LU82187A1 - Determination de la teneur en glucose d'un echantillon de liquide corporel - Google Patents
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Description
D. 5ο.93δ
/\ Λ Λ TT GRAND-DUCHÉ DE LUXEMBOURG
Brevet N°jQ* ..„JL·.......1........i^r......^ du 21...février 198 a... Monsieur le Ministre . 1¾¾¾¾ de l’Économie Nationale et des Classes Moyennes
Titre delivre : ........................................
jSLJgj Service de la Propriété Industrielle
' 0¾¾ LUXEMBOURG
Demande de Brevet d’invention I. Requête , ...La....s.ocié.té.....di.te.î.....HILES.....LAB.QRÄT.Q.RIES./.....INC..*../......£.,0..,......E.QX.....4.Q./......à...................(i) ...elkhart.,.....XndlaRa 46515/.....E.ta.ts-ünis.....d.!..Mërlguê./.....représentée.......................
...par...Monsieur...Jacgues......de....Muy.s.er./......agi.ssant.....en....gu.alifcé....!ie...man-...........(2> ...dataire............................................................................................................................................................................................................................................................
dépose........ ce vlng.tr.at-.un....f.éy.rier.....19..QQ.....g.ua.tr.é.“y.in.gt.........................................
à.......15............. .... heures, au Ministère de l’Économie Nationale et des Classes Moyennes, à Luxembourg : ' 1. la présente requête pour l’obtention d’un brevet d’invention concernant : ....."Dêterini.nat±on....de.....la.....tene.ur.....en.....gl.u.CQS.é.....d.!.wn.....êchanM.llQ.n............................(4) ........de.....liquide.....corporel".*............................................................................................................................................................................
/Φ/*/*/ fi/ fififififi/]/ /fi/qfi/tfiÿ/s/éfdfififil/el/kfifififi/af fi/e/v/fi/ idiJobUxli^) feJk/[loL·/)/ ......................................................................................................................................................................................................................................................................................(5) 2. la délégation de pouvoir, datée dRELKHABT.f....Indiana.............. le 3.Q.....QG.fcQb.TS 19.79 3. la description en langue ....£rançalse........................................de l’invention en deux exemplaires ; 4..........„3.________________ planches de dessin, en deux exemplaires ; 5. la quittance des taxes versées au Bureau de l’Enregistrement à Luxembourg, le.....21.....février.....l9..8.o................................................................................................................................................................................................................
revendique pour la susdite demande de brevet la priorité d’une (des) demande(s) de (6)__________________brevet__________________________________________________déposée© fi/ (7) .auxEtatsrünis.....dlMirique_____________________ le......23.....février.1979..........(No.......14,5oo)------------------------------------------------ (8) au nom de ....1'.inventeur........................................................................................................ (9) élit domicile pour lui (elle) et, si désigné, pour son mandataire, à Luxembourg ........................................
.....35.,......bldA.....Nc®;al.............................................................. uo) sollicite la délivrance d’un brevet d’invention pour l’objet décrit et représenté dans les annexes
Eientionnées, — avec ajournement de cette délivrance à ... .................. ......mois.
...rt^nda^air^............|..........Cj • Π. Procès-verbal de Dépôt
La susdite demande de brevet d’invention a été déposée au Ministère de l’Économie Nationale et des Classes Moyennes, Service de la Propriété Industrielle à Luxembourg, en date du : \.
7Λ février 19 8o pr. le Ministre à.........1.5............ ... heures / l’Économie Nationale ek/ùes Classes Moyennes, / & * 1 . P/p· A 6800T V *S"........Yi. Æk .£ / / ) f λ ·. t —îy-2-1-
REVENDICATION DE LA di_$oî£îI
PRIORITE DU DEPOT DE LA DEMANDE DE BREVET
EN ETATS-UNIS D«AMERIQUE DU 23 décembre 1979
VAÀAUV
Mémoire Descriptif déposé à l’appui d’une demande de
BREVET D’INVENTION
au
Luxembourg formée par: MILES LABORATORIES, INC.
pour: Détermination de la teneur en glucose d*un échantillon » de liquide corporel.
- 2 -
La présente invention concerne, d'une manière générale, le domaine des essais diagnostiques et, plus particulièrement, les essais utiles pour la détermination qualitative et quantitative du glucose, essais au cours desquels du glucose est transformé en un peroxyde.
„ L'oxydase de glucose transforme le glucose en acide gluconique et en peroxyde d'hydrogène par voie enzymatique. Le peroxyde d'hydrogène ainsi formé peut être réduit en H^O par une substance à activité peroxydante en présence d'un système indicateur qui est oxydé pour produire une réponse telle qu'un changement de coloration. L'o-tolidii qui est un indicateur chromogène, a été utiliséependant un certain temps dans des systèmes dessai de détermination de glucose, mais elle donne des résultats qui sont sujets à la réduction de l'indicateur oxydé par des substances perturbatrices telles que l'acide ascorbique. De plus, la sécurité de l’o-tolidine a été mise en doute.
Dans les brevets britanniques publiés 1.464*359 et 1.464*360, on décrit l'utilisation de la 3*3’,5>51-tétra-méthylbenzidine et de composés semblables, ainsi que leur % utilisation pour la détection et la détermination du peroxyde d'hydrogène ou de constituants réagissant pour former des peroxydes* Les concentrations des dérivés de benzidine décrits dans ces brevets sont incompatibles et, en règle générale, elles ne dépassent pas environ 6 mg/ml de la solution d'imprégnation utilisée.
L'utilisation des dérivés de benzidine aux concentrations décrites dans les brevets britanniques précités donne lieu à une formation relativement lente d'une couleur ou à la formation d'une couleur qui ne reste pas stable au - 3 - loppée a tendance à s’altérer au repos, si bien que les lectures effectuées sont susceptibles de comporter des erreurs et sont difficiles, voire impossibles à réaliser par lin personnel non expérimenté.
En conséquence, un objet de la présente invention est de fournir un système d'essai amélioré pour la détection du glucose.
Un autre objet encore de l'invention est de fournir un système d'essai amélioré pour la détermination du glucose en utilisant des matières dont la sécurité est reconnue.
Un autre objet encore de l'invention est de fournir un système d'essai amélioré pour la détection du glucose, ce système donnant lieu à la formation d'une couletu restant stable à mesure que le temps s'écoule.
Un autre objet encore de la présente invention est de fournir un système d'essai amélioré pour la détection du glucose dans un échantillon, système dans lequel les avantages précités sont réalisés par un nouveau moyen d'essa: comprenant de l'oxydase de glucose, une substance à activité
Y
peroxydante et un indicateur à base de 3j3* i5,5’-tétra-alkylbenzidine, cet indicateur étant présent en une quantité suffisante pour produire rapidement un produit réactionnel coloré stable lors du contact de ce moyen d'essai avec une quantité prédéterminée d'un échantillon contenant du glucose
La présente invention, ainsi que d'autres objets de celle-ci seront mieux compris à la lecture des revendications et de la description ci-après données en se référant à certaines formes de réalisation préférées conjoin tement avec les dessins annexés dans lesquels : - 4 - la figure 1 est une représentation graphique des résultats repris au tableau ci-après en employant des dispositi: d'essai de détermination de glucose réalisés en utilisant une solution d'imprégnation de formule I suivant l'exemple ci-après, cette représentation étant obtenue en traçant la courbe de la valeur K/S définie ci-après vis-à-vis de la concentration de glucose j
la figure 2 est une représentation graphique des résultats repris au tableau ci-après en employant des dispositifs d’essai de détermination de glucose réalisés en utilisant la solution d'imprégnation de formule II de l'exemple ci-après cette représentation étant obtenue en traçant la courbe de la valeur K/S vis-à-vis de la concentration de glucose J
la figure 3 est une représentation graphique des résultats repris au tableau ci-après en employant des dispositif S d'essai de détermination de glucose réalisés en utilisant la solution d'imprégnation de formule III de l'exemple ci-après, cette représentation étant obtenue en traçant la courbe de la valeur K/S vis-à-vis de la concentration de glucose ; la figure 4 est une représentation graphique des résultats repris au tableau ci-après en employant des dispositifs d'essai de détermination de glucose réalisés en utilisant la solution d'imprégnation de formule IV de l'exemple ci-après, cette représentation étant obtenue en traçant la courbe de la valeur K/S vis-à-vis de la concentration de glucose, et la figure 5 est une représentation graphique du pourcentage de changement de coloration observé (défini par (AK/S)/K/S x 100) pour les dispositifs d'essai utilisés pour obtenir les résultats illustrés dans les figures 1 à 4· / - 5 -
Contrairement aux compositions de la technique antérieure, celles de la présente invention ne posent pratiquement pas le problème de l'altération des couleurs# Cette propriété inattendue est observée lorsqu'on augmente la concentration de l'indicateur à base de 3»3* >5,5'-tétra-alkyl-benzidine. En conséquence, la présente invention se différencie de la méthodologie actuelle du fait qu'elle fournit rapidement une couleur restant stable après sa formation.
On ne doit pas attendre que la couleur de l'indicateur se stabilise ni qu'il se produise, à la longue, un changement continu de coloration après le début de la formation d'une couleur. Suivant la présente invention, il existe dorénavau une composition et un dispositif dans lesquels on utilise une 3*3’i5j5’-tétra-alkylbenzidine produisant rapidement une couleur stable lors de son contact avec un échantillon contenant du glucose à une concentration se situant entre une quantité faible, mais détectable et au moins environ 400 mg/ I Suivant la présente invention, on prévoit un ^ moyen d'essai tel qu'une composition, un dispositif d'essai, un procédé de réalisation de ce dispositif, de même qu'un procédé pour la détermination du glucose dans un échantillon Plus particulièrement, le moyen d'essai envisagé suivant l'invention comprend de l'oxydase de glucose, une substance à activité peroxydante telle qu'une peroxydase, ainsi qu'un indicateur à base d'une 3,3' >5,5'-tétra-alkylbenzidine en une quantité suffisante pour produire rapidement, lors du contact de ce moyen d'essai avec une quantité prédéterminée d'un échantillon contenant du glucose, un produit réactionne coloré stable que l'on pense être constitué des formes réduites et oxydées de cet indicateur en un équilibre stable / /ï/\ - 6 -
Ce produit réactionnel coloré stable est obtenu en une période ne dépassant pas environ 60 secondes et, plus spécifiquement, en une période comprise entre environ 30 et 60 secondes après le contact du moyen d1essai avec 1* échantillon de liquide corporel devant être soumis à l’essai*
La concentration de la 3*3’jSjS’-tétra-alkylbenzidine vis-à-vis de la quantité d’activité d’oxydase de glucose présente dans le moyen d’essai de l’invention est critique. Suivant l'invention, la 3*3’,5 j5 *“ tétra-alkylbenzidine est présente dans le moyen d’essai en une concentration d'au moins environ 2,5 millimoles' par 1.000 Unités Internationales d’activité d’oxydase de glucose.
Les composés de 3,31,5, 5 *-tétra-alkylbenzidine sont particulièrement avantageux,car ils sont reconnus pour leurs propriétés non carcinogènes.
De même, suivant l’invention, on prévoit un dispositif d’essai pour la détermination du glucose, ce dispositif comprenant une matrice ou un support incorporé au moyen d’essai de l’invention. Un dispositif d’essai de ce type peut être sous forme d’un comprimé ou, de préférence, sous forme d’une bande. Comme dispositifs d’essai de ce type, on envisage également des feuilles allongées d’une matière support que l’on incorpore au moyen d’essai de l’invention. Lors de leur fabrication et de leur distribution, ces feuilles allongées peuvent être sous forme de rouleaux en vrac tels que des rouleaux de papier-filtre.
On prépare ce dispositif, par exemple, en imprégnant un support d’une solution du moyen d’essai de l’invention, puis en séchant le surmort ainsi imoréené. L’invention orévoit également un procédé de détermination du glucose dans un échantillon liquide, ce procédé consistant à mettre cet échantillon en contact avec le moyen ou le dispositif d’essai suivant l'invention, puis observer le changement de coloration qui en résulte éventuellement.
Bien que, pour des raisons de clarté, on utilise des expressions spécifiques dans la description ci-après, il est entendu que ces expressions se rapportent uniquement à la forme de réalisation particulière de l'invention choisie à titre d'exemple illustratif et qu’elles ne définissent ou ne limitent nullement le cadre de l'invention.
Le moyen d’essai suivant l’invention peut avoir de nombreuses formes physiques et il peut comporter de nombreuses 3*3’,5,51-tétra-alkylbenzidines spécifiques, quelle qu'en soit sa forme. On décrira ces 3>3’,5*5’-tétra-alkylbenzidines conjointement avec des additifs connus tels que des agents stabilisants que l'on peut éventuellement utiliser en complément. Ce moyen d'essai est utilisé pour détecter le glucose en le mettant en contact avec un échantillon tel que l’urine, le sang, le sérum, le liquide cérébi spinal, le produit surnageant d’une culture de tissu ou analogues.
Parmi les différents indicateurs de benzidinef * que l'on peut utiliser, il y a les 3*3*,5j5*“bétra-alkyl- benzidines dans lesquelles le groupe alkyle contient 1 à 4 atomes de carbone, la 3,3% 5,51-tétraméthylbenzidine étant particulièrement préférée. Parmi d’autres 3*3’>5>5*-tétra-alkylbenzidines que l’on peut également utiliser, il y a la 3-méthyl,3’-méthyl,5-éthyl,5’-éthyl-benzidine et la 3,3’,5, têt ^ « t« · m · m . . __ .
- 8 - exemples, les quatre groupes alkyle peuvent être identiques ou différents·
Les enzymes de glucose que l’on peut utiliser, sont celles réagissant avec un liquide contenant du glucose et devant être soumis à un essai pour former un produit réactionnel prédéterminé tel que le peroxyde d’hydrogène. Par exemple, on peut utiliser l1oxydase de glucose obtenue à partir de moisissures· Ces enzymes sont habituellement appelées " enzymes du type des flavoprotéines", étant donné qu’elles contiennent une flavine ou une isoalloxazine comme groupe prosthétique ou comme coenzyme·
De préférence, on prévoit un système enzymatiqu< double ï une enzyme transforme le glucose pour produire du peroxyde d’hydrogène, tandis que l'autre enzyme exerce une activité peroxydante. Des substances exerçant une activité peroxydante et utiles suivant la présente invention peuvent être choisies parmi différentes sources organiques et inorganiques· On peut utiliser des peroxydases d’origine végétale telles que la peroxydase de raifort ou la peroxydase de pomme de terre. Parmi les composés inorganiques exerçant une activité de peroxydase, il y a les iodures tels que les iodures de sodium et d’ammonium, de même que les molybdates tels que les molybdates de potassium et d'ammonium· En outre ‘ on peut utiliser 1'urohémine, ainsi qu'un certain nombre d’autres substances de porphyrine exerçant une activité peroxydante· Parmi d'autres substances qui ne sont pas des enzymes, mais qui exercent une activité peroxydante, il y a des composés tels que le sulfocyanate de fer, le tannate de fer, le ferrocyanure ferreux, le sulfate chromique de τ·\λΊ*πγ>ο·Ϊ lim Ö+· nrifil /\ mi Λη - 9 -
Etant donné que, par exemple, les compositions utilisées pour mesurer la teneur en glucose dans le sang doivent être maintenues à un pH allant d’environ 4 à environ 7,5, un système tampon comprenant du tris-(hydroxyméthyl)— .aminométhane, de l’acide malonique et du malonate disodique est particulièrement utile à cet effet.
Un interpolymère d’éther méthylvinylique et d’anhydride maléique est également utile dans la formulation des indicateurs de glucose de la présente invention. Un interpolymère de ce type est vendu dans le commerce sous le nom "Gantrez AN-139" par ”GAF Corporation”· Lorsqu’on dissout cet interpolymère dans un alcool, il forme un dérivé d’ester partiel et, lorsqu’on le dissout dans l’eau, il forme un dérivé acide. Etant donné que les moyens d’essai préparés suivant la présente invention sont spécifiquement obtenus à partir de solutions alcooliques aqueuses, les compositions d'essai intervenant dans le produit final contiendront un dérivé acide, un dérivé d'ester partiel ou un mélange de ces dérivés. La présence des dérivés ci-dessu d’un interpolymère conjointement avec de la polyvinylpyrroli done ayant, par exemple, un poids moléculaire moyen d'envir 40.000^améliore considérablement la couleur formée lorsque des indicateurs chromogènes sont oxydés par le peroxyde > d’hydrogène en présence d'une peroxydase. Cette amélioratic de la coloration contribue à définir plus nettement les différentes nuances de coloration pour différentes teneurs en glucose dans un échantillon liquide donné. Cette caracte ristique est particulièrement importante pour permettre, au médecin, de poser son diagnostic en présence d’un état diabé i · · ____*_ - 10 -
De même, l’invention prévoit des dispositifs d’essai comprenant le moyen d’essai de l’invention, de même qu’un procédé de réalisation de ces dispositifs d’essai, ce procédé consistant à incorporer un support à ce moyen d’essai· Outre l’imprégnation décrite ci-dessus, l’incorporation du support dans le moyen d’essai peut être effectuée par d’autres techniques appropriées, par exemple, en imprimant ou en pulvérisant la composition d’essai sur le support.
De préférence, on prépare ce dispositif d’essai par un procédé consistant à imprégner un support d’une première solution contenant environ 4 x 10^ à environ 8 x 10^ Unités Internationales d'activité d’oxydase de glucose et environ 22 x 10^ Unités Internationales d’activité de peroxy-dase par litre et, après séchage de ce support, avec une deuxième solution contenant au moins environ 6 g de 3,3',5,5'-tétra-alkylbenzidine par litre pour environ 1 x 10^ Unités Internationales d’activité d’oxydase de glucose par litre dans la première solution. Le support imprégné est à nouveau séché après la deuxième imprégnation.
L’expression ”support” désigne des matrices qui sont insolubles dans le liquide physiologique ou un autre liquide devant être soumis à un essai, ces matrices conservant également leur intégrité structurale lorsqu’elles sont exposées à ce liquide. Parmi les matrices pouvant être utilisées, il y a le papier, la cellulose, le bois, les voiles de résines synthétiques, les fibres de verre, les tissus tissés et non tissés, la gélatine, différents polymères organiques tels que le polypropylène, ainsi que d’autres matières organiques bien connues de l'homme de métier comme n « ·« «. ^ · i · JL .
- 11 - forme d’un comprimé formé à la presse ou au moule et contenant une matière support classique· Pour plus de facilité, le support peut être avantageusement fixé sur un support insoluble ou sur un organe de préhension et pouvant être réalisé à partir de polystyrène·
Lorsque la composition d'essai doit être utiliséi * pour détecter le glucose dans le sang, la surface de la ma trice support imprégnée est avantageusement recouverte d’une pellicule ou d’un revêtement semi-perméable transparent d'éthyl-cellulose ou d’une autre matière appropriée* A cet effet, on peut appliquer une couche d’éthyl-cellulose en solution dans du benzène, par exemple, sur la surface de la matrice support imprégnée, le solvant étant ensuite éliminé par séchage avec évaporation· En variante, 1’éthyl-cellulose peut faire partie de la deuxième solution d'imprégnation comme décrit dans l'exemple ci-après*
Les dispositifs d'essai de détermination de glucose réalisés sous forme de matrices supports traitées sont souvent conservés pendant d’importantes périodes avant leur utilisation et, par conséquent, il est souhaitable que ·» les réactifs choisis ne soient pas aisément auto-oxydables à l'air· XI est recommandé de protéger les dispositifs d'essai contre l'exposition à la lumière et, dans certains cas, il est souhaitable de les conserver enfermés hermétique-• ment dans un emballage repoussant l'humidité et qui est ouvert uniquement pour retirer un ou plusieurs dispositifs d'essai peu avant l'emploi*
Si cela s'avère souhaitable, on peut traiter une matrice support avec un colorant de fond d'une couleur particulière telle que le jaune afin que la couleur produite Dar la réaction avec le fflucose vienne se marier avec la - 12 - couleur de fond pour produire des teintes variables correspondant à la concentration du glucose présent dans le liquide devant être soumis à l’essai* Il psut etre particulièrement souhaitable de colorer la matrice en jaune lorsque le produit réactionnel coloré est de couleur bleue.
On utilise avantageusement ce dispositif d’ essai én le plongeant momentanément dans un échantillon d’essai ou en introduisant un échantillon d’essai d’une ! autre manière dans cette matrice support de telle sorte ! qu’il se produise un changement de coloration détectable en présence de glucose# La capacité volumétrique du support sert à limiter la quantité d’échantillon ainsi absorbée et à laquelle est exposé le moyen d’essai ainsi incorporé.
Tout excès d’échantillon peut être éliminé du support par j lavage ou absorption afin de limiter la quantité d’échantillc ! soumis à 1’essai au volume ayant réellement pénétré dans la matrice support. Le dispositif d’essai peut être utilisé de la même manière lors d’essais pratiqués sur des échantillc j de plasma, de sérum ou d’autres liquides corporels, |
Les lectures du pouvoir réfléchissant de la ! , couleur produite par réaction avec le glucose présent dans un échantillon peuvent être fournies par des spectrophoto-mètres disponibles dans le commerce tels que le spectrophoto* mètre "Beckman DK-2” de "Beckman Instruments, Inc,”, Fullert( Californie, E,U,A,, ou le spectrocolorimètre "SCF-l” de "Israël Electro-Optical Industry Ltd.” (vendu aux Etats-Unis d’Amérique par "Broomer Research Corporation’1, Plainwell, Long Island, Ν,ΐ,)· (L· - 13 -
Pour des déterminations très précises des concentrations de glucose* on peut adopter des, procédés photoélectriques, colorimétriques ou spectrophotométriques pour déterminer une indication coloré.e, Le colorimètre à pouvoir réfléchissant "EYETONE" (marque commerciale déposée j| de "Ames Company , Division of Miles Laboratories, Inc,) est un instrument portatif conçu pour mesurer quantitativement la teneur en glucose d'un sang complet lorsqu'il est utilisé conjointement avec des bandes de réactifs "DEXTROSTIX" (marque commerciale déposée de "Ames Company, Division of Miles Laboratories, Inc,"), Le colorimètre "EYETONE" mesure la lumière réfléchie par la surface de la matrice du dispositif d*essai ayant réagi et, au moyen d'un circuit électronique, il transforme cette mesure en une lecture sur une échelle calibrée avec précision sur l'instrument et qui est en mesure d'indiquer des teneurs en glucose du sang se situan dans l'intervalle allant de 10 à 400 mg/100 ml. Plus la teneur en glucose du sang est élevée, plus la bande est foncé et moins la lumière est réfléchie. En revanche, plus la teneur en glucose du sang est faible, plus la bande est de couleur claire et plus la lumière est réfléchie. On a trouvé que le moyen ou le dispositif d'essai avec formation de couleur décrit dans la présente spécification était particulièr ment utile du fait qu'il fournit une réponse colorée exceptionnelle pouvant être déterminée au moyen du colorimètre "EYETONE" d'une manière analogue à celle des bandes de réacti "DEXTROSTIX", En variante, on peut obtenir des résultats semi-quantitatifs en utilisant 1'indicateur. - de glucose de la présente invention par comparaison de la couleur obtenue avec J « «I > I I a I a « ~ 14 -
La relation entre la valeur K (coefficient d’absorption de l’échantillon) et la concentration de l’espèce absorbante (c’est-à-dire le glucose) est donnée par l’équation de "Kubelka-Monk" qui est indiquée, conjointement avec une description détaillée de la spectrophoto-métrie par le pouvoir réfléchissant,par Kortumi, 6·, "Réflectance Spectroscopy", "Springer-Verlag Inc,*’, New York, 1969· L’expression "Κ/S", utilisée dans l’exemple ci-après est un rapport défini par la formule (l-R) /2R dans laquelle R indique le pouvoir réfléchissant et S indiqu le coefficient de dispersion du support particulier utilisé. En conséquence, la valeur "K/S" est proportionnelle à la quantité de substance chromogène formée par la réaction.
Les lectures mentionnées dans l’exemple ci-après ont été prises aux longueurs d’onde indiquées,
La peroxydase de raifort et l’oxydase de glucose utilisées dans l’exemple ci-après sont fournies par "The Research Products Division, Miles Laboratories, Inc,’’, Elkhart, Indiana, Un copolymère d’éther méthyl-vinylique et d’anhydride maléique ("Gantrez AN-13911 ) et la polyvinylpyrrolidône sont fournis par "GAF Corporation" ("Chemical Products ", New York, N,Y,)· Le solvant utilisé pour préparer les solutions peut être choisi parmi l’eau, ' les solutions physiologiques, les solvants organiques tels que le méthanol ou leurs mélanges.
L’exemple ci-après est donné simplement à tit: d’illustration et il ne limite nullement 1‘.invention, L’hoi de métier sera en mesure d’apporter, aux ingrédients et aux paramètres indiqués, les variations, les substitutions et
- 15 -EXEMPLE
On prépare des dispositifs destinés à être incorporés à des compositions utilisées pour la détermination quantitative du glucose. Les compositions utilisées pour préparer ces dispositifs ont chacune une concentration différente de 1*indicateur de 3,3’ ,5,5’-tétraméthylbenzidine. On étudie 1*effet exercé par cette différence sur la stabilit de la couleur formée en fonction de la durée.
On prépare une première solution d1imprégnation contenant les ingrédients suivants ï
Composants Quantité Concentration finale
Ethanol 25 ml 25% en volume/volume H20 40,5 ml
Oxydase de glucose 1,6 ml 8 x 10^ Unités Internais x 103 Unités In- tionales/litre t ernationales/ml)
Peroxydase de raifort 250 mg 22 x 10^ Unités Inter- (90,8 Unités Inter- nationales/litre nationales/mg)
Tampon de citrate 25 ml 0,30M
(1,8m ; pH : 4,8) ”Gantrez AN-139” 12 ml 1t2% fen poids/volume) dans ILjO (10% en poids/volume)
Polyvinylpyrrolidone 300 mg Z% (en poids/volume)
On prépare une deuxième solution d1imprégnatioi pour chacune des concentrations de 3,3 ’ , 5,5’-tétraméthyl-benzidine devant être soumise à l’essai, en ajoutant respectivement 10, 25, 50 et 75 g de cette 3,31,5,5*-tétraméthyl-benzidine à quatre solutions de 1 litre de chloroforme contenant chacune 17,5 g d1 éthyl-cellulose. tes concentrations finales de 3,3’,5,5’—tétraméthylbenzidine dans ces solutions d’imprégnation sont respectivement de 41,9, 104, 208 et 312 ί - 16 - désignées par les chiffres I, II, III et IV. Dès lors, les relations entre les quantités (en millimoles) de 3*3’*5*5'-tétraméthylbenzidine dans les solutions d'imprégnation I à IV et le nombre d’Unités Internationales d’oxydase de glucose dans la première solution d’imprégnation sont respectivement * de 0,52, 1,3* 2,6 et 3*9 millimoles par 1*000 Unités Inter nationales* De même, les relations entre le poids de 3*3*>5* tétraméthylbenzidine dans les solutions d’imprégnation I à IV et le nombre d’Unités Internationales d’oxydase de glucose dans la première solution d’imprégnation sont respectivement de 0,125* 0,313* 0,625 et 0,938 g/l*000 Unités Internationale Toutes ces relations sont reprises dans le tableau ci—après pour les solutions d’imprégnation respectives I à IV*
On imprègne quatre feuilles de papier-filtre ”Eaton-Dikeman 204 (E & D)" jusqu'à saturation avec la première solution d'imprégnation et on les sèche à 8CPC« Ensuit on imprègne chacune des feuilles ainsi imprégnées jusqu'à saturation dans une solution séparée choisie parmi les secondes solutions d’imprégnation, puis on sèche à 60°C*
On découpe les papiers ainsi.préparés à une dimension de 0,5 x 1 cm pour former des dispositifs d’essai* Ensuite, sur la face dorsale de ces dispositifs, on applique un ruban adhésif double face et ainsi, on fixe ces dispositii • sur des organes supports en matière plastique.organique*
Chaque dispositif d’essai ainsi préparé contient environ 1,7 Unité Internationale d'oxydase de glucose et 5*4 Unités Internationales de peroxydase* Les quantités finales de 3*3**5*5'-tétraméthylbenzidine dans les dispositifs contenanl les formulations I-IV sont d’environ 0,22, 0,55* 1,10 et 1,6 j · j ” 17~
On soumet les dispositifs constitués de chaque formulation à des essais en les mettant respectivement en contact avec une solution séparée choisie parmi quatre solutions aqueuses de glucose· Les concentrations en glucose de ces solutions sont respectivement de 93* 201,9* 302,4 et 372,2 mg/dl· Après saturation du support de chaque dispositif avec 1*échantillon, on laisse se dérouler la réaction pendant 60 secondes* Tout excès d’échantillon subsistant sur le dispositif est ensuite éliminé par lavage en déposant momentanément ce dispositif dans de l’eau courante et en absorbant le liquide en excès au moyen d'un tissu ordinaire pour les soins du visage. On dépose ensuite le dispositif dans un spectrophotomètre d1enregistrement par le pouvoir réfléchissanl et on lit le changement de coloration à 550 nanomètres (nm) 20 et 60 secondes après le lavage. Les valeurs observées concernant le pouvoir réfléchissant sont transformées en * valeurs "K/S" comme décrit précédemment ; les résultats obtenus sont repris dans le tableau ci-après,
TABLEAU
Formule I - 0,52 millimole (0,125 g) de 3*31 *5*51 -tétraméthyl-benzidine par 1,000 Unités Internationales d’oxydase de glucose
Teneur en glucose K/S
(mg/dl) 20 secondes 60 secondes 93 0,219 0,215 201,9 0,677 0,558 302,4 1,460 1,000 372,2 1*710 1,150 - 18 -
Formule XI - 1,30 millimole (0,313 g) de 3,3’ ,5,5'~tétra- méthylbenzidine par 1#000 Unités Internationale, d'oxydase de glucose
Teneur en glucose KS
(mg/dl) 20 secondes 60 secondes 93 0,238 0,239 201.9 0,651 0,640 302,4 1,200 1,100 . . 372,2 1,560 1,310
Formule III - 2,60 millimoles (0,625 g) de 3,3*,5,5*-tétra-méthylbenzidine par 1*000 Unités International d’oxydase de glucose
Teneur en glucose KS
(mg/dl) 20 secondes 60 secondes 93 0,278 0,283 201.9 0,630 0,634 302,4 1,170 1,160 372.2 1,550 1,530
Formule IV - 3,90 millimoles (0,938 g) de 3,3!,5,5’“bétra- méthylbenzidine par la000 Unités Internationale d'oxydase de glucose
Teneur en glucose KS
(mg/dl) 20 secondes 60 secondes 93 0,279 0,281 201.9 0,716 0,715 302,4 1,280 1,210 372.2 1,480 1,430
Les figures 1 à 4 représentent^ par des graphiques^ les résultats mentionnés dans le tableau ci-dessus poui des dispositifs contenant les formulations I à IV respectivement# Les lignes en traits pleins représentent les lec- - 19 - du dispositif, tandis que les lignes en traits discontinus représentent les lectures K/S relevées à 60 secondes· La figure 5 représente, par un graphique, le pourcentage de changement de coloration observé, défini par (AK/S)/ K/S x 10C pour des dispositifs contenant chacune des formulations X à IV· * On observe visuellement une coloration stable (bleue) pratiquement dès que l’on retire 11 échantillon en excès des dispositifs ayant les formulations XXX et IV, tandis qu’avec les dispositifs ayant les formulations I et II, on observe une altération de la coloration avec les erreurs qui en résultent dans les teneurs en glucose détectées*
Les dispositifs ayant les formulations III et IV (avec les concentrations supérieures en 3,3’,5,5,-tétraméthylbenzidine) donnent un point définitif de coloration pratiquement immédiat qui reste ensuite stable·
Les figures 1 et 2 montrent qu’il se produit tin changement important entre les lectures relevées à 20 secondes et à 60 secondes* Ces lectures sont proportionnelles à la quantité de substance chromogène formée· Dès lors, la quantité de glucose indiquée par ces dispositifs est totalement non fiable. En revanche, les lectures virtuellement identiques indiquées dans les figures .3 et 4 démontrent la stabilité de la coloration obtenue conformément à l’invention» La figure 5 indique, pour le changement de coloration entre la lecture relevée à 20 secondes et la lecture relevée à 60 secondes, un pourcentage supérieur à 30$ lorsqu’on utilise la formulation I et moins de 3$ lorsqu’on utilise la formulation III, En conséquence, la présente invention apporte une amélioration dix fois supérieure par rapport à la technique I * * - 20 -
Bien que l'invention ait été décrite avec un certain degré de particularité, il est entendu que la description ci-dessus est donnée uniquement à titre d'exemple et que de nombreux changements peuvent être apportés dans les détails sans pour autant se départir du cadre de l'invention.
f(/\ .
Claims (6)
- 6. Dispositif d'essai pour la détermination du glucose dans un échantillon de liquide corporel, caractérisé en ce qu'il comprend un support incorporé au moyen d'essai suivant l'une quelconque des revendications 1 à 3· * - 22 - * 7# Dispositif d’essai pour la détermination du glucose dans un échantillon de liquide corporel, caractérisé en ce qu’il comprend un support incorporé au moyen d’essai suivant la revendication 4· 8# Dispositif d'essai pour la détermination du glucose dans un échantillon de liquide corporel, caractérisé en ce qu'il comprend un support incorporé au moyen d'essai suivant la revendication 5#
- 9· Dispositif d’essai pour la détermination du glucose dans un échantillon de liquide corporel, ce dispositif d’essai comprenant une matrice support dans laquelle on incorpore, pour 0,5 x 1 cm de matrice support, environ 1,7 Unité Internationale d'oxydase de glucose, environ 5*4 Unités Internationales de peroxydase et au moins environ 1,1 mg de tétraméthylbenzidine,
- 10, Procédé de préparation d’un dispositif pour la détermination du glucose dans un échantillon de liquide corporel, caractérisé en ce qu'il consiste à incorporer un support au moyen d'essai suivant l’une quelconque des revendications 1 à 3·
- 11, Procédé de préparation d'un dispositif pour la détermination du glucose dans un échantillon de liquide corporel, caractérisé en ce qu'il consiste à incor- ·* ‘ porer un support au moyen d’essai suivant la revendication 4
- 12, Procédé de préparation d'un dispositif pour la détermination du glucose dans un échantillon de liquide corporel, caractérisé en ce qu'il consiste à incorporer un support au moyen d'essai suivant la revendication £ U J - 23 - 13* Procédé pour la détermination du glucose dans un échantillon de liquide corporel, caractérisé en ce qu’il consiste à mettre une quantité prédéterminée de cet échantillon en contact avec le moyen d’essai suivant l’une quelconque des revendications 1 à 3, puis observer tout changement de coloration qui en résulte* * »
- 14· Procédé pour la détermination du glucose dans un échantillon de liquide corporel, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre une quantité prédéterminée de cet échantillon en contact avec le moyen d’essai suivant la revendication 4> puis observer tout changement de coloration qui en résulte* 15* Procédé pour la détermination du glucose dans un échantillon de liquide corporel, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre une quantité prédéterminée de cet échantillon en contact avec le moyen d'essai suivant la revendication S, puis observer tout changement de coloration qui en résulte* 16* Procédé pour la détermination du glucose dans un échantillon de liquide corporel, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre cet échantillon en contact avec le dispositif d’essai suivant la revendication 6, puis observer tout changement de coloration qui en résulte sur ce dispo-sitif· ΙΛΛ.ΑΑΜ
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