LU87554A1

LU87554A1 - Procede de preparation de composes affino-fermentatifs destines a l'indication visuelle du cholesterol sur la surface de la peau d'un patient

Info

Publication number: LU87554A1
Application number: LU87554A
Authority: LU
Original assignee: Nii Fiz Khim Meditsiny
Priority date: 1989-07-12
Filing date: 1989-07-12
Publication date: 1989-10-26

Description

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Procédé de préparation de composés affino-fermentatifs destinés à l'indication visuelle.du cholestérol sur la surface de la peau d'un patient

La présente invention se rapporte au domaine de la chimie bioorganique, et notamment à un procédé de préparation de composés affino-fermentatifs destinés à l'indication visuelle du cholestérol sur la 5 surface de la peau d'un patient, à base d’un agent de détection qui est affinant au cholestérol (c'est-à-dire présentant de l'affinité vis-à-vis du cholestérol) et d'un agent de visualisation.

Les composés obtenus sont les plus efficaces 10 lorsqu'ils sont appliqués au diagnostic, y compris au diagnostic précoce de l'athérosclérose, à la précision du diagnostic dans des conditions cliniques et de dispensaire , ainsi que pour le contrôle du traitement. Lesdits composés peuvent également être 15 employés dans des tests physiologiques, histologiques et histochimiques, pour mettre en évidence une teneur élevée en cholestérol et pour la localiser.

Les composés proposés permettent en plus de mettre en évidence les teneurs faibles en cholestérol de 20 patients, qui sont caractéristiques pour des malades présentant des pathologies déterminées» y compris de type oncologique.

L'athérosclérose et ses complications telles que infarctus, ictus et gangrènes, constituent une 25 des causes principales de mortalité de la population t

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2 dans tous les pays du monde.

Les études effectuées pendant de longues années ont démontré que l’athérosclérose fait partie des maladies qui sont à mettre en évidence et 5 à prévenir en premier lieu, et que le facteur de risque principal de l’athérosclérose est constitué par l'accumulation du cholestérol dans l'organisme.

La prophylaxie de l'athérosclérose chez une population prévoit tout d'abord la mise en évidence du 10 groupe de risque le plus dangereux parmi les patients et ensuite la thérapeutique différenciée et le changement de mode de vie de ce groupe. La sélection des groupes de risques élevés parmi les patients d'après la quantité de cholestérol accumulée dans 15 l'organisme constitue la partie la plus difficile du problème de prophylaxie de l'athérosclérose. Les méthodes connues de diagnostic de l'athérosclérose se basent sur la détection quantitative de la teneur en cholestérol générale du plasma de sang veineux, 20 (Consensus Conference on Lowering Blood Cholesterol to Prevent Heart Disease, JAMA., 1985, 25¾, p. 2080-2086 ;

The Lipid Research Clinics Population Studies Data Book ; publication 80-152, Bethesda, Ma, National 25 Institutes of Health, 1980, vol. 1 ;

Lipid Research Clinics Programm, JAMA, 1984, 251, p. 551-364).

Une teneur en cholestérol supérieure à 260 mg % est perçue, dans certains cas, comme étant 30 suffisante pour que le patient soit indu dans le groupe de risque. Un diagnostic plus détaillé peut être établi au moyen d'une analyse de lipoprotéines du plasma sanguin et d'une détermination de l'indice d'athérogénéité, c'est-à-dire du rapport 35 entre la différence du cholestérol général et du 5 cholestérol de lipoprotéines de haute densité, et du cholestérol de lipoprotéines de haute densité: CH - CH,, .

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Si l'indice d'athérogénéité est supérieur à 3, le patient se rapporte au groupe de risque et si l’indice d'athérogénéité est supérieur à 5,6 , le patient est qualifié d'atteint d'athérosclérose.

10 Klimov A.N. ''Phénotypisation de lipoprotéines", Recommandations méthodiques du Ministère de la Santé Publique de l'URSS, Moscou, Ed. ''Medicina'', 1975.

Goldfourt V., Holtzman E., Neufeld H.N. Total and 15 Hi$i Density Lipoprotein Cholesterol in the Serum and Risk of Mortality -British Medical Journal, 1985, 290, p. 1239-124¾ .

L'application de ces méthodes est liée à la prise de sang, ce qui est traumatisant pour le 20 patient, et, en plus, ne garantit pas la sécurité, compte tenu de la possibilité de transmission d'infections virales. Le fractionnement des lipoprotéines du plasma et l'analyse du cholestérol continuent à être une méthode compliquée et coûteuse. De 25 plus, dans l'un des trois cas, la détermination du cholestérol général et même la phénotypisation complète ne sont pas corrélatives de la gravité de l'athérosclérose (voir Miasnikov A.L. "Maladie hypertensive", 1965, Moscou, Ed. "Medicina", p.

30 300).

De plus, les études effectuées ces dernières années ont montré que le plasma sanguin est incapable de refléter en totalité les processus d'accumulation du cholestérol , caractéristiques pour la pa-35 roi artérielle et les autres tissus bradytrophes.

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Un perfectionnement ultérieur aux méthodes de diagnostic est devenu possible après la solution de certaines questions touchant la pathogénèse de l'athérosclérose, qui ont une importance de principe.

5 On a démontré que le rôle primordial dans le développement de la maladie athérosclérotique appartient au cholestérol tissulaire. On est arrivé à mettre en évidence les tissus qui accumulent le cholestérol . de manière analogue à la paroi artérielle.

10 Les études de ces dernières années ont montré la présence d’une corrélation étroite entre la teneur en cholestérol de la paroi artérielle et celle de la peau. Ceci a rendu possible la création de méthodes de diagnostic nouvelles en principe, et 15 notamment de méthodes nouvelles de diagnostic de l'athérosclérose.

La corrélation susmentionnée entre la teneur

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en cholestérol de la paroi artérielle et celle de la peau fut détectée au moyen de la détermination 20 directe du cholestérol dans les bioptats de peau. Les échantillons de peau ont été congelés dans de l’azote liquide, lyophilisés, le cholestérol fut extrait par le réactif de Folch et déterminé par des méthodes chimiques ou biochimiques traditionnel-25 les.

Voir : Nikitine You. P., Gordienko I.A. » Dolgov A.V., Filimonova T.A.. ” Teneur de la peau en cholestérol et sa corrélation avec l’indice lipide du sérum sanguin chez des gens sains et chez des gens souf-30 frant de maladie coronarienne’’, Cardiologie, 1987, XXVII N° 10, p. 48-51.

Bouisson H., De Graeve, Solera M.L. et coll. ’’Ann. Biol. Clin.” 1982, vol. 40, p. 361-407.

Cependant, il est évident qu’une telle mé-35 thode ne peut pas être appliquée à l’examen en masse 5 de la population, étant donné son caractère traumatisant et la difficulté de sa mise en oeuvre.

Le brevet des E.U.A. No. 4 458 686 décrit une méthode de détection du glucose et de l'éthanol lo-5 calisés dans le sang immédiatement sous la peau et à la surface de celle-ci et indique la possibilité de détecter le cholestérol en utilisant la choies-téro-oxydase . Cette méthode de mesure des quantités desdites substances se base sur la variation 10 stoechiométrique de la concentration en oxygène se manifestant lors de l'utilisation de ferments oxydants réducteurs spécifiques vis-à-vis du substrat à mettre en évidence, de préférence des oxyréduc-tases. Dans ce cas, on réalise la mesure quantitative 15 de la variation de concentration en oxygène au moyen de méthodes électro chimique s, par exemple par pola-, rographie , en utilisant un équipement spécial et une électrode élaborée spécialement à ces fins.

L'appareillage complexe nécessite également 20 un personnel hautement qualifié , apte à effectuer le diagnostic. Tout ceci limite inévitablement les possibilités d’application de cette méthode à l’examen en masse de la population.

On connaît, d’après la demande PCT/US 25 84/00888, une unité de détection et de visualisation dans laquelle l’élément de détection et l’élément de visualisation sont reliés entre eux soit directement, soit par l’intermédiaire d’un agent réticu-lant. Ladite imité est destinée à déterminer de fai-δ0 blés quantités de molécules désirées, y compris de lipides, dans les tissus biologiques. Cependant, la méthode décrite de détection des lipides n'est applicable que dans des conditions de laboratoire et nécessite une prise préalable du liquide biologique δ5 ou du tissu chez le patient. Autrement dit, ce pro- * 6 cédé est traumatisant, se réalise en plusieurs stades et sa mise en oeuvre est compliquée.

Les données sur la corrélation de la teneur en cholestérol de la peau et du degré de lésion 5 athérosclérotique des vaisseaux sont obtenues sur des bioptats de peau. Une telle méthode présente, en plus du caractère traumatisant, certains inconvénients, étant donné que des bioptats de 1 mm d* épaisseur renferment des couches différentes de 10 peau , et notamment la couche cornée de la peau (épaisseur moyenne de 0,1 mm) et le tissu conjonctif (derme proprement dit) constitué de deux couches, papillaire et réticulaire. Ces deux couches ont une bonne vascularité et, par conséquent, les biop-15 tats renferment des vaisseaux et du sang et, par surcroît des glandes sudoripares et sébacées, ainsi que leurs sécrétions. L'hypoderme se trouvant immédiatement sous le derme peut également se trouver dans le bioptat. Autrement dit, le caractère hétéro-20 gène des bioptats peut entraîner une déformation des données sur la teneur en cholestérol accumulée dans la peau. De ce point de vue, la méthode la plus précise doit être celle qui permettrait de mesurer la teneur en cholestérol à la surface de 25 la peau, dans la couche cornée du derme.

La présente invention vise à résoudre le problème de la création d’un procédé de préparation de composés affino-fermentatifs servant à l'indication visuelle du cholestérol immédiatement sur la 30 peau du patient, et notamment dans la couche cornée de l'épiderme de la peau, sans prise de sang ni de bioptats de peau chez les patients. On peut utiliser pour le diagnostic n'importe quelle région de la peau humaine, mais la plus commode est la surface 35 de la paume, du fait qu'elle ne renferme pas de 7 glandes sébacées dont les sécrétions, de même que la couche cornée de la peau, comprennent du cholestérol qui peut influencer les résultats des indications diagnostiques.

5 Conformément à l'invention, ce problème est résolu grâce à l’élaboration d'un procédé de préparation de composés affino-fermentatifs.représentant des composés bifonctionnels. Les composés préparés se lient sélectivement au cholestérol libre de la 10 peau du patient et peuvent ensuite être rendus distinguables visuellement. Pour préparer un tel composé, il est nécessaire d'utiliser au moins deux composants, notamment un agent de détection A choisi dans le groupe des substances susceptibles de former, d'une 15 façon sélective et solide, un complexe avec le cholestérol libre de la peau, afin d'assurer " l'adres-sage ' ' de la totalité du composé bifonctionnel au cholestérol, et un agent de visualisation B qui permette de rendre visuellement distinguable le 20 composé bifonctionnel lié au cholestérol.

Les composés obtenus selon l’invention simplifient au maximum le diagnostic de l'athérosclérose, ne sont pas traumatisants et ne nécessitent pas d' équipement spécial. L'application desdits composés 25 au diagnostic de l'athérosclérose permet la répartition des patients examinés en trois groupes : celui des malades de l'athérosclérose, celui de risque et celui des gens sains.

Les composés affino-fermentatifs pour l'indi-30 cation visuelle du cholestérol, préparés selon l'invention, et la méthode de diagnostic se basant sur l'application desdits composés et désignée par convention ''méthode de trois points'' sont applicables pour l'examen en masse de la population, et 35 la mise en oeuvre de la méthode est si simple qu'une 8 qualification spéciale du personnel de service n'est pas nécessaire, l'examen pouvant même être réalisé à la maison.

Les composés selon l'invention peuvent éven-5 tuellement être préparés seulement à partir d'un agent de détection A et d’un agent de visualisation B, par l'activation chimique des groupes fonctionnels de l'un desdits agents. Dans ce cas, après addition, à l'un de ces agents comportant des groupes chirai-10 que s activés, de l’autre agent, il se forme, sous des conditions déterminées, une liaison chimique solide entre les agents A et B et il en résulte une préparation de composés bifonctionnels à poids moléculaire élevé destinés à l'indication visuelle du 15 cholestérol sur la peau d'un patient.

On utilise, à titre d'agent d'affinité vis-à-vis du cholestérol - agent de détection A :

Les glucosides stéroïdes renfermant, à titre d'aglycone, un fragment cyclopentaneperhydrophénan-20 trène de la série furostanolique ou spirostanolique et un fragment d'oligosaccharide contenant de 3 à 10 monosucres de structure linéaire ou ramifiée (P.K. Kintia "Structure et activité biologique de glyco-sides stéroïdes de série spirostane et furostane'', 25 Kichinev, Ed. ' 'Chtinza* ', 1987, p. 142), ou bien Les glucosides triterpéniques contenant une aglycone de série a- ou ß-amirilique, lupanique, hopanique, dammaranique, linostanique ou holostani-que et un oligosaccharide en 2 à 8 groupes de struc-/ 30 ture ramifiée ou linéaire (G.E. Dekanossidze, V.Ya.

Tchirva, T.V. Sierguienko, N.I. Ouvarova "Etudes sur des glucosides triterpéniques", Tbilissi, Ed. "Metzniereba'', 1982)» ou bien

Les protéines hydrophobes susceptibles de 35 former sélectivement un complexe avec le cholestérol 9 (1. Klimov A.N., Titova G.V., Kozevnikova K.A., Biochimie, 1982, vol. 47, N° 2, p. 226-252 2. Klimov A.N., Kozevnikova K.A., Kluieva N.N. et coll. Questions de chimie médicale”, 1984, vol. 50, 5 Ne 3, p. 86-90 5. Titova G.V., Kluieva N.N., Kozevnikova K.A. et coll. Biochimie, 1980, vol. 45, N® 1, p. 51-55), ou bien

Les toxines albumineuses susceptibles de for-10 mer sélectivement un complexe avec le cholestérol, obtenues à partir de bactéries, de microorganismes marins, d’insectes ou de vipères (Dalin M.V., Fiche N.G. ”Toxines albumineuses de microbes”, Moscou,

Ed. ’’Medicina", 1980), ou bien 15 Les antibiotiques polyéniques susceptibles de former sélectivement un complexe avec le cholestérol (1. J.P. Katzenstein, A.M. Spielvogel, A.W. Norman ”J. Antibiot.”, 27, 12, 1974, p. 943-951, 20 2. Jong Shang - Shyng, Wang Hsi-Hua * 'Clin. J. Micro- biol.”, 1976 , 9, (1-2), p. 19-50, 3. Readig Josephine D. et coll. "Biochim Biophis Acta”, 1982 , 685 (2), p. 219-224), ou bien

Les ferments à forte affinité dont le substrat 25 est constitué par le cholestérol et qui manifestent une affinité élevée vis-à-vis de celui-ci.

L'agent de visualisation B utilisé est cons -titué par les ferments choisis dans la série renfermant l'acétylcholine-estérase, la tyrosinase, la - 50 glucose-6-phosphatedéhydrogénase, la glucoxydase, la glucoamylase, la galactosidase, la peroxydase, les phosphatases alcaline ou acide, l'a-chymotrypsine ou la pyrophosphatase.

Le problème posé est résolu grâce à ce qu'un 55 agent affinant - agent de détection (A) choisi dans t t 10 un groupe de glucosides stéroïdes comportant à titre d'aglycone un fragment de cyclopentaneperhydro-phénantrène de série furostanolique ou spirostanoli-que et un fragment d'oligosaccharide contenant de <5 5 à 10 monosaccharides de structure linéaire ou ramifiée, ou bien choisi dans un groupe de glucosides triterpéniques comportant une aglycone de série a- ou ß- amiralique, ou lupanique, ou hopanique, ou dammaranique, ou 10 lanstanique, ou holostanique et un oligosaccharide en 2 à 8 groupes de structure ramifiée ou linéaire, ou bien choisi dans un groupe de protéines hydrophobes susceptibles de former sélectivement un complexe avec 15 le cholestérol, ou bien choisi dans un groupe de toxines albumineuses susceptibles de former sélectivement un complexe avec le cholestérol et obtenues à partir de bactéries, de microorganismes marins, d'insectes ou de vipères, 20 ou bien choisi dans un groupe d'antibiotiques polyéniques susceptibles de former sélectivement un complexe avec le cholestérol, ou bien choisi dans un groupe de ferments présentant une affinité élevée vis-à-vis 25 du cholestérol, est activé par des méthodes chimiques en milieu aqueux, avec un rapport molaire agent de détection A : activateur = 1:1 - 1:10, à une concentration de l'agent de détection A comprise entre 1 et 20 mg/ml, 50 à une température allant de 0 à 25eC, avec un pH de 4 à 11, pendant 0,1 à 24 heures, et du fait qu'on ajoute à la solution obtenue un agent de visualisation B choisi dans un groupe de ferments constitué par 1'acétylcholine-estérase, la tyrosinase, la 35 gXucose-6-phosphatedéhydrogénase, la glucoseoxydase, 11 la glucoseamylase, la galactosidase, la peroxydase, la phosphatase alcaline ou acide, 11 a—chymotrypsine ou la pyrophosphatase, avec un rapport molaire Aï B -20:1 - 1:1, et que la solution est incubée à une 5 température allant de 0 à 25°C pendant 1 à 24 heures jusqu'à l’obtention du produit final.

Comme indiqué ci-dessus, il est possible de soumettre à une préactivation chimique également les groupes fonctionnels de l’agent de visualisation B.

10 Dans ce cas, l’activation chimique de l’agent de visualisation B est réalisée dans un milieu aqueux, avec un rapport molaire entre l’agent de visualisation B et·l’activateur compris entre 1:1 et 1:10, à une concentration de l’agent de visualisation B de 15 1 à 20 mg/ral , à une température comprise entre 0 et 25®C, avec un pH de 4 à 11, pendant 0,1 à 24 heures, et ensuite la solution obtenue est ajoutée à l’agent de détection A représenté par l’une des substances susmentionnées, avec un rapport molaire A:B = 20:1 -20 1:1 et la solution est incubée à une température de 0 à 25°C pendant 1 à 24 heures Jusqu’à l’obtention du produit final.

Conformément à l’invention, l’activation chimique de l’agent de détection A ou de l’agent de vi-25 sualisation B est réalisée par les méthodes azidique, carbodiimidique, succinimidique ou d’oxydation aux périodates, connues en soi.

Dans les cas où l’on utilise, à titre d’agent de visualisation B, un composé à haut poids molécu-30 laire comme un ferment, et à titre d’agent de détection A des composés à bas poids moléculaire, tels que des glucosides, la molécule du produit final ne peut pas contenir plus d’une molécule de l’agent de visualisation B. La quantité molaire d’agent de dé-ô5 tection A assurant la liaison avec le cholestérol 12 de la peau dans le produit final peut alors dépasser la teneur en agent de visualisation B seulement de plusieurs fois, en conformité avec la quantité de groupes fonctionnels dans la molécule du ferment, 5 aptes à la liaison avec l’agent de détection A, sans perte considérable de l'activité fermentative. Dans de tels composés, la teneur en agent de visualisation B constitué par un ferment est limitée. Il en résulte une sensibilité relativement faible des 10 composés obtenus et une nécessité d'augmenter le temps d'exposition au cours du diagnostic.

Pour augmenter les possibilités technologiques des composés affino-fermentatifs destinés à l'indication visuelle du cholestérol dans la peau 15 d'un patient et en vue d'améliorer la sensibilité desdits composés, il est proposé de lier ledit agent de détection A et ledit agent de visualisation B à l'aide d'un agent de réticulation C choisi dans une série de composés bifonctionnels asymétriques à 20 bas poids moléculaire, tels que le bromure de cyanogène, la trichlorotriazine ou la 2-amino-4,6-di-chloro-S-triazine. Dans ce cas, les composés peuvent être préparés des deux façons suivantes : soit l'agent de détection A est d'abord lié à l'agent de 25 réticulation C et ensuite, pour préparer le produit final, on ajoute au produit intermédiaire (A + C) l'agent de visualisation B, soit on obtient d'abord le produit intermédiaire (B + C) et on ajoute ensuite à celui-ci l'agent de détection A.

30 Dans le premier cas, les composés affino- fermentatifs sont obtenus par solubilisation, au moyen de la méthode classique, dans une solution tampon aqueuse saline dont le pH est de 5 à 9, de l'agent de détection A choisi parmi les substances 55 susmentionnées, à une concentration de 1 à 20 mg/ml ; i 15 ensuite, on ajoute à ladite solution un agent réti-culant bifonctionnel asymétrique, à bas poids moléculaire, C, choisi dans un groupe constitué par le bromure de cyanogène, la trichlorotriazine, ou la 5 2-amino-4,6-dichloro-S-triazine, avec un rapport molaire A:C « 1:0,5 - 1:10; on fait incuber la solution obtenue à une température comprise entre 0 et 20°C pendant 1 à 20 heures et on ajoute ensuite un agent de visualisation B choisi parmi les substances 10 susmentionnées, avec un rapport molaire A:B = 20:1 -1:1 et l’on fait incuber la solution à une température de 0 à 20°C pendant 1 à 48 heures, jusqu’à l’obtention du produit final.

Lorsqu’on prépare le composé affino-fermenta-15 tif en passant par le produit intermédiaire B + C, un agent de visualisation B choisi parmi les substances susmentionnées est solubilisé par la méthode classique dans une solution tampon aqueuse saline ayant un pH de 5 à 9» la concentration en agent de 20 visualisation B allant de 1 à 20 mg/ml ; puis on ajoute à la solution un agent de réticulation C bifonctionnel, asymétrique, à bas poids moléculaire, choisi dans le groupe constitué par le bromure de cyanogène, la trichlorotriazine ou la 2-amino-4,6-25 dichloro-S-triazine, avec un rapport molaire B:C « 1:0,5 - 1:10 ; on fait incuber la solution ainsi obtenue à une température comprise entre 0 et 20°C pendant 1 à 20 heures ; et ensuite on ajoute un agent de détection A pris parmi les substances sus-50 mentionnées, avec un rapport molaire A:B = 20:1 -1:1 et on fait incuber la solution à une température allant de 0 à 20°C pendant 1 à 48 heures jusqu’à l'obtention du produit final.

Toutefois, la sensibilité la plus élevée 55 des composés affino-fermentatifs destinés à l'indi- 14 cation visuelle du cholestérol sur la peau d’un patient est obtenue lorsque l’agent de réticulation C utilisé est un composé polyfonetionnel à haut poids moléculaire tel que les polysaccharides, les albu-5 mines ou les polymères synthétiques, c’est-à-dire n'importe quel composé à haut poids moléculaire renfermant n'importe quel groupe fonctionnel choisi dans une série constituée par l'amine primaire, le carboxyle, l'hydroxyle, l'aldéhyde, l'anhydride 10 halogène, l'anhydride mixte, 1'iraido-éther, l'azide, l'hydrazide, le maléimide, l'isocyanate ou l'époxyde. Par ailleurs, sur un de ses composés est indépendamment immobilisé l'agent de détection A représentant l'une des substances susmentionnées ou leurs mélan-15 ges, ainsi que l'agent de visualisation B qui est également l'une des substances susmentionnées. Un tel composé affino-fermentatif destiné à l'indication visuelle du cholestérol sur la surface de la peau d'un patient permet une variation dans de très 20 larges limites du rapport entre l'agent, de détection A et l'agent de visualisation B, en conformité avec le degré d'affinité de l'agent de détection A choisi avec le cholestérol de la peau et, respectivement, avec l'activité du ferment B utilisé. Par 25 exemple, lorsqu'on utilise un agent de détection A présentant une plus faible affinité vis-à-vis du cholestérol de la peau, sa teneur molaire en produit final peut être augmentée considérablement.

De tels composés affino-fermentatifs sont 30 obtenus grâce au fait que l'agent de détection A

représentant l'une des substances susmentionnées ou bien leurs mélanges, et l'agent de visualisation B qui est également l'une des substances susmentionnées, sont pris dans un rapport molaire Aï B de 20:1 - 1:1 35 et solubilisés dans une solution tampon aqueuse sa- 15 » line ayant un pH de 5-9» la concentration en chacun desdits agents A et B étant de 0,1 à 20 mg/ml ; et on ajoute à la solution ainsi obtenue un agent de réticulation polyfonctionnel à haut poids molécu-5 laire, C, constitué par des polysaccharides, des albumines ou des polymères synthétiques, autrement dit par n’importe quels composés à haut poids moléculaire renfermant n’importe quel groupe fonctionnel choisi dans la série contenant l'amine primaire, 10 le carboxyle, l*hydroxyle, l’aldéhyde halogène, l'anhydride mixte, l’azide, l'hydrazide, le maléimi-de, l'isocyanate ou l'époxyde, avec un rapport molaire A + B : C = 1:0,5 - 1:10 ; on fait incuber la solution obtenue à une température comprise entre 15 0 et 20°C pendant 1 à 20 heures, jusqu'à l'obtention du produit final.

Parmi les glucosides stéroïdes utilisés à » titre d'agent de détection A et possédant, comme aglycone, un fragment de cyclopentaneperhydrophénan-20 trène de série furostanolique ou spirostanolique et un fragment d'oligosaccharide contenant de 5 à 10 monosaccharides de structure linéaire ou ramifiée, les plus avantageux sont : l'agavoside A, l'agavoside B, l'agavoside C, l'agavoside D, l'agavoside F, 25 l'agavoside H, l'agavoside G, la trilline, le funco-side C, le funcoside D, le funcoside F, le funcoside G, le funcoside I, la dioscine, la gracilline, la protodoscine, la quicubasaponine, le juncoside E, le juncoside H, la lanotigonine, la desglucodigi-50 tonine, la digitonine, la gitonine, le rocoside C, le rocoside D, le rocoside E, le funcoside E, 1' alliumoside C, la polygonatonine, le tétraoside de tigogénine, l'hexaoside de tigogénine, le capsicosi-de, l'ammumoside B, l'ammumoside C, l'ammumoside D, 55 1 'ammumoside E, la desglucodesrhamnoparilline, la 16 desglucoparilline, la parilline, le sarmaparilloside, 1'asparogoside C, l'asparogoside D, l'asparogoside G, l'asparogoside H, le prothojuccoside H, le jucco-side B, le lanotigoside , le monoside, le bioside, 5 le trioside, le purpurrhéagitoside, l'hécogénine, le rocogénine, la diogénine, la tigogénine, le pro-thopolygamatoside, la tomatonine, le licotétraoside de laxogénine, le licotétraoside d'alliogénine, le caratavioside A, le cyclosiversioside H, l'acanto-10 phyloside C, l'alliofusoside A, l'alliospiroside A, le cyclosiversioside F, la saponine de thé, l'acanto-phyloside B, la tigonine (sommaire), le glucoside de Calha Bolypatala ou le cyclosiversioside G.

Parmi les glucosides stéroïdes suspentionnés, 15 encore plus avantageux sont les funcosides C, P, E, F, G ou I, la dioscine, le rocoside, la lanotigonine, la digitonine et la tomatonine. Les composés les plus avantageux sont la digitonine et la tomatonine.

Parmi les glucosides triterpéniques utilisés 20 à titre d'agent de détection A et comportant l'agly-cone de série a- ou ß-amirilique, lupanique, hopa-nique, dammaranique, lanostanique ou holostanique et un oligosaccharide ayant 2 à 8 groupes de structure ramifiée ou linéaire, ceux que l'on préfère 25 sont l'escine, l'avinacine, la théasaponine, l'cc-hédérine, le cauloside Cf le stichinôside A, la cyclamine, la quinovine, les saponines provenant de la betterave à sucre, le gypsoside, et les glucosides triterpéniques obtenus à partir de Fatsia 50 Japonica.

Parmi les protéines hydrophobes utilisées à titre d'agent de détection A et susceptibles de former sélectivement un complexe avec le cholestérol, ceux que l'on préfère sont la protéine méilinique 55 de Folch, les protéines de lysosomes, de mitochon- * 17 driums, le fibrinogène, les immunoglobulines, le cérébrone, la myoglobine, la tripsine, le cytochrome C, le cytochrome P-450 ou bien les apo-proteines de lipoprotéines.

5 Parmi les toxines albumineuses utilisées à titre d'agent de détection A, susceptibles de former sélectivement un complexe avec le cholestérol et préparées à partir de bactéries, de microorganismes marins, d'insectes ou de vipères, les toxines que 10 l'on préfère sont la Streptolysine o, la pneumo- lysine, la listériolysine, la θ-toxine C.I. obtenue à partir de Perfrigens de type. A et C , la ô-toxine CI. novyi de type A et C, l'hémolysine C.I. histo-lyticum, l'hémolysine C.I. botulinum de type C et D, 15 la tétanolysine, la cérébrolysine, l'alvéolysine, la turinguéolysine ou la cytotoxine provenant de l'actinie Metridium senile.

Parmi les antibiotiques polyéniques utilisés comme agent de détection A et susceptibles de former 20 un complexe avec le cholestérol, les antibiotiques préférés sont 1'amphotéricine B, la philipine ou la nistatine.

Parmi les ferments à affinité élevée, possédant une grande affinité vis-à-vis du cholestérol 25 et utilisés à titre d'agent de détection A, les cholestéro-oxydases, les cholestérodéhydrogénases ou les cholestéro-estérases sont tout particulièrement préférées.

Parmi tous les affinants - agents de détec-30 tion A mentionnés, tels que les glucosides, les protéines hydrophobes , les toxines albumineuses, les antibiotiques polyéniques et les ferments à forte affinité, on préfère les glucosides parce qu'ils sont les plus stables chimiquement, supportant aussi 35 bien les solvants organiques que les températures 18 élevées lors de la synthèse, sans perdre leur capacité de former un complexe avec le cholestérol de la peau. Le bas poids moléculaire des glucosides permet d'obtenir un moyen présentant une teneur mor 5 laire élevée en agent de détection, ce qui assure une multiplicité de points de contact dudit moyen et du cholestérol de la peau.

Les glucosides stéroïdes sont les plus avantageux parmi les glucosides, parce qu'ils forment un 10 complexe avec le cholestérol, de la manière la plus efficace par comparaison avec les glucosides tri-terpéniques.

Les protéines hydrophobes, les toxines albumineuses, les antibiotiques polyéniques et les fer-15 ments à forte affinité sont également intéressants lorsqu'ils sont utilisés pour la préparation du moyen diagnostique, mais ils· apportent certaines limitations au procédé de préparation d'un composé affino-fermentatif , à cause de leur faible stabi-20 lité chimique et de leur capacité d'inactivation.

De plus, le poids moléculaire élevé desdits agents de détection réduit quelque peu la sensibilité du composé final, ce qui nécessite une augmentation de la concentration du moyen et dù temps d'exposition, 25 pour l'indication du cholestérol sur la peau.

On comprend bien le désir d'opérer dans des conditions douces, autrement dit à un pH neutre, à une faible force ionique , à de basses températures et avec une durée de réaction réduite.

30 Comme agent de visualisation B, on utilise des ferments dont la réaction avec l'agent de détection A aboutit à un produit affino-fermentatif destiné à l'indication visuelle du cholestérol sur la peau d'un patient, et choisis dans la série cons-35 tituée par l'acétylcholinestérase, la tirosinase, 19 la glucose-6-phosphatedéhydrogénase, la glucose-oxydase, la glucosamylase, la galactosidase, la peroxydase, la phosphatase alcaline ou acide, l'a-chymotrypsine ou la pyrophosphatase.

5 Tous ces ferments peuvent être utilisés avec n' importe quel agent de détection A parmi ceux mentionnés ci-dessus ; cependant, on préférera les glucosides stéroïdes.

L’utilisation de l’agent de réticulation C 10 rend plus larges les possibilités technologiques du procédé de préparation d’un composé destiné à l’indication visuelle du cholestérol à la surface de la peau d'un patient, tout en maintenant au degré maximal l'activité fonctionnelle des agents A et B.

15 Les composés que l’on préfère comportent, à titre d’affinant - agent de détection A» les glucosides stéroïdes qui renferment, comme aglycone, un fragment de cyclopentaneperhydrophénantrène de série furostanolique ou spirostanolique et un fragment d' 20 oligosaccharide contenant de 3 à 10 monosucres de structure linéaire ou ramifiée.

De tels glucosides stéroïdes possèdent une stabilité chimique élevée et peuvent être immobilisés sur le polymère réticulant dans des condi-25 tions rigides, c'est-à-dire à des températures élevées et éventuellement par une solubilisation dans des solvants organiques, ce qui assure leur teneur élevée en produit final. Le composé destiné à l’indication visuelle du cholestérol sur la surface de 30 la peau d'un patient est obtenu au moyen de l'immobilisation successive, sur l'agent de réticulation C, de l'agent de détection A, dans des conditions rigides, et ensuite, sur le produit ainsi obtenu, contenant l'agent de réticulation C et l'agent de 35 détection A , on immobilise le ferment de visualisa- 20 tion B , dans des conditions douces, pour conserver l'activité fermentative de ce dernier.

Il est possible d'utiliser, en tant qu'agents de réticulation C, des composés bifonctionnels à 5 bas poids moléculaire, asymétriques, tels que, par exemple, le bromure de cyanogène, la trichloro-triazine ou la 2-amino-4,6-dichloro-S-triazine.

L'application, en tant qu*agent de réticulation C, de composés polyfonctionnels à haut poids 10 moléculaire permet d'avoir une large gamme de variations du rapport entre l'agent de détection A et l'agent de visualisation B dans le composé destiné à l'indication visuelle du cholestérol, par exemple en vue d'obtenir un rapport optimal entre le nombre 15 de centres de liaison du composé à la surface de la peau (agent de détection A) et la quantité d'agent 5 de visualisation B.

On utilise, à titre d'agent de réticulation C polyfonctionnel , à haut poids moléculaire, les 20 polysaccharides, les protéines ou les polymères synthétiques, autrement dit n'importe quels composés à haut poids moléculaire comportant n'importe quel groupe fonctionnel choisi dans la série constituée par l'amine primaire, le carboxyle, l'hydroxyle, 25 l'aldéhyde, l'anhydride halogéné, l'anhydride mixte, 1'imido-éther, l'azide, l'hydrazide, le maléimide, l'isocyanate ou l'époxyde.

De préférence, on utilisera, à titre d'agent de réticulation C polyfonctionnel à poids molécu-50 laire élevé, les copolymères de l'acide acrylique ou de l'anhydride maléique.

Le copolymère de N-vinylpyrrolidone avec 1' anhydride maléique constitue l'agent C polyfonctionnel, à poids moléculaire élevé , que l'on préfère. 55 Les agents de réticulation C susmentionnés sont 21 utilisables avec n'importe quel agent de détection A et n'importe quel agent de visualisation B. On obtient dans ce cas toujours un produit final A-C-B.

Les composés que l'on préfère comportent, à 5 titre d'agent de détection A, les glucosides stéroïdes.

? Les activateurs de l'agent de détection A et de l'agent de visualisation B sont les composés qui transforment les groupes fonctionnels desdits agents 10 en forme réactive. Les groupes tels que l'amine primaire, le carboxyle, l'oc-glycol, peuvent être activés par les méthodes azidique, carbodiimidique, succini-midique , aux périodates, etc., connues en soi.

Les méthodes aux périodates et carbodiimidi-15 que sont les plus préférables, étant donné qu'elles assurent les conditions les plus douces de la synthèse et qu'elles permettent une conservation maximale de l'activité du ferment immobilisé.

Les solutions tampons aqueuses salines uti-20 Usées sont des solutions préparées à partir de composés assurant l'action de tampon dans l'intervalle de pH allant de 5 à 9, qui ne provoquent pas l'inactivation ou l'inhibition des ferments. Parmi de telles solutions, on citera, par exemple, les 25 solutions tampons boratique, citratique, phosphati-que et autres. Habituellement, on utilise des solutions aqueuses salines dont la concentration en sel assure une valeur stable du pH de la solution pendant l'immobilisation, mais la concentration ne 30 doit pas, en même temps, dépasser les valeurs pour lesquelles on observe une dénaturation du ferment.

Certains agents de détection A, tels que les glucosides stéroïdes, les glucosides triterpéniques et les antibiotiques polyéniques, sont peu ou par-35 tiellement solubles dans l'eau ; c'est pourquoi on 22 utilise, pour leur dissolution, des solvants organiques. Il est possible d'utiliser, à titre de tels solvants, les solvants aprotiques polaires tels que le diméthyl sulfoxyde, le diméthylformamide, l'hexa-5 méthanol, un mélange de diméthylf ormamide et de toluène en un rapport de 2:1 ou un mélange de diméthyl-formamide et d'hexane en un rapport de 2:1.

Les conditions du procédé de préparation d'un composé destiné à l'indication du cholestérol (tem-10 pérature, temps d'incubation) sont déterminées par le choix des composants A, B et C. L'utilisation de ferments à titre d'agent de visualisation B, limite la température opérationnelle à 20°C. Il est préférable d'opérer à 4°C dans des solutions tampons 15 dont le pH va de 5 à 9. L'utilisation de polymères synthétiques à titre d'agent de réticulation C et de glucosides à titre d'agent de détection k permet d'opérer dans des solvants organiques et à des températures élevées (allant jusqu'à 120°C) et de 20 choisir la durée de réaction suffisante pour obtenir un rendement maximal en produit final.

Les rapports molaires des composants de la réaction sont choisis en conformité avec les poids moléculaires des agents A ou B choisis, par le degré 25 d'affinité vis-à-vis du cholestérol de la peau et par l'activité du ferment choisi.

On trouvera ci-dessous une explication de l'invention, faite en se référant aux exemples de réalisation et au dessin sur lequel : 50 - La figure 1 représente les symboles con ventionnels ; - la figure 2 représente les composés obtenus et leur coopération avec le cholestérol sur la surface de la peau d'un patient, conformément aux re-55 vendications 1 et 2 ; 23 - la figure 3 représente les composés préparés et leur coopération avec le cholestérol sur la surface de la peau d’un patient, conformément aux revendications 3 et 4 ; 5 -la figure 4 représente les composés prépa- rés et leur coopération avec le cholestérol sur la surface de la peau d'un patient, conformément aux revendications 5 et 18 .

Exemple 1 10 100 mg de tomatonine (A) sont placés dans 10 ml d'eau, puis on ajoute 40 ing de périodate de sodium et on fait incuber à 20°C pendant 4 heures.

A 1 ml de la solution obtenue , on ajoute 1 ml d'une solution d’cc-chymo trypsine (B) (10 mg/ml) dans 15 une solution tampon au phosphate 0,2 Mdont le pH

est de 7>5 et l'on fait incuber pendant 12 heures à 4°C. Finalement, on obtient une solution aqueuse du produit final.

Exemple 2 20 On dissout 3 mg de peroxydase (B) provenant d'armoracie dans 1 ml d'eau,on ajoute 0,5 g de périodate de sodium et on fait incuber pendant 8 heures à 4eC. On ajoute à la solution ainsi obtenue 3 mg de cholestéro-oxydase (A) dans 1 ml d'une solution 25 tampon au phosphate 0,2 M dont le pH est de 7,5 et l'on fait incuber pendant 12 heures à 4°C. Il en résulte une solution du produit final.

Exemple 5

On dissout 10 mg d'acide polyacrylique (C) 30 dans 10 ml d'une solution tampon à l'acétate dont le pH est de 4,8 et on ajoute 15 mg de sulfonate de P-cyclohexyl-2- ( 4-morpho lino ) éthyl-carbodiimide-métho-p-toluène. on fait incuber pendant 1,5 heure à 0°C. On ajoute à la solution ainsi obtenue 5 ml 35 d'une solution tampon contenant 5 mg d'O-strepto- 24 lysine (A) et 5 mg de peroxydase (B) provenant d' armoracie. La solution est incubée pendant 2 heures à 20°C. A l’issue de l’incubation, on obtient le produit final.

5 Exemple 4

On met l'agavoside Γ (100 mg) (A) dans 5 ml d’eau et on ajoute 100 mg de bromure de cyanogène (C) tout en maintenant le pH à 11 en ajoutant une solution 1M de NaOH. On fait incuber le mélange 10 pendant 50 minutes à 4®C, on amène le pH à 8,5 par addition d’acide phosphorique. On ajoute, à 1 ml de la solution obtenue, δ ml de solution tampon au phosphate 0,5 M dont le pH est de 8,5 et qui contient 6 mg de phosphatase alcaline (B) et on fait 15 incuber pendant 12 heures à 4°C. Il en résulte une solution du produit final.

Exemple 5

On dissout la nistatine A (500 mg) et un copolymère d'éthylène et d'anhydride maléique (C) 20 (250 mg) dans 5 ml de diméthylformamide et on fait incuber dans un courant d'argon,à 50°C pendant δ heures. Le produit obtenu est repris dans 20 ml d'éther et séché sous vide à 20°C. On ajoute, à 1 ml de ß-galactosidase (B) (2 mg/ml) dans line solution 25 tampon au phosphate 0,2 M ayant un pH de 7»5> 6 ml du produit obtenu et l'on fait incuber à 4°C pendant 12 heures. A l'issue de la réaction, on obtient une solution du produit final.

Exemple 6 50 L'escine (A) (50 mg) et un copolymère de N- vinylpyrrolidone avec de l'anhydride maléique (C) (100 mg) sont solubilisés dans 1 ml de diméthyl-sulfoxyde et incubés pendant 2 heures à 100°C. Le produit obtenu est repris dans 5 ml d'acétone et 55 séché sous vide sur du pentoxyde de phosphore pen- 25 dant 4 heures à 100°C.

On ajoute, à 1 ml de solution d'a-chymo-trypsine (B) (1 mg/ml) dans une solution tampon au phosphate 0,2 M ayant un pH de 7,5 , 8 mg du produit 5 obtenu et on fait incuber pendant 15 heures à 6°C.

A l'issue de la réaction, on obtient une solution du produit final.

Dans cet exemple, le produit préparé présente une teneur molaire élevée en agent de détection A, 10 et le stade de préparation préalable du produit contenant l'agent de détection A et l’agent de réticulation C à poids moléculaire élevé, permet de conserver à un degré maximal l’activité fermentative de l’agent de visualisation B, grâce à des condi-15 tions d'immobilisation du ferment douces.

Application de composés pour l'indication visuelle du cholestérol sur la peau d'un patient

Le diagnostic réalisé à l’aide des composés 20 selon l’invention ne se base pas sur la mesure quantitative précise du cholestérol, mais sur la possibilité d’inclure le patient dans l’un de trois groupes , à savoir celui de malades souffrant d’ athérosclérose, celui de risque et celui de gens 25 pratiquement sains. Pour inclure le patient dans l’un desdits groupes, il est nécessaire d’évaluer la teneur en cholestérol de la couche cornée de l’épiderme de la peau, chacun des groupes susmentionnés ayant sa teneur caractéristique.

50 Conformément à ce principe, on choisit, pour chaque composé obtenu selon l’invention, trois concentrations qui sont ensuite utilisées. Ces trois concentrations différentes en moyen affino-fermenta-tif sont appliquées sous forme de trois points sur 55 la peau d'un patient, de préférence sur la paume. Or, 26 la concentration maximale de ce composé assure ensuite un développement de coloration de la tache appliquées chez toutes les personnes, y compris chez les personnes saines dont la peau possède la 5 plus faible teneur en cholestérol. Cette tache est utilisée, pour ainsi dire, comme tache témoin vis-à-vis de l'action du cholestérol. La solution, à la concentration minimale du composé obtenu selon l'invention, n'assure le développement de la colo-10 ration que chez les malades souffrant d'athérosclérose au stade clinique, dont la peau présente la plus forte teneur en cholestérol. La solution du composé obtenu selon l'invention, à une con-' centration intermédiaire, assure un développement de 15 coloration chez les gens malades aussi bien que chez les gens faisant partie du groupe de risque (teneur élevée en cholestérol), mais n'assure pas le développement de la coloration chez les personnes saines.

20 De cette manière, on applique à la peau du patient trois concentrations différentes du composé obtenu conformément à l'invention. S'il a une tache colorée, le patient fait partie du groupe des gens sains, s'il a deux taches colorées, il fait partie 25 du groupe de risque et s'il a trois taches colorées, il fait partie du groupe des malades souffrant d' athérosclérose au stade clinique.

' Pour effectuer le diagnostic, il suffit d'une surface de peau de quelques centimètres carrés, choi-30 sie sur n'importe quelle partie du corps humain. On choisira tout de même, de préférence, la partie intérieure de la paume qui est facilement accessible et qui, en plus, ne renferme pas de glandes sébacées.

Le composé suivant l'invention est appliqué, 35 en trois concentrations différentes , à la surface 27 de la peau, en une quantité allant de 10 à 20 μΐ et est incubé pendant une minute. L'excès de composé qui ne s'est pas lié au cholestérol de la peau est éliminé par lavage. Pour visualiser le composé se-5 Ion l'invention , lié au cholestérol de la peau, on applique aux mêmes points de la peau le substrat du ferment approprié, utilisé à titre d'agent de visualisation B lors de la préparation dudit composé, qui, à l'issue d'une réaction de ferment, forme avec 10 le composé selon l'invention un produit coloré.

(T.T. Ngo et H.M. Lenhoff ''Enzime-mediated immuno-essei'', 1985» Plenum Press, New York ; A. Leninger ''Biochemie'', Edit. ''Mir'', Moscou ,1976, p. 198).

En fonction du substrat de la réaction du 15 ferment choisi, la solution incolore du substrat se colore en rouge, jaune, bleu, vert, violet ou en d'autres couleurs, ou bien la solution colorée se décolore.

Par exemple, si on a utilisé,comme agent de 20 visualisation B, la peroxydase provenant d'armoracie, il est possible d'utiliser, à titre de substrat de ce ferment, n'importe laquelle des solutions mentionnées ci-dessous, immédiatement après sa préparation : 25 Solution 1 : ABTC (acide 2,2'-azinobis-(3-éthyl- benzothiazoline-6-sulfonique) 1 mM, peroxyde d’hydrogène - 0,002 % dans une solution tampon au phosphate et citrate dont le pH est de 4,3.

Solution 2: o-phénylènediamine 4 mM, peroxyde d' 30 hydrogène - 0,004 % dans une solution tampon au phosphate et au citrate dont le pH est de 5 .

Solution oî 3,3',5»5'-tétraméthylène-benzidine 0,4 mM, peroxyde d'hydrogène - 0,004 % dans une solution tampon à l'acétate dont le pH est de 6,0 , 35 ou bien d'autres substrats de peroxydase qui sont 28 largement employés pour l'analyse immuno-fermentaire.

Par exemple, si l’on utilise une phosphatase alcaline à titre d’agent de visualisation B dans le· procédé de préparation du composé affino-fermentatif 5 destiné à l'indication visuelle, on peut utiliser, en tant que substrat de ce ferment, une solution contenant le p-nitrophénol phosphate 1,5 mM, le chlorure de magnésium 0,05 mM dans une solution tampon à la diéthylamine, à un pH de 9,5 , 10 ou bien n'importe quel autre substrat de phos phatase alcaline utilisé pour l'analyse immuno-f ermentaire.

Les résultats de tests réalisés sur 200 personnes à diagnostic vérifié, qui sont rassemblés 15 dans le tableau qui suit , montrent une corrélation élevée de la méthode de diagnostic proposée au degré de lésion athérosclérotique des vaisseaux.

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31 Légende des figures Sur les figures i CH = le cholestérol

Αϋ-'Ά’ ' = agent de détection A

5 Αν-’Έ** = agent de visualisation B

AL-B*fC1’ = agent de liaison C à bas poids moléculaire AL-H^C’’ = agent de liaison C à haut poids moléculaire 10 SP = surface de la peau

Claims

32
1. Procédé de préparation de composés affino-fermentatifs destinés à l’indication visuelle du cholestérol sur la surface de la peau d’un patient, 5. à base d’un agent de détection A(ayant de l'affinité vis-à-vis du cholestérol) et d'un agent de visualisation B, caractérisé en ce que l'agent de détection A choisi dans le groupe des glucosides stéroïdes qui comportent, en tant qu'agly-10 cône, un fragment de cyclopentaneperhydrophénantrène de série furostanolique ou spirostanolique et un fragment d'oligosaccharide contenant de 3 à 10 monosucres de structure linéaire ou ramifiée ; ou choisi dans le groupe des glucosid‘es tr ite rpéni-15 ques qui comportent une aglycone de série a- ou ß-amiralique, lupanique, hopanique, dami^ranique, lanostanique, holostanique et un oligosaccharide en 2 à 8 groupes de structure ramifiée ou linéaire ; ou choisi dans le groupe des protéines hydrophobes 20 susceptibles de former sélectivement un complexe avec le cholestérol , ou dans le groupe des toxines albumineuses susceptibles de former sélectivement un complexe avec le cholestérol et préparées à partir de bactéries, de microorganismes marins, d'insectes 25 ou de vipères ; ou choisi dans le groupe des antibiotiques polyéni-ques susceptibles de former sélectivement un complexe avec le cholestérol, ou dans le groupe des ferments présentant une affinité élevée vis-à-vis du 30 cholestérol , est activé par des méthodes chimiques en milieu aqueux, avec un rapport molaire A : activateur allant de 1:1 à 1:10, la concentration en agent A étant de 1 à 20 mg/ml, à une température comprise entre 0 et 35 25°C , avec un pH de 4 à 11, pendant 0,1 à 24 heures; 3¾ et l'on ajoute à la solution obtenue, respectivement, l'agent de visualisation B choisi dans le groupe de ferments constitué par l'acétylcholinestérase , la tyrosinase, la glucose-6-phosphatedéhydrogénase, 5 la glucoseoxydase, la glucoseamylase, la galacto-sidase, la peroxydase, la phosphatase alcaline ou acide, l'cc-chymotrypsine ou la pyrophosphatase, avec un rapport molaire A:B allant de 20:1 à 1:1 ; et l'on fait incuber la solution à une température 10 comprise entre 0 et 25°C pendant 1 à 24 heures.
2. Procédé de préparation de composés affino-fermentatifs destinés à l'indication visuelle du cholestérol sur la surface de la peau d'un patient, à base d'un agent de détection A (qui présente de 15 l’affinité vis-à-vis du cholestérol) et d'un agent de visualisation B, caractérisé en ce que l'agent de visualisation B choisi dans le groupe de ferments constitué par l'acétylcholinestérase, la tyrosinase, la glucose-6-phosphatedéhydrogénase, la glucose-20 oxydase, la glucoseamylase, la galactosidase, la peroxydase, la phosphatase alcaline ou acide, l'a-chymotrypsine ou la pyrophosphatase, est activé par des méthodes chimiques en milieu aqueux, avec un rapport molaire B : activateur allant de 1:1 à 1:10, 25 la concentration en agent B étant de 1 à 20 mg/ml, à une température comprise entre 0 et 25°C, avec un pH de 4 à 11, pendant 1 à 24 heures; et l'on ajoute à la solution obtenue, respectivement, l'agent de détection A choisi dans le groupe des glucosides 30 stéroïdes qui comportent, en tant qu'aglycone, un fragment de cyclopentaneperhydrophénantrène de série furostanolique ou spirostanolique et un fragment d'oligosaccharide qui comporte de 3 à 10 monosucres de structure linéaire ou ramifiée, ou choisi dans 35 le groupe des glucosides triterpéniques qui compor- » 54 tent une aglycone de série a- ou ß-amiralique, lupanique, hopanique, dammaranique, lanostanique ou holostanique et un oligosaccharide en 2 à 8 groupes de structure ramifiée ou linéaire, ou choisi dans 5 le groupe des protéines hydrophobes susceptibles de former sélectivement un complexe avec le cholestérol, ou dans le groupe des toxines albumineuses susceptibles de former sélectivement un complexe avec le cholestérol et préparées à partir de bacté-10 ries , de microorganismes marins, d'insectes ou de vipères, ou choisi dans le groupe des antibiotiques polyéniques susceptibles de former sélectivement un complexe avec le cholestérol, ou dans le groupe des ferments présentant une affinité élevée vis-à-vis 15 du cholestérol , avec un rapport molaire A : B allant de 20:1 à 1:1 ; et l'on fait incuber la solution à ,, une température comprise entre 0 et 25 °C pendant 1 à 24 heures.
5. Procédé de préparation de composés affino-20 fermentatifs destinés à l'indication visuelle du cholestérol sur la surface de la peau d'un patient, à base d'un agent de détection A (qui présente de l'affinité vis-à-vis du cholestérol) et d'un agent de visualisation B, caractérisé en ce que l'agent 25 de détection A choisi dans le groupe des glucosides stéroïdes qui comportent, en tant qu'aglycone, un fragment de cyclopentaneperhydrophénantrène de série furostanolique ou spirostanolique et un fragment d' oligosaccharide qui comporte de 5 à 10 monosucres de 50 structure linéaire ou ramifiée, ou choisi dans le groupe des glucosides triterpéniques qui comportent une aglycone de série a- ou ß-amiralique, lupanique, hopanique, dammaranique, lanostanique ou holostanique et un oligosaccharide en 2 à 8 groupes de struc-55 ture ramifiée ou linéaire, ou choisi dans le groupe 55 des protéines hydrophobes susceptibles de former sélectivement un complexe avec le cholestérol, ou dans ’ le groupe des toxines albumineuses susceptibles de former sélectivement un complexe avec le cholestérol 5 et préparées à partir de bactéries, de microorganismes marins, d'insectes ou de vipères, ou choisi dans le groupe des antibiotiques polyéniques susceptibles de former sélectivement un complexe avec le cholestérol, ou dans le groupe des ferments présentant une 10 forte affinité vis-à-vis du cholestérol, est solubilisé dans une solution tampon aqueuse saline dont le pH va de 5 à 9, à une concentration du produit A allant de 1 à 20 mg/ml ; et l'on ajoute un agent de réticulation C bifonctionnel, asymétrique, à bas 15 poids moléculaire, choisi dans le groupe constitué par le bromure de cyanogène, la trichlorotriazine ou la 2-amino-4,6-dichloro-S-triazine, avec un rapport molaire A : C allant de 1:0,5 à 1:10; on fait incuber la solution à une température comprise entre 20 0 et 20°C pendant 1 à 20 heures ; on ajoute ensuite l'agent de visualisation B choisi dans le groupe de ferments constitué par l'acétylcholinestérase, la tyrosinase, la glucose-6-phosphatedéhydrogénase, la glucose oxydase, la glucoseamylase, la galactosidase, 25 la peroxydase, la phosphatase alcaline ou acide, 1-' α-chymotrypsine ou la pyrophosphatase, avec un rapport molaire A : B allant de 20:1 à 1:1 ; et l'on fait incuber la solution à une température comprise entre 0 et 20°C pendant 1 à 48 heures .
4. Procédé de préparation de composés affino- fermentatifs destinés à l'indication visuelle du cholestérol sur la surface de la peau d'un patient, à base d'un agent de détection A (présentant de l'affinité vis-à-vis du cholestérol) et d'un agent 35 de visualisation B, caractérisé en ce que l'agent de 56 visualisation B, choisi dans le groupe des ferments constitué par l’acétylcholinestérase, la tyrosinase, la glucose-6-phosphatedéhydrogénase, la glucose-oxydase, la glucoseamylase, la galactosidase, la 5 peroxydase, la phosphatase alcaline ou acide, l'a-chymotrypsine ou la pyrophosphatase, est dissous dans une solution tampon aqueuse saline dont le pH va de 5 à 9, et la concentration dudit agent de visualisation B est comprise entre 1 et 20 mg/ml ; 10 on ajoute un agent de réticulation C bifonctionnel, asymétrique, à bas poids moléculaire choisi dans le groupe constitué par le bromure de cyanogène, la trichlorotriazine ou la 2-amino-4,6-dichloro-S-triazine, avec un rapport molaire B : C de 1:0,5 à 15 1:10 ; on fait incuber la solution à une température comprise entre 0 et 20°C pendant 1 à 20 heures et on ajoute, respectivement, un agent de détection A choisi dans le groupe constitué par les glucosides stéroïdes qui comportent, en tant qu’aglycone, un 20 fragment de cyclopentaneperhydrophénantrène de série furostanolique ou spirostanolique et un fragment d’ oligosaccharide qui comprend de 5 à 10 monosucres de structure linéaire ou ramifiée, ou choisi dans le groupe des glucosides triterpéniques qui comportent 25 une aglycone de série a- ou ß-amiralique, lupanique, hopanique, dammaranique, lanostanique ou holostani-que et un oligosaccharide en 2 à 8 groupes de structure linéaire ou ramifiée, ou choisi dans le groupe des protéines hydrophobes susceptibles de former 50 sélectivement un complexe avec le cholestérol, ou dans le groupe des toxines albumineuses susceptibles de former sélectivement un complexe avec le cholestérol et préparées à partir de bactéries, de microorganismes marins, d’insectes , de vipères, ou choisi 55 dans le groupe des antibiotiques polyéniques suscepti- 57 blés de former sélectivement un complexe avec le cholestérol, ou dans le groupe des ferments présentant une affinité élevée vis-à-vis du cholestérol, avec un rapport molaire A : B compris entre 20:1 et 5 1:1 ; et lfon fait incuber la solution à une tempé rature comprise entre 0 et 20eC pendant 1 à 48 heures.
5. Procédé de préparation de composés affino-fermentatifs destinés à l’indication visuelle du 10 cholestérol sur la surface de la peau d’un patient, à base d’un agent de détection A (présentant de l'affinité vis-à-vis du cholestérol) et d'un agent de visualisation B, caractérisé en ce que l'agent de détection A choisi dans le groupe constitué par 15 les glucosides stéroïdes qui comportent, en tant qu'aglycone, un fragment de cyclopentaneperhydro-phénantrène de série furostanolique ou spirostanoli-que et un fragment d'oligosaccharide contenant de 3 à 10 monosucres de structure linéaire ou ramifiée, 20 ou choisi dans le groupe des glucosides triterpéni-ques qui comportent une aglycone de série a- ou ß-amiralique, lupanique, hopanique, dammaranique, lanostanique ou holostanique et un oligosaccharide en 2 à 8 groupes de structure ramifiée ou linéaire, 25 ou choisi dans le groupe des protéines hydrophobes susceptibles de former sélectivement un complexe avec le cholestérol, ou dans le groupe des toxines albumineuses susceptibles de former sélectivement un complexe avec le cholestérol et préparées à partir 50 de bactéries, de microorganismes marins, d'insectes ou de vipères, ou choisi dans le groupe des antibiotiques polyéniques susceptibles de former sélectivement un complexe avec le cholestérol, ou dans * le groupe des ferments présentant une affinité éle- 55 vée vis-à-vis du cholestérol, ou choisi dans un 38 mélange desdites substances , et l'agent de visualisation B choisi dans le groupe des ferments constitué par l'acétylcholinestérase, la tyrosinase, la glucose-6-phosphatedéhydrogénase, la glucoseoxydase, 5 la glucoseamylase, la galactosidase, la peroxydase, la phosphatase alcaline ou acide, l'a-chymotrypsine, avec un rapport molaire de A : B allant de 20:1 à 1:1 , sont solubilisés dans une solution tampon aqueuse saline dont le pH va de 5 à 9» la concen-10 tration de chacun des agents A et B allant de 0,1 à 20 mg/ml ; et l'on ajoute à la solution obtenue un agent de réticulation C polyfonctionnel, à poids moléculaire élevé, constitué par des polysaccharides, des protéines ou des polymères synthétiques compor-15 tant n'importe lequel des groupes fonctionnels choisi dans la série comportant l'amine primaire, le carbo-xyle, l'hydroxyle, l'aldéhyde, l'anhydride halogéné, l'anhydride mixte, l'azide, l'hydrazide, le maléimide, l'isocyanate ou l'époxyde, avec un rapport molaire 20 (A+B) : C = 1:0,5 à 1:10 ; et on fait incuber la solution obtenue à une température comprise entre 0 et 20°C pendant 1 à 20 heures.
6. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les glucosi-25 des stéroïdes utilisés à titre d'agent de détection A sont l'agavoside A, l'agavoside B, l'agavoside C, l'agavoside D, l'agavoside F, l'agavoside H, l'agavoside G, la trilline, le funcoside C, le funcoside D, le funcoside F, le funcoside G, le funcoside I, la 30 dioscine, la gracilline, la protodiscine, la quicuba-sanine, le juncoside E, le juncoside H, la lanotigo-nine, la desglucodigitonine, la digitonine, la gito-nine, le rocoside C, le rocoside D, le rocoside E, le funcoside E, 1'alliumoside C, la polyganatonine, 35 le tétraoside de tigogénine, l'hexaoside de tigogénine, 4 59 le capsicoside, 1'ammumoside C, 1'ammumoside D, 1' ammumoside E, la desglucodesrhamnoparilline, la desglucoparilline, la parilline, le sarsaparilloside, 1'asparagoside C, l'asparagoside D, l'asparagoside G, 5 l'asparagoside H, le prothojuccoside H, le juccoside B, le lanotigoside, le monoside, le bioside, le trioside, le purpurhéagitoside, l'hécogénine, la rocogénine, la diogénine, la tigogénine, le protopo lygamatoside, la tomatonine, le licotétraoside de 10 laxogénine, le lactotétraoside d'alliogénine, le carataioside A, le cyclosiversioside H, l'acantho-phyloside C, l'alliofusoside A, 1'alliospiroside A, le cyclosiversioside P, la saponine de thé, l'acantho-phyloside B, la tigonine (sommaire), le glucoside 15 provenant de Calha Polypatala ou le cyclosiversioside G.
7. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que l'agent de détection A utilisé est constitué par les funcosides C, D, E, F, G ou I, la 20 dioscine, le rocoside, la lantigonine, la digitonine ou la tomatonine.
8. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que l'agent de détection A utilisé est constitué par la digitonine ou la tomatonine.
9. Procédé suivant l’une quelconque des re vendications 1 à 5» caractérisé en ce que les gluco-sides triterpéniques utilisés à titre d'agent de détection A sont constitués par l'escine, l'avénacine, la théasaponine, 1'α-hédérine, le cauloside C, le 30 stichionoside A, la cyclamine, la quinovine, les saponines provenant de la betterave à sucre, le gypsoside,ou les glucosides triterpéniques obtenus à partir de Fatsia Japonica.
10. Procédé suivant l'une quelconque des 35 revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les 40 protéines hydrophobes utilisées à titre d’agent de détection A sont constituées par la protéine méilini-que de Folch, les protéines de lysosomes et de mito-chondriums, le fibrinogène, les immunoglobulines, 5 le cérébrone, la myoglobine, la tripsine, le cytochrome C, le cytochrome P-450, les apo-protéines de lipoprotéines.
11. Procédé suivant l’une quelconque des revendications 1 à 5» caractérisé en ce que les toxines 10 albumineuses utilisées à titre d'agent de détection A sont constituées par la Streptolysine o, la pneumo-lysine, la listériolysine, la θ-toxine C.I préparée à partir de Perfringens , de type A et C, la ô-toxine CI, novyi de type A ou C, l'hémolysine C.I. 15 histolyticum, l'hémolysine C.I. botulinum de type C et D, la tétanolysine, la céréolysine, l’alvéo-lysine, la turinguéolysine, la cytotoxine préparée à partir de l’actinie Metridium Senile.
12. Procédé suivant l’une quelconque des re- 20 vendications 1 à 5» caractérisé en ce que l'agent de détection A constitué par les antibiotiques poly-éniques est représenté par l’amphotéricine B, la philipine ou la nistatine.
13. Procédé suivant l’une quelconque des re- 25 vendications 1 à 5, caractérisé en ce que les ferments à forte affinité, utilisés à titre d’agent de détection A sont constitués par les cholestéro-oxydases, les cholestérodéhydrogénases ou les cho-lestéro-estérases.
14. Procédé suivant la revendication 5, carac térisé, en ce que l'agent de réticulation C à haut poids moléculaire utilisé est constitué par les copolymères d'acide acrylique ou d'anhydride maléique .
15. Procédé suivant la revendication 14, i 41 caractérisé en ce que l’agent de réticulation C à haut poids moléculaire utilisé est constitué par un copolymère de N-vinylpyrrolidone avec l'anhydride maléique.
16. Procédé suivant l'une quelconque des re vendications 1 à 15, caractérisé en ce qu'on utilise, pour l'activation chimique de l'agent de détection A ou de l’agent de visualisation B, des méthodes connues en soi, carbodiimidique, succinimidique, azidi-10 que ou la méthode d'oxydation aux périodates.
17. Procédé suivant la revendication 16, caractérisé en ce qu'on utilise, pour l'activation chimique de l'agent de détection A ou de l'agent de visualisation B, la méthode carbodiimidique ou la 15 méthode d'oxydation aux périodates.
18. Procédé de préparation de composés affino-fermentatifs destinés à l'indication visuelle du cholestérol sur la surface de la peau d’un patient, à base d'un agent de détection A qui possède une 20 affinité vis-à-vis du cholestérol, et d'un agent de visualisation B, suivant l'une quelconque des revendications 1 à 9 et 12, caractérisé en ce que l'agent de détection A choisi dans le groupe des glucosides stéroïdes qui comportent, en tant qu’aglycone, un 25 fragment cyclopentaneperhydrophénantrène de série furostanolique ou spirostanolique et un fragment d' oligosaccharide contenant de 5 à 10 mono sucre s de structure linéaire ou ramifiée, ou choisi dans le groupe des glucosides triterpéniques qui comportent 50 une aglycone de série a- ou ß-amirilique, lupanique, hopanique, dammaranique, linostanique ou holostani-que et lin oligosaccharide en 2 à 8 groupes de structure ramifiée ou linéaire, ou choisi dans le groupe des antibiotiques polyéniques susceptibles de former 55 sélectivement un complexe avec le cholestérol, ou » 42 dans un mélange desdites substances, est solubilisé préalablement dans un solvant polaire aprotique; et on ajoute un agent de réticulation C polyfonction-nel à haut poids moléculaire, choisi dans le groupe 5 constitué par les polysaccharides, les protéines ou les polymères synthétiques contenant n'importe lequel parmi les groupes fonctionnels choisis dans la série constituée par l'amine primaire, le carbo-xyle, l'hydroxyle, l'aldéhyde, l'anhydride halogène, 10 l'anhydride mixte, l'imido-éther, l'azide, l'hydra-zide, le maléimide, l'isocyanate, l'époxyde, en une concentration de chacun des agents A et C allant de 1 à 20 mg/ml et avec un rapport molaire CïA de 100:1 à 10:1 ; et l'on fait incuber la solution à une 15 température comprise entre 20 et 120°C pendant 0,5 à 6 heures ; on réalise ensuite, par une méthode connue en soi, une précipitation du produit obtenu (A-C) du solvant ; on maintient le produit obtenu sous vide sur du pentoxyde de phosphore, à une tem-20 pérature comprise entre 80 et 120°C pendant 4 à 10 heures; et on ajoute, à une solution tampon aqueuse saline dont le pH va de 5 à 9 et où est dissous l'agent de visualisation B choisi dans le groupe des ferments constitué par l'acétylcholinestérase, la 25 tyrosinase, la glucose-6-phosphatedéhydrogénase, la glucoseoxydase, la glucoseamylase, la galactosidase, la peroxydase, la phosphatase alcaline ou acide, l'a-chymotrypsine ou la pyrophosphatase, à une concentration comprise entre 1 et 10 mg/ml , le produit 30 sec obtenu (A-C) en une concentration allant de 2 à 20 mg/ml ; et l'on fait incuber la solution à une température comprise entre 4 et 8°C pendant 2 à 12 heures.
19. Procédé suivant la revendication 18, 35 caractérisé en ce que le solvant polaire aprotique 4S t utilisé est constitué par le diméthylsulfoxyde, le diméthylformamide, l'hexaméthanol, un mélange de diméthylformamide et de toluène dans un rapport de 2:1 ou un mélange de diméthylformamide et d'hexanol 5 dans un rapport de 2:1.
20. Procédé suivant l'une quelconque des revendications <5 à 5> 18, 19, caractérisé en ce que les solutions aqueuses salines utilisées sont des solutions choisies dans la série constituée par des 10 solutions de borate, de citrate ou de phosphate, assurant une action tampon dans l'intervalle de pH compris entre 5 et 9.
21. Produit préparé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 20.
22. Application, pour la visualisation des composés obtenus suivant l'une quelconque des revendications 1 à 20, d'un substrat choisi à titre d'agent de visualisation B du ferment (substrat) qui forme avec le composé préparé un produit coloré.