MC1465A1 - Procede et dispositif integres de mise en place,de blocage et de traitement des cartes magnetiques et/ou a memoire - Google Patents

Description

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Domaine technique

La présente invention concerne des composés activés par la glutathion-S-transférase. Les composés comprennent du glutathion ou un de ses analogues couplés à un groupement partant, tel qu'un indicateur ou groupement médicamenteux, qui est libéré du glutathion ou de l'analogue lorsque les composés sont amenés à réagir avec de la glutathion-S-transférase (GST).

Art anterieur

Le glutathion (GSH), sous sa forme réduite, est un tripeptide de formule : y-Glu-Cys-Gly. Le glutathion réduit a un rôle central dans le maintien de la condition d'oxydoréduction dans les cellules et est également un substrat essentiel pour la glutathion-S-transférase (GST). La GST existe chez les mammifères en tant qu'une superfamille d'isoenzymes régulant le métabolisme de la détoxification de substances étrangères introduites dans les cellules. En général, la GST peut faciliter la détoxification des substances étrangères par un certain nombre de mécanismes et peut également convertir certains précurseurs en substances toxiques.

Fonctions et structure de la GST

Waxman, D.J., Cancer Res. (1990), 50 : 6449-6454, a passé en revue les fonctions assurées par les isoenzymes GST. De la manière résumée dans ce rapport, les GST peuvent détoxifier les substances lipophiles qui

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contiennent un agent électrophile en catalysant le couplage de la portion électrophile au GSH, en rendant ainsi une portion importante de la molécule plus polaire et sensible à l'élimination. Un certain nombre des médicaments utilisés 5 en chimiothérapie du cancer sont sensibles à ce type de détoxification et comprennent, par exemple, diverses moutardes à l'azote. Un deuxième mécanisme, qui utilise également le GSH comme substrat, consiste en la réduction des peroxydes avec l'oxydation concomitante du GSH ; un 10 troisième mécanisme comprend simplement l'association d'un ligand à la GST dans une association non covalente. Inversement, les GST catalysent également certaines réactions qui convertissent des précurseurs non toxiques en agents toxiques. Par exemple, des GST sont capables de 15 convertir le 1, 2-dibromoéthane et 1'azathioprine en toxines.

En ce qui concerne le mécanisme catalytique des GST, un passage en revue par Mannervik et Danielson (Mannervik, B. et al., CRC Crit Rev. Biochemistry (1988), 20 23 : 283-355) a suggéré initialement la présence d'un résidu histidine proche du site de liaison du glutathion qui éliminerait les protons de groupe sulfhydryle du GSH, en engendrant un anion sulfure nucléophile. Cet anion serait plus réactif avec des agents électrophiles que le 25 GSH sans l'action de l'enzyme GST. Un travail cristallographique ultérieur avec la GST PI (Reieneman, P., et al., J. Mol. Biol. (1992), 213 : 214-226) a montré que le groupement enzymatique réel d'abstraction de proton était un groupement hydroxyle de tyrosine.

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proprietes et distribution des isoenzymes GST

Les diverses isoenzymes GST sont des protéines dimères formées par des combinaisons binaires de monomères codées par au moins quinze gènes connus dans quatre 35 familles de gènes, avec pour résultat la possibilité théorique de plusieurs douzaines de dimères différents même en permettant la dimérisation préférentielle de monomères à

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partir de la même famille de gènes. En plus de la variabilité qui provient de ces possibilités combinatoires, les sous-unités des isoenzymes GST sont polymorphes dans la population humaine, et il a été considéré qu'elles sont le 5 sujet d'une variation supplémentaire due à des événements de conversion de gènes entre les membres répétés en tandem de la famille. Des modifications de post-traduction augmentent en outre cette variabilité. Ainsi, les GST obtenues à partir d'échantillons de tissu d'un individu 10 donné peuvent ne pas correspondre obligatoirement de manière exacte avec n'importe quelles GST connues auparavant. Des types cellulaires particuliers expriment habituellement seulement un petit nombre de ces nombreuses formes. Le complément de GST particulier dans une cellule 15 est également probablement influencé par l'exposition à certains facteurs ambiants, tels que des substances chimiques, puisque les enzymes sont inductibles. La GST représente une famille d'isoenzymes qui diffèrent par leurs quantités et leurs propriétés enzymatiques et physiques 20 dans divers types cellulaires et chez différents individus.

Mannervik, B., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (1985) 82 : 7202-7206, ont proposé un schéma de classification des GST, divisant les groupes en une sous-catégorie microsomale unique et trois sous-catégories 25 cytosoliques, a, p et n. Ces catégories présentent des différences de structure, d'activité immunologique, de spécificité pour le substrat et de sensibilités aux inhibiteurs.

L'aptitude de différentes enzymes GST purifiées 30 de rat à détoxifier la 1,2-bis-(2-chloréthyl)-1-nitroso-urée (BCNU) par dénitrosation a été étudiée par Smith, M.T., et al., Cancer Res. (1989), 49 : 2621-2625. Les résultats publiés indiquent que les isoenzymes p contenant la sous-unité 4 sont les catalyseurs les plus actifs pour 35 cette réaction, tandis que plusieurs membres de la sous-catégorie a avaient une très faible activité.

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Ainsi, chaque type de tissu ou type cellulaire peut être caractérisé par un complément de GST particulier -- c'est-à-dire une série de concentrations d'isoenzymes GST particulières qui est présente dans la cellule ou le 5 tissu. Cela est illustré par Castro et al., Carcinogenesis (1990), 11 : 1569-1596, qui décrivent les résultats de séparations par électrophorèse sur gel au SDS de GST solubles qui avaient été purifiées sur une colonne de S-hexylglutathion-Sepharose. Les compléments d'isoenzymes 10 dans diverses lignées cellulaires tumorales sont comparés à des représentants purifiés des principales familles de gènes de GST.

Association des isoenzymes GST a des tumeurs

15 L'association des isoenzymes GST spécifiques à

des tumeurs a été également étudiée. Wiencke, J.K. et al., Cancer Res. (1990) 50 : 1585-1590 décrivent en outre l'association, reconnue dans ce domaine, d'une déficience génétique dans 1'isoenzyme p de la GST avec un risque accru 20 de cancer pulmonaire. Il a été trouvé que cette déficience est associée à la sensibilité à une altération cytogénétique induite par l'oxyde de trans-stilbène. Castro et al., 1990, ci-dessus, montrent également nettement les différences de complément de GST, en fonction de la lignée 25 de cellules tumorales particulières considérée.

L'isotype p de GST a été également associé à des tumeurs, comprenant des cancers du côlon, de l'estomac, du pancréas, du col de l'utérus et du cortex rénal, un adénocarcinome du sein et du poumon, un lymphome nodulaire 30 à petites cellules, un mésothélium, un carcinome pulmonaire à petites cellules et un carcinome pulmonaire non à petites cellules et un carcinome de la vessie EJB ainsi que le CLL (Ketterer, B. et al., dans "Glutathione Conjugation : Mechanisms and Biological Significance ; Sies, H. et al. 35 éds. (1988) Academic Press, Londres, pages 74-137 ; Schisselbauer, J.C., et al., Cancer Res. (1990) 50 : 3562-3568). Il n'est pas considéré que la catégorie n de la GST

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est un marqueur pour des carcinomes particuliers ou des tumeurs particulières ; cependant, des anticorps contre la catégorie n de GST indiqués en tant qu'anticorps utiles pour la détection d'un cancer sont décrits dans la demande 5 PCT WO 90/12088.

Le rôle des diverses isoenzymes de la GST pour conférer une résistance à des toxines a été confirmé en utilisant l'expression d'isoenzymes GST recombinantes dans des transformants de cellules de mammifères ; 10 Puchalski, R.B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990), 87 : 24 43-2447. Ce travail a montré que chacun des trois ADNc de GST clonés complets -- n (acide) , Ya (basique) et Yb! (neutre) -- conférait une résistance à des médicaments lors de son expression dans des cellules de mammifères en 15 culture. Il a été trouvé que Ya GST conférait la plus grande augmentation de résistance au chlorambucil et au melphalan ; Ybi conférait la plus grande augmentation de résistance au cisplatine, et n conférait la plus grande augmentation de résistance à des mélanges de benzopyrènes 20 racémiques et à la doxorubicine. Aucun d'entre eux ne conférait une résistance à la vinblastine.

L'importance de la GST dans les mécanismes de détoxification et de résistance à des médicaments et la disponibilité d'une famille importante d'isoenzymes qui est 25 répartie non uniformément quant à ses membres par rapport au tissu normal ou tissu tumoral, en association avec des différences entre les membres de la famille en ce qui concerne la spécificité pour le substrat et la sensibilité aux inhibiteurs, fait de cette famille une cible importante 30 pour la conception de thérapeutiques pour des affections associées à des états malins ou la présence d'un autre tissu indésirable, caractérisées par un complément de GST discernable. Des procédés pour l'obtention de compléments de GST de n'importe quelle cellule particulière ou de 35 n'importe quel tissu particulier sont indiqués dans les

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demandes de brevets des Etats-Unis d'Amérique précitées à partir desquelles la priorité est revendiquée.

En particulier, il se révèle que les taux de GST, notamment de certains sous-types d'isoenzymes de GST, sont élevés dans des cellules tumorales qui ont acquis une résistance à des médicaments chimiothérapeutiques. Ainsi, l'utilisation de précurseurs médicamenteux activés par des GST est particulièrement efficace pour atteindre des cibles consistant en des cellules tumorales qui ont acquis par ailleurs une résistance à des médicaments.

Don d'electrons comme mecanisme de liberation

La contribution générale d'électrons à un système dans lequel un groupe partant peut absorber ces électrons a été utilisée auparavant pour libérer le groupe partant, y compris la libération par une liaison uréthanne. Par exemple, Senter, P.D. et al., J. Org. Chem. (1990) 55 : 2975 décrit la libération de la para-nitroaniline par réduction du disulfure de parabenzylcarbamate en utilisant du dithiothréitol. Il est décrit également la libération de la mitomycine C, dans laquelle l'atome d'azote du noyau du médicament est un élément participant à la liaison carbamate au groupement benzyle paradisulfure.

En outre, Nicolaou, K.C. et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (1991), 30 : 1032 décrivent la (3-élimination par abstraction d'un atome d'hydrogène adjacent à l'atome de soufre dans une phénylsulfone, pour libérer du C02 et un médicament complexe contenant de l'azote. Cependant, aucune de ces approches n'est susceptible de conférer une spécificité attribuable aux degrés d'enzymes de détoxification dans des tissus cibles. De la manière décrite ci-dessous, la présente invention a pour avantage de conférer une telle spécificité.

"v——A

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Moutardes

Une catégorie particulière de composés toxiques utilisés en chimiothérapie, et utilisée ci-dessous à titre illustratif, est constituée des moutardes. ^ Les composés indiqués en tant que composés engendrant des moutardes phosphoramide comprennent le cyclophosphamide et certains de ses analogues (Borch et al., J. Med. Chem. (1991), 34 : 3044-3052) (ci-après Borch I), ainsi que 1 ' aldophosphamide et certains de ses analogues (Borch et al., J. Med. Chem. (1991), 34 : 3052-3058) (ci-après Borch II) . Les mécanismes des procédés d'activation qui engendrent des moutardes phosphoramide à partir de ces composés ont été décrits (Borch et al., J. Med. Chem. (1984), 27 : 490-494 ; et Borch et al., J. Med. 15 Chem. (1987), 30 : 427-431).

La libération de moutardes phosphorodiamidate à partir d'analogues perhydrooxazine d'aldophosphamide a également été décrite par Borch et al. (Borch II) . Il a été trouvé que les composés qui libèrent ces "moutardes doubles" présentent une plus forte cytotoxicité que les composés qui libèrent une moutarde phosphoramide (idem). L'augmentation de cytotoxicité observée est probablement due à l'aptitude des moutardes doubles à réticuler l'ADN.

Puisque les moutardes produisent des effets 25 métaboliques extrêmement toxiques, ayant pour résultat des effets secondaires néfastes y compris une mortalité (Borch II), il existe un besoin de composés qui peuvent être conçus pour atteindre des cibles consistant en cellules choisies et qui libèrent de manière prévisible des 30 moutardes phosphoramide et/ou des moutardes doubles phosphorodiamidate dans les cellules qui sont les cibles envisagées. Les précurseurs médicamenteux de la présente invention sont conçus à cette fin.

Les précurseurs médicamenteux décrits ci-dessous peuvent utiliser le glutathion ou ses analogues pour le couplage avec le médicament, en rendant le

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précurseur médicamenteux sensible à l'activation par la GST. Certains analogues intéressants sont connus dans ce domaine.

Adang, A.E.P., et al., Biochem. J. (1990), 5 269 : 47-54 décrivent des formes modifiées de GSH dans lesquelles au moins un des résidus glycine, cystéine ou gamma-glutamine est remplacé par un autre résidu d'amino-acide, qui interagit avec diverses isoenzymes GST à des vitesses différentes. D'autres analogues ont été décrits 10 par Principato, G.B., et al., Enzyme (1989) 41 : 175-180, qui ont étudié d'un analogue tripeptidique de GSH sur l'enzyme glyoxalase II de foie de rat. Le tripeptide utilisé par ce groupe répondait à la formule y-Glu-Cys (p-chlorophénylcarbonylméthyl)-Ser. Morris, D. , dans Biochem. 15 J. (1960) 76 : 349-353, décrit la synthèse de y-Glu-Cys-(benzyl)-Val. Des analogues tripeptidiques de GSH contenant une substitution d'un seul des trois amino-acides de la GSH ont été décrits et certains sont disponibles dans le commerce.

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Description de l'invention

La présente invention a pour objet des composés, activés par la GST, comprenant du glutathion (GSH) ou un de ses analogues couplé à un groupement 25 partant, tel qu'un indicateur ou un groupement médicamenteux, qui est libéré du glutathion ou de son analogue lorsque les composés sont amenés à réagir avec la GST.

Les composés de la présente invention sont, de 30 la manière la plus importante, des précurseurs médicamenteux, par exemple pour un médicament cytotoxique destiné à détruire des cellules tumorales. Ces précurseurs médicamenteux peuvent être des substrats seulement pour des isoenzymes GST choisies, et sont capables, par exemple, de 35 tuer sélectivement des cellules avec des compléments particuliers d'isoenzymes GST dans lesquelles au moins une isoenzyme de GST est élevée ou avec des taux élevés de GST

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en général. Cela est particulièrement important dans la conception d'un traitement chimiothérapeutique puisque la résistance aux médicaments des cellules tumorales est souvent caractérisée par des taux élevés d'une ou plusieurs 5 GST. Ainsi, les véritables cellules qui sont les plus réfractaires aux traitements classiques sont les plus sensibles à l'attaque par les agents cytotoxiques incorporés aux précurseurs médicamenteux de la présente invention. Les taux élevés de GST présents dans ces 10 cellules leur permettent de faciliter la libération de l'agent cytotoxique au niveau intracellulaire dans la tumeur, comparativement à la capacité des cellules normales. Dans une illustration, la présente invention propose du glutathion ou un analogue couplé à des 15 groupements de moutardes phosphorodiamidate cytotoxiques. Lors de la réaction avec la GST, les précurseurs médicamenteux libèrent la moutarde phosphorodiamidate. Cela offre un procédé pour délivrer cet agent cytotoxique seulement aux tissus choisis ou aux cellules choisies, 20 telles que ces cellules tumorales.

Les composés de la présente invention se sont révélés également stimuler la production des cellules souches de granulocytes-macrophages (GM) dans la moelle osseuse d'animaux auxquels les composés ont été 25 administrés. Il n'est pas nettement établi si le composé du type précurseur médicamenteux proprement dit ou ses produits métaboliques sont responsables de cet effet.

En variante, le groupement partant d'un composé de la présente invention peut comprendre un indicateur qui, 30 une fois libéré d'un composé de la présente invention, peut être aisément détecté et utilisé convenablement pour contrôler le degré d'une telle réaction de clivage, par exemple par colorimétrie. Un composé de la présente invention comprenant un groupement indicateur, tel que le 35 p-nitrophénol qui est incolore lorsqu'il est couplé dans le précurseur médicamenteux, mais qui développe une couleur

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lors de la libération par la GST, est un réactif utile dans une méthode d'analyse de l'activité de GST. De telles analyses comprennent des analyses spécifiques des isoenzymes GST en utilisant des réactifs comprenant 5 certains analogues de GSH qui sont des substrats seulement pour des isoenzymes GST choisies.

En conséquence, dans un aspect, la présente invention concerne un composé de formule :

y-co-nhchco-aa^

10 |

ch2 h r3

i I I

s* c {cr2 = cr2)n— c—l (1)

l' l>

15

ou ses amides, esters, esters/amides mixtes ou sels, formule dans laquelle :

L représente un groupe partant électrophile ; S* représente un groupe S=0, 0=S=0, S=NH, 20 HN=S=0, Se=0, 0=Se=0, Se=NH, HN=Se=0, S'R4 dans lequel R4 représente un groupe alkyle (en C[ à C6) ou 0-C=0, ou HN-C=0 ;

chaque groupe R de R1, R2 et R3 représente indépendamment H ou un substituant non perturbateur ; 25 n est égal à 0, 1 ou 2 ;

le groupe Y-CO est choisi dans le groupe consistant en y-Glu, p~Asp, Glu, Asp, y-GluGly, p-AspGly, GluGly et AspGly ; et

AAc représente la glycine, la phénylglycine, la 30 p-alanine, l'alanine, la phénylalanine, la valine, l'acide 4-aminobutyrique, l'acide aspartique, l'histidine, le tryptophane ou la tyrosine, lié par une liaison peptidique au reste dudit composé de formule (1).

Dans d'autres aspects, la présente invention 35 concerne des procédés pour la synthèse des composés de formule (1), des compositions pharmaceutiques contenant ces

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composés, et des méthodes pour le traitement de cellules tumorales par administration des composés de formule (1) dans le contexte où les précurseurs médicamenteux sont clivés sélectivement par les cellules tumorales en libérant 5 l'agent cytotoxique.

Dans des aspects supplémentaires, la présente invention concerne des procédés pour la formation d'agents chimiothérapeutiques tout en protégeant la fonction de la moelle osseuse chez des sujets vertébrés en administrant 10 les précurseurs médicamenteux de la présente invention, et des méthodes pour traiter sélectivement des cellules tumorales ayant des teneurs en GST caractérisées en administrant sélectivement les précurseurs médicamenteux de la présente invention qui sont sensibles au clivage par une 15 GST qui présente un taux élevé dans les cellules cibles.

La présente invention concerne également des intermédiaires dans la synthèse des composés de formule (1) et des procédés de synthèse. Dans des procédés appréciés de synthèse, le soufre ou sélénium oxydé indiqué est obtenu à 20 partir du sulfure ou séléniure correspondant. Le glutathion tripeptidique ou son analogue peut être couplé par l'atome de soufre ou de sélénium au reste de la molécule, sous forme du tripeptide achevé ou sous forme d'un dipeptide intermédiaire, de formule :

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y-conchcooh ch2sfh ou nh2chco - aaç, CHtS^H

dans laquelle S* représente S ou Se. Le troisième amino-35 acide peut être ensuite couplé au reste de la molécule. En

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conséquence, la présente invention concerne également ces intermédiaires, comprenant des composés de formules :

y-co-nhchco-aac

, CH2 H R!

1,1 I

sf C—(CR2=CR2)—C—L (2)

1' !•

10 y-co-nhchcooh

I

ch2 h r3

' S* c—(CR2=CR2)—c—L (11)

R1 R3

15

NHjCHCO-A^

I

ch2 h r3

s' C—(CR2=CR2)n—C—L (12)

20 R' r'

dans lesquelles Y, AAC, R1, R2, R3, n, Sx, S* et L répondent aux définitions mentionnées pour la formule (1), et S*

25 représente S* ou S*.

breve description des dessins

La figure 1 est un graphique représentant la décomposition du TER 230 par diverses GST.

3Q La figure 2 est un graphique représentant la décomposition du TER 231 par diverses GST.

Les figures 3a et 3b sont des graphiques représentant la décomposition du TER 286 et du TER 322 par diverses GST.

35 Les figures 4a, 4b et 4c sont des graphiques qui représentent la différence de toxicité in vitro de

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divers agents chimiothérapeutiques pour des cellules ayant des taux élevés ou bas de GST Pl-1.

La figure 5 représente l'effet du TER 286 sur la croissance des tumeurs chez des souris. 5 La figure 6 représente l'effet de 100 à

200 mg/kg de TER 286 sur la valeur de GM-CFU dans la moelle osseuse de souris.

La figure 7 représente la dépendance vis-à-vis de la dose de la valeur de GM-CFU de la moelle osseuse 10 pour l'administration du TER 286.

Modes de mise en pratique de l ' invention

Les composés de formule (1) sont des précurseurs médicamenteux qui peuvent être utilisés 15 sélectivement pour atteindre des cibles consistant en tissus ayant des compléments de GST qui sont élevés ou qui ont une spécificité particulière pour le précurseur médicamenteux fourni. De la manière indiquée ci-dessous, les précurseurs médicamenteux préparés à titre illustratif, 20 consistant en TER 230 servant de composé modèle, et TER 231, TER 286, TER 296 et TER 303, en tant que précurseurs médicamenteux efficaces, sont activés différentiellement par des enzymes GST des catégories p, n et a. Ces précurseurs médicamenteux, outre le fait d'être sélectifs 25 pour des cellules ayant des taux élevés de compléments de GST proprement dites, peuvent être utilisés dans un protocole finement élaboré pour atteindre des cibles consistant en des cellules qui ont des taux élevés d'une isoenzyme particulière du groupe des GST. 30 Les précurseurs médicamenteux de la présente invention ont un avantage supplémentaire -- ils protègent la moelle osseuse et ils permettent ainsi d'utiliser des doses plus élevées ou plus intenses. Ainsi, non seulement l'effet chimiothérapeutique de l'agent cytotoxique libéré 35 est focalisé sur les cellules cibles, mais les composés de la présente invention sont capables de potentialiser la fonction de la moelle osseuse, de la manière mesurée par

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l'aptitude de ces composés à stimuler la production de cellules souches de GM par la moelle osseuse, ce qui accroît la protection des tissus normaux. Le mécanisme de cette potentialisation, se manifestant par une augmentation 5 de la production des granulocytes-macrophages, est mal élucidé. Cette potentialisation peut être utile dans le traitement de l'anémie. Il n'est également pas élucidé à l'heure actuelle si le précurseur médicamenteux proprement dit ou son produit métabolique, par exemple l'analogue de 10 glutathion qui est engendré par clivage du composé mère, est responsable de cet effet.

Dans une utilisation supplémentaire, les composés de formule I peuvent être utilisés comme réactifs analytiques pour la détermination de l'activité de GST en 15 utilisant comme "L" un groupement indicateur qui est détectable lorsqu'il est libéré du composé de formule (1). Un tel réactif convient à la détermination de la concentration de GST présentant une spécificité connue pour le substrat, ou à l'analyse de la spécificité de GST 20 particulière en faisant varier le constituant analogue de glutathion du composé de formule (1).

Composes de la présente invention

Les composés de la présente invention, 25 répondant à la formule (1), sont constitués d'un tripeptide qui consiste en glutathion ou un de ses analogues couplé à un groupe partant par un système moléculaire qui permet la libération du groupe partant L lorsque le composé de formule (1) est traité avec la GST appropriée. La 30 libération du groupe partant se produit par une "élimination p" -- c'est-à-dire l'élimination du proton sur l'atome de carbone en position a par rapport au carbone pauvre en électrons ; le soufre ou le sélénium libèrent des électrons qui sont finalement absorbés par le groupe 35 partant et ont pour résultat sa libération. Cela peut être représenté schématiquement de la manière suivante :

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y-co-nhchco-aac ch2

h r3

5

La paire d'électrons peut être libérée et fournie directement au groupe partant par élimination P de la manière représentée ci-dessus ou par l'intermédiaire 10 d'un système de conjugaison représenté par (CR2=CR2)n dans la formule (1) . Ainsi, n peut être égal à 0, 1 ou 2 ; en théorie, n peut représenter n'importe quel nombre entier, mais il est considéré que l'efficacité du transport d'électrons diminue lorsque n augmente. 15 Les substituants R1, R2 et R3 n'ont aucune part directe à la libération du substituant L et doivent simplement être des substituants non perturbateurs. La vitesse d'élimination P peut être ajustée par la nature de ces groupes R ; en choisissant des substituants 20 électrophiles ou des substituants cédant des électrons, la vitesse d'élimination peut être augmentée ou réduite. Des substituants convenables pour R1 et R3 comprennent h, des groupes alkyle (en Ci à C6) substitués ou non substitués, des groupes aryle (en C6 à Ci2) substitués ou non 25 substitués, des groupes arylalkyle (en C7 à CJ2) substitués ou non substitués, des groupes cyano, des groupes halogéno, des groupes alkoxy (en Ci à C6) substitués ou non substitués, des groupes aryloxy (en C6 à Ci2) substitués ou non substitués, ou des groupes arylalkyloxy (en C7 à Ci2) 30 substitués ou non substitués.

leurs significations classiques ; les groupes alkyle sont des groupements hydrocarbonés saturés droits, à chaîne ramifiée ou cycliques, tels que les groupements méthyle, 35 tertio-butyle, cyclohexyle, etc. Les groupes aryle comprennent des systèmes aromatiques tels que les groupes

Les termes alkyle, aryle et arylalkyle ont

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phényle, naphtyle, pyridyle, etc. Les substituants arylalkyle contiennent un groupement aryle couplé au reste de la molécule par un groupement alkylène. Ces groupes comprennent le plus couramment les groupes benzyle, 5 phényléthyle, 2-pyridyléthyle, etc.

Des substituants convenables dans les formes substituées comprennent des substituants halogéno, SR, OR et NR2, dans lesquels R représente H ou un groupe alkyle inférieure (en Ci à C<) .

10 Les formes préférées de réalisation pour R1 et

R3 sont, indépendamment, H, des groupes alkyle inférieur

2

(en Cx a C4), et phenyle. R peut représenter de préférence H ou un groupe alkyle (en Ci à Cg) . Dans des formes de réalisation particulièrement appréciées, R1 représente H ou

3

15 un groupe phenyle, les deux groupes R représentent H et n est égal à zéro. Cependant, il est possible d'utiliser en 12 3

tant que R , R et R n'importe quels substituants non perturbateurs. Ces substituants sont représentés indépendamment.

20 Les formes de réalisation préférées de Y-CO et

-AAC déterminent la nature du tripeptide analogue au glutathion. Une forme de réalisation appréciée est celle dans laquelle Y-CO représente un groupe y-glutamique et AAC représente la glycine, la phénylglycine, la p-alanine, 25 l'alanine ou la phénylalanine, avec pour résultat le tripeptide consistant en glutathion ou un de ses analogues proches. Cependant, d'autres formes de réalisation de Y-CO comprennent p-Asp, Glu, Asp, y-GluGly, p-Asp-Gly, GluGly et AspGly. D'autres formes de réalisation de AAC sont, avec la 30 glycine qui est préférée, la phénylglycine, la p-alanine, l'alanine, la valine, l'acide 4-amino-butyrique, l'acide aspartique, la phénylglycine, l'histidine, le tryptophane et la tyrosine. Des substituants phénylalanine convenables sont ceux décrits ci-dessus pour les formes substituées de 35 R! à R3. \

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Des formes de réalisation convenables pour L comprennent celles qui engendrent des médicaments qui peuvent être cytotoxiques pour des cellules indésirables. Ces médicaments comprennent les moutardes phosphoramidate, 5 les moutardes phosphorodiamidate, les agents chimiothérapeutiques consistant en adriamycine, et daunorubicine, des toxines telles que la ricine ou la toxine diphtérique, des médicaments anti-inflammatoires ou à base de stéroïdes, etc., et d'autres modulateurs 10 métaboliques tels que le 2,3-di-tertio-butyl-4-hydroxy-anisole. Les formes préférées des moutardes phosphorodiamidate sont les suivantes : -OP(O) (N (CH2CH2C1) 2) 2, -OP(O) (N (CH2CH2Br ) 2) 2, -OP(O) (NHCH2CH2C1 ) 2 et -OP (0) (NHCH2CH2Br ) 2. Il est possible d'utiliser n'importe quels groupements 15 biologiquement actifs, munis d'une liaison absorbant les électrons au reste du composé, de telle sorte que "L" soit libéré par élimination (3.

Outre les moutardes phosphorodiamidate et divers médicaments supplémentaires contenant des groupes 20 électrophiles, une catégorie importante de groupes partants comprend un groupement uréthanne dans lequel, par élimination P, du C02 est libéré et un groupement contenant une aminé primaire ou secondaire est libéré. Ces composés comprennent alors les moutardes à l'azote telles que la 25 bis-(2-chloréthyl)aminé ; les moutardes uracile dans lesquelles la bis-(2-chloréthyl)aminé est un substituant en position 5 du noyau uracile, et d'autres moutardes qui comprennent des aminés primaires ou secondaires ; divers antibiotiques qui contiennent des groupes amino convenables 30 pour participer à la liaison uréthanne, tels que la mitomycine C, 1'actinomycine D, et les alkaloides dérivés du gendre Vinca, tels que la vincristine, et la vinblastine, et un analogue de dynémycine, qui suit ultérieurement une voie de réaction conduisant à un 35 diradical benzénoide capable d'inactiver l'ADN par abstraction d'atomes d'hydrogène.

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10

En principe, 11 aminé primaire ou secondaire libérée est libérée en utilisant le même mécanisme d'élimination j3 par l'intermédiaire de l'uréthanne, conjointement avec la libération de C02. Cela peut être représenté schématiquement de la manière suivante :

etc H R3

1 1 /v °

S" C C-^D-S^C^Nfetc),

R1 R3.

De la manière représentée, l'abstraction de l'atome d'hydrogène (3 sous l'action de la GST a pour 15 résultat des déplacements électroniques, qui libèrent finalement le groupement contenant de l'azote. Celui-ci peut également ne pas être obligatoirement le produit final. Il est possible de tirer parti de systèmes conjugués pour libérer n'importe quel groupement qui peut absorber 20 des électrons. Par exemple, dans un article de Mulcahy, R.T. et al., J. Med. Chem. (1994), 37 : 1610, la libération d'une moutarde phosphoramidate a été décrite. Le phosphoramidate est couplé par une liaison méthylène à un groupement paranitrobenzène, et le conjugué est réduit dans 25 les conditions hypoxiques régnant dans certaines cellules pour libérer la moutarde phosphoramidate OP (0) (N (CH2CH2C1) 2) 2, en laissant une paraphénylène monoaraine. Dans les composés de la présente invention, une libération similaire de la moutarde phosphoramidate par médiation de 30 l'atome d'azote para est effectuée en cédant des électrons par 1 ' intermédiaire du groupement uréthanne au noyau aromatique, avec de nouveau pour résultat la paraphénylène monoamine et la moutarde phosphoramidate.

Egalement d'une manière analogue à la 35 production connue de la moutarde à l'azote extrêmement cytotoxique consistant en méchloréthamine (Me-N (CH2CH2C1 ) 2)

19

par réduction de 1'aminé quaternaire couplée par une liaison méthylène au nitrobenzène ortho ou para, l'élimination p peut de nouveau être utilisée comme source d'électrons par médiation d'une liaison uréthanne, pour 5 engendrer la méchloréthamine, et le sous-produit consistant en phénylène monoamine. La libération hypoxique, non à médiation par la GST, d'ortho ou de paranitrobenzyle, est décrite par Papanastassiou, Z.B. et al., Experientia (1968) 24 : 325 ; Tercel, M. et al., J. Med. Chem. (1993) 10 36 : 2578.

En outre, des molécules d'indicateurs tels que le p-nitrophénol peuvent être utilisées lorsque le composé de formule (1) est destiné à être utilisé comme réactif. De tels groupements peuvent également être libérés par 15 l'intermédiaire d'une liaison uréthanne avec la libération de C02. Par exemple, une élimination P en rapport avec 1'uréthanne formé à partir de la paranitroaniline engendre le produit consistant en paranitroaniline.

Des composés particulièrement appréciés de la 20 présente invention sont les suivants :

y-Glutamyl-a-amino-p-((2-éthyl-N,N,N,N-tétra-(2'-chloro)-éthylphosphoramidate)-sulfonyl)-propionylglycine, (TER 231) ;

y-Glutamyl-a-amino-p-((2-éthyl-N,N,N,N-tétra-25 (2'-chloro)-éthylphosphoramidate)-sulfonyl)-propionyl-(R)-(-)-phénylglycine, (TER 286) ;

y-Glutamyl-a-amino-p-((2-éthyl-N,N,N,N-tétra-(2'-chloro)-éthylphosphoramidate)-sulfonyl)-phénylalanine, (TER 303) ;

30 y-Glutamyl-a-amino-p- ( 1-phényle-, 2-éthyl-N, N, N, N-

tétra-(2'-chloroéthyl)-phosphoramidate)-sulfonyl) -propionylglycine, (TER 296) ;

y-Glutamyl-a-amino-p- ( 1-phényle, 2-éthyl-N, N, N, N-tétra-(2'-chloroéthyl)-phosphoramidate)-sulfonyl) -35 propionyl-(R)-(-)-phénylglycine, (TER 297) ;

20

y-Glutamyl-a-amino-p- (2-éthyle, N, N-bis- (2 1 — chloroéthyl )-carbamoyl ) sulfonyl)-propionylglycine, (TER 322) et son ester diéthylique (TER 325) ; et y-Glutamyl-a-amino-p-((2-éthyl-(4-benzyloxy-(N, N, N1, N'-tétrakis-(2-chloroéthyl)-phosphoramidate))-carbamido)-sulfonyl)-propionylglycine.

Les composés de la présente invention peuvent également être préparés sous forme de leurs esters ou araides, ester/amides mixtes ou sels. Les esters, amides ou sels sont formés avec n'importe lesquels ou la totalité des groupes carboxyle présents dans la molécule ; en conséquence, ce groupe comprend des monoesters, des diesters et, si cela est possible, des triesters. De manière similaire, des monoamides, des diamides ou, si cela est possible, des triamides sont inclus. Des ester/amides mixtes font également partie de la présente invention.

Les esters ou amides peuvent être des esters ou amides d'alkyle (en Ci à C6) , d'alcényle (en Ci à C6) ou d'arylalkyle (en C7 à C[2) . Des esters alkyliques des groupes carboxyle libres sont des esters des alcools alkyliques à chaîne droite et à chaîne ramifiée (en Ci à C6) tels que le méthanol, l'éthanol, 1 ' isopropanol, le tertio-butanol, le n-hexanol, etc. Des alkyl- (en Ci à C6) -amides convenables sont ceux provenant d'alkylamines primaires à chaîne droite ou à chaîne ramifiée, telles que la mét.hylamine, 1 ' éthylamine, la n-propylamine, l'isopentyl-amine et 1'isohexylamine. Les esters alcényliques sont similaires, mais contiennent au moins une double liaison. Le terme arylalkyle répond à la définition précitée. Les alcools ou les aminés peuvent porter également des substituants non perturbateurs, par exemple halogéno, alkoxy ou alkylamines. Les esters et amides sont préparés en utilisant des techniques classiques, avec une protection convenable de n'importe quels groupes fonctionnels de type alcool ou amino dans le composé de formule (1).

21

Les sels des composés de la présente invention peuvent être formés à partir de bases inorganiques ou organiques pour produire les sels basiques des groupes carboxyle libres, ou bien peuvent être formés à partir d'acides organiques ou inorganiques, pour obtenir les sels d'addition d'acides de groupes amino libres. Ainsi, les sels peuvent être formés avec des bases inorganiques telles que 1'hydroxyde de sodium, l'hydroxyde de potassium, 1'hydroxyde de calcium, l'hydroxyde d'ammonium, l'hydroxyde de magnésium, etc., ou à partir de bases organiques telles que la triméthylamine, la pyridine, la pyrimidine, la pipéridine, la lysine, la caféine, etc. Les sels d'addition d'acides peuvent être formés à partir d'acides inorganiques tels que l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique, etc., ou bien à partir d'acides organiques tels que l'acide acétique, l'acide propionique, l'acide glycolique, l'acide pyruvique, l'acide oxalique, l'acide malique, l'acide tartrique, l'acide citrique, l'acide benzoique, l'acide cinnamique, l'acide mandélique, l'acide salicylique, etc. Les sels d'acide citrique sont préférés.

Les sels des composés de formule (1) sont formés suivant des protocoles classiques par traitement avec la base ou l'acide approprié à une température comprise dans l'intervalle d'environ 0 °C à environ 100 °C, de préférence à température ambiante, dans de l'eau seule ou en association avec un solvant organique inerte miscible à l'eau, tel que le méthanol, 1'éthanol ou le dioxanne.

Utilisation des composes de la présente invention pour délivrer des medicaments a des cibles

La présente invention propose un moyen général de délivrer des médicaments à des tissus spécifiquement sur la base de leur teneur en GST. Le groupe partant, lorsqu'il est libéré dans le tissu cible, exerce ses effets désirés de manière sélective dans ce tissu cible. En plus d'une cytotoxicité, le groupement libéré peut avoir d'autres

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caractéristiques régulatrices. Par exemple, lorsqu'un "L" représente le 2,3-di~tertio-butyl-4-hydroxyanisole, on sait que ce composé induit la synthèse de GST chez les souris. L'administration du composé de formule (1) dans laquelle 5 "L" libère ce groupement peut avoir pour résultat une augmentation concomitante de la teneur en GST. Les cellules cibles, lorsque la libération se produit, peuvent être soumises à une régulation en modifiant la nature de la portion de la molécule consistant en un analogue de 10 glutathion. Il peut être souhaitable d'augmenter le constituant GST des cellules tumorales conjointement avec l'apport d'un composé de formule (1) contenant une cytotoxine.

De la manière décrite ci-dessus et démontrée 15 dans les exemples ci-dessous, les divers précurseurs médicamenteux de la présente invention sont sélectifs pour les diverses isoenzymes de GST dont les taux peuvent être élevés dans les cellules tumorales. En déterminant le profil des taux d'isoenzymes GST dans la cible tumorale, et 20 en faisant concorder ce profil avec la spécificité du précurseur médicamenteux, il est possible de parvenir à une efficacité maximale contre la cellule tumorale, et à une sélectivité maximale pour la cellule tumorale, à l'opposé du tissu normal. De la manière indiquée ci-dessous, la 25 sélectivité du précurseur médicamenteux dépend du choix de l'analogue de glutathion utilisé comme constituant du médicament. Dans les composés illustrés ci-dessous, le TER 231 est particulièrement sensible au clivage par la GST Mla-la ; le TER 303 est particulièrement sensible au 30 clivage par Al-1 ; le TER 286 est particulièrement sensible au clivage par Pl-1 et Al-1, tandis que le TER 296 est clivé sélectivement par Pl-1. Ainsi, lors du traitement d'une tumeur ayant des taux élevés de Pl-1, l'utilisation de TER 296 serait préférée. Les précurseurs médicamenteux 35 de la présente invention sont pa rt iculièrement avantageux pour le traitement de sujets puisque, en plus de la

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cytotoxicité pour les tumeurs, ils se révèlent stimuler les cellules souches de GM dans la moelle osseuse. Il existe une toxicité relativement faible pour les organes et il n'existe aucun signe de leucocytose. Pour le TER 286, 1 ' isoenzyme intéressante, consistant en GST Pl-1 présente un taux élevé dans plus de 75 % d'échantillons de tumeur humaine du sein, du poumon, du foie et du côlon.

Le choix approprié du précurseur médicamenteux est également facilité par la détermination du complément de GST des cellules à traiter, comparativement aux tissus normaux. Des instructions détaillées pour l'obtention de tels compléments se trouvent dans la demande PCT US 92/03537 publiée en octobre 1992. La description de cette demande PCT concerne des méthodes pour la détermination des isoenzymes GST qui ont des taux élevés dans des tissus particuliers.

Les composés de formule (1) sont administrés sous forme de compositions pharmaceutiques dans des formulations usuelles telles que celles indiquées dans Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, dernière édition. Des formulations classiques comprennent les formulations pour l'injection, pour l'administration transdermique et à travers les muqueuses et pour l'administration orale. Les formulations, en fonction du mode envisagé, peuvent être des liquides, des sirops, des poudres, des gélules, des suppositoires, etc. Les composés de la présente invention peuvent être incorporés à des liposomes ou à d'autres formes émulsionnées. Les protocoles d'administration et les formulations convenables peuvent être rendus optimaux en utilisant des modes opératoires classiques, connus de 1'homme de l'art.

L'activité antitumorale des composés de la présente invention couplés à une moutarde phosphorodiamidate ou à d'autres toxines peut être déterminée en utilisant un certain nombre de xénographes de

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tumeurs humaines pour déterminer l'inhibition de la croissance tumorale ou un mélanome de souris B16 et en mesurant le prolongement de la durée de survie, afin de déterminer l'efficacité de composés particuliers.

5

Composes pour l'analyse de l'activité d'isoenzymes GST

Une autre utilisation du composé de formule (1) est l'utilisation comme réactif dans des analyses où le groupement "L", lorsqu'il est libéré du composé, peut être 10 aisément détecté. Les composés de formule (1) peuvent ainsi être utilisés convenablement pour contrôler le degré de la réaction de clivage par la GST, par exemple par colorimétrie. Ainsi, un groupement indicateur, tel que le p-nitrophénol, qui est incolore lorsqu'il est couplé au 15 GSH, ou un analogue de GSH mais qui développe une couleur lorsqu.'il est libéré du composé par la GST, offre une méthode perfectionnée d'analyse de l'activité de GST. Des analyses spécifiques d'isoenzymes GST utilisant des composés comprenant certains analogues de GSH, qui sont des 20 substrats seulement pour des isoenzymes GST choisies peuvent être utilisées pour déterminer la spécificité pour le substrat.

synthese des composes de la presente invention

25 Les composés comprenant du glutathion ou ses analogues, décrits ci-dessus, couplés à un groupe partant avantageux, peuvent être synthétisés en utilisant des moyens connus de manière générale dans ce domaine. Lorsque Sx représente une forme oxydée de S ou Se, les procédés 3q illustrés ci-dessous peuvent être utilisés, ces procédés comprenant des modifications qui les rendent applicables aux composés désirés de la présente invention. En général, les composés de formules 2, 11 et 12 peuvent servir de composés intermédiaires dans la synthèse de composés de 2^ formule (1) .

Ainsi, par exemple, des composés de formule (1) dans laquelle Sx représente un groupe S-O, Se=0, 0=S=0 ou

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0=Se=0 peuvent être produits à partir des composés correspondants de formule (2) dans laquelle S* représente S ou Se, respectivement, par oxydation avec des agents oxydants doux, tels qu'un oxyde ou un peracétate. Des 5 composés de formule (1), dans laquelle Sx représente un groupe S=NH, Se=NH, 0=S=NH ou 0=Se=NH peuvent être obtenus par traitement du précurseur approprié de formule (2), ou d'une de ses formes partiellement oxydées, avec la chloramine T dans des conditions connues dans ce domaine. 10 En variante, le procédé de Whitehead, J.K., et al., J. Chem. Soc. (1952), 1572-1574, peut être utilisé. Des composés de formule (1)1 ou de formule (1)2 peuvent être convertis en le composé de formule (1) en couplant le groupement Y-CO par l'intermédiaire d'une liaison 15 peptidique au composé de formule (1)2 ou 1'amino-acide AAC au composé de formule (1)1 en utilisant des techniques classiques de couplage de peptides. Lorsque S* représente S ou Se sous forme réduite dans les composés de formules (11) et (12), ces composés peuvent être de manière similaire 20 convertis en composés de formule (2). Les composés de formule (1) dans laquelle Sx représente un ion sulfonium, c'est-à-dire S% peuvent être synthétisés en traitant les composés de formule (2) avec des halogénures d'alkyle dans des conditions convenables pour l'alkylation du sulfure, ou 25 bien des intermédiaires peuvent être synthétisés à partir de composés correspondants de formule (1)1 ou (12). R4 représente un groupe alkyle en Ci à C6 répondant à la définition précitée. Les halogénures d'alkyle préférés pour la réaction de formation, finalement, de composés de 30 formule (1) dans cette forme de réalisation sont les iodures.

Les composés de formule (1) dans laquelle Sx représente un groupe 0-C=0 sont obtenus en utilisant, comme matière de départ dipeptidique ou tripeptidique, des 35 analogues de glutathion dans lesquels le groupement cystéine est remplacé par un groupement sérine. Des

composés de formules (11), (12) et (1) sont ensuite obtenus par estérification du di- ou tripeptide contenant de la sérine. Lorsque Sx représente un groupe NH-C=0, la réaction d'amidation correspondante est effectuée avec des analogues dans lesquels l'acide 2,3-diaminopropionique remplace la cystéine.

ci-dessous. La synthèse du TER 230, qui est un composé servant de modèle, est utilisée pour illustrer le schéma réactionnel 1.

Deux modes préférés de synthèse sont illustrés

27

Schéma reactionnel 1

poci3 ♦ C c2h5) 2nh

0

Il /

C 1 _ p—n

N

O

0

ho—v 0— p — n,

n h*

i O

thpoch2ch2oh

0

- Il f T HPO—\ 0—P —N,

A/ 1

n o

1) T s C

23 L i Br

0

N

M7

30

Le TER 230 est ainsi préparé par alkylation du GSH avec du 2-bromoéthyl-N,N,N,N-tétraéthyl-phosphoro-diamidite. Deux équivalents de diéthylamine sont ajoutés à de 1'oxychlorure de phosphore, ce qui donne le composé 3, 35 en suivant le mode opératoire de Borch et al., J. Med. Chem. (1991), 34 : 3052-3058. Puis, le composé 3 est alkylé

28

avec du monotétrahydropyranyléthylèneglycol (préparé de la manière décrite par Satyam, A. et Narang, S., Polymer Reprints (1992), 33 : 122-123), ce qui donne le composé 4, qui est hydrolysé avec un acide pour éliminer le groupe 5 protecteur TPH, et qui est ensuite converti en le bromure 6a en deux étapes par conversion en le tosylate, puis par réaction avec du bromure de lithium, donnant le composé 6a. Le composé 6a est ensuite ajouté à du glutathion, ce qui donne le sulfure 2a, qui est oxydé avec l'acide 10 peracétique, en donnant le TER 230, de formule (la).

Le schéma réactionnel 2 résumant la manière de synthétiser le TER 231 est illustré ci-dessous. Le TER 231 est un précurseur médicamenteux de la présente invention qui, lorsqu'il est activé avec la GST, libère une moutarde 15 cytotoxique.

SCHEMA REACTIONNEL 2

29

hooc

10

1 h2o2

2. CH3COOH

Comme le montre le schéma réactionnel 2, l'intermédiaire crucial 6b, par exemple, est synthétisé 25 d'une manière simplifiée par réaction de 1'oxychlorure de phosphore avec l'alcool 2-bromoéthylique et le chlorhydrate de bis-2-chloréthylamine. Les conditions appropriées pour cette réaction sont décrites dans l'Exemple 2, ci-dessous. Les étapes restantes dans la synthèse sont analogues à 30 celles figurant sur le schéma réactionnel 1.

Dans une forme de réalisation préférée, illustrée sur les deux schémas réactionnels, le composé couplé de formule (1) est tout d'abord synthétisé sous une forme réduite de formule (2) pour empêcher l'élimination du 35 phosphate. Le composé de formule (2) est ainsi oxydé dans

30

l'étape finale du procédé de synthèse, pour empêcher la décomposition de la molécule.

Bien que les exemples ci-dessous présentent des détails expérimentaux pour la synthèse du TER 230 et du TER 5 231, ce schéma réactionnel est applicable aux composés de la présente invention en général en remplaçant par les constituants appropriés l'intermédiaire 6 qui donne le groupe partant et l'accepteur tripeptidique approprié contenant un groupement cystéine. Des modifications 10 appropriées du GSH représentées sur le schéma réactionnel 2 ont pour résultat le précurseur médicamenteux désiré. Par exemple, pour la synthèse du TER 296 ou du TER 297, le résidu cystéine dans l'analogue est remplacé par l'acide a-amino-p-sulfhydryl-p-phénylpropionique. Pour la synthèse du 15 TER 286, la glycine est remplacée par la phénylglycine dans le tripeptide sous la forme AAc. Pour la synthèse du TER 303, la glycine est remplacée par la phénylalanine, sous la forme AAc dans l'analogue de GSH.

Au moins un proton en position a par rapport à 20 l'atome privé d'électrons de Sx et de manière effective en position P par rapport à l'atome d'oxygène du groupe phosphate doit être suffisamment acide pour être éliminé par le groupement basique qui est considéré comme se trouvant dans le site actif de GST pour permettre la 25 libération de la moutarde phosphorodiamidate. La nature de groupe électrophile ou de groupe cédant des électrons du groupe R1 peut être utilisée pour réguler la vitesse de la réaction en influençant l'acidité de ce proton. La nature de R3 est également importante. Par exemple, une forme de 30 réalisation dans laquelle les deux groupes R3 sont des groupes méthyle, diminue l'énergie de l'état de transition pour l'élimination P catalysée par l'enzyme.

Les exemples suivants sont destinés à illustrer, mais non à limiter, la présente invention.

10

15

25

31

Exemple 1

SYNTHESE DE GLUTATHION COUPLE AU PHOSPHORODIAMIDATE : y-GLUTAMYL-g-AMINOPROPIONYL ((3~ (2~ETHYL~N, N , N , N~ TETRAETHYLPHOSPHORAMIDATE) -SULFONYL)-GLYCINE (TER 230)

Cet exemple décrit la synthèse du TER 230, répondant la formule suivante :

0 O

N\ N—'

,P

^0 N- x

C ^

0 /s;o hooc;^^. 11^ a n h c00 h

'nh

NH2 o

Lorsqu'il est utilisé comme composé modèle, et mis en contact avec de la GST, le TER 230 subit une élimination (3, ce qui donne le composé de formule :

20 oO

n .N-y

"0-p:

"N-

0

Co ^

H00C 1 NH ^.COOH

NH

NH;, 0

La synthèse de ce composé est résumée sur le schéma réactionnel 1.

30 Chloro-N,N,N,N-tétraéthyI-phosphorodiamidate, 3

De la diéthylamine (33,72 ml, 360 mM) a été ajoutée goutte à goutte sous agitation à une solution refroidie (0-5 °C) d'oxychlorure de phosphore (15,2 ml, 160 mM) , dans 1 litre de CH2C12 auquel de la triéthylamine 35 (50 ml, 360 mM) avait été préalablement ajoutée goutte à goutte. On a laissé la solution se réchauffer à température

32

. ambiante et on l'a agitée pendant trois jours. Le mélange réactionnel a été désactivé en le refroidissant et en ajoutant 200 ml d'une solution aqueuse à 10 % de KH2P04. Le mélange a été réchauffé à température ambiante. Le mélange 5 a été versé dans une ampoule à robinet et séparé. La phase organique inférieure a été mise de côté et la phase aqueuse a été soumise à une extraction avec 100 ml de CH2C12. Les phases organiques réunies ont été lavées avec 500 ml de saumure saturée et déshydratées sur Na2S04. La solution a 10 été filtrée et réduite en une huile sous vide. Une certaine quantité de substance solide a été séparé de l'huile par une filtration supplémentaire. Une analyse par CCM (EM n° 5534 F 254, développée avec un mélange hexane/EtOAc dans le rapport 1:1 et visualisée avec de la vapeur d'iode) 15 a montré que deux produits étaient présents ; le produit principal, rf 0,3, a été isolé par chromatographie sur colonne, en utilisant de la silice JT Baker FC, 40 m, en effectuant une élution isocratique avec un mélange hexane/EtOAc dans le rapport 4:1. Des fractions de colonne 20 contenant le composé pur ayant une plus basse valeur de rf ont été réunies et évaporées, ce qui a donné 12 g (rendement de 33 %) d'une huile jaune pâle. 'H-RMN, CDC13, ppm : 3,3-3,05. q, (j = 5,3 Hz), 1,2-1,05. t, (j = 5,3 Hz), M/e intens. rel.), 227,1 (100, MH+), 191,2 (11), 154,1 25 (38), 136,1 (28).

Monotétrahydropyranyléthylèneglycol

Du dihydropyranne (18,25 ml, 200 mM) a été ajouté goutte à goutte à une mélange froid (0 °C) 30 d ' éthylèneglycol (55, 92 ml, 1 mole) et de 500 ml de CH2C12 contenant 3,8 g (20 mM) d'acide p-toluènesulfonique monohydraté dissous, en un temps de deux heures. On a laissé le mélange sous agitation pendant un temps supplémentaire de deux heures à cette température, puis on 35 l'a laissé se réchauffer à température ambiante. On a continué l'agitation pendant deux jours, temps au bout duquel on a versé le mélange dans une ampoule à robinet, et

33

on l'a laissé se séparer. La phase organique inférieure a été séparée et mise de côté, et la phase supérieure a été soumise à une extraction avec 100 ml de CH2C12. Les phases de CH2C12 réunies ont été lavées six fois avec des portions 5 de 100 ml d'une solution de NaCl saturée, et ont été déshydratées sur Na2S04. La solution a été filtrée et réduite, et le résidu a été purifié par chromatographie avec une silice identique à celle indiquée ci-dessus. La colonne a été soumise à une élution isocratique avec un 10 mélange EtOAc : hexane dans le rapport 3:2, qui contenait 1 % de triéthylamine (TEA). Les fractions qui contenaient le produit pur, rf, 0,5, en utilisant un système de CCM identique à celui indiqué ci-dessus, ont été réunies et évaporées, ce qui a donné 9,7 g (rendement 33 %) d'une 15 huile incolore. 'H-RMN (300 MHz, CDC13, ppm) : 5,6-5,5. m, 1H, 4,0-3,9. m, 1H, 4,8-4,65. m, 4H, 3,6-3,5. m, 1H, 1,9-1,7 m, 2H, 1,65-1,5 m, 4H.

2-Tétrahydropyranyloxyéthyl-N,N,N,N-tétraéthylphosphorodiamidate, 4

20 Une solution de 4,4 g (30 mM) de monotétrahydropyrannyléthylèneglycol préparé de la manière indiquée ci-dessus dans 25 ml de THF qui avait été fraîchement recueilli à partir d'une colonne de distillation de THF à benzophénone sodique sous atmosphère 25 d'argon a été ajoutée goutte à goutte à une solution sous agitation à 0 °C de 0,72 g (30 mM) d'hydrure de sodium dans 50 ml du même THF anhydre. Une solution de 5,67 g (25 mM) du composé 2 dans 25 ml de THF y a été ajoutée en un temps de 10 minutes, et le mélange a été agité pendant 18 heures 30 à température ambiante. CCM (même système que ci-dessus, à l'exception de 1'élution avec EtOAC/MeOH dans le rapport 9:1). Le mélange réactionnel a été désactivé par addition goutte à goutte de 100 ml d'eau et a été soumis à deux extractions avec des portions de 250 ml de EtOAc. Les 35 extraits organiques réunis ont été lavés deux fois avec des portions de 100 ml de saumure et déshydratés sur Na2SO<. Ils ont été filtrés et évaporés, ce qui a donné 8,3 g

34

(rendement 98 %) d'une huile qui a été utilisée sans autre purification. 'H-RMN (300 MHz, cdc13, ppm) : 4,65 m, 1H, 4,1-4,0. m, 1H, 3,9-3,8. m, 1H, 3,7-3,6 q, (j = 5,6 Hz), 1H, 3,55-3,45. m, 1H, 3,1-3,0. dq, (j = 4,35, 16,3 Hz), 8H, 5 1,85-1,5. M, 6H, 1,15-1,05. t, (j = 16,3 Hz), 12 H. M/e (intens. rel.) 337,2 (MH+, 28), 253,1 (100), 235,1 (12), 180,1 (22).

2-Hydroxyéthyl-N,N,N, N-tétraéthylphosphorodiamidate

10 8,3 g (24,7 mM) de 2-tétrahydrpyrannyloxyéthyl-

N,N,N,N-tétraéthylphosphorodiamidate préparé ci-dessus ont été dissous dans 200 ml de méthanol, et 190 mg d'acide p-toluènesulfonique ont été ajoutés. Le mélange a été chauffé au reflux pendant 8 heures et refroidi, puis 3 ml de TEA 15 ont été ajoutés. La substance a été réduite et purifiée par chromatographie, en utilisant 36 g de silice identique à celle indiquée ci-dessus, en éluant avec EtOAc. Les fractions contenant le produit (rf 0,5, EtOAc/MeOH dans le rapport 9:1) ont été réunies et évaporées, ce qui a donné 20 4,5 g (rendement 72 %) d'une huile incolore. *H-RMN (300 MHz, CDC13, ppm) : 4,1-4,0 dt, (j = 12,7, 2,3), 1H, 3,8, t (j = 2,3), 1H. 3,7-3,6, 1 s, 1H (disparaît avec D20). 3,2-3,0, résonance du pic 11 symétrique, j = 3,4 Hz, 8H, 1,2-1,1, t (j = 7,0), 12H. M/e (intens. rel.) 253,1 25 (MH+, 100), 180,1 (11).

2-p-toluènesulfonyloxyéthyl-N, N,N, N-tétraéthylphosphorodiamida te

Une solution de 4,5 g (23 mM) de chlorure de p-toluènesulfonyle dans 10 ml de THF a été ajoutée goutte à 2Q goutte à une solution sous agitation de 4,5 g (17,9 mM) du 2-hydroxyéthyl-N,N,N,N-tétraéthylphosphorodiamidate préparé ci-dessus et 1,6 g (40 mM) de NaOH dans 12 ml de THF et 8 ml d'eau à 0 °C en un temps de deux heures. On a laissé le mélange se réchauffer à la température ambiante et on l'a agité pendant une nuit. Le mélange réactionnel a été versé dans 35 ml d'eau et soumis à une extraction avec deux portions de 50 ml de toluène, et les phases organiques

35

10

réunies ont été déshydratées sur Na2S04 et concentrées en une huile visqueuse. Une CCM (EtOAc/MeOH dans le rapport 9:1) a mis en évidence une tache, rf 0,7, active en lumière UV. La quantité obtenue était égale à 7,32 g, 99 %. 'H-RMN (300 MHz, CDC13, ppm) : 7,8, d (j = 8,3), 2H. 7,35, d, (j = 8,3), 2H, 4,2, m, 2H. 4,1-4,0, m, 2H. 3,1-2,9, m, 8H. 2,45, s, 3H. 1,15-1,0, t, (J = 7,1), 12H. M/e (intens. rel.) 407,1 (MH+, 100), 334,0 (24), 253,1 (49), 199,0 (20).

2-Bromoéthyl-N,N,N,N-tétraéthylphosphorodiamidate, 6a

1,2 g (17,8 mM) du tosylate indiqué ci-dessus ont été dissous dans 125 ml d'acétone et 3,04 g (35 mM) de LiBr ont été ajoutés. Le mélange réactionnel a été chauffé au reflux pendant 7 heures, refroidi et laissé au repos 15 pendant deux jours. Le mélange réactionnel a été filtré et les substances solides résiduelles ont été lavées avec 25 ml d'acétone. Le filtrat et les liquides de lavage ont été soumis à un entraînement, ce qui a donné une substance solide gommeuse. Cette substance a été triturée avec 100 ml 20 de CH2CI2 et filtrée, et le liquide a été réduit en une huile. *H-RMN (400 MHz, CDC13, ppm) : 4,25, m, 2H. 3,6, m, 2H. 3,1-3,0, m, 8H. 1,05, t (j = 7 Hz), 12H. M/e (intens. rel.) 323,1 (96), 321,1 (100, MH+ avec 1 atome de brome), 241,2 (26), 191,2 (14).

25

30

35

y-Glutamyl-a-aminopropionyl-p-(2-éthyl-N,N,N,N-tétraéthyl-phosphoramidate)-sulfidyl-glycine, 2a

250 mg (0,8 mM) de glutathion ont été dissous dans 5 ml d'eau et la solution a été portée à pH 12 au moyen d'une solution de NaOH concentrée. Cette solution a été ajoutée, sous agitation, à une solution de 300 mg (0,95 mM) du composé 6a dans 5 ml d'éthanol. Le mélange réactionnel a été agité pendant 4 heures et neutralisé avec HC1 1 N. Un produit limpide, donnant une tache par CCM à rf 0,66 (butanol/HOAc/EtOAc/eau dans le rapport 1:1:1:1), visualisé par pulvérisation de ninhydrine, était présent. La solution a été concentrée en une substance solide et

36

purifiée par CLHP : une colonne de 1 inch garnie de silice fonctionnalisée C-18 5 m (YMC Corp.) a été balayée avec une solution à 90 % de CH3CN dans une solution aqueuse à 0,2 % de HOAc (B) , avec ensuite une mise à l'équilibre au moyen 5 de 300 ml d'une solution à 0,2 % de HOAc (A) à un débit de 12 ml/minute. Le sulfure brut a été dissous dans 20 ml d'eau et chargé sur la colonne, puis 100 ml de A ont été introduits. Un gradient jusqu'à 50 % de B a été réalisé en un temps de 90 minutes, et les fractions qui sont apparues 10 sous forme de fractions nettes par CCM ont été réunies et lyophilisées. Cela a donné 240 mg (55 %) d'une poudre blanche, pure à plus de 90 % par CLHP analytique, PF. 100-105 °C. ^-RMN (400 MHz, CDC13, ppm) : 4,3, m, 1H. 3,8, m, 2H, 3,7, s, 2H. 3,5, m, 1H., 2,9-2,5, m, 12H. 2,2, m, 2H. 15 1,9, m, 2H. 0,8, t (j = 7 Hz), 12H. M/e (intens. rel.) 564,2 (M+Na, 18), 542,2 (MH+, 100). 306,1 (32). 209,2 (26). 177,1 (43).

C 42,63. H 7,23. N 11,29. Trouvé : C 42,18. H 6,58. 20 N 11,51.

y-Glutamyl-a-aminopropionyl-(J3-(2-éthyl-N,N,N,N-tétraéthyl-phosphoramidate)-sulfonyl)-glycine (TER 230)

25 dans 10 ml de HOAc avec traitement par ultrasons, et 400 ml (2 mM) de H202 à 30 % ont été ajoutés. Le mélange réactionnel a été agité à température ambiante pendant 2,5 heures et 200 ml d'acide peracétique à 32 % ont été ajoutés. Le mélange réactionnel a été agité pendant 30 3 jours, et a été désactivé avec 200 ml de sulfure de diméthyle. La substance a été lyophilisée en une substance solide blanche et a été purifiée par CLHP : une colonne de 1 inch garnie de silice fonctionnalisée C-18 5 m (YMC Corp.) a été balayée avec une solution à 90 % de CH3CN dans 35 une solution aqueuse à 0,2 % de HOAc (B), avec ensuite une mise à l'équilibre avec 300 ml de solution à 0,2 % de HOAc (A) à un débit de 12 ml par minute. La sulfone brute a été

Analyse calculé pour C2oH4oNs08PS . HOAc. 1/2HC1 :

528 mg (0,97 mM) du composé 2a ont été dissous

37

dissoute dans 10 ml de HOAc et diluée avec 150 ml d'eau, avant d'être chargée sur la colonne, puis 100 ml de (A) ont été ajoutés. Un gradient jusqu'à 100 % de (B) a été réalisé en un temps de 60 minutes, et les fractions qui sont 5 apparues sous forme de fractions nettes par CLHP analytique ont été réunies et lyophilisées. On a obtenu 350 mg (63 %) d'une substance solide blanche, pure à plus de 90 % par CLHP analytique, P. F. 120-125 °C. 'H-RMN (400 MHz, CDC13, ppm) : 4,9, dd (j = 3,5, 9,1 Hz), 1H. 4,1, dd (j = 5,3, 10 10 Hz), 2H. 3,7, s, 2H. 3, 69-3, 65, dd (j = 3,6, 14,6 Hz), 1H. 3,6, t (j = 6,4 Hz), 1H. 3,5-3,45, m, 3H. 2,8, (résonance du pic 6 symétrique avec j = 7 Hz), 8H. 2,3, m, 2H. 1,9, m, 2H. 0,9, t (j = 7 Hz), 12 H. 13C-RMN (100 MHz, CDC13, ppm) : 177,05, 176, 01, 173, 00, 60,79, 56, 60, 56,26, 15 50,05, 44,25, 42,04, 41,99, 33,82, 28,30, 16,07. M/e (MALDI TOF Finnigan) 575, (MH+) 596 (MNa+).

Analyse calculé pour C2oH4oOioN5PS. 2H20 : C 39, 40, H 7,27, N 11,48. Trouvé : C 39,16, H 7,36, N 11,78.

20

30

Exemple 2

synthese de glutathion couple A une moutarde phosphorodiamidate : y-glutamyl—oc—aminopropionyl ([3- (2~ethyl-N,N,N,N~tetra- (2 ' -chloro) -ethylphosphoramidate) sulfonyl) glycine (TER 231)

Le TER 231 répond à la formule suivante : 25 C I

Ce composé est un composé analogue au TER 230 qui contient 35 une moutarde phosphoramidite, ce qui donne le produit suivant : .

38

lors de 1'activation par la GST.

10 Le TER 231 a été synthétisé d'après le schéma réactionnel 2, indiqué ci-dessus.

2-Bromoéthyl-N,N,N,N-tétra-(2'-chloroéthyl)-phosphoramidite, 6b

14 ml (100 mM) de triéthylamine ont été ajoutés 15 lentement, en un temps de 5 minutes, à une solution sous agitation de 9,3 ml (100 mM) d ' oxychlorure de phosphore dans 450 ml de CH2C12 refroidie à 0 °C sous atmosphère d'argon, dans un ballon de 1000 ml à trois cols équipé d'un agitateur mécanique. Puis une solution de 7,09 ml (100 mM) 20 de 2-bromoéthanol dans 50 ml de CH2C12 a été ajoutée lentement en un temps de 4 heures. On a agité le mélange réactionnel pendant une nuit et on l'a laissé se réchauffer à la température ambiante. La solution a été refroidie à nouveau à 0 °C et 35,7 g (200 mM) de chlorhydrate de bis-25 (2-chloréthyl)aminé ont été ajoutés sous forme d'une substance solide. Une solution de 61,33 ml (440 mM) de triéthylamine dans 100 ml de CH2C12 a été ajoutée en un temps de 3 heures à cette suspension sous agitation. On a laissé le mélange se réchauffer à la température ambiante 30 et on l'a agité pendant 3 jours. La suspension a été filtrée à la trompe et le filtrat a été soumis à une réduction sous vide sous forme d'une huile visqueuse de couleur brune. Cette huile a été mélangée à 100 ml de EtOAc et filtrée de nouveau pour éliminer le chlorhydrate de 35 triéthylamine. La solution a été concentrée à un volume d'environ 50 ml et a été soumise à une purification chromatographique. Un lit de silice de 38 par 5,5 cm a été

39

10

15

20

25

utilisé, en éluant avec un mélange EtOAc/éther de pétrole dans le rapport 1:1. 12,3 g (rendement 27 %) d'une huile jaune limpide ont été isolés, r.f. 0,5. M/e (MALDI TOF Finnigan) 454,2 (MH+) . ^-RMN (300 MHz, CDC13) , ppm : 4,4-4,3, m, 2H. 3,75-36, t, j = 2,2 Hz, 8H. 3,6-3,5, t, j = 5 Hz, 2H. 3,5-3,4, m, 8H.

y-Glu tamyl- a-amino-p-(2-éthyl-N, N, N,N-té tra-(2-chloro é thyl)-phosphoramidate)-sulfidylpropionyl~gIycine, 2b

4,5 g (15 mM) de glutathion ont été dissous dans 75 ml d'eau désionisée, et le pH a été ajusté dans la plage de 9 à 10, en ajoutant une solution de NaOH 1 N. Une solution du composé 13 dans 100 ml d'éthanol a été ajoutée à cette solution sous agitation à température ambiante. Le mélange réactionnel trouble est devenu limpide au bout de deux minutes, et a été agité pendant une nuit. Un contrôle par CCM a mis en évidence une réaction partielle, et le mélange réactionnel a été agité pendant un temps supplémentaire de trois jours. Puis la solution a été neutralisée à pH 5-6 et l'éthanol a été éliminé sous vide. La solution a été divisée en trois portions approximativement égales, et a été purifiée par CLHP préparative, comme pour le composé 2a, ce qui a donné 0,5 g (rendement 36 %) d'une poudre blanche, P.F. 80 °C (décomposition). M/e (MALDI TOF Finnigan) 680,2 (MH+) . 1H-RMN (300 MHz, DMSO-d6, ppm : 8,8-8,7 t, j = 1,5 Hz, 1H. 8,5-8,4, d, j = 2,5 Hz, 1H. 4,5-4,4 ls, 1H. 4,1-4,0, dd, j = 2,2, 1,8 Hz, 2H. 3,8-3,6, m, 10H, 3,5-3,2, lm, 12H. 3,0-2,9, dd, j = 1,3, 3,2 Hz, 1H. 2,9-2,8, t, j = 1,9 Hz, 1H. 2, 75-2, 65, dd, j = 3,2, 1,3 Hz, 1H. 2,4-2,3, m, 2H. 2,0-1,85, m, 2H.

C 32,75, H 5,77, N 9,54. Trouvé : C 33,05, H 5,38, N 9,42.

Analyse calculé pour CaoHseNsOePSCl^. 3H20 :

40

y-Glutamyl-a-amino-j3-(2-éthyl-N,N,N,N-tétra-(2'-chloro)-éthyl-phosphoramidate)sulfonyl-propionylglycine, 1b, TER 231

1,5 g (2,2 mM) du composé 2b ont été dissous dans 22 ml de HOAc, et un volume de 0,78 ml (4 mM) de H202 à 5 30 % y a été ajouté. Au bout de deux heures, un spectre de masse du mélange a révélé la conversion totale en le sulfoxyde. Un volume 0,525 ml (2,5 mM) d'acide peracétique à 32 % a été ajouté, et le mélange réactionnel a été agité pendant une nuit. Un spectre de masse du mélange a révélé la conversion pratiquement totale de la substance en le composé désiré, et le mélange a été lyophilisé et purifié par CLHP par un procédé identique à celui utilisé pour le TER 230, ce qui a donné 1,05 g (rendement 67 %) de TER 231 sous forme d'une poudre blanche, P.F. 95 °C (décomposition). M/e (MALDI TOF Finnigan) 712,7 (MH+) . 1H-RMN, 300 MHz, D20, ppm : 5,2-5,1 m, 1H., 4,6-4,6, d, j = 1,4 Hz, 2H. 4,0, s, 2H. 3,95-3,9, m, 1H. 3,85-3,65, m, 12H. 3,55-3,45, m, 8H. 2,2-2,5, m, 2H. 2,3-2,15, m, 2H.

Analyse calculé pour C2oH3GNsOioPSCl4. 2H20 : 20 C 32,14, H 5,41, N 9,37. Trouvé : C 32,07, H 5,11, N 9,22.

Autres précurseurs médicaments analogues du glutathion

D'une manière totalement analogue à celle décrite pour la préparation du TER 231 mentionné ci-dessus, 25 les analogues supplémentaires suivants ont été préparés :

y-Glutamyl-a-amino-p-((2-éthyl-N,N,N,N-tétra-(2'-chloro)-éthylphosphoramidate)sulfonyl)-propionyl-(R)-(-)-phénylglycine (TER 286) ;

y-Glutamyl-a-amino-p-((2-éthyl-N,N,N,N-tétra-30 (2'-chloro)-éthylphosphoramidate)-sulfonyl)propionyl-phénylalanine, (TER 303) ;

y-Glutamyl-a-amino-p- (1-phényle, 2-éthyl-N, N, N, N-tétra-(2'-chloro)éthylphosphoramidate)sulfonyl)propionyl-, glycine, (TER 296) ;

1

41

y-Glutamyl-a-amino-p- (1-phényle, (2-éthyl-N, N, N, N-tétra-(2'-chloro)éthylphosphoramidate)sulfonyl)-propionyl (R)-(-)-phénylglycine, (TER 297).

Des détails supplémentaires concernant le 5 TER 286 sont les suivants :

y-Glutamylcystéinyl-(R)-(-)-phénylglycine. Un volume d'environ 50 ml d'ammoniac anhydre a été condensé dans un ballon qui avait été refroidi à -78 °C dans un bain de neige carbonique sous une atmosphère 10 d'argon. Une quantité d'environ 0,5 g de sodium métallique a été ajoutée, et la solution a viré au bleu foncé et a été soumise à une agitation magnétique pendant 10 minutes. Le composé 6 consistant en y-glutamyl-S-hexylcystéinyl-(R)-(-)-phénylglycine décrit par Lyttle, M. et al., J. Med. 15 Chem. (1991), 34 : 189-194, en une quantité de 240 mg (0, 506 mM) a été ajoutée, et la solution a été agitée pendant une heure. On a ajouté du NH4 solide jusqu'à ce que la solution devienne incolore, et on a laissé l'ammoniac s'évaporer. Le ballon et son contenu ont été soumis à un 20 vide poussé pendant une nuit. Une petite quantité de la substance a été purifiée par CLHP préparative, ce qui a donné une poudre blanche, P.F. 68-73 °C. SM m/z (intensité relative) : 406 : 3 (MNa+, 100), Analyse (Ci6H2iN306S*TFA) , C, H,N.

25

y-GlutamyI-a-amino-p-[[2-éthyt-N,N,N,N-tétrakis-(2-chloroéthyl)-phosphorodiamidate]-thio]-propionyl-(R)-(-)-phénylglycine

La totalité de la substance brute obtenue ci-dessus a été dissoute dans 7,5 ml d'eau sous atmosphère 30 d'argon et la solution a été soumise à une injection d'argon pendant 5 minutes. Le pH de la solution a été ajusté dans la plage de 9 à 10 avec une solution de NaOH 1 N, et une solution de 1,36 g (3 mM) du composé 14 dissous dans 7,5 ml de EtOH et 7,5 ml de CH3CN a été ajoutée. Le 35 mélange réactionnel a été agité pendant une nuit et acidifié à pH 5 avec HOAc. La solution a été évaporée et purifiée par CLHP. La quantité obtenue était égale à

42

139 mg, P. F. 57-80 °C. SM m/z : 780 (MNa*) , 799 (MK+) . Analyse : (CjoH^NsO - PSC1<*TFA) C, H, N.

y-Glutamyl-a-amino-{3-[[2-éthyl-N,N,N,N-tétrakis-(2-chloroéthyl)-5 phosphorodiamidate]-sulfonyI]-propionyl-(R)-(-)-phénylglycine

67 pi de H202 à 30 % ont été ajoutés à une solution du composé 18, en une quantité de 125 mg (0,16 mM) , dissous dans 1,7 ml d'acide acétique. La solution a été entourée d'une feuille métallique pour 10 exclure la lumière, puis a été soumise à une agitation magnétique pendant 2 heures. Un spectre de masse du produit brut a montré que la transformation en le sulfoxyde s'était produite ; 42 pi d'acide peracétique à 32 % ont été ajoutés, et la solution a été agitée pendant une nuit. La 15 solution a été réduite en une substance solide et purifiée par CLHP, ce qui a donné 87 mg (rendement 67 %) d'une substance blanche, P. F. 82-90 °C. SM m/z : 790 (MH+) , 812 (MNa*), 830 (MK+) . Analyse (C25H4oN5010PSCl4) C, H, N.

On a également préparé les analogues dans 20 lesquels le groupe partant contient une liaison uréthanne, comme suit :

y-Glutamyl-a-amino-p-((2-éthyl-N,N-bis-(2'-chloroéthyl)-carbamoyl)-sulfonyl)-propionylglycine, (TER

322) et son ester diéthylique (TER 325). 25 On a préparé également la :

y-Glutamyl-a-amino-p-((2-éthyl-(4-benzyloxy-(N, N, N1, N'tétrakis- (2-chloroéthyl) -phosphorodiamidate) ) -carbamido)-sulfonyl)-propionylglycine.

Exemple 3

30

Liberation selective de "L" par des isoenzymes GST

Le composé à tester a été dissous dans du tampon au phosphate 0,2 M et une solution de GST a été ajoutée. Les concentrations finales étaient égales à 0,3 mM 35 pour le composé d'essai et 0, 006 mM pour la GST, à pH 7 pour le TER 230 ; pour le TER 231, la concentration de GST était égale à 0, 003 mM et le pH était égal à 7,1. La

43

solution a été mise en incubation à 37 °C. La décomposition a été suivie par CLHP. La colonne était une colonne C-18 de J.T. Baker de 250 x 4,6 mm, avec des particules de 5 pm. Le tampon A consistait en tampon à l'acétate d'ammonium 5 0, 05 M, à un pH de 5,5 ; avec 5 % de CH3CN ; le tampon B consistait en une solution à 70 % de CH3CN dans A.

On a fait fonctionner la colonne avec un gradient de 20 % à 50 % de B en un temps de 15 minutes, puis jusqu'à 100 % de B en un temps de 3 minutes ; et 10 ensuite en revenant à 20 % de B en un temps de 6 minutes. Un échantillon de 10 pi a été injecté, et le débit était égal à 1 ml/minute. Des portions aliquotes ont été prélevées et la décomposition catalytique a été désactivée par addition d'acide acétique. Une CLHP effectuée pendant 15 une nuit en utilisant un appareil de prélèvement automatique d'échantillon a été utilisée ; les vitesses de décomposition ont été calculées en mesurant les vitesses de disparition du pic par rapport à un étalon interne, qui consistait en une solution 0,06 mM d'un marqueur peptidique 20 inerte. Les résultats pour le TER 230 sont représentés sur la figure 1, et ceux pour les TER 231 sont représentés sur la figure 2.

Comme le montre la figure 1, Mla décompose le TER 230 environ quatre fois plus rapidement que le bruit de 25 fond, et PI décompose le TER 230 environ deux fois plus rapidement que le bruit de fond. Ces deux isoenzymes sont exprimées d'une manière prédominante dans de nombreuses tumeurs. L'isoenzyme Al, habituellement associée aux tissus sains, n'accélère pas la décomposition du TER 230 au-dessus 30 du bruit de fond dans les limites de l'erreur expérimentale.

De manière similaire, comme le montre la figure 2, Mla décompose le TER 231 environ 12 fois plus rapidement que le bruit de fond ; et PI et Al décomposent 35 le TER 231 cinq fois plus rapidement que le bruit de fond. Le TER 231 subit en général une décomposition plus rapide

V

44

que le TER 230, probablement en raison de l'effet électrophile des quatre atomes de chlore.

Le TER 286 a été testé d'une manière similaire, les résultats étant indiqués sur la figure 3a. Pl-1 et Al-1 5 accélèrent le clivage du TER 286 approximativement six fois plus rapidement que le bruit de fond ; il existe une accélération négligeable du clivage avec Mla-la.

Le TER 322 a été testé de la manière décrite ci-dessus, et a présenté une forte sélectivité pour 10 l'activation par Pl-1. Les isoenzymes GST Al-1 et Ml-1 ont présenté une activation négligeable du précurseur médicamenteux au-dessus du bruit de fond dans des conditions classiques, consistant en une température de 37 °C et un pH de 7,1. Ces résultats sont présentés sur la 15 figure 3b.

En outre, les demi-vies ont été déterminées de la manière décrite ci-dessus, en utilisant 3 pM de GST humaine recombinante Pl-1, Al-1 ou Mla-la, en partant d'une concentration du composé à tester égale à 300 pM et en 20 contrôlant la disparition par CLHP. Le tableau 1 ci-dessous présente les résultats :

Tableau 1

Demi-vies in vitro (minutes)

Composé :

296

286

303

231

Sélectivité :

Pl-1

Pl-l/Al-1

Al-1

Mla-la

TEMOIN

280

275

335

350

Pl-1

2,5

50

310

110

Al-1

200

65

45

110

Mla-la

50

225

200

25

Comme le montre le tableau, en fonction du précurseur médicamenteux choisi, la spécificité peut être obtenue pour n'importe laquelle des trois GST humaines testées. Ainsi, le TER 296 est clivé sélectivement par Pl-1, le TER 286 est clivé sélectivement par Pl-1 et Al-1 ; le

45

TER 303 est clivé sélectivement par Al-1 ; et le TER 231 est clivé sélectivement par Mla-la.

Pour ces précurseurs médicamenteux, la décomposition a pour résultat un effet cytotoxique dû à la 5 libération de la moutarde phosphorodiamidate. Cet effet est similaire à celui de l'entité biologiquement active responsable de l'action du cyclophosphamide, qui est un médicament chimiothérapeutique couramment utilisé à l'état activé par le cytochrome P450 ou des oxydases à fonction 10 mixte. L'activité résulte de l'attaque de l'atome N sur la liaison C-Cl, conduisant à la formation d'un noyau aziridine chargé positivement :

15

stabilisé sous forme d'un zwitterion avec le phosphate libre. L'entité aziridinium réagit comme un agent d'alkylation avec des groupements nucléophiles sur l'ADN a 20 pour résultat une réticulation lorsqu'une alkylation multiple a lieu. Une telle réticulation met hors service, de manière permanente, le mécanisme de reproduction des cellules.

25 Exemple 4

Détermination de la cytotoxicité in vitro

Les composés qui présentent la libération de groupements moutarde du type phosphoramide lors de la réaction avec la GST peuvent être ensuite sélectionnés pour 30 déterminer la cytotoxicité in vitro par des procédés connus dans ce domaine (voir, par exemple, Borch II). Des résultats préliminaires, en utilisant des cellules de cancer humain HT29 montrent que le TER 231 est toxique pour ces cellules, tandis que le TER 230 ne l'est pas. Ce 35 résultat est le résultat prévu car le groupement libéré par le TER 230 est non toxique.

b

46

Les résultats obtenus avec des cellules de cancer MCF-7 et un produit de transfection n correspondant contenant des taux élevés de GST PI mettent également en évidence les résultats désirés. Les cellules MCF-7 5 transfectées avec n sont plus sensibles au TER 231 que les cellules non transfectées.

Les précurseurs médicamenteux décrits ci-dessus ont été testés avec diverses cellules MCF-7 transfectées avec un vecteur pour la production de taux supplémentaires 10 de GST Pl-1 ou un vecteur contenant seulement le marqueur de sélection. La transfection avec Pl-1 a eu pour résultat une multiplication par 13 du taux de cette enzyme. Ces cellules ont été obtenues auprès du Dr. Alan Townsend, Bowman Grâce School of Medicine. On a testé également des 15 cellules MCF-7 choisies pour leur résistance au cyclo-phosphamide (MCF-CTX) et leur analogue de type sauvage. La résistance au cyclophosphamide a été associée à des taux élevés d'aldéhyde-déshydrogénase ; cependant, les cellules MCE'-CTX présentent également une multiplication par trois 20 de l'activité de GST comparativement au type sauvage. Ces cellules ont été obtenues auprès du Dr. Beverly Teicher, Dana Farber Cancer Institute.

Les analyses ont été effectuées en traitant une suspension de 2 x 10s cellules par ml pendant 2 heures avec 25 des concentrations variables du précurseur médicamenteux. Puis les cellules ont été étalées à raison de 1000 à 2000 cellules par puits dans des plaques à 96 puits, et ont été analysées au cinquième jour par une modification de l'analyse utilisant du bleu de méthylène décrite par 30 Oliver, M.H., et al., J. Cell Science (1989), 92 : 513-518.

Les figures 4a, 4b et 4c présentent les résultats obtenus lorsque des cellules de tumeur MCF-7 transfectées par Pl-1 ont été comparées à des cellules transfectées seulement avec le vecteur témoin. Comme le 35 montre la figure 4a, lorsque le TER 286 est utilisé, les cellules contenant des taux élevés d'enzyme Pl-1 sont

47

quatre fois plus sensibilisées aux précurseurs médicamenteux que les cellules témoins ; la figure 4b met en évidence une sensibilisation double en ce qui concerne le TER 231. Lorsqu'un agent toxique classique, tel que le 5 mafosfamide, est utilisé, comme cela est représenté sur la figure 4c, il n'effectue aucune différence, que les cellules aient ou non des taux élevés de GST Pl-1.

Des résultats similaires ont été obtenus pour des cellules MCF-7 qui sont sensibles au CTX 10 comparativement aux formes résistantes au CTX. Les cellules résistantes au CTX étaient plus sensibles au TER 286, d'un facteur de 1,8, comparativement aux cellules sensibles au CTX dans un essai clonogène classique.

En outre, le TER 325 était deux fois plus 15 toxique pour les cellules MCF-7 exprimant Pl-1 que pour MCF-7-néo.

Exemple 5 Cytotoxicité in vivo

20 Les précurseurs médicamenteux de la présente invention ont été testés chez des souris Balb/C nu/nv. Les souris ont été soumises à l'implantation sous-cutanée de fragments de tumeur MX-1 et ont été ensuite traitées par une seule injection intrapéritonéale après que les tumeurs 25 ont atteint un volume moyen de 100 mm3 (c'est-à-dire approximativement 18 jours après l'implantation). La croissance tumorale et le poids de l'organisme ont été contrôlés pendant un mois après le traitement. Les résultats sont représentés sur la figure 5. De la manière 30 indiquée, le volume de la tumeur chez les souris traitées, comparativement aux témoins, est fortement réduit. Sur la figure 5, les carrés représentent les témoins ; les cercles représentent une quantité de 300 mg/kg de TER 286 ; les triangles représentent une quantité de 400 mg/kg du même 35 médicament. Les points indiqués représentent la moyenne plus ou moins l'écart-type de 5 à 7 souris par groupe.

48

Exemple 6

Effet du précurseur médicamenteux sur la moelle osseuse

Dans l'analyse, des souris B6D2Fi ont été traitées avec diverses doses de TER 286 par voie intrapéritonéale, sous forme d'une seule injection, ou bien sous forme de cinq injections quotidiennes. Les moelles osseuses fémorales ont été prélevées 24 heures plus tard, et analysées pour la détermination de GM-CFU par le procédé de East, C.J. et al. Cancer Chemother. Pharmacol. (1992), 31 : 123-126. Les résultats sont représentés sur la figure 6. Des augmentations allant jusqu'à 180 % des témoins pour les GM-CFU ont été obtenues avec administration de 100 à 200 mg/kg de TER 286 ; les valeurs indiquées représentent la moyenne plus l'écart-type de 2 ou 3 expériences.

En outre, de la manière représentée sur la figure 7, l'intervalle de doses optimal se révèle être présent dans cette région de 100 à 200 mg/kg pour le TER 286. Ce résultat est particulièrement remarquable, puisque le précurseur médicamenteux est capable d'engendrer une cytotoxicité en lui-même ; les résultats avec le melphalan représentés sur la figure indiquent une toxicité extrême des agents chimiothérapeutiques vis-à-vis de la moelle osseuse.

49

Claims (15)

REVENDICATIONS

1. Composé de formule :

Y-CO-NHCHCO-AAc

CH2 H R3

I I , , I

S* C— {CR =CR ) -—C L ( 1 )

| |

R1 RJ

10 et ses amides, esters, ester/amides mixtes et sels,

formule dans laquelle :

L représente un groupe partant électrophile ;

Sx représente un groupe S=0, 0=S=0, S=NH, HN=S=0, Se=0, 0=Se=0, Se=NH, HN=Se=0, S+R4 dans lequel R4 15 représente un groupe alkyle (en Ci à C6) , ou 0-C=0 ou bien HN-C=0 ;

chaque groupe R de R1, R2 et R3 représente, indépendamment, H ou un substituant non perturbateur ;

n est égal à 0, 1 ou 2 ; 20 Y-CO est choisi dans le groupe consistant en y-Gly, p-Asp, Glu, Asp, y-GluGly, p-AspGly, GluGly et AspGly ; et

AAC représente la glycine, la phénylglycine, la P-alanine, l'alanine, la phénylalanine, la valine, l'acide 25 4-aminobutyrique, l'acide aspartique, l'histidine, le tryptophane ou la tyrosine, lié par une liaison peptidique au reste dudit composé de formule (1).

2. Composé suivant la revendication 1, dans lequel L représente un groupement biologiquement actif lors

30 de sa libération par le composé de formule (1).

3. Composé suivant la revendication 2, dans lequel ledit groupement biologiquement actif est une moutarde phosphoramide ou une moutarde phosphorodiamidate.

4. Composé suivant l'une quelconque des reven-35 dic.ations 1 à 3, dans lequel n est égal à 0 ; et/ou

50

dans lequel Y-CO représente l'acide y-glutamique ; et/ou dans lequel AAC représente l'alanine, la phénylalanine, la glycine ou la phénylglycine ; et/ou 5 dans lequel chaque R3 représente,

indépendamment, H, un groupe alkyle inférieur (en Ci à C4) ou phényle ; et/ou dans lequel L représente un groupe -0P(0) (N(CH2CH3)2)2, -OP(O) (N (CH2CH2C1)2)2, -OP(O) (NHCH2CH2C1)2, -OP(O) (N(CH2CH2Br)2)2, 10 -OP(O) (NHCH2CH2Br) 2 ou 4-méthoxy-2, 3-di-tertio-butylphénoxy- ; et /'ou dans lequel L comprend une liaison uréthanne ;

et/ou dans lequel Sx représente un groupe 0=S=0. 15

5. Composé suivant la revendication 1, qui répond à une formule choisie dans le groupe consistant en les formules suivantes :

x

^ r-x

,0 N

25

30

-c ^

0 ^0

N V C 00 H

NHZ 0 CCH2Y)z

/

dans laquelle chaque groupe Y représente, indépendamment, H ou un groupe phényle ; Z est égal à 0 ou 1 ; et X représente H, Cl ou Br, y compris ses amides, esters, ester/amides mixtes ou sels ;

0 K,J~X

^P*

^.0' N" \

Y / X

1^0

o fS^o

35 NH; o

51

dans laquelle chaque groupe Y représente, indépendamment, H ou un groupe phényle ; Z est égal à 0 ou 1 ; et X représente H, Cl ou Br, y compris ses amides, esters, ester/amides mixtes ou sels ; et dans laquelle chaque groupe Y représente, indépendamment, H ou un groupe phényle ; Z est égal à 0 ou 1 ; et X représente 15 H, Cl ou Br, y compris ses amides, esters, ester/amides mixtes ou sels.

6. Composition pharmaceutique efficace dans le traitement sélectif de cellules cibles chez des mammifères, composition qui comprend au moins un composé suivant l'une

20 quelconque des revendications 1 à 5 en mélange avec un excipient pharmaceutiquement acceptable, lesdites cellules ayant un complément d'iso-enzymes GST dans lesquelles le taux d'au moins une iso-enzyme GST est élevé, ledit composé ayant été choisi en tant que composé sensible au clivage par 25 ladite iso-enzyme GST dont le taux est élevé dans le complément de GST desdites cellules cibles.

7. Composition pharmaceutique pour accroître la stimulation des cellules souches de granulocytes-macrophages (GM) dans la moelle osseuse, qui comprend au moins un

30 composé suivant l'une quelconque des revendications 1 à 5 en mélange avec un excipient pharmaceutiquement acceptable.

8. Composé répondant à une formule choisie dans le groupe consistant en les formules suivantes :

5

10

NH;

0 CCHjY),

52

10

ou

15 ou y-co-nhchco-aac

I

ch2 h r3

't 1 I

sf c— ( crz=cr2 ) „ c—L ;

(2)

20

y-co-nhchcooh

I

ch2 h r3

S'- c— ( CR2=CR2) ft 0——L ; ( ! ! )

RJ R3

kh2chco-aac

CH2 h r3

S" -C (CR2=CR2) ft C—L; (12)

K i pi c3

ou ses amides, esters, ester/amides mixtes ou sels,

formules dans lesquelles : 25 L représente un groupe partant électrophile ;

-j-

S* représente un groupe S ou S ;

S+ représente S ou Se ;

Sx représente un groupe S=0, 0=S=0, S=NH, HN=S=0, Se=0, 0=Se=0, Se=NH, HN=Se=0, S+R4 dans lequel R4 30 représente un groupe alkyle (en Ci à C6) ou 0-C=0 ou bien HN—C=0 ;

chaque groupe R de R1, R2 et R3 représente, indépendamment, H ou un substituant non perturbateur ;

n est égal à 0, 1 ou 2 ;

35 Y est choisi dans le groupe consistant en y-Glu,

p-Asp, Glu, Asp, y-GluGly, (}-AspGly, GluGly et AspGly ; et

53

AAC représente la glycine, la phénylglycine, la P-alanine, l'alanine, la phénylalanine, la valine, l'acide 4-aminobutyrique, l'acide aspartique, l'histidine, le tryptophane ou la tyrosine, lié par une liaison peptidique 5 au reste dudit composé de formule (1),

pour la préparation du composé suivant la revendication 1.

9. Procédé pour la production du composé de formule :

10

y-co-nhchco-aac i

ch2 h r3

I 1 _ , I

sx— c— ( cr - cr2 ) „■—c l ( 1 )

r1 r3

15

dans laquelle Y-CO, AAC, n, L et R1, R2 et R3 répondent aux définitions suivant la revendication 1 et Sx représente un groupe S=0, 0=S=0, Se=0 ou 0=Se=0, 2 0 procédé qui comprend le traitement du composé de formule (2) suivant la revendication 8 avec un agent oxydant.

10. Procédé pour la production du composé de formule :

25

y - CO-NHCHCO - AAc

CHj H R3

s" c-—(cr2=cr2) n—-c—l ■ (i)

30 Rl R3

dans laquelle Y-CO, AAC, n, L et R1, R2 et R3 répondent aux définitions suivant la revendication 1, et Sx 35 représente un groupe S=NH ou Se=NH,

b

54

procédé qui comprend le traitement du composé de formule (2) suivant la revendication 8 avec la chloramine T.

11. Procédé pour la production d'un composé de formule :

Y-CO-NHCHCO-AAc

I

CH2 H R3

S* C—(CR2=CR2) —C-î-L (1)

10

dans laquelle Y-CO, AAC, n, L et R1, R2 et R3 répondent aux définitions suivant la revendication 1, et Sx 15 représente un groupe 0=S=NH ou 0=Se=NH,

procédé qui comprend le traitement du composé de formule (2) suivant la revendication 8 avec un agent oxydant et la chloramine T.

12. Procédé pour la production du composé de

2 0 formule :

Y-CÛ-NHCHCO-AAc

I

CH, H R3

ri a 2 i

S*- C— ( CR2=CR2 ) „—C—L ( 1 )

dans laquelle Y-CO, AAC, n, L et R1, R2 et R3 répondent aux définitions suivant la revendication 1, et Sx 30 représente un groupe 0-C=0,

procédé qui comprend le traitement du composé de formule

*7

55

Y-CO-NHCHCO-AAf-

I

chjoh

5 avec un composé qui cède un groupement de formule

H R3

0=C—C (CR2=CR2) C— L

10 R1 R3.

13. Procédé pour la production du composé de formule :

15

20

Y-CO-NHCHCO-AAc

I

CH2 H R3

S1 C— ( CR2=CR2) n—C—L ( i )

A- J.

dans laquelle Y-CO, AAC, n, L et R1, R2 et R3 répondent aux définitions suivant la revendication 1, et Sx représente un groupe HN-C=0 ;

procédé qui comprend le traitement du composé de

25 formule

Y-CO-NHCHCO-AiV

I

ch2nh2

30 avec un composé qui cède un groupement de formule

H R3

35

0=C—C— (CR2=CR2) n—C L

• l' k

56

14. Procédé pour la production du composé de formule :

Y-CO-NHCHCO-Mc

I

k2 | j

S' C— t CR2=CR2 ) C—L ( 1 )

CH, H R3

R1 R3

10 dans laquelle Y-CO, AA c, n, L et R1, R2 et R3

répondent aux définitions suivant la revendication 1, et Sx représente un groupe S+R4 dans lequel R4 représente un groupe alkyle (en Ci à Cô) ;

procédé qui comprend le traitement du composé de 15 formule (2) suivant la revendication 8 avec l'halogénure de R4.

15. Composé suivant la revendication 1, qui consiste en glutamyl_o<L-amino -p_( (2-éthyl-N,N,N,N-tétra-(2 chloro)-éthylphospho.-ramidate)-sulfonyl)-propionyl-(R)-(-)-phénylglycine.