DK149599B - Fremgangsmaade til fremstilling af aminosukkerderivater kaldet trestatina, trestatin b og trestatin c eller salte deraf - Google Patents

Description

149599 i

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte aminosukkerderivater kaldet Tres-tatin A, Trestatin B og Trestatin C med den almene formel 5 r i

CHtOH h CHi CHiOH CHzOH CHtOH H_OH

h/h \h h/T"°\h νΓΛ? y£TN

HO- —l\OH H/LN—l\OH H/Lq-J\0H H/Lq J\OH yLo-Knil H/Lo—^HOftCy^n

H OH H OH H OH H OH H OK H

J n 10 hvor n er 1 (Trestatin B), 2 (Trestatin A) og 3 (Trestatin C), eller salte eller blandinger deraf,

Trestatin A, Trestatin B og Trestatin C er basiske hvide 15 pulvere med følgende fysisk-kemiske egenskaber: a) Analyse:

C Η N O

Trestatin A: 46,72 7,13 2,08 43,28 20 Trestatin B: 46,27 7,04 1,65 44,69

Trestatin C: 47,55 7,15 2,29 42,66 b) Molekylvægt (osmometri): 25 Trestatin A: 1470

Trestatin B: 975

Trestatin C: 1890 c) Smeltepunkt: 30

Trestatin A: 221 - 232°C (sønderdeling)

Trestatin B: 209 - 219°C (sønderdeling)

Trestatin C: 230 - 237°C (sønderseling).

35 2 149599 d) . Specifik drejning:

Trestatin A: [α]^4 = +177° (c = 1,0 i vand)

Trestatin B: Eet] ^6 = +187° (c = 1,0 i vand) 5 Trestatin C: [a]23 = +169,5° (c = 1,0 i vand).

e) Ultraviolet absorptionsspektrum (i vand):

Trestatin A, Trestatin B og Trestatin C viser slut-2Q absorption.

f) Infrarødt absorptionsspektrum (i KBr):

Trestatin A: se figur 1 ^5 Trestatin B: se figur 2

Trestatin C: se figur 3.

g) 1H NMR-Spektrum (i DjO ved 100 MHz): 20 Trestatin A: se figur 4

Trestatin B: se figur 5

Trestatin C: se figur 6.

h) Opløselighed i opløsningsmidler: 25

Trestatin A, Trestatin B og Trestatin C samt hydrochlo-riderne deraf er letopløselige i vand, opløselige i dime thylsulf oxid, svagt opløselige i ethanol og acetone og uopløselige i ethylacetat og chloroform.

30 i) Farvereaktion:

Trestatin A, Trestatin B og Trestatin C giver en positiv permanganat- og anthron-reaktion og en negativ 25 sakaguehi-reaktion.

3 149599

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at en stamme af arten Streptomyces dimorphogenes dyrkes under aerobe betingelser i et vandigt medium, trestatinerne skilles fra fermentationsvæsken, og, om ønsket, Trestatin A,

Trestatin B og Trestatin C adskilles fra hinanden og isole-^ res, om ønsket, i form af salte heraf.

Foretrukne stammer er Streptomyces dimorphogenes NR-320--0M7HB og Streptomyces dimorphogenes NR-320-OM7HBS, som er isoleret fra en jordprøve fra Chichibu-shi, Saitama-ken, 10 Japan, samt mutanter og varianter deraf med væsentlig samme egenskaber som disse.

Stammerne Streptomyces dimorphogenes NR-320-OM7HM og Streptomyces dimorphogenes NR-320-OM7HBS er deponeret 15 i Agency of Industrial Science and Technology, Fermentations Research Institute, Japan under betegnelsen "FERM-P no. 3664", henholdsvis "FERM-P nr. 3665". Stammerne er endvidere deponeret ved American Type Culture Collection (ATCC) Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20 20852 (USA) som følger: ATCC-nr. Deponeret den: FERM-P nr. 3664 31484 30. januar 1979 FERM-P nr. 3665. 31485 30. januar 1979 25 og har følgende mykologiske karakteristika: I: Morfologi: 30 Mikroskopisk udvikler FERM-P nr. 3664 overvejende et lige og sjældent spiralformet luftmycelium med 10 - 50 sporer pr. kæde ud fra et godt forgrenet mycelium på forskellige ISP-medier. Sporerne har en glat overflade, og de er 0,6 - 1,0 x 0,8 -l,4^,u store. Der er ikke konstateret forgreninger i det 35 4 149599 spiralformige mycelium eller sporangiedannelse. Endvidere blev der ved undersøgelse af luftmyceliets morfologi konstateret en lille population (mindre end 1%) med spiralf ormigt luftmycelium, som optræder som en klynge inden 5 for en dominerende population med lige sporekæder.

Ved enkeltisolering af den spiralformige koloni viser det sig, at donen bevarer sin morfologi med det spiralformige luftmycelium over generationer, hvorhos der konstant dannes en lille procentdel (0,7 - 2%) lige luftmycelium som 10 kvaste eller kolonier. Disse ved enkeltisolering af den spiralformige koloni fra stammen FERM-P 3664 vundne underart betegnes FERM-P 3665. En tydeligere forskel i karakteristikken mellem FERM-P 3664 og FERM-P 3665, bortset fra det pågældende luftmyceliums morfologi, 15 blev ikke konstateret.

II. Kulturkarakteristika.

Stammerne FERM-P 3664 og FERM-P 3665 har de samme, i 20 tabel I anførte kulturkarakteristika. Alle tests udføres med kulturer dyrket ved 27°C, bortset fra skummetmælks-testen, der udføres ved 37°C. Farvebestemmelsen udføres på 14 - 21 dage gamle kulturer på grundlag af Color Harmony Manual 4. udgave 1958 (Container Cooperation of 25 America, Chicago).

5 149599

4-1 +J +J

CJ C C

<U H H

g HH

C s s •H 3d

ft +> G G

C Λ Λ -P

4-1 -Η 3l

C Η 4-1 4-1 -P -P -P 44 Η -P

•HG tt) G G C <U C H Q) HG -P 3 G 3 -P 3 d £

<U G G G G > G ί> G G

Μ ffl -Η Λ Λ Μ -Η 03 Cl ·Η

Si rH

ft ο S Η -- , 3 tt) G , , Η >4 £ 44 1 Η

1-4 ο G G Η G G

A) *· -P G +J 3 S 4-) G 0 > Cl 0 C.M ffl 44 <U I G— GO tn S Cl 1 § O 0) >i G G G I tn , G G Λ 54 -HO , 3 ,,Ci « g H f« ft 3 G -P G £ ffl HH -P -PG -PCN4J >i

-P '—' 4-4 <u 3 G Λ O 1 HH in CG M —ffl H

3 M 0) Λ 'C G 3 G G G0)>i3-H >i

G 44 Q HO G -P G) 44 0 CifH H GU H -P - I

-P G I 44 O Λ Oi G g -Q G 0)---.

cn G - tnU-PH-Hd) 3 3 i* i , η - 13-HG -P

A G —- H -H C 3 H f> GG &i 44 3 Ci G cn 3 cn 3 Λ Φ ft H 0) -H CiH O Λ G -P G 44 G C1H -P Λ EH S.

CD Hrf HHH Gr) -H G« M 3 fO Gi H

1 4J ft'-' G OH -P tnU -P u 3-" SU -P — G -P >3 g) tn Ci 3 tn G tn Cl G — Η Λ C , G C O G >

G -Hg-P ^ tn Ή 44 » H - Λ JJ dl 0) -H-PG Λ H O 3 G

m H G 44 tt) Π ffl -H HC1 0)Gh>4JHG& tt) Η Λ -P G

> h 5 G tn Η -P »3 G G HH tnGft G C >3 3 o inHEtn 4t 0) G O G >)CM 3 GOiro G H >1 G 3 3 -H G G G >1 3 3 3

ffl CHffl ffl—g Cg — 31-- Η Λ S GH Cffl ffl h Cffl S

ίο Φ 1 G 1 t! *G In -p

4J H Ci -G O * >3 G g >1 *· H

Ci O G I £ Gg C» G G O H O 3

- -HU3H0 33 |G Cffl G C« C

g 44 HG3HGG H 44 pqitN-P tt) 3 C-P «· HOOC-Ph ffl G -P — Ci * I , — ffl . tn •H -HCC 3H Co) -H G h-PG-P >1

Η Η H-HH C O 4J 41 Ή 44 U 3-P-~-H Ό-ΡΟ Η -P ^ H

tu HHH tn tncH ci G G O) h O G g 3 G o) --n

H O 3 «3— S - -Η -Η Η - -Η- Λ 3 H 3 C 3 3 tn3-Hd I

0) >1 CG HtUHHGC HC Hl G ft tu GG tt) G cn 3

Λ g tnc-P-' HH >3 CG HH m ffl 3 μ i ffl G m ffl gi -P

3 -p >)GG *·Γ4 3 G M 3 h >1 S >1 Η -H >1,1 tn gt 3 H 1 3 £ 4J—CCI—· C— H-P H -P 3 U H 4J Ό «1

G GO 3 r-v C & 3 C COGH

44 «·44,£ί G G -P -P -4J-P<U »-P G »H O *-P G - *--H O 3 tt) M -P G (U ffl (DG344GGH44GS 44HH-PGtt)4JC 4J H ffl -P >

n 1033 3 3 g 3 3 3 ft 3 3 O Ό Η Η Ό 3 Ό CH Ό H g tn G

3 OG >i-P OG O G G 3 O G G O G 0) OG O HH 0 3 3 3 3 CO Cffl H ffl g Λ I CfflfflS Cffl ffl CCtn Cffl g H — C Cffl S 4) H 44 v I Q) »3 I 0) 1 0) 0 44 44 G O -P 44 0-344

I U Μ H C u M H u 10 H

4J - 44 >1— >1— >1—'

Ό O C - - - - I ^H *H

g -H'O H I O 0) <U -P O <U (U -P Q) 44 3 > Η H '044r-.4)|o3-sT344—.-P 44lo3-^4t|c3-^ •Η Λ — G -P CN CN >1 (N G >1 CN CN >1 Ό CN G >1 CN G >1 Η I 3 O— 3 —C 3 —1 3-H --r^C>3—'r— C3

O P4J— G -HIG >i U IG> >tG,>iG -P

o C°3 Η Λ > 44 O 44 3 44 o 44 O il 44 3 44 O -P «440 0)

>i -H G 3 xj 03 H »3 G C =3 H 03 G C »3 G C -P

g H C G - CG34J GU-HG G34J - GO-HGGO-HG G

44 G tU 3 44 -HCGGCHtUCGG-P tnHtUCHtt) -H

4) 3W-P O4J HQ)3I) 0)41 C > <U 3 tt) Π3 Q)-PG> <U4JG>

3 G >13 G «3 i3tn-P> il G 3H tn4J> G WG3H tn G 3 H

ffl fflHS >t G G >1 3 O >1 0) G H >1 3 O in >iQ)G-H >itUG-H

-P C CH'SU H>ÆW HSU 44 H >-Q W Η > Λ M

44 ·

I IH CN G

•H 13 3 G I ffl 3 I

G 3 ft r> tn 3r- r-· 1+4¾ C-^ M

i ft m tn Ci*^ Gi— G -PAis 3H A!

<U 3 3 0)3 3 3 3 ^ 0) H

cn 3 G IG* Λ!3· C· C 3 G ft ft· g OG 13 G3O WtUO 3Ό 3 G-Pffl ftO g

G 3 (UC HCQ) -Hmtu G tt) tn 44 tn H 3 (U -P

g 3 C M3 G 3 g G H g -Hg C MK'- Mg tt) 3 ffl 3 OG tt) G 3 0) M G ffl 0) <U g

•H O-P O-H O -H ft C>ft Oft H tt) M G Gft |G

Ό 03 3 C >ί C CO G-HC0 G CO G G-h3 >C0 P3

tu 3 G H3 H3H O -P H >iH S S3tn 3H fflC

g CO-P UG UG— 3 tt— E-i —· S U g 3 ffl— C03 6 149599 +) +> Ο) 0)

μ 4J

G G

•Η ιΗ

I I

•μ g μ μ Λ 4J 0) +> η w Φ 0 >ι 0Ϊ CT» 1-4 -μ (ϋ μ ω ι ο >ι m Γμ -μ cflj η ι μ tn μ +* φ ω -μ λ &. tn to η ·μ * £ 3 μ 3 ιΰ μ *μ Λ μ ts •Η > Λ +> * φ -μ •μ Ό C g Η κΊ -μ

G

Ο I μ Η ft-H

φ +> Η ft I « ι φ ε Φ G t n 43 ' ω -η G Φ —» ο -μ ·μ I ο Ο Φ G go G Γμ +J 3 ΓΗ Φ ffi X en O t n ta co "" 7 149599 -μ -p

Ό Ό I

0) (U

Ρ -Ρ -Ρ Ρ -Ρ -Ρ -Ρ ja di η ja c c 8 -h g 8 g -η g G Η Di Ρ 1 Ρ Η Ρ CO Ρ g4J flrj Λ

φ G * G -Ρ » G«G G

ο +) +> ρ bi -μ ρ p -ρ d> -ρ Μ G σι at ja Ή ιίΛ δ> & , 6> ,

φ Ο Η rii Μ Η -Ρ -Ρ -Ρ Ρ Ή -Ρ ·Ρ Ή 4J

1 -ri CO ft -Ρ φ -Ρ -Ρ G G G Φ φ-Ρ-Ρ HAiGHG

§ Η m G Ό ID4 ΐ.3 3 -Ρ rcitQDiHPGH-P

3 ft - Η Ο >t P P P Ρ G Ο >ϊ·Η 3§Ρ3 Ρ Ρ ft cn 6 6 Η θ' bi Λ ·Η g Η Η b> g J5 Di -Η to · cn co Η o -p -P-p-p , m to Di +> +) +» aj g Ρ ' ρ -η tn i tn bi P G js1 -P “

(ti Φ ft Η H -r-l I ·Η ·©- P S

x o ft g h -ph g-p ngjai, h

•P G CN G H W H G °G H ;' H

-P > n- - p P S 3 Ρ P G I -P jH "· w -που ja ijiHtn ja di di Dig -p ,

•H Hin et! Ρ -Ρ φ -Ρ -Ρ -P •P-H&G’+J

p o ft -p Ό -P-P PC > -P G Φ Ό-Ρ-Ρ -P G Η Φ Φ

Φ C4 (ti G tno«j to p p to G P GtobitoGHiopP

P >CO - H >1 >iP >|p G >i P G >1 >|H >iP 3 >1^;« X COH CO Di P H Di Hja mHja-H -PHHHja DlH 0!>·Η 2 5

G η +J

x cg 1-1 s P , P i p

Φ Φ -P bi I P

x h ost p +> -p ja to o .pp.p P3«a h .

H id Di bi Di -P DiPPd-P-P

Dl Η -H G -Η H HjaD'D'D'.D'.

O -Η Η Η φ Η Ρ Η Φ Ή Ρ Ή -P

H pr- ft -Ρ Φ > G Dl ft Φ ft ft J!H flH P

O Di o ft (d Di-P ·©. -Ρ H Di W b> p H G Η P

•η -ρ m η η η p (d Ρ ·Η >ι-Η θ 3 P 3 P

0) G b> P O Dig DiPHHg Di J3 Di ja H >i ft

H ft P · CO

Φ CO Η I

H Di g

φ O g -P-P

ja G -P-P Di P

(d Φ -P CO -P D> Di -HG

ÉHDiOipq I Di I ·Η I ·Η I Η P

Ή ft ·Η Η H G ja

to Φ r- ~ -P -PH -PH -PH +1 -P P

to 'O g ft DiotdGHpHG-P Dioid P -P

ftj φ O ft -PPGGDiGDiDi -H Pi I? g ft I --- HDiPDi-PDi-P-H H Di ·Η ft ft ft

Pbi o -Ρ φ dli-PtuJGlNJGH ΦΦ-P-PHG S G

p ftJ na - (d D> tOtOoGcfliOGtotOGH Di tQ to »id Η Ρ Ρ P

-PH ro ja Η -Η >i>iP >ι>(Ρ >i>tP Ρ -H >1 >1P G P P P

H to I CO Di Ρ Η H DiH HJ5HHJJ Di PHHDi DiJ3 J3 J)

P <D ft I

** 8 ft -pi

- Di D> -P -P D> G

Φ O -H Di D> -HG

X I Η I Η I Η I Η P

Iflcnpa G H H , C i

•ri ft ft r-. -P *P G -PH -PH -P-PG

Di Μ Γ- CO bioitipHGHG-P Di»G P -P

On- g — -HPjaGDiGDiDi -HPjaDi

Hg O H Di D> -P Di -Ρ -Η H Di -p ft ft ft

OO I - -P 0) Φ-Ρ-ΡΦ-PGtU-PGH ΦΦ-P-PHG G P

»Hl o G G b> iQto°GCQtoGtflioGH Di 10 to °G HG G G

PO ni ft Η -Η >ι>ίΡ >ι>ιΡ >ι ΪΡ P G -P >i >i P G Ρ Ρ P

O ni ro ft Di Ρ Η H DiH Η Λ Η H J5 Di PHHDiDU3 ja J5

gn I

I ft ft ft a g a Φ b> - in Ό G ft ft G ro "tf •hk cn JT h

Gr- to h ” ft g g

DiS -H — - P G G

H o Di ro φ -ρ -H

Hl O G ^ > Ό J5 'D

Go Η O O Φ · _ Φ J

φηα O -Ρ Φ gO Φ g D> g g gro ft -P · p . · · · · ·· SI p J4 Ό O ft g g 10 ft ft g g toft g ft ο φ Φ a cn . · · · cn · · ·· coa g to g cn hg to P to hg to Pto 149599

8 I

α) ο f te u +> tn 6

8 "4 0) H

• •k <u

in <D

<* g tn mi + + + +1++1+++11++ t 3 +++++++ 8 φ +> υ £ ,3

S

4-1 P

tu p fl r4 0) p* tn III + + + +I+I+I + + + +!' + <p "· 5 + + + + i Ό -w o CM ·» Ή 0) 4-i tn

U H

0) Φ ft -tf

(ti 4J

‘ri >1 H fi m β Ό

-P III + + ++Ι I 1 +1+ + + + I + + 1 O P

ni 4-4-+ o ro

g + cm ¢5 -MM

jj -Η Φ Φ 14 +> β +! n OJ S3 ^4 ώ U (ti -ri ^ 'b t n

i_i ·* P

h o tu M m ϋ ·- η γ 3+' ϋ T i T +’+ + +++ + + + + + +·· + o -μ * (ti — w + + + ++++ + + N ? m cj tn -η ή tn ^ Q) 1-4 44 ri ri Η φ β +> Φ (ti t n tu S + m & ε <u -p •Η H tut) >1 ft ft-ri Q β m tn o Agt)

_ _ P P

III + + + ++++ + ++ + +II+ i ·*· v; o ——+++++++++ o λ tn >H ·- > OJ + -ri

<*· 4-J

— - (ti i tu tn tn )4 — tn ti) _ ^ ^ Φί 0— ΙΗβ si m u tn -η tn+i o tn +> ‘•tu ^ >ιββΟΦπ3+-μ··· ni tu tDr-1'da-ritU'-HS45JiJ| ΜΗΐσΓ-ΐη O C >lfi O Ufl "Η -P 5 r4 Η Η k4 W r4 Ό -H (D oiti CN ΛΜββ«·

(ugego) HtiUriiJiny i -rf-S

C § 3 p+J 0>i!4+(ti-rlgpi( XP tlØ-H

q-H-H-H+O) Ρ,βΟ+ίΗβΟΜ fl) Olg _ + (ti Ό τ) 'b >1 tn (Ud) t) I IH 3 3 O )IH r4 I Η (Β^Ή

η30)α)0)βθ tutnin tu >i m ι Ό tn -P p ή F° 'Ί 2. S

I g g gt) 3 ti 0) O O -P φιη-ρ -β Φ IU <U Π) ft+ otti -ri MH^JtnO

p -h tn o -P M-H tno-H i tn β μ o tu (ti ft +> <u Φ -h ft rlfcPiPi Si O O U (ti 0) O S S β H -ri +> 34 ft S4 O >0 ·»

Cramt003rl33 Λ O β-Ηβ -Htu-Pnjtutuaj-P Φ (ti Η Η Η 33 U >ιΗ U OS g +< <2 ®>(t)P+!3«ifttn P P g I + +

Η M (ti X tjuu ϋ-ri (0446 tn-rlr4+HH|-M

φ 3iti a(ti <xd <0 1 I I I (til 33 (ti I (ti -P tu -H ffl Φ g « ·* CZ m

gftftftOPQQQ to H K PS Q OtnO!SSSE4> (ti +1 riJfflO

9 149599 III. Fysiologiske egenskaber.

Der er ikke konstateret nogen tydelig forskel mellem de nedenstående karakteristika for stammerne FERM-P 5 nr. 3664 og 3665.

1) Temperaturområde for vækst.

På ISP-2-medium iagttages moderat til rigelig vækst ved 10 20°C, 25°C, 27°C, 30°C, 37°C og 35°C, dog ikke ved 6°C

og 55°c. Den optimale væksttemperatur bestemmes til ca.

37°C.

2) Gelatineforflydning på glucose-pepton-gelatineagar 15 ved 27°C.

Der indtræder en forflydning med moderat intensitet på den 12. dag.

20 3) Stivelseshydrolyse på uorganisk salt-stivelses-agar ved 27°C.

Der indtræder en hydrolyse med en middelstærk intensitet.

25 4) Koagulering og peptonisering i 10%'s skummetmælksmedium ved 37°C.

Der iagttages en peptonisering med stærk intensitet omkring 5. dagen. Koagulationen er negativ.

30 5) Caseinhydrolyse på 10%"s skummetmælksnæringsagar ved 27°C.

Der iagttages en hydrolyse med moderat til stærk inten-35 sitet.

149599 ίο 6) Nitratreduktion på ISP-8-medium ved 27°C.

Negativ.

5 7) Melanindannelse ved 27°C.

På pepton-gær-jernagar (ISP-6) dannes intet pigment. Pigmentdannelsen skønnes at være negativ på trypton-gær-næringssubstrat (ISP-1) og tyrosinagar (ISP-7).

10 8) Carbonhydratudnyttelse på Pridham-Gottlieb-agarmedium (ISP-9) ved 27°C.

Der iagttages rigelig vækst med L-arabinose, D-xylose, 15 D-glucose, D-fructose, saccharose, inosit, raffinose, D-mannit og L-rhamnose.

Sammenfattende kan de ovenfor anførte mikrobiologiske egenskaber for stammerne FERM-P nr. 3664 og 3665 beskri-20 ves som følger:

Stammerne er Actinomycetaler og hører til slægten Strep-tomyces. Luftmyceliets form er lige eller spiralformigt (overvejende lige hos NR-320-OM7HB og overvejende spiral-25 formigt hos NR-320-OM7HBS). Der iagttages ingen krans = (Quirl) dannelse. Sporerne fra begge stammer er overfladisk glatte og 0,6 - 1,8 x 0,8 - l,4yu store. Stammerne udvikler på forskellige ISP-medier lysegråt til lystbrunligt-gråt luftmycelium fra lysgulligt-brun til gullig-brun vækst med 30 ej: brunligt opløselig pigment. Melanoidt pigment dannes ikke på pepton-gær-jern-agar og formodentlig ikke på trypton-gæringsmedium og tyrosin-agar. Stammerne pepto-niserer skummetmælk stærkt. Gelatineforflydningen er svag, medens stivelseshydrolyse optræder i moderat om-35 fag. I alle som de ovenfor udførte tests viser der sig ingen forskel mellem NR-320-OM7HBS og NR-320-OM7HB.

11 149599

Disse karakteristika gør det nærliggende, at stammerne ligner S. nigrifaciens [Waksman, S.A. (1961) Classification, identification and description of genera and species, The Actinomycetes Vol. 2, The Williams and g Wilkins Co., Baltimore, Shirling, E.B. & D. Gottlieb (1968) Cooperative description of type culture of Streptomycetes, II. Species descriptions from the first study, Inst. J. Syst. Bacteriol., 18:69-189. Buchanan, R.E. & N.E. Gibbons (1974) Bergey’s Manual of Determinative Bac-teriology, 8th ed., The Williams and Wilkins Co., Baltimore. Waksman, S.A. (1919) Cultural studies of species of Actinomyces, Soil Sci., 8:167-171], S. olivaceus [Waksman, S.A. (1961) Classification, identification and description of genera and species, The Actinomycetes Vol.

2, The Williams and Wilkins Co., Baltimore. Shirling, E.B. & D. Gottlieb (1968) Cooperative description of •type culture of Streptomyces, II. Species descriptions from the first study, Inst. J. Syst. Bacteriol., 18:69-189.

Buchanan, R.E. & N.E. Gibbons (1974) Bergey’s Manual of 2Q Determinative Bacteriology, 8th ed., The Williams and Wilkins Co., Baltimore. Waksman, S.A. (1919) Cultural studies of species of Actinomyces, Soil Sci., 8:167-171.

Breed, R.S., E.G.D. Murray & N.R. Smith (1957) Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7th ed., The Williams and Wilkins Co., Baltimore] og S. plicatus [Buchanan, R.E. & N.E. Gibbons (1974) Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th ed., The Williams and Wilkins Co.,

Baltimore. Shirling, E.B. & D. Gottlieb (1969) Cooperative description of type culture of Streptomyces, IV.

2Q Species descriptions from the second, third and fourth studies, Inst. J. Syst. Bacteriol., 19:391-512. Parke,

Davis and Co. (1954) Antibiotics and methods for obtained same, britisk patentskrift nr. 707.332, 14. april]. Sammenligningen af de her omhandlede stammer med iSP-stammer -c med ISP-stammer fremgår af tabel II.

JD

Det har vist sig, at de to stammer, nemlig NR-320-OM7HB og NR-320-OM7HBS, kan skelnes fra hver af disse tre ovenfor 12 149599 nævnte nært beslægtede arter.

I sammenligning med S. nigrifacies adskiller NR-320-OM7HB sig for det første ved peptonisering af skummetmælk og ud-5 nyttelse af saccharose, inosit og raffinose. Morfologisk danner S. negrifacies aldrig spiraler. Disse kendsgerninger gør det sammen med at S. negrifacies danner et olivengråt luftmycelium og grønligt substratmycelium på ISP-3-medium samt mangler evne til inhibitorproduktion usandsynligt, at de to 10 stammer tilhører samme art.

På den anden side optræder sporekæderne hos S. plicatus ISP 5319 hovedsagelig spiralformigt på ISP-2-, 3-, 4- og 5-me-dier. Selv om der mere sjældent iagttages et snoet mycelium 25 ses ingen lige form hos ISP 5319, hvilket adskiller S. plicatus fra NR-320-OM7HB. Endvidere ses grundlæggende forskelle i udbredelsen af luftmyceliet, af pigmenteringen, koaguleringen, gelatineforflydningen og udnyttelsen af saccharose og raffinose.

20 S. olivaceus viser sig blandt de tre testede arter at være NR-320-OM7HB nærmest beslægtet. Således viser S. olivaceus ISP 5072 spiralformet vækst i de fleste dele på ISP-2-, 3-, 4- og 5-medier, delvis med snoetformede 25 lige sporekæder i luftmyceliet. Den adskiller sig dog fra både NR-320-OM7HB og fra NR-320-OM7HBS ved, at spiralformede, snoetformede og lige sporekeder eksisterer ved siden af hinanden inden for en klynges luftmycelium, hvilket aldrig er iagttaget hos NR-320-OM7HB 30 og NR-320-OM7HBS. Mellem ISP 5072 og NR-320-OM7HB er

yderligere iagttaget forskelle ved produktionen af opløseligt pigment (ingen pigmentering ved ISP 5072 på ISP-2-, 3-, 4- og 5-medier), udvikling af luftmycelium (tyndt luftmycelium hos ISP 5072) udnyttelse af carbon-35 kilder (saccharose/raffinose) og produktion af a-amylase-inhibitor (ingen hæmning ved ISP 5072-metaboliter). Alle disse resultater viser, at NR-320-OM7HB og også NR-320-OM7HBS

13 149599 synes at være nært beslægtede men dog ikke identiske med arten S. olivaceus ISP 5072.

Det synes derfor berettiget at anse denne taxonomiske 5 gruppe som en hidtil ukendt art inden for slægten Strep-tomyces, og denne art betegnes her Streptomyces dimor-phogenes nov. sp. WATANABE og MARUYAMA, 1978. Typestammen for Streptomyces dimorphogenes er NR-320-OM7HB (FERM-P nr. 3664). Etymologien: di (dual), (græsk), morfe' (form) + genesis 10 baseret på tilstedeværelsen af to former af sporekædernes morfologi, dvs. stedvis fordeling af spiralkædede kvaste som minoritet. En biotype, NR-320-OM7BS (FERM-p nr. 3665), hvori den spiralformede sporekæde er dominant, med stedvis fordeling af de lige sporekæder som mindre samlinger kunne derfor hen-15 sigtsmæssigt kaldes Streptomyces dimorphogenes subsp. spirofor-matus, under hensyntagen til myceliets morfologi. Typestammen FERM-P nr. 3664 skulle derpå tilsvarende benævnes Streptomyces dimorphogenes subsp. dimorphogenes.

20 Dyrkningen kan gennemføres i et dyrkningsmedium, der indeholder sædvanlige næringssubstanser, som disse mikroorganismer kan anvende. Carbonkilderne er f.eks. stivelse, dextrin, glucose, glycerol, saccharose, trehalose, melasse eller blandinger deraf, nitrogenkilder er f.eks. soja-25 bønnepulver, kødekstrakt, pepton, gærekstrakt, majsstøbevand, ammoniumsulfat, natriumnitrat, ammoniumchlorid eller blandinger deraf. Dyrkningsmediet kan, hvis det er nødvendigt, indeholde egnede uorganiske stoffer såsom cal-ciumcarbonat, natriumchlorid og/eller salte af zink.

14 149599 kobber, mangan eller jern. Der kan yderligere tilsættes antiskummidler såsom silicone eller vegetabilske olier for at forhindre en skumning under dyrkningen.

5 Dyrkningen kan foretages under aerobe betingelser i et vandigt medium, især ved submers fermentation. Mediets pH-værdi er ved dyrkningens begyndelse ca. 7. Den foretrukne temperatur ligger i området fra 20 til 40°C, især fra 25 til 30°C.

10

Efter dyrkning i 1 - 5 dage under de ovenfor angivne betingelser kan trestatinerne udvindes af gæringsvæsken. Dyrkningen afbrydes hensigtsmæssigt på det tidspunkt, da der er opnået den største trestatinaktivitet. Mængden 15 af vundne trestatiner kan bestemmes på følgende måde:

Bestemmelse af trestatiner.

Trestatinerne udviser en stærk hæmningsvirkning på a-amy-20 lase. De kan derfor bestemmes ved hjælp af en metode, hvori anvendes α-amylasetesten ifølge P. Bernfeld (Methods in Enzymology, I. 149, 1955) .

To enheder (en enhed α-amylase er den enzymmængde, som 25 under de nedenfor angivne betingelser i fravær af tres-tatin katalyserer dannelsen af reducerende sukkerarter i en mængde ækvivalent til 1 iryumol maltose) svinepan-creas-a-amylase i 0,1 ml 6,4 millimolær ammoniumsulfat-opløsning sættes til 0,6 ml 20 millimolær phosphatpuffer 30 (pH-værdi 6,9),. som indeholder 10 millimol natriumchlorid og forskellige mængder trestatin. Blandingen inkuberes efter 5 minutters ækvilibrering ved 37°C efterfulgt af tilsætning af 0,5 ml 4%'s stivelsesopløsning i 5 minutter ved 37°C. Reaktionen afsluttes ved tilsætning af 2 ml 35 dinitrosalicylsyrereagens (fremstillet ifølge P. Bernfeld). Blandingen opvarmes i 5 minutter på det kogende vandbad og fortyndes derpå med 10 ml vand. Absorptionen (A^) for 15 149599 den vundne farvede opløsning måles ved 540 nm, hvorefter a-amylasehæmningsaktiviteten kan bestemmes ud fra følgende ligning:

A — A

c Hæmning = (1--x 100 (%) A2 ” A0

Aq Absorption uden enzym A2 Absorption uden trestatin.

Iq Hæmningsenheden (Ιϋ) defineres som den mængde trestatin, som under de beskrevne testbetingelser bevirker en 50%'s enzymhæmning.

Efter forgæringen kan isoleringen af de fremstillede tres-15 tatiner ske fra fermentationsopløsningen på 1 °9 for sig kendt måde, f.eks. på følgende måde: Myceliet fraskilles ved centrifugering eller filtrering. Trestatinerne er vandopløselige, svagt basiske forbindelser. Derfor kan der til isolering og rensning af trestatinerne anvendes 20 sådanne konventionelle metoder, som anvendes til isolering og rensning åf et vandopløseligt basisk stof. F.eks. kan dette opnås ved absorptionsmetoder ved et absorptionsmiddel såsom aktivkul eller kationbytterharpikser eller fældningsmetoder med et opløsningsmiddel såsom en alkohol 25 eller acetone eller chromatografiske metoder under anvendelse af cellulose eller "Sephadex"® eller ved kombinationer af de ovenfor nævnte metoder.

Isoleringen af Trestatin A, Trestatin B og Trestatin C 30 som enkeltforbindelser fra fermentationsfiltratet kan hensigtsmæssigt ske ved søjlechromåtografi under anvendelse af en blanding af H-formen og ammoniumformen af en svagt sur kationbytterharpiks. En fordelagtig metode er følgende: 35 Fermentationsfiltratets pH-værdi indstilles med alkali såsom natriumhydroxid, kaliumhydroxid, natriumcarbonat eller kaliumcarbonat på pH-værdi 7. Til filtratet sættes 16 149599 derpå aktivkul, og opløsningen filtreres. Trestatinerne elueres fra kullet med 30 - 70%'s, fortrinsvis 50%'s, vandig acetone. Elueringsmidlet indstilles fortrinsvis med en syre til pH-værdi 1 - 3, og elueringen udføres ved 50 -5 70°C. Eluatet koncentreres, og koncentratet føres over en kationbytterharpikssøjle såsom "Dowex"® 50 (H-form) .

Søjlen vaskes med vand og elueres med IN vandig ammoniak. Fraktionerne med amvlasehæmningsaktivitet samles, koncentreres under reduceret tryk og lyofiliseres, hvorved fås 10 et pulverformigt råprodukt, som indeholder trestatinerne. Råproduktet behandles med methanol til fjernelse af me-thanolopløselige forureninger. Trestatinerne er næsten uopløselige i methanol. Den methanoluopløselige remanens med trestatinerne opløses i vand. Opløsningen føres 15 over en anionbytterharpikssøjle såsom "Dov/ex"® 1 (acetatform) . Søjlen fremkaldes med vand, og eluatet fraktioneres.

De aktive fraktioner samles, koncentreres under reduceret tryk og føres over en kationbytterharpikssøjle såsom "Dowex"® 50 (ammoniumform). Søjlen elueres med vand. Fraktionerne 20 roed amylasehæmningsaktivitet opsamles, koncentreres og lyofiliseres, hvorved fås et pulver, som ved højtryks-væskechromatografi viser, at det hovedsagelig består af Trestatin A, Trestatin B og Trestatin C. De vandige opløsninger af trestatinerne føres over en kationbvtter-25 harpikssøjle såsom "Amberlit"® CG 50 (blanding af H-form og ammoniumform). Det foretrukne forhold mellem H-form og ammoniumform ligger i området 1:9 - 9:1 (volumendele).

Søjlen elueres med vand, hvorhos Trestatin B, Trestatin A og Trestatin C fås i den nævnte rækkefølge. Hver så-30 ledes vunden trestatin rechromatograferes, hvorved de rene trestatiner A, B og C fås. Trestatinerne kan, om ønsket, omdannes til forskellige salte såsom hydrochlo-rider, sulfater, phosphater, acetater eller oxalater.

35 Smeltepunkt for hydrochloriderne: 17 149599

Trestatin A-hydrochlorid: 163 - 190°C (sønderdeling under skumning).

Trestatin B-hydrochlorid: 158 - 186°C (sønderdeling under 5 skumning).

Trestatin C-hydrochlorid: 190 - 200°C (sønderdeling under skumning).

10 Specifik drejning for hydrochloriderne:

Trestatin A-hydrochlorid: [a]^ = +162,5° (c = 1,0 i 0,0IN saltsyre).

15 Trestatin B-hydrochlorid: = +169° (c - 1,0 i 0,01N

saltsyre).

Trestatin C-hydrochlorid: [a]p5 = +160,5° (c = 1,0 i 0,01N saltsyre.

20

Titrering (i vand): pKa' Ækvivalent

Trestatin A 5,0 720 25 Trestatin B 5,0 960

Trestatin C 5,0 650

Disse data viser sammen med den ovenfor angivne molekylvægt, at Trestatin A, B og C er tobasige, enbasige 30 henholdsvis trebasige baser.

Empirisk formel:

Trestatin A: C56H94N2°40 35 Trestatin B: C37H63N028

Trestatin C: C75H125N3°52 18 149599

Kerneresonansspektrene (i D20 ved 100 MHz) for Trestatin A, B og C som frie baser optages med et JEOL FX-100 spek-trometer med "homo gated decoupling" (indstråling ved δ 4,71 ppm) under anvendelse af DSS som intern standard 5 og er angivet i fig. 4, 5 og 6.

Tyndtlagschromatografi:

Plade: Silicagel (Merck)

Opløsningsmiddelsystem: Chloroform-methanol 25%'s vandig ammoniak-vand (1:4:2:1) Påvisning: varm svovlsyre.

Under de ovenfor beskrevne betingelser er R^ værdierne ^ for Trestatin A, B og C henholdsvis 0,19, 0,28 og 0,14.

Høj tryksvæskechromatografi: Søjle: u-Bondapak/CH (30,48 cm x 0,635 cm,

Waters Co., USA)

Opløsningsmiddel: Acetonitril-vand (63:37).

Flydehastighed: 4,0 ml/minut.

Påvisning: UV-absorption ved 210 nm.

25

Under de ovenfor beskrevne betingelser er retentionstiderne for Trestatin A, B og C henholdsvis 5,5, 3,4 og 8,8 minutter. Chromatogrammerne er angivet i fig. 7.

Papirelektroforese: 30

Papir: Toyo Roshi nr. 51

Puffer: Myresyre-eddikesyre-vand (25:75:900, pH-værdi 1,8)

Spænding: 3000 V

35

Tid: 40 minutter.

19 149599

Under de ovenfor beskrevne betingelser vandrer alle tres-tatiner mod katoden: Trestatin A: 12 cm, Trestatin B: 9 cm, Trestatin C: 13 cm.

5 Struktur:

Efter hydrolyse med 4N saltsyre ved 80°C i 3 timer giver Trestatin A, B og C glucose og en amin. Aminen har en pKa'-værdi på 3,9 og bruttoformlen C]_3H21N®7' hvilket 10 fremgår af "high resolution"-massespektret. Trestatiner-ne A, B og C indeholder henholdsvis 5, 4 og 6 mol glucose. Mild syrehydrolyse (80°C, 4 timer) med "Dowex"® 50 (H-form) som katalysator giver trehalose (α-D-gluco-pyranosyl-a-D-glucopyranosid). Ingen af trestatinerne 15 A, B og C indeholder aminosyrer.

Ud fra de ovenfor angivne egenskaber kan det sluttes, at de her omhandlede trestatiner A, B og C er svagt basiske aminoglucosider med trehalose som en fælles 20 strukturel bestanddel.

Trestatin A, Trestatin B og Trestatin C udviser en høj amylasehæmningsaktivitet, som det påvises nedenfor, og kan anvendes som amylasehæmmere.

25 ^ Konventionelle amylasehæmmere, som fremstilles ved fermentation, er følgende: 1) Nojirimycin, Niwa et al. (Agr. Biol. Chem., 3£, 966, 30 1970).

Nojirimycin er et monosaccharid og er derfor helt klart forskelligt fra trestatinerne, der fås ifølge den foreliggende opfindelse.

35 20 149599 2) Peptidsukker, S. Ueda et al. (Agr. Biol. Chem. 37, 2025, 1973 og Agr. Biol. Chem., 4J), 1167, 1976).

Peptidsukkeret indeholder aminosyrer som strukturel 5 byggesten.

3) Amylostatin A, S. Murao et al. (japansk patentansøgning, Kokai 123891/1975).

10 I denne patentansøgning beskrives det, at Amylostatin A ikke absorberes af stærkt sure kationbytterharpikser i pH-området 1-14. Som det er nævnt, adsorberes tres-tatinerne af en sådan ionbytterharpiks.

15 4) Amylase-inhibitor, K. Ueda et al. (japansk patentan søgning, Kokai 54990/1976).

Denne amylase-hæmmer har en molekylvægt på ca. 600, som er forskellig fra molekylvægten for Trestatin A, B og C.

20 5) Aminosukkerforbindelser, W. Frommer et al. (dansk fremlæggelsesskrift nr. 139.979).

Disse forbindelser er enbasige baser, medens Trestatin A 25 er en tobasig base og Trestatin C en trebasig base.

Trestatin B indeholder, selv om den er en énbasig base, trehalose som strukturel byggesten og er derfor forskellig fra de af Frommer et al. beskrevne aminosukkerarter.

30 6) I amino sukker forb inde1s erne ifølge tysk fremlæggelses skrift nr. 2.614.393 er glucoseenhederne bundet sammen 1,4-glycosidisk, dvs. de indeholder ingen trehaloserest (1,1-binding). Forbindelserne ifølge tysk fremlæggelsesskrift nr. 2.614.393 indeholder i modsætning til Trestati-35 nerne en reducerende endegruppe.

21 149599 7) Hos forbindelserne ifølge dansk fremlæggelsesskrift nr.

139.533, der fås ved hjælp af Streptomyces fradiae CBS 498.68, S. chrysomallus NRRL 2580 og ATCC 11523 og S. aureo-faciens CBS 434.51, kunne der ikke observeres nogen amylase-5 hæmning. Det ved hjælp af S. murinus NRRL B-2286 vundne produkt var efter 1 times behandling med amyloglucosidase næsten inaktiveret, medens Trestatinernes hæmningsvirkning under de samme betingelser stadigvæk udgjorde 85%.

10 Amylase-hæmmere med trehalosebyggesten er hidtil ikke beskrevet.

De biologiske egenskaber for trestatinerne og saltene deraf er følgende: 15 1) Akut toxicitet:

En akut toxicitet kan ikke iagttages, selv når rotter fodres oralt med 500 mg/kg Trestatin A, B og C (dvs.

20 65 - 700 gange det virksomme dosis). En trestatinblan- ding svarende til det i eksempel 1 som trin III-pul-ver betegnede præparat tåles godt i daglige doseringer på op til 8000 mg/kg i 10 dage af mus og rotter.

2^ 2) Antimikrobielt spektrum:

Manglen på antimikrobiel virkning hos Trestatin A, B og C bestemmes ved en agarfortyndingsmetode og fremgår af nedenstående tabel: 22 149599

Antimikrobielt spektrum for Trestatin A, Trestatin B og Trestatin C.

Testorganisme Trestatin A Trestatin B Trestatin C

^ug/ml ^ug/ml ^ug/ml

Escherichia coli NIHJ >100 >100 >100

Escherichia coli NIHJ SMf >100 >100 >100

Escherichia coli NIHJ STf >100 >100 >100

Escherichia coli K-12 ML1630 >100 >100 >100

Escherichia.coli CF17 >100 >100 >100

Escherichia coli CF41 >100 >100 >100

Salmonella typhimurium IF012529 >100 >100 >100

Salmonella paratyphi B >100 >100 >100

Citrobacter >100 >100 >100

Shigella flexneri >100 >100 >100

Klebsiella pneumoniae PCI602 >100 >100 >100

Pseudomonas aeruginosa IF012689 >100 >100 >100

Pseudomonas aeruginosa A3 >100 >100 >100

Pseudomonas aeruginosa P2 >100 >100 >100

Proteus vulgaris 0X19 ATCC6898 >100 >100 >100

Bordetella bronchiseptica

Aichi 202 >100 >100 >100

Proteus rettgeri >100 >100 >100

Serratia marcescens IF012648 >100 >100 >100

Staphylococcus aureus FDA209P >100 >100 >100

Staphylococcus aureus MS3937 >100 >100 >100

Staphylococcus aureus MS9261 >100 >100 >100

Staphylococcus aureus Smith >100 >100 >100

Bacillus subtilis PCI 219 >100 >100 >100

Sarcina lutea ATCC9341 >100 >100 >100

Candida albicans Yul200 >100 >100 >100

Mycobacterium smegmatis ATCC607 >100 >100 >100 23 149549 3) Amylasehæmningsvirkning: Hæmningsvirkningeri af Trestatin A, B og C, saltene deraf og blandinger deraf på svinepancreas-α-amylase beskrives 5 i det nedenstående. Aktiviteten bestemmes ved den ovenfor beskrevne metode.

Amylase-hæmmer Hæmningsaktiviteter (IU/g) * 7

Trestatin Complex 3,6 x 10 10 Trestatin A 7,1 x 10^

C

Trestatin B 1,5 x 10 7

Trestatin C 4,9 x 10 7

Trestatin A.HC1 6,3 x 10

Trestatin B-HC1 1,3 x 10^ 15 Trestatin C-HC1 4,5 x 10^ Hæmning af med kogt risstivelse inducerede hyperglykæmi

Rotter

ED

20 ' 20** (ittg/kg) Mus,' per or alt

Trestatin A 1,0 1,1

Trestatin B 7,7 3,2

Trestatin C 3,0 0,7 25 * Trestatin Complex henviser til det præparat, som fås ifølge eksempel 1, -II isolering 5), og som indeholder Trestatin A, Trestatin B og Trestatin C.

** ED2q er den dosis, som efter 20 minutter bevirker en 30 20%'s reduktion af den hyperglykæmi, der fremkaldes ved oral administration af 2 g/kg legemsvægt kogt risstivelse.

Trestatinerne kan også hæmme a-amylase fra Bacillus subtilis og Aspergillus oryzae og amylo-ct-l,4-a-l,6-gluco-35 sidase fra Aspergillus niger. De udviser dog ingen hæmningsvirkning på β-amylase fra batater.

Fordøjelsen af stivelsen, som udgør hovedcarbonhydratet 24 149599 i de menneskelige næringsmidler, begynder med a-amylases virkning. Dette enzym befinder sig i spyttet og i pancreas sekretet. Pancreasamylasen er hovedsagelig ansvarlig for den fuldstændige fordøjelse af stivelsen i mave-5 tarmsystemet. Den katalyserer nedbrydningen af carbonhy-dratpolymeren, hvilket til slut resulterer i maltose, der atter gennem intestinale disaccharidaser hydrolyseres til glucose. Derfor iagttages kort tid efter et måltid af stivelsesholdige levnedsmidler en udpræget hypergly-10 kæmi, som fører til en hyperinsulinæmi.

Hos diabetikere er denne hyperglykæmi som bekendt meget udpræget og særdeles uønsket. Hos overvægtige mennesker er denne hyperglykæmi ofte ledsaget af en forøget in-15 sulinsekretion, hvilket kan føre til en udtømning af pancreas's β-celler. Desuden begunstiger hyperinsulinæmi lipogenesén, som bidrager til hyperlipidæmien.

Trestatin A, B og C og præparater/ som indeholder ét 20 eller flere af disse trestatiner, kan reducere postprandial hyperglykæmi og hyperinsulinæmi, som det fremgår af eksperimenter med rotter og mus efter stivelsesbelastning (side 23 og tabel I) eller efter administration af foder (tabel II).

25

Den ved oral saccharosetilførsel inducerede reduktion af hyperglykæmien (tabel I) viser udover hæmningen af o--amylase en vis invertasehæmning. Den udøver ingen virkning på den glucoseinducerede hyperglykæmi.

30

De her omhandlede trestatiner er derfor af værdi til behandling af diabetes, fedme, hyperlipidæmi og athero-schleroser.

35 Da α-amylase i spyttet ved fordøjelse af stivelse i munden kan bidrage til caries, kan trestatine også anvendes til forhindring eller reduktion for dannelsen af caries.

149599 25

Trestatiner kan endvidere anvendes som biokemiske reagenter.

é 26 149599 \ G ., (us ft to i ·η <u η +j rt 3 Φ tO -P η Φ > rt to o to -rt Ό i to Φ XX ·£) Ο -P >i > H to XX , ® rt to £ o (uo * * * x , . , ^ <0 a) rt rt Λ o ill ill i i i Λ 5

Λ Ό O O (Urt on's· ^ tn-H

ϋ Φ ,0 tji to Η σι r- vo oo oo _ u > rt ο Ο ϋ S'

(tJ Λ to g rt O

to o h to to ο Λ ft rt <D « O £ φ vo Ό O >

H - <U td H

rrt h m to w S

φ ''OH- ft Φ rt φ m 53 W ·Η Η Ή £ irt +J Φ "2 0) (0 to --. 5 > -P +) rrt rt •H to rt o >

4- 1 0) (U O

tn rt u - tr Λ

+)00 rt * XX

tn rt -rt X X X X X

•h +an rt rt x * -X x x x x x x to Η +> -H rt 5- f M g ft tflirtrrtCOH|l|VOCMCM|HHmi -rt rt (DO'-' to rt vo m ^ VO ^ m vo vo rt +J +) tfl rrt tQ 0) to to x <u c h c rt +) X Λ Μ o Ό <u x to___5

Ό >1 > 0) *H

H Q) rrt -rt to 1

s G to - H XXX XXX XXX H

,rt o rt 0) XXX XXX XXX H

<U to ΛΠ5Η >(UXXXIIlXXXlXXXI I

Λ rt rt o -rt to ro-H td rt - +J o m o vo oovom hooo -

phG otuo to o r·» vo in vomtn γ- vo in H

•P rt , in rt (U ll η h to <D rt U___£ i—i +j rt a----1¾ <D *rt (U '— DDDDDDG'Gitp&i&'&'&'gig ·

,q Λ (D +» HHHHHHgggggggg (DU

•rt <0 X tr » _

H g rt -P X X oooooonooofnooo ΛΙ G

njBtUi-i \ oooooo - -- -- -- - φ-rt

rt rt +-) rt - to voooooooi—imoor-Hmo +J

0-rt+JtO— -rt CO MOJtd

Hrttum tovotNvoooo to +J

Ό rt C rtJ o 0 cm vo cm vo o Hto φιη-rt- Q M to Μ Ό Ο) > rt g · o <rt rt -rt CM -rt E-t C rt O CO || . .

φ (D CM X > tO

d ft \ ft ho »tå £ -rt to rt pq ft - H 0 X -ft rt rt — rt rt c -rt to ta +j -rj

•η g c λ rt ^ , +J

+j S -rt o tu X -rt ta ta ,« o r-ι , -p +j >, & ιβ η to +) to

10 irt O tO O rt ® P

Φ to rt · -rt Ό rt rtrtOtn+J— Ό E-t

+J Φ to rt -P C H

ft 0 CM 0 to ta -rt - m>iO-ft4<D h rf! u +J<! (8 i! rt co -P Λ _ _ , hoi rt rt rt ft c tJ\ φ &l rt a > -rt -rt -rt Φ -rt

rt Ό <0 <D <D Ο -P -P +1 rt -P

•rt rt g *rt -P rt to iO to (OtO

COtOrttOrt -P -P -P > -P

to id (D 10 -rt to 10 to to to

rt rrt r-1 rrt g Φ <D Ο P

h s. ft & in ω rt rt rt --- rt > Ή — ,¾ Λ I E-t E-t E-t X Ei 27 149599 me , QJ - (0 -H LO CM Η ή 'O 6

£ β O

a +i +i +i +i o m

OHO M

•H g CM Ο r- ro *< Ο 4K 0> 51

+J \ * i—I m Η H 4K ^ O

id D ·-----g

P 3 W S

-P = C; to η ω 6 ^ .,-1 · O Q) λ β β +1 β Η Γ0 H H a Η Ή Η β β 2 e Η ·Η g +1 +1 +1 +1 £, ·Η ° Η 3 Ό O' H ' id ω ρ ο ·μ< οο ^ τΚ οο-Κ <1)0 Η ·Η > * 0 & <0 I Η______ 5 μ <0 ω *+ ·Η „ ο ε ό . φ m Ό Ό Η -Μ Ρ ιΰ ·Η Ο Η *

ο η ε · ο ^ S

+1 Ο,'-CH cm oo ,, g _r

m ·Η ro Ρ β H

® ε +1 +1 +1 +l °<2 s H O

•H o o in * CM·« oo -K _ & 0) £ (Min r—! CM H tTi Id a o S o ρ ε S (d <u o.

η ------- OM - H ^ I « O * Φ β Λ -Η H t'· O' *“ « n ε ^ oh —

Eh <U (M - ’S m ft O o »w o ^ OCJ^D^ CO CM-H ·Η * £ rH ·Η ^ ^ \ - ε +i +i +i +i ω * ,, « tji oi a) -K -P «π) a o g w o h m> m HK ο 4K +>^<um "

• cmo oo r~ ίο ω Cn M

•rH ·Η Μ Η Η Η Η H Id β <D g τΚ

£-----IP -Η Ό O

B a) +i Ό β in > 3 w — β <1> 0 >1 OH Η 'Μ1 &) Id β) +1 β

rH U'd’H H in (M H 10 0) P

tn 3 ρ β m Λ 3 Ρ h p h « -η +i +i +i +i ο β ω <p u ε a) tn > ε η > ω ft i h co o oo iK rf tK i +) Ρ H tn i >, (dd)o cm ο 4K r- ·« o -¾ id ID 3 0 > x! g >d ιο na Η Η Η in -Ρ 'ϋ a 0 tø Td___CO Μ Ο I ffl Ρ «ο <d ·η--- - <u m > o ft Η ε P 0) H - O' ft — · ο o cm in p +> ·η «3 h

C β <U Ρ β O

•H -H +1 +1 +1 +1 +j +1 0 -Η β ε +) £ +) -Ρ Ρ H 0

id in m ΊΚ r- HK o-iK 0 —· ni -M -t-* M

+). or- ό-K o -K oo -X P CD P d

tø p (Μ (Μ (Μ Η Η β 4+ 0 H +J ID

a)(U 3 +> Λ ·Η D) O'

p +) ,^__J__ --- XJ o m -P Q) H

+)+) Ρ Η Ρ Όι

ο £3 vo N, ID E-ι *P

ΜΗ P D £0 Η H+)>d -H

Id HH «d 8 Η β P

H — Ofttd<U<D,*

tr-r) Η ο ο O ogMO-H

β+) o "C <N ^ P\PMH+)

•H ro fl)&\0>OM

β p m p+)p p PM< 0)β<ηχ!-Η ^10) -Η ο) β o) cm o)r- 0) cm ana 0)+) ΡΌ to Τ30ΌΜ d id Ό in 3 - H00 Ο X Ο Ο Ο P CM ^ * β 4) >tp a [)4-11)+ pd+ ft+ cd — * * η ca 149599 28

De her omhandlede trestatiner og saltene deraf kan anvendes som medikamenter, f.eks. i form af farmaceutiske præparater, som indeholder dem i blanding med et til enteral administration egnet organisk eller uorganisk inert 5 bæremateriale, f.eks. vand, gelatine, gummi arabicum, lactose, stivelse, magnesiumstearat, talkum, vegetabilske olier eller polyalkylenglycoler. De farmaceutiske præparater kan være i fast form, f.eks. som tabletter, dragéer eller kapsler, eller i flydende form, f.eks. lo som opløsninger eller suspensioner.

En dosisenhed kan indeholde 20 - 50 mg virksomt stof.

Den daglige dosis til voksne kan variere mellem 10 og 200 mg og skal varieres svarende til de individuelle 15 krav.

Trestatinerne og saltene deraf kan også anvendes som tilsætninger til næringsmidler og diætpræparater såsom sukker, frugtsaft, chokolade, marmelade, kartoffel-20 produkter og brød. Hensigtsmæssigt indeholder sådanne næringsmidler eller præparater 0,1 - 1 vægtprocent af de hér omhandlede trestatiner.

Opfindelsen belyses nærmere ved følgende eksempler: 25

Eksempel 1.

I Fermentation.

30

Et næringsmedium fremstilles af følgende bestanddele: Kartoffelstivelse 20 g

Glucose 20 g Gærekstrakt 5 g 35 Natriumchlorid 2,5 g

Mineralsaltopløsning * 1 1 ml

Deioniseret vand 1 liter 29 149599 4 Opløsningen indeholder 50 g ZnS0^.7H20 og 5 g CuS04.5.H20 og 5 g MnCl2.4H20 pr. liter deioniseret vand.

Den ovenstående opløsnings pH-vaerdi indstilles ved til-5 sætning af 6N natriumhydroxid til 6, hvorpå tilsættes 3,2 g calciumcarbonat og 20 g sojabønnemel, og næringsopløsningen dampsteriliseres i 20 minutter ved 120°C.

Sporer af en skråagarkultur af Streptomyces dimorphogenes 10 Sp. NR-320-OM7HB (FERM-P nr. 3664) overpodes på 10 500 ml's Erlenmeyer-kolber, som hver indeholder 110 ral steriliseret medium. Kolberne anbringes på en rotationsrystemaskine med et omdrejningstal på 185/minut og rystes i 72 timer ved 27°C. Derpå anvendes kulturerne til podning af en 15 50 liters fermentationsbeholder, som indeholder 25 liter af det samme medium. Fermentationscyklen er ca. 43 timer, hvorunder temperaturen holdes på 27°C, og der tilføres filtreret luft med en hastighed på 25 liter/minut. Rystehastigheden er 300 bevægelser/minut. En typisk tres-20 tation-fermentations-kultur (pH-værdi 6,9) udviser en ak tivitet på 3,1 x 10^ IU/ml.

II Isolering.

25 i) Kuladsorption:

Det fra den ovenfor beskrevne trestatin-fermentation vundne fuld--kultur indstilles med 5N natriumhydroxid til pH-værdi 7,0 og 4 filtreres derpå. Filtratet (19 liter, 3,1 x 10 IU/ml, 5,9

O

30 x 10 IU/total) tilsættes 380 g aktivkul, og blandingen omrøres ved stuetemperatur i 20 minutter og filtreres derpå. Kulkagen vaskes med 4 liter ledningsvand og suspenderes i 10 liter varm 50%'s vandig acetone. Suspensionen indstilles ved tilsætning af 6N saltsyre til pH-værdi 2 og 35 holdes under omrøring ved 60°C i 20 minutter, hvorhos blandingen ved lejlighedsvis tilsætning af 6N saltsyre holdes på pH-værdi 2. Blandingen filtreres derpå, og kul- 149599 30 kagen behandles flere gange med yderligere 10 liter 50%'s vandig acetone på samme måde. De forenede filtrater indstilles ved tilsætning af 6N natriumhydroxid på pH-Værdi 7, og en ringe mængde bundfald frafiltreres. Filtratet

O

5 (5 x 10 IU/total) koncentreres under reduceret tryk til ca. 3 liter. En del af koncentratet lyofiliseres, hvorved fås et råt trestatincomplex i form af et mørkebrunt g pulver (3,2 x 10 Ιϋ/g), som her betegnes som trin I-pul-ver.

10 2) "Dowex"®50-adsorption:

Q

Koncentratet (ca. 3 liter, 5,6 x 10 IU/total) hældes over en søjle (80 x 7,5 cm) af "Dowex" ^ 50 (H-forra, 3,5 li-15 ter 20 - 50 mesh) med en hastighed på ca. 10 milliliter/minut. Søjlen vaskes med 10,5 liter deioniseret vand, elueres med IN ammoniak og fraktiones. De fraktioner, der inde- 3 holder mere end 3 x 10 IU/ml trestatin forenes, koncentreres under reduceret tryk og lyofiliseres, hvorved fås 20 75,4 g brunt pulver (7,0 x 106 IU/g, 5,3 g 108 IU/total), som i det følgende betegnes trin Il-pulver.

3) Methanolbehandling: 25 75,4 g af trin Il-pulveret suspenderes i 3.770 ml methanol og omrøres i 2 timer ved stuetemperatur. Den uopløselige del frafiltreres, vaskes med lidt methanol og tørres, hvorved fås 41,5 g brunt pulver (1,1 x 107 IU/g, 4,6 x 10° IU/total), som i det følgende betegnes trin III-Pulver.

30 4) "Dowex" ® 1-chromatografi: 41,5 g trin III-pulver opløses i 100 ml deioniseret vand. Opløsningen hældes på en søjle (87 x 5,5 cm) af "Dowex" ®1 35 (acetatform, 2,050 ml, 200 - 400 mesh). Søjlen udvikles med deioniseret vand med en hastighed på 2,5 ml/minut, og eluatet opsamles i 17 ml's fraktioner. De aktive 31 145599 fraktioner 35 - 70 forenes, koncentreres, inddampes under reduceret tryk og lyofiliseres, hvorved fås 22,6 g af et gult pulver (1,8 x 107 IU/g, 4,1 x 108 IU/total), som i det følgende betegnes trin IV-pulver.

5 (^ 5) "Dowex" v-/ 5 0-chroma tograf i: 22.6 g trin IV-pulver opløses i 50 ml deioniseret vand, og opløsningen hældes på en søjle (85 x 6,6 cm) af "Dowex"® 10 50 (ammoniumform, 2,900 ml, 200 - 400 mesh). Søjlen elu- eres med deioniseret vand (2,5 ml/minut), og eluatet opsamles i 17 ml's fraktioner. De aktive fraktioner 65 -89 forenes, koncentreres og lyofiliseres, hvorved fås 10.6 g trestatincomplex i form af et lysegult pulver 15 (3,6 x 107 IU/g, 3,8 x 108 IU/total), som i det følgende betegnes trin V-pulver.

III Opspaltning af trestatincomplexet i Trestatin A, B og C.

20 10,6 g trin V-pulver opløses i 20 ml destilleret vand, og opløsningen hældes på en søjle (78 x 4,8 cm) af "Amberlite"® CG 50 (blandingslag bestående af 3,5 dele ammoniumform og 6,5 dele H-form, 1.420 ml type I). Søjlen elueres med destilleret vand med 2,0 ml/minut, og eluatet op-25 samles i 14 ml's fraktioner. De aktive fraktioner underkastes højtryksvæskechromatografi under de nedenstående betingelser.

Søjle U Bondapak/carbohydrat 30 (l,4"x 1', Waters Associate) Bærer CH3CN:H20 (63s37)

Gennems trømningshastighed: 4,0 ml/minut

Injektions volumen: 2-10 jiliter g,. Påvisning: Ultraviolet absorption ved 210 nm.

De tilsvarende fraktioner forenes, koncentreres og lyofiliseres. Resultaterne er angivet nedenfor: 149599 32

Fraktion nr. Vægt af re- Aktivitet Hovedbestanddel manensen (IU/g) (retentionstid) _(g)_ 71 - 90 1,40 9,4 x 10^ Trestatin B (3,4 min.) 131 - 165 1,88 5,9 x 107 Trestatin A (5,5 min.) 5 311 - 380 0,79 4,4 - 107 Trestatin C (8,8 min.) IV Fremstilling af Trestatin A.

Et rent Trestatin A-præparat fremstilles ved rechromatografi "itoberlite"® CG 50. 1,17 g af det ifølge afsnit III vund-ne Trestatin A opløses i 4 ml destilleret vandog hældes på en søjle (133 x 1,7 cm) af "Amberlite"®CG 50(blandingslag bestående af 8 dele H-form og 2 dele ammonium-1 R

fform (300 ml, type II)). Søjlen elueres med destilleret vand, og eluatet opsamles i 7 ml's fraktioner, hvorhos de enkelte fraktioner overvåges ved høj tryksvæskechroma-tografi som beskrevet ovenfor. Fraktionerne 245 - 465 indeholder Trestatin A og forenes, koncentreres og lyofili- 20 seres, hvorved fås 649 mg Trestatin A i form af et hvidt pulver med de ovenfor angivne egenskaber.

V Fremstilling af Trestatin B. pc

Et rent Trestatin B-præparat fas ved rechromatografi på "Amberlite"®CG 50. 450 mg af det i afsnit III vundne Trestatin B opløses i 2 ml destilleret vand og hældes på en søjle (122 x 1,7 cm) af "Amberlite"®CG 50 (blandingslag bestående af 8 dele H-form og 2 dele ammonium- O Λ form, 280 ml type II). Søjlen elueres med destilleret vand, og eluatet opsamles i 3 ml's fraktioner og overvåges, som beskrevet ovenfor, ved højtryksvæskechromato-grafi. Fraktionerne 121 - 129 indeholder Trestatin B og forenes, koncentreres og lyofiliseres. Herved fås ^ 170 mg Trestatin B i form af et hvidt pulver med de ovenfor angivne egenskaber.

33 149599 VI Fremstilling af Trestatin C.

Et rent Trestatin C-præparat fås ved rechromatografi på "Amberlite"®CG 50. 720 mg af af det i afsnit III vund-5 Trestatin C opløses i 3 ml destilleret vand og hældes på en søjle (133 x 1,7 cm) af "Amberlite"®CG 50 (blandingslag bestående af 6,2 dele H-form og 3,8 dele ammoniumform, 300 ml type II). Søjlen elueres med destilleret vand, og eluatet opsamles i 6 ml's fraktioner og overvåges# 10 som beskrevet ovenfor, ved højtryksvæskechromatografi.

Fraktionerne 42 - 59 indeholder Trestatin C og forenes, koncentreres og lyofiliseres. Herved fås 515 mg Trestatin C i form af et hvidt pulver med de ovenfor beskrevne egenskaber.

15

Eksempel 2.

Fremstilling af Trestatin A-hydrochlorid.

20 95 mg af det ifølge eksempel 1 vundne Trestatin A opløses i 1 ml destilleret vand, og pH-værdien indstilles ved tilsætning af 0,1N saltsyre til 2,0. Opløsningen inddampes under reduceret tryk til et volumen på ca. 0,5 ml. Derpå tilsættes 6 25 ml ethanol, og det dannede hvide bundfald opsamles ved centrifugering, vaskes med 2 ml ethanol og tørres under reduceret tryk. Herved fås 97 mg Trestatin A-dihydrochlo-rid i form af et hvidt pulver.

30

Eksempel 3.

Fremstilling af Trestatin B-hydrochlorid.

35 92 mg af det ifølge eksempel 1 vundne Trestatin B opløses i 1 ml destilleret vand, og opløsningen indstilles med 0,1N saltsyre til pH-værdi 2,0. Opløsningen inddampes under 34 149599 reduceret tryk til ca. 0,5 ml, og der tilsættes 7 ml ethanol. Bundfaldet fracentrifugeres, vaskes med 2 ml ethanol og tørres, hvorved fås 91 mg Trestatin B-mono-hydrochlorid i form af et hvidt pulver.

5

Eksempel 4.

Fremstilling af Trestatin C-hydrochlorid.

10 90 mg af det ifølge eksempel 1 fremstillede Trestatin C opløses i 1 ml destilleret vand, og opløsningen indstilles med 0,1N saltsyre til pH-værdi 2,0. Opløsningen inddampes til 0,5 ml, der tilsættes 6 ml ethanol og 15 centrifugeres, og bundfaldet vaskes med 2 ml ethanol og tørres. Herved fås 91 mg Trestatin C-trihydrochlorid i form af et hvidt pulver.

20 Eksempel 5.

I analogi med den i eksempel 1 beskrevne fremgangsmåde fremstilles Trestatin A, Trestatin B og Trestatin C under anvendelse af Streptomyces dimorphogenes sp.

25 NR-320-OM7HBS (FERM-P nr. 3665).

Figurerne 1, 2 og 3 viser infrarødt absorptionsspektrum af Trestatin A, Trestatin B og Trestatin C.

30 Fig. 4, 5 og 6 viser NMR-spektret i D2O ved 100 MHz af Trestatin A, Trestatin B og Trestatin C.

Fig. 7 viser højtryksvæskechromatogram af Trestatin A, B og C.

35