볍게 톡톡 쳐주고 즉시 37℃ 가습 인큐베이터, 5-9% CO2에 놓았다. 사용하는 사이토카인에 따라 24 내지 72시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 쌓아놓지 않았다. 인큐베이터 문을 조심스럽게 열고 닫음으로써 플레이트가 흔들리는 것을 피하였다. 인큐베이션 동안 플레이트를 만지지 않았다.
제2일. 이 날에 대한 세척 용액: PBS, 증류수 및 Tween-PBS를 제조하였다. 특정 프로토콜에 따라 검출 항체를 희석함으로써 검출 용액을 제조하였다. 플레이트를 PBS로 2회 세척한 후 0.05% Tween-PBS, 200 μL/웰로 2회 세척하였다. 80 μL/웰의 검출 용액을 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 특정 프로토콜에 따라 삼차 항체를 희석함으로써 삼차 용액을 제조하였다. 플레이트를 0.05% Tween-PBS, 200 μL/웰로 3회 세척하였다. 80 μL/웰의　Strep-AP 용액을 첨가하였다. 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 소정의 특정 프로토콜에 따라 디벨로퍼 용액을 제조하였다. 플레이트를 0.05% Tween-PBS로 2회 세척한 후, 증류수, 200 μL/웰로 2회 세척하였다. 80 μL/웰의 디벨로퍼 용액을 첨가하였다. 실온에서 10-20분 동안 인큐베이션하였다. 막을 수돗물로 부드럽게 세정하고, 붓고, 이 과정을 3회 반복하여 반응을 중단시켰다. 플레이트의 보호성 배수를 제거하고, 플레이트를 수돗물로 다시 세정하였다. 플레이트를 작동 후드에서 면을 아래로 하여 2시간 동안 또는 벤치 탑 상의 종이 타월상에서 24시간 동안 공기 건조시켰다. 플레이트를 스캐닝하고 계수하였다.
HLA-A2 트랜스제닉 B6 마우스를 기술된 것과 같이 예방접종하고, 비장세포를 생체외에서 특정 WT1 펩타이드 (RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 197), FMFPNAPYL (SEQ ID NO 160))로 자극한 후 IFNg ELISpot 검정에 의해 검정하였다. 불규칙변화성 예방접종 (WT1-F 미니유전자: FMFPNAPYL; SEQ ID NO: 160)은 면역화된 HLA2 트랜스제닉 마우스에서 Ag-특이적 T 세포 반응을 유도하였다. 도 4 및 도 6B를 참조한다. 이에 더불어, 불규칙변화성 예방접종은 천연 WT1 종양 항원 (RMFPNAPYL; SEQ ID NO: 197)과 교차 반응한 T 세포 반응을 이끌어냈다. 도 4 및 도 6A를 참조한다. 데이터는 WT1-F 불규칙변화성 미니유전자 백신으로의 예방접종이 WT1-천연 종양 항원 (RMFPNAPYL; SEQ ID NO: 197)과 교차 반응성인 T 세포를 이끌어낼 수 있음을 입증하였다. 전체적으로, 데이터는 불규칙변화성 미니유전자 백신이 천연 종양 항원과 교차 반응하는 T 세포를 이끌어낼 수 있음을 입증하였다.
HLA-A2 트랜스제닉 B6 마우스를 기술한 것과 같이 예방접종하고 비장세포를 수득하였다. 백신-특이적 YMFPNAPYL 펩타이드 (SEQ ID NO: 169) 또는 천연 WT1 펩타이드 (RMFPNAPYL; SEQ ID NO: 197)에 반응하는 IFNg를 생성하는 T 세포의 능력을 IFNg ELISpot 검정에 의해 측정하였다. 불규칙변화성 예방접종 (WT1-AH1-Tyr 미니유전자: YMFPNAPYL; SEQ ID NO: 169)은 면역화된 HLA2 트랜스제닉 마우스에서 Ag-특이적 T 세포 반응을 유도하였다. 도 5 및 도 7B를 참조한다. 이에 더불어, 불규칙변화성 예방접종은 천연 WT1 종양 항원 (RMFPAPYL; SEQ ID NO: 197)과 교차 반응하는 T 세포 반응을 이끌어냈다. 도 5 및 도 7A를 참조한다.
실시예 4. 개념의 증명: CT26 도전 연구에서 불규칙변화성 Lm -AH1 구성물의 치료적 효능.
이 연구는 Lm AH1-HC 불규칙변화성 미니유전자 백신이 CR26 종양 성장을 제어 또는 억압할 수 있는지를 조사하였다.
치료 스케줄
표 28에서 기술한 것과 같이 불규칙변화성 AH1-HC 예방접종을 시작하고 권장 백신으로 1주 간격으로 2회 부스팅하였다.
치료 스케줄.
그룹 (N=10마리) CT26 이식
3x10 5 세포 		역가
CFU/mL 		주간 용량:
Lm 1x10 8
(IV/200uL/마우스)		 주간 용량:
Lm 1x10 8
(IV/200uL/마우스)		 주간 용량:
Lm 1x10 8
(IV/200uL/마우스)
나이브 8/7/2017 N/A 8/10/2017 8/17/2017 8/24/2017
AH1-HC 8/7/2017 6x108 8/10/2017 8/17/2017 8/24/2017
실험의 상세한 내용
백신 투약 상세. AH1-HC는 불규칙변화성 AH1-HC 백신으로 프라이밍되고 부스팅된 마우스를 나타낸다.
종양 세포주 팽창. CT26 세포주를 10% FBS가 첨가된 RPMI에서 배양하였다.
종양 접종. 제0일에, (14JUN17) CT26 세포를 0.25% 트립신으로 1회 트립신처리하고 PBS 중의 적절한 농도의 배지로 2회 세척하였다 (3x105 세포/마우스). CT26 세포를 각 마우스의 우측 옆구리에 피하 이식하였다.
치료. 백신 제조는 다음과 같았다: (a) -80℃로부터의 1개 바이알을 37℃ 수조에서 해동시키고; (b) 14,000 rpm에서 2분 동안 회전시킨 후 상층액을 따라 버리고; (c) 1 mL PBS로 2회 세척하고 PBS를 따라 버리고; 그리고 (d) 5x108 CFU/mL의 최종 농도로 재현탁하였다. 백신 투약을 종양 이식 후 3-4일 후에 시작하였다.
구성물 서열.
구성물 서열
Lm -AH1 HC DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDKQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRGGMPKYAYHML (SEQ ID NO: 206)

유비퀴틴: 22-96
불규칙변화성 AH1 9mer: 97-105
AH1 야생형 SPSYVYHQF (SEQ ID NO: 207)
AH1 불규칙변화성 MPKYAYHML (SEQ ID NO: 208)
결과 및 결론
Lm-AH1 HC 구성물은 또한 쥐과 CT26 대장암 모델에서 종양 성장을 상당히 제어할 수 있었다. 도 8을 참조한다.
SEQUENCE LISTING <110> Advaxis, Inc. <120> IMMUNOGENIC HETEROCLITIC PEPTIDES FROM CANCER-ASSOCIATED PROTEINS AND METHODS OF USE THEREOF <130> 62384-522598 <150> US 62/583,292 <151> 2017-11-08 <150> US 62/592,884 <151> 2017-11-30 <160> 977 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 gcacgtagta taatcaactt tgaaaaactg taataa 36 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 gcacgttcta ttatcaactt cgaaaaacta taataa 36 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 gcccgcagta ttatcaattt cgaaaaatta taataa 36 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 gcgcgctcta taattaactt cgaaaaactt taataa 36 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 gcacgctcca ttattaactt tgaaaaactt taataa 36 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 gctcgctcta tcatcaattt cgaaaaactt taataa 36 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 7 gcacgtagta ttattaactt cgaaaagtta taataa 36 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 8 gcacgttcca tcattaactt tgaaaaacta taataa 36 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 9 gctcgctcaa tcatcaactt tgaaaagcta taataa 36 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 10 gctcgctcta tcatcaactt cgaaaaattg taataa 36 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 11 gctcgctcta ttatcaattt tgaaaaatta taataa 36 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 12 gctcgtagta ttattaattt cgaaaaatta taataa 36 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 13 gctcgttcga ttatcaactt cgaaaaactg taataa 36 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 14 gcaagaagca tcatcaactt cgaaaaactg taataa 36 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 15 gcgcgttcta ttattaattt tgaaaaatta taataa 36 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 16 Ala Arg Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 10 <210> 17 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 17 gattataaag atcatgacgg agactataaa gaccatgaca ttgattacaa agacgacgat 60 gacaaa 66 <210> 18 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 18 gactataaag accacgatgg cgattataaa gaccatgata ttgactacaa agatgatgat 60 gataag 66 <210> 19 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 19 gattataaag atcatgatgg cgactataaa gatcatgata tcgattacaa agatgacgat 60 gacaaa 66 <210> 20 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 20 gactacaaag atcacgatgg tgactacaaa gatcacgaca ttgattataa agacgatgat 60 gacaaa 66 <210> 21 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 21 gattacaaag atcacgatgg tgattataag gatcacgata ttgattacaa agacgacgac 60 gataaa 66 <210> 22 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 22 gattacaaag atcacgatgg cgattacaaa gatcatgaca ttgactacaa agacgatgat 60 gataaa 66 <210> 23 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 23 gattacaagg atcatgatgg tgattacaaa gatcacgata tcgactacaa agatgatgac 60 gataaa 66 <210> 24 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 24 gactacaaag atcatgatgg tgattacaaa gatcatgaca ttgattataa agatgatgat 60 gacaaa 66 <210> 25 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 25 gattataaag accatgatgg tgattataag gatcatgata tcgattataa ggatgacgac 60 gataaa 66 <210> 26 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 26 gattataaag atcacgatgg cgattataaa gaccacgata ttgattataa agacgacgat 60 gacaaa 66 <210> 27 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 27 gactataaag accacgatgg tgattataaa gatcacgaca tcgactacaa agacgatgat 60 gataaa 66 <210> 28 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 28 gactacaaag atcacgacgg cgattataaa gatcacgata ttgactataa agatgacgat 60 gataaa 66 <210> 29 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 29 gattataaag accatgatgg agattacaaa gatcatgata ttgactataa agacgacgac 60 gataaa 66 <210> 30 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 30 gattataaag atcacgatgg tgactacaaa gatcacgata tcgattataa agacgatgac 60 gataaa 66 <210> 31 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 31 gactacaaag atcacgatgg tgattataaa gaccatgata ttgattacaa agatgatgat 60 gacaaa 66 <210> 32 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 32 Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr 1 5 10 15 Lys Asp Asp Asp Asp Lys 20 <210> 33 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 33 Gly Ala Ser Gly Ala Ser 1 5 <210> 34 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 34 Gly Ser Ala Gly Ser Ala 1 5 <210> 35 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 35 Gly Gly Gly Gly 1 <210> 36 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 36 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 37 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 37 Val Gly Lys Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 <210> 38 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 38 Pro Ala Pro Ala Pro 1 5 <210> 39 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 39 Glu Ala Ala Ala Lys 1 5 <210> 40 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 40 Ala Tyr Leu Ala Tyr Leu 1 5 <210> 41 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 41 Leu Arg Ala Leu Arg Ala 1 5 <210> 42 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 42 Arg Leu Arg Ala 1 <210> 43 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 43 Lys Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala 1 5 10 15 Ser Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys 20 25 30 <210> 44 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 44 Lys Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala 1 5 10 15 Ser Pro Lys <210> 45 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 45 Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg 1 5 10 <210> 46 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 46 Lys Glu Ser Val Val Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu Asp Ser Ser Met 1 5 10 15 Gln Ser Ala Asp Glu Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys 20 25 <210> 47 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 47 Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp 1 5 10 15 Glu Glu Leu Arg 20 <210> 48 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 48 Arg Gly Gly Arg Pro Thr Ser Glu Glu Phe Ser Ser Leu Asn Ser Gly 1 5 10 15 Asp Phe Thr Asp Asp Glu Asn Ser Glu Thr Thr Glu Glu Glu Ile Asp 20 25 30 Arg <210> 49 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 49 Lys Gln Asn Thr Ala Ser Thr Glu Thr Thr Thr Thr Asn Glu Gln Pro 1 5 10 15 Lys <210> 50 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 50 Lys Gln Asn Thr Ala Asn Thr Glu Thr Thr Thr Thr Asn Glu Gln Pro 1 5 10 15 Lys <210> 51 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 51 Arg Ser Glu Val Thr Ile Ser Pro Ala Glu Thr Pro Glu Ser Pro Pro 1 5 10 15 Ala Thr Pro <210> 52 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 52 Lys Ala Ser Val Thr Asp Thr Ser Glu Gly Asp Leu Asp Ser Ser Met 1 5 10 15 Gln Ser Ala Asp Glu Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys 20 25 <210> 53 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 53 Lys Asn Glu Glu Val Asn Ala Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp 1 5 10 15 Glu Glu Leu Arg 20 <210> 54 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 54 Arg Gly Gly Ile Pro Thr Ser Glu Glu Phe Ser Ser Leu Asn Ser Gly 1 5 10 15 Asp Phe Thr Asp Asp Glu Asn Ser Glu Thr Thr Glu Glu Glu Ile Asp 20 25 30 Arg <210> 55 <211> 529 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 55 Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu 1 5 10 15 Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys 20 25 30 Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser 35 40 45 Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr 50 55 60 Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly 65 70 75 80 Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn 85 90 95 Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn 100 105 110 Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly 115 120 125 Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val 130 135 140 Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly 145 150 155 160 Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser 165 170 175 Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys 180 185 190 Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp 195 200 205 Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala 210 215 220 Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser 225 230 235 240 Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr 245 250 255 Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys 260 265 270 Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn 275 280 285 Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu 290 295 300 Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp 305 310 315 320 Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn 325 330 335 Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala 340 345 350 Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp 355 360 365 Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro 370 375 380 Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile 385 390 395 400 Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp 405 410 415 Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn 420 425 430 Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu Ile Val 435 440 445 Gln His Lys Asn Trp Ser Glu Asn Asn Lys Ser Lys Leu Ala His Phe 450 455 460 Thr Ser Ser Ile Tyr Leu Pro Gly Asn Ala Arg Asn Ile Asn Val Tyr 465 470 475 480 Ala Lys Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val Ile 485 490 495 Asp Asp Arg Asn Leu Pro Leu Val Lys Asn Arg Asn Ile Ser Ile Trp 500 505 510 Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Lys Tyr Ser Asn Lys Val Asp Asn Pro Ile 515 520 525 Glu <210> 56 <211> 529 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 56 Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu 1 5 10 15 Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys 20 25 30 Glu Asn Ser Ile Ser Ser Val Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser 35 40 45 Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr 50 55 60 Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly 65 70 75 80 Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn 85 90 95 Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn 100 105 110 Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly 115 120 125 Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val 130 135 140 Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly 145 150 155 160 Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser 165 170 175 Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys 180 185 190 Tyr Ala Gln Ala Tyr Ser Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp 195 200 205 Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala 210 215 220 Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser 225 230 235 240 Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr 245 250 255 Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys 260 265 270 Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn 275 280 285 Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu 290 295 300 Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp 305 310 315 320 Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn 325 330 335 Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala 340 345 350 Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp 355 360 365 Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro 370 375 380 Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile 385 390 395 400 Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp 405 410 415 Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn 420 425 430 Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu Ile Val 435 440 445 Gln His Lys Asn Trp Ser Glu Asn Asn Lys Ser Lys Leu Ala His Phe 450 455 460 Thr Ser Ser Ile Tyr Leu Pro Gly Asn Ala Arg Asn Ile Asn Val Tyr 465 470 475 480 Ala Lys Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg Thr Val Ile 485 490 495 Asp Asp Arg Asn Leu Pro Leu Val Lys Asn Arg Asn Ile Ser Ile Trp 500 505 510 Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Lys Tyr Ser Asn Lys Val Asp Asn Pro Ile 515 520 525 Glu <210> 57 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 57 Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu 1 5 10 15 Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys 20 25 30 Glu Asn Ser Ile Ser Ser Val Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser 35 40 45 Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr 50 55 60 Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly 65 70 75 80 Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn 85 90 95 Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn 100 105 110 Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly 115 120 125 Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val 130 135 140 Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly 145 150 155 160 Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser 165 170 175 Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys 180 185 190 Tyr Ala Gln Ala Tyr Ser Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp 195 200 205 Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala 210 215 220 Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser 225 230 235 240 Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr 245 250 255 Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys 260 265 270 Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn 275 280 285 Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu 290 295 300 Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp 305 310 315 320 Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn 325 330 335 Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala 340 345 350 Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp 355 360 365 Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro 370 375 380 Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile 385 390 395 400 Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp 405 410 415 Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn 420 425 430 Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp 435 440 <210> 58 <211> 416 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 58 Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu 1 5 10 15 Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys 20 25 30 Glu Asn Ser Ile Ser Ser Val Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser 35 40 45 Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr 50 55 60 Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly 65 70 75 80 Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn 85 90 95 Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn 100 105 110 Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly 115 120 125 Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val 130 135 140 Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly 145 150 155 160 Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser 165 170 175 Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys 180 185 190 Tyr Ala Gln Ala Tyr Ser Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp 195 200 205 Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala 210 215 220 Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser 225 230 235 240 Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr 245 250 255 Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys 260 265 270 Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn 275 280 285 Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu 290 295 300 Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp 305 310 315 320 Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn 325 330 335 Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala 340 345 350 Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp 355 360 365 Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro 370 375 380 Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile 385 390 395 400 Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp 405 410 415 <210> 59 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 59 Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu 1 5 10 15 Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys 20 25 30 Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser 35 40 45 Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr 50 55 60 Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly 65 70 75 80 Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn 85 90 95 Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn 100 105 110 Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly 115 120 125 Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val 130 135 140 Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly 145 150 155 160 Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser 165 170 175 Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys 180 185 190 Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp 195 200 205 Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala 210 215 220 Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser 225 230 235 240 Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr 245 250 255 Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys 260 265 270 Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn 275 280 285 Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu 290 295 300 Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp 305 310 315 320 Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn 325 330 335 Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala 340 345 350 Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp 355 360 365 Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro 370 375 380 Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile 385 390 395 400 Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp 405 410 415 Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn 420 425 430 Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp 435 440 <210> 60 <211> 1323 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 60 atgaaaaaaa taatgctagt ttttattaca cttatattag ttagtctacc aattgcgcaa 60 caaactgaag caaaggatgc atctgcattc aataaagaaa attcaatttc atccatggca 120 ccaccagcat ctccgcctgc aagtcctaag acgccaatcg aaaagaaaca cgcggatgaa 180 atcgataagt atatacaagg attggattac aataaaaaca atgtattagt ataccacgga 240 gatgcagtga caaatgtgcc gccaagaaaa ggttacaaag atggaaatga atatattgtt 300 gtggagaaaa agaagaaatc catcaatcaa aataatgcag acattcaagt tgtgaatgca 360 atttcgagcc taacctatcc aggtgctctc gtaaaagcga attcggaatt agtagaaaat 420 caaccagatg ttctccctgt aaaacgtgat tcattaacac tcagcattga tttgccaggt 480 atgactaatc aagacaataa aatagttgta aaaaatgcca ctaaatcaaa cgttaacaac 540 gcagtaaata cattagtgga aagatggaat gaaaaatatg ctcaagctta tccaaatgta 600 agtgcaaaaa ttgattatga tgacgaaatg gcttacagtg aatcacaatt aattgcgaaa 660 tttggtacag catttaaagc tgtaaataat agcttgaatg taaacttcgg cgcaatcagt 720 gaagggaaaa tgcaagaaga agtcattagt tttaaacaaa tttactataa cgtgaatgtt 780 aatgaaccta caagaccttc cagatttttc ggcaaagctg ttactaaaga gcagttgcaa 840 gcgcttggag tgaatgcaga aaatcctcct gcatatatct caagtgtggc gtatggccgt 900 caagtttatt tgaaattatc aactaattcc catagtacta aagtaaaagc tgcttttgat 960 gctgccgtaa gcggaaaatc tgtctcaggt gatgtagaac taacaaatat catcaaaaat 1020 tcttccttca aagccgtaat ttacggaggt tccgcaaaag atgaagttca aatcatcgac 1080 ggcaacctcg gagacttacg cgatattttg aaaaaaggcg ctacttttaa tcgagaaaca 1140 ccaggagttc ccattgctta tacaacaaac ttcctaaaag acaatgaatt agctgttatt 1200 aaaaacaact cagaatatat tgaaacaact tcaaaagctt atacagatgg aaaaattaac 1260 atcgatcact ctggaggata cgttgctcaa ttcaacattt cttgggatga agtaaattat 1320 gat 1323 <210> 61 <211> 633 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 61 Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr Ala Asn Cys Ile Thr Ile 1 5 10 15 Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu 20 25 30 Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu 35 40 45 Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala Arg Glu Val Ser Ser Arg 50 55 60 Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys Val Lys Asn Thr Asn Lys 65 70 75 80 Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Ala Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn 85 90 95 Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu Gln Thr Gly Asn Val Ala Ile Asn Glu 100 105 110 Glu Ala Ser Gly Val Asp Arg Pro Thr Leu Gln Val Glu Arg Arg His 115 120 125 Pro Gly Leu Ser Ser Asp Ser Ala Ala Glu Ile Lys Lys Arg Arg Lys 130 135 140 Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser Glu Leu Glu Ser Leu Thr Tyr Pro Asp 145 150 155 160 Lys Pro Thr Lys Ala Asn Lys Arg Lys Val Ala Lys Glu Ser Val Val 165 170 175 Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu Asp Ser Ser Met Gln Ser Ala Asp Glu 180 185 190 Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys Ala Asn Gln Lys Pro Phe Phe Pro Lys 195 200 205 Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp Ala Gly Lys Trp Val Arg Asp Lys Ile 210 215 220 Asp Glu Asn Pro Glu Val Lys Lys Ala Ile Val Asp Lys Ser Ala Gly 225 230 235 240 Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr Lys Lys Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala 245 250 255 Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu 260 265 270 Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Thr Pro Ser Glu 275 280 285 Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg 290 295 300 Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala 305 310 315 320 Thr Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Glu Asp 325 330 335 Glu Leu Glu Ile Met Arg Glu Thr Ala Pro Ser Leu Asp Ser Ser Phe 340 345 350 Thr Ser Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Ser Ala Ile Asn Arg His Ser 355 360 365 Glu Asn Phe Ser Asp Phe Pro Leu Ile Pro Thr Glu Glu Glu Leu Asn 370 375 380 Gly Arg Gly Gly Arg Pro Thr Ser Glu Glu Phe Ser Ser Leu Asn Ser 385 390 395 400 Gly Asp Phe Thr Asp Asp Glu Asn Ser Glu Thr Thr Glu Glu Glu Ile 405 410 415 Asp Arg Leu Ala Asp Leu Arg Asp Arg Gly Thr Gly Lys His Ser Arg 420 425 430 Asn Ala Gly Phe Leu Pro Leu Asn Pro Phe Ile Ser Ser Pro Val Pro 435 440 445 Ser Leu Thr Pro Lys Val Pro Lys Ile Ser Ala Pro Ala Leu Ile Ser 450 455 460 Asp Ile Thr Lys Lys Ala Pro Phe Lys Asn Pro Ser Gln Pro Leu Asn 465 470 475 480 Val Phe Asn Lys Lys Thr Thr Thr Lys Thr Val Thr Lys Lys Pro Thr 485 490 495 Pro Val Lys Thr Ala Pro Lys Leu Ala Glu Leu Pro Ala Thr Lys Pro 500 505 510 Gln Glu Thr Val Leu Arg Glu Asn Lys Thr Pro Phe Ile Glu Lys Gln 515 520 525 Ala Glu Thr Asn Lys Gln Ser Ile Asn Met Pro Ser Leu Pro Val Ile 530 535 540 Gln Lys Glu Ala Thr Glu Ser Asp Lys Glu Glu Met Lys Pro Gln Thr 545 550 555 560 Glu Glu Lys Met Val Glu Glu Ser Glu Ser Ala Asn Asn Ala Asn Gly 565 570 575 Lys Asn Arg Ser Ala Gly Ile Glu Glu Gly Lys Leu Ile Ala Lys Ser 580 585 590 Ala Glu Asp Glu Lys Ala Lys Glu Glu Pro Gly Asn His Thr Thr Leu 595 600 605 Ile Leu Ala Met Leu Ala Ile Gly Val Phe Ser Leu Gly Ala Phe Ile 610 615 620 Lys Ile Ile Gln Leu Arg Lys Asn Asn 625 630 <210> 62 <211> 639 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 62 Met Gly Leu Asn Arg Phe Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr 1 5 10 15 Ala Asn Cys Ile Thr Ile Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp 20 25 30 Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr 35 40 45 Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala 50 55 60 Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys 65 70 75 80 Val Lys Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Ala Lys 85 90 95 Ala Glu Lys Gly Pro Asn Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu Gln Thr Gly 100 105 110 Asn Val Ala Ile Asn Glu Glu Ala Ser Gly Val Asp Arg Pro Thr Leu 115 120 125 Gln Val Glu Arg Arg His Pro Gly Leu Ser Ser Asp Ser Ala Ala Glu 130 135 140 Ile Lys Lys Arg Arg Lys Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser Glu Leu Glu 145 150 155 160 Ser Leu Thr Tyr Pro Asp Lys Pro Thr Lys Ala Asn Lys Arg Lys Val 165 170 175 Ala Lys Glu Ser Val Val Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu Asp Ser Ser 180 185 190 Met Gln Ser Ala Asp Glu Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys Ala Asn Gln 195 200 205 Lys Pro Phe Phe Pro Lys Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp Ala Gly Lys 210 215 220 Trp Val Arg Asp Lys Ile Asp Glu Asn Pro Glu Val Lys Lys Ala Ile 225 230 235 240 Val Asp Lys Ser Ala Gly Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr Lys Lys Lys 245 250 255 Ser Glu Glu Val Asn Ala Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu 260 265 270 Glu Leu Arg Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn 275 280 285 Ala Pro Thr Pro Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro 290 295 300 Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu 305 310 315 320 Gly Phe Asn Ala Pro Ala Thr Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro 325 330 335 Pro Pro Pro Thr Glu Asp Glu Leu Glu Ile Met Arg Glu Thr Ala Pro 340 345 350 Ser Leu Asp Ser Ser Phe Thr Ser Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Ser 355 360 365 Ala Ile Asn Arg His Ser Glu Asn Phe Ser Asp Phe Pro Leu Ile Pro 370 375 380 Thr Glu Glu Glu Leu Asn Gly Arg Gly Gly Arg Pro Thr Ser Glu Glu 385 390 395 400 Phe Ser Ser Leu Asn Ser Gly Asp Phe Thr Asp Asp Glu Asn Ser Glu 405 410 415 Thr Thr Glu Glu Glu Ile Asp Arg Leu Ala Asp Leu Arg Asp Arg Gly 420 425 430 Thr Gly Lys His Ser Arg Asn Ala Gly Phe Leu Pro Leu Asn Pro Phe 435 440 445 Ile Ser Ser Pro Val Pro Ser Leu Thr Pro Lys Val Pro Lys Ile Ser 450 455 460 Ala Pro Ala Leu Ile Ser Asp Ile Thr Lys Lys Ala Pro Phe Lys Asn 465 470 475 480 Pro Ser Gln Pro Leu Asn Val Phe Asn Lys Lys Thr Thr Thr Lys Thr 485 490 495 Val Thr Lys Lys Pro Thr Pro Val Lys Thr Ala Pro Lys Leu Ala Glu 500 505 510 Leu Pro Ala Thr Lys Pro Gln Glu Thr Val Leu Arg Glu Asn Lys Thr 515 520 525 Pro Phe Ile Glu Lys Gln Ala Glu Thr Asn Lys Gln Ser Ile Asn Met 530 535 540 Pro Ser Leu Pro Val Ile Gln Lys Glu Ala Thr Glu Ser Asp Lys Glu 545 550 555 560 Glu Met Lys Pro Gln Thr Glu Glu Lys Met Val Glu Glu Ser Glu Ser 565 570 575 Ala Asn Asn Ala Asn Gly Lys Asn Arg Ser Ala Gly Ile Glu Glu Gly 580 585 590 Lys Leu Ile Ala Lys Ser Ala Glu Asp Glu Lys Ala Lys Glu Glu Pro 595 600 605 Gly Asn His Thr Thr Leu Ile Leu Ala Met Leu Ala Ile Gly Val Phe 610 615 620 Ser Leu Gly Ala Phe Ile Lys Ile Ile Gln Leu Arg Lys Asn Asn 625 630 635 <210> 63 <211> 93 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 63 Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu 1 5 10 15 Glu Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr 20 25 30 Glu Thr Ala Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys 35 40 45 Ser Asn Lys Val Lys Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu 50 55 60 Lys Ala Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu 65 70 75 80 Gln Thr Gly Asn Val Ala Ile Asn Glu Glu Ala Ser Gly 85 90 <210> 64 <211> 200 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 64 Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu 1 5 10 15 Glu Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr 20 25 30 Glu Thr Ala Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys 35 40 45 Ser Asn Lys Val Lys Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu 50 55 60 Lys Ala Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu 65 70 75 80 Gln Thr Gly Asn Val Ala Ile Asn Glu Glu Ala Ser Gly Val Asp Arg 85 90 95 Pro Thr Leu Gln Val Glu Arg Arg His Pro Gly Leu Ser Ser Asp Ser 100 105 110 Ala Ala Glu Ile Lys Lys Arg Arg Lys Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser 115 120 125 Glu Leu Glu Ser Leu Thr Tyr Pro Asp Lys Pro Thr Lys Ala Asn Lys 130 135 140 Arg Lys Val Ala Lys Glu Ser Val Val Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu 145 150 155 160 Asp Ser Ser Met Gln Ser Ala Asp Glu Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys 165 170 175 Ala Asn Gln Lys Pro Phe Phe Pro Lys Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp 180 185 190 Ala Gly Lys Trp Val Arg Asp Lys 195 200 <210> 65 <211> 303 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 65 Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu 1 5 10 15 Glu Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr 20 25 30 Glu Thr Ala Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys 35 40 45 Ser Asn Lys Val Lys Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu 50 55 60 Lys Ala Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu 65 70 75 80 Gln Thr Gly Asn Val Ala Ile Asn Glu Glu Ala Ser Gly Val Asp Arg 85 90 95 Pro Thr Leu Gln Val Glu Arg Arg His Pro Gly Leu Ser Ser Asp Ser 100 105 110 Ala Ala Glu Ile Lys Lys Arg Arg Lys Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser 115 120 125 Glu Leu Glu Ser Leu Thr Tyr Pro Asp Lys Pro Thr Lys Ala Asn Lys 130 135 140 Arg Lys Val Ala Lys Glu Ser Val Val Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu 145 150 155 160 Asp Ser Ser Met Gln Ser Ala Asp Glu Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys 165 170 175 Ala Asn Gln Lys Pro Phe Phe Pro Lys Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp 180 185 190 Ala Gly Lys Trp Val Arg Asp Lys Ile Asp Glu Asn Pro Glu Val Lys 195 200 205 Lys Ala Ile Val Asp Lys Ser Ala Gly Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr 210 215 220 Lys Lys Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro 225 230 235 240 Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu 245 250 255 Gly Phe Asn Ala Pro Thr Pro Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro 260 265 270 Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro 275 280 285 Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala Thr Ser Glu Pro Ser Ser 290 295 300 <210> 66 <211> 370 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 66 Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu 1 5 10 15 Glu Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr 20 25 30 Glu Thr Ala Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys 35 40 45 Ser Asn Lys Val Lys Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu 50 55 60 Lys Ala Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu 65 70 75 80 Gln Thr Gly Asn Val Ala Ile Asn Glu Glu Ala Ser Gly Val Asp Arg 85 90 95 Pro Thr Leu Gln Val Glu Arg Arg His Pro Gly Leu Ser Ser Asp Ser 100 105 110 Ala Ala Glu Ile Lys Lys Arg Arg Lys Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser 115 120 125 Glu Leu Glu Ser Leu Thr Tyr Pro Asp Lys Pro Thr Lys Ala Asn Lys 130 135 140 Arg Lys Val Ala Lys Glu Ser Val Val Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu 145 150 155 160 Asp Ser Ser Met Gln Ser Ala Asp Glu Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys 165 170 175 Ala Asn Gln Lys Pro Phe Phe Pro Lys Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp 180 185 190 Ala Gly Lys Trp Val Arg Asp Lys Ile Asp Glu Asn Pro Glu Val Lys 195 200 205 Lys Ala Ile Val Asp Lys Ser Ala Gly Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr 210 215 220 Lys Lys Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro 225 230 235 240 Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu 245 250 255 Gly Phe Asn Ala Pro Thr Pro Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro 260 265 270 Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro 275 280 285 Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala Thr Ser Glu Pro Ser Ser Phe 290 295 300 Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Glu Asp Glu Leu Glu Ile Met Arg Glu 305 310 315 320 Thr Ala Pro Ser Leu Asp Ser Ser Phe Thr Ser Gly Asp Leu Ala Ser 325 330 335 Leu Arg Ser Ala Ile Asn Arg His Ser Glu Asn Phe Ser Asp Phe Pro 340 345 350 Leu Ile Pro Thr Glu Glu Glu Leu Asn Gly Arg Gly Gly Arg Pro Thr 355 360 365 Ser Glu 370 <210> 67 <211> 390 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 67 Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr Ala Asn Cys Ile Thr Ile 1 5 10 15 Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu 20 25 30 Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu 35 40 45 Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala Arg Glu Val Ser Ser Arg 50 55 60 Asp Ile Lys Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys Val Arg Asn Thr Asn Lys 65 70 75 80 Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Glu Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn 85 90 95 Ile Asn Asn Asn Asn Ser Glu Gln Thr Glu Asn Ala Ala Ile Asn Glu 100 105 110 Glu Ala Ser Gly Ala Asp Arg Pro Ala Ile Gln Val Glu Arg Arg His 115 120 125 Pro Gly Leu Pro Ser Asp Ser Ala Ala Glu Ile Lys Lys Arg Arg Lys 130 135 140 Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser Glu Leu Glu Ser Leu Thr Tyr Pro Asp 145 150 155 160 Lys Pro Thr Lys Val Asn Lys Lys Lys Val Ala Lys Glu Ser Val Ala 165 170 175 Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu Asp Ser Ser Met Gln Ser Ala Asp Glu 180 185 190 Ser Ser Pro Gln Pro Leu Lys Ala Asn Gln Gln Pro Phe Phe Pro Lys 195 200 205 Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp Ala Gly Lys Trp Val Arg Asp Lys Ile 210 215 220 Asp Glu Asn Pro Glu Val Lys Lys Ala Ile Val Asp Lys Ser Ala Gly 225 230 235 240 Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr Lys Lys Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala 245 250 255 Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu 260 265 270 Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala Thr Ser Glu 275 280 285 Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg 290 295 300 Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala 305 310 315 320 Thr Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Glu Asp 325 330 335 Glu Leu Glu Ile Ile Arg Glu Thr Ala Ser Ser Leu Asp Ser Ser Phe 340 345 350 Thr Arg Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Asn Ala Ile Asn Arg His Ser 355 360 365 Gln Asn Phe Ser Asp Phe Pro Pro Ile Pro Thr Glu Glu Glu Leu Asn 370 375 380 Gly Arg Gly Gly Arg Pro 385 390 <210> 68 <211> 1170 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 68 atgcgtgcga tgatggtggt tttcattact gccaattgca ttacgattaa ccccgacata 60 atatttgcag cgacagatag cgaagattct agtctaaaca cagatgaatg ggaagaagaa 120 aaaacagaag agcaaccaag cgaggtaaat acgggaccaa gatacgaaac tgcacgtgaa 180 gtaagttcac gtgatattaa agaactagaa aaatcgaata aagtgagaaa tacgaacaaa 240 gcagacctaa tagcaatgtt gaaagaaaaa gcagaaaaag gtccaaatat caataataac 300 aacagtgaac aaactgagaa tgcggctata aatgaagagg cttcaggagc cgaccgacca 360 gctatacaag tggagcgtcg tcatccagga ttgccatcgg atagcgcagc ggaaattaaa 420 aaaagaagga aagccatagc atcatcggat agtgagcttg aaagccttac ttatccggat 480 aaaccaacaa aagtaaataa gaaaaaagtg gcgaaagagt cagttgcgga tgcttctgaa 540 agtgacttag attctagcat gcagtcagca gatgagtctt caccacaacc tttaaaagca 600 aaccaacaac catttttccc taaagtattt aaaaaaataa aagatgcggg gaaatgggta 660 cgtgataaaa tcgacgaaaa tcctgaagta aagaaagcga ttgttgataa aagtgcaggg 720 ttaattgacc aattattaac caaaaagaaa agtgaagagg taaatgcttc ggacttcccg 780 ccaccaccta cggatgaaga gttaagactt gctttgccag agacaccaat gcttcttggt 840 tttaatgctc ctgctacatc agaaccgagc tcattcgaat ttccaccacc acctacggat 900 gaagagttaa gacttgcttt gccagagacg ccaatgcttc ttggttttaa tgctcctgct 960 acatcggaac cgagctcgtt cgaatttcca ccgcctccaa cagaagatga actagaaatc 1020 atccgggaaa cagcatcctc gctagattct agttttacaa gaggggattt agctagtttg 1080 agaaatgcta ttaatcgcca tagtcaaaat ttctctgatt tcccaccaat cccaacagaa 1140 gaagagttga acgggagagg cggtagacca 1170 <210> 69 <211> 100 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 69 Met Gly Leu Asn Arg Phe Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr 1 5 10 15 Ala Asn Cys Ile Thr Ile Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp 20 25 30 Ser Glu Asp Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr 35 40 45 Glu Glu Gln Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala 50 55 60 Arg Glu Val Ser Ser Arg Asp Ile Lys Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys 65 70 75 80 Val Arg Asn Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Glu Lys 85 90 95 Ala Glu Lys Gly 100 <210> 70 <211> 390 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 70 Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr Ala Asn Cys Ile Thr Ile 1 5 10 15 Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala Ala Thr Asp Ser Glu Asp Ser Ser Leu 20 25 30 Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr Glu Glu Gln Pro Ser Glu 35 40 45 Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala Arg Glu Val Ser Ser Arg 50 55 60 Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys Val Lys Asn Thr Asn Lys 65 70 75 80 Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Ala Lys Ala Glu Lys Gly Pro Asn 85 90 95 Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu Gln Thr Gly Asn Val Ala Ile Asn Glu 100 105 110 Glu Ala Ser Gly Val Asp Arg Pro Thr Leu Gln Val Glu Arg Arg His 115 120 125 Pro Gly Leu Ser Ser Asp Ser Ala Ala Glu Ile Lys Lys Arg Arg Lys 130 135 140 Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser Glu Leu Glu Ser Leu Thr Tyr Pro Asp 145 150 155 160 Lys Pro Thr Lys Ala Asn Lys Arg Lys Val Ala Lys Glu Ser Val Val 165 170 175 Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu Asp Ser Ser Met Gln Ser Ala Asp Glu 180 185 190 Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys Ala Asn Gln Lys Pro Phe Phe Pro Lys 195 200 205 Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp Ala Gly Lys Trp Val Arg Asp Lys Ile 210 215 220 Asp Glu Asn Pro Glu Val Lys Lys Ala Ile Val Asp Lys Ser Ala Gly 225 230 235 240 Leu Ile Asp Gln Leu Leu Thr Lys Lys Lys Ser Glu Glu Val Asn Ala 245 250 255 Ser Asp Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg Leu Ala Leu 260 265 270 Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Thr Pro Ser Glu 275 280 285 Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Asp Glu Glu Leu Arg 290 295 300 Leu Ala Leu Pro Glu Thr Pro Met Leu Leu Gly Phe Asn Ala Pro Ala 305 310 315 320 Thr Ser Glu Pro Ser Ser Phe Glu Phe Pro Pro Pro Pro Thr Glu Asp 325 330 335 Glu Leu Glu Ile Met Arg Glu Thr Ala Pro Ser Leu Asp Ser Ser Phe 340 345 350 Thr Ser Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Ser Ala Ile Asn Arg His Ser 355 360 365 Glu Asn Phe Ser Asp Phe Pro Leu Ile Pro Thr Glu Glu Glu Leu Asn 370 375 380 Gly Arg Gly Gly Arg Pro 385 390 <210> 71 <211> 1170 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 71 atgcgtgcga tgatggtagt tttcattact gccaactgca ttacgattaa ccccgacata 60 atatttgcag cgacagatag cgaagattcc agtctaaaca cagatgaatg ggaagaagaa 120 aaaacagaag agcagccaag cgaggtaaat acgggaccaa gatacgaaac tgcacgtgaa 180 gtaagttcac gtgatattga ggaactagaa aaatcgaata aagtgaaaaa tacgaacaaa 240 gcagacctaa tagcaatgtt gaaagcaaaa gcagagaaag gtccgaataa caataataac 300 aacggtgagc aaacaggaaa tgtggctata aatgaagagg cttcaggagt cgaccgacca 360 actctgcaag tggagcgtcg tcatccaggt ctgtcatcgg atagcgcagc ggaaattaaa 420 aaaagaagaa aagccatagc gtcgtcggat agtgagcttg aaagccttac ttatccagat 480 aaaccaacaa aagcaaataa gagaaaagtg gcgaaagagt cagttgtgga tgcttctgaa 540 agtgacttag attctagcat gcagtcagca gacgagtcta caccacaacc tttaaaagca 600 aatcaaaaac catttttccc taaagtattt aaaaaaataa aagatgcggg gaaatgggta 660 cgtgataaaa tcgacgaaaa tcctgaagta aagaaagcga ttgttgataa aagtgcaggg 720 ttaattgacc aattattaac caaaaagaaa agtgaagagg taaatgcttc ggacttcccg 780 ccaccaccta cggatgaaga gttaagactt gctttgccag agacaccgat gcttctcggt 840 tttaatgctc ctactccatc ggaaccgagc tcattcgaat ttccgccgcc acctacggat 900 gaagagttaa gacttgcttt gccagagacg ccaatgcttc ttggttttaa tgctcctgct 960 acatcggaac cgagctcatt cgaatttcca ccgcctccaa cagaagatga actagaaatt 1020 atgcgggaaa cagcaccttc gctagattct agttttacaa gcggggattt agctagtttg 1080 agaagtgcta ttaatcgcca tagcgaaaat ttctctgatt tcccactaat cccaacagaa 1140 gaagagttga acgggagagg cggtagacca 1170 <210> 72 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 72 Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu 1 5 10 15 Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Ser Arg Ala Thr Asp Ser Glu Asp 20 25 30 Ser Ser Leu Asn Thr Asp Glu Trp Glu Glu Glu Lys Thr Glu Glu Gln 35 40 45 Pro Ser Glu Val Asn Thr Gly Pro Arg Tyr Glu Thr Ala Arg Glu Val 50 55 60 Ser Ser Arg Asp Ile Glu Glu Leu Glu Lys Ser Asn Lys Val Lys Asn 65 70 75 80 Thr Asn Lys Ala Asp Leu Ile Ala Met Leu Lys Ala Lys Ala Glu Lys 85 90 95 Gly Pro Asn Asn Asn Asn Asn Asn Gly Glu Gln Thr Gly Asn Val Ala 100 105 110 Ile Asn Glu Glu Ala Ser Gly Val Asp Arg Pro Thr Leu Gln Val Glu 115 120 125 Arg Arg His Pro Gly Leu Ser Ser Asp Ser Ala Ala Glu Ile Lys Lys 130 135 140 Arg Arg Lys Ala Ile Ala Ser Ser Asp Ser Glu Leu Glu Ser Leu Thr 145 150 155 160 Tyr Pro Asp Lys Pro Thr Lys Ala Asn Lys Arg Lys Val Ala Lys Glu 165 170 175 Ser Val Val Asp Ala Ser Glu Ser Asp Leu Asp Ser Ser Met Gln Ser 180 185 190 Ala Asp Glu Ser Thr Pro Gln Pro Leu Lys Ala Asn Gln Lys Pro Phe 195 200 205 Phe Pro Lys Val Phe Lys Lys Ile Lys Asp Ala Gly Lys Trp Val Arg 210 215 220 Asp Lys 225 <210> 73 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 73 Gln Asp Asn Lys Arg 1 5 <210> 74 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 74 Glu Cys Thr Gly Leu Ala Trp Glu Trp Trp Arg 1 5 10 <210> 75 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 75 Glu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys Arg 1 5 10 <210> 76 <211> 368 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 76 Met Val Thr Gly Trp His Arg Pro Thr Trp Ile Glu Ile Asp Arg Ala 1 5 10 15 Ala Ile Arg Glu Asn Ile Lys Asn Glu Gln Asn Lys Leu Pro Glu Ser 20 25 30 Val Asp Leu Trp Ala Val Val Lys Ala Asn Ala Tyr Gly His Gly Ile 35 40 45 Ile Glu Val Ala Arg Thr Ala Lys Glu Ala Gly Ala Lys Gly Phe Cys 50 55 60 Val Ala Ile Leu Asp Glu Ala Leu Ala Leu Arg Glu Ala Gly Phe Gln 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ile Leu Val Leu Gly Ala Thr Arg Lys Glu Asp Ala Asn 85 90 95 Leu Ala Ala Lys Asn His Ile Ser Leu Thr Val Phe Arg Glu Asp Trp 100 105 110 Leu Glu Asn Leu Thr Leu Glu Ala Thr Leu Arg Ile His Leu Lys Val 115 120 125 Asp Ser Gly Met Gly Arg Leu Gly Ile Arg Thr Thr Glu Glu Ala Arg 130 135 140 Arg Ile Glu Ala Thr Ser Thr Asn Asp His Gln Leu Gln Leu Glu Gly 145 150 155 160 Ile Tyr Thr His Phe Ala Thr Ala Asp Gln Leu Glu Thr Ser Tyr Phe 165 170 175 Glu Gln Gln Leu Ala Lys Phe Gln Thr Ile Leu Thr Ser Leu Lys Lys 180 185 190 Arg Pro Thr Tyr Val His Thr Ala Asn Ser Ala Ala Ser Leu Leu Gln 195 200 205 Pro Gln Ile Gly Phe Asp Ala Ile Arg Phe Gly Ile Ser Met Tyr Gly 210 215 220 Leu Thr Pro Ser Thr Glu Ile Lys Thr Ser Leu Pro Phe Glu Leu Lys 225 230 235 240 Pro Ala Leu Ala Leu Tyr Thr Glu Met Val His Val Lys Glu Leu Ala 245 250 255 Pro Gly Asp Ser Val Ser Tyr Gly Ala Thr Tyr Thr Ala Thr Glu Arg 260 265 270 Glu Trp Val Ala Thr Leu Pro Ile Gly Tyr Ala Asp Gly Leu Ile Arg 275 280 285 His Tyr Ser Gly Phe His Val Leu Val Asp Gly Glu Pro Ala Pro Ile 290 295 300 Ile Gly Arg Val Cys Met Asp Gln Thr Ile Ile Lys Leu Pro Arg Glu 305 310 315 320 Phe Gln Thr Gly Ser Lys Val Thr Ile Ile Gly Lys Asp His Gly Asn 325 330 335 Thr Val Thr Ala Asp Asp Ala Ala Gln Tyr Leu Asp Thr Ile Asn Tyr 340 345 350 Glu Val Thr Cys Leu Leu Asn Glu Arg Ile Pro Arg Lys Tyr Ile His 355 360 365 <210> 77 <211> 289 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 77 Met Lys Val Leu Val Asn Asn His Leu Val Glu Arg Glu Asp Ala Thr 1 5 10 15 Val Asp Ile Glu Asp Arg Gly Tyr Gln Phe Gly Asp Gly Val Tyr Glu 20 25 30 Val Val Arg Leu Tyr Asn Gly Lys Phe Phe Thr Tyr Asn Glu His Ile 35 40 45 Asp Arg Leu Tyr Ala Ser Ala Ala Lys Ile Asp Leu Val Ile Pro Tyr 50 55 60 Ser Lys Glu Glu Leu Arg Glu Leu Leu Glu Lys Leu Val Ala Glu Asn 65 70 75 80 Asn Ile Asn Thr Gly Asn Val Tyr Leu Gln Val Thr Arg Gly Val Gln 85 90 95 Asn Pro Arg Asn His Val Ile Pro Asp Asp Phe Pro Leu Glu Gly Val 100 105 110 Leu Thr Ala Ala Ala Arg Glu Val Pro Arg Asn Glu Arg Gln Phe Val 115 120 125 Glu Gly Gly Thr Ala Ile Thr Glu Glu Asp Val Arg Trp Leu Arg Cys 130 135 140 Asp Ile Lys Ser Leu Asn Leu Leu Gly Asn Ile Leu Ala Lys Asn Lys 145 150 155 160 Ala His Gln Gln Asn Ala Leu Glu Ala Ile Leu His Arg Gly Glu Gln 165 170 175 Val Thr Glu Cys Ser Ala Ser Asn Val Ser Ile Ile Lys Asp Gly Val 180 185 190 Leu Trp Thr His Ala Ala Asp Asn Leu Ile Leu Asn Gly Ile Thr Arg 195 200 205 Gln Val Ile Ile Asp Val Ala Lys Lys Asn Gly Ile Pro Val Lys Glu 210 215 220 Ala Asp Phe Thr Leu Thr Asp Leu Arg Glu Ala Asp Glu Val Phe Ile 225 230 235 240 Ser Ser Thr Thr Ile Glu Ile Thr Pro Ile Thr His Ile Asp Gly Val 245 250 255 Gln Val Ala Asp Gly Lys Arg Gly Pro Ile Thr Ala Gln Leu His Gln 260 265 270 Tyr Phe Val Glu Glu Ile Thr Arg Ala Cys Gly Glu Leu Glu Phe Ala 275 280 285 Lys <210> 78 <211> 1107 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 78 atggtgacag gctggcatcg tccaacatgg attgaaatag accgcgcagc aattcgcgaa 60 aatataaaaa atgaacaaaa taaactcccg gaaagtgtcg acttatgggc agtagtcaaa 120 gctaatgcat atggtcacgg aattatcgaa gttgctagga cggcgaaaga agctggagca 180 aaaggtttct gcgtagccat tttagatgag gcactggctc ttagagaagc tggatttcaa 240 gatgacttta ttcttgtgct tggtgcaacc agaaaagaag atgctaatct ggcagccaaa 300 aaccacattt cacttactgt ttttagagaa gattggctag agaatctaac gctagaagca 360 acacttcgaa ttcatttaaa agtagatagc ggtatggggc gtctcggtat tcgtacgact 420 gaagaagcac ggcgaattga agcaaccagt actaatgatc accaattaca actggaaggt 480 atttacacgc attttgcaac agccgaccag ctagaaacta gttattttga acaacaatta 540 gctaagttcc aaacgatttt aacgagttta aaaaaacgac caacttatgt tcatacagcc 600 aattcagctg cttcattgtt acagccacaa atcgggtttg atgcgattcg ctttggtatt 660 tcgatgtatg gattaactcc ctccacagaa atcaaaacta gcttgccgtt tgagcttaaa 720 cctgcacttg cactctatac cgagatggtt catgtgaaag aacttgcacc aggcgatagc 780 gttagctacg gagcaactta tacagcaaca gagcgagaat gggttgcgac attaccaatt 840 ggctatgcgg atggattgat tcgtcattac agtggtttcc atgttttagt agacggtgaa 900 ccagctccaa tcattggtcg agtttgtatg gatcaaacca tcataaaact accacgtgaa 960 tttcaaactg gttcaaaagt aacgataatt ggcaaagatc atggtaacac ggtaacagca 1020 gatgatgccg ctcaatattt agatacaatt aattatgagg taacttgttt gttaaatgag 1080 cgcataccta gaaaatacat ccattag 1107 <210> 79 <211> 870 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 79 atgaaagtat tagtaaataa ccatttagtt gaaagagaag atgccacagt tgacattgaa 60 gaccgcggat atcagtttgg tgatggtgta tatgaagtag ttcgtctata taatggaaaa 120 ttctttactt ataatgaaca cattgatcgc ttatatgcta gtgcagcaaa aattgactta 180 gttattcctt attccaaaga agagctacgt gaattacttg aaaaattagt tgccgaaaat 240 aatatcaata cagggaatgt ctatttacaa gtgactcgtg gtgttcaaaa cccacgtaat 300 catgtaatcc ctgatgattt ccctctagaa ggcgttttaa cagcagcagc tcgtgaagta 360 cctagaaacg agcgtcaatt cgttgaaggt ggaacggcga ttacagaaga agatgtgcgc 420 tggttacgct gtgatattaa gagcttaaac cttttaggaa atattctagc aaaaaataaa 480 gcacatcaac aaaatgcttt ggaagctatt ttacatcgcg gggaacaagt aacagaatgt 540 tctgcttcaa acgtttctat tattaaagat ggtgtattat ggacgcatgc ggcagataac 600 ttaatcttaa atggtatcac tcgtcaagtt atcattgatg ttgcgaaaaa gaatggcatt 660 cctgttaaag aagcggattt cactttaaca gaccttcgtg aagcggatga agtgttcatt 720 tcaagtacaa ctattgaaat tacacctatt acgcatattg acggagttca agtagctgac 780 ggaaaacgtg gaccaattac agcgcaactt catcaatatt ttgtagaaga aatcactcgt 840 gcatgtggcg aattagagtt tgcaaaataa 870 <210> 80 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 80 Met Asn Ala Gln Ala Glu Glu Phe Lys Lys Tyr Leu Glu Thr Asn Gly 1 5 10 15 Ile Lys Pro Lys Gln Phe His Lys Lys Glu Leu Ile Phe Asn Gln Trp 20 25 30 Asp Pro Gln Glu Tyr Cys Ile Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Thr Lys Leu 35 40 45 Thr Ser Ile Ser Glu Asn Gly Thr Ile Met Asn Leu Gln Tyr Tyr Lys 50 55 60 Gly Ala Phe Val Ile Met Ser Gly Phe Ile Asp Thr Glu Thr Ser Val 65 70 75 80 Gly Tyr Tyr Asn Leu Glu Val Ile Ser Glu Gln Ala Thr Ala Tyr Val 85 90 95 Ile Lys Ile Asn Glu Leu Lys Glu Leu Leu Ser Lys Asn Leu Thr His 100 105 110 Phe Phe Tyr Val Phe Gln Thr Leu Gln Lys Gln Val Ser Tyr Ser Leu 115 120 125 Ala Lys Phe Asn Asp Phe Ser Ile Asn Gly Lys Leu Gly Ser Ile Cys 130 135 140 Gly Gln Leu Leu Ile Leu Thr Tyr Val Tyr Gly Lys Glu Thr Pro Asp 145 150 155 160 Gly Ile Lys Ile Thr Leu Asp Asn Leu Thr Met Gln Glu Leu Gly Tyr 165 170 175 Ser Ser Gly Ile Ala His Ser Ser Ala Val Ser Arg Ile Ile Ser Lys 180 185 190 Leu Lys Gln Glu Lys Val Ile Val Tyr Lys Asn Ser Cys Phe Tyr Val 195 200 205 Gln Asn Leu Asp Tyr Leu Lys Arg Tyr Ala Pro Lys Leu Asp Glu Trp 210 215 220 Phe Tyr Leu Ala Cys Pro Ala Thr Trp Gly Lys Leu Asn 225 230 235 <210> 81 <211> 714 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 81 atgaacgctc aagcagaaga attcaaaaaa tatttagaaa ctaacgggat aaaaccaaaa 60 caatttcata aaaaagaact tatttttaac caatgggatc cacaagaata ttgtattttt 120 ctatatgatg gtatcacaaa gctcacgagt attagcgaga acgggaccat catgaattta 180 caatactaca aaggggcttt cgttataatg tctggcttta ttgatacaga aacatcggtt 240 ggctattata atttagaagt cattagcgag caggctaccg catacgttat caaaataaac 300 gaactaaaag aactactgag caaaaatctt acgcactttt tctatgtttt ccaaacccta 360 caaaaacaag tttcatacag cctagctaaa tttaatgatt tttcgattaa cgggaagctt 420 ggctctattt gcggtcaact tttaatcctg acctatgtgt atggtaaaga aactcctgat 480 ggcatcaaga ttacactgga taatttaaca atgcaggagt taggatattc aagtggcatc 540 gcacatagct cagctgttag cagaattatt tccaaattaa agcaagagaa agttatcgtg 600 tataaaaatt catgctttta tgtacaaaat cttgattatc tcaaaagata tgcccctaaa 660 ttagatgaat ggttttattt agcatgtcct gctacttggg gaaaattaaa ttaa 714 <210> 82 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 82 Met Asn Ala Gln Ala Glu Glu Phe Lys Lys Tyr Leu Glu Thr Asn Gly 1 5 10 15 Ile Lys Pro Lys Gln Phe His Lys Lys Glu Leu Ile Phe Asn Gln Trp 20 25 30 Asp Pro Gln Glu Tyr Cys Ile Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Thr Lys Leu 35 40 45 Thr Ser Ile Ser Glu Asn Gly Thr Ile Met Asn Leu Gln Tyr Tyr Lys 50 55 60 Gly Ala Phe Val Ile Met Ser Gly Phe Ile Asp Thr Glu Thr Ser Val 65 70 75 80 Gly Tyr Tyr Asn Leu Glu Val Ile Ser Glu Gln Ala Thr Ala Tyr Val 85 90 95 Ile Lys Ile Asn Glu Leu Lys Glu Leu Leu Ser Lys Asn Leu Thr His 100 105 110 Phe Phe Tyr Val Phe Gln Thr Leu Gln Lys Gln Val Ser Tyr Ser Leu 115 120 125 Ala Lys Phe Asn Val Phe Ser Ile Asn Gly Lys Leu Gly Ser Ile Cys 130 135 140 Gly Gln Leu Leu Ile Leu Thr Tyr Val Tyr Gly Lys Glu Thr Pro Asp 145 150 155 160 Gly Ile Lys Ile Thr Leu Asp Asn Leu Thr Met Gln Glu Leu Gly Tyr 165 170 175 Ser Ser Gly Ile Ala His Ser Ser Ala Val Ser Arg Ile Ile Ser Lys 180 185 190 Leu Lys Gln Glu Lys Val Ile Val Tyr Lys Asn Ser Cys Phe Tyr Val 195 200 205 Gln Asn Arg Asp Tyr Leu Lys Arg Tyr Ala Pro Lys Leu Asp Glu Trp 210 215 220 Phe Tyr Leu Ala Cys Pro Ala Thr Trp Gly Lys Leu Asn 225 230 235 <210> 83 <211> 713 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 83 atgaacgctc aagcagaaga attcaaaaaa tatttagaaa ctaacgggat aaaaccaaaa 60 caatttcata aaaaagaact tatttttaac caatgggatc cacaagaata ttgtattttt 120 ctatatgatg gtatcacaaa gctcacgagt attagcgaga acgggaccat catgaattta 180 caatactaca aaggggcttt cgttataatg tctggcttta ttgatacaga aacatcggtt 240 ggctattata atttagaagt cattagcgag caggctaccg catacgttat caaaataaac 300 gaactaaaag aactactgag caaaaatctt acgcactttt tctatgtttt ccaaacccta 360 caaaaacaag tttcatacag cctagctaaa tttaatgttt tttcgattaa cgggaagctt 420 ggctctattt gcggtcaact tttaatcctg acctatgtgt atggtaaaga aactcctgat 480 ggcatcaaga ttacactgga taatttaaca atgcaggagt taggatattc aagtggcatc 540 gcacatagct cagctgttag cagaattatt tccaaattaa agcaagagaa agttatcgtg 600 tataaaaatt catgctttta tgtacaaaat ctgattatct caaaagatat gcccctaaat 660 tagatgaatg gttttattta gcatgtcctg ctacttgggg aaaattaaat taa 713 <210> 84 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 84 ggtggtggag ga 12 <210> 85 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 85 ggtggaggtg ga 12 <210> 86 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 86 ggtggaggag gt 12 <210> 87 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 87 ggaggtggtg ga 12 <210> 88 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 88 ggaggaggtg gt 12 <210> 89 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 89 ggaggtggag gt 12 <210> 90 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 90 ggaggaggag gt 12 <210> 91 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 91 ggaggaggtg ga 12 <210> 92 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 92 ggaggtggag ga 12 <210> 93 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 93 ggtggaggag ga 12 <210> 94 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 94 ggaggaggag ga 12 <210> 95 <211> 529 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 95 Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu 1 5 10 15 Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys 20 25 30 Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser 35 40 45 Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr 50 55 60 Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly 65 70 75 80 Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn 85 90 95 Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn 100 105 110 Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly 115 120 125 Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val 130 135 140 Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly 145 150 155 160 Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser 165 170 175 Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys 180 185 190 Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp 195 200 205 Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala 210 215 220 Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser 225 230 235 240 Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr 245 250 255 Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys 260 265 270 Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn 275 280 285 Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu 290 295 300 Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp 305 310 315 320 Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn 325 330 335 Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala 340 345 350 Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp 355 360 365 Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro 370 375 380 Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile 385 390 395 400 Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp 405 410 415 Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn 420 425 430 Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Pro Glu Gly Asn Glu Ile Val 435 440 445 Gln His Lys Asn Trp Ser Glu Asn Asn Lys Ser Lys Leu Ala His Phe 450 455 460 Thr Ser Ser Ile Tyr Leu Pro Gly Asn Ala Arg Asn Ile Asn Val Tyr 465 470 475 480 Ala Lys Glu Ala Thr Gly Leu Ala Trp Glu Ala Ala Arg Thr Val Ile 485 490 495 Asp Asp Arg Asn Leu Pro Leu Val Lys Asn Arg Asn Ile Ser Ile Trp 500 505 510 Gly Thr Thr Leu Tyr Pro Lys Tyr Ser Asn Lys Val Asp Asn Pro Ile 515 520 525 Glu <210> 96 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 96 Glu Ala Thr Gly Leu Ala Trp Glu Ala Ala Arg 1 5 10 <210> 97 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 97 Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu 1 5 10 15 Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys 20 25 <210> 98 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 98 Met Gly Leu Asn Arg Phe Met Arg Ala Met Met Val Val Phe Ile Thr 1 5 10 15 Ala Asn Cys Ile Thr Ile Asn Pro Asp Ile Ile Phe Ala 20 25 <210> 99 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 99 Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr 1 5 10 15 Lys Asp Asp Asp Lys 20 <210> 100 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 100 Ile Leu Ile Gly Val Leu Val Gly Val 1 5 <210> 101 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 101 Ile Met Ile Gly Val Leu Val Gly Val 1 5 <210> 102 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 102 Ile Leu Met Gly Val Leu Val Gly Val 1 5 <210> 103 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 103 Ile Met Ile Gly Val Leu Val Gly Val 1 5 <210> 104 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 104 His Val Phe Gly Tyr Ser Trp Tyr Lys 1 5 <210> 105 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 105 His Leu Phe Gly Tyr Ser Trp Tyr Lys 1 5 <210> 106 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 106 Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Phe 1 5 <210> 107 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 107 Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile 1 5 <210> 108 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 108 Ile Pro Gln Val His Thr Gln Val Leu 1 5 <210> 109 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 109 Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu 1 5 <210> 110 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 110 Ser Leu Tyr Tyr Trp Pro Arg Pro Arg 1 5 <210> 111 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 111 Ser Thr Tyr Tyr Trp Pro Arg Pro Arg 1 5 <210> 112 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 112 Trp Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Val Met 1 5 <210> 113 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 113 Trp Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Val Gln 1 5 <210> 114 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 114 Ile Met Ala Lys Phe Leu His Trp Leu 1 5 <210> 115 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 115 Ile Leu Ala Lys Phe Leu His Trp Leu 1 5 <210> 116 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 116 Val Tyr Ile Leu Gly Gly Ser Gln Phe 1 5 <210> 117 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 117 Val Tyr Ile Leu Gly Gly Ser Gln Leu 1 5 <210> 118 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 118 Lys Val Pro Glu Ile Val His Phe Leu 1 5 <210> 119 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 119 Lys Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu 1 5 <210> 120 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 120 Tyr Met Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys 1 5 <210> 121 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 121 Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys 1 5 <210> 122 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 122 Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Phe 1 5 <210> 123 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 123 Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile 1 5 <210> 124 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 124 Leu Pro Trp Thr Met Asn Tyr Pro Leu 1 5 <210> 125 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 125 Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro Leu 1 5 <210> 126 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 126 Met Pro Ser Leu Arg Glu Ala Ala Leu 1 5 <210> 127 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 127 Tyr Pro Ser Leu Arg Glu Ala Ala Leu 1 5 <210> 128 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 128 Tyr Leu Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys 1 5 <210> 129 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 129 Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys 1 5 <210> 130 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 130 Tyr Leu Met Pro Val Asn Ser Glu Val 1 5 <210> 131 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 131 Tyr Met Met Pro Val Asn Ser Glu Val 1 5 <210> 132 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 132 Val Trp Gly Ile Arg Leu Glu His Phe 1 5 <210> 133 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 133 Val Tyr Gly Ile Arg Leu Glu His Phe 1 5 <210> 134 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 134 Arg Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Val 1 5 <210> 135 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 135 Arg Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Met 1 5 <210> 136 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 136 Ala Pro Arg Gly Pro His Gly Gly Met 1 5 <210> 137 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 137 Ala Pro Arg Gly Pro His Gly Gly Ala 1 5 <210> 138 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 138 Met Ala Pro Asp Val Val Ala Phe Val 1 5 <210> 139 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 139 Glu Ala Pro Asp Val Val Ala Phe Val 1 5 <210> 140 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 140 Asn Met Thr His Val Leu Tyr Pro Leu 1 5 <210> 141 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 141 Asn Leu Thr His Val Leu Tyr Pro Val 1 5 <210> 142 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 142 Gly Met Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg 1 5 <210> 143 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 143 Gly Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg 1 5 <210> 144 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 144 Thr Tyr Ser Val Ser Phe Phe Ser Trp 1 5 <210> 145 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 145 Thr Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu 1 5 <210> 146 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 146 Asn Pro Gln Pro Val Trp Leu Cys Leu 1 5 <210> 147 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 147 Asn Ser Gln Pro Val Trp Leu Cys Leu 1 5 <210> 148 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 148 Leu Met Gln Ala Glu Ala Pro Arg Leu 1 5 <210> 149 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 149 Leu Leu Gln Ala Glu Ala Pro Arg Leu 1 5 <210> 150 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 150 Arg Leu Gln Gly Ile Ser Pro Lys Val 1 5 <210> 151 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 151 Arg Leu Gln Gly Ile Ser Pro Lys Ile 1 5 <210> 152 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 152 Leu Leu Leu Gly Thr Ile His Ala Val 1 5 <210> 153 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 153 Leu Leu Leu Gly Thr Ile His Ala Leu 1 5 <210> 154 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 154 Lys Tyr Lys Lys Phe Pro Trp Trp Leu 1 5 <210> 155 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 155 Lys Tyr Lys Lys Phe Pro His Trp Leu 1 5 <210> 156 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 156 Lys Met Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu 1 5 <210> 157 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 157 Lys His Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu 1 5 <210> 158 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 158 Ser Trp Phe Lys Asn Trp Pro Phe Phe 1 5 <210> 159 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 159 Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu 1 5 <210> 160 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 160 Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 161 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 161 Tyr Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val 1 5 <210> 162 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 162 Tyr Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu 1 5 <210> 163 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 163 Tyr Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val 1 5 <210> 164 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 164 Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Val 1 5 <210> 165 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 165 Tyr Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val 1 5 <210> 166 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 166 Lys Leu Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu 1 5 <210> 167 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 167 Tyr Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu 1 5 <210> 168 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 168 Gly Leu Arg Arg Gly Ile Gln Asp Val 1 5 <210> 169 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 169 Tyr Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 170 <211> 702 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 170 Met Glu Ser Pro Ser Ala Pro Pro His Arg Trp Cys Ile Pro Trp Gln 1 5 10 15 Arg Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr 20 25 30 Thr Ala Lys Leu Thr Ile Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly 35 40 45 Lys Glu Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln His Leu Phe Gly 50 55 60 Tyr Ser Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Ile 65 70 75 80 Gly Tyr Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser 85 90 95 Gly Arg Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Ile 100 105 110 Ile Gln Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser Asp 115 120 125 Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu 130 135 140 Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys 145 150 155 160 Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr 165 170 175 Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln 180 185 190 Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn 195 200 205 Asp Thr Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg 210 215 220 Arg Ser Asp Ser Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro 225 230 235 240 Thr Ile Ser Pro Leu Asn Thr Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Asn Leu Asn 245 250 255 Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe 260 265 270 Val Asn Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn 275 280 285 Ile Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys Gln Ala His Asn Ser 290 295 300 Asp Thr Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Thr Ile Thr Val Tyr Ala 305 310 315 320 Glu Pro Pro Lys Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu 325 330 335 Asp Glu Asp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr 340 345 350 Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg 355 360 365 Leu Gln Leu Ser Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr 370 375 380 Arg Asn Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Lys Leu Ser 385 390 395 400 Val Asp His Ser Asp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp 405 410 415 Asp Pro Thr Ile Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn 420 425 430 Leu Ser Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser 435 440 445 Trp Leu Ile Asp Gly Asn Ile Gln Gln His Thr Gln Glu Leu Phe Ile 450 455 460 Ser Asn Ile Thr Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Asn 465 470 475 480 Asn Ser Ala Ser Gly His Ser Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Thr Val 485 490 495 Ser Ala Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro 500 505 510 Val Glu Asp Lys Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Ala Gln 515 520 525 Asn Thr Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser 530 535 540 Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn 545 550 555 560 Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser 565 570 575 Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu Tyr Gly 580 585 590 Pro Asp Thr Pro Ile Ile Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly 595 600 605 Ala Asn Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln 610 615 620 Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu 625 630 635 640 Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe 645 650 655 Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile 660 665 670 Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala Gly Ala Thr 675 680 685 Val Gly Ile Met Ile Gly Val Leu Val Gly Val Ala Leu Ile 690 695 700 <210> 171 <211> 139 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 171 Met Ser Trp Arg Gly Arg Ser Thr Tyr Tyr Trp Pro Arg Pro Arg Arg 1 5 10 15 Tyr Val Gln Pro Pro Glu Met Ile Gly Pro Met Arg Pro Glu Gln Phe 20 25 30 Ser Asp Glu Val Glu Pro Ala Thr Pro Glu Glu Gly Glu Pro Ala Thr 35 40 45 Gln Arg Gln Asp Pro Ala Ala Ala Gln Glu Gly Glu Asp Glu Gly Ala 50 55 60 Ser Ala Gly Gln Gly Pro Lys Pro Glu Ala Asp Ser Gln Glu Gln Gly 65 70 75 80 His Pro Gln Thr Gly Cys Glu Cys Glu Asp Gly Pro Asp Gly Gln Glu 85 90 95 Met Asp Pro Pro Asn Pro Glu Glu Val Lys Thr Pro Glu Glu Glu Met 100 105 110 Arg Ser His Tyr Val Ala Gln Thr Gly Ile Leu Trp Leu Leu Met Asn 115 120 125 Asn Cys Phe Leu Asn Leu Ser Pro Arg Lys Pro 130 135 <210> 172 <211> 1132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 172 Met Pro Arg Ala Pro Arg Cys Arg Ala Val Arg Ser Leu Leu Arg Ser 1 5 10 15 His Tyr Arg Glu Val Leu Pro Leu Ala Thr Phe Val Arg Arg Leu Gly 20 25 30 Pro Gln Gly Trp Arg Leu Val Gln Arg Gly Asp Pro Ala Ala Phe Arg 35 40 45 Ala Leu Val Ala Gln Cys Leu Val Cys Val Pro Trp Asp Ala Arg Pro 50 55 60 Pro Pro Ala Ala Pro Ser Phe Arg Gln Val Ser Cys Leu Lys Glu Leu 65 70 75 80 Val Ala Arg Val Leu Gln Arg Leu Cys Glu Arg Gly Ala Lys Asn Val 85 90 95 Leu Ala Phe Gly Phe Ala Leu Leu Asp Gly Ala Arg Gly Gly Pro Pro 100 105 110 Glu Ala Phe Thr Thr Ser Val Arg Ser Tyr Leu Pro Asn Thr Val Thr 115 120 125 Asp Ala Leu Arg Gly Ser Gly Ala Trp Gly Leu Leu Leu Arg Arg Val 130 135 140 Gly Asp Asp Val Leu Val His Leu Leu Ala Arg Cys Ala Leu Phe Val 145 150 155 160 Leu Val Ala Pro Ser Cys Ala Tyr Gln Val Cys Gly Pro Pro Leu Tyr 165 170 175 Gln Leu Gly Ala Ala Thr Gln Ala Arg Pro Pro Pro His Ala Ser Gly 180 185 190 Pro Arg Arg Arg Leu Gly Cys Glu Arg Ala Trp Asn His Ser Val Arg 195 200 205 Glu Ala Gly Val Pro Leu Gly Leu Pro Ala Pro Gly Ala Arg Arg Arg 210 215 220 Gly Gly Ser Ala Ser Arg Ser Leu Pro Leu Pro Lys Arg Pro Arg Arg 225 230 235 240 Gly Ala Ala Pro Glu Pro Glu Arg Thr Pro Val Gly Gln Gly Ser Trp 245 250 255 Ala His Pro Gly Arg Thr Arg Gly Pro Ser Asp Arg Gly Phe Cys Val 260 265 270 Val Ser Pro Ala Arg Pro Ala Glu Glu Ala Thr Ser Leu Glu Gly Ala 275 280 285 Leu Ser Gly Thr Arg His Ser His Pro Ser Val Gly Arg Gln His His 290 295 300 Ala Gly Pro Pro Ser Thr Ser Arg Pro Pro Arg Pro Trp Asp Thr Pro 305 310 315 320 Cys Pro Pro Val Tyr Ala Glu Thr Lys His Phe Leu Tyr Ser Ser Gly 325 330 335 Asp Lys Glu Gln Leu Arg Pro Ser Phe Leu Leu Ser Ser Leu Arg Pro 340 345 350 Ser Leu Thr Gly Ala Arg Arg Leu Val Glu Thr Ile Phe Leu Gly Ser 355 360 365 Arg Pro Trp Met Pro Gly Thr Pro Arg Arg Leu Pro Arg Leu Pro Gln 370 375 380 Arg Tyr Trp Gln Met Arg Pro Leu Phe Leu Glu Leu Leu Gly Asn His 385 390 395 400 Ala Gln Cys Pro Tyr Gly Val Leu Leu Lys Thr His Cys Pro Leu Arg 405 410 415 Ala Ala Val Thr Pro Ala Ala Gly Val Cys Ala Arg Glu Lys Pro Gln 420 425 430 Gly Ser Val Ala Ala Pro Glu Glu Glu Asp Thr Asp Pro Arg Arg Leu 435 440 445 Val Gln Leu Leu Arg Gln His Ser Ser Pro Trp Gln Val Tyr Gly Phe 450 455 460 Val Arg Ala Cys Leu Arg Arg Leu Val Pro Pro Gly Leu Trp Gly Ser 465 470 475 480 Arg His Asn Glu Arg Arg Phe Leu Arg Asn Thr Lys Lys Phe Ile Ser 485 490 495 Leu Gly Lys His Ala Lys Leu Ser Leu Gln Glu Leu Thr Trp Lys Met 500 505 510 Ser Val Arg Asp Cys Ala Trp Leu Arg Arg Ser Pro Gly Val Gly Cys 515 520 525 Val Pro Ala Ala Glu His Arg Leu Arg Glu Glu Ile Leu Ala Lys Phe 530 535 540 Leu His Trp Leu Met Ser Val Tyr Val Val Glu Leu Leu Arg Ser Phe 545 550 555 560 Phe Tyr Val Thr Glu Thr Thr Phe Gln Lys Asn Arg Leu Phe Phe Tyr 565 570 575 Arg Lys Ser Val Trp Ser Lys Leu Gln Ser Ile Gly Ile Arg Gln His 580 585 590 Leu Lys Arg Val Gln Leu Arg Glu Leu Ser Glu Ala Glu Val Arg Gln 595 600 605 His Arg Glu Ala Arg Pro Ala Leu Leu Thr Ser Arg Leu Arg Phe Ile 610 615 620 Pro Lys Pro Asp Gly Leu Arg Pro Ile Val Asn Met Asp Tyr Val Val 625 630 635 640 Gly Ala Arg Thr Phe Arg Arg Glu Lys Arg Ala Glu Arg Leu Thr Ser 645 650 655 Arg Val Lys Ala Leu Phe Ser Val Leu Asn Tyr Glu Arg Ala Arg Arg 660 665 670 Pro Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Gly Leu Asp Asp Ile His Arg 675 680 685 Ala Trp Arg Thr Phe Val Leu Arg Val Arg Ala Gln Asp Pro Pro Pro 690 695 700 Glu Leu Tyr Phe Val Lys Val Asp Val Thr Gly Ala Tyr Asp Thr Ile 705 710 715 720 Pro Gln Asp Arg Leu Thr Glu Val Ile Ala Ser Ile Ile Lys Pro Gln 725 730 735 Asn Thr Tyr Cys Val Arg Arg Tyr Ala Val Val Gln Lys Ala Ala His 740 745 750 Gly His Val Arg Lys Ala Phe Lys Ser His Val Ser Thr Leu Thr Asp 755 760 765 Leu Gln Pro Tyr Met Arg Gln Phe Val Ala His Leu Gln Glu Thr Ser 770 775 780 Pro Leu Arg Asp Ala Val Val Ile Glu Gln Ser Ser Ser Leu Asn Glu 785 790 795 800 Ala Ser Ser Gly Leu Phe Asp Val Phe Leu Arg Phe Met Cys His His 805 810 815 Ala Val Arg Ile Arg Gly Lys Ser Tyr Val Gln Cys Gln Gly Ile Pro 820 825 830 Gln Gly Ser Ile Leu Ser Thr Leu Leu Cys Ser Leu Cys Tyr Gly Asp 835 840 845 Met Glu Asn Lys Leu Phe Ala Gly Ile Arg Arg Asp Gly Leu Leu Leu 850 855 860 Arg Leu Val Asp Asp Phe Leu Leu Val Thr Pro His Leu Thr His Ala 865 870 875 880 Lys Thr Phe Leu Arg Thr Leu Val Arg Gly Val Pro Glu Tyr Gly Cys 885 890 895 Val Val Asn Leu Arg Lys Thr Val Val Asn Phe Pro Val Glu Asp Glu 900 905 910 Ala Leu Gly Gly Thr Ala Phe Val Gln Met Pro Ala His Gly Leu Phe 915 920 925 Pro Trp Cys Gly Leu Leu Leu Asp Thr Arg Thr Leu Glu Val Gln Ser 930 935 940 Asp Tyr Ser Ser Tyr Ala Arg Thr Ser Ile Arg Ala Ser Leu Thr Phe 945 950 955 960 Asn Arg Gly Phe Lys Ala Gly Arg Asn Met Arg Arg Lys Leu Phe Gly 965 970 975 Val Leu Arg Leu Lys Cys His Ser Leu Phe Leu Asp Leu Gln Val Asn 980 985 990 Ser Leu Gln Thr Val Cys Thr Asn Ile Tyr Lys Ile Leu Leu Leu Gln 995 1000 1005 Ala Tyr Arg Phe His Ala Cys Val Leu Gln Leu Pro Phe His Gln 1010 1015 1020 Gln Val Trp Lys Asn Pro Thr Phe Phe Leu Arg Val Ile Ser Asp 1025 1030 1035 Thr Ala Ser Leu Cys Tyr Ser Ile Leu Lys Ala Lys Asn Ala Gly 1040 1045 1050 Met Ser Leu Gly Ala Lys Gly Ala Ala Gly Pro Leu Pro Ser Glu 1055 1060 1065 Ala Val Gln Trp Leu Cys His Gln Ala Phe Leu Leu Lys Leu Thr 1070 1075 1080 Arg His Arg Val Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Ser Leu Arg Thr 1085 1090 1095 Ala Gln Thr Gln Leu Ser Arg Lys Leu Pro Gly Thr Thr Leu Thr 1100 1105 1110 Ala Leu Glu Ala Ala Ala Asn Pro Ala Leu Pro Ser Asp Phe Lys 1115 1120 1125 Thr Ile Leu Asp 1130 <210> 173 <211> 586 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 173 Met Ala Ala Ser Gly Val Glu Lys Ser Ser Lys Lys Lys Thr Glu Lys 1 5 10 15 Lys Leu Ala Ala Arg Glu Glu Ala Lys Leu Leu Ala Gly Phe Met Gly 20 25 30 Val Met Asn Asn Met Arg Lys Gln Lys Thr Leu Cys Asp Val Ile Leu 35 40 45 Met Val Gln Glu Arg Lys Ile Pro Ala His Arg Val Val Leu Ala Ala 50 55 60 Ala Ser His Phe Phe Asn Leu Met Phe Thr Thr Asn Met Leu Glu Ser 65 70 75 80 Lys Ser Phe Glu Val Glu Leu Lys Asp Ala Glu Pro Asp Ile Ile Glu 85 90 95 Gln Leu Val Glu Phe Ala Tyr Thr Ala Arg Ile Ser Val Asn Ser Asn 100 105 110 Asn Val Gln Ser Leu Leu Asp Ala Ala Asn Gln Tyr Gln Ile Glu Pro 115 120 125 Val Lys Lys Met Cys Val Asp Phe Leu Lys Glu Gln Val Asp Ala Ser 130 135 140 Asn Cys Leu Gly Ile Ser Val Leu Ala Glu Cys Leu Asp Cys Pro Glu 145 150 155 160 Leu Lys Ala Thr Ala Asp Asp Phe Ile His Gln His Phe Thr Glu Val 165 170 175 Tyr Lys Thr Asp Glu Phe Leu Gln Leu Asp Val Lys Arg Val Thr His 180 185 190 Leu Leu Asn Gln Asp Thr Leu Thr Val Arg Ala Glu Asp Gln Val Tyr 195 200 205 Asp Ala Ala Val Arg Trp Leu Lys Tyr Asp Glu Pro Asn Arg Gln Pro 210 215 220 Phe Met Val Asp Ile Leu Ala Lys Val Arg Phe Pro Leu Ile Ser Lys 225 230 235 240 Asn Phe Leu Ser Lys Thr Val Gln Ala Glu Pro Leu Ile Gln Asp Asn 245 250 255 Pro Glu Cys Leu Lys Met Val Ile Ser Gly Met Arg Tyr His Leu Leu 260 265 270 Ser Pro Glu Asp Arg Glu Glu Leu Val Asp Gly Thr Arg Pro Arg Arg 275 280 285 Lys Lys His Asp Tyr Arg Ile Ala Leu Phe Gly Gly Ser Gln Pro Gln 290 295 300 Ser Cys Arg Tyr Phe Asn Pro Lys Asp Tyr Ser Trp Thr Asp Ile Arg 305 310 315 320 Cys Pro Phe Glu Lys Arg Arg Asp Ala Ala Cys Val Phe Trp Asp Asn 325 330 335 Val Val Tyr Ile Leu Gly Gly Ser Gln Leu Phe Pro Ile Lys Arg Met 340 345 350 Asp Cys Tyr Asn Val Val Lys Asp Ser Trp Tyr Ser Lys Leu Gly Pro 355 360 365 Pro Thr Pro Arg Asp Ser Leu Ala Ala Cys Ala Ala Glu Gly Lys Ile 370 375 380 Tyr Thr Ser Gly Gly Ser Glu Val Gly Asn Ser Ala Leu Tyr Leu Phe 385 390 395 400 Glu Cys Tyr Asp Thr Arg Thr Glu Ser Trp His Thr Lys Pro Ser Met 405 410 415 Leu Thr Gln Arg Cys Ser His Gly Met Val Glu Ala Asn Gly Leu Ile 420 425 430 Tyr Val Cys Gly Gly Ser Leu Gly Asn Asn Val Ser Gly Arg Val Leu 435 440 445 Asn Ser Cys Glu Val Tyr Asp Pro Ala Thr Glu Thr Trp Thr Glu Leu 450 455 460 Cys Pro Met Ile Glu Ala Arg Lys Asn His Gly Leu Val Phe Val Lys 465 470 475 480 Asp Lys Ile Phe Ala Val Gly Gly Gln Asn Gly Leu Gly Gly Leu Asp 485 490 495 Asn Val Glu Tyr Tyr Asp Ile Lys Leu Asn Glu Trp Lys Met Val Ser 500 505 510 Pro Met Pro Trp Lys Gly Val Thr Val Lys Cys Ala Ala Val Gly Ser 515 520 525 Ile Val Tyr Val Leu Ala Gly Phe Gln Gly Val Gly Arg Leu Gly His 530 535 540 Ile Leu Glu Tyr Asn Thr Glu Thr Asp Lys Trp Val Ala Asn Ser Lys 545 550 555 560 Val Arg Ala Phe Pro Val Thr Ser Cys Leu Ile Cys Val Val Asp Thr 565 570 575 Cys Gly Ala Asn Glu Glu Thr Leu Glu Thr 580 585 <210> 174 <211> 314 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 174 Met Pro Leu Glu Gln Arg Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Leu 1 5 10 15 Glu Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro Ala 20 25 30 Thr Glu Glu Gln Glu Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val Glu Val 35 40 45 Thr Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Pro Asp Pro Pro Gln Ser 50 55 60 Pro Gln Gly Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro Leu Trp 65 70 75 80 Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Ser Ser Asn Gln Glu Glu Glu Gly Pro Ser 85 90 95 Thr Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu Ser Arg Lys 100 105 110 Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu 115 120 125 Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Asn Trp Gln 130 135 140 Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gln Leu 145 150 155 160 Val Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr 165 170 175 Ile Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp 180 185 190 Asn Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile 195 200 205 Ile Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile Trp Glu Glu 210 215 220 Leu Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile Leu Gly 225 230 235 240 Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu 245 250 255 Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu Phe Leu 260 265 270 Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu His 275 280 285 His Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr Pro Pro Leu 290 295 300 His Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu 305 310 <210> 175 <211> 317 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 175 Met Ser Ser Glu Gln Lys Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Val 1 5 10 15 Glu Ala Gln Glu Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro Thr 20 25 30 Thr Glu Glu Gln Glu Ala Ala Val Ser Ser Ser Ser Pro Leu Val Pro 35 40 45 Gly Thr Leu Glu Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Ala Gly Pro Pro Gln 50 55 60 Ser Pro Gln Gly Ala Ser Ala Leu Pro Thr Thr Ile Ser Phe Thr Cys 65 70 75 80 Trp Arg Gln Pro Asn Glu Gly Ser Ser Ser Gln Glu Glu Glu Gly Pro 85 90 95 Ser Thr Ser Pro Asp Ala Glu Ser Leu Phe Arg Glu Ala Leu Ser Asn 100 105 110 Lys Val Asp Glu Leu Ala His Phe Leu Leu Arg Lys Tyr Arg Ala Lys 115 120 125 Glu Leu Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Glu Arg Val Ile Lys Asn Tyr 130 135 140 Lys Arg Cys Phe Pro Val Ile Phe Gly Lys Ala Ser Glu Ser Leu Lys 145 150 155 160 Met Ile Phe Gly Ile Asp Val Lys Glu Val Asp Pro Ala Ser Asn Thr 165 170 175 Tyr Thr Leu Val Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly 180 185 190 Asn Asn Gln Ile Phe Pro Lys Thr Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Gly 195 200 205 Thr Ile Ala Met Glu Gly Asp Ser Ala Ser Glu Glu Glu Ile Trp Glu 210 215 220 Glu Leu Gly Val Met Gly Val Tyr Asp Gly Arg Glu His Thr Val Tyr 225 230 235 240 Gly Glu Pro Arg Lys Leu Leu Thr Gln Asp Trp Val Gln Glu Asn Tyr 245 250 255 Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asn Pro Ala Arg Tyr Glu Phe 260 265 270 Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ala Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu 275 280 285 Glu His Val Val Arg Val Asn Ala Arg Val Arg Ile Ala Tyr Pro Ser 290 295 300 Leu Arg Glu Ala Ala Leu Leu Glu Glu Glu Glu Gly Val 305 310 315 <210> 176 <211> 314 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 176 Met Pro Leu Glu Gln Arg Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Leu 1 5 10 15 Glu Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro Ala 20 25 30 Thr Glu Glu Gln Glu Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val Glu Val 35 40 45 Thr Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Pro Asp Pro Pro Gln Ser 50 55 60 Pro Gln Gly Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro Leu Trp 65 70 75 80 Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Ser Ser Asn Gln Glu Glu Glu Gly Pro Ser 85 90 95 Thr Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu Ser Arg Lys 100 105 110 Val Ala Lys Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu 115 120 125 Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Asn Trp Gln 130 135 140 Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Ser Asp Ser Leu Gln Leu 145 150 155 160 Val Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Val Tyr 165 170 175 Ile Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp 180 185 190 Asn Gln Ile Met Pro Lys Thr Gly Phe Leu Ile Ile Ile Leu Ala Ile 195 200 205 Ile Ala Lys Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile Trp Glu Glu 210 215 220 Leu Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile Phe Gly 225 230 235 240 Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln Tyr Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu 245 250 255 Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu Phe Leu 260 265 270 Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ile Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu His 275 280 285 His Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro Arg Ile Ser Tyr Pro Leu Leu 290 295 300 His Glu Trp Ala Leu Arg Glu Gly Glu Glu 305 310 <210> 177 <211> 464 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 177 Met Glu Thr Leu Ser Phe Pro Arg Tyr Asn Val Ala Glu Ile Val Ile 1 5 10 15 His Ile Arg Asn Lys Ile Leu Thr Gly Ala Asp Gly Lys Asn Leu Thr 20 25 30 Lys Asn Asp Leu Tyr Pro Asn Pro Lys Pro Glu Val Leu His Met Ile 35 40 45 Tyr Met Arg Ala Leu Gln Ile Val Tyr Gly Ile Arg Leu Glu His Phe 50 55 60 Tyr Met Met Pro Val Asn Ser Glu Val Met Tyr Pro His Leu Met Glu 65 70 75 80 Gly Phe Leu Pro Phe Ser Asn Leu Val Thr His Leu Asp Ser Phe Leu 85 90 95 Pro Ile Cys Arg Val Asn Asp Phe Glu Thr Ala Asp Ile Leu Cys Pro 100 105 110 Lys Ala Lys Arg Thr Ser Arg Phe Leu Ser Gly Ile Ile Asn Phe Ile 115 120 125 His Phe Arg Glu Ala Cys Arg Glu Thr Tyr Met Glu Phe Leu Trp Gln 130 135 140 Tyr Lys Ser Ser Ala Asp Lys Met Gln Gln Leu Asn Ala Ala His Gln 145 150 155 160 Glu Ala Leu Met Lys Leu Glu Arg Leu Asp Ser Val Pro Val Glu Glu 165 170 175 Gln Glu Glu Phe Lys Gln Leu Ser Asp Gly Ile Gln Glu Leu Gln Gln 180 185 190 Ser Leu Asn Gln Asp Phe His Gln Lys Thr Ile Val Leu Gln Glu Gly 195 200 205 Asn Ser Gln Lys Lys Ser Asn Ile Ser Glu Lys Thr Lys Arg Leu Asn 210 215 220 Glu Leu Lys Leu Ser Val Val Ser Leu Lys Glu Ile Gln Glu Ser Leu 225 230 235 240 Lys Thr Lys Ile Val Asp Ser Pro Glu Lys Leu Lys Asn Tyr Lys Glu 245 250 255 Lys Met Lys Asp Thr Val Gln Lys Leu Lys Asn Ala Arg Gln Glu Val 260 265 270 Val Glu Lys Tyr Glu Ile Tyr Gly Asp Ser Val Asp Cys Leu Pro Ser 275 280 285 Cys Gln Leu Glu Val Gln Leu Tyr Gln Lys Lys Ile Gln Asp Leu Ser 290 295 300 Asp Asn Arg Glu Lys Leu Ala Ser Ile Leu Lys Glu Ser Leu Asn Leu 305 310 315 320 Glu Asp Gln Ile Glu Ser Asp Glu Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys Thr 325 330 335 Glu Glu Asn Ser Phe Lys Arg Leu Met Ile Val Lys Lys Glu Lys Leu 340 345 350 Ala Thr Ala Gln Phe Lys Ile Asn Lys Lys His Glu Asp Val Lys Gln 355 360 365 Tyr Lys Arg Thr Val Ile Glu Asp Cys Asn Lys Val Gln Glu Lys Arg 370 375 380 Gly Ala Val Tyr Glu Arg Val Thr Thr Ile Asn Gln Glu Ile Gln Lys 385 390 395 400 Ile Lys Leu Gly Ile Gln Gln Leu Lys Asp Ala Ala Glu Arg Glu Lys 405 410 415 Leu Lys Ser Gln Glu Ile Phe Leu Asn Leu Lys Thr Ala Leu Glu Lys 420 425 430 Tyr His Asp Gly Ile Glu Lys Ala Ala Glu Asp Ser Tyr Ala Lys Ile 435 440 445 Asp Glu Lys Thr Ala Glu Leu Lys Arg Lys Met Phe Lys Met Ser Thr 450 455 460 <210> 178 <211> 180 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 178 Met Gln Ala Glu Gly Arg Gly Thr Gly Gly Ser Thr Gly Asp Ala Asp 1 5 10 15 Gly Pro Gly Gly Pro Gly Ile Pro Asp Gly Pro Gly Gly Asn Ala Gly 20 25 30 Gly Pro Gly Glu Ala Gly Ala Thr Gly Gly Arg Gly Pro Arg Gly Ala 35 40 45 Gly Ala Ala Arg Ala Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Arg Gly Pro 50 55 60 His Gly Gly Ala Ala Ser Gly Leu Asn Gly Cys Cys Arg Cys Gly Ala 65 70 75 80 Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Met Pro Phe 85 90 95 Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala Arg Arg Ser Leu Ala Gln Asp 100 105 110 Ala Pro Pro Leu Pro Val Pro Gly Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val 115 120 125 Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg Gln 130 135 140 Leu Gln Leu Ser Ile Ser Ser Cys Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met 145 150 155 160 Trp Ile Thr Gln Cys Phe Leu Pro Val Phe Leu Ala Gln Pro Pro Ser 165 170 175 Gly Gln Arg Arg 180 <210> 179 <211> 102 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 179 Met Ser Ala Arg Val Arg Ser Arg Ser Arg Gly Arg Gly Asp Gly Gln 1 5 10 15 Glu Ala Pro Asp Val Val Ala Phe Val Ala Pro Gly Glu Ser Gln Gln 20 25 30 Glu Glu Pro Pro Thr Asp Asn Gln Asp Ile Glu Pro Gly Gln Glu Arg 35 40 45 Glu Gly Thr Pro Pro Ile Glu Glu Arg Lys Val Glu Gly Asp Cys Gln 50 55 60 Glu Met Asp Leu Glu Lys Thr Arg Ser Glu Arg Gly Asp Gly Ser Asp 65 70 75 80 Val Lys Glu Lys Thr Pro Pro Asn Pro Lys His Ala Lys Thr Lys Glu 85 90 95 Ala Gly Asp Gly Gln Pro 100 <210> 180 <211> 509 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 180 Met Glu Arg Arg Arg Leu Trp Gly Ser Ile Gln Ser Arg Tyr Ile Ser 1 5 10 15 Met Ser Val Trp Thr Ser Pro Arg Arg Leu Val Glu Leu Ala Gly Gln 20 25 30 Ser Leu Leu Lys Asp Glu Ala Leu Ala Ile Ala Ala Leu Glu Leu Leu 35 40 45 Pro Arg Glu Leu Phe Pro Pro Leu Phe Met Ala Ala Phe Asp Gly Arg 50 55 60 His Ser Gln Thr Leu Lys Ala Met Val Gln Ala Trp Pro Phe Thr Cys 65 70 75 80 Leu Pro Leu Gly Val Leu Met Lys Gly Gln His Leu His Leu Glu Thr 85 90 95 Phe Lys Ala Val Leu Asp Gly Leu Asp Val Leu Leu Ala Gln Glu Val 100 105 110 Arg Pro Arg Arg Trp Lys Leu Gln Val Leu Asp Leu Arg Lys Asn Ser 115 120 125 His Gln Asp Phe Trp Thr Val Trp Ser Gly Asn Arg Ala Ser Leu Tyr 130 135 140 Ser Phe Pro Glu Pro Glu Ala Ala Gln Pro Met Thr Lys Lys Arg Lys 145 150 155 160 Val Asp Gly Leu Ser Thr Glu Ala Glu Gln Pro Phe Ile Pro Val Glu 165 170 175 Val Leu Val Asp Leu Phe Leu Lys Glu Gly Ala Cys Asp Glu Leu Phe 180 185 190 Ser Tyr Leu Ile Glu Lys Val Lys Arg Lys Lys Asn Val Leu Arg Leu 195 200 205 Cys Cys Lys Lys Leu Lys Ile Phe Ala Met Pro Met Gln Asp Ile Lys 210 215 220 Met Ile Leu Lys Met Val Gln Leu Asp Ser Ile Glu Asp Leu Glu Val 225 230 235 240 Thr Cys Thr Trp Lys Leu Pro Thr Leu Ala Lys Phe Ser Pro Tyr Leu 245 250 255 Gly Gln Met Ile Asn Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ser His Ile His Ala 260 265 270 Ser Ser Tyr Ile Ser Pro Glu Lys Glu Glu Gln Tyr Ile Ala Gln Phe 275 280 285 Thr Ser Gln Phe Leu Ser Leu Gln Cys Leu Gln Ala Leu Tyr Val Asp 290 295 300 Ser Leu Phe Phe Leu Arg Gly Arg Leu Asp Gln Leu Leu Arg His Val 305 310 315 320 Met Asn Pro Leu Glu Thr Leu Ser Ile Thr Asn Cys Arg Leu Ser Glu 325 330 335 Gly Asp Val Met His Leu Ser Gln Ser Pro Ser Val Ser Gln Leu Ser 340 345 350 Val Leu Ser Leu Ser Gly Val Met Leu Thr Asp Val Ser Pro Glu Pro 355 360 365 Leu Gln Ala Leu Leu Glu Arg Ala Ser Ala Thr Leu Gln Asp Leu Val 370 375 380 Phe Asp Glu Cys Gly Ile Thr Asp Asp Gln Leu Leu Ala Leu Leu Pro 385 390 395 400 Ser Leu Ser His Cys Ser Gln Leu Thr Thr Leu Ser Phe Tyr Gly Asn 405 410 415 Ser Ile Ser Ile Ser Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gln His Leu Ile Gly 420 425 430 Leu Ser Asn Leu Thr His Val Leu Tyr Pro Val Pro Leu Glu Ser Tyr 435 440 445 Glu Asp Ile His Gly Thr Leu His Leu Glu Arg Leu Ala Tyr Leu His 450 455 460 Ala Arg Leu Arg Glu Leu Leu Cys Glu Leu Gly Arg Pro Ser Met Val 465 470 475 480 Trp Leu Ser Ala Asn Pro Cys Pro His Cys Gly Asp Arg Thr Phe Tyr 485 490 495 Asp Pro Glu Pro Ile Leu Cys Pro Cys Phe Met Pro Asn 500 505 <210> 181 <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 181 Met Trp Val Pro Val Val Phe Leu Thr Leu Ser Val Thr Trp Ile Gly 1 5 10 15 Ala Ala Pro Leu Ile Leu Ser Arg Ile Val Gly Gly Trp Glu Cys Glu 20 25 30 Lys His Ser Gln Pro Trp Gln Val Leu Val Ala Ser Arg Gly Arg Ala 35 40 45 Val Cys Gly Gly Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu Thr Ala Ala 50 55 60 His Cys Ile Arg Asn Lys Ser Val Ile Leu Leu Gly Arg His Ser Leu 65 70 75 80 Phe His Pro Glu Asp Thr Gly Gln Val Phe Gln Val Ser His Ser Phe 85 90 95 Pro His Pro Leu Tyr Asp Met Ser Leu Leu Lys Asn Arg Phe Leu Arg 100 105 110 Pro Gly Asp Asp Ser Ser His Asp Leu Met Leu Leu Arg Leu Ser Glu 115 120 125 Pro Ala Glu Leu Thr Asp Ala Val Lys Val Met Asp Leu Pro Thr Gln 130 135 140 Glu Pro Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser Gly Trp Gly Ser Ile 145 150 155 160 Glu Pro Glu Glu Phe Leu Thr Pro Lys Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu 165 170 175 His Val Ile Ser Asn Asp Val Cys Ala Gln Val His Pro Gln Lys Val 180 185 190 Thr Lys Phe Met Leu Cys Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gly Lys Ser Thr 195 200 205 Cys Ser Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Gly Val Leu Gln 210 215 220 Gly Ile Thr Ser Trp Gly Ser Glu Pro Cys Ala Leu Pro Glu Arg Pro 225 230 235 240 Ser Leu Tyr Thr Lys Val Val His Tyr Arg Lys Trp Ile Lys Asp Thr 245 250 255 Ile Val Ala Asn Pro 260 <210> 182 <211> 750 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 182 Met Trp Asn Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val Ala Thr Ala Arg 1 5 10 15 Arg Pro Arg Trp Leu Cys Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe 20 25 30 Phe Leu Leu Gly Phe Leu Phe Gly Trp Phe Ile Lys Ser Ser Asn Glu 35 40 45 Ala Thr Asn Ile Thr Pro Lys His Asn Met Lys Ala Phe Leu Asp Glu 50 55 60 Leu Lys Ala Glu Asn Ile Lys Lys Phe Leu Tyr Asn Phe Thr Gln Ile 65 70 75 80 Pro His Leu Ala Gly Thr Glu Gln Asn Phe Gln Leu Ala Lys Gln Ile 85 90 95 Gln Ser Gln Trp Lys Glu Phe Gly Leu Asp Ser Val Glu Leu Ala His 100 105 110 Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr His Pro Asn Tyr Ile 115 120 125 Ser Ile Ile Asn Glu Asp Gly Asn Glu Ile Phe Asn Thr Ser Leu Phe 130 135 140 Glu Pro Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Asn Val Ser Asp Ile Val Pro Pro 145 150 155 160 Phe Ser Ala Phe Ser Pro Gln Gly Met Pro Glu Gly Asp Leu Val Tyr 165 170 175 Val Asn Tyr Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys Leu Glu Arg Asp Met 180 185 190 Lys Ile Asn Cys Ser Gly Lys Ile Val Ile Ala Arg Tyr Gly Lys Val 195 200 205 Phe Arg Gly Asn Lys Val Lys Asn Ala Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly 210 215 220 Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Val Lys 225 230 235 240 Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly Val Gln Arg Gly 245 250 255 Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr 260 265 270 Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ile Ala Glu Ala Val Gly 275 280 285 Leu Pro Ser Ile Pro Val His Pro Ile Gly Tyr Tyr Asp Ala Gln Lys 290 295 300 Leu Leu Glu Lys Met Gly Gly Ser Ala Pro Pro Asp Ser Ser Trp Arg 305 310 315 320 Gly Ser Leu Lys Val Pro Tyr Asn Val Gly Pro Gly Phe Thr Gly Asn 325 330 335 Phe Ser Thr Gln Lys Val Lys Met His Ile His Ser Thr Asn Glu Val 340 345 350 Thr Arg Ile Tyr Asn Val Ile Gly Thr Leu Arg Gly Ala Val Glu Pro 355 360 365 Asp Arg Tyr Val Ile Leu Gly Gly His Arg Asp Ser Trp Val Phe Gly 370 375 380 Gly Ile Asp Pro Gln Ser Gly Ala Ala Val Val His Glu Ile Val Arg 385 390 395 400 Ser Phe Gly Thr Leu Lys Lys Glu Gly Trp Arg Pro Arg Arg Thr Ile 405 410 415 Leu Phe Ala Ser Trp Asp Ala Glu Glu Phe Gly Leu Leu Gly Ser Thr 420 425 430 Glu Trp Ala Glu Glu Asn Ser Arg Leu Leu Gln Glu Arg Gly Val Ala 435 440 445 Tyr Ile Asn Ala Asp Ser Ser Ile Glu Gly Asn Tyr Thr Leu Arg Val 450 455 460 Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser Leu Val His Asn Leu Thr Lys Glu 465 470 475 480 Leu Lys Ser Pro Asp Glu Gly Phe Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Glu Ser 485 490 495 Trp Thr Lys Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe Ser Gly Met Pro Arg Ile 500 505 510 Ser Lys Leu Gly Ser Gly Asn Asp Phe Glu Val Phe Phe Gln Arg Leu 515 520 525 Gly Ile Ala Ser Gly Arg Ala Arg Tyr Thr Lys Asn Trp Glu Thr Asn 530 535 540 Lys Phe Ser Gly Tyr Pro Leu Tyr His Ser Val Tyr Glu Thr Tyr Glu 545 550 555 560 Leu Val Glu Lys Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys Tyr His Leu Thr Val 565 570 575 Ala Gln Val Arg Gly Gly Met Val Phe Glu Leu Ala Asn Ser Ile Val 580 585 590 Leu Pro Phe Asp Cys Arg Asp Tyr Ala Val Val Leu Arg Lys Tyr Ala 595 600 605 Asp Lys Ile Tyr Ser Ile Ser Met Lys His Pro Gln Glu Met Lys Thr 610 615 620 Tyr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu Phe Ser Ala Val Lys Asn Phe Thr 625 630 635 640 Glu Ile Ala Ser Lys Phe Ser Glu Arg Leu Gln Asp Phe Asp Lys Ser 645 650 655 Asn Pro Ile Val Leu Arg Met Met Asn Asp Gln Leu Met Phe Leu Glu 660 665 670 Arg Ala Phe Ile Asp Pro Leu Gly Leu Pro Asp Arg Pro Phe Tyr Arg 675 680 685 His Val Ile Tyr Ala Pro Ser Ser His Asn Lys Tyr Ala Gly Glu Ser 690 695 700 Phe Pro Gly Ile Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser Lys Val Asp 705 710 715 720 Pro Ser Lys Ala Trp Gly Glu Val Lys Arg Gln Ile Tyr Val Ala Ala 725 730 735 Phe Thr Val Gln Ala Ala Ala Glu Thr Leu Ser Glu Val Ala 740 745 750 <210> 183 <211> 783 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 183 Met Ser Gly Gly His Gln Leu Gln Leu Ala Ala Leu Trp Pro Trp Leu 1 5 10 15 Leu Met Ala Thr Leu Gln Ala Gly Phe Gly Arg Thr Gly Leu Val Leu 20 25 30 Ala Ala Ala Val Glu Ser Glu Arg Ser Ala Glu Gln Lys Ala Ile Ile 35 40 45 Arg Val Ile Pro Leu Lys Met Asp Pro Thr Gly Lys Leu Asn Leu Thr 50 55 60 Leu Glu Gly Val Phe Ala Gly Val Ala Glu Ile Thr Pro Ala Glu Gly 65 70 75 80 Lys Leu Met Gln Ser His Pro Leu Tyr Leu Cys Asn Ala Ser Asp Asp 85 90 95 Asp Asn Leu Glu Pro Gly Phe Ile Ser Ile Val Lys Leu Glu Ser Pro 100 105 110 Arg Arg Ala Pro Arg Pro Cys Leu Ser Leu Ala Ser Lys Ala Arg Met 115 120 125 Ala Gly Glu Arg Gly Ala Ser Ala Val Leu Phe Asp Ile Thr Glu Asp 130 135 140 Arg Ala Ala Ala Glu Gln Leu Gln Gln Pro Leu Gly Leu Thr Trp Pro 145 150 155 160 Val Val Leu Ile Trp Gly Asn Asp Ala Glu Lys Leu Met Glu Phe Val 165 170 175 Tyr Lys Asn Gln Lys Ala His Val Arg Ile Glu Leu Lys Glu Pro Pro 180 185 190 Ala Trp Pro Asp Tyr Asp Val Trp Ile Leu Met Thr Val Val Gly Thr 195 200 205 Ile Phe Val Ile Ile Leu Ala Ser Val Leu Arg Ile Arg Cys Arg Pro 210 215 220 Arg His Ser Arg Pro Asp Pro Leu Gln Gln Arg Thr Ala Trp Ala Ile 225 230 235 240 Ser Gln Leu Ala Thr Arg Arg Tyr Gln Ala Ser Cys Arg Gln Ala Arg 245 250 255 Gly Glu Trp Pro Asp Ser Gly Ser Ser Cys Ser Ser Ala Pro Val Cys 260 265 270 Ala Ile Cys Leu Glu Glu Phe Ser Glu Gly Gln Glu Leu Arg Val Ile 275 280 285 Ser Cys Leu His Glu Phe His Arg Asn Cys Val Asp Pro Trp Leu His 290 295 300 Gln His Arg Thr Cys Pro Leu Cys Met Phe Asn Ile Thr Glu Gly Asp 305 310 315 320 Ser Phe Ser Gln Ser Leu Gly Pro Ser Arg Ser Tyr Gln Glu Pro Gly 325 330 335 Arg Arg Leu His Leu Ile Arg Gln His Pro Gly His Ala His Tyr His 340 345 350 Leu Pro Ala Ala Tyr Leu Leu Gly Pro Ser Arg Ser Ala Val Ala Arg 355 360 365 Pro Pro Arg Pro Gly Pro Phe Leu Pro Ser Gln Glu Pro Gly Met Gly 370 375 380 Pro Arg His His Arg Phe Pro Arg Ala Ala His Pro Arg Ala Pro Gly 385 390 395 400 Glu Gln Gln Arg Leu Ala Gly Ala Gln His Pro Tyr Ala Gln Gly Trp 405 410 415 Gly Leu Ser His Leu Gln Ser Thr Ser Gln His Pro Ala Ala Cys Pro 420 425 430 Val Pro Leu Arg Arg Ala Arg Pro Pro Asp Ser Ser Gly Ser Gly Glu 435 440 445 Ser Tyr Cys Thr Glu Arg Ser Gly Tyr Leu Ala Asp Gly Pro Ala Ser 450 455 460 Asp Ser Ser Ser Gly Pro Cys His Gly Ser Ser Ser Asp Ser Val Val 465 470 475 480 Asn Cys Thr Asp Ile Ser Leu Gln Gly Val His Gly Ser Ser Ser Thr 485 490 495 Phe Cys Ser Ser Leu Ser Ser Asp Phe Asp Pro Leu Val Tyr Cys Ser 500 505 510 Pro Lys Gly Asp Pro Gln Arg Val Asp Met Gln Pro Ser Val Thr Ser 515 520 525 Arg Pro Arg Ser Leu Asp Ser Val Val Pro Thr Gly Glu Thr Gln Val 530 535 540 Ser Ser His Val His Tyr His Arg His Arg His His His Tyr Lys Lys 545 550 555 560 Arg Phe Gln Trp His Gly Arg Lys Pro Gly Pro Glu Thr Gly Val Pro 565 570 575 Gln Ser Arg Pro Pro Ile Pro Arg Thr Gln Pro Gln Pro Glu Pro Pro 580 585 590 Ser Pro Asp Gln Gln Val Thr Arg Ser Asn Ser Ala Ala Pro Ser Gly 595 600 605 Arg Leu Ser Asn Pro Gln Cys Pro Arg Ala Leu Pro Glu Pro Ala Pro 610 615 620 Gly Pro Val Asp Ala Ser Ser Ile Cys Pro Ser Thr Ser Ser Leu Phe 625 630 635 640 Asn Leu Gln Lys Ser Ser Leu Ser Ala Arg His Pro Gln Arg Lys Arg 645 650 655 Arg Gly Gly Pro Ser Glu Pro Thr Pro Gly Ser Arg Pro Gln Asp Ala 660 665 670 Thr Val His Pro Ala Cys Gln Ile Phe Pro His Tyr Thr Pro Ser Val 675 680 685 Ala Tyr Pro Trp Ser Pro Glu Ala His Pro Leu Ile Cys Gly Pro Pro 690 695 700 Gly Leu Asp Lys Arg Leu Leu Pro Glu Thr Pro Gly Pro Cys Tyr Ser 705 710 715 720 Asn Ser Gln Pro Val Trp Leu Cys Leu Thr Pro Arg Gln Pro Leu Glu 725 730 735 Pro His Pro Pro Gly Glu Gly Pro Ser Glu Trp Ser Ser Asp Thr Ala 740 745 750 Glu Gly Arg Pro Cys Pro Tyr Pro His Cys Gln Val Leu Ser Ala Gln 755 760 765 Pro Gly Ser Glu Glu Glu Leu Glu Glu Leu Cys Glu Gln Ala Val 770 775 780 <210> 184 <211> 963 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 184 Met Ala Thr Ala Ala Glu Thr Ser Ala Ser Glu Pro Glu Ala Glu Ser 1 5 10 15 Lys Ala Gly Pro Lys Ala Asp Gly Glu Glu Asp Glu Val Lys Ala Ala 20 25 30 Arg Thr Arg Arg Lys Val Leu Ser Arg Ala Val Ala Ala Ala Thr Tyr 35 40 45 Lys Thr Met Gly Pro Ala Trp Asp Gln Gln Glu Glu Gly Val Ser Glu 50 55 60 Ser Asp Gly Asp Glu Tyr Ala Met Ala Ser Ser Ala Glu Ser Ser Pro 65 70 75 80 Gly Glu Tyr Glu Trp Glu Tyr Asp Glu Glu Glu Glu Lys Asn Gln Leu 85 90 95 Glu Ile Glu Arg Leu Glu Glu Gln Leu Ser Ile Asn Val Tyr Asp Tyr 100 105 110 Asn Cys His Val Asp Leu Ile Arg Leu Leu Arg Leu Glu Gly Glu Leu 115 120 125 Thr Lys Val Arg Met Ala Arg Gln Lys Met Ser Glu Ile Phe Pro Leu 130 135 140 Thr Glu Glu Leu Trp Leu Glu Trp Leu His Asp Glu Ile Ser Met Ala 145 150 155 160 Gln Asp Gly Leu Asp Arg Glu His Val Tyr Asp Leu Phe Glu Lys Ala 165 170 175 Val Lys Asp Tyr Ile Cys Pro Asn Ile Trp Leu Glu Tyr Gly Gln Tyr 180 185 190 Ser Val Gly Gly Ile Gly Gln Lys Gly Gly Leu Glu Lys Val Arg Ser 195 200 205 Val Phe Glu Arg Ala Leu Ser Ser Val Gly Leu His Met Thr Lys Gly 210 215 220 Leu Ala Leu Trp Glu Ala Tyr Arg Glu Phe Glu Ser Ala Ile Val Glu 225 230 235 240 Ala Ala Arg Leu Glu Lys Val His Ser Leu Phe Arg Arg Gln Leu Ala 245 250 255 Ile Pro Leu Tyr Asp Met Glu Ala Thr Phe Ala Glu Tyr Glu Glu Trp 260 265 270 Ser Glu Asp Pro Ile Pro Glu Ser Val Ile Gln Asn Tyr Asn Lys Ala 275 280 285 Leu Gln Gln Leu Glu Lys Tyr Lys Pro Tyr Glu Glu Ala Leu Leu Gln 290 295 300 Ala Glu Ala Pro Arg Leu Ala Glu Tyr Gln Ala Tyr Ile Asp Phe Glu 305 310 315 320 Met Lys Ile Gly Asp Pro Ala Arg Ile Gln Leu Ile Phe Glu Arg Ala 325 330 335 Leu Val Glu Asn Cys Leu Val Pro Asp Leu Trp Ile Arg Tyr Ser Gln 340 345 350 Tyr Leu Asp Arg Gln Leu Lys Val Lys Asp Leu Val Leu Ser Val His 355 360 365 Asn Arg Ala Ile Arg Asn Cys Pro Trp Thr Val Ala Leu Trp Ser Arg 370 375 380 Tyr Leu Leu Ala Met Glu Arg His Gly Val Asp His Gln Val Ile Ser 385 390 395 400 Val Thr Phe Glu Lys Ala Leu Asn Ala Gly Phe Ile Gln Ala Thr Asp 405 410 415 Tyr Val Glu Ile Trp Gln Ala Tyr Leu Asp Tyr Leu Arg Arg Arg Val 420 425 430 Asp Phe Lys Gln Asp Ser Ser Lys Glu Leu Glu Glu Leu Arg Ala Ala 435 440 445 Phe Thr Arg Ala Leu Glu Tyr Leu Lys Gln Glu Val Glu Glu Arg Phe 450 455 460 Asn Glu Ser Gly Asp Pro Ser Cys Val Ile Met Gln Asn Trp Ala Arg 465 470 475 480 Ile Glu Ala Arg Leu Cys Asn Asn Met Gln Lys Ala Arg Glu Leu Trp 485 490 495 Asp Ser Ile Met Thr Arg Gly Asn Ala Lys Tyr Ala Asn Met Trp Leu 500 505 510 Glu Tyr Tyr Asn Leu Glu Arg Ala His Gly Asp Thr Gln His Cys Arg 515 520 525 Lys Ala Leu His Arg Ala Val Gln Cys Thr Ser Asp Tyr Pro Glu His 530 535 540 Val Cys Glu Val Leu Leu Thr Met Glu Arg Thr Glu Gly Ser Leu Glu 545 550 555 560 Asp Trp Asp Ile Ala Val Gln Lys Thr Glu Thr Arg Leu Ala Arg Val 565 570 575 Asn Glu Gln Arg Met Lys Ala Ala Glu Lys Glu Ala Ala Leu Val Gln 580 585 590 Gln Glu Glu Glu Lys Ala Glu Gln Arg Lys Arg Ala Arg Ala Glu Lys 595 600 605 Lys Ala Leu Lys Lys Lys Lys Lys Ile Arg Gly Pro Glu Lys Arg Gly 610 615 620 Ala Asp Glu Asp Asp Glu Lys Glu Trp Gly Asp Asp Glu Glu Glu Gln 625 630 635 640 Pro Ser Lys Arg Arg Arg Val Glu Asn Ser Ile Pro Ala Ala Gly Glu 645 650 655 Thr Gln Asn Val Glu Val Ala Ala Gly Pro Ala Gly Lys Cys Ala Ala 660 665 670 Val Asp Val Glu Pro Pro Ser Lys Gln Lys Glu Lys Ala Ala Ser Leu 675 680 685 Lys Arg Asp Met Pro Lys Val Leu His Asp Ser Ser Lys Asp Ser Ile 690 695 700 Thr Val Phe Val Ser Asn Leu Pro Tyr Ser Met Gln Glu Pro Asp Thr 705 710 715 720 Lys Leu Arg Pro Leu Phe Glu Ala Cys Gly Glu Val Val Gln Ile Arg 725 730 735 Pro Ile Phe Ser Asn Arg Gly Asp Phe Arg Gly Tyr Cys Tyr Val Glu 740 745 750 Phe Lys Glu Glu Lys Ser Ala Leu Gln Ala Leu Glu Met Asp Arg Lys 755 760 765 Ser Val Glu Gly Arg Pro Met Phe Val Ser Pro Cys Val Asp Lys Ser 770 775 780 Lys Asn Pro Asp Phe Lys Val Phe Arg Tyr Ser Thr Ser Leu Glu Lys 785 790 795 800 His Lys Leu Phe Ile Ser Gly Leu Pro Phe Ser Cys Thr Lys Glu Glu 805 810 815 Leu Glu Glu Ile Cys Lys Ala His Gly Thr Val Lys Asp Leu Arg Leu 820 825 830 Val Thr Asn Arg Ala Gly Lys Pro Lys Gly Leu Ala Tyr Val Glu Tyr 835 840 845 Glu Asn Glu Ser Gln Ala Ser Gln Ala Val Met Lys Met Asp Gly Met 850 855 860 Thr Ile Lys Glu Asn Ile Ile Lys Val Ala Ile Ser Asn Pro Pro Gln 865 870 875 880 Arg Lys Val Pro Glu Lys Pro Glu Thr Arg Lys Ala Pro Gly Gly Pro 885 890 895 Met Leu Leu Pro Gln Thr Tyr Gly Ala Arg Gly Lys Gly Arg Thr Gln 900 905 910 Leu Ser Leu Leu Pro Arg Ala Leu Gln Arg Pro Ser Ala Ala Ala Pro 915 920 925 Gln Ala Glu Asn Gly Pro Ala Ala Ala Pro Ala Val Ala Ala Pro Ala 930 935 940 Ala Thr Glu Ala Pro Lys Met Ser Asn Ala Asp Phe Ala Lys Leu Phe 945 950 955 960 Leu Arg Lys <210> 185 <211> 188 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 185 Met Asn Gly Asp Asp Ala Phe Ala Arg Arg Pro Thr Val Gly Ala Gln 1 5 10 15 Ile Pro Glu Lys Ile Gln Lys Ala Phe Asp Asp Ile Ala Lys Tyr Phe 20 25 30 Ser Lys Glu Glu Trp Glu Lys Met Lys Ala Ser Glu Lys Ile Phe Tyr 35 40 45 Val Tyr Met Lys Arg Lys Tyr Glu Ala Met Thr Lys Leu Gly Phe Lys 50 55 60 Ala Thr Leu Pro Pro Phe Met Cys Asn Lys Arg Ala Glu Asp Phe Gln 65 70 75 80 Gly Asn Asp Leu Asp Asn Asp Pro Asn Arg Gly Asn Gln Val Glu Arg 85 90 95 Pro Gln Met Thr Phe Gly Arg Leu Gln Gly Ile Ser Pro Lys Ile Met 100 105 110 Pro Lys Lys Pro Ala Glu Glu Gly Asn Asp Ser Glu Glu Val Pro Glu 115 120 125 Ala Ser Gly Pro Gln Asn Asp Gly Lys Glu Leu Cys Pro Pro Gly Lys 130 135 140 Pro Thr Thr Ser Glu Lys Ile His Glu Arg Ser Gly Pro Lys Arg Gly 145 150 155 160 Glu His Ala Trp Thr His Arg Leu Arg Glu Arg Lys Gln Leu Val Ile 165 170 175 Tyr Glu Glu Ile Ser Asp Pro Glu Glu Asp Asp Glu 180 185 <210> 186 <211> 339 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 186 Met Glu Ser Arg Lys Asp Ile Thr Asn Gln Glu Glu Leu Trp Lys Met 1 5 10 15 Lys Pro Arg Arg Asn Leu Glu Glu Asp Asp Tyr Leu His Lys Asp Thr 20 25 30 Gly Glu Thr Ser Met Leu Lys Arg Pro Val Leu Leu His Leu His Gln 35 40 45 Thr Ala His Ala Asp Glu Phe Asp Cys Pro Ser Glu Leu Gln His Thr 50 55 60 Gln Glu Leu Phe Pro Gln Trp His Leu Pro Ile Lys Ile Ala Ala Ile 65 70 75 80 Ile Ala Ser Leu Thr Phe Leu Tyr Thr Leu Leu Arg Glu Val Ile His 85 90 95 Pro Leu Ala Thr Ser His Gln Gln Tyr Phe Tyr Lys Ile Pro Ile Leu 100 105 110 Val Ile Asn Lys Val Leu Pro Met Val Ser Ile Thr Leu Leu Ala Leu 115 120 125 Val Tyr Leu Pro Gly Val Ile Ala Ala Ile Val Gln Leu His Asn Gly 130 135 140 Thr Lys Tyr Lys Lys Phe Pro His Trp Leu Asp Lys Trp Met Leu Thr 145 150 155 160 Arg Lys Gln Phe Gly Leu Leu Ser Phe Phe Phe Ala Val Leu His Ala 165 170 175 Ile Tyr Ser Leu Ser Tyr Pro Met Arg Arg Ser Tyr Arg Tyr Lys Leu 180 185 190 Leu Asn Trp Ala Tyr Gln Gln Val Gln Gln Asn Lys Glu Asp Ala Trp 195 200 205 Ile Glu His Asp Val Trp Arg Met Glu Ile Tyr Val Ser Leu Gly Ile 210 215 220 Val Gly Leu Ala Ile Leu Ala Leu Leu Ala Val Thr Ser Ile Pro Ser 225 230 235 240 Val Ser Asp Ser Leu Thr Trp Arg Glu Phe His Tyr Ile Gln Ser Lys 245 250 255 Leu Gly Ile Val Ser Leu Leu Leu Gly Thr Ile His Ala Leu Ile Phe 260 265 270 Ala Trp Asn Lys Trp Ile Asp Ile Lys Gln Phe Val Trp Tyr Thr Pro 275 280 285 Pro Thr Phe Met Ile Ala Val Phe Leu Pro Ile Val Val Leu Ile Phe 290 295 300 Lys Ser Ile Leu Phe Leu Pro Cys Leu Arg Lys Lys Ile Leu Lys Ile 305 310 315 320 Arg His Gly Trp Glu Asp Val Thr Lys Ile Asn Lys Thr Glu Ile Cys 325 330 335 Ser Gln Leu <210> 187 <211> 142 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 187 Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp 1 5 10 15 His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala 20 25 30 Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr 35 40 45 Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu 50 55 60 Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys His 65 70 75 80 Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu 85 90 95 Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys 100 105 110 Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala 115 120 125 Lys Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met Asp 130 135 140 <210> 188 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 188 Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val 1 5 10 15 Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys 20 25 30 Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln 35 40 45 Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser 50 55 60 Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly 65 70 75 <210> 189 <211> 546 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 189 Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu 1 5 10 15 Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys 20 25 30 Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser 35 40 45 Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr 50 55 60 Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly 65 70 75 80 Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn 85 90 95 Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn 100 105 110 Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly 115 120 125 Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val 130 135 140 Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly 145 150 155 160 Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser 165 170 175 Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys 180 185 190 Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp 195 200 205 Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala 210 215 220 Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser 225 230 235 240 Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr 245 250 255 Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys 260 265 270 Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn 275 280 285 Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu 290 295 300 Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp 305 310 315 320 Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn 325 330 335 Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala 340 345 350 Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp 355 360 365 Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro 370 375 380 Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile 385 390 395 400 Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp 405 410 415 Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn 420 425 430 Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly 435 440 445 Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Lys Gln Ile 450 455 460 Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro 465 470 475 480 Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly 485 490 495 Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu 500 505 510 Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu 515 520 525 His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Phe Met Phe Pro Asn Ala Pro 530 535 540 Tyr Leu 545 <210> 190 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 190 Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg His His Asn Met His Gln Arg Asn Met 1 5 10 15 Thr Lys Leu <210> 191 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 191 Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His 1 5 10 15 Ser Arg Lys His Thr Gly 20 <210> 192 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 192 Ser Gly Gln Ala Tyr Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys 1 5 10 15 Leu Glu Ser <210> 193 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 193 Ser Gly Gln Ala Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys 1 5 10 15 Leu Glu Ser <210> 194 <211> 616 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 194 Met Lys Lys Ile Met Leu Val Phe Ile Thr Leu Ile Leu Val Ser Leu 1 5 10 15 Pro Ile Ala Gln Gln Thr Glu Ala Lys Asp Ala Ser Ala Phe Asn Lys 20 25 30 Glu Asn Ser Ile Ser Ser Met Ala Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ala Ser 35 40 45 Pro Lys Thr Pro Ile Glu Lys Lys His Ala Asp Glu Ile Asp Lys Tyr 50 55 60 Ile Gln Gly Leu Asp Tyr Asn Lys Asn Asn Val Leu Val Tyr His Gly 65 70 75 80 Asp Ala Val Thr Asn Val Pro Pro Arg Lys Gly Tyr Lys Asp Gly Asn 85 90 95 Glu Tyr Ile Val Val Glu Lys Lys Lys Lys Ser Ile Asn Gln Asn Asn 100 105 110 Ala Asp Ile Gln Val Val Asn Ala Ile Ser Ser Leu Thr Tyr Pro Gly 115 120 125 Ala Leu Val Lys Ala Asn Ser Glu Leu Val Glu Asn Gln Pro Asp Val 130 135 140 Leu Pro Val Lys Arg Asp Ser Leu Thr Leu Ser Ile Asp Leu Pro Gly 145 150 155 160 Met Thr Asn Gln Asp Asn Lys Ile Val Val Lys Asn Ala Thr Lys Ser 165 170 175 Asn Val Asn Asn Ala Val Asn Thr Leu Val Glu Arg Trp Asn Glu Lys 180 185 190 Tyr Ala Gln Ala Tyr Pro Asn Val Ser Ala Lys Ile Asp Tyr Asp Asp 195 200 205 Glu Met Ala Tyr Ser Glu Ser Gln Leu Ile Ala Lys Phe Gly Thr Ala 210 215 220 Phe Lys Ala Val Asn Asn Ser Leu Asn Val Asn Phe Gly Ala Ile Ser 225 230 235 240 Glu Gly Lys Met Gln Glu Glu Val Ile Ser Phe Lys Gln Ile Tyr Tyr 245 250 255 Asn Val Asn Val Asn Glu Pro Thr Arg Pro Ser Arg Phe Phe Gly Lys 260 265 270 Ala Val Thr Lys Glu Gln Leu Gln Ala Leu Gly Val Asn Ala Glu Asn 275 280 285 Pro Pro Ala Tyr Ile Ser Ser Val Ala Tyr Gly Arg Gln Val Tyr Leu 290 295 300 Lys Leu Ser Thr Asn Ser His Ser Thr Lys Val Lys Ala Ala Phe Asp 305 310 315 320 Ala Ala Val Ser Gly Lys Ser Val Ser Gly Asp Val Glu Leu Thr Asn 325 330 335 Ile Ile Lys Asn Ser Ser Phe Lys Ala Val Ile Tyr Gly Gly Ser Ala 340 345 350 Lys Asp Glu Val Gln Ile Ile Asp Gly Asn Leu Gly Asp Leu Arg Asp 355 360 365 Ile Leu Lys Lys Gly Ala Thr Phe Asn Arg Glu Thr Pro Gly Val Pro 370 375 380 Ile Ala Tyr Thr Thr Asn Phe Leu Lys Asp Asn Glu Leu Ala Val Ile 385 390 395 400 Lys Asn Asn Ser Glu Tyr Ile Glu Thr Thr Ser Lys Ala Tyr Thr Asp 405 410 415 Gly Lys Ile Asn Ile Asp His Ser Gly Gly Tyr Val Ala Gln Phe Asn 420 425 430 Ile Ser Trp Asp Glu Val Asn Tyr Asp Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg 435 440 445 His His Asn Met His Gln Arg Asn Met Thr Lys Leu Gly Gly Gly Gly 450 455 460 Gly Pro Gly Cys Asn Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met 465 470 475 480 His Ser Arg Lys His Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gln Ala 485 490 495 Tyr Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu Pro Ser Cys Leu Glu Ser Asp 500 505 510 Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys 515 520 525 Asp Asp Asp Lys Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile 530 535 540 Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys 545 550 555 560 Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe 565 570 575 Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile 580 585 590 Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Tyr 595 600 605 Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 610 615 <210> 195 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 195 catcgatcac tctgga 16 <210> 196 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 196 ctaactccaa tgttacttg 19 <210> 197 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 197 Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu 1 5 <210> 198 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 198 Ser Leu Gly Glu Gln Gln Tyr Ser Val 1 5 <210> 199 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 199 Ala Leu Leu Pro Ala Val Pro Ser Leu 1 5 <210> 200 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 200 Asp Leu Asn Ala Leu Leu Pro Ala Val 1 5 <210> 201 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 201 Ala Leu Leu Leu Arg Thr Pro Tyr Ser 1 5 <210> 202 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 202 Asn Leu Gly Ala Thr Leu Lys Gly Val 1 5 <210> 203 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 203 Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu 1 5 <210> 204 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 204 Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu 1 5 <210> 205 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 205 Gly Val Phe Arg Gly Ile Gln Asp Val 1 5 <210> 206 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 206 Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr 1 5 10 15 Lys Asp Asp Asp Lys Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr 20 25 30 Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala 35 40 45 Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile 50 55 60 Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn 65 70 75 80 Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly 85 90 95 Met Pro Lys Tyr Ala Tyr His Met Leu 100 105 <210> 207 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 207 Ser Pro Ser Tyr Val Tyr His Gln Phe 1 5 <210> 208 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 208 Met Pro Lys Tyr Ala Tyr His Met Leu 1 5 <210> 209 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 209 Ala Asp Leu Val Val Gly 1 5 <210> 210 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 210 Ala Asp Leu Ile Glu Ala Thr Ala Glu Glu Val Leu 1 5 10 <210> 211 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 211 Gly Asp Gly Ser Ile Val Ser Leu Ala Lys Thr Ala 1 5 10 <210> 212 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 212 Arg Asp Gly Ser Val Ala Asp Leu Ala Lys Val Ala 1 5 10 <210> 213 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 213 Ala Asp Gly Ser Val Lys Thr Leu Ser Lys Val Leu 1 5 10 <210> 214 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 214 Gly Asp Gly Ser Ile Val Asp Gly Ser Lys Glu Leu 1 5 10 <210> 215 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 215 Gly Asp Gly Ser Ile Lys Thr Ala Val Lys Ser Leu 1 5 10 <210> 216 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 216 Ala Asp Leu Ser Val Ala Thr Leu Ala Lys Ser Leu 1 5 10 <210> 217 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 217 Ala Asp Leu Ala Val Lys Thr Leu Ala Lys Val Leu 1 5 10 <210> 218 <211> 369 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 218 Val Gly Lys Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Leu Ile Glu Ala Thr Ala 1 5 10 15 Glu Glu Val Leu His Val Phe Gly Tyr Ser Trp Tyr Lys Gly Asp Gly 20 25 30 Ser Ile Val Ser Leu Ala Lys Thr Ala Tyr Leu Phe Pro Val Ile Phe 35 40 45 Ser Lys Arg Asp Gly Ser Val Ala Asp Leu Ala Lys Val Ala Ile Pro 50 55 60 Gln Val His Thr Gln Val Leu Ala Asp Gly Ser Val Lys Thr Leu Ser 65 70 75 80 Lys Val Leu Met Pro Ser Leu Arg Glu Ala Ala Leu Gly Asp Gly Ser 85 90 95 Ile Val Ser Leu Ala Lys Thr Ala Trp Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Val 100 105 110 Met Gly Asp Gly Ser Ile Val Asp Gly Ser Lys Glu Leu Ile Tyr Pro 115 120 125 Asn Ala Ser Leu Leu Phe Ala Asp Leu Ile Glu Ala Thr Ala Glu Glu 130 135 140 Val Leu Arg Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Val Gly Asp Gly Ser Ile 145 150 155 160 Lys Thr Ala Val Lys Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Ile His Ala Val 165 170 175 Ala Asp Gly Ser Val Lys Thr Leu Ser Lys Val Leu Lys Tyr Lys Lys 180 185 190 Phe Pro Trp Trp Leu Ala Asp Leu Ser Val Ala Thr Leu Ala Lys Ser 195 200 205 Leu Asn Pro Gln Pro Val Trp Leu Cys Leu Ala Asp Leu Ala Val Lys 210 215 220 Thr Leu Ala Lys Val Leu Val Gly Lys Gly Gly Ser Gly Gly Asp Tyr 225 230 235 240 Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp 245 250 255 Asp Asp Lys Ala Asp Gly Ser Val Lys Thr Leu Ser Lys Val Leu Ser 260 265 270 Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Ala Asp Leu Val Val Gly Gln Ile Phe 275 280 285 Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser 290 295 300 Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile 305 310 315 320 Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp 325 330 335 Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His 340 345 350 Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Ile Leu Ile Gly Val Leu Val Gly 355 360 365 Val <210> 219 <211> 294 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 219 Val Gly Lys Gly Gly Ser Gly Gly Ala Asp Leu Ile Glu Ala Thr Ala 1 5 10 15 Glu Glu Val Leu His Val Phe Gly Tyr Ser Trp Tyr Lys Gly Asp Gly 20 25 30 Ser Ile Val Ser Leu Ala Lys Thr Ala Tyr Leu Phe Pro Val Ile Phe 35 40 45 Ser Lys Arg Asp Gly Ser Val Ala Asp Leu Ala Lys Val Ala Ile Pro 50 55 60 Gln Val His Thr Gln Val Leu Ala Asp Gly Ser Val Lys Thr Leu Ser 65 70 75 80 Lys Val Leu Met Pro Ser Leu Arg Glu Ala Ala Leu Gly Asp Gly Ser 85 90 95 Ile Val Ser Leu Ala Lys Thr Ala Trp Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Val 100 105 110 Met Gly Asp Gly Ser Ile Val Asp Gly Ser Lys Glu Leu Ile Tyr Pro 115 120 125 Asn Ala Ser Leu Leu Phe Ala Asp Leu Ile Glu Ala Thr Ala Glu Glu 130 135 140 Val Leu Arg Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Val Gly Asp Gly Ser Ile 145 150 155 160 Lys Thr Ala Val Lys Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Ile His Ala Val 165 170 175 Ala Asp Gly Ser Val Lys Thr Leu Ser Lys Val Leu Lys Tyr Lys Lys 180 185 190 Phe Pro Trp Trp Leu Ala Asp Leu Ser Val Ala Thr Leu Ala Lys Ser 195 200 205 Leu Asn Pro Gln Pro Val Trp Leu Cys Leu Ala Asp Leu Ala Val Lys 210 215 220 Thr Leu Ala Lys Val Leu Val Gly Lys Gly Gly Ser Gly Gly Asp Tyr 225 230 235 240 Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp 245 250 255 Asp Asp Lys Ala Asp Gly Ser Val Lys Thr Leu Ser Lys Val Leu Ser 260 265 270 Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Ala Asp Leu Val Val Gly Ile Leu Ile 275 280 285 Gly Val Leu Val Gly Val 290 <210> 220 <211> 1113 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 220 gttggtaaag gtggatctgg aggagcagac cttatcgaag caacagcaga agaagtatta 60 catgtttttg gttatagttg gtacaaagga gatggtagta ttgtaagttt agctaaaaca 120 gcttatttat ttcccgttat ttttagtaaa cgtgacggta gtgttgcaga tttagcaaaa 180 gtagcaattc cacaagttca tacacaagtt ttagctgacg gaagtgttaa aacattatct 240 aaagtattaa tgccaagttt aagagaagca gcattaggag acggaagtat tgtaagttta 300 gctaagacag cttggccacg tcctcgtcgt tatgttatgg gtgacggtag tatcgtagac 360 ggttctaaag aattaattta tccaaatgct agtttattat ttgcagattt aattgaagct 420 acagctgagg aagttttacg tttacttgaa ttttacttag cagttggtga tggaagtatt 480 aagacagctg taaaaagttt attattatta ggtacaattc acgcagttgc tgacggttct 540 gtaaaaacat taagtaaagt tttaaaatac aaaaaatttc catggtggtt agctgattta 600 tctgttgcaa cattagcaaa aagtttaaat ccacaaccag tatggttatg tcttgctgat 660 ttagctgtta aaacacttgc aaaagtttta gttggaaaag gtggtagtgg tggtgactat 720 aaggatcatg atggtgacta caaagatcac gatattgatt acaaagacga tgataaagca 780 gatggtagtg ttaaaactct ttctaaagtt ttaagtatta ttaatttcga aaaattagca 840 gatttagttg ttggacaaat ttttgttaag acattaactg gtaaaacaat tacattagag 900 gtagaaccat ctgatacaat cgaaaatgta aaagcaaaaa tccaagataa agaaggtatc 960 ccaccagacc agcagcgtct tatcttcgct ggtaaacaat tagaagatgg tcgtacatta 1020 tctgattata acattcaaaa agaaagtaca ttacatttag ttcttcgttt acgtggaggt 1080 attttaattg gagttttagt aggtgtataa taa 1113 <210> 221 <211> 888 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 221 gtgggtaaag gcggtagcgg tggtgctgat ttaattgaag ctacagctga agaagtatta 60 catgtttttg gatatagttg gtataaaggt gatggatcta ttgtaagttt agcaaaaaca 120 gcttatttat ttccagttat ttttagtaaa cgtgatggaa gtgtagcaga tttagctaaa 180 gtagcaattc cacaagtaca tacacaagta ttagctgatg gtagtgttaa aacattaagt 240 aaagttttaa tgccaagttt acgtgaagca gctttaggag atggttctat tgtttcttta 300 gctaaaacag catggccacg tccacgtcgt tatgttatgg gtgatggtag tattgtagat 360 ggaagtaaag aattaattta tccaaatgct tctttattat ttgcagattt aattgaagca 420 acagcagaag aagtattacg tttattagaa ttttatttag cagtaggtga tggaagtatt 480 aaaacagcag ttaaaagtct tcttcttctt ggtacaattc atgcagtggc ggatggaagt 540 gtaaaaacac tttctaaagt tcttaaatat aaaaaatttc catggtggtt agcagattta 600 agtgttgcaa cacttgctaa atctttaaat ccacaaccag tatggctttg tcttgcagat 660 cttgctgtta aaacattagc taaagtatta gtaggaaaag gtggaagtgg aggagattat 720 aaagatcatg atggtgatta taaagatcat gatattgatt ataaagatga tgataaagca 780 gatggtagtg taaaaacatt atctaaagta ttaagtatta ttaattttga aaaattagca 840 gatttagtag ttggaattct tattggtgtg cttgttggtg tttgataa 888 <210> 222 <211> 888 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 222 gttggaaagg gaggtagtgg tggtgctgat ttaattgaag ctacagcaga ggaagtttta 60 cacgtttttg gttatagttg gtataaagga gacggaagta tcgtatcttt agcaaaaaca 120 gcttatttat ttccagttat tttttctaaa agagatggta gtgtagctga tttagcaaaa 180 gttgctatcc cacaagtaca tacacaagtt ttagctgacg gttctgttaa aactctttct 240 aaagtattaa tgccaagttt acgtgaggct gcacttggtg atggttctat cgtttctctt 300 gcaaaaactg cttggccacg tccacgtcgt tatgttatgg gagacggtag tatcgttgac 360 ggatctaaag aattaattta tccaaacgca agtttattat ttgcagatct tattgaagca 420 actgctgaag aagttttacg tcttttagaa ttttatcttg cagttggaga tggaagtatc 480 aaaacagctg ttaaaagtct tttactttta ggtacaattc atgcagtagc tgatggaagt 540 gtaaaaacat taagtaaagt tttaaaatat aaaaaatttc catggtggtt agctgattta 600 agtgtagcaa ctttagcaaa atctttaaat ccacagccag tatggttatg ccttgcagat 660 ttagctgtaa aaacacttgc taaagtttta gttggaaaag gaggttctgg tggtgactac 720 aaagaccatg acggagatta caaagatcat gatattgatt ataaagatga tgataaagct 780 gacggtagtg taaagacact tagtaaagtt cttagtatta ttaattttga aaaattagct 840 gacttagttg ttggtatttt aattggtgtt ttagttggag tttaataa 888 <210> 223 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 223 cacgtatttg gttatagttg gtataaa 27 <210> 224 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 224 cacgtatttg gttatagttg gtataaa 27 <210> 225 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 225 catgtttttg gttatagttg gtataaa 27 <210> 226 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 226 catgtattcg gttatagctg gtacaaa 27 <210> 227 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 227 cacgttttcg gttatagctg gtacaaa 27 <210> 228 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 228 catgtgtttg gttatagctg gtataaa 27 <210> 229 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 229 cacgtgttcg ggtatagttg gtataag 27 <210> 230 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 230 catgtttttg gatattcttg gtataaa 27 <210> 231 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 231 catgtatttg gttatagttg gtataaa 27 <210> 232 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 232 catgtttttg gttatagttg gtataaa 27 <210> 233 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 233 catgtttttg gatatagttg gtataaa 27 <210> 234 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 234 catgtttttg gttattcttg gtataaa 27 <210> 235 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 235 catgtttttg gttattcttg gtacaaa 27 <210> 236 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 236 catgtatttg gttatagttg gtacaaa 27 <210> 237 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 237 catgtttttg gatattcttg gtataaa 27 <210> 238 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 238 catgtattcg gttatagttg gtataaa 27 <210> 239 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 239 catgtatttg gttatagttg gtataaa 27 <210> 240 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 240 catgtttttg gatatagttg gtataaa 27 <210> 241 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 241 catgtttttg gatatagttg gtataaa 27 <210> 242 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 242 tatctatttc cagtgatctt cagcaag 27 <210> 243 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 243 tatttattcc cagtgatctt cagtaaa 27 <210> 244 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 244 tatttatttc cagtgatctt ctctaaa 27 <210> 245 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 245 tatctttttc cagtgatttt cagcaaa 27 <210> 246 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 246 tatttatttc cagtgatttt cagcaaa 27 <210> 247 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 247 tatttatttc cagtgatttt tagtaaa 27 <210> 248 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 248 tatttgtttc cagtgatttt ttctaaa 27 <210> 249 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 249 tatttatttc cagttatttt tagtaaa 27 <210> 250 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 250 tatttatttc cagtaatttt tagtaaa 27 <210> 251 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 251 tatttatttc cagtaatttt tagtaaa 27 <210> 252 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 252 tatttatttc cagttatttt tagtaaa 27 <210> 253 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 253 tatttatttc cagttatttt tagtaaa 27 <210> 254 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 254 tatctttttc cagttatttt tagtaaa 27 <210> 255 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 255 tatctttttc cagttatttt tagtaaa 27 <210> 256 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 256 tatttatttc cagttatttt tagtaaa 27 <210> 257 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 257 tatctttttc cagttatttt tagtaaa 27 <210> 258 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 258 tacttatttc cagtaatttt ctctaaa 27 <210> 259 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 259 tatttatttc cagttatttt tagtaaa 27 <210> 260 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 260 tatttatttc cagttatttt tagtaaa 27 <210> 261 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 261 attccacaag ttcatacaca agttttg 27 <210> 262 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 262 attccgcaag ttcatacaca agtgcta 27 <210> 263 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 263 attccacaag ttcatacaca agtgctt 27 <210> 264 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 264 atcccacaag ttcatacaca agtttta 27 <210> 265 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 265 atcccacaag ttcatacaca agtttta 27 <210> 266 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 266 attccgcaag ttcatacaca agtgctg 27 <210> 267 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 267 atccctcaag ttcatacaca agtactc 27 <210> 268 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 268 attccacaag tacatacaca agtttta 27 <210> 269 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 269 attccacaag tacatacaca agtatta 27 <210> 270 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 270 attccacaag ttcatacaca agtatta 27 <210> 271 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 271 attccacaag tacatacaca agtatta 27 <210> 272 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 272 attccacaag ttcatacaca agtttta 27 <210> 273 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 273 atcccacaag ttcatacaca agtatta 27 <210> 274 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 274 ataccacaag ttcatacaca agtatta 27 <210> 275 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 275 attccacaag tacatacaca agtttta 27 <210> 276 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 276 atcccacaag tacacacaca agtactt 27 <210> 277 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 277 attccacaag ttcacactca agtactt 27 <210> 278 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 278 attccacaag tacatacaca agtatta 27 <210> 279 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 279 attccacaag tacatacaca agtatta 27 <210> 280 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 280 atgccgagtc tacgtgaggc ggcatta 27 <210> 281 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 281 atgccatctc tgcgcgaagc agccttg 27 <210> 282 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 282 atgcctagtc ttcgtgaagc agcacta 27 <210> 283 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 283 atgccaagcc ttagagaagc agcatta 27 <210> 284 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 284 atgccaagcc ttagagaagc agcatta 27 <210> 285 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 285 atgccaagtt tacgtgaagc agcattg 27 <210> 286 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 286 atgccgagct taagagaagc agcactt 27 <210> 287 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 287 atgccatctt tacgtgaagc tgcatta 27 <210> 288 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 288 atgccaagtt tacgtgaagc agcatta 27 <210> 289 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 289 atgccatctt tacgtgaagc agcttta 27 <210> 290 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 290 atgccaagtt tacgtgaagc agcttta 27 <210> 291 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 291 atgccatctt tacgtgaagc agcttta 27 <210> 292 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 292 atgccatctt tacgtgaagc agcttta 27 <210> 293 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 293 atgccatctt tacgtgaagc agcttta 27 <210> 294 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 294 atgccatctt tacgtgaagc tgcatta 27 <210> 295 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 295 atgcctagtc ttcgtgaagc tgcactt 27 <210> 296 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 296 atgccaagtc ttcgtgaggc agcatta 27 <210> 297 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 297 atgccaagtt tacgtgaagc agcttta 27 <210> 298 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 298 atgccaagtt tacgtgaagc agcttta 27 <210> 299 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 299 tggccaagac ctcgaagata tgttatg 27 <210> 300 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 300 tggccaagac caagacgcta tgtaatg 27 <210> 301 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 301 tggcctcgtc cacgcagata tgttatg 27 <210> 302 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 302 tggccaagac caagaagata tgttatg 27 <210> 303 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 303 tggccaagac caagaagata tgttatg 27 <210> 304 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 304 tggccgagac caagaagata tgtcatg 27 <210> 305 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 305 tggccgcgcc cccgtcgcta tgttatg 27 <210> 306 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 306 tggccacgtc cacgtcgtta tgttatg 27 <210> 307 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 307 tggccacgtc cacgtcgtta tgtaatg 27 <210> 308 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 308 tggccacgtc cacgtcgtta tgttatg 27 <210> 309 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 309 tggccacgtc cacgtcgtta tgttatg 27 <210> 310 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 310 tggccacgtc cacgtcgtta tgttatg 27 <210> 311 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 311 tggccaagac caagaagata tgtaatg 27 <210> 312 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 312 tggccaagac caagaagata tgttatg 27 <210> 313 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 313 tggccacgtc cacgtcgtta tgttatg 27 <210> 314 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 314 tggcctcgtc ctcgtcgtta tgttatg 27 <210> 315 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 315 tggccacgtc ctcgtcgtta tgttatg 27 <210> 316 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 316 tggccacgtc cacgtcgtta tgttatg 27 <210> 317 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 317 tggccacgtc cacgtcgtta tgttatg 27 <210> 318 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 318 atttatccaa atgcaagtct tttattt 27 <210> 319 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 319 atctatccaa atgcaagttt gttattt 27 <210> 320 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 320 atatatccaa atgcaagtct tttattt 27 <210> 321 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 321 atctacccaa atgcgagcct cttattt 27 <210> 322 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 322 atttacccaa atgcgagcct cttattt 27 <210> 323 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 323 atttatccaa atgcaagctt attattt 27 <210> 324 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 324 atttatccaa atgcgagcct tttattc 27 <210> 325 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 325 atttatccaa atgcttcttt attattt 27 <210> 326 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 326 atttatccaa atgcttcttt attattt 27 <210> 327 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 327 atttatccaa atgctagttt attattt 27 <210> 328 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 328 atttatccaa atgcttcttt attattt 27 <210> 329 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 329 atttatccaa atgcaagttt attattt 27 <210> 330 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 330 atatatccaa atgcatctct tcttttt 27 <210> 331 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 331 atctatccaa atgcaagtct tcttttc 27 <210> 332 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 332 atttatccaa atgcttcttt attattt 27 <210> 333 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 333 atttatccaa atgcatcttt attattt 27 <210> 334 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 334 atctatccta atgcttcttt acttttc 27 <210> 335 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 335 atttatccaa atgcttcttt attattt 27 <210> 336 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 336 atttatccaa atgcttcttt attattt 27 <210> 337 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 337 cgcttattag aattctacct tgcggta 27 <210> 338 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 338 cgtctattgg aattctacct tgcggtg 27 <210> 339 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 339 cgtttattgg aattctacct tgcggtg 27 <210> 340 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 340 cgattactag aattctatct tgcggtt 27 <210> 341 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 341 agattacttg aattctatct tgcggtt 27 <210> 342 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 342 cgtttattgg aattttattt agcggtt 27 <210> 343 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 343 agacttttag aattttattt agcggta 27 <210> 344 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 344 cgtttattag aattttattt agctgta 27 <210> 345 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 345 cgtttattag aattttattt agctgtt 27 <210> 346 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 346 cgtttattag aattttattt agctgta 27 <210> 347 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 347 cgtttattag aattttattt agcagta 27 <210> 348 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 348 cgtttattag aattttattt agctgtt 27 <210> 349 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 349 agacttttag aattttattt agcagtt 27 <210> 350 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 350 agacttttag aattttattt agcagtt 27 <210> 351 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 351 cgtttattag aattttattt agctgta 27 <210> 352 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 352 agattattag aattttattt agctgtt 27 <210> 353 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 353 cgtttacttg aattttacct tgcagtt 27 <210> 354 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 354 cgtttattag aattttattt agcagta 27 <210> 355 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 355 cgtttattag aattttattt agcagta 27 <210> 356 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 356 atcttaattg gcgttttagt tggtgtt 27 <210> 357 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 357 atcttaattg gcgttttagt tggtgtt 27 <210> 358 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 358 atcttaattg gcgttttagt tggtgtt 27 <210> 359 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 359 atcttaattg gcgttttagt tggtgtt 27 <210> 360 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 360 atcttaattg gcgttttagt tggtgtt 27 <210> 361 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 361 atcttaattg gcgttttagt tggtgtt 27 <210> 362 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 362 atcttaattg gcgttttagt tggtgtt 27 <210> 363 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 363 attcttattg gtgtgcttgt tggtgtg 27 <210> 364 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 364 attcttattg gtgtgttagt aggcgtt 27 <210> 365 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 365 attcttattg gcgttttagt tggcgtt 27 <210> 366 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 366 attcttattg gtgtgcttgt tggtgtt 27 <210> 367 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 367 attcttattg gcgtgttagt gggagtt 27 <210> 368 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 368 attcttattg gagtgttagt aggtgtt 27 <210> 369 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 369 attcttattg gcgtgcttgt gggcgtt 27 <210> 370 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 370 attcttattg gtgtgcttgt tggtgtg 27 <210> 371 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 371 attttaattg gtgttttagt tggagtt 27 <210> 372 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 372 attttaattg gtgttttagt aggagtt 27 <210> 373 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 373 attcttattg gtgtgcttgt tggtgtt 27 <210> 374 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 374 attcttattg gtgtgcttgt tggtgtt 27 <210> 375 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 375 atgcctagtt taagagaagc agcatta 27 <210> 376 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 376 atgccaagtt taagagaagc agcatta 27 <210> 377 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 377 atgccgagtt taagagaagc agcactt 27 <210> 378 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 378 atgccaagtc ttcgtgaagc agcatta 27 <210> 379 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 379 atgccaagtc ttcgtgaagc agcatta 27 <210> 380 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 380 atgcctagtt taagagaagc agcacta 27 <210> 381 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 381 atgccaagtt taagagaagc ggcacta 27 <210> 382 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 382 atgccatctt tacgtgaagc agcatta 27 <210> 383 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 383 atgccatctt tacgtgaagc tgcttta 27 <210> 384 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 384 atgccatctt tacgtgaagc tgcatta 27 <210> 385 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 385 atgccaagtt tacgtgaagc agcttta 27 <210> 386 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 386 atgccaagtt tacgtgaagc agcttta 27 <210> 387 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 387 atgccatctt tacgtgaagc agcttta 27 <210> 388 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 388 atgccaagtt tacgtgaagc tgcatta 27 <210> 389 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 389 atgccaagtt tacgtgaggc agcttta 27 <210> 390 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 390 atgcctagtc ttcgtgaggc tgctctt 27 <210> 391 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 391 atgccatctt tacgtgaagc agcatta 27 <210> 392 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 392 atgccaagtt tacgtgaagc agcttta 27 <210> 393 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 393 cttttattag gcacaattca tgcagtt 27 <210> 394 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 394 cttttattag gcacaattca tgcagtt 27 <210> 395 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 395 cttttattag gcacaattca tgcagtt 27 <210> 396 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 396 cttttattag gcacaattca tgcagtt 27 <210> 397 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 397 cttttattag gcacaattca tgcagtt 27 <210> 398 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 398 cttttattag gcacaattca tgcagtt 27 <210> 399 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 399 cttttattag gcacaattca tgcagtt 27 <210> 400 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 400 ttacttcttg gaactattca tgctgtt 27 <210> 401 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 401 cttcttttag gcactattca tgctgtg 27 <210> 402 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 402 cttttacttg gcactattca tgctgtt 27 <210> 403 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 403 cttcttcttg gcactattca tgctgtg 27 <210> 404 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 404 ttacttttag gcactattca tgctgtg 27 <210> 405 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 405 cttcttttag gcactattca tgcggtt 27 <210> 406 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 406 cttcttcttg gcactattca tgcggtg 27 <210> 407 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 407 ttacttttag gaacaattca cgcagtt 27 <210> 408 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 408 ttattattag gaacaattca cgcagta 27 <210> 409 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 409 ttacttcttg gaactattca tgctgtt 27 <210> 410 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 410 cttcttcttg gcactattca tgctgtg 27 <210> 411 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 411 aaatacaaaa aatttccatg gtggctt 27 <210> 412 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 412 aaatataaaa aatttccatg gtggtta 27 <210> 413 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 413 aaatacaaaa aatttccatg gtggtta 27 <210> 414 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 414 aagtacaaga agttcccatg gtggtta 27 <210> 415 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 415 aagtacaaga agttcccatg gtggtta 27 <210> 416 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 416 aaatataaaa aatttccatg gtggtta 27 <210> 417 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 417 aaatataaaa aatttccatg gtggtta 27 <210> 418 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 418 aaatataaaa aatttccatg gtggtta 27 <210> 419 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 419 aaatataaaa aatttccatg gtggtta 27 <210> 420 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 420 aaatataaaa aatttccatg gtggtta 27 <210> 421 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 421 aaatataaaa aatttccatg gtggtta 27 <210> 422 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 422 aaatataaaa aatttccatg gtggtta 27 <210> 423 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 423 aaatataaaa aatttccatg gtggctt 27 <210> 424 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 424 aaatataaaa aatttccatg gtggctt 27 <210> 425 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 425 aaatataaga aattcccatg gtggtta 27 <210> 426 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 426 aaatataaaa aatttccttg gtggctt 27 <210> 427 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 427 aaatataaaa aatttccatg gtggtta 27 <210> 428 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 428 aaatataaaa aatttccatg gtggtta 27 <210> 429 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 429 cgcctacaag gcatctctcc aaaagtc 27 <210> 430 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 430 cgcttgcaag gtatctcacc aaaagtg 27 <210> 431 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 431 cgtttacaag gaatttcccc aaaggtt 27 <210> 432 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 432 agattacaag gcattagccc aaaagtt 27 <210> 433 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 433 agattacaag gtattagccc aaaagtt 27 <210> 434 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 434 cgcttacaag gtattagtcc taaggtt 27 <210> 435 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 435 agacttcaag gtattagtcc aaaagtt 27 <210> 436 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 436 cgtttacaag gtatttctcc aaaagtt 27 <210> 437 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 437 cgtttacaag gtatttctcc aaaagtt 27 <210> 438 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 438 cgtttacaag gtattagtcc aaaagta 27 <210> 439 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 439 cgtttacaag gaattagtcc aaaagta 27 <210> 440 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 440 cgtttacaag gtattagtcc aaaagtt 27 <210> 441 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 441 cgtttacaag gtattagtcc aaaagtt 27 <210> 442 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 442 cgtttacaag gaattagtcc aaaagtt 27 <210> 443 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 443 cgtttacaag gtatctctcc aaaagta 27 <210> 444 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 444 agattacaag gtatttctcc taaggtt 27 <210> 445 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 445 cgtttacaag gtatttctcc aaaagtt 27 <210> 446 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 446 cgtttacaag gaattagtcc aaaagta 27 <210> 447 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 447 ttaatgcaag cagaagcacc ccggctt 27 <210> 448 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 448 ctaatgcaag cagaagcacc acgcctc 27 <210> 449 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 449 ttgatgcaag cagaagcacc acgttta 27 <210> 450 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 450 ttaatgcaag cagaagcacc aagatta 27 <210> 451 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 451 ttaatgcaag cagaagcacc aagatta 27 <210> 452 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 452 ttaatgcaag cggaagcacc aagactt 27 <210> 453 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 453 ctcatgcagg cagaagcacc ccgttta 27 <210> 454 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 454 ttaatgcaag cagaagctcc acgttta 27 <210> 455 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 455 ttaatgcaag cagaagcacc acgttta 27 <210> 456 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 456 ttaatgcaag ctgaagctcc acgttta 27 <210> 457 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 457 ttaatgcaag cagaagcacc acgttta 27 <210> 458 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 458 ttaatgcaag ctgaagcacc acgttta 27 <210> 459 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 459 ttaatgcaag ctgaagctcc acgttta 27 <210> 460 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 460 ttaatgcaag ctgaagcacc acgttta 27 <210> 461 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 461 cttatgcaag cagaggctcc acgtctt 27 <210> 462 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 462 ttaatgcaag ctgaagcacc acgttta 27 <210> 463 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 463 ttaatgcaag cagaagctcc acgttta 27 <210> 464 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 464 ttaatgcaag cagaagcacc acgttta 27 <210> 465 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 465 atggctcctg atgttgtagc atttgtg 27 <210> 466 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 466 atggctcctg atgtcgtagc attcgtt 27 <210> 467 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 467 atggctccag atgttgtagc atttgta 27 <210> 468 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 468 atggcaccag atgttgttgc atttgtt 27 <210> 469 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 469 atggcaccag atgttgttgc atttgtt 27 <210> 470 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 470 atggcaccag atgttgttgc gtttgta 27 <210> 471 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 471 atggcaccag atgttgttgc gtttgta 27 <210> 472 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 472 atggcaccag atgttgtagc ttttgtt 27 <210> 473 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 473 atggctccag atgtagttgc ttttgta 27 <210> 474 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 474 atggcaccag atgttgttgc atttgta 27 <210> 475 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 475 atggcaccag atgtagttgc atttgta 27 <210> 476 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 476 atggctccag atgttgtagc ttttgtt 27 <210> 477 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 477 atggcgccag atgttgtagc atttgtt 27 <210> 478 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 478 atggcgccag atgtagttgc atttgta 27 <210> 479 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 479 atggcaccag acgtagtagc tttcgta 27 <210> 480 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 480 atggcacccg atgttgttgc tttcgta 27 <210> 481 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 481 atggcaccag atgttgtagc ttttgtt 27 <210> 482 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 482 atggcaccag atgtagttgc atttgta 27 <210> 483 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 483 acatatagtg tgagcttctt ctcttgg 27 <210> 484 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 484 acttatagtg tgagcttctt ttcttgg 27 <210> 485 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 485 acgtacagtg tgagcttctt cagctgg 27 <210> 486 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 486 acatatagtg ttagcttttt tagctgg 27 <210> 487 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 487 acatatagtg ttagcttttt tagctgg 27 <210> 488 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 488 acatatagtg ttagcttctt ttcatgg 27 <210> 489 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 489 acatatagtg ttagcttttt ttcctgg 27 <210> 490 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 490 acgtatagtg ttagtttctt tagttgg 27 <210> 491 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 491 acatattctg tatctttctt tagttgg 27 <210> 492 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 492 acatatagtg taagtttctt tagttgg 27 <210> 493 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 493 acatatagtg tttctttctt tagttgg 27 <210> 494 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 494 acatatagtg tttctttctt tagttgg 27 <210> 495 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 495 acatatagtg tttctttctt ttcttgg 27 <210> 496 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 496 acatattctg ttagtttctt tagttgg 27 <210> 497 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 497 acatatagtg ttagtttctt cagttgg 27 <210> 498 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 498 acatattctg taagtttttt ttcttgg 27 <210> 499 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 499 acgtatagtg ttagtttctt tagttgg 27 <210> 500 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 500 acatatagtg tttctttctt tagttgg 27 <210> 501 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 501 ggtatggcac cattaatttt atctaga 27 <210> 502 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 502 ggtatggcac cattaattct tagtcgg 27 <210> 503 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 503 ggcatggcac cattaatttt gtcacgc 27 <210> 504 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 504 ggtatggcac cacttatttt aagtaga 27 <210> 505 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 505 ggtatggcac cacttatttt aagtaga 27 <210> 506 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 506 ggcatggcac cattaatctt atcaaga 27 <210> 507 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 507 gggatggcac cattaatttt aagcaga 27 <210> 508 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 508 ggtatggcac cattaatttt aagtcgt 27 <210> 509 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 509 ggtatggctc cattaatttt atctcgt 27 <210> 510 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 510 ggtatggctc cattaatttt atctcgt 27 <210> 511 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 511 ggaatggctc cattaatttt aagtcgt 27 <210> 512 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 512 ggaatggcac cattaatttt atctcgt 27 <210> 513 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 513 ggtatggctc cattaatttt aagtcgt 27 <210> 514 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 514 ggaatggcac cattaatttt aagtcgt 27 <210> 515 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 515 ggtatggctc cacttatcct ttctcgt 27 <210> 516 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 516 ggtatggcac cattaattct tagtcgt 27 <210> 517 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 517 ggtatggcac cattaatttt aagtcgt 27 <210> 518 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 518 ggaatggctc cattaatttt aagtcgt 27 <210> 519 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 519 tggccacggc cgcgtcgtta tgttatg 27 <210> 520 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 520 tggccacgtc cacgtcgtta tgttatg 27 <210> 521 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 521 tggcctcgtc caagacgtta cgttatg 27 <210> 522 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 522 tggccacgtc cacgtcgtta cgtaatg 27 <210> 523 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 523 tggccacgtc cacgtcgtta tgttatg 27 <210> 524 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 524 tggcctcgtc cacgtcgtta tgtaatg 27 <210> 525 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 525 tggccacgtc cacgtcgtta tgttatg 27 <210> 526 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 526 tggccacgtc cacgtcgtta tgttatg 27 <210> 527 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 527 tggccacgtc cacgtcgtta tgtaatg 27 <210> 528 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 528 tggccacgtc cacgtcgtta tgttatg 27 <210> 529 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 529 tggccacgtc cacgtcgtta tgtaatg 27 <210> 530 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 530 tggccacgtc cacgtcgtta tgtaatg 27 <210> 531 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 531 tggcctcgtc cacgtcgtta tgtaatg 27 <210> 532 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 532 tggcctcgtc caagacgtta cgttatg 27 <210> 533 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 533 tggccacgtc caagacgtta cgtaatg 27 <210> 534 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 534 tggcctcgtc cacgtcgtta cgttatg 27 <210> 535 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 535 tggccacgtc cacgtcgtta tgttatg 27 <210> 536 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 536 tggccaagac cacgtcgtta tgttatg 27 <210> 537 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 537 cgtttacttg aattctatct tgcagtt 27 <210> 538 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 538 cgtcttttag aattttattt agcggtg 27 <210> 539 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 539 cgtttattag aattttactt agcagtt 27 <210> 540 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 540 cgtttattag aattttacct tgctgta 27 <210> 541 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 541 cgtttattag agttttactt agcagta 27 <210> 542 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 542 cgtttacttg aattttactt agctgtt 27 <210> 543 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 543 cgtttacttg aattctactt agctgtt 27 <210> 544 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 544 cgtcttttag aattttatct tgcggta 27 <210> 545 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 545 cgtttacttg aattttatct tgctgtt 27 <210> 546 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 546 cgtttacttg aattttatct tgcggta 27 <210> 547 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 547 cgtttacttg aattttatct tgcggta 27 <210> 548 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 548 cgtttacttg aattttatct tgctgtt 27 <210> 549 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 549 cgtttacttg aattttactt agctgtt 27 <210> 550 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 550 cgtttattag aattttactt agcagtt 27 <210> 551 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 551 cgtttattag aattctacct tgcagtt 27 <210> 552 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 552 cgtcttttag agttttactt agctgtt 27 <210> 553 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 553 cgtcttttag aattttatct tgcagtt 27 <210> 554 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 554 cgtcttttag aattttattt agcagtt 27 <210> 555 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 555 tacttaatgc cagtcaactc agaagtc 27 <210> 556 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 556 tatttaatgc cagttaatag tgaagtt 27 <210> 557 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 557 taccttatgc cagttaacag tgaggtt 27 <210> 558 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 558 tacttaatgc cagttaacag tgaggta 27 <210> 559 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 559 taccttatgc ccgttaacag tgaggta 27 <210> 560 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 560 tatttaatgc cagtaaattc tgaagtt 27 <210> 561 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 561 tatttaatgc cagtaaattc tgaagtt 27 <210> 562 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 562 tatcttatgc cagtaaatag tgaagtt 27 <210> 563 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 563 tatcttatgc cagtaaatag tgaagtt 27 <210> 564 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 564 tatcttatgc cagtaaatag tgaagtt 27 <210> 565 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 565 tatcttatgc cagtaaatag tgaagtt 27 <210> 566 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 566 tatcttatgc cagtaaatag tgaagtt 27 <210> 567 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 567 tatttaatgc cagtaaattc tgaagtt 27 <210> 568 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 568 taccttatgc cagttaacag tgaggtt 27 <210> 569 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 569 tacttaatgc cagttaattc tgaagtt 27 <210> 570 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 570 tatttaatgc cagtaaattc tgaagtt 27 <210> 571 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 571 tatttaatgc cagttaatag tgaagta 27 <210> 572 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 572 tatttaatgc cagttaatag tgaagta 27 <210> 573 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 573 gtttggggta ttagacttga acatttt 27 <210> 574 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 574 gtttggggaa ttcgtttaga acatttt 27 <210> 575 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 575 gtttggggta tccgtcttga acacttc 27 <210> 576 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 576 gtttggggta tccgtttaga gcatttc 27 <210> 577 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 577 gtttggggta ttcgtcttga gcacttc 27 <210> 578 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 578 gtatggggta ttcgtttaga acacttc 27 <210> 579 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 579 gtttggggaa tccgtcttga acatttt 27 <210> 580 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 580 gtttggggaa ttcgtttaga acatttc 27 <210> 581 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 581 gtttggggta ttcgtttaga acatttc 27 <210> 582 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 582 gtttggggaa ttcgtttaga acatttc 27 <210> 583 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 583 gtatggggta ttcgtttaga acatttt 27 <210> 584 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 584 gtatggggaa ttcgtttaga acatttt 27 <210> 585 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 585 gtatggggta ttcgtttaga acacttc 27 <210> 586 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 586 gtttggggta tccgtcttga acacttc 27 <210> 587 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 587 gtatggggta tccgtcttga gcatttt 27 <210> 588 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 588 gtatggggta ttcgtttaga acacttt 27 <210> 589 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 589 gtttggggaa ttcgtttaga acatttc 27 <210> 590 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 590 gtatggggaa ttcgtttaga acatttt 27 <210> 591 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 591 gtctatattc ttggtggaag tcaattc 27 <210> 592 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 592 gtttatattt taggtggaag tcaattt 27 <210> 593 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 593 gtttacatcc ttggtggtag tcaattc 27 <210> 594 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 594 gtatatattt taggaggtag tcaattc 27 <210> 595 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 595 gtatacattt taggtggtag tcagttc 27 <210> 596 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 596 gtttatattt taggtggttc tcaattt 27 <210> 597 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 597 gtttatattc ttggtggttc tcaattt 27 <210> 598 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 598 gtttacattt taggtggaag tcaattt 27 <210> 599 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 599 gtttacattt taggtggtag tcaattc 27 <210> 600 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 600 gtttacattt taggtggaag tcaattt 27 <210> 601 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 601 gtttatattt taggtggatc tcaattt 27 <210> 602 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 602 gtttatattt taggtggtag tcaattt 27 <210> 603 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 603 gtttatattt taggtggttc tcaattt 27 <210> 604 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 604 gtttacatcc ttggtggtag tcaattc 27 <210> 605 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 605 gtttacatct taggaggttc tcagttc 27 <210> 606 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 606 gtttacattc ttggaggaag tcaattc 27 <210> 607 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 607 gtttacattt taggtggatc tcaattt 27 <210> 608 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 608 gtatatattt taggtggatc tcaattt 27 <210> 609 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 609 ataatgccaa aagcaggcct tcttttt 27 <210> 610 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 610 attatgccaa aagctggatt attattt 27 <210> 611 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 611 atcatgccaa aagctggttt attattt 27 <210> 612 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 612 atcatgccaa aggctggtct tcttttc 27 <210> 613 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 613 atcatgccaa aggctggact tttattc 27 <210> 614 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 614 attatgccaa aagctggttt acttttt 27 <210> 615 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 615 attatgccta aagctggttt attattc 27 <210> 616 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 616 attatgccaa aagcaggttt acttttt 27 <210> 617 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 617 attatgccaa aagcaggttt acttttt 27 <210> 618 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 618 attatgccaa aagcaggttt acttttt 27 <210> 619 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 619 attatgccaa aagctggatt acttttt 27 <210> 620 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 620 attatgccaa aagctggttt acttttt 27 <210> 621 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 621 attatgccaa aagctggttt acttttt 27 <210> 622 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 622 atcatgccaa aagctggttt attattt 27 <210> 623 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 623 atcatgccaa aagctggttt attattc 27 <210> 624 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 624 atcatgccaa aggctggttt acttttc 27 <210> 625 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 625 attatgccaa aagctggtct tcttttt 27 <210> 626 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 626 attatgccaa aagcaggtct tcttttt 27 <210> 627 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 627 tcgctatatt attggcctag accacgt 27 <210> 628 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 628 agtttatatt attggccacg tccacgt 27 <210> 629 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 629 agtctttact actggccacg tccacgt 27 <210> 630 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 630 agtctttact actggccacg tccacgt 27 <210> 631 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 631 agtctttact actggccacg tcctcgt 27 <210> 632 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 632 agtctttatt actggccacg tcctcgt 27 <210> 633 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 633 agtttatatt attggccaag accacgt 27 <210> 634 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 634 agtttatatt attggccacg tccacgt 27 <210> 635 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 635 agtttatatt attggccacg tccacgt 27 <210> 636 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 636 agtttatatt attggccacg tccacgt 27 <210> 637 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 637 tctctttatt attggccacg tccacgt 27 <210> 638 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 638 tctctttatt attggccacg tccacgt 27 <210> 639 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 639 agtctttatt actggccacg tcctcgt 27 <210> 640 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 640 agtctttact actggccacg tccacgt 27 <210> 641 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 641 agtctttact actggccacg tccaaga 27 <210> 642 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 642 agtctttatt actggccacg tccacgt 27 <210> 643 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 643 agtttatatt attggccacg tccacgt 27 <210> 644 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 644 agtctttatt attggccacg tccacgt 27 <210> 645 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 645 tacatgttcc cggtgatttt cagcaaa 27 <210> 646 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 646 tatatgtttc cagttatttt tagtaaa 27 <210> 647 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 647 tatatgtttc cagtaatttt ttctaaa 27 <210> 648 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 648 tatatgtttc cagttatttt tagtaaa 27 <210> 649 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 649 tacatgttcc ccgttatttt ttctaaa 27 <210> 650 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 650 tatatgtttc cagttatttt cagtaaa 27 <210> 651 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 651 tacatgtttc cagtaatttt tagtaag 27 <210> 652 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 652 tacatgtttc cagtaatttt tagtaaa 27 <210> 653 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 653 tacatgtttc cagtaatttt tagtaaa 27 <210> 654 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 654 tacatgtttc cagtaatttt tagtaaa 27 <210> 655 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 655 tatatgtttc cagtaatttt tagtaaa 27 <210> 656 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 656 tatatgtttc cagtaatttt tagtaaa 27 <210> 657 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 657 tatatgtttc cagttatttt cagtaaa 27 <210> 658 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 658 tatatgtttc cagtaatttt ttctaaa 27 <210> 659 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 659 tatatgtttc cagttatttt tagtaag 27 <210> 660 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 660 tatatgtttc cagtaatctt tagtaaa 27 <210> 661 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 661 tatatgtttc cagtaatttt tagtaaa 27 <210> 662 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 662 tatatgtttc cagttatttt tagtaaa 27 <210> 663 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 663 gctccacgtg gtccgcatgg tggtatg 27 <210> 664 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 664 gctccacgtg gaccacatgg aggaatg 27 <210> 665 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 665 gctccacgtg gtccacatgg aggaatg 27 <210> 666 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 666 gcaccacgtg gtccacatgg tggaatg 27 <210> 667 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 667 gctccacgtg gtccacatgg tggaatg 27 <210> 668 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 668 gcaccacgtg gaccacacgg tggtatg 27 <210> 669 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 669 gcaccacgtg gaccacacgg aggtatg 27 <210> 670 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 670 gctccacgtg gtccacatgg tggaatg 27 <210> 671 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 671 gctccacgtg gtccacatgg tggtatg 27 <210> 672 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 672 gctccacgtg gtccacatgg tggaatg 27 <210> 673 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 673 gctccacgtg gtccacatgg tggaatg 27 <210> 674 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 674 gctccacgtg gaccacatgg tggtatg 27 <210> 675 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 675 gcaccacgtg gaccacacgg tggtatg 27 <210> 676 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 676 gctccacgtg gtccacatgg aggaatg 27 <210> 677 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 677 gctccacgtg gtccacatgg tggaatg 27 <210> 678 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 678 gctcctagag gtccacatgg aggtatg 27 <210> 679 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 679 gcaccacgtg gaccacatgg tggaatg 27 <210> 680 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 680 gcaccacgtg gaccacatgg tggaatg 27 <210> 681 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 681 ttaccatgga caatgaacta tccacta 27 <210> 682 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 682 ttaccatgga caatgaatta tccatta 27 <210> 683 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 683 ttaccatgga ctatgaacta cccactt 27 <210> 684 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 684 ttaccatgga ctatgaatta tccatta 27 <210> 685 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 685 cttccatgga caatgaacta cccactt 27 <210> 686 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 686 cttccatgga caatgaatta tccttta 27 <210> 687 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 687 ttaccatgga ctatgaacta tccatta 27 <210> 688 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 688 ttaccatgga caatgaatta tccatta 27 <210> 689 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 689 ttaccatgga caatgaatta tccatta 27 <210> 690 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 690 ttaccatgga caatgaatta tccatta 27 <210> 691 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 691 ttaccatgga caatgaatta tccatta 27 <210> 692 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 692 ttaccatgga caatgaatta tccatta 27 <210> 693 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 693 cttccatgga caatgaatta tccttta 27 <210> 694 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 694 ttaccatgga ctatgaacta cccactt 27 <210> 695 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 695 ttaccatgga caatgaacta tccatta 27 <210> 696 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 696 ttaccatgga ctatgaatta cccatta 27 <210> 697 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 697 ttaccatgga caatgaatta tccatta 27 <210> 698 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 698 ttaccatgga caatgaatta tccatta 27 <210> 699 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 699 cacgtatttg gttatagttg gtacaag 27 <210> 700 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 700 cacgttttcg gatacagttg gtataag 27 <210> 701 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 701 cacgtttttg gatactcttg gtataaa 27 <210> 702 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 702 catgttttcg gatatagttg gtacaaa 27 <210> 703 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 703 cacgtatttg gatattcttg gtacaaa 27 <210> 704 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 704 catgtatttg gttatagttg gtataaa 27 <210> 705 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 705 catgtatttg gttatagttg gtataaa 27 <210> 706 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 706 catgtatttg gttatagttg gtataaa 27 <210> 707 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 707 catgtatttg gatatagttg gtataaa 27 <210> 708 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 708 catgtatttg gatatagttg gtataaa 27 <210> 709 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 709 atccctcaag ttcacacaca agttctt 27 <210> 710 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 710 attccacaag ttcacacaca agtatta 27 <210> 711 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 711 atccctcaag ttcatacaca agttctt 27 <210> 712 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 712 atcccacaag ttcatacaca agtttta 27 <210> 713 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 713 atcccacaag ttcatacaca agttctt 27 <210> 714 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 714 ataccacaag tacatacaca agtttta 27 <210> 715 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 715 ataccgcaag tacatacaca agtttta 27 <210> 716 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 716 ataccgcaag tacatacaca agtttta 27 <210> 717 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 717 attccacaag tacatacaca agttctt 27 <210> 718 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 718 attccacaag tacatacaca agttctt 27 <210> 719 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 719 atttatccaa acgcatcttt attattt 27 <210> 720 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 720 atttatccaa atgctagtct tttattt 27 <210> 721 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 721 atctacccta atgcatcttt attattt 27 <210> 722 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 722 atttatccaa atgctagttt attattc 27 <210> 723 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 723 atttacccaa atgcaagtct tcttttt 27 <210> 724 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 724 atatatccaa atgctagtct tcttttc 27 <210> 725 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 725 atctatccaa atgcaagtct tttattc 27 <210> 726 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 726 atctatccaa atgcaagtct tttattc 27 <210> 727 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 727 atttatccaa atgcaagtct tcttttt 27 <210> 728 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 728 atttatccaa atgctagtct tcttttt 27 <210> 729 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 729 atccttatcg gtgttcttgt tggagta 27 <210> 730 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 730 attttaattg gtgtacttgt tggtgtt 27 <210> 731 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 731 atcttaattg gtgttttagt tggtgtt 27 <210> 732 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 732 attcttattg gagttttagt aggtgtt 27 <210> 733 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 733 attttaatcg gagttttagt aggtgtt 27 <210> 734 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 734 attcttattg gagttttagt tggtgtt 27 <210> 735 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 735 atacttattg gagttttagt tggtgtt 27 <210> 736 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 736 atacttattg gagttttagt tggtgtt 27 <210> 737 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 737 attcttattg gagttttagt aggtgtt 27 <210> 738 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 738 attcttattg gagttttagt aggtgtt 27 <210> 739 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 739 ttattacttg gtacaattca tgctgta 27 <210> 740 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 740 ttattacttg gtacaatcca cgctgta 27 <210> 741 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 741 ttacttttag gaacaattca tgctgtt 27 <210> 742 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 742 ttattattag gtactattca cgcagtt 27 <210> 743 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 743 ttattattag gtacaattca tgctgtt 27 <210> 744 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 744 ttacttttag gcactattca tgcggtt 27 <210> 745 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 745 ttacttttag gcactattca tgctgtt 27 <210> 746 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 746 cttcttcttg gaactattca tgctgtg 27 <210> 747 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 747 ttacttcttg gaactattca tgctgtt 27 <210> 748 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 748 cttcttcttg gaactattca tgctgtt 27 <210> 749 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 749 aaatataaaa aattcccatg gtggtta 27 <210> 750 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 750 aaatataaaa agttcccatg gtggtta 27 <210> 751 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 751 aaatataaga aatttccatg gtggtta 27 <210> 752 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 752 aagtataaaa aatttccatg gtggctt 27 <210> 753 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 753 aaatataaaa aatttccatg gtggctt 27 <210> 754 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 754 aaatataaaa aatttccatg gtggtta 27 <210> 755 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 755 aagtataaaa aatttccatg gtggtta 27 <210> 756 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 756 aagtataaaa aatttccatg gtggtta 27 <210> 757 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 757 aaatataaaa aatttccatg gtggctt 27 <210> 758 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 758 aaatataaaa aatttccatg gtggctt 27 <210> 759 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 759 aaccctcaac cagtatggtt atgcctt 27 <210> 760 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 760 aacccacaac cagtttggct ttgctta 27 <210> 761 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 761 aatccacaac cagtttggtt atgcctt 27 <210> 762 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 762 aacccacaac cagtttggtt atgctta 27 <210> 763 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 763 aatcctcaac cagtttggct ttgctta 27 <210> 764 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 764 aatccacaac cagtatggtt atgctta 27 <210> 765 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 765 aatccacaac cagtatggtt atgctta 27 <210> 766 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 766 aatccacaac cagtatggtt atgctta 27 <210> 767 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 767 aatccacaac cagtatggct ttgtctt 27 <210> 768 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 768 aatccacaac cagtatggct ttgtctt 27 <210> 769 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 769 atcatgccaa aggctggtct tttattc 27 <210> 770 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 770 attatgccaa aggctggtct tttattc 27 <210> 771 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 771 atcatgccaa aagctggatt attattc 27 <210> 772 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 772 attatgccaa aggctggttt attattc 27 <210> 773 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 773 attatgccaa aggctggtct tcttttc 27 <210> 774 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 774 atcatgccaa aagcaggttt acttttt 27 <210> 775 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 775 ataatgccaa aagctggttt attattt 27 <210> 776 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 776 ataatgccaa aagctggttt attattt 27 <210> 777 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 777 attatgccaa aagctggttt acttttt 27 <210> 778 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 778 attatgccaa aagcaggttt acttttt 27 <210> 779 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 779 tacatgttcc cagtaatctt tagtaag 27 <210> 780 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 780 tatatgtttc cagtaatttt tagtaaa 27 <210> 781 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 781 tatatgttcc cagttatttt tagtaaa 27 <210> 782 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 782 tatatgtttc cagttatttt ttctaaa 27 <210> 783 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 783 tacatgtttc cagttatttt tagtaag 27 <210> 784 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 784 tatatgtttc cagttatttt tagtaaa 27 <210> 785 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 785 tatatgtttc cagttatttt tagtaaa 27 <210> 786 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 786 tatatgtttc cagttatttt tagtaaa 27 <210> 787 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 787 tatatgtttc cagtaatttt tagtaaa 27 <210> 788 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 788 tatatgtttc cagtaatttt tagtaaa 27 <210> 789 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 789 aatatgactc acgttttata cccactt 27 <210> 790 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 790 aacatgacac atgttcttta cccatta 27 <210> 791 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 791 aatatgacac atgtattata tcctctt 27 <210> 792 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 792 aatatgactc atgttttata tccatta 27 <210> 793 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 793 aatatgactc atgttcttta cccactt 27 <210> 794 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 794 aatatgacac atgttcttta tccatta 27 <210> 795 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 795 aacatgacac atgttcttta tccatta 27 <210> 796 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 796 aacatgacac atgttcttta tccatta 27 <210> 797 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 797 aatatgacac atgtacttta tccatta 27 <210> 798 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 798 aatatgacac atgtacttta tccatta 27 <210> 799 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 799 attatggcaa aatttttaca ttggtta 27 <210> 800 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 800 attatggcta aatttttaca ttggtta 27 <210> 801 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 801 attatggcta aattccttca ttggctt 27 <210> 802 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 802 attatggcaa aattccttca ttggtta 27 <210> 803 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 803 atcatggcta agttcttaca ctggtta 27 <210> 804 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 804 atcatggcta aatttcttca ttggtta 27 <210> 805 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 805 attatggcaa aatttcttca ttggtta 27 <210> 806 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 806 attatggcaa aatttcttca ttggtta 27 <210> 807 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 807 attatggcaa aatttcttca ttggtta 27 <210> 808 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 808 attatggcta aatttcttca ttggtta 27 <210> 809 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 809 catgtatttg gttattcttg gtataaa 27 <210> 810 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 810 catgtatttg gttattcttg gtataaa 27 <210> 811 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 811 catgtatttg gttattcttg gtataaa 27 <210> 812 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 812 catgtttttg gatatagttg gtataaa 27 <210> 813 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 813 catgtttttg gatattcttg gtataaa 27 <210> 814 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 814 cacgtattcg gttactcttg gtacaag 27 <210> 815 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 815 cacgttttcg gatacagttg gtacaag 27 <210> 816 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 816 cacgtattcg gttacagttg gtacaag 27 <210> 817 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 817 catgtattcg gttactcttg gtacaag 27 <210> 818 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 818 catgttttcg gatacagttg gtataaa 27 <210> 819 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 819 atcccacaag tacatacaca agtttta 27 <210> 820 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 820 atcccacaag tacatacaca agtttta 27 <210> 821 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 821 atcccacaag tacatacaca agtttta 27 <210> 822 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 822 attccacaag tacatacaca agttctt 27 <210> 823 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 823 attccacaag tacatacaca agttctt 27 <210> 824 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 824 atcccacaag ttcacacaca agttctt 27 <210> 825 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 825 atcccacaag ttcacacaca agttctt 27 <210> 826 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 826 attccacaag ttcatacaca agttctt 27 <210> 827 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 827 attccacaag ttcatactca agtttta 27 <210> 828 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 828 attccacaag tacatacaca agtttta 27 <210> 829 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 829 atatatccaa atgcttctct tcttttc 27 <210> 830 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 830 atatatccaa atgcatctct tcttttc 27 <210> 831 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 831 atatatccaa atgcatctct tcttttc 27 <210> 832 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 832 atttatccaa atgcatctct tcttttt 27 <210> 833 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 833 atttatccaa atgcttctct tcttttt 27 <210> 834 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 834 atctacccta acgctagttt attattt 27 <210> 835 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 835 atctacccaa atgctagttt attattt 27 <210> 836 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 836 atttacccaa acgcaagtct tcttttc 27 <210> 837 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 837 atttacccaa atgctagttt attattc 27 <210> 838 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 838 atttatccaa atgctagtct tttattc 27 <210> 839 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 839 attcttattg gtgttttagt tggtgtt 27 <210> 840 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 840 attcttattg gtgttttagt tggcgta 27 <210> 841 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 841 attcttattg gcgttttagt gggcgta 27 <210> 842 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 842 attcttattg gtgttcttgt tggtgtt 27 <210> 843 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 843 attcttattg gcgttttagt gggcgta 27 <210> 844 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 844 atcttaattg gagttttagt aggtgtt 27 <210> 845 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 845 attttaatcg gagttttagt tggtgtt 27 <210> 846 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 846 attttaattg gtgttttagt aggtgtt 27 <210> 847 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 847 attttaattg gtgttttagt tggagta 27 <210> 848 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 848 attttaattg gagtattagt tggtgtt 27 <210> 849 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 849 ttacttcttg gaacaattca tgctgtt 27 <210> 850 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 850 ttacttcttg gtacaattca tgcagtt 27 <210> 851 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 851 ttacttcttg gaacaattca tgcagtt 27 <210> 852 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 852 cttcttcttg gaacaattca tgctgta 27 <210> 853 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 853 cttcttcttg gaacaattca tgcagta 27 <210> 854 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 854 cttttattag gaacaatcca tgcagta 27 <210> 855 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 855 ttattattag gtacaatcca tgcagta 27 <210> 856 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 856 ttacttttag gaactattca tgctgtt 27 <210> 857 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 857 ttattattag gtactattca cgcagta 27 <210> 858 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 858 ttattattag gaacaattca cgctgta 27 <210> 859 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 859 aaatataaaa aatttccatg gtggtta 27 <210> 860 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 860 aagtataaaa aatttccatg gtggtta 27 <210> 861 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 861 aagtataaaa aatttccatg gtggtta 27 <210> 862 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 862 aaatataaaa aatttccatg gtggtta 27 <210> 863 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 863 aaatataaaa aatttccatg gtggtta 27 <210> 864 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 864 aaatataaga agtttccatg gtggctt 27 <210> 865 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 865 aaatataaaa aatttccatg gtggtta 27 <210> 866 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 866 aaatataaaa aatttccatg gtggtta 27 <210> 867 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 867 aaatacaaga aattcccatg gtggctt 27 <210> 868 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 868 aaatataaaa agtttccttg gtggtta 27 <210> 869 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 869 tacatgtttc cagttatttt tagtaaa 27 <210> 870 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 870 tacatgtttc cagttatttt tagtaaa 27 <210> 871 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 871 tacatgtttc cagttatttt tagtaaa 27 <210> 872 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 872 tatatgtttc cagtaatttt tagtaaa 27 <210> 873 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 873 tatatgtttc cagtaatttt tagtaaa 27 <210> 874 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 874 tatatgtttc cagtaatttt cagtaag 27 <210> 875 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 875 tacatgtttc cagtaatctt tagtaaa 27 <210> 876 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 876 tacatgtttc cagtaatttt tagtaaa 27 <210> 877 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 877 tacatgttcc cagttatttt ttctaaa 27 <210> 878 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 878 tacatgtttc ccgttatttt tagtaag 27 <210> 879 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 879 aatatgacac atgttcttta tccatta 27 <210> 880 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 880 aacatgacac atgttcttta tccatta 27 <210> 881 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 881 aacatgacac atgttcttta tccatta 27 <210> 882 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 882 aatatgacac atgttcttta tccatta 27 <210> 883 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 883 aatatgacac atgttcttta tccatta 27 <210> 884 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 884 aacatgacac acgttttata tccactt 27 <210> 885 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 885 aacatgactc atgtacttta tccactt 27 <210> 886 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 886 aacatgactc acgtacttta tccactt 27 <210> 887 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 887 aatatgacac acgtacttta cccatta 27 <210> 888 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 888 aatatgacac atgtattata tccatta 27 <210> 889 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 889 attatggcaa aatttcttca ttggtta 27 <210> 890 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 890 atcatggcta aatttcttca ttggtta 27 <210> 891 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 891 atcatggcta aatttcttca ttggtta 27 <210> 892 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 892 attatggcaa aatttcttca ttggtta 27 <210> 893 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 893 attatggcta aatttcttca ttggtta 27 <210> 894 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 894 attatggcaa aatttttaca ctggctt 27 <210> 895 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 895 attatggcta aattccttca ctggctt 27 <210> 896 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 896 attatggcta aatttttaca ttggtta 27 <210> 897 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 897 attatggcta aatttttaca ttggctt 27 <210> 898 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 898 attatggcaa aattccttca ttggctt 27 <210> 899 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 899 aaggtaccag aaattgttca ttttctt 27 <210> 900 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 900 aaagtaccag aaattgttca ttttctt 27 <210> 901 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 901 aaagtaccag aaattgttca ttttctt 27 <210> 902 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 902 aaagttccag aaattgtaca ttttctt 27 <210> 903 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 903 aaagttccag aaattgtaca ttttctt 27 <210> 904 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 904 aaggttccag agatcgtaca tttcctt 27 <210> 905 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 905 aaggttccag aaattgttca tttcctt 27 <210> 906 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 906 aaggttccag aaattgttca cttttta 27 <210> 907 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 907 aaagttccag aaattgttca tttttta 27 <210> 908 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 908 aaagtaccag aaattgtaca tttcctt 27 <210> 909 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 909 aagatgagtt ctggttgtgc attttta 27 <210> 910 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 910 aagatgagtt ctggttgtgc attttta 27 <210> 911 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 911 aagatgagtt ctggttgtgc attttta 27 <210> 912 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 912 aaaatgagtt ctggttgtgc attttta 27 <210> 913 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 913 aaaatgagtt ctggttgtgc attttta 27 <210> 914 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 914 aaaatgagta gtggatgcgc tttttta 27 <210> 915 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 915 aaaatgagtt ctggttgtgc ttttctt 27 <210> 916 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 916 aaaatgagta gtggatgtgc tttctta 27 <210> 917 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 917 aaaatgagtt ctggatgcgc attttta 27 <210> 918 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 918 aaaatgtcta gtggttgcgc tttctta 27 <210> 919 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 919 agttggttta aaaattggcc atttttc 27 <210> 920 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 920 agttggttta aaaattggcc atttttc 27 <210> 921 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 921 agttggttta aaaattggcc atttttc 27 <210> 922 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 922 tcttggttta aaaattggcc atttttc 27 <210> 923 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 923 tcttggttta aaaattggcc atttttc 27 <210> 924 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 924 tcttggttta aaaattggcc attcttc 27 <210> 925 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 925 agttggttta aaaattggcc atttttc 27 <210> 926 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 926 tcttggttta agaattggcc atttttt 27 <210> 927 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 927 agttggttca aaaattggcc atttttt 27 <210> 928 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 928 tcttggttta aaaattggcc atttttt 27 <210> 929 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 929 catgtttttg gttattcttg gtataaa 27 <210> 930 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 930 catgtatttg gttattcttg gtataaa 27 <210> 931 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 931 cacgtattcg gttactcttg gtataaa 27 <210> 932 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 932 catgtatttg gatatagttg gtataaa 27 <210> 933 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 933 tatctttttc cagtaatttt tagtaaa 27 <210> 934 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 934 tatctttttc cagtaatttt tagtaaa 27 <210> 935 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 935 tatttatttc cagttatttt ttctaaa 27 <210> 936 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 936 tatttatttc cagtaatttt tagtaaa 27 <210> 937 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 937 attccacaag ttcatacaca agtatta 27 <210> 938 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 938 attccacaag ttcatacaca agtactt 27 <210> 939 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 939 atcccacaag ttcacacaca agttctt 27 <210> 940 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 940 atcccacaag ttcatactca agtatta 27 <210> 941 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 941 atgccatctt tacgtgaagc tgcttta 27 <210> 942 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 942 atgccaagtt tacgtgaagc tgcatta 27 <210> 943 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 943 atgcctagtc ttcgtgaagc tgcttta 27 <210> 944 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 944 atgccaagtc ttagagaggc agcttta 27 <210> 945 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 945 tggccacgtc cacgtcgtta tgttatg 27 <210> 946 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 946 tggccacgtc cacgtcgtta tgttatg 27 <210> 947 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 947 tggccaagac caagacgtta cgttatg 27 <210> 948 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 948 tggccacgtc cacgtcgtta tgtaatg 27 <210> 949 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 949 atctatccaa atgcttctct tcttttc 27 <210> 950 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 950 atttatccaa atgcatctct tcttttt 27 <210> 951 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 951 atttacccaa atgcatctct tcttttc 27 <210> 952 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 952 atttatccaa atgctagttt attattc 27 <210> 953 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 953 cgtcttttag aattttatct tgcagtt 27 <210> 954 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 954 cgtcttttag aattttattt agcagtt 27 <210> 955 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 955 cgtttattag aattctattt agcagta 27 <210> 956 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 956 cgtcttttag aattttatct tgctgtt 27 <210> 957 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 957 ttacttcttg gcactattca tgctgtt 27 <210> 958 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 958 ttacttttag gcactattca tgctgtt 27 <210> 959 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 959 cttcttcttg gtacaattca tgctgtt 27 <210> 960 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 960 ttattattag gtacaatcca tgcagta 27 <210> 961 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 961 aatccacaac cagtttggtt atgctta 27 <210> 962 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 962 aatccacaac cagtttggct ttgtctt 27 <210> 963 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 963 aatccacagc cagtttggtt atgcctt 27 <210> 964 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 964 aacccacagc cagtttggtt atgcctt 27 <210> 965 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 965 aaagttccag aaattgtaca ttttctt 27 <210> 966 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 966 aaagttccag aaattgtaca ttttctt 27 <210> 967 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 967 aaagttcccg aaattgtaca ttttctt 27 <210> 968 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 968 aaagttccag aaatcgttca tttctta 27 <210> 969 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 969 cttcttcttg gtacaattca tgcagtg 27 <210> 970 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 970 aaatataaaa aatttccatg gtggtta 27 <210> 971 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 971 aatccacaac cagtatggct ttgtctt 27 <210> 972 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 972 attccacaag ttcatacaca agtactt 27 <210> 973 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 973 aatccacaac cagtttggct ttgtctt 27 <210> 974 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 974 catgtatttg gttatagttg gtataaa 27 <210> 975 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 975 attcttattg gtgttttagt aggtgtt 27 <210> 976 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 976 aatccacaac cagtttggtt atgttta 27 <210> 977 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 977 aatatgacac atgtacttta tccatta 27

Claims (62)

  1. 암 관련 단백질의 면역원성 단편을 포함하는 분리된 펩타이드로서, 단편은 불규칙변화성 돌연변이를 포함하는, 분리된 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 불규칙변화성 돌연변이는 앵커 위치의 바람직한 아미노산에 대한 돌연변이인 것을 특징으로 하는 분리된 펩타이드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단편은 길이가 약 7 내지 약 11개 아미노산, 길이가 약 8 내지 약 10개 아미노산, 또는 길이가 약 9개 아미노산인 것을 특징으로 하는 분리된 펩타이드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 암 관련 단백질은 암 정소 항원 또는 종양태아 항원인 것을 특징으로 하는 분리된 펩타이드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 암 관련 단백질은 다음 인간 유전자: CEACAM5, GAGE1, TERT, KLHL7, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA6, NUF2, NYESO1, PAGE4, PRAME, PSA, PSMA, RNF43, SART3, SSX2, STEAP1, 및 SURVIVIN 중 하나에 의해 암호화되는 것을 특징으로 하는 분리된 펩타이드.
  6. 제5항에 있어서,
    (a) 암 관련 단백질은 CEACAM5에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 100, 102, 104, 106, 및 108 중 어느 하나를 포함하거나;
    (b) 암 관련 단백질은 GAGE1에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 110 및 112 중 어느 하나를 포함하거나;
    (c) 암 관련 단백질은 TERT에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 114를 포함하거나;
    (d) 암 관련 단백질은 KLHL7에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 116을 포함하거나;
    (e) 암 관련 단백질은 MAGEA3에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 118, 120, 122, 및 124 중 어느 하나를 포함하거나;
    (f) 암 관련 단백질은 MAGEA4에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 126을 포함하거나;
    (g) 암 관련 단백질은 MAGEA6에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 128을 포함하거나;
    (h) 암 관련 단백질은 NUF2에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 130 및 132 중 어느 하나를 포함하거나;
    (i) 암 관련 단백질은 NYESO1에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 134 및 136 중 어느 하나를 포함하거나;
    (j) 암 관련 단백질은 PAGE4에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 138을 포함하거나;
    (k) 암 관련 단백질은 PRAME에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 140을 포함하거나;
    (l) 암 관련 단백질은 PSA에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 142를 포함하거나;
    (m) 암 관련 단백질은 PSMA에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 144를 포함하거나;
    (n) 암 관련 단백질은 RNF43에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 146을 포함하거나;
    (o) 암 관련 단백질은 SART3에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 148을 포함하거나;
    (p) 암 관련 단백질은 SSX2에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 150을 포함하거나;
    (q) 암 관련 단백질은 STEAP1에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 152 및 154 중 어느 하나를 포함하거나; 또는
    (r) 암 관련 단백질은 SURVIVIN에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 156 및 158 중 어느 하나를 포함하는
    것을 특징으로 하는 분리된 펩타이드.
  7. 제6항에 있어서,
    (a) 암 관련 단백질 CEACAM5에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 100, 102, 104, 106, 및 108 중 어느 하나로 이루어지거나;
    (b) 암 관련 단백질은 GAGE1에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 110 및 112 중 어느 하나로 이루어지거나;
    (c) 암 관련 단백질은 TERT에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 114로 이루어지거나;
    (d) 암 관련 단백질은 KLHL7에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 116으로 이루어지거나;
    (e) 암 관련 단백질은 MAGEA3에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 118, 120, 122, 및 124 중 어느 하나로 이루어지거나;
    (f) 암 관련 단백질은 MAGEA4에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 126으로 이루어지거나;
    (g) 암 관련 단백질은 MAGEA6에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 128로 이루어지거나;
    (h) 암 관련 단백질은 NUF2에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 130 및 132 중 어느 하나로 이루어지거나;
    (i) 암 관련 단백질은 NYESO1에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 134 및 136 중 어느 하나로 이루어지거나;
    (j) 암 관련 단백질은 PAGE4에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 138로 이루어지거나;
    (k) 암 관련 단백질은 PRAME에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 140으로 이루어지거나;
    (l) 암 관련 단백질은 PSA에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 142로 이루어지거나;
    (m) 암 관련 단백질은 PSMA에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 144로 이루어지거나;
    (n) 암 관련 단백질은 RNF43에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 146으로 이루어지거나;
    (o) 암 관련 단백질은 SART3에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 148로 이루어지거나;
    (p) 암 관련 단백질은 SSX2에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 150으로 이루어지거나;
    (q) 암 관련 단백질은 STEAP1에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 152 및 154 중 어느 하나로 이루어지거나; 또는
    (r) 암 관련 단백질은 SURVIVIN에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 156 및 158 중 어느 하나로 이루어지는
    것을 특징으로 하는 분리된 펩타이드.
  8. 제7항에 있어서,
    (a) 암 관련 단백질은 CEACAM5에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 100, 102, 104, 106, 및 108 중 어느 하나로 이루어지거나;
    (b) 암 관련 단백질은 GAGE1에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 110 및 112 중 어느 하나로 이루어지거나;
    (c) 암 관련 단백질은 TERT에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 114로 이루어지거나;
    (d) 암 관련 단백질은 KLHL7에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 116으로 이루어지거나;
    (e) 암 관련 단백질은 MAGEA3에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 118, 120, 122, 및 124 중 어느 하나로 이루어지거나;
    (f) 암 관련 단백질은 MAGEA4에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 126으로 이루어지거나;
    (g) 암 관련 단백질은 MAGEA6에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 128로 이루어지거나;
    (h) 암 관련 단백질은 NUF2에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 130 및 132 중 어느 하나로 이루어지거나;
    (i) 암 관련 단백질은 NYESO1에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 134 및 136 중 어느 하나로 이루어지거나;
    (j) 암 관련 단백질은 PAGE4에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 138로 이루어지거나;
    (k) 암 관련 단백질은 PRAME에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 140으로 이루어지거나;
    (l) 암 관련 단백질은 PSA에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 142로 이루어지거나;
    (m) 암 관련 단백질은 PSMA에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 144로 이루어지거나;
    (n) 암 관련 단백질은 RNF43에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 146으로 이루어지거나;
    (o) 암 관련 단백질은 SART3에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 148로 이루어지거나;
    (p) 암 관련 단백질은 SSX2에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 150으로 이루어지거나;
    (q) 암 관련 단백질은 STEAP1에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 152 및 154 중 어느 하나로 이루어지거나; 또는
    (r) 암 관련 단백질은 SURVIVIN에 의해 암호화되고, 분리된 펩타이드는 SEQ ID NO: 156 및 158 중 어느 하나로 이루어지는
    것을 특징으로 하는 분리된 펩타이드.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 단편은 다음 HLA 유형: HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상에 결합하는 것을 특징으로 하는 분리된 펩타이드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 분리된 펩타이드를 암호화하는 핵산.
  11. 제10항에 있어서, 핵산은 인간에서의 발현을 위해 코돈 최적화되는 것을 특징으로 하는 핵산.
  12. 제10항에 있어서, 핵산은 리스테리아 모노사이토게네스에서의 발현을 위해 코돈 최적화되는 것을 특징으로 하는 핵산.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산은 DNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  14. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산은 RNA를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산은 SEQ ID NO: 223-977 중 어느 하나로부터 선택된 서열 및 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 그것의 축퇴성 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  16. 제15항에 있어서, 핵산은 SEQ ID NO: 223-977 중 어느 하나로부터 선택된 서열 및 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 그것의 축퇴성 변이체로 이루어지는 것을 특징으로 하는 핵산.
  17. 제약학적 조성물로서,
    (a) 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 하나 이상의 분리된 펩타이드 또는 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항의 하나 이상의 핵산; 및
    (b) 보조제
    를 포함하는 제약학적 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 보조제는 독성이 제거된 리스테리오리신 O (dtLLO), 과립구/대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 단백질, GM-CSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 분자, 사포닌 QS21, 모노포스포릴 지질 A, 메틸화되지 않은 CpG-함유 올리고뉴클레오타이드, 또는 몬타나이드 ISA 51를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서, 제약학적 조성물은 다음 HLA 유형: HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02의 각각에 결합하는 펩타이드 또는 펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 제약학적 조성물은:
    (a) 표 3에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 3에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산;
    (b) 표 5에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 5에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산;
    (c) 표 7에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 7에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산;
    (d) 표 9에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 9에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산;
    (e) 표 11에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 11에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산;
    (f) 표 13에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 13에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산;
    (g) 표 15에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 15에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산;
    (h) 표 17에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 17에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산;
    (i) 표 19에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 19에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산; 또는
    (j) 표 21에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 21에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 제약학적 조성물은:
    (a) 표 3에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 3에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산;
    (b) 표 5에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 5에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산;
    (c) 표 7에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 7에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산;
    (d) 표 9에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 9에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산;
    (e) 표 11에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 11에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산;
    (f) 표 13에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 13에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산;
    (g) 표 15에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 15에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산;
    (h) 표 17에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 17에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산;
    (i) 표 19에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 19에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산; 또는
    (j) 표 21에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 21에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
  22. 제1항 내지 제9항의 분리된 펩타이드 중 임의의 하나를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 박테리아 균주.
  23. 제1항 내지 제9항의 분리된 펩타이드 중 둘 이상을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함하는 재조합 박테리아 균주.
  24. 제23항에 있어서, 둘 이상의 펩타이드는:
    (a) 표 3에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 3에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산;
    (b) 표 5에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 5에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산;
    (c) 표 7에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 7에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산;
    (d) 표 9에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 9에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산;
    (e) 표 11에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 11에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산;
    (f) 표 13에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 13에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산;
    (g) 표 15에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 15에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산;
    (h) 표 17에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 17에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산;
    (i) 표 19에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 19에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산; 또는
    (j) 표 21에 제시된 펩타이드의 둘 이상 또는 표 21에 제시된 펩타이드의 둘 이상을 암호화하는 핵산
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 박테리아 균주.
  25. 제24항에 있어서, 둘 이상의 펩타이드는:
    (a) 표 3에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 3에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산;
    (b) 표 5에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 5에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산;
    (c) 표 7에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 7에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산;
    (d) 표 9에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 9에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산;
    (e) 표 11에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 11에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산;
    (f) 표 13에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 13에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산;
    (g) 표 15에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 15에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산;
    (h) 표 17에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 17에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산;
    (i) 표 19에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 19에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산; 또는
    (j) 표 21에 제시된 모든 펩타이드 또는 표 21에 제시된 모든 펩타이드를 암호화하는 핵산
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 박테리아 균주.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 둘 이상의 펩타이드의 조합은 다음 HLA 유형: HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02의 각각에 결합하는 것을 특징으로 하는 재조합 박테리아 균주.
  27. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 균주는 살모넬라, 리스테리아, 예르시니아, 시겔라, 또는 미코박테리움 균주인 것을 특징으로 하는 재조합 박테리아 균주.
  28. 제27항에 있어서, 박테리아 균주는 리스테리아 균주이고, 선택적으로 리스테리아 균주는 리스테리아 모노사이토게네스 균주인 것을 특징으로 하는 재조합 박테리아 균주.
  29. 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 오픈 리딩 프레임을 포함하는 핵산을 포함하는 재조합 리스테리아 균주로서, 융합 폴리펩타이드는 암 관련 단백질의 면역원성 단편에 융합된 PEST-함유 펩타이드를 포함하고, 단편은 불규칙변화성 돌연변이를 포함하는, 재조합 리스테리아 균주.
  30. 제29항에 있어서, 불규칙변화성 돌연변이는 앵커 위치의 바람직한 아미노산에 대한 돌연변이인 것을 특징으로 하는 재조합 리스테리아 균주.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 단편은 길이가 약 7 내지 약 11개 아미노산, 길이가 약 8 내지 약 10개 아미노산, 또는 길이가 약 9개 아미노산인 것을 특징으로 하는 재조합 리스테리아 균주.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 암 관련 단백질은 암 정소 항원 또는 종양태아 항원인 것을 특징으로 하는 재조합 리스테리아 균주.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 암 관련 단백질은 다음 인간 유전자: CEACAM5, GAGE1, TERT, KLHL7, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA6, NUF2, NYESO1, PAGE4, PRAME, PSA, PSMA, RNF43, SART3, SSX2, STEAP1, 및 SURVIVIN 중 하나인 것을 특징으로 하는 재조합 리스테리아 균주.
  34. 제33항에 있어서,
    (a) 암 관련 단백질은 CEACAM5에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 100, 102, 104, 106, 및 108 중 어느 하나를 포함하거나;
    (b) 암 관련 단백질은 GAGE1에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 110 및 112 중 어느 하나를 포함하거나;
    (c) 암 관련 단백질은 TERT에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 114를 포함하거나;
    (d) 암 관련 단백질은 KLHL7에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 116을 포함하거나;
    (e) 암 관련 단백질은 MAGEA3에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 118, 120, 122, 및 124 중 어느 하나를 포함하거나;
    (f) 암 관련 단백질은 MAGEA4에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 126을 포함하거나;
    (g) 암 관련 단백질은 MAGEA6에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 128을 포함하거나;
    (h) 암 관련 단백질은 NUF2에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 130 및 132 중 어느 하나를 포함하거나;
    (i) 암 관련 단백질은 NYESO1에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 134 및 136 중 어느 하나를 포함하거나;
    (j) 암 관련 단백질은 PAGE4에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 138을 포함하거나;
    (k) 암 관련 단백질은 PRAME에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 140을 포함하거나;
    (l) 암 관련 단백질은 PSA에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 142를 포함하거나;
    (m) 암 관련 단백질은 PSMA에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 144를 포함하거나;
    (n) 암 관련 단백질은 RNF43에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 146을 포함하거나;
    (o) 암 관련 단백질은 SART3에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 148을 포함하거나;
    (p) 암 관련 단백질은 SSX2에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 150을 포함하거나;
    (q) 암 관련 단백질은 STEAP1에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 152 및 154 중 어느 하나를 포함하거나; 또는
    (r) 암 관련 단백질은 SURVIVIN에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 156 및 158 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 리스테리아 균주.
  35. 제34항에 있어서,
    (a) 암 관련 단백질은 CEACAM5에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 100, 102, 104, 106, 및 108 중 어느 하나로 이루어지거나;
    (b) 암 관련 단백질은 GAGE1에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 110 및 112 중 어느 하나로 이루어지거나;
    (c) 암 관련 단백질은 TERT에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 114로 이루어지거나;
    (d) 암 관련 단백질은 KLHL7에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 116으로 이루어지거나;
    (e) 암 관련 단백질은 MAGEA3에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 118, 120, 122, 및 124 중 어느 하나로 이루어지거나;
    (f) 암 관련 단백질은 MAGEA4에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 126으로 이루어지거나;
    (g) 암 관련 단백질은 MAGEA6에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 128로 이루어지거나;
    (h) 암 관련 단백질은 NUF2에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 130 및 132 중 어느 하나로 이루어지거나;
    (i) 암 관련 단백질은 NYESO1에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 134 및 136 중 어느 하나로 이루어지거나;
    (j) 암 관련 단백질은 PAGE4에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 138로 이루어지거나;
    (k) 암 관련 단백질은 PRAME에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 140으로 이루어지거나;
    (l) 암 관련 단백질은 PSA에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 142로 이루어지거나;
    (m) 암 관련 단백질은 PSMA에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 144로 이루어지거나;
    (n) 암 관련 단백질은 RNF43에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 146으로 이루어지거나;
    (o) 암 관련 단백질은 SART3에 의해 암호화되고, 단편은 consists of SEQ ID NO: 148로 이루어지거나;
    (p) 암 관련 단백질은 SSX2에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 150으로 이루어지거나;
    (q) 암 관련 단백질은 STEAP1에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 152 및 154 중 어느 하나로 이루어지거나; 또는
    (r) 암 관련 단백질은 SURVIVIN에 의해 암호화되고, 단편은 SEQ ID NO: 156 및 158 중 어느 하나로 이루어지는 것을 특징으로 하는 재조합 리스테리아 균주.
  36. 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 단편은 다음 HLA 유형: HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02 중 하나 이상에 결합하는 것을 특징으로 하는 재조합 리스테리아 균주.
  37. 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, PEST-함유 펩타이드는 박테리아 분비 신호 서열을 포함하고, 융합 폴리펩타이드는 단편에 융합된 유비퀴틴 단백질을 추가로 포함하며, PEST-함유 펩타이드, 유비퀴틴, 및 카르복시-말단 항원성 펩타이드는 융합 폴리펩타이드의 아미노-말단 단부로부터 카르복시-말단 단부 쪽으로 나란히 배열되는 것을 특징으로 하는 재조합 리스테리아 균주.
  38. 제29항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 폴리펩타이드는 암 관련 단백질의 둘 이상의 면역원성 단편에 융합된 PEST-함유 펩타이드를 포함하고, 둘 이상의 단편의 각각은 불규칙변화성 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 리스테리아 균주.
  39. 제38항에 있어서, 둘 이상의 면역원성 단편은 개재 서열 없이 직접 서로에게 융합되는 것을 특징으로 하는 재조합 리스테리아 균주.
  40. 제38항에 있어서, 둘 이상의 면역원성 단편은 펩타이드 링커를 통해 서로에게 연결되는 것을 특징으로 하는 재조합 리스테리아 균주.
  41. 제40항에 있어서, SEQ ID NO: 209-217에 제시된 링커 중 하나 이상은 둘 이상의 면역원성 단편을 연결시키기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 재조합 리스테리아 균주.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 폴리펩타이드에서 둘 이상의 면역원성 단편의 조합은 다음 HLA 유형: HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*24:02, 및 HLA-B*07:02의 각각에 결합하는 것을 특징으로 하는 재조합 리스테리아 균주.
  43. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 둘 이상의 면역원성 단편은:
    (a) 표 3에 제시된 펩타이드의 둘 이상;
    (b) 표 5에 제시된 펩타이드의 둘 이상;
    (c) 표 7에 제시된 펩타이드의 둘 이상;
    (d) 표 9에 제시된 펩타이드의 둘 이상;
    (e) 표 11에 제시된 펩타이드의 둘 이상;
    (f) 표 13에 제시된 펩타이드의 둘 이상;
    (g) 표 15에 제시된 펩타이드의 둘 이상;
    (h) 표 17에 제시된 펩타이드의 둘 이상;
    (i) 표 19에 제시된 펩타이드의 둘 이상; 또는
    (j) 표 21에 제시된 펩타이드의 둘 이상
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 리스테리아 균주.
  44. 제43항에 있어서, 둘 이상의 면역원성 단편은:
    (a) 표 3에 제시된 모든 펩타이드;
    (b) 표 5에 제시된 모든 펩타이드;
    (c) 표 7에 제시된 모든 펩타이드;
    (d) 표 9에 제시된 모든 펩타이드;
    (e) 표 11에 제시된 모든 펩타이드;
    (f) 표 13에 제시된 모든 펩타이드;
    (g) 표 15에 제시된 모든 펩타이드;
    (h) 표 17에 제시된 모든 펩타이드;
    (i) 표 19에 제시된 모든 펩타이드; 또는
    (j) 표 21에 제시된 모든 펩타이드
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 리스테리아 균주.
  45. 제29항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, PEST-함유 펩타이드는 융합 폴리펩타이드의 N-말단 단부 상에 있는 것을 특징으로 하는 재조합 리스테리아 균주.
  46. 제45항에 있어서, PEST-함유 펩타이드는 LLO의 N-말단 단편인 것을 특징으로 하는 재조합 리스테리아 균주.
  47. 제46항에 있어서, LLO의 N-말단 단편은 SEQ ID NO: 59에 제시된 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 재조합 리스테리아 균주.
  48. 제29항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산은 에피솜성 플라스미드에 있는 것을 특징으로 하는 재조합 리스테리아 균주.
  49. 제29항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산은 재조합 리스테리아 균주에 항생물질 내성을 부여하지 않는 것을 특징으로 하는 재조합 리스테리아 균주.
  50. 제29항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 리스테리아 균주는 약독화된, 영양요구성 리스테리아 균주인 것을 특징으로 하는 재조합 리스테리아 균주.
  51. 제50항에 있어서, 약독화된, 영양요구성 리스테리아 균주는 하나 이상의 내인성 유전자를 비활성화하는 하나 이상의 내인성 유전자에서의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 리스테리아 균주.
  52. 제51항에 있어서, 하나 이상의 내인성 유전자는 actA, dal, 및 dat를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 리스테리아 균주.
  53. 제29항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산은 대사 효소를 암호화하는 제2 오픈 리딩 프레임을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 리스테리아 균주.
  54. 제53항에 있어서, 대사 효소는 알라닌 라세마제 효소 또는 D-아미노산 아미노트랜스퍼라제 효소인 것을 특징으로 하는 재조합 리스테리아 균주.
  55. 제29항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 융합 폴리펩타이드는 hly 프로모터로부터 발현되는 것을 특징으로 하는 재조합 리스테리아 균주.
  56. 제29항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 리스테리아 균주는 재조합 리스테리아 모노사이토게네스 균주인 것을 특징으로 하는 재조합 리스테리아 균주.
  57. 제29항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 리스테리아 균주는 actA, dal, 및 dat가 삭제되었거나 그것에 비활성화 돌연변이를 포함하고, 핵산은 에피솜성 플라스미드에 있으며 알라닌 라세마제 효소 또는 D-아미노산 아미노트랜스퍼라제 효소를 암호화하는 제2 오픈 리딩 프레임을 포함하고, PEST-함유 펩타이드는 LLO의 N-말단 단편인 것을 특징으로 하는 재조합 리스테리아 균주.
  58. 면역원성 조성물로서,
    (a) 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항의 재조합 박테리아 균주 또는 제29항 내지 제57항 중 어느 한 항의 재조합 리스테리아 균주; 및
    (b) 보조제
    를 포함하는 면역원성 조성물.
  59. 제58항에 있어서, 보조제 독성이 제거된 리스테리오리신 O (dtLLO), 과립구/대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF) 단백질, GM-CSF 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 분자, 사포닌 QS21, 모노포스포릴 지질 A, 또는 메틸화되지 않은 CpG-함유 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  60. 대상체에서 종양 또는 암에 대한 면역 반응을 유도 또는 증강시키는 방법으로서, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 분리된 펩타이드, 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항의 핵산, 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항의 제약학적 조성물, 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항의 재조합 박테리아 균주, 제29항 내지 제57항 중 어느 한 항의 재조합 리스테리아 균주, 또는 제58항 또는 제59항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  61. 대상체에서 종양 또는 암을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 분리된 펩타이드, 제10항 내지 제16항 중 어느 한 항의 핵산, 제17항 내지 제21항 중 어느 한 항의 제약학적 조성물, 제22항 내지 제28항 중 어느 한 항의 재조합 박테리아 균주, 제29항 내지 제57항 중 어느 한 항의 재조합 리스테리아 균주, 또는 제58항 또는 제59항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  62. 제60항 또는 제61항에 있어서, 암은 비-소세포 폐암, 전립선암, 췌장암, 방광암, 유방암, 자궁암, 난소암, 저등급 신경교종, 대장암, 또는 두경부암인 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020207015786A 2017-11-08 2018-11-08 암 관련 단백질로부터의 면역원성 불규칙변화성 펩타이드 및 그것의 사용 방법 Withdrawn KR20200070405A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762583292P 2017-11-08 2017-11-08
US62/583,292 2017-11-08
US201762592884P 2017-11-30 2017-11-30
US62/592,884 2017-11-30
PCT/US2018/059849 WO2019094607A2 (en) 2017-11-08 2018-11-08 Immunogenic heteroclitic peptides from cancer-associated proteins and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20200070405A true KR20200070405A (ko) 2020-06-17

Family

ID=66437981

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207015786A Withdrawn KR20200070405A (ko) 2017-11-08 2018-11-08 암 관련 단백질로부터의 면역원성 불규칙변화성 펩타이드 및 그것의 사용 방법

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20210177955A1 (ko)
EP (1) EP3707152A4 (ko)
JP (1) JP2021502083A (ko)
KR (1) KR20200070405A (ko)
CN (1) CN111655714A (ko)
AU (1) AU2018366131A1 (ko)
CA (1) CA3081710A1 (ko)
IL (1) IL274434A (ko)
MX (1) MX2020004829A (ko)
SG (1) SG11202004107YA (ko)
WO (1) WO2019094607A2 (ko)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9012141B2 (en) 2000-03-27 2015-04-21 Advaxis, Inc. Compositions and methods comprising KLK3 of FOLH1 antigen
MA41644A (fr) 2015-03-03 2018-01-09 Advaxis Inc Compositions à base de listeria comprenant un système d'expression de minigènes codant pour des peptides, et leurs procédés d'utilisation
CA3035591A1 (en) 2016-11-30 2018-06-07 Advaxis, Inc. Immunogenic compositions targeting recurrent cancer mutations and methods of use thereof
CN111356760A (zh) 2017-09-19 2020-06-30 阿德瓦希斯公司 细菌或李斯特菌菌株的冻干组合物和方法
MA53543A (fr) 2018-09-04 2021-07-14 Treos Bio Ltd Vaccins peptidiques
MX2022014249A (es) * 2020-05-12 2023-02-22 Sumitomo Pharma Co Ltd Composición farmacéutica para tratar el cáncer.
CN116710115A (zh) 2020-11-20 2023-09-05 思维疗法股份有限公司 用于优化的肽疫苗的组合物和方法
US11421015B2 (en) 2020-12-07 2022-08-23 Think Therapeutics, Inc. Method of compact peptide vaccines using residue optimization
US11058751B1 (en) 2020-11-20 2021-07-13 Think Therapeutics, Inc. Compositions for optimized RAS peptide vaccines
US11464842B1 (en) 2021-04-28 2022-10-11 Think Therapeutics, Inc. Compositions and method for optimized peptide vaccines using residue optimization
WO2024086846A1 (en) * 2022-10-21 2024-04-25 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Methods and compositions for immunizing against campylobactor hepaticus
CN117552115B (zh) * 2024-01-12 2024-03-26 天津鲸鹏生物科技有限责任公司 用于诱导肿瘤特异性免疫响应的通用型抗原肽库及其应用

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9340577B2 (en) * 1992-08-07 2016-05-17 Epimmune Inc. HLA binding motifs and peptides and their uses
WO2001036452A2 (en) * 1999-11-18 2001-05-25 Epimmune Inc. Heteroclitic analogs of class i epitodes
CA2400215A1 (en) * 2000-02-23 2001-08-30 Epimmune Inc. Hla binding peptides and their uses
US8771702B2 (en) * 2001-03-26 2014-07-08 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Non-hemolytic LLO fusion proteins and methods of utilizing same
SG145559A1 (en) * 2002-06-06 2008-09-29 Oncotherapy Science Inc Genes and polypeptides relating to human colon cancers
GB0700284D0 (en) * 2007-01-08 2007-02-14 Glaxosmithkline Biolog Sa Combination therapy
KR20090101313A (ko) * 2007-01-15 2009-09-24 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. 백신
US8166971B2 (en) * 2007-03-15 2012-05-01 Ric Investments, Llc End-tidal gas estimation system and method
US9650639B2 (en) * 2008-05-19 2017-05-16 Advaxis, Inc. Dual delivery system for heterologous antigens
US9017660B2 (en) * 2009-11-11 2015-04-28 Advaxis, Inc. Compositions and methods for prevention of escape mutation in the treatment of Her2/neu over-expressing tumors
EP2324057B1 (en) * 2008-08-12 2018-03-21 MSD Italia S.r.l. Minigene comprising htpa signal peptide, t-cell epitopes, e. coli ltb and furin sensitive linkers
WO2012023033A2 (en) * 2010-08-18 2012-02-23 Purdue Pharma L.P. Improved peptide immunogens
CA2829960A1 (en) * 2011-03-11 2012-09-20 John Rothman Listeria-based adjuvants
CA2861206C (en) * 2012-01-13 2021-07-06 Richard J. O'reilly Immunogenic wt-1 peptides and methods of use thereof
SG11201700090RA (en) * 2014-07-18 2017-02-27 Advaxis Inc Listeria-based immunogenic compositions for eliciting anti-tumor responses
SG11201700092XA (en) * 2014-07-18 2017-02-27 Advaxis Inc Recombinant listeria strain expressing heterologous antigen fusion proteins and methods of use thereof
MA41644A (fr) * 2015-03-03 2018-01-09 Advaxis Inc Compositions à base de listeria comprenant un système d'expression de minigènes codant pour des peptides, et leurs procédés d'utilisation
US20180305702A1 (en) * 2015-09-15 2018-10-25 Advaxis, Inc. Listeria-Based Immunogenic Compositions And Methods Of Use Thereof in Cancer Prevention And Treatment
SMT202200370T1 (it) * 2015-11-20 2022-11-18 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Composizione per il trattamento del cancro
MX2019000215A (es) * 2016-07-05 2019-11-12 Advaxis Inc Composiciones inmunogenicas a base de listeria que comprenden antigenos de proteinas del tumor de wilms y metodos para su uso.
CA3035591A1 (en) * 2016-11-30 2018-06-07 Advaxis, Inc. Immunogenic compositions targeting recurrent cancer mutations and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
WO2019094607A2 (en) 2019-05-16
JP2021502083A (ja) 2021-01-28
WO2019094607A3 (en) 2019-06-20
EP3707152A4 (en) 2021-12-01
MX2020004829A (es) 2020-11-11
US20210177955A1 (en) 2021-06-17
CA3081710A1 (en) 2019-05-16
AU2018366131A1 (en) 2020-05-28
CN111655714A (zh) 2020-09-11
SG11202004107YA (en) 2020-06-29
IL274434A (en) 2020-06-30
EP3707152A2 (en) 2020-09-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240124540A1 (en) Immunogenic compositions targeting recurrent cancer mutations and methods of use thereof
US20210177955A1 (en) Immunogenic heteroclitic peptides from cancer-associated proteins and methods of use thereof
WO2019157098A1 (en) Compositions comprising a recombinant listeria strain and an anti-ccr8 antibody and methods of use
US20190248856A1 (en) Listeria-Based Immunogenic Compositions Comprising Wilms Tumor Protein Antigens And Methods Of Use Thereof
JP7649344B2 (ja) 細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の凍結乾燥のための組成物および方法
DK2977456T3 (en) Compositions comprising HMW-MAA and fragments thereof for the treatment of cancer
WO2018102585A1 (en) Personalized immunotherapy in combination with immunotherapy targeting recurrent cancer mutations
JP2010526533A (ja) Ｋｌｋ３、ｐｓｃａ、またはｆｏｌｈ１抗原を含む組成物および方法
KR20180100443A (ko) 개인 맞춤형 전달 벡터-기반 면역요법 및 그 사용
WO2018129306A1 (en) Recombinant listeria vaccine strains and methods of using the same in cancer immunotherapy
KR20140134695A (ko) 리스테리아 백신 치료 후 억제 세포 기능 저해
KR20170120119A (ko) 펩타이드 미니유전자 발현 시스템을 포함하는 리스테리아-기반 조성물 및 이의 사용 방법
TW201726171A (zh) 以李斯特菌屬為主的免疫治療及其用法
WO2019006401A2 (en) LISTERIA-BASED IMMUNOGENIC COMPOSITIONS COMPRISING HETERICCLIENT WILMS TUMOR PROTEIN ANTIGENS AND METHODS OF USE THEREOF
WO2018170313A1 (en) Methods and compositions for increasing efficacy of vaccines
HK40033849A (en) Compositions and methods for lyophilization of bacteria or listeria strains

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

St.27 status event code: A-0-1-A10-A15-nap-PA0105

PG1501 Laying open of application

St.27 status event code: A-1-1-Q10-Q12-nap-PG1501

A201 Request for examination
E13-X000 Pre-grant limitation requested

St.27 status event code: A-2-3-E10-E13-lim-X000

P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

PA0201 Request for examination

St.27 status event code: A-1-2-D10-D11-exm-PA0201

PC1202 Submission of document of withdrawal before decision of registration

St.27 status event code: N-1-6-B10-B11-nap-PC1202

P22-X000 Classification modified

St.27 status event code: A-2-2-P10-P22-nap-X000

P22-X000 Classification modified

St.27 status event code: A-2-2-P10-P22-nap-X000