MC2072A1

MC2072A1 - Procede pour la preparation d'une proteine hybride

Info

Publication number: MC2072A1
Application number: MC892075A
Authority: MC
Inventors: W Ju Grace
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1988-11-17
Filing date: 1989-11-15
Publication date: 1990-10-03
Also published as: AU4474589A; ZA898139B; EP0369316A2; IL92316A0; FI895456A0; PT92335A; EP0369316A3; HUT52154A; JPH02273193A; FI895456A7; YU219289A; HU895908D0; DK570589D0; NO894573L; CA2002854A1; DK570589A; NO894573D0

Description

Procédé pour la préparation d'une protéine hybride.

La présente invention concerne des protéines hybrides composées d'un polypeptide interleukine-2 (IL-2) humaine et d'un polypeptide agissant comme une immunotoxine. Ces protéines de fusion sont utiles comme agents thérapeutiques pour le traitement de maladies telles que la thyroldite autoimmune, le diabète type I, la polyarthrite rhumatoide et la maladie de Crohn, dans lesquelles les cellules portant des récepteurs IL-2 (cellules IL-2R positives) sont supposées être impliquées dans la régulation aberrante de la réponse immunitaire. Ces protéines de fusion immunotoxiques sont utiles également pour la suppression de la réponse immunitaire dans des cas de rejet d'allogreffes et de transplants d'organes.

Lorberboum-Galski et al,, Proo. Natl. Acad, Soi. USA, 1922-1926 (1988) ont décrit le clonage et l'expression de la protéine chimérique Asp2lL2-exotoxine de Pseudomonas (Asp2lL2-PE40) dans E. coli. Dans cette protéine de fusion, IL-2 remplace le domaine de reconnaissance des cellules au niveau de l'exotoxine de Pseudomonas (PE 40) ou, en d'autres termes, la protéinede fusion a une séquence d'interleukine-2 humaine recombinante à l'extrémité amino terminale et l'extrémité carboxy terminale de ladite protéine de fusion comprend la séquence d'acides aminés d'une molécule PE dépourvue du domaine I. Une molécule PE dont le domaine I a été délété (= PE 40)

2

10

15

20

25

30

35

possède une pleine activité ADP-ribosylante mais une activité de destruction cellulaire extrêmement faible à cause de la perte du domaine de reconnaissance des cellules. La molécule IL-2 à l'extrémité amino terminale de la protéine de fusion est complètement exposée et conserve son activité biologique et fournit un domaine de reconnaissance des cellules différent de celui présent dans PE. Comme résultat du procédé de préparation de la protéine chimérique, un résidu d'acide aspartique est inséré entre l'alanine et la proline en positions 1 et 2 de la molécule IL-2 rendant ainsi la partie IL-2 de la molécule "non-naturelle" à l'extrémité amino terminale. Une isoleucine codée par synthèse est utilisée pour lier la thréonine en position 131 de IL-2 à l'extrémité amino terminale de la molécule toxine, c'est-à-dire PE 40 (proline en position 251 de PE). Une autre description de la production de la protéine de fusion Asp2lL2-PE est donnée dans la Demande de Brevet Européen, Publication n° 261 271, publiée le 30 mars 1988. La protéine de fusion Asp2lL2-PE40 présente une activité cytotoxique pour les cellules portant des récepteurs IL-2.

Le vecteur pHL310 utilisé par Lorberboum-Galski et al. (voir plus haut) pour l'expression de la protéine de fusion Asp^IL2-PE conduit à un peptide avec la séquence amino terminale Met-Ala^-Asp^Pro^hr4... qui diffère de la séquence trouvée dans l'IL-2 humaine naturelle (Robb et al., Proc. Natl. Acad. Soi. USA, âl, 6486-6490 [1984]). De plus, le vecteur pHL310 n'a pas permis l'expression de taux élevés de protéine. Pour corriger ces deux problèmes, la stratégie illustrée sur la figure 1 a été utilisée pour créer un vecteur d'expression qui programmerait la synthèse de taux très élevés de la protéine de fusion et coderait pour une protéine de fusion avec une extrémité amino terminale ressemblant plus à celle du l'IL-2 humaine, c'est-à-dire Met-Ala^-Pro^Thr^. , . ,

3

10

15

20

25

30

35

Ainsi, la présente invention propose une protéine hybride immunotoxine IL2-PE humaine reoombinante qui se distingue en oe qu'elle possède une séquence IL-2 naturelle à son extrémité amino terminale en comparaison de la protéine de fusion Asp2lL2-PE40 décrite dans la profession. La protéine hybride immunotoxine possède une séquence interleukine-2 humaine recombinante à l'extrémité amino terminale et l'extrémité carboxy terminale de ladite protéine hybride comprend la séquence d'un domaine d'exotoxine de Pseudomonas, de préférence exotoxine de Pseudomonas 40 caractérisée en oe que la séquence amino terminale de ladite interleukine-2 est identique à la séquence amino terminale de 1'interleukine-2 humaine naturelle. La protéine hybride immunotoxine- peut éventuellement comprendre un résidu méthionine supplémentaire à l'extrémité N-terminale. Au mieux, la protéine hybride immunotoxine est sous une forme essentiellement homogène. En outre, la présente invention propose un ADN codant pour une telle protéine hybride immunotoxine et un vecteur recombinant contenant un tel ADN. Au mieux, le vecteur recombinant est un plasmide. Un microorganisme hôte unioellulaire transformé par un tel vecteur ou plasmide recombinant est capable d'exprimer une protéine hybride IL2 humaine-PE normalisée. Le microorganisme hôte unioellulaire est de préférence un hôte bactérien classique, tel que, de préférence, E. ooli.

Le vecteur parent choisi pour la construction du plasmide décrit dans l'exemple est dérivé du plasmide connu pRC233/IL-2/delta tet, qui est un plasmide d'environ 3 paires de kilobases (kb) qui contient la séquence codante d'ADNc complète d'IL-2 humaine en aval (3') des séquence régulatrices du promoteur du bactériophage lambda P^. Le plasmide pRC233/IL-2/delta tet est capable d'exprimer l'IL-2 humaine recombinante dans un hôte E. coli à des taux élevés. Le plasmide est décrit dans la Demande de Brevet Européen, Publication n# 147 819, publiée le 10 juillet 1985. Une autre description de la

préparation et de l'utilisation de oe plasmide pour produire l'IL-2 humaine reoombinante est donnée par Ju et al. dans J Biol. Chem. 261, 5723-5731 (1987).

Ainsi, les protéines hybrides de la présente invention sont produites en utilisant les méthodes de la technologie de l'ADN recombinant. Ainsi, un microorganisme hôte unioellulaire contenant un vecteur recombinant comprenant une séquence d'ADN codant pour ladite protéine hybride est fermenté, c'est-à-dire cultivé dans des conditions convenant à l'expression de ladite séquence d'ADN et la protéine hybride produite par le mioroorganisme unioellulaire est isolée à partir de la culture.

Un tel microorganisme hôte unioellulaire peut être un procaryote ou 'un eucaryote. Un grand nombre de ces microorganismes hôtes unicellulaires se trouvent dans le commerce ou peuvent être obtenus librement dans des collections comme 1'"American Type Culture Collection" (ATCC), 12301 Parlawn Drive, Rockville, Maryland, USA. Des exemples de procaryotes sont des bactéries, notamment E. coli [p.ex. E. coli M15 décrit comme DZ291 par Villarejo et al. dans J. Bacteriol., 120. 466-474 (1974), E. coli 294 (ATCC n* 31446), E. coli RR1 (ATCC n" 31343) ou E. coli W3110 (ATCC n* 27325)], des bacilles tels que B. subtilis et des entérobactéres parmi lesquelles on peut mentionner comme exemples Salmonella typhimurium et Serratia marcescens. E. coli souche MC1061 contenant le plasmide pRK248cIts (voir Exemple) est spécialement préféré. Ou encore, des cellules de levures telles que Saccharomyces cerevisiae peuvent être utilisées comme microorganismes hôtes. De nombreux euoaryotes convenant comme mioroorganismes hôtes pour des vecteurs recombinants sont connus du spécialiste. Des cellules de mammifères telles que CV-1 (ATCC n* CCL 70) et des dérivés tels que COS-1 (ATCC n# CRL 1650) ou COS-7 (ATCC n8 CRL 1651) sont utilisées de préférence. De plus, il est possible d'utiliser des cellules d'insectes comme celles décrites par

5

Smith et al. (Mol. Cell. Biol. 2, 2156-2165 [1983]).

Diverses méthodes pour l'introduction de vecteurs reoombinants dans des microorganismes hôtes unicellulaires sont connues. Des exemples de telles méthodes sont la micro-injection, la transfection ou la transduotion, Le spécialiste en la matière n'a pas de difficulté à choisir la méthode qui convient le mieux pour le microorganisme hôte spécifique utilisé.

Les vecteurs recombinants utilisés dans la présente invention sont des vecteurs contenant un ADN codant pour une protéine hybride immunotoxine de-la présente invention. Cet ADN peut être synthétisé par des méthodes chimiques classiques, par exemple par la méthode des phosphotriesters qui est décrite par Narang et al. dans Meth. Enzymol. èSL, 90-108 [1979] ou par la méthode des phosphodiesters (Brown et al., Meth. Enzymol, ££, 109-151 [1979]). Dans les deux méthodes de longs oligonucléotides sont d'.abord synthétisés, puis liés ensemble d'une manière prédéterminée. La séquence nucléotidique de l'ADN peut être identique aux séquences nucléotidiques naturelles ou bien elle peut être partiellement ou complètement différente. Ce ci est dû au fait que le code génétique est dégénéré, ce qui signifie qu'un acide aminé peut être codé par plusieurs codons. Les codons choisis peuvent être adaptés à l'usage des codons préférés du microorganisme hôte utilisé pour exprimer la protéine hybride immunotoxine (Grosjean et al., Gene 1£, 199-209 [1982]). Il faut veiller à ce que l'ADN obtenu de cette façon ne contienne pas de séquences partielles qui rendent difficile la construction du vecteur reoombinant, par exemple en introduisant un site de clivage d'enzyme de restriction indésirable, ou qui empêche l'expression du polypeptide.

35

De nombreux vecteurs comme ceux mentionnés dans la Demande de Brevet Européen, Publication n* 200 986 peuvent être utilisés

pour la construction de vecteurs reoombinants mentionnés plus haut. Ces vecteurs contiennent les éléments nécessaires à la transcription et à la traduction de l'ADN codant pour la protéine hybride immunotoxine de même que les éléments nécessaires au màintien et à la réplication du vecteur dans l'hôte. Le choix d'un vecteur approprié pour la construction des vecteurs recombinants de la présente invention et le choix d'un microorganisme hôte unioellulaire compatible avec lesdits vecteurs recombinants entrent dans le cadre des compétences d'un spécialiste en la matière.

Les vecteurs recombinants de la présente invention sont préparés de préférence en modifiant des vecteurs recombinants contenant un ADN codant pour une protéine hybride immunotoxine en utilisant la méthode de mutagenèse spécifique de sites dirigée par des oligonucléotides décrite par Morinaga et al., Bio/Technology 2., 636-639 (1984). Un exemple d'un tel vecteur recombinant comprenant un ADN codant pour une protéine hybride immunotoxine est le plasiqide pHL310 mentionné plus haut.

La façon dont l'expression de la protéine hybride immunotoxine selon l'invention est réalisée dépend du vecteur d'expression et du microorganisme hôte utilisé. Habituellement, les microorganismes hôtes qui contiennent le vecteur d'expression sont cultivés dans des conditions qui sont optimales pour la croissance du mioroorganisme hôte. Vers la fin de la phase exponentielle de croissance, lorsque l'augmentation du nombre de cellules par unité de temps diminue, l'expression de la protéine hybride immunotoxine est induite, o'est-à-dire que l'ADN codant pour la protéine est transcrit et l'ARNm transcrit est traduit. L'induction peut être réalisée en ajoutant un inducteur ou un dérépresseur au milieu de croissance ou en modifiant un paramètre physique, par exemple par un changement de température.

La protéine hybride immunotoxine produite dans le microorganisme hôte peut être sécrétée par la cellule par des mécanismes de transport spéciaux ou bien elle peut être isolée en faisant éclater la cellule. La cellule peut être rompue par des moyens mécaniques (Charm et al., Meth. Enzymol. 21, 476-556 [1971]), par traitement enzymatique (par exemple, traitement par un lysozyme) ou par des moyens chimiques (par exemple, traitement par un détergent, traitement par l'urée ou la guanidine-HCl, etc.) ou par une combinaison de ces procédés.

Chez les eucaryotes, les polypeptides qui sont sécrétés par la cellule sont synthétisés sous forme d'une molécule précurseur. Le polypeptide mature se forme par séparation du peptide dit peptide signal. Etant donné que les mioroorganismes hôtes procaryotes ne sont pas capables de séparer les peptides signaux eucaryotes des molécules précurseurs, les polypeptides eucaryotes doivent être exprimés directement sous leur forme mature dans les microorganismes hôtes procaryotes. Le signal de début de traduction AUG,, qui correspond au codon ATG au niveau de l'ADN, fait que tous les polypeptides sont synthétisés dans un microorganisme hôte prooaryote avec un résidu méthionine à l'extrémité N-terminale. Dans certains cas, suivant le système d'expression utilisé et éventuellement suivant le polypeptide devant être exprimé, oe résidu méthionine N-terminal est séparé.

La protéine hybride immunotoxine de la présente invention peut être purifiée jusqu'à une homogénéité essentielle par des méthodes connues, par exemple, par centrifugation à différentes vitesses, par précipitation au sulfate d'ammonium, par dialyse (sous pression normale ou sous pression réduite), par focalisation isoélectrique préparative, par éleotrophorèse sur gel préparative ou par diverses méthodes ohromatographiques, notamment filtration sur gel, chromatographie liquide haute performance (HPLC), chromatographie par échange d'ions, chromatographie en phases inversées et chromâtographie par

e affinité (par exemple, sur Sepharose™ Blue CL-6B ou sur IL-2R liée à un support ou des anticorps monoclonaux dirigés contre IL-2 ou l'exotoxine de Pseudomonas).

La protéine hybride immunotoxine purifiée de la présente invention peut être utilisée d'une manière connue en soi pour le traitement de maladies telles que la thyroïdite autoimmune, le diabète type I, la polyarthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn et d'autres maladies où une régulation aberrante de la réponse immunitaire est supposée être impliquée. La protéine hybride immunotoxine est utile également pour la suppression de la réponse immunitaire dans des cas de rejet d"allogreffes et de transplants d'organes.

Les protéines hybrides immunotoxines préparées conformément à cette invention peuvent être administrées à des mammifères à sang chaud aux fins cliniques indiquées plus haut. Pour l'administration, ■ toute méthode classique peut être utilisée, notamment l'administration parentérale par voie intraveineuse, sous-cutanée ou intramusculaire. La dose nécessaire variera évidemment en fonction de l'état particulier traité, de la gravité de l'état, de la durée du traitement et du mode d'administration. Une forme convenant à l'emploi pharmaceutique peut être obtenue à partir d'une protéine lyophilisée, filtrée pour la rendre stérile, reconstituée avant l'emploi d'une manière habituelle. Cela entre également dans le cadre des compétences du spécialiste en la matière de préparer des compositions pharmaceutiques contenant une protéine hybride immunotoxine de la présente invention en mélangeant ladite protéine hybride immunotoxine avec des véhicules compatibles pharmaceutiquement acceptables tels que tampons, stabilisants, bactériostatiques et autres excipients et additifs habituellement utilisés dans des formes pharmaceutiques pour administration parentérale. La présente invention ooncerne également ces compositions pharmaceutiques.

9

Cette invention ayant été décrite d'une façon générale, elle peut être plus facilement comprise en se référant à l'exemple suivant lorsqu'il est considéré en relation avec les 5 croquis suivants, où

La Figure 1 montre schématiquement (le tracé n'est pas fait à l'échelle) la construction du plasmide de la présente invention utilisé pour l'expression d'une protéine de fusion

10 appelée IL2-PE40, comprenant une IL-2 humaine ayant une extrémité amino terminale correspondant à la séquence d'une IL-2 humaine authentique et un domaine de toxine souhaitée de PE, o'est-â-dire PE40.

1 5

La Figure 2 représente la séquence d'acides aminés de la protéine hybride Asp2lL2-PE comme prévu d'après la séquence d'ADN du clone d'ADNc utilisé dans la préparation du plasmide pHL310 de la technique antérieure.

20

La Figure 3 montre les 15 premiers résidus d'acides aminés obtenus lors du séquençage de la protéine hybride IL2-PE40 produite par expression du plasmide pRC233/IL-2/PE40/desASp2 de la présente invention.

? 5

La Figure 4 montre un schéma de purification de IL2-PE40.

Il est bien entendu que l'exemple suivant est donné uniquement à. titre d'illustration et ne doit pas être considéré comme limitant cette invention de quelque façon que oe soit à la descriotion qui y est donnée.

35

{

10

Exemple

20 microgrammes d'ADN de pRC233/IL-2/delta tet ont été digérés avec Tth 111 I (New England Biolabs, Mass., U.S.A.), puis comblés avec 4 désoxyribonuoléotide triphosphates (dNTP) en utilisant l'ADN polymérase de Klenow (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, Maryland, U.S.A.), Après extraction au phénol, l'ADN a été digéré complètement avec Xba I (Boehringer Mannheim, Mannheim, RFA). Le fragment Xba I/Tth 111 I de 2,6 kb comblé a été isolé par élution après éleotrophorèse sur agarose de bas point de fusion purifiée en utilisant une colonne Elutip (Schleicher & Schuell, Keene, New Hampshire, U.S.A.). Environ 2 microgrammes d'ADN du vecteur ont été récupérés.

Le fragment d'insertion était dérivé du plasmide pHL310 (Demande de Brevet Européen, Publication n8 261 671). Ce plasmide contient les séquences Asp2lL2-PE40 situées en aval du promoteur du bactériophage T7. 20 microgrammes d'ADN de pHL310 ont été digérés complètement avec Eco RI (New England Biolabs), puis comblés avec 4 dNTP et l'ADN polymérase de Klenow. Après extraction au phénol, l'ADN a été digéré complètement avec Xba I. Le fragment de 1,4 kb a été purifié comme décrit ci-dessus pour le fragment du vecteur. Environ 1,2 microgrammes d'ADN d'insertion ont été récupérés.

Pour construire le vecteur d'expression recombinant, 320 nanogrammes du fragment de 1,4 kb (pHL310, Xba I/Eco RI comblé) ont été mélangés avec 50 nanogrammes d'ADN du vecteur (pRC233/IL-2/delta tet, Tth 111 I comblé). Ces ADN ont été liés dans un tampon PL (6,5 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 0,1 M de NaCl, 4,5 mM de MgCl2/ 100 mM de 2-mercaptoéthanol) en présence de 1,0 mM d'ATP et d'ADN ligase de T4 (New England Biolabs). La réaction dè ligation a été incubée à 15#C pendant 2 heures. Un supplément d'ADN ligase de T4 a été inclus dans la réaction et le mélange a ensuite été incubé à 48C pendant 18 heures. Le

11

mélange de ligation a été chauffé à 65°C pendant 5 minutes pour inactiver la ligase, puis digéré avec Tth 111 I pour linéariser tout ADN du vecteur parent restant. Une partie du mélange de ligation a ensuite été transformée dans des cellules E. coli 5 MC1061 compétentes contenant le plasmide pRK248cIts. La souche MC1061 d'E. coli et le plasmide pRK248cIts sont disponibles à 1'"American Type Culture Collection", leurs numéros de dépôt étant respectivement ATCC n" 53338 et ATCC n° 33766. La souche hôte E. coli MC1061 et le plasmide compatible pRK248cIts, qui 0 code pour le répresseur thermosensible du promoteur P^, sont connus du spécialiste en la matière et ont été décrits respectivement par Casabadan et al., J. Mol. Biol. 138. 179-207 [1980] et par Bernard et al., Methods Enzymol. 482-492

[1979]. Les cellules d'E. coli ont été rendues compétentes conformément au procédé décrit par Maniatis et al., dans "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory U.S.A., pp. 249-255 [1982].

Les colonies obtenues ont été triées pour le vecteur recombinant correct par préparation de minilysats d'ADN plasmidique (Miniatis et al., voir plus haut, pp. 366-369) et digestion de restriction avec Eco RI, Xba I et Bgl II. Deux colonies contenant le plasmide approprié (désigné pRC233 / IL-2 / PE40 / desASP^) ont de plus été analysées pour la production de protéines, Les deux colonies (appelées # 4 et # 5) ont été cultivées à 30*C jusqu'à la DOôqo = 0/5, puis les cultures ont été passées à 42*C jusqu'à la DOgQQ = 1,0 pour induire la synthèse protéique. Des pellets des cellules induites ont été extraits par lyse dans un tampon typede Laemmli (Laemmli, Nature 227. 680-685 [1970]) comme décrit par Ju et al., voir plus haut, L'analyse des pellets par électrophorèse en gel de polyacrylamide a montré que les deux cultures ont produit la protéine attendue de 54 kilodaltons, qui n'était pas présente dans les cultures non induites. Il a été trouvé également que l'extrait du clone # 4 contient une bioaotivité appréciable lors

C

12

de l'essai avec des cellules CTLL murines et d'autres cellules. On peut trouver ci-dessous une description détaillée de l'essai utilisé et des résultats obtenus.

5 La culture du clone # 4 contenant le plasmide pRC233 /

IL-2 / PE40 / desASp2 a été utilisée pour ensemencer une charge de fermentation de 20 litres. Les cellules de cette fermentation ont été traitées comme décrit pour extraire et purifier la protéine de fusion IL2-PE40. Le schéma global de purification 0 pour IL2-PE40 est représenté à la figure 4.

Pour les phases de solubilisation et de renaturation, toutes les opérations ont été menées à 2-8°C, sauf indication différente. Les cellules d'E. coli congelées ont été dégelées et mises en suspension dans 50 mM de Tris-HCl, pH 8,0 contenant 1 mM d'EDTA (4 ml/g de cellules). La suspension cellulaire a été traitée aux ultrasons 6 fois pendant 30 secondes avec un Sonifier Cell Disruptor 350 (Branson Sonic Power Co., Farmingdale, New York, U.S.A.), Les cellules désagrégées ont été ° centrifugées à 10 000 x g pendant 20 minutes dans une centrifugeuse Sorvall RC-5 (Dupont, Wilmington, Delaware, U.S.A.) avec un rotor SS-34 et le culot a été recueilli. Le culot a été mis en suspension dans 5 ml/g de cellules d'une solution de 7 M de guanidine HC1 (GuHCl) dans 0,1 M de Tris-HCl, pH 8,0 contenant 1 mM d'EDTA et 1 mM de dithiothreitol (DTT), et il a été traité aux ultrasons comme précédemment. Le mélange a été agité pendant 60 minutes et le surnageant a été recueilli par centrifugation. Il a été dilué 80 fois avec PBS (solution 3 saline tamponnée aux phosphates, pH 7,4, Whittaker M. A. Bioproduots, Walkersville, Maryland, U.S.A.) et agité pendant une nuit. L'extrait dilué a été clarifié par centrifugation à 24.000 x g pendant 20 minutes avec un rotor GSA ou filtré sur un filtre de 0,8/0,2 p..

L'extrait clarifié a été utilisé comme substance de départ

C

13

pour la purification d'IL2-PE40 par affinité aux récepteurs, cette purification étant suivie de ohromatographie par échange de cations et par exclusion de taille. L'activité IL2-PE40 dans l'extrait d'E. coli se lie quantitativement à la colonne des récepteurs comme indiqué par l'absence d'activité dans le liquide traversant les matériaux. Environ 98% de l'activité IL2-PE40 liée sont récupérés de la colonne des récepteurs. Les données de la ohromatographie à perméation des gels, l'analyse par GPA-SDS dans des conditions de réduction et de non réduction de même que les résultats de l'essai biologique ont indiqué la présence d* "agrégats" d'IL2-PE40 réductibles et biologiquement inactifs dans le produit purifié par affinité aux récepteurs en même temps que la forme monomère soluble biologiquement active d'IL2-PE40. Lorsque le produit purifié par affinité aux récepteurs est dialysé contre un tampon pH 5,0, les substances inaotives. précipitent en majeure partie. La ohromatographie par échange de cations élimine un contaminant non protéique absorbant fortement dans l'UV = 260 nm), qui ne se lie pas

à la colonne de l'échangeur de cations. Cette étape entraîne une augmentation de l'activité spécifique. La préparation d'IL2-PE40 est exempte de contaminants de haut poids moléculaire comme on peut en juger d'après les résultats de 1'éleotrophorèse sur GPA-SDS dans des conditions de non réduction. Bien qu'aucune augmentation significative de pureté ne s'observe, la perméation des gels est utile pour éliminer les contaminants de bas poids moléculaire et 1 'èndotoxine. La préparation finale ne contient pas de concentration décelable d"endotoxine, lorsque l'étape de filtration sur gel est menée dans des conditions aseptiques. Cette étape est également un moyen pratique d"échanger l'IL2-PE40 dans le tampon de stockage final.

Les procédés de production et de purification d'une forme soluble d'IL-2R(p55), appelée IL-2R-A-Nae ont été décrits par Hakimi et al., J. Biol. Chem. 2èl, 17336-17341 [1987], L'IL-2R purifié a été immobilisé en utilisant le NuGel P-AF

14

Poly-N-hydroxy-succinimide (500 , 50 |im, Séparation Industries, Metuchen, New Jersey, U.S.A.) à une densité de couplage de 1,05 mg/ml de gel et utilisé comme adsorbant d'affinité pour la purification d'IL2-PE40, comme décrit par Bailon et al., Bio/Technology ji, 1195-1198 (1987).

Quarante millilitres de gel IL-2R immobilisé ont été chargés sur une colonne Amicon G-22 x 250 équipée de deux adaptateurs (Amicon, Div. ff.R. Grâce & Co., Danvers, Mass., U.S.A.). La colonie a été équilibrée avec une solution saline tamponnée aux phosphates (PBS). Sept litres d'extrait (la moitié de l'extrait total obtenu à partir de 35 g de oellules) ont été appliqués sur la colonne à un débit de 7 ml/minute. Les effluents de la colonne ont été contrôlés par un détecteur UV Gilson 111B et enregistrés à l'aide d'un enregistreur Kippen Zonen (Gilson Médical Electronics, Inc., Middletown, tfisconsin, U.S.A.). La colonne a été lavée avec du PBS jusqu'à ce que l'absorbance à 280 nm reprenne sa valeur de base, L'activité IL2-PE40 a été éluée de la colonne avec 3 M de KSCN dans 50 mM de phosphate de potassium, pH 6,0. La solution de KSCN de réserve a été décolorée par filtration sur un filtre de charbon actif avant l'emploi. L'IL2-PE40 éluée a été dialysée contre 2 litres de 50 mM d'acétate de sodium, pH 5,0 dans des tubes à dialyse avec un point limite de poids moléculaire de 12-14.000. Le dialysat a été centrifugé pour éliminer toutes les substances précipitées. Le dialysat limpide était prêt maintenant pour la ohromatographie par échange de cations.

L'IL2-PE40 dialysée de la précédente étape a été chargée sur une colonne CM-Fast Flow de 1,6 x 15 cm (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, New Jersey, U.S.A.), équilibrée avec 50 mM d'acétate de sodium, pH 5,0 à un débit de 3,3 ml/minute. La colonne a été lavée avec le tampon d'équilibrage jusqu'à oe que toutes les substances non adsorbées soient éliminées. L'IL2-PE40 adsorbée a été éluée de la colonne avec

15

0,5 M NaCl dans 50 mM de phosphate de potassium, pH 6,0. Elle a ensuite été concentrée dans une chambre agitée dans un fin canal d'un concentrateur Amicon équipé d'une membrane YM 10.

5 Une colonne Pharmacia K25/100 a été chargée avec du

Sepharose™ CL-6B (Pharmacia LKB Bioteohnology Inc.) à une hauteur de 90 cm. La colonne a été équilibrée avec 50 mM de phosphate de potassium, pH 6,0 contenant 0,15 M de NaCl, à un débit de 0,7 ml/minute. L'IL2-PE40 (20 ml) a été chargée sur la ^ G colonne et développée avec le tampon d'équilibrage. Les opérations de la colonne ont été contrôlées comme décrit dans l'étape d'affinité. Des fractions de six minutes ont été recueillies dans un collecteur de fractions LKB Ultra Rac-7000 (LKB-Produkter, Brômmer, Suède). Le pic correspondant à l'activité IL2-PE40 (~ 54 kDA) a été recueilli et concentré à 0,5-1,0 mg de protéine par ml, filtré sur un filtre de 0,2 n et stocké à l'état congelé à -20#C. L'étape de perméation des gels a été menée dans des conditions aseptiques.

20

La bioactivité de 1'IL2-PE40 de la présente invention peut être examinée in vitro en étudiant son pouvoir d'inhiber la synthèse protéique dans des cellules lymphoïdes portant des récepteurs de haute affinité pour IL-2. Les cellules qui peuvent être utilisées dans ces études comprennent des oellules de la lignée CTLL murine (CTLL est une lignée à long-terme de cellules T murines IL-2 dépendantes pouvant être obtenues à l'ATCC sous le numéro de dépôt TIB 214), des splénocytes murins qui ont été activés pour exprimer des récepteurs d'IL-2 de haute affinité jg (IL-2R) par incubation avec la concanavaline A (Con A) et des lymphocytes de sang périphérique humain qui ont été activés pour exprimer des IL-2R de haute affinité par incubation dans des cultures de leucocytes mélangées (MLC blastes). Comme témoin négatif, on peut utiliser toutes cellules exemptes d'IL-2R, 3 5 comme la lignée du mastocytome P815 murin (ATCC n* TIB 64).

16

Les splénocytes murins activés par Con-A peuvent être préparés en incubant des splénocytes de souris C57BL/5 à une densité de 1 x 10^ cellules/ml dans un milieu de culture contenant 5% de sérum bovin foetal inactivé par la chaleur et 2 Hg/ml de Con A. Après incubation pendant 3 jours à 37°C, les splénocytes ont été récoltés et lavés trois fois dans du milieu frais sans Con A avant d'être utilisés dans l'essai. Pour préparer les MLC blastes humains, des cellules mononucléées du sang périphérique de deux donneurs volontaires normaux sont isolées comme décrit par Gately et al., J. Natl. Can. Inst. £9, 1245-1254 (1982). Les leucocytes d'un donneur ("cellules stimulateurs") sont traitées par 1500 rads de rayons X avant de les mélanger avec les leucocytes du deuxième donneur ("cellules répondeurs"). Les oellules stimulateurs (1 x 10®/ml) et les cellules répondeurs (1 x 10®/ml) sont cultivées ensemble pendant 6 jours au total à 37°C. Le 4ème jour de culture, de l'IL-2 humaine recombinante (rIL-2) est ajoutée à chaque culture à une concentration finale de 50 unités/ml. Le 6ème jour, les cellules sont récoltées et lavées trois fois dans du milieu frais avant l'essai.

Les essais ont été effectués en mélangeant des aliquots de 50 [il de cellules, rIL-2 et IL2-PE40 dans les puits de microplaques à fond plat (par exemple Costar 3596). Le milieu utilisé dans les essais était le milieu essentiel minimal d'Eagle exempt de leuoine, enrichi de 5% de sérum bovin foetal inaotivé par la chaleur, 0,1 mM d'acides aminés non essentiels, 1 mM de pyruvate de sodium, 2 mM de L-glutamine, 5 x 10~5 M de mercaptoéthanol, 10 unités/ml de pénicilline, , 100 |ig/ml de streptomycine et 50 (ig/ml de gentamicine. Les lymphoblastes humains et murins ont été ajoutés à une concentration de 2 x 10^ cellules/puits. Les cultures ont été incubées pendant 24 heures (CTLL et P815) ou'48 heures (lymphoblastes humains et murins) à 37*C. Des aliquots de 25 fil de ^H-leucine (^H-leu), 20 |iCi/ml, ont ensuite été ajoutés à chaque puits. Les cultures ont été

17

incubées pendant 6 heures supplémentaires à 37"C, puis récoltées sur des filtres en fibres de verre. L'incorporation de la %-leucine dans les protéines cellulaires a été mesurée par comptage de scintillation liquide. Toutes les valeurs rapportées sont les moyennes ± SEM d'échantillons mesurés en triple.

Les résultats de l'incubation d'IL2-PE40 avec des cellules CTLL murines, qui portent des IL-2R de haute affinité (IL-2R+) et avec des cellules de mastocytome murin P815, dépourvues d'IL-2R (IL-2R-), sont présentés dans le tableau 1, IL2-PE40 a été un très puissant inhibiteur de la synthèse protéique par les cellules CTLL portant des IL-2R. Une inhibition de 50% de la synthèse protéique par les cellules CTLL a été observée à des concentrations d'IL2-PE40 entre 0,03 ng/ml et 0,15 ng/ml dans ces expériences. Par contre, environ 5 à 6 tig/ml d'IL2-PE40 ont été nécessaires pour provoquer une inhibition de 50% de la synthèse protéique par les cellules P815, dépourvues d'IL-2R. Par conséquent, il y avait une différence de plus de 10.000 fois entre les concentrations d'IL2-PE40 qui étaient toxiques pour une lignée de cellules murines portant des IL-2R et une lignée de cellules IL-2R négatives dans ces expériences. Cela démontre qu'IL2-PE40 était sélectivement toxique pour des cellules portant des IL-2R de haute affinité.

«5

C «s -o

<D r-J

L®i

•o

(D Tf

C O

•H +->

«S

n o m

H 00 Oh f-l t-1

„ E-i plu

M

O O C! f—I

O

w "

t a

M M G

<3 —

O

o

W _,

t-g a*

<m a i " i-1 cr> '—I =L M —

o

a>

cm

CO

m c*

m

H

KO

m r—i o

KO

H

co

GO

Ch co

O

00

CM

00

m

H

r-4

r—1

«J1

r~i

f—l

1—1

•H

+*

•H

-H

+t

-H

00

O

a*

O

o>

r^

m

O

VO

CO

0*

1—1

r—1

CO

ro

CO

co r-

n

M

o

»

«

%

«

%

CM

KO

o

O

m m

r-l ro in

H

m o> m

"^r^fSJOCNJt^^UDr-I eoNpiooocon^ifïii in(Mr-4inr^r>jminHin

•H-H-H-H-H-H-H+t-fi-fl nuif-nriNNinoeo

CllOO'O^plHMlOrl NO>rlH(0>nNinN

M rl n «o H tSJ

NlOO rsj <a

O «3 «n O rl o

OOOOOOOOOOOOOOOOOOO

o o o o o o O O

O O M in i—i

O *o m 00 rl O

a X H

0000000000000000000

O o o o o o o o o O (M

in rl

OOOOOOOOOOOOOOOOOOO HHrIHHHHHH

U5

o

CM

a»

(SI

O

o

M

O

o o

O

en

co i—1

•H

-H

41

-H

en

O

co

00

O

M

o*

O

o

%

«

r-l

«o rH

CO

m

(S!

M

m

CM

O

r-

m in r-i a>

in

UD

o r~l *0

in en n

r-l i-i r-

(SI

in n

tn n en

(SI

r-l

N

CM

r-l r-l

(SI

-H -H

+i

+)

-H

-rl

•H

-H

+!

in io

ID

lD

m ro

O

N

M

in

M

rl in

CM

cr>

lO

O

(M

io

O

•£>

r*-

CM

00

o»

O»

co

%

«

%

co

n en

H

rsj r-J

(SI

o

CM

o

(SI

M

O O O o o oooooooooo

O «O

o lO

ro

CO H

co rl o

O O O O O

o o o o o

o o o o o o o o o o o

(SI

o X

w o o o o o

H rl rl pt o X

w

O (M

OOOOOOOOOO

r~H i—I i—I i—I r—I

o co

19

Le tableau 2 montre les résultats d'études complémentaires dans lesquelles les effets d'IL2-PE40 sur des lymphoblastes murins ou humains primaires ont été examinés, IL2-PE40 a inhibé la synthèse protéique par des splénocytes murins activés par Con,-A, 50% d'inhibition étant observés à environ 4 ng/ml d'EL2-PE40. De même IL2-PE40 a inhibé la synthèse protéique par des lymphoblastes MLC humains avec une concentration inhibitrice à 50% d'environ 11 ng/ml.

20

Tableau 2. Pouvoir d'IL2-PE40 d'inhiber la synthèse protéique par des splénocytes murins activés par Con-A et des lymphoblastes humains activés en cultures mixtes de leucocytes.

sp2 Incorporation de ^H-Leu dans:

rIL-2 IL2-PE40 IL2-PE40 Blastes Con-A Blastes MLC (lig/ml) (ng/ml) (ng/ml) murins humains

Exp

0

763

±

273

10

0

18,135

±

936

10

500

0

1,521

±

96

10

100

0

2 ,765

±

50

10

20

0

4, 579

±

154

10

4

0

8 , 977

±

352

10

0.8

0

14,703

892

10

0

500

1, 900

±

191

10

0

100

2,533

±

84

10

0

20

4,386

■k

70

10

0

4

10,030

±

570

10

0

0.8

14,761

±

1364

Exp . 2a

0

1,837

±

198

10

0

18,744

±

511

10

500

0

1, 740

±

199

10

100

0

4,384

±

180

10

20

0

7 , 450

±

624

10

4

0

12,186

±

822

10

0.8

0

17,198

85 9

25

a Les données présentées dans ce tableau sous les expériences 1 et 2 proviennent des mêmes expériences que les expériences 1 et 2 du tableau 1 .

30

35

21

Dans les expériences mentionnées plus haut, l'activité biologique d'IL2-PE40 a été comparée à celle d'Asp2lL2-PE40 de la technologie antérieure, dans des essais sur des cellules CTLL et P815 murines et des splénocytes murins activés par Con-A (tableaux 1 et 2). Les activités biologiques d'IL2-PE40 et Asp2lL2-PE40 ont été très semblables dans ces études.

Un échantillon d'IL2-PE40 préparé comme ci-dessus a été soumis à une analyse des acides aminés en utilisant un instrument avec une dérivation à la fluoresoamine après la colonne (voir Pan and Stein, Amino Acid analysis with postoolumn fluoresoamine derivatization, in: "Methods of protein miorooharacterization", Shively, J.E. (éd.), The Humana Press Inc., Clifton, New Jersey, U.S.A. [1986]). Avant l'analyse, la protéine a été hydrolysée dans HC1 6 N contenant 4% d'acide thioglycolique à 110*C pendant 20-24 heures sous vide. Les résultats sont résumés dans le tableau 3.

L'échantillon a également été soumis à une analyse séquentielle. Les deux séquences montrées sur la figure 3 ont été obtenues. On a trouvé que 25% de la protéine recombinante dans l'échantillon contiennent un résidu méthionine supplémentaire à l'extrémité N-terminale. Il a été trouvé que la séquence d'acides aminés N-terminale (les 15 premiers acides aminés, sans compter le résidu méthionine N-terminal d'une séquence) correspond à la séquence d'acides aminés N-terminale de l'IL-2 humaine naturelle. Il faut noter que les résultats présentés dans le tableau 3 sont basés sur une analyse préliminaire de l'échantillon. Aucun tampon à blanc n'a été analysé comme témoin et PRO, CYS et TRP n'ont pas été déterminés (ND).

22

Tableau 3. Analyse des acides aminés d'IL-2 PE40

Acide aminé Calculé Déterminé

ASP (D)

40

40.0

THR (T)

29

27. 6

SER (S)

27

25.5

GLU (E)

65

64.2

PRO (P)

32

ND

GLY (G)

41

40.7

ALA (A)

51

51.6

CYS (C)

7

ND

VAL (V)

24

23 .1

MET (M)

4

4.0

ILE (I)

23

21.1

LEU (L)

60

63 . 3

TYR (Y)

14

16 . 2

PHE (F)

15

16.0

HIS (H)

9

9.1

LYS (K)

14

15 . 5

ARG (R)

34

33.3

TRP (W)

6

ND

20

25

30

35

23

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé pour la préparation d'une protéine hybride immunotoxine ayant une séquence d'interleukine-2 humaine

5 recombinante à l'extréminé amino terminale et l'extrémité carboxy terminale de ladite protéine hybride comprenant la séquence d'un domaine d'exotoxine de Pseudomonas, caractérisée en oe que la séquence amino terminale de ladite interleukine-2 est identique à la séquence amino terminale de 1'interleukine-2 Û humaine naturelle et comprend éventuellement un résidu méthionine supplémentaire à l'extrémité N-terminale, procédé qui comprend:

(a) la fermentation de mioroorganismes hôtes unicellulaires transformés avec un plasmide d'expression capable d'exprimer ladite protéine hybride immunotoxine; et

(b) la purification de ladite protéine hybride immunotoxine par des procédés connus dans la profession.

D

2. Procédé pour la préparation d'une protéine hybride immunotoxine selon la revendication 1, dans laquelle ledit domaine d'exotoxine de Pseudomonas à l'extrémité carboxy terminale est l'exotoxine 40 de Pseudomonas, procédé qui

>

comprend la fermentation de microorganismes hôtes unicellulaires transformés avec un plasmide d'expression capable d'exprimer ladite protéine hybride immunotoxine; et

(b) la purification de ladite protéine hybride immunotoxine par des procédés èonnus dans la profession.

3. Procédé pour la préparation d'un microorganisme hôte unioellulaire capable d'exprimer une protéine hybride

(a)

30

24

immunotoxine comme défini dans la revendication 1 ou 2, procédé

3 S • .

qui comprend la transformation d'un, microorganisme hôte

'''tenJïîi ni 'i1 - "

unioellulaire d'une manière connue en soi avec un vecteur reoombinant contenant un ADN codant pour ladite protéine hybride 5 immunotoxine.

4. Procédé/ pour la préparation d'une composition pharmaceutique contenant une protéine hybride immunotoxine comme défini dans la revendication 1 ou 2, procédé qui comprend le

0 mélange de ladite protéine hybride immunotoxine avec un excipient pharmaceutiquement acceptable.

5. Utilisation d'une protéine hybride immunotoxine comme défini dans la revendication 1 ou 2 pour la préparation d'une composition pharmaceutique.

!

6. L'invention telle qu'elle est réalisée et décrite ci-dessus.

3 7. ADN codant pour une protéine hybride immunotoxine comme défini dans la revendication 1 ou 2.

8. Vecteur recombinant contenant un ADN codant pour une protéine hybride immunotoxine comme défini dans la revendication 1 ou 2, vecteur recombinant qui est capable de diriger l'expression de l'ADN dans un microorganisme hôte unicellulaire compatible.

9. Microorganisme hôte unicellulaire transformé avec un vecteur recombinant comprenant un ADN codant pour une protéine hybride immunotoxine comme défini dans la revenication 1 ou 2, microorganisme hôte unicellulaire qui est capable d'exprimer une protéine hybride immunotoxine comme défini dans la revendication 1 ou 2.