LU84756A1

LU84756A1 - Procede pour l'immobilisation de matieres biologiques dans des polymeres condenses de polyalkylene-imines

Info

Publication number: LU84756A1
Application number: LU84756A
Authority: LU
Inventors: Wayne Elliott Swann
Original assignee: Genex Corp
Priority date: 1982-04-20
Filing date: 1983-04-18
Publication date: 1983-11-17
Also published as: GB8310650D0; FI831203A0; JPS58190393A; NL8301379A; DK171383D0; IT8320693A0; SE8302073D0; IT8320693A1; DE3314294A1; FI831203L; DD212747A5; US4434228A; BR8301922A; FI831203A7; ES8502158A1; FR2525234A1; IT1164193B; AU1344483A; IL68274A0; BE896509A

Description

S t j 1 \

Procédé pour 11 immobilisation de matières biologiques dans des polymères condensés de polyalkylène-imines.

La présente invention concerne un procédé en vue d* immobiliser des matières biologiques. Plus 5 particulièrement, 1*invention concerne 11 immobilisa tion de matières biologiques en les enfermant dans un polymère.

Des matières biologiques telles que des enzymes ou des cellules ou micro-organismes produc-10 teurs d1enzymes, sont souvent utilisées comme catalyseurs pour des réactions de synthèse et pour des techniques analytiques. De tels catalyseurs sont souhaitables car ils agissent avec une haute spécificité et une haute efficacité dans des conditions 15 réactionnelles généralement modérées.

Etant donné que les enzymes et d’autres biocatalyseurs sont généralement hydrosolubles, on peut les utiliser dans des systèmes réactionnels du type à charges discontinues, La réutilisation de ces 20 enzymes et d’autres biocatalyseurs est limitée en raison des difficultés que l’on rencontre pour récupérer ces matières du milieu réactionnel usé et ce, sous une forme active ou utilisable. De plus, ces matières ont tendance à subsister comme impuretés 25 dans le produit préparé. Afin d’éviter ces problèmes, on a élaboré des procédés en vue d’immobiliser des matières biologiques exerçant une activité catalytique sur des supports solides insolubles. L’immobilisation est destinée à fournir une matière biologique stabï-30 Usée pouvant résister aux conditions rigoureuses d’une utilisation répétée ou continue.

On a mentionné différents systèmes d’immobilisation pour des matières biologiques. Des enzymes ont été immobilisées par absorption sur des matières 35 insolubles telles que le charbon, le verre, la cellu— ! /a .1 ♦ I Λ 5 2 ; lose, le gel de phosphate de calcium, la montmoril- lonite et des résines organiques échangeuses d’ions, entre autres. L’immobilisation a été également effectuée en emprisonnant, dans des gels d’amidon et 5 d’acrylamide, des liaisons covalentes entre des en zymes et des polymères organiques insolubles, ainsi que des liaisons covalentes entre des molécules d’enzymes elles-mêmes.

Les procédés de la technique antérieure 10 donnent très souvent des produits d’une activité enzymatique réduite comparativement à celle de la matière biologique correspondante non liée. On sait que ces matières biologiques sont sensibles à l’inactivation ou à la dénaturation thermique et chimique.

15 La perte d’activité biologique se produit très souvent lorsqu’on effectue des opérations d’immobilisa— : tion dans des conditions rigoureuses qui peuvent être l particulièrement problématiques lorsque des réactions s de condensation de polymères sont en cause. De plus, 20 les produits obtenus par les procédés de la technique î antérieure sont souvent désavantageux en ce qui con- 5 cerne leur nature hydrophile, leur résistance, leur ! durabilité et leur porosité.

A présent, on a trouvé que l’on pouvait î ' 25 immobiliser des matières biologiques d’une manière simple et économique, tout en maintenant leur activité catalytique à un haut degré. Le procédé de la présente invention donne un produit conposite de matière biologique insolubiliséecontenant une matière biologique enfer-30 mée dans un polymère condensé d’une polyalkylène— imine. Bien que l’on prépare ce produit composite i en effectuant les réactions de condensation de poly mères en présence de la matière biologique, les conditions réactionnelles sont à ce point modérées 35 qu’il se produit une très faible perte d’activité.

/! J' i

A

3

Ces produits composites ont une résistance et une durabilitp excellentes# De plus, on peut régler la nature hydrophile de ces matières en faisant varier le degré de condensation. Le procédé de la présente 5 invention donne un produit composite pouvant être séparé de mélanges réactionnels par simple filtration, ce produit composite pouvant également être utilisé dans des procédés réactionnels continus tels que ceux dans lesquels un substrat réactif s’écoule à travers 10 un réacteur à colonne garnie.

Suivant le procédé de la présente invention, on condense ixn polymère d’une polyalkylène-imine avec un acide polycarboxylïque en une quantité donnant lieu à la condensation, en présence d’un agent de conden-15 sation également en une quantité provoquant la condensation, cette matière biologique étant mélangée avec ce polymère de polyalkylène-imine au cours de cette réaction de condensation. L'addition de l'agent de condensation donne lieu à la formation d'un 20 produit composite de matière biologique insolubilisée dans lequel la matière biologique est immobilisée à l’intérieur du polymère. L’immobilisation de la matière biologique à l'intérieur du polymère peut avoir lieu par emprisonnement physique, ainsi que par liaison 25 covalente entre la polyalkylène-imine ou l'agent de condensation et des groupes réactifs présents sur la matière biologique. Par exemple, la matière biologique peut être immobilisée par liaison covalente étant donné que l'on peut substituer des groupes amino et 30 carboxy de la matière biologique à un groupe amino de la polyalkylène-imine ou à un groupe carboxy de l'acide polycarboxylïque pour obtenir finalement une liaison covalente avec le polymère.

Le procédé de la présente invention permet 35 la préparation d'une large variété de produits composites de ma-

P

4 tières biologiques pouvant se différencier par leur nature hydrophile, leur résistance, leur durabilité et leur porosité. Une réduction du degré de condensation peut donner lieu à un produit composite ayant 5 une plus forte solubilité dans l'eau. L’addition d'agents multifonctionnels de réticulation peut accroître la résistance et la durabilité du produit composite constitué d’un polymère et d'une matière biologique, les groupes fonctionnels supplémentaires 10 condensant davantage le polymère de polyalkylène-' imine.

On peut accroître la porosité générale de la matrice en ajoutant une matière hydrosoluble en particules au mélange du polymère avant que la con-15 densation ne soit achevée. Ensuite, on retire la matière sèche par addition d’eau après condensation, dissolvant ainsi le solide. La fraction du produit composite qui a été antérieurement déplacée par les solides, reste vide, augmentant ainsi la porosité 20 de la matrice. Pour accroître la porosité du mélange, on peut utiliser n’importe quelle matière hydrosoluble en particules n’exerçant aucun effet néfaste important sur le polymère et la matière biologique.

Des acides polycarboxyliques hydrosolubles tels que 25 ceux ayant réagi avec les polyalkylène-imines non condensées sont particulièrement appropriés pour accroître la porosité de la matrice, étant donné que des quantités excessives utilisées pour accroître j cette porosité ne gênent pas sensiblement les réac- I _ 30 tions de condensation.

! Les polyalkylène-imines utilisées dans le procédé et les produits composites de la présente I invention sont des polymères dont on peut effectuer i la synthèse par polymérisation d’addition de mono— ! 35 mères d’alkylène-imines en présence d’un catalyseur ! / a

î J

Π /( j * y f 5 ' acide. Ces polymères ont généralement un poids moléculaire variant entre 30.000 et 100.000 suivant les conditions réactionnelles et, de préférence, ils comportent une structure à chaîne ramifiée.

5 La polyéthylène—imine est une polyalkylène— imine préférée, car elle est habituellement aisément disponible à un prix relativement bas et elle agit parfaitement dans les réactions de condensation adoptées dans le procédé de la présente invention. On 10 obtient la polyéthylène-imine par' polymérisation d'éthylène-imine avec ouverture du noyau en présence de catalyseurs tels que des acides minéraux. Le polymère obtenu est fortement ramifié et contient des groupes amino primaires, secondaires et tertiai-15 res. La polyéthylène-imine est hydrosoluble et, lors de la condensation des chaînes du polymère, on obtient un produit insoluble dans l'eau. Dans un procédé de condensation hautement efficace, on utilise un acide polycarboxylique pour ponter des groupes amino sur 20 des chaînes adjacentes de polyéthylène-imine. Des agents de condensation, de préférence, des carbodi-imides assurent aisément la condensation. Les réactions intervenant dans la préparation de la polyéthy— lène-imine condensée de la présente invention sont 25 illustrées ci—dessous,:

Ci) H2C~CH2~> [CH2CH2N]n[CH2CH2m]nICH2CH2NH2 I N [CH2CH2NH]nII-CH2CH2NH2 I (polyéthylène-imine) (polyéthylène-imine) 30 nh2 nh3+

S

I 6 ! ' ο (2) COOH C-O” i i

R -> R

COOH C-O” NH +

Il «j 5 nh9 o i 1 (polyéthylène-imine) (polyéthylène-imine) (polyéthylène-imine) (polyéthylène-imine) 10 I 0 NH0 _NH-R» la. h z /

0 NH. R» C-O-C

| C-0” N | '^N-R" (3) R + 2 C —> R . N-Rn 1 _ a- h i χ ! C-0 NH, N C-O-C '

Il i II V

! 15 0 R” 0 XNH-R* . (po1yéthylen e- (carbo- NH^ imine) diimide) | i (polyéthylène- i imine) ! 2 0 (polyéthylène-imine) (polyéthylène-imine)

0 NH

Il z1®-*’ I

C-O-C o=c , 1^1

Tï-Rn NH

I . 25 (4) R ->- R + 2 0 = C

ί: I /'R" I f · C-O-C' 0=C R1

| ^NH-R* NH

0 • 30 ?H2 ^ (polyéthylène—imine) (polyéthylène-imine)

La réaction (l) illustre la polymérisation de 11 éthylène-imine pour former la polyéthylène— ' ^ I imine ayant une structure à chaîne ramifiée dans 35 laquelle n et n 1 sont des nombres entiers supérieurs / 7 I r I .

' |: à 0, tandis que n” peut être 0 (indiquant que le ; groupe [Cf^Cï^NH] est absent) ou supérieur à 0. La ! réaction (2) illustre la formation d’un sel des groupes amino de la polyéthylène-imine avec un acide \ 5 polycarboxylique, R pouvant être une liaison directe î ' ou un groupe d’hydrocarbure substitué ou non, par exemple, un hydrocarbure à chaîne droite ou ramifiée contenant facultativement des groupes alicycliques, oléfiniques ou aromatiques, ainsi que différents ; 10 groupes fonctionnels tels que des groupes hydroxy, carbonyle, carboxy, amino, nitrilo, amido, ester et analogues, lesquels n’exercent aucune influence néfaste sur la réaction de condensation, les matières biologiques ou le produit composite obtenu. Ces 15 groupes peuvent varier largement pour donner une large gamme d’acides polycarboxyliques utiles, ainsi qu’on le décrira ci-après. Les réactions (3) et (4) illustrent la condensation de la polyéthylène-imine et d’un acide polycarboxylique en utilisant un carbo-20 diimide comme agent de condensation. R’et R” sont des groupes d’hydrocarbures qui seront décrits ci-après plus en détail avec les autres réactifs et les conditions des réactions illustrées.

En règle générale, les acides polycarbo-25 xyliques que l’on peut utiliser suivant la présente invention, peuvent être des acides carboxyliques substitués ou non comportant au moins deux groupes carboxy. De préférence, les acides polycarboxyliques - sont hydrosolubles de sorte qu’ils peuvent être 30 utilisés pour accroître la porosité du produit composite, de même que pour condenser la polyalkylène-imine. Parmi les acides polycarboxyliques pouvant être utilisés dans les procédés et les produits composites de la présente invention, il y a, par exemple, 35 l’acide adipique, l’acide azélaïque, l’acide 1,11- / 9 8 undécanedioïque, lucide 1,12-dodécanedioïque, l’acide traumatique, l’acide pentadécanedioïque, l’acide hexadécanedioïque, l’acide sébacique, l'acide subérique, l’acide glutarique, l’acide malonique, 5 l’acide pimélique, l’acide succinique, l’acide mali- que, l’acide maléique, l’acide glutamique, l’acide aspartique, l’acide oxalique, l’acide fumarique, l’acide polyaspartique, et analogues. Suivant la présente invention, il est préférable d’utiliser 10 des acides dicarboxyliques, notamment, l’acide maléique, l'acide succinique, l’acide glutarique et l’acide adipique. Les acides polycarboxyliques supérieurs englobent n’importe quelle substance contenant deux groupes d’acides carboxyliques ou plus, 15 par exemple, des matières polymères de poids molécu-’ laire élevé telles que l’acide polyaspartique, ayant un poids moléculaire d’environ 5*000 à 70*000. Les i réactions de condensation sont generalement exothermiques ; en conséquence, les mélanges réactionnels 20 sont avantageusement refroidis à une température qui n'est pas néfaste pour la matière biologique à immobiliser, par exemple, une température d’environ 37° ou moins.

Le rapport molaire entre l’acide polycar— 25 boxylique et la polyalkylène-imine peut varier dans de larges limites en raison de la variation du poids moléculaire des réactifs. En règle générale, l’acide polycarboxylique peut être utilisé en n’importe quelle quantité donnant lieu à une condensation, tandis que 30 le rapport entre l’acide polycarboxylique et la poly-alkylène—imine se situe généralement entre 1:20 et 1:0005 · Lorsqu'on ajoute un acide polycarboxylique pour accroître la porosité du produit composite de la présente invention, on emploie souvent un excès 35 molaire considérable de cet acide polycarboxylique.

/ 9 f

Lors de la préparation des produits composites, les ingrédients peuvent être ajoutés dans n’importe quel ordre. Par exemple, la matière biologique devant être immobilisée peut être introduite à 5 n’importe quel moment précédant la solidification du polymère mais, de préférence, on l’aj'oute après addition de l’acide polycarboxylique à la polyalky-lène-imine. Un procédé préféré pour préparer les ! produits composites de la présente invention consis- 10 te à ajouter, à la polyalkylène-imine, un acide polycarboxylique en une quantité donnant lieu à la condensation et ce, dans des conditions de prépolymérisation afin de former un prépolymère'hydrosoluble.

Le prépolymère -est généralement nn liquide visqueux 15 auquel on peut aisément aj'outer la matière biologique, laquelle est maintenue en suspension au cours de la réaction de condensation. Ensuite, on aj'oute 11’agent de condensation afin d’assurer la condensation et la solidification du produit composite cons-20 titué d’un polymère et d’une matière biologique.

On maintient le pH du mélange réactionnel à une valeur à laquelle il ne neutralise pas sensiblement * ni n’altère la matière biologique. Le pH peut se situer entre environ 2 et 12, de préférence, entre 25 environ 5 et 10.

La quantité de matière biologique ajoutée au polymère peut varier suivant l’utilisation finale spécifique du produit composite constitué d’une ma-| tière biologique. En règle générale, cette quantité I ^ 30 se situe entre 0,001 et 10 g (poids à sec), de pré- ; ference, entre environ 0,1 et 5 g par gramme de la polyalkylène-imine utilisée. La matière biologique peut englober des enzymes, des cellules microbiennes, des antigènes, des anticorps, des antibiotiques, des 35 carbohydrates, des co-enzymes, des cellules végétales,

L

i / ! s iio des cellules animales, des bactéries, des levures, des champignons, des cultures de tissus ou leurs mélanges. On peut ajouter des enzymes au mélange réactionnel en solution aqueuse ou sous forme d’une 5 poudre, cette dernière forme étant préférée. Des cellules peuvent être ajoutées sous forme d’une pâte humide ou de particules sèches.

Comme on l'a indiqué ci-dessus, pour effectuer la condensation de chaînes de polyalkylène-10 ijnines à l’intervention d’acides polycarboxyliques, on emploie avantageusement un agent de condensation.

En règle générale, on peut utiliser n’importe quel agent de condensation catalysant ou facilitant la réaction des amines et des acides carboxyliques.

15 Parmi ces agents de condensation, il y a, par exemple, le hT-éthyl-5-phényl-isoazolium-3-sulfonate, la n-éthoxycarbonyl-2-éthoxy-l,2-dihydroquinoléine et différents carbodiimides. Les agents de condensation à base de carbodiimides sont préférés et ces 20 agents englobent généralement des composés de formule R'-N=C=N-R" dans laquelle R’ et R" représentent des groupes d'hydrocarbures contenant 3 à environ 20 atomes de carbone, de préférence, environ 5 à environ 112 atomes de carbone. Parmi ces agents de condensa-25 tion à base de carbodiimides, il y a le l-éthyl-3,3“ diméthylaminopropyl-carbodiimide, le dicyclohexyl-carbodiimide, le l-cyclohexyl-3-(2-morpholinoéthyl)-carbodiimide (métho-p-toluène-sulfonate) et leurs sels. On ajoute les agents de condensation à base 30 de carbodiimides au mélange réactionnel en une quantité donnant lieu à la condensation, cette quantité S - étant généralement pratiquement une quantité stoechio métrique, par exemple, d'environ 0,2 à 3 fois, de î préférence, d'environ 0,5 a 1,5 fois une quantité 35 stoechiométrique. Chaque molécule de carbodiimide

L

/ ; 11 réagit avec un seul groupe acide de l’acide poly-

Icarboxylique. Par exemple, dans le procédé de la présente invention, on adopte généralement des rapports molaires d’environ 2:1 entre le carbodiimide 5 et l’acide dicarboxylique; toutefois, on emploie

Ides rapports molaires nettement inférieurs si on utilise un excès de l’acide polycarboxylique pour accroître la porosité du produit composite. Lorsqu’on ajoute l’agent de condensation à la tempérait) ture ambiante, on obtient une polymérisation remarquable dans les 30 secondes et cette polymérisation est généralement achevée endéans 2 heures environ.

Des formes de réalisation spécifiques de I la présente invention peuvent impliquer, en outre, 15 un traitement ultérieur du produit composite avec un agent de réticulation à base d’une amine afin ] de renforcer la stabilité et la résistance. Parmi

Ices agents de réticulation, il y a le dialdéhyde glutarique, les diisocyanates, les polyisocyanates, | 20 la 2,456-trichloro-S-triazine, le bisoxiranne, le Îbisimidate, la divinylsulfone, le 1,5-difluoro-2,4- dinitrobenzène et analogues. Le dialdéhyde glutari— que est préféré à cet effet.

En adoptant les procédés décrits de la 25 présente invention, on peut immobiliser une large variété de matières biologiques pour obtenir de nouveaux produits composites biocatalytiques. Les I procédés d’immobilisation sont décrits de manière I ' ‘plus détaillée dans les exemples ci-après. Ces exem- I 30 pies illustrent la méthode et le procédé de mise en jj oeuvre et d’utilisation de l’invention en référence i à différentes formes de réalisation de cette der— ! - 1 nière, mais sans aucun caractère limitatif.

! u \ ! i i .

! ' ; 1 ί 12

; EXEMPLE I

On a mélangé de la polyéthylène-imine s (4 g d’une solution aqueuse à 30%) avec 2 g d’acide 1 _ , !’ succinique. La température du mélange s’est elevee 5 à 45°C et on l’a laissé descendre a 22°C. A ce \ moment, le mélange obtenu était un prépolymère hydro soluble. On a préparé une solution aqueuse d’aspar-; tase exempte de cellules conformément aux procédés de l’exemple I, paragraphe 1 de la demande de brevet 10 des Etats-Unis d’Amérique n° 311,618 déposée le 15 octobre 1981· Ensuite, on a ajouté 1 ml de la solution d’aspartase au mélange du prépolymère hydrosoluble que l’on a ensuite condensé par addition de chlorhydrate de l-éthyl-3,3-diméthylaminopropyl-15 carbodiimide en poudre. L’addition de l’agent de condensation a donné lieu à la polymérisation dans I les 30 secondes et l’on a obtenu un gel d’un produit composite constitué d’une matière biologique fixée.

1 On a ensuite broyé le gel avec un pilon dans un mor- 20 tier pour obtenir de petites particules.

' EXEMPLE II

On a déposé les particules du produit composite d’une matière biologique de l’exemple I dans 50 ml d’une solution comprenant du fumarate , 25 d’ammonium 1 molaire et du sulfate de magnésium 1 millimolaire (pH : 8,5), puis on a agité le mélange 1 pendant 30 minutes. On a filtré la solution et on a répété deux fois le procédé, la deuxième agitation ί se poursuivant pendant 16 heures.

30 On a ensuite déposé les particules dans 35 ml de la même solution de substrat de fumarate d’ammonium à 37°C. Après une heure, on a trouvé que les particules biologiquement actives avaient I transformé 1 .509 ^imoles de fumarate d’ammonium en > 35 acide L-aspartique, On a ensuite rincé les particu-

! U

iâ I * ! / i 13 ! les avec un substrat frais, on les a séchées par tiellement et on les a à nouveau déposées dans 35 ml d'une solution de substrat de fumarate d'ammonium à 37°C. Dans ce cas également, après une heure, 5 I.509 ^imoles de fumarate d'ammonium avaient été transformées en acide L-aspartique, ce qui indique que l'activité biologique du produit composite avait été maintenue.

EXEMPLE III

10 On mélange 6 g de polyéthylène-imine avec 3 g d'acide succinique en poudre et on laisse refroidir à la température ambiante. A partir de B. coli frais contenant de l'aspartase, par le procédé J décrit ci—après, on a préparé une pâte humide de j I 15 cellules contenant environ 75% en poids d'eau. On j a préparé un milieu de fermentation en dissolvant, I dans un litre d'eau, 24 g d'extrait de levure, 30 g J d'acide fumarique, 2 g de carbonate de sodium, du j sulfate de magnésium 2mM et du chlorure de calcium ; 20 0,lmM, puis on a réglé le pH à environ 732 avec de ! 1'hydroxyde d'ammonium. Dans ce milieu, on a ino- ! culé 1 ml d'une culture d'E. coli (ATCC n° 31976) que l'on avait incubée pendant 12-16 heures à 37°C j dans un milieu -de peptone contenant 0,5% de gluta- j 25 mate monosodique. On a incubé le milieu inoculé pendant 12-14 heures à 37°C. On a récolté les cellules par centrifugation à 5.000 tours/minute pendant 30 minutes. -On a ajouté uniformément 3 g de la * pâte humide de cellules au prépolymère. On a ensuite 30 ajouté 2 g de chlorhydrate de l-éthyl-3,3-diméthyl— aminopropyl-carbodiimide et l'on a mélangé pendant environ 1 minute. Le mélange obtenu a polymérisé. Après l'avoir laissé reposer dans des conditions ambiantes pendant 2 heures, on a broyé le mélange 35 polymérisé en particules. On a ensuite plongé les

L

i ί * ! 14 particules du gel dans une solution aqueuse de fuma-rate d'ammonium 1,5M à tin pH de 8,5 et à une température de 22 °C. On a répété cette immersion avec * le substrat frais, puis on a rincé le gel avec une } 5 troisième partie aliquote du substrat. On a dosé | ! l'activité d'aspartase du gel en mesurant la dispa rition de l'acide fumarique au moyen d'un spectro— photomètre à 240 nm. On a agité continuellement les particules du gel dans un réacteur à charges 10 discontinues et à la température ambiante pendant une heure en présence de 75 ml de substrat. On a observé une transformation d’environ 9&%j ce qui correspond à l'équilibre réactionnel connu. On a ensuite répété la réaction et l'on a obtenu des ré-15 sultats semblables. Le tableau I ci—dessous indique la diminution de la concentration du fumarate d'ammo- ' i nium en fonction de la durée pour les deux réactions s J discontinues.

TABLEAU I

20 Diminution de la concentration du substrat en fonction de la durée

Temps de la réaction Fumarate d'ammonium (mg/ml) (minutes) Réaction 1 Réaction 2 25 0 174,0 174,0 15 77,9 78,6 30 37,6 36,5 60 1,8 - 2,7

EXEMPLE IV

30 On a chargé la moitié du gel utilisé pour les réactions discontinues de l'exemple III dans une colonne d'un diamètre de 0,9 cm. Le volume du lit obtenu était de 14 cm3. A travers cette colonne, on a pompé, en un courant ascendant, une solution de 35 fumarate d'ammonium 1,5M (22°C ; pH : 8,5) à 1 volu- i 15 » 1 me spatial par heure (14 cm3/heure) et ce, conti- >J nuellement pendant 70 jours. On a analysé des 1 échantillons de l’effluent pour déterminer la dis- J parition du fumarate d’ammonium. Les résultats |:; 5 obtenus sont repris dans le tableau II ci-après.

P ' ri La vitesse de transformation initiale de la colonne f ;.i ^ .

Il * était de 190 g de fumarate d’ammonium/1 de volume de î lit/h à 22°C et cette vitesse est tombée à 168 g/l/h ! après une opération continue pendant JO joursP ce qui |1 10 - représente une perte de productivité de 12% seule- Π |y ment.

I TABLEAU II

p ji Jours Transformation (%) Γ 1 95,4 h 15 2 95,9 L 22 96,8 h 38 93,1 70 84,2

1 EXEMPLE V

— 20 On a mélangé 3 g de polyéthylène-imine avec 1 1,4 g d’acide succinique et on a laissé refroidir à ! ; la température ambiante. Dans ce mélange, on a ï ί mélangé 1,5 g de cellules de levure récoltées Rhodo-torula rubra (ATCC-4056) contenant une activité de 25 lyase, d’ammoniac et de phénylalanine. Ensuite, on ^ a ajouté 1 g du chlorhydrate de l-éthyl-3,3—diméthyl- r; aminopropyl—carbodiimide et on a mélangé pendant une y || minute. Le mélange obtenu a polymérisé en une ma- [ tière analogue à un gel rigide. On a broyé le gel [ k 30 avec un pilon dans un mortier, puis on l’a trempé, fe. on l’a lavé et on l’a retrempé dans une solution de f substrat contenant de l’acide t-cinnamique et de f l’hydroxyde d’ammonium à un pH de 9,5. La matière lavée a conservé une couleur rouge, tandis que la • : 35 solution de lavage était visuellement incolore et ‘ ü 16 i i ! i j y claire, indiquant ainsi que les cellules rouges de y R. rubra sont restées dans les particules du produit N:; —" 1' composite. Après 39 heures, on a filtré le mélange Γ réactionnel obtenu et on a analysé le filtrat pour la 5 détermination de la L—phénylalanine. On a trouvé !â ξ que la concentration de phenylalanine dans le filtrat Γ.

'f: ‘ était d'environ 0,5 g/l· 5

EXEMPLE VI

On a effectué une série d’expériences afin 10 d’étudier les effets de l’acide polycarboxylique sur le système. Pour chaque expérience, on a suivi le procédé de l’exemple XIX avec les exceptions suivantes : on a utilisé 3 g de polyéthylène-imine, 2 g d’acide polycarboxylique, 1,5 g de chlorhydrate 15 de 1-éthyl—3,3-diméthylaminopropyl-carbodiimide et i 1 g d’une pâte de cellules d’E. coli. On a effectué une réaction d’immobilisation séparée pour chacun des acides polycarboxylxques suivants : l’acide azélaïque, l'acide 1,11-undécanedioïque, l’acide 20 1,12—dodécanedioïque, l’acide traumatique, l’acide jî pentadécanedioique, l’acide hexadécanedioïque, l’acide sébacique, l’acide subérique, l’acide gluta-rique, l’acide malonique et l’acide pimélique.

Chaque acide polycarboxylique a assuré efficacement 25 l’immobilisation des cellules. On a choisi six des !; produits composites obtenus se rangeant entre des produits composites d’un faible poids moléculaire ft j et des produits composites d’un poids moléculaire ; élevé (acide glutarique, acide pimélique, acide 30 sébacique, acide 1,11-undécanedioïque, acide 1,12-dodécanedioïque et acide subérique) pour procéder à des essais analytiques en vue d’en déterminer les activités biologiques. Tous les six produits composites ont transformé efficacement le fumarate d’am-35 monium en acide aspartique, L· 17 ί

EXEMPLE VII

On a mélangé 5 g de polyéthylène-imine avec 1 g d’acide polyaspartique, puis on a ajouté I 1,5 g de chlorhydrate de l-éthyl-3i3~diméthylamino- 5 propyl-carbodiimide. La polymérisation s'est pro- I duite dans les 5 minutes en formant un polymère analogue à un gel dur qui était insoluble dans l’eau.

EXEMPLE VXII - 10 La synthétase de tryptophane (EC 4«2.1.20) est une enzyme pouvant être dérivée de différentes sources microbiennes, par exemple, des micro-orga— ; ; nismes Proteus, Erwinia, Escherichia, Pseudomonas ! - - - --

Iet Aerobacter (voir ”Methods in Enzymology, Chem.

15 Tech, Rev,’1, Academie Press (1980)). Cette enzyme J peut être utilisée pour catalyser la transformation il de l’indole et de la sérine en tryptophane. Cet ;| exemple décrit l’immobilisation d’un extrait de 11’enzyme de synthétase de tryptophane provenant de 20 cellules d’E. coli. On a mélangé 4 g de polyéthy— ^ lène-imine et 2 g d’acide succinique, puis on a !! laissé refroidir le mélange à la température ambiante.

On a ajouté 0,5 ml de l’extrait de l’enzyme au mélange, puis lj5 g de chlorhydrate de 1—éthyl-3j3-25 diméthylamïnopropyl-carbodiimide. On a broyé le gel obtenu en particules que l’on a lavées convenablement. Ensuite, on a ajouté les particules obtenues à une solution de substrat contenant de la L-sérine 0,05M et de l’indole 0,05M. On a trouvé que le pro-s _ 30 duit composite transformait efficacement le substrat en L-tryptophane dans le mélange réactionnel et ce, en deux réactions successives.

| L-

Claims

11 I 18 ;

1. Procédé en vue d’immobiliser une matière biologique en préparant un produit composite de matière biologique insolubilisée, ce procédé con- , 5 sistant à condenser un polymère d’une polyalkylène- imine avec un acide polycarboxylique en une quantité donnant lieu à la condensation, en présence d’un I agent de condensation en une quantité donnant égale ment lieu à la condensation, caractérisé en ce qu’on 10 mélange cett'e matière biologique avec ce polymère de polyalkylène-imine au cours de cette réaction de ‘ condensation,

2, Procédé suivant la revendication 1, I caractérisé en ce que le polymère de polyalkylène- 15 imine est choisi parmi le groupe comprenant la polyéthylène—imine, la polypropylène-imine, la polybutylène-imine et la polypentylène-imine.

3· Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le polymère de polyalkylène-20 imine est la polyéthylène-imine,

4· Procédé suivant la revendication 1, |j caractérisé en ce que l’acide polycarboxylique est Iun acide dicarboxylique.

5. Procédé suivant la revendication 1, 25. ou 3, caractérisé en ce que l’acide polycarboxy lique est choisi parmi le groupe comprenant l’acide adipique, l’acide azélaïque, l’acide 1,11-undécane-diol’que, l’acide 1,12-dodécanedioi'que, l’acide traumatique, l’acide pentadécanedioïque, l’acide 30 hexadécanedioïque, l’acide sébacique, l’acide subé- rique, l’acide glutarique, l’acide malonique, l’acide I pimélique, l’acide succinique, l’acide malique, ® l’acide maléique, l’acide glutamique, l’acide aspar- I tique, l’acide oxalique, l’acide fumarique et l’acide Il 35 polyaspartique, 1 / ? U I 19

16. Procédé suivant la revendication 1, 2 ou 3j caractérisé en ce que l’acide polycarboxyli-que est l’acide succinique. î> * ^ ^ r 7· Procédé suivant la revendication 1, 5 caractérisé en ce que l’agent de condensation est choisi parmi le groupe comprenant le N-éthyl-5-phényl-isoxazolium-3-sulfonate et la N-éthoxy-carbonyl—2—éthoxy—1,2—dihydroquinoléine.

8. Procédé suivant la revendication 1, 10 caractérisé en ce que l’agent de condensation est un agent de condensation à base d’un carbodiimide.

9. Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce que l’agent de condensation à base d’un carbodiimide est le l-éthyl-3,3—diméthylamino-15 propyl—carbodiimide, le dicyclohexyl—carbodiimide, le l-cyclohexyl-3-(2-morpholinoéthyl)-carbodiimide Ï(métho-p-toluène-sulfonate) ou un de leurs sels.

10. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l’agent de condensation à 20 base d’un carbodiimide est le l-éthyl-3,3“diméthyl— ί aminopropyl-carbodiimide ou un de ses sels.

11. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que l’agent de condensation est i le l-éthyl-3,3—diméthylamino-propyl-carbodiimide ou 125 un de ses sels.

12. Procédé suivant la revendication 1, 2 3 ou 4j caractérisé en ce que le rapport molaire entre la polyalkylène-imine et l’acide polycarboxy-lique se situe entre environ 1:20 et 1:0005. i1 30 13. Procédé suivant la revendication 12, caractérisé en ce que l’agent de condensation est utilisé en une quantité se situant entre environ 0,2 à 3 fois la quantité stoechiométrique vis-à—vis de l’acide polycarboxylique. 4 20 i !

14· Procédé suivant la revendication 12, 1 caractérisé en ce que 1*agent de condensation est utilisé en une quantité se situant entre environ 0,5 et 1,5 fois la quantité stoechiométrique vis- * „ 5 à-vis de 1*acide polycarboxylique. ^ 15· Procédé suivant la revendication 1, I 2, 3j 4 ou 5) caractérisé en ce qulon mélange tout j d1 abord la polyalkylène-imine et l1acide polycarbo- I xylique, puis on ajoute la matière biologique et ? 10 ensuite, l’agent de condensation, l6. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la matière biologique immobi- * lisée est une enzyme,

17· Procédé suivant la revendication 1, 15 caractérisé en ce que la matière biologique immobilisée est constituée de cellules complètes, f 18, Procédé suivant la revendication 17* caractérisé en ce que les cellules complètes sont des cellules d’E, coli contenant de l’aspartase, Ü 20 19· Procédé suivant la revendication 9* » caractérisé en ce que la matière biologique est - l’aspartase· J 20, Procédé suivant la revendication 1, \ caractérisé en ce que la matière biologique est 25 constituée de lyase d’ammoniac et de phénylalanine,

21, Procédé suivant la revendication 1, l caractérisé en ce que la matière biologique est constituée de synthétase de tryptophane. ! 22, Procédé suivant la revendication 1, j ^ 30 caractérisé en ce qu’il consiste également à sou- I mettre le produit composite de matière biologique insolubilisée à un traitement ultérieur avec un agent de réticulation à base d’une amine afin de renforcer la résistance et la stabilité du produit 35 composite. 21 «

23· Procédé suivant la revendication 22, caractérisé en ce que l'agent de réticulation à base d’une amine est choisi parmi le groupe comprenant le dialdéhyde glutarique, les diisocyanates, les 5 polyîsocyanates, la 2,4*6—trichloro-S—triazine, le bisoxiranne, le bisimidate, la divinylsulfone et le 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzène.

24· Procédé suivant la revendication 22, caractérisé en ce que l'agent de réticulation à base 10 d’une amine est le' dialdéhyde glutarique.

25. Produit composite d’une matière biologique insolubilisée comprenant une matière biologiquement active immobilisée à l’intérieur d’un polymère condensé d’une polyalkylène-imine, caractérisé 15 en ce que des groupes amino des chaînes de polyalky— lène—imines sont pontés par un acide polycarboxylique.

26, Produit composite suivant la revendication 2S9 caractérisé en ce que la matière biologiquement active est choisie parmi le groupe compre— 20 nant les enzymes, les cellules microbiennes, les antigènes, les anticorps, les antibiotiques, les carbohydrates, les co-enzymes, les cellules végétales, les cellules animales, les bactéries, les levures, les champignons et les cultures de tissus. 25 27· Produit composite suivant la revendi cation 25, caractérisé en ce que la matière biologiquement active est choisie parmi le groupe comprenant les enzymes et les cellules complètes. K

28. Produit composite suivant la reven— 30 dication 25, caractérisé en ce que la matière biologiquement active est l’aspartase,

29. Produit composite suivant la revendication 25j caractérisé en ce que la matière biologique est constituée de cellules complètes d’E. coli / 35 contenant de l’aspartase. L ! 4 * ί 22

30. Produit composite suivant la revendication 2S, caractérisé en ce que la matière biolo-] gique est constituée de lyase d’ammoniac et de phényl- alanine, i 5 31· Produit composite suivant la revendi- 3 cation 25> caractérisé en ce que la matière biologique est constituée de synthétase de tryptophanè.

32. Procédé de production d*acide aspar- 5 tique, ce procédé consistant à mettre, dans des con- 10. ditions de production d'acide aspartique, un substrat contenant du fumarate d'ammonium en contact avec un produit composite de matière biologique insolubilïsée d’aspartase ou de cellules microbiennes contenant de l’aspartase immobilisées à l'intérieur d’un polymère Jj 15 condensé d’une polyalkylène—imine, caractérisé en ce ! que les groupes amino des chaînes du polymère de ] polyalkylène-imine sont pontés par un acide polycar- boxylique.

33· Procédé pour la production de phényl-20 alanine, ce procédé consistant à mettre, dans des i conditions productrices de phénylalanine, un substrat j contenant de l'acide t-cinnamique et de l’ammoniac ; en contact avec un produit composite de matière biologique insolubilisée de lyase d’ammoniac et de i· 25 phénylalanine ou de cellules microbiennes contenant de la lyase d’ammoniac et de phénylalanine immobilisées ! à l'intérieur d’un polymère condensé d’une polyalky- î. lène-imine, caractérisé en ce que des groupes amino î * des chaînes du polymère de polyalkylène-imine sont ; 30 pontés par un acide polycarboxylique. 4 m

34· Procédé de production de tryptophanè, ce procédé consistant à mettre, dans des conditions ! productrices de tryptophanè, un substrat contenant de l’indole et de la sérine en contact avec un pro- 135 duit composite de matière biologique insolubilisée de L i 23 i ! synthétase de tryptophane ou de cellules microbien- nés contenant de la synthétase de tryptophane inrmo-i bilisées à l’intérieur d’un polymère condensé d’une ' ' polyalkylène-imine, caractérisé en ce que des grou- ! 5 Pes amino des chaînes du polymère de polyalkylène— i ~ imine sont pontés par un acide polycarboxylique. VAAJ01J\ . t . l ί | i ( . l· i i· t t ! : î i. F- ? i i * [