KR20220123402A - 폴리에틸렌 글리콜 화합물의 정제 방법 - Google Patents

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Abstract

하기 (A) 공정 및 (B) 공정을 갖는 것을 특징으로 하는, 식 [1]로 표시되는 폴리에틸렌 글리콜 화합물의 정제 방법.
(A) 공정: 상기 식 [1]로 표시되는 화합물을, 힐데브란드 용해 파라미터가 8∼10(cal/cm3)1/2인 유기용제에 용해시킴으로써 용액을 얻는 공정
(B) 공정: 식 [1]의 화합물 1질량부에 대해, 비표면적이 50∼200m2/g인 하이드로탈사이트로 이루어지는 0.1∼1질량부의 흡착제를 상기 용액에 혼합함으로써 슬러리를 조제하는 공정
Figure pct00013

(식 [1] 중, Z는, 2∼5개의 활성 수소기를 갖는 화합물에서 상기 활성 수소기를 제거한 잔기이고, A는 아미노기이고, Y1 및 Y2는, 각각 독립적으로, 에테르 결합, 아미드 결합, 에스테르 결합, 우레탄 결합, 카보네이트 결합, 2급 아미노기, 티오에테르 결합, 디술피드 결합, 티오에스테르 결합 또는 이들을 포함하는 알킬렌기이고, Polymer는, 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 나타내고, X는, 탄소수 1∼7의 탄화수소기, 탄소수 3∼9의 아세탈기, 수산기, 수산기의 보호기, 카르복실기, 카르복실기의 보호기, 티올기, 티올기의 보호기, 시아노기 또는 이들을 포함하는 알킬렌기이고, l 및 m은, 각각 l=1 또는 0, m=1 또는 0이고, a 및 b는 0≤a≤4, 0≤b≤4 또한 1≤a＋b≤4를 만족하는 정수이다.)

Description

폴리에틸렌 글리콜 화합물의 정제 방법
본 발명은, 의약 용도에 바람직하게 사용되는 1개의 아미노기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 화합물의 정제 방법에 관한 것이다. 더욱 자세한 것은, 본 발명은, 약물수송계에 있어서의 화학 수식 용도의 고분자량의 활성화 폴리에틸렌 글리콜이며, 또한 그 원료로서 사용되는 고순도의 1개의 아미노기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 화합물을 얻는 정제 방법이다.
본 발명은, 폴리펩티드, 효소, 항체나 그 외 저분자 약물이나 유전자, 올리고핵산 등을 포함하는 핵산 화합물, 핵산 의약이나 그 외의 생리 활성 물질의 수식, 또는, 리포솜, 폴리머 미셀, 나노 파티클 등의 약물수송계 캐리어에의 응용을 포함하는 의약 용도에 특히 적합하다.
폴리에틸렌 글리콜(PEG)은, 약물수송계에 있어서의 표준 담체로서 널리 알려져 있으며, 매우 유용하고 없어서는 안 될 소재이다. 생리 활성 물질이나 리포솜 등의 약제에, 폴리에틸렌 글리콜 화합물을 수식함으로써, 폴리에틸렌 글리콜이 높은 수화층과 입체적 반발 효과에 의해, 약제가 세망내피계(RES)로 포착되는 것이나 신장으로 배설되는 것을 억제하여, 약제의 혈중 체류성의 개선 및 항원성의 저감이 가능해진다. 그 중에서도, 말단에 아미노기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 화합물은 그 자신이 카르복실기를 가지는 약제의 수식제인 것과 동시에, 저분자의 활성화 시약과 반응시킴으로써, 말단 말레이미드 화합물, 아지드 화합물, 및 요오도아세트아미드 화합물과 같은 다른 활성화 폴리에틸렌 글리콜 화합물을 합성하는 원료나, α-아미노산-N-카르복시 무수물과 반응시킴으로써, 고분자 미셀을 형성하기 위한 블록 공중합체의 원료가 되기 위하여, 특히 중요한 소재이다.
이러한 의약 용도를 목적으로 하는 활성화 폴리에틸렌 글리콜 화합물은, 이것을 수식하여 제조되는 약제의 성능이나 안전성의 관점으로부터 불순물의 적은 것이 요구되고 있다. 현재, 말단에 1개의 아미노기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 화합물에는, 다양한 골격을 갖는 것이 개발되고 있으며, 그 제조 방법에 의해 부생하는 불순물도 다양하다. 아미노기를 복수개 갖는 폴리에틸렌 글리콜 화합물이 불순물로서 포함되어 있을 경우, 약제의 수식을 행했을 경우, 약제의 올리고머화의 원인이 되기 때문에 가능한 한 저감시키는 것이 바람직하다. 그러나, 1개의 아미노기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 화합물과 불순물로서 아미노기를 복수개 갖는 폴리에틸렌 글리콜 화합물은 모두 폴리머이며, 또한 이온성인 아미노기를 가짐으로써, 물리화학적 성질이 유사하여, 일반의 기술에서는 분리 정제가 곤란하다.
특허문헌 1에는, 이온교환 수지를 이용한 컬럼 크로마토그래피에 의해서 1개의 아미노기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 화합물을 정제하는 방법이 기재되어 있다. 이 방법에서는, 용리액의 조성을 연속적으로 변화시키는 것으로, 아미노기의 수의 차이에 따라 폴리에틸렌 글리콜 화합물을 분리하고 정제하는 것이 가능하다. 그러나, 이러한 이온교환 수지를 사용한 정제 방법은, 원리적으로 고체 표면에의 상호작용, 흡착 현상을 이용한 방법이므로, 묽은 용액 조건 하에 있어서 대량의 수지를 사용한 정제 처리가 필요하다. 공정 중의 폴리에틸렌 글리콜 화합물의 농도는, 분리능의 저하를 억제하기 위해 1∼2%정도의 희석 조건이 되어야 하므로, 공업적인 생산성을 충분히 만족할 수 있는 것은 아니다. 또한, 최종적으로 대량의 이온교환 수지가 폐기물이 되어, 산업 이용 상에 있어서도 문제를 가지는 정제 방법이다.
특허문헌 2에는, 1개의 아미노기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 화합물을 pH1∼3의 강산성 수용액 중에 용해시켜 말단 아미노기를 이온화하여, 특정의 혼합 유기용제를 이용하여 특정의 온도 범위에서 폴리에틸렌 글리콜 화합물을 추출하는 정제 방법이 기재되어 있다. 이 특허에 있어서는, 이온화에 의해 친수성이 높아진 아미노기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 화합물이 수층에 분배되고, 아미노기를 갖지 않는 폴리에틸렌 글리콜 화합물은 혼합 유기층에 분배되기 때문에, 선택적으로 분리하고 정제할 수 있다. 그러나, 이 정제 방법은, 아미노기의 유무에 따라서 폴리에틸렌 글리콜 화합물을 분리하기 때문에, 목적물과 불순물의 양자 모두에 1개 이상의 아미노기가 포함되어 있을 경우, 그 아미노기의 수의 차이로 양자를 분리할 수 없다.
특허문헌 3, 및 특허문헌 4에는, 수산기 및 카르복실기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 화합물과 흡착제 사이의 상호작용을 이용함으로써 폴리에틸렌 글리콜 화합물을 정제하는 방법이 기재되어 있다. 이러한 관능기와 상호작용하는 적절한 흡착제를 사용하면, 관능기 수가 많은 폴리에틸렌 글리콜이 흡착제에 우선적으로 흡착되므로, 관능기의 유무, 및 경우에 따라서는 관능기 수에 의해 분리하고 정제할 수 있다. 그러나, 아미노기 유무 및 아미노기 수에 따라 선택적으로 불순물을 제거할 수 있다고 하는 기재는 없다.
일본국 특허공개 평 8-165343호 공보 일본국 특허공개 2014-208786호 공보 일본국 특허공개 2010-254978호 공보 일본국 특허공개 2011-79934호 공보
발명의 요약
발명이 해결하려는 과제
이와 같이, 말단에 1개의 아미노기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 화합물은, 의약 용도에 있어서 중요한 소재인 것에도 불구하고, 공업적으로 제조하기 용이한 방법에 의해서는 얻을 수 없고, 많은 과제를 가지고 있다.
본 발명의 과제는, 주성분으로부터 불순물인 다관능 화합물을 저감시킨, 말단에 1개의 아미노기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 화합물을 공업적으로 실시 가능한 방법에 의해 고효율로 그리고 우수한 순도로 정제하는 것이다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토한 결과, 하이드로탈사이트(hydrotalcite)로 이루어지는 흡착제에, 알칼리성인 아미노기를 복수개 갖는 폴리에틸렌 글리콜 화합물을 선택적으로 흡착 제거하는 효과가 있는 것을 발견하였고, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
하기 (A) 공정 및 (B) 공정을 갖는 것을 특징으로 하는, 식 [1]로 표시되는 폴리에틸렌 글리콜 화합물의 정제 방법.
(A) 공정： 상기 식 [1]로 표시되는 화합물을, 힐데브란드(Hildebrand) 용해 파라미터가 8∼10(cal/cm3)1/2인 유기용제에 용해시킴으로써 용액을 얻는 공정
(B) 공정： 상기 식 [1]의 화합물 1질량부에 대해, 비표면적이 50∼200m2/g인 하이드로탈사이트로 이루어지는 0.1∼1질량부의 흡착제를 상기 용액에 혼합함으로써 슬러리를 조제하는 공정
Figure pct00001
(식 [1] 중,
Z는, 2∼5개의 활성 수소기를 갖는 화합물에서 상기 활성 수소기를 제거한 잔기이고,
A는 아미노기이고,
Y1 및 Y2는, 각각 독립적으로, 에테르 결합, 아미드 결합, 에스테르 결합, 우레탄 결합, 카보네이트 결합, 2급 아미노기, 티오에테르 결합, 디술피드 결합, 티오에스테르 결합 또는 이들을 포함하는 알킬렌기이고,
Polymer는, 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 나타내고,
X는, 탄소수 1∼7의 탄화수소기, 탄소수 3∼9의 아세탈기, 수산기, 수산기의 보호기, 카르복실기, 카르복실기의 보호기, 티올기, 티올기의 보호기, 시아노기 또는 이들을 포함하는 알킬렌기이고,
l 및 m은, 각각 l=1 또는 0, m=1 또는 0이고,
a 및 b는 0≤a≤4, 0≤b≤4 또한 1≤a＋b≤4를 만족하는 정수이다.)
본 발명에 의하면, 말단에 1개의 아미노기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 화합물에 하이드로탈사이트로 이루어지는 흡착제를 작용시키는 것에 의해서, 불순물인 아미노기를 복수개 갖는 폴리에틸렌 글리콜을 선택적으로 제거하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 제조 방법은, 의약 용도에 적합한 고품질의 폴리에틸렌 글리콜 화합물을 공업적 스케일로 용이하게 제공할 수 있다.
도 1은 실시예 1-1의 원료(정제 전)의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 2는 실시예 1-1의 정제 후의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
본 발명의 자세한 것은, 일반식 [1]로 표시되는, 1개의 아미노기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 화합물을, 이하의 조작을 포함하는 처리 공정에 의해 정제하는 방법이다.
Figure pct00002
Z는, 2∼5개의 활성 수소기(-GH)를 갖는 화합물(Z(GH)n: n=2∼5)에서 활성 수소기를 제거한 잔기이다. 활성 수소기란, 활성 수소를 갖는 관능기를 의미한다. 활성 수소기의 예로서는, 수산기, 카르복실기, 아미노기, 2급 아미노기, 티올기 등을 들 수 있다. 활성 수소기(GH)가 수산기 또는 카르복실기인 경우는, 잔기 Z는 탈수산기 잔기이며, 활성 수소기가 아미노기, 2급 아미노기, 티올기의 경우는, 잔기 Z는 탈수소 잔기이다.
2∼5개의 활성 수소기(-GH)를 갖는 화합물(Z(GH)n：n=2∼5)의 구체적인 예로서는, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 트리메틸렌글리콜, 이소프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 테트라메틸렌글리콜, 트리메틸올프로판, 글리세린, 디글리세린, 트리글리세린, 펜타에리트리톨, 자일리톨 등의 다가 알코올류, 또는 리신이나 글루탐산 등, 아미노기, 카르복실기, 또는 티올기를 갖는 아미노산이나 펩티드, 또는 유기 아민, 유기 카르복실산 등의 화합물을 들 수 있다.
Y1은, 잔기 Z와 A의 사이의 결합기이며, 공유결합이면 특히 제한은 없다. Y1 및 Y2는, 각각 독립적으로, 에테르 결합, 아미드 결합, 에스테르 결합, 우레탄 결합, 카보네이트 결합, 2급 아미노기, 티오에테르 결합, 디술피드 결합, 티오에스테르 결합 또는 이들을 포함하는 알킬렌기를 들 수 있다. 상기 알킬렌기 부분으로서 바람직한 것은, 메틸렌기, 에틸렌기, 프로필렌기, 이소프로필렌기, 부틸렌기, 이소부틸렌기, 펜틸렌기, 이소펜틸렌기, 헥실렌기 등을 들 수 있으며, 이들은 분기될 수 있다.
A는, 아미노기를 나타낸다.
Polymer는, 직쇄 또는 분기형 폴리에틸렌 글리콜 사슬이다. 분기형 폴리에틸렌 글리콜 사슬이란, 도중에 링커를 개입시켜, 2개의 사슬 또는 그 이상으로 분기 하고 있는 폴리에틸렌 글리콜 사슬이며, 복수의 분기점을 가질 수 있다. 예로서는, 하기 식 (i)로 표시되는 글리세린 등의 다가알코올을 분기점으로 하여, 2개의 사슬, 또는 그 이상으로 분기하고 있는 폴리에틸렌 글리콜 사슬이다.
Figure pct00003
(단, n1 및 n2는 각각 1∼1000이며, 바람직하게는 100∼1000이다.)
폴리에틸렌 글리콜 화합물의 중량 평균 분자량은, 특히 제한은 없지만, 바람직하게는 2,000∼100,000이며, 더욱 바람직하게는 2,000∼80,000이다.
l=0 또는 1, m=0 또는 1, a 및 b는 0≤a≤4, 0≤b≤4 또한 1≤a＋b≤4를 만족하는 정수이다.
이하, 각 공정을 더욱 상세하게 설명한다.
(A) 공정은, 식 [1]로 표시되는 화합물을, 힐데브란드 용해 파라미터가 8∼10(cal/cm3)1/2인 유기용제에 용해시킴으로써 용액을 얻는 공정이다.
공정 (A)에서는, 힐데브란드 용해 파라미터가 8∼10(cal/cm3)1/2인 유기용제를 이용한다. 이 유기용제의 힐데브란드 용해 파라미터가 8 미만인 경우, 폴리에틸렌 글리콜 화합물이 용해하지 않을 것이고, 10을 넘는 경우, 탈착이나 흡착제로부터의 금속 성분의 용출의 우려가 있기 때문에 바람직하지 않다. 이 유기용제의 힐데브란드 용해 파라미터는, 바람직하게는 8.5∼9.5이며, 보다 바람직하게는 8.5∼9.0이다. 이 유기용제는, 톨루엔, 크실렌, 벤젠, 클로로포름 및 디클로로메탄으로부터 선택되는 유기용제가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 톨루엔, 클로로포름이며, 보다 바람직하게는 톨루엔이다.
공정 (A)에서는, 식 [1]의 화합물 1질량부에 대해 유기용제의 양을 W로 나타내고, 식 [1]로 표시되는 화합물의 중량 평균 분자량을 M으로 나타낼 때, 2.0M×10-4+2.0≤W≤50을 만족하는 것이 바람직하고, 2.0M×10-4＋2.0≤W≤30을 만족하는 것이 더욱 바람직하다.
상기 유기용제를 이용하고, 폴리에틸렌 글리콜 화합물의 용해를 실시한다. 처리 용기에 투입하는 순서는 폴리에틸렌 글리콜 화합물 또는 유기용제 중 어느 하나를 먼저 투입할 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜 화합물의 분자량에 따라 가온이 필요할 수 있으며, 가열 방법은 특히 제한되지 않으나, 일반적으로 30℃이상으로 가온하여 화합물을 용해시킬 수 있다.
공정 (B)은, 상기 식 [1]의 화합물 1질량부에 대해, 비표면적이 50∼200m2/g인 하이드로탈사이트로 이루어지는 0.1∼1질량부의 흡착제를 상기 용액에 혼합함으로써 슬러리를 조제하는 공정이다.
공정 (B)의 흡착제는, 하기 일반식을 갖는 화합물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 하이드로탈사이트로 이루어진다.
(M2＋)1－x 1(M3＋)x 1(OH)2(An－)x 1 /n·aH2O
(식 중, M2＋은 2가 금속 이온을 나타내고, M3＋은 3가 금속 이온을 나타내고, An－는 n가의 음이온을 나타내고, n는 An－의 음이온의 가수를 나타내고, x1 및 a는 각각 0＜x1＜0.5, 0≤a＜1의 범위를 나타낸다.)
또는
x2(M2＋)O·y(M3＋)2O3·z(An－)·bH2O
(식 중, M2＋은 2가 금속 이온을 나타내고, M3＋은 3가 금속 이온을 나타내고, An－는 n가의 음이온을 나타내고, n는 An－의 음이온의 가수를 나타내고, x2, y, z, b는 각각 0＜x2≤10, 0＜y≤10, 0≤z≤10, 0≤b≤20의 범위를 나타낸다.)
M2＋로서는 Mg, Ca 또는 Zn의 2가 이온이 바람직하고, M3＋으로서는 Al 또는 Fe의 3가 이온이 바람직하고, An－로서는 OH, ClO4, NO3, SO4, CO3, SiO3, HPO4, PO4 또는 CH3COO를 들 수 있다. 그 중에서도 M2＋가 Mg이며, M3＋이 Al이며, An－가 CO3인 하이드로탈사이트가 바람직하다. 특히 바람직하게는 (Mg)1－x 1(Al)x 1(OH)2(CO3)x1/2·aH2O(0.2≤x1≤0.4, 0.4≤a≤0.7), 또는 x2MgO·yAl2O3·z(CO3)·bH2O(1≤x2≤4, 0.5≤y≤3, 0≤z≤3, 0≤b≤10)이고, 가장 바람직하게는 x2MgO·yAl2O3·z(CO3)·bH2O (1≤x2≤5, 0.5≤y≤3, 0≤z≤3, 0≤b≤10)이다. 구체적인 예로서는, Sakai Chemical Industry Co., Ltd.제의 STABIACE HT 시리즈의 STABIACE HT-1 (Mg0.67Al0.33(OH)2(CO3)0.17·0.5H2O), STABIACE HT-P (Mg0.69Al0.31(OH)2(CO3)0.15·0.54H2O), Kyowa Chemical Industry Co., Ltd.제의 Kyoward 시리즈의 Kyoward 300 (2.5MgO·Al2O3·0.7CO3·aH2O, 6≤a≤7), Kyoward 500(Mg0.75Al0.25(OH)2(CO3)0.13·aH2O, 0.50≤a≤0.63), Kyoward 1000(Mg0.69Al0.31(OH)2(CO3)0.15·aH2O, 0.46≤a≤0.62) 등으로서 시장으로부터 입수할 수 있다. 그 중에서도, Kyoward 300이 바람직하다. 상기 흡착제는 단독, 또는 조합하여 사용해도 된다.
식 [1]로 표시되는 화합물 1질량부에 대해, 흡착제의 양은 0.1∼1.0질량부의 범위가 바람직하다. 흡착제의 양이 0.1질량부 미만이면, 충분한 정제 효과를 얻지 못하고, 흡착제의 양이 1질량부보다 많으면, 처리 후의 슬러리 용액을 여과했을 때에 여과 케이크에 폴리에틸렌 글리콜 화합물이 남아 수율이 저하한다. 더욱 바람직하게는, 흡착제량이 0.1∼0.5질량부이다.
공정(B)에 있어서의 처리 온도로서는, 25∼60℃가 바람직하다. 25℃보다 저온에서는, 용액의 점성이 높고 정제 효율이 나빠진다. 또한, 폴리에틸렌 글리콜 화합물의 구조나 분자량에 따라서는 결정이 석출되기 위하여, 25℃ 이상이 바람직하다. 더욱 바람직한 온도 범위로서는, 40∼60℃이다.
공정(B)에 있어서의 처리 시간으로서는, 0.1∼24시간의 사이가 바람직하다. 또한, 이 조작을 실시하는 분위기는 특히 한정되지 않지만, 바람직하게는 산화를 최소한으로 억제하는 것을 목적으로 하고, 질소 등의 불활성 가스 존재 하에서 실시할 수도 있다. 또한, 장치도 특히 한정되지 않지만, 산화 열화가 일어나기 어려운 질소 하 또한 밀폐 상태로의 조작을 고려해 내압 용기에서 실시할 수도 있다.
회수 공정： 상기 슬러리로부터 상기 폴리에틸렌 글리콜 화합물을 회수하는 공정
이 공정은, 상기 공정(B)의 흡착 처리 용액(슬러리)으로부터 흡착제와 용제의 제거를 실시하여, 목적의 폴리에틸렌 글리콜 화합물을 단리하는 공정이다. 흡착제의 제거 방법은 특히 제한은 없지만, 일반적으로는, 감압 여과, 또는 가압 여과에 의해서 제거를 실시한다. 이 때, 여과 시의 온도의 저하에 의한 결정의 석출을 예방하는 목적으로 미리 여과기를 공정(B)의 처리 온도와 동일하게 가온해 두는 것이 바람직하다. 여과 후, 목적의 폴리에틸렌 글리콜 화합물은, 여액에 함유된다.
흡착제 제거 후의 처리 공정에 대해서는, 특히 이것을 한정하는 것은 아니지만, 전형적으로는 폴리에틸렌 글리콜 화합물을 포함하는 용액을 냉각하거나, 또는 헥산이나 시클로헥산 등의 탄화수소, 이소프로판올 등의 고급 알코올, 디에틸 에테르나 메틸 tert-부틸 에테르 등의 에테르를 빈용매(poor solvent)로서 첨가하고, 폴리에틸렌 글리콜 화합물을 결정화하고, 여과한 후에 건조하여 단리할 수 있다. 또한, 탈용제에 의해서 용제를 제거하고, 폴리에틸렌 글리콜 화합물을 건조 및 고화하여 단리하는 것도 가능하다.
실시예
이하에, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명할 것이다. 또한, 실시예 중의 화합물 중의 다관능 PEG 함량의 정량에는, 이하에 나타내는 분석법 A 또는 B를 이용하였고, 유도체화에 의해 아미노기에 형광 물질을 결합시킨 후, RP－HPLC에 의해 측정했다.
＜유도체화＞
분석법 A：
샘플 100mg와 숙신이미딜 6-[[7-(N,N-디메틸아미노술포닐)-2,1,3-벤조옥사디아졸-4-일]아미노]헥사노에이트 11.3 mg와 톨루엔 4 mL, 아세토니트릴 1 mL를 9 mL 스크류 튜브에 투입한 다음, 25℃로 용해했다. 여기에 N－메틸모르폴린 5.5μL를 첨가하였고, 25℃로 1시간 동안 교반을 실시했다. 반응 후에, 아세트산 에틸로 희석하여, 헥산에서 결정화하였다. 석출한 결정을 여과 분리하고, 진공 건조를 실시하여, 분석용 샘플을 회수하였다.
분석법 B:
3,5-디니트로벤조일클로라이드(DNB) 300 mg에 테트라히드로푸란 1.5 mL를 첨가하여 용해시켜 DNB 용액을 제조하였다. 1mL 스크류 튜브에 샘플 10mg과 테트라히드로푸란 60μL를 넣은 다음, 25℃에서 용해시켰다. 여기에 피리딘 4μL와 DNB 용액 36μL를 첨가하였고, 40℃에서 1시간 동안 유도체화를 실시하였다. 유도체화가 완료된 후, 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액 0.4mL로 희석하였고, 여과하여 분석용 샘플을 얻었다.
＜RP－HPLC의 분석 방법＞
분석법 A：
HPLC 시스템으로서는 Alliance(Waters)를 이용하여 하기 조건에서 측정을 실시하였다.
이동상
이동상 D：1mmol/L 염산/아세토니트릴(2/1)
이동상 A：1mmol/L 염산/아세토니트릴(1/1)
그래디언트 조건
0분 이동상D:이동상A=100:0
22분 이동상D:이동상A=0:100
24분 이동상D:이동상A=0:100
26분 이동상D:이동상A=100:0
35분 이동상D:이동상A=100:0
유속：1ml/min
컬럼：apHera C4, φ4.6 mm, 15cm (SUPELCO)
컬럼 온도：33℃(분자량 20,000의 경우) 또는 25℃(분자량 40,000의 경우)
검출기:형광 검출기(ex384nm, em520nm)
샘플 농도: 1mg/mL
주입량：50μl(분자량 20,000의 경우) 또는 20μl(분자량 40,000의 경우)
분석법 B：
HPLC 시스템으로서는 Thermo Fisher Ultimate 3000를 사용했다.
이동상
이동상A: 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액
이동상B: 0.1% 트리플루오로아세트산 아세토니트릴 용액
그래디언트 조건
0분 이동상A:이동상B=70:30
30분 이동상A:이동상B=50:50
30.1분 이동상A:이동상B=5:95
35분 이동상A:이동상B=5:95
유속：0.6min
컬럼：Sun Shel HFC 18－30,φ3mm, 15 cm
컬럼 온도:50℃
검출기:UV검출기(220 nm)
샘플 농도:20mg/mL
주입량:5μL
분석법 A, B 모두, HPLC 측정값으로서, 목적물인 1관능성 화합물 유래의 메인 피크와 유도체화된 다관능 PEG 피크를 기준선에 대해서 수직으로 나누어, 얻은 각 피크의 면적값으로부터 하기 식에 의해 다관능 PEG 함량을 산출했다.
다관능 PEG 함량[%]
Figure pct00004
P: 메인 피크의 피크 면적
Qq : 유도체화된 q-관능 PEG의 피크 면적
a', b : 하기 식(ii) 또는 식(iii)으로 표시되는 불순물의 구조로 결정되는 정수
분석법 A에서는, 하기 식(ii)로 표시되는 불순물이 검출되고, 분석법 B에서는 하기 식(iii)로 표시되는 불순물이 검출된다.
Figure pct00005
Figure pct00006
(식(ii), (iii) 중,
Z는, 2∼5개의 활성 수소기를 갖는 화합물에서 상기 활성 수소기를 제거한 잔기이고,
A는 아미노기이고,
Y1 및 Y2는, 각각 독립적으로, 에테르 결합, 아미드 결합, 에스테르 결합, 우레탄 결합, 카보네이트 결합, 2급 아미노기, 티오에테르 결합, 디술피드 결합, 티오에스테르 결합 또는 이들을 포함하는 알킬렌기이고,
Polymer는, 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 나타내고,
X는, 탄소수 1∼7의 탄화수소기, 탄소수 3∼9의 아세탈기, 수산기, 수산기의 보호기, 카르복실기, 카르복실기의 보호기, 티올기, 티올기의 보호기, 시아노기 또는 이들을 포함하는 알킬렌기이고,
l 및 m은, 각각 l=1 또는 0, m=1 또는 0이고,
a' 및 b는 1≤a＇≤4, 0≤b≤4 또한 1≤a＇＋b≤4를 만족하는 정수이다.)
(실시예 1-1)
하기 식(iv)로 표시되는 글리세린 골격에 2개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 갖는 분기형 폴리에틸렌 글리콜 화합물(중량 평균 분자량: 20,000, 2관능 PEG 함량:1.3%, 3관능 PEG 함량: 불검출) 100g와 톨루엔 1150g를 2L 4구 플라스크에 채웠다. 쓰리-원 모터, 냉각관, 질소 취입관을 부착하고 워터 배스를 사용하여 50℃에서 전체를 용해했다. 여기에 Kyoward 300(Kyowa Chemical Industry Co., Ltd.) 30g를 첨가하고, 50℃에서 1시간 동안 교반을 실시했다. 그 후, 여과에 의해 여액을 회수하고, 농축 후 헥산을 첨가하여 결정을 석출시켰다. 석출된 결정을 여과 분리하고 진공 건조하여 결정을 회수하였다(수율 91%).
분석법 A에 의한 RP-HPLC 분석의 결과, 2관능 PEG 함량은 0.1%이었다.
Figure pct00007
(실시예 1-2 ∼ 1-3)
실시예 1-1과 동일한 원료를 사용하여, Kyoward 300을 이하의 표에 나타내는 흡착제로 변경한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 수행하였다. 이하에 결과를 나타내었다. 하기 표에서, Kyoward를 「KW」로 약칭하였다.
Figure pct00008
이상의 결과로부터, 하이드로탈사이트류인 Kyoward 300, Kyoward 500, Kyoward 1000에는 모두 2관능 PEG 제거 효과가 있으며, 그 중에서도 300이 가장 효과가 높고, 한편 수율도 양호했다.
(비교예 1-1 ∼ 1-3)
실시예 1-1과 동일한 분기형 폴리에틸렌 글리콜 화합물(중량 평균 분자량： 20,000, 2관능 PEG 함량: 1.4%, 3관능 PEG 함량: 불검출)을 이용하여, Kyoward 300을 이하의 표에 나타내는 무기염류로 변경한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 수행하였다. 이하에 결과를 나타내었다.
Figure pct00009
이상의 결과로부터, 규산알루미늄인 Kyoward 700에서는, 산성 흡착제이기 때문에 2관능 PEG를 제거하는 효과는 있었지만, 목적물도 모두 흡착되었기 때문에, 수율이 현저하게 저하했다. 한편, 알루미나와 같은 무기산화물이나 황산마그네슘 등의 무기염류에서는 정제 효과가 없었다.
(실시예 1-4 ∼ 1-5)
실시예 1-1과 동일한 원료를 이용하여, Kyoward 300을 이하의 표에 나타내는 양으로 변경한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 수행하였다. 이하에 결과를 나타내었다.
Figure pct00010
이상의 결과로부터, 약간 효율은 저하하지만, 0.1 질량배에서도 2관능 PEG를 제거하는 효과가 있는 것을 알 수 있었다. 또한, 0.1∼0.4 질량배의 사이에서 수율의 저하는 거의 볼 수 없었다.
(실시예 2)
식(iv)로 표시되는 글리세린 골격에 2개의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 갖는 분기형 폴리에틸렌 글리콜 화합물(중량 평균 분자량: 40,000, 2관능 PEG 함량:1.1%, 3관능 PEG 함량: 불검출) 10g와 톨루엔 180 g를 500mL 4구 플라스크에 채웠다. 쓰리-원 모터, 냉각관, 질소 취입관을 부착하고 워터 배스를 사용하여 50℃에서 전체를 용해했다. 여기에 Kyoward 300(Kyowa Chemical Industry Co., Ltd.) 3g를 첨가하고, 50℃에서 1시간 동안 교반을 실시했다. 그 후, 여과에 의해 여액을 회수하고, 농축 후 헥산을 첨가하여 결정을 석출시켰다. 석출된 결정을 여과 분리하고 진공 건조하여 결정을 회수하였다(수율 86%).
분석법 A에 의한 RP-HPLC 분석의 결과, 2관능 PEG 함량은 0.1%미만(0.03%)이었다.
(실시예 3)
하기 식(v)로 표시되는 α-아미노프로필-, ω-메톡시-폴리에틸렌 글리콜(분자량：20,000, 2관능 PEG 함량:2.8%) 20g와 톨루엔 360g를 1L 4구 플라스크에 채웠다. 쓰리-원 모터, 냉각관, 질소 취입관을 부착하고 워터 배스를 사용하여 50℃에서 전체를 용해했다. 여기에 Kyoward 300: 6g을 첨가하고, 50℃에서 1시간 동안 교반을 실시했다. 그 후, 여과에 의해 여액을 회수하고, 농축 후 헥산을 첨가하여 결정을 석출시켰다. 석출된 결정을 여과 분리하고 진공 건조하여 결정을 회수하였다(수율 82%).
분석법 A에 의한 RP-HPLC 분석의 결과, 2관능 PEG 함량은 0.5%이었다.
Figure pct00011
(실시예 4)
식 (v)로 표시되는 α-아미노프로필-, ω-메톡시-폴리에틸렌 글리콜(분자량: 2,000, 2관능 PEG 함량: 1.8%) 10g와 톨루엔 45g를 300 mL 4구 플라스크에 채웠다. 쓰리-원 모터, 냉각관, 질소 취입관을 부착하고 워터 배스를 사용하여 질소 하에서 전체를 40℃으로 용해했다. 이것에 Kyoward 300: 3 g를 첨가하고, 40℃에서 30분 동안 교반을 실시했다. 그 후, 여과에 의해 여액을 회수하고, 농축 후 헥산을 첨가하여 결정을 석출시켰다. 석출된 결정을 여과 분리하고 진공 건조하여 결정을 회수하였다(수율 84%).
분석법 B에 의한 RP-HPLC 분석의 결과, 샘플의 2관능 PEG 함량은 0.9%이었다.
본 발명에 의해, 의약 용도로 적합한 고품질의 폴리에틸렌 글리콜 화합물을 공업적 스케일로 용이하게 제공할 수 있다.
본 발명을 상세하게 또 특정한 실시 양태를 참조하여 설명했지만, 본 발명의 정신과 범위를 벗어나는 일 없이 여러 가지 변경이나 수정을 가할 수 있는 것은 당업자에게 있어서 분명하다.
본 출원은 2019년 12월 27일 출원의 일본 특허 출원(일본 특허 출원 번호 2019-237880)에 기초하는 것이고, 그 내용은 여기에 참조로서 받아들여진다.

Claims (1)

  1. 하기 (A) 공정 및 (B) 공정을 갖는 것을 특징으로 하는, 식 [1]로 표시되는 폴리에틸렌 글리콜 화합물의 정제 방법.
    (A) 공정： 상기 식 [1]로 표시되는 화합물을, 힐데브란드(Hildebrand) 용해 파라미터가 8∼10(cal/cm3)1/2인 유기용제에 용해시킴으로써 용액을 얻는 공정
    (B) 공정： 상기 식 [1]의 화합물 1질량부에 대해, 비표면적이 50∼200m2/g인 하이드로탈사이트(hydrotalcite)로 이루어지는 0.1∼1질량부의 흡착제를 상기 용액에 혼합함으로써 슬러리를 조제하는 공정
    Figure pct00012

    (식 [1] 중,
    Z는, 2∼5개의 활성 수소기를 갖는 화합물에서 상기 활성 수소기를 제거한 잔기이고,
    A는 아미노기이고,
    Y1 및 Y2는, 각각 독립적으로, 에테르 결합, 아미드 결합, 에스테르 결합, 우레탄 결합, 카보네이트 결합, 2급 아미노기, 티오에테르 결합, 디술피드 결합, 티오에스테르 결합 또는 이들을 포함하는 알킬렌기이고,
    Polymer는, 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 나타내고,
    X는, 탄소수 1∼7의 탄화수소기, 탄소수 3∼9의 아세탈기, 수산기, 수산기의 보호기, 카르복실기, 카르복실기의 보호기, 티올기, 티올기의 보호기, 시아노기 또는 이들을 포함하는 알킬렌기이고,
    l 및 m은, 각각 l=1 또는 0, m=1 또는 0이고,
    a 및 b는 0≤a≤4, 0≤b≤4 또한 1≤a＋b≤4를 만족하는 정수이다.)
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