MC362A1 - L'extraction de l'hydroxocobalamine a partir du foie ou de poudre bactérielle tels que certains bacilles propioniques et certains megatherium - Google Patents

Description

BREVET D* INVENTION

BREVET POUR L'EXTRACTION DE L'HÏDROXOCOBALAMINE A PARTIR DU FOIE OU DE POUDRE BACTERIELLE TELS QUE CERTAINS BACILLES PROPIONIQUES ET CERTAINS MEGATHERIUM»

On trouve dans le foie une certaine quantité de vitamine B.12 qui y existe en majorité sous forme d*hydroxocobalamine complexée à des protéines et à des acides aminés.

Une autre source de vitamines B.12 est aussi constituée par certains micro-organismes bactériens qui, dans des conditions spéciales, peuvent s'enrichir notablement en B.12 sou " . t£reo

DEMANDEUR» SOCIETE ANONYME MONEGASQUE

~ "L'OPOCHIMIE"

INVENTEURS: Monsieur Robert COTE

Monsieur Jean BOIGE

2)

Nous avons mis au point une technique d'enrichissement et

(lO) d'extraction permettant d'obtenir avec de bons rendements souj forme d'hydroxocobalamine ce produit contenu sous forme libre ou liée dans la matière première initiales

Une première extraction alcoolique est tout d'abord effectuée dans les conditions suivantes:

(15) Pour le foie: après hachage, on reprend le foie par deux volumes d'alcool à 50* à pH 4 environ, à température ambiante< On laisse sous agitation pendant deux heures puis on filtre sur filtre-presse ou filtre rotatifo On lave le résidu sur le filtre avec un peu d'alcool à 50* et obtient ainsi un premier (20) extrait alcoolique*

Pour les poudres bactérielles: on utilise la même techniqu< mais, pour tenir compte du fait que ces poudres sont pratiquement sèches, tandis que le foie a environ 80$ d'humidité, l'es traction est effectuée non pas avec deux volumes d'alcool à 5( (25) mais avec 6 volumes»

Sans certains cas, pour améliorer l'extraction on peut por1 le mélange à une température de 60° avant filtration«

L'extrait alcoolique obtenu est concentré sous vide à basse température et amené au lOème de son volume initial, afin d'ei (30) chasser complètement l'alcool* On laisse 12 heures à une tempé rature comprise entre 0 et 5°, si l'on a une précipitation, le produit solide est séparé par centrifugation. Le liquide contient la B.12 extraite»

(35) relargage au sulfate d'ammoniaque dans les conditions suivante On détermine la teneur en extrait sec de ce liquide et en fonction de sa teneur en eau on ajoute du sulfate d'ammonium à raison de 60 grammes par 100 cm3 d'eauo On agite et porte à une ten ' ' ou 60® pour bien mettre le

On absorbe et insolubilise la B.12 et les protéines par

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(40)sulfate d'ammonium en solution* La solution ainsi obtenue est mise à refroidir de façon à ce que la température tombe à envir 0° à 5°» Il s'effectue un relargage, le gâteau formé contient d'une part, une quantité importante de sulfate d'ammoniaque et d'autre part, certains produits organiques ainsi que pratiquent (45)la totalité de la B»12 du liquide initial*

On filtre sur BUCHNER et récolte le gâteau essoré»

Ce gâteau est repris par son volume d'eau afin d'obtenir une solution totaleo On ajuste à pH 3,5/4 par un acide fort de façoi à faciliter la séparation de la B«12 d'avec les protéines et le. (50)acides aminés (l'hydroxo se bloquant sur l'acide fort qui déplà* les acides aminés)» On laisse en contact un certain temps puis reprend par environ un volume d'acétone* On agite vigoureusemen-et laisse décanter*

(55)deux couches: une eouche inférieure aqueuse contenant pratiquement la totalité du sulfate d'ammonium et une couche supérieure acétonique» La quantité d'acétone à utiliser doit être suffisan1 pour que, dans la décantation, la couche supérieure titre envir< 60$ d'acétone* Il est utile de faire un essai préalable pour (60)déterminer la quantité d'acétone à mettre en oeuvre*

La couche inférieure est rejetée, après avoir toutefois vérifié qu'elle ne contenait pratiquement plus de B.12* Si du fait d'un mauvais réglage elle en contenait encore, une deuxième exti tion acétonique. serait effectuée»

(65) On laisse la couche-supérieure pendant 12 heures entre 0° et +5° pour que la séparation entre la B*12 et les protéines puisf s'effectuer complètement» On ajoute alors une quantité d'acétone suffisante et nécessaire pour porter le titre à 80$ d'acétone»

Du fait de la haute teneur en sulfate d'ammonium on obtient

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On peut avoir une précipitation de protéines que l'on sépare (70) par filtration» Pour être certain que toute la B.12 a bien

été extraite, ces protéines sont épuisées par un peu d'acétor à 80$ et l'on s'assure qu'une solution aqueuse de ces protéines ne contient pratiquement plus de vitamine B.12»

La solution acétonique à 80$ d'acétone filtrée est ensuite (75) chromatographiée sur une colonne d'alumine tamponnée à pH 7« On élue avec de l'acétone à 50$» La fraction contenant la B.12 est tout d'abord amenée à pH 3,5/4 puis l'acétone est chassée sous vide» On effectue un deuxième relargage au sulfa d*ammoniaque puis le gâteau est repris par l'acétone ainsi (80) qu'il a été indiqué précédemment» On chromatographie une deuxième fois sur alumine puis le coeur de chromato contenant la B.12 est porté à pH 8,5/9, ceci de façon à libérer l'hydre xocobalaminé qui pourrait être complexée avec les acides contenus dans le milieu»

(85) Le titre de la solution en acétone est alors ajusté de façon à être sensiblement de 10 à 12 volumes d'acétone pour 1 d'eauo On laisse cristalliser au froid, on obtient des cristaux d'hydroxocobalamine»

EHMPLE:

(90) 1000 Xg de foie sont repris par 2000 litres d'alcool à 50® amené à pH 4 par'l'acide chlorhydrique0 Après agitation et chauffage à 50° C, on filtre puis lave le résidu resté sur le filtre par passage de 200 litres d'alcool à 50°. On obtien 2200 litres d'un extrait jaune contenant la B.12o Cet extrait (95) est concentré sous vide à basse température et ramené à 250 litreso

Ce concentré est laissé pendant une douzaine d'heures à une température comprise entre 0® et 5®, et on clarifie par centrifjig;ation si on a observé une précipitation»

(5)

(lOO) A cette solution on ajoute 125 Kg de sulfate d* ammoniaque, en agitant et en portant à une température de 55/60°. On laiss refroidir an réfrigérateur jusqu'à une température comprise entre 0 et 5°. On a un relargage et on filtre*

On obtient 40Kg de gâteau humide, le filtrat étant rejeté (105) après contrôle*

Après mise en solution dans l'eau on ajuste à pH 3,8 et on laisse au repos pendant deux heures, puis, on ajoute 40 litres d*acétone, on agite et on laisse décanter0 On prend alors la densité de la couche supérieure qui doit être sensiblement de (llô) 0,910 ce qui correspond à environ 60$ d'acétoneo

La couche inférieure aqueuse après contrôle d'absence de B.12 est rejetée» La couche supérieure est laissée à 0/5° pendant 12 heures; puis on y ajoute un volume égal d'acétone de façon à en porter le degré acétonique à 80$»

(ll5) On filtre, puis lave le résidu avec 5 litres d'acétone à 80; On obtient 80 litres d'une solution acétonique à 80$ titrant 1 à 2$ d*extrait sec et 15 gamma de B.12 au cc» On chromatograph sur une colonne d9alumine par passage du jus acétonique à 80$ puis élue avec de l'acétone à 50$» La Bol2 contenue dans le ju (120) initial est retrouvée dans une fraction de six litres de solut; acétonique à 50$«

On concentre sous vide pour chasser 1'acétone* On obtient 2 litres de solution aqueuse contenant la Bol2. On rajoute 1ÎC 300 de sulfate d'ammoniaque et fait relarguer comme précédei (125) ment» On obtient 600 grammes d'un gâteau humide qui est repri, par son volume d*eau amené à PH 3,60 On laisse en contact deux heures puis on reprend par 600 cc d'acétone* Après agitation e-décantation^on ajuste, par addition d'acétone, la couche supé-

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rieure à 80$ d'acétoneo On obtient 1200 cc de solution acétoni (130) que»

On chromatographie sur une petite colonne d'alumine et on obtient 250 cc de solution riche en £«12 que l'on amène à pH 9 par addition de soude» On porte à 1250 cc le volume par additi d'acétone et laisse cristalliser» Après filtration et séchage (135) ©n obtient 1 gramme d'hydroxocobalamine»

2°) La même technique est appliquée pour les poudres de bacill propioniques ou poudre de megatherium»

Les rendements dépendent de la richesse initiale de ces micro-organismes secs«

Claims (1)

1. RESUME

   (140) Procédé d'extraction, du foie ou de certains corps bacterien, de 1'hydroxocobalamine qui s'y trouve complexée à des protéines ou des acides aminés et purification de cette vitamine en utilisant les méthodes suivantes:

   1°) absorption par le sulfate d'ammonium en milieu aqueux (145) puis élution en milieu acétonique»

   2°) séparation et élimination de certaines protéines par le sulfate d'ammonium à certaines concentrations.

   3°) destruction des complexes hydroxocobalamine-acide aminés ou protéines, par action des acides forts* (150) 4°) séparation et purification de 1'hydroxocobalamine sur alumine.

   5°) cristallisation en milieu acétonique fort à un pH pour lequel 1'hydroxocobalamine se trouve libéré®

   Par procuration de Monsieur Georges BARCS, Administrateur-Délégu de la Société Anonyme Monégasque "L1OPOCHIMIE" :

   Monsieur Robert Louis Florentin COTE

   Eden Park — Boulevard de Belgique à MONACO (Pté)

   Original comprenant 7 feuillets sans renvoi ni mot nul ni ajouté.