JPH02273193A - 組換えインターロイキン―２融合蛋白質類 - Google Patents
組換えインターロイキン―２融合蛋白質類Info
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- JPH02273193A JPH02273193A JP1297759A JP29775989A JPH02273193A JP H02273193 A JPH02273193 A JP H02273193A JP 1297759 A JP1297759 A JP 1297759A JP 29775989 A JP29775989 A JP 29775989A JP H02273193 A JPH02273193 A JP H02273193A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）ポリ
ペプチドと、イムノトキシン（ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ
）として作用するペプチドとから構成される融合蛋白質
類に関するものである。このような融合蛋白質類は、Ｉ
Ｌ−２レセプタを有する細胞（ＩＬ−２Ｒ正細胞）が、
免疫応答の異常制御にかかわっていると考えられている
自己免疫甲状腺炎、タイプｌ ｔＪ！尿病、慢性関節リ
ウマチおよびクローン（Ｃｒｏｈｎ）疾患等の治療のた
めの治療剤として有用である。
ペプチドと、イムノトキシン（ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ
）として作用するペプチドとから構成される融合蛋白質
類に関するものである。このような融合蛋白質類は、Ｉ
Ｌ−２レセプタを有する細胞（ＩＬ−２Ｒ正細胞）が、
免疫応答の異常制御にかかわっていると考えられている
自己免疫甲状腺炎、タイプｌ ｔＪ！尿病、慢性関節リ
ウマチおよびクローン（Ｃｒｏｈｎ）疾患等の治療のた
めの治療剤として有用である。
これらの免疫毒性融合蛋白質は、また、同種移植片およ
び器官移植の拒絶における免疫応答の抑制のためにも有
用である。
び器官移植の拒絶における免疫応答の抑制のためにも有
用である。
Ｌｏｒｂｅｒｂｏｕａ＋−Ｇａｌｓｋｉら（Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。
ＵＳＡ、８５．１９２２−１９２６（１９８Ｂ））は、
Ｅ、ｃｏｌｉ中におけるキメラ蛋白質Ａｓｐ”ｌＬ ２
−シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏ−ｍｏｎａｓ）外毒素
（八５ｐＪＬ ２−ＰＥ４０）のクローニングおよび発
現を開示した。この融合蛋白質においては、シュードモ
ナスエクソトキシン（ＰＥ）の細胞認識領域をＩＬ−２
が置換しており、言い換えれば、該融合蛋白質はアミノ
末端に組換えヒトインターロイキン−２配列を有し、か
つ、この融合蛋白質のカルボキシル末端は、領域Ｉを欠
失したＰＥ分子のアミノ酸配列を含んでなる。領域Ｉが
削除されたＰＥ分子は、完全なリボシル化活性を有して
いるが、細胞認識領域を欠失するために極めて低い細胞
致死活性を有する。該融合蛋白質のアミノ末端にあるＩ
Ｌ−２分子は、完全に露出され、かつその生物学的活性
を保持しており、またＰＥに存在する細胞認識領域とは
異なったものを与える。
Ｅ、ｃｏｌｉ中におけるキメラ蛋白質Ａｓｐ”ｌＬ ２
−シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏ−ｍｏｎａｓ）外毒素
（八５ｐＪＬ ２−ＰＥ４０）のクローニングおよび発
現を開示した。この融合蛋白質においては、シュードモ
ナスエクソトキシン（ＰＥ）の細胞認識領域をＩＬ−２
が置換しており、言い換えれば、該融合蛋白質はアミノ
末端に組換えヒトインターロイキン−２配列を有し、か
つ、この融合蛋白質のカルボキシル末端は、領域Ｉを欠
失したＰＥ分子のアミノ酸配列を含んでなる。領域Ｉが
削除されたＰＥ分子は、完全なリボシル化活性を有して
いるが、細胞認識領域を欠失するために極めて低い細胞
致死活性を有する。該融合蛋白質のアミノ末端にあるＩ
Ｌ−２分子は、完全に露出され、かつその生物学的活性
を保持しており、またＰＥに存在する細胞認識領域とは
異なったものを与える。
該キメラ蛋白質の調製工程の結果として、アスパラギン
酸残基が、■シー２分子の１および２位にあるアラニン
とプロリンとの間に挿入され、従って該ＩＬ−２部分の
分子をアミノ末端において°“非天然”′とする。合成
的にコードされたイソロイシンが、ＩＬ−２の１３１゛
位のスレオニンを該毒素分子、すなわちＰＥ４０（ＰＥ
の２５１位のプロリン）のアミノ末端に連結するために
使用される。該ＡｓｐＪＬ２ＰＥ融合蛋白質の製造につ
いての更なる記述は、１９８８年３月３０日発行のヨー
口・ツバ特許公開筒２６１゜６７１号になされている。
酸残基が、■シー２分子の１および２位にあるアラニン
とプロリンとの間に挿入され、従って該ＩＬ−２部分の
分子をアミノ末端において°“非天然”′とする。合成
的にコードされたイソロイシンが、ＩＬ−２の１３１゛
位のスレオニンを該毒素分子、すなわちＰＥ４０（ＰＥ
の２５１位のプロリン）のアミノ末端に連結するために
使用される。該ＡｓｐＪＬ２ＰＥ融合蛋白質の製造につ
いての更なる記述は、１９８８年３月３０日発行のヨー
口・ツバ特許公開筒２６１゜６７１号になされている。
該Ａｓｐ”ｌＬ ２−ＰＥ４０融合蛋白質は、ＩＬ−２
レセプターを有する細胞に対して細胞毒活性を示す。
レセプターを有する細胞に対して細胞毒活性を示す。
該Ａｓｐ” ＩＬ ２−ＰＥ融合蛋白質の発現において
Ｌｏｒｂｅｒｂｏｕｍ−Ｇａｌｓｋｉ ら（前掲文献）
により用いられたベクターｐＨＬ３１０は、天然ヒト
ＩＬ−２（ＲｏｂｂらのＰｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃ
ａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ８１．６４８６−６４９０
［１９８４］ ’）に見出された配列とは異なったアミ
ノ末端配列、Ｍｅｔ−＾１ａ’Ａｓｐ”Ｐｒｏ”Ｔｈｒ
’−−−を有するペプチドを誘導する。更には、該ベク
ターｐＨＬ３１０は、高水準での蛋白質の発現を可能と
しなかった。これらの２つの問題点を解決するため、該
融合蛋白質の極めて高水準での合成をプログラムし、か
つヒトＴＬ−２のアミノ末端により近似したアミノ末端
、すなわちＭｅｔ−八１ａ’Ｐｒｏ”Ｔｈｒ′３．・−
を有する融合蛋白質をコードする発現ベクターを創成す
るために第１図に示した方針が採用された。
Ｌｏｒｂｅｒｂｏｕｍ−Ｇａｌｓｋｉ ら（前掲文献）
により用いられたベクターｐＨＬ３１０は、天然ヒト
ＩＬ−２（ＲｏｂｂらのＰｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃ
ａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ８１．６４８６−６４９０
［１９８４］ ’）に見出された配列とは異なったアミ
ノ末端配列、Ｍｅｔ−＾１ａ’Ａｓｐ”Ｐｒｏ”Ｔｈｒ
’−−−を有するペプチドを誘導する。更には、該ベク
ターｐＨＬ３１０は、高水準での蛋白質の発現を可能と
しなかった。これらの２つの問題点を解決するため、該
融合蛋白質の極めて高水準での合成をプログラムし、か
つヒトＴＬ−２のアミノ末端により近似したアミノ末端
、すなわちＭｅｔ−八１ａ’Ｐｒｏ”Ｔｈｒ′３．・−
を有する融合蛋白質をコードする発現ベクターを創成す
るために第１図に示した方針が採用された。
従って、本発明は、先行技術中に記載された該Ａｓｐ”
ｌＬ ２−ＰＥ４０融合蛋白質と比較して、そのアミノ
末端に天然ヒトＩＬ−２配列を有する点において区別さ
れる組換えヒトＩＬ２−ＰＥイムノトキシン融合蛋白質
を提供するものである。該イムノトキシン融合蛋白質は
、アミノ末端に組換えヒトインターロイキン−２配列を
有し、かつ前記融合蛋白質のカルボキシ末端は、シュー
ドモナス外毒素領域の配列、好ましくはシュードモナス
外毒素４０を含有し、前記インターロイキン−２のアミ
ノ末端配列が天然ヒトインターロイキン−２のアミノ末
端配列と同等であることを特徴とする。該イムノキシン
融合蛋白質は、選択的にＮ−末端に付加的なメチオニン
残基を有していてもよい。最も好ましくは、該イムノト
キシン融合査白質は、本質的に均質な形態で存在する。
ｌＬ ２−ＰＥ４０融合蛋白質と比較して、そのアミノ
末端に天然ヒトＩＬ−２配列を有する点において区別さ
れる組換えヒトＩＬ２−ＰＥイムノトキシン融合蛋白質
を提供するものである。該イムノトキシン融合蛋白質は
、アミノ末端に組換えヒトインターロイキン−２配列を
有し、かつ前記融合蛋白質のカルボキシ末端は、シュー
ドモナス外毒素領域の配列、好ましくはシュードモナス
外毒素４０を含有し、前記インターロイキン−２のアミ
ノ末端配列が天然ヒトインターロイキン−２のアミノ末
端配列と同等であることを特徴とする。該イムノキシン
融合蛋白質は、選択的にＮ−末端に付加的なメチオニン
残基を有していてもよい。最も好ましくは、該イムノト
キシン融合査白質は、本質的に均質な形態で存在する。
更には、本発明は、このようなイムノトキシン融合蛋白
質をコードするＤＮＡ、およびこのようなりＮＡを含む
組換えベクターを提供する。最も好ましくは、該組換え
ベクターは、プラスミドである。このような組換えベク
ターまたはプラスミドにより形質転換された単細胞宿主
微生物は、標準化されたヒ目Ｌ２−ＰＥ融合蛋白質を発
現することができる。好ましくは、該単細胞宿主微生物
は、慣用の細菌性宿主、最も好ましくはＥ、ｃｏｌｉ等
である。
質をコードするＤＮＡ、およびこのようなりＮＡを含む
組換えベクターを提供する。最も好ましくは、該組換え
ベクターは、プラスミドである。このような組換えベク
ターまたはプラスミドにより形質転換された単細胞宿主
微生物は、標準化されたヒ目Ｌ２−ＰＥ融合蛋白質を発
現することができる。好ましくは、該単細胞宿主微生物
は、慣用の細菌性宿主、最も好ましくはＥ、ｃｏｌｉ等
である。
実施例に記載されているプラスミドを構築するために選
択された親ベクターは、公知のプラスミドｐＲＣ２３３
／ ＩＬ−２／デルタｔｅｔから誘導されるもので、こ
れは、バクテリオファージラムダＰｔプロモータの制御
配列の下流側（３′）にヒトＩＬ−２の配列をコードす
る完全なｃＤＮＡを含む約３キロ塩基対（ｋｂ）のプラ
スミドである。該プラスミドｐＲＣ２３３／ ＩＬ−２
／デルタｔｅｔは、Ｅ、ｃｏｌｉ宿主中にて組換えヒト
ＩＬ−２を高水準で発現することができる。該プラスミ
ドは、１９８５年７月ＩＯ日発行のヨーロッパ特許公開
第１４７．８１９号に記載されている。
択された親ベクターは、公知のプラスミドｐＲＣ２３３
／ ＩＬ−２／デルタｔｅｔから誘導されるもので、こ
れは、バクテリオファージラムダＰｔプロモータの制御
配列の下流側（３′）にヒトＩＬ−２の配列をコードす
る完全なｃＤＮＡを含む約３キロ塩基対（ｋｂ）のプラ
スミドである。該プラスミドｐＲＣ２３３／ ＩＬ−２
／デルタｔｅｔは、Ｅ、ｃｏｌｉ宿主中にて組換えヒト
ＩＬ−２を高水準で発現することができる。該プラスミ
ドは、１９８５年７月ＩＯ日発行のヨーロッパ特許公開
第１４７．８１９号に記載されている。
組換えヒト！Ｌ−２製造のためのこのプラスミドの調製
および使用に関する更なる開示は、Ｊｕらの、Ｊ、Ｂｉ
ｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６２．５７２３−５７３１ （１９
８７）により与えられている。
および使用に関する更なる開示は、Ｊｕらの、Ｊ、Ｂｉ
ｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６２．５７２３−５７３１ （１９
８７）により与えられている。
従って、本発明による融合蛋白質は、組換えＤＮＡ技術
の方法を使用して製造される。これによって、前記融合
蛋白質をコードするＤＮＡ配列を有する組換えベクター
を含む単細胞宿主生物を発酵、すなわち前記ＤＮＡ配列
の発現に適した条件で培養し、該単細胞生物により産生
された融合蛋白質を培養物から単離する。
の方法を使用して製造される。これによって、前記融合
蛋白質をコードするＤＮＡ配列を有する組換えベクター
を含む単細胞宿主生物を発酵、すなわち前記ＤＮＡ配列
の発現に適した条件で培養し、該単細胞生物により産生
された融合蛋白質を培養物から単離する。
このような単細胞宿主生物は、原核性あるいは真核性細
胞であってよい。このような単細胞宿主生物の多くが商
業的に入手可能であるか、または米国、メリーランド、
ロックヴイル、バークローンドライブ、１２３０１にあ
るＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）等の寄託機関から自由に入
手することができる。原核性細胞の例は、Ｅ、ｃｏｌｉ
（例えば、Ｖｉｌｌａｒｅｊｏ らのＪ、Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ、月刊、 ４６６−４７４［１９７４］にＤｚ
２９１として記載されているＥ、ｃｏｌｉ Ｍ２Ｓ、Ｅ
、ｃｏｌｉ ２９４（ＡＴＣＣｋ３１４４６）、Ｅ、ｃ
ｏｌｉ ＲＲＩ（ＡＴＣ（： Ｎｏ。
胞であってよい。このような単細胞宿主生物の多くが商
業的に入手可能であるか、または米国、メリーランド、
ロックヴイル、バークローンドライブ、１２３０１にあ
るＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌ
ｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）等の寄託機関から自由に入
手することができる。原核性細胞の例は、Ｅ、ｃｏｌｉ
（例えば、Ｖｉｌｌａｒｅｊｏ らのＪ、Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ、月刊、 ４６６−４７４［１９７４］にＤｚ
２９１として記載されているＥ、ｃｏｌｉ Ｍ２Ｓ、Ｅ
、ｃｏｌｉ ２９４（ＡＴＣＣｋ３１４４６）、Ｅ、ｃ
ｏｌｉ ＲＲＩ（ＡＴＣ（： Ｎｏ。
３１３４３）またはｔ！、ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（ＡＴ
ＣＣＮα２７３２５）） 、Ｂ。
ＣＣＮα２７３２５）） 、Ｂ。
５ｕｂｔｉｌｉｓ等のｂａｃｉｌｕｓ属、ならびにＳａ
ｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｓおよび５ｅｒ
ｒａｔ、（ａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓが例示され得る腸
内細菌等である。特に好ましくは、プラスミドｐＲに２
４８ｃｌｔｓを含有するＬｃｏｌｉ株ＭＣ１０６１であ
る（実施例参照）。別法として、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓ、（ａｅ等の酵母細胞を宿主生物
として使用してもよい。組換えベクターの宿主生物とし
て好適な多くの真核性細胞が当業者に知られている。
ｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｓおよび５ｅｒ
ｒａｔ、（ａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓが例示され得る腸
内細菌等である。特に好ましくは、プラスミドｐＲに２
４８ｃｌｔｓを含有するＬｃｏｌｉ株ＭＣ１０６１であ
る（実施例参照）。別法として、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
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として使用してもよい。組換えベクターの宿主生物とし
て好適な多くの真核性細胞が当業者に知られている。
ＣＶ−１（ＡＴＣＣＮ（ＬＣＣＬ ７０）等の哺乳類細
胞およびそのＣＯ５−１（ＡＴＣＣＮ（ｌＣＲＬ １６
５０）またはＣＯ３−７（ＡＴＣＣＮｏ。
胞およびそのＣＯ５−１（ＡＴＣＣＮ（ｌＣＲＬ １６
５０）またはＣＯ３−７（ＡＴＣＣＮｏ。
ＣＲＬ １６５１）等の誘導体が好適に使用される。加
えて、Ｓｍ ｉ ｔｈら（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ
、 ２ 、２１５６−２１６５ ［１９８３］ ）に記
載されているような昆虫細胞を使用することができる。
えて、Ｓｍ ｉ ｔｈら（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ
、 ２ 、２１５６−２１６５ ［１９８３］ ）に記
載されているような昆虫細胞を使用することができる。
組換えベクターを単細胞宿主生物中に導入するための種
々の方法が知られている。このような方法の例としては
、マイクロインジェクション、トランスフェクションま
たはトランスダクションがある。当業者にとっては、使
用した特定の宿主生物に対する最適な方法を選択するこ
とに困難はない。
々の方法が知られている。このような方法の例としては
、マイクロインジェクション、トランスフェクションま
たはトランスダクションがある。当業者にとっては、使
用した特定の宿主生物に対する最適な方法を選択するこ
とに困難はない。
本発明において使用した組換えベクターは、本発明のイ
ムノトキシン融合蛋白質をコードするＤＮＡを含むベク
ターである。このようなりＮＡは、慣用の化学的方法、
例えばＮａｒａｎｇらのＭｅｔｈ。
ムノトキシン融合蛋白質をコードするＤＮＡを含むベク
ターである。このようなりＮＡは、慣用の化学的方法、
例えばＮａｒａｎｇらのＭｅｔｈ。
Ｅｎｚｙｍｏｌ、６８．９０−１０８［１９７９］ に
記載されたリン酸三エステル法またはリン酸二エステル
法（ＢｒｏｗｎらのＭｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、 ６８
，１０９−１５１［１９７９］）により合成され得る。
記載されたリン酸三エステル法またはリン酸二エステル
法（ＢｒｏｗｎらのＭｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、 ６８
，１０９−１５１［１９７９］）により合成され得る。
両方法において、第１には長いオリゴヌクレオチド類が
合成され、次いであらかじめ定めた方法で連結される。
合成され、次いであらかじめ定めた方法で連結される。
該Ｄ Ｎ Ａのヌクレオチド配列は、天然のヌクレオチ
ド配列と同等であるか、または部分的もしくは完全に異
なっていてもよい。
ド配列と同等であるか、または部分的もしくは完全に異
なっていてもよい。
このことは、遺伝子コードが縮重している、すなわち、
ひとつのアミノ酸が数種のコドンによってコードされ得
るという事実による。選択されるコドンは、該イムノト
キシン融合蛋白質を発現するために用いられる宿主生物
の好適な使用コドンに適合させてもよい（Ｇｒｏｓｊｅ
ａｎらのＧｅｎｅ １Ｂ、 １９９−２０９ ［１９Ｂ
２］ ）。この方法において得られたＤＮＡは、例えば
無用な制限酵素切断部位の導入等により組換えベクター
の構築を困難にしたり、あるいは該ポリペプチドの発現
を妨げるような部分配列を含まないように注意すべきで
ある。
ひとつのアミノ酸が数種のコドンによってコードされ得
るという事実による。選択されるコドンは、該イムノト
キシン融合蛋白質を発現するために用いられる宿主生物
の好適な使用コドンに適合させてもよい（Ｇｒｏｓｊｅ
ａｎらのＧｅｎｅ １Ｂ、 １９９−２０９ ［１９Ｂ
２］ ）。この方法において得られたＤＮＡは、例えば
無用な制限酵素切断部位の導入等により組換えベクター
の構築を困難にしたり、あるいは該ポリペプチドの発現
を妨げるような部分配列を含まないように注意すべきで
ある。
ヨーロッパ特許公開筒２００．９８６号に述べられてい
るような多くのベクターを上記の組換えベクターの構築
のために使用することができる。これらのベクターは、
同ベクターの宿主中における維持および複製のために必
要な要素に加え、該イムノトキシン融合蛋白質をコード
するＤＮＡの転写および翻訳に必要な要素を含んでいる
。本発明の組換えベクターの構築のために好適なベクタ
ーの選択、および前記組換えベクターと適合する単細胞
宿主生物の選択は、当業者の技術の範囲内にある。
るような多くのベクターを上記の組換えベクターの構築
のために使用することができる。これらのベクターは、
同ベクターの宿主中における維持および複製のために必
要な要素に加え、該イムノトキシン融合蛋白質をコード
するＤＮＡの転写および翻訳に必要な要素を含んでいる
。本発明の組換えベクターの構築のために好適なベクタ
ーの選択、および前記組換えベクターと適合する単細胞
宿主生物の選択は、当業者の技術の範囲内にある。
本発明の組換えベクターは、ＭｏｒｉｎａｇａらのＢｉ
ｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２．６３６−６３９（１９
８４）記載されているオリゴヌクレオチド支配部位特異
性変異生成法を用いて、イムノトキシン融合蛋白質をコ
ードするＤＮＡを含有している組換えベクターを修飾す
ることにより調製することが好ましい。このようなイム
ノトキシン融合蛋白質をコードするＤＮＡを含んだ組換
えベクターの例は、上述したプラスミドｐＨＬ３１０で
ある。
ｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２．６３６−６３９（１９
８４）記載されているオリゴヌクレオチド支配部位特異
性変異生成法を用いて、イムノトキシン融合蛋白質をコ
ードするＤＮＡを含有している組換えベクターを修飾す
ることにより調製することが好ましい。このようなイム
ノトキシン融合蛋白質をコードするＤＮＡを含んだ組換
えベクターの例は、上述したプラスミドｐＨＬ３１０で
ある。
本発明によるイムノトキシン融合蛋白質の発現方法は、
使用する発現ベクターおよび宿主生物に依存して行なわ
れる。通常は、発現ベクターを含む宿主生物を、該宿主
生物の成育に適した条件下で成育させる。対数的成育の
終点に向けて、単位時間あたりの細胞数の増加が滅じた
際に、該イムノトキシン融合蛋白質の発現が誘発され、
該蛋白質をコードする［）ＮＡが転写され、そして転写
されたｍＲＮＡが翻訳される。この誘発は、育生培地に
誘発剤もしくはデリブレッサーを添加するか、または例
えば温度変化等の物理的因子を変化させることによって
行ない得る。
使用する発現ベクターおよび宿主生物に依存して行なわ
れる。通常は、発現ベクターを含む宿主生物を、該宿主
生物の成育に適した条件下で成育させる。対数的成育の
終点に向けて、単位時間あたりの細胞数の増加が滅じた
際に、該イムノトキシン融合蛋白質の発現が誘発され、
該蛋白質をコードする［）ＮＡが転写され、そして転写
されたｍＲＮＡが翻訳される。この誘発は、育生培地に
誘発剤もしくはデリブレッサーを添加するか、または例
えば温度変化等の物理的因子を変化させることによって
行ない得る。
該宿主生物中に産生されたイムノトキシン融合蛋白質は
、特殊な輸送機構によって細胞から分泌され得、あるい
は該細胞を破壊することによって単離され得る。該細胞
は、機械的手段（ＣｈａｒｍらのＭｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ、２２．４７６−５５６ （１９７１］）、酵素的
処理（例えばリゾチーム処理）または化学的手段（例え
ば洗浄剤処理、尿素もしくはグアニジン・ＨＣＩ処理等
）、あるいはこれらの組合せによって破壊され得る。
、特殊な輸送機構によって細胞から分泌され得、あるい
は該細胞を破壊することによって単離され得る。該細胞
は、機械的手段（ＣｈａｒｍらのＭｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ、２２．４７６−５５６ （１９７１］）、酵素的
処理（例えばリゾチーム処理）または化学的手段（例え
ば洗浄剤処理、尿素もしくはグアニジン・ＨＣＩ処理等
）、あるいはこれらの組合せによって破壊され得る。
真核生物においては、細胞から分泌されるポリペプチド
類は、前駆体分子の形態で合成される。
類は、前駆体分子の形態で合成される。
成熟ポリペプチドは、いわゆるシグナルペプチドの切除
により得られる。原核性宿主生物は、真核性シグナルペ
プチド類を前駆体分子から解離することができないため
、真核性ポリペプチドは、原核性宿主生物内においてそ
れらの成熟形態をもって直接発現されなければならない
。ＤＮＡ水準でのコドンＡＴＧに対応する翻訳開始シグ
ナルＡＵＧは、すべてのポリペプチドが原核性宿主生物
内でＮ−末端にメチオニン残基を伴って合成される原因
となる。使用される発現系および、おそらく発現される
べきポリペプチドに依存して、ある場合にはこのＮ−末
端メチオニン残基は切除される。
により得られる。原核性宿主生物は、真核性シグナルペ
プチド類を前駆体分子から解離することができないため
、真核性ポリペプチドは、原核性宿主生物内においてそ
れらの成熟形態をもって直接発現されなければならない
。ＤＮＡ水準でのコドンＡＴＧに対応する翻訳開始シグ
ナルＡＵＧは、すべてのポリペプチドが原核性宿主生物
内でＮ−末端にメチオニン残基を伴って合成される原因
となる。使用される発現系および、おそらく発現される
べきポリペプチドに依存して、ある場合にはこのＮ−末
端メチオニン残基は切除される。
本発明のイムノトキシン融合蛋白質は、公知の方法、例
えば異なる速度での遠心分離、硫酸アンモニウムによる
沈澱、透析（常圧もしくは減圧下）、調製用等電的フォ
ーカシング、調製用ゲル電気泳動、または、ゲル口過、
高速液体クロマトグラフィ （ＨＰＬＣ）、イオン交換
クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィおよびアフィ
ニティクロマトグラフィ （例えば、セファロース（商
標）ブルーＣＬ−６Ｂ上、または担体結合ＴＬ−２Ｒま
たはＩＬ−２もしくはシュードモナス外毒素に対するモ
ノクローナル抗体上）により本質的に均質に精製され得
る。
えば異なる速度での遠心分離、硫酸アンモニウムによる
沈澱、透析（常圧もしくは減圧下）、調製用等電的フォ
ーカシング、調製用ゲル電気泳動、または、ゲル口過、
高速液体クロマトグラフィ （ＨＰＬＣ）、イオン交換
クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィおよびアフィ
ニティクロマトグラフィ （例えば、セファロース（商
標）ブルーＣＬ−６Ｂ上、または担体結合ＴＬ−２Ｒま
たはＩＬ−２もしくはシュードモナス外毒素に対するモ
ノクローナル抗体上）により本質的に均質に精製され得
る。
本発明の精製イムノトキシン融合蛋白質は、それ自体公
知の方法により、免疫応答の異常制御に係ると考えられ
ている自己免疫甲状腺炎、タイ１ｌｗＭ尿病、慢性関節
リウマチ、クローン疾患および他の疾患等の治療に利用
され得る。該イムノトキシン融合蛋白質は、同種移植片
および器官移植の拒絶における免疫応答の抑制のために
も有用である。
知の方法により、免疫応答の異常制御に係ると考えられ
ている自己免疫甲状腺炎、タイ１ｌｗＭ尿病、慢性関節
リウマチ、クローン疾患および他の疾患等の治療に利用
され得る。該イムノトキシン融合蛋白質は、同種移植片
および器官移植の拒絶における免疫応答の抑制のために
も有用である。
本発明により調製されたイムノトキシン融合蛋白質は、
上記のような臨床的用途のために温血動物に投与し得る
。投与は、皮肉的、皮下的または筋肉内的ないずれかの
非経口投与等の慣用的方法であり得る。明白であるが、
必要な投与量は、治療されるべき容体、容体の状況、・
治療の期間、および投与方法により変化するであろう。
上記のような臨床的用途のために温血動物に投与し得る
。投与は、皮肉的、皮下的または筋肉内的ないずれかの
非経口投与等の慣用的方法であり得る。明白であるが、
必要な投与量は、治療されるべき容体、容体の状況、・
治療の期間、および投与方法により変化するであろう。
医薬的な使用における適当な投与形態は、慣用的手段に
ての使用に先立って再構成される滅菌的に口過された凍
結乾燥蛋白質により得られる。本発明のイムノトキシン
融合蛋白質を含む医薬組成物を、前記イムノトキシン融
合蛋白質と、緩衝剤、安定側、静菌薬ならびに医薬の非
経口投与形態に使用される慣用的な賦形剤および添加剤
とを混合することにより調製することは、当業者の技術
範囲にある。
ての使用に先立って再構成される滅菌的に口過された凍
結乾燥蛋白質により得られる。本発明のイムノトキシン
融合蛋白質を含む医薬組成物を、前記イムノトキシン融
合蛋白質と、緩衝剤、安定側、静菌薬ならびに医薬の非
経口投与形態に使用される慣用的な賦形剤および添加剤
とを混合することにより調製することは、当業者の技術
範囲にある。
本発明は、また、このような医薬組成物にも関するもの
である。
である。
本発明を一般的に説明したが、これは、以下の実施例を
以下の図面と関連させて参照することにより、更に容易
に理解されるであろう。
以下の図面と関連させて参照することにより、更に容易
に理解されるであろう。
第１図は、真正のヒ１−ＩＬ−２の配列に対応するアミ
ノ末端を有するヒトＩＬ−２およびＰＥの所望の領域、
すなわちＰＥ４０を含有するＩＬ ２−ＰＥ４０と命名
された融合蛋白質の発現に使用される本発明のプラスミ
ド構築を模式的（−足止をもって示されていない）に示
している。
ノ末端を有するヒトＩＬ−２およびＰＥの所望の領域、
すなわちＰＥ４０を含有するＩＬ ２−ＰＥ４０と命名
された融合蛋白質の発現に使用される本発明のプラスミ
ド構築を模式的（−足止をもって示されていない）に示
している。
第２図は、先行技術のプラスミドｐＨＬ３１０の調製に
おいて使用されるｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列から演
鐸されたＡｓｐｚＩＬ ２−ＰＥ融合蛋白質のアミノ酸
配列を示している。
おいて使用されるｃＤＮＡクローンのＤＮＡ配列から演
鐸されたＡｓｐｚＩＬ ２−ＰＥ融合蛋白質のアミノ酸
配列を示している。
第３図は、本発明のｐＲＣ２３３／ ＩＬ−２／ ＰＥ
４０／ｄｅｓＡｓｐ”プラスミドの発現により生成され
たＩＬ ２−ＰＥ４０融合蛋白質の配列決定により得ら
れた最初の１５個のアミノ酸残基を示している。
４０／ｄｅｓＡｓｐ”プラスミドの発現により生成され
たＩＬ ２−ＰＥ４０融合蛋白質の配列決定により得ら
れた最初の１５個のアミノ酸残基を示している。
第４図は、ＩＬ ２−ＰＥ４０の精製スキームを示して
いる。
いる。
以下の実施例は、例示的な目的のみで示されるものと理
解され、いかなる意味においても本発明をここに示した
特定の実施例に限定するものと解釈されるべきではない
。
解され、いかなる意味においても本発明をここに示した
特定の実施例に限定するものと解釈されるべきではない
。
−１」Ｌ貫−
２０ｔｔ ｇのｐＲＣ２３３／ ＩＬ−２／デルタｔｅ
ｔＤＮＡを、Ｔｔｈ １１１ Ｉ （Ｎｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ベヴアリーミマサチューセ
ッツ州、米国）で消化させた後、フレナラＤＮＡポリメ
ラーゼ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ、ベテスダ、メリーランド州、米国）
を用い、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（
ｄＮＴＰ）で充填した。フェノール抽出後、該ＤＮＡを
Ｘｂａ Ｉ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ、マンハイム、西ドイツ）で完全消化させた。Ｅｌｕ
ｔｉｐカラム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ ５ｃｈ
ｕｅｌｌ 、キーン、ニューハンプシャー州、米国）を
用いて精製した低融点アガロースを通して電気泳動させ
た後、充填された２、６ｋｂのＸｂａ Ｉ 、”’ｒｔ
ｈ １１１ １断片を溶離によって単離した。約２μｇ
のベクターＤＮＡを回収した。
ｔＤＮＡを、Ｔｔｈ １１１ Ｉ （Ｎｅｗ Ｅｎｇ
ｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、ベヴアリーミマサチューセ
ッツ州、米国）で消化させた後、フレナラＤＮＡポリメ
ラーゼ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ、ベテスダ、メリーランド州、米国）
を用い、４種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（
ｄＮＴＰ）で充填した。フェノール抽出後、該ＤＮＡを
Ｘｂａ Ｉ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ
ｍ、マンハイム、西ドイツ）で完全消化させた。Ｅｌｕ
ｔｉｐカラム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ ５ｃｈ
ｕｅｌｌ 、キーン、ニューハンプシャー州、米国）を
用いて精製した低融点アガロースを通して電気泳動させ
た後、充填された２、６ｋｂのＸｂａ Ｉ 、”’ｒｔ
ｈ １１１ １断片を溶離によって単離した。約２μｇ
のベクターＤＮＡを回収した。
挿入断片を、プラスミドｐＨＬ３１０ （１−ロッパ特
許公開第２６１，６７１号）から誘導した。このプラス
ミドは、バタテリオファージＴ７プロモーターの下流に
位置する＾ｓｐ”ＩＬ ２−ＰＥ４０の配列を含む。２
゜ｕｇのｐＨＬ３１０ ＤＮＡを、Ｅｃｏ ＲＩ （Ｎ
ｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）で完全消化させ
、次いで４種類のｄＮＴＰおよびフレナラＤＮＡポリメ
ラーゼで充填した。フェノール抽出後、ＤＮＡをＸｂａ
Ｉで完全消化させた。１．４ ｋｂの断片を、ベクタ
ー断片用に前記と同様にして精製した。約１．２μｇの
挿入ＤＮＡを回収した。
許公開第２６１，６７１号）から誘導した。このプラス
ミドは、バタテリオファージＴ７プロモーターの下流に
位置する＾ｓｐ”ＩＬ ２−ＰＥ４０の配列を含む。２
゜ｕｇのｐＨＬ３１０ ＤＮＡを、Ｅｃｏ ＲＩ （Ｎ
ｅｗ ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）で完全消化させ
、次いで４種類のｄＮＴＰおよびフレナラＤＮＡポリメ
ラーゼで充填した。フェノール抽出後、ＤＮＡをＸｂａ
Ｉで完全消化させた。１．４ ｋｂの断片を、ベクタ
ー断片用に前記と同様にして精製した。約１．２μｇの
挿入ＤＮＡを回収した。
組換え発現ベクターを構築するために、３２０ｎｇの１
．４ｋｂの断片（ｐＨＬ３１０、Ｘｂａ Ｉ ／Ｅｃｏ
Ｒ１充填）を、５０ｎｇのベクターＤ Ｎ Ａ （ｐ
ＲＣ２３３／ ＩＬ−２／デルタｔｅｔ 、 Ｔｔｈ
１１１ １充填）と混合した。これらのＤＮＡを、１．
０ ｍＭのＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下、ＰＬｙ衝
液（６，５ｍＭ トリス−ＨＣＬＳｐｎ７．４．０．
ＩＭ ＮａＣ１，４，５ｍＭ ＭｇＣｌ□、１００ｍＭ
２−メルカプトエタノール）中で連結させた。該連結
反応を、１５°Ｃで２時間熟成させた。追加のＴ、ＤＮ
Ａリガーゼを、該反応に入れ、次いで混合物を４°Ｃで
１８時間熟成した。連結混合物を、６５°Ｃで５分間加
熱し、リガーゼを不活性にさせ、次いでＴｈｔ １１１
１で消化させてすべての残存する親ベクターＤＮＡを
線状にさせた。
．４ｋｂの断片（ｐＨＬ３１０、Ｘｂａ Ｉ ／Ｅｃｏ
Ｒ１充填）を、５０ｎｇのベクターＤ Ｎ Ａ （ｐ
ＲＣ２３３／ ＩＬ−２／デルタｔｅｔ 、 Ｔｔｈ
１１１ １充填）と混合した。これらのＤＮＡを、１．
０ ｍＭのＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下、ＰＬｙ衝
液（６，５ｍＭ トリス−ＨＣＬＳｐｎ７．４．０．
ＩＭ ＮａＣ１，４，５ｍＭ ＭｇＣｌ□、１００ｍＭ
２−メルカプトエタノール）中で連結させた。該連結
反応を、１５°Ｃで２時間熟成させた。追加のＴ、ＤＮ
Ａリガーゼを、該反応に入れ、次いで混合物を４°Ｃで
１８時間熟成した。連結混合物を、６５°Ｃで５分間加
熱し、リガーゼを不活性にさせ、次いでＴｈｔ １１１
１で消化させてすべての残存する親ベクターＤＮＡを
線状にさせた。
次いで連結混合物の蛋白質を、プラスミドｐＲＫ２４８
ｃＩｔｓを含む受容能力のあるＥ、ｃｏｌｉ ＭＣ１０
６１ａｔ胞中に形質転換させた。Ｅ、ｃｏｌｉ株ＭＣ１
０６１およびプラスミドｐＲＫ２４８ｃ Ｉ ｔｓは、
それぞれ寄託番号ＡＴＣＣＨａ５３３３Ｂおよび＾ＴＣ
Ｃｋ３３７６６のもとにＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎより入手可能であ
る。
ｃＩｔｓを含む受容能力のあるＥ、ｃｏｌｉ ＭＣ１０
６１ａｔ胞中に形質転換させた。Ｅ、ｃｏｌｉ株ＭＣ１
０６１およびプラスミドｐＲＫ２４８ｃ Ｉ ｔｓは、
それぞれ寄託番号ＡＴＣＣＨａ５３３３Ｂおよび＾ＴＣ
Ｃｋ３３７６６のもとにＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎより入手可能であ
る。
宿主株Ｅ、ｃｏｌｔ ＭＣ１０６１およびＰＬプロモー
ターの温度感受性リプレッサーをコードする受容プラス
ミドｐＲに２４８ｃｌｔｓは、当業者に知られておりＣ
ａ５ａｄａｂａｎらのＪ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１３８，
１７９−２０７［１９８０］およびＢｅｒｎａｒｄらの
Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、６８，４８２−４９
２［１９７９］にそれぞれ記載されている。Ｅ、ｃｏｌ
ｉ細胞は、Ｍａｎ、（ａｔｉｓらの“Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ’Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ ”Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ米国、２４９−２５５頁［１
９８２］中に記載された方法に従って受容能力をつけた
。
ターの温度感受性リプレッサーをコードする受容プラス
ミドｐＲに２４８ｃｌｔｓは、当業者に知られておりＣ
ａ５ａｄａｂａｎらのＪ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１３８，
１７９−２０７［１９８０］およびＢｅｒｎａｒｄらの
Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ、６８，４８２−４９
２［１９７９］にそれぞれ記載されている。Ｅ、ｃｏｌ
ｉ細胞は、Ｍａｎ、（ａｔｉｓらの“Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ’Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ ”Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ １ｌａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ米国、２４９−２５５頁［１
９８２］中に記載された方法に従って受容能力をつけた
。
得られたコロニーを、プラスミドＤＮＡの最小溶解調製
法（Ｍａｎ、（ａｔｉｓらの前掲文献、３６６−３６９
頁）およびＥｃｏ Ｒ１、Ｘｂａ ＩおよびＢｇｌＩＩ
を用いた制限消化法によって正しい組換えベクターのた
めにスクリーニングした。適切なプラスミド（ｐＲＣ２
３３／ＩＬ−２／ＰＨ４０／デスＡＳＰ”と称す）を含
む２つのコロニーを、更に蛋白質製造のために分析した
。２つのコロニーからの培養物（＃４および＃５と称す
）を、３０°Ｃで００．。。＝０．５になる迄、次いで
４２°Ｃに変え０Ｄｈｏ。＝１．０になる迄成育させ蛋
白質合成を誘発させた。誘発された細胞のペレットを、
Ｊｕらの前掲文献に記載されたＬａｅ＋＋ｕｗｌｉ試料
緩衝液（Ｌａｅｍｍｌｉ、 Ｎａｔｕｒｅ ２２７，６
８０−６８５［１９７０］）中での溶解によって抽出し
た。ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるペレットの
分析は、両方の培養物が、非誘発培養物中には存在しな
い５４ｋｄの予期された蛋白質を産生じていたことを示
した。クローン＃４からの抽出物もまた、ネズミＣＴＬ
Ｌおよび他の細胞で検定される様な実質的な生物活性を
含むことが見出された。使用されたアッセイ方法の詳細
な記載および得られた結果を、以下に示す。
法（Ｍａｎ、（ａｔｉｓらの前掲文献、３６６−３６９
頁）およびＥｃｏ Ｒ１、Ｘｂａ ＩおよびＢｇｌＩＩ
を用いた制限消化法によって正しい組換えベクターのた
めにスクリーニングした。適切なプラスミド（ｐＲＣ２
３３／ＩＬ−２／ＰＨ４０／デスＡＳＰ”と称す）を含
む２つのコロニーを、更に蛋白質製造のために分析した
。２つのコロニーからの培養物（＃４および＃５と称す
）を、３０°Ｃで００．。。＝０．５になる迄、次いで
４２°Ｃに変え０Ｄｈｏ。＝１．０になる迄成育させ蛋
白質合成を誘発させた。誘発された細胞のペレットを、
Ｊｕらの前掲文献に記載されたＬａｅ＋＋ｕｗｌｉ試料
緩衝液（Ｌａｅｍｍｌｉ、 Ｎａｔｕｒｅ ２２７，６
８０−６８５［１９７０］）中での溶解によって抽出し
た。ポリアクリルアミドゲル電気泳動によるペレットの
分析は、両方の培養物が、非誘発培養物中には存在しな
い５４ｋｄの予期された蛋白質を産生じていたことを示
した。クローン＃４からの抽出物もまた、ネズミＣＴＬ
Ｌおよび他の細胞で検定される様な実質的な生物活性を
含むことが見出された。使用されたアッセイ方法の詳細
な記載および得られた結果を、以下に示す。
プラスミドｐＲＣ２３３／ ＩＬ−２／ＰＨ４０／デス
Ａｓｐ”を含むクローン＃４の培養物を使用して、２０
１の大培養バッチに植菌した。この培養からの細胞を前
記の様に処理して、ＩＬ−２−ＰＨ４０融合蛋白質を抽
出し、精製した。ＩＬ−２−ＰＥ４０のための全体にわ
たる精製の模式図を、第４図に示した。
Ａｓｐ”を含むクローン＃４の培養物を使用して、２０
１の大培養バッチに植菌した。この培養からの細胞を前
記の様に処理して、ＩＬ−２−ＰＨ４０融合蛋白質を抽
出し、精製した。ＩＬ−２−ＰＥ４０のための全体にわ
たる精製の模式図を、第４図に示した。
可溶化工程および正常化工程のためのすべての操作は、
特に記載しない限り、２−８°Ｃで行なった。凍結した
Ｅ、ｃｏｌｉ細胞を溶かし、１ｍＭのＥＤＴＡを含む５
０ｎ＋Ｍのトリス−ＨＣｌ ｐＨ８，０に懸濁させた（
４ｄ／ｇ細胞）。細胞懸濁液を、５ｏｎｉｆｉｅｒ Ｃ
ｅ１ｌＤｉｓｒｕｐｔｏｒ ３５０（Ｂｒａｎｓｏｎ
５ｏｎｉｃ Ｐｏ５ｖｅｒ Ｃｏ、＋ファーミングデラ
ン、ニューヨーク、米国）を用いて、パルス超音波で６
×３０秒処理した。崩壊された細胞を、５Ｓ−３４０−
ターを用い５ｏｒｖａｌｌ ＲＣ−５遠心分離機（Ｄｕ
ｐｏｎｔ、ウイルミントン、プラウエア州、米国）中、
１０．ＯＯＯＸｇで２０分間遠心分離し、ベレ、ントを
集めた。ペレ・ントを、それぞれｌｌ１１ＭのＥＤＴ八
およびジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む０．１Ｍの
トリス−ＨＣｌ ｐＨ８゜θ中に７ＭのグアニジンＨＣ
Ｉ溶液中に５ ｍｆｌ ／ ｇ細胞で懸濁させ、前記２
同様に超音波処理した。混合物を６０分間攪拌し、上澄
みを、遠心分離によって集めた。これをＰＢＳ （リン
酸緩衝食塩水、ｐＨ７，４、Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ Ｍ、
Ａ、Ｂｉ。
特に記載しない限り、２−８°Ｃで行なった。凍結した
Ｅ、ｃｏｌｉ細胞を溶かし、１ｍＭのＥＤＴＡを含む５
０ｎ＋Ｍのトリス−ＨＣｌ ｐＨ８，０に懸濁させた（
４ｄ／ｇ細胞）。細胞懸濁液を、５ｏｎｉｆｉｅｒ Ｃ
ｅ１ｌＤｉｓｒｕｐｔｏｒ ３５０（Ｂｒａｎｓｏｎ
５ｏｎｉｃ Ｐｏ５ｖｅｒ Ｃｏ、＋ファーミングデラ
ン、ニューヨーク、米国）を用いて、パルス超音波で６
×３０秒処理した。崩壊された細胞を、５Ｓ−３４０−
ターを用い５ｏｒｖａｌｌ ＲＣ−５遠心分離機（Ｄｕ
ｐｏｎｔ、ウイルミントン、プラウエア州、米国）中、
１０．ＯＯＯＸｇで２０分間遠心分離し、ベレ、ントを
集めた。ペレ・ントを、それぞれｌｌ１１ＭのＥＤＴ八
およびジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む０．１Ｍの
トリス−ＨＣｌ ｐＨ８゜θ中に７ＭのグアニジンＨＣ
Ｉ溶液中に５ ｍｆｌ ／ ｇ細胞で懸濁させ、前記２
同様に超音波処理した。混合物を６０分間攪拌し、上澄
みを、遠心分離によって集めた。これをＰＢＳ （リン
酸緩衝食塩水、ｐＨ７，４、Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ Ｍ、
Ａ、Ｂｉ。
ρｒｏｄｕｃｔｓ、ウォーカーズビル、メリーランド州
、米国）を用いて８０倍に希釈し、−夜攪拌した。希釈
された抽出液をＧＳＡローターを用い、２４，０００Ｘ
ｇ 、２０分間の遠心分離によって清澄化させるかまた
は０．８１０．２μのフィルターを通す口過を行なった
。
、米国）を用いて８０倍に希釈し、−夜攪拌した。希釈
された抽出液をＧＳＡローターを用い、２４，０００Ｘ
ｇ 、２０分間の遠心分離によって清澄化させるかまた
は０．８１０．２μのフィルターを通す口過を行なった
。
清澄化させた抽出液を、ＴＬ ２−ＰＥ４０ レセプタ
ーアフィニティクロマトグラフィのための出発物質とし
て使用し、次いで陽イオン交換およびサイズーイクスク
ルーシブ液体クロマトグラフィにかけた。Ｅ、ｃｏｌｉ
抽出液中のＩＬ ２−ＰＥ４０活性は、素通り材料中の
活性の不存在によって示される様にカラムに定量的に結
合する。結合したＩＬ ２−ＰＥ４０活性の約９８％は
、レセプターカラムから回収される。
ーアフィニティクロマトグラフィのための出発物質とし
て使用し、次いで陽イオン交換およびサイズーイクスク
ルーシブ液体クロマトグラフィにかけた。Ｅ、ｃｏｌｉ
抽出液中のＩＬ ２−ＰＥ４０活性は、素通り材料中の
活性の不存在によって示される様にカラムに定量的に結
合する。結合したＩＬ ２−ＰＥ４０活性の約９８％は
、レセプターカラムから回収される。
ゲル浸透データ、還元および非還元条件下の５ＯＳＰＡ
ＧＥ分析並びに生物アッセイの結果は、ＩＬ ２−ＰＨ
４０の主要な生物学的活性可溶単量体形能と一諸になっ
てレセプターアフィニティ精製された物質中に還元可能
であり生物学的に不活性なＩＬ ２−ＰＥ４０“会合体
′°の存在することを示している。レセプターアフィニ
ティ精製された生成物をｐＨ５，０の緩衝液で透析する
際、不活性な物質のほとんどが沈澱した。陽イオン交換
クロマトグラフィは、陽イオン交換カラムに結合し損っ
た強い紫外線吸収（λｍａｘ ＝ ２６０ｎｍ）の非蛋
白質の夾雑物を除去する。
ＧＥ分析並びに生物アッセイの結果は、ＩＬ ２−ＰＨ
４０の主要な生物学的活性可溶単量体形能と一諸になっ
てレセプターアフィニティ精製された物質中に還元可能
であり生物学的に不活性なＩＬ ２−ＰＥ４０“会合体
′°の存在することを示している。レセプターアフィニ
ティ精製された生成物をｐＨ５，０の緩衝液で透析する
際、不活性な物質のほとんどが沈澱した。陽イオン交換
クロマトグラフィは、陽イオン交換カラムに結合し損っ
た強い紫外線吸収（λｍａｘ ＝ ２６０ｎｍ）の非蛋
白質の夾雑物を除去する。
この工程は、特異的な活性の増加をもたらす。ＩＬ２−
ＰＥ４０調製物は、非還元条件下で５ＯＳ−ＰＡＧＥに
よる判定では高分子量の夾雑物を含んでいない。
ＰＥ４０調製物は、非還元条件下で５ＯＳ−ＰＡＧＥに
よる判定では高分子量の夾雑物を含んでいない。
純度について著しい増加は観察されなかったが、ゲル浸
透は、低分子量の夾雑物および内毒素を除去するのに有
用である。ゲル口過工程を無菌の条件下で行なう場合、
最終調製物は、探知できる程度の内毒素を含んでいない
。またこの工程は、ＩＬ２−ＰＨ４０を最終貯蔵緩衝液
中に交換するのに都合が良い。
透は、低分子量の夾雑物および内毒素を除去するのに有
用である。ゲル口過工程を無菌の条件下で行なう場合、
最終調製物は、探知できる程度の内毒素を含んでいない
。またこの工程は、ＩＬ２−ＰＨ４０を最終貯蔵緩衝液
中に交換するのに都合が良い。
ＩＬ−２Ｒ−Δ−Ｎａｅとして表わされるＩＬ−２Ｒ（
ｐ５５）の可溶化形能の調製および精製は、ｔＩａｋｉ
ｍｉ らのＪ。
ｐ５５）の可溶化形能の調製および精製は、ｔＩａｋｉ
ｍｉ らのＪ。
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｓ＋、２６２．１７３３６−１７３４
１ ［１９８７］ に記載されている。精製されたＩＬ
−２Ｒを、カップリング密度１．０５ｍｇ／ｍゲルでＮ
ｕＧｅｌ Ｐ−＾ＦポリーＮ−ヒドロキシーサクシンイ
ミド（５００人、５０μｍ、 ５ｅｐａｒａｔｉｏｎＩ
ｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、メトーチェン、ニュージャジー州
、米国）に固定し、Ｂａ１ｌｏｎらのＢｉｏ／ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ５．１１９５−１１９８（１９８７）に
よって記載されている様に、ＩＬ ２−ＰＨ４０の精製
のためのアフィニティ吸収剤として使用した。
１ ［１９８７］ に記載されている。精製されたＩＬ
−２Ｒを、カップリング密度１．０５ｍｇ／ｍゲルでＮ
ｕＧｅｌ Ｐ−＾ＦポリーＮ−ヒドロキシーサクシンイ
ミド（５００人、５０μｍ、 ５ｅｐａｒａｔｉｏｎＩ
ｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、メトーチェン、ニュージャジー州
、米国）に固定し、Ｂａ１ｌｏｎらのＢｉｏ／ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ５．１１９５−１１９８（１９８７）に
よって記載されている様に、ＩＬ ２−ＰＨ４０の精製
のためのアフィニティ吸収剤として使用した。
４０ｄの固定化したＩＬ−２Ｒゲルを、２種類のアダプ
ターに取り付けたＡｍ１ｃｏｎ Ｇ−２２Ｘ２５０カラ
ム（Ａｍｉｃｏｎ＋Ｄｉｖ、Ｗ、Ｒ，Ｇｒａｃｅ ＆
Ｃｏ、＋ ダンバース、マサチューセッツ州、米国）に
充填した。カラムをリン酸緩衝液食塩水（ＰＢＳ）で平
衡化させた。
ターに取り付けたＡｍ１ｃｏｎ Ｇ−２２Ｘ２５０カラ
ム（Ａｍｉｃｏｎ＋Ｄｉｖ、Ｗ、Ｒ，Ｇｒａｃｅ ＆
Ｃｏ、＋ ダンバース、マサチューセッツ州、米国）に
充填した。カラムをリン酸緩衝液食塩水（ＰＢＳ）で平
衡化させた。
７！の抽出液（３５ｇの細胞から誘導した全抽出液のＶ
２＞を、７ｄ／分の流速でカラムにかけた。カラム流出
液をＧ１１ｓｏｎ １ｆｌＢ紫外線検出器で監視し、Ｋ
ｉｐｐｅｎ Ｚｏｎｅｎ記録計（Ｇｉｌｓｏｎ Ｍｅｄ
ｉｃａｌ ＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓＩｎｃ、 ＋ ミ
ドルタウン、ウィスコンシン州、米国）で記録した。カ
ラムを、２８０ｎｍに於ける吸収が基線に戻るまでＰＢ
Ｓで洗浄した。ＩＬ２−ＰＨ４０活性を、５０ｍＭ リ
ン酸カリウムに溶解した３ＭのＫＳＣＮｐＨ６，０を用
いてカラムから溶離させた。貯蔵にＳＣＮ溶液を、使用
する前に、活性炭フィルターを通す口過によって脱色し
た。溶離したＩＬ ２−ＰＨ４０を、１２−１４，００
０Ｍ、Ｗ、分離透析チューブ中、２！の５０ｍＭ酢酸ナ
トリウム、ｐ）（５，０に対して透析した。
２＞を、７ｄ／分の流速でカラムにかけた。カラム流出
液をＧ１１ｓｏｎ １ｆｌＢ紫外線検出器で監視し、Ｋ
ｉｐｐｅｎ Ｚｏｎｅｎ記録計（Ｇｉｌｓｏｎ Ｍｅｄ
ｉｃａｌ ＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓＩｎｃ、 ＋ ミ
ドルタウン、ウィスコンシン州、米国）で記録した。カ
ラムを、２８０ｎｍに於ける吸収が基線に戻るまでＰＢ
Ｓで洗浄した。ＩＬ２−ＰＨ４０活性を、５０ｍＭ リ
ン酸カリウムに溶解した３ＭのＫＳＣＮｐＨ６，０を用
いてカラムから溶離させた。貯蔵にＳＣＮ溶液を、使用
する前に、活性炭フィルターを通す口過によって脱色し
た。溶離したＩＬ ２−ＰＨ４０を、１２−１４，００
０Ｍ、Ｗ、分離透析チューブ中、２！の５０ｍＭ酢酸ナ
トリウム、ｐ）（５，０に対して透析した。
透析物を、遠心分離してすべての沈澱物を除去した。澄
んだ透析物を、陽イオン交換クロマトグラフィー用に用
意した。
んだ透析物を、陽イオン交換クロマトグラフィー用に用
意した。
前記工程からの透析されたＩＬ ２−ＰＥ４０を、５０
ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５，０で平衡化した１、６Ｘ
１５Ｃｍ ＣＭ−Ｆａｓｔ Ｆｌｏ＆４カラム（Ｐｈａ
ｒｎ＋ａｃ、（ａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ Ｉｎｃ、、ピスカタウエー、ニューシャーシー州、
米国）に、３．３ｄ／分の流速でかけた。
ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５，０で平衡化した１、６Ｘ
１５Ｃｍ ＣＭ−Ｆａｓｔ Ｆｌｏ＆４カラム（Ｐｈａ
ｒｎ＋ａｃ、（ａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ Ｉｎｃ、、ピスカタウエー、ニューシャーシー州、
米国）に、３．３ｄ／分の流速でかけた。
カラムを、すべての非吸着物質が除去される迄、平衡緩
衝液で洗浄した。吸着したＩＬ ２−ｐＨ！４０を、５
０ｍＭのリン酸カリウムｐＨ６，０中の０．５ＭのＮａ
Ｃ１を用いてカラムから溶離させた。次いでＹＭ １０
膜を取り付けた薄型チャンネル攪拌セルＡｍ１ｃｏｎ濃
縮器中で濃縮した。
衝液で洗浄した。吸着したＩＬ ２−ｐＨ！４０を、５
０ｍＭのリン酸カリウムｐＨ６，０中の０．５ＭのＮａ
Ｃ１を用いてカラムから溶離させた。次いでＹＭ １０
膜を取り付けた薄型チャンネル攪拌セルＡｍ１ｃｏｎ濃
縮器中で濃縮した。
Ｐｈａｒｍａｃ、（ａ Ｋ２５／ １００カラムに、９
０ｃｒｎの高さに５ｅｐｈａｒｏｓｅ （商標） ＣＬ
−６８（Ｐｈａｒｍａｃ、（ａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ、）を充填した。カラムを、０
．５ｄ／分の流速で、０．１５ＭのＮａＣ１を含む５０
ｍＭのリン酸カリウムｐｉ（６，０を用いて平衡化させ
た。濃縮されたＩＬ ２−ＰＥ４０（２０戚）を、カラ
ムにかけ、更に平衡化緩衝液で展開させた。カラム操作
を、アフィニティ工程で記述したと同様にして監視した
。６分の分画を、ＬＫＢ １ｌｌｔｒａ Ｒａｃ−７０
００分画収集装置（ＩＪＢＰｒｏｄｕｋｔｅｒ、 Ｂｒ
Ｏｍｍｅｒ、スエーデン）中に集めた。
０ｃｒｎの高さに５ｅｐｈａｒｏｓｅ （商標） ＣＬ
−６８（Ｐｈａｒｍａｃ、（ａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ、）を充填した。カラムを、０
．５ｄ／分の流速で、０．１５ＭのＮａＣ１を含む５０
ｍＭのリン酸カリウムｐｉ（６，０を用いて平衡化させ
た。濃縮されたＩＬ ２−ＰＥ４０（２０戚）を、カラ
ムにかけ、更に平衡化緩衝液で展開させた。カラム操作
を、アフィニティ工程で記述したと同様にして監視した
。６分の分画を、ＬＫＢ １ｌｌｔｒａ Ｒａｃ−７０
００分画収集装置（ＩＪＢＰｒｏｄｕｋｔｅｒ、 Ｂｒ
Ｏｍｍｅｒ、スエーデン）中に集めた。
ＩＬ ２−ＰＥ４０活性（〜５４ｋＤａ）に対応するピ
ークを集め、０．５−１．０ ｍｇ蛋白質／ ｍｌに濃
縮し、更に０．２μフイルターを通し口過し、−２０’
Ｃで凍結させて貯蔵した。ゲル浸透工程を、無菌条件下
で行なった。
ークを集め、０．５−１．０ ｍｇ蛋白質／ ｍｌに濃
縮し、更に０．２μフイルターを通し口過し、−２０’
Ｃで凍結させて貯蔵した。ゲル浸透工程を、無菌条件下
で行なった。
本発明のＩＬ ２−ＰＥ４０の生物活性は、ＩＬ−２の
高親和性レセプターを保持するリンパ球様細胞における
蛋白質合成の阻害能力の研究により、インビトロにおい
て試験され得る。これらの研究において使用され得る細
胞は、ネズミＣＴＬＬ株（ＣＴＬＬは、長期、ＩＬ−２
−依存性ネズミＴｉｌ胞系であり、寄託番号ＴＩＢ ２
１４のもとにＡＴＣＣから入手可能である）、コンカナ
バリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）を用いた培養により高親和性Ｔ
Ｌ−２レセプター（ＩＬ−２［？）を発現するように活
性化されたネズミ肺臓細胞、および白血球混合培養物（
ＭＬＣ芽細胞）中での熟成により高親和性ＩＬ−２Ｒを
発現するように活性化されたヒト末梢血リンパ球を含む
。負の対照としては、ネズミＰ８１５肥満細胞腫株（Ａ
ＴＣＣＮａ、ＴＩＢ ６４）等のＩＬ−２Ｒを欠失して
いるいかなる細胞を用いてもよい。
高親和性レセプターを保持するリンパ球様細胞における
蛋白質合成の阻害能力の研究により、インビトロにおい
て試験され得る。これらの研究において使用され得る細
胞は、ネズミＣＴＬＬ株（ＣＴＬＬは、長期、ＩＬ−２
−依存性ネズミＴｉｌ胞系であり、寄託番号ＴＩＢ ２
１４のもとにＡＴＣＣから入手可能である）、コンカナ
バリンＡ（Ｃｏｎ Ａ）を用いた培養により高親和性Ｔ
Ｌ−２レセプター（ＩＬ−２［？）を発現するように活
性化されたネズミ肺臓細胞、および白血球混合培養物（
ＭＬＣ芽細胞）中での熟成により高親和性ＩＬ−２Ｒを
発現するように活性化されたヒト末梢血リンパ球を含む
。負の対照としては、ネズミＰ８１５肥満細胞腫株（Ａ
ＴＣＣＮａ、ＴＩＢ ６４）等のＩＬ−２Ｒを欠失して
いるいかなる細胞を用いてもよい。
ネズミＣｏｎ Ａ−活性化肺臓細胞は、Ｃ５７ＢＬ／
６ネズミ由来の肺臓細胞を、５％加熱不活性化胎児性ウ
シ血清および２μｇ／ｒｒｄｌのＣｏｎ Ａを含む培養
培地中でｌＸｌ０’細胞／−の密度にて熟成することに
より調製され得る。３７°Ｃにて３日間の熟成後、咳肺
臓細胞を培養物から採取し、アッセイに先立ってＣｏｎ
Ａを含まない新鮮培地により３回洗浄した。
６ネズミ由来の肺臓細胞を、５％加熱不活性化胎児性ウ
シ血清および２μｇ／ｒｒｄｌのＣｏｎ Ａを含む培養
培地中でｌＸｌ０’細胞／−の密度にて熟成することに
より調製され得る。３７°Ｃにて３日間の熟成後、咳肺
臓細胞を培養物から採取し、アッセイに先立ってＣｏｎ
Ａを含まない新鮮培地により３回洗浄した。
ヒ） ＭＬＣ芽細胞を調製するために、２人の健常人か
らの末梢血単核細胞を、ＧａｔｅｌｙらのＪ、Ｎａｔｌ
、Ｃａｎ。
らの末梢血単核細胞を、ＧａｔｅｌｙらのＪ、Ｎａｔｌ
、Ｃａｎ。
Ｉｎ５ｔ、 ６９．１２４５−１２５４（１９８２）に
記載されているようにして単離した。第１の提供者から
の白血球じ刺激細胞”）を、第２の提供者からの白血球
（“応答細胞″）と混合する前に、１５００ｒａｄのＸ
線照射により処理した。刺激細胞（Ｉ Ｘｌ０ｈ／ｄ）
および応答細胞（Ｉ ＸＩＯ’／ｄ）を、合せて６日間
、３７℃にて共に培養した。培養４日目に、組換えヒト
ＩＬ−２（ｒｌＬ−２）を各培養物に最終濃度５０単位
／ ｔｎｆｌをもって添加した。６日目に、細胞を採集
し、アッセイに先立って新鮮培地により３回洗浄した。
記載されているようにして単離した。第１の提供者から
の白血球じ刺激細胞”）を、第２の提供者からの白血球
（“応答細胞″）と混合する前に、１５００ｒａｄのＸ
線照射により処理した。刺激細胞（Ｉ Ｘｌ０ｈ／ｄ）
および応答細胞（Ｉ ＸＩＯ’／ｄ）を、合せて６日間
、３７℃にて共に培養した。培養４日目に、組換えヒト
ＩＬ−２（ｒｌＬ−２）を各培養物に最終濃度５０単位
／ ｔｎｆｌをもって添加した。６日目に、細胞を採集
し、アッセイに先立って新鮮培地により３回洗浄した。
アッセイは、細胞、ｒＩＬ−２およびｒＬ ２−ＰＥ４
０の５０μｌ分別量を平底マイクロプレート （例えば
Ｃｏ５ｔａｒ ３５９６）の大中で混合することにより
行なった。該アッセイに使用した培地は、５％熱不活性
化胎児性ウシ血清、０．１ｍＭ非必須アミノ酸類、１ｍ
Ｍピルビン酸ナトリウム、２ｍＭＬ−グルタミン、５
ｘｌＯ−’Ｍ ２−メルカプトエタノール、１００単位
／ｄペニシリン、１００μｇ ／ ｍａｌストレプトマ
イシンおよび５０μｇ／ｄゲンタマイシンを補充したロ
イシン非含有Ｅａｇｌｅの最少必須培地であった。ヒト
およびネズミリンパ球細胞は、２Ｘ１０’細胞／穴の濃
度で添加され、ネズミ細胞株は５Ｘ１０３細胞／穴にお
いて使用された。該培養物は、３７°Ｃにて、２４時間
（ＣＴＬＬおよびＰ８１５）または４８時間（ヒトおよ
びネズミリンパ芽細胞）培養した。２５μｌの分別量の
３Ｈ−ロイシンＣＨ−Ｌｅｕ）、２０μｃｉ／−を各人
に加えた。該培養物を３７°Ｃにて更に６時間培養し、
引続きガラス繊維フィルター上に採取した。
０の５０μｌ分別量を平底マイクロプレート （例えば
Ｃｏ５ｔａｒ ３５９６）の大中で混合することにより
行なった。該アッセイに使用した培地は、５％熱不活性
化胎児性ウシ血清、０．１ｍＭ非必須アミノ酸類、１ｍ
Ｍピルビン酸ナトリウム、２ｍＭＬ−グルタミン、５
ｘｌＯ−’Ｍ ２−メルカプトエタノール、１００単位
／ｄペニシリン、１００μｇ ／ ｍａｌストレプトマ
イシンおよび５０μｇ／ｄゲンタマイシンを補充したロ
イシン非含有Ｅａｇｌｅの最少必須培地であった。ヒト
およびネズミリンパ球細胞は、２Ｘ１０’細胞／穴の濃
度で添加され、ネズミ細胞株は５Ｘ１０３細胞／穴にお
いて使用された。該培養物は、３７°Ｃにて、２４時間
（ＣＴＬＬおよびＰ８１５）または４８時間（ヒトおよ
びネズミリンパ芽細胞）培養した。２５μｌの分別量の
３Ｈ−ロイシンＣＨ−Ｌｅｕ）、２０μｃｉ／−を各人
に加えた。該培養物を３７°Ｃにて更に６時間培養し、
引続きガラス繊維フィルター上に採取した。
細胞蛋白質中への３Ｈ−ロイシンの取込みを、液体シン
チレーション計数により測定した。報告したすべての値
は、３重の試料の平均±Ｉ ＳＥＭである。
チレーション計数により測定した。報告したすべての値
は、３重の試料の平均±Ｉ ＳＥＭである。
高親和性ＩＬ−２（ＩＬ−２Ｒ＋）を有するネズミＣＴ
ＬＬ細胞、およびＩＬ−２Ｒ欠失（ＩＬ−２Ｒ−）のネ
ズミＰ８１５肥満細胞腫細胞を用いたＩＬ ２−Ｐ２Ｏ
の培養結果を第１表に示す。ＩＬ ２−ＰＨ４０は、Ｉ
Ｌ−２Ｒ−保有ＣＴＬＬ細胞による蛋白質合成の有力な
阻害剤である。ＣＴＬＬ細胞による蛋白質合成の５０％
阻害は、これらの実験において、０．０３ｎｇ／ｒｄと
０．１６ｎｇ／ｄとの間のＩＬ２−ＰＥ４０濃度で観察
された。他方において、約５ないし６μｇ／ｄのＩＬ
２−ＰＨ４０が、ｒＬ−２Ｒを欠くＰ８１５細胞による
蛋白質合成の５０％阻害を起こすために必要であった。
ＬＬ細胞、およびＩＬ−２Ｒ欠失（ＩＬ−２Ｒ−）のネ
ズミＰ８１５肥満細胞腫細胞を用いたＩＬ ２−Ｐ２Ｏ
の培養結果を第１表に示す。ＩＬ ２−ＰＨ４０は、Ｉ
Ｌ−２Ｒ−保有ＣＴＬＬ細胞による蛋白質合成の有力な
阻害剤である。ＣＴＬＬ細胞による蛋白質合成の５０％
阻害は、これらの実験において、０．０３ｎｇ／ｒｄと
０．１６ｎｇ／ｄとの間のＩＬ２−ＰＥ４０濃度で観察
された。他方において、約５ないし６μｇ／ｄのＩＬ
２−ＰＨ４０が、ｒＬ−２Ｒを欠くＰ８１５細胞による
蛋白質合成の５０％阻害を起こすために必要であった。
従って、これらの実験においては、ＩＬ−２Ｒ−保有ネ
ズミ細胞株に対して毒性のＩＬ ２−ＰＥ４０（７）濃
度は、ＩＬ−２Ｒ−負細胞とは１０．０００倍以上の差
がある。このことは、ｒＬ ２−Ｐ２Ｏが高親和性ＩＬ
−２Ｒを有する細胞に対して選択的に毒性であることを
示している。
ズミ細胞株に対して毒性のＩＬ ２−ＰＥ４０（７）濃
度は、ＩＬ−２Ｒ−負細胞とは１０．０００倍以上の差
がある。このことは、ｒＬ ２−Ｐ２Ｏが高親和性ＩＬ
−２Ｒを有する細胞に対して選択的に毒性であることを
示している。
（本頁以下余白）
第２表は、付加的な研究の結果を示すもので、発達の第
１段階にあるネズミまたはヒトリンパ芽細胞に対する１
１２−ＰＥ４０の効果を測定した。 ＩＬ２−ＰＥ４０
は、Ｃｏｎ Ａ−活性化ネズミ肺臓細胞による蛋白質合
成の５０％狙害を約４ ｎｇ ／ ｍｌ ｒＬ ２−
ＰＥ４０にて住することが観察された。同様に、ＩＬ
２−ＰＨ４０は、ヒ） ＭＬＣ芽細胞による蛋白質合成
を、約１１ｎｇ／ｚｊ！の５０％阻害濃度をもって阻害
した。
１段階にあるネズミまたはヒトリンパ芽細胞に対する１
１２−ＰＥ４０の効果を測定した。 ＩＬ２−ＰＥ４０
は、Ｃｏｎ Ａ−活性化ネズミ肺臓細胞による蛋白質合
成の５０％狙害を約４ ｎｇ ／ ｍｌ ｒＬ ２−
ＰＥ４０にて住することが観察された。同様に、ＩＬ
２−ＰＨ４０は、ヒ） ＭＬＣ芽細胞による蛋白質合成
を、約１１ｎｇ／ｚｊ！の５０％阻害濃度をもって阻害
した。
（本頁以下余白）
第２表
Ｃｏｎ Ａ−活性化ネズミ牌臓ｍ胞および混合白血球培
養により活性されたヒトリンパ芽細胞の蛋白質合成の阻
害におけるＩＬ ２−ＰＨ４０の能カフ６３±２７３ １８．１３５土９３６ １、５２１±Ｉ ２．７６５±（資） ４．５７９±１５４ ８．９７７±３５２ １４．７０３±８９２ １．９００ ｆ １９１ ２、シロ±泪 ４．３８６±７０ １０．０３０±５７０ Ｌ４．７６１±１３６４ １、顕±１兇 １８．７４４±５１１ １．７４０±１９９ ４．３８４±１８０ ７．４５０±６２４ １２．１８６±８２２ 上述した実験において、ＩＬ ２−ＰＥ４０の生物学的
活性は、ネズミＣＴＬＬ、 ＰＨ１５およびＣｏｎ Ａ
−活性化肺臓細胞によるアッセイにおける先行技術の＾
ｓｐ”１Ｌ２−ＰＥ４０の活性と比較した（第１表およ
び第２表）。
養により活性されたヒトリンパ芽細胞の蛋白質合成の阻
害におけるＩＬ ２−ＰＨ４０の能カフ６３±２７３ １８．１３５土９３６ １、５２１±Ｉ ２．７６５±（資） ４．５７９±１５４ ８．９７７±３５２ １４．７０３±８９２ １．９００ ｆ １９１ ２、シロ±泪 ４．３８６±７０ １０．０３０±５７０ Ｌ４．７６１±１３６４ １、顕±１兇 １８．７４４±５１１ １．７４０±１９９ ４．３８４±１８０ ７．４５０±６２４ １２．１８６±８２２ 上述した実験において、ＩＬ ２−ＰＥ４０の生物学的
活性は、ネズミＣＴＬＬ、 ＰＨ１５およびＣｏｎ Ａ
−活性化肺臓細胞によるアッセイにおける先行技術の＾
ｓｐ”１Ｌ２−ＰＥ４０の活性と比較した（第１表およ
び第２表）。
ＩＬ ２−ＰＨ４０および＾ｓｐ’ｌＬ ２−ＰＥ４０
の生物学的活性は、これらの研究において非常に類領し
ていた。
の生物学的活性は、これらの研究において非常に類領し
ていた。
上記のようにｉｌｌ製した試料を、ポストカラム・フル
オレスカミン誘導による装置を用いたアミノ酸分析に供
した（Ｐａｎおよび５ｔｅｉｎのボストカラム・フルオ
レスカミン誘導によるアミノ酸分析、Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍ１ｃｒｏｃｈａｒａｃｔｅｒ
ｉｚａｔｉｏｎ”５ｈｉｖｅｌｙ、 Ｊ、ｌ！、（［
） 、 Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ
Ｉｎｃ、 クリフトン、ニュージャージ、米国、（１
９８６］） 、分析に先立って、該蛋白質を４％のチオ
グリコール酸を含む６ＮｌｆＣ１中で、１１０°Ｃにて
２０−２４時間減圧下に加水分解した。結果は、第３表
にまとめて示した。
オレスカミン誘導による装置を用いたアミノ酸分析に供
した（Ｐａｎおよび５ｔｅｉｎのボストカラム・フルオ
レスカミン誘導によるアミノ酸分析、Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍ１ｃｒｏｃｈａｒａｃｔｅｒ
ｉｚａｔｉｏｎ”５ｈｉｖｅｌｙ、 Ｊ、ｌ！、（［
） 、 Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ
Ｉｎｃ、 クリフトン、ニュージャージ、米国、（１
９８６］） 、分析に先立って、該蛋白質を４％のチオ
グリコール酸を含む６ＮｌｆＣ１中で、１１０°Ｃにて
２０−２４時間減圧下に加水分解した。結果は、第３表
にまとめて示した。
該試料を、配列分析にも供した。第３図に示す２個の配
列が得られた。試料中の２５％の組換え蛋白質がＮ−末
端に付加的メチオニン残基を有することが見出された。
列が得られた。試料中の２５％の組換え蛋白質がＮ−末
端に付加的メチオニン残基を有することが見出された。
Ｎ−末端アミノ酸配列（一方の配列のＮ−末端メチオニ
ン残基を無視して、最初の１５個のアミノ酸）は、天然
ヒトＩＬ−２のＮ−末端アミノ酸配列に一致した。第３
表中に示した結果は、試料の予備的な分析に基づくこと
に注意すべきである。対照として緩衝液によるブランク
は分析しておらず、また、ＰＲＯｌＣＹＳおよびＴＲＰ
は測定しなかった（ＮＤ） 。
ン残基を無視して、最初の１５個のアミノ酸）は、天然
ヒトＩＬ−２のＮ−末端アミノ酸配列に一致した。第３
表中に示した結果は、試料の予備的な分析に基づくこと
に注意すべきである。対照として緩衝液によるブランク
は分析しておらず、また、ＰＲＯｌＣＹＳおよびＴＲＰ
は測定しなかった（ＮＤ） 。
（本頁以下余白）
第１図は、本発明のプラスミドの構築を示す模式図、
第２図は、＾ｓｐ”ｌＬ ２−ＰＨ４０のアミノ酸配列
を示す図、 第３図は、ＩＬ ２−ＰＨ４０のＮ−末端アミノ酸配列
分析の結果を示す図、および 第４図は、ＩＬ ２−Ｐ［！４０の精製方法を模式的に
示す図である。 出願人 エフ・ホフマンーラロシュ７−ｖ −代理人
弁理士 平 木 祐 輔第３表 ｒＬ ２−ＰＨ４０のアミノ酸分析 Ｔ）ＩＲ（Ｔ） ＳＥＲ（Ｓ） ＧＬＵ （Ｅ） ＰＲＯ（Ｐ） ＧＬＹ （Ｇ） ＡＬＡ（＾） ＣＹＳ （Ｃ） ＶＡＬ（Ｖ） ＭＥＴ（Ｍ） １１、ｔ！（１） ＬＥＤ（Ｌ） ＴＹＲ（Ｙ） Ｐ）１Ｂ （Ｆ） ＨＩＳ（Ｈ） ＬＹＳ （Ｋ） 八ＲＧ （Ｒ） ２７．６ ２５．５ ６４．２ Ｔｌ ４０．７ ５１．６ Ｏ ２３，１ ４，０ ２１，１ ６３，３ １６，２ １６，０ ９，１ １５，５ ３３，３ １面の浄書 第４図 ４倍容５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、 １ｍＭ ＥＤＴＡ、 ｐＨ８，０ ５倍容７Ｍ ＧｕｆｌＣｌ、０．１Ｍ ）リス−〇ＣＩ
、ｐ）１８．０ 、各１ｒｎＭのＥ［ｌ’ｒＡとＤＴＴ
ＰＢＳによる１−８０希釈 一夜撹拌、清澄化 緩衝液洗浄、ＰＢＳ溶出緩衝液３ＭＫＳＣＮ５０ｒｎＭ
リン酸カリウム中、ｐＨ６，０５０ｎ＋Ｐ酢酸塩、ｐＨ
５，０，５０ｍＭリン酸カリウム中の０．５ＭＮａＣ：
Ｉによる溶出、Ｆ）４１６．０遊動相：５０ｔｎＭリン
酸カリウム、 ｐＨ６，０，０，１５ＭＮａＣ１ −２０°Ｃにて凍結保存
を示す図、 第３図は、ＩＬ ２−ＰＨ４０のＮ−末端アミノ酸配列
分析の結果を示す図、および 第４図は、ＩＬ ２−Ｐ［！４０の精製方法を模式的に
示す図である。 出願人 エフ・ホフマンーラロシュ７−ｖ −代理人
弁理士 平 木 祐 輔第３表 ｒＬ ２−ＰＨ４０のアミノ酸分析 Ｔ）ＩＲ（Ｔ） ＳＥＲ（Ｓ） ＧＬＵ （Ｅ） ＰＲＯ（Ｐ） ＧＬＹ （Ｇ） ＡＬＡ（＾） ＣＹＳ （Ｃ） ＶＡＬ（Ｖ） ＭＥＴ（Ｍ） １１、ｔ！（１） ＬＥＤ（Ｌ） ＴＹＲ（Ｙ） Ｐ）１Ｂ （Ｆ） ＨＩＳ（Ｈ） ＬＹＳ （Ｋ） 八ＲＧ （Ｒ） ２７．６ ２５．５ ６４．２ Ｔｌ ４０．７ ５１．６ Ｏ ２３，１ ４，０ ２１，１ ６３，３ １６，２ １６，０ ９，１ １５，５ ３３，３ １面の浄書 第４図 ４倍容５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、 １ｍＭ ＥＤＴＡ、 ｐＨ８，０ ５倍容７Ｍ ＧｕｆｌＣｌ、０．１Ｍ ）リス−〇ＣＩ
、ｐ）１８．０ 、各１ｒｎＭのＥ［ｌ’ｒＡとＤＴＴ
ＰＢＳによる１−８０希釈 一夜撹拌、清澄化 緩衝液洗浄、ＰＢＳ溶出緩衝液３ＭＫＳＣＮ５０ｒｎＭ
リン酸カリウム中、ｐＨ６，０５０ｎ＋Ｐ酢酸塩、ｐＨ
５，０，５０ｍＭリン酸カリウム中の０．５ＭＮａＣ：
Ｉによる溶出、Ｆ）４１６．０遊動相：５０ｔｎＭリン
酸カリウム、 ｐＨ６，０，０，１５ＭＮａＣ１ −２０°Ｃにて凍結保存
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、アミノ末端に組換えヒトインターロイキン−２配列
を有し、カルボキシル末端にシュードモナス（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎｕｓ）エクソトキシン領域の配列を含有する
融合蛋白質であって、前記インターロイキン−２のアミ
ノ末端が天然ヒトインターロイキン−２のアミノ末端配
列と同等であり、および、選択的にＮ−末端に付加的な
メチオニン残基を有していてもよいイムノトキシン（ｉ
ｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ）融合蛋白質。 ２、該カルボキシル末端のシュードモナス外毒素領域が
、シュードモナスエクソトキシン４０である請求項第１
項に記載のイムノトキシン。 ３、該イムノトキシンが、本質的に均質な蛋白質である
請求項第１項に記載のイムノトキシン。 ４、請求項第１項または第２項に定義されたイムノトキ
シン融合蛋白質をコードするＤＮＡ。 ５、請求項第１項または第２項に定義されたイムノトキ
シン融合蛋白質をコードするＤＮＡを含んでなる組換え
ベクター。 ６、請求項第１項または第２項に定義されたイムノトキ
シン融合蛋白質をコードするＤＮＡを含んでなる組換え
ベクターを有する単細胞宿主微生物。 ７、自己免疫甲状腺炎、タイプ１糖尿病、慢性関節リウ
マチ、またはクローン（Ｃｒｏｈｎ）疾患等の自己免疫
疾患の治療用、ならびに同種移植片および器官移植の拒
絶における免疫反応の抑制のための請求項第１項ないし
第３項のいずれか１項に記載のイムノトキシン融合蛋白
質。 ８、（ａ）前記イムノトキシン融合蛋白質を高水準で発
現し得る発現プラスミドにより形質転換された単細胞宿
主微生物を培養し；および （ｂ）前記イムノトキシン融合蛋白質を公知の方法によ
り精製すること、 を含んでなる請求項第１項ないし第３項に記載のイムノ
トキシン融合蛋白質の製造方法。 ９、該発現された融合イムノトキシン蛋白質をインター
ロイキン−２レセプターアフィニティクロマトグラフィ
工程を使用して精製する請求項第８項に記載の方法。 １０、少量かつ有効量の請求項第１項ないし第３項のい
ずれか１項に記載のイムノトキシン融合蛋白質、および
主要量の非経口投与に適した医薬的賦形剤を含んでなる
医薬組成物。 １１、自己免疫甲状腺炎、タイプ１糖尿病、慢性関節リ
ウマチ、またはクローン疾患等の自己免疫疾患の治療、
ならびに同種移植片および器官移植の拒絶における免疫
反応の抑制のための請求項第１項ないし第３項のいずれ
かに記載のイムノトキシン融合蛋白質の使用。 １２、請求項第１０項に記載の医薬組成物の調製のため
の請求項第１項ないし第３項のいずれかに記載のイムノ
トキシン融合蛋白質の使用。 １３、請求項第８項または第９項に記載の方法により調
製された請求項第１項ないし第３項のいずれか１項に記
載のイムノトキシン融合蛋白質。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US27235688A | 1988-11-17 | 1988-11-17 | |
| US272,356 | 1988-11-17 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02273193A true JPH02273193A (ja) | 1990-11-07 |
Family
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1297759A Pending JPH02273193A (ja) | 1988-11-17 | 1989-11-17 | 組換えインターロイキン―２融合蛋白質類 |
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| JP (1) | JPH02273193A (ja) |
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-
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