LU86491A1 - Nouveaux disaccharides,leur preparatione et leur utilisation comme medicaments - Google Patents

Description

I- - 1 -

La présente invention a pour objet de nouveaux disaccha-rides, leur préparation et leur utilisation comme médicaments.

L'invention concerne en particulier les disaccharides de formule I 5 HO—.

\_0 HO»/ \ —O—CH- \ / ^ i i /—0 0H i 10 VJ Z HO-/ \-O.P^

Il \ / ΓθΗ K K i—i 0

TV

"i S

15 dans laquelle

Ri', R2'> R3' et R4* représentent, indépendamment les uns des autres, l'hydrogène ou un groupe acyle éventuellement substitué, et W, X, Y et Z représentent, indépendamment les uns des autres, 20 l'oxygène ou un groupe imino, avec la condition que a) au moins un des symboles Ri', R2', R3' et R41 représente un groupe acyle éventuellement susbtitué, et b) lorsque Z et X représentent un groupe imino et W et Y reprê- 25 sentent l'oxygène, a) Ri' et R2' ne signifient pas simultanément un groupe (R)-3-hydroxytétradécanoyle, pour autant que R3' et R4' soient identiques et représentent un groupe (R)-3-hydroxy-tétradêcanoyle ou que R41 représente un groupe (R)-3-30 dodécanoyloxytétradécanoyle et R3' un groupe (R)-3-tétra- décanoyloxytétradécanoyle, ß) R2* soit autre que l'hydrogène ou qu'un groupe (R)-3-hydroxytétradêcanoyle, pour autant que Ri' et R3' représentent l'hydrogène et R4' représente un groupe 35 (R)-3-hydroxytétradécanoyle, et w * - 2 - /) R3' soit autre qu'un groupe -(C0)2~CH2-(CH0H)4-CH20H, pour autant que les autres substituants représentent l'hydro-gène, et leurs sels.

5 L'invention a également pour objet un procédé de prépara tion des composés de formule la

HOHO—/ \-—O — CH

10 \-\ \__O OH la V ? HO_/ \_0./

^3 K \_/ t0B

I I

15 R1 K2 dans laquelle X, Y, W et Z ont les significations données précédemment, et

Rl, R2, R3 et R4 représentent, indépendamment les uns des autres, 20 l'hydrogène ou un groupe acyle éventuellement substitué, avec la condition qu'au moins un des symboles Ri, R2, R3 et R4 représente un groupe acyle éventuellement substitué, et de leurs sels,

procédé selon lequel on condense par voie enzymatique un composé de 25 formule II

HO—^

/ — \ ηΏ'°η OH

HO-/ ,--°*PN I τγ

\_. / δ 0 ' ï - D

30 ]| O

w z

I I

Am t>m R3 4 le - 3 - dans laquelle W et Z ont les significations données précédemment, R3" et R4" ont les significations données précédemment pour R3 et R4 excepté l'hydrogène, et U représente 1'uridine,

5 avec un composé de formule III

HO—

'__O OH

HO-/ \_0.pC. 111

\__/ è °H

10 1 1 - T ? R" R" 1 2 · dans laquelle X et Y ont les significations données précédemment, et 15 Ri" et R2" ont les significations données précédemment pour Ri et R2, avec la condition qu'au moins un des deux substituants représente un groupe acyle éventuellement substitué et que lorsque X ou Y représente un groupe imino, le sustituant Ri" ou R2" lié au groupe imino soit autre que l'hydrogène, 20 et, si on le désire, on hydrolyse le composé résultant en composé correspondant de formule la dans laquelle, lorsque X, Y, Z et/ou W représentent l'oxygène, Ri, R2, R3 et/ou R4 représentent l'hydrogène, ou si on le désire, on soumet le composé résultant a une réaction 25 d*acylamidase, ce qui donne le composé de formule la dans laquelle, lorsque X, Y, Z et/ou W représentent un groupe imino, Ri, R2, R3 et/ou R4 représentent l'hydrogène, et on récupère les composés de formule la sous forme libre ou sous forme de sels.

30 La condensation enzymatique peut par exemple être effec tuée dans un système tampon, par exemple dans le tampon tris a pH 7. On peut opérer à des températures égales ou supérieures à la température ambiante, par exemple a 30°C. On peut utiliser comme extrait enzymatique une préparation obtenue a partir d'une bactérie 35 a gram négatif, de préférence à partir des souches de E. coli - 4 .

*- i* < [Raetz, J.Biol.Chem. 2£9 (1984) 4852]. Les souches préférées sont „ celles produites par manipulation génétique en vue d'une surproduc tion de l'enzyme désirée.

L'hydrolyse éventuelle peut être effectuée selon les 5 méthodes décrites dans la littérature.

On peut effectuer la réaction d'acylamidase en procédant de manière analogue à celle décrite par C.R. Verret et coll. dans J.Biol.Chem. 257 [1982] 10 222.

Les composés de formule I ainsi obtenus peuvent être iso-10 lés et, si on le désire, être purifiés selon les méthodes connues.

Les composés de formule la et III peuvent exister sous forme libre ou, éventuellement, sous forme de sels. Une forme libre peut être transformée en sel selon les méthodes habituelles, et vice-versa.

15 Les symboles Rj_, R2, R3 et R4 sont de préférence iden tiques. Ils représentent de préférence l'hydrogène ou un groupe acyle contenant de préférence de 4 à 20, plus particulièrement de 12 a 16 atomes de carbone, spécialement 14 atomes de carbone. Ils peuvent par exemple être substitués en position 3 par un groupe 20 hydroxy, acétoxy ou acyloxy tel que défini ci-dessus. La configuration de l'atome de carbone en position 3 peut être (R) ou (S). Les symboles Ri, R2, R3 et R4 peuvent donc être présents dans un composé de formule la sous forme achirale ou sous forme (R), (S) ou racémique. Cela s'applique également aux composés de formule II, 25 III ou IV. La configuration demeure inchangée au cours du procédé de l'invention, ce qui signifie que lorsqu'on utilise un produit de départ sous forme (R), (S) ou racémique, on obtient un produit final (R), (S) ou racémique correspondant.

Les composés préférés sont les composés de formule la dans 30 laquelle R\, R2, R3 et R4 représentent un groupe acyle éventuelle-s ment substitué. D'autres composés préférés sont les composés de formule la dans laquelle, lorsque Ri, R2, R3 et/ou R4 représentent l'hydrogène, Y, X, W et/ou Z représentent l'oxygène.

*« - 5 -

Les composés de formule la sont de préférence obtenus sous ^ forme de sels. Pour augmenter la solubilité dans l'eau, on utilise de préférence des composés basiques hydrophiles, par exemple le tris-(hydroxyméthyl)aminométhane ou la L-lysine.

5 Les composés de formule II peuvent être obtenus selon les méthodes connues en faisant réagir un composé de formule III avec l'uridine-5'-monophosphate activé.

Les composés de formule III dans laquelle a) Y représente l'oxygène et X représente un groupe NH avec la 10 condition que a) lorsque R]/1 représente un groupe (R)-3-hydroxytétra- décanoyle, R2" soit autre qu'un groupe (R)-3-hydroxytétradécanoyle ou (R)-3-hexadécanoyloxy-tétradécanoyle, 15 B) Ri" soit autre que l'hydrogène, et Y) Ri" et R2" ne signifient pas simultanément un groupe acétyle ou -C0(CH2)10CH3, b) Y et X représentent l'oxygène ou c) Y représente un groupe NH et X représente l'oxygène, 20 avec la condition que au moins un des deux substituants R^" et R2" représente un groupe acyle et que lorsque X ou Y représente un groupe imino, le substituant R]_" ou R2" lié au groupe imino soit autre que l'hydrogène, sont nouveaux et font également partie de la présente invention.

25 Les composés de formule III peuvent être obtenus selon un procédé comprenant a) pour la préparation des composés de formule IIla HO_

\_O OH

30 HO_/ ^__O.P^ IHa : \_/ i· i·

I I

Rü R2 t ' - 6 - dans laquelle

Rl" et R2" ont les significations données précédemment et i soit X1 et Y' représentent l'oxygène, soit Y1 représente un groupe imino et X' représente l'oxygène, 5 la transformation du groupe hydroxy libre dans un composé de

formule IV

RO—

/ ’°\ IV

RO-/ \ — OH

10 \ / • — ·

I. I

Y’ X'

I I

Rï R5 15 dans laquelle

Rl", R2", X' et Y' ont les significations données précédemment, et R signifie un groupe protecteur, en un groupe protégé sous forme d'ester phosphorique, ou bien 20 b) pour la préparation des composés de formule Illb

H0-\ OH

.·-°x Illb

\ / 0 0H

25 *---- I I .

ο 1IH

1” R” R1 R2 30 dans laquelle Ri" et R2" ont les significations données précédemment, l'acylation des composés correspondants de formule IIle - 7 - RO— \ 0 i / \ /0R' RO—· «—0·Ρ>. TTTf \_/ 1110 5 i i

HO NH

D" R2 dans laquelle R2" et R ont les significations données précédemment, et 10 R1 représente un groupe protecteur, et l'élimination subséquente des groupes protecteurs.

On peut effectuer par exemple le procédé a) en dissolvant le composé de formule IV dans un solvant inerte, par exemple un éther cyclique tel que le tétrahydrofuranne, et en faisant réagir a 15 basse température, par exemple à -70°C, avec du butyllithium dans un hydrocarbure aliphatique tel que l'hexane, puis en ajoutant du phosphorochloridate de dibenzyle. Le produit obtenu peut être isolé et éventuellement purifié selon les méthodes habituelles. Les groupes hydroxy libres du reste phosphate sont protégés, par exemple 20 par des groupes benzyle. L'élimination des groupes protecteurs peut également être effectuée selon les méthodes connues. On peut par exemple éliminer selon les méthodes classiques un groupe protecteur sous des conditions acides, par exemple avec un acide aqueux (échangeur d'ions), ou par hydrogénolyse.

25 On peut effectuer par exemple le procédé b) en dissolvant le composé de formule IIle dans un solvant inerte, par exemple dans un hydrocarbure chloré tel que le chlorure de méthylène, avec un agent d'acylation, avantageusement avec addition de dicyclohexyl-carbodiimide et de 4-diméthylaminopyridine, et en opérant a basse 30 température, par exemple à environ 4°C. On peut isoler le produit du mélange réactionnel et le purifier, si on le désire, selon les méthodes habituelles. On élimine ensuite les groupes protecteurs présents selon les méthodes connues.

.¾.

- 8 - m <

Comme groupe protecteur, on peut utiliser n'importe quel ç groupe utilisé habituellement comme groupe protecteur dans la chi mie des saccharides. Les deux substituants R peuvent par exemple c représenter tous les deux un groupe benzylidène ou isopropylidène.

5 Comme groupes protecteurs du reste phosphate, on peut aussi utiliser des groupes protecteurs connus tels que le groupe benzyle.

Les composés de formule IIle sont nouveaux et peuvent être obtenus selon le schéma réactionnel suivant: HO—.

\_O

HO—/ \—OH

\__/ / \ HO NH2 acylati on HO— \lo

HO—/ \_OH

\__/

Ho" NHR^ R0_. protection (pos. 4 + 6)

RO-/' -Λ -OH

/ \ HO NHR" protection y * RO— y \ \__0 \ RO_/ \_OH \ V_/ \ TBDMS.O NHR" \ RO— · RO— J >_o “ · \_o y RO—/ \_O.P( _V RO—/ '_O.P.n„,

Λ_/ * \__/ fcN0R

TBDMS.O \jHR" HO \lHR" IIIc TBDMS= terts-butyldimethylsilyl - 9 -

Les composés de formule IV peuvent être obtenus selon les S schémas réactionnels suivants, les groupes hydroxy qui ne partici pent pas a la réaction étant avantageusement sous une forme protê-·?. gée. Les substituants ont les significations suivantes: 5 R, R1 = groupes protecteurs R5 = les deux symboles possèdent, indépendamment l'un de l'autre, la signification donnée pour R\, R2, R3 ou R4 Ac = acétyle TBDMS = tert. butyldîmêthylsilyle.

ί 1. Préparation des composés de formule IVa: - 10 - t /—\_.°_\-o Ao0-\._0

^'o—/ \-OH--* AcO / \-0AO

\_/ oJ V °2N'| N3 HO— i HO__ /—°x

\ réduction HO—/ \ — OH

y—o ______— \ ./

HO-/ \-OH ^ rnntrnlÔP ' X

\ / contrôlée o2n N3 O u \h réduction 2n wh2 HO—. y

H0—\ I protection (pos. 2) H0_/_OH

\-0 \_/ HO—/ OH / \ \ / H-N NH- / \ ^ ^ , 02N NHR ho—acylatiorr

HO—. y HO_/_0\_OH

\_0 ’ N__/ HO-/ \_ OH / \ \ / R.HN NHR.

H,N7 Nnhr ro_. otection (pos. 4+6) ΗΠ 2 , . \Jl_0

H0— ψ acylation . R0__/ \_0H

'__O \_/ HO_/ \_OH / \ \ / RcHN NHRc /r\ 5 5

Rg.HN NHR ^ R identiques ) Ù deprotection . (pos. 2) xva vies z 5 H0--._0

HO-/ \— OH

\ / • — · / 4 \

RgHN NH2 H0—’v^ YQ acylation

HO—' \-OH

• ——»· - / \

RcHN NHR,.

RO—— ^

Yq protection (pos. 4 + 6)

RO—/ \_ OH /"“N

R.HN ~ NHR-5 D

(les 2 % différents)- > - 2. Préparation des composés de formule IVb - 11 - » * «! HO__

^__O

' - HO -/ \-OH

i i n3 oh- protection (pos. 4 + 6) RO--y

X — O

RO / \ —OH

• «MM ·

I I

N3 oh . protection (pos. 1)

RO-·*.,· · Y

\__o

R0-J \ -0. TBDMS

s__/ i i N, OH r J 1. réduction • · 2. acylation RO--- \Io

RO_/ \-0. TBDMS

\_/ / \ r hn: or_ 5 5 RO__^ \f déprotection (pos. 1)

RO_/ \-0H

\ / • ' · / \ R5HN. ORg IVfa y ? 3. Préparation des composés de formule IVc - 12 - b»

AcO—.

\--O

x AcO--/ \— OAc \ / • MM · / \

AcO OAc

AcO—. I protection (p0s. 1) \ —0

AcO / \—O. CH0CC1^ \__/ 2 3 / \

AcO OAc HO__j déprotection , (pos. 2, 3, 4, 6)

\ —O

HO / \ O. CH0CC1- \—/ 23

I I

HO O H

I protection (pos. 4 + 6)

RO—. X

\Jo RO— / \— O.CH-CC1-, \ / 2 3 • ' ·

I I HO OH

RO v acylation \._0 RO—J O.CH-CCl-, \ / 2 3 ' I· / \

RgO 0R5 RO.— Y déprotection (pos. 1) V—o

RO — / \ — OH

\ / * - · / \ R5° or5 ^ IVc * * - 13 -

Lorsque la préparation d'un produit de départ quelconque n'est pas décrite en détail, ce produit est connu ou peut être prê-5 paré selon les méthodes connues ou en procédant de manière analogue a celle décrite dans les exemples.

5 Les exemples suivants illustrent la présente invention sans aucunement en limiter la portée. Dans ces exemples, les températures sont indiquées en degrés Celsius. EDTA signifie l'acide édétique (acide éthylènediaminetétraacétique), DTE signifie la 1,4-dithioérythrite, UDP représente 1'uridinephosphate et tris est 10 une abréviation du tris(hydroxyméthyl)aminométhane.

14 » *

Exemple 1 c 6~Q~Î2-déoxy-3-Q-[(R)-3-hydroxytëtradëcanoyl ]-2-[(R)-3- .

hydroxytétradécanoylamidoI-ß-D-glucopyranosyl ]-2,3-di-0-_ [(R)- 3-hydroxytétradécanoyl ]-l-0-phosphono-a-D-gluco-5 pyranose

On dissout 2,03 mg de UDP-2-déoxy-3-0[(R)" 3-hydroxytétradécanoyl]-2-[(R)-3-hydroxy-tëtradêcanoyl-amido]-a-D-g1ucopyranose et 1,42 mg de 2,3-di-0-[(R)- 3-hydroxytétradécanoyl]-l-O-phosphono-a-D-glucopyranose, 10 tous les deux sous forme de sels tris , dans du tampon tris 10 mM, pH 7, contenant 0,2 mM de EDTA et 0,2 mM de DTE et on incube à 30° avec 60 jul d'extrait enzymatique.

L'extrait enzymatique peut être obtenu 15 comme suit :

On cultive E. coli JB 1104 dans une culture L (préculture + 10 ug d'ampicilline / ml à 30° pendant la nuit; culture principale à 30° dans un fermenteur à agitation, en partant à partir de ODggonm"" 20 0,1 jusqu'à ^D550nm = 0n recue’’^e ^es cellules par centrifugation à 10.800 g (10 minutes / 4°), on met en suspension le culot de centrifugation dans du tampon tris 10 mM, pH 7,0 + 0,2 mM de EDTA et 0,2 mM de DTE et on centrifuge à nouveau (6000 g, 25 10 minutes / 4°). Le culot de centrifugation est ensuite remis en suspension dans le tampon ci-dessus et est fractionné aux ultra-sons (5 x 20 secondes/ 30 secondes de pause avec 120 watts). Les fragments - cellulaires sont séparés par centrifugation (12000 g, 30 10 minutes / 4°) et la solution est soumise à une ultracentrifugation (150.000 g, 90 minutes / 7°).

On récupère les 2/3 supérieurs du surnageant. Cette fraction est soumise à une précipitation fractionnée 15 9 4 avec du sulfate d'ammonium. Comme préparation enzymatique, on utilise la fraction à 10-40¾ de sulfate d'ammonium.

Le culot de centrifugation résultant est mis en suspension dans le tampon ci-dessus.

5 La réaction terminée (vérification par chromatographie en couche mince), on acidifie la solution à pH 2 avec de l'acide citrique et on la centrifuge. Le culot de centrifugation est mis en suspension dans le mélange chloroforme / méthanol / 10 acide acétique / eau (65/15/5/2) et on le chromatographie sur gel de silice en utilisant le même ëluant.

Les fractions contenant le produit sont rassemblées et évaporées jusqu'à élimination complète de tout solvant organique, et le résidu est lyophilisé. On 15 dissout le lyophilisât dans un mélange tétrahydrofuranne/ eau (8/2) et, dans ce solvant, on le transforme en sel tris sur un échangeur de cation sous forme tris. On évapore le tétrahydrofuranne et on lyophilise le résidu. Toutes les valeurs Rf sont déterminées 20 sur plaques de gel de silice. Rf = 0,48 (chloroforme / méthanol / acide acétique / eau , 65/25/5/5).

Exemple 2 6-0-[2-dëoxy-3-0-[(R)-3-hydroxytëtradécanoyl]-2-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamido]-ß-D-glucopyranosyl]-2-25 déoxy-3-0-[(S)-3-hydroxytëtradécanoyl]-2-[(S)-3-hydroxy tëtradécanoyl ami do] -1 -0-phosphono-q-D-glucopyranose 20 parties en volume d'une solution 5 mM de 2-dëoxy-3-0-[(S)-3-hydroxytétradéca- ? noyl]-2-[(S)-3-hydroxytétradëcanoylamido]-l-0-phosphono-

30 α-D-glucopyranose dans du tampon tris / HCl 10 mM

(pH 7) contenant 0,2 mM de EDTA et 0,2 mM de DTE, 20 parties d'une solution 5mM de UDP-2-déoxy-3-0-[(R)-3-hydroxytëtradécanoyl]-2-[(R)-3-hydroxytêtradëcanoyl- 16 amido]-ct-D-glucopyranose dans le même tampon et 20 parties de tampon tris / HCl 100 mM (pH7) contenant 2 mM de EDTA et 0,2 mM de DTE sont mis à réagir pendant 8 heures à 30° avec 40 parties d'une préparation 5 enzymatique préparée comme décrit à l'exemple 1, dans du tampon tris / HCl 10 mM (pH 7) contenant 2 mM de EDTA, 2 mM de DTE et 0,1 % de Triton X-100 , la concentration finale en Triton X-100 étant réglée à 0,1 %. Le mélange réactionnel est lyophilisé, dissous 10 dans environ 1/3 du volume initial d'éluant servant à la chromatographie subséquente pour la séparation selon le poids moléculaire (Sephadex LH 20 , êl'uant : pyridine / acide acétique / eau , 98/1/1) et filtré.

Le volume de la colonne est environ 20 fois celui 15 du volume de l'échantillon . Les fractions contenant le produit pur sont rassemblées et évaporées sous pression réduite, mises en suspension dans de l'eau exempt de pyrogène et lyophilisées. Après lyophilisation, on élimine le Triton X-100 en faisant digérer 20 le produit dans de l'éther diéthylique. Après centrifugation, on dissout le culot de centrifugation dans un mélange de chloroforme et de méthanol 1/1, on filtre et on élimine le solvant sous pression réduite.

A une suspension aqueuse du résidu , on ajoute la 25 quantité stoechiométrique de L-lysine (base libre) sous forme d'une solution aqueuse 100 mM , pour 7 obtenir le monosel de L-lysine, et on lyophilise à nouveau le mélange. Rf = 0,44 (chloroforme / méthanol/ s· acide acétique / eau / 65/25/5/5).

30 Exemple 3 6-0-[2-déoxy-3-0-[(R)-3-hydroxytétradécanoyl]-2-[(R)-3-hydroxy-tétradécanoylamido]-ß>-D-glucopyranosyl]-2-déoxy-3-0-[(R)-3-hydroxytëtradëcanoyl]-l-0-phosphono-2-[(R)-3-tëtradëcanoyloxy-tétradëcanoylami do]-g-D-glucopyranose ** 17 H * 20 parties en volume d'une solution 5 mM de 2-dëoxy-3-0-[(R)-3-hydroxy-tétradécanoyl]-l-0-phosphono-2-[(R)-3-tëtradécanoy1oxytétradêcanoyl-ami do]-α-D-glucopyranose dans du tampon tris / HCl 10 mM 5 (pH 7) contenant 0,2 mM de EDTA et 0,2 mM de DTE, 20 parties d'une solution 5 mM de UDP-2-dëoxy -3-0-[(R)-3-hydroxytétradécanoyl]-2-[(R)-3-hydroxytétradé-canoylamido]-a-D-glucopyranose dans le même tampon et 20 parties de tampon tris / HCl 100 mM (pH 7) contenant 10 2 mM de EDTA et 0,2 mM de DTE , sont mis à réagir pendant 48 heures à 30° avec 40 parties d'un extrait enzymatique (préparé comme décrit à l’exemple 1) dans du tampon tris / HCl 10 mM (pH 7) contenant 2 mM de EDTA, 2 mM de DTE et 0,1 % de Triton X-100, la 15 concentration finale en Triton X-100 étant réglée à 0,1%. On lyophilise le mélange , on le traite par de la pyridine et on le filtre. On concentre le filtrat sous pression réduite et on le chromatographie sur gel de silice en utilisant, comme ëluant, un mélange 20 chloroforme / méthanol / eau / bromure de 2-phénêthyl-picolonium 800/175/22,5/2,5 . On rassemble les fractions contenant le produit pur et on élimine le bromure de 2-phénéthylpi colonium servant d'agent générateur de paire d'ions, par agitation avec 20 mM de HgPO^ dans 25 de l’eau. On concentre la phase organique sous pression réduite, on ajoute la quantité stoechiométrique de L-lysine base sous forme d'une solution aqueuse 100 mM pour former, le mono sel de L-lysine , et on ? lyophilise le mélange. Rf = 0,53 (chloroforme / mëtha- 30 nol / acide acétique / eau 65/25/5/5).

En procédant de manière analogue à celle décrite aux exemplesl à 3, on obtient les composés de formule I suivants , les quantités d'enzyme étant choisies , selon les composés de formule II et III

18 utilisées, de telle manière que la réaction se déroule de préférence pendant environ 24 à 48 heures.

* TABLEAU

5 R1 = R2 = R3 = R4 = (R)“3“hydro*ytétradécanoyl

Exemple ’ w__z__Y__X__Rf 4 0 NH NH NH 0,45 10 5 NH NH NH NH 0,40 6 O O O NH 0,49 7 O NH NH O 0,39 8 NH NH O NH 0,41 9 O O O O 0,48 15 c ,

Exemple 10 6-0-[2-déoxy-3-0-[(R)-3-hydroxytétradëcanoyl ]-2-[(R)-3-hydroxytétradécanovl ami do]-ß-D-g1ucopyranosyl ]-2-déox,y- 1-Q-phosphono-3-0-tëtradécanoyl -2-tëtradécanoylamid o-a-D-g 1ucopyranose 20 Le composé du titre est obtenu de manière analogue à celle décrite aux exemples 1 à 3.

Rf = 0,50 (chloroforme / méthanol / acide acétique / eau 65/25/5/5).

Exemple 11 25 6-0-[2-dëoxy-3-0-[(R)-3-hydroxytëtradécanoyl]-2-[(R)-3- hydroxytétradécanoylamido]-ß-D-glucopyranosyl]-2-acëtamido-2-déoxy-3-0-[(R)-3-hydroxytëtradëcanoyl]-1 -0 -phosphono-a-D-glucopyranose

Le composé du titre est obtenu de manière 30 analogue à celle décrite aux exemples 1 à 3.

Rf = 0,32 (chloroforme / méthanol / acide acétique / eau / 65/25/5/5).

19 *

Exemple 12 6-Q-[2-déoxy“2-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamido]-ß-D-glucopyranosyl1-1-Q-phosphono-g-D-glucopyranose

On dissout 5 mg de 6-0-[(2-déoxy-3-0-5 [(R)-3-hydroxytétradëcanoyl]-2-[(R)-3-hydroxytétradéca-noylamido]-ß-D-glucopyranosyl]-2,3-di-0-[(R)-3-hydroxy-tétradécanoyl]-l-O-phosphono-a-D-glucopyranose dans un mélange à parts égales de chloroforme et de mêthanol, on fait réagir avec une solution ammonicale aqueuse 10 à 25¾ (1/3 du volume) et on laisse reposer pendant la nuit. La réaction terminée, on évapore le mélange à sec, on triture le résidu dans de l'éther diéthylique afin d'éliminer les acides gras formés par coupure, on filtre le précipité et on le lave à l'éther. On dissout le 15 résidu dans de l'eau, on ajoute la quantité calculée de tris pour former le di-sel de tris, et on lyophilise le produit. Rf = 0,45 (chloroforme / mêthanol / acide acétique / eau 25/15/2/4).

Exemple 13 20 2-déoxy-3-0-[(R)-3-hydroxytëtradécanoyl]-2-[(R)-3- hydroxytëtradécanoylami do 1-1-O-phosphono-a-D-glucopyranose a) 4,6-0;benzylidène-3-0-[[R]-3-benzyloxytétradêcanoyl]-_ ?:E[^):3:benzyl:Oxytétradécanoylamido]=2=déoxy-l-0- ^1!·!22?Υΐ2!]22Ε!}202ΐ9ίΐ9:2ΐ222βΗ22222 25 A une solution refroidie à -10° et constituée de 3,9 g de 4,6-0-benzylidène-2-[(R)-3-benzyloxytëtradécanoylamido]-2-dëoxy-l-0-dibenzyl-phosphono-a-D-glucopyranose, de 2 g d'acide (R)-3-benzyloxytétradëcanolque et de 50 mg de 4-dimëthyl-30 aminopyridine dans 20 ml de chlorure de méthylène, on ajoute 2 g de dicyclohexylcarbodiimide et on maintient le mélange réactionnel à 4° pendant la nuit. On filtre ensuite le mélange, on évapore le filtrat 20 à siccité , on reprend le résidu dans une petite quantité d'un mélange toluène / acétate d'éthyle v 8/2 et on chromatographie avec le même solvant.

20 F = 96-98°. [a]D = +33,3° (c = 1, chloroforme).

" 5 Rf = 0,5 (toluène / acétate d'éthyle 2/1).

b) 2-dëoxy-3;0;[[R]-3-hydroxytétradécanoyl]-2-[(R}-3-hydroxytétradécanoylamidolzl^O-ghosphono-a-D-gluço-pyranose_

On dissout 4,2 g de 4,6-0-benzylidène-3-0-10 [(R)-3-benzyloxytëtradëcanoyl]-2-[(R)-3-benzyloxytétra- décanoylamido]-2-déoxy-l-0-di benzylphosphono-a-D-g1ucopyranone dans 900 ml d'un mélange têtrahydro-furanne / eau (85/15) et on hydrogène pendant 2 heures à 40° et sous 10 bar, en présence de 1 ,5 g 15 de charbon palladiê à 10%. On élimine ensuite le catalyseur par filtration, on évapore le tétrahy- drofuranne et on lyophilise la suspension aqueuse.

20 [a]p = +28,5° (c = 0,2 , chloroforme + 1 goutte de méthanol). Rf = 0,56 (chloroforme / mëthanol / 20 acide acétique / eau 125/75/10/20).

La purification ultérieure peut être effectuée comme suit: 10 g de 2-dëoxy-3-0-[(R)-3-hydroxytëtra-dëcanoyl]-2-[(R)-3-hydroxytétradécanoylamido]-l-0-phos-25 phono-a-D-glucopyranose et 1,7 g de tris dans 150 ml de méthanol sont traités aux ultra-sons pendant 10 minutes à 45° dans un bain à ul tra-sons. On centrifuge la suspension et on sépare le surnageant limpide et le culot de centrifugation par décantation. A cette 30 solution, on ajoute 1,7 g de tris (dissous dans 20 ml de méthanol ) , on amorce la solution et on laisse cristalliser à la température ambiante. On obtient le di-sel de tris du composé du titre.

•J " 21

On évapore les 1iqueur-mëres â siccité . On. dissout ensemble le résidu et le culot de centrifugation dans un mélange de 300 ml de chloroforme, de 600 ml de méthanol et de 240 ml d'eau (exempte de 5 pyrogène). A cette solution, on ajoute encore 300 ml de chloroforme et 300 ml d'acide chlorhydrique 0,1 N, on agite avec précaution et on laisse les phases se séparer . On sépare la phase chloroformique et on l'évapore à sec. Le résidu est constitué de 2-dëoxy-10 3-0-[(R)-3-hydroxytétradécanoyl]-2-[(R)-3-hydroxytétra- décanoylamido]-l-0-phosphono-a-D-glucopyranose impur.

Le produit résultant est traité aux ultra-sons avec du tris et du méthanol comme décrit ci-dessus et est ensuite centrifugé. La 15 solution est ensuite chromatogra'phiëe sur colonne de Sephadex LH 20 avec du méthanol comme ëluant. On rassemble les fractions contenant le produit et on les évapore à sec. On obtient le mono-sel de tris du composé du titre.

20 On dissout *a 45° 5,1 g de ce produit dans 40 ml de méthanol dans le bain â ultra-sons, on ajoute une solution de 0,74 g de tris dans 10 ml de méthanol , on amorce la solution et on laisse cristalliser d'abord à la température ambiante puis à 4°. On 25 obtient ainsi des quantités supplémentaires de cristaux du di-sel de tris du composé du titre.

Le résidu provenant des liqueur-mères et le culot de centrifugation peuvent être soumis à un autre essai de purification.

20 30 F = 183-185° (décomposition); [a]D = +15° (c = 1,0 dans 1'eau).

I * 22

Exemple 14 3-dëoxy-2-0-[(R)-3-hydroxytétradécanoyl]-3-[(R)-3-hydroxyi tëtradëcanoylamido]-!-O-phosphono-a-D-glucopyranose a) 2:0:[{R):3:benzYloxytétradécanoyl]-3-[(R}-3:benzyloxy^ 5 tétradécan°ylamido]-3-déoxy~l;0:dibenzyiphosphono; 4,6-0-isogr°py!idène-a-D=glucopyranose A une solution refroidie à -70° et constituée de 4,85 g de 2-0-[(R)-3-benzyloxytétra-décanoyl]-3-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamido]-3-10 déoxy-4,6-0-isopropylidène-D-glucopyranose dans 40 ml de tétrahydrofuranne anhydre, on ajoute 8 ml de butyllithium 1,6 M dans de l'hexane. Après 5 minutes, on ajoute à la même température une solution de 3,8 g de phosphorochloridate de dibenzyle dans 15 10 ml de benzène. On continue d'agiter à -70° pendant 10 minutes, on ajoute 0,3 ml d'acide acétique et on concentre la solution au quart du volume initial.

On dilue la solution avec 200 ml de chlorure de méthylène , on l'extrait avec 50 ml d'eau, 50 ml 20 d'une solution diluée d'hydrogênocarbonate de sodium et 50 ml d'une solution de chlorure de sodium, <bn la sèche sur sulfate de sodium, on l'évapore à sec et on chromatographie le résidu (toluène / acétate d'éthyle 7/3). Rf = 0,58 (toluène /acétate 25 d'éthyle 2/1).

b) 3-déoxy-2-0-[[R)-3-hydrox^tétradëcano^l]-3-[[R);3; hydroxytétradécanoylamidol-l-O-ghosghono-a-D-çjluco-gyranose_

Une solution de 980 mg de 2-0-[(R)-3-30 benzyloxytétradécanoyl]-3-[(R)-3-benzyloxytétradê- canoylami do]-3-dëoxy-l-0-di benzylphosphono-4,6-0-i sopropylidène-a-D-gl ucopyranose dans 100 ml de tëtra-hydrofuranne, est hydrogénée pendant environ 5 heures il * 23 sous pression normale, en présence de 300 mg de charbon pal 1 adié à 10%. On élimine ensuite le catalyseur par filtration, on ajoute de l'eau (10 ml) et du Dowex AG50WX8 H+ et on agite le mélange 5 à la température ambiante jusqu'à scission complète du groupe isopropylidène. On sépare l'échangeur d'ions par filtration, on neutralise la solution avec du tris et on élimine le tétrahydrofuranne et l'eau par évaporation sous pression réduite. On 10 dissout le résidu dans du méthanol et on le chromatographie sur Sephadex LH 20. Rf = 0,65 (chloroforme / méthanol /acide acétique / eau 125/75/10/20).

Exemple 15 2,3-di-0-[(R)-3-hydroxytëtradëcanoyl]-l-0-phosphono-a-15 D-g 1ucopyranose a ) §» * 2-di- 0;[[R];3;benzj(loxytêtra; décanoyl]-l-0-dibenzylphosphono-a-D-glucopyranose A une solution de 1 g de 4,6-0-benzy-1i dëne-2,3-di-0-[(R)-3-benzyloxytétradécanoyl]-D-20 glucopyranose dans 10 ml de tétrahydrofuranne anhydre refroidie à -70° , on ajoute goutte à goutte 0,9 ml de butyl1ïthium 1,6 M dans de l'hexane. Après 5 minutes, on ajoute goutte à goutte , à la même tempë-rature»une solution de 420 mg de phosphorochloridate 25 de dibenzyle dans 4 ml de benzène. On continue d'agiter pendant 10 minutes à -70°, on neutralise la solution avec de l'acide acétique et on l'évapore à sec. Le résidu est chromatographie (gel de silice, hexane / toluène / acétate d'éthyle 4/4/1).

30 Rf = 0,65 (tolène / acétate d'éthyle 6/1).

b) 2,3-di-0-[(R)-3-hydroxytétradëcanoylH-T-0-phosphonO2_ 24

On dissout 230 mg de 4,6-0-benzylidène-2,3-di-0-c [(R)-3-benzyloxytétradécanoyl1-1-0-dibenzylphosphono- α-D-glucopyranose dans un mélange tëtrahydrofuranne / eau 9/1 et on hydrogène pendant environ 5 heures sous 5 pression normale en présence de 80 mg de charbon palladié à 10¾. On élimine le catalyseur par filtration , on neutralise la solution avec du tris et on l'évapore à siccité. Le résidu est chromatographié sur Sephadex LH 20 avec du mëthanol. Rf = 0,65 10 (chloroforme / mëthanol acide acétique / eau 125/75/10/20).

Exemple 16 2-déoxy-3-0-[(S)-3-hydroxytëtradécanoyl]-2-[(S)-3-hy-droxy-tétradécanoylamido]-l-0-phosphono-a-D-glucopy-15 ranose a) 4,6-0-benzylène-3-0-C(S}-3-benzyloxytétradécanoyl1-2-[ÎSl:3:benzyloxytétradêcanoylamido]-2-dëoxy-l-0-^ÎȧD?yISlî2§E!32D2laz9lS^ u22EY!TËD2se

Le composé est obtenu de manière analogue 20 à celle décrite à l'exemple 13a). Rf = 0,44 (toluène/ acétate d1êthyle 4/1).

b) 2-déoxy;3-0-[[S)-3-hydroxytétradécanoyl];2;[[S];3- !3y2L2ïyi§ÏLÊ^ec2D2Ylam1^2]:l:9“PhosEhono"“:9:2luco: p^ran2§e 25 Le composé du titre est obtenu de manière analogue à celle décrite à l'exemple 13b).

F = 150-200° (avec décomposition). Rf = 0,5 (chlorure de méthylène / mëthanol / ammoniaque 1/1/1; phase · inférieure).

30 Exemple 17 2-dëoxy-3-0-[(R)-3-hydroxytëtradécanoyl]-l-0-phosphono- 2-[ (R)-3-tétradëcanoyloxytëtradëcanoyl amido3-a-D-gl ucopyranose 25 a) 4,6-O^benzylid|ne23-0-[[R)-3-benzylox^tétradécanoyl]- £zd§2XYzlz9zi!i!?2DZYl2!3222lî2D2zi:zIÎBlz§ZΧÎEadëcanoyl - ~ oxytétradécanoylami do Jz^fZ^zS 12222^20222

Le composé du titre est obtenu de manière - 5 analogue à celle décrite à l'exemple 13a). F = 82-95°.

[a]p° = +24,1° (c = 1, chloroforme). Rf = 0,7 (toluène/ acétate d'éthyle 2/1).

b) 2-déoxy-3:0Î[R)-3-hydroxytétradécanoyl]:^-0-phosghono:_ ?_”t[Blz?zî§ÎrÊ^§2ËD2^l25yî§îrÊ^§2ËD2ylÊ!DlÎ2^z2f_0z_ 10 gluç2pyranose

Le composé du titre est obtenu de manière analogue à celle décrite à l'exemple 21b).

20 [a]Q = +14,3° (c = 1, tétrahydrofuranne / pyridine).

Rf = 0,35 (chloroforme / mëthanol / acide acétique / 15 eau 80/25/5/5).

Exemple 18 2-déoxy-l-Q-phosphono-3-0-tétradëcanoyl-2-tétradécanoyl- amido-g-D-glucopyranose a) 1»§ζ0:^§ηζγ1idène-2-dêoxY-l-0-dibenzolphosphono-3:0: 20 tétradécanoyl-2-tétradêcan2ylamidoza jl“Xl_u_c_ojDy_r_a_n_o_s e

Le composé du titre est obtenu de manière analogue à celle décrite à l'exemple 13a) en utilisant de l'acide tétradëcanolque et un mélange toluène / acétate d'éthyle (4/1) comme éluant. F = 123-129°.

25 Rf = 0,6 (toluène / acétate d'éthyle 2/1).

b) 2-dêoxy-l-0-phosphono-3-0-tëtradécanoyl-2-tétradê-canoylamido-a-D-glucopyranose_

Le composé du titre est obtenu de manière analogue à celle décrite à l'exemple 21b). Rf = 0,65 30 (chloroforme / méthanol / acide acétique / eau 125/75/10/20).

J

26

Exemple 19 2-déoxy-2-[(R)-3-hydroxytétradëcanoylamido3-l-0-phospho-no-3-0-[(R)-3-tétradécanoyl oxytétradécanoyl]-a-D-g1uco-pyranose âîk 5 a) 4,6-0-benzylidène-2-[[R|-3-benzyloxytëtradécanoylamido]- 2-dëoxY-l-0-dibenzylphosghon°-3-0-[[R)-3-tétradécanoYl-oxytétradécanoYlJza^D-glucop^ranose

Le composé du titre est obtenu de manière analogue à celle décrite à l'exemple 13a), en uti1i- 10 sant l'acide (R)-3-tétradécanoyloxytétradécanoique et le système toluène /acétate d'éthyle (4/1) comme 2Ω mélange de solvants. F = 89-90°. [α]β = +30,9° (c = 1, chloroforme / mëthanol 1/1). Rf = 0,5 (toluène/ acétate d'éthyle 4/1).

15 b) 2:déoxy-2;[[R):3-hydroxYtétradécanoylamido]-l-0-phos; 2222Y220222

Le composé du titre est obtenu de manière analogue à celle décrite à l'exemple 21b). Le lyophi- 20 lisat est dissous dans du méthanol et chromatographié sur Sephadex LH 20 en utilisant le même solvant.

Rf = 0,32 (chloroforme / mëthanol /acide acétique / eau / 80/25/5/5).

Exemple 20 2 5 2-déoxy-2-[(R)-3-hydroxytétradëcanoylami do]-l-0-phospho- no-3-0-tëtradëcanoy1-a-D-glucopyranose a) 4,6:0:benzylidène:2:[[R]:3:benzyloxytétradécanoyl amido]-2-déoxy-l.-0-di benzyl phosphono^S^O^tëtradé-2222¥ΐ:®:9ι9ΐ222ΒΥΠ2Π2§2 30 Le composé du titre est obtenu de manière analogue à celle décrite à l'exemple 13a), en utilisant l'acide tëtradêcanolque et le système toluène/ acétate d'éthyle (3/1) comme mélange de solvants.

? 27 F = 125,5 - 126,5°. Rf = 0,6 (toluène / acétate d'éthyle 3/2).

b) 2-déoxy-2-[(R]-3;hydroxytétradécanoylaniido]-l;0-ghos; 2hono=3-0-tétradécanoyl-a-D-glucopyranose *5 On dissout 354 mg de 4,6-0-benzylidène- 2-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamido]-2-déoxy-l-0-dibenzylphosphono-3-0-tétradécanoyl-a-D-glucopyranose dans 30ml d'un mélange tétrahydrofuranne / eau (9/1) et on hydrogène pendant 10 heures sou s 1 apression 10 normale en présence de 200 mg de palladium sur charbon.

On sépare le catalyseur par filtration et on règle la solution à pH 7,5 avec du tris (hydroxyméthyl) -aminométhane. On évapore le tétrahydrofuranne sous pression réduite et on lyophilise la solution aqueuse." 15 On triture 2 fois le lyophilisât dans de l'éther et on le sèche. Rf = 0,6 (chloroforme / méthanol / acide acétique / eau 125/75/10/20).

Exemple 21 2-acétami do-2-dëoxy-3-0-[(R)-3-hydroxytétradëcanoyl]-l-20 O-phosphono-g-D-glucopyranose a) 2-acétami do-4,6-0-benzylidène-3-0-C(R]-3-benzyloxy-tétradécanoyl]-2-déoxy;l-0;dibenzylghosghono=a-D= g!ucopyranose

On refroidit à 0° une solution de 3,55 g 25 de 2-acétamido-4,6-0-benzylidène-2-déoxy-l-0-diben- zylphosphono-a-D-glucopyranose et de 2,1 g d'acide (R)-3-benzyloxytétradécano*ique dans 15 ml de chlorure de méthylène et on ajoute 1,32 g de dicyclohexylcarbodiimide et de la p-dimëthylamino-30 pyridine. Après 2 heures à cette température, la réaction est terminée . On filtre le mélange, on l'évapore à siccitë et on chromatographie le résidu sur gel de silice d'abord avec un mélange chlorure 7 28 de méthylène / méthanol (50/1) et ensuite avec un mélange toluène / acétate d'éthyle (2/1).

Rf = 0,7 (chloroforme / méthanol 20/1).

b) 2:acétamido:2:dëoxy:3:0:[[R}:3:hydroxytëtradêcanoyl]: 5 l-0-ghosphono-a-D-gluco|3yranose_

On dissout 2,08 g de 2-acétamido-4,6-0-benzylidène-3-0-[(R)-3-benzyloxytëtradécanoyl]-2-déoxy-1-0-dibenzylphosphono-a-D-glucopyranose dans un mélange tétrahydrofuranne / eau (9/1) et on hydro- 10 gène pendant 3 heures sous pression normale en présence de 1 g de charbon palladië à 10¾. On sépare le cata lyseur par filtration , on évapore le filtrat et on le lyophilise. On dissout le lyophilisât dans du méthanol, on le neutralise avec du tri s(hydroxymêthyl)- 15 aminomêthane et on le chromatographie sur Sephadex 20 LH 20 avec du méthanol . [a]D = + 43,3° (c = 1, méthanol). Rf = 0,4 (chloroforme / méthanol / acide acétique / eau 125/75/10/20).

Exemple 22 20 l-0-phosphono-2,3-di-0-Ç(R)-3-tétradëcanoyloxytëtra-décanoyl3-a-D-glucopyranose a) 4,6-0-benzyl idene-l-0-di benzyl ghosphono-2,3-di;;^ [[R^-3-tétradëcanoyloxytëtradêcanoyl3-a-D-glucogyra-nose 25 Le composé du titre est obtenu de manière analogue à celle décrite à l'exemple 15a), le produit étant, purifië par chromatographie sur gel de silice avec un mélange à parts égales d'éther et d'hexane comme éluant. Rf = 0,5 (éther / hexane 1/1).

30 b) 1-0;ghosghono-2,3-di-0-[[R];3;tëtradécanoyloxytétra^ dëcanoyl]-a-D-g1ucopyranose

On dissout 470 mg de 4,6-0-benzylidëne-l- 0-di benzylphosphono-2,3-di-0-C(R)-3-tëtradécanoyl-oxytétradécanoyl]-a-D-glucopyranose dans 47 ml 29 de tétrahydrofuranne et on hydrogène pendant 1 heure sous pression normale en présence de 230 mg de charbon palladié. On sépare le catalyseur par filtration, on concentre le filtrat à sec et on chromato-' 5 graphie le résidu sur gel de silice (chloroforme / méthanol / eau / triëthylami ne 15/10/2/0,2). Les fractions contenant le produit sont rassemblées et évaporées à sec. Le composé du titre est obtenu sous forme de sel de di-triëthylami ne-ami ne .

10 Rf = 0,5 (chloroforme / méthanol /acide acétique / eau 80/25/5/5).

Exemple 23 2-dëoxy-3-0-[(R)-3-hydroxytëtradécanoyl]-2-[(S)-3-hydroxytëtradëcanoylamido]-l-0-phosphono-a-D-glucopy-15 ranose a) 4,6-0-benzylidène-3-0-[[R^S-benzyloxytétradécanoyl]- 2- [[S^-3-benzyloxytétradëcanoylamido]-2-dêoxy-l-0-

Le composé est obtenu de manière analogue 20 à celle décrite à l'exemple 13a). Rf = 0,44 (toluène/ acétate d'éthyle 4/1).

b) 2-déoxy-3-0-[[R]-3-hydroxytêtradêcanoy]J-2-[(S]·- 3- hydroxytétradécanoylamido]-l-0-phosghono-a-D-_ gluc2gyran2se 25 Le composé est obtenu de manière analogue I celle décrite à l'exemple 13b). Rf = 0,5 (chlorure de méthylène / méthanol / ammoniaque 1/1/1, phase inférieure ).

D'autres caractéristiques des composés 30 ont été obtenus en spectroscopie de masse par bombardement d'atomes rapides (FAB) (ions négatifs) (Raetz, J. Biol. Chem. 259/4852 [1984]).

30

TABLEAU

Exemple No. Masse 1 1325 2 1324 3 1534 4 1323 5 1322 6 1325 7 1324 8 1323 9 1326 10 1292 11 1140 12 647 ’ ' 31 «

Frefliple No: Spectre RMN— 1 9.82 (d, 9 Hz, IH); 6.65 (dd£,8 et 3,5 Hz, IH); 6.25 (t, 10 Hz, IH); (C5D5N) 5.83 (t, 10 Hz, 1H); 5.63 (d, 8,8 Hz, 1H); 5.35 (dd,lQ et 2,5 Hz, 1H); 4.0 (t, 10 Hz, 1H); 3.83 (m 1H).

13 5.49 (dd,3,5 et 7,5 Hz, 1H); 5.24 (dd,9,5 et 10,5 Hz, 1H); «X> OD) 4,17 (ddd’ 2’5’3’5 et 10’5 H2> 1H)î 4,0 (m’ 3H)î 3,90 (dd’ 2 et 3 12 Hz, 1H); 3.75 (dd, 5,5 et 12 Hz, 1H); 3.71 (s, Tris); 3,63 (t, 10 Hz, 1H).

14 5.77 (dd,3,5 et 7,5 Hz, 1H); 4.77 (ddd, 2,5,3,5 et 10,5 Hi, (CDCW ih); 4.38 (dd,9,5 et 10,5 Hz); 3.8 à 4.1 (m, 4H); 3.73 (dd, ^3 } 5,5 et 12 Hz, 1H); 3.53 (t, 10 Hz, 1H).

15 5.71 (dd, 3,5 et 7,5 Hz, 1H); 5.48 (t, 10 Hz, 1H); 4.77 (ddd, 2, (CD3OD) 4 et 10 Hz, 1H); 3.9 à 4.05 (m, 3H); 3.86 (dd, 2 et 12 Hz, 1H); 3.7 (dd, 5,5 et 12 Hz, 1H); 3.67 (s, Tris); 3.58 (t, 10 Hz, 1H).

16 5.58 (dd,3 et 7 Hz, 1H); 5.22 (t, 10 Hz, 1H); 4.19 (dt, 3 et ^ Hz> ^ 4,1 ^H); 3.7 (s, Tris et d,d,lH); 3.46 3 (t, 10 Hz, 1H).

17 5.46 (dd,3 et 7 Hz, 1H); 5.22 (t, 10 Hz, IH); 5.17 (m, 1H); CDcSÎ 4,19 (<jt’ 3 Ä 10 Hz» 1H)î 3,9 â 4,1 (m» 3H)î 3,7 (s’ Tris)î 3 3.65 (dd, IH); 3.51 (t, 10 Hz, IH).

18/ étape a) 7.38 (m, 15H); 5.70 (dd, 3,5 et 6 Hz, IH); 5.63 (d, 9,5 Hz, ( protégé) IH); 5.50 (s, IH); 5.26 (t, 10 Hz, IH); 5.08 (m, 4H); 4.38 (m, (CDC13) m). 4.08 (dd, 5 et 10 Hz, IH); 3.95 (dt,5 et 10 Hz, IH); 3.73 (t, 10 Hz, IH); 3.69 (t, 10 Hz, IH); 2.29 (m, 2H); 1.89 (m, 2H).

32 19/étape a) 7.2 à 7.45 (m, 20H); 6.34 (d, 9 Hz, 1H); 5.77 (dd, 3,5 et '(protégé) 6 Hz, 1H); 5.49 (s, 1H); 5.29 (t, 10 Hz, 1H); 5.14 (quintet , v (CDCI3) 6 Hz, 1H); 5.0 (m, 4H);4,51 et 4.41 (AB, 12 Hz, 2H); 4.41 (m, 1H); 4.08 (dd,5 et 10 Hz, 1H); 3.95 (dt,5 et 10 Hz, 1H); 3.7 (m, 3H); 2,58 et 2.47 (ABX, 5,5,7,5 et 15,5 Hz, 2H).

20/étape a) 7.2 à 7.45 (m, 20H); 6.29 (d, 9 Hz, 1H); 5.74 (dd, 3,5 et (protégé) 6 Hz, 1H); 5.49 (s, 1H); 5.30 (t, 10 Hz, 1H); 5.0 (m, 4H); 4.52 (CDC13) et hA2 (AB> n H2j 2H); 4>44 1Hj, 4>Q3 (dd} s et 1Q Hz, 1H); 3.94 (dt, 5 et 10 Hz, 1H); 3.7 (m, 3H); 2.15 â 2.35 (m, 4H).

21/ étape a) 5.47 (dd, 3,5 et 7,5 Hz, 1H); 5.23 (dd, 9,5 et 10,5 Hz, 1H); (protégé) 4.I8 (ddd, 2,5, 3,5 et 10,5 Hz, 1H); 3.90 (m; 3H); 3.85 (dd, 2 (CD3OD) et 12 Hz, 1H); 3.72 (dd, 5,5 etl2 Hz, 1H); 3.68 (s, Tris); 3.61 (t, 10 Hz, 1H); 1.94 (s, 3H).

22/ étape a) 7.3 à 7145 (m, 15H); 5.92 (dd,3,5 et6,7 Hz, 1H); 5.60 (t,-9,5 ( protégé ) et 10 Hz, 1H); 5.48 (s, 1H); 5.02 à 5.22 (m, 6H); 4.95 (ddd, (αχ13} 2,5, 3,5 et 9,5 Hz, 1H); 4.10 (dd,4,5 et 10 Hz, 1H); 3.96 (ddd, 5,9 et 10 Hz, 1H); 3.67 (t, 9,5 Hz, 2H); 2.60 (m, 2H); 2.38 (d, 6,5 Hz, 2H); 2.24 (t, 7,5 Hz, 2H); 2.12 (t, 7,5 Hz, 2H).

23/ étape a) 7.2 à 7.42 (m, 25H); 6.49 (d, 9 Hz, 1H); 5.77 (dd, 3,5 et (protégé) 6 Hz, 1H); 5.45 (s, 1H); 5.35 (t, 10 Hz, 1H); 5.0 (m, 4H); 4.54 (CTCI3) et 4>40 (AB> u ^ 2H). 4}47et 4.36 (ab, u Hz, 2H); 4.45 (m, 1H); 3.9 bis 4.1 (m, 2H); 3.6 à 3.8 (m, 4H); 2.58 (dd, 6,5 ^ et 15,5 Hz, 1H); 2.34 (dd, 6 et 15,5 Hz, 1H); 2.2 (m, 2H).

Les composés utilisés comme produits de départ peuvent être obtenus comme suit : - 33 - A) 4,6-0-benz,ylidène-2-[(R)-3-benzy1 oxytétradécanoy1amido]-2-deoxy-l-O-dibenzylphosphono-a-D-glucopyranose (pour les exemples 13, 19 et 20) a) 2-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamido]-2-déoxy-D-glucopyranose 5 On agite pendant 24 heures à la température ambiante un mélange de 5,4 g de chlorhydrate de D-glucosamine, 10,8 g de N-[(R)-3-benzyloxytétradécanoyloxy]succinimide et 5 ml de diiso-propyléthylamine dans 25 ml de diméthylformamide sec. Le solvant est éliminé par distillation et le résidu est dissous dans un mé-10 lange de 150 g de chloroforme, 300 ml de méthanol et 120 ml d'eau. Après avoir ajouté une partie supplémentaire constituée de 150 ml de chloroforme et de 150 ml d'eau, on sépare la phase inférieure et on la lave deux fois avec la phase supérieure constituée de 100 ml de chloroforme, 100 ml de méthanol et 90 ml d'eau. On évapore la 15 solution et on la sèche sous vide poussé. On utilise le produit ainsi obtenu dans l'étape suivante sans autre purification.

A des fins d'analyse, on purifie par chromatographie (toluène/éthanol 9/1) une petite partie du produit à l'état brut, F = 150-158°.

20 [of|20 = +53° (c = 1,diméthylformamide)

Rf (chloroforme/méthanol 9/1) = 0,3.

b) 4,6-0-benzylidène-2-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylami do]-2- ^22^:9:912222^222222

Une solution de 5,83 g de 2-[(R)-3-benzyloxytétradécanoyl-25 amido]-2-déoxy-D-glycopyranose, 3 g de benzaldéhydediméthylacétal et 500 g de monohydrate d'acide p-toluène-sulfonique dans 200 ml de diméthylformamide anhydre est maintenue pendant environ 3 heures a 55-60° et sous 30-40 mbar dans un évaporateur rotatif. Il ne reste ensuite aucun produit de départ. On sépare la majeure partie 30 du diméthylformamide par distillation, on ajoute 500 ml de chlorure de méthylène et on extrait la solution deux fois avec 200 ml d'une solution diluée d'hydrogénocarbonate de sodium et 200 ml d'eau. On sèche la solution avec du sulfate de sodium, on l'évapore a sec et on chromatographie le résidu (toluène/acétate d'éthyle 6/4).

Ir * - 34 - F = 162-165°.

[α]£0 = +5,5° (c = 1, chloroforme)

Rf (toluène/acétate d'éthyle 1/1) = 0,2.

c) 4,6-0-benzy]idène-2-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamido]-2- A une solution de 4,86 g de 4,6-0-benzylidène-2-[(R)-3-benzyloxytétradécanoylamido]-2-déoxy-D-glucopyranose dans 40 ml de tétrahydrofuranne anhydre refroidie a -70°, on ajoute goutte à goutte 8 ml de butyllithium 1,6 M dans de l'hexane. Après 5 minutes 10 à cette température, on ajoute goutte a goutte une solution de 3,8 g de phosphorochloridate de dibenzyle dans 10 ml de benzène. Après avoir agité pendant 10 minutes a -70°, on ajoute 0,3 ml d'acide acétique et on concentre la solution à 1/4 de son volume initial. On dilue la solution avec 200 ml de chlorure de méthylène, 15 on l'extrait avec 50 ml d'eau, 50 ml d'une solution diluée d'hydro-génocarbonate de sodium et 50 ml d'une solution diluée de chlorure de sodium, on la sèche sur du sulfate de sodium et on l'évapore à sec. Le résidu est Chromatograph!é (toluène/acétate d'éthyle 7/3).

F = 102-105°.

20 [a]20 = +31,7° (c = 1, chloroforme)

Rf (toluène/acétate d'éthyle 1/1) 3 0,32.

B) 4,6-0-benzylidène-2,3-di-0-[(R)-3-benzylox.ytétradécanoyl ]-D-glucop.yranose (pour l'exemple 15) 25 A une solution refroidie avec de la glace et constituée de 2,34 g de penta-O-acétyl-D-glucopyranose dans 9 ml de trichloro-éthanol, on ajoute 0,9 ml de trifluoroéthérate de bore et on maintient la solution pendant 4 heures a cette température. La solution est ensuite versée sur 100 ml d'eau glacée, extraite avec 100 ml de 30 chlorure de méthylène, la phase organique est séparée, lavée avec 50 ml d'une solution d'hydrogénocarbonate de sodium et 50 ml d'eau, séchée sur du sulfate de sodium et évaporée a sec. Après purifica- - 35 - tion par chromatographie (gel de silice, toluène/acétate d'éthyle, 4/1), le produit est cristallisé' dans un mélange d'acétate d'éthyle/éther de pétrole.

F = 138-140°.

" 5 Rf (toluène/acétate d'éthyle 1/1) = 0,67.

b) trichloroéthyl-4,6-0-benzylid|ne-B-D-g]ucopyranoside_

On dissout 7,13 g de trichloroéthy1-2,3,4,6-tétra-0-acétyl-3-D-glucopyranoside dans un mélange de méthanol et de chlorure de méthylène, on refroidit la solution avec de la glace et 10 on fait réagir avec une solution de méthanolate de sodium (60 mg de sodium dans 26 ml de méthanol). Après 2 heures a 0°, la solution est neutralisée avec du Dowex AG 50 WX8 H+, les échangeurs d'ions sont filtrés et le solvant est évaporé sous pression réduite. On dissout le résidu dans 60 ml de benzaldéhyde, on ajoute 4,1 g de 15 chlorure de zinc et on agite le mélange pendant 10 heures a la température ambiante. On verse ensuite le mélange sur de l'eau glacée, on l'extrait avec de l'éther, on sèche la solution éthérée sur du sulfate de sodium et on l'évapore à sec. Le résidu est chromatogra-phié (gel de silice, toluène/acétate d'éthyle 4/1).

20 Rf (chloroforme/méthanol 9/1) = 0,60.

c) ÎLl2t)]9r2lÎhy]-4,6-0-benzylidène-2,3-di-0-[(R)^3-benzyloxy:_ A une solution constituée de 800 mg de trichloroêthyl- 4,6-0-benzylidène-B-D-glucopyranoside, 1,4 g d'acide (R)-3-25 benzyloxytétradêcanoïque et 20 mg de diméthylaminopyridine dans 10 ml de chlorure de méthylène refroidie a 0°, on ajoute 930 mg de dicyclohexylecarbodiimide et on maintient le mélange réactionnel à 4° jusqu'au lendemain. On filtre ensuite le mélange réactionnel, on évapore le filtrat a sec, on clissout le résidu dans un mélange 30 hexane/toluène/acétate d'éthyle (12/5/1) et on le chromatographie avec le même mélange de solvants.

Rf (hexane/acétate d'éthyle 5/1) = 0,52.

- 36 - d) 4,6-0:benzylidène:2,3:di-0:[(R)-3^ ^ g1ucopyranose

On dissout 480 mg de trichloroéthyl-4,6-0-benzylidène-v 2,3-di-0-[(R)-3-benzyloxy-tétradécanoyl]-B-D-glucopyranoside dans 5 50 ml d'un mélange de dioxanne et d'acide acétique (1/1) et on fait réagir par portions a la température ambiante avec de la poudre de zinc jusqu'à ce que le produit de départ soit entièrement consommé. On filtre le mélange réactionnel, on l'évapore à sec et on chromatographie le résidu (gel de silice, hexane/toluène/acétate 10 d'éthyle 2/5/1).

Rf (toluène/acétate d'éthyle 9/1) = 0,32.

C) 2-0-[(R)-3-benzyloxytétradécanoyl3-3-[(R)-3-benzyloxytétra- décanoylami do]-3-déox.y-4,6-0-i sopropyli dène-D-qlucopyranose (pour l'exemple 14) 15 a) azido-32déoxy-4,6-0-isopropylidène-D-glucopyr^

On dissout 1,02 g de 3-azido-déoxy-D-glucopyranose dans 10 ml diméthylformamide sec, on ajoute 940 μΐ de 2-mêthoxypropène et une quantité catalytique du monohydrate de l'acide p-toluène-sulfonique et on maintient la solution à la température ambiante 20 pendant environ 2 heures. On neutralise l'acide p-toluènesulfonique avec de 1'hydrogénocarbonate de sodium, onévapore la solution à sec et on chromatographie le résidu (gel de silice, chloroforme/ méthanol 9/1).

Rf (chloroforme/méthanol 9/1) = 0,64.

25 b) t6rt.-butyldiméthylsilyl-3-azido-3-déoxy-4,6-0; A une solution constituée de 560 mg de 3-azido-3-déoxy- 4,6-0-isopropylène-D-glucopyranose et de 310 mg d'imidazole dans.

25 ml de chlorure de méthylène sec, on ajoute 345 mg de chlorure de 30 tert.-butyldiméthylsilyle et on agite le mélange pendant 2 heures à la température ambiante. On filtre l'excès du chlorhydrate d'imidazole, on agite le filtrat deux fois avec 10 ml d'eau, on le sèche - 37 - sur du sulfate de sodium et on l'évapore à sec. Le résidu est chro-matographié (gel de silice, toluène/acétate d'éthyle 12/1).

Rf (toluène/acétate d'éthyle 1/1) = 0,6.

c) tert^-butyldlméthylsilyl^-O-ÇW-^-benzyloxytétradécanoyl ]- 5 3-L_(R)-3-benzyloxytêtradécano^lamido3-3;déoxy-4,6-0-

On hydrogène une solution de 3,1 g de tert.-butyldiméthyl-silyl-3-azido-3-déoxy-4,6-0-isopropylidene-ß-D-g1ucopyranoside dans 100 méthanol pendant 2 heures avec 300 mg de palladium a 10¾ sur 10 charbon. Le catalyseur est filtré et le filtrat est évaporé à sec. Le résidu est dissous avec 5,35 g d'acide (R)-3-benzyloxytétra-décanoïque et 100 ml de diméthylaminopyridine dans 50 ml de chlorure de méthylène sec. On refroidit la solution avec de la glace et on ajoute 4,1 g de dicyclohéxyl-carbodiimide.Après environ 15 3 heures à la température ambiante, la solution est filtrée, le solvant évaporé et le résidu chromatographie (gel de silice, toluène/acétate d'éthyle 9/1).

Rf (toluène/acétate d'éthyle 6/1) = 0,42.

d) 2-0-[(R)-3-benzyloxytétradécanoyl]-3-C(R)-3-benzyloxyté^ A une solution comprenant 5 g de tert.-butyldiméthyl-silyl-2-0-[(R)-3-benzyloxytétradécanoyl]-3-[(R)-3-benzyloxytétra-décanoylami do]-3-déoxy-4,6-0-i sopropyli dène-B-D-g1ucopyranosi de dans 100 ml de tétrahydrofuranne anhydre et refroidie a -60e, on 25 ajoute goutte a goutte 5,2 ml d'une solution de fluorure de tétra-butylammonium dans du tétrahydrofuranne. On laisse monter la température de cette solution à -40° et on la maintient à cette température jusqu'à disparition du produit de départ (environ 30 minutes). On ajoute ensuite 5 ml de méthanol, on fait chauffe jusqu'à 30 la-température ambiante et on évapore le solvant. On extrait le résidu avec un mélange de chlorure de méthylène et d'eau, on sèche la phase organique sur du sulfate de sodium et on évapore le sol- 3 * - 38 - vant. Après purification par chromatographie (gel de silice, toluène/acétate d'éthyle 3/1), on obtient le composé du titre sous forme d'un mélange d'anomères.

Rf (toluène/acétate d'éthyle 1/1) = 0,48 et 0,52.

5 0) 4,6-0-benz.ylidène-2-[(S)-3-benz.yloxytétradécanoyl]-2-déox,y-l- O-dibenzylphosphono-ot-D-glucopyranose (pour l'exemple 16) a) 2-[(S)-3-benzy]oxytétradécanoylamido]-2:déoxy=D-glucopyranose

On obtient le composé du titre en procédant de manière analogue à celle décrite à l'exemple Aa).

10 Rf (chloroforme/méthanol 7/1) = 0,37.

b) 4,6-0-benzy]idène-2-[(S)-3-benzyloxytétradé^

On obtient le composé du titre en procédant de manière analogue a celle décrite à l'exemple Ab).

15 [a]20 = -3}5° (c = 1, chloroforme).

Rf (toluène/acétate d'éthyle 1/1) = 0,37.

c) 4,6-0-benzylidène-2-[(S)^3-benzyloxytêtradécanoylamido]-2- déoxy-l-O-di benzylphosphono-a-D-glucopyranose

On obtient le composé du titre en procédant de manière 20 analogue a celle décrite a l'exemple Ac).

[a^20 = +39,2° (c = 1, chloroforme).

Rf (toluène/acétate d'éthyle 1/1) = 0,46.

E) 4,6-0-benzylidène-2-déoxy-l-Q-dibenzylphosphono-2-[(R)-3-tétradécanoyloxytétradécanoylamido]-a-D-glucopyranose (pour 25 l'exemple 17) a) 2-déoxy;2-Ç(RM;;tétradécanoyloxytétradécanoylamifo^ glucose

Un mélange composé de 650 mg de chlorhydrate de D-glucosamine, 1,9 g de N-[(R)-3-tétradécanoyloxytétra-30 décanoyloxyüsuccinimide et 0,5 ml de diisopropyléthylamine dans 15 ml de diméthylformamide est agité pendant 20 heures a la température ambiante. Le solvant est ensuite éliminé par distillation et le résidu est chromatographié sur gel de silice avec un 3 - 39 - mélange acétate d'éthyle/méthanol (8/1) comme éluant.

[a]20 = +25° (c = 1, méthanol).

Rf (acétate d'éthyle/méthanol 6/1) = 0,5.

b) 4,6-0:benzylidène-2:déoxy-2:Ç(R):3-tétradécanoy^ 5 décanoylamido]-D-glucopyranose

Une solution composée de 5,83 g de 2-déoxy-2-[(R)-3-tétra-décanoyloxytétradécanoylamido]-D-glucose, 3 g de benzaldéhyde-diméthylacétal et 500 mg de monohydrate de l'acide p-toluène-sulfonique dans 200 ml de diméthylformamide sec est maintenue pen-10 dant 3 heures a 55-60° et sous 30-40 mbar dans un êvaporateur rotatif. Le produit de départ a alors disparu. On distille ensuite la majorité du diméthylformamide, on ajoute 500 ml de chlorure de méthylène et on extrait la solution deux fois avec 200 ml d'une solution diluée d'hydrogénocarbonate de sodium et 200 ml d'eau.

15 Après séchage sur sulfate de sodium et évaporation, le résidu est Chromatograph!é (toluène/acêtate d'éthyle 6/4). F = 162-165°.

[a]20 = -1,5° (c = 1, chloroforme/méthanol 1/1).

Rf (toluène/acétate d'éthyle 1/1) = 0,32.

c) 456-0-benzylidène-2-déoxy-l-0-dibenzylphosphono-2-[(R)-3- 20 2x-yïêtr ad éc ano^l ami d ° ]-ot- D-g 1 uçopy r ano s e A une solution constituée de 950 mg de 4,6-0-benzylidène- 2-déoxy-C(R)-3-tétradécanoyloxytétradécanoylamido]-D-glucopyranose dans 40 ml de tétrahydrofuranne sec et refroidie à -40°, on ajoute goutte à goutte 1,25 ml de butyllithium 1,6 M dans de l'hexane.

25 Après 5 minutes, on ajoute une solution de pbosphorochloridate de di-benzÿle dans du benzène et on continue d'agiter pendant 5 minutes a la meme température. On neutralise ensuite la solution avec de l'acide acétique, on évapore le mélange à sec et on extrait le résidu avec du chlorure de méthylène et de l'eau. On sèche la phase organique 30 sur du sulfate de sodium, on l'évapore a sec et on chromatographie le résidu sur du gel de silice (toluène/acêtate d'éthyle 3/1).

[a]20 = +19,3° (c = 1, chloroforme).

Rf ftoluène/acétate d'éthyle 1/1) = 0,6.

- 40 - F) 4,6-0-benz.ylidène-2-déoxy-l-0-dibenz.ylphosphono-2-tétra-décanoylamido-ot-D-glucopyranose (pour l'exemple 18) a) 2-déoxy-2-tétr adêcanoylami do-D-glucose

Un mélange composé de 3 g de chlorhydrate de D-gluco-5 samine, 4,56 g de N-tétradêcanoyloxysuccinimide et 2,8 ml de άτι sopropyléthyl amine dans 40 ml de diméthylformamide sec est maintenu à la température ambiante durant 24 heures. Le produit est ensuite filtré, lavé avec du diméthylformamide et de l'eau, séché sous vide et utilisé pour l'étape suivante sans autre purification. 10 b) 426-03benzylid|ne-2=déoxy-2-tétradécanoyl^ido-D-g]uco

On dissout à 55° 4 g de 2-déoxy-2-tétradécanoylamido-D-glucose dans 320 ml de diméthylformamide sec, on ajoute 2,6 ml de diméthoxytoluène et 400 mg de monohydrate de l'acide p-toluène-sulfonique et on maintient le mélange dans un évaporateur rotatif 15 pendant 4 heures à 55-60° et sous 30-40 mbar. Le solvant est ensuite distillé, le résidu est lavé avec une solution diluée d'hydrogênocarbonate de sodium, de l'eau et de l'éthanol, séché sous vide et utilisé directement pour l'étape suivante, c) 4a6-0-benzy1idène-3-0-(tert^-buty1dimethy1si2y22~2-déoxy-2- 20 tétradécanoylamido-D-glucopyranose

On dissout à 60° 2,2 g de 4,6-0-benzylidène-2-déoxy-2-tétradécanoylamido-D-glucose dans 250 ml de diméthylformamide sec, on ajoute 960 mg d'imidazole et 2,13 g de tert.-butyldiméthyl-chlorosilane et on maintient le mélange réactionnel a la meme tem-25 pérature pendant 24 heures. Après addition de 480 mg d'imidazole et 1 g de tert.-butyldiméthylchlorosilane et 24 heures de plus a 60°, * le produit de départ a complètement disparu. Le solvant est séparé par distillation, le résidu est extrait avec du chlorure de méthylène et de l'eau, la phase organique est lavée une fois avec 30 de l'eau, séchée sur du sulfate de sodium et distillée. Le résidu est chromatographié sur du gel de silice avec un gradient toluène/acétate d'éthyle (20/1 a 2/1). On obtient deux fractions principales: le composé du titre (650 mg) et le composé 1,3-bis- - 41 - silylique correspondant (1,82 g). On dissout le composé 1,3-bis-silylique dans 25 ml de tétrahydrofuranne sec, on refroidit la

V

solution a -40° et on ajoute goutte à goutte 2,5 ml d'une solution IN de fluorure de tétrabutylammonium dans du tétrahydrofuranne.

5 Après environ 1 heure à -40°, le groupe protecteur du groupe silyle anomère est éliminé. On ajoute 3 ml de méthanol, on chauffe jusqu'à la température ambiante et on élimine le solvant sous vide. Le résidu est extrait avec du chlorure de méthylène et de l'eau, la phase organique est extraite une fois avec de l'eau, puis elle est 10 séchée et distillée. On obtient une quantité supplémentaire de 1,52 g du composé du titre sous forme d'un mélange anomère.

Rf (toluène/acétate d'éthyle 1/1) = 0,42.

d) 4A6-0-benzy]id§ne-3-0-(terti=but^ldiméthy2§ilyl)z?z^i25^zîz9z ^]^êD?ylB!39§Pb2D9:2:yîL^|çanoylamido-a-D-glucopyranose 15 A une solution composée de 2,46 g de 4,6-0-benzylidène-3- 0-(tert.-butyld i méthylsi 1yl)-2-déoxy-2-tétradécanoylami do-D-gluco-pyranose dans 100 ml de tétrahydrofuranne sec et refroidie à -60°, on ajoute goutte à goutte 3,12 ml de butyllithium 1,6 M dans de Vhexane. Après 5 minutes à cette température, on ajoute goutte à 20 goutte une solution de phosphorochloridate de dibenzyle dans du benzène. On maintient sous agitation à -60° pendant encore 5 minutes, puis on neutralise la solution avec de l'acide acétique et on l'évapore à sec. Le résidu est repris dans du chlorure de méthylène et extrait avec de l'eau. Après traitement et chromato-25 graphie sur gel de silice avec un mélange toiuène/acétate d'éthyle (3/1) comme êluant, on obtient le composé du titre.

Rf (toiuène/acétate d'éthyle 7/4) = 0,75.

e) 4,6-02benzylidène-2-déoxy-l20-dibenzylphosphono-2-tétra-décanoylamido-a-D-glucopyranose 30 A une solution refroidie à -10° et constituée de 2,05 g de 4,6-0-benzylidène-3-0-(tert.-butyldiméthylsilyl)-2-déoxy-l-0-dibenzylphosphono-2-tétradécanoylamido-a-D-glucopyranose dans 40 ml de tétrahydrofuranne anhydre, on ajoute goutte à goutte 2,5 ml - 42 - d'une solution IN de fluorure de tétrabutylammonium dans du tétra-hydrofuranne et on maintient sous agitation pendant 2 heures a 0°. On ajoute ensuite 3 ml de méthanol, on évapore la solution à sec et on extrait le résidu avec du chlorure de méthylène et de l'eau.

5 Après traitement selon les méthodes habituelles et chromatographie sur gel de silice avec un mélange toluène/acétate d'éthyle (3/2) comme éluant, on obtient le composé du titre.

Rf (toluène/acétate d'éthyle 1/1) = 0,35.

G) 2-acétamido-4,6-0-benzylidène-2-déoxy-l-0-dibenzylphosphono-10 oi-D-glucopyranose (pour l'exemple 21)

a) 2-acétamido:4,6-0-benzylidène-3-M

üC0P^raD9fe

Une solution constituée de 5,17 g de 2-acétamido-4,6-0-benzylidène-2-déoxy-D-glucopyranose, 3,4 g d'imidazole et 6,3 g de 15 tert.-butyldiméthylchlorosilane dans 300 ml de diméthylformamide est maintenue a 60-70°. Après 6 heures, on ajoute 500 mg d'imidazole et 1 g de tert.-butyldiméthylchlorosilane et on maintient le mélange à la même température jusqu'à ce que la réaction soit terminée. Le solvant est évaporé, le résidu est extrait avec du 20 chlorure de méthylène et de l'eau et purifié par chromatographie avec un mélange toluène/acétate d'éthyle (5/1). Pour l'élimination du groupe tert.-butyldiméthylsilyle anomère, on dissout le produit dans 600 ml de tétrahydrofuranne sec, on refroidit la solution à -40° et on ajoute 14 ml d'une solution IN de fluorure de 25 tétrabutylammonium. Après 10 minutes, on arrête la réaction en ajoutant 17 ml de méthanol. On évapore le mélange à sec, on reprend le résidu dans du chlorure de méthylène et on l'extrait avec de l'eau. On sèche la phase organique et on distille le solvant.

Rf (chloroforme/méthanol 9/1) = 0,5.

- 43 - b) 2-acétamido-4,6-0^benz^]idène-3-0-(tert.-butyldiméthylsilyl)- » 2:!l22XY:l:9:d!k§D?ylP!]22P!]929:9::0:9ly22Py22222e

On obtient le composé du titre en procédant de manière analogue à celle décrite à l'exemple Ec) et après chromatographie 5 avec un mélange toluène/acétate d'éthyle (1/1) comme éluant.

Rf (toluène/acétate d'éthyle 2/1) = 0,58.

c) 2-acétamido-4,6-0-benzylidène-2-^^ a-D-glucopyranose A une solution refroidie par de la glace et composée de 10 4,4 g de 2-acétamido-4,6-0-benzylidène-3-0-(tert.-butyldiméthyl- silyl)-2-déoxy-l-0-dibenzylphosphono-a-D-glucopyranose dans 200 ml de tétrahydrofuranne sec, on ajoute goutte a goutte 6,5 ml d'une solution IN de fluorure de têtrabutylammonium dans du têtrahydro-furanne et on maintient le mélange pendant 2 heures a 0e. On ajoute 15 ensuite 7 ml de méthanol et on évapore la solution à sec. Une solution du résidu dans du chlorure de méthylène est lavée avec de l'eau, séchée et évaporée a sec.

Rf (chloroforme/méthanol 9/1) = 0,65.

H) 4,6-0-benzylidène-2,3-di-0-[(R)-3-tétradécano.ylox.ytétra-20 décanoyl]-D-glucopyranose (pour l'exemple 22) a) trichloroéthyl-^e-O-benzylidène^^S-di-O-Ç^Rl-S^têtra- ^22222^ΐ2:!^:ί:2Ϊ22θ22222^13:§:9:9ΐ222Ρ^Γ222§1ί!2

On obtient le composé du titre en procédant de manière analogue a celle décrite a l'exemple Bc) en utilisant l'acide 25 (R)-3-tétradécanoyloxytétradécanoïque comme agent d'acylation et un mélange toluène/acétate d'éthyle comme éluant.

Rf (toluène/acétate d'éthyle 9/1) = 0,75.

b) 4,6-0-benzy]idène-2,3-dÎ-0-[(R)-3-tét^ · 022229^13:0:912222^222222 30 On obtient le composé du titre en procédant de manière analogue à celle décrite a l'exemple Bd) après purification par chromatographie sur gel de silice en utilisant un mélange toluène/acétate d'éthyle (15/1) comme éluant.

Rf (toluène/acétate d'éthyle 9/1) = 0,25.

►/ * - 44 - I) Synthèse des UDP-2,3-diacy1-hexoses

On dissout 1,4 g de sel d'uridine-5'-phosphoro-

Ufi morpholidate-N,N'-dicyclohéxylcarboxamidine dans 25 ml de pyridine anhydre et on sèche deux fois par évaporation et par redissolution 5 dans 25 ml de pyridine anhydre. A cette solution, on ajoute une solution composée de 1 g de 2,3-diacyl-hexose-l-phosphate dans 25 ml de pyridine et qui a été préalablement traitée de la même manière, on maintient le mélange a 37° pendant 24 heures, puis on le refroidit avec de la glace. On ajoute ensuite 50 ml de chloroforme et 10 12 ml d'acide formique a 90%. On chromatographie cette solution sur gel de silice et on élue le produit de départ qui n'a pas réagi avec un mélange chloroforme/pyridine/acide formique à 90% (30/30/7). On lave la colonne avec un mélange chloroforme/ méthanol (9/1) pour la débarasser de la pyridine et on élue le 15 dérivé UDP avec un mélange chloroforme/méthanol/eau (66/33/4).

On évapore sous vide le chloroforme et le méthanol de la fraction pic et on filtre la suspension aqueuse restante. On dissout le précipité dans 100 ml d'un mélange tétrahydrofuranne/eau (2/1) et on agite la solution pendant 2 heures avec du Dowex AG50WX8 [sous 20 une forme tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane]. On filtre l'échangeur d'ions, on élimine le tétrahydrofuranne par distillation et on lyo-phylise la solution aqueuse. Le lyophylisat est utilisé dans l'étape suivante sans autre purification.

Les composés de formule II peuvent être obtenus de ma-25 nière analogue à celle décrite sous I), a partir des composés de formule III correspondants.

Les composés de formule la et III se signalent par d'intéressantes propriétés pharmacologiques et peuvent par conséquent être utilisés en thérapeutique comme médicaments. Ils exercent une 30 influence favorable sur la résistance microbienne non spécifique. Cette activité peut être mise en évidence par exemple dans les essais suivants.

s - 45 - υ 1. Détermination de l'activité endotoxique a l'aide du test LAL au litnulus (lysat d'amibocytes de limulus) L'endotoxine catalyse l'activation d'un proenzyme dans le lysat d'amibocytes de limule. On mesure la scission de p-nitro-5 aniline à partir d'une substance incolore. Le taux d'élimination est détecté photométriquement, la corrélation entre l'absorption et la concentration d'endotoxine (ou bien, respectivement, l'activité endotoxique pour les analogues) étant linéaire dans le domaine de 0,01 à 0,1 ng/ml d'endotoxine(comparai son avec les valeurs d'ab-10 sorption d'une endotoxine standard). A partir de chaque échantillon (dissous dans de l'eau bidistiliée stérile et exempte de pyrogène), on prépare une dilution en série 1:10. A 100 pi d'un échantillon d'essai ou bien d'un échantillon standard de référence ou d'un échantillon a blanc, on ajoute 100 pl de lysat d'amibocytes de 15 limule. Après 10 minutes d'incubation à 37eC, on ajoute 200 pl de substrat au mélange réactionnel. On arrête la réaction avec 200 pl d'acide acétique à 50% après 3 autres minutes d'incubation. Après agitation de l'échantillon, on mesure l'absorption a 405 nm avec un spectrophotomètre en soustrayant la valeur de base. On calcule les 20 teneurs en endotoxine (activité endotoxique) de l'échantillon en unités endotoxine (UE) par régression linéaire avec les valeurs de l'endotoxine standard.

2. Induction du choc a l'endotoxine chez la souris L'essai consiste à induire un choc a l'endotoxine ou une 25 condition clinique létale analogue au moyen de substances apparentées au LPS chez des souris sensibilisées à la galactosamine (GalN). On administre par voie intrapéritonéale a des souris mâles C57 bl. (6 animaux par groupe) simultanément 8 mg de GalN dissous dans 0,5 ml de PBS et 0,1 pg de LPS de Salmonella abortus equi 30 (Sigma) dissous dans 0,2 ml d'une solution saline physiologique. Ce traitement tue tous les animaux en l'espace de 6 a 12 heures [voir C. Galanos et coll., Proc.Natl.Acad.Sei., USA 76 (1979) 5939-5943]. A la place du LPS dans le traitement standard, les substances à essayer sont administrées a des doses variées simulta-35 nêment avec la GalN, ou par voie parentérale ou orale avant ou - 46 - après Te traitement a la GalN. On évalue les résultats en comparant les doses les plus faibles qui sont létales pour tous les animaux d'un groupe, ou en calculant la DL50 selon la méthode Spearman-Kärber.

5 3. Septicémie microbienne chez la souris neutropénique

Ce modèle permet de déterminer un accroissement de la réponse immunitaire provoquée par la substance chez une souris neutropénique, infectée par des microbes. Pour induire la neutropénie, on administre en une fois par voie sous-cutanée 200 mg/kg de cyclo-10 phosphamide dissous dans 0,2 ml d'eau distillée, au jour 0, à des groupes de 20 souris femelles BgD2Fi. Au jour 3, on administre la substance a essayer par voie parentérale (principalement par voie intrapéritonéale) ou par voie orale, si possible dissoute dans une solution physiologique du chlorure de sodium, ou bien dissoute 15 d'une autre manière (0,3 ml). On provoque l'infection au jour 4 en injectant par voie intraveineuse 1'inoculât approprié dans un volume de 0,2 ml (nombre de germes par souris: par exemple Pseudomonas aeruginosa 12:1 x 10^; E. coli Δΐ20:2 x 106;

Staph. aureus Δ. 113:1 x 10^; Candida albicansΔ 124:1 x 104. Les 20 animaux sont observés jusqu'au jour 10 a partir de l'infection et on enregistre chaque jour le nombre d'animaux morts. Les paramètres suivants sont calculés par rapport aux témoins infectés ou par rapport aux standards: a) durée moyenne de survie 25 b) taux de survie.

Après administration par voie parentérale, les composés de formule la et III améliorent nettement la durée et le taux de survie par rapport aux témoins infectés non soignés, aussi bien dans le cas d'infections expérimentales provoquées par des agents a gram 30 négatif (par exemple les souches Pseudonomas et E. coli), que dans le cas d'infections provoquées par des agents à gram positif (par exemple les souches Staph. aureus) ou des levures (par exemple la souche Candida albicans).

- 47 - « 4. Activation du métabolisme d'oxydation des neutrophiles sanguins humains

On incube à 37°C des neutrophiles (purs à 95¾ au moins) ,s avec la substance d'essai a 3 différentes concentrations pendant 1 5 a 2 heures. La libération d'anions superoxydes par les cellules témoigne de leur activation et est mesurée par l'inhibition de la superoxyde-dismutase qui catalyse la réduction du cytochrome C. On ajoute 1 x 106 neutrophiles préalablement traités ou non par la substance a essayer a une solution contenant du cytochrome C (80 10 jjMoI), ainsi que de la formylméthionylleucylphénylalanine (10“6m). Les témoins contiennent en outre 50 pg de superoxyde-dismutase. Après 15 minutes d'incubation à 37°C, on arrête la réaction en refroidissant les tubes a essai dans un bain de glace. On centrifuge ensuite ces tubes à 400 g pendant 5 minutes pour élimi-15 ner les cellules. La réduction du cytochrome C, qui est proportionnelle a la quantité d'anion superoxyde libéré, est mesurée par pho-tomêtrie a 550 nm. L'effet inhibiteur de la substance à essayer sur l'activation du PMN par le LPS est mesuré comme décrit ci-dessus, excepté qu‘après la prêincubation des leucocytes, on continue d'in-20 cuber les cellules avec une concentration stimulante de LPS.

5. Essai de clairance au carbone

Cet essai est fondé sur le principe selon lequel les particules d'une dimension comprise entre 200 et 250 A, par exemple des particules du carbone, ne peuvent être éliminées de l'organisme 25 que par phagocytose par des macrophages. Après administration par voie intraveineuse de particules de carbone, celles-ci sont éliminées de la circulation sanguine par phagocytose des macrophages dans le foie (cellules étoilées de Kupffer) et dans la rate. On détermine l'activation RES d'une substance en l'administrant une 30 seule fois ou de façon répétée en solution aqueuse ou sous forme de suspension. Les substances a essayer sont administrées par voie intrapéritonéale ou sous-cutanée à raison de 4 doses quotidiennes ou en une fois 24 heures avant le début de l'essai. On dilue une suspension contenant 10% de noir de carbone avec une solution géla-35 tineuse de chlorure de sodium a 1% jusqu'à une teneur en carbone * - 48 - de 16 mg/ml. On injecte à chaque souris par voie intraveineuse 0,2 ml par 20 g de poids corporel. On recueille 25 pi de sang par . ponction dans le plexus orbital 3, 6, 9, 12 et 15 minutes après l'administration par voie intraveineuse. On hémolyse le sang dans 5 2 ml d'eau distillée. On détermine par photométrie la concentration de carbone. On sacrifie ensuite les animaux et on calcule le poids du foie et de la rate.

6. Infection herpétique (souris) L'infection herpétique par voie intra-cutanée permet de 10 déterminer l'augmentation de la réponse immunitaire provoquée par une substance chez les souris contaminées par des virus herpétiques. L'évolution de la maladie est prolongée et permet d'observer l'apparition successive de plusieurs paramètres. Les lésions herpétiques apparaissent a l'endroit de l'infection et ensuite corn- -15 mencent a s'ulcérer. Eventuellement, on observe une paralysie de la patte adjacente à l'infection, cette paralysie évoluant progressivement jusqu'à la mort. Des souris nudes immunocompétentes sont infectées par voie intracutanée au jour 0 par administration intra-cutanée de T inoculât dans un volume de 0,025 ml (par exemple 20 1 x 106 unités formant plaque d'Herpès simplex type 1 / par sou ris). La substance a essayer est administrée par voie intrapéritonéale dans une solution, par exemple dans une solution saline physiologique (0,1 ml).

L'infection herpétique systémique permet également la 25 détermination d'une augmentation de la réponse immunitaire provoquée par une substance chez les souris infectées par un virus herpétique. Des souris NMRI immunocompétentes sont infectées au jour 0 par administration intrapéritonéale de 1'inoculât dans un volume de 0,1 ml (par exemple 1,3 x 10^ unités formant plaque d'Herpès 30 simplex type 1 / par souris). La substance a essayer est administrée par voie sous-cutanée dans une solution, par exemple une solution physiologique de chlorure de sodium.

•3 - 49 -

On observe les animaux d'essais jusqu'au jour 20 après l'infection et on enregistre l'apparition de lésions, de paralysie ainsi que les animaux morts. On mesure et on compare les paramètres suivants avec les témoins infectés ou un standard: ~ 5a) nombre de souris présentant des lésions (cumulativement) b) nombre de souris atteintes de paralysie (cumulativement) c) durée moyenne de survie d) taux de survie.

Dans l'infection HSV-1 expérimentale, les composés de for-10 mule la et III produisent une amélioration marquée au niveau de l'évolution de la maladie, de la durée de survie et du taux de survie par rapport aux témoins non traités. Ces effets sont observés après une seule administration par voie intrapéritonéale ou sous-cutanée entre les jours 0 ou -1 et +6.

15 7. Induction de CSF (facteur stimulateur de colonie)

Les CSF sont des médiateurs produits par l'organisme à la suite d'infections ou en réponse a des toxines. Leurs effets biologiques sont complexes; ils sont détectés par l'intermédiaire de la stimulation de la prolifération du système hémopoïétique, en parti-20 culier des cellules de la moelle osseuse. On administre à des souris BgD2Fi la substance a essayer une ou plusieurs fois par voie parentérale ou orale, à des doses allant jusqu'à 50 mg/kg. On recueille le sérum des animaux à différents intervalles. Les titres de l'activité CSF du sérum sont déterminés dans un essai de culture 25 cellulaire comme taux de prolifération de cultures de moelle osseuse provenant de souris B6D2F1 Cv°ir 0- Metcalf, The Hemopoietic Colony Stimulating Factors, (1984), Elsevier; T. Mosmann, O.Immunol.Methods, 65 (1983) 55-63; L.M. Green et col!., J.Immunol.Methods, 70 (1984) 257-268].

30 Les composés de formule la et III induisent chez la souris la formation des CSF à différents degrés, des différences cinétiques dans les activités CSF étant également observées. Ces différences peuvent présenter des avantages dans l'utilisation en thérapeutique.

- 50 - 8. Induction d1Interleukine-1 (IL-1) L'aptitude d'une substance a stimuler les cellules a produire IL-1 est déterminée dans des essais de culture de tissus. Les ** macrophages résidents ainsi que les macrophages libérés par le 5 thioglycolate sont tout d'abord récupérés sous forme de macrophages adhérents. Ceux-ci sont incubés dans un milieu RPMI pendant 48 heures avec diverses concentrations de la substance à essayer et les cellules surnageantes sont recueillies. L'activité IL-1 de ces cellules est mise en évidence dans des cultures de thymocytes pro-10 venant de souris C3H/HeJK. On induit les cellules surnageantes contenant IL-1 produit par les macrophages à faire proliférer les thymocytes pendant une période d'incubation de 72 heures. On mesure la prolifération par incorporation de 3H-thymidine a l'aide d'un compteur a scintillation [voir J. Gery et coll., J.Exp.Med. 136 15 (1972) 128-142; J. Oppenheim et coll., Cellular Immunol. 50 (1980) 71-81].

Les composés de formule la et III possèdent à des degrés divers (concentrations de Tordre de 0,1 a 50 pg/ml) la capacité d'induire la production de IL-1 dans les macrophages.

20 9. Induction de la tolérance (tolérance de l'effet létal) au LPS

(endotoxine)

Une tolérance de ce type peut être induite chez des souris par administration parentérale de LPS, une à trois fois par jour. Cette tolérance protège l'animal contre l'effet létal du LPS après 25 administration de galactosamine (voir plus haut sous "Induction du choc a l'endotoxine chez la souris").

Les composés de formule la et III assurent déjà cette tolérance après administration par voie intrapéritonéale a une dose unique de 0,25 mg/souris. Les souris préalablement traitées (toié-30 rantes) sont soumises a une provocation au LPS a une dose de 0,01 jjg de LPS + 8 mg de galactosamine/souris, administrée par voie intrapéritonéale a des périodes diverses (de 1 jour à 3 semaines) après le dernier traitement. Un plus grand nombre d'animaux survit a cette provocation au LPS, en particulier après administration 35 répétée (3 fois), par rapport aux animaux témoins non traités préalablement et soumis a la provocation.

- 51 -

Les composés de formule la et III possèdent en outre une activité anti-inflammatoire, en particulier dans les inflammations non spécifiques, dans les inflammations induites immunologiquement, dans les inflammations induites par hypersensibilité ainsi que dans v 5 les réactions allergiques. Cette activité peut être mise en évi dence au moyen de diverses méthodes d'essai, par exemple en étudiant l'influence de ces composés sur la synthèse des prostaglandines in vivo et in vitro. On a examiné l'inhibition exercée in vitro sur la libération de PGE2 et de PGFi induite par le LPS et le 10 Zymosan. On incube pendant 24 heures des leucocytes péritonéaux stimulés par le thioglycolate, provenant de souris NMRI, avec du LPS ou la substance à essayer. Après changement de milieu et triple lavage des cellules, ces dernières sont stimulées pendant 2 heures avec du LPS ou pendant 1 heure avec du Zymosan. Les PGE2 et les 15 PGFi sont déterminées dans les cellules surnageantes. On constate une inhibition de la production de PGE2 stimulée par le LPS ou le Zymosan.

On a mesuré in vivo l'inhibition exercée par les composés sur la libération de PGE2 induite par le LPS dans les leucocytes 20 péritonéaux de souris. Des groupes de 3 souris NMRI sont traités par voie intrapéritonéale aux jours 1, 2 et 3 avec du LPS ou avec la substance à essayer. Au jour 4, on administre par voie intrapéritonéale aux animaux d'essais ainsi qu'aux animaux témoins 1,5 ml de thioglycolate; au jour 7, on recueille les leucocytes 25 péritonéaux et on les stimule avec du LPS. On constate une nette diminution de la libération de PGE2 par rapport aux animaux témoins.

Dans un autre essai, on a mesuré l'influence des composés sur l'activité procoagulante (PCA). Après stimulation avec du LPS, ** 30 ’ les cellules endothéliales humaines synthétisent la PCA, ce qui * peut être mis en évidence par une réduction du temps de coagula tion du plasma. Les macrophages péritonéaux de souris obtenus après traitement au LPS ainsi que les leucocytes péritonéaux (prélevés sur des lapins) après libération de la réaction de Schwartzman 35 généralisée, réduisent eux aussi la durée de coagulation du plasma - 52 - « recalcifié. Pour déterminer l'influence de la PCA induite par le LPS in vitro, on traite pendant toute une nuit des leucocytes péri-tonéaux de souris B5D2F1 stimulés par du thioglycolate soit unique-** ment avec du LPS, soit avec du LPS et la substance a essayer, dans 5 un milieu DMEM dépourvu de sérum foetal de veau (FCS) (essai a)). Dans un essai b), on traite des leucocytes péritonéaux de souris pendant 24 heures avec du LPS ou avec la substance a essayer. Après changement de milieu, on stimule les cellules pendant une nuit entière avec du LPS. On détermine le temps de coagulation du plasma 10 humain recalcifié de contrôle en utilisant la méthode de Häkchen après avoir ajouté une suspension de leucocytes péritonéaux de souris qui a été auparavant congelée a plusieurs reprises et traitée aux ultrasons.

L'addition de la substance ä essayer réduit la PCA provo-15 quée par le LPS par rapport aux valeurs témoins, comme il résulte de l'augmentation du temps de coagulation. De même, un traitement préalable avec la substance ä essayer a pour résultat une réduction de la PCA.

In vivo, l'influence de la PCA induite par le LPS dans les 20 leucocytes péritonéaux de souris après traitement préalable avec la substance a essayer peut être démontrée comme suit: des souris b6d2f1 sont traitées par voie intrapéritonéale aux jours 1, 2 et 3 avec du LPS ou avec la substance à essayer. Au jour 3, tous les animaux reçoivent en plus 1,5 ml de thioglycolate par voie intra-25 péritonéale. Au jour 6, on recueille les leucocytes péritonéaux, on règle l'échantillon provenant de chaque animal a 1 x 106 cel-lules/ml, et on les stimule pendant 24 heures avec du LPS dans un milieu DMEM exempt de FCS. La PCA de ces cellules est déterminée selon la méthode décrite précédemment. Un traitement préalable au 30 LPS ou avec la substance à essayer, provoque une réduction marquée de la PCA. On observe une réduction semblable chez le lapin. La PCA des leucocytes péritonéaux de lapin peut être réduite après réaction de Schwartzman généralisée, et par traitement préalable avec le LPS ou la substance à essayer.

T

- 53 - c

Pour étudier l'inhibition de la réaction de Schwartzman locale, des groupes de 3 lapins chinchilla sont traités préalablement par voie intraveineuse ou intrapéritonéale avec du LPS ou avec * la substance à essayer, aux jours 1, 2 et 3. Le 6ème jour, on admi- v 5 nistre par voie intradermale 40, 20, 10, 5, 2,5 et 1,25 pg de LPS.

Le 7ème jour, on déclenche la réaction avec 2 pg de LPS/kg par voie intraveineuse. L'essai est évalué semi-quantitativement par un examen des nécroses de la peau. On constate une inhibition pratiquement totale de la réaction de Schwartzman après traitement préa-10 labié avec du LPS ou avec la substance a essayer.

Les composés de formule la et III possèdent en outre une activité contre les tumeurs, comme cela a été mis en évidence dans les essais suivants.

1. Induction du facteur de nécrose tumorale (TNF) 15 Dans le but de stimuler les macrophages de la moelle os seuse chez la souris, on dilue des cellules de moelle osseuse prélevées sur des souris BDFi (âgées d'environ 10 a 13 jours, induites avec du CSF) de façon a obtenir 1 x 106 cellules/ml dans un milieu [RPMI 1540 + 1% Pen/Strep (5000 U/ml) + 1% glutamine] et on incube 20 pendant 4 heures à 37°C/5% CO2 dans des microplaques plates avec la substance a essayer dans une solution dont la concentration finale (étapes de dilution 1:10) est de l'ordre de 100 pg à 0,1 pg/ml. Après filtration à travers des filtres de 0,45 pm, on congèle les cellules surnageantes a -70°C avant de les utiliser.

25 Des cellules L 929 sont précultivées pendant une nuit (37°C, 5% CO2) dans des microplaques 3 x 10^ cellules/godet/100 pl, puis on ajoute 100 pl de chaque échantillon et on continue de diluer la culture en étapes 1:2. On ajoute 100 pl d'actinomycine D (8 pg/ml de milieu) et on poursuit l'incubation pendant encore 18 30 heures à 37eC/5 % CO2. Après avoir retiré les cellules surna-' géantes, on colore la couche de cellules restantes avec une solution Giemsa et on mesure l'absorption à 620 nm au moyen d'un appareil Titertek Multiscan Autoreader (Flow). Une unité de TNF est définie comme étant l'activité qui produit une lyse de 50¾ des 35 cellules cibles L 929.

- 54 - <c 2. Essai de mélanome B16F1

On cultive des cellules de mélanome B16F1 in vitro pendant j Λ 5 jours. On synchronise ces cellules un jour avant d'effectuer ** l'essai en séparant la monocouche en cellules individuelles en uti- 5 lisant de la trypsine-EDTA et en remettant la quantité totale dans la même bouteille dans un milieu frais. On compte les cellules et on fait une préparation contenant 10^ cellules/ml de milieu. On injecte par voie intraveineuse 0,1 ml de la suspension cellulaire (105 cellules) dans la veine caudale de souris BgD2Fi. 21 jours 10 après, on sacrifie les animaux et on compte le nombre de tumeurs pulmonaires. La substance a essayer est mise en solution et injectée par voie intrapéritonéale aux jours -6, -4 et -1.

On a trouvé que les composés de formule la et III possèdent une activité immuno-prophylactique qui se traduit par une 15 réduction du nombre de métastases du mélanome B16F1 dans les poumons. Comme essai de l'activité thérapeutique de ces composés, on traite des souris aux jours 3, 5, 8, 10, 13 et 15 après leur avoir inoculé les cellules tumorales. Dans ce cas également, on a constaté une nette diminution du nombre de métastases.

20 Les composés de formule la et III peuvent donc être utili sés en thérapeutique comme modulateurs de la résistance anti-microbienne non spécifique, dans le renforcement systémique de la réponse immunitaire et dans le renforcement de l'immunité non spécifique. Les composés de formule la et III peuvent donc être utili-25 sés pour le traitement ou le traitement d'appoint (par exemple avec d'autres formes thérapeutiques spécifiques ou d'appoint) de conditions associées a une baisse de la réponse immunitaire, en particulier une baisse de la réponse immunitaire humorale et/ou une baisse de la réaction d'hypersensibilité de type prolongé, et pour le 30 traitement de conditions dans lesquelles en général une modulation de la réponse immunitaire est indiquée. En particulier, les composés de formule la et III sont utiles dans le traitement ou le traitement d'appoint de conditions pathologiques dues à des immunodéficiences idiopathiques ou des immuno-déficiences du type rencon-35 tré chez les patients âgés, ou bien chez les sujets atteints de - 55 - brûlures graves ou d'infections généralisées. Les composés de formule la et III peuvent également être utilisés dans le traitement ou le traitement d'appoint des maladies virales (telles que i* l'Herpès disséminé, la variole progressive et les formes de 5 varicelle disséminée), la maladie de Hodgkin et autres tumeurs malignes. Les composés de formule la et III peuvent en outre être utilisés pour la prévention du choc endotoxinique, par exemple en cas d'accidents, de brûlures et d'interventions chirurgicales, et comme agents anti-inflammatoires.

10 Pour les indications mentionnées ci-dessus, la dose à administrer variera évidemment en fonction du composé utilisé, du mode d'administration et du traitement désiré. D'une manière générale, on obtient des résultats satisfaisants en administrant ces composés en une dose quotidienne, ou bien en une dose unique comme 15 effet d'appoint, par exemple dans le cadre d'un traitement d'appoint, à raison d'environ 0,0015 mg/kg a environ 1 mg/kg de substance active.

L'administration peut être faite par exemple par voie parentérale, de préférence par voie intrapéritonéale. En thérapeu-20 tique humaine, la dose quotidienne appropriée sera de Tordre d'environ 0,1 mg à environ 70 mg, administrée avantageusement en doses fractionnées 2 a 4 fois par jour sous forme de doses unitaires contenant d'environ 0,025 a environ 35 mg de substance active, ou sous une forme à libération prolongée. Une dose unique d'appoint peut 25 aller jusqu'à 70 mg de substance active.

Grâce à leur activité immuno-modulatrice, les composés de formule la et III peuvent également être utilisés comme adjuvants dans des vaccins. Pour cette utilisation, la dose appropriée sera * comprise entre environ 0,5 et environ 100 mg, de préférence environ ** 30 70 mg, administrée le jour de la vaccination, avantageusement sui vie d'un rappel à la même dose 2 à 4 semaines après.

i» - 56 - » L'invention concerne donc les composés de formule la et III sous forme libre ou sous forme de sels, pour l'utilisation ^ comme médicaments, en particulier comme immuno-modulateurs, comme ** agents anti-viraux et comme agents anti-inflammatoires.

^ 5 L'invention concerne également une composition pharmaceu tique comprenant un composé de formule la ou III, sous forme libre ou sous forme de sel, en mélange avec des diluants ou véhicules pharmaceutiquement acceptables. De telles compositions peuvent être préparées selon les méthodes galéniques connues et se présenter par 10 exemple sous forme de solutions injectables.

%

Claims (15)

1. 57 *
2. 1. Une composition pharmaceutique comprenant ^ un composé de formule la t c HO— \ /-° HO_/ \—O — CH, \_/ ^ I I >—°\ (I·) W Z HO-/ \-O.P^ 10. l X__/ 1 08
3. 3 R4 I I O I ï «i B2 dans laquelle
4. 15 R-j9 Rgj R3 et R^ indépendamment signifient l'hydrogène ou un groupe acyle éventuellement substitué, et X, Y , W et Z indépendamment signifient l'oxygène ou un groupe imino, avec la condition qu'au moins un des symboles R^, R£, R3 et R^ 20 signifie un groupe acyle éventuellement substitué , sous forme 1ibre ou sous forme d'un sel pharmaceutiquement acceptable , en association avec un véhicule ou diluant pharmaceutiquement acceptable.
5. 2. Les composés de formule I
6. 25 HO- V-O HO__/ \--O-CH2 \-/ \__O ‘ OH (I) ! i / \ y W f HO-/ /—°*lv t' R' \ / n 0H
7. 30 R3 R4 . -/ 0 y x l· R' R1 2 58 a a. dans laquelle Ri'» R21 » R3‘ et R4' représentent, indépendamment les uns des autres, l'hydrogène ou un groupe acyle éventuellement substitué, et
8. 5 W, X, Y et Z représentent, indépendamment les uns des autres, l'oxygène ou un groupe imino, avec la condition que a) au moins un des symboles Ri', R2 * » R31 et R4' représente un groupe acyle éventuellement susbtitué, et 10 b) lorsque Z et X représentent un groupe imino et W et Y représentent l'oxygène, a) Ri' et R2' ne signifient pas simultanément un groupe (R)-3-hydroxytétradécanoyle, pour autant que R3' et R4' soient identiques et représentent un groupe (R)-3-hydroxy-15 tétradécanoyle ou que R4' représente un groupe (R)-3- dodécanoyloxytétradécanoyle et R3' un groupe (R)-3-têtra-décanoyloxytétradécanoyle, ß) R2* soit autre que l'hydrogène ou qu'un groupe (R)-3-hydroxytétradécanoyle, pour autant que Rj' et R3' 20 représentent l'hydrogène et R41 représente un groupe (R)-3-hydroxytétradécanoyle, et R3' soit autre qu'un groupe -(C0)2-CH2-(CH0H)4-CH20H, pour autant que les autres substituants représentent 1'hydrogène 7 25 et leurs sels.
9. 3.- Un procédé de préparation des composés de formule la spécifiés à la revendication 1, caractérisé en ce qu'on condense par voie enzymatique un composé de formule II 30 - (formule II voir page suivante) 59 A HO— /' °\ X°H
10. 1, HO-/ \_o.p' °H " 5 Xj—i7 dH w Z I I R5 r4 10 dans laquelle W et Z sont tels que définis à la revendication 1, RJ et RJ ont les significations données à la revend!ction 1 pour R3 et R^ excepté 11 hydrogène et U représente 1'uridine, 15 avec un composé de formule III HO— \--O ‘ OH (III) / Y / HO-/ \— O.Pv \ / £ OH ?o ---' o άΌ ! I Y Y R” R" 1 2 · 25 dans laquelle X et Y ont les significations données à la revendication 1 ,et ^ Ri" et R211 ont les significations données à la revendication 1 pour Rj et R^,avec la condition qu'au moins un des deux substituants repré-c sente un groupe acyle éventuellement substitué et que lorsque X ou 3q Y représente un groupe imino, le sustituant Ri" ou R2" lié au groupe imino soit autre que l'hydrogène, et, si on le désire, on hydrolyse le composé résultant en composé correspondant de formule la dans laquelle, lorsque X, Y, Z et/ou W 60 représentent l'oxygène, Ri, R2, R3 et/ou R4 représentent l'hydrogène, ou “ si on le désire, on soumet le composé résultant a une réaction * d'acylamidase, ce qui donne le composé de formule la dans laquelle, - 5 lorsque X, Y, Z et/ou W représentent un groupe imino, Ri, R2, R3 et/ou R4 représentent l'hydrogène, et on récupère les composés de formule la sous forme libre ou sous forme de sels.
11. 4. Une composition pharmaceutique , caractérisée en 10 ce qu'elle comprend un composé de formule III HO— \-O OH H0 \ /0mh (ΙΠ) ις \_/ t 0H
12. 15. I T ï R» R«· 1 2 dans laquelle X et Y sont tels que définis à la revendication 1 et 20 R!j et R£ ont les significations données à la revendication 1 pour R-j et R2 avec la condition qu'au moins un des deux substituants représente un groupe acyle éventuellement substitué et que lorsque X ou Y représente un groupe imino, le substituant R!| ou R£ lié au 25 groupe imino soit autre que l'hydrogène, sous forme libre ou sous forme d'un sel pharmaceutiquement acceptable, en association avec un véhicule ou diluant pharmaceu-tiquement acceptable.
13. 5. Les composés de formule III • · 61 / « HO-. /—/>« (III) t HO-/ \—O.P, \_/ à oh t ? _ R" R" 5 1 2 dans laquelle Rlj et R£ signifient indépendamment l'hydrogène ou un groupe acyle éventuellement substitué et 10 a) Y représente l'oxygène et X représente un groupe NH avec la condition que a) lorsque Ri" représente un groupe (R)-3-hydroxytétra- décanoyle, R2" soit autre qu'un groupe (R)-3-hydroxytétradécanoyle ou (R)-3-hexadécanoyloxy-15 tétradécanoyle, ß) Ri" soit autre que l'hydrogène, et Ri" et R2" ne signifient pas simultanément un groupe acétyle ou -CO(CHg)10CH3, b) Y et X représentent l'oxygène ou 2q c) Y représente un groupe NH et X représente l'oxygène, avec la condition que au moins un des deux substituants Ri" et R2" représente un groupe acyle et que lorsque X ou Y représente un groupe imino, le substituant Ri" ou R2" lié au groupe imino soit autre que l'hydrogène, 25 et leurs sels.
14. 6.- Un procédé de préparation des composés de ^ formule III tels que spécifiés à la revendication 4, caractérisé en ce qu'il comprend a) pour la préparation des composés de formule IIla ; * » 62 HO— \_0 OH ^ H°-{ /-^OH 'IIIa) ; i- 1· ' * 5 I I R" R“ dans laquelle Rl" et R2" ont les significations données à la revendication4 et soit X' et Y' représentent l'oxygène, 10 soit Y' représente un groupe imino et X' représente l'oxygène, la transformation du groupe hydroxy libre dans un composé de formule IV RQ_ ^__O RO-/ \ — OH 15 \__/ i. ï (iv) Y' X’ I I Rï R2 20 dans laquelle Rl"» R2"> X1 et Y' ont les significations données à la revendication 4, et R signifie un groupe protecteur, en un groupe protégé sous forme d'ester phosphorique , ou 25 bien b) pour la préparation des composés de formule Illb HO — \_0 0H I HO—/* \_O.PX ( 111 b ) \__/ oS°H 30. i O WH ! 1 Rï Rj -^-1 — Ί ι.ι ι 11 « —~ ' ...... ' * · i X * 63 dans laquelle Ri" et R2" ont les significations données à la revendication 4, :!$ j l'acylation des composés correspondants de formule IIle ; · t . . * ï:: Î " " 5 K0-\ ( II le) K RO_/ \-O.P^ \ / ^XOR' i i
15. 10 HO 1JF R2 ! dans laquelle j 15 R2" et R ont les significations données préçédemmant, et /' ' j R1 représente un groupe protecteur, ~~~ ^ l et l'élimination subséquente des groupes protecteurs, et on récupère le composé résultant sous forme libre ou sous -i * forme de sel. 20 7,- Un composé de formule la tel que défini à la revendication 1 ou un composé de formule III tel que défini à la revendication 4, sous forme libre ou sous forme d’un sel pharmaceutiquement acceptable , pour l'utilisation comme médicament. ; t . . ' j 8.- Produits et procédés en substance comme ci-dessus décrit avec référence aux exemples cités. j L j :Ί ; ' I. K. r I 1 ‘