MC2265A1 - Analogues de la lhrh - Google Patents

Description

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10 Analogues de la LHRH

La présente invention a été réalisée avec l'aide du Gouvernement, sous les numéros d'autorisation 40003 et 40004, délivrés par le N.C.I. (NIH). Le Gouvernement des E.U.A. a certains 15 droits sur cette demande.

, Demandes apparentées

La présente demande est une suite partielle des demandes 20 U.S. en cours d'examen s.n. 07/260 994, déposée le 10/21/1988 et s.n. 07/404 667, déposée le 09/07/1989.

Arrière-plan de l'invention

25 La présente invention a pour objet de nouveaux peptides qui contiennent des motifs cytotoxiques, ont une action sur la libération de gonadotropines à partir de l'hypophyse de mammifères et possèdent une activité antinéoplasique. En particulier, la présente invention a pour objet des analogues de l'hormone lutéinisante-3 0 hormone de libération LHRH ayant la structure suivante :

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

ses sels et les compositions pharmaceutiques et les procédés 3 5 utilisant ces analogues.

?

+

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Description de la technique antérieure

L'hormone lutéinisante-hormone de libération (LHRH) hypo-thalamique commande la libération hypophysaire de 5 gonadotropines (LH et FSH) qui stimulent la synthèse de stéroïdes sexuels dans les gonades.

Une nouvelle orientation dans le traitement des tumeurs sensibles aux hormones a été développée, et est dirigée vers l'utilisation d'agonistes et d'antagonistes de la LHRH (A.V. Schally 10 and A.M. Comaru-Schally, Sem. Endocrinol., 5., 389-398, 1987). Certains agonistes de la LHRH, lorsqu'ils sont substitués en positions 6, 10 ou les deux, sont bien plus actifs que la LHRH et présentent également une activité prolongée. Les superagonistes suivants sont utilisés dans la pratique clinique :

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[D-Leu5,NH-Et10] LHRH (Leuprolide; J.A. Vilchez-Martinez et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 59 1226-1232, 1974)

[D-Trp5]LHRH (Decapeptyl, D. H. Coy et al., J.Med.Chem., 19 423-425, 1976). [D-Ser(tBu)6,NH-Et10]LHRH (Buserelin, W. Koenig et al., In: R. Walter and J.

2 0 Meienhofer (eds.),

Peptides: Chemistry, Structure and Biology. Proceedings of the Fourth American

Peptide Symposium. Ann Arbor Science, Ann Arbor, Ml, 1975, pp. 883-888.

[D-Ser(tBu)6,NH-NH-CO-NH210]LHRH (Zoladex, A.S. Dutta et al., J. Med. Chem.,

25 211018-1024,1978).

[D-Nal(2)6]LHRH (Nafarelin, J.J. Nestor et al., J. Med. Chem., 25 795-801,1982).

Des modifications en positions 1, 2, 3, 6 et éventuellement en 3 0 positions 5 et 10 de la molécule LHRH ont conduit à la création d'antagonistes puissants (M.J. Karten and J.E. Rivier, Endocrine Review, 2. 44-66, 1986 ; S. Bajusz et al., Int. J. Pept. Prot. Res., 32 425-435, 1988) qui inhibent la libération de LH et de FSH à partir de l'hypophyse et sont des agents thérapeutiques potentiels dans le 3 5 traitement de cancers dépendants des hormones (prostate, sein et pancréas) (A.V. Schally, General Gynecology, vol. 6, Parthenon Press, Carnforth, England, 1989, pp. 1-20).

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Les médicaments anticancéreux parfaits seraient théoriquement ceux qui permettent d'éradiquer les cellules cancéreuses sans endommager les cellules normales. Les hormones porteuses d'agents antinéoplasiques pourraient résoudre le 5 problème en réalisant une chimiothérapie mieux ciblée des tumeurs contenant des récepteurs. Un mécanisme parfait de l'activité des conjugués hormone-médicament serait leur liaison au récepteur membranaire cellulaire, suivie par l'internalisation des molécules hybrides et la libération des drogues ou de leurs dérivés 10 biologiquement actifs à partir de l'hormone porteuse dans les endosomes ou les lysosomes secondaires. Les substances libérées traversent alors la membrane des vésicules pour passer dans le cytosol, et atteignent leur site cible final. Pour que les conjugués soient efficaces en participant à ce mécanisme, la liaison entre la 15 drogue et l'hormone doit être stable avant l'internalisation des conjugués dans les cellules tumorales cibles, mais doit être coupée de façon efficace après cette internalisation.

De nombreuses tumeurs humaines sont dépendantes des hormones, ou réagissent aux hormones, et contiennent des 20 récepteurs hormonaux. Certaines de ces tumeurs sont dépendantes de, ou réagissent aux hormones sexuelles ou aux facteurs de croissance, ou comprennent des composants qui sont dépendants ou réactifs. Les autres tumeurs ou composants de tumeurs ne sont pas aussi dépendants. Les carcinomes mammaires contiennent de 25 l'oestrogène, de la progestérone, du glucocorticoïde, de la LHRH, du EGF, du IGF-I. et des récepteurs à la somatostatine. Des récepteurs aux hormones peptidiques ont également été détectés dans la leucémie aiguë, les cancers de la prostate, du sein, du pancréas, des ovaires, de la matrice, du colon et du cerveau (M.N. Pollak, et al., 3 0 Cancer Lett. 3223-230, 1987; F. Pekonen, et al., Cancer Res., 48 1343-1347, 1988; M. Fekete, et al., J. Clin. Lab. Anal. 3 137-147, 1989; G. Emons, et al., Eur. J. Cancer Oncol., 25 215-221, 1989). On a découvert (M. Fekete, et al., Endocrinology, 124 946-955, 1989; M. Fekete, et al., Pancréas 4. 521-528, 1989) qu'à la fois les 35 agonistes et les antagonistes de la LHRH se lient aux membranes des cellules cancéreuses du sein chez l'être humain et aussi aux membranes cellulaires du cancer pancréatique, bien que cette

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dernière tumeur soit supposée indépendante des hormones. On a démontré que des peptides biologiquement actifs tels que la mélanotropine (MSH), le facteur de croissance épidermique, l'insuline et les analogues agonistes et antagonistes de la LHRH 5 (L. Jennes, et al., Peptides 5.215-220, 1984) sont internalisés par leurs cellules cibles, par endocytose.

Les agents d'alkylation utilisés dans le traitement du cancer ont un mécanisme d'action essentiellement non sélectif. Ils agissent en exerçant une action cytotoxique par transfert de leurs groupes 10 alkyles à divers constituants cellulaires. L'alkylation de l'ADN à l'intérieur du noyau représente probablement l'interaction majeure qui conduit à la mort de la cellule. Toutefois, dans des conditions physiologiques, on peut alkyler tous les nucléophiles cellulaires tels que les groupes acide phosphorique et acide carboxylique ionisés, 15 les groupes hydroxyle, les groupes thiols et les groupes azotés non chargés. Les moutardes azotées (le chlorambucile, le cyclophosphamide et le melphalane) sont parmi les plus anciens médicaments anticancéreux utilisés dans la pratique clinique. Ils forment spontanément des dérivés cycliques du cation aziridinium 20 (éthylèneimonium), par une cyclisation intramoléculaire qui peut transférer, soit directement soit par l'intermédiaire de la formation d'un ion carbonium, un groupe alkyle à un nucléophile cellulaire. Le motif aziridine contenant des médicaments tels que le thio-TEPA agit par le même mécanisme.

25 Le cyclopropane est un autre agent d'alkylation. Le cycle, qui présente une tension interne élevée, peut être coupé facilement par les nucléophiles. Il peut être coupé pour donner un état de transition biradicalaire de singulet et un état de transition à zwitterion dans les réactions d'épimérisation, et peut agir ainsi 3 0 comme un agent d'alkylation pour entrer en interaction avec des bases nucléophiles d'ADN. L'incorporation du groupe cyclopropyle dans la distamycine (agent antitumoral antiviral naturel) entraîne un accroissement de l'activité cytostatique, qui est multipliée par quatre (K. Krowicki, et al., J. Med. Chem. 3JL 341-345, 1988). 3 5 Pratiquement tous les agents d'alkylation utilisés dans la pratique clinique sont bifonctionnels et ont une aptitude à réticuler deux molécules séparées ou à alkyler une molécule en deux sites

y

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nucléophiles séparés. Les réticulations avec l'ADN peuvent être à l'intérieur d'un simple brin, entre deux brins complémentaires ou entre l'ADN et d'autres molécules telles que les protéines. On pense que la cytotoxicité des agents d'alkylation est reliée à leur efficacité 5 de réticulation (J.J. Roberts et al., Adv. Radiat. Biol. 7_ 211-435, 1978).

Le cisplatine (cis-diaminedichloroplatine) est utilisé depuis longtemps dans le traitement du cancer. Les analogues de la LHRH, ayant une structure apparentée à celle du cisplatine dans la chaîne 10 latérale, ont des affinités importantes pour les récepteurs membranaires de cellules cancéreuses de l'hypophyse chez le rat et du sein chez l'être humain (S. Bajusz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 6313-6317, 1989). L'incorporation de complexes cytotoxiques du cuivre (II) et du nickel (II) dans des analogues de la LHRH 15 modifiés de façon appropriée donne des composés ayant une activité hormonale élevée et une grande affinité pour les récepteurs de la LHRH sur la membrane des cellules du cancer du sein chez l'être humain. Plusieurs de ces métallopeptides présentent une activité cytotoxique in vitro vis-à-vis des lignées cellulaires de la 20 prostate et du sein chez l'être humain. Par exemple, le pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys[Ahx-A2bu(SAL)2(Cu)]-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 inhibe l'incorporation de la [3H]thymidine dans l'ADN de la lignée cellulaire mammaire humaine MDA-MB-231, à 87 %, pour une dose de 10 jxg.

25 La structure de nombreux médicaments utilisés dans la chimiothérapie anticancéreuse renferme le groupe quinone. Les antibiotiques antitumoraux du type anthracycline, tels que l'adriamycine, la daunorubicine, la mitomycine C et le mitoxantrone, se lient à l'ADN par l'intermédiaire d'une 3 0 intercalation entre des bases spécifiques et bloquent la synthèse de nouveaux ARN ou ADN (ou les deux), provoquent une scission du brin d'ADN et interfèrent avec la réplication cellulaire. Les réactions bioréductrices du groupe quinone peuvent conduire à la formation de radicaux libres (radicaux superoxyde et hydroxyle) qui peuvent 3 5 induire des ruptures du brin d'ADN (Bachur et al., Cancer Res.

1745-1750, 1978). Une autre voie consiste à réduire la quinone en hydroquinone, puis à convertir celle-ci en l'intermédiaire

y r

d'alkylation, la quinoneméthide (Moore et al., Drug Exp. Clin. Res. 12 475-494, 1986). La daunorubicine est couplée au véhicule peptidique à la mélanotropine (MSH) et le conjugué s'est révélé être plus toxique vis-à-vis des cellules de mélanome chez la souris que 5 la drogue à l'état libre (J.M. Varga, Meth. Enzymol. 112 259-269, 1985). Les dérivés de la 2-méthylanthraquinone ont une activité cytotoxique vis-à-vis des cellules néoplasiques hypoxiques (T.S. Lin, et al. J. Med. Chem. 23 1237-1242, 1980).

Plusieurs antimétabolites présentent un intérêt 10 chimiothérapique en raison de leur importance dans le métabolisme du folate cellulaire (I.D. Goldman, et al., Eds. Folyl and Antifolyl Polyglutamates. Plénum press, New York, 1983). Le méthotrexate, l'acide {N-[p[[2,4-diamino-6-ptéridinyl)méthyl]méthylamino]-benzoyljglutamique, est un antagoniste de l'acide folique qui inhibe 15 la fonction de la réductase du dihydrofolate et de cette façon, interrompt la synthèse du thymidilate, des nucléotides de purine et des aminoacides sérine et méthionine, interférant ainsi avec la formation d'ADN, d'ARN et de protéines.

Initialement, l'incorporation de la drogue d'alkylation 20 chlorambucile, l'acide {4-[4-(bis[2-chloroéthyl]amino)phényl}-butyrique, dans des agonistes et antagonistes de la LHRH, a conduit à des composés ayant une faible activité ou pas d'activité du tout [K. Channabasavaiah and J.M. Stewart, Biochem. Biophys. Res. Commun., &6., 1266-1273 (1979), C.Y. Bowers et al., Biochem. 25 Biophys. Res. Commun., 6JL, 698-703 (1974), K. Channabasavaiah et al., In : E. Gross and J. Meienhofer (eds.), Peptides, Proceedings of the Sixth American Peptide Symposium, Pierce Chem. Co. Rockford, IL, 1979, pp. 803-807].

Le D-melphalane (un agent d'alkylation du type moutarde 3 0 azotée, la 4-[bis{2-chloroéthyl}amino]-D-phénylalanine), contenant des analogues de la LHRH, présente une activité élevée agoniste et antagoniste et se lie aux membranes des cellules cancéreuses de la prostate et du sein chez l'être humain, de l'hypophyse chez le rat, avec une grande affinité (S. Bajusz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 3 5 M. 6318-6322, 1989). La liaison est réversible et il ne se produit pas d'alkylation des récepteurs de LHRH. Une activité cytotoxique importante (inhibition de l'incorporation de la [3H]thymidine) dans

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des cultures d'une lignée cellulaire du cancer du sein chez l'être humain, T-47D, et des lignées cellulaires MT-4 et MT-5 tumorales mammaires chez le rat, a pu être démontrée.

5 RESUME DE L'INVENTION

Les tumeurs ou composants de tumeurs qui dépendent de l'hormone sexuelle et du facteur de croissance peuvent être supprimés par abaissement des taux de ces facteurs dans 10 l'organisme du patient. Toutefois, ceci ne résoud pas le problème des autres tumeurs ou composants de tumeurs non dépendants. Comme l'ont montré Fekete et autres (voir plus haut'), les récepteurs de LHRH sont soit présents, soit apparaissent dans les tumeurs et les composants de tumeurs non dépendants de 15 l'hormone sexuelle ou des facteurs de croissance.

Ainsi, les analogues de la LHRH contenant un motif cytotoxique peuvent servir de véhicule aux agents chimiothérapiques. Ces peptides peuvent se lier à des récepteurs de la LHRH et ne détruisent pas le site récepteur, ce qui peut fournir

2 0 une certaine sélectivité de la cible pour l'analogue de la LHRH

cytotoxique ainsi modifiée, et peut la rendre "spécifique à la cellule". Après internalisation, le composant cytotoxique de ces composés hybrides peut interférer avec les événements cellulaires et peut provoquer ainsi la mort de la cellule cancéreuse. 25 Parmi les drogues anticancéreuses utilisées, il existe plusieurs composés qui présentent une aptitude potentielle à être couplés à une molécule de véhicule peptidique. Le couplage peut être réalisé par modification du groupe fonctionnel du motif cytotoxique et du groupe amino ou carboxyle libre d'un peptide.

3 0 La présente invention a pour objet de fournir de tels analogues de la LHRH, qui possèdent une activité agoniste ou antagoniste élevée et contiennent des chaînes latérales cytotoxiques, telles que des motifs ayant une structure du type quinone (naphtoquinones et anthraquinones substituées, de 3 5 préférence par un groupe alkyle inférieur dont peuvent dériver ces motifs), des agents d'alkylation tels que des moutardes azotées, des motifs avec des cycles à trois chaînons tels qu'un groupe

I

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cyclopropyle, aziridinyle et époxy, des anticorps antitumoraux et des antimétabolites tels que le méthotrexoyle. La majorité des composés inhibe de façon significative la croissance de différentes lignées cellulaires du cancer du sein chez l'être humain, dans des 5 cultures cellulaires.

Les composés selon l'invention sont représentés par la formule I

X-Rl-R2-R3-Ser-R5-R6(Q)-Leu-Arg-Pro-RlO-NH2 I dans laquelle 10 R1 est pGlu ou D-Nal(2),

R2 est His ou D-Phe(4Cl),

R3 est Trp, D-Trp ou D-Pal(3),

R5 est Tyr ou Arg,

R6 est D-Lys ou D-Orn,

15 R10 est Gly ou D-Ala,

X est l'hydrogène ou un groupe alcanoyle inférieur comportant 2 à 5 atomes de carbone,

Q est un motif cytotoxique répondant à la formule

-Q4 ou -A(Q3) ou -B(Ql)2 ou -B(AQ2)2 20 II III IV(a) IV(b)

dans laquelle

A représente -NH-(CH2)n-CO- ou -OC-(CH2)n-CO où n vaut 2-6,

25 B représente -HN-CH2-(CH2)m-CH(NH)-(CH2)n-CO-

où

1

m vaut 0 ou 1,

n vaut 0 ou 1,

3 0 le motif -CO de A- et de B- étant lié à un groupe amino sur R6,

et dans le groupe B(AQ2)2, le motif -CO de A- étant lié à un groupe amino sur B,

Q1 est D ou L-Mel, un groupe cyclopropanecarbonyle, 3 5 aziridine-2-carboxyle, époxyalkyle ou l,4-naphtoquinone-5-oxycarbonyl-éthyle,

Q2 est Q1, un groupe anthraquinonylalcoxy ou doxorubicinyle,

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Q3 est Q2, un groupe mitomycinyle, espéramycinyle ou méthotrexoyle,

Q4 est Q1 ou un groupe méthotrexoyle et leurs sels d'addition acide et basique pharmaceutiquement 5 acceptables.

Les composés de formule I peuvent être préparés par une combinaison de la technique en phase solide et de la synthèse classique (en solution).

Les composés de formule I sont préparés de préférence à 10 partir de peptides intermédiaires de formule VI :

Xl-Rl-R2(X2)-R3-Ser(X4)-R5(X5)-R6(X6)-Leu-Arg(X8)-Pro-Rl0-NH-Xl0

!

VI

15

dans laquelle

R1, R2, /R3, R5, R6 et R10 sont définis comme ci-dessus,

X1 est un groupe acyle comportant 2 à 5 atomes de carbone ou lorsque R1 est pGlu, X1 est l'hydrogène,

20 X2 est nul ou un groupe protecteur pour l'azote du groupe imidazole de His,

X4 est l'hydrogène ou un groupe protecteur pour le groupe hydroxyle Ser,

X5 est l'hydrogène ou un groupe protecteur pour le groupe 25 hydroxyle phénolique Tyr ou un groupe protecteur pour le groupe guanidino d'Arg,

X6 est l'hydrogène ou un groupe protecteur pour Lys, Orn, X8 est l'hydrogène ou un groupe protecteur pour le groupe guanidino d'Arg,

3 0 X10 est l'hydrogène ou un groupe benzhydryle incorporé à la résine.

Les peptides de formule VI sont préparés de préférence par synthèse suivant le procédé en phase solide.

Les peptides intermédiaires de formule VII sont obtenus à 3 5 partir des peptides de formule VI, dans laquelle X2, X4, X5, X6, X8 et X10 sont l'hydrogène, par acylation avec A :

4

«

10

Xl-Rl-R2-R3_Ser-R5-R6(A)-Leu-Arg-Pro-RlO-NH2 VII

où X1, R1, R2, R3, R5, R6, R10 et A sont définis comme ci-dessus. 5 L'acylation des peptides de formule VI dans laquelle X2, X4,

X5, X6, X8' et X10 sont l'hydrogène, avec B protégé de manière appropriée, donne, après déprotection, des peptides intermédiaires de formule VIII :

10 Xl-R1-R2-R3-Ser-R5-R6(B)-Leu-Arg-Pro-RlO-NH2 VIII

dans laquelle X1, R1, R2, R3, R5, R6, R10 et B. sont définis comme ci-dessus.

Selon un autre procédé approprié, les peptides intermédiaires 15 de formule VIII sont obtenus par déprotection des peptides intermédiaires de formule VIIIA :

X1-R1-R2(X2)-R3-Ser(X4)-R5(X5)-R6[A(X6')2]-Leu-Arg(X8)-Pro-R10-NH-X10

20 VIIIA

dans laquelle X6' est l'hydrogène ou un groupe protecteur pour la chaîne latérale diaminoacide, R1, R2, R3, R5, R6, R10, A, X1, X2, X4, X5, X6, X8, et X10 sont définis comme ci-dessus,

25 qui sont préparés à leur tour par un procédé en phase solide comme peptides intermédiaires de formule VI, sauf que le groupe R6[B(X6)2] protégé de façon appropriée est incorporé à la place du groupe R6(X6) en position 6.

Pour produire les composés de formule I, dans laquelle Q est 3 0 B(Q1)2, on fait réagir les peptides de formule VIII, par exemple avec un aminoacide à N protégé, un halogénure d'alkyle ou d'alcanoyle, par exemple Boc-D- ou Boc-L-Mel, Trt-Azy, l'épibromhydrine, la 5(3-chloropropionyloxy)-l,4-naphtoquinone ou le chlorure de cyclopropanecarbonyle. Selon une variante, les 3 5 composés de formule VI sont obtenus à partir des peptides de formule I qui sont couplés avec B(Q')2 préformé, B_ et Q étant définis comme ci-dessus.

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Pour produire les composés de formule I, dans laquelle Q est B(AQ2)2, les peptides de formule VIII sont couplés avec (AQ2) préformé, où A et Q2 sont définis comme ci-dessus. Selon une variante, les composés de formule I, dans laquelle Q est B(AQ2)2, 5 peuvent être préparés par réaction des peptides de formule VIII d'abord avec un agent d'acylation ayant un motif A et ensuite par exemple avec Boc-D- ou Boc-L-Mel, Trt-Azy, l'épibromhydrine, la 2-hydroxyméthylanthraquinone, la 2-hydroxyméthylnaphto-quinone ou la doxorubicine.

10 La synthèse des composés de formule I, dans laquelle Q est

A(Q3), est réalisée par allongement de la chaîne latérale D-Lys des peptides de formule VI avec un acide & -aminoalcanoïque ou un acide a,£2-dicarboxylique et ensuite, couplage avec par exemple la 2-hydroxyméthyl-anthraquinone, la doxorubicine, la mitomycine C 15 ou le méthotrexate. Selon une variante, les composés de formule I, dans laquelle Q est A(Q3), peuvent être préparés par réaction des peptides de formule VI avec A(Q3) préformé, A et Q étant définis comme ci-dessus.

Le procédé de préparation des composés de formule I, dans 20 laquelle Q est Q4, comprend la réaction par exemple d'un peptide de formule VI avec D-Mel, Boc-D- ou Boc-L-Mel, Trt-Azy, le chlorure de cyclopropanecarbonyle, l'épibromhydrine, la 5(3-chloro-propionyloxy)l,4-naphtoquinone ou le méthotrexate. De préférence, la réaction est effectuée lorsque X1 est l'hydrogène ou un groupe 25 alcanoyle inférieur de 2-5 atomes de carbone, et tous les autres motifs X sont des hydrogènes.

Une composition pharmaceutique est fournie par mélange du composé de formule I avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable comprenant des microcapsules (microsphères) ou des 3 0 microgranules (microparticules) formulées à partir du poly-(DL-lactide-co-glycolide) pour une libération progressive.

!

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DESCRIPTION DES MODES DE REALISATION PREFERES

Pour une meilleure compréhension de la présente invention, les abréviations classiques des aminoacides, des peptides et de 5 leurs dérivés sont utilisées tel que généralement accepté dans la technique des peptides et tel que recommandé par la Commission on Biochemical Nomenclature IUPAC-IUB [European. J. Biochem., 138. 9-37 (1984)].

Les abréviations des résidus d'aminoacides individuels sont 10 basées sur le nom vulgaire de l'aminoacide, par exemple pGlu est l'acide pyroglutamique, His est l'histidine, Trp est le tryptophane, Ser est la sérine, Tyr est la tyrosine, Lys est la lysine, Orn est l'ornithine, Leu est la leucine, Arg est l'arginine, Pro est la proline, Gly est la glycine, Ala est l'alanine et Phe est la phénylalanine. 15 Lorsque le résidu d'aminoacide a des formes isomères, c'est la forme L de l'aminoacide qui est représentée, sauf indication contraire.

Les abréviations des aminoacides non courants utilisées dans la présente invention sont les suivantes : D-Mel est la 4-[bis(2-20 chloroéthyl)amino]-D-phénylalanine, A2pr est l'acide 2,3-diamino-propionique, D-Nal(2) est la 3-(2-naphtyl)-D-alanine, D-Pal(3) est la 3-(3-pyridyl)-D-aIanine, D-Phe(4Cl) est la 4-chloro-D-phényl-alanine.

Les séquences peptidiques sont représentées conformément à 25 la convention selon laquelle l'aminoacide à N-terminal est sur la gauche et l'aminoacide à C-terminal est sur la droite.

D'autres abréviations utilisées sont les suivantes :

AcOH

acide acétique

30

Ac20

anhydride acétique

Ahx

6-aminohexanoyle

Azy aziridine-2-carbonyle

Boc tert.butoxycarbonyle

Bzl benzyle

35

CFC

cyclopropanecarbonyle

DCB

2,6-dichlorobenzyle

DOC

N,N'-dichlohexylcarbodiimide

13

DCM dichlorométhane

DIC N,N'-diisopropylcarbodiimide

DMF diméthylformamide

DCK doxorubicine (adriamycine)

5 EPP époxy-propyle

ESP espéramycine

Git glutaroyle

HMAQG 2-méthylglutarate d'anthraquinone

HOBt 1-hydroxybenzotriazole

10 HOPCP pentachlorophénol

HPLC chromatographie liquide haute performance

MeCN acétonitrile

MeOH alçool méthylique

MIT mitomycine. C

15 MIX méthotrexate (améthoptérine)

NQCE l,4-naphtoquinone-5-oxycarbonyléthyle

TEA triéthylamine

TFA acide trifluoroacétique

THF tétrahydrofurane

20 Tos 4-toluènesulfonyle

Z(2-C1) 2-chloro-benzyloxycarbonyle

Z benzyloxycarbonyle

On préfère en particulier les analogues de la LHRH 25 formule I

X-R1-R2-R3-Ser-R5-R6(Q)-Leu-Arg-Pro-R10-NH2 I

dans laquelle

3 0 R1 est D-Nal(2),

R2 est D-Phe(4Cl),

R3 est D-Trp ou D-Pal(3),

R5 est Tyr ou Arg,

R6 est D-Lys,

3 5 R10 est D-Ala,

X est acétyle, ainsi que des séries de peptide dans lesquelles

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Rl est pGlu,

R2

est

His,

R3

est

Trp,

r5

est

Tyr,

5

r6

est

D-Lys ou D-Orn,

rio est

Gly, et,

X

est l'hydrogène,

Q

est un motif cytotoxique répondant à la formule :

10

Q4 ou A(Q3) ou B(Q!)2 ou B(AQ2)2

A

est l'acide 6-aminohexanoïque ou un résidu d'acide

glutarique

B

est A2pr,

O2

est Q1, anthraquinone-2-méthoxy ou doxorubicinyle,

15

Q3

est Q2, mitomycine-C-yle, espéramycinyle ou

méthotréxoyle,

Q4

est Q1, ou méthotréxoyle.

Les modes de réalisation particulièrement préférés sont les

20

suivants

*

1. pGIu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(D-Mel)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

2. pGIu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(CPC)-Leu-Arg-Pro-GIy-NH2

3. pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(HMAQG)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

4. pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(MTX)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

5. pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys[A2pr(D-Mel)2]-Leu-Arg-Pro-GIy-NH2

6. pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys[A2pr(CPC)2]-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

7. pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys[A2pr(HMAQG)2]-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

8. pGIu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Om(D-Mel)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

9. pGlu-Hîs-Trp-Ser-Tyr-D-Orn(CPC)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

10. pG!u-His-Trp-Ser-Tyr-D-Orn(HMAQG)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

11. pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Orn(MTX)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

12. pGIu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Orn [A2pr(D-M el)2] -Leu-Arg-Pro-Gly-N H2

13. pGIu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Orn[A2pr(CPC)2]-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

14. pG!u-Hîs-Trp-Ser-Tyr-D-Orn[A2pr(HMAQG)2]-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

15

15. Ac-Nai(2)-D-Phe(4CI)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(D-Mel)-Leu-Arg-Pro-D-AIa-NH2

16. Ac-Nal(2)-D-Phe(4CI)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(CPC)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2

17. Ac-Nal(2)-D-Phe(4CI)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(HMAQG)-Leu-Arg-Pro-D-A!a-NH2

18. Ac-Nal(2)-D-Phe(4CI)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(MTX)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2

19. Ac-Nal(2)-D-Phe(4CI)-D-Trp-Sér-Arg-D-Lys(D-Mei)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2

20. Ac-Nal(2)-D-Phe(4CI)-D-Trp-Ser-Arg-D-Lys(CPC)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2

21. Ac-Nal(2)-D-Phe(4CI)-D-Trp-Ser-Arg-D-Lys(HMAQG)-Leu-Arg-Pro-D-A!a-NH2

22. Ac-Nal(2)-D-Phe(4CI)-D-Trp-Ser-Arg-D-Lys(MTX)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2

23. Ac-Nal(2)-D-Phe(4CI)-D-Trp-Ser-Arg-D-Lys[A2pr(D-Mei)2]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2

24. Ac-Nal(2)-D-Phe(4CI)-D-Trp-Ser-Arg-D-Lys[A2pr(CPC)2]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH:

25. Ac-Nal(2)-D-Phe(4CI)-D-Trp-Ser-Arg-D-Lys[A2pr(HMAQG)2]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2

26. Ac-Nal(2)-D-Phe(4CI)-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Lys(D-Mel)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2

27. Ac-Nal(2)-D-Phe(4CI)-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Lys(CPC)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2

28. Ac-Nal(2)-D-Phe(4CI)-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Lys(HMAQG)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2

29. Ac-NaI(2)-D-Phe(4CI)-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Lys(MTX)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2

30. Ac-Nal(2)-D-Ph6(4CI)-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Lys[A2pr(D-Mel)2]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2

31. Ac-Nal(2)-D-Phe(4C!)-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Lys[A2pr(CPC)2]- Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2

32. Ac-Nal(2)-D-Phe(4C!)-D-Pal(3)-Sér-Arg-D-Lys[A2pr(HMAQG)2]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2

33. pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(Glt-DOX)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

34. pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(Ahx-MTX)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

16

Les peptides selon l'invention peuvent être administrés sous la forme de sels non toxiques pharmaceutiquement acceptables tels que les sels d'addition d'acide. Des exemples de sels d'addition d'acide de ce type sont le chlorhydrate, le bromhydrate, le sulfate, 5 le phosphate, le fumarate, le gluconate, le tannate, le maléate, l'acétate, le citrate, le benzoate, le succinate, l'alginate, la pamoate, le malate, l'ascorbate, le tartrate, et autres.

Les microcapsules ou microparticules de ces peptides, formulées à partir du poly(DL-lactide-co-glycolide), peuvent être 10 les systèmes à libération progressive préférés. L'administration intraveineuse en solution saline isotonique, en solutions tampons phosphate ou autres peut également être utilisée.

Les compositions pharmaceutiques contiennent généralement le peptide conjointement avec un véhicule classique, 15 pharmaceutiquement acceptable. Généralement, la dose est d'environ 1 à environ 100 microgrammes de peptide par kilogramme de poids corporel de l'hôte, en cas d'administration intraveineuse. Globalement, le traitement des sujets avec ces peptides est réalisé généralement de la même manière que le 20 traitement clinique utilisant d'autres agonistes ou antagonistes de la LHRH.

Ces peptides peuvent être administrés chez les mammifères par voie intraveineuse, sous-cutanée, intramusculaire, intranasale, ou intravaginale, pour produire une action antitumorale. Les doses 25 efficaces varient avec le mode d'administration et l'espèce particulière de mammifère traitée. Un exemple d'une forme galénique typique est une solution saline physiologique contenant le peptide, laquelle solution est administrée à une dose dans la gamme d'environ 0,1 à 2,5 mg/kg de poids corporel.

3 0 Bien que l'invention ait été décrite à l'aide de ces modes de réalisation préférés, il faut noter que des modifications qui paraissent évidentes aux spécialistes peuvent être effectuées sans sortir du domaine de l'invention, qui est défini par les revendications annexées. Les substitutions connues dans la 3 5 technique, qui n'abaissent pas notablement son efficacité, peuvent être utilisées dans l'invention.

17

Modes opératoires des essais

Les composés selon l'invention produisent une action 5 puissante sur la libération de gonadotropine par l'hypophyse, se lient aux membranes de cellules tumorales et inhibent l'incorporation de la [3H]thymidine dans l'ADN, dans les cultures cellulaires.

10 (a) Activités de libération de LH etd'inhibition de LH-RH

L'aptitude des composés à influencer la libération in vitro de LH est testée par utilisation d'un système cellulaire superfusionnée hypophysaire du rat [S. Vigh and A.V. Schally, Peptides, 5

15 Suppl. JL» 241-247 (1984); V. Csernus and A.V. Schally, in Neuroendocrine Research Methods, Ed. B. Greenstein, Harwood Academic Publishers, London, (1990)].

L'activité libératrice de LH des composés est déterminée comme suit :

20 On fait passer chaque peptide par perfusion à travers les cellules pendant 3 mn (1 ml de solution de perfusion) à 20-100 pM. La teneur en LH des fractions de 1 ml recueillies est déterminée par un dosage radioimmunologique (RIA). La capacité des peptides est comparée à celle de la LHRH 3 nM soumise à une

2 5 perfusion similaire.

L'action inhibitrice de LHRH des peptides est testée comme suit :

On fait passer chaque peptide par perfusion à travers les cellules pendant 9 mn (3 ml d'une solution de perfusion) à 1 nM.

3 0 Immédiatement après, un mélange contenant la même concentration de peptide et LHRH 3 nM est administré pendant 3 mn. Cette opération est suivie par quatre perfusions consécutives de LHRH 3 nM pendant 3 mn (1 ml de solution de perfusion) à 30 mn d'intervalles (30, 60, 90, 120 mn). La teneur en LH des

3 5 fractions de 1 ml recueillies est déterminée par RIA.

18

(b) Activité antiovulatoire in vivo

I

Cette activité des peptides est déterminée chez des rats, ayant un cycle de 4 jours, comme décrit [A. Corbin and C.W. Beattie, 5 Endocr. Res. Commun., 2, 1-23 (1975)].

(c) Fixation sur un récepteur

L'affinité des peptides pour les membranes des cellules 10 cancéreuses du sein chez l'être humain est déterminée à l'aide de LHRH et de [D-Trp6]LHRH marqués. Le dosage est réalisé d'une manière similaire à celle décrite par T. Kadar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8 5. 890-894 (1988) et M. Fekete et al., Endocrinology, 124. 946-955 (1989).

15

(d) Test de cytotoxicité

L'aptitude des peptides de formule I à inhiber l'incorporation de la [3H]thymidine dans l'ADN des cultures monocouches de lignées 20 cellulaires tumorales mammaires chez l'être humain, MCF-7, est déterminée comme décrit [V.K. Sondak et al., Cancer Research, 44, 1725-1728 (1984) ; F. Holzel et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 109. 217-226 (1985) ; M. Albert et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 109. 210-216 (1985)].

25

Synthèse des peptides

Les peptides selon la présente invention peuvent être préparés par des techniques quelconques connues par les 3 0 spécialistes dans la technique des peptides. Un résumé de ces techniques ainsi disponibles peut être trouvé chez M. Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heildelberg, 1984. La synthèse classique en solution est décrite en détail dans le traité "Methoden der Organische Chemie" (Houben-Weyl), vol. 15, 3 5 Synthese von Peptiden, Parts I et II, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1974. Les techniques de synthèse exclusivement en phase solide sont exposées dans l'ouvrage de J.M. Stewart and J.D. Young,

•U

19

Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chem Co., Rockford, IL, 1984 (2ème éd.) et dans la revue de G. Barany, et al., Int. J. Peptide Protein Res. 20, 705-739, 1987.

Les peptides basiques selon l'invention sont obtenus par 5 synthèse suivant le procédé en phase solide, et seulement les chaînes latérales cytotoxiques sont incorporées par le mode opératoire "classique". Dans la synthèse en phase solide, des aminoacides protégés de manière appropriée (parfois des peptides protégés) sont ajoutés étape par étape dans le sens C—>N, une fois 10 que l'aminoacide à C-terminal a été fixé (ancrée) d'une manière appropriée à un support solide inerte (résine). Après achèvement de l'étape de couplage, le groupe protecteur de l'azote terminal est éliminé de ce résidu d'aminoacide nouvellement ajouté, et l'aminoacide suivant (protégé d'une manière appropriée) est alors 15 ajouté, et ainsi de suite. Après que tous les aminoacides voulus aient été liés suivant la séquence souhaitée, le peptide est séparé du support par coupure et débarrassé du ou des groupes protecteurs restants, dans des conditions qui ne sont destructrices que d'une façon minime par rapport aux résidus dans la séquence. 20 Ceci doit être suivi par une purification prudente et une caractérisation scrupuleuse du produit synthétisé, afin de s'assurer que la structure voulue est bien celle qui a été obtenue.

Mode de réalisation préféré de la synthèse

25

Un procédé particulièrement préféré pour la préparation des composés selon la présente invention est la synthèse en phase solide ; les incorporations des chaînes latérales cytotoxiques sont réalisées en solution. Les peptides de formule I, dans lesquelles R6 3 0 est D-Lys ou D-Orn, sont préparés de préférence à partir des peptides intermédiaires de formule VI :

Xl-Rl-R2(X2)-R3-Ser(X4)-R5(X5)-R6(X6)-Leu-Arg(X8)-Pro-R10-NH-Xl0 35 VI

20

dans laquelle

R1, R2, R3, R5, R6, R10 et X1 sont définis comme ci-dessus,

X2 est un groupe protecteur p-toluènesulfonyle ou 2,4-dinitrophényle, dans le cas où R2 est His et nul dans le cas 5 où R2 est D-Phe(4Cl),

X4 est un groupe protecteur pour le groupe hydroxyle de la sérine, tel que le groupe benzyle (Bzl) ou 2,6-dichlorobenzyle (DCB). Le groupe protecteur préféré est Bzl.

X5 est un groupe benzyle, 2-Br-benzyloxycarbonyle ou DCB 10 (préféré) pour protéger l'hydroxyle phénolique dans le cas où

R5 est Tyr, ou X5 est Tos (préféré), nitro ou méthyl-(t-butylbenzène)sulfonyle pour protéger le groupe guanidino lorsque R5 est Arg,

X6 est un groupe protecteur pour le groupe amino de la chaîne 15 latérale de Lys ou Orn, tel que Z, Z(2-C1) (préféré),

X8 est un groupe approprié pour protéger Arg : nitro, méthyl-

(t-butylbenzène)sulfonyle ou Tos (préféré),

X10 est un groupe amidoprotecteur, benzhydryle ou méthylbenzhydryle, incorporé dans la résine de support ; 20 pour la synthèse des peptide-amides, on préfère le copolymère benzhydrylamino-polystyrène-divinylbenzène à 2 % disponible dans le commerce.

La synthèse en phase solide des peptides de formule VI 25 commence par la fixation. de Gly ou D-Ala protégé par Boc à une résine benzhydrylamine dans CH2CI2. Le couplage est réalisé à l'aide de DIC ou de DIC/HOBt à la température ambiante. Après élimination du groupe Boc, le couplage des aminoacides protégés successifs (chacun est appliqué en un excès trois fois molaire) est 3 0 réalisé dans CH2CI2 ou dans des mélanges DMF/CH2CI2, en fonction de la solubilité des aminoacides-Boc. Le succès de la réaction de couplage à chaque étape de la synthèse est contrôlé de préférence par le test à la ninhydrine, comme décrit par Kaiser et al. [Anal. Biochem. M, 595 (1970)]. Dans les cas où il se produit un couplage 3 5 incomplet, l'opération de couplage est répétée avant l'élimination du groupe alpha-aminoprotecteur avant la réaction avec l'aminoacide suivant.

*

21

Après que la séquence d'aminoacide voulue des peptides intermédiaires de formule VI ait été obtenue, si on le souhaite, l'acétylation du N-terminal est réalisée à l'aide de Ac20/imidazole, et le composé peptide-résine est ensuite traité avec HF liquide en 5 présence d'anisol pour donner les peptides de formule VI dans lesquels X2, X4, X5, X6, X8 et X10 sont des hydrogènes.

Les peptides de formule VII sont obtenus soit par acylation des peptides de formule VI avec l'anhydride glutarique, soit par couplage avec l'acide Boc-6-aminohexanoïque, suivi d'une 10 déprotection :

X1-Rl-R2-R3-Ser-R5-R6(A)-Leu-Arg-Pro-RlO-NH2 vu où X1, R1, R2, R3, R5, R6 et R10 sont définis comme ci-dessus, et A est 15 un groupe glutaryle ou 6-aminohexanoyle.

L'acylation des peptides de structure de formule VI avec un acide diaminoalcanbïque approprié, protégé par Boc, de préférence l'acide 2,3-diaminopropionique, après déprotection, donne les 20 peptides de formule VIII :

Xl-Rl-R2-R3-Ser-R5-R6(B)-Leu-Arg-Pro-RlO-NH2 VIII

dans laquelle X1, R1, R2, R3, R5, R6 et R10 sont définis comme

2 5 ci-dessus, et B est un groupe diaminoalcanoyle, de préférence

2,3-diaminopropionyle.

Selon une variante de synthèse, les peptides de formule VIII sont obtenus par déprotection des peptides intermédiaires de formule VIIIA, qui sont préparés par le procédé en phase solide

3 0 exactement comme les peptides répondant à la formule VI, mais un résidu R6(B) protégé de manière appropriée, de préférence Boc-R6[B(Z)2], est incorporé en position 6 à la place de Boc-R6X6.

Certains composés de formule I, dans lesquels le résidu Q est BCQ1^» sont préparés à partir de peptides intermédiaires de 3 5 formule VIII par acylation avec Boc-D- ou Boc-L-Mel-OPCP ou Trt-Azy. Des halogénures de cyclopropane-alcanoyle, de préférence le chlorure de cyclopropane-carbonyle, sont utilisés pour obtenir les

f

22

analogues contenant (CPC)2- L'alkylation des peptides de formule VIII avec l'épibromhydrine ou la 5(3-chloro-propionyloxy)-l,4-naphtoquinone donne des analogues contenant (EPP)2 ou (NQCE)2.

5 Selon une variante, les composés de formule I dans laquelle

Q est B(Q!)2 peuvent être préparés par couplage des peptides de formule VI, par couplage avec B(Q1)2 préformé, où B et Q sont définis comme ci-dessus, par exemple par la réaction avec le carbodiimide.

10 Les composés de formule I, dans laquelle le résidu Q est

B(AQ2)2, sont préparés de préférence à partir des peptides intermédiaires de formule VIII et de la 2-hémiglutoroyl-oxyméthyl-anthraquinone, par couplage dans une réaction avec le carbodiimide.

1 5 Pour produire les composés de formule I, dans laquelle Q est

A(Q3), la mitomycine C, le MTX ou la doxorubicine sont liés à des peptides intermédiaires de formule VII par réaction avec le carbodiimide. Un autre groupe de peptides de formule I, dans laquelle Q est A(Q3), est préparé par synthèse par couplage d'un 20 A(Q2) préformé (par exemple la 2-hémiglutaroyloxyméthyl-anthraquinone, ou la hémiglutaroyl-espéramycine) avec des peptides de formule VI, par la réaction avec le carbodiimide.

Les peptides de formule VI sont transformés en peptides de formule I, dans laquelle Q est Q4, par le procédé de couplage avec 25 le carbodiimide, avec 1,1 équivalent de Trt-Azy, de MTX ou par réaction avec Boc-D- ou Boc-L-Mel-OPCP. Les peptides de formule VI sont acylés avec le chlorure de cyclopropane-carbonyle pour obtenir des analogues avec un motif CPC. L'alkylation des peptides de formule I avec l'épibromhydrine ou la 3 0 5(3-chloropropionyloxy)l-4-naphtoquinone donne des analogues contenant EPP ou NQCE.

PURIFICATION DES PEPTIDES

3 5 Les produits de synthèse bruts (>500 mg) sont purifiés à

l'aide d'un système HPLC préparative BECKMAN Prep-350 muni d'une colonne DYNAMAX MACRO (41,4x250 mm) garnie de gel

éy.

23

de silice C18 sphérique (taille des pores: 300 , taille des particules: 12 ji-m) (RAININ Inc., Co., Woburn, MA) (Colonne A). La purification de plus faibles quantités de peptides (<250 mg) est réalisée à l'aide d'un système HPLC BECKMAN (Modèle 142) à l'aide 5 d'une colonne DYNAMAX MACRO (21,2x250 mm) garnie avec le même milieu que ci-dessus (Colonne B). Pour purifier les peptides dont le poids est <50 mg, on utilise une colonne à phase inversée, de 10 x 250 mm, VYDAC Protein & Peptide Ci 8 (taille des pores: 300 À, taille des particules: 5 |i.m) (ALTECH, Deerfield, IL)

10 (Colonne C) ou une colonne de 10 x 250 mm W-POREX Ci 8 (taille des pores: 300 , taille des particules: \i m) (Phenomenex, Rancho Palos Verdes, CA) (Colonne D). Les colonnes sont éluées avec un système de solvant i constitué de (A) 0,1 % de TFA aqueux et (B) 0,1 % de TFA dans l'acétonitrile aqueux à 70 %, ou avec un 15 système de solvant ii constitué de (A) 0,2 % d'acide acétique aqueux et (B) 0,2 % d'acide acétique dans l'acétonitrile aqueux à 70 %, généralement selon un mode de gradient. L'élution de la colonne est contrôlée à l'aide de détecteurs UV opérant à 230 ou 280 nm. La chromatographie est réalisée à la température 20 ambiante.

HPLC ANALYTIQUE

L'analyse des peptides bruts et purifiés est réalisée à l'aide 25 d'un chromatographe en phase liquide Hewlett-Packard Model 1090, muni d'un détecteur de zone à diode ajusté à 220 et 280 nm et d'une colonne à phase inversée, de 4,6 x 250 nm W-POREX C18 (taille des pores: 300 , taille des particules: 5 [im) (Colonne E). Un débit de l,2ml/mn du système de solvant i est 3 0 maintenu et les séparations sont réalisées à la température ambiante.

ANALYSE D'AMINOACIDES

35 Les échantillons de peptide sont hydrolysés à 110°C pendant

20 heures dans dès tubes scellés sous vide contenant de l'acide

24

méthane-sulfonique 4 M. Les analyses sont effectuées à l'aide d'un analyseur d'aminoacide Beckman 6300.

PREPARATION I

5

Boc-D-Mel-OPCP

La D-4-[bis-(2-chloroéthyl)amino]phénylalanine, D-Mel, (5 mmole), est transformée en son dérivé Boc comme décrit pour 10 l'isomère L [H. Kun-hwa and G.R. Marshall, J. Med. Chem. 24., 1304-1310 (1981)] sauf que, comme agent d'acylation, on utilise le bicarbonate de di-tert-butyle à la place du Boc-azide. Le produit huileux, Boc-D-Mel, est dissous dans le THF (10 ml) et refroidi à 0°C. A la solution agitée on ajoute du pentachlorophénol 15 (5,25 mmole) et du DIC (6,5 mmole). Au bout de 10 mn d'agitation, on fait passer le mélange réactionnel sur un filtre, lave le gâteau de filtration avec du THF (2x5 ml) et l'on concentre le filtrat par évaporation à un faible volume (5 ml). On ajoute 10 ml d'éthanol et l'on observe la séparation des cristaux au bout de 20 2 heures de refroidissement (0°C). Le Boc-D-Mel-OPCP ainsi obtenu (environ 3,4 mmole) présente un point de fusion de 138-140°C.

PREPARATION II

25 pGlu-His-Trp-Ser-Tvr-D-Lvs-Leu-Arg-Pro-Glv-NHo QIA)

et pGlu-His-Trp-Ser-Tvr-D-Orn-Leu-Arg-Pro-Glv-NHo (TIB)

La [D-Lys]6LHRH [N.C. Nicholas et al., J. Med. Chem., 19 3 0 937-941 (1976)] et la [D-Orn]6LHRH sont construites, étape par étape, sur une résine benzhydrylamine-HCl contenant environ 1 méq de NH2/g (Advanced ChemTech, Louisville, KY) dans un récipient réactionnel destiné à la synthèse manuelle en phase solide, en commençant avec Boc-Gly selon les modes opératoires 3 5 décrits ci-après.

La résine benzhydrylamine-HCl (1 g, environ 1 mmole), après neutralisation avec TEA à 10 % dans CH2CI2, est couplée

25

séquentiellement avec un excès 3 fois molaire d'aminoacides protégés selon le schéma suivant :

5

ETAPE

REACTIFS ET OPERATIONS

TEMPS DE MELANGE (mn)

1

Couplage : aminoacide-Boc

dans le DCM ou le DMF, selon

10

la solubilité de l'aminoacide

particulier protégé, plus DIC

60-90

2

Lavage au MeOH (ou DMF et

ensuite MeOH)

2

3

Lavage au DCM

2

15

4

Lavage au MeOH

2

5

Lavage au DCM (trois fois)

2

6

Déprotection : TFA à 50 %

dans le DCM (deux fois)

5 et 25

7

Lavage au DCM

2

20

8

Lavage au 2-propanol

1

9

Neutralisation : TEA à 10 %

dans le DCM

2

10

Lavage au MeOH

1

11

Neutralisation : TEA à 10 %

25

dans le DCM

2

12

Lavage au MeOH

1

13

Lavage au DCM (trois fois)

2

3 0 Ainsi, la résine est traitée avec Boc-Gly, Boc-Pro, Boc-Arg(Tos),

Boc-Leu, Boc-D-Lys[Z(2-Cl)], Boc-Tyr(Bzl), Boc-Ser(Bzl), Boc-Trp, Boc-His(Tos) et pGlu pendant des cycles de couplage successifs pour donner un composé peptide-résine ayant la structure de pGlu-His(Tos)-Trp-Ser(Bz!)-Tyr(DCB)-D-Lys[Z(2-Cl)]-Leu-Arg(Tos)-3 5 Pro-Gly-NH-RESINE. En utilisant le Boc-D-Orn(Z) à la place du Boc-D-Lys[Z(2-Cl)], on obtient le composé peptide-résine ayant la

26

structure pGlu-His(Tos)-Trp-Ser(Bzl)-Tyr(DCB)-D-Orn(Z)-Leu-Arg-(Tos)-Pro-Gly-NH-RESINE.

Les composés peptide-résine ainsi obtenue sont traités avec 2 ml d'anisol et 20 ml de HF à 0°C pendant 45 mn. Après 5 élimination du HF sous vide, le composé peptide-résine restant est lavé avec du diéthyléther anhydre. Le peptide est ensuite extrait avec de l'acide acétique aqueux à 50 %, séparé de la résine par filtration, et lyophilisé.

Les peptides bruts (860 mg, 725 mg) sont purifiés sur une 10 Colonne A avec un système de solvant i, avec un gradient linéaire de 10-40 % de B en 60 mn, avec un débit de 30 ml/mn. 230 nm.

Les peptides purifiés se révèlent être pratiquement purs (>96 %) par HPLC analytique, en utilisant le solvant i avec un mode 15 de gradient linéaire (15-35 % de B en 20 mn). Les temps de rétention sont de 11,3 mn et de 10,4 mn, respectivement. L'analyse d'aminoacide donne les résultats attendus.

PREPARATION III

20

pGlu-His-Trp-Ser-Tvr-D-LvsfAgprVLeu-Arg-Pro-Glv-NH? (IÏIA)

et pGlu-His-Trp-Ser-Tvr-D-OrnCA^orVLeu-Arg-Pro-Glv-NH? (IIIB)

25 Une solution de BoC2A2pr (60,6 mg) dans le DMF (1ml) est refroidie à 0°C, du pentachlorophénol (60 mg) et 35 fil de DIC y sont ajoutés et le mélange est agité pendant une heure. La [D-Lys]6LHRH (319 mg du sel de TFA) dans le DMF (0,5 ml) est neutralisée avec de la TEA (84 jj.1) et versée dans la solution d'ester

3 0 active préparée ci-dessus. Le mélange réactionnel est laissé sous agitation pendant 2 heures à 0°C. Après concentration sous vide, le résidu huileux est dissous dans du TFA à 0,1 % et du diéthyléther et la phase aqueuse est. soumise à une chromatographie HPLC sur une Colonne B avec un système de solvant! selon un mode de 3 5 gradient linéaire (20-60% de solvant B en 60 mn). Le peptide pur protégé par Boc est ensuite traité avec du TFA à 30 % dans le DCM

10

15

27

pour donner le sel de TFA de la [D-Lys(A2pr)6]LHRH (IIIA) (251 mg).

En opérant de la même manière mais en utilisant les sels de TFA de la [D-Orn]6LHRH comme produit de départ, on obtient la préparation IIIB (202 mg).

Les temps de rétention en HPLC des peptides IIIA et IIIB sont de 12,2 mn et de ll,2mn, lorsqu'on utilise le système de solvant i suivant un mode de gradient linéaire (15-35 % de B en 20 mn).

PREPARATION IV

Ac-D-Nalf2VD-Phef4Cn-D-Trp-Ser-Arg-D-Lvs-Leu-Arg-Pro-D-Ala-

NH? (IV)

La préparation de IV est réalisée par un procédé en phase solide selon le mode opératoire décrit dans le schéma de préparation II. La synthèse commence par couplage de Boc-D-Ala à 1 g de résine benzhydrylamine contenant environ l,0méqNH2. 20 Le décapeptide est constitué en neuf étapes successives de couplage, en utilisant Boc-Pro, Boc-Leu, Boc-Arg(Tos), B oc-Lys [Z(2-C1)], Boc-Tyr(DCB), Boc-Ser(Bzl), Boc-Trp, Boc-D-Phe(4Cl), Boc-D-Nal(2). L'acétylation du N-terminal est réalisée avec une quantité 50 fois en excès d'anhydride acétique 25 dans le CH2CI2 pendant 30 mn. Le peptide est coupé de la résine avec 15 ml de HF, en présence de 1,5 ml de m-crésol à 0°C pendant 30 mn et à la température ambiante pendant 30 mn. Après élimination de HF, le mélange de résine et de peptide est lavé avec du diéthyléther, le peptide est extrait avec le DMF. La solution 3 0 de DMF est concentrée à un faible volume sous un vide poussé, puis on triture avec du diéthyléther. Le produit brut ainsi obtenu est purifié par HPLC préparative comme décrit pour la Préparation II, en appliquant un gradient linéaire de 40-70 % de B en 60 mn. Le peptide pur (837 mg) présente un temps de rétention de 25,5 mn 3 5 lorsqu'on utilise le système de solvant i suivant un mode de gradient linéaire (30-60 % de B en 30 mn).

28

PREPARATION V

Ac-D-Nal(2VD-Phef4C1VP-PainKSer-Ar?-D-Lvs-Leu-Arg-Pro-D-

Ala-NH? (VA)

5 Ac-NaK^-D-PheM-CD-D-Trp-Ser-Arg-D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-

NHo (VB)

Les peptides de VA et VB sont préparés par la technique en phase solide sur une résine benzhydrylamine-HCl, suivant les 10 modes opératoires présentés dans le schéma de Préparation II.

Ainsi, la résine (0,5 g contenant environ 0,5 mmole de NH2) est traitée durant dix cycles de couplage successifs avec Boc-D-Ala, Boc-Pro, Boc-Leu, Boc-Arg(Tos), Boc-Lys[Z(2-Cl)], Boc-Arg(Tos), Boc-Ser(Bzl), Boc-D-Pal(3), Boc-D-Phe(4Cl), Boc-D-Nal(2) et 15 finalement avec Ac20/imidazole, pour donner un composé peptide-résine qui est ensuite traité avec HF et l'anisol pour donner le décapeptide libre contenant D-Lys de VA (540 mg).

En procédant d'une manière similaire, mais en incorporant Boc-D-Trp à la place de Boc-D-Pal(3), en position 3, on prépare le 20 décapeptide libre de VB contenant D-Lys (500 mg). Les peptides sont purifiés sur la Colonne A avec un gradient du système de solvant i (20-60 % de B en 80 mn). Les temps de rétention de HPLC de VA et de VB sont de 11,4 mn et de 18,8 mn, respectivement, lorsqu'on utilise le système de solvant i selon un 25 mode de gradient linéaire (30-50% de B en mn).

PREPARATION VI

Boc-D-LvsfZ2-A2pr^

30

A un anhydride mixte préparé à partir de Z2-A2pr (0,72 g) et de chloroformiate d'éthyle (0,2 ml) en présence de TEA (0,28 ml) en solution dans le DMF (4 ml), on ajoute Boc-D-Lys (0,5 g) et TEA (0,3 ml) dans DMF aqueux à 50 % (4 ml), sous agitation à 0°C. 3 5 Après 2 heures d'agitation à 0°C, on concentre le mélange réactionnel sous pression réduite pour obtenir une huile, dissout cette huile dans l'eau et dans l'acétate d'éthyle, acidifie avec

4

I

■l

29

KHSO4 1 M. La phase organique est lavée à l'eau puis séchée sur Na2S04 et évaporée sous vide pour donner Boc-D-Lys(Z2-A2pr)

(1.1 g).

5 PREPARATION VII

Ac-D-NaK^-D-Phe^CP-D-PainySer-Arg-D-LysCATprVLeu-Arg-

Pro-D-Ala-NH? (WUA) Ac-D-Nal(2VD-Pher4Cn-D-Trp-Ser-Arg-D-LvsrA7Pr)-Leu-Arg-Pro-10 D-Ala-NH? CVIIB)

Les composés VIIA et VIIB sont constitués, étape par étape, sur une résine benzhydrylamine-HCl contenant environ 1 méq de NH2/g (Advanced ChemTech, Louisville, KY) dans un récipient 15 réactionnel destiné à la synthèse manuelle en phase solide, en partant de Boc-D-Ala, selon les modes opératoires décrits ci-après.

La résine benzhydrylamine-HCl (1 g, environ 1 mmole), après neutralisation avec TEA à 10 % dans le CH2CI2, est couplée séquentiellement avec un excès 3 fois molaire d'aminoacides 20 protégés, selon le schéma indiqué dans la Préparation II.

Ainsi, la résine est traitée avec Boc-D-Ala, Boc-Pro, Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-D-Lys(Z2-A2pr) (Préparation VI), Boc-Arg (Tos), Boc-Ser(Bzl), Boc-D-Pal(3), Boc-D-Phe(4Cl) et Boc-D-Nal(2). Après que la séquence aminoacide du décapeptide ait 25 été complétée, le groupe terminal Boc est éliminé et le N-terminal est acétylé à l'aide d'un excès 10 fois supérieur de AC2O et d'imidazole pour donner le composé peptide-résine ayant la structure de Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Pal(3)-Ser(Bzl)-Arg(Tos)-D-Lys(Z2-A2pr)-Leu-Arg(Tos)-Pro-D-Ala-NH-RESINE. En procédant 3 0 d'une manière similaire, mais en incorporant Boc-D-Trp à la place de Boc-D-PaI(3), on prépare le composé peptide-résine ayant la structure de Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Trp-Ser(Bzl)-Arg(Tos)-D-Lys(Z2-A2pr)-Leu-Arg(Tos-Pro-D-Ala-RESINE.

La résine peptide ainsi obtenue est traitée avec de l'anisol et 3 5 du HF, et les peptides libres bruts sont isolés comme décrit dans la Préparation IV. Ensuite, les peptides bruts (1,3 g) sont soumis à une purification par HPLC sur la Colonne A, en utilisant le

30

système de solvant i selon un mode de gradient linéaire (20-50 % de B en 60 mn).

Les peptides VIIA et VIIB ainsi obtenus (705 mg et 780 mg) se révèlent être pratiquement purs (>95 %) lorsqu'on 5 utilise le système de solvant! selon un mode de gradient linéaire (30-50 % de B en 20 mn). Les temps de rétention sont de 10,1 mn et de 17,5 mn, respectivement.

Selon une variante, les Préparations VIIA et VIIB sont obtenues à partir des Préparations VA et VB par acylation avec 10 Boc2-A2pr, comme décrit dans la Préparation III. Après purification, les peptides protégés par Boc sont traités avec TFA à 50 % dans le DCM et repurifiés par HPLC (voir ci-dessus).

15

PREPARATION VIII

pGlu-His-Trp-Ser-Tvr-D-LvsfAhxVLeu-Arg-Pro-Glv-NH?

160 mg de [D-Lys]6LHRH sont dissous dans le DMF (0,5 ml) neutralisés avec 3 éq de TEA (42 |a.l), puis Boc-Ahx (28 mg), 20 DIC (20 ji.1), et HOBt (19 mg) sont ajoutés et l'ensemble est agité à 0°C pendant 2 heures. Le peptide protégé par Boc est isolé par précipitation avec du diéthyléther et purification par HPLC sur la Colonne B, avec un gradient du système de solvant! (20-50 % de B en 60 mn). Les fractions contenant le peptide protégé sont 25 traitées avec TFA à 30% dans le DCM. La repurification sur la Colonne B en utilisant le système de solvant i selon un mode de gradient (10-30 % de B en 40 mn) donne 79 mg de [D-Lys(Ahx)]^LHRH. Le temps de rétention en HPLC de la préparation VIII est de 9,0 mn lorsqu'on utilise le système de 3 0 solvant! selon un mode de gradient linéaire (20-40% de B en 20 mn).

35

31

PREPARATION IX

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-LysfGltVLeu-Arg-Pro-Glv-NH?

5 Le peptide IX est préparé par acylation de [D-Lys]6LHRH

(Préparation IIIA, 160 mg) avec l'anhydride glutarique (57 mg) dans 500 jj.1 de DMF en présence de TEA (42 (il) pendant 2 heures à la température ambiante. Le [D-Lys(Glt)]6LHRH brut est purifié par HPLC sur la Colonne B, en utilisant le système de solvant!

10 selon un mode de gradient (20-40 % de B en 40 mn). La Préparation IX pure (120 mg) a un temps de rétention en HPLC de 12,4 mn lorsqu'on utilise le système de solvant i selon un mode de gradient linéaire (20-40 % de B en 20 mn).

1 5 PREPARATION X

Hémiglutarate d'anthraquinone-2-méthyle

576 mg (2 mmole) de 2-(hydroxyméthyl)-anthraquinone

2 0 sont mis en suspension dans 6 ml de pyridine anhydre et soumis au reflux pendant 24 heures avec 456 mg (4 mmole) d'anhydride glutarique. La pyridine est éliminée sous vide, le résidu est acidifié et extrait à l'acétate d'éthyle. Le produit jaune est recristallisé à partir d'acétate d'éthyle-hexane (580 mg, p.f. : 150-151°C). Le

25 temps de rétention en HPLC de la Préparation VIII est de 19,7 mn, en utilisant le système de solvant! (gradient linéaire de 30-60 % de B en 30 mn).

PREPARATION XI

30

5(3-chloropropionyloxyV 1.4-naphtoquinone

Une solution de triéthylamine (1,4 ml) et de 1,27 g de chlorure de 3-chloropropionyle dans 5 ml de DCNM est ajoutée à

3 5 une solution de 1,73 g de 5-hydroxy-l,4-naphtoquinone. Le mélange réactionnel est agité pendant 2 heures à la température ambiante. La solution est filtrée et concentrée à un faible volume et

32

chromatographiée sur une colonne gel de silice (acétate d'éthyle-cyclohexane-DCM) pour donner 741 mg du produit voulu.

EXEMPLE I

5

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-LysfD-MelVLeu-Arg-Pro-Glv-NH? fl')

Le peptide pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(D-Mel)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (1) est préparé par réaction de [D-Lys]6L H R H 10 (Préparation IIA, 31,9 mg (20 \imole) de sel de TFA) dans 0,5 ml de DMF avec Boc-D-Mel-OPCP (Préparation I, 26 mg) dans 200 jj.1 de MeCN, en présence de 4 méq de TEA. Le mélange est agité en continu pendant 10 heures à la température ambiante. Le mélange réactionnel est précipité avec le diéthyléther, filtré et lavé avec le 15 même solvant trois fois de suite. Le peptide ainsi obtenu, protégé par Boc, est traité avec 5,0 ml de TFA à 50 % dans le CH2CI2 pendant 10 mn à la température ambiante, la solution est évaporée et soumise à une HPLC sur la Colonne C, en utilisant le système de solvant il. Les fractions lyophilisées contenant le peptide pur 20 donnent 14,3 mg de 1.

Les peptides pGIu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Om(D-Mel)-Leu-Arg-Pro-GIy-NH2 (8) (15, mg), [Ac-Nal(2)-D-Phe(4CI)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(D-Mel)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (1S (16 mg), [Ac-Nal(2)-D-Phe(4CI)-D-Trp-Ser-Arg-D-Lys(D-Mel)-Leu-Arg-Pro-D-A!a-NH (19) (13.6 mg), [Ac-Nal(2)-D-Phe(4CI)-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Lys(D-Mel)-Leu-Arg-Prc D-Ala-NH2 (26) (12,1 mg) _

25

30

sont obtenus d'une manière similaire mais en utilisant respectivement R

I [D-Om]6LHRh

(Preparation IIB, 31,6 mg), [Ac-Nal(2)1,D-Phe(4CI)2ID-Trp3ID-Lys6,D-Ala10]LHRH (Préparation IV, 33,4 mg), [Ac-Nal(2),,D-Phe(4CI)2ID-Trp31Arg51D-Lys5ID-Ala10]LHRH (Préparation VA, 35,6 mg) at [Ac-Nal(2)1,D-Phe(4CI)2,D-Pal(3)3,Arg5>D-Lys6,D-Ala10]LHRH (Préparation VB, 34,8 mg),

35

M

33

DONNEES DE HPLC

Peptide

Gradient (% de B/mn) pour

Temps de

N°

Purification

Analyse rétention

5

(mn)

01

20-50/60

35-55/20

8,8

08

20-50/60

35-55/20

7>8

15

40-70/60

65-85/20

11,5

10

19

35-55/40

50-70/20

11,2

26

30-50/40

40-60/20

13,5

15

EXEMPLE II

pOlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-LysfCPCVLeu-Arg-Pro-Glv-NH? (2)

20 La préparation de pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(CPC)-Leu-Arg-

Pro-Gly-NH2 (2) est réalisée par une réaction d'acylation de [D-Lys]6LHRH (Préparation IIA, 31,9 mg du sel de TFA) avec le chlorure de cyclopropane-carbonyle. Le peptide est dissous dans 0,2 ml de DMF, neutralisé par addition de TEA et refroidi à -30°C. 25 10 p.1 ( |imole) d'une solution à 20 % de chlorure de cyclopropane-carbonyle dans le MeCN sont ajoutés. Ce procédé est répété deux fois et le mélange réactionnel est maintenu à 0°C pendant une nuit. Le mélange réactionnel est dilué avec une petite quantité d'eau et injecté sur la Colonne C pour être purifié dans le système de 3 0 solvant i. Les fractions lyophilisées contenant le peptide pur donnent 8,3 mg de 2.

En procédant d'une manière similaire mais en utilisant t

——— [D-0m]6LHRH (Préparation IIB, 31,6

3 5 mg), [Ac-Nal(2)1,D-Phe(4CI)2,D-Trp3,D-Lys6,D-Ala10]LHRH (Préparation IV, 33,4 mg), [Ac-Nai(2)1,D-Phe(4CI)2,D-Trp3,Arg5,D-Lys6,D-Ala10JLHRH (Préparation VA, 35,6 mg) et [Ac-Nal(2)1lD-Phe(4CI)2,D-Pal(3)3,Arg5,D-Lys6,D-Ala10]LHRH (Préparation VB, 34,8 mg),

"h

34

on prépare les peptides suivants :

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Orn(CPC)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (9) (12,1 mg), [Ac-Nal(2)-D-Phe(4CI)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(CPC)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (16) (24,4 mg), [Ac-5 Nal(2)-D-Phe(4C!)-D-Trp-Ser-Arg-D-Lys(CPC)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (20) (10,6 mg), [Ac-Nal(2)-D-Phe(4CI)-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Lys(CPC)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2(27) (8,4 mg).

DONNEES DE HPLC

10

Peptide

Gradient (% de B/mn)

pour

Temps de

N°

Purification

Analyse rétention

(mn)

02

15-35/50

20-40/20

12,6

09

10-30/40

25-45/20

9,8

16

40-60/40

50-79/20

10,3

20

25-50/50

45-65/20

12,3

27

25-45/40

35-55/20

13,0

EXEMPLE III

25

pGlu-His-Trp-Ser-Tvr-D-LvsCHMAOGVLeu-Arg-Pro-Glv-NHo (3)

La synthèse du pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(HMAQG)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (3) est réalisée par couplage de la [D-Lys]6LHRH 3 0 (Préparation IIA, 31,9 mg du sel de TFA) et de l'hémiglutarate d'anthraquinone-2-méthyle (X) avec le carbodiimide. La solution (200 fil de DMF) de 10,6 mg d'hémiglutarate d'anthraquinone-2-méthyle et de 4,(5 mg de HOBt est refroidie à 0°C, puis mise à réagir avec 3,5 ji.1 de DIC. Au bout de 15 mn, cette solution est 3 5 mélangée avec la solution froide (200 |il) de 31,9 mg de [D-Lys]6LHRH (Préparation IIA) (neutralisée par TEA) et maintenue à 0°C pendant 24 heures. Lorsque la réaction n'est pas

M

35

complète, le couplage est répété avec la demi-quantité de DIC. Le mélange réactionnel est dilué à l'eau et soumis à une purification comme décrit dans l'exemple I, pour donner 21,6 mg de peptide 3.

5

Les peptides pGiu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Orn(HMAQG)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (10) (15,4 mg), [Ac-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(HMAQG)-Leu-Arg-Pro-D-AJa-NH2 (17) j q (18,2 mg), [Ac-Nal(2)-D-Phe(4CI)-D-Trp-Ser-Arg-D-Lys(HMAQG)-Leu-Arg-Pro-D-A!a-NH2 (21) (20,6 .mg), [Ac-Nal(2)-D-Phe(4CI)-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Lys(HMAQG)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (28) (14,7 mg)

i sont préparés d'une manière similaire, sauf que, comme produit de 15 départ on utilise

[D-Om]6LHRH (Préparation IIB, 31,6 mg), [Ac-Nal(2)1,D-Phe(4CI)2,D-Trp3,D-Lys6,D-Ala10]LHRH (Préparation IV, 33,4 mg), [Ac-Nal(2)1,D-Phe(4C!)2ID-Trp3lArg5,D-Lys6,D-Ala10]LHRH (Préparation VA, 35,6 mg) ©tr [Ac-Nal(2)1,D-Phe(4CI)2>D-Pal(3)3>Arg5,D-20 Lys6,D-Ala10]LHRH (Préparation VB, 34,8 mg)

DONNEES DE HPLC

Peptide 25 N°

Gradient (% de B/mn) pour Purification Analyse

Temps de rétention (mn)

30

03 10 17 21 28

30-50/40 25-45/40 50-70/40 35-65/60 35-55/40

45-65/20 45-65/20 65-85/20 65-85/20 45-65/20

8.6

8.7

6.3

7.4

7.8

35

4

36

EXEMPLE IV

pGlu-His-Trp-Ser-Tvr-D-LvsCMTXVLeu-Arg-Pro-Glv-NHo (4)

5 La préparation du pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(MTX)-Leu-

Arg-Pro-Gly-NH2 (4) est réalisée par acylation de la [D-Lys]6LHRH avec le méthotrexate (améthoptérine). A la solution de 12,0 mg de méthotrexate dans 100 jil de DMF, un certain nombre d'équivalents de DIC est ajouté à 0°C. Au bout de 15 mn, la solution est mélangée 10 avec la solution neutralisée (TEA) de 31,9 mg de [D-Lys]6LHRH (Préparation IIA) et maintenue à 0°C pendant une nuit. Ensuite, le mélange réactionnel est dilué à l'eau et soumis à une HPLC, comme décrit dans l'exemple II. Deux principaux produits, ayant des temps de rétention légèrement différents, sont isolés (a : 5,2 mg, 15 b : 5,5 mg).

En procédant d'une manière similaire mais en utilisant

[D-Orn]6LHRH (Préparation IIB, 31,6

mg), [Ac-Nai(2)1,D-Phe(4CI)2,D-Trp3,D-Lys6,D-Aia10]LHRH (Préparation IV, 33,4 mg), 20 [Ac-Nal(2)1,D-Ph8(4CI)2,D-Trp3,Arg5)D-Lys6,D-Ala10]LHRH (Préparation VA, 35,6 mg), [Ac-Nal(2)1,D-Phe(4CI)2,D-Pal(3)3,Arg5,D-Lys6,D-Ala10]LHRH (Préparation VB, 34,8 mg),

et [D-Lys(Ahx)]6LHRH (Préparation VIII, 35 mg)

on prépare les peptides suivants :

pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Orn(MTX)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (11) (4,3 mg), [Ac-Nal(2)-D-Phe(4CI)-D-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(MTX)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (18) (8,4 mg), [Ac-Nal(2)-D-Phe(4CI)-D-Trp-Ser-Arg-D-Lys(MTX)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (22) (11,8 mg),[Ac-Nal(2)-D-Phe(4CI)-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Lys(MTX)-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2(29) (11,6 mg) and pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Orn[Ahx(MTX)j-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (34) (24 mg).

35

25

30

i

37

DONNEES DE HPLC

Peptide N°

Gradient (% de B/mn) pour Purification Analyse

Temps de rétention (mn)

10

04 11 18 22 29 34

20-40/40 15-45/60 40-60/40 25-45/40 25-45/40 20-40/40

20-40/20 25-45/20 45-65/20 45-65/20 30-50/20 25-45/20

12,3/12,8 10,1

10,3/10,7 7,1/7,4

11.8

10.9

15

EXEMPLE V

20 Autres peptides

Les peptides pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys[A2pr(D-Mel)2]-Leu-Arg-Pro-GIy-NH2 (i (12,4 mg), pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Orn[A2pr(D-Mel)2]-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (12) (11, mg), [Ac-Nal(2)-D-Phe(4CI)-D-Trp-Ser-Arg-D-Lys[A2pr(D-Mel)2]-Leu-Arg-Pro-D-Alc

2 5 NH2 (23) (5,8 mg), [Ac-Nal(2)-D-Phe(4CI)-D-PaI(3)-Ser-Arg-D-Lys[A2pr(D-Mel)2]-LeL

Arg-Pro-D-Ala-NH2 (30) (10,0 mg)

sont préparés comme décrits dans l'exemple I, sauf que l'on utilise,

comme composants amino, [D-Lys(A2pr)]5LHRH (Préparation IIIA, 35,9 mg),

3 0 [D-Orn(A2pr)]6LHRH (Préparation IIIB, 35,6 mg), [Ac-Nal(2)1,D-Phe(4CI)2,D-Trp3,.

Arg5,D-Lys(A2pr)6,D- Ala10]LHRH (Préparation VIIA, 39,6 mg) et I [Ac-Nal(2)1,D-Phe(4CI)2,

D-Pal(3)3,Arg5,D-Lys(A2pr)®,D-Ala10] LHRH (Préparation VIIB, 38,8 mg)

et que la quantité du Boc-D-Mel-OPCP utilisée pour l'acylation est 35 doublée.

*

38

DONNEES DE HPLC

Peptide

Gradient

(% de B/mn) pour

Temps de

N°

Purification

Analyse rétention

(mn)

05

30-50/40

50-70/20

9,8

12

25-45/40

50-70/20

7,8

23

25-45/40

55-70/20

9,8

30

40-70/60

65-85/20

12r3

28

35-55/40

45-65/20

7,8

15

EXEMPLE VI

20

Autres peptides

La synthèse des pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys[A2pr(CPC)2]-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (6) (8,4 mg), £G!u-His-Trp-Ser-Tyr-D-Om[A2pr(CPC)2î-Leu-Arg-Pro-GIy-NH2 (13)

2 ^ (9,6 mg), [Ac-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-D-Trp-Ser-Arg-D-Lys[A2pr(CPC)2]-Leu-Arg-Pro-D-

Ala-NH2 (24) (7,6 mg), [Ac-Nal(2)-D-Phe(4CI)-D-Pai(3)-Ser-Arg-D-Lys[A2pr(CPC)2]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 (31) (6,8 mg)

est réalisée comme décrit dans l'exemple II, sauf que [D-Lys(A2pr)] LHRH

3 0 (Préparation MA, 35)9 mg), [D- Orn(A2pr)]6- LHRH (Préparation MB, 35,6 mg),

[Ac-Nal(2)1,D-Phe(4CI)2,D-Trp3,Arg5,D- Lys(A2pr)6,D-Ala10]LHRH (Préparation VIIA, 39.6mg) et [Ac-Nal(2)1,D-Phe(4CI)2, D- Pal(3)3,Arg5,D-Lys(A2pr)6)D-Ala1û]LHRH (Préparation VIIB, 38,8 mg)

sont acylés avec deux équivalents de chlorure de cyclopropane-3 5 carbonyle.

39

DONNEES DE HPLC

Peptide Gradient (% de B/mn) pour Temps de

N° Purification Analyse rétention

5 (mn)

06 15-35/40 25-45/20 10,6

13 15-35/40 25-45/20 9,3

24 20-50/60 45-65/20 11,6

10 31 20-50/60 40-60/20 8,7

15 EXEMPLE VII

I

Autres peptides

Les peptides

20 pGIu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys[A2pr(HMAQG)2]-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (7) (4,3 mg), pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Orn[A2pr(HMAQG)2]-Leu-Arg-Pro-G!y-NH2 (14) (8,9 mg), [Ac-

Nal(2)-D-Phe(4CI)-D-Trp-Ser-Arg-D-Lys[A2pr(HMAQG)2]-Leu-Arg-Pro-D-AIa-NH2(25) (10,7 mg), [Ac-Nal(2)-D-Phe(4CI)-D-Pal(3)-Ser-Arg-D-Lys[A2pr(HMAQG)2]-]Leu-Arg-

25 pro-D-Ala-NH2 (32) (9,1 mg),

sont préparés par synthèse comme décrit dans l'exemple III, sauf que l'on utilise

3 Q [D-Lys(A2pr)]6LHRH (Préparation NIA, 35,9 mg), [D-0m(A2pr)]6LHRH (Préparation IIIB, 35,6 mg), [Ac-Nal(2)1ID-Phe(4CI)2,D-Trp3,Arg5,D-Lys(A2pr)6,D-Ala10]LHRH (Préparation VIIA, 39,6 mg) eX [Ac-Nai(2)1,D-Phe(4CI)2lD-Pal(3)3,Arg5,D-lys(A2pr)6,D-Ala10]LHRH (Préparation VIIB, 38,8 mg)

3 5 dans une réaction de couplage avec le carbodiimide et que l'on utilise deux fois plus d'hémiglutarate d'anthraquinone-2-méthyle,

de DIC et de HOBt.

40

DONNEES DE HPLC

Peptide Gradient (% de B/mn) pour

N° Purification Analyse

Temps de rétention (mn)

10

07 14 25 32

35-65/60 40-60/40 40-80/80 40-70/40

50-70/20 50-70/20 65-85/20 60-80/20-

12,6 10,4 13,9 15,2

15

20

EXEMPLE VIII

pGlu-His-Trp-Ser-D-LysCGlt-DOXVLeu-Arg-Pro-Gly-NH? (33)

La synthèse du pGlu-His-Trp-Ser-D-Lys(Glt-DOX)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 (33) est réalisée par couplage de la fraction 25 aminosucre de la doxorubicine à la chaîne latérale de glutaroyle de la [D-Lys(Glt)]6LHRH. 29,6 mg de la Préparation IX sont dissous dans 200 (J.1 de DMF et mis à réagir avec 14 mg de doxorubicine et 4 jil de DIC, en présence de 6,2 |il de TEA et de 3,3 mg HOBt, à 0°C pendant une nuit. Le mélange réactionnel est soumis à une HPLC 3 0 sur la Colonne D, en utilisant le système de solvant i (20-50 % de B en 60 mn). Le temps de rétention en HPLC de la [D-Lys(Glt-DOX)J6LHRH (20 mg) est de 10,5 mn lorsqu'on utilise le système! selon un mode de gradient linéaire (30-50 % de B en 20 mn).

35

*

41

EXEMPLE IX

La synthèse du pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(NQCE)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 est réalisée par alkylation de la [D-Lys]6LHRH 5 (Préparation IIA) avec la 5(3-chloropropionyloxy)-l,4-naphto-quinone. A la solution de [D-Lys]6LHRH (31,9 mg) dans 200 jil de DMF, on ajoute 1,2 équivalent de 5(3-chloropropionyIoxy)-l,4-naphtoquinone, en présence d'une quantité équivalente de K2CO3 solide. Au bout de 24 heures, le mélange réactionnel est soumis à 10 une évaporation pour être concentré à un faible volume et à une HPLC sur la Colonne D en utilisant le système de solvant i.

EXEMPLE X

15 La synthèse du pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(Azy)-Leu-Arg-

Pro-Gly-NH2 (3) est réalisée par couplage de la [D-Lys]6LHRH et du Trt-Azy avec le carbodiimide. La solution (200 ni d'acétonitrile) de 10,6 mg de Trt-Azy et de 4,6 mg de HOBt est refroidie à 0°C, puis mise à réagir avec 3,5 jj.1 de DIC. Au bout de 15 minutes, cette

2 0 solution est mélangée avec la solution froide (200 jj.1) de 31,9 mg de [D-Lys]6LHRH (Préparation IIA) (neutralisée avec TEA) et maintenue à 0°C pendant 24 heures. Le peptide protégé avec Trt est isolé par HPLC sur la Colonne D, détritylé avec de l'acide acétique aqueux à 80 % et repurifié sur la même colonne avec le 25 système de solvant iL

EXEMPLE XI

La préparation du pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(EPP)-Leu-

3 0 Arg-Pro-Gly-NH2 (2) est réalisée par une réaction d'alkylation de la

[D-Lys]6LHRH (Préparation IIA, 31,9 mg du sel de TFA) avec l'épibromhydrine. A 200 jil de solution de peptide dans le DMF, on ajoute 4 équivalents de TEA et 3 mg d'épibromhydrine. Le mélange réactionnel est agité pendant 24 heures à la température 3 5 ambiante et ensuite, appliqué sur la Colonne D pour purification.

I

À

42

EXEMPLE XII

La préparation du pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(MIT)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 est réalisée par acylation de la mitomycine C avec 5 la [D-Lys(Glt)]6LHRH. 29,6 mg de la Préparation IX sont dissous dans 200 |il de DMF et mis à réagir avec 7 mg de mitomycine C et 5 |il de DIC, en présence de 6,2 fil de TEA et de 3,3 mg de HOBt à 0°C pendant une nuit. Ensuite, le mélange réactionnel est dilué à l'eau et soumis à une HPLC sur la Colonne D, avec le système de 1 0 solvant ii.

EXEMPLE XIII

Le pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Lys(Glt-ESP)-Leu-Arg-Pro-Gly-1 5 NH2 est préparé par synthèse par couplage de la [D-Lys] 6LHRH avec l'hémiglutaroyl-espéramycine préformée (position(s) d'acylation non identifié(s). La solution de 2 mg d'hémiglutaroyl-espéramycine (100 jj.1 de DMF) et de 1,3 mg de HOBt est refroidie à 0°C et mise à réagir avec 1 jxl de DIC. Au bout de 10 minutes, 16 mg de 20 [D-Lys]6LHRH sont ajoutés dans 100 jj.1 de DMF neutralisé et le mélange réactionnel est maintenu à 0°C pendant 24 heures. Plusieurs produits sont isolés par HLPC (Colonne C, système de solvant ii).

25 EXEMPLE XIV

Effets biologiques, capacité de liaison au récepteur et activités cytotoxiques.

3 0 Les effets biologiques, la capacité de liaison au récepteur et les activités cytotoxiques des composés revendiqués sont rassemblés dans les tableaux 1 à 4.

Le tableau 1 représente l'activité hormonale des composés selon l'invention ayant des propriétés agonistes vis-à-vis de la

3 5 LHRH, comparées à celles de la LHRH in vitro, dans un système dispersé en superfusion de cellules hypophysaires du rat [S. Vigh and A.V. Schally, Peptides 5_, 241-247 (1984)]. Le peptide est

t

43

soumis à une perfusion pendant 3 minutes à des concentrations variées, et la quantité de LH libérée est comparée à celle libérée par LHRH 3 nM. Le tableau 1 contient également des données concernant l'affinité de liaison au récepteur de ces composés pour 5 les membranes des cellules cancéreuses du sein chez l'être humain.

Le tableau 2 présente l'activité antiovulatoire et l'affinité de liaison au récepteur membranaire de cellules cancéreuses du sein chez l'être humain des composés revendiqués ayant des propriétés inhibitrices de la LHRH. L'action inhibitrice est déterminée in vivo. 10 chez des rats ayant des cycles de 4 jours, comme décrit [A. Corbin and C.W. Beattie, Endocr. Res. Commun., 2, 1-23 (1975)].

Les tableaux 3 et 4 représentent des données concernant l'inhibition de l'incorporation de la 3H-thymidine dans l'ADN, par des analogues cytotoxiques de la LHRH sur des lignées de cellules 15 cancéreuses mammaires humaines MCF-7, T47D, MDA-MB-231 et SKBr-3. Deux cent mille cellules dans 200 |xl de RPMI-160 + 2 % de CFBS sont soumis à une incubation avec 1,5 ou 10 p. g d'analogues cytotoxiques pendant 3 heures ou 23 heures puis 1 n Ci de 3H-tymidine est ajouté et incubé pendant 60 autres 2 0 minutes. L'ADN est extrait avec de l'acide perchlorique I N et la radioactivité est mesurée.

44

TABLEAU 1

Activité libératrice de LH et activité de liaison au récepteur de peptides pGlu-His-Trp-Ser-Trp-R6(YX)-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 5 contenant des radicaux cytotoxiques vis-à-vis des membranes cellulaires du cancer du sein chez l'être humain.

Peptide

Constante d'affinité

Activité

Ka2 mM'1

Ex.

R6

Y

X

Relative nM"1

1.

D-Lys

-

(D-Mel)

66.74

1,07

2.

D-Lys

-

CPC

52

1,65

-

3.

D-Lys

-

HMAQG

35

1,52

-

4A.

D-Lys

-

MTX

5,42

1,59

4B.

D-Lys

-

MTX

0,63

-

5.

D-Lys

L-A2pr

(D-Mel)2

30,48

3,45

6.

D-Lys

L-A2pr

(CPC)2

25

0,14

-

7.

D-Lys

L-A2pr

(AQHMG).

2 30

NB

NB

8.

D-Orn

-

D-Mel

11,51

0,34

9.

D-Orn

-

CPC

40

-

44,2

10.

D-Orn

-

HMAQG

56

-

1f3

11.

D-Orn

-

MTX

12.

D-Orn

L-A2pr

(D-Mel)2

6,47

-

13.

D-Orn

L-A2pr

(CPC)2

NB

NB

14.

D-Orn

L-A2pr

(HMAQG)

2

33.

D-Lys

Glt

DOX

12

-

14,4

34.

D-Lys

Ahx

MTX

6.7

4,42

-

* L'activité libératrice de LH est comparée à celle produite par 3 5 LH-RH 3 nM.

** 125I-[D-Trp]6LHRH utilisé comme ligand marqué.

45

TABLEAU 2

Activité antiovulatoire et affinité de peptides Ac-D-Nal(2)-D-Phe(4Cl)-R3-Ser-R5-D-Lys-[AX]-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2 contenant 5 des radicaux cytotoxiques vis-à-vis des récepteurs membranaires de cellules du cancer du sein chez l'être humain.

Peptides

Constante d'affinité**

10 Ex.

R3

R5

A

X

% Ovulation

"ai k32

Blockade*

nM"1

uM"1

15.

D-Trp

Tyr

-

D-Mel

100

3,58

-

15 16-

D-Trp

Tyr

-

CPC

NB

NB

17.

D-Trp

Tyr

-

HMAQG

NB

NB

18.

D-Trp

Tyr

-

MTX

3,58

1,07

19.

D-Trp

Arg

-

D-Mel

40

-

32,54

20.

D-Trp

Arg

-

CPC

80

NB

NB

20 21.

D-Trp

Arg

-

HMAQG

80

0,29

-

22.

D-Trp

Arg

-

MTX

NB

-

23.

D-Trp

Arg

L-A2pr

(D-Mel)2

3,82

-

24.

D-Trp

Arg

L-A2pr

(CPC)2

60

0,42

-

25 25"

D-Trp

Arg

L-A2pr

(HMAQG)2

0

7,05

8.6

26.

D-Pal(3)

Arg

-

D-Mel

100

0,97

1,34

27.

D-Pal(3)

Arg

-

CPC

100

NB

NB

28.

D-Pal(3)

Arg

-

HMAQG

100

NB

NB

29.

D-Pal(3)

Arg

-

MTX

100

0.44

1,04

30 30.

D-Pal(3)

Arg

L-A2pr

(D-Mel)2

NB

NB

31.

D-Pal(3)

Arg

L-A2pr

(CPC)2

100

1,52

-

32.

D-Pal(3)

Arg

L-A2pr

(HMAQG)2

40

2f28

-

35 * Les peptides sont testés à 10 n g par rat.

** 125I-[D-Trp]6LHRH utilisé comme ligand marqué. NB, pas de liaison.

46

TABLEAU 3

Effet inhibiteur des analogues cytotoxiques de formule I de la LHRH sur l'incorporation de la 3H-thymidine dans l'ADN dans une lignée cellulaire, MCF-7, du cancer du sein chez l'être humain.

Ex.

10

15

20

25

Témoin 3

7

10

11 19

21

24

25

26

28

29

3 0 32

33

34

35

Dose /ig/ml

1

10 1

10 1 5 1

10 1

10 1

10 1

10 1

10 1

10 1

10 1

10 1

10 1 5 1

10

% Inhibition après 4 h 0

29** 32** 26** 38** 32** 36** 34** 29**

25** 34**

31** 49**

31**

28**

19** 34**

% Inhibition oiprèb 24 h 0 14** 71**

24** 44**

28**

51**

7 3

34** 49**

0 0

8

37**

3 11

33**

54**

0 0 10 16

15

40**

0

61**

16 21

p<0,01, dans le test à gamme multiple de Duncan.

Al

TABLEAU 4

Effet inhibiteur des analogues cytotoxiques de formule I de la LHRH vis-à-vis de l'incorporation de la 3H-Thymidine dans l'ADN 5 dans différentes lignées cellulaires du cancer du sein chez l'être humain.

Ex.

Dose jLig/ml

% Inhibition « près: 4 h

% Inhibition «près 24 h

T&rno/n 4

Lignée cellulaire T47D

1 10

5 1

10

24 1

10

25 1

10

33 1

10

Lignée cellulaire MDA-MB-231

0

38** 54** 31**

39** 44**

50** 37** 41**

32** 44**

0 26 41 15 28 22 12 20 54 11 10

T&inrtçrilft

-

0

0

4

1

23*

0

10

31**

8

5

1

20*

15

10

20*

62**

24

1

25*

8

10

73**

11

25

1

36**

0

10

40**

90**

33

1

20*

0

10

9

0

4

r

»

48

Lignée cellulaire SKBr-3

5

Temo/n

-

0

0

4

1

2"| **

16**

10

36**

10

5

1

24**

30**

10

21**

66**

10

24

1

37**

18*

10

42**

29**

25

1

30**

9

10

53**

88**

15

33

1

27**

0

10

24**

14**

20 * p<0,05 dans le test à gamme multiple de Duncan. ** p<0,01 dans le test à gamme multiple de Duncan.

49

Claims (1)

REVENDICATIONS

1. Peptide choisi dans le groupe de peptides répondant à la formule :

5

X-R1-R2-R3-Ser-R5-R6(Q)-Leu-Arg-Pro-RlO-NH2

dans laquelle R1 est pGlu ou D-Nal(2),

1 0 R2 est His ou D-Phe(4Cl),

R3 est Trp, D-Trp ou D-Pal(3),

R5 est Tyr ou Arg,

R6 est D-Lys ou D-Orn,

RIO est Gly ou D-Ala,

15 X est l'hydrogène ou un groupe alcanoyle inférieur comportant 2 à 5 atomes de carbone,

Q est un motif cytotoxique répondant à la formule

-Q* ou -A(Q3) ou -B(Ql)2 ou -B(AQ2)2 20 II III IV(a) IV(b);dans laquelle;A représente -NH-(CH2)n-CO- ou -OC-(CH2)n-CO 25 où n vaut 2-6,;B représente -HN-CH2-(CH2)m-CH(NH)-(CH2)n-CO-où;m vaut 0 ou 1,;3 0 n vaut 0 ou 1,;le motif -CO de A- et de B- étant lié à un groupe amino sur R6, et dans le groupe B(AQ2)2, le motif -CO de A- étant lié à un groupe amino sur B,;35;4;r;50;Q1 est D ou L-Mel, un groupe cyclopropanecarbonyle, aziridine-2-carboxyle, époxyalkyle ou 1,4-naphtoquinone-5-oxycarbonyl-éthyle,;Q2 est Q1, un groupe anthraquinonylalcoxy ou doxorubicinyle, 5 Q3 est Q2, un groupe mitomycinyle, espéramycinyle ou méthotrexoyle,;Q4 est Q1 ou un groupe méthotrexoyle et leurs sels d'addition acide et basique pharmaceutiquement acceptables.;10;2. Peptide selon la revendication 1, dans lequel Q est Q4.;3. Peptide selon la revendication 2, dans lequel;R1 est pGlu, R2 est His, R3 est Trp, R5 est Tyr, R6 est D-Lys ou 1 5 D-Orn, R10 est Gly et X est l'hydrogène.;4. Peptide selon la revendication 2, dans lequel;R1 est D-Nal(2), R2 est D-Phe(4Cl), R3 est D-Trp ou D-Pal(3), R5 est Tyr ou Arg, R6 est D-Lys ou D-Orn, R10 est D-Ala et X est un groupe 20 alcanoyle inférieur de 2-5 atomes de carbone.;I;5. Peptide selon la revendication 1, dans lequel Q est A(Q3).;6. Peptide selon la revendication 5, dans lequel;25 R1 est pGlu, R2 est His, R3 est Trp, R5 est Tyr, R6 est D-Lys ou D-Orn, R10 est Gly et X est l'hydrogène.;7. Peptide selon la revendication 6, dans lequel;Rl est D-Nal(2), R2 est D-Phe(4Cl), R3 est D-Trp ou D-Pal(3), R5 est 3 0 Tyr ou Arg, R6 est D-Lys ou D-Orn, R10 est D-Ala et X est un groupe alcanoyle inférieur de 2-5 atomes de carbone.;8. Peptide selon la revendication 1, dans lequel Q est;B(Q!)2.;35;51;9. Peptide selon la revendication 8, dans lequel;R1 est pGlu, R2 est His, R3 est Trp, R5 est Tyr, R6 est D-Lys ou D-Orn, RIO est Gly et X est l'hydrogène.;10. Peptide selon la revendication 8, dans lequel;Rl est D-Nal(2), R2' est D-Phe(4Cl), R3 est D-Trp ou D-Pal(3), R5 est Tyr ou Arg, R6 est D-Lys ou D-Orn, Rî0 est D-Ala et X est un groupe alcanoyle inférieur de 2-5 atomes de carbone.;11. Composition pharmaceutique exerçant notamment une action sur la libération des gonadotropines à partir de l'hypophyse chez les mammifères et présentant une activité antinéoplasique, caractérisée en ce qu'elle renferme une quantité efficace d'au moins un peptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, notamment un véhicule comprenant les microcapsules (microsphères) ou des microgranules (microparticules) formulés, pour une libération progressive, en particulier à partir du poly-(DL-lactide-CO-glycoside).;11. Procédé de préparation des peptides de formule I caractérisé en ce qu'on opère en combinant les techniques en phase solide et la synthèse en solution, en utilisant le peptide intermédiaire de formule VI;Xl-Rl-R2(X2)-R3-Ser(X4)-R5(X5)-R6(X6)-Leu-Arg(X8)-Pro-Rl0-NH-Xl0;VI;dans laquelle;Rl, R2, /R3, R5, R6 et Rl° sont définis comme ci-dessus,;52;f»;X1 est un groupe acyle comportant 2 à 5 atomes de carbone ou lorsque R1 est pGlu, X1 est l'hydrogène,;X2 est nul ou un groupe protecteur pour l'azote du groupe imidazole de His,;5 X4 est l'hydrogène ou un groupe protecteur pour le groupe hydroxyle Ser,;X5 est l'hydrogène ou un groupe protecteur pour le groupe hydroxyle phénolique Tyr ou un groupe protecteur pour le groupe guanidino d'Arg,;10 X6 est l'hydrogène ou un groupe protecteur pour Lys, Orn,;X8 est l'hydrogène ou un groupe protecteur pour le groupe guanidino d'Arg,;X*0 est l'hydrogène ou un groupe benzhydryle incorporé à la résine.

SCHALLY Andrew V

JANAKY Tamas

JUHASZ Atilla

BAJUSZ Sandor