JPS5850719B2 - トリグリセライドの定量方法 - Google Patents
トリグリセライドの定量方法Info
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- JPS5850719B2 JPS5850719B2 JP53127328A JP12732878A JPS5850719B2 JP S5850719 B2 JPS5850719 B2 JP S5850719B2 JP 53127328 A JP53127328 A JP 53127328A JP 12732878 A JP12732878 A JP 12732878A JP S5850719 B2 JPS5850719 B2 JP S5850719B2
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- reagent
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/61—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving triglycerides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はトリグリセライドの定量方法に関する。
さらに詳しくは、トリグリセライドに由来するグリセロ
ールにグリセロールオキシダーゼを作用させ、生皮する
グリセルアルデハイドもしくは過酸化水素または消費さ
れる酸素の量を測定するととを特徴とするトリグリセラ
イドの定量方法に関する。
ールにグリセロールオキシダーゼを作用させ、生皮する
グリセルアルデハイドもしくは過酸化水素または消費さ
れる酸素の量を測定するととを特徴とするトリグリセラ
イドの定量方法に関する。
その目的は、血清中の中性脂肪を迅速、簡便に定量する
方法を提供するにある。
方法を提供するにある。
中性脂肪上としてトリグリセライドの定量は高脂血症の
脂質検査の一つとして臨床的に重要な検査項目となって
いるので、その定量法は種々開発されている〔臨床病理
２４（８）６７５ （１９７６） ）。
脂質検査の一つとして臨床的に重要な検査項目となって
いるので、その定量法は種々開発されている〔臨床病理
２４（８）６７５ （１９７６） ）。
従来の検査法としては（１）有機溶媒を用いて抽出し苛
性カリ−エタノール溶液でケン化し、発生したグリセリ
ンをメタ過ヨウ素酸ナトリウム液で酸化し、アセチルア
セトンと反応させ、４１０ ｎｍの吸光度を測定するア
セチルアセトン法〔臨床検査１４（５）４９８（１９７
０）〕、 （２）酵素を用いる方法〔特開昭４９−１１３６９５１
３６９５号公報〕れているが、これらの方法では強酸や
強アルカリを用いるので操作が煩雑である。
性カリ−エタノール溶液でケン化し、発生したグリセリ
ンをメタ過ヨウ素酸ナトリウム液で酸化し、アセチルア
セトンと反応させ、４１０ ｎｍの吸光度を測定するア
セチルアセトン法〔臨床検査１４（５）４９８（１９７
０）〕、 （２）酵素を用いる方法〔特開昭４９−１１３６９５１
３６９５号公報〕れているが、これらの方法では強酸や
強アルカリを用いるので操作が煩雑である。
オた（３） テトラゾリウム系の発色を利用した酵素
反応系を用いる定量法〔特開昭５１−６８２９７号公報
〕が開発されたが、この方法では、色素が測定器のチュ
ーブに付着したり、キャリーオーバしたり、測定値がば
らつくなどの問題がある。
反応系を用いる定量法〔特開昭５１−６８２９７号公報
〕が開発されたが、この方法では、色素が測定器のチュ
ーブに付着したり、キャリーオーバしたり、測定値がば
らつくなどの問題がある。
最近では測定の自動化が進み、これらの機器に組み入れ
られる測定試薬が望すれているが、上記したごとき従来
法の試薬では自動分析への応用が困難である。
られる測定試薬が望すれているが、上記したごとき従来
法の試薬では自動分析への応用が困難である。
本発明者らは、トリグリセライドの自動分析に応用でき
る定量法釦よび定量試薬について検討り。
る定量法釦よび定量試薬について検討り。
た結果、本発明者らが新規に見出したグリセロールオキ
シダーゼを用いる酵素的方法によればトリグリセライド
定量の自動分析が簡便、精確、迅速に行なえることを見
出し本発明を完成するに致った。
シダーゼを用いる酵素的方法によればトリグリセライド
定量の自動分析が簡便、精確、迅速に行なえることを見
出し本発明を完成するに致った。
本発明によれば、トリグリセライドを加溶媒分解（例え
ば加水分解など）して生じたグリセロールにグリセロー
ルオキシダーゼを作用させ、グリセルアルデハイド、過
酸化水素などの生成物ｔｉは消費される酸素の量を測定
することによってトリグリセライ ドの量を算出することができる。
ば加水分解など）して生じたグリセロールにグリセロー
ルオキシダーゼを作用させ、グリセルアルデハイド、過
酸化水素などの生成物ｔｉは消費される酸素の量を測定
することによってトリグリセライ ドの量を算出することができる。
本発明方法の反応機構を式で示せば次のとｉ−Ｊカ＊で
ある。
ある。
本発明方法はトリグリセライドを含有するものｉら、い
かなる試料にも応用できるが、血液、血清中のトリグリ
セライドの定量に用いると便利である。
かなる試料にも応用できるが、血液、血清中のトリグリ
セライドの定量に用いると便利である。
トリグリセライドの加溶媒分解法の一つである加水分解
法としては、リポプロティンリパーゼ（以下ＬＰＬと略
記する）、コレステロールエステラーゼ、！たはリパー
ゼとプロテアーゼ（α−キモトリプシン）などを用いる
酵素的方法（ＣＩｉｎ。
法としては、リポプロティンリパーゼ（以下ＬＰＬと略
記する）、コレステロールエステラーゼ、！たはリパー
ゼとプロテアーゼ（α−キモトリプシン）などを用いる
酵素的方法（ＣＩｉｎ。
Ｃｈｅｍ、、 １９．４７６−４８２ 、１９７３ ’
）、苛性カリ−アルコール溶液を用いるケン化法〔病床
病理１４（５）４９８（１９７０）〕など公知の方法が
利用できる。
）、苛性カリ−アルコール溶液を用いるケン化法〔病床
病理１４（５）４９８（１９７０）〕など公知の方法が
利用できる。
グリセロールオキシダーゼ（以下ＣＯＤと略記する）と
しては微生物起源の酵素を用いるのが好適である。
しては微生物起源の酵素を用いるのが好適である。
具体的に好適な例としてはアスペルギルス属オたはニュ
ーロスポラ属に属する微生物より得られるＣＯＤがあげ
られる。
ーロスポラ属に属する微生物より得られるＣＯＤがあげ
られる。
ＣＯＤは本発明者らがはじめて見出した酵素であり、本
出願人による特願昭５２−４４１４６号出願明細書にそ
の製造法は詳細に説明しであるが、後の参考例にＣＯＤ
の具体的製造法の例を示す。
出願人による特願昭５２−４４１４６号出願明細書にそ
の製造法は詳細に説明しであるが、後の参考例にＣＯＤ
の具体的製造法の例を示す。
ｆｌＧＯＤの力価は３７℃で１分間にグリセロールを１
μｍｏｌｅ分解する酵素量を１単位とし、力価の測定法
はＣ，Ｃ−Ａ１１ａｉｎ Ｃ−）ＣＩｉｎ−Ｃｈｅｍ−
ｔ ２０５４７０（１９７４）に記載された反応原理に
基いて行った。
μｍｏｌｅ分解する酵素量を１単位とし、力価の測定法
はＣ，Ｃ−Ａ１１ａｉｎ Ｃ−）ＣＩｉｎ−Ｃｈｅｍ−
ｔ ２０５４７０（１９７４）に記載された反応原理に
基いて行った。
グリセロールを分解して生成する過酸化水素の定量には
パーオキシダーゼを用いる方法釦よびカタラーゼを用い
る方法が用いられる。
パーオキシダーゼを用いる方法釦よびカタラーゼを用い
る方法が用いられる。
パーオキシダーゼ（以下ＰＯＤと略記する）を用いる方
法としては、過剰のフェノールの存在下でＰＯＤの作用
により４−アミノアンチピリンと反応させて赤色のキノ
ン色素を導き５０５ｎｍの吸光度を測定する方法（ＣＩ
ｉｎ−Ｃｈｅｍ、２０ 、４７０ 。
法としては、過剰のフェノールの存在下でＰＯＤの作用
により４−アミノアンチピリンと反応させて赤色のキノ
ン色素を導き５０５ｎｍの吸光度を測定する方法（ＣＩ
ｉｎ−Ｃｈｅｍ、２０ 、４７０ 。
１９７４）が用いられる。
この方法では、黄痕症状時にみられる高ビリルビン血清
などを定量する場合、５０５ｎｍの測定でブランク値が
高くなって精度が落ちる場合がある。
などを定量する場合、５０５ｎｍの測定でブランク値が
高くなって精度が落ちる場合がある。
このようなときは、フェノールの代りにＮ、Ｎ−ジメチ
ルアニリン。
ルアニリン。
１−アミノ−８−ナフトール−２，４−ジスルフオニツ
クアシツド々どを用いて、５５０ｎｍの吸光値を測定す
れば、血清ブランクの必要なしに測定することができる
。
クアシツド々どを用いて、５５０ｎｍの吸光値を測定す
れば、血清ブランクの必要なしに測定することができる
。
また、この方法では、４−アミノアンチピリンを２．６
−ジクロルフェノールインドフェノールＣＣ１ａｒｋ
＆Ｔｉｍｕｓ 、 Ｐｒｏｃ。
−ジクロルフェノールインドフェノールＣＣ１ａｒｋ
＆Ｔｉｍｕｓ 、 Ｐｒｏｃ。
Ａｓ５ｏｃ、ＣＣｌ１ｎ−Ｂｉｏｃｈｅ、５ 、６１
（１９６１’） 〕、〕３−メチルー２−ベンゾチアゾ
ロンヒドラチン ＭＢＴＨ） ＣＲ，Ｎｅ１ｌｌ Ｃａ
ｒｅｙ ｓ Ｃ１１ｎ−Ｃｈｅｍ、 ２０（５） ５９
５ （１９７４’） ）にかえたり、青色生成物を得る
ためニハーオキシダーゼの存在下にグアヤク脂と反応さ
せることもできるＣＭｏｒ ｉ ｅｙ Ｄａｗｓｏｎ＆
Ｍａｒｋｓ 、 Ｐｒｏｃ−Ａｓ５ｏｃ、 Ｃｌ１ｎ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ５ 、４２（１９６８）ｌ）。
（１９６１’） 〕、〕３−メチルー２−ベンゾチアゾ
ロンヒドラチン ＭＢＴＨ） ＣＲ，Ｎｅ１ｌｌ Ｃａ
ｒｅｙ ｓ Ｃ１１ｎ−Ｃｈｅｍ、 ２０（５） ５９
５ （１９７４’） ）にかえたり、青色生成物を得る
ためニハーオキシダーゼの存在下にグアヤク脂と反応さ
せることもできるＣＭｏｒ ｉ ｅｙ Ｄａｗｓｏｎ＆
Ｍａｒｋｓ 、 Ｐｒｏｃ−Ａｓ５ｏｃ、 Ｃｌ１ｎ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ５ 、４２（１９６８）ｌ）。
さらに、過酸化水素はＰＯＤの存在下、アルカリ性溶液
中でホモバニリン酸を高蛍光生成物に酸化するので、こ
の蛍光を測定して過酸化水素を定量することができる。
中でホモバニリン酸を高蛍光生成物に酸化するので、こ
の蛍光を測定して過酸化水素を定量することができる。
カタラーゼを用いる方法としては、過酸化水素とメタノ
ールにカタラーゼを作用させて生成するホルムアルデヒ
ドをアンモニアの存在下アセチルアセトンと縮合させ、
黄色の色素３．５−ジアセチル−１，４−ジヒドロルチ
ジンとし、この黄色色素を比色定量することによる方法
を用いることができる。
ールにカタラーゼを作用させて生成するホルムアルデヒ
ドをアンモニアの存在下アセチルアセトンと縮合させ、
黄色の色素３．５−ジアセチル−１，４−ジヒドロルチ
ジンとし、この黄色色素を比色定量することによる方法
を用いることができる。
この場合、発色する色素が血清の色調と同じであること
などから血清ブランクをとる必要があるが一段階で反応
を進めることができるので自動分析が可能である。
などから血清ブランクをとる必要があるが一段階で反応
を進めることができるので自動分析が可能である。
生成するグリセルアルデハイドの定量には、グリセルア
ルデヒドを含む液に強アルカリ性下２．４−ジニトロフ
ェニルヒドラジンを作用させ、生成した２、４−ジニト
ロフェニルヒドラゾン（着色物質）を４９５ ｎｍの波
長で吸光測定する方法が用いられる。
ルデヒドを含む液に強アルカリ性下２．４−ジニトロフ
ェニルヒドラジンを作用させ、生成した２、４−ジニト
ロフェニルヒドラゾン（着色物質）を４９５ ｎｍの波
長で吸光測定する方法が用いられる。
しかし、この方法では酵素反応系と発色系のｐＨが異な
るので自動化には不便である。
るので自動化には不便である。
グリセロール量を酸素の消費量から定量する場合は、ト
リグリセライドをケン化する試薬とグリセロールオキシ
ダーゼを緩衝剤に溶解し、脱酸素電極を用いて、酸素の
分圧比より酸素の消費量を求め、グリセロール量を算出
することができる。
リグリセライドをケン化する試薬とグリセロールオキシ
ダーゼを緩衝剤に溶解し、脱酸素電極を用いて、酸素の
分圧比より酸素の消費量を求め、グリセロール量を算出
することができる。
本発明方法に釦いて、血清中のトリグリセライド濃度が
高い場合には血清が混濁していることがある。
高い場合には血清が混濁していることがある。
これらの混濁は酵素反応の進行により少なくなり分光測
定を妨げるようなコロイド状懸濁液を生成することはな
いが、トリトンＸＩ ００ （エチレンオキサイド約１
０モルを含むイソオクチルフェノキシポリエトキシエタ
ノール、和光紬薬工業社製）やＢｒ１ｊ３５（ポリオキ
シエチレンラウリルエーテル、和光紬薬工業社製）など
の界面活性剤なｏ、１％程度試薬中に存在させることに
よってトリグリセライドを可溶化し混濁を減少させるこ
ともできる。
定を妨げるようなコロイド状懸濁液を生成することはな
いが、トリトンＸＩ ００ （エチレンオキサイド約１
０モルを含むイソオクチルフェノキシポリエトキシエタ
ノール、和光紬薬工業社製）やＢｒ１ｊ３５（ポリオキ
シエチレンラウリルエーテル、和光紬薬工業社製）など
の界面活性剤なｏ、１％程度試薬中に存在させることに
よってトリグリセライドを可溶化し混濁を減少させるこ
ともできる。
本発明によるトリグリセライド測定用組成物はトリグリ
セライドを加溶媒分解するための試薬渣たは酵素類、グ
リセロールオキシダーゼ、過酸化水素釦よびグリセルア
ルデハイド測定用の試薬捷たは酵素類ならびに酸素消費
量を測定するための試薬を適当に組合わせる。
セライドを加溶媒分解するための試薬渣たは酵素類、グ
リセロールオキシダーゼ、過酸化水素釦よびグリセルア
ルデハイド測定用の試薬捷たは酵素類ならびに酸素消費
量を測定するための試薬を適当に組合わせる。
試薬類、酵素類は液剤固型剤もしくは凍結乾燥製剤とし
、必要に応じて使用前に緩衝液を添加して測定用試薬と
する。
、必要に応じて使用前に緩衝液を添加して測定用試薬と
する。
本発明によるトリグリセライド定量用組成物およびそれ
を用いる定量法の一例を次の実施例に示す。
を用いる定量法の一例を次の実施例に示す。
実施例 Ｉ
■ 試薬の組成
（１）酵素試薬−■
リパーゼ（生化学工業社製、以下同じ）
６×１０単位
（単位は国際単位を示す。
以下同じ）α−キモトリプシン（生化学工業社製、以下
同じ） ２×１０単位 ４−アミノアンチピリン ６０ｍ９ 以上を０．１ＭＴＥＳ緩衝液（ＴＥＳ ： Ｎ−Ｔｒｉ
ｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅ ｔｈｙｌ ）ｍｅｔｈｙｌ
２− ａｍｉｎｏｍｅ ｔｈａｎｅａｕｌｆｏｎｉｃ
ａｃｉｄ ｔＧｏｏｄ ｓＮ、Ｅ、ｅｔａｌＢｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ５．４６７（１９６６）：）（ｐＨ８，
０）に溶解し２５ｍ１とする。
同じ） ２×１０単位 ４−アミノアンチピリン ６０ｍ９ 以上を０．１ＭＴＥＳ緩衝液（ＴＥＳ ： Ｎ−Ｔｒｉ
ｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅ ｔｈｙｌ ）ｍｅｔｈｙｌ
２− ａｍｉｎｏｍｅ ｔｈａｎｅａｕｌｆｏｎｉｃ
ａｃｉｄ ｔＧｏｏｄ ｓＮ、Ｅ、ｅｔａｌＢｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ５．４６７（１９６６）：）（ｐＨ８，
０）に溶解し２５ｍ１とする。
この液を１０ｍ１のバイアル瓶に２、５ ｍｌずつ分注
し、凍結乾燥する。
し、凍結乾燥する。
（２）酵素試薬−■
Ｃ０Ｄ（参考例１で製造したもの）５００単位Ｐ ＯＤ
（Ｗｏｒｔｈｉｎｇ ｔｏｎ社製 以下同じ）１５０
０単位 以上を０．１ＭＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解し２
：５ｍｌとする。
（Ｗｏｒｔｈｉｎｇ ｔｏｎ社製 以下同じ）１５０
０単位 以上を０．１ＭＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解し２
：５ｍｌとする。
この液を２．５ｍｌずつバイアル瓶に分注し凍結乾燥す
る。
る。
（３）発色液
フェノール３００■、トリトンＸ１００
３００１１１ｇを０．１Ｍ ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ８，
０）に溶解し３００ｍ１とする。
０）に溶解し３００ｍ１とする。
（４）標準液
グリセロール２６ｒｒ１ｇを０．１Ｍ’ｒＥｓ緩衝液（
ｐＨ８，０’）ＩＩＣ溶解し２て１００７ｆｉ／！とす
る。
ｐＨ８，０’）ＩＩＣ溶解し２て１００７ｆｉ／！とす
る。
これはトリオレインとして２５０ ｍｑＡｔに相当する
。
。
■ 操作法
酵素試薬−Ｉ ｉ−よび酵素試薬−■のバイアルを発色
液３０ｍ１に溶解し、反応液とする。
液３０ｍ１に溶解し、反応液とする。
反応液３ｍｌをとり、これに血清（検体）０．０２ｍ１
を加えて３７℃で１０分間反応を行なわせる。
を加えて３７℃で１０分間反応を行なわせる。
反応液の５０５ｎｍに釦ける吸光度を測定する。
別に、標準液釦よび試薬ブランクを用いて検量線を作成
し、これに前記測定結果をあてはめて検体中のトリグリ
セライドの量を算出する。
し、これに前記測定結果をあてはめて検体中のトリグリ
セライドの量を算出する。
血清サンプル５検体について測定を行った結果は下表の
通り。
通り。
血清崖は実施例１〜５を通じて共通である。
実施例 ２
■ 試薬の組成
（１）酵素試薬
ＬＰＬ峙開昭５３−６９８７８号記載の方法でリゾープ
ス属菌から製造したもの。
ス属菌から製造したもの。
以下同じ） ２０．０００単位
Ｃ０Ｄ（参考例１で示したもの） ５００単位ＰＯＤ
１．０００単位４−アミノアン
チピリン ６０ｍｆ！以上を０．１ＭＴＥＳ緩
衛液（ｐＨ６，８）２５ｍｌに溶解した後グラスフィル
ターＧ４（柴田化学器機工業社製）で済過し、バイアル
瓶１０個に分注して凍結乾燥する。
１．０００単位４−アミノアン
チピリン ６０ｍｆ！以上を０．１ＭＴＥＳ緩
衛液（ｐＨ６，８）２５ｍｌに溶解した後グラスフィル
ターＧ４（柴田化学器機工業社製）で済過し、バイアル
瓶１０個に分注して凍結乾燥する。
（２）発色液
ジメヂルアニリン３５０■を水５ｍｌに溶解する。
（３）緩衝液
トリトンＸ１００ ０．３ｍｌを０−ＩＭＴＥＳ緩衝液
（ｐＨ６，８）に溶解して３００ｍ１とする。
（ｐＨ６，８）に溶解して３００ｍ１とする。
（４）標準液
実施例１に同じ。
■ 操作法
酵素試薬１バイアルを緩衝液３０ｍ１で溶解し、これに
発色液０．５ ｍｌを加え、反応液とする。
発色液０．５ ｍｌを加え、反応液とする。
反応液３ｍｌをとり、これに血清（検体’）０．０２ｍ
１を加え３７℃で１０分間反応を行う。
１を加え３７℃で１０分間反応を行う。
反応液の５５０ｎｍ［ｉ−ける吸光度を測定する。
別に、標準液訃よび試薬ブランクを用いて検量線を作成
し、これに前記測定結果をあてはめて検体中のトリグリ
セライドの量を算出する。
し、これに前記測定結果をあてはめて検体中のトリグリ
セライドの量を算出する。
血清サンプル５検体について測定を行った結果は下表の
通り。
通り。
実施例 ３
■ 試薬の組成
（１）酵素試薬
Ｃ０Ｄ（参考例１で製造したもの）５０単位乳糖
５０１１Ｉｆ！ 以上を精製水１０ｍ１に溶解し、バイアル瓶１０個に分
注し、凍結乾燥する。
５０１１Ｉｆ！ 以上を精製水１０ｍ１に溶解し、バイアル瓶１０個に分
注し、凍結乾燥する。
（２）加水分解用溶液（苛性カリ−アルコール溶液）
水酸化カリウム５．６２を無水エタノール１００ｍ１に
溶解する。
溶解する。
（３）中和剤（ＩＮ塩酸）
塩酸９５ｍ／Ｉｃ精製水を加えて１００１ｎｌとする。
（４）緩衝液（０，１Ｍアンモニア緩衝液）０、１ Ｍ
塩化アンモニウム液９６ｍ１と０．ＩＮアンモニア水溶
液３ｍｌを混合する。
塩化アンモニウム液９６ｍ１と０．ＩＮアンモニア水溶
液３ｍｌを混合する。
（５）標準液
実施例ＩＫ同じ。
ａ 操作法
血清０．０２ｍ１を試験管にと９、加水分解用溶液０．
１ ｍｌを加え、試料液Ａとする。
１ ｍｌを加え、試料液Ａとする。
次に酵素試薬１バイアルを緩衝液１ｍＪｉｇ溶解し、試
料液Ｂとする。
料液Ｂとする。
試料液Ａを７５℃で１０分間反応させて加水分解を行う
。
。
これに中和剤０．１ｍｌを加えさらに緩衝液３ｍｌを加
え、３７℃で１０分間加温する。
え、３７℃で１０分間加温する。
この試験管に膜酵素電極（ペックマン１６０℃、ベック
マン社製）を装着する。
マン社製）を装着する。
加温後、試料液Ｂを０．１ ｍｌマイクロシリンジによ
り液面下に針先が入るようにして投入する。
り液面下に針先が入るようにして投入する。
必要なら小回転子で攪拌する等して酸素量の変化を読む
。
。
別に標準液および試薬ブランクを用いて検量線を作威し
、これに前記側床結果をあてはめて検体中のトリグリセ
ライドの量を算出する。
、これに前記側床結果をあてはめて検体中のトリグリセ
ライドの量を算出する。
血清サンプル５検体について測定を行った結果は下表の
通り。
通り。
実施例 ４
■ 試薬の組成
（１）酵素試薬
リパーゼ ６×１０ 単位α−キモト
リプシン ２．６Ｘ１０ 単位４−アミノアン
チピリン ６０９ＣＯＤ（参考例１で製造した
もの）５００単位ＰＯＤ １
０００単位Ｄ−マンニット ２００■
以上をよ〈混合し、広口のガラス瓶５本に分注する。
リプシン ２．６Ｘ１０ 単位４−アミノアン
チピリン ６０９ＣＯＤ（参考例１で製造した
もの）５００単位ＰＯＤ １
０００単位Ｄ−マンニット ２００■
以上をよ〈混合し、広口のガラス瓶５本に分注する。
（２）緩衝液
フェノール３００■）トリトンＸ１００
３００■を０．１ Ｍアンモニア緩衝液（ｐＨ８，０）
で１００呵とする。
で１００呵とする。
（３）標準液
実施例１に同じ。
■ 操作法
酵素試薬１本を緩衝液２０ｍ１ｂよび精製水４０ｍ１に
溶解し試料液とする。
溶解し試料液とする。
この試料液３呵に血清２０μｔを入れ３７℃で反応させ
、１分会よび５分の５０５ ｎｍの吸光度を読む。
、１分会よび５分の５０５ ｎｍの吸光度を読む。
別に、標準液を用いて検量線を作成し、これに前記測定
結果をあてはめて検体中のトリグリセライドの量を算出
する。
結果をあてはめて検体中のトリグリセライドの量を算出
する。
血清サンプル５検体について測定を行った結果は下表の
通り。
通り。
９実施例 ５
■ 試薬の組成
（１）酵素試薬
ＬＰＬ ２００００単位Ｃ０Ｄ（
参考例２で製造したもの）５００単位ＰＯＤ
１５００単位４−アミノアンチピリン
６０■乳糖 ４０■ 以上を精製水２０ｍ１に溶解し、ガラスフィルターＧ３
で濾過し、５ｍｆｆつバイアル瓶に分注し、凍結乾燥す
る。
参考例２で製造したもの）５００単位ＰＯＤ
１５００単位４−アミノアンチピリン
６０■乳糖 ４０■ 以上を精製水２０ｍ１に溶解し、ガラスフィルターＧ３
で濾過し、５ｍｆｆつバイアル瓶に分注し、凍結乾燥す
る。
（２）緩衝液
７１−／−ル３００７１１ＩＩ、 ０．３ｍｌトリトン
Ｘ１００を０．１Ｍアンモニア緩衝液（ｐＨ８，０）に
溶解し３００ｍ１とする。
Ｘ１００を０．１Ｍアンモニア緩衝液（ｐＨ８，０）に
溶解し３００ｍ１とする。
（３）標準液
実施例１と同じ。
■ 操作法
酵素試薬１本を緩衝液７５ｍ１に溶解し反応液とする。
反応液３ｍｌに血清０．０２ｍ１を加えて３７℃で１０
分間反応させ、５０５ｎｍの吸光度を測定する。
分間反応させ、５０５ｎｍの吸光度を測定する。
別に、標準液釦よび試薬ブランクを用いて検量線を作成
し、これに前記測定結果をあてはめて検体中のトリグリ
セライドの量を算出する。
し、これに前記測定結果をあてはめて検体中のトリグリ
セライドの量を算出する。
血清１６検体についての定量結果を下表に示す。
捷た同じ血清についてアセチルアセトン法を用いて定量
した結果も下表に示す。
した結果も下表に示す。
参考例
アスペルギルス・ジャポニカスＫＹ−４５ＣＡＴＣＣ１
０４２ 、ＮＲＲＬ１１１０２（微生物寄 託受理番号第３９５９号）〕を２を三角フラスコ中、グ
リセロール１０ｆ／ｌ、麦芽エキス１０ ？／ｌ。
０４２ 、ＮＲＲＬ１１１０２（微生物寄 託受理番号第３９５９号）〕を２を三角フラスコ中、グ
リセロール１０ｆ／ｌ、麦芽エキス１０ ？／ｌ。
酵母エキス５ ’？／ｌの組成を有する種培地（殺菌前
ｐＨ６，２）３００ｍｌに植菌し、３０℃で４８時間振
盪培養する。
ｐＨ６，２）３００ｍｌに植菌し、３０℃で４８時間振
盪培養する。
この種培養液９００ｍ１（フラスコ３本分）を、３０ｔ
ジャーファーメンタ−中上記種培地と同じ培地１５ｔに
植菌し、３０℃で４０時間、通気（１５ｔ／分）攪拌（
２５０ｒｐｍ）培養後、この培養液をプフナー漏斗を用
いて済過し；水で洗浄後、菌体約１５０２（乾重量）を
得る。
ジャーファーメンタ−中上記種培地と同じ培地１５ｔに
植菌し、３０℃で４０時間、通気（１５ｔ／分）攪拌（
２５０ｒｐｍ）培養後、この培養液をプフナー漏斗を用
いて済過し；水で洗浄後、菌体約１５０２（乾重量）を
得る。
この菌体を１０ｍＭ燐酸バッファー（ｐＨ７，１５ｔに
懸濁し、ＤＹＮＯ−ＭＩＬＬ （ＷｉｌｌｙＡＢａｃ
ｈｏ’ｆ ｅｎ社製、スイス）にかげ菌体を磨砕した後
、冷凍遠心分離（２００００Ｘｆ、２０分）し、上清液
４．７ｔ（蛋白量５１Ｓ’、比活性０．０５ｕｎｉ ｔ
／”２１Ｆ）を得る。
懸濁し、ＤＹＮＯ−ＭＩＬＬ （ＷｉｌｌｙＡＢａｃ
ｈｏ’ｆ ｅｎ社製、スイス）にかげ菌体を磨砕した後
、冷凍遠心分離（２００００Ｘｆ、２０分）し、上清液
４．７ｔ（蛋白量５１Ｓ’、比活性０．０５ｕｎｉ ｔ
／”２１Ｆ）を得る。
得られた上清液に硫酸アンモニウムを加え、硫酸アンモ
ニウム３０〜７０％飽和で沈澱する区分をとり、１０ｍ
Ｍ ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７，０）５０ｒｕｌに溶解す
る。
ニウム３０〜７０％飽和で沈澱する区分をとり、１０ｍ
Ｍ ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７，０）５０ｒｕｌに溶解す
る。
この溶液をセロファンチューブを透析膜として１０ｍＭ
ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７，０）１０１に対して透析する。
ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７，０）１０１に対して透析する。
１２時間訃きに透析液をとりかえながら１合計４０ｔの
透析液で４８時間透析した酵素液を予め１０ｍＭＴＥＳ
緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロー
ス（５ｅｒｖａ社製、西独）のカラム（５，５Ｘ ４０
ｃｒｎ）に通す。
透析液で４８時間透析した酵素液を予め１０ｍＭＴＥＳ
緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロー
ス（５ｅｒｖａ社製、西独）のカラム（５，５Ｘ ４０
ｃｒｎ）に通す。
この操作で、酵素は吸着され、同じ緩衝液で、吸着され
ない不純蛋白を洗滌し次に１０ｍＭ ＴＥＳ緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）ｌｔ−Ｌ−よび２００ｍＭＴＥＳ緩衝液（ｐ
Ｈ７，０’） １ｔを用いて濃度勾配で溶出すると、グ
リセロール・オキシダーゼは溶出される。
ない不純蛋白を洗滌し次に１０ｍＭ ＴＥＳ緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）ｌｔ−Ｌ−よび２００ｍＭＴＥＳ緩衝液（ｐ
Ｈ７，０’） １ｔを用いて濃度勾配で溶出すると、グ
リセロール・オキシダーゼは溶出される。
この活性画分５００ＭＥ（蛋白量１．２１？、比活性１
．１）を合わせ、硫酸アンモニウム７０％飽和になるよ
うに添加し、酵素を沈澱させる。
．１）を合わせ、硫酸アンモニウム７０％飽和になるよ
うに添加し、酵素を沈澱させる。
次に、遠心分離（２００００Ｘｆｆ、２０分）で沈澱を
集め、１０ｍＭＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７，０）５０ｍｌに
溶解する。
集め、１０ｍＭＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７，０）５０ｍｌに
溶解する。
これを１０ｍＭＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化し
て訃いたセファデックスＧ −１００（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、スエーデン
）のカラム（５，５ｘ８０ｃｖｔ）ｖｃ通す。
て訃いたセファデックスＧ −１００（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、スエーデン
）のカラム（５，５ｘ８０ｃｖｔ）ｖｃ通す。
１０ｍ；ｖｉＴＥＳ緩衝液１ｔを流し分画した溶出液を
得る。
得る。
溶出液の画分中で、比活性の高い区分３００ｍ１（蛋白
量３１０７９．比活性３．２）［、硫酸アンモニウムを
７０％飽和捷で添加し、酵素を沈澱させる。
量３１０７９．比活性３．２）［、硫酸アンモニウムを
７０％飽和捷で添加し、酵素を沈澱させる。
次に沈澱を遠心分離（２００００Ｘｇ’、２０分）で集
め、１０ｍＭ ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７，０）２０ｍｌ
で溶解させる。
め、１０ｍＭ ＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７，０）２０ｍｌ
で溶解させる。
この溶液をセロファン・チューブを透析膜として用い、
１０ｍＭＴＥＳ緩衝液５ｔで２回透析液を替えて、２４
時間透析する。
１０ｍＭＴＥＳ緩衝液５ｔで２回透析液を替えて、２４
時間透析する。
透析後酵素液を、ｌＯｍＭＴＥＳ緩衝液（ｐＨ７，０）
で平衡化してかいたハイドロオキシ・アパタイトのカラ
ム（５，５Ｘ２０ｃＷＬ）に通す。
で平衡化してかいたハイドロオキシ・アパタイトのカラ
ム（５，５Ｘ２０ｃＷＬ）に通す。
同バッファー２５０ｍ１をさらに通し、溶出液を分画回
収する。
収する。
比活性の高い画分を集め、凍結乾燥しグリセロール・オ
キシダーゼの粉末精製酵素標品１０．２■（比活性３０
．２）を得る。
キシダーゼの粉末精製酵素標品１０．２■（比活性３０
．２）を得る。
精製酵素は細胞抽出液に比べて比活性は約６１０倍に上
昇し、活性の収率は１２係である。
昇し、活性の収率は１２係である。
参考例 ２
参考例１のアスペルギルス・ジャポニカスＫＹ−４５に
代えて、ニューロスポラ・クラップＫＹ−４６２（ＮＲ
ＲＬＩ １１０６ 、微生物寄託受理番号３９６０号）
を用いる他は、参考例１と同様にグリセロール１０ Ｙ
／ｌ、麦芽エキス１０グ／１．酵母エキス５ｆ／Ａ、の
組成を有する培地（殺菌前ｐＨ６，２’） ３００ｍｌ
を容れた２を一三角フラスコ５本に植菌し、３０℃、４
８時間振とう培養する。
代えて、ニューロスポラ・クラップＫＹ−４６２（ＮＲ
ＲＬＩ １１０６ 、微生物寄託受理番号３９６０号）
を用いる他は、参考例１と同様にグリセロール１０ Ｙ
／ｌ、麦芽エキス１０グ／１．酵母エキス５ｆ／Ａ、の
組成を有する培地（殺菌前ｐＨ６，２’） ３００ｍｌ
を容れた２を一三角フラスコ５本に植菌し、３０℃、４
８時間振とう培養する。
得られた培養液を参考例１と同様に抽出・精製を行々つ
た結果、グリセロール・オキシダーゼの精製酵素標品１
，１１１Ｉｇ（比活性１４．１）を収率１０．５係で得
る。
た結果、グリセロール・オキシダーゼの精製酵素標品１
，１１１Ｉｇ（比活性１４．１）を収率１０．５係で得
る。
Claims (1)
- １ トリグリセライドに由来するグリセロールにグリセ
ロールオキシダーゼを作用させ、生皮するグリセルアル
デハイドもしくは過酸化水素捷たは消費される酸素の量
を測定することを特徴とするトリグリセライドの定量方
法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP53127328A JPS5850719B2 (ja) | 1978-10-18 | 1978-10-18 | トリグリセライドの定量方法 |
| EP19790104011 EP0010296B1 (en) | 1978-10-18 | 1979-10-17 | Test composition for the determination of triglycerides and its use |
| DE7979104011T DE2964158D1 (en) | 1978-10-18 | 1979-10-17 | Test composition for the determination of triglycerides and its use |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP53127328A JPS5850719B2 (ja) | 1978-10-18 | 1978-10-18 | トリグリセライドの定量方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5555263A JPS5555263A (en) | 1980-04-23 |
| JPS5850719B2 true JPS5850719B2 (ja) | 1983-11-11 |
Family
ID=14957204
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP53127328A Expired JPS5850719B2 (ja) | 1978-10-18 | 1978-10-18 | トリグリセライドの定量方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0010296B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5850719B2 (ja) |
| DE (1) | DE2964158D1 (ja) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4259440A (en) * | 1979-05-21 | 1981-03-31 | Miles Laboratories, Inc. | Hydrolysis and assay of triglycerides |
| US4399218A (en) * | 1980-02-05 | 1983-08-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | Method and reagent for the determination of glycerin |
| EP0048347B1 (de) * | 1980-09-19 | 1983-07-27 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren und Reagens zur Bestimmung von Glycerin |
| JPS5886083A (ja) * | 1981-11-12 | 1983-05-23 | Wako Pure Chem Ind Ltd | グリセロ−ル−３−リン酸オキシダ−ゼの安定化剤 |
| US6936289B2 (en) | 1995-06-07 | 2005-08-30 | Danisco A/S | Method of improving the properties of a flour dough, a flour dough improving composition and improved food products |
| ES2182986T5 (es) | 1995-06-07 | 2009-03-01 | Danisco A/S | Hexosa oxidasa recombinante, procedimiento para su produccion y utilizacion de dicha enzima. |
| US7745599B1 (en) | 1995-06-07 | 2010-06-29 | Danisco A/S | Hexose oxidase-encoding DNAs and methods of use thereof |
| DE69604491T3 (de) | 1995-06-07 | 2008-09-25 | Danisco A/S | Methode zur verbesserung der eigenschaften von mehlteig, sowie zusammensetzung zur teigverbesserung und verbesserte nahrungsmittel |
| US8178090B2 (en) | 1995-06-07 | 2012-05-15 | Danisco A/S | Recombinant hexose oxidase |
| EP1559788A1 (en) | 1997-04-09 | 2005-08-03 | Danisco A/S | Use lipase for improving doughs and baked products |
| ATE231186T1 (de) | 1998-07-21 | 2003-02-15 | Danisco | Lebensmittel |
| ES2284897T3 (es) | 2001-05-18 | 2007-11-16 | Danisco A/S | Procedimiento para la preparacion de una masa con una enzima. |
| US7955814B2 (en) | 2003-01-17 | 2011-06-07 | Danisco A/S | Method |
| US20050196766A1 (en) | 2003-12-24 | 2005-09-08 | Soe Jorn B. | Proteins |
| MXPA05007653A (es) | 2003-01-17 | 2005-09-30 | Danisco | Metodo. |
| US7906307B2 (en) | 2003-12-24 | 2011-03-15 | Danisco A/S | Variant lipid acyltransferases and methods of making |
| US7718408B2 (en) | 2003-12-24 | 2010-05-18 | Danisco A/S | Method |
| GB0405637D0 (en) | 2004-03-12 | 2004-04-21 | Danisco | Protein |
| CN102533440B (zh) | 2004-07-16 | 2017-09-19 | 杜邦营养生物科学有限公司 | 用酶使油脱胶的方法 |
| MX2009008021A (es) | 2007-01-25 | 2009-08-07 | Danisco | Produccion de una aciltransferasa de lipido de celulas de bacillus licheniformis transformadas. |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5169691A (en) * | 1974-06-07 | 1976-06-16 | Iatron Lab | Ketsuseichuno chuseishibosokuteiyoshaku |
| JPS6049477B2 (ja) * | 1977-04-19 | 1985-11-01 | 協和醗酵工業株式会社 | グリセロ−ル酸化酵素およびその製造法ならびにグリセロ−ル酸化酵素を用いるグリセロ−ルの定量法 |
-
1978
- 1978-10-18 JP JP53127328A patent/JPS5850719B2/ja not_active Expired
-
1979
- 1979-10-17 DE DE7979104011T patent/DE2964158D1/de not_active Expired
- 1979-10-17 EP EP19790104011 patent/EP0010296B1/en not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0010296A1 (en) | 1980-04-30 |
| JPS5555263A (en) | 1980-04-23 |
| EP0010296B1 (en) | 1982-12-01 |
| DE2964158D1 (en) | 1983-01-05 |
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