KR20220080215A

KR20220080215A - 재조합 단백질의 효율적인 선택성

Info

Publication number: KR20220080215A
Application number: KR1020227018877A
Authority: KR
Inventors: 디팔리 데슈판데; 다리아 부라코프; 강 첸; 제임스 판들
Original assignee: 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
Priority date: 2014-08-19
Filing date: 2015-08-19
Publication date: 2022-06-14
Anticipated expiration: 2035-08-19
Also published as: LT3183359T; EP3183359B1; AU2023200752A1; JP2023076667A; PL3183359T3; MA40371B1; AU2020205336B2; MX2017002203A; HRP20210301T1; JP2017525368A; SG11201701121UA; IL287020B; US20210340564A1; AU2020205336A1; IL250531A0; EA201790241A1; MX384990B; TW202124716A; HUE054069T2; SI3183359T1

Abstract

본 발명은 당단백질의 바람직한 번역후 변형을 촉진하는 포유류 선택성 마커를 포함하는 새로운 발현 체계를 제공한다. 특히, 본 발명은 포유류 기원의 GPT 유전자에 기초한 선별 마커 시스템을 사용함으로써 포유류 세포에서 최적의 재조합 단백질 발현을 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 본 발명은 포유류 세포에서 재조합 단백질의 선택성 및 향상된 발현 사본 뿐만 아니라 단백질 수율을 용이하게 하는 방법, 및 GPT 발현 체계를 사용하는 방법을 포함한다.

Description

재조합 단백질의 효율적인 선택성{EFFICIENT SELECTIVITY OF RECOMBINANT PROTEINS}

서열 목록

본 출원은 2015년 8월 3일에 작성된 8700WO_ST25.txt 파일(75,769 바이트)로서 컴퓨터 판독가능 형식(Computer Readable Form)으로 제출된 서열 목록을 참조문서로 통합한다.

본 발명은 일관되고 효율적인 방식으로 포유류 세포에서 재조합 단백질을 발현하는 것을 제공한다. 특히, 본 발명은 포유류 선택 마커를 사용함으로써 포유류 세포에서 단백질의 개선된 발현을 위한 방법 및 조성물을 포함한다. 본 발명은 포유류 세포에서 재조합 단백질의 선택성 및 향상된 발현 사본 뿐만 아니라 단백질 수율을 촉진하는 방법, 및 이러한 발현 체계를 사용하는 방법을 포함한다.

세포 발현 체계의 개발은 연구 및 치료용으로 주어진 단백질의 신뢰성 있고 효율적인 공급원을 제공하기 위한 중요한 목표이다. 포유류 세포에서 재조합 단백질 발현은, 예를 들어, 재조합 단백질을 적절하게 번역후 변형하는 포유류 발현 체계의 능력 때문에 종종 치료용 단백질의 제조에 선호된다.

다양한 벡터가 포유류 숙주에서의 발현에 이용될 수 있으며, 각 벡터는 세포 배양 중 재조합 단백질-발현 세포의 분리를 용이하게 할 수 있는 선택 마커를 포함한다. 선택성 마커 유전자(SMG)는 관심 단백질을 발현하는 세포에 선택적 우위를 부여하기 때문에 이러한 시스템에서 사용되나, SMG은 여러 이유중 이들의 표현형 중립성, 효율성 및 융통성에 있어 최적화되어야 한다.

SMG를 호스팅하는 수많은 벡터 및 발현 체계의 유효성에도 불구하고, 포유류 시스템에서 얻은 재조합 단백질의 발현은 종종 양적, 질적으로 또는 이들 모두를 만족시키지 못한다 분자의 생물학적 “지문(fingerprint)”, 예를 들어, 당질화와 같은 번역후 변형은 재조합 단백질 치료제의 개발에 있어 분자의 유용성과 효능을 정의하는데 있어 특히 중요하다(Cumming, D.A., 1990, Glycobiology, 1(2):115-130). 발현된 관심 단백질의 생물학적 특성에 부정적인 영향을 끼치지 않는 SMG가 특히 유익하다.

대부분의 SMG는 세균 유래로 환경 세균에 대한 세균성 항생제 저항성 유전자의 수평 이동 위험에 대한 우려 증가 때문에 포유류 시스템에서 사용되는데 불리하다(Breyer, D. 등, 2014, Critical Reviews in Plant Sciences 33:286-330). 세균성 항생제 저항성 유전자의 사용 배제는 사용자 수용 및 이러한 인지된 위험을 완화하는데 긍정적인 효과를 가질 수 있다.

유전자-조작된 자가 세포는 빠르게 임상적 성공을 거두고 있다(예를 들어, Kershaw, M.H. 등, 2013, Nature Reviews: Cancer 13:525-541 참조). 인간 자가 세포 산물에서 유전적 변형을 위한 벡터의 선정 및 제작이 중요한데, 특히, 인간 자가 세포로의 비-인간성 성분의 원치 않는 도입은 환자의 안전에 있어 심각한 결과를 초래할 수 있기 때문이다(Eaker, 등, 2013, Stem cells Trans. Med. 2:871-883; SCTMEXPRESS October 7, 2013에 최초로 온라인 출판). 세균 대신, 포유류 유래의 성분만을 가진 벡터 시스템은 입양 면역요법을 위한 환자-특이적 T 세포에 사용하기에 유리할 것이다.

따라서, 포유류 선택성 유전자, 특히, 상기 형질전환된 세포에 목적 포유류 단백질의 생산을 위한 발현 체계에 있어 표현형 또는 대사적 이점을 부여하는 유전자를 도입하는 것이 바람직하다. 게다가, 충분히 높은 양의 치료성 단백질을 신뢰성 있게 발현하고 단백질 번역 후 상기 치료성 단백질을 적절하고 지속적으로 변형하는 세포주가 매우 바람직하다. 따라서, 당해 기술 분야에서는 향상된 포유류 발현 체계가 요구된다.

포유류 발현 체계에서 선택성 마커로서 포유류 튜니카마이신(Tn) 저항성 유전자의 사용은 형질감염체의 효율 및 사본 수를 증가시킬 수 있다. 관심 유전자에 작동가능하게 연결된 Tn 저항성 유전자의 사용은 포유류 세포의 군집에 대한 선택압을 생성해 상기 형질감염체(즉, 관심 유전자)의 무작위 통합이 증가되는 것이 관찰되었다. 선택 마커 시스템은 목적하는 형질감염체의 선택을 촉진할 수 있으나, 본 발명의 방법은 상기 목적하는 단백질의 신뢰성 있는 생물학적 성질뿐 아니라 상기 관심 유전자의 효율 및 무작위 통합 모두를 예상치 못하게 증가시키는 것으로 이해된다. 따라서 본 발명의 조성물 및 방법은 발현 단백질에 대한 질적으로 바람직한 번역후 변형이라는 이로운 선택을 허용한다.

일 측면에서, 본 발명은 관심 유전자(GOI) 및 적어도 하나의 조절 요소에 작동가능하게 연결된, 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 93% 동일성을 가진 단백질을 암호화하는 포유류 튜니카마이신(Tn)-저항성 유전자를 포함하는 단리된 세포를 제공한다.

다른 측면에서, 본 발명은 (i) 포유류 튜니카마이신(Tn)-저항성 유전자 및 (ii) 상기 POI를 암호화하는 유전자를 포함하는 핵산 분자를 암호화하는 포유류 숙주 세포를 제공하는 단계; 제1 농도의 Tn 존재 하에 상기 세포를 배양하는 단계; 상기 Tn-저항성 유전자의 적어도 하나의 사본을 발현하는 세포 군집을 단리시키는 단계; 및 증가하는 농도의 Tn의 존재 하에 세포 군집을 배양하는 단계로, 상기 Tn 농도의 증가는 상기 POI의 생산을 증가시키는, 단계; 및 상기 세포 배양으로부터 POI를 단리시키는 단계를 포함하는 재조합 관심 단백질(POI)을 생산하는 방법을 제공한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 당질화가 요구되는 상기 단백질 기질을 암호화하는 유전자에 작동가능하게 연결된 포유류 튜니카마이신(Tn)-저항성 유전자를 포함하는 핵산 분자를 암호화하는 포유류 숙주 세포를 제공하는 단계; 제1 농도의 Tn 존재 하에 상기 세포를 배양하는 단계; 상기 Tn-저항성 유전자의 적어도 하나의 사본을 발현하는 세포 군집을 단리시키는 단계; 증가하는 농도의 Tn의 존재 하에 상기 세포 군집을 배양하는 단계로, 상기 Tn 농도의 증가는 상기 POI의 생산을 증가시키는 단계; 및 상기 세포 배양으로부터 상기 단백질 기질을 단리시키는 단계를 포함하는, N-글리칸 단백질 기질을 당질화하는 방법을 제공한다.

상기 방법의 일부 실시예에서, 상기 Tn-저항성 유전자는 상기 POI를 암호화하는 유전자에 작동가능하게 연결되고, 상기 POI를 암호화하는 유전자는 적어도 하나의 조절 요소에 작동가능하게 연결된다.

일부 실시예에서, Tn-저항성 유전자는 세포에 외생적으로 부가된 것이다. 다른 실시예들에서, Tn-저항성 유전자는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 93%의 동일성을 갖는 단백질을 암호화한다. 다른 실시예들에서, Tn-저항성 유전자는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 94%의 동일성을 갖는 단백질을 암호화한다. 일부 실시예에서, Tn-저항성 유전자는 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 93%의 동일성을 갖는 단백질을 암호화한다. 또 다른 실시예들에서, Tn-저항성 유전자는 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 94%의 동일성을 갖는 단백질을 암호화한다.

일부 실시예에서, 포유류 Tn-저항성 유전자는 중국 햄스터 (Cricetulus griseus) Tn-저항성 유전자를 포함한다. 다른 실시예들에서, 포유류의 Tn-저항성 유전자는 인간 Tn-저항성 유전자를 포함한다.

Tn-저항성 유전자는 또한 서열번호 2, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함할 수도 있다.

상기 발명의 소정의 실시예들에서 포유류 Tn-저항성 유전자는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 92%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시예에서, 포유류 Tn-저항성 유전자는 서열번호 12의 핵산 서열과 적어도 92%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다.

Tn-저항성 유전자에 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 조절 요소가 본 발명의 단리된 세포에 제공되며, 여기서 조절 요소는 프로모터, 리보솜-결합 부위 및 인핸서를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 또 다른 실시예에서, GOI는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 또 다른 실시예에서, 예를 들어, GOI는 IRES와 같은, 리보솜-결합 부위에 작동 가능하게 연결된다.

일부 실시예에서, 본 발명의 단리된 세포 및 방법은 제2 관심 유전자(GOI)를 더 포함하는 반면, GOI는 관심 단백질(POI)을 암호화한다. 일 실시예에서, 관심 유전자(GOI)는 외생적으로 부가된 GOI이다. 또 다른 실시예에서, 외생적으로 부가된 GOI는 인간 유전자이다. 또 다른 실시예에서, 조절 요소는 외생적으로 부가된 조절 요소이다.

다른 실시예들에서, 제1 및/또는 제2 GOI는 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항원-결합 단편 및/또는 Fc-융합 단백질을 포함하지만 이에 한정되지 않는 POI를 암호화한다.

또 다른 실시예에서, 제1 GOI 및 제2 GOI는 항체 경쇄 또는 그의 항원-특이적 단편, 항체 중쇄 또는 그의 항원-특이적 단편, Fc-융합 단백질 또는 그의 단편, 및 수용체 또는 그의 리간드-특이적 단편을 암호화하는 유전자로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 일 실시예에서, 재조합효소 인식 부위는 제1 GOI와 제2 GOI 사이에 존재한다. 다른 실시예들에서, 본 발명은 제1 GOI에 대한 재조합효소 인식 부위 5' 및 제2 GOI에 대한 재조합효소 인식 부위 3'를 더 제공한다.

또 다른 실시예에서, GOI는 항체 경쇄 또는 그의 항원-결합 단편, 항체 중쇄 또는 그의 항원-결합 단편, Fc-융합 단백질 또는 그의 단편, 리간드, 및 수용체 또는 그의 리간드-결합 단편으로부터 선택된 당단백질을 암호화한다.

본 발명의 단리된 비-자연발생 세포는 진핵 세포로부터 유래될 수도 있다. 일 실시예에서, 세포는 포유류 세포이다. 일부 실시예에서, 단리된 세포는 생체 외 인간 세포이다. 다른 실시예들에서, 세포는 CHO(예를 들어, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS(예를 들어, COS-7), 림프구, 줄기 세포, 망막 세포, Vero, CV1, 신장(예를 들어, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, Jurkat, Daudi, A431 (epidermal), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 세포, 종양 세포, 및 전술된 세포로부터 유래한 세포주로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 실시예들에서, 본 발명의 단리된 세포는 CHO-K1 세포, 림프구, 망막 세포, 또는 줄기 세포이다.

일 실시예에서, Tn의 제1 농도는 1μg/mL이다. 또 다른 실시예에서, 증가하는 Tn의 농도는 Tn의 제2 농도 및 제3 농도를 포함한다.

일부 실시예에서, 제2 농도는 Tn의 제1 농도보다 크고, 제3 농도는 Tn의 제2 농도보다 크다. 소정의 실시예들에서, Tn의 제2 농도는 2.5μg/ml이고, 제3 농도는 5μg/mL이다.

또 다른 실시예들에서, 증가하는 Tn의 농도는 Tn의 제2 농도를 포함하며, 여기서 Tn의 제2 농도는 2.5μg/ml 또는 5μg/ml이다.

본 발명의 임의의 측면 및 실시예는 달리 명시되거나 문맥으로부터 명백하지 않는 한, 본 발명의 임의의 다른 측면 또는 실시예와 관련하여 사용될 수 있다.

다른 목적 및 이점은 후속하는 상세한 설명의 검토로부터 명백해질 것이다.

도 1은 관심 유전자, 예를 들어, eGFP를 암호화하는 상기 핵산 서열의 세포 게놈으로의 도입을 위해 사용되는 클로닝 벡터 구조물 내 유효 발현 카세트의 개략도를 나타낸다. SV40 프로모터: 시미언 바이러스(Simian virus) 40 프로모터; GPT: GlcNAc-1-P transferase(예를 들어, CHO-GPT, 서열번호 2; 또는 hGPT, 서열번호 12); IRES: 내부 리보솜 도입 부위(internal ribosomal entry site); eGFP: 향상된 녹색 형광 단백질(enhanced Green Fluorescent Protein); SV40polyA: 시미언 바이러스 40 폴리A.
도 2a 내지 2c는 중국 햄스터(GPT_CRIGR; UniProtKB Accn. No. P24140; 서열번호 3) GPT 아미노산 서열과 비교해 포유류 GPT 아미노산 서열, 다시 말해, 인간(GPT_HUMAN; UniProtKB Accn. No. Q9H3H5; 서열번호 4), 히말라야 원숭이(Rhesus macaque; GPT_MACMU; UniProtKB Accn. No. F6TXM3; 서열번호 5), 침팬지(GPT_PANTR; UniProtKB Accn. No. H2R346; 서열번호 6), 개(GPT_CANFA; UniProtKB Accn. No. E2RQ47; 서열번호 7), 기니아 피그(GPT_CAVPO; UniProtKB Accn. No. E2RQ47; 서열번호 8), 랫트(GPT_RAT; UniProtKB Accn. No. Q6P4Z8; 서열번호 9), 및 마우스(GPT_MOUSE; UniProtKB Accn. No. P42867; 서열번호 10)의 배열을 나타낸다.
도 3a 및 3b는 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 단백질을 최적화하는 방법을 예시한다. 도 3a는 1 μg/mL 튜니카마이신(Tn)과 함께 배양된 첫번째 세포 풀(pool)로부터 양성 세포 형질감염체를 선택하는 방법을 나타낸다. 이어서, 단백질 발현을 향상시키기 위해 증가된 농도, 예를 들어, 2.5 μg/mL 또는 5 μg/mL의 튜니카마이신과 함께 두번째 세포를 배양한다. 도 3b는 단백질 발현을 최적화하기 위해 1 μg/mL 튜니카마이신(Tn)과 함께 배양된 첫번째 세포 풀로부터 양성 세포 형질감염체를 선택한 다음, 이후의 세포 배양시 Tn 농도를 연속적으로 증가시키는 방법을 나타낸다.
도 4a 및 4b는 히그로마이신 선택성의 다양한 파라미터를 나타내는 FACS 산포도를 보여준다. 변형된 CHO 세포는 lox 자리 옆에 위치한 YFP 유전자를 포함한다. Lox 자리 옆에 위치한 선택 마커(항생제 저항성 유전자 및 eGFP)는 상기 YFP 자리에 포함되고 표적화 통합(targeted integration)을 통해 YFP를 Cre 재조합효소로 치환한다. 무작위 통합 성분은 YFP 및 eGFP 모두를 표현한다. 도 4a는 세포가 Cre 재조합효소 벡터 및 eGFP로 구성된 hpt 발현 벡터로 형질감염되나, 배양시 히그로마이신 없이 배양된다는 것을 나타낸다. 도 4b는 세포가 400 μg/mL 히그로마이신의 존재 하에 Cre 재조합효소 벡터 및 eGFP로 구성된 hpt 발현 벡터로 형질감염된다는 것을 나타낸다.
도 5a 내지 5f는 튜니카마이신(Tn) 선택성의 다양한 파라미터를 나타내는 FACS 산포도를 보여준다. 변형된 CHO 세포는 lox 자리 옆에 위치한 YFP 유전자를 포함한다. Lox 자리 옆에 위치한 선택 마커(항생제 저항성 유전자 및 eGFP)는 상기 YFP 자리에 포함되고 표적화 통합을 통해 YFP를 Cre 재조합효소로 치환한다. 무작위 통합 성분은 YFP 및 eGFP 모두를 표현한다. 도 5a는 세포가 Cre 재조합효소 벡터 및 eGFP로 구성된 CHO-GPT 발현 벡터로 형질감염되나; 배양시 튜니카마이신 없이 배양된다는 것을 나타낸다. 도 5b는 세포가 1 μg/mL Tn 존재 하에 Cre 재조합효소 벡터 및 eGFP로 구성된 CHO-GPT 발현 벡터로 형질감염된다는 것을 나타낸다. 도 5c는 세포가 2.5 μg/mL Tn의 존재 하에 Cre 재조합효소 벡터 및 eGFP로 구성된 CHO-GPT 발현 벡터로 형질감염된다는 것을 나타낸다. 도 5d는 세포가 Cre 재조합효소 벡터 및 eGFP로 구성된 인간 GPT 발현 벡터로 형질감염되나; 배양시 튜니카마이신 없이 배양된다는 것을 나타낸다. 도 5e는 세포가 1 μg/mL Tn 존재 하에 Cre 재조합효소 벡터 및 eGFP로 구성된 인간 GPT 발현 벡터로 형질감염된다는 것을 나타낸다. 도 5f는 세포가 2.5 μg/mL Tn의 존재 하에 Cre 재조합효소 벡터 및 eGFP로 구성된 인간 GPT 발현 벡터로 형질감염된다는 것을 나타낸다.
도 6a 및 6b는 eGFP와 같은 작동가능하게 연결된 GOI의 발현을 향상시키는 상대적 능력에 대해 세포 풀을 발현하는 비-GPT와 비교한 세포 풀을 발현하는 GPT를 나타낸다. 도 6a는 세포 풀에 대한 PCR에 의해 측정된 CHO-GPT의 상대적 유전자 사본 수를 나타내며, 다음과 같다: Tn 선택없는 풀-49 세포(외인성 GPT 미첨가); 5 μg Tn 선택하는 풀-49 세포(외인성 GPT 없음); 풀-1 세포는 자연적으로 더 많은 양의 GPT 발현하고(데이터 미도시), Tn 선택없이 검사한다; Tn 선택없는 풀-78 세포(외인성 GPT 없음); 외생적으로 부가된 hpt를 발현하는 CHO 세포 및 400 μg/mL 히그로마이신 선택; 1 μg/mL Tn 선택 조건 하에 외인성 GPT를 발현하는 CHO 세포; 1 μg/mL Tn 선택 풀에서 선택된 외인성 GPT를 발현하는 CHO 세포는 1 μg/mL Tn에서 더 배양된다; 1 μg/mL Tn 선택 풀에서 선택된 외인성 GPT를 발현하는 CHO 세포는 2.5 μg/mL Tn에서 더 배양된다; 1 μg/mL Tn 선택 풀에서 선택된 외인성 GPT를 발현하는 CHO 세포는 5 μg/mL Tn에서 더 배양된다. 도 6b는 동일 세포 풀(도 6a에 도시)에 대한 qPCR에 의해 측정된 관심 유전자 eGFP의 상대적 유전자 사본 수를 나타낸다.
도 7a 내지 7d는 세포 배양으로부터 생산된 Fc-융합 단백질 1(FcFP1)의 글리코폼 특성을 나타내며 다음과 같다: 도 7a은 도 7b의 CHO-GPT를 발현하고 Tn 선택이 없는 CHO 세포(Lot 110728)와 비교한 결과, 표준 프로토콜을 사용한 GPT 발현없는 CHO 세포(Lot B10002M410)을 나타낸다. 도 7c는 도 7d의 CHO-GPT를 발현하고 5 μg/mL Tn으로 선택된 CHO 세포(Lot 110728-02)와 비교한 결과, CHO-GPT를 발현하고 1 μg/mL Tn으로 선택된 CHO 세포(Lot 110728-01)를 나타낸다. 각각의 크로마토그램은 시알화( sialylated) 잔기를 함유한 부분을 나타내며 다음과 같다: 0SA = 시알산 잔기 없음; 1SA = 하나의 시알산 잔기; 2SA = 두 개의 시알산 잔기; 3SA = 세 개의 시알산 잔기; 4SA = 네 개의 시알산 잔기.
도 8은(A) Lot B10002M410,(B) Lot 110728,(C) Lot 110728-01 및(D) Lot 110728-02으로부터 샘플링된 Fc-융합 단백질 1(FcFP1)의 중첩된 당질화 프로파일을 나타낸다. 상기 GPT 롯트로부터 생산된 각 단백질의 글리코프로파일(glycoprofile)은 참조 표준 단백질과 호환될 수 있으며 다수의 글리코폼 종은 지속적으로 생산된다. 상기 참조 표준 단백질과 비교해서 상기 GPT 롯트에서 새롭고 독특한 글리코폼 종이 생산되지 않았음이 명백하다.

본 발명의 방법을 설명하기 전에, 본 발명은 특정 방법 및 설명된 실험 조건이 다양하여 이러한 방법 및 조건에 제한되지 않는 것으로 이해해야 한다. 또한 본 발명의 범위는 단지 첨부된 청구항에 의해 제한되므로 본 발명에서 사용된 용어는 특정 실시예를 설명하고자할 뿐 제한하는 것은 아닌 것으로 이해해야 한다.

본 명세서 및 첨부된 청구항에 사용된 바와 같이, 문맥에 달리 명시되어 있지 않는 한 단수 형태인 “a”, “an”, 및 “the”는 다수의 참조를 포함한다. 따라서, 예를 들어, “하나의 방법”에 대한 참조는 하나 이상의 방법 및/또는 본 발명에서 설명 및/또는 본 명세서를 읽으면 당업자에게 명백해질 종류의 단계를 포함한다.

달리 정의되거나 규정되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 당해 기술분야의 당업자에 의해 통상 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 발명에 기재된 방법 및 재료와 유사 또는 동등한 어떠한 방법 및 재료도 본 발명의 실시 또는 검사에 사용될 수 있으나, 특정 방법 및 재료를 지금부터 설명한다. 본 발명에 언급된 모든 문헌은 그 전체가 본 발명에 참조로 인용되어 있다.

당해 기술 분야에 잘 알려진 다양한 유전자는 배양시 포유류 세포에 선택성 표현형을 부여할 수 있다. 통상, 선택성 마커 유전자는 단백질, 보통 세포 배양시 다양한 항생제에 저항성을 부여할 수 있는 효소를 발현한다. 몇몇 선택적 조건에서, 형광 단백질 마커를 발현하는 세포는 가시화되어 선택가능하다. 당해 기술분야에서 실시예는 베타-락타마아제(bla; 베타-락탐 항생제 저항성 유전자 또는 ampR; 암피실린 저항성 유전자), bls(블라스티시딘 저항성 아세틸 트랜스퍼라제 유전자), 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제(hpt; 히그로마이신 저항성 유전자), 및 기타를 포함한다.

본 명세서에 기재된 방법은 튜니카마이신 및 튜니카마이신에 저항성 있는 세포를 세포 배양시 성장시킬 수 있는 효소(마커)의 사용에 의존한다. 튜니카마이신(Tn)은 N-아세틸글루코사민 지질 중간체의 형성 및 새로 합성된 당단백질의 당질화를 저해하는 세균 및 진핵생물의 N-아세틸글루코사민 트랜스퍼라제의 저해제로 작용하는 항생제 혼합물이다. (King, I.A., 및 Tabiowo, A., 1981, 생체외 표피 당단백질 및 글리코사미노글리칸 합성에 대한 튜니카마이신의 효과. Biochem. J., 198(2):331-338). Tn은 특히 UDP-N-아세틸글루코사민를 저해하기 때문에 세포독성이다: 돌리콜 포스페이트 N-아세틸글루코사민-1-P 트랜스퍼라제(dolichol phosphate N-acetylglucosamine-1-P transferase; GPT), 돌리콜-연결된 올리고당의 생합성의 초기 단계를 촉매화하는 효소. 튜니카마이신의 존재 하에, 소포체(ER) 내에서 만들어진 아스파라긴-연결된 당단백질은 N-연결된 글리칸으로 당질화되지 않으므로 상기 ER 내에서 정확하게 접히지 않을 수 있어 분해될 수 있다(Koizumi, 등, 1999, Plant Physiol. 121(2):353-362). 따라서, Tn은 세균 및 진핵 세포에서 세포사멸을 일으키는 접히지 않은 단백질 반응(UPR)의 주목할 만한 인듀서이다.

우리딘 디포스페이트 GPT(GlcNAc-1-P 트랜스퍼라제로도 알려진) 에 대한 유전자는 Tn에 저항성을 부여하기 위해 임의의 세포 조건 하에 과발현됨에 따라 확인되었다(Criscuolo and Krag, 1982, J Biol Chem, 263(36):19796-19803; Koizumi, 등, 1999, Plant Physiology, Vol. 121, pp. 353-361). GenBank Accn. No. M36899(서열번호 2)에도 기재된GPT를 암호화하는 유전자는 Tn-저항성 중국 햄스터 난소 세포주로부터 분리되었고 408 아미노산 단백질(서열번호 3)을 암호화한다(Scocca and Krag, 1990, J Biol Chem 265(33):20621-20626; Lehrman, M. 등, 1988, J Biol Chem 263(36):19796-803). 햄스터 GPT는 효모 세포(S. pombe) 내에서 과발현되었고 이들 세포 내에서 Tn 저항성을 부여하였으며, 또한 상기 GPT 효소의 정제를 위한 편리한 소스를 제공한다(Scocca JR, 등. 1995, Glycobiology, 5(1):129-36). GPT의 전사 수준을 하이브리도마 세포에서 분석하는 반면(IgG을 발현하는 B 세포 vs. 휴지기 B 세포) IgG-생산 세포는 상승된 GPT 전사 또는 활성 레벨을 보이지 않았으나, GPT의 적은 증가는 휴지 상태에서 활성화된 B 세포로의 이행에서 관찰되었다. GPT 레벨은 B 세포 내 LPS(항원) 자극에 대한 증식 반응의 초기 발달과 일치할 수 있는 것으로 결론내렸다(Crick, D.C. 등, 1994, J Biol Chem 269(14):10559-65).

또한, 세포 발현 체계에서 Tn의 존재 또는 부존재에 따라 GPT의 발현이 변화하는지 여부가 단백질 산물의 당질화에 영향을 미치므로 산물 품질에 영향을 미칠 것이라는 것에 대해서는 이전에 알려진 바 없었다. 최적화되고 일관된 당질화는 치료적 당단백질의 생산에 있어 중요한 단백질 속성으로 이해된다.

본 발명은 포유류 Tn-저항성 유전자, GPT를 규제가능한 선택 마커로 사용하는 포유류 세포 시스템에서 재조합 단백질을 생산하는 개선된 방법을 제공하는 반면, GPT에 작동가능하게 연결된 관심 유전자의 사본수의 증가는 GPT 발현 카세트의 상기 세포 내로의 무작위 통합의 증가와 상관 관계가 있다.

당해 기술은 치료적 단백질, 특히, 당단백질의 제조는 이러한 단백질의 자연 당질화를 모방하는 포유류타입 발현 체계에 의존하는 것을 인정해왔다. (리뷰를 위해, Bork, K. 등, 2009, J Pharm Sci. 98(10):3499-3508. 참조) 예를 들어, N연결된 복합체 글리칸과 같은 어떤 당단백질의 최종 단당류는 일반적으로 시알산에 의해 점유된다. 시알릴화는 당단백질의 흡수, 혈청반감기 및 제거율 같은 약동학적 성질, 또는 당단백질의 기타 물리화학적 또는 면역원성에 영향을 미칠 수도 있다. 과발현된 재조합 당단백질은 종종 불완전하거나 불연속적인 당질화를 가진다. 신뢰성 있는 방법은 포유류 세포주에서 생산된 치료적 당단백질의 공정 일관성 및 품질에 있어 매우 중요하다.

본 발명은 목적하는 단백질의 일관된 품질 산출량을 제공하기 위해 재조합 단백질의 개선된 당질화 방법, 즉, 포유류 세포 시스템에서 당단백질을 만드는 방법 또한 제공한다.

정의

DNA 영역은 이들이 각각 기능적으로 연관되어 있을 때 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터는 상기 프로모터가 상기 서열의 전사에 참여할 수 있으면 코딩 서열에 작동가능하게 연결되고; 리보솜-결합 부위는 번역이 가능하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된다는 것은 접근을 포함하나, 요구되지는 않는다. 분비 리더(leaders)와 같은 서열의 경우, 접근 및 리딩 프레임(reading frame)에서 적절한 배치는 일반적인 특징이다. 프로모터와 같은 생산 향상 서열은 GOI에 기능적으로 관련된, 예를 들어, 그것의 존재가 상기 GOI의 발현을 증가시키는 관심 유전자(GOI)에 작동가능하게 연결된다.

이와 같이, DNA 발현 벡터 구조체의 문맥에 기술된 바와 같이 문구 “작동가능하게 연결된”은 제어 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 작동자 또는 마커는 코딩 서열에 상대적인 위치에 적절하게 배치되어 상기 제어 서열은 상기 코딩 서열에 의해 암호화된 목적하는 폴리펩티드/단백질의 생산을 지시 또는 허용한다. 예를 들어, 선택 마커는 어떤 배양 조건에서 세포가 생존할 것을 요구하나, 작동가능한 선택 마커 단백질의 존재 없이는 발현이 일어나지 않을 것이므로 상기 관심 유전자는 상기 선택 마커 유전자에 작동가능하게 연결된다.

본 발명에 사용된 “프로모터” 는 작동가능하게 연결된, 즉, 적절한 신호가 있을 때 상기 관심 유전자 및/또는 선택 마커 유전자의 전사을 허용하는 방식으로 연결된 DNA 서열의 직접 전사에 충분한 DNA 서열을 나타낸다. 유전자의 발현은 당해 기술 분야에 알려진 어떤 프로모터 또는 인핸서 요소의 조절 하에 배치될 수 있다.

본 발명의 문맥에서 “발현 벡터” 는 염색체, 비-염색체, 및 합성 핵산 벡터(적합한 발현 제어 요소 세트를 포함하는 핵산 서열)을 포함하는 어떤 적합한 벡터일 수 있다. 이러한 벡터의 예는 SV40의 유도체, 세균 플라스미드, 파아지 DNA, 바큘로바이러스, 효모 플라스미드, 플라스미드 및 파지 DNA의 조합에서 유도된 벡터, 및 바이러스 핵산(RNA 또는 DNA) 벡터를 포함한다. 일 실시예에서, Fc-융합 단백질 또는 폴리펩티드-암호화된 핵산 분자는, 예를 들어, 선형 발현 요소(가령, Sykes and Johnston, 1997, Nat Biotech 12, 355-59에 기재된 것과 같이), 작은 핵산 벡터(가령, US6,077,835 및/또는 WO00/70087에 기재된 것과 같이), 또는 pBR322, pUC 19/18, 또는 pUC 118/119와 같은 플라스미드 벡터를 포함하는, 노출된 DNA 또는 RNA 벡터에서 구성된다. 이러한 핵산 벡터 및 이들의 용도는 당해 기술분야에 잘 알려져 있다(가령, US5,589,466 및 US5,973,972에 기재되어 있음).

본 발명에서 사용된 바와 같이 "작동자" 는 상기 작동자에 억제 단백질의 결합하여 상기 유전자를 조절할 수 있는 방식으로 유전자 내 또는 가까이에 도입된 DNA 서열을 나타내어, 그 결과, 상기 GOI, 즉, 관심있는 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드의 전사를 저해 또는 허용한다.

리보솜 결합 부위는 “내부 리보솜 유입점(IRES)”을 포함하거나 또는 5’ 캡을 포함할 수 있다. 많은 IRES 서열은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. IRES는 번역 제어 서열을 나타내며, 상기 IRES 부위는 일반적으로 관심 유전자의 5’에 위치하고 캡-독립적 방식으로 상기 RNA를 번역한다. 전사된 IRES는 직접적으로 리보좀 서브유닛을 결합하여 mRNA의 개시 코돈의 위치가 번역을 위해 적절하게 리보좀 내에서 배향될 수 있다. IRES 서열은 일반적으로 상기 mRNA의 5’ UTR에 위치한다(상기 개시 코돈의 바로 상류에). IRES는 진핵생물의 번역기와 상호작용하는 다양한 단백질 요소의 필요성을 기능적으로 대체한다.

단백질 발현을 설명하기 위해 사용하는 경우 “향상된(enhanced)” 또는 “개선된(improved)”이라는 용어는 본 발명의 발현 체계 또는 방법에 의해 생산된 상기 단백질(즉, 유전자 산물)의 양 및/또는 품질의 일관성의 증가를 포함한다. 이와 같이, 이는, 예를 들어, 다른 선택 마커 구조체를 사용하는 통합 성분의 풀과 비교할 때, 게놈으로의 무작위 통합에 의해 일반적으로 관찰되는 것보다 발현이 적어도 약 1.5-배에서 적어도 약 3-배 향상되는 것을 포함한다. 이와 같이, 목적하는 단백질에 대해 관찰된 접힘-발현 향상을 GPT 유전자를 포함하는 본 발명의 발현 카세트 또는 세포의 부재 또는 다른 선택 마커를 포함하는 발현 카세트 또는 세포의 존재 시 실질적으로 동일한 조건 하에서 측정된 동일 유전자의 발현양과 비교한다. 또한 그 결과 무작위 통합 사건의 수에 의해 발현 향상을 측정할 수 있다. 향상된 재조합 효율은 재조합을 위해 유전자자리의 능력 향상을 포함한다(예를 들어, 재조합효소-인식 부위 이용). 향상은 무작위 재조합보다 측정가능한 효율을 의미하며, 일반적으로 0.1%이다. 특정 조건에서, 향상된 재조합 효율은 무작위보다 약 10배 또는 약 1%이다. 명시되지 않은 한, 청구된 발명은 특정한 재조합 효율에 제한되지 않는다. 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 또는 다른 잘 알려진 기술에 의해 측정됨에 따라 결과적인 유전자 사본 수에 의해 발현 향상 역시 측정될 수 있다.

향상된 또는 개선된 산물은 또한 보다 일관된 품질, 예를 들어, 본 발명의 GPT 발현 체계로 관찰되는 번역후 변형을 의미한다. 일관된 품질은, 예를 들어, 복제 생산 라인 다음 목적하는 당질화 프로파일을 가지는 것을 포함한다. 품질에 대한 일관성은 불균일도 및 표준화를 의미하는 반면, 복제 생산 배치(batches)는 본질적으로 변형이 없다. 일관성을 측정하기 위한 Z-수의 계측을 본 발명에 교시한다. 일관성을 측정하기 위해 다른 통계적 방법이 당해 기술 분야에 알려져 있다.

상기 문구 “선택압”은 주어진 환경 안에서 상기 생물 또는 시스템의 행위 및 생존(생존력과 같은)을 변화되는 생물(예를 들어, 세포) 또는 시스템(예를 들어, 발현 체계)에 적용된 힘 또는 자극을 의미한다.

상기 문구 “유전자 증폭”은 유전자 서열의 동등한 사본의 수의 증가를 의미한다. 어떤 세포성 공정은 특정 유전자의 복수개의 사본 또는, 예를 들어, 항생제 저항성과 같이 상기 유전자가 세포에 대해 부여하는 표현형을 증폭시키는 유전자의 생성에 의해 특징 지어진다.

상기 문구 “외생적으로 부가된 유전자” 또는 “외생적으로 부가된 GOI”은 발현 카세트를 참조하여 사용되나, 상기 문구는 자연에서 발견되는 세포 게놈 내에 존재하지 않는 어떤 유전자, 또는 상기 게놈(내 다른 자리)에 통합된 추가적인 유전자 사본을 의미한다. 예를 들어, CHO 게놈(예를 들어, 선택 마커 유전자) 내에 “외생적으로 부가된 유전자”는 자연에서 특정 CHO 자리 내에서 발견되지 않는 햄스터 유전자(즉, 햄스터 게놈 내 다른 자리에서 유래된 햄스터 유전자), 다른 종에서 유래된 유전자(예를 들어, 인간 유전자) 또는 키메라 유전자(예를 들어, 인간/마우스) 일 수 있고, 또는 자연에서 CHO 게놈 내에서 확인되지 않는 햄스터 유전자(즉, 햄스터 게놈의 다른 자리 유래의 유전자와 99.9% 미만의 동일성을 가진 햄스터 유전자), 또는 CHO 자연 게놈 내에 존재하는 것으로 자연에서는 발견되지 않는 다른 유전자일 수 있다.

무작위 통합 사건은 표적 통합 사건과 다른 반면, 세포의 게놈 내 유전자 삽입은 무작위 통합 사건에서 부위-특이적인 것은 아니다. 표적 통합의 예는 동종 재조합이다. 무작위(비-동종) 통합은 상기 결과로 얻은 통합 성분의 위치(자리)가 알려져 있지 않거나 특정되는 것을 의미한다. 무작위 통합은 비동종 말단 연결(NHEJ)에 의해 일어난 것으로 생각되나, 상기 방법에 제한되는 것은 아니다.

선택 효율은 선택 마커를 발현하는 생존 세포 및 적용 가능하다면, 상기 선택 마커의 제어 하에 상기 목적 단백질의 퍼센트 군집을 의미한다.

Tn-저항성 단백질을 기술할 때, 동일성 %은 연속적인 상동성의 영역을 따라 인용된 동일성을 표시하는 상동 서열을 포함하는 것을 의미하지만, 비교된 서열에는 상동성이 없는 갭, 결실 또는 삽입의 존재는 동일성 %을 계산할 때 고려되지 않는다. 이 문맥에서 "동일성 %"의 사용을 설명함에 있어서, 하기의 아미노산 서열 비교가 참조될 것이다:

1 MWAFPELPLPLPLLVNLIGSLLGFVATVTLIPAFRSHFIAARLCGQDLNKLSQQQIPESQ 60 GPT_MOUSE

1 MWAFPELPL--PLLVNLFGSLLGFVATVTLIPAFRSHFIAARLCGQDLNKLSRQQIPESQ 58 GPT_CRIG

본원에서 사용된 마우스 상동체 ("GPT_MOUSE")와 상기 "GPT_CRIG" 서열(중국 햄스터 GPT) 간의 "동일성 %" 결정은 햄스터 아미노산 10 및 11의 비교를 포함하지 않는데, 햄스터 상동체는 정렬 (즉, 마우스 GPT가 그 지점에서 삽입을 가지거나, 경우에 따라, 햄스터 상동체가 갭 또는 결실을 가짐)에서 비교할 상동 서열이 없기 때문이다. 따라서, 상기의 비교에서, 동일성 % 비교는 5' 말단의 "MWA"에서 3' 말단의 "ESQ"까지 확장된다. 그 경우, 마우스 상동체는 햄스터 GPT 위치 51에서 "R"이 있다는 것만 상이하다. 비교는 60개 염기쌍의 스트레치에서 58개 넘는 연속적인 염기이기 때문에, 오직 한 개의 아미노산 차이가 있는 경우 (갭, 결실 또는 삽입이 아님), 햄스터 GPT 위치 1에서 햄스터 GPT 위치 58까지 두 서열 (햄스터 및 마우스) 간에 98% 넘는 동일성이 있다 ("동일성 %"는 갭, 결실 및 삽입에 대한 페널티를 포함하지 않기 때문). 상기의 예는 아미노산 서열에 기초하고 있지만, 핵산 서열 동일성 %은 동일한 방식으로 계산된다는 것이 이해된다.

용어 "세포"는 재조합 핵산 서열을 발현하는데 적합한 임의의 세포를 포함한다. 세포는 원핵 세포 및 진핵 세포(단세포 또는 다세포), 박테리아 세포(예를 들어, E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp. 등), 마이코박테리아세포, 진균 세포, 효모 세포(예를 들어, S. cerevisiae, S. pombe, P. partoris, P. methanolica 등), 식물 세포, 곤충 세포(예를 들어, SF-9, SF-21, 배큘로바이러스에 감염된 곤충 세포, Trichoplusia ni 등), 비인간 동물 세포, 포유류 세포, 인간 세포, 또는 세포 융합물, 예를 들어, 하이브리도마 또는 쿼드로마(quadroma)를 포함한다. 소정의 실시예들에서, 세포는 인간, 원숭이, 유인원, 햄스터, 랫트, 또는 마우스 세포이다. 다른 실시예들에서, 세포는 진핵 세포이고, 다음의 세포로부터 선택된다: CHO(예를 들어, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS(예를 들어, COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장(예를 들어, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, Jurkat, Daudi, A431 (epidermal), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 세포, 종양 세포, 및 전술된 세포로부터 유래한 세포주. 일부 실시예에서, 세포는 하나 이상의 바이러스 유전자, 예를 들어, 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포(예를 들어, PER.C6® cell)를 포함한다.

상기 문구 “통합된 세포 밀도” 또는 “ICD”는 mL당 세포-일수로 표현되는 기간에 대한 적분으로 얻어진 배양 배지 내 세포의 밀도를 의미한다. 일부 실시예에서, 상기 ICD는 세포 배양 12일째에 측정된다.

상기 단어 “당질화” 또는 문구 “단백질의 당질화” 는 당단백질의 형성을 포함하는 반면, 올리고당이 단백질의 아스파라긴(Asn) 잔기(즉, N-연결) 또는 세린(Ser)/트레오닌(Thr) 잔기(즉, O-연결)의 측쇄중 어느 하나에 부착된다. 글리칸은 선형 또는 분지형의 단당류 잔기의 동종 또는 이종중합체일 수 있다. N-연결 당질화는 주로 소포체에서 시작되는 것으로 알려진 반면, O-연결 당질화는 소포체(ER) 또는 골지체중 어느 하나에서 시작되는 것으로 보여진다.

용어 “N-글리칸 단백질” 또는 “N-글리칸 단백질 기질”은 N-연결 올리고당을 함유하거나 수용할 수 있는 단백질을 포함한다. N-글리칸은 N-아세틸 갈락토사민(GalNAc), 만노오스(Man), 푸코오스(Fuc), 갈락토오스(Gal), 뉴라민산(NANA), 및 다른 단당류로 구성될 수 있으나, N-글리칸은 대개 세 개의 만노오스 및 두 개의 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc) 당류을 포함하는 공통 중심 오탄당 구조를 가진다. X가 프로린을 제외한 어떤 아미노산인 연속된 아미노산 서열(즉, 시퀀) Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr을 가진 단백질은 N-글리칸에 대한 부착 부위를 제공할 수 있다.

일반적인 설명

본 발명은 적어도 일부로 어떤 조건 하에서 재조합 단백질이 세포 내에서 생산될 수 있다는 발견을 기반으로 하며 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자는 Tn-저항성 유전자, GPT에 작동가능하게 연결되고 단백질-생산 세포의 선택은 세포 게놈에서 무작위 통합 사건을 증가시도록 구성되어 상기 관심 유전자의 사본 수를 증가시키고 결국 단백질이 생산된다.

본 발명은 또한 적어도 일부로 단백질-생산 세포가 일관성 및 신뢰성 있는 번역후 변형이 있는 단백질을 발현하는데 최적화될 수 있다는 발견을 기반으로 한다. GPT 발현 카세트는 또한 당해 기술 분야에 알려진 다양한 유전자 편집 기술을 사용해 발현 벡터 경유와 같은 발현 구조체 내 세포 게놈에 통합될 수 있다. GPT를 포함하는 발현 벡터는 특정 재조합 부위를 인식하는 재조합 효소에 의해 매개된 동종 재조합 또는 재조합(예를 들어, Cre-lox-매개 재조합)과 같은 무작위 또는 표적 재조합에 의해 게놈에 통합될 수 있다.

진핵 세포에서 동종 재조합은 상기 통합 부위에서 염색체 DNA 내 절단을 도입하여 촉진될 수 있다. 모델 시스템은 염색체 목적 서열 내 이중 가닥 절단이 도입되면 유전자 표적화시 동종 재조합 빈도가 증가하는 것을 설명했다. 이는 통합 특정 부위에 어떤 뉴클레아제를 표적화하여 수행될 수 있다. 상기 목표 자리에서 DNA 서열을 인식하는 DNA-결합 단백질은 당해 기술 분야에 알려져 있다. 유전자 표적화 벡터는 또한 동종 재조합을 용이하게 하는데 사용된다. 상동성 지시된 수선을 위한 유전자 표적화 벡터의 부재시, 상기 세포는 상기 절단 부위에서 다수의 뉴클레오티드의 삭제 또는 삽입시킬 수 있는 비-동종 말단-연결(NHEJ)에 의해 상기 이중 가닥 절단을 종종 폐쇄한다. 유전자 표적화 벡터 제작 및 뉴글레아제 선택은 본 발명이 속하는 기술자의 가술에 의한다.

몇몇 예에서, 모듈러 구조를 가지며 개별 징크 핑거 도메인을 함유하는 징크 핑거 뉴클레아제(ZFNs)는 상기 목적 서열(예를 들어, 표적화 통합 부위) 내 특정 3-뉴클레오티드 서열을 인식한다. 몇몇 실시예는 다수의 목적 서열을 표적화하는 개별 징크 핑거 도메인의 조합과 함께 ZFN을 사용할 수 있다.

전사 촉진제-유사(TAL) 이펙터 뉴클레아제(TALENs)는 또한 부위-특이적 게놈 편집을 위해 사용될 수 있다. TAL 이펙터 단백질 DNA-결합 도메인은 일반적으로 FokI과 같은 제한 뉴클레아제의 비-특이적 절단 도메인과 조합하여 사용된다. 일부 실시예에서, TAL 이펙터 단백질 DNA-결합 도메인 및 제한 뉴클레아제 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질은 본 발명의 유전자자리 내 목적 서열에서 DNA를 인식하고 절단하는데 사용된다(Boch J 등, 2009 Science 326:1509-1512).

RNA 유전자가위(RNA-guided endonucleases; RGENs)는 세균의 적응 면역 기계로부터 개발된 기구를 조작하는 프로그램 가능한 게놈이다. 이 시스템-간헐적으로 반복되는 회문 구조 염기 서열 집합체(the clustered regularly interspaced short palindromic repeats; CRISPR)/CRISPR-관련(Cas) 면역 반응-에서 두 개의 RNA로 복합체를 형성할 때 상기 단백질 Cas9은 서열-특이적 엔도뉴클레아제를 형성하며 이들 RNA중 하나는 표적 선택을 유도한다. RGEN는 구성성분(Cas9 및 tracrRNA) 및 표적-특이적 CRISPR RNA(crRNA)로 구성된다. DNA 표적 절단 효율 및 절단 부위의 위치 모두는 프로토스페이서 인접 모티브(protospacer adjacent motif; PAM)의 위치, 표적 인식에 대한 추가 요건에 따라 다양하다(Chen, H. 등, J. Biol. Chem. 원고 M113.539726로 2014년 3월 14일자 온라인 출판).

정확한 DNA-결합 특이성을 가진 BuD-유래 뉴클레아제(BuDNs) 와 같은 동종 재조합의 또 다른 방법은 숙련된 기술자가 이용할 수 있다(Stella, S. 등, Acta Cryst. 2014, D70, 2042-2052). 정확한 게놈 변형 방법을 상기 게놈 내에서 독특한 목적 서열과 호환가능한 기구에 따라 선택하여 세포 표현형의 파괴를 피할 수 있다.

핵산 서열(관심 유전자)을 포유류 세포로 안정되게 통합되기 위한 세포 및 방법이 제공되며, 상기 핵산 서열은 GPT 서열과 통합되어 발현을 향상시킨다. 또한 GPT를 예를 들어, 발현 벡터와 같은 발현 구조체와 결합하여 사용하고 외인성 GPT를 목적 포유류 세포에 첨가하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 세포 및 방법은 당단백질, 특히, 치료적 당단백질을 만드는 지속적이나 강력한 방법에 사용되기 위해 제공된다.

GPT 선택 마커 카세트의 제작

본 발명은 작동하는 GPT 발현 카세트로 구성된 발현 벡터를 제공한다. 상기 발현 카세트는 포유류 GPT 및 목적하는 유전자 산물의 전사 및 번역을 허용하고 촉진하는데 필요한 조절 요소를 포함한다.

상기 유전자 및 본 발명에 기재된 조절 서열의 다양한 조합 역시 개발될 수 있다. 역시 개발될 수 있는 본 발명에 기재된 적합한 서열의 다른 조합 예는 최적의 조절 요소 조합을 얻기 위해 본 발명에 개시된 상기 GPT 유전자의 다수의 사본, 또는 상기 개시된 GPT과 다른 뉴클레오티드 서열의 혼합에 의해 파생된 서열을 포함한다. 이러한 조합은 상기 관심 유전자 및 조절 요소에 배향된 GPT의 최적 간격을 제공하기 위해 연속적으로 연결 또는 배열될 수 있다.

GPT를 암호화하는 유전자의 동종 서열은 다른 포유류 조직 타입으로부터 유래된 세포주 내뿐 아니라 다른 포유류 종(예를 들어, 인간; 도 2 참조)에서 유래된 세포 내에 존재하는 것으로 알려져 있으며, 당해 기술 분야에 잘 알려진 기술에 의해 분리될 수 있다. 포유류 GPT 아미노산 서열의 예시적인 리스트가 도 2에서 제공된다. 코돈 최적화와 같은 뉴클레오티드 서열의 변화는 서열번호 3 내지 10에 기재된 해당 GPT 단백질의 최적의 발현을 허용하기 위해 서열번호 2 및 11 내지 17에 기재된 뉴클레오티드 서열 내에서 이루어질 수 있다. 게다가, 변화는 GPT를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 변화를 주어 서열번호 3 내지 10에 기재된 아미노산 서열 내에서 일어날 수 있다. 부위-지정 또는 무작위 돌연변이 유발을 포함하나 이에 제한되지 않는 이러한 기술은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다.

그래서 그 결과로 얻은 GPT 변이체는 본 발명에서 설명된 바와 같이 GPT 활성에 대해 실험, 예를 들어, 튜니카마이신에 대한 저항성에 대해 실험 할 수 있다. 아미노산 서열에 있어 GPT 활성을 가진 서열번호 3에 적어도 약 93%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 또는 적어도 약 98% 동일성이 있는 GPT 단백질은 일상적인 실험으로 분리가능하고, Tn에 대한 동일한 저항성, 선택 효율 및 서열번호 3에 대해 번역후 이점을 나타내는 것으로 기대된다. 따라서, GPT의 포유류 동족체 및 GPT의 변이체는 또한 본 발명의 실시예에 의해 포함된다. 도 2a 내지 2c는 다양한 포유류 GPT 아미노산 서열 (즉, 서열번호 3 내지 10)의 정렬을 보여준다. 포유류 GPT 서열(핵산 및 아미노산)은 햄스터, 인간, 마우스 및 랫 게놈 간에 보존된다. 표 1은 예시적인 포유류 GPT 단백질 및 이의 상동성 정도를 확인한다.

강화된 수준의 관심 단백질을 발현하는 세포 집단은 본원에 제공된 GPT/튜니카마이신 방법을 사용하여 개발할 수 있다. 절대 발현 수준은 단백질이 세포에 의해 얼마나 효율적으로 처리되는지에 따라, 특이적 단백질에 따라 달라진다.

따라서, 본 발명은 또한 서열번호 2 및 11-17로 이루어진 군으로부터 선택된 GPT-발현 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명은 또한 서열번호 2 및 11-17로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 적어도 92% 동일하거나, 적어도 93% 동일하거나, 적어도 94% 동일하거나, 적어도 95% 동일하거나, 적어도 96% 동일하거나, 적어도 98% 동일하거나 또는 적어도 99% 동일한 GPT-발현 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 12를 포함하는 벡터를 포함한다. 포유류 GPT 유전자, 및 선택적 조절 요소를 포함하는 벡터는 일시적 또는 안정적 형질감염을 위한 벡터를 포함한다.

일 실시예에서, 도 1에 예시된 바와 같이, GPT 유전자는 GOI의 발현을 향상시키는데 사용된다. 도 1은 IRES 서열 및 GPT 선택성 마커와 작동 가능하게 연결된 GOI를 도시한다. GPT 카세트는 예를 들어, SV40 프로모터 및 폴리아데닐화(폴리(A)) 서열, 예를 들어 SV40 폴리(A)을 더 포함한다.

발현 강화 카세트 (GPT와 상류 프로모터 포함)는 세포 게놈에 최적으로 편입된다. 본 발명의 방법을 사용하여, GOI는 증가하는 농도의 Tn에 기초한 배양 조건 하에서 GPT 발현 카세트 내에서 발현된다 (도 3a 또는 도 3b). 도 5b, 5c, 5e 및 5f에 도시된 것과 같은, FACS 판독은 안정적으로 형질감염된 세포 집단에서의 발현의 분포, 특히 포유류 Tn-저항성 선택 마커, CHO-GPT 및 hGPT를 이용하여 극적인 선택 효율의 증가를 예시한다. 포유류 GPT 발현은 관심 유전자 산물, 예를 들어 형광 단백질, eGFP의 생산의 발현을 더욱 향상시킨다. Tn의 농도를 증가시키는 연속 배양의 결과 도 6b에서 예시된 바와 같이, Tn의 한 농도에 기초한 배양 조건 하에서 GPT를 사용하는 발현 체계에서 발현된 GOI와 비교하여 약 2배의 향상된 발현을 초래한다.

본 발명은 GPT 유전자가 외인성이고 본 발명의 방법에 의해 세포 게놈에 통합되는 이러한 GPT 유전자를 포함하는 포유류 세포를 포함한다. GPT 유전자의 상류 또는 하류에 있는 적어도 하나의 외생적으로 부가된 관심 유전자(GOI)를 갖는 이러한 GPT 유전자를 포함하는 세포.

다양한 실시예에서, GOI의 발현은 포유류 선택성 마커 GPT의 제어 하에 GOI를 위치시킴으로써 향상될 수 있다. 다른 실시예들에서, 무작위 GOI의 통합 행위는 포유류 선택성 마커 GPT의 제어 하에 GOI를 위치시키고 0.5μg/mL 초과 Tn 농도를 포함하는 세포 배양 조건을 제공함으로써 향상될 수 있다. 일부 실시예에서, 세포 배양 조건은 1μg/mL 초과 Tn 농도를 포함한다. 조절 요소는 GOI에 작동 가능하게 연결될 수 있는데, 이때 GOI의 발현-GOI 및 GPT (5 '또는 3' 방향)로부터 선택된 거리에서-은 예를 들어, 일반적으로 무작위 통합 행위로 인해 관찰된 발현에 비해 GOI의 발현을 향상시키는 능력을 보유한다. 다양한 실시예에서, 향상은 약 1.5배 내지 약 2배 또는 그 이상이다. 무작위 통합, 또는 무작위 발현과 비교하여 발현 향상은 약 1.5배 또는 약 2배 또는 그 이상이다.

또 다른 실시예에서, 균일하게 당질화된 단백질이 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 달성될 수 있다. 표 4에서 볼 수 있듯이, Tn으로 처리한 GPT/GOI 재조합 단백질 배치(batch)는 동등한 당질화 프로파일을 갖는 복제물 배치를 허용한다. 이와 같이, 일관된 당질화 프로파일과 같은 향상된 단백질 발현은 본원에서 교시된 Z-수를 계산함으로써 직접적으로 비교될 수 있다. Z-수 방정식은 시알 산 (sialic acid; SA) 잔기를 나타내는 크로마토그램의 상대적 피크 수, 뿐만 아니라 각 피크의 상대적 모양 및 강도를 고려한다. Z-수는 각 피크가 점유한 면적에 기반하며 복합체 당단백질에 대한 일관성의 척도로 사용될 수도 있다 (예 도 도 7a 내지 도 7d, 도 8 및 실시예 3 참조.

단백질 발현 최적화는 또한 예를 들어, 발현 카세트 배향 또는 코돈 최적화를 포함하여, 각 GOI에 대해 달성될 수 있다. 단백질 최적화는 또한 세포 배양 방법에서 증분식 Tn 농도를 변화시킴으로써 달성될 수도 있다.

재조합 발현 벡터는 포유류, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래된 적절한 전사 및/또는 번역 조절 요소에 작동 가능하게 연결된, 단백질을 암호화하는 합성 또는 cDNA 유래 DNA 단편을 포함할 수 있다. 이러한 조절 요소는 본원에서 상세히 기술된 바와 같이, 전사 프로모터, 인핸서, 적절한 mRNA 리보솜 결합 부위를 암호화하는 서열, 및 전사 및 번역의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 또한 포유류 발현 벡터는 복제 기원, 다른 5' 또는 3' 측면에 위치하는 비-전사 서열, 5' 또는 3' 비-번역 서열, 예컨대 스플라이스 공여자 및 수여자 부위 같은 비-전사 요소를 포함할 수 있다. 형질감염체의 인식을 용이하게 하기 위한 부가적인 선택성 마커 유전자 (예, 형광 마커) 또한 통합될 수도 있다.

또 다른 실시예에서, 벡터는 기술된 핵산 분자(유전자)를 포함하는 발현 벡터를 포함하여, 관심 단백질을 암호화하는 핵산 분자(또는 관심 유전자)를 포함하며, 여기서 상기 핵산 분자(유전자)는 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다.

관심 유전자(GOI)를 포함하는 벡터가 제공되며, 여기서 상기 GOI는 포유류 숙주 세포에서의 발현에 적절한 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다.

본 발명에서 사용될 수도 있는 유용한 프로모터는 SV40 초기 프로모터 영역, Rous 육종 바이러스의 3' 긴 말단 반복체에 함유된 프로모터, 메탈로티오닌 유전자의 조절 서열, 마우스 또는 인간 세포거대바이러스(cytomegalovirus) IE 프로모터 (Gossen 등, (1995) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:5547-5551), 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S RNA 프로모터, 광합성 효소 리불로오스 이인산 카르복실라아제의 프로모터, 효모 또는 다른 균류 유래 프로모터, 예컨대 Gal 4 프로모터, ADC (알코올 탈수소효소) 프로모터, PGK (phosphoglycerol kinase) 프로모터, 알칼리 포스파타아제 프로모터, 및 조직 특이성을 나타내며 트랜스제닉 동물에서 사용된 하기 동물 전사 조절 영역: 엘라스타제 I; 인슐린; 면역글로불린; 마우스 유방 종양 바이러스; 알부민; α-태아단백질; α1-항트립신; β-글로빈; 및 미오신 경쇄-2를 포함하지만, 이들에만 한정되지는 않는다.

본 발명의 핵산 분자는 또한 효과적인 폴리 (A) 종결 서열, 예를 들어 SV40 폴리(A), 대장균에서 플라스미드 산물을 위한 복제 기점 및/또는 간편한 클로닝 부위(예, 폴리링커)에 작동 가능하게 연결될 수도 있다. 또한 핵산은 CMV IE와 같은 구성적(constitutive) 프로모터와는 대조적으로 조절가능한 유도성(inducible) 프로모터 (유도성, 억제성, 발달적으로 조절됨)를 포함할 수도 있다 (당업자라면 그러한 용어들이 소정의 조건 하에서 실제로 유전자 발현 정도의 설명어임을 인식할 것이다).

본 발명은 관심 단백질을 생산하는 방법을 제공하며, 관심 유전자(GOI)를 포함하는 발현 벡터가 제공된다. 그러한 발현 벡터는 임의의 관심 단백질의 재조합 생산에 사용될 수도 있다. 척추동물 세포를 형질감염시키는 데 유용한 발현 벡터에서의 전사 및 번역 조절 서열은 바이러스 출처에 의해 제공될 수도 있다. 예를 들어, 일반적으로 사용되는 프로모터 및 인핸서는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 시미안 바이러스 40 (SV40) 및 인간 세포거대바이러스 (CMV)와 같은 바이러스로부터 유래한다. 그러한 조절 서열이 선택된 숙주 세포와 양립할 수 있다면, 바이러스 게놈 프로모터, 제어 및/또는 신호 서열이 발현을 유도하는데 사용될 수도 있다. 또한 재조합 단백질이 발현되어야 하는 세포 유형에 따라, 비-바이러스 세포 프로모터가 사용될 수도 있다 (예,β-글로빈 및 EF-1α 프로모터).

SV40 바이러스 게놈, 예를 들어 SV40 기원, 초기 및 후기 프로모터, 인핸서, 스플라이스 및 폴리아데닐화 부위로부터 유래된 DNA 서열을 사용해서 이종 DNA 서열의 발현에 유용한 다른 유전 요소를 제공할 수도 있다. 초기 및 후기 프로모터는 둘 다 SV40 바이러스 복제 기점을 또한 포함하는 단편으로서 SV40 바이러스에서 쉽게 얻어지기 때문에 특히 유용하다 (Fiers 등, Nature 273:113, 1978). 더 작거나 더 큰 SV40 단편 또한 사용할 수도 있다. 통상적으로, Hind III 부위로부터 SV40 복제 기점에 위치하는 BglI 부위 쪽으로 연장되는 약 250bp 서열이 포함된다.

다중 전사체의 발현에 사용되는 바이시스트론(Bicistronic) 발현 벡터는 이전에 기술되어 있으며 (Kim S. K. 및 Wold B. J., Cell 42:129, 1985; Kaufman 등 1991, 상기), GPT 발현 체계와 함께 사용될 수 있다. 다른 유형의 발현 벡터도 또한 유용할 것이며, 예를 들어 미국 특허 제4,634,665호 (Axel 등) 및 미국 특허 제4,656,134호(Ringold 등)에 기재된 것이다.

통합 부위, 예를 들어 재조합 효소 인식 부위는 POI를 암호화하는 유전자 서열에 5' 또는 3'에 위치할 수 있다. 적절한 통합 부위의 한 예는 lox p 부위이다. 적절한 통합 부위의 다른 예는 2개의 재조합 효소 인식 부위, 예를 들어 lox p 부위, lox 및 lox 5511 부위로 이루어진 군으로부터 선택된다.

유전자 증폭 카세트 및 그의 발현 벡터

이전에 기술되었거나 당업계에 공지된 유용한 조절 요소는 또한 포유류 세포를 형질감염시키는 데 사용되는 핵산 구조체에 포함될 수 있다. 도 1은 프로모터 서열, IRES 서열, 관심 유전자 및 폴리(A) 서열을 추가로 포함하는 GPT 벡터의 작동 카세트를 예시한다.

본 발명의 문맥에서 발현 벡터는 염색체, 비-염색체 및 합성 핵산 벡터(적절한 발현 조절 요소 세트를 포함하는 핵산 서열)를 포함하는, 임의의 적합한 벡터일 수도 있다. 이러한 벡터의 예는 SV40의 유도체, 세균 플라스미드, 파아지 DNA, 바큘로바이러스, 효모 플라스미드, 플라스미드 및 파지 DNA의 조합에서 유도된 벡터, 및 바이러스 핵산(RNA 또는 DNA) 벡터를 포함한다. 일 실시예에서, 항체-암호화 핵산 분자는 예를 들어, (Sykes and Johnston, Nat Biotech 12, 355-59 (1997)에 기술된 바와 같이) 선형 발현 요소를 포함하여, 네이키드(naked) DNA 또는 RNA 벡터, (예를 들어, 미국 특허 제6,077,835호 및/또는 WO 00/70087에 기재된 바와 같은) 압축된 핵산 벡터, 또는 플라스미드 벡터, 예컨대 pBR322, pUC 19/18 또는 pUC 118/119에 포함되어 있다. 그러한 핵산 및 그의 용도는 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, 미국 특허 제5,589,466호 및 미국 특허 제5,973,972호 참조).

발현 벡터는 대안적으로 효모 체계에서의 발현에 적합한 벡터일 수도 있다. 효모 체계에서의 발현에 적합한 어떠한 벡터도 사용될 수도 있다. 적합한 벡터는 예를 들어, 구성적 또는 유도성 프로모터를 포함하는 벡터, 예컨대 효모 알파 인자, 알코올 산화효소 및 PGH를 포함한다 (F. Ausubel 등, ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York (1987), 및 Grant 등, Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987)에서 검토되었음).

소정의 실시예들에서, 벡터는 기술된 핵산 분자(유전자)를 포함하는 발현 벡터를 포함하여, 관심 단백질을 암호화하는 핵산 분자(또는 관심 유전자)를 포함하며, 여기서 상기 핵산 분자(유전자)는 숙주 세포에서의 발현에 적합한 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다.

발현 조절 서열은 관심 유전자의 전사와, 다양한 세포 체계에서의 단백질의 후속 발현을 제어하고 유도하도록 조작된다. 플라스미드는 발현가능한 관심 유전자를 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 선택성 마커, 작동자 등과 같은 바람직한 조절 요소를 포함하는 발현 조절 서열(즉, 발현 카세트)과 결합한다. 본 발명의 발현 벡터에서, GPT 및 관심 단백질, 예컨대 항체-암호화 핵산 분자는 임의의 적합한 프로모터, 인핸서, 작동자, 억제자 단백질, 폴리(A) 종결 서열 및 기타 발현 촉진 요소를 포함할 수도 있고 이들과 결합될 수도 있다.

항체-암호화 뉴클레오티드 서열과 같은 관심 유전자의 발현은 당업계에 공지된 임의의 프로모터 또는 인핸서 요소의 제어 하에 놓일 수도 있다. 이러한 요소의 예로는 강한 발현 프로모터 (예, 인간 CMV IE 프로모터/인핸서 또는 CMV 메이저 IE (CMV-MIE) 프로모터, 뿐만 아니라 RSV, SV40 후기 프로모터, SL3-3, MMTV, 유비퀴틴 (Ubi), 유비퀴틴 C (UbC), 및 HIV LTR 프로모터)를 포함한다.

일부 실시예에서, 벡터는 SV40, CMV, CMV-IE, CMV-MIE, RSV, SL3-3, MMTV, Ubi, UbC 및 HIV LTR로 구성된 군으로부터 선택된 프로모터를 포함한다.

본 발명의 핵산 분자는 또한 효과적인 폴리 (A) 종결 서열, 대장균에서 플라스미드 산물을 위한 복제 기점, 선택성 마커로서 항생제 저항성 유전자 및/또는 간편한 클로닝 부위(예, 폴리링커)에 작동 가능하게 연결될 수도 있다. 또한 핵산은 CMV IE와 같은 구성적(constitutive) 프로모터와는 대조적으로 조절가능한 유도성(inducible) 프로모터 (유도성, 억제성, 발달적으로 조절됨)를 포함할 수도 있다 (당업자라면 그러한 용어들이 소정의 조건 하에서 실제로 유전자 발현 정도의 설명어임을 인식할 것이다).

선택성 마커는 당업계에 잘 알려진 요소이다. 어떤 상황에서는, GPT 이외에 추가적인 선택성 마커가 사용될 수도 있는데, 여기서 마커는 세포를 보이게 한다. 양성 또는 음성 선택을 사용할 수도 있다.

일부 실시예에서, 벡터는 녹색 형광 단백질 (GFP), 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP), 시아노 형광 단백질 (CFP), 향상된 시아노 형광 단백질 (eCFP), 황색 형광 단백질 (YFP) 또는 향상된 황색 형광 단백질 (eYFP)을 암호화하는 하나 이상의 선택성 마커 유전자를 포함한다.

본 발명의 목적상, 진핵 세포에서의 유전자 발현은 조절 융합 단백질(regulatory fusion protein; RFP)에 의해 차례로 조절되는 작동자에 의해 제어되는 강한 프로모터를 사용하여 엄격히 조절될 수도 있다. RFP는 본질적으로 전사 차단 도메인과 그 활성을 조절하는 리간드-결합 도메인으로 구성된다. 이러한 발현 체계의 예는 US20090162901A1에 기재되어 있으며, 그 전문이 본원에 참고로 인용된다.

원핵 세포와 박테리오파지에서 여러 가지 작동자가 잘 특성화되어 있다 (Neidhardt, ed. Escherichia coli and Salmonella; Cellular and Molecular Biology 2d. Vol 2 ASM Press, Washington D.C. 1996). 이들은 LexA 펩티드를 결합하는 대장균의 LexA 유전자의 작동자 영역, 대장균의 LacI 및 trpR 유전자에 의해 암호화된 억제자 단백질을 결합하는 락토오스 및 트립토판 작동자를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 이들은 또한 람다 cI와 P22 arc에 의해 암호화된 억제자 단백질을 결합하는 람다 P_R과 파지 P22 ant/mnt 유전자의 박테리오파지 작동자를 포함한다. 일부 실시예에서, 억제자 단백질의 전사 차단 도메인이 NotI와 같은 제한 효소일 때, 작동자는 그 효소에 대한 인식 서열이다. 당업자라면 작동자가 프로모터에 의해 전사를 제어할 수 있도록 상기 프로모터에 인접하거나 또는 3'에 위치해야 한다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제5,972,650호는 tetO 서열이 TATA 박스로부터 특정 거리 내에 있어야 한다고 규정하고 있다. 특정 실시예에서, 작동자는 바람직하게는 프로모터 바로 하류에 위치한다. 다른 실시예들에서, 작동자는 프로모터의 10개 염기 쌍 내에 위치한다.

소정의 실시예들에서, 작동자는 tet 작동자 (tetO), NotI 인식 서열, LexA 작동자, 락토오스 작동자, 트립토판 작동자 및 Arc 작동자 (AO)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시예에서, 억제자 단백질은 TetR, LexA, LacI, TrpR, Arc, LambdaC1 및 GAL4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시예들에서, 전사 차단 도메인은 진핵 세포 억제자 단백질, 예를 들어, GAL4에서 유래한 억제자 도메인에서 유래한다.

예시적인 세포 발현 체계에서, 세포는 테트라사이클린 억제자 단백질(TetR)을 발현하도록 조작되고 관심 단백질은 그 활성이 TetR에 의해 조절되는 프로모터의 전사 제어 하에 놓인다. 2개의 탠덤 TetR 작동자(tetO)는 벡터에서 CMV-MIE 프로모터/인핸서의 바로 하류에 위치한다. 그러한 벡터에서 CMV-MIE 프로모터에 의해 유도된 관심 단백질을 암호화하는 유전자의 전사는 테트라사이클린 또는 몇몇 다른 적합한 유도자(예, 독시사이클린)의 부재 하에 TetR에 의해 차단될 수도 있다. 유도자의 존재 하에서, TetR 단백질은 tetO에 결합할 수 없으므로, 따라서 관심 단백질의 전사와 이어서 번역(발현)이 일어난다. (예, 미국 특허 제7,435,553호 참조, 이는 그 전문이 본원에 참고로 인용됨).

또 다른 예시적인 세포 발현 체계는 TetR-ER_LBDT2 융합 단백질과 같은 조절 융합 단백질을 포함하는데, 상기 융합 단백질의 전사 차단 도메인이 TetR이고 리간드-결합 도메인이 에스트로겐 수용체 리간드-결합 도메인(ER_LBD)이며, T2 돌연변이를 보유한다 (ER_LBDT2; Feil 등 (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 237:752-757). tetO 서열을 강한 CMV-MIE 프로모터 하류와 근위 거리에 놓았을 때, CMV-MIE/tetO 프로모터 유래 관심 뉴클레오티드 서열의 전사는 타목시펜의 존재 시에 차단되었으며 타목시펜의 제거에 의해 차단해제되었다. 또 다른 예에서, 15개 아미노산 링커와 ER_LBDT2 (상기)로 연결된 2개의 Arc 단백질로 구성된 단일 사슬 이합체로 구성된 융합 단백질인, 융합 단백질 Arc2-ER_LBDT2는, Arc 작동자(AO)와 연관되며, 보다 특이적으로는 CMV-MIE 프로모터/인핸서의 바로 하류에 있는 두 개의 탠덤 arc 작동자와 연관된다. 세포주는 Arc2-ER_LBDT2에 의해 조절될 수도 있는데, 관심 단백질을 발현하는 세포는 CMV-MIE/ArcO2 프로모터에 의해 유도되고 타목시펜의 제거로 유도 가능하다. (예, US 20090162901A1 참조, 이는 본원에 참고로 인용됨).

일부 실시예에서, 본 발명의 벡터는 CMV-MIE/TetO 또는 CMV-MIE/AO2 혼성 프로모터를 포함한다.

본 발명의 벡터는 관심 유전자의 복제를 용이하게 하기 위해 재조합 기술을 위한 Cre-lox 도구를 사용할 수도 있다. Cre-lox 전략은 적어도 두 가지 구성요소를 필요로 한다: 1) 두 개의 loxP 부위 간에 재조합을 촉매하는 효소인, Cre 재조합 효소; 및 2) loxP 부위 (예, 재조합이 일어나는, 8-bp 코어 서열과, 두 개의 측면에 위치하는 13-bp의 역방향 반복으로 구성된 특이적 34-염기쌍 bp 서열) 또는 돌연변이 lox 부위. (예. Araki 등 PNAS 92:160-4 (1995); Nagy, A. 등 Genesis 26:99-109 (2000); Araki 등 Nuc Acids Res 30(19):e103 (2002); 및 US20100291626A1 참조, 이들 전부는 본원에 참고로 인용됨). 다른 재조합 전략에서, 효모-유래 FLP 재조합 효소가 컨센서스 서열 FRT과 함께 활용될 수도 있다 (역시, 예, Dymecki, S. PNAS 93(12): 6191-6196 (1996) 참조).

또 다른 측면에서, 유전자(즉, 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열)가 발현 카세트의 GPT 유전자의 상류 또는 하류에 삽입되고, 선택적으로 프로모터에 작동 가능하게 연결되며, 여기서 프로모터-연결 유전자는 제1 재조합 효소 인식 부위 5' 옆에 위치하고 제2 재조합 효소 인식 부위 3' 옆에 위치한다. 이러한 재조합 효소 인식 부위는 발현 체계의 숙주 세포에서 Cre-매개 재조합을 허용한다. 일부 경우에는, 제2 프로모터-연결 유전자가 제1 유전자의 하류(3')에 있고 제2 재조합 효소 인식 부위 3' 옆에 위치한다. 또 다른 경우에, 제2 프로모터-연결 유전자는 제2 재조합 단백질 부위 5' 옆에 위치하며, 제3 재조합 단백질 인식 부위 3' 옆에 위치한다. 일부 실시예에서, 재조합 효소 인식 부위는 loxP 부위, lox511 부위, lox2272 부위 및 FRT 부위로부터 선택된다. 다른 실시예들에서, 재조합 효소 인식 부위는 다르다. 추가의 실시예들에서, 숙주 세포는 Cre 재조합 효소를 발현할 수 있는 유전자를 포함한다.

일 실시예에서, 벡터는 본 발명의 항체의 경쇄 또는 항체의 중쇄를 암호화하는 제1 유전자 및 본 발명의 항체의 경쇄 또는 항체의 중쇄를 암호화하는 제2 유전자를 포함한다.

일부 실시예에서, 벡터는 소포체(ER)에서의 단백질 접힘에 관여하는 유전자들의 발현을 조절하여 단백질 생산/단백질 분비를 더욱 향상시킬 수 있는 X-box-결합-단백질 1 (mXBP1) 유전자를 더 포함한다. (예, Ron D 및 Walter P. Nat Rev Mol Cell Biol.8:519-529 (2007) 참조).

임의의 세포는 본 발명의 재조합 핵산 서열을 발현하는 데 적합하다. 본 발명에서 사용된 세포는 인간 이외의 동물 세포, 인간 세포와 같은 포유류 세포, 또는 예를 들어 하이브리도마 또는 쿼드로마와 같은 세포 융합체를 포함한다. 소정의 실시예들에서, 세포는 인간, 원숭이, 햄스터, 랫트, 또는 마우스 세포이다. 다른 실시예들에서, 세포는 진핵 세포이고, 다음의 세포로부터 선택된다: CHO(예를 들어, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS(예를 들어, COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장(예를 들어, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK21), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo25, HB 8065, HL-60, Jurkat, Daudi, A431 (epidermal), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 세포, 종양 세포, 및 전술된 세포로부터 유래한 세포주. 일부 실시예에서, 세포는 하나 이상의 바이러스 유전자, 예를 들어, 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포(예를 들어, PER.C6® cell)를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 항체 또는 이중특이적 분자와 같은 면역 글로불린을 생산하는 트랜스펙토마(transfectoma)와 같은 재조합 포유류 숙주 세포에 관한 것이다. 이러한 숙주 세포의 예로 CHO 또는 HEK 세포와 같은 조작된 포유류 세포을 포함한다. 예를 들어, 일 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 포함하는 항체의 발현을 암호화하는 서열을 포함하는 세포의 게놈에 안정적으로 통합되는 핵산을 포함하는 세포를 제공한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 포함하는 항체의 발현을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드, 코스미드, 파아지미드, 또는 선형 발현 요소와 같은 비-통합(즉, 에피좀) 핵산을 포함하는 세포를 제공한다. 다른 실시예들에서, 본 발명은 본 발명의 발현 벡터를 포함하는 플라스미드로 숙주 세포를 안정적으로 형질감염하여 생산되는 세포주를 제공한다.

따라서, 하나의 측면에서, 본 발명은 (a) 외생적으로 부가된 포유류 GPT 유전자를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드 및 (b) 다중-서브유닛 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 세포를 제공한다. 일부 실시예에서, 상기 외생적으로 부가된 GPT 유전자는 서열번호 2의 핵산 서열에 90% 동일성이 있고, 이의 비-제한적 예는 서열번호 11 내지 17에 제공되어 있고, 상기 다중-서브유닛 단백질은 항체이다. 다른 실시예들에서, 상기 세포는 또한 외생적으로 부가된 GPT 유전자, 및 조절 요소를 함유한다. 일 실시예에서, 상기 세포는 생물약제 제조에 사용되는 CHO 세포와 같은 포유류 세포이다.

다른 측면에서, 본 발명은 이전 측면에서 설명된 상기 세포에서 유래한 세포주를 제공한다. “유래된”에 의해, 이는 개별 세포에서 클론에 의해 유래되고 주어진 역가에서 활성 단백질을 생산하는 능력 또는 특정 밀도로 확산되는 능력과 같은 몇몇 선택된 특성을 가진 세포 군집을 의미한다. 일부 실시예에서, 포유류 GPT 유전자를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드 및 다중-서브유닛 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 가진 세포에서 유래한 상기 세포주는 배지 리터당 적어도 3 그램(g/L), 적어도 5 g/L 또는 적어도 8 g/L의 역가로 상기 다중-서브유닛 단백질을 생산할 수 있다. 일부 실시예에서, 상기 세포주는 상기 GPT를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 없으나 본질적으로 같은 세포에서 유래된 세포주에 의해 달성할 수 있는 상기 통합된 세포 밀도보다 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 60% 또는 적어도 90% 큰 통합된 세포 밀도(ICD)를 달성할 수 있다.

상기 GOI를 증폭하는 방법을 제공한다. 상기 예시된 방법은 튜니카마이신 농도 증가를 진핵 GPT 발현 체계에 적용하여, 외생적으로 부가된 포유류 GPT 유전자에 작동가능하게 연결된 GOI의 상기 유전자 사본을 증폭시킨다.

관심 단백질

관심 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 Tn 저항성 마커 유전자 및 IRES를 포함하는 세포로 편리하게 통합될 수 있고, 재조합효소 인식부위 옆에 선택적으로 존재할 수 있다. 포유류 세포에서 발현에 적합한 어떤 관심 단백질이 사용될 수 있으나, 당단백질은 특히 본 발명의 방법으로부터 이익을 얻을 것이다. 예를 들어, 상기 관심 단백질은 항체 또는 이들의 항원-결합 단편, 이중 특이적 항체 또는 이들의 단편, 키메릭 항체 또는 이들의 단편, ScFv 또는 이들의 단편, Fc-태그된 단백질(예를 들어, Trap 단백질) 또는 이들의 단편, 성장 인자 또는 이들의 단편, 사이토카인 또는 이들의 단편, 또는 세포 표면 수용체의 세포외 도메인 또는 이들의 단편일 수 있다.

아스파라긴-연결(N-연결) 글리칸을 가진 당단백질은 진핵 세포에서 아주 흔하다. 이들 글리칸의 생합성 및 폴리펩티드로의 이들의 전달은 소포체(ER)에서 일어난다. N-글리칸 구조는 소포체 및 골지체에서 다수의 글리코시다아제 및 글리코실-트랜스퍼라제에 의해 더욱 변형된다. 본 발명을 사용한 단백질 생산은 면역원성 결정인자(“글리코토프(glycotopes)”)를 제거하기 위해 상기 네이티브(native) N-글리칸 구조의 일관성을 지향한다.

본 발명의 방법을 사용하여, 재조합 단백질 롯트는 유리한 특성을 나타낸다. 복제 단백질 생산 배치의 HPLC(형광 검출과 함께)는 도 7 및 8에 예시된 바와 같이 상기 당단백질이 균일한 발현 및 당질화 패턴을 가진다는 것을 보여주었다. N-글리칸 단백질 기질을 당질화하는 방법이 제공되어, 당질화를 필요로하는 단백질 기질을 암호화하는 유전자에 작동가능하게 연결된 포유류 튜니카마이신(Tn)-저항성 유전자를 포함하는 핵산 분자를 암호화하는 포유류 숙주 세포가 제공되며; 상기 세포를 제1 농도의 Tn 존재 하에 배양하고; Tn-저항성 유전자의 적어도 하나의 사본을 발현하는 세포 군집을 분리하고; 상기 세포 군집을 Tn 농도의 증가시 배양하고; 및 상기 N-글리칸 단백질 기질을 세포 배양액으로부터 분리한다. 상기 단백질 기질의 N-글리칸 성분을 당해 기술 분야에 알려진 어떤 방법에 의해 단당류 및 올리고당의 존재에 대해 평가할 수 있다.

글리칸-연결 단백질의 상세한 구조 분석은 상기 단백질의 기능적 특징과 상호 관련될 수 있다. 단백질 당질화를 특징으로하는 이러한 분석은 일반적으로 여러 단계를 포함한다: i) 상기 접착된 글리칸의 효소적 또는 화학적 방출; ii) 방향족 또는 지방족 아민을 이용한 환원성 아미노화에 의한 방출된 글리칸의 유도체화 또는 퍼메틸화; iii) 상기 글리칸의 분석. 당업자에게 알려져있는 당질화 패턴 분석의 다양한 변화. 당단백질은 특정한 양으로 다양한 부위를 차지하는 여러 종류의 글리코폼을 담지하므로 이들의 복잡성은 어떤 생산 방법에서 이의 재생산을 어렵게 만들 수 있다. 글리코폼의 종류 및 양의 일관성은 측정 가능하고 치료적 단백질 생산을 위한 바람직한 결과를 나타낸다.

숙주 세포 및 형질감염

본 발명의 방법에서 사용된 포유류 숙주 세포는 통상 포유류 세포, 예를 들어, CHO 세포 및 마우스 세포를 포함하는 진핵 숙주 세포이다. 일 실시예에서, 본 발명은 Cricetulus griseus (중국 햄스터; 서열번호 3에 기재)에서 유래된 Tn 저항성 마커 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 세포, 이들의 동족체 또는 변이체를 제공한다. 일부 실시예에서, 상기 세포는 상기 Tn 저항성 마커 유전자의 다수의 유전자 사본을 포함한다. 다른 실시예들에서, 본 발명은 인간(서열번호 4), 히말라야 원숭이(서열번호 5), 침팬지(서열번호 6), 개(서열번호 7), 기니아 피그(서열번호 8), 랫트(서열번호 9) 또는 마우스(서열번호 10)에서 유래된 Tn 저항성 마커 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 제공한다.

본 발명은 본 발명의 발현 벡터로 형질감염시킨 포유류 숙주 세포를 포함한다. 형질감염된 숙주 세포는 관심 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함하는 발현 벡터로 형질감염시킨 세포를 포함한다. 발현된 단백질은 일반적으로 상기 선택된 핵산 서열에 따라 배양 배지로 분비될 것이나, 상기 세포 내에 유지 또는 세포막 내에 침전될 수 있다. 다양한 포유류 세포 배양 시스템은 재조합 단백질을 발현하는데 사용될 수 있다. 적합한 포유류 숙주 세포주의 예로 Gluzman(1981) Cell 23:175에 기재된 원숭이 신장 세포주 COS-7, 및 예를 들어, CV-1/EBNA(ATCC CRL 10478), L 세포, C127, 3T3, CHO, HeLa 및 BHK 세포주를 포함하는, 적합한 벡터를 발현할 수 있는 다른 세포주를 포함한다. 특정한 선택 또는 증폭 계획을 위해 개발된 다른 세포주 역시 본 발명에서 제공된 방법 및 조성물과 함께 사용될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 세포는 CHO 세포주-지정 K1(즉, CHO K1 세포)이다. 재조합 단백질의 고부피 생산이라는 목표를 달성하기 위해, 상기 숙주 세포주는 적합한 경우에 생물 반응기 배지에 사전 적응된다.

여러 형질감염 프로토콜이 당해 기술 분야에 알려져 있고, Kaufman(1988) Meth. Enzymology 185:537에서 검토된다. 선택된 형질감염 프로토콜은 숙주 세포 종류 및 상기 GOI의 성질에 의존하며 일상적인 실험을 기반으로 선택될 수 있다. 이러한 프로토콜의 기본 요건은 상기 관심 단백질을 암호화하는 DNA를 적합한 숙주 세포로 도입한 다음, 상대적으로 안정하고, 발현가능한 방식으로 상기 이종 DNA를 편입하는 숙주 세포를 동정 및 단리시키는 것이다.

이종 DNA를 포유류 세포로 도입하는데 유용한 어떤 시약은 리포펙틴(Lipofectin™) 시약 및 리포펙타민(Lipofectamine™) 시약(Gibco BRL, Gaithersburg, Md.)을 포함한다. 이들 시약은 모두 지질-핵산 복합체(또는 리포좀)를 형성하는데 사용되는 상업적으로 이용가능한 시약으로, 배양된 세포에 적용시, 핵산을 상기 세포 내로 쉽게 흡수시킨다.

선택된 형질감염 프로토콜 및 본 발명에서 사용되도록 선택된 구성요소는 사용된 숙주 세포의 종류에 의존할 것이다. 당업자는 수많은 다른 프로토콜 및 숙주 세포를 알고 있으며, 사용된 세포 배양 시스템의 요건을 기준으로 목적하는 단백질의 발현을 위한 적합한 시스템을 선택할 수 있다. 또 다른 측면에 따라, 본 발명은 항체, 이중 특이적 항체, 키메릭 항체, ScFv, 항원-결합 단백질, 또는 Fc 융합 단백질을 포함하는 폴리펩티드을 암호화하는 발현 벡터에 관한 것으로, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 발현 벡터는 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 폴리펩티드의 재조합 생산을 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 특징은 본 발명의 설명을 위해 제공된 바람직한 실시예에 대한 이하의 설명 과정에서 명백해질 것이나 본 발명을 제한하기 위한 것은 아니다.

실시예

하기 실시예는 당해 기술 분야의 당업자에게 본원에 기재된 방법 및 조성물을 제조하고 사용하는 방법을 제공하기 위해 제시되나 발명자가 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하려는 것은 아니다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위한 노력을 기울였으나 약간의 실험 오차와 편차에 대해서는 설명되어야 한다. 달리 언급이 없는 한, 부(parts)는 중량부, 분자량은 평균 분자량, 온도는 섭씨 온도, 압력은 대기압 또는 그 주변을 의미한다.

실시예 1. GPT를 발현하는 형질감염체 세포의 선택 효율.

변형된 CHO K1 세포는 CHO-GPT를 함유한 플라스미드 벡터(서열번호 2), 인간 GPT(서열번호 12) 또는 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제를 포함한 플라스미드 벡터(Hpt, 히그로마이신 저항성 유전자)로 형질감염되었다; 예를 들어, 상기 선택 마커 유전자(CHO-GPT or hpt)는 이들 각각의 벡터에서 IRES 서열을 통해 eGFP 유전자 하부에 전사적으로 연결된다. 예를 들어, 각 플라스미드는 5’에서 3’ 방향으로 다음의 유전자 서열을 함유하도록 제조되었다: Lox 자리, SV40 후기 프로모터, CHO-GPT(또는 Hpt), IRES, 향상된 녹색 형광 단백질(eGFP), 및 두번째 Lox 자리. 정제된 재조합 플라스미드는 Cre 재조합효소를 발현하는 플라스미드와 함께 5' 에서 3' 방향으로 전사적으로 활성 자리에 lox 자리, YFP 및 두번째 lox 자리를 함유하는 변형된 CHO 숙주 세포주로 형질감염되었다. 따라서, 상기 숙주 CHO 세포는 녹색-양성 또는 노란색-음성 세포로서 유세포 분석으로 분리될 수 있다. 상기 eGFP을 발현하는 재조합 플라스미드(상기 GPT 또는 hpt 유전자에 의해 전사적으로 조절)가 Cre 재조합효소를 발현하는 플라스미드와 함께 형질감염되면, 상기 Cre 재조합효소에 의해 매개된 재조합으로 상기 lox 자리를 가진 염색체 자리에서 GPT/eGFP 카세트의 부위-특이적 통합이 이루어지며 YFP 유전자의 치환이 일어난다(즉, 녹색-양성 세포). 상기 eGFP가 무작위적으로 통합되면, 녹색-양성 및 노란색-양성 세포 모두를 얻을 것이다.

세포 군집을, 표 2에 요약된 바와 같이, 0, 1 μg/ml, 2.5 μg/ml 또는 5 μg/ml 튜니카마이신(Tn) 또는 400 μg 히그로마이신(Hyg)과 함께 배양하였다. 관찰된 재조합 군집(ORPs)을 형광표지 세포 분류 분석법(FACS) 에 의해 측정하였다. 세포의 각 군집을 정량하기 위해 세포를 분류하였으며, YFP가 아닌 GFP만 발현하는 세포에 대해 선택 효율을 계산하였다(도 4 또는 5).

선택 효율(생존한 GFP 발현 세포의 퍼센트 군집)을 Tn나 Hyg에 저항성 있는 세포 풀 내에서 비교하였다(표 2).

선택 효율

Hpt 또는 GPT	Cre	선택 제제 (ug/ml Hyg 또는 Tn)	선택 효율 %(총 GFP+)
Hpt	+	-	1.35
Hpt	+	+ (400 Hyg)	98.8
choGPT	+	-	0.89
choGPT	+	+ (1Tn)	86.9
choGPT	+	+ (2.5 Tn)	96.1
hGPT	+	-	2.6
hGPT	+	+ (1Tn)	97
hGPT	+	+ (2.5 Tn)	96.7

튜니카마이신 선택이 히그로마이신 선택만큼 효율적이라는 것을 관찰하였다. CHO-GPT와 인간 GPT 모두는 1 μg/ml 또는 2.5 μg/ml 튜니카마이신의 존재 하에 통합 성분의 선택에 효율적이었다. 실시예 2. 유전자 산물의 증폭.

튜니카마이신의 농도 증가를 GPT 발현 체계에 적용하여 증분 선택이 이루어졌다. CHO K1 세포를 상술한 CHO-GPT 유전자(서열번호 2) 를 함유한 플라스미드 벡터로 형질감염하였다. 상기 플라스미드는 5’에서 3’ 방향으로 첫번째 Lox 자리, SV40 후기 프로모터, 상기 CHO-GPT 유전자, IRES, eGFP, 및 두번째 Lox 자리를 함유한다. 상기 관심 유전자의 게놈으로의 CRE-lox 자리-지정 통합으로 세포당 적어도 하나의 GPT 삽입를 가지는 안정된 세포의 형질감염체 풀이 된다. (앞서 확인된 바와 같이, 무작위 통합으로 인해 더 많은 통합 성분이 발생될 수 있다). CHO 세포를 초기에 1 μg/ml 튜니카마이신(Tn)의 존재 하에 배양하였다. 이후 형질감염체는 안정된 풀(세포 풀 2으로 명명)에서 선택된 다음 1 μg/ml, 2.5 μg/ml 또는 5 μg/ml Tn의 존재 하에 확장되었다. eGFP의 발현(다수의 사본)을 향상시킬 수 있는 세포 군집을 확인하기 위해 여러 차례의 선택과정이 수행되었다. 2.5 μg/ml 또는 5 μg/ml Tn의 존재 하에, 상기 무작위 통합 사건이 크게 증가되었다.

유전자 산물, 예를 들어, CHO GPT, eGFP 또는 mGapdh(표준화된 대조군) 각각의 사본 수를 표준 qPCR법을 사용하여 측정하였다. 2.5 μg/ml Tn와 함께 더욱 배양된 1 μg/ml Tn-저항성 풀에서 유래된 세포 내 eGFP의 사본 수는 1 μg/ml Tn와 함께 더욱 배양된 1 μg/ml Tn-저항성 풀에서 유래된 세포 내 eGFP의 사본 수의 적어도 2배이다. 1 μg/ml Tn-처리된 풀을 5 μg/ml Tn와 함께 더욱 배양하였을 때 상기 유전자 사본 수가 더욱 증가하였다. eGFP에 대한 유전자 사본 수의 증가는 CHO-GPT의 유전자 사본의 증가와 상호 관련이 있다. (도 6a 및 6b 참조)

유전자 사본 수의 증가가 단백질 발현 증가으로 해석되는지 확인하기 위해, 평균 형광 강도(MFI)를 여러 차례의 Tn 선택 과정, 즉, 1, 2.5 또는 5 μg Tn(예를 들어, 도 6b의 샘플 7, 8, 및 9 참조)로 처리된 GPT 및 eGFP를 발현하는 세포 풀에 대해 FACS법으로 측정하였다. 이들 세포 풀에 대한 eGFP 발현 비교를 표 3에 나타내었다.

상기 GPT를 발현하는 세포풀은 5 μg Tn으로 두번째 선택에 들어가 그 결과 eGFP 생산에 있어 생산량이 1 μg Tn 처리한 경우 비교해 2.5 배 이상, 2.5 μg Tn 처한 경우와 비교해 1.5 배가 되었다(표 3).

eGFP 단백질 생산

GPT 1μg 풀 + 두번째 Tn(μg) 처리	MFI
1 μg	1098
2.5 μg	1867
5 μg	2854

어떤 이론에 구속되지 않고, Tn 농도의 증분 증가는 통제된 방식으로 세포에 대한 선택압을 증폭시켜, 생산량이 증가된다. Tn-저항성 발현 벡터는 당질화 패턴에 대한 Tn 선택의 효과를 검사하기 위해 아래 설명되는 추가 실험에도 사용되었다.

실시예 3. 예시적인 이량체 단백질의 발현 및 당질화 프로파일.

“트랩” 단백질(Fc 융합 단백질-1, 이하 FcFP1라 지칭)을 발현하는 CHO 세포는 GPT-함유 발현 벡터로 형질감염되었다. 상기 플라스미드는 5’에서 3’ 방향으로, Lox 자리, SV40 후기 프로모터, Tn-저항성 유전자(CHO-GPT), IRES eGFP, SV40 폴리A 및 두번째 Lox 자리를 가진다. 1 μg/mL Tn 또는 5 μg/mL Tn는 상기 GPT 선택 마커의 선택에 사용되었다. 상기 선택된 세포 풀은 무혈청 생산 배지에서 현탁 배양하여 증대시켰다. GPT 형질감염을 FACS 분석에 의해 eGFP 발현으로 확인하였다. 선택된 풀에서 수집된 펠렛을 GPT 발현을 위한 사본 수 분석을 의뢰하였으며, 다른 농도의 튜니카마이신으로 선택된 풀에서 FcFP1의 발현양을 결정하기 위해 12일간 생산성 분석을 실시하였다.

FcFP1은 풍부한 당질화 부위를 가진 그것의 복합 당질화 패턴으로 인해 선택되었다. 당질화 프로파일을 결정하기 위해, FcF1 단백질을 발현하는 세포는 표준 프로토콜(Tn 없음) 또는 표 4에 나타난 것과 같이 Tn 처리 조건 하에 세포 배양으로 증대시킨 후 단백질을 분리 정제하였다.

FcFP1 단백질 생산

단백질	롯트 번호	처리
FcFP1 트랩	110728	없음
FcFP1 트랩	110728-1	1 μg/ml Tn
FcFP1 트랩	110728-2	5 μg/ml Tn

상세한 글리칸 분석은 HPLC 및 형광 안트라닐산(anthranilic acid; AA) 태그(Anumula, 및 Dhume, Glycobiology, 8(7):685-694, 1998)를 위해 잘 알려진 방법을 기반으로 크로마토그래피를 사용하여 당 단백질의 각 롯트가 Tn이 당질화 프로파일에 부정적인 영향을 주는지 여부를 확인하기 위해 수행하였다. 생산 롯트 또한 치료적으로 허용가능한 단백질 배치(batch)를 나타내는 참조 표준과 비교하였다. 대표적인 글리칸 분석을 도 7a 내지 7d에 도시하였다. 참조 롯트와 비교해, 각 롯트는 동일한 피크 수, 상대적 형태 및 강도를 지속적으로 생산한다. 각 크로마토그램의 오버랩(도 8)은 독특하거나 특이한 피크가 발견되지 않았음을 나타낸다.

FcFP1 단백질에 대한 참조 표준 롯트와 비교해 잘 알려진 HPLC법에 의해 올리고당 프로파일링을 수행하였다. FcFP1 트랩 단백질 롯트에 대해 시알화 레벨을 측정하고 각 롯트에 대해 Z-수를 계산하였다(3개의 복제). Z-수는 롯트간의 변화의 측정을 나타낸다. 상기 Z-수는 각 피크의 상대적 형태 및 강도뿐 아니라 상대 피크 수를 고려한다. 예를 들어, 도 7a 내지 7d에서 각 0SA, 1SA, 2SA, 3SA 및 4SA 피크의 영역을 표 5와 같이 정량하였다.

정량적 올리고당 분석

단백질 롯트	복제	OSA	1SA	2SA	3SA	4SA	OS 프로파일 (Z-수)
참조 B100002M410	1	6506.43	13388.34	11268.60	5176.21	1728.15	1.53
	2	5869.80	11932.32	10159.21	4196.10	1550.09	1.51
	3	6870.18	14536.84	12090.21	5200.58	1707.74	1.51
	평균	6415.47	13285.83	11172.65	4857.63	1661.99	1.52±0.01
FcFP1 트랩 110728	1	6159.09	9394.92	7368.03	3074.66	675.48	1.34
	2	7530.49	12117.03	9589.08	2951.63	810.09	1.36
	3	5508.95	8580.56	6902.59	3794.81	630.79	1.34
	평균	6399.51	10030.84	7953.23	3074.66	705.45	1.35±0.01
FcFP1 트랩 110728-1	1	5330.22	8149.81	6539.33	2490.06	641.37	1.35
	2	5034.39	9009.42	7059.61	2698.05	812.21	1.40
	3	6222.44	10235.08	8428.04	3276.75	848.83	1.39
	평균	5529.02	9131.44	7342.33	2821.62	767.47	1.38±0.03
FcFP1 트랩 110728-2	1	6300.77	10001.93	8109.12	3000.96	790.99	1.36
	2	5999.09	9952.47	7968.58	2885.50	717.70	1.36
	3	4322.29	6176.33	5187.48	1742.26	458.52	1.32
	평균	5540.72	8710.24	7088.39	2542.91	655.74	1.35±.0.02

OS = 올리고당; 0SA = 시알산 잔기 없음; 1SA = 하나의 시알산 잔기; 2SA = 두 개의 시알산 잔기; 3SA = 세 개의 시알산 잔기; 4SA = 네 개의 시알산 잔기

각 롯트에 대해 계산된 Z-수는 참조 롯트와 비교하여 허용가능한 범위 내에 있으므로, 각 단백질 롯트는 치료용 분자와 동일한 물질을 얻는 것으로 이해된다. Tn의 존재가 N-연결 당단백질의 당질화에 부정적인 영향을 미치는 것으로 알려져 있기 때문에, Tn에 의한 선택압 증가라는 조건 하에서는, 단백질 생산이 신뢰성 있고 일관성 있을 뿐만 아니라 생산적일 것이라고는 예상되지 않았다.

본 발명은 그것의 사상 또는 본질을 벗어나지 않고 다른 특정 실시예들에서 구현될 수도 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Deshpande, Dipali Burakov, Darya Chen, Gang Fandl, James P. <120> EFFICIENT SELECTIVITY OF RECOMBINANT PROTEINS <130> 8700WO <150> US 62/039,416 <151> 2014-08-19 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6964 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 aagcttatac tcgagctcta gattgggaac ccgggtctct cgaattcgag atctagttta 60 aacacgcggc cgctaatcag ccataccaca tttgtagagg ttttacttgc tttaaaaaac 120 ctcccacacc tccccctgaa cctgaaacat aaaatgaatg caattgttgt tgttaacttg 180 tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa 240 gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat 300 gtctaccggt ataacttcgt ataatgtata ctatacgaag ttagccggta gggcccctct 360 cttcatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc 420 gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag 480 gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt 540 gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg 600 aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg 660 ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg 720 taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac 780 tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg 840 gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt 900 taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg 960 tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc 1020 tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt 1080 ggtcatgggc gcgcctcata ctcctgcagg catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta 1140 gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg 1200 gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg 1260 ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc 1320 atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc 1380 agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc 1440 ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag 1500 tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat 1560 ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg 1620 caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt 1680 gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag 1740 atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg 1800 accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatact gcgccacata gcagaacttt 1860 aaaagtgctc atcattggaa aacgtttttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct 1920 gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac 1980 tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat 2040 aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat 2100 ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca 2160 aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtcaggt acacaacttc 2220 gtatagcata cattatacga agttatggta ccaagcctag gcctccaaaa aagcctcctc 2280 actacttctg gaatagctca gaggcagagg cggcctcggc ctctgcataa ataaaaaaaa 2340 ttagtcagcc atggggcgga gaatgggcgg aactgggcgg agttaggggc gggatgggcg 2400 gagttagggg cgggactatg gttgctgact aattgagatg catgctttgc atacttctgc 2460 ctgctgggga gcctggggac tttccacacc tggttgctga ctaattgaga tgcatgcttt 2520 gcatacttct gcctgctggg gagcctgggg actttccaca ccggatccac catgtgggcc 2580 ttcccggagt tgccgctgcc gctgctggtg aatttgttcg gctcgctgct gggatttgtg 2640 gctactgtga ccctcatccc tgccttccgt agccacttta tcgccgcgcg cctctgtggc 2700 caggacctca acaagctcag ccggcagcag atcccagaat cccagggagt gatctgcggt 2760 gctgttttcc ttatcatcct cttctgcttc atccctttcc ccttcctgaa ctgctttgtg 2820 gaggagcagt gtaaggcatt cccccaccat gaatttgtgg ccctgatagg tgccctcctt 2880 gccatctgct gcatgatctt cctgggcttc gctgatgatg tactcaatct gcgctggcgc 2940 cataagctgc tgctgcccac agctgcctct ctacctctcc tcatggttta cttcactaac 3000 tttggcaata caaccattgt ggtacccaag cccttccgct ggattcttgg cctgcatttg 3060 gacttgggaa tcctatacta tgtctacatg ggactgcttg cggtgttctg taccaatgcc 3120 atcaacatcc tagcaggaat taatggccta gaggctggtc agtcactagt catctctgct 3180 tctatcattg tcttcaacct ggtagagctg gaaggtgatt atcgggatga tcatgtcttt 3240 tccctctact tcatgatacc attttttttt accaccttgg gattgctata ccataactgg 3300 tacccatcac aggtgtttgt gggagatacc ttctgttatt ttgctggcat gacctttgcc 3360 gtggtgggaa tcttgggaca cttcagcaag accatgctac tcttctttat tccacaagtg 3420 ttcaatttcc tctactcgct gcctcagctc cttcacgcca tcccctgccc tcgacaccgc 3480 atacccagac tcaatccgaa gacgggcaaa ctggagatga gctattccaa gttcaagacc 3540 aagaacctct ctttcttggg cacctttatt ttaaaggtag cagagcgcct ccagctagtg 3600 acagttcacc gaggcgagag tgaggatggt gccttcactg aatgtaacaa catgaccctc 3660 atcaacttgc tactcaaaat ctttgggccc atacatgaga gaaacctcac actgctcctg 3720 ctgcttttgc agatcctgag cagcgctgtc accttctcca ttcgatacca gcttgtccga 3780 ctcttctatg atgtctgaac gcgtcccccc tctccctccc ccccccctaa cgttactggc 3840 cgaagccgct tggaataagg ccggtgtgcg tttgtctata tgttattttc caccatattg 3900 ccgtcttttg gcaatgtgag ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac gagcattcct 3960 aggggtcttt cccctctcgc caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca 4020 gttcctctgg aagcttcttg aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg 4080 aaccccccac ctggcgacag gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct 4140 gcaaaggcgg cacaacccca gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa 4200 tggctctcct caagcgtatt caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt 4260 atgggatctg atctggggcc tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa 4320 aacgtctagg ccccccgaac cacggggacg tggttttcct ttgaaaaaca cgattgctcg 4380 aatcaccatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga 4440 gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc 4500 cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg 4560 gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca 4620 catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac 4680 catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga 4740 caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct 4800 ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tacatcatgg ccgacaagca 4860 gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca 4920 gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga 4980 caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca 5040 catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta 5100 caagtaatcg gccgctaatc agccatacca catttgtaga ggttttactt gctttaaaaa 5160 acctcccaca cctccccctg aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact 5220 tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata 5280 aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc 5340 atgtcggcgc gttgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca 5400 ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct 5460 ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta 5520 acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac 5580 ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt 5640 aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag 5700 tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtgatgc ggttttggca gtacatcaat 5760 gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga tttccaagtc tccaccccat tgacgtcaat 5820 gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg gactttccaa aatgtcgtaa caactccgcc 5880 ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta cggtgggagg tctatataag cagagctctc 5940 cctatcagtg atagagatct ccctatcagt gatagagatc gtcgacgttt agtgaaccgt 6000 cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagaca ccgggaccga 6060 tccagcctcc gcggccggga acggtgcatt ggaacgcgga ttccccgtgc caagagtgac 6120 gtaagtaccg cctatagagt ctataggccc acccccttgg cttcttatgc atgctatact 6180 gtttttggct tggggtctat acacccccgc ttcctcatgt tataggtgat ggtatagctt 6240 agcctatagg tgtgggttat tgaccattat tgaccactcc cctattggtg acgatacttt 6300 ccattactaa tccataacat ggctctttgc cacaactctc tttattggct atatgccaat 6360 acactgtcct tcagagactg acacggactc tgtattttta caggatgggg tctcatttat 6420 tatttacaaa ttcacatata caacaccacc gtccccagtg cccgcagttt ttattaaaca 6480 taacgtggga tctccacgcg aatctcgggt acgtgttccg gacatgggct cttctccggt 6540 agcggcggag cttctacatc cgagccctgc tcccatgcct ccagcgactc atggtcgctc 6600 ggcagctcct tgctcctaac agtggaggcc agacttaggc acagcacgat gcccaccacc 6660 accagtgtgc cgcacaaggc cgtggcggta gggtatgtgt ctgaaaatga gctcggggag 6720 cgggcttgca ccgctgacgc atttggaaga cttaaggcag cggcagaaga agatgcaggc 6780 agctgagttg ttgtgttctg ataagagtca gaggtaactc ccgttgcggt gctgttaacg 6840 gtggagggca gtgtagtctg agcagtactc gttgctgccg cgcgcgccac cagacataat 6900 agctgacaga ctaacagact gttcctttcc atgggtcttt tctgcagtca ccgtccttga 6960 cacg 6964 <210> 2 <211> 1231 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 2 caccatgtgg gccttcccgg agttgccgct gccgctgctg gtgaatttgt tcggctcgct 60 gctgggattt gtggctactg tgaccctcat ccctgccttc cgtagccact ttatcgccgc 120 gcgcctctgt ggccaggacc tcaacaagct cagccggcag cagatcccag aatcccaggg 180 agtgatctgc ggtgctgttt tccttatcat cctcttctgc ttcatccctt tccccttcct 240 gaactgcttt gtggaggagc agtgtaaggc attcccccac catgaatttg tggccctgat 300 aggtgccctc cttgccatct gctgcatgat cttcctgggc ttcgctgatg atgtactcaa 360 tctgcgctgg cgccataagc tgctgctgcc cacagctgcc tctctacctc tcctcatggt 420 ttacttcact aactttggca atacaaccat tgtggtaccc aagcccttcc gctggattct 480 tggcctgcat ttggacttgg gaatcctata ctatgtctac atgggactgc ttgcggtgtt 540 ctgtaccaat gccatcaaca tcctagcagg aattaatggc ctagaggctg gtcagtcact 600 agtcatctct gcttctatca ttgtcttcaa cctggtagag ctggaaggtg attatcggga 660 tgatcatgtc ttttccctct acttcatgat accatttttt tttaccacct tgggattgct 720 ataccataac tggtacccat cacaggtgtt tgtgggagat accttctgtt attttgctgg 780 catgaccttt gccgtggtgg gaatcttggg acacttcagc aagaccatgc tactcttctt 840 tattccacaa gtgttcaatt tcctctactc gctgcctcag ctccttcacg ccatcccctg 900 ccctcgacac cgcataccca gactcaatcc gaagacgggc aaactggaga tgagctattc 960 caagttcaag accaagaacc tctctttctt gggcaccttt attttaaagg tagcagagcg 1020 cctccagcta gtgacagttc accgaggcga gagtgaggat ggtgccttca ctgaatgtaa 1080 caacatgacc ctcatcaact tgctactcaa aatctttggg cccatacatg agagaaacct 1140 cacactgctc ctgctgcttt tgcagatcct gagcagcgct gtcaccttct ccattcgata 1200 ccagcttgtc cgactcttct atgatgtctg a 1231 <210> 3 <211> 408 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 3 Met Trp Ala Phe Pro Glu Leu Pro Leu Pro Leu Leu Val Asn Leu Phe 1 5 10 15 Gly Ser Leu Leu Gly Phe Val Ala Thr Val Thr Leu Ile Pro Ala Phe 20 25 30 Arg Ser His Phe Ile Ala Ala Arg Leu Cys Gly Gln Asp Leu Asn Lys 35 40 45 Leu Ser Arg Gln Gln Ile Pro Glu Ser Gln Gly Val Ile Cys Gly Ala 50 55 60 Val Phe Leu Ile Ile Leu Phe Cys Phe Ile Pro Phe Pro Phe Leu Asn 65 70 75 80 Cys Phe Val Glu Glu Gln Cys Lys Ala Phe Pro His His Glu Phe Val 85 90 95 Ala Leu Ile Gly Ala Leu Leu Ala Ile Cys Cys Met Ile Phe Leu Gly 100 105 110 Phe Ala Asp Asp Val Leu Asn Leu Arg Trp Arg His Lys Leu Leu Leu 115 120 125 Pro Thr Ala Ala Ser Leu Pro Leu Leu Met Val Tyr Phe Thr Asn Phe 130 135 140 Gly Asn Thr Thr Ile Val Val Pro Lys Pro Phe Arg Trp Ile Leu Gly 145 150 155 160 Leu His Leu Asp Leu Gly Ile Leu Tyr Tyr Val Tyr Met Gly Leu Leu 165 170 175 Ala Val Phe Cys Thr Asn Ala Ile Asn Ile Leu 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ggatttgtgg ccacagtcac cctcatcccg gccttccggg gccacttcat tgctgcgcgc 540 ctctgtggtc aggacctcaa caaaaccagc cgacagcaga tcccagaatc ccagggagtg 600 atcagcggtg ctgttttcct tatcatcctc ttctgcttca tccctttccc cttcctgaac 660 tgctttgtga aggagcagtg taaggcattc ccccaccatg aatttgtggc cctgataggt 720 gccctccttg ccatctgctg catgatcttc ctgggctttg cggatgatgt actgaatctg 780 cgctggcgcc ataagctgct gctacctaca gctgcctcac tacctctcct catggtctat 840 ttcaccaact ttggcaacac gaccattgtg gtgcccaagc ccttccgccc gatacttggc 900 ctgcatctgg acttgggaat cctgtactat gtctacatgg ggctgctggc agtgttctgt 960 accaatgcca tcaatatcct agcaggaatt aacggcctag aggctggcca gtcactagtc 1020 atttctgctt ccatcattgt cttcaacctg gtagagttgg aaggtgattg tcgggatgat 1080 catgtctttt ccctctactt catgataccc ttttttttca ccactttggg attgctctac 1140 cacaactggt acccatcacg ggtgtttgtg ggagatacct tctgttactt tgctggcatg 1200 acctttgccg tggtgggcat cttgggacac ttcagcaaga ccatgctact attcttcatg 1260 ccccaggtgt tcaacttcct ctactcactg cctcagctcc tgcatatcat cccctgccct 1320 cgccaccgca tacccagact caatatcaag acaggcaaac tggagatgag ctattccaag 1380 ttcaagacca agagcctctc tttcttgggc acctttattt taaaggtggc agagagcctc 1440 cagctggtga cagtacacca gagtgagact gaagatggtg aattcactga atgtaacaac 1500 atgaccctca tcaacttgct acttaaagtc cttgggccca tacatgagag aaacctcaca 1560 ttgctcctgc tgctgctgca gatcctgggc agtgccatca ccttctccat tcgatatcag 1620 ctcgttcgac tcttctatga tgtctgagtc ccttgatcat tgtcctttac ctcacagtct 1680 ctaggattcc tgactcaggc tgacctctct ctctggtccc agactgcctc cttgcccagg 1740 cctctctcac tcttcatact cctccagatt ttgttctcag cattttcctt tctctgtgat 1800 cattggcatc ctgggcgttt cttgccctct gctgactact gattggattt tacctatggc 1860 tttctgcaac ttgctactct ctccctctcc atcccatctt tgcagcctca tagggtggga 1920 tacagcagct ttttttgcag ttatccacac tcacatttca gagtcctgac tctcaaggaa 1980 ccactggttt ttgggataga acttgggcca gggctaggaa cacaggctcc acggtgacat 2040 gtcatttgat tgtaaattaa gtgttctgat tagtaagaac taagcagggg gccacatgct 2100 ctcaatggag acaataaagt gttgtctttt tcttattgtt taaaaaaaaa 2150 <210> 13 <211> 1840 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 13 gggggctggc gccggaatcc tctgagtgta gggagctgca ctgctggctg ccgaggcctc 60 tggtttgttc ctggcttacc aagttagctg agtaggcggc ggagcggcgg cccccggagg 120 gtcactatgt gggccttccc ggagttacct ctgccgctgc cgctgttggt gaatttgatc 180 ggatcgctgt tgggatttgt ggctaccgtc accctcatcc ctgccttccg tagccacttt 240 atcgccgcgc gtctctgtgg ccaggacctc aacaagctca gccggcagca gatcccagag 300 tcccagggag tgatcagcgg tgctgttttc cttatcatcc tcttctgctt catccctttc 360 cctttcctga actgctttgt ggaggagcag tgtaaggcat tcccccacca tgaatttgtg 420 gccctgatag gtgccctcct tgctatctgc tgcatgatct tcctgggttt tgctgatgac 480 gtactcaatc tgcgatggcg tcataagctg ctgctcccca cagctgcctc actacctctc 540 ctcatggtct acttcactaa ctttggcaat acaaccattg tggtgccgaa gcccttccgc 600 tggattcttg gcctgcattt ggatttgggc atcctgtact atgtctacat gggactgctt 660 gcagtgttct gtaccaatgc catcaacatc ctagcgggaa ttaatggcct agaggctggt 720 caatcactag tcatctctgc ttctattatt gtcttcaacc tggtggagct ggaaggtgat 780 tatcgggacg atcatgtctt ttccctctac ttcatgatgc catttttttt taccaccttg 840 ggattgctgt accataactg gtacccgtct caggtgtttg tgggagacac cttctgttat 900 tttgctggca tgacctttgc cgtggtggga atcttgggac acttcagcaa gaccatgctg 960 ctcttcttta tgccacaagt attcaatttc ctctactcac tgcctcagct ctttcagatc 1020 atcccctgcc ctcgacaccg tatgcccaga ctcaatacga agacaggcaa actggagatg 1080 agctattcca agttcaagac caagagcctc tctttcttgg gcacgtttat tttaaaggta 1140 gcagagagcc tccggctggt gacagttcac cgaggggaga gtgaggatgg tgccttcact 1200 gagtgtaaca acatgaccct catcaacttg ctacttaaag tctttgggcc tacacatgag 1260 agaaacctca cactgttcct gctgctcctg caggttctga gcagcgctgt caccttctcc 1320 attcgttacc agctcgtccg actcttctat gatgtctgag ctccctgacg actgcccttt 1380 accacacagt ctccattgga cctcagccag gacccacctc tgtccgctcc gaccgccttc 1440 tggtccaggc tcagcttctg ccgtcatctg tgactactga catcctggat ggactcctta 1500 gtggacttga cgtccactag ttggacttgc ctatgctttc ttgagtttgc tactccctcc 1560 ctttctgcag cctcaccagg tgggcctgta gcatctttta tgcaaatatt catggctcaa 1620 ctttcagaac cctaactcta aaggaatccc ctgggccttg agagagaacc tgggctaggg 1680 ctagagttag ggcaacatac tccaaggtaa cctcacatct gactatcaaa ttaagtgttc 1740 tgattaggaa gagcagaggc agggccatgt gctcagaatg gtgacaataa aggattgcct 1800 tttacttgcc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1840 <210> 14 <211> 5424 <212> DNA <213> Macaca mulatta <400> 14 tattaaaaat ggcggctgcc gccctccgca gtaatagttg ttcagcgaat aaaatccggg 60 cggaaacagt aggtaggctg gttcagtggg ggcagaacct aggttgcctt agagaggttc 120 ttcgaggtcc cgagggcggc tcaagtcaga gttgttggat tctgctcaga ttggtgtggg 180 aagagcctgc ctgtggggag cggccactcc atactgctga ggcctcagga ctgctgctca 240 gcttgccagt tacctgaaga ggcggcggag ccgggcccct gaccggtcac catgtgggcc 300 ttctcggaat tgcccatgcc gctgctggtc aatttgatcg tctcgctgct gggatttgtg 360 gccacagtca ccctcatccc agccttccgg ggccacttca ttgctgcgcg cctctgtggt 420 caggacctca acaaaaccag ccgacaacag atgtgagcag cggcacacgg ttccgggcag 480 ggggcaaggg ctaaggaagg agtggctagg gcaggggcgg ggaccggggt gtttgaccac 540 acgtgaaaac tcagaactaa cccaggcagc ctggaactcg gagaggtgat gagcagaact 600 tattcgcatt ggggaaagga tgggtaggga 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tcctccccta ggtggcacta 1500 cttttcctac catctctccc ttcaggaatc ctgtactatg tctacatggg gctgctggca 1560 gtgttctgta ccaatgccat caatatccta gcaggaatta atggcctaga ggctggccag 1620 tcactagtaa tttctgcttc catcattgtc ttcaacctgg tagagttgga aggtaggtgg 1680 gattgggggt ggggagagag aagtctgaat gttaaaggtg tggcctgata tatgactttg 1740 ggaaattcag ggaaaaaaag caatatgcgt agtaattata gaagataagg gaggctactt 1800 actttgcaaa taatgcagat ttattgaaag tgagaaagaa aaatagcagc cgtgtcattt 1860 atagctggat tggcactaac agctaggcca tgatcttctc ccattgaata taaacaattt 1920 cacagaacct caacgttaca cagggtcatt ctgtgaccat gatggaggaa gaccaaaact 1980 cgacccctcc ctctataatc ctgtttgagc acagataaaa ccacaaaaac actgagcaac 2040 ccacaaaatg gccaagatcc tctctctctg ttaacgtgag ccatgagcga ctgctgcggc 2100 tttccaataa caactcagtt cctaccacct tttattttgt tttttgagac agggtctccc 2160 tctgtcaccc aggctggaga gcagtggcac gatcttagct cactgcatcc tctgactcaa 2220 acgatcctcc tgccccagac tcccaggtag ctggggctac aggcatgcgc caccacacct 2280 ggcaaatttt tgtatttttt gtagagacag ggtttcacca 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ttgcctgtgg ctttcttcaa cttgctgctc 4320 tccctctcta tcccatccct gcggcctccc aaagtgggat actgtgcttt ttatgcagtt 4380 atccaccact cggactctcg aggaatatgt tgggcctggg gatagaaccc tggctgggga 4440 gagggacaca ggctcgaaga tcacttgatt atttgaccat aaattaagta ttctgattcg 4500 taagagcaga ttggggggcc aggtgctccc agtggtgaca ataaagtgtt gtctttt 4557 <210> 17 <211> 5374 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 17 caaggcagag cctaggttgc tttataaaac ctcttgggga agcccgaggg cggttcaaat 60 taagagttgt tgggttttgc cccgcctcgc atgtgaggag cggacactgc tcacggctga 120 gacctcgggg ctgcttccca ccagttagct gagaaggctg cggagctgga acctctggcc 180 actcgccatg tgggccttct ctgaggtacc gattccgctg ctggtgaatt tgatcggctc 240 gctgctggga tttgtggcca cgctcaccct catcccggcc tttcgtggcc actttatcgc 300 tgcgcgcctc tgtggccagg acctcaacaa aaccaaccgg cagcagatgt gagcagtggc 360 acacgggtgt cccgggcagg ggccaggggt gggcaaggca caggcgagct ctgaggtgct 420 taaatgtgcg tacgaaccaa atctaactgg agttgtccgg gaccctggga ctcgatggcc 480 agaagtggtt agcactgggg aatgctaagg aaggggaccc ttgagtgaga acatccagcg 540 gcgcctgcct ccccccgccc cccactgccc tcccgctcca ctgctccccc gcctcactcc 600 tgggaagatc ttttgggtca catggttttt gcactaacca cgcccatttc ttcttccttc 660 tccaccccct tgctgcgggg ccacagccca gaatcccagg gagtgatcag cggtgccgtt 720 ttccttatca tcctgttctg cttcatcccc ttccccttct tgaactgctt tgtgaaggag 780 cagtgtaagg ctttccccca ccatgaagta agtgggttcg tgggggcggt tgcctggggc 840 ctgggaggtt cccgagagag ttggggttgt gtggatttga ggaggaggga ctgaggacct 900 agtggaaaag acagaaattt ttgaaagctt gaatggcagt aggcttgagt catgacctgc 960 ccgagcctcc cccagtttgt ggccctcata ggtgcccttc ttgccatctg ctgcatgatt 1020 ttcttgggct tcgcggacga tgtcctgaat ctacgctggc gccataagct gctgctgccc 1080 acagctgcat cactacctct tcttatggtc tattttacca actttggcaa cacaaccatt 1140 gtggtaccca agcccttccg cccagttctt ggcttgcatc tggatttggg tgagtatccc 1200 tgctgctaca gcccctgtgg cacttatttc aagtcaccct ccccccaaag gtgcccagca 1260 gagcaccctt cttgatgttc cacactcccc tgtttttgtt ccgtccctgt gaatgctcag 1320 gttctctctt gtgccctgtc attgtgtgtt ctgttttcag aataccgtta gatcctttcc 1380 tagctgtcac tgctttttat actatgtctt gcagggatcc tgtactatgt ctacatgggg 1440 ctcctggcag tgttctgtac caatgccatc aatatcctag caggaattaa cggcctagag 1500 gccggccagt cattggtcat ctctgcttcc atcattgtct tcaacctggt ggagctgcaa 1560 ggttggtggg aagagagaga tctcagtgtt cagagaattg cctgatatat agctttgaga 1620 aaaggggggc ttatagaaga tagggaaagc tatttacttt gcaaataaca atgaagagtt 1680 acttgagtag gaggaagaaa aatagcagtc tgtcatttat agctggattg gcatgagtag 1740 ctagaccatg actgtttcct attggacata aatagtttca tagaacccca gcatgagaga 1800 ggggcgccct gaccgtggtg aaacaagaca gaaaccagac ttctcccact gtaatcatgt 1860 ctgaacaccg acaaaagcac aggaacaaag tcagcccaaa catcccttct tgtctaatgt 1920 gagagggtat agcttctttg cagtaacaac tcagttcctg ctacttctta agttgttcag 1980 tcagaaaatt acttctgctt tctgacatca ggcagtccag agcacaactt ttccttgcag 2040 cctccccaga accacttaaa gtgaatccta ttgtaagtcc cttctaacaa cctttagagt 2100 acctgcccag catgaggcct tgggtacagt ccccagtatc tctgtttgca tgcatgtaca 2160 catacccaca tgcacacact gaacttactt attgaaggta agcaatattt atttgcattt 2220 tttgtgtgtg tgacaaaatt tcactatgta attcagaata gccttgaatt cactatgtag 2280 cctaggccgt cctcgaactt acagtgataa tcctgcctca gcttcctaag tgctaagatt 2340 caaggtatgc actaccaggc cagctaagaa agcaattttt aaactaggta tggtggcaca 2400 catcactaat tctaacactc tgggagactt gggcaggaag atcatgagtt tgagctcagc 2460 ctgggcactt ggtaagtctc tgtttctaga aataaaacat ggagtggtga tacacacctg 2520 taatcccagc attcatgagg ctggggcagg aggatcacca caaggtcaag acctgcctgg 2580 gttacataag caagttcaag gccagcgtga actacgtagt gagaccctgc ctcaaacaaa 2640 caaataaata aataaacatg atcctgagtt tggttcccag tactcccccc aataaatgaa 2700 atgaaatgaa agagctgggg aggcagctta gtgctaaggt ccaggacccc atgtgaaggc 2760 agctgcgtgt atgtgttatc agccctgttt catacactag ataataaaac tggttttcaa 2820 acttaagtca gcatgtctgg acaaagtgaa gactttaact tgtttttgac ggtttcatga 2880 cagtagtgag ctattgggaa ctgcctgggt accatcaaag gaataatgag gggctgggga 2940 tttagctcag cggcataagc gcctgccttg caagcaggca gtcatgagtt tgatccccgg 3000 taccgataaa aaggaaaaag acaaaaaaaa aaggaataat gagtttttga aggtggctcg 3060 ggtgagggga ggtggcaaca gagacaggga tgcgacagac aaaatgaaga gcaggggaca 3120 taggggagat gggtgttcac ttttccttct ttgtcctttg tttcccaagg tgattaccgg 3180 gatgatcatg tcttttccct ctacttcatg ataccgtttt ttttcaccac cttgggattg 3240 ctgtatcata actggtaagg aggctgtggc tcagggaaaa ggaaaacaac taactggtca 3300 ttggacaaag atggtcctga tcttaaccca gctcctgaaa gacaggctga acttgcgcat 3360 acttttgctc agtgttttct gggtattcag ttggtggatt gcctcccccc gccccgtttt 3420 ttttttgaga cacctgtggc ctctcgagtg ctaggccagt gctttactac tgagtcttgc 3480 cctctagtat tctcaggttt gttcttttct cagcagttgg agacaagtgc tatggagccc 3540 caggaataat tatggggact tgcgttctgc agacttgcta gaccctcctg tccgaactag 3600 gatcagggga gcatgtgtgg tggctcacac ctgtaatccc agcactcagg agactgaggc 3660 aggaggatta ccatgagatc gagggcaccc tcagctcaca tagtgacttt gaggccagcc 3720 tggactacat agcgagactc ttgtctccaa aagaaaaaaa aagaaagaat aaaagaacag 3780 gggtctgagt tcgtccagta cctagcctgt gtgatgtgag agaaaagact gtgatgcctc 3840 ttggcactgg cttggatcct ttcccccaca caggtaccca tctcaggtgt ttgtgggaga 3900 caccttctgt tactttgctg gcatgacctt tgccgtggta ggcatcttgg gacacttcag 3960 caagaccatg ctgctcttct tcatgccaca ggtgttcaac ttcctctact cgctgcctca 4020 gctcctgcat atcatcccct gtcctcgcca ccgtataccc aggtagctgt ttgggggctg 4080 gaaagccttt ctactgggat gtctaacacc aggctctaca tttgctgtgc aaagaatgtg 4140 ggcccatagg aaggctaact tttttcatgt aggtggccct ttaagtttac acagcacgtt 4200 tacttccata atctcattta atactcacag tagttctgat catagagtag taagcagcag 4260 agccagaaat agatctcact ccatgatcag tgtttttctt agtcattaac ggaagaaagt 4320 tttttgagta gtgacccagt cacacgaagc tgtctttccc ctacagactc aataccaaga 4380 caggcaaact ggagatgagc tattccaagt tcaagaccaa cagcctttct ttcttgggca 4440 cctttatttt aaaggtaaca aggtaacgag gaggtaaggc cccaggccac catcctgaac 4500 ttgggacatg ggggacccag gcctacatta gatctagagg gagcttggaa gcattaagca 4560 gagccctgtt cctgacatac aggtattggc tgaagttttt ctgtctgtct ctggtctctc 4620 taggtagcag agagactcca gctagtgaca gtgcaccgga gtgagggtga ggacggggcc 4680 ttcactgagt gtaacaacat gaccctcatc aacttgctgc ttaaaatctt tgggcccata 4740 catgagagga acctcacatt gctcttgctg ctgctacagg tgagcctggg gtgagtttgt 4800 gcctcctcat gtccttttct ctatggttct tattctagtc catttctcct tgcagatcgt 4860 gggcagtgct gtcaccttct ccattcgata ccagcttgtc cgactcttct atgacgtttg 4920 agttcctgaa gattgccctc tgccacactg tctccagggg tcctgctcag gccagccagt 4980 ctggttctgt gggcctctcc caatcttcag tctccttcag atttattccc agcatttttc 5040 ataacctatg attatcaaca tcctgagcca tttttgccct ccagcaacta ctaactggac 5100 tttgcctatg gcctccttca acttgccact ctccctaccc atcacagcca gaggcttgat 5160 gtagcagctt ttatgcagat atccacaact cagctttcag agtcctcact ctcaaagaac 5220 atgctgggcc ttgagataga acctgagcta gggctaggga cactggtgca agggtgattt 5280 gatatttgat tataaattaa gtgttctgat tagtaagaca gaaggggagc ctggtgctcc 5340 caacggtgac aataaagtgt tacctttttc ttgt 5374

Claims

관심 유전자(GOI) 및 적어도 하나의 조절 요소에 작동가능하게 연결된, 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 93% 동일성을 가진 단백질을 암호화하는 포유류 튜니카마이신(Tn)-저항성 유전자를 포함하는 단리된 세포.
제1항에 있어서, 상기 Tn-저항성 유전자는 상기 세포에 외생적으로 부가된 것인, 단리된 세포.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Tn-저항성 유전자는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 단백질을 암호화하는, 단리된 세포.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Tn-저항성 유전자는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 98%의 동일성을 갖는 단백질을 암호화하는, 단리된 세포.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Tn-저항성 유전자는 서열번호 2, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는, 단리된 세포.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Tn-저항성 유전자는 서열번호 12를 포함하는 핵산 서열을 포함하는, 단리된 세포.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 조절 요소는 프로모터, 리보솜-결합 부위 및 인핸서로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 단리된 세포.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 관심 유전자(GOI)를 더 포함하는, 단리된 세포.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 유전자(GOI)는 외생적으로 부가된 GOI인, 단리된 세포.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외생적으로 부가된 GOI는 인간 유전자인, 단리된 세포.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절 요소는 외생적으로 부가된 조절 요소인, 단리된 세포.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 GOI는 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항원-결합 단편 및 Fc-융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 단리된 세포.
제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 GOI 및 상기 제2 GOI는 항체 경쇄 또는 그의 항원-특이적 단편, 항체 중쇄 또는 그의 항원-특이적 단편, Fc-융합 단백질 또는 그의 단편, 및 수용체 또는 그의 리간드-특이적 단편을 암호화하는 유전자로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 것인, 단리된 세포.
제1항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GOI는 프로모터에 작동 가능하게 연결된, 단리된 세포.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 GOI는 항체 경쇄 또는 그의 항원-결합 단편, 항체 중쇄 또는 그의 항원-결합 단편, Fc-융합 단백질 또는 그의 단편, 리간드, 및 수용체 또는 그의 리간드-결합 단편으로부터 선택된 당단백질을 암호화하는, 단리된 세포.
제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합효소 인식 부위는 상기 제1 GOI와 상기 제2 GOI 사이에 존재하는, 단리된 세포.
제8항에 있어서, 상기 제1 GOI에 대한 재조합효소 인식 부위 5' 및 상기 제2 GOI에 대한 재조합효소 인식 부위 3'를 더 포함하는, 단리된 세포.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 진핵 세포인, 단리된 세포.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 포유류 세포인, 단리된 세포.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 CHO-K1, COS-7, HEK293, 종양 세포, 림프구, 망막 세포, 및 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 단리된 세포.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 CHO-K1 세포인, 단리된 세포.
재조합 관심 단백질(POI)을 생산하는 방법으로, 상기 방법은
a. (i) 포유류 튜니카마이신(Tn)-저항성 유전자 및 (ii) 상기 POI를 암호화하는 유전자를 포함하는 핵산 분자를 암호화하는 포유류 숙주 세포를 제공하는 단계;
b. 제1 농도의 Tn의 존재 시에 상기 세포를 배양하는 단계;
c. 상기 Tn-저항성 유전자의 적어도 하나의 사본을 발현하는 세포 군집을 단리시키는 단계;
d. 증가하는 농도의 Tn의 존재 시에 상기 세포 군집을 배양하는 단계로, 여기서 상기 Tn 농도의 증가는 상기 POI의 생산을 증가시키는, 단계; 및
e. 상기 세포 배양으로부터 상기 POI를 단리시키는 단계를 포함하는, 방법.
제22항에 있어서, 상기 포유류 Tn-저항성 유전자는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 95%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 방법.
제22항에 있어서, 상기 포유류 Tn-저항성 유전자는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 98%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 방법.
제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류 Tn-저항성 유전자는 중국 햄스터 (Cricetulus griseus) Tn-저항성 유전자를 포함하는, 방법.
제22항에 있어서, 상기 포유류 Tn-저항성 유전자는 인간 Tn-저항성 유전자를 포함하는, 방법.
제22항에 있어서, 상기 포유류 Tn-저항성 유전자는 서열번호 2, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는, 방법.
제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Tn-저항성 유전자는 상기 POI를 암호화하는 유전자에 작동가능하게 연결된, 방법.
제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 POI를 암호화하는 유전자는 적어도 하나의 조절 요소에 작동가능하게 연결된, 방법.
제29항에 있어서, 상기 적어도 하나의 조절 요소는 프로모터, 리보솜-결합 부위 및 인핸서로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 방법.
제22항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 POI를 암호화하는 제2 유전자를 더 포함하는, 방법.
제22항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자는 외생적으로 부가된 관심 유전자(GOI)인, 방법.
제32항에 있어서, 상기 외생적으로 부가된 GOI는 인간 유전자인, 방법.
제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 조절 요소는 외생적으로 부가된 조절 요소인, 방법.
제22항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 POI는 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항원-결합 단편 및 Fc-융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 방법.
제22항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Tn의 제1 농도는 1μg/mL인, 방법.
제22항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증가하는 Tn의 농도는 Tn의 제2 농도 및 제3 농도를 포함하는, 방법.
제37항에 있어서, 상기 제2 농도는 상기 Tn의 제1 농도보다 크고, 상기 제3 농도는 상기 Tn의 제2 농도보다 큰, 방법.
제37항 또는 제38항에 있어서, 상기 Tn의 제2 농도는 2.5μg/ml이고, 상기 제3 농도는 5μg/mL인, 방법.
제22항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증가하는 Tn의 농도는 Tn의 제2 농도를 포함하며, 여기서 상기 Tn의 제2 농도는 2.5μg/ml 또는 5μg/ml인, 방법.
N-글리칸 단백질 기질을 당질화하는 방법으로, 상기 방법은
a. 당질화가 요구되는 상기 단백질 기질을 암호화하는 유전자에 작동가능하게 연결된 포유류 튜니카마이신(Tn)-저항성 유전자를 포함하는 핵산 분자를 암호화하는 포유류 숙주 세포를 제공하는 단계;
b. 제1 농도의 Tn의 존재 시에 상기 세포를 배양하는 단계;
c. 상기 Tn-저항성 유전자의 적어도 하나의 사본을 발현하는 세포 군집을 단리시키는 단계;
d. 증가하는 농도의 Tn의 존재 시에 상기 세포 군집을 배양하는 단계로, 여기서 상기 Tn 농도의 증가는 상기 POI의 생산을 증가시키는, 단계; 및
e. 상기 세포 배양으로부터 상기 단백질 기질을 단리시키는 단계를 포함하는, 방법.
제41항에 있어서, 상기 포유류 Tn-저항성 유전자는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 93%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 방법.
제39항에 있어서, 상기 포유류 Tn-저항성 유전자는 서열번호 2의 핵산 서열과 적어도 98%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하는, 방법.
제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유류 Tn-저항성 유전자는 중국 햄스터 (Cricetulus griseus) Tn-저항성 유전자를 포함하는, 방법.
제41항에 있어서, 상기 포유류 Tn-저항성 유전자는 인간 Tn-저항성 유전자를 포함하는, 방법.
제41항에 있어서, 상기 포유류 Tn-저항성 유전자는 서열번호 2, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는, 방법.
제41항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Tn-저항성 유전자는 상기 POI를 암호화하는 유전자에 작동가능하게 연결된, 방법.
제41항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 POI를 암호화하는 유전자는 적어도 하나의 조절 요소에 작동가능하게 연결된, 방법.
제48항에 있어서, 상기 적어도 하나의 조절 요소는 프로모터, 리보솜-결합 부위 및 인핸서로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 방법.
제41항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 관심 유전자(GOI)를 더 포함하는, 방법.
제50항에 있어서, 상기 관심 유전자(GOI)는 외생적으로 부가된 GOI인, 방법.
제51항에 있어서, 상기 외생적으로 부가된 GOI는 인간 유전자인, 방법.
제48항 또는 제49항에 있어서, 상기 조절 요소는 외생적으로 부가된 조절 요소인, 방법.
제41항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 POI는 항체 중쇄, 항체 경쇄, 항원-결합 단편 및 Fc-융합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 방법.
제41항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Tn의 제1 농도는 1μg/mL인, 방법.
제41항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증가하는 Tn의 농도는 Tn의 제2 농도 및 제3 농도를 포함하는, 방법.
제56항에 있어서, 상기 제2 농도는 상기 Tn의 제1 농도보다 크고, 상기 제3 농도는 상기 Tn의 제2 농도보다 큰, 방법.
제56항 또는 제57항에 있어서, 상기 Tn의 제2 농도는 2.5μg/ml이고, 상기 제3 농도는 5μg/mL인, 방법.
제41항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증가하는 Tn의 농도는 Tn의 제2 농도를 포함하며, 여기서 상기 Tn의 제2 농도는 2.5μg/ml 또는 5μg/ml인, 방법.