KR20220121246A - 핵산 전달용 신규한 지질 나노입자 - Google Patents

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KR20220121246A
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젬마 나바르로
페트릭 바움호프
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큐어백 아게
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Abstract

본 발명은 살아 있는 세포로의 핵산 전달에 유용한 신규한 양이온성 지질 및 양이온성 지질을 포함하는 신규한 조성물에 관한 것이다.

Description

핵산 전달용 신규한 지질 나노입자
본 발명은 mRNA 기반 백신으로 유용한 지질 나노입자(lipid nanoparticles)를 포함하는 mRNA에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 지질 나노입자를 포함하는 mRNA를 포함하는 조성물, 및 지질 나노입자를 포함하는 mRNA의 용도 또는 예를 들어, 감염성 질병, 종양 또는 암 질병, 알레르기 또는 자가면역 질병의 예방 또는 치료에 이용되는 약학 조성물, 특히 백신 제조를 위한 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 전술한 질병의 치료 또는 예방 방법을 추가로 기술한다.
유전자 요법 및 유전자 백신 접종은 현대 의학에서 가장 유망하고 빠르게 발전하고 있는 방법에 속한다. 이들은 매우 다양한 질병의 치료를 위해 매우 구체적이고 개별적인 옵션을 제공할 수 있다. 유전자 백신 접종은 박테리아 표면, 바이러스 입자, 종양 항원 등과 같은 선택된 항원에 대해 원하는 면역 반응을 유발하도록 한다. 일반적으로, 백신 접종은 현대 의학의 중추적인 성과 중 하나이다. 그러나, 효과적인 백신은 현재 제한된 수의 질병에만 사용할 수 있다. 따라서, 백신 접종으로 예방할 수 없는 감염은 여전히 매년 수백만 명의 사람들에게 영향을 미친다.
통상적으로, 백신은 "1세대", "2세대" 및 "3세대" 백신으로 세분될 수 있다. "1세대" 백신은 일반적으로 전체 유기체(whole-organism) 백신이다. 이들은 살아 있는 병원체와 약독화된 병원체 또는 사멸화된 병원체, 예를 들어, 바이러스, 박테리아 등을 기반으로 한다. 생백신과 약독화 백신의 주요 결점은 생명을 위협하는 변종으로의 회귀 위험이다. 따라서, 약독화되었더라도, 그러한 병원체는 여전히 본질적으로 예측할 수 없는 위험을 품을 수 있다. 사멸된 병원체는 특정 면역 반응을 생성하는데 원하는 만큼 효과적이지 않을 수 있다. 이러한 위험을 최소화하기 위하여, "2세대" 백신이 개발되었다. 이들은 일반적으로 정의된 항원 또는 병원체로부터 유래된 재조합 단백질 성분으로 이루어진 서브유닛(subunit) 백신이다.
유전자 백신, 즉, 유전자 백신 접종용 백신은 일반적으로 "3세대" 백신으로 이해된다. 이들은 일반적으로 생체 내에서 병원체 또는 종양 항원에 대해 특징적인 펩타이드 또는 단백질 (항원) 단편의 발현을 가능하게 하는 유전자 조작된 핵산 분자로 구성된다. 유전자 백신은 표적 세포에 의해 흡수된 후 환자에게 투여될 때 발현된다. 투여된 핵산의 발현은 코딩된 단백질의 생산을 초래한다. 이러한 단백질이 환자의 면역 시스템에 의해 이물질로 인식되는 경우, 면역 반응이 유발된다.
DNA 및 RNA는 유전자 백신 접종의 맥락에서 투여를 위한 핵산 분자로 이용될 수 있다. DNA는 비교적 안정적이고 다루기 쉬운 것으로 알려져 있다. 그러나, DNA의 이용은 투여된 DNA-단편이 환자의 게놈에 원치 않게 삽입되어, 잠재적으로 손상된 유전자의 기능 상실과 같은 돌연변이 유발 사례(mutagenic events)를 초래할 위험이 있다. 추가적인 위험으로, 원하지 않는 항 DNA 항체의 생성이 나타났다. 다른 결점은 생성된 mRNA가 번역될 수 있기 전에 전사되기 위해 DNA가 핵에 들어가야 하기 때문에, DNA 투여 시 달성될 수 있는 코딩된 펩타이드 또는 단백질의 제한된 발현 수준이다. 다른 이유 중에서, 투여된 DNA의 발현 수준은 DNA 전사를 조절하는 특정 전사 인자의 존재에 의존할 것이다. 그러한 인자가 없으면, DNA 전사는 만족스러운 양의 RNA를 산출하지 못할 것이다. 결과적으로, 번역된 펩타이드 또는 단백질의 수준이 제한된다.
유전자 백신 접종에 DNA 대신에 RNA를 이용함으로써, 원치 않는 게놈 통합 및 항 DNA 항체 생성의 위험을 최소화하거나 피할 수 있다. 그러나, RNA는 유비쿼터스 RNAes에 의해 쉽게 분해될 수 있는 다소 불안정한 분자 종으로 간주된다.
프로타민(protamine)과 복합된 항원-코딩 mRNA를 포함하는 mRNA 백신은 선행기술에 이미 기술되어 있다(예를 들어, PMID: 27336830, PMID: 23159882, EP1083232, WO2010/037539, WO2012/116811, WO2012/116810, 및 WO2015/024665). 또한, WO2016/176330은 상이한 항원을 코딩하는 뉴클레오사이드-변형(nucleoside-modified) RNA를 포함하는 지질 나노입자 조성물을 기재하고 있다.
지난 몇 년 동안 많은 진전이 있었다 하더라도, 항원의 조기 분해에 의해 또는 세포에서 mRNA의 비효율적인 방출로 인한 mRNA의 비효율적 번역에 의해 투여가 심하게 손상되지 않는 적응 면역 반응(adaptive immune response)을 유발할 수 있는 mRNA 백신 접종을 위한 효율적인 방법을 제공하는 것이 당업계에서 여전히 요구된다. 더욱이, 잠재적인 안전성 문제를 낮추고, 제3세계를 위하여 백신을 저렴하게 만들기 위하여 mRNA 백신의 용량을 줄이는 것이 시급하다.
생물학적 시스템에서 원하는 반응을 일으키는 핵산의 전달과 관련된 많은 문제가 있다. 백신과 같은 핵산 기반 치료제는 엄청난 잠재력을 가지고 있지만, 이러한 잠재력을 실현하기 위해서는 세포 또는 유기체 내의 적절한 부위에 핵산을 보다 효과적으로 전달할 필요가 있다.
그러나, 현재 치료 맥락에서 핵산의 사용은 두 가지 문제에 직면하고 있다. 첫째, 유리 RNA는 혈장에서 뉴클레아제 소화에 민감하다. 둘째, 유리 RNA는 관련 번역 조직이 있는 세포 내 구획에 대한 접근을 얻는데 한계가 있다. 중성 지질, 콜레스테롤, PEG, 페길화 지질 및 올리고뉴클레오타이드와 같은 다른 지질 성분과 양이온성 지질로부터 형성된 지질 나노입자는 혈장에서 RNA의 분해를 차단하고, 올리고뉴클레오타이드의 세포 흡수를 촉진하는데 사용되었다.
올리고뉴클레오타이드의 전달을 위한 개선된 양이온성 지질 및 지질 나노입자에 대한 요구가 여전히 존재한다. 바람직하게, 이러한 지질 나노입자는 최적 약물:지질 비를 제공하고, 혈청에서 분해 및 제거로부터 핵산을 보호하고, 전신 또는 국소 전달에 적합하며, 핵산의 세포 내 전달을 제공할 것이다. 또한, 이러한 지질-핵산 입자는 내약성이 우수하고, 적합한 치료 지수를 제공하여, 핵산의 유효 용량에서의 환자 치료가 환자에 대한 허용할 수 없는 독성 및/또는 위험과 관련되지 않도록 하여야 한다. 본 발명은 이들 및 관련된 이점을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 핵산을 살아 있는 세로포 전달하는데 유용한 신규한 양이온성 지질에 관한 것이다. 양이온성 지질은 화학식 (Ⅰ):
[화학식 Ⅰ]
Ra-A-Rb
에 따른 화합물이며,
상기 식에서,
Ra는
Figure pct00001
,
Figure pct00002
,
Figure pct00003
,
Figure pct00004
,
Figure pct00005
,
Figure pct00006
,
또는
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4로부터 선택되며;
Rb는
Figure pct00007
,
Figure pct00008
,
Figure pct00009
,
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4, 또는
-R1-N(CH3)2로부터 선택되며;
A는 -S-, -S-S-, -S-C(O)- -NH-C(O)-, -NH-C(O)O-, -NH-C(O)-NH-, -S-C(O)-N(H)-, -C(O)O-, 또는 -O-P(O)(OH)-O-이며;
R1은 선택적으로 치환된 에탄디일, 프로판디일, 부탄디일, 또는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 비분지형(unbranched) 알칸디일이며;
R2는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
R3는 선택적이며, 존재하는 경우, -R5-C(O)-O-, 또는 -R5-O-C(O)-, -R5-C(O)-NH-, -R5-OC(O)-NH-, 또는 R5-NH-C(O)O-이며;
R4는 12 내지 36개의 탄소 원자를 갖는 친유성 치환기이며;
R5는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
X는 탄소 또는 질소 원자이며;
여기서 모든 선택은 서로 독립적이며,
선택적으로, R1, R2 및 R5가 모두 에탄디일이고, A가 -S-S-이고, Ra 및 Rb가 동일한 경우, R4는
Figure pct00010
이 아니다.
이와 관련하여, 알칸디일(alkanediyl)은 (-CnH2n-) 기에 대한 용어이며; 예를 들어, "2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일"은 화학식 -C2H4-, -C3H6-, -C4H8-, -C5H10-, -C6H12-, -C7H14-, 또는 각각 -C8H16-을 갖는 알칸디일기와 동일하다. 다르게 말하면, 알칸디일은 지방족 탄화수소로부터 유래된 일반식 CnH2n의 일련의 2가 라디칼이다. 다르게 특정되지 않는 한, 그러한 알칸디일은 치환 알칸디일을 포함한다.
다른 실시형태에서, R1, R2 및 R5가 모두 에탄디일이고, A가 -S-S-이며, Ra 및 Rb가 동일한 경우, R4는
Figure pct00011
이 아니며, 또는 각각 일 실시형태에서, 화학식 (Ⅰ)에 따른 지질은 본 명세서의 표 1에 개시된 지질 C23 또는 하기 본 명세서에 기재된 각각의 지질 SS-EC가 아니다 (의심의 여지를 피하기 위해, 즉, 일부 선택된 실시형태에서, 양이온성 지질 COATSOME® SS-EC는 화학식 (Ⅰ)에 따른 양이온성 지질과 관련된 실시형태에서 제외된다).
다른 측면에서, 본 발명은 상기 정의된 신규한 양이온성 지질과 같은 양이온성 지질을 포함하는 신규한 조성물을 제공한다.
양이온성 지질 및 조성물은 핵산을 살아 있는 세포로 도입하는데 특히 효과적인 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 이들은 개선된 RNA(예를 들어, mRNA) 백신 즉, 특정 감염성 질병 또는 종양에 대한 mRNA 기반 백신을 가능하게 한다.
다른 측면에서, 본 발명은 의약으로서, 특히 백신으로서의 양이온성 지질 및 핵산 화합물을 포함하는 조성물의 용도, 및 이러한 백신에 기초한 백신 접종 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 또한 본 명세서에 정의된 mRNA 서열을 포함하는 mRNA 화합물 및 본 명세서에 정의된 적어도 하나의 화학식 (Ⅰ) 또는 화학식 (Ⅱ)에 따른 지질을 포함하는 키트, 특히 부품 키트(kit of parts)를 제공한다.
정의
명확성과 가독성을 위하여, 하기 과학적 배경 정보 및 정의가 제공된다. 여기에 언급되거나 개시된 임의의 기술적 특징은 본 발명의 각각의 모든 실시예의 일부일 수 있거나 각각의 모든 실시예에서 읽어질 수 있다. 본 개시내용의 맥락에서 추가적인 정의 및 설명이 제공될 수 있다.
다르게 정의되지 않는 한, 또는 특정 문맥에서 다르게 요구되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어는 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
문맥이 다르게 지시하거나 요구하지 않는 한, "포함하다(comprise)", "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)" 및 유사한 표현은 발명의 설명 및 청구범위에서 "포함하지만 이에 제한되지 않는"으로 개방적이고 포괄적인 의미로 해석되어야 한다.
"일 실시형태(one embodiment)", "일 실시형태(an embodiment)", "특정 실시형태(specific embodiment)" 등의 표현은 각각의 표현과 결합하여 언급된 바와 같이, 특정한 특색, 특성 또는 특징, 또는 특색, 특성 또는 특징의 특정한 군 또는 조합이 본 발명의 적어도 하나의 실시형태에 존재하는 것을 의미한다. 본 명세서 전반에 걸쳐 다양한 곳에서 이러한 표현이 발생한다고 하여 반드시 동일한 실시형태를 지칭하는 것은 아니다. 또한, 특정한 특색, 특성 또는 특징은 일 이상의 실시형태에서 임의의 적절한 방식으로 조합될 수 있다.
단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수 참조를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
숫자의 맥락에서 백분율은 각 항목의 총 수에 대한 상대적인 것으로 이해되어야 한다. 다른 경우, 문맥에서 달리 지시하지 않는 한, 백분율은 중량 백분율 (wt-%)로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용된 "화합물"은 본질적으로 동일한 화학 구조 및 특성을 갖는 분자로 이루어진 물질인 화학 물질을 의미한다. 소분자 화합물의 경우, 분자는 일반적으로 원자 조성 및 구조적 구성과 관련하여 동일하다. 거대 분자 또는 폴리머 화합물의 경우, 화합물의 분자는 매우 유사하지만 모두가 반드시 동일한 것은 아니다. 예를 들어, 50개의 모노머 단위로 이루어지도록 지정된 폴리머의 한 부분은 예를 들어, 48개 또는 53개 모노머 단위를 갖는 개별적인 분자도 함유할 수 있다.
용어 "분자"는 "화합물" 또는 개별적인(즉, 단일) 분자에 대한 동의어로 사용될 수 있다.
생리학적 조건 하에서 이온화될 수 있는 기능기를 갖는 화합물 또는 모이어티에 대한 임의의 언급은 각각의 화합물 또는 모이어티의 이온화된 형태를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 역으로, 생리학적 조건 하에서 비이온화 형태로도 존재할 수 있는, 생리학적 조건 하에서 이온화 형태의 기능기를 갖는 화합물 또는 모이어티는 각각의 화합물 또는 모이어티의 비이온화 형태를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 카르복실기를 갖는 화합물의 개시는 비이온화된 카르복실기를 갖는, 또는 이온화된 카르복실레이트기를 갖는 각각의 화합물을 나타내는 것으로 해석되어야 한다.
본 명세서에서 사용된 "생리학적 조건(생리학적 상태)"은 세포 외 및 세포 내 조건을 모두 포함하는, 인간 생리학으로부터 공지된 pH 범위 내에 있는 pH를 갖는 수성 환경을 나타낸다. 이 pH 범위의 근사치는 약 pH 1 내지 약 pH 9이다. 문맥에 따라, 생리학적 조건은 약 pH 5 내지 약 pH 8.5, 또는 약 pH 5.5 내지 약 pH 8과 같은 대략 중성 조건을 나타낼 수 있다.
리피도이드(lipidoid)로도 나타내어지는 리피도이드 화합물은 지질 유사 화합물, 즉, 지질 유사 물리적 특성을 갖는 양친매성 화합물이다. 본 발명의 맥락에서, 지질이라는 용어는 리피도이드를 포함하는 것으로 간주된다.
본 발명의 맥락에서, "로 이루어진 군으로부터 선택되는"이라는 용어 다음에 특정 군의 요소(예를 들어, "A, B 및 C")가 오는 것은 본 발명의 맥락에서 상기 군으로 제한되지 않는 것을 의미한다. 다르게 말하면, 그러한 용어는 본 개시가 인용되지 않은 요소에 대해 폐쇄된다는 것을 나타내지 않으며, 즉, 대안적인 의미가 이 용어 다음의 군 내에 포함된다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, "로 이루어진 군으로부터 선택되는" 용어 다음에 특정 군의 요소(예를 들어, "A, B 및 C")가 오는 것은 "A, B 및 C로부터 선택되는" 또는 대안적으로 "A, B 또는 C이다"인 것으로 이해되어야 하며, 다른 구조적 및 기능적으로 관련된, 및 관련이 없지만 언급되지 않은 요소를 포함한다.
용어 "약"은 파라미터 또는 값이 동일, 즉 100% 같을 필요가 없는 경우에 사용된다. 따라서, "약"은 파라미터 또는 값이 0.1% 내지 20%, 바람직하게 0.1% 내지 10%; 특히, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20% 벗어날 수 있음을 의미한다. 통상의 기술자는 예를 들어, 특정 파라미터 또는 값이 파라미터가 결정된 방법에 따라 약간 다를 수 있음을 알 것이다. 예를 들어, 특정 파라미터 또는 값이 예를 들어, "약 1000개 뉴클레오타이드"의 길이를 갖는 것으로 본 명세서에 정의되면, 길이는 0.1% 내지 20%, 바람직하게 0.1% 내지 10%; 특히, 0.5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20% 벗어날 수 있다. 따라서, 통상의 기술자는 본 명세서에서, 길이가 1 내지 200개 뉴클레오타이드, 바람직하게 1 내지 100개 뉴클레오타이드; 특히, 5개, 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 200개 뉴클레오타이드로 벗어날 수 있음을 알 것이다.
용어 "양이온성(cationic)"은 특정 맥락에서 다른 의미가 명확하지 않는 한, 각각의 구조가 영구적으로(permanently) 또는 영구적이지 않으나 예를 들어, pH와 같은 특정 조건에 반응하여 양전하를 띠는 것을 의미한다. 따라서, 용어 "양이온성"은 "영구적인 양이온성" 및 "양이온화될 수 있는(cationisable)"을 모두 포함한다. 본 명세서에 사용된 용어 "양이온화될 수 있는"은 화합물, 기 또는 원자가 환경의 더 낮은 pH에서 양으로 하전되고, 환경의 더 높은 pH에서 하전되지 않음을 의미한다. 또한, pH를 결정할 수 없는 비수성 환경에서, 양이온화될 수 있는 화합물, 기 또는 원자는 높은 수소 이온 농도에서 양전하를 띠고, 수소 이온의 낮은 농도 또는 활성에서는 전하를 띠지 않는다. 이는, 양이온화될 수 있는 또는 폴리양이온화될 수 있는 화합물의 개별적인 특성, 특히 pH 또는 수소 이온 농도에서 하전되거나 하전되지 않은 각각의 양이온화될 수 있는 기 또는 원자의 pKa에 따라 다르다. 희석된 수성 환경에서, 양전하를 띠는 양이온화될 수 있는 화합물, 기 또는 원자의 분획은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려진 소위 헨더슨-하셀바흐(Henderson-Hasselbalch) 식을 이용하여 추정될 수 있다. 예를 들어, 화합물 또는 모이어티가 양이온화될 수 있는 경우, 약 1 내지 9, 바람직하게 4 내지 9, 5 내지 8 또는 6 내지 8의 pH 값에서, 더욱 바람직하게 9 이하, 8 이하, 7 이하의 pH 값에서, 가장 바람직하게 생리학적 pH 값, 예를 들어, 약 7.3 내지 7.4, 즉, 생리학적 조건 하에서, 특히 생체 내 세포의 생리학적 염 조건 하에서 양으로 하전되는 것이 바람직하다. 실시형태에서, 양이온화될 수 있는 화합물 또는 모이어티는 생리학적 pH 값, 예를 들어 약 7.0-7.4에서 주로 중성이나 더 낮은 pH 값에서 양전하를 띠는 것이 바람직하다. 일부 실시형태에서, 양이온화될 수 있는 화합물 또는 모이어티의 바람직한 pKa 범위는 약 5 내지 약 7이다. 일부 실시형태에서, 양성자화될 수 있는(protonatable) 지질은 약 4 내지 약 11 범위의 양성자화될 수 있는 기의 pKa, 예를 들어, 약 5 내지 약 7의 pKa를 갖는다.
특정 맥락에서 다른 의미가 명확하지 않은 한, 용어 "양이온성"은 각각의 구조가 영구적으로 또는 영구적이지 않으나 예를 들어, pH와 같은 특정 조건에 반응하여 양전하를 띠는 것을 의미한다. 따라서, 용어 "양이온성"은 "영구적인 양이온성" 및 "양이온화될 수 있는"을 모두 포함한다. 예를 들어, 1급, 2급 또는 3급 아미노기를 갖는 화합물 또는 모이어티는 양이온성이며, 보다 구체적으로 생리학적 조건 하에서 양전하 상태로 우세적으로 존재할 수 있으므로 양이온화될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "영구적인 양이온성"은 각각의 화합물, 또는 기 또는 원자가 그 환경의 임의의 pH 값 또는 수소 이온 활성에서 양전하를 띠는 것을 의미한다. 매우 자주, 양전하는 4급 질소 원자의 존재로 인하여 발생한다. 화합물이 이러한 복수의 양전하를 띠는 경우, 영구적인 양이온성인 것의 서브 카테고리인 영구적으로 폴리양이온성(polycationic)인 것으로 나타내어질 수 있다.
유사하게, 용어 "음이온성(anionic)", "음이온화될 수 있는(anionizable)" 및 "영구적으로 음이온성"은 각각의 화합물, 기 또는 원자의 전하가 양전하가 아닌 음전하라는 점을 제외하고는, "양이온성", "양이온화될 수 있는" 및 "영구적인 양이온성"과 유사한 의미를 갖도록 사용된다.
지질 또는 스테로이드와 같은 화합물에, 또는 기 또는 모이어티에 적용되는 경우, 표현 "중성(neutral)"은 생리학적 조건 하에서 이온화될 수 있는 기능기를 갖지 않는 화합물과 같이 양이온성도 음이온성도 아님을 의미하거나; 또는 전형적인 본래 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine)과 같이 전형적인 생리학적 조건 하에서 양이온성 및 음이온성 양자 모두인, 즉 즈비터 이온성(zwitterionic)인 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 "지질(lipid)"은 지방산의 유도체(예를 들어, 에스테르)이며, 일반적으로 물에는 불용성이지만 많은 유기 용매에는 용해되는 것을 특징으로 한다. 지질은 일반적으로 적어도 세 가지 부류로 나뉜다: (1) 왁스 뿐 아니라 지방 및 오일을 포함하는 "단순 지질(simple lipids)"; (2) 인지질(phospholipids) 및 당지질(glycolipids)을 포함하는 "복합 지질(compound lipids)"; 및 (3) 스테로이드와 같은 "유도 지질(derived lipids)". 당지질과 관련하여, 특정 실시형태에서, LNP는 당지질(예를 들어, 모노시알로강글리오사이드(monosialoganglioside) GM1)을 포함한다.
이러한 맥락에서, 접두사 "폴리(poly)-"는 화합물에서 각각의 특성을 갖는 복수의 원자 또는 기를 나타낸다. 괄호 안에 있는 경우, 복수의 존재 여부는 선택 사항이다. 예를 들어, (폴리)양이온성은 양이온성 및/또는 폴리양이온성을 의미한다. 그러나, 접두사의 부재가 복수를 배제하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 폴리양이온성 화합물도 양이온성 화합물이며 그 자체로 나타내어질 수 있다.
용어 "핵산"은 DNA 또는 RNA를 포함하거나, DNA 또는 RNA로 이루어진 임의의 화합물을 의미한다. 이 용어는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 올리고뉴클레오타이드에 대해 사용될 수 있다. 본 명세서에서 핵산 또는 특정 단백질 및/또는 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열이 언급되는 경우, 상기 핵산 또는 핵산 서열은 각각 바람직하게 적합한 숙주, 예를 들어, 인간에서, 그 발현, 즉, 특정 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 가능하게 하는 조절 서열(regulatory sequences)도 포함한다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "뉴클레오사이드 변형(nucleoside modification)"은 본래(native) mRNA에서 정상적으로 발생하지 않는 뉴클레오사이드, 바람직하게 비천연(non-natural) 뉴클레오사이드를 포함하는 mRNA 화합물 또는 분자와 같은 핵산을 나타낸다. 특히, 이 용어는 바람직하게 아데닌, 구아닌, 시토신, 우라실 및 티민 이외의 mRNA 뉴클레오사이드를 나타낸다.
용어 "뉴클레오사이드"는 일반적으로 당, 보통 리보오스 또는 데옥시리보오스, 및 퓨린 또는 피리미딘 염기로 이루어진 화합물을 나타낸다. 용어 "뉴클레오타이드"는 일반적으로 당에 부착된 포스페이트기를 포함하는 뉴클레오사이드를 나타낸다.
"펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 연결된 적어도 2개의 아미노산 모노머의 올리고머 또는 폴리머를 의미한다. 이 용어는 아미노산의 폴리머 사슬의 길이를 제한하지 않는다. 펩타이드는 예를 들어, 50개 미만의 모노머 단위를 함유할 수 있다. 더 긴 펩타이드는 일반적으로 50 내지 600개의 모노머 단위, 더욱 구체적으로 50 내지 300개의 모노머 단위를 갖는 소위 폴리펩타이드라고도 한다.
"단백질"은 생물학적 기능을 용이하게 하는 3차원 형태로 접힌 일 이상의 폴리펩타이드를 포함하거나, 이로 이루어진다.
"인플루엔자 판데믹(influenza pandemic)" 또는 "판데믹 플루(pandemic flu)"는 비인간 (신규) 인플루엔자 바이러스가 효율적이고 지속적인 인간 대 인간 전염 능력을 얻은 다음 전세계적으로 퍼질 때 발생할 수 있다. 판데믹을 일으킬 가능성이 있는 인플루엔자 바이러스는 "판데믹 가능성이 있는 인플루엔자 바이러스" 또는 "판데믹 인플루엔자 바이러스"로 나타내어진다.
판데믹 가능성이 있는 인플루엔자 바이러스의 예는 조류 인플루엔자 A (H5N1) 및 조류 인플루엔자 A (H7N9)를 포함하며, 이는 두 가지 상이한 "조류 독감(bird flu)" 바이러스이다. 이는 비인간 바이러스(즉, 이들은 인간 사이에서는 새롭고, 세계 일부에서는 새에서 순환됨)이므로, 사람들 사이에서 이러한 바이러스에 대한 면역이 거의 또는 전혀 없다. 이러한 바이러스에 의한 인간 감염은 거의 발생하지 않았지만, 이러한 바이러스 중 하나가 인간을 쉽게 감염시키고 사람 대 사람으로 쉽게 퍼질 수 있는 방식으로 변경된다면 인플루엔자 판데믹이 발생할 수 있다.
판데믹 인플루엔자/플루용 백신 또는 판데믹 인플루엔자/플루 백신: 판데믹 인플루엔자 바이러스에 대한 백신은 본 명세서에서 판데믹 인플루엔자/플루용 백신 또는 판데믹 인플루엔자/플루 백신으로 지칭된다.
플루/인플루엔자 시즌: 플루 시즌은 인플루엔자(플루) 발생의 유행에 의해 특징지워지는 매년 반복되는 기간이다. 시즌은 각 반구에서 연중 추운 절반의 계절에 발생한다. 인플루엔자 활성은 때때로 예측되고 지리적으로 추적될 수도 있다. 각 시즌의 주요 플루 활성의 시작은 지역에 따라 다르지만, 특정 지역에서 이러한 사소한 전염병은 일반적으로 정점에 도달하는데 약 3주가 소요되고 크게 감소하는데 3주가 더 걸린다. 플루 백신 접종은 플루 시즌의 영향을 줄이는데 사용되었다; 폐렴 백신 접종은 플루 시즌의 영향과 합병증을 추가로 감소시킨다. 북반구와 남반구는 연중 다른 시기에 겨울을 보내기 때문에, 실제로 매년 두 번의 플루 시즌이 있다.
계절성 인플루엔자/플루용 백신 또는 계절성 인플루엔자/플루 백신: 플루 시즌에 계절성으로 발생하는 인플루엔자 바이러스에 대한 백신은 본 명세서에서 "계절성 인플루엔자/플루용 백신 또는 계절성 인플루엔자/플루 백신"으로 지칭된다.
면역 시스템: 면역 시스템은 유기체를 감염으로부터 보호할 수 있다. 병원체가 유기체의 물리적 장벽을 뚫고 유기체에 들어가면, 선천 면역 시스템(innate immune system)은 즉각적이지만 비특이적인 반응을 제공한다. 병원체가 이 선천적 반응을 회피하면, 척추 동물은 두 번째 보호층인 적응 면역 시스템(adaptive immune system)을 갖게 된다. 여기에서, 면역 시스템은 감염 중 병원체에 대한 인식을 개선하기 위하여 반응을 조정한다. 이 개선된 반응은 병원체가 제거된 후에도 면역학적 기억의 형태로 유지되며, 적응 면역 시스템이 이 병원체와 마주칠 때마다 더 빠르고 더 강력한 공격을 가할 수 있도록 한다. 이에 따르면, 면역 시스템은 선천 면역 시스템 및 적응 면역 시스템을 포함한다. 이 두 부분 각각은 소위 체액 성분 및 세포 성분을 함유한다.
면역 반응: 면역 반응은 일반적으로 특정 항원에 대한 적응 면역 시스템의 특이적 반응(소위 특이적 또는 적응 면역 반응), 또는 선천 면역 시스템의 비특이적 반응(소위 비특이적 또는 선천 면역 반응)일 수 있다. 본 발명은 적응 면역 시스템의 특이적 반응(적응 면역 반응)에 대한 핵심에 관한 것이다. 특히, 이는 예를 들어, 인플루엔자 바이러스와 같은 바이러스에 의한 감염에 대한 적응 면역 반응에 관한 것이다. 그러나, 이 특이적 반응은 추가적인 비특이적 반응(선천 면역 반응)에 의해 뒷받침될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 효율적인 적응 면역 반응을 유발하기 위해 선천 및 적응 면역 시스템의 동시 자극을 위한 화합물에 관한 것이다.
적응 면역 시스템: 적응 면역 시스템은 고도로 전문화된 전신 세포 및 병원체 성장을 제거하거나 예방하는 과정으로 구성된다. 적응 면역 반응은 특정 병원체를 인식하고 기억할 수 있는 능력(면역을 생성하기 위해), 및 병원체를 만날 때마가 더 강한 공격을 가할 수 있는 능력을 척추 동물 면역 시스템에 제공한다. 이 시스템은 체세포 과돌연변이(somatic hypermutation)(체세포 돌연변이의 빈도가 증가하는 과정), 및 V(D)J 재조합(항원 수용체 유전자 절편의 비가역적 유전자 재조합) 때문에 적응력이 높다. 이 메커니즘을 통해 소수의 유전자가 방대한 수의 서로 다른 항원 수용체를 생성할 수 있으며, 이 수용체는 각 개별 림프구에서 고유하게 발현된다. 유전자 재배열은 각 세포의 DNA에 비가역적 변화를 가져오기 때문에, 그 세포의 모든 자손(progeny)(자식(offspring))은 오래 지속되는 특이적 면역에 대한 열쇄인 기억 B 세포 및 기억 T 세포를 포함하여, 동일한 수용체 특이성을 코딩하는 유전자를 상속할 것이다. 면역 네트워크 이론(immune network theory)은 T 세포 및 B 세포의 수용체의 가변 영역(variable regions)과, 가변 영역을 갖는 T 세포 및 B 세포에 의해 만들어진 분자 사이의 상호 작용을 기반으로 하는 적응 면역 시스템의 작동 방식에 대한 이론이다.
적응 면역 반응: 적응 면역 반응은 일반적으로 항원 특이적인 것으로 이해된다. 항원 특이성은 특정 항원, 병원체 또는 병원체 감염된 세포에 맞춰진 반응 생성을 가능하게 한다. 이러한 맞춤형 반응을 탑재하는 능력은 "기억 세포"에 의해 신체에서 유지된다. 병원체가 신체를 두 번 이상 감염시키면, 이 특이적 기억 세포는 이를 신속하게 제거하는데 이용된다. 이러한 맥락에서, 적응 면역 반응의 첫 번째 단계는 나이브(naive) 항원 특이적 T 세포 또는 항원 제시 세포에 의해 항원 특이적 면역 반응을 유도할 수 있는 상이한 면역 세포의 활성화이다. 이는, 나이브 T 세포가 지속적으로 통과하는 림프 조직 및 기관에서 발생한다. 항원 제시 세포로 작용할 수 있는 세포 유형은 그 중에서도 수지상 세포(dendritic cells), 대식 세포(macrophages), 및 B 세포이다. 이 세포들 각각은 면역 반응을 끌어내는 독특한 기능을 갖고 있다. 수지상 세포는 식세포 작용(phagocytosis) 및 대음세포 작용(macropinocytosis)에 의해 항원을 흡수하고, 예를 들어, 외래 항원과 접촉함으로써 자극되어 국소 림프 조직으로 이동하여, 성숙한 수지상 세포로 분화된다. 대식 세포는 박테리아와 같은 미립자 항원을 섭취하고, 감염원 또는 다른 적절한 자극에 의해 유도되어 MHC 분자를 발현한다. 수용체를 통해 가용성 단백질 항원에 결합하고 내재화하는 B 세포의 독특한 능력은 T 세포를 유도하는데 중요할 수 있다. MHC 분자에 항원을 제시하면, T 세포를 활성화시켜, 무장된 작동 T 세포(effector T cell)로의 증식 및 분화를 유도한다. 작동 T 세포의 가장 주용한 기능은 CD8+ 세포 독성 T 세포에 의한 감염 세포의 사멸 및 세포 매개 면역을 구성하는 Th1 세포에 의한 대식 세포의 활성화, 및 Th2 및 Th1 세포 모두에 의한 B 세포의 활성화에 의해 상이한 부류의 항체를 생성함으로써, 체액 면역 반응을 유도하는 것이다. T 세포는, 항원을 직접 인식하고 결합하지는 않으나 대신에 다른 세포의 표면에서 NHC 분자에 결합하는 예를 들어, 병원체 유래 단백질 항원의 짧은 펩타이드 단편을 인식하는 T 세포 수용체에 의해 항원을 인식한다.
세포 면역/세포 면역 반응: 세포 면역은 일반적으로 대식 세포, 자연 살상 세포(natural killer cells, NK), 항원 특이적 세포 독성 T-림프구의 활성화, 및 항원에 대한 반응에서 다양한 사이토카인의 방출과 관련이 있다. 보다 일반적 방식으로, 세포 면역은 항체에 관련된 것이 아니라, 면역 시스템의 세포 활성화에 관련된다. 세포 면역 반응은 예를 들어, 바이러스 감염된 세포, 세포 내 바이러스를 갖는 세포 및 종양 항원을 나타내는 암세포와 같이 그 표면에 항원의 에피토프를 나타내는 체세포에서 아포토시스를 유도할 수 있는 항원 특이적 세포 독성 T-림프구를 활성화하는 것; 대식 세포 및 자연 살상 세포를 활성화하여, 병원체를 파괴할 수 있도록 하는 것; 및 적응 면역 반응 및 선천 면역 반응에 관여하는 다른 세포의 기능에 영향을 미치는 다양한 사이토카인을 분비하도록 세포를 자극하는 것을 특징으로 한다.
체액 면역/체액 면역 반응: 체액 면역은 일반적으로 항체 생성 및 그에 수반될 수 있는 보조 과정을 나타낸다. 체액 면역 반응은 일반적으로 예를 들어, Th2 활성화 및 사이토카인 생성, 배중심(germinal center) 형성 및 아이소타입 전환(isotype switching), 친화도 성숙(affinity maturation) 및 기억 세포 생성을 특징으로 한다. 체액 면역은 또한 전형적으로 병원체 및 독소 중화, 고전 보체(classical complement) 활성화, 식세포 작용의 옵소닌(opsonin) 촉진 및 병원체 제거를 포함하는, 항체의 작동 기능(effector functions)을 나타낼 수 있다.
선천 면역 시스템: 비특이적 면역 시스템으로도 알려진 선천 면역 시스템은 비특이적 방식으로 다른 유기체에 의한 감염으로부터 숙주를 방어하는 세포 및 메커니즘을 포함한다. 이는, 선천 시스템의 세포가 일반적인 방식으로 병원체를 인식하고 방어하지만, 적응 면역 시스템과 달리 숙주에 오래 지속되거나 보호적인 면역을 부여하지 않는다는 것을 의미한다. 선천 면역 시스템은 리포 다당류, TNF-알파, CD40 리간드, 또는 사이토카인, 모노카인(monokines), 림포카인(lymphokines), 인터류킨(interleukins) 또는 케모카인(chemokines), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-베타, TNF-알파, 성장 인자, 및 hGH, 인간 톨 유사 수용체 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10의 리간드, 쥣과 톨 유사 수용체 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 또는 TLR13의 리간드, NOD 유사 수용체의 리간드, RIG-I 유사 수용체의 리간드, 면역 자극성(immunostimulatory) 핵산, 면역 자극성 RNA(isRNA), CpG-DNA, 항박테리아제, 또는 항바이러스제와 같은, 병원체 관련 분자 패턴(pathogen-associated molecular patterns, PAMP) 수용체, 예를 들어, 톨 유사 수용체(Toll-like receptors, TLRs)의 리간드 또는 다른 보조 물질에 의해 활성화될 수 있다. 전형적으로, 선천 면역 시스템의 반응은 사이토카인이라고 하는 특수 화학적 매개체인 화학적 인자의 생성을 통하여 감염 부위에 세포를 모집하는 것; 보체 캐스케이드(complement cascade)의 활성화; 특수 백혈구 세포에 의한 기관, 조직, 혈액 및 림프액에 존재하는 외래 물질의 식별 및 제거; 항원 제시로 알려진 과정을 통한 적응 면역 시스템의 활성화; 및/또는 감염원에 대한 물리적 및 화학적 장벽으로의 작용을 포함한다.
보조제/보조 성분(Adjuvant/adjuvant component): 가장 넓은 의미의 보조제 또는 보조 성분은 일반적으로 약물 또는 백신과 같은 다른 제제의 효능을 변형, 예를 들어 향상시킬 수 있는 (예를 들어, 약리학적 또는 면역학적) 제제 또는 조성물이다. 통상적으로 이 용어는, 본 발명의 맥락에서 면역원(immunogens) 및/또는 다른 약학적 활성 화합물에 대한 담체 또는 보조 물질로 작용하는 화합물 또는 조성물을 나타낸다. 이는 넓은 의미로 해석되어야 하며, 문제의 보조제에 통합되거나 공동 투여되는 항원의 면역원성(immunogenicity)을 증가시킬 수 있는 광범위한 물질을 나타낸다. 본 발명의 맥락에서, 보조제는 바람직하게는 본 발명의 활성제의 특이적 면역원성 효과를 향상시킬 것이다. 전형적으로, "보조제" 또는 "보조 성분"은 동일한 의미를 가지며 상호간에 사용될 수 있다. 보조제는 예를 들어, 면역 강화제(immunopotentiators), 항원 전달 시스템 또는 그 조합으로 나눠질 수 있다.
용어 "보조제"는 일반적으로 그 자체로 면역을 부여하는 제제를 포함하지 않는 것으로 이해된다. 보조제는 예를 들어, 면역 시스템에 대한 항원의 제시를 촉진하거나 비특이적 선천 면역 반응의 유도에 의해 면역 시스템을 보조하여, 항원 특이적 면역 반응을 비특이적으로 향상시킨다. 더욱이, 보조제는 바람직하게 예를 들어, 지배적인 Th2 기반 항원 특이적 반응을 보다 Th1 기반 항원 특이적 반응으로 쉬프트하거나, 또는 그 반대에 의해 항원 특이적 면역 반응을 조절할 수 있다. 따라서, 보조제는 사이토카인 발현/분비, 항원 제시, 면역 반응의 유형 등을 유리하게 조절할 수 있다.
면역 자극성 RNA: 본 발명의 맥락에서, 면역 자극성 RNA(isRNA)는 전형적으로 선천 면역 반응 자체를 유도할 수 있는 RNA일 수 있다. 이는, 일반적으로 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 가지지 않으므로, 펩타이드-항원 또는 면역원을 제공하지 않지만, 예를 들어, 특정 종류의 톨 유사-수용체 (TLR) 또는 다른 적합한 수용체에 결합함으로써, 선천 면역 반응을 이끌어낸다. 그러나, 물론, 오픈 리딩 프레임을 갖고 펩타이드/단백질(예를 들어, 항원 기능)을 코딩하는 mRNA도 선천 면역 반응을 유도할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항체"는 온전한(intact) 항체 및 항체 단편(fragment)을 모두 포함한다. 일반적으로, 온전한 "항체"는 특정 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린이다. 항체는 인간 부류: IgG, IgM, IgE, IgA 및 IgD를 포함하는 임의의 면역글로불린 부류의 일원일 수 있다. 일반적으로, 온전한 항체는 테트라머(tetramer)이다. 각각의 테트라머는 2개의 동일한 폴리펩타이드 사슬의 쌍으로 이루어지며, 각각의 쌍은 "경쇄(light chain)" 및 "중쇄(heavy chain)"를 갖는다. "항체 단편"은 항체의 항원 결합 또는 가변 영역과 같은 온전한 항체의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 트라이브(tribes); 테트라(Tetra); 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중 특이적 항체를 포함한다. 예를 들어, 항체 단편은 분리된 단편인, 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩타이드 링커에 의해 함께 연결된 재조합 단일 사슬 폴리펩타이드 분자("ScFv 단백질") 및 초가변 영역을 모방하는 아미노산 잔기로 이루어진 최소 인식 단위(recognition units)로 이루어진 "Fv" 단편을 포함한다. 항체의 항원 결합 단편의 예는, Fab 단편, Fab'단편, F (ab') 2 단편, scFv 단편, Fv 단편, dsFv 디아바디(diabody), dAb 단편, 단편 Fd', Fd 단편 및 및 분리된 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 치료 RNA에 의해 코딩될 수 있는 적합한 항체는 단일 클론 항체, 다중 클론 항체, 항체 혼합물 또는 칵테일, 인간 또는 인간화 항체, 키메라 항체, Fab 단편, 또는 이중 특이적 항체를 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 항체는 본 발명의 조합/조성물의 적어도 하나의 치료 RNA에 의해 제공될 수 있다.
본 발명의 맥락에서 용어 "항원"은 일반적으로 면역 시스템, 바람직하게 적응 면역 시스템에 의해 인식될 수 있으며, 적응 면역 반응의 일부로서 항체 및/또는 항원 특이적 T 세포의 형성에 의해 항원 특이적 면역 반응을 유발할 수 있는 물질을 나타낸다. 일반적으로, 항원은 MHC에 의해 T 세포에 제시될 수 있는 펩타이드 또는 단백질일 수 있거나, 이를 포함할 수 있다. 본 발명의 의미에서, 항원은 제공된 핵산 분자, 바람직하게 본 명세서에 정의된 mRNA의 번역 산물일 수 있다. 이러한 맥락에서, 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 펩타이드 및 단백질의 단편, 변이체 및 유도체도 항원으로 이해된다. 따라서, 본 명세서에 사용된 용어 "항원"은 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어, 면역 시스템, 바람직하게 적응 면역 시스템에 의해 인식될 수 있고, 예를 들어, 적응 면역 반응의 일부로서 항체 및/또는 항원 특이적 T 세포의 형성에 의해, 항원 특이적 면역 반응을 유발할 수 있는 물질을 나타내도록 의도된다. 일반적으로, 항원은 MHC에 의해 T 세포에 제시될 수 있는 펩타이드 또는 단백질일 수 있거나, 이를 포함할 수 있다. 또한, 예를 들어, 적어도 하나의 에피토프를 포함하는 암 항원으로부터 유래되는 펩타이드 또는 단백질의 단편, 변이체 및 유도체도 항원으로 이해될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 항원은 제공된 치료 RNA(예를 들어, 코딩 RNA, 레플리콘(replicon) RNA, mRNA)의 번역 산물일 수 있다. 용어 "항원 펩타이드 또는 단백질"은 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어, 적응 면역 반응을 제공하기 위하여 신체의 적응 면역 시스템을 자극할 수 있는 (항원) 단백질로부터 유래되는 펩타이드 또는 단백질을 나타내도록 의도된다. 따라서, "항원 펩타이드 또는 단백질"은, 그가 유래된 단백질의 적어도 하나의 에피토프 또는 항원을 포함한다(예를 들어, 종양 항원, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 원생 동물 항원). 본 발명의 맥락에서, 항원은 본 발명의 조합/조성물의 적어도 하나의 치료 RNA에 의해 제공될 수 있다.
핵산의 맥락에서 본 명세서 전반에 사용된 용어 "유래된"은, 즉 (다른) 핵산으로부터 "유래된" 핵산은 (다른) 핵산으로부터 유래된 핵산이 그가 유래된 핵산과 예를 들어, 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 약 99% 서열 동일성을 공유하는 것을 의미한다. 통상의 기술자는 서열 동일성이 일반적으로 동일한 유형의 핵산, 즉 DNA 서열 또는 RNA 서열에 대하여 계산된다는 것을 알고 있다. 따라서, DNA가 RNA로부터 "유래된" 경우, 또는 RNA가 DNA로부터 "유래된" 경우, RNA 서열이 상응하는 DNA 서열로 전환되는, 또는 그 반대의 첫 번째 단계에서(특히, 서열 전반에 걸쳐 U를 T로 대체함으로써), DNA 서열은 상응하는 RNA 서열로 전환되는(특히, 서열 전반에 걸쳐 T를 U로 대체함으로써) 것이 이해된다. 그 후, DNA 서열의 서열 동일성 또는 RNA 서열의 서열 동일성이 결정된다. 바람직하게, 핵산으로부터 "유래된" 핵산은 예를 들어, RNA 안정성을 더욱 증가시키고, 및/또는 단백질 생성을 연장 및/또는 증가시키기 위하여, 그 핵산이 유래된 핵산과 비교하여 변형된 핵산을 나타낸다. 아미노산 서열의 맥락에서, 용어 "유래된"은 (다른) 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열이 그것이 유래된 아미노산 서열과 예를 들어, 적어도 약 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 약 99% 서열 동일성을 공유하는 것을 의미한다.
에피토프(소위 "항원 결정부위(determinant)"): 본 발명의 맥락에서, 단백질의 T 세포 에피토프 또는 부분은 바람직하게 약 6개 내지 약 20개 또는 그 이상의 아미노산 길이를 갖는 단편, 예를 들어, 바람직하게 약 8개 내지 약 10개의 아미노산, 예를 들어, 8개, 9개 또는 10개 아미노산(또는 11개 또는 12개 아미노산) 길이를 갖는 MHC 클래스 I 분자에 의해 처리되고 제시되는 단편, 또는 바람직하게 약 13개 이상의 아미노산, 예를 들어, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 그 이상의 아미노산 길이를 갖는 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 의해 처리되고 제시되는 단편을 포함할 수 있으며, 이러한 단편은 아미노산 서열의 임의의 부분으로부터 선택될 수 있다. 이러한 단편은 일반적으로 펩타이드 단편 및 MHC 분자로 이루어진 복합체 형태로 T 세포에 의해 인식된다.
B 세포 에피토프는 일반적으로 본 명세서에 정의된 (본래) 단백질 또는 펩타이드 항원의 외부 표면에 위치한 단편이며, 바람직하게 5 내지 15개 아미노산, 더욱 바람직하게 5 내지 12개 아미노산, 더욱더 바람직하게 6 내지 9개 아미노산을 가지며, 항체에 의해, 즉 그 본래 형태로 인식될 수 있다.
단백질 또는 펩타이드의 그러한 에피토프는 또한 본 명세서에 언급된 그러한 단백질 또는 펩타이드의 임의의 변이체로부터 선택될 수 있다. 이러한 맥락에서 항원 결정 부위는 본 명세서에 정의된 단백질 또는 펩타이드의 아미노산 서열에서 불연속이지만 3차원 구조로 함께 결합된 본 명세서에서 정의된 단백질 또는 펩타이드의 절편으로 구성된 입체형태적(conformational) 또는 불연속적 에피토프, 또는 단일 폴리펩타이드 사슬로 구성된 연속적 또는 선형 에피토프일 수 있다.
용어 "백신"은 일반적으로 적어도 하나의 항원 또는 항원 기능을 제공하는 예방 또는 치료 물질인 것으로 이해된다. 항원 또는 항원 기능은 신체의 적응 면역 시스템을 자극하여 적응 면역 반응을 제공할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "항원 제공 mRNA"는 일반적으로 그 mRNA가 제공된 세포 또는 유기체에 의해 번역될 수 있는 적어도 하나의 오픈 리딩 프레임을 갖는 mRNA일 수 있다. 이 번역 산물은 항원, 바람직하게 면역원으로 작용할 수 있는 펩타이드 또는 단백질이다. 이 산물은 하나를 넘는 면역원으로 구성된 융합 단백질, 예를 들어, 동일하거나 상이한 바이러스-단백질로부터 유래된 2개 이상의 에피토프, 펩타이드 또는 단백질로 이루어진 융합 단백질일 수 있으며, 여기에서 에피토프, 펩타이드 또는 단백질은 링커 서열에 의해 연결될 수 있다.
용어 "인공 mRNA" (서열)은 일반적으로 자연적으로 발생하지 않는 mRNA 분자로 이해될 수 있다. 다르게 말하면, 인공 mRNA 분자는 비천연 mRNA 분자인 것으로 이해될 수 있다. 이러한 mRNA 분자는 개별적인 서열(자연적으로 발생하지 않는) 및/또는 다른 변형, 예를 들어, 자연적으로 발생하지 않는 뉴클레오타이드의 구조적 변형에 의해 비천연일 수 있다. 일반적으로, 인공 mRNA 분자는 원하는 뉴클레오타이드의 인공 서열(이종 서열)에 상응하도록 유전 공학 방법에 의해 설계 및/또는 생성될 수 있다. 이러한 맥락에서, 인공 서열은 일반적으로 자연적으로 발생하지 않을 수 있는 서열이며, 즉, 적어도 하나의 뉴클레오타이드만큼 야생형 서열과 다르다. 용어 "야생형"은 자연적으로 발생하는 서열로 이해될 수 있다. 또한, 용어 "인공 핵산 분자"는 "하나의 단일 분자"를 의미하는 것으로 제한되지 않고, 일반적으로 동일한 분자의 앙상블을 포함하는 것으로 이해된다. 따라서, 앨리쿼트(aliquot)에 포함된 복수의 동일한 분자와 관련될 수 있다.
핵산 서열 또는 아미노산 서열의 맥락에서 본 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 용어 "이종(heterologous)" 또는 "이종 서열"은 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식되고 이해되는 서열(예를 들어, DNA, RNa, 아미노산)이며, 다른 유전자로부터, 다른 대립 유전자(allele)로부터, 다른 종으로부터 유래되는 서열을 나타내도록 의도된다. 2개의 서열은 동일한 유전자 또는 동일한 대립 유전자로부터 유래될 수 없으면 일반적으로 "이종"인 것으로 이해되며, 즉, 이종 서열이 동일한 유기체로부터 유래될 수 있긴 하지만, 이들은 동일한 핵산 분자, 예를 들어 동일한 RNA 또는 단백질에서 자연적으로 발생하지 않는다.
바이시스트로닉/멀티시스트로닉(bi-/multicistronic) mRNA: mRNA는 일반적으로 2개(바이시스트로닉) 또는 그 이상의(멀티시스트로닉) 오픈 리딩 프레임(ORF) (코딩 영역 또는 코딩 서열)을 가질 수 있다. 이러한 맥락에서, 오픈 리딩 프레임은 펩타이드 또는 단백질로 번역될 수 있는 몇몇 뉴클레오타이드 삼중 (코돈)의 서열이다. 그러한 mRNA의 번역은 2개의(바이시스트로닉) 또는 그 이상의(멀티시스트로닉) 별개의 번역 산물을 생성한다(ORF이 동일하지 않은 경우). 진핵 생물에서의 발현의 경우, 이러한 mRNA는 예를 들어, 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosomal entry site, IRES) 서열을 포함할 수 있다.
모노시스트로닉 mRNA: 모노시스트로닉 mRNA는 일반적으로 하나의 오픈 리딩 프레임(코딩 서열 또는 코딩 영역)만을 포함하는 mRNA일 수 있다. 이러한 맥락에서, 오픈 리딩 프레임은 펩타이드 또는 단백질로 번역될 수 있는 몇몇 뉴클레오타이드 삼중 (코돈)의 서열이다.
3'-비번역 영역 (3'-UTR): 3'-UTR은 일반적으로 mRNA의 단백질 코딩 영역(즉, 오픈 리딩 프레임)과 폴리(A) 서열 사이에 위치한 mRNA의 일부이다. mRNA의 3'-UTR은 아미노산 서열로 번역되지 않는다. 3'-UTR 서열은 일반적으로 유전자 발현 과정 중에 각각의 mRNA로 전사되는 유전자에 의해 코딩된다. 게놈 서열은 먼저 선택적 인트론(introns)을 포함하는 미성숙(pre-mature) mRNA로 전사된다. 미성숙 mRNA는 성숙 과정에서 성숙한 mRNA로 더 처리된다. 이 성숙 과정은 5'-CAP핑(Capping) 단계, 선택적 인트론을 절제하기 위한 미성숙 mRNA의 스플라이싱(splicing) 단계 및 미성숙 mRNA의 3'-말단의 폴리아데닐화 및 선택적인 엔도- 또는 엑소뉴클레아제 절단(cleavages) 등과 같은 3'-말단의 변형 단계를 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 3'-UTR은 단백질 코딩 영역의 종결 코돈에 대해 3'에, 바람직하게 단백질 코딩 영역의 종결 코돈에 대해 바로 3'에 위치하고, 폴리(A) 서열의 5'-측에, 바람직하게 폴리(A) 서열에 대해 바로 5'의 뉴클레오타이드로 연장하는 성숙 mRNA의 서열에 상응한다. 용어 "에 상응하다"는, 3'-UTR 서열이 3'-UTR 서열을 정의하는데 이용되는 mRNA 서열과 같은 RNA 서열, 또는 그러한 RNA 서열에 상응하는 DNA 서열일 수 있음을 의미한다. 본 발명의 맥락에서, "알부민 유전자의 3'-UTR"과 같은 용어 "유전자의 3'-UTR"은 이 유전자로부터 유래된 성숙 mRNA, 즉 유전자의 전사 및 미성숙 mRNA의 성숙에 의해 얻어지는 mRNA의 3'-UTR에 해당하는 서열이다. 용어 "유전자의 3'-UTR"은 3'-UTR의 DNA 서열 및 RNA 서열을 포함한다.
5'-비번역 영역 (5'-UTR): 5'-UTR은 일반적으로 메신저 RNA(mRNA)의 특정 섹션으로 이해된다. 이는, mRNA의 오픈 리딩 프레임의 5'에 위치한다. 일반적으로, 5'-UTR은 전사 시작 부위(transcriptional start site)에서 시작하여, 오픈 리딩 프레임의 시작 코돈(start codon) 전 1개의 뉴클레오타이드에서 끝난다. 5'-UTR은 유전자 발현을 제어하기 위한 요소, 소위 조절 요소(regulatory elements)를 포함할 수 있다. 그러한 조절 요소는 예를 들어, 리보솜 결합 부위(ribosomal binding sites) 또는 5'-말단 올리고피리미딘 트랙(5'-Terminal Oligopyrimidine Tract)일 수 있다. 5'-UTR은 예를 들어, 5'-CAP의 추가에 의해 전사 후 변형될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 5'-UTR은 5'-CAP과 시작 코돈 사이에 위치하는 성숙 mRNA의 서열에 상응한다. 바람직하게, 5'-UTR은 5'-CAP에 대하여 3'에 위치하는 뉴클레오타이드로부터, 바람직하게 5'-CAP에 대하여 바로 3'에 위치하는 뉴클레오타이드로부터, 단백질 코딩 영역의 시작 코돈에 대하여 5'에 위치하는 뉴클레오타이드로, 바람직하게 단백질 코딩 영역의 시작 코돈에 대하여 바로 5'에 위치하는 뉴클레오타이드로 연장하는 서열에 상응한다. 성숙 mRNA의 5'-CAP에 대하여 바로 3'에 위치하는 뉴클레오타이드는 일반적으로 전사 시작 부위에 상응한다. 용어 "에 상응하다"는, 5'-UTR 서열이 5'-UTR 서열을 정의하는데 사용되는 mRNA 서열과 같은 RNA 서열, 또는 그러한 RNA 서열에 상응하는 DNA 서열일 수 있음을 의미한다. 본 발명의 맥락에서, "TOP 유전자의 5'-UTR"과 같은 용어 "유전자의 5'-UTR"은 이 유전자로부터 유래되는 성숙 mRNA, 즉, 유전자의 전사 및 미성숙 mRNA의 성숙에 의해 얻어지는 mRNA의 5'-UTR에 상응하는 서열이다. 용어 "유전자의 5'-UTR"은 5'-UTR의 DNA 서열 및 RNA 서열을 포함한다.
5'-말단 올리고피리미딘 트랙(TOP): 5'-말단 올리고피리미딘 트랙(TOP)은 일반적으로 특정 mRNA 분자의 5'-말단 영역 또는 특정 유전자의 기능적 엔티티(functional entity), 예를 들어, 전사 영역의 5'-말단 영역에 위치한 피리미딘 뉴클레오타이드의 스트레치(stretch)이다. 서열은 일반적으로 전사 시작 부위에 상응하는 시티딘으로 시작하고, 일반적으로 약 3 내지 30개 피리미딘 뉴클레오타이드가 이어진다. 예를 들어, TOP는 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개 또는 그 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. 피리미딘 스트레치 및 따라서 5'-TOP는 TOP의 다운스트림에 위치한 첫 번째 퓨린 뉴클레오타이드에 대하여 5'의 1개의 뉴클레오타이드에서 끝난다. 5'-말단 올리고피리미딘 트랙을 포함하는 메신저 RNA는 종종 TOP 유전자로 나타내어질 수 있다. TOP 서열은 예를 들어, 펩타이드 신장 인자 및 리보솜 단백질을 코딩하는 유전자 및 mRNA에서 발견되었다.
TOP 모티프(motif): 본 발명의 맥락에서, TOP 모티프는 상기에서 정의된 5'-TOP에 상응하는 핵산 서열이다. 따라서, 본 발명의 맥락에서, TOP 모티프는 바람직하게 3-30개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는 피리미딘 뉴클레오타이드의 스트레치이다. 바람직하게, TOP 모티프는 적어도 3개 피리미딘 뉴클레오타이드, 바람직하게 적어도 4개 피리미딘 뉴클레오타이드, 바람직하게 적어도 5개 피리미딘 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게 적어도 6개 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게 적어도 7개 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게 적어도 8개 피리미딘 뉴클레오타이드로 이루어지며, 여기에서 피리미딘 뉴클레오타이드의 스트레치는 바람직하게 시토신 뉴클레오타이드를 갖는 그 5'-말단에서 시작된다. TOP 유전자 및 TOP mRNA에서, TOP 모티프는 바람직하게 전사 시작 부위를 갖는 그 5'-말단에서 시작하고, 상기 유전자 또는 mRNA의 첫 번째 퓨린 잔기에 대하여 5'의 1개의 뉴클레오타이드에서 끝난다. 본 발명의 의미에서, TOP 모티프는 바람직하게 5'-UTR을 나타내는 서열의 5'-말단에, 또는 5'-UTR을 코딩하는 서열의 5'-말단에 위치한다. 따라서, 바람직하게, 3개 이상의 피리미딘 뉴클레오타이드의 스트레치가 본 발명의 mRNA, 본 발명의 mRNA의 5'-UTR 요소, 또는 본 명세서에 기재된 TOP 유전자의 5'-UTR로부터 유래된 핵산 서열과 같은 각각의 서열의 5' 말단에 위치하는 경우, 본 발명의 의미에서 "TOP 모티프"로 지칭된다. 다르게 말하면, 5'-UTR 또는 5'-UTR 요소의 5'-말단에 위치하지 않으나, 5'-UTR 또는 5'-UTR 요소 내 임의의 곳에 위치하는 3개 이상의 피리미딘 뉴클레오타이드의 스트레치는 바람직하게 "TOP 모티프"로 나타내어지지 않는다.
TOP 유전자: TOP 유전자는 일반적으로 5'-말단 올리고피리미딘 트랙의 존재에 의해 특징지워진다. 더욱이, 대부분의 TOP 유전자는 성장 관련 번역 조절을 특징으로 한다. 그러나, 조직 특이적 번역 조절을 갖는 TOP 유전자도 알려져 있다. 상기 정의된 바와 같이, TOP 유전자의 5'-UTR은 TOP 유전자로부터 유래된 성숙 mRNA의 5'-UTR의 서열에 상응하며, 이는 바람직하게 5'-CAP에 대하여 3'에 위치한 뉴클레오타이드로부터 시작 코돈에 대하여 5'에 위치한 뉴클레오타이드로 연장된다. TOP 유전자의 5'-UTR은 일반적으로 임의의 시작 코돈을 포함하지 않으며, 바람직하게 업스트림 AUG(uAUG) 또는 업스트림 오픈 리딩 프레임(uORF)을 포함하지 않는다. 여기에서, 업스트림 AUG 및 업스트림 오픈 리딩 프레임은 일반적으로번역되어야 하는 오픈 리딩 프레임의 시작 코돈(AUG)의 5'에 발생하는 AUG 및 오픈 리딩 프레임인 것으로 이해된다. TOP 유전자의 5'-UTR은 일반적으로 다소 짧다. TOP 유전자의 5'-UTR의 길이는 20개 뉴클레오타이드에서 500개 이하의 뉴클레오타이드로 다양할 수 있으며, 일반적으로 약 200개 미만의 뉴클레오타이드, 바람직하게 약 150개 미만의 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게 약 100개 미만의 뉴클레오타이드이다. 본 발명의 의미에서, TOP 유전자의 예시적인 5'-UTR은 개시 내용이 참조로 본 명세서에 포함되는 국제공개공보 WO2013/143700의 서열식별번호:1-1363, 서열식별번호:1395, 서열식별번호:1421 및 서열식별번호:1422에 따른 서열 또는 그 동족체 또는 변이체의 위치 5의 뉴클레오타이드로부터 시작 코돈(예를 들어, ATG)에 대해 바로 5'에 위치한 뉴클레오타이드로 연장되는 핵산 서열이다. 이러한 맥락에서, TOP 유전자의 5'-UTR의 특히 바람직한 단편은 5'-TOP 모티프가 없는 TOP 유전자의 5'-UTR이다. 용어 "TOP 유전자의 5'-UTR"은 바람직하게 자연적으로 발생하는 TOP 유전자의 5'-UTR을 의미한다.
핵산 서열, 특히 mRNA의 단편: 핵산 서열의 단편은 단편의 핵산 서열의 기초가 되는 전장 핵산 서열의 연속적인 스트레치에 상응하는 뉴클레오타이드의 연속적인 스트레치로 이루어지며, 이는 전장 핵산 서열의 적어도 20%, 바람직하게 적어도 30%, 더욱 바람직하게 적어도 40%, 더욱 바람직하게 적어도 50%, 더욱더 바람직하게 적어도 60%, 더욱더 바람직하게 적어도 70%, 더욱더 바람직하게 적어도 80%, 가장 바람직하게 적어도 90%를 나타낸다. 본 발명의 의미에서, 그러한 단편은 바람직하게는 전장 핵산 서열의 기능적 단편(functional fragment)이다.
본 발명의 맥락에서, 단백질 또는 펩타이드의 "단편" 또는 "변이체"는 그러한 단백질 또는 펩타이드의 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 50개, 적어도 75개 또는 적어도 100개 아미노산의 스트레치에 걸쳐 적어도 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 아미노산 동일성을 가질 수 있다. 더욱 바람직하게, 본 명세서에 사용된 단백질 또는 펩타이드의 "단편" 또는 "변이체"는 그 변이체가 유래된 단백질 또는 펩타이드와 적어도 40%, 바람직하게 적어도 50%, 더욱 바람직하게 적어도 60%, 더욱 바람직하게 적어도 70%, 더욱더 바람직하게 적어도 80%, 더욱더 바람직하게 적어도 90%, 가장 바람직하게 적어도 95% 동일하다.
핵산 서열, 특히 mRNA의 변이체: 핵산 서열의 변이체는 핵산 서열의 기초를 형성하는 핵산 서열의 변이체를 나타낸다. 예를 들어, 변이체 핵산 서열은 그 변이체가 유래된 핵산 서열과 비교하여, 일 이상의 뉴클레오타이드 결실(deletions), 삽입(insertions), 추가(additions) 및/또는 치환(substitutions)을 나타낼 수 있다. 바람직하게, 핵산 서열의 변이체는 그 변이체가 유래된 핵산 서열과 적어도 40%, 바람직하게 적어도 50%, 더욱 바람직하게 적어도 60%, 더욱 바람직하게 적어도 70%, 더욱더 바람직하게 적어도 80%, 더욱더 바람직하게 적어도 90%, 가장 바람직하게 적어도 95% 동일하다. 바람직하게, 변이체는 기능적 변이체이다. 핵산 서열의 "변이체"는 그러한 핵산 서열의 10개, 20개, 30개, 50개, 75개 또는 100개 뉴클레오타이드의 스트레치와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 뉴클레오타이드 동일성을 가질 수 있다.
안정화된 핵산, 바람직하게 mRNA: 안정화된 핵산, 바람직하게 mRNA는 일반적으로 생체 내 분해(예를 들어, 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제에 의한 분해) 및/또는 생체 외(ex vivo) 분해(예를 들어, 백신 투여 이전의 제조 공정에 의해, 예를 들어, 투여될 백신 용액을 제조하는 과정에서)에 대한 내성을 증가시키는 변형을 나타낸다. RNA의 안정화는 예를 들어, 5'-CAP-구조, 폴리A-테일, 또는 임의의 다른 UTR-변형을 제공함으로써 이루어질 수 있다. 이는 또한, 핵산의 화학적 변형 또는 G/C 함량의 변형에 의해 이루어질 수 있다. 다양한 다른 방법이 당해 기술분야에 공지되어 있고, 본 발명의 맥락에서 생각될 수 있다.
RNA 시험관 내(In vitro) 전사: 용어 "RNA 시험관 내 전사" 또는 "시험관 내 전사"는 RNA가 무세포 세스템(시험관 내)에서 합성되는 과정에 관한 것이다. DNA, 특히 플라스미드 DNA가 RNA 전사체(transcripts) 생성을 위한 템플릿(template)으로 이용된다. RNA는, 본 발명에 따르면 바람직하게는 선형화된 플라스미드 DNA 템플릿인 적절한 DNA 템플릿의 DNA 의존성 시험관 내 전사에 의해 얻어질 수 있다. 시험관 내 전사를 제어하기 위한 프로모터는 임의의 DNA 의존성 RNA 폴리머라제에 대한 임의의 프로모터일 수 있다. DNA 의존성 RNA 폴리머라제의 특정 예는 T7, T3, 및 SP6 RNA 폴리머라제이다. 시험관 내 RNA 전사를 위한 DNA 템플릿은 핵산, 특히 시험관 내 전사되는 각각의 RNA에 상응하는 cDNA의 클로닝(cloning) 및 이를 시험관 내 전사를 위한 적절한 벡터, 예를 들어, 플라스미드 DNA 내에 도입함으로써 얻어질 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, DNA 템플릿은 시험관 내 전사되기 전에, 적합한 제한 효소(restriction enzyme)로 선형화된다. cDNA는 mRNA의 역전사 또는 화학적 합성에 의해 얻어질 수 있다. 또한, 시험관 내 RNA 합성을 위한 DNA 템플릿은 유전자 합성에 의해서 얻어질 수도 있다.
시험관 내 전사 방법은 당해 기술분야에 알려져 있다(예를 들어, Geall et al. (2013) Semin. Immunol. 25(2): 152-159; Brunelle et al. (2013) Methods Enzymol. 530:101-14 참조). 상기 방법에 사용되는 시약은 일반적으로 다음을 포함한다:
1) 박테리오파지-코딩된 RNA 폴리머라제와 같은 각각의 RNA 폴리머라제에 대해 높은 결합 친화도를 갖는 프로모터 서열을 갖는 선형화된 DNA 템플릿;
2) 4개의 염기(아데닌, 시토신, 구아닌 및 우라실)에 대한 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트(NTP);
3) 선택적으로, 상기 정의된 CAP 유사체(예를 들어, m7G(5')ppp(5')G (m7G));
4) 선형화된 DNA 템플릿 내의 프로모터 서열에 결합할 수 있는 DNA 의존성 RNA 폴리머라제(예를 들어, T7, T3 또는 SP6 RNA 폴리머라제);
5) 선택적으로, 임의의 오염된 RNAe를 비활성화하기 위한 리보뉴클레아제 (RNAe) 억제제;
6) 선택적으로, 전사를 억제할 수 있는 파이로포스페이트(pyrophosphate)를 분해하는 파이로포스파타제(pyrophosphatase)
7) 폴리머라제에 대한 보조 인자로서 Mg2+ 이온을 공급하는 MgCl2;
8) 항산화제(예를 들어, DTT) 및/또는 최적 농도의 스페르미딘(spermidine)과 같은 폴리아민을 함유할 수 있는, 적합한 pH 값을 유지하기 위한 버퍼.
전장 단백질: 본 명세서에 사용된 용어 "전장 단백질"은 일반적으로 자연적으로 발생된 단백질의 전체 아미노산 서열을 실질적으로 포함하는 단백질을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, 예를 들어, 단백질의 돌연변이로 인한 아미노산의 치환도 용어 전장 단백질에 포함된다.
단백질의 단편: 본 발명의 맥락에서, 단백질 또는 펩타이드의 "단편"은 일반적으로 원래 (천연) 단백질 (또는 코딩된 핵산 분자)의 아미노산 서열과 비교하여 N-말단 및/또는 C-말단이 절단된, 본 명세서에 정의된 단백질 또는 펩타이드의 서열을 포함할 수 있다. 그러한 절단(truncation)은 아미노산 수준 또는 상응하는 핵산 수준에서 발행할 수 있다. 본 명세서에 정의된 그러한 단편에 대한 서열 동일성은 바람직하게는 본 명세서에 정의된 전체 단백질 또는 펩타이드 또는 그러한 단백질 또는 펩타이드의 전체 (코딩) 핵산 분자를 나타낼 수 있다.
유전자의 핵산 서열의 맥락에서, 용어 "변이체"는 핵산 서열 변이체, 즉, 레퍼런스 (또는 "모") 핵산 또는 유전자의 레퍼런스 (또는 "모") 핵산 서열과 적어도 하나의 핵산이 상이한 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열 또는 유전자를 나타낸다. 변이체 핵산 또는 유전자는 바람직하게는 각각의 레퍼런스 서열과 비교하여 핵산 서열 내에, 적어도 하나의 돌연변이, 치환, 삽입 또는 결실을 포함할 수 있다. 바람직하게, 본 명세서에 사용된 용어 "변이체"는 핵산 서열 또는 유전자의 자연 발생 변이체 및 조작된 변이체를 포함한다. 따라서, 본 명세서에 정의된 "변이체"는 레퍼런스 핵산 서열로부터 유래되거나, 분리되거나, 관련되거나, 기초하거나, 또는 상동일 수 있다. "변이체"는 바람직하게 각각의 자연 발생 (야생형) 핵산 서열 또는 유전자, 또는 그의 동족체, 단편 또는 유도체의 핵산 서열에 대하여 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 바람직하게 적어도 70%, 더욱 바람직하게 적어도 80%, 더욱더 바람직하게 적어도 85%, 더욱더 바람직하게 적어도 90%, 가장 바람직하게 적어도 95% 또는 더욱 97%의 서열 동일성을 가질 수 있다.
또한, 단백질 또는 펩타이드의 맥락에서 본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 용어 "변이체"는 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 일 이상의 치환, 삽입 및/또는 결실된 아미노산(들)과 같은 일 이상의 돌연변이(들)에서 원래 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 펩타이드 변이체를 나타내는 것으로 의도된다. 바람직하게, 이러한 단편 및/또는 변이체는 전장 천연 단백질과 비교하여 동일한 생물학적 기능 또는 특이적 활성, 예를 들어, 특이적 항원 특성을 갖는다. 본 명세서에 정의된 단백질 또는 펩타이드의 "변이체"는 그 천연 서열, 즉 돌연변이되지 않은 생리학적 서열과 비교하여 보존적 아미노산 치환기(들)를 포함할 수 있다. 이 아미노산 서열 및 그의 코딩 뉴클레오타이드 서열은 특히 본 명세서에 정의된 용어 변이체에 속한다. 동일한 부류에서 유래한 아미노산이 서로 교환되는 치환을 보존적 치환이라고 한다. 특히, 이들은 지방족 측쇄, 양전하 또는 음전하를 띤 측쇄, 측쇄 또는 아미노산에 방향족 기를 갖는 아미노산이며, 그 측쇄가 수소 가교로 들어갈 수 있는, 즉 측쇄가 하이드록실 기능을 갖는 아미노산일 수 있다. 이는, 예를 들어, 극성 측쇄를 갖는 아미노산이 유사한 극성 측쇄를 갖는 다른 아미노산에 의해 대체되거나, 또는 예를 들어, 소수성 측쇄를 갖는 아미노산이 유사한 소수성 측쇄를 갖는 다른 아미노산에 의해 치환되는 것을 의미한다(예를 들어, 트레오닌(세린)에 의한 세린(트레오닌)의 치환, 또는 이소류신(류신)에 의한 류신(이소류신)의 치환). 삽입 및 치환은 특히 3차원 구조에 변형을 일으키지 않거나 결합 영역에 영향을 미치지 않는 서열 위치에서 가능하다. 삽입(들) 또는 결실(들)에 의한 3차원 구조에 대한 변형 예를 들어, CD 스펙트럼(원형 이색성 스펙트럼(circular dichroism spectra))을 이용하여 쉽게 결정될 수 있다. 단백질 또는 펩타이드의 "변이체"는 그러한 단백질 도는 펩타이드의 적어도 10개, 20개, 30개, 50개, 75개 또는 100개 아미노산의 스트레치에 걸쳐 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 아미노산 동일성을 가질 수 있다. 바람직하게, 단백질의 변이체는 단백질의 기능적 변이체를 포함하며, 이는 변이체가 유래된 단백질과 동일한 효과 또는 기능성, 또는 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%의 효과 또는 기능성을 발휘하는 것을 의미한다.
또한, 핵산 서열 또는 유전자의 맥락에서 용어 "단편"은 전장 레퍼런스 (또는 "모") 핵산 서열 또는 유전자의 연속 하위서열(subsequence)을 나타낸다. 따라서, 단편은 일반적으로 전장 핵산 서열 또는 유전자 내의 상응하는 스트레치와 동일한 서열로 이루어진다. 이 용어는 자연 발생 단편 및 조작된 단편을 포함한다. 본 발명의 맥락에서 서열의 바람직한 단편은 단편이 유래된 핵산 또는 유전자에서 엔터티의 연속적인 스트레치에 상응하는 핵산의 연속적인 스트레치로 이루어지며, 단편이 유래된 총 (즉, 전장) 핵산 서열 또는 유전자의 적어도 20%, 바람직하게 적어도 30%, 더욱 바람직하게 적어도 40%, 더욱 바람직하게 적어도 50%, 더욱더 바람직하게 적어도 60%, 더욱더 바람직하게 적어도 70%, 가장 바람직하게 적어도 80%를 나타낸다. 그러한 단편에 대하여 표시된 서열 동일성은 바람직하게 전체 핵산 서열 또는 유전자를 나타낸다. 바람직하게, "단편"은 그가 유래된 레퍼런스 핵산 서열 또는 유전자에 대하여 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 바람직하게 적어도 70%, 더욱 바람직하게 적어도 80%, 더욱더 바람직하게 적어도 85%, 더욱더 바람직하게 적어도 90%, 가장 바람직하게 적어도 95% 또는 더욱 97%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 이러한 맥락에서, 단백질의 단편은 일반적으로 각각의 자연 발생 전장 단백질의 아미노산 서열과 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 바람직하게 적어도 70%, 더욱 바람직하게 적어도 80%, 더욱더 바람직하게 적어도 85%, 더욱더 바람직하게 적어도 90%, 가장 바람직하게 적어도 95% 또는 더욱 97%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
핵산 서열 또는 아미노산 서열의 맥락에서 본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 용어 "동일성"은 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식되고 이해될 것이며, 예를 들어, 2개의 서열이 동일한 비율을 나타내도록 의도된다. 2개의 서열이 동일한 비율을 결정하기 위하여, 예를 들어, 본 명세서에 정의된 핵산 서열 또는 아미노산(aa) 서열, 바람직하게 본 명세서에 정의된 핵산 서열에 의해 코딩되는 aa 서열 또는 aa 서열 그 자체가 있는 경우, 서열은 후속적으로 서로 비교되기 위해 정렬될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 제1 서열의 위치는 제2 서열의 상응하는 위치와 비교될 수 있다. 제1 서열에서의 위치가 제2 서열에서의 위치에서와 같이 동일한 잔기에 의해 점유된다면, 2개의 서열은 이 위치에서 동일하다. 그렇지 않다면, 서열은 이 위치에서 상이하다. 제1 서열과 비교하여 제2 서열에서 삽입이 발생하면, 추가적인 정렬을 가능하도록 하기 위하여 갭이 제1 서열에 삽입될 수 있다. 제1 서열과 비교하여 제2 서열에 결실이 발생하면, 추가적인 정렬을 가능하도록 하기 위하여 갭이 제2 서열에 삽입될 수 있다. 2개의 서열이 동일한 비율은 동일한 위치의 수를 하나의 서열에서만 점유된 위치를 포함하는 위치의 총수로 나눈 함수이다. 2개의 서열이 동일한 비율은 알고리즘, 예를 들어, BLAST 프로그램에 통합된 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 단백질 또는 펩타이드의 단편은 예를 들어 적어도 5개 아미노산, 바람직하게 적어도 6개 아미노산, 바람직하게 적어도 7개 아미노산, 더욱 바람직하게 적어도 8개 아미노산, 더욱더 바람직하게 적어도 9개 아미노산; 더욱더 바람직하게 적어도 10개 아미노산; 더욱더 바람직하게 적어도 11개 아미노산; 더욱더 바람직하게 적어도 12개 아미노산; 더욱더 바람직하게 적어도 13개 아미노산; 더욱더 바람직하게 적어도 14개 아미노산; 더욱더 바람직하게 적어도 15개 아미노산; 더욱더 바람직하게 적어도 16개 아미노산; 더욱더 바람직하게 적어도 17개 아미노산; 더욱더 바람직하게 적어도 18개 아미노산; 더욱더 바람직하게 적어도 19개 아미노산; 더욱더 바람직하게 적어도 20개 아미노산; 더욱더 바람직하게 적어도 25개 아미노산; 더욱더 바람직하게 적어도 30개 아미노산; 더욱더 바람직하게 적어도 35개 아미노산; 더욱더 바람직하게 적어도 50개 아미노산; 또는 가장 바람직하게 적어도 100개 아미노산의 길이를 갖는, 본 명세서에 정의된 단백질 또는 펩타이드의 서열을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 그러한 단편은 약 6개 내지 약 20개 도는 그 이상의 아미노산 길이를 가질 수 있으며, 예를 들어, 바람직하게 약 8개 내지 약 10개 아미노산, 예를 들어, 8개, 9개 또는 10개 아미노산(또는 6개, 7개, 11개, 또는 12개 아미노산)의 길이를 갖는 MHC 클래스 I 분자에 의해 처리되고 제시되는 단편, 또는 바람직하게 약 13개 이상의 아미노산, 예를 들어, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 또는 그 이상의 아미노산의 길이를 갖는 MHC 클래스 Ⅱ 분자에 의해 처리 및 제시되는 단편일 수 있으며, 여기서 이러한 단편은 아미노산 서열의 임의의 부분으로부터 선택될 수 있다. 이러한 단편은 일반적으로 펩타이드 단편 및 MHC 분자로 이루어진 복합체 형태로 T 세포에 의해 인식될 수 있다. 즉, 단편은 일반적으로 그 천연 형태로는 인식되지 않는다. 단백질 또는 펩타이드의 단편은 그러한 단백질 또는 펩타이드의 적어도 하나의 에피토프를 포함할 수 있다. 더욱이, 세포 외 도메인(domain), 세포 내 도메인, 또는 막횡단(transmembrane) 도메인과 같은 단백질의 도메인 및 단백질의 단축 또는 절단된 버전은 단백질의 단편을 포함하는 것으로 이해될 수 있다.
단백질의 변이체: 본 발명의 맥락에서 정의된 단백질 또는 펩타이드의 "변이체"는 일 이상의 치환된, 삽입된 및/또는 결실된 아미노산(들)과 같이 일 이상의 돌연변이(들)에서 원래 서열과 상이한 아미노산 서열을 갖도록 생성될 수 있다. 바람직하게, 이 단편 및/또는 변이체는 전장 천연 단백질과 비교하여 동일한 생물학적 기능 또는 특이적 활성, 예를 들어, 특이적 항원 특성을 갖는다. 본 발명의 맥락에서 정의된 단백질 또는 펩타이드의 "변이체"는 본래의, 즉, 돌연변이되지 않은, 생리학적, 서열과 비교하여 보존적 아미노산 치환기(들)를 포함할 수 있다. 이 아미노산 서열 및 그의 코딩 뉴클레오타이드 서열은 특히 본 명세서에 정의된 용어 변이체에 속한다. 동일한 부류에서 유래된 아미노산이 서로 교환되는 치환을 보존적 치환이라고 한다. 특히, 이들은, 지방족 측쇄, 양전하 또는 음전하를 띤 측쇄, 측쇄 또는 아미노산에 방향족 기를 갖는 아미노산이며, 그 측쇄가 수소 가교로 들어갈 수 있으며, 즉, 그 측쇄는 하이드록실 기능을 갖는다. 이는, 예를 들어, 측성 측쇄를 갖는 아미노산이 유사한 극성 측쇄를 갖는 다른 아미노산에 의해 대체되거나, 또는 소수성 측쇄를 갖는 아미노산이 유사한 소수성 측쇄를 갖는 다른 아미노산에 의해 치환되는 것을 의미한다(예를 들어, (예를 들어, 트레오닌(세린)에 의한 세린(트레오닌)의 치환, 또는 이소류신(류신)에 의한 류신(이소류신)의 치환). 삽입 및 치환은 특히, 3차원 구조에 변형을 일으키지 않거나 결합 여역에 영향을 미치지 않는 서열 위치에서 가능하다. 삽입(들) 또는 결실(들)에 의한 3차원 구조에 대한 변형은 예를 들어, CD 스펙트럼 (원형 이색성 스펙트럼)을 이용하여 쉽게 결정될 수 있다(Urry, 1985, Absorption, Circular Dichroism and ORD of Polypeptides, in: Modern Physical Methods in Biochemistry, Neuberger et al. (ed.), Elsevier, Amsterdam).
단백질 또는 펩타이드의 "변이체"는 그러한 단백질 또는 펩타이드의 10개, 20개, 30개, 50개, 75개 또는 100개 아미노산의 스트레치에 걸쳐 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 아미노산 동일성을 가질 수 있다.
더욱이, 핵산 분자에 의해 코딩될 수 있는 본 명세서에 정의된 단백질 또는 펩타이드의 변이체는 이러한 서열을 포함할 수 있으며, 여기에서, 코딩 핵산 서열의 뉴클레오타이드는 단백질 또는 펩타이드의 각각의 아미노산 서열의 변경을 일으키지 않고 유전자 코드의 변성에 따라 교환되며, 즉 아미노산 서열 또는 적어도 그 부분은 상기 의미 내에서 일 이상의 돌연변이(들)에서 원래 서열과 상이하지 않을 수 있다.
서열의 동일성: 2개의 서열이 동일한 비율을 결정하기 위하여, 예를 들어, 본 명세서에 정의된 핵산 서열 또는 아미노산 서열, 바람직하게 본 명세서에 정의된 폴리머 담체의 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열 또는 그 아미노산 서열 자체가 있는 경우, 서열은 후속적으로 서로 비교되기 위해 정렬될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 제1 서열의 위치는 제2 서열의 상응하는 위치와 비교될 수 있다. 제1 서열에서의 위치가 제2 서열에서의 위치에서와 같이 동일한 성분 (잔기)에 의해 점유된다면, 2개의 서열은 이 위치에서 동일하다. 그렇지 않다면, 서열은 이 위치에서 상이하다. 제1 서열과 비교하여 제2 서열에서 삽입이 발생하면, 추가적인 정렬을 가능하도록 하기 위하여 갭이 제1 서열에 삽입될 수 있다. 제1 서열과 비교하여 제2 서열에 결실이 발행하면, 추가적인 정렬을 가능하도록 하기 위하여 갭이 제2 서열에 삽입될 수 있다. 2개의 서열이 동일한 비율은 동일한 위치의 수를 하나의 서열에서만 점유된 위치를 포함하는 위치의 총수로 나눈 함수이다. 이용될 수 있는 수학적 알고리즘의 바람직하지만 제한적이지 않은 예는 Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877 또는 Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res., 25:3389-3402의 알고리즘이다. 그러한 알고리즘은 BLAST 프로그램에 통합된다. 이 프로그램에 의해 본 발명의 서열과 어느 정도 동일한 서열을 식별할 수 있다.
단백질 또는 펩타이드의 유도체: 펩타이드 또는 단백질의 유도체는 일반적으로 상기 펩타이드 또는 단백질과 같은 다른 분자로부터 유래된 분자인 것으로 이해된다. 펩타이드 또는 단백질의 "유도체"는 본 발명에 사용된 펩타이드 또는 단백질의 융합(fusion)도 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합은 예를 들어, 에피토프, 예를 들어, FLAG 에피토프 또는 V5 에피토프와 같은 라벨을 포함할 수 있다. 예를 들어, 에피토프는 FLAG 에피토프이다. 그러한 태그는 예를 들어, 융합 단백질을 정제하는데 유용하다.
약학적 유효량: 본 발명의 맥락에서 약학적 유효량은 일반적으로 면역 반응을 유도하기에 충분한 양으로 이해된다.
담체(Carrier): 본 발명의 맥락에서 담체는 일반적으로 다른 화합물의 이동(transport) 및/또는 복합화(complexation)를 용이하게 하는 화합물일 수 있다. 상기 담체는 상기 다른 화합물과 복합체(complex)를 형성할 수 있다. 폴리머 담체는 폴리머로 형성된 담체이다.
비히클(Vehicle): 약학 조성물 또는 백신의 성분을 개체에 투여하는 것을 용이하게 하기 위하여 약학적 조성물 또는 백신 내에 전형적으로 사용될 수 있는 제제, 예를 들어, 담체.
도 1a 내지 도 1i (HEXA 지질의 화학적 구조)은 본 명세서에 기재된 본 발명의 HEXA 지질 화합물의 구조를 나타낸다. 지질 화합물 C1(도 1a) HEXA-C4DE-PipSS, 지질 화합물 C2(도 1b) HEXA-C5DE-PipSS, 지질 화합물 C3(도 1c) HEXA-C6DE-PipSS, 지질 화합물 C4(도 1d) HEXA-C7DE-PipSS, 지질 화합물 C5(도 1e) HEXA-C8DE-PipSS, 지질 화합물 C6(도 1f) HEXACA-C3ME-PipSS, 지질 화합물 C7(도 1g) HEXACA-C4ME-PipSS, 지질 화합물 C8(도 1h) HEXACA-C6ME-PipSS, 지질 화합물 C9(도 1i) HEXACA-C8ME-PipSS (자세한 내용은 실시예 2.1에서 볼 수 있음).
도 2a 내지 도 2c (HEXA 지질의 양성자화 프로파일 / pKa)는 본 발명의 HEXA 지질 화합물 양성자화 프로파일 / pKa을 나타낸다. - TNS (염료 2-p-톨루이디닐나프탈렌-6-설포네이트) 형광을 통한 양성자화 정도의 측정. A: 조성물 1 (DSPC)에서 LNP1, LNP2, LNP3 및 LNP4의 TNS 형광. B: 조성물 1 (DSPC)에서 LNP5, LNP6, LNP7 및 GN01의 TNS 형광. C: 조성물21 (DPhyPE 또는 4ME 16:0 PE)에서 LNP8, LNP9, LNP10 및 LNP11의 TNS 형광. D: 조성물 2 (DPhyPE)에서 LNP12, LNP13, LNP14 및 GN01의 TNS 형광. E: LNP15 (조성물 1-DSPC에서), LNP16 (조성물 2-DPhyPE에서), LNP17(조성물 2-DSPC에서), LNP 18 (조성물 2-DPhyPE에서) 및 GN01의 TNS 형광 (자세한 내용은 실시예 2.1.2 / 표 Ex-4에서 볼 수 있음).
도 3a 내지 도 3c (HEAD 지질의 구조)는 본 명세서에 기재된 본 발명의 HEAD 지질 화합물의 구조를 나타낸다 (자세한 내용은 실시예 2.1 / 표 Ex-6에서 볼 수 있음), 즉, 지질 화합물 CISE (도 3a), 지질 화합물 CPZE (도 3b), 지질 화합물 에스테르 (도 3c).
도 4a 내지 도 4b (HEAD 지질의 양성자화 프로파일 / pKa)는 본 발명의 HEAD 지질 화합물의 양성자화 프로파일 / pKa를 나타낸다. - TNS (염료 2-p-톨루이디닐나프탈렌-6-설포네이트) 형광을 통한 양성자화 정도의 측정. 도 4a의 A: GN01와 비교된 조성물 A (DSPC) 및 조성물 B (DPhyPE)에서 HEAD 지질 CISE의 TNS 형광. 도 4a의 B: GN01과 비교된 조성물 A (DSPC) 및 조성물 B (DPhyPE)에서 HEAD 지질 CPZE의 TNS 형광. 도 4b의 C: GN01와 비교된 조성물 A (DSPC) 및 조성물 B (DPhyPE)에서 HEAD 지질 에스테르의 TNS 형광 (자세한 내용은 실시예 2.2.2 / 표 Ex-9에서 볼 수 있음).
도 5a 및 도 5b (HeLa 및 HepG2에서 PpLuc 발현 - HEXA 지질 1 내지 7) - HEXA 지질 1 내지 7은 조성물 1 또는 2를 사용하여 LNP로 제제화되고, PpLuc mRNA에 의해 HeLa 세포 또는 HepG2 세포로 형질감염되었다. 상대 광 단위(Relative light unit, RLU)를 형질감염 후 24 h에 측정하였다. 도 5a의 A: LNP1 내지 LNP7 (조성물 1-DSPC) 및 GN01의 HeLa 세포로의 형질감염. 도 5a의B: LNP8 내지 LNP14 (조성물 2- DPhyPE) 및 GN01의 HeLa 세포로의 형질감염. 도 5b의 C: LNP1 내지 LNP7 (조성물 1-DSPC) 및 GN01의 HepG2 세포로의 형질감염. 도 5b의 D: LNP8 내지 LNP14 (조성물 2- DPhyPE) 및 GN01의 HepG2 세포로의 형질감염. 즉, 도 5a 내지 도 5b는 지질 및 조성물로 제제화된 mRNA가 HeLa 및 마우스에서 매우 좋고 훨씬 우수한 PpLuc 발현을 나타냄을 보여준다 (자세한 내용은 실시예 3.1.1에서 볼 수 있음).
도 6 (HEAD 지질의 HeLa에서의 PpLuc 발현)은 실시예 3.1.1 및 도 5a 내지 도 5b에 따르면, DPhyPE를 포함하는 조성물이 거의 모든 최신 기술의 LNP 조성물에서 표준 중성 지질로 지금까지 당해 기술분야에서 사용되는 DSPC에 대하여 분명한 이점을 가짐을 보여준다. HEAD 지질 CISE, CPZE 및 에스테르는 조성물 A 또는 B를 이용하여 제제화되고, PpLuc mRNA에 의해 HeLa 세포로 형질감염되었다. 상대 광 단위 (RLU)는 형질감염 후 24 h에 측정하였다 (자세한 내용은 실시예 3.2.1에서 볼 수 있음).
도 7 (HeLa 세포에서 HEXA 지질 1 내지 7의 hEPO 발현)은 처리 후 HeLa 세포에서 시험관 내 우수한 hEpo 발현을 나타낸다 - GN01 및 조성물 2를 사용하여 LNP로 제조된 HEXA 지질 - DPhyPE는 hEPO를 코딩하는 mRNA로 제제화되고, HeLa 세포에서 형질감염되었다. hEpo ELISA는 형질감염 후 24 h에 수행되었으며, 형질감염 효율을 보여준다 (자세한 내용은 실시예 4.1.1에서 볼 수 있음).
도 8 (마우스에서 HEXA 지질 1 내지 7의 hEPO 발현)은 또한 본 발명의 조성물의 생체 내 분석이 주사 후 6시간 및 24시간 후에 뚜렷이 높은 hEpo 발현을 제공함을 나타낸다 - GN01 및 조성물 2를 사용하여 LNP로 제조된 HEXA 지질 - DPhyPE hEPO를 코딩하는 mRNA로 제제화되었으며, Balb/C 마우스에 0.5 mg/kg 주사하였다(그룹 당 5마리). HsEpo 수준은 ELISA를 사용하여 혈장 주사 후 6 h 및 24 h에 측정되었다 (자세한 내용은 실시예 4.1.1에서 볼 수 있음).
도 9 (HEXA 지질의 내약성 - 간 효소)는 버퍼 대조군과 비교할 때 테스트 동물 중 어느 것도 유의하게 상승된 AST 및 ALT 간 효소 활성을 나타내지 않았음을 보여준다 - HEXA 지질의 내약성 분석을 위하여, ALT 및 AST 수준은 Balb/C 마우스에 각각의 LNP의 정맥 내 형질감염 후 24 h에 측정되었다. A: 버퍼와 비교한 HEXA 지질 1 to 9 함유 LNP 및 GN01의 ALT 및 AST 수준. B: 버퍼와 비교한 지질 2 m/m 비율 (m/m 20, m/m 30, m/m 40) 및 GN01의 ALT 및 AST 수준 (자세한 내용은 실시예 4.1.2에서 볼 수 있음).
도 10a 및 도 10b (HEXA 지질의 내약성 - 면역자극)는 테스트된 지질 화합물 중 어느 것도 유의하게 상승된 사이토카인 수준을 유도하지 않았음을 보여준다 - HEXA 지질의 면역 자극 특성 분석을 위하여, Balb/C 마우스에 HEXA 지질 함유 LNP의 주사 후 6 h에 채취한 HEXA 지질 함유 LNPh 혈청 샘플 CBA 분석 wit HEXA 지질 함유 LNPh 혈청 샘플을 사용한 CBA 분석이 수행되었다. 혈청 내 IFN-α의 수준은 ELISA에 의해 결정되었다. 도 10a의 A: HEXA 지질 1 내지 7 및 GN01의 MCP-1. 도 10a의 B: HEXA 지질 1 내지 7 및 GN01의 IL-6. 도 10a의 C: HEXA 지질 1 내지 7 및 GN01의 MP1-ß. 도 10a의 D: HEXA 지질 1 내지 7 및 GN01의 INF-α. 도 10b의 E: EX지질 8, 9 및 지질 2 m/m 비율 (m/m 20, m/m 30, m/m 40) 및 GN01의 MCP-1. 도 10b의F: HEXA 지질 8, 9 및 지질 2 m/m 비율 (m/m 20, m/m 30, m/m 40) 및 GN01의 IL-6. 도 10b의G: HEXA 지질 8, 9 및 지질 2 m/m 비율 (m/m 20, m/m 30, m/m 40) 및 GN01의 MP1-ß. 도 10b의 H: HEXA 지질 8, 9 및 지질 2 m/m 비율 (m/m 20, m/m 30, m/m 40) 및 GN01의 INF-α (자세한 내용은 실시예 4.1.2에서 볼 수 있음).
도 11 (예방 및 치료 백신 접근에 대한 LNP - 종양 항원 Trp2 i.d. 주사)은 trp2 mRNA를 포함하는 GN01, GN02 및 CISE LNP를 사용한 백신 접종 (자세한 내용은 실시예 4.2.1에서 볼 수 있음)이 안정한 IgG1 및 IgG2 역가를 나타내었으며(도 11A 및 11B), GN01, GN02 및 CISE LNP가 낮은 T 세포 반응을 나타내었음을 보여준다(도 11C 및 11D) - 즉, 종양 항원 Trp2를 코딩하는 제제화된 mRNA 및 GN01, GN02 또는 CIS를 C57/BL6 마우스의 등에 피부 내(i.d) 주사하였다. 면역화는 day 0, day 7 및 day 14에 이루어졌다. 혈액 샘플은 14h에 채취되었으며, 혈액 및 기관 샘플은 첫 번째 백신 접종 후 21일째 채취되었다. T 세포 반응 및 체액 면역 반응은 ELISA를 사용하여 측정되었다. A: IgG1 종말점 역가(종말점 역가). B: IgG2a[b] 종말점 역가. C: CD4+ 세포의 %TNFα+/IFNγ+. D: CD8+ 세포의 %TNFα+/IFNγ+ (자세한 내용은 실시예 4.2.1에서 볼 수 있음).
도 12a (HEAD 지질-간 효소의 내약성)는 버퍼 대조군과 비교할 때 테스트된 동물 중 어느 것도 유의하게 상승된 AST 및 ALT 간 효소 활성을 나타내지 않았음을 보여준다 - HEAD 지질의 내약성 분석을 위하여, Balb/C 마우스로 정맥 내 형질감염 후 24 h에 ALT 및 AST 수준을 측정하였다. HEAD 지질 에스테르 (m/m 40) 및 CPZE (m/m 20)의 ALT 및 AST 수준을 측정하였으며, CISE/지질 2 (m/m 30), 지질 2 (m/m 30) 및 GN01 및 버퍼의 수준과 비교하였다. 상이한 몰/질량(molar/mass, m/m) 비율 (m/m 20, m/m 30, m/m 40)이 이용되었다 (자세한 내용은 실시예 4.2.2에서 볼 수 있음).
도 12b (HEAD 지질의 내약성 - 면역자극)는 테스트된 지질 화합물의 어느 것도 유의하게 상승된 사이토카인 수준을 유도하지 못하였음을 보여준다 - HEXA 지질(지질 2), GN01 및 양자의 혼합물(CISE/지질 2)과 비교하여 HEAD 지질(CPZE, 에스테르)의 면역자극 특성을 분석하기 위하여, Balb/C 마우스로 HEXA 지질을 주사한 후 6 h에 CBA 분석을 수행하였다. 혈청 내 IFN-α 수준을 ELISA에 의해 결정하였다. A: MCP-1. B: IL-6. C: MP1-β. D: INF-α (자세한 내용은 실시예 4.2.2에서 볼 수 있음).
도 13 (장기간 저장 후 본 발명의 LNP의 안정성)은 장기간 동안 4℃ 및 -80℃에서 저장된 GN01 LNP의 무결성 및 생물물리학적 특성의 분석을 보여준다. 명백한 바와 같이, 입자 및 RNA는 안정하였으며, 큰 차이가 관찰되지 않았다 - 즉,겔 전기영동 후 아가로스 겔에서 LNP의 생물물리적 특성 및 mRNA 무결성의 변화가 나타날 수 있었다. hEPO mRNA로 제제화된 GN01 LNP를 1.5개월 또는 5개월 동안 4℃ 및 -80℃에서 저장하였다. 겔 전기영동에 대한 분석을 위하여, LNP를 파괴하여 통합된 mRNA가 겔에 표시될 수 있도록 하였다. 1.5개월 후(A), 6개월 후(B) - 분해 조건 1 (헤파린 및 트리톤 조합을 사용하여 LNP를 분해하였다; 도면의 C1), 분해 조건 2 (헤파린 및 Pluronic® 조합 및 15분 동안 45℃로 가열하는 것이 LNP를 분해하는데 사용되었다; 도면의 C2) (자세한 내용은 실시예 5.1에서 볼 수 있음).
도 14a (10주 동안 -80℃ 저장 후 GN01의 생물학적 활성)는 1주 저장과 비교할 때 주사 후 6 h 및 24 h 후 훨씬 높은 발현 효율을 가져온 10주 저장 후 GN01 제제화된 mRNA의 분석을 보여준다 - 즉, 제제화된 GN01의 생물학적 활성을 ELISA에 의해 평가하였다. GN01 LNP를 hEPO mRNA로 제제화하였으며, 1주 및 10주 동안 각각 동결시켰다. Balb/C 마우스 (5마리 마우스/그룹)에게 정맥 내 주사하였다. 혈장 샘플을 채취하여, 주사 후 6 h 및 24 h에 분석하였다 (자세한 내용은 실시예 5.2에서 볼 수 있음).
도 14b (상이한 F/T 사이클 후 GN01 LNP의 생물학적 활성)는 2 F/T 사이클 후 혈장 샘플과 비교할 때 하나의 동결/해동 사이클 (1 F/T) 후 혈장 샘플이 분석된 제2 평가를 보여준다(양자 모두에서 1주 저장됨) - 결과는, HsEpo의 생물학적 활성이 모든 테스트된 접근법에 대해 나타날 수 있다는 것이었다. 즉, 제제화된 GN01의 생물학적 활성을 ELISA에 의해 평가하였다. GN01 LNP를 hEPO mRNA로 제제화하였으며, 1주 동안 동결시키고, Balb/C 마우스에게 정맥 주사하였다(5마리 마우스/그룹). Elisa 혈장 수준을 1 F/T 사이클 후에 (A) 및 2 F/T 사이클 후에 (B) 분석하였다 (자세한 내용은 실시예 5.2에서 볼 수 있음).
도 15a의 A 및 B (인지질 성분의 변형 및 본 발명의 조성물에 대한 영향)는 표준 중성 지질 DSPC과 비교할 때, DPhyPE의 혼입이 더 높은 발현을 가져왔음을 보여준다 - 즉, LNP는 상이한 인지질 (DPhyPE, DSPC, DPhyPE+DSPC (1+1))을 이용하여 생성되었다. A: 지질 1 (지질 화합물 C1) 및 GN01 LNP를 PpLuc mRNA에 제제하고, HeLa 세포로 형질감염시켰다. 형질감염 효율은 형질감염 후 24 h에 RLU 강도를 측정함으로써 분석되었다. B: GN01 및 상이한 인지질을 포함하는 LNP를 포함하는 지질 화합물 C1의 TNS (염료 2-p-톨루이디닐나프탈렌-6-설포네이트) 형광 을 통한 양성자화 정도의 측정. 점선 = GN01; 파선 = DPhyPE; 실선 = DSPC, 파선 오른쪽의 계단 모양의 선 = DSPC/DPhyPE (자세한 내용은 실시예 6에서 볼 수 있음).
도 15b (PEG 성분의 변형 및 본 발명의 조성물에 대한 영향)는 더 짧은 알킬 사슬을 갖는 폴리머 컨쥬게이트 지질(polymer conjugated lipids) (C8 테일, C8-세라마이드-PEG, 도면에서 Cer8로 표시됨)을 포함하는 조성물이 더 긴 알킬 사슬을 포함하는 폴리머 컨쥬게이트 지질 (C14 = C14 DMG-PEG = 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000 (DMG-PEG 2000))을 포함하는 조성물보다 효율적이었음을 보여준다. HepG2 세포에서 PpLuc의 발현. 채워진 막대는 1시간 후 결과를 보여주고, 열린 막대는 4시간 후 결과를 보여준다 (자세한 내용은 실시예 7에서 볼 수 있음).
도 16 (단일 i.v. 후 항광견병 mAb 발현 GN01)은 단일 i.v. 주사 후 GN01에서 제제화된 항광견병 단일 클론 항체의 발현을 보여준다 - 명백한 바와 같이, a 매우 강한 항광견병 mAb 발현이 i.v. 주사 후 6 h 및 24 h 후에 검출될 수 있었다 (자세한 내용은 실시예 8에서 볼 수 있음).
도 17a 및 도 17b (생체 내 GN01 및 GN02의 면역원성-T 세포 반응-VNT 분석) - 도 17a의 A는 5 ㎍ GN01- 및 GN02-LNP-제제화된 RABV-G-mRNA에 의한 단일 i.m. 면역화가 프라임 백신 접종 후 day 35에 모든 동물에서 0.5 IU/ml의 보호 역가(보호 역가)보다 훨씬 높은 매우 강력한 VNT를 유도하였음을 보여준다. 도 17a의 B 및 도 17b의 C는 본 발명의 GN01 및 GN02-LNP-제제화된 RABV-G mRNA 백신이 백신 접종 후 특이적 세포 반응을 유도하였음을 나타내며, 이는 대조군 LNP 백신접종 동물에서 관찰되지 않은 효과이다. RABV-G-특이적 CD4+ T 세포 (B)는 mRNA 제제 GN01 및 GN02 모두에서 관찰되었다. 이는, RABV-G-특이적 CD8+ T에서도 마찬가지였다 (C) (자세한 내용은 실시예 9에서 볼 수 있음).
도 18 (모노토프 백신 접근에 대한 GN01)은 GN01 제제화된 RNA의 높은 반응원성이 관찰될 수 있었음을 보여준다; 비장 세포 수는 GN01 LNP를 통하여 PADRE를 함유하는 모노토프 구성체로 백신 접종함으로써 증가된다 (도 18A). 모노토프 구성체는 GN01 제제 및 피부 내 적용과 조합하여, 매우 강력한 CD8 T 세포 반응을 일으켰다 (도 18B, 18C 및 18D) (자세한 내용은 실시예 10에서 볼 수 있음).
도 19 (인플루엔자/플루 백신 접종에 대한 GN01 - H3N2)는 10 ㎍ GN01 LNP-제제화된 HA-mRNA에 의한 단일 i.m. 면역화가 프라임 백신 접종 후 day 21에 모든 동물에서 40의 보호 역가보다 훨씬 높은 보호 HI 역가를 유도하였으며, 10 ㎍ GN01 LNP-제제화된 HA-mRNA에 의한 부스트가 체액 면역 반응의 다중 증가를 유도하였음을 보여준다 (자세한 내용은 실시예 11에서 볼 수 있음).
도 20 (송아지 동물 모델에서 테스트된 광견병에 대한 GN01)은 GN01-제제화된 RABV-G-코딩 mRNA를 사용한 송아지의 근육 내 백신 접종이 프라임 백신 접종 후 14일 후에 단지 30 ㎍ mRNA의 용량만으로 중화 항체를 매우 강하게 유도하였음을 보여준다 (0.5 IU/ml의 WHO 표준은 파선으로 표시됨; 열린 막대 = Rabisin 대조군, 닫힌 막대 = GN01 제제화된 mRNA) (자세한 내용은 실시예 12에서 볼 수 있음).
도 21a (생체 내 말라리아 백신 접종에 대한 GN01 - 종말점 역가)은 ELIS분석을 사용하여, GN01 제제화된 CSP를 코딩하는 mRNA 말라리아 백신이 마우스에서 매우 강한 체액 면역 반응을 유도하였음을 보여준다 (A - 코팅: [NANP]7 펩타이드, 프라임 후 day 21 및 day 35에 IgG1 및 IgG2a 종말점 역가; B - 코팅 C-말단 펩타이드, 프라임 후 day 21 및 day 35에 IgG1 및 IgG2a 종말점 역가; 그룹 1: CSP 백신을 갖는 GN01-LNP; 그룹 2: 관련 없는 mRNA를 갖는 GN01-LNP) (자세한 내용은 실시예 13에서 볼 수 있음).
도 21b (생체 내 말라리아 백신 접종에 대한 GN01 - ICS)는 세포 내 사이토카인 염색 분석을 이용하여(백신 접종 후 day 35에), GN01 제제화된 CSP를 코딩하는 mRNA 말라리아 백신이 마우스에서 세포 면역 반응을 유도하였음을 보여준다(CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포 반응). 그룹 1: CSP 백신을 갖는 GN01-LNP; 그룹 2: 관련 없는 mRNA를 갖는 GN01-LNP (자세한 내용은 실시예 13에서 볼 수 있음).
도 22 (FGF21의 생체 내 발현에 대한 GN01)는 본 발명의 LNP에서 제제화된 FGF21 mRNA가 i.v. 주사를 통하여 마우스에 0.25 mg/kg의 낮은 용량을 투여한 후 높은 FGF21 농도를 발생시켰음을 보여준다 (자세한 내용은 실시예 14에서 볼 수 있음).
도 23 (FGF21의 생체 내 발현에 대한 GN01)은 본 발명의 LNP에서 제제화된 FGF21 mRNA가 i.v. 주사를 통하여 1 mg/kg의 높은 용량을 투여한 후 매우 높은 FGF21 농도를 발생시켰음을 보여준다 (자세한 내용은 실시예 14에서 볼 수 있음).
도 24a 및 도 24b (HEXA 지질의 화학적 구조)는 본 명세서에 기재된 본 발명의 HEXA 지질 화합물, 즉, 지질 화합물 C24 (도 24a) HEXA-C5DE-역전 PipSS, 및 지질 화합물 C25 (도 24b) HEXA-C5DE-Pip-C3 티오에테르의 구조를 나타낸다 (자세한 내용은 실시예 20.1에서 볼 수 있음).
도 25a 및 도 25b (HEAD 지질의 구조)는 본 명세서에 기재된 본 발명의 HEAD 지질 화합물, 즉, 지질 화합물 티오에테르 (도 25a), 및 지질 화합물 C3SS (도 25b)의 구조를 나타낸다 (자세한 내용은 실시예 20.2에서 볼 수 있음).
도 26 (생체 내-T 세포 반응-VNT 분석에서 C2-포함 LNP의 면역원성)은 5 ㎍ LNP (C2를 포함)-제제화된 RABV-G-mRNA에 의한 단일 i.m. 면역화가 프라임 백신 접종 후 day 21에 모든 동물에서 0.5 IU/ml의 보호 역가보다 훨씬 높은 매우 강력한 VNT를 유도하였음을 보여준다. 자세한 내용은 실시예 21에서 찾아볼 수 있다.
도 27a 내지 도 27c (생체 내-T 세포 반응-VNT 분석에서 상이한 양이온성 지질을 포함하는 LNP의 면역원성) - 도 27a는 5 ㎍ LNP-제제화된 RABV-G-mRNA에 의한 단일 i.m. 면역화가 프라임 백신 접종 후 day 21에 모든 동물에서 0.5IU/ml의 보호 역가보다 훨씬 높은 매우 강력한 VNT를 유도하였음을 보여준다. LNP는 실시예 21에 나타내어진 본 발명에 따른 상이한 양이온성 지질로 제제화되었다. 도 27b 및 도 27c는 본 발명의 LNP-제제화된 RABV-G mRNA 백신이 재자극된 비장 세포 대 자극되지 않은 비장 세포에서 백신 접종 후 특이적 세포 반응을 유도하였음을 보여준다. RABV-G-특이적 CD4+ T 세포 (도 27b) 및 RABV-G-특이적 CD8+ T 세포 (도 27c)는 (ⅰ) 재자극된 및 (ⅱ) 자극되지 않은 설정에 대하여 표시된다. 자세한 내용은 실시예 21에서 볼 수 있다.
도 28 (생체 내-T 세포 반응-VNT 분석에서 티오에테르를 포함하는 LNP의 면역원성)은 1 ㎍ LNP (티오에테르 포함)-제제화된 RABV-G-mRNA에 위한 단일 i.m. 면역화가 프라임 백신 접종 후 day 21에 모든 동물에서 0.5IU/ml의 보호 역가보다 훨씬 높은 매우 강력한 VNT를 유도하였음을 보여준다. 자세한 내용은 실시예 21에서찾을 수 있다.
도 29 (생체 내 말라리아 백신 접종에 대한 GN02 유사 LNP - ICS)는 세포 내 사이토카인 염색 분석을 사용하여(백신 접종 후 day 35에), GN02 유사 제제화된 CSP를 코딩하는 mRNA 말라리아 백신이 마우스에서 세포 면역 반응을 유도하였음을 보여준다 (CD4+ T 세포 반응). RABV-G-특이적 CD4+ T 세포는 (ⅰ) 재자극된, 및 (ⅱ) 자극되지 않은 설정에 대해 나타내어진다. 자세한 내용은 실시예 22에서 찾을 수 있다.
도 30 (생체 내 말라리아 백신 접종에 대한 GN02 유사 LNP - ICS)은 세포 내 사이토카인 염색 분석을 사용하여(백신 접종 후 day 35에), GN02 유사 제제화된 CSP를 코딩하는 mRNA 말라리아 백신이 마우스에서 세포 면역 반응을 유도하였음을 보여준다 (CD8+ T 세포 반응). RABV-G-특이적 CD8+ T 세포는 (ⅰ) 재자극된, 및 (ⅱ) 자극되지 않은 설정에 대해 나타내어진다. 자세한 내용은 실시예 22에서 찾을 수 있다.
도 31 (생체 내 말라리아 백신 접종에 대한 GN02 유사 LNP - IgGtotal 역가)은 ELIS분석을 사용하여(코팅: [NANP]7 펩타이드, 프라임 접종 후 day 35에 IgGtotal 종말점 역가), GN02 유사 제제화된 CSP를 코딩하는 mRNA 말라리아 백신이 마우스에서 매우 강한 체액 면역 반응을 유도하였음을 보여준다. 자세한 내용은 실시예 22에서 찾을 수 있다.
도 32 (생체 내 말라리아 백신 접종에 대한 본 발명의 상이한 양이온성 지질을 갖는 LNP - ICS)는 세포 내 사이토카인 염색 분석을 사용하여(백신 접종 후 day 35에), LNP 제제화된 CSP를 코딩하는 mRNA 말라리아 백신이 마우스에서 세포 면역 반응을 유도하였음을 보여준다 (CD4+ T 세포 반응은 (ⅰ) 재자극된, 및 (ⅱ) 자극되지 않은 설정에 대하여 나타내어짐). 자세한 내용은 실시예 22에서 찾아질 수 있다.
도 33 (생체 내 말라리아 백신 접종에 대한 본 발명의 상이한 양이온성 지질을 갖는 LNP - ICS)은 세포 내 사이토카인 염색 분석을 사용하여(백신 접종 후 day 35에), LNP 제제화된 CSP를 코딩하는 mRNA 말라리아 백신이 마우스에서 세포 면역 반응을 유도하였음을 보여준다 (CD8+ T 세포 반응은 (ⅰ) 재자극된, 및 (ⅱ) 자극되지 않은 설정에 대하여 나타내어짐). 자세한 내용은 실시예 22에서 찾을 수 있다.
도 34 (생체 내 말라리아 백신 접종에 대한 본 발명의 상이한 양이온성 지질을 갖는 LNP - IgGtotal 역가)는 ELIS분석을 사용하여(코팅: [NANP]7 펩타이드, 프라임 접종 후 day 35에 IgGtotal 종말점 역가), LNP 제제화된 CSP를 코딩하는 mRNA 말라리아 백신이 마우스에서 매우 강한 체액 면역 반응을 유도하였음을 보여준다. 자세한 내용은 실시예 22에서 찾을 수 있다.
도 35 (생체 내 말라리아 백신 접종에 대한 본 발명의 C26-지질을 갖는 LNP - IgG1 역가)는 ELIS분석을 사용하여(코팅: [NANP]7 펩타이드, 프라임 접종 후 day 35에 IgGtotal 종말점 역가), LNP 제제화된 CSP를 코딩하는 mRNA 말라리아 백신이 마우스에서 매우 강한 체액 면역 반응을 유도하였음을 보여준다. 자세한 내용은 실시예 22에서 찾을 수 있다.
본 발명은 신규한 양이온성 지질(cationic lipids) 및/또는 지질 나노입자(lipid nanoparticles, LNP)의 사용이 mRNA와 같은 핵산을 인간 개체와 같은 살아 있는 유기체로 전달하는데 매우 효과적이라는 본 발명자들의 놀라운 발견에 기초한다. 특히, 그러한 핵산의 세포 내 전달이 향상된다. 이는, 본 발명자들이 예를 들어, 항원성 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 mRNA 화합물을 전달하고, 매우 낮은 투여량에서 항원 특이적 면역 반응을 매우 효율적으로 유도하는 향상된 백신을 생성할 수 있게 해주었다. 본 발명에 의해 달성된 추가적인 이점은 매우 놀랍게도 본 발명의 측면 및 실시형태에 따르면, 상당히 증진되고, 많은 측면에서 향상된 항원 생성 및 중화 능력을 갖는 기능적 항체 생성을 포함하는 상승적인 면역 반응에 이르는 생체 내 mRNA 백신 전달을 위한 제제의 부류를 발견했다는 것이다. 이러한 결과는 지질 기반 제제의 다른 부류에 사용되는 mRNA 용량과 비교하여 현저하게 낮은 용량의 mRNA가 투여되는 경우에도 달성될 수 있다. 본 발명의 제제는 예방 및 치료제로서 기능성 mRNA 백신의 효능을 확립하는데 충분한 유의미한 예측하지 못한 생체 내 면역 반응을 입증하였다. 일반적으로, 자가 복제(self-replicating) RNA 백신은 면역원성 반응(immunogenic response)을 생성하기에 충분한 RNA을 전달하기 위해 바이러스 복제 경로에 의존한다. 본 발명의 제제는 강한 면역 반응을 일으키기에 충분한 단백질을 생성하기 위하여 바이러스 복제를 필요로 하지 않는다. 따라서, 바람직하게, 본 발명의 mRNA는 자가 복제 RNA가 아니며, 바이러스 복제에 필요한 성분을 포함하지 않는다.
지질 조성물
제1 측면에서, 본 발명은 하기 본 명세서에 기재된 바와 같은 양이온성 지질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 그 자체로 양이온성 지질에 대해 개시된 모든 옵션 및 선호도는 본 발명의 이러한 측면에 대한 조성물에 적용가능하다. 다르게 말하면, 양이온성 지질, 특히 바람직한 양이온성 지질의 구체적으로 개시된 실시형태는 본 발명에 따른 조성물, 즉 본 명세서에 기재된 하나의 특정 섹션에 따른 양이온성 지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물의 특정 바람직한 실시형태를 정의하는 것으로도 이해되어야 한다. 이 조성물은 하기에 더 설명되는 추가적인 활성 및/또는 비활성 부형제를 포함할 수 있다. 특정 일 실시형태에서, 양이온성 지질에 더하여, 조성물은 (a) 스테로이드; (b) 중성 지질; 및 (c) 폴리머 컨쥬게이트 지질, 바람직하게, 페길화 지질로 이루어진 군으로부터 선택되는 일 이상을 지질을 포함한다.
양이온성 지질
양이온성 지질은 바람직하게는 양이온화될 수 있으며, 즉, pH가 지질의 이온화가능한 기의 pKa 보다 낮아짐에 따라 양성자화되지만, 더 높은 pH 값에서는 점진적으로 더 중성이다. 양전하를 띤 경우, 지질은 음전하를 띤 핵산과 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, 양이온성 지질은 pH 감소에 대해 양전하를 띠는 즈비터 이온성 지질을 포함한다.
일 측면에서, 본 발명은 화학식 (Ⅰ):
화학식 (Ⅰ):
[화학식 Ⅰ]
Ra-A-Rb
에 따른 화합물로 정의되는 신규한 양이온성 지질을 제공하며,
상기 식에서,
Ra는
Figure pct00012
,
Figure pct00013
, 또는
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4로부터 선택되며;
Rb는
Figure pct00014
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4, 또는
-R1-N(CH3)2로부터 선택되며;
A는 -S-, -S-S-, -NH-C(O)-, -NH-C(O)O-, -NH-C(O)-NH-, -S-C(O)-N(H)-, -C(O)O-, 또는 -O-P(O)(OH)-O-이며;
R1은 선택적으로 치환된 에탄디일, 프로판디일, 부탄디일, 또는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 비분지형 알칸디일이며;
R2는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
R3는 선택적이며, 존재하는 경우, -R5-C(O)-O-, -R5-O-C(O)-, -R5-C(O)-NH-, -R5-OC(O)-NH-, 또는 R5-NH-C(O)O-이며;
R4는 12 내지 36개의 탄소 원자를 갖는 친유성 치환기이며;
R5는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
X는 탄소 또는 질소 원자이며;
여기서 모든 선택은 서로 독립적이며,
선택적으로, R1, R2 및 R5가 모두 선형 비치환 에탄디일이고, A가 -S-S-이고, Ra 및 Rb가 동일한 경우, R4는
Figure pct00015
이 아니다.
다른 측면에서, 본 발명은 살아 있는 세포로의 핵산 전달에 유용한 신규한 양이온성 지질에 관한 것이다. 양이온성 지질은 화학식 (Ⅰ):
[화학식 Ⅰ]
Ra-A-Rb
에 따른 화합물이며,
상기 식에서,
Ra는
Figure pct00016
,
Figure pct00017
,
Figure pct00018
,
Figure pct00019
,
또는
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4로부터 선택되며;
Rb는
Figure pct00020
,
Figure pct00021
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4, 또는
-R1-N(CH3)2로부터 선택되며;
A는 -S-, -S-S-, -S-C(O)- -NH-C(O)-, -NH-C(O)O-, -NH-C(O)-NH-, -S-C(O)-N(H)-, -C(O)O-, 또는 -O-P(O)(OH)-O-이며;
R1은 선택적으로 치환된 에탄디일, 프로판디일, 부탄디일, 또는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 비분지형 알칸디일이며;
R2는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
R3는 선택적이며, 존재하는 경우, -R5-C(O)-O-, 또는 -R5-O-C(O)-, -R5-C(O)-NH-, -R5-OC(O)-NH-, 또는 R5-NH-C(O)O-이며;
R4는 12 내지 36개의 탄소 원자를 갖는 친유성 치환기이며;
R5는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
X는 탄소 또는 질소 원자이며;
여기서 모든 선택은 서로 독립적이며,
선택적으로, R1, R2 및 R5가 모두 에탄디일이고, A가 -S-S-이고, Ra 및 Rb가 동일한 경우, R4는
Figure pct00022
이 아니다.
또 다른 측면, 측면 A에서, 본 발명은 화학식 (Ⅰ)에 따른 화합물로 정의되는 신규한 양이온성 지질, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 프로드러그 또는 입체이성질체를 제공한다:
[화학식 Ⅰ]
Ra-A-Rb
상기 식에서,
Ra는
Figure pct00023
,
Figure pct00024
,
Figure pct00025
,
Figure pct00026
,
Figure pct00027
,
Figure pct00028
, 또는
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4로부터 선택되며;
Rb는
Figure pct00029
,
Figure pct00030
,
Figure pct00031
,
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4, 또는 -R1-N(CH3)2로부터 선택되며;
A는 -S-, -S-S-, -NH-C(O)-, -NH-C(O)O-, -NH-C(O)-NH-, -S-C(O)-N(H)-, -C(O)O-, 또는 -O-P(O)(OH)-O-이며;
R1은 에탄디일, 프로판디일, 부탄디일, 또는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 비분지형 알칸디일이며, 여기에서, 각각의 치환가능한 탄소 원자는 비치환되거나 또는 일 이상의 C1-C4 알킬, C1-C4 알케닐렌, C3-C8 사이클로알킬렌, 또는 C3-C8 사이클로알케닐렌으로 치환되며;
R2는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
R3는 선택적이며, 존재하는 경우, -R5-C(O)-O-, -R5-O-C(O)-, -R5-C(O)-NH-, -R5-OC(O)-NH-, 또는 R5-NH-C(O)O-이며;
R4는 12 내지 36개의 탄소 원자를 갖는 친유성 치환기이며, 여기에서, 12 내지 36개의 탄소 원자를 갖는 친유성 치환기는 12 내지 25개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬 또는 알케닐이거나, 또는 알파-토코페롤로부터 유래되며;
R5는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
X는 수소 원자에 결합된 탄소 원자(CH) 또는 질소 원자이며;
여기서 모든 선택은 서로 독립적이며;
선택적으로 (ⅰ) R3가 -R5-C(O)-O-로 존재하고, (ⅱ) R1 및 R2가 선형 비치환된 에탄디일이며, (ⅲ) R5가 선형 비치환된 에탄디일, 선형 비치환된 프로판디일 또는 선형 비치환된 부탄디일이며, (ⅳ) A가 -S-S-이고, (ⅴ) Ra 및 Rb가 동일한 경우, R4는
Figure pct00032
가 아니며,
또한, (ⅰ) R3가 부재이고, (ⅱ) R1 및 R2가 선형 비치환된 에탄디일이며, (ⅲ) A가 -S-S-이고, (ⅴ) Ra 및 Rb가 동일한 경우, R4는
Figure pct00033
및
Figure pct00034
가 아니거나,
또는, 상기 단서에 대한 대안으로서, 선택적으로 양이온성 지질이
Figure pct00035
,
Figure pct00036
,
Figure pct00037
,
Figure pct00038
,
Figure pct00039
,
Figure pct00040
, 및
Figure pct00041
로 이루어진 군으로부터 선택되는 양이온성 지질이 아니다.
신규한 양이온성 지질에서, 분해성 / 생분해성 모이어티 A는 동일하거나 상이할 수 있는 2개의 구조 Ra 및 Rb를 연결한다. Ra 및 Rb의 각각은 3급 질소 원자를 포함하는 적어도 하나의 염기성, 즉, 양이온성 모이어티를 포함한다. Ra 및 Rb의 적어도 하나는 실질적으로 친유성인 테일 구조 및 적어도 하나의 에스테르기를 갖는다.
분해성 / 생분해성 모이어티 A는 하기 기능기로부터 선택될 수 있다: -S-, -S-S-, -NH-C(O)-, -NH-C(O)O-, -NH-C(O)-NH-, -S-C(O)-N(H)-, -C(O)O-, 또는 -O-P(O)(OH)-O-. 바람직한 일 실시형태에서, A는 -S-, -S-S-, 또는 -S-C(O)-N(H)-와 같은 일 이상의 황 원자를 함유하는 모이어티 또는 기이다. 다른 바람직한 실시형태에서, A는 디설파이드기(-S-S-)이며, 여기에서, 양이온성 지질은 Ra-S-S-Rb로 나타내어질 수 있으며, Ra 및 Rb는 상기 정의된 바와 같이 선택될 수 있다. 또다른 바람직한 실시형태에서, 특히, 상기 측면 A의 또다른 바람직한 실시형태에서, A는 -S-이며, 여기에서 양이온성 지질은 Ra-S-Rb로 나타내어질 수 있으며, Ra 및 Rb는 상기 정의된 바와 같이 선택될 수 있다.
이론에 얽매이지 않고, 본 발명자들은 현재 모이어티 A의 분해성이 새로운 지질의 현저한 생물학적 효과에 중요한 역할을 할 수 있다고 믿고 있다. 예를 들어, A가 디설파이드 모이어티이고, 지질이 화물(cargo)로서 핵산 화합물이 로딩된 리포솜 또는 지질 나노입자(LNP)를 형성하기 위하여 하기에 상세하게 설명되는 바와 같이 다른 부형제와 함께 사용되는 경우, 그러한 리포솜 또는 LNP는 세포 내 이입(endocytosis)을 통해 세포에 효과적으로 흡수될 것이다. 세포 내 이입 소포(endocytotic vesicle) 내에서, 양이온성 지질의 디설파이드기는 2개의 티올 모이어티로 환원될 수 있으며(아마도 글루타티온의 존재 하에), 이는 동시에 양이온성 지질 분자를 2개의 더 작은 양이온성 종으로 절단되도록 한다. 잠재적으로, 세포 내 높은 농도의 티올은 티오에스테르화(thioesterification)와 같은 지질의 추가적인 분해를 유발할 수도 있다.
Ra 및 Rb는 선택적으로 서로 상이할 수 있으므로, 이들은 독립적으로 선택될 수 있다. 언급된 바와 같이, Ra는
Figure pct00042
,
Figure pct00043
,
(상기 식에서, 바람직하게, X는 CH임), 또는
또는 -R1-N(H)-C(O)-R3-R4로부터 선택될 수 있으며;
Rb는
Figure pct00044
(상기 식에서, 바람직하게, X는 CH임)
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4, 또는 -R1-N(CH3)2로부터 선택될 수 있다.
또한, 언급된 바와 같이, Ra는
Figure pct00045
,
Figure pct00046
,
Figure pct00047
,
Figure pct00048
,
(상기 식에서, 바람직하게, X는 CH임)
로부터 선택될 수 있으며,
Rb는
Figure pct00049
, 또는
Figure pct00050
(상기 식에서, 바람직하게, X는 CH임)
로부터 선택될 수 있다.
바람직한 일 실시형태에서, Ra 및 Rb의 적어도 하나는 각각 R2와 A 또는 R1 사이에, 피페리딘- 또는 피페라진-유래 6원 고리 구조를 포함한다. 이는, 모이어티 A 부근에 존재하고 위치하는 적어도 하나의 3급 질소 원자가 적어도 하나의 스페이서 (R2) 및 에스테르기에 의해 분리되는 것을 의미한다. 에스테르기(또는 기, R3가 존재하는 경우)의 잠재적 이점은 가수분해적으로 불안정한 에스테르 결합(들)에 의해 제공되는 생리학적 환경, 예를 들어, 세포 내 환경에서 추가적으로 향상된 지질의 분해성과 관련이 있다.
추가적인 실시형태에서, Ra 및 Rb는 모두 피페리딘- 또는 피페라진-유래 6원 고리 구조를 포함한다. 또한, Ra 및 Rb가 모두
Figure pct00051
(상기 식에서, 바람직하게, X는 CH임)
인 양이온성 지질이 바람직하며, Ra 및 Rb는 독립적으로 선택되거나, 또는 대안으로, Ra 및 Rb는 동일하다.
언급된 바와 같이, R1은 선택적으로 치환된 에탄디일, 프로판디일, 부탄디일, 또는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 비분지형 알칸디일이다. 프로판디일은 바람직하게 일 이상의 수소 원자가 선택적으로 치환된 n-프로판디일, 즉, -CH2-CH2-CH2-이다. 부탄디일은 바람직하게 일 이상의 수소 원자가 선택적으로 치환된 n-부탄디일, 즉, -CH2-CH2-CH2-CH2-이다. 바람직하게, 그러나, 에탄디일, 프로판디일 또는 부탄디일의 하나 이하의 수소 원자가 치환된다. 일부 실시형태에서, Ra 의 R1 치환기 및 Rb의 R1 치환기는 동일하거나 상이하다. 일부 실시형태에서, Ra 의 R1 치환기 및 Rb의 R1 치환기는 모두 에탄디일이다. 다른 실시형태에서, Ra 의 R1 치환기 및 Rb의 R1 치환기는 모두 프로판디일이다. 다른 실시형태에서, Ra 의 R1 치환기 및 Rb의 R1 치환기는 모두 부탄디일이다. 일부 실시형태에서, Ra 의 R1 치환기는 에탄디일이고, Rb의 R1 치환기는 프로판디일이다. 다른 실시형태에서, Ra 의 R1 치환기는 프로판디일이고, Rb의 R1 치환기는 에탄디일이다. 일부 실시형태에서, Ra 의 R1 치환기는 부탄디일이고, Rb의 R1 치환기는 프로판디일이다. 다른 실시형태에서, Ra 의 R1 치환기는 부탄디일이고, Rb의 R1 치환기는 에탄디일이다. 특정 다른 실시형태에서, 특히 R1에 관한 경우, 용어 "선택적으로 치환된"은 각각의 치환가능한 탄소 원자가 일 이상의 C1-C4 알킬, C1-C4 알케닐렌, C3-C8 사이클로알킬렌, 또는 C3-C8 사이클로알케닐렌으로 독립적으로 치환될 수 있음을 나타낸다.
유사하게, 일부 실시형태에서, Ra 의 R2 치환기 및 Rb의 R2 치환기는 동일하거나 상이하다. 일부 실시형태에서, Ra 의 R2 치환기 및 Rb의 R2 치환기는 모두 에탄디일, 프로판디일, 부탄디일, 펜탄디일, 헥산디일, 헵탄디일, 또는 옥탄디일이다. 다른 실시형태에서, Ra 의 R2 치환기는 프로판디일이고, Rb의 R2 치환기는 헵탄디일이다. 다른 실시형태에서, Ra 의 R2 치환기는 헵탄디일이고, Rb의 R2 치환기는 프로판디일이다. 일부 실시형태에서, 특히 상기 측면 A의 일부 실시형태에서, Ra 의 R2 치환기 및 Rb의 R2 치환기는 모두 에탄디일이다.
또한, R3가 Ra 및 Rb 모두에 존재하는 일부 실시형태에서, Ra 의 R5 치환기 및 Rb의 R5 치환기는 동일하거나 상이하다. 일부 실시형태에서, Ra 의 R5 치환기 및 Rb의 R5 치환기는 모두 메탄디일, 에탄디일, 프로판디일, 부탄디일, 펜탄디일, 또는 헥산디일이다. 다른 실시형태에서, Ra 의 R5 치환기는 에탄디일이고, Rb의 R5 치환기는 헥산디일이다. 다른 실시형태에서, Ra 의 R5 치환기는 헥산디일이고, Rb의 R5 치환기는 에탄디일이다. R3가 Ra 및 Rb 모두에 존재하는 일부 실시형태에서, 특히 상기 측면 A의 일부 실시형태에서, Ra 의 R5 치환기 및 Rb의 R5 치환기는 모두 에탄디일이다.
치환기는 임의의 적합한 치환기, 즉, 에스테르기 또는 아미드기와 같은 추가적인 기능기를 선택적으로 포함할 수 있는 임의의 선형 또는 분지형 알킬, 아릴, 헤테로알킬, 헤테로방향족 구조일 수 있다.
특히, -R1-N(H)-C(O)-R3-R4가 Ra 및/또는 Rb에 대해 선택되는 경우, R1은 치환된 에탄디일, 프로판디일, 부탄디일, 또는 치환된 프로판디일과 같은 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 비분지형 알칸디일인 것이 바람직하다. 그 자체는 아미노기와 같은 양이온성 모이어티를 포함하지 않는 -R1-N(H)-C(O)-R3-R4 가 사용되는 경우, R1의 치환기는 그러한 아미노기를 포함하는 것이 바람직하며, 선택적으로 그러한 아미노기는 피페리딘 또는 피페라진으로부터 유래된 6원 고리 구조와 같은 사이클릭 구조의 일부일 수 있다. 선택적으로, 양이온성 질소 원자를 특징으로 하는 고리 구조는 에스테르기와 같은 분해성 기를 통하여 에탄디일 또는 프로판디일에 연결된다.
일 실시형태에서, Ra는
Figure pct00052
또는
Figure pct00053
(상기 식에서, 바람직하게, X는 CH임)
이며, 및/또는 Rb는
Figure pct00054
(상기 식에서, 바람직하게, X는 CH임)
이며,
R2는 각각의 염기성 피페리딘- 또는 피페라진-유래 고리 구조와 에스테르기 사이에서 링커 또는 스페이서로 작용한다. 언급된 바와 같이, R2는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일로 정의된다. R2는 선형 또는 분지형 형태일 수 있으며, 그렇지 않으면(즉, 임의의 분지형 제외), 바람직하게는 비치환된다. 일 실시형태에서, R2는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 탄소 원자를 갖는 선형 비치환 알칸디일이다. 다른 실시형태에서, R2는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 비치환 알칸디일이다. 추가적인 바람직한 실시형태에서, R2는 선형 비치환된 에탄디일 또는 프로판디일이다. 예를 들어, Ra 및 Rb는 모두
Figure pct00055
(상기 식에서, 바람직하게, X는 CH임)
일 수 있으며, R2는 에탄디일 또는 프로판디일과 같이, 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 비치환 알칸디일로부터 선택된다.
추가적인 실시형태에서, Ra는
Figure pct00056
,
Figure pct00057
,
Figure pct00058
, 또는
Figure pct00059
(상기 식에서, 바람직하게, X는 CH임)
이며, 및/또는 Rb는
Figure pct00060
또는
Figure pct00061
(상기 식에서, 바람직하게, X는 CH임)
이며, R2는 각각의 염기성 피페리딘- 또는 피페라진-유래 고리 구조와 에스테르기 사이에서 링커 또는 스페이서로 작용한다. 언급된 바와 같이, R2는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일로 정의된다. R2는 선형 또는 분지형 형태일 수 있으며, 그렇지 않으면(즉, 임의의 분지형 제외), 바람직하게 비치환된다. 일 실시형태에서, R2는 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 탄소 원자를 갖는 선형 비치환 알칸디일이다. 다른 실시형태에서, R2는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 비치환 알칸디일. 추가적인 바람직한 실시형태에서, R2는 선형 비치환된 에탄디일 또는 프로판디일이다. 예를 들어, Ra 및 Rb는 모두
Figure pct00062
(상기 식에서, 바람직하게, X는 CH임)
일 수 있으며, R2는 에탄디일 또는 프로판디일과 같이, 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 선형 비치환 알칸디일로부터 선택된다.
선택적 구조 R3는 생리학적 조건, 예를 들어, 세포 내 조건 하에서, 양이온성 지질의 더 작은 분자 종으로의 분해성을 더 향상시킬 수 있는 에스테르기를 포함한다. 상기 정의된 바와 같이, R3는 존재하는 경우, 특히 -R5-C(O)-O- 또는 -R5-O-C(O)-로 정의되며, 여기에서, R5는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일로 이루어지는 스페이서일 수 있다. 다르게 말하면, 에스테르기는 어느 한 배향을 가질 수 있다. 바람직하게, R5는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 탄소 원자를 갖는 비치환된 선형 알칸디일이다. 다른 바람직한 실시형태에서, R3가 존재하고, R5는 2 또는 3개의 탄소 원자, 또는 3 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 비치환된 선형 알칸디일일 수 있다.
R4는 12 내지 36개의 탄소 원자를 갖는 친유성 치환기로 정의된다. Ra 및 선택적으로 Rb (Rb가 -R1-N(CH3)2가 아닌 경우)의 "테일(tail)" 말단은 일반적으로 분자가 생물학적 막을 통과할 수 있는데 필요한 친유성 정도를 제공하는 것으로 믿어진다. 따라서, R4는 원칙적으로 실질적으로 친유성인 임의의 구조일 수 있다. 예를 들어, 탄화수소 구조는 친유성이다. 일 실시형태에서, R4는, 그의 경우 중 적어도 하나에서, 탄소 및 수소 원자만으로 이루어질 수 있다. 바람직한 일 실시형태에서, R4는 바람직하게는 12 내지 25개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬 또는 알케닐을 나타낸다. 분지형 알킬 또는 알케닐은 2, 3, 4개 또는 그 이상의 메틸 측쇄와 같은 복수의 측쇄를 선택적으로 가질 수 있다. 다른 실시형태에서, R4는 예를 들어, 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 단일 알킬 또는 알케닐 측쇄를 포함하는 알킬 또는 알케닐일 수 있다. 예를 들어, R4는 1-n-헥실-n-노닐 (또는 7-n-펜타데실), 또는 2-n-헥실-n-데실일 수 있다. 다른 실시형태에서, 친유성 치환기는 선택적으로 O, S, 또는 N과 같은 일 이상의 헤테로원자를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 친유성 치환기는 O, S, 또는 N과 같은 일 이상의 헤테로 원자를 선택적으로 포함할 수 있는 일 이상의 포화, 불포화, 또는 방향족 고리 구조를 포함할 수 있다.
R4는 또한 주로 친유성 특성이 유지되는 한, 산소 원자와 같은 소수의 헤테로 원자도 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, R4는 일 이상의 산소 원자를 포함하고, 다른 헤테로 원자는 포함하지 않는다. R4는 또한 선택적으로 일 이상의 산소 원자를 포함하는 방향족 또는 지방족 고리 구조와 같은 사이클릭 구조를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 헤테로 원자 및/또는 사이클릭 구조가 "테일"의 말단을 향하기 보다는 선택적 R3 구조를 향하여 위치하는 것이 바람직하다. 일 실시형태에서, R4는 토코페롤(tocopherol) 또는 토코트레이놀(tocotreinol)로부터 유래되는 친유성 기이다. 일 실시형태에서, R4는 알파-토코페롤로부터 유래되는 친유성 기, 특히
Figure pct00063
(상기 식에서, 특히 R1, R2 및 R5의 모두가 다 선형 비치환된 에탄디일은 아닌 경우, A가 -S-S-이고, Ra 및 Rb는 동일함)
이다.
본 명세서에 언급되는 "토코페롤 또는 토코트레이놀로부터 유래되는 친유성 기"는 토코페롤 및 토코트레이놀의 유도체, 특히 하기 구조식 1에 나타내어진 구조를 갖는 유도체, 즉, 알파-토코페롤, 베타-토코페롤, 감마-토코페롤, 델타-토코페롤, 알파-토코트레이놀, 베타-토코트레이놀, 감마-토코트레이놀 및 델타-토코트레이놀로부터 유래되는 유도체를 포함한다.
Figure pct00064
구조식 1: 토코페롤의 유도체는 포화 피틸(phytyl) 사슬을 갖는 반면, 토코트레이놀의 유도체는 폴리-불포화 피틸 사슬을 갖는다. 토코페롤 및 토코트레이놀의 유도체 양자의 경우 모두, 동형 단백질(isoforms)은 CH3 및 H로부터 선택되는 R1 및 R2에 의해 정의된다. 따라서, 나타내어진 바와 같이, 예를 들어, R1이 CH3이고, R2가 CH3인 경우, 생성된 유도체는 각각 토코페롤 및 토코트레이놀의 알파 동형 단백질이다 (각각, 알파-토코페롤 및 알파-토코트레이놀의 유도체로 나타내어짐). OH기는 왼쪽의 2개의 구조에서 볼 수 있듯이 부착점이기 때문에 유도체에는 물론 존재하지 않는다.
바람직한 실시형태에서, 특히 전술한 측면 A의 바람직한 실시형태에서, R4는 12 내지 25개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬 또는 알케닐, 또는 구조식 1에 나타내어진 바와 같이, 알파-토코페롤, 베타-토코페롤, 감마-토코페롤, 델타-토코페롤, 알파-토코트레이놀, 베타-토코트레이놀, 감마-토코트레이놀 및 델타-토코트레이놀의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 친유성 기이다.
또다른 바람직한 실시형태에서, 특히 전술한 측면 A의 바람직한 실시형태에서, R4는 12 내지 25개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬 또는 알케닐, 또는
Figure pct00065
이다.
또다른 바람직한 실시형태에서, 특히 전술한 측면 A의 바람직한 실시형태에서, R4는
Figure pct00066
,
Figure pct00067
,
Figure pct00068
,
Figure pct00069
, 및
Figure pct00070
로 이루어진 군으로부터 선택된다.
언급된 바와 같이, X는 각각의 경우에 독립적으로 선택되는 탄소 원자 또는 질소 원자이다. 일 실시형태에서, X는 탄소 원자이다. 다른 실시형태에서, Ra 및 Rb는 모두 X를 포함하는 구조이며, 바람직하게 X는 각 경우에 탄소 원자이다. 대안적으로, X는 질소 원자이다. 예를 들어, Ra 및 Rb는 모두 X를 포함하는 구조이며, 각각의 경우에 질소 원자가 X에 대해 선택된다. X가 탄소 원자인 것으로 언급될 때마다, 이는 수소 원자에 결합된 탄소 원자, 즉, CH를 나타내는 것으로 이해된다. 본 명세서의 일부 예에서 X는 CH인 것으로 이미 언급되어 있다.
추가적인 특정 실시형태에서, 화학식 (Ⅰ)을 갖는 양이온성 지질이 제공되며, 여기에서 Ra는
Figure pct00071
Figure pct00072
,
(상기 식에서, 바람직하게, X는 CH임)
또는 -R1-N(H)-C(O)-R3-R4로부터 선택되며;
Rb 는
Figure pct00073
이며,
(상기 식에서, 바람직하게, X는 CH임)
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4, 또는 -R1-N(CH3)2로부터 선택되며;
A는 -S-, -S-S-, -NH-C(O)-, -NH-C(O)O-, -NH-C(O)-NH-, -S-C(O)-N(H)-, -C(O)O-, 또는 -O-P(O)(OH)-O-이며;
R1은 선택적으로 치환된 에탄디일, 프로판디일, 부탄디일, 또는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 비분지형 알칸디일이며;
R2는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
R3는 선택적이며, 존재하는 경우, -R5-C(O)-O-, -R5-O-C(O)-, -R5 -C(O)-NH-, -R5 -OC(O)-NH-, 또는 R5 -NH-C(O)O-이며;
R4는 12 내지 36개의 탄소 원자를 갖는 친유성 치환기이며;
R5는 3 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
X는 탄소 또는 질소 원자이며;
여기서 모든 선택은 서로 독립적이다. 선택적으로, R2 및/또는 R5에 의해 나타내어지는 알칸디일은 선형이며, 비치환된다.
추가적인 특정 실시형태에서, 화학식 (Ⅰ)을 갖는 양이온성 지질이 제공되며, 여기에서 Ra는
Figure pct00074
,
Figure pct00075
,
(상기 식에서, 바람직하게, X는 CH임),
또는 -R1-N(H)-C(O)-R3-R4로부터 선택되며;
Rb는
Figure pct00076
(상기 식에서, 바람직하게, X는 CH임),
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4, 또는 -R1-N(CH3)2로부터 선택되며;
A는 -S-, -S-S-, -NH-C(O)-, -NH-C(O)O-, -NH-C(O)-NH-, -S-C(O)-N(H)-, -C(O)O-, 또는 -O-P(O)(OH)-O-이며;
R1은 선택적으로 치환된 에탄디일, 프로판디일, 부탄디일, 또는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 비분지형 알칸디일이며;
R2는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
R3는 선택적이며, 존재하는 경우, -R5-C(O)-O-, -R5-O-C(O)-, -R5 -C(O)-NH-, -R5 -OC(O)-NH-, 또는 R5 -NH-C(O)O-이며;
R4는 12 내지 25개의 탄소 원자를 갖는 알킬 또는 알케닐이며;
R5는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
X는 탄소 또는 질소 원자이며;
여기서 모든 선택은 서로 독립적이다. 선택적으로, R2 및/또는 R5에 의해 나타내어지는 알칸디일은 선형이며, 비치환된다.
더욱이, 다른 실시형태에서, 화학식 (Ⅰ)을 갖는 양이온성 지질이 제공되며, 여기에서
Ra 및 Rb는
Figure pct00077
(상기 식에서, 바람직하게, X는 CH임),
또는 -R1-N(H)-C(O)-R3-R4로부터 선택되며;
A는 -S-, -S-S-, -NH-C(O)-, -NH-C(O)O-, -NH-C(O)-NH-, -S-C(O)-N(H)-, -C(O)O-, 또는 -O-P(O)(OH)-O-이며;
R1은 선택적으로 치환된 에탄디일, 프로판디일, 부탄디일, 또는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 비분지형 알칸디일이며;
R2는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
R3는 선택적이며, 존재하는 경우, -R5-C(O)-O-, -R5-O-C(O)-, -R5 -C(O)-NH-, -R5 -OC(O)-NH-, 또는 R5 -NH-C(O)O-이며;
R4는 12 내지 36개의 탄소 원자를 갖는 친유성 치환기이며;
R5는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
X는 탄소 또는 질소 원자이며;
여기서 모든 선택은 서로 독립적이며,
선택적으로, R1, R2 및 R5는 모두 선형 비치환된 에탄디일이며, A가 -S-S-이고, Ra 및 Rb가 동일한 경우, R4는
Figure pct00078
가 아니다.
이 실시형태에서, R2 및/또는 R5로 나타내어지는 알칸디일은 선형이고 비치환될 수 있으며; 선택적으로, R5는 2 내지 6개의 탄소 원자를 포함하고, Ra 및 Rb의 각각은
Figure pct00079
(상기 식에서, 바람직하게, X는 CH임)
이다.
추가적인 특정 실시형태에서, 화학식 (Ⅰ)을 갖는 양이온성 지질이 제공되며, 여기에서 Ra 및 Rb의 각각은
Figure pct00080
(상기 식에서, 바람직하게, X는 CH임)
이며;
A는 -S-S-이며;
R1은 선택적으로 치환된 에탄디일, 프로판디일, 부탄디일, 또는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 비분지형 알칸디일이며;
R2는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
R3는 선택적이며, 존재하는 경우, -R5-C(O)-O- 또는 -R5-O-C(O)-이며;
R4는 12 내지 36개의 탄소 원자를 갖는 친유성 치환기이며;
R5는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
X는 탄소 또는 질소 원자이며;
여기서 모든 선택은 서로 독립적이며,
선택적으로, R1, R2 및 R5는 모두 선형 비치환된 에탄디일이며, A가 -S-S-이고, Ra 및 Rb가 동일한 경우, R4는
Figure pct00081
가 아니다.
다시, R2 및/또는 R5에 의해 나타내어지는 알칸디일은 선형이고 비치환될 수 있다.
추가적인 실시형태는 화학식 (Ⅰ)에 따른 양이온성 지질을 제공하며, 여기에서 Ra 및 Rb의 각각은
Figure pct00082
(상기 식에서, 바람직하게, X는 CH임)
이며;
A는 -S-S-이며;
R1은 선택적으로 치환된 에탄디일, 프로판디일, 부탄디일, 또는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 비분지형 알칸디일이며;
R2는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
R3는 선택적이며, 존재하는 경우, -R5-C(O)-O- 또는 -R5-O-C(O)-이며;
R4는 12 내지 25개의 탄소 원자를 갖는 알킬 또는 알케닐이며;
R5는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
X는 탄소 또는 질소 원자이며;
여기서 모든 선택은 서로 독립적이며,
R2 및/또는 R5로 나타내어지는 알칸디일은 선형이고 비치환될 수 있다.
다른 실시형태에서, 화학식 (Ⅰ)에 따른 양이온성 지질이 제공되며, 여기에서 Ra 및 Rb의 각각은
Figure pct00083
(상기 식에서, 바람직하게, X는 CH임)
이며;
A는 -S-S-이며;
R1은 선택적으로 치환된 에탄디일, 프로판디일, 부탄디일, 또는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 비분지형 알칸디일이며;
R2는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
R3는 선택적이며, 존재하는 경우, -R5-C(O)-O- 또는 -R5-O-C(O)-이며;
R4는
Figure pct00084
,
Figure pct00085
,
Figure pct00086
,
Figure pct00087
로부터 선택되는 알킬이며;
R5는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
X는 탄소 또는 질소 원자이며;
여기서 모든 선택은 서로 독립적이며, R2 및/또는 R5로 나타내어지는 알칸디일은 선형이고 비치환될 수 있다.
추가적인 실시형태는 화학식 (Ⅰ)에 따른 양이온성 지질에 관한 것이며, 여기에서 Ra 및 Rb의 각각은
Figure pct00088
(상기 식에서, 바람직하게, X는 CH임)
이며;
A는 -S-S-이며;
R1은 선택적으로 치환된 에탄디일, 프로판디일, 부탄디일, 또는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 비분지형 알칸디일이며;
R2는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
R3는 -R5-C(O)-O- 또는 -R5-O-C(O)-이며;
R4는
Figure pct00089
또는
Figure pct00090
이며,
R5는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
X는 탄소 또는 질소 원자이며;
Ra 및 Rb는 동일하고, 다른 모든 선택은 서로 독립적이며, R2 및/또는 R5로 나타내어지는 알칸디일은 선형이고 비치환될 수 있다.
추가적인 실시형태에서, 본 발명은 화학식 (Ⅰ)에 따른 양이온성 지질을 제공하며, 여기에서 Ra 및 Rb의 각각은
Figure pct00091
(상기 식에서, 바람직하게, X는 CH임)
이며;
A는 -S-S-이며;
R1은 선택적으로 치환된 에탄디일, 프로판디일, 부탄디일, 또는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 비분지형 알칸디일이며;
R2는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
R3는 -R5-C(O)-O-이며;
R4는
Figure pct00092
또는
Figure pct00093
이며;
R5는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
X는 탄소 또는 질소 원자이며;
Ra 및 Rb는 동일하고, 다른 모든 선택은 서로 독립적이며, R2 및/또는 R5로 나타내어지는 알칸디일은 선형이고 비치환될 수 있다.
추가적인 실시형태에 따르면, 본 발명에 의해 제공되는 양이온성 지질은 화학식 (Ⅰ)의 화합물이며, 여기에서 Ra 및 Rb의 각각은
Figure pct00094
(상기 식에서, 바람직하게, X는 CH임)
이며;
A는 -S-S-이며;
R1은 선택적으로 치환된 에탄디일, 프로판디일, 부탄디일, 또는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 비분지형 알칸디일이며;
R2는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
R3는 -R5-C(O)-O-이며;
R4는
Figure pct00095
또는
Figure pct00096
이며;
R5는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
X는 탄소 원자이며;
Ra 및 Rb는 동일하고, 다른 모든 선택은 서로 독립적이며, R2 및/또는 R5로 나타내어지는 알칸디일은 선형이고 비치환될 수 있다.
다른 특정 실시형태에서, 본 발명에 의해 제공되는 양이온성 지질은 화학식 (Ⅰ)에 따른 화합물이며, 여기에서 Ra 및 Rb의 각각은
Figure pct00097
(상기 식에서, 바람직하게, X는 CH임)
이며;
A는 -S-S-이며;
R1은 에탄디일이며;
R2는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
R3는 -R5-C(O)-O-이며;
R4는
Figure pct00098
또는
Figure pct00099
이며;
R5는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
X는 탄소 원자이며;
Ra 및 Rb는 동일하고, 다른 모든 선택은 서로 독립적이며, R2 및/또는 R5로 나타내어지는 알칸디일은 선형이고 비치환될 수 있으며, 바람직하게, R1의 에탄디일도 선형이고 비치환된다.
다른 하나의 바람직한 실시형태에서, 양이온성 지질은 각각의 경우에 독립적으로 선택되는 일 이상의 하기 특징을 갖는다:
(ⅰ) R1은 비치환된 에탄디일, 프로판디일, 또는 부탄디일이다;
(ⅱ) R2는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 선형 및 비분지형 알칸디일이다;
(ⅲ) R3는 -R5-C(O)-O- 또는 -R5-O-C(O)-이다;
(ⅳ) R4는 12 내지 25개의 탄소 원자를 갖는 알킬 또는 알케닐이다;
(ⅴ) R5는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이다; 및/또는
(ⅵ) X는 탄소 원자이다.
다른 바람직한 실시형태에서, 특히 상기 측면 A의 다른 바람직한 실시형태에서, R3는 존재하고, -R5-C(O)-O-, -R5-O-C(O)-, -R5-C(O)-NH-, -R5-OC(O)-NH-, 및 R5-NH-C(O)O-로 이루어진 군으로부터 선택되며; R4는 12 내지 25개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬 또는 알케닐이다. 이 실시형태에서, R3는 -R5-C(O)-O- 또는 -R5-O-C(O)-인 것이 특히 바람직할 수 있다. 이 실시형태에서, R4가
Figure pct00100
,
Figure pct00101
,
Figure pct00102
및
Figure pct00103
로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 더 바람직할 수 있다.
또다른 바람직한 실시형태에서, 특히 상기 측면 A의 다른 바람직한 실시형태에서, A는 -S-이다. 이 실시형태에서, Ra 및 Rb는 동일하고,
Figure pct00104
(상기 식에서, X는 바람직하게 CH임)
인 것이 바람직할 수 있다. 이 실시형태에서, R3가 존재하고, -R5-C(O)-O- 또는 -R5-O-C(O)-로부터 선택되는 것이 바람직할 수 있다. 이 실시형태에서, R4가
Figure pct00105
인 것이 바람직할 수 있다. 이 실시형태에서, Ra의 R4와 Rb의 Ra가 동일한 것이 바람직할 수 있다. 마지막으로, 이 실시형태에서, R1, R2 및 R3의 하나 또는 전부가 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는, 특히 2, 3 또는 3개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일인 것이 바람직하다.
다른 추가적인 실시형태에서, 양이온성 지질은 바람직하게 표 1에 나열된 양이온성 지질로부터 선택된다.
[표 1: 화학식 (Ⅰ)에 따른 바람직한 양이온성 지질 - 이 표에서 특정 지질을 언급하는 경우, 예를 들어, 지질 C1, 지질 화합물 1 또는 C1을 참조함]
Figure pct00106
Figure pct00107
Figure pct00108
Figure pct00109
Figure pct00110
Figure pct00111
Figure pct00112
Figure pct00113
Figure pct00114
Figure pct00115
Figure pct00116
따라서, 본 발명은 상기 기재된 양이온성 지질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 예를 들어, 조성물은 표 1의 화합물 C1 내지 C27로부터 선택되는 양이온성 지질을 포함할 수 있다.
추가적인 특정 실시형태에서, 양이온성 또는 양이온화될 수 있는 지질은 3급 또는 4급 질소 / 아미노기를 포함하거나, 생리학적 pH와 같은 선택적 pH에서 순 양전하를 띠는 다수의 지질 종 중 임의의 것일 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 3급 또는 4급 질소 / 아미노기를 포함하는 양이온성 지질 또는 생리학적 pH에서 순 양전하를 띠는 양이온성 지질은 N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드 (DODAC); N-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA); N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드 (DDAB); N-(2,3-디올레오일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTAP); 3-(N-(N',N'-디메틸아미노에탄)-카바모일)콜레스테롤 (DC-Chol); N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필)N-2-(스페르민카르복스아미도)에틸)-N,N-디메틸암모늄 트리플루오르아세테이트 (DOSPA); 디옥타데실아미도글리실 카르복시스페르민 (DOGS); 1,2-디올레오일-3-디메틸암모늄 프로판 (DODAP); N,N-디메틸-2,3-디올레오일옥시)프로필아민 (DODMA); 및 N-(1,2디미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-하이드록시에틸 암모늄 브로마이드 (DMRIE)로 이루어진 군으로부터 선택되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
추가적인 실시형태에서, 3급 또는 4급 질소 / 아미노기를 포함하는 양이온성 지질 또는 생리학적 pH에서 순 양전하를 띠는 양이온성 지질은 아미노 지질로 이루어진 군으로부터 선택되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 실시형태에서, 적합한 아미노 지질은 전체적으로 참조로 본 명세서에 포함되는 WO 2012/016184 A2에 기재된 것을 포함한다 [0320]. 조성물에 이용되는 다른 적합한 추가적인 양이온성 지질은 콜레스테롤계 양이온성 지질을 포함한다.
추가의 대표적인 아미노 지질은 다음을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다:
(ⅰ) 하기 화학식:
Figure pct00117
을 갖는 것, 상기 식에서, R1 및 R2는 동일하거나 상이하며, 독립적으로 선택적으로 치환된 C10-C24 알킬, 선택적으로 치환된 C10-C24 알케닐, 선택적으로 치환된 C10-C24 알키닐, 또는 선택적으로 치환된 C10-C24 아실이며; R3 및 R4는 동일하거나 상이하며, 독립적으로 선택적으로 치환된 C1-C6 알킬, 선택적으로 치환된 C2-C6 알케닐, 또는 선택적으로 치환된 C2-C6 알키닐이거나, 또는 R3 및 R4가 연결되어 4 내지 6개의 탄소 원자 및 질소 및 산소로부터 선택되는 1 또는 2개의 헤테로원자를 갖는 선택적으로 치환된 헤테로사이클릭 고리를 형성할 수 있으며; R5는 부재이거나, 존재하며, 존재하는 경우, 수소 또는 C1-C6 알킬이며; m, n, 및 p는 동일하거나 상이하며, 독립적으로 0 또는 1이며, 단, m, n, 및 p는 동시에 0이 아니며; q는 0, 1, 2, 3, 또는 4이며; 및 Y 및 Z 동일하거나 상이하며, 독립적으로 O, S, 또는 NH이다. 일 실시형태에서, R1 및 R2는 각각 리놀레일이며, 아미노 지질은 디리놀레일 아미노 지질이다;
또는
(ⅱ) 디리놀레일 아미노 지질; 1,2-디리놀레일옥시-3-(디메틸아미노)아세톡시프로판 (DLin-DAC); 1,2-디리놀레일옥시-3-모르폴리노프로판 (DLin-MA); 1,2-디리놀레오일-3-디메틸아미노프로판 (DLinDAP); 1,2-디리놀레일티오-3-디메틸아미노프로판 (DLin-S-DMA); 1-리놀레오일-2-리놀레일옥시-3-디메틸아미노프로판 (DLin-2-DMAP); 1,2-디리놀레일옥시-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염 (DLin-TMA.Cl); 1,2-디리놀레오일-3-트리메틸아미노프로판 클로라이드 염 (DLin-TAP.Cl); 1,2-디리놀레일옥시-3-(N-메틸피페라지노)프로판 (DLin-MPZ); 3-(N,N디리놀레일아미노)-1,2-프로판디올 (DLinAP); 3-(N,N-디올레일아미노)-1,2-프로판디올 (DOAP); 1,2-디리놀레일옥소-3-(2-N,N-디메틸아미노)에톡시프로판 (DLin-EG-DMA); 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[1,3]-디옥소란 (DLin-K-DMA); 및 DLin-KC2-DMA (상기 DLin-K-DMA, 여기에서 n은 2임)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것.
본 명세서에 기재된 양이온성 지질은 염, 예를 들어, 산 부가 염 또는 특정 경우, 카르복실레이트, 설포네이트 및 포스페이트 염과 같이 유기 및 무기 염기의 염의 형태로 존재할 수 있다. 이러한 모든 염은 본 발명의 범위 내에 있으며, 화학식 (Ⅰ)의 양이온성 지질 및 화합물 및 그 하위 그룹에 대한 언급은 그 화합물의염 형태를 포함한다.
추가적인 실시형태에서, 양이온성 지질의 상업적 제제가 본 발명에 이용될 수 있다. 이는, 예를 들어, LIPOFECTIN® (GIBCO/BRL, Grand Island, N.Y.로부터의 DOTMA 및 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE)을 포함하는 상업적으로 이용가능한 양이온성 리포솜); LIPOFECTAMINE® (GIBCO/BRL로부터의 상업적으로 이용가능한 N-(1-(2,3디올레일옥시)프로필)-N-(2-(스페르민카르복스아미도)에틸)-N,N-디메틸암모늄 트리플루오로아세테이트 (DOSPA) 및 DOPE를 포함하는 양이온성 리포솜); 및 TRANSFECTAM® (Promega Corp., Madison, Wis.로부터의 에탄올 중 디옥타데실아미도글리실 카르복시스페르민 (DOGS)을 포함하는 상업적으로 이용가능한 양이온성 지질)을 포함한다.
추가적인 실시형태에서, 조성물은 전체적으로 참조로 본 명세서에 포함되는 WO 2019226925 A1의 단락 [0320] 및 [0339]-[0340]에 개시된 이미다졸 콜레스테롤 에스테르 또는 "ICE"를 포함한다. 다른 적합한 (양이온성) 지질은 WO2009/086558, WO2009/127060, WO2010/048536, WO2010/054406, WO2010/088537, WO2010/129709, WO2011/153493, US2011/0256175, US2012/0128760, US2012/0027803, US8158601, WO2016118724, WO2016118725, WO2017070613, WO2017070620, WO2017099823, 및 WO2017112865에 개시되어 있으며, 이들 모두는 전체적으로 참조로 본 명세서에 포함된다. 일부 실시형태에서, 양이온성 지질은 모두 전체적으로 참조로 본 명세서에 포함되는 WO2017049074, US9512073B2, WO2015200465, US20150376144에 개시된 98N12-5, C12-200, 및 ckk-E12로 이루어진 군으로부터 선택된다.
양이온성 지질은 본 발명의 조성물 또는 지질 나노입자에 존재하는 총 지질의 약 20 mol% 내지 약 70 또는 75 mol%, 또는 약 45 내지 약 65 mol% 또는 약 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 또는 약 70 mol%를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, 지질 나노입자는 몰 기준으로 양이온성 지질의 약 25% 내지 약 75%, 예를 들어, 몰 기준으로(지질 나노입자 내 지질의 100% 총 몰을 기준으로 함) 약 20 내지 약 70%, 약 35 내지 약 65%, 약 45 내지 약 65%, 약 60%, 약 57.5%, 약 57.1%, 약 50% 또는 약 40%를 포함한다.
일반적으로, 본 발명의 조성물은 일 이상의 추가적인 지질과 같은 다른 부형제를 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 조성물은 추가적인 양이온성 지질, 즉, 제2, 제3 등의 양이온성 지질을 포함할 수 있다. 그러한 추가적인 양이온성 지질은 선택적으로 본 명세서에 개시된 양이온성 지질일 수 있다. 대안적으로, 이는, 약학 조성물, 특히 mRNA와 같은 핵산 화합물로부터 선택되는 활성 성분을 포함하는 조성물에 적합한 임의의 다른 양이온성 지질일 수 있다.
특정 일 실시형태에서, 추가적인 양이온성 지질은 적어도 하나의 4차 질소 원자를 포함하는 영구적인 양이온성 지질이다. 이 경우, 제1 양이온성 지질은 바람직하게 영구적인 양이온성보다는 양이온화될 수 있는 지질이다.
염기성 양이온성 지질의 약학적으로 허용가능한 염은 무기 또는 유기 산으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 염산, 브롬화수소산, 황산, 설팜산, 인산, 질산 등과 같은 무기산으로부터의 염, 및 아스트산, 프로판산, 석식산, 글리콜산, 스테아르산, 락트산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르므산, 파모산, 말레산, 하이드록시말레산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 설파닐산, 2-아세톡시벤조산, 푸마르산, 톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 나프탈렌설폰산, 벤젠설폰산, 트리플루오로아세트산과 같은 유기산으로부터 염. 약학적으로 허용가능한 염의 추가적인 예는 아민과 같은 염기성 잔기의 미네랄 염 또는 유기산 염; 카르복실산과 같은 산성 잔기의 알칼리 염 또는 유기 염 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 대표적인 산 부가 염은 아세테이트, 아세트산, 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠설포네이트, 벤젠 설폰산, 벤조에이트, 바이설페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 시트레이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵토네이트, 헥사노에이트, 하이드로브로마이드, 하이드로클로라이드, 하이드로아이오다이드, 2-하이드록시-에탄설포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올리에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 석시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 발레레이트 염 등을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리토 금속 염은 소듐, 리튬, 포타슘, 칼슘, 마그네슘 등, 및 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 에틸아민 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아닌 비독성 암모늄, 4차 암모늄, 및 아민 양이온을 포함한다. 본 개시의 약학적으로 허용가능한 염은 예를 들어, 비독성 무기산 또는 유기산으로부터 형성되는 모 화합물의 통상적인 비독성 염을 포함한다. 본 개시의 약학적으로 허용가능한 염은 통상적인 화학적 방법에 의해 염기성 또는 산성 모이어티를 함유하는 모 화합물로부터 합성될 수 있다. 일반적으로, 그러한 염은 물 또는 유기 용매에서, 또는 둘의 혼합물에서, 그러한 화합물의 유리 산 또는 유리 염기 형태를 화학양론적 양의 적절한 염기 또는 산을 반응시킴으로써 제조될 수 있으며, 일반적으로 에테르, 에틸 아세테이트, 에탄올, 이소프로판올 또는 아세토니트릴과 같은 비수성 매질이 바람직하다. 적합한 염의 목록은 전체적으로 참조로 본 명세서에 포함되는, Remington's Pharmaceutical Sciences, 1 7th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418, Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, P.H. Stahl and C.G. Wermuth (eds.), Wiley-ⅴCH, 2008, 및 Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science, 66, 1 -1 9 (1977)에 기재되어 있다.
폴리머 컨쥬게이트 지질(Polymer conjugated lipid), 페길화(pegylated) 지질
일부 실시형태에서, LNP는 지질-컨쥬게이트, 바람직하게 폴리머 컨쥬게이트 지질을 포함한다. 용어 "폴리머 컨쥬게이트 지질"은 지질 부분 및 폴리머 부분을 모두 포함하는 분자를 나타낸다. 바람직하게, 폴리머 컨쥬게이트 지질은 페길화 지질 또는 PEG-지질이다. 용어 "페길화 지질" 또는 "PEG-지질"은 지질 부분 및 폴리에틸렌 글리콜 부분을 모두 포함하는 분자를 나타낸다. 페길화 지질은 당해 기술분야에 공지되어 있으며, PEG-DMG 등을 포함한다.
특정 실시형태에서, 폴리머 컨쥬게이트 지질은 화학식 (Ⅱ):
[화학식 Ⅱ]
P-A-L
에 따른 화합물로 정의되며, 상기 식에서, P는 친수성 폴리머 모이어티이며, A는 선택적 링커 또는 스페이서이며, L은 지질 모이어티이다.
친수성 폴리머 모이어티 P
화학식 (Ⅱ)에 따른 폴리머 컨쥬게이트 지질에서 친수성 폴리머 모이어티 P는 폴리에틸렌 글리콜 ("PEG") 모이어티일 수 있다. 특정 실시형태에서, PEG 모이어티는 1 kDa 내지 3 kDa, 예를 들어, 1.5-2.5 kDa, 1.7-2.3 kDa, 1.8-2.2 kDa, 1.9- 2.1 kDa, 또는 2 kDa의 평균 분자량(mean molecular mass)을 갖는다. 따라서, PEG는 더 짧은 "PEG 1000" 및 더 긴 "PEG 3000"도 사용될 수 있으나, "PEG 2000" 또는 "PEG 2k"로 통상적으로 알려진 PEG일 수 있다. PEG 모이어티는 일반적으로 선형 폴리머 사슬을 포함하나, 일부 실시형태에서, PEG 모이어티는 분지형 폴리머 사슬을 포함할 수 있다. 대안적으로, 고려되는 PEG-변형 지질은 지질에 공유적으로 부착된 길이 2 kD이하, 3 kD이하, 4 kD이하 또는 5 kD이하인 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 실시형태에서, 폴리머 컨쥬게이트 지질에서 친수성 폴리머 모이어티 P는 상기 기재된 친수성 폴리머 모이어티와 상이한 실질적으로 친수성 폴리머일 수 있으며, 즉, 폴리머 컨쥬게이트 지질의 친수성 폴리머 모이어티 P는 폴리(프로필렌 옥사이드), 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알코올), 폴리-N-(2-하이드록시프로필) 메타크릴아미드, 헤실화 프로세스(hesylation-process)(PMID 24681396에 따름), 파실화 접근(PASylation-approach)(즉, 프롤린-알라닌-세린), 당해 기술분야에 공지된 XTEN-접근(즉, 펩타이드 기반 PEG), 폴리사르코신 또는 폴리(비닐 아세테이트)에 기초할 수 있다.
선택적 링커 또는 스페이서 A
화학식 (Ⅱ)에 따른 폴리머 컨쥬게이트 지질에서 선택적 링커 또는 스페이서 A는, 예를 들어, 석신이미드, 아민, 에테르, 에스테르, 무수물, 알데히드, 케톤, 아미드, 카바메이트 링커 또는 그 조합이지만, 이에 제한되는 것은 아닌, 일반적으로 페길화 지질에서 유용한 것으로 밝혀진 것으로부터 선택되는 스페이서와 같은, 임의의 유용한 스페이서 구조일 수 있다.
지질 모이어티 L
화학식 (Ⅱ)에 따른 폴리머 컨쥬게이트 지질에서 지질 모이어티 L는 인지질, 스핑고지질 또는 세라마이드로부터 유래될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 표현 "인지질 또는 세라마이드로부터 유래된"은 인지질 및 세라마이드의 라디칼을 포함한다. 예는 포스파티딜에탄올아민 또는 포스파티딜글리세롤 모이어티를 포함하는 폴리머 컨쥬게이트 지질이다.
특정 실시형태에서, 폴리머 컨쥬게이트 지질은 페길화 지질이다. 보다 구체적인 실시형태에서, 본 발명의 조성물에 포함되는 폴리머 컨쥬게이트 지질은 페길화 디아실글리세롤 지질 (PEG-DAG); 페길화 세라마이드 지질 (PEG-Cer); 페길화 포스파티딜에탄올o아민 지질 (PEG-PE); 페길화 석시네이트 디아실글리세롤 지질 (PEG-S-DAG); 페길화 디알콕시프로필카바메이트 지질; 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜 ("PEG-DMG" 또는 "DMG-PEG"); 1,2-디카프릴-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌 글리콜 (C10 디아실글리세롤 PEG); N-옥타노일-스핑고신-1-{석시닐[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)2000]} (N-옥타노일-D-에리쓰로-스핑고신 (d18:1/8:0)을 포함함, PEG-세라마이드8, C8-세라마이드-PEG, PEG-Cer8, C8 PEG2000 세라마이드 또는 세라마이드 8 PEG로도 명명됨); 4-O-(2',3'-디(테트라데카노일옥시)프로필-1-O-(ω-메톡시(폴리에톡시)에틸)부탄디오에이트 (PEG-S-DMG); 2-mPEG2000-n,n 디테트라데실아세트아미드; N-[(메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)2000)카바밀]-1,2-디미리스틸옥시로필-3-아민 (PEG-c-DMA); ω-메톡시(폴리에톡시)에틸-N-(2,3-디(테트라데칸옥시)프로필)카바메이트; WO2018126084, WO2020093061, 또는 WO2020219941 (3개의 참조문헌 모두 전체적으로 참조로 본 명세서에 포함됨)에 개시된 PEG-지질, 본 명세서에 기재된 페길화 콜레스테롤 또는 페길화 콜레스테롤-유도체, 및 2,3-디(테트라데칸옥시)프로필-N-(ω-메톡시(폴리에톡시)에틸)카바메이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리머 컨쥬게이트 지질이다.
추가적인 바람직한 실시형태에서, 지질 모이어티 L은 1, 2, 3, 4개, 또는 그 이상의 소수성 지방산 ("테일", 짝수의 탄소 원자를 포함하는 지방족 사슬에 상응함)을 포함한다. 더욱 바람직한 실시형태에서, 지질 모이어티 L은 동일하거나 상이한 탄소 원자를 갖는 2개의 소수성 지방산 ("테일")을 포함한다.
바람직하게, 지질 모이어티 L은 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26개의 탄소 원자를 포함하는 지방산 ("테일") 또는 그 조합을 포함한다. 더욱 바람직하게, 지질 모이어티 L은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개의 탄소 원자를 포함하는 지방산 ("테일") 또는 그 조합을 포함한다. 보다 구체적인 실시형태에서, 지질 모이어티 L은 카프릴산 또는 옥탄산 (8:0); 카프르산 (10:0); 라우르산 (12:0); 미리스트산 (14:0); 팔미트산 (16:0); 스테아르산 (18:0); 아라키드산 (20:0); 베헨산 (22:0); 리그노세르산 (24:0); 및 세로트산 (26:0)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 지방산 ("테일")을 포함한다.
더욱더 바람직한 실시형태에서, 지질 모이어티 L은 8, 10 또는 12개의 탄소 원자, 바람직하게 8 또는 10개의 탄소 원자를 포함하는 적어도 하나의 지방산 ("테일")을 포함한다.
추가적인 바람직한 실시형태에서, 조성물은 폴리머 컨쥬게이트 지질:
- 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000 (DMG-PEG 2000)
Figure pct00118
을 포함한다.
바람직하게, 또한 당해 기술분야에서 사용되는 바와 같이, "DMG-PEG 2000"은 ~97:3 비율의 1,2-DMG PEG2000 및 1,3-DMG PEG2000의 혼합물로 간주된다.
추가적인 특정 실시형태에서, 조성물은
- 1,2-디카프릴-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌 글리콜 2000 (C10-PEG 2000)
Figure pct00119
; 및
- N-옥타노일-스핑고신-1-{석시닐[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)2000]} (Cer8-PEG 2000)
Figure pct00120
로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리머 컨쥬게이트 지질을 포함한다.
추가적인 실시형태에서, 조성물은 하기 화학 구조:
Figure pct00121
를 갖는 "C8-PEG 2000"과 유사한 구조로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리머 컨쥬게이트 지질을 포함한다.
본 발명의 특정 실시형태에서, "C10-PEG 2000"을 포함하는 본 명세서 내에서 본원에 개시된 각각의 조성물은 "C10-PEG 2000" 대신에 "C8-PEG 2000"으로 제제화될 수 있다.
따라서, 예로서, 폴리머 컨쥬게이트 지질, 또는 각각의 지질 모이어티 L은 하나의 포화 지방산 사슬 (8:0; 카프릴산 또는 각각의 옥탄산) 및 8개 초과의 탄소 원자를 갖는 상이한 길이의 하나의 불포화 지방산 사슬을 포함하는 Cer8-PEG 2000과 같이, 포화 지방산, 불포화 지방산 또는 그 조합 ("테일")을 포함하는 2개의 지방산 테일을 가질 수 있다.
특히, mRNA 백신의 생체 내 전달을 위하여, 바람직하게는 본 명세서에 개시된, 예를 들어, 표 1 및/또는 DPhyPE에 개시된 본 발명의 지질과 조합하여 본 명세서에 개시된 더 짧은 아릴 사슬을 갖는 폴리머 컨쥬게이트 지질(예를 들어, Cer8)을 DSPC 대신에 중성 지질로 이용함으로써, 현저하게 향상된 면역 반응을 이루는 것이 본 발명자들에 의해 이루어진 추가의 놀라운 발견이며, 본 발명의 특정 측면 및 실시형태와 유사하다.
스테로이드
"스테로이드"는 특정 분자 배열로 밸열된 4개의 고리를 갖는 유기 화합물이다. 이는 다음과 같은 탄소 골격을 포함한다:
Figure pct00122
스테로이드 및 중성 스테로이드는 자연 발생 스테로이드 및 그의 유사체를 모두 포함한다(예를 들어, 콜레스테롤 유도체로서 콜레스테롤의 베타-하이드록실기에 에스테르화된 석신으로 이루어진 양친매성(amphipathic) 지질 콜레스테릴 헤미석시네이트 (CHEMS)). 본 명세서에 제공된 "중성"에 대한 정의를 사용하여, 중성 스테로이드는 생리학적 조건 하에 이온화될 수 있는 원자 또는 기를 갖지 않는 스테로이드이거나, 또는 즈비터 이온성 스테로이드일 수 있다. 바람직한 일 실시형태에서, 중성 스테로이드는 생리학적 조건 하에 이온화될 수 있는 원자 또는 기가 없다. 일부 바람직한 실시형태에서, 스테로이드 또는 스테로이드 유사체는 콜레스테롤이다. 용어 "스테로이드" 및 "중성 스테로이드"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
추가적인 실시형태에서, 스테로이드는 전체적으로 참조로 본 명세서에 포함되는 WO 2019226925 A1의 단락 [0320] 및 [0339]-[0340]에 개시된 이미다졸 콜레스테롤 에스테르 또는 "ICE"이다.
중성 지질, 중성 인지질
본 발명에 따르면 "헬퍼(helper) 지질"이라고도 하는 "중성 지질"은 바람직하게 인지질 또는 중성 인지질이다. 본 명세서에서 사용된 "중성 인지질"은 일반적으로 2개의 소수성 지방산 "테일" 및 포스페이트기를 포함하는 친수성 "헤드(head)"를 갖는 분자로 이루어진 양친매성 화합물이다. 포스페이트기는 콜린, 에탄올아민 또는 세린과 같은 단순한 유기 분자로 변형될 수 있다. 인지질은 자연계에 풍부하게 존재한다. 예를 들어, 그들은 생물학적 막의 부형제의 상당한 부분을 나타낸다. 본 명세서에서 사용된 표현 "인지질" 또는 "중성 인지질"은 천연 및 합성 인지질 모두 포괄한다.
본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "중성 지질", "중성 인지질" 또는 "즈비터 이온성 화합물"은 생리학적 pH에서 전하를 띠지 않거나 중성 즈비터 이온성 형태로 존재하는 다수의 지질 종의 임의의 하나를 나타낸다. 대표적인 중성 지질은 하기에서 추가적으로 기재되는 디아실포스파티딜콜린, 디아실포스파티딜에탄올아민, 세라마이드, 스핑고미엘린, 디하이드로 스핑고미엘린, 세팔린, 및 세레브로시드를 포함한다.
바람직한 실시형태 중 하나에 따르면, 조성물은 포스파티딜콜린 또는 포스파티딜에탄올아민과 같은 즈비터 이온성인 중성 지질을 포함한다. 적합한 포스파티딜콜린의 예는 종종 난황 또는 대두로부터 유래되는 때때로 "레시틴" 또는 "포스파티딜콜린"으로 지칭되는, 천연 또는 정제된 혼합물; 또는 린미리스토일, 팔미토일, 스테아로일, 올레오일 등으로부터 선택되는 2개의 지방 아실 모이어티를 갖는 포스파티딜콜린과 같은 정제된 또는 반합성 화합물을 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에서, 중성 지질 또는 중성 인지질은 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPhyPE; 1,2-디-(3,7,11,15-테트라메틸헥사데카노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민이라고도 함), 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPhyPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC; 디올레오일포스파티딜콜린이라고도 함), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC, 디팔미토일포스파티딜콜린이라고도 함), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 포스파티딜에탄올아민, 디스테아로일포스파티딜콜린, 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 (DOPEA), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린 (POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민 (POPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPPE), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카르복실레이트 (DOPE-mal), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DMPE), 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DLoPE), 디스테아로일-포스파티딜에탄올아민 (DSPE), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (POPE), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DLPE), 16-O-모노메틸포스포에탄올아민, 16-O-디메틸 포스파티딜에탄올아민, 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DEPE), 18-1-트랜스 포스파티딜에탄올아민, 1-스테아로일-2-올레오일포스파티딜에탄올아민 (SOPE), 1,2-디스쿠알레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSQPE), 1,2-디엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (트랜스DOPE), 1-스테아로일-2-리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (SLPE), 1-트리데카노일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린 (소듐 염), 1-올레오일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포-L-세린 (소듐 염), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린 (소듐 염) (POPS), 1-1-스테아로일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린 (소듐 염), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린 (소듐 염) (DOPS), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린 (소듐 염), 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린 (소듐 염), 1-O-헥사데카닐-2-O-(9Z-옥타데세닐)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 1,2-디-O-피타닐-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1-팔미토일-2-콜레스테릴헤미석시노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (PChemsPC), 1,2-디콜레스테릴헤미석시노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DChemsPC), 2-((2,3-비스(올레오일옥시)프로필)디메틸암모니오)에틸 수소 포스페이트 (DOCP), 2-((2,3-비스(올레오일옥시)프로필)디메틸암모니오)에틸 에틸 포스페이트 (DOCPe), 및 1-O-옥타데실-2-O-메틸-sn-글리세로-3-포스포콜린 (Edelfosine)으로부터 선택되나 이에 제한되는 것은 아닌 즈비터 이온성 화합물이다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 중성 지질은 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC) 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE)이다. 더욱 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 중성 지질은 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPhyPC)이다. 더욱더 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 중성 지질은 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPhyPE)이다. DPhyPE 사용과 관련된 본 발명의 이점은 부피가 큰 테일로 인한 융합 형성(fusogenicity)에 대한 높은 용량이며, 이에 의해 엔도솜 지질(endosomal lipids)과 높은 수준에서 융합할 수 있다.
특히, mRNA 백신의 생체 내 전달을 위하여, 바람직하게 본 명세서에 개시된, 예를 들어 표 1에 개시된 본 발명의 지질과 조합하여, 본 명세서에 개시된 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPhyPE)을 유리하게 이용함으로써, 현저하게 향상된 면역 반응에 이르게 되는 것은 본 발명의 특정 측면 및 실시형태와 유사한 본 발명자들에 의한 놀라운 발견이다. 다르게 말하면, 본 발명자들은 놀랍게도 DPhyPE의 사용이 특히 mRNA 및 또한 siRNA에 대한 거의 모든 최신 기술의 LNP-조성물을 제공하며, 백신 접종 설정에 국한되지 않는다는 것을 발견하였다. 다르게 말하면, 본 발명의 조성물은 매우 유리하고 예측하지 못한 생체 내 거동을 가져, 매우 향상된 면역 반응에 이르게 된다.
흥미롭게도, 본 발명자들은 DSPC 대신에 DPhyPE를 포함하는 조성물이 GN01 조성물과 비교할 때조차도 우수한 시험관 내 및 생체 내 발현 프로파일을 나타내는것을 발견하였다. 따라서, 놀랍게도 DPhyPE의 사용은 거의 모든 최신 기술의 LNP-조성물에서 표준 중성 지질로서 지금까지 사용되는 DSPC에 비하여 분명한 이점을 제공한다는 것이 밝혀졌다.
중요하게도, 본 발명자들은 본 발명의 조성물 및 지질 나노입자, 예를 들어, GN01 제제의 유리한 특징 중 하나가, 강한 CD8+ T 세포 반응을 유도할 수 있다는 것을 발견하였다. 이는, 예를 들어, 말라리아의 경우, CD8+ T 세포가 말라리아 기생충에 의해 야기된 세포 내 감염에 대한 주요 보호 면역 메커니즘이므로, 효과적인 말라리아 백신이 강한 CD8+ T 세포 반응을 유도해야 한다는 사실에 기인한다.
또한, 실시예에 제시된 데이터는 본 발명의 조성물을 사용하여 유의하게 향상된 면역 반응을 입증하며, 즉, 모든 본 발명의 RNA 백신은 본 발명에 따라 유용하다. 놀랍게도, DSPC가 지질 나노입자에 대한 가장 일반적이고 의심의 여지가 없는 중성 지질이라고 보여주는 선행 기술 지식과 달리, 본 발명자들은 백신 생성을 위한 조성물에서 mRNA 제제에 DPhyPE를 사용하는 것이 바람직하다는 것을 발견하였다.
본 발명자들은 추가로 놀랍게도 상기 중성 지질에 적어도 하나의 추가적인 중성 지질, 특히 제2 중성 지질을 첨가함으로써 면역 반응을 향상시킬 수 있음을 발견하였다(도 28 내지 31 및 상응하는 실시예 참조). 상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 (제1) 중성 지질에 있어서, 미리스토일, 팔미토일, 스테아로일, 올레오일 등으로부터 선택되는 2개의 지방 아실 모이어티를 갖는 것이 바람직하며, 이는 특히 지방 아실 모이어티가 14개의 탄소 원자를 갖는 모이어티에서 출발하는 다소 긴 모이어티임을 의미한다. 본 발명자들은 이 추가적인 중성 지질이 펜타노일, 헥사노일, 헵타노일, 옥타노일, 노나오일 및 데카노일로부터 선택되는 2개의 지방산 모이어티, 즉 최대 10개의 탄소 원자를 갖는 모이어티를 갖는 경우, 더 짧은 지방 아실 모이어티를 갖는 중성 지질의 추가가 유리한 효과를 제공하는 것을 발견하였다. 특히 바람직한 추가적인 중성 지질은 1,2-디헵타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DHPC)이지만, 예를 들어, 05:0 PC (1,2-디펜타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 06:0 PC (1,2-디헥사노일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 08:0 PC (1,2-디옥타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 09:0 PC (1,2-디노난노일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 및 10:0 PC (1,2-디헥사노일-sn-글리세로-3-포스포콜린)과 같은 관련 중성 지질도 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 측면에서, 본 발명의 지질 나노입자는 C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13 또는 C14의 길이, 바람직하게 C6, C7, C8, C9, 또는 C10의 길이, 더욱 바람직하게 C6, C7, C8의 길이, 가장 바람직하게 C7의 길이를 갖는 적어도 하나의 알킬 사슬을 갖는 중성 지질 또는 인지질을 포함한다. 본 발명의 다른 실시형태에서, 본 발명의 지질 나노입자는 적어도 2개의 알킬 사슬을 갖는 중성 지질 또는 인지질을 포함하며, 이에 의해 각각의 알킬 사슬은 독립적으로 C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13 또는 C14의 길이, 바람직하게 C6, C7, C8, C9, 또는 C10의 길이, 더욱 바람직하게 C6, C7, C8의 길이, 가장 바람직하게 C7의 길이를 갖는다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 지질 나노입자는 DHPC를 추가적으로 포함한다. 추가적인 실시형태에서, 일 이상의 알킬 사슬은 탄소 이중 결합을 포함한다. 다른 실시형태에서, 지질 나노입자는 05:0 PC (1,2-디펜타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 04:0 PC (1,2-디부티릴-sn-글리세로-3-포스포콜린), 06:0 PC (DHPC, 1,2-디헥사노일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 08:0 PC (1,2-디옥타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 및 09:0 PC (1,2-디노난노일-sn-글리세로-3-포스포콜린)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 추가적인 인지질을 포함한다.
지질 나노입자 조성물
용어 "지질 나노입자 조성물" 및 "조성물"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 본 발명의 맥락에서, 지질 나노입자는 임의의 특정 형태로 제한되지 않으며, 예를 들어, 수성 환경에서, 및/또는 핵산 화합물의 존재 하에, 양이온성 지질 및 선택적으로 일 이상의 추가적인 지질이 조합될 때 생성되는 임의의 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 예를 들어, 리포솜, 지질 복합체, 리포플렉스(lipoplex) 등은 지질 나노입자의 범위 내에 있다.
본 발명의 맥락에서, "조성물"은 특정 성분이 선택적으로 임의의 추가적인 부형제와 함께, 일반적으로 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께 혼입될 수 있는 임의의 유형의 조성물을 나타낸다. 따라서, 조성물은 분말 또는 과립과 같은 건조 조성물이거나, 또는 동결건조 형태 또는 정제와 같은 고체 단위일 수 있다. 대안적으로, 조성물은 액체 형태일 수 있으며, 각각의 부형제는 용해되거나 분산된(예를 들어, 현탁된 또는 유화된) 형태로 독립적으로 혼입될 수 있다. 바람직한 일 실시형태에서, 조성물은 수성 액체 담체로 재구성하기 위해 분말 또는 동결건조 형태와 같은 멸균 고체 조성물로 제제화된다. 그러한 제제는 또한 하기에 추가로 상세하게 기재된 바와 같이 핵산 화물을 포함하는 조성물의 버전에 대해 바람직하다.
본 발명의 조성물에서, 양이온성 지질은 지질 나노입자(LNP) 내에, 또는 그 일부로서 존재할 수 있다. 다르게 말하면, 그러한 조성물은 지질 나노입자를 포함하며, 양이온성 지질은 지질 나노입자 내에 존재한다.
본 명세서에서 사용된 "나노입자"는 임의의 구조 또는 형태를 갖는 서브마이크론 입자이다. 서브마이크론 입자는 콜로이드 또는 콜로이달로도 나타내어질 수 있다. 나노입자의 기반이 되는 물질 및 구조 또는 형태에 관하여, 나노입자는 예를 들어, 나노캡슐, 소포(vesicle), 리포솜, 지질 나노입자, 미셀(micelle), 가교 미셀, 리포플렉스, 폴리플렉스, 혼합 또는 하이브리드 복합체로 분류될 수 있으며, 특정 유형의 나노입자에 대한 가능한 지정 중 일부만 언급한다. "지질 나노입자" (LNP)는 지질에 의해 형성되는 나노입자이며, 일반적으로 적어도 하나의 양친매성, 막 형성 지질, 및 선택적으로 다른 지질을 포함하고, 핵산 화합물과 같은 화물(cargo) 물질을 추가적으로 선택적으로 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 표현 "지질 나노입자" 또는 "LNP"는 리포솜 및 리포플렉스와 같은 지질에 의해 형성되거나 공동 형성된 나노입자의 임의의 하위 유형 및 형태를 포함한다.
상기 정의된 바와 같이, 지질 나노입자는 지질에 의해 형성되거나 공동 형성된 임의의 유형의 나노입자를 포함한다. 특히, 지질 나노입자는 적어도 하나의 양친매성, 소포 형성 지질을 포함하는 지질의 조합에 의해 공동 형성될 수 있다. 리포솜 및 리포플렉스는 지질 나노입자의 예이다.
일부 실시형태에서, 그러한 지질 나노입자는 양이온성 지질 (예를 들어, 화학식 (Ⅰ)의 지질) 및 중성 지질, 하전된 지질, 스테로이드 및 폴리머 컨쥬게이트 지질 (예를 들어, 화학식 (Ⅱ)의 페길화 지질과 같은 페길화 지질)로부터 선택되는 일 이상의 부형제를 포함한다. 본 발명자들은 현재, 본 명세서에 정의된 양이온성 지질, 스테로이드, 중성 지질, 및 화학식 (Ⅱ)에 따른 폴리머 컨쥬게이트 지질을 포함하는 조성물이 적어도 수성 환경에서, 일반적으로 이러한 부형제에 의해 형성되는 지질 나노입자를 포함하는 조성물로 존재할 것으로 믿고 있다.
LNP는 일 이상의 핵산 분자가 부착되거나, 또는 일 이상의 핵산 분자가 캡슐화되는 입자를 형성할 수 있는 임의의 지질을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, mRNA, 또는 그 일부는 지질 나노입자의 지질 부분, 또는 지질 나노입자의 지질 부분의 일부 또는 전부에 의해 둘러싸인 수성 공간에 캡슐화되어, 효소 분해 또는 숙주 유기체 또는 세포의 메커니즘에 의해 유도되는 다른 바람직하지 않은 효과, 예를 들어, 유해한 면역 반응으로부터 보호된다. 일부 실시형태에서, mRNA 또는 그 일부는 지질 나노입자와 회합된다.
언급된 바와 같이, 본 명세서에 기재된 지질 부형제를 포함하는 조성물은 적어도 수성 환경에서 일반적으로 지질 나노입자를 형성할 것이다. 본 명세서에 정의된 바와 같이, 나노입자는 주로 서브마이크론 크기를 갖는다. 특정 실시형태에서, mRNA가 지질 나노입자에 존재하는 경우, 뉴클레아제에 의한 분해에 대해 수용액에서 저항성이다. 본 명세서에서 사용된 평균 직경은 동적 광 산란(dynamic light scattering)에 의해 결정된 z-평균으로 나타내어질 수 있다. 일 실시형태에서, 조성물은 약 30 nm 내지 약 800 nm의 동적 레이저 산란에 의해 결정된 평균 유체역학적 직경(mean hydrodynamic diameter)(또는 평균 크기)을 갖는 지질 나노입자를 포함하는 멸균 액체 조성물이다. 다양한 실시형태에서, 지질 나노입자는 약 30 nm 내지 약 150 nm, 약 50 nm 내지 약 200 nm, 약 60 nm 내지 약 200 nm, 약 70 nm 내지 약 200 nm, 약 80 nm 내지 약 200 nm, 약 90 nm 내지 약 200 nm, 약 90 nm 내지 약 190 nm, 약 90 nm 내지 약 180 nm, 약 90 nm 내지 약 170 nm, 약 90 nm 내지 약 160 nm, 약 90 nm 내지 약 150 nm, 약 90 nm 내지 약 140 nm, 약 90 nm 내지 약 130 nm, 약 90 nm 내지 약 120 nm, 약 90 nm 내지 약 100 nm, 약 70 내지 약 90 nm, 약 80 nm 내지 약 90 nm, 약 70 nm 내지 약 80 nm, 또는 약 30 nm, 35 nm, 40 nm, 45 nm, 50 nm, 55 nm, 60 nm, 65 nm, 70 nm, 75 nm, 80 nm, 85 nm, 90 nm, 95 nm, 100 nm, 105 nm, 110 nm, 115 nm, 120 nm, 125 nm, 130 nm, 135 nm, 140 nm, 145 nm, 150 nm, 160 nm, 170 nm, 180 nm, 190 nm, 또는 200 nm의 평균 직경을 가지며, 실질적으로 비독성이다. 본 발명의 다른 바람직한 실시형태에서, 지질 나노입자는 약 50 nm 내지 약 300 nm, 또는 약 60 nm 내지 약 250 nm, 약 60 nm 내지 약 150 nm, 또는 약 60 nm 내지 약 120 nm, 또는 약 80 nm 내지 약 160, 또는 약 90 nm 내지 약 140 nm, 50 nm 내지 약 300 nm, 또는 약 60 nm 내지 약 250 nm, 또는 약 60 nm 내지 약 200 nm, 또는 약 70 내지 200 nm, 또는 약 75 nm 내지 약 160, 또는 약 100 nm 내지 약 140 nm, 또는 약 90 nm 내지 약 140 nm 범위의 유체역학적 직경을 갖는다.
본 발명의 지질 나노입자를 생성하는 본 명세서에 기재된 지질 부형제를 포함하는 조성물은 비교적 균질할 수 있다. 다분산 지수(polydispersity index, PDI)는 나노입자 조성물의 균질성, 예를 들어, 나노입자 조성물의 입자 크기 분포를 나타내기 위해 사용될 수 있다. 작은 (예를 들어, 0.3 미만) 다분산 지수는 일반적으로 좁은 입자 크기 분포를 나타낸다. 본 발명의 나노입자 조성물은 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.10, 0.11, 0.12, 0.13, 0.14, 0.15, 0.16, 0.17, 0.18, 0.19, 0.20, 0.21, 0.22, 0.23, 0.24, 0.25, 0.26, 0.27, 0.28, 0.29, 0.30, 0.31, 0.32, 0.33, 0.34 또는 0.35와 같은 약 0 내지 약 0.35의 다분산 지수를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 나노입자 조성물의 다분산 지수 (PDI)는 약 0.1 내지 약 0.2이다.
일반적으로 본 발명의 조성물과 관련된 다양한 선택적 특징, 선택 및 선호도가 본 명세서에 기재되어 있다. 이들 모두는 당해 기술분야에 의해 명백하게 이해되는 바와 같이 지질 나노입자에 적용된다. 유사하게, 옵션 및 선호도는 이러한 지질 나노입자를 포함하는 조성물에 적용된다.
예를 들어, 바람직한 실시형태 중 하나에 따른 지질 나노입자는 상기 정의된 양이온성 지질, DphyPE일 수 있는 중성 지질을 포함하며, 선택적으로 DHPC일 수 있는 제2 중성 지질, 콜레스테롤일 수 있는 스테로이드, 및 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜 (PEG-DMG)일 수 있는 폴리머 컨쥬게이트 지질과 선택적으로 조합될 수 있으며, 양이온성 지질은 선택적으로 표 1에 열거된 화합물로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, mRNA는 따라서 바람직하게는 액체 또는 반액체(semi-liquid) 조성물에 포함되며, mRNA는 바람직한 실시형태 중 하나에 따른 지질 나노입자와 복합화되거나 이와 회합된다. 즉, 바람직한 실시형태에서, 상기 액체 또는 반액체 조성물은 복합체를 포함하며, 이 복합체는 mRNA를 포함하고, 바람직하게는 본 명세서에 정의된 지질 나노입자로 존재한다.
각 부형제의 양과 관련하여, 양이온성 지질은 폴리머 컨쥬게이트 지질이 존재하는 몰량에 비하여 상대적으로 높은 몰량으로 지질 나노입자에, 또는 본 발명의 조성물에 혼입되는 것이 바람직하다. 또한, 양이온성 지질의 몰량은 바람직하게는 각각 조성물 또는 나노입자 내의 중성 지질의 몰량보다 높다. 더욱이, 스테로이드의 몰량은 선택적으로 폴리머 컨쥬게이트 지질의 몰량보다 높다.
특정 실시형태에서, 폴리머 컨쥬게이트 지질은 나노입자의 총 지질 함량에 대해 약 1 mol% 내지 약 10 mol%의 양으로 LNP에 존재한다. 일 실시형태에서, 폴리머 컨쥬게이트 지질은 약 1 mol% 내지 약 5 mol%의 양으로 LNP 내에 존재한다. 일 실시형태에서, 폴리머 컨쥬게이트 지질은 약 1 mol% 또는 약 1.5 mol%의 양으로 LNP 내에 존재한다.
다양한 실시형태에서, 폴리머 컨쥬게이트 지질에 대한 양이온성 지질 (예를 들어, 화학식 (Ⅰ)의 지질)의 몰비는 약 100:1 내지 약 25:1, 약 50:1 내지 약 25:1, 또는 약 40:1 내지 약 25:1이다.
특정 실시형태에서, LNP는 입자 형성 중에 입자 형성을 안정화시키는 일 이상의 추가적인 지질을 포함한다. 적합한 안정화 지질은 중성 지질 및 음이온성 지질을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 중성 지질에 대한 양이온성 지질 (예를 들어, 화학식 (Ⅰ)의 지질)의 몰비는 약 2:1 내지 약 8:1, 약 3:1 내지 약 7:1, 또는 약 4:1 내지 약 6:1이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 지질 나노입자가 전형적으로 부형제에 의해 형성되고, 나노입자를 함유하는 전체 조성물과 동일한 부형제의 정량적 비율을 반영하기 때문에, 본 발명의 조성물 중 지질 부형제의 몰량에 대한 언급은 조성물에 포함되는 지질 나노입자 중 각 부형제의 몰량을 기술하는 것으로 이해되어야 한다.
일반적으로, 조성물 (및 따라서 지질 나노입자) 중 양이온성 지질의 양은 조성물 (또는 나노입자) 중 모든 지질 부형제의 총 몰량에 대해 일반적으로 적어도 약 20 mol%이다. 다른 실시형태에서, 양이온성 지질의 양은 각각 적어도 약 25 mol%, 또는 적어도 30 mol%이다. 다른 바람직한 실시형태에서, 조성물 중 양이온성 지질의 양은 약 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 또는 70 mol% 같이, 각각 약 30 mol% 내지 약 70 mol%, 또는 약 40 mol% 내지 약 70 mol%, 또는 약 45 mol% 내지 약 65 mol%; 또는 각각 약 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 또는 60 mol%과 같이, 각각 약 40 mol% 내지 약 60 mol%이다.
조성물 중 스테로이드의 양은 선택적으로 적어도 약 10 mol%일 수 있으며, 또는 각각 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 또는 60 mol%와 같이, 각각 약 10 mol% 내지 약 60 mol%, 또는 약 20 mol% 내지 약 50 mol%, 또는 약 25 mol% 내지 약 45 mol%의 범위일 수 있다. 다시, 의심의 여지를 피하기 위하여, 몰 백분율(molar percentages)은 조성물 중 모든 지질 부형제의 총 몰량에 대한 것이다.
중성 지질은 선택적으로 적어도 약 5 mol%의 양으로 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 조성물 중 중성 지질의 양은 동일한 몰 백분율에 대한 기준을 사용하여, 각각 약 5 mol%, 6 mol%, 7 mol%, 8 mol%, 9 mol%, 10 mol%, 11 mol%, 12 mol%, 13 mol%, 14 mol%, 15 mol%, 16 mol%, 17 mol%, 18 mol%, 19 mol%, 20 mol%, 21 mol%, 22 mol%, 23 mol%, 24 mol% 또는 25 mol%와 같이, 각각 약 5 mol% 내지 약 25 mol%, 또는 약 5 mol% 내지 약 15 mol%, 또는 약 8 mol% 내지 약 12 mol%의 범위이다. 이 양은 총 중성 지질의 양이며, 즉, 이는 2개의 중성 지질, 예를 들어, DPhyPE 및 DHPC의 양으로부터 기인하는 총량일 수 있다.
조성물 또는 지질 나노입자 중 폴리머 컨쥬게이트 지질의 양은 예를 들어, 약 0.1 mol% 이상이 되도록 선택될 수 있다. 특정 실시형태에서, 폴리머 컨쥬게이트 지질의 양은 몰 백분율에 대한 기준으로 모든 지질 부형제의 총 몰량을 다시 사용하여, 각각 약 0.1, 0.3, 0.5, 1, 2, 3, 4 또는 5 mol%와 같이, 약 0.5 mol% 내지 약 5 mol%, 또는 약 1 mol% 내지 약 3 mol%의 범위이다. 다른 특정 실시형태에서, 조성물 또는 지질 나노입자는 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7 mol% 또는 7 mol% 초과의 폴리머 컨쥬게이트 지질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 폴리머 컨쥬게이트 지질 또는 페길화 지질의 함량은 제제의 전체 지질 함량의 약 1 내지 5 mol%이다. 비제한적 예로서, 지질 나노입자는 1.5%의 폴리머 컨쥬게이트 지질을 포함한다. 다른 비제한적 예로서, 지질 나노입자는 1.7%의 폴리머 컨쥬게이트 지질을 포함한다. 다른 비제한적 예로서, 지질 나노입자는 3%의 폴리머 컨쥬게이트 지질을 포함한다. 또 다른 예로서, 지질 나노입자는 5%의 폴리머 컨쥬게이트 지질을 포함한다.
일 실시형태에서, 조성물은 하기를 포함하는 지질 나노입자를 포함한다
(a) 30-70 mol% 양의 화학식 (Ⅰ)에 따른 또는 본 명세서에 기재된 양이온성 지질;
(b) 20-50 mol% 양의 스테로이드;
(c) 5-25 mol% 양의 중성 지질; 및
(d) 0.5-5 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
각각의 양은 지질 나노입자의 모든 지질 부형제의 총 몰량에 대한 것이다.
다른 실시형태에서, 조성물은 하기를 포함하는 지질 나노입자를 포함한다:
(a) 40-70 mol% 양의 화학식 (Ⅰ)에 따른 또는 본 명세서에 기재된 양이온성 지질;
(b) 20-50 mol% 양의 스테로이드;
(c) 5-15 mol% 양의 중성 지질; 및
(d) 0.5-5 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
각각의 양은 지질 나노입자의 모든 지질 부형제의 총 몰량에 대한 것이다.
일 실시형태에서, 조성물은 하기를 포함하는 지질 나노입자를 포함한다:
(a) 20-60 mol% 양의 화학식 (Ⅰ)에 따른 또는 본 명세서에 기재된 양이온성 지질;
(b) 25-55 mol% 양의 스테로이드;
(c) 5-25 mol% 양의 중성 지질; 및
(d) 0.5-15 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
각각의 양은 지질 나노입자의 모든 지질 부형제의 총 몰량에 대한 것이다.
추가적인 실시형태에서, 조성물은 하기를 포함하는 지질 나노입자를 포함한다:
(a) 45-65 mol% 양의 화학식 (Ⅰ)에 따른 또는 본 명세서에 기재된 양이온성 지질;
(b) 25-45 mol% 양의 스테로이드;
(c) 8-12 mol% 양의 중성 지질; 및
(d) 1-3 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
각각의 양은 지질 나노입자의 모든 지질 부형제의 총 몰량에 대한 것이다.
추가적인 바람직한 실시형태에서, 조성물은 하기를 포함하는 지질 나노입자를 포함한다:
(a) 45-65 mol% 양의 화학식 (Ⅰ)에 따른 또는 본 명세서에 기재된 양이온성 지질;
(b) 25-45 mol% 양의 콜레스테롤;
(c) 8-12 mol% 양의 중성 지질; 및
(d) 1-3 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
각각의 양은 지질 나노입자의 모든 지질 부형제의 총 몰량에 대한 것이다.
추가적인 바람직한 실시형태에서, 조성물은 하기를 함유하는 지질 나노입자를 포함한다:
(a) 45-65 mol% 양의 화학식 (Ⅰ)에 따른 또는 본 명세서에 기재된 양이온성 지질;
(b) 25-45 mol% 양의 콜레스테롤;
(c) 8-12 mol% 양의 DPhyPE 및 선택적으로 1 내지 10 mol% 양의 DHPC; 및
(d) 1-3 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
각각의 양은 지질 나노입자의 모든 지질 부형제의 총 몰량에 대한 것이다.
추가적인 바람직한 실시형태에서, 조성물은 하기를 함유하는 지질 나노입자를 포함한다:
(a) 45-65 mol% 양의 화학식 (Ⅰ)에 따른 또는 본 명세서에 기재된 양이온성 지질;
(b) 25-45 mol% 양의 콜레스테롤;
(c) 8-12 mol% 양의 DPhyPE 및 선택적으로 1 내지 10 mol% 양의 DHPC; 및
(d) 1-3 mol% 양의 PEG-DMG 2000;
각각의 양은 지질 나노입자의 모든 지질 부형제의 총 몰량에 대한 것이다.
이러한 실시형태에서, 양이온성 지질은 바람직하게는 본 명세서에 개시된 선호도 중 어느 하나에 따라 선택되는 화합물이다. 예를 들어, 양이온성 지질은 표 1에 열거된 화합물로부터 선택될 수 있다. 또한, 이러한 실시형태는 본 명세서에 개시된 선호도 중 어느 하나에 따라 선택되는 스테로이드, 중성 지질, 및/또는 폴리머 컨쥬게이트 지질을 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성물 또는 지질 나노입자를 인용하고, mol%-값이 각 부형제에 대해 제공되는 모든 실시형태에서, 각각의 양은 지질 나노입자의 모든 지질 부형제의 총 몰량에 대한 것으로 보여야 한다.
추가적인 바람직한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 또는 지질 나노입자는 59 mol%의 본 발명의 화학식 (Ⅰ)에 따른 양이온성 지질, 10 mol%의 중성 지질, 29.3 mol%의 스테로이드 및 1.7 mol%의 폴리머 컨쥬게이트 지질을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 또는 지질 나노입자는 59 mol%의 본 발명의 화학식 (Ⅰ)에 따른 양이온성 지질, 10 mol%의 DPhyPE, 29.3 mol%의 콜레스테롤 및 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 또는 지질 나노입자는 59 mol%의 본 발명의 화학식 (Ⅰ)에 따른 양이온성 지질, 10 mol%의 DPhyPE, 29.3 mol%의 콜레스테롤 및 1.7 mol%의 C10-PEG 2000을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 또는 지질 나노입자는 59 mol%의 본 발명의 화학식 (Ⅰ)에 따른 양이온성 지질, 10 mol%의 DPhyPE, 29.3 mol%의 콜레스테롤 및 1.7 mol%의 Cer8-PEG 2000을 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 또는 지질 나노입자는 47.4 mol%의 본 발명의 화학식 (Ⅰ)에 따른 양이온성 지질, 10 mol%의 중성 지질, 40.9 mol% 스테로이드 및 1.7 mol% 폴리머 컨쥬게이트 지질을 포함한다.
추가적인 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 또는 지질 나노입자는 47.4 mol%의 본 발명의 화학식 (Ⅰ)에 따른 양이온성 지질, 10 mol%의 DPhyPE, 40.9 mol%의 콜레스테롤 및 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 또는 지질 나노입자는 47.4 mol%의 본 발명의 화학식 (Ⅰ)에 따른 양이온성 지질, 10 mol%의 DPhyPE, 40.9 mol%의 콜레스테롤 및 1.7 mol%의 C10-PEG 2000을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 또는 지질 나노입자는 47.4 mol%의 본 발명의 화학식 (Ⅰ)에 따른 양이온성 지질, 10 mol%의 DPhyPE, 40.9 mol%의 콜레스테롤 및 1.7 mol%의 Cer8-PEG 2000을 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 또는 지질 나노입자는 59 mol%의 본 발명의 화학식 (Ⅰ)에 따른 양이온성 지질, 11 mol%의 중성 지질, 28.3 mol%의 스테로이드 및 1.7 mol%의 폴리머 컨쥬게이트 지질을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 또는 지질 나노입자는 59 mol%의 본 발명의 화학식 (Ⅰ)에 따른 양이온성 지질, 10 mol%의 DphyPE 및 1 mol%의 DHPC, 28.3 mol%의 콜레스테롤 및 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 또는 지질 나노입자는 59 mol%의 본 발명의 화학식 (Ⅰ)에 따른 양이온성 지질, 10 mol%의 DphyPE 및 1 mol%의 DHPC, 28.3 mol%의 콜레스테롤 및 1.7 mol%의 C10-PEG 2000을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 또는 지질 나노입자는 59 mol%의 본 발명의 화학식 (Ⅰ)에 따른 양이온성 지질, 10 mol%의 DphyPE 및 1 mol%의 DHPC, 29.3 mol%의 콜레스테롤 및 1.7 mol%의 Cer8-PEG 2000을 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 또는 지질 나노입자는 49 mol%의 본 발명의 화학식 (Ⅰ)에 따른 양이온성 지질, 20 mol%의 중성 지질, 29.3 mol%의 스테로이드 및 1.7 mol%의 폴리머 컨쥬게이트 지질을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 또는 지질 나노입자는 49 mol%의 본 발명의 화학식 (Ⅰ)에 따른 양이온성 지질, 10 mol%의 DphyPE 및 10 mol%의 DHPC, 29.3 mol%의 콜레스테롤 및 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 또는 지질 나노입자는 49 mol%의 본 발명의 화학식 (Ⅰ)에 따른 양이온성 지질, 10 mol%의 DphyPE 및 10 mol%의 DHPC, 29.3 mol%의 콜레스테롤 및 1.7 mol%의 C10-PEG 2000을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 또는 지질 나노입자는 49 mol%의 본 발명의 화학식 (Ⅰ)에 따른 양이온성 지질, 10 mol%의 DphyPE 및 10 mol%의 DHPC, 29.3 mol%의 콜레스테롤 및 1.7 mol%의 Cer8-PEG 2000을 포함한다.
부형제에 대하여 별개의 %-값을 갖는 특정 조성물 또는 지질 나노입자를 개시하는 이 섹션의 임의의 상기 실시형태에서, 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPhyPE)이 중성 지질로 언급되는 경우, 추가적인 실시형태에서, DPhyPE는 다른 중성 지질, 바람직하게 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPhyPC)와 교환될 수 있다. 더욱이, 부형제에 대하여 별개의 %-값을 갖는 특정 조성물 또는 지질 나노입자를 개시하는 이 섹션의 임의의 상기 실시형태에서, 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPhyPE)이 중성 지질로 언급되는 경우, 추가적인 실시형태에서, DPhyPE는 다른 중성 지질, 바람직하게 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC; 디올레오일포스파티딜콜린로도 지칭됨) 또는 대안적으로 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE)와 교환될 수 있다.
본 발명의 추가적인 특정 실시형태에 따른 추가적인 바람직한 지질 조성물은 본 명세서의 표 E에 개시된 바와 같은 적어도 4종의 지질 부형제를 포함한다. 예를 들어, 바람직한 지질 조성물은 양이온성 지질로서 "C1" (본 명세서의 표 1에 개시됨), 중성 지질로서 DPhyPE, 스테롤로서 콜레스테롤 및 폴리머 컨쥬게이트 지질 부형제로서 DMG-PEG 2000인, 라인 "E1"에 개시된 부형제를 포함한다. 다른 예로서, 바람직한 지질 조성물은 양이온성 지질로서 "C12" (본 명세서의 표 1에 개시됨), 중성 지질로서 DPhyPE, 스테롤로서 콜레스테롤 및 폴리머 컨쥬게이트 지질 부형제로서 C10-PEG 2000인, 라인 "E35"에 개시된 부형제를 포함한다.
[표 E: 본 발명의 바람직한 조성물에 대한 지질 부형제 조합 (Chol = 콜레스테롤; DMG-PEG2K = DMG-PEG 2000; C10-PEG2K = C10-PEG 2000; Cer8-PEG2K = Cer8-PEG 2000; 2개의 표로 분할된 표)]
Figure pct00123
Figure pct00124
Figure pct00125
Figure pct00126
또한, 본 발명의 조성물의 적어도 4종의 지질 부형제의 별개의 몰 백분율을 나타내는 본 발명의 바람직한 지질 제제가 표 F에 제시된다. 예를 들어, 바람직한 지질 조성물은 라인 "F1"에 개시된 지질의 몰 백분율을 포함하며, 즉 59 mol%의 이온성 지질, 29,3 mol%의 스테롤, 10 mol%의 중성 지질, 및 1,7 mol%의 폴리머 컨쥬게이트 지질을 포함한다. 다른 예로서, 바람직한 지질 조성물은 라인 "F31"에 개시된 지질의 몰 백분율을 포함하며, 즉, 45 mol%의 양이온성 지질, 43,5 mol%의 스테롤, 10 mol%의 중성 지질 및 1.5 mol%의 폴리머 컨쥬게이트 지질을 포함한다.
[표 F: 본 발명의 바람직한 조성물의 부형제에 대한 몰 백분율 (2개의 표로 분할된 표)]
Figure pct00127
Figure pct00128
** 자명하게, 표 F의 마지막 4개의 제제인 F57, F58, F59 및 F60의 합계 [mol%]는 100 mol%인 것으로 정의된다. 즉, 통상의 기술자는 자연적으로 4종의 부형제의 주어진 범위로부터 값을 선택할 수 있어, 본 발명의 바람직한 조성물의 각 부형제에 대한 몰 백분율의 합이 최대 100%가 되도록 한다.
따라서, 본 발명의 추가적인 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 부형제 조합 명칭
E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E8, E9, E10, E11, E12, E13, E14, E15, E16, E17, E18, E19, E20, E21, E22, E23, E24, E25, E26, E27, E28, E29, E30, E31, E32, E33, E34, E35, E36, E37, E38, E39, E40, E41, E42, E43, E44, E45, E46, E47, E48, E49, E50, E51, E52, E53, E54, E55, E56, E57, E58, E59, E60, E61, E62, E63, E64, E65, E66, E67, E68, E69, E70, E71, E72, E73, E74, E75, E76, E77, E78, E79, E80, E81, E82, E83, E84, E85, E86, E87, E88, E89, E90, E91, E92, E93, E94, E95, E96, E97, E98, E99, E100, E101, E102, E103, E104, E105, E106, E107 및 E108;
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 표 E에 개시된 부형제를
제제 명칭:
F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8, F9, F10, F11, F12, F13, F14, F15, F16, F17, F18, F19, F20, F21, F22, F23, F24, F25, F26, F27, F28, F29, F30, F31, F32, F33, F34, F35, F36, F37, F38, F39, F40, F41, F42, F43, F44, F45, F46, F47, F48, F49, F50, F51, F52, F53, F54, F55, F56, F57, F58, F59, F60, F61 및 F62
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 표 F에 개시된 별개의 몰 백분율로 포함한다.
본 발명의 지질 나노입자에 대한 특히 바람직한 실시형태는 표 E 및 표 F에 따른 조합 F1×E23이 지질 나노입자를 제제화하기 위하여 이용되는 경우, 즉, 59 mol%의 표 1에 개시된 양이온성 지질 C23, 즉, COATSOME® SS-EC (실시예 부분으로부터 명백한 바와 같이 이전 명칭 SS-33/4PE-15; NOF Corporation, Tokyo, Japan), 스테로이드로서 29.3 mol%의 콜레스테롤, 중성 지질/인지질로서 10 mol%의 DPhyPE 및 폴리머 컨쥬게이트 지질로서 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000이 이용되는 경우 제공된다. 상기 LNP 조성물은 본 명세서 및 실시예에서 "GN01"로 지칭된다. SS-EC는 pH 4에서 양전하를 갖고, pH 7에서 중성 전하를 가지며, 이는 본 발명의 LNP 및 제제/조성물에 유리하다. "GN01"에 있어서, N/P (지질 대 mRNA 몰비)는 바람직하게 14이며, 총 지질/mRNA 질량비는 바람직하게 약 20 내지 약 60이며, 더욱 바람직하게 약 30 내지 약 50이며, 가장 바람직하게 40 (m/m)이다.
본 발명의 지질 나노입자에 대한 추가적인 특히 바람직한 실시형태는 표 E 및 표 F에 따른 조합 F1×E2가 지질 나노입자를 제제화하기 위하여 이용되는 경우, 즉, 양이온성 지질로서 59 mol%의 표 1에 개시된 C2 지질 (즉, 실시예 부분, 도 1b로부터 명백한 바와 같이 HEXA-C5DE-PipSS), 스테로이드로서 29.3 mol%의 콜레스테롤, 중성 지질/인지질로서 10 mol%의 DPhyPE 및 폴리머 컨쥬게이트 지질로서 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000이 이용되는 경우 제공된다. 상기 LNP 조성물은 본 명세서 및 실시예에서 "GN02"로 지칭된다. "GN02"에 있어서, N/P (지질 대 mRNA 몰비)는 바람직하게 17.5이며, 총 지질/mRNA 질량비는 바람직하게 약 20 내지 약 60이며, 더욱 바람직하게 약 30 내지 약 50이며, 가장 바람직하게 40 (m/m)이다.
본 발명의 지질 나노입자에 대한 다른 특히 바람직한 실시형태는 표 E 및 표 F에 따른 조합 F1×E23이 지질 나노입자를 제제화하기 위하여 이용되는 경우, 즉, 59 mol%의 표 1에 개시된 양이온성 지질 C23, 즉, COATSOME® SS-EC (실시예 부분으로부터 명백한 바와 같이 이전 명칭 SS-33/4PE-15; NOF Corporation, Tokyo, Japan), 스테로이드로서 26 mol%의 콜레스테롤, 중성 지질/인지질로서 10 mol%의 DPhyPE 및 더 짧은 알킬 사슬을 포함하는 폴리머 컨쥬게이트 지질로서 5 mol%의 Cer8이 이용되는 경우 제공된다. 상기 LNP 조성물은 본 명세서 및 실시예에서 "GN01-C8"로 지칭된다. "GN01-C8"에 있어서, N/P (지질 대 mRNA 몰비)는 바람직하게 14이며, 총 지질/mRNA 질량비는 바람직하게 약 20 내지 약 60이며, 더욱 바람직하게 약 30 내지 약 50이며, 가장 바람직하게 40 (m/m)이다.
본 발명의 지질 나노입자에 대한 추가적인 특히 바람직한 실시형태는 표 E 및 표 F에 따른 조합 F1×E72가 지질 나노입자를 제제화하기 위하여 이용되는 경우, 즉, 양이온성 지질로서 표 1에 개시된 59 mol%의 C26 지질 (즉, 실시예 부분, 도 25a에서 명백한 바와 같이 THIOETER), 스테로이드로서 29.3 mol%의 콜레스테롤, 중성 지질/인지질로서 10 mol%의 DPhyPE 및 폴리머 컨쥬게이트 지질로서 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000이 이용되는 경우 제공된다. 상기 LNP 조성물은 본 명세서 및 실시예에서 "LNP28"로 지칭된다. "LNP28"에 있어서, N/P (지질 대 mRNA 몰비)는 바람직하게 14이며, 총 지질/mRNA 질량비는 바람직하게 약 20 내지 약 60이며, 더욱 바람직하게 약 30 내지 약 50이며, 가장 바람직하게 40 (m/m)이다.
더욱이, 바람직한 조성물에 있어서,
(ⅰ) 양이온성 지질은 표 1의 화합물로부터 선택될 수 있으며; 및/또는
(ⅱ) 중성 지질 또는 중성 인지질은, 선택적으로 1,2-디헵타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DHPC)과 조합된, 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPhyPE; 1,2-디-(3,7,11,15-테트라메틸헥사데카노일)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민로도 지칭됨), 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPhyPC), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC; 디올레오일포스파티딜콜린로도 지칭됨), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DPPC, 디팔미토일포스파티딜콜린로도 지칭됨), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 포스파티딜에탄올아민, 디스테아로일포스파티딜콜린, 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 (DOPEA), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린 (POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민 (POPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPPE), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-1-카르복실레이트 (DOPE-mal), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DMPE), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민 (DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민 (DMPE), 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DLoPE), 디스테아로일-포스파티딜에탄올아민 (DSPE), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (POPE), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DLPE), 16-O-모노메틸포스포에탄올아민, 16-O-디메틸 포스파티딜에탄올아민, 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DEPE), 18-1-트랜스 포스파티딜에탄올아민, 1-스테아로일-2-올레오일포스파티딜에탄올아민 (SOPE), 1,2-디스쿠알레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSQPE), 1,2-디엘라이도일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (트랜스DOPE), 1-스테아로일-2-리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (SLPE), 1-트리데카노일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린 (소듐 염), 1-올레오일-2-하이드록시-sn-글리세로-3-포스포-L-세린 (소듐 염), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린 (소듐 염) (POPS), 1-1-스테아로일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린 (소듐 염), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린 (소듐 염) (DOPS), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린 (소듐 염), 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린 (소듐 염), 1-O-헥사데카닐-2-O-(9Z-옥타데세닐)-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스파티딜콜린 또는 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 1,2-디-O-피타닐-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민, 1-팔미토일-2-콜레스테릴헤미석시노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (PChemsPC), 1,2-디콜레스테릴헤미석시노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DChemsPC), 2-((2,3-비스(올레오일옥시)프로필)디메틸암모니오)에틸 수소 포스페이트 (DOCP), 2-((2,3-비스(올레오일옥시)프로필)디메틸암모니오)에틸 에틸 포스페이트 (DOCPe), 및 1-O-옥타데실-2-O-메틸-sn-글리세로-3-포스포콜린 (Edelfosine)로 이루어진 군으로부터 선택되는 즈비터 이온성 화합물이며; 및/또는
(ⅲ) 폴리머 컨쥬게이트 지질은 페길화 디아실글리세롤 지질 (PEG-DAG); 페길화 세라마이드 지질 (PEG-Cer); 페길화 포스파티딜에탄올아민 지질 (PEG-PE); 페길화 석시네이트 디아실글리세롤 지질 (PEG-S-DAG); 페길화 디알콕시프로필카바메이트 지질; 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜 ("PEG-DMG" 또는 "DMG-PEG"); 1,2-디카프릴-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌 글리콜 (C10 디아실글리세롤 PEG); N-옥타노일-스핑고신-1-석시닐[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)] (PEG-세라마이드8 또는 PEG-Cer8); 4-O-(2',3'-디(테트라데카노일옥시)프로필-1-O-(ω-메톡시(폴리에톡시)에틸)부탄디오에이트 (PEG-S-DMG); 2-mPEG2000-n,n 디테트라데실아세트아미드; N-[(메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)2000)카바밀]-1,2-디미리스틸옥시프로필-3-아민 (PEG-c-DMA); ω-메톡시(폴리에톡시)에틸-N-(2,3디(테트라데칸옥시)프로필)카바메이트; 및 2,3-디(테트라데칸옥시)프로필-N-(ω-메톡시(폴리에톡시)에틸)카바메이트로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
대안적으로, 조성물은 고체 형태로 제공될 수 있다. 특히, 이는 멸균 액체 담체로 재구성하기 위한 멸균 고체 조성물로 제공될 수 있으며, 고체 조성물은 이 경우 pH 조정제, 증량제(bulking agents), 안정화제, 비이온성 계면활성제 및 항산화제로 이루어진 군으로부터 선택되는 일 이상의 비활성 성분을 더 포함할 수 있다. 이 실시형태에서, 멸균 액체 담체는 바람직하게 수성 담체이다.
나노입자 조성물의 제타 전위는 조성물의 동전기적 전위를 나타내기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 제타 전위는 나노입자 조성물의 표면 전하를 설명할 수 있다. 본 발명에 따른 지질 나노입자는 음전하 및 양전하를 띤 화합물 모두의 존재로 인해 비교적 중성인 제타 전위를 나타낼 수 있다. 제타 전위(때때로 "전하"로 약칭됨)는 예를 들어 Malvern Zetasizer Nano(Malvern Instruments Ltd.; Malvern, UK)를 사용하여, 예를 들어, 동적 광 산란 및 레이저 도플러 마이크로전기영동(Laser Doppler Microelectrophoresis)에 의해 입자의 입자 크기와 함께 결정될 수 있다. 지질 나노입자에서 하전된 화합물의 양 및 성질에 따라, 나노입자는 제타 전위에 의해 특징지워질 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 제타 전위는 약 -50 mV 내지 약 +50 mV 범위이다. 다른 바람직한 실시형태에서, 제타 전위는 약 -25 mV 내지 약 +25 mV 범위이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 지질 나노입자의 제타 전위는 약 -10 mV 내지 약 +20 mV, 약 -10 mV 내지 약 +15 mV, 약 -10 mV 내지 약 +10 mV, 약 -10 mV 내지 약 +5 mV, 약 -10 mV 내지 약 0 mV, 약 -10 mV 내지 약 -5 mV, 약 -5 mV 내지 약 +20 mV, 약 -5 mV 내지 약 +15 mV, 약 -5 mV 내지 약 +10 mV, 약 -5 mV 내지 약 +5 mV, 약 -5 mV 내지 약 0 mV, 약 0 mV 내지 약 +20 mV, 약 0 mV 내지 약 +15 mV, 약 0 mV 내지 약 +10 mV, 약 0 mV 내지 약 +5 mV, 약 +5 mV 내지 약 +20 mV, 약 +5 mV 내지 약 +15 mV, 또는 약 +5 mV 내지 약 +10 mV일 수 있다.
특정 실시형태에서, LNP는 LNP를 세포 또는 세포 집단에 표적화할 수 있는 일 이상의 표적화 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 표적화 모이어티는 LNP를 세포 표면에서 발견되는 수용체로 안내하는 리간드이다.
특정 실시형태에서, LNP는 일 이상의 내재화(internalization) 도메인을 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, LNP는 LNP의 내재화를 유도하기 위하여 세포에 결합하는 일 이상의 도메인을 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 일 이상의 내재화 도메인은 LNP의 수용체-매개 흡수를 유도하기 위하여 세포 표면에서 발견되는 수용체에 결합한다. 특정 실시형태에서, LNP는 생체 내 생체분자에 결합할 수 있으며, 여기에서 LNP-결합된 생체분자는 내재화를 유도하기 위하여 세포-표면 수용체에 의해 인식될 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, LNP는 전신 ApoE에 결합하여, LNP 및 관련 화물의 흡수를 초래한다. 본 발명의 특정 실시형태에서, ApoE는 사용된 배지 또는 약학 조성물에 보충될 수 있다.
바람직하게, 일 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 생물학적 활성 성분을 더 포함한다.
생물학적 활성 성분
본 명세서에서 사용된 생물학적 활성 성분은 생물학적 활성을 갖는 임의의 화합물 또는 물질을 의미하며, 그로 인해 그 화합물 또는 물질은 동물과 같은 대상, 특히 인간 대상에서, 질병 또는 상태의 예방, 관리, 개선, 치료 또는 요법에 잠재적으로 유용하다.
바람직한 일 실시형태에서, 활성 성분은 핵산 화합물이다. 본 발명을 수행하는데 잠재적으로 유용한 핵산 화합물의 예는 화학적으로 변형되거나 또는 변형되지 않은 메신저 RNA (mRNA), 화학적으로 변형되거나 또는 변형되지 않은 RNA, 단일 가닥 또는 이중 가닥 RNA, 코딩 또는 비코딩 RNA, 바이러스 RNA, 레플리콘 RNA, 및 자가 복제 RNA, 또는 그 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 화합물을 포함하며, 바람직하게 생물학적 활성 성분은 mRNA이다.
바람직한 실시형태에서, 핵산 화합물은 일 이상의 지질 (예를 들어, 양이온성 지질 및/또는 중성 지질)과 복합화되거나 회합되어, 리포솜, 지질 나노입자(LNP), 리포플렉스, 및/또는 나노리포솜을 형성한다. 이러한 맥락에서, 용어 "복합화되는(complexed)" 또는 "회합되는(associated)"는 공유 결합 없이 더 큰 복합체 또는 어셈블리로의 일 이상의 지질과 제1 측면의 핵신 화합물의 본질적으로 안정한 조합을 나타낸다.
특정 실시형태에서, 활성 성분은 CRISPR 엔도뉴클레아제와 함께, CRISPR RNA (crRNA) + 트레이서(tracer) RNA (tracrRNA), 가이드 RNA (gRNA) 또는 단일 가이드 RNA (sgRNA) 및/또는 도너 DNA를 포함할 수 있다. 적합하게는, CRISPR 엔도뉴클레아제는 단백질 또는 폴리펩타이드로서, 또는 상기 CRISPR 엔도뉴클레아제를 코딩하는 mRNA로서 제공될 수 있다. 이 조합을 포함하는 조성물 또는 제제는 표적 세포에 CRISPR 유전자 편집 활성(gene editing activity)을 전달하는데 적합하다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따른 조성물은 개별적, 순차적, 또는 동시 투여를 위해, gRNA 및 CRISPR 엔도뉴클레아제를 코딩하는 mRNA를 제공할 수 있다. 즉, gRNA 및 mRNA는 본 발명에 따른 동일한 제제 또는 지질 나노입자 내에 제공될 수 있거나, 또는 개별적, 동시 또는 순차적 투여를 위하여 별도의 지질 나노입자 내에 제공될 수 있다. 적절하게는 투여를 위한 mRNA에 대한 gRNA의 비율은 1:1, 1:3, 1:9, 1:19, 예를 들어 (즉, 가이드 RNA의 50%, 25%, 10% 및 5%)이다. 일 실시형태에서, gRNA 및 cas9과 같은 CRISPR 엔도뉴클레아제를 코딩하는 mRNA는 본 발명에 따른 제제에 공동 로딩(co-loading)된다. 유리하게, 공동 로딩은 더 나은 캡슐화 효율(encapsulation efficiency, EE)을 얻을 수 있도록 한다. 적합하게, gRNA 및 mRNA가 공동 로딩된 본 발명에 따른 제제 또는 약학적 조성물은 80 내지 160 nm의 평균 직경을 갖는 LNP를 포함한다. 일 실시형태에서, gRNA는 변형된 gRNA 서열일 수 있다. 적합한 변형은, 예를 들어 WO2016/089433 및 PCT/GB2016/053312에 기재되어 있다. 다른 적합한 변형은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 익숙할 것이다.
"CRISPR 엔도뉴클레아제"는 CRISPR 유전자 편집 조성물에 이용될 수 있는 엔도뉴클레아제를 의미한다. 적합한 "CRISPR 엔도뉴클레아제"는 cas9 및 그의 돌연변이 및 변형된 형태를 포함한다. 따라서, gRNA와 조합하여 사용하기 위한 mRNA는 CRISPR 엔도뉴클레아제, 바람직하게 cas9을 코딩하는 mRNA이다. 다른 "CRISPR 엔도뉴클레아제"는 예를 들어, cpf1을 포함한다. 통상의 기술자는 gRNA가 특정 "CRISPR 엔도뉴클레아제"와 쌍을 이룬다는 것을 알 것이다. 따라서, 본 발명은 적합한 gRNA/엔도뉴클레아제 쌍을 이용하는 조성물을 고려한다. 적합하게, gRNA는 표적 유전자에 특이적이며, 바람직하게 표적 유전자는 간 질병과 관련된 유전자이다.
다른 실시형태에서, 핵산 화합물에 의해 발현되는 펩타이드 또는 단백질은 치료 단백질, 또는 그 단편 또는 변이체이며, 여기에서 치료 단백질은 임의의 선천 또는 후천 질병의 치료 또는 예방에 유익하거나, 또는 개체의 상태를 개선한다. 특히, 치료 단백질은 다른 기능 중에서도, 유전자 결함을 수정 및 복구하고, 암세포 또는 병원체 감염 세포를 파괴하고, 면역 시스템 장애를 치료 또는 예방하거나, 대사 또는 내분비 장애를 치료 또는 예방할 수 있는 새로운 치료제의 설계에서 핵심적인 역할을 한다.
다른 실시형태에서, 핵산 화합물에 의해 발현되는 펩타이드 또는 단백질은 항원이다. 본 명세서에서 상기에 보다 상세하게 정의된 바와 같이, 항원은 항원 특이적 면역 반응을 유발하는 것과 같이, 면역 시스템, 바람직하게는 적응 면역 시스템에 의해 인식될 수 있는 화합물 또는 물질이다.
일부 실시형태에서, 활성 성분은 siRNA이다. siRNA는 예를 들어, 국제특허출원 PCT/EP03/08666에 기재된 바와 같은 작은 간섭(interfering) RNA이다. 이들 분자는 일반적으로 왓슨-크릭 염기쌍 형성(Watson-Crick base-pairing)에 의해 매개되는, 서로 염기쌍을 형성할 수 있는, 즉, 서로 본질적으로 상보적인 15 내지 25개, 바람직하게 18 내지 23개 뉴클레오타이드를 포함하는 이중 가닥 RNA 구조로 이루어진다. 이 이중 가닥 RNA 분자의 하나의 가닥은 표적 핵산, 바람직하게 mRNA에 본질적으로 상보적인 반면, 상기 이중 가닥 RNA 분자의 제2 가닥은 상기 표적 핵산의 스트레치와 본질적으로 동일하다. siRNA 분자는 반드시 서로 염기쌍일 필요는 없는, 다수의 추가적인 뉴클레오타이드에 의해 각각의 측면 및 각각의 스트레치에 플랭킹될 수 있다(flanked).
일부 실시형태에서, 활성 성분은 RNAi이다. RNAi는 siRNA와 본질적으로 동일한 디자인을 갖지만, 분자는 siRNA에 비하여 상당히 길다. RNAi 분자는 일반적으로 각각 50개 이상의 뉴클레오타이드 및 염기쌍을 포함한다.
일부 실시형태에서, 활성 성분은 안티센스 핵산(antisense nucleic acid)이다. 본 명세서에서 바람직하게 사용되는 안티센스 핵산은 표적 RNA, 바람직하게 mRNA와의 염기 상보성을 기반으로 혼성화되어, RNAeH를 활성화시킨다. RNAeH는 포스포디에스테르 및 포스포티오에이트-결합 DNA에 의해 활성화된다. 그러나, 포스포디에스테르-결합 DNA은 세포 뉴클레아제에 의해 빠르게 분해되지만, 포스포티오에이트-결합 DNA는 그렇지 않다. 따라서, 안티센스 폴리뉴클레오타이드는 DNA-RNA 혼성화 복합체로서만 효과적이다. 안티센스 핵산의 바람직한 길이는 16 내지 23개 뉴클레오타이드 범위이다. 이러한 유형의 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 대한 예는 무엇보다도 US 특허 5,849,902 및 US 특허 5,989,912에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 활성 성분은 리보자임(ribozyme)이다. 리보자임은 바람직하게는 기본적으로 2개의 모이어티를 포함하는 RNA로 이루어지는 촉매적 활성 핵산(catalytically active nucleic acids)이다. 제1 모이어티는 촉매 활성을 나타내는 반면, 제2 모이어티는 표적 핵산과의 특이적 상호작용에 책임이 있다. 표적 핵산과 상기 리보자임의 상기 모이어티 사이의 상호작용 시, 일반적으로 2개의 혼성화 가닥 상의 염기의 본질적인 상보적 스트레치의 혼성화 및 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해, 촉매적 활성 모이어티는 활성으로 될 수 있으며, 이는 리보자임의 촉매 활성이 포스포에스테라제 활성인 경우 표적 핵산을 분자 내 또는 분자 간 절단하는 것을 의미한다. 리보자임, 용도 및 설계 원칙은 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, Doherty and Doudna (Annu. Ref. Biophys. Biomolstruct. 2000; 30: 457-75)에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 활성 성분은 압타머(aptamer)이다. 압타머는 단일 가닥 또는 이중 가닥이며, 표적 분자와 특이적으로 상호작용하는 D-핵산이다. 압타머의 제조 또는 선택은 예를 들어, 유럽 특허 EP 0 533 838에 기재되어 있다. RNAi, siRNA, 안티센스-뉴클레오타이드 및 리보자임과 달리, 압타머는 표적 mRNA를 분해하지 않지만, 단백질과 같은 표적 화합물의 2차 및 3차 구조와 특이적으로 상호작용한다. 표적과 상호작용할 때, 표적은 일반적으로 그 생물학적 활성의 변화를 보인다. 압타머의 길이는 일반적으로 적게는 15개 내지 많게는 80개의 뉴클레오타이드의 범위이며, 바람직하게 약 20 내지 약 50개의 뉴클레오타이드 범위이다.
일부 실시형태에서, 활성 성분은 스피겔머(spiegelmer)이다. 스피겔머는 예를 들어, 국제특허출원 WO 98/08856에 기재되어 있다. 스피겔머는 압타머와 유사한 분자이다. 그러나, 스피겔머는 압타머와 달리 D-뉴클레오타이드가 아닌 L-뉴클레오타이드로 완전히 또는 대부분 이루어진다. 그렇지 않으면, 특히 스피겔머의 가능한 길이와 관련하여, 압타머와 관련하여 설명된 바와 동일하게 스피겔머에 적용된다.
mRNA
바람직한 일 실시형태에서, 핵산 화합물은 mRNA 또는 mRNA 화합물이다. 본 발명자들에 의해 발견된 바와 같이, 본 발명의 지질 및 조성물은 항원을 발현하는 mRNA 화합물의 생체 내 전달에 특히 적합하며, 따라서 적당한 비용으로 신속하게 개발될 수 있는 매우 효과적이고, 강력하고, 다목적이며, 안전한 백신을 가능하게 한다. 본 발명을 수행하기 위한 특정 관심 항원은 하기에 더 상세하게 기재된다. 본 발명에 따른 mRNA 화합물은 지질 나노입자 내에 캡슐화되거나, 또는 회합된다.
지질 나노입자(LNP)에 포함되는 적어도 하나의 항원성 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 mRNA의 이점은 다음과 같다:
- 강한 체액 면역 반응의 유도
- B-세포 기억의 유도
- 면역 보호의 빠른 개시
- 유도된 면역 반응의 긴 수명(Longevity)
- 광범위한 세포 T 세포 반응의 유도
- (국소 및 일과성) 전염증성(pro-inflammatory) 환경의 유도
- 전신 사이토카인 또는 케모카인 반응을 유도하지 않음
- 우수한 내약성, 부작용 없음, 무독성
- 유리한 안정성 특성
- 많은 상이한 항원과 호환되는 제형: 동일한 (생산) 기술을 기반으로 더 큰 항원 칵테일(antigen cocktails) 가능
- 벡터 면역 없음, 즉, 기술을 사용하여 다중 (상이한) 항원에 대하여 동일한 대상에게 여러 번 백신 접종할 수 있다
- 생산 속도, 적응성, 단순성 및 확장성
특정 실시형태에서, 지질 나노입자는 적어도 다음을 포함한다
(ⅰ) 본 명세서에 정의된 양이온성 지질 및/또는 폴리머 컨쥬게이트 지질; 및
(ⅱ) 항원성 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 mRNA 서열을 포함하는 mRNA 화합물.
다른 특정 실시형태에서, 지질 나노입자 조성물은 하기를 포함한다:
(a) 본 명세서에 기재된 화학식 (Ⅰ)에 따른 양이온성 지질;
(b) 스테로이드;
(c) 중성 지질;
(d) 폴리머 컨쥬게이트 지질, 여기에서 상기 폴리머 컨쥬게이트 지질은 본 명세서에 기재된 화학식 (Ⅱ)에 따른 화합물임; 및
(e) 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 mRNA 화합물.
양이온성 지질, 스테로이드, 중성 지질, 폴리머 컨쥬게이트 지질, 및 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 mRNA 화합물과 관련하여, 상기 본 명세서에서 이러한 특징에 관하여 기재된 것과 동일한 옵션, 선호도 및 대안이 적용된다. 예를 들어, 바람직한 일 실시형태에서, mRNA 화합물에 의해 발현되는 펩타이드 또는 단백질은 항원이다.
지질 나노입자 중 mRNA 화합물의 양에 대한 양이온성 지질의 양은 중량비 (예를 들어, "m/m"로 약칭됨)로 표현될 수 있다. 예를 들어, 지질 나노입자는 약 20 내지 약 60, 또는 약 10 내지 약 50 범위의 지질 대 mRNA 중량비를 달성하도록 하는 양으로 mRNA 화합물을 포함한다. 다른 실시형태에서, 질량비는 약 30 내지 약 50의 범위이다. 다른 실시형태에서, 핵산 또는 mRNA에 대한 양이온성 지질의 비는 약 5 내지 약 13, 약 4 내지 약 8, 또는 약 7 내지 약 11과 같은, 약 3 내지 약 15의 범위이다. 본 발명의 매우 바람직한 실시형태에서, 총 지질/mRNA 질량비는 약 40 또는 40, 즉, mRNA 캡슐화를 보장하기 위하여 약 40 또는 40 배의 질량 과량(mass excess)이다. 다른 바람직한 RNA/지질 비는 약 1 내지 약 10, 약 2 내지 약 5, 약 2 내지 약 4, 또는 바람직하게 약 3이다.
또한, 양이온성 지질의 양은 mRNA 화합물과 같은 핵산 화물의 양을 고려하여 선택될 수 있다. 일 실시형태에서, N/P 비는 약 1 내지 약 50 범위일 수 있다. 다른 실시형태에서, 범위는 약 1 내지 약 20, 약 1 내지 약 10, 약 1 내지 약 5이다. 바람직한 일 실시형태에서, 이러한 양은 지질 나노입자 또는 조성물의 N/P 비가 약 10 내지 약 20 범위가 되도록 선택될 수 있다. 추가적인 매우 바람직한 실시형태에서, N/P는 14이다 (즉, mRNA 캡슐화를 보장하기 위한 양전하의 14배 몰 과량). 다른 매우 바람직한 실시형태에서, N/P는 17,5이다 (즉, mRNA 캡슐화를 보장하기 위한 양전하의 17.5배 몰 과량).
이러한 맥락에서, N/P 비는 생물학적 활성 화물로서 지질 나노입자 내에 혼입되거나 이와 회합하는 핵산의 포스페이트기 ("P")에 대한 양이온성 지질의 염기성 질소 함유 기의 질소 원자 ("N")의 몰비로 정의된다. N/P 비는 예를 들어, RNA가 염기의 통계학적 분포를 나타내는 경우, 1 ㎍ RNA가 일반적으로 약 3 nmol 포스페이트 잔기를 함유한다는 것을 기반으로 계산될 수 있다. 양이온성 지질 또는 리피도이드의 "N"-값은 그 분자량 및 양이온성 기의 상대적 함량에 기초하여 계산될 수 있다. 하나를 초과하는 양이온성 지질이 존재하는 경우, N-값은 지질 나노입자에 포함된 모든 양이온성 지질을 기준으로 계산되어야 한다.
지질 나노입자 중 mRNA의 총량은 변화하며, mRNA 대 총 지질 w/w 비에 따라 정의될 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, mRNA 총 지질 비는 0.06 w/w 미만, 바람직하게 0.03 및 0.04 w/w 미만이다.
바람직하게, mRNA 화합물 또는 그의 코딩 서열은 약 50 내지 약 20000개, 또는 100 내지 약 20000개 뉴클레오타이드, 바람직하게 약 250 내지 약 20000개 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게 약 500 내지 약 10000개, 더욱더 바람직하게 약 500 내지 약 5000개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다.
언급된 바와 같이, mRNA 화합물에 의해 발현되는 펩타이드 또는 단백질은 항원일 수 있다. 다르게 말하면, 조성물은 항원성 펩타이드 또는 단백질, 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체를 코딩하는 mRNA 서열을 포함하는 mRNA 화합물을 포함한다. 그러한 항원, 또는 항원성 펩타이드 또는 단백질은 바람직하게는 본 명세서에 정의된 바와 같은 병원성 항원, 종양 항원, 알레르기 항원 또는 자가면역 자가-항원, 또는 그의 단편 또는 변이체로부터 유래될 수 있다.
병원성 항원
병원성 항원은 대상, 특히 포유동물 대상, 더욱 특히 인간에 의해 면역학적 반응을 유발하는 병원성 유기체, 특히 박테리아, 바이러스 또는 원생동물 (다세포) 병원성 유기체로부터 유래된다. 더욱 구체적으로, 병원성 항원의 바람직하게 표면 항원, 예를 들어, 바이러스 또는 박테리아 또는 원생동물 유기체의 표면에 위치하는 단백질(또는 단백질의 단편, 예를 들어, 표면 항원 외부 부분)이다.
따라서, 일부 바람직한 실시형태에서, 인공 핵산 (RNA) 분자는 그의 하나 이상의 코딩 영역에서 박테리아, 바이러스, 진균 또는 원생동물 항원으로부터 선택되는 적어도 하나의 병원성 항원을 코딩할 수 있다. 코딩된 (폴리-)펩타이드 또는 단백질은 병원성 항원 또는 그의 단편, 변이체 또는 유도체로 이루어지거나, 이를 포함할 수 있다.
병원성 항원은 전체적으로 참조로 본 명세서에 포함되는 WO 2018/078053 A1의 21-35페이지에 개시된 병원체로부터 유래된 항원 그룹으로부터 바람직하게 선택되지만 이에 제한되는 것은 아닌 감염성 질병과 관련된 병원체로부터 바람직하게 유래되는 펩타이드 또는 단백질 항원이다. 더욱이, 병원성 항원은 전체적으로 참조로 본 명세서에 포함되는 WO 2019/077001 A1의 57페이지 3단락에서 63페이지 2단락에 개시된 병원체로부터 유래된 항원 그룹으로부터 바람직하게 선택되지만 이에 제한되는 것은 아닌 감염성 질병과 관련된 병원체로부터 바람직하게 선택되는 펩타이드 또는 단백질 항원이다.
추가적인 병원성 항원은 바람직하게는 WO 2013120628 A1의 32페이지 26라인 내지 34페이지 27라인에 개시된 병원체로부터 선택되지만 이에 제한되는 것은 아닌 병원체로부터 유래되는 항원으로부터 바람직하게 선택되는 감염성 질병과 관련된 병원체로부터 바람직하게 유래되는 펩타이드 또는 단백질 항원이다. 더욱이 이와 관련하여, 병원성 항원 (감염성 질병과 관련된 병원체로부터 유래되는 항원)은 전체적으로 참조로 본 명세서에 포함되는 WO 2013120628 A1의 34페이지 29라인 내지 59페이지 5라인(괄호 안에는 항원(들)이 유도된 특정 병원체 또는 병원체 패밀리 및 병원체와 관련된 감염성 질병이 있음)에 개시된 항원 그룹으로부터 바람직하게 선택되나 이에 제한되는 것은 아닌 항원으로부터 바람직하게 선택될 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 mRNA 화합물에 의해 발현되는 바람직한 항원 중에서, SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 부니아 바이러스목 바이러스(Bunyavirales virus), 사이토메갈로바이러스 (Cytomegalovirus, CMV), 뎅기열 바이러스 (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4), 에볼라 바이러스(Ebola virus), 플라비바이러스(Flavivirus), B형 간염 바이러스 (HBV), 단순 포진 바이러스 (Herpes simplex virus, HSV), 인간 면역 결핍 바이러스 (Human immunodeficiency virus, HIV), 인간 메타뉴모바이러스 (Human metapneumovirus, hMPV), 인간 유두종 바이러스 (Human Papilloma virus, HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스 (Human parainfluenza viruses, HPIV), 인플루엔자 바이러스, 장외 병원성 대장균(extraintestinal pathogenic E. coli), 라사 맘마레나바이러스 (Lassa mammarenavirus, LASV), 메르스 코로나바이러스(MERS coronavirus), 결핵균(Mycobacterium tuberculosis), 니파 바이러스(Nipah virus), 노로바이러스(Norovirus), 광견병 바이러스(Rabies virus), 호흡기 세포 융합 바이러스 (Respiratory syncytial virus, RSV), 라이노바이러스(Rhinovirus), 로타 바이러스(Rota virus), 백시니아 바이러스(Vaccinia virus), 황열병 바이러스(Yellow Fever Virus), 지카 바이러스(Zika virus), 클라미디아 트라코마티스 (Chlamydia trachomatis, 즉, 클라미디아를 일으키는 클라미디아 박테리아), 및 말라리아 기생충 (Malaria parasites, 예를 들어, 열대열 말라리아 원충(Plasmodium falciparum), 삼일열 말라리아 원충(Plasmodium vivax), 사일열 말라리아 원충(Plasmodium malariae), 또는 난형 말라리아 원충(Plasmodium ovale))으로 이루어진 군으로부터 선택되나, 이에 제한되는 것은 아닌 병원체이다. 다른 하나의 바람직한 실시형태에서, 병원성 항원은 SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 말라리아 기생충, 인플루엔자 바이러스 또는 광견병 바이러스로부터 유래된다.
또한, 병원성 항원은 더욱 바람직하게 아시네토박터 바우만니(Acinetobacter baumannⅱ), 아나플라즈마 속(Anaplasma genus), 아나플라즈마 파고사이토필리움(Anaplasma phagocytophilum), 브라질 구충(Ancylostoma braziliense), 두비니 구충(Ancylostoma duodenale), 용혈성 아카노박테리아균(Arcanobacterium haemolyticum), 회충(Ascaris lumbricoides), 아스퍼질러스 속(Aspergillus genus), 아스트로바이러스 (Astroviridae), 바베스열원충 속(Babesia genus), 탄저균(Bacillus anthracis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바르토넬라 헨셀라에(Bartonella henselae), BK 바이러스, 블라스토시스티스 호미니스(Blastocystis hominis), 블라스토미세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 보르데텔라 백일해(Bordetella pertussis), 보렐리아 부르그도페리(Borrelia burgdorferi), 보렐리아 속(Borrelia genus), 보렐리아 종(Borrelia spp), 부르셀라 속(Brucella genus), 말레이사상충(Brugia malayi), 분야바이러스 과(Bunyaviridae family), 버크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia) 및 다른 버크홀데리아 종, 버크홀데리아 말레이(Burkholderia mallei), 버크홀데리아 슈도말레이(Burkholderia pseudomallei), 칼리시바이러스 과(Caliciviridae family), 캄포일러박터 속(Campylobacter genus), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 종(Candida spp), 클라미디아 트라코마티스, 클라미디아 폐렴균(Chlamydophila pneumoniae), 클라미도필라 프시타시(ChlamydophilPSittaci), CJD 프리온(prion), 간흡충(Clonorchis sinensis), 클로스트리디움 보툴리늄(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile), 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 종(Clostridium spp), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 콕시디오이데스 종(Coccidioides spp), 코로나바이러스, 코리데박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae), 콕시엘라 부르네티(Coxiella burnetii), 크림-콩고 출혈열 바이러스(Crimean-Congo haemorrhagic fever virus), 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 크립토스포리디움 속(Cryptosporidium genus), 사이토메갈로바이러스 (CMV), 이핵 아메바(Dientamoeba fragilis), 에볼라바이러스 (EBOV - 예를 들어 엔벨로프 당단백질), 에키노코쿠스 속(Echinococcus genus), 에를리키아 샤펜시스(Ehrlichia chaffeensis), 에를리키아 에인지(Ehrlichia ewingii), 에를리키아 속(Ehrlichia genus), 이질아메바(Entamoeba histolytica), 엔테로코쿠스 속(Enterococcus genus), 엔테로바이러스 속, 엔테로바이러스(Enteroviruses), 주로 콕사키 A 바이러스(Coxsackie A virus) 및 엔테로바이러스 71 (EV71), 표피사상균 종(Epidermophyton spp), 엡스타인-바 바이러스 (Epstein-Barr Virus, EBV), 대장균 01 57:H7, 01 1 1 및 O1 04:H4, 간질(Fasciola hepatica) 및 거대간질(Fasciola gigantica), FFI 프리온, 고양이 면역 결핍 바이러스 (FIV), 사상충 상과(Filarioidea superfamily), 플라비바이러스, 야토병균(Francisella tularensis), 푸소박테리움 속(Fusobacterium genus), 게오트리쿰 칸디덤(Geotrichum candidum), 지알디아편모충(Giardia intestinalis), 악구충 속(Gnathostoma spp), GSS 프리온, 구아나리토 바이러스(Guanarito virus), 헤모필루스 듀크레이(Haemophilus ducreyi), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae, 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 헤니파바이러스(Henipavirus)(헨드라 바이러스 니파 바이러스), A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스 (HBV), C형 간염 바이러스 (HCV), D형 간염 바이러스, E형 간염 바이러스, 히스토플라스마 카프술라툼(Histoplasma capsulatum), 호르테이 웨르넥키(Hortaea werneckii), 인간 보카바이러스 (HBoV), 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV), 일본 뇌염 바이러스, JC 바이러스, 후닌 바이러스(Junin virus), 킨젤라 킨가에(Kingella kingae), 클렙시에라 그래뉼로마키스(Klebsiella granulomatis), 쿠루(Kuru) 프리온, 라사 바이러스(Lassa virus), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 리슈마니아 속(Leishmania genus), 렙토스피라 속(Leptospira genus), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 림프구성 맥락수막염 바이러스(Lymphocytic choriomeningitis virus, LCMV), 마츄포 바이러스(Machupo virus), 말라세지아 종(Malassezia spp), 마버그 바이러스(Marburg virus), 홍역 바이러스(Measles virus), 메타고니무스 요코가와(Metagonimus yokagawai), 마이크로스포리디아 필룸(Microsporidia phylum), 전염성 연속종 바이러스(Molluscum contagiosum virus, MCV), 유행성이하선염 바이러스(Mumps virus), 미코박테리움 레프라에(Mycobacterium leprae) 및 미코박테리움 레프로마토시스(Mycobacterium lepromatosis), 결핵균, 미코박테리움 울세란스(Mycobacterium ulcerans), 미코플라즈마 폐렴(Mycoplasma pneumoniae), 네글레리아 파울러리(Naegleria fowleri), 아메리카 구충(Necator americanus), 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아 메닌지티스(Neisseria meningitidis), 노카디아 아스테로이드(Nocardia asteroides), 노카디아 종(Nocardia spp), 회선사상충(Onchocerca volvulus), 오리엔티아 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi), 올소믹비리다에 과(오르토믹소비리데 과)/ (인플루엔자), 파라콕시디오이디즈 브라질리엔시스(Paracoccidioides brasiliensis), 폐흡충 종(Paragonimus spp), 웨스터만 폐흡충(Paragonimus westermani), 파보바이러스 B19, 파스퇴렐라 속(Pasteurella genus), 플라스모디움 속(Plasmodium genus), 폐포자충(Pneumocystis jirovecii), 폴리오바이러스(Poliovirus), 라이노바이러스, 라이노바이러스, 리케치아 아키리(Rickettsia akari), 리케치아 속(Rickettsia genus), 리케치아 프로와제키(Rickettsia prowazekii), 리케치아 리케트시(Rickettsia rickettsii), 리케치아 티피(Rickettsia typhi), 리프트 계곡열 바이러스(Rift Valley fever virus), 로타바이러스 (바람직하게 예를 들어, VP8 항원), 루벨라 바이러스(Rubella virus), 사비아 바이러스(Sabia virus), 살로넬라 속(Salmonella genus), 옴진드기(Sarcoptes scabiei), SARS 코로나바이러스, 주혈흡충 속(Schistosoma genus), 이질균 속(Shigella genus), 신 놈브레 바이러스(Sin Nombre virus), 한타바이러스(Hantavirus), 스포로트릭스 센키(Sporothrix schenckii), 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus genus), 스트렙토코쿠스 아갈락티에treptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스 뉴모니에(Streptococcus pneumoniae), 스트렙토코쿠스 파이로젠(Streptococcus pyogenes), 분선충(Strongyloides stercoralis), 타에니아 속(Taenia genus), 타에니아 솔리움(Taenia solium), 진드기 매개 뇌염 바이러스(Tick-borne encephalitis virus, TBEV), 개회충(Toxocara canis) 또는 고양이 회충(Toxocara cati), 톡소포자충(Toxoplasma gondii), 트레포네마 팔리듐(Treponema pallidum), 트리키넬라 스피랄리스(Trichinella spiralis), 트리코모나스 바지날리스(Trichomonas vaginalis), 트리코파이톤 종(Trichophyton spp), 편충(Trichuris trichiura), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 유레아플라즈마 유레아티쿰(Ureaplasma urealyticum), 백시니아 바이러스 (바람직하게 예를 들어, 면역 회피 단백질(immune evasion proteins) E3, K3, 또는 B18), 수두 대상포진 바이러스(Varicella zoster virus, VZV), 대두창(Variola major) 또는 소두창(Variola minor), vCJD 프리온, 베네수엘라 말뇌염 바이러스(Venezuelan equine encephalitis virus), 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae), 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus), 서부 말뇌염 바이러스(Western equine encephalitis virus), 반크로프트 사상충(Wuchereria bancrofti), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 여시니아 페스티스(Yersinia pestis), 및 여시니아 슈도투베르쿨로시스(Yersinia pseudotuberculosis), 지카 바이러스, 지카SPH2015-브라질, Z1106033-수리남, MR766-우간다 또는 Natal RGN, 또는 이들 단백질의 동형 단백질, 동족체, 단편, 변이체 또는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되나 이에 제한되는 것은 아닌 병원체로부터 유래되는 항원으로부터 선택될 수 있다. 특히 바람직한 병원성 항원은 병원체 SARS 코로나바이러스, 특히 SARS 코로나바이러스의 스파이크 단백질 (S)로부터 유래되는 항원이다.
추가적인 실시형태에서, 감염 치료에 유용한 병원성 항원은 하기 항원으로부터 선택될 수 있다 (관련 감염 및 관련 병원체는 각각의 항원 뒤에 괄호 내에 표시됨 - 자연적으로, 괄호 내의 하기 병원체로부터 유래될 수 있는 다른 항원도 본 발명에 따라 유래되고 이용될 수 있다):
- 스파이크 단백질 (S), 외피 단백질 (E), 막 단백질 (M) 또는 뉴클레오캡시드(nucleocapsid) 단백질 (N), 또는 이들 중 임의의 것의 면역원성 단편 또는 변이체 (감염성 질병은 "COVID-19 질병"; 병원체: SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV));
- 스파이크 단백질 (S), 스파이크 S1 단편 (S1), 외피 단백질 (E), 막 단백질 (M) 또는 뉴클레오캡시드 단백질 (N) (감염성 질병은 메르스 감염; 병원체: 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스 (메르스 코로나바이러스/메르스-CoV));
- 복제(replication) 단백질 E1, 조절(regulatory) 단백질 E2, 단백질 E3, 단백질 E4, 단백질 E5, 단백질 E6, 단백질 E7, 단백질 E8, 주요 캡시드(capsid) 단백질 L1, 부캡시드(minor capsid) 단백질 L2 (감염성 질병은 인간 유두종바이러스 (HPV) 감염; 병원체: 인간 유두종바이러스 (HPV) 또는 HPV16);
- 융합 단백질 F, 헤마클루티닌-뉴라미다제(hemagglutinin-neuramidase) HN, 당단백질 G, 매트릭스 단백질 M, 포스포단백질 P, 뉴클레오단백질 N, 폴리머라제 L, 헤마클루티닌-뉴라미니다제(hemagglutinin-Neuraminidase), 융합 (F) 당단백질 F0, F1 또는 F2, 재조합 PIV3/PIV1 융합 당단백질 (F) 및 헤마클루티닌 (HN), C 단백질, 포스포단백질, D 단백질, 매트릭스 단백질 (M), 뉴클레오캡시드 단백질 (N), 바이러스 레플리카제(replicase) (L), 비구조(non-structural) V 단백질 (감염성 질병은 인간 파라인플루엔자 바이러스 감염; 병원체: 인간 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV / PIV) hPIV-1, hPIV-2, hPIV-3, 또는 hPIV-4 혈청형(serotype), 바람직하게 hPIV-3 혈청형, 바람직하게 PIV3);
- 융합 (F) 당단백질, 당단백질 G, 포스포단백질 P, 뉴클레오단백질 N, 뉴클레오캡신 단백질 (감염성 질병: hMPV 감염; 병원체: 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV));
- 헤마클루티닌 (HA), 뉴라미니다제 (NA), 뉴클레오단백질 (NP), M1 단백질, M2 단백질, NS1 단백질, NS2 단백질 (NEP 단백질: 핵외 수송 단백질(nuclear export protein)), PA 단백질, PB1 단백질 (폴리머라제 베이직 1 단백질(polymerase basic 1 protein)), PB1-F2 단백질 및 PB2 단백질, H10N8, H7N9, H10, H1N1, H3N2 (X31), H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, H17, H18, HA의 항원성 서브도메인: HA1, HA2, 뉴라미니다제 (NA), 뉴클레오단백질 (NP), 매트릭스 단백질 1 (M1), 매트릭스 단백질 2 (M2), 비구조 단백질 1 (NS 1), 비구조 단백질 2 (NS2), HA7 항원, H7 또는 H10 및 B, 병원체: 오르토믹소비리데 과(Orthomyxoviridae family), 인플루엔자 바이러스 (플루));
- 뉴클레오단백질 N, 대형 구조 단백질 L, 포스포단백질 P, 매트릭스 단백질 M, 당단백질 G, G 단백질 (감염성 질병은 광견병; 병원체: 광견병 바이러스);
- HIV p24 항원, HIV 외피 단백질 (Gp120, Gp41, Gp160), 폴리단백질 GAG, 음성 인자 단백질 Nef, 전사 Tat의 트랜스 활성인자, Brec1 (감염성 질병 HIV; 병원체: 인간 면역 결핍 바이러스);
- 주요 외막 단백질(major outer membrane protein) MOMP, 프라버블 외막 단백질(probable outer membrane protein) PMPC, 외막 복합체 단백질(outer membrane complex protein) B OmcB, 열 쇼크 단백질(heat shock proteins) Hsp60 HSP10, 단백질 IncA, Ⅲ형 분비계로부터의 단백질, 리보뉴클레오타이드 환원효소 소쇄 단백질(ribonucleotide reductase small chain protein) NrdB, 플라스미드 단백질 Pgp3, 클라미디아 외막 단백질(chlamydial outer protein) N CopN, 항원 CT521, 항원 CT425, 항원 CT043, 항원 TC0052, 항원 TC0189, 항원 TC0582, 항원 TC0660, 항원 TC0726, 항원 TC0816, 항원 TC0828 (감염성 질병: 클라미디아 트라코마티스에 의한 감염; 병원체: 클라미디아 트라코마티스);
- pp65 항원, 막 단백질 pp15, 캡시드 근위 피막(capsid-proximal tegument) 단백질 pp150, 단백질 M45, DN폴리머라제 UL54, 헬리카제 UL105, 당단백질 gM, 당단백질 gN, 당단백질 H, 당단백질 B gB, 단백질 UL83, 단백질 UL94, 단백질 UL99, gH gL, gB, gO, gN, 및 gM로부터 선택되는 HCMV 당단백질, UL83, UL123, UL128, UL130 및 UL131A로부터 선택되는 HCMV 단백질, 피막(Tegument) 단백질 pp150 (pp150), 피막 단백질 pp65/로워 매트릭스 포스포단백질(lower matrix phosphoprotein) (pp65), 외피 당단백질 M (UL100), 조절 단백질 IE1 (UL123), 외피단백질 (UL128), 외피 당단백질 (130), 외피단백질 (UL131A), 외피 당단백질 B (UL55), 구조 당단백질 N gpUL73 (UL73), 구조 당단백질 O gpUL74 (UL74) (감염성 질병은 사이토메갈로바이러스 감염; 병원체: 사이토메갈로바이러스 (CMV/HCMV));
- 캡시드 단백질 C, 전막(premembrane) 단백질 prM, 막 단백질 M, 외피 단백질 E (도메인 I, 도메인 Ⅱ, 도메인 Ⅱ), 단백질 NS1, 단백질 NS2A, 단백질 NS2B, 단백질 NS3, 단백질 NS4A, 단백질 2K, 단백질 NS4B, 단백질 NS5 (감염성 질병 뎅기열; 병원체: 뎅기열 바이러스 (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4));
- EBOV 당단백질 (GP), 표면 EBOV GP, 야생형 EBOV pro-GP, 성숙 EBOV GP, 분비된 야생형 EBOV pro-GP, 분비된 성숙 EBOV GP, EBOV 뉴클레오단백질 (NP), RNA 폴리머라제 L, 및 VP35, VP40, VP24, 및 VP30로부터 선택되는 EBOV 매트릭스 단백질 (감염성 질병: 에볼라; 병원체: 에볼라 바이러스);
- B형 간염 표면 항원 HBsAg, B형 간염 코어 항원 HbcAg, 폴리머라제, 단백질 Hbx, preS2 중간 표면 단백질, 표면 단백질 L, 대형 S 단백질, 바이러스 단백질 VP1, 바이러스 단백질 VP2, 바이러스 단백질 VP3, 바이러스 단백질 VP4 (감염성 질병은 B형 간염; 병원체: B형 간염 바이러스 (HBV));
- 융합단백질 F, F 단백질, 뉴클레오단백질 N, 매트릭스 단백질 M, 매트릭스 단백질 M2-1, 매트릭스 단백질 M2-2, 포스포단백질 P, 소형 소수성 단백질 SH, 주요 표면 당단백질 G, 폴리머라제 L, 비구조 단백질 1 NS1, 비구조 단백질 2 NS2, RSV 부착 단백질 (G) (당단백질 G), 융합 (F) 당단백질 (당단백질 F), 뉴클레오단백질 (N), 포스포단백질 (P), 대형 폴리머라제 단백질 (L), 매트릭스 단백질 (M, M2), 소형 소수성 단백질 (SH), 비구조 단백질 1 (NS1), 비구조 단백질 2 (NS2), 막-결합 RSV F 단백질, 막-결합 DS-Cavl (안정화된 융합전 RSV F 단백질) (감염성 질병은 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV)에 의한 감염; 병원체: 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV));
- 분비성 항원 SssA (스타필로코쿠스 속, 스타필로코쿠스 식중독); 분비성 항원 SssA (스타필로코쿠스 속, 예를 들어, 아우레우스, 스타필로코쿠스 감염); 분자 샤프론(molecular chaperone) DnaK, 세포 표면 지질 단백질 Mpt83, 지질 단백질 P23, 포스페이트 수송계 침투효소 단백질(phosphate transport system permease protein) pstA, 14 kDa 항원, 피브로넥틴 결합 단백질(fibronectin-binding protein) C FbpC1, 알라닌 탈수소효소(Alanine dehydrogenase) TB43, 글루타민 합성효소(Glutamine 합성효소) 1, ESX-1 단백질, 단백질 CFP10, TB10.4 단백질, 단백질 MPT83, 단백질 MTB12, 단백질 MTB8, Rpf 유사 단백질, 단백질 MTB32, 단백질 MTB39, 크리스탈린(crystallin), 열 쇼크 단백질 HSP65, 단백질 PST-S (감염성 질병은 결핵; 병원체: 결핵균);
- 게놈 폴리단백질, 단백질 E, 단백질 M, 캡시드 단백질 C, 프로테아제 NS3, 단백질 NS1, 단백질 NS2A, 단백질 AS2B, 단백질 NS4A, 단백질 NS4B, 단백질 NS5 (감염성 질병은 황열병; 병원체: 황열병 바이러스);
- 포자소체 단백질 (circumsporozoite protein, CSP) (감염성 질병은 말라리아; 병원체: 열대열원충(P. falciparum) 및 삼일열 말라리아 원충(P. vivax)); 및
- WO 2017/140905 A1에 따른 지카 바이러스 단백질, 즉, 지카 바이러스 캡시드 단백질 (C), 지카 바이러스 전막 단백질 (prM), 지카 바이러스 pr 단백질 (pr), 지카 바이러스 막 단백질 (M), 지카 바이러스 외피 단백질 (E), 지카 바이러스 비구조 단백질, ZIKV prME 항원, ZIKV 캡시드 단백질, 전막/막 단백질, ZIKV 외피 단백질, ZIKV 비구조 단백질 1, ZIKV 비구조 단백질 2A, ZIKV 비구조 단백질 2B, ZIKV 비구조 단백질 3, ZIKV 비구조 단백질 4A, ZIKV 비구조 단백질 4B, ZIKV 비구조 단백질 5, 또는 전체적으로 참조로 본 명세서에 포함되는 WO 2017/140905 A1에 따라 도메인 Ⅱ의 융합 루프(fusion loop)가 돌연변이된 지카 바이러스 외피 단백질 (E) (감염성 질병은 지카 바이러스 감염; 병원체: 지카 바이러스);
본 발명의 일부 실시형태에서, 대상에서 항원 특이적 면역 반응을 유도하는 방법이 제공되며, 이는 항원 특이적 면역 반응을 생성하기에 효과적인 양으로 본 명세서에 제공된 임의의 RNA (예를 들어, mRNA)를 대상에게 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, RNA (예를 들어, mRNA) 백신은 SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 부니아 바이러스목 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뎅기열 바이러스 (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4), 에볼라 바이러스, 플라비바이러스, B형 간염 바이러스 (HBV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 인간 유두종 바이러스 (HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV), 인플루엔자 바이러스, 장외 병원성 대장균, 라사 맘마레나바이러스 (LASV), 메르스 코로나바이러스, 결핵균, 니파 바이러스, 노로바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 라이노바이러스, 로타 바이러스, 백시니아 바이러스, 황열병 바이러스, 지카 바이러스, 클라미디아 트라코마티스 (즉, 클라미디아를 일으키는 클라미디아 박테리아), 및 말라리아 기생충 (예를 들어, 열대열 말라리아 원충, 삼일열 말라리아 원충, 사일열 말라리아 원충, 또는 난형 말라리아 원충)이다. 다른 하나의 바람직한 실시형태에서, 병원성 항원은 SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 말라리아 기생충, 인플루엔자 바이러스 또는 광견병 바이러스 백신으로부터 유래된다. 다른 실시형태에서, RNA (예를 들어, mRNA) 백신은 COVID-19, 광견병, 인플루엔자 또는 말라리아 백신이다.
일부 실시형태에서, RNA (예를 들어, mRNA) 백신은 인플루엔자 백신의 조합(광범위한 스펙트럼의 인플루엔자 백신)을 포함하는 혼합 백신(combination vaccine)이다. 일부 실시형태에서, 항원- 특이적 면역 반응은 T 세포 반응 또는 B 세포 반응을 포함한다.
일부 실시형태에서, 항원 특이적 면역 반응을 생성하는 방법은 대상에게 SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 부니아 바이러스목 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뎅기열 바이러스 (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4), 에볼라 바이러스, 플라비바이러스, B형 간염 바이러스 (HBV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 인간 유두종 바이러스 (HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV), 인플루엔자 바이러스, 장외 병원성 대장균, 라사 맘마레나바이러스 (LASV), 메르스 코로나바이러스, 결핵균, 니파 바이러스, 노로바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 라이노바이러스, 로타 바이러스, 백시니아 바이러스, 황열병 바이러스, 지카 바이러스, 클라미디아 트라코마티스 (즉, 클라미디아를 일으키는 클라미디아 박테리아), 및 말라리아 기생충 (예를 들어, 열대열 말라리아 원충, 삼일열 말라리아 원충, 사일열 말라리아 원충, 또는 난형 말라리아 원충)의 단일 용량(즉, 부스터 용량은 없음)을 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 다른 하나의 바람직한 실시형태에서, 병원성 항원은 본 발명의 SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 말라리아 기생충, 인플루엔자 바이러스 또는 광견병 바이러스 (예를 들어, mRNA) 백신으로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 방법은 대상에게 SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 부니아 바이러스목 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뎅기열 바이러스 (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4), 에볼라 바이러스, 플라비바이러스, B형 간염 바이러스 (HBV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 인간 유두종 바이러스 (HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV), 인플루엔자 바이러스, 장외 병원성 대장균, 라사 맘마레나바이러스 (LASV), 메르스 코로나바이러스, 결핵균, 니파 바이러스, 노로바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 라이노바이러스, 로타 바이러스, 백시니아 바이러스, 황열병 바이러스, 지카 바이러스, 클라미디아 트라코마티스 (즉, 클라미디아를 일으키는 클라미디아 박테리아), 및 말라리아 기생충 (예를 들어, 열대열 말라리아 원충, 삼일열 말라리아 원충, 사일열 말라리아 원충, 또는 난형 말라리아 원충)의 제2 (부스터) 용량을 투여하는 것을 더 포함한다. 다른 하나의 바람직한 실시형태에서, 병원성 항원은 SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 말라리아 기생충, 인플루엔자 바이러스 또는 광견병 바이러스 RNA (예를 들어, mRNA) 백신으로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 대상은 백신의 제1 또는 제2 (부스터) 용량 후에 적어도 80% (예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%)의 혈청 전환율(seroconversion rate)을 나타낸다. 혈청 전환이 발생한 후, 바이러스는 항체에 대한 혈액 테스트에서 검출될 수 있다. 감염 또는 면역화 중에, 항원은 혈액으로 들어가고, 면역 시스템은 반응에서 항체를 생성하기 시작한다. 혈청 전환 전에, 항원 자체는 검출될 수도 있고, 검출되지 않을 수도 있으나, 항체는 없는 것으로 간주된다. 혈청 전환 중에, 항체는 존재하지만 아직 검출할 수 없다. 혈청 전환 후 언제든지, 항체는 혈액에서 검출될 수 있으며, 이는 이전 또는 현재의 감염을 나타낸다. 일부 실시형태에서, RNA (예를 들어, mRNA) 백신은 피부 내 주사, 근육 내 주사, 또는 비강 내 투여에 의해 대상에게 투여된다. 일부 실시형태에서, RNA (예를 들어, mRNA) 백신은 근육 내 주사에 의해 대상에게 투여된다.
본 개시내용의 일부 실시형태는 SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 부니아 바이러스목 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뎅기열 바이러스 (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4), 에볼라 바이러스, 플라비바이러스, B형 간염 바이러스 (HBV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 인간 유두종 바이러스 (HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV), 인플루엔자 바이러스, 장외 병원성 대장균, 라사 맘마레나바이러스 (LASV), 메르스 코로나바이러스, 결핵균, 니파 바이러스, 노로바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 라이노바이러스, 로타 바이러스, 백시니아 바이러스, 황열병 바이러스, 지카 바이러스, 클라미디아 트라코마티스 (즉, 클라미디아를 일으키는 클라미디아 박테리아), 및 말라리아 기생충 (예를 들어, 열대열 말라리아 원충, 삼일열 말라리아 원충, 사일열 말라리아 원충, 또는 난형 말라리아 원충)을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 항원 특이적 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 다른 하나의 바람직한 실시형태에서, 병원성 항원은 대상에서 항원 특이적 면역 반응을 생성하기에 효과적인 양으로 SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 말라리아 기생충, 인플루엔자 바이러스 또는 광견병 바이러스 RNA (예를 들어, mRNA) 백신으로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 대상에서 항원 특이적 면역 반응은 항체의 역가(본 명세서에 개시된 SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 부니아 바이러스목 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뎅기열 바이러스 (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4), 에볼라 바이러스, 플라비바이러스, B형 간염 바이러스 (HBV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 인간 유두종 바이러스 (HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV), 인플루엔자 바이러스, 장외 병원성 대장균, 라사 맘마레나바이러스 (LASV), 메르스 코로나바이러스, 결핵균, 니파 바이러스, 노로바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 라이노바이러스, 로타 바이러스, 백시니아 바이러스, 황열병 바이러스, 지카 바이러스, 클라미디아 트라코마티스 (즉, 클라미디아를 일으키는 클라미디아 박테리아), 또는 말라리아 기생충 (예를 들어, 열대열 말라리아 원충, 삼일열 말라리아 원충, 사일열 말라리아 원충, 또는 난형 말라리아 원충) RNA (예를 들어, mRNA) 백신을 대상에게 투여한 후, 항체 역가(SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 부니아 바이러스목 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뎅기열 바이러스 (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4), 에볼라 바이러스, 플라비바이러스, B형 간염 바이러스 (HBV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 인간 유두종 바이러스 (HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV), 인플루엔자 바이러스, 장외 병원성 대장균, 라사 맘마레나바이러스 (LASV), 메르스 코로나바이러스, 결핵균, 니파 바이러스, 노로바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 라이노바이러스, 로타 바이러스, 백시니아 바이러스, 황열병 바이러스, 지카 바이러스, 클라미디아 트라코마티스 (즉, 클라미디아를 일으키는 클라미디아 박테리아), 또는 말라리아 기생충 (예를 들어, 열대열 말라리아 원충, 삼일열 말라리아 원충, 사일열 말라리아 원충, 또는 난형 말라리아 원충) RNA (예를 들어, mRNA) 에 결합하는 항체의 역가에 대하여)를 분석함으로써 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상에서 생성된 항-항원성 폴리펩타이드 항체 역가는 대조군에 비해 적어도 1 log 증가된다. 일부 실시형태에서, 대상에서 생성된 항-항원성 폴리펩타이드 항체 역가는 대조군에 비해 1-3 log 증가된다.
종양 항원
추가적인 바람직한 실시형태에서, mRNA를 포함하는 mRNA 화합물은 바람직하게 본 명세서에 정의된 바와 같은 종양 항원, 또는 그 단편 또는 변이체를 코딩하며, 여기에서 종양 항원은 바람직하게는 전체적으로 참조로 본 명세서에 포함되는 WO 2018/078053 A1 47-51페이지에 개시된 종양 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
더욱이, 본 발명, 특히 암 치료에 유용한, 사이토카인, 케모카인, 자살 효소(suicide enzyme) 및 유전자 산물, 아포토시스 유도제, 내인성 혈관신생 억제제(endogenous angiogenesis inhibitors), 열 쇼크 단백질, 종양 항원, 선천적 면역 활성화제(innate immune activators), 전체적으로 참조로 본 명세서에 포함되는 WO 2016/170176의 표 1, 표 2, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6, 표 7, 표 8, 표 9, 표 10, 표 11 및 표 12의 종양 또는 암 발달과 관련된 단백질에 종양 항체로부터 선택되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
치료 단백질 및 임의의 선천성 또는 후천성 질병의 치료 또는 예방을 위한 용도
추가적인 실시형태에서, 활성 성분은 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 핵산 화합물이며, 여기에서 적어도 하나의 코딩 서열은 펩타이드 또는 단백질을 코딩하며, 여기에서 단백질은 치료 단백질, 또는 치료 단백질의 단편 또는 변이체이다. 이러한 맥락에서, 치료 펩타이드, 단백질 또는 그의 단편은 동물과 같은 대상, 특히 인간 대상에서 질병 또는 상태의 예방, 관리, 개선, 치료 또는 요법에 유용한 임의의 펩타이드 화합물일 수 있다.
따라서, 일 실시형태에서, 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 mRNA는 하기를 코딩할 수 있다:
(a) 펩타이드 또는 단백질, 또는 그 단편 또는 변이체, 여기에서 펩타이드 또는 단백질은 항원이며, 여기에서 항원은 바람직하게 병원성 항원, 종양 항원, 알레르기 항원 또는 자가면역 자가-항원, 또는 그 단편 또는 변이체로부터 유래되며; 또는
(b) 치료 단백질 또는 그 단편 또는 변이체. 치료 단백질은 예를 들어, 하기로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
(ⅰ) 대사, 내분비 또는 아미노산 장애의 치료를 위한 효소 대체 요법(enzyme replacement therapy)에 사용하거나, 또는 부재, 결핍 또는 돌연변이 단백질을 대체하는 데 사용하기 위한 치료 단백질;
(ⅱ) 혈액 장애, 순환계 질병, 호흡계 질병, 감염성 질병 또는 면역 결핍의 치료에 사용하기 위한 치료 단백질;
(ⅲ) 암 또는 종양 질병의 치료에 사용하기 위한 치료 단백질;
(ⅳ) 호르몬 대체 요법(hormone replacement therapy)에 사용하기 위한 치료 단백질
(ⅴ) 체세포를 다능성 또는 전능성 줄기 세포(pluri- or omnipotent 스템 cells)로 재프로그래밍하는데 사용하기 위한 치료 단백질;
(ⅵ) 보조제 또는 면역 자극제로 사용하기 위한 치료 단백질;
(ⅶ) 치료 항체인 치료 단백질;
(ⅷ) 유전자 편집제인 치료 단백질; 및
(ⅸ) 간 섬유증, 간경변 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 간 질병을치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 치료 단백질.
특정 실시형태에서, 치료 단백질, 또는 그의 단편 또는 변이체는 하기로부터 선택된다:
산 스핑고미엘리나제(Acid sphingomyelinase), 아디포타이드(Adipotide), 아갈시다제-베타(Agalsidase-beta), 아글루코시다제(Alglucosidase), 알파-갈락토시다제 A(alpha-galactosidase A), 알파-글루코시다제(alpha-glucosidase), 알파-L-이두로니다제(alpha-L-iduronidase), 알파-N-아세틸글루코사미니다제(alpha-N-acetylglucosaminidase), 암피레귤린(Amphiregulin), 안지오포이에틴(Angiopoietins) (Ang1, Ang2, Ang3, Ang4, ANGPTL2, ANGPTL3, ANGPTL4, ANGPTL5, ANGPTL6, ANGPTL7), ATPase, Cu(2+)-수송 베타 폴리펩타이드 (ATP7B), 아르기니노석시네이트 합성효소 (argininosuccinate synthetase, ASS1), 베타셀룰린(Betacellulin), 베타-글루쿠로니다제(Beta-glucuronidase), 골형성 단백질(Bone morphogenetic proteins) BMPs (BMP1, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP10, BMP15), CLN6 단백질, 표피 성장 인자 (Epidermal growth factor, EGF), 에피젠(Epigen), 에피레귤린(Epiregulin), 섬유아세포 성장 인자(Fibroblast Growth Factor) (FGF, FGF-1, FGF-2, FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, FGF-10, FGF-11, FGF-12, FGF-13, FGF-14, FGF-16, FGF-17, FGF-17, FGF-18, FGF-19, FGF-20, FGF-21, FGF-22, FGF-23), 푸마릴아세토아세테이트 가수분해효소 (Fumarylacetoacetate Hydrolase, FAH), 갈설파제(Galsulphase), 그렐린(Ghrelin), 글루코세레브로시다제(Glucocerebrosidase), GM-CSF, 헤파린-결합 EGF-유사 성장 인자 (Heparin-binding EGF-like growth factor, HB-EGF), 간세포 성장 인자(Hepatocyte growth factor) HGF, 헵시딘(Hepcidin), 인간 알부민, 알부민의 손실 증가, 이두르설파제(Idursulphase) (이두로네이트-2-설파타제), 인테그린 αVβ3, αVβ5 및 α5β1, 이두로네이트 설파타제(Iuduronate sulfatase), 라로니다제(Laronidase), N-아세틸갈락토사민-4-설파타제 (rhASB; 갈설파제, 아릴설파타제 A (ARSA), 아릴설파타제 B (ARSB)), N-아세틸글루코사민-6-설파타제, 신경 성장 인자(Nerve growth factor) (NGF, 뇌 유래 신경 영양 인자(Brain-Derived Neurotrophic Factor) (BDNF), 뉴로프로핀(Neurotrophin)-3 (NT-3), 및 뉴로프로핀 4/5 (NT-4/5), 뉴레귤린(Neuregulin) (NRG1, NRG2, NRG3, NRG4), 뉴로필린(Neuropilin) (NRP-1, NRP-2), 오베스타틴(Obestatin), 페닐알라닌 수산화효소 (phenylalanine hydroxylase, PAH), 페닐알라닌 암모니아 분해효소 (Phenylalanine 암모니아 lyase, PAL), 혈소판 유래 성장 인자 (Platelet Derived Growth factor, PDGF (PDFF-A, PDGF-B, PDGF-C, PDGF-D), TGF 베타 수용체 (엔도글린, TGF-베타 1 수용체, TGF-베타 2 수용체, TGF-베타 3 수용체), 트롬보포이에틴 (Thrombopoietin, THPO) (거핵구 성장 및 발달 인자(Megakaryocyte growth and development factor, MGDF)), 형질전환 성장 인자 (Transforming Growth factor, TGF (TGF-a, TGF-베타 (TGF베타1, TGF베타2, 및 TGF베타3))), VEGF (VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F 및 PIGF), 네시리티드(Nesiritide), 트립신, 부신피질 자극 호르몬 (adrenocorticotrophic hormone, ACTH), 심방 나트륨 이뇨 펩타이드 (Atrial-natriuretic peptide, ANP), 콜레시스토키닌(Cholecystokinin), 가스트린(Gastrin), 렙틴, 옥시토신(Oxytocin), 소마토스타틴(Somatostatin), 바소프레신(Vasopressin) (항이뇨 호르몬), 칼시토닌(Calcitonin), 엑세나타이드(Exenatide), 성장 호르몬 (Growth hormone, GH), 소마토트로핀(somatotropin), 인슐린(Insulin), 인슐린 유사 성장 인자 1 IGF-1, 메카세르민 린파베이트(Mecasermin rinfabate), IGF-1 유사체, 메카세르민(Mecasermin), IGF-1 유사체, 페그비소만트(Pegvisomant), 프람린타이드(Pramlintide), 테리파라타이드(Teriparatide) (인간 부갑상선 호르몬 잔기 1-34), 베카플레르민(Becaplermin), 디보테르민-알파(Dibotermin-alpha) (골형성 단백질 2), 히스트렐린 아세테이트(Histrelin acetate) (고나도트로핀 방출 호르몬(gonadotropin releasing hormone); GnRH), 옥트레오타이드(Octreotide), 간세포 핵 인자(hepatocyte nuclear factor) 4 알파 (HNF4A), CCAAT/인핸서-결합 단백질 알파 (CEBPA), 섬유아세포 성장 인자 21 (FGF21), 세포 외 매트릭스 프로테아제 또는 인간 콜라게나제 MMP1, 간세포 성장 인자 (HGF), TNF-관련 아포토시스-유도 리간드 (TRAIL), 오피오이드 성장 인자 수용체 유사 1 (OGFRL1), 클로스트리듐 Ⅱ형 콜라게나제(clostridial type II collagenase), 릴랙신(Relaxin) 1 (RLN1), 릴랙신 2 (RLN2), 릴랙신 3 (RLN3) 및 팔미페르민(Palifermin) (케라티노사이트 성장 인자; KGF)을 포함하는 대사, 내분비 또는 아미노산 장애의 치료를 위한 효소 대체 요법에 사용하거나, 또는 부재, 결핍 또는 돌연변이 단백질을 대체하는 데 사용하기 위한 치료 단백질;
알테플라제(Alteplase) (조직 플라스미노겐 활성화제; tPA), 아니스트레플라제(Anistreplase), 안티트롬빈(Antithrombin) Ⅲ (AT-Ⅲ), 비발리루딘(Bivalirudin), 다르베포에틴-알파(Darbepoietin-alpha), 드로트레코긴-알파(Drotrecogin-alpha) (활성화된 단백질 C, 에리쓰로포이에틴(Erythropoietin), 에포에틴-알파, 에리쓰로포이에틴(erythropoietin), 에리쓰로포이에틴(erthropoyetin), 인자 Ⅸ, 인자 Ⅶa, 인자 Ⅷ, 레피루딘(Lepirudin), 단백질 C 농축물(cencentrate), 레테플라제(Reteplase) (tPA의 뮤테인 결실), 스트렙토키나제(Streptokinase), 테넥테플라제(Tenecteplase), 유로키나제(Urokinase), 안지오스타틴(Angiostatin), 항CD22 면역 독소(immunotoxin), 데니류킨 디프티톡스(Denileukin diftitox), 이뮤노시아닌(Immunocyanin), MPS (메탈로판스트뮬린(Metallopanstimulin)), 아플리베르셉트(Aflibercept), 엔도스타틴(Endostatin), 콜라게나제, 인간 데옥시-리보뉴클레아제 I, 도르나제(doRNAe), 히알루로니다제(Hyaluronidase), 파파인(Papain), L-아스파라기나제(Asparaginase), 페그-아스파라기나제(Peg-asparaginase), 라스부리카제(Rasburicase), 인간 융모성 생식선 자극 호르몬 (Human chorionic gonadotropin, HCG), 인간 여포 자극 호르몬 (Human follicle-stimulating hormone, FSH), 루트로핀-알파(Lutropin-alpha), 프로락틴(Prolactin), 알파-1-프로테아제 억제제, 락타아제(Lactase), 췌장 효소(Pancreatic enzyme) (리파제, 아밀라제, 프로테아제), 아데노신 디아미나제(adenosine deaminase) (소 페가데마제(pegademase bovine), PEG-ADA), 아바타셉트(Abatacept), 알레파셉트(Alefacept), 아나킨라(Anakinra), 에타네르셉트(Etanercept), 인터류킨-1 (IL-1) 수용체 길항제, 아나킨라(Anakinra), 티뮬린(Thymulin), TNF-알파 길항제, 엔푸비르타이드(Enfuvirtide), 및 티모신(Thymosin) α1을 포함하는 혈액 장애, 순환계 질병, 호흡계 질병, 암 또는 종양 질병, 감염성 질병 또는 면역 결핍의 치료에 사용하기 위한 치료 단백질;
사이토카인, 케모카인, 자살 유전자 산물, 면역원성 단백질 또는 펩타이드, 아포토시스 유도제, 혈관신생 억제제, 열 쇼크 단백질, 종양 항원, 베타-카테닌 억제제, STING 경로의 활성화제, 체크포인트 조절제(checkpoin modulators), 선천적 면역 활성화제, 항체, 우성 음성 수용체(dominant negative receptors) 및 유인 수용체(decoy receptors), 미엘로이드 유래 억제 세포 (myeloid derived suppressor cells, MDSCs)의 억제제, IDO 경로 억제제, 및 아포토시스 억제제와 결합하는 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 암 또는 종양 질병의 치료에 사용하기 위한 치료 단백질;
인간 보조제 단백질, 특히 패턴 인식 수용체(pattern recognition receptors) TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11; NOD1, NOD2, NOD3, NOD4, NOD5, NALP1, NALP2, NALP3, NALP4, NALP5, NALP6, NALP6, NALP7, NALP7, NALP8, NALP9, NALP10, NALP11, NALP12, NALP13, NALP14,l IPAF, NAIP, CⅱTA, RIG-I, MDA5 및 LGP2, 예를 들어, Trif 및 Cardif를 포함하는 어댑터 단백질(adaptor proteins)을 포함하는 TLR 신호전달의 신호 변환기(signal transducers); Small-GTPases 신호전달의 성분 (RhoA, Ras, Rac1, Cdc42, Rab 등), PIP 신호전달의 성분 (PI3K, Src-키나제 등), MyD88 의존성 신호전달의 성분 (MyD88, IRAK1, IRAK2, IRAK4, TIRAP, TRAF6 등), MyD88-독립성 신호전달의 성분 (TICAM1, TICAM2, TRAF6, TBK1, IRF3, TAK1, IRAK1 등); 예를 들어, Akt, MEKK1, MKK1, MKK3, MKK4, MKK6, MKK7, ERK1, ERK2, GSK3, PKC 키나제, PKD 키나제, GSK3 키나제, JNK, p38MAPK, TAK1, IKK, 및 TAK1을 포함하는 활성화된 키나제; NF-kB, c-Fos, c-Jun, c-Myc, CREB, AP-1, Elk-1, ATF2, IRF-3, IRF-7, HSP10, HSP60, HSP65, HSP70, HSP75 및 HSP90와 같은 열 쇼크 단백질, gp96, 피브리노겐(Fibrinogen), 피브로넥틴의 TypⅢ 반복 엑스트라 도메인 A를 포함하는 활성화된 전사 인자; 또는 C1q, MBL, C1r, C1s, C2b, Bb, D, MASP-1, MASP-2, C4b, C3b, C5a, C3a, C4a, C5b, C6, C7, C8, C9, CR1, CR2, CR3, CR4, C1qR, C1INH, C4bp, MCP, DAF, H, I, P 및 CD59와 같은 보체 시스템(complement system)의 성분, 또는 예를 들어, 베타-데펜신(Beta-Defensin), 세포 표면 단백질을 포함하는 유도된 표적 유전자; 또는 트리프(trif), flt-3 리간드, Gp96 또는 피브로넥틴을 포함하는 인간 보조제 단백질, IL-1 알파, IL1 베타, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-21, IL-23, TNF알파, IFN알파, IFN베타, IFN감마, GM-CSF, G-CSF, M-CSF을 포함하는 선천 면역 반응을 유도 또는 증강시키는 사이토카인; IL-8, IP-10, MCP-1, MIP-1알파, RANTES, 에오탁신(Eotaxin), CCL21을 포함하는 케모카인; IL-1, IL-6, IL-8, IL-12 및 TNF-알파를 포함하는 대식 세포로부터 방출되는 사이토카인; 및 IL-1R1 및 IL-1 알파를 포함하는 보조제 또는 면역 자극제로부터 선택되는 치료 단백질;
Hsp60, Hsp70, Hsp90, Hsp100을 포함하는 박테리아 열 쇼크 단백질 또는 샤페론; 그램 음성 박테리아로부터 OmpA (외막 단백질); OspA; OmpF를 포함하는 박테리아 포린; 보르데텔라 백일해로부터의 백일해 독소 (pertussis toxin, PT), 보르데텔라 백일해로부터의 백일해 아데닐레이트 사이클라제 독소(pertussis adenylate cyclase toxin) CyaA 및 CyaC, 백일해 독소로부터의 PT-9K/129G 돌연변이, 보르데텔라 백일해로부터의 백일해 아데닐레이트 사이클라제 독소 CyaA 및 CyaC, 파상풍 독소(tetanus toxin), 콜레라 독소 (cholera toxin, CT), 콜레라 독소 B-서브유닛, 콜레라 독소로부터의 CTK63 돌연변이, CT로부터의 CTE112K 돌연변이, 대장균 이열성 장독소 (Escherichia coli heat-labile enterotoxin, LT), 이열성 장독소로부터의 B 서브유닛 (LTB), LTK63, LTR72을 포함하는 감소된 독성을 갖는 대장균 이열성 장독소 돌연변이를 포함하는 박테리아 독소; 페놀 가용성 모듈린(phenol-soluble modulin); 헬리코박터 파일로리의 호중구 활성화 단백질 (HP-NAP); 계면활성제 단백질 D; 보렐리아 부르그도페리로부터의 외부 표면 단백질 A, 결핵균으로부터의 Ag38 (38 kDa 항원); 박테리아 핌브리아(fimbriae)로부터의 단백질; 비브리오 콜레라로부터의 장독소 CT, 그램 음성 박테리아로부터의 필리로부터의 필린, 및 계면활성제 단백질 A 및 박테리아 플라젤린(flagellins)을 포함하는 박테리아 (보조제) 단백질;
트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi)로부터의 Tc52, 트리파노소마 곤디(Trypanosoma gondii)로부터의 PFTG, 원생 동물 열 쇼크 단백질, 리슈마니아 종(Leishmania spp.)으로부터의 LeIF, 톡소플라즈마 곤디(Toxoplasma gondii)로부터의 프로파일링 유사 단백질(profiling-like protein)을 포함하는 원생 동물 (보조제) 단백질;
호흡기 세포 융합 바이러스 융합 당단백질 (F-단백질), MMT 바이러스로부터의 외피 단백질, 마우스 백혈병 바이러스 단백질, 야생형 홍역 바이러스의 헤마클루티닌 단백질을 포함하는 바이러스 (보조제) 단백질;
진균 면역조절 단백질 (fungal immunomodulatory protein, FIP; LZ-8)을 포함하는 진균 (보조제) 단백질;
키홀 림펫 헤모사이아닌(Keyhole limpet hemocyanin, KLH)을 포함하는 동물 유래 단백질;
호르몬 대체 요법에 사용되는 치료 단백질, 여기에서 호르몬은 에스트로겐(oestrogens), 프로게스테론(progesterone) 또는 프로게스틴(progestins), 및 테스토스페론(testosterone)을 포함함; 및
Oct-3/4, Sox 유전자 패밀리 (Sox1, Sox2, Sox3, 및 Sox15), Klf 패밀리 (Klf1, Klf2, Klf4, 및 Klf5), Myc 패밀리 (c-myc, L-myc, 및 N-myc), Nanog, 및 LIN28을 포함하는, 체세포를 다능성 또는 전능성 줄기 세포로 재프로그래밍하는데 사용되는 치료 단백질.
본 발명은 대상에게 본 명세서에 기재된 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상의 질병 또는 상태를 예방, 개선 또는 치료하는 방법을 포함한다. 본 발명의 조성물은 인간 또는 동물 신체의 치료에 이용될 수 있다.
이러한 맥락에서, 대사 또는 내분비 장애의 치료에 이용될 수 있는 특히 바람직한 치료 단백질은 WO 2017/191274의 표 A(표 C와 조합하여)에 개시되어 있는 것으로부터 선택될 수 있다. 더욱이, 본 발명의 조성물에 의해 바람직하게 치료될 수 있는 질병, 바람직하게 감염성 질병, 신생물(neoplasms)(예를 들어, 암 또는 종양 질병), 혈액 및 혈액 형성 기관의 질병, 내분비, 영양 및 대사 질병, 신경계 질, 순환계 질병, 호흡계 질병, 소화기 질병, 피부 및 피하 조직 질병, 근골격계 및 결합 조직 질병, 및 비뇨생식기 질병으로부터 선택되는 질병은 WO 2017/191274의 95페이지 4라인 내지 103페이지 24라인에 개시되어 있다. 대사 또는 내분비 장애의 치료에 이용될 수 있는 추가적인 특히 바람직한 치료 단백질은 참조로 본 명세서에 포함되는, 특이적 표적 / 질병 조합 및 서열을 나타내고 있는 WO 2017/191274의 표 1에 개시되어 있다. WO 2017/191274에 포함된 표 A/C 및 표 1은 전체적으로 참조로 본 명세서에 포함된다.
바람직한 실시형태에서, 인공 핵산 (RNA) 분자, (약학) 조성물 또는 백신 또는 키트는 감염성 질병의 치료 또는 예방에 이용된다. 용어 "감염" 또는 "감염성 질병"은 일반적으로 체내에 존재하지 않는 박테리아, 바이러스, 및 기생충과 같은 미생물의 침입 및 증식에 관한 것이다. 감염은 증상을 일으키지 않고 무증상일 수 있으며, 또는 증상을 유발하고 임상적으로 명백할 수도 있다. 감염은 국소적으로 남아 있거나, 혈액 또는 림프계를 통하여 퍼져 전신성이 될 수 있다. 이러한 맥락에서, 감염성 질병은, 바람직하게 바이러스, 박테리아, 진균 또는 원생동물 감염성 질병을 포함한다. 특히, 감염성 질병은 전체적으로 참조로 본 명세서에 포함되는 WO 2019/077001 A1의 157페이지에서 시작하는 "감염성 질병" 부분(160페이지에서 끝남)에 개시된 군으로부터 선택된다.
이러한 맥락에서, 본 발명의 조성물 또는 각각의 본 발명의 번역가능한 분자가 치료에 이용될 수 있는 질병 및/또는 상태의 추가적인 특히 바람직한 예는 전체적으로 참조로 본 명세서에 포함되는 US 2019/0002906의 표 2에 개시되어 있다.
동물, 보다 특히 인간의 간 질병 또는 간 관련 질병은 선천성 질병 또는 후천성 질병, 예를 들어 바이러스 및 기생충 감염성 질병, 원발성 종양 및 전이와 같은 종양학적 병리, 대사, 아미노산 및/또는 내분비 장애 뿐만 아니라 염증 및 면역 및 자가면역 상태를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물에 의해 바람직하게 치료될 수 있는 간 질병은 C형 간염, B형 간염, 간염, A형 간염, 간경변, 간암, 간세포 암종, 간성 뇌증(Hepatic Encephalopathy), 자가면역 간염, 윌슨병, 알파-1 항트립신 결핍 (AAT-결핍), D형 간염, 페닐케톤뇨증 (Phenylketonuria, PKU), 윌슨병 (간렌즈핵 변성(hepatolenticular degeneration)), I형 티로신혈증(thyrosinemia Type I) (FAH 결핍), 알라질 증후군(Alagille Syndrome), 문맥 고혈압(Portal Hypertension), 지방간염(Steatohepatitis), 만성 간염 및 E형 간염으로 이루어진 군으로부터 선택되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
추가적인 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 장애를 치료 또는 예방하는 방법에 바람직하게 사용될 수 있으며, 여기에서 장애는 간 질병, 바람직하게 간 섬유증, 간경변 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 따라서, 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 mRNA는 간 섬유증, 간경변 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 간 질병을 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 치료 단백질 또는 그 단편 또는 변이체를 코딩할 수 있다. 더욱이, 바람직하게, 간 질병, 또는 간 섬유증, 간경변 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 간 질병의 치료 또는 예방을 위한 mRNA는 간세포 핵 인자 4 알파 (HNF4A), CCAAT/인핸서-결합 단백질 알파 (CEBPA), 섬유아세포 성장 인자 21 (FGF21), 세포 외 매트릭스 프로테아제 또는 인간 콜라게나제 MMP1, 간세포 성장 인자 (HGF), TNF-관련 아포토시스-유도 리간드 (TRAIL), 오피오이드 성장 인자 수용체 유사 1 (OGFRL1), 클로스트리듐 Ⅱ형 콜라게나제, 릴랙신 1 (RLN1), 릴랙신 2 (RLN2) 및 릴랙신 3 (RLN3)로 이루어진 군으로부터 선택되는 펩타이드 또는 단백질을 코딩한다. 이와 관련하여, WO 2018/104538 A1의 간 질병 특이적인 개시내용 및 WO 2018/104538 A에 개시된 서열이 본 명세서에 참조로 포함된다.
기타 항원
본 발명에 유용한 추가적인 항원은 전체적으로 참조로 본 명세서에 포함되는 WO 2018/078053의 48-51페이지에 열거된다.
알레르기 항원 및 자가면역 자가-항원
언급된 바와 같이, 본 발명의 조성물에 포함되는 mRNA는, 일부 실시형태에 따르면, 알레르겐을 나타내는 항원, 또는 자가항원 또는 자가면역 항원으로도 나타내어지는 알레르기 항원 또는 자가-항원을 코딩할 수 있다.
알레르기 또는 알레르기 질병과 관련된 그러한 항원 및 자가-항원(알레르겐 또는 알레르기 항원)은 전체적으로 참조로 본 명세서에 포함되는 WO 2018/078053 A1 59-73페이지에 개시된 항원의 군으로부터 바람직하게 선택되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
체크포인트 조절제/체크포인트 억제제( checkpoint modulators/checkpoint inhibitors)
본 발명의 맥락에서, 면역 체크포인트 단백질, 체크포인트 조절제 또는 체크포인트 억제제는 일반적으로 단백질 (예를 들어, 항체), 우성 음성 수용체, 유인 수용체, 또는 리간드 또는 그 단편 또는 변이체와 같은 분자이며, 이는, 면역 체크포인트 단백질의 기능을 조절하며, 예를 들어, 체크포인트 억제제(또는 억제성 체크포인트 분자)의 활성을 억제 또는 감소시키거나, 또는 체크 포인트 자극제(또는 자극성 체크포인트 분자)의 활성을 자극 또는 증강시킨다. 따라서, 본 명세서에 정의된 체크포인트 조절제는 체크포인트 분자의 활성에 영향을 미친다. 이러한 맥락에서, 억제성 체크포인트 분자는 체크포인트 억제제로 정의되며, 동의어로 사용될 수 있다. 또한, 자극성 체크포인트 분자는 체크포인트 자극제로 정의되며, 동의어로 사용될 수 있다.
추가적인 바람직한 실시형태에서, mRNA를 포함하는 mRNA 화합물은 바람직하게 본 명세서에 정의된 바와 같은 면역 체크포인트 단백질, 체크포인트 조절제 또는 체크포인트 억제제, 또는 그 단편 또는 변이체를 코딩하며, 여기에서 면역 체크포인트 단백질, 체크포인트 조절제 또는 체크포인트 억제제는 바람직하게 전체적으로 참조로 본 명세서에 포함되는 WO 2018/078053 A1의 51-56페이지에 개시된 체크포인트 단백질, 체크포인트 조절제 또는 체크포인트 억제제로 이루어진 군으로부터 선택되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
RNA 요소, mRNA 요소
본 발명의 특정 실시형태에 따르면, mRNA 서열은 바람직하게 본 명세서에 정의된 바와 같은 모노-, 바이-, 또는 멀티시스트로닉이다. 바이- 또는 멀티시스트로닉 mRNA의 코딩 서열은 바람직하게 본 명세서에 정의된 바와 같은 별개의 펩타이드 또는 단백질, 또는 그 단편 또는 변이체를 코딩한다. 바람직하게, 2 이상의 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 코딩 서열은 하기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 IRES (내부 리보솜 진입 부위) 서열에 의해 바이- 또는 멀티시스트로닉 mRNA에서 분리될 수 있다. 따라서, 용어 "2 이상의 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는"은, 바이- 또는 멀티시스트로닉 mRNA가 예를 들어, 본 명세서에 제공된 정의 내에서 적어도 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 이상의 (바람직하게는 상이한) 펩타이드 또는 단백질, 또는 그들의 단편 또는 변이체를 코딩할 수 있음을 의미하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더욱 바람직하게, 바이- 또는 멀티시스트로닉는 본 명세서에 정의된 적어도 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 이상의 (바람직하게는 상이한) 펩타이드 또는 단백질, 또는 본 명세서에 정의된 그들의 단편 또는 변이체를 코딩할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 맥락에서, 상기 정의된 바와 같은 소위 IRES (내부 리보솜 진입 부위) 서열은 유일한 리보솜 결합 부위로 기능할 수 있으나, 상기 정의된 바와 같은 바이- 또는 멀티시스트로닉 mRNA를 제공하기 위한 역할을 할 수 있으며, 이는 서로 독립적으로 번역되는 몇몇 펩타이드 또는 단백질을 코딩한다. 본 발명에 따라 이용될 수 있는 IRES 서열의 예는, 피코르나바이러스(picornaviruses) (예를 들어, FMDV), 페스티바이러스(pestiviruses) (CFFV), 폴리오바이러스(polioviruses) (PV), 뇌심근염 바이러스(encephalomyocarditis viruses) (ECMV), 구제역 바이러스(foot and mouth disease viruses) (FMDV), C형 간염 바이러스 (HCV), 고전 돼지 열병 바이러스(classical swine fever viruses) (CSFV), 마우스 백혈병 바이러스 (MLV), 유인원 면역 결핍 바이러스(simian immunodeficiency viruses) (SIV) 또는 귀뚜라미 마비병 바이러스(cricket paralysis viruses) (CrPV)으로부터의 것이다.
추가적인 실시형태에 따르면, 본 발명에 따른 mRNA 서열의 적어도 하나의 코딩 영역은 아미노산 링커 서열과 함께, 또는 아미노산 링커 서열 없이, 연결된 본 명세서에 정의된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 또는 그 이상의 펩타이드 또는 단백질 (또는 그의 단편 및 유도체)을 코딩할 수 있으며, 여기에서 상기 링커 서열은 단단한(rigid) 링커, 유연한(flexible) 링커, 절단가능한(cleavable) 링커 (예를 들어, 자가 절단(self-cleaving) 펩타이드) 또는 그 조합을 포함할 수 있다. 여기에서, 펩타이드 또는 단백질은 동일하거나 상이하거나, 또는 그 조합일 수 있다. 특정 펩타이드 또는 단백질 조합은 본 명세서에 설명된 바와 같은 적어도 2개의 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 상기 mRNA에 의해 코딩될 수 있다 (본 명세서에서, "다중-항원-구성체/mRNA"로도 지칭됨).
다른 바람직한 실시형태에서, 조성물에 포함되는 mRNA 화합물은 그의 아미노산 서열이 각각의 야생형 아미노산 서열에 대해 변형되지 않은 병원성 항원을 코딩한다. 이 경우, mRNA 화합물은 각각의 야생형 mRNA 서열에 대해 변형되지 않은 핵산 서열을 갖는 코딩 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, mRNA 화합물은 천연 및 비변형 mRNA일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 천연 및 비변형 mRNA는 화학적 변형 또는 서열의 변화 없이, 시험관 내에서 생성되는 mRNA를 포함한다.
mRNA 변형 및 서열
본 발명의 다른 실시형태에서, mRNA 화합물은 인공 mRNA를 포함한다. 이러한 맥락에서, 인공 mRNA는 화학적 변형, 서열 변형 또는 비천연 서열을 갖는 mRNA를 포함한다.
화학적 변형
본 발명의 다른 실시형태에 따르면, 조성물에 포함되는 mRNA 화합물은 적어도 하나의 화학적 변형을 포함한다. 일 실시형태에서, 화학적 변형은 염기 변형, 당 변형, 골격 변형 및 지질 변형으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명과 관련된 골격 변형은, 본 명세서에 정의된 mRNA 서열을 포함하는 mRNA 화합물에 함유된 뉴클레오타이드의 골격의 포스페이트가 화학적으로 변형되는, 변형이다. 본 발명과 관련된 당 변형은 본 명세서에 정의된 mRNA 서열을 포함하는 mRNA 화합물의 뉴클레오타이드의 당의 화학적 변형이다. 더욱이, 본 발명에 관련된 염기 변형은 mRNA 서열을 포함하는 mRNA 화합물의 뉴클레오타이드의 염기 모이어티의 화학적 변형이다. 이러한 맥락에서, 뉴클레오타이드 유사체 또는 변형은 바람직하게 전사 및/또는 번역에 적용될 수 있는 뉴클레오타이드 유사체로부터 선택된다.
당 변형
본 명세서에 기재된 mRNA 서열을 포함하는 변형된 mRNA 화합물에 혼입될 수 있는 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 당 모이어티에서 변형될 수 있다. 예를 들어, 2' 하이드록실기 (OH)는 다수의 상이한 "옥시" 또는 "데옥시" 치환기로 변형되거나 치환될 수 있다. "옥시" -2' 하이드록실기 변형의 예는 알콕시 또는 아릴옥시 (-OR, 예를 들어, R=H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아랄킬, 헤테로아릴 또는 당); 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), -O(CH2CH2O)nCH2CH2OR; 2' 하이드록실이 예를 들어, 메틸렌 가교에 의해 동일한 리보오스 당의 4' 탄소에 연결된 "잠긴(locked)" 핵산 (LNA); 및 아미노기 (-O-아미노, 여기에서, 아미노기, 예를 들어, NRR은 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 디헤테로아릴 아미노, 에틸렌 디아민, 폴리아미노) 또는 아미노알콕시를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
"데옥시" 변형은 수소, 아미노 (예를 들어, NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 디헤테로아릴 아미노, 또는 아미노산)를 포함하며; 또는 아미노기는 링커를 통하여 당에 부착될 수 있으며, 여기에서 링커는 원자 C, N, 및 O 중 일 이상을 포함한다.
당 기는 리보오스의 상응하는 탄소와 반대의 입체화학적 배열을 갖는 일 이상의 탄소를 함유할 수 있다. 따라서, 변형된 mRNA는 예를 들어, 당으로서 아라비노스를 함유하는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
골격 변형
골격의 포스페이트기는 일 이상의 산소 원자를 상이한 치환기로 대체함으로써 변형될 수 있다. 또한, 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 변형되지 않은 포스페이트 모이어티를 본 명세서에 기재된 변형된 포스페이트로 완전히 대체하는 것을 포함할 수 있다. 변형된 포스페이트기의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스테르, 수소 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트리에스테르ㄹ를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 포스포로디티오에이트는 비연결 산소가 모두 황에 의해 대체된다. 포스페이트 링커는 연결 산소를 질소(가교된 포스포로아미데이트), 황(가교된 포르포로티오에이트) 및 탄소(가교된 메틸렌-포스포네이트)로 대체함으로써 변형될 수 있다.
지질 변형
지질-변형 mRNA는 일반적으로 본 명세서에 정의된 mRNA를 포함한다. 본 명세서에 정의된 그러한 지질-변형 mRNA는 그 mRNA와 공유적으로 연결된 적어도 하나의 링커, 및 각각의 링커와 공유적으로 연결된 적어도 하나의 지질을 더 포함한다. 대안적으로, 지질-변형 mRNA는 본 명세서에 정의된 적어도 하나의 mRNA 및 그 mRNA에 공유적으로 연결된 (링커 없이) 적어도 하나의 (이중 기능성) 지질을 포함한다. 제3 대안에 따르면, 지질-변형 mRNA는 본 명세서에 정의된 mRNA 분자, 그 mRNA 분자에 공유적으로 연결된 적어도 하나의 링커, 및 각각의 링커에 공유적으로 연결된 적어도 하나의 지질, 및 그 mRNA에 공유적으로 연결된 (링커 없이) 적어도 하나의 (이중 기능성) 지질을 포함한다. 이러한 맥락에서, 지질 변형이 선형 mRNA 서열의 말단에 존재하는 것이 특히 바람직하다.
다른 바람직한 실시형태에서, mRNA 화합물은 뉴클레오사이드 변형을 포함하지 않으며, 특히 염기 변형을 포함하지 않는다. 추가적인 실시형태에서, mRNA 화합물은 1-메틸슈도우리딘, 슈도우리딘 또는 5-메톡시-우리딘 변형을 포함하지 않는다. 바람직한 일 실시형태에서, mRNA는 자연적으로 존재하는 뉴클레오사이드만을 포함한다. 추가적인 바람직한 실시형태에서, mRNA 화합물은 임의의 화학적 변형을 포함하지 않으며, 선택적으로 서열 변형을 포함한다. 본 발명의 추가적인 바람직한 실시형태에서, mRNA 화합물은 자연적으로 존재하는 뉴클레오사이드 아데닌, 우라실, 구아닌 및 시토신만을 포함한다.
염기 변형
대안적인 실시형태에서, mRNA 화합물은 적어도 하나의 염기 변형을 포함한다.
본 명세서에 기재된 mRNA 서열을 포함하는 변형된 mRNA 화합물에 혼입될 수 있는 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 핵염기 모이어티에서 추가적으로 변형될 수 있다. mRNA에서 발견되는 핵염기의 예는 아데닌, 구아닌, 시토신 및 우라실을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 주요 그루브(major groove) 면에서 화학적으로 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 주요 그루브 화학적 변형은 아미노기, 티올기, 알킬기, 또는 할로기를 포함할 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 실시형태에서, 뉴클레오타이드 유사체/변형은 염기 변형으로부터 선택되며, 이는 2-아미노-6-클로로퓨린리보사이드-5'-트리포스페이트, 2-아미노퓨린-리보사이드-5'-트리포스페이트; 2-아미노아데노신-5'-트리포스페이트, 2'-아미노-2'-데옥시시티딘-트리포스페이트, 2-티오시티딘-5'-트리포스페이트, 2-티오우리딘-5'-트리포스페이트, 2'-플루오로티민-5'-트리포스페이트, 2'-O-메틸-이노신-5'-트리포스페이트 4-티오우리딘-5'-트리포스페이트, 5-아미노알릴시티딘-5'-트리포스페이트, 5-아미노알릴우리딘-5'-트리포스페이트, 5-브로모시티딘-5'-트리포스페이트, 5-브로모우리딘-5'-트리포스페이트, 5-브로모-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트, 5-브로모-2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트, 5-아이오도시티딘-5'-트리포스페이트, 5-아이오도-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트, 5-아이오도우리딘-5'-트리포스페이트, 5-아이오도-2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트, 5-메틸시티딘-5'-트리포스페이트, 5-메틸우리딘-5'-트리포스페이트, 5-프로피닐-2'-데옥시시티딘-5'-트리포스페이트, 5-프로피닐-2'-데옥시우리딘-5'-트리포스페이트, 6-아자시티딘-5'-트리포스페이트, 6-아자우리딘-5'-트리포스페이트, 6-클로로퓨린리보사이드-5'-트리포스페이트, 7-데아자아데노신-5'-트리포스페이트, 7-데아자구아노신-5'-트리포스페이트, 8-아자아데노신-5'-트리포스페이트, 8-아지도아데노신-5'-트리포스페이트, 벤즈이미다졸-리보사이드-5'-트리포스페이트, N1-메틸아데노신-5'-트리포스페이트, N1-메틸구아노신-5'-트리포스페이트, N6-메틸아데노신-5'-트리포스페이트, O6-메틸구아노신-5'-트리포스페이트, 슈도우리딘-5'-트리포스페이트, 또는 퓨로마이신-5'-트리포스페이트, 잔토신-5'-트리포스페이트로부터 바람직하게 선택된다. 5-메틸시티딘-5'-트리포스페이트, 7-데아자구아노신-5'-트리포스페이트, 5-브로모시티딘-5'-트리포스페이트, 및 슈도우리딘-5'-트리포스페이트로 이루어진 염기 변형 뉴클레오타이드의 군으로부터 선택되는 염기 변형 뉴클레오타이드가 특히 바람직하다. 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드는 피리딘-4-온 리보뉴클레오사이드, 5-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-하이드록시우리딘, 3-메틸우리딘, 5-카르복시메틸-우리딘, 1-카르복시메틸-슈도우리딘, 5-프로피닐-우리딘, 1-프로피닐-슈도우리딘, 5-타우리노메틸우리딘, 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘, 1-타우리노메틸-4-티오-우리딘, 5-메틸-우리딘, 1-메틸-슈도우리딘, 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 디하이드로우리딘, 디하이드로슈도우리딘, 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-메톡시우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 및 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드는 5-아자-시티딘, 슈도이소시티딘, 3-메틸-시티딘, N4-아세틸시티딘, 5-포르밀시티딘, N4-메틸시티딘, 5-하이드록시메틸시티딘, 1-메틸-슈도이소시티딘, 피롤로-시티딘, 피롤로-슈도이소시티딘, 2-티오-시티딘, 2-티오-5-메틸-시티딘, 4-티오-슈도이소시티딘, 4-티오-1-메틸-슈도이소시티딘, 4-티오-1-메틸- 1-데아자-슈도이소시티딘, 1-메틸-1-데아자-슈도이소시티딘, 제불라린(zebularine), 5-아자-제불라린, 5-메틸-제불라린, 5-아자-2-티오-제불라린, 2-티오-제불라린, 2-메톡시-시티딘, 2-메톡시-5-메틸-시티딘, 4-메톡시-슈도이소시티딘, 및 4-메톡시-1-메틸-슈도이소시티딘을 포함한다. 다른 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드는 2-아미노퓨린, 2, 6-디아미노퓨린, 7-데아자-아데닌, 7-데아자-8-아자-아데닌, 7-데아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-2,6-디아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2,6-디아미노퓨린, 1-메틸아데노신, N6-메틸아데노신, N6-이소펜텐일아데노신, N6-(시스-하이드록시이소펜텐일)아데노신, 2-메틸티오-N6-(시스-하이드록시이소펜텐일) 아데노신, N6-글리신일카바모일아데노신, N6-트레오닐카바모일아데노신, 2-메틸티오-N6-트레오닐 카바모일아데노신, N6,N6-디메틸아데노신, 7-메틸아데닌, 2-메틸티오-아데닌, 및 2-메톡시-아데닌을 포함한다. 다른 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드는 이노신, 1-메틸-이노신, 와이오신(wyosine), 와이부토신(wybutosine), 7-데아자-구아노신, 7-데아자-8-아자-구아노신, 6-티오-구아노신, 6-티오-7-데아자-구아노신, 6-티오-7-데아자-8-아자-구아노신, 7-메틸-구아노신, 6-티오-7-메틸-구아노신, 7-메틸이노신, 6-메톡시-구아노신, 1-메틸구아노신, N2-메틸구아노신, N2,N2-디메틸구아노신, 8-옥소-구아노신, 7-메틸-8-옥소-구아노신, 1-메틸-6-티오-구아노신, N2-메틸-6-티오-구아노신, 및 N2,N2-디메틸-6-티오-구아노신을 포함한다. 일부 실시형태에서, 뉴클레오타이드는 주요 그루브 면에서 변형될 수 있으며, 우라실의 C-5에서의 수소를 메틸기 또는 할로기로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드는 5'-O-(1-티오포스페이트)-아데노신, 5'-O-(1-티오포스페이트)-시티딘, 5'-O-(1-티오포스페이트)-구아노신, 5'-O-(1-티오포스페이트)-우리딘 또는 5'-O-(1-티오포스페이트)-슈도우리딘이다.
추가적인 특정 실시형태에서, 변형된 mRNA는 6-아자-시티딘, 2-티오-시티딘, α-티오-시티딘, 슈도-이소-시티딘, 5-아미노알릴-우리딘, 5-아이오도-우리딘, N1-메틸-슈도우리딘, 5,6-디하이드로우리딘, α-티오-우리딘, 4-티오-우리딘, 6-아자-우리딘, 5-하이드록시-우리딘, 데옥시-티민, 5-메틸-우리딘, 피롤로-시티딘, 이노신, α-티오-구아노신, 6-메틸-구아노신, 5-메틸-시티딘, 8-옥소-구아노신, 7-데아자-구아노신, N1-메틸-아데노신, 2-아미노-6-클로로-퓨린, N6-메틸-2-아미노-퓨린, 슈도-iso-시티딘, 6-클로로-퓨린, N6-메틸-아데노신, α-티오-아데노신, 8-아지도-아데노신, 7-데아자-아데노신으로부터 선택되는 뉴클레오사이드 변형을 포함할 수 있다.
추가적인 실시형태에서, 화학적 변형은 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, N1-에틸슈도우리딘, 2-티오우리딘, 4'-티오우리딘, 5-메틸시토신, 5-메틸우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오-디하이드로슈도우리딘, 2-티오-디하이드로우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘, 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 5-아자-우리딘, 디하이드로슈도우리딘, 5-메톡시우리딘 및 2'-0-메틸 우리딘으로부터 선택된다.
특정 실시형태에서, 화학적 변형은 슈도우라실 (ψ), N1-메틸슈도우라실 (N1Mψ), 1-에틸슈도우라실, 2-티오우라실 (s2U), 4-티오우라실, 5-메틸시토신, 5-메틸우라실, 5-메톡시우라실, 및 그 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
서열 변형
추가적인 실시형태에 따르면, mRNA 화합물은 변형된 mRNA 서열을 포함한다. 예를 들어, mRNA 서열의 변형은 mRNA 서열의 안정화로 이어질 수 있다. 일 실시형태에서, mRNA 화합물은 본 명세서에 정의된 적어도 하나의 코딩 영역을 포함하는 안정화된 mRNA 서열을 포함한다. 특히, 본 명세서에 기재된 본 발명의 조성물은 본 명세서에 기재된 임의의 실시형태에 정의된 바와 같이, 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 코딩 영역을 포함하는 mRNA 화합물을 포함할 수 있으며, 여기에서 상기 코딩 영역은 서열 변형을 나타낸다.
일 실시형태에 따르면, mRNA 화합물은 "안정화된 mRNA 서열", 즉, 생체 내 분해(예를 들어, 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제에 의해)에 본질적으로 내성인 mRNA를 포함한다. 그러한 안정화는, 예를 들어, 본 발명의 mRNA의 변형된 포스페이트 골격에 의해 이루어질 수 있다. 본 발명과 관련된 골격 변형은 mRNA에 함유된 뉴클레오타이드의 골격의 포스페이트가 화학적으로 변형된, 변형이다. 이와 관련하여 바람직하게 이용될 수 있는 뉴클레오타이드는 예를 들어, 포스포로티오에이트-변형 포스페이트 골격, 바람직하게 포스페이트 골격에 함유된 포스페이트 산소의 적어도 하나가 황 원자로 대체된 것을 함유한다. 안정화된 mRNA는 예를 들어: 예를 들어, 하전된 포스포네이트 산소가 알킬 또는 아릴기로 대체된 알킬 및 아릴 포스포네이트와 같은 비이온성 포스페이트 유사체, 또는 하전된 산소 잔기가 알킬화된 형태로 존재하는 포스포디에스테르 및 알킬포스포트리에스테르를 더 포함할 수 있다. 그러한 골격 변형은 일반적으로 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트 및 포스포로티오에이트 (예를 들어, 시티딘-5'-O-(1-티오포스페이트))를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
하기에서, 바람직하게 본 명세서에 정의된 바와 같이 mRNA를 "안정화"할 수 있는 특정 변형이 기술된다.
G/C 함량 변형
일 실시형태에 따르면, mRNA 화합물은 그의 구아노신/시토신 (G/C) 함량의 변형에 의해 변형되고, 이에 따라 안정화된 mRNA 서열을 포함한다. 그러한 변형, 또는 이러한 변형의 적어도 하나는 mRNA 화합물의 코딩 영역에 위치한다.
바람직한 일 실시형태에서, mRNA 화합물의 코딩 영역의 G/C 함량은 각각의 야생형 mRNA, 즉 변형되지 않은 mRNA의 코딩 영역의 G/C 함량과 비교하여 증가된다. 동시에, mRNA에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 각각의 야생형 mRNA에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 비교하여 바람직하게는 변형되지 않는다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 조성물은 그 아미노산 서열이 각각의 야생형 핵산의 코딩된 아미노산 서열에 대해 변형되지 않은 병원성 항원을 코딩하는 mRNA 화합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 mRNA 서열의 이 변형은 번역될 임의의 mRNA의 서열이 그 mRNA의 효율적 번역에 중요하다는 사실에 기초한다. 따라서, mRNA의 조성물 및 다양한 뉴클레오타이드의 서열이 중요하다. 특히, 증가된 G (구아노신)/C (시토신) 함량을 갖는 서열은 증가된 A (아데노신)/U (우라실) 함량을 갖는 서열보다 더 안정하다. 본 발명에 따르면, mRNA의 코돈은 각각의 야생형 mRNA에 비하여 변하는 반면, 번역된 아미노산 서열은 유지되어, 증가된 양의 G/C 뉴클레오타이드를 포함한다. 몇몇 코돈이 하나의 동일한 아미노산을 코딩한다는 사실(소위, 유전자 코드의 변성)과 관련하여, 안정성에 가장 유리한 코돈을 결정할 수 있다. mRNA에 의해 코딩되는 아미노산에 따라, 그의 야생형 서열과 비교하여 mRNA 서열의 변형 가능성이 다양하게 존재한다. G 또는 C 뉴클레오타이드만을 함유하는 코돈에 의해 코딩되는 아미노산의 경우, 코돈의 변형이 필요하지 않다. 따라서, Pro (CCC 또는 CCG), Arg (CGC 또는 CGG), Ala (GCC 또는 GCG) 및 Gly (GGC 또는 GGG)에 대한 코돈은 A 또는 U가 존재하지 않으므로 변형을 필요로 하지 않는다. 대조적으로, A 및/또는 U 뉴클레오타이드를 함유하는 코돈은 동일한 아미노산을 코딩하지만 A 및/또는 U를 함유하지 않는 다른 코돈의 치환에 의해 변형될 수 있다. 그 예는 다음과 같다: Pro에 대한 코돈은 CCU 또는 CCA로부터 CCC 또는 CCG로 변형될 수 있다; Arg에 대한 코돈은 CGU 또는 CGA, 또는 AGA 또는 AGG로부터 CGC 또는 CGG로 변형될 수 있다; Ala에 대한 코돈은GCU 또는 GCA로부터 GCC 또는 GCG로 변형될 수 있다; Gly에 대한 코돈은 GGU 또는 GGA로부터 GGC 또는 GGG로 변형될 수 있다. 다른 경우, A 또는 U 뉴클레오타이드가 코돈으로 제거될 수는 없지만, A 및/또는 U 뉴클레오타이드의 함량이 더 낮은 코돈을 이용하여 A 및 U 함량을 감소시킬 수 있다. 그 예는 다음과 같다: Phe에 대한 코돈은 UUU로부터 UUC로 변형될 수 있다; Leu에 대한 코돈은 UUA, UUG, CUU 또는 CUA로부터 CUC 또는 CUG로 변형될 수 있다; Ser에 대한 코돈은 UCU 또는 UCA 또는 AGU로부터 UCC, UCG 또는 AGC로 변형될 수 있다; Tyr에 대한 코돈은 UAU로부터 UAC로 변형될 수 있다; Cys에 대한 코돈은 UGU로부터 UGC로 변형될 수 있다; His에 대한 코돈은 CAU로부터 CAC로 변형될 수 있다; Gln에 대한 코돈은 CAA로부터 CAG로 변형될 수 있다; Ile에 대한 코돈은 AUU 또는 AUA로부터 AUC로 변형될 수 있다; Thr에 대한 코돈은 ACU 또는 ACA로부터 ACC 또는 ACG로 변형될 수 있다; Asn에 대한 코돈은 AAU로부터 AAC로 변형될 수 있다; Lys에 대한 코돈은 AAA로부터 AAG로 변형될 수 있다; Val에 대한 코돈은 GUU 또는 GUA로부터 GUC 또는 GUG로 변형될 수 있다; Asp에 대한 코돈은 GAU로부터 GAC로 변형될 수 있다; Glu에 대한 코돈은 GAA로부터 GAG로 변형될 수 있다; 정지 코돈 UAA는 UAG 또는 UGA로 변형될 수 있다. 한편, Met (AUG) 및 Trp (UGG)에 대한 코돈의 경우, 서열 변형의 가능성이 없다. 상기 열거된 치환은 그 특정 야생형 mRNA (즉, 원래 서열)와 비교하여 본 발명의 mRNA 서열의 G/C 함량을 증가시키기 위하여, 개별적으로 또는 모든 가능한 조합으로 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 야생형 서열에 발생하는 Thr에 대한 모든 코돈은 ACC (또는 ACG)로 변형될 수 있다. 바람직하게, 그러나, 예를 들어, 상기 치환 가능성의 조합이 이용된다:
- 원래 서열(야생형 mRNA)에서 Thr을 코딩하는 모든 코돈의 ACC (또는 ACG)로의 치환; 및
- 원래 Ser을 코딩하는 모든 코돈의 UCC (또는 UCG 또는 AGC)로의 치환;
- 원래 서열에서 Ile를 코딩하는 모든 코돈의 AUC로의 치환; 및
- 원래 Lys를 코딩하는 모든 코돈의 AAG로의 치환; 및
- 원래 Tyr을 코딩하는 모든 코돈의 UAC로의 치환;
- 원래 서열에서 Val을 코딩하는 모든 코돈의 GUC (또는 GUG)로의 치환; 및
- 원래 Glu을 코딩하는 모든 코돈의 GAG로의 치환; 및
- 원래 Ala를 코딩하는 모든 코돈의 GCC (또는 GCG)로의 치환; 및
- 원래 Arg를 코딩하는 모든 코돈의 CGC (또는 CGG)로의 치환;
- 원래 서열에서 Val을 코딩하는 모든 코돈의 GUC (또는 GUG)로의 치환; 및
- 원래 Glu를 코딩하는 모든 코돈의 GAG로의 치환; 및
- 원래 Ala을 코딩하는 모든 코돈의 GCC (또는 GCG)로의 치환; 및
- 원래 Gly를 코딩하는 모든 코돈의 GGC (또는 GGG)로의 치환; 및
- 원래 Asn를 코딩하는 모든 코돈의 AAC로의 치환;
- 원래 서열에서 Val을 코딩하는 모든 코돈의 GUC (또는 GUG)로의 치환; 및
- 원래 Phe를 코딩하는 모든 코돈의 UUC로의 치환; 및
- 원래 Cys를 코딩하는 모든 코돈의 UGC로의 치환; 및
- 원래 Leu를 코딩하는 모든 코돈의 CUG (또는 CUC)로의 치환; 및
- 원래 Gln을 코딩하는 모든 코돈의 CAG로의 치환; 및
- 원래 Pro을 코딩하는 모든 코돈의 CCC (또는 CCG)로의 치환; 등
바람직하게, 본 발명의 mRNA 서열을 포함하는 mRNA 화합물의 코딩 영역의 G/C 함량은 본 명세서에 정의된 항원 또는 그 단편 또는 변이체를 코딩하는, 양생형 RNA의 코딩 영역의 G/C 함량에 비하여, 적어도 7%, 더욱 바람직하게 적어도 15%, 특히 바람직하게 적어도 20% 증가한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 정의된 펩타이드 또는 단백질 또는 그 단편 또는 변이체 또는 야생형 mRNA 서열의 전체 서열을 코딩하는 영역에서 치환가능한 코돈의 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 더욱 바람직하게 적어도 70 %, 더욱더 바람직하게 적어도 80%, 가장 바람직하게 적어도 90%, 95% 또는 심지어 100%가 치환되며, 이에 의해 상기 서열의 G/C 함량을 증가시킨다. 이러한 맥락에서, 본 발명의 mRNA 서열, 바람직하게 본 발명에 따른 mRNA 서열의 적어도 하나의 코딩 영역의 G/C 함량을 야생형 서열과 비교하여 최대(즉, 치환가능한 코돈의 100%)로 증가시키는 것이 특히 바람직하다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 mRNA 서열의 더 바람직한 변형은 번역 효율이 세포에서 tRNA의 발생에 있어서 상이한 빈도로 결정된다는 발견에 기초한다. 따라서, 소위 "드문(rare) 코돈"이 본 발명의 mRNA 서열에 증가된 정도로 존재하면, 상응하는 변형된 mRNA 서열은 상대적으로 "빈번한(frequent)" tRNA를 코딩하는 코돈이 존재하는 경우보다 현저하게 낮은 정도로 번역된다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 변형된 mRNA 서열에서, 본 명세서에 정의된 펩타이드 또는 단백질 또는 그 단편 또는 변이체를 코딩하는 영역은 야생형 mRNA 서열의 상응하는 영역과 비교하여 변형되어, 세포에서 상대적으로 드문 tRAN를 코딩하는 야생형 서열의 적어도 하나의 코돈이 세포에서 상대적으로 빈번하고 상대적으로 드문 tRNA와 동일한 아미노산을 운반하는 tRNA를 코딩하는 코돈으로 교환된다. 이 변형에 의해, 본 발명의 mRNA의 서열은 빈번하게 발생하는 tRNA가 이용가능한 코돈이 삽입되도록 변형된다. 다시 말해서, 본 발명에 따르면, 이러한 변형에 의해 세포에서 상대적으로 드문 tRNA를 코딩하는 야생형 서열의 모든 코돈은 각각의 경우, 세포에서 상대적으로 빈번하고 상대적으로 드문 tRNA와 동일한 아미노산을 운반하는 tRNA를 코딩하는 코돈으로 교환될 수 있다. 어떤 tRNA가 세포에서 상대적으로 빈번하게 발생하고, 대조적으로 드물게 발생하는지는 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev. 2001, 11(6): 660-666 참조. 가장 빈번하게 발행하는 tRNA, 예를 들어 (인간) 세포에서 가장 빈번하게 발생하는 tRNA를 사용하는 Gly 코돈을 특정 아미노산에 사용하는 것이 특히 바람직하다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 변형된 mRNA 서열에서 증가된, 특히 최대화된 순차적 G/C 함량을 mRNA의 코딩 영역에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 변형시키지 않고 "빈번한" 코돈에 연결시키는 것이 특히 바람직하다. 이 바람직한 실시형태는 본 발명의 특히 효율적으로 번역되고 안정화된 (변형된) mRNA 서열을 제공할 수 있도록 한다. 전술한 바와 같은 본 발명의 변형된 mRNA 서열의 결정(증가된 G/C 함량; tRNA의 교환)은 WO02/098443에 설명된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 수행될 수 있으며, 그 개시내용은 본 발명의 전체 범위에 포함된다. 이 컴퓨터 프로그램을 이용하여, 임의의 원하는 mRNA 서열의 뉴클레오타이드 서열은 세포에서 가능한 한 빈번하게 발생하는 tRNA를 코딩하는 코돈의 사용과 함께, 최대 G/C 함량이 생성되도록 유전자 코드 또는 이의 축퇴성 특성의 도움으로 변형될 수 있으며, 변형된 mRNA 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 비변형 서열과 비교하여 바람직하게는 변형되지 않는다. 대안적으로, 원래 서열과 비교하여 G/C 함량만을 변형하거나, 또는 코돈 사용만을 변형하는 것도 가능하다. Visual Basic 6.0 (사용 개발 환경: Microsoft Visual Studio Enterprise 6.0 with Service Pack 3)의 소스 코드도 WO02/098443에 설명되어 있다. 본 발명의 추가적인 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 mRNA 서열의 리보솜 결합 부위의 환경에서 A/U 함량은 그의 각각의 야생형 mRNA의 리보솜 결합 부위의 환경에서 A/U 함량에 비하여 증가된다. 이 변형 (리보솜 결합 부위 주변의 증가된 A/U 함량)은 mRNA에 대한 리보솜 결합의 효율성을 증가시킨다. 리보솜 결합 부위 (Kozak 서열: 서열식별번호:1 또는 서열식별번호:2, 또는 최소 Kozak 서열 ACC, 여기에서 AUG는 시작 코돈을 형성함)에 대한 리보솜의 효과적인 결합은 차례로 효율적인 mRNA의 번역 효과를 갖는다. 본 발명에 따른 추가적인 실시형태에 따르면, 본 발명의 mRNA 서열은 잠재적으로 불안정화 서열 요소(destabilizing sequence elements)와 관련하여 변형될 수 있다. 특히, 이 mRNA 서열의 코딩 영역 및/또는 5' 및/또는 3' 비번역 영역은 불안정화 서열 요소를 함유하지 않도록 각각의 야생형 mRNA와 비교하여 변형될 수 있으며, 변형된 mRNA 서열의 코딩된 아미노산 서열은 각각의 야생형 mRNA와 비교하여 바람직하게는 변형되지 않는다. 예를 들어, 진핵생물 mRNA의 서열에서, 신호 단백질이 결합하고 생체 내에서 mRNA의 효소 분해를 조절하는 안정화 서열 요소 (DSE)이 발생하는 것으로 알려져 있다. 변형된 mRNA 서열의 추가적인 안정화를 위하여, 선택적으로 적어도 하나의 본 명세서에 정의된 적어도 하나의 펩타이드 또는 단백질 또는 그 단편 또는 변이체를 코딩하는 영역에서, 야생형 mRNA의 상응하는 영역과 비교하여 일 이상의 그러한 변형이 수행될 수 있으며, 이에 불안정화 서열 요소는 전혀 또는 실질적으로 포함되지 않는다. 본 발명에 따르면, 비번역 영역 (3'- 및/또는 5'-UTR)에 존재하는 DSE는 그러한 변형에 의해 본 발명의 mRNA 서열로부터 제거될 수 있다. 그러한 불안정화 서열은 예를 들어, 다수의 불안정한 mRNA의 3'-UTR 섹션에서 발생하는 AU-풍부 서열 (AURES)이다 (Caput et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 83: 1670-1674). 따라서, 본 발명의 mRNA 서열은 바람직하게는 본 발명의 mRNA 서열이 그러한 불안정화 서열을 함유하지 않도록 각각의 야생형 mRNA와 비교하여 변형된다. 이는, 가능한 엔도뉴클레아제, 예를 들어, 트랜스페린 수용체를 코딩하는 유전자의 3'-UTR 단편에 함유된 서열 GAACAAG에 의해 인식되는 서열 모티프(sequence motifs)에도 적용될 수 있다 (Binder et al., EMBO J. 1994, 13: 1969-1980). 이 서열 모티프는 바람직하게는 본 발명의 mRNA 서열에서 제거된다.
추가적인 실시형태에 따르면, mRNA 화합물은 전체적으로 참조로 본 명세서에 포함되는 WO 2018/078053의 표 1-5, 도 20-24 또는 서열 목록에 개시된 임의의 RNA 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진 mRNA 서열을 포함한다.
인간 코돈 사용에 적응된 서열
mRNA 화합물의 추가적인 바람직한 변형은 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈이 일반적으로 상이한 빈도로 발생한다는 발견에 기초한다. 이 실시형태에 따르면, mRNA 화합물의 코딩 영역에서 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈의 빈도는 예를 들어, 표 2(인간 코돈 사용 표)에 나타내어진 바와 같이, 인간 코돈 사용에 따라 그 코돈의 자연 발생 빈도와 상이하다. 예를 들어, 아미노산 알라닌 (Ala)의 경우, 야생형 코딩 영역은 바람직하게는 코돈 "GCC"가 0.40의 빈도로 사용되고, 코돈 "GCT"가 0.28의 빈도로 사용되고, 코돈 "GCA"가 0.22의 빈도로 사용되고, 코돈 "GCG"가 0.10의 빈도로 사용되는 방식으로 적응된다 (표 2 참조).
[표 2: 인간 코돈 사용 표, 가장 빈번한 코돈은 별표로 표시됨]
Figure pct00129
* 가장 빈번한 코돈
코돈-최적화 서열
일 실시형태에서, 세포에서 상대적으로 드문, tRNA를 코딩하는 야생형 서열의 모든 코돈은 세포에서 상대적으로 빈번하고, 각각의 경우, 상대적으로 드문 tRNA와 동일한 아미노산을 운반하는 tRNA를 코딩하는 코돈으로 교환된다. 따라서, 가장 빈번한 코돈이 각각의 코딩된 아미노산에 사용되는 것이 특히 바람직하다 (표 2 참조). 그러한 최적화 절차는 코돈 적응 지수 (codon adaptation index, CAI)를 증가시키고, 궁극적으로 CAI를 최대화한다. 본 발명의 맥락에서, 증가되거나 최대화된 CAI를 갖는 서열은 일반적으로 "코돈-최적화" 서열 및/또는 CAI 증가 및/또는 최대화 서열로 나타내어진다. 바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명의 mRNA 서열을 포함하는 mRNA 화합물은 적어도 하나의 코딩 영역을 포함하며, 여기에서 코딩 영역/서열은 본 명세서에 기재된 바와 같이 코돈-최적화된다. 더욱 바람직하게, 적어도 하나의 코딩 서열의 코돈 적응 지수 (CAI)는 적어도 0.5, 적어도 0.8, 적어도 0.9 또는 적어도 0.95이다. 가장 바람직하게, 적어도 하나의 코딩 서열의 코돈 적응 지수 (CAI)는 1이다.
예를 들어, 본 발명에 따른 RNA의 적어도 하나의 코딩 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열에 존재하는 아미노산 알라닌 (Ala)의 경우, 야생형 코딩 서열은 가장 빈번한 인간 코돈 "GCC"가 항상 상기 아미노산에 대해, 또는 아미노산 시스테인 (Cys)에 대해 사용되는 방식으로 적응되며, 야생형 서열은 가장 빈번한 인간 코돈 "TGC"가 상기 아미노산 등에 항상 사용되는 방식으로 적응된다.
C-최적화 서열
다른 실시형태에 따르면, mRNA 서열을 포함하는 mRNA 화합물은 각각의 야생형 mRNA, 즉 변형되지 않은 mRNA의 코딩 영역의 C 함량과 비교하여, 바람직하게는 mRNA 서열의 코딩 영역의 변형된, 특히 증가된 시토신 (C) 함량을 갖는다. 동시에, 본 발명의 mRNA 서열의 적어도 하나의 코딩 영역에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 각각의 야생형 mRNA에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 비교하여 바람직하게는 변형되지 않는다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 변형된 mRNA 서열은 이론적으로 가능한 최대 시토신-함량 또는 최대 시토신-함량의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80%, 또는 적어도 90%가 달성되도록 변형된다.
추가적인 바람직한 실시형태에서, "시토신 함량 최적화 가능한" 표적 mRNA 야생형 서열의 코돈의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 심지어 100%가 야생형 서열에 존재하는 것보다 더 높은 시토신 함량을 갖는 코돈에 의해 대체된다.
추가적인 바람직한 실시형태에서, 야생형 코딩 서열의 코돈의 일부는 세포에서 상대적으로 드문 tRNA에 대한 코돈이 세포에서 상대적으로 빈번한 tRNA에 대한 코돈으로 교환되도록 추가적으로 변형될 수 있으며, 단 상대적으로 빈번한 tRNA는 원래 야생형 코돈의 상대적으로 드문 tRNA와 동일한 아미노산을 운반한다. 바람직하게, 상대적으로 드문 tRNA에 대한 코돈 전부는, 임의의 시토신을 함유하지 않는 코돈에 의해 배타적으로 코딩되는 아미노산을 코딩하는 코돈을 제외하고, 또는 각각 동일한 수의 시토신을 함유하는 2개의 코돈에 의해 코딩되는 글루타민 (Gln)을 제외하고, 세포에서 상대적으로 빈번한 tRNA에 대한 코돈으로 교환된다.
본 발명의 추가적인 바람직한 실시형태에서, 변형된 표적 mRNA는 이론적으로 가능한 최대 시토신-함량 또는 최대 시토신-함량의 적어도 80%, 또는 적어도 90%가 세포에서 상대적으로 빈번한 tRNA에 의해 코딩되는 코돈에 의해 달성되도록 변형되고, 여기에서 아미노산 서열은 변경되지 않고 유지된다.
유전자 코드의 자연 발생적 축퇴성으로 인해, 하나를 초과하는 코돈이 특정 아미노산을 코딩할 수 있다. 따라서, 20개의 자연 발생 아미노산 중 18개가 하나를 초과하는 코돈에 의해 코딩되며(Tryp 및 Met는 예외임), 예를 들어, 2개의 코돈에 의해 (예를 들어, Cys, Asp, Glu), 3개의 코돈에 의해 (예를 들어, Ile), 4개의 코돈에 의해 (예를 들어, Al, Gly, Pro) 또는 6개의 코돈에 의해 (예를 들어, Leu, Arg, Ser) 코딩된다. 그러나, 동일한 아미노산을 코딩하는 모든 코돈이 생체 내 조건에서 동일한 빈도로 사용되는 것은 아니다. 각각의 단일 유기체에 따라, 일반적인 코돈 사용 프로파일이 수립될 수 있다.
본 발명의 맥락에서 사용되는 용어 "시토신 함량-최적화 가능한 코돈"은 동일한 아미노산을 코딩하는 다른 코돈보다 더 낮은 시토신 함량을 나타내는 코돈을 지칭한다. 따라서, 동일한 아미노산을 코딩하고, 그 코돈 내에서 더 많은 수의 시토신을 나타내는 다른 코돈으로 대체되는 임의의 야생형 코돈은 시토신-최적화 가능한 (C-최적화 가능한) 것으로 간주된다. 야생형 코딩 영역 내의 특정 C-최적화 코돈에 의한 C-최적화 가능한 야생형 코돈의 임의의 그러한 치환은 그의 전체 C-함량을 증가시키고, C-풍부 변형된 mRNA 서열을 반영한다. 바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명의 mRNA 서열, 바람직하게 본 발명의 mRNA 서열의 본 발명의 mRNA 서열의 적어도 하나의 코딩 영역은 모든 잠재적으로 C-최적화 가능한 코돈을 함유하는 C-최대화된 mRNA 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 따라서, 이론적으로 대체가능한 C-최적화 가능한 코돈의 100% 또는 전부는 바람직하게 코돈 영역의 전체 길이에 걸쳐 바람직하게 C-최적화 코돈으로 대체된다.
이러한 맥락에서, 시토신-함량 최적화 가능한 코돈은 동일한 아미노산을 코딩하는 다른 코돈보다 더 적은 수의 시토신을 함유하는 코돈이다.
아미노산 Ala를 코딩하는 코돈 GCG, GCA, GCU의 임의의 것은 동일한 아미노산을 코딩하는 GCC에 의해 교환될 수 있으며, 및/또는
Cys를 코딩하는 코돈 UGU는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 UGC에 의해 교환될 수 있으며, 및/또는
Asp를 코딩하는 코돈 GAU는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 GAC에 의해 교환될 수 있으며, 및/또는
Phe를 코딩하는 코돈 UUC는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 UUC에 의해 교환될 수 있으며, 및/또는
Gly를 코딩하는 코돈 GGG, GGA, GGU의 임의의 것은 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 GGC에 의해 교환될 수 있으며, 및/또는
His를 코딩하는 코돈 CAU는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 CAC에 의해 교환될 수 있으며, 및/또는
Ile를 코딩하는 코돈 AUA, AUU의 임의의 것은 코돈 AUC에 의해 교환될 수 있으며, 및/또는
Leu를 코딩하는 코돈 UUG, UUA, CUG, CUA, CUU의 임의의 것은 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 CUC에 의해 교환될 수 있으며, 및/또는
Asn을 코딩하는 코돈 AAU는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 AAC에 의해 교환될 수 있으며, 및/또는
Pro를 코딩하는 코돈 CCG, CCA, CCU의 임의의 것은 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 CCC에 의해 교환될 수 있으며, 및/또는
Arg를 코딩하는 코돈 AGG, AGA, CGG, CGA, CGU는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 CGC에 의해 교환될 수 있으며, 및/또는
Ser을 코딩하는 코돈 AGU, AGC, UCG, UCA, UCU의 임의의 것은 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 UCC에 의해 교환될 수 있으며 , 및/또는
Thr을 코딩하는 코돈 ACG, ACA, ACU는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 ACC에 의해 교환될 수 있으며, 및/또는
Val을 코딩하는 코돈 GUG, GUA, GUU는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 GUC에 의해 교환될 수 있으며, 및/또는
Tyr를 코딩하는 코돈 UAU는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 UAC에 의해 교환될 수 있다.
위의 경우, 시토신의 수는 교환된 코돈 당 1씩 증가한다. 코딩 영역의 모든 비 C-최적화 코돈(C-최적화 가능한 코돈에 상응함)의 교환은 C-최대화된 코딩 서열을 생성한다. 본 발명의 맥락에서, 본 발명에 따른 mRNA 서열의 적어도 하나의 코딩 영역 내의 비 C-최적화 코돈의 적어도 70%, 바람직하게 적어도 80%, 더욱 바람직하게 적어도 90%가 C-최적화 코돈에 의해 대체된다.
코딩 영역의 모든 C-최적화 가능한 야생형 코돈의 적어도 70%의 C-최적화의 전체 백분율을 충족시키기 위하여, 일부 아미노산의 경우, C-최적화 코돈에 의해 대체된 C-최적화 가능한 코돈의 백분율이 70% 미만인 반면, 다른 아미노산의 경우 대체된 코돈의 백분율이 70%보다 높은 것이 바람직하다.
바람직하게, C-최적화 mRNA 서열에서, 임의의 주어진 아미노산에 대한 C-최적화 가능한 야생형 코돈의 적어도 50%가 C-최적화 코돈으로 대체되며, 예를 들어, 임의의 변형된 C-풍부 mRNA 서열은 바람직하게 상기 언급된 아미노산 Ala, Cys, Asp, Phe, Gly, His, Ile, Leu, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val 및 Tyr의 임의의 하나를 코딩하는 C-최적화 가능한 야생형 코돈 위치에서 적어도 50% C-최적화 코돈, 바람직하게 적어도 60%의 C-최적화 코돈을 함유한다.
이러한 맥락에서, 시토신-함량 최적화 가능하지 않고, 적어도 2개의 코돈에 의해 코딩되는 아미노산을 코딩하는 코돈은 임의의 추가적인 선택 과정(selection process) 없이 사용될 수 있다. 그러나, 세포, 예를 들어, 인간 세포에서 상대적으로 드문 tRNA를 코딩하는 야생형 서열의 코돈은 세포에서 상대적으로 빈번한 tRNA를 코딩하는 코돈으로 교환되며, 여기에서 양자는 동일한 아미노산을 코딩한다. 따라서, Glu를 코딩하는 상대적으로 드문 코돈 GAA는 동일한 아미노산을 코딩하는 상대적으로 빈번한 코돈 GAG에 의해 교환될 수 있다, 및/또는
Lys를 코딩하는 상대적으로 드문 코돈 AAA는 동일한 아미노산을 코딩하는 상대적으로 빈번한 코돈 AAG에 의해 교환될 수 있으며, 및/또는
Gln을 코딩하는 상대적으로 드문 코돈 CAA는 동일한 아미노산을 코딩하는 상대적으로 빈번한 코돈 CAG으로 교환될 수 있다.
이러한 맥락에서, 각각 하나의 코돈에 의해 코딩되는 아미노산 Met (AUG) 및 Trp (UGG)는 변경되지 않고 유지된다. 정지 코돈(Stop codons)은 시토신-함량 최적화되지 않지만, 상대적으로 드문 정지 코돈 앰버(amber), 오커(ochre) (UAA, UAG)는 상대적으로 빈번한 정지 코돈 오팔(opal) (UGA)에 의해 교환될 수 있다.
상기 나열된 단일 치환은 야생형 mRNA 서열과 비교하여 변형된 mRNA 서열의 시토신-함량을 최적화하기 위하여, 개별적으로 뿐만 아니라 모든 가능한 조합으로 사용될 수 있다.
따라서, 본 명세서에 정의된 적어도 하나의 코딩 서열은 각각의 야생형 mRNA의 코딩 영역과 비교하여, 아미노산이 그 중 하나는 하나의 추가적인 시토신을 포함하는 적어도 2 이상의 코돈에 의해 코딩되는 방식으로 변경될 수 있으며, 그러한 코돈은 하나의 추가적인 시토신을 포함하는 C-최적화 코돈에 의해 교환될 수 있으며, 여기에서 아미노산은 바람직하게는 야생형 서열과 비교하여 변경되지 않는다.
더 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 조성물은 코딩 영역이 상응하는 야생형 mRNA의 상응하는 코딩 영역의 G/C 함량과 비교하여 증가된 G/C 함량, 및/또는 상응하는 야생형 mRN의 상응하는 코딩 영역의 C 함량과 비교하여 증가된 C 함량을 가지며, 및/또는 코딩 영역의 코돈은 인간 코돈 사용에 적응되며, mRNA에 의해 코딩되는 아미노산 서열 서열은 바람직하게는 상응하는 야생형 mRNA에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 비교하여 변형되지 않는다.
본 발명의 바람직한 일 실시형태에서, 조성물은 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 코딩 영역을 포함하는 mRNA 화합물을 포함하며, 여기에서 코딩 영역은 서열의 G/C 함량 변형, 코돈 변형, 코돈 최적화 또는 C-최적화로부터 선택되는 변형을 나타낸다.
다른 바람직한 실시형태에서, 본 명세서에 정의된 조성물 또는 지질 나노입자는 본 명세서에 정의된 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 코딩 영역을 포함하는 mRNA를 포함하며, 상응하는 야생형 mRNA의 코딩 영역과 비교하여,
- 코딩 영역의 G/C 함량이 증가되며;
- 코딩 영역의 C 함량이 증가되며;
- 코딩 영역의 코돈 사용이 인간 코돈 사용에 적응되며; 및/또는 코돈 적응 지수 (CAI)가 코딩 영역에서 증가되거나 또는 최대화된다.
5'-CAP 구조
본 발명의 또 다른 바람직한 실시형태에 따르면, mRNA 화합물은 바람직하게는 본 명세서에 기재된 mRNA를 안정화시키는, 소위 "5'-CAP 구조"의 첨가에 의해 변형된 서열을 가질 수 있다. 5'-CAP은 일반적으로 성숙 mRNA의 5'-말단을 "덮는(caps)" 엔티티(entity), 일반적으로 변형된 뉴클레오타이드 엔티티이다. 5'-CAP은 일반적으로 변형된 뉴클레오타이드에 의해, 특히 구아닌 뉴클레오타이드의 유도체에 의해 형성될 수 있다. 바람직하게, 5'-CAP은 5'-5'-트리포스페이트 연결을 통하여 5'-말단에 연결될 수 있다. 5'-CAP은 메틸화될 수 있으며, 예를 들어, m7GpppN이며, 여기에서 N은 5'-CAP, 일반적으로 mRNA의 5'-말단을 운반하는 핵산의 말단 5' 뉴클레오타이드이다. m7GpppN는 폴리머라제 Ⅱ에 의해 전사된 mRNA에서 자연적으로 발생되므로 바람직하게는 이러한 맥락에서 변형된 mRNA에 포함되는 변형으로 간주되지 않는 5'-CAP 구조이다. 따라서, 본 발명의 변형된 mRNA 서열은 5'-CAP으로서 m7GpppN을 포함할 수 있으나, 변형된 mRNA 서열은 일반적으로 본 명세서에 정의된 적어도 하나의 추가적인 변형을 포함한다. 바람직한 일 실시형태에서, 본 발명의 mRNA 화합물은 5'-CAP 구조를 포함하며, 상기 5'-CAP 구조는 m7GpppN이다. 가장 바람직한 실시형태에서, 5'-CAP 구조는 m7G(5'), m7G(5')ppp(5')(2'OMeA) 및 m7G(5')ppp(5')(2'OMeG), 또는 각각 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG 및 m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 맥락에서, 5'-CAP 구조는 화학적 RNA 합성 또는 CAP 유사체를 사용하는 RNA 시험관 내 전사 (공동-전사 캡핑(co-transcriptional capping))에서 형성될 수 있거나, 또는 CAP 구조는 캡핑 효소를 이용하여 시험관 내에서 형성될 수 있다. 캡핑 효소를 포함하는 키트는 상업적으로 이용가능하다(예를 들어, ScriptCapTM 캡핑 효소 및 ScriptCapTM 2'-0-메틸트랜스페라제 (양자는 모두 CellScript로부터)). 따라서, RNA 전사체(transcript)는 바람직하게 제조사의 지시에 따라 처리된다.
따라서, CAP 유사체는 번역 또는 국소화를 용이하게 하고, 및/또는 RNA 분자의 5'-말단에 통합될 때, RNA 분자의 분해를 방지한다는 점에서 CAP 기능성을 갖는 CAP 유사체가 5' 트리포스페이트를 갖지 않아 템플릿 의존성 RNA 폴리머라제에 의해 3'-방향으로 확장할 수 없으므로 5'-말단에만 통합된다는 것을 의미한다.
CAP 유사체는 m7GpppG, m7GpppA, m7GpppC; 비메틸화 CAP 유사체 (예를 들어, GpppG); 디메틸화 CAP 유사체 (예를 들어, m2,7GpppG), 트리메틸화 CAP 유사체 (예를 들어, m2,2,7GpppG), 디메틸화 대칭 CAP 유사체 (예를 들어, m7Gpppm7G), 또는 안티 리버스(anti reverse) CAP 유사체 (예를 들어, ARCA; m7,2'OmeGpppG, m7,2'dGpppG, m7,3'OmeGpppG, m7,3'dGpppG 및 그의 테트라포스페이트 유도체) (Stepinski et al., 2001. RNA 7(10):1486-95)로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학 구조를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
5'-CAP 구조의 추가적인 예는 글리세릴, 역전(inverted) 데옥시 무염기 잔기(abasic residue) (모이어티), 4',5' 메틸렌 뉴클레오타이드, 1-(베타-D-에리쓰로퓨라노실) 뉴클레오타이드, 4'-티오 뉴클레오타이드, 카르보사이클릭 뉴클레오타이드, 1,5-안하이드로헥시톨 뉴클레오타이드, L-뉴클레오타이드, 알파-뉴클레오타이드, 변형된 염기 뉴클레오타이드, 트레오-펜토퓨라노실 뉴클레오타이드, 비고리형 3',4'-세코 뉴클레오타이드, 비고리형(acyclic) 3,4-디하이드록시부틸 뉴클레오타이드, 비고리형 3,5 디하이드록시펜틸 뉴클레오타이드, 3'-3'-역전 뉴클레오타이드 모이어티, 3'-3'-역전 무염기 모이어티, 3'-2'-역전 뉴클레오타이드 모이어티, 3'-2'-역전 무염기 모이어티, 1,4-부탄디올 포스페이트, 3'-포스포라미데이트, 헥실포스페이트, 아미노헥실 포스페이트, 3'-포스페이트, 3'포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 또는 가교 또는 비가교 메틸포스포네이트 모이어티를 포함한다. 이러한 변형된 5'-CAP 구조는 이러한 맥락에서 적어도 하나의 변형으로 간주되고, 본 발명의 맥락에서 본 발명의 조성물의 mRNA 서열을 변형시키는데 이용될 수 있다.
특히 바람직한 변형된 5'-CAP 구조는 CAP1 (m7G의 인접한 뉴클레오타이드의 리보오스의 메틸화), cap2 (m7G의 하류에 있는 두 번째 뉴클레오타이드의 리보오스의 추가적인 메틸화), cap3 (m7G의 하류에 있는 세 번째 뉴클레오타이드의 리보오스의 추가적인 메틸화), cap4 (m7G의 하류에 있는 네 번째 뉴클레오타이드의 리보오스의 메틸화), ARCA (안티 리버스 CAP 유사체, 변형된 ARCA (예를 들어, 포스포티오에이트 변형된 ARCA), CleanCap 또는 각각의 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG 또는 m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG (TriLink) 및 또는 WO2017053297A1 (참조로 포함됨)에 개시된 CAP-구조, 이노신, N1-메틸-구아노신, 2'-플루오로-구아노신, 7-데아자-구아노신, 8-옥소-구아노신, 2-아미노-구아노신, LNA-구아노신, 및 2-아지도-구아노신이다. 특히, WO2017/053297의 청구항 1 내지 5에 개시된 구조로부터 유래되는 CAP 구조가 변형된 CAP1 구조를 공동-전사적으로 생성하기 위하여 적합할 수 있다. 또한, WO2018/075827의 청구항 1 또는 청구항 21에 정의된 구조로부터 유래되는 임의의 CAP 구조는 CAP1 구조를 공동-전사적으로 생성하기 위하여 적합할 수 있다.
더욱이, CAP 유사체는 이전에 기술되었다 (US7074596, WO2008/016473, WO2008/157688, WO2009/149253, WO2011/015347, 및 WO2013/059475). N7-(4-클로로페녹시에틸) 치환된 디뉴클레오타이드 CAP 유사체의 합성은 최근 기술되었다 (Kore et al. (2013) Bioorg. Med. Chem. 21(15): 4570-4). 이러한 맥락에서 추가적인 적합한 CAP 유사체는 WO2017/066793, WO2017/066781, WO2017/066791, WO2017/066789, WO2017/066782, WO2018075827 및 WO2017/066797에 기술되어 있으며, 여기에서 CAP 유사체를 언급하는 특정 개시내용은 참조로 본 명세서에 참조로 포함된다.
폴리(A) 서열 / 폴리A-테일(tail)
"3'-폴리(A) 테일", "폴리A 서열" 또는 "폴리(A) 서열"이라고도 하는 폴리A-테일은 일반적으로 RNA의 3'-말단에 첨가된, 약 400개 이하의 아데노신 뉴클레오타이드의 긴 서열이며, 예를 들어, 10 내지 200개, 10 내지 100개, 40 내지 80개, 50 내지 70개, 약 25 내지 약 400개, 바람직하게 약 50 내지 약 400개, 더욱 바람직하게 약 50 내지 약 300개, 더욱더 바람직하게 약 50 내지 약 250개, 가장 바람직하게 약 60 내지 약 250개의 아데노신 뉴클레오타이드, 또는 약 40 내지 약 150개의 아데노신 뉴클레오타이드, 또는 약 70 내지 90개 아데노신 뉴클레오타이드이다. 특히 바람직한 실시형태에서, 폴리(A) 서열은 약 64개 아데노신 뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 특히 바람직한 실시형태에서, 폴리(A) 서열은 약 100개의 아데노신 뉴클레오타이드를 포함한다. 또한, 폴리(A) 서열, 또는 폴리(A) 테일은 RNA의 효소적 폴리아데닐화(enzymatic polyadenylation)에 의해, 예를 들어, 대장균 또는 이스트로부터 유래되는 폴리(A)폴리머라제를 이용하여 시험관 내에서 생성될 수 있다. 적합하게, 코딩 RNA의 폴리(A) 서열은 폴리A 결합 단백질의 적어도 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 모노머에 결합하게에 충분히 길 수 있다.
폴리아데닐화는 일반적으로 RNA 분자와 같은 핵산 분자, 예를 들어, 미성숙(premature) mRNA에 대한 폴리(A) 서열의 부가로 이해된다. 폴리아데닐화는 소위 폴리아데닐화 신호에 의해 유도될 수 있다. 이 신호는 바람직하게 폴리아데닐화될 RNA 분자와 같은 핵산 분자의 3'-말단에서 뉴클레오타이드의 스트레치 내에 위치한다. 폴리아데닐화 신호는 일반적으로 아데닌 및 우라실/티민 뉴클레오타이드로 이루어진 헥사머(hexamer), 바람직하게 헥사머 서열 AAUAAA를 포함한다. 다른 서열, 바람직하게 헥사머 서열도 생각할 수 있다. 폴리아데닐화는 일반적으로 프리-mRNA(pre-mRNA) (미성숙-mRNA라고도 함) 처리 중에 발생된다. 일반적으로, RNA 성숙 (프리-mRNA로부터 성숙 mRNA로)은 폴리아데닐화 단계를 포함한다.
따라서, 더 바람직한 실시예에 따르면, 조성물은 일반적으로 약 10 내지 200개 아데노신 뉴클레오타이드, 바람직하게 약 10 내지 100개 아데노신 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게 약 40 내지 80개 아데노신 뉴클레오타이드, 또한 바람직하게 약 70 내지 약 90개 아데노신 뉴클레오타이드, 또는 더욱더 바람직하게 약 50 내지 70개 아데노신 뉴클레오타이드의 3'-말단에 폴리A 테일을 함유하는 mRNA 서열을 포함하는 mRNA 화합물을 포함한다. 바람직하게, 폴리(A) 서열은 RNA 시험관 내 전사에 의해 DNA 템플릿으로부터 유래된다. 대안적으로, 폴리(A) 서열은 DNA-프로제니터(progenitor)로부터 전사될 필요 없이 통상적인 화학적-합성 방법에 의해 시험관 내에서 수득될 수 있다. 또한, 폴리(A) 서열, 또는 폴리(A) 테일은 상업적으로 이용가능한 폴리아데닐화 키트 및 당해 기술분야에 공지된 상응하는 프로토콜을 이용하여 본 발명에 따른 RNA의 효소적 폴리아데닐화에 의해 생성될 수 있다.
대안적으로, 본 명세서에 기재된 mRNA는 선택적으로 폴리아데닐화 신호를 포함하며, 이는 본 명세서에서 특정 단백질 인자 (예를 들어, 절단 및 폴리아데닐화 특이성 인자 (cleavage and polyadenylation specificity factor, CPSF), 절단 자극 인자 (cleavage stimulation factor, CstF), 절단 인자 I 및 Ⅱ (CF I 및 CF Ⅱ), 폴리(A) 폴리머라제 (PAP))에 의해 (전사) RNA에 폴리아데닐화를 전달하는 신호로 정의된다. 이러한 맥락에서, NN(U/T)ANA 컨센서스 서열을 포함하는 컨센서스(consensus) 폴리아데닐화 신호가 바람직하다. 특히 바람직한 측면에서, 폴리아데닐화 신호는 하기 서열의 하나를 포함한다: AA(U/T)AAA 또는 A(U/T)(U/T)AAA (여기에서, 우리딘은 일반적으로 RNA에 존재하고, 티미딘은 일반적으로 DNA에 존재함).
폴리(C) 서열
폴리-(C)-서열은 일반적으로 시토신 뉴클레오타이드, 일반적으로 약 10 내지 약 200개 시토신 뉴클레오타이드, 바람직하게 약 10 내지 약 100개 시토신 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게 약 10 내지 약 70개 시토신 뉴클레오타이드 또는 더욱더 바람직하게 약 20 내지 약 50개 또는 약 20 내지 약 30개 시토신 뉴클레오타이드의 긴 서열이다. 폴리(C) 서열은 바람직하게는 핵산에 의해 포함되는 코딩 영역의 3'에 위치할 수 있다.
따라서, 더 바람직한 실시예에 따르면, 본 발명의 조성물은 일반적으로 약 10 내지 200개 시토신 뉴클레오타이드, 바람직하게 약 10 내지 100개 시토신 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게 약 20 내지 70개 시토신 뉴클레오타이드 또는 더욱더 바람직하게 약 20 내지 60개 또는 10 내지 40개 시토신 뉴클레오타이드의 3'-말단에 폴리(C) 테일을 포함하는 mRNA 화합물을 포함한다.
바람직한 일 실시형태에서, mRNA 화합물은 바람직하게 5'-에서 3'-방향으로:
a) 5'-CAP 구조, 바람직하게 CAP1 또는 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG;
b) 선택적으로 5'-UTR 요소,
c) 적어도 하나의 항원성 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 코딩 영역,
d) 선택적으로, 3'-UTR 요소,
e) 선택적으로, 폴리(A) 서열, 바람직하게 64개 아데노신을 포함함;
f) 선택적으로, 폴리(C) 서열, 바람직하게 30개 시토신을 포함한다.
UTR
바람직한 실시형태에서, 조성물은 적어도 하나의 5'- 또는 3'-UTR 요소를 포함하는 mRNA 화합물을 포함한다. 이러한 맥락에서, UTR 요소는 임의의 자연 발생 유전자의 5'- 또는 3'-UTR로부터 유래되거나, 또는 유전자의 5'- 또는 3'-UTR의 단편, 동족체 또는 변이체로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 바람직하게, 본 발명에 따라 사용되는 5'- 또는 3'-UTR 요소는 본 발명의 mRNA 서열의 적어도 하나의 코딩 영역에 대하여 이종이다. 자연 발생 유전자로부터 유래되는 5'- 또는 3'-UTR 요소가 바람직하더라도, 합성적으로 조작된 UTR 요소가 본 발명의 맥락에서 이용될 수 있다.
용어 "3'-UTR 요소"는 일반적으로 3'-UTR로부터 또는 3'-UTR의 변이체로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하거나, 이로 이루어진 핵산 서열을 나타낸다. 본 발명의 의미에서 3'-UTR 요소는 RNA, 바람직하게 mRNA의 3'-UTR을 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명의 의미에서, 바람직하게, 3'-UTR 요소는 RNA, 바람직하게 mRNA의 3'-UTR일 수 있으며, 또는 RNA의 3'-UTR에 대한 전사 템플릿일 수 있다. 따라서, 3'-UTR 요소는 RNA의 3'-UTR, 바람직하게 유전자 조작된 벡터 구성체의 전사에 의해 얻어지는 mRNA와 같은, mRNA의 3'-UTR에 상응하는 핵산 서열이다. 바람직하게, 3'-UTR 요소는 3'-UTR의 기능을 수행하거나, 3'-UTR의 기능을 수행하는 서열을 코딩한다.
바람직하게, 적어도 하나의 3'-UTR 요소는 척색동물 유전자, 바람직하게 척추 동물 유전자, 더욱 바람직하게 포유동물 유전자, 가장 바람직하게 인간 유전자의 3'-UTR로부터, 또는 척색동물 유전자, 바람직하게 척추 동물 유전자, 더욱 바람직하게 포유동물 유전자, 가장 바람직하게 인간 유전자의 3'-UTR의 변이체로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다.
바람직하게, 조성물은 3'-UTR 요소를 포함하는 mRNA 화합물을 포함하며, 이는 향상된 반감기를 갖는 mRNA와 관련된(안정한 mRNA를 제공하는) 유전자, 예를 들어, 하기에 정의되고 기술되는 3'-UTR 요소로부터 유래될 수 있다. 바람직하게, 3'-UTR 요소는 바람직하게 안정한 mRNA를 코딩하는 유전자의 3'-UTR로부터, 또는 상기 유전자의 동족체, 단편 또는 변이체로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다.
바람직한 일 실시형태에서, WO 2019/077001 A1의 표 1, 청구항 1, 4, 6-8 및 9에 개시된 UTR-조합이 본 발명의 mRNA 화합물의 UTR-조합에 바람직하다. 또한, 바람직하게, 전체적으로 참조로 본 명세서에 포함되는 WO 2019/077001 A1의 24페이지 표 1 다음의 두 번째 단락 및 24페이지 마지막 단락 내지 29페이지 두 번째 단락에 개시된 UTR-조합이 본 발명의 mRNA 화합물의 UTR-조합에 바람직하다.
추가적인 바람직한 실시형태에서, 3'-UTR 요소는 PSMB3, ALB 또는 ALB7, 알파-글로빈 ("muag" 즉, 돌연변이 알파-글로빈 3'-UTR로도 나타내어짐), CASP1, COX6B1, GNAS, NDUFA1 및 RPS9로부터 선택되는 유전자의 3'UTR, 또는 이들 유전자의 임의의 하나의 동족체, 단편 또는 변이체(예를 들어, 본 명세서에 참조로 포함되는 WO2013/143700의 서열식별번호:1369에 개시된 인간 알부민7/alb7 3'-UTR), 또는 그의 동족체, 단편 또는 변이체로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 추가적인 바람직한 실시형태에서, 3'-UTR 요소는 WO2013/143700의 서열식별번호:1376에 따른 인간 알부민 유전자의 단편으로부터 유래되는 핵산 서열을 포함한다 (알부민7/alb7 3'-UTR). 추가적인 바람직한 실시형태에서, 3'-UTR 요소는 알부민 유전자, 바람직하게 척추 동물 알부민 유전자, 더욱 바람직하게 포유동물 알부민 유전자, 가장 바람직하게 GenBank Accession number NM_000477.5 (서열식별번호: 13-18)에 따른 인간 알부민 유전자의 3'-UTR과 같은 인간 알부민 유전자, 또는 그 단편 또는 변이체의 3'-UTR로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 다른 바람직한 실시형태에서, 3'-UTR 요소는 바람직하게 서열식별번호:5 또는 서열식별번호:6-8에 따른, 인간 α-글로빈 유전자와 같은 α-글로빈 유전자, 또는 α-글로빈 유전자의 동족체, 단편, 또는 변이체의 3'-UTR의 중심, α-복합체-결합 부분, 또는 α-글로빈 유전자 (본 명세서에서 "muag"로도 명명됨) GCCCGATGGGCCTCCCAACGGGCCCTCCTCCCCTCCTTGCACCG의 3'-UTR의 α-복합체-결합 부분(서열식별번호: 11 또는 서열식별번호: 12, 특허출원 WO2013/143700의 서열식별번호:1393에 상응함)을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다.
다른 바람직한 실시형태에서, 3'-UTR 요소는 α- 또는 β-글로빈 유전자, 바람직하게 척추 동물 α- 또는 β -글로빈 유전자, 및 바람직하게 포유동물 α- 또는 β -글로빈 유전자, 바람직하게 서열식별번호:5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 또는 상응하는 RNA 서열 서열식별번호:6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 즉, (서열식별번호:5 ;DNA; HBA1 3'-UTR); (서열식별번호:7 ;DNA; HBA2 3'-UTR); (서열식별번호:9 ;DNA; HBB 3'-UTR); (서열식별번호:11 ;DNA; muag 3'-UTR); (서열식별번호:13 ;DNA; 알부민 3'-UTR); (서열식별번호:15 ;DNA; 알부민7 3'-UTR); (서열식별번호:17 ;DNA; ALB7 3'-UTR); (서열식별번호:19 ;DNA; PSMB3 3'-UTR); (서열식별번호:6 ;RNA; HBA1 3'-UTR); (서열식별번호:8 ;RNA; HBA2 3'-UTR); (서열식별번호:10 ;RNA; HBB 3'-UTR); (서열식별번호:12 ;RNA; muag 3'-UTR); (서열식별번호:14 ;RNA; 알부민 3'-UTR); (서열식별번호:16 ;RNA; 알부민7 3'-UTR); (서열식별번호:18 ;RNA; ALB7 3'-UTR); (서열식별번호:20 ;RNA; PSMB3 3'-UTR)에 따른 인간 α- 또는 β 글로빈 유전자의 3'-UTR로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다.
이러한 맥락에서, 본 발명에 따른 mRNA 서열의 3'-UTR 요소는 서열식별번호:12에 나타내어진 서열식별번호:11에 따른 핵산 서열의 상응하는 RNA 서열, 또는 그 동족체, 단편 또는 변이체를 포함하거나, 또는 이로 이루어진다.
용어 "[...] 유전자의 3'-UTR로부터 유래되는 핵산 서열"은 바람직하게 알부민 유전자, α-글로빈 유전자, β-글로빈 유전자, 티로신 수산화효소 유전자, 리폭시게나제 유전자, 또는 콜라겐 알파 1(Ⅰ) 유전자와 같은 콜라겐 알파 유전자, 바람직하게 알부민 유전자의 3'-UTR, 또는 그 부분에 기초하는 [...] 유전자의 3'-UTR 서열 또는 그 부분에 기초하는 핵산 서열을 나타낸다. 이 용어는 전체 3'-UTR 서열, 즉 유전자의 전장 3'-UTR 서열 및 알부민 유전자, α-글로빈 유전자, β-글로빈 유전자, 티로신 수산화효소 유전자, 리폭시게나제 유전자, 또는 콜라겐 알파 1(Ⅰ) 유전자와 같은 콜라겐 알파 유전자, 바람직하게 알부민 유전자와 같은 유전자의 3'-UTR 서열의 단편에 상응하는 서열을 포함한다.
용어 "[…] 유전자의 3'-UTR 의 변이체로부터 유래되는 핵산 서열"은 바람직하게 알부민 유전자, α-글로빈 유전자, β-글로빈 유전자, 티로신 수산화효소 유전자, 리폭시게나제 유전자, 또는 콜라겐 알파 1(Ⅰ) 유전자와 같은 콜라겐 알파 유전자의 3'-UTR의 변이체, 또는 상기 기술된 것의 부분과 같은 유전자의 3'-UTR 서열의 변이체에 기초하는 핵산 서열을 나타낸다. 이 용어는 유전자의 3'-UTR의 변이체의 전체 서열, 즉 유전자의 전장 길이 변이체 3'-UTR에 상응하는 서열, 및 유전자의 변이체 3'-UTR의 단편에 상응하는 서열을 포함한다. 이러한 맥락에서, 단편은 바람직하게 전장 변이체 3'-UTR의 뉴클레오타이드의 연속적인 스트레치에 상응하는 뉴클레오타이드의 연속적인 스트레치로 이루어지며, 이는 전장 변이체 3'-UTR의 적어도 20%, 바람직하게 적어도 30%, 더욱 바람직하게 적어도 40%, 더욱 바람직하게 적어도 50%, 더욱더 바람직하게 적어도 60%, 더욱더 바람직하게 적어도 70%, 더욱더 바람직하게 적어도 80%, 가장 바람직하게 적어도 90%를 나타낸다. 본 발명의 의미에서, 그러한 변이체의 단편은 바람직하게 본 명세서에 기재된 변이체의 기능적 단편이다.
바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명에 따른 mRNA 서열을 포함하는 mRNA 화합물은 바람직하게 본 명세서에 정의된, 5'-CAP 구조 및/또는 적어도 하나의 3'-비번역 영역 요소 (3'-UTR 요소)를 포함한다. 더욱 바람직하게, RNA는 본 명세서에 정의된 5'-UTR 요소를 더 포함한다.
바람직한 일 실시형태에서, mRNA 화합물은 바람직하게 5'-에서 3'-방향으로 하기를 포함한다:
a) 5'-CAP 구조, 바람직하게 CAP1 또는 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG;
b) 선택적으로, 5'-UTR 요소,
c) 적어도 하나의 항원성 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 코딩 영역,
d) 선택적으로, 3'-UTR 요소, 바람직하게 알파 글로빈 유전자로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며, 바람직하게 서열식별번호:12에 나타내어진 바와 같이, 서열식별번호:11에 따른 핵산 서열의 상응하는 RNA 서열, 그의 동족체, 단편 또는 변이체를 포함함;
e) 선택적으로, 폴리(A) 서열, 바람직하게 64개 아데노신 또는 100개 아데노신을 포함함;
f) 선택적으로, 폴리(C) 서열, 바람직하게 30개 시토신을 포함함.
추가적인 바람직한 실시형태에서, mRNA 화합물은 바람직하게 5'-에서 3'-방향으로 하기를 포함한다:
a) 5'-CAP 구조, 바람직하게 CAP1 또는 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG;
b) 적어도 하나의 항원성 펩타이드 또는 단백질, 바람직하게 SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 부니아 바이러스목 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뎅기열 바이러스 (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4), 에볼라 바이러스, 플라비바이러스, B형 간염 바이러스 (HBV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 인간 유두종 바이러스 (HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV), 인플루엔자 바이러스, 장외 병원성 대장균, 라사 맘마레나바이러스 (LASV), 메르스 코로나바이러스, 결핵균, 니파 바이러스, 노로바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 라이노바이러스, 로타 바이러스, 백시니아 바이러스, 황열병 바이러스, 지카 바이러스, 클라미디아 트라코마티스 (즉, 클라미디아를 일으키는 클라미디아 박테리아), 또는 말라리아 기생충 (예를 들어, 열대열 말라리아 원충, 삼일열 말라리아 원충, 사일열 말라리아 원충, 또는 난형 말라리아 원충)으로부터 유래되는 단백질 또는 그 단편 또는 변이체를 코딩하는 적어도 하나의 코딩 영역,
c) 선택적으로, 3'-UTR 요소, 바람직하게 알파 글로빈 유전자로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어지며, 바람직하게 서열식별번호:12에 나타내어진 바와 같이, 서열식별번호:11에 따른 핵산 서열의 상응하는 RNA 서열, 또는 그의 동족체, 단편 또는 변이체를 포함함;
d) 선택적으로, 폴리(A) 서열, 바람직하게 64개 아데노신을 포함함;
e) 선택적으로, 폴리(C) 서열, 바람직하게 30개 시토신을 포함함.
추가적인 바람직한 실시형태에서, 조성물은 적어도 하나의 5'-비번역 영역 요소 (5'-UTR 요소)를 포함하는 mRNA 화합물을 포함한다. 바람직하게, 적어도 하나의 5'-UTR 요소는 TOP 유전자의 5'-UTR로부터 유래되거나, 또는 TOP 유전자의 5'-UTR의 단편, 동족체 또는 변이체로부터 유래되는 핵산 서열을 포하하거나 또는 이로 이루어진다. 5'-UTR 요소가 상기 정의된 바와 같은 TOP 모티프 또는 5'-TOP를 포함하지 않는 것이 바람직하다.
일부 실시형태에서, TOP 유전자의 5'-UTR로부터 유래되는 5'-UTR 요소의 핵산 서열은 그것이 유래된 유전자 또는 mRNA의 시작 코돈(예를 들어, A(U/T)G)의 업스트림에서 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10에 위치한 뉴클레오타이드에 의해 그 3'-말단에서 종결된다. 따라서, 5'-UTR 요소는 단백질 코딩 영역의 임의의 부분을 포함하지 않는다. 따라서, 바람직하게, 적어도 하나의 mRNA 서열의 단백질 코딩 부분은 코딩 영역에 의해 제공된다.
TOP 유전자의 5'-UTR로부터 유래되는 핵산 서열은 바람직하게 진핵생물 TOP 유전자, 바람직하게 식물 또는 동물 TOP 유전자, 더욱 바람직하게 척색동물 TOP 유전자, 더욱더 바람직하게 척추 동물 TOP 유전자, 가장 바람직하게 인간 TOP 유전자와 같은 포유동물 TOP 유전자로부터 유래된다.
예를 들어, 5'-UTR 요소는 그 개시내용이 본 명세서에 참조로 포함되는 특허출원 WO2013/143700의 서열식별번호:1-1363, 서열식별번호:1395, 서열식별번호:1421 및 서열식별번호:1422로 이루어진 군으로부터, 특허출원 WO2013/143700의 서열식별번호:1-1363, 서열식별번호:1395, 서열식별번호:1421 및 서열식별번호:1422의 동족체로부터, 그 변이체로부터, 또는 상응하는 RNA 서열로부터 선택되는 핵산 서열로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어지는 5'-UTR 요소로부터 선택될 수 있다. 용어 "특허출원 WO2013/143700의 서열식별번호:1-1363, 서열식별번호:1395, 서열식별번호:1421 및 서열식별번호:1422의 동족체"는 특허출원 WO2013/143700의 서열식별번호:1-1363, 서열식별번호:1395, 서열식별번호:1421 및 서열식별번호:1422에 따른 서열과 상동성인 호모 사피엔스가 아닌 다른 종의 서열을 나타낸다.
바람직한 실시형태에서, mRNA 화합물의 5'-UTR은 뉴클레오타이드 위치 5 (즉, 서열의 위치 5에 위치하는 뉴클레오타이드)로부터 시작 코돈(서열의 3'-말단에 위치함)에 대하여 바로 5'의 뉴클레오타이드 위치로, 예를 들어, 특허출원 WO2013/143700의 서열식별번호:1-1363, 서열식별번호:1395, 서열식별번호:1421 및 서열식별번호:1422로부터, 특허출원 WO2013/143700의 서열식별번호:1-1363, 서열식별번호:1395, 서열식별번호:1421 및 서열식별번호:1422의 동족체로부터, 그 변이체로부터, 또는 상응하는 RNA 서열로부터 선택되는 핵산 서열의 ATG 서열의 바로 5'의 뉴클레오타이드 위치로 연장하는 핵산 서열로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 5'-UTR 요소는 바로 3' 내지 5'의 뉴클레오타이드 위치로부터 시작 코돈(서열의 3'-말단에 위치함)에 대하여 바로 5'의 뉴클레오타이드 위치로, 예를 들어, 특허출원 WO2013/143700의 서열식별번호:1-1363, 서열식별번호:1395, 서열식별번호:1421 및 서열식별번호:1422로부터, 특허출원 WO2013/143700의 서열식별번호:1-1363, 서열식별번호:1395, 서열식별번호:1421 및 서열식별번호:1422의 동족체로부터, 그 변이체로부터, 또는 상응하는 RNA 서열로부터 선택되는 핵산 서열의 ATG 서열에 대한 바로 5'의 뉴클레오타이드 위치로 연장하는 핵산 서열로부터 유래된다.
추가적인 바람직한 실시형태에서, 5'-UTR 요소는 리보솜 단백질을 코딩하는 TOP의 5'-UTR 또는 리보솜 단백질을 코딩하는 TOP의 5'-UTR의 변이체로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 예를 들어, 5'-UTR 요소는 바람직하게 특허출원 WO2013/143700의 서열식별번호:67, 170, 193, 244, 259, 554, 650, 675, 700, 721, 913, 1016, 1063, 1120, 1138, 및 1284-1360의 임의의 것에 따른 핵산 서열, 상응하는 RNA 서열, 또는 그의 동족체, 또는 본 명세서에 기재된 바람직하게는 5'-TOP 모티프가 결여된 그의 변이체의 5'-UTR로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 전술한 바와 같이, 위치 5로부터 ATG(서열의 3'-말단에 위치함)에 대해 바로 5'의 뉴클레오타이드까지 연장되는 서열은 상기 서열의 5'-UTR에 상응한다.
바람직하게, 5'-UTR 요소는 리보솜 대형 단백질(ribosomal Large protein, RPL)을 코딩하는 TOP 유전자의 5'-UTR로부터 유래하거나, 또는 리보솜 대형 단백질(RPL)을 코딩하는 TOP 유전자의 5'-UTR의 동족체 또는 변이체로부터 유래하는 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 예를 들어, 5'-UTR 요소는 특허출원 WO2013/143700의 서열식별번호:67, 259, 1284-1318, 1344, 1346, 1348-1354, 1357, 1358, 1421 및 1422의 임의의 것에 따른 핵산 서열, 상응하는 RNA 서열, 또는 그의 동족체, 또는 본 명세서에 기재된 바람직하게는 5'-TOP 모티프가 결여된 그의 변이체의 5'-UTR로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다.
특히 바람직한 실시형태에서, 5'-UTR 요소는 리보솜 단백질 대형 32 유전자, 바람직하게 척추 동물 리보솜 단백질 대형 32 (L32) 유전자, 더욱 바람직하게 포유동물 리보솜 단백질 대형 32 (L32) 유전자, 가장 바람직하게 인간 리보솜 단백질 대형 32 (L32) 유전자의 5'-UTR로부터, 또는 리보솜 단백질 대형 32 유전자, 바람직하게 척추 동물 리보솜 단백질 대형 32 (L32) 유전자, 더욱 바람직하게 포유동물 리보솜 단백질 대형 32 (L32) 유전자, 가장 바람직하게 인간 리보솜 단백질 대형 32 (L32) 유전자의 5'UTR의 변이체로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어지며, 여기에서, 바람직하게 5'-UTR 요소는 상기 유전자의 5'-TOP를 포함하지 않는다.
따라서, 바람직한 실시형태에서, 5'-UTR 요소는 서열식별번호:23 또는 서열식별번호:24 (5'-말단 올리고피리미딘 트랙이 결여된 인간 리보솜 단백질 대형 32의 5'-UTR: GGCGCTGCCTACGGAGGTGGCAGCCATCTCCTTCTCGGCATC; 특허출원 WO2013/143700의 서열식별번호:1368에 상응함)에 따른 핵산 서열, 또는 바람직하게 상응하는 RNA 서열에 대하여 적어도 약 40%, 바람직하게 적어도 약 50%, 바람직하게 적어도 약 60%, 바람직하게 적어도 약 70%, 더욱 바람직하게 적어도 약 80%, 더욱 바람직하게 적어도 약 90%, 더욱더 바람직하게 적어도 약 95%, 더욱더 바람직하게 적어도 약 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어지며, 여기에서, 적어도 하나의 5'-UTR 요소는 서열식별번호:23에 따른 핵산 서열 또는 더욱 바람직하게 상응한 RNA 서열(서열식별번호:24)에 대하여 적어도 약 40%, 바람직하게 적어도 약 50%, 바람직하게 적어도 약 60%, 바람직하게 적어도 약 70%, 더욱 바람직하게 적어도 약 80%, 더욱 바람직하게 적어도 약 90%, 더욱더 바람직하게 적어도 약 95%, 더욱더 바람직하게 적어도 약 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열의 단편을 포함하거나, 이로 이루어지며, 여기에서, 바람직하게, 단편은 전술한 바와 같으며, 즉, 전장 5'-UTR의 적어도 20%를 나타내는 뉴클레오타이드의 연속적인 스트레치이다. 바람직하게, 단편은 적어도 약 20개 이상의 뉴클레오타이드, 바람직하게 적어도 약 30개 이상의 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게 적어도 약 40개 이상의 뉴클레오타이드의 길이를 나타낸다. 바람직하게, 단편은 본 명세서에 기재된 기능적 단편이다.
매우 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 mRNA 서열의 5'-UTR 요소는 서열식별번호: 21 또는 서열식별번호: 22에 따른 핵산 서열의 상응하는 RNA 서열, 즉, HSD17B4를 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 또한, 매우 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 mRNA 서열의 3'-UTR 요소는 서열식별번호: 19 또는 서열식별번호: 20에 따른 핵산 서열의 상응하는 RNA 서열, 즉 PSMB3을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다. 또한 매우 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 mRNA 서열의 5'-UTR 요소 및 3'-UTR-요소는 전술한 HSD17B4 및 PSMB3-UTR의 조합을 포함하거나, 또는 이로 이루어진다.
일부 실시형태에서, mRNA 화합물은 RPSA, RPS2, RPS3, RPS3A, RPS4, RPS5, RPS6, RPS7, RPS8, RPS9, RPS10, RPS11, RPS12, RPS13, RPS14, RPS15, RPS15A, RPS16, RPS17, RPS18, RPS19, RPS20, RPS21, RPS23, RPS24, RPS25, RPS26, RPS27, RPS27A, RPS28, RPS29, RPS30, RPL3, RPL4, RPL5, RPL6, RPL7, RPL7A, RPL8, RPL9, RPL10, RPL10A, RPL11, RPL12, RPL13, RPL13A, RPL14, RPL15, RPL17, RPL18, RPL18A, RPL19, RPL21, RPL22, RPL23, RPL23A, RPL24, RPL26, RPL27, RPL27A, RPL28, RPL29, RPL30, RPL31, RPL32, RPL34, RPL35, RPL35A, RPL36, RPL36A, RPL37, RPL37A, RPL38, RPL39, RPL40, RPL41, RPLP0, RPLP1, RPLP2, RPLP3, RPLP0, RPLP1, RPLP2, EEF1A1, EEF1B2, EEF1D, EEF1G, EEF2, EIF3E, EIF3F, EIF3H, EIF2S3, EIF3C, EIF3K, EIF3EIP, EIF4A2, PABPC1, HNRNPA1, TPT1, TUBB1, UBA52, NPM1, ATP5G2, GNB2L1, NME2, UQCRB로부터 선택되는 포유동물과 같은 척추 동물 TOP 유전자, 예를 들어, 인간 TOP 유전자, 또는 그 동족체 또는 변이체의 5'-UTR로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어진 5'-UTR 요소를 포함하며, 여기에서 바람직하게 5'-UTR 유전자의 TOP 모티프 또는 5'-TOP을 포함하지 않으며, 선택적으로 5'-UTR 요소는 5'-말단 올리고피리미딘 트랙 (TOP)의 다운스트림에서 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10에 위치하는 뉴클레오타이드로 그 5'-말단에서 시작하며, 추가적으로 선택적으로 TOP 유전자의 5'-UTR로부터 유래되는 5'-UTR 요소는 그가 유래되는 유전자의 시작 코돈 (A(U/T)G)의 업스트림에서 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10에 위치하는 뉴클레오타이드에 의해 그의 3'-말단에서 종결된다.
추가적인 바람직한 실시형태에서, 5'-UTR 요소는 리보솜 단백질 대형 32 유전자 (RPL32), 리보솜 단백질 대형 35 유전자 (RPL35), 리보솜 단백질 대형 21 유전자 (RPL21), ATP 신타제, H+ 수송, 미토콘드리아 F1 복합체, 알파 서브유닛 1, 심장 근육 (ATP5A1) 유전자, 하이드록시스테로이드 (17-베타) 탈수소효소 4 유전자 (HSD17B4), 안드로겐-유도 1 유전자 (androgen-induced 1 gene, AIG1), 시토크롬 c 옥시다아제 서브유닛 VIc 유전자 (cytochrome c oxidase subunit VIc gene) (COX6C), 또는 N-아실스핑고신 아미도하이드롤라제 (N-acylsphingosine amidohydrolase) (산 세라미다제(acid ceramidase)) 1 유전자 (ASAH1) 또는 그 변이체로부터, 바람직하게 척추 동물 리보솜 단백질 대형 32 유전자 (RPL32), 척추 동물 리보솜 단백질 대형 35 유전자 (RPL35), 척추 동물 리보솜 단백질 대형 21 유전자 (RPL21), 척추 동물 ATP 신타제, H+ 수송, 미토콘드리아 F1 복합체, 알파 서브유닛 1, 심장 근육 (ATP5A1) 유전자, 척추 동물 하이드록시스테로이드 (17-베타) 탈수소효소 4 유전자 (HSD17B4), 척추 동물 안드로겐-유도 1 유전자 (AIG1), 척추 동물 시토크롬 c 옥시다아제 서브유닛 VIc 유전자 (COX6C), 또는 척추 동물 N-아실스핑고신 아미도하이드롤라제 (산 세라미다제) 1 유전자 (ASAH1)의 5'-UTR로부터 또는 그 변이체로부터, 더욱 바람직하게 포유동물 리보솜 단백질 대형 32 유전자 (RPL32), 리보솜 단백질 대형 35 유전자 (RPL35), 리보솜 단백질 대형 21 유전자 (RPL21), 포유동물 ATP 신타제, H+ 수송, 미토콘드리아 F1 복합체, 알파 서브유닛 1, 심장 근육 (ATP5A1) 유전자, 포유동물 하이드록시스테로이드 (17-베타) 탈수소효소 4 유전자 (HSD17B4), 포유동물 안드로겐-유도 1 유전자 (AIG1), 포유동물 시토크로 c 옥시다제 서브유닛 VIc 유전자 (COX6C), 또는 포유동물 N-아실스핑고신 아미도하이드롤라제 (산 세라미다제) 1 유전자 (ASAH1)의 5'-UTR로부터 또는 그 변이체로부터, 가장 바람직하게 인간 리보솜 단백질 대형 32 유전자 (RPL32), 인간 리보솜 단백질 대형 35 유전자 (RPL35), 인간 리보솜 단백질 대형 21 유전자 (RPL21), 인간 ATP 신타제, H+ 수송, 미토콘드리아 F1 복합체, 알파 서브유닛 1, 심장 근육 (ATP5A1) 유전자, 인간 하이드록시스테로이드 (17-베타) 탈수소효소 4 유전자 (HSD17B4), 인간 안드로겐-유도 1 유전자 (AIG1), 인간 시토크롬 c 옥시다아제 서브유닛 VIc 유전자 (COX6C), 또는 인간 N-아실스핑고신 아미도하이드롤라제 (산 세라미다제) 1 유전자 (ASAH1)의 5'-UTR로부터 또는 그 변이체로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지며, 여기에서 바람직하게 5'-UTR 요소는 상기 유전자의 5'-TOP를 포함하지 않는다.
따라서, 바람직한 실시형태에서, 5'-UTR 요소는 특허출원 WO2013/143700의 서열식별번호:1368, 또는 서열식별번호:1412-1420에 따른 핵산 서열, 또는 상응하는 RNA 서열에 대하여 적어도 약 40%, 바람직하게 적어도 약 50%, 바람직하게 적어도 약 60%, 바람직하게 적어도 약 70%, 더욱 바람직하게 적어도 약 80%, 더욱 바람직하게 적어도 약 90%, 더욱더 바람직하게 적어도 약 95%, 더욱더 바람직하게 적어도 약 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함하거나, 또는 이로 이루어지며, 여기에서, 적어도 하나의 5'-UTR 요소는 특허출원 WO2013/143700의 서열식별번호:1368, 또는 서열식별번호:1412-1420에 따른 핵산 서열에 대하여 적어도 약 40%, 바람직하게 적어도 약 50%, 바람직하게 적어도 약 60%, 바람직하게 적어도 약 70%, 더욱 바람직하게 적어도 약 80%, 더욱 바람직하게 적어도 약 90%, 더욱더 바람직하게 적어도 약 95%, 더욱더 바람직하게 적어도 약 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열의 단편을 포함하거나, 또는 이로 이루어지며, 여기에서, 바람직하게 단편은 전술한 바와 같으며, 즉 전장 5'-UTR의 적어도 20% 등을 나타내는 뉴클레오타이드의 연속적인 스트레치이다. 바람직하게, 단편은 적어도 약 20개 이상의 뉴클레오타이드, 바람직하게 적어도 약 30개 이상의 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게 적어도 약 40개 이상의 뉴클레오타이드의 길이를 나타낸다. 바람직하게, 단편은 본 명세서에 기재된 기능적 단편이다.
따라서, 바람직한 실시형태에서, 5'-UTR 요소는 서열식별번호:25 (5'-말단 올리고피리미딘 트랙이 결여된 ATP5A1의 5'-UTR: GCGGCTCGGCCATTTTGTCCCAGTCAGTCCGGAGGCTGCGGCTGCAGAAGTACCGCCTGCGGAGTAACTGCAAAG; 특허출원 WO2013/143700의 서열식별번호:224289에 상응함)에 따른 핵산 서열 또는 바람직하게 상응하는 RNA 서열 (서열식별번호:26)에 대하여 적어도 약 40%, 바람직하게 적어도 약 50%, 바람직하게 적어도 약 60%, 바람직하게 적어도 약 70%, 더욱 바람직하게 적어도 약 80%, 더욱 바람직하게 적어도 약 90%, 더욱더 바람직하게 적어도 약 95%, 더욱더 바람직하게 적어도 약 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열을 포하하거나 또는 이로 이루어지며, 또는 여기에서 적어도 하나의 5'-UTR 요소는 서열식별번호:25에 따른 핵산 서열 또는 더욱 바람직하게 상응하는 RNA 서열 (서열식별번호:26)에 대하여 적어도 약 40%, 바람직하게 적어도 약 50%, 바람직하게 적어도 약 60%, 바람직하게 적어도 약 70%, 더욱 바람직하게 적어도 약 80%, 더욱 바람직하게 적어도 약 90%, 더욱더 바람직하게 적어도 약 95%, 더욱더 바람직하게 적어도 약 99%의 동일성을 갖는 핵산 서열의 단편을 포함하거나, 또는 이로 이루어지며, 바람직하게, 단편은 전술한 바와 같으며, 즉, 전장 5'-UTR의 적어도 20% 등을 나타내는 뉴클레오타이드의 연속적인 스트레치이다. 바람직하게, 단편은 적어도 약 20개 이상의 뉴클레오타이드, 바람직하게 적어도 약 30개 이상의 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게 적어도 약 40개 이상의 뉴클레오타이드의 길이를 나타낸다. 바람직하게, 단편은 본 명세서에 기재된 기능적 단편이다.
다른 바람직한 실시형태에서, mRNA 화합물은 60S 리보솜 단백질 L31 (RPL31) 유전자로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 5'-UTR 요소를 포함하며, 상기 5'-UTR 요소는 WO2019077001A1에 개시된 서열식별번호:13에 따른 DNA 서열 또는 WO2019077001A1에 개시된 서열식별번호:14에 따른 각각의 RNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 다른 바람직한 실시형태에서, mRNA 화합물은 40S 리보솜 단백질 S9 (RPS9) 유전자로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 3'-UTR 요소를 포함하며, 상기 3'-UTR 요소는 WO2019077001A1에 개시된 서열식별번호:33에 따른 DNA 서열 또는 WO2019077001A1에 개시된 서열식별번호:34에 따른 각각의 RNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 추가적인 바람직한 실시형태에서, mRNA 화합물은 WO2019077001A1에 개시된 UTR-조합, 즉, RPL31 유전자로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 5'-UTR 요소 양자 모두, 및 S9 유전자로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하거나 또는 RPS9 유전자로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 3'-UTR 요소를 포함한다.
다른 바람직한 실시형태에서, mRNA 화합물은 양이온성 아미노산 트랜스포터 3 (용질 운반체 패밀리 7 멤버 3(solute carrier family 7 member 3), SLC7A3) 유전자로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하거나 이로 이루어진 5'-UTR 요소를 포함하며, 상기 5'-UTR 요소는 WO2019077001A1에 개시된 서열식별번호:15에 따른 DNA 서열 또는 WO2019077001A1에 개시된 서열식별번호:16에 따른 각각의 RNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 다른 바람직한 실시형태에서, mRNA 화합물은 프로테아좀 서브유닛 베타 타입-3 (proteasome subunit beta type-3) (PSMB3) 유전자로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 3'-UTR 요소를 포함하며, 상기 3'-UTR 요소는 WO2019077001A1에 개시된 서열식별번호:23에 따른 DNA 서열 또는 WO2019077001A1에 개시된 서열식별번호:24에 따른 각각의 RNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 추가적인 바람직한 실시형태에서, mRNA 화합물은 WO2019077001A1에 개시된 UTR-조합, 즉, SLc7a3 유전자로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 5'-UTR 요소 양자 모두, 및 PSMB3 유전자로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어지는 3'-UTR 요소를 포함한다.
바람직하게, 적어도 하나의 5'-UTR 요소 및 적어도 하나의 3'-UTR 요소는 전술한 바와 같이 적어도 하나의 mRNA 서열로부터 생성된 단백질 생산을 증가시키기 위하여 상승적으로 작용한다.
바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명의 조성물은 바람직하게 5'-에서 3'-방향으로 하기를 포함하는 mRNA 화합물을 포함한다:
a) 5'-CAP 구조, 바람직하게 CAP1 또는 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG;
b) 선택적으로, 바람직하게 TOP 유전자의 5'-UTR 또는 그의 동족체, 단편 또는 변이체로부터 유래되는 핵산 서열, 더욱 바람직하게 서열식별번호:21, 23, 25 또는 각각의 서열식별번호:22, 24 또는 26에 따른 핵산 서열의 상응하는 RNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진 5'-UTR 요소;
c) 바람직하게, 전체적으로 참조로 포함되는, PCT/EP2016/075843 또는 WO 2018/078053의 "유래된 및/또는 변형된 CDS 서열 (wt)" 또는 "유래된 및/또는 변형된 CDS 서열 (opt1)", "유래된 및/또는 변형된 CDS 서열 (opt2)", "유래된 및/또는 변형된 CDS 서열 (opt3)", "유래된 및/또는 변형된 CDS 서열 (opt4)", 또는 "유래된 및/또는 변형된 CDS 서열 (opt5)"로 시작하는 식별자(Numeric identifier) <223> 를 갖는 서열 목록, 또는 표 1-5의 각각의 "컬럼 B" 또는 "컬럼 C" 또는 도 20-24 또는 각각의 서열목록에 개시된 핵산 서열의 임의의 하나를 포함하거나, 또는 이로 이루어진, SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 인플루엔자 바이러스 또는 광견병 바이러스의 단백질로부터 바람직하게 유래되는 적어도 하나의 항원성 펩타이드 또는 단백질, 또는 그 단편 또는 변이체를 코딩하는 적어도 하나의 코딩 영역; 또는 서열식별번호:27-40, 또는 71에 포함되는 ORF 또는 그 서열의 임의의 것의 단편 또는 변이체; 또는 바람직하게 SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 부니아 바이러스목 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뎅기열 바이러스 (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4), 에볼라 바이러스, 플라비바이러스, B형 간염 바이러스 (HBV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 인간 유두종 바이러스 (HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV), 인플루엔자 바이러스, 장외 병원성 대장균, 라사 맘마레나바이러스 (LASV), 메르스 코로나바이러스, 결핵균, 니파 바이러스, 노로바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 라이노바이러스, 로타 바이러스, 백시니아 바이러스, 황열병 바이러스, 지카 바이러스, 클라미디아 트라코마티스 (즉, 클라미디아를 일으키는 클라미디아 박테리아), 또는 말라리아 기생충 (예를 들어, 열대열 말라리아 원충, 삼일열 말라리아 원충, 사일열 말라리아 원충, 또는 난형 말라리아 원충)의 단백질로부터 바람직하게 유래되는, 적어도 하나의 항원성 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 코딩 영역;
d) 선택적으로, 바람직하게 서열식별번호:5, 7, 9, 11, 13, 15, 17 또는 19에 따른, 바람직하게 서열식별번호:11 또는 서열식별번호:17에 따른 핵산 서열의 상응하는 RNA 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진, 바람직하게 안정한 mRNA를 제공하는 유전자로부터 유래되는 핵산 서열 또는 그 동족체, 단편 또는 변이체를 포함하거나 또는 이로 이루어진 3'-UTR 요소;
e) 선택적으로, 폴리(A) 서열 바람직하게 64개 아데노신을 포함함; 및
f) 선택적으로, 폴리(C) 서열, 바람직하게 30개 시토신을 포함함.
일 실시형태에 따르면, mRNA 화합물은 miRNA 서열을 포함한다. miRNA (microRNA)는 일반적으로 예를 들어, mRNA 분해 또는 번역 억제 또 는 억압에 의해(그러나 이에 제한되는 것은 아님) 소형, 비코딩 단일 가닥 RNA 분자이다. miRNA는 일반적으로 헤어핀 프리커서(hairpin precursor) RNA(pre-miRNA)로부터 생성되며, 단백질과 기능적 복합체를 형성할 수 있다. 더욱이, miRNA는 표적 mRNA의 3'-UTR 영역에 결합할 수 있다. 바람직하게, microRNA 결합 부위는 miR-126, miR-142, miR-144, miR-146, miR-150, miR-155, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27, miR-26a, 또는 그 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 microRNA에 대한 것이다.
일 실시형태에서, miRNA 서열은 자연 발생 miRNA 서열이다. 다른 실시형태에서, miRNA 서열은 모방체(mimetic)이거나 또는 자연 발생 miRNA 서열의 변형일 수 있다.
바람직한 일 형태에 따르면, 본 발명에 따른 mRNA 서열을 포함하는 mRNA 화합물은 본 명세서에 정의된 바와 같이 하기를 더 포함할 수 있다:
a) 5'-CAP 구조;
b) 적어도 하나의 miRNA 서열, 바람직하게 microRNA 결합 부위는 miR-126, miR-142, miR-144, miR-146, miR-150, miR-155, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27, miR-26a, 또는 그 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 microRNA에 대한 것임;
c) 적어도 하나의 5'-UTR 요소;
d) 적어도 하나의 3'-UTR 요소;
e) 적어도 하나의 폴리(A) 서열;
f) 적어도 하나의 폴리(C) 서열;
또는 그 임의의 조합.
히스톤 스템-루프 (HSL) / 히스톤 3' UTR 스템-루프
추가적인 바람직한 실시형태에서, 조성물은 히스톤 스템-루프 서열/구조 (HSL)를 포함하는 mRNA 화합물을 포함한다. 상기 실시형태에서, mRNA 서열은 적어도 하나의 (또는 그 이상의) 히스톤 스템 루프 서열 또는 구조를 포함할 수 있다. 그러한 히스톤 스템-루프 서열은 바람직하게 그 개시내용이 참조로 본 명세서에 포함되는 WO 2012/019780 A1에 개시된 히스톤 스템-루프 서열로부터 선택된다. 본 발명 내에서 이용될 수 있는 히스톤 스템-루프 서열은 바람직하게 WO 2012/019780 A1의 화학식 (Ⅰ) 또는 (Ⅱ)로부터 유래될 수 있다. 더 바람직한 실시예에 따르면, 코딩 RNA는 특허출원 WO 2012/019780 A1의 특정 화학식 (Ia) 또는 (Ⅱa)의 적어도 하나로부터 유래되는 적어도 하나의 히스톤 스템-루프 서열을 포함할 수 있다. 더 바람직한 실시예에 따르면, 코딩 RNA는 화학식 (Ⅰ), 화학식 (Ⅱ), 화학식 (Ia) 또는 49-52페이지 "히스톤 스템-루프" 섹션에서 특허출원 WO 2018/104538 A1에 개시된, 및 WO 2018/104538 A1에 개시된 서열식별번호:1451-1452에 개시된 히스톤 스템-루프로부터 유래되는 적어도 하나의 히스톤 스템-루프 서열을 포함할 수 있으며, WO 2018/104538 A1 특히 서열식별번호:1451-1452는 본 명세서에 참조로 포함된다.
특히 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 RNA는 적어도 하나의 히스톤 스템-루프 서열을 포함하며, 상기 히스톤 스템-루프 서열은 서열식별번호: 3 또는 4와 동일하거나, 또는 적어도 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 핵산 서열, 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함한다.
신호 펩타이드
다른 실시형태에 따르면, 본 발명의 조성물은 추가적으로 또는 대안적으로 분비성 신호 펩타이드를 코딩할 수 있는 mRNA 화합물을 포함한다. 그러한 신호 펩타이드는, 일반적으로 약 15 내지 30개 아미노산의 길이를 나타내고, 바람직하게 코딩도니 펩타이드의 N-말단에 위치하며, 이에 제한되는 것은 아닌 서열이다. 본 명세서에 정의된 신호 펩타이드는 적어도 하나의 mRNA 서열에 의해 코딩되는 항원, 항원성 단백질 또는 항원성 펩타이드를 정의된 세포 구획, 바람직하게 세포 표면, 소포체 (endoplasmic reticulum, ER) 또는 엔도솜-리소좀 구획(endosomal-lysosomal compartiment)으로 수송될 수 있도록 한다. 본 명세서에 정의된 분비성 신호 펩타이드 서열의 예는 고전적 또는 비고적적 MHC-분자의 신호 서열 (예를 들어, MHC I 및 Ⅱ 분자, 예를 들어, MHC 클래스 I 분자 HLA-A*0201의 신호 서열), 본 명세서에 정의된 사이토카인 또는 면역글로불린의 신호 서열, 본 명세서에 정의된 면역글로불린 또는 항체의 불변 사슬의 신호 서열, Lamp1의 신호 서열, 타파신(Tapasin), Erp57, 칼레티쿨린(Calreticulin), 칼넥신(Calnexin), 및 추가적인 막 관련 단백질의 신호 서열 또는 소포체 (ER) 또는 엔도솜-리소좀 구획과 관련된 단백질의 신호 서열을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 가장 바람직하게, MHC 클래스 I 분자 HLA-A*0201의 신호 서열이 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 예를 들어, HLA-A로부터 유래되는 신호 펩타이드는 바람직하게 본 명세서에 정의된 코딩된 항원 또는 그 단편 또는 변이체의 분비를 촉진하기 위하여 사용된다. 더욱 바람직하게, HLA-A 신호 펩타이드는 본 명세서에 정의된 코딩된 항원 또는 그 단편 또는 변이체에 융합된다.
본 발명의 조성물에 혼입되는 mRNA 화합물은 예를 들어, 고체 상 RNA 합성과 같은 합성 방법, 및 특히 실시예에 기술된 바와 같은, RNA 시험관 내 전사 반응과 같은 시험관 내 방법을 포함하는 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
지질 나노입자 조성물의 제조방법
본 발명은 하기 단계를 포함하는 상기 지질 나노입자의 제조방법에 추가적으로 관련된다:
(ⅰ) 하기를 제공하는 단계:
a) 본 명세서에 정의된 화학식 (Ⅰ)의 양이온성 지질 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 호변이성질체, 프로드러그 또는 입체이성질체;
b) 본 명세서에 정의된 폴리머 컨쥬게이트 지질 ;
c) 적어도 하나의 항원성 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 mRNA 서열을 포함하는 mRNA 화합물;
d) 선택적으로, 스테로이드; 및
e) 선택적으로, 중성 지질;
(ⅱ) 양이온성 지질 및/또는 폴리머 컨쥬게이트 지질 및 선택적으로 중성 지질 및/또는 스테로이드 또는 스테로이드 유도체를 에탄올과 같은 알코올에서 가용화하는 단계;
(ⅲ) 알코올성 지질 용액을 mRNA 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 수용액과 혼합하는 단계;
(ⅳ) 알코올을 제거하여, mRNA 폴리뉴클레오타이드를 캡슐화하거나 회합하여 지질 나노입자를 형성하는 단계; 및 선택적으로
(ⅴ) 지질 나노입자를 분리 또는 정제하는 단계.
알코올은 지질 또는 지질 나노입자의 형성에 부정적 영향을 미치지 않는 임의의 적합한 방법에 의해 제거될 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 알코올은 투석에 의해 제거된다. 대안적인 실시형태에서, 알코올은 정용여과(diafiltration)에 의해 제거된다.
지질 나노입자의 분리 및 선택적 정제는 임의의 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게, 지질 나노입자는 여과되며, 더욱 바람직하게 지질 나는 멸균 필터를 통한 여과에 의해 분리 또는 정제된다.
일부 실시형태에서, 용액은 미세유체 혼합기(microfluidic mixer)에서 혼합되어 조성물을 수득한다. 적합하게, 미세유체 혼합 상태는 80% 초과, 바람직하게 90% 초과, 더욱 바람직하게 94% 초과의 캡슐화 효율(encapsulation efficiency, EE)로 약학적 활성 화합물의 캡슐화를 얻도록 선택된다.
약학 조성물 및 키트
본 발명은 추가적으로 본 발명에 따른 적어도 하나의 지질 나노입자를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 지질 나노입자는 본 명세서에 정의된 적어도 하나의 항원성 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 mRNA 화합물을 포함한다.
본 발명의 일 실시형태에서, mRNA 서열은 하나의 항원성 펩타이드 또는 단백질을 코딩한다. 본 발명의 대안적인 실시형태에서, mRNA 서열은 하나를 초과하는 항원성 펩타이드 또는 단백질을 코딩한다.
본 발명의 일 실시형태에서, 약학 조성물은 본 발명에 따른 지질 나노입자를 포함하며, 지질 나노입자는 각각 항원성 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 상이한 mRNA 서열을 포함하는, 하나를 초과하는 mRNA 화합물을 포함한다.
본 발명의 대안적인 실시형태에서, 약학 조성물은 제2 지질 나노입자를 포함하며, 제2 지질 나노입자에 의해 포함되는 mRNA 화합물은 제1 지질 나노입자에 의해 포함되는 mRNA 화합물과 상이하다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 지질 나노입자를 포함하는 mRNA를 포함하는 조성물에 관한 것이며, 여기에서 mRNA는 본 명세서에 정의된 적어도 하나의 코딩 영역을 포함하는 mRNA 서열 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 본 발명의 조성물은 바람직하게 약학 조성물로서, 또는 백신으로서 제공된다.
본 발명의 조성물은 적합한 약학적으로 허용가능한 보조제를 더 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 보조제는 바람직하게 조성물의 면역 자극 특성을 향상시키기 위하여 첨가된다. 이러한 맥락에서, 보조제는 본 발명의 조성물의 투여 및 전달을 뒷받침하기에 적합한 임의의 화합물로 이해될 수 있다. 더욱이, 그러한 보조제는 선천 면역 시스템의 면역 반응, 즉, 비특이적 면역 반응을 개시 또는 증가시킬 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 다르게 말하면, 투여될 때, 본 발명의 조성물은 일반적으로 본 발명의 조성물에 함유되는 본 발명의 mRNA의 적어도 하나의 코딩 서열에 의해 코딩되는 본 명세서에 정의된 항원 또는 그 단편 또는 변이체에 기인하여 적응 면역 반응을 개시한다. 또한, 본 발명의 조성물은 본 명세서에 정의된 보조제를 본 발명의 조성물에 첨가하는 것에 의해 (지지) 선천 면역 반응을 생성할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 대상에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공하며, 이 방법은 대상에서 항원 특이적 면역 반응을 생성하기에 효과적인 양으로 본 발명의 백신을 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 바이러스 항원을 코딩하는 mRNA의 유효량을 포함하는 대상의 백신 접종에 사용하기 위한 본 명세서에 기재된 조성물 또는 키트 또는 부품 키트를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
그러한 보조제는 당해 기술분야에 공지되고 본 경우에 적합한, 즉 포유동물에서 면역 반응의 유도를 지지하는 임의의 보조제로부터 선택될 수 있다. 바람직하게, 보조제는 전체적으로 참조로 본 명세서에 포함되는 WO 2018/078053 A1의 160페이지 3-161라인에 개시된 보조제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
특히 바람직한 보조제는 Th1-면역 반응의 유도 또는 나이브 T-세포, 예를 들어, GM-CSF, IL-12, IFNγ, 상기 정의된 임의의 면역 자극성 핵산, 바람직하게 면역 자극성 RNA, CpG DNA 등의 성숙을 지지하는 보조제로부터 선택될 수 있다.
추가적인 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 항원 제공 mRNA 외에, 추가적인 항원 (예를 들어, 펩타이드 또는 단백질의 형태) 또는 추가적인 항원-코딩 핵산; 추가적인 면역치료제(immunotherapeutic agent); 일 이상의 보조 물질; 또는 인간 톨 유사 수용체에 대한 그의 결합 친화도(리간드로서)로 인하여 면역자극성으로 알려진 임의의 추가적인 화합물; 및/또는 보조제 핵산, 바람직하게 면역 자극성 RNA (isRNA)을 포함하는 군으로부터 선택되는 추가적인 성분을 함유하는 것이 가능하다.
본 발명의 조성물은 또한 원하는 경우, 그의 면역원성 또는 면역 자극 능력을 증가시키기 위하여 일 이상의 보조 물질을 함유할 수 있다. 본 명세서에 정의된 mRNA 및 본 발명의 조성물에 선택적으로 함유될 수 있는 보조 물질의 상승 작용은 바람직하게 이에 의해 달성된다. 다양한 유형의 보조 물질에 따라, 다양한 메커니즘이 이와 관련하여 고려될 수 있다. 예를 들어, 수지상 세포 (DCs), 예를 들어 리포 다당류, TNF-알파 또는 CD40 리간드의 성숙을 가능하게 하는 화합물은 적합한 보조 물질의 첫 번째 부류를 형성한다. 일반적으로, 표적화된 방식으로 면역 반응이 향상되거나 영향받을 수 있도록 하는 "위험(danger) 신호" (LPS, GP96 등) 또는 GM-CFS와 같은 사이토카인의 방식으로 면역 시스템에 영향을 미치는 임의의 제제를 보조 물질로 사용할 수 있다. 특히 바람직한 보조 물질은 모노카인, 림포카인, 인터류킨 또는 케모카인과 같은 사이토카인, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IFN-알파, IFN-베타, IFN-감마, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-베타 또는 TNF-알파와 같은 선천 면역 반응을 더 촉진시키는 사이토카인, hGH와 같은 성장 인자이다.
적합한 보조제는 화학식 GlXmGn(상기 식에서, G는 구아노신, 우리실, 또는 구아노신 또는 우라실의 유사체이며; X는 구아노신, 우라실, 아데노신, 티민, 시토신 또는 전술한 뉴클레오타이드의 유사체이며; l은 1 내지 40의 정수이며, l이 1인 경우, G는 구아노신 또는 그의 유사체이며, l이 1보다 큰 경우, 뉴클레오타이드의 적어도 50%는 구아노신 또는 그의 유사체이며; m은 적어도 3인 정수이며; m이 3인 경우, X는 우라실 또는 그의 유사체이며, m이 3보다 큰 경우, 적어도 3개의 연속적인 우라실 또는 그의 유사체가 발생하며; n은 1 내지 40의 정수이며, n이 1인 경우, G는 구아노신 또는 그의 유사체이며, n이 1보다 큰 경우, 뉴클레오타이드의 적어도 50%는 구아노신 또는 그의 유사체임)를 갖는 핵산, 또는 화학식: (NuGlXmGnNv)a (상기 식에서, G는 구아노신 (구아닌), 우리딘 (우라실) 또는 구아노신 (구아닌) 또는 우리딘 (우라실)의 유사체, 바람직하게 구아노신 (구아닌) 또는 그의 유사체이며; X는 구아노신 (구아닌), 우리딘 (우라실), 아데노신 (아데닌), 티민 (티민), 시티딘 (시토신), 또는 이들 뉴클레오타이드 (뉴클레오사이드)의 유사체, 바람직하게 우리딘 (우라실) 또는 그의 유사체이며; N은 약 4 내지 50개, 바람직하게 약 4 내지 40개, 더욱 바람직하게 약 4 내지 30개 또는 4 내지 20개 핵산의 길이를 갖는 핵산 서열이며, 각각의 N은 구아노신 (구아닌), 우리딘 (우라실), 아데노신 (아데닌), 티민 (티민), 시티딘 (시토신) 또는 이들 뉴클레오타이드 (뉴클레오사이드)의 유사체로부터 독립적으로 선택되며; a는 1 내지 20, 바람직하게 1 내지 15, 가장 바람직하게 1 내지 10의 정수이며; l은 1 내지 40의 정수이며, l이 1인 경우, G는 구아노신 (구아닌) 또는 그 유사체이며, l이 1보다 큰 경우, 이러한 뉴클레오타이드 (뉴클레오사이드)의 적어도 50%가 구아노신 (구아닌) 또는 그의 유사체이며; m은 적어도 3인 정수이며; m이 3인 경우, X는 우리딘 (우라실) 또는 그의 유사체이며, 및 m이 3보다 큰 경우, 적어도 3개의 연속적인 우리딘 (우라실) 또는 우리딘 (우라실)의 유사체가 발생하며; n은 1 내지 40의 정수이며, n이 1인 경우, G는 구아노신 (구아닌) 또는 그의 유사체이며, n이 1보다 큰 경우, 이러한 뉴클레오타이드 (뉴클레오사이드)의 적어도 50%가 구아노신 (구아닌) 또는 그의 유사체이며; u, v는 서로 독립적으로 0 내지 50의 정수일 수 있으며, 바람직하게 u = 0, v ≥ 1, 또는 v = 0, u ≥ 1임)을 갖는 핵산으로부터 더 선택될 수 있으며, 화학식 (NuGlXmGnNv)a의 핵산 분자는 적어도 50개 뉴클레오타이드, 바람직하게 적어도 100개 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게 적어도 150개 뉴클레오타이드, 더욱더 바람직하게 적어도 200개 뉴클레오타이드, 가장 바람직하게 적어도 250개 뉴클레오타이드의 길이를 갖는다. 다른 적합한 보조제는 화학식: ClXmCn을 갖는 핵산으로부터 더 선택될 수 있으며, 상기 식에서, C는 시토신, 우라실 또는 시토신 또는 우라실의 유사체이며; X는 구아노신, 우라실, 아데노신, 티민, 시토신 또는 전술한 뉴클레오타이드의 유사체이며; l은 1 내지 40의 정수이며, l이 1인 경우, C는 시토신 또는 그의 유사체이며, l이 1보다 큰 경우, 뉴클레오타이드의 적어도 50%가 시토신 또는 그의 유사체이며; m은 적어도 3인 정수이며; m이 3인 경우, X는 우라실 또는 그의 유사체이며, m이 3보다 큰 경우, 적어도 3개의 연속적인 우라실 또는 그의 유사체가 발생하며; n은 1 내지 40의 정수이며, n이 1인 경우, C는 시토신 또는 그의 유사체이며, n이 1보다 큰 경우, 뉴클레오타이드의 적어도 50%는 시토신 또는 그의 유사체이다.
이러한 맥락에서, WO 2008/014979 (전체 개시내용, 본질적으로 청구항 1, 2, 3, 4 및 5의 요지) 및 WO 2009/095226의 개시내용은 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함된다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 코딩 여역을 포함하는 m RNA 서열을 포함하는 적어도 하나의 mRNA 화합물을 포함하는 본 발명에 따른 지질 나노입자를 포함하는 mRNA에 기초하는 백신을 제공한다. 본 발명에 따른 백신은 바람직하게 본 명세서에 정의된 (약학) 조성물이다.
따라서, 본 발명에 따른 백신은 본 명세서에 기재된 (약학) 조성물과 동일한 성분에 기초한다. 본 명세서에 제공된 (약학) 조성물의 설명을 참조할 수 있다. 바람직하게, 본 발명에 따른 백신은 본 명세서에 정의된 적어도 하나의 mRNA 서열을 포함하는 지질 나노입자를 포함하는 적어도 하나의 mRNA 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 백신이 지질 나노입자를 포함하는 mRNA에 캡슐화된 하나를 초과하는 mRNA 서열(바람직하게는 별개의 항원성 펩티드 또는 단밸질을 코딩하는, 본 발명에 따른 복수의 RNA 서열과 같이)을 포함하는 실시형태에서, 백신은 물리적으로 분리된 형태로 제공될 수 있으며, 별개의 투여 단계에 의해 투여될 수 있다. 본 발명에 따른 백신은 특히 mRNA 서열이 하나의 단일 조성물에 의해 제공되는 본 명세서에 기재된 (약학) 조성물에 상응할 수 있다. 그러나, 본 발명의 백신은 물리적으로 분리되어 제공될 수 있다. 예를 들어, 백신이 본 명세서에 정의된 지질 나노입자를 포함하는 mRNA에 캡슐화된 하나를 초과하는 mRNA 서열/종을 포함하는 실시형태에서, 이러한 RNA 종은 각각 별개의 항원성 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는, 각각 적어도 하나의 mRNA 종/서열 (예를 들어, 3개의 별개의 mRNA 종/서열)을 함유할 수 있는, 예를 들어, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 별개의 조성물이 제공될 수 있으며, 이는 조합되거나 조합되지 않을 수 있다. 또한, 본 발명의 백신은 적어도 2개의 별개의 조성물의 조합일 수 있으며, 각각의 조성물은 본 명세서에 정의된 항원성 펩타이드 또는 단백질의 적어도 하나를 코딩하는 적어도 하나의 mRNA를 포함한다. 대안적으로, 백신은 적어도 하나의 mRNA, 바람직하게 적어도 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 이상의 mRNA의 조합으로 제공될 수 있으며, 각각은 본 명세서에 정의된 항원성 펩타이드 또는 단백질의 하나를 코딩한다. 백신은 사용 전에 하나의 단일 조성물을 제공하기 위하여 조합될 수 있으며, 또는 본 명세서에 정의된 지질 나노입자를 포함하는 mRNA에 캡슐화된 항원성 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 별개의 mRNA 서열/종을 투여하기 위하여 1회를 초과하는 투여가 필요하도록 사용될 수 있다. 백신이, 본 명세서에 정의된 항원 조합을 코딩하는 지질 나노입자를 포함하는, 일반적으로 적어도 2개의 mRNA 서열을 포함하는 적어도 하나의 mRNA를 함유하는 경우, 예를 들어, 하나의 단일 투여에 의해(모든 mRNA 종/서열의 조합), 적어도 2개의 개별적인 투여에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 별개의 엔티티로(하나의 mRNA 종을 함유), 또는 조합된 엔티티로(하나를 초과하는 mRNA 종을 함유)제공되는, 본 명세서에 정의된 적어도 하나의 항원성 펩타이드 또는 단백질 또는 항원의 조합을 코딩하는 모노-, 바이- 또는 멀티시스트로닉 mRNA의 임의의 조합은 본 발명에 따른 백신으로 이해된다. 본 발명의 백신의 특히 바람직한 실시형태에 따르면, 전체적으로 본 발명의 조성물에 의해 코딩되는 적어도 하나의 항원, 또는 본 명세서에 정의된 적어도 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 항원의 조합은 별개로 투여되는 개별적인 (모노시스트로닉) mRNA로서 제공된다.
본 발명에 따른 (약학) 조성물에서와 같이, 백신의 엔티티는 액체 형태 또는 건조 (예를 들어, 동결건조) 형태로 제공될 수 있다. 이들은 추가적인 성분, 특히 약학적 용도를 가능하게 하는 추가적인 성분을 더 함유할 수 있다. 백신 또는 (약학) 조성물은, 예를 들어, 또한 약학적으로 허용가능한 담체 및/또는 추가적인 보조 물질 및 첨가제 및/또는 보조제를 추가적으로 함유할 수 있다.
백신 또는 (약학) 조성물은 일반적으로 지질 나노입자에 캡슐화된 및/또는 회합된, 본 명세서에 정의된 항원성 펩타이드 또는 단백질 또는 그 단편 또는 변이체 또는 항원의 조합을 코딩하는 본 명세서에 정의된 바와 같은 본 발명에 따른 mRNA 화합물의 안전한 유효량을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 "안전한 유효량"은 mRNA의 양이 암 또는 질병 또는 암과 관련된 질병 또는 장애의 긍정적인 변형을 유의하게 유도하기에 충분한 것을 의미한다. 동시에, 그러나, "안전한 유효량"은 심각한 부작용을 회피하기에, 즉, 이점과 위험 사이의 합리적인 관계를 허용할 만큼 충분히 작다. 이 한계의 결정은 일반적으로 합리적인 의학적 판단의 범위 내에 있다. 본 발명의 백신 또는 (약학) 조성물과 관련하여, 표현 "안전한 유효량"은 바람직하게 과도하거나 손상을 주는 면역 반응이 달성되지 않지만, 바람직하게 그러한 면역 반응이 측정 가능한 수준 미만의 면역 반응이 달성되지 않는 방식으로 적응 면역 시스템을 자극하기에 적합한 mRNA (및 그의 코딩된 항원)의 양을 의미한다. 본 명세서에 정의된 (약학) 조성물 또는 백신의 mRNA의 그러한 "안전한 유효량"은, 바이- 또는 멀티시스트로닉 mRNA가 동일한 양의 모노시스트로닉 mRNA의 사용보다 코딩된 항원의 상당히 더 높은 발현에 이를 수 있으므로, mRNA의 유형에 따라, 예를 들어, 모노시스트로닉, 바이- 또는 멀티시스트로닉 mRNA로부터 더 선택될 수 있다. 상기 정의된 (약학) 조성물 또는 백신의 mRNA의 "안전한 유효량"은 의사의 지식과 경험 내에서 치료될 특정 상태 및 치료될 환자의 연령 및 신체 상태, 상태의 심각도, 치료 기간, 수반되는 요법의 성질, 사용되는 특정 약학적으로 허용되는 담체, 유사한 인자와 관련하여 더 변화될 수 있다. 본 발명에 따른 백신 또는 조성물은 약학 조성물 또는 백신으로서, 인간에 대하여 및 수의학적 목적을 위하여 본 발명에 따라 이용될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 (약학) 조성물, 백신 또는 부품 키트의 지질 나노입자를 포함하는 mRNA는 동결건조된 형태로 제공된다. 바람직하게, 지질 나노입자를 포함하는 동결건조된 mRNA는 투여 전에, 적합한 버퍼, 유리하게는 수성 담체, 예를 들어, 링거-락테이트 용액, 링거액, 포스페이트 버퍼 용액에 기초하는 적한한 버퍼에서 재구성된다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 (약학) 조성물, 백신 또는 부품 키트는 적어도 1종, 2종, 3종, 4종, 5종, 6종 또는 그 이상의 mRNA 화합물을 함유하며, 이는 선택적으로 동결건조된 형태(선택적으로 적어도 하나의 추가적인 첨가제와 함께)로 단일 종 지질 나노입자로서, 또는 각각의 LNP 종에 대하여 개별적으로 제공될 수 있으며, 바람직하게 각각의 (모노시스트로닉) mRNA의 개별적인 투여를 가능하게 하도록 그 이용 전에 적합한 버퍼 (링거-락테이트 용액과 같이)에서 별개로 재구성된다.
본 발명에 따른 백신 또는 (약학) 조성물은 일반적으로 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 함유할 수 있다. 적합한 담체 및 부형제의 예는 당해 기술분야의 통상의 기술자에 공지되어 있으며, 투여 형태 및 제형의 성질에 따라, 보존제, 충전제, 붕해제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 감미제, 풍미제, 방향제, 항박테리아제, 항진균제, 윤활제 및 분산제를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 맥락에서 용어 "약학 조성물"은 활성제를 포함하고, 또한 일 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 의미한다. 조성물은 투여 형태 및 제형의 성질데 따라, 예를 들어, 희석제, 부형제, 비히클, 보존제, 충전제, 붕해제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 감미제, 풍미제, 방향제, 항박테리아제, 항진균제, 윤활제 및 분산제로 이루어진 군으로부터 선택되는 성분을 추가적으로 함유할 수 있다.
본 명세서에 사용된 표현 "약학적으로 허용가능한 담체"는 바람직하게 본 발명의 백신의 액체 또는 비액체 기반을 포함한다. 본 발명의 백신이 액체 형태로 제공되는 경우, 담체는 물, 일반적으로 발열원이 없는 물(pyrogen-free water); 등장 식염수 또는 버퍼 (수성) 용액, 예를 들어, 포스페이트, 시트레이트 등 버퍼 용액일 것이다. 특히, 본 발명의 백신의 주사를 위하여, 물 또는 바람직하게 버퍼, 더욱 바람직하게 수성 버퍼가 사용될 수 있으며, 이는 소듐 염, 바람직하게 적어도 50mM 의 소듐 염, 칼슘 염, 바람직하게 적어도 0,01mM의 칼슘 염, 및 선택적으로 포타슘 염, 바람직하게 적어도 3mM의 포타슘 염을 함유한다. 바람직한 실시형태에 따르면, 소듐, 칼슘, 및 선택적으로, 포타슘 염은 그들의 할로겐화물의 형태로, 예를 들어, 클로라이드, 아이오다이드, 또는 브로마이드로, 그들의 하이드록사이드, 카보네이트, 또는 설페이트 등의 형태로 존재할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니지만, 소듐 염의 예는 예를 들어, NaCl, NaI, NaBr, Na2CO3, NaHCO3, Na2SO4,를 포함하며, 선택적인 포타슘 염의 예는 예를 들어, KCl, KI, KBr, K2CO3, KHCO3, K2SO4를 포함하며, 칼슘 염의 예는 예를 들어, CaCl2, CaI2, CaBr2, CaCO3, CaSO4, Ca(OH)2를 포함한다. 더욱이, 전술한 양이온의 유기 음이온이 버퍼에 함유될 수 있다. 더 바람직한 실시형태에 따르면, 상기 정의된 바와 같이 주사 목적에 적합한 버퍼는 소듐 클로라이드 (NaCl), 칼슘 클로라이드 (CaCl2) 및 선택적으로 포타슘 클로라이드 (KCl)로부터 선택되는 염을 함유할 수 있으며, 여기에서 클로라이드에 더하여 추가적인 음이온이 존재할 수 있다. CaCl2는 KCl과 같은 다른 염으로 대체될 수 있다. 일반적으로, 주사 버퍼에서 염은 적어도 50mM 소듐 클로라이드 (NaCl), 적어도 3mM 포타슘 클로라이드 (KCl) 및 적어도 0,01mM 칼슘 클로라이드 (CaCl2)의 농도로 존재한다. 주사 버퍼는 특정 레퍼런스 매질에 대하여 고장성(hypertonic), 등장성(isotonic) 또는 저장성(hypotonic)일 수 있으며, 즉, 버퍼는 특정 레퍼런스 매질에 대하여 더 높은, 동일한 또는 더 낮은 염 함량을 가질 수 있으며, 바람직하게 전술한 염의 그러한 농도가 사용될 수 있으며, 이는 삼투 또는 다른 농도 효과로 인한 세포 손상을 유발하지 않는다. 레퍼런스 매질은 예를 들어, 혈액, 림프액, 세포질액, 또는 다른 체액과 같은 액체를 발생시키는 "생체 내" 방법에서의 액체, 또는 예를 들어, 통상적인 버퍼 또는 액체와 같은 "시험관 내"에서 레퍼런스 매질로 사용될 수 있는 액체이다. 그러한 통상적인 버퍼 또는 액체는 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
그러나, 사람에게 투여하기에 적합한 일 이상의 상용성 고체 또는 액체 충전제 또는 희석제 또는 캡슐화 화합물도 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "상용성(compatible)"은 본 발명의 백신의 부형제가 본 명세서에 정의된 본 발명에 따른 mRNA와 상호작용이 발생하지 않는 방식으로 혼합될 수 있다는 것을 의미하며, 이는 전형적인 사용 조건 하에서 본 발명의 백신의 약학적 효과를 실질적으로 감소시키지 않는다. 약학적으로 허용가능한 담체, 충전제 및 희석제는 물론 치료할 사람에게 투여하기에 적합하게 만들기 위하여 충분히 높은 순도 및 충분히 낮은 독성을 가져야 한다. 그의 약학적으로 허용가능한 담체, 충전제 또는 부형제로 사용될 수 있는 화합물의 일부 예는 예를 들어, 락토오스, 글루코오스, 트레할로스 및 수크로오스와 같은 당; 예를 들어, 옥수수 전분 또는 감자 전분과 같은 전분; 덱스트로스; 예를 들어, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트와 같은 셀룰로오스 및 그의 유도체; 분말 트라가칸트; 맥아; 젤라틴; 탈로우(tallow); 예를 들어, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트와 같은 고체 활택제(glidants); 칼슘 설페이트; 땅콩 오닐, 면실유, 참기름, 올리브 오일, 옥수수 오일 및 테오브로마 오일과 같은 식물성 오일; 예를 들어, 폴리프로필렌 글리콜, 글리세롤, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; 알긴산이다.
약학적으로 허용가능한 담체의 선택은 원칙적으로 본 발명에 따른 약학 조성물 또는 백신이 투여되는 방식에 의해 결정된다. 조성물 또는 백신은 예를 들어, 전신적으로 또는 국소적으로 투여될 수 있다.
전신 투여를 위한 경로는, 일반적으로 예를 들어, 경피, 경구, 피하, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 피부 내 및 복강 내 주사를 포함하는 비경구 경로, 및/또는 비강 내 투여 경로를 포함한다. 백신 투여를 위한 본 발명에 따른 바람직한 투여 경로는 근육 내 주사 및 피부 내 주사이다.
국소 투여를 위한 경로는, 일반적으로 예를 들어, 국소 투여 경로, 또한 피부 내, 경피, 피하, 또는 근육 내 주사 또는 병변 내, 두개 내, 폐 내, 심장 내, 및 설하 주사를 포함한다. 더욱 바람직하게, 본 발명에 따른 조성물 또는 백신은 피부 내, 피하, 또는 근육 내 경로에 의해, 바람직하게 바늘이 없는 및/또는 바늘이 있는 주사일 수 있는 주사에 의해 투여될 수 있다.
바람직한 실시형태에 따르면, 인공 핵산 (RNA) 분자, (약학) 조성물 또는 백신 또는 키트는 비경구 경로에 의해, 바람직하게 피부 내, 피하, 또는 근육 내 경로를 통하여 투여된다. 바람직하게, 상기 인공 핵산 (RNA) 분자, (약학) 조성물 또는 백신 또는 키트는 주사, 예를 들어, 피하, 근육 내 또는 피부 내 주사에 의해 투여될 수 있으며, 이는 바늘이 없는 및/또는 바늘이 있는 주사일 수 있다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 의학 용도 및/또는 치료 방법은 피하, 근육 내 또는 피부 내 주사에 의해, 바람직하게 근육 내 또는 피부 내 주사에 의해, 더욱 바람직하게 피부 내 주사에 의해 상기 인공 핵산 (RNA) 분자, (약학) 조성물 또는 백신 또는 키트를 투여하는 것을 포함한다. 그러한 주사는 통상적인 바늘 주사 또는 (바늘 없는) 제트 주사를 사용하여, 바람직하게 (바늘 없는) 제트 주사를 사용하여 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "제트 주사"는 바늘이 없는 주사 방법을 나타내며, 여기에서, 적어도 하나의 본 발명의 mRNA 서열 및 선택적으로 추가적인 적합한 부형제를 함유하는 유체가 오리피스를 통과하도록 하여, 포유동물 피부 및 주사 설정에 따라 피하 조직 또는 근육 조직에 침투할 수 있는 고압의 초미세 액체를 생성한다. 원칙적으로, 액체 흐름은 피부에 구멍을 형성하며, 이 구멍을 통하여 액체 흐름이 표적 조직으로 밀려간다. 바람직하게, 제트 주사는 본 발명에 따른 mRNA 서열의 피부 내, 피하 또는 근육 내 주사에 이용된다. 바람직한 실시형태에서, 제트 주사는 본 발명에 따른 mRNA 서열의 근육 내 주사에 이용된다. 추가적인 바람직한 실시형태에서, 제트 주사는 본 발명에 따른 mRNA 서열의 피부 내 주사에 이용된다.
따라서, 조성물/백신은 바람직하게 제제화된 액체 또는 고체 형태로 제제화된다. 투여되는 본 발명에 따른 백신 또는 조성물의 적합한 양은 일상적인 실험에 의해, 예를 들어, 동물 모델을 이용하여 결정될 수 있다. 그러한 모델은 토끼, 양, 마우스, 쥐, 개 및 인간이 아닌 영장류 모델을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 주사용으로 바람직한 단위 제형은 물, 생리 식염수 또는 이들의 혼합물의 멸균 용액을 포함한다. 그러한 용액의 pH는 약 7.4와 같이 생리학적으로 허용가능한 pH로 조정되어야 한다. 주사에 적합한 담체는 하이드로겔, 제어 또는 지연 방출을 위한 장치, 폴리락트산 및 콜라겐 매트릭스를 포함한다. 국소 적용을 위한 적합한 약학적으로 허용가능한 담체는 로션, 크림, 겔 등에 이용되기에 적합한 것을 포함한다. 본 발명의 조성물 또는 백신이 경구 투여되는 경우, 정제, 캡슐 등이 바람직한 단위 제형이다. 경구 투여에 이용될 수 있는 단위 제형의 제조를 위한 약학적으로 허용가능한 담체는 당해 기술분야에 공지되어 있다. 그 선택은 맛, 비용 및 저장성과 같은 2차적 고려사항에 의존할 것이며, 이는 본 발명의 목적에 중요하지 않으며, 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 어려움 없이 이루어질 수 있다.
본 발명의 백신 또는 조성물은 면역원성을 추가적으로 증가시키기 위하여 일 이상의 보조 물질을 더 함유할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이 본 발명의 백신 또는 조성물과 선택적으로 공동 제제화될 수 있는(또는 개별적으로 제제화될 수 있는), 본 발명의 조성물에 함유된 mRNA 및 보조 물질의 상승 작용은 바람직하게는 이에 의해 달성된다. 다양한 유형의 보조 물질에 따라, 다양한 메커니즘은 이와 관련하여 역할을 할 수 있다. 예를 들어, 수지상 세포 (DCs), 예를 들어 리포 다당류, TNF-알파 또는 CD40 리간드의 성숙을 가능하게 하는 화합물은 적합한 보조 물질의 첫 번째 부류를 형성한다. 일반적으로, "위험 신호" (LPS, GP96 등) 또는 GM-CFS와 같은 사이토카인의 방식으로 면역 시스템에 영향을 미치는 임의의 제제를 보조 물질로 사용할 수 있으며, 이는 본 발명에 따른 면역 자극 보조제에 의해 생성되는 면역 반응이 표적화된 방식으로 향상 및/또는 영향받을 수 있도록 한다. 특히 바람직한 보조 물질은 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, INF-알파, IFN-베타, INF-감마, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-베타 또는 TNF-알파와 같은 - 코딩된 적어도 하나의 항원에 의한 적응 면역 반응의 유도에 더하여 - 선천 면역 반응을 촉진하는 모노카인, 림포카인, 인터류킨 또는 케모카인과 같은 사이토카인, hGH와 같은 성장 인자이다. 바람직하게, 그러한 면역원성 증가제 또는 화합물은 개별적으로 제공되며(본 발명의 백신 또는 조성물과 공동 제제화되지 않음), 개별적으로 투여된다.
본 발명의 백신 또는 조성물에 포함될 수 있는 추가적인 첨가제는 예를 들어, Tween과 같은 유화제; 예를 들어, 소듐 라우릴 설페이트와 같은 습윤제; 착색제; 맛 전달제(taste-imparting agents), 약학 담체; 정제 형성제; 안정화제; 항산화제; 보존제이다.
본 발명의 백신 또는 조성물은 또한 인간 톨 유사 수용체 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10에 대한 결합 친화도(리간드로서)로 인해, 또는 쥣과 톨 유사 수용체 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 또는 TLR13에 대한 결합 친화도(리간드로서)로 인해 면역자극성으로 알려져 있는 임의의 추가적인 화합물을 추가적으로 함유할 수 있다.
이러한 맥락에서 본 발명의 백신 또는 조성물에 첨가될 수 있는 다른 부류의 화합물은 CpG 핵산, 특히 CpG-RNA 또는 CpG-DNA일 수 있다. CpG-RNA 또는 CpG-DNA는 단일 가닥 CpG-DNA (ss CpG-DNA), 이중 가닥 CpG-DNA (dsDNA), 단일 가닥 CpG-RNA (ss CpG-RNA) 또는 이중 가닥 CpG-RNA (ds CpG-RNA)일 수 있다. CpG 핵산은 바람직하게 CpG-RNA의 형태, 더욱 바람직하게 단일 가닥 CpG-RNA (ss CpG-RNA)의 형태일 수 있다. CpG 핵산은 바람직하게 적어도 일 이상의 (유사분열촉진(mitogenic)) 시토신/구아닌 디뉴클레오타이드 서열(들) (CpG 모티프(s))이다. 첫 번째 바람직한 대안에 따르면, 이 서열에 함유되는 적어도 하나의 CpG 모티프, 즉 CpG 모티프의 C (시토신) 및 G (구아닌)은 비메틸화된다. 이 서열에 선택적으로 함유되는 모든 추가적인 시토신 또는 구아닌은 메틸화되거나, 또는 비메틸화될 수 있다. 추가적인 바람직한 대안에 따르면, CpG 모티프의 C (시토신) 및 G (구아닌)은 메틸화된 형태로 존재할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 본 명세서에 정의된 mRNA 서열을 포함하는 mRNA 화합물 및 본 명세서에 정의된 화학식 (Ⅰ) 또는 화학식 (Ⅱ)에 따른 적어도 하나의 지질을 포함하는 키트, 특히 부품 키트를 제공한다. 본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 또한 본 명세서에 정의된 mRNA 서열을 포함하는 mRNA 하합물 및 중성 지질/인지질로서 DPhyPE를 포함하는 키트, 특히 부품 키트를 제공한다. 추가적인 실시형태에서, 키트는 상기 정의된 지질 나노입자 또는 상기 정의된 지질 나노입자를 포함하는 (약학) 조성물, 및/또는 본 발명에 따른 백신, 선택적으로 가용화를 위한 액체 비히클 및 선택적으로 지질 나노입자, 조성물 및/또는 백신을 포함하는 MRNA의 투여 및 용량에 대한 정보를 갖는 기술 지침을 포함한다. 기술 지침은 지질 나노입자, 조성물 및/또는 백신를 포함하는 mRNA의 투여 및 용량에 대한 정보를 포함할 수 있다. 그러한 키트, 바람직하게 부품 키트는 전술한 적용 또는 용도의 임의의 것을 위하여, 바람직하게 SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 부니아 바이러스목 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뎅기열 바이러스 (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4), 에볼라 바이러스, 플라비바이러스, B형 간염 바이러스 (HBV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 인간 유두종 바이러스 (HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV), 인플루엔자 바이러스, 장외 병원성 대장균, 라사 맘마레나바이러스 (LASV), 메르스 코로나바이러스, 결핵균, 니파 바이러스, 노로바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 라이노바이러스, 로타 바이러스, 백시니아 바이러스, 황열병 바이러스, 지카 바이러스, 클라미디아 트라코마티스 (즉, 클라미디아를 일으키는 클라미디아 박테리아), 또는 말라리아 기생충 (예를 들어, 열대열 말라리아 원충, 삼일열 말라리아 원충, 사일열 말라리아 원충, 또는 난형 말라리아 원충) 감염 또는 그와 관련된 질병 또는 장애의 치료 또는 예방을 위한 본 발명에 따른 지질 나노입자의 사용을 위하여 (본 발명의 의약, 바람직하게 백신의 제조를 위하여) 적용될 수 있다.
키트는 또한 SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 부니아 바이러스목 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뎅기열 바이러스 (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4), 에볼라 바이러스, 플라비바이러스, B형 간염 바이러스 (HBV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 인간 유두종 바이러스 (HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV), 인플루엔자 바이러스, 장외 병원성 대장균, 라사 맘마레나바이러스 (LASV), 메르스 코로나바이러스, 결핵균, 니파 바이러스, 노로바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 라이노바이러스, 로타 바이러스, 백시니아 바이러스, 황열병 바이러스, 지카 바이러스, 클라미디아 트라코마티스 (즉, 클라미디아를 일으키는 클라미디아 박테리아), 또는 말라리아 기생충 (예를 들어, 열대열 말라리아 원충, 삼일열 말라리아 원충, 사일열 말라리아 원충, 또는 난형 말라리아 원충) 감염 또는 그에 관련된 질병 또는 장애의 치료 또는 예방을 위하여 본 명세서에 정의된 지질 나노입자, 조성물 또는 백신의 사용을 위하여 (본 발명의 백신의 제조를 위하여) 적용될 수 있으며, 여기에서 지질 나노입자, 조성물 및/또는 백신은 상기 정의된 바와 같이 포유동물에서 면역반응을 유도 또는 증강시킬 수 있다.
그러한 키트는 상기 정의된 바와 같이 포유동물에서 면역 반응을 조절, 바람직하게 유발, 예를 들어 유도 또는 증강시키기 위하여, 바람직하게 SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 부니아 바이러스목 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뎅기열 바이러스 (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4), 에볼라 바이러스, 플라비바이러스, B형 간염 바이러스 (HBV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 인간 유두종 바이러스 (HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV), 인플루엔자 바이러스, 장외 병원성 대장균, 라사 맘마레나바이러스 (LASV), 메르스 코로나바이러스, 결핵균, 니파 바이러스, 노로바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 라이노바이러스, 로타 바이러스, 백시니아 바이러스, 황열병 바이러스, 지카 바이러스, 클라미디아 트라코마티스 (즉, 클라미디아를 일으키는 클라미디아 박테리아), 또는 말라리아 기생충 (예를 들어, 열대열 말라리아 원충, 삼일열 말라리아 원충, 사일열 말라리아 원충, 또는 난형 말라리아 원충) 감염 또는 그에 관련된 질병 또는 장애의 치료 또는 예방을 지지하기 위하여, 본 명세서에 정의된 지질 나노입자, 조성물 또는 백신의 사용에 (본 발명의 백신의 제조를 위하여) 추가적으로 적용될 수 있다.
키트의 특별한 형태인 부품 키트는 키트의 상이한 부분에서 일 이상의 동일하거나 또는 상이한 본 명세서에 기재된 조성물 및/또는 일 이상의 동일하거나 또는 상이한 본 명세서에 기재된 백신을 함유할 수 있다. 부품 키트는 키트의 상이한 부분에 본 발명에 따른 지질 나노입자를 포함하는 (예를 들어, 하나의) 조성물, (예를 들어, 하나의) 백신 및/또는 mRNA를 함유할 수 있으며, 예를 들어, 키트의 각각의 부분은 바람직하게 별개의 항원을 코딩하는 본 명세서에 정의된 지질 나노입자를 포함하는 mRNA를 함유한다. 바람직하게, 키트 또는 부품 키트는 본 발명에 따른 mRNA를 가용화시키기 위한 비히클을 일부로 함유하며, 비히클은 선택적으로 링거-락테이트 용액이다. 상기 키트의 임의 것은 상기 정의된 바와 같이 치료 또는 예방에 이용될 수 있다.
이러한 측면의 다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 키트는 적어도 하나의 보조제를 더 함유할 수 있다. 추가적인 실시형태에서, 본 발명에 따른 키트는 적어도 하나의 추가적인 약학적 활성 성분, 바람직하게 암 또는 관련 장애의 치료 및/또는 예방에 적합한 치료 화합물을 더 함유할 수 있다. 또한, 다른 실시형태에서, 키트는 바늘, 어플리케이터, 패치 또는 주사 장치를 포함하는 본 발명에 따른 조성물 또는 백신의 투여에 필요하거나 적합한 부분 및/또는 장치를 더 함유할 수 있다.
투여 경로
약학적으로 허용가능한 담체의 선택은 원칙적으로 본 발명에 따른 약학 조성물 또는 백신이 투여되는 방식에 의해 결정된다. 본 발명의 조성물 또는 백신은 예를 들어, 전신적으로 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 전신 투여를 위한 경로는 일반적으로 예를 들어, 경피, 경구, 피하, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 피부 내 및 복강 내 주사를 포함하는 비경구 경로, 및/또는 비강 내 투여 경로를 포함한다. 국소 투여를 위한 경로는 일반적으로 예를 들어, 국소 투여 경로, 및 피부 내, 경피, 피하, 또는 근육 내 주사 또는 병변 내, 두개 내, 폐 내, 심장 내, 종양 내 및 설하 주사를 포함한다. 호흡기에 대한 투여는 스프레이 투여에 의해 수행될 수 있으며, 흡입은 특히, 폐, 기관기, 세기관지, 폐포 또는 부비동에 에어로졸 투여에 의해 수행될 수 있다.
추가적인 바람직한 실시형태에서, 투여 경로는 혈관 외 주사, 주입 또는 이식에 의한 것과 같이 대상에 대한 혈관 외 투여; 피부 또는 점막에 대한 국소 투여; 호흡기에 대하여 조성물을 전달하는 것과 같은 흡입; 또는 경피 또는 피부를 통한 투여로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더욱 추가적인 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 조성물 또는 백신은 국소 또는 국부 주사, 주입 또는 이식, 특히 피부 내, 피하, 근육 내, 전방 내(intracameral), 결막 하(subconjunctive), 맥락막상 주사(suprachoroidal injection), 망막 하(subretinal), 테논낭 하(subtenon), 안구 후(retrobulbar), 국소(topical), 후방 공막옆(posterior juxtascleral) 투여, 또는 폐 내 흡입, 간질(interstitial), 국소(locoregional), 유리체 내(intravitreal), 종양 내, 림프 내, 결절 내, 관절 내(intra-articular), 활액 내(intrasynovial), 관절 주위(periarticular), 복강 내(intraperitoneal), 복강 내(intra-abdominal), 심장 내, 병변 내, 심낭 내(intrapericardial), 심실 내(intraventricular), 흉강 내(intrapleural), 신경간 내(perineural), 흉 내(intrathoracic), 경막 외(epidural), 경막 내(intradural), 경막 주위의(peridural), 척추 강내(intrathecal), 골수 내(intramedullary), 대뇌 내(intracerebral), 음경 해면체 내(intracavernous), 음경 해면체 내(intracorporus cavernosum), 전립선 내(intraprostatic), 고환 내(intratesticular), 연골 내(intracartilaginous), 골 내(intraosseous), 디스크 내(intradiscal), 척수 내(intraspinal), 미추 내(intracaudal), 윤활낭 내(intrabursal), 치은 내(intragingival), 난소 내(intraovarian), 자궁 내(intrauterine), 안구 주위(periocular), 치주(periodontal), 안구후, 지주막 하(subarachnoid), 결막 하 또는 맥락막상 주사, 주입 또는 이식을 통하여 투여될 수 있다.
또한, 피부 또는 점막에 대한 국소 투여는 진피 또는 피부, 비강, 협측(buccal), 설하, 귀(otic) 또는 심이의(auricular), 눈의(ophthalmic), 결막(conjunctival), 질(vaginal), 직장(rectal), 자궁 경관 내(intracervical), 부비동 내(endosinusial), 후두(laryngeal), 구강인두(oropharyngeal), 수뇨관(ureteral), 요도(urethral) 투여에 의해 이루어질 수 있다. 백신 투여의 더 바람직한 경로는 근육 내, 피부 내, 비강 내 및 경구 투여이다 (예를 들어, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드, RNA 또는 mRNA를 포함하는 정제를 통하여).
바람직하게, 본 발명에 따른 조성물 또는 백신은 피부 내, 피하, 또는 근육 내 경로에 의해, 바람직하게 바늘이 없는 및/또는 바늘이 있는 주사일 수 있는, 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물 또는 백신은 바람직하게 액체 또는 고체 형태로 제제화된다. 투여되는 본 발명에 따른 백신 또는 조성물의 적합한 양은 일상적인 실험에 의해, 예를 들어, 동물 모델을 사용하여 결정될 수 있다. 그러한 모델은 토끼, 양, 마우스, 쥐, 개 및 인간이 아닌 영장류 모델이 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다.
주사를 위하여 바람직한 단위 제형은 물, 생리 식염수 또는 그 혼합물의 멸균 용액을 포함한다. 그러한 용액의 pH는 약 7.4와 같은 생리학적으로 허용가능한 pH로 조정되어야 한다. 주사를 위한 적합한 담체는 하이드로겔, 제어 또는 지연 방출을 위한 장치, 폴리락트산 및 콜라겐 매트릭스를 포함한다. 국소 적용을 위한 적합한 약학적으로 허용가능한 담는 로션, 크림, 겔 등에 사용되기에 적합한 것을 포함한다. 본 발명의 조성물 또는 백신이 경구적으로 투여되는 경우, 정제, 캡슐 등이 적합한 단위 제형이다. 경구 투여에 이용될 수 있는 단위 제형의 제조를 위한 약학적으로 허용가능한 담체는 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 그 선택은 맛, 비용 및 저장성과 같은 2차적인 고려사항에 따라 달라질 수 있으나, 이는 본 발명의 목적에 중요하지 않으며, 당해 기술분야의 통상의 기술자에 의해 어려움 없이 이루어질 수 있다.
조성물의 용도
본 발명의 조성물은 특히 의약으로 특히 유용하고, 이는 조성물 내에 혼입될 수 있고, 상기 조성물 및/또는 상기 조성물에 포함되는 지질 나노입자에 의해 인간 대상과 같은 대상에게 전달될 수 있는 활성 성분의 설명으로부터 명백할 것이다. 이와 같이, 본 발명의 추가적인 측면은 상기 기재된 조성물의 의약으로서 용도이다. 그러한 용도는 의약 제조를 위한 조성물의 용도로 표현될 수도 있다. 관련된 측면에 따르면, 본 발명은 이를 필요로 하는 인간 대상과 같은 대상에게 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법을 제공한다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 의약으로 이용되며, 여기에서 의약은 백신이다.
다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 의약으로 이용되며, 여기에서 의약은 바이러스, 박테리아 또는 원생동물 감염성 질병을 포함하는 감염성 질병, 암 또는 종양 질병, 간 질병, 자가면역 질병, 알레르기, 유전 질병을 포함하는 단성 유전자 질병, 일반적 유전자 질병, 유전적 배경이 있고 일반적으로 정의된 유전자 결함에 의해 유발되고 멘델의 법칙에 의해 유전되는 질병; 심혈관 질병, 신경 질병, 호흡계 질병, 소화기 질병, 피부 질병, 근골격계 장애, 결합 조직의 장애, 신생물, 면역 결핍, 내분비, 영양 및 대사 질병, 눈 질병, 귀 질병 및 펩타이드 또는 단백질 결핍과 관련된 질병으로부터 선택되는 질병의 방지, 예방, 치료 및/또는 개선에 적합하다.
다른 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 의약으로 이용되며, 여기에서 의약은 바이러스, 박테리아 또는 원생동물 감염성 질병을 포함하는 감염성 질병의 방지, 예방, 치료 및/또는 개선에 적합하며, 의약은 백신이다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 백신은 바이러스, 박테리아 또는 원생동물 감염성 질병을 포함하는 감염성 질병, 암 또는 종양 질병으로부터 선택되는 질병의 예방, 예장, 치료 및/또는 개선을 위한 본 명세서에 기재된 조성물, 키트 또는 부품 키트를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에, 감염성 질병; 암 또는 종양 질병, 장애 또는 상태; 간 섬유증, 간경변 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 간 질병; 알레르기; 또는 자가면역 질병; 장애 또는 상태의 치료 또는 예방 방법이 제공되며, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 본 명세서에 기재된 mRNA, 조성물, 백신, 키트 또는 부품 키트를 제공하는 단계; 및
b) mRNA, 조성물, 백신 또는 키트 또는 부품 키트를 조직 또는 유기체에 적용하거나 투여하는 단계.
다른 실시형태에서, mRNA, 조성물, 백신 또는 키트 또는 부품 키트가 정맥 내, 근육 내, 피하 또는 피부 내 주사에 의해 조직 또는 유기체에 투여되는 방법이 제공된다.
다른 추가적인 실시형태에서, 대상에서 항원 특이적 면역 반응을 생성하기에 효과적인 양으로 본 발명의 백신을 대상에게 투여하는 것을 포함하는 대상에서 면역 반응을 유도하는 방법이 제공된다.
추가적인 실시형태에서, 바이러스 항원을 코딩하는 mRNA의 유효량을 포함하는, 대상의 백신 접종에 사용되거나 또는 이에 적합한 본 명세서에 기재된 조성물을 포함하는 약학 조성물 또는 키트 또는 부품 키트가 제공된다.
다른 바람직한 실시형태에서, (ⅰ) 면역 반응을 유도하기 위한, 또는 (ⅱ) CD8+ T 세포 반응을 유도하기 위한 본 명세서에 기재된 조성물을 포함하는 약학 조성물 또는 키트 또는 부품 키트의 용도가 제공된다.
특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물 또는 키트 또는 부품 키트를 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상의 질병 또는 상태를 예방, 개선 또는 치료하는 방법이 제공된다.
또한, 특정 실시형태에서, 조성물의 투여가 대상의 림프구에서 mRNA에 의해 코딩되는 항원의 발현에 이르는 방법이 제공된다. 또한, 조성물의 투여가 항원 특이적 항체 반응에 이르는 방법이 제공되며, 바람직하게 항원 특이적 항체 반응은 혈청에서 항원 특이적 항체의 존재에 의해 측정된다.
특정 실시형태에서, 의약은 바이러스, 박테리아 또는 원생동물 감염성 질병을 포함하는 감염성 질병, 암 또는 종양 질병, 간 질병, 자가면역 질병, 알레르기, 유전 질병을 포함하는 단성 유전자 질병, 일반적 유전자 질병, 유전적 배경이 있고 일반적으로 정의된 유전자 결함에 의해 유발되고 멘델의 법칙에 의해 유전되는 질병; 심혈관 질병, 신경 질병, 호흡계 질병, 소화기 질병, 피부 질병, 근골격계 장애, 결합 조직의 장애, 신생물, 면역 결핍, 내분비, 영양 및 대사 질병, 눈 질병, 귀 질병 및 펩타이드 또는 단백질 결핍과 관련된 질병으로부터 선택되는 질병의 방지, 예방, 치료 및/또는 개선을 위한 것이다. 바람직한 일 실시형태에서, 의약은 SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 부니아 바이러스목 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뎅기열 바이러스 (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4), 에볼라 바이러스, 플라비바이러스, B형 간염 바이러스 (HBV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 인간 유두종 바이러스 (HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV), 인플루엔자 바이러스, 장외 병원성 대장균, 라사 맘마레나바이러스 (LASV), 메르스 코로나바이러스, 결핵균, 니파 바이러스, 노로바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 라이노바이러스, 로타 바이러스, 백시니아 바이러스, 황열병 바이러스, 지카 바이러스, 클라미디아 트라코마티스 (즉, 클라미디아를 일으키는 클라미디아 박테리아), 또는 말라리아 기생충 (예를 들어, 열대열 말라리아 원충, 삼일열 말라리아 원충, 사일열 말라리아 원충, 또는 난형 말라리아 원충) 백신이다.
대안적인 실시형태에서, 본 발명은 의약 제조에서 지질을 포함하는 약학 조성물 또는 mRNA의 용도에 관한 것이다. 특히 상기 의약은 이를 필요로 하는 대상의 면역 반응을 치료적으로 또는 예방적으로 증가시키기 위한 것이다.
바람직한 실시형태에서, 의약은 예방 또는 암 또는 종양 질병, 감염성 질병, 알레르기 , 또는 자가면역 질병 또는 이와 관련된 장애의 예방 또는 치료를 위한 것이다.
특히, 의약은 대상, 바람직하게 척추 동물의 치료를 위한 것이다. 바람직한 실시형태에서, 대상은 바람직하게 염소, 소, 돼지, 개, 고양이, 당나귀, 원숭이, 유인원, 마우스, 햄스터, 토끼와 같은 설치류, 특히 인간으로 이루어진 군으로부터 선택되는 포유동물이다.
따라서, 바람직한 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 의약으로서 사용되기에 적합하다. 추가적인 바람직한 실시형태에서, 상기 의약은 바이러스, 박테리아 또는 원생동물 감염성 질병을 포함하는 감염성 질병, 암 또는 종양 질병, 간 질병, 자가면역 질병, 알레르기, 유전 질병을 포함하는 단성 유전자 질병, 일반적 유전자 질병, 유전적 배경이 있고 일반적으로 정의된 유전자 결함에 의해 유발되고 멘델의 법칙에 의해 유전되는 질병; 심혈관 질병, 신경 질병, 호흡계 질병, 소화기 질병, 피부 질병, 근골격계 장애, 결합 조직의 장애, 신생물, 면역 결핍, 내분비, 영양 및 대사 질병, 눈 질병, 귀 질병 및 펩타이드 또는 단백질 결핍과 관련된 질병으로부터 선택되는 질병의 방지, 예방, 치료 및/또는 개선을 위한 것이다. 추가적인 바람직한 실시형태에서, 의약으로 사용되는 조성물은 바람직하게 백신이다.
대상, 특히 인간 대상에 대한 조성물의 투여와 관련하여, 임의의 적합한 경로가 이용될 수 있다. 일 실시형태에서, 조성물은 주사 또는 주입에 의한 투여에 적응된다. 본 명세서에서 사용된 표현 "에 적응된(adapted for)"은 조성물이 각각의 투여 경로에 적합하도록 제제화 및 프로세싱되는 것을 의미한다.
추가적인 바람직한 실시형태에서, 조성물은 혈관 외 주사, 주입 또는 이식; 피부 또는 점막에 대한 국소 투여; 호흡기에 대하여 조성물을 전달하는 것과 같은 흡입; 또는 경피 또는 피부를 통한 투여와 같이, 대상에게의 혈관 외 투여에 적응된다. 이러한 맥락에서, 혈관 외 주사, 주입 또는 이식은 국소 또는 국부 주사, 주입 또는 이식, 특히 피부 내, 피하, 근육 내, 간질, 국소, 유리체내, 종양내, 림프 내, 결절 내, 활액 내, 활액 내, 관절 주위, 복강 내, 복강 내, 심장 내, 병변 내, 심낭 내, 심실 내, 흉강 내, 신경간 내, 흉 내, 경막 외, 경막 내, 경막 주위의, 척추 강내, 골수 내, 대뇌 내, 음경 해면체 내, 음경 해면체 내, 전립선 내, 고환 내, 연골 내, 골 내, 디스크 내, 척수 내, 미추 내, 윤활낭 내, 치은 내, 난소 내, 자궁 내, 안구 주위, 치주, 안구후, 지주막 하, 결막 하 또는 맥락막상 주사, 주입 또는 이식에 의해 수행될 수 있다. 또한, 피부 또는 점막에 대한 국소 투여는 진피 또는 피부, 비강, 협측, 설하, 귀의 심이의, 눈의, 결막의, 질, 직장, 자궁 경관 내, 부비동 내, 후두, 구강인두, 수뇨관, 또는 요도 투여에 의해 수행될 수 있다. 흡입에 의한 호흡기로의 투여는 특히 폐, 기관지, 세기관기, 폐포 또는 부비동으로의 에어로졸 투여에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 지질 나노입자를 포함하는 mRNA, (약학) 조성물 또는 백신은 다음 용도로 본 발명에 따라 (의약 제조를 위하여) 이용될 수 있다:
(ⅰ) 감염성 질병; 암 또는 종양 질병, 장애 또는 상태; 간 섬유증, 간경변 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 간 질병; 알레르기; 또는 자가면역 질병; 장애 또는 상태의 치료 또는 예방에; 및/또는
(ⅱ) 대사, 아미노산 또는 내분비 장애를 치료를 위한 효소 대체 요법에, 부재, 결핍 또는 돌연변이 단백질을 대체에 사용되기 위하여.
이러한 맥락에서, 말라리아, 인플루엔자 바이러스 또는 광견병 바이러스 감염, 또는 그러한 감염에 관련된 장애의 치료 또는 예방이 특히 바람직하다.
SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 부니아 바이러스목 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뎅기열 바이러스 (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4), 에볼라 바이러스, 플라비바이러스, B형 간염 바이러스 (HBV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 인간 유두종 바이러스 (HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV), 인플루엔자 바이러스, 장외 병원성 대장균, 라사 맘마레나바이러스 (LASV), 메르스 코로나바이러스, 결핵균, 니파 바이러스, 노로바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 라이노바이러스, 로타 바이러스, 백시니아 바이러스, 황열병 바이러스, 지카 바이러스, 클라미디아 트라코마티스 (즉, 클라미디아를 일으키는 클라미디아 박테리아), 또는 말라리아 기생충 (예를 들어, 열대열 말라리아 원충, 삼일열 말라리아 원충, 사일열 말라리아 원충, 또는 난형 말라리아 원충) 감염, 또는 그러한 감염과 관련된 장애의 치료 또는 예방이 추가적으로 특히 바람직하다.
더욱이, 본 발명에 따른 지질 나노입자를 포함하는 mRNA, (약학) 조성물 또는 백신의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여함으로써, 바람직하게 본 명세서에 정의된 바와 같이 암 또는 종양 질병, 감염성 질병, 알레르기, 또는 자가면역 질병 또는 그에 관련된 장애를 치료 또는 예방하는 방법이 본 발명에 포함된다. 그러한 방법은 일반적으로 본 발명의 지질 나노입자를 포함하는 mRNA, 조성물 또는 백신을 제조하는 선택적인 제1 단계, 및 (약학적 유효량의) 상기 조성물 또는 백산을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는 제2 단계를 포함한다. 이를 필요로 하는 대상은, 일반적으로 포유동물이다. 본 발명의 맥락에서, 포유동물은 바람직하게 예를 들어, 염소, 소, 돼지, 개, 고양이, 당나귀, 원숭이, 유인원, 마우스, 햄스터, 토끼와 같은 설치류, 특히, 인간을 포함하는 군으로부터 선택되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 대상은 조류, 바람직하게 닭이다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 조성물, 제제 또는 약학 조성물은 간에서 세포를 우선적으로 표적화하지만, 다른 기관(예를 들어, 폐, 신장, 심장)에서는 그렇지 않다. 간 세포(Liver cells)는 예를 들어, 간 세포(hepatocytes) 및 간 세포 전구체, 성상 세포/주위 세포, 내피 세포, 쿠퍼 세포, 대식 세포 및 호중구를 포함한다. 조성물, 제제 또는 약학 조성물이 cas9과 같이 CRISPR 엔도뉴클레아제를 코딩하는 mRNA와 조합되어 gRNA를 포함하는 일 실시형태에서, 조성물은 간 세포, 중심주위 간 세포 (건강한 간에서 줄기 세포로 작용함) 및, 또는 적합하게는 간 세포 줄기 세포를 우선적으로 표적화한다. 간에서 세포의 우선적 표적화는 지질 나노입자의 크기 및 중성 전하 때문이다. 특정 경우, 간 세포의 표적화는 신체의 다른 기관에 2차적인 영향을 미치거나 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물, 제제 또는 약학 조성물은 간에 관련된 질병 이외의 질병 치료에 유용성을 갖는다는 것이 이해될 것이다.
적합하게, 상기 약학 조성물은 간 질병 또는 간에서의 단백질 발현이 척추 동물 병리에 영향을 미치는 질병의 치료에 이용되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 언급된 바와 같이, 본 명세서에 기재된 약학 조성물은 간과 관련되지 않은 질병의 치료에서 용도를 찾을 수 있다.
적합하게, 임의의 간 질병 또는 간 관련 장애에 관련된 유전자 또는 조절 요소의 엑손 및 인트론을 포함하나, 이에 제한하는 것은 아닌, 상이한 전사체 또는 게놈 염색체 또는 미토콘드리아 서열의 임의의 전사체, 전사체 패밀리 또는 시리즈는 본 발명에 따른 조성물 또는 제제를 사용하여 표적화될 수 있다. 상이한 전사체의 그러한 임의의 전사체, 전사체 패밀리 또는 시리즈는 본 명세서에 기재된 임의의 생물학적 활성 화합물에 의해 표적화될 수 있다. 일 실시형태에서, 생물학적 활성 화합물은 병리-관련 전사체를 인식하는 핵산 분자, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 mRNA, gRNA, siRNA, saRNA 등이다.
적합하게, 임의의 간 질병에 관련된 임의의 유전자는 본 발명에 따른 조성물 또는 제제를 이용하여 표적화될 수 있다. 그러한 유전자는 본 명세서에 기재된 바와 같이 임의의 생물학적 활성 화합물에 의해 표적화될 수 있다. 일 실시형태에서, 생물학적 활성 화합물은 간 질병 유전자를 인식하는 핵산 분자, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 mRNA, gRNA, siRNA 등이다.
본 발명은 또한 본 명세서에 정의된 바와 같이 포유동물에서 면역 반응을 조절하기 위한, 바람직하게 유도 또는 향상시키기 위한, 더욱 바람직하게 SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 부니아 바이러스목 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뎅기열 바이러스 (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4), 에볼라 바이러스, 플라비바이러스, B형 간염 바이러스 (HBV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 인간 유두종 바이러스 (HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV), 인플루엔자 바이러스, 장외 병원성 대장균, 라사 맘마레나바이러스 (LASV), 메르스 코로나바이러스, 결핵균, 니파 바이러스, 노로바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 라이노바이러스, 로타 바이러스, 백시니아 바이러스, 황열병 바이러스, 지카 바이러스, 클라미디아 트라코마티스 (즉, 클라미디아를 일으키는 클라미디아 박테리아), 또는 말라리아 기생충 (예를 들어, 열대열 말라리아 원충, 삼일열 말라리아 원충, 사일열 말라리아 원충, 또는 난형 말라리아 원충) 감염, 또는 그에 관련된 질병 또는 장애의 예방 및/또는 치료를 위한, 본 명세서에 정의된 본 발명에 따른 지질 나노입자를 포함하는 mRNA, (약학) 조성물 또는 백신의 용도를 포함한다.
이러한 맥락에서, SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 부니아 바이러스목 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뎅기열 바이러스 (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4), 에볼라 바이러스, 플라비바이러스, B형 간염 바이러스 (HBV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 인간 유두종 바이러스 (HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV), 인플루엔자 바이러스, 장외 병원성 대장균, 라사 맘마레나바이러스 (LASV), 메르스 코로나바이러스, 결핵균, 니파 바이러스, 노로바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 라이노바이러스, 로타 바이러스, 백시니아 바이러스, 황열병 바이러스, 지카 바이러스, 클라미디아 트라코마티스 (즉, 클라미디아를 일으키는 클라미디아 박테리아), 또는 말라리아 기생충 (예를 들어, 열대열 말라리아 원충, 삼일열 말라리아 원충, 사일열 말라리아 원충, 또는 난형 말라리아 원충) 감염의 치료 또는 예방에 대한 지지는 통상적인 SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 부니아 바이러스목 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뎅기열 바이러스 (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4), 에볼라 바이러스, 플라비바이러스, B형 간염 바이러스 (HBV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 인간 유두종 바이러스 (HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV), 인플루엔자 바이러스, 장외 병원성 대장균, 라사 맘마레나바이러스 (LASV), 메르스 코로나바이러스, 결핵균, 니파 바이러스, 노로바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 라이노바이러스, 로타 바이러스, 백시니아 바이러스, 황열병 바이러스, 지카 바이러스, 클라미디아 트라코마티스 (즉, 클라미디아를 일으키는 클라미디아 박테리아), 또는 말라리아 기생충 (예를 들어, 열대열 말라리아 원충, 삼일열 말라리아 원충, 사일열 말라리아 원충, 또는 난형 말라리아 원충) 치료법, 예를 들어, 뉴라미니다제 억제제 (예를 들어, 오셀타미비르(oseltamivir) 및 자나미비르(zanamivir)) 및 M2 단백질 억제제 (예를 들어, 아다만탄(adamantane) 유도체)와 같은 항바이러스제에 의한 요법과 같은 치료법, 및 본 명세서에 정의된 RNA 또는 약학 조성물을 이용하는 요법의 임의 조합일 수 있다.
SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 부니아 바이러스목 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뎅기열 바이러스 (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4), 에볼라 바이러스, 플라비바이러스, B형 간염 바이러스 (HBV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 인간 유두종 바이러스 (HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV), 인플루엔자 바이러스, 장외 병원성 대장균, 라사 맘마레나바이러스 (LASV), 메르스 코로나바이러스, 결핵균, 니파 바이러스, 노로바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 라이노바이러스, 로타 바이러스, 백시니아 바이러스, 황열병 바이러스, 지카 바이러스, 클라미디아 트라코마티스 (즉, 클라미디아를 일으키는 클라미디아 박테리아), 또는 말라리아 기생충 (예를 들어, 열대열 말라리아 원충, 삼일열 말라리아 원충, 사일열 말라리아 원충, 또는 난형 말라리아 원충) 감염의 치료 또는 예방에 대한 지지는 본 명세서에 정의된 다른 실시형태의 임의의 것에서 예상될 수 있다. 따라서, 임의의 다른 접근법, 바람직하게 일 이상의 상기 치료 접근법과의 공동 요법, 특히 항바이러스제와의 조합에서의 본 발명에 따른 지질 나노입자를 포함하는 mNRA, (약학) 조성물 또는 백신의 용도는 본 발명의 범위 내이다.
투여를 위해, 바람직하게, 임의의 투여 경로가 본 명세서에 정의된 바와 같이 사용될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 지질 나노입자를 포함하는 mRNA에 의해 코딩되는 항원에 기초하영 적응 면역 반응을 유도 또는 향상시킴으로써, SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 부니아 바이러스목 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뎅기열 바이러스 (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4), 에볼라 바이러스, 플라비바이러스, B형 간염 바이러스 (HBV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 인간 유두종 바이러스 (HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV), 인플루엔자 바이러스, 장외 병원성 대장균, 라사 맘마레나바이러스 (LASV), 메르스 코로나바이러스, 결핵균, 니파 바이러스, 노로바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 라이노바이러스, 로타 바이러스, 백시니아 바이러스, 황열병 바이러스, 지카 바이러스, 클라미디아 트라코마티스 (즉, 클라미디아를 일으키는 클라미디아 박테리아), 또는 말라리아 기생충 (예를 들어, 열대열 말라리아 원충, 삼일열 말라리아 원충, 사일열 말라리아 원충, 또는 난형 말라리아 원충) 감염 또는 본 명세서에 정의된 질병 또는 그에 관련된 장애의 치료 또는 예방에 적합한 투여 경로가 이용된다.
본 발명에 따른 조성물 및/또는 백신의 투여는 지질 나노입자를 포함하는 다 른 mRNA 또는 상이한 항원 또는 항원의 조합을 코딩하는 지질 나노입자를 포함하는 mRNA의 조합을 함유하는 본 명세서에 정의된 다른 조성물 및/또는 백신의 투여 전에, 동시에, 및/또는 이후에 이루어질 수 있으며, 여기에서, 본 발명에 따른 mRNA 서열에 의해 코딩되는 각각의 항원은 바람직하게는, SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 부니아 바이러스목 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뎅기열 바이러스 (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4), 에볼라 바이러스, 플라비바이러스, B형 간염 바이러스 (HBV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 인간 유두종 바이러스 (HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV), 인플루엔자 바이러스, 장외 병원성 대장균, 라사 맘마레나바이러스 (LASV), 메르스 코로나바이러스, 결핵균, 니파 바이러스, 노로바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 라이노바이러스, 로타 바이러스, 백시니아 바이러스, 황열병 바이러스, 지카 바이러스, 클라미디아 트라코마티스 (즉, 클라미디아를 일으키는 클라미디아 박테리아), 또는 말라리아 기생충 (예를 들어, 열대열 말라리아 원충, 삼일열 말라리아 원충, 사일열 말라리아 원충, 또는 난형 말라리아 원충) 감염 및 그에 관련된 질병 또는 장애의 치료 또는 예방에 적합하다.
이러한 맥락에서, 본 명세서에 정의된 치료는 SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 부니아 바이러스목 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뎅기열 바이러스 (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4), 에볼라 바이러스, 플라비바이러스, B형 간염 바이러스 (HBV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 인간 유두종 바이러스 (HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV), 인플루엔자 바이러스, 장외 병원성 대장균, 라사 맘마레나바이러스 (LASV), 메르스 코로나바이러스, 결핵균, 니파 바이러스, 노로바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 라이노바이러스, 로타 바이러스, 백시니아 바이러스, 황열병 바이러스, 지카 바이러스, 클라미디아 트라코마티스 (즉, 클라미디아를 일으키는 클라미디아 박테리아), 또는 말라리아 기생충 (예를 들어, 열대열 말라리아 원충, 삼일열 말라리아 원충, 사일열 말라리아 원충, 또는 난형 말라리아 원충) 감염에 관련된 질병 및 그에 관련된 질병 또는 장애의 조절을 포함할 수 있다.
본 발명의 이러한 측면의 바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명에 따른 (약학) 조성물 또는 백신은 주사에 의해 투여된다. 당해 기술분야에 공지된 임의의 적합한 주사 기술이 채용될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 조성물은 주사, 바람직하게 바늘 없는 주사, 예를 들어 제트-주사에 의해 투여된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 본 명세서에 정의된 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12종 또는 그 이상의 mRNA를 포함하며, 이들 각각은 바람직하게 바늘 없는 주사에 의해 바람직하게는 개별적으로 주사된다. 대안적으로, 본 발명의 조성물은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12종 또는 그 이상의 mRNA를 포함하며,적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12종 또는 그 이상의 mRNA는 혼합물로서 바람직하게 본 명세서에 정의된 주사에 의해 투여된다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 항원 또는 항원 조합에 대한 대상의 면역화 방법에 관한 것이다.
본 명세서에 정의된 항원 또는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12종 또는 그 이상의 항원의 조합에 대한 대상의 면역화를 위한 면역화 프로토콜은 일반적으로 본 발명에 따른 (약학) 조성물 또는 백신의 일련의 단일 용량 또는 투여량을 포함한다. 본 명세서에 사용된 단일 투여량은 각각 초기/제1 용량, 제2 또는 임의의 추가적인 용량을 나타내며, 이는 바람직하게는 면역 반응을 "부스트"하기 위하여 투여된다. 이러한 맥락에서, 각각의 단일 투여량은 바람직하게 본 명세서에 정의된 동일한 항원 또는 항원의 동일한 조합의 투여를 포함하며, 2개의 단일 투여량 사이의 간격은 적어도 1일, 바람직하게 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일에서 적어도 1주, 바람직하게 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주로 변화될 수 있다. 단일 투여량 사이의 간격은 면역화 프로토콜의 과정에 걸쳐 일정하거나 또는 변화할 수 있으며, 예를 들어, 간격은 프로토콜의 시작 부분에서 더 짧고, 끝 부분으로 갈수록 더 길어질 수 있다. 단일 투여의 총 횟수 및 단일 투여 사이의 간격에 따라, 면역화 프로토콜은 바람직하게 적어도 1주, 더욱 바람직하게 몇 주(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12 주), 더욱더 바람직하게 몇개월(예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18 또는 24개월) 지속되는 기간에 걸쳐 연장될 수 있다. 각각의 단일 투여량은 바람직하게 본 명세서에 정의된 항원, 바람직하게 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12종 또는 그 이상의 항원의 조합의 투여를 포함하며, 따라서, 적어도 하나의,바람직하게 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12회의 주사를 포함할 수 있다. 일부 경우, 본 발명에 따른 조성물 또는 백신은 일반적으로 하나의 주사에서 단일 투여량으로 투여된다. 본 명세서에 정의된 바와같이, 본 발명에 따른 백신이 별개의 항원을 코딩하는 별개의 mRNA 제제를 포함하는 경우, 단일 투여량의 투여 중 수행되는 주사의 최소 횟수는 백신의 개별적인 성분의 수에 상응한다. 특정 실시형태에서, 단일 투여량의 투여는 백신의 각 성분에 대한 1회를 초과하는 주사를 포함할 수 있다(예를 들어, 본 명세서에 정의된 하나의 항원성 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 mRNA를 포함하는 특정 mRNA 제제). 예를 들어, 백신의 개별적인 성분의 총 부피의 일부가 상이한 신체 부분에 주사될 수 있으므로, 1회를 초과하는 횟수의 주사를 수반할 수 있다. 보다 구체적인 예에서, 각각 2개의 상이한 신체 부위에 투여되는 4종의 별개의 mRNA 제제를 포함하는 백신의 단일 투여량은 8회의 주사를 포함할 수 있다. 전형적으로, 단일 투여량은 백신의 모든 성분을 투여하는데 필요한 모든 주사를 포함하며, 여기에서 단일 성분은 상기 요약된 바와 같이 1회를 초과하는 주사를 수반할 수 있다. 본 발명에 따른 백신의 단일 투여량의 투여가 1회 초과의 주사를 포함하는 경우, 주사는 본질적으로 동시에 또는 동시에, 즉, 일반적으로 의사가 단일 주사 단계를 차례로 수행하는데 필요한 시간 프레임 내에서 시차 방식으로 수행된다. 따라서, 단일 투여량의 투여는 바람직하게는 몇 분, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 30 또는 60분의 시간에 걸쳐 연장된다.
본 명세서에 정의된 지질 나노입자를 포함하는 mRNA, 본 발명에 따른 (약학) 조성물 또는 백신의 투여는 시차 치료(time staggered treatment)로 수행될 수 있다. 시차 치료는 예를 들어, SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 부니아 바이러스목 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뎅기열 바이러스 (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4), 에볼라 바이러스, 플라비바이러스, B형 간염 바이러스 (HBV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 인간 유두종 바이러스 (HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV), 인플루엔자 바이러스, 장외 병원성 대장균, 라사 맘마레나바이러스 (LASV), 메르스 코로나바이러스, 결핵균, 니파 바이러스, 노로바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 라이노바이러스, 로타 바이러스, 백시니아 바이러스, 황열병 바이러스, 지카 바이러스, 클라미디아 트라코마티스 (즉, 클라미디아를 일으키는 클라미디아 박테리아), 또는 말라리아 기생충 (예를 들어, 열대열 말라리아 원충, 삼일열 말라리아 원충, 사일열 말라리아 원충, 또는 난형 말라리아 원충) 감염 또는 그에 관련된 질병 또는 장애의 치료 또는 예방에 적합한 치료법 또는 치료제의 투여 전에, 이와 동시에, 및/또는 후에, 지질 나노입자를 포함하는 mRNA, 조성물 또는 백신의 투여에 의해, 예를 들어, SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 부니아 바이러스목 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뎅기열 바이러스 (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4), 에볼라 바이러스, 플라비바이러스, B형 간염 바이러스 (HBV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 인간 유두종 바이러스 (HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV), 인플루엔자 바이러스, 장외 병원성 대장균, 라사 맘마레나바이러스 (LASV), 메르스 코로나바이러스, 결핵균, 니파 바이러스, 노로바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 라이노바이러스, 로타 바이러스, 백시니아 바이러스, 황열병 바이러스, 지카 바이러스, 클라미디아 트라코마티스 (즉, 클라미디아를 일으키는 클라미디아 박테리아), 또는 말라리아 기생충 (예를 들어, 열대열 말라리아 원충, 삼일열 말라리아 원충, 사일열 말라리아 원충, 또는 난형 말라리아 원충) 감염 또는 그에 관련된 질병 또는 장애의 통상적인 치료법 전에, 이와 동시에, 및/또는 후에 지질 나노입자를 포함하는 mRNA, 조성물 또는 백신의 투여일 수 있다. 그러한 시차 치료는 예를 들어, 본 명세서에 정의된 키트, 바람직하게 부품 키트를 사용하여 수행될 수 있다.
시차 치료는 추가적으로 또는 대안적으로 본 명세서에 정의된 지질 나노입자를 포함하는 mRNA, 본 발명에 따른 (약학) 조성물 또는 백신의 투여 형태를 포함하며, 여기에서, 본 명세서에 정의된 펩타이드 또는 단백질 또는 그 단편 또는 변이체를 코딩하고, 바람직하게 조성물 또는 백신의 부분을 형성하는 mRNA는 바람직하게 동일한 본 발명의 조성물 또는 백신의 부분을 형성하는, 본 명세서에 정의된 지질 나노입자를 포함하는 다른 mRNA와 병행하여, 그 전에 또는 그 후에 투여된다. 바람직하게, (지질 나노입자를 포함하는 모든 mRNA의) 투여는 1시간 내에, 더욱 바람직하게 30분 내에, 더욱더 바람직하게 15, 10, 5, 4, 3, 또는 2분 내에, 또는 1분 내에 이루어진다. 그러한 시차 치료는 예를 들어, 본 명세서에 정의된 키트, 바람직하게 부품 키트를 이용하여 수행될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 약학 조성물 또는 백신은 반복적으로 투여되고, 여기에서, 각각의 투여는 바람직하게 본 발명의 조성물 또는 백신의 지질 나노입자를 포함하는 적어도 하나의 mRNA의 개별적인 투여를 포함한다. 각각의 투여 시점에서, 적어도 하나의 mRNA는 1회를 초과하여(예를 들어, 2 또는 3회) 투여될 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 실시형태에서, 상기 정의된 지질 나노입자를 포하하는 mRNA로 캡슐화되거나 이와 회합한 적어도 2, 3, 4, 5, 6종 또는 그 이상의 mRNA 서열 (각각은 본 명세서에 정의된 항원의 개별적인 하나를 코딩함) - 여기에서, mRNA 서열은 동일하거나 상이한 지질 나노입자의 mRNA 화합물의 일부임 - 은 각 시점에 투여되고, 각각의 mRNA는 4개의 사지에 분포된 주사에 의해 2회 투여된다.
다른 바람직한 실시형태에서, (ⅰ) 면역 반응 유도, (ⅱ) 항원 특이적 T 세포 반응 유도, 또는 바람직하게 (ⅲ) CD8+ T 세포 반응 유도를 위한, 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 키트 또는 부품 키트를 포함하는 약학 조성물의 용도가 제공된다. 대상에서 (ⅰ) 면역 반응 유도, (ⅱ) 항원 특이적 T 세포 반응 유도, 또는 바람직하게 (ⅲ) CD8+ T 세포 반응 유도를 위한 방법은 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 면역원성 펩타이드 또는 포릴펩타이드를 코딩하는 mRNA를 포함하는 본 명세서에 기재된 조성물의 유효량을 적어도 1회 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 다른 실시형태에서, (ⅰ) 면역 반응 유도, (ⅱ) 항원 특이적 T 세포 반응 유도, 또는 바람직하게 (ⅲ) CD8+ T 세포 반응 유도를 위한 본 발명의 조성물 또는 본 발명의 키트 또는 부품 키트를 포함하는 약학 조성물의 용도가 레퍼런스 (지질 나노입자) 제제 또는 조성물과 비교하여 제공된다. 바람직한 실시형태에서, 상기 레퍼런스 (지질 나노입자) 제제 또는 조성물은 DPhyPE 및/또는 화학식 (Ⅰ)에 따른 양이온성 지질을 포함하지 않는다.
제1 및 제2 / 추가적인 의학 용도 :
추가적인 측면은 본 발명의 지질 부형제(들)를 포함하는 본 발명의 조성물이 핵산을 전달하기 위하여 사용되는, 제공된 핵산, 조성물, 폴리펩타이드, 백신 또는 키트의 제1 의학 용도에 관한 것이다. 특히, 핵산, 조성물, 폴리펩타이드, 백신, 또는 키트 또는 부품 키트에 관한 실시형태는 마찬가지로 본 발명의 의학 용도의 적합한 실시형태로 읽고 이해될 수 있다.
따라서, 본 발명은 적어도 하나의 핵산 (예를 들어, DNA 또는 RNA), 바람직하게 의약으로 사용하기 위한 제1 측면에 정의된 RNA, 의약으로 사용하기 위한 조성물, 의약으로 사용하기 위해 정의된 바와 같은 폴리펩타이드, 의약으로 사용하기 위해 정의된 바와 같은 백신, 및 의약으로 사용하기 위한 키트 또는 부품 키트를 제공하며, 여기에서 본 발명의 지질 부형제(들)를 포함하는 본 발명의 조성물이 핵산을 전달하기 위하여 사용된다.
본 발명은 또한, 핵산, 조성물, 폴리펩타이드, 백신, 또는 키트의 몇몇 적용 및 용도를 제공하며, 즉, 특히, 핵산 (바람직하게 RNA), 조성물, 폴리펩타이드, 백신, 또는 키트는 인간 의학 목적을 위하여, 또한 수의학적 의학 목적을 위하여, 바람직하게 인간 의학 목적을 위하여 사용되며, 본 발명의 지질 부형제(들)를 포함하는 본 발명의 조성물이 핵산을 전달하기 위하여 사용된다.
특히, 핵산 (바람직하게 RNA), 조성물, 폴리펩타이드, 백신, 또는 키트 또는 부품 키트는 인간 의학 목적을 위한 의약으로 사용하기 위한 것이며, 여기에서, 상기 핵산 (바람직하게 RNA), 조성물, 폴리펩타이드, 백신, 또는 키트 또는 부품 키트는 어린 유아, 신생아, 면역 저하 환자, 임산부 및 모유 수유 여성, 및 노인에게 적합할 수 있다. 특히, 핵산 (바람직하게 RNA, 가장 바람직하게 mRNA), 조성물, 폴리펩타이드, 백신, 또는 키트 또는 부품 키트는 인간 의학 목적을 위한 의약으로 사용하기 위한 것이며, 여기에서, 상기 핵산 (바람직하게 RNA, 가장 바람직하게 mRNA), 조성물, 폴리펩타이드, 백신, 또는 키트 또는 부품 키트는 노인 인간 대상에 특히 적합하다.
상기 핵산 (바람직하게 RNA), 조성물, 폴리펩타이드, 백신, 또는 키트는 인간 의학 목적을 위한 의약으로 사용하기 위한 것이며, 여기에서, 상기 RNA, 조성물, 백신, 또는 키트 또는 부품 키트는 근육 내 주사 또는 피부 내 주사에 특히 적합하다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 제공된 핵산, 조성물, 폴리펩타이드, 백신, 또는 키트의 제2 의학 용도에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 적어도 하나의 핵산을 제공하며, 여기에서 핵산은 코로나바이러스, 바람직하게 베타코로나바이러스, 더욱 바람직하게 중증 급성 호흡기 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2)의 감염, 또는 코로나바이러스 질병 2019 (COVID-19)과 같은 그러한 감염과 관련된 장애 또는 질병의 치료 또는 예방을 위하여, 상기 핵산, 바람직하게 RNA, 가장 바람직하게 mRNA를 전달하는데 사용되는 본 발명의 지질 부형제(들)를 포함하는 본 발명의 조성물 내에 포함되며, 본 발명은 코로나바이러스, 바람직하게 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 감염 또는 COVID-19와 같은 그러한 감염과 관련된 장애 또는 질병의 치료 또는 예방을 위한 조성물; 코로나바이러스, 바람직하게 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 감염 또는 COVID-19와 같은 그러한 감염과 관련된 장애 또는 질병의 치료 또는 예방을 위한 폴리펩타이드; 코로나바이러스, 바람직하게 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 감염 또는 COVID-19와 같은 그러한 감염과 관련된 장애 또는 질병의 치료 또는 예방을 위한 백신; COVID-19와 같은 코로나바이러스, 바람직하게 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 감염 또는 그러한 감염과 관련된 장애 또는 질병의 치료 또는 예방을 위한 키트 또는 부품 키트를 제공한다.
다른 실시형태에서, 핵산, 바람직하게 RNA, 가장 바람직하게 mRNA, 조성물, 폴리펩타이드, 백신, 또는 키트 또는 부품 키트는 코로나바이러스, 바람직하게 SARS-CoV-2 코로나바이러스에 의한 감염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 것이며, 여기에서 본 발명의 지질 부형제(들)를 포함하는 본 발명의 조성물은 핵산을 전달하기 위하여 사용된다.
특히, 핵산, 바람직하게 RNA, 가장 바람직하게 mRNA, 조성물, 폴리펩타이드, 백신, 또는 키트 또는 부품 키트는 SARS-CoV-2 코로나바이러스 감염에 의해 유발되는 COVID-19 질병의 예방(노출 전 예방 또는 노출 후 예방) 및/또는 치료 방법에 사용되며, 여기에서, 본 발명의 지질 부형제(들)를 포함하는 본 발명의 조성물이 핵산을 전달하기 위하여 사용된다.
핵산, 조성물, 폴리펩타이드, 또는 백신은 바람직하게 국소 투여될 수 있다. 특히, 조성물 또는 백신은 피부 내, 피하, 비강 내, 또는 근육 내 경로에 의해 투여될 수 있으며, 여기에서, 본 발명의 지질 부형제(들)를 포함하는 본 발명의 조성물이 핵산을 전달하기 위하여 사용된다. 다른 실시형태에서, 상기 핵산, 조성물, 폴리펩타이드, 백신은 통상적인 바늘 주사 또는 바늘 없는 제트 주사에 의해 투여될 수 있다. 이러한 맥락에서 근육 주사가 바람직하다.
다른 실시형태에서, 본 발명의 지질 부형제(들)을 포함하는 본 발명의 조성물에 포함되는 핵산은 본 명세서에 정의된 바와 같이 상기 핵산을 전달하기 위하여 사용되며, 약 100ng 내지 약 500㎍의 양으로, 약 1㎍ 내지 약 200㎍의 양으로, 약 1㎍ 내지 약 100㎍의 양으로, 약 5㎍ 내지 약 100㎍의 양으로, 바람직하게 약 10㎍ 내지 약 50㎍의 양으로, 특히, 약 1㎍, 2㎍, 3㎍, 4㎍, 5㎍, 10㎍, 15㎍, 20㎍, 25㎍, 30㎍, 35㎍, 40㎍, 45㎍, 50㎍, 55㎍, 60㎍, 65㎍, 70㎍, 75㎍, 80㎍, 85㎍, 90㎍, 95㎍ 또는 100㎍의 양으로 제공된다.
일 실시형태에서, 코로나바이러스, 바람직하게 SARS-CoV-2 코로나바이러스에 대한 대상의 치료 또는 예방을 위한 면역화 프로토콜은 조성물 또는 백신의 1회 단일 용량을 포함하며, 여기에서, 본 발명의 지질 부형제(들)를 포함하는 본 발명의 조성물은 상기 핵산을 전달하기 위하여 사용된다.
일부 실시형태에서, 유효량은 1회의 백신 접종에서 대상에게 투여되는 1㎍, 2㎍, 3㎍, 4㎍, 5㎍, 6㎍, 7㎍, 8㎍, 9㎍, 10㎍, 11㎍, 12㎍, 13㎍, 14㎍, 15㎍, 16㎍, 20㎍, 30㎍, 40㎍, 50㎍, 75㎍, 100㎍ 또는 200㎍의 용량이며, 여기에서, 본 발명의 지질 부형제(들)를 포함하는 본 발명의 조성물이 핵산을 전달하기 위하여 사용된다. 바람직한 실시형태에서, 코로나바이러스, 바람직하게 SARS-CoV-2 코로나바이러스의 감염의 치료 또는 예방을 위한 면역화 프로토콜은 조성물 또는 백신의 일련의 단일 용량 또는 투여량, 바람직하게 총 2회의 용량을 포함하며, 여기에서, 본 발명의 지질 부형제(들)를 포함하는 본 발명의 조성물이 핵산을 전달하기 위하여 사용된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이 단일 투여량은 바람직하게 면역 반응을 "부스트"하기 위하여 투여되는 각각 초기/제1 용량, 제2 용량 또는 임의의 추가적인 용량을 나타내며, 본 발명의 지질 부형제(들)를 포함하는 본 발명의 조성물은 상기 핵산을 전달하기 위하여 사용된다.
바람직한 실시형태에서, 백신/조성물은 적어도 1년, 바람직하게 적어도 2년 동안 코로나바이러스, 바람직하게 SARS-CoV-2 코로나바이러스 감염에 대하여 대상을 면역화하며(본 명세서에 정의된 투여 시에), 여기에서, 면역화를 위하여, 본 발명의 지질 부형제(들)를 포함하는 본 발명의 조성물은 상기 핵산을 전달하기 위하여 사용된다.
표준 요법
더욱 바람직하게, 본 발명의 RNA를 포함하는 약학 조성물 또는 백신, 그 조합, 또는 상기 RNA를 포함하는 약학 조성물 또는 백신을 투여받는 대상은 본 명세서에 기재된 바와 같은 종양 또는 암 질병을 앓고 있고, 화학 요법 (예를 들어, 1 차 또는 2차 화학 요법), 방사선 요법, 화학 방사선 요법(chemoradiotherapy) / 화학 방사선 조사(chemoradiation) (화학 요법 및 방사선 요법의 조합), 키나제 억제제, 항체 요법 및/또는 체크포인트 조절제 (예를 들어, CTLA4 억제제, PD1 경로 억제제)를 받았거나 받는 환자, 또는 상기 특정된 일 이상의 치료를 받은 후 부분적 반응 또는 안정적인 질병을 달성한 환자이다. 더욱 바람직하게, 대상은 본 명세서에 기재된 바와 같은 종양 또는 암 질병을 앓고 있고, 본 명세서에 기재된 이러한 질병의 임의의 것에 통상적으로 사용되는 화합물을 투여받았거나 또는 투여받는 환자, 더룩 바람직하게 체크포인트 조절제를 투여받거나 또는 투여받았던 환자이다.
표준 요법에 바람직하게 사용되고, 본 발명의 RNA를 포함하는 약학 조성물 또는 백신과 조합되어 적용될 수 있는 화합물은 전체적으로 참조로 본 명세서에 포함되는 WO 2018/078053 A1의 56-58페이지에 개시된 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
종양 징후
본 명세서에서 사용된 용어 "종양", "암" 또는 "암 질병"은 악성 질병을 나타내며, 이는 바람직하게 전체적으로 참조로 본 명세서에 포함되는 WO 2018/078053 A1의 58-59페이지에 개시된 악성 질병의 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예시적인 실시형태
하기에서, 본 발명의 상이한 실시형태의 몇몇 세트가 개시된다. 실시예들의 세트로부터 유래하는 각각의 모든 실시형태는 서로 조합될 수 있는 것으로 본 명세서에서 의도되며, 즉, 제1 실시형태 세트의 실시형태 1은 예를 들어 제2 실시형태 세트의 실시형태 3과 조합될 수 있다.
제1 실시형태 세트
1. 화학식 (Ⅰ):
[화학식 Ⅰ]
Ra-A-Rb
에 따른 양이온성 지질, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 프로드러그(prodrug) 또는 입체이성질체(stereoisomer)로서,
상기 식에서,
Ra는
Figure pct00130
,
Figure pct00131
,
Figure pct00132
,
Figure pct00133
,
Figure pct00134
,
Figure pct00135
, 또는
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4로부터 선택되며;
Rb는
Figure pct00136
,
Figure pct00137
,
Figure pct00138
,
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4, 또는
-R1-N(CH3)2로부터 선택되며;
A는 -S-, -S-S-, -NH-C(O)-, -NH-C(O)O-, -NH-C(O)-NH-, -S-C(O)-N(H)-, -C(O)O-, 또는 -O-P(O)(OH)-O-이며;
R1은 선택적으로 치환된 에탄디일, 프로판디일, 부탄디일, 또는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 비분지형 알칸디일이며;
R2는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
R3는 선택적이며, 존재하는 경우, -R5-C(O)-O-, -R5-O-C(O)-, -R5-C(O)-NH-, -R5-OC(O)-NH-, 또는 R5-NH-C(O)O-이며;
R4는 12 내지 36개의 탄소 원자를 갖는 친유성 치환기이며;
R5는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
X는 탄소 또는 질소 원자이며;
여기서 모든 선택은 서로 독립적인
양이온성 지질.
2. 실시형태 1에 있어서, R5는 각각의 경우에 독립적으로 선택되는, 3 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일인 양이온성 지질.
3. 실시형태 1 내지 실시형태 2에 있어서, R4는 각각의 경우에 독립적으로 선택되는, 12 내지 25개의 탄소 원자를 갖는 알킬 또는 알케닐인 양이온성 지질.
4. 실시형태 1 내지 실시형태 3에 있어서, Ra 및 Rb는
Figure pct00139
,
Figure pct00140
또는
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4로부터 독립적으로 선택되는 양이온성 지질.
5. Ra 및 Rb의 각각은, 각각의 경우에 독립적으로 선택되는
Figure pct00141
이며;
R5는 각각의 경우에 독립적으로 선택되는, 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일인 양이온성 지질.
6. 실시형태에 5에 있어서, A는 -S-S-인 양이온성 지질.
7. 실시형태 6에 있어서, R4는 각각의 경우에 독립적으로 선택되는, 12 내지 25개의 탄소 원자를 갖는 알킬 또는 알케닐인 양이온성 지질.
8. 실시형태 7에 있어서, 각각의 R4는
Figure pct00142
,
Figure pct00143
,
Figure pct00144
, 또는
Figure pct00145
로부터 각각의 경우에 독립적으로 선택되는 알킬인 양이온성 지질.
9. 실시형태 8에 있어서, R3는 -R5-C(O)-O- 또는 -R5-O-C(O)-이며;
R4는
Figure pct00146
, 또는
Figure pct00147
이며;
Ra 및 Rb는 동일한 따른 양이온성 지질.
10. 실시형태 9에 있어서, R3는 -R5-C(O)-O-인 양이온성 지질.
11. 실시형태 10에 있어서, X는 탄소 원자인 양이온성 지질.
12. 실시형태 11에 있어서, R1은 에탄디일인 양이온성 지질.
13. 전술한 실시형태의 임의의 하나에 있어서, 각각의 경우에 독립적으로 선택되는 하기 특징의 일 이상을 추가적으로 나타내는 양이온성 지질:
(ⅰ) R1은 비치환된 에탄디일, 프로판디일, 또는 부탄디일이며;
(ⅱ) R2는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 선형 및 비분지형 알칸디일이며;
(ⅲ) R3는 -R5-C(O)-O- 또는 -R5-O-C(O)-이며;
(ⅳ) R4는 12 내지 25개의 탄소 원자를 갖는 알킬 또는 알케닐이며;
(ⅴ) R5는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며; 및/또는
(ⅵ) X는 탄소 원자이다.
14. 실시형태 1에 있어서, 표 1에 열거된 화합물의 하나로부터 선택되는 양이온성 지질.
15. (ⅰ) 실시형태 1 내지 14의 어느 하나의 양이온성 지질; 또는
(ⅱ) 표 1에 열거된 양이온성 지질 C15
를 포함하는 조성물.
16. 실시형태 15에 있어서, 일 이상의 하기 부형제를 더 포함하는 조성물:
(ⅰ) 스테로이드, 바람직하게 콜레스테롤;
(ⅱ) 중성 지질;
여기에서, 상기 중성 지질은 바람직하게, 선택적으로 중성 지질 1,2-디헵타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DHPC)과 조합된 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPhyPE)이며; 또는 상기 중성 지질은 펜타노일, 헥사노일, 헵타노일, 옥타노일, 노나오일 및 데카노일로부터 선택되는 2개의 지방산 모이어티를 갖는 즈비터 이온성 화합물과 조합된, 즈비터 이온성 화합물, 선택적으로 미리스토일, 팔미토일, 스테아로일 및 올레이올로부터 선택되는 2개의 지방산 모이어티를 갖는 즈비터 이온성 화합물이며;
및/또는
(ⅲ) 폴리머 컨쥬게이트 지질(polymer conjugated lipid);
여기에서, 상기 폴리머 컨쥬게이트 지질은 화학식 (Ⅱ):
[화학식 Ⅱ]
P-A-L
에 따른 화합물이며,
상기 식에서,
P는 친수성 폴리머 모이어티이며, A는 선택적 링커이며, L은 지질 모이오티이며,
바람직하게, 폴리머 컨쥬게이트 지질은 페길화 지질(pegylated lipid)이다.
17. 일 이상의 하기 부형제를 포함하는 조성물:
(ⅰ) 실시형태 1 내지 14의 어느 하나의 양이온성 지질 또는 3급 또는 4급 질소 / 아미노기를 포함하는 양이온성 지질 또는 생리학적 pH에서 순 양전하를 띠는 양이온성 지질;
(ⅱ) 스테로이드, 바람직하게 콜레스테롤;
(ⅲ) 실시형태 16의 하위항목 (ⅱ)에 기재된 중성 지질; 및/또는
(ⅳ) 폴리머 컨쥬게이트 지질,
여기에서, 상기 폴리머 컨쥬게이트 지질은 화학식 (Ⅱ):
[화학식 Ⅱ]
P-A-L
에 따른 화합물이며,
상기 식에서, P는 친수성 폴리머 모이어티이며, A는 선택적 링커이며, L은 지질 모이어티이며,
바람직하게, 폴리머 컨쥬게이트 지질은 페길화 지질이며;
더욱 바람직하게, 지질 모이어티 L은 8, 10 또는 12개의 탄소 원자, 바람직하게 8 또는 10개의 탄소 원자를 포함하는 적어도 하나의 지방산 ("테일")을 포함하며;
더욱더 바람직하게, 페길화 지질은 1,2-디카프릴-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌 글리콜 2000 (C10-PEG 2000); 및 N-옥타노일-스핑고신-1-{석시닐[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)2000]} (Cer8-PEG 2000)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
18. 일 이상의 하기 부형제를 포함하는 조성물
(ⅰ) 실시형태 17의 하위항목 (ⅰ)에 기재된 양이온성 지질;
(ⅱ) 스테로이드, 바람직하게 콜레스테롤;
(ⅲ) 실시형태 16의 하위항목 (ⅱ)에 기재된 중성 지질; 및/또는
(ⅳ) 폴리머 컨쥬게이트 지질,
여기에서, 상기 폴리머 컨쥬게이트 지질은 화학식 (Ⅱ):
[화학식 Ⅱ]
P-A-L
에 따른 화합물이며,
상기 식에서, P는 친수성 폴리머 모이어티이며 A는 선택적 링커이며, L은 지질 모이어티이며;
바람직하게, 폴리머 컨쥬게이트 지질은 페길화 지질이며;
더욱 바람직하게, 페길화 지질은 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000 (DMG-PEG 2000)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
19. 실시형태 15 내지 18 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 바람직하게, 조성물은 하기:
(a-i) 30-70 mol% 양의 양이온성 지질; 20-50 mol% 양의 스테로이드; 5-25 mol% 양의 중성 지질; 및 0.5-5 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(a-ⅱ) 40-70 mol% 양의 양이온성 지질; 20-50 mol% 양의 스테로이드; 5-15 mol% 양의 중성 지질; 및 0.5-5 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(a-ⅲ) 20-60 mol% 양의 양이온성 지질; 25-55 mol% 양의 스테로이드; 5-25 mol% 양의 인지질; 및 0.5-15 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(a-ⅳ) 45-65 mol% 양의 양이온성 지질; 25-45 mol% 양의 스테로이드; 8-12 mol% 양의 인지질; 및 1-3 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(a-ⅴ) 45-65 mol% 양의 양이온성 지질; 25-45 mol% 양의 콜레스테롤; 8-12 mol% 양의 중성 지질; 및 1-3 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(a-ⅵ) 45-65 mol% 양의 양이온성 지질; 25-45 mol% 양의 콜레스테롤; 8-12 mol% 양의 DPhyPE 및 선택적으로 1 내지 10 mol% 양의 DHPC; 및 1-3 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질; 및
(a-ⅵ) 45-65 mol% 양의 양이온성 지질; 25-45 mol% 양의 콜레스테롤; 8-12 mol% 양의 DPhyPE 및 선택적으로 1 내지 10 mol% 양의 DHPC; 및 P1-3 mol% 양의 PEG-DMG 2000;
로 이루어진 군으로부터 선택되는 비율로 부형제를 포함하거나, 또는
더욱 바람직하게, 조성물은 하기:
(b-i) 59 mol% 양의 양이온성 지질; 29.3 mol% 양의 스테로이드; 10 mol% 양의 중성 지질; 및 1.7 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(b-ⅱ) 59 mol% 양의 양이온성 지질; 29.3 mol% 양의 콜레스테롤; 10 mol% 양의 중성 지질; 및 1.7 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(b-ⅲ) 59 mol% 양의 양이온성 지질; 29.3 mol% 양의 콜레스테롤; 10 mol% 양의 DPhyPE; 및 1.7 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(b-ⅳ) 59 mol% 양의 양이온성 지질; 29.3 mol% 양의 콜레스테롤; 10 mol% 양의 DPhyPE; 및 1.7% 양의C10-PEG 2000; 및
(b-ⅴ) 59 mol% 양의 양이온성 지질; 29.3 mol% 양의 콜레스테롤; 10 mol% 양의 DPhyPE; 및 1.7% 양의 Cer8-PEG 2000
로 이루어진 군으로부터 선택되는 비율로 부형제를 포함하며,
각각의 양은 지질 나노입자의 모든 지질 부형제의 총 몰량에 대한 것이며, 또는
더욱 바람직하게, 조성물은 하기:
(c-i) 표 F에 개시된 F1 내지 F60으로 이루어진 군으로부터 선택되는 몰 백분율로 표 E에 개시된 E1 내지 E69로 이루어진 군으로부터 선택되는 지질 부형제 조합
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비율로 부형제를 포함하는 조성물.
20. 실시형태 15 내지 19 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 바람직하게, 조성물은 하기 비율로 부형제를 포함하는 조성물:
(ⅰ) 59 mol%의 표 1에 개시된 양이온성 지질 C23, 29.3 mol%의 콜레스테롤, 10 mol%의 DPhyPE 및 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000;
(ⅱ) 59 mol%의 표 1에 개시된 양이온성 지질 C2, 29.3 mol%의 콜레스테롤, 10 mol%의 DPhyPE 및 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000; 또는
(ⅲ) 59 mol%의 표 1에 개시된 양이온성 지질 C15, 29.3 mol%의 콜레스테롤, 10 mol%의 DPhyPE 및 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000.
21. 실시형태 15 내지 20 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 생물학적 활성 성분을 더 포함하는 조성물.
22. 실시형태 21에 있어서, 생물학적 활성 성분은 인공 mRNA, 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 화학적으로 변형되거나 또는 변형되지 않은 메신저 RNA (mRNA), 자가 복제 RNA, 원형 RNA, 바이러스 RNA, 및 레플리콘 RNA; 또는 그 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 화합물이며, 바람직하게 생물학적 활성 성분은 mRNA 또는 mRNA 화합물인 조성물.
23. 실시형태 15 내지 22중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 지질 나노입자가 mRNA를 하기와 같은 양으로 포함하는 조성물:
(ⅰ) 10 내지 20 범위의 N/P 비율을 달성하도록 하는 양; 또는
(ⅱ) 20 내지 60, 바람직하게 약 3 내지 약 15, 5 내지 약 13, 약 4 내지 약 8 또는 약 7 내지 약 11 범위의 지질 : mRNA 중량비를 달성하도록 하는 양.
24. 실시형태 15 내지 23 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 조성물은 멸균 액체 담체로 재구성하기 위한 멸균 고체 조성물이며, 조성물은 pH 조정제, 증량제, 안정화제, 비이온성 계면활성제 및 항산화제로 이루어진 군으로부터 선택되는 일 이상의 비활성 성분을 더 포함하며, 멸균 액체 담체는 수성 담체인 조성물.
25. 실시형태 15 내지 24중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 조성물은 멸균 액체 조성물이며, 지질 나노입자가 약 50 nm 내지 약 300 nm, 또는 약 60 nm 내지 약 250 nm, 또는 약 60 nm 내지 약 200 nm, 또는 약 70 내지 200 nm, 또는 약 75 nm 내지 약 160, 또는 약 90 nm 내지 약 140 nm, 또는 약 100 nm 내지 약 140 nm의동적 레이저 산란에 의해 결정된 평균 유체역학적 직경을 갖는 조성물.
26. 실시형태 15 내지 25중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 지질 나노입자가 -50 mV 내지 +50 mV 범위의 제타 전위를 나타내는 조성물.
27. 실시형태 22 내지 26 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, mRNA 화합물은 모노-, 바이- 또는 멀티시스트로닉 mRNA인 조성물.
28. 실시형태 22 내지 26 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, mRNA 화합물은 적어도 하나의 화학적 변형을 포함하는 조성물.
29. 실시형태 28에 있어서, 화학적 변형은 염기 변형, 당 변형, 골격 변형 및 지질 변형로 이루어진 군으로부터 선택되며, 바람직하게 화학적 변형은 염기 변형이며, 더욱 바람직하게 염기 변형은 바람직하게 슈도우라실 (ψ), N1-메틸슈도우라실 (N1Mψ), 1-에틸슈도우라실, 2-티오우라실 (s2U), 4-티오우라실, 5-메틸시토신, 5-메틸우라실, 5-메톡시우라실, 및 그 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
30. 실시형태 22 내지 29 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, mRNA 화합물은 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 코딩 영역을 포함하며, 코딩 영역은 서열 변형을 나타내는 조성물.
31. 실시형태 30에 있어서, 서열 변형은 G/C 함량 변형, 코돈 변형, 코돈 최적화 또는 서열의 C-최적화로부터 선택되며; 바람직하게, 상응하는 야생형 mRNA의 코딩 영역과 비교하여,
- 코딩 영역의 G/C 함량이 증가하며;
- 코딩 영역의 C 함량이 증가하며;
- 코딩 영역의 코돈 사용이 인간 코돈 사용에 적응되며; 및/또는 코돈 적응 지수 (CAI)가 코딩 영역에서 증가되거나 또는 최대화되는 조성물.
32. 실시형태 22 내지 31 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, mRNA 화합물은 하기를 더 포함하는 조성물:
a) 5'-CAP 구조;
b) 적어도 하나의 miRNA 서열, 바람직하게 여기에서, microRNA 결합 부위는 miR-126, miR-142, miR-144, miR-146, miR-150, miR-155, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27, miR-26a, 또는 그 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 microRNA에 대한 것이며;
c) 적어도 하나의 5'-UTR 요소;
d) 적어도 하나의 폴리(A) 서열;
e) 적어도 하나의 폴리(C) 서열;
f) 적어도 하나의 3'-UTR 요소;
또는 그 임의의 조합.
33. 실시형태 22 내지 32 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 코딩 RNA는 5'-CAP 구조, 바람직하게 m7G, CAP0, CAP1, CAP2, 변형된 CAP0 또는 변형된 CAP1 구조를 포함하는 조성물.
34. 실시형태 22 내지 33 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 코딩 RNA는 적어도 하나의 이종 5'-UTR 및/또는 적어도 하나의 이종 3'-UTR을 포함하며, 바람직하게 적어도 하나의 이종 5'-UTR은 HSD17B4, RPL32, ASAH1, ATP5A1, MP68, NDUFA4, NOSIP, RPL31, SLC7A3, TUBB4B 및 UBQLN2로부터 선택되는 유전자의 5'-UTR 또는 이들 유전자의 어느 하나의 동족체, 단편, 또는 변이체로부터 유래되는 핵상 서열을 포함하거나; 및/또는
바람직하게 적어도 하나의 이종 3'-UTR은 PSMB3, ALB7, 알파-글로빈, CASP1, COX6B1, GNAS, NDUFA1 및 RPS9선택되는 유전자의 3'-UTR 또는 이들 유전자의 어느 하나의 동족체, 단편, 또는 변이체로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하는 조성물.
35. 실시형태 22 내지 34 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 코딩 RNA는 (ⅰ) HSD17B4 5'-UTR 및 PSMB3 3'-UTR 또는 (ⅱ) RPL32 5'-UTR 및 ALB7 3'-UTR을 포함하는 조성물.
36. 실시형태 22 내지 35 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 5'에서 3' 방향으로 하기 요소를 포함하는 조성물:
a) 바람직하게 m7G(5'), m7G(5')ppp(5')(2'OMeA) 및 m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 5'-CAP 구조;
b) TOP 유전자의 5'-UTR 또는 그의 동족체, 단편 또는 변이체로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하는 5'-UTR 요소, 상기 핵산 서열은 바람직하게, 서열식별번호: 22, 24, 24에 따른 핵산 서열을 포함하는 RNA 서열을 포함하며;
c) 적어도 하나의 코딩 서열;
d) α-글로빈 유전자 또는 그의 동족체, 단편 또는 변이체로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하는 3'-UTR 요소, 상기 핵산 서열은 바람직하게 서열식별번호:6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20에 따른 핵산 서열에 상응하는 RNA 서열을 포함하며; 및/또는 알부민 유전자 또는 그의 동족체, 단편 또는 변이체로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하는 3'-UTR 요소, 상기 핵산 서열은 바람직하게 서열식별번호:18에 따른 핵산 서열에 상응하는 RNA 서열을 포함하며;
e) 선택적으로, 바람직하게 0 내지 200, 10 내지 100, 40 내지 80, 50 내지 70, 또는 70 내지 90개 아데노신 뉴클레오타이드로 이루어진, 적어도 하나의 폴리(A) 서열;
f) 선택적으로, 바람직하게 10 내지 200개, 10 내지 100개, 20 내지 70개, 20 내지 60개 또는 10 내지 40개 시토신 뉴클레오타이드로 이루어진, 적어도 하나의 폴리(C) 서열; 및
g) 선택적으로, 바람직하게 서열식별번호:4에 따른 RNA 서열을 포함하는, 적어도 하나의 히스톤 스템-루프.
37. 실시형태 21 내지 36 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 생물학적 활성 성분은 하기인 조성물:
(a) 펩타이드 또는 단백질, 또는 그 단편 또는 변이체를 코딩하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 mRNA, 여기에서, 펩타이드 또는 단백질은 항원이며, 여기에서, 항원은 바람직하게 병원성 항원, 종양 항원, 알레르기 항원 또는 자가면역 자가-항원, 또는 그 단편 또는 변이체로부터 유래되며, 또는
(b) 치료 단백질, 또는 그 단편 또는 변이체를 코딩하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 mRNA, 여기에서, 치료 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되며:
(ⅰ) 대사, 내분비 또는 아미노산 장애의 치료를 위한 효소 대체 요법에 사용하거나, 또는 부재, 결핍 또는 돌연변이 단백질을 대체하는데 사용하기 위한 치료 단백질;
(ⅱ) 혈액 장애, 순환계 질병, 호흡계 질병, 감염성 질병 또는 면역 결핍의 치료에 사용하기 위한 치료 단백질;
(ⅲ) 암 또는 종양 질병의 치료에 사용하기 위한 치료 단백질;
(ⅳ) 호르몬 대체 요법에 사용하기 위한 치료 단백질;
(ⅴ) 체세포를 다능성 또는 전능성 줄기 세포로 재프로그래밍하는데 사용하기 위한 치료 단백질;
(ⅵ) 보조제 또는 면역 자극제로 사용하기 위한 치료 단백질;
(ⅶ) 치료 항체인 치료 단백질;
(ⅷ) 유전자 편집제인 치료 단백질; 및
(ⅸ) 간 섬유증, 간경변 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 간 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 치료 단백질.
38. 실시형태 37의 하위항목 (a)에 있어서, 항원은 박테리아, 바이러스, 진균 및 원생동물 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 병원성 항원을 코딩하는 조성물.
39. 실시형태에 38에 있어서, 병원성 항원은 SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 부니아 바이러스목 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뎅기열 바이러스 (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4), 에볼라 바이러스, 플라비바이러스, B형 간염 바이러스 (HBV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 인간 유두종 바이러스 (HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV), 인플루엔자 바이러스, 장외 병원성 대장균, 라사 맘마레나바이러스 (LASV), 메르스 코로나바이러스, 결핵균, 니파 바이러스, 노로바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 라이노바이러스, 로타 바이러스, 백시니아 바이러스, 황열병 바이러스, 지카 바이러스, 클라미디아 트라코마티스 (즉, 클라미디아를 일으키는 클라미디아 박테리아), 또는 말라리아 기생충 (예를 들어, 열대열 말라리아 원충, 삼일열 말라리아 원충, 사일열 말라리아 원충, 또는 난형 말라리아 원충)으로부터 유래되는 조성물.
40. 실시형태 15 내지 39 중 어느 하나의 실시형태에서 있어서, 하기에 사용하기 위한 조성물:
(ⅰ) 감염성 질병; 암 또는 종양 질병, 장애 또는 상태; 간 섬유증, 간경변 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 간 질병; 알레르기; 또는 자가면역 질병; 장애 또는 상태의 치료 또는 예방; 및/또는
(ⅱ) 대사 또는 내분비 장애의 치료를 위한 효소 대체 요법에 사용 또는 부재, 결핍 또는 돌연변이 단백질을 대체하는데 사용.
41. 실시형태 15 내지 39 중 어느 하나의 실시형태에서 있어서, 감염성 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 조성물.
42. 실시형태 40 또는 41에 있어서, 적어도 하나의 코딩 RNA를 포함하며, 적어도 하나의 코딩 RNA는 질병, 장애 또는 상태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 적어도 하나의 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하며, 상기 조성물은 이를 필요로 하는 대상에게 근육 내 또는 피부 주사를 통하여 투여되는 조성물.
43. 실시형태 21 내지 42 중 어느 하나의 조성물을 포함하며, 선택적으로 가용화를 위한 액체 비히클, 및 선택적으로, 성분의 투여 및 투여량에 대한 정보를 제공하는 기술 설명서를 포함하는, 키트 또는 부품 키트.
44. 의약으로 사용하기 위한, 실시형태 21 내지 42 중 어느 하나의 조성물 또는 실시형태 43의 키트 또는 부품 키트.
45. 실시형태 44에 있어서, 의약은 바이러스, 박테리아 또는 원생동물 감염성 질병을 포함하는 감염성 질병, 암 또는 종양 질병, 간 질병, 자가면역 질병, 알레르기, 유전 질병을 포함하는 단성 유전자 질병, 일반적 유전자 질병, 유전적 배경이 있고 일반적으로 정의된 유전자 결함에 의해 유발되고 멘델의 법칙에 의해 유전되는 질병; 심혈관 질병, 신경 질병, 호흡계 질병, 소화기 질병, 피부 질병, 근골격계 장애, 결합 조직의 장애, 신생물, 면역 결핍, 내분비, 영양 및 대사 질병, 눈 질병, 귀 질병 및 펩타이드 또는 단백질 결핍과 관련된 질병으로부터 선택되는 질병의 방지, 예방, 치료 및/또는 개선을 위한 것인 의약으로서 사용하기 위한 조성물.
46. 실시형태 44 또는 45에 있어서, 의약은 백신인 의약으로 사용하기 위한 조성물.
47. 바이러스, 박테리아 또는 원생동물 감염성 질병을 포함하는 감염성 질병, 암 또는 종양 질병으로부터 선택되는 질병의 방지, 예방, 치료 및/또는 개선을 위한 실시형태 15 내지 42 중 어느 하나의 조성물 또는 실시형태 43의 키트 또는 부품 키트를 포함하는 백신.
48. 하기 단계를 포함하는 감염성 질병; 암 또는 종양 질병, 장애 또는 상태; 간 섬유증, 간경변 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 간 질병; 알레르기; 또는 자가면역 질병; 장애 또는 상태의 치료 또는 예방 방법:
a) 상기 실시형태의 어느 하나에 기재된 mRNA, 상기 실시형태의 어느 하나에 기재된 조성물, 실시형태 47의 백신, 실시형태 43의 키트 또는 부품 키트를 제공하는 단계; 및
b) mRNA, 조성물, 백신 또는 키트 또는 부품 키트를 조직 또는 유기체에 적용하거나 투여하는 단계.
49. 실시형태 48에 있어서, 실시형태 15 내지 42 중 어느 하나의 mRNA, 조성물, 실시형태 47의 백신 또는 실시형태 43의 키트 또는 부품 키트는 정맥 내, 근육 내, 피하 또는 피부 내 주사에 의해 조직 또는 유기체에 투여되는 방법.
50. 실시형태 47의 백신을 대상에서 항원 특이적 면역 반응을 생성하기에 효과적인 양으로 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 대상에서 면역 반응을 유도하는 방법.
51. 바이러스 항원을 코딩하는 mRNA의 유효량을 포함하는 대상의 백신 접종에 사용하기 위한, 실시형태 15 내지 42 중 어느 하나의 조성물, 또는 실시형태 43의 키트 또는 부품 키트를 포함하는 약학 조성물.
52. (ⅰ) 면역 반응의 유도, (ⅱ) 항원 특이적 T 세포 반응 유도, 또는 바람직하게 (ⅲ) CD8+ T 세포 반응 유도를 위한 실시형태 15 내지 42 중 어느 하나의 조성물, 또는 실시형태 43의 키트 또는 부품 키트를 포함하는 약학 조성물의 용도.
53. 실시형태 52에 있어서, 감염성 질병의 예방을 위하여, 또는 감염성 질병의 예방을 위한 의약 제조에 이용되며, 상기 의약은 바람직하게 백신인 용도.
54. 실시형태 15 내지 42 중 어느 하나의 조성물, 또는 실시형태 43의 키트 또는 부품 키트를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 대상의 질병 또는 상태를 예방, 개선 또는 치료하는 방법.
55. 전술한 실시형태 중 어느 하나의 방법에 있어서, 조성물의 투여에 의해 대상의 림프구에서 mRNA에 의해 코딩되는 항원의 발현이 초래되는 방법.
56. 전술한 실시형태 중 어느 하나의 방법에 있어서, 조성물 투여에 의해 항원 특이적 항체 반응이 초래되며, 바람직하게 항원 특이적 항체 반응은 혈청에서 항원 특이적 항체의 존재에 의해 측정되는 방법.
제2 실시형태 세트
1. 화학식 (Ⅰ):
[화학식 Ⅰ]
Ra-A-Rb
에 따른 양이온성 지질, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 프로드러그(prodrug) 또는 입체이성질체(stereoisomer)를 포함하는 조성물로서,
상기 식에서,
Ra는
Figure pct00148
,
Figure pct00149
,
Figure pct00150
,
Figure pct00151
,
Figure pct00152
,
Figure pct00153
, 또는
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4로부터 선택되며;
Rb는
Figure pct00154
,
Figure pct00155
,
Figure pct00156
,
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4, 또는
-R1-N(CH3)2로부터 선택되며;
A는 -S-, -S-S-, -NH-C(O)-, -NH-C(O)O-, -NH-C(O)-NH-, -S-C(O)-N(H)-, -C(O)O-, 또는 -O-P(O)(OH)-O-이며;
R1은 선택적으로 치환된 에탄디일, 프로판디일, 부탄디일, 또는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 비분지형 알칸디일이며;
R2는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
R3는 선택적이며, 존재하는 경우, -R5-C(O)-O-, -R5-O-C(O)-, -R5-C(O)-NH-, -R5-OC(O)-NH-, 또는 R5-NH-C(O)O-이며;
R4는 12 내지 36개의 탄소 원자를 갖는 친유성 치환기이며;
R5는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
X는 탄소 또는 질소 원자이며;
여기서 모든 선택은 서로 독립적이며
일 이상의 하기 부형제:
(ⅰ) 콜레스테롤;
(ⅱ) 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPhyPE); 및/또는
(ⅲ) 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000 (DMG-PEG 2000), 1,2-디카프릴-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌 글리콜 2000 (C10-PEG 2000); 및 N-옥타노일-스핑고신-1-{석시닐[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)2000]} (Cer8-PEG 2000)로 이루어진 군으로부터 선택되는 페길화 지질
를 더 포함하는 조성물.
2. 실시형태 1에 있어서, 바람직하게 조성물은 하기:
(a-i) 30-70 mol% 양의 양이온성 지질; 20-50 mol% 양의 스테로이드; 5-25 mol% 양의 중성 지질; 및 0.5-5 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(a-ⅱ) 40-70 mol% 양의 양이온성 지질; 20-50 mol% 양의 스테로이드; 5-15 mol% 양의 중성 지질; 및 0.5-5 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(a-ⅲ) 20-60 mol% 양의 양이온성 지질; 25-55 mol% 양의 스테로이드; 5-25 mol% 양의 인지질; 및 0.5-15 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(a-ⅳ) 45-65 mol% 양의 양이온성 지질; 25-45 mol% 양의 스테로이드; 8-12 mol% 양의 인지질; 및 1-3 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(a-ⅴ) 45-65 mol% 양의 양이온성 지질; 25-45 mol% 양의 콜레스테롤; 8-12 mol% 양의 중성 지질; 및 1-3 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(a-ⅵ) 45-65 mol% 양의 양이온성 지질; 25-45 mol% 양의 콜레스테롤; 8-12 mol% 양의 DPhyPE 및 선택적으로 1 내지 10 mol% 양의 DHPC, 및 1-3 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질; 및
(a-ⅵ) 45-65 mol% 양의 양이온성 지질; 25-45 mol% 양의 콜레스테롤; 8-12 mol% 양의 DPhyPE 및 선택적으로 1 내지 10 mol% 양의 DHPC, 및 P1-3 mol% 양의 PEG-DMG 2000;
로 이루어진 군으로부터 선택되는 비율로 부형제를 포함하거나, 또는
더욱 바람직하게 조성물은 하기:
(b-i) 59 mol% 양의 양이온성 지질; 29.3 mol% 양의 스테로이드; 10 mol% 양의 중성 지질; 및 1.7 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(b-ⅱ) 59 mol% 양의 양이온성 지질; 29.3 mol% 양의 콜레스테롤; 10 mol% 양의 중성 지질; 및 1.7 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(b-ⅲ) 59 mol% 양의 양이온성 지질; 29.3 mol% 양의 콜레스테롤; 10 mol% 양의 DPhyPE; 및 1.7 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(b-ⅳ) 59 mol% 양의 양이온성 지질; 29.3 mol% 양의 콜레스테롤; 10 mol% 양의 DPhyPE; 및 1.7% 양의 C10-PEG 2000; 및
(b-ⅴ) 59 mol% 양의 양이온성 지질; 29.3 mol% 양의 콜레스테롤; 10 mol% 양의 DPhyPE; 및 1.7% 양의 Cer8-PEG 2000
로 이루어진 군으로부터 선택되는 비율로 부형제를 포함하며:
각각의 양은 지질 나노입자의 모든 지질 부형제의 총 몰량에 대한 것이며;
더욱 바람직하게 조성물은 하기:
(c-i) 표 f에 개시된 F1 내지 F60으로 이루어진 군으로부터 선택되는 몰 백분율로 표 E에 개시된 E1 내지 E69로 이루어진 군으로부터 선택되는 지질 부형제 조합
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비율로 부형제를 포함하는 조성물.
3. 실시형태 1 또는 2의 어느 하나에 있어서, 바람직하게 조성물은 하기 비율로 부형제를 포함하는 조성물:
(ⅰ) 59 mol%의 표 1에 개시된 양이온성 지질 C23, 29.3 mol%의 콜레스테롤, 10 mol%의 DPhyPE 및 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000;
(ⅱ) 59 mol%의 표 1에 개시된 양이온성 지질 C2, 29.3 mol%의 콜레스테롤, 10 mol%의 DPhyPE 및 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000; 또는
(ⅲ) 59 mol%의 표 1에 개시된 양이온성 지질 C15, 29.3 mol%의 콜레스테롤, 10 mol%의 DPhyPE 및 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000.
4. 실시형태 1 내지 3 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 생물학적 활성 성분을 더 포함하는 조성물.
5. 실시형태 4에 있어서, 생물학적 활성 성분은 인공 mRNA, 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 화학적으로 변형되거나 또는 변형되지 않은 메신저 RNA (mRNA), 자가 복제 RNA, 원형 RNA, 바이러스 RNA, 및 레플리콘 RNA; 또는 그 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 화합물이며, 바람직하게 생물학적 활성 성분은 mRNA 또는 mRNA 화합물인 조성물.
6. 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 지질 나노입자는 mRNA를 하기와 같은 양으로 포함하는 조성물:
(ⅰ) 10 내지 20 범위의 N/P 비율을 달성하도록 하는 양; 또는
(ⅱ) 20 내지 60, 바람직하게 약 3 내지 약 15, 5 내지 약 13, 약 4 내지 약 8 또는 약 7 내지 약 11 범위의 지질 : mRNA 중량비를 달성하도록 하는 양.
7. 실시형태 1 내지 6 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 조성물은 멸균 액체 담체로 재구성하기 위한 멸균 고체 조성물이며, 조성물은 pH 조정제, 증량제, 안정화제, 비이온성 계면활성제 및 항산화제로 이루어진 군으로부터 선택되는 일 이상의 비활성 성분을 더 포함하며, 멸균 액체 담체는 수성 담체인 조성물.
8. 실시형태 1 내지 7 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 조성물은 멸균 액체 조성물이며, 지질 나노입자가 약 50 nm 내지 약 300 nm, 또는 약 60 nm 내지 약 250 nm, 또는 약 60 nm 내지 약 200 nm, 또는 약 70 내지 200 nm, 또는 약 75 nm 내지 약 160, 또는 약 90 nm 내지 약 140 nm, 또는 약 100 nm 내지 약 140 nm의 동적 레이저 산란에 의해 결정된 평균 유체역학적 직경을 갖는 조성물.
9. 실시형태 1 내지 8 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 지질 나노입자가 -50 mV 내지 +50 mV 범위의 제타 전위를 나타내는 조성물.
10. 실시형태 5 내지 9 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, mRNA 화합물은 모노-, 바이- 또는 멀티시스트로닉 mRNA인 조성물.
11. 실시형태 5 내지 10 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, mRNA 화합물은 적어도 하나의 화학적 변형을 포함하는 조성물.
12. 실시형태 11에 있어서, 화학적 변형은 염기 변형, 당 변형, 골격 변형 및 지질 변형로 이루어진 군으로부터 선택되며, 바람직하게 화학적 변형은 염기 변형이며, 더욱 바람직하게 염기 변형 바람직하게 슈도우라실 (ψ), N1-메틸슈도우라실 (N1Mψ), 1-에틸슈도우라실, 2-티오우라실 (s2U), 4-티오우라실, 5-메틸시토신, 5-메틸우라실, 5-메톡시우라실, 및 그 임의의 조합로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
13. 실시형태 5 내지 12 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, mRNA 화합물은 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 코딩 영역을 포함하며, 코딩 영역은 서열 변형을 나타내는 조성물.
14. 실시형태 13에 있어서, 서열 변형은 G/C 함량 변형, 코돈 변형, 코돈 최적화 또는 서열의 C-최적화로부터 선택되며; 바람직하게 상응하는 야생형 mRNA의 코딩 영역과 비교하여,
- 코딩 영역의 G/C 함량이 증가하며;
- 코딩 영역의 C 함량이 증가하며;
- 코딩 영역의 코돈 사용이 인간 코돈 사용에 적응되며; 및/또는 코돈 적응 지수 (CAI)가 코딩 영역에서 증가되거나 또는 최대화되는
조성물.
15. 실시형태 5 내지 14 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, mRNA 화합물은 하기를 더 포함하는 조성물:
a) 5'-CAP 구조;
b) 적어도 하나의 miRNA 서열, 바람직하게 여기에서, microRNA 결합 부위는 miR-126, miR-142, miR-144, miR-146, miR-150, miR-155, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27, miR-26a, 또는 그 임의의 조합로 이루어진 군으로부터 선택되는 microRNA에 대한 것이며;
c) 적어도 하나의 5'-UTR 요소;
d) 적어도 하나의 폴리(A) 서열;
e) 적어도 하나의 폴리(C) 서열;
f) 적어도 하나의 3'-UTR 요소;
또는 그 임의의 조합.
16. 실시형태 5 내지 15 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 코딩 RNA는 5'-CAP 구조, 바람직하게 m7G, CAP0, CAP1, CAP2, 변형된 CAP0 또는 변형된 CAP1 구조를 포함하는 조성물.
17. 실시형태 5 내지 16 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 코딩 RNA는 적어도 하나의 이종 5'-UTR 및/또는 적어도 하나의 이종 3'-UTR을 포함하며, 바람직하게 적어도 하나의 이종 5'-UTR은 HSD17B4, RPL32, ASAH1, ATP5A1, MP68, NDUFA4, NOSIP, RPL31, SLC7A3, TUBB4B 및 UBQLN2로부터 선택되는 유전자의 5'-UTR 또는 이들 유전자의 어느 하나의 동족체, 단편, 또는 변이체로부터 유래되는 핵상 서열을 포함하거나; 및/또는
바람직하게 적어도 하나의 이종 3'-UTR은 PSMB3, ALB7, 알파-글로빈, CASP1, COX6B1, GNAS, NDUFA1 및 RPS9로부터 선택되는 유전자의 3'-UTR 또는 이들 유전자의 어느 하나의 동족체, 단편, 또는 변이체로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하는 조성물.
18. 실시형태 5 내지 17 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 코딩 RNA는 (ⅰ) HSD17B4 5'-UTR 및 PSMB3 3'-UTR 또는 (ⅱ) RPL32 5'-UTR 및 ALB7 3'-UTR을 포함하는 조성물.
19. 실시형태 5 내지 18 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 5'에서 3' 방향으로 하기 요소를 포함하는 조성물:
a) 바람직하게 m7G(5'), m7G(5')ppp(5')(2'OMeA) 및 m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 5'-CAP 구조;
b) TOP 유전자의 5'-UTR 또는 그의 동족체, 단편 또는 변이체로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하는 5'-UTR 요소, 상기 핵산 서열은 바람직하게, 서열식별번호: 22, 24, 24에 따른 핵산 서열을 포함하는 RNA 서열을 포함하며;
c) 적어도 하나의 코딩 서열;
d) α-글로빈 유전자 또는 그의 동족체, 단편 또는 변이체로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하는 3'-UTR 요소, 상기 핵산 서열은 바람직하게 서열식별번호:6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20에 따른 핵산 서열에 상응하는 RNA 서열을 포함하며; 및/또는 알부민 유전자 또는 그의 동족체, 단편 또는 변이체로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하는 3'-UTR 요소, 상기 핵산 서열은 바람직하게 서열식별번호:18에 따른 핵산 서열에 상응하는 RNA 서열을 포함하며;
e) 선택적으로, 바람직하게 10 내지 200, 10 내지 100, 40 내지 80, 또는 50 내지 70개 아데노신 뉴클레오타이드로 이루어진, 적어도 하나의 폴리(A) 서열, 바람직하게;
f) 선택적으로, 바람직하게, 10 내지 200, 10 내지 100, 20 내지 70, 20 내지 60 또는 10 내지 40개 시토신 뉴클레오타이드로 이루어진, 적어도 하나의 폴리(C) 서열; 및
g) 선택적으로, 바람직하게 서열식별번호:4에 따른 RNA 서열을 포함하는, 적어도 하나의 히스톤 스템-루프.
20. 실시형태 4 내지 19 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 생물학적 활성 성분은 하기인 조성물.
(a) 펩타이드 또는 단백질, 또는 그 단편 또는 변이체를 코딩하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 mRNA, 여기에서, 펩타이드 또는 단백질은 항원이며, 여기에서, 항원은 바람직하게 병원성 항원, 종양 항원, 알레르기 항원 또는 자가면역 자가-항원, 또는 그 단편 또는 변이체로부터부터 유래되며, 또는
(b) 치료 단백질, 또는 그 단편 또는 변이체를 코딩하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 mRNA, 여기에서, 치료 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되며:
(ⅰ) 대사, 내분비 또는 아미노산 장애의 치료를 위한 효소 대체 요법에 사용하거나, 또는 부재, 결핍 또는 돌연변이 단백질을 대체하는데 사용하기 위한 치료 단백질;
(ⅱ) 혈액 장애, 순환계 질병, 호흡계 질병, 감염성 질병 또는 면역 결핍의 치료에 사용하기 위한 치료 단백질;
(ⅲ) 암 또는 종양 질병의 치료에 사용하기 위한 치료 단백질;
(ⅳ) 호르몬 대체 요법에 사용하기 위한 치료 단백질;
(ⅴ) 체세포를 다능성 또는 전능성 줄기 세포로 재프로그래밍하는데 사용하기 위한 치료 단백질;
(ⅵ) 보조제 또는 면역 자극제로 사용하기 위한 치료 단백질;
(ⅶ) 치료 항체인 치료 단백질;
(ⅷ) 유전자 편집제인 치료 단백질; 및
(ⅸ) 간 섬유증, 간경변 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 간 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 치료 단백질.
21. 실시형태 20의 하위항목 (a)에 있어서, 항원은 박테리아, 바이러스, 진균 및 원생동물 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 병원성 항원을 코딩하는 조성물.
22. 실시형태 21에 있어서, 병원성 항원은 SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 부니아 바이러스목 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뎅기열 바이러스 (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4), 에볼라 바이러스, 플라비바이러스, B형 간염 바이러스 (HBV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 인간 유두종 바이러스 (HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV), 인플루엔자 바이러스, 장외 병원성 대장균, 라사 맘마레나바이러스 (LASV), 메르스 코로나바이러스, 결핵균, 니파 바이러스, 노로바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 라이노바이러스, 로타 바이러스, 백시니아 바이러스, 황열병 바이러스, 지카 바이러스, 클라미디아 트라코마티스 (즉, 클라미디아를 일으키는 클라미디아 박테리아), 또는 말라리아 기생충 (예를 들어, 열대열 말라리아 원충, 삼일열 말라리아 원충, 사일열 말라리아 원충, 또는 난형 말라리아 원충)으로부터 유래되는 조성물.
23. 실시형태 5 내지 22 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 하기에 사용하기 위한 조성물:
(ⅰ) 감염성 질병; 암 또는 종양 질병, 장애 또는 상태; 간 섬유증, 간경변 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 간 질병; 알레르기; 또는 자가면역 질병; 장애 또는 상태의 치료 또는 예방; 및/또는
(ⅱ) 대사 또는 내분비 장애의 치료를 위한 효소 대체 요법에 사용 또는 부재, 결핍 또는 돌연변이 단백질을 대체하는데 사용.
24. 실시형태 5 내지 23 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 감염성 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 조성물.
25. 실시형태 5 내지 24 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 코딩 RNA를 포함하며, 적어도 하나의 코딩 RNA는 질병, 장애 또는 상태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 적어도 하나의 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하며, 상기 조성물은 이를 필요로 하는 대상에게 근육 내 또는 피부 주사를 통하여 투여되는 조성물.
26. 실시형태 4 내지 26 중 어느 하나의 실시형태의 조성물을 포함하며, 선택적으로 가용화를 위한 액체 비히클, 및 선택적으로, 성분의 투여 및 투여량에 대한 정보를 제공하는 기술 설명서를 포함하는, 키트 또는 부품 키트.
27. 의약으로 사용하기 위한, 실시형태 4 내지 25 중 어느 하나의 실시형태의 조성물 또는 실시형태 26의 키트 또는 부품 키트.
28. 실시형태 27에 있어서, 의약은 바이러스, 박테리아 또는 원생동물 감염성 질병을 포함하는 감염성 질병, 암 또는 종양 질병, 간 질병, 자가면역 질병, 알레르기, 유전 질병을 포함하는 단성 유전자 질병, 일반적 유전자 질병, 유전적 배경이 있고 일반적으로 정의된 유전자 결함에 의해 유발되고 멘델의 법칙에 의해 유전되는 질병; 심혈관 질병, 신경 질병, 호흡계 질병, 소화기 질병, 피부 질병, 근골격계 장애, 결합 조직의 장애, 신생물, 면역 결핍, 내분비, 영양 및 대사 질병, 눈 질병, 귀 질병 및 펩타이드 또는 단백질 결핍과 관련된 질병으로부터 선택되는 질병의 방지, 예방, 치료 및/또는 개선을 위한 것인 의약으로 사용하기 위한 조성물.
29. 전술한 실시형태 중 어느 하나에 있어서, 실시형태 27 또는 28에 따른 의약으로 사용하기 위한 것이여, 의약은 백신인 조성물.
30. 바이러스, 박테리아 또는 원생동물 감염성 질병을 포함하는 감염성 질병, 암 또는 종양 질병으로부터 선택되는 질병의 방지, 예방, 치료 및/또는 개선을 위한 실시형태 5 내지 25 중 어느 하나의 조성물 또는 실시형태 26의 키트 또는 부품 키트를 포함하는 백신.
31. 하기 단계를 포함하는 감염성 질병; 암 또는 종양 질병, 장애 또는 상태; 간 섬유증, 간경변 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 간 질병; 알레르기; 또는 자가면역 질병; 장애 또는 상태의 치료 또는 예방 방법:
a) 상기 실시형태의 어느 하나에 기재된 mRNA, 상기 실시형태의 어느 하나에 기재된 조성물, 실시형태 30의 백신, 실시형태 26의 키트 또는 부품 키트를 제공하는 단계; 및
b) mRNA, 조성물, 백신 또는 키트 또는 부품 키트를 조직 또는 유기체에 적용하거나 투여하는 단계.
32. 실시형태 31에 있어서, 실시형태 5 내지 29 중 어느 하나의 mRNA, 조성물, 실시형태 30의 백신 또는 실시형태 26의 키트 또는 부품 키트는 정맥 내, 근육 내, 피하 또는 피부 내 주사에 의해 조직 또는 유기체에 투여되는 방법.
33. 실시형태 30의 백신 대상에서 항원 특이적 면역 반응을 생성하기에 효과적인 양으로 대상에 투여하는 단계를 포함하는 대상에서 면역 반응을 유도하는 방법.
34. 바이러스 항원을 코딩하는 mRNA의 유효량을 포함하는 대상의 백신 접종에 사용하기 위한, 실시형태 4 내지 29 중 어느 하나의 조성물 또는 실시형태 26의 키트 또는 부품 키트를 포함하는 약학 조성물.
35. ⅰ) 면역 반응의 유도, (ⅱ) 항원 특이적 T 세포 반응 유도, 또는 바람직하게 (ⅲ) CD8+ T 세포 반응 유도를 위한 실시형태 4 내지 29 중 어느 하나의 조성물 또는 실시형태 26의 키트 또는 부품 키트를 포함하는 약학 조성물의 용도.
36. 실시형태 34에 있어서, 감염성 질병의 예방을 위하여, 또는 감염성 질병의 예방을 위한 의약 제조에 이용되며, 상기 의약은 바람직하게 백신인 용도.
37. 실시형태 4 내지 29 중 어느 하나의 조성물 또는 실시형태 26의 키트 또는 부품 키트를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 대상의 질병 또는 상태를 예방, 개선 또는 치료하는 방법.
38. 전술한 실시형태 중 어느 하나의 방법에 있어서, 조성물의 투여에 의해 대상의 림프구에서 mRNA에 의해 코딩되는 항원의 발현이 초래되는 방법.
39. 전술한 실시형태 중 어느 하나의 방법에 있어서, 조성물 투여에 의해 항원 특이적 항체 반응이 초래되며, 바람직하게 항원 특이적 항체 반응은 혈청에서 항원 특이적 항체의 존재에 의해 측정되는 방법.
제3 실시형태 세트
1. 조성물로서, 선택적으로 1,2-디헵타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DHPC)와 조합하여, 화학식 (Ⅰ)에 따른 양이온성 지질 및 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPhyPE)을 포함하며, 생물학적 활성 성분을 더 포함하며, 바람직하게 생물학적 활성 성분은 mRNA이며,
(a) mRNA는 펩타이드 또는 단백질, 또는 그 단편 또는 변이체를 코딩하는 적어도 하나의 코딩 서열은 포함하며, 여기에서, 펩타이드 또는 단백질은 항원이며, 여기에서, 항원은 바람직하게 병원성 항원, 종양 항원, 알레르기 항원 또는 자가면역 자가-항원, 또는 그 단편 또는 변이체로부터 유래되며; 또는
(b) mRNA는 치료 단백질, 또는 그 단편 또는 변이체를 코딩하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하며, 여기에서, 치료 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
(ⅰ) 대사, 내분비 또는 아미노산 장애의 치료를 위한 효소 대체 요법에 사용하거나, 또는 부재, 결핍 또는 돌연변이 단백질을 대체하는데 사용하기 위한 치료 단백질;
(ⅱ) 혈액 장애, 순환계 질병, 호흡계 질병, 감염성 질병 또는 면역 결핍의 치료에 사용하기 위한 치료 단백질;
(ⅲ) 암 또는 종양 질병의 치료에 사용하기 위한 치료 단백질;
(ⅳ) 호르몬 대체 요법에 사용하기 위한 치료 단백질;
(ⅴ) 체세포를 다능성 또는 전능성 줄기 세포로 재프로그래밍하는데 사용하기 위한 치료 단백질;
(ⅵ) 보조제 또는 면역 자극제로 사용하기 위한 치료 단백질;
(ⅶ) 치료 항체인 치료 단백질;
(ⅷ) 유전자 편집제인 치료 단백질; 및
(ⅸ) 간 섬유증, 간경변 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 간 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 치료 단백질.
2. 실시형태 1의 하위항목 (a)에 있어서, 항원은 박테리아, 바이러스, 진균 및 원생동물 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 병원성 항원을 코딩하는 조성물.
3. 실시형태 2에 있어서, 병원성 항원은 SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 부니아 바이러스목 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뎅기열 바이러스 (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4), 에볼라 바이러스, 플라비바이러스, B형 간염 바이러스 (HBV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 인간 유두종 바이러스 (HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV), 인플루엔자 바이러스, 장외 병원성 대장균, 라사 맘마레나바이러스 (LASV), 메르스 코로나바이러스, 결핵균, 니파 바이러스, 노로바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 라이노바이러스, 로타 바이러스, 백시니아 바이러스, 황열병 바이러스, 지카 바이러스, 클라미디아 트라코마티스 (즉, 클라미디아를 일으키는 클라미디아 박테리아), 또는 말라리아 기생충 (예를 들어, 열대열 말라리아 원충, 삼일열 말라리아 원충, 사일열 말라리아 원충, 또는 난형 말라리아 원충)으로부터 유래되는 조성물.
4. 전술한 실시형태의 어느 하나의 실시형태에 있어서, 하기에 사용하기 위한 조성물:
(ⅰ) 감염성 질병; 암 또는 종양 질병, 장애 또는 상태; 간 섬유증, 간경변 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 간 질병; 알레르기; 또는 자가면역 질병; 장애 또는 상태의 치료 또는 예방; 및/또는
(ⅱ) 대사 또는 내분비 장애의 치료를 위한 효소 대체 요법에 사용 또는 부재, 결핍 또는 돌연변이 단백질을 대체하는데 사용.
5. 전술한 실시형태 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 감염성 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 조성물.
6. 전술한 실시형태 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 코딩 RNA를 포함하며, 적어도 하나의 코딩 RNA는 질병, 장애 또는 상태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 적어도 하나의 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하며, 상기 조성물은 이를 필요로 하는 대상에게 근육 내 또는 피부 주사를 통하여 투여되는 조성물.
7. 전술한 실시형태 중 어느 하나의 조성물, 선택적으로 가용화를 위한 액체 비히클, 선택적으로, 성분의 투여 및 투여량에 대한 정보를 제공하는 기술 설명서를 포함하는 키트 또는 부품 키트.
8. 의약으로 사용하기 위한 전술한 실시형태 중 어느 하나의 실시형태의 조성물 또는 또는 실시형태 7의 키트 또는 부품 키트.
9. 전술한 실시형태 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 의약으로 사용하기 위한 것이며, 의약은 바이러스, 박테리아 또는 원생동물 감염성 질병을 포함하는 감염성 질병, 암 또는 종양 질병으로부터 선택되는 질병, 간 질병, 자가면역 질병, 알레르기, 유전 질병을 포함하는 단성 유전자 질병, 일반적 유전자 질병, 유전적 배경이 있고 일반적으로 정의된 유전자 결함에 의해 유발되고 멘델의 법칙에 의해 유전되는 질병; 심혈관 질병, 신경 질병, 호흡계 질병, 소화기 질병, 피부 질병, 근골격계 장애, 결합 조직의 장애, 신생물, 면역 결핍, 내분비, 영양 및 대사 질병, 눈 질병, 귀 질병 및 펩타이드 또는 단백질 결핍과 관련된 질병으로부터 선택되는 질병의 방지, 예방, 치료 및/또는 개선을 위한 것인 조성물.
10. 전술한 실시형태 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 의약으로 사용하기 위한 것이며, 의약은 백신인 조성물.
11. 바이러스, 박테리아 또는 원생동물 감염성 질병을 포함하는 감염성 질병, 암 또는 종양 질병으로부터 선택되는 질병의 방지, 예방, 치료 및/또는 개선을 위한 전술한 실시형태 중 어느 하나의 실시형태의 조성물 또는 실시형태 7의 키트 또는 부품 키트를 포함하는 백신.
12. 하기 단계를 포함하는 감염성 질병; 암 또는 종양 질병, 장애 또는 상태; 간 섬유증, 간경변 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 간 질병; 알레르기; 또는 자가면역 질병; 장애 또는 상태의 치료 또는 예방 방법:
a) 상기 실시형태의 어느 하나에 기재된 mRNA, 상기 실시형태의 어느 하나에 기재된 조성물, 실시형태 11의 백신, 실시형태 7의 키트 또는 부품 키트를 제공하는 단계; 및
b) mRNA, 조성물, 백신 또는 키트 또는 부품 키트를 조직 또는 유기체에 적용하거나 투여하는 단계.
13. 실시형태 12에 있어서, 전술한 실시형태의 어느 하나의 mRNA, 조성물, 실시형태 11의 백신 또는 실시형태 7의 키트 또는 부품 키트는 정맥 내, 근육 내, 피하 또는 피부 내 주사에 의해 조직 또는 유기체에 투여되는 방법.
14. 실시형태 11의 백신을 대상에서 항원 특이적 면역 반응을 생성하기에 효과적인 양으로 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 대상에서 면역 반응을 유도하는 방법.
15. 바이러스 항원을 코딩하는 mRNA의 유효량을 포함하는 대상의 백신 접종에 사용하기 위한, 전술한 실시형태 중 어느 하나의 실시형태의 조성물 또는 실시형태 7의 키트 또는 부품 키트를 포함하는 약학 조성물.
16. (ⅰ) 면역 반응의 유도, (ⅱ) 항원 특이적 T 세포 반응 유도, 또는 바람직하게 (ⅲ) CD8+ T 세포 반응 유도를 위한 전술한 실시형태 중 어느 하나의 실시형태의 조성물 또는 실시형태 7의 키트 또는 부품 키트를 포함하는 약학 조성물의 용도.
17. 감염성 질병의 예방을 위한, 또는 감염성 질병의 예방을 위한 의약 제조를 위한 실시형태 15의 약학 조성물의 용도로서, 상기 의약은 바람직하게 백신인 용도.
18. 전술한 실시형태 중 어느 하나의 조성물, 또는 실시형태 7의 키트 또는 부품 키트를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상의 질병 또는 상태를 예방, 개선 또는 치료하는 방법.
19. 전술한 실시형태 중 어느 하나의 방법에 있어서, 조성물의 투여에 의해 대상의 림프구에서 mRNA에 의해 코딩되는 항원의 발현이 초래되는 방법.
20. 전술한 실시형태 중 어느 하나의 방법에 있어서, 조성물 투여에 의해 항원 특이적 항체 반응이 초래되며, 바람직하게 항원 특이적 항체 반응은 혈청에서 항원 특이적 항체의 존재에 의해 측정되는 방법.
제4 실시형태 세트
1. 조성물로서, 선택적으로 1,2-디헵타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DHPC)와 조합하여, 화학식 (Ⅰ)에 따른 양이온성 지질 및 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPhyPE), 또한 mRNA를 포함하며, mRNA는 펩타이드 또는 단백질, 또는 그 단편 또는 변이체를 코딩하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하며, 여기에서, 펩타이드 또는 단백질은 항원이며, 여기에서, 항원은 바람직하게 병원성 항원, 종양 항원, 알레르기 항원 또는 자가면역 자가-항원, 또는 그 단편 또는 변이체로부터 유래되며, 바람직하게 항원은 박테리아, 바이러스, 진균 및 원생동물 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 병원성 항원을 코딩하는 조성물.
2. 실시형태 1에 있어서, 병원성 항원은 SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 부니아 바이러스목 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뎅기열 바이러스 (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4), 에볼라 바이러스, 플라비바이러스, B형 간염 바이러스 (HBV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 인간 유두종 바이러스 (HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV), 인플루엔자 바이러스, 장외 병원성 대장균, 라사 맘마레나바이러스 (LASV), 메르스 코로나바이러스, 결핵균, 니파 바이러스, 노로바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 라이노바이러스, 로타 바이러스, 백시니아 바이러스, 황열병 바이러스, 지카 바이러스, 클라미디아 트라코마티스 (즉, 클라미디아를 일으키는 클라미디아 박테리아), 또는 말라리아 기생충 (예를 들어, 열대열 말라리아 원충, 삼일열 말라리아 원충, 사일열 말라리아 원충, 또는 난형 말라리아 원충)으로부터 유래되는 조성물.
3. 전술한 실시형태 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 감염성 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 조성물.
4. 전술한 실시형태 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 코딩 RNA를 포함하며, 적어도 하나의 코딩 RNA는 질병, 장애 또는 상태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 적어도 하나의 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하며, 상기 조성물은 이를 필요로 하는 대상에게 근육 내 또는 피부 주사를 통하여 투여되는 방법.
5. 전술한 실시형태 중 어느 하나의 조성물, 선택적으로 가용화를 위한 액체 비히클, 선택적으로, 성분의 투여 및 투여량에 대한 정보를 제공하는 기술 설명서를 포함하는 키트 또는 부품 키트.
6. 의약으로 사용하기 위한 전술한 실시형태 중 어느 하나의 실시형태의 조성물 또는 또는 실시형태 5의 키트
7. 전술한 실시형태 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 의약으로 사용하기 위한 것이며, 의약은 바이러스, 박테리아 또는 원생동물 감염성 질병을 포함하는 감염성 질병, 암 또는 종양 질병으로부터 선택되는 질병, 간 질병, 자가면역 질병, 알레르기, 유전 질병을 포함하는 단성 유전자 질병, 일반적 유전자 질병, 유전적 배경이 있고 일반적으로 정의된 유전자 결함에 의해 유발되고 멘델의 법칙에 의해 유전되는 질병; 심혈관 질병, 신경 질병, 호흡계 질병, 소화기 질병, 피부 질병, 근골격계 장애, 결합 조직의 장애, 신생물, 면역 결핍, 내분비, 영양 및 대사 질병, 눈 질병, 귀 질병 및 펩타이드 또는 단백질 결핍과 관련된 질병으로부터 선택되는 질병의 방지, 예방, 치료 및/또는 개선을 위한 것인 조성물.
8. 전술한 실시형태 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 의약으로 사용하기 위한 것이며, 의약은 백신인 조성물.
9. 바이러스, 박테리아 또는 원생동물 감염성 질병을 포함하는 감염성 질병, 암 또는 종양 질병으로부터 선택되는 질병의 방지, 예방, 치료 및/또는 개선을 위한 전술한 실시형태 중 어느 하나의 실시형태의 조성물 또는 실시형태 5의 키트 또는 부품 키트를 포함하는 백신.
10. 하기 단계를 포함하는 감염성 질병; 암 또는 종양 질병, 장애 또는 상태; 간 섬유증, 간경변 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 간 질병; 알레르기; 또는 자가면역 질병; 장애 또는 상태의 치료 또는 예방 방법:
a) 상기 실시형태의 어느 하나에 기재된 mRNA, 상기 실시형태의 어느 하나에 기재된 조성물, 실시형태 9의 백신, 실시형태 5의 키트 또는 부품 키트를 제공하는 단계; 및
b) mRNA, 조성물, 백신 또는 키트 또는 부품 키트를 조직 또는 유기체에 적용하거나 투여하는 단계.
11. 실시형태 10에 있어서, 전술한 실시형태의 어느 하나의 mRNA, 조성물, 실시형태 9의 백신 또는 실시형태 5의 키트 또는 부품 키트는 정맥 내, 근육 내, 피하 또는 피부 내 주사에 의해 조직 또는 유기체에 투여되는 방법.
12. 실시형태 9의 백신을 대상에서 항원 특이적 면역 반응을 생성하기에 효과적인 양으로 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 대상에서 면역 반응을 유도하는 방법.
13. 바이러스 항원을 코딩하는 mRNA의 유효량을 포함하는 대상의 백신 접종에 사용하기 위한, 전술한 실시형태 중 어느 하나의 실시형태의 조성물 또는 실시형태 5의 키트 또는 부품 키트를 포함하는 약학 조성물.
14. (ⅰ) 면역 반응의 유도, (ⅱ) 항원 특이적 T 세포 반응 유도, 또는 바람직하게 (ⅲ) CD8+ T 세포 반응 유도를 위한 전술한 실시형태 중 어느 하나의 실시형태의 조성물 또는 실시형태 5의 키트 또는 부품 키트를 포함하는 약학 조성물의 용도.
15. 감염성 질병의 예방을 위한, 또는 감염성 질병의 예방을 위한 의약 제조를 위한 실시형태 13의 약학 조성물의 용도로서, 상기 의약은 바람직하게 백신인 용도.
16. 전술한 실시형태 중 어느 하나의 조성물, 또는 실시형태 5의 키트 또는 부품 키트를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상의 질병 또는 상태를 예방, 개선 또는 치료하는 방법.
17. 전술한 실시형태 중 어느 하나의 방법에 있어서, 조성물의 투여에 의해 대상의 림프구에서 mRNA에 의해 코딩되는 항원의 발현이 초래되는 방법.
18. 전술한 실시형태 중 어느 하나의 방법에 있어서, 조성물 투여에 의해 항원 특이적 항체 반응이 초래되며, 바람직하게 항원 특이적 항체 반응은 혈청에서 항원 특이적 항체의 존재에 의해 측정되는 방법.
제5 실시형태 세트
1. 화학식 (Ⅰ):
[화학식 Ⅰ]
Ra-A-Rb
에 따른 양이온성 지질, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 프로드러그(prodrug) 또는 입체이성질체(stereoisomer)로서,
상기 식에서,
Ra는
Figure pct00157
,
Figure pct00158
,
Figure pct00159
,
Figure pct00160
,
Figure pct00161
,
Figure pct00162
, 또는
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4로부터 선택되며;
Rb는
Figure pct00163
,
Figure pct00164
,
Figure pct00165
,
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4, 또는
-R1-N(CH3)2로부터 선택되며;
A는 -S-, -S-S-, -NH-C(O)-, -NH-C(O)O-, -NH-C(O)-NH-, -S-C(O)-N(H)-, -C(O)O-, 또는 -O-P(O)(OH)-O-이며;
R1은 에탄디일, 프로판디일, 부탄디일, 또는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 비분지형 알칸디일이며, 여기에서, 각각의 치환가능한 탄소 원자는 비치환되거나 또는 일 이상의 C1-C4 알킬, C1-C4 알케닐렌, C3-C8 사이클로알킬렌, 또는 C3-C8 사이클로알케닐렌으로 치환되며;
R2는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
R3는 선택적이며, 존재하는 경우, -R5-C(O)-O-, -R5-O-C(O)-, -R5-C(O)-NH-, -R5-OC(O)-NH-, 또는 R5-NH-C(O)O-이며;
R4는 12 내지 36개의 탄소 원자를 갖는 친유성 치환기이며, 여기에서, 12 내지 36개의 탄소 원자를 갖는 친유성 치환기는 (ⅰ) 12 내지 25개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬 또는 알케닐이거나, 또는 (ⅱ) 토코페롤 또는 토코트레이놀로부터 유래되며
R5는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
X는 수소 원자에 결합된 탄소 원자(CH) 또는 질소 원자이며;
여기서 모든 선택은 서로 독립적이다.
2. 실시형태 1에 있어서, R4는 (ⅰ) 12 내지 25개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬 또는 알케닐이건, 또는 (ⅱ) 구조식 1에 나타내어진 토코페롤 및 토코트레이놀의 유도체로부터 선택되는 양이온성 지질.
3. 실시형태 1 또는 2에 있어서, R4는 하기로 이루어진 군으로부터 각각의 경우에 독립적으로 선택되는 양이온성 지질:
Figure pct00166
,
Figure pct00167
,
Figure pct00168
,
Figure pct00169
, 및
Figure pct00170
4. 실시형태 1 내지 3의 어느 하나의 실시형태에 있어서, (ⅰ) R3는 -R5-C(O)-O-로 존재하고, (ⅱ) R1 및 R2는 선형 비치환 에탄디일이며, (ⅲ) R5는 선형 비치환 에탄디일, 선형 비치환 프로판디일 또는 선형 비치환 부탄디일이며, (ⅳ) A는 -S-S-이고, (v) Ra 및 Rb가 동일한 경우, R4 는
Figure pct00171
이 아니며, (ⅰ) R3는 부재이고, (ⅱ) R1 및 R2는 선형 비치환 에탄디일이고, (ⅲ) A는 -S-S-이고, (ⅳ) Ra 및 Rb가 동일한 경우, R4 는
Figure pct00172
및
Figure pct00173
이 아닌 양이온성 지질.
5. 실시형태 1 내지 3의 어느 하나의 실시형태에 있어서, A는 -S-인 양이온성 지질.
6. 실시형태 1 또는 2에 있어서, R3 는 존재하고, -R5-C(O)-O-, -R5-O-C(O)-, -R5-C(O)-NH-, -R5-OC(O)-NH-, 및 R5-NH-C(O)O-로 이루어진 군으로부터 선택되며; 및 R4는 12 내지 25개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬 또는 알케닐인 양이온성 지질.
7. 실시형태 1 내지 6 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, Ra 및 Rb는 독립적으로 하기로부터 선택되며,
Figure pct00174
,
Figure pct00175
여기에서, X는 CH 또는 -R1-N(H)-C(O)-R3-R4인 양이온성 지질.
8. 실시형태 1 내지 7 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, Ra 및 Rb의 각각은:
Figure pct00176
이며, X는 CH이며; 및
R3는 존재하고, R5 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며, 각각의 경우에 독립적으로 선택되는 양이온성 지질.
9. 실시형태 1 내지 8 중 어느 하나의 실시형태에 있어서,
R3는 존재하고, -R5-C(O)-O- 또는 -R5-O-C(O)-이며;
R4는:
Figure pct00177
, 또는
Figure pct00178
,
이며;
Ra 및 Rb 는 동일한 양이온성 지질.
10. 실시형태 1 내지 8 중 어느 하나의 실시형태에 있어서,
R3 는 존재하고, -R5-C(O)-O- 또는 -R5-O-C(O)-이며;
R4 는:
Figure pct00179
이며;
Ra 및 Rb 는 동일한 양이온성 지질.
11. 실시형태 1 내지 10 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, R3는 -R5-C(O)-O-인 양이온성 지질.
12. 실시형태 7 또는 8에 있어서, R1 은 에탄디일인 양이온성 지질.
13. 전술한 실시형태 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 각각의 경우에 독립적으로 선택되는 하기 특징의 일 이상을 더 나타내는 양이온성 지질:
(ⅰ) R1은 비치환된 에탄디일, 프로판디일, 또는 부탄디일이며;
(ⅱ) R2는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 선형 및 비분지형 알칸디일이며;
(ⅲ) R3는 -R5-C(O)-O- 또는 -R5-O-C(O)-이며;
(ⅳ) R5는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며; 및/또는
(ⅵ) X는 CH이다.
14. 실시형태 1에 있어서, 표 1에 열거된 화합물의 하나로부터 선택되는 양이온성 지질.
15. 하기를 포함하는 조성물:
(ⅰ) 실시형태 1 내지 14의 어느 하나의 양이온성 지질;
(ⅱ) 표 1에 열거된 양이온성 지질 C15;
(ⅲ) 표 1에 열거된 양이온성 지질 C2; 또는
(ⅳ) 표 1에 열거된 양이온성 지질 C26.
16. 실시형태 15에 있어서, 일 이상의 하기 부형제를 더 포함하는 조성물:
(ⅰ) 스테로이드, 바람직하게 콜레스테롤;
(ⅱ) 중성 지질;
상기 중성 지질은 바람직하게 선택적으로 중성 지질 1,2-디헵타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DHPC)과 조합된, 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPhyPE); 또는 상기 중성 지질은 펜타노일, 헥사노일, 헵타노일, 옥타노일, 노나오일 및 데카노일로부터 선택되는 2개의 지방산 모이어티를 갖는 즈비터 이온성 화합물과 조합하여, 즈비터 이온성 화합물, 선택적으로 미리스토일, 팔미토일, 스테아로일 및 올레이올로부터 선택되는 2개의 지방산 모이어티를 갖는 즈비터 이온성 화합물이며;
및/또는
(ⅲ) 폴리머 컨쥬게이트 지질;
여기에서, 상기 폴리머 컨쥬게이트 지질은 화학식 (Ⅱ):
[화학식 Ⅱ]
P-A-L
에 따른 화합물이며,
상기 식에서,
P는 친수성 폴리머 모이어티이며, A는 선택적 링커이며, L은 지질 모이오티이며,
바람직하게, 폴리머 컨쥬게이트 지질은 페길화 지질이다.
17. 일 이상의 하기 부형제를 포함하는 조성물
(ⅰ) 실시형태 1 내지 14의 어느 하나의 양이온성 지질 또는 3급 또는 4급 질소 / 아미노기를 포함하는 양이온성 지질 또는 생리학적 pH에서 순 양전하를 띠는 양이온성 지질;
(ⅱ) 스테로이드, 바람직하게 콜레스테롤;
(ⅲ) 실시형태 16의 하위항목 (ⅱ)에 기재된 중성 지질; 및/또는
(ⅳ) 폴리머 컨쥬게이트 지질, 여기에서, 상기 폴리머 컨쥬게이트 지질은 화학식 (Ⅱ):
[화학식 Ⅱ]
P-A-L
에 따른 화합물이며,
상기 식에서, P는 친수성 폴리머 모이어티이며, A는 선택적 링커이며, L은 지질 모이어티이며,
바람직하게, 폴리머 컨쥬게이트 지질은 페길화 지질이며;
더욱 바람직하게, 지질 모이어티 L은 8, 10 또는 12개의 탄소 원자, 바람직하게 8 또는 10개의 탄소 원자를 포함하는 적어도 하나의 지방산 ("테일")을 포함하며;
더욱더 바람직하게, 페길화 지질은 1,2-디카프릴-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌 글리콜 2000 (C10-PEG 2000); 및 N-옥타노일-스핑고신-1-{석시닐[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)2000]} (Cer8-PEG 2000)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
17. 일 이상의 하기 부형제를 포함하는 조성물
(ⅰ) 실시형태 17의 하위항목 (ⅰ)에 기재된 양이온성 지질;
(ⅱ) 스테로이드, 바람직하게 콜레스테롤;
(ⅲ) 실시형태 16의 하위항목 (ⅱ)에 기재된 중성 지질, 또는 바람직하게 2개의 중성 지질의 조합, 여기에서 이 조합은 적어도 2개의 알킬 사슬을 갖는 중성 지질 또는 인지질을 포함하며, 이에 의해 각각의 알킬 사슬은 독립적으로 바람직하게 C6, C7, C8, C9, 또는 C10의 길이, 더욱 바람직하게 C6, C7, C8의 길이, 가장 바람직하게 C7의 길이, 더욱 가장 바람직하게 5:0 PC (1,2-디펜타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 04:0 PC (1,2-디부티릴-sn-글리세로-3-포스포콜린), 06:0 PC (DHPC, 1,2-디헥사노일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 08:0 PC (1,2-디옥타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 및 09:0 PC (1,2-디노난노일-sn-글리세로-3-포스포콜린)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인지질이며; 및/또는
(ⅳ) 폴리머 컨쥬게이트 지질, 여기에서, 상기 폴리머 컨쥬게이트 지질은 화학식 (Ⅱ):
[화학식 Ⅱ]
P-A-L
에 따른 화합물이며,
상기 식에서, P는 친수성 폴리머 모이어티이며 A는 선택적 링커이며, L은 지질 모이어티이며;
바람직하게, 폴리머 컨쥬게이트 지질은 페길화 지질이며;
더욱 바람직하게, 페길화 지질은 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000 (DMG-PEG 2000)로부터 선택된다.
19. 실시형태 15 내지 18 중 어느 하나의 실시형태에 있어서,
바람직하게 조성물은 하기:
(a-i) 30-70 mol% 양의 양이온성 지질; 20-50 mol% 양의 스테로이드; 5-25 mol% 양의 중성 지질; 및 0.5-5 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(a-ⅱ) 40-70 mol% 양의 양이온성 지질; 20-50 mol% 양의 스테로이드; 5-15 mol% 양의 중성 지질; 및 0.5-5 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(a-ⅲ) 20-60 mol% 양의 양이온성 지질; 25-55 mol% 양의 스테로이드; 5-25 mol% 양의 인지질; 및 0.5-15 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(a-ⅳ) 45-65 mol% 양의 양이온성 지질; 25-45 mol% 양의 스테로이드; 8-12 mol% 양의 인지질; 및 1-3 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(a-ⅴ) 45-65 mol% 양의 양이온성 지질; 25-45 mol% 양의 콜레스테롤; 8-12 mol% 양의 중성 지질; 및 1-3 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(a-ⅵ) 45-65 mol% 양의 양이온성 지질; 25-45 mol% 양의 콜레스테롤; 8-12 mol% 양의 DPhyPE 및 선택적으로 1 내지 10 mol% 양의 DHPC, 및 1-3 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질; 및
(a-ⅵ) 45-65 mol% 양의 양이온성 지질; 25-45 mol% 양의 콜레스테롤; 8-12 mol% 양의 DPhyPE 및 선택적으로 1 내지 10 mol% 양의 DHPC, 및 P1-3 mol% 양의 PEG-DMG 2000;
로 이루어진 군으로부터 선택되는 비율로 부형제를 포함하거나; 또는
더욱 바람직하게 조성물은 하기:
(b-i) 59 mol% 양의 양이온성 지질; 29.3 mol% 양의 스테로이드; 10 mol% 양의 중성 지질; 및 1.7 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(b-ⅱ) 59 mol% 양의 양이온성 지질; 29.3 mol% 양의 콜레스테롤; 10 mol% 양의 중성 지질; 및 1.7 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(b-ⅲ) 59 mol% 양의 양이온성 지질; 29.3 mol% 양의 콜레스테롤; 10 mol% 양의 DPhyPE; 및 1.7 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(b-ⅳ) 59 mol% 양의 양이온성 지질; 29.3 mol% 양의 콜레스테롤; 10 mol% 양의 DPhyPE; 및 1.7% 양의 C10-PEG 2000;
(b-ⅴ) 59 mol% 양의 양이온성 지질; 29.3 mol% 양의 콜레스테롤; 10 mol% 양의 DPhyPE; 및 1.7% 양의 Cer8-PEG 2000
(b-ⅵ) 59 mol% 양의 양이온성 지질; 28.3 mol% 양의 스테로이드; 11 mol% 양의 중성 지질; 및 1.7 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(b-ⅶ) 59 mol% 양의 양이온성 지질; 28.3 mol% 양의 콜레스테롤; 11 mol% 양의 중성 지질; 및 1.7 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(b-ⅷ) 59 mol% 양의 양이온성 지질; 28.3 mol% 양의 콜레스테롤; 10 mol% 양의 DPhyPE 및 1 mol% 양의 DHPC; 및 1.7 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(b-ⅸ) 59 mol% 양의 양이온성 지질; 28.3 mol% 양의 콜레스테롤; 10 mol% 양의 DPhyPE 및 1 mol% 양의 DHPC; 및 1.7% 양의 C10-PEG 2000; 및
(b-ⅹ) 59 mol% 양의 양이온성 지질; 28.3 mol% 양의 콜레스테롤; 10 mol% 양의 DPhyPE 및 1 mol% 양의 DHPC; 및 1.7% 양의 Cer8-PEG 2000
(b-ⅹi) 49 mol% 양의 양이온성 지질; 29.3 mol% 양의 스테로이드; 20 mol% 양의 중성 지질; 및 1.7 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(b-ⅹⅱ) 49 mol% 양의 양이온성 지질; 29.3 mol% 양의 콜레스테롤; 20 mol% 양의 중성 지질; 및 1.7 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(b-ⅹⅲ) 49 mol% 양의 양이온성 지질; 29.3 mol% 양의 콜레스테롤; 10 mol% 양의 DPhyPE 및 10 mol% 양의 DHPC; 및 1.7 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(b-ⅹⅳ) 49 mol% 양의 양이온성 지질; 29.3 mol% 양의 콜레스테롤; 10 mol% 양의 DPhyPE 및 10 mol% 양의 DHPC; 및 1.7% 양의 C10-PEG 2000; 및
(b-ⅹⅴ) 49 mol% 양의 양이온성 지질; 29.3 mol% 양의 콜레스테롤; 10 mol% 양의 DPhyPE 및 10 mol% 양의 DHPC; 및 1.7% 양의 Cer8-PEG 2000
로 이루어진 군으로부터 선택되는 비율로 부형제를 포함하며,
각각의 양은 지질 나노입자의 모든 지질 부형제의 총 몰량에 대한 것이며;
더욱 바람직하게 조성물은 하기:
(c-i) 표 F에 개시된 F1 내지 F62로 이루어진 군으로부터 선택되는 몰 백분율로 표 E에 개시된 E1 내지 E108로 이루어진 군으로부터 선택되는 지질 부형제 조합
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비율로 부형제를 포함하는 조성물.
19. 실시형태 15 내지 19 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 조성물은 하기 비율로 부형제를 포함하는 조성물:
(ⅰ) 59 mol%의 표 1에 개시된 양이온성 지질 C23 (COATSOME® SS-EC), 29.3 mol%의 콜레스테롤, 10 mol%의 DPhyPE 및 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000;
(ⅱ) 59 mol%의 표 1에 개시된 양이온성 지질 C2, 29.3 mol%의 콜레스테롤, 10 mol%의 DPhyPE 및 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000;
(ⅲ) 59 mol%의 표 1에 개시된 양이온성 지질 C15, 29.3 mol%의 콜레스테롤, 10 mol%의 DPhyPE 및 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000;
(ⅳ) 59 mol%의 표 1에 개시된 양이온성 지질 C26, 29.3 mol%의 콜레스테롤, 10 mol%의 DPhyPE 및 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000;
(ⅴ) 59 mol%의 표 1에 개시된 양이온성 지질 C23 (COATSOME® SS-EC), 28.3 mol%의 콜레스테롤, 10 mol%의 DPhyPE, 1 mol% DHPC 및 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000;
(ⅵ) 59 mol%의 표 1에 개시된 양이온성 지질 C2, 28.3 mol%의 콜레스테롤, 10 mol%의 DPhyPE, 1 mol% DHPC 및 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000;
(ⅶ) 59 mol%의 표 1에 개시된 양이온성 지질 C15, 28.3 mol%의 콜레스테롤, 10 mol%의 DPhyPE, 1 mol% DHPC 및 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000;
(ⅷ) 59 mol%의 표 1에 개시된 양이온성 지질 C26, 28.3 mol%의 콜레스테롤, 10 mol%의 DPhyPE, 1 mol% DHPC 및 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000;
(ⅸ) 49 mol%의 표 1에 개시된 양이온성 지질 C23, 29.3 mol%의 콜레스테롤, 10 mol%의 DPhyPE, 10 mol% DHPC 및 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000;
(x) 49 mol%의 표 1에 개시된 양이온성 지질 C2, 29.3 mol%의 콜레스테롤, 10 mol%의 DPhyPE, 10 mol% DHPC 및 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000;
(xi) 49 mol%의 표 1에 개시된 양이온성 지질 C15, 29.3 mol%의 콜레스테롤, 10 mol%의 DPhyPE, 10 mol% DHPC 및 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000; 또는
(xⅱ) 49 mol%의 표 1에 개시된 양이온성 지질 C26, 29.3 mol%의 콜레스테롤, 10 mol%의 DPhyPE, 10 mol% DHPC 및 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000.
21. 실시형태 15 내지 20 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 생물학적 활성 성분을 더 포함하는 조성물.
22. 실시형태 21에 있어서, 생물학적 활성 성분은 인공 mRNA, 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 화학적으로 변형되거나 또는 변형되지 않은 메신저 RNA (mRNA), 자가 복제 RNA, 원형 RNA, 바이러스 RNA, 및 레플리콘 RNA; 또는 그 임의의 조합로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 화합물이며, 바람직하게 생물학적 활성 성분은 mRNA 또는 mRNA 화합물인 조성물.
23. 실시형태 15 내지 22 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 지질 나노입자는 하기 양으로 mRNA를 포함하는 조성물:
(ⅰ) 10 내지 20 범위의 N/P 비율을 달성하도록 하는 양; 또는
(ⅱ) 20 내지 60, 바람직하게 약 3 내지 약 15, 5 내지 약 13, 약 4 내지 약 8 또는 약 7 내지 약 11 범위의 지질 : mRNA 중량비를 달성하도록 하는 양.
24. 실시형태 15 내지 23 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 조성물은 멸균 액체 담체로 재구성하기 위한 멸균 고체 조성물이며, 조성물은 pH 조정제, 증량제, 안정화제, 비이온성 계면활성제 및 항산화제로 이루어진 군으로부터 선택되는 일 이상의 비활성 성분을 포함하며, 멸균 액체 담체는 수성 담체인 조성물.
25. 실시형태 15 내지 24 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 조성물은 멸균 액체 조성물이며, 지질 나노입자가 약 50 nm 내지 약 300 nm, 또는 약 60 nm 내지 약 250 nm, 또는 약 60 nm 내지 약 200 nm, 또는 약 70 내지 200 nm, 또는 약 75 nm 내지 약 160, 또는 약 90 nm 내지 약 140 nm, 또는 약 100 nm 내지 약 140 nm의 동적 레이저 산란에 의해 결정된 평균 유체역학적 직경을 갖는 조성물.
26. 실시형태 15 내지 25 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 지질 나노입자가 -50 mV 내지 +50 mV 범위의 제타 전위를 나타내는 조성물.
27. 실시형태 22 내지 26중 어느 하나의 실시형태에 있어서, mRNA 화합물은 모노-, 바이- 또는 멀티시스트로닉 mRNA인 조성물.
28. 실시형태 22 내지 26중 어느 하나의 실시형태에 있어서, mRNA 화합물은 적어도 하나의 화학적 변형을 포함하는 조성물.
29. 실시형태 28에 있어서, 화학적 변형은 염기 변형, 당 변형, 골격 변형 및 지질 변형로 이루어진 군으로부터 선택되며, 바람직하게 화학적 변형은 염기 변형이며, 더욱 바람직하게 염기 변형은 바람직하게 슈도우라실 (ψ), N1-메틸슈도우라실 (N1Mψ), 1-에틸슈도우라실, 2-티오우라실 (s2U), 4-티오우라실, 5-메틸시토신, 5-메틸우라실, 5-메톡시우라실, 및 그 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
30. 실시형태 22 내지 26중 어느 하나의 실시형태에 있어서, mRNA 화합물은 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 코딩 영역을 포함하며, 코딩 영역은 서열 변형을 나타내는 조성물.
31. 실시형태 30에 있어서, 서열 변형은 G/C 함량 변형, 코돈 변형, 코돈 최적화 또는 서열의 C-최적화로부터 선택되며; 바람직하게 상응하는 야생형 mRNA의 코딩 영역과 비교하여,
- 코딩 영역의 G/C 함량이 증가하며;
- 코딩 영역의 C 함량이 증가하며;
- 코딩 영역의 코돈 사용이 인간 코돈 사용에 적응되며; 및/또는 코돈 적응 지수 (CAI)가 코딩 영역에서 증가되거나 또는 최대화되는 조성물.
32. 실시형태 22 내지 31중 어느 하나의 실시형태에 있어서, mRNA 화합물은 하기를 더 포함하는 조성물:
a) 5'-CAP 구조;
b) 적어도 하나의 miRNA 서열, 바람직하게 여기에서, microRNA 결합 부위는 miR-126, miR-142, miR-144, miR-146, miR-150, miR-155, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27, miR-26a, 또는 그 임의의 조합로 이루어진 군으로부터 선택되는 microRNA에 대한 것이며;
c) 적어도 하나의 5'-UTR 요소;
d) 적어도 하나의 폴리(A) 서열;
e) 적어도 하나의 폴리(C) 서열;
f) 적어도 하나의 3'-UTR 요소;
또는 그 임의의 조합.
33. 실시형태 22 내지 32중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 코딩 RNA는 5'-CAP 구조, 바람직하게 m7G, CAP0, CAP1, CAP2, 변형된 CAP0 또는 변형된 CAP1 구조를 포함하는 조성물.
34. 실시형태 22 내지 33중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 코딩 RNA는 적어도 하나의 이종 5'-UTR 및/또는 적어도 하나의 이종 3'-UTR을 포함하며, 바람직하게 적어도 하나의 이종 5'-UTR은 HSD17B4, RPL32, ASAH1, ATP5A1, MP68, NDUFA4, NOSIP, RPL31, SLC7A3, TUBB4B 및 UBQLN2로부터 선택되는 유전자의 5'-UTR 또는 이들 유전자의 어느 하나의 동족체, 단편, 또는 변이체로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하며; 및/또는
바람직하게 적어도 하나의 이종 3'-UTR은 PSMB3, ALB7, 알파-글로빈, CASP1, COX6B1, GNAS, NDUFA1 및 RPS9로부터 선택되는 유전자의 3'-UTR 또는 이들 유전자의 어느 하나의 동족체, 단편, 또는 변이체로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하는 조성물.
35. 실시형태 22 내지 34중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 코딩 RNA는 (ⅰ) HSD17B4 5'-UTR 및 PSMB3 3'-UTR 또는 (ⅱ) RPL32 5'-UTR 및 ALB7 3'-UTR을 포함하는 조성물.
36. 실시형태 22 내지 35중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 5'에서 3' 방향으로 하기 요소를 포함하는 조성물:
a) 바람직하게 m7G(5'), m7G(5')ppp(5')(2'OMeA) 및 m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 5'-CAP 구조;
b) TOP 유전자의 5'-UTR 또는 그의 동족체, 단편 또는 변이체로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하는 5'-UTR 요소, 상기 핵산 서열은 바람직하게, 서열식별번호: 22, 24, 24에 따른 핵산 서열을 포함하는 RNA 서열을 포함하며;
c) 적어도 하나의 코딩 서열;
d) α-글로빈 유전자 또는 그의 동족체, 단편 또는 변이체로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하는 3'-UTR 요소, 상기 핵산 서열은 바람직하게 서열식별번호:6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20에 따른 핵산 서열에 상응하는 RNA 서열을 포함하며; 및/또는 알부민 유전자 또는 그의 동족체, 단편 또는 변이체로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하는 3'-UTR 요소, 상기 핵산 서열은 바람직하게 서열식별번호:18에 따른 핵산 서열에 상응하는 RNA 서열을 포함하며;
e) 선택적으로, 바람직하게 10 내지 200, 10 내지 100, 40 내지 80, 또는 50 내지 70개 아데노신 뉴클레오타이드로 이루어진, 적어도 하나의 폴리(A) 서열;
f) 선택적으로, 바람직하게 10 내지 200, 10 내지 100, 20 내지 70, 20 내지 60 또는 10 내지 40개 시토신 뉴클레오타이드로 이루어진, 적어도 하나의 폴리(C) 서열; 및
g) 선택적으로, 바람직하게 서열식별번호:4에 따른 RNA 서열을 포함하는, 적어도 하나의 히스톤 스템-루프.
37. 실시형태 21 내지 36중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 생물학적 활성 성분은 하기인 조성물:
(a) 펩타이드 또는 단백질, 또는 그 단편 또는 변이체를 코딩하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 mRNA, 여기에서, 펩타이드 또는 단백질은 항원이며, 여기에서, 항원은 바람직하게 병원성 항원, 종양 항원, 알레르기 항원 또는 자가면역 자가-항원, 또는 그 단편 또는 변이체로부터 유래되며; 또는
(b) 치료 단백질, 또는 그 단편 또는 변이체를 코딩하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 mRNA, 여기에서, 치료 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되며:
(ⅰ) 대사, 내분비 또는 아미노산 장애의 치료를 위한 효소 대체 요법에 사용하거나, 또는 부재, 결핍 또는 돌연변이 단백질을 대체하는데 사용하기 위한, 치료 단백질;
(ⅱ) 혈액 장애, 순환계 질병, 호흡계 질병, 감염성 질병 또는 면역 결핍의 치료에 사용하기 위한 치료 단백질;
(ⅲ) 암 또는 종양 질병의 치료에 사용하기 위한 치료 단백질;
(ⅳ) 호르몬 대체 요법에 사용하기 위한 치료 단백질;
(ⅴ) 체세포를 다능성 또는 전능성 줄기 세포로 재프로그래밍하는데 사용하기 위한 치료 단백질;
(ⅵ) 보조제 또는 면역 자극제로 사용하기 위한 치료 단백질;
(ⅶ) 치료 항체인 치료 단백질;
(ⅷ) 유전자 편집제인 치료 단백질; 및
(ⅸ) 간 섬유증, 간경변 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 간 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 치료 단백질.
38. 실시형태 37의 하위항목 (a)에 있어서, 항원은 박테리아, 바이러스, 진균 및 원생동물 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 병원성 항원을 코딩하는 조성물.
39. 실시형태 38에 있어서, 병원성 항원은 SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 부니아 바이러스목 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뎅기열 바이러스 (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4), 에볼라 바이러스, 플라비바이러스, B형 간염 바이러스 (HBV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 인간 유두종 바이러스 (HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV), 인플루엔자 바이러스, 장외 병원성 대장균, 라사 맘마레나바이러스 (LASV), 메르스 코로나바이러스, 결핵균, 니파 바이러스, 노로바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 라이노바이러스, 로타 바이러스, 백시니아 바이러스, 황열병 바이러스, 지카 바이러스, 클라미디아 트라코마티스 (즉, 클라미디아를 일으키는 클라미디아 박테리아), 또는 말라리아 기생충 (예를 들어, 열대열 말라리아 원충, 삼일열 말라리아 원충, 사일열 말라리아 원충, 또는 난형 말라리아 원충)으로부터 유래되는 조성물.
40. 실시형태 15 내지 39 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 하기에 사용하기 위한 조성물:
(ⅰ) 감염성 질병; 암 또는 종양 질병, 장애 또는 상태; 간경변 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 간 질병; 알레르기; 또는 자가면역 질병; 장애 또는 상태의 치료 또는 예방; 및/또는
(ⅱ) 대사 또는 내분비 장애의 치료를 위한 효소 대체 요법에 사용 또는 부재, 결핍 또는 돌연변이 단백질을 대체하는데 사용.
41. 실시형태 15 내지 39 중 어느 하나의 실시형태에 있어서 감염성 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 조성물.
42. 실시형태 40 또는 41에 있어서, 적어도 하나의 코딩 RNA를 포함하며, 적어도 하나의 코딩 RNA는 질병, 장애 또는 상태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 적어도 하나의 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하며, 상기 조성물은 이를 필요로 하는 대상에게 근육 내 또는 피부 주사를 통하여 투여되는 조성물.
43. 실시형태 21 내지 42 중 어느 하나의 조성물을 포함하며, 선택적으로 가용화를 위한 액체 비히클, 및 선택적으로, 성분의 투여 및 투여량에 대한 정보를 제공하는 기술 설명서를 포함하는, 키트 또는 부품 키트.
44. 의약으로 사용하기 위한, 실시형태 21 내지 42 중 어느 하나의 조성물 또는 실시형태 43의 키트 또는 부품 키트.
45. 실시형태 44에 있어서, 의약은 바이러스, 박테리아 또는 원생동물 감염성 질병을 포함하는 감염성 질병, 암 또는 종양 질병, 간 질병, 자가면역 질병, 알레르기, 유전 질병을 포함하는 단성 유전자 질병, 일반적 유전자 질병, 유전적 배경이 있고 일반적으로 정의된 유전자 결함에 의해 유발되고 멘델의 법칙에 의해 유전되는 질병; 심혈관 질병, 신경 질병, 호흡계 질병, 소화기 질병, 피부 질병, 근골격계 장애, 결합 조직의 장애, 신생물, 면역 결핍, 내분비, 영양 및 대사 질병, 눈 질병, 귀 질병 및 펩타이드 또는 단백질 결핍과 관련된 질병으로부터 선택되는 질병의 방지, 예방, 치료 및/또는 개선을 위한 것인 의약으로서 사용하기 위한 조성물.
46. 실시형태 44 또는 45에 있어서, 의약은 백신인 의약으로 사용하기 위한 조성물.
47. 바이러스, 박테리아 또는 원생동물 감염성 질병을 포함하는 감염성 질병, 암 또는 종양 질병으로부터 선택되는 질병의 방지, 예방, 치료 및/또는 개선을 위한 실시형태 15 내지 42 중 어느 하나의 조성물 또는 실시형태 43의 키트 또는 부품 키트를 포함하는 백신.
48. 하기 단계를 포함하는 감염성 질병; 암 또는 종양 질병, 장애 또는 상태; 간 섬유증, 간경변 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 간 질병; 알레르기; 또는 자가면역 질병; 장애 또는 상태의 치료 또는 예방 방법:
a) 상기 실시형태의 어느 하나에 기재된 mRNA, 상기 실시형태의 어느 하나에 기재된 조성물, 실시형태 47의 백신, 실시형태 43의 키트 또는 부품 키트를 제공하는 단계; 및
b) mRNA, 조성물, 백신 또는 키트 또는 부품 키트를 조직 또는 유기체에 적용하거나 투여하는 단계.
49. 실시형태 48에 있어서, 실시형태 15 내지 42 중 어느 하나의 mRNA, 조성물, 실시형태 47의 백신 또는 실시형태 43의 키트 또는 부품 키트는 정맥 내, 근육 내, 피하 또는 피부 내 주사에 의해 조직 또는 유기체에 투여되는 방법.
50. 실시형태 47의 백신을 대상에서 항원 특이적 면역 반응을 생성하기에 효과적인 양으로 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 대상에서 면역 반응을 유도하는 방법.
51. 바이러스 항원을 코딩하는 mRNA의 유효량을 포함하는 대상의 백신 접종에 사용하기 위한, 실시형태 15 내지 42 중 어느 하나의 조성물, 또는 실시형태 43의 키트 또는 부품 키트를 포함하는 약학 조성물.
52. (ⅰ) 면역 반응의 유도, (ⅱ) 항원 특이적 T 세포 반응 유도, 또는 바람직하게 (ⅲ) CD8+ T 세포 반응 유도를 위한 실시형태 15 내지 42 중 어느 하나의 조성물, 또는 실시형태 43의 키트 또는 부품 키트를 포함하는 약학 조성물의 용도.
53. 실시형태 52에 있어서, 감염성 질병의 예방을 위하여, 또는 감염성 질병의 예방을 위한 의약 제조에 이용되며, 상기 의약은 바람직하게 백신인 용도.
54. 실시형태 15 내지 42 중 어느 하나의 조성물, 또는 실시형태 43의 키트 또는 부품 키트를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 대상의 질병 또는 상태를 예방, 개선 또는 치료하는 방법.
55. 실시형태 48 내지 50 및 54 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 조성물의 투여에 의해 대상의 림프구에서 mRNA에 의해 코딩되는 항원의 발현이 초래되는 방법.
56. 실시형태 48 내지 50, 54 및 55 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 조성물 투여에 의해 항원 특이적 항체 반응이 초래되며, 바람직하게 항원 특이적 항체 반응은 혈청에서 항원 특이적 항체의 존재에 의해 측정되는 방법.
57. 실시형태 15 내지 39 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 조성물은 C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13 또는 C14의 길이, 바람직하게 C6, C7, C8, C9, 또는 C10의 길이, 더욱 바람직하게 C6, C7, C8의 길이, 가장 바람직하게 C7의 길이를 갖는 중성 지질 또는 인지질을 포함하며, 가장 바람직하게 조성물은 2종의 중성 지질의 조합을 포함하며, 여기에서, 조합은 적어도 2개의 알킬 사슬을 갖는 중성 지질 또는 인지질을 포함하며, 이에 의해 각각의 알킬 사슬은 독립적으로 바람직하게 C6, C7, C8, C9, 또는 C10의 길이, 더욱 바람직하게 C6, C7, C8의 길이, 가장 바람직하게 C7의 길이를 가지며, 더욱더 가장 바람직하게 DHPC (1,2-디헵타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 05:0 PC (1,2-디펜타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 04:0 PC (1,2-디부티릴-sn-글리세로-3-포스포콜린), 06:0 PC (DHPC, 1,2-디헥사노일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 08:0 PC (1,2-디옥타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 및 09:0 PC (1,2-디노난노일-sn-글리세로-3-포스포콜린)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인지질을 포함하는 조성물.
58. 실시형태 15 내지 39 중 어느 하나의 실시형태에 있어서, 조성물은 적어도 2개의 알킬 사슬을 갖는 중성 지질 또는 인지질을 포함하며, 이에 의해 각각의 알킬 사슬은 독립적으로 C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13 또는 C14의 길이, 바람직하게 C6, C7, C8, C9, 또는 C10의 길이, 더욱 바람직하게 C6, C7, C8의 길이, 가장 바람직하게 C7의 길이를 가지며, 또는 더욱더 가장 바람직하게 조성물은 2종의 중성 지질의 조합을 포함하며, 조합은 적어도 2개의 알킬 사슬을 갖는 중성 지질 또는 인지질을 포함하며, 이에 의해 각각의 알킬 사슬은 독립적으로 바람직하게 C6, C7, C8, C9, 또는 C10의 길이, 더욱 바람직하게 C6, C7, C8의 길이, 가장 바람직하게 C7의 길이를 가지며, 더욱더 가장 바람직하게 DHPC (1,2-디헵타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 05:0 PC (1,2-디펜타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 04:0 PC (1,2-디부티릴-sn-글리세로-3-포스포콜린), 06:0 PC (DHPC, 1,2-디헥사노일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 08:0 PC (1,2-디옥타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 및 09:0 PC (1,2-디노난노일-sn-글리세로-3-포스포콜린)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인지질을 포함하는 조성물.
실시예
하기 섹션에서, 본 발명의 다양한 실시형태 및 측면을 예시하는 특정 실시예가 제시된다. 그러나, 본 발명은 단지 본 발명의 단일 측면의 예시로서 의도된 예시된 실시형태에 의해 범위가 제한되지 않으며, 기능적으로 동등한 방법은 본 발명의 범위 내에 있다. 실제로, 본 명세서에 설명된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형이 전술한 설명, 첨부된 도면 및 하기 실시예로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백해질 것이다. 그러한 모든 변형은 여기에 개시된 청구범위의 범위에 속한다.
실시예 1: RNA 구성체의 생성
본 실시예는 본 발명의 RNA를 수득하기 위한 방법을 제공한다.
실시예 1.1: DNA 템플릿의 제조
원하는 단백질, 예를 들어, 포티누스 피랄리스 루시페라제 (Photinus pyralis luciferase, PpLuc)를 코딩하는 DNA 서열이 준비되었고, 후속 RNA 시험관 내 전사에 이용되었다. 예시적으로, 포티누스 피랄리스 루시페라제 (PpLuc)를 코딩하는 G/C 최적화 mRNA 서열, 즉, 5'-CAP - 32L-5'-UTR (RPL32) - GC-최적화 포티누스 피랄리스 루시페라제 ORF - 알부민7-3'-UTR - 폴리(A) 서열 -폴리(C) 서열 - 히스톤 스템-루프 서열; 3'-말단에서 64× 아데노신 (폴리A-테일); 5개 뉴클레오타이드, 3'-말단에서 30× 시토신 (폴리-C-테일) 및 5개의 추가적인 뉴클레오타이드 (서열식별번호:27)이 이용되었다.
상기 (DNA) 서열은 GC 최적화 CDS를 도입하여 야생형 CDS 서열을 선택적으로 변형함으로써 제조되었다. 서열은 UTR 서열, 아데노신의 스트레치, 선택적으로 히스톤-스템-루프 구조, 및 선택적으로, 30개 시토신의 스트레치를 포함하는 플라스미드 벡터로 도입되었다. 수득된 플라스미드 DNA는 일반적인 프로토콜을 이용하여 박테리아에서 형질전환 및 증식되었으며, 플라스미드 DNA는 추출 및 정제되고, 하기에 요약된 바와 같이 후속 RNA 시험관 내 전사에 이용되었다.
실시예 1.2: 플라스미드 DNA 템플릿으로부터 RNA 시험관 내 전사 - mRNA의 제조
실시예 1.1.에 따라 제조된 DNA 플라스미드는 제한 효소 / EcoRI를 이용하여 효소적으로 선형화되었고, 적합한 버퍼 조건 하에서, 뉴클레오타이드 혼합물 (ATP/GTP/CTP/UTP) 및 cap 유사체 (예를 들어, m7GpppG 또는 m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG 또는 m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG))의 존재 하에 T7 RNA 폴리머라제를 이용하는 DNA 의존적 RNA 시험관 내 전사에 이용되었다. 수득된 RNA는 RP-HPLC (PureMessenger®; WO2008/077592에 따른)을 이용하여 정제되고, 추가적인 실험에 이용되었다. 수득된 mRNA는 상업적인 폴리아데닐화 키트를 사용하여 효소적으로 폴리아데닐화되었다.
실시예 2: HEXA 및 HEAD 지질의 합성
본 실시예는 본 발명의 지질 화합물을 얻기 위한 방법 및 정보 뿐 아니라, 본 발명의 조성물을 생성 및 분석 방법을 제공한다.
실시예 2.1: HEXA 지질 - HEXA 지질의 합성
HEXA 지질은 ChiroBlock GmbH (Bitterfeld-Wolfen, Germany)의 일반 프로토콜에 따라 합성되었다. 표 Ex-1 및 도 1에 나타내어진 9종의 HEXA 지질이 합성되어Tdau, 추가적인 지질은 상기 표 1에 나타낸다.
[표 Ex-1: 합성된 HEXA 지질의 개요]
Figure pct00180
***표 Ex-1에 표시된 지질의 명칭은 하기와 같이 유래된다: 기본 명칭은 세 부분: “테일-링커-헤드”로 이루어진다. 테일은 헥실데칸산 (헥실-1-데칸올)을 나타내는 “HEXA” 또는 2-헥실데칸산 (카르복실산)을 나타내는 “HEXACA”일 수 있다. 링커는 디에스테르 링커를 포함하는 C4 기를 나타내는 (C4 = 2개의 에스테르를 갖는 링커의 4개의 탄소 원자) C4DE 또는 모노에스테르 링커를 포함하는 C3 기를 나타내는 C3ME일 수 있다. 헤드 “PipSS”에 대한 참조는 디설파이드 가교를 통해 연결된 피페리딘 잔기를 나타낸다. 본 출원에서 추가로 언급되는 PipC3SS는 피페리딘/피페라진 고리와 디설파이드 가교 사이에 3개의 탄소 원자를 갖는 구조를 나타낸다.
HEXA 지질의 순도 및 구조 동일성은 핵 자기 공명 분광법(H-NMR, 500.13 MHz) 및 질량 분석법(전자 분무 이온화-ESI 또는 대기압 화학적 이온화-APCI, 직접 주입을 통함)에 의해 확인되었다.
실시예 2.1.1: NanoAssemblr TM 미세유체 시스템을 이용한 LNP의 제조
LNP는 나노리터 스케일로 나노입자 성분의 밀리초 혼합을 가능하게 하는 맞춤형 미세유체 혼합 칩을 통해 나노입자의 제어된 상향식 분자 자가 조립을 가능하게 하는 표준 프로토콜에 따라 NanoAssemblrTM 미세유체 시스템 (Precision NanoSytems Inc., Vancouver, BC)을 이용하여 제조되었다.
양이온성 지질 COATSOME® SS-EC (이전 명칭: SS-33/4PE-15; NOF Corporation, Tokyo, Japan; 표 1의 화합물 C23 참조, 표 Ex-2 참조)을 포함하는 GN01-LNP는 s.c. 주사 후에 T 세포를 효율적으로 활성화시키는 것으로 나타났다 (데이터는 표시되지 않음). 작업 실시예와 관련하여, "SS-EC"만 표시되는 경우, 전술한 COATSOME® SS-EC를 참조한다.
본 실시예에서, 표 1에 개시된 양이온성 지질 C1-C22 (ChiroBlock GmbH, Bitterfeld-Wolfen, Germany, custom synthesis) 및 C24-C27 (Symeres, Groningen, The Netherlands, custom synthesis) 또는 각각의 HEXA 지질, 또는 COATSOME® SS-EC (NOF Corporation, Tokyo, Japan; 표 1의 화합물 C23)이 지질 나노입자 조성물의 제조에 이용되었다. 더욱이, 콜레스테롤 (Avanti Polar Lipids; Alabaster, AL), 중성 지질/인지질 DPhyPE (Avanti Polar Lipids; Alabaster, AL) 및 DMG-PEG 2000 (NOF Corporation, Tokyo, Japan)가 이용되었다.
작업 실시예 및 본 발명의 개시와 관련하여, "DMG-PEG" / "DSG-PEG" 또는 "DMG-mPEG" / "DSG-mPEG" 만이 표시되는 경우, 각각 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜-2000 (DMG-(m)PEG2000) 및 디스테아로일-rac-글리세롤-PEG2000 (DSG-(m)PEG 2000)을 참조한다.
지질은 표준 과정에 따라 알코올 용액 (에탄올)에 용해되었다. 상응하는 지질 나노입자 조성물은 하기 표 Ex-2에 상세하게 기재되어 있다.
구체적으로, LNP는 에탄올 버퍼 중 적절한 부피의 지질 스톡 용액을 적절한 양의 본 명세서에 표시된 mRNA; 콜레스테롤, 인지질 및 폴리머 컨쥬게이트 지질: EtOH 중 20 mg/ml, 양이온성 지질을 함유하는 수성 상 (50 mM 소듐 아세테이트, pH 4.0)을 혼합함으로써 제조되었고, GN01: EtOH 중 20 mg/ml, GN01-지질: tert-부탄올 중 30 mg/ml는 예외이며, 지질 C24, C25, C26 및 C27도 30 mg/ml t-부탄올에 용해되었고, 지질의 에탄올 프리믹스에 첨가되었다.
간단히 말해서, mRNA는 pH 4의 10 내지 50 mM 아세테이트 버퍼에서 0.05 내지 0.2 mg/ml로 희석되었다. 주사기 펌프를 NanoAssemblrTM (Precision NanoSytems Inc., Vancouver, BC)의 입구 부분에 설치하고, 총 유속(total flow rates) 약 14 ml/min 내지 약 18 ml/min로 약 1:5 내지 1:3 (vol/vol)의 비율로 에탄올성 지질 용액과 mRNA 수용액을 혼합하는데 이용하였다.
이어서, 에탄올을 제거하고, 외부 버퍼를 투석 (Slide-A-Lyzer™ 투석 Cassettes, ThermoFisher)에 의해 PBS/수크로오스 버퍼 (pH 7.4, 75 mM NaCl, 10mM 포스페이트, 150 mM 수크로오스)로 교체하였다. 마지막으로, 지질 나노입자를 0.2 ㎛ 기공 멸균 필터를 통하여 여과하였다. Malvern Zetasizer Nano (Malvern Instruments Ltd.; Malvern, UK)를 이용한 준탄성 광 산란(quasi-elastic light scattering)에 의해 결정된 지질 나노입자 입자 직경 크기는 약 90 nm 내지 약 140 nm 이었다. 본 명세서에 언급된 다른 양이온성 지질 화합물의 경우, 제제화 과정은 유사하다. 이어서, 에탄올을 제거하고, 버퍼를 pH 7.4의 9% 수크로오스를 포함하는 10 mM PBS로 교체하였다.
[표 Ex-2: 작업 실시예의 지질 나노입자 조성물의 제조에 대한 요약 / 개요 - HEXA 지질을 포함하는 제제- 본 명세서에 특정 조성물(즉, 조성물 1/2)에 대한 참조가 이루어진 경우, 각각의 HEXA-지질이 각각의 작업 실시예에 표시된다.]
Figure pct00181
상기 기재된 바와 같이, 용어 "GN01"은 59 mol%의 표 1에 개시된 양이온성 지질 C23, 즉, COATSOME® SS-EC (이전 명칭: 본 실시예 섹션으로부터 명백한 바와 같이 SS-33/4PE-15), 스테로이드로서 29.3 mol%의 콜레스테롤, 중성 지질/인지질로서 10 mol%의 DPhyPE 및 폴리머 컨쥬게이트 지질로서 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000을 포함하는 지질 나노입자와 유사하다. "GN01"의 경우, N/P (지질 대 mRNA 몰비)는 바람직하게 14이며, 총 지질/mRNA 질량비는 바람직하게 40이다.
또한, 상기 기재된 바와 같이, "GN02"는 59 mol%의 표 1에 개시된 양이온성 지질 C2 (즉, 실시예 섹션 및 도 1b로부터 명백한 바와 같이 HEXA-C5DE-PipSS), 스테로이드로서 29.3 mol%의 콜레스테롤, 중성 지질/인지질로서 10 mol%의 DPhyPE 및 폴리머 컨쥬게이트 지질로서 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000을 포함하는 지질 나노입자와 유사하다. "GN02"의 경우, N/P (지질 대 mRNA 몰비)는 바람직하게 17.5이고, 총 지질/mRNA 질량비는 바람직하게 40이다.
실시예 2.1.2: 지질 나노입자 조성물 / HEXA 지질의 생물물리학적 특성화
각각의 LNP를 입자 크기, 제타 전위, 캡슐화 효율 / %-캡슐화 (EE), RNA 함량 (기본적으로 본 발명의 맥락에서 mRNA 함량이 상응함) 및 양성자화 프로파일 / pKa의 관점에서 특성화하였다.
양성자화 프로파일 / HEXA 지질의 pKa을 측정하기 위하여, 표 Ex-1에 개시된 지질 1 내지 9를 상이한 지질 조성물(표 Ex-3에 나타내어짐)을 사용하여 KNP로 제조하였다. 이로써 표 Ex-1로부터 명백한 바와 같이 HEXA 지질 화합물 1-9를 상이한 비율의 중성 인지질 DPhyPE (1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민), DSPC (1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 중성 스테로이드 콜레스테롤 (Chol) 및 폴리머 컨쥬게이트 지질 DMG-PEG 2000과 혼합하였다.
[표 Ex-3: HEXA 지질의 제제 요약 - 표 1에 나타내어진 양이온성 지질을 참조함]
Figure pct00182
Figure pct00183
대상 mRNA (예를 들어, 상기 기재된 바와 같이 PpLuc)의 HEXA 지질 LNP로의 제제화를 위하여, RNA/지질 비 3 및 니트레이트 대 포스페이트 (N/P) 비 14가 이용되었다.
pKa는 용액의 산 해리 상수 (Ka)의 음수 염기 10 로그이며, 즉, pKa = -log(Ka)이다. pKa 값은 형광 염료 2-p-톨루이디닐나프탈렌-6-설포네이트 (TNS)를 사용하는 표준 과정에 따라 측정되었다. HEXA 지질 화합물의 양성자화 프로파일 / pKa은 도 2 또는 표 Ex-4에 각각 나타내어진다.
또한, 투석 후 평균 직경 및 제타 전위는 각각 Malvern Zetasizer Nano (Malvern Instruments Ltd.; Malvern, UK)를 사용하여 동적 광 산란 및 레이저 도플러 마이크로전기영동에 의해 결정되었다. 캡슐화 효율 (EE [%])은 하기 방정식에 의해 계산되었다: %-캡슐화 = (Ft - Fi)/Ft x 100; 여기에서, Fi는 RiboGreen (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)을 LNP 앨리쿼트에 첨가함으로써 결정된 캡슐화되지 않은 유리 RNA이며, Ft는 RiboGreen (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)을 0.25% Triton X-100에 의한 배양에 의해 달성된 용해된 LNP의 앨리쿼트에 첨가함으로써 측정된 총 RNA 함량을 나타낸다.
이 분석의 결과를 하기 표 Ex-4 및 표 Ex-5에 나타낸다.
[표 Ex-4: HEXA 지질의 생물학적 특성화]
Figure pct00184
Figure pct00185
[표 Ex-5: TNS 형광: HEXA 지질의 양성자화 정도 ]
Figure pct00186
실시예 2.2: HEAD 지질 - HEAD 지질의 합성
HEAD 지질은 ChiroBlock GmbH (Bitterfeld-Wolfen, Germany)의 일반 프로토콜에 따라 합성되었다. 이 작업 실시예에서, 3종의 HEAD 지질이 합성되었다(표 Ex-6 및 도 3에 나타내어진 바와 같이).
[표 Ex-6: 합성된 HEAD 지질의 개요]
Figure pct00187
HEAD 지질의 순도 및 구조 동일성은 핵 자기 공명 분광법 (H-NMR, 500.13 MHz) 및 질량 분석법 (전자 분무 이온화-ESI 또는 대기압 화학적 이온화-APCI, 직접 주입을 통함)에 의해 확인되었다.
실시예 2.2.1: NanoAssemblr TM 미세유체 시스템 / HEAD 지질을 사용한 LNP의 제조
HEXA 지질과 유사하게, HEAD 지질은 표준 프로토콜에 따라 NanoAssemblrTM 미세유체 시스템 (Precision NanoSytems Inc., Vancouver, BC)을 이용하여 LNP로 제제화되었다 (상기 실시예 2.1.1 참조).
실시예 2.2.2: 지질 나노입자 조성물 / HEAD 지질의 생물물리학적 특성화
각각의 LNP를 상기 기술한 바와 같은 지질 나노입자 조성물의 생물물리학적 특성화와 유사하게(상기 실시예 2.1.2 참조), 입자 크기, 제타 전위, 캡슐화 효율 (%-캡슐화; EE), RNA 함량 및 양성자화 프로파일 / pKa의 관점에서 특성화하였다.
HEAD 지질의 양성자화 프로파일 / pKa를 측정하기 위하여, HEAD 지질은 상이한 지질 조성물을 사용하여 LNP로 제조되었으며(표 Ex-7 및 표 Ex-8에 나타내어진 바와 같이), GN01와 함께 측정되었다.
[표 Ex-7: 작업 실시예의 지질 나노입자 조성물의 제조에 대한 요약 / 개요 - HEAD 지질을 포함하는 제제- 본 명세서에 특정 조성물(즉, 조성물 A 또는 B)에 대한 참조가 이루어진 경우, 각각의 HEAD-지질이 각각의 작업 실시예에 표시된다.]
Figure pct00188
Figure pct00189
[표 Ex-8: HEAD 지질의 제제 요약]
Figure pct00190
수득된 HEAD 지질 화합물의 양성자화 프로파일 / pKa는 각각 도 4 또는 표 Ex-9에 나타내어진다.
투석 후 평균 직경 및 제타 전위는 상기 기재된 바와 같이 동적 광 산란 및 레이저 도플러 미세 전기영동에 의해 결정되었다.
mRNA (예를 들어, 상기 기재된 바와 같이 PpLuc 및 다른 대상 mRNA)의 HEAD 지질 LNP로의 제제화를 위하여, RNA/지질 비 3 및 니트레이트 대 포스페이트 (N/P) 비 14가 이용되었다.
이 분석의 결과는 하기 표 Ex-9에 나타내어진다.
[표 Ex-9: HEAD 지질의 생물학적 특성화]
Figure pct00191
Figure pct00192
실시예 3: HEXA 지질 및 HEAD 지질의 시험관 내 분석
본 실시예는 본 발명의 조성물 및 지질의 시험관 내 분석에 대한 세부사항을 제공한다.
실시예 3.1: HEXA 지질의 시험관 내 분석
실시예 3.1.1: HEXA 지질을 이용한 HeLa 및 HepG2에서 PpLuc 발현
EXA 지질을 포함하는 본 발명에 따른 다양한 LNP 조성물의 시험관 내 발현, 형질감염 및 발현 효율을 결정하기 위하여, PpLuc mRNA를 간세포 암종 세포주(hepatocyte carcinoma cell line)인 HepG2 세포 및 자궁 경부 불멸성 암 세포주(cervical immortal cancer cell line)인 HeLa 세포에서 양성 및 음성 대조군과 비교하였다.
HEXA 지질의 발현 효율을 분석하기 위하여, 설명된 바와 같은 상이한 지질 조성물이 PpLuc mRNA에 의해 제제화되었다(순서 실시예 1.1 참조, 아세테이트 50 mM, pH 4에서). HeLa 또는 HepG2 세포를 100.000개 세포/웰로 12웰 포맷으로 시딩하고, LNP 및 PpLuc 0,125 ㎍/ml (웰당 125 ng)로 형질감염시키기 전에 하룻밤 동안 배양하였다. PpLuc 판독은 형질감염 24시간 후에 수행되었다(도 5 참조). 제제 세부사항은 표 Ex-3에 설명됨.
결과:
HeLa 세포에서, LNP1 내지 LNP6는 GN01에 비하여 열등한 PpLuc 발현을 보였다. 그러나, 중성 지질이 상이한 점, 즉, DSPC 대신에 DPhyPE인 것을 제외하고는 동일한 지질을 포함하는 LNP8 내지 LNP13는 GN01에 비하여 HeLa에서 매우 좋고 훨씬 우수한 발현을 보였다. HepG2 세포에서, LNP1 내지 LNP5는 GN01에 비하여 적절한(decent) 발현을 보였다. 그러나, 여기에서도, LNP8 내지 LNP13는 GN01에 비하여 훨씬 강한 발현을 보였다 (LNP8 내지 LNP12가 훨씬 더 우수함). 즉, 다시 LNP1 내지 LNP5과 LNP8 내지 LNP12 사이의 유일한 차이점은 DSPC 대신에 DPhyPE를 이용했다는 것이다.
따라서, DPhyPE의 사용은 거의 모든 최신 기술의 LNP-조성물에서 표준 중성 지질로서 현재까지 당해 기술분야에서 사용되는 DSPC에 비하여 분명한 이점을 제공하였다.
실시예 3.2: HEAD 지질의 시험관 내 분석
실시예 3.2.1: HEAD 지질을 이용한 HeLa 및 HepG2에서 PpLuc 발현
이 실시예는 HeLa 세포에서 양성 및 음성 대조군과 비교하여 HEAD 지질을 포함하는 본 발명에 따른 다양한 LNP 조성물의 형질감염 효율을 보여준다.
HEAD 지질의 발현 효율을 분석하기 위하여, 상이한 지질 조성물을 PpLuc mRNA로 제제화하였다 (순서 실시예 1.1 참조, 아세테이트 50 mM pH 4에서). HeLa 세포를 100.000개 세포/웰로 12웰 포맷으로 시딩하고, LNP 및 PpLuc 0,125 ㎍/ml (웰당 125 ng)로 형질감염시키기 전에 하룻밤 동안 배양하였다. PpLuc 판독은 형질감염 24시간 후에 수행되었다 (도 6 참조).
결과:
이로써, 조성물 B는 세 가지 HEAD 지질 모두에 대하여 더 높은 발현을 나타내었다. 조성물 B를 갖는 GN01 및 CPZP는 가장 높은 발현율을 나타내었다 (1×106 RLU). 따라서, DPhyPE의 사용은 거의 모든 최신 기술의 LNP-조성물에서 표준 중성 지질로서 현재까지 당해 기술분야에서 사용되는 DSPC에 비하여 분명한 이점을 제공하였다.
실시예 4: HEXA 지질 및 HEAD 지질의 생체 내 및 시험관 내 분석
본 실시예는 본 발명의 조성물 및 지질의 생체 내 및 시험관 내 분석에 대한 세부사항을 제공한다.
실시예 4.1: 생체 내 및 시험관 내 분석 of HEXA 지질
실시예 4.1.1: GN01 LNP를 포함하여, HEXA 지질을 이용하는 HeLa 세포 및 마우스에서 hEPO 발현
HEXA 및 HEAD 지질을 포함하는 본 발명에 따른 다양한 LNP 조성물의 시험관 내 및 생체 내 발현, 형질감염 및 발현 효율을 결정하기 위하여, 하기에 기재되는 바와 같이 상이한 mRNA를 하기에 상세하게 기재된 바와 같이 특정 대조군과 비교하였다.
생체 내 분석을 위하여, 인간 에리쓰로포이에틴 코딩 mRNA (hEpo)를 이용하였다 (서열식별번호:28).
hEpo mRNA는 표준 과정에 따라 효소적으로 캡핑되었으며; 메틸기가 제2 단계에서 첨가되어 CAP1을 수득하였으며, mRNA는 상업적으로 이용가능한 폴리아데닐화 키트 및 당해 기술분야에 공지된 상응하는 프로토콜을 이용하여 추가적으로 효소적으로 아데닐화되었다.
LNP를 상기 기재된 바와 같이 표 Ex 10에 나타내어지는 바와 같이 제조하였다. 대조군으로, hEpo mRNA를 포함하는 LNP를 HeLa 세포 내로 형질감염시켰다. 시험관 내 형질감염 분석을 위하여, HeLa 세포를 100.000개 세포/웰로 12웰 포맷으로 시딩하고, 제제화된 LNP (웰 당 0,125 ㎍/ml 최종 농도)로 형질감염시키기 전에 하룻밤 동안 배양하였다. hEpo ELISA를 형질감염 24시간 후에 수행하였다.
[표 Ex-10: HeLa 및 마우스에서 hEpo 발현의 분석을 위한 HEXA 지질 C1 내지 C5를 포함하는 HEXA 지질 제제 및 GN01의 개요]
Figure pct00193
전반적으로, 모든 제제는 HeLa 세포에서 안정한 hEpo 발현을 나타내었다(도 7).
생체 내 분석을 위하여, 6 내지 8주령 Balb/C 마우스 (그룹 당 5마리 마우스)에 0.5 mg/kg LNP 제제화된 hEpo를 주사하였다(표 Ex-10 참조). EDTA 혈장 샘플링은 주사 후 6시간 및 24시간에 수행되었다.
결과:
LNP8 내지 LNP12 (HEXA 지질 C1 내지 C5) 및 GN01의 생체 내 분석은 주사 후 6시간 및 24시간에 뚜렷한 높은 hEpo를 나타내는 시험관 내 실험의 결과를 확인하였다(도 8).
실시예 4.1.2: HEXA 지질의 내약성 - ALT/AST 및 사이토카인 측정
HEXA 지질 화합물 C1 내지 C9 및 SS-EC (표 Ex-1 참조)의 내약성은 아미노트랜스페라제 ALT (알라닌 아미노트랜스페라제) 및 AST (아스파르테이트 아미노트랜스페라제)의 활성을 측정함으로써 추가적으로 분석되었다. 이를 위하여, HEXA 지질- 및 SS-EC-함유 LNP (0.5 mg/kg)를 를 Balb/C 에 정맥 주사하였으며, 표준 절차차에 따라 주사 후 24시간에 ALT 및 AST를 측정함으로써 분석하였다(도 9). 지질 화합물 C2의 경우, 상이한 m/m 비율의 내약성도 측정되었다(도 10).
결과 1:
버퍼 대조군과 비교할 때, 동물 중 어느 것도 유의하게 상승된 AST 및 ALT 간 효소 활성을 나타내지 않았다 (도 9). 또한, 치료된 동물의 체중 감소는 5% 미만이었다 (데이터는 표시되지 않음).
초기 시점에서 HEXA 지질 C1 내지 C9의 면역 자극 특성 분석을 위하여, EDTA 혈장 사이토카인 분석이 주사 후 6시간 후에 수행되었다. 따라서, HEXA 지질에 의한 치료 후 6시간 후에 마우스로부터 채취한 혈청 샘플에 의한 CBA 분석은 하기 사이토카인/케모카인 수준을 나타내었다: MCP-1, MIP-1, MIP-1, RANTES, IL-12p70, IL-6, TNF, IL-1β, IFN-γ. 더욱이, 혈청 내 IFN-α의 수준은 ELISA에 의해 결정되었다. 혈청 내 마우스 IFN-α의 분석은 시약 희석제 (1:20)에서 50 ㎕ 혈청에 의해 제조사의 지침에 따라 수행되었다(도 10 A-D). 지질 화합물 2에 대하여 측정된 상이한 m/m 비율의 면역 자극 특성도 측정되었다(도 10 E-H).
결과 2:
표시된 도면으로부터 명백한 바와 같이, 테스트된 지질 화합물의 어느 것도 유의하게 상승된 사이토카인 수준을 유도하지 않았다.
실시예 4.2: HEXA 및 HEAD 지질의 생체 내 분석
실시예 4.2.1: 예방 및 치료 백신 접근 - HEXA 지질, HEAD 지질, GN01 및 GN02 LNP를 이용하여 마우스에서 종양 항원 trp2
GN01 및 GN02 LNP를 포함하여, HEXA 및 HEAD 지질-포함 LNP의 예방 및 치료 능력을 테스트하기 위하여, 생체 내 분석이 수행되었다. 이를 위하여, trp2 mRNA (종양 항원 Trp2를 코딩함)를 전술한 바에 따라 제조하여, 다음을 포함하는 trp2 mRNA를 수득하였다: CleanCap AG, 32L4-5'-UTR 리보솜 5'TOP UTR (32L4); 3'-말단에서 64× 아데노신 (폴리A-테일); 5개 뉴클레오타이드, 3'-말단에서 30× 시토신 (폴리-C-테일) 및 5개의 추가적인 뉴클레오타이드 (서열식별번호:29).
LNP에 대한 조성 및 제제화 과정은 예를 들어 실시예 2.1.1, 실시예 2.2.2, 표 Ex-2, 및 표 Ex-6에 따라 상기 설명된다.
면역화를 위하여, 표 Ex-11에 나타내어진 바와 같은 조성 세부 사항에 따라 상기 나타낸 바와 같이 제제화된 종양 항원 Trp2를 코딩하는 mRNA를 7-8 주 암컷 C57/BL6 마우스 (그룹 당 5마리 마우스)의 등에 피부 내(i.d.) 주사하였다.
[표 Ex-11: 조성물 및 제제 세부사항. 실시예 2.2.1, 실시예 2.2.2, 표 Ex-2 및 표 Ex-6의 설명을 추가로 참조하며, 여기에서 GN01, GN02, CISE 및 조성의 mol% 비율이 설명된다.]
Figure pct00194
면역화는 day 0, day 7 및 day 14에 이루어졌다. 혈액 샘플은 14h 및 21일에 채취되었다; 기관 샘플은 첫 번째 백신 접종 후 21일째에 채취되었다. T 세포 반응 및 체액 면역 반응은 ELISA를 사용하여 측정되었다(결과는 도 11A, 11B, 11C 및 11D에 나타내어진다).
결과:
도 11A 및 11B에 따르면, GN01, GN02 및 trp2 mRNA를 포함하는 CISE LNP를 사용한 백신 접종은 안정한 IgG1 및 IgG2 역가를 나타내었다. 더욱이, 도 11C 및 11D에 따르면, GN01, GN02 및 CISE LNP는 낮은 T 세포 반응을 나타내었다.
실시예 4.2.2: HEAD 지질의 내약성 - ALT/AST 및 사이토카인 측정
HEAD 지질 CISE, CPZE 및 ESTER (표 Ex-6 참조)의 내약성이 아미노트랜스페라제 ALT (알라닌 아미노트랜스페라제) 및 AST (아스파르테이트 아미노트랜스페라제)의 활성을 측정함으로써 추가적으로 분석되었다. 이를 위하여, HEAD 지질-함유 LNP 및 SS-EC-함유 LNP (0.5 mg/kg)를 Balb/C에 정맥 주사하였으며, 주사 후 24시간후에 ALT 및 AST를 측정함으로써 분석하였다. 상이한 m/m 비율의 내약성은 지질 화합물 2에 대해서도 측정되었다.
결과:
동물 중 어느 것도 버퍼 대조군과 비교할 때 유의하게 상승된 AST 및 ALT를 나타내지 않았다(도 12a). 또한, 치료된 동물의 체중 감소는 2% 미만이었다(데이터는 표시되지 않음).
상기 본 명세서에 기재된 HEXA 지질에 대한 사이토카인 측정과 유사하게, HEAD 지질에 대한 사이토카인 분석이 수행되었다. 명백한 바와 같이, 테스트된 지질 화합물의 어느 것도 유의하게 상승된 사이토카인 수준을 유도하지 않았다(도 12b의 A-D).
실시예 5: 본 발명의 조성물 / LNP의 안정성 데이터(GN01)
본 발명의 조성물 / LNP의 안정성을 분석하기 위하여, 예를 들어, 연장된 기간에 걸쳐 저장한 후 하기 기재된 바와 같이 상이한 특성 및 생물학적 활성을 측정하였다.
실시예 5.1: GN01 제제화된 hEPO mRNA의 무결성 및 생물물리학적 특성의 분석
GN01 LNP는 실시예 4.1.1(GN01 LNP를 포함하여, HEXA 지질을 이용하는 HeLa 세포 및 마우스에서 hEPO 발현)에 기재된 바와 같이 hEPO mRNA로 제제화되었으며, 1.5개월 및 6개월 동안 4℃ 및 -80℃에서 저장하였다. 겔 전기영동을 통하여 LNP 내에 포함된 mRNA의 분석을 위하여, 당해 기술분야에 공지된 일상적인 과정에 따라, LNP는 변형/파괴되어, 포함된 mRNA가 겔에 표시될 수 있도록 하였다.
결과:
입자 크기, 다분산 지수 (PDI), charge/제타 전위 및 EE% 및 RNA 함량이 측정되었다. GN01 LNP는 1.5개월 및 6개월 저장 시에 안정한 입자 크기, 제타 전위 및 EE% 값을 나타내었다. mRNA의 무결성은 6개월까지 아가로스 겔 전기영동에 의해 나타내어진 바와 같이 보존되었다. 1.5개월 동안 -80℃에서 저장한 후, LNP의 mRNA 활성이 테스트되었으며, 새로 제조된 LNP와 비교되었다.
1.5개월 (도 13A) 및 6개월 (도 13B) 동안 결과 4℃ 및 -80℃에서 저장한 결과가 나타내어진다. LNP의 분해를 위하여, 두 가지 조건이 이용되었다: 분해 조건 1 (헤파린 및 트리톤 조합이 LNP: 도면에서 C1을 분해하기 위하여 사용됨) 또는 분해 조건 2 (헤파린 및 Pluronic® 조합 및 15분 동안 45℃로 가열하는 것이 LNP: 도면에서 C2를 분해하기 위하여 사용됨). 6개월 분석을 위해, 조건 C1이 적용되었다.
결과:
유의미한 차이가 관찰되지 않았다 (상세한 결과는 하기 표 Ex-12 및 실시예 5.2 참조).
[표 Ex-12: 생물물리적 특성 및 GN01 LNP mRNA 무결성]
Figure pct00195
실시예 5.2: 최대 10주 동안 -80℃ 저장 후 GN01 LNP의 생물학적 활성
GN01 LNP에 제제화된 mRNA의 저장 후 생물학적 활성을 평가하기 위하여, 상기 GN01 LNP를 hEPO mRNA로 제제화하였으며, Balb/C 마우스에 정맥 내 주사하기(10 ㎍ mRNA, 5마리 마우스/그룹) 전에, 1주 동안 동결시켰다. 상기 LNP의 투여 후에, 혈액 샘플을 채취하여, EDTA 혈장에 대해 처리하였다(투여 후 6시간 및 24시간). 나머지 GN01 LNP를 동결하여, 최대 10주 동안 -80℃에서 저장하였다. 이 기간 후에, LNP를 새로운 세트의 동물에 주사하였다.
결과:
10주 저장 후, GN01 LNP는 저장이 LNP의 생물학적 활성을 손상시키지 않았음을 나타내는 유사한 수준을 보였다(1주 저장과 비교할 때 주사 후 6시간 및 24시간; 도 14.1 참조).
두 번째 평가에서, 혈장 샘플은 1회의 동결/해동 사이클 (1 F/T) 후에 2 F/T 사이클 후의 혈장 생플과 비교하여 분석되었다; 둘다 -80℃에서 1주일 저장 후. HsEpo 생물학적 활성에 대한 우수한 재현성은 테스트된 모든 접근 방식에 대하여 나타내어질 수 있었다(도 14b의 A 및 B 참조).
실시예 6: LNP 형질감염에 대한 인지질의 효과
LNP 형질감염에 대한 상이한 인지질의 효과를 분석하기 위하여, DPhyPE, DSPC, 및 DPhyPE+DSPC의 1:1 혼합물을 표 Ex-13에 표시된 바와 같이 지질 화합물 No. 1 (표 Ex-1 참조) 및 GN01으로 제제화하였다. 상기 기재된 PpLuc는 LNP에 대하여 화물로 이용되었다 (0,125 ㎍/ml, 웰당 125 ng)). 수득된 조성물을 HeLa 세포 내로 형질감염시켰다. 이로써, 100.000개 HeLa 세포/웰이 12웰 포맷으로 시딩되었다.
[표 Ex-13: LNP 형질감염에 대한 인지질 DPhyPE, DSPC, DPhyPE+DSPC (1:1 혼합물)의 효과. 지질 화합물 No. C1 (표 Ex-1 참조). GN01 기반 LNP에 대한 N/P 비는 14로 설정되었으며, C1-함유 LNP에 대해서는 17로 설정되었다; 모든 조성물에 대한 지질/mRNA 질량비는 40 (m/m)으로 설정되었다.]
Figure pct00196
PpLuc 활성은 앞서 설명된 표준 과정에 따라 24시간 후에 측정되었다. 결과는 도 15a의 A에 나타내어진다. LNP의 pKa에 대한 중성 인지질의 영향은 형광 염료 2-p-톨루이디닐나프탈렌-6-설포네이트 (TNS)에 의한 표준 과정에 따라 측정되었다. HEXA 지질 화합물의 양성자화 프로파일 / pKa는 도 15a의 B에 나타내어지거나, 각각의 pKa는 표 Ex-13에 나타내어진다.
결과:
DPhyPE의 통합, 또는 DPhyPE 및 DSPC의 1:1 조합은 양이온성 지질 C1 및 GN01 모두에 대하여 중성 지질 DSPC보다 더 높은 발현을 나타내었다. 본 명세서에서 상기 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 놀랍게도 융합 형성(fusogenic) 인지질이 DSPC와 비교할 때 훨씬 수행되는 것을 발견하였으며, DSPC는 당해 기술분야에서 대부분의 지질 나노입자에 사용되는 인지질이다. 더욱이, pKa에 대한 인지질의 큰 효과가 나타났다(표 Ex-13).
실시예 7: 폴리머 컨쥬게이트 지질 성분의 효과
LNP 형질감염에 대한 PEG 성분 및 그의 알킬 테일의 효과를 분석하기 위하여, 상이한 양 및 그 조합(1% Cer8 및 0.7% C14-DMG-PEG)의 세라마이드 8 PEG (즉, C8 테일을 포함함; Cer8-PEG; N-옥타노일-D-에리쓰로-스핑고신을 포함함) 및 C14-DMG-PEG (즉, C14 테일을 포함함, DMG-PEG 2000)를 SS-EC, 콜레스테롤 및 DPhyPE (기본적으로 전술한 GN01 제제로 제제화하였으나, 폴리머 컨쥬게이트 지질 부형제는 변화하였음)로 제제화하였으며, 이어서 HepG2 세포 내로 형질감염되었다; 조성물은 표 Ex-14에 나타낸 바와 같았다. 모든 조성물 모든 조성물에 대한 N/P 비는 14로 설정되었으며; 모든 조성물에 대한 지질/mRNA 질량비는 40로 설정되었다.
[표 Ex-14: PEG 성분에 대한 변화 (기준: GN01 제제); Cer8 (세라마이드 8 PEG), C14-DMG-PEG (표 Ex-14의 C14) 및 혼합물로 제조된 LNP.]
Figure pct00197
이를 위하여, 10.000개 HepG2 세포/웰을 96 웰 포맷으로 시딩하였다. 상기 기재된 PpLuc mRNA (0,125 ㎍/ml; 웰 당 25ng)를 LNP로 제제화하고, OptiMEM 또는 완전 배지에서 1시간 또는 4시간 동안 HepG2 세포와 함께 배양하였다.
HepG2 세포에 대한 PpLuc 활성은 1시간 또는 4시간 후에 측정되었다(결과는 도 15.2에 나타내어짐).
결과:
명백한 바와 같이, 본 발명의 발명자들은 놀랍게도 더 짧은 알킬 사슬(예를 들어, Cer8)을 갖는 폴리머 컨쥬게이트 지질을 포함하는 조성물이 더 긴 알킬 사슬(예를 들어, C14-DMG-PEG)을 포함하는 폴리머 컨쥬게이트 지질을 포함하는 조성물보다 더 효율적이었음을 발견하였다. 5% Cer8 폴리머 컨쥬게이트 지질의 이용은 놀랍게도 심지어 PpLuc 활성을 향상시켰다.
실시예 8: 단일 i.v. 주사 후 GN01 LNP에서 제제화된 항광견병 단일 클론 항체 발현
GN01 LNP에서 제제화된 mRNA의 발현 효율을 추가적으로 분석하기 위하여, NIH 스위스 알비노 (n = 6) 마우스에 항광견병 단일 클론 항체 (mAb; S057, Thran et al., EMBO Mol Med (2017)9:1434-1447)를 코딩하는 mRNA (1 mg/kg)를 주사하였다. 항광견병 mAb mRNA는 HSD17B4로부터의 5'-UTR, PSMB3로부터의 3'-UTR, 3'-말단에서 64× 아데노신 (폴리A-테일); 5개 뉴클레오타이드, 3'-말단에서 30× 시토신 (폴리-C-테일) 및 5개의 추가적인 뉴클레오타이드를 포함한다. mRNA를 제조사의 지침에 따라 ScriptCapTM m7G Capping System (CellScript, Madison, WI, USA)을 이용하여 추가적으로 효소적으로 캡핑하였으며, 상업적 폴리아데닐화 키트를 이용하여 효소적으로 폴리아데닐화하였다(서열식별번호:30 = 중쇄, 서열식별번호:31 = 경쇄).
mRNA의 GN01 LNP로의 제제화는 상기 기재된 바와 같이 수행되었다.
마우스에 20 ㎍ LNP-제제화된 항광견병 mAb 코딩 mRNA를 정맥 내(i.v.) 주사하였으며, 6시간 및 24시간에 채혈하였다. 1:5000 희석을 기반으로 한 항체 역가의 분석은 IgG 혈청 ELISA를 이용하여 수행되었다(결과는 도 16에 나타내어진다).
결과:
도 16으로부터 명백한 바와 같이, 매우 강한 항광견병 mAb 발현이 6 h 및 24 h 후의 i.v. 주사 후에 검출될 수 있었다.
실시예 9: 근육 내 투여를 이용한 RABV-G 백신 접종을 위한 GN01- 및 GN02-제제화된 LNP
GN01 및 GN02-제제화된 LNP의 면역원성을 분석하기 위하여, RABV-G (또는 RAV-G, 광견병 바이러스 당단백질) mRNA를 상기 기재된 과정에 따라 제조하여, mCap, a muag-3'-UTR; 3'-말단에서 64× 아데노신 (폴리A-테일); 5개 뉴클레오타이드, 3'-말단에서 30× 시토신 (폴리C-테일) 및 5개의 추가적인 뉴클레오타이드 (서열식별번호:32)를 포함하는 RABV-G mRNA를 수득하였다
day 0 및 day 21에, 전술한 RABV-G mRNA를 포함하는 표 Ex-15에 따른 제제를 7주령 암컷 Balb/C 마우스 (n=6)에 근육 내 주사하였다. 비교를 위해, KC2-지질 함유 LNP를 웰로 제제화하였다. KC2-대조군-LNP는 양이온성 지질로 57.1 mol%의 DLin KC2-DMA, 7.1 mol%의 DPPC (1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린; Avanti Polar Lipids; Alabaster, AL), 34.4 mol%의 콜레스테롤 (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Germany) 및 1.4 mol%의 PEG-C-DMA를 포함하였다.
[표 Ex-15: 조성물 및 제제 세부사항; 명칭, 즉, GN01, GN02, 및 조성물의 mol%-비가 기술된 실시예 2.1.1, 실시예 2.2.2, 표 Ex-2, 및 표 Ex-6의 설명을 추가적으로 참조한다.]
Figure pct00198
혈청에서 광견병 바이러스에 대한 항체의 수준을 결정하기 위하여, 고전적인 바이러스 중화 테스트를 수행하였다 (형광 항체 바이러스 중화 (FAVN) 분석).
따라서, 제1 mRNA 투여 후 35일 후에, 마우스를 희생시키고 혈액 및 기관 샘플 (간)을 추가적인 분석, 즉, FAVN 분석을 통한 바이러스 중화 항체 (VNA) 분석을 위하여 수집하였다. 상기 면역원성 분석의 경우, VNT는 이전에 설명된 바와 같이 측정되었으며, 즉, 혈청에서 항광견병 바이러스 중화 역가 (VNTs)는 HO 프로토콜에 따라 FAVN 분석 및 표준 Challenge Virus CVS-11을 사용하여 Eurovir® Hygiene-Labor GmbH, Germany에 의해 분석되었다.
더욱이, 간 샘플은 T 세포 반응 (CD4 및 CD8)의 분석을 위하여 채취되었으며, 즉, CD4 T 세포 면역 반응 (CD4 T 세포를 생성하는 IFNγ/TNFα) 및 CD8 T 세포 면역 반응 (CD8 T 세포를 생성하는 IFNγ/TNFα 및 CD8 T 세포를 생성하는 CD107+ IFNу)이 평가되었으며; 항원 특이적 T 세포의 유도는 세포 내 사이토카인 염색 (ICS)을 사용하여 결정되었다. 분석은 앞서 설명된 바와 같이 수행되었다; 결과는 도 17의 A, B, C에 나타내어진다.
결과:
도 17의 A는 5 ㎍ GN01- 및 GN02-LNP-제제화된 RABV-G-mRNA를 사용한 단일 i.m. 면역화는 프라임 백신 접종 후 day 35에 모든 동물에서 0.5 IU/ml의 보호 역가보다 훨씬 높은 매우 강력한 VNT를 유도하였음을 보여준다.
도 17의 B 및 C는 본 발명의 GN01 및 GN02-LNP-제제화된 RABV-G mRNA 백신이 백신 접종 후 특이적 세포 반응을 유도하였음을 나타내며, 이는 대조군 LNP 백신접종 동물에서는 관찰되지 않았던 효과이다. RABV-G-특이적 CD4+ T 세포 (도 17의 B)는 mRNA 제제 GN01 및 GN02 모두에 대해 관찰되었다. 이는 RABV-G-특이적 CD8+ T에 대해서도 마찬가지였다(도 17의 C).
실시예 10: 백신으로 이용되는 모노토프 접근법을 위한 GN01
백신 접종 맥락에서 GN01을 추가적으로 분석하기 위하여, 펩타이드 huCTLA4 (1-35)를 코딩하는 mRNA, 헬퍼 지질 PADRE, 링커 (G4S)2가 설계되었다(세부 사항은 표 Ex-16에 나타내어짐).
[표 Ex-16: 단일-에피토프 RNA 구성체]
Figure pct00199
PpLuc mRNA (서열식별번호:33)는 대조군으로 이용되었다. 상응하는 mRNA는 상기 기재된 바와 같이 GN01 LNP로 제제화되었으며, 이어서 C57Bl/6 마우스에 주사하였다 (실험 세부 사항은 표 Ex-17에 나타내어짐).
[표 Ex-17: 표 Ex-16에 나타내어진 바와 같은 그룹 1-7에 대한 실험 세부 사항, 대조군은 PpLuc mRNA를 포함함]
Figure pct00200
day 1에 제1 백신 접종을 위하여, C57Bl/6 마우스에 5 ㎍의 GN01 LNP 제제화된 RNA를 피부 내 백신 접종하였다. day 7에, C57Bl/6 마우스에 5 ㎍의 GN01 LNP 제제화된 RNA를 피부 내 제2 백신 접종하고, 채혈 후 혈청을 수집하였다. day 14에 제3 백신 접종을 위하여, C57Bl/6 마우스에 다시 백신 접종하였다. 분석은 day 21에 이루어졌으며, 비장 세포를 비장으로부터 분리하고, 모든 각각의 에피토프 펩타이드 (29mer)로 재자극하거나, 대조군 (ELISPOT / ICS)에서 모든 펩타이드로 재자극하였다. 단일 세포에 대한 사이토카인 분비의 빈도는 효소 결합 면역 흡착 점적 (enzyme-linked immune absorbent spot, ELISpot) 분석을 사용하여 정량적으로 측정되었다. 단일 세포 수준에서 항원 특이적, 사이토카인-분비 T 세포 (CD107a 및 INFγ 및 TNF)를 확인하기 위하여, 유세포 분석(flow cytometry) 기반 방법인 ICS (세포 내 사이토카인 염색) 분석이 이용되었다.
결과:
GN01 제제화된 RNA의 높은 반응원성이 관찰되었다. 비장 세포 수는 GN01 LNP를 통해 PADRE를 함유하는 모노토프 구성체에 의한 백신 접종에 의해 증가한다 (도 18A 참조). GN01 제제 및 피부 내 적용과 조합하여 모노토프 구성체는 통합된 강한 항원에 대하여 CD8 T 세포 반응을 유도하는데 매우 강력하다. Pmel, Trp1 및 Obsl1에 대한 강한 CD8 T 세포 반응이 검출될 수 있었다 (도 18B, 18C 및 18D 참조).
실시예 11: 인플루엔자/플루 백신 접종용 GN01 - H3N2
GN01 제제화된 LNP의 면역원성을 분석하기 위하여, HA (H3N2 A/Hongkong/4801/2014) mRNA를 상기 기재된 방법에 따라 제조하여, mCap, muag-3'-UTR; 3'-말단에서 64× 아데노신 (폴리A-테일); 5개 뉴클레오타이드, 3'- 말단에서 30× 시토신 (폴리C-테일); 히스톤 스템 루프 및 5개의 추가적인 뉴클레오타이드 (서열식별번호:37)를 포함하는 HA mRNA를 수득하였다
표 Ex-17에 나타내어진 백신 접종 계획에 따라 day 0 및 day 21(프라임 / 부스트)에 7주령 암컷 Balb/C 마우스 (n=5)에 근육 내 주사하였다. mRNA의 GN01 제제는 상기 기재된 바와 같이 이루어졌으며; 대조군은 NaCl 버퍼를 받았다. 체액 면역 반응을 결정하기 위하여 혈청 샘플을 day 21 및 day 35에 채취하였다.
[표 Ex-18: 실시예 11의 백신 접종 계획]
Figure pct00201
면역원성 분석을 위하여, 프라임 후 3주 및 부스트 후 2주에 혈청에서 적혈구 응집 반응 억제 (HI) 역가를 분석하였다.
적혈구 응집 반응(Hemagglutination) 억제 분석:
적혈구 응집 반응 억제 (HI) 분석은 기능성 항HA 항체 역가를 분석하기 위하여 사용되었다. 마우스 혈청을 열 비활성화하고(56℃, 30min), 카올린 (Carl Roth, Germany)으로 배양하고, 및 닭 적혈구 세포 (CRBC; Lohmann Tierzucht, Germany)에 미리 흡착시켰다. 전처리된 혈청의 2-배 희석액 50 ㎕를 4 적혈구 응집 반응 단위 (HAU)의 비활성화된 인플루엔자 A/Hongkong/4801/2014 (H3N2) 바이러스 (NIBSC, UK)로 45min 동안 배양하고, 50㎕ 0.5% CRBC를 첨가하였다. HI 역가는 적혈구 응집 반응을 억제할 수 있는 혈청의 최고 희석액의 역수에 의해 결정되었다. HI 분석의 결과는 도 19에 나타내어진다.
결과:
도 19는 10 ㎍ GN01 LNP-제제화된 HA-mRNA에 의한 단일 i.m. 면역화가 프라임 백신 접종 후 day 21에 모든 동물에서 40의 보호 역가보다 훨씬 높은 보호성 HI 역가를 유도하고, 10 ㎍ GN01 LNP-제제화된 HA-mRNA에 의한 부스트는 체액 면역 반응의 다중 증가를 유도하였음을 보여준다.
실시예 12: 더 큰 동물 (송아지)의 생체 내 광견병 백신 접종을 위한 GN01
더 큰 동물의 광견병 백신과 관련하여 GN01 LNP의 분석을 위하여, RABV-G mRNA를 이용하여 약 100 kg의 송아지에서 연구가 수행되었다. GN01 제제화 LNP의 면역원성을 분석하기 위하여, RABV-G mRNA를 전술한 방법에 따라 제조하여, mCap, muag-3'-UTR; 3'-말단에서 64× 아데노신 (폴리A-테일); 5개 뉴클레오타이드, 3'- 말단에서 30× 시토신 (폴리C-테일); 히스톤 스템 루프 및 5개의 추가적인 뉴클레오타이드 (서열식별번호:32)를 포함하는 RABV-G mRNA를 수득하였다.
수득된 mRNA는 앞서 설명된 바와 같이 GN01 LNP로 제제화되었으며, day 0 및 day 21에 송아지에 근육 내 주사하였다 (세부 계획은 표 Ex-19에 나타내어짐). 양성 대조군으로, Rabisin® (비활성화된 광견병 바이러스, Merial GmbH)이 이용되었다. 혈액 샘플을 days 0, 7, 14, 21, 28 및 35에 채취하였다. VNT를 각 시점에 분석하였다. 실험 결과는 도 20에 나타내어진다.
[표 Ex-19: 실시예 12의 백신 접종 / 치료 계획 및 실험 설계]
Figure pct00202
결과:
도 20에서 입증된 바와 같이, GN01-제제화된 RABV-G-코딩 mRNA에 의한 송아지의 근육 내 백신 접종은 놀랍게도 프라임 백신 접종 후 14일 후에 30 ㎍ mRNA의 용량만으로 중화 항체의 매우 강한 유도를 초래하였다. 0.5 IU/ml의 WHO 표준은 그래프에서 파선으로 표시된다. 따라서, 0.3 ㎍/kg 용량의 GN01-제제화된 RABV-G mRNA는 프라임 백신 접종 후 제제화되지 않은 mRNA에 의한 이전 실험과 비교하여 상당히 더 높은 반응을 유도하였다(데이터는 표시되지 않음). VNT는 부스트 백신 접종 후에도 증가하였다 (도 20); 데이터는 Mann-Whitney로 테스트된 중앙값을 나타낸다.
실시예 13: 생체 내 말라리아 백신 접종을 위한 GN01
본 실시예는 말라리아 mRNA 백신 코딩 CSP가 마우스에서 강한 체액 및 세포 면역 반응을 유도함을 나타낸다.
CSP mRNA는 HSD17B4로부터의 5'-UTR, PSMB3로부터의 3'-UTR, 3'-말단에서 64× 아데노신 (폴리A-테일); 5개 뉴클레오타이드, 3'-말단에서 30× 시토신 (폴리-C-테일), 히스톤-스템 루프, 및 5개의 추가적인 뉴클레오타이드를 포함하였다. mRNA를 ScriptCapTM m7G Capping System (CellScript, Madison, WI, USA)를 사용하여 추가적으로 효소적으로 캡핑하였으며, 제조사의 지침에 따라 상업적 폴리아데닐화 키트를 이용하여 효소적으로 폴리아데닐화하여, 서열식별번호:38을 생성하였다.
수득된 mRNA 구성체를 이전에 설명된 바와 같이 GN01 지질 나노입자에 제제화하였다.
GN01-LNP 제제를 표 Ex-20에 나타내어진 용량의 RNA, 제제, 및 대조군으로 days 0 및 21에 근육 내(i.m.; 경골 근육) 적용하였다. 음성 대조군은 GN01-LNP에 제제화된 관련 없는 RAN에 의해 백신 접종을 받았다. ELISA를 위하여 혈청 샘플을 day 21 및 day 35에 채취하였다.
[표 Ex-20: 실시예 13의 백신 접종 계획]
Figure pct00203
ELISA에 의한 특이적 체액 면역 반응의 결정:
ELISA는 코팅을 위하여 말라리아 [NANP]7 펩타이드 또는 C-말단 펩타이드를 이용하여 수행되었다. 코팅된 플레이트를 각각의 혈청 희석액으로 배양하고, 각각의 말라리아 [NANP]7 또는 C-말단 펩타이드에 대한 특이적 항체의 결합을 비오틴화 아이소타입 특이적 항 마우스 항체, 및 이어서 기질로 Amplex™ Red Reagent를 갖는 스트렙타비딘-HRP (호스 래디쉬 퍼옥시다제(horse radish peroxidase))를 사용하여 검출하였다. 말라리아 [NANP]7 또는 C-말단 펩타이드에 대한 항체 (IgG1, IgG2a)의 종말점 역가를 프라임 후 day 21 및 day 35에 ELISA에 의해 측정하였다. 결과는 도 21a의 A 및 B에 나타낸다.
세포 내 사이토카인 염색:
백신 접종된 마우스로부터의 비장 세포를 당해 기술분야에 공지된 표준 프로토콜에 따라 day 35에 분리하였다. 간단히 말해서, 분리된 비장을 세포 스트레이너를 통하여 분쇄하고, PBS/1% FBS에서 세척한 후, 적혈구 용해를 수행하였다. PBS/1% FBS를 사용한 광범위한 세척 단계 후, 비장 세포를 96-웰 플레이트에 시딩하였다(웰 당 2×106개 세포). 세포를 2.5 ㎍/ml의 항CD28 항체 (BD Biosciences)의 존재 하에 CSP 펩타이드 (1 ㎍/ml)의 혼합물 및 단백질 이동 억제제로 37℃에서 6시간 동안 자극하였다. 자극 후에, 세포를 세척하고, 제조사의 지침에 따라 Cytofix/CytopermTM 시약 (BD Biosciences)을 이용하여 세포 내 사이토카인에 대하여 염색하였다. 하기 항체를 염색에 사용하였으며: Thy1.2-FITC (1:100), CD8-PE-Cy7 (1:200), TNF-PE (1:100), IFNγ-APC (1:100) (eBioscience), CD4-BD Horizon V450 (1:200) (BD Biosciences), 1:100으로 희석된 Fcγ-블록으로 배양하였다. Aqua Dye를 살아 있는/죽은 세포를 구별하기 위하여 사용하였다 (Invitrogen). 세포는 BD FACS Canto II 유세포 분석기 (Becton Dickinson)를 이용하여 획득되었다. 유세포 분석 데이터를 FlowJo software (Tree Star, Inc.)를 이용하여 분석하였다. 결과를 도 21에 나타낸다.
결과:
도 21b에 나타내어진 바와 같이, LNP 제제화된 CSP mRNA 백신은 마우스에서 강한 체액 면역 반응을 유도하였다. 테스트된 조건에서, 그룹 A (1ug 용량)에 적용된 LNP 제제화된 백신은 매우 강한 면역 반응을 유도하였다.
도 21b에 나타내어진 바와 같이, LNP 제제화된 CSP mRNA 백신은 마우스에서 세포 면역 반응을 유도하였다 (CD8+ 및/또는 CD4+ T 세포 반응).
CD8+ T 세포는 말라리아 기생충에 의한 세포 내 감염에 대한 주요 보호 면역 메커니즘이므로, 효과적인 말라리아 백신은 강한 CD8+ T 세포 반응을 유도하여야 한다. 따라서, 이러한 발견은 본 발명의 GN01 제제의 유리한 특징 중 하나를 강조한다.
실시예 14: LNP-제제화된 mRNA의 i.v 주사 후 생체 내 FGF21 발현
상이한 HEXA 지질을 갖는 다양한 LNP 조성물의 형질감염, 생체 내 발현 및 발현 효율을 결정하기 위하여(표 Ex-21에 나타내어짐), 섬유아세포 성장 인자 21 (FGF21)를 코딩하는 mRNA를 제제화하였으며, CD-1 마우스에 정맥 내 (i.v.) 주사하였다. 또한 독성, 사이토카인 방출 및 발현과 사이토카인 방출의 상관관계를 결정하였다.
이를 위하여, 더 높은 안정성 및 더 적은 단백질 분해를 위한 몇몇 아미노산 교환이 인간 FGF21 (L126R, P199G, A208E; 참조로 본 명세서에 포함되는 WO 2018/104538 A1에 개시됨)에 도입되었다. 상응하는 mRNA 서열은 HSD17B4로부터의 5'UTR 및 PSMB3로부터의 3'-UTR을 포함하였다 (서열식별번호:39).
추가적인 mRNA는 표준 과정에 따라 효소적으로 캡핑되었다; 메틸기가 제2 단계에서 첨가되어 CAP1을 수득하였으며, mRNA는 상업적으로 이용가능한 폴리아데닐화 키트 및 당해 기술분야에 공지된 상응하는 프로토콜을 이용하여 추가적으로 효소적으로 아데닐화되었다. 또한, mRNA는 화학적으로 변형되었다 (즉, 우리딘을 슈도우리딘 (ψ)으로 완전히 대체함). mRNA의 LNP로의 제제화는 상기 기재된 바와 같이 및 표 Ex-21에 나타내어진 바와 같이 수행되었다.
CD-1 마우스 (그룹 당 4 개체)에 저용량 또는 고용량 mRNA (0.25 mg/kg 및 1 mg/kg)를 단일 i.v.로 주사하고, 주사 후 6시간에 채혈하였다. FGF21 단백질 발현의 분석은 항FGF21 단백질 ELISA를 사용하여 수행되었다 (결과는 도 22 및 23에 나타내어진다).
다양한 LNP 조성물(표 Ex-21 참조)의 내약성이 아미노트랜스페라제 ALT (알라닌 아미노트랜스페라제) 및 AST (아스파르테이트 아미노트랜스페라제)의 활성을 측정함으로써 추가적으로 분석되었다. ALT 및 AST 수준을 주사 후 6 h 및 24 h에 측정하였다.
사이토카인 방출의 분석을 위하여, EDTA 혈장 사이토카인 분석이 주사 후 6시간에 수행되었다. 따라서, 다양한 LNP 제제 (표 Ex-21 참조)에 의한 치료 후 6h 에 마우스로부터 채취된 혈청 샘플을 사용한 CBA 분석은 하기 사이토카인/케모카인의 수준을 나타내었다: MCP-1, MIP-1, MIP-1, RANTES, IL-12p70, IL-6, TNF, IL-1β, IFN-γ. 더욱이, 혈청 내 IFN-α의 수준은 ELISA에 의해 결정되었다. 혈청에서 마우스 IFN-α의 분석은 시약 희석액 (1:20)에서 50 ㎕ 혈청을 사용하여 제조사의 지침에 따라 수행되었다.
[표 Ex-21: HEXA 지질의 제제 요약]
Figure pct00204
결과:
LNP 제제화된 mRNA의 저용량 i.v. 주사 (0.25 mg/kg) 6시간 후, FGF21 단백질 수준의 발현은 모든 제제에 대하여 검출가능하였다 (도 22). LNP-C14, LNP-C15, LNP-21 및 LNP-GN01은 FGF21를 코딩하는 mRNA의 저용량 i.v. 후 FGF12 단백질의 우수한 발현 수준을 나타내었다. 1 mg/kg에 의한 치료 후, 매우 강한 단백질 발현이 제제 LNP-C14, LNP-C15, LNP-21 및 LNP-GN01에 대하여 검출되었다 (도 23). 모든 LNP 제제는 비히클에 비하여 더 높은 단백질 수준을 나타내었다. 가장 높은 단백질 수준은 LNP-C15에 의해 측정되었다. 놀랍게도, 단백질 수준은 저용량 치료에 비하여 약 35배 더 높았다.
실시예 15: HEXA-C4DE-PipSS의 합성
Figure pct00205
실시예 15.1
Figure pct00206
4-(2-헥실데옥시)-4-옥소-부탄산의 합성
2-헥실-1-데칸올 (10g)을 실온에서 100ml의 무수 디클로로메탄에 용해시켰다. 석신산 무수물 (4.99g) 및 디메틸아미노피리딘 (6.1g)을 첨가하고, 반응 혼합물을 질소 하 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 용매를 증발시키고, 조 잔사를 디클로메탄 → 디클로로메탄:메탄올 95:5의 경사로 용리하는 실리카 상의 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 농축하여, 표적 화합물을 황색을 띤 오일로 수득하였다 (9.32g, 65.8% 수율).
실시예 15.2
Figure pct00207
O1-[2-(1-tert-부톡시탄소일-4-피페리딜)에틸] O4-(2-헥실데실) 부탄디오에이트의 합성
실시예 15.1로부터의 생성물 (2.5g) 및 tert-부틸 4-(2-하이드록시에틸)피페리딘-1-카르복실레이트 (1.852g)를 실온에서 30 ml의 무수 디클로로메탄에 용해시켜, 투명한 용액을 제공하였다. N,N'-디사이클로헥실카르보디이미드 (1.666g)를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 하룻밤 동안 교반하였다. 형성된 백색 침전을 여과하고, 소량의 석유 에테르로 세척하였다. 합쳐진 여액을 진공에서 농축하고, 잔사를 순수한 석유 에테르로부터 석유 에테르:에틸아세테이트 80:20의 용매 경사를 갖는실리카 상의 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 생성물의 순수한 분획을 합하고 농축하여, 표적 화합물을 약간 황색 오일로서 수득하였다 (3.31g, 81.4% 수율).
실시예 15.3
Figure pct00208
O4-(2-헥실데실) O1-[2-(4-피페리딜)에틸] 부탄디오에이트의 합성
실시예 15.2로부터의 생성물 (3.3g)을 실온에서 10ml의 무수 디클로로메탄에 용해시킨다. 트리플루오로아세트산 (4ml)을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한다. 혼합물을 포화 탄산수소나트륨 용액으로 2회 세척하고, 수상을 디클로메탄으로 역추출한다. 합쳐진 유기 용액을 브라인으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과 및 농축하여, 표적 화합물을 트리플루오로아세트산 염으로 수득하였다 (황색 오일 3.08g, 91% 수율). 생성물은 추가 정제 없이 다음 단계에 사용되었다.
실시예 15.4
Figure pct00209
O4-(2-헥실데실) O1-[2-[1-(2-설파닐에틸)-4-피페리딜]에틸] 부탄디오에이트의 합성
실시예 15.3으로부터의 조 생성물 (1.3g)을 10ml의 무수 톨루엔에 용해시킨다. N,N-디이소프로필에틸아민 (0.526ml)을 실온에서 첨가하여, 투명 용액을 생성한다. 혼합물을 압력 바이알로 옮기고, 0.7ml의 에틸렌 설파이드를 첨가한다. 바이알을 밀봉하고, 65℃ 오일욕에서 하룻밤 동안 가열한다. 실온으로 냉각한 후, 복합 반응 혼합물을 농축하여, 후속 단계에서 수득된 대로 사용한다.
실시예 15.5
Figure pct00210
O1-[2-[1-[2-[2-[4-[2-[4-(2-헥실데옥시)-4-옥소-부타노일]옥시에틸]-1-피페리딜]에틸디설파닐]에틸]-4-피페리딜]에틸] O4-(2-헥실데실) 부탄디오에이트의 합성
실시예 15.4로부터의 조 생성물 혼합물을 15ml 아세토니트릴에 용해시킨다. 아세토니트릴:물 9:1 중의 아이오다인의 용액을 갈색이 남을 때까지 교반하면서 실온에서 적가한다. 반응 혼합물을 농축하고, 에틸아세테이트에 녹인다. 이 용액을 이어서 탄산수소나트륨 용액, 티오황산나트륨 용액 및 브라인으로 세척한다. 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축시킨다. 표적 화합물 클로로포름 → 클로로포름:메탄올 80:20의 경사로 용리하는 실리카 상의 플래쉬 크로마토그래피에 의해 분리한다. 각각의 분획을 합하고, 용매를 증발시켜, 순수한 표적 화합물을 황색 오일로 제공하였다 (272mg, 2단계에 걸쳐 11% 수율).
1H-NMR (500MHz, CDCl3): 4.15ppm (4H), 4.01ppm (4H), 3.2-2.5ppm (20H), 2.2-1.9ppm (4H), 1.8-1.5ppm (10H), 1.5-1.1ppm (54H), 0.91 (12H)
실시예 16: HEXA-C5DE-PipSS의 합성
Figure pct00211
실시예 16.1
Figure pct00212
5-(2-헥실데옥시)-5-옥소-펜탄산의 합성
1000ml의 무수 디클로로메탄 중 2-헥실-1-데칸올 (150g) 및 글루타르산 무수물 (74.13g)의 용액에, 디메틸아미노피리딘 (90.71g)을 첨가하고, 반응 혼합물을 질소 하 실온에서 65시간 동안 교반한다. 형성된 백색 침전을 여과하고, 배출한다. 여액을 진공에서 농축하고, 200ml의 석유 에테르와 40분 동안 혼합하여, 백색 현탁액을 생성한다. 침전을 여과하고, 여액을 농축하였다. 조 물질을 300ml의 1N 염산과 500ml의 에틸 아세테이트 사이에 분배한다. 유기상을 분리하고, 500ml의 물로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시킨다. 황산나트륨을 여과하고, 용매를 진공에서 증발시킨다. 조 잔사를 디클로로메탄 → 디클로로메탄:메탄올 90:10의 경사로 용리하는 실리카 상의 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제한다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 농축하여, 순수한 표적 화합물을 황색 오일로 수득한다 (123.9g, 56.1% 수율).
실시예 16.2
Figure pct00213
O1-[2-(1-tert-부톡시탄소일-4-피페리딜)에틸] O5-(2-헥실데실) 펜탄디오에이트의 합성
실시예 16.1로부터의 생성물 (52.6g) 및 tert-부틸 4-(2-하이드록시에틸)피페리딘-1-카르복실레이트 (37.2g)를 실온에서 600ml의 디클로로메탄에 용해시켜, 투명한 황색 용액을 수득한다. N,N'-디사이클로헥실카르보디이미드 (33,48.6g)을 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 22시간 동안 교반한다. N,N'-디사이클로헥실카르보디이미드 (15,2g)을 더 첨가하고, 혼합물을 실온에서 추가 42시간 동안 교반한다. 형성된 백색 침전을 여과하고, 소량의 석유 에테르로 세척한다. 합쳐진 여액을 진공에서 농축하고, 잔사를 순수한 석유 에테르에서 석유 에테르:에틸아세테이트 90:10로의 용매 경사를 갖는 실리카 상의 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제한다. 생성물의 순수한 분획을 합하고 농축하여, 표적 화합물을 오일로 수득한다 (32.8g, 39.2% 수율).
실시예 16.3
Figure pct00214
O5-(2-헥실데실) O1-[2-(4-피페리딜)에틸] 펜탄디오에이트의 합성
실시예 16.2로부터의 생성물 (32.8g)을 실온에서 1000ml의 디클로로메탄에 용해시킨다. 용액을 얼음욕에서 냉각시키고, 트리플루오로아세트산 (35.6ml)을 ~0℃에서 천천히 첨가한다. 혼합물을 실온으로 가온하고, 하룻밤 동안 교반한다. 혼합물을 포화 탄산수소나트륨 용액으로 세척하고, 수상을 디클로로메탄으로 역추출한다. 합쳐진 유기 용액을 브라인으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과 및 농축하여, 표적 화합물을 황색 오일로 수득한다 (27.15g, 정량적 수율). 생성물은 추가 정제 없이 다음 단계에 사용되었다.
실시예 16.4
Figure pct00215
O5-(2-헥실데실) O1-[2-[1-(2-설파닐에틸)-4-피페리딜]에틸] 펜탄디오에이트의 합성
실시예 16.3으로부터 조 생성물 (1.37g)을 10ml의 무수 톨루엔에 용해시킨다. N,N-디이소프로필에틸아민 (0.533ml)을 실온에서 첨가하여, 투명 용액을 생성한다. 혼합물을 압력 바이알로 옮기고, 0.7ml의 에틸렌 설파이드를 첨가한다. 바이알을 밀봉하고, 65℃ 오일욕에서 하룻밤 동안 가열한다. 실온으로 냉각한 후, 복합 반응 혼합물을 농축하여, 후속 단계에서 수득된 대로 사용한다.
실시예 16.5
Figure pct00216
O1-[2-[1-[2-[2-[4-[2-[5-(2-헥실데옥시)-5-옥소-펜타노일]옥시에틸]-1-피페리딜]에틸디설파닐]에틸]-4-피페리딜]에틸] O5-(2-헥실데실) 펜탄디오에이트의 합성
실시예 16.4로부터의 조 생성물 혼합물 15ml를 아세토니트릴에 용해시킨다. 아세토니트릴:물 9:1 중의 아이오다인의 용액을 갈색이 남을 때까지 교반하면서 실온에서 적가한다. 반응 혼합물을 농축하고, 에틸아세테이트에 녹인다. 이 용액을 이어서 탄산수소나트륨 용액 및 티오황산나트륨 용액으로 세척한다. 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축시킨다. 표적 화합물을 클로로포름 → 클로로포름:메탄올 80:20의 경사로 용리하는 실리카 상의 플래쉬 크로마토그래피에 의해 분리한다. 각각의 분획을 합하고, 용매를 증발시켜, 순수한 표적 화합물을 황색 오일로 제공하였다 (562mg, 2단계에 걸쳐 22% 수율).
1H-NMR (500MHz, CDCl3): 4.11ppm (4H), 3.98ppm (4H), 3.15-2.5ppm (12H), 2.37 (8H), 2.17-1.84ppm (8H), 1.81-1.5ppm (10H), 1.49-1.08ppm (54H), 0.88 (12H)
실시예 17: HEXA-C5DE-PipC3SS의 합성
Figure pct00217
실시예 17.1
Figure pct00218
[3-브로모프로필설파닐(di페닐)메틸]벤젠의 합성
225ml의 무수 테트라하이드로퓨란 중 트리페닐메탄티올 (12g) 및 1,3-디브로모프로판 (22ml)의 용액에 탄산칼륨 (6.6g)을 첨가한다. 반응 혼합물을 질소 하, 50℃에서 2일 동안, 및 60℃에서 추가 4일 동안 교반한다. 불용성 염을 여과하고, 여액을 진공에서 농축한다. 150ml의 디클로로메탄 중 잔사의 용액을 500ml 물로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과 및 농축한다. 잔사를 석유 에테르:디클로로메탄 4:1로 용리하는 실리카 상의 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제한다. 관련 분획을 합하고, 용매를 진공 하 증발시켜, 순수한 표적 화합물을 고체로서 수득한다 (4.2g, 24.3% 수율).
실시예 17.2
Figure pct00219
O5-(2-헥실데실) O1-[2-[1-(3-트리틸설파닐프로필)-4-피페리딜]에틸] 펜탄디오에이트의 합성
실시예 16.3으로부터의 생성물 (4g) 및 실시예 17.1로부터의 생성물 (3.4g)을 실온에서 85ml 아세토니트릴과 혼합하여, 현탁액을 수득한다. 디메틸 포름아미드 (2ml)를 첨가하고, 혼합물을 55℃에서 16시간 동안, 또한 65℃에서 24시간 동안 교반한다. 탄산칼륨 (600mg)을 첨가하고, 혼합물을 추가 3시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 여과 및 농축하고, 플래쉬 크로마토그래피(실리카, 용리액으로 디클로로메탄:메탄올 90:10)에 의해 정제하여, 일부 잔류 디메틸 포름아미드를 함유하는 본질적으로 순수한 표적 화합물을 수득한다 (3.55g, 52.9% 수율).
실시예 17.3
Figure pct00220
O5-(2-헥실데실) O1-[2-[1-(3-설파닐프로필)-4-피페리딜]에틸] 펜탄디오에이트의 합성
실시예 17.2로부터의 생성물 (1g)을 을 5ml의 무수 디클로로메탄에 용해시키고, 용액을 얼음 욕에서 0℃로 냉각시킨다. 이어서, 트리플루오로 아세트산 (1.965ml) 및 트리에틸 실란 (0.206ml)을 첨가하여, 약간 갈색을 띤 용액을 수득한다. 반응 혼합물을을 0℃에서 30분 동안 교반하고, 50ml 디클로로메탄으로 희석하고, 100ml의 포화 탄산수소나트륨 용액으로 세척한다. 유기상을 분리하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 농축한다. 잔사를 디클로로메탄 → 디클로로메탄:메탄올 95:5의 경사로 용리하는 실리카 상의 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여, 표적 화합물을 수득한다 (0.47g, 68% 수율).
실시예 17.4
Figure pct00221
O1-[2-[1-[3-[3-[4-[2-[5-(2-헥실데옥시)-5-옥소-펜타노일]옥시에틸]-1-피페리딜]프로필디설파닐]프로필]-4-피페리딜]에틸] O5-(2-헥실데실) 펜탄디오에이트의 합성
실시예 17.3으로부터의 생성물 (0.47g)을 10ml 아세토니트릴에 용해시킨다. 아세토니트릴:물 9:1 중 아이오다인의 용액을 실온에서 갈색이 남을 때까지 적가한다. 반응 혼합물을 실온에서 58시간 동안 교반하고, 농축하고, 플래쉬 크로마토그래피(실리카, 디클로로메탄 → 디클로로메탄:메탄올 95:5)에 의해 정제하여, 표적 화합물을 요오드화수소산염으로서 수득한다 (240mg, 45.8% 수율).
1H-NMR (500MHz, CDCl3): 10.01ppm (2H), 4.15ppm (4H), 3.99ppm (4H), 3.83ppm (4H), 3.28ppm (4H), 2.94-2.80ppm (8H), 2.53-2.44ppm (4H), 2.43-2,36ppm (8H), 2.21-2.09ppm (4H), 2.04-1.91ppm (8H), 1.84-1.67ppm (6 h), 1.36-1.2ppm (50H), 0.90ppm (12H)
실시예 18: HEXACA-C5DE-PipSS의 합성
Figure pct00222
실시예 18.1
2-헥실데카노일 클로라이드의 합성
Figure pct00223
250ml 무수 디클로로메탄 + 0.1ml 디메틸 포름아미드 중 2-헥실데칸산 (25g)의 용액을 얼음 욕에서 0℃로 냉각시키고, 옥살릴 클로라이드 (12.54ml)를 이 온도에서 적가한다. 혼합물을 실온으로 가온하고, 3시간 동안 교반한다. 용매를 진공에서 제거하여, 황색 오일 (26.5g)을 수득하며, 이는 추가적인 정제 없이 다음 단계에 사용된다.
실시예 18.2
Figure pct00224
5-하이드록시펜틸 2-헥실데카노에이트의 합성
250ml 무수 테트라하이드로퓨란 중 1,5-펜탄디올 (51.07g) 및 트리에틸 아민의 용액을 얼음 욕에서 0℃에서 교반한다. 250ml 무수 테트라하이드로퓨란 중 실시예 18.1로부터의 생성물 (26.5g)의 용액을 이 온도에 80분에 걸쳐 천천히 첨가한다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 하룻밤 동안 교반한다. 용매를 진공에서 증발시키고, 수득된 갈색 오일을 300ml 디클로로메탄에 용해시키고, 500ml 물로 2회 세척한다. 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과 및 농축한다. 조 생성물을 디클로로메탄:메탄올 95:5로 용리하는 실리카 상의 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제한다. 관련 분획을 모으고, 용매를 증발시켜, 표적 화합물을 약간 갈색 오일로서 수득한다 (27.36g, 81.9% 수율).
실시예 18.3
Figure pct00225
5-(2-헥실데카노일옥시)펜탄산의 합성
258ml 물 중 크롬(Ⅵ)옥사이드 (86.06g)의 냉각된 용액 (5℃) 용액에 진한 황산 (158.36g)을 적가하여, 진한 오렌지색 용액을 제공함으로써, 존스 시약의 용액을 새로 준비한다. 이 용액을 0℃에서 258ml 아세톤 중 실시예 18.2로부터의 화합물 (19.75g)의 용액에 70분에 걸쳐 천천히 첨가한다. 혼합물을 1시간 동안 교반하고, 120ml 이소프로판올을 조심스럽게 (발열성) 첨가하여 반응을 켄치하여 끈적한 침전을 형성한다. 용액을 따라내고, 400ml 디클로로메탄과 300ml 물 사이에 분배한다. 디클로로메탄 용액을 분리한다. 끈적한 침전을 500ml 디클로로메탄 및 500ml 물과 함께 교반한다. 유기상을 분리하고, 이전에 수득된 디클로로메탄 용액과 합하여, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 농축한다. 잔사를 실리카 상의 플래쉬 크로마토그래피에 의해(용리액 디클로로메탄:메탄올 96:4)에 의해 정제하여, 용매 증발 후, 표적 화합물을 황색을 띤 오일로서 수득한다 (16.38g, 79.7% 수율).
실시예 18.4
Figure pct00226
tert-부틸 4-[2-[5-(2-헥실데카노일옥시)펜타노일옥시]에틸]피페리딘-1-카르복실레이트의 합성
무수 200ml 디클로로메탄 중 실시예 18.3으로부터의 화합물 (10g)의 용액을 20mg 무수 디메틸포름아미드 및 옥살릴 클로라이드 (3.6ml)로 처리한다. 혼합물을 20℃에서 1시간 동안 교반하고, 진공에서 농축시키고, 100ml 무수 디클로로메탄에 재용해시킨다. 이 용액을 실온에서 100ml 디클로로메탄 중 tert-부틸 4-(2-하이드록시에틸)피페리딘-1-카르복실레이트 (7.08g) 및 트리에틸 아민 (5.67g)의 용액에 적가한다. 반응 혼합물을 하룻밤 동안 교반한 후, 진공에서 농축시킨다. 잔사를 에틸아세테이트:석유 에테르 1:5로 용리하는 실리카 상의 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제한다. 관련 분획을 합하고, 용매를 증발시켜, 순수한 표적 화합물 (13.05g, 81.9% 수율)을 약간 황색 오일로서 수득한다.
실시예 18.5
Figure pct00227
[5-옥소-5-[2-(4-피페리딜)에톡시]펜틸] 2-헥실데카노에이트의 합성
실시예 18.4로부터의 생성물 (5g)을 실온에서 120ml의 디클로로메탄에 용해시킨다. 트리플루오로아세트산 (10.04g)을 첨가하고, 혼합물을 하룻밤 동안 교반한다. 모든 휘발성 물질을 진공에서 제거하고, 잔사(6.28g, 정량적 수율)를 추가적인 정제 없이 다음 단계에서 사용한다.
실시예 18.6
Figure pct00228
[5-옥소-5-[2-[1-(2-설파닐에틸)-4-피페리딜]에톡시]펜틸] 2-헥실데카노에이트의 합성
실시예 18.5로부터의 조 생성물 (3g)을 35ml의 무두 톨루엔에 용해시킨다. N,N-디이소프로필에틸아민 (5.6ml)을 실온에서 첨가하여, 투명 용액을 생성한다. 혼합물을 압력 바이알로 옮기고, 1.91ml의 에틸렌 설파이드를 첨가한다. 바이알을 밀봉하고, 65℃ 오일욕에서 하룻밤 동안 가열한다. 실온으로 냉각한 후, 반응 혼합물을 농축하여, 수득된 대로 다음 단계에 사용한다
실시예 18.7
Figure pct00229
[5-[2-[1-[2-[2-[4-[2-[5-(2-헥실데카노일옥시)펜타노일옥시]에틸]-1-피페리딜]에틸디설파닐]에틸]-4-피페리딜]에톡시]-5-옥소-펜틸] 2-헥실데카노에이트의 합성
실시예 18.6로부터의 조 생성물 혼합물을 30ml의 아세토니트릴에 용해시킨다. 20ml 아세토니트릴 중 아이오다인 (814mg)의 용액을 갈색이 남을 때까지 실온에서 적가한다. 반응 혼합물을 실온에서 90분 동안 교반한 후, 진공에서 농축시킨다. 잔사를 50ml 클로로포름에 용해시키고, 용액을 이어서 50ml 포화 탄산수소나트륨 용액 및 티오황산나트륨 용액으로 세척한다. 유기상을 분리하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축시킨다. 표적 화합물은 실리카 상의 플래쉬 크로마토그래피(용리액 디클로로메탄:메탄올 20:1 + 1% 수성 암모니아)에 의해 분리한다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 용매를 증발시켜, 표적 화합물을 황색 오일로서 제공한다 (680mg, 2단계에 걸쳐 10% 수율 ).
1H-NMR (500MHz, CDCl3): 4.15-4.02ppm (8H), 2.92ppm (4H), 2.83ppm (4H), 2.66ppm (4H), 2.36-2.26ppm (6 h), 2.0ppm (4H), 1.74-1.62 (12H), 1.61-1.52ppm (8H), 1.46-1.17ppm (50H), 0.86ppm (12H)
실시예 19: HEXA-C5DE-Pip-티오에테르의 합성
실시예 19.1
Figure pct00230
O5-(2-헥실데실) O1-[2-[1-(2-하이드록시에틸)-4-피페리딜]에틸] 펜탄디오에이트의 합성
65.8ml 디메틸 포름아미드 중 실시예 16.3로부터의 생성물 (4g), 2-브로모에탄올 (2.14g) 및 탄산칼륨 (2.37g)의 혼합물을 하룻밤 동안 50℃에서 교반한다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고, 500ml 물로 희석하고, 각각 250ml 디클로로메탄으로 3회 추출한다. 합쳐진 유기 추출물을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과 및 농축한다. 수득된 조 표적 화합물 수득된(3.3g)을 추가적인 정제 없이 다음 단계에서 사용한다.
실시예 19.2
Figure pct00231
O1-[2-[1-(2-클로로에틸)-4-피페리딜]에틸] O5-(2-헥실데실) 펜탄디오에이트의 합성
60ml 톨루엔 중 실시예 19.1로부터의 조 생성물 (3.3g)의 용액에 티오닐 클로라이드 (1.58g)를 실온에서 적가한다. 반응 혼합물을 90분 동안 교반한 후, 농축시킨다. 생성물을 디클로로메탄 → 디클로로메탄:메탄올 90:10의 경사로 용리하는 실리카 상의 플래쉬 크로마토그래피에 의해 사전 정제한다. 표적 화합물 (염산염으로서)을 함유하는 분획을 합하고, 용매를 증발시킨다. 최종 정제는, 용리액으로 에틸아세테이트 → 에틸아세테이트:메탄올 98:2를 이용하는 실리카 상의 제2 플래쉬 크로마토그래피에 의해 이루어진다. 용매를 진공에서 제거하고, 잔사를 100ml 디클로로메탄에 녹인다. 이 용액을 100ml 포화 탄산수소나트륨 용액 및 브라인으로 집중적으로 세척한다. 유기상을 분리하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과 및 농축하여, 표적 화합물을 유리 염기로 제공한다 (1.95g, 57% 수율).
실시예 19.3
Figure pct00232
O5-(2-헥실데실) O1-[2-[1-(2-설파닐에틸)-4-피페리딜]에틸] 펜탄디오에이트의 합성
실시예 16.3로부터의 조 생성물 (12.5g)을 75ml의 무수 톨루엔에 용해시킨다. N,N-디이소프로필에틸아민 (14ml)을 실온에서 첨가하여, 투명 용액을 생성한다. 에틸렌 설파이드 (7.96ml)를 첨가하고, 혼합물을 아르곤 분위기 하, 55℃에서 8시간 동안, 및 실온에서 하룻밤 동안 교반한다. 혼합물을 농축하고, 디클로로메탄 → 디클로로메탄:메탄올 95:5의 경사로 용리하는 실리카 상의 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제한다. 주로 표적 화합물을 함유하는 분획을 합하고, 용매를 증발시킨다. 생성물 (1.95g, 12.4% 수율)은 일부 각각의 디설파이드를 함유한다 (공기에 의한 산화에 의해 생성됨).
실시예 19.4
Figure pct00233
O1-[2-[1-[2-[2-[4-[2-[5-(2-헥실데옥시)-5-옥소-펜타노일]옥시에틸]-1-피페리딜]에틸설파닐]에틸]-4-피페리딜]에틸] O5-(2-헥실데실) 펜탄디오에이트의 합성
실시예 19.3으로부터의 생성물 (1g)을 10ml의 디메틸포름아미드 + 물 2방울에 용해시킨다. 진공 / 아르곤 퍼징을 교대로 적용하여 3 사이클로 용액을 탈기한다. 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드 (0.543g)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 3일 동안 교반한다. 반응 혼합물을 250ml의 탈기된 디클로로메탄으로 희석하고, 탈기된 탄산수소나트륨 용액 및 탈기된 브라인으로 세척한다 (각각 200ml). 유기층을 분리하고, 무수 황산나트륨으로 건조시키고, 여과 및 농축한다.
잔사를 10ml의 탈기된 디메틸 포름아미드에 녹이고, 5ml의 탈기된 디메틸포름아미드 및 트리에틸아민 (0.72ml) 중 실시예 19.2로부터의 생성물 (1.005g)의 용액을 첨가한다. 반응 혼합물을 아르곤 하 실온에서 18시간 동안 교반한다. 디메틸포름아미드의 대부분은 55℃에서 감압 하 증류 제거된다. 잔사를 여러 번 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 혼합 분획을 생성한다. 이용된 실리카는 용리액 (디클로로메탄 : 메탄올 : 수성 암모니아 97 : 2.85 : 0.15)으로 사전 컨디셔닝된다. 순수한 분획을 합하고, 용매를 진공에서 제거하여, 깨끗한 표적 화합물을 수득한다 (120mg, 5.9% 수율).
1H-NMR (500MHz, CDCl3): 4.11ppm (4H), 3.98ppm (4H), 3.07-2.84ppm (4H), 2.75-2.51ppm (8H), 2.37 (8H), 2.10-1.88ppm (8H), 1.69-1.54ppm (10H), 1.44-1.15ppm (54H), 0.88 (12H)
실시예 20: HEXA 및 HEAD 지질의 합성
본 실시예는 본 발명의 지질 화합물을 얻기 위한 방법 및 정보, 및 본 발명의 조성물의 생성 및 분석 방법을 제공한다.
실시예 20.1: HEXA 지질 - HEXA 지질의 합성
HEXA 지질은 ChiroBlock GmbH (Bitterfeld-Wolfen, Germany)의 일반 프로토콜에 따라 합성되었다. 표 Ex-22 및 도 24에 나타내어진 2종의 HEXA 지질이 합성되었다. 실시예 23 및 24 참조.
[표 Ex-22: 합성된 HEXA 지질의 개요]
Figure pct00234
*** 표 Ex-1에 대한 코멘트 참조
HEXA 지질의 순도 및 구조 동일성은 핵 자기 공명 분광법 (H-NMR, 500.13 MHz) 및 질량 분석법 (전자 분무 이온화-ESI 또는 대기압 화학적 이온화-APCI, 직접 주입을 통함)에 의해 확인되었다.
C24에 대한 NMR 데이터는 다음과 같다:
1H NMR (400 MHz, C6D6) δ 4.28 - 4.14 (8H), 2.83 (4H), 2.70 - 2.61 (4H), 2.48 (4H), 2.31 (8H), 2.03 (4H), 1.88 (4H), 1.76 - 1.61 (6 h), 1.57 - 1.20 (58H), 1.03 (12H)
C25에 대한 NMR 데이터는 다음과 같다:
1H NMR (400 MHz, C6D6) δ 4.21 - 4.08 (8H), 2.84 (4H), 2.62 (4H), 2.41 (4H), 2.31 (8H), 2.04 (4H), 1.84 (8H), 1.71 (2H), 1.59 - 1.21 (62H), 1.03 (12H)
실시예 20.1.1: NanoAssemblr TM 미세유체 시스템을 사용한 LNP의 제조
LNP는 하기 표 Ex-23에 나타내어진 LNP19 내지 LNP24에 대해 표 Ex-2에서 "조성물 2"라는 제목의 일반 제제로 실시예 2.1.1에 기재된 바와 같이 제조되었다. LNP25 내지 LNP27도 실시예 2.1.1에 기재된 바와 같이 제조되었다. 따라서, 양이온성 지질은 표준 프로토콜에 따라 NanoAssemblrTM 미세유체 시스템 (Precision NanoSytems Inc., Vancouver, BC)을 사용하여 제제화되었다.
Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL)으로부터 (07:0) PC (DHPC - 1,2-디헵타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린)의 구조는 다음과 같다:
Figure pct00235
실시예 20.1.2: 지질 나노입자 조성물 / HEXA 지질의 생물물리학적 특성화
표 Ex-23에 나타내어진 LNP는 실시예 2.1.2에 논의된 바와 유사하게 제제화 및 특성화되었다. 특성화는, 표 Ex-23의 LNP가 실시예 2.1.2의 LNP와 유사한 특성을 나타냄을 보여주었다. 즉, 수득된 특성화 결과는 기본적으로 실시예 2.1.2의 LNP 범위 내에 있었다.
[표 Ex-23: HEXA 지질의 제제 - 표 Ex-22 및 표 1에 개시된 양이온성 지질을 참조함]
Figure pct00236
*** 용어 "PCL"은 "폴리머 컨쥬게이트 지질" 부류의 지질을 나타낸다.
실시예 20.2: HEAD 지질 - HEAD 지질의 합성
HEAD 지질은 ChiroBlock GmbH (Bitterfeld-Wolfen, Germany)의 일반 프로토콜에 따라 합성되었다. 이 작업 실시예에서, 2종의 HEAD 지질이 합성되었다(표 Ex-24 및 도 25에 나타내어진 바와 같음), 실시예 25 및 26 참조.
[표 Ex-24: 합성된 HEAD 지질의 개요]
Figure pct00237
HEAD 지질의 순도 및 구조 동일성은 핵 자기 공명 분광법 (H-NMR, 500.13 MHz) 및 질량 분석법 (전자 분무 이온화-ESI 또는 대기압 화학적 이온화-APCI, 직접 주입을 통함)에 의해 확인되었다.
THIOETER에 대한 NMR 데이터는 다음과 같다:
1H NMR (400 MHz, C6D6) δ 4.16 (4H), 2.85 - 2.67 (12H), 2.64 - 2.52 (8H), 2.44 (4H), 2.35 (6 h), 2.23 (12H), 1.84 (4H), 1.64 (16 h), 1.55 - 1.17 (50H), 1.04 (24 h)
C3SS에 대한 NMR 데이터는 다음과 같다:
1H NMR (400 MHz, C6D6) δ 4.17 (4H), 2.85 - 2.71 (12H), 2.63 - 2.52 (4H), 2.45 (4H), 2.34 (10H), 2.23 (12H), 1.92 (4H), 1.79 (4H), 1.73 - 1.15 (68H), 1.01 (24 h)
실시예 20.2.1: NanoAssemblr TM 미세유체 시스템 / HEAD 지질을 이용한 LNP의 제조
LNP28 내지 LNP32는 표 Ex-7에서 "조성물 B"라는 제목의 일반 제제로 실시예 2.1.1에 기재된 바와 같이 제조되었다. LNP-C는 표 Ex-7에서 "조성물 A:라는 제목의 일반 제제로 실시예 2.1.1에 기재된 바와 같이 제조되었다. 따라서, 양이온성 지질은 표준 프로토콜에 따라 NanoAssemblrTM 미세유체 시스템 (Precision NanoSytems Inc., Vancouver, BC)을 사용하여 LNP로 제제화되었다.
실시예 20.2.2: 지질 나노입자 조성물 / HEAD 지질의 생물물리학적 특성화
표 Ex-25에 나타내어진 LNP는 실시예 2.2.2에 논의된 바와 유사하게 제제화 및 특성화되었다. 특성화는, 표 Ex-25의 LNP가 실시예 2.2.2의 LNP와 유사한 특성을 나타냄을 보여주었다. 즉, 수득된 특성화 결과는 기본적으로 실시예 2.2.2의 LNP의 범위 내에 있다.
[표 Ex-25: HEAD 지질 및 대조군 (LNP-C)의 제제 요약]
Figure pct00238
*** 용어 "CL"은 최신 기술의 양이온성 지질을 나타낸다.
*** 용어 "PL"은 최신 기술의 mPEG 2000을 포함하는 폴리머 컨쥬게이트 지질을 나타낸다.
실시예 21: 근육 내 투여를 이용한 RABV-G 백신 접종을 위한 실시예 20의 LNP
실시예 20에 따른 LNP의 면역원성을 분석하기 위해, RABV-G (광견병 바이러스 당단백질) mRNA를 상기 기재된 방법에 따라 제조하여, mCap, muag-3'-UTR; 3'-말단에서 64× 아데노신 (폴리A-테일); 5개 뉴클레오타이드, 3'-말단에서 30× 시토신 (폴리C-테일) 및 5개의 추가적인 뉴클레오타이드 (서열식별번호:32)를 포함하는 RABV-G mRNA를 수득하였다.
상기 기재된 RABV-G mRNA를 포함하는 표 Ex-26, 표 Ex-27 및 표 Ex-28에 따른 제제를 7주령 암컷 Balb/C 마우스 (표s Ex-26 및 Ex-27의 각 그룹의 경우 n=8; 표 Ex-28의 각 그룹의 경우 n=6)에 day 0 및 day 21에 근육 내 주사하였다.
[표 Ex-26: 조성물 및 제제 세부사항; 조성물의 mol%-비가 기술된 실시예 20.1.1, 실시예 20.2.2, 표 Ex-23, 및 표 Ex-25의 기재를 추가적으로 참조함]
Figure pct00239
[표 Ex-27: 조성물 및 제제 세부사항; 조성물의 mol%-비가 기술된 실시예 20.1.1 및 표 Ex-23의 기재를 추가적으로 참조함]
Figure pct00240
[표 Ex-28: 조성물 및 제제 세부사항; 조성물의 mol%-비가 기술된 실시예 20.2.2 및 표 Ex-25의 기재를 추가적으로 참조함]
Figure pct00241
혈청에서 광견병 바이러스에 대한 항체의 수준을 결정하기 위하여, 표 Ex-26, Ex-27 및 Ex-28의 그룹에 대하여 고전적인 바이러스 중화 테스트가 수행되었다 (형광 항체 바이러스 중화 (FAVN) 분석).
제1 mRNA 투여 28일 후, 마우스를 희생시키고 혈액 및 기관 샘플 (비장)을 추가적인 분석을 위하여 수집하였다. 이와 관련하여, 이 단계에서 수득된 비장 세포 샘플에서 광견병 바이러스 당단백질 (RABV-G)-특이적 세포 반응은 RABV-G-특이적 T 세포 활성화로서 측정되었다. 이는 하기와 같은 표준 프로토콜에 따라 세포 내 사이토카인 염색 및 유세포 분석에 의한 후속적 분석에 의해 분석되었다: 비장 세포를 항CD107a (Biolegend, San Diego, USA) 및 항CD28 (BD Biosciences, San Jose, USA) 존재 하에 RABV-G 펩타이드 칵테일로 자극하였다. 자극되지 않은 비장 세포를 동일한 방식으로 처리하였으나, 펩타이드 칵테일로 보충되지는 않았다. 추가적인 대조군은 PMA/이오노마이신 (항CD28 없음; Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Germany로부터 PMA 및 이오노마이신)으로 자극된 비장 세포 (양성 대조군) 및 형광단-컨쥬게이트 항체에 의해 염색되지 않고 남은 비장 세포 (음성 대조군)이었다. 자극 과정 후, 비장 세포를 표면 및 세포 내 형광단-컨쥬게이트 항체로 염색하고, 유세포 분석에 의해 분석하였다.
혈청 샘플은 부스트 전 day 21에 채취되었으며, day 21의 혈청 샘플은 FAVN 분석을 통하여 바이러스 중화 항체 (VNA) 분석을 위해 분석되었다. 또한, 혈청 샘플은 LNP로 제제화된 RABV-G-코딩 mRNA로 면역화된 마우스의 혈청에서 사이토카인 수준의 초기 분석을 위하여 제제의 제1 적용 후 18h에 채취되었다.
상기 면역원성 분석의 경우, VNT는 이전에 설명된 바와 같이 측정되었으며, 즉, 혈청에서 항광견병 바이러스 중화 역가 (VNTs)가 WHO 프로토콜에 따라 FAVN 분석 및 Standard Challenge 바이러스 CVS-11을 이용하여 Eurovir® Hygiene-Labor GmbH, Germany에 의해 분석되었다.
CBA 분석은 어레이에 포함된 하기 사이토카인/케모카인에 의하여, LNP-제제화된 항원-코딩 mRNA로 면역화된 후 18h에 마우스로부터 채취한 혈청 샘플을 사용하여 수행되었다: MIG, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, IL-12p70, IL-6, TNF, IL-1β, IFN-γ. 더욱이, 혈청에서 IFN-α의 수준은 표준 프로토콜에 따라 ELISA에 의해 결정되었다.
또한, 표 Ex-26의 그룹에 있어서, day 28에 채취된 비장 샘플은 RABV-G 펩타이드 라이브러리로 재자극되고, T 세포 반응 (CD4 및 CD8), 즉, CD4 T 세포 면역 반응 (IFNу/TNFα 생산 CD4 T 세포) 및 CD8 T 세포 면역 반응 (IFNу/TNFα 생산 CD8 T 세포 및 CD107+ IFNу producing CD8 T 세포)에 대해 분석되었다; 항원 특이적 T 세포의 유도 세포 내 사이토카인 염색 (ICS)을 사용하여 결정되었다. 분석은 이전에 설명된 바와 같이 수행되었다.
결과는 도 26 (표 Ex-27의 그룹에 관련됨), 도 27a, 27b 및 27c (표 Ex-26의 그룹에 관련됨), 도 28 (표 Ex-28의 그룹에 관련됨)에 나타내어진다.
결과:
도 26, 도 27a 및 도 28는, 표 Ex-27 (도 26), 표 Ex-26 (도 27a) 및 표 Ex-28 (도 28)에 기재된 바와 같이 LNP에서 제제화된 5 ㎍ RABV-G-mRNA 및 1 ㎍ RABV-G-mRNA에 의한 단일 i.m. 면역화는 프라임 백신 접종 후 day 21에 모든 동물에서 0.5IU/ml의 보호 역가보다 훨씬 높은 매우 강력한 VNT를 유도하였음을 보여준다.
도 27b 및 27c는 표 Ex-26의 LNP-RABV-G mRNA 백신이 백신 접종 후 특이적 세포 반응, 즉 RABV-G 펩타이드 라이브러리로 재자극된 비장 세포에서 특이적 세포 반응을 유도하였음을 보여준다(자극되지 않은 비장 세포를 갖는 대조군도 도시됨). 버퍼 i.m. 주사된 대조군 동물에서는 효과가 관찰되지 않았다. RABV-G-특이적 CD4+ T 세포 (도 27b) 및 RABV-G-특이적 CD8+ T (도 27c)가 모든 제제에 대해 관찰되었다.
실시예 22: 생체 내 말라리아 백신 접종을 위한 본 발명의 지질을 포함하는 상이한 LNP
CSP mRNA는 HSD17B4로부터의 5'-UTR, PSMB3로부터의 3'-UTR, 3'-말단에서 64× 아데노신 (폴리A-테일); 5개 뉴클레오타이드, 3'-말단에서 30× 시토신 (폴리-C-테일), 히스톤-스템 루프, 및 5개의 추가적인 뉴클레오타이드를 포함하였다. mRNA를 제조사의 지침에 따라 ScriptCapTM m7G Capping System (CellScript, Madison, WI, USA)을 사용하여 추가적으로 효소적으로 캡핑하였으며, 상업적 폴리아데닐화 키트를 이용하여 효소적으로 폴리아데닐화하여, 서열식별번호:38을 생성하였다.
수득된 mRNA 구성체를 표 Ex-29 내지 Ex-31에 나타내어진 지질 나노입자에 제제화하였으며, 하기 구조의 지질(모두 상업적으로 이용가능함)이 참조되었다 ((07:0) PC (DHPC) 구조에 대해서는 실시예 20.1.1 참조):
C8-PEG 2000 (N-옥타노일-스핑고신-1-{석시닐[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)2000]}, Avanti Polar Lipids; Alabaster, AL):
Figure pct00242
C10-PEG 2000 (NOF Corporation, Tokyo, Japan):
Figure pct00243
[표 Ex-29: HEXA 지질의 제제 - 표 1에 개시된 양이온성 지질을 참조함]
Figure pct00244
[표 Ex-30: HEXA 지질의 제제 - 표 1에 개시된 양이온성 지질을 참조함]
Figure pct00245
[표 Ex-31: HEAD 지질의 제제 - 표 Ex-25에 개시된 양이온성 지질을 참조함]
Figure pct00246
*** PCL은 "폴리머 컨쥬게이트 지질"을 나타낸다.
표 Ex-29 및 Ex-30 및 Ex-25의 일부에 따른 LNP 제제는 표 Ex-32 내지 Ex-34에 나타내어진 바와 같은 용량의 RNA, 제제, 및 대조군을 days 0 및 21에 근육 내 (i.m.; 경골 근육) 적용하였다. 음성 대조군은 버퍼만 받았다. 혈청 샘플을 ELISA를 위하여 day 21 및 day 35에 채취하였다
[표 Ex-32: 표 Ex-29에 따른 LNP에 대한 백신 접종 계획]
Figure pct00247
[표 Ex-33: 표 Ex-30에 따른 LNP에 대한 백신 접종 계획]
Figure pct00248
[표 Ex-34: 표 Ex-25에 따른 LNP에 대한 백신 접종 계획]
Figure pct00249
[표 Ex-35: Ex-25에 따른 LNP의 일부에 대한 백신 접종 계획]
Figure pct00250
ELISA에 의한 특이적 체액 면역 반응의 결정:
코팅을 위하여 말라리아 [NANP]7 펩타이드를 사용하여 ELISA를 수행하였다. 코팅된 플레이트를 각각의 혈청 희석액을 사용하여 배양하고, 각각의 말라리아 [NANP]7 펩타이드에 대한 특이적 항체의 결합은 비오틴화 아이소타입 특이적 항 마우스 항체, 이어서 기질로 Amplex™ Red Reagent를 갖는 스트렙타비딘-HRP (호스 래디쉬 퍼옥시다제)을 이용하여 검출되었다. 말라리아 [NANP]7 펩타이드에 대한 항체(각각의 도면에서 표시된 바와 같이 총 IgG 또는 IgG)의 종말점 역가는 프라임 후 day 35에 ELISA에 의해 측정되었다. 결과는 도 31, 34 및 35에 나타내어진다.
세포 내 사이토카인 염색:
백신 접종된 마우스로부터의 비장 세포를 당해 기술분야에 공지된 표준 프로토콜에 따라 day 35에 분리하였다. 간단히 말해서, 분리된 비장 세포를 스트레이너를 통하여 분쇄하고, PBS/1% FBS에서 세척한 후, 적혈구 용해를 수행하였다. PBS/1% FBS를 사용한 광범위한 세척 단계 후, 비장 세포를 96-웰 플레이트에 시딩하였다(웰 당 2×106개 세포). 세포를 2.5 ㎍/ml의 항CD28 항체 (BD Biosciences) 및 단백질 이동 억제제의 존재 하에 37℃에서 6시간 동안 CSP 펩타이드 (1 ㎍/ml)의 혼합물로 자극하였다. 자극 후에, 세포를 세척하고, 제조사의 지침에 따라 Cytofix/CytopermTM 시약 (BD Biosciences)을 이용하여 세포 내 사이토카인에 대하여 염색하였다. 하기 항체를 염색에 사용하였으며: Thy1.2-FITC (1:100), CD8-PE-Cy7 (1:200), TNF-PE (1:100), IFNγ-APC (1:100) (eBioscience), CD4-BD Horizon V450 (1:200) (BD Biosciences), 1:100으로 희석된 Fcγ-블록으로 배양하였다. Aqua Dye를 살아 있는/죽은 세포를 구별하기 위하여 사용하였다 (Invitrogen). 세포는 BD FACS Canto II 유세포 분석기 (Becton Dickinson)를 이용하여 획득되었다. 유세포 분석 데이터를 FlowJo software (Tree Star, Inc.)를 이용하여 분석하였다. 결과를 도 29, 30, 32 및 33에 나타낸다.
결과:
도 31, 34 및 35에 나타내어진 바와 같이, LNP 제제화된 CSP mRNA 백신은 ㅁ마우스에서 강한 체액 면역을 유도하였다 (LNP33-제제 제외, 도 31 참조). LNP (LNP28 및 LNP32)를 포함하는 C26-지질에 대한 IgG1-농도는 최신 기술의 LNP 제제 (LNP-C)에 비해 더 높았다는 점에 유의한다. 도 35 참조.
도 29, 30, 32 및 33에 나타내어진 바와 같이, LNP 제제화된 CSP mRNA 백신은 마우스에서 세포 면역 반응을 유도하였다 (CD4+ [도 29 및 32] 및 CD8+ [도 30 및 33] T 세포 반응).
CD8+ T 세포가 말라리아 기생충에 의한 세포 내 감염에 대한 주요 보호 면역 메커니즘이므로, 효과적인 말라리아 백신은 강한 CD8+ T 세포 반응을 유도하여야 한다. 따라서, 이러한 발견은 본 발명의 GN01 제제의 유리한 특징 중 하나를 강조한다.
실시예 23: HEXA-C5DE-역전-PipSS의 합성
HEXA-C5DE-역전-PipSS의 합성을 위하여, 포타슘 티오아세테이트를 토실레이트 11으로 알킬화하여 티오아세테이트 유도체 12를 정량적 수율로 얻었다. 디설파이드 유도체 13의 형성은 MeOH 중 수성 NaOH에 의해 이루어졌으며, 정제 후, 13은 80%로 수득되었다. HCl로 Boc-탈보호하여 정량적 수율로 14를 수득하였다. 2-브로모에탄올에 의한 화합물 16으로의 직접적 알킬화는 실패하였다. 따라서, 알데히드 19에 의한 14의 환원성 알킬화를 수행하여, TBDMS-보호된 디올 16'을 수득하였다. TBAF에 의한 후속적인 탈보호에 의해 16으로 깨끗하게 전환되었다. 생성물을 잔류 TBA-염으로부터 완전히 분리할 수 없었기 때문에, 이를 그대로 카르복실산 21과의 최종 커플링에 이용하였다. 이 카르복실산은 알코올 20을 글루타르산 무수물로 처리하여 제조하였으며, 21을 34-40%로 수득하였다. 21과 16의 최종 커플링은 성공적으로 테스트되었으며, HEXA-C5DE-역전-PiPSS를 제공하였으나, 낮은 수율(23%) 및 불충분한 순도로 분리되었다. 스케일-업은 초기에 단지 9%의 HEXA-C5DE-역전-PiPSSin만 제공하였다. 그러나, 대규모 추출 단계에서 하나의 산 모이어티만이 16에 결합된 중간체를 함유하는 MeCN-층으로부터 물질이 분리되었다. 이 물질은 동일한 조건을 사용하여 최종 생성물을 향한 커플링에 성공적으로 재사용되었으며, 불순한 배치와 함께 이 물질을 정제하여 43% 및 원하는 순도로 HEXA-C5DE-역전-PiPSS를 제공하였다.
반응식
Figure pct00251
실시예 24: HEXA-C5DE-Pip-C3 티오에테르의 합성
HEXA-C5DE-Pip-C3 티오에테르에 대한 경로는 디올 22의 메실화로 시작되었으며, 이는 비스메실화된 유도체 23을 99%로 제공하였다. 후속적인 치환은 68%로 비스아민 24를 제공하였다. 카르복실산 21에 의한 최종 에스테르화는 추출 및 플래쉬 크로마토그래피 후에 23%의 HEXA-C5DE-Pip-C3 티오에테르를 제공하였다.
반응식
Figure pct00252
실시예 25: THIOETER의 합성
THIOETER의 합성을 위하여, 디카르복실산 유도체 3와 4-피페리딘에탄올의 커플링은 비스아미드 4를 86%로 제공하였다. LiAlH4에 의한 후속적인 환원은 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제한 후, 24%의 5를 제공하였다. 상업적으로 이용가능한 Vitamin E 유도체 6과의 최종 커플링은 52%의 THIOETER를 제공하였으며, 이는 헵탄과 MeCN 사이의 추출 및 이어서 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제되었다.
반응식
Figure pct00253
실시예 26: C3SS의 합성
C3SS에 대한 경로는 7의 이량체화로 시작되었으며, 정량적 수율로 8을 제공하였다. 메실화는 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하나 후 70%로 9를 제공하였다. 4-피페리딘에탄올과의 후속적인 커플링에 의해 33%로 10을 수득하였다. 6과의 후속적인 커플링은 추출 및 플래쉬 정제 후 51%의 C3SS를 제공하였다
반응식
Figure pct00254
실시예 P1: 토끼의 근육 내 주사는 HEXA 제트 주사의 높은 항체 수준을 산출함
토끼에게 상기 기재된 HEXA 및 HEAD 지질을 기반으로 하는 GN01 LNP 및 LNP에서 제제화된 항체를 코딩하는 상이한 mRNA를 i.m. 주사하였다. 주사를 위하여, 통상적인 바늘 주사 또는 바늘 없는 주사가 적용되며, 바늘 없는 주사는 제트 주사(PharmaJet i.m. 장치)를 이용하여 수행된다.
각각의 그룹은 10마리의 동물로 이루어진다. 토끼는 10개 시점에서 채혈된다: day 0 (주사 전), day 1, day 3, day 5, day 7, day 9, day 11, day 14, day 21, day 28. 혈청에서 IgG 농도를 평가하기 위하여, 인간 Fc-특이적 ELISA는 생산된 항체의 판독 역할을 한다(IgG ELISA).
실시예 P2: 마우스에서 피부 내 및 근육 내 주사 후 폴리머 컨쥬게이트 지질 성분의 생체 내 효과
생체 내 PEG 성분의 효과를 분석하기 위하여, 실시예 7로부터의 LNP를 생체 내 설정에서 유사하게 사용한다. PpLuc 대신에, 상기 기재된 hEpo mRNA를 화물로 사용한다. 생체 내 분석을 위하여, 6 내지 8주령 Balb/C 마우스 (그룹 당 5마리 마우스)에 0.5 mg/kg LNP 제제화된 hEpo를 주사한다. EDTA 혈장 샘플링은 주사 후 6 h 및 24 h에 수행된다; 하나의 그룹에는 피부 내 경로를 통하여 hEpo가 투여되고, 다른 그룹에는 근육 내 경로를 통하여 hEpo가 투여된다.
결과:
생체 내 분석은 실시예 7에 나타낸 시험관 내 실험의 결과, 즉 더 짧은 알킬 사슬 (C8)을 갖는 폴리머 컨쥬게이트 지질의 뚜렷한 효과, 즉 주사 후 6시간 및 24시간 후에 더 높은 hEpo 발현을 나타내는 것을 확인시켜준다.
실시예 P3:
하기 백신은 생체 내 백신 접종 분석에 사용되는 표준 mRNA에 의해 제제화되며, 마우스에서 생체 내 백신 접종을 위하여 테스트된다.
[표 P-1: 표 Ex-2, 표 Ex-8 및 표 Ex-25에 따른 LCP에 대한 백신 접종 계획]
Figure pct00255
** 표 Ex-2 참조
*** 표 Ex-8 참조: "조성물 B", GN-CISE-001 : Chol : DPhyPE : DMG-PEG 2000
**** 표 Ex-25 참조
<110> CureVac AG <120> Novel lipid nanoparticles for Delivery of Nucleic Acids <130> P22MP010/KR <150> PCT/EP2019/086825 <151> 2019-12-20 <160> 71 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak sequence <400> 1 gccgccacca tgg 13 <210> 2 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak sequence <400> 2 gccgccacca ugg 13 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> histone stem-loop <400> 3 caaaggctct tttcagagcc acca 24 <210> 4 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> histone stem-loop <400> 4 caaaggcucu uuucagagcc acca 24 <210> 5 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBA1 3'-UTR <400> 5 gctggagcct cggtggccat gcttcttgcc ccttgggcct ccccccagcc cctcctcccc 60 ttcctgcacc cgtacccccg tggtctttga ataaagtctg agtgggcggc 110 <210> 6 <211> 110 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBA1 3'-UTR <400> 6 gcuggagccu cgguggccau gcuucuugcc ccuugggccu ccccccagcc ccuccucccc 60 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<213> Artificial Sequence <220> <223> muag 3'-UTR <400> 11 gcccgatggg cctcccaacg ggccctcctc ccctccttgc accg 44 <210> 12 <211> 44 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> muag 3'-UTR <400> 12 gcccgauggg ccucccaacg ggcccuccuc cccuccuugc accg 44 <210> 13 <211> 186 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> albumin 3'-UTR <400> 13 catcacattt aaaagcatct cagcctacca tgagaataag agaaagaaaa tgaagatcaa 60 aagcttattc atctgttttt ctttttcgtt ggtgtaaagc caacaccctg tctaaaaaac 120 ataaatttct ttaatcattt tgcctctttt ctctgtgctt caattaataa aaaatggaaa 180 gaatct 186 <210> 14 <211> 186 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> albumin 3'-UTR <400> 14 caucacauuu aaaagcaucu cagccuacca ugagaauaag agaaagaaaa ugaagaucaa 60 aagcuuauuc aucuguuuuu cuuuuucguu gguguaaagc caacacccug ucuaaaaaac 120 auaaauuucu uuaaucauuu ugccucuuuu cucugugcuu caauuaauaa aaaauggaaa 180 gaaucu 186 <210> 15 <211> 186 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> albumin7 3'-UTR <400> 15 catcacattt aaaagcatct cagcctacca tgagaataag agaaagaaaa tgaagatcaa 60 tagcttattc atctcttttt ctttttcgtt ggtgtaaagc caacaccctg tctaaaaaac 120 ataaatttct ttaatcattt tgcctctttt ctctgtgctt caattaataa aaaatggaaa 180 gaacct 186 <210> 16 <211> 186 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> albumin7 3'-UTR <400> 16 caucacauuu aaaagcaucu cagccuacca ugagaauaag agaaagaaaa ugaagaucaa 60 uagcuuauuc aucucuuuuu cuuuuucguu gguguaaagc caacacccug ucuaaaaaac 120 auaaauuucu uuaaucauuu ugccucuuuu cucugugcuu caauuaauaa aaaauggaaa 180 gaaccu 186 <210> 17 <211> 187 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALB7 3'-UTR <400> 17 gcatcacatt taaaagcatc tcagcctacc atgagaataa gagaaagaaa atgaagatca 60 atagcttatt catctctttt tctttttcgt tggtgtaaag ccaacaccct gtctaaaaaa 120 cataaatttc tttaatcatt ttgcctcttt tctctgtgct tcaattaata aaaaatggaa 180 agaacct 187 <210> 18 <211> 187 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ALB7 3'-UTR <400> 18 gcaucacauu uaaaagcauc ucagccuacc augagaauaa gagaaagaaa augaagauca 60 auagcuuauu caucucuuuu ucuuuuucgu ugguguaaag ccaacacccu gucuaaaaaa 120 cauaaauuuc uuuaaucauu uugccucuuu ucucugugcu ucaauuaaua aaaaauggaa 180 agaaccu 187 <210> 19 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PSMB3 3'-UTR <400> 19 ccctgttccc agagcccact tttttttctt tttttgaaat aaaatagcct gtctttc 57 <210> 20 <211> 57 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PSMB3 3'-UTR <400> 20 cccuguuccc agagcccacu uuuuuuucuu uuuuugaaau aaaauagccu gucuuuc 57 <210> 21 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSD17B4 5'-UTR <400> 21 gtcccgcagt cggcgtccag cggctctgct tgttcgtgtg tgtgtcgttg caggccttat 60 tc 62 <210> 22 <211> 62 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSD17B4 5'-UTR <400> 22 gucccgcagu cggcguccag cggcucugcu uguucgugug ugugucguug caggccuuau 60 uc 62 <210> 23 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPL32 (32L4) 5'-UTR <400> 23 ggcgctgcct acggaggtgg cagccatctc cttctcggca tc 42 <210> 24 <211> 42 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPL32 (32L4) 5'-UTR <400> 24 ggcgcugccu acggaggugg cagccaucuc cuucucggca uc 42 <210> 25 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATP5A1 5'-UTR <400> 25 gcggctcggc cattttgtcc cagtcagtcc ggaggctgcg gctgcagaag taccgcctgc 60 ggagtaactg caaag 75 <210> 26 <211> 75 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATP5A1 5'-UTR <400> 26 gcggcucggc cauuuugucc cagucagucc ggaggcugcg gcugcagaag uaccgccugc 60 ggaguaacug caaag 75 <210> 27 <211> 2035 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PpLuc mRNA <400> 27 ggggcgcugc cuacggaggu ggcagccauc uccuucucgg caucaagcuu gaggauggag 60 gacgccaaga acaucaagaa gggcccggcg cccuucuacc cgcuggagga cgggaccgcc 120 ggcgagcagc uccacaaggc caugaagcgg uacgcccugg ugccgggcac gaucgccuuc 180 accgacgccc acaucgaggu cgacaucacc uacgcggagu acuucgagau gagcgugcgc 240 cuggccgagg ccaugaagcg guacggccug aacaccaacc accggaucgu ggugugcucg 300 gagaacagcc ugcaguucuu caugccggug cugggcgccc ucuucaucgg cguggccguc 360 gccccggcga acgacaucua caacgagcgg gagcugcuga acagcauggg gaucagccag 420 ccgaccgugg uguucgugag caagaagggc cugcagaaga uccugaacgu gcagaagaag 480 cugcccauca uccagaagau caucaucaug gacagcaaga ccgacuacca gggcuuccag 540 ucgauguaca cguucgugac cagccaccuc ccgccgggcu ucaacgagua cgacuucguc 600 ccggagagcu ucgaccggga caagaccauc gcccugauca ugaacagcag cggcagcacc 660 ggccugccga aggggguggc ccugccgcac cggaccgccu gcgugcgcuu cucgcacgcc 720 cgggacccca ucuucggcaa ccagaucauc ccggacaccg ccauccugag cguggugccg 780 uuccaccacg gcuucggcau guucacgacc cugggcuacc ucaucugcgg cuuccgggug 840 guccugaugu accgguucga ggaggagcug uuccugcgga gccugcagga cuacaagauc 900 cagagcgcgc ugcucgugcc gacccuguuc agcuucuucg ccaagagcac ccugaucgac 960 aaguacgacc ugucgaaccu gcacgagauc gccagcgggg gcgccccgcu gagcaaggag 1020 gugggcgagg ccguggccaa gcgguuccac cucccgggca uccgccaggg cuacggccug 1080 accgagacca cgagcgcgau ccugaucacc cccgaggggg acgacaagcc gggcgccgug 1140 ggcaaggugg ucccguucuu cgaggccaag gugguggacc uggacaccgg caagacccug 1200 ggcgugaacc agcggggcga gcugugcgug cgggggccga ugaucaugag cggcuacgug 1260 aacaacccgg aggccaccaa cgcccucauc gacaaggacg gcuggcugca cagcggcgac 1320 aucgccuacu gggacgagga cgagcacuuc uucaucgucg accggcugaa gucgcugauc 1380 aaguacaagg gcuaccaggu ggcgccggcc gagcuggaga gcauccugcu ccagcacccc 1440 aacaucuucg acgccggcgu ggccgggcug ccggacgacg acgccggcga gcugccggcc 1500 gcgguggugg ugcuggagca cggcaagacc augacggaga aggagaucgu cgacuacgug 1560 gccagccagg ugaccaccgc caagaagcug cggggcggcg ugguguucgu ggacgagguc 1620 ccgaagggcc ugaccgggaa gcucgacgcc cggaagaucc gcgagauccu gaucaaggcc 1680 aagaagggcg gcaagaucgc cguguaagac uagugcauca cauuuaaaag caucucagcc 1740 uaccaugaga auaagagaaa gaaaaugaag aucaauagcu uauucaucuc uuuuucuuuu 1800 ucguuggugu aaagccaaca cccugucuaa aaaacauaaa uuucuuuaau cauuuugccu 1860 cuuuucucug ugcuucaauu aauaaaaaau ggaaagaacc uagaucuaaa aaaaaaaaaa 1920 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa augcaucccc 1980 cccccccccc cccccccccc cccccccaaa ggcucuuuuc agagccacca gaauu 2035 <210> 28 <211> 858 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HsEPO mRNA <400> 28 gggagagucc cgcagucggc guccagcggc ucugcuuguu cgugugugug ucguugcagg 60 ccuuauucaa gcuuaccaug ggcgugcacg agugccccgc cuggcugugg cuccugcuga 120 gccuccuguc ccugccgcuc gggcugcccg uccugggcgc ccccccgcgg cucaucugcg 180 acagccgcgu gcuggagcgg uaccugcucg aggcgaagga ggccgagaac aucaccaccg 240 ggugcgccga gcacugcucc cugaacgaga acaucacggu gccggacacc aaggucaacu 300 ucuacgccug gaagcgcaug gaggugggcc agcaggccgu ggaggucugg caggggcugg 360 cgcuccugag cgaggccgug cugcggggcc aggcccuccu ggugaacucc agccagcccu 420 gggagccccu gcagcuccac gucgacaagg ccguguccgg ccugcgcagc cugaccaccc 480 uccugcgggc gcugggggcc cagaaggagg ccaucucccc cccggacgcc gccagcgcgg 540 ccccgcuccg cacgaucacc gccgacaccu uccggaagcu guuccgcgug uacuccaacu 600 uccugcgggg caagcucaag cuguacaccg gggaggccug ccgcacgggc gaccggugag 660 gacuaguccc uguucccaga gcccacuuuu uuuucuuuuu uugaaauaaa auagccuguc 720 uuucagaucu aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 780 aaaaaaaaaa aaaaugcauc cccccccccc cccccccccc cccccccccc aaaggcucuu 840 uucagagcca ccagaauu 858 <210> 29 <211> 1975 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MmDCT mRNA <400> 29 agggcgcugc cuacggaggu ggcagccauc uccuucucgg caucaagcuu accaugggcc 60 ugguggggug gggccuccug cuggggugcc ucggcugcgg gauccugcug cgggcccgcg 120 cccaguuccc ccgggucugc augacccucg acggcgugcu gaacaaggag ugcugcccgc 180 cccugggccc cgaggcgacc aacaucugcg gguuccucga gggccgcggg cagugcgccg 240 aggugcagac ggacacccgg cccuggagcg gcccguacau ccugcgcaac caggacgacc 300 gggagcagug gccccgcaag uucuucaacc ggaccugcaa gugcaccggg aacuucgccg 360 gcuacaacug cggcgggugc aaguucggcu ggacggggcc cgacugcaac cgcaagaagc 420 ccgccauccu gcggcgcaac auccacuccc ucaccgccca ggagcgggag caguuccugg 480 gcgcgcugga ccucgccaag aagagcaucc acccggacua cgucaucacc acccagcacu 540 ggcugggccu gcucgggccc aacggcacgc agccccagau cgccaacugc uccguguacg 600 acuucuucgu guggcugcac uacuacagcg uccgcgacac ccugcucggg cccggccggc 660 cguacaaggc caucgacuuc ucccaccagg ggcccgcguu cgugaccugg caccgcuacc 720 accugcugug gcucgagcgg gagcugcagc gccugaccgg caacgagagc uucgcccucc 780 ccuacuggaa 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aguucgacaa gcuguacauc 600 uggggcgucc accaccccgg gaccgacaag gaccagaucu ucccguacgc gcaguccagc 660 gggcgcauca ucgugagcac caagcggucc cagcaggccg ugauccccaa caucggcagc 720 cgcccccgga uccgcgacau cccgucccgg aucagcaucu acuggaccau cgucaagccg 780 ggcgacaucc uccugaucaa cuccacgggg aaccugaucg ccccgcgcgg cuacuucaag 840 cuccggagcg ggaaguccag caucaugcgc uccgacgccc ccaucggcaa gugcaagagc 900 gagugcauca cccccaacgg cuccaucccg aacgacaagc ccuuccagaa cgugaaccgg 960 aucaccuacg gggccugccc ccgcuacgug aagcacagca cccugaagcu ggcgacgggc 1020 augcggaacg uccccgagaa gcagacccgc gggaucuucg gcgccaucgc cggguucauc 1080 gagaacggcu gggagggcau gguggacggg ugguacggcu uccggcacca gaacuccgag 1140 gggcgcggcc aggccgccga ccucaagagc acccaggcgg ccaucgacca gaucaacggg 1200 aagcugaacc ggcugaucgg caagaccaac gagaaguucc accagaucga gaaggaguuc 1260 uccgaggugg agggccgcau ccaggaccuc gagaaguacg ucgaggacac gaagaucgac 1320 cuguggagcu acaacgccga gcugcucgug gcccuggaga accagcacac caucgaccug 1380 accgacuccg agaugaacaa gcucuucgag aagaccaaga agcagcugcg cgagaacgcc 1440 gaggacaugg ggaacggcug cuucaagauc uaccacaagu gcgacaacgc gugcaucggg 1500 agcauccgga acggcacgua cgaccacaac guguaccgcg acgaggcccu gaacaaccgg 1560 uuccagauca agggggucga gcucaagucc ggcuacaagg acuggauccu guggaucagc 1620 uucgccauca gcugcuuccu gcucugcgug gcccugcugg gcuucaucau gugggccugc 1680 cagaagggga acauccgcug caacaucugc aucugaggac uaguuauaag acugacuagc 1740 ccgaugggcc ucccaacggg cccuccuccc cuccuugcac cgagauuaau aaaaaaaaaa 1800 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaugcauc 1860 cccccccccc cccccccccc cccccccccc aaaggcucuu uucagagcca ccagaauu 1918 <210> 38 <211> 1470 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PfCSP mRNA <400> 38 gggagagucc cgcagucggc guccagcggc ucugcuuguu cgugugugug ucguugcagg 60 ccuuauucaa gcuuaccaug augcgcaagc uggccauccu cagcgugucc agcuuccugu 120 ucgucgaggc ccuguuccag gaguaccagu gcuacggcuc cagcuccaac acccgggugc 180 ucaacgagcu gaacuacgac aacgcgggga ccaaccugua caacgagcuc gagaugaacu 240 acuacggcaa gcaggagaac ugguacagcc ugaagaagaa cucccgcagc cugggggaga 300 acgacgacgg caacaacgag gacaacgaga agcuccggaa gcccaagcac aagaagcuga 360 agcagccggc cgacgggaac cccgacccca acgccaaccc caacguggac ccgaacgcca 420 accccaacgu cgaccccaac gccaacccca acguggaccc gaacgcgaac cccaacgcca 480 accccaacgc caaccccaac gccaacccga acgcgaaccc caacgccaac cccaacgcca 540 accccaacgc caacccgaac gccaacccca acgcgaaccc caacgccaac cccaacgcca 600 acccgaacgc caaccccaac gccaacccca acgcgaaccc caacgccaac ccgaacgcca 660 accccaacgu ggaccccaac gccaacccca acgccaaccc gaacgcgaac cccaacgcca 720 accccaacgc caacccgaac gccaacccca acgccaaccc caacgcgaac cccaacgcca 780 acccgaacgc caaccccaac gccaacccca acgcgaaccc caacgccaac ccgaacgcca 840 accccaacgc caaccccaac gccaacccca acgcgaaccc gaacgccaac cccaacaaga 900 acaaccaggg caacggccag gggcacaaca ugcccaacga ccccaaccgc aacgucgacg 960 agaacgccaa cgccaacucc gccgugaaga acaacaacaa cgaggagccg agcgacaagc 1020 acaucaagga guaccugaac aagauccaga acucccucag cacggagugg ucccccugca 1080 gcgugaccug cggcaacggg auccaggucc ggaucaagcc cggcuccgcg aacaagccca 1140 aggacgagcu ggacuacgcc aacgacaucg agaagaagau cugcaagaug gagaagugca 1200 gcuccguguu caacgugguc aacagcucca ucgggcugau cauggugcuc agcuuccugu 1260 uccugaacug aggacuaguc ccuguuccca gagcccacuu uuuuuucuuu uuuugaaaua 1320 aaauagccug ucuuucagau cuaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaugca uccccccccc cccccccccc cccccccccc 1440 ccaaaggcuc uuuucagagc caccagaauu 1470 <210> 39 <211> 847 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HsFGF21 mRNA <400> 39 aggagagucc cgcagucggc guccagcggc ucugcuuguu cgugugugug ucguugcagg 60 ccuuauucaa gcuuaccaug gacucggacg agaccggguu cgagcacuca ggacuguggg 120 uuucugugcu ggcuggucuu cugcugggag ccugccaggc acaccccauc ccugacucca 180 guccucuccu gcaauucggg ggccaagucc ggcagcggua ccucuacaca gaugaugccc 240 agcagacaga agcccaccug gagaucaggg aggaugggac gguggggggc gcugcugacc 300 agagccccga aagucuccug cagcugaaag ccuugaagcc gggaguuauu caaaucuugg 360 gagucaagac auccagguuc cugugccagc ggccagaugg ggcccuguau ggaucgcucc 420 acuuugaccc ugaggccugc agcuuccggg agcggcuucu ugaggacgga uacaauguuu 480 accaguccga agcccacggc cucccgcugc accucccagg gaacaagucc ccacaccggg 540 acccugcacc ccgaggacca gcucgcuucc ugccacuacc aggccugccc cccgcacucc 600 cggagccacc cggaauccug gccccccagc cccccgaugu gggcuccucg gacccucuga 660 gcaugguggg agguucccag ggccgaagcc ccagcuacga guccugagga cuagucccug 720 uucccagagc ccacuuuuuu uucuuuuuuu gaaauaaaau agccugucuu ucagaucuaa 780 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 840 aagaauu 847 <210> 40 <211> 1470 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PfCSP mRNA <400> 40 aggagagucc cgcagucggc guccagcggc ucugcuuguu cgugugugug ucguugcagg 60 ccuuauucaa gcuuaccaug augcgcaagc uggccauccu cagcgugucc agcuuccugu 120 ucgucgaggc ccuguuccag gaguaccagu gcuacggcuc cagcuccaac acccgggugc 180 ucaacgagcu gaacuacgac aacgcgggga ccaaccugua caacgagcuc gagaugaacu 240 acuacggcaa gcaggagaac ugguacagcc ugaagaagaa cucccgcagc cugggggaga 300 acgacgacgg caacaacgag gacaacgaga agcuccggaa gcccaagcac aagaagcuga 360 agcagccggc cgacgggaac cccgacccca acgccaaccc caacguggac ccgaacgcca 420 accccaacgu cgaccccaac gccaacccca acguggaccc gaacgcgaac cccaacgcca 480 accccaacgc caaccccaac gccaacccga acgcgaaccc caacgccaac cccaacgcca 540 accccaacgc caacccgaac gccaacccca acgcgaaccc caacgccaac cccaacgcca 600 acccgaacgc caaccccaac gccaacccca acgcgaaccc caacgccaac ccgaacgcca 660 accccaacgu ggaccccaac gccaacccca acgccaaccc gaacgcgaac cccaacgcca 720 accccaacgc caacccgaac gccaacccca acgccaaccc caacgcgaac cccaacgcca 780 acccgaacgc caaccccaac gccaacccca acgcgaaccc caacgccaac ccgaacgcca 840 accccaacgc caaccccaac gccaacccca acgcgaaccc gaacgccaac cccaacaaga 900 acaaccaggg caacggccag gggcacaaca ugcccaacga ccccaaccgc aacgucgacg 960 agaacgccaa cgccaacucc gccgugaaga acaacaacaa cgaggagccg agcgacaagc 1020 acaucaagga guaccugaac aagauccaga acucccucag cacggagugg ucccccugca 1080 gcgugaccug cggcaacggg auccaggucc ggaucaagcc cggcuccgcg aacaagccca 1140 aggacgagcu ggacuacgcc aacgacaucg agaagaagau cugcaagaug gagaagugca 1200 gcuccguguu caacgugguc aacagcucca ucgggcugau cauggugcuc agcuuccugu 1260 uccugaacug aggacuaguc ccuguuccca gagcccacuu uuuuuucuuu uuuugaaaua 1320 aaauagccug ucuuucagau cuaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1380 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaugca uccccccccc cccccccccc cccccccccc 1440 ccaaaggcuc uuuucagagc caccagaauu 1470 <210> 41 <211> 128 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end A64-N5-C30-histoneSL-N5 <400> 41 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaugcauc cccccccccc cccccccccc cccccccccc aaaggcucuu uucagagcca 120 ccagaauu 128 <210> 42 <211> 129 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end histoneSL-A100-N5 <400> 42 caaaggcucu uuucagagcc accaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaagaauu 129 <210> 43 <211> 93 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end histoneSL-A64-N5 <400> 43 caaaggcucu uuucagagcc accaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaga auu 93 <210> 44 <211> 105 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end A100-N5 <400> 44 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gaauu 105 <210> 45 <211> 69 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end A64-N5 <400> 45 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaagaauu 69 <210> 46 <211> 124 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end histoneSL-A100 <400> 46 caaaggcucu uuucagagcc accaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaa 124 <210> 47 <211> 88 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end histoneSL-A64 <400> 47 caaaggcucu uuucagagcc accaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 88 <210> 48 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end A100 <400> 48 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 100 <210> 49 <211> 64 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end A64 <400> 49 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaa 64 <210> 50 <211> 93 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end A64-histoneSL-N5 <400> 50 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaacaaagg cucuuuucag agccaccaga auu 93 <210> 51 <211> 134 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N6-A64-N5-C30-histoneSL-N5 <400> 51 auuaauaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa ugcauccccc cccccccccc cccccccccc ccccccaaag gcucuuuuca 120 gagccaccag aauu 134 <210> 52 <211> 134 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N6-A64-N5-C30-histoneSL-N5 <400> 52 agaucuaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa ugcauccccc cccccccccc cccccccccc ccccccaaag gcucuuuuca 120 gagccaccag aauu 134 <210> 53 <211> 135 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N6-histoneSL-A100-N5 <400> 53 auuaaucaaa ggcucuuuuc agagccacca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa gaauu 135 <210> 54 <211> 135 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N6-histoneSL-A100-N5 <400> 54 agaucucaaa ggcucuuuuc agagccacca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa gaauu 135 <210> 55 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N6-histoneSL-A64-N5 <400> 55 auuaaucaaa ggcucuuuuc agagccacca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaagaauu 99 <210> 56 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N6-histoneSL-A64-N5 <400> 56 agaucucaaa ggcucuuuuc agagccacca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaagaauu 99 <210> 57 <211> 111 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N6-A100-N5 <400> 57 auuaauaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaagaau u 111 <210> 58 <211> 111 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N6-A100-N5 <400> 58 agaucuaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaagaau u 111 <210> 59 <211> 75 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N6-A64-N5 <400> 59 auuaauaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa gaauu 75 <210> 60 <211> 75 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N6-A64-N5 <400> 60 agaucuaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa gaauu 75 <210> 61 <211> 130 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N6-histoneSL-A100 <400> 61 auuaaucaaa ggcucuuuuc agagccacca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa 130 <210> 62 <211> 130 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N6-histoneSL-A100 <400> 62 agaucucaaa ggcucuuuuc agagccacca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120 aaaaaaaaaa 130 <210> 63 <211> 94 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N6-histoneSL-A64 <400> 63 auuaaucaaa ggcucuuuuc agagccacca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 94 <210> 64 <211> 94 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N6-histoneSL-A64 <400> 64 agaucucaaa ggcucuuuuc agagccacca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 94 <210> 65 <211> 106 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N6-A100 <400> 65 auuaauaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 106 <210> 66 <211> 106 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N6-A100 <400> 66 agaucuaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 106 <210> 67 <211> 70 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N6-A64 <400> 67 auuaauaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa 70 <210> 68 <211> 70 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N6-A64 <400> 68 agaucuaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa 70 <210> 69 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N6-A64-histoneSL-N5 <400> 69 auuaauaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa caaaggcucu uuucagagcc accagaauu 99 <210> 70 <211> 99 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA 3'-end N6-A64-histoneSL-N5 <400> 70 agaucuaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa caaaggcucu uuucagagcc accagaauu 99 <210> 71 <211> 1925 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PpLuc mRNA <400> 71 aggagagucc cgcagucggc guccagcggc ucugcuuguu cgugugugug ucguugcagg 60 ccuuauucaa gcuuaccaug gaggacgcca agaacaucaa gaagggcccg gcgcccuucu 120 acccgcugga ggacgggacc gccggcgagc agcuccacaa ggccaugaag cgguacgccc 180 uggugccggg cacgaucgcc uucaccgacg cccacaucga ggucgacauc accuacgcgg 240 aguacuucga gaugagcgug cgccuggccg aggccaugaa gcgguacggc cugaacacca 300 accaccggau cguggugugc ucggagaaca gccugcaguu cuucaugccg gugcugggcg 360 cccucuucau cggcguggcc gucgccccgg cgaacgacau cuacaacgag cgggagcugc 420 ugaacagcau ggggaucagc cagccgaccg ugguguucgu gagcaagaag ggccugcaga 480 agauccugaa cgugcagaag aagcugccca ucauccagaa gaucaucauc auggacagca 540 agaccgacua ccagggcuuc cagucgaugu acacguucgu gaccagccac cucccgccgg 600 gcuucaacga guacgacuuc gucccggaga gcuucgaccg ggacaagacc aucgcccuga 660 ucaugaacag cagcggcagc accggccugc cgaagggggu ggcccugccg caccggaccg 720 ccugcgugcg cuucucgcac gcccgggacc ccaucuucgg caaccagauc aucccggaca 780 ccgccauccu gagcguggug ccguuccacc acggcuucgg cauguucacg acccugggcu 840 accucaucug cggcuuccgg gugguccuga uguaccgguu cgaggaggag cuguuccugc 900 ggagccugca ggacuacaag auccagagcg cgcugcucgu gccgacccug uucagcuucu 960 ucgccaagag cacccugauc gacaaguacg accugucgaa ccugcacgag aucgccagcg 1020 ggggcgcccc gcugagcaag gaggugggcg aggccguggc caagcgguuc caccucccgg 1080 gcauccgcca gggcuacggc cugaccgaga ccacgagcgc gauccugauc acccccgagg 1140 gggacgacaa gccgggcgcc gugggcaagg uggucccguu cuucgaggcc aagguggugg 1200 accuggacac cggcaagacc cugggcguga accagcgggg cgagcugugc gugcgggggc 1260 cgaugaucau gagcggcuac gugaacaacc cggaggccac caacgcccuc aucgacaagg 1320 acggcuggcu gcacagcggc gacaucgccu acugggacga ggacgagcac uucuucaucg 1380 ucgaccggcu gaagucgcug aucaaguaca agggcuacca gguggcgccg gccgagcugg 1440 agagcauccu gcuccagcac cccaacaucu ucgacgccgg cguggccggg cugccggacg 1500 acgacgccgg cgagcugccg gccgcggugg uggugcugga gcacggcaag accaugacgg 1560 agaaggagau cgucgacuac guggccagcc aggugaccac cgccaagaag cugcggggcg 1620 gcgugguguu cguggacgag gucccgaagg gccugaccgg gaagcucgac gcccggaaga 1680 uccgcgagau ccugaucaag gccaagaagg gcggcaagau cgccguguga ggacuagucc 1740 cuguucccag agcccacuuu uuuuucuuuu uuugaaauaa aauagccugu cuuucagauc 1800 ucaaaggcuc uuuucagagc caccaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1860 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1920 aaaaa 1925

Claims (58)

1. 화학식 (Ⅰ):
[화학식 Ⅰ]
Ra-A-Rb
에 따른 양이온성 지질, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 프로드러그(prodrug) 또는 입체이성질체(stereoisomer)로서,
상기 식에서,
Ra는
Figure pct00256
,
Figure pct00257
,
Figure pct00258
,
Figure pct00259
,
Figure pct00260
,
Figure pct00261
, 또는
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4로부터 선택되며;
Rb는
Figure pct00262
,
Figure pct00263
,
Figure pct00264
,
-R1-N(H)-C(O)-R3-R4, 또는
-R1-N(CH3)2로부터 선택되며;
A는 -S-, -S-S-, -NH-C(O)-, -NH-C(O)O-, -NH-C(O)-NH-, -S-C(O)-N(H)-, -C(O)O-, 또는 -O-P(O)(OH)-O-이며;
R1은 에탄디일, 프로판디일, 부탄디일, 또는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 비분지형 알칸디일이며, 여기에서, 각각의 치환가능한 탄소 원자는 비치환되거나 또는 일 이상의 C1-C4 알킬, C1-C4 알케닐렌, C3-C8 사이클로알킬렌, 또는 C3-C8 사이클로알케닐렌으로 치환되며;
R2는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
R3는 선택적이며, 존재하는 경우, -R5-C(O)-O-, -R5-O-C(O)-, -R5-C(O)-NH-, -R5-OC(O)-NH-, 또는 R5-NH-C(O)O-이며;
R4는 12 내지 36개의 탄소 원자를 갖는 친유성 치환기이며, 여기에서, 12 내지 36개의 탄소 원자를 갖는 친유성 치환기는 (ⅰ) 12 내지 25개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬 또는 알케닐이거나, 또는 (ⅱ) 토코페롤 또는 토코트레이놀로부터 유래되며;
R5는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며;
X는 수소 원자에 결합된 탄소 원자(CH), 또는 질소 원자이며;
여기서 모든 선택은 서로 독립적인
양이온성 지질.
제1항에 있어서,
R4는 (ⅰ) 12 내지 25개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬 또는 알케닐이거나, 또는 (ⅱ) 구조식 1에 나타내어진 토코페롤 및 토코트레이놀의 유도체로부터 선택되는
양이온성 지질.
제1항 또는 제2항에 있어서,
R4는
Figure pct00265
,
Figure pct00266
,
Figure pct00267
,
Figure pct00268
, 및
Figure pct00269

로 이루어진 군으로부터 각각의 경우 독립적으로 선택되는
양이온성 지질.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
(ⅰ) R3가 -R5-C(O)-O-로 존재하고, (ⅱ) R1 및 R2는 선형 비치환된 에탄디일이고, (ⅲ) R5가 선형 비치환된 에탄디일, 선형 비치환된 프로판디일 또는 선형 비치환된 부탄디일이며, (ⅳ) A가 -S-S-이고, (ⅴ) Ra 및 Rb가 동일한 경우, R4 는
Figure pct00270

이 아니며,
(ⅰ) R3가 존재하고, (ⅱ) R1 및 R2는 선형 비치환된 에탄디일이며, (ⅲ) A가 -S-S-이고, (ⅳ) Ra 및 Rb가 동일한 경우, R4 는
Figure pct00271
및
Figure pct00272

이 아닌
양이온성 지질.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
A는 -S-인
양이온성 지질.
제1항 또는 제2항에 있어서,
R3는 존재하고, -R5-C(O)-O-, -R5-O-C(O)-, -R5-C(O)-NH-, -R5-OC(O)-NH-, 및 R5-NH-C(O)O-로 이루어진 군으로부터 선택되며; 및 R4는 12 내지 25개의 탄소 원자를 갖는 선형 또는 분지형 알킬 또는 알케닐인
양이온성 지질.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
Ra 및 Rb는
Figure pct00273
,
Figure pct00274

(상기 식에서, X는 CH 또는 -R1-N(H)-C(O)-R3-R4임)
로부터 독립적으로 선택되는
양이온성 지질.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
Ra 및 Rb는 각각
Figure pct00275

(상기 식에서, X는 CH임)이며,
R3는 존재하고, R5는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며, 각각의 경우에 독립적으로 선택되는
양이온성 지질.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
R3는 존재하고, -R5-C(O)-O- 또는 -R5-O-C(O)-이며;
R4 는
Figure pct00276
, 또는
Figure pct00277

이며;
Ra 및 Rb는 동일한
양이온성 지질.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
R3는 존재하고, -R5-C(O)-O- 또는 -R5-O-C(O)-이며;
R4 는
Figure pct00278

이며;
Ra 및 Rb는 동일한
양이온성 지질.
제9항 또는 제10항에 있어서,
R3는 -R5-C(O)-O-인
양이온성 지질.
제7항 또는 제8항에 있어서,
R1은 에탄디일인
양이온성 지질.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
각각의 경우에 독립적으로 선택되는 하기 특징의 일 이상을 더 나타내는
양이온성 지질:
(ⅰ) R1은 비치환된 에탄디일, 프로판디일, 또는 부탄디일이며;
(ⅱ) R2는 2 내지 8개의 탄소 원자를 갖는 선형 및 비분지형 알칸디일이며;
(ⅲ) R3는 -R5-C(O)-O- 또는 -R5-O-C(O)-이며;
(ⅳ) R5는 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알칸디일이며; 및/또는
(ⅵ) X는 CH이다.
제1항에 있어서,
표 1에 열거된 화합물의 하나로부터 선택되는
양이온성 지질.
(ⅰ) 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 양이온성 지질;
(ⅱ) 표 1에 열거된 양이온성 지질 C15;
(ⅲ) 표 1에 열거된 양이온성 지질 C2; 또는
(ⅳ) 표 1에 열거된 양이온성 지질 C26을 포함하는
조성물.
제15항에 있어서,
일 이상의 하기 부형제:
(ⅰ) 스테로이드, 바람직하게 콜레스테롤;
(ⅱ) 중성 지질; 및/또는
(ⅲ) 폴리머 컨쥬게이트 지질(polymer conjugated lipid)
을 더 포함하며,
상기 중성 지질은 바람직하게 선택적으로 중성 지질 1,2-디헵타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DHPC)과 조합된, 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPhyPE)이며; 또는 상기 중성 지질은 펜타노일, 헥사노일, 헵타노일, 옥타노일, 노나오일 및 데카노일로부터 선택되는 2개의 지방산 모이어티를 갖는 즈비터 이온성 화합물과 조합된, 즈비터 이온성 화합물, 선택적으로 미리스토일, 팔미토일, 스테아로일 및 올레이올로부터 선택되는 2개의 지방산 모이어티를 갖는 즈비터 이온성 화합물이며;
상기 폴리머 컨쥬게이트 지질은 화학식 (Ⅱ):
[화학식 Ⅱ]
P-A-L
에 따른 화합물이며,
상기 식에서,
P는 친수성 폴리머 모이어티이며, A는 선택적 링커이며, L은 지질 모이오티이며,
바람직하게, 폴리머 컨쥬게이트 지질은 페길화 지질(pegylated lipid)인
조성물.
일 이상의 하기 부형제:
(ⅰ) 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 양이온성 지질 또는 3급 또는 4급 질소 / 아미노기를 포함하는 양이온성 지질 또는 생리학적 pH에서 순 양전하를 띠는 양이온성 지질;
(ⅱ) 스테로이드, 바람직하게 콜레스테롤;
(ⅲ) 제16항의 하위항목 (ⅱ)에 기재된 중성 지질; 및/또는
(ⅳ) 폴리머 컨쥬게이트 지질
을 포함하며,
여기에서, 상기 폴리머 컨쥬게이트 지질은 화학식 (Ⅱ):
[화학식 Ⅱ]
P-A-L
에 따른 화합물이며,
상기 식에서, P는 친수성 폴리머 모이어티이며, A는 선택적 링커이며, L은 지질 모이어티이며,
바람직하게, 폴리머 컨쥬게이트 지질은 페길화 지질이며;
더욱 바람직하게, 지질 모이어티 L은 8, 10 또는 12개의 탄소 원자, 바람직하게 8 또는 10개의 탄소 원자를 포함하는 적어도 하나의 지방산 ("테일")을 포함하며;
더욱더 바람직하게, 페길화 지질은 1,2-디카프릴-rac-글리세로-3-메틸폴리옥시에틸렌 글리콜 2000 (C10-PEG 2000); 및 N-옥타노일-스핑고신-1-{석시닐[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)2000]} (Cer8-PEG 2000)로 이루어진 군으로부터 선택되는
조성물.
일 이상의 하기 부형제:
(ⅰ) 제17항의 하위항목 (ⅰ)에 기재된 양이온성 지질;
(ⅱ) 스테로이드, 바람직하게 콜레스테롤;
(ⅲ) 제16항의 하위항목 (ⅱ)에 기재된 중성 지질, 또는 바람직하게 2개의 중성 지질의 조합, 여기에서 이 조합은 적어도 2개의 알킬 사슬을 갖는 중성 지질 또는 인지질을 포함하며, 이에 의해 각각의 알킬 사슬은 독립적으로 바람직하게 C6, C7, C8, C9, 또는 C10의 길이, 더욱 바람직하게 C6, C7, C8의 길이, 가장 바람직하게 C7의 길이, 더욱 가장 바람직하게 DHPC (1,2-디렙타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 5:0 PC (1,2-디펜타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 04:0 PC (1,2-디부티릴-sn-글리세로-3-포스포콜린), 06:0 PC (DHPC, 1,2-디헥사노일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 08:0 PC (1,2-디옥타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 및 09:0 PC (1,2-디노난노일-sn-글리세로-3-포스포콜린)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인지질이며; 및/또는
(ⅳ) 폴리머 컨쥬게이트 지질
을 포함하며,
여기에서, 상기 폴리머 컨쥬게이트 지질은 화학식 (Ⅱ):
[화학식 Ⅱ]
P-A-L
에 따른 화합물이며,
상기 식에서, P는 친수성 폴리머 모이어티이며 A는 선택적 링커이며, L은 지질 모이어티이며;
바람직하게, 폴리머 컨쥬게이트 지질은 페길화 지질이며;
더욱 바람직하게, 페길화 지질은 1,2-디미리스토일-rac-글리세로-3-메톡시폴리에틸렌 글리콜 2000 (DMG-PEG 2000)로부터 선택되는
조성물.
제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
바람직하게 조성물은 하기:
(a-i) 30-70 mol% 양의 양이온성 지질; 20-50 mol% 양의 스테로이드; 5-25 mol% 양의 중성 지질; 및 0.5-5 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(a-ⅱ) 40-70 mol% 양의 양이온성 지질; 20-50 mol% 양의 스테로이드; 5-15 mol% 양의 중성 지질; 및 0.5-5 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(a-ⅲ) 20-60 mol% 양의 양이온성 지질; 25-55 mol% 양의 스테로이드; 5-25 mol% 양의 인지질; 및 0.5-15 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(a-ⅳ) 45-65 mol% 양의 양이온성 지질; 25-45 mol% 양의 스테로이드; 8-12 mol% 양의 인지질; 및 1-3 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(a-ⅴ) 45-65 mol% 양의 양이온성 지질; 25-45 mol% 양의 콜레스테롤; 8-12 mol% 양의 중성 지질; 및 1-3 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(a-ⅵ) 45-65 mol% 양의 양이온성 지질; 25-45 mol% 양의 콜레스테롤; 8-12 mol% 양의 DPhyPE 및 선택적으로 1 내지 10 mol% 양의 DHPC, 및 1-3 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질; 및
(a-ⅵ) 45-65 mol% 양의 양이온성 지질; 25-45 mol% 양의 콜레스테롤; 8-12 mol% 양의 DPhyPE 및 선택적으로 1 내지 10 mol% 양의 DHPC, 및 P1-3 mol% 양의 PEG-DMG 2000
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비율로 부형제를 포함하거나, 또는
더욱 바람직하게 조성물은 하기:
(b-i) 59 mol% 양의 양이온성 지질; 29.3 mol% 양의 스테로이드; 10 mol% 양의 중성 지질; 및 1.7 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(b-ⅱ) 59 mol% 양의 양이온성 지질; 29.3 mol% 양의 콜레스테롤; 10 mol% 양의 중성 지질; 및 1.7 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(b-ⅲ) 59 mol% 양의 양이온성 지질; 29.3 mol% 양의 콜레스테롤; 10 mol% 양의 DPhyPE; 및 1.7 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(b-ⅳ) 59 mol% 양의 양이온성 지질; 29.3 mol% 양의 콜레스테롤; 10 mol% 양의 DPhyPE; 및 1.7% 양의 C10-PEG 2000;
(b-ⅴ) 59 mol% 양의 양이온성 지질; 29.3 mol% 양의 콜레스테롤; 10 mol% 양의 DPhyPE; 및 1.7% 양의 Cer8-PEG 2000;
(b-ⅵ) 59 mol% 양의 양이온성 지질; 28.3 mol% 양의 스테로이드; 11 mol% 양의 중성 지질; 및 1.7 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(bⅶ) 59 mol% 양의 양이온성 지질; 28.3 mol% 양의 콜레스테롤; 11 mol% 양의 중성 지질; 및 1.7 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(b-ⅷ) 59 mol% 양의 양이온성 지질; 28.3 mol% 양의 콜레스테롤; 10 mol% 양의 DPhyPE 및 1 mol% 양의 DHPC; 및 1.7 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(b-ⅸ) 59 mol% 양의 양이온성 지질; 28.3 mol% 양의 콜레스테롤; 10 mol% 양의 DPhyPE 및 1 mol% 양의 DHPC; 및 1.7% 양의 C10-PEG 2000; 및
(b-ⅹ) 59 mol% 양의 양이온성 지질; 28.3 mol% 양의 콜레스테롤; 10 mol% 양의 DPhyPE 및 1 mol% 양의 DHPC; 및 1.7% 양의 Cer8-PEG 2000;
(b-ⅹi) 49 mol% 양의 양이온성 지질; 29.3 mol% 양의 스테로이드; 20 mol% 양의 중성 지질; 및 1.7 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(b-ⅹⅱ) 49 mol% 양의 양이온성 지질; 29.3 mol% 양의 콜레스테롤; 20 mol% 양의 중성 지질; 및 1.7 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(b-ⅹⅲ) 49 mol% 양의 양이온성 지질; 29.3 mol% 양의 콜레스테롤; 10 mol% 양의 DPhyPE 및 10 mol% 양의 DHPC; 및 1.7 mol% 양의 폴리머 컨쥬게이트 지질;
(b-ⅹiv) 49 mol% 양의 양이온성 지질; 29.3 mol% 양의 콜레스테롤; 10 mol% 양의 DPhyPE 및 10 mol% 양의 DHPC; 및 1.7% 양의 C10-PEG 2000; 및
(b-ⅹv) 49 mol% 양의 양이온성 지질; 29.3 mol% 양의 콜레스테롤; 10 mol% 양의 DPhyPE 및 10 mol% 양의 DHPC; 및 1.7% 양의 Cer8-PEG 2000
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비율로 부형제를 포함하거나;
각각의 양은 지질 나노입자의 모든 지질 부형제의 총 몰량에 대한 것이며;
더욱 바람직하게 조성물은 하기:
(c-i) 표 F에 개시된 F1 내지 F62로 이루어진 군으로부터 선택되는 몰 백분율로 표 E에 개시된 E1 내지 E108로 이루어진 군으로부터 선택되는 지질 부형제 조합
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비율로 부형제를 포함하는
조성물.
제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
바람직하게, 조성물은 하기:
(ⅰ) 59 mol%의 표 1에 개시된 양이온성 지질 C23 (COATSOME® SS-EC), 29.3 mol%의 콜레스테롤, 10 mol%의 DPhyPE 및 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000;
(ⅱ) 59 mol%의 표 1에 개시된 양이온성 지질 C2, 29.3 mol%의 콜레스테롤, 10 mol%의 DPhyPE 및 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000;
(ⅲ) 59 mol%의 표 1에 개시된 양이온성 지질 C15, 29.3 mol%의 콜레스테롤, 10 mol%의 DPhyPE 및 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000;
(ⅳ) 59 mol%의 표 1에 개시된 양이온성 지질 C26, 29.3 mol%의 콜레스테롤, 10 mol%의 DPhyPE 및 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000;
(ⅴ) 59 mol%의 표 1에 개시된 양이온성 지질 C23 (COATSOME® SS-EC), 28.3 mol%의 콜레스테롤, 10 mol%의 DPhyPE, 1 mol% DHPC 및 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000;
(ⅵ) 59 mol%의 표 1에 개시된 양이온성 지질 C2, 28.3 mol%의 콜레스테롤, 10 mol%의 DPhyPE, 1 mol% DHPC 및 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000;
(ⅶ) 59 mol%의 표 1에 개시된 양이온성 지질 C15, 28.3 mol%의 콜레스테롤, 10 mol%의 DPhyPE, 1 mol% DHPC 및 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000;
(ⅷ) 59 mol%의 표 1에 개시된 양이온성 지질 C26, 28.3 mol%의 콜레스테롤, 10 mol%의 DPhyPE, 1 mol% DHPC 및 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000;
(ⅸ) 49 mol%의 표 1에 개시된 양이온성 지질 C23, 29.3 mol%의 콜레스테롤, 10 mol%의 DPhyPE, 10 mol% DHPC 및 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000;
(x) 49 mol%의 표 1에 개시된 양이온성 지질 C2, 29.3 mol%의 콜레스테롤, 10 mol%의 DPhyPE, 10 mol% DHPC 및 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000;
(xi) 49 mol%의 표 1에 개시된 양이온성 지질 C15, 29.3 mol%의 콜레스테롤, 10 mol%의 DPhyPE, 10 mol% DHPC 및 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000; 또는
(xⅱ) 49 mol%의 표 1에 개시된 양이온성 지질 C26, 29.3 mol%의 콜레스테롤, 10 mol%의 DPhyPE, 10 mol% DHPC 및 1.7 mol%의 DMG-PEG 2000
의 비율로 부형제를 포함하는
조성물.
제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
생물학적 활성 성분을 더 포함하는
조성물.
제21항에 있어서,
생물학적 활성 성분은 인공 mRNA, 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 화학적으로 변형되거나 또는 변형되지 않은 메신저 RNA (mRNA), 자가 복제 RNA, 원형 RNA, 바이러스 RNA, 및 레플리콘 RNA; 또는 그 임의의 조합로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 화합물이며, 바람직하게 생물학적 활성 성분은 mRNA 또는 mRNA 화합물인
조성물.
제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
지질 나노입자는
(ⅰ) 10 내지 20 범위의 N/P 비율을 달성하도록 하는 양으로; 또는
(ⅱ) 20 내지 60, 바람직하게 약 3 내지 약 15, 5 내지 약 13, 약 4 내지 약 8 또는 약 7 내지 약 11 범위의 지질 : mRNA 중량비를 달성하도록 하는 양으로
mRNA를 포함하는
조성물.
제15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
조성물은 멸균 액체 담체로 재구성하기 위한 멸균 고체 조성물이며, 조성물은 pH 조정제, 증량제, 안정화제, 비이온성 계면활성제 및 항산화제로 이루어진 군으로부터 선택되는 일 이상의 비활성 성분을 포함하며, 멸균 액체 담체는 수성 담체인
조성물.
제15항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
조성물은 멸균 액체 조성물이며, 지질 나노입자가 약 50 nm 내지 약 300 nm, 또는 약 60 nm 내지 약 250 nm, 또는 약 60 nm 내지 약 200 nm, 또는 약 70 내지 200 nm, 또는 약 75 nm 내지 약 160, 또는 약 90 nm 내지 약 140 nm, 또는 약 100 nm 내지 약 140 nm의 동적 레이저 산란에 의해 결정된 평균 유체역학적 직경(mean hydrodynamic diameter)을 갖는
조성물.
제15항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
지질 나노입자가 -50 mV 내지 +50 mV 범위의 제타 전위를 나타내는
조성물.
제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
mRNA 화합물은 모노시스트로닉(monocistronic), 바이시스트로닉(mbicistronic) 또는 멀티시스트로닉(multicistronic) mRNA인
조성물.
제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
mRNA 화합물은 적어도 하나의 화학적 변형(chemical modification)을 포함하는
조성물.
제28항에 있어서,
화학적 변형은 염기 변형, 당 변형, 골격 변형 및 지질 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 바람직하게 화학적 변형은 염기 변형이며, 더욱 바람직하게 염기 변형은 바람직하게 슈도우라실 (ψ), N1-메틸슈도우라실 (N1Mψ), 1-에틸슈도우라실, 2-티오우라실 (s2U), 4-티오우라실, 5-메틸시토신, 5-메틸우라실, 5-메톡시우라실, 및 그 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는
조성물.
제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
mRNA 화합물은 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 코딩 영역을 포함하며, 코딩 영역은 서열 변형을 나타내는
조성물.
제30항에 있어서,
서열 변형은 G/C 함량 변형, 코돈 변형, 코돈 최적화 또는 서열의 C-최적화로부터 선택되며; 바람직하게 상응하는 야생형 mRNA의 코딩 영역과 비교하여,
- 코딩 영역의 G/C 함량이 증가하며;
- 코딩 영역의 C 함량이 증가하며;
- 코딩 영역의 코돈 사용이 인간 코돈 사용에 적응되며; 및/또는 코돈 적응 지수 (CAI)가 코딩 영역에서 증가되거나 또는 최대화되는
조성물.
제22항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
mRNA 화합물은 하기:
a) 5'-CAP 구조;
b) 적어도 하나의 miRNA 서열, 바람직하게 여기에서, microRNA 결합 부위는 miR-126, miR-142, miR-144, miR-146, miR-150, miR-155, miR-16, miR-21, miR-223, miR-24, miR-27, miR-26a, 또는 그 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 microRNA에 대한 것이며;
c) 적어도 하나의 5'-UTR 요소;
d) 적어도 하나의 폴리(A) 서열;
e) 적어도 하나의 폴리(C) 서열;
f) 적어도 하나의 3'-UTR 요소;
또는 그 임의의 조합
를 더 포함하는
조성물.
제22항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 하나의 코딩 RNA는 5'-CAP 구조, 바람직하게 m7G, CAP0, CAP1, CAP2, 변형된 CAP0 또는 변형된 CAP1 구조를 포함하는
조성물.
제22항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 하나의 코딩 RNA는 적어도 하나의 이종 5'-UTR 및/또는 적어도 하나의 이종 3'-UTR을 포함하며, 바람직하게 적어도 하나의 이종 5'-UTR은 HSD17B4, RPL32, ASAH1, ATP5A1, MP68, NDUFA4, NOSIP, RPL31, SLC7A3, TUBB4B 및 UBQLN2로부터 선택되는 유전자의 5'-UTR 또는 이들 유전자의 어느 하나의 동족체, 단편, 또는 변이체로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하며; 및/또는
바람직하게 적어도 하나의 이종 3'-UTR은 PSMB3, ALB7, 알파-글로빈, CASP1, COX6B1, GNAS, NDUFA1 및 RPS9로부터 선택되는 유전자의 3'-UTR 또는 이들 유전자의 어느 하나의 동족체, 단편, 또는 변이체로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하는
조성물.
제22항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
적어도 하나의 코딩 RNA는 (ⅰ) HSD17B4 5'-UTR 및 PSMB3 3'-UTR 또는 (ⅱ) RPL32 5'-UTR 및 ALB7 3'-UTR을 포함하는
조성물.
제22항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
5'에서 3' 방향으로 하기 요소:
a) 5'-CAP 구조, 바람직하게 로 이루어진 군으로부터 선택되며 m7G(5'), m7G(5')ppp(5')(2'OMeA) 및 m7G(5')ppp(5')(2'OMeG);
b) TOP 유전자의 5'-UTR 또는 그의 동족체, 단편 또는 변이체로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하는 5'-UTR 요소, 상기 핵산 서열은 바람직하게, 서열식별번호: 22, 24, 24에 따른 핵산 서열을 포함하는 RNA 서열을 포함하며;
c) 적어도 하나의 코딩 서열;
d) α-글로빈 유전자 또는 그의 동족체, 단편 또는 변이체로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하는 3'-UTR 요소, 상기 핵산 서열은 바람직하게 서열식별번호:6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20에 따른 핵산 서열에 상응하는 RNA 서열을 포함하며; 및/또는 알부민 유전자 또는 그의 동족체, 단편 또는 변이체로부터 유래되는 핵산 서열을 포함하는 3'-UTR 요소, 상기 핵산 서열은 바람직하게 서열식별번호:18에 따른 핵산 서열에 상응하는 RNA 서열을 포함하며;
e) 선택적으로, 바람직하게 10 내지 200, 10 내지 100, 40 내지 80, 또는 50 내지 70개 아데노신 뉴클레오타이드로 이루어진, 적어도 하나의 폴리(A) 서열;
f) 선택적으로, 바람직하게 10 내지 200, 10 내지 100, 20 내지 70, 20 내지 60 또는 10 내지 40개 시토신 뉴클레오타이드로 이루어진, 적어도 하나의 폴리(C) 서열; 및
g) 선택적으로, 바람직하게 서열식별번호:4에 따른 RNA 서열을 포함하는, 적어도 하나의 히스톤 스템-루프
를 포함하는
조성물.
제21항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
생물학적 활성 성분은 하기:
(a) 펩타이드 또는 단백질, 또는 그 단편 또는 변이체를 코딩하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 mRNA, 여기에서, 펩타이드 또는 단백질은 항원이며, 여기에서, 항원은 바람직하게 병원성 항원, 종양 항원, 알레르기 항원 또는 자가면역 자가-항원, 또는 그 단편 또는 변이체로부터 유래되며; 또는
(b) 치료 단백질, 또는 그 단편 또는 변이체를 코딩하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하는 mRNA, 여기에서, 치료 단백질은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되며:
(ⅰ) 대사, 내분비 또는 아미노산 장애의 치료를 위한 효소 대체 요법에 사용하거나, 또는 부재, 결핍 또는 돌연변이 단백질을 대체하는데 사용하기 위한, 치료 단백질;
(ⅱ) 혈액 장애, 순환계 질병, 호흡계 질병, 감염성 질병 또는 면역 결핍의 치료에 사용하기 위한 치료 단백질;
(ⅲ) 암 또는 종양 질병의 치료에 사용하기 위한 치료 단백질;
(ⅳ) 호르몬 대체 요법에 사용하기 위한 치료 단백질;
(ⅴ) 체세포를 다능성 또는 전능성 줄기 세포로 재프로그래밍하는데 사용하기 위한 치료 단백질;
(ⅵ) 보조제 또는 면역 자극제로 사용하기 위한 치료 단백질;
(ⅶ) 치료 항체인 치료 단백질;
(ⅷ) 유전자 편집제인 치료 단백질; 및
(ⅸ) 간 섬유증, 간경변 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 간 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 치료 단백질인
조성물.
제37항에 있어서,
하위항목 (a)에서, 항원은 박테리아, 바이러스, 진균 및 원생동물 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 병원성 항원을 코딩하는
조성물.
제38항에 있어서,
병원성 항원은 SARS 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2), nCoV-2019 코로나바이러스, SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV), 부니아 바이러스목 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뎅기열 바이러스 (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4), 에볼라 바이러스, 플라비바이러스, B형 간염 바이러스 (HBV), 단순 포진 바이러스 (HSV), 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 인간 메타뉴모바이러스 (hMPV), 인간 유두종 바이러스 (HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스 (HPIV), 인플루엔자 바이러스, 장외 병원성 대장균, 라사 맘마레나바이러스 (LASV), 메르스 코로나바이러스, 결핵균, 니파 바이러스, 노로바이러스, 광견병 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스 (RSV), 라이노바이러스, 로타 바이러스, 백시니아 바이러스, 황열병 바이러스, 지카 바이러스, 클라미디아 트라코마티스 (즉, 클라미디아를 일으키는 클라미디아 박테리아), 또는 말라리아 기생충 (예를 들어, 열대열 말라리아 원충, 삼일열 말라리아 원충, 사일열 말라리아 원충, 또는 난형 말라리아 원충)으로부터 유래되는
조성물.
제15항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
하기에 사용하기 위한 조성물:
(ⅰ) 감염성 질병; 암 또는 종양 질병, 장애 또는 상태; 간경변 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 간 질병; 알레르기; 또는 자가면역 질병; 장애 또는 상태의 치료 또는 예방; 및/또는
(ⅱ) 대사 또는 내분비 장애의 치료를 위한 효소 대체 요법에 사용 또는 부재, 결핍 또는 돌연변이 단백질을 대체하는데 사용.
제15항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
감염성 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한
조성물.
제40항 또는 제41항에 있어서,
적어도 하나의 코딩 RNA를 포함하며, 적어도 하나의 코딩 RNA는 질병, 장애 또는 상태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 적어도 하나의 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 적어도 하나의 코딩 서열을 포함하며, 상기 조성물은 이를 필요로 하는 대상에게 근육 내 또는 피부 주사를 통하여 투여되는
조성물.
제21항 내지 제42항 중 어느 하나의 조성물을 포함하며, 선택적으로 가용화를 위한 액체 비히클 및 선택적으로 성분의 투여 및 투여량에 대한 정보를 제공하는 기술 설명서를 포함하는
키트 또는 부품 키트(kit of parts).
의약으로 사용하기 위한, 제21항 내지 제42항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제43항의 키트 또는 부품 키트.
제44항에 있어서,
의약으로 사용하기 위한 것이며, 의약은 바이러스, 박테리아 또는 원생동물 감염성 질병을 포함하는 감염성 질병, 암 또는 종양 질병, 간 질병, 자가면역 질병, 알레르기, 유전 질병을 포함하는 단성 유전자 질병, 일반적 유전자 질병, 유전적 배경이 있고 일반적으로 정의된 유전자 결함에 의해 유발되고 멘델의 법칙에 의해 유전되는 질병; 심혈관 질병, 신경 질병, 호흡계 질병, 소화기 질병, 피부 질병, 근골격계 장애, 결합 조직의 장애, 신생물, 면역 결핍, 내분비, 영양 및 대사 질병, 눈 질병, 귀 질병 및 펩타이드 또는 단백질 결핍과 관련된 질병으로부터 선택되는 질병의 방지, 예방, 치료 및/또는 개선을 위한 것인
조성물.
제44항 또는 제45항에 있어서,
의약은 백신인
조성물.
제15항 내지 제42항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제43항의 키트 또는 부품 키트를 포함하는, 바이러스, 박테리아 또는 원생동물 감염성 질병을 포함하는 감염성 질병, 암 또는 종양 질병으로부터 선택되는 질병의 방지, 예방, 치료 및/또는 개선을 위한
백신.
하기 단계:
a) 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 기재된 mRNA, 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 기재된 기재된 조성물, 제47항의 백신, 제43항의 키트 또는 부품 키트를 제공하는 단계; 및
b) mRNA, 조성물, 백신 또는 키트 또는 부품 키트를 조직 또는 유기체에 적용하거나 투여하는 단계
를 포함하는 감염성 질병; 암 또는 종양 질병, 장애 또는 상태; 간 섬유증, 간경변 및 간암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 간 질병; 알레르기; 또는 자가면역 질병; 장애 또는 상태의 치료 또는 예방 방법.
제48항에 있어서,
mRNA, 제15항 내지 제42항 중 어느 한 항의 조성물, 제47항의 백신 또는 제43항의 키트 또는 부품 키트는 정맥 내, 근육 내, 피하 또는 피부 내 주사에 의해 조직 또는 유기체에 투여되는
방법.
제47항의 백신을 대상에서 항원 특이적 면역 반응을 생성하기에 효과적인 양으로 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 대상에서 면역 반응을 유도하는 방법.
제15항 내지 제42항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제43항의 키트 또는 부품 키트를 포함하는, 바이러스 항원을 코딩하는 mRNA의 유효량을 포함하는 대상의 백신 접종에 사용하기 위한 약학 조성물.
(ⅰ) 면역 반응의 유도, (ⅱ) 항원 특이적 T 세포 반응 유도, 또는 바람직하게 (ⅲ) CD8+ T 세포 반응 유도를 위한 제15항 내지 제42항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제43항의 키트 또는 부품의 키트를 포함하는 약학 조성물의 용도.
제52항에 있어서,
감염성 질병의 예방을 위하여, 또는 감염성 질병의 예방을 위한 의약 제조에 이용되며, 상기 의약은 바람직하게 백신인
용도.
제15항 내지 제42항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제43항의 키트 또는 부품의 키트를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 이를 필요로 하는 대상의 질병 또는 상태를 예방, 개선 또는 치료하는 방법.
제48항 내지 제50항 및 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
조성물의 투여에 의해 대상의 림프구에서 mRNA에 의해 코딩되는 항원의 발현이 초래되는
방법.
제48항 내지 제50항, 제54항 및 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
조성물 투여에 의해 항원 특이적 항체 반응이 초래되며, 바람직하게 항원 특이적 항체 반응은 혈청에서 항원 특이적 항체의 존재에 의해 측정되는
방법.
제15항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
조성물은 C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13 또는 C14의 길이, 바람직하게 C6, C7, C8, C9, 또는 C10의 길이, 더욱 바람직하게 C6, C7, C8의 길이, 가장 바람직하게 C7의 길이를 갖는 중성 지질 또는 인지질을 포함하며, 가장 바람직하게 조성물은 2종의 중성 지질의 조합을 포함하며, 여기에서, 조합은 적어도 2개의 알킬 사슬을 갖는 중성 지질 또는 인지질을 포함하며, 이에 의해 각각의 알킬 사슬은 독립적으로 바람직하게 C6, C7, C8, C9, 또는 C10의 길이, 더욱 바람직하게 C6, C7, C8의 길이, 가장 바람직하게 C7의 길이를 가지며, 더욱더 가장 바람직하게 DHPC (1,2-디헵타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 05:0 PC (1,2-디펜타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 04:0 PC (1,2-디부티릴-sn-글리세로-3-포스포콜린), 06:0 PC (DHPC, 1,2-디헥사노일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 08:0 PC (1,2-디옥타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 및 09:0 PC (1,2-디노난노일-sn-글리세로-3-포스포콜린)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인지질을 포함하는
조성물.
제15항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
조성물은 적어도 2개의 알킬 사슬을 갖는 중성 지질 또는 인지질을 포함하며, 이에 의해 각각의 알킬 사슬은 독립적으로 C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13 또는 C14의 길이, 바람직하게 C6, C7, C8, C9, 또는 C10의 길이, 더욱 바람직하게 C6, C7, C8의 길이, 가장 바람직하게 C7의 길이를 가지며, 또는 더욱더 가장 바람직하게 조성물은 2종의 중성 지질의 조합을 포함하며, 조합은 적어도 2개의 알킬 사슬을 갖는 중성 지질 또는 인지질을 포함하며, 이에 의해 각각의 알킬 사슬은 독립적으로 바람직하게 C6, C7, C8, C9, 또는 C10의 길이, 더욱 바람직하게 C6, C7, C8의 길이, 가장 바람직하게 C7의 길이를 가지며, 더욱더 가장 바람직하게 DHPC (1,2-디헵타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 05:0 PC (1,2-디펜타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 04:0 PC (1,2-디부티릴-sn-글리세로-3-포스포콜린), 06:0 PC (DHPC, 1,2-디헥사노일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 08:0 PC (1,2-디옥타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 및 09:0 PC (1,2-디노난노일-sn-글리세로-3-포스포콜린)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 인지질을 포함하는
조성물.
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