KR20200098370A - 콜레르파 라세모사 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 항산화 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 콜레르파 라세모사 (C. racemosa) 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 항산화 또는 항염증용 조성물에 관한 것으로, C. racemosa의 에탄올 추출물, 이의 헥산 및 에틸 아세테이트 분획물 및 분리된 활성 성분인 스쿠알렌의 항산화성과 항염증 효과를 확인하였으며, 자외선에 대한 피부세포 보호효과를 확인하였다. 따라서 본 발명의 C. racemosa의 추출물, 이의 분획물은 또는 C. racemosa에서 분리된 스쿠알렌은 항산화, 항염증 또는 자외선에 대한 피부보호 용도로 의약품, 약용 화장품 제형의 기능성 성분 및 기능성 식품에 유용하게 응용 가능하다.

Description

콜레르파 라세모사 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 항산화 조성물{A composition comprising Caulerpa racemosa extracts or fraction having anti-oxidation or anti-inflammation activity}
본 발명은 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 항산화 또는 항염증용 조성물에 관한 것이다.
활성산소종(reactive oxygen species, ROS)으로는 산소(oxygen), 과산화(superoxide), 수산기 라디칼(hydroxyl radical), 과산화수소(hydrogen peroxide) 등이 있다. 활성산소종(Reactive Oxygen Species, ROS)에 의해 유발되는 산화적 스트레스(oxidative stress)는 세포 손상 및 염증을 일으켜 다양한 질병의 원인이 되며, 노화의 직ㆍ간접적 원인물질로 작용한다. 구체적으로 활성산소 종들은 반응성이 매우 커서 체내에서 DNA 변성, 과도한 신호전달 유발 및 단백질 변성 등을 초래하며, 각종 질병을 유발하는 것으로 알려져 있다.
염증은 해로운 주위 환경, 즉 세균과 같은 외부 이물질의 침입과 기계적 손상으로부터 생체를 보호하는 생리적인 반응이다. 염증 반응에는 다양한 생화학적 현상이 관여하지만, 특히 대식세포(Macrophage)는 화학적 자극 등에 의하여 산화질소(NO)와 여러 염증성 사이토카인을 생성하여 염증반응에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 산화질소는 산화질소의 합성효소(nitric oxide synthase, NOS)의 작용에 의하여 L-아르기닌(L-arginine)으로부터 합성되는데, NOS는 몇 가지 이소 형태가 존재한다. 뇌에 존재하는 bNOS(brain NOS), 신경계에 존재하는 nNOS(neuronal NOS), 혈관 내피계에 존재하는 eNOS(endothelial NOS) 등은 체내에서 항상 일정수준으로 발현되고 있으며, 이들에 의해 소량 생성되는 일산화질소(NO)는 혈압 조절 작용, 신경 전달 작용, 학습, 기억 등과 관련된 다양한 생리 반응을 수행함으로써 인체의 항상성 유지에 중요한 역할을 수행한다. 이에 반하여 어떤 자극에 의하여 그 발현이 유도되는 iNOS(induced NOS)는 NO를 과다 생성하며, iNOS에 의해 과다 생성된 산화질소는 수퍼옥사이드(superoxide)와 반응하여 퍼옥시니트라이트(peroxynitrite)를 형성하고 이는 강력한 산화제로 작용하여 세포에 손상을 입힘으로써 다양한 염증성 질환을 유발한다.
이에 본 발명에서는, 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa)를 이용하는 항산화, 항염증 또는 자외선에 대한 피부보호용 조성물을 개발하고자 한다.
대한민국 등록특허 제10-1910156호
본 발명의 목적은 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항염증용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증 또는 자외선에 대한 피부보호용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 하나의 양태로 본 발명은 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항염증용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 “콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa)”는 옥덩굴속(Caulerpa)의 녹조류로 동남아시아에서 널리 소비되는 식용 조류이다. 주로 얕은 온대와 열대 바다에 분포하며, 영미권에서는 근연종인 콜레르파 렌틸리페라(Caulerpa lentillifera)와 함께 바다포도라는 뜻의 '씨 그레이프(sea grapes)' 또는 철갑상어 알인 캐비어와 비슷하게 생겼다고 해 '그린 캐비어(green caviar)'라 불린다.
본 발명에서 용어, "추출물"은 천연물로부터 그 안의 성분을 뽑아낸 물질로 물, 유기 용매 또는 이들 혼합용매를 이용하여 추출과정으로 획득할 수 있으며, 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.
본 발명에서 추출물의 건조는 채취한 조류로부터 유용한 성분들이 파괴되지 않는 범위에서 공지의 방법으로 진행될 수 있고, 예를 들어 음지에서 자연건조의 방법 또는 동결건조로 진행될 수 있다. 또한, 파쇄 또는 분쇄는 이후 추출과정에서 해조류의 유용한 성분들이 충분하게 추출될 수 있을 정도로 파쇄 또는 분쇄하여 분말화할 수 있다. 상기 건조와 파쇄 또는 분쇄 공정은 필요에 따라서 순서를 뒤바꿔서 진행하거나 반복하여 실시할 수 있다.
본 발명의 추출에 있어서, 상기 추출하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다.
본 발명에서 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa) 추출물은 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa), 또는 건조된 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa)를 이용하여 추출할 수 있으며, 구체적은 건조된 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa)에 물, 유기용매, 또는 이들의 혼합용매를 이용하는 추출과정으로 획득할 수 있다. 더욱 구체적으로 건조된 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa)에 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 수득될 수 있다. 또한, 상기 저급 알코올은 에탄올일 수 있다
본 발명에서 사용되는 용어, "분획물"은 여러 다양한 구성 성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다.
본 발명에서 상기 분획물을 얻는 분획 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 분획 방법의 비제한적인 예로는, 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa) 추출물에 소정의 용매를 처리하여 상기 추출물로부터 분획물을 얻는 방법을 들 수 있다.
본 발명에서 상기 분획물을 얻는 데에 사용되는 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 분획 용매의 비제한적인 예로는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 헥산(Hexane), 에틸아세테이트(Ethyl acetate), 클로로포름(Chloroform), 또는 이들의 혼합용매를 들 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa)를 동결건조시켜 파우더를 제조하고, 70%(w/v) 에탄올로 4회 반복 추출하고 여과하여 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa)의 에탄올 추출물을 얻었으며, 이를 헥산(hexane, Hex), 클로로포름(Chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate, EtOAc), 물(water, H2O) 분획하여 총 4개의 용매 분획층인 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 및 잔여 물층의 분획물을 제조하였다.
본 발명에서, 상기 분획물은 헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물 또는 물 분획물이다.
또한, 상기 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa) 에탄올 추출물 및 용매별 분획물의 DPPH 소거능, alkyl 소거능, hydroxyl 소거능을 분석하여 항산화 효과를 분석한 결과, 에틸아세테이트 분획물 및 헥산 분획물이 DPPH 소거능, alkyl 소거능, hydroxyl 소거능이 우수하여 항산화 효과가 우수함을 확인하였다.
또한 콜레르파 라세모사의 에탄올 추출물(CRE)와 이의 분획물(에틸아세테이트 분획물(CREE) 및 헥산 분획물(CREH))이 LPS 유도 RAW 세포에서 일부 주요 염증 마커(NO)를 감소시킴을 확인하였다. 또한, RAW 대식세포의 생존율 역시, CRE, CREE 또는 CREH의 농도가 증가함에 따라 증가하여 CRE, CREE 또는 CREH가 염증 유도 세포 손상에 대한 보호 효과를 가짐을 확인하였다.
또한, HaCaT 각질형성 세포에서 자외선에 유도되는 ROS 생성이 CRE 처리로 인해 감소되었고, CRE에 의해 자외선으로 인한 세포 생존율 감소가 억제되는 것을 확인하였다. 또한, CRE의 분획물인 CREE와 CREH가 ROS로 인한 세포 손상에 대한 보호 효과를 가지면서 자외선에 의해 유도된 ROS 생성을 억제하는 효과가 더 우수함을 확인하였다.
또한,콜레르파 라세모사의 에탄올 추출물의 헥산 분획물(CREH)을 bioassay-guided 정제하여 NO 생성 억제 활성이 우수한 분획물에서 스쿠알렌을 분리하였으며, 스쿠알렌이 알킬 및 히드록시 라디칼 소거활성이 우수함을 확인하였으며, Vero 세포에서 H2O2 및 AAPH 에 의해 유도되는 세포 내 ROS 생성을 억제함을 확인하였다. 또한 HaCaT 세포 생존율이 의미하는 상당히 우수한 UV 보호 효과를 나타냈다.
스쿠알렌이 RAW 264.7 대식세포에서 LPS로 유도된 NO 생성을 농도 의존적으로 저해하였고, 염증 유도 세포 손상으로 인한 세포 생존율을 증가시켰다. 또한, 스쿠알렌이 LPS 유도 RAW 세포에서 iNOS 및 COX-2의 증가된 수준을 용량 의존적으로 감소시킴을 확인하였으며, 전염증성 매개체인 TNF-α, IL1-β, IL-6의 발현을 농도 의존적으로 감소시켰다.
따라서 본 발명의 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa) 추출물 또는 이의 분획물은 항산화, 항염증 또는 자외선에 대한 보호 효과를 가지는 것을 특징으로 한다.
따라서 본 발명의 조성물은 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa) 추출물 상기 또는 이의 분획물을 포함한다. 상기 분획물은 구체적으로 에틸아세테이트 분획물 또는 헥산 분획물일 수 있다.
또한, 상기 추출물, 이의 헥산 분획물 또는 에틸아세테이트 분획물은 스쿠알렌을 포함할 수 있다.
본 발명의 스쿠알렌은 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa) 에탄올 추출물의 헥산 분획물을 실리카 컬럼에서 헥산, 에틸아세테이트 또는 이들 혼합물을 이용하여 용출시킨 용출물에서 분리된 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에서 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa) 분말 (250.0g)을 70% 에탄올을 사용하여 4회 추출하고 진공하여 여액을 추출물을 수득하였으며, 추출물(CRE)을 탈이온수에 현탁하여 헥산(CREH), 클로로포름(CREC), 에틸 아세테이트 (CREE) 및 물(CREW) 분획물을 제조하였다. 이 중 생리활성(항산화, 항염증 활성)과 수율을 헥산 분획물(CREH)을 헥산, 에틸아세테이트 또는 이들 혼합용매를 이용하여 분리하였다. 첫 번째 개방 컬럼의 용출물 중에서, RAW 대식세포에서 NO 생성 저해 효과를 평가하여 효과가 우수한 용출물(80% 헥산 및 20% 에틸 아세테이트 용출물)을 선택하여 추가 정제를 수행하였다. 상기 용출물(80% 헥산 및 20% 에틸 아세테이트 용출물)을 두 번째 개방 컬럼에서 분리를 수행하고 NO 생성 저해 효과가 우수한 100% 헥산 분획물을 PTLC에서 추가 정제를 수행하였다. PTLC 정제로부터 스쿠알렌을 분리하였다.
따라서 상기 스쿠알렌은 구체적으로 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa) 70% 에탄올 추출물의 헥산 분획물을 실리카 컬럼에서 80% 헥산, 20% 에틸아세테이트 이용하여 용출시킨 용출물에서 분리된 것일 수 있으며, 더욱 구체적으로 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa) 70% 에탄올 추출물의 헥산 분획물을 실리카 컬럼에서 80% 헥산, 20% 에틸아세테이트 이용하여 용출시킨 용출물을 실리카 컬럼에서 다시 100% 헥산으로 용출시킨 용출물에서 분리된 것일 수 있다.
본 발명의 용어 "항산화"는 산화를 억제하는 작용을 의미하는 것으로, 인체는 산화촉진물질(prooxidant)과 산화 억제물질(antioxidant)이 균형을 이루고 있으나 여러 가지 요인들에 의하여 이런 균형상태가 불균형을 이루게 되고 산화촉진 쪽으로 기울게 되면, 산화적 스트레스(oxidative stress)가 유발되어 잠재적인 세포손상 및 병리적 질환을 일으키게 된다. 이러한 산화적 스트레스의 직접적 원인이 되는 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)은 불안정하고 반응성이 높아 여러 생체물질과 쉽게 반응하고, 체내 고분자들을 공격하여 세포와 조직에 비가역적인 손상을 일으키거나 돌연변이, 세포독성 및 발암 등을 초래하게 된다. NO, HNO2, ONOO-와 같은 활성 질소종(reactive nitrogen species, RNS)은 염증 반응 시 대식세포 호중구 및 다른 면역 세포 들의 면역반응으로 인해 다량 생성되며, 이때 ROS도 같이 생성된다. 상기와 같은 활성산소는 체내에서 세포를 산화시켜 파괴시키며, 그에 따라 각종 질환에 노출되게 된다.
따라서, 본 발명의 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa) 추출물 또는 이의 분획물을 식품에 포함시키면 항산화 효과를 달성함으로써, 건강증진에 기여할 수 있다
본 발명에 있어서, “항염증”이란 염증을 억제하는 것을 말하며, 상기 염증은 어떤 자극에 대한 생체조직의 방어반응의 하나로, 조직 변질, 순환 장애와 삼출, 조직 증식의 세가지를 병발하는 복잡한 병변을 말한다. 보다 구체적으로 염증은 선천성 면역의 일부이며 다른 동물에서처럼 인간의 선천성 면역은 병원체에 특이적으로 존재하는 세포 표면의 패턴을 인식한다. 식세포는 그런 표면을 가진 세포를 비자기로 인식하고 병원체를 공격한다. 만일 병원균이 신체의 물리적 장벽을 깨고 들어온다면 염증반응이 일어난다. 염증반응은 상처부위에 침입한 미생물들에 대한 적대 환경을 만드는 비특이적인 방어작용이다. 염증반응에서, 상처가 나거나 외부 감염체가 체내로 들어왔을 때, 초기단계 면역반응을 맡고 있는 백혈구들이 몰려들어 사이토카인을 발현한다. 따라서 세포 내 사이토카인의 발현양이 염증반응 활성화의 지표가 된다.
본 발명의 항산화, 항염증 조성물은 유효성분인 발명의 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa) 추출물 또는 이의 분획물 이외에, 항산화, 또는 항염증 효과를 상승 또는 보강시킬 수 있도록 항산화, 항염증 효과가 있다고 알려진 화합물이나 천연 추출물을 포함할 수 있다.
또한 본 발명에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태를 포함할 수 있으며, 본 발명의 발명의 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa) 추출물 또는 이의 분획물을 첨가할 수 있는 식품의 종류에는 별다른 제한이 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있다.
상기 식품 조성물에는 발명의 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa) 추출물 또는 이의 분획물 이외에도 다른 성분을 추가할 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 통상의 식품과 같이 여러 가지 생약 추출물, 식품학적으로 허용되는 식품보조첨가제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
상기 천연 탄수화물의 예는 포도당, 과당 등의 단당류; 말토스, 수크로스 등의 이당류; 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이 있으며, 상기한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴 등), 스테비아 추출물(레바우디오시드 Ａ, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 기능성이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어날 수 있다.
유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품의 제조 시에 본 발명의 유효성분은 원료 조성물 중 1 내지 50 중량%, 바람직하게는 5 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품은 이너뷰티 푸드(inner beauty) 형태로 섭취함으로써 더욱 우수한 항산화와 항염증 효과를 갖는 장점을 가진다. 상기 이너뷰티(inner beauty)는‘먹는 화장품 또는 뷰티푸드’로 일컬어지는 이너뷰티 푸드로, 피부에 좋은 여러 가지 성분을 몸속으로 흡수시켜 피부 체질을 건강하게 바꾸는 식품을 지칭하며, 피부 타입에 맞는 화장품을 고르듯 피부 컨디션과 라이프스타일을 고려해 개개인에게 맞는 이너뷰티 푸드를 선택하여 섭취할 수 있다. 보다 구체적으로는 상기 화장료 조성물을 포함하는 화장품과 상기 발명의 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa) 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 이너뷰티 푸드를 혼용할 경우, 화장품만 사용하는 것에 비해 항산화 및 항염증 효과가 월등히 높아져 더욱 효과적이다.
다른 하나의 양태로 본 발명은 발명의 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증, 자외선에 대한 피부 보호용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 발명의 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa) 추출물 또는 이의 분획물, 항산화, 항염증에 관한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명에서 용어 “자외선에 대한 보호”는 자외선 노출로 인해 피부 세포에서 유도되는 ROS 생성을 억제하거나 또는 세포의 손상을 저해시키는 것을 의미한다.
본 발명의 화장료 조성물은 유효성분인 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa) 추출물 또는 이의 분획물 이외에, 항산화 또는 항염증 효과를 상승 또는 보강시킬 수 있도록 항산화, 항염증 또는 자외선에 대한 피부 보호 효과가 있다고 알려진 화합물이나 천연 추출물을 포함할 수 있다.
본 발명의 항산화, 항염증, 또는 자외선에 대한 피부 보호용 화장료 조성물에 있어서, 그 유효성분은 항산화, 항염증, 또는 자외선에 대한 피부 보호 활성을 나타낼 수 있는 한 용도, 제형, 배합 목적 등에 따라 임의의 양(유효량)으로 포함할 수 있는데, 통상적인 유효량은 조성물 전체 중량을 기준으로 할 때 0.001 중량 % 내지 99.99 중량 % 범위 내에서 포함될 수 있다. 여기서 "유효량"이란 항산화 효과를 유도할 수 있는 유효성분의 양을 말한다. 이러한 유효량은 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 실험적으로 결정될 수 있다.
본 발명의 항산화, 항염증, 또는 자외선에 대한 피부 보호용 화장료 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 구체적으로, 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이크업 베이스, 파운데이션, 프레스파우더 및 루스파우더로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형을 가질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 항산화, 항염증, 또는 자외선에 대한 피부 보호용 화장료 조성물은 그 유효성분 이외에 화장료 제제에 있어서 수용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서 "화장료 제제에 있어서 수용 가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다. 상기 담체는 본 발명의 항산화, 항염증, 또는 자외선에 대한 피부 보호용 화장료 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 5 중량% 내지 약 99 중량 %로 포함될 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발명의 화장료의 제조되는 제형에 따라 또한 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴이나 손)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
한편, 상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 담체로서 사용될 수 있는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선 차단제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 발명의 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa) 추출물 또는 이의 분획물, 항산화, 항염증에 관한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 약학적 조성물은 임상 투여 시에 경구적, 비경구적으로 투여될 수 있지만, 통상적으로 외용제 제형으로 피부에 국소적으로 직접 투여될 수 있다.
또 본 발명의 약학적 조성물은 제제화할 경우에는 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제제화할 수 있다.
경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 본 발명의 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등을 들 수 있는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 국소형 제형 예컨대 크림, 로션, 연고(반고형의 외용약), 마이크로 에멀젼, 젤, 페이스트, 경피제제(TTS) 등이 포함된다.
본 발명의 약학적 조성물은 1일 투여량은 통상 0.001 ~ 150 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 실제 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 및 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해해서는 안된다.
본 발명은 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa, C. racemosa) 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 항산화 또는 항염증용 조성물에 관한 것으로, C. racemosa의 에탄올 추출물, 이의 헥산 및 에틸 아세테이트 분획물 및 분리된 활성 성분인 스쿠알렌의 항산화성과 항염증 효과를 확인하였으며, 자외선에 대한 피부세포 보호효과를 확인하였다. 따라서 본 발명의 C. racemosa의 추출물, 이의 분획물은 또는 C. racemosa에서 분리된 스쿠알렌은 항산화, 항염증 또는 자외선에 대한 피부보호 용도로 의약품, 약용 화장품 제형의 기능성 성분 및 기능성 식품에 유용하게 응용 가능하다.
도 1은 세포 내 ROS 소거 효과 및 세포 보호 효과를 분석한 결과이다. (a) AAPH 처리된 Vero 세포 및 (b) H2O2 처리된 Vero 세포에서 Caulerpa racemosa의 에탄올 추출물(CRE)의 세포 내 ROS 수준 감소에 미치는 효과를 분석한 결과이다. (c) AAPH 처리된 Vero 세포 및 (d) H2O2 처리된 Vero 세포에서 Caulerpa racemosa의 에탄올 추출물(CRE)의 용매 분획물(헥산:CREH, 클로로포름: CREC 및 에틸 아세테이트: CREE, 물: CREW)이 세포 내 ROS 수준의 감소에 미치는 효과를 분석한 결과이다. 실험은 3회 실시하였고 결과는 평균 ± SD로 나타내었다. 값은 * p < 0.05 및 ** p <0.001에서 양성 대조군(H2O2 또는 AAPH 처리군 - "#"로 표시)과 유의한 차이가 있다.
도 2는 CRE가 LPS에 의해 유도되는 NO 생성 및 RAW 대식세포의 생존율에 미치는 영향을 분석한 결과이다. (a) CRE 추출물 및 (b) CRE 용매 분획물이 NO 생성 억제 효과 및 LPS 유도 세포 독성에 대한 보호 효과를 가짐을 확인하였다. RAW 대식세포를 24-웰 배양 플레이트에 접종하고, 25, 50 또는 100㎍/㎖ 농도의 시료로 처리하고, LPS로 자극하였다. 24시간 후, MTT 분석법으로 세포 생존율을 측정하고, NO 생성량을 그리스 분석 (Griess assay)으로 평가하였다. 실험은 3회 실시하였고, 결과는 평균 ± SD로 나타내었다. 값은 * p < 0.05와 ** p < 0.001에서 양성 대조군(LPS 처리군 - "#"로 표시)과 유의한 차이가 있다.
도 3은 UV에 대한 피부세포 보호 효과를 분석한 결과이다. 자외선 유도 HaCaT 각질 형성 세포에서 (a) CRE 및 (b) CRE 용매 분획물이 세포 내 ROS 생성 및 세포 생존율에 미치는 영향을 분석하였다. 세포 생존율은 MTT 분석법으로 24시간 후에 측정하였다. 실험은 3회 실시하였고 결과는 평균 ± SD로 나타내었다. 값은 * p < 0.05와 ** p < 0.001에서 양성 대조군(자외선 노출군 - "#"로 표시)과 유의한 차이가 있다.
도 4는 CREH의 크로마토그래피 정제를 나타낸다. bioassay-guided speparation 기법을 이용하여 정제를 수행하였다 CREH를 극성이 증가하는 용매 시스템을 이용하여 실리카 개방 컬럼으로 2회 정제하였다. 마지막으로, 실리카 PTLC에 의해 선택된 분획 (두 번째 개방 컬럼의 100% 헥산 용출액)으로부터 화합물을 분리하였다.
도 5는 분리된 화합물인 C2의 특성 분석한 결과이다. C2의 (a) HMBC 스펙트럼, (b) 가스 크로마토그램, (c) 질량 스펙트럼 분석결과이다.
도 6은 C. racemosa로부터 분리한 스쿠알렌(C2)의 항산화 효과, 항염증 효과 및 자외선 차단 효과를 분석한 결과이다. (a) Vero 세포에서 AAPH 유도 및 H2O2 유도 산화 스트레스에 미치는 효과를 분석한 결과이다. (b) RAW 대식세포에서 LPS 유도 NO 생성 및 세포 생존율에 미치는 효과를 분석한 것이다. (c) UV 노출에 시킨 세포에서 세포 내 ROS 생성 및 세포생존율에 미치는 효과를 분석한 결과이다. 모든 실험은 3회 수행하였고, 결과는 평균 ± SD로 나타내었다. 값은 * p < 0.05 및 ** p < 0.001에서 각 양성 대조군(“#”으로 표시)과 유의하게 상이하다.
도 7은 C. racemosa에서 분리된 스쿠알렌이 RAW 대식세포에서 LPS 유도 염증 조절 인자 및 전염증성 사이토카인 생성에 미치는 효과를 분석한 결과이다. 스쿠알렌이 (a) iNOS 및 COX-2 생성, (b) PGE2 수준 및 (c) 전염증성 사이토카인 발현에 미치는 영향을 분석하였다. RAW 대식세포를 24-웰 배양 플레이트에 접종하고 12.5, 25, 50㎍/㎖ 농도의 시료로 처리하고 LPS로 자극하였다. 24시간 후, 세포를 웨스턴 블롯 분석을 위해 회수하고, 배양 배지를 ELISA를 위해 수집하였다. 실험은 3회 실시하였고 결과는 평균 ± SD로 나타내었다. 값은 * p < 0.05 및 ** p < 0.001에서 양성 대조군 (LPS 처리군 단독)과 유의한 차이가 있다.
도 8은 C. racemosa에서 분리된 스쿠알렌의 Proton single pulse, 1H NMR 분석결과이다.
도 9는 C. racemosa에서 분리된 스쿠알렌의 13C NMR 분석결과이다.
도 10은 C. racemosa에서 분리된 스쿠알렌의 DEPT 분석결과이다.
도 11은 C. racemosa에서 분리된 스쿠알렌의 COSY, NMR 분석결과이다.
도 12는 C. racemosa에서 분리된 스쿠알렌의 Phase sensitive NOESY, NMR 분석결과이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<재료 및 방법>
<실시예1> 세포 및 시약의 준비
RAW 264.7 대식세포, Vero 세포 및 HaCaT 각질형성세포는 한국 세포주 은행 (KCLB, Seoul, Korea)에서 구입하였다. DMEM, RPMI, 소태아혈청 (FBS) 및 페니실린/스트렙토마이신은 GIBCO INC. (USA)로부터 구입하였다. 중수소화(Deuterated) 클로로포름, 아크리딘 오렌지, 2',7'-2'7'-디클로로디하이드로플루오세인 디아세테이트 (DCFH-DA) 및 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 (MTT)는 시그마, 알드리치사 (미국)에서 구입하였다. 유도성 산화 질소 합성 효소 (iNOS), 시클로옥시게나제 (COX-2) 및 β-액틴 항체는 Santa Cruz Biotechnology (USA)에서 구입하였다
마우스 인터루킨 (IL)-1 베타, 마우스 IL-6, 종양 괴사 인자 (TNF-α) 및 PGE2 측정을 위한 ELISA 키트는 eBioscience, Inc. (미국), BD Biosciences (미국) 및 R & D Systems, Inc에서 구입하였다. 추출 및 정제에 사용된 모든 유기 용매는 분석등급을 사용하였다.
<실시예2> 시료 수집, 추출 및 추가 정제
콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa, C. racemosa) 시료는 2015년 8월에 스리랑카의 남서 해안 지역(6° 07’51.9"N, 80° 05’58.7"E)에서 수집하였다. 시료를 수돗물로 세척하여 소금과 잔해를 제거하고 동결 건조 후 분말로 분쇄하였다. 해조류 분말 (250.0g)을 70% 에탄올을 사용하여 4회 추출하고 진공 여과하였다. 여액을 회전 증발기로 농축하여 추출물을 수득하였다. 추출물(CRE)을 탈이온수에 현탁하여 헥산(CREH), 클로로포름(CREC) 및 에틸 아세테이트 (CREE)에서 분획하였다. 용매를 진공에서 증발시켰다. 선택된 CREH 분획을 2회 연속 실리카 개방 컬럼 크로마토그래피 분리를 통해 추가로 정제하고, 분취용 박막 크로마토그래피를 사용하여 활성 화합물을 분리하였다.
<실시예3> 구조적 특성 평가
실시예2에서 분리된 활성 화합물을 중수소화 클로로포름에 용해하고, 33K에서 40TH5AT/FG 프로브가 장착된 JEOL JNM-ECX400, 400 MHz 분광기 (일본)로 분석하였다. 구조분석을 위해 1H, 13C, DEPT, COSY, HMBC 및 HMQC 스펙트럼을 측정하였다. 분리된 화합물의 분자량을 Rtx-5MS 용융 실리카 모세관 컬럼 (30.0 m × 0.25 mm i.d. 0.25 ㎛)이 장착된 Shimadzu GCMS-TQ8040 시스템 (일본)을 사용하여 GC-MS/MS로 분석하였다. 철 공급원 온도 200°C, 주사 범위 50-500 m/z, GC 오븐 프로그램; 260℃, 3분, 6℃/분 ~ 320℃, 5℃/분 ~ 330℃, 2분. 헬륨은 일정한 유속(0.73 ml/분)으로 운반 기체로서 사용하였다. 시료 주입은 스플릿리스(splitless) 모드로 수행하였다.
<실시예4> 라디칼 소거 항산화성의 평가
항산화능을 평가하고자 시료의 DPPH, 알킬 및 히드록시 자유 라디칼 소거 활성을 각각 측정하였다. 분석은 변조 주파수 100 kHz, 중심 필드 3475G, 변조 진폭 2G, 게인(gain) 6.3 x 105, 온도 298K의 장비 구성을 갖는 ESR 분광기 (JESFA200, Jeol, Tokyo, Japan)를 사용하였다. 마이크로파 전력은 DPPH, 히드록시 및 알킬 라디칼 소거 분석에서 각각 5 mW, 1 mW 및 10 mW로 실험에 따라 변경하였다.
<실시예5> 세포주의 유지 (maintenance)
RAW 264.7 대식세포와 HaCaT 각질형성세포는 DMEM 배지를 이용하여 배양하였다. "Vero" (아프리카 녹색 원숭이의 신장 상피 세포) 세포는 10% FBS와 1% 항생제 (페니실린과 스트렙토마이신)를 보충한 RPMI 배지를 이용하여 배양하였다. 세포를 주기적으로 계대 배양하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 대수증식기의 세포를 실험을 위해 접종하였다. 시료의 세포 독성은 MTT로 분석하여 세포 생존률을 평가하였다.
<실시예6> 세포 내 ROS 소거 효과 및 자외선 보호 효과 분석
Vero 세포에서 DCFH-DA 분석을 이용하여 세포 내 ROS 소거능을 분석하였다. 분석을 위해 Vero 세포를 세포에 25, 50 또는 100㎍/㎖ 농도의 시료로 처리하고, H2O2 1 mM 또는 2,2'-아조비스(2-아미디노프로판)디하이드로클로라이드 (AAPH) 10 mM을 동시에 처리하였다. 30분 후, DCFH-DA 분석법을 이용하여 세포 내 ROS 수준을 측정하였다.
HaCaT 각질형성세포를 사용하여 시료의 UV 보호 효과를 분석하였다. 블랭크(blank) 웰을 알루미늄 호일로 덮은 채로 플레이트를 UV(30 mJ cm-2)에 노출시켰다. PBS를 제거하고 세포를 무혈청 DMEM 배지로 배양하였다. 24시간 후, 세포 생존율을 MTT로 분석하여 측정하였다. UV에 의해 유도된 세포 내 ROS 에 대한 시료의 항산화 효과를 분석하고자, 미리 접종된 HaCaT 각질 형성 세포를 3시간 동안 시료와 함께 배양하고 UV (30 mJ cm-2)에 노출시켰다. ROS 수준은 DCF-DA 분석법을 이용하여 형광 강도를 측정하였다.
<실시예7> 항염증 효과 분석
항염증 효과를 분석하고자, 리포폴리사카라이드(LPS)로 자극된 RAW 264.7 대식세포에서 NO 생성의 저해효과를 분석하였다. RAW 세포를 24-웰 배양 플레이트에 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 시료를 3.25, 6.5, 12.5 또는 25㎍/㎖의 농도로 플레이트에 처리하고 LPS로 자극하였다. 24시간 후, 그리스 (Griess) 분석을 이용하여 배양 배지의 NO 수준을 측정하고, MTT로 분석하여 세포 생존율을 측정하였다.
<실시예8> 웨스턴 블롯 및 ELISA 분석
LPS 자극 RAW 264.7 대식세포에서의 시료의 iNOS 및 COX-2 발현의 저해 효과를 평가하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행되었다. RAW 세포를 6-웰 배양 플레이트에 24 시간 동안 배양하고, 시료를 처리하고, 1시간 후 LPS로 자극하였다. 24시간 후, 세포를 수득하고, 용해 완충액으로 세척 후, 16,000 rpm으로 원심 분리하여 세포 잔해를 제거하였다. 30㎍ 의 단백질을 SDS-PAGE의 웰에 로딩한 후, 전기영동하여 단백질을 분리하였다. 단백질 밴드를 니트로셀룰로오스 멤브레인에 블롯팅(blotting)하고 비특이적 결합 부위를 탈지유 (skim milk)를 사용하여 차단시켰다. 막은 1차 항체로 4℃에서 8시간 반응시킨 후, 2차 항체로 실온에서 2시간 반응시켰다. 신호는 화학 발광 기질 (Cyanagen Srl, Bologna, Italy)을 첨가하여 유도하였다. 형광 이미지는 FUSION SOLO Vilber Lourmat 시스템 (Paris, France)을 사용하여 촬영하였다. 이미지 J 프로그램을 사용하여 밴드 강도를 정량하였다.
PGE2 및 전염증성 사이토카인 생성의 평가는 효소면역 분석 키트를 사용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다. LPS 자극 RAW 세포 배양액으로부터의 배양 배지에 시료를 처리하고 24시간 후 수집하였다.
<실시예9> 통계 분석
데이터 값은 최소 3회의 독립적인 실험을 기준으로 평균 ± 표준 편차 (SD)로 표시하였다. 결과를 비교하기 위한 통계 분석은 던칸의 다중검정 (Duncan’s multiple range test, DMRT)에 의해 일원 분산 분석 (one-way ANOVA)을 이용한 IBM SPSS Statistics 20 소프트웨어를 이용하여 수행하였다. P값이 * 0.05 (p < 0.05) 및 ** 0.001 (p < 0.001)인 경우 유의한 것으로 판단하였다.
<결과 및 검토>
<실험예1> 항산화 활성 분석
CRE 및 이의 분획물의 항산화 활성을 분석하고자, DPPH, 알킬(Alkyl), 히드록시(Hydroxy) 라디칼 소거능을 분석하였다. 표 1은 CRE 및 이의 용매 분획물의 라디칼 소거 활성을 분석한 결과이다. 헥산 (CREH), 클로로포름 (CREC), 에틸 아세테이트 (CREE) 및 물 (CREW) 분획물에 대한 용매 분획물의 수율은 각각 53.0, 19.75, 4.12 및 16.33%였다. 라디칼 소거 활성은 시료 색상에 의한 간섭에도 불구하고 정확한 데이터를 얻을 수 있는 ESR 분광법을 사용하여 측정하였다. CREE는 라디칼 소거 활성에 대한 용매 분획 중에서 우수한 라디칼 소거능을 나타냈다. 그러나, CREE 수율은 추가 정제에 충분하지 못했다. 따라서, 히드록시 및 알킬 라디칼 소거 항산화성을 고려하여 CREH를 추가 정제를 위해 선택하였다.
시료명 DPPH 알킬(Alkyl) 히드록시(Hydroxy)
CRE 0.915 ± 0.057 0.319 ± 0.014 0.182 ± 0.02
CREH 1.673 ± 0.55 0.22 ± 0.02 0.25 ± 0.03
CREC 1.378 ± 0.43 0.33 ± 0.04 0.82 ± 0.02
CREE 0.76 ± 0.66 0.09 ± 0.01 0.07 ± 0.04
CREW 1.57 ± 0.61 0.52 ± 0.05 0.84 ± 0.04
상기 결과는 3개의 결정 인자의 평균 ± S.D를 나타낸다.
<실험예2> AAPH 및 H 2 O 2 유도 산화 스트레스에 대한 세포 내 ROS 소거 효과
세포내 ROS 소거 효과를 확인하고자, Vero세포를 이용하였다. "Vero"는 많은 생체 스크리닝 실험에서 주로 이용되는 세포주로, 아프리카 녹색 원숭이의 신장 상피 세포주에서 유래되었다.
도 1에서 대조군과 비교하여 H2O2 (1 mM)의 처리한 세포에서 ROS 수준이 증가함을 확인하였다. 그러나, AAPH (10 mM)가 ROS의 급격한 증가(surge)에 미치는 영향은 H2O2보다 강했다. Vero 세포에서 H2O2 또는 AAPH로 유도된 세포 내 ROS생성은 CRE의 처리 농도가 증가함에 따라 두드러지게 감소하였다. 즉, CRE가 세포 내 ROS생성을 감소시켜, 항산화 효과를 가짐을 확인하였다.
다음으로 CRE의 분획물에서 항산화 효과를 분석하였다. 분석결과, CRE의 분획물들이 농도 의존적으로 H2O2 또는 AAPH로 유도된 세포 내 ROS생성을 억제하는 것을 확인하였으며, 이 중 헥산(CREH) 및 에틸 아세테이트(CREE) 분획물이 클로로포름(CREC) 분획물 및 물(CREW) 분획물에 비해 Vero 세포에서 AAPH에 의해 유도된 세포 내 ROS 소거효과가 우수함을 확인하였다.
상기 실험결과를 통해 CRE와 이의 분획물인 CREE와 CREH에는 Vero 세포에서 ROS 유도 산화 스트레스를 억제할 수 있는 항산화 물질이 포함되어 있음을 확인하였다.
<실험예3> 항염증 효과 분석
도 2a를 참고하면, LPS 자극 RAW 264.7 대식세포에서 CRE 처리 농도에 의존적으로 NO 생성을 감소시키며, 또한 LPS (단독) 처리군과 비교하여 세포 생존율을 증가하였다. 이는 LPS로 인한 세포 손상에 대해 CRE가 보호효과를 가짐을 보여준다.
도 2b는 RAW 세포에서 CRE의 용매 분획물의 LPS 유도 NO 생성 저해효과를 분석한 결과이다. 분석결과, CRE의 용매 분획물들이 농도 의존적으로 NO의 생성을 감소시킴을 확인하였으며, 그 중 CREE 및 CREH 분획물이 CREC 및 CREW 분획물과 비교하여 NO 생성 억제 효과가 우수함을 확인하였다. CREH와 CREE에서 세포 생존율의 증가는 염증 반응의 감소로 인한 것으로 판단된다.
NO, iNOS, COX-2, PGE2 등 염증 매개체와 TNF-α, IL-1β, IL-6 등 전염증성 사이토카인의 수준을 저해하거나 감소시킬 수 있는 화합물은 약물 발견에서 리드(leed) 물질로 생물학적 연구의 핵심이다. NO는 염증 및 면역 조절을 비롯한 여러 생리 과정을 매개하는데 중추적인 역할을 한다. 그러나, iNOS 유도에 의한 NO 생성 증가는 세포 독성 및 조직 손상을 초래할 수 있으며 결국 류마티스성 관절염 및 염증성 장 질환을 비롯한 염증성 질환 상태를 초래할 수 있다. NO 생성의 저해는 염증의 병인을 저해하는 효과적인 방법이다. 본 실험 결과에서 CRE와 이의 분획물(CREE 및 CREH)이 LPS 유도 RAW 세포에서 일부 주요 염증 마커(NO)를 감소시킴을 확인하였다. 또한, RAW 대식세포의 생존율 역시 CRE, CREE 또는 CREH의 농도가 증가함에 따라 증가하였다. 즉, CRE, CREE 또는 CREH가 염증 유도 세포 손상에 대한 보호 효과를 가짐을 확인하였다.
<실험예4> 피부세포에서 UV 조사 유도 산화 스트레스에 대한 ROS 소거 및 보호 효과
시료 처리 후, HaCaT 각질형성세포를 자외선 (30 mJ cm-2)에 노출시켰다. 세포 내 ROS 수준은 DCFDA 분석법으로 측정하였고, 자외선 조사로 인한 세포 손상에 대한 시료의 보호 효과는 MTT 세포 생존율 분석법으로 측정 하였다. 분석결과, UV 노출시 ROS 생성이 현저하게 증가하였으며, 세포 생존율이 감소하였다(도 3). 그러나, CRE 처리로 인해 ROS 생성이 감소되었고 세포 생존율이 증가하여 자외선 유도 세포 손상에 대한 보호 효과를 가짐을 확인하였다. 또한, CRE의 분획물인 CREE와 CREH가 ROS로 인한 세포 손상에 대한 보호 효과를 가지면서 자외선에 의해 유도된 ROS 생성을 억제하는 효과가 더 우수하였다.
따라서 CREE 또는 CREH는 자외선에 노출된 세포에서 ROS 수준을 현저히 감소시켜, 자외선에 대해 세포 보호 효과를 가짐을 확인하였다.
<실험예5> CREH 분획물에서 표적 화합물의 정제, 분리 및 특성 규명
bioassay-guided 정제에 따라 표적물질을 분리하였다. 헥산 분획물(CREH)은 2회 연속 실리카 개방 컬럼 정제 후 분취용 박막 크로마토그래피 (PTLC)를 사용하여 추가로 분석하였다. 정제 과정은 도 4에 요약되어 있다. 첫 번째 개방 컬럼의 용출물 중에서, RAW 대식세포에서 NO 생성 저해 효과를 평가하여 효과가 우수한 용출물(80% 헥산 및 20% 에틸 아세테이트 용출물)을 선택하여 추가 정제를 수행하였다. 상기 용출물((80% 헥산 및 20% 에틸 아세테이트 용출물)을 두 번째 개방 컬럼에서 분리를 수행하고, NO 생성 저해 효과가 우수한 100% 헥산 분획물을 PTLC에서 추가 정제를 수행하였다. PTLC 정제로부터 두 개의 분획물인 C1 (17.1 mg) 및 C2 (18.2)를 얻었다. C1 및 C2는 GC-MS/MS 및 NMR 분석에 의해 특성을 규명하였다. 화합물은 상이한 NMR 실험에 기초하여 스쿠알렌으로 확인되었다. 도 5a는 C2의 HMBC 스펙트럼을 나타낸다. 1H, 13C, DEPT, COZY 및 NOESY NMR 스펙트럼은 도 8 내지 12와 같다. C2의 1H NMR 데이터는 도 8과 같다. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 5.14-5.04 (6H, m), 2.09-1.91 (20H, m), 1.67-1.64 (24H, m) ). 13C NMR (400MHz, CDCl3) δ135.5-124.00 (6C), 40.0-25.5 (10C), 18.00-16.00 (8C). 5.14-5.04 ppm 내 1H NMR 피크는 6개의 비닐 메틸기, 2.09-1.91 ppm의 10개의 메틸렌기 및 1.67-1.64 ppm의 8개의 메틸기를 나타낸다. 13C NMR 스펙트럼 (도 9)에서 135.5-124.0 ppm의 피크는 6개의 비닐 메틸을 나타내며 40.0-25.5 ppm은 10개의 메틸렌을 나타내며 18.00-16.00은 8개의 메틸을 나타낸다. C1의 NMR 스펙트럼은 특성 규명에 있어서 명확하지 않았다. 도 5b 및 5c에 도시된 바와 같이, C2의 분자량은 GC-MS/MS 분석에 의해 410으로 얻어졌다. 이 값은 스쿠알렌의 이론값 (410.718)과 상당히 일치했다. 더욱이, C2의 단편 패턴은 NIST 17 질량 스펙트럼 라이브러리에 기초하여 스쿠알렌과 91%의 유사성을 나타냈다.
<실험예6> 항산화성 및 항염증성을 갖는 스쿠알렌
스쿠알렌의 알킬 및 히드록시 라디칼 소거 특성에 상응하는 IC50 값은 각각 0.273 ± 0.02 및 0.12 ± 0.02 mg/㎖이었다. 그러나, 스쿠알렌은 조사된 농도 범위에서 DPPH 라디칼 소거 효과를 나타내지 않았다. 스쿠알렌은 효과적으로 H2O2 및 AAPH 유도 Vero 세포에서 세포 내 ROS 수준을 감소시켰다 (도 6a). 또한, 스쿠알렌은 ROS 수준의 감소와 HaCaT 세포 생존율의 증가를 통해 알 수 있는 바와 같이 상당히 우수한 UV 보호 효과를 나타냈다 (도 6c). 이들 결과는 스쿠알렌이 자외선 차단 효과를 가지고 있으며 스쿠알렌 및 다른 정의되지 않은 생체 활성 대사 산물을 함유한 C. racemosa의 에탄올 추출물이 화장품의 자외선 차단제 또는 자외선에 대한 피부보호제로 사용될 수 있음을 확인하였다. 또한, 스쿠알렌이 RAW 264.7 대식세포에서 LPS로 유도된 NO 생성을 농도 의존적으로 저해하였고, 염증 유도 세포 손상으로 인한 세포 생존율을 증가시켰다(도 6b). 이러한 효과는 스쿠알렌이 LPS 유도 염증의 잠재적 억제제로서 활용 가능함을 보여준다.
<실험예7> 스쿠알렌의 염증 매개체와 항염증성 사이토카인 감소 효과
염증은 세포 반응을 조절하는 신호 전달 체계의 복잡한 시스템에 의해 매개된다. iNOS, COX-2, PGE2, 및 TNF-α, IL1-β, IL-6와 같은 전염증성 사이토카인은 식물 화학물질의 항염증성의 평가에 널리 사용되는 핵심 염증 매개체 이다. 도 7에서 스쿠알렌이 LPS 유도 RAW 세포에서 iNOS 및 COX-2의 증가된 수준을 용량 의존적으로 감소시킴을 확인하였으며, iNOS 수준의 감소는 스쿠알렌이 NO의 생성을 감소할 수 있음을 확증한다. 더욱이, PGE2 의 저해는 COX-2의 발현 수준 감소와 관련된다. 또한, 스쿠알렌은 LPS 유도 RAW 세포에서 전염증성 매개체인 TNF-α, IL1-β 및 IL-의 발현을 농도 의존적으로 감소시켰다.
결론적으로, 이러한 결과는 C. racemosa의 에탄올 추출물, 이의 헥산 및 에틸 아세테이트 분획물 및 분리된 활성 성분인 스쿠알렌의 항산화성과 항염증 효과를 확인하였다. 또한, 자외선에 대한 피부세포 보호효과를 확인하였다. 따라서 본 발명의 C. racemosa의 에탄올 추출물 및 헥산 및 에틸 아세테이트 분획물 또는 C. racemosa에서 분리된 스쿠알렌은 항산화, 항염증 또는 자외선에 대한 피부보호 용도로 의약품, 약용 화장품 제형의 기능성 성분 및 기능성 식품과 같은 응용 분야에서 사용될 수 있다.

Claims (9)

  1. 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 항염증용 식품 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, C1-C4의 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것인 식품 조성물.
  3. 제2항에서, 상기 알코올은 에탄올인 것인 식품 조성물.
  4. 제1항에서, 상기 분획물은 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 클로로포름 분획물 또는 물 분획물인 것인 식품 조성물.
  5. 제4항에서, 상기 분획물을 헥산 분획물 또는 에텔아세테이트 분획물이며, 상기 추출물은 스쿠알렌을 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
  6. 제5항에서, 상기 스쿠알렌은 상기 헥산 분획물을 실리카 컬럼에서 헥산, 에틸아세테이트 또는 이들 혼합물을 이용하여 용출시킨 용출물에서 분리된 것인, 식품 조성물.
  7. 제1항에서, 상기 식품은 이너뷰티 푸드인 것인 식품 조성물.
  8. 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증용, 또는 자외선에 대한 피부 보호용 화장료 조성물.
  9. 콜레르파 라세모사(Caulerpa racemosa) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학 조성물.
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