MC1637A1 - Composes polymerisables contenant des polypeptides comme partie integrante et leur utilisation dans des epreuves immunologiques de separation induite par polymerisation - Google Patents

Composes polymerisables contenant des polypeptides comme partie integrante et leur utilisation dans des epreuves immunologiques de separation induite par polymerisation

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MC1637A1
MC1637A1 MC841736A MC1736A MC1637A1 MC 1637 A1 MC1637 A1 MC 1637A1 MC 841736 A MC841736 A MC 841736A MC 1736 A MC1736 A MC 1736A MC 1637 A1 MC1637 A1 MC 1637A1
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Robert C Nowinssky
Alan S Hauffman
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    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
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    • C08F290/00—Macromolecular compounds obtained by polymerising monomers on to polymers modified by introduction of aliphatic unsaturated end or side groups
    • C08F290/08—Macromolecular compounds obtained by polymerising monomers on to polymers modified by introduction of aliphatic unsaturated end or side groups on to polymers modified by introduction of unsaturated side groups
    • C08F290/14—Polymers provided for in subclass C08G
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Description

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La présente invention concerne dans son ensemble la synthèse de novo de polymères contenant des polypeptides comme partie intégrante de leur structure par conjugaison de composés polymérisables en liaison de covalence avec 5 un polypeptide, l'utilisation de ces conjugués pour effectuer l'élimination sélec.tive de substances de leur solution par polymérisation des conjugués, et des épreuves immunolo-giques dans lesquelles une réaction de polymérisation est utilisée pour effectuer une séparation des corps réac-10 tionnels spécifiques.
1. Chimie des polymères
Des polymères insolubles dans l'eau (tels que des polysaccharides et des matières polyacryliques) ont été utilisés couramment dans les domaines de la biochimie 15 et de 1'immunologie (chromatographie par affinité et épreuves immunologiques), comme supports en phase solide avec des anticorps passivement absorbés ou en liaison de covalence. De tels polymères insolubles dans l'eau sont produits par polymérisation de composés, tels que des 20 monomères ou des oligomères, pour former des structures moléculaires polymériques plus grandes (polymères), ou par le déclenchement d'une copolymérisation de monomères avec des composés polyinsaturés polymérisables. Des polymères peuvent être formés à partir d'une espèce monomérique 25 unique (homopolymères), à partir d'un mélange de monomères différents (copolymères), à partir de composés polyinsaturés polymérisables contenant une insaturation oléfinique ou acétylénique ou à partir d'un mélange de composés polyinsaturés polymérisables, et d'un ou plusieurs monomères. 30 Des structures linéaires, ramifiées ou réticulées sont possibles. En faisant varier la composition chimique ou les rapports des monomères, il est possible de former des polymères solubles ou insolubles qui comprennent une large gamme de structures chimiques et physiques. Par 35 exemple, des monomères hydrosolubles (tels que 1'acrylamide) peuvent être copolymérisés pour former des homopolymères hydrosolubles. Ils peuvent aussi être copolymérisés avec
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des monomères moins hydrosolubles (tels que des N-alkyl-ou N,N-dialkyl-acrylamides) ou avec des monomères réticu-lants (tels que le N,N'-méthylènebisacrylamide) pour former des structures copolymériques insolubles dans l'eau. Cer-5 tains monomères hydrosolubles (tels que le méthacrylate d'hydroxyéthyle ou 11acrylonitrile) peuvent être homopoly-mérisés pour former des homopolymères insolubles dans l'eau. Voir, par exemple, les brevets des Etats-Unis d'Amérique N° 3 957 741, N° 4 257 884, N° 4 195 129, 10 N' 4 225 784, N° 4 181 636, N° 4 401 765 et N° 4 166 105.
Jusqu'à présent, le couplage d'un polypeptide à un polymère a eu lieu dans des circonstances dans lesquelles le polypeptide était introduit sous une forme soluble et le polymère était introduit comme matière soluble 15 préformée ou comme matière insoluble préformée. Bien que ces polymères présentent un intérêt en offrant une surface sur laquelle des réactions biochimiques ou immunologiques sélectives peuvent avoir lieu, les polymères ont une valeur limitée en ce que l'accessibilité stérique, quant à l'espa-20 cernent, et le nombre de polypeptides liés par unité de longueur du polymère, ne peuvent pas être réglés avec précision ou de façon reproductible. Une variation d'un lot à un autre se rencontre communément au cours de la production de ces matrices polymère en phase solide/corps 25 réactionnel. Dans certaines applications finales où la reproductibilité et la normalisation sont essentielles (par exemple dans des épreuves immunologiques), cette variation de composition des matrices polymère en phase solide/corps réactionnel présente un problème critique. 30 En conséquence, il est nécessaire dans l'art antérieur de trouver un procédé permettant d'adapter spécifiquement ou d'édifier moléculairement des composés polymériques renfermant des quantités réglées de corps réactionnels.
2. Epreuves immunologiques 35 Ces épreuves immunologiques ont trouvé de nom breuses applications dans le domaine du diagnostic clinique pour la détection et le dosage de médicaments, de vitamines,
d'hormones, de protéines, de métabolites, de micro-organismes et d'autres substances intéressantes (analytes) dans des liquides biologiques et non biologiques. Normalement , ces analytes apparaissent à une concentration micro-
m* fi
5 moléculaire (10 M) ou moins.
Les épreuves immunologiques comportent généralement des anticorps et des antigènes comme corps réactionnels, dont l'un au moins est marqué avec un composé produisant un signal (par exemple radio-isotope, fluorophore, etc.). 10 Après mélange avec l'échantillon et incubation, des réactions spécifiques antigène/anticorps ont lieu (liaison spécifique). Le mélange réactionnel est ensuite interrogé pour détecter le corps réactionnel marqué libre et en liaison spécifique, ce qui permet un dosage de l'analyte 15 dans l'échantillon.
Les épreuves immunologiques peuvent être divisées en deux catégories générales, les épreuves homogènes et les épreuves hétérogènes» Dans une épreuve immunologique homogène, le signal émis par le corps réactionnel marqué 20 en liaison spécifique est différent du signal émis par le corps réactionnel marqué libre. Par conséquent, on peut faire la distinction entre corps marqué et corps libre sans séparation physique.
L'archétype de l'épreuve immunologique homogène 25 est la technique d'analyse immunologique par multiplication enzymatique -(EMIT) qui est décrite dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 3 817 837. Dans cette technologie, un analyte présent dans un échantillon d'un patient et un conjugué analyte/enzyme se disputent une quantité limitée 30 d'anticorps anti-analyte. La liaison spécifique de l'anticorps au conjugué module son activité enzymatique. Par conséquent . la quantité d'activité enzymatique est proportionnelle à la quantité d'analyte dans l'échantillon. Des épreuves immunologiques homogènes offrent l'avantage d'être rapides, 35 faciles à exécuter et elles se prêtent aisément à une automatisation. Leurs principaux inconvénients résident dans le fait qu'elles sont relativement susceptibles d'inter
férences, qu'elles sont en général limitées à des analytes de bas poids moléculaire et que leur sensibilité est en
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général limitée à environ 10 H.
Dans une épreuve immunologique hétérogène, 5 le signal émis par le corps réactionnel marqué lié ne peut pas être distingué du signal émis par le corps réactionnel marqué libre. Par conséquent, une étape de séparation est nécessaire pour faire la distinction entre les deux.
10 Des exemples d'épreuves immunologiques hétéro gènes comprennent le radio-immuno-essai (RIA) et l'épreuve d'immunosorption à liaison enzymatique (ELISA). Dans le RIA, un analyte marqué par un radio-isotope et un analyte présent dans un échantillon d'un patient se disputent 15 une quantité limitée d'anticorps anti-analyte immobilisé (phase solide). La phase solide est lavée pour éliminer l'analyte marqué non lié, et la fraction liée ou la fraction libre est analysée en vue de détecter la présence de corps réactionnel marqué. Les épreuves ELISA sont con-20 duites de façon analogue. Dans ce cas, cependant, le signal est un enzyme au lieu d'un radio-isotope. Les épreuves immunologiques hétérogènes utilisent normalement au moins un réactif immobilisé sur une phase solide. Attendu que la cinétique de réaction entre un anticorps (ou un antigène) 25 immobilisé et son site de liaison tend à être plus lente que la cinétique de la même réaction s'effectuant en solution, de longues périodes d'incubation sont fréquemment nécessaires.Si l'on considère les multiples étapes de lavage souvent nécessaires, on peut remarquer que des épreuves 30 hétérogènes tendent à prendre du temps et à être laborieuses. Toutefois, elles sont en général plus sensibles que des épreuves homogènes et moins susceptibles d'interférences, attendu que les substances qui interfèrent peuvent être éliminées au cours des étapes de lavage.
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35 Les matières solides utilisées pour immobiliser des corps réactionnels dans des épreuves immunologiques ont consisté en verre d'une certaine porosité et en poly
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mères préformés tels que des polymères polyvinyliques, des polyacrylamides, des polydextranes et un polystyrène.
On connaît dans l'art antérieur de nombreuses • méthodes de séparation qui ont été utilisées dans des 5 épreuves immunologiques hétérogènes. Ces méthodes de sépara tion comprennent la centrifugation, la filtration, la chromatographie par affinité, la chromatographie par perméa tion sur gel, etc.
Les méthodes -homogènes de dosage immunologique 10 de l'art antérieur sont en général susceptibles d'interférences, elles ont une sensibilité limitée et elles ont une plage limitée de dimensions des antigènes. Bien que les épreuves immunologiques hétérogènes de l'art antérieur aient une plus grande sensibilité et soient moins suscep-15 tibles d'interférences, elles tendent à prendre du temps et à être laborieuses. Ces difficultés proviennent en général de l'étape additionnelle de séparation physique et de la nécessité d'effectuer de nombreux lavages pour réduire l'interférence de fond.
20 II existe dans l'art antérieur un besoin d'éta blir une méthode de dosage immunologique qui soit sensible à des concentrations submicromoléculaires d'analyte ; qui ait une cinétique rapide de réaction ; et qui minimise le nombre de manipulations nécessaire pour obtenir un 25 résultat.
L'un des aspects de l'invention réside dans un procédé de préparation de novo de polymères qui contiennent des polypeptides comme partie intégrante de leur structure, à partir de conjugués de composés polymérisables 30 en liaison de covalence avec un polypeptide. Des composés polymérisables comprennent des monomères, des oligomères polyinsaturés ou leurs mélanges en liaison directe de covalence avec le polypeptide ou en liaison indirecte par un composé chimique intermédiaire tenant lieu de "bras 35 d 'espacement".
Un autre aspect de l'invention a trait à l'élimination sélective de substances d'une solution en raison
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de l'aptitude de la substance à se lier à des polypeptides qui font partie du conjugué. Après liaison spécifique, les conjugués sont polymérisés ou copolymérisés pour éliminer de la solution les substances spécifiquement JLiées.
5 Un autre aspect de l'invention a trait à la liaison de composés polymérisables à une matière solide dont la surface est modifiée par les composés polymérisables, en sorte que ces derniers peuvent se copolymériser avec un conjugué composé polymérisable/polypeptide. 10 Un autre aspect de l'invention concerne la liaison de composés initiateurs de polymérisation à une surface solide de manière que la surface agisse comme un initiateur pendant la polymérisation ou la copolyméri-sation du conjugué.
15 La présente invention concerne aussi des méthodes d'analyse immunologique pour détecter la présence d'un analyte dans un échantillon liquide suspecté de contenir ledit analyte, qui consistent à faire entrer ledit échantillon liquide en contact avec un conjugué monomère/corps 20 réactionnel en vue. de former un complexe entre le conjugué monomère/corps réactionnel et 1'analyte et d'engendrer un rapporteur pour ledit complexe de conjugué monomère/corps réactionnel et d'analyte, à séparer le complexe marqué par le rapporteur par déclenchement de la polymérisation 25 du complexe formé entre le conjugué monomère/corps réactionnel et 1'analyte et à détecter l'incorporation du rapporteur audit complexe polymérisé.
Un autre aspect de l'invention a trait à des méthodes d'analyse immunologique permettant de doser simul-30 tanément deux ou plttl^Àlips-deux analytes dans un échantillon liquide^
Un autre aspect de l'invention offre des méthodes d'analyse immunologique utilisant des conjugués monomère/ analyte pour des épreuves immunologiques compétitives. 35 Un autre aspect de l'invention se rapporte
à des conjugués monomère/corps réactionnel et monomère/ analyte destinés à être utilisés dans les épreuves immunologiques de la présente invention.
Une particularité nouvelle de cette épreuve immunologique réside dans l'utilisation d'un corps réactionnel (anticorps ou antigène) qui se trouve en liaison de covalence avec un monomère organique polymérisable. Après 5 mélange et réaction des composants de l'épreuve immunologique, le conjugué monomère/corps réactionnel et son complément de liaison spécifique (c'est-à-dire l'antigène ou l'anticorps formant sa contrepartie appropriée liée à par des interactions spécifiques anticorps/antigène) peut 10 être séparé rapidement et commodément de la solution par déclenchement d'une réaction de polymérisation. En contraste avec le conjugué monomère/corps réactionnel et son complément en liaison spécifiquef d'autres composants de l'épreuve immunologique restent en solution libre. Par conséquent, 15 cette méthode permet la séparation efficace en une seule étape de corps réactionnels spécifiquement liés et libres.
Les épreuves immunologiques de séparation induite par polymérisation de la présente invention offrent plusieurs avantages sur les méthodes d'analyse immunologique 20 homogènes et hétérogènes de l'art antérieur. A cause de la séparation réalisée par polymérisation du conjugué monomère/corps' réactionnel, l'épreuve immunologique de la présente invention peut atteindre la sensibilité propre
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aux techniques hétérogènes de l'art antérieur conjointement 25 avec la facilité d'exécution des techniques homogènes.
Les épreuves immunologiques de la présente invention peuvent normalement être conduites en moins de temps que des épreuves hétérogènes classiques parce que les réactions de liaison qui s'effectueraient normale-30 ment sur une phase solide peuvent, en revanche, avoir lieu en solution. De même, la nécessité d'un lavage poussé de la phase solide peut être éliminée.
Des méthodes immunologiques à double site (ou sandwich) nécessitent normalement une élution du corps 35 réactionel marqué, en liaison spécifique, de la phase solide avant la mesure. Cela ajoute une opération supplémentaire et rend encore plus long et plus Incommode un
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procédé déjà long et pénible.
L'épreuve immunologique de la présente invention peut être conduite sans que le corps réactionnel marqué et lié soit élué du polymère, ce qui simplifie l'exécution.
5 Sur les dessins annexés :
la figure 1A une représentation schématique de la synthèse d'un acide acrylique activé monomère ;
la figure 1B est une représentation schématique d'une conjugaison impliquant ce monomère et, par exemple, 10 des groupes amino portés par un corps réactionnel de la présente invention ;
la figure 2 est un représentation schématique d'un gel de polyacrylamide pour l'analyse au point isoélectrique de la chaîne lourde de l'anticorps réactionnel 15 2H1 avant et après conjugaison avec l'acide acrylique ;
la figure 3 représente l'effet de la concentration du méthacrylate de 2-hydroxyéthyle (HEMA) monomère sur la vitesse de formation de particules insolubles d'homo-polymère de HEMA ;
20 la figure 4 illustre l'incorporation de conjugués monomère/anticorps réactionnel marqué à la fluorescéine à des particules de polymère contenant un corps réactionnel ;
la figure 5 est un graphique illustrant la relation qui existe entre l'intensité de la fluorescence 25 et la concentration de 1'analyte dans une forme de réalisation de la présente invention ; et la figure 6 illustre l'incorporation de conjugués monomère marqué à la fluorescéine/polypeptide à des particules insolubles de polymère contenant un polypeptide. 30 A. Généralités sur la mise en oeuvre de
1'invention
On peut édifier, sur le plan moléculaire, des composés polymériques renfermant des quantités réglées de polypeptide pour des applications particulières, en 35 formant tout d'abord un conjugué d'un composé polymérisable en liaison de. covalence avec un polypeptide, puis en poly-mérisant le conjugué avec lui-même ou en le copolymérisant
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avec des quantités prédéterminées de composés polyinsaturés non transformés, pour produire des polymères renfermant le polypeptide comme partie intégrante. Les conjugués sont préparés par liaison de covalence d'un composé poly-5 mérisable approprié, directement à un polypeptide spécifique ou par liaison indirecte du polypeptide à un composé polymérisable au moyen d'un composé chimique intermédiaire fonctionnant comme bras d'espacement, puis polymérisation du conjugué avec lui-même ou copolymérisation du conjugué 10 avec des quantités prédéterminées de composés insaturés polymérisables et/ou avec un composé polymérisable attaché à une surface solide, pour former des polymères contenant le polypeptide. Ces conjugués peuvent être utilisés pour diverses applications telles que des épreuves immunologiques 15 avec séparation induite par polymérisation.
Aux fins de la présente invention, les termes utilisés ont les définitions suivantes :
Polypeptide - Il s'agit de tout peptide ou polypeptide formé d'amino-acides. Le terme polypeptide 20 couvre des anticorps (monoclonaux ou polyclonaux) naturels ou élaborés par voie génétique, des enzymes, des antigènes, des récepteurs, des haptènes, des lectines, des hormones, des protéines de transport, des protéines de liaison d'anticorps, des antibiotiques polypeptidiques, des médicaments 25 polypeptidiques et des peptides et polypeptides obtenus par synthèse chimique qui peuvent correspondre, du point de vue fonctionnel, à l'une quelconque des catégories énumérées ci-dessus.
Partie intégrante - Le polypeptide est en liai-30 son de covalence avec le polymère à mesure de sa formation au lieu d'être couplé ou lié à un polymère préformé.
Analyte - La substance ou le groupe de substances dont la présence ou la quantité doit être déterminée.
Liquides biologiques - Il s'agit de sang, de 35 sérum sanguin, de plasma sanguin, d'urine, de matières fécales, de liquides céphalorachidiens, de salive, de crachats, d'extraits dérivés de cellules et de tissus,
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etc., que l'on suspecte de contenir 1'analyte.
Corps réactionnels - Substances naturelles ou synthétiques, par exemple antigènes et anticorps, qui sont capables de reconnaissance et de liaison spécifique 5 mutuelle .
Antigène - Molécules qui peuvent elles-mêmes induire des anticorps ainsi que de petites molécules qui ne sont pas capables de provoquer la production d'anticorps à moins qu'elles ne soient couplées à un support (par 10 exemple haptènes).
Epitope - Tout déterminant antigénique.
Monomère - Tout composé organique polymérisable qui est capable de former des liaisons de covalence bout à bout (c'est-à-dire par polymérisation) dans les condi-15 tions appropriées, ce terme couvrant certains oligomères polyinsaturés.
Rapporteur - Toute substance qui est capable de produire un signal détectable seule ou conjointement avec d'autres réactifs, par exemple des radio-isotopes, 20 des fluorophores, dès chromophores, des composés luminescents, etc.
B. Epreuves immunologiques
L'un des aspects de la présente invention est axé sur une application de la technologie des épreuves 25 immunologiques, selon, laquelle les partenaires de liaison du conjugué sont des corps réactionnels antigène et anticorps. La technologie peut être utilisée (1) pour doser un analyte en utilisant un conjugué rapporteur/corps réactionnel convenable ou des analytes, (2) pour doser simulta-30 nément deux ou plusieurs analytes en utilisant le nombre correspondant de conjugués rapporteur/corps réactionnel, chaque rapporteur présentant une différence détectable.
Les méthodes de la présente invention pour le dosage immunologique d'analytes dans des liquides biolo-35 giques utilisent des conjugués de corps réactionnels avec des monomères ou des composés produisant des signaux (conjugués monomère/corps réactionnel ou rapporteur/corps
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réactionnel). Une séparation entre rapporteur/corps réactionnel libre et spécifiquement lié est effectuée par une réaction de polymérisation. La détection du signal incorporé au polymère peut être effectuée par diverses 5 méthodes, telles que la microfluorimétrie en phase mobile et la filtration»
Bien que les commentaires suivants s'adressent principalement au dosage immunologique d'analytes dans des liquides biologiques, il y a lieu de remarquer qu'il 10 existe de nombreuses disciplines qui nécessitent l'analyse d'échantillons liquides pour détecter la présence ou la quantité de substances organiques.
Les épreuves immunologiques de la présente invention peuvent être conduites selon plusieurs configura-15 tions. Il peut s'agir d'épreuves immunologiques à configuration compétitive,, double site et non compétitive. Dans chaque cas, 1'analyte en question peut être un antigène ou un anticorps. Dans chaque cas, l'un ou l'autre des corps réactionnels (c'est-à-dire antigène ou anticorps) 20 peut être conjugué avec une substance marquée (par exemple monomère ou rapporteur). Les diverses configurations possibles selon lesquelles des épreuves immunologiques peuvent être exécutées sont analysées en détail dans Enzyme-Immuno-assay, E. T. Maggio (Ed.) CRC Press, Boca Raton, Floride 25 (1980) et dans de nombreuses autres publications.
Selon une configuration, par exemple, un échantillon suspecté de contenir un analyte est soumis à une incubation avec un conjugué monomère/analyte et un conjugué rapporteur/corps réactionnel. Dans ce cas, le corps réac-30 tionnel est normalement un anticorps contre l'analyte. Si l'analyte est lui-même un anticorps, le corps réactionnel peut être un second anticorps contre le premier et il peut être l'antigène relatif au premier anticorps. L'analyte présent dans l'échantillon et le conjugué monomère/ 35 analyte se disputent une quantité limitée de rapporteur/
corps réactionnel. La séparation induite par polymérisation entre la formé libre et la forme spécifique liée du rapporteur/corps réactionnel permet la détection et la mesure
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de l'analyte initialement présent dans l'échantillon. Cette configuration est dite compétitive.
Dans la configuration compétitive, les épreuves immunologiques de la présente invention peuvent être uti-5 lisées pour doser des composés mono-épitopiques (haptènes) et des composés multi-épitopiques. Le terme multi-épitopique couvre à la fois des composés ayant plus d'un épitope particulier et des composés ayant un seul épitope répété. La sensibilité maximale est généralement atteinte lorsque 10 le corps réactionnel est monovalent par rapport à l'analyte.
Dans une autre configuration, les épreuves immunologiques de la présente invention peuvent être conduites comme épreuve double site (sandwich). Cette configuration ne convient que pour des analytes multi-épitopiques. 15 Dans la configuration directe double site, on fait incuber un excès de conjugué monomère/corps réactionnel avec un échantillon suspecté de contenir un analyte. Dans ce cas, le corps réactionnel est normalement un anticorps contre l'analyte. Si l'analyte est lui-même un anticorps, le 20 corps réactionnel du conjugué rapporteur/corps réactionnel peut être un second anticorps contre le premier ou un antigène relatif au premier anticorps. L'incubation est conduite dans des conditions desquelles on attend une liaison spécifique. Après la polymérisation du conjugué 25 monomère/corps réactionnel, un excès de ce conjugué est ajouté au mélange soumis à l'épreuve immunologique. Par exemple, le corps réactionnel est un anticorps qui se fixe à un épitope différent de celui auquel est lié le conjugué monomère/corps réactionnel. Là encore, si l'analyte 30 est lui-même un anticorps, le corps réactionnel du conjugué rapporteur/corps réactionnel peut être un anticorps contre le premier anticorps ou un antigène relatif au premier anticorps. Après une incubation appropriée pour permettre à une liaison spécifique de se produire, la présence ou 35 la quantité de conjugué rapporteur/corps réactionnel spécifiquement lié au polymère est déterminée. Les particules de polymère peuvent être lavées, le cas échéant, pour
éliminer tout conjugué rapporteur/corps réactionnel libre. Toutefois, en général, on considère qu'il est suffisant de diluer simplement le mélange réactionnel d'un facteur 2 à 100 avant de mesurer la quantité de rapporteur associée 5 à la particule de polymère. De même, le cas échéant,les particules de polymère peuvent être séparées de la solution et le rapporteur qui y est associé peut être élué avant la détection ou le dosage.
L'ordre d'addition des réactifs peut aussi 10 être inversé, c'est-à-dire que l'échantillon suspecté de contenir un analyte peut être soumis à l'incubation avec le conjugué rapporteur/corps réactionnel avant l'addition du conjugué monomère/corps réactionnel. Cette configuration est appelée épreuve immunologique double site inverse. 15 De même, l'échantillon, le conjugué rapporteur/corps réactionnel et le conjugué monomère/corps réactionnel peuvent être soumis en même temps à l'incubation plutôt que d'y être soumis successivement , auquel cas l'épreuve immunologique est appelée épreuve immunologique double site simul-20 tanée. Parmi les trois configurations double site possibles, l'épreuve immunologique double site simultanée est celle que l'on préfère parce qu'elle nécessite le plus petit nombre de manipulations. Toutefois, ces trois configurations offrent des avantages importants par rapport aux épreuves 25 immunologiques double site de l'art antérieur en ce que les durées d'incubation sont raccourcies et les opérations de lavage sont éliminées.
Dans une autre configuration, les épreuves immunologiques de la présente invention peuvent être con-30 duites par incubation dé l'échantillon prélevé sur un patient suspecté de contenir un analyte avec un conjugué monomère/corps réactionnel (le corps réactionnel étant un anticorps contre l'analyte) dans des conditions dans lesquelles on s'attend à ce qu'il y ait une liaison spéci-35 fique- Le conjugué rapporteur/corps réactionnel peut être ajouté successivement ou simultanément, mais dans ce cas, le corps réactionnel est un anticorps contre le complexe
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formé entre le conjugué monomère/corps réactionnel et l'analyte plutôt que contre l'analyte. Après séparation, induite par polymérisation, du conjugué rapporteur/corps réactionnel libre de son homologue lié spécifiquement^ 5 la présence ou la quantité de conjugué rapporteur/corps réactionnel spécifiquement lié aux particules de polymère est déterminée. Dans cette configuration, le premier corps réactionnel (anti-analyte) peut être conjugué au monomère ou au rapporteur. De même, le second corps réactionnel 10 (contre le complexe formé entre le premier corps réactionnel et l'analyte) peut être conjugué au monomère ou au rapporteur, selon celui des deux qui n'est pas conjugué au premier corps réactionnel. Cette configuration, qui est dite non compétitive, offre l'avantage que les deux corps réac-15 tionnels peuvent être utilisés en excès. Par conséquent, la sensibilité de l'épreuve immunologique n'est pas strictement limitée par les constantes d'affinité des corps réactionnels. Cette configuration est égale^^Ép»- appropriée aux analytes mono-épitopiques et aux analytes multi-épito-20 piques.
Lorsqu'il est intéressant de détecter la présence de deux ou plus de deux analytes simultanément dans un même échantillon, on peut utiliser des conjugués multiples rapporteur/corps réactionnel dans l'une quelconque des 25 configurations ci-dessus, chaque rapporteur produisant un signal qui présente une différence détectable par rapport à chaque autre rapporteur. Par exemple, la présence de deux virus dans un seul et même échantillon, par exemple le virus associé à la lymphadénopathie (LAV) et le virus 30 de l'hépatite B, peut être détectée en utilisant des anticorps contre chacun des virus, l'un conjugué avec la fluo-rescéine et l'autre avec une phycobiliprotéine. Le dosage simultané de deux ou plus de deux analytes dans le même échantillon pourrait aussi présenter un intérêt dans le 35 contrôle thérapeutique de médicaments, lorsque des médicaments sont co-administrés, et dans le contrôle de protéines sériques, telles que les immunoglobulines, et des hormones,
15
par exemple dans l'exploration de la fonction thyroïdienne.
Les épreuves immunologiques de la présente invention utilisent un conjugué monomère/corps réactionnel. Normalement, le corps réactionnel est un anticorps ou 5 un antigène. Toutefois, d'autres corps réactionnels sont connus dans l'art antérieur, par exemple des lectines, des récepteurs, des protéines de transport et la protéine staphylococcique A. Lorsque le corps réactionnel est un anticorps, on peut utiliser des anticorps monoclonaux 10 ou polyclonaux. Avant la conjugaison, l'anticorps est en général au moins partiellement purifié par des opérations connues dans l'art antérieur.
G- Composés polymérisables
Des composés polymérisables utiles pour la 15 formation des conjugués de la présente invention comprennent des monomères polymérisables, des composés insaturés polymérisables et des oligomères.
Des monomères polymérisables consistent normalement en un composé à insaturation éthylénique ou acétyléni-20 que contenant au moins une fonctionnalité permettant le couplage à un polypeptide ou à un corps réactionnel. Les fonctionnalités présentées par le corps réactionnel peuvent comprendre, par exemple, des fonctionnalités "susceptibles de liaison par covalence telles qu'hydroxyle, amino, car-25 boxyle ou sulfhydryle. Des monomères à insaturation oléfini-que peuvent être choisis entre des composés qui répondent à la formule générale :
\
R4 ^ Ri
30
c=c r3 r2
dans laquelle R,j représente H ou un radical alkyle inférieur ayant 1 à 8 atomes de carbone et R2 peut être :
16
10
15
20
-H
-coc1 -cooh
-CO2(CH2)n OH
-CH2NH2
-ch2ci
-co2c2h4nhr (R = H -CO2CH2-ch - ch2 \ /
0
-c02ch2-ch0hch20h -cho
-^Ô^-CH2C1 -CO2(CH2)nNCO (n = 1-8)
NCO
25
Rg et R^, représentent le plus souvent H ; toutefois, ils peuvent être choisis de manière à apporter un groupe insaturé, par exemple tout monomère allylique :
ch2 = ch-ch2-
un monomère du type vinylène :
-ch - ch-
on
J ou un monomère diénique :
n \ \ /
^c-c^c^
A titre de variante, R2 et R^ peuvent être asso-35 ciés par exemple en -c0-0-c0- pour former
1 7
R4 r1
\ /
c=c
5 I I
oc co \/
0
On peut aussi utiliser des monomères à insatura-10 tion acétylénique portant un groupe apte à réagir :
-cs c-<
De plus, on peut utiliser des molécules, des oligomères ou des polymères polyinsaturés (en général avec une insaturation définie) portant des groupes aptes 15 à réagir. Pour des exemples représentatifs, on renvoie à A. S. Hoffman, "Electron Curing of Coatings", Isotopes and Radiation Technology, 9^:1, pages 78-92 (1971 ).
Des composés polyinsaturés polymérisables qui peuvent être utilisés comprennent des monomères, des oligo-20 mères et des polymères contenant deux ou plus de deux groupes oléfiniques ou acétyléniques et au moins un site apte à réagir pour le couplage avec un polypeptide, ou avec un composé chimique intermédiaire d'"espacement". Ces composés polyinsaturés polymérisables sont désignés 25 par le terme collectif de monomères aux fins de la présente invention, bien qu'ils comprennent certains oligomères ou polymères. Des oligomères ou polymères du type que l'on peut utiliser comprennent :
Des molécules à insaturation latérale et à 30 groupes réactifs latéraux et terminaux ;
35
nale et à
Des molécules à insaturation latérale et termi-groupes latéraux réactifs ;
1 8
Des molécules portant à la fois des groupes réactifs et insaturés latéraux ;
10
Des molécules portant des groupes insaturés 15 latéraux et des groupes terminaux réactifs ;
20
Des molécules portant des groupes insaturés latéraux, un groupe terminal insaturé et un groupe terminal réactif ;
25
Des molécules à insaturation dans la chaîne 30 principale et à groupes terminaux réactifs ;
35
Des molécules à insaturation dans la chaîne principale et portant un groupe terminal réactif ;
1 9
5
et
Des molécules portant un groupe terminal insaturé et un groupe terminal réactif ;
10
qù «—o" désigne un groupe polaire réactif et " = " indique 15 une insaturation.
Des monomères particuliers que l'on peut utiliser comprennent l'acide acrylique, l'acide méthacrylique, le chlorure d'acryloyle, le chlorure de méthacryloyle, l'acrylate ou le méthacrylate de glycidyle, l'acrylate 20 ou le méthacrylate de glycérol, 1'allylamine, le chlorure d'allyle, des acrylates d'hydroxyalkyle inférieur (par exemple le méthacrylate de 2-hydroxyéthyle [HEMA] ou méthacrylate de 3-hydroxypropyle), des acrylates amino-alkyliques inférieurs (par exemple méthacrylate de 2-amino-éthyle) 25 et le benzoate de vinyle.
Des monomères appréciés sont ceux qui se dissolvent dans l'eau et/ou dans des mélanges d'eau et d'un solvant organique polaire.
Le couplage par covalence du composé polyméri-30 sable au corps réactionnel ou au glucide qui y est attaché (dans le cas de corps réactionnels 'glycoprotéiniques) peut être effectué par l'un quelconque de divers procédés chimiques connus. Par exemple, le composé polymérisable et/ou le corps réactionnel peuvent être activés pour pro-35 duire un composé intermédiaire stable, mais chimiquement réactif qui peut être amené à réagir ensuite. Le corps réactionnel peut aussi être activé par oxydation au perio-
20
date des glucides liés si le corps réactionnel est une glycoprotéine. Cette réaction forme des aldéhydes qui peuvent ensuite être condensés avec des groupes amino du composé polymérisable tels que le méthacrylate de 2-5 amino-éthyle, pour former une base de Schiff. Cette base de Schiff peut être réduite avec le cyanoborohydrure de sodium pour former une liaison stable de covalence. Le composé polymérisable peut se présenter sous la forme d'un halogénure d'acide monomère ou peut aussi être amené 10 directement à réagir avec le corps réactionnel en présence d'un accepteur d'acide pour éliminer l'acide au fur et à mesure qu'il se forme au cours de la réaction. En outre, on peut utiliser des réactifs bifonctionnels ou hétérobi-fonctionnels. Ces réactifs bifonctionnels ou hétérobifonc-15 tionnels sont connus. Dans presque tous les cas, les conditions réactionnelles, c'est-à-dire le temps, la température, le solvant et le pH doivent être choisis de manière à éviter une dénaturation et/ou une dégradation du corps réactionnel.
20 Un autre aspect de l'invention réside dans la liaison chimique du monomère avec des composés chimiques intermédiaires qui jouent le rôle d'un bras d'espacement, le corps réactionnel ou le polypeptide étant également lié au composé chimique intermédiaire. Le composé formant 25 le bras d'espacement doit présenter des sites réactifs, par exemple des fonctionnalités susceptibles de liaison par covalence, telles que des groupes hydroxyle, amino, carboxyle ou sulfhydryle. Des exemples de ces composés comprennent l'acide e-aminocaproique, le 1,4-diaminobutane, 30 le 1,6-diaminohexane, le 1,4-butanediol et l'acide p-aminobenzoxque. Des avantages possibles de l'utilisation de composés d'espacement sont une plus grande incorporation du conjugué au polymère et une meilleure réactivité de la portion corps réactionnel du conjugué avec son partenaire 35 de liaison spécifique. On considère que ces deux effets sont dus à la meilleure accessibilité du conjugué et/ou des groupes oléfiniques ou acétyléniques du monomère à
la solution globale»
Aux fins de l'analyse immunologique, un seul type de monomère est en général conjugué à un corps réactionnel ou un analyte"' choisi. Toutefois, il y a lieu de remarquer qu'un mélange de monomères copolymérisables peut être conjugué au .corps réactionnel ou à l'analyte qui sont ensuite séparés par polymérisation.
L'homopolymérisation du conjugué avec lui-même ou la copolymérisation avec des monomères non transformés est déclenchée par la génération de radicaux libres. Des monomères non transformés qui peuvent être utilisés comprennent, par exemple, des monomères à insaturation éthylénique et/ou acétylénique, comme indiqué ci-dessus, des acrylates ou des méthacrylates d'alkyle dont le radical alkyle contient 1 à 8 atomes de carbone, 11acrylonitrile, l'acétate de vinyle et le benzoate de vinyle. De même, des composés de réticulation peuvent être copolymérisés avec le conjugué. Ces composés de réticulation peuvent comprendre, par exemple, le N,N'-méthylènebisacrylamide ou un di-, tri- ou tétra-méthacrylate ou acrylate. Le pourcentage de monomère transformé et non transformé peut aller depuis des traces jusqu'à 100 %, mais la plage préconisée va de 0,001 à 100 % de monomère transformé et de 0 à 99,999 % de monomère non transformé.
Le conjugué monomère/corps réactionnel, au lieu d'être copolymérisé seulement avec des composés polymérisables non transformés, peut aussi être amené à réagir avec des matières solides dont la surface a été modifiée chimiquement pour la rendre apte à réagir avec des groupes latéraux liés à un composé polymérisable. Ces surfaces solides peuvent revêtir la forme de perles microscopiques, de membranes, de fibres, de matières solides poreuses, etc. Aux fins de l'analyse immunologique, par exemple, un composé polymérisable est lié à une surface solide. On fait incuber le monomère/corps réactionnel avec un analyte et un rapporteur prévu pour le marquage du complexe formé entre le conjugué monomère/corps réactionnel et
22
l'analyte. Pendant la copolymérisation du conjugué et du composé polymérisable lié à la surface solide, la concen tration du rapporteur à la surface de la matière solide est favorisée, et il en résulte une épreuve plus rapide 5 et plus sensible. La surface solide peut être un poly-saccharide, un polymère hydrocarboné, un polymère fluoro-carboné, un polyamide, un polyuréthanne, un polyester un polymère vinylique, un polymère cellulosique ou un dérivé d'un polymère cellulosique, du verre, un polymère 10 siliconé.
Il existe de nombreux procédés par lesquels un composé polymérisable peut être lié à une surface poly-mérique solide.
(a) Des surfaces polymériques solides contenant 15 des groupes aromatiques, telles qu'un polystyrène ou un téréphtalate de polyéthylène, peuvent être traitées de manière à les rendre réactives avec des groupes latéraux portés par un monomère. Par exemple, on peut faire réagir des microperles de polystyrène avec l'acide chlorosulfoni-20 que pour obtenir les chlorures de sulfonyle aromatiques correspondants que l'on peut ensuite faire réagir avec un groupe amide latéral lié à un monomère vinylique ou avec une alkyldiamine pour obtenir un composé correspondant portant des groupes amino primaires latéraux qui peuvent 25 réagir avec des groupes latéraux liés à un monomère vinylique ayant un conjugué d'acide carboxylique latéral avec le N-hydroxysuccinimide ou un chlorure d'acide latéral.
23
10
15
20
25
30
/ / / / / / /
A / / / /
O
A / J
S02C1
H ou R
/
ch2=c
/
H ou Rl
5=0
C=0
A / / / / / / / /
ou R
ch2=c
\
so2nh
R
I
NH
l
0=0
I
c-h ou R
w ch2
Sur ce schéma, r et r ayant 1 à 8 atomes de carbone.
c-cl il
O
A
/
1
/ /: / / / / /
sont so2nh
■(o}
r
I
nh
I
c=0
c-h ii ch2
des radicaux alkyle
24
(b) Des surfaces de verre ou des surfaces siliconées de matières solides et de polymères siliconés sous toute forme désirée, c'est-à-dire sous la forme d'une perle microscopique,1 d'une fibre, etc., peuvent être traitées chimiquement pour créer des surfaces aptes à réagir avec des groupes latéraux liés à des composés polymérisables, par exemple :
25
/ / / / / /
/
Verre
(CH3-0)3-Si-C3H7NH2
\ Si-OH >
/ (CH3-0)3-Si-CK=GH2
/-
/ /■
/ / /
-Si-0-Si-C3H7NH2 (3) Si-0-Si-CH=CH2 (4)
/ / / / / / / / / /
/
Surface siliconée ou polymère siliconé
(CH3-O3 SI-C3H7NH2 /
/ > /
Si-CH3 /
I /
- 0 (CH2-0)3 Si-CH=CH2 / > /
/
-Si-CH2-0-Si-C3H7NH2 (5)
-Si-CH2-0-Si-CH=CH2 (6)
Faire réagir (3) ou (5) ci-dessus avec :
H ou R
I
cho» c l
c=o
I
0
1
0
a
I
ou 0112=0
I
H ou R
0=0
I
Cl
H ou R ■Si-0-Si-C3H7NHC0-C=Ca2 ou
A /-/
/
H ou R
y\ • I
/—Si-CH2-0-Si-C3H7NHC0-C=GH2 /
26
(c) Des surfaces polymériques solides peuvent être traitées avec des radiations ionisantes en présence de monomères pour former une surface portant des groupes latéraux réactifs tels qu'hydroxyle, carboxyle, amino ou époxy, là où le groupe latéral peut être utilisé pour une liaison ultérieure avec un groupe latéral réactif d'un monomère vinylique, par exemple :
27
/
/
(1> / / /
-OH
ou
/ /
(2) / / /
—nh2
ou
A /
(3) /
A /
\ / o ou
A / /
(4) /
À
-cooh ch2=c
/
H ou R
\
■ COCl
H ou R
—CH-CH2 + CH2=C
/
i
\
/
CO
I
O
ch2*C
\
Hou R
. h ou' r
(2î ci-dessus + ch2=c
CO
I
O
h ou r
(4) ci-desVus + cho-c
\
ch2
/CH
->
H ou R
/
/■ - ^
/ /■
/ /
/
-OCOC=CH2
H ou R /
■NHCOC=CH2
h ou r /
—ch-ch2-ococ=ch2 oh
A / /
.\ / / / /
h ou r
/
—nhcoc-ch2
A . /
/
\ / 7 / /
oh
I
•cooch2ch—ch2 r ou h-c
\CH2
ch2
28
(d) Au lieu de créer des sites réactifs sur une surface polymérique, on peut créer des sites d'amorçage pour une polymérisation par radicaux libres au moyen d'agents oxydants, par divers procédés connus, à savoir :
5 1. Création de sites d'hydroperoxyde et/ou de peroxyde à la surface d'une matière solide par : (a)
réaction de la surface avec l'air ou l'oxygène en présence de radiations ionisantes partant d'une source radio-active 6 0
telle que Co ou de rayons ultraviolets ; (b) exposition 10 de la surface à la décharge d'un plasma en présence d'oxygène ; ou (c) traitement thermique de la surface en présence d'air, d'oxygène ou d'ozone. La surface modifiée résultante est ensuite soumise à la chaleur et/ou à un agent réducteur pour former des sites actifs d'amorçage 15 à la surface du polymère solide, qui réagissent ensuite avec des conjugués monomère vinylique/corps réactionnel et d'autres composés polymérisables.
2. Création de sites photosensibles d'amorçage sur les matières solides ou des surfaces polymériques 20 ou protéiniques par : (a) réaction de surfaces solides portant des groupes réactifs latéraux tels que les groupes amino, hydroxyle, sulfhydryle ou époxy pour former une surface que l'on peut faire réagir avec un conjugué monomère/ corps réactionnel, par exemple :
j
29
A /■ / /
•nh2
o 0
1/ tt + Cl-C-A-C-Gl ou
/ /-
/ /
Û o n »«
•nhc-a-c-cl
/ / / /
—SH
Ô O « li + C1-C-A-C-0H
ou
/ / / /
o o tt il —s-c-a-c-oh
A /■ / /
o ô u it
-CH-CH2 + Cl-C-A-C-OR
V/
o û
Il 11
—ch-ch2-o-c-a-c-
I
oh
Où A =
• chj cl-
1 i
C-N-C-C-
cm cV
r
NH2
et x = 1
/j—UH-R £)4-
fr-SB ♦ (Ô)--
/U-ch-ch2
A V
/j—S-R <Ç O )~c
/}—CH-CH2-0-1R
A i
OH
O c=o
30
3. Formation de copolymères greffés par radiations en utilisant un monomère renfermant un photosensibilisateur,, par exemple h ou r
/
ch2 = c 0
Aux fins d'analyses immunologiques, un conjugué monomère/corps réactionnel et un conjugué rapporteur/corps réactionnel sont nécessaires. Le rapporteur peut être choisi parmi ceux qui sont connus dans l'art antérieur, comprenant des enzymes, des fluorophores, des radio-isotopes, des matières chimioluminescentes, des particules colorantes, etc. Toutefois, en général, on donne la préférence à des fluorophores. Certains fluorophores convenables comprennent la fluorescéine, la rhodamine, la phycoérythrine et le bleu Nil.
En général, on utilise une seule espèce de rapporteur dans la présente invention. Toutefois, il y a lieu de remarquer qu'on peut prévoir un mélange de conjugués rapporteur/corps réactionnel dans lequel chaque espèce réactionnelle choisie est conjuguée avec un rapporteur distinct. En utilisant un mélange analogue de conjugués monomère/corps réactionnel dans lesquels chaque espèce monomérique choisie a une réactivité différente, on peut analyser un échantillon pour doser plusieurs analytes simultanément, comme décrit avec de plus amples détails dans ce qui suit. Des procédés de couplage du rapporteur au corps réactionnel ou à l'analyte sont bien connus dans l'art antérieur. En général, on donne la préférence au couplage par covalence, bien que d'autres moyens de liaison soient possibles. Les sites réactifs qui peuvent être i
utilisés pour la liaison sont les mêmes que ceux qui ont été commentés ci-dessus. En général , il est avantageux
31
de marquer le corps réactionnel avec un rapporteur aussi densément que possible sans perte d'activité de liaison.
Pour séparer les corps réactionnels spécifiquement liés des corps réactionnels libres, on procède par 5 polymérisation du conjugué. Une polymérisation ou copolymé-risation avec un monomère non modifié est en général conduite à une température de l'ordre de la température ambiante, sous agitation ou non. Un agent tensio-actif (par exemple un détergent) peut ou non être présent. Bien 10 que la réaction puisse être conduite en présence d'oxygène, il est en général préférable de la conduire en l'absence d'oxygène ou en présence d'une quantité réglée d'oxygène. La plage de pH peut varier largement de 3 à 10, bien qu'il soit préférable de choisir un pH pour lequel le corps 15 réactionnel reste le plus stable, pH qui se situe normalement entre 6 et 8. Si l'on utilise un agent tensio-actif, on peut le choisir parmi des composés convenables tels que le dodécylsulfate de sodium, le stéarate de sodium ou des matières non ioniques telles qu'un polyéthylène-20 oxyde ou l'éther de lauryle.
Les radicaux libres peuvent être engendrés par amorçage par oxydoréduction, amorçage photochimique,
l radiations ionisantes ou amorçage thermique. Un avantage de l'amorçage par oxydoréduction et de l'amorçage photo-25 chimique est la production de radicaux libres à des vitesses raisonnables, â des températures relativement basses telles que la température ambiante ou la température du corps (22-37°C). Des exemples d'initiateurs d'oxydation-réduction que l'on peut utiliser comprennent (1) des peroxydes en 30 association avec un agent réducteur, par exemple le peroxyde d'hydrogène en association avec l'ion ferreux, ou le peroxyde de benzoyle avec une N,N-dialkylaniline ou la toluidine, et (2) des persulfates en association avec . un agent réducteur, par exemple la N,N,N",N'-tétra-éthyl-35 méthylènediamine (TEMED), le métabisulfite de sodium ou le thiosulfate de sodium. En particulier, on peut utiliser le persulfate d'ammonium, le peroxyde de benzoyle, le
32
peroxyde de lauroyle, 11 hydroperoxyde de tertio-butyle, le perbenzoate de tertio-butyle, 1'hydroperoxyde de cumène ou leurs mélanges avec des agents réducteurs tels que le bisulfate de sodium ou le thiosulfate de sodium. Il 5 apparaît également que le bisulfite de sodium seul peut être utilisé pour la polymérisation.
Une polymérisation photo-initiée peut aussi être utilisée en choisissant des photo-initiateurs tels que 1'azodiisobutyronitrile, 1 ' azodiisobutyramide, l'éther 10 méthylique de la benzoine, la riboflavine, des colorants thiaziniques tels que le bleu de méthylène et l'éosine et des métaux de transition tels que le chlorure ferrique ou l'azoture de diazidotétrammine-cobalt (III) en association avec une irradiation, par la lumière ultraviolette 15 et/ou par la lumière visible,du système réactionnel.
On peut aussi utiliser des radiations ionisantes provenant d'une source radio-active ou d'un accélérateur de particules.
La polymérisation peut être conduite en présence 20 de diverses matières physiologiques que l'on rencontre couramment dans des liquides biologiques.
Des monomères non transformés et des composés initiateurs de polymérisation peuvent être présents dans le mélange réactionnel pendant toute la durée de l'épreuve 25 immunologique, ou bien on peut les ajouter à tout moment approprié. La mesure de la quantité de rapporteur spécifiquement lié au polymère peut être effectuée selon l'une quelconque de diverses méthodes, en fonction du type de signal émis par le rapporteur. Dans une forme de réalisa-30 tion, le rapporteur est un fluorophore et la fluorescence associée aux particules de polymère est détectée ou mesurée par cytométrie en mouvement et microfluorimétrie en mouvement. Dans une autre forme de réalisation, la fluorescence associée à des particules de polymère est mesurée après 35 filtration des particules.
Les exemples suivants sont donnés à des fins d'illustration, et n'impliquent nulle limitation de la présente invention.
c
33
Partie expérimentale
Les exemples présentés ici utilisent un monomère représentatif, à savoir le méthacrylate de 2-hydroxyéthyle [HEMA], deux anticorps et un antigène (IgM humaine) à 5 détecter. Le premier anticorps est un anticorps monoclonal de souris appelé 2H1, .qui réagit avec la chaîne légère kappa de l'IgM humaine et qui est conjugué avec un monomère. Le second anticorps est un anticorps monoclonal de souris appelé 2C3, qui réagit - avec la chaîne lourde u de l'IgM 10 humaine et qui n'interfère pas avec la liaison du premier anticorps à l'IgM humaine. Le second anticorps est marqué avec un marqueur fluorescent. En bref, ces exemples utilisent une épreuve immunologique à configuration double site simultanée dans laquelle la présence de l'analyte 15 à détecter intervient en provoquant l'incorporation de conjugué rapporteur/corps réactionnel (anticorps 2C3 marqué à la fluorescéine) au polymère formé. La quantité de conjugué rapporteur/corps réactionnel spécifiquement lié au polymère, c'est-à-dire à l'intensité de fluorescence, 20 est proportionnelle à la quantité d'analyte qui se trouve dans l'échantillon. Selon un mode opératoire représentatif, on fait incuber les deux conjugués de corps réactionnels conjointement avec l'échantillon suspecté de contenir l'analyte pour former un complexe ternaire. On ajoute 25 ensuite un monomère non transformé (libre) et le déclenchement ultérieur de la polymérisation entraîne la copolyméri-sation du monomère non transformé avec le conjugué monomère/ corps réactionnel présent dans le complexe ternaire avec formation d'un polymère fluorescent. En l'absence d'analyte, 30 le conjugué rapporteur/corps réactionnel ne forme pas de complexe ternaire et les particules de polymère ne sont pas notablement fluorescentes.
L'exemple I explique (a) l'activation d'un monomère acrylique pour permettre sa conjugaison avec 35 le premier corps réactionnel, (b) la conjugaison du monomère acrylique avec le premier corps réactionnel, y compris la démonstration du succès de la conjugaison, (c) la démons
34
tration du fait que le conjugué monomère/corps réactionnel a gardé son aptitude à se lier à l'analyte et (d) la conjugaison du second corps réactionnel avec le rapporteur, en l'occurrence 1'isothiocyanate de fluorescéine. L'exemple 5 II démontre la polymérisation du monomère HEMA dans une solution tamponnée de sel. Pour assurer, dans ce processus de polymérisation, la non-interférence de la part de composés communément rencontrés dans des échantillons biologiques ou ajoutés à ces échantillons, on a également conduit 10 cette réaction en présence d'un échantillon de sérum et en présence d'un détergent non ionique. L'exemple III illustre l'incorporation, par l'intermédiaire d'un analyte, de fluorescence aux particules insolubles de polymère. On est parvenu à ce résultat en faisant tout d'abord incuber 15 des échantillons du conjugué monomère/corps réactionnel et du conjugué rapporteur/corps réactionnel avec l'analyte ou bien avec une solution tampon témoin. Après la polymérisation ultérieure, les particules ont été analysées au cytomètre à écoulement et on a trouvé que l'échantillon 20 positif d'analyte contenait des particules hautement fluorés centes, tandis que les particules contenues dans la solution témoin ne présentaient que la fluorescence de fond. De même, on a trouvé que le degré auquel s'effectuait cette incorporation de fluorescence aux particules dépendait 25 directement de la quantité d'analyte présent, constituant la base d'un système d'analyse immunologique quantitatif. L'exemple IV illustre la copolymérisation du conjugué monomère/MAb (Mab/M) avec une quantité additionnelle de monomère HEMA non transformé, entraînant la formation 30 de particules synthétiques de polymère contenant comme partie intégrante du Mab dans leur structure. Aux fins de la démonstration, le conjugué MAb/M a été tout d'abord marqué par un corps fluorescent, en l'occurrence 1'isothiocyanate de fluorescéine. Les particules de polymère conte-35 nant ces molécules de MAb/M marquées par la fluorescéine ont ensuite été examinées au microscope à fluorescence. En outre, la fluorescence des particules individuelles
35
de polymère a été déterminée quantitativement par analyse de l'écoulement, en utilisant un cytomètre à écoulement.
L'exemple V illustre la synthèse d'un ester de N-hydroxysuccinimide de l'acide vinylbenzoxque monomère 5 et sa conjugaison à un anticorps réactionnel. Le conjugué monomère/anticorps résultant est utilisé avec un conjugué fluorescéine-anticorps (ce dernier anticorps étant dirigé contre un second site épitopique non compétitif) dans une analyse immuno logiqïie double site dans laquelle les 10 particules de polymère formées par copolymérisation du conjugué monomère/anticorps avec le monomère libre sont séparées de la solution globale par filtration à travers un filtre d'acétate de cellulose à pores de 0,45 jim, lavées, et le signal associé à ces particules est lu sur le filtre 15 au moyen d'un fluorimètre à surface frontale.
L'exemple VI illustre une analyse immunologique simultanée en deux couleurs pour IgG et IgM. On utilise le mime conjugué monomère/anticorps que dans l'exemple V avec deux conjugués rapporteur/corps réactionnel, l'un 20 spécifique de l'IgG et en conjugaison avec la phycoérythrine et l'autre spécifique de l'IgM et en conjugaison avec la fluorescéine. La mesure de la fluorescence rouge et de la fluorescence verte associées aux particules est effectuée sur un microfluorimètre à écoulement.
25 Exemple 1
A : Synthèse d'un monomère d'acide acrylique activé destiné à la conjugaison avec un corps réactionnel
On a fait refluer sous agitation énergique pendant 3 heures en atmosphère anhydre un mélange contenant 30 du N-hydroxysuccinimide (NHS) (4,6 g, .40 mmoles) et du chlorure d'acryloyle (18 ml, 220 mmoles) et on a évaporé le mélange réactionnel, sous la forme d'une solution homogène, jusqu'à l'obtention d'un sirop. On a ajouté de l'eau distillée (50 ml) au sirop et on a agité le mélange pendant 35 30 minutes à 4°C. Après addition de chloroforme (50 ml), le mélange a été divisé en deux phases et la phase organique a été extraite successivement avec de l'eau (en général
36
5 fois, avec 50 ml d'eau à chaque fois) jusqu'à ce que le pH de la phase aqueuse soit approximativement égal à 5. Les solutions aqueuses ainsi obtenues ont été rassemblées et extraites une fois au chloroforme (50 ml) ; cette 5 solution chloroformique et la solution chloroformique venant de l'opération ci-dessus ont été rassemblées, déshydratées sur du sulfate de sodium et évaporées en donnant un sirop. Des cristaux, obtenus en conservant le sirop pendant la nuit à —20°C, ont été triturés avec de l'éther 10 de diéthyle et récoltés par filtration.
Une recristallisation dans de l'éthanol absolu a donné 2,0 g 'du produit désiré. Ce composé a été analysé par spectrométrie de masse, spectroscopie infrarouge, RM, chromatographie en phase liquide et détermination du point de fusion et il a été identifié comme étant l'ester 15 de N-hydroxysuccinimide de l'acide acrylique (figure 1a). B : Préparation d'un conjugué monomère/corps réactionnel
On a fait réagir l'ester de N-hydroxysuccinimide de l'acide acrylique (NSA) avec un anticorps monoclonal de souris (MAb) 2H1 de la façon suivante : on a ajouté 20 2,2 mg de MAb dans un tampon au carbonate de sodium 0,2 9M à pH 9,3 à 20 microgrammes de NSA dans un volume total de 0,5 ml. On a fait incuber le mélange réactionnel à 37°C pendant 1 heure en l'agitant constamment. On a ensuite prélevé 100 microlitres de cette solution en vue d'une 25 analyse par chromatographie en phase liquide à haute performance à phase inversée (CLHP-PI) qui a révélé la quantité d'acide acrylique libre (provenant de l'hydrolyse non spécifique de NSA) et la quantité restante de NSA dans le mélange réactionnel (tableau 1) (figure 1b).
<q
37
TABLEAU 1
Résultats de l'analyse CLHP du mélange réactionnel de conjugaison au monomère
Anticorps NSA (monomère Acide 5 activé) acrylique
Qua nt i té a j ou t é e ,
nanomoles 14 j 5 116,0 0,0
Quantité détectée non déter-
en solution, rainée 0,0 26,7
10 nanomoles
Cela a indiqué qu'une quantité nette de 89 nanomoles de monomère s'était liée aux 14,5 nanomoles de MAb, soit un rapport de 6,2 molécules de monomère par MAb.
15 Pour éliminer le NSA résiduel et ses produits d'hydrolyse et pour caractériser davantage l'anticorps transformé, on a chromatographié 200 microlitres du mélange réactionnel sur une colonne de Sephadex G-25 (perles de dextrane réticulées avec de 1'épichlorhydrine, de la 20 firme Pharmacia Fine Chemicals AB d'Uppsala, Suède) dans le même tampon de carbonate auquel avait été ajoutée de la sérum-albumine de boeuf en quantité de 0,1 mg/ml pour empêcher une adsorption non spécifique de polypeptides sur le Sephadex G-2 5.
25 Un échantillon du conjugué monomère/corps réac tionnel a ensuite été analysé par concentration iso-électri-que. Dans cette analyse, les sous-unités polypeptidiques des protéines ont été séparées conformément à leur point iso-électrique, c'est-à-dire le pH auquel elles n'avaient 30 pas de charge positive ou négative nette. A cette fin, les chaînes lourdes et les chaînes légères du conjugué monomère/corps réactionnel ont tout d'abord dissociées en présence de 3 % (en poids/volume) de dodécylsulfate de sodium (SDS) et 5 % (en volume/volume) de 2-mercapto-35 éthanol et elles ont été séparées sur la base du poids moléculaire par électrophorèse sur plaque de gel de poly-acrylamide contenant du SDS. Les chaînes séparées lourdes et légères du corps réactionnel ont été détachées du gel
38
et analysées ensuite par concentration iso-électrique dans un gel de polyacrylamide en plaque conformément à leur point iso-électrique. La coloration du gel de concentration iso-électrique avec un colorant (bleu brillant 5 Coomassie . R-250) a donné un diagramme caractéristique de bandes pour chaque échantillon. Attendu que les chaînes lourdes et les chaînes légères d'anticorps sont toutes des glycoprotéines qui renferment des variations intrinsèques dans leur teneur en acide sialique, chaque chaîne 10 lourde et chaque chaîne légère peuvent être divisées par une charge en une famille caractéristique de bandes dont chacune contient un polypeptide et des quantités différentes d'acide sialique. Attendu que la réaction de l'acide acrylique activé a eu lieu principalement avec des groupes amino 15 fonctionnels portés par les résidus de lysine de la protéine, on devrait s'attendre à ce que l'addition de monomère à l'anticorps MAb neutralise une charge positive de la sous-unité de protéine pour chaque molécule liée d'acide acrylique. Cela devrait entraîner à son tour une variation 20 du point iso-électrique de la protéine transformée.
Les résultats de l'analyse par concentration iso-électrique ont indiqué que chaque chaîne lourde était modifiée par la liaison de covalence d'environ trois monomères acryliques (figure 2). L'analyse a également indiqué 25 que le diagramme électrophorétique de la chaîne légère transformée par le monomère était si proche du diagramme du polypeptide non transformé qu'il y avait eu une conjugaison essentiellement minimale de monomère aux chaînes légères. On a estimé sur cette base que six moles d'acide acrylique 30 monomère avaient été conjuguées à chaque mole d'anticorps, (3 par chaîne lourde pour 2 chaînes lourdes par anticorps), ce qui concorde avec l'analyse par chromatographie CLHP-PI.
39
C : Démonstration de la persistance de la capacité de liaison du conjugué monomère/corps réactionnel envers 11analyte
Pour démontrer que le conjugué monomère/corps 5 réactionnel purifié était encore actif, on l'a testé dans une épreuve d'immunosorption en liaison avec un enzyme (ELISA), et les résultats ont indiqué qu'il n'y avait pas de perte de la capacité de liaison spécifique. A cette fin, de l'IgG humaine (qui contient le même antigène à 10 chaîne Kappa que l'IgM humaine) a été fixée par absorption à la surface d'alvéoles ménagés dans une microplaque ELISA (96 alvéoles). Les alvéoles ont été lavés, les sites résiduels d'adsorption non spécifique à la surface de la matière plastique ont été bloqués à la sérum-albumine de boeuf, 15 puis une incubation a été pratiquée avec des dilutions en série des. anticorps (anticorps témoin et conjugué monomère/anticorps). On a lavé de nouveau la plaque, on l'a fait incuber avec de 1 ' immunoglobuline de chèvre anti-souris en conjugaison avec de la peroxydase de raifort, 20 de la o-phénylènediamine et du peroxyde d'hydrogène. De l'acide sulfurique aqueux dilué a été ajouté pour arrêter la réaction, les plaques ont été analysées sur un micro-lecteur ELISA et les densités optiques de chaque dilution de conjugué monomère/anticorps ont été comparées avec 25 celle de l'anticorps témoin. Sur base molaire, le conjugué monomère/corps réactionnel a montré une activité de liaison spécifique comparable à celle de l'anticorps non conjugué seul.
D : Préparation d'un conjugué rapporteur/corps réactionnel 30 L'étape finale de l'assemblage des composants d'un système d'épreuves immunologiques double site simultanées a été l'identification d'un second anticorps (2C3, qui réagit avec la chaîne lourde n de l'IgM humaine) qui s'est liée à un épitope différent de l'analyte, c'est-35 à-dire qu'il n'a pas inhibé la liaison du premier conjugué monomère/corps réactionnel à l'analyte. Le second anticorps réactionnel a été marqué avec un rapporteur (fluorescéine).
A cette fin, on a ajouté 60 microgrammes (20 microlitres d'une solution à 3,0 mg/ml dans le DHSO) d'isothiocyanate de fluorescéine, isomère II (FITC) à 1 mg d'anticorps 2C3 dans 0,125 ml de tampon au carbonate 0,2 7 M, à pH 9,3. On a fait incuber le mélange pendant 30 minutes à 37°C et on l'a chromatographié sur une colonne de Sephadex G-25 dans une solution de sel tamponnée au phosphate à laquelle on avait ajouté du NaCl 0,5 M et 0,1 % de NaN3. On a séparé ainsi l'anticorps marqué à la fluorescéine de tout FITC libre qui restait en solution. Le pic a été recueilli dans un volume de 0,25 ml et le rapport fluorescéine îanticorps, calculé d'après les absorptions à 280 nm et à 495 nm en utilisant l'équation rapport F/Ab = 3,1 x A495/A280 - 0,31 x A495, a été trouvé égal à 4,7. En utilisant des méthodes semblables à celles de l'exemple I.C, on a trouvé que ce conjugué rapporteur/corps réactionnel était tout à fait capable d'une liaison spécifique avec l'analyte.
Exemple II
Polymérisation de monomère HEMA dans une solution tamponnée de sel
La polymérisation de méthacrylate de 2-hydroxyéthyle en présence de composés physiologiques a été effectuée comme suit : on a ajouté à 2,73 ml d'eau distillée ou de solution de sel tamponnée au phosphate à pH 7,4, 0,06 à 0,24 ml de méthacryalte de 2-hydroxyéthyle à 25 % (volume/volume) (HEMA, Aldrich Chemical Company). On a ajouté de l'eau en quantité nécessaire pour compléter le volume final à 2,97 ml. Après avoir fait barboter de l'azote préalablement purifié, à travers une pipette Pasteur, au fond de la cuve pendant au moins 5 minutes, on a ajouté 30 microlitres de Na2S20g 1 M et on a suivi la précipitation du polymère résultant à 550 nm à l'aide d'un spectro-photomètre Beckman, modèle 26. La figure 3 illustre la dépendance de la vitesse de précipitation par rapport à la concentration du monomère. D'après ces résultats, on a choisi une concentration de 2 L
41
L'inclusion de sérum de foetus de veau en proportion allant jusqu'à 10 % (volume/volume) ou de "Nonidet P-40", détergent non ionique de la firme Shell Chemical Co., à des concentrations allant jusqu'à 1 % (en poids/ 5 volume), n'a exercé aucun effet sur la vitesse de formation des particules de polymère. Etant donné que le sérum de foetus de veau contient diverses protéines et d'autres composés physiologiques, cela indique que la plupart des protéines et des compo.sés physiologiques n'inhibent pas 10 la formation des particules de polymère. Attendu que des détergents non ioniques sont communément utilisés dans des épreuves immunologiques pour solubiliser des substances biologiques, cela signifie qu'il est possible, sans interférence, d'utiliser des détergents dans des épreuves immuno-15 logiques de séparation induite par polymérisation.
Exemple III
Démonstration de l'incorporation, spécifique de l'analyte, d'une fluorescence dans un polymère
Cet exemple illustre une méthode d'analyse 20 immunologique double site simultanée à deux anticorps. Dans cette méthode, le conjugué rapporteur/corps réactionnel (2C3 marqué à la fluorescéine, 5 microgrammes), l'analyte (IgM humaine, 4,5 microgrammes) et le conjugué monomère/ corps réactionnel (2H1 marqué à l'acide acrylique, 5 micro-25 grammes) ont été soumis à l'incubation ensemble, et il en est résulté la formation d'un complexe ternaire ou "sandwich" contenant, à la fois, le monomère et le rapporteur. La copolymérisation de ce complexe avec une quantité additionnelle de monomère non transformé (HEMA) a entraîné 30 la formation de particules fluorescentes de polymère (échantillon a)*
En vue d'une comparaison, on a préparé un échantillon témoin qui était identique au premier, à la différence que l'analyte avait été omis. Il en est résulté 35 la formation de particules de polymère qui contenaient du conjugué monomère/corps réactionnel, mais pas de conjugué rapporteur/corps réactionel ;par conséquent, les particules
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de polymère n'étaient pas fluorescentes (échantillon b) . Pour comparer quantitativement les degrés d'incorporation de fluorescence aux particules de polymère provenant des deux échantillons, on les a soumis à une analyse quantita-5 tive au moyen d'un cytomètre à écoulement.
Après progression de la polymérisation pendant 10 minutes, la suspension de particules de polymère a été diluée d'un facteur 100, puis introduite dans un cytomètre à écoulement (Becton Dickinson, FAGS IV) équipé 10 d'une source de lumière laser à ions argon. Dans ce mode opératoire, les particules en suspension étaient transportées en file indienne dans un courant laminaire de tampon. L'interrogation du courant de particules par la lumière engendrée par le faisceau laser a engendré une diffusion 15 de lumière chaque fois qu'une particule entrait dans la trajectoire du laser. Le degré de diffusion de la lumière était un reflet du diamètre et de la forme des particules. La mesure de diffusion de la lumière est utilisée pour déclencher électroniquement une mesure simultanée de fluo-20 rescence émise par là particule. On peut mesurer sélectivement de cette façon une fluorescence associée spécifiquement à des particules de polymère.
Les résultats sont reproduits graphiquement sur la figure 4 qui compare l'intensité de fluorescence 25 de particules de copolymère venant d'un échantillon a (courbe en traits interrompus) avec l'intensité de fluorescence de particules de copolymère d'un échantillon témoin h (courbe en trait plein) dans lequel l'analyte a été omis. L'intensité de fluorescence des particules de copoly-30 mère formées en présence d'analyte (système complet) a été décalée sur 73 canaux par rapport au témoin (voir les flèches sur la figure 4). L'échelle d'intensité de fluorescence (axe des x) est logarithmique, et une dérive de 73 canaux correspondait à une multiplication d'un fac-35 teur 20 de l'intensité de fluorescence. Cette multiplication de l'intensité de fluorescence a prouvé qu'elle était une fonction linéaire de la quantité d'analyte présente
CZ
43
dans l'échantillon. La figure 5 est une représentation graphique de l'intensité de fluorescence, en coordonnées linéaires, par rapport à la quantité de l'analyte présente dans l'échantillon, en utilisant 1 microgramme de chaque 5 conjugué de corps réactionnel et, par ailleurs, les mêmes conditions que celles qui ont été utilisées pour la figure 3.
Exemple IV
Démonstration de l'incorporation d'un conjugué monomère/ 10 polypeptide à un polymère
Pour créer un moyen d'identification et de contrôle de la présence de polypeptides dans des polymères, le conjugué monomère/anticorps (MAb-M) a été marqué par covalence avec un composé fluorescent. A cette fin, 15 88 microgrammes (8,8 microlitres de solution à 10 mg/ml dans le DMSO) de l'isomère II de 1'isothiocyanate de fluo-rescéine (FITC) ont été ajoutés à 3,6 mg de MAb-M dans 1,2 ml de tampon au carbonate 0,29 M, à pH 9,3. Le mélange a été agité pendant 1 heure à 37°C et chromatographié
(R)
20 sur une colonne de Sephadex G-25 dans une solution de sel tamponnée au phosphate à laquelle de la sérum-albumine de boeuf (0,01 mg/ml) avait été ajoutée pour empêcher une fixation par adsorption non spécifique sur la colonne. On a ainsi séparé le MAb-M marqué à la fluorescéine de 25 tout isothiocyanate de fluorescéine libre qui restait dans la solution.
Les conjugués MAb-M marqués à la fluorescéine ont ensuite été copolymérisés avec une quantité additionnelle de HEMA. pour former des particules insolubles de 30 polymère. Deux méthodes ont été utilisées pour démontrer l'incorporation de MAb-M marqué à la fluorescéine au polymère synthétisé de novo. Les deux méthodes, à savoir micros-copie à fluorescence et analyse quantitative en écoulement avec le dispositif de triage de cellules activées par 35 fluorescence, ont mesuré réellement la présence de fluorescence dans les particules de polymère. A titre comparatif, on a utilisé deux témoins (échantillons a et b). Dans
44
l'échantillon ia, du HEMA s'est polymérisé de lui-même en particules insolubles de polymère dans une version à plus petite échelle du système de polymérisation de l'exemple I (volume total : 1 ml). Dans l'échantillon 5 b, 50 microgrammes d'un MAb "assistant" marqué à la fluorescéine (mais non conjugué au monomère) ont été ajoutés au système à polymériser pour tester l'emprisonnement non spécifique de polypeptides assistants au cours de la formation de particules insolubles de polymère. L'asso-10 dation d'une fluorescence quelconque aux particules de polymère n'a été observée ni dans un cas ni dans l'autre, à l'examen au microscope à fluorescence. Dans l'échantillon £, 50 microgrammes de MAb-M marqué à la fluorescéine, conjugué au monomère, ont été ajoutés au système à polymé-15 riser pour tester l'incorporation spécifique du polypeptide, par copolymérisation, aux particules de polymère. Dans ce cas, on a observé que toute la fluorescence était associée aux particules de polymère, à l'examen au microscope à fluorescence.
20 Le même examen a été effectué par analyse quanti tative en écoulement à l'aide d'un dispositif de triage de cellules activées par fluorescence. Après une durée de polymérisation de 10 minutes, la suspension de particules de polymère a été diluée d'un facteur 100, puis introduite 25 dans un cytomètre à écoulement (Becton Dickinson, FACS IV) équipé d'une source de lumière laser à ions argon. Dans cette méthode, les particules en suspension étaient transportées en file indienne dans un courant laminaire de tampon. L'interrogation du courant de particules avec 30 le faisceau laser a engendré une diffusion de lumière chaque fois qu'une particule entrait sur la trajectoire du laser. Le degré de diffusion de la lumière était un reflet du diamètre et de la forme des particules. En outre, on peut aussi utiliser une mesure de diffusion de la lumière 35 pour déclencher électroniquement une mesure simultanée de fluorescence émise par la particule qui a été responsable du signal de diffusion de la lumière. On peut mesurer i
45
sélectivement de la sorte une fluorescence spécifiquement associée à des particules de polymère.
En se référant à la figure 6, on peut résumer les résultats comme suit :
5 Analyse par diffusion de la lumière. L'analyse par diffusion de la lumière (graphiques A et C) de particules de polymère formées à partir de HEMA seul (courbe en trait plein), de particules de polymère formées à partir de HEMA polymérisé en présence d'anticorps assistant (courbe 10 en traits interrompus), de particules de polymère formées par copolymérisation de HEMA avec MAb marqué à la fluorescéine (courbe en traits interrompus) montre que la distribution de diamètres des particules a été pratiquement la même pour les trois échantillons.
15 Analyse par fluorescence. Le graphique B compare l'intensité de fluorescence de particules de polymère formées à partir de HEMA seul (courbe en trait plein) et de particules de polymère formées à partir de HEMA polymérisé en présence d'anticorps assistant (courbe en 20 traits interrompus). L'intensité de fluorescence a été pratiquement la même pour les deux échantillons. Etant donné que l'intensité a été pratiquement la même indépendamment de ce qu'il y avait ou non l'anticorps assistant marqué par la fluorescéine, le faible signal de fluorescence 25 des deux échantillons a été considéré comme vraisemblablement dû à une autofluorescence du polymère HEMA lui-même et a indiqué qu'il y avait un emprisonnement minimal non spécifique de l'anticorps assistant dans le polymère. Le graphique D compare l'intensité de fluorescence de 30 particules de polymère formées à partir de HEMA seul (courbe en trait plein) et de particules formées par copolymérisation de HEMA avec MAb marqué à la fluorescéine, modifié par le monomère (courbe en traits interrompus). L'intensité de fluorescence des particules de copolymère (MAb marqué 35 à la fluorescéine, modifié au monomère, et HEMA) s'est décalée sur 28 canaux. L'échelle des intensités de fluorescence (axe des x) est logarithmique, et une dérive de
C
28 canaux a correspondu à une élévation d'un facteur 3 de l'intensité de fluorescence. Cette élévation spectaculaire de l'intensité de fluorescence a démontré de façon concluante que le MAb marqué à la fluorescéine, modifié 5 au monomère, s'était intégré aux particules de polymère. Exemple V
A : Synthèse de l'ester de N-hydroxysuccinimide (NHS) de l'acide 4-vinylbenzoique (VBA)
On a ajouté 0,775 g de NHS et 1,39 g de dicyclo-10 hexylearbodiimide à 1 g (6,74 mmoles) de VBA dans 40 ml de tétrahydrofuranne (THF). Le mélange résultant a été agité pendant la nuit à la température ambiante. Le mélange a été filtré et le filtrat a été additionné d'une petite quantité de p-méthoxyphénol. Le filtrat a ensuite été 15 évaporé à sec en donnant des cristaux jaune pâle que l'on a ensuite triturés avec de l'éther de diéthyle. La matière solide résultante a été recristallisée une fois dans du méthanol. L'analyse par RMN, par spectrométrie de masse et par spectroscopie infrarouge, a confirmé l'identité 20 du composé, à savoir le N-succinimidyloxy-(4-vinylbenzoate) (NSB).
B : Conjugaison de NSB à un anticorps monoclonal
Un anticorps monoclonal de souris appelé 2H1, qui est réactif avec les chaînes légères kappa d'immunoglo-25 buline humaine, a été conjugué au NSB en donnant un conjugué monomère/anticorps. En bref, on a ajouté à 7 mg d'IgC 2H1 purifiée dans 1,23 ml de tampon au carbonate 0,29 M (pH 9,3), 113 microgrammes de NSB dans 11,3 microlitres de THF. Le mélange a été agité pendant 1 heure 30 à 37°C, puis chromatographié sur une colonne de Sephadex G-25 (colonne PD-10 à utilisation unique, de la firme Pharmacia Fine Chemicals de Piscataway, N.J.) qui avait été équilibrée dans une solution de sel tamponnée au phosphate (STP, pH 7,4). On a recueilli des fractions et on 35 a déterminé leur absorption à 280 nm. Les fractions correspondant au maximum ont été rassemblées, réparties en portions aliquotes de 100 microlitres et conservées à l'état
I
47
congelé à -20°C jusqu'au moment de leur utilisation. C : Conjugaison d'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) à un anticorps monoclonal
Un anticorps monoclonal de souris, répondant 5 à la désignation 3F6, qui est réactif avec des chaînes lourdes gamma d'immunoglobuline humaine, a été conjugué au FITC en donnant un conjugué rapporteur/corps anticorps. En bref, 60 microgrammes (20 microlitres de solution à 3,0 mg/ml dans le DMSO) d'isomère II du FITC ont été ajoutés 10 à 1 mg d'IgG 3F6 purifiée dans 0,125 ml de tampon au carbonate 0,29 M (pH 9,3). On a fait incuber le mélange pendant une demi-heure à 37°C, puis on l'a chromatographié sur une colonne de Sephadex G-25 équilibrée en milieu PBS/NaCl 0,5M/NaN3 à 0,1 % (en poids/volume). On a recueilli des 15 fractions et on a déterminé le rapport de la fluorescéine à la protéine d'anticorps (F/P) des fractions correspondant au maximun, en utilisant l'équation suivante :
20
25
F/p . (3,1 X - <°.31 * A495 nm'
280 nm
On a trouvé que le rapport F/P était égal à
environ 5.
D : Epreuve immunologique de séparation induite par polymérisation pour l'IgG humaine
On a conduit une épreuve immunologique de détection de l'IgG humaine en utilisant l'anticorps 2H1 conjugué au NSB (Abjj) et l'anticorps 3F6 conjugué au FITC (Ab^). On a utilisé comme antigène une protéine de myélome humain IgG de type kappa.
30 L'analyse a été conduite comme suit : On a mélangé de l'Ab^ (concentration finale 30 microgrammes/ml), de l'AbF (concentration finale 30 microgrammes/ml) et du méthacrylate d'hydroxyéthyle (HEMA, concentration finale 1 % (en poids/volume)) avec un échantillon contenant l'anti-35 gène dans un volume total de 100 microlitres. Après une période d'incubation de 10 minutes à 37°C, la polymérisation a été déclenchée par l'addition de 25 microlitres de persulfate d'ammonium 30 mM et de 25 microlitres de
48
N,N,N',N'-tétra-éthylméthylènediamine (TEMED) 240 mM. La polymérisation a été conduite pendant 20 minutes à 37°C. La quantité de fluorescence incorporée aux particules résultantes de copolymère a été déterminée par microfluori-métrie avec écoulement ou par filtration sur une Screen Machine (Pandex Laboratories, Mundelein, 111.). Dans la méthode microfluorimétrique avec écoulement, on a dilué un échantillon de 50 microlitres du mélange réactionnel dans 2 ml de STP avant dî.effectuer l'analyse sur un appareil FACS IV (Becton-Dickinson, Sunnyvale, Ca. ). Dans la méthode de filtration, ori a dilué un échantillon de 50 microlitres du mélange réactionnel avec un volume égal de STP contenant 0,05 % (en poids/volume) de Tween 20 et on l'a introduit dans un alvéole d'une plaquette de microtitrage de Screen Machine. Les alvéoles de ces plaquettes contiennent des filtres d'acétate de cellulose à pores d'un diamètre moyen de 0,45 micromètre. Les filtres ont été préalablement équilibrés par lavage avec de la sérum-albumine de boeuf à 1 % (en poids/volume) dans du STP.
fluorescence obtenue pour diverses concentrations de l'antigène en utilisant les deux méthodes de mesure.
Le tableau I compare l'intensité relative de
Tableau I
Intensité relative de fluorescence
Concentration de l'antigène (microgrammes/ml)
0
Micyofluorimétrie avec "écoulement
Filtration
(x 10~2)
0,007
0,015
0,03
0,06
0,125
0,250
2,9 4,0
4.7
5.8 9,0
16,0 27,2
11,7 12,9
13.4
17.5 25,0 37,2 64,0
Exemple VI
Epreuve immunologique de séparation induite par polymérisation pour le dosage simultané en deux couleurs d'IgG et d'IgM humaines
5 On a préparé comme décrit ci-dessus l'anticorps
2H1 conjugué au NSB (Ab^, contre les chaînes légères humaines du type kappa) et l'anticorps 2C3 conjugué au FITC (Abp, anticorps monoclonal de souris contre les chaînes lourdes humaines du type ji).
10 A : Conjugaison de la R-phycoérythrine à un anticorps monoclonal
L'anticorps monoclonal de souris, portant la désignation 3F6, qui est réactif envers des chaînes lourdes de type gamma d'immoglobuline humaine, a été conjugué 15 avec la R-phycoérythrine (PE) en donnant un conjugué rapporteur/anticorps, La R-phycoérythrine a été tirée à l'état pur de l'algue rouge Porphyra yesoensis comme décrit par Oi et collaborateurs dans J. Cell Biol., £3: 981 , 1982. La conjugaison a eu lieu par liaison sulfo-éther, en utili-20 sant du 4-(N-maléimidométhyl)cyclohexane-1-carboxylate de succinimidyle (SMCC) comme agent bifonctionnel de réticulation. En bref, des groupes thiol ont été introduits sur l'anticorps en utilisant l'anhydride S-acétylmercapto-succinique, tandis que les groupes maléimide réactifs 25 ont été introduits sur la PE en utilisant du SMCC. Le dérivé de PE a ensuite été couplé au dérivé d'anticorps.
L'introduction de groupes thiol dans l'anticorps 3F6 a été accomplie comme suit : On a ajouté 5 microlitres d'une solution à 60 mg/ml d'anhydride S-acétylmercapto-30 succinique dans du DMF à 2,5 mg de l'IgG de 3F6 purifiée dans 0,5 ml de STP. On a fait incuber le mélange à la température ambiante en agitant continuellement pendant une demi-heure, après quoi on a ajouté 0,5 ml d'hydroxyl-amine 1 M à pH 7,0 et 0,05 ml de tampon tris 0,1 M à pH 35 7,0, contenant de l'EDTA 0,2 M.
L'incubation a été poursuivie pendant 10 minutes à la température ambiante, après quoi le mélange réaction-
50 >
nel a été chromatographié sur une colonne de Sephadex G-25 (1 ,0 x 45 cm) équilibrée dans un tampon au phosphate 0,02 M à pH 6,0, contenant de l'EDTA 0,005 M. On a recueilli des fractions et on a déterminé leur absorption à 5 280 nm. Les fractions correspondant au maximum ont été rassemblées et le nombre de groupes thiol par mole d'IgG a été déterminé conformément à la méthode de Grassetti et collaborateurs, Arch. Biochem. Biophys. 119:41, 1967. Environ sept thiols par mole d'IgG ont été introduits. 10 Des groupes maléimide réactifs ont été introduits dans de la PE de la façon suivante : On a ajouté à 1,0 mg de PE dans 1,0 ml de STP, 25 microlitres d'une solution à 0,9,mg/ml de SMCC dans du DMF. On a fait incuber le mélange à la température ambiante pendant une demi-15 heure, après quoi on l'a chromatographié sur une colonne de Sephadex G-25 (1 ,0 x 45 cm) équilibrée dans un tampon au phosphate 0,1 M, à pH 6,5. On a recueilli des fractions et on a contrôlé leur absorption à 280 nm. Les fractions correspondant au maximum ont été rassemblées et le rapport 20 molaire SMCCrPE a été déterminé conformément à la méthode de J. Ishikawa, Immunoassay 4:209, 1983. Environ quatre molécules de SMCC ont été introduites par molécule de PE.
Le dérivé de PE résultant a été couplé au 3F6 25 thiolé de la façon suivante : On a ajouté à 1 mg de dérivé de PE dans 2 ml de tampon au phosphate 0,1 M à pH 6,5, 1,5 mg de 3F6 thiolé dans 1 ml de tampon au phosphate 0,02 M à pH 6,0, contenant de l'EDTA 0,005 M. Après agitation, on a ajouté 0,3 ml de STP 10X et on a fait incuber 30 le mélange résultant pendant 2 heures à la température ambiante. Après l'incubation, on a ajouté 50 microlitres de N-éthylmaléimide 0,1 M dans du DMF. L'incubation a été poursuivie pendant 10 minutes, après quoi le mélange réactionnel a été chromatographié sur une colonne de Sepha-35 cryl S-300 (1,5 x 120 cm) équilibrée dans la solution STP contenant 0,1 % (en poids/volume) d'azide. On a obtenu deux pics contenant de la PE, le pic de plus haut poids
moléculaire correspondant à la PE conjuguée avec 3F6 et le pic de plus bas poids moléculaire correspondant à la PE non conjuguée* Les fractions correspondant au pic de haut poids moléculaire ont été rassemblées et on a trouvé qu'elles avaient un rapport molaire 3F6:PE de 1,5. Ce conjugué est appelé Abpg..
B : Epreuve immunologique simultanée en deux couleurs pour la détection d'IgG et d'IgM humaines
On a conduit .de la manière suivante une épreuve immunologique de séparation induite par polymérisation pour la mesure simultanée en deux couleurs d'IgG et d'IgM humaines : on a mélangé de l'Ab^ (concentration finale 30 microgrammes/ml), de l'Ab^, (concentration finale 45 microgrammes/ml) et de l'Abpg (concentration finale 30 microgrammes/ml) avec un échantillon contenant des quantités variables des deux antigènes dans un volume total de 100 microlitres. On a utilisé une protéine IgG de myélome de type kappa et une protéine IgM de myélome de type kappa comme antigènes. Après une période d'incubation de 10 minutes à 37°C, la polymérisation a été déclenchée par l'addition de 25 microlitres de persulfate d'ammonium 30 mM et de 25 microlitres de TEMED 240 nM. Après polymérisation pendant 20 minutes, on a dilué un échantillon de 50 microlitres du mélange réactionnel dans 2 ml de STP en vue de l'analyse par microf luorimétrie avec écoulement impliquant des paramètres multiples, en utilisant un appareil FACS IV. On a utilisé-en vue de l'excitation un rayon laser de 488 nm. Un miroir dichroique de 560 nm (Becton-Dickinson) a été utilisé pour diviser les longueurs d'ondes d'émission. En outre, on a placé un filtre passe-long de 580 pm et un filtre passe-court de 540 Jim (Ditric Optics, Hudson, Ma.) en face, respectivement, des tubes rouge (PE) et vert (FITC) du photomultiplicateur. Un compensateur a été utilisé pour corriger toute déformation résiduelle des signaux de vert et de rouge.
Une mesure simultanée en deux couleurs de l'IgG et de l'IgM a été effectuée dans une série d'échantillons
52
en présentant les résultats d'après le nombre de particules (axe vertical) en fonction du logarithme de la fluorescence verte et en fonction du logarithme de la fluorescence rouge sur une grille de 64 x 64 points sur laquelle 5 4,5 points représentent à chaque fois un doublage approximatif de la fluorescence. Un premier profil de fluorescence de particules de copolymère a été formé en présence de 0 microgramme/ml d'IgM et de 1 microgramme/ml d'IgG et est entré en fluorescence, sans fluorescence verte au-10 dessus du fond. Un second profil de fluorescence de particules de copolymère a été formé en présence de 1 microgramme/ml d'IgM et de 0 microgramme/ml d'IgG, les particules donnant une fluorescence verte. Un profil de fluorescence obtenu en mélangeant les particules de copolymère formées 15 dans le premier profil avec celles qui ont été formées dans le second profil ont donné deux pics distincts, un pic vert contenant des particules portant l'IgM et un pic rouge contenant des particules portant l'IgG.
Profils de fluorescence de particules de copoly-20 mère formées en présence d'une quantité constante d'IgG (1 microgramme/ml) et de quantités variables d'IgM (concentration finale de 0 microgramme/ml, 0,125 microgramme/ml, 0,500 microgramme/ml et, respectivement, 1,0 microgramme/ml). Les particules de copolymère formées ont émis une fluores-25 cente verte et une fluorescence rouge et, en représentation graphique, elles forment un seul pic qui se déplace le long des deux axes proportionnellement à la quantité de chaque antigène présente dans l'échantillon.
Il va de soi que la présente invention n'a 30 été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent y être apportées sans sortir de son cadre.

Claims (11)

53 RESUME L'invention a pour objets : I - Un conjugué utilisé dans la préparation de novo de polymères contenant un ou plusieurs polypeptides, 5 caractérisé par les points suivants, pris séparément ou en combinaisons :
1. Il comprend un composé polymérisable contenant au moins un site réactif de liaison avec un polypeptide ; et
10 un polypeptide en liaison de covalence avec lui.
2. Le polypeptide est un anticorps choisi dans le groupe comprenant un anticorps monoclonal naturel, un anticorps polyclonal, un anticorps synthétisé chimique-
15 ment et un anticorps dérivé d'ADN recombinant (ADNr).
3. Le polypeptide est lié à un composé intermédiaire formant un "bras d'espacement" qui est également lié au composé polymérisable.
4. Le composé polymérisable est soluble dans
20 l'eau ou dans des mélanges d'eau et d'un solvant organique polaire.
5. Il est homopolymérisé pour former un polymère auquel le polypeptide est intégré.
6. Il est copolymérisé avec un monomère non
25 transformé pour former un copolymère auquel le polypeptide est intégré.
7. ,Le composé polymérisable est un composé contenant une insaturation oléfinique ou acétylénique et au moins un site réactif de liaison avec le polypeptide
30 ou le composé intermédiaire formant le "bras d'espacement".
8. Le composé polymérisable est un oligomère polyinsaturé présentant au moins un site réactif de liaison avec le polypeptide ou le composé intermédiaire formant "bras d'espacement".
35
9. Le composé polymérisable comprend un monomère organique polymérisable à insaturation éthylénique choisi dans le groupe des composés de formule :
54
r4 ^ Ri c=c r3 ^ R2
dans laquelle R^ est l'hydrogène ou un groupe alkyle inférieur ayant 1 à 8 atomes de carbone et R£ est choisi entre
-H
-COCl -COOH
\
-C02(CH2)n^H = 1-8}
-CH2NH2
-ch2ci
-co2c2b4nhr (R = H ou tout groupe organique) -co2ch2-CH - CH2
-c02ch2-ch0hch20h \ ; .
-CHO
-<^)~CH2C1 -C02(CH2)nNC0 (n = 1-8) \
~^Oy-NC0
NCS
et R^ et R^ sont choisis entre H et des composés qui produisent un groupe insaturé.
10. R^ et R^ représentent H.
II - Un procédé pour éliminer sélectivement des substances d'un mélange liquide, comportant les particularités suivantes, prises séparément ou ensemble :
55
1. Il consiste à effectuer la liaison par covalence d'un composé organique polymérisable avec un polypeptide doué d'activité de liaison envers la substance se trouvant dans le mélange liquide pour former un conjugué ;
5 à faire entrer la substance en contact avec le conjugué pour lier le composé au polypeptide et pour former un . complexe entre le conjugué de composé organique polymérisable et de polypeptide et la substance ; et à polymériser le complexe pour former un polymère insoluble qui peut 10 être séparé du mélange liquide.
2. La substance à éliminer est un antigène, le polypeptide est un anticorps et le mélange liquide est aqueux.
3. Il consiste à choisir une surface solide 15 en liaison avec au moins un composé polymérisable capable de së copolymériser avec le conjugué de composé organique polymérisable et de polypeptide et à polymériser le conjugué en présence du composé polymérisable lié à la surface solide.
20 III - Une méthode d'analyse immunologique pour détecter la présence d'un analyte dans un échantillon liquide suspecté de contenir un analyte, caractérisée par les points suivants, pris individuellement ou ensemble :
1• Elle consiste :
25 (a) à faire entrer l'échantillon liquide en contact avec un conjugué monomère/corps réactionnel en vue de former un complexe entre le conjugué monomère/corps réactionnel et l'analyte et à prévoir un rapporteur pour le marquage du complexe entre conjugué monomère/corps 30 réactionnel et analyte ;
(b) à séparer le complexe marqué en déclenchant une polymérisation du complexe formé entre conjugué monomère/ corps réactionnel et analyte ; et
(c) à détecter l'incorporation du rapporteur 35 au complexe polymérisé.
56
2. Le rapporteur est introduit par un conjugué rapporteur/corps réactionnel capable de reconnaître l'analyte, le conjugué monomère/corps réactionnel et le complexe formé entre le conjugué monomère/corps réactionnel et
5 l'analyte,et de s'y lier.
3. Elle consiste :
(a) à faire entrer l'échantillon liquide en contact avec un conjugué monomère/analyte pour former un mélange contenant l'échantillon liquide ;
10 (b) à faire entrer le mélange en contact avec un conjugué rapporteur/corps réactionnel capable de se lier spécifiquement à l'analyte pour former un complexe d'analyte marqué au rapporteur et un complexe entre le monomère marqué au rapporteur et l'analyte ;
15 (c) à séparer le complexe formé entre le monomère marqué au rapporteur et l'analyte par déclenchement de la polymérisation du complexe monomère/conjugué d'analyte ; et
(d) à détecter l'incorporation du rapporteur
20 au complexe polymérisé.
4. Le rapporteur est choisi dans le groupe comprenant des radio-isotopes, des enzymes, des inhibiteurs d'enzymes, des cofacteur s d'enzyme, des fluorophores, des matières luminescentes, des chromophores et des particules.
25 5. Le monomère comprend un monomère organique polymérisable à insaturation éthylénique choisi dans le groupe des composés de formule :
r4 *1
>c=cr i
30 / \
R3 r2
dans laquelle est un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle inférieur ayant 1 à 8 atomes de carbone, R2 est choi-35 si dans le groupe comprenant :
-H
-COCl
1
57
15
-COOH
-CO2(CH2)n OH (n = 1-8)
-CH2NH2
-CH2CI
-C02C2Hî!jHR (R = H ou tout groupe organique) -CO2CH2-CH-CH2
V
-CO2 OH2CHOHCH2OH 10 "CHO
(5>-CH2Cl
"~002 (CH2 )nNCO (n = 1-8)
20
NCO
25
NCS
et Rg et ^4 sont choisis dans le groupe comprenant H et des composés qui apportent un groupe insaturé.
6. R^ et R^ représentent l'hydrogène. 30 7. Le monomère est un monomère à insaturation acétylénique portant un groupe apte à réagir.
8, Le monomère est le méthacrylate de 2-hydroxyéthyle . 35 céine.
9. Le rapporteur est 11isothiocyanate de fluores-
10. Les corps réactionnels et les analytes sont choisis dans le groupe comprenant des anticorps, des antigènes et des haptènes.
58
11 . Elle consiste à détecter la présence de plus d'un analyte dans un échantillon liquide suspecté de contenir un ou plusieurs desdits analytes, par :
(a) mise en contact dudit échantillon liquide 5 avec des conjugués monomère/corps réactionnel respectifs, un pour chaque analyte suspecté d'être présent dans l'échantillon liquide pour former des complexes respectifs entre conjugué monomère/corps réactionnel et analyte et l'apport d'un rapporteur pour le marquage de chaque complexe formé 10 entre conjugué monomère/corps réactionnel et analyte, chaque rapporteur offrant un signal détectable d'une façon différente de tout autre rapporteur présent dans ledit échantillon liquide ;
(c) séparation desdits complexes marqués respec-15. tifs par déclénchement d'une polymérisation des complexes respectifs entre conjugué monomère/corps réactionnel et analyte ; et
(d) détection de l'incorporation de chaque rapporteur à chacun desdits complexes polymérisés.
MC841736A 1983-11-10 1984-11-12 Composes polymerisables contenant des polypeptides comme partie integrante et leur utilisation dans des epreuves immunologiques de separation induite par polymerisation MC1637A1 (fr)

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