BE897340A

BE897340A - Support en vermiculite pour des matieres biologiques immobillisees

Info

Publication number: BE897340A
Application number: BE0/211214A
Authority: BE
Inventors: W E Swann
Original assignee: Genex Corp
Priority date: 1982-07-20
Filing date: 1983-07-20
Publication date: 1983-11-14
Also published as: JPS5939291A; ZA834291B

Description

Support en vermiculite pour des matières biologiques immobilisées.

Demandes de brevets aux Etats-Unis d'Amérique n 400. 141 du 20 juillet 1982 et nO 464. 376 du 7 février 1983 en faveur de W. E. SWANN.

La présente invention concerne un procédé pour immobiliser des matières biologiques. Plus particulièrement, elle concerne l'immobilisation de matières biologiques par absorption de celles-ci par des particules de vermiculite qui sont ensuite enrobées d'un

polymère.

Les matières biologiques telles que les enzymes ou les microorganismes ou cellules produisant des enzymes sont d'usage fréquent comme catalyseurs pour des synthèses et des analyses. Ces catalyseurs sont intéressants parce qu'ils agissent avec beaucoup de spécificité et d'efficacité dans des conditions de réaction généralement modérées.

Les enzymes et autres biocatalyseurs se prêtent aux réactions à marche discontinue en raison de leur caractère généralement hydrosoluble. La réutilisation de ces enzymes et autres biocatalyseurs est limitée par la difficulté de les isoler sous une forme active ou utile à partir du milieu de réaction usé. De plus, ces enzymes et biocatalyseurs tendent à subsister comme impuretés dans le produit final. Afin d'éviter ces inconvénients, des procédés ont été mis au point pour immobiliser sur des supports solides insolubles les matières biologiques qui manifestent une activité catalytique. Cette immobilisation vise à donner une matière biologique stabilisée qui peut résister aux conditions rigoureuses d'une utilisation répétée ou continue.

Différents systèmes d'immobilisation pour les matières biologiques sont connus. Des enzymes ont été immobilisées par absorption sur des matières insolubles, comme le charbon de bois, le verre, la cellulose, le phosphate de calcium gélifié, la montmorillonite et diverses résines organiques échangeuses d'ions, entre autres. L'immobilisation a été réalisée aussi par piégeage dans des gels d'amidon ou d'acrylamide, par liaison covalente entre les enzymes et des polymères organiques insolubles et par liaison covalente entre les molécules de l'enzyme elle-même.

Les procédés connus conduisent souvent à des

produits dont l'activité biologique est affaiblie en comparaison de celle de la même matière biologique non immobilisée. On sait que ces matières biologiques sont sensibles à la dénaturation ou à l'inactivation thermique ou chimique. La perte de l'activité biologique est souvent la conséquence d'opérations d'immobilisation exécutées dans des conditions rigoureuses qui peuvent devenir particulièrement gênantes dans les réactions de condensation sur les polymères. De plus, les produits que donnent les procédés connus laissent souvent à désirer dans le domaine de la porosité, de la durabilité, de la résistance mécanique ou du caractère hydrophile.

L'invention a donc pour but de procurer un procédé pour immobiliser des matières biologiques qui n'affaiblisse pas l'activité biologique des produits obtenus.

Elle a pour but de procurer un procédé pour immobiliser des matières biologiques donnant des produits dont la résistance, la durabilité, la porosité et la stabilité biologique sont excellentes. Un autre but de l'invention est de procurer un procédé pour immobiliser une quantité élevée de matière biologique par volume unitaire de support final (haute densité).

La Demanderesse a en effet découvert à présent que des matières biologiques peuvent être immobilisées d'une manière fort simple et économique en conservant une haute activité catalytique. Le procédé de l'invention donne une matière biologique insolubilisée composite qui contient une matière biologique piégée dans des particules de vermiculite enrobées d'un polymère. Suivant la nature du polymère et celle de la matière biologique piégée dans la vermiculite, il peut être avantageux de réticulier ou condenser le polymère. La préparation n'induit guère de perte d'activité de la

matière composite qui manifeste une résistance mécanique et une durabilité excellentes.

En outre,'lorsque le polymère est condensé ou réticulé, le caractère hydrophile des matières peut être ajusté par modification du degré de condensation ou réticulation. Le procédé de l'invention donne une matière composite qui peut être séparée des mélanges de réaction par simple filtration ou être utilisé dans des systèmes de réaction en marche continue, par exemple ceux dans lesquels le substrat qui réagit s'écoule dans une colonne garnie.

Conformément à l'invention, des particules de vermiculite sont mises en contact avec la matière biologique, par exemple des cellules humides entières isolées hors du bouillon de fermentation. La matière biologique est absorbée dans les particules de vermiculite. Un polymère est ajouté à la vermiculite pour en enrober les particules. Divers agents de réticulation, de condensation et de gélification sont ensuite ajoutés pour réticuler et consolider le polymère et/ou la matière biologique et en former un enrobage perméable et dur. Avant d'être mélangé à la vermiculite, le polymère peut éventuellement être combiné avec un acide polycarboxylique pour la formation d'un prépolymère hydrosoluble. Ce mode opératoire conduit à une matière biologique biologique dans laquelle la matière composite est immobilisée dans la vermiculite enrobée de polymère.

L'immobilisation de la matière biologique dans la vermiculite peut se faire par piégeage physique, par liaison covalente du polymère à l'intervention de l'agent de réticulation ou condensation et de radicaux réactifs que porte la matière biologique ou bien par réticulation dans les particules de vermiculite à l'intervention d'un agent de réticulation approprié.

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Pa.-est Par exemple, lorsque imine, liaison covalente, du fait que les radicaux amine et acide carboxylique de la matière biologique peuvent se substituer à un radical amine de la polyalcoylèneinine ou à un radical carboxylique d'un acide polycarboxylique dont la vermiculite enrobée peut être additionnée. La liaison covalente avec le polymère se fait finalement à l'intervention d'un agent de condensation.

Le procédé de l'invention permet de préparer des matières biologiques composites très diverses. La matière biologique peut comprendre des enzymes, des cellules microbiennes, des antigènes, des anticorps, des antibiotiques, des coenzymes, des cellules végétales, des cellules animales, des bactéries, des levures, des champignons ou des cultures de tissus, outre leurs divers mélanges. Les matières biologiques sont ajoutées, de préférence, sous forme aqueuse à la vermiculite.

La Demanderesse a en effet découvert que la vermiculite constitue un support excellent pour immobiliser une matière biologique. Les particules de vermiculite sont capables d'absorber de très grandes quantités de matière biologique et de conduire ainsi à une forte densité de chargement. De plus, la vermiculite est peu onéreuse et facile à obtenir, ce qui la rend fort avantageuse comme support pour une production industrielle. Enfin, le procédé de l'invention pour immobiliser une matière biologique donne un produit qui est rigide et très actif.

La Demanderesse a observé que la granulométrie de la vermiculite utilisée dans le procédé d'immobilisation de l'invention peut varier notablement. Par exemple, la granulométrie de la vermiculite peut s'échelonner de celle d'une poudre fine à celle de

granules d'environ 1 cm et de préférence d'environ 0,5 à 1 mm. La quantité de matière biologique ajoutée à la vermiculite peut varier avec l'application envisagée pour la matière biologique composite. En règle générale, elle s'échelonne d'environ 0,01 à 2 g (sur base sèche) par g de vermiculite et, de préférence, d'environ 0,01 à 1 g par g de vermiculite.

Les matières biologiques composites obtenues par le procédé de l'invention peuvent différer beaucoup par le caractère hydrophile, la résistance mécanique, la durabilité et la porosité. Une diminution du degré de réticulation ou condensation du polymère enrobant la vermiculite peut conduire à un caractère hydrophile plus marqué du produit. L'addition d'agents de réticulation multifonctionnels peut augmenter la résistance mécanique et la durabilité de l'ensemble formé par le polymère, la vermiculite et la matière biologique, auquel cas les radicaux fonctionnels supplémentaires augmentent la condensation du polymère et rendent la matière composite plus hydrophobe.

La porosité d'ensemble de la matrice peut être augmentée par addition d'un matière particulaire hydrosoluble au mélange contenant le polymère avant que la condensation soit achevée. Après la condensation, cette matière est éliminée par addition d'eau qui la dissout. La fraction volumique du produit composite antérieurement occupée par cette matière particulaire subsiste sous forme de vides qui augmentent la porosité de la matrice. Toute matière particulaire hydrosoluble, qui est sans effet défavorable sensible sur le polymère, la vermiculite ou la matière biologique, convient pour augmenter la porosité du mélange.

Les acides polycarboxyliques hydrosolubles, tels que ceux réagissant avec les polymères non condensés, conviennent particulièrement pour augmenter la porosité de la

matrice parce que les quantités utilisées en excès pour augmenter la porosité ne gênent pas notablement les réactions de condensation.

Les polymères utilisés dans le procédé et les produits composites de l'invention varient généralement en poids moléculaire suivant les conditions de réaction et ont, de préférence, une structure en chaîne ramifiée. Différentes matières polymères conviennent pour le procédé de l'invention, notamment les polyalcoylèneimines, les polysaccharides, le polyacrylamide, les polyuréthannes, les alginates et le carragheenane.

Les polymères préférés sont les polyalcoylèneimines.

Les polyalcoylènemimines peuvent être synthétisées au départ des alcoylèneimines monomères par polymérisation d'addition catalysée par les acides. Une polyalcoylèneimine préférée est la polyéthylèneimine (PEI) parce qu'elle est facile à obtenir à un prix modéré et donne de bons résultats dans les réactions de condensation appliquées aux fins de l'invention. La polyéthylèneimine est produite par polymérisation de l'éthylèneimine avec ouverture du cycle en présence de catalyseurs tels que les acides minéraux. Ce polymère est hautement ramifié et contient des radicaux amino primaires, secondaires et tertiaires. La polyéthylèneimine est hydrosoluble et donne, par condensation ou réticulation des chaînes, un produit insoluble dans l'eau.

La polyéthylèneimine peut être réticulée à l'aide d'un agent de réticulation des amines qui augmente la stabilité et la résistance mécanique. Cette opération donne une matière biologique piégée avec une certaine réticulation entre la polyalcoylèneimine et les radicaux amine libres de la matière biologique. Des agents de réticulation utiles sont notamment le dialdéhyde glutarique, les diisocyanates, les polyiso-

cyanates, la 2,4, 6-trichloro-s-triazine, le bisoxiranne, le bisimidate, la divinylsulfone, le 1,5-di- fluoro-2, 4-dinitrobenzène, etc.. Le dialdéhyde glutarique est préféré à cette fin.

Le polymère choisi est généralement ajouté à la matière composite en quantité suffisante pour enrober sensiblement les particules de vermiculite et cette quantité varie notablement avec la granulométrie de la vermiculite, la nature de la matière biologique et les propriétés physiques recherchées. En règle générale, la quantité de polymère peut s'échelonner d'environ 0,5 à environ 25% et de préférence d'environ 2 à environ 15% du poids de la matière composite. La quantité d'agent de réticulation et/ou de condensation utilisée est en relation avec la quantité de polymère, comme envisagé plus en détail ci-après.

Lorsque le polymère est la polyéthylèneimine, un procédé de condensation hautement efficace est exécuté au moyen d'un acide polycarboxylique (APC) qui forme des ponts entre les radicaux amine de chaînes adjacentes de la polyéthylènemine. Des agents de condensation, qui sont de préférence des carbodiimides (CDI), assurent une condensation aisée.

Les réactions appliquées suivant l'invention pour préparer la poly- éthylèneimine condensée sont illustrées ci-après :
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La réaction (1) illustre la polymérisation de l'éthylêneimine en polyéthylèneimine à structure ramifiée, où n et n'représentent des nombres entiers supérieurs à 0 et n''peut représentenr 0 (indiquant l'absence du radical CHCHN ou un nombre entier supérieur à O. La réaction (2) illustre la formation d'un sel des radicaux amine de la polyéthylèneimine avec un acide carboxylique où R peut représenter un radical hydrocarboné substitué ou non.

Les réactions (3) et (4) illustrent la condensation de la polyéthylèneimine avec un acide carboxylique à l'aide d'un carbodiimide comme agent de condensation. R et R' représentent des radicaux hydrocarbonés décrits plus en détail ci-après, tout comme les autres réactifs et les conditions pour les réactions illustrées.

En règle générale, les acides polycarboxyliques convenant aux fins de l'invention peuvent être

des acides carboxyliques substitués ou non comprenant au moins deux radicaux acide carboxylique. De préférence, les acides carboxyliques sont hydrosolubles, auquel cas ils conviennent pour augmenter la porosité de la matière composite et, simultanément, condenser la polyalcoylèneimine.

Des exemples d'acides polycarboxyliques convenant pour les procédés et matières composites de l'invention sont l'acide adipique, l'acide azélaîque, l'acide 1, 11-undécanedioîque, l'acide 1,12- dodécanedioîque, l'acide traumatique, l'acide pentadécanediolque, l'acide hexadécanediolque, l'acide sébacique, l'acide subérique, l'acide glutarique, l'acide malonique, l'acide pimélique, l'acide succinique, l'acide malique, l'acide maléique, l'acide glutarique, l'acide aspartique, l'acide oxalique, l'acide fumarique, l'acide polyaspartique, etc.. Les acides dicarboxyliques sont préférés aux fins de l'invention et des exemples en sont l'acide maléique, l'acide succinique, l'acide glutarique et l'acide adipique.

Les acides polycarboxyliques supérieurs peuvent être toute substance contenant deux ou plusieurs radicaux acide carboxylique et notamment des polymères de haut poids moléculaire, tels que l'acide polyaspartique d'un poids moléculaire de 5.000 à 50.000. Les réactions de condensation sont généralement exothermiques et les mélanges de réaction sont, par conséquent avec avantage, refroidis jusqu'à une température ne nuisant pas à la matière biologique qui est immobilisée, par exemple environ 37 C sinon moins.

Le rapport molaire de l'acide polycarboxylique à la polyalcoyiêneimine (APC : PAI) peut varier beaucoup en raison des différences de poids moléculaires des réactifs. En règle générale, ces rapports s'échelonnent de 1 : 20 à 1 : 0, 0005. Lorsque l'acide polycarboxylique est ajouté pour augmenter la porosité du produit de

l'invention, il est souvent utilisé en un excès molaire considérable.

L'acide polycarboxylique peut être ajouté à la polyalcoylèneimine en quantité propre à la condensation dans les conditions de la prépolymérisation en vue de la formation d'un prépolymère hydrosoluble. Le prépolymère est généralement un liquide visqueux auquel la vermiculite contenant la matière biologique immobilisée peut, avec avantage, être ajoutée, avec maintien en suspension pendant la condensation. L'agent de condensation est ajouté ensuite pour provoquer la condensation et la solidification du mélange de prépolymère et de vermiculite. Le pH du mélange de réaction est maintenu à une valeur qui est sans effet défavorable ou inactivant sensible sur la matière biologique. Le pH peut s'échelonner d'environ 2 à environ 12 et est, de préférence, d'environ 5 à environ 10.

Comme déjà indiqué, pour provoquer la condensation des chaînes de la polyalcoylèneimine par un acide polycarboxylique, il est avantageux d'utiliser un agent de condensation. En règle générale, tout agent de condensation qui catalyse ou facilite la réaction des amines avec les acides carboxyliques convient. Des exemples de tels agents de condensation sont notamment le N-éthyl-5-phénylisoxazolium-3-sulfonate, la N-étho- xycarbonyl-2-éthoxy-l, 2-dihydroquinoléine et différents carbodiimides. Les carbodiimides de condensation qui peuvent être utilisés aux fins de l'invention sont de la formule :
R'-N=C=N-R" où R'et R"représentent des radicaux hydrocarbyle de 3 à environ 20 et de préférence d'environ 5 à environ 12 atomes de carbone.

De tels agents de condensation

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sont notaITent sont no ùarLLrtien"e diimide, le dicyclohexylcarbodiimide, le métho-ptoluènesulfonate de l-cyclohexyl-3- (2-morpholinoéthyl) - carbodiimide et leurs sels. Les carbodiimides de condensation sont ajoutés au mélange de réaction en quantité propre à la condensation, qui est généralement sensiblement une quantité stoechiométrique, par exemple d'environ 2 à 3 fois et de préférence environ 0,5 à 1,5 fois la quantité stoechiométrique. Chaque molécule de carbodiimide réagit avec un seul radical acide de l'acide polycarboxylique. Par exemple, le rapport molaire du carbodiimide à l'acide dicarboxylique est généralement d'environ 2 : 1 dans le procédé de l'invention.

Lorsque l'agent de condensation est ajouté à la température ambiante, la polymérisation est notable dans les 30 secondes et est généralement achevée en environ 2 heures.

Lorsque la polyéthylèneimine a été insolubilisée par addition d'un agent de condensation, un post-traitement éventuel est la réticulation de la vermiculite enrobée condensée à l'aide d'un agent de condensation des amines, comme le dialdéhyde glutarique, mentionné ci-dessus, en vue d'augmenter la résistance mécanique et la stabilité du produit composite final.

Suivant la nature du polymère choisi, différents agents de condensation et réticulation peuvent être choisis par le spécialiste pour augmenter la résistance mécanique du produit. Les procédés de l'invention permettent d'immobiliser des matières biologiques très diverses pour obtenir de nouvelles matières biocatalytiques composites. Dans les exemples ci-après, les techniques d'immobilisation sont décrites plus en détail. Les exemples illustrent l'invention plus en détail sans toutefois la limiter.

EXEMPLE 1.-
A partir de E. coli contenant de l'aspartase à l'état frais, on prépare 80 g d'une pâte contenant de ces cellules de E. coli contenant de l'aspartase d'une teneur en eau d'environ 75% en poids. Pour obtenir la pâte, on prépare le milieu de fermentation en dissolvant dans un litre d'eau 24 g d'extrait de levure, 30 g d'acide fumarique, 2 g de carbonate de sodium, du sulfate de magnésium jusqu'à 2mM et du chlorure de
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calcium puis on ajuste le pH à environ caL i 7,2 avec de l'hydroxyde d'ammonium. On inocule le milieu avec 1 ml d'une culture de E. coli (ATCC 31976) qu'on a préalablement mis à incuber pendant 12 à 16 heures à 37 C dans un milieu peptoné contenant 0, 5% de glutamate monosodique.

On met le milieu inoculé à incuber pendant 12 à 14 heures à 37 C. On récolte les cellules par centrifugation à 5.000 tours par minute pendant 30 minutes.

On ajoute les 80 g de E. coli contenant de l'aspartase à 20 g de particules de vermiculite. Après avoir laissé la pâte de cellules s'absorber dans la vermiculite, on ajoute 10 g de polyéthylèneimine au mélange et on agite le tout jusqu'à une répartition uniforme. On ajoute ensuite du dialdéhyde glutarique (20 g d'une solution aqueuse à 25%) et on agite le tout jusqu'à obtenir des particules dures. On prépare un second lot de la même façon. On laisse les deux lots de produit sécher jusqu'au lendemain.

On introduit le produit dans une colonne de manière à former un lit d'un volume final de 353 ml. On utilise la colonne ensuite pour convertir du fumarate d'ammonium en acide L-aspartique. On fait passer dans la colonne au débit de 360 ml par heure (1, 0 volume par heure) une solution 1, 5M de fumarate d'ammonium contenant du sulfate de magnésium lmM de pH 8,5 à 37 C. On

surveille l'activité de l'aspartase dans l'effluent en mesurant la disparition de l'acide fumarique au moyen d'un spectrophotomètre à 240 nm. On fait fonctionner la colonne sans interruption pendant 151 jours. Pendant cette durée, on dose des échantillons de l'effluent pour déterminer le pourcentage de conversion du substrat. Les résultats sont rassemblés au tableau I.

TABLEAU l
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<tb>
<tb> Jour <SEP> Conversion <SEP> % <SEP> du <SEP> fumarate
<tb> d'ammonium <SEP> 1, <SEP> 5M
<tb> (1 <SEP> passe <SEP> à <SEP> 1 <SEP> volume/heure)
<tb> 1 <SEP> 98,2
<tb> 6 <SEP> 99,2
<tb> 16 <SEP> 99, <SEP> 4 <SEP>
<tb> 26 <SEP> 99, <SEP> 2
<tb> 37 <SEP> 99, <SEP> 0
<tb> 55 <SEP> 98,7
<tb> 90 <SEP> 98,2
<tb> 120 <SEP> 91,3
<tb> 151 <SEP> 91,3
<tb>
EXEMPLE 2.-
On répète le mode opératoire général de l'exemple 1 avec 120 g de pâte de cellules et 15 g de polyéthylèneimine. On introduit un lot de matière
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immobilisée dans une colonne dont le volume du lit est e de 173 ml. On utilise la colonne avec succès pour convertir 99% d'une solution de fumarate d'ammonium 1,8M au débit de 360 ml par heure (2,08 volume par heure).

La productivité calculée de la colonne est de 493 g d'acide L-aspartique obtenu par litre de volume du lit de cellules immobilisées et par heure à 37 C (3,7 moles par litre et par heure).
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EXEMPLE 3.-
On prépare dix lots de cellules de E. coli immobilisées (100 g de vermiculite par lot) suivant le

mode opératoire général de l'exemple 2.

On introduit le biocatalyseur ensuite dans une colonne dont le volume du lit est de 12,5 litres. On fait passer une solution de fumarate d'ammonium (1,8M) à 37 C dans la colonne à différents débits et on détermine, comme dans l'exemple 1, la conversion de fumarate d'ammonium dans l'effluent. Les résultats sont rassemblés au tableau II.

TABLEAU II
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<tb>
<tb> Débit <SEP> Conversion <SEP> % <SEP> Acide <SEP> L-aspartique
<tb> (litre/heure) <SEP> (Acide <SEP> fumarique) <SEP> kg/h <SEP> mole/litre/h
<tb> 12,50 <SEP> 99,1 <SEP> 2,97 <SEP> 1,79
<tb> 18,75 <SEP> 97,5 <SEP> 4,38 <SEP> 2,63
<tb> 25,00 <SEP> 95,0 <SEP> 5,69 <SEP> 3,42
<tb> 62,50 <SEP> 56, <SEP> 00 <SEP> 8,38 <SEP> 5,04
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EXEMPLE 4.-
On répète le mode opératoire général de l'exemple 3 avec un lot frais de cellules de E. coli sauf que les cellules fraîches ont une activité supérieure de 29% à celle des cellules du lot précédent. Lorsqu'on fait passer le substrat dans la colonne au débit de 62,5 litre par heure (comme dans l'exemple 3), la quantité d'acide aspartiqe obtenue est de 10,56 kg par heure (6,35 moles par litre par heure). Ceci constitue une augmentation de productivité de 27% par rapport à l'exemple 3.

EXEMPLE 5.-
On peut utiliser la tryptophane synthétase dans le procédé de l'invention pour catalyser la conversion de l'indole et de la sérine en tryptophane.

On mélange 2 g de particules de vermiculite avec 4 ml d'un extrait brut de tryptophane synthétase de cellules de E. coli. On laisse l'extrait s'absorber dans la

vermiculite. On ajoute 1 g de polyéthylèneimine au mélange pour enrober les particules de vermiculite. On ajoute ensuite 2 ml d'une solution aqueuse à 25% de dialdéhyde glutarique et on mélange le tout jusqu'à obtenir des particules enrobées dures. On introduit la quantité totale de produit dans une colonne qu'on lave avec une solution de substrat consistant en sérine 0, 05M, en indole 0, 05M, en glutathion 0, 005M, en phosphate dibasique de potassium 0,005M et contenant 200 mg par litre de pyridoxal-5-phosphate, le pH étant ajusté à 7,8.

On utilise la colonne à plusieurs reprises dans un système à recirculation à marche discontinue pour produire 80 mg de L-tryptophane en 24 heures.

EXEMPLE 6.-
On mélange 9 g de cellules entières de R. rubra contenant de la phénylalanine ammonia-lyase avec 3 g de particules de vermiculite qu'on laisse s'imbiber complètement, après quoi on refroidit le tout à 10*C. On prépare une solution d'enrobage de polysaccharide en ajoutant 0,8 g du polysaccharide Kelco (K9A50) en poudre à 100 ml d'eau désionisée à 80 C et en agitant le mélange pendant 10 minutes. Après dissolution de la poudre, on ajoute 1 g de chlorure de potassium à la solution. On laisse la solution refroidir jusqu'à 50 C (sans qu'il y ait précipitation). On verse la solution chaude ensuite sous agitation sur la vermiculite froide. Le polysaccharide forme très rapidement un gel qui enrobe les particules de vermiculite contenant R. rubra.

On introduit les particules dans 100 ml d'un tampon au phosphate de potassium O, 1M de pH 7,0 et on les lave soigneusement par agitation.

On retire les particules de la solution tampon. La solution ne donne aucun signe de trouble ou d'opalescence et est sensiblement exempte de cellules de

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'Levure, lé--, l levure, de l'immobilisation. ce qui indique le succèsOn introduit les particules dans 50 ml d'une solution de cinnamate d'ammonium 0, 1M à pH 9,3 et on vérifie l'activité de la phénylalanine ammonia-lyase en surveillant la formation de la L-phénylalanine. Les cellules ainsi immobilisées sont efficaces pour produire de la L-phénylalanine dont il apparaît que la quantité augmente au cours du temps dans la solution de réaction.

Claims

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R REVENDICATIONS E V E N D I C A T I O N S1. - Procédé pour immobiliser des matières biologiques par préparation d'une matière biologique insolubilisée composite, caractérisé par les stades : a) d'ajouter des particules de vermiculite à un milieu aqueux contenant la matière biologique ; b) de laisser le milieu aqueux contenant la matière biologique s'absorber dans la vermiculite ; c) d'enrober la vermiculite d'un polymère.
2.-Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la vermiculite enrobée du stade c) est réticulée à l'aide dfun agent de réticulation ou condensée à l'aide d'un agent de condensation.
3.-Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le polymère est choisi parmi les polyalcoylèneimines, les polysaccharides, le polyacrylamide, les polyuréthannes, les alginates et le carragheenane.
4.-Procédé pour immobiliser des matières biologiques par préparation d'une matière biologique insolubilisée composite, caractérisé par les stades : a) d'ajouter des particules de vermiculite à un milieu aqueux contenant la matière biologique ; b) de laisser le milieu aqueux contenant la matière biologique s'absorber dans la vermiculite : c) d'enrober la vermiculite d'une polyalcoylèneimine ; d) de réticuler la vermiculite enrobée à l'aide d'un agent de réticulation des amines ou de la condenser à l'aide d'un agent de condensation.
5.-Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce la vermiculite enrobée de polymère est mélangée avec un agent de réticulation des amines en quantité propre à la réticulation pour immobiliser <Desc/Clms Page number 20> la matière biologique dans la vermiculite enrobée.
6.-Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce la polyalcoylèneimine est mélangée avec un acide polycarboxylique en quantité propre à la condensation pour produire un polymère hydrosoluble partiellement polymérisé précondensé avant qu'il soit mélangé avec la vermiculite.
7.-Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que la vermiculite enrobée est condensée par addition d'un carbodiimide de condensation en quantité propre à la condensation, dans des conditions de condensation.
8.-Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que la vermiculite enrobée est condensée par addition d'un carbodiimide de condensation en quantité propre à la condensation, dans des conditions de condensation.
9.-Procédé suivant la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce que la matière biologique insolubilisée composite est en outre modifiée par posttraitement au moyen d'un agent de réticulation des amines afin de conférer davantage de résistance mécanique et de stabilité au produit composite. EMI20.1
10.-Procédé suivant la revendication 4, 5, 6, 7 ou 8, caractérisé en ce que la polyalcoylèneimine est choisie entre la polyéthylèneimine, la polypropylèneimine, la polybutylèneimine et la polypentylèneimine.
11.-Procédé suivant la revendication 4,5, 6, 7 ou 8, caractérisé en ce que la polyalcoylèneimine est la polyéthylèneimine.
12.-Procédé suivant la revendication 6 ou 8, caractérisé en ce que l'acide polycarboxylique est choisi entre l'acide maléique, l'acide succinique et l'acide adipique.
13.-Procédé suivant la revendication 7 ou 8, <Desc/Clms Page number 21> caractérisé en ce que le carbodiimide de condensation est choisi entre le chlorhydrate de l-éthyl-3, 3-diméthylaminopropylcarbodiimide, le dicyclohexylcarbodiimide et le métho-p-toluènesulfonate de l-cyclohexyl-3- (2-morpholinoéthyl) carbodiimide, outre leurs sels.
14.-Procédé suivant la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce que l'agent de réticulation des amines est choisi parmi le dialdéhyde glutarique, les diisocyanates, les polyisocyanates, la 2,4, 6-s-triazine, le bisoxiranne, le bisimidate, la divinylsulfone et le 1, 5-difluoro-2,4-dinitrobenzène.
15.-Procédé suivant la revendication 1 ou 4, caractérisé en ce que la quantité de matière biologique ajoutée à la vermiculite est d'environ 0,001 à environ 2 g, sur base sèche, par g de vermiculite.
16.-Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que le rapport molaire de la polyalcoylèneimine à l'acide polycarboxylique est d'environ 1 : 20 à 1 : 0,0005.
17.-Procédé suivant la revendication 16, caractérisé en ce que le carbodiimide est utilisé en une quantité d'environ 0,2 à 3 fois la quantité stoechiométrique, par rapport à l'acide polycarboxylique.
18.-Procédé suivant la revendication 16, caractérisé en ce que le carbodiimide est utilisé en une quantité d'environ 0,5 à 1,5 fois la quantité stoechiométrique, par rapport à l'acide polycarboxylique.
19.-Procédé suivant la revendication 1 ou 4, caractérisé en ce que la matière biologique immobilisée est choisie parmi les enzymes, les cellules microbiennes, les antigènes, les anticorps, les antibiotiques, les coenzymes, les bactéries, les levures, les champignons, les cellules végétales, les cellules animales et les cultures de tissus. <Desc/Clms Page number 22>
20.-Procédé suivant la revendication 1 ou 4, caractérisé en ce que la matière biologique est l'aspartase produite par voie microbienne.
21.-Procédé suivant la revendication 1 ou 4, caractérisé en ce que l'enzyme est la tryptophane synthétase.
22.-Matière biologique insolubilisée composite, caractérisée en ce qu'elle comprend une matière biologiquement active absorbée dans des particules de vermiculite qui sont immobilisées dans un polymère.
23.-Matière biologique insolubilisée composite, caractérisée en ce qu'elle comprend une matière biologiquement active adsorbée dans des particules de vermiculite qui sont immobilisées dans un polymère, le polymère étant réticulé par un agent de réticulation.
24.-Matière biologique insolubilisée composite suivant la revendication 23, caractérisée en ce que le polymère est une polyalcoyièneimine et l'agent de réticulation est un agent de réticulation des amines.
25.-Matière composite suivant la revendication 24, caractérisée en ce que l'agent de réticulation des amines est choisi parmi le dialdéhyde glutarique, les diisocyanates, les polyisocyanates, la 2,4, 6-trichloro-s-triazine, le bisoxiranne, le bisimidate, la divinylsulfone et le 1, 5-difluor-2, 4dinitrobenzène.
26.-Matière composite suivant la revendication 24, caractérisée en ce que l'agent de réticulation des amines est le dialdéhyde glutarique.
27.-Matière biologique insolubilisée composite, caractérisée en ce qu'elle comprend une matière biologiquement active adsorbée dans des particules de vermiculite qui sont immobilisées dans un polymère, le polymère étant condensé par un agent de condensation. <Desc/Clms Page number 23>
28. - Matière biologique insolubilisée compo- site suivant la revendication 27, caractérisée en ce que le polymère est une polyalcoylèneimine et l'agent de condensation est un carbodiimide de condensation.
29.-Matière composite suivant la revendication 28, caractérisée en ce que l'agent de conden- EMI23.1 sation est choisi entre le chlorhydrate de l-éthyl-3, 3diméthylaminopropylcarbodiimide, le dicyclohexylcarbodiimide et le métho-p-toluènesulfonate de l-cyclohexyl- 3- (2-morpholinoéthyl) carbodiimide, outre leurs sels.
30.-Matière composite suivant la revendication 24 ou 26, caractérisée en ce que la polyalcoylèneimine est choisie entre la polyéthylèneimine, la polypropylèneimine, la polybutylèneimine et la polypentylèneimine.
31.-Matière composite suivant la revendication 22,23, 24,27 ou 28, caractérisée en ce que la matière biologiquement active est choisie parmi les enzymes, les cellules microbiennes, les antigènes, les anticorps, les antibiotiques, les coenzymes, les cellules végétales, les cellules animales, les bactéries, les levures, les champignons et les cultures de tissus.
32.-Matière composite suivant la revendication 22,23, 24,27 ou 28, caractérisée en ce que la matière biologiquement active est l'aspartase.
33.-Matière composite suivant la revendication 22,23, 24,27 ou 28, caractérisée en ce que la matière biologiquement active est la tryptophane synthétase.
34.-Procédé pour produire de l'acide aspartique, caractérisé en ce qu'on met en contact, dans les conditions de la production de l'acide aspartique, un substrat contenant du fumarate d'ammonium avec une matière biologique insolubilisée composite comprenant <Desc/Clms Page number 24> EMI24.1 de des cellules microbiennes ue'L'aspar-L-ase de l'aspartase absorbées dans des particules de vermiculite et immobilisées dans un polymère, la vermiculite immobilisée étant réticulée avec un agent de réticulation ou condensée avec un agent de condensation..
35.-Procédé de production du tryptophane, caractérisé en ce qu'on met en contact, dans les conditions de la production du tryptophane, un substrat contenant de l'indole et de la sérine avec une matière biologique insolubilisée composite comprenant de la tryptophane synthétase ou des cellules microbiennes contenant de la tryptophane synthétase absorbées dans des particules de vermicule et immobilisées dans un polymère, la vermiculite immobilisée étant réticulée avec un agent de réticulation ou condensée avec un agent de condensation.
36.-Procédé de production de la Lphénylalanine, caractérisé en ce qu'on met en contact, dans les conditions de la production de la Lphénylalanine, un substrat contenant du cinnamate d'ammonium avec une matière biologique insolubilisée composite comprenant de la phénylalanine ammonia-lyase ou des cellules microbiennes contenant de la phénylalanine ammonia-lyase absorbées dans des particules de vermiculite et immobilisées dans un polymère.