JPH0614043B2 - 蛍光標識としてのペリジニン−クロロフィル複合体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、典型的には蛍光団結合分子と結合する分子及
びサンプル中のその他の分子、細胞表面等との間の相互
作用を検出するために、他の分子への標識として用いる
蛍光団に関する。

［従来の技術］ 免疫検定法のような診断検定法に現在標識として用いら
れている主な種類の蛍光団は、フルオレセイン、ローダ
ミン、ウムベリフェロン、及びランタニドキレートであ
る。フルオレセインは抗原または抗体に直接結合する活
性形として容易に入手可能であるので、最も一般的に用
いられている。フルオレセインとローダミンの両方は良
好な化学的安定性を示し、標識としての実際の使用時に
実証された記録を有する。しかし、フルオレセインとロ
ーダミンの両方は比較的小さいストークスシフト（Stok
es shift）を有し、幾つかの点で使用可能な方法を限定
する。ウムベリフェロンとランタニドキレートの両方は
大きなストークスシフトを有するが、免疫検定法に標識
としてそれらが用いられたのは比較的最近であり、それ
らは多くの点でまだ確められていない。例えば、ランタ
ニドキレートと抗原との間の結合は幾つかの問題を提示
しており、また蛍光団自体は不安定であることからその
用途を著しく限定している。ランタニドキレートを標識
として用いている検定法はごく若干が発表されているに
すぎない。

ランタニドキレートに関して知られている問題は蛍光標
識法に用いる蛍光団の選択に多くの制約があることを示
唆している。１つの制約は蛍光団の吸収と発光特性であ
る、例えば血液、尿または脳脊髄液のような被検サンプ
ル中の多くのリガンド、レセプタおよびこのような化合
物に関連した物質は蛍光を発し、蛍光標識の蛍光の正確
な測定を妨げるからである。第２の問題点は蛍光団の量
子効果であり、良好な感度のためにはこの効果がおおき
くなければならない。他の問題点は蛍光団がリガンド及
びレセプタに結合しうることと、蛍光団に対するこのよ
うな結合の影響である。多くの状況下で、他の分子との
結合は蛍光団の蛍光特性を実質的に変化させ、ある場合
には、蛍光団の量子効果を実質的に破壊または減ずる。
蛍光分子が密接に接近した場合に互いに相互作用して、
自己消光を生ずるか否かも重要である。蛍光団自体によ
ってまたは蛍光団が結合する化合物に関連して、蛍光団
が他の化合物または容器壁に非特異的に結合するか否か
も関係する。

蛍光標識分野の最近の開発はフィコビリプロティン抱合
体の使用である。フィコビリプロティンは青緑色細菌、
２群の真核藻、紅藻及びクリプトモナスの光合成器官の
光回収系の１部を形成する高蛍光性蛋白質の１種類であ
る。これらの特に有用な変った用途は、大きなストーク
スシフトを有するフィコビリプロティン・タンデム共役
体の製造である。このような抱合体の１例はフィコエリ
スリンのアロフィコシアニンへの共有結合である。生成
したタンデム抱合体は大きなストークス・シフト、６６
０nmにおける最大発光及び約440nmから開始する励起波
長バンドを有する。しかし、このようなタンデム複合体
の製造は２成分間の共有結合または他の化学結合の形成
を必要とするので、最終共役体の製造の複雑性を高め
る。

従って、大きなストークス・シフトを有し、安定性と製
造の容易さの両方を満たす、診断検定法の蛍光標識の必
要性がある。組織学、細胞学及び免疫検定法のような多
くの方法は、このような試薬の利用可能性による実質的
な利点を有している。

ぺリジニン−クロロフィル蛋白質、それらの性質、及び
単離方法はハキソ(Haxo)ら、プラント・フィジオール(P
lant Physiol)（１９７６）５７，２９７〜３０３；ソ
ング(Song)ら、バイオケミストリー(Biochemistry)（１
９６７）１５，４４２２〜４４２７；プレゼリン(Preze
lin)とハキソ(Haxo)，プランタ(Planta)［ベール(Ber
l.)］（１９７６）１２８：１３３〜１４４；及びコカ
(Koka)とソング(Song)，バイオチム．バイオフィズ．ア
クタ(Biochim.Biophys.Acta.)（１９７７）４９５，２
２０〜２３１を含めた多くの刊行物に述べられている。
フィコビリプロティン種の蛋白質蛍光団は米国特許第4,
520,110号、第4,542,104号及び上記刊行物に述べられて
いる。

［発明の構成］ ぺリジニン−クロロフィル−蛋白質複合体は、免疫検定
法のような特異的結合対の要素間の結合反応に関係する
系の蛍光標識として用いられている。蛋白質複合体は容
易に他の分子に結合して、大きなストークス・シフトを
形成する。結合した複合体は診断検定法に蛍光団として
用いるために充分な感度と安定性とを有する。ぺリジニ
ン−クロロフィル蛋白質複合体は単独で、または他の蛋
白質蛍光団もしくは非蛋白質蛍光団と組合せて用いるこ
とができる。

下記の特定の実施態様の詳細な説明に関連して、本明細
書の１部をなす図面を参照して検討するならば、本発明
はさらに良く理解される。

分析物の蛍光標識を含む公知のまたは後で開示される方
法に用いるために、ぺリジニン−クロロフィル蛋白質複
合体を特定結合対の要素に結合させる方法と組成物を提
供する。ぺリジニン−クロロフィル蛋白質は天然に存在
するものから容易に入手可能であるか、または改質して
種々な吸光度、発光または標識特性を有する新規な複合
体を形成することができる。これらの組成物は生化学的
結合対の要素の標識に用いられ、生成する共役体は特異
的結合対の相補的要素に対する非共有結合を含む分析に
用いられる。リガンドまたはレセプターの存在を検出、
分析または測定するためにリガンドとレセプタの競合的
または非競合的結合を含む多様な方法が存在する。

先行技術の開示は、ぺリジニン−クロロフィル複合体が
診断検定法に標識として使用可能であるか否かに関して
疑問を残している。診断検定法は標識の蛍光性の変化か
ら生ずる誤った陽性または陰性反応を避けるために、高
度の安定性を必要とする。コカ(Koka)等のバイオチム．
バイオフィズ．アクタ（１９７７）４９５，２２０−２
３１は、ペリジニンの存在が、生成する一重項酸素を消
費するので、ぺリジニン−クロロフィル蛋白質複合体(P
erCP)中のクロロフィルaの酸素存在下での光分解が避け
られることを示している。この消費は通常、ペリジニン
を消費（すなわち破壊）する反応の存在を示唆する。複
合体中のペリジニン量が診断系においては、修復が可能
なin vivo系とは異り絶えず変化するので、その結果生
じる吸光度低下のため、診断検定法へのＰerＣＰの使用
が不可能になる。さらに、遊離ＰerＣＰは生物学的要素
に対する有意な量の非特異的結合を示すことが公知であ
る。この非特異的結合が特定の結合化合物の標識へのＰ
erＣＰの使用を不利に妨げるか否かを判定することはで
きなかった。

本発明の抱合体は特定のリガンドまたはレセプタに共有
的または非共有的に（通常は共有的に）結合するぺリジ
ニン−クロロフィル蛋白質(PerCP)複合体である。アポ
フォトプロティンと呼ばれる、ＰerＣＰの蛋白質部分は
約25,000〜38,000ダルトン、典型的には約32,000ダルト
ンの分子量を有する。多くのアポフォトプロティンが種
々な生物学的供給源から単離されており、これらは約6.
4〜7.6のｐＩ値を有する。ある場合には、アポフォトプ
ロティンが15,000〜16,000の分子量を有する同一または
同じようなサブユニットのダイマーとして存在するよう
に見える。他のアポフォトプロティンは同じ条件下で解
離しない。アポフォトプロティンのアミノ酸組成も研究
されている。多くはアラニンが多く含まれており、そし
て類似のアミノ酸組成を有する。

ＰerＣＰ複合体の蛋白質成分は複合体全体の約９０％
(時には９０％未満)をなす。複合体の残りはぺリジニン
とクロロフィル分子(典型的にはクロロフィルa)から成
る非共有結合した発色団によって説明される。しかし、
クロロフィルaの代りに置換反応によって他のタイプの
クロロフィル分子を用いることもできる。最も一般的な
比率は４:１のモル比のぺリジニン対クロロフィルであ
るが、９:２のモル比も報告されている。見かけ上ぺリ
ジニン９分子とクロロフィルa２分子を有する複合体
は、互いに離れて存在するぺリジニンとクロロフィルa
との２複合体を含むと思われる。この発色団は疎水性間
隙に収容され、溶媒に暴露されないように思われる。ア
ポフォトプロティンの表面自体は非常に親水性である。
複合体全体の蛋白質部分には、いずれの構造が存在する
としても、蛍光標識としての複合体の使用を可能にする
ために充分な表面積が存在するので、本発明の実施にと
って実際の構造(４:１複合体または９:２複合体)は重要
ではない。

個々の複合体の代りに架橋したＰerＣＰ複合体を標識と
して用いることによって、蛍光反応の強度を高めること
が可能である。架橋複合体はここに述べる蛋白質結合方
法によって製造することができる。

今までに研究されている多様なフィトプランクトンか
ら、ＰerＣＰ蛋白質がペリジニン含有ジノフラゲレート
の通常成分であるように思われる。ペリジニンを含むこ
とが知られており、ＰerＣＰ複合体をも含むように思わ
れる渦鞭藻科 (Dinophyceae)の生物は、ズーキサンテラェ イーエッ
クス(Zooxanthellae ex)［シャコ貝種(Tridacna specie
s)］，アムフィジニウム カルテラエ(Amphidinium car
terae)［プリマウス(Plymouth４５０)］カコニナ ニエ
イ (Cachonina niei)，ゴニアウラックス ポリエジラ(Gon
yaulax polyedra)，グレノジニウム種(Glenodinium spe
cies)，アムノフィジニウム リノセファロイム(Amphid
inium rhynocephaleum)及びギムノジニウム スプレン
デンス Gymnodinium splendens )である。ＰＹ−１として確認さ
れる少なくとも１系統のアムフィジニウム カルテラエ
は多量のペリジニンを含むが、ＰerＣＰ複合体を含まな
いので、注目すべき例外である。この複合体のアポフォ
トプロティンは種間で充分に保存されているように思わ
れる。現在までに得られている天然の単離物の全てが同
一のペリジニン分子とクロロフィルaとを含んでいる。

複合体中のアポフォトプロティンの存在は蛋白質分子ま
たは非蛋白質分子に結合するための広範囲な官能基を与
える。存在する官能基には、アミノ基、チオ基及びカル
ボキシ基がある。アポフォトプロティンを他の蛋白質に
結合させる場合には、場合によっては、官能基特にチオ
基を導入することが望ましい。

アポフォトプロティンに対して複数の結合対要素が存在
する場合には、複合体に結合させるべき分子(例えば、
特異的結合対の要素)の性質に依存して、２成分の比が
広範囲に変動する。小さな分子では、すなわち分子量2,
000d(ダルトン)、一般に１００d以上、より一般的には
１５０d以上の分子では、ＰerＣＰ複合体に対する結合
比が少なくとも1,100未満、通常は約６０未満である。
分子量が少なくとも約2,000、通常は少なくとも5000で
ある大きい分子では、共役体中に複数のアポフォトプロ
ティンが存在するか、または共役体中に複数の特異的結
合対要素が存在しうるので、リガンドまたはレセプタに
対するＰerＣＰ複合体の比が広範囲に変動する。さら
に、ある場合には小さなリガンドがＰerＣＰ複合体に共
有結合することによって１次中間体が形成され、次に相
補的レセプターによって特異的結合対複合体が形成さ
れ、この場合にはレセプタが次の複合体におけるリガン
ドまたはレセプタとして役立つか、または次の複合体に
用いるように意図されたリガンドまたはレセプタにそれ
自体が共有結合する。

特異的結合対はしばしばリガンド及びレセプタとして呼
ばれ、リガンドなる用語は対の小さい要素を意味する。
結合対が少なくとも１０^７、好ましくは少なくとも１０
^８、より好ましくは少なくとも１０^９リッター／moleの
結合親和力(アビジチー)を示す場合には、特異的結合を
有するといわれる。リガンドは相補的レセプタがそれに
対して存在する重要な化合物である。リガンドなる用語
は、例えば水のようなＰerＣＰ複合体に自然に付随する
ような全ての化合物またはＰerＣＰ複合体に付随する他
の自然「リガンド」を特に除外するように意図する。重要
なリガンドの大部分は自然に生成するか、または合成に
よって製造される、生理的活性を有する化合物である。
約１２５〜2,0００、通常は約１２５〜1,0００の分子量
を有するある化合物群には、広範囲な薬物、小さいポリ
ペプチド、ビタミン、酵素基質、補酵素、有害生物殺滅
剤、ホルモン、脂質等がある。これらの化合物の大部分
は少なくとも１個のヘテロ原子、通常はカルコゲン(酸
素または硫黄)または窒素を有し、脂肪族、脂環式、芳
香族、または複素環式あるいはこれらの化合物の組合せ
である。代表的な化合物には、エピネフリン、プロスタ
グランジン、チロキシン、エストロゲン、コルチコステ
ロン、エクジソン、ジギトキシン、アスピリン、ペニシ
リン、ヒドロクロロサイアザイド、キニジン、オキシト
シン、ソマトスタチン、ジフェニルヒダントイン、レチ
ノール、ビタミンＫ，コバラミン、ビオチン及び葉酸塩
がある。

分子量が大きく、一般に5,000以上である化合物には、
ポリペプチドと蛋白質の両方を含むポリアミノ酸、多糖
類、核酸及びこれらの組合せ、例えばグリコサミノグリ
カン、糖蛋白質、リボソームがある。これらの化合物は
結合対の他方の要素に依存して、リガンドまたはレセプ
タになりうる。代表的な化合物にはアルブミン、グロブ
リン、ヘモグロブリン、細胞の表面蛋白質(例えばＴ細
胞及びＢ細胞抗原、例えばＬey，Ｔhy，Ｉa)、腫瘍特異
的抗原、α−フェトプロティン、レチノール−結合蛋白
質、Ｃ反応性蛋白質、酵素、トキシン(例えばコレラト
キシン、ジフテリアトキシン、ボツリヌストキシン、蛇
毒トキシン、テトロドトキシン、サキシトキシン)、レ
クチン(例えばコンカナバリン、小麦胚芽アグルチニ
ン、大豆アグルチニン)、免疫グロブリン、補因子、リ
ンホカイン、ムコ蛋白質、ポリシアル酸、キチン、コラ
ーゲン、ケラチンがある。

被標識分子に依存して、ＰerＣＰ複合体を他の分子に結
合させるために、多様な結合基を用いることができる。
大部分の小分子(分子量2,000未満)では、結合のために
考えられる官能基はカルボニル、アルデヒド(還元性ア
ミノ化を行うために)またはカルボキシル(カルボジイミ
ドと関係して、または例えばＮ−ヒドロキシスクシンイ
ミドのような活性化エステルとして、ＰerＣＰ複合体の
アポフォトプロティン中に存在するアミノ基と共有結合
を形成する)であり；アポフォトプロティンが活性化エ
レフィンと添加したメルカプト基または結合した活性化
メルカプト基[例えば、エールマン(Ellman)試薬，イソ
チオシアネート、ジアゾニウム、ニトレンまたはカルベ
ン]によって改質される場合には、チオエーテルまたは
ジスルフィドである。アポフォトプロティンが蛋白質
(リガンドまたはレセプタとして用いる)と結合する場合
には、種々の二官能性試薬と、例えばジアルデヒド、テ
トラゾリウム塩、二酸等を用いることができる、または
この代りに、関係する２種類の蛋白質の中の１方または
両方を他方の蛋白質との結合のために改質することがで
きる；例えば１方の蛋白質にメルカプト基を存在させる
か、または導入し、他方の蛋白質には例えばマレイミド
のような活性化オレフィンを導入することができる。典
型的な試薬には、グルタールアルデヒド、ビス−ジアゾ
ビフェニル、マレイミド酢酸ＮＨＳエステル、メチルジ
チオ酢酸ＮＨＳエステル、及び３−(２′−ピリジルチ
オ)−プロピオン酸ＮＨＳエステルがある(ＮＨＳはＮ−
ヒドロキシスクシニミジルである；例えばp-ニトロフェ
ニルのような、他のエステルも用いられる)。非共有結
合には、種々な多価レセプタまたはレセプタとリガンド
の組合せ、例えば抗体、ビオチン−アビジン、Ｆ(ab′)
₂、天然に生成するレセプタ等を用いることができる。

多様な化合物と蛋白質との結合に関しては多くの文献が
存在する。例えば、エイ．エヌ．グレイザー(Ａ．Ｎ．
Ｇlazer)デ プロティンズ (Ｔhe Ｐroteins)IIＡ巻，第３版，エヌ．ノイラス
(Ｎ．Ｎeurath)とアール．エル．ヒル(Ｒ．Ｌ．Ｈill)
編集，アカデミック プレス(Ａcademic Ｐress)，１
〜１０３頁(１９７６)；エイ．エヌ．グレイザー等の
「蛋白質の化学的改質(Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍodificatio
n of Proteins)」，ラボラトリー テクニック イン
バイオケミストリー アンド モレキュラー バイオロ
ジー(Ｌaboratory Techniques inＢiochemistry and Mo
lecular Biology）４巻，第１部，テイ．エス．ワーク
(Ｔ．Ｓ．Ｗork)とイー．ワーク(Ｅ．Ｗork)編集，ノー
スホランドパブリシュイング社(Ｎorth Ｈolland Ｐu
blishing Ｃｏ．）(１９７５)；及びケイ．ペータース
(Ｋ．Ｐeters)のアン．レブ．バイオケム．(Ａnn. Ｒe
v. Ｂｉｏｃｈｅｍ．(１９７７)４６，４２３〜５１頁
(これらの内容は参考文献としてここに関係する)参照の
こと。市販の架橋剤の例は、ザ ビアース１９８１〜８
２ ハンドブック アンド ゼネラル カタログ(Ｔhe
Ｐierce１９８１〜８２ Ｈandbook and Ｇeneral C
atalog１６１〜１６６頁［ピアス ケミカル社(Pierce
Ｃhemical Ｃｏ．），イリノイ州ロックフォード］
に開示されている。

上記刊行物に述べられているような公知の結合方法を用
いることができる。例えば、ＰerＣＰ複合体の蛋白質部
分をイミノチオランと反応させて、それに接近されやす
いスルフヒドリル基を付着させることができる。共役体
の他方の成分はスクシニミジルピリジルチオプロピオネ
ートとの反応によって活性化することができる。共役体
の調製した２成分の混合物はジスルフィド結合による成
分の結合を生ずる。または、スクシニミジルピリジルチ
オプロピオネートを用いる代りに、第２蛋白質をm-マレ
イミドベンゾイルＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ルと反応させ、得られた共役体をスルフヒドリル改質蛋
白質と結合させて、チオエーテルを形成することができ
る。

前述したように、問題の特異的結合対要素とアポフォト
プロティンとの間に共有結合を設ける代りに、非共有結
合を用いることもできる。例えば、ＰerＣＰ複合体をア
ビジンに結合させたい場合には、ビオチンをカルボキシ
ル基を介してＰerＣＰ複合体蛋白質に共有結合させ、生
成したビオチニル化ＰerＣＰ複合体をアビジンと結合さ
せて、蛋白質標識アビジンを得ることができる。さら
に、アビジン自体を種々なリガンド及びレセプタに結合
させ、得られた共役体をビオチニル化ＰerＣＰ複合体
(中間体として)と共に用いて、目的のリガンド／レセプ
タＰerＣＰ複合体生成物を製造することができる。

本発明の蛍光団化合物は標識として多様な分子に結合さ
せることができる。これらの共役体を多様な方法で用い
て、個々の分子として存在するかまたはより複雑な組織
中に存在する、例えばウィルス、細胞、組織、細胞小器
官(例えば、プラスチド、核)等のような、抗原及びレセ
プタの検出、診断、測定及び研究のための公知の方法を
容易にすることができる。

本発明の共役体の用途の１つの細胞の蛍光染色である。
これによって細胞を顕微鏡下で観察することがき、蛍光
団の存在は特異的な決定子部位の存在を示すことにな
る、またはこのような細胞を蛍光活性化細胞選別機(Ｆ
ＡＣＳ)に用いることができる。これらの方法はハーゼ
ンベルグ (Ｈerzenberg)等が「細胞免疫学(Ｃellular Immunolog
y)」第３版，第２２章，ブラックウェル サイエンティ
フィック パブリケーション(Ｂlackwell Ｓcientific
Ｐublication)，１９７８(蛍光活性化細胞選別)に、
またゴールドマン(Ｇoldman)が「蛍光抗体方法(Ｆluores
cence Ａntibody Ｍethods)」，アカデミック プレス
(Academic Ｐress)ニューヨーク，１９６８(蛍光顕微
鏡検査と蛍光染色)に述べている。１種類以上のＰerＣ
Ｐ複合体を用いることができる。または、ＰerＣＰ複合
体をＰerＣＰ複合体以外の蛍光団、例えばフルオレセイ
ン、ダンシル、ウムベリフェロン、ベンゾキサジアゾー
ル、ピレン、ローズベンガル、及び／またはフィコビリ
プロティンと共に用いることもでき、この場合には最大
発光は少なくとも約１５nm、好ましくは少なくとも約２
５nmによって分離する。

蛍光団の組合せを用いることによって、例えば特定のタ
イプの細胞、細菌の菌株、ウィルスの菌株、種々の蛋白
質または抗原の自然の複合体化または相互作用等のよう
な、凝集のサブセットを検出することができる。特に興
味深い組合せは同じレーザー光源によって活性化されう
るフルオレセイン、ビリプロティン及びＰerＣＰ複合体
の組合せである。すなわち約４５０〜５５０nmの範囲内
に最大吸収を有する物質である。

本発明共役体の他の用途は、免疫検定法または競合的蛋
白質結合検定法のような診断検定法であり、これらの場
合には非常に大きい波長で発光を測定する。複合体をリ
ガンドまたはレセプタ、特に抗体に結合させることがで
きる。多くの場合には、抗体はＩgＧであるが、例えば
ＩgＡ，ＩgＤ，ＩgＥ及びＩgＭのような他の抗体ならび
に免疫グロブリンのフラグメントも使用することができ
る。

さらに、自然に発生する種々なレセプタ、特にアビジン
のような高い結合特異性を有するレセプタを用いること
ができる。レセプタ、ドナーアクセプタ共役体または両
方をビオチニル化することによって、種々な分子をアビ
ジンを介して結合させることができる。

多様な蛍光検定法が公知である。これらの検定法の幾つ
かは米国特許第3,998,943号、第3,985,867号、第3,996,
345号、第4,036,946号、第4,067,959号、第4,160,016
号、及び第4,166,105号で説明されている。

これらの特許の関連部分は参考文献としてここに関係す
る。

本発明の共役体は、例えば(1)長波長可視スペクトル領
域における高い吸光係数、(2)高い蛍光量子収量、(3)良
好な貯蔵安定性を含めた長期間安定性、(4)高い水溶解
度、(5)他の分子への結合しやすさ、(6)結合時の低い非
特異的結合性、(7)結合しない場合にシフトするタンデ
ム複合体とは対照的に、結合しない場合にはスペクトル
が維持される、(8)ストークシフトが大きいので、バッ
クグラウンド蛍光が実質的に減少し、非常に長波長で蛍
光を観察することができ、散乱、サンプル中に通常検出
される物質の蛍光等に起因するバックグラウンド妨害が
殆んど無いというＰerＣＰ複合体の好ましい性質を有す
る。この他、典型的な塑性物質は黄色〜赤色スペクトル
領域において吸光及び発光しないため、紫外領域よりも
スペクトルの赤色端部で操作するほうが容易であるとい
う利点も存在する。

本発明を今まで一般的に説明してきたが、次の実施例を
参照することによって本発明はさらに充分に理解され
る；これらの実施例は説明のために記載するのであり、
特に指定しないかぎり、本発明を限定する意図は有さな
い。

実施例 ＰerＣＰの単離と精製 赤潮領域の海水をプランクトンネットに通して過し、
粒状物質を回収することによって、双鞭毛藻類を得た。
藻類１０ｇを直径７５〜１５０μガラスビーズの存在下
で攪流(vortexing)することによって破壊した。遠心処
理により上清を単離した。この懸濁液５０ｍに(Ｎ
Ｈ₄)₂ＳＯ_４１８ｇを加えることによって非ＰerＣＰ蛋
白質の大部分は沈殿した。沈殿物を遠心処理によって除
去し、上清をトリス緩衝液に対して透析して、(ＮＨ₄)₂
ＳＯ_４を除き、ＡＭＩＣＯＮ過によって1.3ｍに濃
縮した。直径が2.6cm×47cmセファデックス(Sephadex)
Ｇ−１００カラムでのゲル過によって純粋なＰerＣＰ
を得た。Ａ₄₇₆₁／Ａ₂₈₀比が３より大きい分画をプール
し、ＰerＣＰとストレプトアビジンの結合に用いた。

分光測定 ベックマンモデル２５分光光度計[ベックマン インス
トルーメント社(Ｂeckman Ｉnstruments，Ｉnc.）カル
フォルニア州フラートン]によって吸収スペクトルを得
た。バーキンエルマーモデル ＭＰＦ−２Ａ蛍光計によ
って蛍光スペクトルを得た。

ゲルクロマトグラフィー 結合反応後にファルマシァ スーパーローズ(Ｐharmaci
a Ｓuperose)１２または６ＦＰＬＣゲル過カラム上
でのゲルクロマトグラフィーによって、主として分子の
流体力学的半径に応じて分子を分離した。調製実験で
は、サンプル２００〜２５０μを供給して、５００μ
分画を回収した。溶離緩衝剤は0.01Ｍリン酸塩−0.15
M NaCl(pH7.2)または0.05Mトリス−0.15M NaCl(pH7.8)
であり、流速度は0.5ｍ／分であった。

リンパ球の蛍光染色 フィコール−ハイパーク(Ficoll-Hypaque)グラジエント
を用いて、ヒト末梢血白血球を調製した。細胞をアクリ
ジンオレンジとエチジウムブロミドによって染色し、標
準フルオレセインオプチックスを用いる蛍光顕微鏡によ
って蛍光細胞を計数した。この染料の組合せは生細胞を
緑に染色し、死細胞を橙赤色に染色する。細胞標本は常
に生存細胞率＞９５％である。

この研究に用いた抗Ｌeu抗体は全てモノクローナルから
誘導したハイブリドーマ抗体であった[ベクトン ジキ
ンソン社(Ｂecton Ｄickinson ＆ Ｃo),モノクロー
ナルセンター，カルフォルニア州マウントビュー]。緑
色蛍光シグナルはフルオレセイン化抗体から直接生じ
た。橙色蛍光シグナルはフィコエリスリンによって直接
標識した抗体から生じた。赤色蛍光シグナルはＰerＣＰ
−アビジンによって逆染色したビオチニル化抗体から生
じた。蛍光抗体染色は１段階または２段階で実施した。

直接フルオレセイン化した抗体をウシ血清２％(v/v)と
アジド0.1%(w/v)を含むハンク(Hank)ＭＥＭまたはＰＢ
Ｓ(0.01M リン酸塩−0.15M NaCl,pH7.2)５０μ中１
０⁶細胞と共に氷上で２０分間インキュベートした。抗
体添加量はこの細胞数を３色染色法で染色するために最
適であるように予め算出した。直接標識したＦＩＴＣ抗
体とＰＥ抗体の両方及びビオチニル化抗体を培地５０μ
中の１０⁶細胞と共に氷上で２０分間インキュベート
した。細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、ＰerＣＰ−アビ
ジン共役体を培地５０μ中の細胞に加えた。この混合
物を氷上でさらに２０分間インキュベートしてから、細
胞を最後にＰＢＳ中で２回洗浄した。蛍光活性化細胞選
別機を用いる蛍光分析のために、細胞をＰＢＳ0.5ｍ
中に再懸濁させた。

蛍光活性化細胞分析 単細胞の蛍光分析のために、ベクトンジキンソン社蛍光
活性化細胞分析機(ＦＡＣＳcan)を用いた。電子補償[ロ
ッケン(Loken)等，ジェイ．ヒストケム．サイトケム(J.
Histochem Cytochem.)(１９７７)２５，８９９〜９０７
頁]によってＰＥチャンネルへのフルオレセイン漏出(sp
illover)とＦＩＴＣチャンネルへのＰＥ漏出及びＰerＣ
ＰチャンネルへのＰＥ漏出を修正した。これらの修正シ
グナルは緑色蛍光、橙色蛍光、赤色蛍光と呼ばれる。蛍
光データは点プロットとして表示した。各点は単細胞を
意味する。このようにしてＦＡＣＳcanデータを得て表
示するコンピュータ・プログラムは、ベクトン−ジキン
ソン社からのコンソート３０リサーチ ソフトウェア
(Ｃonsort３０ Ｒesearch Ｓoftware)である。さら
に、ＰerＣＰ−アビジン共役体の量子収量と発光スペク
トルは本来のＰerＣＰのものと全く同じである。

蛍光共役体：ＰerＣＰ−アビジンの製造 本発明の蛍光共役体のサンプルとして、 ＰerＣＰ−アビジン共役体を製造した。ＰerＣＰに２−
イミノチオランを添加して、チオール化ＰerＣＰ(Ｐer
ＣＰ−ＳＨ）を製造した。Ｎ−スクシニミジル−３−
(２−ピリジルジチオ)−プロピオネート(ＳＰＤＰ)を加
えることによって、２−ピリジルジスルフィド基含有活
性化アビジン(IgG−Ｓ−Ｓ−Ｐyr)を製造した。蛍光共
役物 (ＰerＣＰ−Ｓ−Ｓ−Ｐyr)はＰerＣＰ−ＳＨとＩgＧ−
Ｓ−Ｓ−Ｐyrを混合することによって得られた。生成物
をファルマシアＦＰＬＣスーパーローズ(Ｐharmacia
ＦＰＬＣ Ｓuperose)１２上でのゲルクロマトグラフィ
ーによって分析した。このゲル過カラムは分子を主と
してそれらの流体力学的半径に応じて分離する。反応生
成物のＰerＣＰ−Ｓ−Ｓ−アビジンはいずれの成分より
も大きいので、カラムからいずれの反応物よりも迅速に
流出する。

蛍光共役体：ＰerＣＰ−ＩgＧの製造 ＰerＣＰ−ＩgＧ共役体の合成によって、 ＰerＣＰの他の分子への結合の第２例を提供する。Ｉg
ＧはＳＰＤＰの添加によって活性化する。次にチオール
化ＰerＣＰ上のスルフヒドリル基が活性化ＩgＧ分子の
ジスルフィド基と反応した。

ＰerＣＰ−アビジンのビオチニル化ビーズ標識への利用 粒子表面に第一アミノ基を有するポリスチレンビーズを
ビオチン−スクシンイミドによってビオチニル化した。
複合体−アビジン共役体の蛍光はこれらのビーズ１０⁶
をリン酸塩緩衝化食塩水(ＰＢＳ)１００μ中でアビジ
ン共役体によって、すなわちアビジン共役体の溶液(約
0.1mg／ｍ）１０μによって処理することによって
試験した。ビーズをＰＢＳ中の遠心処理によって洗浄し
て、非結合複合体を除去した。共役体のＰerＣＰ複合体
蛍光をベクトン−ジキンソン社から市販されているＦＡ
ＣＳcan機器によって検出した。処理ビーズ(アビジンＰ
erＣＰ複合体による)及び非処理ビーズに対する機器の
蛍光−３チャンネルの蛍光強度ヒストグラムは、ＰerＣ
Ｐ複合体がＦＡＣＳの蛍光標識としての使用に適してい
ることを示した。

３色免疫蛍光、ＰerＣＰ−Ｌeu−３による染色実験 ベクトン−ジキンソンＦＡＣＳcanフローサイトメータ
ーに備えられた応用シート「ヒト末梢血からの単細胞懸
濁液の調製」に述べられている通りに、ヒト単核末梢血
細胞を調製した。単球除去は省略した。細胞懸濁液を２
×１０⁷細胞／ｍの濃度に調節した。この懸濁液５０
μを混合したＬeu−３a−ＰerＣＰ，Ｌeu−１２−Ｐ
Ｅ(フィコエリスリン)及びＬeu−２a−ＦＩＴＣ(フルオ
レセインイソチオシアネート)の滴定量に加え、氷上で
２０分間インキュベートした。リン酸塩緩衝化食塩水
(ＰＢＳ)１ｍを加え、細胞を８００×ｇ、５分間の遠
心処理によって洗浄した。上清を除去した後に、細胞ペ
レットをＰＢＳ１ｍ中に再懸濁して分析した。

または、細胞をＬeu−３a−ＰerＣＰの代りに、Ｌeu−
３a−ビチオンによって染色し、洗浄し、次にアビジン
−ＰerＣＰによって染色して、細胞とＬeu−３a−ビオ
チンとの反応を検出した。他の細胞サンプルをアビジン
−ＰerＣＰのみによって染色して、染料−アビジン共役
体の非特異的結合性を調べた。

分析はベクトン−ジキンソンＦＡＣＳcanフローサイト
メーターを用いて実施した。この機器は５３０nm(ＦＩ
１；ＦＩＴＣ)、５７５nm(ＦＩ２；ＰＥ)及び６４０nm
以上(ＦＩ３；ＰerＣＰ)において前方散乱、側方散乱、
蛍光発光を測定する。ベクトン−ジキンソン社からのコ
ンソート３０によって、データ分析を実施した。リンパ
球を前方散乱が低く、側方散乱の低い集団にゲーティン
グ(gating-in)することによって選択した(第１図)。非
染色細胞のＦ１３ヒストグラム(第２図)とアビジン−Ｐ
erＣＰのみによって染色した細胞のヒストグラム(第３
図)との比較は、２−チャンネルシフトのみによって明
示される非特異的結合が無視できることを示す。Ｌeu−
３a−ＰerＣＰとＬeu−３a−ビオチン−アビジン−Ｐer
ＣＰ染色実験の非染色集団は、第２図に比べて、１３−
チャンネルシフト(第４図，第５図)を示す。Leu-2a-R.P
Eとの比較においては６チャンネルのシフトが観察され
(第６図および第７図)、また、Leu-2a-FITCとの比較に
おいては１１チャンネルのシフトが観察される(第８図
および第９図)。これらのデータは、 ＰerＣＰ標識抗体による非特異的染色がＦＩＴＣ標識抗
体及びＲ．ＰＥ標識抗体によって見られる非特異的染色
に比べて無視できることを示す。これらの図の右側部分
に示した特異的結合は非特異的結合から容易に区別され
る。

ＰerＣＰ共役体のフィコエリスリン共役体を凌駕する利
点は蛍光スペクトルの多色補正ネットワークのセッチン
グの検査から明らかである。第１０図に示した実験で
は、ＰＥ蛍光を検出するチャンネルへのフルオレセイン
蛍光の６３％漏出が生じ、フルオレセインチャンネルへ
のＰＥ蛍光の0.1%漏出が生ずる。ＰerＣＰチャンネルに
は４８％ＰＥ蛍光が存在し、ＰＥチャンネルにはＰerＣ
Ｐ蛍光が存在しない。第１表における蛍光発光スペクト
ルによるスペクトルオーバーラップは、フルオレセイン
チャンネル中にＰerＣＰ蛍光が存在せず、ＰerＣＰチャ
ンネル中のフルオレセイン蛍光が１％未満であることを
示している。

これは、蛍光染料組合せフルオレセインと ＰerＣＰが殆んど補正を必要としない２色免疫蛍光系に
使用できることを実証する。蛍光補正は多色免疫蛍光分
析において主要な厄介な問題であった。

フルオレセイン、フィコエリスリン及び ＰerＣＰを用いる３色−免疫蛍光を第１１図に示す。フ
ルオレセイン・チャンネル(ＦＩ１)はα−Ｌeu−２a結
合を検出してサプレッサーリンパ球を確認し、フィコエ
リスリン・チャンネル(ＦＩ２)はα−Ｌeu−１２結合を
検出して、Ｂ細胞リンパ球を確認し、ＰerＣＰチャンネ
ル(ＦＩ３)はＬeu−３a結合を検出してヘルパー細胞リ
ンパ球を確認する。パネルＡ参照のこと。第１１図のパ
ネルＢ〜Ｄのヒストグラムは種々なチャンネルを比較
し、染色細胞と非染色細胞の明確な分離を実証し(マー
カーによって示す)、この３染料組合せの３色免疫蛍光
への有用性を示唆する。

この明細書に引用した刊行物と特許出願の全ては本発明
が含まれる技術分野の熟練者の技術レベルを示してい
る。個々の刊行物または特許出願が特に個別に参考文献
として関与することが示されているとしても、全ての刊
行物と特許出願は同程度にここに参考文献として関与す
る。

本発明を完全に説明したが、本発明の本質または特許請
求の範囲から逸脱することなく、多くの変化及び修正が
行われうることは当業者にとって自明のことである。

図面の簡単な説明 第１図は実施例で用いるリンパ球の選別を示すヒストグ
ラムであり； 第２図は第３図と比較するための非染色細胞のヒストグ
ラムであり； 第３図はアビジン−ＰerＣＰのみによって染色した細胞
のヒストグラムであり； 第４図はＬeu−３a−ＰerＣＰによって染色した細胞の
ヒストグラムであり； 第５図はＬeu−３a−ビチオン−アビジン−ＰerＣＰに
よって染色した細胞のヒストグラムであり； 第６図は第７図と比較するための非染色細胞のヒストグ
ラムであり； 第７図はＬeu−１２−Ｒ．ＰＥによって染色した細胞の
ヒストグラムであり； 第８図は第９図と比較するための非染色細胞のヒストグ
ラムであり； 第９図はＬeu−２a−ＦＩＴＣによって染色した細胞の
ヒストグラムであり； 第１０図はフルオレセイン(ＦＩ１)、フィコエリスリン
(ＦＩ２)及びＰerＣＰ(ＦＩ３)に対する交差チャンネル
漏出(spillover)を示す、種々の蛍光チャンネルの点プ
ロット・シリーズであり； 第１１図は第１０図の標識を用いた３色免疫蛍光検定法
からの４ヒストグラム・シリーズである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭58−86459（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−96458（ＪＰ，Ａ) 特開 昭53−71898（ＪＰ，Ａ) Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃ ｔａ．，Ｖｏｌ．495，Ｐ220−231（1977)

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】相互に特異的に結合する２種類の生化学的
   分子を含む特異的結合対の１要素に結合した蛍光化合物
   共役体を試薬として用い、前記共役体を相補的結合対要
   素に結合させる段階を含む診断検定法において、 前記試薬として前記特異的結合対の１要素に結合したペ
   リジニン−クロロフィル蛋白質複合体を用いることを特
   徴とする方法。
2. 【請求項２】第２要素として細胞または細胞表面抗原を
   含む特異的結合対の１要素に対する蛍光標識としてペリ
   ジニン−クロロフィル昼白質複合体を用いる、請求項１
   記載の診断検定方法。
3. 【請求項３】前記複合体としてペリジニン−クロロフィ
   ルa-蛋白質複合体を用いる、請求項１記載の診断検定方
   法。
4. 【請求項４】前記試薬として前記結合対の１要素である
   免疫グロブリンに結合したペリジニン−クロロフィルa-
   蛋白質複合体を用いる、請求項１記載の診断検定方法。
5. 【請求項５】相互に特異的に結合する２種類の生化学的
   分子から成る特異的結合対の１要素に結合したペリジニ
   ン−クロロフィル−蛋白質複合体から成る蛍光化合物。
6. 【請求項６】前記要素が蛋白質である、請求項５記載の
   化合物。
7. 【請求項７】前記特異的結合対要素が細胞表面レセプタ
   または抗原に結合する、請求項６記載の化合物。
8. 【請求項８】前記特異的結合対要素が抗体であり、前記
   特異的結合対が前記抗体と前記抗体が特異的に結合する
   抗原とから成る、請求項７記載の化合物。
9. 【請求項９】前記複合体がペリジニン−クロロフィルa-
   蛋白質複合体である、請求項５記載の化合物。
10. 【請求項１０】前記特異的結合対要素が抗原であり、前
    記特異的結合対が前記抗原と前記抗原に対して特異的な
    抗体とから成る、請求項５記載の化合物。