MC1253A1 - Derives amines de sucre utiles notamment comme medicaments - Google Patents
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Description
La présente invention concerne de nouveaux dérivés aminés de sucre ayant du tréhalose comme particularité structurale commune ainsi que leurs sels.
Ci-après, les .dérivés aminés de sucre selon l'invention sont appelés "Trestanines".
L'invention concerne aussi un procédé pour la préparation des Trestations et des compositions inh.ibitri.ces d'amylase contenant une ou plusieurs des Trestatines ou leurs sels.
Plus particulièrement, l'invention concerne la Trestatine A, la Trestatine B et la Trestatine C, leurs sels et leurs mélanges ainsi que des compositions contenant au moins une des Trestations A, B ou C ou un de leurs sels.
La Trestatine A, la Trestatine B et la Trestat ne C sont des poudres blanches basiques ayant les propriétés physicochimiques suivantes :
a) Analyse élémentaire:
N%
2,08 1,65 2,29
Trestatine A Trestatine B Trestatine C
46,72 7,13 46,27 7,04 47,55 7,15
43,28 44,69 42,66
b) Masse moléculaire (osmométrie)
Trestatine A Trestatine B Trestatine C
1470 975 1890
c) Point de fusion :
Trestatine A Trestatine B Trestatine C
221-232°C (déc.) 209-219°C (déc.) 230-237°C (déc.)
Trestatine A :
d) Rotation spécifique :
/wf = +177° (c = 1,0, H20)
Trestatine B :
/yjl6 = +187° (c - 1,0, H20)
Trestatine C : ~ +169,5° (c = 1,0, H^O)
e) Spectre d'absorption dans l'ultraviolet
(dans l'eau) :
La Trestatine A, la Trestatine B et la Trestatine C présentent chacune une absorption terminale f) Spectre d'absorption dans l'infrarouge
(dans KBr): Trestatine A Trestatine B Trestatine C
comme représenté sur la figure 1 comme représenté sur la figure 2 comme représenté sur la figure 3
g) Spectre de RMN "'"H (dans D2O à A00 MHz)
Trestatine A 10 Trestatine B Trestatine C
comme représenté sur la figure 4 comme représenté sur la figure 5 comme représenté sur la figure 6
h) Solubilité dans les solvants :
La Trestatine A, la Trestatine B et la Trestatine C ainsi que leurs chlorhydrates sont facilement solubles 15 dans l'eau; solubles dans le diméthylsulfoxyde; faiblement solubles dans l'éthanol et l'acétone; et insolubles dans l'acétate d'éthyle et le chloroforme.
i) Réactions de coloration :
La Trestatine A, la Trestatine B et la Tresta-20 tine C sont chacune positives aux réactions du permanganate et de l'anthrone et négatives à la réaction de Salcaguchi.
Selon la présente invention, les nouvelles Trestatines, c'est-à-dire la Trestatine A, la Trestatine B et la Trestatine C sont préparées par un procédé caractérisé en 25 ce qu'on cultive un microorganisme producteur de Trestatines appartenant au genre Streptomyces dans des conditions aérobies dans un milieu aqueux, 011 recueille les Trestatines à partir du bouillon de fermentation et, si nécessaire, on sépare la Trestatine A, la Trestatine B et la Trestatine C les unes des autres.
30 Les microorganismes producteurs de Trestatines utilisés selon la présente invention comprennent toutes les souches appartenant au genre Streptomyces qui sont capables de produire des Trestatines ainsi que leurs mutants et leurs variantes. De telles souches préférées sont Streptomyces dimorphogenes 35 NR-320-0M7HB et Streptomyces dimorphogenes NR-320-0M7HBS qui ont été isolées à partir d'échantillons de terre à Chichibu-shi, Saitama-ken, Japon, ainsi que leurs mutants et leurs variantes.
Les souches Streptomyces dimo.rphogenes NR-320-
0M7IIB et Streptomyces dimorphogenes NR--320-0M711BS ont été déposées à l'Agency of Industrial Science and Technology, Fermentation Research Institute, Japon, sous les numéros "FERM-P N° 3664" et "FERM-P N° 3665", respectivement, et leurs caractéristiques mycologiques'sont les suivantes :
I. Morphologie
Microscopiquement, FERM-P N° 3664 développe du mycélyum aérien principalement droit et rarement en spirale avec 10 à 50 spores par chaîne à partir d'un mycélium "bien ramifié comme substrat sur divers milieux ISP. Les spores sont lisses en surface et ont des dimensions de 0,6-1,0 x 0,8-1,4 ^î. On n'observe pas de ramifications verticillées ni de formation de sporanges. De plus, durant l'observation de la morphologie de son mycélium aérien, on a trouvé qu'une petite population (moins de 1%) avec mycélium aérien en spirale existait sous la forme d'une touffe parmi la population dominante à chaîne droite de spores. En isolant complètement la colonie spiralée, on a trouvé que le clone conservait sa morphologie de mycélium aérien spirale pendant des générations en produisant constamment une petite portion (0,7-2%) de touffes ou colonies de mycélium aérien droit. A cette souche secondaire obtenue en isolant complètement la colonie spiralée de la souche de FERM-P 3664, on a donné la désignation FERM P-3665. On n'a observé aucune différence nette de caractéristiques entre FERM P-3664 et FERM P-3665, sauf en ce qui concerne la morphologie de chaque mycélium aérien.
II. Caractéristiques culturales
Les deux souches, FERM P-3664 et FERM P-3665 ont les mêmes caractéristiques culturales que mentionnées dans le Tableau 1. Tous les essais ont été effectués avec des cultures conduites à 27°C, sauf l'essai au lait écrémé qui a été effectué à 37°C. Les déterminations de couleur ont été effectuées avec des cultures vieillies de 14 à 21 jours conformément au Color Harmony Manual, 4ème édition, 1958 (Container Corporation of America, Chicago).
Tableau I. Cnractéristiques culturales
Milieu
Mycélium aérien
Mycélium de support
Envers du Mycélium de support
Pigment solubie
Gélose au sucrose-nitrate blanc brunâtre à gris clair (3dc, Natural)
bon,brun jaunâtre pâle à brun jaune grisâtre (31g, Lt Brown)
brun jaunâtre (3ng, Yellow maple) à brun foncé (4pl,Deep Brown)
brunâtre
Gélose au glucose-
asparagine fin,gris brunâtre modéré,brun jaunâtre pâle (21e,01d Gold) à orangé jaunâtre mat brun jaunâtre pâle (21e, Old Gold) à orangé jaunâtre mat néant
Gélose au glycérol-3-spa- . ragine (ISP med. 5)
blanc grisâtre à gris clair (2dc, Natural, à 2fe, Covert Gray)
bon,brun-jaune grisâtre brun jaunâtre (3ng,Yellow Maple)
brun-jaune grisâtre à brun jaunâtre foncé (3ni, Clove Brown)
brun
Gélose aux sels inorganiques et à 1'amidon(ISP med. 4)
gris clair (2fe, Covert Gray) à gris brunâtre clair (3fe,Silver Gray)
bon, brun jaunâtre à brun (31g,Cinnamon Brown)
brun jaunâtre à brun (31g,Cinnamon Brown)
brun
Gélose à la tyrosine (ISP" med. 7)
gris clair (2dc, Natural à 2fe,Covert Gray) à gris bon, brun pâle à brun jaunâtre (3ng,Yellow Maple)
brun pâle à brun jaunâtre (3ng,Yellow Maple)
légèrement brunâtre
Gélose nutritive fin, blanc médiocre, brun jaunâtre pâle incolore à brun jaunâtre pâle néant
Gélose à l'extrait de levures et à l'extrait de raalt (ISP med. 2)
gris clair (2fe, Covert Gray) à gris brunâtre clair (3fe,Silver Gray)
modéré à bon,brun-jaune grisâtre à brun (31g,Cinnamon Brown)
brun-jaune grisâtre à brun (31g,Cinnamon Brown légèrement ) brunâtre
Tableau I. Caractéristiques culturales (suite)
Milieu
Mycélium aérien
Mycélium de support
Envers du Mycélium de support
Pigment solubie
Gélose à la f ar ine d'avo ine (ISP med. 3)
gris clair (2fe> Covert Gray) à gris brunâtre clair (3fe,Silver Gray bon, jaune pâle à brun jaunâtre pâle (2gc, Bamboo à 2ie, Lt Mus-tard Tan)
jaune pâle à brun jaunâtre pâle (2gc,Bamboo à 2ie, Lt Mustard Tan)
jaunâtre
Gélose nutritive au lait écrémé
néant incolore à jaune pâle incolore à jaune pâle néant
Tube profond de gélatine glucosée-pep-tonée néant incolore à jaune pâle
néant
Lait écrémé fin, blanc gris brunâtre à brun - néant
(37 °C) pâle ■
Tableau II. Comparaison des caractéristiques morphologiques, culturales et physiologiques des souches NR-320-0M7HB, NR-320-0M7HBS et de souches apparentées
Section morphologique (ISP med. 2,3,4,5)
Surface des spores'
ISP médium 3 d et • m •
3 • m •
r. s.nu s.p.°
ISP médium 4 a.m.
NR-320-0M7HB
(S)
lisse abondant gris clair à gris brunâtre clair jaune pâle à brun jaunâtre pâle jaune pâle à brun jaunâtre pâle jaunâtre abondant gris clair à gris brunâtre clair
NR-320-0M-7HBS
S , (RF)
lisse abondant gris .clair à gris brunâtre clair jaune pâle à brun jaunâtre pâle jaune pâle à brun jaunâtre pâle jaunâtre abondant gris clair à gris brunâtre clair
S. nigrifaciens ISP 5071
RF
lisse abondant gris olive jaune verdâtre à jaune foncé
jaune mat jaune abondant gris brunâtre clair
S. olivaceus ISP 5072
S, RA°, RF lisse fin gris brunâtre clair brun jaunâtre pâle
S. plicatus ISP 5319
S, RA
lisse modéré
s 1 étalant gris brunâtre clair brun jaunâtre pâle incolore à brun brun jaunâtre jaunâtre pâle pâle néant fin gris brunâtre clair néant modéré s ' étalant gris brunâtre clair
&
s .m.
r. s. m.
Tableau II (suite)
KR-320-0M7HB NR-320-0M-7HBS S. nigrifaciens
ISP 5071
brun jaunâtre brun jaunâtre à brun à brun brun jaunâtre brun jaunâtre à brun à brun jaune foncé à brun jaunâtre brun jaunâtre
S. olivaceus ISP 507 2
brun jaunâtre pâle à brun jaunâtre foncé
jaune pâle à brun jaunâtre nâle
S.plicatus ISP 5319
brun jaunâtre à brun j aunâtre foncé
brun jaunâtre s. p.
brun brun brun néant néant
Formation de mélanine^ sur milieu ISP 1 sur milieu ISP 6 sur milieu ISP 7 Utilisation du carbone ^ L-arabinose D-xylose D-glucose . D-fructose sucrose I-inositol rhamno s e raffinose
(") (-)
-H-
++
(") (")
++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
+ + ++ +
++
4—{-+
+ -H-
++
+4-++
++
Tableau II (suite)
NR-320-0M7HB
NR-320-0M-7HBS
S. nigrifaciens ISP 5071
S. olivaceus ISP 5072
S.plicatus
ISP 5319
D-matmitol
Hydrolyse de C)
caseine '
Hydrolyse d'amidon
Liquéfaction de gélatine
Réduction de nitrate
++ + • +
+
+
+ (médiocre) + (médiocre)
+ +
+ (médiocre)
+ +
+ (médiocre)
+
Coagulation du lait
Peptonisation du lait + (forte)
Intervalle de température de développement sur ISP-2 ( C) 20 ^45
+
+ (forte)
20 ^45
+ (forte)
20 r^31
(forte)
20 /^37
+ (forte)
20 ^45
a : rectiflexibles b.: spirales c: retinaculiaperti d: mycélium aérien e: mycélium de suppo f : envers du mycélium de support g: pigment solubie
A) - : pas formé (-) : probablement pas formé
B) -H-: bonne utilisation + : utilisation + : utilisation probable - : pas d'utilisation
C) +: résultat positif - : résultat négatif
11I. P rop ri 61; 6 s phy s :i.olog i q lie s
A.uciinG différence nette n'a été observée dans les caractéristiques suivantes entre FERM-P 3664 et 3665'
1) Intervalle de température de développement
Quand on effectue les essais sur le milieu ISP-2, on observe un développement modéré à abondant à 20°CS 25°C, 27°C, 30°C, 37°C et 45°C, mais pas à 6°C et à 55°C. On trouve'que les températures optimales pour le développement sont aux environs de 37°C.
2) Liquéfaction de la gélatine sur de la gélose à la gélatine glucosée-peptonée, culture à 27°C.
La liquéfaction est positive après le douzième jour environ et son intensité est médiocre.
3) Hydrolyse de l'amidon sur de la gélose à l'amidon et aux sels inorganiques, culture à 27°C.
L'hydrolyse est positive, mais moyenne dans son intensité.
4) Coagulation et peptonisation dans un milieu à 10% de lait écrémé à 37°C.
La peptonisation devient positive vers le cinquième jour et son intensité est forte. La coagulation est négative.
5) Hydrolyse de la caséine sur de la gélose nutritive à 10% de lait écrémé à 27°C.
L'hydrolyse est positive avec une' intensité modérée à forte.
6) Réduction du nitrate sur milieu ISP-8 à 27°C.
Résultat négatif.
7) Formation de mélanine, culture conduite à 27°C
Aucun pigment n est formé sur de la gélose peptonée,
à la levure et au fer (ISP-6). Le résultat est négatif aussi tant sur du bouillon trypton-levure (ISP-l) que sur de la gélose à la tyrosine (ISP-7).
.8) Utilisation des hydrates de carbone sur un milieu de gélose Pridham-Gottlieb (ISP-9), culture conduite à 27°C.
On observe un développement abondant avec le L-ara-
binose, le D-xylose, le D-glucose, le D-fructose, le sucrose, l'isonitol, le raffinose, le D-mannitol et le L-rhamnose.
On peut résumer comme suit les propriétés micro-biologiques mentionnées ci-dessus des souches "FERM-P N° 3664 et 3665" :
Cette souche est un Actinomycetales appartenant au genre Streptomyces et la forme de son mycélium aérien est droite et en spirale (principalement droite avec NR-320-0M7HB et principalement en spirale avec NR-320-0M7HBS). On n'a observé aucune formation de verticilles. Les spores des deux souches étaient à surface lisse et avaient des dimensions de 0,6-1,0 x 0,8-1,4 p.. Les souches ont produit un mycélium aérien gris clair à gris brunâtre clair à partir d'un mycélium de support brun jaunâtre pâle à brun jaunâtre sur divers milieux ISP avec du pigment soluble brunâtre. Il n'y a pas eu de pigment mélanoïdique produit sur la gélose peptonée à la levure et au fer, et probablement pas sur le bouillon tryptone-levure et sur la gélose à la tyrosine. Ces souches ont fortement peptonisé le lait écrémé. La liquéfaction de la gélatine était médiocre, tandis qu'elles ont hydrolysé l'amidon dans une mesure modérée. Aucune différence entre NR-320-0M7HBS et NR-320-0M7HB n'a été observée dans tous les essais effectués comme ci-dessus.
Ces caractéristiques suggèrent que les souches ressemblent à S. nigrifaciens (Waksman, S.A. (1961) Classification, identification and description of général and species, The Actinomyces, Vol. 2, The Williams and Wilkins Co., Baltimore. Shirling, E. B. & D. Gottlied (1968) Coopérative description of type culture of Streptomyces, II. Species descriptions from the first study, Inst. J. Syst. Bacteriol., 18:69-189. Buchanan, R. E. & N. E. Gibbons (1974) Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th éd., The Williams and Wilkins Co., Baltimore. Waksman, S.A. (1919) Cultural studies of species of Actinomyces, Soil Sci., 8:167-171.), S. olivaceus (Waksman, S.A. (1961) Classification, identification and description of général and species, The Actinomycetes Vol. 2, The Williams and Wilkins Co., Baltimore. Shirling, E.B. & D. Gottlieb (1968) Coopérative description of type culture of Streptomyces, II. Species descriptions from the first study, Inst. J. Syst. Bacteriol., 18:69-189. Buchanan, R.E. & N0E.Gibbons (1974) Bergey's Manual of Determina-
tivc Bacteriology, 8th éd., The Williams and Wilkins Co., Baltimore. Waksman, S.A. (1919) Cultural studios of species of Actinomyces, Soil Soi.,■8 :167-171. Breed, R.S., E.G.D.
Murray & N.R. Smith (1957) Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7th éd., The Williams an1 Wilkins Co., Baltimore.)
and S. plicatus (Buchanan, R.E. & N.E. Gibbons (1974) Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th éd., The Williams and Wilkins Co., Baltimore. Shirling, E.B. & D. Gottlieb (1969) Coopérative description of type culture of Streptomyces, IV0 Species descriptions from the second, third and fourth studies, Inst. J. Syst. Bacteriol., 19:391-512. Parlce, David and Co. (1954) Antibiotics and methods for obtaining same, Brevet britannique n° 707 332. La comparaison des présentes souches avec celles obtenues d'après ISP est montrée dans le Tableau II. On voit bien que NR-320-0M7HB ainsi que les souches dérivées d'une morphologie différente du mycélium aérien, NR-320-0M6HBS, peuvent se distinguer de chacune de ces trois espèces très voisines.
Par rapport à S. nigrifaciens, NR-320-0M7HB présente des différences dans la coagulation du lait écrémé et dans l'utilisation du sucrose, de l'inositol et du raffinose. Morphologiquement, S. nigrifaciens n'a jamais formé de spirales. Ces faits, en même temps que la production de mycélium aérien gris olive, d'un mycélium de support jaune verdâtre sur le milieu ISP-3 et 1:impossibilité de production d'inhibiteur ont montré qu'il était très peu probable que les deux souches appartiennent à des espèces identiques.
Par ailleurs, la chaîne de spores de S. plicatus ISP 5319 apparaît principalement en forme de spirale dans les milieux ISP-2, 3, 4 et 5. Bien que du mycélium aérien en forme de boucle ait été moins fréquemment observé, aucune forme droite n'a été observée avec ISP 5319, ce qui distingue S. plicatus de NR-320-0M7HB. De plus, des différences nettes ont été observées dans l'étalement du mycélium aérien, la pigmentation, la coagulation, la liquéfaction de la gélatine et l'utilisation du sucrose et du raffinose.
On a trouvé que S. olivaceus était.le plus voisin de NR-320-0M7HB parmi les trois espèces examinées. Ainsi, S. olivaceus ISP 5072 a présenté une formation de spirales dans la plupart des parties sur les milieux ISP-2, 3, 4 et 5, contenant
des chaînes de spores partiellement: bouclées et partiellement droites dans le mycélium aérien. Toutefois, cette souche diffère tant de NR-320-0M7HB que de KR-320-0M7HBS en ce que des chaînes de spores en spirale, en boucle et droites existent simultanément 5 dans une même touffe de mycélium aérien d'ISP 5072, ce qui n'a jamais été observé avec NR-320-0M7HB et NR-320-0M7HBS. Entre la souche. ISP 5072 et la souche NR-320-0M7HB, d'autres différences ont été observées dans la production de pigment solubie (pas de pigmentation par la souche ISP 5072 sur les milieux ISP-2, 3, 4 10 et 5), le développement du mycélium aérien (mycélium aérien fin avec ISP 5072), l'utilisation d'une source de carbone(sucrose/ raffinose) et la production d'inhibiteur d'alpha-amylase (pas d'inhibition par les métabolites d'ISP 507 2). Tous ces résultats ont prouvé que NR-320-0M7HB aussi bien que NR-320-0M7HBS semblaient 15 très voisins de l'espèce S. olivaceus ISP 5072, mais pas identiques à cette espèce»
Il apparaît dpnc justifié de reconnaître ce taxon comme une nouvelle espèce dans le genre Streptomyces et il est proposé de l'appeler Streptomyces dimorphogenes nov. sp. WÀTANABE 20 et MARUYAMA, 1978. La souche type de S. dimorphogenes est NR-320-0M7IIB (FERM-P N° 3664). Etyrnologie : di (double), (Gr.), morphe (forme) + genèse, est basée sur la présence de deux formes dans la morphologie des chaînes de spores, à savoir la distribution irrégulière d'une minorité de touffes de chaînes en spirale. Un 25 biotype, NR-320-0M7HBS (FERM-P N° 3665), dans lequel il y a une prédominance de chaînes de spores en spirale avec une distribution irrégulière d'une minorité de touffes de chaînes droites de spores, pourrait alors très bien être appelée S. dimorphogenes subsp. spiroformatus, en relation avec la morphologie du mécylium 30 aérien. En conséquence, la souche type FERM-P N° 3664 sera appelée S. dimorphogenes subsp. dimorphogenes.
Selon la présente invention, les Trestatines peuvent être produites en cultivant le microorganisme producteur de Trestatines appartenant au genre Streptomyces comme mentionné ci-35 dessus, par exemple Streptomyces dimorphogenes sp. nov., Watanabe et Maruyarna (NR-32O-0M7HB, FERM-P N° 3664) ou Streptomyces dimorphogenes subsp. spiroformatus (NR-320-0M7IIBS, FERM-P N° 3665) dans des conditions aérobies dans un milieu aqueux.
La culture peut être conduite dans un milieu de culture contenant des substances nutritives usuelles que le. microorganisme utilisé dans la présente invention peut utiliser.. Les sources de carbone, par exemple, sont de l'amidon, de la 5 dextrine,- du glucose, du glycérol, du sucrose, du tréhalose, de la mélasse ou un mélange de telles matières; et les sources d'azote sont par exemple de la poudre de soja, de l'extrait de viande, de la peptone, de l'extrait de levures, de la liqueur de macération de maïs, du sulfate d'ammonium, du nutrate de 10 sodium, du chlorure d'ammonium ou un mélange de telles matières. De plus, si nécessaire, le milieu de culture peut contenir des substances inorganiques appropriées telles que du carbonate de calcium, du chlorure de sodium, etc; et/ou des sels de zinc, de cuivré, de manganèse, de fer, etc. De plus, un agent anti-15 mousse tel qu'une silicone, une huile végétale, etc, peut être ajouté au milieu de culture afin d'empêcher la formation de mousse durant la conduite de- la culture.
La culture peut être conduite dans des conditions aérobies dans un milieu aqueux, spécialement par une technique 20 de fermentation immergée. Le pH du milieu au début de l'opération de culture est de 7 environ. La température préférée pour la culture est comprise entre 20 et 40°C, en particulier entre 25 et 30°C.
Quand on conduit la culture pendant 1 à 5 jours 25 environ dans les conditions mentionnées ci-dessus, les Trestatines peuvent être obtenues dans le bouillon de fermentation. On arrête commodément la culture au moment où la puissance maximale des Trestatines a été obtenue. La quantité de Trestatines obtenues est déterminée par la méthode suivante :
30 Détermination des Trestatines
Les Trestatines ont une forte activité d'inhibition de 1'alpha-amylase. En conséquence, on peut les déterminer par un procédé utilisant la détermination de 1'alpha-amylase par P. Berafeld (Methods in Enzymology, I, 149, 1955) comme mentionné 35 ci-après.
2 unités" d'alpha-amylase pancréatique de porc
3
dans 0,1 cm de solution 6,4 mM de sulfate d'ammonium sont ajoutées à 0,6 cra^ de tampon phosphate 20 mM (pll 6,9) contenant du chlorure de sodium 10 mM et différentes quantités de Trestatine.
Le mélange, après mise en équilibre à 37°C pendant 5 minutes
3
suivie de l'addition de 0,5 cm de solution à k% d'amidon solubie, est mis à incuber pendant 5 minutes à 37°C. On arrête la
3
réaction par l'addition de 2 cm de réactif acide dinitrosalicy-lique préparé conformément au procédé de P. Bernfeld. On chauffe le mélange au bain-marie bouillant pendant 5 minutes et ensuite on le dilue avec 10 cm d'eau. Le facteur d'absorption (A-^) de la solution colorée résultante est mesuré à 540 nm et l'inhibition de l'activité de 11alpha-amylase peut être calculée d'après l'équation suivante :
A - A
Inhibition = (1- — — x 100 (%)
2 A0
Aq : facteur d'absorption sans enzyme A2 : facteur d'absorption sans Trestatine
'* 1 unité de 1'alpha-amylase est la quantité d'enzyme qui catalyse dans les conditions ci-dessus sans Trestatine la formation de sucres réducteurs équivalents à 1 micromole de maltose.
L'unité d'inhibition (IU) est définie comme la quantité de Trestatine qui donne une inhibition de 50% de l'enzyme dans les conditions de détermination décrites ci-dessus.
Après l'opération de culture, l'isolement des Trestatines produites dans le bouillon de fermentation peut être effectué en utilisant des techniques en elles-mêmes connues, telles que les suivantes : Du bouillon de fermentation obtenu de la manière décrite ci-dessus, le mycélium est séparé par cer.trifugation ou filtration. Les Trestatines sont des compozés faiblement basiques, solubles dans l'eau. En conséquence, des techniques classiques utilisées fréquemment dans l'isolement et la purification d'une substance basique soluble dans l'eau peuvent être utilisées pour isoler et purifier les Trestatines. Par exemple, l'isolement et la purification des Trestatines à partir du filtrat peuvent être effectués par des techniques d'adsorption en utilisant un adsorbant tel que du charbon actif, une résine échangeuse de cations, etc; des techniques de précipitation en utilisant un solvant comme de l'alcool, de l'acétone, etc; des techniques chroma-tographiques en utilisant de la cellulose, du Sephadex (le nom commercial de Pharmacia Co.), etc; ou des combinaisons de ces techniques.
L'isolement: de la Trestatine A, de la Trestatine B et de la Trestatine C respectivement sous la forme du composé unique à partir du filtrat de fermentation peut être effectué commodément par chromatographie sur colonne en utilisant un mélange de la forme H et de la forme ammonium d'une résine échan-geuse de cations faiblement acide. Un des modes d'exécution préférables est le suivant :
Le pH du filtrat de fermentation est réglé à 7 avec un alcali comme de l'hydroxyde de sodium, de l'hydroxyde de potassium, du carbonate de sodium, du carbonate de potassium, etc. Au filtrat, on ajoute du charbon actif pour adsorber les Trestatines et on filtre le mélange. On élue les Trestatines du gâteau de charbon avec une solution aqueuse à 30-70%, de préférence à 50% d'acétone. L'agent d'élution est de préférence réglé à un pH de 1 à 3 avec un acide et on effectue l'élution à 50-70°C. On concentre l'éluat et on fait passer le concentré à travers une colonne de résine échangeuse de cations, comme de Dowex 50 (forme H, le nom commercial de Dow Chemical Co.) pour adsorber les Trestatines. La colonne est lavée avec de l'eau et éluée avec une solution aqueuse IN d'ammoniac. On recueille les fractions présentant une activité d'inhibition d'araylase, on les concentre sous vide et on les lyophilise pour obtenir une poudre brute avec du méthanol pour éliminer les impuretés solubles dans le méthanol. Les Trestatines sont presque insolubles dans le méthanol. La poudre insoluble dans le méthanol contenant les Trestatines est dissoute dans l'eau. On fait passer la solution à travers une colonne garnie d'une résine éch.ang.euse d'anions, comme de Dowex 1 (forme acétate, le nom commercial de Dow Chemical Co.). On développe la colonne avec de l'eau et on fractionne l'éluat. Les fractions actives sont recueillies, concentrées sous pression réduite et passées à travers une colonne remplie d'une résine échangeuse de cations, comme de Dowex 50 (forme ammonium, le nom commercial de Dow Chemical Co.). On élue la colonne avec de l'eau. Les fractions présentant une activité d'inhibition d'amylase sont recueillies, concentrées et lyophilisées pour donner une poudre constituée principalement de Trestatine A, de Trestatine B et de Trestatine C, comme montré par chromatographie en phase liquide à grande vitesse. La solution de ces Trestatines dans ]. 'eau est passée à travers une colonne remplie d'une résine
échangeuse de cations, comme d'Amberlite CG 50 (un mélange de forme M et de forme ammonium, le nom commercial de Rohm and.
Ilaas Co. ) • Le rapport préféré de la forme H à la forme ammo~ . nium est compris entre 1:9 (v/v) et 9:1 (v/v). . On élue la 5 colonne avec de l'eau, pour obtenir la Trestatine B, la Tresta tine À et la Trestatine C dans cet ordre. Chaque Trestatine ainsi obtenue est soumise de nouveau à une chromatographie pour donner à l'état, pur de la Trestatine A, de la Trestatine B et de la Trestatine C, respectivement. Ces Trestatines peuvent 10 être, si nécessaire, transformées en divers sels comme le chlorhydrate, le sulfate, le phosphate, l'acétate, l'oxalate, etc.
Point de fusion des chlorhydrates :
Chlorhydrate de Trestatine A :
163-190°C (décomposition avec formation de mousse)
15 Chlorhydrate de Trestatine B :
158-186°C (décomposition avec formation de mousse)
Chlorhydrate de Trestatine C :
190-200°C (décomposition avec formation de mousse)
Rotation spécifique des chlorhydrates :
20 Chlorhydrate de Trestatine A :
/c^7d5 = +162>5° (c = 1'0 » HC1 °>01N)
Chlorhydrate de Trestatine B :
ZI^Zd6 = +169° (c= 1,0, HC1 0,01N) 25 Chlorhydrate de Trestatine C :
ZÔÇ7d5 = M160,5° (c = 1,0, HCl 0,01N)
Titrage(dans l'eau) :
pKa' Equivalent
Trestatine A 5,0 720
30 Trestatine B 5,0 960
Trestatine C. 5,0 650
Ces résultats, associés aux résultats de masse moléculaire donnés ci-dessus, indiquent que les Trestatines A, B et C sont des bases diacide, mono-acide et triacide, respectivement.
10
15
20
30
35
Formule empirique : Trestatine A :
Trestatine B :
Trestatine C :
C56n94N2°40 C37H63N028
C75H125N3°52
Les spectres de résonance magnétique protonique (dans D20 à 100 MHz) des Trestatines A, B et C sous la forme de la base libre ont été pris avec un spectromètre JEOL FX-100 dans une technique à découplage "homo gated" (irradiation à
4,71 ppm) en utilisant DSS comme étalon interne et sont représentés sur les figures 4, 5 et 6, respectivement.
Chromatographie en couche mince :
Plaque : gel de silice ^ 25k (Merck)
Système de solvants : chloroforme-méthano1-solution aqueuse à
25% d'ammoniac-eau (1:4:2:1)
Détection : acide sulfurique chaud
Dans les conditions décrites ci-dessus, les valeurs de Rf pour les Trestatines A, B et C sont de 0,19, 0,28 et 0,14, respectivement.
Chromatographie en phase liquide à grande vitesse :
Colonne :
u-Bondapak/CH (30,5 cm x 6,35 mm, Waters Co., EUA)
Solvant : acétonitrile-eau (63:37)
Débit : 4,0 cm /min
Détection : absorption UV à 210 nm
25 Dans les conditions décrites ci-dessus, les temps de rétention des Trestatines A, B et C sont de 5,5, 3,4 et 8,8 minutes, respectivement. Les chromatogrammes sont représentés sur la Figure 7.
Electrophorèse sur papier :
Papier : Toyo Roshi N° 51
Tampon : acide formique-acide acétique-eau (25:75:900,
pH 1,8)
Tension : 3 000 V
>s : 40 min.
Dans les conditions décrites ci-dessus, toutes les
Trestatines se déplacent vers la cathode : la Trestatine A de 12 cm, la Trestatine B de 9 cm et la Trestatine C de 13 cm.
Constituants structuraux :
Lors de l'hydrolyse avec de l'acide chlorhydrique 4N à 80°C pendant 3 heures, les Trestatines A, B et C donnent à la fois du glucose et une aminé. L'aminé a un pKa' de 3,9 et la formule moléculaire C]_3^21^7 ' déduite du spectre de masse à haute résolution. Les Trestatines A, B et C contiennent 5,4 et 6. moles de glucose, respectivement. Une hydrolyse acide douce (80°C, 4 heures) des Trestatines A, B ou C en utilisant du Dowex 50 (forme H) comme catalyseur donne du tréhalose (alpha-D-glucopy-ranosyl-alpha-D-glucopyranoside). Aucune des Trestatines A, B et C ne contient d'amino-acides.
D'après les propriétés mentionnées ci-dessus, on considère que les Trestatines A, B et C obtenues selon la présente invention sont des aminoglucosides faiblement basiques ayant le tréhalose comme constituant structural commun. Sur la base des découvertes ci-dessus, les structures suivantes sont proposées pour les Trestatines A et B (figure 8).
De plus, la Trestatine A, la Trestatine B et la Trestatine C ont de hautes activités d'inhibition d'amylase comme montré ci-après et sont utiles comme inhibiteurs d'amylase.
Des inhibiteurs d'amylase classiques qui sont produits par fermentation ont été rapportés antérieurement comme suit :
1) Nojirimycine de Niwa et autres (Agr. Biol. Chem. , 34, 966, 1970).
La Nojirimycine est un monosaccharide et donc est nettement différente'des Trestatines de la présente invention.
2) Sucre de peptide de S. Ueda et autres (Agr. Biol. Chem., 37_, 2025, 1973 et Agr. Biol. Chem., 40, 1167, 1976)
Le sucre de peptide contient des amino-acides comme constituants structuraux.
3) Amylostatine A de S. Murao et autres (demande de brevet japonais, Kokai 123891/1975)
Dans cette demande de brevet, il est décrit que l'Amj^los-tatine A n'est pas adsorbée sur une résine échangeuse de cations fortement acide dans un intervalle de pH:de 1 à 14. Toutefois,
comme mentionné ci-dessus, les Trestatines sont adsorbées sur une telle résine échangeuse d'ions.
4) Inhibiteur d'amylase de K. Ueda et autres (demande de brevet japonais, Kokai 54990/1976)
Cet inhibiteur d'amylase a une masse moléculaire de 600 environ qui est différente de celles de la Trestatine A, de la Trestatine B et de la Trestatine C.
5) Composés amino-sucre de W. Frommer et autres (brevet allemand DT 2 347 782; demande de brevet japonais, Kokai
N° 53593/1975)
Tous ces composés sont des bases monoacides tandis que la Trestatine A est une base diacide et la Trestatine C est une base triacide. La Trestatine B bien qu'étant une base monoacide a le tréhalose comme constituant structural et est ainsi différente des sucres aminés de Frommer et autres.
Des inhibiteurs d'amylase contenant des constituants tréhalose n'ont pas encore été décrits.
Les propriétés biologiques des Trestatines et de leurs sels sont les suivantes :
1) Toxicité aigiie :
On n'observe pas de toxicité aigiie, même quand 500 mg/kg de Trestatine A, de Trestatine B et de Trestatine C, respectivement, sont administrés à des rats par voie orale (ce qui représente de 65 à 700 fois la dose efficace).
Un mélange de Trestatines (correspondant à la poudre de stade III obtenue comme décrit dans l'exemple 1, - II Isolement 3) - ) est bien tolérée avec les doses journalières allant jusqu'à 8000 mg/lcg pendant 10 jours chez les souris et les rats.
2) Spectre antimicrobien :
L'absence d'activité antimicrobienne de la Trestatine A, de la Trestatine B et de la Trestatine C comme déterminé par une méthode de dilution à la gélose se voit d'après le tableau ci-dessous :
Spectres antimicrobiens de la Trestatine A, de la Trestatine B et de la Trestatine C
Organismes d'essai
Trestatine A
Tresta.tine
B Trestati
ne C
E. coli NIHJ
p100 pg/ml
> 100 ^jg/ml
>100 /ag/ml
E » coli NIHJ SMf
>100
>100
>100
5
E. coli NIHJ STf
>100
? 100
>100
E. coli K-12 ML1630
>100
>1000
>100
E. coli CF17
>100
>100
>100
E. coli CF41
>100
^ 100
> 100
10
Salmonella typhimurium IFO 12529
>100
^ 100
> 100
Salmonella paratyphi B
>100
>100
>100
Citrobacter rl 00
7100
>100
Shigella. flexneri
>100
;> 100
>100
Klebsiella pneumoniae PCI602
>100
> 100
>100
15
Pseudomonas aeruginosa IFO 12689
>100
7 100
^100
Pseudomonas aeruginosa A3
>100
o o i—i l\
>100
Pseudomonas aeruginosa P2
>100
>100
>100
Proteus vulgaris 0X19 ATCC 6898
>100
>100
>100
20
Bordetella bronchiseptica Aichi 202
>100
>100
>100
Proteus rettgeri
>100
>100
>100
Serratia marcescens IF012648
>100
>100
>100
Staphylococcus aureus FDA209P
>100
>100
> 100
25
Staphylococcus aurexis MS3937
>100
>100
>100
Staphylococcus aureus MS9261
>100
>100
> 100
Staphylococcus aureus Smith
>100
>100
>100
Bacillus subtilis PCI 219
>100
>100
^>100
Sarcina lutea ATCC9341
>100
^>100
>100
30
Candida albicans Yul200
>100
>100
>100
Mycobacterium smcgmatis ATCC607
>100
■y. 100
>100
3) Activité d'inhibition d'amylase : 35 On indique ci-dessous l'activité d'inhibition de 1'alpha-
amylase pancréatique du porc de la Trestatine A, de la Trestatine B, de la Trestatine C, de leurs sels et de leurs mélanges. Chacune de ces activités inhibitrices a été déterminée par la méthode mentionnée ci-dessus.
In h ibi teurs d 'amylase
Complexe de Trestatines Trestatine À Trestatine B Trestatine C Trestatine A.HC1 Trestatine B,.CH1 Trestatine C.HC1
Activités irihibitrlces (IU/g) J
3,6 x 10'
7,1 x 10
1,5 x 10C
4,9 x 10'
6,3 x 10'
1,3 x 10e
4,5 x 10
7
7
Inhibition de l'hyperglycémie provoquée par l'amidon de riz cuit
Rats DE
20
Souris (mg/kg) p.o.
Trestatine A Trestatine B Trestatine G
1,0 7,7 3,0
1.1
3.2 0,7
On appelle ici complexe de Trestatine l'échantillon obtenu conformément à l'Exemple 1 - II Isolement 5) -, qui contient de la Trestatine A, de la Trestatine B et de la Trestatine C.
DE2Q est défini comme la dose causant après 20 minutes une réduction de 20 pour cent de l'hyperglycémie provoquée par administration orale de 2 g/lcg de poids du corps d'amidon de riz cuit.
De plus, ces Trestatines peuvent aussi inhiber 1'alpha-amylase de Bacillus subtilis et d ' Aspergillus orj^zae ainsi que 1'amylo-alpha-l,4-alpha-l,6-glucosidase d'Aspergillus niger, toutefois elles ne présentent pas d'activité inhibitrice en ce qui concerne la bêta-arnylase de la patate.
La digestion de l'amidon, le principal hydrate de carbone dans l'alimentation humaine, commence avec l'action de 1'alpha-amylase. Cette- enzyme est présente dans la salive et dans les sécrétions du pancréas. L'amylase pancréatique est principalement responsable de la digestion complète de l'amidon dans le conduit gastro-intestinal» Elle catalyse la décomposition du polymère d'hydrate de carbone donnant finalement du maltose qui est hydrolyse. par les disaccharidases intestinales en glucose» Donc, peu après un repas constitué d'aliments contenant de l'amidon, on observe une hyperglycémie marquée conduisant à de l'hyperi.n-sulinémie.
11 est connu que chez les diabétiques cette hyperglycémie est très prononcée et très indésirable. Chez les obèses, cette hyperglycémie s'accompagne souvent d'une sécrétion accrue d'insuline, qui peut conduire à un épuisement des cellules bêta du pancréas. De plus, 1'hyperinsulinémie favorise la lipogenèse qui contribue à 1'hyperlipidémie.
Tableau 1 : Effet de la Trestatine sur l'hyperglycémie (hyperinsulinémie) après une absorption orale d'amidon naturel ou de sucrose
(Glucose et insuline dans le plasma 20 minutes après hydrate de carbone + Trestatine (1,6 g d'amidon de blé/kg ou 3,2 g de sucrose/kg). Résultats en pourcentage dThydrate de carbone de témoins amorcés
('* (p<0,05), «« (p<0,01), *** (p <0,001) conformément au Kolmogorov-Smirnov-Test)
absoprtion d'amidon absorption de sucrose
dose/kg glucose insuline glucose co
6 600 IU
75 ***
61 *
-
CU CD T3 H •H
22 000 IU
60 ***
59 *
i i
cy .p
W) cj
66 000 IU
5 6
41 **
-
C
oj m i—! d)
220 000 IU
-
-
90 *
••cy m S H
660 000 ÏU 2 200 000 IU
-
-
73 ***
64 *** |
j i
* i i
0,3 mg
68 " " "
66 *
Î
cd
AJ <c oo cy cy u C
1,0 mg
56 ***
42 ***
-
3,0 mg
55 ***
42 ***
-
H
30,0 mg
-
-
84 *
i
•H
0,3 mg
71 ***
51 **
J_)
rj
O
V)
cy cy
1,0 mg 3,0 mg
58 ***
51 ''r"'
63 **
-
M pl H
30jO mg
-
1
85*
'0 Correspondant à la poudre au stade IV obtenue dans l'exemple 1, -II Isolement 4) - qui contient de la Trestatine A, de la Trestatine B et de la Trestatine C
Tableau 2 : Effet de la Trestatine sur l'hyperglycémie et 1'hyperinsulinémie après administration orale de nourriture.
Dose/rat
Glucose dans le plasma en mg/100 cm (moyenne + écart-type)
Insuline dans le plasma en uU/cmJ (moyenne + écart-type)
i
20 min.
60 min.
120 min.
20 min.
60 min.
120 min.-
Nourriture (témoin)
275 + 9
228 + 11
191 + 6
59 + 10
44 + 10
30 + 5
Nourriture + 22 440 IU
205 + 9 ~*
/s
190 + 14
j,
sv
184 + 4
15 + 2
•A—J- ""
18+3
\
17 + 2 |
! j
Nourriture +67 320 IU
197 + 2
J-
/V
173 + 5
175 + 3
•J-/%
22 + 8
•A»
14 + 1
/V
j
13 + 1
Vr j i
Nourriture +224 400 IU
189 + 5
/\
164 + 2
169 + 2
18+3
7C
8 + 1
!,t 1 'l
/wC )
1
Des groupes de 6 rats femelles (85-95 g), mis à la diète pendant 24 heures,reçoivent de la nourriture ") par sonde stomacale (2,2 g/6 cm3/rat) + mélange de Trestatines **)
« nourriture en poudre normale pour laboratoires (Nafag 859/850, particules de 0,177 mm; NAFAG, Gossau SG, Suisse), en suspension dans de la carraghénine à 0,07 pour cent correspondant à la poudre du-stade IV obtenue dans l'exemple 1, -II Isolement 4) - qui contient de la TrestatineA, de la Trestatine B et de la Trestatine C.
(Statistique selon Kolmogorov-Smirnov * (p<0,05), ** (p<0,01), *** (p<0,001)
Les nouvelles Trestatines et leurs sels fournis par l'invention peuvent trouver une utilisation comme médicaments, par exemple sous la forme de préparations pharmaceutiques qui contiennent ces Trestatines ou leurs sels en mélange avec un véhicule inerte organique ou inorganique convenable pour administration intertinale, comme par exemple de l'eau, de la gélatine, de la gomme arabique, du lactose, de l'amidon, du stéarate de magnésium, du talc, des huiles végétales, des polyalcoylène-gly-cols, etc. Les préparations pharmaceutiques peuvent être présentes dans une forme solide, par exemple sous la forme de comprimés, de dragées ou de capsules, ou dans une forme liquide, par exemple sous la forme de solutions ou de suspensions.
Une unité de dosage peut contenir de 20- à 50 mg d'ingrédient actif. La dose journalière pour un adulte peut être comprise entre 10 et 200 mg et on peut la faire varier selon les besoins individuels.
On peut aussi utiliser les Trestatines et leurs sels comme additifs pour des denrées alimentaires et on peut les utiliser pour la préparation d'aliments de régime comme du sucre, du jus de fruits, du chocolat, de la confiture, des produits à base de pomme de terre, de la farine et des produits préparés à 'partir de farine comme de la pâtisserie ou du pain0
D'une manière appropriée, ces denrées ou ces préparations contiennent de 0,1 à 1 pour cent en poids des Trestatines selon la présente invention.
Les exemples suivants illustrent encore l'invention.
Exemple 1 I F e rmenta t 1 on
On prépare un milieu nutritif à partir des matières suivantes :
Amidon de pomme de terre 20 g
Glucose 20 g
Extrait de levures 5 g
Chlorure de sodium 2,5 g
Solution de réserve de substances ' ^
minérales «1 1 cm
Eau désionisée 1 litre .
*1 La solution contient ZnSO^.7H2O (50 g), CuSO^.SI^O (5 g) et MnC^»klLjO (5 g) par litre d'eau désionisée.
Le pH du mélange ci-dessus est réglé à 6 avec de l'hydroxyde de sodium 6N et ensuite on ajoute 3,2 g de carbonate de calcium et 20 g de farine de soja, cela étant suivi d'une stérilisation à la vapeur d'eau, à 120°C pendant 20 minutes.
Les spores recueillis par raclage d'une culture sur gélose inclinée de Streptomyces dimorphogenes sp. NR-320-
0M7HB (FERM-P N° 3664) sont utilisés pour inoculer dix flacons
3 3
d'Erlenmeyer de'500 cm contenant chacun 110 cm du milieu stérilisé ci-dessuso On place les flacons sur une secoueuse rotative fonctionnant à 185 tpm et on les agite pendant 72 heures à 27°C. Au bout de ce temps, on utilise les inoculums des flacons pour ensemencer un fermenteur de 50 litres contenant 25 litres du même milieu. Le cycle de fermentation est d'environ 43 heures, période durant laquelle la température est maintenue à 27°C, de l'air filtré est introduit à un débit de 25 litres par minute et l'agitation est effectuée à une vitesse de 300 tpm. Une bière typique de fermentation de Trestatine (pH 6,9) a une activité de 3,1 x 10^ IU/cm^.
II Isolement
1) Adsorption sur charbon
La bière complète résultant de la fermentation de Trestatine décrite ci-dessus est réglée au pH 7,0 avec de l'hydroxyde de sodium 5N et ensuite filtrée. Au filtrat (19 litres, 3,1 x 10^" IU/cm^, 5,9 x 10^ IU/total), on ajoute 380 g de charbon actif et on agite le mélange à la température ambiante pendant 20 minutes et ensuite on le filtre» Le gâteau de charbon est lavé avec 4 litres d'eau du robinet et mis en suspension dans 10 litres d'acétone aqueuse à 50% chaude» La suspension est réglée au pH 2 avec du HC1 6N, puis maintenue à 60°C pendant 20 minutes avec agitation, le mélange■durant cette période étant maintenu au pH 2 par addition occasionnelle de HC1 6N. On filtre le mélange et on traite le gâteau de charbon de nouveau avec une quantité supplémentaire de '10 litres d'acétone aqueuse à 50% d'une manière similaire. Le filtrat combiné est réglé au pH 7,0 avec une solution 6N de NaOH et filtré pour élimination
8
d'une petite quantité de précipité formée» Le filtrat (5,6 x 18 IU/total) est concentré sous pression réduite à un volume de 3
litres environ. On lyophilise une partie du concentré pour obtenir un complexe de. Trestatines brut sous la forme d'une poudre brun foncé '3,2 x 10^ IU/g), appelée ici poudre du Stade I.
2) Adsorption sur Dowex 50
g
5 Le concentré (environ 3 litres, 5,6 x 10 IU/to tal), comme décrit ci-dessus, est passé à travers une colonne
(80 x 7,5 cm) de Dowex 50 (forme H, 3,5 litres, particules de
3
0,297 à 0,84 mm) à un débit d'environ 10 cm /min. La colonne est lavée avec 10,5 litres d'eau désionisé^, éluée avec IN NFLOH
3 3
10 et fractionnée. Les fractions contenant plus de 3 x 10 IU/cm de Trestatine sont combinées, concentrées sous pression réduite et lyophilisées pour donner 75,4 g de poudre brune (7,0 x 10^
g
IU/g, 5,3 x 10 IU/total), appelée ici poudre du Stade II.
15 La poudre du Stade II (75,4 g, 7,0 x 10 IU/s?
3) Traitement au méthanol
6 J-u/6>
g
5,3 x 10 IU/total), comme décrit ci-dessus, est mise en suspen-
3
sion dans 3 770 cm de méthanol et le mélange est agité à la température ambiante pendant 2 heures» La partie insoluble est recueillie par filtration, lavée avec de petites quantités de mé-20 thanol et séchée pour donner 41,5 g de poudre brune (1,1 x 10^
g
IU/g, 4,6 x 10 IU/total), appelée ici poudre du Stade III.
4) Chromatographie sur Dowex 1 :
La poudre du Stade III (41,5 g, 1,1 x 10^ IU/g,
8
4,6 x 10 IU/total), comme décrit ci-dessus, est dissoute dans 3
25 100 cm d'eau désionisée» La solution est appliquée à une colon-
3
ne (87 x 5,5 cm) de Dowex 1 (forme acétate, 2 050 cm , particules de 0,037 à 0,074 mm). La colonne est développée avec de l'eau
^3
désionisée à un débit de 2,5 cm /min et on fractionne l'éluat (chaque fraction : 17 cm )»
30 Les fractions actives 35-70 sont combinées, concen trées sous pression réduite et tyophiUsées pour donner 22,6 g d'une poudre jauen (1,8 x 10^ IU/g, 4,1 x 10® IU/total), appelée ici poudre du Stade IV.
5) Chromatographie sur Dowex 50
35 La poudre du Stade IV (22,6 g, 1,8 x 10^ IU/g,
g
4,1 x 10 IU/total), comme décrit ci-dessus, est dissoute dans 3
50 cm d'eau désionisée et on applique la solution à une colonne
(85 x ()5b cm)-de Dowex 50 (forme ammonium, 2 900 cm'"*, particules de 0,037 à 0,074 min). La colonne est éluée avec de l'eau.
3
désionisée à un débit de 2,5 cm /min c.t on fractionne l'éluat (fractions de 17 cm chacune). Les fractions actives 65-89 5 sont combinées, concentrées sous pression réduite et lyophilisées pour donner 10,6 g de complexe de Trestatines sous la forme
7 P
d'une poudre jaune pâle (3,6 x 10 IU/g, 3,8 x. 10 IU/total), appelée ici poudre du Stade V.
III Séparation du complexe de Trestatines en Trèstatines A,B 10 et C
La poudre du Stade V (10,6 g, 10^ IU/g, 3,8 x
3 3
10 IU/total), comme décrit ci-dessus, est dissoute dans 20 cm d'eau distillée et on applique la solution à une colonne
(78 x 4,8 cm) d'Amberlite CG 50 (un lit mixte constitué de 3,5
3
15 parties de forme ammonium et de 6,5 parties de forme H, 1 42.0 cm ,
type I). La colonne est éluée avec de l'eau distillée à un dé-3
bit de 2,0 cm /min et on fractionne l'éluat (chaque fraction : 14 cm ). On examine les fractions actives par chromatographie e.n phase liquide à grande vitesse (I-ISLC) dans les conditions 20 suivantes :
Colonne : pi Bondapak/Carbohydrate
(6,35 mm x 2,54 cm, Waters Associate)
Véhicule : CH3CN:H20 (63:37)
Débit : 4,0 cm /min
25 Volume d'injection : 2 - 10 pi
Détection : Absorption dans l'ultraviolet à 210 nm
Les fractions appropriées sont Combinées, concentrées sous pression réduite et lyophilisées. Les résultats sont présentés ci-dessous.
30 N° des fractions Poids de Activité Constituant majeur
(temps de rétention sur HSLC)
(IU/g)
9,4 x 10^ Trestatine B (3,4 min.)
35 131 - 165 1,88 5,9 x ÎO'7 Trestatine A (5,5 min, )
4,4 x lO'7 Trestatine C (8,8 min.)
IV) Préparation de Trestatine A
Un échantillon pur de Trestatine A est préparé par nouvelle chromatographie sur Amberlite CG 50. En conséquen-40 ce, un échantillon de 1,17 g de Trestatine A obtenu comme dans résidu
(g)
71
0
CTÏ
1
1,40
131
- 165
1,88
311
- 380
0,79
3
1g cas de la poudre du Stade III est dissous dans 4 cm d'eau distillée et appliqué à une colonne (133 x 1,7 cm) d'Arnberlite GG 50 (un lit mixte constitué de 8 parties de résine de forme II et de 2 parties de résine de forme ammonium, 300 cm , type II). La colonne est éluée avec de l'eau distillée et l'éluat est fractionné (chaque fraction : 7 cm ) et contrôlé par chromatographie en phase liquide à grande vitesse dans les conditions décrites ci-dessus. Les fractions 245-465 contenant la Trestatine A sont combinées, concentrées sous pression réduite et lyophilisées pour donner 649 mg de Trestatine A sous la forme d'une poudre blanche ayant les propriétés indiquées ci-dessus.
V) Préparation de Trestatine B
Un échantillon pur de Trestatine B est préparé par nouvelle chromatographie sur Amberlite GG 50„ En conséquence, un échantillon de 450 mg de Trestatine B obtenu comme dans
3
le cas de la poudre du Stade III est dissous dans 2 cm d'eau distillée et appliqué à une colonne (122 x 1,7 cm) d'Arnberlite
CG 50(un lit mixte constitué de 8 parties de résine de forme H
et de 2 parties de résine de forme ammonium, 280 cm , type II).
La colonne est éluée avec de l'eau distillée et l'éluat est frac-
3
tionné (chaque fraction : 3 cm ) et contrôlé par chromatographie en phase liquide à grande vitesse dans les conditions décrites ci-dessus. Les fractions 121-129 contenant la Trestatine B sont combinées, concentrées sous pression réduite et lyophilisées pour donner 170 mg de Trestatine B sous la forme d'une poudre blanche, ayant les propriétés indiquées ci-dessus.
VI) Préparation de Trestatine C
Un échantillon pur de Trestatine C est préparé par nouvelle chromatographie sur Amberlite CG 50. En conséquence,
3
le cas de la poudre du Stade III est dissous dans 3 cm d'eau distillée et appliqué à une colonne (133 x 1,7 cm) d'Arnberlite CG 50 (un lit mixte constitué de 6,2 parties de résine de forme H et de 3,8 parties de résine de forme ammonium, 300 cm , type II). La colonne est éluée avec de l'eau distillée et. l'éluat est frac-tionné (chaque fraction : 6 cm ) et contrôlé par chromatographie en phase liquide à grande vitesse dans les conditions décrites ci-dessus. Les fractions 42 à 59 contenant la Trestatine C sont combinées, concentrées sous pression réduite et lyophilisées pour donner 515 mg de Trestatine C sous la forme d'une poudre blanche ajT-ant les propriétés indiquées ci-dessus.
Exemple 2
Préparation de chlorhydrate de Trestatine A
De la Trestatine A (95 mg) obtenue comme dans
3
l'exemple 1 est dissoute dans 1 cm d'eau distillée et on règle le pH à 2,0 avec de l'acide chlorhydrique 0,1N. La solution est concentrée sous pression réduite à un volume d'environ 0,5 crrT .
3
On ajoute de l'éthanol (6 cm ), formant un précipité blanc qui est recueilli par centrifugation, lavé avec 2 cm d'éthanol et séché sous vide, donnant 97 mg de dichlorhydrate de Trestatine A sous la forme d'une poudre blanche.
Exemple 3
Préparation de chlorhydrate de Trestatine B
De la Trestatine B (92 mg) obtenue comme dans l'exemple 1 est dissoute dans 1 cm d'eau distillée et on règle le pH à 2,0 avec de l'acide chlorhydrique 0,1N. La solution est
3
concentrée sous pression réduite à un volume d'environ 0,5 cm „
3
On ajoute de l'éthanol (7 cm ), formant un précipité blanc qui
3
est recueilli par centrifugation, lavé avec 2 cm d'éthanol et séché sous vide, donnant 91 mg de monochlorhydrate de Trestatine B sous la forme d'une poudre blanche»
Exemple 4
Préparation de chlorhydrate de Trestatine C
De la Trestatine C (90 mg) obtenue comme dans
3
l'exemple 1 est dissoute dans 1 cm d'eau distillée et on règle le pH à 2,0 avec de l'acide chlorhydrique 0,1N. La solution est concentrée sous pression réduite à un volume d'environ 0,5
3 ✓ 3
cm . On ajoute de l'éthanol (6 cm ), formant un précipité blanc qui est recueilli par centrifugation, lavé avec 2 cm d'éthanol et séché sous vide, donnant 91 mg de trichlorhydrate de Trestatine C sous la forme d'une poudre blanche»
Exemple 5
Par un mode opératoire similaire à celui décrit dans l'exemple 1, à ceci près qu'on utilise Streptomyces dimorphogenes sp» NR ~ 3 2 0 - OM 7 H B S (FERM-P N° 3665), on obtient de la Trestatine A, de la Trestatine B et de la Trestatine C, respectivement.
4. Brève explication des dessins
Les figures 1, 2 et 3 représentent les spectres
d'absorption dans l'infrarouge de la Trestatine A, de la Trestatine B et de la Trestatine C, respectivement»
Les figures 4, 5 et 6 représentent les spectres de RMN "hr! (dans D£0 à 100 MHz) de la Trestatine A, de la Trestatine B et de la Trestatine C, respectivement.
La figure 7 représente les chromatogrammes en phase liquide à grande vitesse de la Trestatine A, de la. Trestatine B et de la Trestatine C, respectivement.
- 32 -
Claims (3)
1. Un procédé pour la production de la Trestatine A, de la Trestatine B et de la Trestatine C et leurs sels et mélanges ayant du tréhalose comme particularité structurale commune et ayant les propriétés suivantes :
5
a)
Analys e élémentaire
:
C cy
/o
H cy
/o
N o,
iO
0 o,
/o
Trestatine
A
46,72
'7,13
2,08
43,28
Trestatine
B
46,27
7,04
1,65
44,69
Trestatine
C
47,55
7,15
2,29
42,66
10
b)
Masse moléculaire
(osmométrie) :
Trestatine
A
1470
Trestatine
B
975
Trestatine
C
1890
15 Trestatine A Trestatine B Trestatine C
Trestatine A 20 Trestatine B
Trestatine C
(dans l'eau) 25 c présentent
(dans KBr) : Trestatine A Trestatine B 30 Trestatine C
c) Point de fusion :
221-232°C (déc.)
209~219°C (déc.)
230-237°C (déc.)
d) Rotation spécifique :
= +177° (c = 1,0, H20)
/-qçTf = +187° (c = 1,0, H20)
r,ljl3 ■ = +169,5° (c = 1,0, H20)
e) Spectre d'absorption dans l'ultraviolet
La Trestatine A, la Trestatine B et la Trestatine chacune une absorption terminale»
f) Spectre d'absorption dans l'infrarouge
: comme représenté sur la figure 1 : comme représenté sur la figure 2 : comme représenté sur la figure 3
- 33 --
g) Spectro de RMN Hl (dans D20 à-100 MHz) :
Trestatine A : comme représenté sur la figure 4
Trestatine B : comme représenté sur la figure 5
Trestatine C : comme représenté sur la figure 6
5 ^ h) Solubilité dans les solvants :
La Trestatine A, la Trestatine B et la Trestatine C ainsi que leurs chlorhydrates sont facilement solubles dans 1 ' ea solubles dans le diméthylsulfoxyde; faiblement solubles dans l'éthanol et l'acétone; et insolubles dans l'acétate d'éthyle et 10 le chloroforme;
i) Réactions de coloration :
La Trestatine A, la Trestatine B et la Trestatine C sont chacune positives aux réactions du permanganate et de l'an-throne et négatives à la réaction de Sakaguchi, 15 caractérisé en ce qu'on cultive un microorganisme producteur de Trestatines appartenant au genre Streptomyces dans des conditions aérobies dans un milieu aqueux, on recueille les Trestatines à partir du bouillon de fermentation et, si nécessaire, on sépare la Trestatine A, 20 la Trestatine B et la Trestatine C les unes des autres.
2. Préparation de compositions inhibitrices d'amylase contenant de la Trestatin'e A, de la Trestatine B ou de la Trestatine C telles que définies dans la revendication 1 ou un sel de ces Trestatines, ou de leurs mélanges^par mise en oeuvre 25 avec un véhicule inerte organique ou inorganique convenable pour administration intestinale.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on utilise comme microorganismes les souches Streptomyces FERM P-3664 ou FERM P-3665.
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