KR20220114031A - 면역 자극 조성물 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 면역 자극 조성물을 제공하는데, 사포닌 및 CpG올리고데옥시뉴클레오타이드를 포함하거나 또는 사포닌을 포함하는 보조제 및 CpG올리고데옥시뉴클레오타이드로 조성되는 면역 자극 조성물에 있어서, 상기 CpG올리고데옥시뉴클레오타이드 서열은 두 개 또는 두 개 이상 복제된 5'-TTCGTT-3'모티프 또는 5'-TCGTCGTCG-3'모티프를 갖는다. 본 발명은 질환을 치료하기 위한 약물을 제조하는 상기 면역 자극 조성물의 용도를 제공한다.

Description

면역 자극 조성물 및 그 용도
본 발명은 생물 제약 분야에 속한다. 구체적으로, 본 발명은 면역 자극 조성물에 관한 것으로, 상기 면역 자극 조성물은 사포닌 및 CpG올리고데옥시뉴클레오타이드를 포함하거나 또는 상기 면역 자극 조성물은 사포닌을 포함하는 보조제 및 CpG올리고데옥시뉴클레오타이드로 조성된다. 여기서, 상기 CpG올리고데옥시뉴클레오타이드 서열은 두 개 또는 두 개 이상 복제된 5'-TTCGTT-3'모티프 또는 5'-TCGTCGTCG-3'모티프를 갖는다. 본 발명은 또한 상기 면역 자극 조성물의 제약 용도에 관한 것이다.
CpG올리고데옥시뉴클레오타이드는 최근 몇 년 동안 발견된 신규한 면역 자극제이고, 화학적 성질은 시토신구아닌디뉴클레오티드를 함유하는 올리고데옥시뉴클레오티드이며, 천연 CpG 패턴 인식 수용체와 유사한 면역 반응을 갖고, 세포막의 Toll-like 수용체에 결합할 수 있으며, TLR9 신호 통로를 통해 포유동물 면역 반응을 효과적으로 유도한다. CpG에 의한 면역 반응은 주로 Thl형이고, Th2형 면역 응답을 Thl으로 전환시켜 세포 면역을 자극할 수 있다. T세포, B세포, NK세포와 같은 면역 활성 세포를 활성화하여 다량의 다양한 사이토카인을 생성함으로써 유기체의 특이적 면역 효과를 향상시키는 바, 천연 및 획득성 면역을 연결하는 중요한 고리이다.
사포닌은 아글리콘이 트리테르페노이드 또는 스피로스테란 화합물인 글리코시드이고, 식물 유래 보조제에 속한다. 여기서, 퀼라야 사포닌(QS)은 퀼라야 나무에서 추출한 사포닌이고, QS 시리즈에서 QS-21은 현재 가장 널리 보도된 보조제 유형이지만 QS-21은 세포 용혈을 유도할 수 있으며, 전신 부작용과 전신 및 국소 독성 및 부작용이 있다. Alving 등(ALVING CR, MATYAS G, BECK Z, et al. Revue Roumaine de Chimie, 2016, 61(8): 631-635.)은 연구에서 ALF 리포좀으로 MPLA 및 QS-21을 보조제로 사용하여 항HIVgp140 단백질에 대해 혈청 내 항체 역가를 효과적으로 증가시킬 수 있는 것을 발견하였다. Ng 등(NG H, FERNANDO G J P, DEPELSENAIRE A C I, et al. Scientific Reports, 2016, 6(1): 228-230.)은 피하 전달 기술-나노패치를 사용하여, QS-21과 보조제 복합체를 형성하였다. 결과는, 전통적인 근육내 주사에 비해, 나노패치는 항원 및 QS-21의 투여량을 유의하게 감소시킬 수 있고 더 높은 IgG 역가를 유도할 수 있음을 입증하였다(Han Ziyi, Zeng Zhongliang, 현대 농업 기술, 2019(14): 220-221.).
선행기술(WO2001051083A3)은 사포닌 및 CpG올리고데옥시뉴클레오타이드에 관한 면역 자극 조성물을 보도하였고, 여기서CpG올리고데옥시뉴클레오타이드는 주로 CpG1826 및 CpG7909를 포함한다. 그러나, CpG올리고데옥시뉴클레오타이드가 구조적 다양성을 갖기에, 상이한 서열의 CpG 보조제 사이의 효과 차이는 매우 크다.
따라서, 현재 면역 효과가 더 강한 보조제 및 약물이 필요하다.
선행기술의 단점에 대하여, 발명자는 다량의 연구를 거친 후, 면역 효과가 보다 강한 면역 자극 조성물을 예기치 않게 발견하였고, 상기 조성물에서, 사포닌과 CpG올리고데옥시뉴클레오타이드 사이는 고효율적인 시너지 효과를 나타내며, 더 강력한 면역 응답을 매개할 수 있다. 상기 면역 자극 조성물을 상이한 항원 또는 항원 조성물에 적용시키면, 모두 상당한 이점을 갖는다.
따라서, 본 발명의 목적은 고효율적인 면역 자극 원성을 얻기 위한 다양한 약물의 제조에 사용될 수 있는 면역 자극 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 포유동물의 면역 반응을 강력하게 유발할수 있는 백신 보조제를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 이하 기술적 해결수단을 통해 구현된다.
한편으로, 본 발명은 면역 자극 조성물을 제공하는데, 상기 면역 자극 조성물은 사포닌 및 CpG올리고데옥시뉴클레오타이드를 포함하거나 또는 사포닌을 포함하는 보조제 및 CpG올리고데옥시뉴클레오타이드로 조성되고, 상기 CpG올리고데옥시뉴클레오타이드 서열은 두 개 또는 두 개 이상 복제된 5'-TTCGTT-3'모티프 또는 5'-TCGTCGTCG-3'모티프를 갖는다.
본 발명에 따른 면역 자극 조성물에 있어서, 상기 CpG올리고데옥시뉴클레오타이드의 서열은 CpG T1: TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT(SEQ ID NO: 6), CpG T2: TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT CGT T(SEQ ID NO: 7) 및 CpG T3: TCG TCG TCG TCG TCG TCG TCG(SEQ ID NO: 8)에서의 임의의 하나로부터 선택된다.
바람직하게, 상기 CpG올리고데옥시뉴클레오타이드의 서열은 CpG T1: TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT(SEQ ID NO: 6)이다.
본 발명에 따른 면역 자극 조성물에 있어서, 상기 사포닌은 퀼라야 사포닌, 진세노사이드, 플라티코닌, 아스트라갈로사이드, 노토진세노사이드, 글리시리진, 합환피 사포닌, 맥문동 사포닌, 사이코 사포닌 또는 죽절삼 사포닌에서의 한가지 또는 여러 가지로부터 선택되고; 바람직하게, 상기 사포닌은 퀼라야 사포닌, 진세노사이드, 플라티코닌 또는 아스트라갈로사이드이며; 보다 바람직하게, 상기 퀼라야 사포닌은 QS-7, QS-17, QS-18 또는 QS-21이고; 보다 바람직하게, 상기 퀼라야 사포닌은 QS-21이며; 상기 진세노사이드는 진세노사이드Rg1, 진세노사이드Rg3, 진세노사이드Rb1 또는 진세노사이드Re일 수 있고; 상기 플라티코닌은 플라티코닌D, 플라티코닌D2 또는 양자의 혼합물일 수 있으며; 상기 아스트라갈로사이드는 아스트라갈로사이드(아스트라갈로사이드IV), 아스트라갈로사이드I, 아스트라갈로사이드II 또는 이들 중에서의 두 가지 또는 두 가지 이상의 사포닌 단량체의 혼합물일 수 있고; 상기 노토진세노사이드는 노토진세노사이드R1일 수 있으며; 상기 맥문동 사포닌은 맥문동 사포닌D일 수 있고; 상기 사이코 사포닌은 사이코 사포닌a, 사이코 사포닌d 또는 양자의 혼합물일 수 있으며; 상기 합환피 사포닌은 합환피의 토탈 사포닌일 수 있고; 상기 글리시리진은 감초의 토탈 사포닌일 수 있으며; 상기 죽절삼 사포닌은 죽절삼의 토탈 사포닌일 수 있다.
본 발명에 따른 면역 자극 조성물에 있어서, 상기 사포닌을 포함하는 보조제는 면역 자극 복합 보조제(Iscom보조제)이다.
본 발명에 따른 면역 자극 조성물에 있어서, 상기 CpG올리고데옥시뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 연결을 포함한다. 특히, 상기 CpG올리고데옥시뉴클레오타이드는 티오올리고데옥시뉴클레오타이드이고, 바람직하게는 퍼티오올리고데옥시뉴클레오타이드이다.
본 발명에 따른 면역 자극 조성물에 있어서, 상기 CpG올리고데옥시뉴클레오타이드와 상기 사포닌의 중량비는 1~40: 0.1~2이고, 바람직하게는 2~40: 0.1~2이며, 더욱 바람직하게는 2: 1이다.
다른 한편으로, 본 발명은 상기 면역 자극 조성물 및 항원 또는 항원 조성물을 포함하는 약물 조성물을 더 제공한다.
본 발명에 따른 약물 조성물에 있어서, 상기 항원 또는 항원 조성물은, 인체 면역 결핍 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스, 수두-대상포진 바이러스, 인간 세포 비대 바이러스, A형, B형, C형 또는 E형 간염 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스, 인유두종 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 결핵균, 살모넬라균, 수막염균 또는 임질균과 같은 나이세리균, 회귀열보렐리아 또는 B.duttoni와 같은 보렐리아속, 트라코마 클라미디아와 같은 클라미디아속, 보르데텔라백일해와 같은 보르데텔라속, 열대열 말라리아 원충(Plasmodium falciparum), 사일열 말라리아 원충(Plasmodium malariae), 난형열 말라리아 원충(Plasmodium ovale), 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax) 또는 원숭이열 말라리아 원충(Plasmodium knowlesi)과 같은 말라리아 원충속, 또는 톡소포자충과 같은 톡소포자충속에서의 임의의 하나로부터 선택된다.
본 발명에 따른 약물 조성물에 있어서, 상기 인간 헤르페스 바이러스는 HSV1 또는 HSV2이다.
본 발명에 따른 약물 조성물에 있어서, 상기 항원은 종양 항원이다.
다른 한편으로, 본 발명은 상기 면역 자극 조성물을 포함하는 백신을 더 제공한다.
본 발명에 따른 백신에 있어서, 상기 백신은 바이러스, 세균 및/또는 기생충 감염을 예방하기 위한 백신이거나, 상기 백신은 면역 요법으로 바이러스, 세균 및/또는 기생충 감염을 치료하는 백신이다.
또 다른 한편으로, 본 발명은 세포용해성 T세포 응답을 유발하기 위한 약물을 제조하는 상기 면역 자극 조성물의 용도를 제공한다.
일부 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 포유동물에서 인터페론γ 응답을 유도하기 위한 약물을 제조하는 상기 면역 자극 조성물의 용도를 제공한다.
일부 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 바이러스, 세균 및/또는 기생충 감염을 예방하기 위한 백신을 제조하는 상기 면역 자극 조성물의 용도를 제공한다.
일부 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 면역 요법으로 바이러스, 세균 및/또는 기생충 감염을 치료하기 위한 백신을 제조하는 상기 면역 자극 조성물의 용도를 제공한다.
일부 구체적인 실시형태에서, 본 발명은 면역 요법으로 종양을 치료하기 위한 백신을 제조하는 상기 면역 자극 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 필요로 하는 피험자에게 유효량의 본 발명의 면역 자극 조성물을 포함하는 약물 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 세포용해성 T세포 응답을 유발하는 방법을 더 제공한다.
본 발명은 필요로 하는 피험자에게 유효량의 본 발명의 면역 자극 조성물을 포함하는 약물 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 포유동물에서 인터페론γ 응답을 유발하는 방법을 더 제공한다.
본 발명은 필요로 하는 피험자에게 예방 유효량의 본 발명의 면역 자극 조성물을 포함하는 백신을 투여하는 단계를 포함하는 바이러스, 세균 및/또는 기생충 감염을 예방하는 방법을 더 제공한다.
본 발명은 필요로 하는 피험자에게 유효량의 본 발명의 면역 자극 조성물을 포함하는 백신을 투여하는 단계를 포함하는 면역 요법으로 바이러스, 세균 및/또는 기생충 감염을 치료하는 방법을 더 제공한다.
본 발명은 필요로 하는 피험자에게 치료 유효량의 본 발명의 면역 자극 조성물을 포함하는 약물 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 종양을 치료하는 방법을 더 제공한다.
본 발명에 의해 제공되는 면역 자극 조성물은 예기치 못한 기술적 효과를 달성하고 더 강한 면역 응답을 매개할 수 있다. CpG T1~T3을 단독으로 사용한 면역 자극 효과는 CpG1018, CpG7909 및 CpG1826 등에 비해 약하지만 QS-21과 연합하여 적용한 후, 상기 면역 자극 조성물은 예기치 못한 시너지 효과를 나타내고, 면역 효과는 유의하게 향상된다.
본 발명의 연구에 따르면, 상기 면역 자극 조성물을 함유하는 B형 간염 치료 백신은 유전자 변형 마우스의 면역 내성을 돌파하고, 고역가의 항HBsAg 항체, 항HBcAg 항체, 중화 항체를 생성할 수 있다. 각 검출 결과는 모두 이 백신이 다중 면역을 통해 유전자 변형 마우스 체내 B형 간염 바이러스를 유의하게 제거할 수 있음을 나타내고, 면역 과정이 종료된 후, HBsAb 수준은 포화에 근접하여 안정적이며 장기적인 면역 효과를 유지할 수 있고, HBsAg의 평균 감소율은 92%로 유지된다. 동시에 상기 면역 자극 조성물을 함유하는 B형 간염 백신은 강한 HBsAg 및 HBcAg 특이적 IFN-γ 수준을 유도할 수 있고, 면역 효과는 단일 보조제보다 유의하게 우수하며, 기존의 CPG 보조제 및 QS-21의 조합보다도 유의하게 우수하다.
상기 면역 자극 조성물을 함유하는 대상포진 백신은 또한 이 면역 자극 조성물이 우수한 면역 자극 효과를 갖는 것을 입증하였다. 세포 면역 실험은 상기 백신이 강한 헤르페스 gE 단백질 특이적 IFN-γ 수준을 유도할 수 있고, 단백질 면역 효과는 단일 보조제보다 유의하게 우수함을 입증하였다. 체액 면역 실험에서도 상기 백신이 높은 헤르페스 gE 단백질 특이적 IgG/IgG1/IgG2a 항체수준을 생성할 수 있고, 효과가 단일 보조제보다 유의하게 우수하며, 기존의 CPG 보조제 및 QS-21의 조합보다도 유의하게 우수함을 입증하였다.
요약하면, 본 발명에 의해 제공되는 면역 자극 조성물은 단일 보조제, 기존의 CPG 보조제 및 QS21의 조합보다 우수한 면역 자극 효과를 갖고, 본 발명의 면역 자극 조성물에서 CpG T1~T3과 QS-21은 고효율적인 시너지 효과를 나타내며, 더 강력한 면역 응답을 매개할 수 있다. 상이한 항원 또는 항원 조성물에 적용시키면, 모두 유의한 이점을 갖는다. 따라서, 본 발명의 면역 자극 조성물은 새로운 보조제로서, 높은 임상적 적용 가치 및 광범위한 시장 전망을 갖는다.
이하, 도면과 결부하여 본 발명의 실시형태를 상세하게 설명하는데, 여기서,
도 1은 HBsAg 항원 특이적 IFN-γ 분비 수준에 대한 상이한 CPG올리고데옥시뉴클레오타이드의 영향을 나타내고;
도 2는 HBcAg 항원 특이적 IFN-γ 분비 수준에 대한 상이한 CPG올리고데옥시뉴클레오타이드의 영향을 나타내며;
도 3은 HBsAg 항원 특이적 IFN-γ 분비 수준에 대한 본 발명에 따른 상이한 면역 자극 조성물의 영향을 나타내고;
도 4는 HBcAg 항원 특이적 IFN-γ 분비 수준에 대한 본 발명에 따른 상이한 면역 자극 조성물의 영향을 나타내며;
도 5는 HBsAg 항원 특이적 IFN-γ 분비 수준에 대한 본 발명에 따른 상이한 투여량의 면역 자극 조성물의 영향을 나타내고;
도 6은 HBcAg 항원 특이적 IFN-γ 분비 수준에 대한 본 발명에 따른 상이한 투여량의 면역 자극 조성물의 영향을 나타내며;
도 7은 혈청 내 HBsAg 수준에 대한 본 발명의 면역 자극 조성물을 함유하는 B형 간염 백신의 영향을 나타내고;
도 8은 혈청 내 HBsAb 수준에 대한 본 발명의 면역 자극 조성물을 함유하는 B형 간염 백신의 영향을 나타내며;
도 9는 HBsAg 항원 특이적 IFN-γ 분비 수준에 대한 본 발명의 면역 자극 조성물을 함유하는 B형 간염 백신의 영향을 나타내고;
도 10은 HBcAg 항원 특이적 IFN-γ 분비 수준에 대한 본 발명의 면역 자극 조성물을 함유하는 B형 간염 백신의 영향을 나타내며;
도 11은 마우스 혈청 내 HBsAg 항원 특이적 IgG 항체 및 이의 아형 수준에 대한 본 발명의 면역 자극 조성물을 함유하는 B형 간염 백신의 영향을 나타내고;
여기서, A도면: 각 군의 마우스 혈청의 HBsAb IgG수준; B도면: 각 군의 마우스 혈청의 HBsAb IgG1수준; C도면: 각 군의 마우스 혈청의 HBsAb IgG2a수준; D도면: 각 군의 마우스 혈청의 HBsAb IgG2a와 IgG1의 비율이며;
도 12는 마우스 혈청 내 HBcAg 항원 특이적 IgG 항체 및 이의 아형 수준에 대한 본 발명의 면역 자극 조성물을 함유하는 B형 간염 백신의 영향을 나타내고;
여기서, A도면: 각 군의 마우스 혈청의 HBcAb IgG수준; B도면: 각 군의 마우스 혈청의 HBcAb IgG1수준; C도면: 각 군의 마우스 혈청의 HBcAb IgG2a수준; D도면: 각 군의 마우스 혈청의 HBcAb IgG2a와 IgG1의 비율이며;
도 13은 헤르페스 gE 항원 특이적 IFN-γ 분비 수준에 대한 본 발명의 면역 자극 조성물을 함유하는 대상포진 백신의 영향을 나타내고;
도 14는 마우스 혈청 내 항원 특이적 IgG항체 및 이의 아형 수준에 대한 본 발명의 면역 자극 조성물을 함유하는 대상포진 백신의 영향을 나타내며;
여기서, A도면: 각 군의 마우스 혈청의 IgG수준; B도면: 각 군의 마우스 혈청의 IgG1수준; C도면: 각 군의 마우스 혈청의 IgG2a수준; D도면: 각 군의 마우스 혈청의 IgG2a와 IgG1의 비율을 나타낸다.
도 15는 헤르페스 gE 항원 특이적 IFN-γ 분비 수준에 대한 본 발명에 따른 상이한 사포닌을 포함하는 면역 자극 조성물의 영향을 나타낸다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어는 본 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 분야의 정의 및 용어에 대해, 전문가는 구체적으로 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel)를 참조할 수 있다. 아미노산 잔기의 약어는 본 분야에서 일반적으로 사용되는 20개의 L-아미노산에서의 하나를 나타내는 표준 3문자 및/또는1문자 코드이다.
본 발명은 넓은 범위로 수치 범위 및 파라미터의 근사치를 나타내지만 구체적인 실시예에 표시된 수치는 최대한 정확하게 기재한다. 그러나, 임의의 수치는 본질적으로 각각의 측정에서 존재하는 표준 편차에서 필연적으로 발생하는 일정한 오차를 포함한다. 이 외에, 본문에 개시된 모든 범위는 여기에 포함된 임의의 및 모든 하위 범위를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어 기재된 "2 내지 40"의 범위는 최소값 2와 최대값 40 사이(엔드 포인트 포함)의 임의의 및 모든 하위 범위를 포함하는 것으로 간주되어야 하고, 다시 말해서, 2 내지 6.1과 같이 최소값 2 또는 이상으로 시작하는 모든 하위 범위 및 5.5 내지 40과 같이 최대값 40 또는 이하로 끝나는 모든 하위 범위이다. 이 외에, "본문에 통합된다"로 언급된 임의의 참조 문헌은 그 전체가 통합되는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 하나의 지시 대상체로 제한된다는 것이 분명하거나 명확하지 않는 한, 그것이 지시하는 대상체의 복수 형태를 포함한다. 문맥에서 달리 명확하게 지시하지 않는 한, 용어 "또는"은 용어 "및/또는"과 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본문에 사용된 용어 "약물 조성물", "조합 약물" 및 "약물 조합"은 상호 교환적으로 사용될 수 있고, 특정 목적을 달성하기 위해 함께 조합되는 적어도 하나의 약물 및 임의로 약용 가능한 부형제 또는 보조 재료의 조합을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 상기 약물 조성물은 본 발명의 목적을 달성하기 위해 공동 작용할 수 있는 한, 시간적으로 및/또는 공간적으로 분리된 조합을 포함한다. 예를 들어, 상기 약물 조성물에 포함된 성분(예를 들어 gE단백질, QS-21, CpG올리고데옥시뉴클레오타이드)은 전체로서 대상체에 투여될 수 있거나 개별적으로 대상체에게 투여될 수 있다. 상기 약물 조성물에 포함된 성분들이 개별적으로 대상체에게 투여될 경우, 상기 성분은 동시에 또는 순차적으로 대상체에게 투여될 수 있다.
본문에 사용된 용어 "CpG올리고데옥시뉴클레오타이드" 또는 "CpG-ODN"은 하나 또는 복수개의 "CpG" 단위를 포함하는 짧은 단일 사슬 합성 DNA 분자를 지칭하고, 여기서 C는 시토신을 나타내며, G는 구아닌을 나타내고, p는 포스포디에스테르 결합을 나타낸다. 특히, 상기 CpG올리고데옥시뉴클레오타이드는 메틸화되지 않은 것이다. 일부 실시형태에서, 상기 CpG-ODN은 포스포로티오에이트 연결 또는 포스포로티오에이트 백본을 포함한다. 다시 말해서, 일부 실시형태에서, 상기 CpG-ODN은 포스포로티오에이트 올리고데옥시뉴클레오타이드(즉 티오올리고데옥시뉴클레오타이드)이다. 바람직하게, 상기 CpG-ODN의 모든 뉴클레오타이드 사이의 연결은 모두 포스포로티오에이트 연결이고, 즉 상기 CpG-ODN은 퍼티오올리고데옥시뉴클레오타이드이다. 다른 실시형태에서, 상기 CpG-ODN은 두 개 또는 두 개 이상 복제된 5'-TTCGTT-3'모티프 또는 5'-TCGTCGTCG-3'모티프를 포함한다. 특히, 상기 CpG-ODN은, TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT(SEQ ID NO: 6), TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT CGT T(SEQ ID NO: 7) 또는 TCG TCG TCG TCG TCG TCG TCG(SEQ ID NO: 8)로부터 선택되는 서열을 갖고, 바람직하게는 TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT(SEQ ID NO: 6)이다.
본문에 사용된 "진세노사이드, 플라티코닌, 아스트라갈로사이드, 노토진세노사이드, 글리시리진, 합환피 사포닌, 맥문동 사포닌, 사이코 사포닌 또는 죽절삼 사포닌”은 대응 식물에 존재하는 활성 성분을 지칭하고, 예를 들어 진세노사이드는 주로 인삼의 약재에 존재하는 스테롤 화합물로서, 인삼의 활성 성분이다. 일부 실시형태에서, 상기 진세노사이드는 바람직하게 진세노사이드Rg1, 진세노사이드Rg3, 진세노사이드Rb1, 진세노사이드Re 등 단량체 또는 이들 중에서의 두 개 또는 두 개 이상의 사포닌 단량체의 혼합물이고; 플라티코닌은 바람직하게 플라티코닌D, 플라티코닌D2 또는 양자의 혼합물이며; 아스트라갈로사이드는 바람직하게 아스트라갈로사이드(아스트라갈로사이드 IV), 아스트라갈로사이드I, 아스트라갈로사이드II 등 단량체 또는 이들 중에서의 두 개 또는 두 개 이상의 사포닌 단량체의 혼합물이고; 노토진세노사이드는 바람직하게는 노토진세노사이드R1 등이며; 맥문동 사포닌은 바람직하게 맥문동 사포닌D 등이고; 사이코 사포닌은 바람직하게 사이코 사포닌a, 사이코 사포닌d 또는 양자의 혼합물이며; 합환피 사포닌은 바람직하게 합환피의 토탈 사포닌 등이고; 글리시리진은 바람직하게 감초의 토탈 사포닌 등이며; 죽절삼 사포닌은 바람직하게 죽절삼의 토탈 사포닌 등이다.
본문에 사용된 "Iscom 보조제"는 면역 자극 복합 보조제로서, 구체적으로 항원을 포함하지 않는 Iscom 매트릭스(ISCOM MATRIX)는 인지질, 사포닌, 콜레스테롤로 조성된 케이지 형상 구조의 보조제이다.
본문에 사용된 "치료 및/또는 예방 유효량" 또는 "유효량"은 그것이 투여되는 대상체에게 이점을 나타내기에 충분한 투여량을 지칭한다. 투여되는 실제량 및 투여 속도와 시간 경과는 치료되는 대상체의 개별 상태 및 중증도에 따라 결정된다. 치료하는 처방(예를 들어 투여량의 결정 등)은 최종적으로 일반 의사 및 기타 의사의 책임이고 이에 의존하여 결정되며, 일반적으로 치료할 질환, 개별 환자의 상태, 전달 부위, 투여 방법 및 의사가 알고 있는 기타 요인을 고려한다.
본문에 사용된 용어 "포유동물"은 인간을 지칭하고, 또한 야생 동물(예: 왜가리, 황새, 두루미 등), 가축(예: 오리, 거위 등) 또는 실험 동물(예: 성성이, 원숭이, 래트, 마우스, 토끼, 기니피그, 우드척, 땅다람쥐 등)과 같은 기타 동물일 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 특히 그것이 약물 제제 형태로 존재할 경우, 약용 가능한 담체 또는 첨가제와 같은 추가의 첨가제를 더 포함할 수 있다.
바람직한 약물 담체는 물, 완충 수용액이고, 바람직한 등장성 염용액은 PBS(인산염 완충액), 포도당, 만니톨, 덱스트로스, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 셀룰로오스, 탄산마그네슘, 0.3% 글리세린, 히알루론산, 에탄올 또는 폴리프로필렌글리콜, 트리글리세리드와 같은 폴리알킬렌글리콜 등이다. 사용되는 약물 담체의 유형은 특히 본 발명에 따른 조성물이 경구, 비강, 피내, 피하, 근육내 또는 정맥 투여용으로 조제되는 지의 여부에 의존한다. 본 발명에 따른 조성물은 첨가제로서 습윤제, 유화제 또는 완충액 물질을 포함할 수 있다.
본 발명의 약물 조성물, 백신 또는 약물 제제는 임의의 적합한 경로로 투여될 수 있고, 예를 들어 경구, 비강, 피내, 피하, 근육내 또는 정맥내 투여될 수 있다.
이하 도면을 결부하여 구체적인 실시형태의 설명을 통해 본 발명을 추가로 설명하지만 본 발명에 대한 한정이 아니고, 본 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기본 사상에 근거하여, 다양한 수정 또는 개선을 가할 수 있지만 본 발명의 기본 사상을 벗어나지 않는 한, 모두 본 발명의 범위 내에 있다.
이하 구체적인 실시예를 참조하여 본 발명을 설명한다. 본 분야에서 통상의 지식을 가진 자는, 이러한 실시예는 단지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하지 않음을 이해할 수 있다.
하기 실시예의 실험 방법은 달리 명시되지 않는 한, 모두 통상적인 방법이다. 하기 실시예에 사용된 원료, 시약 재료 등은 달리 명시되지 않는 한, 모두 시판 제품이다.
실시예1 본 발명의 면역 자극 조성물 및 B형 간염 백신의 제조
1. HBsAg원액: HBsAg단백질의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 1로 표시된다.
HBsAg단백질은 HBsAg유전자 재조합 효모 세포로부터 제조되고, 효모 세포 유형은 한세눌라 폴리모르파, 맥주효모균 및 피히아 파스토리스를 포함하며, 바람직하게는 한세눌라 폴리모르파이다. 구체적인 제조 단계는 중국특허출원 CN108330145A를 참조하고, HBsAg유전자 재조합 한세눌라 폴리모르파 세포는 발효 배양을 통해, 균체를 수확하였다. 파균 처리 및 실리카겔 흡착, 컬럼크로마토그래피 및 TFF 등 단계를 통해 정제하였다.
2. HBcAg원액: HBcAg단백질의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 2로 표시된다.
HBcAg단백질은 HBcAg유전자 재조합 효모 세포로부터 제조되고, 효모 세포 유형은 한세눌라 폴리모르파, 맥주효모균 및 피히아 파스토리스를 포함하며, 바람직하게는 한세눌라 폴리모르파이다. 구체적인 제조 단계는 중국특허출원 CN108047316A를 참조하고, HBcAg유전자 재조합 한세눌라 폴리모르파 세포는 발효 배양을 통해, 균체를 수확하였다. 파균 처리 및 황산암모늄, 컬럼크로마토그래피 및 TFF 등 단계를 통해 정제하고, HBcAg원액을 제조하였다.
3. QS-21: BRENNTAG 회사에서 구입하였고, CAS.NO.A010-023이다.
4. CPG올리고데옥시뉴클레오타이드 원료의 제조 방법:
올리고데옥시뉴클레오타이드는 합성으로 제조된 올리고데옥시뉴클레오타이드 서열 세그먼트로서, 하나 또는 복수개의 CpG모티프를 포함하고, 표 1을 참조하면 본 실시예는 올리고데옥시뉴클레오타이드 서열을 사용하였다.
표 1 CPG올리고데옥시뉴클레오타이드의 구체적인 서열
CPG올리고데옥시뉴클레오타이드의 유형화 CPG올리고데옥시뉴클레오타이드 서열
B형 CpG 1018 TGACTGTGAACGTTCGAGATGA(SEQ ID NO: 3)
CpG 7909 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO: 4)
CpG 1826 TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQ ID NO: 5)
CpG T1 TCGTTCGTTCGTTCGTTCGTT(SEQ ID NO: 6)
CpG T2 TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT CGT T(SEQ ID NO: 7)
CpG T3 TCG TCG TCG TCG TCG TCG TCG(SEQ ID NO: 8)
CpG 684 TCGACGTTCGTCGTTCGTCGTTC(SEQ ID NO: 9)
CpG 1668 TCC ATG ACG TTC CTG ATGCT(SEQ ID NO: 10)
CpG D2 TGTCGTCGTCGTTTGTCGTTTGTCGTT(SEQ ID NO: 11)
A형 CpG 2216 GGGGGACGATCGTCGGGGGG(SEQ ID NO: 12)
ODN 2336 GGGGACGACGTCGTGGGGGGG(SEQ ID NO: 13)
C형 ODN 2395 TCGTCGTTTCGCGCGCGCCG(SEQ ID NO: 14)
ODN M362 TCGTCGTTCGTTCGTCGAACGACGTTTGAT(SEQ ID NO: 15)
구체적인 제조방법: 통상적인 고체상 포스포라미다이트 트리에스테르 화학적 합성 방법을 사용하고, 3'단으로부터 시작하며, 1)탈보호기: 먼저 트리클로로아세트산으로 CpG에 연결된 뉴클레오타이드의 보호기 DMT(디메톡시트리틸기)를 제거하여, 유리된 5'히드록시기를 수득하여, 다음 단계의 축합 반응에 사용되도록 제공하고; 2)활성화: 포스포라미다이트 보호된 뉴클레오타이드 단량체를 테트라졸 활성화제와 혼합하며 합성 컬럼에 진입시켜, 포스포라미다이트 테트라졸 활성 중간체를 형성하고, 이 중간체와 CpG의 탈보호된 뉴클레오타이드는 축합 반응을 발생하며; 3)연결: 포스포라미다이트 테트라졸 활성 중간체가 CpG의 탈보호된 뉴클레오타이드를 만나면, 5'히드록시기와 친화성 반응을 발생하여 테트라졸을 축합하고 제거하며, 이때 올리고뉴클레오타이드 사슬은 하나의 염기만큼 앞으로 연장되고; 4)산화: 축합 반응 시 뉴클레오타이드 단량체는 아인산염 결합을 통해 CpG에 연결된 올리고뉴클레오타이드에 연결되지만 아인산염 결합은 불안정하여 산 또는 염기에 의해 쉽게 가수분해되며, 이때 티오 시약으로 포스포라미다이트를 티오인 이중 결합의 포스포트리에스테르로 산화시킴으로써 안정한 올리고뉴클레오타이드를 얻고; 5)밀봉: 축합 반응 후 CpG에 연결된 미반응 5'히드록시기가 이후의 순환 반응에서 연장되는 것을 방지하기 위하여, 종종 아세틸화로 이 말단 히드록시기를 밀봉하며; 이상 5개의 단계를 경과한 후, 하나의 데옥시뉴클레오타이드는 CpG의 뉴클레오타이드에 연결되고; 이상 탈보호기, 활성화, 연결, 산화, 밀봉 과정을 반복하면 하나의 DNA 세그먼트 조품을 얻을 수 있으며; 마지막으로 절단, 탈보호기, 정제, 정량화 등 합성 후 처리하면 된다.
5. PBS 용액(Hyclone 회사에서 구입)으로 HBsAg원액 및 HBcAg원액을 각각 200μg/ml 및 100μg/ml로 희석하고; PBS 용액으로 각 CPG 원료를 각각 용해시키며 100μg/ml로 희석하고, 다음 단계에 사용된다.
실시예2 CPG올리고데옥시뉴클레오타이드의 선별 실험
1. 실험 동물: C57BL/6(N) 마우스, 수컷, 4주령, 135마리, 상하이링창바이오테크유한회사(Shanghai Lingchang Laboratory Animal Technology Co., Ltd.).
2. 실험 그룹화: 표 2를 참조하면, 1회 주사량은 100μL/마리이다. 여기서 A군은 음성 대조이고, 100μL/마리의 PBS 용액을 주사하였다.
표 2 실험 동물의 그룹화
그룹별 개수
(마리)		 조성성분(μg/마리 마우스)
HBsAg HBcAg CpG T1 CpG T2 CpG T3 CpG 1018 CpG 7909 CpG 1826 CpG 684 CpG 1668 CPG D2 CpG 2216 ODN2336 ODN
2395		 ODNM362
대조 9
항원 9 20 10
T1 9 20 10 10
T2 9 20 10 10
T3 9 20 10 10
1018 9 20 10 10
7909 9 20 10 10
1826 9 20 10 10
684 9 20 10 10
1668 9 20 10 10
D2 9 20 10 10
2216 9 20 10 10
2336 9 20 10 10
2395 9 20 10 10
M362 9 20 10 10
3. 실험 단계: 마우스 면역 후 제7일에 비장을 취하여, 통상적인 방법으로 비장 림프구를 제조하였고, 구체적으로 다음과 같다. 무균 작업으로 비장을 취하였다. 무균 집게 및 가위로 비장을 잘라 70μm의 세포 여과망에 놓고, 2mL의 미리 냉각된 2% FBS(GIBCO 회사에서 구입)-PBS가 함유된 접시에 놓으며; 절구로 비장을 연마하고, 비장 세포는 메쉬를 통해 플레이트에 진입하여, 세포 현탁액을 얻으며, 파스퇴르 피펫으로 현탁액을 40μm의 세포 여과망으로 여과(BD 회사에서 구입)된 50mL의 무균 원심분리관에 넣고; 500xg, 4℃로 5분 동안 원심분리하며; 상층액을 제거하고, 2mL의 lХ적색 파괴제(BD 회사에서 구입)를 넣어 세포를 재현탁시키며, 4℃에서 빛을 피하여 5분 동안 정치시켜, 적혈구를 파괴하고; 10mL의 2% FBS-PBS를 넣어 적색 파괴 반응을 중지시키며; 500xg, 4℃에서 5분 동안 원심분리하고; 상층액을 제거하며, 5mL의 2% FBS-PBS를 넣어 세포를 재현탁시켰다. 자극 물질 HBsAg 특이적 펩타이드 라이브러리PS4 및 HBcAg 특이적 펩타이드 라이브러리PCP로 비장 세포를 자극하고; 키트 설명서에 따라, ELISPOT키트(BD 회사)를 사용하여 HBsAg 및 HBcAg 항원 특이적 IFN-γ 분비 수준을 검출하며; ImmunoSPOT Series 3 엘리사 분석기로 ELISPOT 키트에 의해 검출된 스팟 개수를 판독하였다(구체적인 작업 단계는 중국특허 CN104043120B의 실시예7을 참조). 여기서, HBsAg 특이적 펩타이드 라이브러리 서열은 중국 특허 CN104043120B의 실시예7을 참조하고; HBcAg 특이적 펩타이드 라이브러리 서열은 SEQ ID NO: 16~30을 참조한다.
4. 실험 결과: ELISPOT 스팟 결과는 도 1 및 도 2를 참조하고, 결과에 따르면, 상이한 서열의 B형 CpG 보조제는 상이한 면역 효과를 가지며, 여기서, CpG T1~T3, CpG1018, CpG7909, CpG 1826 및 CpG 684는 전체적으로 A형 CpG 보조제 및 C형 CpG 보조제보다 우수하지만 CpG1618 및 CPG D2의 면역 효과는 좋지 않았고, HBsAg 및 HBcAg 특이적 IFN-γ 수준은 모두 A형 CpG 보조제 및 C형 CpG 보조제보다 낮았다.
실시예3 면역 자극 조성물의 선별 실험
1. 실험 동물: C57BL/6(N) 마우스, 수컷, 4주령, 81마리, 상하이링창바이오테크유한회사,
2. 실험 그룹화: 표 3을 참조하면, 1회 주사량은 100μL/마리이다. 여기서 A군은 음성 대조이고, 100μL/마리의 PBS 용액을 주사하였다.
표 3 실험 동물의 그룹화
그룹별 개수
(마리)		 조성성분(μg/마리 마우스)
HBsAg HBcAg CpG T1 CpG T2 CpG T3 CpG 1018 CpG 7909 CpG 1826 CpG 684 QS21
대조 9
항원 9 20 10
T1 9 20 10 10 5
T2 9 20 10 10 5
T3 9 20 10 10 5
1018 9 20 10 10 5
7909 9 20 10 10 5
1826 9 20 10 10 5
684 9 20 10 10 5
3. 실험 단계: 실시예2와 동일하다.
4. 실험 결과: ELISPOT 스팟 결과는 도 3 및 도 4를 참조하고, 결과에 따르면, CpG T1~T3과 QS21을 연합하여 적용한 후 고효율적인 시너지 효과를 발생하였으며, 유도된 HBsAg 및 HBcAg 특이적 IFN-γ 수준은 CpG1018, CpG7909 등 기타 CpG 보조제보다 유의하게 높았고, 예기치 못한 면역 효과를 갖는다.
실시예4 약물 조성물의 면역 효과에 대한 상이한 함량의 보조제의 영향
1. 실험 동물: C57BL/6(N)마우스, 수컷, 4주령, 60마리, 상하이링창바이오테크유한회사.
2. 시약 재료:
1) HBsAg단백질, HBcAg단백질 및 CpG T1은 모두 실시예1에 의해 제조;
2) QS-21(CAS.NO.A010-023, BRENNTAG 회사에서 구입)
3) PBS 용액(Hyclone 회사에서 구입)으로 HBsAg원액, HBcAg원액을 각각 200μg/ml, 100μg/ml로 희석하고, PBS 용액으로 QS21을 각각 5μg/ml, 50μg/ml, 100μg/ml로 희석하며, PBS 용액으로 CpG T1을 용해시키고 각각 50μg/ml, 100μg/ml, 2mg/ml로 희석하며, PBS 용액으로 CPG7909를 용해시키고 100μg/ml로 희석하며, 다음 단계에 사용되었다.
3. 실험 그룹화: 표 4를 참조하면, 1회 주사량은 100μL/마리이다. 여기서 A군은 음성 대조이고, 100μL/마리의 PBS 용액을 주사하였다.
4. 실험 단계: 실시예2와 동일하다.
5. 실험 결과: ELISPOT 스팟 결과는 도 5 및 도 6을 참조하고, 결과에 따르면, CpG T1과 QS21의 투여량 변화가 백신 조성물에 대하여 모두 유의한 영향을 미치며, 투여량5의 면역 자극 조성물보다 크고, 유도된 HBsAg 및 HBcAg 특이적 IFN-γ 수준은 CPG7909군보다 유의하게 높지만 종속의 차이로 인해 보조제 투여량은 유도 효과를 추가로 증가시켜도 유의하게 증가하지 않았으며, 마우스가 보조제의 면역 강도를 정확하게 반영할 수 없기 때문이라고 추측하였다.
투여량1, 2, 4 및 CPG7909군의 면역 자극 효과는 상당하지만 사용된 보조제 투여량은 동등한 CPG7909군보다 낮으므로 또한 일정한 이점을 갖는다.
표 4 실험 동물의 그룹화
그룹별 개수
(마리)		 조성성분(μg/마리 마우스)
HBsAg HBcAg CpG T1 QS21 CPG7909
대조 5
항원 5 20 10
투여량1 5 20 10 5 0.5
투여량2 5 20 10 5 5
투여량3 5 20 10 5 10
투여량4 5 20 10 10 0.5
투여량5 5 20 10 10 5
투여량6 5 20 10 10 10
투여량7 5 20 10 200 0.5
투여량8 5 20 10 200 5
투여량9 5 20 10 200 10
CPG7909 5 20 10 5 10
실시예5 B형 간염 백신의 실험군 설정 및 면역화 과정
1. 실험 동물 및 모델 구축:
C57BL/6(N) 마우스, 수컷, 4주령, 81마리, 상하이링창바이오테크유한회사, rAAV8-HBV아데노바이러스, 베이징우쟈허분자의학연구소유한회사(Beijing Wujiahe Institute of Molecular Medicine Co., Ltd)에서 구입하였다. C57BL/6(N) 마우스의 꼬리에 rAAV8-HBV아데노바이러스를 정맥 주사하여, rAAV8-HBV에 의해 지속적으로 감염된 C57BL/6(N)의 마우스 모델을 구축하였다.
2. 시약 재료:
1) HBsAg단백질: 실시예1에 의해 제조된다.
2) HBcAg단백질: 실시예1에 의해 제조된다.
3) PBS 용액(Hyclone 회사에서 구입)으로 HBsAg원액, HBcAg원액 및 QS-21을 각각 200μg/ml, 100μg/ml, 50μg/ml로 희석하고, PBS 용액으로 CpG를 용해시키며 100μg/ml로 희석하고, 다음 단계에 사용되었다.
3. 실험 그룹화: 표 5를 참조하면, 각 마우스의 1회 주사량은 100μL/마리이고, 여기서 A군은 음성 대조이며, 100μL/마리의 PBS 용액을 주사하였다.
표 5 실험 동물의 그룹화 및 각 군의 주사량
그룹별 개수
(마리)		 조성성분(μg/마리 마우스)
HBsAg HBcAg CpG T1 CpG 7909 QS-21
A 9
B 9 10
C 9 5
D 9 10 5
E 9 20 10
F 9 20 10 10
G 9 20 10 5
H 9 20 10 10 5
I 9 20 10 10 5
4. 동물 면역화: 모든 군은 2주에 1회 근육 주사하였고, 접종 부위는 오른쪽 뒷다리이며, 꼬리 정맥에 rAAV8-HBV바이러스를 주사한 후 각각 제4주, 제6주, 제8주, 제10주, 제12주, 제14주에 총 6회 투여하였다. 투여 시작 후 2주마다 1회 채혈하였고, 채혈 시간은 각각 제4주, 제6주, 제8주, 제10주, 제12주, 제14주, 제16주, 제18주, 제20주, 제22주이다. 제22주에 모든 마우스를 희생시켰다.
실시예6 혈청 내 HBsAg 수준에 대한 B형 간염 백신의 영향
1. 혈청 HBsAg의 검출 단계: 남경고로우병원(Nanjing Drum Tower Hospital)에 위탁하여 검출하였다.
2단계 면역 측정법을 사용하였고, 먼저 검출 샘플 및 B형 간염 표면 항체로 코팅된 상자성 미세입자를 결합하며, 세척 후, 아크리디늄 에스테르 표지된 B형 간염 표면 항체 접합체를 넣은 후, 다시 세척하고, 예비 여기 용액 및 여기 용액을 반응 혼합물에 넣으며, 검출 샘플의 상대 발광값(RLU)을 검출하고, 샘플의 HBsAg 함량과 RLU 사이에는 양의 상관 관계가 있으며, 생성된 ARCHTITECT HBsAg 표준 곡선으로 마우스 혈청 샘플의 HBsAg 농도를 측정하였고, 최종 마우스 혈청 샘플의 HBsAg 농도는 측정값의 50~200배이다.
2. 결과 분석(도 7): 본 발명의 상기 면역 자극 물질을 함유하는 H군의 백신에 있어서, 대응되는 HBsAg 수준은 유의하게 감소하는 경향을 나타냈고, 면역 과정이 종료된 후(제14주부터), 안정적이고 장기적인 면역 효과를 유지하며, 단일 CpG군(F군) 및 QS-21군(G군)에 비해, 유의한 이점을 갖는다. H군의 HBsAg 수준은 >6350 IU/ml에서 시작하여 약 50 IU/ml로 감소하였고, 2차 면역(제6주) 후 이 군의 HBsAg 수준은 30% 이상 감소하였으며, 3차 면역(제8주) 후 HBsAg 수준은 70% 이상 감소하였고, 제14주 면역이 종료된 후 평균 감소율은 약 92%를 유지하였다. 우수한 면역 효과를 갖는다. 이중 보조제 대조(I군)에 비해, H군은 제14주 면역이 종료된 후에도 여전히 안정적인 면역 효과를 유지하였고, 면역 수준은 I군보다 유의하게 우수하였다.
실시예7 B형 간염 백신의 체액 면역 효과 평가
1. 혈청 HBsAb의 검출 단계: 남경고로우병원에 위탁하여 검출하였다.
2단계 면역 측정법을 사용하였고, 즉 먼저 검출 샘플 및 재조합 HBsAg(rHBsAg)로 코팅된 상자성 미세입자를 혼합하며, 세척 후, 아크리디늄 에스테르 표지된 rHBsAg 접합체를 넣은 후, 다시 세척하고, 예비 여기 용액 및 여기 용액을 반응 혼합물에 넣으며, 검출 샘플의 상대 발광값(RLU)을 검출하고, 샘플의 HBsAb 함량과 RLU 사이에는 양의 상관 관계가 있으며, 생성된 ARCHTITECT HBsAb 검층 곡선으로 마우스 혈청 샘플의 HBsAb 농도를 측정하였고, 최종 마우스 혈청 샘플의 HBsAb 농도는 측정값의 50~200배이다.
2. 결과 분석(도 8): 상기 면역 자극 물질을 함유하는 H군의 백신은 2차 면역(제6주) 후 HBsAb(>10mIU/ml) 생성을 시작하였고, 면역 횟수가 증가함에 따라, HBsAb 수준은 지속적인 증가 추세를 나타냈으며, 증가 추세는 단일 CpG군(F군) 및 QS-21군(G군)보다 현저하게 우수하였다. 면역이 종료된 후 2주(제16주) 후 HBsAb 수준은 포화에 근접하였고, 4.0개의 로그값, 즉 약 10000mIU/ml의 HBsAb 수준에 도달할 수 있으며, 이중 보조제 대조(I군)에 비해, 생성된 항체 수준은 또한 유의한 이점을 갖는다.
실시예8 B형 간염 백신의 세포 면역 효과 평가
1. 검출 단계: 실시예2와 동일하다.
2. 평가 지표: 대조웰의 스팟 개수≤5 SCF이고, 샘플웰의 스팟 개수≥10 SCF이면, 양성으로 판정되고; 5 SFC＜대조웰의 스팟 개수≤10 SCF이고, 샘플웰의 스팟 개수/대조웰의 스팟 개수≥2이면, 양성으로 판정되며; 대조웰의 스팟 개수＞10 SFC이고, 샘플웰의 스팟 개수/대조웰의 스팟 개수≥3이면, 양성으로 판정된다.
3. 실험 결과:
표 6 비장 세포에서 분비하는 HBsAg 및 HBcAg 특이적 IFN-γ의 양성 전환율
그룹별 개수(마리) 양성 전환율(%)
HBsAg HBcAg
A 9 11.1 11.1
B 9 0 11.1
C 8 0 0
D 8 12.5 12.5
E 9 37.5 12.5
F 9 100 100
G 8 100 100
H 8 100 100
I 8 100 100
세포 면역 수준 검출 결과: ELISPOT 스팟 결과는 도 9 및 10을 참조하고, 분석 결과에 따르면, F군-I군의 HBsAg 특이적 IFN-γ 양성 전환율은 모두 100%이며, HBcAg 특이적 IFN-γ 양성 전환율은 약 100%임을 나타냈다. 상기 면역 자극 물질을 함유하는 H군의 백신은 높은 HBsAg 및 HBcAg 특이적 IFN-γ 수준을 유도할 수 있고, 각각 2350 SFC/106 비장 세포 및 1250 SFC/106 비장 세포보다 크며, 단일 CpG군(F군) 및 QS-21군(G군)에 비해, 유의한 차이를 갖는다. H군 및 이중 보조제 대조(I군)를 비교하면, 후자에 의해 유도된 HBsAg 및 HBcAg 특이적 IFN-γ 수준은 약 1630 SFC/106 비장 세포 및 750 SFC/106 비장 세포이고, H군보다 유의하게 낮았다.
실시예9 혈청 내 약물 조성물의 HBsAg 및 HBcAg 특이적 항체의 검출
1. 검출 단계: 정제된 HBsAg 및 HBcAg로 96웰 효소 표지 플레이트를 코팅하여 고체상 항원을 형성하고, 밀봉 처리한 후, 시험할 혈청을 일정한 초기 희석도로 이중 희석하며, 복수개의 희석도를 설정하고, 96웰 효소 표지 플레이트에 이중 희석된 혈청 샘플을 넣은 후, HRP 표지된 항IgG/IgG1/IgG2a항체와 결합하여 항원-항체(혈청)-효소 표지 항체 복합체를 형성하며, 마지막으로 기질 TMB를 첨가하여 발색하고, 마이크로플레이트 리더로 450nm 파장에서의 흡광도(OD값)를 측정하며, 발색 색심도는 검출 샘플의 HBsAg 및 HBcAg 특이적 항체IgG/IgG1/IgG2a 수준과 양의 상관 관계가 있고, "흡광도 OD값-혈청 샘플 희석 배수(Log)"의 관계 곡선을 피팅하여, 항체 역가를 측정하였다.
2. 결과 분석:
1) 혈청 내 HBsAb IgG 항체 및 아형 검출 결과:
도 11에 도시된 바와 같이, 각 군에서 상이한 시간에 ELISA 방법으로 마우스 혈청 내 HBsAb IgG 항체 및 아형 수준을 검출하였다. 상기 면역 자극 물질을 함유하는 H군의 백신은 높은 역가의 항HBsAg 특이적 IgG/IgG1/IgG2a 항체를 생성하고, 면역 횟수의 증가에 따라, 항체 수준은 지속적으로 증가하며, 6회 면역(제14주) 시 항체 수준은 포화에 근접하였고, 특이적 항체 역가는 5.4개 로그값 이상에 도달할 수 있으며; A군-D군에서는 특이적 항체가 검출되지 않았고, E군-G군은 일정한 HBsAg 특이적 IgG/IgG1/IgG2a 항체 수준을 생성하지만 항체 수준은 H군보다 유의하게 낮았으며, 이중 보조제 대조(I군)에 의해 생성된 항HBsAg 특이적 IgG 항체 및 IgG2a 항체 수준은 H군보다 유의하게 낮았다.
2) 혈청 내 HBcAb IgG 항체 및 아형 검출 결과:
도 12에 도시된 바와 같이, 각 군에서 상이한 시간에 ELISA 방법으로 마우스 혈청 내 HBcAb IgG 항체 및 아형 수준을 검출하였다. 상기 면역 자극 물질을 함유하는 H군의 백신은 높은 역가의 항HBcAg 특이적 IgG/IgG1/IgG2a 항체를 생성하고, 면역 횟수의 증가에 따라, 항체수준은 지속적으로 증가하며, 6회 면역(제14주) 시 항체 수준은 포화에 근접하였고, 특이적 항체 역가는 4.8개 로그값 이상에 도달할 수 있으며; A군-D군에서는 특이적 항체가 검출되지 않았고, E군-G군은 일정한 HBcAg 특이적 IgG/IgG1/IgG2a 항체 수준을 생성하지만 항체 수준은 H군보다 유의하게 낮았다. H군은 Th1 통로에 더 편향하고, D도면은 특이적 항체 IgG2a가 유의한 상승 추세를 나타내며, H군의 백신이 항HBcAg 항체 아형의 형질전환을 촉진할 수 있고, 형질전환 효율이 이중 보조제 대조(I군)보다 유의하게 높은 것을 알 수 있다.
실시예10 대상포진 백신의 실험군 설정
1. 실험 동물 및 모델 구축:
C57BL/6(N) 마우스, 암컷, 5주령, 48마리, 상하이스래크실험동물유한회사(Shanghai SLAC Laboratory Animal Co.,Ltd)에서 구입하였다.
2. 시약 재료:
1) 헤르페스 gE 단백질: 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 31로 표시된다.
제조 단계는 문헌 Thomsson E, Persson L 등은 <Journal of Virological Methods>2011, 제175권, 제1호, 제53-59페이지의 보도를 참조하고, 구체적인 단계는 다음과 같다. 표적 단백질 서열에 근거하여 핵산 서열을 최적화하여 코돈이 포유동물 발현 시스템에 부합되도록 하고, 표적 유전자를 합성하며; 합성된 표적 유전자를 효소 절단 연결 방식으로 pcDNA3.1(+) 플라스미드에 연결시키고, Top 10 컴피턴트로 형질전환하며, 양성 단일 클론을 선별하고, 양성 단일 클론을 시퀀싱 검증하며; 단일 클론 균체를 다량으로 증폭하고, 내독소가 없는 플라스미드 추출 키트를 사용하여 세포 형질감염에 부합되는 플라스미드를 다량으로 추출하며; 일시적 형질감염 방식에 의해 플라스미드로 CHO 현탁 세포를 형질감염시키고, CHO 세포 활력이 70% 미만이거나 발효 시간이 7일을 초과할 경우, 4℃에서 5000rpm으로 30min 동안 원심분리하여 발효액의 상층액을 수집하였다. 발효액을 4℃의 크로마토그래피 캐비닛에서 50mM의 Tris-HCl, 500mM의 NaCl, 20mM의 이미다졸을 포함하는 용액으로 투석하고, 투석 비율은 1: 100이며, 4h에 1회 투석하고, 총 3회 투석하며; 니켈 컬럼으로 수집한 샘플을 정제하고, 수집한 표적 단백질 피크 샘플에 대해 SDS-PAGE 검출을 수행하며, 보다 순수한 정제액을 병합하고, 20mM의 인산염, 150mM의 NaCl를 함유하는 용액을 4℃의 크로마토그래피 캐비닛에서 24h 동안 투석하며, 투석 비율은 1: 100이고, 8h에 1회 교체하며; 샘플을 0.22μm의 무균 여과막에 통과시키고, 4℃의 냉장고에 보관하였다.
제조된 헤르페스 gE 단백질 원액은 순도가 95%보다 높아야 하고, 단백질 함량은 200μg/ml보다 낮지 않아야 하며, 내독소 수준은 0.1Eu/ug보다 높지 않아야 한다.
2) PBS 용액(Hyclone 회사에서 구입)으로 헤르페스 gE 원액을 각각 50μg/ml 및 10μg/ml로 희석하고, PBS 용액으로 QS-21을 각각 50μg/ml 및 10μg/ml로 희석하며, PBS 용액으로 CpG를 각각 100μg/ml 및 20μg/ml로 희석하고, PBS 용액으로 CpG7909를 각각 100μg/ml 및 20μg/ml로 희석하였다.
3. 실험 그룹화: 표 7을 참조하면, 각 마우스의 1회 주사량은 100μL/마리이고, 여기서 A군은 음성 대조이며, 100μL/마리의 PBS 용액을 주사하였다.
표 7 실험 동물의 그룹화 및 각 군의 주사량
그룹별 개수(마리) 조성성분μg/마리
헤르페스 gE 단백질 CpG T1 CpG7909 QS-21
A 6
B 6 5
C 6 5 10
D 6 5 5
E 6 5 10 5
F 6 5 10 5
G 6 1 2 1
H 6 1 2 1
4. 동물 면역화: 모든 군은 2주에 1회 근육 주사하였고, 접종 부위는 오른쪽 뒷다리이며, 연속 2회, 즉 0주 및 제2주에 각각 주사 투여하였고, 제4주에 모든 마우스를 희생시켰다.
실시예11 대상포진 백신의 세포 면역 약효 검증
1. 검출 단계 및 평가 지표는 실시예2와 동일하고; 여기서 gE특이적 펩타이드 라이브러리 서열은 SEQ ID NO.32~46을 참조한다.
2. 실험 결과: 각 군의 마우스의 비장 세포가 gE 특이적 IFN-γ를 분비하는 T림프구 스팟 개수는 도 13에 도시된 바와 같고, gE 특이적 IFN-γ 양성 전환율 결과는 표 8에 도시된 바와 같다. 결과는, 고투여량으로 면역화된 E, F군에 대응되는 비장 세포가 gE 특이적 IFN-γ를 분비하는 T림프구 스팟 개수 수준(>4000SFC/106 비장 세포)은 모두 저투여량의 G, H군보다 유의하게 높았고; 여기서, E군, G군(CpGTl+QS-21)에 대응되는 비장 세포가 gE 특이적 IFN-γ를 분비하는 T림프구 스팟 개수 수준은 동일한 투여량의 F군, H군(CpG7909+QS-21)보다 높았으며, E-H군의 IFN-γ의 양성 전환율은 모두 100%임을 입증하였다.
표 8 비장 세포가 분비하는 SgE 특이적 IFN-γ의 양성 전환율
그룹별 A B C D E F G H
양성 전환 개수/마리 1/6 0/6 4/6 5/6 6/6 6/6 6/6 6/6
양성 전환율/% 16.7 0 66.7 83.3 100 100 100 100
실시예12 대상포진 백신의 체액 면역 약효 검증
1. 검출 단계: 면역화 후 제28일에 채혈하고, 혈청을 분리하며(전혈을 37℃의 항온 인큐베이터에 넣고 40min, 12000rpm, 4℃에서 10min 동안 원심분리하며; 상층액을 흡인하고, -20℃에서 동결 보관), 키트 설명서에 따라, ELISA 키트(상하이커화(Shanghai Kehua Bio-engineering Co. Ltd))를 사용하여 생성된 헤르페스 gE 단백질 특이적 항체의 양성 전환율을 검출하였다. 블랭크 대조, 음성 대조 및 시험할 샘플을 검출을 위해 설정하고, 각각은 두 개의 평행웰이며, 여기서 음성 대조는 음성 마우스 혈청이고; 블랭크 대조 외에, 각각의 웰에 음성 대조 또는 시험할 샘플을 넣으며, 효소 접합체를 더 넣고, 균일하게 혼합하여 밀봉한 후 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하며; 세척 용액을 사용하여 각 웰을 세척하고, 각 웰에 발색제 A용액 및 발색제 B용액을 넣으며, 균일하게 혼합하여 밀봉한 후 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하고; 각 웰에 중지 용액을 넣고 균일하게 혼합하며; 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm 파장에서의 각 웰의 OD값을 판독하였다.
2. 실험 결과: ELISA는 마우스 혈청에서 항원 특이적 IgG 항체 및 아형 수준을 검출하고 도 14에 도시된 바와 같이, 결과에 따르면, 본 발명의 면역 자극 물질을 함유하는 E군의 면역 효과는 단일 CpG군(C군) 및 QS-21군(D군) 및 이중 보조제 대조(F군)보다 유의하게 우수하였고, 대응되는 IgG 및 IgG2a 항체 수준은 두 군에서 모두 유의한 차이가 존재하였으며, 즉 QS-21에 CpG를 넣으면 상응한 체액 면역 수준을 향상시킬 수 있다.
실시예13 재조합 대상포진 백신 조성물 약효에 대한 상이한 사포닌의 영향
1. 실험 동물 및 모델 구축:
C57BL/6(N) 마우스, 암컷, 5주령, 48마리, 상하이스래크실험동물유한회사에서 구입하였다.
2. 시약 재료:
1)헤르페스 gE 단백질은 실시예10에 의해 수득, CpG T1, CpG 7909는 모두 실시예1에 의해 제조;
2)QS-21(CAS.NO.A010-023, BRENNTAG 회사에서 구입); 진세노사이드Rg1(CAS: 22427-39-0, 남경춘치우바이오유한회사(Nanjing Spring&Autumn Biotech Co.,Ltd)에서 구입), 아스트라갈로사이드(CAS: 84687-43-4, 남경춘치우바이오유한회사에서 구입), 플라티코닌D(CAS: 58479-68-8, 호북윈메이캐미칼유한회사(Hubei Yunmei Chem Co.,Ltd)에서 구입), Iscom보조제(상하이시왠바이오유한회사(Shanghai Xiyuan bio Co.,Ltd)에서 구입).
3) PBS 용액(Hyclone 회사에서 구입)으로 헤르페스 gE 원액을 50μg/mL로 희석하고, PBS 용액으로 각 사포닌을 각각 50μg/mL로 희석하며, PBS 용액으로 CpG T1 및 CpG 7909를 각각 용해시키고 100μg/mL로 희석하며, 다음 단계에 사용되었다.
3. 실험 그룹화:
표 9를 참조하면, 1회 주사량은 100μL/마리이다. 여기서 대조군에 100μL/마리의 PBS 용액을 주사하였다.
4. 실험 단계: 실시예2와 동일하다.
5. 실험 결과:
ELISPOT 스팟 결과는 도 15를 참조하고, 결과에 따르면, CpG T1과 각 사포닌을 연합 적용한 후 모두 고효율적인 시너지 효과를 발생하였으며, gE 특이적 IFN-γ수준이 다른 CpG 및 사포닌의 조성물보다 유의하게 높도록 유도할 수 있고, 여기서, QS-21의 효과는 가장 우수하였다.
표 9 실험 동물의 그룹화
그룹별 개수(마리) 조성성분(μg/마리 마우스)
gE CpG T1 QS-21 진세노사이드 Rg1 플라티코닌D 아스트라갈로사이드
IV		 Iscom보조제 CpG 7909
대조 6
항원 6 5
QS-21 6 5 10 5
진세노사이드 Rg1 6 5 10 5
플라티코닌D 6 5 10 5
아스트라갈로사이드 6 5 10 5
Iscom 6 5 10 5
7909 6 5 5 10
종합해보면, 본 발명에 의해 제공되는 면역 조성물은 우수한 면역 자극 효과를 갖고, 단일 보조제, 기타 CpG 보조제 및 QS21의 조합에 비해, CpG T1~T3과 QS-21은 고효율적인 시너지 효과를 나타내며, 더 강력한 면역 응답을 매개할 수 있다. 상이한 항원 또는 항원 조성물에 적용시키면, 모두 유의한 이점을 갖는다. 따라서, 본 발명의 면역 자극 조성물은 새로운 보조제로서, 높은 임상적 적용 가치 및 광범위한 시장 전망을 갖는다.
이상 본 발명을 상세하게 설명하였지만 본 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고 본 발명에 대해 다양한 수정 및 변경을 가할 수 있음을 이해할 수 있다. 본 발명의 권리범위는 상술한 상세한 설명에 한정되지 않고, 상기 수정 및 변경은 특허청구범위에 속하여야 한다. 이상 본 발명의 구체적인 실시형태의 예시만을 설명하였지만 본 분야에서 통상의 지식을 가진 자는, 상술한 것은 단지 예시일 뿐, 본 발명의 보호범위는 첨부된 특허청구범위에 의해 한정되는 것을 이해해야 한다. 본 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 원리 및 실질을 벗어나지 않고, 이러한 실시형태에 대하여 다양한 변경 또는 수정을 가할 수 있지만 이러한 변경 또는 수정은 모두 본 발명의 보호범위에 있어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> GRAND THERAVAC LIFE SCIENCE（NANJING）CO.,LTD. <120> IMMUNOSTIMULATORY COMPOSITION AND USE THEREOF <130> EIC20310034P-KR <150> CN2019112795360.0 <151> 2019-12-13 <160> 46 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 226 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBsAg protein <400> 1 Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln 1 5 10 15 Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu 20 25 30 Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys 35 40 45 Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser 50 55 60 Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe 65 70 75 80 Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val 85 90 95 Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly 100 105 110 Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala 115 120 125 Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp 130 135 140 Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys 145 150 155 160 Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu 165 170 175 Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu 180 185 190 Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile 195 200 205 Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val 210 215 220 Tyr Ile 225 <210> 2 <211> 183 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HBcAg protein <400> 2 Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Ile Arg Asp Leu Leu Asp 20 25 30 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys 35 40 45 Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu 50 55 60 Leu Met Asn Leu Ala Thr Trp Val Gly Ser Asn Leu Glu Asp Pro Ala 65 70 75 80 Ser Arg Glu Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys 85 90 95 Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg 100 105 110 Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr 115 120 125 Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro 130 135 140 Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr 145 150 155 160 Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser 165 170 175 Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys 180 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG oligodeoxynucleotide <400> 3 tgactgtgaa cgttcgagat ga 22 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG oligodeoxynucleotide <400> 4 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG oligodeoxynucleotide <400> 5 tccatgacgt tcctgacgtt 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG oligodeoxynucleotide <400> 6 tcgttcgttc gttcgttcgt t 21 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CpG oligodeoxynucleotide <400> 7 tcgttcgttc gttcgttcgt tcgtt 25 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial 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Gln Met Ser Ala Gln Glu Asp Leu 85 90 95 Gly Asp Asp Thr Gly Ile His Val Ile Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp 100 105 110 Arg His Lys Ile Val Asn Val Asp Gln Arg Gln Tyr Gly Asp Val Phe 115 120 125 Lys Gly Asp Leu Asn Pro Lys Pro Gln Gly Gln Arg Leu Ile Glu Val 130 135 140 Ser Val Glu Glu Asn His Pro Phe Thr Leu Arg Ala Pro Ile Gln Arg 145 150 155 160 Ile Tyr Gly Val Arg Tyr Thr Glu Thr Trp Ser Phe Leu Pro Ser Leu 165 170 175 Thr Cys Thr Gly Asp Ala Ala Pro Ala Ile Gln His Ile Cys Leu Lys 180 185 190 His Thr Thr Cys Phe Gln Asp Val Val Val Asp Val Asp Cys Ala Glu 195 200 205 Asn Thr Lys Glu Asp Gln Leu Ala Glu Ile Ser Tyr Arg Phe Gln Gly 210 215 220 Lys Lys Glu Ala Asp Gln Pro Trp Ile Val Val Asn Thr Ser Thr Leu 225 230 235 240 Phe Asp Glu Leu Glu Leu Asp Pro Pro Glu Ile Glu Pro Gly Val Leu 245 250 255 Lys Val Leu Arg Thr Glu Lys Gln Tyr Leu Gly Val Tyr Ile Trp Asn 260 265 270 Met Arg Gly Ser Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Phe Leu Val Thr 275 280 285 Trp Lys Gly Asp Glu Lys Thr Arg Asn Pro Thr Pro Ala Val Thr Pro 290 295 300 Gln Pro Arg Gly Ala Glu Phe His Met Trp Asn Tyr His Ser His Val 305 310 315 320 Phe Ser Val Gly Asp Thr Phe Ser Leu Ala Met His Leu Gln Tyr Lys 325 330 335 Ile His Glu Ala Pro Phe Asp Leu Leu Leu Glu Trp Leu Tyr Val Pro 340 345 350 Ile Asp Pro Thr Cys Gln Pro Met Arg Leu Tyr Ser Thr Cys Leu Tyr 355 360 365 His Pro Asn Ala Pro Gln Cys Leu Ser His Met Asn Ser Gly Cys Thr 370 375 380 Phe Thr Ser Pro His Leu Ala Gln Arg Val Ala Ser Thr Val Tyr Gln 385 390 395 400 Asn Cys Glu His Ala Asp Asn Tyr Thr Ala Tyr Cys Leu Gly Ile Ser 405 410 415 His Met Glu Pro Ser Phe Gly Leu Ile Leu His Asp Gly Gly Thr Thr 420 425 430 Leu Lys Phe Val Asp Thr Pro Glu Ser Leu Ser Gly Leu Tyr Val Phe 435 440 445 Val Val Tyr Phe Asn Gly His Val Glu Ala Val Ala Tyr Thr Val Val 450 455 460 Ser Thr Val Asp His Phe Val Asn Ala Ile Glu Glu Arg Gly Phe Pro 465 470 475 480 Pro Thr Ala Gly Gln Pro Pro Ala Thr Thr Lys Pro Lys Glu Ile Thr 485 490 495 Pro Val Asn Pro Gly Thr Ser Pro Leu Leu Arg Gly Gly Gly Gly Ser 500 505 510 His His His His His His 515 <210> 32 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gE-specific peptide <400> 32 Ser Val Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Ile Asp Glu Asp Lys Leu 1 5 10 15 <210> 33 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gE-specific peptide <400> 33 Tyr Asp Asp Phe His Ile Asp Glu Asp Lys Leu Asp Thr Asn Ser 1 5 10 15 <210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gE-specific peptide <400> 34 His Ile Asp Glu Asp Lys Leu Asp Thr Asn Ser Val Tyr Glu Pro 1 5 10 15 <210> 35 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gE-specific peptide <400> 35 Asp Lys Leu Asp Thr Asn Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser 1 5 10 15 <210> 36 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gE-specific peptide <400> 36 Thr Asn Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala Glu 1 5 10 15 <210> 37 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gE-specific peptide <400> 37 Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser Ser Trp Val 1 5 10 15 <210> 38 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gE-specific peptide <400> 38 Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser Ser Trp Val Asn Arg Gly Glu 1 5 10 15 <210> 39 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gE-specific peptide <400> 39 His Ala Glu Ser Ser Trp Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys 1 5 10 15 <210> 40 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gE-specific peptide <400> 40 Ser Trp Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His 1 5 10 15 <210> 41 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gE-specific peptide <400> 41 Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn Ser Pro Tyr 1 5 10 15 <210> 42 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gE-specific peptide <400> 42 Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn Ser Pro Tyr Ile Trp Pro Arg 1 5 10 15 <210> 43 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> gE-specific peptide <400> 43 Tyr Asp His Asn Ser Pro 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Claims (23)

  1. 사포닌 및 CpG올리고데옥시뉴클레오타이드를 포함하거나 또는 사포닌을 포함하는 보조제 및 CpG올리고데옥시뉴클레오타이드로 조성되는 면역 자극 조성물에 있어서,
    상기 CpG올리고데옥시뉴클레오타이드 서열은 두 개 또는 두 개 이상 복제된 5'-TTCGTT-3'모티프 또는 5'-TCGTCGTCG-3'모티프를 갖는 것을 특징으로 하는 면역 자극 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 CpG올리고데옥시뉴클레오타이드의 서열은 CpG T1: TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT(SEQ ID NO: 6), CpG T2: TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT CGT T(SEQ ID NO: 7) 및 CpG T3: TCG TCG TCG TCG TCG TCG TCG(SEQ ID NO: 8)에서의 임의의 하나로부터 선택되고;
    바람직하게, 상기 CpG올리고데옥시뉴클레오타이드의 서열은 CpG T1: TCG TTC GTT CGT TCG TTC GTT(SEQ ID NO: 6)인 것을 특징으로 하는 면역 자극 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 사포닌은 퀼라야 사포닌, 진세노사이드, 플라티코닌, 아스트라갈로사이드, 노토진세노사이드, 글리시리진, 합환피 사포닌, 맥문동 사포닌, 사이코 사포닌 또는 죽절삼 사포닌에서의 한가지 또는 여러 가지로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 면역 자극 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 퀼라야 사포닌은 QS-7, QS-17, QS-18 또는 QS-21이고, 바람직하게, 상기 퀼라야 사포닌은 QS-21이며; 상기 진세노사이드는 진세노사이드Rg1, 진세노사이드Rg3, 진세노사이드Rb1 또는 진세노사이드Re이고; 상기 플라티코닌은 플라티코닌D, 플라티코닌D2 또는 양자의 혼합물이며; 상기 아스트라갈로사이드는 아스트라갈로사이드, 아스트라갈로사이드I, 아스트라갈로사이드II 또는 이들 중에서의 두 가지 또는 두 가지 이상의 사포닌 단량체의 혼합물이고; 상기 노토진세노사이드는 노토진세노사이드R1이며; 상기 맥문동 사포닌은 맥문동 사포닌D이고; 상기 사이코 사포닌은 사이코 사포닌a, 사이코 사포닌d 또는 양자의 혼합물이며; 상기 합환피 사포닌은 합환피의 토탈 사포닌이고; 상기 글리시리진은 감초의 토탈 사포닌이며; 상기 죽절삼 사포닌은 죽절삼의 토탈 사포닌인 것을 특징으로 하는 면역 자극 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 사포닌을 포함하는 보조제는 Iscom 보조제인 것을 특징으로 하는 면역 자극 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CpG올리고데옥시뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 자극 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 CpG올리고데옥시뉴클레오타이드는 퍼티오올리고데옥시뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하는 면역 자극 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 CpG올리고데옥시뉴클레오타이드와 사포닌의 중량비는 1~40: 0.1~2이고, 바람직하게는 2~40: 0.1~2이며; 보다 바람직하게는 2: 1인 것을 특징으로 하는 면역 자극 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 면역 자극 조성물 및 항원 또는 항원 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 항원 또는 항원 조성물은, 인체 면역 결핍 바이러스, 인간 헤르페스 바이러스, 수두-대상포진 바이러스, 인간 세포 비대 바이러스, A형, B형, C형 또는 E형 간염 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스, 인유두종 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 결핵균, 살모넬라균, 수막염균 또는 임질균과 같은 나이세리균, 회귀열보렐리아 또는 B.duttoni와 같은 보렐리아속, 트라코마 클라미디아와 같은 클라미디아속, 보르데텔라백일해와 같은 보르데텔라속, 열대열 말라리아 원충(Plasmodium falciparum), 사일열 말라리아 원충(Plasmodium malariae), 난형열 말라리아 원충(Plasmodium ovale), 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax) 또는 원숭이열 말라리아 원충(Plasmodium knowlesi)과 같은 말라리아 원충속, 또는 톡소포자충과 같은 톡소포자충속에서의 임의의 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약물 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 인간 헤르페스 바이러스는 HSV1 또는 HSV2인 것을 특징으로 하는 약물 조성물.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 항원은 종양 항원인 것을 특징으로 하는 약물 조성물.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 면역 자극 조성물을 포함하는 백신에 있어서,
    바람직하게, 상기 백신은 바이러스, 세균 및/또는 기생충 감염을 예방하기 위한 백신이거나, 상기 백신은 면역 요법으로 바이러스, 세균 및/또는 기생충 감염을 치료하는 백신인 것을 특징으로 하는 백신.
  14. 세포용해성 T세포 응답을 유발하기 위한 약물을 제조하는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 면역 자극 조성물의 용도.
  15. 포유동물에서 인터페론γ 응답을 유도하기 위한 약물을 제조하는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 면역 자극 조성물의 용도.
  16. 바이러스, 세균 및/또는 기생충 감염을 예방하기 위한 백신을 제조하는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 면역 자극 조성물의 용도.
  17. 면역 요법으로 바이러스, 세균 및/또는 기생충 감염을 치료하기 위한 백신을 제조하는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 면역 자극 조성물의 용도.
  18. 면역 요법으로 종양을 치료하기 위한 백신을 제조하는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 상기 면역 자극 조성물의 용도.
  19. 필요로 하는 피험자에게 유효량의 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 약물 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포용해성 T세포 응답을 유발하는 방법.
  20. 필요로 하는 피험자에게 유효량의 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 약물 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 포유동물에서 인터페론γ 응답을 유발하는 방법.
  21. 필요로 하는 피험자에게 예방 유효량의 제13항에 따른 백신을 백신을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스, 세균 및/또는 기생충 감염을 예방하는 방법.
  22. 필요로 하는 피험자에게 치료 유효량의 제13항에 따른 백신을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역 요법으로 바이러스, 세균 및/또는 기생충 감염을 치료하는 방법.
  23. 필요로 하는 피험자에게 치료 유효량의 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 약물 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 종양을 치료하는 방법.
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