MC1078A1 - Procede de preparation d'un complexe enzymatique et hormonal stable a partir de l'intestin grele - Google Patents

Description

La présente invention concerne un procédé de préparation d'un complexe enzyma,tique et hormonal stable, par extraction à partir de l'intestin grêle des animaux tels que le porc et le boeuf.

On sait que les deux parties composant l'intestin grêle„ le duodénum et le jéjunum, produisent des pro-enzymeSj des enzymes et des hormones jouant un rôle important dans le métabolisme de la digestion et de l'assimilation des aliments.

Dans les enzymes présentes dans le duodénum, on trouve par exemple des disaccharidases qui libèrent du glucose à partir des dissacharides, des dipeptidases qui coupent les dipep-tides et parmi lesquelles se trouve la leucylprolinase qui libère de la leucine, et tout particulièrement de 1'entérokinase qui est l'enzyme capable d'activer le trypsinogène et le chymotrypsi-nogène du pancréas. Dans le jéjunum on ne trouve pas d1entérokinase, mais on trouve en plus grande quantité certaines sacchara-ses.

Il est donc intéressant de mettre au point une technique permettant d'extraire ces enzymes, pro-enzymes et hormones à partir de l'intestin grêle entiez^ sans les dénaturer pour leur permettre de garder leur activité totale en vue de les conditionner sous la forme de médicament.

En effet, il est connu que si l'on prend de l'intestin et si on le broie, une partie importante de l'acticité recherchée disparait de sorte que si on recueille simplement le liquide obtenu par l'écrasement de l'intestin, on s'aperçoit qu'tzxie grande partie des enzymes ou des hormones n'y sont pas présentes, car elles se trouvent à l'intérieur des cellules du tissu musculaire où elles sont fixées sur la bordure en brosse de l'intestin. En particulier, on a pu mettre en évidence le fait que 1'entérokinase se trouve en grande partie dans la paroi interne du duodénum» Si on procède à une simple extraction aqueuse de l'intestin, on s'aperçoit que les enzymes endocellulaires et les enzymes fixées intimement au tissu externe de l'intestin ne sont pratiquement pas extraites.

Par ailleurs, les extractions effectuées à l'aide des solvants organiques dénaturent très souvent les produits recher-

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chés ou les rendent inactifs. De plus, lors de la précipitation, on perd soit par dénaturation, soit par inaetivation, la presque totalité de certaines enzymes ou hormones.

Le but de la présente invention est de remédier aux 5 inconvénients précités en fournissant un procédé qui permet d'obtenir un complexe enzymatique et hormonal contenant la presque totalité des enzymes et des hormones de l'intestin grêle avec leur activité « initialeen vue notamment de l'utilisation de ce complexe .e:a tant que médicament pour le traitement des affections inteîsti-10 nales dues à une carence snzymatique ou hormonale.

Suivant l'invention, le procédé de préparation d'un complexe enssymatique et hormonal stable à partir de l'intestin grêle est caractérisé en ce qu'on met en présence de l'intestin grêle, frais ou conservé par le froid, une solution aqueuse d'aci-15 des choliques et d'éther mcno-para-(tétraméthyl 1,1*3?3 butyl)

phénylique du polyéthylène glycol, puis on sépare l'intestin grêle du liquide dans lequel les enzymes et les hormones sont passées en solution.

On désigne par acides choliques la série d'acides bi--20 liaires comprenant l'acide cholique de formule ou sou dérivé l'acide dé soxycholique, et les composés résultant de la combinaison de l'acide cholique avec les acides aminés,, par exemple l'acide glycocholique Cp^H^^O^N ou acide taurocholique

C2.6H45°?SN "

25 L'éther mono-téra-(tétraméthyl 1,1»3»3 butyl)phényli que du polyéthylène glycol, est plus généralement connu sous sa dénomination TRITON X 100 (marque déposée de la Société MERCK) comme agent mouillant.

L'emploi conjugué des deux produits précités en solu» 30 tion dans l'eau pour l'extraction des enzymes et des hormones présente des effets inattendus. On a constaté en effet que ces deux produits possédaient des propriétés physiques complémentaires et que leur action d'extraction était amplifiée notablement par la faculté dont est doué l'éther précité d'extraire les enzymes 35 fixées dans la bordure en brosse de l'intestin ou contenues à l'intérieur des cellules de la paroi intestinale.

Les acides choliques et l'éther précité présentent également l'avantage de ne pa3 réagir chimiquement avec les

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enzymes et les hormones de l'intestin.

Le procédé selon l'invention permet ainsi une mise en solution et par conséquent, une extraction pratiquement totale des enzymes et des hormones. On peut utiliser la solution telle qtielle, ou lui faire subir un traitement de purification par dialyse puis un traitement de lyophilisation, en vue de l'obtention d'une poudre d'extrait sec.

La. proportion de solution aqueuse par rapport au poids de l'intestin truite peut varier ontre de larges limites, par exemple entre 1 et 2,5 litres de solution par kg d'intestin» Toutefois. on utilisera de préférence, le rapport de 1 litre de solution pour 1 kg d'intestin pour ne pas avoir à éliminer une trop grande quantité de liquide.

Les quantités d'acides choliques et d'éther mono-para» (tétra raéthyl 1,1,3»3 butyl)phénylique du poIyéthyXens glycol dissous dans l'eau peuvent varier dans les limites comprises entre 100 et 600 g pour le premier composé et entre 50 et 400 ml pour le second, pour 100 litres d'eau.

De préférence, avant de mettre l'intestin grêle en présence de la solution aqueuse renfermant les composés précités, on le coupe en morceaux pour faciliter l'extraction des enzymes et des hormones, mais sans broyage ultérieur car ce dernier ferait disparaître une partie importante de l'activité enzymatique et hormonale.

De préférence également, après avoir mis l'intestin en présence de la solution d? extraction, on règle le pH du mélange obtenu à une valeur comprise entre 6 et 7< En effet, on a pu vérifier qu'en dessous de pH 6 (notamment à partir de pH 5)? on inactivait 1'entérokinase. De même, au-dessus de pH 7* on a des risques d'autodigestion des protéines et en particulier de dégradation des enzymes.

L'extraction s'effectue de préférence à température ambiante sous agitation pendant deux heures, puis on laisse le mélange au repos pendant douze heures à une température comprise entre 0°C et 5°C* Après l'extraction, il est avantageux de filtrer le mélange sur une grosse toile pour séparer les plus gros morceaux et puis de centrifuger le filtrat.

La description de l'exemple indiqué à titre non limitatif ci~après a uniquement pour but d'illustrer la mise en oeuvre du procédé de l'invention.

Dans cet exemple, on utilise 100 kg d'intestins grê-5 les de porc congelés à -20°C et stockés à cette température jusqu'au moment de l'extraction. Après avoir ramené la température de l'intestin à environ 0°C, on le coupe au hachoir et on reprend par 100 1 d'eau contenant 100 cm de TRITON X 100 et 200 g . d'acides choliques. On ajuste le pH à une valeur entre 6 et 7 et 10 on laisse d'abord sous agitation pendant deux heures, puis au re« pos pendant une nuit à 0°C. On filtre le tout et on centrifuge le filtrat recueilli. Le résidu est épuisé par lavage au moyen de 20 1 d'eau. Les liquides réunis sont filtrés de nouveau puis concentrés par passage sur des colonnes du type "revers dialyse" 15 constituées de disques poreux permettant le passage des molécules de poids moléculaire inférieur à 1000 environ. Le volume initial de liquide qui est compris entre 200 et 250 1 est réduit par concentration à environ 30 1. Par dialyse à travers la colonne précitée, on perdj avec l'eau qui est éliminée, environ 40 $> de ma,-20 tière sèche initiale.

On dose le liquide concentré et on constate la présence de toutes les enzymes et hormones actives. Après passage du liquide dans un dialyseur, on soumet le liquide à la lyophilisation. On obtient ainsi 4 kg de poudre sèche lyophilisée qui se met bien 25 en solution.

On procède à l'analyse du complexe enzymatique et hormonal selon les méthodes suivantes.

ENZYMES

On titre les unités d'entérokinase d'après la méthode 30 de KUNÏTZ (Methods in Enzymology, COLOVICK-KAPLAN, n° 2, page 32) qui consiste à une activation du trypsinogène en trypsine 1'entérokinase, une unité d'entérokinase étant définie comme la quantité qui active 0,065 ug de trypsinogène à pH 5j8 à 5°C et pendant une heure.

35 Le dosage de phosphatase alcaline est effectué selon la méthode de O.A. BESSEY, H. LOVRY et M.J. BROCK ("DIVISION OF NUTRITION AND PHYSIOLOGY, PUBLIC HEALTH RESEARCH INSTITUTE OF NEW-YORK) publiée le 28 mars 1946.

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Les méthodes indisuées dans "Méthods in Enzyraology"

cité précédemment sont utilisées pour les dosages de maltase (d'après DAHLQUIST, volume 8, page 584) lactase, sucrase, tréha-lase et ornithine carbamyl transférase (volume 17j BP 885).

5 La teneur de gamma-glutamyl transférase est détermi née d'après NERVILLE et celle d• aminopeptidase d'après G„ PRONCARI et ZUBER (inter 5 Protein Alsearch 1,45).

Les résultats de ces dosages, exprimés en unités/mg • effectués sur le produit obtenu après mise en oeuvre du procédé 10 selon l'exemple précité ont été les suivants :

- Entérokinase 8 u/mg

- Maltase 110 u/rng

- Tréhalase 2,4 u/g

- Phosphatase alcaline 25 u/g 15 - Aminopeptidase . 12 u/g

- Glutamyl transférase 0,5 "u/g

- Ornithine carbamyl transférase5 saccharase et lactase en quantités appréciablesc

Ce3 dosages varient bien entendu d'un essai à l'au-20 tre et notamment avec la quantité d'acides choliques et de TRITON X 100 utilisée.

Les essais effectués ont cependant permis de constater que dans tous les cas, en faisant varier la quantité d'acides choliques entre 100 et 600 g- et la quantité de TRITON X 100 entre 25 50 et 400 ml potjr 100 kg d'intestins et 100 litres d'eati, on obtenait les résultats suivants:

- Entérokinase 8 à 12 u/mg

- Maltase > 40 u/mg

- Phosphatase alcaline >10 u/mg 30 ~ Aminopeptidase 2 u/mg

HORMONES

Les hormones dont la présence a été détectée dans le complexe obtenu sont principalement l'entéro gastrone, la sécré-tine, la cholécystokinine, la caeruleine et la pancréozymine. 35 L'activité hormonale du complexe est certaine, car lors de l'administration en thérapeutique du complexe, on a pu constater une inhibition des contractions intestinales.

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Des tests comparatifs ont été conduits pour mettre en évidence les résultats techniques obtenus grâce à l'application du procédé selon l'invention.

Les conditions des essais ont été les suivantes s Cinq lots de cent kilogrammes chacun d'intestin grêle ont été récoltés et immédiatement congelés à -20°C. Après une période de stockage, on laisse dégeler lentement pour porter le tout à la température d'environ 0°C à ~5°C.

On coupe les lots au couteau électrique. On prépare cinq milieux d'extraction, de cent litrec. d1 eau chacun. Sauf pour le premier bain d'extraction, qui est constitué d'eau pure, on dissout dans les quatre bains restants des quantités de produits indiqués ci-après.

Les résultats obtenus sont exprimés en unités par milligramme, tandis que la quantité d'extrait sec est indiquée en pourcent par rapport à la quantité de ma tière première employée »

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Eau seule

Acide cholique seul 600g/l00kg d'intestins

TRITON seul 400ml/100kg d'intestins

Essaxs conxormes à 1' invention

Acide cholique 200g TRITON

Acide cholique 600g TRITON

100 ml/l00kg|300 ml/l001<g d'intestins fd1 intestins

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30

extrait sec obtenu entérokinase phosphatase alcaline amino pep-iîidase

2 $ 1 u 10 u

5 u

3 £

3 u

10 u

5 u k io

3 u

15 u

10 u

6 rfo

5 u

20 vt

12 u

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5 u

20 u

1 2 u

35

On constate ainsi que le rendement d'extraction est nettement plus élevé lors de l'emploi de la solution d'extraction conforme au procédé de l'invention, aussi bien en ce qui concerne l'importance de la matière extraite que la concentration en unités d'enzyme. Il apparaît également que l'utilisation de teneurs d'acides choliques supérieures à 200 g et de teneurs de TRITON X 100 supérieures à 100 ml pour 100 kg d'intestins ne

conduit pas à des résiiltats supérieurs.

Le liquide obtenu après l'extraction est filtré une nouvelle fois sur toile puis on le concentre par passage à travers des colonnes de dialyse garnies de disques permettant le passage des molécules à poids moléculaire inférieur à 1000 environ# •

On sépare ainsi en grande partie les sels, le TRITON X 100 et des produits de dégradation» On termine par une dialyse et une lyophilisation.

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Claims (5)

REVENDICATIONS

1. Procédé do préparation d'un complexe enzymatique et hormonal stable à partir de l'intestin grêle, caractérisé en ce qu'on met en présence de l'intestin grêle frais ou conservé

5 par le froid une solution aqueuse d'acides choliques et d'éther mono-para-(tétraméthyl 1,1,3j>3 butyl)phénylique du polyéthylène glycol, puis on sépare l'intestin grêle du liquide dans lequel les enzymes et les hormones sont passées en solution.

2. Procédé conforme à la revendication 1, caractérisé

10 en ce que le liquide d'extraction est purifié par dialyse puis soumis à une lyophilisation en vue de l'obtention d'une poudre sèche.

3. Procédé conforme à l'une des revendications 1 oii 2, caractérisé en ce que la proportion de solution aqueuse utilisée

15 est comprise entre 1 et 2,5 litres par kg d'intestins.

4. Procédé conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 3» caractérisé en ce que la solution aqueuse contient pour 100 litres d'eau une quantité d'acides choliques comprise entre 100 et 600 g et une quantité d'éther mono-para—(tétramé-

20 thyl1 ,1 ,3? 3 butyl)phénylique comprise entre 50 et 400 inl«

5. Procédé conforme à l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que 100 kg d'intestin grêle sont mis en présence de 100 litres d'eau contenant 200 g d'acides choliques et 100 ml d'éther mono-para-(tétraniéthyl 1,1,3»3 butyl)

25 phénylique.

original

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