LU602158B1 - Méthode d'extraction par adsorption sur gel de l'acide désoxycholique de l’oie à usage biopharmaceutique - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne le domaine de l’extraction et de la fabrication de produits biopharmaceutiques, et porte plus précisément sur une méthode d’extraction par adsorption sur gel de l’acide désoxycholique de l’oie à usage biopharmaceutique. Dans la méthode de la présente invention, la bile de poulet a été utilisée comme matière première, et l'acide désoxycholique d'oie brut a été obtenu par saponification avec de l'hydroxyde de sodium, acidification avec de l'acide chlorhydrique, élimination des impuretés par des réactifs organiques, précipitation avec du chlorure de calcium, extraction avec de l'acétate d'éthyle et acidification, puis l'acide désoxycholique d'oie a été obtenu par isolation et purification à partir d'un gel polymère contenant de la β-cyclodextrine pour obtenir un acide désoxycholique d'oie d'une grande pureté. Ce dernier est ensuite purifié par séparation sur un gel polymère contenant de la β-cyclodextrine, permettant d’obtenir de l’acide désoxycholique de l’oie de haute pureté. La méthode de la présente invention utilise la β-cyclodextrine comme agent de réticulation, formant par polymérisation radicalaire avec des monomères polymères un gel polymère contenant de la β-cyclodextrine, capable de former des complexes stables avec l'acide désoxycholique de l’oie dans certains solvants organiques et solutions aqueuses, présentant une bonne capacité d'adsorption ainsi que de multiples avantages tels qu'une haute sécurité, une grande sélectivité et une réutilisabilité, offrant de vastes perspectives d'application industrielle.

Description

Méthode d'extraction par adsorption sur gel de l'acide désoxycholique de l’oie à usage 10006158 biopharmaceutique

Domaine technique

La présente invention concerne le domaine de l'extraction et de la fabrication de produits biopharmaceutiques, et porte plus particulièrement sur une méthode d'extraction par adsorption sur gel de l'acide désoxycholique de l’oie à usage biopharmaceutique.

Contexte technique

L’acide désoxycholique de l’oie (3a,7a-dihydroxy-5B-cholanoïque), de couleur blanche, cristaux en forme d’aiguilles, est un composé stéroidien acide. En raison de sa structure chimique unique et de sa forte activité de surface, l’acide désoxycholique de l’oie est largement utilisé dans les domaines de la biopharmacie, de la reconnaissance moléculaire et de la fabrication de matériaux, notamment pour ses propriétés de dissolution des calculs biliaires et d’autres fonctions pharmaceutiques, suscitant un grand intérêt chez les chercheurs.

L’acide désoxycholique d’oie disponible sur le marché provient principalement de deux sources d’extraction, à savoir l’extraction à partir de bile animale et la synthèse chimique ; La composition et la teneur en acides biliaires varient considérablement selon la bile animale utilisée ; dans la bile de poulet, l’acide désoxycholique d’oie représente 80 % de la teneur totale en acides biliaires, les autres types d’acides biliaires étant peu nombreux. Par conséquent, il est plus aisé d’obtenir un acide désoxycholique d’oie de haute pureté à partir de la bile de poulet qu’à partir de la bile de porc ou de bœuf ; les matières premières utilisées pour la synthèse chimique sont principalement l’acide cholique, l’acide désoxycholique de porc, etc.

Les méthodes d’extraction de l’acide désoxycholique d’oie à partir de bile animale comprennent principalement l’extraction par solvant organique, la précipitation et l’utilisation de résines. Toutefois, les méthodes traditionnelles d’extraction requièrent l’utilisation de grandes quantités de solvants, présentent un rendement de récupération du produit relativement faible et des procédés complexes, ce qui entrave leur application industrielle ;

Par conséquent, une méthode d’extraction de l’acide désoxycholique d’oie plus simple et plus — efficace constitue un problème à résoudre dans l’état de la technique.

Contenu de l’invention 6027156

L’objet de la presente invention est de fournir une methode d’extraction par adsorption sur gel de l’acide desoxycholique d’oie à usage biopharmaceutique, afin de résoudre les problèmes des méthodes d’extraction traditionnelles, à savoir l’utilisation de grandes quantités de solvants, un rendement de récupération du produit relativement faible, la complexité du procédé et les obstacles à l’application industrielle.

Pour atteindre l’objectif susmentionné, la présente invention propose la solution technique suivante : une méthode d’extraction par adsorption sur gel de l’acide désoxycholique d’oie à usage biopharmaceutique, comprenant les étapes suivantes :

S1. La bile de poulet fraîche a été extraite, saponifiée, acidifiée, décontaminée avec des réactifs organiques, précipitée avec du chlorure de calcium, extraite avec de l'acétate d'éthyle et acidifiée pour obtenir l'acide désoxycholique de goose brut ;

S2. Dissolution du produit brut d’acide désoxycholique de l’oie obtenu en S1 dans une solution éthanolique à 40 %, puis adsorption avec un gel polymère de P-cyclodextrine, filtration et lavage, obtenant un complexe ;

S3, dans le complexe obtenu à l’étape S2, on ajoute une solution éthanolique à 95 % pour procéder à la désorption, obtenant ainsi une élution ; le produit obtenu après élimination de l’éthanol dans l’élution est re-dissous dans de l’acétate d’éthyle, puis recristallisé afin de modifier la forme cristalline, séché, ce qui permet d’obtenir un acide désoxycholique de l’oie de haute qualité.

En outre, dans l’étape S1, une vésicule biliaire de poulet fraîche est prélevée, puis soumise à une congélation, à des coupes, à une décongélation et à une filtration par pressage, permettant ainsi d’obtenir une bile de poulet fraîche.

En outre, dans l’étape S1, sous agitation et chauffage lent, du NaOH solide est ajouté en une quantité équivalente à 10 % en poids de la bile de poulet afin d’effectuer la saponification ; lorsque la température atteint 100 °C, l’agitation est arrêtée, puis le chauffage est poursuivi jusqu’à 110 °C. À 110 °C, un chauffage à reflux est maintenu pendant 8 heures afin d’assurer un état de légère ébullition du système réactionnel. Apres la saponification, le refroidissement naturel à température ambiante permet d’obtenir le liquide de saponification.

En outre, dans l’étape S1, prélever le liquide de saponification obtenu et, sous agitation,

ajouter lentement une solution d’acide chlorhydrique (1+1) afin de procéder à l’acidification, 10006158 ajuster le pH de la solution entre 4 et 6, puis, lorsque la quantité de solide précipité n’augmente plus, arrêter l’agitation, laisser reposer et filtrer pour obtenir le produit solide après acidification.

En outre, dans l’étape S1, dissoudre le produit solide obtenu après acidification dans une solution éthanolique, ajouter de l’éther de pétrole pour l’extraction, laisser reposer puis procéder à la décantation afin d’obtenir la phase éthanolique, permettant ainsi l’élimination des impuretés du produit solide après acidification ; La fraction massique de la solution éthanolique est de 95 %, le rapport massique entre la solution éthanolique et le produit solide après acidification est de 2 à 4:1, et le rapport volumique entre la solution éthanolique et l’éther de pétrole est de 2:1.

En outre, dans ladite S1, prendre la phase d'éthanol obtenue après élimination des impuretés et y ajouter une solution de chlorure de calcium saturée, précipiter le produit solide ; agiter le mélange d'éthanol obtenu, de chlorure de calcium et du produit solide et ajouter de l'acétate d'éthyle pour l'extraction, et séparer le liquide après repos, obtenir la phase d'acétate d'éthyle ; l'évaporation rotative est effectuée sur la phase d'acétate d'éthyle obtenue, récupérer l'acétate d'éthyle et obtenir le produit solide ; le produit solide est recueilli, dispersé dans l'eau, filtré pour obtenir le filtrat, acidifié par l'acide chlorhydrique, filtré et séché, obtenir l'acide désoxycholique de l'oie brut. Le produit solide est recueilli et dispersé dans l'eau, le filtrat est filtré, acidifié avec de l'acide chlorhydrique, filtré et séché, et le produit brut d'acide désoxycholique d'oie est obtenu.

En outre, dans l’étape S2, le gel polymère de B-cyclodextrine est obtenu en utilisant la

B-cyclodextrine comme agent de réticulation, par polymérisation de monomères polymères ;

Les monomères polymères comprennent des monomères d'oxyde d'éthylène, d'acrylamide, de méthacrylate de méthyle, d'éthylène, de propylene ainsi que des monomères de polyester.

En outre, dans l’étape S3, la désorption est effectuée sous agitation, la durée d’agitation étant de 30 minutes, et le gel polymère de B-cyclodextrine est récupéré lors de la collecte de l’éluat ; La pureté de l’acide désoxycholique de l’oie obtenu est de 97,3 %, avec un rendement correspondant à 4,2 % du poids total de la bile de poulet.

Effets bénéfiques de la présente invention :

1, Comparé à la durée de saponification traditionnelle de 10 à 20 heures, la présente 17602758 invention adopte d’abord une agitation avec chauffage progressif, puis l’arrêt de l’agitation et un reflux à 110°C pendant 8 heures, ce qui permet de réduire le temps de réaction, de simplifier le procédé et de réaliser des économies d’énergie ; 2, La récupération et la réutilisation de l’éther de pétrole, de l’acétate d’éthyle et du gel polymère de P-cyclodextrine présentent une grande recyclabilité ; leur réutilisation pour l’extraction permet de réduire efficacement les coûts de production. 3, Les sels de baryum sont toxiques et nocifs pour l’organisme humain, ce qui les rend inadaptés à une production à grande échelle. La présente invention utilise une précipitation par sel de calcium, une étape simple, à coût réduit, et présentant une sécurité supérieure par rapport aux sels de baryum. 4, Comparée à la technique traditionnelle qui consiste à purifier l’acide désoxycholique d’oie brut par recristallisation répétée à l’aide d’acétate d’éthyle et de solvant acétonitrile, la présente invention utilise une méthode de purification par adsorption complexe hôte-invité avec la B-cyclodextrine, offrant une pureté et un rendement équivalents, tout en mettant en avant de multiples avantages tels qu’une biosécurité élevée, une grande sélectivité et une recyclabilité accrue.

Mode de réalisation spécifique

Les exemples de réalisation de la présente invention seront décrits ci-après de manière claire et complète, en relation avec les solutions techniques mises en œuvre dans ces exemples.

Le principe de la présente invention est le suivant :

L'interaction hôte-invité constitue un système supramoléculaire à haute spécificité, résultant d'une correspondance élevée entre l'hydrophilie/hydrophobicité, les dimensions spatiales et l'énergie des molécules hôtes et invitées. L'interaction hôte-invité a déjà été largement appliquée dans le domaine de la reconnaissance et de l'analyse moléculaires spécifiques. La molécule hôte présente généralement une structure cavitaire appropriée permettant d'encapsuler la molécule invitée. La cyclodextrine (CD) est une molécule hôte naturelle dotée d'une structure cavitaire, capable de former des complexes d'inclusion avec diverses molécules invitées par le biais d'interactions hydrophobes, de forces de van der

Waals et de liaisons hydrogène. 6027156

Dans la presente methode d’invention, un nouveau materiau d’adsorption et de séparation, doté d’une adsorption sélective et de fonctionnalités spécifiques, est élaboré sur la base de la chimie hôte-invité ; Le gel polymère de B-cyclodextrine est préparé en utilisant la 5 P-cyclodextrine comme agent de réticulation, le gel polymère de B-cyclodextrine servant de molécule hôte. Par l’action de complexation entre la molécule hôte et la molécule invitée, à savoir l’acide désoxycholique d’oie, il présente une sélectivité élevée ainsi qu’une forte affinité pour l’acide désoxycholique d’oie, permettant ainsi l’extraction et la purification de ce dernier.

Dans la présente invention, les monomères polymères comprennent le monomère de polyoxyéthylène, le monomère d’acrylamide, le monomère de polyméthyléthylvinyléther, le monomère de polyéthylène, le monomère de polypropylène ainsi que le monomère de polyester, etc. Le gel polymère de B-cyclodextrine obtenu peut être recyclé au cours de son utilisation, permettant ainsi une utilisation en cycle, et présente de vastes perspectives d’application industrielle.

Exemple d’exécution 1

Procédé d’extraction par adsorption sur gel de l’acide désoxycholique d’oie à usage biopharmaceutique, comprenant les étapes suivantes :

S1. Prélever de la bile de poulet fraîche, procéder à la congélation, à la découpe en coupes, à la décongélation, puis à la filtration par pressage afin d’obtenir de la bile de poulet fraîche ;

S2. Prélever 500 g de bile de poulet, ajouter quantitativement 50 g de NaOH selon 10wt.% % en poids de la bile, activer l’agitation, chauffer progressivement jusqu’à ébullition à 100 °C puis arrêter l’agitation ; après le début de la saponification, maintenir la température a 110 °C sous chauffage à reflux pendant 8 h afin d’assurer un état de légère ébullition du système réactionnel ; après la saponification, laisser refroidir à température ambiante pour obtenir le liquide de saponification ;

S3. Prélever une quantité appropriée d’acide chlorhydrique concentré, ajouter un volume égal d’eau afin de diluer l’acide chlorhydrique de moitié, obtenant ainsi une solution d’acide — chlorhydrique (1+1) ; Ajouter lentement la solution d’acide chlorhydrique (1+1) dans le liquide de saponification sous agitation, ajuster le pH à 4~6 ; lorsque la quantité de produit 10006158 solide précipité n’augmente plus, arrêter l’agitation et laisser reposer pendant 30 minutes, puis filtrer après décantation afin d’obtenir le produit solide après acidification ;

S4. Dissoudre le produit solide après acidification dans une solution éthanolique à 95 %, la quantité de solution éthanolique représentant 2 à 4 fois celle du produit solide ; ajouter ensuite de l’éther de pétrole en un volume équivalent à la moitié de la solution éthanolique pour procéder à l’extraction, agiter pendant 30 minutes, laisser reposer pendant 30 minutes, puis séparer les phases afin d’obtenir la phase éthanolique et de récupérer l’éther de pétrole ;

SS. 100 ml de solution saturée de chlorure de calcium ont été ajoutés à la phase éthanol, le produit solide précipité a été obtenu, 200 ml d'acétate d'éthyle ont été ajoutés pour l'extraction après agitation, et le liquide a été séparé après repos pour obtenir la phase d'acétate d'éthyle ; la phase d'acétate d'éthyle obtenue a été soumise à une évaporation rotative, l'acétate d'éthyle a été récupéré, et le produit solide a été obtenu ; le produit solide a été collecté, dispersé dans l'eau, le filtrat a été obtenu par filtration, et le PH a été ajusté à 2,5 en ajoutant de l'acide chlorhydrique, et il a été filtré et séché. Le produit brut de l'acide désoxycholique de l'oie a été obtenu ;

S6. Dissoudre et diluer le produit brut d’acide désoxycholique d’oie dans une solution éthanolique à 40 %, de sorte que la concentration d’acide désoxycholique d’oie dans la solution soit de 5 mg/ml ; prélever 40 ml de cette solution, puis ajouter 1,5 g de gel polymère de B-cyclodextrine pour l’adsorption. Après établissement de l’équilibre d’adsorption, filtrer afin d’obtenir le complexe. Rincer le complexe à l’eau distillée afin d’éliminer la solution résiduelle, puis introduire le complexe dans 15 ml de solution éthanolique à 95 %, sous agitation à 75 rpm et à une température de 20 °C pendant 30 minutes pour procéder à la désorption. Recueillir l’éluat correspondant et récupérer le gel polymère de B-cyclodextrine, lequel peut être réutilisé ;

S7. Après élimination de l’éthanol par évaporation rotative, redissoudre dans de l’acétate d’éthyle, modifier la forme cristalline par recristallisation, puis sécher afin d’obtenir de l’acide désoxycholique d’oie de qualité supérieure. La pureté de l’échantillon, déterminée par chromatographie liquide à haute performance, est de 97,3 %, et le rendement par rapport à la masse totale de bile est de 4,2 %.

La présente invention ne se limite pas aux modes de réalisation préférés décrits ci-dessus. 10006158

Toute personne, à la lumière des enseignements de la présente invention, peut concevoir d'autres formes de produits ; toutefois, quelles que soient les modifications apportées à leur forme ou à leur structure, toute solution technique identique ou similaire à celle de la présente demande relève du champ de protection de la présente invention.

Claims (8)

Revendications 6027156

1. Procédé d'extraction par adsorption sur gel de l'acide désoxycholique de l’oie à usage biopharmaceutique, caractérisé par les étapes suivantes :

S1. Extraction de bile de poulet fraîche, suivie de saponification, acidification, élimination des impuretés par réactifs organiques, précipitation par chlorure de calcium et acidification, puis extraction à l’acétate d’éthyle, obtenant un produit brut d’acide désoxycholique de l’oie ;

S2. Dissolution du produit brut d’acide désoxycholique de l’oie obtenu en S1 dans une solution éthanolique à 40 %, puis adsorption avec un gel polymère de P-cyclodextrine, filtration et lavage, obtenant un complexe ; S3, dans le complexe obtenu à l’étape S2, on ajoute une solution éthanolique à 95 % pour procéder à la désorption, obtenant ainsi une élution ; le produit obtenu après élimination de l’éthanol dans l’élution est re-dissous dans de l’acétate d’éthyle, puis recristallisé afin de modifier la forme cristalline, séché, ce qui permet d’obtenir un acide désoxycholique de l’oie de haute qualité.

2. Méthode d’extraction par adsorption sur gel de l’acide désoxycholique de l’oie à usage biopharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée en ce que, dans l’étape S1, on prélève de la bile de poulet fraîche, laquelle est soumise à congélation, tranchage, décongélation, puis pressage et filtration, permettant ainsi d’obtenir de la bile de poulet fraîche.

3. Selon la revendication 1, méthode d'extraction par adsorption sur gel de l'acide désoxycholique de l’oie à usage biopharmaceutique, caractérisée en ce que : dans l’étape S1, sous agitation et chauffage lent, une quantité de NaOH solide équivalente à 10 % en poids de la bile de poulet est ajoutée pour procéder à la saponification ; lorsque la température atteint 100 °C, l’agitation est arrêtée, puis la température est portée à 110 °C, où un chauffage par reflux est maintenu pendant 8 heures afin d’assurer un état d’ébullition douce du système réactionnel ; après la saponification, le mélange est refroidi naturellement à température ambiante pour obtenir la solution saponifiée.

4. Selon la revendication 3, méthode d'extraction par adsorption sur gel de l'acide — désoxycholique de l’oie à usage biopharmaceutique, caractérisée en ce que : dans l’étape S1,

la solution saponifiée obtenue est prise, et sous agitation, une solution d’acide chlorhydrique 10006158 (1+1) est ajoutée lentement pour procéder à l’acidification, en ajustant le pH de la solution entre 4 et 6 ; lorsque la quantité de solide précipité cesse d’augmenter, l’agitation est arrêtée et le mélange est laissé au repos avant filtration, permettant d’obtenir le produit solide après acidification.

5. Selon la revendication 4, une méthode d'extraction par adsorption sur gel de l'acide désoxycholique de l’oie à usage biopharmaceutique, caractérisée en ce que : dans ledit S1, le produit solide après acidification est dissous dans une solution éthanolique, puis on ajoute de l’éther de pétrole pour procéder à une extraction, après décantation, on effectue une séparation des phases, obtenant la phase éthanolique, permettant ainsi l’élimination des impuretés du produit solide après acidification ; La fraction massique de la solution éthanolique est de 95 %, le rapport massique entre la solution éthanolique et le produit solide après acidification est de 2 à 4:1, et le rapport volumique entre la solution éthanolique et l’éther de pétrole est de 2:1.

6. Selon la revendication 5, un procédé d'extraction par adsorption sur gel de l'acide désoxycholique de l’oie à usage biopharmaceutique, caractérisé en ce que : dans le SI, on prélève la phase éthanolique obtenue après élimination des impuretés, puis on y ajoute une solution saturée de chlorure de calcium afin de précipiter un produit solide ; Le mélange obtenu d’éthanol, de chlorure de calcium et de produit solide est agité, puis on ajoute de l’acétate d’éthyle pour procéder à une extraction ; après décantation, on réalise une séparation des phases pour obtenir la phase d’acétate d’éthyle ; La phase d’acétate d’éthyle obtenue est soumise à une évaporation rotative afin de récupérer l’acétate d’éthyle et d’obtenir un produit brut d’acide désoxycholique de l’oie.

7. Selon la revendication 1, un procédé d'extraction par adsorption sur gel de l'acide désoxycholique de l’oie à usage biopharmaceutique, caractérisé en ce que, dans ledit S2, le gel polymère de B-cyclodextrine est formé par polymérisation de monomères polymères en utilisant la P-cyclodextrine comme agent de réticulation ; Les monomères polymères comprennent des monomères d'oxyde d'éthylène, d'acrylamide, de méthacrylate de méthyle, d'éthylène, de propylène ainsi que des monomères de polyester.

8. Selon la revendication 1, un procédé d'extraction par adsorption sur gel de l'acide désoxycholique de l’oie à usage biopharmaceutique, caractérisé en ce que, dans ledit S3, la 10006158 désorption est effectuée sous agitation pendant 30 minutes, tout en collectant l'élution et en récupérant simultanément le gel polymère de P-cyclodextrine ; La pureté de l’acide désoxycholique de l’oie obtenu est de 97,3 %, avec un rendement correspondant à 4,2 % du poids total de la bile de poulet.