MD3388075T2

MD3388075T2 - Noi peptide și combinații de peptide pentru utilizare în imunoterapia împotriva unor diverse tumori (SEQ ID 25 - MXRA5-003)

Info

Publication number: MD3388075T2
Application number: MDE20180992T
Authority: MD
Inventors: Andrea Mahr; Lea Stevermann; Toni Weinschenk; Oliver Schoor; Jens Fritsche; Harpreet Singh
Original assignee: Immatics Biotechnologies Gmbh
Priority date: 2015-03-27
Filing date: 2016-03-24
Publication date: 2023-10-31
Also published as: AU2023201933A1; ES2991207T3; PH12021550850A1; MY200343A; JP2020188764A; US11434274B2; US11365235B2; US20210403530A1; IL298914A; IL260877B2; US10745460B2; US20230203127A1; IL254129B2; US20210395336A1; DK3388075T3; EP4397676A2; ES2981540T3; US12006349B2; US20230348563A1; US20220002378A1

Abstract

Prezenta invenţie se referă la peptide, proteine, acizi nucleici şi celule pentru utilizare în metode imunoterapeutice. În particular, prezenta invenţie se referă la imunoterapia împotriva cancerului. În plus, prezenta invenţie se referă la epitopii peptidici ai unei celule T asociate tumorii, singuri sau asociaţi cu alte peptide asociate tumorii, care pot servi, de exemplu, drept ingrediente farmaceutice active ale compoziţiilor de vaccinuri care stimulează răspunsurile imunitare antitumorale sau pentru stimularea celulelor T ex vivo şi transferarea la pacienţi. Peptidele legate de moleculele complexului major de histocompatibilitate (MHC), sau peptidele ca atare, pot fi, de asemenea, ţinte ale anticorpilor, ale receptorilor solubili de celule T şi ale altor molecule de legare.

Description

Prezenta invenţie se referă la mai multe secvenţe noi de peptide şi variantele lor derivate din molecule HLA de clasă I ale celulelor tumorale umane care pot fi utilizate în compoziţii de vaccinuri pentru stimularea răspunsurilor imunitare antitumorale sau ca ţinte pentru dezvoltarea de compuşi şi celule active din punct de vedere farmaceutic/imunologic.

FUNDAMENTELE INVENŢIEI

Potrivit Organizaţiei Mondiale a Sănătăţii (OMS), în 2012, cancerul se număra printre cele patru mari boli mortale netransmisibile la nivel mondial. În acelaşi an, cancerul colorectal, cancerul de glandă mamară şi cancerul de tract respirator au fost enumerate printre primele 10 cauze de deces în ţările cu venituri ridicate (http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs310/en/).

Epidemiologie

În 2012, la nivel mondial au fost estimate 14,1 milioane de cazuri noi de cancer, 32,6 milioane de pacienţi care suferă de cancer (în interval de 5 ani de la diagnosticare) şi 8,2 milioane de decese cauzate de cancer (Ferlay et al., 2013; Bray et al., 2013).

În cadrul grupurilor de cancer cerebral, leucemie şi cancer pulmonar, prezenta descriere se concentrează în special pe glioblastom (GB), leucemie limfocitară cronică (CLL) şi leucemie mieloidă acută (AML), cancer pulmonar non-microcelular (NSCLC) şi, respectiv, microcelular (SCLC).

GB este cea mai frecventă afecţiune malignă a sistemului nervos central, cu o rată de incidenţă ajustată în funcţie de vârstă de 3,19 la 100.000 de locuitori în Statele Unite. GB are un prognostic foarte slab, cu o rată de supravieţuire la un an de 35% şi o rată de supravieţuire la 5 ani mai mică de 5%. Sexul masculin, vârsta înaintată şi etnia par a fi factori de risc pentru GB (Thakkar et al., 2014).

CLL este cea mai frecventă leucemie în lumea occidentală, unde reprezintă aproximativ o treime din totalul leucemiilor. Ratele de incidenţă sunt similare în SUA şi în Europa, iar cazurile noi sunt estimate la aproximativ 16.000 pe an. CLL este mai frecvent la caucazieni decât la africani, mai rar la hispanici şi la nativii americani şi foarte rar la asiatici. La persoanele de origine asiatică, ratele de incidenţă a CLL sunt de 3 ori mai mici decât la caucazieni (Gunawardana et al., 2008). Supravieţuirea generală la cinci ani pentru pacienţii cu CLL este de aproximativ 79% (http://www.cancer.net/cancer-types/leukemia-chronic-lymphocytic-cll/statistics).

Cancerul pulmonar este cel mai frecvent tip de cancer la nivel mondial şi principala cauză de deces prin cancer în multe ţări. Cancerul pulmonar este subîmpărţit în cancer pulmonar microcelular şi cancer pulmonar non-microcelular. NSCLC include tipurile histologice adenocarcinom, carcinom cu celule scuamoase şi carcinom cu celule mari şi reprezintă 85% din toate cancerele pulmonare din Statele Unite. Incidenţa NSCLC este strâns corelată cu prevalenţa fumatului, incluzând fumătorii actuali şi foştii fumători, iar rata de supravieţuire la cinci ani a fost raportată la 15% (World Cancer Report, 2014; Molina et al., 2008).

Terapie

Cancer de glandă mamară

Tratamentul standard pentru pacientele cu cancer de glandă mamară depinde de diferiţi parametri: stadiul tumorii, statutul receptorilor hormonali şi modelul de exprimare al HER2. Standardul de tratament include rezecţia chirurgicală completă a tumorii, urmată de radioterapie. Chimioterapia, în principal cu antracicline şi taxani, poate fi începută înainte sau după rezecţie. Pacientele cu tumori HER2-pozitive primesc anticorpul anti-HER2 trastuzumab în plus faţă de chimioterapice (S3-Leitlinie Mammakarzinom, 2012). Cancerul de glandă mamară este o entitate oncologică imunogenă, iar diferitele tipuri de celule imune infiltrate în tumorile primare prezintă o semnificaţie prognostică şi predictivă distinctă. Un număr mare de studii de imunoterapie în fază incipientă au fost efectuate la paciente cu cancer de glandă mamară. Sunt în curs de apariţie date clinice privind efectele modulării punctelor de control imunitar cu ipilimumab şi alţi anticorpi activatori ai celulelor T la pacientele cu cancer de glandă mamară (Emens, 2012).

Leucemie limfocitară cronică

Deşi LLC nu este vindecabil în prezent, mulţi pacienţi prezintă doar o evoluţie lentă a bolii sau o agravare a simptomelor. Pentru pacienţii cu boală simptomatică sau cu evoluţie rapidă, sunt disponibile mai multe opţiuni de tratament. Printre acestea se numără chimioterapia, terapia ţintită, terapiile pe bază imunitară, cum ar fi anticorpii monoclonali, receptori himerici de antigen (CAR) şi imunoterapia activă, precum şi transplanturile de celule stem.

Mai multe studii finalizate şi în curs de desfăşurare se bazează pe celule T autologe autologe modificate cu receptor chimeric de antigen (CAR) cu specificitate CD19 (Maus et al., 2014). Până în prezent, doar o minoritate de pacienţi au prezentat CAR detectabili sau persistenţi. Un răspuns parţial (PR) şi două răspunsuri complete (CR) au fost detectate în studiile cu celule CAR T efectuate de Porter et al. şi Kalos et al. (Kalos et al., 2011; Porter et al., 2011).

Imunoterapia activă include următoarele strategii: terapia genică, vaccinuri cu celule tumorale modificate integral, vaccinuri pe bază de DC şi vaccinuri peptidice derivate din antigenul asociat tumorii (TAA).

Mai multe TAA-uri sunt supraexprimate în CLL şi sunt potrivite pentru vaccinări. Printre acestea se numără fibromodulina (Mayr et al., 2005), RHAMM/CD168 (Giannopoulos et al., 2006), MDM2 (Mayretal., 2006), hTERT (Counter et al., 1995), proteina receptoare de laminină imatură a antigenului oncofetal (OFAiLRP) (Siegel et al., 2003), adipofilina (Schmidt et al., 2004), survivina (Granziero et al., 2001), KW1 până la KW14 (Krackhardt et al., 2002) şi regiunea lgVHCDR3 derivată din tumori (Harig et al., 2001; Carballido et al., 2012). Un studiu clinic de fază I a fost efectuat folosind peptida R3 derivată din RHAMM ca vaccin. 5 din 6 pacienţi au avut răspunsuri detectabile ale celulelor T CD8+ specifice R3 (Giannopoulos et al., 2010).

Cancer colorectal

În funcţie de stadiul în care se află cancerul colorectal (CRC), sunt disponibile diferite terapii standard pentru cancerul de colon şi rectal. Procedurile standard includ chirurgia, radioterapia, chimioterapia şi terapia ţintită pentru CRC (Berman et al., 2015a; Berman et al., 2015b).

Cele mai recente studii clinice analizează imunoterapia activă ca opţiune de tratament împotriva CRC. Aceste strategii includ vaccinarea cu peptide din antigeni asociaţi tumorilor (TAA-uri), celule tumorale întregi, vaccinuri cu celule dendritice (DC) şi vectori virali (Koido et al., 2013).

Până în prezent, vaccinurile peptidice au fost direcţionate împotriva antigenului carcinoembrionar (CEA), mucinei 1, EGFR-ului, antigenului carcinomului cu celule scuamoase recunoscut de celulele T 3 (SART3), beta-gonadotropinei corionice umane (beta-hCG), antigenului 1 al tumorii Wilms (WT1), Survivin-2B, MAGE3, p53, proteinei 43 de tip „deget inelar» şi translocazei membranei mitocondriale exterioare 34 (TOMM34) sau KRAS-ului mutant. În mai multe studii clinice de fază I şi II, pacienţii au prezentat răspunsuri CTL specifice antigenului sau producţie de anticorpi. În contrast cu răspunsurile imunologice, numeroşi pacienţi nu au au avut beneficii la nivel clinic în urma vaccinurilor peptidice (Koido et al., 2013; Miyagi et al., 2001; Moulton et al., 2002; Okuno et al., 2011).

Vaccinurile cu celule dendritice cuprind DC-uri pulsate fie cu peptide derivate din TAA, fie cu lizate de celule tumorale, fie cu celule tumorale apoptotice, fie cu ARN tumoral sau cu produse de fuziune de celule DC-tumorale. Deşi mulţi pacienţi din studiile de fază l/ll au prezentat răspunsuri imunologice specifice, doar o minoritate a avut un beneficiu clinic (Koido et al., 2013).

Cancer esofagian

Strategia de tratament primar pentru cancerul esofagian depinde de stadiul şi localizarea tumorii, de tipul histologic şi de starea medicală a pacientului. Regimurile chimioterapeutice includ oxaliplatină plus fluorouracil, carboplatină plus paclitaxel, cisplatină plus fluorouracil, FOLFOX şi cisplatină plus irinotecan. Pacienţii cu tumori HER2-pozitive ar trebui să fie trataţi în conformitate cu orientările pentru cancerul gastric, deoarece datele randomizate pentru terapiile ţintite în cancerul esofagian sunt foarte limitate (Stahl et al., 2013).

Datele privind abordările imunoterapeutice în cancerul esofagian sunt puţine, deoarece a fost realizat doar un număr foarte limitat de studii clinice în fază incipientă. Un vaccin alcătuit din trei peptide derivate din trei antigeni diferiţi ai cancerului testicular (protein kinaza TTK, antigenul limfatic 6 complex locus K şi proteina 3 de legare a ARNm-ului factorului de creştere asemănător insulinei (IGF)-II) a fost administrat pacienţilor cu cancer esofagian avansat într-un studiu de fază I, cu rezultate moderate. Injectarea intratumorală de celule T activate după provocarea in vitro cu celule maligne autologe a provocat răspunsuri tumorale complete sau parţiale la patru din unsprezece pacienţi într-un studiu de fază l/ll (Toomey et al., 2013).

Cancer gastric

Cancerul gastric (GC) începe în celulele care căptuşesc stratul mucozal şi se răspândeşte prin straturile exterioare pe măsură ce creşte. Sunt utilizate patru tipuri de tratament standard. Tratamentul pentru cancerul gastric poate implica rezecţie endoscopică sau chirurgicală, chimioterapie, radioterapie sau chimioradioterapie (Leitlinie Magenkarzinom, 2012).

Eficacitatea regimurilor terapeutice actuale pentru GC avansat este slabă, ceea ce duce la rate scăzute de supravieţuire la 5 ani. Imunoterapia ar putea fi o abordare alternativă pentru ameliorarea supravieţuirii pacienţilor cu GC. Transferul adoptiv de limfocite asociate tumorii şi de celule killer induse de citokine, vaccinurile pe bază de peptide care ţintesc HER2/neu, MAGE-3 sau receptorii 1 şi 2 ai factorului de creştere endotelială vasculară şi vaccinurile pe bază de celule dendritice care ţintesc HER2/neu au prezentat rezultate promiţătoare în studiile clinice de GC. Inhibarea punctului de control imunitar şi celulele T modificate ar putea reprezenta opţiuni terapeutice suplimentare, care sunt evaluate în prezent în studii preclinice şi clinice (Matsueda şi Graham, 2014).

Glioblastom

Opţiunile terapeutice pentru glioblastom (gradul IV OMS) sunt foarte limitate. Diferite abordări imunoterapeutice sunt investigate pentru tratamentul GB, inclusiv inhibarea punctului de control imunitar, vaccinarea şi transferul adoptiv de celule T modificate.

În prezent, sunt investigate diferite strategii de vaccinare pentru pacienţii cu GB, inclusiv vaccinuri pe bază de peptide, vaccinuri pe bază de proteine de şoc termic, vaccinuri autologe pe bază de celule tumorale, vaccinuri pe bază de celule dendritice şi vaccinuri pe bază de proteine virale. În aceste abordări, peptidele derivate din proteinele asociate cu GB, cum ar fi varianta III a receptorului factorului de creştere epidermică (EGFRvlll), proteinele de şoc termic sau celulele dendritice pulsate cu lizat de celule tumorale autologe sau componente ale citomegalovirusului sunt aplicate pentru a induce un răspuns imunitar antitumoral la pacienţii cu GB. Mai multe dintre aceste studii relevă profiluri bune de siguranţă şi tolerabilitate, precum şi date promiţătoare privind eficacitatea.

Transferul adoptiv de celule T modificate genetic reprezintă o abordare imunoterapeutică suplimentară pentru tratamentul GB-ului. Diferite studii clinice evaluează în prezent siguranţa şi eficacitatea celulelor T purtătoare de receptori de antigen himeric direcţionate împotriva HER2, a receptorului IL-13 alfa 2 şi a EGFRvlll (Ampie et al., 2015).

Cancer hepatic

Gestionarea bolii depinde de stadiul tumorii la momentul diagnosticului şi de starea generală a ficatului. Chimioterapia împotriva HCC-ului include combinaţii de doxorubicină, 5-fluorouracil şi cisplatină pentru terapia sistemică şi doxorubicină, floxuridină şi mitomicină C pentru perfuzii în artera hepatică. Cu toate acestea, majoritatea HCC-urilor prezintă o rezistenţă ridicată la chimioterapie (Enguita-German şi Fortes, 2014).

Opţiunile terapeutice în HCC avansat nerezecabil sunt limitate la Sorafenib, un inhibitor de multitirozin kinază (Chang et al., 2007; Wilhelm et al., 2004). Sorafenibul este singurul medicament sistemic care a confirmat creşterea supravieţuirii cu aproximativ 3 luni şi reprezintă în prezent singura opţiune de tratament experimental pentru aceşti pacienţi (Chapiro et al., 2014; Llovet et al., 2008).

În ultima vreme, au fost efectuate un număr limitat de studii de imunoterapie pentru HCC. Citokinele au fost utilizate pentru a activa subseturi de celule imune şi/sau pentru a creşte imunogenitatea tumorală (Reinisch et al., 2002; Sangro et al., 2004). Alte studii s-au axat pe infuzarea de limfocite care infiltrează tumorile sau de limfocite activate din sânge periferic (Shi et al., 2004; Takayama et al., 1991; Takayama et al., 2000).

Până în prezent, au fost efectuate un număr mic de teste de vaccinare terapeutică. Butterfield et al. au efectuat două studii folosind peptide derivate din alfa-fetoproteina (AFP) ca vaccin sau DC-uri încărcate cu peptide AFP ex vivo (Butterfield et al., 2003; Butterfield et al., 2006). În două studii diferite, celulele dendritice (DC-uri) autologe au fost pulsate ex vivo cu un lizat de tumoră autologă (Lee et al., 2005) sau cu un lizat al liniei celulare de hepatoblastom HepG2 (Palmer et al., 2009). Până în prezent, studiile de vaccinare au arătat doar îmbunătăţiri limitate în ceea ce priveşte rezultatele clinice.

Melanom

Terapia standard în melanom este rezecţia chirurgicală completă cu ţesut sănătos din jur. Opţiunile terapeutice includ monochimioterapia, polichimioterapia şi terapiile ţintite cu inhibitori specifici (S3-Leitlinie Melanom, 2013).

Mai multe abordări diferite de vaccinare au fost deja evaluate la pacienţii cu melanom avansat. Până în prezent, studiile de fază III au dat rezultate mai degrabă dezamăgitoare, iar strategiile de vaccinare trebuie în mod clar îmbunătăţite. Prin urmare, noile studii clinice, cum ar fi studiul OncoVEX GM-CSF sau studiul DERMA, au ca scop îmbunătăţirea eficacităţii clinice fără a reduce tolerabilitatea (http://www.cancerresearchuk.org).

Transferul adoptiv de celule T este foarte promiţător pentru tratamentul melanomului în stadiu avansat. Limfocitele autologe infiltrate în tumori expandate in vitro, precum şi celulele T care adăpostesc un receptor de celule T cu afinitate ridicată pentru antigenul NY-ESO-1 al cancerului testicular au avut efecte benefice semnificative şi efecte toxice reduse în urma transferului la pacienţii cu melanom. Din nefericire, celulele T cu receptori de celule T cu afinitate mare pentru antigenii specifici melanocitelor MART1 şi gp100 şi pentru antigenul cancerului testicular MAGEA3 au indus efecte toxice considerabile în studiile clinice. Astfel, transferul adoptiv de celule T are un potenţial terapeutic ridicat, dar siguranţa şi tolerabilitatea acestor tratamente trebuie să fie în continuare îmbunătăţite (Phan şi Rosenberg, 2013; Hinrichs şi Restifo, 2013).

Cancer pulmonar non-microcelular

Opţiunile de tratament sunt stabilite în funcţie de tipul de cancer (microcelular sau non-microcelular) şi stadiul cancerului, şi pot include chirurgia, radioterapia, chimioterapia şi bioterapiile biologice ţintite, cum ar fi cele cu bevacizumab, erlotinib şi gefitinib (S3-Leitlinie Lungenkarzinom, 2011).

Pentru a extinde opţiunile terapeutice pentru NSCLC, diferite abordări imunoterapeutice au fost studiate sau sunt încă în curs de investigare. În timp ce vaccinarea cu L-BLP25 sau MAGEA3 nu a reuşit să demonstreze un avantaj de supravieţuire mediat de vaccin la pacienţii cu NSCLC, un vaccin derivat din linia celulară alogenă a prezentat rezultate promiţătoare în studiile clinice. În plus, în prezent sunt în curs de desfăşurare alte studii de vaccinare care vizează gangliozidele, receptorul factorului de creştere epidermică şi alţi câţiva antigeni. O strategie alternativă pentru sporirea răspunsului celulelor T anti-tumorale ale pacientului constă în blocarea receptorilor celulelor T inhibitoare sau a liganzilor acestora cu anticorpi specifici. Potenţialul terapeutic al câtorva dintre aceşti anticorpi, inclusiv ipilimumabul, nivolumabul, pembrolizumabul, MPDL3280A şi MEDI-4736 în NSCLC este evaluat în prezent în cadrul unor studii clinice (Reinmuth et al., 2015).

Cancer ovarian

Rezecţia chirurgicală este terapia primară în cazul carcinomului ovarian atât în stadii incipiente, cât şi în stadii avansate (S3-Leitlinie maligne Ovarialtumore, 2013).

Imunoterapia pare a fi o strategie promiţătoare pentru îmbunătăţirea tratamentului pacientelor cu cancer ovarian, deoarece prezenţa limfocitelor proinflamatorii infiltrante tumorale, în special a celulelor T CD8-pozitive, se corelează cu un prognostic bun, iar celulele T specifice pentru antigenii asociaţi tumorii pot fi izolate din ţesutul canceros.

Prin urmare, se depun numeroase eforturi ştiinţifice pentru investigarea diferitelor imunoterapii în cancerul ovarian. A fost deja efectuat un număr considerabil de studii preclinice şi clinice, iar alte studii sunt în curs de desfăşurare. Sunt disponibile date clinice privind terapia cu citokine, vaccinarea, tratamentul cu anticorpi monoclonali, transferul adoptiv de celule şi imunomodularea.

Studiile de vaccinare de fază I şi II, care utilizează peptide singulare sau multiple, derivate din mai multe proteine asociate tumorilor (Her2/neu, NY-ESO-1, p53, tumoare Wilms-1) sau antigeni tumorali întregi, derivate din celule tumorale autologe, au evidenţiat profiluri bune de siguranţă şi tolerabilitate, însă numai efecte clinice slabe sau moderate.

Transferul adoptiv de celule imunitare a obţinut rezultate eterogene în studiile clinice. Transferul adoptiv de celule T autologe, extinse in vitro, care infiltrează tumorile, s-a dovedit a fi o abordare promiţătoare într-un studiu pilot. În schimb, transferul de celule T care adăpostesc un receptor de antigen himeric specific pentru receptorul alfa al folatului nu a indus un răspuns clinic semnificativ într-un studiu de fază I. S-a demonstrat că celulele dendritice pulsate cu lizat de celule tumorale sau cu proteine asociate tumorilor in vitro sporesc răspunsul antitumoral al celulelor T în urma transferului, însă gradul de activare a celulelor T nu a fost corelat cu efectele clinice. Transferul de celule natural killer a provocat toxicităţi semnificative într-un studiu de fază II.

Imunitatea antitumorală intrinsecă, precum şi imunoterapia sunt perturbate de un micromediu tumoral imunosupresiv. Pentru a depăşi acest obstacol, medicamentele imunomodulatoare, cum ar fi ciclofosfamida, anticorpii anti-CD25 şi doxorubicina lipozomală pegilată sunt testate în combinaţie cu imunoterapia. Cele mai fiabile date sunt disponibile în prezent pentru ipilimumab, un anticorp anti-CTLA4, care îmbunătăţeşte activitatea celulelor T. Ipilimumabul s-a dovedit a exercita efecte antitumorale semnificative la pacientele cu cancer ovarian (Mantia-Smaldone et al., 2012).

Cancer pancreatic

Opţiunile terapeutice pentru pacienţii cu cancer pancreatic sunt foarte limitate. O problemă majoră pentru un tratament eficient este reprezentată de obicei de stadiul avansat al tumorii în momentul diagnosticului.

Strategiile de vaccinare sunt studiate ca o alternativă inovatoare şi promiţătoare pentru tratamentul cancerului pancreatic. Vaccinurile pe bază de peptide care vizează mutaţiile KRAS, telomeraza reactivă, gastrina, survivina, CEA şi MUC1 au fost deja evaluate în studiile clinice, parţial cu rezultate promiţătoare. În plus, testele clinice pentru vaccinurile pe bază de celule dendritice, vaccinurile alogene care secretă GM-CSF şi algenpantucel-L la pacienţii cu cancer pancreatic au evidenţiat, de asemenea, efectele benefice ale imunoterapiei. În prezent, sunt în curs de desfăşurare studii clinice suplimentare care investighează în continuare eficienţa diferitelor protocoale de vaccinare (Salman et al., 2013).

Cancer de prostată

Strategia terapeutică pentru cancerul de prostată depinde în principal de stadiul cancerului. Pentru cancerul de prostată nemetastazant restrâns la nivel local, opţiunile de tratament includ supravegherea activă (wait and watch), rezecţia chirurgicală completă a prostatei şi radioterapia locală cu doze mari cu sau fără brahiterapie (S3-Leitlinie Prostatakarzinom, 2014).

Vaccinul pe bază de celule dendritice sipuleucel-T a fost primul vaccin anticancer aprobat de FDA. Datorită efectului său pozitiv asupra supravieţuirii pacienţilor cu CRPC, se depun multe eforturi pentru dezvoltarea de noi imunoterapii. În ceea ce priveşte strategiile de vaccinare, vaccinul peptidic cu antigen specific prostatic (PSA)-TRICOM, vaccinul peptidic personalizat PPV, vaccinul ADN pTVG-HP şi vaccinul cu celule întregi care exprimă GM-CSF GVAX au prezentat rezultate promiţătoare în diferite studii clinice. În plus, s-a demonstrat că alte vaccinuri pe bază de celule dendritice, altele decât sipuleucel-T, şi anume BPX-101 şi DCVAC/Pa, au provocat răspunsuri clinice la pacienţii cu cancer de prostată. Inhibitorii punctului de control imunitar, cum ar fi ipilimumabul şi nivolumabul, sunt evaluaţi în prezent în studii clinice ca monoterapie, precum şi în combinaţie cu alte tratamente, inclusiv terapia de deprivare de androgeni, radioterapia locală, PSA-TRICOM şi GVAX. Substanţa imunomodulatoare tasquinimod, care a încetinit semnificativ progresia şi a crescut supravieţuirea fără progresie într-un studiu de fază II, este în prezent investigată în continuare într-un studiu de fază III. Lenalidomida, un alt imunomodulator, a produs efecte promiţătoare în studiile clinice din faza iniţială, dar nu a reuşit să îmbunătăţească supravieţuirea într-un studiu de fază III. În ciuda acestor rezultate dezamăgitoare, sunt în curs de desfăşurare alte studii cu lenalidomidă (Quinn et al., 2015).

Carcinom cu celule renale

Tratamentul iniţial constă cel mai frecvent în extirparea parţială sau completă a rinichiului (rinichilor) afectat (afectaţii) şi rămâne pilonul principal al tratamentului curativ (Rini et al., 2008). Pentru tratamentul de primă linie al pacienţilor cu un scor de prognostic slab, un ghid elaborat de mai multe organizaţii şi societăţi de cancer recomandă inhibitorii receptorilor tirozin kinazei (TKI) sunitinib şi pazopanib, anticorpul monoclonal bevacizumab combinat cu interferon-α (IFN-α) şi inhibitorul mTOR temsirolimus. Pe baza orientărilor elaborate de NCCN din SUA, precum şi de EAU şi ESMO din Europa, TKI-urile sorafenib, pazopanib sau, mai recent, axitinib sunt recomandate ca terapie de linia a doua la pacienţii cu RCC care au eşuat în terapia anterioară cu citokine (IFN-a, IL-2). Orientările NCCN recomandă, de asemenea, sunitinib în acest context (dovezi de nivel înalt în conformitate cu NCCN de categoria I).

Imunogenitatea cunoscută a RCC a reprezentat baza de susţinere a utilizării imunoterapiei şi a vaccinurilor împotriva cancerului în RCC-ul avansat. Corelaţia interesantă dintre exprimarea PD-1 a limfocitelor şi stadiul avansat, gradul şi prognosticul RCC-ului, precum şi exprimarea selectivă a PD-L1 de către celulele tumorale ale RCC şi asocierea sa potenţială cu rezultate clinice mai proaste, au condus la dezvoltarea de noi agenţi anti-PD-1/PD-L1, singuri sau în combinaţie cu medicamente anti-angiogenice sau alte abordări imunoterapeutice, pentru tratamentul RCC-ului (Massari et al., 2015). În cazul RCC-ului avansat, un studiu de fază III privind un vaccin împotriva cancerului, denumit TRIST, evaluează dacă TroVax (un vaccin care utilizează un antigen asociat tumorii, 5T4, cu un vector de virus al variolei), adăugat la tratamentul standard de primă linie, prelungeşte supravieţuirea pacienţilor cu RCC local avansat sau mRCC. Mediana supravieţuirii nu a fost atinsă în niciunul dintre grupuri, 399 de pacienţi (54%) rămânând în studiu, însă analiza datelor confirmă rezultatele clinice anterioare, demonstrând că TroVax este activ din punct de vedere imunologic şi că există o corelaţie între intensitatea răspunsului anticorpilor specifici 5T4 şi îmbunătăţirea supravieţuirii. În plus, există mai multe studii care caută vaccinuri peptidice care utilizează epitopi supraexprimaţi în RCC.

Au fost investigate diverse abordări ale vaccinurilor tumorale. La pacienţii cu RCC au fost efectuate studii care au utilizat abordări ale tumorii întregi, inclusiv lizate de celule tumorale, fuziuni de celule dendritice cu celule tumorale sau ARN al tumorii întregi, iar în unele dintre aceste studii au fost raportate remisiuni ale leziunilor tumorale (Avigan et al., 2004; Holtl et al., 2002; Marten et al., 2002; Su et al., 2003; Wittig et al., 2001).

Cancer pulmonar microcelular

Tratamentul şi prognosticul SCLC depind în mare măsură de stadiul în care este diagnosticat cancerul. Stadializarea SCLC pe baza rezultatelor clinice este mai frecventă decât stadializarea patologică. Stadializarea clinică se bazează pe rezultatele examenului fizic, pe diferite teste imagistice şi pe biopsii. Tratamentul chimioterapic standard al SCLC utilizează combinaţia de etopozid sau irinotecan cu cisplatină sau carboplatină (American Cancer Society, 2015; S3-Leitlinie Lungenkarzinom, 2011).

Imunoterapia reprezintă un domeniu excesiv de investigat în terapia împotriva cancerului. În tratamentul SCLC sunt folosite diferite abordări. Una dintre abordări vizează blocarea CTLA-4, un supresor imunitar uman natural. Inhibarea CTLA-4 urmăreşte stimularea sistemului imunitar pentru combaterea cancerului. Recent, a început dezvoltarea unor inhibitori promiţători ai punctelor de control imunitar pentru tratamentul SCLC-ului. O altă abordare se bazează pe vaccinurile anticancerigene, care sunt disponibile în prezent pentru tratamentul SCLC-ului în cadrul studiilor clinice (American Cancer Society, 2015; National Cancer Institute, 2015).

Leucemie mieloidă acută

Tratamentul pentru LMA este împărţit în două faze: terapia de inducţie şi terapia post-remisiune/„terapia de consolidare». Terapia de inducţie este administrată pentru a induce remisiunea şi constă în chimioterapie combinativă. Terapia de consolidare constă în chimioterapie suplimentară sau transplant de celule hematopoietice (HCT) (Showel şi Levis, 2014).

Studiile clinice sunt recomandate pentru pacienţii care fac parte din grupele de prognostic nefavorabil şi intermediar-2. Opţiunile de tratament includ agenţi hipometilicanţi (HMA-uri) precum azacitidina sau decitabina, CPX-351, care este o formulă lipozomală de daunorubicină şi citarabină într-un raport molar „optim» de 1:5, şi volasertib, care este un inhibitor al polo-kinazelor. Volasertibul se administrează în asociere cu LDAC (citarabină în doze mici). În cazul mutaţiilor FLT3 pot fi administraţi mai mulţi inhibitori FLT3 diferiţi. Aceştia includ sorafenib, care se administrează în combinaţie cu 3+7, quizartinib, un inhibitor mai selectiv al FLT3 ITD care inhibă şi CKIT, crenolanib şi midostaurin, un inhibitor neselectiv al FLT3 ITD. O altă opţiune de tratament vizează CD33 cu conjugate anticorp-medicament (anti-CD33 + calechiamicină, SGN-CD33a, anti-CD33 + actiniu-225), anticorpi bispecifici (recunoaşterea CD33 + CD3 (AMG 330) sau CD33 + CD16) şi receptori de antigen himeric (CAR) (Estey, 2014).

Limfom non-Hodgkin

NHL-ul are peste 60 de subtipuri. Cele mai frecvente trei subtipuri sunt limfomul difuz cu celule B mari (DLBCL, cel mai frecvent subtip), limfomul folicular (FL, al doilea cel mai frecvent subtip) şi limfomul limfocitar mic/limfomul limfocitar cronic (SLL/CLL, al treilea cel mai frecvent subtip). DLBCL, FL şi SLL/CLL reprezintă aproximativ 85% din NHL (Li et al., 2015). Tratamentul NHL-ului depinde de tipul histologic şi de stadiul în care se află (National Cancer Institute, 2015).

Regresia spontană a tumorii poate fi observată la pacienţii cu limfom. Prin urmare, imunoterapia activă este o opţiune terapeutică (Palomba, 2012).

O opţiune importantă de vaccinare include vaccinurile Id. Limfocitele B exprimă imunoglobuline de suprafaţă cu o secvenţă specifică de aminoacizi în regiunile variabile ale lanţurilor lor grele şi uşoare, unică pentru fiecare clonă celulară (= idiotip, Id). Idiotipul funcţionează ca un antigen asociat tumorii.

Imunizarea activă include injectarea de proteină recombinantă (Id) conjugată cu un adjuvant (KLH), administrată împreună cu GM-CSF ca adjuvant imunitar. Id-ul specific tumorii este produs prin culturi de hibridomuri sau cu ajutorul tehnologiei ADN recombinant (plasmide) prin culturi de celule bacteriene, de insecte sau de mamifere.

Cancer uterin

Mai mult de 80% dintre cancerele endometriale apar sub formă de adenocarcinoame endometrioide (tip I), o formă care este asociată cu expunerea la estrogeni şi care este bine sau moderat diferenţiată. Tratamentul carcinoamelor endometriale şi al cancerelor de col uterin este dependent de stadiul în care se află (World Cancer Report, 2014).

Există, de asemenea, unele abordări imunoterapeutice care sunt în curs de testare. În cadrul unui studiu clinic de fază I/II, pacientele suferind de cancer uterin au fost vaccinate cu celule dendritice (DC) autologe electroporate cu ARNm al genei 1 a tumorii Wilms (WT1). În afară de un caz de reacţie alergică locală la adjuvant, nu au fost observate efecte secundare adverse şi 3 din 6 pacienţi au prezentat un răspuns imunologic (Coosemans et al., 2013).

Adenocarcinom de vezică biliară şi colangiocarcinom

Colangiocarcinomul (CCC) este dificil de tratat şi este, de obicei, letal. Singura opţiune de tratament curativ este rezecţia completă (R0). Eficacitatea terapiilor biologice în cancerele tractului biliar a fost mixtă. Medicamentele care vizează creşterea vaselor de sânge, cum ar fi sorafenibul, bevacizumabul, pazopanibul şi regorafenibul, sunt acum studiate pentru tratamentul CCC-ului. În plus, medicamentele care vizează EGFR-ul, cum ar fi cetuximabul şi panitumumumabul, sunt utilizate în studii clinice în combinaţie cu chimioterapia (American Cancer Society, 2015). Pentru majoritatea medicamentelor testate până în prezent, controlul bolii şi supravieţuirea generală nu au fost îmbunătăţite în mod semnificativ, dar sunt în curs de desfăşurare alte studii clinice.

Cancerul de vezică biliară (GBC) este cea mai frecventă şi agresivă tumoare malignă a tractului biliar la nivel mondial. Din cauza rarităţii carcinoamelor tractului biliar în general, există doar câteva studii specifice privind GBC-ul sau CCC-ul, iar cele mai multe dintre ele includ toate cancerele tractului biliar. Acesta este motivul pentru care tratamentul nu s-a îmbunătăţit în ultimele decenii, iar rezecţia R0 este încă singura opţiune de tratament curativ.

Cancer de vezică urinară

Tratamentul standard pentru cancerul de vezică urinară include intervenţii chirurgicale, radioterapie, chimioterapie şi imunoterapie (National Cancer Institute, 2015).

O abordare imunoterapeutică eficace este stabilită în tratamentul cancerului non-muscular invaziv agresiv al vezicii urinare (NMIBC). Astfel, se aplică o formă slăbită a bacteriei Mycobacterium bovis (bacillus Calmette-Guérin = BCG) sub formă de soluţie intravezicală. Efectul major al tratamentului cu BCG este o protecţie semnificativă pe termen lung (până la 10 ani) împotriva recidivei cancerului şi o rată de progresie redusă. În principiu, tratamentul cu BCG induce un răspuns inflamator local care stimulează răspunsul imunitar celular. Răspunsul imunitar la BCG se bazează pe următoarele etape cheie: infectarea celulelor uroteliale şi a celulelor canceroase vezicale de către BCG, urmată de o exprimare crescută a moleculelor prezentatoare de antigen, inducerea răspunsului imunitar mediat prin eliberarea de citokine, inducerea activităţii antitumorale prin implicarea diferitelor celule imunitare (limfocite T citotoxice, neutrofile, celule natural killer şi macrofage) (Fuge et al., 2015; Gandhi et al., 2013).

Având în vedere efectele secundare severe şi cheltuielile asociate cu tratamentul cancerului, este necesar să se identifice factorii care pot fi utilizaţi în tratamentul cancerului în general şi al carcinomului hepatocelular (HCC), al carcinomului colorectal (CRC), al glioblastomului (GB), al cancerului gastric (GC), al cancerului esofagian, al cancerului pulmonar non-microcelular (NSCLC), al cancerului pancreatic (PC), al carcinomului cu celule renale (RCC), al hiperplaziei benigne de prostată (BPH), al cancerului de prostată (PCA), al cancerului ovarian (OC), al melanomului, al cancerului de glandă mamară, al leucemiei limfocitare cronice (CLL), al carcinomului cu celule Merkel (MCC), al cancerului pulmonar microcelular (SCLC), al limfomului non-Hodgkin (NHL), al leucemiei mieloide acute (AML), al cancerului de vezică biliară şi colangiocarcinomului (GBC, CCC), al cancerului de vezică urinară (UBC) şi al cancerului uterin (UEC), în special. De asemenea, este necesară identificarea factorilor care reprezintă biomarkeri pentru cancer, în general, şi pentru tipurile de cancer menţionate mai sus, în special, ceea ce duce la o diagnosticare mai bună a cancerului, la evaluarea prognosticului şi la predicţia succesului tratamentului.

Imunoterapia împotriva cancerului reprezintă o opţiune care vizează în mod specific celulele canceroase, reducând în acelaşi timp la minimum efectele secundare. Imunoterapia împotriva cancerului se foloseşte de existenţa antigenilor asociaţi tumorilor. Clasificarea curentă a antigenilor asociaţi tumorii (TAA) cuprinde următoarele grupuri principale:

a) Antigeni pentru cancer testicular; Primele TAA-uri identificate vreodată care pot fi recunoscute de către celulele T aparţin acestei clase, denumite iniţial antigeni de cancer testicular (CT) deoarece exprimarea membrilor clasei se face în diferite tipuri histologice de tumori umane şi, în ţesuturile normale, are loc numai în spermatocite/spermatogoniile din testicul şi, ocazional, din placentă. Deoarece celulele testiculare nu exprimă molecule HLA de clasă I şi II, aceşti antigeni nu pot fi recunoscuţi de celulele T în ţesuturi normale şi, prin urmare, se pot considera ca fiind din punct de vedere imunologic specifici tumorii. Exemple binecunoscute de antigeni CT sunt membrii familiei MAGE şi NY-ESO-1. b) Antigeni de diferenţiere: Aceste TAA-uri sunt împărţite între tumori si ţesutul normal din care provine tumoarea. Majoritatea antigenilor de diferenţiere sunt identificaţi în melanoame şi melanocite normale. Multe dintre aceste proteine derivate din melanocite sunt implicate în biosinteza melaninei şi prin urmare nu sunt specifice tumorii, dar sunt totuşi folosite pe scală largă pentru imunoterapia împotriva cancerului. Exemplele includ, fără a se limita la, tirozinază şi melan-A/MART-1 pentru melanom sau PSA pentru cancer prostatic. c) TAA-uri supraexprimate: Genele care codifică TAA exprimate larg au fost depistate în tipuri histologice diferite de tumori precum şi în multe ţesuturi normale, în general cu niveluri reduse de exprimare. Este posibil ca mulţi dintre epitopii procesaţi şi posibil prezentaţi de ţesuturile normale să fie sub nivelul prag pentru recunoaşterea de către celulele T, în timp ce supraexprimarea lor în celulele tumorale poate declanşa un răspuns anticanceros prin încălcarea toleranţei stabilite anterior. Exemplele cunoscute pentru această clasă de TAA-uri sunt Her-2/neu, survivina, telomeraza şi WT1. d) Antigeni specifici tumorii: Aceste TAA-uri unice apar din mutaţii ale genelor normale (cum ar fi β-catenina, CDK4 etc.). Unele dintre aceste modificări moleculare sunt asociate cu transformări neoplazice şi/sau progresie. Antigenii specifici tumorii sunt în general capabili să inducă un răspuns imunitar puternic, fără a purta riscul unor reacţii autoimune împotriva ţesuturilor normale. Pe de altă parte aceste TAA-uri sunt în majoritatea cazurilor relevanţi numai tumorii exacte din care au fost identificate şi de obicei nu sunt comune mai multor tipuri individuale de tumori. Specificitatea tumorală (sau asocierea tumorală) a unei peptide poate apărea, de asemenea, dacă peptida provine dintr-un exon tumoral (asociat tumorii) în cazul proteinelor cu izoforme specifice tumorale (asociate tumorii). e) TAA care apar prin modificări anormale post-translaţie: Aceste TAA-uri apar din proteine care nu sunt nici specifice, nici supraexprimate în tumori, dar care devin totuşi asociate tumorii prin procese post-translaţionale active în principal în tumori. Exemplele pentru aceste clase apar din tipare de glicozilare alterată, care duc la epitopi noi în tumori, cum ar fi pentru MUC1 sau evenimente de tip scindare a proteinei in timpul degradării, care pot sau nu să fie specifice tumorii. f) Proteine oncovirale: Aceste TAA sunt proteine virale care pot juca un rol critic în procesul oncogen şi acestea, deoarece sunt străine (nu au origine umană) pot evoca un răspuns al celulelor T. Exemple de astfel de proteine sunt proteinele papilomavirusului uman de tip 16, E6 si E7, care sunt exprimate in carcinomul cervicall.

Imunoterapia pe bază de celule T vizează epitopi peptidici derivaţi din proteine asociate sau specifice tumorii, care sunt prezentate de moleculele complexului major de histocompatibilitate (MHC). Antigenii care sunt recunoscuţi de limfocitele T citotoxice specifice tumorii, adică epitopii acestora, pot fi molecule derivate din toate categoriile de proteine, cum sunt enzimele, receptorii, factorii de transcriere etc. care sunt exprimate şi care, comparativ cu celulele nemodificate cu aceeaşi origine, de obicei sunt reglate ascendent în celulele respectivei tumori.

Există două clase de molecule MHC, MHC de clasă I şi MHC de clasă II. Moleculele MHC de clasă I sunt compuse dintr-un lanţ alfa greu şi beta-2-microglobulină, iar moleculele MHC de clasă II dintr-un lanţ alfa şi unul beta. Conformaţia lor tridimensională prezintă un şanţ de legare care este folosit pentru interacţiuni necovalente cu peptide.

Moleculele MHC de clasă I pot fi găsite pe majoritatea celulelor nucleate. Ele prezintă peptide care rezultă din clivajul proteolitic al proteinelor predominant endogene, produse ribosomale defecte (DRIP-uri) şi peptide mai mari. Totuşi, proteinele derivate din compartimente endozomale sau surse exogene se regăsesc frecvent pe moleculele MHC de clasă I. Această modalitate non-clasică de prezentare a clasei I este cunoscută în literatură ca „prezentare încrucişată» (Brossart and Bevan, 1997; Rock et al., 1990). Moleculele MHC de clasă II se pot găsi numai pe celulele „profesioniste» prezentatoare de antigen (APC) şi prezintă iniţial peptidele unor proteine exogene sau transmembranare captate de APC-uri în timpul endocitozei şi care sunt procesate ulterior.

Complexele de peptide şi moleculele MHC de clasă I sunt recunoscute de limfocitele T citotoxice CD8-pozitive care poartă receptorul de celule T (TCR) adecvat, iar complexele peptidă - molecule MHC de clasă II sunt recunoscute de celulele T helper CD4-pozitive care poartă TCR-ul adecvat. Este bine cunoscut că TCR-ul, peptida şi MHC-ul sunt astfel prezente în raport stoechiometric 1:1:1.

Celulele T CD4-pozitive joacă un rol important în inducerea şi susţinerea răspunsurilor efective de către celulele T citotoxice CD8-pozitive. Identificarea epitopilor celulelor T CD4-pozitive derivate din antigeni asociaţi tumorilor (TAA) are o mare importanţă pentru dezvoltarea de produse farmaceutice care declanşează răspunsuri imunitare antitumorale (Gnjatic et al., 2003). La locul tumorii, celulele T helper susţin un mediu de citokine favorabile celulelor T citotoxice (CTL-favorabile) (Mortara et al., 2006) şi atrag celule efectoare, de exemplu CTL, celule natural killer (NK), macrofage şi granulocite (Hwang et al., 2007).

În absenţa inflamaţiei, exprimarea moleculelor MHC de clasă II este limitată în principal la celulele sistemului imunitar, în special la celulele „profesioniste» prezentatoare de antigen (APC) cum ar fi monocitele, celulele derivate din monocite, macrofagele sau celulele dendritice. La pacienţii cu cancer, s-a constatat că celulele tumorale exprimă molecule MHC de clasă II (Dengjel et al., 2006).

Peptidele elongate din descriere pot acţiona ca epitopi activi ai MHC-ului de clasă II.

Celulele T helper, activate de epitopi ai MHC-ului de clasă II, joacă un rol important în orchestrarea funcţiei efectoare a CTL-urilor în imunitatea antitumorală. Epitopii celulelor T care declanşează un răspuns din partea celulelor T helper de tip TH1 susţin funcţiile efectorii ale celulelor T killer CD8-pozitive, care includ funcţii citotoxice îndreptate împotriva celulelor tumorale care prezintă pe suprafaţa celulară complexe peptidă/MHC asociate tumorii. Astfel, epitopii peptidei unei celule T helper asociate tumorii, singure sau în combinaţie cu alte peptide asociate tumorii, poate servi ca ingredient farmaceutic activ al formulelor de vaccin care ar stimula răspunsul imunitar antitumoral.

S-a demonstrat pe modele animale (mamifere), de exemplu şoarece, că chiar şi în absenţa limfocitelor T CD8-pozitive, celulele T-CD4 pozitive sunt suficiente pentru inhibarea manifestărilor tumorale prin inhibarea angiogenezei prin sinteza de interferon gamma (IFNγ) (Beatty and Paterson, 2001; Mumberg et al., 1999). Există dovezi că celulele T CD4 sunt efectori antitumorali direcţi (Braumuller et al., 2013; Tran et al., 2014).

Deoarece exprimarea constitutivă a moleculelor HLA de clasă II este de obicei limitată la celulele sistemului imunitar, posibilitatea de izolare a peptidelor de clasă II direct din tumori primare nu a fost considerată anterior posibilă. Totuşi, Dengjel et al. au reuşit să identifice cu succes un număr de epitopi ai MHC-ului de clasă II direct din tumori (WO 2007/028574, EP 1 760 088 B1).

Deoarece ambele tipuri de răspuns, CD8 şi CD4 dependente, contribuie împreună şi sinergic la efectul antitumoral, identificarea şi caracterizarea antigenilor asociaţi tumorii recunoscuţi de CTL CD8+ (ligand: moleculă MHC de clasă I + epitop peptidă) sau celule T helper CD4-pozitive (ligand: moleculă MHC de clasă II + epitop peptidă) sunt importante în dezvoltarea de vaccinuri tumorale.

Pentru ca o peptidă MHC de clasă I să declanşeze (inducă) un răspuns imunitar celular, trebuie să se lege de o moleculă MHC. Acest proces depinde de alelele moleculei MHC şi de polimorfismele specifice ale secvenţei de aminoacizi ai peptidei. Peptidele care leagă MHC de clasă I au de obicei o lungime de 8-12 resturi de aminoacizi şi conţin două resturi conservate („ancore») în secvenţa acestora, care interacţionează cu şanţul de legare corespunzătoare a moleculei MHC. Astfel, fiecare alelă de MHC are un „motiv de legare» care determină ce peptide se pot lega specific de şanţul de legare.

În reacţia imunitară dependentă de MHC-ul de clasă I, peptidele nu numai că trebuie să fie capabile să se lege de anumite molecule MHC de clasă I exprimate de celulele tumorale, ci trebuie, de asemenea, să fie recunoscute ulterior de celulele T purtătoare de receptori specifici de celule T (TCR).

Pentru ca proteinele să fie recunoscute de limfocitele T ca antigeni specifici sau asociaţi tumorii şi pentru a fi utilizaţi într-o terapie, trebuie îndeplinite anumite condiţii prealabile. Antigenul ar trebuie să fie exprimat în principal de celulele tumorale şi deloc, sau în cantităţi comparabil de mici, de ţesuturile normale sănătoase. Într-o concretizare preferată, peptida trebuie să fie suprareprezentată de celulele tumorale în comparaţie cu ţesuturile normale sănătoase. De asemenea, este de dorit ca antigenul respectiv să fie prezent nu numai într-un tip de tumoare, ci şi în concentraţii ridicate (adică număr de copii ale peptidei respective per celulă). Antigenii specifici tumorii şi asociaţi tumorii sunt adesea derivate din proteine implicate direct în transformarea unei celule normale într-o celulă tumorală datorită funcţiei lor, de exemplu în controlul ciclului celular sau suprimarea apoptozei. Suplimentar, ţintele din aval pentru proteinele care cauzează direct transformarea pot fi reglate în sens crescător şi prin urmare pot fi asociate indirect tumorii. Astfel de antigeni asociaţi indirect tumorii pot fi, de asemenea, ţinte aleunei abordări de tip vaccinare (Singh-Jasuja et al., 2004). Este esenţial ca epitopi să fie prezenţi în secvenţa de aminoacizi a antigenului, pentru a se asigura că o astfel de peptidă („peptidă imunogenă»), derivată dintr-un antigen asociat unei tumori, conduce la un răspuns in vitro sau in vivo al celulelor T.

În principiu, orice peptidă capabilă să se lege la o moleculă MHC poate funcţiona ca epitop al celulei T. Cerinţa prealabilă pentru inducerea unui răspuns al celulelor T, in vivo sau in vitro, este prezenţa unei celule T care are un TCR corespunzător şi absenţa toleranţei imunologice pentru acest anumit epitop.

Prin urmare, TAA-urile reprezintă un punct de plecare pentru dezvoltarea unei terapii bazate pe celule T, inclusiv, dar fără a se limita la vaccinuri anti-tumorale. Metodele pentru identificarea şi caracterizarea TAA-urilor sunt bazate, de obicei, pe utilizarea de celule T care pot fi izolate de la pacienţi sau subiecţi sănătoşi sau sunt bazate pe generarea de profiluri diferenţiate sau tipare de exprimare diferenţiate pentru peptide între tumori şi ţesuturi normale. Totuşi, identificarea genelor supraexprimate în ţesuturi tumorale sau linii celulare tumorale umane sau exprimate selectiv în astfel de ţesuturi sau linii celulare, nu asigură informaţii precise asupra utilizării antigenilor care se transcriu din aceste gene într-un tratament imunitar. Acest lucru se datorează faptului că numai o subpopulaţie individuală de epitopi ai acestor antigeni este adecvată pentru o astfel de aplicaţie, deoarece trebuie să fie prezentă o celulă T cu un TCR corespunzător, iar toleranţa imunologică pentru acest epitop specific trebuie să fie absentă sau minimă. Într-o concretizare foarte preferată a descrierii, este, prin urmare, important să se selecteze numai acele peptide supraprezentate sau selectiv prezentate împotriva cărora se poate găsi o celulă T funcţională şi/sau o celulă T proliferantă. Astfel de celule T funcţionale sunt definite ca celule T care, la stimularea cu un antigen specific, pot fi extinse clonal şi sunt capabile să execute funcţii efectoare („celule T efectoare»).

În cazul direcţionării complexelor peptidă-MHC prin TCR-uri specifice (de exemplu, TCR-uri solubile) şi anticorpi sau alte molecule de legare (schelete) în conformitate cu descrierea, imunogenitatea peptidelor subiacente este secundară. În aceste cazuri, prezentarea este factorul determinant.

W02015/018805A1 descrie o peptidă derivată din gena MXRA5 care se leagă de HLA- A*02, dar nu descrie o peptidă care cuprinde o secvenţă de aminoacizi din SEQ ID NO: 25 care are o lungime totală de 11 până la 16 aminoacizi.

Bassani-Sternberg et al. (2015) descriu spectrometria de masă de înaltă rezoluţie pentru identificarea peptidelor care prezintă HLA asociate cu cancerul, dar nu divulgă o peptidă care cuprinde o secvenţă de aminoacizi din SEQ ID nr. 25 care are o lungime totală cuprinsă între 11 şi 16 aminoacizi.

WO02/086443A2 descrie gena MXRA5 asociată cu cancerul, dar nu descrie o peptidă care să cuprindă o secvenţă de aminoacizi din SEQ ID NO: 25 care are o lungime totală cuprinsă între 11 şi 16 aminoacizi.

REZUMATUL INVENŢIEI

Prezenta invenţie se referă la o peptidă care cuprinde o secvenţă de aminoacizi din SEQ ID NO: 25, aşa cum este definită în Revendicarea 1 anexată. Alte aspecte ale invenţiei sunt definite în revendicările anexate.

Într-un prim aspect, este descrisă o peptidă care cuprinde o secvenţă de aminoacizi selectată din grupul format din SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 288 sau o secvenţă variantă a acesteia care este cel puţin 77%, preferabil cel puţin 88%, omologă (preferabil cel puţin 77% sau cel puţin 88% identică) cu SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 288, în care varianta respectivă se leagă de MHC şi/sau induce celule T care reacţionează încrucişat cu peptida respectivă, sau o sare farmaceutică acceptabilă a acesteia, în care peptida respectivă nu este polipeptida de lungime completă care stă la baza acesteia.

În timp ce cel mai important criteriu pentru ca o peptidă să funcţioneze ca ţintă a terapiei împotriva cancerului este supraprezentarea acesteia în ţesuturile tumorale primare în comparaţie cu ţesuturile normale, profilul de exprimare a ARN-ului genei corespunzătoare poate ajuta la selectarea peptidelor adecvate. În special, unele peptide sunt greu de detectat prin spectrometrie de masă, fie din cauza proprietăţilor lor chimice, fie din cauza numărului lor scăzut de copii în celule, iar o abordare de screening axată pe detectarea prezentării peptidelor poate eşua în identificarea acestor ţinte. Cu toate acestea, aceste ţinte pot fi detectate printr-o abordare alternativă, începând cu analiza exprimării genelor în ţesuturile normale şi evaluând în al doilea rând prezentarea peptidelor şi exprimarea genelor în tumori. Această abordare a fost realizată în această descriere folosind date de ARNm dintr-o bază de date disponibilă public (Lonsdale, 2013) în combinaţie cu alte date de exprimare genică (inclusiv eşantioane tumorale), precum şi date de prezentare a peptidelor. Dacă ARNm-ul al unei gene este aproape absent în ţesuturile normale, în special în sistemele de organe vitale, direcţionarea peptidelor corespunzătoare, chiar şi prin strategii foarte puternice (cum ar fi anticorpii bispecifici cu afinitate optimizată sau receptorii de celule T), este mai probabil să fie sigură. Astfel de peptide, chiar dacă sunt identificate doar într-un procentaj mic de ţesuturi tumorale, reprezintă ţinte interesante. Analiza de rutină prin spectrometrie de masă nu este suficient de sensibilă pentru a evalua acoperirea ţintei la nivel peptidic. Mai degrabă, exprimarea ARNm-ului tumorii poate fi utilizată pentru a evalua acoperirea. Pentru detectarea peptidei în sine, ar putea fi necesară o abordare de spectrometrie de masă ţintită, cu o sensibilitate mai mare decât în cazul screeningului de rutină, ceea ce ar putea duce la o mai bună estimare a acoperirii la nivelul prezentării peptidelor.

Este descrisă, de asemenea, o peptidă care cuprinde o secvenţă selectată din grupul format din SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 288 sau o variantă a acesteia care este cel puţin 77%, preferabil cel puţin 88%, omologă (preferabil cel puţin 77% sau cel puţin 88% identică) cu SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 288, în care respectiva peptidă sau varianta acesteia are o lungime totală cuprinsă între 8 şi 100, preferabil între 8 şi 30 şi, cel mai preferabil, între 8 şi 14 aminoacizi.

Tabelele de mai jos prezintă peptida conform prezentei descrieri, respectiv SEQ ID NO şi gena sursă potenţială (de bază) pentru această peptidă. Peptida din Tabelul 1 se leagă de HLA-A*02.

Tabelul 1: Peptidă în conformitate cu prezenta invenţie

SEQ ID No. Secvenţă ID-uri gene Simboluri oficiale ale genelor 25 LLWGHPRVALA 25878 MXRA5

Deosebit de preferate sunt peptidele - singure sau în combinaţie - în conformitate cu prezenta descriere, selectate din grupul format din SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 288 şi utilizarea lor în imunoterapia carcinomului hepatocelular (HCC), a carcinomului colorectal (CRC), a glioblastomului (GB), a cancerului gastric (GC), a cancerului esofagian, a cancerului pulmonar non-microcelular (NSCLC), a cancerului pancreatic (PC), a carcinomului cu celule renale (RCC), a hiperplaziei benigne de prostată (BPH), a cancerului de prostată (PCA), a cancerului ovarian (OC), a melanomului, a cancerului de glandă mamară, a leucemiei limfocitare cronice (CLL), a carcinomului cu celule Merkel (MCC), a cancerului pulmonar microcelular (SCLC), a limfomului non-Hodgkin (NHL), a leucemiei mieloide acute (AML), a cancerului de vezică biliară şi colangiocarcinomului (GBC, CCC), a cancerului de vezică urinară (UBC) şi a cancerului uterin (UEC).

Cea mai preferată este peptida din SEQ ID NO: 25 (vezi Tabelul 1), precum şi utilizările sale în imunoterapia pentru HCC, CRC, GB, GC, cancer esofagian, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanom, cancer de glandă mamară, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC şi CLL.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la peptide, aşa cum sunt descrise în prezentul document, care au capacitatea de a se lega de o moleculă a complexului major de histocompatibilitate (MHC) uman de clasă I sau - într-o formă elongată, cum ar fi o variantă de lungime - a MHC-ului de clasă II.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la peptidele descrise în prezentul document, în care peptidele (fiecare) constau sau constau în principal dintr-o secvenţă de aminoacizi conform SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 288.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la peptidele descrise în prezentul document, în care respectiva peptidă este modificată şi/sau include legături non-peptidice.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la peptidele descrise în prezentul document, în care respectiva peptidă face parte dintr-o proteină de fuziune, în special fuzionată cu aminoacizii N-terminali ai lanţului invariant asociat cu antigenul HLA-DR (Ii) sau fuzionată cu (sau în secvenţa) unui anticorp, cum ar fi, de exemplu, un anticorp care este specific pentru celule dendritice.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la un acid nucleic care codifică peptidele descrise în prezentul document. Prezenta descriere se referă, de asemenea, la acidul nucleic conform descrierii, care este ADN, ADNc, ANP, ARN sau combinaţii ale acestora.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la un vector de exprimare capabil să exprime şi/sau să exprime un acid nucleic aşa cum este descris în prezentul document.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la o peptidă, aşa cum este descrisă în în prezentul document, la un acid nucleic, aşa cum este descris sau la un vector de exprimare, aşa cum este descris în prezentul document, pentru utilizare în tratamentul bolilor şi în medicină, în special în tratamentul cancerului.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la anticorpi care sunt specifici împotriva peptidelor descrise în prezentul document sau a complexelor dintre aceste peptide descrise în prezentul document şi MHC, precum şi la metode de obţinere a acestora.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la receptorii de celule T (TCR-uri), în special la TCR-uri solubile (sTCR-uri) şi la TCR-uri clonate, modificate în celule T autologe sau alogene, precum şi la metode de obţinere a acestora, precum şi la celulele NK sau la alte celule care poartă respectivele TCR-uri sau care reacţionează încrucişat cu respectivele TCR-uri.

Anticorpii şi TCR-urile sunt concretizări suplimentare ale utilizării imunoterapeutice a peptidelor conform prezentei descrieri.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la o celulă-gazdă care cuprinde un acid nucleic aşa cum este descris în prezentul document sau un vector de exprimare aşa cum a fost descris anterior. Prezenta descriere se referă, de asemenea, la celula-gazdă, aşa cum este descrisă în prezentul document, care este o celulă prezentatoare de antigen şi, de preferinţă, este o celulă dendritică.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la o metodă pentru producerea unei peptide, aşa cum este descrisă în prezentul document, metoda respectivă cuprinzând cultivarea celulei-gazdă, aşa cum este descris în prezentul document, şi izolarea peptidei din celula-gazdă sau din mediul de cultură al acesteia.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la metoda descrisă în prezentul document, în care antigenul este încărcat pe molecule MHC de clasă I sau II exprimate pe suprafaţa unei celule prezentatoare de antigen adecvate sau a unei celule prezentatoare de antigen artificiale prin punerea în contact a unei cantităţi suficiente de antigen cu o celulă prezentatoare de antigen.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la metoda, aşa cum este descrisă în prezentul document, în care celula prezentatoare de antigen cuprinde un vector de exprimare capabil să exprime sau care exprimă respectiva peptidă care conţine de la SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 288, de preferinţă care conţine de la SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 126, sau o variantă a secvenţei de aminoacizi.

Prezenta desciere se referă, de asemenea, la celulele T activate, produse prin metoda descrisă în prezentul document, în care aceste celule T recunosc în mod selectiv o celulă care exprimă o polipeptidă care cuprinde o secvenţă de aminoacizi, aşa cum este descrisă în prezentul document.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la o metodă de distrugere a celulelor-ţintă la un pacient, celule-ţintă care exprimă în mod aberant o polipeptidă care cuprinde orice secvenţă de aminoacizi, aşa cum este descrisă în prezentul document, metoda cuprinzând administrarea la pacient a unui număr eficient de celule T produse aşa cum este descris în prezentul document.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la utilizarea oricărei peptide descrise, a acidului nucleic descris în prezentul document, a vectorului de exprimare descris în prezentul document, a celulei descrise în prezentul document, a limfocitelor T activate, a receptorului de celule T sau a anticorpului ori a altor molecule de legare a peptidelor şi/sau a peptidelor la MHC descrise în prezentul document ca medicament sau la fabricarea unui medicament. De preferinţă, medicamentul respectiv este activ împotriva cancerului.

De preferinţă, medicamentul respectiv este adecvat şi utilizat pentru o terapie celulară, un vaccin sau o proteină bazată pe un TCR sau un anticorp solubil.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la o utilizare aşa cum este prezentată în prezentul document, în care celulele canceroase sunt HCC, CRC, GB, GC, cancer esofagian, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanom, cancer de glandă mamară, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC sau celule CLL.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la biomarkerii pe baza peptidelor descrise în prezentul document, numiţi în în prezentul document „ţinte», care pot fi utilizaţi în diagnosticarea cancerului, de preferinţă HCC, CRC, GB, GC, cancer esofagian, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanom, cancer de sân, SCLC, NHL, AML, GBC, GBC, CCC, UBC, UEC şi CLL. Markerul poate fi ori o supraprezentare a peptidei (peptidelor) în sine, ori o supraexprimare a genei (genelor) corespunzătoare. Markerii pot fi, de asemenea, utilizaţi pentru a prezice probabilitatea de succes a unui tratament, de preferinţă o imunoterapie şi, cel mai preferabil, o imunoterapie care vizează aceeaşi ţintă care este identificată de biomarker. De exemplu, un anticorp sau un TCR solubil poate fi utilizat pentru a colora secţiuni ale tumorii pentru a detecta prezenţa unei peptide de interes în complex cu MHC.

Opţional, anticorpul poartă o funcţie efectoare suplimentară, cum ar fi un domeniu de stimulare imunitar sau o toxină.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la utilizarea acestor ţinte noi în contextul tratamentului cancerului.

MXRA5 codifică una dintre proteinele asociate remodelării matricei, care conţine 7 repetări bogate în leucină şi 12 domenii de tip C2 asemănătoare imunoglobulinei în legătură cu perlecanul (RefSeq, 2002). Un studiu efectuat în China a identificat MXRA5 ca fiind a doua cea mai frecventă genă mutantă în cancerul pulmonar non-microcelular (Xiong et al., 2012). În cazul cancerului de colon, MXRA5 s-a dovedit a fi supraexprimat şi ar putea servi drept biomarker pentru diagnosticarea precoce şi metastaza omentală (Zou et al., 2002; Wang et al., 2013a).

Stimularea unui răspuns imun depinde de prezenţa unor antigeni recunoscuţi ca străini de către sistemul imunitar al gazdei. Descoperirea antigenilor asociaţi tumorilor a creat posibilitatea de a folosi sistemul imunitar al gazdei pentru a interveni asupra creşterii tumorale. În prezent, imunoterapia împotriva cancerului explorează diferite mecanisme de a valorifica atât componenta umorală cât şi pe cea celulară a sistemului imunitar.

Elemente specifice ale răspunsului imun celular sunt capabile de a recunoaşte şi distruge în mod specific celulele tumorale. Izolarea celulelor T din populaţiile de celule care infiltrează tumorile sau din sângele periferic sugerează că aceste celule joacă un rol important în apărarea imunitară naturală împotriva cancerului. Celulele T CD8-pozitive, în special, care recunosc moleculele de clasă I ale peptidelor purtătoare a complexului major de histocompatibilitate (MHC) cu, de obicei, 8 până la 10 reziduuri de aminoacizi derivate din proteine sau produse ribozomale defecte (DRIP-uri) localizate în citosol, joacă un rol important în acest răspuns. Moleculele MHC umane sunt desemnate şi ca antigeni leucocitari umani (HLA).

Termenul „răspuns celular T» se referă la proliferarea şi activarea specifică a funcţiilor efectoare induse de o peptidă in vitro sau in vivo. Pentru celule T citotoxice restricţionate la MHC de clasă I, funcţiile efectoare pot fi de liză a celulelor ţintă cu peptide pulsate, precursori de peptide pulsate sau care prezintă peptide naturale, de secreţie de citochine, preferabil interferon gamma, TNF-alfa sau IL-2 indusă de peptide, secreţie de molecule efectoare, preferabil granzime sau perforine induse de peptidă, sau degranulare.

Termenul „peptidă» este folosit în prezentul document pentru a desemna o serie de resturi de aminoacid conectate între ele de obicei prin punţi peptidice între grupările alfa-amino şi carbonil ale aminoacizilor adiacenţi. Peptidele au, de preferinţă, o lungime de 9 aminoacizi, dar pot avea o lungime de până la 8 aminoacizi şi o lungime de 10, 11, 12 sau 13 aminoacizi sau mai mare, iar în cazul peptidelor MHC de clasă II (variante alungite ale peptidelor din descriere), acestea pot avea o lungime de 14, 15, 16, 17, 18, 19 sau 20 sau mai mulţi aminoacizi.

În plus, termenul „peptidă» include sărurile unei serii de reziduuri de aminoacizi, conectate între ele în mod obişnuit prin legături peptidice între grupele alfa-amino şi carbonil ale aminoacizilor adiacenţi. De preferinţă, sărurile sunt săruri acceptabile din punct de vedere farmaceutic ale peptidelor, cum ar fi, de exemplu, sărurile de clorură sau de acetat (trifluoroacetat). Trebuie remarcat faptul că sărurile peptidelor conform prezentei descrieri diferă substanţial de peptidele în starea (stările) lor in vivo, deoarece peptidele nu sunt săruri in vivo.

Termenul „peptidă» include, de asemenea, „oligopeptidă». Termenul „oligopeptidă» este folosit în prezentul document pentru a desemna o serie de resturi aminoacid conectate între ele de obicei prin punţi peptidice între grupările alfa-amino şi carbonil ale aminoacizilor adiacenţi. Lungimea oligopeptidei nu este critică pentru descriere, atâta timp cât epitopul corect (sau epitopii corecţi) se păstrează în aceasta. Oligopeptida are de obicei o lungime mai mică de 30 de aminoacizi, dar mai mare de 15 aminoacizi.

Termenul „polipeptidă» desemnează o serie de resturi aminoacid conectate între ele de obicei prin punţi peptidice între grupările alfa-amino şi carbonil ale aminoacizilor adiacenţi. Lungimea polipeptidei nu este critică pentru descriere atâta timp cât epitopii corecţi se păstrează. Spre deosebire de termenii „peptidă» sau „oligopeptidă», termenul „polipeptidă» se referă la molecule care conţin mai mult de circa 30 de resturi de aminoacid.

O peptidă, o oligopeptidă, o proteină sau o polinucleotidă care codifică o astfel de moleculă este „imunogenă» (şi, prin urmare, este un „imunogen» în sensul prezentei descrieri), dacă este capabilă să inducă un răspuns imunitar. În cazul prezentei descrieri, imunogenitatea este definită mai specific ca fiind abilitatea de a induce un răspuns mediat de celulele T. Astfel, un „imunogen» este o moleculă capabilă să inducă un răspuns imunitar şi, în cazul prezentei descrieri, o moleculă capabilă să inducă un răspuns al celulelor T. Într-un alt aspect, imunogenul poate fi peptida, complexul peptidei cu MHC, oligopeptida şi/sau proteina care este utilizată pentru a crea anticorpi specifici sau TCR-uri împotriva acesteia.

Un „epitop» al celulei T de clasă I necesită o peptidă scurtă care se leagă de receptorul MHC de clasă I formând un complex ternar (lanţ alfa MCH de clasă I, beta-2-microglobulină şi peptidă) care poate fi recunoscut de o celulă T care poartă un receptor de celulă T corespunzător care se leagă de complexul MHC/peptidă cu afinitatea adecvată. Peptidele care se leagă de molecule MHC de clasă I au de obicei o lungime de 8-14 aminoacizi, cel mai frecvent având lungimea de 9 aminoacizi.

La oameni există trei loci genetici diferiţi care codifică moleculele MHC de clasă I (moleculele MHC ale omului sunt şi antigeni leucocitari umani desemnaţi (HLA)): HLA-A, HLA-B, and HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02 şi HLA-B*07 sunt exemple de diferite alele MHC de clasă I care pot fi exprimate pe baza acestor loci.

Tabelul 2: Frecvenţele F de exprimare pentru HLA-A*02 şi HLA-A*24 şi cele mai frecvente serotipuri HLA-DR. Frecvenţele sunt deduse din frecvenţele haplotipurilor Gf din populaţia americană adaptate din Mori et al. (Mori et al., 1997) care implică formula Hardy-Weinberg: F=1-(1-Gf)².2. Combinaţiile de A*02 sau A*24cu anumite alele HLA-DR pot fi îmbogăţite sau mai puţin frecvente decât s-a estimat pe baza frecvenţelor singulare datorită unor dezechilibre de legare. Pentru detalii, vezi Chanock et al. (Chanock et al., 2004).

Alelă Populaţie Fenotip calculat din frecvenţa alelei A*02 Caucazieni (America de Nord) 49,1% A*02 Afro-americani (America de Nord) 34,1% A*02 Asiatic-americani (America de Nord) 43,2% A*02 Latino-americani (America de Nord) 48,3% DR1 Caucazieni (America de Nord) 19,4% DR2 Caucazieni (America de Nord) 28,2% DR3 Caucazieni (America de Nord) 20,6% DR4 Caucazieni (America de Nord) 30,7% DR5 Caucazieni (America de Nord) 23,3% DR6 Caucazieni (America de Nord) 26,7% DR7 Caucazieni (America de Nord) 24,8% DR8 Caucazieni (America de Nord) 5,7% DR9 Caucazieni (America de Nord) 2,1% DR1 Africani (nord) americani 13,20% DR2 Africani (nord) americani 29,80% DR3 Africani (nord) americani 24,80% DR4 Africani (nord) americani 11,10% DR5 Africani (nord) americani 31,10% DR6 Africani (nord) americani 33,70% DR7 Africani (nord) americani 19,20% DR8 Africani (nord) americani 12,10% DR9 Africani (nord) americani 5,80% DR1 Asiatici (nord) americani 6,80% DR2 Asiatici (nord) americani 33,80% DR3 Asiatici (nord) americani 9,20% DR4 Asiatici (nord) americani 28,60% DR5 Asiatici (nord) americani 30,00% DR6 Asiatici (nord) americani 25,10% DR7 Asiatici (nord) americani 13,40% DR8 Asiatici (nord) americani 12,70% DR9 Asiatici (nord) americani 18,60% DR1 Hispanici (nord) americani 15,30% DR2 Hispanici (nord) americani 21,20% DR3 Hispanici (nord) americani 15,20% DR4 Hispanici (nord) americani 36,80% DR5 Hispanici (nord) americani 20,00% DR6 Hispanici (nord) americani 31,10% DR7 Hispanici (nord) americani 20,20% DR8 Hispanici (nord) americani 18,60% DR9 Hispanici (nord) americani 2,10% A*24 Filipine 65% A*24 Rusia, Neneţ 61% A*24:02 Japonia 59% A*24 Malaysia 58% A*24:02 Filipine 54% A*24 India 47% A*24 Coreea de Sud 40% A*24 Sri Lanka 37% A*24 China 32% A*24:02 India 29% A*24 Australia de Vest 22% A*24 SUA 22% A*24 Rusia, Samara 20% A*24 America de Sud 20% A*24 Europa 18%

Peptidele din prezenta descriere, de preferinţă atunci când sunt incluse într-un vaccin din prezenta descriere, aşa cum este descris aici, se leagă de A*02. Un vaccin poate include, de asemenea, peptide MHC de clasă II care se leagă la nivel de pan-legătură. Prin urmare, vaccinul din descriere poate fi utilizat pentru a trata cancerul la pacienţi care sunt A*02-pozitivi, în timp ce nu este necesară nicio selecţie pentru alotipurile MHC de clasă II datorită naturii pan-legătoare a acestor peptide.

Dacă peptidele A*02 din descriere sunt combinate cu peptide care se leagă la o altă alelă, de exemplu A*24, un procentaj mai mare din orice populaţie de pacienţi poate fi tratat în comparaţie cu adresarea unei singure alele MHC clasa I. În timp ce în cele mai multe populaţii, mai puţin de 50% dintre pacienţi ar putea fi trataţi numai cu oricare dintre alele, un vaccin care cuprinde epitopi HLA-A*24 şi HLA-A*02 poate trata cel puţin 60% dintre pacienţii din orice populaţie relevantă. În mod specific, următoarele procentaje de pacienţi vor fi pozitive pentru cel puţin una dintre aceste alele în diferite regiuni: SUA 61%, Europa de Vest 62%, China 75%, Coreea de Sud 77%, Japonia 86% (calculate de la www.allelefrequencies.net).

Într-o concretizare preferată, termenul „secvenţă nucleotidică» se referă la un heteropolimer al dezoxiribonucleotidelor.

Secvenţa de nucleotidă care codifică o anumită peptidă, oligopeptidă sau polipeptidă poate fi întâlnită în mod natural sau poate fi construită artificial. În general, segmentele de ADN care codifică peptidele, polipeptidele şi proteinele din descriere sunt asamblate din fragmente de ADNc şi legături oligonucleotidice scurte sau dintr-o serie de oligonucleotide, pentru a obţine o genă sintetică care poate fi exprimată într-o unitate transcripţională recombinantă care cuprinde elemente de reglare derivate dintr-un operon microbian sau viral.

În sensul prezentului document, termenul „o nucleotidă care codifică o peptidă» se referă la o secvenţă de nucleotide care codifică peptida şi care include codonii artificiali de start şi stop compatibili cu sistemul biologic prin care secvenţa urmează să fie exprimată, de exemplu, o celulă dendritică sau un alt sistem celular util pentru producerea de TCR-uri.

În sensul prezentului document, referirea la o secvenţă de acid nucleic include atât acidul nucleic monocatenar, cât şi cel bicatenar. Astfel, de exemplu pentru ADN, secvenţa specifică, cu excepţia cazului în care contextul indică altfel, se referă la ADN-ul monocatenar al unei astfel de secvenţe, la duplexul unei astfel de secvenţe cu complementul său (ADN bicatenar) şi la complementul unei astfel de secvenţe.

Termenul „regiune de codare» se referă la acea porţiune a genei care codifică, fie în mod natural, fie în mod normal, produsul de exprimare al acelei gene în mediul său genomic natural, adică regiunea care codifică in vivo produsul de exprimare nativ al genei respective.

Regiunea codificatoare poate fi derivată dintr-o genă nemutantă („normală»), mutantă sau modificată, sau poate fi chiar derivată dintr-o secvenţă de ADN sau dintr-o genă sintetizată în întregime în laborator, folosind metode bine cunoscute de către specialiştii din domeniul sintezei de ADN.

Termenul „produs de exprimare» desemnează polipeptida sau proteina care este produsul natural de translaţie al genei şi orice echivalent de codificare a secvenţei de acid nucleic care rezultă din degenerarea codului genetic şi care codifică astfel acelaşi (aceiaşi) aminoacid (aminoacizi).

Termenul „fragment», când este vorba despre o secvenţă de codificare, se referă la o porţiune de ADN care conţine mai puţin decât regiunea completă de codificare, al cărei produs complet de exprimare reţine în principal aceeaşi funcţie sau activitate biologică ca şi produsul de exprimare al întregii regiuni de codificare.

Termenul „segment ADN» se referă la un polimer ADN sub forma unui fragment separat sau ca o componentă a unei structuri ADN mai mari, care a fost obţinută din ADN izolat cel puţin o dată în formă substanţială pură, adică fără contaminanţi endogeni şi în cantităţi sau concentraţii care permit identificarea, manevrarea şi recuperarea segmentului şi a secvenţelor nucleotidice componente prin metode biochimice standard, de exemplu prin utilizarea unui vector de clonare. Aceste segmente sunt furnizate sub forma unui cadru deschis de citire, neîntrerupt de secvenţe interne netraduse (sau introni) care sunt de obicei prezente în genele eucariote. Secvenţele de ADN netradus pot fi prezente în aval de cadrul de citire deschis, unde acestea nu interferă cu manipularea sau exprimarea regiunilor de codificare.

Termenul „amorsă» se referă la o secvenţă de acid nucleic scurtă care se poate împerechea cu o monocatenă ADN şi care asigură un capăt 3'-OH liber la nivelul căruia ADN polimeraza începe sinteza unui lanţ dezoxiribonucleic.

Termenul „promotor» se referă la o regiune ADN implicată în legarea ARN-polimerazei pentru a iniţia transcripţia.

Termenul „izolat» se referă la faptul că materialul este îndepărtat din mediul său original (de exemplu, mediul natural, dacă apare în mod natural). De exemplu, o polinucleotidă sau polipeptidă care apare natural într-un animal viu nu este izolată; dar aceeaşi polinucleotidă sau polipeptidă separată de una sau toate materialele coexistente din sistemul natural reprezintă un izolat. Aceste polinucleotide pot face parte dintr-un vector şi/sau aceste polinucleotide sau polipeptide pot face parte dintr-un compus, dar rămânând izolate deoarece vectorul sau compusul nu face parte din mediul natural.

Polinucleotidele şi polipeptidele recombinate sau imunogene descrise în conformitate cu prezenta invenţie, pot să fie în formă „purificată». Termenul „purificat» nu se referă la puritate absolută; mai degrabă este intenţionat ca definiţie relativă, şi poate include produse care sunt înalt purificate sau produse care sunt numai parţial purificate, deoarece aceşti termeni sunt înţeleşi de cei instruiţi în domeniul relevant. Pentru exemplificare, clonele individuale izolate dintr-o bibliotecă de ADNc au fost purificate în mod convenţional până la omogenitate electroforetică. Purificarea materialelor de început sau naturale până la cel puţin un ordin de mărime, preferabil la două sau trei ordine de mărime, şi ideal la patru sau cinci ordine de mărime este de dorit în special. Mai mult, se include în mod explicit o polipeptidă revendicată care are o puritate de preferinţă de 99,999%, sau de cel puţin 99,99% sau de 99,9%; şi chiar, de dorit, de 99% masic sau mai mult.

Acizii nucleici şi produsele de exprimare polipeptidică descrise în conformitate cu prezenta invenţie, precum şi vectorii de exprimare care conţin astfel de acizi nucleici şi/sau astfel de polipeptide, pot fi în „formă îmbogăţită». În sensul prezentului document, termenul „îmbogăţit» înseamnă că concentraţia materialului este de cel puţin aproximativ 2, 5, 10, 100 sau 1000 de ori mai mare decât concentraţia sa naturală (de exemplu), în mod avantajos de 0,01% masic, de preferinţă de cel puţin 0,1% masic. Produsele îmbogăţite cu 0,5%, 1%, 5%, 10% şi 20% masic sunt de asemenea de interes. Secvenţele, compuşii, vectorii, clonele şi celelalte materiale care sunt cuprinse în prezenta descriere pot fi, în funcţie de interes, în formă îmbogăţită sau izolată. Termenul „fragment activ» înseamnă un fragment, de obicei o peptidă, o polipeptidă sau o secvenţă de acid nucleic, care generează un răspuns imunitar (adică are activitate imunogenă) atunci când este administrat, singur sau, opţional, cu un adjuvant adecvat sau într-un vector, unui animal, cum ar fi un mamifer, de exemplu, un iepure sau un şoarece, şi, de asemenea, inclusiv un om, un astfel de răspuns imunitar luând forma stimulării unui răspuns al celulelor T în cadrul animalului receptor, cum ar fi un om. Alternativ, „fragmentul activ» poate fi, de asemenea, utilizat pentru a induce un răspuns al celulelor T in vitro.

Aşa cum sunt utilizaţi în prezentul document, termenii „porţiune», „segment» şi „fragment», atunci când sunt utilizaţi în legătură cu polipeptidele, se referă la o secvenţă continuă de reziduuri, cum ar fi reziduuri de aminoacizi, secvenţă care formează un subset al unei secvenţe mai mari. De exemplu, dacă o polipeptidă este supusă unui tratament cu oricare dintre endopeptidazele uzuale, cum ar fi tripsina sau chimotripsina, oligopeptidele care rezultă din acest tratament reprezintă porţiuni, segmente sau fragmente ale polipeptidei iniţiale. Atunci când sunt utilizaţi în legătură cu polinucleotidele, aceşti termeni se referă la produsele obţinute prin tratarea polinucleotidelor respective cu oricare dintre endonucleaze.

În conformitate cu prezenta descriere, termenul „identitate procentuală» sau „procentual identic», atunci când se referă la o secvenţă, înseamnă că o secvenţă este comparată cu o secvenţă revendicată sau descrisă după alinierea secvenţei care urmează a fi comparată („secvenţa comparată») cu secvenţa descrisă sau revendicată („secvenţa de referinţă»). Identitatea procentuală se determină conform următoarei formule: identitate procentuală = 100 [1 -(C/R)], unde C este numărul de diferenţe dintre secvenţa de referinţă şi secvenţa comparată pe lungimea aliniamentului dintre secvenţa de referinţă şi cea comparată, în care

(i) fiecare bază sau aminoacid din secvenţa de referinţă care nu are un corespondent aliniat, bază sau aminoacid, în secvenţa comparată, şi (ii) fiecare lipsă din secvenţa de referinţă, şi (iii) fiecare bază sau aminoacid aliniat(ă) din secvenţa de referinţă care diferă de baza sau aminoacidul aliniat din secvenţa comparată, reprezintă o diferenţeă şi (iii) alinierea trebuie să înceapă în poziţia 1 a secvenţelor aliniate;

şi R este numărul de baze sau aminoacizi din secvenţa de referinţă pe lungimea alinierii cu secvenţa comparată, orice lipsă apărută în secvenţa de referinţă fiind de asemenea numărată ca bază sau aminoacid.

Dacă există o aliniere între secvenţa comparată şi secvenţa de referinţă pentru care identitatea procentuală calculată mai sus este aproximativ egală sau mai mare decât identitatea procentuală minimă specificată, atunci secvenţa comparată are identitatea procentuală minimă specificată faţă de secvenţa de referinţă, chiar dacă pot exista alinieri în care identitatea procentuală calculată mai sus este mai mică decât identitatea procentuală specificată.

După cum s-a menţionat mai sus, prezenta descrieere furnizează astfel o peptidă care cuprinde o secvenţă care este selectată din grupul format din SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 288 sau o variantă a acestuia care este omologă în proporţie de 88% cu SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 288, sau o variantă a acestuia, care va induce celule T care reacţionează încrucişat cu peptida respectivă. Peptidele din descriere au capacitatea de a se lega de o moleculă a complexului major de histocompatibilitate (MHC) uman de clasă I sau de versiuni alungite ale acestor peptide la clasa II.

În prezenta descriere, termenul „omolog» se referă la gradul de identitate (a se vedea identitatea procentuală de mai sus) dintre secvenţele a două secvenţe de aminoacizi, adică secvenţe peptidice sau polipeptidice. „Omologia» menţionată mai sus se determină prin compararea a două secvenţe aliniate în condiţii optime faţă de secvenţele care urmează a fi comparate. O astfel de omologie de secvenţă poate fi calculată prin crearea unei alinieri folosind, de exemplu, algoritmul ClustalW. Programele software de analiză a secvenţelor disponibile în mod obişnuit, mai exact Vector NTI, GENETYX sau alte instrumente sunt furnizate de baze de date publice.

O persoană specializată în domeniu va putea evalua dacă celulele T induse de o variantă a unei peptide specifice vor fi capabile să reacţioneze încrucişat cu peptida în sine (Appay et al., 2006; Colombetti et al., 2006; Fong et al., 2001; Zaremba et al., 1997).

Prin „variantă» a secvenţei de aminoacizi date, inventatorii înţeleg că lanţurile laterale, de exemplu, ale unuia sau a două dintre reziduurile de aminoacizi sunt modificate (de exemplu, prin înlocuirea lor cu lanţul lateral al unui alt reziduu de aminoacid natural sau cu un alt lanţ lateral), astfel încât peptida să fie în continuare capabilă să se lege de o moleculă HLA în mod substanţial în acelaşi mod ca o peptidă compusă din secvenţa de aminoacizi dată, constând în SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 288. De exemplu, o peptidă poate fi modificată astfel încât să menţină cel puţin, dacă nu să îmbunătăţească, capacitatea de a interacţiona cu şi de a se lega la şanţul de legare al unei molecule MHC adecvate, cum ar fi HLA-A*02 sau -DR şi, în acest fel, să menţină cel puţin, dacă nu să îmbunătăţească, capacitatea de a se lega la TCR-ul celulelor T activate.

Aceste celule T pot ulterior să reacţioneze încrucişat cu celulele şi să distrugă celulele care exprimă o polipeptidă care conţine secvenţa naturală de aminoacizi a peptidei cognate, aşa cum este definită în aspectele descrierii. După cum reiese din literatura ştiinţifică şi din bazele de date, anumite poziţii ale peptidelor de legare HLA sunt, de obicei, reziduuri de ancorare care formează o secvenţă centrală care se potriveşte motivului de legare al receptorului HLA, care este definit de proprietăţile polare, electrofizice, hidrofobe şi spaţiale ale lanţurilor polipeptidice care constituie şanţul de legare. Astfel, un specialist în domeniu ar putea modifica secvenţele de aminoacizi prezentate în SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO 288 prin menţinerea reziduurilor de ancorare cunoscute, şi ar putea determina dacă aceste variante păstrează capacitatea de a se lega de moleculele MHC de clasă I sau II. Variantele prezentei descrieri îşi păstrează abilitatea de a lega TCR-urile celulelor T activate, care pot reacţiona încrucişat cu celulele şi pot ucide celulele care exprimă polipeptida care conţine secvenţa naturală de aminoacid a peptidei cognate definite în aspectele descrierii.

Peptidele originale (nemodificate), astfel cum sunt descrise în prezentul document, pot fi modificate prin înlocuirea uneia sau mai multor reziduuri în diferite locuri, eventual selective, din lanţul peptidic, dacă nu se specifică altfel. De preferinţă, aceste substituţii sunt situate la capătul lanţului de aminoacizi. O astfel de substituţie poate fi conservatoare, de exemplu, dacă un aminoacid este substituit cu un alt aminoacid cu structură şi caracteristici similare, astfel încât de exemplu un aminoacid hidrofob să fie înlocuit cu un alt aminoacid hidrofob. Chiar mai conservativă ar fi înlocuirea aminoacizilor de aceeaşi mărime sau similară şi de natură chimică, cum ar fi înlocuirea leucinei cu izoleucina. În studiile privind variaţiile de secvenţă în familiile de proteine omologe care apar în mod natural, anumite substituţii de aminoacizi sunt mai des tolerate decât altele, iar acestea prezintă adesea o corelaţie cu similitudinile de mărime, sarcină, polaritate şi hidrofobicitate dintre aminoacidul original şi cel de înlocuire, ceea ce constituie baza pentru definirea „substituţiilor conservative».

Substituţiile conservatoare sunt în prezentul document definite ca schimburi în cadrul unuia dintre următoarele cinci grupuri: Grupul 1 - resturi mici, alifatice, nepolare sau uşor polare (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); Grupul 2 - resturi polare, încărcate negativ şi amidele lor (Asp, Asn, Glu, Gln); Grupul 3 - resturi polare, încărcate pozitiv (His, Arg, Lys); Grupul 4 - resturi mari, alifatice, nepolare (Met, Leu, Ile, Val, Cys); şi Grupul 5 - resturi mari, aromatice (Phe, Tyr, Trp).

Substituţiile mai puţin conservatoare pot implica schimbarea unui aminoacid cu un altul cu caracteristici similare dar oarecum diferit ca dimensiuni, cum ar fi, de exemplu, substituirea alaninei cu un rest de izoleucină. Substituţiile înalt neconservative pot implica substituirea unui aminoacid acid cu unul care este polar sau chiar bazic. Astfel de substituţii „radicale» nu pot fi apreciate, totuşi, ca potenţial ineficiente deoarece efectele chimice nu sunt complet previzibile; astfel de substituţii radicale pot provoca efecte caracterizate de serendipitate, fiind impredictibile pe baza principiilor chimice elementare.

Desigur, aceste substituţii pot implica structuri diferite de L-aminoacizii uzuali. Astfel, D-aminoacizii se pot substitui cu L-aminoacizii identificaţi uzual în peptidele antigenice ale descrierii fiind în continuare incluşi în prezentul document. În plus, aminoacizii nestandard (şi anume, alţii decât aminoacizii proteinogeni naturali obişnuiţi) pot fi, de asemenea, utilizaţi în scopul substituirii pentru a produce imunogeni şi polipeptide imunogene în conformitate cu prezenta descriere.

Dacă substituţiile din mai mult de o poziţie se descoperă că pot conduce la o peptidă cu activitate antigenică substanţial echivalentă sau mai mare decât cea descrisă mai jos, atunci aceste substituţii se vor testa pentru a identifica dacă substituţiile combinate provoacă efecte cumulative sau sinergice ale antigenicităţii peptidei. Cel mult, nu mai mult de patru poziţii din cadrul peptidei pot fi substituite simultan.

O peptidă care constă în esenţă din secvenţa de aminoacizi indicată în prezentul document poate avea unul sau doi aminoacizi care nu sunt de ancorare (a se vedea mai jos în ceea ce priveşte motivul de ancorare) schimbaţi fără ca abilitatea de a se lega de o moleculă a complexului major de histocompatibilitate uman (MHC) de clasă I sau II să fie modificată în mod substanţial sau să fie afectată în mod negativ, în comparaţie cu peptida nemodificată. Într-o altă concretizare, într-o peptidă care constă în esenţă din secvenţa de aminoacizi indicată aici, unul sau doi aminoacizi pot fi schimbaţi cu partenerii lor de schimb conservativ (a se vedea mai jos) fără ca abilitatea de a se lega de o moleculă a complexului major de histocompatibilitate (MHC) uman de clasă I sau II să fie modificată în mod substanţial sau să fie afectată în mod negativ, în comparaţie cu peptida nemodificată.

Reziduurile de aminoacizi care nu contribuie în mod substanţial la interacţiunile cu receptorul de celule T pot fi modificate prin înlocuire cu alţi aminoacizi a căror încorporare nu afectează în mod substanţial reactivitatea celulelor T şi nu elimină legătura cu MHC-ul relevant. Astfel, în afară de condiţia menţionată, peptida din prezenta descriere poate fi orice peptidă (termen prin care inventatorii includ oligopeptida sau polipeptida), care include secvenţele de aminoacizi sau o porţiune sau variantă a acestora, aşa cum sunt prezentate.

Pot fi, de asemenea, adecvate peptide mai lungi (elongate). Este posibil ca epitopii MHC de clasă I, deşi au de obicei o lungime cuprinsă între 8 şi 11 aminoacizi, să fie generaţi prin procesarea peptidelor din peptide sau proteine mai lungi care includ epitopul real. Este preferabil ca resturile care flanchează epitopul efectiv să fie resturi care să nu influenţeze substanţial clivajul proteolitic necesar pentru expunerea epitopului efectiv în timpul procesării.

Peptidele din descriere pot fi alungite cu până la patru aminoacizi, adică 1, 2, 3 sau 4 aminoacizi pot fi adăugaţi la ambele capete în orice combinaţie între 4:0 şi 0:4. Combinaţiile de elongaţii descrise în prezentul document pot fi găsite în Tabelul 3.

Tabelul 3: Combinaţii de elongaţii ale peptidelor din descriere

C-terminal N-terminal 4 0 3 0 sau 1 2 0 sau 1 sau 2 1 0 sau 1 sau 2 sau 3 0 0 sau 1 sau 2 sau 3 sau 4 N-terminal C-terminal 4 0 3 0 sau 1 2 0 sau 1 sau 2 1 0 sau 1 sau 2 sau 3 0 0 sau 1 sau 2 sau 3 sau 4

Aminoacizii pentru alungire/extindere pot fi peptidele din secvenţa originală a proteinei sau orice alt aminoacid (alţi aminoacizi). Alungirea poate fi utilizată pentru a spori stabilitatea sau solubilitatea peptidelor.

Astfel, epitopi ai prezentei descrieri pot fi identici cu epitopi naturali asociaţi tumorilor sau specifici tumorilor sau pot include epitopi care nu diferă cu mai mult de patru reziduuri de peptida de referinţă, atât timp cât au o activitate antigenică substanţial identică.

Într-o altă concretizare, peptida este alungită pe una sau pe ambele părţi cu mai mult de 4 aminoacizi, de preferinţă până la o lungime totală de până la 30 de aminoacizi. Acest lucru poate duce la peptide de legare la MHC-ul de clasă II. Legarea la MHC-ul de clasă II poate fi testată prin metode cunoscute în domeniu.

În consecinţă, prezenta descriere furnizează peptide şi variante ale epitopilor MHC de clasă I, în care peptida sau varianta are o lungime totală cuprinsă între 8 şi 100 de aminoacizi, preferabil între 8 şi 30 de aminoacizi, şi cel mai preferabil între 8 şi 14 aminoacizi, şi anume 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 aminoacizi; în cazul peptidelor alungite de legare de clasă II, lungimea poate fi şi de 15, 16, 17, 18, 19, 19, 20, 21 sau 22 de aminoacizi.

Bineînţeles, peptida sau varianta conform prezentei descrieri va avea capacitatea de a se lega de o moleculă din complexul major de histocompatibilitate (MHC) uman clasă I sau II. Legarea unei peptide sau a unei variante la un complex MHC poate fi testată prin metode cunoscute în domeniu.

De preferinţă, atunci când celulele T specifice pentru o peptidă conform prezentei descrieri sunt testate împotriva peptidelor substituite, concentraţia de peptidă la care peptidele substituite obţin jumătate din creşterea maximă a lizei în raport cu fondul nu este mai mare de aproximativ 1 mM, preferabil nu mai mare de aproximativ 1 µM, mai preferabil nu mai mare de aproximativ 1 nM, şi încă şi mai preferabil nu mai mare de aproximativ 100 pM şi cel mai preferabil nu mai mare de aproximativ 10 pM. Este, de asemenea, de preferat ca peptida substituită să fie recunoscută de celule T provenind de la mai mulţi indivizi, cel puţin doi şi, preferabil, trei indivizi.

Într-o concretizare deosebit de preferată a descrierii, peptida constă sau constă în esenţă dintr-o secvenţă de aminoacizi conform SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 288.

„Care constă în esenţă din» înseamnă că o peptidă conform prezentei descrieri, în plus faţă de secvenţa conformă cu oricare dintre secvenţele SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 288 sau o variantă a acesteia, conţine segmente suplimentare de aminoacizi localizaţi N- şi/sau C-terminal care nu fac neapărat parte din peptida care funcţionează ca epitop pentru epitopul moleculelor MHC.

Totuşi, aceste resturi pot fi importante pentru a furniza o introducere adecvată a peptidei care face obiectul prezentei descrieri în interiorul celulelor. Într-o concretizare a prezentei descrieri, peptida face parte dintr-o proteină de fuziune care cuprinde, de exemplu, cei 80 de aminoacizi N-terminali ai lanţului invariant asociat cu antigenul HLA-DR (p33, în continuare „Ii»), aşa cum rezultă din NCBI, numărul de acces GenBank X00497. În alte fuziuni, peptida din prezenta descriere poate fi fuzionată cu un anticorp, astfel cum este descris în prezenta descriere, sau cu o parte funcţională a acestuia, în special într-o secvenţă a unui anticorp, astfel încât să fie ţintită în mod specific de respectivul anticorp sau, de exemplu, cu sau într-un anticorp care este specific pentru celulele dendritice, astfel cum este descris în prezentul document.

În plus, peptida sau varianta pot fi ulterior modificate pentru a îmbunătăţi stabilitatea şi/sau legarea de molecule MHC pentru a exercita un răspuns imun mai puternic. Metodele pentru această optimizare a secvenţei de peptidă este cunoscută în domeniu şi poate include, de exemplu, introducerea unor legături peptidice inversate sau a unor legături non-peptidice.

Într-o legătură peptidică inversă, reziduurile de aminoacizi nu sunt unite prin legături peptidice (-CO-NH-), ci legătura peptidică este inversată. Astfel de peptidomimetice retro-inversate pot fi realizate folosindu-se metode cunoscute în domeniu, de exemplu, cum ar fi cele descrise în Meziere et al (1997) (Meziere et al., 1997). Această abordare implică sinteza de pseudopeptide care conţin modificări care implică scheletul şi nu orientarea lanţurilor secundare. Meziere et al. (Meziere et al., 1997) demonstrează că aceste pseudopeptide sunt utile pentru legarea MHC şi răspunsurile celulelor T helper. Peptidele retro-inversate, care conţin legături NH-CO şi nu legături peptidice CO-NH, sunt mult mai rezistente la proteoliză.

O legătură non-peptidică este, de exemplu, -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, - CH(OH)CH2- sau -CH2SO-. US 4,897,445 furnizează o metodă pentru sinteza în fază solidă a unor legături non-peptidice (-CH2-NH) în lanţuri de polipeptide care implică polipeptide sintetizate de procedurile standard şi legături non-peptidice sintetizate prin reacţia dintre o amino-aldehidă şi un aminoacid în prezenţa NaCNBH3.

Peptidele care conţin secvenţele descrise mai sus pot fi sintetizate cu ajutorul unor grupări chimice suplimentare prezente la capetele amino- sau carboxi-terminale, pentru a îmbunătăţi stabilitatea, biodisponibilitatea şi/sau afinitatea peptidelor. De exemplu, grupările hidrofobe, cum ar fi carbo-benzoxil, dansil sau T-butil-oxi-carbonil pot fi adăugate capătului peptidic amino-terminal. Similar, o grupare acetil sau o grupare 9-fluorenil-metoxi-carbonil se poate plasa la capătul amino-terminal al peptidei. În plus, grupările hidrofobe, cum ar T-butil-oxi-carbonil, sau o grupare amido- pot fi adăugate capătului peptidic amino-terminal.

Mai mult, peptidele din descriere pot fi sintetizate pentru a li se modifica configuraţia sterică. De exemplu, se poate folosi izomerul D al unuia sau mai multor resturi de aminoacid peptidic în locul izomerului L uzual. Ba chiar mai mult, cel puţin unul dintre resturile de aminoacid al peptidei din descriere poate fi substituit cu unul dintre resturile de aminoacid cunoscute, care nu apar în mod natural. Astfel de modificări pot servi la creşterea stabilităţii, biodisponibilităţii şi/sau a acţiunii de legare ale peptidelor din descriere.

Similar, o peptidă sau o variantă din descriere se poate modifica din punct de vedere chimic prin reacţii cu diverşi aminoacizi înainte sau după sinteza peptidei. Exemple de astfel de modificări sunt bine cunoscute în domeniu şi sunt rezumate, de exemplu, în R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2004 (Lundblad, 2004). Modificarea chimică a aminoacizilor include, fără a se limita la, modificarea prin acilare, amidinare, piridoxilarea lizinei, alkilare reductivă, trinitrobenzilarea grupurilor amino cu acid 2,4,6-trinitrobenzen sulfonic (TNBS), modificarea amidică a grupărilor carboxil şi sulfhidril prin oxidarea cu acid performic a cisteinei la acid cisteic, formarea de derivaţi de mercur, formarea de disulfuri mixte cu alţi compuşi tiolici, reacţia cu maleimidă, carboximetilarea cu acid iodoacetic sau iodoacetamidă şi carbamoilare cu cianat la pH alcalin, deşi fără a se limita la acestea. În aceste privinţe, doritorii sunt trimişi la Capitolul 15 al protocolului prezent din Protein Science, Eds. Coligan et al. (John Wiley and Sons NY 1995-2000) (Coligan et al., 1995) pentru o metodologie mai amplă referitoare la modificarea chimică a proteinelor.

Pe scurt, modificarea de exemplu a resturilor arginil sunt de obicei bazate pe reacţia dintre compuşii dicarbonil vecini cum ar fi fenilglioxal, 2, 3-butandionă, şi 1,2-ciclohexan-dionă pentru formarea unui aduct. Un alt exemplu e reacţia dintre metilglioxal şi resturile de arginină. Cisteina se poate modifica fără modificarea concomitentă a altor situri nucleofile cum ar fi lizina şi histidina. Ca rezultat, pentru modificarea cisteinei sunt disponibili un număr mare de reactivi. Site-urile web ale unor companii, cum ar fi Sigma-Aldrich (http://www.sigma-aldrich.com) furnizează informaţii despre anumiţi reactivi.

Reducerea selectivă a punţilor disulfurice din proteine este şi ea frecventă. Punţile disulfurice se pot forma şi oxida prin tratamentul termic al produselor biofarmaceutice. Reactivul K de la Woodward se poate folosi pentru modificarea resturilor de acid glutamic. N-(3-(dimetil-amino)propil)-N'-etilcarbodiimida se poate folosi pentru a forma legături intra-moleculare între un rest de lizină şi un rest de acid glutamic. De exemplu, dietilpirocarbonatul este un reactiv pentru modificarea resturilor de histidil din proteine. Histidina se poate modifica la rândul sau folosind 4-hidroxi-2-nonenal. Reacţia resturilor de lisină şi a altor grupări α-amino este utilă, de exemplu, pentru legarea peptidelor de suprafeţe sau de legături încrucişate proteine/peptide. Lisina este locul de ataşare a poli(etilen)glicolului şi locul principal de modificare în cazul glicolizării proteinelor. Resturile de metionină din proteine se pot modifica, de exemplu, folosind iodacetamidă, brometilamină şi cloramină T.

Tetranitrometanul şi N-acetil-imidazolul se pot folosi pentru modificarea resturilor tirozil. Legarea încrucişată prin formarea de ditirosină poate fi realizată cu ioni de cupru sau apă oxigenată.

Studii recente privind modificarea triptofanului au utilizat N-bromosuccinimidă, bromură 2-hidroxi-5-nitrobenzil sau 3-bromo-3-metil-2-(2-nitrofenilmercapto)-3H-indol (BPNS-scatol).

Modificarea cu succes a proteinelor şi peptidelor terapeutice cu PEG este adesea asociată cu o extindere a timpului de înjumătăţire circulatorie în timpul legării încrucişate a proteinelor cu glutaraldehidă, diacrilat de polietilen-glicol, iar formaldehida este utilizată pentru pregătirea hidrogelurilor. Modificarea chimică a alergenilor pentru imunoterapie este obţinută adesea prin carbamilare cu cianat de potasiu.

O peptidă sau o variantă, în care peptida este modificată sau include legături non-peptidice, este o concretizare preferată a descrierii. În general, peptidele şi variantele (cel puţin cele care conţin legături peptidice între reziduurile de aminoacizi) pot fi sintetizate prin sinteza peptidelor în fază solidă în modul Fmoc-poliamidă, aşa cum este prezentat de Lukas et al. (Lukas et al., 1981) şi de referinţele citate. Protecţia temporară a grupării N-amino este asigurată de gruparea 9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc). Clivajul repetitiv al acestei grupări de protecţie cu intensă labilitate de bază este realizat folosind 20% piperdină în N,N-dimetilformamidă. Funcţionalităţile lanţurilor secundare se pot proteja sub forma butil-eterilor (în cazul serinei, treoninei şi tirozinei), a butil-esterilor (în cazul acizilor glutamic şi aspartic), a derivaţilor butiloxicarbonil (în cazul lizinei şi histidinei), a derivaţilor tritil (în cazul cisteinei) şi a derivaţilor de 4-metoxi-2,3,6-trimetilbenzensulfonil (în cazul argininei). Dacă resturile C-terminale sunt glutamina sau asparagina, pentru protejarea funcţiei amido a lanţului secundar se va folosi gruparea 4,4'-dimetoxibenzhidril. Suportul în fază solidă se bazează pe un polimer de polidimetilacrilamidă constituit din trei monomeri: dimetilacrilamidă (monomer de bază), bisacriloiletilendiamină (agent de legătură încrucişată) şi ester metilic de acrililsarcosină (agent de funcţionalizare). Agentul de legătură peptid-răşină scindabil folosit este derivatul labil în mediu acid al acidului 4-hidroximetil-fenoxiacetic. Toţi derivaţii aminoacid sunt adăugaţi sub formă de derivaţi simetrici anhidri preformaţi cu excepţia asparaginei şi glutaminei, care sunt adăugate folosind o procedură de cuplare inversă mediată de N,N-diciclohexil-carbodiimidă/1-hidroxibenzotriazol. Toate reacţiile de cuplare şi deprotejare sunt monitorizate folosind proceduri care folosesc ninhidrină, trinitrobenzen, acid sulfonic şi izotin-test. După finalizarea sintezei, peptidele sunt scindate din suportul rezinic cu îndepărtarea concomitentă a grupărilor protectoare ale lanţurilor secundare prin tratarea cu acid trifluoroacetic 95% care conţine un amestec curăţător 50%. Printre agenţii de curăţare utilizaţi în mod obişnuit se numără etan-ditiolul, fenolul, anizolul şi apa, alegerea exactă depinzând de aminoacizii constituenţi ai peptidei care se sintetizează. De asemenea, este posibilă o combinaţie de metodologii în fază solidă şi în fază de soluţie pentru sinteza peptidelor (a se vedea, de exemplu, (Bruckdorfer et al., 2004) şi referinţele citate).

Acidul trifluoracetic este eliminat prin evaporare în vid, cu triturare ulterioară cu eter dietilic, obţinându-se peptida brută. Eventualii agenţi de curăţare prezenţi sunt eliminaţi printr-o procedură simplă de extragere care, prin liofilizarea fazei apoase, permite obţinerea peptidei brute fără agenţi de curăţare. Reactivii pentru sinteza peptidelor sunt în general disponibili, de exemplu, la Calbiochem-Novabiochem (Nottingham, Regatul Unit).

Purificarea poate fi efectuată prin oricare dintre tehnicile sau printr-o combinaţie de tehnici, cum ar fi recristalizarea, cromatografia de excludere a dimensiunii, cromatografia de schimb de ioni, cromatografia de interacţiune hidrofobă şi (de obicei) cromatografia lichidă de înaltă performanţă în fază inversă folosind, de exemplu, separarea în gradient acetonitril/apă.

Analiza peptidelor poate fi efectuată folosind cromatografie în strat subţire, electroforeză, în particular electroforeză capilară, extragere în fază solidă (CSPE), cromatografie lichidă de înaltă performanţă în fază inversă, analiză a aminoacizilor după hidroliza acidă şi prin analiză spectrometrică în masă la bombardarea rapidă cu atomi (FAB), dar şi analiză spectrometrică în masă de tip MALDI şi ESI-Q-TOF.

Pentru identificarea peptidelor din prezenta descriere, baza de date a datelor de exprimare a ARN-ului disponibile în mod public (Lonsdale, 2013) din aproximativ 3.000 de eşantioane de ţesut normal a fost verificată pentru genele cu exprimare aproape absentă în sistemele de organe vitale şi cu exprimare scăzută în alte sisteme de organe importante. Într-o a doua etapă, peptidele asociate cancerului, derivate din produsele proteice ale acestor gene, au fost identificate prin spectrometrie de masă cu ajutorul platformei XPRESIDENT™, aşa cum este descris în prezentul document.

În detaliu, pentru a selecta genele de interes utilizând datele RNASeq din baza de date menţionată, sistemele de organe vitale au fost considerate a fi: creierul, inima, vasele de sânge, plămânii şi ficatul. Mediana de citiri pe kilobază per milion de citiri (RPKM) pentru organele vitale trebuia să fie mai mică de 2, iar percentila de 75% trebuia să fie mai mică de 5 RPKM pentru selectarea genei. În cazul în care sistemele de organe au fost acoperite de mai mult de o clasă de eşantioane, de exemplu, diferite regiuni ale creierului care au fost analizate separat, pentru calcul s-a utilizat mediana maximă şi percentila maximă de 75% din clasele de eşantioane multiple. Alte sisteme de organe importante au fost considerate a fi: pielea, nervii, hipofiza, colonul, rinichii, ţesutul adipos, glanda suprarenală, vezica urinară, sângele integral, esofagul, muşchii, pancreasul, glanda salivară, intestinul subţire, stomacul, glanda mamară, splina, glanda tiroidă. Pentru selectarea genei, a fost necesar ca RPKM-ul median maxim pentru aceste organe să fie mai mic de 10. Celelalte organe au fost considerate ca fiind nevitale şi, prin urmare, nu s-a aplicat nicio valoare de prag pentru exprimarea genelor. Aceste organe erau colul uterin şi uterul, trompele uterine, vaginul, prostata, testiculele şi ovarul. Folosind acest filtru, au fost selectate aproximativ 14.000 de gene candidate. Apoi, au fost analizate profilurile de prezentare a peptidelor derivate din proteinele corespunzătoare. Peptidele au fost considerate interesante dacă au fost prezentate în mai puţin de cinci eşantioane normale dintr-un set de peste 170 de eşantioane normale (adică necanceroase) analizate şi dacă cea mai mare prezentare a ţesutului normal a fost mai mică de 30% din semnalul median al tumorii (pe toate eşantioanele tumorale).

Pentru a selecta peptidele suprareprezentate, se calculează un profil de prezentare care arată prezentarea mediană a eşantioanelor, precum şi variaţia replicilor. Profilul juxtapune eşantioane ale entităţii tumorale de interes la o bază de referinţă de eşantioane de ţesut normal. Fiecare dintre aceste profiluri poate fi apoi consolidat într-un scor de suprareprezentare prin calcularea valorii p a unui model liniar cu efecte mixte (Pinheiro et al., 2015) care se ajustează pentru teste multiple prin rata de descoperiri false (Benjamini şi Hochberg, 1995).

Pentru identificarea şi cuatificarea relativă ale liganzilor HLA prin spectrometrie de masă, au fost purificate moleculele HLA din probele de ţesut congelate rapid şi au fost izolate peptidele asociate cu HLA. Peptidele izolate au fost separate şi secvenţele au fost identificate prin experimente de cromatografie lichidă-spectrometrie de masă (LC-MS) cu nano-electropulverizare-ionizare (nanoESI) online. Secvenţele peptidice rezultate au fost verificate prin compararea modelului de fragmentare a TUMAP-urilor naturale înregistrate din eşantioane tumorale primare cu modelele de fragmentare ale peptidelor sintetice de referinţă corespunzătoare cu secvenţe identice. Având în vedere că peptidele au fost identificate direct ca liganzi ai moleculelor HLA din tumorile primare, aceste rezultate reprezintă o dovadă directă a procesării şi prezentării naturale a peptidelor identificate pe ţesutul canceros primar.

Numerele de eşantioane au fost (în total/eşantioane care au trecut QC): pentru PC N=39 (36), pentru CCR N= 22 (18), pentru CCR N=31 (28), pentru carcinom esofagian N= 14 (11), pentru BPH şi cancer de prostată N= 53 (43), pentru HCC N=15 (15), pentru NSCLC N=96 (87), pentru GC N=35 (33), pentru GB N= 38 (27), pentru cancer de glandă mamară N= 2 (2), pentru melanom N=5 (2), pentru cancer ovarian N= 21 (20), pentru LLC N= 5 (4), pentru SCLC N= 18 (17), NHL N= 18 (18), AML N= 23 (18), GBC, CCC N= 18 (17), pentru UBC N= 17 (15), pentru UEC N= 19 (16). Probele au trecut de controlul de calitate (QC) dacă sunt achiziţionate 5 replici de spectrometrie de masă sau dacă proba este consumată complet, iar peptidele utilizate pentru a calcula factorul de normalizare (adică care apar în replici tehnice ale aceleiaşi probe cu o variaţie mai mică de 50% şi care apar în cel puţin 2 eşantioane independente) reprezintă cel puţin 30% din toate peptidele măsurate în eşantion. Eşantioanele care au fost subtipate, rezultând un subtip rar (cum ar fi A*02:05, A*02:06) au fost excluse pentru selectarea peptidelor din prezenta descriere.

Pipeline-ul descoperirii XPRESIDENT® v2.1 (a se vedea, de exemplu, US 2013-0096016) permite identificarea şi selectarea candidaţilor de vaccinuri peptidice suprareprezentate relevante pe baza cuantificării relative directe a nivelurilor de peptide restricţionate de HLA pe ţesuturile canceroase în comparaţie cu mai multe ţesuturi şi organe necanceroase diferite. Acest lucru a fost realizat prin dezvoltarea unei cuantificări diferenţiale fără marcaje, utilizând datele LC-MS achiziţionate şi procesate de un pipeline propriu de analiză a datelor, care combină algoritmi de identificare a secvenţelor, de grupare spectrală, de numărare a ionilor, de aliniere a timpului de retenţie, de deconvoluţie şi normalizare a stării de încărcare.

Au fost stabilite niveluri de prezentare, inclusiv estimări de eroare pentru fiecare peptidă şi eşantion. Au fost identificate peptide prezentate exclusiv pe ţesutul tumoral şi peptide supraprezentate în ţesuturile şi organele tumorale faţă de cele necanceroase.

Complexele HLA-peptidă din eşantioane primare de HCC, CRC, GB, GC, cancer esofagian, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanom, cancer de glandă mamară, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC şi CLL au fost purificate, iar peptidele asociate cu HLA au fost izolate şi analizate prin LC-MS (vezi exemplele). Toate TUMAP-urile conţinute în prezenta solicitare de brevet au fost identificate cu această abordare pe probe de HCC, CRC, GB, GC, cancer esofagian, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanom, cancer de glandă mamară, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC şi/sau CLL, confirmând prezentarea lor pe aceste tipuri de tumori.

TUMAP-urile identificate pe mai multe tumori şi ţesuturi normale au fost cuantificate prin numărarea ionică a datelor LC-MS fără marcare. Metoda presupune că zonele de semnal LC-MS ale unei peptide sunt corelate cu abundenţa acesteia în eşantion. Toate semnalele cantitative ale unei peptide din diferite experimente LC-MS au fost normalizate pe baza tendinţei centrale, au fost calculate ca medie per eşantion şi au fost reunite într-un grafic cu bare, numit profil de prezentare. Profilul de prezentare consolidează diferite metode de analiză, cum ar fi căutarea în bazele de date de proteine, gruparea spectrală, deconvoluţia stării de încărcare (descărcare) şi alinierea şi normalizarea timpului de retenţie.

În plus, pipeline-ul descoperirii XPRESIDENT® v2.x permite cuantificarea directă absolută a nivelurilor de peptide restricţionate de MHC, de preferinţă HLA, pe ţesuturi canceroase sau alte ţesuturi infectate. Pe scurt, numărul total de celule a fost calculat din conţinutul total de ADN al eşantionului de ţesut analizat. Cantitatea totală de peptide pentru un TUMAP într-un eşantion de ţesut a fost măsurată prin nanoLC-MS/MS ca raport între TUMAP-ul natural şi o cantitate cunoscută a unei versiuni marcate cu izotopi a TUMAP-ului, aşa-numitul standard intern. Eficacitatea izolării TUMAP-urilor a fost determinată prin adiţionarea complexelor peptidă:MHC ale tuturor TUMAP-urilor selectate în lizatul tisular în cel mai scurt moment posibil al procedurii de izolare a TUMAP-urilor şi detectarea lor prin nanoLC-MS/MS după finalizarea procedurii de izolare a peptidelor. Numărul total de celule şi cantitatea de peptidă totală au fost calculate pe baza măsurătorilor triplicate pentru fiecare eşantion de ţesut. Eficacitatea de izolare specifică peptidelor a fost calculată ca medie din 10 experimente cu adiţionare, fiecare fiind măsurat ca triplicat (vezi Exemplul 6 şi Tabelul 11).

Această analiză combinată a exprimării ARN şi a datelor de spectrometrie de masă a dus la obţinerea celor 288 de peptide din prezenta descriere. În multe cazuri, peptida a fost identificată doar pe un număr mic de tumori. Cu toate acestea, din cauza sensibilităţii limitate a analizei de rutină prin spectrometrie de masă, datele ARN oferă o bază mult mai bună pentru estimarea acoperirii (vezi Exemplul 2).

Prezenta descriere furnizează peptide care sunt utile în tratarea cancerelor/tumorilor, de preferinţă HCC, CRC, GB, GC, cancer esofagian, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanom, cancer de glandă mamară, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC şi CLL care prezintă în exces sau în exclusivitate peptidele din prezenta dezvăluire. S-a demonstrat prin spectrometrie de masă că aceste peptide sunt prezentate în mod natural de moleculele HLA în probele primare umane de HCC, CRC, GB, GC, cancer esofagian, NSCLC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanom, cancer de glandă mamară, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC, CLL şi/sau în probele de PC.

Multe dintre genele-/proteinele-sursă (denumite şi „proteine de lungime completă» sau „proteine de bază») din care sunt derivate peptidele s-au dovedit a fi puternic supraexprimate în cancer în comparaţie cu ţesuturile normale - „ţesuturile normale», în legătură cu această descriere înseamnă fie ţesuturi sănătoase de tipul tumorii corespunzătoare (ficat, colon/rect, creier, stomac, esofag, plămân, pancreas, rinichi, prostată, ovar, piele, glandă mamară şi leucocite), fie alte celule din ţesuturi normale, demonstrând un grad ridicat de asociere tumorală a genelor-sursă (vezi Exemplul 2). Mai mult, peptidele în sine sunt puternic supraprezentate pe ţesutul tumoral - „ţesut tumoral», în sensul prezentei descrieri, însemnând un eşantion de la un pacient care suferă de HCC, CRC, GB, GC, cancer esofagian, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanom, cancer de glandă mamară, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC sau CLL, dar nu şi pe ţesuturile normale (vezi Exemplul 1).

Peptidele legate de HLA pot fi recunoscute de sistemul imunitar, în special de limfocitele T. Celulele T pot distruge celulele care prezintă complexul HLA/peptidă recunoscut, de exemplu HCC, CRC, GB, GC, cancer esofagian, NSCLC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanom, cancer de glandă mamară, PC, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC sau celule CLL care prezintă peptidele derivate.

S-a demonstrat că peptidele din prezenta descriere sunt capabile să stimuleze răspunsurile celulelor T şi/sau sunt suprareprezentate şi, prin urmare, pot fi utilizate pentru producerea de anticorpi şi/sau TCR-uri, cum ar fi TCR-uri solubile, în conformitate cu prezenta descriere (a se vedea Exemplul 3 şi Exemplul 4). Mai mult, peptidele, atunci când sunt complexate cu MHC-ul respectiv, pot fi utilizate, de asemenea, pentru producerea de anticorpi şi/sau TCR-uri, în special sTCR-uri, în conformitate cu prezenta descriere. Metodele respective sunt bine cunoscute de către specialiştii în domeniu şi pot fi găsite, de asemenea, în literatura de specialitate. Astfel, peptidele din prezenta descriere sunt utile pentru a genera un răspuns imunitar la un pacient, prin care celulele tumorale pot fi distruse. Răspunsul imunitar la pacient se poate induce prin administrarea directă a peptidelor descrise sau a substanţelor precursor adecvate (de exemplu peptide elongate, proteine sau acizi nucleici care codifică aceste peptide) pacientului, în mod ideal combinate cu un agent care creşte imunogenitatea. Răspunsul imunitar care are originea în astfel de vaccinare terapeutică se poate aştepta să fie foarte specific împotriva celulelor tumorale deoarece peptidele ţintă ale prezentei descrieri nu sunt prezente pe ţesuturi normale în numere de copii comparabile, fapt care previne riscul unor reacţii autoimune nedorite îndreptat împotriva celulelor normale ale pacientului.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la receptorii de celule T (TCR-uri) care cuprind un lanţ alfa şi un lanţ beta („TCR alfa/beta»). De asemenea, sunt furnizate peptidele capabile să se lege la TCR-uri şi anticorpi atunci când sunt prezentate de o moleculă MHC. Prezenta descriere se referă, de asemenea, la acizi nucleici, vectori şi celule-gazdă pentru exprimarea TCR-urilor şi a peptidelor din prezenta descriere, precum şi la metode de utilizare a acestora.

Termenul „receptor de celule T» (prescurtat TCR) se referă la o moleculă heterodimerică care cuprinde un lanţ polipeptidic alfa (lanţ alfa) şi un lanţ polipeptidic beta (lanţ beta), în care receptorul heterodimeric este capabil să se lege de un antigen peptidic prezentat de o moleculă HLA. Termenul include, de asemenea, aşa-numitele TCR-uri gamma/delta.

Într-una dintre concretizări, descrierea furnizează o metodă de producere a unui TCR, aşa cum este descrisă aici, metoda cuprinzând cultivarea unei celule-gazdă capabile să exprime TCR-ul în condiţii adecvate pentru a promova exprimarea TCR-ului.

Într-un alt aspect, descrierea se referă la metodele conform descrierii, în care antigenul este încărcat pe moleculele MHC de clasă I sau II exprimate pe suprafaţa unei celule prezentatoare de antigen adecvate sau a unei celule prezentatoare de antigen artificiale prin punerea în contact a unei cantităţi suficiente de antigen cu o celulă prezentatoare de antigen sau antigenul este încărcat pe tetrameri MHC de clasă I sau II prin tetramerizarea monomerilor complexului antigen/ MHC de clasă I sau II.

Lanţurile alfa şi beta ale TCR-urilor alfa/beta şi lanţurile gamma şi delta ale TCR-urilor gamma/delta sunt în general considerate ca având fiecare două „domenii», şi anume domeniul variabil şi domeniul constant. Domeniul variabil constă într-o concatenare a regiunii variabile (V) şi a regiunii de îmbinare (J). Domeniul variabil poate include, de asemenea, o regiune lider (L). Lanţurile beta şi delta pot include, de asemenea, o regiune de diversitate (D). Domeniile constante alfa şi beta pot include, de asemenea, domenii transmembranare (TM) C-terminale care ancorează lanţurile alfa şi beta la membrana celulară.

În ceea ce priveşte TCR-urile gamma/delta, termenul „domeniu variabil TCR gamma», astfel cum este utilizat în prezentul document, se referă la concatenarea regiunii TCR gamma V (TRGV) fără regiunea lider (L) şi a regiunii TCR gamma J (TRGJ), iar termenul domeniu constant TCR gamma se referă la regiunea TRGC extracelulară sau la o secvenţă TRGC trunchiată C-terminală. De asemenea, termenul „domeniu variabil TCR delta» se referă la concatenarea regiunii TCR delta V (TRDV) fără regiunea lider (L) şi a regiunii TCR delta D/J (TRDD/TRDJ), iar termenul „domeniu constant TCR delta» se referă la regiunea TRDC extracelulară sau la o secvenţă TRDC trunchiată C-terminală.

TCR-urile din prezenta descriere se leagă, de preferinţă, la un complex peptidă-moleculă HLA cu o afinitate de legare (KD) de aproximativ 100 µM sau mai puţin, aproximativ 50 µM sau mai puţin, aproximativ 25 µM sau mai puţin, sau aproximativ 10 µM sau mai puţin. Mai preferate sunt TCR-urile de mare afinitate care au afinităţi de legare de aproximativ 1 µM sau mai puţin, de aproximativ 100 nM sau mai puţin, de aproximativ 50 nM sau mai puţin, de aproximativ 25 nM sau mai puţin. Exemple nelimitative de intervale preferate de afinitate de legare pentru TCR-urile din prezenta descriere includ de la aproximativ 1 nM la aproximativ 10 nM; de la aproximativ 10 nM la aproximativ 20 nM; de la aproximativ 20 nM la aproximativ 30 nM; de la aproximativ 30 nM la aproximativ 40 nM; de la aproximativ 40 nM la aproximativ 50 nM; de la aproximativ 50 nM la aproximativ 60 nM; de la aproximativ 60 nM la aproximativ 70 nM; de la aproximativ 70 nM la aproximativ 80 nM; de la aproximativ 80 nM la aproximativ 90 nM; şi de la aproximativ 90 nM la aproximativ 100 nM.

În sensul prezentei descrieri cu privire la TCR-uri, termenul „legare specifică» şi variantele gramaticale ale acestuia sunt utilizate pentru a desemna un TCR care are o afinitate de legare (KD) pentru un complex peptidă-moleculă HLA de 100 µM sau mai puţin.

TCR-urile heterodimerice alfa/beta din prezenta descriere pot avea o legătură disulfurică introdusă între domeniile lor constante. TCR-urile preferate de acest tip le includ pe cele care au o secvenţă de domeniu constant TRAC şi o secvenţă de domeniu constant TRBC1 sau TRBC2, cu excepţia faptului că Thr 48 din TRAC şi Ser 57 din TRBC1 sau TRBC2 sunt înlocuite cu reziduuri de cisteină, cisteinele respective formând o legătură disulfurică între secvenţa de domeniu constant TRAC şi secvenţa de domeniu constant TRBC1 sau TRBC2 a TCR-ului.

Cu sau fără legătura introdusă între lanţuri menţionată mai sus, TCR-urile heterodimerice alfa/beta din prezenta descriere pot avea o secvenţă de domeniu constant TRAC şi o secvenţă de domeniu constant TRBC1 sau TRBC2, iar secvenţa de domeniu constant TRAC şi secvenţa de domeniu constant TRBC1 sau TRBC2 ale TCR-ului pot fi legate prin legătura disulfurică nativă dintre Cys4 din exonul 2 al TRAC şi Cys2 din exonul 2 al TRBC1 sau TRBC2.

TCR-urile din prezenta descriere pot cuprinde un marker detectabil selectat din grupul format dintr-un radionuclid, un fluorofor şi biotină. TCR-urile din prezenta descriere pot fi conjugate cu un agent activ din punct de vedere terapeutic, cum ar fi un radionuclid, un agent chimioterapeutic sau o toxină.

Într-una dintre concretizări, un TCR din prezenta descriere care are cel puţin o mutaţie în lanţul alfa şi/sau care are cel puţin o mutaţie în lanţul beta are glicozilarea modificată în comparaţie cu TCR-ul nemutant.

Într-una dintre concretizări, un TCR care conţine cel puţin o mutaţie în lanţul alfa al TCR-ului şi/sau în lanţul beta al TCR are o afinitate de legare şi/sau un timp de înjumătăţire de legare pentru un complex peptidă-moleculă HLA, care este cel puţin dublu faţă de un TCR care conţine lanţul alfa al TCR-ului nemutant şi/sau lanţul beta al TCR-ului nemutant. Amplificarea afinităţii TCR-urilor specifice tumorilor şi exploatarea acestora se bazează pe existenţa unei ferestre pentru afinităţile TCR optime. Existenţa unei astfel de ferestre se bazează pe observaţiile conform cărora TCR-urile specifice pentru agenţii patogeni restricţionaţi de HLA-A2 au valori KD care sunt, în general, de aproximativ 10 ori mai mici în comparaţie cu TCR-urile specifice pentru autoantigenii asociaţi tumorilor HLA-A2-restricţionate. În prezent se cunoaşte că, deşi antigenii tumorali au potenţialul de a fi imunogeni, deoarece tumorile provin din propriile celule ale individului, doar proteinele mutante sau cele cu procesare translaţională modificată vor fi considerate străine de către sistemul imunitar. Antigenii care sunt reglaţi în sens crescător sau supraexprimaţi (aşa-numiţii autoantigeni) nu vor induce neapărat un răspuns imunitar funcţional împotriva tumorii: Celulele T care exprimă TCR-uri foarte reactive la aceşti antigeni vor fi fost selectate negativ în timus într-un proces cunoscut sub numele de toleranţă centrală, ceea ce înseamnă că rămân doar celulele T cu TCR-uri cu afinitate scăzută pentru autoantigeni. Prin urmare, afinitatea TCR-urilor sau a variantelor din prezenta descriere faţă de pepidele conform descrierii poate fi îmbunătăţită prin metode bine cunoscute în domeniu.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la o metodă de identificare şi izolare a unui TCR în conformitate cu prezenta descriere, metoda respectivă cuprinzând incubarea de PBMC-uri de la donatori sănătoşi HLA-A*02-negativi cu monomeri A2/peptidă, incubarea PBMC-urilor cu tetramer-ficoeritrină (PE) şi izolarea celulelor T cu aviditate mare prin analiză cu sortare celulară activată prin fluorescenţă (FACS)-Calibur.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la o metodă de identificare şi izolare a unui TCR în conformitate cu prezenta descriere, metoda respectivă cuprinzând obţinerea unui şoarece transgenic cu toţi locii genici TCRαβ umani (1.1 şi 0.1. 7 Mb), ale cărui celule T exprimă un repertoriu TCR uman divers care compensează deficienţa TCR de şoarece, imunizarea şoarecelui cu peptida de interes, incubarea PBMC obţinute de la şoarecii transgenici cu tetramer-ficoeritrină (PE) şi izolarea celulelor T cu aviditate mare prin analiză cu sortare celulară activată prin fluorescenţă (FACS)-Calibur.

Într-unul dintre aspecte, pentru a obţine celule T care exprimă TCR-urile din prezenta descriere, acizii nucleici care codifică lanţurile TCR-alfa şi/sau TCR-beta din prezenta descriere sunt clonaţi în vectori de exprimare, cum ar fi retrovirusul gamma sau lentivirusul. Virusurile recombinante sunt generate şi apoi testate pentru funcţionalitate, cum ar fi specificitatea antigenului şi aviditatea funcţională. O parte aliquotă din produsul final este apoi utilizată pentru a transduce populaţia de celule T-ţintă (în general purificată din PBMC-uri ale pacientului), care este expandată înainte de a fi perfuzată pacientului.

Într-un alt aspect, pentru a obţine celule T care exprimă TCR-urile din prezenta descriere, ARN-urile TCR sunt sintetizate prin tehnici cunoscute în domeniu, de exemplu, prin sisteme de transcripţie in vitro. ARN-urile TCR sintetizate in vitro sunt apoi introduse în celulele T CD8+ primare obţinute de la donatori sănătoşi prin electroporare pentru a reexprima lanţurile TCR-alfa şi/sau TCR-beta specifice tumorii.

Pentru a creşte exprimarea, acizii nucleici care codifică TCR-urile din prezenta descriere pot fi legaţi în mod operaţional de promotori puternici, cum ar fi repetările terminale lungi (LTR) retrovirale, citomegalovirusul (CMV), virusul celulelor stem murine (MSCV) U3, fosfoglicerat kinaza (PGK), β-actina, ubiquitina şi un promotor compozit al virusului simian 40 (SV40)/CD43, factorul de elongare (EF)-1a şi promotorul virusului de formare a focarelor splenice (SFFV). Într-o concretizare preferată, promotorul este heterolog cu acidul nucleic care este exprimat.

În plus faţă de promotorii puternici, casetele de exprimare TCR din prezenta descriere pot conţine elemente suplimentare care pot amplifica exprimarea transgenică, inclusiv un tract polipurinic central (cPPT) (Follenzi et al., 2000), care promovează translocarea nucleară a construcţiilor lentivirale, şi elementul de reglare posttranscripţională a virusului hepatitei Woodchuck (wPRE), care creşte nivelul de exprimare a transgenică prin creşterea stabilităţii ARN-ului (Zufferey et al., 1999).

Lanţurile alfa şi beta ale unui TCR din prezenta descriere pot fi codificate de acizi nucleici localizaţi în vectori separaţi sau pot fi codificate de polinucleotide localizate în acelaşi vector.

Obţinerea unui nivel ridicat de exprimare la suprafaţa TCR-ului necesită ca ambele lanţuri TCR-alfa şi TCR-beta ale TCR-ului introdus să fie transcripţionate la niveluri ridicate. Pentru a face acest lucru, lanţurile TCR-alfa şi TCR-beta din prezenta descriere pot fi clonate în construcţii bi-cistronice într-un singur vector, care s-a dovedit a fi capabil să depăşească acest obstacol. Utilizarea unui situs de intrare intraribozomal viral (IRES) între lanţurile TCR-alfa şi TCR-beta are ca rezultat exprimarea coordonată a ambelor lanţuri, deoarece lanţurile TCR-alfa şi TCR-beta sunt generate dintr-o singură transcripţie care este scindată în două proteine în timpul translaţiei, asigurând producerea unui raport molar egal între lanţurile TCR-alfa şi TCR-beta. (Schmitt et al.) 2009).

Acizii nucleici care codifică TCR-uri din prezenta descriere pot fi optimizaţi din punct de vedere al codonului pentru a creşte exprimarea dintr-o celulă-gazdă. Redundanţa în codul genetic permite ca unii aminoacizi să fie codificaţi prin mai mult de un codon, dar anumiţi codoni sunt mai puţin „optimi»decât alţii din cauza disponibilităţii relative a ARNt-urilor corespunzătoare, precum şi a altor factori (Gustafsson et al., 2004). S-a demonstrat că modificarea secvenţelor genelor TCR-alfa şi TCR-beta astfel încât fiecare aminoacid să fie codificat de codonul optim pentru exprimarea genei de mamifer, precum şi eliminarea motivelor de instabilitate a ARNm-ului sau a situsurilor de scindare criptice, sporeşte semnificativ exprimarea genelor TCR-alfa şi TCR-beta (Scholten et al., 2006).

Mai mult decât atât, o diferenţă între lanţurile TCR introduse şi cele endogene poate duce la dobândirea unor specificităţi care prezintă un risc semnificativ pentru autoimunitate. De exemplu, formarea de dimeri TCR combinaţi poate reduce numărul de molecule CD3 disponibile pentru a forma complexe TCR împerecheate corespunzător şi, prin urmare, poate scădea semnificativ aviditatea funcţională a celulelor care exprimă TCR-ul introdus (Kuball et al., 2007).

Pentru a reduce împerecherea greşită, domeniul C-terminal al lanţurilor TCR introduse din prezenta descriere poate fi modificat pentru a promova afinitatea între lanţuri, reducând în acelaşi timp capacitatea lanţurilor introduse de a se împerechea cu TCR-ul endogen. Aceste strategii pot include înlocuirea domeniilor C-terminal TCR-alfa şi TCR-beta umane cu omologii lor murini (domeniu C-terminal murinizat); generarea unei a doua legături disulfurice între lanţuri în domeniul C-terminal prin introducerea unui al doilea reziduu de cisteină în ambele lanţuri TCR-alfa şi TCR-beta ale TCR-ului introdus (modificarea cu cisteină); schimbarea reziduurilor de interacţiune din domeniile C-terminale ale lanţurilor TCR-alfa şi TCR-beta („knob-in-hole»); şi fuzionarea domeniilor variabile ale lanţurilor TCR-alfa şi TCR-beta direct cu CD3ζ (fuziune CD3ζ). (Schmitt et al.) 2009).

Într-una dintre concretizări, o celulă-gazdă este modificată pentru a exprima un TCR din prezenta descriere. În concretizările preferate, celula-gazdă este o celulă T umană sau un progenitor de celulă T umană. În unele concretizări, celula T sau progenitorul de celule T este obţinut de la un pacient cu cancer. În alte concretizări, celula T sau progenitorul de celule T este obţinut de la un donator sănătos. Celulele-gazdă din prezenta descriere pot fi alogene sau autologe în ceea ce priveşte un pacient care urmează să fie tratat. Într-una dintre concretizări, gazda este o celulă T gamma/delta transformată pentru a exprima un TCR alfa/beta.

O „compoziţie farmaceutică» este o compoziţie adecvată pentru a fi administrată unei fiinţe umane într-o instituţie medicală. De preferinţă, o compoziţie farmaceutică este sterilă şi produsă în conformitate cu orientările GMP.

Compoziţiile farmaceutice cuprind peptidele fie sub formă liberă, fie sub forma unei săruri acceptabile din punct de vedere farmaceutic (a se vedea şi mai sus). În sensul prezentului document, „o sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic» se referă la un derivat al peptidelor prezentate, în care peptida este modificată prin obţinerea de săruri acide sau bazice ale agentului. De exemplu, sărurile acide se prepară din baza liberă (de obicei, în cazul în care forma neutră a medicamentului are o grupare neutră -NH2), implicând reacţia cu un acid adecvat. Acizii adecvaţi pentru prepararea sărurilor acide includ atât acizi organici, de exemplu acid acetic, acid propionic, acid glicolic, acid piruvic, acid oxalic, acid malic, acid malonic, acid succinic, acid maleic, acid fumaric, acid tartric, acid citric, acid benzoic, acid cinamic, acid mandelic, acid metan-sulfonic, acid etan-sulfonic, acid p-toluensulfonic, acid salicilic şi altele asemenea, precum şi acizi anorganici, de exemplu acid clorhidric, acid bromhidric, acid sulfuric, acid azotic, acid fosforic şi altele asemenea. Dimpotrivă, preparatele sărurilor bazice ale grupărilor acide care pot face parte din peptidă sunt preparate folosind o bază acceptabilă farmaceutic, cum ar fi hidroxidul de sodiu, hidroxidul de potasiu, hidroxidul de amoniu, hidroxidul de calciu, trimetilamina sau altele asemenea.

Într-o concretizare deosebit de preferată, compoziţiile farmaceutice cuprind peptidele sub formă de săruri ale acidului acetic (acetaţi), ale trifluoroacetaţilor sau ale acidului clorhidric (cloruri).

De preferinţă, medicamentul din prezenta descriere este un imunoterapeutic, cum ar fi un vaccin. Acesta poate fi administrat direct pacientului, în organul afectat sau pe cale sistemică i.d., i.m., s.c., i.p. şi i.v., sau poate fi aplicat ex vivo celulelor provenite de la pacient sau unei linii de celule umane care sunt ulterior administrate pacientului, sau poate fi utilizat in vitro pentru a selecta o subpopulaţie de celule imune provenite de la pacient, care sunt apoi readministrate pacientului. În cazul în care acidul nucleic este administrat celulelor in vitro, poate fi util ca celulele să fie transfectate astfel încât să coexprime citokine imunostimulatoare, cum ar fi interleukina-2. Peptida poate fi substanţial pură sau poate fi combinată cu un adjuvant imunostimulator (a se vedea mai jos) sau poate fi utilizată în combinaţie cu citokine imunostimulatoare, sau poate fi administrată cu un sistem de livrare adecvat, de exemplu lipozomi. De asemenea, peptida poate fi conjugată cu un transportor adecvat, cum ar fi hemocianina melcului Megathura crenulata (keyhole limpet hemocyanin, KLH) sau mannan (vezi WO 95/18145 şi (Longenecker et al., 1993)). Peptida poate fi, de asemenea, marcată, poate fi o proteină de fuziune sau poate fi o moleculă hibridă. Se aşteaptă ca peptidele a căror secvenţă este prezentată în prezenta descriere să stimuleze celulele T CD4 sau CD8. Cu toate acestea, stimularea celulelor T CD8 este mai eficientă în prezenţa ajutorului furnizat de celulele CD4 T-helper. Astfel, pentru epitopi MHC de clasă I care stimulează celulele T CD8, partenerul de fuziune sau secţiunile unei molecule hibride furnizează în mod corespunzător epitopi care stimulează celulele T CD4-pozitive. Epitopi care stimulează CD4 şi CD8 sunt bine cunoscuţi în domeniu şi îi includ pe cei identificaţi în prezenta descriere.

Într-un aspect, vaccinul cuprinde cel puţin o peptidă având secvenţa de aminoacizi prezentată de la SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 288 şi cel puţin o peptidă suplimentară, de preferinţă între 2 şi 50 de peptide, mai preferabil între 2 şi 25 de peptide, chiar mai preferabil între 2 şi 20 de peptide şi cel mai preferabil între 2, 3, 4, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 sau 18 peptide. Peptida (peptidele) poate (pot) fi derivată (derivate) din una sau mai multe TAA-uri specifice şi se poate (pot) lega de molecule MHC de clasă I.

Un alt aspect al descrierii furnizează un acid nucleic (de exemplu o polinucleotidă) care codifică o peptidă sau o variantă a peptidei din descriere. Polinucleotida poate fi, de exemplu, ADN, ADNc, ANP, ARN sau combinaţii ale acestora, fie monocatenar şi/sau bicatenar, fie forme native sau stabilizate de polinucleotide, cum ar fi, de exemplu, polinucleotide cu o cu bază de fosforotioat şi poate sau nu să conţină introni, atât timp cât codifică peptida. Desigur, numai peptidele care conţin reziduuri de aminoacizi naturali unite prin legături peptidice naturale pot fi codificate de un polinucleotid. Un alt aspect al descrierii oferă un vector de exprimare capabil să exprime o polipeptidă în conformitate cu descrierea.

Au fost dezvoltate o varietate de metode pentru a lega polinucleotide, în special ADN, de vectori, de exemplu prin terminus coeziv complementar. De exemplu segmentului ADN i se pot adăuga regiuni homopolimerice complementare care să fie introduse în ADN-ul vector. Vectorul şi segmentul de ADN sunt apoi unite prin legături de hidrogen între cozile homopolimerice complementare pentru a forma molecule de ADN recombinate.

Agenţii de legare sintetici care conţin unul sau mai multe situsuri de restricţie furnizează o metodă alternativă de îmbinare a segmentului de ADN cu vectorii. Agenţii de legare sintetici care conţin o varietate de situsuri de endonuclează de restricţie sunt disponibili în comerţ de la o serie de surse, inclusiv International Biotechnologies Inc. New Haven, CN, SUA.

O metodă dezirabilă de modificare a ADN-ului care codifică polipeptida din descriere utilizează reacţia în lanţ a polimerazei, aşa cum este prezentată de Saiki RK, et al. (Saiki et al., 1988). Această metodă poate fi utilizată pentru a introduce ADN-ul într-un vector adecvat, de exemplu prin inginerie în situsuri de restricţie adecvate, sau poate fi utilizată pentru a modifica ADN-ul în alte moduri utile, aşa cum este cunoscut în domeniu. În cazul în care se utilizează vectori virali, se preferă vectorii pox- sau adenovirus.

ADN-ul (sau în cazul vectorilor retrovirali, ARN-ul) poate fi apoi exprimat într-o gazdă adecvată pentru a produce o polipeptidă compusă din peptidă sau varianta din descriere. Astfel, ADN-ul care codifică peptida sau varianta din descriere poate fi utilizat în conformitate cu tehnicile cunoscute, modificat corespunzător instrucţiunilor din prezentul document, pentru a construi un vector de exprimare, care este apoi utilizat pentru a transforma o celulă-gazdă adecvată pentru exprimarea şi producerea polipeptidei din descriere. Astfel de tehnici le includ pe cele prezentate, de exemplu în US 4,440,859, 4,530,901, 4,582,800, 4,677,063, 4,678,751, 4,704,362, 4,710,463, 4,757,006, 4,766,075 şi 4,810,648.

ADN-ul (sau, în cazul vectorilor retrovirali, ARN-ul) care codifică polipeptida care constituie compusul din descriere poate fi unit cu o mare varietate de alte secvenţe de ADN pentru a fi introdus într-o gazdă adecvată. ADN-ul însoţitor va depinde de natura gazdei, de modul de introducere a ADN-ului în gazdă şi de dorinţa de menţinere sau de integrare episomală.

În general, ADN-ul este inserat într-un vector de exprimare, cum ar fi o plasmidă, în orientarea corespunzătoare şi în cadrul de citire corect pentru exprimare. Dacă este necesar, ADN-ul poate fi legat de secvenţe de nucleotide de control al reglării transcripţionale şi translaţionale adecvate recunoscute de gazda dorită, deşi astfel de controale sunt în general disponibile în vectorul de exprimare. Vectorul este apoi introdus în gazdă prin tehnici standard. În general, nu toate gazdele vor fi transformate de vector. Prin urmare, va fi nevoie de selectarea unor celule-gazdă transformate. Una dintre tehnicile de selecţie implică încorporarea în vectorul de exprimare a unei secvenţe de ADN, cu toate elementele de control necesare, care codifică pentru o trăsătură selectabilă în celula transformată, cum ar fi rezistenţa la antibiotice.

Alternativ, gena pentru o astfel de trăsătură selectabilă se poate afla pe un alt vector, care este utilizat pentru a co-transforma celula-gazdă dorită.

Celulele-gazdă care au fost transformate de ADN-ul recombinant din descriere sunt apoi cultivate pentru o perioadă suficientă de timp şi în condiţii adecvate, cunoscute de specialiştii în domeniu, având în vedere instrucţiunile din prezentul document, pentru a permite exprimarea polipeptidei, care poate fi apoi recuperată.

Sunt cunoscute multe sisteme de exprimare, inclusiv bacterii (de exemplu, E. coli şi Bacillus subtilis), levuri (de exemplu, Saccharomyces cerevisiae), fungi filamentoşi (de exemplu, Aspergillus spec.), celule vegetale, celule animale şi celule de insecte. Este de preferat ca sistemul să poată fi format din celule de mamifere, cum ar fi celulele CHO, disponibile din ATCC Cell Biology Collection.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la o celulă-gazdă transformată cu o construcţie de vector polinucleotidică din prezenta descriere. Celula-gazdă poate fi procariotă sau eucariotă. Celulele bacteriene pot fi, în anumite circumstanţe, celule-gazdă procariote preferate şi, de obicei, sunt o tulpină de E. coli, cum ar fi, de exemplu, tulpinile de E. coli DH5 disponibile de la Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, SUA, şi RR1 disponibile de la American Type Culture Collection (ATCC) din Rockville, MD, SUA (nr. ATCC 31343). Celulele gazdă eucariote preferate includ celule de levuri, de insecte şi de mamifere, de preferinţă celule de vertebrate, cum ar fi cele de şoarece, de şobolan sau de maimuţă ori linii de celule fibroblastice şi de colon umane. Celulele-gazdă de levuri includ YPH499, YPH500 şi YPH501, care sunt în general disponibile de la Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, SUA. Celulele-gazdă preferate de mamifere includ celulele ovariene de hamster chinezesc (CHO) disponibile la ATCC sub denumirea CCL61, celulele embrionare de şoarece elveţian NIH/3T3 disponibile la ATCC sub denumirea CRL 1658, celulele COS-1 derivate din rinichi de maimuţă disponibile la ATCC sub denumirea CRL 1650 şi celulele 293, care sunt celule de rinichi embrionar uman. Celulele de insecte preferate sunt celulele Sf9, care pot fi transfectate cu vectori de exprimare baculovirus. O prezentare generală cu privire la alegerea celulelor-gazdă adecvate pentru exprimare poate fi găsită, de exemplu, în manualul de Paulina Balbás şi Argelia Lorence „Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols», Part One, Second Edition, ISBN 978-1-58829-262-9, precum şi în alte lucrări cunoscute de către specialişti.

Transformarea gazdelor celulare corespunzătoare cu o construcţie de ADN din prezenta descriere se realizează prin metode bine cunoscute, care depind de obicei de tipul de vector utilizat. În ceea ce priveşte transformarea celulelor-gazdă procariote, a se vedea, de exemplu, Cohen et al. (Cohen et al., 1972) şi (Green and Sambrook, 2012). Transformarea celulelor de levuri este descrisă în Sherman et al. (Sherman et al., 1986). Metoda lui Beggs (Beggs, 1978) este, de asemenea, utilă. În ceea ce priveşte celulele vertebrate, reactivii utili pentru transfectarea acestor celule, de exemplu fosfatul de calciu şi DEAE-dextranul sau formulările lipozomice, sunt disponibile la Stratagene Cloning Systems sau Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, SUA. Electroporarea este, de asemenea, utilă pentru transformarea şi/sau transfectarea celulelor şi este bine cunoscută în artă pentru transformarea celulelor de levuri, a celulelor bacteriene, a celulelor de insecte şi a celulelor de vertebrate.

Celulele transformate cu succes, adică celulele care conţin o construcţie de ADN din prezenta descriere, pot fi identificate prin tehnici bine cunoscute, cum ar fi PCR. Alternativ, prezenţa proteinei în stratul supranatant poate fi detectată folosind anticorpi.

Se va aprecia că anumite celule gazdă ale descrierii sunt utile la prepararea peptidelor din descriere, de exemplu celulele bacteriene, de levuri şi de insecte. Cu toate acestea, şi alte celule-gazdă pot fi utile în anumite metode terapeutice. De exemplu, celulele prezentatoare de antigen, cum ar fi celulele dendritice, pot fi utilizate în mod util pentru a exprima peptidele din descriere, astfel încât acestea să poată fi încărcate în moleculele MHC corespunzătoare. Astfel, prezenta descriere furnizează o celulă-gazdă care cuprinde un acid nucleic sau un vector de exprimare în conformitate cu invenţia.

Într-o concretizare preferată, celula gazdă este o celulă prezentatoare de antigen, în special o celulă dendritică sau o celulă prezentatoare de antigen. APC-urile încărcate cu o proteină de fuziune recombinantă care conţine fosfatază acidă prostatică (PAP) au fost aprobate de către Administraţia americană pentru alimente şi medicamente (FDA), la 29 aprilie 2010, pentru tratarea HRPC-urilor metastatice asimptomatice sau minim simptomatice (Sipuleucel-T) (Rini et al., 2006; Small et al., 2006).

Un alt aspect al descrierii oferă o metodă de producere a peptidei sau a variantei sale, metoda cuprinzând cultivarea unei celule-gazdă şi izolarea peptidei din celula-gazdă sau din mediul de cultură al acesteia.

Într-o altă concretizare, peptida, acidul nucleic sau vectorul de exprimare al descrierii sunt utilizate în medicină. De exemplu, peptida sau varianta sa poate fi preparată pentru injectare intravenoasă (i.v.), injectare subcutanată (s.c.), injectaare intradermică (i.d.), injectare intraperitoneală (i.p.) sau injectare intramusculară (i.m.). Metodele preferate de injectare a peptidelor includ s.c., i.d., i.p., i.m. şi i.v. Metodele preferate de injectare a ADN-ului includ i.d., i.m., s.c., i.p. şi i.v. Se pot administra doze de exemplu între 50 µg şi 1,5 mg, de preferinţă între 125 µg şi 500 µg, de peptidă sau ADN, care depind de peptida sau de ADN-ul respectiv. Dozele din acest interval au fost utilizate cu succes în studiile anterioare (Walter et al., 2012).

Polinucleotida utilizată pentru vaccinarea activă poate fi substanţial pură sau poate fi conţinută într-un vector sau sistem de livrare adecvat. Acidul nucleic poate fi ADN, ADNc, APN, ARN sau o combinaţie a acestora. Metodele de concepere şi de introducere a unui astfel de acid nucleic sunt bine cunoscute în domeniu. O prezentare generală este furnizată, de exemplu, de Teufel et al. (Teufel et al., 2005). Vaccinurile polinucleotidice sunt uşor de preparat, însă modul de acţiune al acestor vectori în inducerea unui răspuns imun nu este pe deplin înţeles. Vectorii şi sistemele de livrare adecvate includ ADN-ul şi/sau ARN-ul viral, cum ar fi sistemele bazate pe adenovirus, virusul vaccinia, retrovirusuri, virusul herpetic, adenovirusul asociat sau hibrizi care conţin elemente din mai multe virusuri. Sistemele de eliberare non-virale includ lipide cationice şi polimeri cationici şi sunt bine cunoscute în domeniul eliberării de ADN. Se poate utiliza, de asemenea, livrarea fizică, cum ar fi prin intermediul unui „pistol de gene». Peptida sau peptidele codificate de acidul nucleic pot fi o proteină de fuziune, de exemplu, cu un epitop care stimulează celulele T pentru CDR-ul opus respectiv, aşa cum s-a menţionat mai sus.c

Adjuvanţii preferaţi sunt anti-CD40, imiquimod, resiquimod, GM-CSF, ciclofosfamidă, sunitinib, bevacizumab, interferon-alfa, oligonucleotide CpG şi derivaţi, poli-(I:C) şi derivaţi, ARN, sildenafil şi formulări particulate cu PLG sau virozomi.

Într-o concretizare preferată, în compoziţia farmaceutică conform descrierii, adjuvantul este selectat din grupul format din factori de stimulare a coloniilor, cum ar fi factorul de stimulare a coloniilor de macrofage granulocite (GM-CSF, sargramostim), ciclofosfamidă, imiquimod, resiquimod şi interferon-alfa.

Într-o concretizare preferată, în compoziţia farmaceutică conform descrierii, adjuvantul este selectat din grupul format din factori de stimulare a coloniilor, cum ar fi factorul de stimulare a coloniilor de macrofage granulocite (GM-CSF, sargramostim), ciclofosfamidă şi interferon-alfa. Într-o concretizare preferată a compoziţiei farmaceutice conform descrierii, adjuvantul este ciclofosfamida, imiquimodul sau resiquimodul. Adjuvanţi şi mai preferaţi sunt Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, poli-ICLC (Hiltonol®) şi mAb anti-CD40 sau combinaţii ale acestora.

Această compoziţie este utilizată pentru administrare parenterală, cum ar fi administrarea subcutanată, intradermică, intramusculară sau orală. În acest scop, peptidele şi, opţional, alte molecule sunt dizolvate sau suspendate într-un suport acceptabil din punct de vedere farmaceutic, de preferinţă apos. În plus, compoziţia poate conţine excipienţi, cum ar fi tampoane, agenţi de legare, agenţi de declanşare, diluanţi, arome, lubrifianţi etc. Peptidele pot fi, de asemenea, administrate împreună cu substanţe imunostimulatoare, cum ar fi citokinele. Lista exhaustivă de excipienţi care se pot folosi în această compoziţie poate, de exemplu, fi preluată din A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients (Kibbe, 2000). Compoziţia poate fi utilizată pentru prevenirea, profilaxia şi/sau terapia bolilor adenomatoase sau canceroase. Exemple de formulări pot fi găsite, de exemplu, în EP2112253.

Este important să se înţeleagă că răspunsul imunitar declanşat de vaccinul conform descrierii atacă cancerul în diferite stadii celulare şi în diferite stadii de dezvoltare. În plus, sunt atacate diferite căi de semnalizare asociate cancerului. Acesta este un avantaj faţă de vaccinurile care se adresează doar uneia sau câtorva ţinte, ceea ce poate determina tumoarea să se adapteze cu uşurinţă la atac (evadare a tumorii). În plus, nu toate tumorile individuale exprimă acelaşi model de antigeni. Prin urmare, o combinaţie de mai multe peptide asociate tumorilor asigură faptul că fiecare tumoare poartă cel puţin o parte din ţinte. Compoziţia este concepută în aşa fel încât fiecare tumoare să exprime mai mulţi antigeni şi să acopere mai multe căi independente necesare pentru creşterea şi menţinerea tumorii. Astfel, vaccinul poate fi utilizat „gata de utilizare» pentru o populaţie mai mare de pacienţi. Acest lucru înseamnă că o preselecţie a pacienţilor care urmează să fie trataţi cu vaccinul poate fi limitată la tipizarea HLA, nu necesită evaluări suplimentare ale biomarkerilor pentru expresia antigenului, dar se asigură totuşi că mai multe ţinte sunt atacate simultan de răspunsul imunitar indus, ceea ce este important pentru eficacitate (Banchereau et al., 2001; Walter et al., 2012).

Peptidele din prezenta invenţie pot fi utilizate pentru a genera şi dezvolta anticorpi specifici împotriva complexelor MHC-peptidă. Aceştia pot fi utilizaţi pentru terapie, direcţionând toxine sau substanţe radioactive către ţesutul bolnav. O altă utilizare a acestor anticorpi poate fi direcţionarea radionuclizilor către ţesutul bolnav în scopuri imagistice, cum ar fi PET. Această utilizare poate ajuta la detectarea metastazelor mici sau la determinarea dimensiunii şi localizării precise a ţesuturilor bolnave.

Prin urmare, un alt aspect al descrierii este acela de a furniza o metodă de producere a unui anticorp recombinant care se leagă în mod specific de un complex major de histocompatibilitate (MHC) uman de clasă I sau II, fiind complexat cu un antigen restricţionat HLA, metoda cuprinzând: imunizarea unui mamifer non-uman modificat genetic care cuprinde celule care exprimă complexul major de histocompatibilitate (MHC) uman de clasă I sau II cu o formă solubilă a unei molecule MHC de clasă I sau II care este complexată cu antigenul restricţionat de HLA; izolarea moleculelor de ARNm din celulele producătoare de anticorpi ale mamiferului non-uman; producerea unei biblioteci de afişare de fagi care prezintă molecule de proteine codificate de moleculele de ARNm respective; şi izolarea a cel puţin unui fag din biblioteca de afişare de fagi, cel puţin un fag prezentând anticorpul care se leagă în mod specific de complexul major de histocompatibilitate (MHC) uman de clasă I sau II care este complexat cu antigenul restricţionat de HLA.

Un alt aspect al descrierii este acela de a furniza un anticorp care se leagă în mod specific de un complex major de histocompatibilitate (MHC) uman de clasă I sau II, fiind complexat cu un antigen restricţionat de HLA, în care anticorpul este, de preferinţă, un anticorp policlonal, un anticorp monoclonal, un anticorp bi-specific şi/sau un anticorp himeric.

Metodele respective de producere a unor astfel de anticorpi şi a complexelor majore de histocompatibilitate de clasă I cu lanţ unic, precum şi alte instrumente pentru producerea acestor anticorpi sunt prezentate în WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752 şi în publicaţii (Cohen et al., 2003a; Cohen et al., 2003b; Denkberg et al., 2003).

De preferinţă, anticorpul se leagă cu o afinitate de legare la complex mai mică de 20 nanomoli, de preferinţă mai mică de 10 nanomoli, ceea ce este, de asemenea, considerat ca fiind „specific» în contextul prezentei descrieri.

Prezenta descriere se referă la o peptidă care cuprinde o secvenţă care este selectată din grupul format din SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 288 sau o variantă a acesteia care este cel puţin 88% omologă (de preferinţă identică) cu SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 288 sau o variantă a acesteia care induce celule T care reacţionează încrucişat cu respectiva peptidă, în care respectiva peptidă nu este polipeptida de lungime completă care stă la baza acesteia.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la o peptidă care cuprinde o secvenţă care este selectată din grupul format din SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 288 sau o variantă a acesteia care este cel puţin 88% omologă (de preferinţă identică) cu SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 288, în care respectiva peptidă sau variantă are o lungime totală cuprinsă între 8 şi 100 de aminoacizi,preferabil între 8 şi 30 de aminoacizi şi, cel mai preferabil, între 8 şi 14 aminoacizi.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la peptidele descrise în prezentul document care au capacitatea de a se lega de o moleculă a complexului major de histocompatibilitate (MHC) uman de clasă I sau II.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la peptidele descrise în prezentul document, în care peptida constă sau constă în principal dintr-o secvenţă de aminoacizi conform SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 288.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la peptidele descrise în prezentul document, în care peptid este modificată şi/sau include legături non-peptidice.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la peptidele descrise în prezentul document, în care peptida face parte dintr-o proteină de fuziune, cuprinzând în special aminoacizii N-terminali ai lanţului invariant asociat antigenului HLA-DR (Ii), sau în care peptida este fuzionată cu (sau în) un anticorp, cum ar fi, de exemplu, un anticorp care este specific pentru celulele dendritice.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la un acid nucleic care codifică peptidele descrise în prezentul document, cu condiţia ca peptida să nu fie o proteină umană completă (integrală).

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la acidul nucleic conform descrierii, care este ADN, ADNc, ANP, ARN sau combinaţii ale acestora.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la un vector de exprimare capabil să exprime un acid nucleic aşa cum este descris în prezentul document.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la o peptidă, aşa cum este descrisă în prezentul document, la un acid nucleic, aşa cum este descris în prezentul document, sau la un vector de exprimare, aşa cum este descris în prezentul document, pentru utilizare în medicină, în special în tratamentul pentru HCC, CRC, GB, GC, cancer esofagian, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanom, cancer de glandă mamară, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC sau CLL.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la o celulă-gazdă care cuprinde un acid nucleic aşa cum este descris în prezentul document sau un vector de exprimare aşa cum este descris în prezentul document,

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la celula-gazdă, aşa cum este descrisă în prezentul document, care este o celulă prezentatoare de antigen şi, de preferinţă, o celulă dendritică.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la o metodă de producere a unei peptide, aşa cum este descrisă în prezentul document, metoda respectivă cuprinzând cultivarea celulei-gazdă, aşa cum este descris în prezentul document, şi izolarea peptidei din celula-gazdă sau din mediul de cultură al acesteia.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la metoda, aşa cum este descrisă în prezentul document, în care antigenul este încărcat pe moleculele MHC de clasă I sau II exprimate pe suprafaţa unei celule prezentatoare de antigen adecvate prin punerea în contact a unei cantităţi suficiente de antigen cu o celulă prezentatoare de antigen.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la metoda, aşa cum este descrisă în prezentul document, în care celula prezentatoare de antigen cuprinde un vector de exprimare capabil să exprime respectiva peptidă care conţine SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 288 sau respectiva variantă a secvenţei de aminoacizi.

Prezenta desciere se referă, de asemenea, la celulele T activate, produse prin metoda descrisă în prezentul document, în care aceste celule T recunosc în mod selectiv o celulă care exprimă în mod aberant o polipeptidă care cuprinde o secvenţă de aminoacizi, aşa cum este descrisă în prezentul document.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la o metodă de distrugere a celulelor-ţintă la un pacient, celule-ţintă care exprimă în mod aberant o polipeptidă care cuprinde orice secvenţă de aminoacizi, aşa cum este descrisă în prezentul document, metoda cuprinzând administrarea la pacient a unui număr eficient de celule T, aşa cum este descris în prezentul document.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la utilizarea oricărei peptide descrise, a unui acid nucleic, aşa cum este descris în prezentul document, a unui vector de exprimare, aşa cum este descris în prezentul document, a unei celule, aşa cum este descrisă în prezentul document, sau a unei limfocite T citotoxice activate, aşa cum este descrisă în prezentul document, ca medicament sau la fabricarea unui medicament. Prezenta descriere se referă, de asemenea, la o utilizare conform descrierii, în care medicamentul este activ împotriva cancerului.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la o utilizare conform descrierii, în care medicamentul este un vaccin. Prezenta descriere se referă, de asemenea, la o utilizare conform descrierii, în care medicamentul este activ împotriva cancerului.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la anumite proteine-marker şi biomarkeri pe baza peptidelor prezentate aici, denumite în continuare „ţinte», care pot fi utilizate în diagnosticul şi/sau prognosticul pentru HCC, CRC, GB, GC, cancer esofagian, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, MCC, melanom, cancer de glandă mamară, SCLC, NHL, AML, GBC, GBC, CCC, UBC, UEC sau CLL. Prezenta descriere se referă, de asemenea, la utilizarea acestor ţinte noi pentru tratamentului cancerului.

Termenul „anticorp» sau „anticorpi» este utilizat în prezentul document în sens larg şi include atât anticorpii policlonali, cât şi monoclonali. Pe lângă moleculele de imunoglobulină intacte sau „complete», în termenul de „anticorpi» sunt incluse şi fragmente (de exemplu, CDR, fragmente Fv, Fab şi Fc) sau polimeri ai acestor molecule de imunoglobulină şi versiuni umanizate ale moleculelor de imunoglobulină, atâta timp cât prezintă oricare dintre proprietăţile dorite (de exemplu, legarea specifică de un HCC, CRC, GB, GC, cancer esofagian, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanom, cancer de glandă mamară, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC, sau (poli)peptidă-marker de CLL, administrarea unei toxine la un HCC, CRC, GB, GC, cancer esofagian, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanom, cancer de glandă mamară, SCLC, NHL, AML, GBC, GBC, CCC, UBC, UEC sau celule CLL care exprimă o genă marker-de cancer la un nivel crescut şi/sau inhibarea activităţii unei polipeptide-marker de HCC, CRC, GB, GC, cancer esofagian, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanom, cancer de glandă mamară, SCLC, NHL, AML, GBC, GBC, CCC, UBC, UEC sau CLL), aşa cum este descris în prezentul document.

Ori de câte ori este posibil, anticorpii din descriere pot fi achiziţionaţi din surse comerciale. Anticorpii din descriere pot fi, de asemenea, generaţi prin metode bine cunoscute. Specialistul în domeniu va înţelege că fie polipeptidele-marker de HCC, CRC, GB, GC, cancer esofagian, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanom, cancer de glandă mamară, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC, sau CLL, fie fragmente ale acestora pot fi utilizate pentru a genera anticorpii din prezenta descriere. O polipeptidă care urmează să fie utilizată pentru generarea unui anticorp din descriere poate fi parţial sau complet purificată dintr-o sursă naturală sau poate fi produsă prin tehnici de ADN recombinant.

De exemplu, un ADNc care codifică o peptidă în conformitate cu prezenta descriere, cum ar fi o peptidă conform SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 288, o polipeptidă sau o variantă sau un fragment al acesteia, poate fi exprimat în celule procariote (de exemplu, bacterii) sau în celule eucariote (de exemplu, celule de levuri, de insecte sau de mamifere), după care proteina recombinantă poate fi purificată şi utilizată pentru a genera un preparat de anticorp monoclonal sau policlonal care se leagă în mod specific de polipeptida-marker de HCC, CRC, GB, GC, cancer esofagian, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanom, cancer de glandă mamară, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC sau CLL utilizat pentru a genera anticorpul descris în prezentul document.

Un specialist în domeniu va înţelege că generarea a două sau mai multe seturi diferite de anticorpi monoclonali sau policlonali maximizează probabilitatea de a obţine un anticorp cu specificitatea şi afinitatea necesare pentru utilizarea prevăzută (de exemplu, ELISA, imunohistochimie, imagistică in vivo, terapie cu imunotoxine). Anticorpii sunt testaţi pentru activitatea lor dorită prin metode cunoscute, în conformitate cu scopul pentru care urmează să fie utilizaţi (de exemplu, ELISA, imunohistochimie, imunoterapie etc.; pentru mai multe îndrumări privind generarea şi testarea anticorpilor, a se vedea, de exemplu, Greenfield, 2014 (Greenfield, 2014)). De exemplu, anticorpii pot fi testaţi prin teste ELISA sau prin Western blot, prin colorarea imunohistochimică a cancerelor fixate în formol sau a secţiunilor de ţesut congelate. După caracterizarea lor iniţială in vitro, anticorpii destinaţi utilizării terapeutice sau diagnosticării in vivo sunt testaţi în conformitate cu metodele cunoscute de testare clinică.

Termenul „anticorp monoclonal», aşa cum este utilizat în prezentul document, se referă la un anticorp obţinut dintr-o populaţie substanţial omogenă de anticorpi, adică anticorpii individuali care compun populaţia sunt identici, cu excepţia unor posibile mutaţii naturale care pot fi prezente în cantităţi minore. Anticorpii monoclonali din prezentul document includ în mod specific anticorpi „himerici» în care o porţiune a lanţului greu şi/sau uşor este identică sau omoloagă cu secvenţele corespunzătoare din anticorpii derivaţi dintr-o anumită specie sau aparţinând unei anumite clase sau subclase de anticorpi, în timp ce restul lanţului (lanţurilor) este identic sau omolog cu secvenţele corespunzătoare din anticorpii derivaţi dintr-o altă specie sau aparţinând unei alte clase sau subclase de anticorpi, precum şi fragmente ale unor astfel de anticorpi, atât timp cât prezintă activitatea antagonistă dorită (US 4,816,567).

Anticorpii monoclonali ai descrierii pot fi preparaţi prin metode cu hibridom. Într-o metodă cu hibridom, un şoarece sau un alt animal-gazdă adecvat este imunizat de obicei cu un agent imunizant pentru a obţine limfocite care produc sau sunt capabile să producă anticorpi care se vor lega în mod specific de agentul imunizant. Ca alternativă, limfocitele pot fi imunizate in vitro.

Anticorpii monoclonali pot fi obţinuţi, de asemenea, prin metode de ADN recombinant, cum ar fi cele descrise în US 4,816,567. ADN-ul care codifică anticorpii monoclonali ai descrierii poate fi izolat şi secvenţiat cu uşurinţă folosind proceduri convenţionale (de exemplu, folosind sonde de oligonucleotide care sunt capabile să se lege în mod specific de genele care codifică lanţurile grele şi uşoare ale anticorpilor murini).

Metodele in vitro sunt, de asemenea, adecvate pentru prepararea anticorpilor monovalenţi. Digestia anticorpilor pentru a produce fragmente ale acestora, în special fragmente Fab, poate fi realizată folosind tehnici de rutină cunoscute în domeniu. De exemplu, digestia poate fi efectuată utilizând papaină. Exemple de digestie cu papaină sunt descrise în WO 94/29348 şi US 4,342,566. Digestia cu papaina a anticorpilor produce, de obicei,două fragmente identice de legare a antigenului, numite fragmente Fab, fiecare cu un singur situs de legare a antigenului, şi un fragment Fc rezidual. Tratamentul cu pepsină produce un fragment F(ab')2 şi un fragment pFc'.

Fragmentele de anticorpi, fie că sunt sau nu ataşate la alte secvenţe, pot include, de asemenea, inserţii, eliminări, substituiri sau alte modificări selectate ale anumitor regiuni sau reziduuri specifice de aminoacizi, cu condiţia ca activitatea fragmentului să nu fie modificată sau afectată în mod semnificativ în comparaţie cu anticorpul sau fragmentul de anticorp nemodificat. Aceste modificări pot conferi anumite proprietăţi suplimentare, cum ar fi eliminarea/adăugarea de aminoacizi capabili de legături disulfurice, creşterea biolungimii, modificarea caracteristicilor sale secretorii etc. În orice caz, fragmentul de anticorp trebuie să posede o proprietate bioactivă, cum ar fi activitatea de legare, reglarea legăturii la nivelul domeniului de legare etc. Regiunile funcţionale sau active ale anticorpului pot fi identificate prin mutageneza unei regiuni specifice a proteinei, urmată de exprimarea şi testarea polipeptidei exprimate. Astfel de metode sunt uşor de înţeles pentru un specialist în domeniu şi pot include mutageneza situs-specifică a acidului nucleic care codifică fragmentul de anticorp.

Anticorpii din descriere pot cuprinde, de asemenea, anticorpi umanizaţi sau anticorpi umani. Formele umanizate ale anticorpilor non-umani (de exemplu, murini) sunt imunoglobuline himerice, lanţuri de imunoglobuline sau fragmente ale acestora (cum ar fi Fv, Fab, Fab' sau alte subsecvenţe de legare a antigenului ale anticorpilor) care conţin o secvenţă minimă derivată din imunoglobulina non-umană. Anticorpii umanizaţi includ imunoglobuline umane (anticorp receptor) în care reziduurile dintr-o regiune determinantă complementară (CDR) a receptorului sunt înlocuite cu reziduuri dintr-o CDR a unei specii neumane (anticorp donator), cum ar fi şoarecele, şobolanul sau iepurele, având specificitatea, afinitatea şi capacitatea dorite. În unele cazuri, reziduurile cadrului Fv (FR) din imunoglobulina umană sunt înlocuite cu reziduuri corespunzătoare non-umane. Anticorpii umanizaţi pot cuprinde, de asemenea, reziduuri care nu se găsesc nici în anticorpul receptor, nici în secvenţele CDR importate sau în secvenţele-cadru. În general, anticorpul umanizat va cuprinde în mare parte cel puţin unul şi, de obicei, două domenii variabile, în care toate sau aproape toate regiunile CDR corespund celor ale unei imunoglobuline neumane şi toate sau aproape toate regiunile FR sunt cele ale unei secvenţe consensuale de imunoglobulină umană. În mod optim, anticorpul umanizat va cuprinde, de asemenea, cel puţin o porţiune din regiunea constantă a imunoglobulinei (Fc), de obicei cea a unei imunoglobuline umane.

Metodele de umanizare a anticorpilor non-umani sunt bine cunoscute în domeniu. În general, un anticorp umanizat are una sau mai multe reziduuri de aminoacizi introduse în acesta dintr-o sursă non-umană. Aceste reziduuri de aminoacizi non-umane sunt adeseori denumite reziduuri de „import», care sunt preluate de obicei dintr-un domeniu variabil de „import». Umanizarea poate fi realizată în principal prin înlocuirea CDR-urilor sau a secvenţelor CDR de rozătoare cu secvenţele corespunzătoare ale unui anticorp uman. În consecinţă, astfel de anticorpi „umanizaţi» sunt anticorpi himerici (US 4,816,567), în care o cantitate substanţial mai mică decât un domeniu variabil uman intact a fost înlocuită cu secvenţa corespunzătoare dintr-o specie non-umană. În practică, anticorpii umanizaţi sunt, de obicei, anticorpi umani în care unele reziduuri CDR şi, eventual, unele reziduuri FR sunt înlocuite cu reziduuri din situsuri analoge din anticorpi de rozătoare.

Se pot folosi animale transgenice (de exemplu, şoareci) care sunt capabile, în urma imunizării, să producă un repertoriu complet de anticorpi umani în absenţa producţiei endogene de imunoglobuline. De exemplu, s-a descris faptul că deleţia homozigotă a genei regiunii de joncţiune a lanţului greu al anticorpilor la şoarecii mutanţi himerici şi la şoarecii mutanţi din linia germinală duce la inhibarea completă a producţiei endogene de anticorpi. Transferul matricei genetice de imunoglobuline din linia germinală umană în astfel de şoareci mutanţi din linia germinală va determina producerea de anticorpi umani la provocarea cu antigen. Anticorpii umani pot fi, de asemenea, produşi în biblioteci de afişare de fagi.

Anticorpii din descriere se administrează de preferinţă unui subiect într-un suport acceptabil din punct de vedere farmaceutic. De obicei, în formulă se utilizează o cantitate adecvată de sare acceptabilă din punct de vedere farmaceutic pentru a face formula izotonă. Exemplele de suport acceptabil din punct de vedere farmaceutic includ soluţie salină, soluţie Ringer şi soluţie de dextroză. pH-ul soluţiei este, preferabil, de la aproximativ 5 la aproximativ 8 şi, mai preferabil, de la aproximativ 7 la aproximativ 7,5. Printre alţi suporturi se numără preparatele cu eliberare prelungită, cum ar fi matricile semipermeabile de polimeri hidrofobi solizi care conţin anticorpul, matrici care se prezintă sub formă de articole modelate, de exemplu, pelicule, lipozomi sau microparticule. Este evident pentru specialiştii în domeniu că anumiţi purtători pot fi mai preferabili în funcţie, de exemplu, de calea de administrare şi de concentraţia de anticorp care se administrează.

Anticorpii pot fi administraţi subiectului, pacientului sau celulei prin injectare (de exemplu, intravenoasă, intraperitoneală, subcutanată, intramusculară) sau prin alte metode, cum ar fi perfuzarea, care asigură livrarea lor în fluxul sanguin într-o formă eficace. Anticorpii pot fi, de asemenea, administraţi pe căi intratumorale sau peritumorale, pentru a exercita efecte terapeutice atât locale, cât şi sistemice. Se preferă injectarea locală sau intravenoasă.

Dozele şi programele eficace de administrare a anticorpilor pot fi determinate în mod empiric, iar efectuarea unor astfel de determinări este de competenţa specialistului în domeniu. Specialiştii în domeniu vor înţelege că doza de anticorp care trebuie administrată va varia în funcţie, de exemplu, de subiectul care va primi anticorpul, de calea de administrare, de tipul special de anticorp utilizat şi de alte medicamente care se administrează. O doză zilnică tipică a anticorpului utilizat singur poate varia de la aproximativ 1 µg/kg până la 100 mg/kg de greutate corporală sau mai mult pe zi, în funcţie de factorii menţionaţi mai sus. În urma administrării unui anticorp, de preferinţă pentru a trata HCC, CRC, GB, GC, cancerului esofagian, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanom, cancer de glandă mamară, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC sau CLL, eficacitatea anticorpului terapeutic poate fi evaluată în diverse moduri bine cunoscute de către practicianul experimentat. De exemplu, dimensiunea, numărul şi/sau distribuţia cancerului la un subiect care primeşte tratament pot fi monitorizate cu ajutorul tehnicilor standard de imagistică tumorală. Un anticorp administrat în scop terapeutic care opreşte creşterea tumorii, determină reducerea tumorii şi/sau previne dezvoltarea de noi tumori, în comparaţie cu evoluţia bolii care ar apărea în absenţa administrării anticorpului, este un anticorp eficace pentru tratarea cancerului.

Un alt aspect al descrierii este acela de a furniza o metodă de producere a unui receptor solubil de celule T (sTCR) care recunoaşte un complex peptidă-MHC specific. Astfel de receptori solubili de celule T pot fi generaţi din clone specifice de celule T, iar afinitatea lor poate fi crescută prin mutageneză care vizează regiunile care determină complementaritatea. În scopul selectării receptorilor de celule T, se poate utiliza afişarea de fagi (US 2010/0113300, (Liddy et al., 2012)). În scopul stabilizării receptorilor de celule T în timpul afişării de fag şi în cazul utilizării practice ca medicament, lanţul alfa şi lanţul beta pot fi legate, de exemplu, prin legături disulfidice non-native, alte legături covalente (receptor de celule T cu un singur lanţ) sau prin domenii de dimerizare (Boulter et al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et al., 1999). Receptorul de celule T poate fi legat de toxine, medicamente, citokine (a se vedea, de exemplu, US 2013/0115191) şi domenii care recrutează celulele efectoare, cum ar fi un domeniu anti-CD3 etc., pentru a executa anumite funcţii asupra celulelor-ţintă. În plus, ar putea fi exprimat în celulele T utilizate pentru transferul adoptiv. Informaţii suplimentare pot fi găsite în WO 2004/033685A1 şi WO 2004/074322A1. O combinaţie de sTCR-uri este descrisă în WO 2012/056407A1. Alte metode de producţie sunt descrise în WO 2013/057586A1.

În plus, peptidele şi/sau TCR-urile sau anticorpii sau alte molecule de legare din prezenta descriere pot fi utilizate pentru a verifica diagnosticul de cancer pus de un anatomopatolog pe baza unui eşantion biopsiat.

Anticorpii sau TCR-urile pot fi, de asemenea, utilizate pentru teste de diagnosticare in vivo. În general, anticorpul este marcat cu un radionucleotid (cum ar fi 111In, 99Tc, 14C, 131I, 3H, 32P sau 35S), astfel încât tumoarea să poată fi localizată prin imunoscintigrafie. Într-una dintre concretizări, anticorpii sau fragmentele acestora se leagă de domeniile extracelulare a două sau mai multe ţinte ale unei proteine selectate din grupul format din proteinele menţionate mai sus, iar valoarea afinităţii (Kd) este mai mică de 1 x 10 µM.

Anticorpii pentru diagnosticare pot fi marcaţi cu sonde care pot fi detectate prin diferite metode de imagistică. Metodele de detectare a sondelor includ, fără a se limita la acestea, microscopia fluorescentă, luminoasă, confocală şi electronică; imagistica prin rezonanţă magnetică şi spectroscopia; fluoroscopia, tomografia computerizată şi tomografia cu emisie de pozitroni. Sondele adecvate includ, dar nu se limitează la fluoresceină, rodamină, eozină şi alţi fluorofori, radioizotopi, aur, gadoliniu şi alte lantanide, fier paramagnetic, fluor-18 şi alţi radionuclizi emiţători de pozitroni. În plus, sondele pot fi bifuncţionale sau multifuncţionale şi pot fi detectabile prin mai mult de una dintre metodele enumerate. Aceşti anticorpi pot fi marcaţi direct sau indirect cu sondele menţionate. Ataşarea sondelor la anticorpi include ataşarea covalentă a sondei, încorporarea sondei în anticorp şi ataşarea covalentă a unui compus chelator pentru legarea sondei, printre alte metode bine cunoscute în domeniu. Pentru imunohistochimie, eşantionul de ţesut bolnav poate fi proaspăt sau congelat sau poate fi inclus în parafină şi fixat cu un conservant, cum ar fi formalina. Secţiunea fixată sau înglobată conţine eşantionul şi este pusă în contact cu un anticorp primar marcat şi un anticorp secundar, anticorpul fiind utilizat pentru a detecta exprimarea proteinelor in situ.

Un alt aspect al prezentei descrieri include o metodă in vitro pentru producerea de celule T activate, metoda cuprinzând punerea în contact a celulelor T in vitro cu molecule MHC umane încărcate cu antigen, exprimate pe suprafaţa unei celule prezentatoare de antigen adecvate, pentru o perioadă de timp suficientă pentru a activa celula T într-o manieră specifică antigenului, în care antigenul este o peptidă descrisă în prezentul document. De preferinţă, se utilizează o cantitate suficientă de antigen cu o celulă prezentatoare de antigen.

De preferinţă, celulei de mamifer îi lipseşte sau are un nivel sau o funcţie redusă a transportatorului de peptide TAP. Celulele adecvate care nu au transportorul de peptide TAP includ celulele T2, RMA-S şi Drosophila. TAP este transportatorul asociat cu procesarea antigenului.

Linia celulară umană T2 cu deficit de încărcare a peptidelor este disponibilă la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, SUA, cu nr. de catalog CRL 1992; linia celulară de Drosophila Schneider line 2 este disponibilă la ATCC cu nr. de catalog CRL 19863; linia celulară RMA-S de şoarece este descrisă în Ljunggren et al. (Ljunggren şi Karre, 1985).

De preferinţă, înainte de transfectare, celula-gazdă nu exprimă practic nicio moleculă MHC de clasă I. Se preferă, de asemenea, ca celula stimulatoare să exprime o moleculă importantă pentru furnizarea unui semnal costimulator pentru celulele T, cum ar fi oricare dintre B7.1, B7.2, ICAM-1 şi LFA 3. Secvenţele de acid nucleic ale numeroaselor molecule MHC de clasă I şi ale moleculelor costimulatoare sunt disponibile în mod public în bazele de date GenBank şi EMBL.

În cazul în care un epitop MHC de clasă I este utilizat ca antigen, celulele T sunt celule T CD8-pozitive.

În cazul în care o celulă prezentatoare de antigen este transfectată pentru a exprima un astfel de epitop, de preferinţă, celula cuprinde un vector de exprimare capabil să exprime o peptidă care conţine SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 288 sau o variantă a secvenţei de aminoacizi a acesteia.

O serie de alte metode pot fi utilizate pentru a genera celule T in vitro. De exemplu, în generarea de CTL-uri se pot utiliza limfocite autologe care infiltrează tumorile. Plebanski et al. (Plebanski et al., 1995) au utilizat limfocite autologe din sânge periferic (PLB) în prepararea celulelor T. În plus, este posibilă producerea de celule T autologe prin pulsarea celulelor dendritice cu peptide sau polipeptide, sau prin infectarea cu virusuri recombinante. De asemenea, celulele B pot fi utilizate în producţia de celule T autologe. În plus, macrofagele pulsate cu peptide sau polipeptide sau infectate cu un virus recombinant pot fi utilizate la prepararea de celule T autologe. S. Walter et al. (Walter et al., 2003) descriu amorsarea in vitro a celulelor T prin utilizarea de celule prezentatoare de antigen artificiale (aAPC), aceasta reprezentând, de asemenea, o modalitate potrivită de generare de celule T pentru peptida aleasă. În prezenta descriere, aAPC-urile au fost generate prin cuplarea complexelor MHC-peptidă preformate la suprafaţa particulelor de polistiren (microbile) prin biochimie biotină:streptavidină. Acest sistem permite controlul exact al densităţii MHC pe aAPC-uri, ceea ce permite obţinerea selectivă de răspunsuri de celule T specifice antigenului cu aciditate mare sau mică, cu eficacitate ridicată, din probe de sânge. Pe lângă complexele MHC:peptidă, celulele aAPC trebuie să poarte alte proteine cu activitate de co-stimulare, cum ar fi anticorpi anti-CD28 cuplaţi pe suprafeţele lor. În plus, astfel de sisteme bazate pe aAPC-uri necesită adesea adăugarea de factori solubili corespunzători, de exemplu citokine, cum ar fi interleukina-12.

La prepararea celulelor T se pot utiliza, de asemenea, celule alogene, iar o metodă este descrisă în detaliu în WO 97/26328. De exemplu, pe lângă celulele Drosophila şi celulele T2, pot fi utilizate şi alte celule pentru a prezenta antigeni, cum ar fi celule CHO, celule de insecte infectate cu baculovirus, bacteriile, levuri şi celule-ţintă infectate cu vaccinia. În plus, se pot utiliza virusuri de plante (vezi, de exemplu, Porta et al. (Porta et al., 1994), care descriu dezvoltarea virusului mozaicului din Vigna unguiculata ca fiind un sistem cu productivitate ridicată pentru prezentarea de peptide străine.

Celulele T activate care sunt direcţionate împotriva peptidelor din descriere sunt utile în terapie. Astfel, un alt aspect al descrierii furnizează celule T activate care pot fi obţinute prin metodele de mai sus ale descrierii.

Celulele T activate, care sunt produse prin metoda de mai sus, vor recunoaşte selectiv o celulă care exprimă în mod aberant o polipeptidă care cuprinde o secvenţă de aminoacizi din SEQ ID NO: 1 până la SEQ ID NO: 288.

De preferinţă, celula T recunoaşte celula prin interacţiune, prin intermediul TCR-ului său, cu complexul HLA-peptidă (de exemplu, legare). Celulele T sunt utile într-o metodă de distrugere a celulelor-ţintă la un pacient ale cărui celule-ţintă exprimă în mod aberant o polipeptidă care cuprinde o secvenţă de aminoacizi din descriere, în care pacientului i se administrează un număr eficient de celule T activate. Celulele T care sunt administrate pacientului pot fi derivate de la pacient şi activate aşa cum s-a descris mai sus (adică sunt celule T autologe). Alternativ, celulele T nu provin de la pacient, ci de la un alt individ. Desigur, este de preferat ca sursa să fie un individ sănătos. Prin „individ sănătos», inventatorii înţeleg că individul este, în general, într-o stare de sănătate bună, de preferinţă are un sistem imunitar competent şi, mai ales, nu suferă de nicio boală care poate fi uşor testată şi detectată.

In vivo, celulele-ţintă pentru celulele T CD8-pozitive conform prezentei descieri pot fi celule ale tumorii (care uneori exprimă MHC de clasă II) şi/sau celule stromale care înconjoară tumoarea (celule tumorale) (care uneori exprimă, de asemenea, MHC de clasă II; (Dengjel et al., 2006)).

Celulele T din prezenta descriere pot fi utilizate ca ingrediente active ale unei compoziţii terapeutice. În consecinţă, descrierea furnizează şi o metodă de distrugere a celulelor ţintă la un pacient ale cărui celule ţintă exprimă aberant o polipeptidă care conţine o secvenţă de aminoacizi din descriere, metoda constând în administrarea unui număr eficient de celule T pacientului, aşa cum s-a arătat mai sus.

Prin „exprimată aberant», inventatorii înţeleg, de asemenea, că polipeptida este supraexprimată în comparaţie cu nivelurile normale de exprimare sau că gena este silenţioasă în ţesutul din care provine tumoarea, însă este exprimată în tumoare. Prin „supraexprimată'', inventatorii înţeleg că polipeptida este prezentă la un nivel de cel puţin 1,2 ori mai mare decât cel prezent în ţesutul normal; preferabil, la un nivel de cel puţin 2 ori şi, mai preferabil, la un nivel de cel puţin 5 ori sau 10 ori mai mare decât cel prezent în ţesutul normal.

Celulele T pot fi obţinute prin metode cunoscute în domeniu, de exemplu cele descrise mai sus.

Protocoalele pentru acest aşa-numit transfer adoptiv de celule T sunt bine cunoscute în domeniu. Recenzii pot fi găsite în: Gattioni et al. şi Morgan et al. (Gattinoni et al., 2006; Morgan et al., 2006).

Un alt aspect al prezentei descrieri include utilizarea peptidelor complexate cu MHC pentru a genera un receptor de celule T al cărui acid nucleic este clonat şi este introdus într-o celulă-gazdă, de preferinţă o celulă T. Această celulă T modificată poate fi apoi transferată unui pacient pentru tratarea cancerului.

Orice moleculă a descrierii, şi anume peptida, acidul nucleic, anticorpul, vectorul de exprimare, celula, celula T activată, receptorul de celule T sau acidul nucleic care o codifică, este utilă pentru tratarea tulburărilor caracterizate prin faptul că celulele scapă unui răspuns imunitar. În consecinţă, orice moleculă din prezenta descriere poate fi utilizată ca medicament sau pentru fabricarea unui medicament. Molecula poate fi utilizată ca atare sau combinată cu altă (altee) moleculă (molecule) a(le) descrierii sau cu o moleculă (molecule) cunoscută (cunoscute).

Prezenta descriere furnizează, de asemenea, un medicament care este util în tratarea cancerului, în special HCC, CRC, GB, GC, cancer esofagian, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanom, cancer de glandă mamară, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC, sau CLL şi alte malignităţi.

Prezenta descriere se referă, de asemenea, la o trusă care cuprinde:

(a) un recipient care conţine o compoziţie farmaceutică aşa cum este descrisă mai sus, în soluţie sau sub formă liofilizată; (b) opţional, un al doilea recipient care conţine un diluant sau o soluţie de reconstituire pentru formula liofilizată; şi (c) opţional, instrucţiuni pentru (i) utilizarea soluţiei sau (ii) reconstituirea şi/sau utilizarea formulei liofilizate.

Trusa poate conţine suplimentar şi una sau mai multe din următoarele: (iii) soluţie tampon, (iv) dizolvant, (v) filtru, (vi) ac sau (v) seringă. Recipientul este în mod preferabil o sticlă, o fiolă, o seringă sau o eprubetă şi poate fi un recipient reutilizabil. Compoziţia farmaceutică este, de preferinţă, liofilizată.

Trusele din prezenta descriere cuprind, de preferinţă, o formulă liofilizată a prezentei descrieri într-un recipient adecvat şi instrucţiuni pentru reconstituirea şi/sau utilizarea acesteia. Recipientele adecvate includ, de exemplu, sticle, flacoane (de exemplu, flacoane cu două camere), seringi (cum ar fi seringile cu două camere) şi eprubete. Recipientul poate fi format dintr-o varietate de materiale, cum ar fi sticla sau plasticul. De preferinţă, trusa şi/sau recipientul conţin instrucţiuni pe sau asociate cu recipientul care indică instrucţiunile de reconstituire şi/sau de utilizare. De exemplu, eticheta poate indica dacă formula liofilizată trebuie reconstituită la o concentraţie a peptidelor descrisă anterior. În plus eticheta poate indica dacă formula este utilizabilă sau destinată pentru administrare subcutanată.

Recipientul care conţine formula poate fi o fiolă pentru utilizări multiple, care permite administrarea repetată (de exemplu, 2-6 administrări) a formulei reconstituite. Trusa poate include în plus şi un al doilea recipient care conţine un dizolvant adecvat (de exemplu, soluţie de bicarbonat de sodiu).

La amestecarea dizolvantului cu formula liofilizată, concentraţia finală de peptide în formula reconstituită este preferabil de cel puţin 0,15 mg/ml/peptidă (=75 μg) şi, preferabil, nu depăşeşte 3 mg/ml/peptidă (=1500 μg). Trusa poate include, de asemenea, alte materiale de dorit din punct de vedere comercial şi al utilizatorului, inclusiv alţi tampoane, diluanţi, filtre, ace, seringi şi prospecte cu instrucţiuni de utilizare.

Trusele din prezenta descriere pot avea un singur recipient care conţine formularea compoziţiilor farmaceutice conform prezentei descrieri cu sau fără alte componente (de exemplu, alţi compuşi sau compoziţii farmaceutice din aceşti alţi compuşi) sau pot avea recipiente distincte pentru fiecare componentă.

De preferinţă, trusele descrierii includ o formulare a descrierii ambalată pentru a fi utilizată în combinaţie cu co-administrarea unui al doilea compus (cum ar fi adjuvanţi (de exemplu, GM-CSF), un agent chimioterapeutic, un produs natural, un hormon sau un antagonist, un agent sau un inhibitor anti-angiogeneză, un agent care induce apoptoza sau un chelator) sau o compoziţie farmaceutică a acestuia. Componentele trusei pot fi precomplexate sau fiecare componentă poate fi într-un recipient separat şi distinct înainte de a fi administrată unui pacient. Componentele trusei pot fi furnizate în una sau mai multe soluţii lichide, preferabil, o soluţie apoasă, mai preferabil, o soluţie apoasă sterilă. Componentele trusei pot fi, de asemenea, furnizate sub formă de solide, care pot fi transformate în lichide prin adăugarea de solvenţi adecvaţi, care sunt de preferinţă furnizate într-un alt recipient distinct.

Recipientul unei truse terapeutice poate fi un flacon, o eprubetă, un balon, o sticlă, o seringă sau orice alt mijloc de înglobare a unui solid sau a unui lichid. De obicei, atunci când există mai mult de o componentă, trrusa va conţine un al doilea flacon sau un alt recipient, care permite o dozare separată. Trusa poate conţine, de asemenea, un alt recipient pentru un lichid acceptabil din punct de vedere farmaceutic. De preferinţă, o trusă terapeutică va conţine un aparat (de exemplu, unul sau mai multe ace, seringi, picături pentru ochi, pipetă etc.), care permite administrarea agenţilor din descriere care sunt componente ale prezentei truse.

Prezenta formulă este una care este adecvată pentru administrarea peptidelor pe orice cale acceptabilă, cum ar fi cea orală (enterală), nazală, oftalmică, subcutanată, intradermică, intramusculară, intravenoasă sau transdermică. De preferinţă, administrarea este s.c. şi, cel mai preferabil, administrarea i.d. poate fi efectuată cu ajutorul unei pompe de perfuzare.

Deoarece peptidele din prezenta descriere au fost izolate din HCC, CRC, GB, GC, cancer esofagian, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanom, cancer de glandă mamară, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC şi CLL, medicamentul din prezenta descriere este utilizat de preferinţă în tratamentul pentru HCC, CRC, GB, GC, cancer esofagian, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanom, cancer de glandă mamară, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC şi CLL.

Pe lângă utilitatea lor în tratamentul cancerului, peptidele care fac obiectul prezentei descrieri sunt utile şi în scop diagnostic. Deoarece peptidele au fost generate din celule de HCC, CRC, GB, GC, cancer esofagian, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanom, cancer de glandă mamară, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC şi CLL şi deoarece s-a stabilit că aceste peptide nu sunt prezente în ţesuturile normale sau sunt prezente la niveluri mai scăzute în ţesuturile normale, aceste peptide pot fi utilizate pentru a diagnostica prezenţa unui cancer.

Prezenţa peptidelor revendicate pe biopsiile de ţesut în eşantioanele de sânge poate ajuta un patolog în diagnosticarea cancerului. Detectarea anumitor peptide cu ajutorul anticorpilor, al spectrometriei de masă sau al altor metode cunoscute în domeniu poate informa patologul că eşantionul de ţesut este malign, inflamat sau, în general, bolnav, sau poate fi utilizată ca biomarker pentru HCC, CRC, GB, GC, cancer esofagian, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA, OC, MCC, melanom, cancer de glandă mamară, SCLC, NHL, AML, GBC, CCC, UBC, UEC sau CLL. Prezenţa unor grupuri de peptide poate permite clasificarea sau subclasificarea ţesuturilor bolnave.

Detectarea peptidelor pe eşantioane de ţesut bolnav poate permite luarea unei decizii cu privire la beneficiile terapiilor care implică sistemul imunitar, în special dacă se ştie sau se aşteaptă ca limfocitele T să fie implicate în mecanismul de acţiune. Pierderea exprimării MHC este un mecanism bine descris prin care celulele maligne infectate scapă de imunosupraveghere.

Astfel, prezenţa peptidelor arată că acest mecanism nu este exploatat de celulele analizate.

Peptidele din prezenta descriere ar putea fi utilizate pentru a analiza răspunsurile limfocitelor împotriva acestor peptide, cum ar fi răspunsurile celulelor T sau răspunsurile anticorpilor împotriva peptidei sau a peptidei complexate cu molecule MHC. Aceste răspunsuri limfocitare pot fi utilizate ca markeri de prognostic pentru a lua o decizie privind etapele ulterioare de tratament. Aceste răspunsuri pot fi, de asemenea, utilizate ca markeri de răspuns surogat în abordările imunoterapeutice care au drept scop inducerea de răspunsuri limfocitare prin diferite mijloace, de exemplu, vaccinare cu proteine, acizi nucleici, materiale autologe, transfer adoptiv de limfocite. În cadrul terapiei genice, răspunsurile limfocitelor împotriva peptidelor pot fi luate în considerare în evaluarea efectelor secundare. Monitorizarea răspunsurilor limfocitare ar putea fi, de asemenea, un instrument valoros pentru examinările de urmărire a terapiilor de transplant, de exemplu pentru detectarea bolilor grefă versus gazdă şi gazdă versus grefă.

FIGURI

Figura 1 prezintă suprareprezentarea diferitelor peptide în diferite ţesuturi canceroase în comparaţie cu ţesuturile normale. Analizele au inclus date din peste 170 de eşantioane de ţesut normal şi 376 de eşantioane de cancer. Sunt prezentate doar eşantioanele în care s-a constatat prezenţa peptidei. Figura 1A) Genă: CENPE, Peptidă: KLQEKIQEL (SEQ ID NO: 1), Ţesuturi (de la stânga la dreapta): 4 linii celulare de cancer leucocitar, 1 linie celulară de cancer pancreatic, 1 linie celulară de melanom, 2 eşantioane de ţesut normal (1 glandă suprarenală, 1 splină), 31 de eşantioane de ţesut canceros primar (1 cancer cerebral, 4 cancere de colon, 1 cancer esofagian, 1 cancer renal, 2 cancere hepatice, 16 cancere pulmonare, 4 cancere ovariene, 1 cancer rectal, 1 cancer gastric), Figura 1B) Genă: KIF15, Peptidă: QLIEKNWLL (SEQ ID NO: 10), Ţesuturi (de la stânga la dreapta): 5 linii celulare de cancer leucocitar, 1 linie celulară de cancer pancreatic, 1 linie celulară de leucemie mieloidă, 1 eşantion de ţesut normal (1 glandă suprarenală), 29 de eşantioane de ţesut canceros (4 cancere de colon, 2 cancere esofagiene, 1 cancer leucocitar, 1 cancer hepatic, 10 cancere pulmonare, 11 cancere ovariene), Figura 1C) Genă: HAVCR1, Peptidă: LLDPKTIFL (SEQ ID NO: 11), Ţesuturi (de la stânga la dreapta): 1 linie celulară de cancer renal, 13 probe de ţesuturi canceroase (8 cancere renale, 1 cancer hepatic, 2 cancere pulmonare, 2 cancere rectale), Figura 1D) Genă: RPGRIP1L, Peptidă: RLHDENILL (SEQ ID NO: 13), Ţesuturi (de la stânga la dreapta): 1 linie celulară de cancer renal, 1 linie celulară de cancer de prostată, 1 linie celulară de melanom, 50 de eşantioane de ţesuturi canceroase (4 cancere cerebrale, 1 cancer de colon, 2 cancere esofagiene, 3 cancere renale, 2 cancere hepatice, 23 de cancere pulmonare, 7 cancere ovariene, 2 cancere pancreatice, 2 cancere de prostată, 3 cancere rectale, 1 cancer gastric). Figurile 1E - 1J arată suprareprezentarea diferitelor peptide în diferite ţesuturi canceroase în comparaţie cu ţesuturile normale. Analizele au inclus date din peste 320 de eşantioane de ţesut normal şi 462 de eşantioane de cancer. Sunt prezentate doar eşantioanele în care s-a constatat prezenţa peptidei. Figura 1E) Genă: DNAH14, Peptidă: SVLEKEIYSI (SEQ ID NO: 2), Ţesuturi (de la stânga la dreapta): 4 linii celulare (3 celule sanguine, 1 pancreas, 2 ţesuturi normale (1 ganglion limfatic, 1 trahee), 52 de ţesuturi canceroase (2 cancere de canal biliar, 1 cancer de celule mieloide, 3 cancere de leucemie leucocitară, 5 cancere de glandă mamară, 1 cancer esofagian, 1 cancer de esofag şi stomac, 1 cancer de vezică biliară, 4 cancere de colon, 7 cancere pulmonare, 6 cancere de ganglioni limfatici, 7 cancere ovariene, 4 cancere de prostată, 4 cancere de piele, 2 cancere de vezică urinară, 4 cancere de uter), Figura 1F) Gene: MAGEA3, MAGEA6, Peptidă: KIWEELSVLEV (SEQ ID NO: 40), Ţesuturi (de la stânga la dreapta): 8 ţesuturi canceroase (1 cancer hepatic, 3 cancere pulmonare, 2 cancere de piele, 1 cancer de stomac, 1 cancer de vezică urinară), Figura 1G) Genă: HMX1, Peptidă: FLIENLLAA (SEQ ID NO: 67), Ţesuturi (de la stânga la dreapta): 7 ţesuturi canceroase (4 cancere cerebrale, 2 cancere pulmonare, 1 cancer uterin), Figura 1H) Genă: CCDC138, Peptidă: FLLEREQLL (SEQ ID NO: 84), Ţesuturi (de la stânga la dreapta): 3 linii celulare (2 celule sanguine, 1 piele), 24 de ţesuturi canceroase (1 cancer de celule mieloide, 3 cancere de leucemie leucocitară, 1 cancer de măduvă osoasă, 1 cancer de glandă mamară, 1 cancer renal, 2 cancere de colon, 3 cancere rectale, 1 cancer pulmonar, 7 cancere de ganglioni limfatici, 3 cancere de vezică urinară, 1 cancer uterin), Figura 1I) Genă: CLSPN, Peptidă: SLLNQPKAV (SEQ ID NO: 235), Ţesuturi (de la stânga la dreapta): 13 linii celulare (3 celule sanguine, 2 rinichi, 8 pancreas), 30 de ţesuturi canceroase (1 cancer de celule mieloide, 1 cancer de leucemie leucocitară, 2 cancere cerebral, 2 cancere de glandă mamară, 2 cancere esofagiene, 1 cancer de vezică biliară, 1 cancer rectal, 2 cancere hepatice, 4 cancere pulmonare, 5 cancere de ganglioni limfatici, 2 cancere ovariene, 2 cancere de piele, 4 cancere de vezică urinară, 1 cancer uterin), Figura 1J) Genă: SPC25, Peptidă: GLAEFQENV (SEQ ID NO: 243), Ţesuturi (de la stânga la dreapta): 3 linii celulare (1 celule sanguine, 1 rinichi, 1 pancreas), 67 de ţesuturi canceroase (1 cancer de canal biliar, 4 cancere de leucemie leucocitară, 1 cancer de celule mieloide, 2 cancere cerebrale, 3 cancere de glandă mamară, 4 cancere esofagiene, 2 cancere de vezică biliară, 2 cancere de colon, 1 cancer rectal, 2 cancere hepatice, 15 cancere pulmonare, 8 cancere de ganglioni limfatici, 9 cancere ovariene, 3 cancere de piele, 4 cancere de vezică urinară, 6 cancere uterine).

Figura 2 prezintă exemple de profiluri de exprimare (exprimare relativă în comparaţie cu rinichiul normal) ale genelor-sursă din prezenta descriere care sunt puternic supraexprimate sau exclusiv exprimate în diferite tipuri de cancer în comparaţie cu un panel de ţesuturi normale. Figura 2A) PRIM2 - Ţesuturi (de la stânga la dreapta): glandă suprarenală, arteră, măduvă osoasă, creier (întreg), glandă mamară, colon, esofag, inimă, rinichi (triplicat), leucocite, ficat, plămân, ganglion limfatic, ovar, pancreas, placentă, prostată, glandă salivară, muşchi scheletic, piele, intestin subţire, splină, splină, stomac, testicul, timus, glandă tiroidă, vezica urinară, col uterin, uter, venă (fiecare eşantion normal reprezintă un grup de mai mulţi donatori), 22 de eşantioane individuale de cancer de prostată, Figura 2B) CHEK1 - Ţesuturi (de la stânga la dreapta): glandă suprarenală, arteră, măduvă osoasă, creier (întreg), glandă mamară, colon, esofag, inimă, rinichi (triplicat), leucocite, ficat, plămân, ganglion limfatic, ovar, pancreas, placentă, prostată, glandă salivară, muşchi scheletic, piele, intestin subţire, splină, stomac, testicul, timus, glandă tiroidă, vezică urinară, col uterin, uter, venă (fiecare eşantion normal reprezintă un grup de mai mulţi donatori), 3 eşantioane individuale de colon normal, 10 eşantioane individuale de cancer colorectal, Figura 2C) TTC30A - Ţesuturi (de la stânga la dreapta): glandă suprarenală, arteră, măduvă osoasă, creier (întreg), glandă mamară, colon, esofag, inimă, rinichi (triplicat), leucocite, ficat, plămân, ganglion limfatic, ovar, pancreas, placentă, prostată, glandă salivară, muşchi scheletic, piele, intestin subţire, splină, splină, stomac, testicul, timus, glandă tiroidă, vezica urinară, col uterin, uter, venă (fiecare eşantion normal reprezintă un grup de mai mulţi donatori), 30 de eşantioane individuale de cancer cerebral, Figura 2D) TRIP13 - Ţesuturi (de la stânga la dreapta): glandă suprarenală, arteră, măduvă osoasă, creier (întreg), sân, colon, esofag, inimă, rinichi (în trei exemplare), leucocite, ficat, plămân, ganglion limfatic, ovar, pancreas, placentă, prostată, glandă salivară, muşchi scheletic, piele, intestin subţire, splină, stomac, testicul, timus, glanda tiroidă, vezica urinară, col uterin, uter, venă (fiecare eşantion normal reprezintă un grup de mai mulţi donatori), 1 eşantion individual de plămân normal, 38 de eşantioane individuale de cancer pulmonar, Figura 2E) MXRA5 - Ţesuturi (de la stânga la dreapta): glandă suprarenală, arteră, măduvă osoasă, creier (întreg), glandă mamară, colon, esofag, inimă, rinichi (triplicat), leucocite, ficat, plămân, ganglion limfatic, ovar, pancreas, placentă, prostată, glandă salivară, muşchi scheletic, piele, intestin subţire, splină, stomac, testicul, timus, glanda tiroidă, vezica urinară, col uterin, uter, venă (fiecare eşantion normal reprezintă un grup de mai mulţi donatori), 9 eşantioane individuale de cancer pancreatic. Figurile 2F - 2H prezintă exemple de profiluri de exprimare ale genelor-sursă din prezenta descriere care sunt puternic supraexprimate sau exclusiv exprimate în cancer într-un panel de ţesuturi normale (bare albe) şi în diferite eşantioane de cancer (bare negre). Figura 2F) MMP11, MMP13 (SEQ ID NO: 24) - Ţesuturi (de la stânga la dreapta): 80 de eşantioane de ţesut normal (6 artere, 2 celule sanguine, 2 creiere, 1 inimă, 2 ficaţi, 3 plămâni, 2 vene, 1 ţesut adipos, 1 glandă suprarenală, 5 măduve osoase, 1 cartilaj, 1 colon, 1 esofag, 2 ochi, 2 vezici biliare, 1 rinichi, 6 ganglioni limfatici, 4 pancreasuri, 2 nervi periferici, 2 glande hipofizare, 1 rect, 2 glande salivare, 2 muşchi scheletici, 1 piele, 1 intestin subţire, 1 splină, 1 stomac, 1 glandă tiroidă, 7 trahei, 1 vezică urinară, 1 glandă mamară, 5 ovare, 5 placente, 1 prostată, 1 testicul, 1 timus, 1 uter), 50 de eşantioane de cancer (10 cancere de glandă mamară, 4 cancere de canal biliar, 6 cancere de vezică biliară, 11 cancere esofagiene, 10 cancere de vezică urinară, 10 cancere uterine), Figura 2G) HORMAD1 (SEQ ID NO: 168) - Ţesuturi (de la stânga la dreapta): 80 de eşantioane de ţesut normal (6 artere, 2 celule sanguine, 2 creiere, 1 inimă, 2 ficaţi, 3 plămâni, 2 vene, 1 ţesut adipos, 1 glandă suprarenală, 5 măduve osoase, 1 cartilaj, 1 colon, 1 esofag, 2 ochi, 2 vezici biliare, 1 rinichi, 6 ganglioni limfatici, 4 pancreasuri, 2 nervi periferici, 2 glande hipofizare, 1 rect, 2 glande salivare, 2 muşchi scheletici, 1 piele, 1 intestin subţire, 1 splină, 1 stomac, 1 glandă tiroidă, 7 trahei, 1 vezică urinară, 1 glandă mamară, 5 ovare, 5 placente, 1 prostată, 1 testicul, 1 timus, 1 uter), 41 de eşantioane de cancer (10 cancere de glandă mamară, 10 cancere de piele, 11 cancere pulmonare non-microcelulare, 10 cancere pulmonare microcelulare), Figura 2H) IGF2BP1, IGF2BP3 (SEQ ID NO: 274) - Ţesuturi de la stânga la dreapta): 80 de eşantioane de ţesut normal (6 artere, 2 celule sanguine, 2 creiere, 1 inimă, 2 ficaţi, 3 plămâni, 2 vene, 1 ţesut adipos, 1 glandă suprarenală, 5 măduve osoase, 1 cartilaj, 1 colon, 1 esofag, 2 ochi, 2 vezici biliare, 1 rinichi, 6 ganglioni limfatici, 4 pancreasuri, 2 nervi periferici, 2 glande hipofizare, 1 rect, 2 glande salivare, 2 muşchi scheletici, 1 piele, 1 intestin subţire, 1 splină, 1 stomac, 1 glandă tiroidă, 7 trahei, 1 vezică urinară, 1 glandă mamară, 5 ovare, 5 placente, 1 prostată, 1 testicul, 1 timus, 1 uter), 53 de eşantioane de cancer (4 cancere de canal biliar, 6 cancere de vezică biliară, 10 cancere de ganglioni limfatici, 12 cancere ovariene, 11 cancere esofagiene, 10 cancere pulmonare).

Figura 3 prezintă exemple de date privind imunogenitatea: rezultate ale citometriei în flux după colorarea multimerului specific peptidelor.

Figura 4A-R prezintă în partea superioară: intensităţile mediane ale semnalului MS din măsurătorile de replicare tehnică sunt reprezentate sub formă de puncte colorate pentru eşantioanele singulare HLA-A*02 pozitive normale (puncte verzi sau gri) şi pentru eşantioanele tumorale (puncte roşii) pe care a fost detectată peptida. Eşantioanele tumorale şi normale sunt grupate în funcţie de organul de origine, iar diagramele „casetă şi mustăţi» reprezintă mediana, percentila 25 şi 75 (caseta), precum şi minimul şi maximul (mustăţile) intensităţilor de semnal normalizate pe mai multe eşantioane. Organele normale sunt ordonate în funcţie de categoriile de risc (celule sanguine, sistem cardiovascular, creier, ficat, plămâni: risc ridicat, puncte de culoare verde închis; organe de reproducere, glandă mamară, prostată: risc scăzut, puncte gri; toate celelalte organe: risc mediu; puncte de culoare verde deschis). Partea de jos: Frecvenţa relativă de detectare a peptidelor în fiecare organ este prezentată sub formă de grafic „spineplot». Numerele de sub panou indică numărul de eşantioane în care a fost detectată peptida din numărul total de eşantioane analizate pentru fiecare organ (N = 298 pentru eşantioane normale, N = 461 pentru eşantioane tumorale). Dacă peptida a fost detectată pe un eşantion, dar nu a putut fi cuantificată din motive tehnice, eşantionul este inclus în această reprezentare a frecvenţei de detectare, însă nu se afişează niciun punct în partea superioară a figurii. Ţesuturi (de la stânga la dreapta): eşantioane normale: arteră; celule sanguine; creier; inimă; ficat; plămân; venă; adipose: ţesut adipos; adren.gl.: glandă suprarenală; BM: măduvă osoasă; colorect: colon şi rect; duod: duoden; esoph: esofag; gallb: vezică biliară; LN: ganglion limfatic; panc: pancreas; parathyr: glanda paratiroidă; perit: peritoneu; pituit: hipofiză; sal. gland: glandă salivară; skel.mus: muşchi scheletic; piele; sm.int: intestin subţire; splină; stomac; tiroidă; trahee; ureter; vezică urinară; glandă mamară; ovar; placentă; prostată; testicul; timus; uter. Eşantioane tumorale: AML: leucemie mieloidă acută; PCA: cancer de prostată; BRCA: cancer de glandă mamară; CLL: leucemie limfocitară cronică; CRC: cancer colorectal; GALB: cancer de vezică biliară; HCC: carcinom hepatocelular; MEL: melanom; NHL: limfom non-Hodgkin; OC: cancer ovarian; OSCAR: cancer esofagian; OSC_GC: cancer esofagian/gastric; PC: cancer pancreatic; GB: glioblastom; GC: cancer gastric; NSCLC: cancer pulmonar non-microcelular; RCC: carcinom cu celule renale; SCLC: cancer pulmonar microcelular; UBC: carcinom de vezică urinară; UEC: cancer uterin şi endometrial.

Figura 5A-R prezintă exemple de profiluri de exprimare ale genelor-sursă ale prezentei descrieri care sunt supraexprimate în diferite eşantioane de cancer. Eşantioanele tumorale (punctele roşii) şi cele normale (punctele verzi sau gri) sunt grupate în funcţie de organul de origine, iar diagramele „casetă şi mustăţi» reprezintă valorile RPKM mediane, percentila 25 şi 75 (caseta) şi valorile minime şi maxime (mustăţile). Organele normale sunt ordonate în funcţie de categoriile de risc. RPKM = citiri per kilobază per milion de citiri cartografiate. Eşantioane normale: arteră; celule sanguine; creier; inimă; ficat; plămân; venă; adipose: ţesut adipos; adren.gl.: glandă suprarenală; BM: măduvă osoasă; cartilaj; colorect: colon şi rect; esoph: esofag; ochi; gallb: vezică biliară; rinichi; LN: ganglion limfatic; nerv; panc: pancreas; pituit: hipofiză; sal. gland: glandă salivară; skel.mus: muşchi scheletic; piele; sm.int: intestin subţire; splină; stomac; tiroidă; trahee; vezică urinară; glandă mamară; ovar; placentă; prostată; testicul; timus; uter. Eşantioane tumorale: AML: leucemie mieloidă acută; PCA: cancer de prostată; BRCA: cancer de glandă mamară; CLL: leucemie limfocitară cronică; CRC: cancer colorectal; GALB: cancer de vezică biliară; HCC: carcinom hepatocelular; MEL: melanom; NHL: limfom non-Hodgkin; OC: cancer ovarian; OSCAR: cancer esofagian; PC: cancer pancreatic; GB: glioblastom; GC: cancer gastric; NSCLC: cancer pulmonar non-microcelular; RCC: carcinom cu celule renale; SCLC: cancer pulmonar microcelular; UBC: carcinom de vezică urinară; UEC: cancer uterin şi endometrial.

Figurile 6A - M prezintă exemple de rezultate ale răspunsurilor in vitro ale celulelor T CD8+ specifice peptidelor de la un donator sănătos de HLA-A*02+. Celulele T CD8+ au fost amorsate folosind APC-uri artificiale acoperite cu mAb anti-CD28 şi HLA-A*02 în complex cu, de exemplu, peptida SEQ ID NO: 11 (A, panoul din stânga) sau peptida SEQ ID NO: 14 (B, panoul din stânga), respectiv [SEQ ID NO: 157 (C), 233 (D), 85 (E), 89 (F), 155 (G), 153 (H), 264 (I), 117 (J), 253 (K), 39 (L) şi 203 (M)]. După trei cicluri de stimulare, detectarea celulelor reactive la peptide a fost efectuată prin colorarea multimerului 2D cu multimerul relevant, de exemplu A*02/SEQ ID NO: 11 (A) sau A*02/SEQ ID NO: 14 (B). Panourile din dreapta (de exemplu, A şi B) arată colorarea de control a celulelor stimulate cu complexe A*02/peptidă irelevante. Celulele singlet viabile au fost selectate pentru limfocite CD8+. Porţile booleene au ajutat la excluderea evenimentelor fals-pozitive detectate cu multimeri specifici pentru peptide diferite. Sunt indicate frecvenţele de celule multimer+ specifice în rândul limfocitelor CD8+.

Figurile 7A - C arată suprareprezentarea diferitelor peptide în diferite ţesuturi canceroase în comparaţie cu ţesuturile normale. Analizele au inclus date din peste 320 de eşantioane de ţesut normal şi 462 de eşantioane de cancer. Sunt prezentate doar eşantioanele în care s-a constatat prezenţa peptidei. Figura 7A) Genă: CCR8, Peptidă: LLIPFTIFM (SEQ ID NO.: 43), Ţesuturi (de la stânga la dreapta): 16 ţesuturi canceroase (1 cancer de canal biliar, 1 cancer de glandă mamară, 1 cancer de colon, 7 cancere pulmonare, 2 cancere de ganglioni limfatici, 3 cancere ovariene, 1 cancer de piele); Figura 7B Genă: CXCR5, Peptidă: ILVTSIFFL (SEQ ID NO.: 152), Ţesuturi (de la stânga la dreapta): 6 ţesuturi normale (1 ganglion limfatic, 5 splină), 16 ţesuturi canceroase (8 cancere de leucemie leucocitară, 8 cancere de ganglioni limfatici); Figura 7C Genă: CYSLTR1, Peptidă: VILTSSPFL (SEQ ID NO.: 156), Ţesuturi (de la stânga la dreapta): 3 ţesuturi normale (1 plămân, 1 ganglion limfatic, 1 splină), 11 ţesuturi canceroase (2 cancere de glandă mamară, 5 cancere de leucemie leucocitară, 3 cancere de ganglioni limfatici, 1 cancer de celule mieloide).

EXEMPLE

EXEMPLUL 1

Identificarea şi cuantificarea peptidelor asociate tumorii prezentate pe suprafaţa celulei

Eşantioanele de ţesut

Ţesuturile tumorale ale pacienţilor au fost obţinute de la Asterand (Detroit, SUA şi Royston, Herts, Regatul Unit); Spitalul Universitar Val d'Hebron (Barcelona); BioServe (Beltsville, MD, SUA); Centrul pentru terapia imunitară a cancerului (CCIT), Spitalul Herlev (Herlev); Geneticist Inc. (Glendale, CA, SUA); Spitalul Universitar din Geneva; Spitalul Universitar din Heidelberg; Spitalul Universitar din Munchen; Universitatea de Medicină din prefectura Kyoto (KPUM); Universitatea din Osaka (OCU); ProteoGenex Inc., (Culver City, CA, SUA); Spitalul Universitar din Tübingen. Ţesuturile normale au fost obţinute de la Bio-Options Inc., CA, SUA; BioServe, Beltsville, MD, SUA; Capital BioScience Inc., Rockville, MD, SUA; Geneticist Inc., Glendale, CA, SUA; Spitalul Universitar din Geneva; Spitalul Universitar din Heidelberg; Spitalul Universitar din München; ProteoGenex Inc., Culver City, CA, SUA; Spitalul Universitar din Tübingen. Toţi pacienţii şi-au dat consimţământul în cunoştinţă de cauză în scris înainte de intervenţia chirurgicală sau autopsie. Ţesuturile au fost congelate brusc imediat după excizie şi au fost păstrate până la izolarea TUMAP-urilor la -70°C sau mai jos.

Izolarea peptidelor HLA din eşantioane de ţesut

Seturile de peptide HLA din eşantioanele de ţesut congelate rapid au fost obţinute prin precipitare imunitară din ţesuturi solide, în conformitate cu un protocol uşor modificat (Falk et al., 1991; Seeger et al., 1999), utilizând anticorpul specific HLA-A*02 BB7.2, anticorpul specific HLA-A, -B, -C- W6/32, sefaroză activată cu CNBr, tratament cu acid şi ultrafiltrare.

Analizele prin spectrometrie de masă

Seturile de peptide HLA obţinute au fost separate după hidrofobie prin cromatografie în fază inversă (sistem nanoAcquity UPLC, Waters), iar peptidele elutate au fost analizate într-un spectrometre de masă hibride LTQ-velos şi de fuziune (ThermoElectron) echipate cu o sursă ESI. Seturile de peptide au fost încărcate direct în coloana de analiză microcapilară cu siliciu infuzat (75 µm i.d. x 250 mm) prevăzută cu material în fază inversă C18, de 1,7 µm (Waters) cu aplicarea unui debit de 400 nL pe minut. Apoi, peptidele au fost separate cu ajutorul unui gradient binar de 180 minute în două trepte, de la 10% la 33% B, la un debit de 300 nl pe minut. Gradientul a fost compus din solvent A (0,1% acid formic în apă) şi solvent B (0,1% acid formic în acetonitril). Pentru introducerea în sursa nanoESI s-a utilizat un capilar de sticlă acoperit cu aur (PicoTip, New Objective). Spectrometrele de masă LTQ-Orbitrap au fost operate în modul dependent de masă folosindu-se o strategie TOP5. Pe scurt, un ciclu de scanare a fost iniţiat cu o scanare completă de mare precizie masică în Orbitrap (R = 30 000), urmată de scanări MS/MS tot în Orbitrap (R = 7500) pe cei mai abundenţi 5 ioni precursori cu excluderea dinamică a ionilor selectaţi anterior. Spectrul de masă tandem a fost interpretat de SEQUEST şi alte controale manuale. Secvenţa peptidică identificată a fost asigurată pin compararea modelului de fragmentare a peptidelor naturale generat cu modelul de fragmentare a peptidei sintetice de referinţă, cu secvenţă identică.

Cuantificarea relativă LC-MS fără marcare a fost realizată prin numărarea ionilor, adică prin extragerea şi analiza caracteristicilor LC-MS (Mueller et al., 2007). Metoda presupune că zona de semnal LC-MS a peptidei este corelată cu abundenţa acesteia în eşantion. Caracteristicile extrase au fost prelucrate ulterior prin deconvoluţia stării de sarcină şi alinierea timpului de retenţie (Mueller et al., 2008; Sturm et al., 2008). În final, toate caracteristicile LC-MS au fost comparate cu rezultatele identificării secvenţei pentru a combina datele cantitative din diferite eşantioane şi ţesuturi cu profilurile de prezentare a peptidelor. Datele cantitative au fost normalizate pe două niveluri, în funcţie de tendinţa centrală, pentru a lua în considerare variaţia în cadrul replicilor tehnice şi biologice. Astfel, fiecare peptidă identificată poate fi asociată cu date cantitative care permit o cuantificare relativă între eşantioane şi ţesuturi. În plus, toate datele cantitative obţinute pentru peptidele candidate au fost inspectate manual pentru a asigura coerenţa datelor şi pentru a verifica acurateţea analizei automate. Pentru fiecare peptidă a fost calculat un profil de prezentare care indică prezentarea medie a eşantionului, precum şi variaţiile din replici. Profilurile juxtapun eşantioanele de cancer pe o bază de referinţă de eşantioane de ţesut normal. Exemple de profiluri de prezentare ale peptidelor supraprezentate sunt arătate în Figura 1. O imagine de ansamblu a prezentării peptidelor între entităţi este arătată în Tabelul 4 pentru anumite peptide.

Tabelul 4: Imagine de ansamblu a prezentării peptidelor selectate în cadrul entităţilor. Peptida a fost considerată interesantă pentru o entitate în cazul în care a fost suprareprezentată pe eşantioane de cancer ale acestei entităţi în comparaţie cu ţesuturile normale. MEL = melanom, BRCA = cancer de glandă mamară, OSCAR = carcinom esofagian. BPH include hiperplazia benignă de prostată, precum şi cancerul pancreatic.

SEQ ID No. Secvenţă Entităţi de interes special 25 LLWGHPRVALA CRC, PC, NSCLC

EXEMPLUL 2

Profilul de exprimare a genelor care codifică peptidele din descriere

Supraprezentarea sau prezentarea specifică a unei peptide pe celulele tumorale în comparaţie cu celulele normale este suficientă pentru ca aceasta să fie utilă în imunoterapie, iar unele peptide sunt specifice tumorilor în pofida faptului că proteina lor sursă se găseşte şi în ţesuturi normale. Cu toate acestea, profilarea exprimării ARNm-ului adaugă un nivel suplimentar de siguranţă în selectarea ţintelor peptidice pentru imunoterapii. În special pentru opţiunile terapeutice cu riscuri ridicate de siguranţă, cum ar fi TCR-urile maturate prin afinitate, peptida-ţintă ideală va fi derivată dintr-o proteină care este unică pentru tumoare şi care nu se găseşte în ţesuturile normale. Pentru această descriere, s-a demonstrat că exprimarea în ţesutul normal a tuturor genelor-sursă este minimă, pe baza bazei de date descrise mai sus de date de exprimare a ARN-ului care acoperă aproximativ 3.000 de eşantioane de ţesut normal. În cazul unor entităţi canceroase (HCC, CRC, GB, GC, NSCLC, PC, RCC, BPH/PCA), au fost adăugate analize suplimentare ale ARN-ului din ţesuturi normale şi tumorale pentru a se estima acoperirea-ţintă în populaţia de pacienţi care suferă de cancerul respectiv.

Sursele de ARN şi pregătirea lor

Eşantioanele de ţesut prelevate chirurgical au fost furnizate conform indicaţiilor de mai sus (a se vedea Exemplul 1), după ce s-a obţinut consimţământul în cunoştinţă de cauză în scris de la fiecare pacient. Eşantioanele de ţesut tumoral au fost congelate imediat după intervenţia chirurgicală şi apoi omogenizate cu mortar şi pistil în azot lichid. ARN-ul total a fost preparat din aceste eşantioane cu ajutorul reactivului TRI (Ambion, Darmstadt, Germania), urmat de o curăţare cu RNeasy (QIAGEN, Hilden, Germania); ambele metode au fost efectuate în conformitate cu protocolul producătorului.

ARN-ul total din ţesuturi umane sănătoase a fost obţinut comercial (Ambion, Huntingdon, Anglia; Clontech, Heidelberg, Germania; Stratagene, Amsterdam, Olanda; BioChain, Hayward, CA, SUA). ARN-ul de la mai mulţi indivizi (între 2 şi 123 indivizi) a fost combinat astfel încât ARN-ul fiecărui individ să fie ponderat în mod egal. Calitatea şi cantitatea tuturor probelor de ARN au fost evaluate pe un bioanalizator Agilent 2100 (Agilent, Waldbronn, Germania) folosind trusa RNA 6000 Pico LabChip (Agilent).

ARN-ul total din ţesuturile umane sănătoase pentru experimentele RNASeq a fost obţinut de la: Asterand (Detroit, MI, SUA şi Royston, Herts, Regatul Unit), BioCat GmbH (Heidelberg, Germania), BioServe (Beltsville, MD, SUA), Capital BioScience Inc. (Rockville, MD, SUA), Geneticist Inc. (Glendale, CA, SUA), Istituto Nazionale Tumori „Pascale» (Napoli, Italia), ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, SUA), Spitalul Universitar din Heidelberg (Heidelberg, Germania).

ARN-ul total din ţesuturile tumorale pentru experimentele RNASeq a fost obţinut de la: Asterand (Detroit, Ml, SUA şi Royston, Herts, Regatul Unit), Bio-Options Inc. (Brea, CA, SUA), BioServe (Beltsville, MD, SUA), Geneticist Inc. (Glendale, CA, SUA), ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, SUA), Tissue Solutions Ltd (Glasgow, Regatul Unit), Spitalul Universitar din Bonn (Bonn, Germania), Spitalul Universitar din Heidelberg (Heidelberg, Germania), Spitalul Universitar din Tübingen (Tübingen, Germania).

Experimente în micromatrice

Acoperirea a fost estimată prin analiza profilurilor de exprimare a ARN-ului (micromatrice Affymetrix) din 30 GB-uri, 16 CRC-uri, 56 RCC-uri, 12 HCC-uri, 38 NSCLC-uri, 11 PC-uri, 34 GC-uri şi 20 de eşantioane de cancer de prostată.

Analiza exprimării genomului tuturor eşantioanelor de ARN din ţesut tumoral şi normal a fost efectuată cu micromatrice de oligonucleotide Affymetrix Human Genome (HG) U133A sau HG-U133 Plus 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA, SUA). Toate etapele au fost efectuate în conformitate cu manualul Affymetrix. Pe scurt, ADNc-ul cu dublu-helix a fost sintetizat din 5-8 µg de ARN total, folosindu-se SuperScript RTII (Invitrogen) şi amorsa oligo-dT-T7 (MWG Biotech, Ebersberg, Germania) conform descrierii din manual. Transcripţia in vitro a fost efectuată cu o trusă BioArray High Yield RNA Transcript Labelling (ENZO Diagnostics, Inc., Farmingdale, NY, SUA) pentru matricele U133A sau cu o trusă GeneChip IVT Labelling (Affymetrix) pentru matricele U133 Plus 2.0, urmată de fragmentarea ARNc-ului, hibridizare şi colorare cu streptavidină-ficoeritrină şi anticorp antistreptavidină biotinilat (Molecular Probes, Leiden, Olanda). Imaginile au fost scanate cu Agilent 2500A GeneArray Scanner (U133A) sau cu Affymetrix Gene-Chip Scanner 3000 (U133 Plus 2.0), iar datele au fost analizate cu software-ul GCOS (Affymetrix), folosindu-se setările implicite pentru toţi parametrii. Pentru normalizare au fost folosite 100 de gene auxiliare furnizate de Affymetrix. Valorile exprimărilor relative au fost calculate pe baza rapoartelor jurnalelor de semnale furnizate de software, iar eşantionul normal a fost stabilit arbitrar la 1,0. În Figura 2 sunt prezentate exemple de profiluri de exprimare ale genelor-sursă ale prezentei descrieri care sunt puternic supraexprimate sau exclusiv exprimate în HCC, CRC, GB, GC, NSCLC, PC, RCC sau BPH/PCA. O imagine de ansamblu a acoperirii pentru genele selectate este prezentată în Eroare! Sursa de referinţă nu a fost găsită.

Experimentele cu RNAseq

Analiza exprimării genice a eşantioanelor de ARN din tumori şi din ţesut normal a fost efectuată prin secvenţiere de generaţia următoare (RNAseq) de către CeGaT (Tübingen, Germania). Pe scurt, bibliotecile de secvenţiere sunt pregătite folosind trusa de reactivi Illumina HiSeq v4 în conformitate cu protocolul furnizorului (Illumina Inc., San Diego, CA, SUA), care include fragmentarea ARN-ului, conversia ADNc-ului şi adăugarea de adaptoare de secvenţiere. Bibliotecile derivate din mai multe eşantioane sunt amestecate echimolar şi secvenţiate pe secvenţiator Illumina HiSeq 2500 în conformitate cu instrucţiunile producătorului, generând citiri single-end de 50 bp. Citirile procesate sunt cartografiate la genomul uman (GRCh38) folosind programul STAR. Datele de exprimare sunt furnizate la nivel de transcripţie ca RPKM (citiri per kilobază per milion de citiri cartografiate, generate de software-ul Cufflinks) şi la nivel de exon (citiri totale, generate de software-ul Bedtools), pe baza adnotărilor din baza de date de secvenţe Ensembl (Ensembl77). Citirile de exoni sunt normalizate în funcţie de lungimea exonului şi de dimensiunea alinierii pentru a obţine valorile RPKM.

Exemple de profiluri de exprimare ale genelor-sursă ale prezentei descrieri care sunt puternic supraexprimate sau exclusiv exprimate în NHL, BRCA, GBC, CCC, MEL, OC, OSCAR, SCLC, UBC, UEC sunt prezentate în Figurile 2 F-H.

EXEMPLUL 3

Imunogenitatea in vitro a peptidelor prezentate de MHC de clasă I

Pentru a obţine informaţii cu privire la imunogenitatea TUMAP-urilor din prezenta descriere, inventatorii au efectuat cercetări folosind un test de iniţiere a celulelor T in vitro bazat pe stimulări repetate ale celulelor T CD8+ cu celule prezentatoare de antigen artificiale (aAPCs) încărcate cu complexe peptidă-MHC şi anticorpi anti-CD28. În acest fel, inventatorii au putut demonstra imunogenitatea pentru 47 de TUMAP-uri restricţionate HLA-A*0201 din cele descrise până în prezent, demonstrând că aceste peptide sunt epitopi ai celulelor T împotriva cărora există celule T precursoare CD8+ la om (Eroare! Sursa de referinţă nu a fost găsită.6A şi B).

Amorsarea in vitro a celulelor T CD8+

Pentru a efectua stimulări in vitro cu celule prezentatoare de antigen artificiale încărcate cu complex peptidă-MHC (pMHC) şi anticorp anti-CD28, inventatorii au izolat mai întâi celule T CD8+ din celule HLA-A*02 proaspete produse de leucafereză prin selecţie pozitivă folosind microsfere CD8 (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Germania) de la donatori sănătoşi obţinute de la Clinicile Universitare din Mannheim, Germania, după obţinerea consimţământului în cunoştinţă de cauză. PBMC-urile şi limfocitele CD8+ izolate au fost incubate în mediu de celule T (TCM) până la utilizare, constând în RPMI-Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Germania) suplimentat cu 10% ser AB uman inactivat termic (PAN-Biotech, Aidenbach, Germania), 100 U/ml Penicilină/100 µg/ml Streptomicină (Cambrex, Köln, Germania), 1 mM piruvat de sodiu (CC Pro, Oberdorla, Germania), 20 µg/ml Gentamicină (Cambrex). În această etapă, în TCM s-au adăugat, de asemenea, 2,5 ng/ml de IL-7 (PromoCell, Heidelberg, Germania) şi 10 U/ml de IL-2 (Novartis Pharma, Nürnberg, Germania). Generarea granulelor acoperite cu pMHC/anti-CD28 şi stimularea şi citirea celulelor T a fost realizată într-un sistem in vitro foarte bine definit, utilizând patru molecule pMHC diferite pentru fiecare condiţie de stimulare şi 8 molecule pMHC diferite pentru fiecare condiţie de citire.

lgG2a antistimulator de şoarece purificat de co-stimulare CD28 uman Ab 9.3 (Jung et al., 1987) a fost biotinilat chimic folosind sulfo-N-hidroxisuccinimidobiotină, conform recomandărilor producătorului (Perbio, Bonn, Germania). Microsferele utilizate au fost particule de polistiren cu diametrul de 5,6 µm acoperite cu streptavidină (Bangs Laboratories, Illinois, SUA).

pMHC-urile utilizate pentru stimulările de control pozitiv şi negativ au fost A*0201/MLA-001 (peptida ELAGIGILTV (SEQ ID NO: 289) din Melan-A/MART-1 modificat) şi, respectiv, A*0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI din DDX5, SEQ ID NO: 290).

800.000 de microsfere/200 µl au fost acoperite în plăci cu 96 de godeuri în prezenţa a 4 x 12,5 ng de biotină-pMHC diferite, spălate şi ulterior au fost adăugate 600 ng de biotină anti-CD28 într-un volum de 200 µl. Stimulările au fost iniţiate în plăci cu 96 de godeuri prin co-incubarea a 1x106 celule T CD8+ cu 2x105 microsfere acoperite spălate în 200 µl de TCM suplimentat cu 5 ng/ml de IL-12 (PromoCell) timp de 3 zile la 37°C. Jumătate din mediu a fost apoi schimbat cu TCM proaspăt suplimentat cu 80 U/ml de IL-2 şi incubarea a continuat timp de 4 zile la 37°C. Acest ciclu de stimulare a fost efectuat, în total, de trei ori. Pentru citirea multimerului pMHC folosind 8 molecule pMHC diferite per condiţie, a fost utilizată o abordare de codificare combinatorie bidimensională, aşa cum a fost descrisă anterior (Andersen et al., 2012), cu modificări minore care includ cuplarea la 5 fluorocromi diferiţi. În cele din urmă, s-au efectuat analize multimerice prin colorarea celulelor cu colorant Live/dead near IR (Invitrogen, Karlsruhe, Germania), anticorp CD8-FITC clona SK1 (BD, Heidelberg, Germania) şi multimeri pMHC fluorescenţi. Pentru analiză, s-a folosit un citometru BD LSRII SORP echipat cu lasere şi filtre adecvate. Celulele specifice peptidelor au fost calculate ca procentaj din totalul celulelor CD8+. Evaluarea analizei multimerice a fost realizată cu ajutorul software-ului FlowJo (Tree Star, Oregon, SUA). Amorsarea in vitro a limfocitelor CD8+ multimer+ specifice a fost detectată prin comparaţie cu stimulările de control negativ. Imunogenitatea pentru un anumit antigen a fost detectată în cazul în care s-a constatat că cel puţin un godeu evaluabil stimulat in vitro de la un donator sănătos conţinea o linie specifică de celule T CD8+ după stimularea in vitro (adică acest godeu conţinea cel puţin 1% celule T CD8+ multimer+ specifice, iar procentajul de celule multimer+ specifice era de cel puţin 10 ori mai mare decât mediana stimulărilor de control negativ).

Imunogenicitatea in vitro a peptidelor

În cazul peptidelor HLA de clasă I testate, imunogenitatea in vitro a putut fi demonstrată prin generarea de linii de celule T specifice peptidelor. Exemple de rezultate ale citometriei în flux după colorarea multimerului specific TUMAP pentru 15 peptide ale descrieri sunt prezentate în Figurile 3 şi 6, împreună cu controalele negative corespunzătoare.

EXEMPLUL 4

Sintetizarea peptidelor

Toate peptidele au fost sintetizate cu ajutorul sintezei standard şi bine stabilite a peptidelor în fază solidă, folosind strategia Fmoc.

Identitatea şi puritatea fiecărei peptide individuale au fost determinate prin spectrometrie de masă şi RP-HPLC analitică. Peptidele au fost obţinute sub formă de liofilizate (sare de trifluoroacetat) de culoare albă până la albă-deschis, cu o puritate de >50%.

Toate TUMAP-urile se administrează de preferinţă sub formă de săruri de trifluoroacetat sau de acetat, dar sunt posibile şi alte forme de sare.

EXEMPLUL 5

Testele de legare a MHC-urilor

Peptidele candidate pentru terapiile pe bază de celule T conform prezentei descrieri au fost testate în continuare pentru capacitatea lor de legare la MHC (afinitate). Complexele peptidă-MHC individuale au fost produse prin schimb de liganzi UV, în care o peptidă sensibilă la UV este scindată prin iradiere UV şi schimbată cu peptida de interes, aşa cum a fost analizată. Numai peptidele candidate care se pot lega şi pot stabiliza eficient moleculele MHC receptiive la peptide împiedică disocierea complexelor MHC. Pentru a determina randamentul reacţiei de schimb, s-a efectuat un test ELISA bazat pe detectarea lanţului uşor (β2m) al complexelor MHC stabilizate. Testul a fost efectuat conform descrierii generale din Rodenko et al.. (Rodenko et al., 2006).

Plăcile MAXISorp cu 96 de godeuri (NUNC) au fost acoperite peste noapte cu 2ug/ml de streptavidină în PBS la temperatura camerei, spălate de 4 ori şi blocate timp de 1 oră la 37°C în soluţie-tampon de blocare cu 2% BSA. Monomerii HLA-A*02:01/MLA-001 repliaţi au servit drept standarde, acoperind intervalul 15-500 ng/ml. Monomerii peptidă-MHC din reacţia de schimb UV au fost diluaţi de 100 de ori în soluţie-tampon de blocare. Eşantioanele au fost incubate timp de o oră la 37°C, spălate de patru ori, incubate cu 2ug/ml de anti-β2m conjugat cu HRP timp de o oră la 37°C, spălate din nou şi detectate cu soluţie de TMB care este oprită cu NH2SO4. Absorbţia a fost măsurată la 450 nm. Peptidele candidate care prezintă un randament de schimb ridicat (preferabil mai mare de 50%, cel mai preferabil de 75%) sunt în general preferate pentru generarea şi producerea de anticorpi sau de fragmente ale acestora şi/sau de receptori de celule T sau de fragmente ale acestora, deoarece prezintă suficientă aviditate faţă de moleculele MHC şi împiedică disocierea complexelor MHC.

Tabelul 5: Scoruri de legare la MHC de clasă I.

Legarea peptidei restricţionate de HLA de clasă I la HLA-A*02:01 a fost evaluată prin randamentul schimbului de peptide: ≥10% = +; ≥20% = ++; ≥50 = +++; ≥ 75% = ++++

SEQ ID Secvenţă Schimb de peptide 25 LLWGHPRVALA +++

EXEMPLUL 6

Tabelul 6: Peptidă preferată în conformitate cu prezenta invenţie

SEQ ID No Secvenţă Cod peptidă 25 LLWGHPRVALA MXRA5-003

Cuantificarea absolută a peptidelor asociate tumorii prezentate pe suprafaţa celulei

Generarea de lianţi, cum ar fi anticorpii şi/sau TCR-urile, este un proces laborios, care poate fi efectuat numai pentru un număr de ţinte selectate. În cazul peptidelor asociate şi specifice tumorilor, criteriile de selecţie includ, dar nu se limitează la exclusivitatea prezentării şi la densitatea peptidei prezentate pe suprafaţa celulară. În plus faţă de izolarea şi cuantificarea relativă a peptidelor, aşa cum este descrisă în prezentul document, inventatorii au analizat copiile absolute de peptide per celulă, aşa cum este descris. Cuantificarea numărului de copii de TUMAP-uri per celulă în eşantioanele de tumori solide necesită cuantificarea absolută a TUMAP-urilor izolate, eficacitatea izolării TUMAP-urilor şi numărul de celule din eşantionul de ţesut analizat.

Cuantificarea peptidelor prin nanoLC-MS/MS

Pentru o cuantificare precisă a peptidelor prin spectrometrie de masă, a fost generată o curbă de calibrare pentru fiecare peptidă folosind metoda standardului intern. Standardul intern este o variantă marcată cu doi izotopi a fiecărei peptide, adică în sinteza TUMAP-urilor au fost incluşi doi aminoacizi marcaţi cu izotopi. Acesta diferă de peptida asociată tumorii doar prin masa sa, dar nu prezintă nicio diferenţă în ceea ce priveşte alte proprietăţi fizico-chimice (Anderson et al., 2012). Standardul intern a fost adiţionat la fiecare probă MS şi toate semnalele MS au fost normalizate la semnalul MS al standardului intern pentru a elimina eventualele variaţii tehnice între experimentele MS.

Curbele de calibrare au fost pregătite în cel puţin trei matrice diferite, şi anume eluaţi de peptide HLA din eşantioane naturale similare cu probele MS de rutină, iar fiecare preparat a fost măsurat în rulări MS duplicate. Pentru evaluare, semnalele MS au fost normalizate în raport cu semnalul standardului intern şi s-a calculat o curbă de calibrare prin regresie logistică.

Pentru cuantificarea peptidelor asociate tumorilor din eşantioanele de ţesut, eşantioanele respective au fost, de asemenea, adiţionate cu standardul intern; semnalele MS au fost normalizate în raport cu standardul intern şi cuantificate cu ajutorul curbei de calibrare a peptidelor.

Eficacitatea izolării complexelor peptidă-MHC

Ca în cazul oricărui proces de purificare a proteinelor, izolarea proteinelor din eşantioane de ţesut este asociată cu o anumită pierdere a proteinei de interes. Pentru a determina eficienţa izolării TUMAP-urilor, au fost generate complexe peptidă-MHC pentru toate TUMAP-urile selectate pentru cuantificare absolută. Pentru a putea discrimina complexele peptidă-MHC adiţionate de cele naturale, s-au utilizat versiuni ale TUMAP-urilor marcate cu un singur izotop, adică în sinteza TUMAP-urilor a fost inclus un aminoacid marcat cu un izotop. Aceste complexe au fost adiţionate în lizaţii tisulari proaspăt preparaţi, adică în cel mai timpuriu punct posibil al procedurii de izolare a TUMAP-urilor, şi apoi au fost capturate la fel ca şi complexele peptidă-MHC naturale în următoarea purificare de afinitate. Prin urmare, măsurarea recuperării TUMAP-urilor cu un singur marcaj permite formularea de concluzii privind eficienţa izolării TUMAP-urilor naturale individuale.

Eficacitatea izolării a fost analizată pe un număr redus de eşantioane şi a fost comparabilă între aceste eşantioane de ţesut. În schimb, eficacitatea izolării diferă între peptidele individuale. Acest lucru sugerează că eficacitatea izolării, deşi determinată doar pe un număr limitat de eşantioane de ţesut, poate fi extrapolată la orice alt preparat tisular. Cu toate acestea, este necesar să se analizeze fiecare TUMAP în parte, deoarece eficacitatea izolării nu poate fi extrapolată de la o peptidă la altele.

Determinarea numărului de celule în ţesuturi solide, congelate

Pentru a determina numărul de celule din eşantioanele de ţesut supuse cuantificării absolute a peptidelor, inventatorii au aplicat analiza conţinutului de ADN. Această metodă este aplicabilă unei game largi de eşantioane de diferite origini şi, cel mai important, eşantioanelor congelate (Alcoser et al., 2011; Forsey şi Chaudhuri, 2009; Silva et al., 2013). În timpul protocolului de izolare a peptidelor, un eşantion de ţesut este procesat pentru a obţine un lizat omogen, din care se prelevează o parte alicotă mică de lizat. Partea alicotă este împărţită în trei părţi, din care se izolează ADN-ul (QiaAmp DNA Mini Kit, Qiagen, Hilden, Germania). Conţinutul total de ADN din fiecare izolare de ADN este cuantificat cu ajutorul unui test de cuantificare a ADN-ului bazat pe fluorescenţă (Qubit dsDNA HS Assay Kit, Life Technologies, Darmstadt, Germania) în cel puţin două replicări.

Pentru a calcula numărul de celule, a fost generată o curbă standard de ADN din părţi alicote de celule sanguine sănătoase singulare, cu o gamă de numere de celule definite. Curba standard este utilizată pentru a calcula conţinutul total de celule din conţinutul total de ADN din fiecare izolare de ADN. Numărul total mediu de celule din eşantionul de ţesut utilizat pentru izolarea peptidelor este extrapolat având în vedere volumul cunoscut al părţilor alicote de lizat şi volumul total al lizatului.

Copii de peptide per celulă

Folosind datele din experimentele menţionate mai sus, inventatorii au calculat numărul de copii ale TUMAP-urilor per celulă prin împărţirea cantităţii totale de peptide la numărul total de celule din eşantion, urmată de împărţirea prin eficacitatea izolării.

Listă de referinţe

Adelaide, J. et al., Cancer Res 67 (2007): 11565-11575

Alcoser, S. Y. et al., BMC.Biotechnol. 11 (2011): 124

Allison, J. P. et al., Science 270 (1995): 932-933

American Cancer Society, (2015), www.cancer.org

Ampie, L. et al., Front Oncol. 5 (2015): 12

Andersen, R. S. et al., Nat.Protoc. 7 (2012): 891-902

Anderson, N. L. et al., J Proteome.Res 11 (2012): 1868-1878

Appay, V. et al., Eur.J Immunol. 36 (2006): 1805-1814

Arafat, H. et al., Surgery 150 (2011): 306-315

Aung, P. P. et al., Oncogene 25 (2006): 2546-2557

Avigan, D. et al., Clin Cancer Res. 10 (2004): 4699-4708

Baba, T. et al., Eur.J Cardiothorac.Surg. 43 (2013): 759-764

Bahnassy, A. A. et al., World J Gastroenterol. 20 (2014): 18240-18248

Banchereau, J. et al., Cell 106 (2001): 271-274

Band, A. M. et al., J Mammary.Gland.Biol Neoplasia. 16 (2011): 109-115

Bankovic, J. et al., Lung Cancer 67 (2010): 151-159

Beatty, G. et al., J Immunol 166 (2001): 2276-2282

Beaty, T. H. et al., Hum.Genet. 132 (2013): 771-781

Beggs, J. D., Nature 275 (1978): 104-109

Bell, J. L. et al., J Clin Oncol 33 (2015): 1285-1293

Bell, J. L. et al., Cell Mol Life Sci. 70 (2013): 2657-2675

Benjamini, Y. et al., Journal of the Royal Statistical Society.Series B (Methodological), 57 (1995): 289-300

Berger, C. et al., Curr.Mol.Med. 13 (2013): 1229-1240

Berman, R. S. et al., National Cancer Institute: PDQ(R) Colon Cancer Treatment (2015a)

Berman, R. S. et al., National Cancer Institute: PDQ(R) Rectal Cancer Treatment (2015b) Bhan, S. et al., Oncol Rep. 28 (2012): 1498-1502

Bode, P. K. et al., Mod.Pathol. 27 (2014): 899-905

Bogush, T. A. et al., Antibiot.Khimioter. 54 (2009): 41-49

Bonventre, J. V., Trans.Am.Clin Climatol.Assoc. 125 (2014): 293-299

Boulter, J. M. et al., Protein Eng 16 (2003): 707-711

Braumuller, H. et al., Nature (2013)

Bray, F. et al., Int J Cancer 132 (2013): 1133-1145

Brossart, P. et al., Blood 90 (1997): 1594-1599

Bruckdorfer, T. et al., Curr.Pharm.Biotechnol. 5 (2004): 29-43

Butterfield, L. H. et al., Clin Cancer Res 12 (2006): 2817-2825

Butterfield, L. H. et al., Clin Cancer Res 9 (2003): 5902-5908

Caballero, O. L. et al., PLoS.One. 5 (2010)

Carballido, E. et al., Cancer Control 19 (2012): 54-67

Card, K. F. et al., Cancer Immunol Immunother. 53 (2004): 345-357

Chang, Y. S. et al., Cancer Chemother.Pharmacol. 59 (2007): 561-574

Chanock, S. J. et al., Hum.Immunol. 65 (2004): 1211-1223

Chapiro, J. et al., Radiol.Med. 119 (2014): 476-482

Chen, H. S. et al., Zhonghua Gan Zang.Bing.Za Zhi. 11 (2003): 145-148

Chen, S. T. et al., Cancer Sci. 102 (2011b): 2191-2198

Chen, Y. L. et al., Int J Surg. 11 (2013c): 85-91

Chen, Y. T. et al., Cancer Immun. 5 (2005): 9

Cierna, Z. et al., BMC.Cancer 14 (2014): 472

Ciruelos Gil, E. M., Cancer Treat.Rev 40 (2014): 862-871

Cohen, C. J. et al., J Mol Recognit. 16 (2003a): 324-332

Cohen, C. J. et al., J Immunol 170 (2003b): 4349-4361

Cohen, S. N. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 69 (1972): 2110-2114

Coligan, J. E. et al., Current Protocols in Protein Science (1995)

Colombetti, S. et al., J Immunol. 176 (2006): 2730-2738

Coosemans, A. et al., Anticancer Res 33 (2013): 5495-5500

Coulie, P. G. et al., Immunol.Rev 188 (2002): 33-42

Counter, C. M. et al., Blood 85 (1995): 2315-2320

Cuadros, T. et al., Cancer Res 74 (2014): 1416-1428

Cuadros, T. et al., Eur.J Cancer 49 (2013): 2034-2047

Dalerba, P. et al., Int.J Cancer 93 (2001): 85-90

De, Plaen E. et al., Immunogenetics 40 (1994): 360-369

Dengjel, J. et al., Clin Cancer Res 12 (2006): 4163-4170

Denkberg, G. et al., J Immunol 171 (2003): 2197-2207

Downie, D. et al., Clin Cancer Res. 11 (2005): 7369-7375

Du, X. et al., Clin Cancer Res 20 (2014): 6324-6335

Duan, Z. et al., Clin Cancer Res 9 (2003): 2778-2785

Ek, S. et al., Cancer Res 62 (2002): 4398-4405

Emens, L. A., Expert.Rev.AnticancerTher. 12(2012): 1597-1611

Enguita-German, M. et al., World J Hepatol. 6 (2014): 716-737

Estey, E. H., Am.J Hematol. 89 (2014): 1063-1081

Falk, K. et al., Nature 351 (1991): 290-296

Ferlay et al., GLOBOCAN 2012 v1.0, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC

CancerBase No. 11 [Internet], (2013), http://globocan.iarc.fr

Findeis-Hosey, J. J. et al., Biotech.Histochem. 87 (2012): 24-29

Fong, L. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.il.S.A 98 (2001): 8809-8814

Forsey, R. W. et al., Biotechnol.Lett. 31 (2009): 819-823

Frasor, J. et al., Mol.Cell Endocrinol. 418 Pt 3 (2015): 235-239

Fuge, 0. et al., Res Rep.Urol. 7 (2015): 65-79

Fujiyama, T. et al., J Dermatol.Sci. 75 (2014): 43-48

Fukuyama, T. et al., Cancer Res. 66 (2006): 4922-4928

Fuqua, S. A. et al., Breast Cancer Res Treat. 144 (2014): 11-19

Gabrilovich, D. I. et al., Nat Med. 2 (1996): 1096-1103

Gandhi, A. V. et al., Ann Surg.Oncol 20 Suppl 3 (2013): S636-S643

Gardina, P. J. et al., BMC.Genomics 7 (2006): 325

Gattinoni, L. et al., Nat Rev.Immunol 6 (2006): 383-393

Giannopoulos, K. et al., Leukemia 24 (2010): 798-805

Giannopoulos, K. et al., Int.J Oncol 29 (2006): 95-103

Gibbs, P. et al., Melanoma Res 10 (2000): 259-264

Gnjatic, S. et al., Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A 100 (2003): 8862-8867

Godkin, A. et al., Int.lmmunol 9 (1997): 905-911

Gong, Y. et al., Adv.Anat.Pathol. 21 (2014): 191-200

Grah, J. J. et al., Tumori 100 (2014): 60-68

Granziero, L. et al., Blood 97 (2001): 2777-2783

Green, M. R. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual 4th (2012)

Greenfield, E. A., Antibodies: A Laboratory Manual 2nd (2014)

Gu, X. et al., Sci.Rep. 4 (2014): 6625

Gunawardana, C. et al., Br.J Haematol. 142 (2008): 606-609

Hall, R. D. et al., Cancer Control 20 (2013): 22-31

Hamilton, K. E. et al., Mol.Cancer Res 13 (2015): 1478-1486

Han, L. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 7 (2014): 6734-6742

Hanagiri, T. et al., Anticancer Res. 33 (2013): 2123-2128

Harig, S. et al., Blood 98 (2001): 2999-3005

Hasegawa, H. et al., Arch.Pathol.Lab Med. 122 (1998): 551-554

Hayashi, S. I. et al., Endocr.Relat Cancer 10 (2003): 193-202

Hennard, C. et al., J Pathol. 209 (2006): 430-435

Herbert, N. et al., J Immunol. 185 (2010): 902-916

Hinrichs, C. S. et al., Nat.Biotechnol. 31 (2013): 999-1008

Hiramoto, T. et al., Oncogene 18 (1999): 3422-3426

Hoffmann, N. E. et al., Cancer 112 (2008): 1471-1479

Holtl, L. et al., Clin.Cancer Res. 8 (2002): 3369-3376

Hsu, H. C. et al., Biochem.Biophys.Res Commun. 329 (2005): 1108-1117

Hu, S. et al., J Cancer Res Clin Oncol 140 (2014): 883-893

Huang, X. et al., Cell Prolif. 48 (2015b): 593-599

Hui, L. et al., Oncol Rep. 34 (2015): 2627-2635

Hussein, Y. M. et al., Med.Oncol 29 (2012): 3055-3062

Hwang, M. L. et al., J Immunol. 179 (2007): 5829-5838

loannidis, P. et al., Anticancer Res 23 (2003): 2179-2183

Jeng, Y. M. et al., Br.J Surg. 96 (2009): 66-73

Jung, G. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 84 (1987): 4611 -4615

Kalos, M. et al., Sci.Transl.Med. 3(2011): 95ra73

Kang, C. Y. et al., J Gastrointest.Surg. 18 (2014): 7-15

Kibbe, A. H., Handbook of Pharmaceutical Excipients rd (2000)

Kim, Y. D. et al., Int.J Mol.Med. 29 (2012): 656-662

Kobayashi, H. et al., Oncol Lett. 10 (2015): 612-618

Koido, S. et al., World J Gastroenterol. 19 (2013): 8531-8542

Krackhardt, A. M. et al., Blood 100 (2002): 2123-2131

Krieg, A. M., Nat Rev.Drug Discov. 5 (2006): 471-484

Lederer, M. et al., Semin.Cancer Biol 29 (2014): 3-12

Lee, M. Y. et al., J Cell Physiol 224 (2010): 17-27

Lee, W. C. et al., J Immunother. 28 (2005): 496-504

Leitlinien fur Diagnostik und Therapie in der Neurologie, 030/099, (2014)

Leivo, I. et al., Cancer Genet.Cytogenet. 156 (2005): 104-113

Leonetti, M. D. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 109 (2012): 19274-19279

Li, H. et al., Bull.Cancer 99 (2012): E26-E33

Li, M. et al., Clin Cancer Res 11 (2005): 1809-1814

Li, W. M. et al., J Surg.Oncol (2016)

Li, Y. et al., Cancer Epidemiol. 39 (2015): 8-13

Liddy, N. et al., Nat Med. 18 (2012): 980-987

Lin, J. et al., Clin Cancer Res 10 (2004): 5708-5716

Lin, L. et al., Oncol Lett. 6 (2013): 740-744

Lisitskaia, K. V. et al., Mol.Gen.Mikrobiol.Virusol. (2010): 34-37

Liu, X. et al., Int.lmmunopharmacol. 25 (2015): 416-424

Ljunggren, H. G. et al., J Exp.Med. 162 (1985): 1745-1759

Llovet, J. M. et al., N.Engl.J Med. 359 (2008): 378-390

Longenecker, B. M. et al., Ann N.Y.Acad.Sci. 690 (1993): 276-291

Lonsdale, J., Nat.Genet. 45 (2013): 580-585

Lukas, T. J. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 78 (1981): 2791-2795

Lundblad, R. L., Chemical Reagents for Protein Modification 3rd (2004)

Luo, C. et al., Clin Cancer Res 13 (2007): 1288-1297

Mantia-Smaldone, G. M. et al., Hum.Vaccin.lmmunother. 8 (2012): 1179-1191

Marten, A. et al., Cancer Immunol.Immunother. 51 (2002): 637-644

Mason, J. M. et al., Nucleic Acids Res. 43 (2015): 3180-3196

Massari, F. et al., Cancer Treat.Rev. 41 (2015): 114-121

Matsueda, S. et al., World J Gastroenterol. 20 (2014): 1657-1666

Maus, M. V. et al., Blood 123 (2014): 2625-2635

Mayr, C. et al., Exp.Hematol. 34 (2006): 44-53

Mayr, C. et al., Blood 105 (2005): 1566-1573

Mehta, A. et al., Breast 23 (2014): 2-9

Meziere, C. et al., J Immunol 159 (1997): 3230-3237

Miyagi, Y. et al., Clin Cancer Res 7 (2001): 3950-3962

Miyoshi, Y. et al., Med.Mol.Morphol. 43 (2010): 193-196

Molina, J. R. et al., Mayo Clin Proc. 83 (2008): 584-594

Mongan, N. P. et al., Mol.Carcinog 45 (2006): 887-900

Morgan, R. A. et al., Science 314 (2006): 126-129

Mori, M. et al., Transplantation 64 (1997): 1017-1027

Mortara, L. et al., Clin Cancer Res. 12 (2006): 3435-3443

Moulton, H. M. et al., Clin Cancer Res 8 (2002): 2044-2051

Mueller, L. N. et al., J Proteome.Res 7 (2008): 51-61

Mueller, L. N. et al., Proteomics. 7 (2007): 3470-3480

Mumberg, D. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 96 (1999): 8633-8638

Murray, G. I. et al., Histopathology 57 (2010): 202-211

National Cancer Institute, (5-6-2015), www.cancer.gov

Noubissi, F. K. et al., J Invest Dermatol. 134 (2014): 1718-1724

Oehlrich, N. et al., Int.J Cancer 117 (2005): 256-264

Okuno, K. et al., Exp.Ther Med. 2 (2011): 73-79

Ottaviani, S. et al., Cancer Immunol.Immunother. 55 (2006): 867-872

Otte, M. et al., Cancer Res 61 (2001): 6682-6687

Ozeki, N. et al., Int.J Mol.Sci. 17 (2016)

Pai, V. P. et al., Breast Cancer Res 11 (2009): R81

Palmer, D. H. et al., Hepatology 49 (2009): 124-132

Palomba, M. L., Curr.Oncol Rep. 14 (2012): 433-440

Perez, C. A. et al., Expert.Rev Anticancer Ther. 11 (2011): 1599-1605

Phan, G. Q. et al., Cancer Control 20 (2013): 289-297

Pineda, C. T. et al., Cell 160 (2015): 715-728

Pinheiro, J. et al., nlme: Linear and Nonlinear Mixed Effects Models (http://CRAN.R- project.org/packe=nlme) (2015)

Piebanski, M. et al., Eur.J Immunol 25 (1995): 1783-1787

Porta, C. et al., Virology 202 (1994): 949-955

Porter, D. L. et al., N.Engl.J Med. 365 (2011): 725-733

Prasad, M. L. et al., Head Neck 26 (2004): 1053-1057

Qian, Z. et al., Mol.Cancer Res 12 (2014): 335-347

Quinn, D. I. et al., Urol.Oncol. (2015)

Raman, J. D. et al., Carcinogenesis 27 (2006): 499-507

Rammensee, H. G. et al., Immunogenetics 50 (1999): 213-219

Reck, M., Ann.Oncol 23 Suppl 8 (2012): viii28-viii34

RefSeq, The NCBI handbook [Internet], Chapter 18, (2002),

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21091/

Reinisch, C. M. et al., Int.J Exp.Pathol. 92 (2011): 326-332

Reinisch, W. et al., J Immunother. 25 (2002): 489-499

Reinmuth, N. et al., Dtsch.Med.Wochenschr. 140 (2015): 329-333

Ries, J. et al., Int.J Oncol 26 (2005): 817-824

Rinaldi, A. et al., Pathobiology 77 (2010): 129-135

Rini, B. I. et al., Curr.Opin.Oncol. 20 (2008): 300-306

Rini, B. I. et al., Cancer 107 (2006): 67-74

Risinger, J. I. et al., Clin Cancer Res 13 (2007): 1713-1719

Rock, K. L. et al., Science 249 (1990): 918-921

Rodenko, B. et al., Nat Protoc. 1 (2006): 1120-1132

S3-Leitlinie Exokrines Pankreaskarzinom, 032-0100L, (2013)

S3-Leitlinie Lungenkarzinom, 020/007, (2011)

S3-Leitlinie maligne Ovarialtumore, 032-0350L, (2013)

S3-Leitlinie Mammakarzinom, 032-0450L, (2012)

S3-Leitlinie Melanom, 032-0240L, (2013)

S3-Leitlinie Prostatakarzinom, 043/0220L, (2014)

Saiki, R. K. et al., Science 239 (1988): 487-491

Salman, B. et al., Oncoimmunology. 2 (2013): e26662

Sangro, B. et al., J Clin Oncol 22 (2004): 1389-1397

Schmidt, S. M. et al., Cancer Res 64 (2004): 1164-1170

Seeger, F. H. et al., Immunogenetics 49 (1999): 571-576

Shahzad, M. M. et al., Cancer Lett. 330 (2013): 123-129

Sherman, F. et al., Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics (1986)

Sherman-Baust, C. A. et al., Cancer Cell 3 (2003): 377-386

Shi, M. et al., World J Gastroenterol. 10 (2004): 1146-1151

Showel, M. M. et al., FIOOOPrime.Rep. 6 (2014): 96

Siegel, S. et al., Blood 102 (2003): 4416-4423

Silva, L. P. et al., Anal.Chem. 85 (2013): 9536-9542

Singh-Jasuja, H. et al., Cancer Immunol.Immunother. 53 (2004): 187-195

Skandalis, S. S. et al., Matrix Biol 35 (2014): 182-193

Small, E. J. et al., J Clin Oncol. 24 (2006): 3089-3094

Smith, M. J. et al., Br.J Cancer 100 (2009): 1452-1464

Son, M. Y. et al., Stem Cells 31 (2013): 2374-2387

Springelkamp, H. et al., Genet.Epidemiol. 39 (2015): 207-216

Stahl, M. et al., Ann.Oncol. 24 Suppl 6 (2013): vi51-vi56

Sturm, M. et al., BMC.Bioinformatics. 9 (2008): 163

Su, Z. et al., Cancer Res. 63 (2003): 2127-2133

Sun, H. et al., J BUON. 20 (2015): 296-308

Szajnik, M. et al., Gynecol.Obstet.(Sunnyvale.) Suppl 4 (2013): 3

Szarvas, T. et al., Int J Cancer 135 (2014): 1596-1604

Takayama, T. et al., Cancer 68(1991): 2391-2396

Takayama, T. et al., Lancet 356 (2000): 802-807

Tanaka, F. et al., Int.J Oncol 10(1997): 1113-1117

Teufel, R. et al., Cell Mol Life Sci. 62 (2005): 1755-1762

Thakkar, J. P. et al., Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev. 23 (2014): 1985-1996

Thorsen, K. et al., Mol Cell Proteomics. 7 (2008): 1214-1224

Tian, X. et al., J Transl.Med. 13 (2015): 337

Toomey, P. G. et al., Cancer Control 20 (2013): 32-42

Tradonsky, A. et al., Am.J Clin Pathol. 137 (2012): 918-930

Tran, E. et al., Science 344 (2014): 641-645

Urgard, E. et al., Cancer Inform. 10 (2011): 175-183

van der Bruggen, P. et al., Immunol.Rev 188 (2002): 51-64

van, Duin M. et al., Haematologica 96 (2011): 1662-1669

Velinov, N. et al., Khirurgiia (Sofiia) (2010): 44-49

Walter, S. et al., J Immunol 171 (2003): 4974-4978

Walter, S. et al., Nat Med. 18 (2012): 1254-1261

Wang, G. H. et al., Oncol Lett. 5 (2013): 544-548

Wang, Y. et al., Anticancer Res 33 (2013): 207-214

Wilhelm, S. M. et al., Cancer Res 64 (2004): 7099-7109

Willcox, B. E. et al., Protein Sci. 8 (1999): 2418-2423

Wittig, B. et al., Hum.Gene Ther. 12 (2001): 267-278

Wlodarski, M. W. et al., J Leukoc.Biol 83 (2008): 589-601

World Cancer Report, (2014)

Wu, Z. Y. et al., Scand.J Immunol. 74 (2011): 561-567

Xie, X. et al., Oncol Lett. 7 (2014): 1537-1543

Xiong, D. et al., Carcinogenesis 33 (2012): 1797-1805

Xu, J. et al., J Mol.Biol 377 (2008): 28-46

Xu, L. et al., Zhongguo Fei.Ai.Za Zhi. 14 (2011): 727-732

Xu, X. et al., Exp.Mol.Pathol. 97 (2014): 579-584

Xu, Y. et al., Sci.Rep. 5 (2015): 12104

Yakimchuk, K. et al., Mol.Cell Endocrinol. 375 (2013): 121-129

Yamada, R. et al., Tissue Antigens 81 (2013): 428-434

Yang, S. et al., Biochim.Biophys.Acta 1772 (2007): 1033-1040

Yao, J. et al., Cancer Immunol.Res. 2 (2014): 371-379

Yin, B. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 7 (2014a): 2934-2941

Yu, J. et al., Gut 64 (2015): 636-645

Yu, W. et al., Toxicol.Appl.Pharmacol. 264 (2012): 73-83

Yuan, R. H. et al., Ann Surg.Oncol 16 (2009): 1711-1719

Zamuner, F. T. et al., Mol.Cancer Ther. 14 (2015): 828-834

Zaremba, S. et al., Cancer Res. 57 (1997): 4570-4577

Zhan, W. et al., Clin Res Hepatol.Gastroenterol. (2015)

Zhang, H. et al., Carcinogenesis 35 (2014): 1863-1871

Zhang, J. et al., Oncotarget. 6 (2015): 42040-42052

Zhang, S. et al., Int.J Clin Exp.Pathol. 8 (2015): 541-550

Zhang, X. et al., Int.J Oncol (2016)

Zhao, H. et al., Zhonghua Gan Zang.Bing.Za Zhi. 10 (2002): 100-102

Zou, T. T. et al., Oncogene 21 (2002): 4855-4862

Follenzi A,et al. Nat Genet. 2000 Jun;25(2):217-22.

Zufferey R, et al. J Virol. 1999 Apr;73(4):2886-92.

Scholten KB, et al. Clin Immunol. 2006 May; 119(2): 135-45.

Gustafsson C, et al. Trends Biotechnol. 2004 Jul;22(7):346-53. Review.

Kuball, J., et al. (2007). Blood 109, 2331-2338.

Schmitt, T. M., et al. (2009). Hum. Gene Ther. 20, 1240-1248

Claims

1. O peptidă care cuprinde o secvenţă de aminoacizi constând din SEQ ID NO: 25; şi o sare farmaceutică acceptabilă a acesteia şi în care respectiva peptidă are o lungime totală de la 11 la 16 aminoacizi.

2. Peptida conform Revendicării 1, în care respectiva peptidă constă dintr-o secvenţă de aminoacizi conform SEQ ID NO: 25.

3. Peptida conform Revendicării 1 sau 2, în care respectiva peptidă include legături non-peptidice.

4. Un receptor de celule T, de preferinţă un receptor de celule T recombinant, solubil sau legat de membrană, care este reactiv cu un ligand HLA în complex cu HLA, în care ligandul respectiv are cel puţin 88% identitate cu o secvenţă de aminoacizi conform SEQ ID NO: 25 şi, de preferinţă, constă din secvenţa de aminoacizi din SEQ ID NO: 25.

5. Un anticorp, în special un anticorp solubil sau legat de membrană, care recunoaşte în mod specific o peptidă constând dintr-o secvenţă de aminoacizi conform SEQ ID NO: 25 atunci când este legată de o moleculă MHC.

6. Un acid nucleic care codifică pentru o peptidă conform uneia dintre Revendicările 1-3 sau pentru un TCR conform Revendicării 4 ori pentru un anticorp conform Revendicării 5, legat în mod opţional de o secvenţă promotoare heterologă, sau un vector de exprimare care exprimă acidul nucleic menţionat.

7. O celulă-gazdă recombinantă care cuprinde peptida conform oricăreia dintre Revendicările 1-3 sau acidul nucleic sau vectorul de exprimare conform Revendicării 6, în care respectiva celulă-gazdă este, de preferinţă, o celulă prezentatoare de antigen, cum ar fi o celulă dendritică, sau în care respectiva celulă-gazdă este, de preferinţă, o celulă T sau o celulă NK.

8. Metodă de producere a peptidei conform oricăreia dintre Revendicările 1-3 sau de producere a receptorului de celule T conform Revendicării 4 ori a unui anticorp conform Revendicării 5, metoda cuprinzând cultivarea celulei-gazdă conform Revendicării 8 care prezintă peptida conform oricăreia dintre Revendicările 1-3 sau care exprimă acidul nucleic sau vectorul de exprimare conform Revendicării 7 şi izolarea peptidei sau a TCR-ului sau a anticorpului din celula-gazdă sau din mediul de cultură al acesteia.

9. O metodă in vitro pentru producerea de limfocite T activate, metoda cuprinzând punerea în contact a celulelor T in vitro cu molecule MHC de clasă I umane încărcate cu antigen, exprimate pe suprafaţa unei celule prezentatoare de antigen adecvate sau a unei construcţii artificiale care imită o celulă prezentatoare de antigen, pentru o perioadă de timp suficientă pentru a activa celulele T respective într-o manieră specifică antigenului, în care antigenul respectiv este o peptidă constând dintr-o secvenţă de aminoacizi conform SEQ ID NO: 25.

10. O limfocită T activată, produsă prin metoda conform Revendicării 9, care recunoaşte selectiv o celulă care prezintă o polipeptidă care cuprinde o secvenţă de aminoacizi de la oricare dintre Revendicările 1 sau 2.

11. O compoziţie farmaceutică care cuprinde cel puţin un ingredient activ selectat din grupul format din peptida conform oricăreia dintre Revendicările 1-3, acidul nucleic sau vectorul de exprimare conform Revendicării 6, celula conform Revendicării 7, limfocita T activată conform Revendicării 10 sau anticorpul conform Revendicării 5 ori receptorul de celule T conform Revendicării 5 şi un suport acceptabil din punct de vedere farmaceutic şi, opţional, excipienţi şi/sau stabilizatori suplimentari acceptaţi din punct de vedere farmaceutic.

12. Peptida conform oricăreia dintre Revendicările 1-3, acidul nucleic sau vectorul de exprimare conform Revendicării 6, celula conform Revendicării 7, limfocita T activată conform Revendicării 10 sau anticorpul conform Revendicării 5 ori receptorul de celule T conform Revendicării 5 pentru utilizare în medicină, de preferinţă pentru utilizare în diagnosticarea şi/sau tratamentul cancerului sau pentru utilizare în fabricarea unui medicament împotriva cancerului.

13. Peptida conform oricăreia dintre Revendicările 1-3, acidul nucleic sau vectorul de exprimare conform Revendicării 6, celula conform Revendicării 7, limfocita T activată conform Revendicării 10 sau anticorpul conform Revendicării 5 ori receptorul de celule T conform Revendicării 4 pentru utilizare în diagnosticarea şi/sau tratamentul cancerului sau pentru utilizarea la fabricarea unui medicament împotriva cancerului conform Revendicării 13, în care cancerul respectiv este selectat din grupul de carcinom hepatocelular (HCC), carcinom colorectal (CRC), glioblastom (GB), cancer gastric (GC), cancer esofagian, cancer pulmonar non-microcelular (NSCLC), cancer pancreatic (PC), carcinom cu celule renale (RCC), hiperplazie benignă de prostată (BPH), cancer de prostată (PCA), cancer ovarian (OC), melanom, cancer de glandă mamară, leucemie limfocitară cronică (CLL), carcinom cu celule Merkel (MCC), cancer pulmonar microcelular (SCLC), limfom non-Hodgkin (NHL), leucemie mieloidă acută (AML), cancer de vezică biliară şi colangiocarcinom (GBC, CCC), cancer de vezică urinară (UBC), cancer uterin (UEC) şi alte tumori care prezintă o supraexprimare a unei proteine din care este derivată peptida din SEQ ID NO: 25.

14. O trusă care cuprinde: a) un recipient care conţine o compoziţie farmaceutică care conţine peptida conform oricăreia dintre Revendicările 1-3, acidul nucleic sau vectorul de exprimare conform Revendicării 6, celula conform Revendicării 7, limfocitele T activate conform Revendicării 10 sau anticorpul conform Revendicării 5 ori receptorul de celule T conform Revendicării 4, în soluţie sau sub formă liofilizată; b) opţional, un al doilea recipient care conţine un diluant sau o soluţie de reconstituire pentru forma liofilizată; c) opţional, instrucţiuni pentru (i) utilizarea soluţiei sau (ii) reconstituirea şi/sau utilizarea formulei şi d) opţional, mai cuprinde unul sau mai multe dintre (iii) o soluţie-tampon, (iv) un diluant, (v) un filtru, (vi) un ac sau (vii) o seringă.