KR20200096800A

KR20200096800A - I형 인터페론 유전자를 자극시키기 위한 양이온성 지질을 포함하는 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR20200096800A
Application number: KR1020207019224A
Authority: KR
Inventors: 프랭크 베두-아도; 그렉 콘; 씨바 케이. 간다푸디; 마틴 워드; 제롤드 우드워드
Original assignee: 피디에스 바이오테크놀러지 코퍼레이션
Priority date: 2017-12-05
Filing date: 2018-12-05
Publication date: 2020-08-13
Also published as: AU2018378588A1; CA3084957A1; BR112020011265A2; US20190321321A1; AU2024266932A1; CN120983614A; JP2024036364A; IL275145B1; WO2019113200A1; EP3720423A1; JP2021505606A; CN111655238A; TW201924722A; IL275145A; JP2026063187A; EP3720423A4; US12551460B2; IL275145B2

Abstract

대상체에게 양이온성 지질을 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 I형 IFN 신호전달 경로를 변형시키기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 양이온성 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTAP), N-1-(2,3-디올레오일옥시)-프로필-N,N,N-트리메틸 암모늄 클로라이드 (DOTMA), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (DOEPC), 거울상 이성질체 및 이의 조합을 포함한다. 조성물은 하나 이상의 항원성 성분을 더 포함할 수 있고, 이러한 성분은 자기유래 또는 비자기유래이다.

Description

I형 인터페론 유전자를 자극시키기 위한 양이온성 지질을 포함하는 방법 및 조성물

관련 출원에 관한 교차 참조

본 출원은 2017년 12월 5일 출원된 미국 가출원 제62/594,815호에 대한 우선권 및 이의 모든 이득을 청구하며, 전문을 참조로 본 명세서에 분명하게 편입시킨다.

발명의 분야

본 발명은 일반적으로 양이온성 지질의 투여 단계를 포함하는 I형 IFN 신호전달 경로를 변형시키기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

지난 십여년간 I형 인터페론 (IFN-I)은 질환에 대한 포유동물 면역 반응에서 결정적으로 중요하다는 것이 확인되었다. I형 인터페론은 면역 반응 동안 T 세포 및 자연 살해 (NK) 세포의 수용체 참여 이후에 합성되는, "면역" IFN, 또는 IFN-γ와 대조적으로, 바이러스 감염에 의한 그들의 직접 유도에 기인하여 "바이러스" 인터페론이라고 불렸다. IFN-I은 또한 인터페론 알파 수용체 (IFNAR)를 통한 신호전달에 의한 종양 세포 아폽토시스 및 항-신생혈관의 충분히 입증된 유도인자이다. 치료적 면역 반응에서, IFN-I의 핵신 역할에 기인하여, 현재는 백신, 면역요법 및 다른 면역 기반 약학의 예방적 및 치료적 이득 둘 모두를 개선시키기 위해 IFN-I을 활성화시키는 안전하고 효과적인 방법의 발견에 상당히 중점을 두고 있다. 예를 들어, 마우스에서의 전임상 연구는 IFN-I이 면역계의 다른 핵심 세포, 예컨대 항원-제시 수지상 세포 (DC) 및 CD4 및 CD8 T 세포를 직접적으로 활성화시킨다는 것이 확인되었다. IFN-I은 또한 T 림프구에 의해 인식되는 종양 세포의 항원 제시를 증가시켜서, 암 면역요법에서의 중요한 잠재적 역할을 제시한다.

백신 개발 분야에서, 병원체에 의해 초래된 질환을 치료하기 위해서 또는 암을 치료하기 위해서 인간에서 대량의 강력한 항원-특이적 세포독성 T 세포를 생산하는 방법 및 접근법은 여전히 의학적 요구를 충족하지 못하고 있다. 면역자극제 예컨대 보강제와 병용하여 사용되는 단백질 및 펩티드-기반 백신은 세포독성 T 세포를 개발하기 위해 평가된 보다 유망한 접근법 중 하나이다. 그러나, 현재 인간 용도로 승인된 대부분의 보강제는 I형 인터페론의 약한 유도제이고, 장기간 지속되는 보호적 또는 치료적 이득을 공고히 하는데 실패하였다.

인터페론 (IFN-α/β/γ)은 보다 강력한 면역 자극 사이토카인의 일부이고, CD8+ 세포독성 T 세포의 발생에서 중요한 역할을 한다. 인터페론은 또한 항-바이러스 면역력에서 핵심적이다. 효과적인 T 세포 면역력은 T 세포 확장, 생존, 분화, 및 이펙터 기능을 촉진시켜서 특이적 T 세포 면역 반응을 구동시키기 위해 적절한 공자극성 신호 (신호 2) 및 사이토카인 (신호 3)의 존재 하에서 항원 (신호 1)에 의한 T 세포의 활성화를 요구한다. IFN-I은 T-세포 활성화를 유도하고 그들의 최적 확장, 생존 및 이펙터 기능을 구동시키기 위해 신호 3으로서 T 세포 상에서 직접적으로 작용할 수 있다. 초기에 항바이러스 사이토카인으로서 동정된, IFN-I은 CD8 T 세포 확장, 생존 및 이펙터 기능을 증강시키는 것으로 확인되었다. 인터페론은 또한 공자극성 분자를 상향조절하고 T 세포 활성화에 필요한 항원 교차 제시를 증강시켜 항원 제시 세포의 성숙화를 구동시킨다. 뿐만 아니라, 인터페론은 직접 항-종양 성질뿐만 아니라 IL-15 생산을 통한 간접 항종양 성질도 갖는다는 것이 입증되었다. 이들의 유의한 면역학적 성질의 결과로서, 다양한 IFN-I 유도제뿐만 아니라 재조합 IFN-I 요법이 현재 인간 시험에서 시험되고 있다.

I형 IFN은 종양 억제인자 유전자 p53의 발현을 지속시켜서 시험관내 세포 형질전환을 방지한다고 보고되었었다 (Takaoka A, Hayakawa S, Yanai H, Stoiber D, Negishi H, Kikuchi H, et al. Integration of interferon-α/β signaling to p53 responses in tumor suppression and antiviral defense. Nature (2003)424:516-23). 인간 암 세포주에서 세포 사멸을 촉발시키고 종양 세포 증식을 음성적으로 조절하는데서 IFN-I 신호전달을 위한 특이적 역할이 또한 입증되었다 (Zitvogel L, Galluzzi L, Kepp O, Smyth MJ, Kroemer G. Type I Interferon in anticancer immunity. Nat Rev Immunol (2015) 15:405-14). 시험관내에서, 장 상피 세포로부터 IFNAR1의 결실은 마우스에서 종양 형성을 증가시켰다 (Tschurtschenthaler M, Wang J, Fricke C, Fritz TMJ, Niederreiter L, Adolph TE, et al. Type I interferon signaling in the intestinal epithelium affects Paneth cells, microbial ecology and epithelial regeneration. Gut (2014) 63:1921-31). 다수의 연구들은 IFN-I이 신속하게 악성 세포를 제거하기 위해 면역 세포의 간접 자극을 통해서 주로 항종양 효과를 유도한다는 강력한 증거를 만들어 내었다. 몇몇 연구들은 IFN-I이 병원체에 대한 숙주의 반응과 유사한 항암 면역 반응을 촉진한다는 것을 강력하게 시사한다.

편재성 IFNAR 발현의 경과로서, IFN-I은 염증 및 바이러스 질환 상황에서 면역 세포에 대해 결정적인 조절 효과를 갖는다는 것이 확인되었다 (Decker T, Muller M, Stockinger S. The yin and yang of type I interferon activity in bacterial infection . Nat Rev Immunol (2005) 5 :675-87; Stetson DB, Medzhitov R. Type I Interferon in host defense . Immunity (2006) 25 :373-81). 그러므로 선천성을 비롯한 적응성 면역 반응의 세포 조절인자가 악성 질환에 대한 보호에서 IFN-I에 의해 매우 충분히 조절될 수 있다는 것은 분명하다.

IFN-I은 종양 면역 감시에서 중요하다는 것이 입증되었다 (Dunn GP, Bruce AT, Sheehan KCF, Shankaran V, Uppaluri R, Bui JD, et al. A critical function for Type I Interferon in cancer immunoediting. Nat Immunol (2005)6:722-9). IFN-γ와 반대로, IFN-I은 보호적 항종양 면역 반응의 유도 동안 종양 세포 그 자체 보다는 숙주 조혈 세포에 대해 작용하는 것으로 골수 이식 실험에서 확인되었다. 종양 감시 상황에서 I형 IFN이 선천성 및 적응성 면역계의 세포에 영향을 미치는 기전에 대해 상당히 보고되었었다 [Zitvogel L, Galluzzi L, Kepp O, Smyth MJ, Kroemer G. T ype I interferon in anticancer immunity. Nat Rev Immunol (2015) 15:405-14; Parker BS, Rautela J, Hertzog PJ. Antitumour actions of interferons: implications for cancer therapy. Nat Rev Cancer (2016) 16:131-44)]. 몇몇 연구들은 숙주 항원 제시 세포의 활성화에서, I형 IFN에 대한 핵심 역할을 발견하였다 (Fuertes MB, Kacha AK, Kline J, Woo S-R, Kranz DM, Murphy KM, et al. Host Type I IFN signals are required for antitumor CD8 ⁺ T cell response through CD8α ⁺ 　dendritic cells. J Exp Med (2011) 208:2005-16; Diamond MS, Kinder M, Matsushita H, Mashayekhi M, Dunn GP, Archambault JM, et al. Type I interferon is selectively required by dendritic cells for immune rejection of tumors.　J Exp Med　(2011)　208:1989-2003). 초기에 생산된 I형 IFN이 종양 항원-특이적 세포독성 CD8⁺　T 림프구 (CTL)의 성공적 활성화에 필요한 CD8α⁺　수지상 세포 (DC)의 수준에 작용한다는 것이 확인되었다. I형 IFN 신호전달은 항원을 교차 제시하는 CD8α⁺　DC의 능력을 특이적으로 촉진시킨다 (Diamond MS, Kinder M, Matsushita H, Mashayekhi M, Dunn GP, Archambault JM, et al.　Type I interferon is selectively required by dendritic cells for immune rejection of tumors.　J Exp Med　(2011)　208:1989-2003). 이러한 효과는 DC의 생존을 증가시키고 그러므로 또한 교차 제시 동안 세포 표면 상에서 항원 지속성을 증강시키는 IFN-I의 결과라고 상정되었다 (Lorenzi S, Mattei F, Sistigu A, Bracci L, Spadaro F, Sanchez M, et al.　Type I IFN s control antigen retention and survival of CD8α(+) dendritic cells after uptake of tumor apoptotic cells leading to cross-priming.　J Immunol　(2011)　186:5142-50; Schiavoni G, Mattei F, Gabriele L.　Type I interferon as stimulators of DC-mediated cross-priming: impact on anti-tumor response.　Front Immunol　(2013)　4:483). I형 IFN은 DC 성숙화, 분화 및 이동을 촉진한다 (Fuertes MB, Woo S-R, Burnett B, Fu Y-X, Gajewski TF.　Type I interferon response and innate immune sensing of cancer.　Trends Immunol　(2013)　34:67-73).

I형 IFN이 DC에 의한 인터류킨 15 (IL15)의 방출을 유도할 수 있다는 것을 주목하는 것이 중요하다 (Mattei F, Schiavoni G, Belardelli F, Tough DF.　IL-15 is expressed by dendritic cells in response to type I IFN, double-stranded RNA, or lipopolysaccharide and promotes dendritic cell activation.　J Immunol (2001)　167:1179-87). 이것은 CD8⁺　메모리 세포 및 NK 세포의 생존을 촉진한다 (Huntington ND.　The unconventional expression of IL-15 and its role in NK cell homeostasis.　Immunol Cell Biol　(2014)　92:210-3). 이러한 효과는 NK 세포에 제한적이지 않다. CTL은 또한 I형 IFN에 반응하여 완전한 이펙터 기능을 획득한다는 것이 확인되었다 (Curtsinger JM, Mescher MF.　Inflammatory cytokines as a third signal for T cell activation.　Curr Opin Immunol　(2010)　22:333-40; Fuertes MB, Kacha AK, Kline J, Woo S-R, Kranz DM, Murphy KM, et al.　Host Type I IFN signals are required for antitumor CD8 ⁺ 　T Cell Response through CD8α ⁺ 　dendritic cells.　J Exp Med　(2011)　208:2005-16). 또한 다른 선천성 면역 세포 세브세트 예컨대 호중구 (Wu C-F, Andzinski L, Kasnitz N, Kroger A, Klawonn F, Lienenklaus S, et al.　The lack of type I interferon induces neutrophil-mediated pre-metastatic niche formation in the mouse lung.　Int J Cancer(2015)　137:837-47; Jablonska J, Wu C-F, Andzinski L, Leschner S, Weiss S.　CXCR2-mediated tumor-associated neutrophil recruitment is regulated by IFN-β.　Int J Cancer　(2014)　134:1346-58), NKT, 및 γδ T 세포 (Woo S-R, Corrales L, Gajewski TF.　Innate immune recognition of cancer.　Annu Rev Immunol　(2015)　33:445-74)에 영향을 미치는 능력을 가짐으로써, I형 IFN은 종양-성장-제한적 성질을 나타낸다.

I형 IFN은 감염 동안 매우 초기에 방출 (Biron CA.　Initial and innate responses to viral infections - pattern setting in immunity or disease.　Curr Opin Microbiol　(1999)　2:374-81)되고, 항암 숙주 반응에서 DC 및 NK 세포와 같은 선천성 면역 세포 서브셋의 중요한 조절인자이다. NK 세포의 경우에, I형 IFN은 바이러스 감염시에 감염에 대한 초기 반응을 발생시키는 능력에서 중요하다는 것이 입증되었고, NK 세포의 세포독성 및 사이토카인 생산을 증강시킨다고 여겨진다 (Lee CK, Rao DT, Gertner R, Gimeno R, Frey AB, Levy DE.　Distinct requirements for IFNs and STAT1 in NK cell function.　J Immunol　(2000)　165:3571-7; Nguyen KB, Salazar-Mather TP, Dalod MY, Van Deusen JB, Wei X, Liew FY, et al.　Coordinated and distinct roles for IFN-alpha beta, IL-12, and IL-15 regulation of NK cell responses to viral infection.　J Immunol　(2002)　169:4279-87).

인간에서, I형 인터페론은 일반적으로 toll 유사 수용체, NOD 유사 수용체, 및 레티노산 유도성 유전자 I 유사 (RIG-I) 수용체와 같은 병원체 연관 패턴 인식 수용체의 참여를 통해 촉발된다고 보고된다. 또한, 다양한 시토졸 2차 메신저 (c-GMP), 및 시토졸 핵산 센서가 또한 STING (Stimulator of Interferon Genes) 경로의 활성화를 통해서 I형 인터페론 생산을 촉발시킬 수 있다.

IFN-I은 다양한 방식으로 항-종양 활성을 매개할 수 있다고 여겨진다. 예를 들어, 인터페론은 종양 세포에 직접적으로 작용하여 그들의 생존 및 성장 능력을 변경시킬 수 있다 [Parker, B.S., J. Rautela, and P.J. Hertzog, Antitumour actions of interferons: implications for cancer therapy. Nat Rev Cancer, 2016. 16(3): p. 131-443].

다수의 방법이 I형 매개 면역학적 성질을 활용하기 위해 인간에서 조사 중에 있다. 재조합 IFN-I 단일요법의 투여는 재조합 인터페론-알파의 투여를 통해 만성 C형 간염의 치료에서 임상적으로 증명되었다 (Adrian M. Di Bisceglie, M.D.,　 Paul Martin, M.D.,　 Chris Kassianides, M.D.,　 Mauricio Lisker-Melman, M.D.,　 Linda Murray, R.N.,　 Jeanne Waggoner, B.A.,　 Zachary Goodman, M.D.,　 Steven M. Banks, Ph.D.,　 and Jay H. Hoofnagle, M.D., Recombinant Interferon Alfa Therapy for Chronic Hepatitis C, November 30, 1989 N Engl J Med 1989; 321:1506-1510). 다른 접근법은 I형 인터페론의 내생적 생산을 촉발시키기 위해서 toll-유사-수용체 (TLR) 효현제 예컨대 이중 가닥 RNA (폴리 I:C), CpG 올리고뉴클레오티드, 이미퀴모드, 단일 가닥 RNA 등의 투여를 포함한다 (Munir Akkaya ,　 Billur Akkaya ,　 Patrick Sheehan ,　 Pietro Miozzo ,　 Mukul Rawat ,　 Mirna Pena ,　 Ann S Kim ,　 Olena Kamenyeva ,　 Juraj Kabat ,　 Chen-Feng Qi ,　 Silvia Bolland ,　 Akanksha Chaturvedi 　and　 Susan K Pierce, The Toll-like receptor ligand CpG-A induces type 1 interferons in B cells contrasting the proinflammatory inducing activity of CpG-B, J Immunol　 May 1, 2017,　 198　 (1 Supplement)　 152.4). 보다 최근에, STING 경로 효현제는 항종양 면역력을 위해 집중된 I형 인터페론 활성인자로서 보다 중요성을 얻는다 [Corrales, L., et al., The host STING pathway at the interface of cancer and immunity. J Clin Invest, 2016. 126(7): p. 2404-11].

그러나, I형 인터페론 경로의 강력한 활성화를 촉진하기 위한 효과적인 방법에 대한 분명한 요구는 여전히 계속 남아있다. I형 인터페론 경로의 활성화 결과와 연관된 많은 치료적 이득을 고려하면, 그렇게 하기 위한 개선된 방법이 분명히 요구된다.

그러므로, 필요한 것은 IFN1 (IFN-α/β/γ)을 강력하게 활성화시킬 수 있는 백신에 대한 개선된 방법 및 조성물이다. 뿐만 아니라, 필요한 것은 항원, 예컨대 펩티드 또는 단백질 항원 존재 또는 부재에서 강한 세포독성 T 세포 면역 반응을 유발시키는 백신과 같은 개선된 방법 및 조성물이다. 바람직하게, 이러한 조성물 및 백신은 안전하고, 투여가 용이하며, 최소의 부작용 또는 독성을 갖는 면역요법제의 사용을 도입한다.

본 명세서는 IFN1 (IFN-α/β/γ)의 강력한 활성인자로서 양이온성 지질을 포함하는 백신을 위한 신규 방법 및 조성물을 제공한다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 본 발명의 조성물은 숙주에게 투여했을 때 효과적이고 강한 세포독성 T 세포 면역 반응을 유도할 수 있다. 조성물은 임의로는 펩티드 또는 단백질 항원과 조합된, 양이온성 지질을 포함하고, 일정 실시형태에서, 양이온성 지질은 리포솜의 형태이다. 하기에 상술된 바와 같이, 본 발명의 조성물은 포유동물 예컨대 마우스에서 확립된 종양의 퇴행에서 강력한 IFN-I 활성화된 세포독성 세포를 야기시킨다. 본 발명은 감염성 병원체에 대한 보다 효과적인 예방을 비롯하여 암 및 다른 질환에 대한 요법을 개발하기 위해서, IFN-I을 특이적으로 활성화시키는데 사용을 위한 양이온성 리포솜의 용도를 더 제공한다.

본 발명의 다른 특징 및 장점은 첨부된 도면과 함께 후속 설명을 읽은 후에, 더 잘 이해되는 바와 같이, 쉽게 이해될 것이다.

도 1은 Versamune® (R-DOTAP)가 배액 림프절에서 신속하고 지속적인 면역 세포의 동원을 유도하였다는 것을 입증하는 그래프를 제공한다. 도 1의 데이터는 C57BL/6J 마우스 (n=4)가 100 ㎕의 12 mM R-DOTAP 리포솜 나노입자를 뒷목 피하로 주사된 실험에 상응한다. PBS, 및 LPS (50 ㎍/마우스) (24시간 시점)가 주사된 마우스는 각각 음성 및 양성 대조군으로서 사용되었다. 주사 후 4시간 또는 24시간에, 각 마우스의 겨드랑이 및 상완 배액 림프절을 모았고 콜라게나제 분해를 통해 처리하였다. 이들 림프절 세포 현탁액 중 CD11c 양성 세포 (∼20,000세포)를 분류-정제하였고 RLT 완충액에 용해시켰으며 nCounter® 마우스 염증 키트 및 나노스트링 (nanostring) 기술을 사용해 상대적 유전자 발현 분석을 위해 처리하였다. 데이터는 R-DOTAP에 의한 I형 인터페론 유전자의 상향 조절을 입증하며, 각 그룹의 4마리 마우스의 평균을 나타낸다.
도 2는 배액 림프절에서 R-DOTAP 유도된 I형 IFN 유전자 발현을 입증한 그래프를 제공한다. 도 2의 데이터는 C57BL/6J 마우스 (n=2)가 50 ㎕의 6 mM R-DOTAP 또는 S-DOTAP 나노입자를 발바닥에 피하로 주사된 실험에 상응한다. PBS, 및 LPS (50 ㎍/마우스) 주사된 마우스 (24시간 시점)는 각각 음성 및 양성 대조군으로서 사용되었다. 주사 후 3시간 또는 24시간에, 각 마우스 유래 슬와부 배액 림프절을 모았고 RLT 완충액에 용해시켰으며 Taqman 유전자 발현 어세이 및 RT-PCR을 사용한 상대적 유전자 발현 분석을 위해 처리하였다. 데이터는 S-DOTAP 및 R-DOTAP 둘 모두에 의한 I형 인터페론 유전자의 상향조절을 입증한다.
도 3a, 3b, 및 3c는 배액 림프절에서 R-DOTAP 유도된 세포 동원 및 CD69 발현을 입증하는 그래프를 제공한다. 도 3의 데이터는 A) C57BL/6J 마우스 (n=3)가 50 ㎕의 6 mM R-DOTAP 또는 280 mM 수크로스를 발바닥 피하에 주사된 실험에 상응한다. 표시된 시간에 각 마우스 유래 슬와부 배액 림프절을 단리하였고 림프절의 단일 현탁액을 혈구계를 사용하여 계산하여 총 세포수를 얻었다. B) C57BL/6J (n=3) 또는 IFNAR-/- (n=3) 마우스는 50 ㎕의 6 mM R-DOTAP 또는 280 mM 수크로스를 발바닥에 주사받았고 배액 슬와부 림프절은 각 마우스로부터 채취하였으며 효소적으로 분해된 림프절은 (B) 혈구계를 사용하여 24시간에 총 세포수에 대해 평가하였고 CD3+ T 세포 상에서 CD69의 발현은 (B) 유세포측정기를 사용해 평가하였다. A-B) 데이터는 각 배액 림프절 내 총 세포수를 나타낸다. C) 데이터는 백신접종 후 24시간에 각 그룹의 CD69 + 세포 백분율을 나타낸다 (그룹 당 n=3 마우스).
도 4는 양이온성 지질에 의한 수지상 세포를 통한 I형 인터페론 생산의 유도를 입증하는 그래프를 제공한다. 도 4의 데이터는 A) IFNAR-Ko 마우스 유래의 골수 유래 수지상 세포 (BMDC)를 표시된 (6-400 μM) 농도의 양이온성 지질 또는 LPS 양성 대조군 (1-500 ng/mL)으로 24시간 동안 자극시킨 실험에 상응한다. B) FLT3-유도된 BMDC (pDC) 및 GM-CSF/IL-4 유래 BMDC (cBMDC)는 표시된 농도 (6-400 μM)의 양이온성 지질 또는 LPS 양성 대조군 (1-500 ng/mL)으로 24시간 동안 자극되었다. I형 인터페론 생산을 측정하기 위해서, 세포 현탁액 (100 ㎕)을 리포터 세포 (InvivoGen, USA의 B16.Blue-IFNα/β 세포) 배양물에 첨가하였고 18시간 동안 인큐베이션시켜서 리포터 세포에 의한 분비된 알칼리 포스파타제 (SEAP)의 I형 인터페론 유도 생산을 자극시켰다. 리포터 세포 상청액 중 SEAP 활성은 제조사 프로토콜에 따라 비색 SEAP 어세이 키트를 사용해 정량하였다. BMDC 분비된 I형 인터페론은 리포터 세포주에서 재조합 마우스 IFN-β 자극된 SEAP 활성을 사용해 생성시킨 표준 그래프를 사용해 정량하였다.
도 5는 I형 IFN 신호 결함 마우스에서 R-DOTAP 기반 백신 효율을 입증하는 그래프를 제공한다. 도 5의 데이터는 Jackson의 C57BL/6J 마우스 (n=6) 또는 IFNAR -/- 마우스가 SIINFEKL 펩티드 (A) (SEQ ID NO: 1) 또는 RF9 펩티드 (B) (SEQ ID NO: 2)를 함유하는 100 ㎕의 백신 제제 (Versamune® 또는 완전 프로인트 보강제)를 0일 및 7일에 피하로 주사된 실험에 상응한다. 2차 백신접종 이후 7일에, 백신접종 및 대조군 마우스로부터의 비장은 야생형 및 IFNAR-/- 마우스에서 백신 제제에 의해 유도된 항원-특이적 CD8 T 세포 반응을 측정하기 위해 처리되었다. 항원-특이적 CD8T 세포 반응은 ELISPOT 어세이에서 IFN-γ의 SIINFEKL 특이적 (A) (SEQ ID NO: 1) 및 RF9 펩티드 특이적 (B) (SEQ ID NO: 2) CD8 T 세포 생산을 측정하여 평가하였다. 데이터는 유사한 결과의 다수 실험을 대표한다. 데이터의 통계적 유의성은 단측 ANOVA를 사용해 추정하였고, 다중 비교는 터키 검정을 사용해 분석하였다. ** WT Versamune® 백신접종 그룹과 비교된 통계적 유의성 (p<0.05).

본 발명은 본 명세서에 포함된 특정 실시형태의 하기 상세한 설명을 참조하여 보다 쉽게 이해될 것이다. 본 발명을 이의 일정 실시형태의 특별한 상세설명을 참조하여 설명하였지만, 이러한 상세설명을 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 간주하려는 의도가 아니다.

본 명세서에 언급된 참조문헌의 전체 내용은 미국 가출원 제62/594,815호, 미국 특허 제7,303,881호, 제8,877,206호, 제9,789,129호, 및 미국 특허 출원 제14/344,327호, 제14/407,419호, 제14/429,123호, 및 제15/775,680호를 포함하는 참조를 그들 전체로 본 명세서에 편입시킨다.

본 명세서는 I형 인터페론 유전자의 변형을 위한, 양이온성 지질의 용도를 포함하는 신규한 방법 및 조성물을 제공한다. 일정 실시형태에서, I형 인터페론 유전자는 I형 인터페론 신호전달을 상향조절시키고 유도시키거나 또는 활성화시키다. 일정 실시형태에서, I형 인터페론 유전자는 I형 인터페론 신호전달을 하향조절하고 억제하거나 또는 탈활성화시킨다. 또한 I형 인터페론의 효과를 통해서 질환-특이적 CD8+ T-세포 개체군의 역가를 촉진시키고 증가시키기 위한 양이온성 지질의 용도를 포함하는 신규한 방법 및 조성물을 제공한다. 일정한 실시형태에서, 본 명세서에서 청구하는 방법 및 조성물은 특이적 감염 또는 질환 세포에 대해서 세포용해 활성을 유도시키고자 하는 질환-특이적 항원의 용도를 포함할 수 있다.

양이온성 리포솜은 저분자량 약물, 플라스미드 DNA, 올리고뉴클레오티드, 단백질, 및 펩티드를 전달하고, 또한 백신 보강제로서 생체내에서 광범위하게 사용되었다. 본 발명에서, 양이온성 지질이 면역계와 어떻게 반응할 수 있는가와 교차 제시를 촉진하는 일정 양이온성 지질의 능력에 대한 기계적 이유를 더 잘 이해하기 위해 수행된 연구들의 결과로서, I형 인터페론을 상향조절시키는 양이온성 지질의 고유한 능력을 발견하였다. 초기에 생산된 I형 IFN은 종양 항원-특이적 세포독성 CD8⁺　T 림프구 (CTL)의 성공적인 활성화에 필요한 CD8α⁺　수지상 세포 (DC)의 수준에 대해 작용하고, I형 IFN 신호전달이 항원을 교차 제시하는 CD8α⁺　DC의 능력을 특이적으로 촉진한다고 보고되었다. 항원-특이적 CD8+ T-세포 반응을 초래하는 항원 교차 제시를 촉진하는 양이온성 지질의 이러한 능력은 이제 전임상 및 인간 임상 연구에서 입증되었다. 항원 교차 제시를 촉진하기 위해 I형 인터페론을 안전하게 활성화시키는 양이온성 지질을 사용하는 능력 및 인간에서 CD8+ T-세포의 유도는 치료적 면역학 분야에서 상당히 충족하지 못한 의학적 요구를 성공적으로 해결하는 잠재성을 제시한다.

본 명세서에서 고려하는 일 실시형태에서, 양이온성 지질은 대상체에서 I형 인터페론 경로를 활성화시키기 위해 투여된다.

다른 실시형태에서, 양이온성 지질은 대상체에서 질환을 치료하기 위해 질환-특이적 CD8+ T-세포를 프라이밍시키도록 항원의 교차 제시를 촉진하고 I형 인터페론을 활성화시키기 위해 질환-특이적 항원과 조합된다.

다른 실시형태에서 암을 치료하는 방법이 제공하고, 이 방법은 단백질 항원과 조합된 I형 인터페론-활성화 양이온성 지질로 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.

다른 실시형태에서, 암을 치료하는 방법이 제공되고, 이 방법은 T-세포 활성화 백신과 조합한 양이온성 지질로 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.

다른 실시형태에서, 암을 치료하는 방법이 제공되고, 이 방법은 단백질 또는 펩티드 종양 항원과 조합하고, 보강제와 조합한 양이온성 지질로 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.

다른 실시형태에서, 암을 치료하는 방법이 제공되고, 이 방법은 DNA 또는 RNA-기반 항원을 포함한 임의 종양 항원과 조합된 양이온성 지질로 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.

다른 실시형태에서, 암을 치료하는 방법이 제공되고, 이 방법은 임의로는 MDSC, Treg의 감소 또는 면역 체크 지점의 차단을 통해 종양 면역 억제와 싸우는 임의의 작용제 및/또는 보강제와 조합하여 종양 항원과 조합된 I형 인터페론 경로를 활성화시키기 위한 양이온성 지질로 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.

다른 실시형태에서, 암을 치료하는 방법이 제공되고, 이 방법은 보강제 및/또는 종양 면역 억제와 싸우는 임의 작용제와 조합하여 DNA 또는 RNA-기반 종양 항원과 조합된 양이온성 지질-기반 백신으로 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.

또 다른 실시형태에서, 포유동물에서 항종양 면역 반응을 증가시키는 방법이 제공된다. 이 방법은 일부 경우에 성장 인자 예컨대 GM-CSF 및 사이토카인과 함께 하나 이상의 양이온성 지질 또는 I형 인터페론-활성화 양이온성 지질로 포유동물을 치료하는 단계를 포함한다.

다양한 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 지질과 적어도 하나의 I형 인터페론-활성화 양이온성 지질 및 적어도 하나의 항원을 포함한다. 일정 실시형태에서, 하나 초과의 항원이 포함된다.

일 실시형태에서, 대상체, 예컨대 포유동물에서 I형 IFN 신호전달 경로를 변형시키기 위한 방법 및 조성물이 제공되고, 이 방법은 대상체에게 양이온성 지질을 포함하는 조성물의 투여 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 양이온성 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTAP), N-1-(2,3-디올레오일옥시)-프로필-N,N,N-트리메틸 암모늄 클로라이드 (DOTMA), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (DOEPC), 및 이의 조합을 포함한다. 조성물은 특별한 양이온성 지질의 거울상 이성질체를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 양이온성 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTAP)이고, 일 실시형태에서, 양이온성 지질은 DOTAP의 R 거울상 이성질체, (R)-1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판 (R-DOTAP)이다. 일정 실시형태에서, 조성물은 항원, 예컨대 단백질 또는 펩티드 항원을 더 포함한다.

일정 실시형태에서, 대상체에서 I형 IFN 신호전달 경로의 변형은 경로의 하향 상향조절 또는 활성화를 포함한다. 일정 실시형태에서, 대상체에서 I형 IFN 신호전달 경로의 변형은 경로의 하향 조절 또는 탈활성화를 포함한다. 일정 실시형태에서, T-세포 반응은 상승되고/되거나, 항원-특이적 CD8+ T 세포 반응이 상승되고/되거나, 조성물의 면역원성이 증강된다. 일 실시형태에서, 대상체에서 암을 치료하기 위한 방법이 제공되고, 이 방법은 양이온성 지질을 포함하는 조성물의 투여 단계를 포함하고 양이온성 지질의 투여 단계는 I형 IFN 신호전달 경로의 자극을 야기한다.

항원　

일 실시형태에서, 본 명세서에 청구된 신규 방법은 양이온성 지질과 하나 이상의 자기유래 항원 예컨대 대상체 자신의 종양으로부터 유래된 항원의 투여 단계를 포함한다. 다른 실시형태에서, 방법은 양이온성 지질을 하나 이상의 비-자기유래 항원(들) 예컨대 제한없이 합성 펩티드, 재조합 단백질, RNA 또는 DNA 또는 이의 활성 단편과 조합하여 포함하는 조성물의 투여 단계를 포함한다. 각 경우에서 목적은 강력한 항원-특이적 CD8+ T-세포 반응의 유도를 촉진하기 위해 I형 인터페론을 활성화시키는 것이다. 항원은 당업자에게 공지된 임의의 질환-연관 항원일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "종양-연관 항원"은 종양 또는 암 세포와 연관되고, MHC 분자 상황에서 항원 제시 세포의 표면 상에서 발현될 때 (체액성 및/또는 세포적) 면역 반응을 유발시키는 분자 또는 화합물 (예를 들어, 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 지단백질, 리포펩티드, 당단백질, 당펩티드, 지질, 당지질, 탄수화물, RNA, 및/또는 DNA, 또는 이의 활성 단백질)이다. 종양-연관 항원은 자기-항원을 비롯하여, 항원과 특별히 연관되지 않았지만, 그럼에도 불구하고 동물에 투여했을 때 종양 또는 암 세포의 성장을 감소시키고/시키거나 면역 반응을 증강시키는 다른 항원을 포함한다. 추가의 특별한 실시형태가 본 명세서에서 제공된다.

본 명세서에서 사용되는 "미생물 항원"은 미생물의 항원이고, 제한없이 감염성 바이러스, 감염성 박테리아, 감염성 기생충 및 감염성 진균을 포함한다. 미생물 항원은 온전한 미생물, 및 천연 단리원, 이의 단편 또는 유도체, 천연 발생 미생물 항원과 동일하거나 또는 유사하고, 바람직하게 상응하는 미생물 (기원되는 천연 발생 미생물 항원 유래)에 특이적인 면역 반응을 유도시키는 합성 화합물일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 화합물은 천연 발생 미생물 항원과 유사하게 (체액성 및/또는 세포적) 면역 반응을 유도시킨다면 천연 발생 미생물과 유사한다. 천연 발생 미생물 항원과 유사한 화합물 또는 항원은 당업자에게 충분히 공지되어 있는 것, 예컨대, 예를 들어, 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 지단백질, 리포펩티드, 당단백질, 당펩티드, 지질, 당지질, 탄수화물, RNA, 및/또는 DNA 등이다. 천연 발생 미생물 항원과 유사한 화합물의 다른 비제한적인 예는 다당류 항원의 펩티드 모방체이다. 보다 특정한 실시형태가 본 명세서에 제공된다.

용어 "항원"은 본 명세서에 기술된 것과 같은 공지된 항원 또는 야생형 항원의 펩티드 또는 단백질 유사체를 더 포괄하고자 한다. 유사체는 야생형 항원에 비해서 더 가용성일 수 있거나 또는 더 안정할 수 있고, 또한 항원을 보다 면역학적으로 활성이게 만드는 돌연변이 또는 변형을 함유할 수도 있다. 항원은 지질 또는 당 모이어티의 첨가, 펩티드 또는 단백질 아미노산 서열의 돌연변이, DNA 또는 RNA 서열의 돌연변이, 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 변형과 같이, 임의의 방식으로 변형될 수 있다. 항원은 당업자에게 공지된 표준 방법을 사용하여 변형될 수 있다.

본 발명의 조성물 및 방법에서 또한 유용한 것은 바람직한 항원의 아미노산 서열과 상동성인 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 단백질이고, 여기서 상동성 항원은 각각의 종양, 미생물 또는 감염된 세포에 대해 면역 반응을 유도한다.

일 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법은 조성물을 포함하고, 여기서 양이온성 지질은 예를 들어 질환 또는 감염 세포를 공격하여 사멸시키도록 자연 살해 세포를 활성화시켜, 대상체에서 질환을 치료하기 위해 바람직한 면역 반응을 촉진시키기 위해서 I형 인터페론을 활성화시키기 위해 항원없이 투여된다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 조성물을 포함하고, 여기서 양이온성 지질은 항원(들)과 함께 투여되고, 항원은 종양을 예방 또는 치료하기 위한 면역치료 개발하기 위해, 종양 또는 암과 연관될 수 있고, 다시 말해서, 종양-연관 항원일 수 있다. 이와 같이, 일 실시형태에서, 본 발명의 종양 또는 면역요법은 적어도 하나의 종양-연관 항원의 적어도 하나의 에피토프를 더 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 면역요법 방법은 하나 이상의 종양-연관 항원 유래 다수의 에피토프를 더 포함한다. 본 발명의 방법 및 양이온성 지질과 사용되는 종양-연관 항원은 선천적으로 면역원성일 수 있거나, 또는 비면역원성일 수 있거나, 또는 약간 면역원성일 수 있다. 본 명세서에서 입증되는 바와 같이, 종양-연관 자기-항원은 치료 효과를 위한 대상 면역요법에서 유리하게 적용될 수 있는데, 대상 조성물이 몇몇 종양 유형에 대한 항종양 효과를 매개하는 것으로 알려진 I형 인터페론 (IFN)을 활성화시킬 수 있다. 예시적인 항원은 제한없이 합성, 재조합, 외래 또는 상동성 항원을 포함하고, 항원성 재료는 제한없이 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 지단백질, 리포펩티드, 지질, 당지질, 탄수화물, RNA 및 DNA를 포함한다. 이러한 요법의 예는 제한없이 유방암, 두경부암, 흑색종, 자궁경부암, 폐암, 전립선암, 소화관 암종, 또는 면역요법에 감수성인 당분야에 공지된 임의의 다른 암의 치료 또는 예방을 포함한다. 이러한 요법에서 캡슐화없이 양이온성 지질과 항원을 조합하는 것이 또한 가능하다.

본 발명에서 사용에 적합한 종양-연관 항원은 정상 세포와 비교하여 종양 세포에서 독점적으로 발현되거나 또는 과발현되고/되거나, 몇몇 유형의 종양 간에 공유되는, 단일 종양 유형을 의미할 수 있는 천연 발생 및 변형 분자 둘 모두를 포함한다. 단백질, 당단백질, 지단백질, 펩티드, 및 리포펩티드 이외에도, 탄수화물, 강글리오시드, 당지질, 및 뮤신의 발현의 종양-특이적 패턴이 또한 입증되었다. 암 백신에서 사용을 위한 예시적인 종양-연관 항원은 종양유전자, 종양 억제인자 유전자, 및 종양 세포에 고유한 돌연변이 또는 재배열을 갖는 다른 유전자의 단백질 생성물, 재활성화된 배아 유전자 생성물, 종양태아 항원, 조직-특이적 (종양-특이적이지 않음) 분화 항원, 성장 인자 수용체, 세포 표면 탄수화물 잔기, 외래 바이러스 단백질, 및 다수의 다른 자기-단백질을 포함한다.

종양-연관 항원의 특별한 실시형태는 예를 들어, 돌연변이 또는 변형 항원 예컨대 Ras p21 원암유전자, 종양 억제인자 p53 및 HER-2/neu 및 BCR-abl 종양유전자의 단백질 생성물을 비롯하여, CDK4, MUM1, 캐스파제 8, 및 베타 카테닌; 과발현된 항원 예컨대 갈렉틴 4, 갈렉틴 9, 카본산 언히드라제, 알돌라제 A, PRAME, Her2/neu, ErbB-2 및 KSA, 종양태아 항원 예컨대 알파 태아단백질 (AFP), 인간 융모성 고나도트로핀 (hCG); 자기 항원 예컨대 암배 항원 (CEA) 및 멜라노사이트 분화 항원 예컨대 Mart 1/Melan A, gp100, gp75, 티로시나제, TRP1 및 TRP2; 전립선 연관 항원 예컨대 PSA, PAP, PSMA, PSM-P1 및 PSM-P2; 재활성화된 배아 유전자 생성물 예컨대 MAGE 1, MAGE 3, MAGE 4, GAGE 1, GAGE 2, BAGE, RAGE, 및 다른 암 고환 항원 예컨대 항원 예컨대 NY-ESO1, SSX2 및 SCP1; 뮤신 예컨대 Muc-1 및 Muc-2; 강글리오시드 예컨대 GM2, GD2 및 GD3, 중성 당지질 및 당단백질 예컨대 루이스 (y) 및 글로보-H; 및 당단백질 예컨대 Tn, 톰슨-프라이덴리히 (Thompson-Freidenreich) 항원 (TF) 및 sTn을 포함한다. 또한 본 명세서에서 종양-연관 항원으로서 전체 세포 및 종양 세포 용해물을 비롯하여 이의 면역원성 부분뿐만 아니라, B 세포 림프종에 대해 사용을 위한 B 림프구의 단일클론 증식 상에서 발현된 면역글로불린 이디오타입을 포함한다.

종양-연관 항원 및 그들 개별 종양 세포 표적은 예를 들어, 암종에 대한 항원으로서, 시토케라틴, 특히 시토케라틴 8, 18 및 19를 포함한다. 상피막 항원 (EMA), 인간 배아 항원 (HEA-125), 인간 유액 지방 글로불, MBr1, MBr8, Ber-EP4, 17-1A, C26 및 T16이 또한 공지된 암종 항원이다. 데스민 및 근육-특이적 액틴은 근원성 육종의 항원이다. 태반 알칼리 포스파타제, 베타-인간 융모성 고나도트로핀, 및 알파-태아 단백질은 영양아층 및 배세포 종양의 항원이다. 전립선 특이적 항원은 전립선 암종의 항원, 결장 선암종의 암배 항원이다. HMB-45는 흑색종의 항원이다. 자궁경부 암에서, 유용한 항원은 인간 파필로마 바이러스에 의해 코딩될 수 있다. 크로마그라닌-A 및 시냅토피신은 신경내분비 및 신경외배엽 종양의 항원이다. 특히 관심있는 것은 괴사성 영역을 갖는 고형 종괴를 형성하는 공격적인 종양이다. 이러한 괴사 세포의 용해는 항원-제시 세포에 대한 항원의 풍부한 공급원이고, 따라서, 대상 요법은 통상의 화학요법 및/또는 방사선 요법과 함께 유리한 용도를 찾을 수 있다.

종양-연관 항원은 당분야에 충분히 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 이들 항원은 암세포의 미정제 추출물을 제조하거나 (예를 들어, [Cohen et al., Cancer Res., 54:1055 (1994)]에 기술됨), 항원을 부분적으로 정제하거나, 재조합 기술에 의하거나, 또는 기지 항원의 신규 합성에 의해 암 세포로부터 제조될 수 있다. 항원은 또한 대상체에서 발현 및 면역된 대상체의 면역계에게 제시를 위해 적합한 형태로 항원성 펩티드를 코딩하는 핵산의 형태일 수 있다. 또한, 항원은 완전한 항원일 수 있거나, 또는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 완전한 항원의 단편일 수 있다.

일정 암에 대한 경향이 있는 것으로 알려진 병원체 유래 항원이 또한 본 발명의 암 백신에서 유리하게 포함될 수 있다. 전세계 암 발병률의 16%에 가깝게, 감염성 병원체가 원인일 수 있다고 추정되고, 많은 일반적인 악성종은 특별한 바이러스 유전자 생성물의 발현을 특징으로 한다. 따라서, 암을 야기하는데 연루된 병원체 유래의 하나 이상의 항원의 포함은 숙주 면역 반응을 넓히고 암 백신의 예방적 또는 치료적 효과를 증강시키는데 도움을 줄 수 있다. 본 명세서에서 제공하는 암에서 사용을 위한 특별한 관심의 병원체는 B형 간염 바이러스 (간세포 암종), C형 간염 바이러스 (간종양), 엡스테인 바 바이러스 (EBV) (버킷 림프종, 비인두암, 면역억제 개체에서 PTLD), HTLVL (성인 T 세포 백혈병), 종양원성 인간 파필로마 바이러스 16형, 18형, 33형, 45형 (성인 자궁경부암), 및 헬리코박터 피로리 (Helicobacter pylori) 박테리아 (B 세포 암 림프종)를 포함한다. 포유동물 및 보다 특히 인간에서 항원으로서 제공될 수 있는 다른 의학적으로 관련된 미생물은 광범위하게 문헌, 예를 들어 [C. G. A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983]에 기술되어 있고, 이의 전체 내용을 참조로 본 명세서에 편입시킨다.

다른 실시형태에서, 항원은 병원체로부터 유래되거나 또는 그와 연관된 항원, 즉 미생물 항원을 포함한다. 이와 같이 일 실시형태에서, 본 발명의 병원체 백신은 적어도 하나의 미생물 항원의 적어도 하나의 에피토프를 더 포함한다. 대상 면역요법으로 표적화할 수 있는 병원체는 제한없이 바이러스, 박테리아, 기생충 및 진균을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 병원체 백신은 하나 이상의 미생물 항원 유래의 다수 에피토프를 더 포함한다.

양이온성 지질 요법 및 방법에서 사용되는 미생물 항원은 선천적으로 면역원성일 수 있거나, 또는 비면역원성일 수 있거나, 또는 약하게 면역원성일 수 있다. 예시적인 항원은 제한없이, 합성, 재조합, 외래 또는 상동성 항원을 포함하고, 항원성 물질은 제한없이 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 지단백질, 리포펩티드, 지질, 당지질, 탄수화물, RNA, 및 DNA를 포함한다.　

예시적인 바이러스 병원체는 제한없이 포유동물, 및 보다 특히 인간을 감염시키는 바이러스를 포함한다. 바이러스의 예는 제한없이 레트로바이러스과 (예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스, 예컨대 HIV-1 (HTLV-III, LAV 또는 HTLV-III/LAV, 또는 HIV-III이라고도 함; 및 다른 단리원, 예컨대 HIV-LP; 피코르나바이러스과 (예를 들어, 폴리오 바이러스, A형 간염 바이러스; 엔테로바이러스, 인간 콕사키 바이러스, 리노바이러스, 에코바이러스); 칼시바이러스과 (예를 들어, 위장염을 일으키는 균주); 토가바이러스과 (예를 들어, 말 뇌염 바이러스, 루벨라 바이러스); 플라비바이러스 (예를 들어, 뎅기 바이러스, 뇌염 바이러스, 황열 바이러스); 코로노바이러스과 (예를 들어, 코로나바이러스); 라브도바이러스과 (예를 들어, 수포성 구내염 바이러스, 공수병 바이러스); 코로나바이러스과 (예를 들어, 코로나바이러스); 라브도바이러스과 (예를 들어, 수포성 구내염 바이러스, 공수병 바이러스); 필로바이러스과 (예를 들어, 에볼라 바이러스); 파라믹소바이러스과 (예를 들어, 파라인플루엔자 바이러스, 유행성 이하선염 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스); 오르쏘믹소바이러스과 (예를 들어, 인플루엔자 바이러스); 분가바이러스과 (예를 들어, 한탄 바이러스, 분가 바이러스, 플레보바이러스 및 나이로 바이러스); 아레나 바이러스과 (출혈열 바이러스); 레오바이러스과 (예를 들어, 레오바이러스, 오르비바이러스 및 로타바이러스); 비르나바이러스과; 헤파드나바이러스과 (B형 간염 바이러스); 파보바이러스과 (파보바이러스); 파포바바이러스과 (파필로마 바이러스, 폴리오마 바이러스); 아데노바이러스과 (대부분의 아데노바이러스); 헤르페스바이러스과, 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV) 1 및 2, 바리셀라 조스터 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 헤르페스 바이러스; 폭시바이러스과 (바리올라 바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스 바이러스); 및 이리도바이러스과 (예를 들어, 아프리카 돼지 열병 바이러스); 및 미분류 바이러스 (예를 들어, 해면상 뇌병증의 병인체, 델타 감염의 원인체 (B형 간염 바이러스의 결함성 위성체로 여겨짐), 비-A형, 비-B형 간염의 원인체 (클래스 1=내부 전염; 클래스 2=비경구 전염 (C형 간염); 노르워크 및 관련 바이러스, 및 아스트로바이러스)를 포함한다.

또한, 그람 음성 및 그람 양성 박테리아가 척추동물에서 대상 조성물 및 방법에 의해 표적화될 수 있다. 이러한 그람 양성 박테리아는 제한없이, 파스퇴렐라 (Pasteurella) 종, 스타필로코커스 (Staphylococcus) 종 및 스트렙토코커스 (Streptococcus) 종을 포함한다. 그람 음성 박테리아는 제한없이 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli), 슈도모나스 (Pseudomonas) 종 및 살모넬라 (Salmonella) 종을 포함한다. 감염성 박테리아의 특정 예는 제한없이 헬리코박터 피롤리 (Helicobacter pyloris), 보렐라 부르그도르페리 (Borella burgdorferi), 레지오넬라 뉴모필리아이 (Legionella pneumophiliaii), 마이코박테리아 종 (예를 들어, 엠. 튜버큘로시스 (M. tuberculosis), 엠. 아비움 (M. avium), 엠. 인트라셀룰라레 (M. intracellulare), 엠. 칸사이 (M. kansaii), 엠. 고르도나 (M. gordonae)), 스트렙토코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 네이세리아 고노레아 (Neisseria gonorrhoeae), 네이세리아 메닌지티디스 (Neisseria meningitidis), 리스테리아 모노시토게네스 (Listeria monocytogenes), 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes) (그룹 A 스트렙토코커스), 스트렙토코커스 아갈락티아 (Streptococcus agalactiae) (그룹 B 스트렙토코커스), 스트렙토코커스 (비리단스 그룹), 스트렙토코커스 패칼리스 (Streptococcus faecalis), 스트렙토코커스 보비스 (Streptococcus bovis), 스트렙토코커스 (혐기성 종), 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumoniae), 병원성 캄필로박터 (Campylobacter) sp., 엔테로코커스 (Enterococcus) sp., 해모필러스 인플루엔자 (Haemophilus infuenzae), 바실러스 안트라시스 (Bacillus antracis), 코리네박테리움 디프테리아 (corynebacterium diphtheriae), 코리네박테리움 (corynebacterium) sp., 에리시펠로트릭스 루시오파티아 (Erysipelothrix rhusiopathiae), 퍼프린저스 (perfringers), 클로스트리디움 테타니 (Clostridium tetani), 엔테로박터 아에로게네스 (Enterobacter aerogenes), 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 파스퇴렐라 물토시다 (Pasturella multocida), 박테로이데스 (Bacteroides) sp., 푸소박테리움 뉴클레아투미 (Fusobacterium nucleatumii), 스트렙토바실러스 모니리포르미스 (Streptobacillus moniliformis), 트레포네마 팔리디움 (Treponema pallidium), 트레포네마 퍼테뉴 (Treponema pertenue), 렙토스피라 (Leptospira), 리케치아 (Rickettsia), 및 악티노마이세스 이스라엘리 (Actinomyces israelli)를 포함한다.　

대상 조성물에서 미생물 항원의 공급원으로서 이용될 수 있는 박테리아 병원체의 폴리펩티드는 제한없이 철-조절 외막 단백질 ("IROMP"), 외막 단백질 ("OMP"), 및 절졸증을 초래하는 애로모니스 살모니시다 (Aeromonis salmonicida)의 A-단백질, 박테리아성 신장 질환 ("BKD")을 초래하는 레니박테리움 살로니나럼 (Renibacterium salmoninarum)의 p57 단백질, 주요 표면 연관 항원 ("msa"), 표면 발현 시토톡신 ("mpr"), 표면 발현 헤모리신 ("ish"), 및 여시니아증의 편모 항원; 세포외 단백질 ("ECP"), 철-조절 외막 단백질 ("IROMP"), 및 파스퇴르증의 구조 단백질; 비브리오증 안귈라럼 (Vibrosis anguillarum) 및 브이. 오르달리 (V. ordalii)의 OMP 및 편모 단백질; 에드워드증 이크탈루리 (Edwardsiellosis ictaluri) 및 이. 타르다 (E. tarda)의 편모 단백질, OMP 단백질, aroA, 및 purA; 및 이크티오프티리우스 (Ichthyophthirius)의 표면 항원; 및 시토파가 콜럼나리 (Cytophaga columnari)의 구조 및 조절 단백질; 및 리케치아 (Rickettsia)의 구조 및 조절 단백질을 포함한다. 이러한 항원은 재조합적으로 또는 당분야에 공지된 임의의 다른 수단을 통해 단리 또는 제조될 수 있다.

병원체의 예에는 제한없이, 포유동물, 및 보다 특히 인간을 감염시키는 진균이 더 포함된다. 진균의 예는 제한없이 크립토코커스 네오포르만시 (Cryptococcus neoformansi), 히스토플라스마 캡슐라텀 (Histoplasma capsulatum), 콕시디오이데스 이미티스 (Coccidioides immitis), 블라스토마이세스 더마티티디스 (Blastomyces dermatitidis), 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis), 칸디다 알비칸스 (Candida albicans)를 포함한다. 감염성 기생충의 예는 플라스모듐 (Plasmodium) 예컨대 플라스모듐 팔시파럼 (Plasmodium falciparum), 플라스모듐 말라리아 (Plasmodium malariae), 플라스모듐 오발레 (Plasmodium ovale), 및 플라스모듐 비박스 (Plasmodium vivax)를 포함한다. 다른 감염성 유기체 (즉, 원생생물)는 톡소플라스마 곤디 (Toxoplasma gondii)를 포함한다. 기생충 병원체의 폴리펩티드는 제한없이 이크티오프티리우스 (Ichthyophthirius)의 표면 항원을 포함한다.　

포유동물, 및 특히 인간에서 항원으로서 제공되는 다른 의학적으로 관련된 미생물은 예를 들어, 문헌 [C. G. A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983]에 광범위하게 설명되어 있으며, 이의 전체 내용을 참조로 본 명세서에 편입시킨다. 감염성 인간 질환 및 인간 병원체의 치료이외에도, 본 발명의 조성물 및 방법은 인간이외의 포유동물의 감염을 치료하는데 유용하다. 인간이외의 포유동물의 치료를 위한 많은 백신은 [Bennett, K. Compendium of Veterinary Products, 3rd ed. North American Compendiums, Inc., 1995], 또한 WO 02/069369를 참조하며, 이의 개시 내용을 본 명세서에서 참조로 분명히 편입시킨다.

예시적인 인간이외의 병원체는 제한없이, 마우스 유선 종양 바이러스 ("MMTV"), 라우스 육종 바이러스 ("RSV"), 조류 백혈병 바이러스 ("ALV"), 조류 골수아구증 바이러스 ("AMV"), 쥐과 백혈병 바이러스 ("MLV"), 고양이 백혈병 바이러스 ("FeLV"), 쥐과 육종 바이러스 ("MSV"), 기본 원숭이 백혈병 바이러스 ("GALV"), 비장 괴사 바이러스 ("SNV"), 세망내피증 바이러스 ("RSV"), 원숭이 육종 바이러스 ("SSV"), 메이슨-화이저 (Mason-Pfizer) 원숭이 바이러스 ("MPMV"), 원숭이 레트로바이러스 1형 ("SRV-1"), 렌티바이러스 예컨대 HIV-1, HIV-2, SIV, 비스나 바이러스, 고양이 면역결핍 바이러스 ("FIV"), 및 말 감염성 빈혈 바이러스 ("EIAV"), T-세포 백혈병 바이러스 예컨대 HTLV-1, HTLV-II, 원숭이 T-세포 백혈병 바이러스 ("STLV"), 및 소 백혈병 바이러스 ("BLV"), 및 거품 바이러스 예컨대 인간 거품 바이러스 ("HFV"), 원숭이 거품 바이러스 ("SFV") 및 소 거품 바이러스 ("BFV")를 포함한다.　

일부 실시형태에서, 감염성 병원체를 참조하여 본 명세서에서 사용되는 용어 "치료", "치료하다", 및 "치료하는"은 병원체에 의한 감염에 대해 대상체의 내성을 증가시키거나 또는 대상체가 병원체에 감염될 가능성을 감소시키는 예방적 치료; 및/또는 감염과 싸우기 위해서, 예를 들어 감염을 감소 또는 제거시키거나 또는 악화되는 것을 방지하기 위해 대상체가 감염된 이후의 치료를 의미한다.

미생물 항원은 당분야에 충분히 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 이들 항원은 미정제 추출물을 제조하거나, 항원을 부분적으로 정제하거나, 또는 대안적으로 재조합 기술에 의해 또는 기지 항원의 신규 합성에 의해 바이러스 및 박테리아 세포로부터 직접적으로 제조할 수 있다. 항원은 또한 대상체에서의 발현 및 면역화된 대상체의 면역계에 대한 제시에 적합한 형태로 항원성 펩티드를 코딩하는 핵산의 형태일 수 있다. 또한, 항원은 완전한 항원일 수 있거나, 또는 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 완전한 항원의 단편일 수 있다.

양이온성 지질 비히클로 항원의 도입을 개선시키고, 또한 면역계의 세포로 전달을 개선시키기 위해서, 항원은 항원의 소수성 또는 음전하를 증가시키도록 변형될 수 있다. 항원의 소수성은 예컨대 예를 들어 분자의 항원성 성질을 유지하면서, 양이온성 지질의 소수성 아실 사슬에서 항원의 가용성을 개선시키기 위해 지질 사슬 또는 소수성 아미노산에 접합시켜 증가시킬 수 있다. 변형된 항원은 지단백질, 리포펩티드일 수 있거나 또는 소수성이 증가된 아미노산 서열을 갖게 변형된 펩티드, 및 이의 조합일 수 있다. 변형된 항원은 지질과 항원 사이에 접합된 링커를 가질 수 있으며, 예컨대, 예를 들어 N-말단 알파 또는 엡실론-팔미토일 리신이 디펩티드 세린-세린 링커를 통해 항원에 연결될 수 있다. 또한, 항원은 항원은 양이온성 지질 복합체로 캡슐화되는 제제 완충액을 변경시키거나 또는 음이온성 모이어티, 예컨대 예를 들어 음이온성 아미노산을 항원에 공유적으로 부착시켜 이의 음전하를 증가시키도록 조작될 수 있다.

본 명세서에 기술된 일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 나노입자 조립체의 형태일 수 있다. 본 명세서에서 사용시, 용어 "나노입자"는 나노미터 규모로 측정된 크기를 갖는 입자를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 "나노입자"는 크기가 약 10,000 나노미터 미만인 구조를 갖는 입자를 의미한다. 일부 실시형태에서, 나노입자는 리포솜이다.

본 발명의 양이온성 지질 조성물은 임의로는 항원과 혼합되고 키랄 양이온성 지질 단독 또는 중성 지질과 조합된 키랄 양이온성 지질을 함유할 수 있는 리포솜을 형성할 수 있다. 적합한 키랄 양이온성 지질 종은 제한없이 R 및 S 거울상 이성질체를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "양이온성 지질"은 생리적 pH에서 순 양전하를 보유하거나 또는 양성자가능한 기를 가지며 pKa보다 낮은 pH에서 양으로 하전되는 임의의 다수의 지질종을 의미한다. 본 개시에 따라 적합한 양이온성 지질은 제한없이 3-β[⁴N―(¹N,⁸-디구아니디노 스퍼미딘)-카바모일]콜레스테롤 (BGSC); 3-β[N,N-디구아니디노에틸-아미노에탄)-카바모일]콜레스테롤; BGTC); N,N¹N²N³테트라-메틸테트라팔미틸스퍼민 (cellfectin); N-t-부틸-N'-테트라데실-3-테트라데실-아미노프로피온-아미딘 (CLONfectin); 디메틸디옥타데실 암모늄 브로미드 (DDAB); 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸-히드록시 에틸 암모늄 브로미드 (DMRIE); 2,3-디올레오일옥시-N-[2(스퍼민카르복사미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로파나미늄 트리플루오로아세테이트) (DOSPA); 1,3-디올레오일옥시-2-(6-카르복시스퍼밀)-프로필 아미드 (DOSPER); 4-(2,3-비스-팔미토일옥시-프로필)-1-메틸-1H-이미다졸 (DPIM) N,N,N',N'-테트라메틸-N,N'-비스(2-히드록시에틸)-2,3-디올레오일옥시-1,4-부탄- 디암모늄 요오다이드) (Tfx-50); N-1-(2,3-디올레오일옥시) 프로필-N,N,N-트리메틸 암모늄 클로라이드 (DOTMA) 또는 다른 N-(N,N-1-디알콕시)-알킬-N,N,N-삼중치환 암모늄 계면활성제; 1,2 디올레오일-3-(4'-트리메틸암모니오) 부타놀-sn-글리세롤 (DOBT) 또는 콜레스테릴 (4'트리메틸암모니아) 부타노에이트 (ChOTB)로서 트리메틸암모늄 기가 부타놀 스페이서 부분을 통해서 이중 사슬 (DOTB의 경우) 또는 콜레스테릴 기 (ChOTB의 경우)에 연결된 것; WO 93/03709에 개시된 DORI (DL-1,2-디올레오일-3-디메틸아미노프로필-베타-히드록시에틸암모늄) 또는 DORIE (DL-1,2-O-디올레오일-3-디메틸아미노프로필-베타-히드록시에틸암모늄) (DORIE) 또는 이의 유사체; 1,2-디올레오일-3-숙시닐-sn-글리세롤 콜린 에스테르 (DOSC); 콜레스테릴 헤미숙시네이트 에스테르 (ChOSC); 리포폴리아민 예컨대 디옥타데실아미도글리실스퍼민 (DOGS) 및 디팔미토일 포스파티딜에탄올아밀스퍼민 (DPPES), 콜레스테릴-3-베타-카복실-아미도-에틸렌트리메틸암모늄 요오다이드, 1-디메틸아미노-3-트리메틸암모니오-DL-2-프로필-콜레스테릴 카르복실레이트 요오다이드, 콜레스테릴-3-O-카르복시아미도에틸렌아민, 콜레스테릴-3-베타-옥시숙신아미도-에틸렌트리메틸암모늄 요오다이드, 1-디메틸아미노-3-트리메틸암모니오-DL-2-프로필-콜레스테릴-3-베타-옥시숙시네이트 요오다이드, 2-(2-트리메틸암모니오)-에틸메틸아미노 에틸-콜레스테릴-3-베타-옥시숙시네이트 요오다이드, 3-베타-N-(N',N'-디메틸아미노에탄) 카바모일 콜레스테롤 (DC-chol), 및 3-베타-N-(폴리에틸렌이민)-카바모일콜레스테롤; O,O'-디미리스틸-N-리실 아스파테이트 (DMKE); O,O'-디미리스틸-N-리실-글루타메이트 (DMKD); 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸-히드록시 에틸 암모늄 브로미드 (DMRIE); 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (DLEPC); 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (DMEPC); 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (DOEPC); 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (DPEPC); 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (DSEPC); 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTAP); 디올레오일 디메틸아미노프로판 (DODAP); 1,2-팔미토일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DPTAP); 1,2-디스테아로일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DSTAP), 1,2-미리스토일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DMTAP); 및 소듐 도데실 술페이트 (SDS)를 포함한다. 뿐만 아니라, 임의의 기술된 양이온성 지질의 구조적 변이체 및 유도체가 또한 고려된다.

일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 DOTAP, DOTMA, DOEPC, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 양이온성 지질은 DOTAP이다. 또 다른 실시형태에서, 양이온성 지질은 DOTMA이다. 다른 실시형태에서, 양이온성 지질은 DOEPC이다. 일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 정제된다.

일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 양이온성 지질의 거울상 이성질체이다. 용어 "거울상 이성질체"는 이의 대응 입체이성질체의 비중첩 거울상인 양이온성 지질의 입체이성질체, 예를 들어 R 및 S 거울상 이성질체를 의미한다. 다양한 실시형태에서, 거울상 이성질체는 R-DOTAP 또는 S-DOTAP이다. 일례에서, 거울상 이성질체는 R-DOTAP이다. 다른 예에서, 거울상 이성질체는 S-DOTAP이다. 일부 실시형태에서, 거울상 이성질체가 정제된다. 다양한 예에서, 거울상 이성질체는 R-DOTMA 또는 S-DOTMA이다. 일례에서, 거울상 이성질체는 R-DOTMA이다. 다른 예에서, 거울상 이성질체는 S-DOTMA이다. 일부 실시형태에서, 거울상 이성질체는 정제된다. 다양한 예에서, 거울상 이성질체는 R-DOEPC 또는 S-DOEPC이다. 일례에서, 거울상 이성질체는 R-DOEPC이다. 다른 예에서, 거울상 이성질체는 S-DOEPC이다. 일부 실시형태에서, 거울상 이성질체는 정제된다.

예시의 목적으로 몇몇 예들이 충분히 연구되고 CD8+ T-세포의 항원 교차 제시에 대한 I형 인터페론 상향조절의 효과를 예시하기 위한 적합한 항원으로서 제공되는 모델 HPV 항원을 이용해 수행된다는 것을 유의한다.

일반적으로, 치료를 언급할 때, 본 명세서에 논의되는 조성물은 경구, 비경구 (예를 들어, 정맥내 또는 피하 투여), 근육내 주사, 복강내 주사, 경피, 체외, 체강내 투여, 경피, 또는 국소 비내 투여 또는 흡입 투여를 포함한, 국소로 투여될 수 있다. 국소 투여는 안구, 질, 직장, 또는 비내일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "국소 비내 투여"는 한쪽 또는 양쪽 콧구멍을 통해 비강 및 코로 조성물의 전달을 의미하고 분무 기전 또는 액적 기전에 의한 전달, 또는 핵산 또는 벡터의 에어로졸화를 통한 전달을 포함할 수 있다. 흡입제에 의한 조성물의 투여는 분무 또는 액적 기전을 통한 전달을 통해서 코 또는 입을 통할 수 있다. 전달은 기관내삽관을 통해 호흡계 (예를 들어, 폐)의 임의 영역으로 직접적으로 될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는, 조성물의 "비경구 투여"는 사용한다면 일반적으로 주사를 특징으로 한다. 주사제는 액상 용액 또는 현탁액, 주사전 액체 중 현탁 용액에 적합한 고체 형태, 또는 에멀션으로, 통상적인 형태로 제조될 수 있다. 비경구 투여는 일정한 용량이 유지되도록 지연 방출, 일정 시간 방출 또는 지속 방출 시스템의 사용을 포함한다.

용어 "치료적으로 유효한"은 사용되는 조성물의 양이 질환의 하나 이상의 원인 또는 증상, 예컨대 이상 세포 성장, 종양 발생 및 암을 완화시키기에 충분한 분량인 것을 의미한다. 이러한 완화는 오직 감소 또는 변경을 요구하며 반드시 제거를 요구하지 않는다. 이러한 완화는 면역 반응의 유발을 포함할 수 있다. 개시된 조성물의 투여를 위한 유효한 용량 및 일정은 경험적으로 결정될 수 있으며, 이러한 결정은 당업자의 기술 내에 속한다. 조성물의 투여를 위한 용량 범위는 장애의 증상에 영향을 미치는 바람직한 효과를 생성하기에 충분히 크다. 용량은 부정적인 부작용, 예컨대 원치않는 교차 반응, 아나필락스 반응 등을 초래할 정도로 커서는 안된다. 일반적으로, 용량은 환자의 연령, 상태, 성별 및 질환 정도, 투여 경로, 용법에 다른 약물의 포함 여부에 따라 가변적일 것이며, 당업자가 결정할 수 있다. 용량은 임의의 역징후의 경우에 개별 의사가 조정할 수 있다. 용량은 가변적일 수 있고, 1일 또는 수일 동안, 매일 하나 이상의 용량 투여로 투여될 수 있다. 소정 약학 제품 부류에 대해 적절한 용량에 대해 문헌에서 확인할 수 있다.

임의의 특정 대상체 또는 환자에 대해 투여되는 조성물의 특별한 유효량은 치료하려는 질환 또는 장애 및 장애의 중증도; 적용되는 특별한 조성물의 정체 및 활성; 환자의 연령, 체중, 전신 건강, 성별 및 식이; 투여 시기; 투여 경로; 적용되는 특별한 조성물의 배출률; 치료 지속기간; 적용되는 특별한 조성물과 병용하거나 또는 우연히 사용되는 약물 및 의약 분야에 공지된 인자 등을 포함한 다양한 인자에 의존적일 것이다.

예를 들어, 바람직한 효과를 획득하고 바람직한 효과가 획득될 때까지 용량을 점진적으로 증가시키기 위해 요구되는 것 미만의 수준으로 조성물의 용량을 시작하는 것은 당분야의 기술 내에서 충분하다. 또한 허혈-재관류 손상, 외상, 약물/독성제 유도 손상, 신경퇴행성 질환, 암 또는 다른 질환 및/또는 병태의 치료를 위해 참여를 필요로 하는 대상체의 상태를 평가하는데 유용한 것으로 알려진 병력, 징후, 증상 및 객관적 실험실 검사의 특정 양태를 평가할 수 있다. 이들 징후, 증상 및 객관적 실험실 검사는 이러한 환자를 치료하는 임의의 의사 이 분야의 실험을 수행하는 연구자에게 공지된 바와 같이, 치료하려는 특정한 질환 또는 병태에 따라 다양할 것이다. 예를 들어, 적절한 대조군과의 비교 및/또는 일반 집단 또는 특정 대상체 또는 환자에서 질환의 정상적인 진행에 대한 지식을 기반, (1) 대상체의 신체 상태를 개선시키는 것을 확인하거나 (예를 들어, 종양이 부분적으로 또는 완전히 퇴행됨), (2) 질환의 진행 또는 병태가 안정화되거나, 또는 둔화되거나, 또는 반전되는 것으로 확인되거나, 또는 (3) 질환 또는 병태의 치료를 위한 다른 약물의 필요성이 줄거나 없어지면, 특정 치료 용법이 효율적인 것으로 간주될 것이다.

처방된 치료제의 유효량은 매일, 2일마다, 주간으로, 1개월마다, 격월로, 2개월마다, 매년, 또는 의사 또는 제공자가 유효하다고 결정한 임의의 다른 간격으로 제공될 수 있다. 예를 들어, 유효한 1일 용량은 투여 목적을 위해 다수 용량으로 분배될 수 있다. 결론적으로, 단일 용량 치료제는 이러한 양 또는 1일 용량을 구성하는 이의 소분된 다수 용량을 함유할 수 있다. 개시된 치료제는 또한 항종양 또는 앙암 치료의 병용물의 일부로서 투여될 수 있다. 일 양상에서, 개시된 조성물은 항종양 또는 항암 치료에 의한 치료 이전에 대상체 또는 환자에게 투여될 수 있다. 일 양태에서, 개시된 조성물은 항종양 또는 항암 치료와 동시발생적으로 투여될 수 있다. 일 양태에서, 개시된 조성물은 항종양 또는 항암 치료에 후속하여 투여될 수 있다. 일 양태에서, 환자 또는 대상체는 교대식 또는 회전식 일정으로 양쪽 치료를 받는다. 일 양태에서, 대상체 또는 환자는 개시된 조성물에 의한 단일 치료를 받는다. 일 양상에서, 대상체 또는 환자는 개시된 조성물의 적어도 1회 치료를 받는다. 일 양태에서, 대상체 또는 환자는 개시된 조성물 및 적어도 하나의 다른 항종양 또는 항암 치료에 의한 적어도 1회 치료를 받는다.

용량은 임의의 반대-증상의 경우에 개별 의사 또는 대상체가 조정할 수 있다. 용량은 다양할 수 있고, 1일 또는 수일 동안, 매일 하나 이상의 용량 투여가 투여될 수 있다. 소정 약학 제품 부류에 대해 적절한 용량에 관한 지침은 문헌에서 확인할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 전문용어는 특정 양태만을 설명하려는 목적이고 제한하려는 의도가 아니다.

본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 단수 형태 "일", "하나" 및 "그"는 분명하게 달리 명시하지 않으며 다수 참조를 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어,"하나의 화합물"에 대한 언급은 화합물들의 혼합물을 포함하고, "약학 담체"에 대한 언급은 둘 이상의 이러한 담체의 혼합물을 포함한다.

범위는 "약" 하나의 특정 값으로부터, 그리고/또는 "약" 다른 특정 값까지로서 표시될 수 있다. 용어 "약"은 대략, 부근, 대개, 또는 쯤을 의미하고자 본 명세서에서 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용될 때, 이는 그 범위를 기재된 수치 값 이상 및 이하의 경계까지 확장시켜 변형시킨다. 일반적으로, 용어 "약"은 본 명세서에서 수치 값을 20% 편차만큼 위 아래로 명시된 값으로 변형시키는데 사용된다. 이러한 범위가 표시되면, 양태는 하나의 특정 값으로부터, 그리고/또는 다른 특정한 값까지를 포함한다. 유사하게, "약"이 선행되어 사용되는 근사치로서 값이 표시될 때, 특정 값이 양태를 형성한다는 것을 이해하게 될 것이다. 각 범위의 종결점은 다른 종결점과 관련하여 둘 다 유의하고, 다른 종결점에 대해 독립적이라는 것을 더 이해하게 될 것이다.

본 명세서에서 사용되는 단어 "또는"은 특정 목록의 어느 하나의 구성원을 의미하고 또한 그 목록의 구성원의 임의 조합을 포함한다.

"억제하다", "억제하는" 및 "억제"는 활성, 반응, 병태, 질환 또는 다른 생물학적 매개변수를 감소 또는 축소시키는 것을 의미한다. 이것은 제한없이, 활성, 반응, 병태 또는 질환의 완전한 제거를 포함할 수 있다. 이것은 또한 예를 들어 천연 또는 대조군 수준과 비교하여 활성, 반응, 병태 또는 질환의 10% 억제 또는 감소를 포함할 수도 있다. 따라서, 일 양태에서, 억제 또는 감소는 천연 또는 대조군 수준과 비교하여, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100%, 또는 이 사이의 임의량의 감소일 수 있다. 일 양태에서, 억제 또는 감소는 천연 또는 대조군 수준과 비교하여 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 또는 90-100%이다. 일 양태에서, 억제 또는 감소는 천연 또는 대조군 수준과 비교하여 0-25, 25-50, 50-75, 또는 75-100%이다.

본 명세서에서 사용되는 "조절하다", 조절하는" 및 "조절"은 활성 또는 기능 또는 수치의 변화를 의미할 수 있다. 변화는 활성, 기능, 또는 수치의 증가 또는 감소, 증강 또는 억제일 수 있다.

"촉진하다", "촉진" 및 "촉진하는"은 활성, 반응, 병태, 질환 또는 다른 생물학적 매개변수의 증가를 의미한다. 이것은 제한없이, 활성, 반응, 병태 또는 질환의 개시를 포함할 수 있다. 이것은 또한 예를 들어, 천연 또는 대조군 수준과 비교하여 활성, 반응, 병태 또는 질환의 10% 증가를 포함할 수 있다. 따라서, 일 양태에서, 증가 또는 촉진은 천연 또는 대조군 수준과 비교하여 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% 이상, 또는 그 사이의 임의량의 촉진일 수 있다. 일 양태에서, 증가 또는 촉진은 천연 또는 대조군 수준과 비교하여 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 또는 90-100%이다. 일 양태에서, 증가 또는 촉진은 천연 또는 대조군 수준과 비교하여 0-25, 25-50, 50-75, 또는 75-100% 이상, 예컨대 200, 300, 500, 또는 1000% 이상일 수 있다. 일 양태에서, 증가 또는 촉진은 천연 또는 대조군 수준과 비교하여 100% 초과, 예컨대 천연 또는 대조군 수준과 비교하여 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500% 이상일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "결정하는"은 활성의 분량 또는 양 또는 변화의 측정 또는 확인을 의미할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 사용시 샘플 중 개시된 폴리펩티드의 양을 결정하는 단계는 당업자가 샘플 중 폴리펩티드의 일부 정량가능한 값을 측정 또는 확인하는 단계를 의미할 수 있다. 당업자는 샘플 중 개시된 폴리펩티드 및 개시된 뉴클레오티드의 양을 측정하는 방식에 익숙하다.

용어 "샘플"은 대상체 유래 조직 또는 장기; 세포 (대상체 내부, 대상체로부터 직접 채취, 또는 배양물로 유지되거나 또는 배양된 세포주 유래의 세포); 세포 용해물 (또는 용해 분획) 또는 세포 추출물; 또는 세포 또는 세포 물질 (예를 들어, 폴리펩티드 또는 핵산) 유래 하나 이상의 분자를 함유하는 용액을 의미한다. 샘플은 또한 세포 또는 세포 성분을 함유하는 임의의 체액 또는 분비물 (예를 들어, 제한없이, 혈액, 소변, 대변, 타액, 눈물, 담즙)일 수 있다.

본 발명을 하기 실시예를 참조하여 더욱 설명할 것이지만, 본 발명이 이러한 실시예로 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 대신에, 본 발명을 실시하기 위한 현재 최선의 방식을 설명하는 본 개시의 관점에서, 본 발명의 정신 및 범주를 벗어나지 않고 당업자가 많은 변형 및 변동을 제시할 것이다. 청구항의 의미 및 등가 범위 내에 있는 모든 변화, 변형 및 변동은 그들 범주 내인 것으로 고려된다.

본 발명은 예시적인 방식으로 설명되었다. 사용된 용어가 제한보다는 설명하려는 단어의 특성상 의도된 것으로 이해해야 한다.

본 발명의 많은 변형 및 변동이 상기 교시의 관점에서 가능하다. 그러므로, 첨부된 청구항의 범주 내에서, 본 발명은 특별히 기술된 것과 다르게 실시될 수 있다.

실시예

하기 기술된 실시예에서, 다음의 재료, 방법 및 프로토콜이 이용되었다.

재료 및 방법

동물: 6 내지 12주령 C57BL6/J 마우스 (B6 마우스), B6. Jackson laboratories (Bar harbor, ME)에서 얻은 인간 HLA-A2 유전자 (AAD 마우스)를 발현하는 Cg-Tg(HLA-A/H2-D)2Enge/J 유전자이식 브리더 마우스, 및 IFNAR-/- (B6.129S2-Ifnar1tm1Agt/Mmjax) 유전자 녹아웃 브리더 마우스는 특별한-병원체가 없는 조건 하에서 사육하였다. 축산업, 번식, 및 실험 과정은 DLAR이 승인한 IACUC 프로토콜에 따라 수행하였다.

펩티드 및 시약: cGMP 등급 R-DOTAP 및 S-DOTAP (1,2-디올레오일-3-트리메틸 암모늄-프로판)는 Merck & Cie (Shaffhausen, Switzerland)가 제공하였다. cGMP 등급 R-DOTAP 리포솜 나노입자는 표준 리포솜 제조 방법으로 제조하였다. 펩티드 항원 (KF18: KSSGQAEPDRAHYNIVTF (SEQ ID NO:3), SF9: SIINFEKL (SEQ ID NO:1), RF9: RAHYNIVTF (SEQ ID NO:2)은 GenScript (Piscataway, New Jersey, USA)가 합성하고 > 95% 순도로 정제하였다. 모든 다른 양이온성 지질은 Avanti polar Lipids (Birmingham, AL)에서 구매하였다.

세포주 및 골수 유래 수지상 세포 배양: 초대 골수 유래 수지상 세포는 조혈 골수 세포를 8일 동안, 재조합 마우스 GM-CSF 및 IL-4 (통상의 BMDC (cDC)) 또는 재조합 flt3 리간드 (형질세포양 BMDC (pDC)의 경우)가 보충된 완전 RPMI 배지 (10% FBS, 1 mM L-글루타민, 1 mM 소듐 피루베이트, 1X MEM 불필수 아미노산, 50 μM β-머캅토에탄올, 100 u/mL 페니실린, 100 u/mL 스트렙토마이신 함유 RPMI)에서 배양하여 수득되었다. 양이온성 지질 유도된 I형 IFN을 검출하기 위해 사용된 B16-Blue™ IFN-α/β 세포는 InvivoGen (San Diego, California, USA)에서 구매하였고, 세포 배양은 제조사 프로토콜에 따라 유지하였다.

IFN 리포터 세포 어세이 및 세포 표현형 분석: IFN을 검출하기 위해서, I형 IFN 생산 세포로부터의 상청액을 96웰 플레이트 중 B16-Blue™ IFN-α/β 세포에 첨가하였다. 24시간 인큐베이션이후에, 상청액은 제조사의 설명서에 따라서, QUANTI-Blue™ 시약 (InvivoGen, USA)을 사용하여 SEAP 활성에 대해 어세이되었다. 간략하게, SEAP를 함유하는 50 ㎕의 세포 상청액을 150 ㎕ QUANTI-Blue™ 시약과 혼합하였고 3-4시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰으며 분광계를 사용해 650 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시험 샘플 중 I형 IFN의 농도는 동일 어세이에서 재조합 I형 IFNβ 처리된 B16-Blue™ IFN-α/β 세포로부터 발생된 표준 그래프를 사용해 정량되었다. CD69 발현을 측정하기 위해서, 림프절의 단일 세포 현탁액은 형광색소 접합된 CD3, 및 CD69로 염색되었고, 각 배액 림프절 중 CD69+ CD3+ T 세포 백분율은 유세포측정법을 사용해 측정하였다.

RNA 단리, Nano 스트링 분석, 및 유전자 발현 어세이: 유전자 발현 분석을 위해서, 배액 슬와부 림프절 (n=4)은 60분 동안 37℃에서 세포 해리 칵테일을 사용하여 효소적으로 분해하였고, 단일 세포 현탁액을 사용하고, Sony SY3200 세포 분류기를 사용해 CD11c+ 세포를 분류하였다. 분류 정제된 CD11c+ 세포 (25K 세포)는 Qiagen RLT 세포 용해 완충액 (Qiagen, USA)에 용해시켰고 총 RNA는 Qiagen 총 RNA 단리 키트 (Qiagen, USA)를 사용해 단리하였다. 수득된 총 RNA는 University of Kentucky의 유전체학 중점 실험실 (genomics core laboratory) (Lexington, KY)로 보내졌고 여기서 총 RNA는 면역 반응에 관여되는 547개 유전자에 걸쳐 측정할 수 있는 ncounterTM 마우스 염증 패널 (Nano String Technologies, Seattle, WA)과 혼합되었다. mRNA의 결합은 Nanso String nCounter 분석 시스템으로 검출하였고, 미가공 계측 데이터는 UK 유전체학 중점 실험실에서 SAS 프로그램을 사용하여 정규화되었고 통계적으로 분석되었다. RT-PCR을 사용한 확인 연구의 경우에, 림프절은 RLT 세포 용해 완충액에 직접적으로 용해시켰고 총 단리 RNA는 QuantiTect 역전사 키트 (Qiagen, USA)를 사용해 cDNA로 역전사하였다. 그 다음으로 cDNA는 TaqMan 유전자 발현 시스템 (Applied biosystems, USA)을 사용하여 증폭시켜서 정량적 PCR 반응을 사용하여 GAPDH 발현에 대한 마우스 IFNα 및 IFNβ 전사물을 검출하고 정량하였다.

항원 특이적 T 세포 반응의 백신접종 및 평가: 마우스를 이소플루란을 사용해 마우스를 마취시켰고, 백신접종 전에 주사 부위를 이발하고 70% 에탄올로 세정하였다. ELISPOT를 사용한 항원 특이적 T 세포 반응을 평가하기 위해서, 마우스는 2회 용량 (100 ㎕/용량)의 양이온성 지질 및 항원성 펩티드를 함유하는 백신 제제를 7일 간격으로 전달하거나 또는 동일 부피의 완전 프로인트 보강제 및 항원 펩티드를 유화시켜 제조된 CFA 제제의 1회 용량을 0일에 전달하여 백신접종하였다. 항원 특이적 반응은 1차 백신 이후 14일에 평가하였다. 항원 특이적 반응을 측정하기 위해서, 안락사된 마우스의 비장을 사용하고 IFN-γ ELISPOT 어세이 (Mabtech, Inc, Cincinnati, Ohio, USA)를 사용하여 항원 특이적 T 세포 반응을 검출하였다. IFN-γ ELISPOT 어세이의 경우에, 마우스 IFN-γ 포획 항체로 사전 코팅된 96웰 플레이트 중 관심 CD8 T 세포 에피토프로 2.5 x 10⁵ 의 처리된 비장 세포를 18-24시간 동안 37℃에서 자극시켰다. 자극 후, 웰은 PBS로 세척하였고 바이오틴-접합된 항-IFN γ 항체와 인큐베이션시킨 후에 스트렙타비딘-HRP 항체와 인큐베이션시켰다. 항원 특이적 IFN-γ 생산 세포를 가시화시키기 위해서, 웰을 6분 동안 TMB 기질과 인큐베이션시켰고, 물로 세척하였으며, 대기 건조시켰다. 반점을 스캔하였고 CTL ImmunoSpot 분석기 및 ImmunoSpot Ver.4 소프트웨어 (Cellular Technology Limited, Cleveland, Ohio, USA)를 사용해 계측하였다. 반점 계측치는 3개 샘플로부터의 중간치 값으로서 요약되었다. 각 샘플은 배경값 및 양성 대조군을 검출하기 위해서 미자극 및 PMS/이오노마이신 대조군 웰을 가졌다. 웰은 반점 계측치가 5개 반점을 초과하면 양성으로 간주되었고 반점 계측치가 대조군에 비해서 3배를 초과하면 항원 특이적 반응이 양성으로서 간주되었다.

실시예 1

R-DOTAP는 배액 림프절에서 I형 인터페론 유전자 발현을 유도한다

양이온성 나노입자 유도된 유전자 발현을 평가하기 위해서, C57BL/6J 마우스는 100 ㎕의 12 mM R-DOTAP 나노입자를 피하로 목뒤에 주사하였고, 배액 림프절 중 염증성 유전자 발현은 백선접종 후 4시간 또는 24시간에 분석하였다. PBS, 및 LPS (50 ㎍/마우스)가 주사된 마우스 (24시간 시점)는 각각 음성 및 양성 대조군으로서 사용되었다. 주사 후 4시간 또는 24시간에, 각 마우스로부터의 겨드랑이 및 상완 배액 림프절을 모았고 콜라게나제 분해로 처리하였다. 림프절 세포 현탁액 중 활성화된 수지상 세포 (CD11c⁺) 세포는 분류-정제되었고 RLT 완충액에 용해시켰고 nCounter® 마우스 염증 키트 및 nanostring 기술을 사용해 상대적 유전자 발현 분석을 위해 처리하였다. R-DOTAP 주사는 양쪽 시점에 몇몇 염증성 유전자의 발현을 상당히 변경시키는 것으로 확인되었다. IFN-1α 및 IFN-1β를 포함한 몇몇 유전자는 양성 대조군으로서 사용된 LPS에 비해서 5배 초과로 더 높은 증가를 보였다. Cxcl10을 포함한 다른 유전자의 발현은 또한 유의하게 증가되었고 LPS에 의해 유도된 수준과 더 비슷하였다 (도 1).

실시예 2

R-DOTAP 및 S-DOTAP는 둘 모두가 배액 림프절에서 인터페론-α 및 인터페론-β 유전자 발현을 유도한다

R-DOTAP 및 S-DOTAP 둘 모두에 의한 I형 인터페론 유전자 발현을 비교하기 위해서, 실시예 1에 약술된 것과 유사한 연구를 수행하였다. C57BL/6J 마우스는 50 ㎕의 6 mM RDOTAP 나노입자를 피하로 발바닥에 주사되었다. PBS, 및 LPS (50 ㎍/마우스)가 주사된 마우스 (24시간 시점)는 각각 음성 및 양성 대조군으로서 사용되었다. 주사 후 3시간 또는 24시간에, 각 마우스로부터의 슬와부 배액 림프절을 모았고 RLT 완충액에서 용해시켰으며 Taqman® 유전자 발현 어세이 및 RT-PCR을 사용하여 상대적 유전자 발현 분석을 위해 처리하였다. 이 연구는 R-DOTAP 및 S-DOTAP 둘 모두가 I형 인터페론의 강력한 유도인자라는 것을 확인해 준다 (도 2).

실시예 3

R-DOTAP 및 S-DOTAP는 T-세포 상에서 I형 인터페론-연관 CD69 발현을 상향조절한다

I형 인터페론을 활성화시키는 양이온성 지질의 능력 및 효과를 더욱 이해하기 위해서, C57BL/6J 마우스 또는 IFNAR-/- 마우스는 50 ㎕의 6 mM R-DOTAP 나노입자 또는 6 mM S-DOTAP 또는 280 mM 수크로스를 피하로 발바닥에 주사하였다. 주사 후 24시간에, 각 마우스로부터의 슬와부 배액 림프절을 단리하였고 림프절의 단일 세포 현탁액을 형광색소 접합된 CD3 및 CD69로 염색하였다. R-DOTAP 단독 (항원없음)은 DLN 크기의 가시적인 증가가 야기되었고 이것은 7일 기간 동안 총 세포수의 꾸준한 증가에 기인하는 것이었다 (도 3a). 백일해 독소가 존재하는 DLN으로 T-세포 유입량의 연구는 R-DOTAP와 구조적으로 관련된 지질이 림프절 귀소 케모카인, 가장 가능성있게는 I형 IFN 신호전달의 직접 결과를 유도한다고 시사한다. 이러한 총 세포수의 증가는 IFNαR 녹-아웃 마우스에서 상당히 감소되었으므로 I형 IFN 신호전달에 의존적이라는 것을 확인시켜주었다 (도 3b). I형 IFN은 이후에 림프구 배출에 요구되는 스핀고신 1 포스페이트 수용체를 억제하는, CD69의 상향조절을 통해서 림프계 기관으로부터 림프구 배출을 억제하는 것으로 알려져 있다. 그러므로 우리는 S-DOTAP 및 R-DOTAP 둘 모두의 주사가 DLN에서 CD69의 상향조절을 야기한다고 상정하였다. 실제로, 야생형 마우스에서 양쪽 양이온성 지질의 피하 주사는 T 세포에서 가장 강력하게 CD69의 상향조절을 야기시켰다. 대조적으로, CD69 상향조절이 IFNαR 녹-아웃 마우스의 R-DOTAP 주사 이후에 보이지 않아서, R-DOTAP 유도된 CD69의 상향 조절이 I형 IFN 의존적이라는 것을 입증한다 (도 3c). 데이터는 각 배액 림프절 중 CD69+ CD3+ T 세포 %를 나타낸다.

실시예 4

다양한 양이온성 지질은 I형 인터페론을 상향조절한다

I형 인터페론을 유도시키는 다양한 양이온성 지질의 잠재력을 평가하기 위한 시험관내 연구들이 수행되었다. 이 연구에서는 양이온성 지질 DOTAP, DOEPC 및 DOTMA가 연구되었다. 중성 지질 DOPC는 또한 양이온성 지질에 대한 인터페론 상향조절의 특이성을 확인하기 위해 평가되었다. 한 연구에서, IFNAR-Ko 마우스로부터의 골수 유래 수지상 세포 (BMDC)는 표시된 (6-400 μM) 농도의 양이온성 지질 또는 LPS 양성 대조군 (1-500 ng/mL)으로 24시간 동안 자극되었다 (도 4a). 2번째 연구에서, FLT3-유도된 BMDC (pDC) 및 GM-CSF/IL-4 유래 BMDC (cBMDC)는 표시된 농도 (6-400 μM) 농도의 R-DOTAP 또는 LPS 양성 대조군 (1-500 ng/mL)으로 24시간 동안 자극되었다 (도 4b). I형 인터페론 생산을 측정하기 위해서, 세포 상청액 (100 ㎕)을 리포터 세포 (B16.Blue-IFNα/β 세포, invivogen, USA) 배양물에 첨가하였고 18시간 동안 인큐베이션시켜서 리포터 세포에 의해 분비된 알칼리 포스파타제 (SEAP)의 I형 인터페론 유도된 생산을 자극시켰다. 리포터 세포 상청액 중 SEAP 활성은 제조 프로토콜에 따라서 비색 SEAP 어세이 키트를 사용해 정량하였다. BMDC 분비된 I형 인터페론은 리포터 세포주에서 재조합 마우스 IFN-β 자극된 SEAP 활성을 사용하여 발생된 표준 그래프를 사용해 정량하였다. 연구들은 I형 인터페론을 상향조절하는 능력이 DOTAP에 특이적이지 않지만 다수의 양이온성 지질에 의해 활성화될 수 있다는 것을 확인해 준다. 또한 I형 인터페론 경로를 활성화시키는 중성 지질의 불능성이 또한 확인된다.

실시예 5

감소된 양이온성 지질 매개 CD8+ T-세포 반응이 I형 IFN-결핍 마우스에서 관찰된다

양이온성 지질에 의한 I형 IFN-유전자의 입증된 상향조절은 양이온성 지질이 I형 IFN 경로를 표적화하여 강한 CD8+ T-세포 반응을 유도한다는 것을 시사한다. 이러한 가정을 더욱 확인하기 위해서, 닭 오발부민의 충분히 특징규명된 마우스 CD8+ T-세포 에피토프 (SIINFEKL (SEQ ID NO:1)) 또는 HPV16 -E7 단백질 유래 CD8 T 세포 에피토프 (RF9: RAHYNIVTF (SEQ ID NO:2))를 함유하는 R-DOTAP 제제를 야생형 C57BL/6J 마우스 및 I형 인터페론 신호 결핍 IFNAR^-/- 마우스에게 0일 및 7일에 투여하였다. 마우스는 또한 완전 프로인트 보강제 (CFA) + SIINFEKL로 백신접종되었다. 펩티드-유일 백신이 양성 대조군으로서 사용되었다. 14일에, R-DOTAP 또는 CFA에 의해 유도된 항원-특이적 (SIINFEKL) CD8+ T 세포 반응은 IFN-γ ELISPOT 어세이를 사용하여 평가하였다. 도 5a에 도시된 바와 같이, DOTAP 제제로 야생형 마우스의 백신접종은 CFA-보강된 제제에 비해서 더 높은 규모로 강한 항원-특이적 CD8+ T 세포 반응을 유도하였다. 대조적으로, R-DOTAP에 의해 유도된 CD8+ T 세포 반응은 IFNAR-/- 마우스에서 극적으로 감소되지만, CFA-보강된 제제에서는 이러한 편차가 나타나지 않는다. 우리는 HPV16 양성 종양에 의해 발현된 종양 연관 항원을 사용한 경우에서도 유사한 결과를 관찰하였다 (도 5b). CFA 보강제는 다수의 TLR 경로를 표적으로 하므로 항원-특이적 CD8+ T 세포 반응을 유도시키는 I형 IFN 신호전달에 대한 요건을 우회할 수 있다는 것이 충분히 보고되었다.

I형 IFN 유전자를 강력하게 활성화시키는 입증된 능력과 결합하여, I형 IFN 신호전달이 없는 마우스에서 양이온성 지질-유도된 효능의 손실은 R-DOTAP가 항원 교차 제시를 효과적으로 촉진하고 또한 강한 항원-특이적 CD8+ T-세포 면역 반응을 구동시키도록 I형 IFN 경로를 자극적으로 활성화시킨다는 것을 강력하게 입증한다 (도 5).

SEQUENCE LISTING <110> PDS BIOTECHNOLOGY CORPORATION BEDU-ADDO, Frank CONN, Greg WOODARD, Jerold GANDHAPUDI, Siva WARD, Martin <120> METHODS AND COMPOSITIONS COMPRISING CATIONIC LIPIDS FOR STIMULATING TYPE 1 INTERFERON GENES <130> PDS-17-1607WO <140> PCT/US2018/064060 <141> 2018-12-05 <150> US 62/594,815 <151> 2017-12-05 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe 1 5 <210> 3 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 Lys Ser Ser Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val 1 5 10 15 Thr Phe

Claims

대상체에서 I형 IFN 신호전달 경로를 변형시키기 위한 방법으로서, 포유동물에게 양이온성 지질을 투여하는 단계를 포함하는 것인 변형 방법.
제1항에 있어서, 양이온성 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTAP), N-1-(2,3-디올레오일옥시)-프로필-N,N,N-트리메틸 암모늄 클로라이드 (DOTMA), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (DOEPC), 및 이의 조합을 포함하는 것인 변형 방법.
제2항에 있어서, 양이온성 지질은 양이온성 지질의 거울상 이성질체를 포함하는 것인 변형 방법.
제3항에 있어서, 양이온성 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTAP)인 변형 방법.
제4항에 있어서, 거울상 이성질체는 (R)-1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판 (R-DOTAP) 또는 (S)-1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판 (S-DOTAP)인 변형 방법.
제1항에 있어서, I형 IFN 신호전달 경로는 상향조절/활성화되는 것인 변형 방법.
제1항에 있어서, I형 IFN 신호전달 경로는 하향조절/탈활성화되는 것인 변형 방법.
제6항에 있어서, 양이온성 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTAP), N-1-(2,3-디올레오일옥시)-프로필-N,N,N-트리메틸 암모늄 클로라이드 (DOTMA), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (DOEPC), 및 이의 조합을 포함하는 것인 변형 방법.
제6항에 있어서, 양이온성 지질은 양이온성 지질의 거울상 이성질체를 포함하는 것인 변형 방법.
제9항에 있어서, 거울상 이성질체는 (R)-1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판 (R-DOTAP) 또는 (S)-1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판 (S-DOTAP)인 변형 방법.
제1항에 있어서, 항원을 더 포함하는 것인 변형 방법.
제10항에 있어서, 항원을 더 포함하는 것인 변형 방법.
제10항에 있어서, T-세포 반응은 상승되는 것인 변형 방법.
제11항에 있어서, 항원-특이적 CD8+ T 세포 반응은 상승되는 것인 변형 방법.
대상체에서 면역원성 반응을 유도시키기 위한 방법으로서, 양이온성 지질을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 양이온성 지질의 투여는 I형 IFN 신호전달 경로의 자극을 야기하는 것인 유도 방법.
제15항에 있어서, 양이온성 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTAP), N-1-(2,3-디올레오일옥시)-프로필-N,N,N-트리메틸 암모늄 클로라이드 (DOTMA), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (DOEPC), 및 이의 조합을 포함하는 것인 유도 방법.
제16항에 있어서, 양이온성 지질은 (R)-1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판 (R-DOTAP)을 포함하는 것인 유도 방법.
제17항에 있어서, T-세포 반응은 상승되는 것인 유도 방법.
제18항에 있어서, 항원-특이적 CD8+ T 세포 반응은 상승되는 것인 유도 방법.
대상체에서 암을 치료하기 위한 방법으로서, 양이온성 지질을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 양이온성 지질의 투여는 I형 IFN 신호전달 경로의 자극을 야기하는 것인 치료 방법.
제20항에 있어서, 양이온성 지질은 1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판 (DOTAP), N-1-(2,3-디올레오일옥시)-프로필-N,N,N-트리메틸 암모늄 클로라이드 (DOTMA), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-에틸포스포콜린 (DOEPC), 및 이의 조합을 포함하는 것인 치료 방법.
제21항에 있어서, 양이온성 지질은 (R)-1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판 (R-DOTAP)을 포함하는 것인 치료 방법.
제20항에 있어서, 항원의 투여 단계를 더 포함하는 것인 치료 방법.
제23항에 있어서, 항원은 종양 항원인 치료 방법.
제24항에 있어서, 종양 항원은 HPV인 치료 방법.