MD3638698T2 - Anticorpi anti-TMPRSS2 și fragmente de legare al antigenului - Google Patents

Anticorpi anti-TMPRSS2 și fragmente de legare al antigenului Download PDF

Info

Publication number
MD3638698T2
MD3638698T2 MDE20200454T MDE20200454T MD3638698T2 MD 3638698 T2 MD3638698 T2 MD 3638698T2 MD E20200454 T MDE20200454 T MD E20200454T MD E20200454 T MDE20200454 T MD E20200454T MD 3638698 T2 MD3638698 T2 MD 3638698T2
Authority
MD
Moldova
Prior art keywords
antigen
tmprss2
cdr
antibody
binding protein
Prior art date
Application number
MDE20200454T
Other languages
English (en)
Inventor
Lisa Purcell
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of MD3638698T2 publication Critical patent/MD3638698T2/ro

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—RNA viruses
    • C07K16/108—Orthomyxoviridae (F), e.g. influenza virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/283—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Prezenta invenţie include un anticorp sau un fragment de legare a antigenului acestuia care se leagă în mod specific de TMPRSS2 şi metode de utilizare a acestor anticorpi şi fragmente pentru tratarea sau prevenirea infecţiilor virale (de exemplu, infecţii cu virus gripal).

Description

Această cerere de brevet revendică beneficiul cererii de brevet de invenţie provizorie U.S. nr. 62/622.292, înregistrată în 26 Ianuarie 2018.
DOMENIUL INVENŢIEI
Prezenta invenţie se referă la anticorpi şi la fragmente de legare a antigenului care se leagă în mod specific la TMPRSS2 şi la metode pentru tratarea sau prevenirea infecţiilor virale cu respectivii anticorpi şi fragmente.
STADIUL TEHNICII
Virusurile gripale au dobândit rezistenţă la medicamentele utilizate în prezent, care ţintesc neuraminidaza virală (NA) sau proteina canalului ionic, proteina matrice 2 (M2). Apariţia rezistenţei la medicamente evidenţiază necesitatea dezvoltării unor noi strategii antivirale. Direcţionarea către celulele gazdă poate reduce sau evita apariţia mutanţilor de evadare, dar ar putea crea o «ramificaţie» din cauza exprimării pe scară largă şi ar creşte îngrijorarea pentru toxicitate. S-a demonstrat că un număr de proteine de fuziune ale virusului respirator necesită scindare prin proteaza (proteazele) gazdă pentru activare (Shirato ş.a. Clinical Isolates of Human Coronavirus 229E Bypass the Endosome for Cell Entry. Journal of Virology. 91, e01387-16 (2017); Reinke ş.a., Different residues in the SARS-CoV spike protein determine cleavage and activation by the host cell protease TMPRSS2. PLoS ONE. 12, e0179177 (2017); Zhou ş.a., Protease inhibitors targeting coronavirus and filovirus entry. Antiviral Research. 116, 76-84 (2015); Zmora ş.a. TMPRSS2 Isoform 1 Activates Respiratory Viruses and Is Expressed in Viral Target Cells. PLoS ONE. 10, e0138380 (2015)), inclusiv gripa (Zmora ş.a., Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS ONE. 12, e0176597 (2017); Bцttcher-Friebertshдuser ş.a., Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology. 85, 1554-1562 (2011); Bertram ş.a., TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology. 84, 10016-10025 (2010); Tarnow ş.a., TMPRSS2 is a host factor that is essential for pneumotropism and pathogenicity of H7N9 influenza A virus in mice. Journal of Virology (2014), May;88(9):4744-51).
Precursorul hemagglutininei gripale A (HA0) necesită scindarea de către o serin protează gazdă, la HA1 şi HA2, pentru activare. De exemplu, proteazaă transmembranară, serina 2; TMPRSS2, TMPRSS4 şi TMPRSS11D, precum şi proteaza asemănătoare tripsinei căilor respiratorii umane (HAT) au fost implicate în scindarea HA (Bertram ş.a., TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology. 84, 10016-10025 (2010); Bottcher ş.a., Proteolytic Activation of Influenza Viruses by Serine Proteases TMPRSS2 and HAT from Human Airway Epithelium. Journal of Virology. 2006 Oct;80(19):9896-8; Publicaţia cererii de brevet internaţional nr. WO2017/151453). De asemenea, TMPRSS2 este o ţintă pentru terapia anti-cancer. Vezi de ex., WO2008127347 şi WO2002004953. O fuziune între TMPRSS2 şi ERG (TMPRSS2:ERG) este o fuziune genică cunoscută a fi un factor principal al carcinogenezei prostatei care este declanşată de ERα şi reprimată de ERβ. Bonkhoff, Estrogen receptor signaling in prostate cancer: Implications for carcinogenesis and tumor progression, Prostate 78(1): 2-10 (2018).
WO 02/04953 descrie TMPRSS2 ca o potenţială ţintă terapeutică pentru anumite tipuri de cancer şi descrie generarea de anticorpi monoclonali anti-TMPRSS2.
US 2013/0273070 se referă la metode pentru tratarea sau prevenirea infecţiei cu virusul gripal prin administrarea unui inhibitor de serin protează, cum ar fi, un inhibitor al TMPRSS2. De Nardis ş.a. (2017) The Journal of Biological Chemistry vol. 292(3):912-924 se referă la proteina 1 legată de receptorul LDL (LRP1) şi descrie expresia recombinantă a ectodomeniului de lungime completă al LRP1. Wilson ş.a. (2005) Biochem J. 388:967-972 se referă la activarea PAR-2 în celulele canceroase de prostată prin TMPRSS2 şi descrie generarea unui anticorp TMPRSS2 anti-uman uman policlonal. Shen ş.a. (2017) Biochimie 142:1-10 revizuieşte rolul TMPRSS2 ca ţintă potenţială pentru tratamentul virusului gripal.
WO 2008/076379 se referă la anticorpii umani pentru delta umană, asemănătoare ligandului 4 şi la secvenţele acestora.
REZUMATUL INVENŢIEI
Deşi există inhibitori cu molecule mici ai TMPRSS2 şi anticorpi de cercetare, utili, de exemplu, pentru imunohistochimie, există o necesitate în domeniu pentru neutralizarea anticorpilor terapeutici anti-TMPRSS2 şi utilizarea acestora pentru tratarea sau prevenirea infecţiei virale. Vezi de ex., Shen ş.a. Biochimie 142: 1-10 (2017), WO2008127347; WO2002004953; US9498529; anticorp ab92323, disponibil de la Abcam (Cambridge, MA) sau anticorpii sc-515727 şi sc-101847 disponibili de la Santa Cruz Biotech (Dallas, TX). Prezenta dezvăluire abordează această necesitate, în parte, prin furnizarea de anticorpi umani anti-umani TMPRSS2, cum ar fi, H1H7017N, şi combinaţii ale acestora incluzând, de exemplu, anticorpi anti-gripali HA (de ex., grupul I HA sau grupul II HA) şi metode de utilizare a acestora pentru tratarea infecţiilor virale.
În mod specific, prezenta invenţie furnizează o proteină care leagă antigenul uman care se leagă în mod specific la TMPRSS2 umană şi care este un anticorp sau un fragment de legare la antigen al acestuia şi în care proteina care leagă antigenul cuprinde:
o regiune variabilă a lanţului greu a imunoglobulinei care cuprinde
(a) un CDR-H1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: G F T F S S Y G (SECV ID NR: 6),
(b) un CDR-H2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: I W N D G S Y V (SECV ID NR: 8), şi
(c) a CDR-H3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: A R E G E W V L Y Y F D Y (SECV ID NR: 10); şi
o regiune variabilă a lanţului uşor al imunoglobulinei care cuprinde
(a) un CDR-L1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: Q S I S S W (SECV ID NR: 12),
(b) un CDR-L2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: K A S (SECV ID NR: 14), şi
(c) un CDR-L3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: Q Q Y N S Y S Y T (SECV ID NR: 16).
Prezenta invenţie furnizează, de asemenea, un complex care cuprinde o proteină de legare a antigenului conform invenţiei legată de o polipeptidă TMPRSS2.
De asemenea, este furnizată de prezenta invenţie o metodă pentru obţinerea unei proteine de legare a antigenului conform invenţiei care cuprinde:
(a) introducerea într-o celulă gazdă: (i) o polinucleotidă care codifică un lanţ greu de imunoglobulină şi un lanţ uşor de imunoglobulină al proteinei care leagă antigenul; sau (ii) o polinucleotidă care codifică un lanţ greu de imunoglobulină al respectivei proteine care leagă antigenul şi o polinucleotidă care codifică un lanţ uşor de imunoglobulină al respectivei proteine care leagă antigenul;
(b) cultivarea celulei gazdă în condiţii favorabile exprimării polinucleotidelor; şi
(c) opţional, izolarea proteinei de legare a antigenului din celula gazdă şi/sau mediu în care este cultivată celula gazdă.
Prezenta invenţie furnizează, de asemenea, o polinucleotidă care codifică:
un lanţ greu de imunoglobulină care cuprinde:
(a) un CDR-H1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: G F T F S S Y G (SECV ID NR: 6),
(b) un CDR-H2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: I W N D G S Y V (SECV ID NR: 8), şi
(c) un CDR-H3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: A R E G E W V L Y Y F D Y (SECV ID NR: 10); şi
un lanţ uşor de imunoglobulină care cuprinde:
(a) un CDR-L1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: Q S I S S W (SECV ID NR: 12),
(b) un CDR-L2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: K A S (SECV ID NR: 14), şi
(c) un CDR-L3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: Q Q Y N S Y S Y T (SECV ID NR: 16).
De asemenea, este furnizat prin prezenta invenţie: un vector care cuprinde o polinucleotidă conform invenţiei; o celulă gazdă care cuprinde o proteină care leagă antigenul conform invenţiei, o polinucleotidă conform invenţiei, sau un vector conform invenţiei; o compoziţie, sau un kit care cuprinde o proteină care leagă antigenul conform invenţiei şi un alt agent terapeutic în care kitul cuprinde proteina care leagă antigenul şi agentul terapeutic suplimentar formulat ca o singură compoziţie, sau separat în două sau mai multe compoziţii; o compoziţie farmaceutică care cuprinde o proteină care leagă antigenul conform invenţiei şi un purtător acceptabil farmaceutic şi, opţional, un alt agent terapeutic; şi un vas sau dispozitiv de injecţie care cuprinde o proteină care leagă antigenul conform invenţiei, sau o compoziţie a invenţiei (de ex., o compoziţie farmaceutică conform invenţiei).
Invenţia furnizează, de asemenea, o proteină care leagă antigenul conform invenţiei pentru a fi utilizată într-o metodă pentru tratarea sau prevenirea infecţiei cu un virus gripal la un subiect care are nevoie de acesta, care cuprinde administrarea unei cantităţi eficiente terapeutic din proteina menţionată care leagă antigenul.
De asemenea, este dezvăluită o proteină de neutralizare umană care leagă antigenul care se leagă în mod specific la TMPRSS2 umanăă, de exemplu, un anticorp sau un fragment de legare a antigenului al acestuia. Într-un aspect al dezvăluirii, proteina care leagă antigenul cuprinde: (a) o regiune variabilă a lanţului uşor al imunoglobulinei care cuprinde o secvenţă de aminoacizi care are cel puţin 90% identitate a secvenţei de aminoacizi cu secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 4 sau 18; şi/sau (b) o regiune variabilă a lanţului greu al imunoglobulinei care cuprinde o secvenţă de aminoacizi care are cel puţin 90% identitate a secvenţei de aminoacizi cu secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 2, 17 sau 19. În cazul în care proteina care leagă antigenul este o proteină care leagă antigenul conform invenţiei, proteina care leagă antigenul este conform revendicărilor şi, în consecinţă, cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu al imunoglobulinei care cuprinde (a) un CDR-H1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: G F T F S S Y G (SECV ID NR: 6); (b) un CDR-H2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: I W N D G S Y V (SECV ID NR: 8); (c) un CDR-H3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: A R E G E W V L Y Y F D Y (SECV ID NR: 10); şi o regiune variabilă a lanţului uşor al imunoglobulinei care cuprinde (a) a CDR-L1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: Q S I S S W (SECV ID NR: 12); (b) a CDR-L2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: K A S (SECV ID NR: 14); şi/sau (c) a CDR-L3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: Q Q Y N S Y S Y T (SECV ID NR: 16). Într-un exemplu de realizarea proteinei de legare a antigenului conform invenţiei, proteina de legare a antigenului cuprinde: (a) un lanţ greu de imunoglobulină care cuprinde secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 17 sau 19; şi/sau (b) un lanţ uşor de imunoglobulină care cuprinde secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 18.
De asemenea, este dezvăluită orice proteină anti-TMPRSS2 care leagă antigenul care concurează cu orice proteină care leagă antigenul care este prezentată aici pentru legarea la TMPRSS2 (de ex., aşa cum se determină prin utilizarea unei analize de interferometrie bio-strat, fără etichetă în timp real, de ex., pe un biosenzor Octet RED384 (Pall ForteBio Corp.)); sau care se leagă de acelaşi sau de un epitop suprapus pe TMPRSS2 (sau un fragment al acestuia) ca orice proteină care leagă antigenul, care este prezentată aici.
Prezenta dezvăluire oferă, de asemenea, proteine multispecifice care leagă antigenul care se leagă de TMPRSS2 şi un alt antigen, sau de TMPRSS2 la un epitop diferit. De exemplu, molecula multispecifică cuprinde (a) un prim domeniu de legare la antigen care se leagă în mod specific de TMPRSS2; şi (b) un al doilea domeniu de legare la antigen care se leagă în mod specific de un alt antigen, sau de TMPRSS2, sau de un epitop care diferă de cel al primului domeniu de legare a antigenului. Într-un exemplu de realizarea invenţiei, proteina de legare a antigenului conform invenţiei este multispecifică.
Prezenta dezvăluire oferă, de asemenea, orice proteină anti-TMPRSS2 care leagă antigenul (de ex., un anticorp sau fragment de legare a antigenului, de ex., care cuprinde o secvenţă prezentată aici) care cuprinde una sau mai multe dintre următoarele proprietăţi:
• Inhibă creşterea virusului gripal (de ex., A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1)) în celule care exprimă TMPRSS2 (de ex., celule Calu-3); • Se leagă de suprafaţa celulelor care exprimă TMPRSS (de ex., MDCK/Tet-on), de ex., cu o valoare EC50 de 440 pM sau 1,06 nM; • Nu se leagă semnificativ de celulele MDCK/Tet-on care nu exprimă TMPRSS2; • Se leagă de TMPRSS2 umană cu o KD de aproximativ 2,81 X 10-9 M la aproximativ 25°C; • Se leagă de TMPRSS2 umană cu o KD de aproximativ 9,31 X 10-9 M la aproximativ 37°C; • Se leagă de TMPRSS2 de cynomolgous cu o KD de aproximativ 5,60 X 10-8 M la aproximativ 25°C; • Se leagă de TMPRSS2 de cynomolgous cu o KD de aproximativ 1,40 X 10-7 M la aproximativ 37°C; • Limitează răspândirea infecţiei cu celule ale virusului gripal in vitro; şi/sau • Protejează un şoarece conceput pentru a exprima proteina umană TMPRSS2 de moartea cauzată de infecţia cu virusul gripal.
Prezenta dezvăluire oferă, de asemenea, un complex care cuprinde orice proteină care leagă antigenul stabilită aici legată de o polipeptidă TMPRSS2, de ex., in vitro sau în corpul unui subiect.
Prezenta dezvăluire oferă, de asemenea, o metodă pentru fabricarea unei proteine anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, prezentată aici (de ex., H1H7017N) sau lanţul său de imunoglobulină care cuprinde: (a) introducerea uneia sau mai multor polinucleotide care codifică un lanţ uşor şi/sau un lanţ de greu de imunoglobulină al proteinei de legare a antigenului menţionată; (b) cultivarea celulei gazdă (de ex., celula CHO, celula Pichia sau celula Pichia pastoris) în condiţii favorabile exprimării polinucleotidei; şi (c) opţional, izolarea proteinei de legare a antigenului sau a lanţului de imunoglobulină de celula gazdă şi/sau de mediul în care este crescută celula gazdă. O proteină care leagă antigenul sau un lanţ de imunoglobulină care este un produs al unei astfel de metode face parte din prezenta dezvăluire.
Prezenta dezvăluire oferă, de asemenea, o polinucleotidă (de ex., ADN sau ARN) care codifică o polipeptidă a prezentei dezvăluiri. Într-un aspect al dezvăluirii, polinucleotida codifică două lanţuri diferite de imunoglobulină (de ex., greu şi uşor). Într-un aspect al dezvăluirii, o polinucleotidă codifică un lanţ uşor de imunoglobulină şi o altă polinucleotidă codifică un lanţ greu de imunoglobulină, de ex., în care lanţurile sunt într-o celulă gazdă sau sunt într-un vas. De exemplu, polinucleotida este într-un vector (de ex., o plasmidă) şi/sau este integrat într-un cromozom al celulei gazdă. Polinucleotida conform invenţiei este cea stabilită în revendicări.
Celulele gazdă (de ex., celula CHO, celula Pichia sau celula Pichia pastoris) din prezenta dezvăluire pot include o proteină anti-TMPRSS2 care leagă antigenul (de ex., H1H7017N), polipeptida acesteia sau polinucleotida care codifică o astfel de polipeptidă şi/sau un vector care include o astfel de polinucleotidă.
Prezenta dezvăluire furnizează, de asemenea, o compoziţie sau un kit care cuprinde o proteină anti-TMPRSS2 care leagă antigenul stabilită aici (de ex., H1H7017N) în asociere cu un alt agent terapeutic (de ex., un medicament antiviral şi/sau un vaccin). Mai specific, în prezenta invenţie este furnizată o compoziţie sau un kit care cuprinde proteina care leagă antigenul conform invenţiei şi un alt agent terapeutic, în care kitul cuprinde proteina care leagă antigenul şi agentul terapeutic suplimentar formulat ca o singură compoziţie, sau separat în două sau mai multe compoziţii. De exemplu, compoziţia poate fi o compoziţie farmaceutică care cuprinde proteina care leagă antigenul şi purtătorul acceptabil farmaceutic şi, opţional, un alt agent terapeutic; în care compoziţia farmaceutică este o compoziţie farmaceutică conform invenţiei, proteina care leagă antigenul este o proteină care leagă antigenul aşa cum este prevăzut în revendicări. Agentul terapeutic suplimentar poate fi ledipasvir, sofosbuvir, o combinaţie de ledipasvir şi sofosbuvir, oseltamivir, zanamivir, ribavirină şi interferon-alfa2b, interferon-alfa2a şi/sau un anticorp sau fragment de legare a antigenului al acestuia care se leagă în mod specific de HA gripal. Agentul terapeutic suplimentar poate fi un anticorp sau un fragment de legare a antigenului al acestuia selectat din grupul care constă din H1H14611N2; H1H14612N2; H1H11723P; H1H11729P; H1H11820N; H1H11829N; H1H11829N2; H2aM11829N; H2M11830N; H1H11830N2; H1H11903N; H1H14571N; H2a14571N ; H1H11704P; H1H11711P; H1H11714P; H1H11717P; H1H11724P; H1H11727P; H1H11730P2; H1H11731P2; H1H11734P2; H1H11736P2; H1H11742P2; H1H11744P2; H1H11745P2; H1H11747P2; H1H11748P2; H1H17952B; H1H17953B; H1H17954B; H1H17955B; H1H17956B; H1H17957B; H1H17958B; H1H17959B; H1H17960B; H1H17961B; H1H17962B; H1H17963B; H1H17964B; H1H17965B; H1H17966B; H1H17967B; H1H17968B; H1H17969B; H1H17970B; H1H17971B; H1H17972B; H1H17973B; H1H17974B; H1H17975B; H1H17976B; H1H17977B; H1H17978B; H1H17979B; H1H17980B; H1H17981B; H1H17982B; H1H17983B; H1H17984B; H1H17985B; H1H17986B; H1H17987B; H1H17988B; H1H17989B; H1H17990B; H1H17991B; H1H17992B; H1H17993B; H1H17994B; H1H17995B; H1H17996B; H1H17997B; H1H17998B; H1H17999B; H1H18000B; H1H18001B; H1H18002B; H1H18003B; H1H18004B; H1H18005B; H1H18006B; H1H18007B; H1H18008B; H1H18009B; H1H18010B; H1H18011B; H1H18012B; H1H18013B; H1H18014B; H1H18015B; H1H18016B; H1H18017B; H1H18018B; H1H18019B; H1H18020B; H1H18021B; H1H18022B; H1H18023B; H1H18024B; H1H18025B; H1H18026B; H1H18027B; H1H18028B; H1H18029B; H1H18030B; H1H18031B; H1H18032B; H1H18033B; H1H18034B; H1H18035B; H1H18037B; H1H18038B; H1H18039B; H1H18040B; H1H18041B; H1H18042B; H1H18043B; H1H18044B; H1H18045B; H1H18046B; H1H18047B; H1H18048B; H1H18049B; H1H18051B; H1H18052B; H1H18053B; H1H18054B; H1H18055B; H1H18056B; H1H18057B; H1H18058B; H1H18059B; H1H18060B; H1H18061B; H1H18062B; H1H18063B; H1H18064B; H1H18065B; H1H18066B; H1H18067B; H1H18068B; H1H18069B; H1H18070B; H1H18071B; H1H18072B; H1H18073B; H1H18074B; H1H18075B; H1H18076B; H1H18077B; H1H18078B; H1H18079B; H1H18080B; H1H18081B; H1H18082B; H1H18083B; H1H18084B; H1H18085B; H1H18086B; H1H18087B; H1H18088B; H1H18089B; H1H18090B; H1H18091B; H1H18092B; H1H18093B; H1H18094B; H1H18095B; H1H18096B; H1H18097B; H1H18098B; H1H18099B; H1H18100B; H1H18101B; H1H18102B; H1H18103B; H1H18104B; H1H18105B; H1H18107B; H1H18108B; H1H18109B; H1H18110B; H1H18111B; H1H18112B; H1H18113B; H1H18114B; H1H18115B; H1H18116B; H1H18117B; H1H18118B; H1H18119B; H1H18120B; H1H18121B; H1H18122B; H1H18123B; H1H18124B; H1H18125B; H1H18126B; H1H18127B; H1H18128B; H1H18129B; H1H18130B; H1H18131B; H1H18132B; H1H18133B; H1H18134B; H1H18135B; H1H18136B; H1H18137B; H1H18138B; H1H18139B; H1H18140B; H1H18141B; H1H18142B; H1H18143B; H1H18144B; H1H18145B; H1H18146B; H1H18147B; H1H18148B; H1H18149B; H1H18150B; H1H18151B; H1H18152B; H1H18153B; H1H18154B; H1H18155B; H1H18156B; H1H18157B; H1H18158B; H1H18159B; H1H18160B; H1H18161B; H1H18162B; H1H18163B; H1H18164B; H1H18165B; H1H18166B; H1H18167B; H1H18168B; H1H18169B; H1H18170B; H1H18171B; H1H18172B; H1H18173B; H1H18174B; H1H18175B; H1H18176B; H1H18177B; H1H18178B; H1H18179B; H1H18180B; H1H18181B; H1H18182B; H1H18183B; H1H18184B; H1H18185B; H1H18186B; H1H18187B; H1H18188B; H1H18189B; H1H18190B; H1H18191B; H1H18192B; H1H18193B; H1H18194B; H1H18195B; H1H18196B; H1H18197B; H1H18198B; H1H18199B; H1H18200B; H1H18201B; H1H18202B; H1H18203B; H1H18204B; H1H18205B; H1H18206B; H1H18207B; H1H18208B; H1H18209B; H1H18210B; H1H18211B; H1H18212B; H1H18213B; H1H18214B; H1H18216B; H1H18217B; H1H18218B; H1H18219B; H1H18220B; H1H18221B; H1H18222B; H1H18223B; H1H18224B; H1H18225B; H1H18226B; H1H18227B; H1H18228B; H1H18229B; H1H18230B; H1H18231B; H1H18232B; H1H18233B; H1H18234B; H1H18235B; H1H18236B; H1H18237B; H1H18238B; H1H18239B; H1H18240B; H1H18241B; H1H18242B; H1H18243B; H1H18244B; H1H18245B; H1H18246B; H1H18247B; H1H18248B; H1H18249B; H1H18250B; H1H18251B; H1H18252B; H1H18253B; H1H18254B; H1H18255B; H1H18256B; H1H18257B; H1H18258B; H1H18259B; H1H18261B; H1H18262B; H1H18263B; H1H18264B; H1H18265B; H1H18266B; H1H18267B; H1H18268B; H1H18269B; H1H18270B; H1H18271B; H1H18272B; H1H18274B; H1H18275B; H1H18276B; H1H18277B; H1H18278B; H1H18279B; H1H18280B; H1H18281B; H1H18282B; H1H18283B; H1H18284B; H1H18285B; H1H18286B; H1H18287B; H1H18288B; H1H18289B; H1H18290B; H1H18291B; H1H18292B; H1H18293B; H1H18294B; H1H18295B; H1H18297B; H1H18298B; H1H18299B; H1H18300B; H1H18301B; H1H18302B; H1H18303B; H1H18304B; H1H18305B; H1H18306B; H1H18307B; H1H18308B; H1H18309B; H1H18310B; H1H18311B; H1H18312B; H1H18313B; H1H18314B; H1H18315B; H1H18316B; H1H18317B; H1H18318B; H1H18319B; H1H18320B; H1H18321B; H1H18322B; H1H18323B; H1H18324B; H1H18325B; H1H18326B; H1H18327B; H1H18328B; H1H18329B; H1H18330B; H1H18331B; H1H18332B; H1H18333B; H1H18334B; and H1H18335B.
Într-un aspect al dezvăluirii, un alt agent terapeutic care este furnizat în asociere cu o proteină anti-TMPRSS2 care leagă antigenul este un anticorp sau un fragment care leagă antigenul care se leagă de proteina HA a grupei II gripale, cum ar fi H1H14611N2; sau un anticorp sau fragment care cuprinde VH şi VL de H1H14611N2; sau un lanţ greu de imunoglobulină care cuprinde CDR-H1, CDR-H2 şi CDR-H3 din H1H14611N2 (de ex., SECV ID NR. 25-27) şi un lanţ uşor de imunoglobulină care cuprinde CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3 din H1H14611N2 (de ex., SECV ID NR. 29-31).
Într-un aspect al dezvăluirii, un alt agent terapeutic care este furnizat în asociere cu o proteină anti-TMPRSS2 care leagă antigenul este un anticorp sau un fragment care leagă antigenul care se leagă de proteina HA a grupei II gripale, cum ar fi, H1H14612N2; sau un anticorp sau fragment care cuprinde VH şi VL de H1H14612N2; sau un lanţ greu de imunoglobulină cu care cuprinde CDR-H1, CDR-H2 şi CDR-H3 din H1H14612N2 (de ex., SECV ID NR: 41-43) şi un lanţ uşor de imunoglobulină care cuprinde CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3 din H1H14612N2 (de ex., SECV ID NR. 45-47).
Într-un aspect al dezvăluirii, un alt agent terapeutic care este furnizat în asociere cu o proteină anti-TMPRSS2 care leagă antigenul este un anticorp sau un fragment care leagă antigenul care se leagă de proteina HA a grupei I gripale, cum ar fi, H1H11729P; sau un anticorp sau fragment care cuprinde VH şi VL de H1H11729P; sau un lanţ greu de imunoglobulină care cuprinde CDR-H1, CDR-H2 şi CDR-H3 din H1H11729P (de ex., SECV ID NR. 33-35) şi un lanţ uşor de imunoglobulină care cuprinde CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3 din H1H11729P (de ex., SECV ID NR. 37-39).
Prezenta dezvăluire oferă, de asemenea, un vas sau un dispozitiv de injecţie care cuprinde o proteină anti-TMPRSS2 care leagă antigenul (de ex., H1H7017N) sau compoziţia acestuia (de ex., compoziţie farmaceutică).
Prezenta dezvăluire oferă, de asemenea, o metodă pentru tratarea sau prevenirea unei infecţii virale, altele decât o infecţie cu virus gripal, la un subiect (de ex., un om) care are nevoie de acesta, care cuprinde administrarea unei cantităţi eficiente terapeutic de proteină anti-TMPRSS2 care leagă antigenul stabilită aici (de ex., H1H7017N).
Prezenta dezvăluire oferă, de asemenea, o metodă pentru tratarea sau prevenirea cancerului (de ex., cancer de prostată) sau a unei infecţii, de ex., o infecţie virală, de ex., o infecţie cu virusul gripei, coronavirus, virusul SARS-Co, virusul MERS-Co, virusul parainfluenza, metapneumovirusul uman sau virusul hepatitei C (VHC), la un subiect (de ex., un om) care are nevoie de acesta, care cuprinde administrarea unei cantităţi eficiente terapeutic de proteină anti-TMPRSS2 care leagă antigenul stabilită aici (de ex., H1H7017N). De exemplu, proteina care leagă antigenul este administrată în asociere cu unul sau mai mulţi agenţi terapeutici suplimentari (de ex., medicament antiviral şi/sau un vaccin). Într-un aspect al dezvăluirii, un alt agent terapeutic este un membru selectat din grupul format din: ledipasvir, sofosbuvir, o combinaţie de ledipasvir şi sofosbuvir, oseltamivir, zanamivir, ribavirină şi interferon-alfa2b, interferon-alfa2a şi un anticorp sau fragment de legare la antigen al acestuia care se leagă în mod specific de HA gripală. Într-un aspect al dezvăluirii, un alt agent terapeutic este un anticorp sau fragment de legare a antigenului al acestuia selectat din grupul care constă din H1H14611N2; H1H14612N2; H1H11723P; H1H11729P; H1H11820N; H1H11829N; H1H11829N2; H2aM11829N; H2M11830N; H1H11830N2; H1H11903N; H1H14571N; H2a14571N ; H1H11704P; H1H11711P; H1H11714P; H1H11717P; H1H11724P; H1H11727P; H1H11730P2; H1H11731P2; H1H11734P2; H1H11736P2; H1H11742P2; H1H11744P2; H1H11745P2; H1H11747P2; H1H11748P2; H1H17952B; H1H17953B; H1H17954B; H1H17955B; H1H17956B; H1H17957B; H1H17958B; H1H17959B; H1H17960B; H1H17961B; H1H17962B; H1H17963B; H1H17964B; H1H17965B; H1H17966B; H1H17967B; H1H17968B; H1H17969B; H1H17970B; H1H17971B; H1H17972B; H1H17973B; H1H17974B; H1H17975B; H1H17976B; H1H17977B; H1H17978B; H1H17979B; H1H17980B; H1H17981B; H1H17982B; H1H17983B; H1H17984B; H1H17985B; H1H17986B; H1H17987B; H1H17988B; H1H17989B; H1H17990B; H1H17991B; H1H17992B; H1H17993B; H1H17994B; H1H17995B; H1H17996B; H1H17997B; H1H17998B; H1H17999B; H1H18000B; H1H18001B; H1H18002B; H1H18003B; H1H18004B; H1H18005B; H1H18006B; H1H18007B; H1H18008B; H1H18009B; H1H18010B; H1H18011B; H1H18012B; H1H18013B; H1H18014B; H1H18015B; H1H18016B; H1H18017B; H1H18018B; H1H18019B; H1H18020B; H1H18021B; H1H18022B; H1H18023B; H1H18024B; H1H18025B; H1H18026B; H1H18027B; H1H18028B; H1H18029B; H1H18030B; H1H18031B; H1H18032B; H1H18033B; H1H18034B; H1H18035B; H1H18037B; H1H18038B; H1H18039B; H1H18040B; H1H18041B; H1H18042B; H1H18043B; H1H18044B; H1H18045B; H1H18046B; H1H18047B; H1H18048B; H1H18049B; H1H18051B; H1H18052B; H1H18053B; H1H18054B; H1H18055B; H1H18056B; H1H18057B; H1H18058B; H1H18059B; H1H18060B; H1H18061B; H1H18062B; H1H18063B; H1H18064B; H1H18065B; H1H18066B; H1H18067B; H1H18068B; H1H18069B; H1H18070B; H1H18071B; H1H18072B; H1H18073B; H1H18074B; H1H18075B; H1H18076B; H1H18077B; H1H18078B; H1H18079B; H1H18080B; H1H18081B; H1H18082B; H1H18083B; H1H18084B; H1H18085B; H1H18086B; H1H18087B; H1H18088B; H1H18089B; H1H18090B; H1H18091B; H1H18092B; H1H18093B; H1H18094B; H1H18095B; H1H18096B; H1H18097B; H1H18098B; H1H18099B; H1H18100B; H1H18101B; H1H18102B; H1H18103B; H1H18104B; H1H18105B; H1H18107B; H1H18108B; H1H18109B; H1H18110B; H1H18111B; H1H18112B; H1H18113B; H1H18114B; H1H18115B; H1H18116B; H1H18117B; H1H18118B; H1H18119B; H1H18120B; H1H18121B; H1H18122B; H1H18123B; H1H18124B; H1H18125B; H1H18126B; H1H18127B; H1H18128B; H1H18129B; H1H18130B; H1H18131B; H1H18132B; H1H18133B; H1H18134B; H1H18135B; H1H18136B; H1H18137B; H1H18138B; H1H18139B; H1H18140B; H1H18141B; H1H18142B; H1H18143B; H1H18144B; H1H18145B; H1H18146B; H1H18147B; H1H18148B; H1H18149B; H1H18150B; H1H18151B; H1H18152B; H1H18153B; H1H18154B; H1H18155B; H1H18156B; H1H18157B; H1H18158B; H1H18159B; H1H18160B; H1H18161B; H1H18162B; H1H18163B; H1H18164B; H1H18165B; H1H18166B; H1H18167B; H1H18168B; H1H18169B; H1H18170B; H1H18171B; H1H18172B; H1H18173B; H1H18174B; H1H18175B; H1H18176B; H1H18177B; H1H18178B; H1H18179B; H1H18180B; H1H18181B; H1H18182B; H1H18183B; H1H18184B; H1H18185B; H1H18186B; H1H18187B; H1H18188B; H1H18189B; H1H18190B; H1H18191B; H1H18192B; H1H18193B; H1H18194B; H1H18195B; H1H18196B; H1H18197B; H1H18198B; H1H18199B; H1H18200B; H1H18201B; H1H18202B; H1H18203B; H1H18204B; H1H18205B; H1H18206B; H1H18207B; H1H18208B; H1H18209B; H1H18210B; H1H18211B; H1H18212B; H1H18213B; H1H18214B; H1H18216B; H1H18217B; H1H18218B; H1H18219B; H1H18220B; H1H18221B; H1H18222B; H1H18223B; H1H18224B; H1H18225B; H1H18226B; H1H18227B; H1H18228B; H1H18229B; H1H18230B; H1H18231B; H1H18232B; H1H18233B; H1H18234B; H1H18235B; H1H18236B; H1H18237B; H1H18238B; H1H18239B; H1H18240B; H1H18241B; H1H18242B; H1H18243B; H1H18244B; H1H18245B; H1H18246B; H1H18247B; H1H18248B; H1H18249B; H1H18250B; H1H18251B; H1H18252B; H1H18253B; H1H18254B; H1H18255B; H1H18256B; H1H18257B; H1H18258B; H1H18259B; H1H18261B; H1H18262B; H1H18263B; H1H18264B; H1H18265B; H1H18266B; H1H18267B; H1H18268B; H1H18269B; H1H18270B; H1H18271B; H1H18272B; H1H18274B; H1H18275B; H1H18276B; H1H18277B; H1H18278B; H1H18279B; H1H18280B; H1H18281B; H1H18282B; H1H18283B; H1H18284B; H1H18285B; H1H18286B; H1H18287B; H1H18288B; H1H18289B; H1H18290B; H1H18291B; H1H18292B; H1H18293B; H1H18294B; H1H18295B; H1H18297B; H1H18298B; H1H18299B; H1H18300B; H1H18301B; H1H18302B; H1H18303B; H1H18304B; H1H18305B; H1H18306B; H1H18307B; H1H18308B; H1H18309B; H1H18310B; H1H18311B; H1H18312B; H1H18313B; H1H18314B; H1H18315B; H1H18316B; H1H18317B; H1H18318B; H1H18319B; H1H18320B; H1H18321B; H1H18322B; H1H18323B; H1H18324B; H1H18325B; H1H18326B; H1H18327B; H1H18328B; H1H18329B; H1H18330B; H1H18331B; H1H18332B; H1H18333B; H1H18334B; and H1H18335B.
Prezenta dezvăluire oferă, de asemenea, o metodă pentru administrarea unei proteine anti-TMRPSS2 care leagă antigenul (de ex., H1H7017N) prezentată aici în corpul unui subiect (de ex., un om) care cuprinde injectarea parenterală a proteinei care leagă antigenul în corpul subiectului (de ex., subcutanat, intravenos sau intramuscular).
SCURTĂ DESCRIERE A FIGURILOR
Figura 1 (A-B). Progresia virusului A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1)-GFP răspândit în diferite linii celulare cu o multiplicitate iniţială a infecţiei de 0,01 (A), sau 0,001 (B) în absenţa tripsinei exogene. Celulele Calu3 (cerc), A549 (pătrat), MDCK (triunghi) şi celule HepG2 (triunghi inversat).
Figura 2. Aplicarea H1H7017N în timpul ciclului de infecţie scade numărul de unităţi de focalizare fluorescente (FFU) din A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) la 72 de ore după infecţie comparativ cu anticorpul de control izotip, fără anticorp, anticorp anti-HA şi martori neinfectaţi.
Figura 3 (A-B). Anti-TMPRSS2, H1H7017N, se leagă TMPRSS2 umană şi de maimuţă cynomolgous exprimată pe celule. (A) H1H7017N, legat la MDCK/Tet-on/hTMPRSS2 şi MDCK/Tet-on/mfTMPRSS2 cu valori EC50 de 460 pM şi respectiv 1,06 nM şi nu au prezentat legături semnificative la celulele MDCK/Tet-on. (B) Control mAb1, un anticorp de control al izotipului irelevant, nu a prezentat legarea la niciuna dintre liniile celulare testate.
Figura 4. Curba de supravieţuire a unui şoarece proiectat pentru a exprima proteina umană TMPRSS2 tratată cu 5 mg/kg de H1H7017N în ziua -1 PI (triunghi inversat, linie punctată), sau ziua 0 PI (cerc, linie continuă) care prezintă protecţie împotriva H1N1 într-un model profilactic. Şoarecii trataţi cu controlul izotipului H1H1238N (triunghi, linie continuă) nu au prezentat nicio protecţie.
Figura 5. Curba de supravieţuire a unui şoarece proiectat pentru a exprima proteina umană TMPRSS2 infectat cu H1N1, tratat cu 10 mg/kg H1H7017N demonstrând protecţie. Şoarecii au fost trataţi în ziua 0 (romb, linie punctată), ziua 1 (cerc, linie continuă), ziua 2 (triunghi inversat, linie continuă) sau ziua 3 PI (pătrat, linie punctată). Controlul izotipului H1H1238N (triunghi, linie continuă) a avut protecţie parţială cu o rată de supravieţuire de 25%.
Figura 6. Curba de supravieţuire a şoarecilor hTPMRSS2 trataţi cu 10 mg/kg de H1H7017N în ziua 1 PI (triunghi) sau în ziua 2 PI (cerc) care prezintă protecţie împotriva H3N2. Şoarecii netrataţi (pătrate) nu au prezentat nicio protecţie.
Figura 7 (A-B). Curba de supravieţuire a şoarecilor de tip sălbatic (A) sau a şoarecilor proiectaţi pentru a exprima proteina umană TMPRSS2 (B) infectaţi cu 150 PFU (triunghi), 750 PFU (pătrat) sau 1.500 PFU (cerc) din A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1). Şoarecii au fost cântăriţi zilnic până în ziua 14 PI.
Figura 8. Curba de supravieţuire a unui şoarece proiectat pentru a exprima proteina umană TMPRSS2 infectat cu A/Aichi/2/68 (HA, NA) x A/PR/8/34 (H3N2) în ziua 0 şi tratat cu o combinaţie de 2,5 mg/kg fiecare dintre H1H7017N şi H1H14611N2 (romb), 10 mg/kg H1H7017N (triunghi), 10 mg/kg H1H14611N2 (pătrat), 5 mg/kg fiecare dintre H1H7017N şi H1H14611N2, sau 10 mg/kg control izotip hlgG1 (cerc). Şoarecii au fost cântăriţi zilnic până în ziua 14 PI.
Figura 9. Curba de supravieţuire a unui şoarece proiectat pentru a exprima proteina umană TMPRSS2 infectat cu A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) în ziua 1 PI şi tratat cu o combinaţie de 1 mg/kg de H1H7017N şi 2 mg/kg de H1H11729P (cerc), 2,5 mg/kg fiecare dintre H1H7017N şi H1H11729P (triunghi inversat), 5 mg/kg H1H11729P (romb), 5 mg/kg H1H7017N (pătrat) sau 5 mg/kg control izotip hlgG1 (triunghi). Şoarecii au fost cântăriţi zilnic până în ziua 14 PI.
DESCRIEREA DETALIATĂ A INVENŢIEI
Înainte ca metodele prezente să fie descrise, trebuie să se înţeleagă că această invenţie nu se limitează la metode particulare şi la condiţiile experimentale descrise, deoarece astfel de metode şi condiţii pot varia. De asemenea, trebuie să se înţeleagă că terminologia utilizată aici are ca scop descrierea unor variante de realizare particulare şi nu este destinată a fi limitativă, deoarece scopul prezentei invenţii va fi limitat doar de revendicările anexate.
Cu excepţia cazului în care este definit altfel, toţi termenii tehnici şi ştiinţifici utilizaţi aici au aceeaşi semnificaţie pe care o înţelege în mod obişnuit un specialist în domeniu căruia îi aparţine această invenţie. Deşi orice metode şi materiale similare sau echivalente cu cele descrise aici pot fi utilizate în practica sau testarea prezentei invenţii, metodele şi materialele preferate sunt descrise acum.
Termenul «hemagglutinină gripală», numită şi «HA gripală» este o glicoproteină trimerică găsită pe suprafaţa virionilor gripali, care mediază ataşamentul viral (prin legarea HA1 la acizii α-2,3- şi α-2,6-sialici) şi intrarea (prin schimbare conformaţională) în celulele gazdă. HA este alcătuită din două domenii structurale: un domeniu de cap globular care conţine situsul de legare a receptorului (supus frecvenţei ridicate de mutaţii antigenice) şi regiunea stem (mai conservată printre diferite tulpini de virus gripal). HA gripală este sintetizată ca un precursor (HA0) care suferă procesări proteolitice pentru a produce două subunităţi (HA1 şi HA2) care se asociază una cu cealaltă pentru a forma structura stem/cap globular. HA virală este cel mai variabil antigen al virusului, iar tulpina (HA2) este foarte conservată în cadrul fiecărui grup.
Termenul "neuraminidază gripală", numită şi "NA gripală" este o exosialidază (EC 3.2.1.18) care scindează legătura α-cetozidică între acidul sialic (N-acetilneuraminic) şi un reziduu de zahăr adiacent.
Secvenţa de aminoacizi a HA gripală de lungime completă este exemplificată de secvenţa de aminoacizi a izolatului gripal H1N1 A/California/04/2009 furnizat în GenBank ca număr de acces FJ966082.1. Termenul "HA gripală" include, de asemenea, variante de proteine ale HA gripală izolate din diferite izolate gripale, de ex., GQ149237.1, NC_002017, KM972981.1, etc. Termenul "HA gripală" include, de asemenea, HA gripală recombinantă sau un fragment al acesteia. Termenul cuprinde, de asemenea, HA gripală sau un fragment al acesteia cuplat, de exemplu, cu etichetă histidină, Fc de şoarece sau uman, sau o secvenţă semnal.
Un anti-TMPRSS2 "proteină care leagă antigenul" este o polipeptidă sau un complex de mai multe polipeptide (de ex., un anticorp IgG tetrameric) care se leagă în mod specific la polipeptida TMPRSS2, de exemplu, un anticorp anti-TMPRSS2 sau un fragment de legare a antigenului, fie că este monospecific. sau multispecific.
TMPRSS2
TMPRSS2 (serin protează transmembranară 2) este o proteină, localizată pe cromozomul uman 21, care aparţine familiei serin proteazei (serin protează transmembranară de tip II (TTSPs)) care este importantă pentru infectivitatea virusului gripal. S-a demonstrat că TMPRSS2 mediază scindarea virusului gripal HA0 la HA1 şi HA2.
Gena TMPRSS2 umană codifică o proteină prevăzută cu 492 de aminoacizi care se ancorează pe membrana plasmatică. Proteina se transformă în forma sa matură prin scindare autocatalitic între Arg255 şi Ile256. După scindare, proteazele mature sunt în mare parte legate de membrană, totuşi o parte din ele poate fi eliberată în mediul extracelular.
Într-un exemplu de realizare a invenţiei, TMPRSS2 umană (V160M) cuprinde secvenţa de aminoacizi:
(SECV ID NR. 22; metionină 160 cu caractere boldate). Într-un exemplu de realizare a invenţiei, polipeptida TMPRSS2 nu cuprinde mutaţia V160M. A se vedea, de asemenea, NM_005656.3.
Într-un caz, TMPRSS2 Macaca mulatta (S129L, N251S, I415V, R431Q, D492G) cuprinde secvenţa de aminoacizi:
(SECV ID NR. 23). Într-un caz, polipeptida TMPRSS2 nu cuprinde mutaţia S129L, N251S, I415V, R431Q şi/sau D492G.
Într-un caz, mARN TMPRSS2 Mus musculus cuprinde secvenţa de nucleotide prezentată în NM_015775.2.
Virusuri
Prezenta dezvăluire include metode pentru tratarea sau prevenirea unei infecţii virale la un subiect. Termenul "virus" include orice virus a cărui infecţie în corpul unui subiect este tratabilă sau prevenită prin administrarea unui anticorp anti-TMPRSS2 sau a unui fragment de legare a antigenului al acestuia (de ex., în care infectivitatea virusului este cel puţin parţial dependentă de TMPRSS2). Într-un aspect al dezvăluirii, un "virus" este orice virus care exprimă HA0 sau un alt substrat al TMPRSS2 a cărui scindare proteolitică este necesară pentru infectarea completă a virusului împotriva unei celule dintr-o gazdă. Termenul "virus" include, de asemenea, un virus respirator dependent de TMPRSS2, care este un virus care infectează ţesutul respirator al unui subiect (de ex., tractul respirator superior şi/sau inferior, traheea, bronhiile, plămânii) şi este tratabil sau prevenibil prin administrarea unui anti-TMPRSS2. De exemplu, într-un aspect al dezvăluirii, virusul include virusul gripei, coronavirusul, virusul SARS-Co (coronavirusul sindromului respirator acut sever), virusul MERS-Co (sindromul respirator din Orientul Mijlociu (MERS) CoV), virusul parainfluenza, virusul sendai ( SeV), metapneumovirusul uman şi/sau virusul hepatitei C (VHC). «nfecţie virală» se referă la invazia şi multiplicarea unui virus în corpul unui subiect. Prezenta dezvăluire include aspecte cu condiţia ca «virusul» să excludă virusul gripal, de ex., în care infecţia virală exclude infecţia cu virusul gripal.
Există acum două genuri de virus parainfluenza uman (HPIV), respirovirus (HPIV-1 şi HPIV-3) şi rubulavirus (HPIV-2 şi HPIV-4). Ambele genuri (paramixovirusuri) pot fi separate morfologic de virusul gripal.
Virusul Sendai, cunoscut şi sub denumirea de virusul parainfluenza de murină, este specia tip din genul respirovirus, care conţine, de asemenea, specia virusul parainfluenza uman 3, virusul parainfluenza bovin 3 şi virusul parainfluenza uman 1. TMPRSS2 este o protează activatoare pentru virusurile parainfluenza respiratorii cum ar fi, virusurile parainfluenza şi virusul Sendai (SeV). Vezi ş.a. Abe ş.a., J. Virol. 87(21): 11930-11935 (2013).
Metapneumovirusul uman (HMPV) este clasificat ca primul membru uman al genului Metapneumovirus din subfamilia Pneumovirinae din cadrul familiei Paramyxoviridae. Acesta este un virus ARN monocatenar învelit cu sens negativ. Genomul ARN include 8 gene care codifică 9 proteine diferite. HMPV este identic în ordinea genelor cu pneumovirusul aviar (AMPV), care aparţine, de asemenea, genului Metapneumovirus. TMPRSS2 este exprimat în epiteliul pulmonar uman, scindează eficient proteina HMPV F şi susţine multiplicarea HMPV şi poate fi implicată în dezvoltarea bolilor tractului respirator inferior la pacienţii infectaţi cu HMPV. Vezi ş.a. Shirogane ş.a. J Virol. 82(17): 8942-8946 (2008).
Virusul hepatitei C (HCV) este un virus ARN monocatenar mic, învelit, cu sens pozitiv, al familiei Flaviviridae. HVC, cu cel puţin 6 genotipuri şi numeroase subtipuri, este membru al genului hepacivirus. TMPRSS2 poate activa infecţia cu HVC în stadiul de post-legare şi intrare. Esumi ş.a., Hepatology 61(2): 437-446 (2015).
Viruşii gripali sunt membri ai familiei Orthomyxoviridae. Această familie reprezintă virusuri învelite, al căror genom are segmente de ARN monocatenare cu sens negativ segmentate. Există patru genuri din această familie: tipurile A, B, C şi Thogotovirus. Clasele de virusuri gripale, A, B şi C, se bazează pe proteine miez şi sunt împărţite în continuare în subtipuri determinate de glicoproteinele învelitoare virale hemagglutinină (HA) şi neuraminidază (NA) (de ex., subtipul A/H1N1). Există cel puţin 18 subtipuri de proteine hemagglutinină gripală ("HA") (H1-H18 sau HA1-HA18) şi cel puţin 11 subtipuri proteice de neuraminidază gripală (NA) (N1-N11 sau NA1-NA11) utilizate pentru a defini subtipurile gripale. Grupa 1 gripală are subtipurile H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17 şi H18 şi subtipurile NA8, NA5, Na4 şi NA1. Grupa 2 are subtipurile H3, H4, H7, H10, H14 şi H15 şi subtipurile NA6, NA9, NA7, NA2 şi NA3. Virusurile gripale A infectează o serie de specii de mamifere şi aviare, în timp ce infecţiile de tip B şi C sunt în mare parte limitate la oameni. Cele opt segmente ale genomului virusurilor gripale A şi B sunt incapsidate slab de nucleoproteină.
Virionii coronavirus sunt sferici cu diametre de aproximativ 125 nm. Cea mai proeminentă caracteristică a coronavirusurilor este proiecţiile vârfurilor în formă de treflă care emană de la suprafaţa virionului. Aceste vârfuri sunt o caracteristică definitorie a virionului şi le conferă aspectul unei coroane solare, determinând denumirea de coronavirusuri. În cadrul învelişului virionului se află nucleocapsida. Coronavirusurile au nucleocapside simetrice elicoidale, ceea ce este neobişnuit printre virusurile ARN cu sens pozitiv, dar mult mai frecvente pentru virusurile ARN cu sens negativ. Atât MERS-CoV (coronavirusul sindromului respirator din Orientul Mijlociu), cât şi SARS-CoV (coronavirusul sindromului respirator acut sever) aparţin familiei coronavirusului. Ataşarea iniţială a virionului la celula gazdă este iniţiată de interacţiunile dintre proteina S şi receptorul acesteia. Situsurile domeniilor de legare a receptorilor (RBD) din regiunea S1 ale unei proteine S de coronavirus variază în funcţie de virus, unele având RBD la capătul C-terminal al S1. Interacţiunea S-proteină/receptor este principalul factor determinant pentru coronavirus pentru a infecta o specie gazdă şi guvernează, de asemenea, tropismul tisular al virusului. Multe coronavirusuri utilizează peptidaze ca receptor celular. După legarea receptorilor, virusul trebuie să aibă acces la citozolul celulei gazdă. Acest lucru se realizează în general prin scindarea proteolitică dependentă de acid a proteinei S de către catepsină, TMPRRS2 sau o altă protează, urmată de fuziunea membranelor virale şi celulare.
Anticorpi anti-TMPRSS2 şi fragmente care leagă antigenul
Prezenta dezvăluire oferă proteine care leagă antigenul, cum ar fi, anticorpi şi fragmente ale acestora care leagă antigenul, care se leagă în mod specific la proteina TMPRSS2 sau la un fragment antigenic al acesteia. Proteinele care leagă antigenul conform prezentei invenţii sunt aşa cum este prezentat în revendicări.
Termenul "anticorp", aşa cum este utilizat aici, se referă la moleculele de imunoglobulină care cuprind patru lanţuri polipeptidice, două lanţuri grele (HCs) şi două lanţuri uşoare (LCs) interconectate prin legături disulfidice (adică., «molecule de anticorp complet»), precum şi multimeri ai acestora (de ex., IgM) -de exemplu, H1H7017N. Fiecare lanţ greu cuprinde o regiune variabilă a lanţului greu («HCVR» sau «VH") (de ex., SECV ID NR. 2) şi o regiune constantă a lanţului greu (compusă din domeniile CH1, CH2 şi CH3). Fiecare lanţ uşor cuprinde o regiune variabilă a lanţului uşor ("LCVR sau" VL") (de ex., SECV ID NR. 4) şi o regiune constantă a lanţului uşor (CL). Regiunile VH şi VL pot fi subdivizate în continuare în regiuni de hipervariabilitate, denumite regiuni care determină complementaritatea (CDR), intercalate cu regiuni care sunt mai conservate, denumite regiuni cadru (FR). Fiecare VH şi VL cuprinde trei CDRs şi patru FRs, aranjate de la amino-terminal la carboxi-terminal în următoarea ordine: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. În anumite exemple de realizare ale invenţiei, FRs ale anticorpului (sau fragmentului de legare a antigenului al acestuia) sunt identice cu secvenţele liniei germinale umane sau sunt naturale sau modificate artificial.
De obicei, domeniile variabile ale lanţurilor grele şi uşoare de imunoglobulină cuprind trei regiuni hipervariabile, numite şi regiuni care determină complementaritatea (CDRs), situate în regiuni cadru relativ conservate (FR). În general, de la N-terminal la C-terminal, ambele domenii variabile ale lanţurilor uşoare şi grele cuprind FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 şi FR4. Atribuirea de aminoacizi fiecărui domeniu poate fi în conformitate cu definiţiile din Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, ş.a.; National Institutes of Health, Bethesda, Md.; ed. a 5-a; NIH Publ. No. 91-3242 (1991); Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32:1-75; Kabat, ş.a., (1977) J. Biol. Chem. 252:6609-6616; Chothia, ş.a., (1987) J Mol. Biol. 196:901-917, sau Chothia, ş.a., (1989) Nature 342:878-883.
Prezenta dezvăluire include proteine monoclonale anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, de ex., anticorpi şi fragmente ale acestora care leagă antigenul, precum şi compoziţii monoclonale care cuprind o multitudine de proteine izolate care leagă antigenul monoclonal. Termenul "anticorp monoclonal", aşa cum este utilizat aici, se referă la o populaţie de anticorpi substanţial omogeni, adică., moleculele de anticorp care cuprind populaţia sunt identice în secvenţa de aminoacizi, cu excepţia posibilelor mutaţii naturale care pot fi prezente în cantităţi mici. O «pluralitate» de astfel de anticorpi monoclonali şi fragmente dintr-o compoziţie se referă la o concentraţie identică de anticorpi şi fragmente (adică., aşa cum s-a discutat anterior, în secvenţa de aminoacizi, cu excepţia mutaţiilor posibile în mod natural care pot fi prezente în cantităţi minore) care este peste cea care ar apărea în mod normal în natură, de ex., în sângele unui organism gazdă, cum ar fi, un şoarece sau un om.
Într-un aspect al dezvăluirii, o proteină anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, de ex., anticorpul sau fragmentul care leagă antigenul cuprinde un domeniu constant al lanţului greu, de ex., de tipul IgA (de ex., IgA1 sau IgA2), IgD, IgE, IgG (de ex., IgG1, IgG2, IgG3 şi IgG4) sau IgM. Într-un aspect al dezvăluirii, o proteină care leagă antigenul, de ex., anticorpul sau fragmentul care leagă antigenul cuprinde un domeniu constant al lanţului uşor, de ex., de tip kapa sau lambda.
Termenul de proteină "umană" care leagă antigenul, cum ar fi, un anticorp, aşa cum este utilizat aici, include anticorpi care au regiuni variabile şi constante derivate din secvenţe de imunoglobulină ale liniei germinale umane, fie într-o celulă umană, fie grefate într-o celulă non-umană, de ex., o celulă de şoarece. Vezi de ex., US8502018, US6596541 sau US5789215. mAbs umane pot include resturi de aminoacizi necodificate de secvenţele imunoglobulinei liniei germinale umane (de ex., mutaţii introduse prin mutageneză aleatorie sau specifică situsului in vitro, sau prin mutaţie somatică in vivo), de exemplu în CDRs şi în special CDR3. Cu toate acestea, termenul "anticorp uman", aşa cum este utilizat aici, nu este destinat să includă mAbs în care secvenţe CDR derivate din linia germinativă a unei alte specii de mamifere (de ex., şoarece) au fost grefate pe secvenţe FR umane. Termenul include anticorpi produşi recombinant într-un mamifer neuman sau în celule ale unui mamifer neuman. Termenul nu este destinat să includă anticorpi izolaţi sau generaţi la un subiect uman. Vezi mai jos.
Prezenta dezvăluire include proteine himerice anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, de ex., anticorpi şi fragmente care leagă antigenul acestora şi metode de utilizare a acestora. Aşa cum este utilizat aici, un "anticorp himeric" este un anticorp care are domeniul variabil dintr-un prim anticorp şi domeniul constant dintr-un al doilea anticorp, în care primul şi al doilea anticorp provin din specii diferite. (US4816567; şi Morrison ş.a., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855).
Termenul proteine de legare la antigen "recombinante", cum ar fi, anticorpi sau fragmente de legare a antigenului ale acestora, se referă la astfel de molecule create, exprimate, izolate sau obţinute prin tehnologii sau metode cunoscute în domeniu ca tehnologia ADN recombinant care include, de ex., îmbinarea ADN şi expresia transgenică. Termenul include anticorpi exprimaţi la un mamifer neuman (inclusiv mamifere transgenice neumane, de ex., şoareci transgenici), sau la un sistem de expresie a celulei (de ex., celule CHO), sau izolat dintr-o bibliotecă recombinantă combinatorial de anticorpi umani.
Proteine recombinate anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, de ex., anticorpii şi fragmentele care leagă antigenul, dezvăluite aici pot fi, de asemenea, produse într-un sistem de exprimare E. coli/T7. În acest aspect, acizii nucleici care codifică moleculele de imunoglobulină ale anticorpilor anti-TMPRSS2 (de ex., H1H7017N) poate fi inserat într-o plasmidă pe bază de pET şi exprimaţi în sistemul E. coli/T7. De exemplu, prezenta dezvăluire include metode pentru exprimarea unui anticorp sau a unui fragment de legare a antigenului al acestuia, sau a unui lanţ de imunoglobulină al acestuia într-o celulă gazdă (de ex., celulă gazdă bacteriană, cum ar fi, E coli, cum ar fi, BL21 sau BL21DE3) care cuprinde exprimarea polimerazei ARN T7 în celulă care include, de asemenea, o polinucleotidă care codifică un lanţ de imunoglobulină care este legat în mod operaţional de un promotor T7. De exemplu, într-un aspect al dezvăluirii, o celulă gazdă bacteriană, cum ar fi, o E coli, include o polinucleotidă care codifică gena polimerază ARN T7 legată operabil de un promotor lac şi expresia polimerazei şi lanţul este indus prin incubarea celulei gazdă cu IPTG (izopropil-beta-D-tiogalactopiranozidă). Vezi US4952496 şi US5693489 sau Studier & Moffatt, Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes, J. Mol. Biol. 1986 5 Mai;189(1): 113-30.
Există mai multe metode prin care se produc anticorpi recombinaţi care sunt cunoscuţi în domeniu. Un exemplu de metodă pentru producerea recombinantă a anticorpilor este descris în US4816567.
Transformarea poate fi prin orice metodă cunoscută pentru introducerea polinucleotidelor într-o celulă gazdă. Metodele de introducere a polinucleotidelor heteroloage în celule de mamifere sunt bine cunoscute în domeniu şi includ transfecţia mediată de dextran, precipitarea fosfatului de calciu, transfecţia mediată de polibren, fuziunea protoplastelor, electroporarea, încapsularea polinucleotidelor în lipozomi, injecţie biolistică şi microinjecţia directă a ADN-ului în nuclee. În plus, moleculele de acid nucleic pot fi introduse în celulele mamiferelor prin vectori virali. Metodele de transformare a celulelor sunt bine cunoscute în domeniu. Vezi, de exemplu, brevetele U.S. nr. 4.399.216; 4.912.040; 4.740.461 şi 4.959.455.
Astfel, prezenta dezvăluire include metode recombinante pentru fabricarea unei proteine anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, cum ar fi, un anticorp sau un fragment de legare a antigenului al acestuia din prezenta invenţie, sau un lanţ de imunoglobulină al acestuia, care cuprinde (i) introducerea unuia sau mai multor polinucleotide (de ex., incluzând secvenţa de nucleotide din oricare sau mai multe dintre SECV ID NR: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 sau 15) care codifică lanţuri uşoare şi/sau grele de imunoglobulină ale proteinei care leagă antigenul, de ex., H1H7017N sau H4H7017N, de exemplu, în care polinucleotida este într-un vector; şi/sau integrată într-un cromozom al celulei gazdă şi/sau este legată operabil de un promotor; (ii) cultivarea celulei gazdă (de ex., CHO sau Pichia sau Pichia pastoris) în condiţii favorabile exprimării polinucleotidei şi, (iii) opţional, izolând proteina care leagă antigenul, (de ex., anticorp sau fragment), sau lanţul din celula gazdă şi/sau mediu în care este cultivată celula gazdă. Când se face o proteină care leagă antigenul (de ex., anticorp sau fragment de legare la antigen) care cuprinde mai multe lanţuri de imunoglobulină, de ex., un anticorp care cuprinde două lanţuri grele de imunoglobulină şi două lanţuri uşoare de imunoglobulină, coexprimarea lanţurilor într-o singură celulă gazdă duce la asocierea lanţurilor, de ex., în celulă sau pe suprafaţa celulei sau în afara celulei dacă astfel de lanţuri sunt secretate, astfel încât să formeze proteina care leagă antigenul (de ex., anticorp sau fragment care leagă antigenul). Metodele le includ pe cele în care este exprimat numai un lanţ greu de imunoglobulină sau doar un lanţ uşor de imunoglobulină (de ex., oricare dintre cele discutate aici incluzând fragmente mature şi/sau domenii variabile ale acestora). Astfel de lanţuri sunt utile, de exemplu, ca intermediari în expresia unui anticorp sau a unui fragment de legare la antigen care include un astfel de lanţ. De exemplu, prezenta dezvăluire include, de asemenea, proteine anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, cum ar fi. anticorpii şi fragmentele care leagă antigenul ale acestora, care cuprind un lanţ greu de imunoglobulină (sau domeniul variabil al acesteuia sau care cuprinde CDRs ale acestuia) codificate de o polinucleotidă care cuprinde secvenţele de nucleotide stabilite în SECV ID NR: 1 şi un lanţ uşor de imunoglobulină (sau domeniu variabil al acesteia sau care cuprinde CDRs ale acesteia) codificat de secvenţa de nucleotide prevăzută în SECV ID NR: 3 care sunt produsul unor astfel de metode de producţie şi, opţional, metodele de purificare stabilite aici. De exemplu, într-un exemplu de realizare a invenţiei, produsul metodei este o proteină anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, care este un anticorp sau un fragment care conţine un VH care cuprinde secvenţa de aminoacizi stabilită în SECV ID NR: 2 şi un VL care cuprinde secvenţa de aminoacizi stabilită în SECV ID NR: 4; sau care conţine un HC care cuprinde secvenţa de aminoacizi stabilită în SECV ID NR: 17 sau 19 şi un LC care cuprinde secvenţa de aminoacizi stabilită în SECV ID NR: 18.
Celulele gazdă eucariote şi procariote, inclusiv celule de mamifere, pot fi utilizate ca gazde pentru exprimarea unei proteine anti-TMPRSS2 care leagă antigenul. Astfel de celule gazdă sunt bine cunoscute în domeniu şi multe sunt disponibile din colecţia American Type Culture Collection (ATCC). Aceste celule gazdă includ, printre altele, Celule ovariene de hamster chinezesc (CHO), NSO, celule SP2, celule HeLa, celule de rinichi de pui de hamster (BHK), celule de rinichi de maimuţă (COS), celule de carcinom hepatocelular uman (de ex., Hep G2), celule A549, celule 3T3, celule HEK-293 şi un număr de alte linii celulare. Celulele gazdă ale mamiferelor includ celule umane, de şoareci, şobolani, câini, maimuţe, porci, capre, bovine, cal şi hamster. Alte linii celulare care pot fi utilizate sunt liniile celulare ale insectelor (de ex., Spodoptera frugiperda sau Trichoplusia ni), celule amfibiene, celule bacteriene, celule vegetale şi celule fungice. Celulele fungice includ celule de drojdie şi de ciuperci filamentoase, inclusiv, de exemplu, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia iindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Physcomitrella patens şi Neurospora crassa. Prezenta dezvăluire include o celulă gazdă izolată (de ex., o celulă CHO) care cuprinde o proteină care leagă antigenul, cum ar fi, H1H7017N; sau o polinucleotidă care codifică o astfel de polipeptidă a acesteia.
Termenul "se leagă în mod specific" se referă la acele proteine care leagă antigenul (de ex., mAbs) care au o afinitate de legare la un antigen, cum ar fi, proteina TMPRSS2 (de ex., TMPRSS2 umană), exprimată ca KD, de cel puţin aproximativ 10-8 M (de ex., 2,81 X 10-9 M; 9,31 X 10-9M; 10-9 M; 10-10M, 10-11 M sau 10-12 M), măsurată prin analiză de interferometrie cu bio-strat fără etichetă, în timp real, de exemplu, la 25°C sau 37°C, de exemplu, un biosenzor Octet® HTX sau prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă, de exemplu, BIACORE™ sau prin soluţie-afinitate ELISA. Prezenta dezvăluire include proteine care leagă antigenul care se leagă în mod specific de proteina TMPRSS2.
Termenii «porţiune de legare a antigenului» sau «fragment de legare la antigen» al unui anticorp sau proteină de legare a antigenului şi alţii asemănători, aşa cum se utilizează aici, includ orice polipeptidă sau glicoproteină care apare în mod natural, care se obţine enzimatic, sintetic sau modificată genetic care leagă specific un antigen pentru a forma un complex. Exemplele nelimitative de fragmente care leagă antigenul includ: (i) fragmente Fab; (ii) fragmente F(ab')2; (iii) fragmente Fd; (iv) fragmente Fv; (v) molecule Fv (scFv) cu un singur lanţ; (vi) fragmente dAb; şi (vii) unităţi minime de recunoaştere care constau din resturi de aminoacizi care imită regiunea hipervariabilă a unui anticorp (de ex., o regiune de determinare a complementarităţii izolată (CDR), cum ar fi, o peptidă CDR3), sau o peptidă FR3-CDR3-FR4 constrânsă. Alte molecule proiectate, cum ar fi, anticorpi specifici domeniului, anticorpi cu un singur domeniu, anticorpi cu domeniu şters, anticorpi himerici, anticorpi grefaţi CDR, diacorpi, triacorpi, tetracorpi, minicorpi, nanocorpi (de ex., aşa cum este definit în WO08/020079 sau WO09/138519) (de ex., nanocorpi monovalenţi, nanocorpi bivalenţi, etc.), imunofarmaceutice modulare mici (SMIPs) şi domeniile variabile de rechin IgNAR, sunt, de asemenea, cuprinse în expresia «fragment de legare la antigen», aşa cum este utilizat aici.
Un fragment care leagă antigenul al unui anticorp va cuprinde, într-un aspect al dezvăluirii, cel puţin un domeniu variabil. Domeniul variabil poate fi de orice dimensiune sau compoziţie de aminoacizi şi va cuprinde în general cel puţin un CDR, care este adiacent sau în cadru cu una sau mai multe secvenţe cadru. În fragmentele care leagă antigenul care au un domeniu VH asociat cu un domeniu VL, domeniile VH şi VL pot fi situate unul în raport cu celălalt în orice aranjament adecvat. De exemplu, regiunea variabilă poate fi dimerică şi conţine dimerii VH - VH, VH - VL sau VL - VL. Alternativ, fragmentul care leagă antigenul al unui anticorp poate conţine un domeniu VH sau VL monomeric.
În anumite aspecte, un fragment care leagă antigenul unui anticorp poate conţine cel puţin un domeniu variabil legat covalent de cel puţin un domeniu constant. Configuraţiile exemplificative nelimitative ale domeniilor variabile şi constante care pot fi găsite într-un fragment care leagă antigenul includ: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; şi (xiv) VL-CL. În orice configuraţie de domenii variabile şi constante, incluzând oricare dintre configuraţiile exemplificative enumerate anterior, domeniile variabile şi constante pot fi fie direct legate între ele, fie pot fi legate printr-o balama completă sau parţială, sau o regiune linker. O regiune balama poate consta din cel puţin 2 aminoacizi (de ex., 5, 10, 15, 20, 40, 60 sau mai mulţi), care au ca rezultat o legătură flexibilă, sau semiflexibilă între domeniile adiacente variabile şi/sau constante într-o singură moleculă de polipeptidă. Mai mult, un fragment care leagă antigenul unui anticorp poate cuprinde un homo-dimer sau hetero-dimer (sau alt multimer) din oricare dintre configuraţiile domeniului variabil şi constant enumerate anterior în asociere non-covalentă unul cu altul şi/sau cu unul sau mai multe domenii VH sau VL monomerice (de ex., prin legătură (legături) disulfură).
Proteinele care leagă antigenul (de ex., anticorpi şi fragmente care leagă antigenul) pot fi mono-specifice sau multi-specifice (de ex., bi-specific). Proteinele multispecifice care leagă antigenul sunt discutate în continuare aici.
În exemplele de realizare specifice, anticorpul sau fragmentele de anticorpi conform invenţiei pot fi conjugate cu un fragment, cum ar fi, un ligand sau un fragment terapeutic («imunoconjugat»), cum ar fi, un medicament antiviral, un al doilea anticorp antigripal, sau orice alt fragment terapeutic util pentru tratarea unei infecţii virale, de ex., infecţie virală gripală. Vezi mai jos.
Prezenta dezvăluire oferă, de asemenea, un complex care cuprinde o proteină anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, de ex., anticorp sau fragment care leagă antigenul, discutată aici complexată cu polipeptida TMPRSS2, sau un fragment antigenic al acestuia şi/sau cu un anticorp secundar sau un fragment care leagă antigenul al acestuia (de ex., anticorp secundar marcat detectabil) care se leagă în mod specific la anticorpul sau fragmentul anti-TMPRSS2. Într-un aspect al dezvăluirii, anticorpul sau fragmentul este in vitro (de ex., este imobilizat la un substrat solid) sau se află în corpul unui subiect. Într-un aspect al dezvăluirii, TMPRSS2 este in vitro (de ex., este imobilizat la un substrat solid), sau se află la suprafaţa unei celule, sau se află în corpul unui subiect. Anticorpi anti-TMRPSS2 imobilizaţi şi fragmentele acestora care leagă antigenul, care sunt legate covalent de un material matricial insolubil (de ex., sticlă sau polizaharidă, cum ar fi, agaroză sau separoză, de ex., o granulă sau altă particulă a acesteia) fac, de asemenea, parte din prezenta dezvăluire; opţional, în care anticorpul imobilizat este complexat cu TMPRSS2 sau un fragment antigenic al acesteia sau un anticorp secundar sau fragment al acestuia. Complexele prezentei invenţii sunt cele prezentate în revendicări.
Proteinele "izolate" care leagă antigenul, anticorpii sau fragmentele acestora care leagă antigenul, polipeptidele, polinucleotidele şi vectorii, sunt cel puţin parţial fără alte molecule biologice din celulele sau cultura celulară din care sunt produse. Astfel de molecule biologice includ acizi nucleici, proteine, alţi anticorpi sau fragmente care leagă antigenul, lipide, carbohidraţi sau alte materiale precum resturi celulare şi mediu de creştere. Un anticorp izolat sau un fragment de legare la antigen poate fi cel puţin parţial fără componente ale sistemului de expresie, cum ar fi, molecule biologice dintr-o celulă gazdă sau ale mediului de creştere al acesteia. În general, termenul "izolat" nu se intenţionează să se refere la absenţa completă a unor astfel de molecule biologice sau la absenţa apei, tampoanelor sau sărurilor, sau la componentele unei formulări farmaceutice care include anticorpii sau fragmentele.
Termenul "epitop" se referă la un determinant antigenic (de ex., pe polipeptida TMPRSS2) care interacţionează cu un situs specific de legare a antigenului al unei proteine care leagă antigenul, de ex., o regiune variabilă a unei molecule de anticorp, cunoscută sub numele de paratop. Un singur antigen poate avea mai mult de un epitop. Astfel, diferiţi anticorpi se pot lega de diferite zone ale unui antigen şi pot avea efecte biologice diferite. Termenul "epitop" se referă, de asemenea, la un situs pe un antigen la care răspund celulele B şi/sau T. De asemenea, se referă la o regiune a unui antigen care este legată de un anticorp. Epitopii pot fi definiţi ca structurali sau funcţionali. Epitopii funcţionali sunt în general un subset al epitopilor structurali şi au acele reziduuri care contribuie direct la afinitatea interacţiunii. Epitopii pot fi lineari sau conformaţionali, adică compuşi din aminoacizi neliniari. În anumite exemple de realizare, epitopii pot include determinanţi care sunt grupări chimice active de suprafaţă ale moleculelor precum aminoacizi, lanţuri laterale de zahăr, grupări fosforil sau grupări sulfonil şi, în anumite exemple de realizare, pot avea caracteristici structurale tridimensionale specifice şi/sau caracteristici specifice de încărcare.
Metodele pentru determinarea epitopului unei proteine care leagă antigenul, de ex., anticorp, sau fragment, sau polipeptidă, includ analiza mutaţională de scanare a alaninei, analiza blotului peptidic (Reineke (2004) Methods Mol. Biol. 248: 443-63), analiza clivajului peptidic, studii cristalografice şi analiză RMN. În plus, pot fi utilizate metode precum excizia epitopului, extracţia epitopului şi modificarea chimică a antigenelor (Tomer (2000) Prot. Sci. 9: 487-496). O altă metodă care poate fi utilizată pentru a identifica aminoacizii dintr-o polipeptidă cu care o proteină care leagă antigenul (de ex., anticorp sau fragment sau polipeptidă) (de ex., coversin) interacţionează este un schimb de hidrogen/deuteriu detectat prin spectrometrie de masă. În termeni generali, metoda de schimb hidrogen/deuteriu implică etichetarea deuteriului cu proteina de interes, urmată de legarea proteinei care leagă antigenul, de ex., anticorp sau fragment sau polipeptidă, la proteina marcată cu deuteriu. Apoi, complexul proteină TMPRSS2/proteine care leagă antigenul este transferat în apă şi protonii schimbabili în aminoacizi care sunt protejaţi de complexul de anticorpi sunt supuşi schimbului de deuteriu-hidrogen la o rată mai mică decât protonii schimbabili din aminoacizi care nu sunt parte a interfeţei. Ca rezultat, aminoacizii care fac parte din interfaţa proteină/proteină care leagă antigenul pot reţine deuteriul şi, prin urmare, prezintă o masă relativ mai mare comparativ cu aminoacizii care nu sunt incluşi în interfaţă. După disocierea proteinei care leagă antigenul (de ex., anticorp, sau fragment, sau polipeptidă), proteina ţintă este supusă analizei de scindare a proteazei şi spectrometriei de masă, dezvăluind astfel reziduurile marcate cu deuteriu care corespund aminoacizilor specifici cu care interacţionează proteina care leagă antigenul. Vezi, de ex., Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267: 252-259; Engen şi Smith (2001) Anal. Chem. 73: 256A-265A.
Termenul "concurează", aşa cum este utilizat aici, se referă la o proteină care leagă antigenul (de ex., anticorp sau fragment de legare a antigenului acestuia) care se leagă de un antigen (de ex., TMPRSS2) şi inhibă sau blochează legarea unei alte proteine care leagă antigenul (de ex., anticorp sau fragment de legare a antigenului acestuia) la antigen. Termenul include, de asemenea, competiţia între două proteine care leagă antigenul de ex., anticorpi, în ambele orientări, adică., un prim anticorp care leagă şi blochează legarea celui de-al doilea anticorp şi viceversa. În anumite aspecte, prima proteină care leagă antigenul (de ex., anticorp) şi a doua proteină care leagă antigenul (de ex., anticorp) se poate lega de acelaşi epitop. Alternativ, prima şi a doua proteină care leagă antigenul (de ex., anticorpi) se pot lega de epitopi diferiţi, dar, de exemplu, suprapuşi, în care legarea unuia inhibă sau blochează legarea celui de-al doilea anticorp, de ex., prin împiedicare sterică. Concurenţa între proteinele care leagă antigenul (de ex., anticorpi) se poate măsura prin metode cunoscute în domeniu, de exemplu, printr-un test de interferometrie cu strat bio, fără etichetă, în timp real. Concurenţă între o primă şi a doua proteină anti-TMPRSS2 care leagă antigenul (de ex., anticorp) poate fi determinat prin măsurarea capacităţii unei prime proteine anti-TMPRSS2 care leagă antigenul imobilizat (de ex., anticorp) (care nu este complexat iniţial cu proteina TMPRSS2) pentru a se lega de proteina TMPRSS2 solubilă complexată cu a doua proteină anti-TMPRSS2 care leagă antigenul (de ex., anticorp). O reducere a capacităţii primei proteine anti-TMPRSS2 care leagă antigenul (de ex., anticorp) de a se lega de proteina TMPRSS2 complexată, raportată la proteina TMPRSS2 necomplexată, indică faptul că prima şi a doua proteină anti-TMPRSS2 care leagă antigenul (de ex., anticorpi) concurează. Gradul de concurenţă poate fi exprimat ca procent din reducerea legăturii. O astfel de competiţie poate fi măsurat utilizând un test de interferometrie cu strat bio, fără etichetă, în timp real, de ex., pe un biosenzor Octet RED384 (Pall ForteBio Corp.), ELISA (teste imunosorbente legate de enzime), sau SPR (rezonanţă plasmonică de suprafaţă).
Concurenţa de legare între proteinele anti-TMPRSS2 care leagă antigenul (de ex., anticorpii monoclonali (mAbs)) se poate determina utilizând un test de interferometrie cu strat bio, fără etichetă, în timp real, pe un biosenzor Octet RED384 (Pall ForteBio Corp.). De exemplu, pentru a determina concurenţa dintre doi anticorpi monoclonali anti-TMPRSS2 umani, anti-TMPRSS2 mAb poate fi capturat mai întâi pe vârfurile biosenzorului Octet acoperit cu anticorp anti-hFc (Pall ForteBio Corp., # 18-5060) prin scufundarea vârfurilor într-un soluţie de mAb TMPRSS2 anti-uman (denumită ulterior «mAb1»). Ca un control pozitiv pentru blocare, anticorpii capturaţi de vârfurile biosenzorilor pot fi apoi saturate cu un mAb de control al izotipului de blocare cunoscut (denumit ulterior «mAb de blocare») prin scufundare într-o soluţie de mAb de blocare. Pentru a determina dacă mAb2 concurează cu mAb1, vârfurile biosenzorilor pot fi ulterior scufundate într-o soluţie co-complexată de polipeptidă TMPRSS2 umană şi o a doua mAb anti-umană TMPRSS2 (denumită ulterior «mAb2»), care fusese pre-incubată pentru o perioadă de timp şi se poate determina legarea mAb1 la polipeptida TMPRSS2. Vârfurile biosenzorului pot fi spălate în tampon între fiecare etapă a experimentului. Răspunsul de legare în timp real poate fi monitorizat în timpul experimentului şi răspunsul de legare la sfârşitul fiecărei etape poate fi înregistrat.
De exemplu, testul de competiţie poate fi efectuat la 25°C şi pH aproximativ 7, de ex., 7,4, de ex., în prezenţa tamponului, sării, surfactantului şi a unei proteine nespecifice (de ex., albumina serică bovină).
De obicei, un anticorp sau fragment de legare la antigen al dezvăluirii care este modificat într-un fel păstrează capacitatea de a se lega în mod specific de TMPRSS2, de ex., păstrează cel puţin 10% din activitatea sa de legare TMPRSS2 (în comparaţie cu anticorpul parental) atunci când acea activitate este exprimat pe o bază molară. De preferinţă, un anticorp sau fragment de legare la antigen din dezvăluire reţine cel puţin 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% sau 100% sau mai mult din afinitatea de legare a TMPRSS2 ca anticorp parental. De asemenea, se intenţionează ca un anticorp sau un fragment care leagă antigenul al dezvăluirii să includă substituţii de aminoacizi conservatori sau neconservatori (denumiţi «variante conservatoare» sau «variante conservate funcţional» ale anticorpului) care nu îşi modifică substanţial activitatea biologică.
O «variantă» a unei polipeptide, cum ar fi, un lanţ de imunoglobulină (de ex., H1H7017N VH, VL, HC sau LC), se referă la o polipeptidă care cuprinde o secvenţă de aminoacizi care este de cel puţin aproximativ 70-99,9% (de ex., 70, 72, 74, 75, 76, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,9%) identică sau similară cu o secvenţă de aminoacizi de referinţă care este prezentată aici (de ex., SECV ID NR. 2, 4, 17, 18 sau 19); atunci când comparaţia este realizată de un algoritm BLAST în care parametrii algoritmului sunt selectaţi pentru a da cea mai mare potrivire între secvenţele respective pe întreaga lungime a secvenţelor de referinţă respective (de ex., pragul aşteptat: 10; dimensiunea cuvântului: 3; potriviri maxime într-un interval de interogare: 0; matrice BLOSUM 62; costuri gap: existenţa 11, extensia 1; ajustarea matricială a scorului compoziţional condiţionat).
O "variantă" a unei polinucleotide se referă la o polinucleotidă care cuprinde o secvenţă de nucleotide care este de cel puţin aproximativ 70-99,9% (de ex., 70, 72, 74, 75, 76, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,9%) identică cu o secvenţă de nucleotide de referinţă care este prezentată aici (de ex., SECV ID NR. 1 sau 3); atunci când comparaţia este realizată de un algoritm BLAST în care parametrii algoritmului sunt selectaţi pentru a da cea mai mare potrivire între secvenţele respective pe întreaga lungime a secvenţelor de referinţă respective (de ex., pragul aşteptat: 10; dimensiunea cuvântului: 28; potriviri maxime într-un interval de interogare: 0; scoruri potrivire/nepotrivire: 1, -2; costurile decalajului: liniar).
Proteinele anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, de ex., anticorpii şi fragmentele acestora care leagă antigenul conform prezentei invenţii, pot include o regiune variabilă a lanţului greu de imunoglobulină care are cel puţin 70% (de ex., 80%, 85%, 90%, 95%, 99%) identitate cu secvenţa de aminoacizi cu aminoacizii stabiliţi în SECV ID NR: 2, 17 sau 19; şi/sau o regiune variabilă a lanţului uşor de imunoglobulină care are cel puţin 70% (de ex., 80%, 85%, 90%, 95%, 99%) identitate cu secvenţa de aminoacizi cu aminoacizii stabiliţi în SECV ID NR: 4 sau 18.
În plus, o variantă de proteină anti-TMPRSS2 care leagă antigenul poate include o polipeptidă care cuprinde o secvenţă de aminoacizi care este prezentată aici, cu excepţia uneia sau mai multor (de ex., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 sau 10) mutaţii, cum ar fi, de exemplu, mutaţii cu sens greşit (de ex., substituţii conservatoare), mutaţii non-sens, ştergeri sau inserţii. De exemplu, prezenta dezvăluire include proteine care leagă antigenul care includ o variantă de lanţ uşor de imunoglobulină care cuprind secvenţa de aminoacizi stabilită în SECV ID NR: 4 sau 18 dar având una sau mai multe dintre aceste mutaţii şi/sau o variantă de lanţ greu de imunoglobulină care cuprinde secvenţa de aminoacizi stabilită în SECV ID NR: 2, 17 sau 19 dar având una sau mai multe dintre astfel de mutaţii. Într-un aspect al dezvăluirii, o variantă de proteină anti-TMPRSS2 care leagă antigenul include o variantă de lanţ uşor de imunoglobulină care cuprinde CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3 în care unul sau mai multe (de ex., 1 sau 2 sau 3) din astfel de CDRs are una sau mai multe dintre aceste mutaţii (de ex., substituţii conservatoare) şi/sau o variantă cu lanţ greu de imunoglobulină care cuprinde CDR-H1, CDR-H2 şi CDR-H3 în care unul sau mai multe (de ex., 1 sau 2 sau 3) din astfel de CDRs are una sau mai multe dintre aceste mutaţii (de ex., substituţii conservatoare).
Dezvăluirea oferă în plus variante de proteine anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, de ex., anticorpi sau fragmente ale acestora care leagă antigenul, care cuprind una sau mai multe variante CDRs (de ex., oricare sau mai multe dintre CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 şi/sau CDR-H3) care sunt prezentate aici cu cel puţin 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% sau 99,9% identitate de secvenţă sau similaritate cu, de exemplu, SECV ID NR: 12, 14, 16, 6, 8 şi/sau 10.
Aspectele prezentei dezvăluiri includ, de asemenea, variante de proteine care leagă antigenul, de exemplu, anticorpi anti-TMPRSS2 şi fragmente ale acestora care leagă antigenul, care cuprind VHs şi VLs; sau HC şi LC de imunoglobulină, care cuprind o secvenţă de aminoacizi având 70% sau mai mult (de ex., 80%, 85%, 90%, 95%, 97% sau 99%) identitate generală a secvenţei de aminoacizi sau similaritate cu secvenţele de aminoacizi ale VHs, VLs, HCs sau LCs corespunzătoare specificate aici, dar în care CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 şi CDR-H3 ale acestor imunoglobuline nu sunt variante şi cuprind secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 12, 14, 16, 6, 8 şi respectiv 10. Astfel, în astfel de aspecte, CDRs din variantele de proteine care leagă antigenul nu sunt, ele însele, variante.
Variantele modificate conservator de anticorpi anti-TMPRSS2 şi fragmentele acestora care leagă antigenul sunt de asemenea descrise aici. O "variantă modificată conservator" sau o "substituţie conservatoare" se referă la o variantă în care există una sau mai multe substituţii de aminoacizi într-o polipeptidă cu alţi aminoacizi având caracteristici similare (de ex., sarcină, dimensiunea lanţului lateral, hidrofobicitate/hidrofilitate, conformaţie şi rigiditate a catenei principale, etc.). Astfel de modificări pot fi făcute frecvent fără a perturba în mod semnificativ activitatea biologică a anticorpului sau a fragmentului. Specialiştii în acest domeniu recunosc că, în general, substituţiile de aminoacizi unici în regiunile neesenţiale ale unei polipeptide nu modifică în mod substanţial activitatea biologică (vezi, de ex., Watson ş.a. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (Ed. a 4-a.)). În plus, substituţiile aminoacizilor similari din punct de vedere structural sau funcţional sunt mai puţin susceptibile să perturbe semnificativ activitatea biologică.
Exemplele de grupuri de aminoacizi care au lanţuri laterale cu proprietăţi chimice similare includ 1) lanţuri laterale alifatice: glicină, alanină, valină, leucină şi izoleucină; 2) lanţuri laterale alifatice-hidroxil: serină şi treonină; 3) lanţuri laterale care conţin amide: asparagină şi glutamină; 4) lanţuri laterale aromatice: fenilalanină, tirozină şi triptofan; 5) lanţuri laterale bazice: lizină, arginină şi histidină; 6) lanţuri laterale acide: aspartat şi glutamat şi 7) lanţuri laterale care conţin sulf: cisteină şi metionină. Grupurile preferate de substituţie a aminoacizilor conservatori sunt: valină-leucină-izoleucină, fenilalanină-tirozină, lizină-arginină, alanină-valină, glutamat-aspartat şi asparagină-glutamină. Alternativ, o înlocuire conservatoare este orice modificare care are o valoare pozitivă în matricea de probabilitate log PAM250 prezentată în Gonnet ş.a. (1992) Science 256: 1443 45.
Variantele conservatoare funcţional ale anticorpilor anti-TMPRSS2 şi fragmentele acestora care leagă antigenul sunt, de asemenea, descrise aici. Oricare dintre variantele anticorpilor anti-TMPRSS2 şi ale fragmentelor care leagă antigenul acestora (aşa cum s-a discutat aici) pot fi «variante conservatoare funcţional». Astfel de variante conservatoare funcţional pot fi, în unele cazuri, caracterizate şi ca variante conservative modificate. "Variante conservatoare funcţional", aşa cum este utilizat aici, se referă la variante ale anticorpilor anti-TMPRSS2 sau ale fragmentelor acestora care leagă antigenul în care unul sau mai multe resturi de aminoacizi au fost modificate fără a modifica semnificativ una sau mai multe proprietăţi funcţionale ale anticorpului sau fragmentului. De exemplu, o variantă conservatoare funcţional a anticorp anti-TMPRSS2 sau un fragment de legare a antigenului al acestuia poate cuprinde o secvenţă variantă de aminoacizi şi prezintă una sau mai multe dintre următoarele proprietăţi funcţionale:
• Inhibă creşterea virusului gripal (de ex., A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1)) în celulele care exprimă TMPRSS2 (de ex., celule Calu-3); • Se leagă de suprafaţa celulelor care exprimă TMPRSS (de ex., MDCK/Tet-on), de ex., cu o valoare EC50 de 440 pM sau 1,06 nM; • Nu se leagă semnificativ de celulele MDCK/Tet-on care nu exprimă TMPRSS2; • Se leagă de TMPRSS2 umană cu o KD de aproximativ 2,81 X 10-9 M la aproximativ 25°C; • Se leagă de TMPRSS2 umană cu o KD de aproximativ 9,31 X 10-9 M la aproximativ 37°C; • Se leagă de TMPRSS2 cynomolgous cu o KD de aproximativ 5,60 X 10-8 M la aproximativ 25°C; • Se leagă de TMPRSS2 cynomolgous cu o KD de aproximativ 1,40 X 10-7 M la aproximativ 37°C; • Limitează răspândirea infecţiei cu virusul gripal (de ex., prin virusul gripal H1_PR34; H1_CA09; H1_Bris; H9N2 sau H3N2) al celulelor, de ex., Calu-3, in vitro; şi/sau • Protejează un şoarece proiectat pentru a exprima proteina umană TMPRSS2 de moartea cauzată de infecţia cu virusul gripal, de ex., H1N1 sau H3N2, de exemplu, în care şoarecii sunt infectaţi cu o doză altfel letală de virus, opţional când s-au combinat cu un anticorp anti-HA.
Prezenta dezvăluire include un şoarece proiectat pentru a exprima proteina TMPRSS2 umană care include, în corpul şoarecelui, o proteină anti-TMPRSS2 care leagă antigenul (de ex., anticorp sau fragment care leagă antigenul), cum ar fi, H1H7017N şi H4H7017N. A se vedea publicaţia cererii internaţionale de brevet nr. WO2017/151453.
O proteină »neutralizantă» sau »antagonistă» anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, de ex., anticorp sau fragment care leagă antigenul, se referă la o moleculă care inhibă o activitate a TMPRSS2 în orice grad detectabil, de ex., inhibă activitatea de protează a TMPRSS2, de exemplu, a unui substrat precum HA; Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC (Sigma), unde Cbz este benziloxicarbonil şi AMC este 7-amino-4-metilcumarină; virus gripal HA0; proteina coronavirus S; sau precursorul TMPRSS2 care este scindat autocatalitic între Arg255 şi Ile256 şi/sau inhibă intrarea virusului gripal într-o celulă şi/sau inhibă reproducerea virusului gripal în corpul unui subiect.
"H1H7017N" şi "H4H7017N" se referă la proteinele care leagă antigenul, cum ar fi, anticorpii şi fragmentele acestora care leagă antigenul, care cuprind lanţul greu sau VH (sau o variantă a acestuia) şi lanţul uşor sau VL (sau o variantă a acestuia) aşa cum este prezentat mai jos; sau care cuprind un VH care cuprinde CDRs ale acestuia (CDR-H1 (sau o variantă a acestuia), CDR-H2 (sau o variantă a acestuia) şi CDR-H3 (sau o variantă a acestuia)) şi un VL care cuprinde CDRs ale acestora (CDR-L1 (sau o variantă a acestuia), CDR-L2 (sau o variantă a acestuia) şi CDR-L3 (sau o variantă a acestuia)), de ex., în care lanţurile de imunoglobulină, regiunile variabile şi/sau CDRs cuprind secvenţele specifice de aminoacizi descrise mai jos.
"H1H7017N" sau "H4H7017N" se poate referi opţional la un anticorp sau fragment de legare a antigenului al acestuia care cuprinde CDR-H1, CDR-H2 şi CDR-H3 ale unui lanţ greu de imunoglobulină care cuprinde secvenţa de aminoacizi stabilită în SECV ID NR. 2, 17 sau 19 şi CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3 ale unui lanţ uşor de imunoglobulină care cuprinde secvenţa de aminoacizi stabilită în SECV ID NR: 4 sau 18.
"H1H7017N" sau "H4H7017N" se poate referi, opţional, la un anticorp sau fragment de legare a antigenului al acestuia care cuprinde un VH care cuprinde secvenţa de aminoacizi stabilită în SECV ID NR: 2; şi un VL care cuprinde secvenţa de aminoacizi stabilită în SECV ID NR: 4.
"H1H7017N" se poate referi, opţional, la un anticorp sau fragment de legare la antigen care cuprinde un lanţ greu de imunoglobulină care cuprinde secvenţa de aminoacizi stabilită în SECV ID NR: 17; şi un lanţ uşor de imunoglobulină care cuprinde secvenţa de aminoacizi stabilită în SECV ID NR: 18.
"H4H7017N" se poate referi, opţional, la un anticorp sau fragment de legare la antigen care cuprinde un lanţ greu de imunoglobulină care cuprinde secvenţa de aminoacizi stabilită în SECV ID NR: 19; şi un lanţ uşorde imunoglobulină care cuprinde secvenţa de aminoacizi stabilită în SECV ID NR: 18. Termenul "H4H7017N" include, de asemenea, exemple de realizare în care VH este fuzionat cu o IgG4 de tip sălbatic, de ex., în care reziduul 108 este S.
Anticorp anti-TMRPS22 sau fragment de legare la antigen H1H7017N şi H4H7017N H1H7017N şi regiunea variabilă a lanţului greu H4H7017N (ADN)
H1H7017N şi regiunea variabilă a lanţului greu H4H7017N (polipeptidă)
H1H7017N şi regiunea variabilă a lanţului uşor H4H7017N (ADN)
H1H7017N şi regiunea variabilă a lanţului uşor H4H7017N (polipeptidă)
H1H7017N şi H4H7017N CDR-H1 (ADN)
GGA TTC ACC TTC AGT TCC TAT GGC (SECV ID NR: 5)
H1H7017N şi H4H7017N CDR-H1 (polipeptidă)
G F T F S S Y G
(SECV ID NR. 6 (sau o variantă a acesteia care are 1, 2, 3 sau 4 mutaţii punctuale şi/sau deleţii punctuale))
H1H7017N şi H4H7017N CDR-H2 (ADN)
ATA TGG AAT GAT GGA AGT TAT GTA
(ID SECV NR. 7)
H1H7017N şi H4H7017N CDR-H2 (polipeptidă)
I W N D G S Y V
(SECV ID NR. 8 (sau o variantă a acestuia care are 1, 2, 3 sau 4 mutaţii punctuale şi/sau deleţii punctuale))
H1H7017N şi H4H7017N CDR-H3 (ADN)
GCG AGA GAG GGG GAG TGG GTA CTT TAC TAC TTT GAC TAC
(ID SECV NR. 9)
H1H7017N şi H4H7017N CDR-H3 (polipeptidă)
A R E G E W V L Y Y F D Y
(SECV ID NR: 10 (sau o variantă a acesteia care are 1, 2, 3 sau 4 mutaţii punctuale şi/sau deleţii punctuale))
H1H7017N şi H4H7017N CDR-L1 (ADN)
CAG AGT ATT AGT AGC TGG
(SECV ID NR: 11)
H1H7017N şi H4H7017N CDR-L1 (Polipeptidă)
Q S I S S W
(SECV ID NR: 12 (sau o variantă a acesteia care are 1, 2, 3 sau 4 mutaţii punctuale şi/sau deleţii punctuale))
H1H7017N şi H4H7017N CDR-L2 (ADN)
AAG GCG TCT
(SECV ID NR: 13)
H1H7017N şi H4H7017N CDR-L2 (Polipeptidă)
K A S (SECV ID NR: 14 (sau o variantă a acesteia care are o mutaţie punctuală şi/sau deleţie punctuală))
H1H7017N şi H4H7017N CDR-L3 (ADN)
CAA CAG TAT AAT AGT TAT TCG TAC ACT
(SECV ID NR: 15)
H1H7017N şi H4H7017N CDR-L3 (Polipeptidă)
Q Q Y N S Y S Y T
(SECV ID NR: 16 (sau o variantă a acesteia care are 1, 2, 3 sau 4 mutaţii punctuale şi/sau deleţii punctuale))
H1H7017N
IgG1 umană cu lanţ greu de lungime totală
Lanţ uşor de lungime totală-Kapa uman
H4H7017N
IgG4 umană cu lanţ greu de lungime totală (S108P)
Lanţ uşor de lungime totală - Kapa uman
Anticorpii şi fragmentele care leagă antigenul din prezenta dezvăluire cuprind lanţuri de imunoglobulină care includ secvenţele de aminoacizi prezentate aici, precum şi modificări post-translaţionale celulare şi in vitro ale anticorpului. De exemplu, prezenta dezvăluire include anticorpi şi fragmente de legare a antigenului ale acestora care se leagă în mod specific la TMPRSS2 care cuprinde secvenţe de aminoacizi cu lanţ greu şi/sau uşor stabilite aici (de ex., CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 şi/sau CDR-L3), precum şi anticorpi şi fragmente în care unul sau mai multe resturi de aminoacizi sunt glicozilate, unul sau mai multe resturi de Asn sunt deamidate, unul sau mai multe reziduuri (de ex., Met, Trp şi/sau His) este oxidat, Gln N-terminal este piroglutamat (pyroE) şi/sau lizina C-terminală lipseşte.
În prezenta invenţie, este furnizată o proteină care leagă antigenul care este o proteină umană care leagă antigenul care se leagă în mod specific la TMPRSS2 umană şi care este un anticorp sau un fragment de legare a antigenului al acestuia şi în care proteina care leagă antigenul cuprinde:
o regiune variabilă a lanţului greu de imunoglobulină care cuprinde
(a) un CDR-H1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: G F T F S S Y G (SECV ID NR: 6),
(b) un CDR-H2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: I W N D G S Y V (SECV ID NR: 8) şi
(c) un CDR-H3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: A R E G E W V L Y Y F D Y (SECV ID NR: 10); şi
o regiune variabilă a lantului uşor de imunoglobulină care cuprinde
(a) un CDR-L1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: Q S I S S W (SECV ID NR: 12),
(b) un CDR-L2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: K A S (SECV ID NR: 14) şi
(c) un CDR-L3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: Q Q Y N S Y S Y T (SECV ID NR: 16).
Prezenta invenţie prevede, de asemenea, un vas (de ex., un flacon din plastic sau sticlă, de ex., cu un capac sau o coloană cromatografică, ac tubular gol sau un cilindru de seringă) care cuprinde o proteină anti-TMPRSS2 care leagă antigenul conform prezentei invenţii, de ex., H1H7017N sau H4H7017N.
Prezenta dezvăluire oferă, de asemenea, un dispozitiv de injecţie care cuprinde una sau mai multe proteine care leagă antigenul (de ex., anticorp sau fragment care leagă antigenul) care se leagă în mod specific de TMPRSS2, de ex., H4H7017N sau H1H7017N, sau o compoziţie farmaceutică a acestora. Dispozitivul de injecţie poate fi ambalat într-un kit. Un dispozitiv de injecţie este un dispozitiv care introduce o substanţă în corpul unui subiect printr-o cale parenterală, de ex., intramuscular, subcutanat sau intravenos. De exemplu, un dispozitiv de injecţie poate fi o seringă (de ex., preumplută cu compoziţia farmaceutică, cum ar fi, un auto-injector) care, de exemplu, include un cilindru sau butoi pentru reţinerea fluidului de injectat (de ex., care cuprinde anticorpul sau fragmentul, sau o compoziţie farmaceutică a acestuia), un ac pentru străpungerea pielii şi/sau a vaselor de sânge pentru injectarea fluidului; şi un piston pentru împingerea fluidului din cilindru şi prin spaţiul gol al acului. Un dispozitiv de injecţie care cuprinde o proteină care leagă antigenul, de exemplu, un anticorp sau un fragment de legare a antigenului al acestuia, dintr-o combinaţie a prezentei dezvăluiri, sau o compoziţie farmaceutică a acestuia poate fi un dispozitiv de injectare intravenos (IV). Un astfel de dispozitiv poate include proteina care leagă antigenul, sau o compoziţie farmaceutică a acesteia într-o canulă sau trocar/ac care poate fi ataşat la un tub care poate fi ataşat la o pungă sau la un rezervor pentru reţinerea fluidului (de ex., ser fiziologic) introdus în corpul subiectului prin canulă sau trocar/ac. Anticorpul sau fragmentul sau o compoziţie farmaceutică a acestuia, într-un aspect al dezvăluirii, poate fi introdus în dispozitiv odată ce trocarul şi canula sunt introduse în vena unui subiect şi trocarul este îndepărtat din canula introdusă. Dispozitivul IV poate fi, de exemplu, introdus într-o venă periferică (de ex., în mână sau braţ); vena cavă superioară sau vena cavă inferioară, sau în atriul drept al inimii (de ex., un IV central); sau într-o venă subclaviană, jugulară internă sau femurală şi, de exemplu, avansată spre inimă până când ajunge la vena cavă superioară sau la atriul drept (de ex., o linie venoasă centrală). Un dispozitiv de injecţie poate fi un autoinjector; un injector cu jet sau o pompă de perfuzie externă. Un injector cu jet utilizează un jet îngust de lichid cu presiune ridicată care pătrunde în epidermă pentru a introduce anticorpul sau fragmentul sau o compoziţie farmaceutică a acestuia în corpul unui subiect. Pompele de perfuzie externe sunt dispozitive medicale care livrează anticorpul sau fragmentul sau o compoziţie farmaceutică a acestuia în corpul unui subiect în cantităţi controlate. Pompele de perfuzie externe pot fi alimentate electric sau mecanic. Diferite pompe funcţionează în moduri diferite, de exemplu, o pompă de seringă reţine fluidul în rezervorul unei seringi, iar un piston mobil controlează livrarea fluidului, o pompă elastomerică reţine fluidul într-un rezervor de balon extensibil şi presiunea din pereţii elastici ai balonului antrenează livrarea fluidului. Într-o pompă peristaltică, un set de role ciupesc în jos pe o lungime de tub flexibil, împingând fluidul înainte. Într-o pompă multicanal, fluidele pot fi livrate din mai multe rezervoare la viteze multiple. Dispozitivele de injectare conform prezentei invenţii cuprind o proteină care leagă antigenul conform prezentei invenţii. Un dispozitiv de injecţie conform invenţiei poate cuprinde o compoziţie conform invenţiei. Într-un exemplu de realizare a invenţiei, dispozitivul de injecţie cuprinde o compoziţie farmaceutică conform invenţiei.
Prezenta dezvăluire oferă, în plus, metode pentru administrarea unei proteine anti-TMPRSS2 care leagă antigenul conform prezentei dezvăluiri, de exemplu, H4H7017N sau H1H7017N, care cuprinde introducerea proteinei care leagă antigenul în corpul unui subiect (de ex., un om). De exemplu, metoda cuprinde străpungerea corpului subiectului cu un ac al unei seringi şi injectarea proteinei care leagă antigenul în corpul subiectului, de exemplu, în venă, arteră, tumoră, ţesut muscular sau subcutanat al subiectului. În prezenta invenţie, este furnizată o proteină de legare a antigenului din invenţie pentru utilizare într-o metodă pentru tratarea sau prevenirea infecţiei cu un virus gripal la un subiect care are nevoie de acesta, care cuprinde administrarea unei cantităţi eficiente terapeutic din proteina de legare a antigenului.
Pregătirea anticorpilor umani
Metodele de generare a anticorpilor umani la şoareci transgenici sunt cunoscute în domeniu. Orice astfel de metode cunoscute pot fi utilizate în contextul prezentei invenţii pentru a produce anticorpi umani care se leagă în mod specific la TMPRSS2. Un imunogen care cuprinde oricare dintre cele care urmează poate fi utilizat pentru a genera anticorpi împotriva TMPRSS2. În anumite aspecte ale dezvăluirii, anticorpii dezvăluirii sunt obţinuţi de la şoareci imunizaţi cu TMPRSS2 nativă de lungime completă, sau cu un virus viu atenuat sau inactivat, sau cu ADN care codifică proteina sau fragmentul acesteia. Alternativ, proteina TMPRSS2 sau un fragment al acesteia se poate produce utilizând tehnici biochimice standard şi modificate şi poate fi utilizată ca imunogen. Într-un aspect al dezvăluirii, imunogenul este o proteină TMPRSS2 produsă recombinant sau un fragment al acesteia. În anumite aspecte ale dezvăluirii, imunogenul poate fi un vaccin polipeptidic TMPRSS2. În anumite aspecte, pot fi administrate una sau mai multe injecţii de rapel. În anumite aspecte, imunogenul poate fi o polipeptidă TMPRSS2 recombinantă exprimată în E. coli sau în orice alte celule eucariote sau de mamifere, cum ar fi, celulele ovarului de hamster chinezesc (CHO).
Folosind tehnologia VELOCIMMUNE® (vezi, de exemplu, US 6.596.541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®) sau orice altă metodă cunoscută pentru generarea anticorpilor monoclonali, pot fi iniţial izolaţi anticorpii himerici cu afinitate ridicată pentru TMPRSS2 care au o regiune variabilă umană şi o regiune constantă de şoarece. Tehnologia VELOCIMMUNE® implică generarea unui şoarece transgenic care are un genom care cuprinde regiuni variabile ale lanţului greu şi uşor uman legate în mod operaţional de loci de regiune constantă endogenă de şoarece astfel încât şoarecele să producă un anticorp care cuprinde o regiune variabilă umană şi o regiune constantă de şoarece ca răspuns la stimularea antigenică. ADN-ul care codifică regiunile variabile ale lanţurilor grele şi uşoare ale anticorpului sunt izolate şi legate în mod operaţional de ADN-ul care codifică regiunile constante ale lanţului greu şi uşor uman. ADN-ul este apoi exprimat într-o celulă capabilă să exprime anticorpul complet uman.
În general, un şoarece VELOCIMMUNE® este provocat cu antigenul de interes, iar celulele limfatice (cum ar fi, celulele B) sunt recuperate de la şoarecii care exprimă anticorpi. Celulele limfatice pot fi fuzionate cu o linie celulară de mielom pentru a prepara linii celulare de hibridom nemuritor şi astfel de linii celulare de hibridom sunt protejate şi selectate pentru a identifica linii celulare de hibridom care produc anticorpi specifici antigenului de interes. ADN-ul care codifică regiunile variabile ale lanţului greu şi lanţului uşor poate fi izolat şi legat de regiunile constante izotipice dorite ale lanţului greu şi lanţului uşor. O astfel de proteină anticorp poate fi produsă într-o celulă, cum ar fi, o celulă CHO. Alternativ, ADN-ul care codifică anticorpii himerici specifici antigenului sau domeniile variabile ale lanţurilor uşoare şi grele poate fi izolat direct din limfocitele specifice antigenului.
Iniţial, sunt izolaţi anticorpii himerici cu afinitate ridicată care au o regiune variabilă umană şi o regiune constantă de şoarece. Ca şi în secţiunea experimentală de mai jos, anticorpii sunt caracterizaţi şi selectaţi pentru caracteristicile dorite, inclusiv afinitate, selectivitate, epitop, etc. Regiunile constante ale şoarecilor sunt înlocuite cu o regiune constantă umană dorită pentru a genera un anticorp complet uman, de exemplu, IgG1 sau IgG4 de tip sălbatic sau modificat. În timp ce regiunea constantă selectată poate varia în funcţie de utilizarea specifică, caracteristicile de legare a antigenului cu afinitate ridicată şi specificitatea ţintei se află în regiunea variabilă.
Anticorpi anti-TMPRSS2 care cuprind variante Fc
Conform anumitor aspecte ale prezentei dezvăluiri, se furnizează proteine anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, de ex., anticorpi sau fragmente de legare a antigenului care cuprind un domeniu Fc care cuprinde una sau mai multe mutaţii, care, de exemplu, sporesc sau diminuează legarea anticorpilor la receptorul FcRn, de ex., la pH acid comparativ cu pH neutru. De exemplu, prezenta dezvăluire include anticorpi anti-TMPRSS2 care cuprind o mutaţie în CH2 sau o regiune CH3 a domeniului Fc, în care mutaţia(mutaţiile) creşte(cresc) afinitatea domeniului Fc pentru FcRn într-un mediu acid (de ex., într-un endozom în care pH-ul variază între aproximativ 5,5 şi aproximativ 6,0). Astfel de mutaţii pot duce la o creştere a timpului de înjumătăţire plasmatică al anticorpului atunci când este administrat unui animal. Exemplele nelimitative de astfel de modificări Fc includ, de ex., o modificare la poziţia 250 (de ex., E sau Q); 250 şi 428 (de ex., L sau F); 252 (de ex., L/Y/F/W sau T), 254 (de ex., S sau T), şi 256 (de ex., S/R/Q/E/D sau T); sau o modificare la poziţia 428 şi/sau 433 (de ex., H/L/R/S/P/Q sau K) şi/sau 434 (de ex., A, W, H, F sau Y [N434A, N434W, N434H, N434F sau N434Y]); sau o modificare la poziţia 250 şi/sau 428; sau o modificare la poziţia 307 sau 308 (de ex., 308F, V308F), şi 434. Într-un caz, modificarea cuprinde o modificare 428L (de ex., M428L) şi 434S (de ex., N434S); o modificare 428L, 2591 (de ex., V259I), şi 308F (de ex., V308F); o modificare 433K (de ex., H433K) şi a 434 (de ex., 434Y); o modificare 252, 254, şi 256 (de ex., 252Y, 254T, şi 256E); o modificare 250Q şi 428L (de ex., T250Q şi M428L); şi o modificare 307 şi/sau 308 (de ex., 308F sau 308P). În încă un alt caz, modificarea cuprinde o modificare 265A (de ex., D265A) şi/sau a 297A (de ex., N297A).
De exemplu, prezenta dezvăluire include proteine anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, de ex., anticorpi sau fragmente care leagă antigenul, care cuprind un domeniu Fc care cuprinde una sau mai multe perechi sau grupuri de mutaţii selectate din grupul care constă din: 250Q şi 248L (de ex., T250Q şi M248L); 252Y, 254T şi 256E (de ex., M252Y, S254T şi T256E); 428L şi 434S (de ex., M428L şi N434S); 2571 şi 3111 (de ex., P257I şi Q311I); 257I şi 434H (de ex., P257I şi N434H); 376V şi 434H (de ex., D376V şi N434H); 307A, 380A şi 434A (de ex., T307A, E380A şi N434A); şi 433K şi 434F (de ex., H433K şi N434F).
Sunt avute în vedere în cadrul prezentei dezvăluiri proteinele anti-TMPRSS care leagă antigenul, de ex., anticorpi şi fragmente ale acestora care leagă antigenul, care cuprind un VH şi/sau VL aşa cum este prezentat aici care cuprinde orice combinaţii posibile ale mutaţiilor domeniului Fc de mai sus.
Prezenta dezvăluire include, de asemenea, proteine anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, anticorpi sau fragmente care leagă antigenul, care cuprind un VH prezentat aici şi o regiune constantă a lanţului greu himeric (CH), în care regiunea CH himerică cuprinde segmente derivate din regiuni CH cu mai mult de un izotip de imunoglobulină. De exemplu, anticorpii pot cuprinde o regiune CH himerică care cuprinde o parte sau tot domeniul CH2 derivat dintr-o moleculă IgG1 umană, IgG2 umană sau IgG4 umană, combinată cu o parte sau tot domeniul CH3 derivat dintr-o moleculă IgG1 umană, IgG2 umană sau IgG4 umană. Anticorpii pot cuprinde o regiune CH himerică care are o regiune de balama himerică. De exemplu, o balama himerică poate cuprinde o secvenţă de aminoacizi "balama superioară" (reziduuri de aminoacizi de la poziţiile 216 până la 227 conform numerotării EU) derivate dintr-o regiune balama de IgG1 umană, IgG2 umană sau IgG4 umană, combinată cu o secvenţa de »balama inferioară"(reziduuri de aminoacizi din poziţiile 228 până la 236 conform numerotării EU) derivată dintr-o regiune balama de IgG1 umană, IgG2 umană sau IgG4 umană. Conform anumitor cazuri, regiunea balamalei himerice cuprinde reziduuri de aminoacizi derivate dintr-o balamă superioară de IgG1 umană sau IgG4 umană şi reziduuri de aminoacizi derivate dintr-o balamală inferioară de IgG2 umană. Un anticorp care cuprind o regiune CH himerică descrisă aici poate, în anumite cazuri, să prezinte funcţii efector Fc modificate fără a afecta negativ proprietăţile terapeutice sau farmacocinetice ale anticorpului. (Vezi, de ex., WO2014/022540).
Imunoconjugate
Dezvăluirea cuprinde proteine anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, de ex., anticorpi sau fragmente care leagă antigenul, conjugate cu un alt fragment, de ex., o porţiune terapeutică (un »imunoconjugat»), cum ar fi, un toxoid sau un medicament antiviral pentru tratarea infecţiei cu virusul gripal. De exemplu, un anticorp sau fragment anti-TMPRSS2 poate fi conjugat cu oricare dintre agenţii terapeutici suplimentari stabiliţi aici. Aşa cum este utilizat aici, termenul "imunoconjugat" se referă la o proteină care leagă antigenul, de ex., un anticorp sau fragment care leagă antigenul, care este legat chimic sau biologic de un agent radioactiv, o citokină, un interferon, un fragment ţintă sau reporter, o enzimă, o peptidă sau o proteină sau un agent terapeutic. Proteina care leagă antigenul poate fi legată de agentul radioactiv, citokina, interferonul, fragmentul ţintă sau reporter, enzima, peptida sau agentul terapeutic în orice locaţie în lungul moleculei, atâta timp cât este capabilă să îşi lege ţinta (TMPRSS2). Exemplele de imunoconjugate includ conjugate anticorp-medicament şi proteine de fuziune anticorp-toxină. Într-un caz, agentul poate fi un al doilea anticorp diferit care se leagă în mod specific de TMPRSS2. Tipul fragmentului terapeutic care poate fi conjugat cu proteina anti-TMPRSS2 care leagă antigenul (de ex., anticorp sau fragment) va lua în considerare starea de tratat şi efectul terapeutic dorit de atins. Vezi, de ex., Arnon ş.a., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld ş.a. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom ş.a., "Antibodies For Drug Delivery", Controlled Drug Delivery (Ed. a 2-a), Robinson ş.a. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", Monoclonal Antibodies 1984: Biological and Clinical Applications, Pinchera ş.a. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, and Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, Baldwin ş.a. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), şi Thorpe ş.a., "The Preparation and Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982).
Anticorpi multi-specifici
Prezenta dezvăluire include proteine anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, de ex., anticorpi şi fragmente care leagă antigenul ale acestora, precum şi metode de utilizare a acestora şi metode de fabricare a unor astfel de proteine care leagă antigenul. Termenul de proteine care leagă antigenul "anti-TMPRSS2", de ex., anticorpi sau fragmente care leagă antigenul, include molecule multispecifice (de ex., molecule bispecifice sau biparatopice) care includ cel puţin un prim domeniu de legare la antigen care se leagă în mod specific de TMPRSS2 (de ex., un domeniu de legare a antigenului de la H1H7017N sau H4H7017N) şi cel puţin un al doilea domeniu de legare a antigenului care se leagă de un antigen diferit, sau de un epitop din TMPRSS2 care este diferit de cel al primului domeniu de legare a antigenului (de ex., HA gripal, cum ar fi, un domeniu de legare la antigen de la H1H14611 N2, H1H14612N2 sau H1H11729P). Opţional, primul şi al doilea epitop se pot suprapune. Alternativ, primul şi al doilea epitop nu se suprapun. De exemplu, într-un exemplu de realizare a invenţiei, un anticorp multispecific este un anticorp IgG bispecific (de ex., IgG1 sau IgG4) care include un prim domeniu care leagă antigenul care se leagă în mod specific de TMPRSS2 incluzând lanţul greu şi uşor de imunoglobulină al H1H7017N sau H4H7017N şi un al doilea domeniu care leagă antigenul care se leagă în mod specific de HA gripal (care cuprinde un lanţ greu de imunoglobulină, cum ar fi, H1H14611N2, H1H14612N2 sau H1H11729P).
»H1H7017N» include o moleculă multispecifică, de ex., anticorpi sau fragmente care leagă antigenul, care includ HCDRs şi LCDRs, VH şi VL, sau HC şi LC ale H1H7017N (inclusiv variante ale acestora aşa cum sunt prezentate aici).
»H4H7017N» include o moleculă multispecifică, de ex., anticorpi sau fragmente care leagă antigenul, care includ HCDRs şi LCDRs, VH şi VL, sau HC şi LC ale H4H7017N (inclusiv variante ale acestora aşa cum sunt prezentate aici).
Într-o realizare a invenţiei, un domeniu de legare la antigen care se leagă în mod specific de TMPRSS, care poate fi inclus într-o moleculă multispecifică, cuprinde:
(1)
(i) o secvenţă de domeniu variabil a lanţului greu care cuprinde CDR-H1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 6, CDR-H2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 8 şi CDR-H3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 10 şi
(ii) o secvenţă de domeniu variabil a lanţului uşor care cuprinde CDR-L1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 12, CDR-L2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 14 şi CDR-L3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 16;
sau,
(2)
(i) o secvenţă de domeniu variabil a lanţului greu care cuprinde secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 2 şi
(ii) o secvenţă de domeniu variabil a lanţului uşor care cuprinde secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 4;
sau,
(3)
(i) o secvenţă a lanţului greu de imunoglobulină care cuprinde secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 17 sau 19 şi
(ii) o secvenţă a lanţului uşor de imunoglobulină care cuprind secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 18.
Într-un exemplu de realizare a invenţiei, anticorpul multispecific sau fragmentul include mai mult de două specificităţi de legare diferite (de ex., o moleculă trispecifică), de exemplu, unul sau mai multe domenii suplimentare de legare la antigen care sunt aceleaşi sau diferite de primul şi/sau al doilea domeniu de legare la antigen.
De exemplu, o moleculă multispecifică poate cuprinde, pe lângă un situs de legare la antigen care se leagă în mod specific de TMPRSS2, un situs de legare la antigen care se leagă în mod specific la HA gripal preluat de la un anticorp selectat din grupul care constă din: H1H14611N2; H1H14612N2; H1H11723P; H1H11729P; H1H11820N; H1H11829N; H1H11829N2; H2aM11829N; H2M11830N; H1H11830N2; H1H11903N; H1H14571N; H2a14571N ; H1H11704P; H1H11711P; H1H11714P; H1H11717P; H1H11724P; H1H11727P; H1H11730P2; H1H11731P2; H1H11734P2; H1H11736P2; H1H11742P2; H1H11744P2; H1H11745P2; H1H11747P2; H1H11748P2; H1H17952B; H1H17953B; H1H17954B; H1H17955B; H1H17956B; H1H17957B; H1H17958B; H1H17959B; H1H17960B; H1H17961B; H1H17962B; H1H17963B; H1H17964B; H1H17965B; H1H17966B; H1H17967B; H1H17968B; H1H17969B; H1H17970B; H1H17971B; H1H17972B; H1H17973B; H1H17974B; H1H17975B; H1H17976B; H1H17977B; H1H17978B; H1H17979B; H1H17980B; H1H17981B; H1H17982B; H1H17983B; H1H17984B; H1H17985B; H1H17986B; H1H17987B; H1H17988B; H1H17989B; H1H17990B; H1H17991B; H1H17992B; H1H17993B; H1H17994B; H1H17995B; H1H17996B; H1H17997B; H1H17998B; H1H17999B; H1H18000B; H1H18001B; H1H18002B; H1H18003B; H1H18004B; H1H18005B; H1H18006B; H1H18007B; H1H18008B; H1H18009B; H1H18010B; H1H18011B; H1H18012B; H1H18013B; H1H18014B; H1H18015B; H1H18016B; H1H18017B; H1H18018B; H1H18019B; H1H18020B; H1H18021B; H1H18022B; H1H18023B; H1H18024B; H1H18025B; H1H18026B; H1H18027B; H1H18028B; H1H18029B; H1H18030B; H1H18031B; H1H18032B; H1H18033B; H1H18034B; H1H18035B; H1H18037B; H1H18038B; H1H18039B; H1H18040B; H1H18041B; H1H18042B; H1H18043B; H1H18044B; H1H18045B; H1H18046B; H1H18047B; H1H18048B; H1H18049B; H1H18051B; H1H18052B; H1H18053B; H1H18054B; H1H18055B; H1H18056B; H1H18057B; H1H18058B; H1H18059B; H1H18060B; H1H18061B; H1H18062B; H1H18063B; H1H18064B; H1H18065B; H1H18066B; H1H18067B; H1H18068B; H1H18069B; H1H18070B; H1H18071B; H1H18072B; H1H18073B; H1H18074B; H1H18075B; H1H18076B; H1H18077B; H1H18078B; H1H18079B; H1H18080B; H1H18081B; H1H18082B; H1H18083B; H1H18084B; H1H18085B; H1H18086B; H1H18087B; H1H18088B; H1H18089B; H1H18090B; H1H18091B; H1H18092B; H1H18093B; H1H18094B; H1H18095B; H1H18096B; H1H18097B; H1H18098B; H1H18099B; H1H18100B; H1H18101B; H1H18102B; H1H18103B; H1H18104B; H1H18105B; H1H18107B; H1H18108B; H1H18109B; H1H18110B; H1H18111B; H1H18112B; H1H18113B; H1H18114B; H1H18115B; H1H18116B; H1H18117B; H1H18118B; H1H18119B; H1H18120B; H1H18121B; H1H18122B; H1H18123B; H1H18124B; H1H18125B; H1H18126B; H1H18127B; H1H18128B; H1H18129B; H1H18130B; H1H18131B; H1H18132B; H1H18133B; H1H18134B; H1H18135B; H1H18136B; H1H18137B; H1H18138B; H1H18139B; H1H18140B; H1H18141B; H1H18142B; H1H18143B; H1H18144B; H1H18145B; H1H18146B; H1H18147B; H1H18148B; H1H18149B; H1H18150B; H1H18151B; H1H18152B; H1H18153B; H1H18154B; H1H18155B; H1H18156B; H1H18157B; H1H18158B; H1H18159B; H1H18160B; H1H18161B; H1H18162B; H1H18163B; H1H18164B; H1H18165B; H1H18166B; H1H18167B; H1H18168B; H1H18169B; H1H18170B; H1H18171B; H1H18172B; H1H18173B; H1H18174B; H1H18175B; H1H18176B; H1H18177B; H1H18178B; H1H18179B; H1H18180B; H1H18181B; H1H18182B; H1H18183B; H1H18184B; H1H18185B; H1H18186B; H1H18187B; H1H18188B; H1H18189B; H1H18190B; H1H18191B; H1H18192B; H1H18193B; H1H18194B; H1H18195B; H1H18196B; H1H18197B; H1H18198B; H1H18199B; H1H18200B; H1H18201B; H1H18202B; H1H18203B; H1H18204B; H1H18205B; H1H18206B; H1H18207B; H1H18208B; H1H18209B; H1H18210B; H1H18211B; H1H18212B; H1H18213B; H1H18214B; H1H18216B; H1H18217B; H1H18218B; H1H18219B; H1H18220B; H1H18221B; H1H18222B; H1H18223B; H1H18224B; H1H18225B; H1H18226B; H1H18227B; H1H18228B; H1H18229B; H1H18230B; H1H18231B; H1H18232B; H1H18233B; H1H18234B; H1H18235B; H1H18236B; H1H18237B; H1H18238B; H1H18239B; H1H18240B; H1H18241B; H1H18242B; H1H18243B; H1H18244B; H1H18245B; H1H18246B; H1H18247B; H1H18248B; H1H18249B; H1H18250B; H1H18251B; H1H18252B; H1H18253B; H1H18254B; H1H18255B; H1H18256B; H1H18257B; H1H18258B; H1H18259B; H1H18261B; H1H18262B; H1H18263B; H1H18264B; H1H18265B; H1H18266B; H1H18267B; H1H18268B; H1H18269B; H1H18270B; H1H18271B; H1H18272B; H1H18274B; H1H18275B; H1H18276B; H1H18277B; H1H18278B; H1H18279B; H1H18280B; H1H18281B; H1H18282B; H1H18283B; H1H18284B; H1H18285B; H1H18286B; H1H18287B; H1H18288B; H1H18289B; H1H18290B; H1H18291B; H1H18292B; H1H18293B; H1H18294B; H1H18295B; H1H18297B; H1H18298B; H1H18299B; H1H18300B; H1H18301B; H1H18302B; H1H18303B; H1H18304B; H1H18305B; H1H18306B; H1H18307B; H1H18308B; H1H18309B; H1H18310B; H1H18311B; H1H18312B; H1H18313B; H1H18314B; H1H18315B; H1H18316B; H1H18317B; H1H18318B; H1H18319B; H1H18320B; H1H18321B; H1H18322B; H1H18323B; H1H18324B; H1H18325B; H1H18326B; H1H18327B; H1H18328B; H1H18329B; H1H18330B; H1H18331B; H1H18332B; H1H18333B; H1H18334B; şi H1H18335B; aşa cum se prevede în publicaţia nr. WO2016/100807 (de ex., CDR-Hs, VH sau lanţ greu al acestuia; şi CDR-Ls, VL sau lanţ uşor al acestuia).
O moleculă multispecifică poate cuprinde, pe lângă un situs de legare a antigenului care se leagă în mod specific de TMPRSS2, un situs de legare a antigenului care se leagă în mod specific de proteina HA a Grupului II gripal, de ex., care cuprinde VH şi VL din H1H14611N2 (de ex., SECV ID Nr. 24 şi 28); sau un lanţ greu de imunoglobulină care cuprinde CDR-H1, CDR-H2 şi CDR-H3 din H1H14611 N2 (de ex., SECV ID NR. 25-27) şi un lanţ uşor de imunoglobulină care cuprinde CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3 din H1H14611N2 (de ex., SECV ID NR. 29-31).
O moleculă multispecifică poate cuprinde, pe lângă un situs de legare a antigenului care se leagă în mod specific de TMPRSS2, un situs de legare a antigenului care se leagă în mod specific de proteina HA a Grupului II gripal, de ex., care cuprinde VH şi VL din H1H14612N2 (de ex., SECV ID Nr. 40 şi 44); sau un lanţ greu de imunoglobulină care cuprinde CDR-H1, CDR-H2 şi CDR-H3 din H1H14612N2 (de ex., SECV ID NR: 41-43) şi un lanţ uşor de imunoglobulină care cuprinde CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3 din H1H14612N2 (de ex., SECV ID NR. 45-47).
O moleculă multispecifică poate cuprinde, pe lângă un situs de legare a antigenului care se leagă în mod specific de TMPRSS2, un situs de legare a antigenului care se leagă în mod specific de proteina HA a Grupei I gripale, de ex., care cuprinde VH şi VL din H1H11729P (de ex., SECV ID Nr. 32 şi 36); sau un lanţ greu de imunoglobulină care cuprinde CDR-H1, CDR-H2 şi CDR-H3 din H1H11729P (de ex., SECV ID NR. 33-35) şi un lanţ uşor de imunoglobulină care cuprind CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3 din H1H11729P (de ex., SECV ID NR. 37-39).
Într-un aspect al dezvăluirii, un fragment bispecific care leagă antigenul cuprinde un prim scFv (de ex., care cuprinde VH şi VL de H1H7017N sau H4H7017N) care are specificitate de legare pentru un prim epitop (de ex., TMPRSS2) şi un al doilea scFv (de ex., care cuprinde VH şi VL ale unui anticorp anti-gripal HA) care are specificitate de legare pentru un al doilea epitop diferit. De exemplu, într-un aspect al dezvăluirii, primul şi al doilea scFv sunt legaţi de un linker, de exemplu, un linker peptidic (de ex., un linker GS precum (GGGGS)n (SECV ID NR: 48) în care n este, de exemplu, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 sau 10). Alte fragmente bispecifice care leagă antigenul includ un F(ab)2 al unui anticorp IgG bispecific care cuprinde CDRs ale lanţului greu şi uşor al H1H7017N sau H4H7017N şi ale unui alt anticorp care se leagă de un epitop diferit.
Metode terapeutice
Prezenta dezvăluire oferă metode pentru tratarea sau prevenirea infecţiei virale sau a cancerului (de ex., cancer de prostată) prin administrarea unei cantităţi eficiente terapeutic de proteine anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, de ex., anticorp sau fragment de legare la antigen, (de ex., H1H7017N sau H4H7017N) unui subiect (de ex., un om) care are nevoie de un astfel de tratament sau prevenire. În prezenta invenţie, este furnizată o proteină de legare a antigenului conform invenţiei pentru utilizare într-o metodă pentru tratarea sau prevenirea infecţiei cu un virus gripal la un subiect care are nevoie de acesta, care cuprinde administrarea unei cantităţi eficiente terapeutic din proteina de legare a antigenului.
Infecţia cu virus gripal poate fi tratată sau prevenită, la un subiect, prin administrarea unui subiect a unei proteine anti-TMPRSS2 care leagă antigenul conform prezentei invenţii. Virusurile gripale sunt clasificate în tipurile A, B şi C pe baza proteinelor lor de bază. Subtipurile de virusuri gripale A sunt determinate de glicoproteinele din înveliş care posedă fie activitate de hemagglutinină (HA), fie de neuraminidază (NA). Există mai multe subtipuri HA (de ex., HA1, HA2, HA3, HA4, HA5, HA6, HA7, HA8, HA9, HA10, HA11, HA12, HA13, HA14, HA15, HA16, HA17 sau HA18 - aceste subtipuri pot fi desemnate ca H1, H2, H3, etc.) şi subtipurile NA (de ex., NA1, NA2, NA3, NA4, NA5, NA6, NA7, NA8, NA9, NA10 sau NA11 - aceste subtipuri pot fi desemnate ca N1, N2, N3, etc.) ale virusurilor gripale A care sunt utilizate pentru a desemna subtipul gripei A. De exemplu, virusul gripal A H1N1 şi H3N2 sunt agenţi patogeni umani cunoscuţi în mod obişnuit. Oamenii sunt infectaţi în mod obişnuit de virusurile din subtipurile H1, H2 sau H3 şi N1 sau N2. Prezenta dezvăluire include metode pentru tratarea sau prevenirea infecţiei cu un subtip de virus gripal discutat aici. Anticorpii multispecifici şi fragmentele acestora care leagă antigenul care se leagă de TMPRSS2, într-un aspect al dezvăluirii, se leagă, de asemenea, de HA / şi/sau de NA, de ex., de un subtip prezentat aici.
O doză eficientă sau eficientă terapeutic de proteină anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, de ex., anticorp sau fragment care leagă antigenul (de ex., H1H7017N sau H4H7017N), pentru tratarea sau prevenirea unei infecţii virale se referă la cantitatea de anticorp sau de fragment suficientă pentru a atenua unul sau mai multe semne şi/sau simptome ale infecţiei la subiectul tratat, fie prin inducerea regresiei sau eliminării unor astfel de semne şi/sau simptome fie prin inhibarea progresiei acestor semne şi/sau simptome. Cantitatea de doză poate varia în funcţie de vârsta şi greutatea unui subiect căruia urmează să îi fie administrată, de boala ţintă, de stări, de calea de administrare şi altele asemenea. Într-un exemplu de realizare a invenţiei, o doză eficientă sau eficientă terapeutic de anticorp sau fragment de legare a antigenului al acestuia din prezenta invenţie, pentru tratarea sau prevenirea infecţiei virale, de ex., la un subiect uman adult, este de aproximativ 0,01 până la aproximativ 200 mg/kg, de ex., până la aproximativ 150 mg/kg. Într-un exemplu de realizare a invenţiei, doza este de până la aproximativ 10,8 sau 11 grame (de ex., aproximativ 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 sau 11 grame). În funcţie de gravitatea infecţiei, frecvenţa şi durata tratamentului pot fi ajustate. În anumite exemple de realizare, proteina care leagă antigenul conform prezentei invenţii poate fi administrată la o doză iniţială, urmată de una sau mai multe doze secundare. În anumite exemple de realizare, doza iniţială poate fi urmată de administrarea unei a doua doze, sau a mai multor doze ulterioare de anticorp sau fragment de legare a antigenului al acestuia într-o cantitate care poate fi aproximativ aceeaşi sau mai mică decât cea a dozei iniţiale, în care dozele sunt separate prin cel puţin 1 zi până la 3 zile; cel puţin o săptămână, cel puţin 2 săptămâni; cel puţin 3 săptămâni; cel puţin 4 săptămâni; cel puţin 5 săptămâni; cel puţin 6 săptămâni; cel puţin 7 săptămâni; cel puţin 8 săptămâni; cel puţin 9 săptămâni; cel puţin 10 săptămâni; cel puţin 12 săptămâni; sau cel puţin 14 săptămâni.
Aşa cum este utilizat aici, termenul "subiect" se referă la un mamifer (de ex., şobolan, şoarece, pisică, câine, vacă, oaie, cal, capră, iepure), de preferinţă un om, de exemplu, care are nevoie de prevenire şi/sau tratament al unei boli sau tulburări precum infecţia virală sau cancerul. Subiectul poate avea o infecţie virală, de ex., o infecţie gripală, sau poate fi predispus la dezvoltarea unei infecţii. Subiecţii predispuşi la dezvoltarea unei infecţii sau subiecţii care pot prezenta un risc crescut de a contracta o infecţie (de ex., a virusului gripal), includ subiecţi cu sistem imunitar compromis din cauza bolii autoimune, subiecţi care primesc terapie imunosupresivă (de exemplu, după transplant de organe), subiecţi afectaţi de sindromul imunodeficienţei umane (HIV), sau sindromul imunodeficienţei dobândite (SIDA), subiecţi cu forme de anemie care epuizează sau distrug globulele albe din sânge, subiecţii care primesc radiaţii sau chimioterapie, sau subiecţii afectaţi de o tulburare inflamatorie. În plus, subiecţii foarte tineri (de ex., cu vârsta de 5 ani sau mai mică) sau bătrâni (de ex., 65 de ani sau peste) prezintă un risc crescut. Mai mult, un subiect poate fi expus riscului de a contracta o infecţie virală din cauza apropierii de un focar al bolii, de ex., subiectul se află într-un oraş dens populat, sau în imediata apropiere a subiecţilor cu infecţii confirmate sau suspectate ale unui virus, sau la alegerea unui loc de muncă; de ex., lucrător în spital, cercetător farmaceutic, călător în zona infectată sau care călătoreşete cu avionul frecvent.
»Tratare» sau »tratament» înseamnă administrarea unei proteine anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, de ex., anticorp sau fragment de legare la antigen din prezenta invenţie (de ex., H1H7017N sau H4H7017N), unui subiect care are unul sau mai multe semne sau simptome ale unei boli sau infecţii, de ex., infecţie virală, pentru care proteina care leagă antigenul este eficientă atunci când este administrată subiectului într-o cantitate sau doză eficientă sau eficientă terapeutic (aşa cum s-a discutat aici).
Prezenta dezvăluire cuprinde, de asemenea, administrarea profilactică a unei proteine anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, de ex., anticorp sau fragment al acestuia care leagă antigenul conform prezentei invenţii (de ex., H1H7017N sau H4H7017N), unui subiect care prezintă un risc de infecţie virală, astfel încât să prevină o astfel de infecţie. Imunoprofilaxia pasivă bazată pe anticorpi s-a dovedit o strategie eficientă pentru prevenirea unei infecţii virale la un subiect. Vezi de ex., Berry ş.a., Passive broad-spectrum influenza immunoprophylaxis. Influenza Res Treat. 2014 ;2014:267594. Epub 2014 Sep 22; şi Jianqiang ş.a., Passive immune neutralization strategies for prevention and control of influenza A infections, Immunotherapy. 2012 February ; 4(2): 175-186; Prabhu ş.a., Antivir Ther. 2009; 14(7):911-21, Prophylactic and therapeutic efficacy of a chimeric monoclonal antibody specific for H5 hemagglutinin against lethal H5N1 influenza. »Prevenire» sau »care previne» înseamnă administrarea unei proteine anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, de ex., anticorp sau fragment de legare la antigen din prezenta invenţie (de ex., H1H7017N sau H4H7017N), unui subiect pentru a inhiba manifestarea unei boli sau infecţii (de ex., infecţie virală) în corpul unui subiect, pentru care proteina care leagă antigenul este eficientă atunci când este administrată subiectului într-o cantitate sau doză eficientă sau eficientă terapeutic (aşa cum s-a discutat aici).
Într-un exemplu de realizare a invenţiei, un semn sau simptom al unei infecţii virale la un subiect este supravieţuirea sau proliferarea virusului în corpul subiectului, de ex., determinat prin testul de titru viral (de ex., propagarea virusului gripal în ouă de pui embrionate, sau analiza hemaglutinării virusului gripal). Alte semne şi simptome ale infecţiei virale sunt discutate aici.
Prezenta dezvăluire oferă o metodă pentru tratarea sau prevenirea infecţiei virale (de ex., virusul gripal sau infecţia cu virusul corona), sau pentru inducerea regresiei, sau eliminării, sau inhibării progresiei a cel puţin unui semn sau simptom al infecţiei virale, cum ar fi:
• Febra sau senzaţie de febră/frisoane; • Tuse; • Durere de gât; • Nas care curge sau înfundat; • Strănut; • Dureri musculare sau corporale; • Dureri de cap; • Oboseală (oboseală); • vărsături ; • diaree; • infecţie a tractului respirator; • disconfort în piept; • dificultăţi de respiraţie; • bronşită; şi/sau • pneumonie,
semn sau simptom care este secundar infecţiei virale, la un subiect care are nevoie de acesta (de ex., un om), prin administrarea unei cantităţi eficiente terapeutic de proteină anti-TMPRSS2 care leagă antigenul (de ex., H1H7017N sau H4H7017N) unui subiect, de exemplu, prin injectarea proteinei în corpul subiectului.
Prezenta dezvăluire include, de asemenea, metode pentru tratarea sau prevenirea cancerului, de ex., cancer metastatic, de ex., cancer de prostată (de ex., care se caracterizează prin exprimarea unei fuziuni TMPRSS2:ERG), cancer de colon, cancer pulmonar, cancer de pancreas, cancer al tractului urinar, cancer mamar, cancer ovarian, adenocarcinom de prostată, carcinom cu celule renale, adenocarcinom colorectal, adenocarcinom pulmonar, carcinom pulmonar cu celule scuamoase şi/sau mezoteliom pleural, la un subiect, prin administrarea subiectului unei cantităţi eficiente terapeutic de proteină care leagă antigenul TMPRSS2 (de ex., H1H7017N sau H4H7017N), de exemplu, prin injectarea de proteine în corpul subiectului. Într-un aspect al dezvăluirii, subiectului i se administrează, de asemenea, proteina TMPRSS2 care leagă antigenul în asociere cu un alt agent terapeutic, de exemplu, un agent terapeutic anticancer. Într-un aspect al dezvăluirii, cancerul este o tumoare ale cărei celule exprimă TMPRSS2, sau o variantă a acesteia.
Combinaţii şi compoziţii farmaceutice
Pentru a prepara compoziţii farmaceutice ale proteinelor anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, de ex., anticorpi şi fragmente care leagă antigenul acestora (de ex., H1H7017N sau H4H7017N), proteina care leagă antigenul este amestecată cu un purtător sau excipient acceptabil farmaceutic. Vezi, de ex., Remington's Pharmaceutical Sciences şi U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1984); Hardman, ş.a. (2001) Goodman şi Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, şi Wilkins, New York, N.Y.; Avis, ş.a. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, ş.a. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, ş.a. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner şi Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y. În prezenta invenţie, este furnizată o compoziţie farmaceutică care cuprinde o proteină de legare a antigenului conform invenţiei şi un purtător acceptabil farmaceutic şi, opţional, un alt agent terapeutic. Într-un exemplu de realizare a invenţiei, compoziţia farmaceutică este sterilă. Astfel de compoziţii fac parte din prezenta invenţie.
Scopul prezentei dezvăluiri include compoziţii deshidratate de ex., liofilizate, care cuprind proteine anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, de ex., anticorp sau fragment de legare a antigenului al acestuia (de ex., H1H7017N sau H4H7017N), sau o compoziţie farmaceutică a acestuia care include un purtător acceptabil farmaceutic, dar substanţial fără apă.
Într-un alt aspect al dezvăluirii, un alt agent terapeutic care este administrat unui subiect în asociere cu o proteină anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, de ex., anticorp sau fragment de legare a antigenului al acestuia (de ex., H1H7017N sau H4H7017N), dezvăluit aici este administrat subiectului în conformitate cu Physicians 'Desk Reference 2003 (Thomson Healthcare; ediţia a 57-a (1 nov. 2002)).
Modul de administrare poate varia. Căile de administrare includ oral, rectal, transmucosal, intestinal, parenteral; intramuscular, subcutanat, intradermic, intramedular, intratecal, intraventricular direct, intravenos, intraperitoneal, intranazal, intraocular, prin inhalare, insuflaţie, topic, cutanat, transdermic sau intra-arterial.
Prezenta dezvăluire oferă metode pentru administrarea unei proteine anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, de ex., anticorp sau fragment de legare a antigenului al acestuia (de ex., H1H7017N sau H4H7017N), care cuprind introducerea proteinei în corpul unui subiect. De exemplu, metoda cuprinde străpungerea corpului subiectului cu un ac al unei seringi şi injectarea proteinei care leagă antigenul în corpul subiectului, de ex., în vena, artera, tumora, ţesutul muscular sau subcutanat al subiectului.
Prezenta dezvăluire oferă un vas (de ex., un flacon din plastic sau sticlă, de ex., cu un capac, sau o coloană cromatografică, ac tubular gol sau un cilindru de seringă) care cuprinde oricare dintre proteinele anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, de ex., anticorpi sau fragmente care leagă antigenul al acestora (de ex., H1H7017N sau H4H7017N), polipeptide (de ex., un HC, LC, VH sau VL al H1H7017N sau H4H7017N) sau polinucleotide sau vectori stabiliţi aici, sau o compoziţie farmaceutică a acestora care cuprinde un purtător acceptabil farmaceutic. Dispozitivele de injectare conform prezentei invenţii cuprind o proteină care leagă antigenul conform prezentei invenţii. Un dispozitiv de injectare conform invenţiei poate cuprinde o compoziţie conform invenţiei. Într-un exemplu de realizare, dispozitivul de injectare cuprinde o compoziţie farmaceutică conform invenţiei.
O proteină anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, de ex., anticorp sau fragment al acestuia care leagă antigenul conform prezentei invenţii (de ex., H1H7017N sau H4H7017N), pot fi în asociere cu unul sau mai mulţi agenţi terapeutici suplimentari. De exemplu, agentul terapeutic suplimentar poate fi un medicament antiviral şi/sau un vaccin. Aşa cum este utilizat aici, termenul "medicament antiviral" se referă la orice medicament antiinfecţios sau terapie utilizată pentru a trata, preveni sau ameliora o infecţie virală la un subiect. Termenul »medicament antiviral» include, dar nu se limitează la acesta, un steroid cationic antimicrobian, leupeptină, aprotinină, amantadină, rimantadină, oseltamivir, zanamivir, ribavirină sau interferon-alfa2b. Metodele pentru tratarea sau prevenirea infecţie cu virus (de ex., gripa) la un subiect care are nevoie de tratamentul sau prevenirea menţionată prin administrarea H1 H7017N sau H4H7017N în asociere cu un alt agent terapeutic fac parte din prezenta dezvăluire.
De exemplu, agentul terapeutic suplimentar poate fi un vaccin, de ex., un vaccin antigripal. Opţional, un vaccin este un vaccin cu virus inactivat/ucis, un vaccin cu virus viu atenuat, sau un vaccin cu subunitate de virus.
De exemplu, agentul terapeutic suplimentar poate fi:
(camostat mesilat);
(nafamostat mesilat);
(bromhexină clorhidrat (BHH));
(fluorură de 4-(2-aminometil)benzensulfonil clorhidrat (AEBSF));
sau
(poliamidă). Vezi Shen ş.a. Biochimie 142: 1-10 (2017).
Opţional, medicamentul antiviral este un anticorp sau un fragment care leagă antigenul care se leagă în mod specific de virusul gripal, de ex., gripă HA. De exemplu, anticorpul anti-HA poate fi oricare dintre H1H14611N2; H1H14612N2; H1H11723P; H1H11729P; H1H11820N; H1H11829N; H1H11829N2; H2aM11829N; H2M11830N; H1H11830N2; H1H11903N; H1H14571N; H2a14571N ; H1H11704P; H1H11711P; H1H11714P; H1H11717P; H1H11724P; H1H11727P; H1H11730P2; H1H11731P2; H1H11734P2; H1H11736P2; H1H11742P2; H1H11744P2; H1H11745P2; H1H11747P2; H1H11748P2; H1H17952B; H1H17953B; H1H17954B; H1H17955B; H1H17956B; H1H17957B; H1H17958B; H1H17959B; H1H17960B; H1H17961B; H1H17962B; H1H17963B; H1H17964B; H1H17965B; H1H17966B; H1H17967B; H1H17968B; H1H17969B; H1H17970B; H1H17971B; H1H17972B; H1H17973B; H1H17974B; H1H17975B; H1H17976B; H1H17977B; H1H17978B; H1H17979B; H1H17980B; H1H17981B; H1H17982B; H1H17983B; H1H17984B; H1H17985B; H1H17986B; H1H17987B; H1H17988B; H1H17989B; H1H17990B; H1H17991B; H1H17992B; H1H17993B; H1H17994B; H1H17995B; H1H17996B; H1H17997B; H1H17998B; H1H17999B; H1H18000B; H1H18001B; H1H18002B; H1H18003B; H1H18004B; H1H18005B; H1H18006B; H1H18007B; H1H18008B; H1H18009B; H1H18010B; H1H18011B; H1H18012B; H1H18013B; H1H18014B; H1H18015B; H1H18016B; H1H18017B; H1H18018B; H1H18019B; H1H18020B; H1H18021B; H1H18022B; H1H18023B; H1H18024B; H1H18025B; H1H18026B; H1H18027B; H1H18028B; H1H18029B; H1H18030B; H1H18031B; H1H18032B; H1H18033B; H1H18034B; H1H18035B; H1H18037B; H1H18038B; H1H18039B; H1H18040B; H1H18041B; H1H18042B; H1H18043B; H1H18044B; H1H18045B; H1H18046B; H1H18047B; H1H18048B; H1H18049B; H1H18051B; H1H18052B; H1H18053B; H1H18054B; H1H18055B; H1H18056B; H1H18057B; H1H18058B; H1H18059B; H1H18060B; H1H18061B; H1H18062B; H1H18063B; H1H18064B; H1H18065B; H1H18066B; H1H18067B; H1H18068B; H1H18069B; H1H18070B; H1H18071B; H1H18072B; H1H18073B; H1H18074B; H1H18075B; H1H18076B; H1H18077B; H1H18078B; H1H18079B; H1H18080B; H1H18081B; H1H18082B; H1H18083B; H1H18084B; H1H18085B; H1H18086B; H1H18087B; H1H18088B; H1H18089B; H1H18090B; H1H18091B; H1H18092B; H1H18093B; H1H18094B; H1H18095B; H1H18096B; H1H18097B; H1H18098B; H1H18099B; H1H18100B; H1H18101B; H1H18102B; H1H18103B; H1H18104B; H1H18105B; H1H18107B; H1H18108B; H1H18109B; H1H18110B; H1H18111B; H1H18112B; H1H18113B; H1H18114B; H1H18115B; H1H18116B; H1H18117B; H1H18118B; H1H18119B; H1H18120B; H1H18121B; H1H18122B; H1H18123B; H1H18124B; H1H18125B; H1H18126B; H1H18127B; H1H18128B; H1H18129B; H1H18130B; H1H18131B; H1H18132B; H1H18133B; H1H18134B; H1H18135B; H1H18136B; H1H18137B; H1H18138B; H1H18139B; H1H18140B; H1H18141B; H1H18142B; H1H18143B; H1H18144B; H1H18145B; H1H18146B; H1H18147B; H1H18148B; H1H18149B; H1H18150B; H1H18151B; H1H18152B; H1H18153B; H1H18154B; H1H18155B; H1H18156B; H1H18157B; H1H18158B; H1H18159B; H1H18160B; H1H18161B; H1H18162B; H1H18163B; H1H18164B; H1H18165B; H1H18166B; H1H18167B; H1H18168B; H1H18169B; H1H18170B; H1H18171B; H1H18172B; H1H18173B; H1H18174B; H1H18175B; H1H18176B; H1H18177B; H1H18178B; H1H18179B; H1H18180B; H1H18181B; H1H18182B; H1H18183B; H1H18184B; H1H18185B; H1H18186B; H1H18187B; H1H18188B; H1H18189B; H1H18190B; H1H18191B; H1H18192B; H1H18193B; H1H18194B; H1H18195B; H1H18196B; H1H18197B; H1H18198B; H1H18199B; H1H18200B; H1H18201B; H1H18202B; H1H18203B; H1H18204B; H1H18205B; H1H18206B; H1H18207B; H1H18208B; H1H18209B; H1H18210B; H1H18211B; H1H18212B; H1H18213B; H1H18214B; H1H18216B; H1H18217B; H1H18218B; H1H18219B; H1H18220B; H1H18221B; H1H18222B; H1H18223B; H1H18224B; H1H18225B; H1H18226B; H1H18227B; H1H18228B; H1H18229B; H1H18230B; H1H18231B; H1H18232B; H1H18233B; H1H18234B; H1H18235B; H1H18236B; H1H18237B; H1H18238B; H1H18239B; H1H18240B; H1H18241B; H1H18242B; H1H18243B; H1H18244B; H1H18245B; H1H18246B; H1H18247B; H1H18248B; H1H18249B; H1H18250B; H1H18251B; H1H18252B; H1H18253B; H1H18254B; H1H18255B; H1H18256B; H1H18257B; H1H18258B; H1H18259B; H1H18261B; H1H18262B; H1H18263B; H1H18264B; H1H18265B; H1H18266B; H1H18267B; H1H18268B; H1H18269B; H1H18270B; H1H18271B; H1H18272B; H1H18274B; H1H18275B; H1H18276B; H1H18277B; H1H18278B; H1H18279B; H1H18280B; H1H18281B; H1H18282B; H1H18283B; H1H18284B; H1H18285B; H1H18286B; H1H18287B; H1H18288B; H1H18289B; H1H18290B; H1H18291B; H1H18292B; H1H18293B; H1H18294B; H1H18295B; H1H18297B; H1H18298B; H1H18299B; H1H18300B; H1H18301B; H1H18302B; H1H18303B; H1H18304B; H1H18305B; H1H18306B; H1H18307B; H1H18308B; H1H18309B; H1H18310B; H1H18311B; H1H18312B; H1H18313B; H1H18314B; H1H18315B; H1H18316B; H1H18317B; H1H18318B; H1H18319B; H1H18320B; H1H18321B; H1H18322B; H1H18323B; H1H18324B; H1H18325B; H1H18326B; H1H18327B; H1H18328B; H1H18329B; H1H18330B; H1H18331B; H1H18332B; H1H18333B; H1H18334B; sau H1H18335B; aşa cum se prevede în publicaţia de brevet internaţional nr. WO2016/100807; sau un fragment de legare a antigenului al acestuia, de exemplu, în care anticorpul sau fragmentul cuprinde un lanţ uşor de imunoglobulină care include CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3 (de ex., VL sau lanţul uşor al acestuia); şi un lanţ greu care include CDR-H1, CDR-H2 şi CDR-H3 (de exemplu, VH sau lanţul greu al acestuia) al oricăruia dintre anticorpii anti-gripali HA de mai sus.
Un alt agent terapeutic poate fi un anticorp sau un fragment care leagă antigenul care se leagă de proteina gripală HA a Grupului II, cum ar fi, H1H14611N2; sau un anticorp sau fragment care cuprinde VH şi VL al H1H14611N2; sau un lanţ greu de imunoglobulină care cuprinde CDR-H1, CDR-H2 şi CDR-H3 al H1H14611N2 (de ex., SECV ID NR. 25-27) şi un lanţ uşor de imunoglobulină care cuprinde CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3 din H1H14611N2 (de ex., SECV ID NR. 29-31). "H1H14611N2" se referă la orice anticorp HA anti-grupa II care cuprinde astfel de secvenţe.
H1H14611N2
Regiune variabilă a lanţului greu
CDR-H1: GFTFSGFS (ID SECV NR: 25)
CDR-H2: ISTSGNYM (SECV ID NR: 26)
CDR-H3: ARGGGYNWNLFDY (SECV ID NR: 27)
Regiune variabilă a lanţului uşor
CDR-L1: QSLNSNY (ID SECV NR: 29)
CDR-L2: GAZ (SECV ID NR: 30)
CDR-L3: QQYGNSPLT (ID SECV NR: 31)
Un alt agent terapeutic poate fi un anticorp sau un fragment care leagă antigenul care se leagă de proteina HA din Grupa II gripală, cum ar fi, H1 H14612N2; sau un anticorp sau fragment care cuprinde VH şi VL al H1H14612N2; sau un lanţ greu de imunoglobulină care cuprinde CDR-H1, CDR-H2 şi CDR-H3 din H1H14612N2 (de ex., SECV ID NR: 41-43) şi un lanţ uşor de imunoglobulină care cuprinde CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3 al H1H14612N2 (de ex., SECV ID NR. 45-47). "H1H14612N2" se referă la orice anticorp HA anti-grupa II care cuprinde astfel de secvenţe.
H1H14612N2
Regiune variabilă a lanţului greu
CDR-H1: GFSFSGFS (SECV ID NR: 41)
CDR-H2: ISTSGNYM (SECV ID NR: 42)
CDR-H3: ARGGGYNWNLFDY (SECV ID NR: 43)
Regiune variabilă a lanţului uşor
CDR-L1: QSLNSNY (ID SECV NR: 45)
CDR-L2: GAZ (SECV ID NR: 46)
CDR-L3: QQYGNSPLT (SECV ID NR: 47)
Un alt agent terapeutic poate fi un anticorp sau un fragment care leagă antigenul care se leagă de proteina HA a grupei I gripale, cum ar fi H1H11729P; sau un anticorp sau fragment care cuprinde VH şi VL al H1H11729P; sau un lanţ greu de imunoglobulină care cuprinde CDR-H1, CDR-H2 şi CDR-H3 al H1H11729P (de ex., SECV ID NR. 33-35) şi un lanţ uşor de imunoglobulină care cuprinde CDR-L1, CDR-L2 şi CDR-L3 al H1H11729P (de ex., SECV ID NR. 37-39). "H1H11729P" se referă la orice anticorp anti-grupa I HA care cuprinde astfel de secvenţe.
H1H11729P
Regiune variabilă a lanţului greu
CDR-H1: GGTFSSYA (SECV ID NR: 33)
CDR-H2: IIPIFGTP (SECV ID NR: 34)
CDR-H3: ARQQPVYQYNMDV (SECV ID NR: 35)
Regiune variabilă a lanţului uşor
CDR-L1: QGIRNN (SECV ID NR: 37)
CDR-L2: AAS (ID SECV NR: 38)
CDR-L3: LQYNNYPWT (SECV ID NR: 39)
Opţional, agentul terapeutic suplimentar nu este amantadina, rimantadina, oseltamivirul, zanamivirul, aprotinina, leupeptina, un steroid cationic antimicrobian, un vaccin antigripal (de ex., ucis, viu, vaccin integral sau subunitate atenuat), sau un anticorp împotriva virusului gripal (de ex., un anticorp anti-hemagglutinină).
Termenul "în asociere cu" indică faptul că componentele, o proteină anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, de ex., anticorpul sau fragmentul acestuia care leagă antigenul conform prezentei invenţii, împreună cu un alt agent, cum ar fi, oseltamivir, se pot formula într-o singură compoziţie, de ex., pentru livrare simultană, sau pot fi formulate separat în două sau mai multe compoziţii (de ex., un kit). Fiecare componentă poate fi administrată unui subiect la un moment diferit faţă de momentul de administrare al celeilalte componente; de exemplu, fiecare administrare poate fi dată non-simultan (de ex., separat sau secvenţial) la intervale pe o anumită perioadă de timp. Mai mult, componentele separate pot fi administrate unui subiect pe aceeaşi cale sau pe o cale diferită (de ex., în care un anticorp anti-TMPRSS2 sau un fragment de legare a antigenului acestuia.
Kituri
În plus, sunt furnizate kituri care conţin una sau mai multe componente care includ, dar nu se limitează la, o proteină anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, de ex., un anticorp sau un fragment de legare la antigen aşa cum s-a discutat aici (de ex., H1H7017N sau H4H7017N), în asociere cu una sau mai multe componente suplimentare care includ, dar fără a se limita la, un alt agent terapeutic, aşa cum s-a discutat aici. Proteina care leagă antigenul şi/sau agentul terapeutic suplimentar poate fi formulată ca o singură compoziţie sau separat în două sau mai multe compoziţii, de ex., cu un purtător acceptabil farmaceutic, într-o compoziţie farmaceutică. În prezenta invenţie, este furnizat un kit care cuprinde o proteină care leagă antigenul conform invenţiei şi un alt agent terapeutic, în care kitul cuprinde proteina care leagă antigenul şi agentul terapeutic suplimentar formulat ca o singură compoziţie, sau separat în două sau mai multe compoziţii.
Într-un caz, kitul include o proteină anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, de ex., un anticorp sau fragment al acestuia care leagă antigenul conform invenţiei (de ex., H1H7017N sau H4H7017N), sau o compoziţie farmaceutică a acestora într-un singur recipient (de ex., într-un flacon de sticlă sau material plastic steril) şi un alt agent terapeutic într-un alt recipient (de ex., într-o sticlă sterilă sau flacon din material plastic).
Într-un alt caz, trusa cuprinde o combinaţie descrisă aici, incluzând o proteină anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, de ex., anticorpul sau fragmentul acestuia care leagă antigenul conform invenţiei (de ex., H1H7017N sau H4H7017N), sau compoziţia farmaceutică a acestora în combinaţie cu unul sau mai mulţi agenţi terapeutici suplimentari formulaţi împreună, opţional, într-o compoziţie farmaceutică, într-un singur recipient comun.
Dacă kitul include o compoziţie farmaceutică pentru administrare parenterală unui subiect, trusa poate include un dispozitiv (de ex., un dispozitiv de injectare) pentru efectuarea unei astfel de administrări. De exemplu, trusa poate include unul sau mai multe ace hipodermice, sau alte dispozitive de injectare, aşa cum s-a discutat anterior, care conţin proteina anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, de ex., anticorpul sau fragmentul acestuia care leagă antigenul conform prezentei invenţii (de ex., H1H7017N sau H4H7017N).
Kitul poate include un prospect care include informaţii despre compoziţiile farmaceutice şi formele de dozare din kit. În general, astfel de informaţii ajută pacienţii şi medicii să utilizeze compoziţiile farmaceutice închise şi formele de dozare în mod eficient şi sigur. De exemplu, în prospect pot fi furnizate următoarele informaţii despre o combinaţie a invenţiei: farmacocinetică, farmacodinamică, studii clinice, parametri de eficacitate, indicaţii şi utilizare, contraindicaţii, avertismente, precauţii, reacţii adverse, supradozaj, dozare şi administrare adecvate, cum sunt furnizate, condiţii adecvate de depozitare, referinţe, informaţii despre producător/distribuitor şi informaţii despre brevet.
Utilizări pentru diagnosticare ale anticorpilor
Proteinele anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, de ex., anticorpi sau fragmente ale acestora care leagă antigenul conform prezentei invenţii (de ex., H1H7017N sau H4H7017N), pot fi utilizate pentru a detecta şi/sau măsura TMPRSS2 într-o probă. Testele exemplificative pentru TMPRSS2 pot include, de ex., contactarea unei probe cu o proteină anti-TMPRSS2 care leagă antigenul conform invenţiei, în care proteina anti-TMPRSS2 care leagă antigenul este marcată cu o etichetă detectabilă, sau o moleculă reporter, sau este utilizată ca ligand de captare pentru a izola selectiv TMPRSS2 din probe. Prezenţa unei proteine anti-TMPRSS2 care leagă antigenul complexată cu TMPRSS2 indică prezenţa TMRPSS2 în probă. Alternativ, un anticorp anti-TMPRSS2 nemarcat poate fi utilizat în combinaţie cu un anticorp secundar care este el însuşi marcat detectabil. Eticheta detectabilă sau molecula reporter poate fi un radioizotop, cum ar fi 3H, 14C, 32P, 35S, sau 125I; o porţiune fluorescentă sau chemiluminiscentă, cum ar fi, fluorescein izotiocianatul sau rodamina; sau o enzimă, cum ar fi, fosfataza alcalină, β-galactozidaza, peroxidaza de hrean, sau luciferaza. Testele exemplificative specifice care pot fi utilizate pentru a detecta sau măsura TMPRSS2 într-o probă includ testul imunosorbent legat de enzime (ELISA), testul radioimuno (RIA) şi sortarea celulelor activate de fluorescenţă (FACS). Astfel, este descrisă aici o metodă pentru detectarea prezenţei polipeptidei TMPRSS2 într-o probă care cuprinde contactarea probei cu o proteină anti-TMPRSS2 care leagă antigenul şi detectarea prezenţei unei proteine care leagă antigenul TMPRSS/anti-TMPRSS2 în care prezenţa complexului indică prezenţa TMPRSS2.
Prezenta dezvăluire include metode ELISA pe bază de celule care utilizează proteinele anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, de ex., anticorpi şi fragmente ale acestora care leagă antigenul conform prezentei invenţii (de ex., H1H7017N), pentru a detecta prezenţa TMPRSS2 pe o celulă. Opţional, metoda include erapele:
(i) contactarea celulelor imobilizate pe o suprafaţă solidă (de ex., o microplacă) care urmează să fie testate pentru prezenţa TMPRSS2 cu o proteină anti-TMPRSS2 care leagă antigenul conform prezentei invenţii;
(ii) opţional, spălarea amestecului pentru a îndepărta proteina anti-TMPRSS2 care nu se leagă la antigen;
(iii) contactarea proteinei anti-TMPRSS2 care leagă antigenul cu un anticorp secundar marcat, sau un fragment de legare a antigenului al acestuia care se leagă de proteina anti-TMPRSS2 care leagă antigenul;
(iv) opţional, spălarea complexului pentru a îndepărta proteina care nu se leagă la antigen; şi
(v) detectarea prezenţei etichetei pe anticorpul secundar sau fragment, în care detectarea etichetei indică faptul că celulele conţin TMPRSS2. De exemplu, prezenta dezvăluire include astfel de metode ELISA bazate pe celule pentru identificarea celulelor TMPRSS2+ dintr-o probă.
O proteină anti-TMPRSS2 care leagă antigenul conform invenţiei (de ex., H1H7017N sau H4H7017N) poate fi utilizată într-o procedură Western blot sau imunoterapie proteică pentru detectarea prezenţei TMPRSS2 sau a unui fragment al acesteia într-o probă. O astfel de procedură face parte din prezenta dezvăluire şi include de ex., etapele:
(1) furnizarea unei membrane sau a unui alt substrat solid care cuprinde o probă care urmează să fie testată pentru prezenţa TMPRSS2, de ex., opţional, inclusiv etapa de transfer a proteinelor dintr-o probă care urmează să fie testată pentru prezenţa TMPRSS2 (de ex., dintr-o separare electroforetică PAGE, sau SDS-PAGE a proteinelor din probă) pe o membrană, sau pe alt substrat solid utilizând o metodă cunoscută în domeniu (de ex., ştergere semi-uscată sau ştergere a godeului); şi contactarea membranei sau a altui substrat solid care urmează a fi testat pentru prezenţa TMPRSS2 sau a unui fragment al acesteia cu o proteină anti-TMPRSS2 care leagă antigenul conform invenţiei.
O astfel de membrană poate avea forma, de exemplu, unei membrane de nitroceluloză sau pe bază de vinil (de ex., membrană de fluorură de poliviniliden (PVDF)) pe care au fost transferate proteinele care urmează să fie testate pentru prezenţa TMPRSS2 într-un gel PAGE nedenaturat (electroforeză cu gel poliacrilamidă) sau gel SDS-PAGE (electroforeză cu gel dodecil sulfat de poliacrilamidă) care a fost transferat (de ex., după separarea electroforetică în gel). Înainte de a contacta membrana cu proteina anti-TMPRSS2 care leagă antigenul, membrana este, opţional, blocată, de exemplu, cu lapte uscat fără grăsimi sau altele asemenea, astfel încât să se lege situsuri de legare nespecifice ale proteinelor pe membrană.
(2) spălarea membranei o dată sau de mai multe ori pentru a îndepărta proteina anti-TMPRSS2 care leagă antigenul şi alte substanţe nelegate; şi
(3) detectarea proteinei anti-TMPRSS2 care leagă antigenul.
Detectarea proteinei care leagă antigenul indică faptul că proteina TMPRSS2 este prezentă pe membrană sau substrat şi în probă. Detectarea proteinei care leagă antigenul legat poate fi prin legarea proteinei care leagă antigenul cu un anticorp secundar (un anticorp anti-imunoglobulină) care este marcat detectabil şi, apoi, prin detectarea prezenţei etichetei anticorpului secundar.
Proteinele anti-TMPRSS2 care leagă antigenul (de ex., anticorpi şi fragmente care leagă antigenul (de ex., H1H7017N sau H4H7017N)) dezvăluite aici pot fi, de asemenea, utilizate pentru imunohistochimie. O astfel de metodă face parte din prezenta dezvăluire şi cuprinde, de ex.,
(1) contactarea ţesutului care urmează să fie testat pentru prezenţa proteinei TMPRSS2 cu o proteină anti-TMPRSS2 care leagă antigenul conform invenţiei; şi
(2) detectarea proteinei care leagă antigenul pe sau în ţesut.
Dacă proteina care leagă antigenul în sine este marcată detectabil, ea poate fi detectată direct. Alternativ, proteina care leagă antigenul poate fi legată de un anticorp secundar marcat detectabil în care este apoi detectată eticheta.
EXEMPLE
Următoarele exemple sunt prezentate astfel încât să ofere persoanelor de specialitate în domeniu o dezvăluire completă şi o descriere a modului de realizare şi utilizare a metodelor şi compoziţiilor invenţiei şi nu sunt destinate să limiteze domeniul avut în vedere de inventatori pentru invenţia lui. S-au depus eforturi pentru a asigura precizia cu privire la numerele utilizate (de ex., cantităţi, temperatură, etc.), dar ar trebui luate în considerare unele erori experimentale şi abateri. Cu excepţia cazului în care se indică altfel, părţile sunt părţi în greutate, greutatea moleculară este greutatea moleculară medie, temperatura este în grade Celsius, temperatura camerei este de aproximativ 25°C şi presiunea este la, sau aproape atmosferică.
Exemplul 1: Replicare multiciclu in vitro.
A fost evaluată capacitatea virusului gripal, A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1)-GFP, de a se replica în celulele Calu3, A549, MDCK şi HepG2.
Tabelul 1. Reactivi utilizaţi.
Descriere Vânzător Celule Calu-3 American Type Culture Collection (ATCC) Celule A549 American Type Culture Collection (ATCC) Celulele MDCK (Londra) IRR Celulele HepG2 American Type Culture Collection (ATCC) A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1)-GFP N/A DMEM Gibco F12 Gibco Pen/Strep Gibco IgG BSA scăzută Sigma PBS Life Technologies Ser fetal bovin Life Technologies
Procedura experimentala
Celulele Calu-3 (ATCC HTB55), celulele A549 (ATCC CCL-185), celulele MDCK (IRR FR-58) şi celulele HepG2 (ATCC HB-8065) au fost diluate la 40.000 celule/godeu într-o placă cu 96 de godeuri în mediu DMEM:F12 cu 5% FBS. A doua zi, a fost preparat A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) purtând o genă reporter GFP din segmentul NS B. Manicassamy ş.a., Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 2010 Jun 22;107(25): 11531-6) la un MOI (multiplicitate de infecţie) de 0,1 şi 0,01 în DMEM:F12 cu IgG BSA scăzută după trei spălări. Virusul a fost incubat pe celule timp de 1 oră la 37°C, după care virusul a fost îndepărtat şi godeurile s-au spălat de încă trei ori. Numărul de celule infectate a fost cuantificat la 24, 48, 72 şi 142 h după infecţie pe un analizor universal CTL-ImmunoSpot® S6 (Cellular Technology Limited, Cleveland, OH).
Rezumatul rezultatelor şi concluziile
Calu-3 este o linie celulară epitelială a căilor respiratorii umane imortalizată care s-a dovedit a permite replicarea pe mai multe cicluri a virusurilor gripale umane în absenţa tripsinei exogene (Zeng ş.a., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type i interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology. 81, 12439-12449 (2007)). În plus, s-a demonstrat că celulele Calu-3 exprimă atât TMPRSS2, cât şi TMPRSS4, dar nu TMPRSS11D (HAT) cel puţin la nivelul mARN (Bottcher-Friebertshauser ş.a., Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology. 85, 1554-1562 (2011)). Pentru a confirma că celulele Calu-3 pot sprijini activarea proteolitică a virusului gripal care posedă hemagglutinină cu un loc de scindare monobazic, creşterea unui virus reporter H1N1 GFP în celulele Calu-3 a fost analizată şi s-a comparat replicarea în timp cu A549 (epitelial bazal alveolar uman) a celulelor MDCK (rinichi canin Madin Darby) şi celulelor HepG2 (carcinom hepatic uman) în absenţa tripsinei. Celulele au fost infectate la un MOI scăzut şi, la momentul indicat, au fost determinate titrurile virale prin numărarea punctelor de focar fluorescente. Tabelul 2 şi Figura 1 arată niveluri scăzute de infecţie în celulele A549, MDCK şi HepG2, în timp ce celulele Calu-3 prezintă titruri crescute semnificativ la fiecare punct de timp. Deşi s-a demonstrat că celulele Calu-3 exprimă TMPRSS2 şi TMPRSS4 la nivelul mARN, colapsarea TMPRSS2 a redus titrurile virusului gripal de 100 până la 1.000 de ori (Bцttcher-Friebertshauser ş.a., Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology. 85, 1554-1562 (2011)). Nivelul scăzut de titruri virale în celulele A549, MDCK şi HepG2 în absenţa tripsinei se datorează probabil adăugării de virus scindat (recoltat din ouă de pui embrionate, sau din cultura MDCK cu tripsină), dar prezenţei unei alte proteaze care activează HA ar putea fi o explicaţie.
Tabelul 2. Numărul de celule infectate reprezentate de unităţi de focalizare fluorescente (FFU) în diferite zile după infecţie cu un MOI de 0,1 sau 0,01 în diferite tipuri de celule după infecţia cu A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1)-GFP.
Linie celulara Ziua(zile) post-infecţie MOI 0,1 MOI 0,01 FFU FFU Calu3 1 697 54 2 1167 201 3 1644 376 4 1530 500 A549 1 238 35 2 238 46 3 258 53 4 228 52 MDCK 1 740 77 2 750 60 3 879 58 4 796 53 HepG2 1 3 1 2 14 9 3 20 13 4 21 20
Referinţe
1. K. Shirato, K. Kanou, M. Kawase, S. Matsuyama, Clinical Isolates of Human Coronavirus 229E Bypass the Endosome for Cell Entry. Journal of Virology. 91, e01387-16 (2017). PMID: 27733646.
2. L. M. Reinke ş.a., Different residues in the SARS-CoV spike protein determine cleavage and activation by the host cell protease TMPRSS2. PLoS ONE. 12, e0179177 (2017). PMID: 27733646.
3. Y. Zhou ş.a., Protease inhibitors targeting coronavirus and filovirus entry. Antiviral Research. 116, 76-84 (2015). PMID:25666761.
4. P. Zmora, A.-S. Moldenhauer, H. Hofmann-Winkler, S. Pohlmann, TMPRSS2 Isoform 1 Activates Respiratory Viruses and Is Expressed in Viral Target Cells. PLoS ONE. 10, e0138380 (2015). PMID:26379044.
5. P. Zmora ş.a., Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS ONE. 12, e0176597 (2017). PMID: 28493964.
6. E. Bцttcher-Friebertshдuser, D. A. Stein, H.-D. Klenk, W. Garten, Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology. 85, 1554-1562 (2011).). PMID: 21123387.
7. S. Bertram ş.a., TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology. 84, 10016-10025 (2010). PMID: 20631123.
8. C. Tarnow ş.a., TMPRSS2 is a host factor that is essential for pneumotropism and pathogenicity of H7N9 influenza A virus in mice. Journal of Virology (2014), May;88(9):4744-51.doi:10.1128/JVI.03799-13. PMID: 24522916.
9. E. Bottcher ş.a., Proteolytic Activation of Influenza Viruses by Serine Proteases TMPRSS2 and HAT from Human Airway Epithelium. Journal of Virology. 2006 Oct;80(19):9896-8. PMID: 16973594.
10. B. Manicassamy ş.a., Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 2010 Jun 22; 107(25): 11531-6. doi: 10.1073/pnas.0914994107. PMID: 20534532 .
11. H. Zeng ş.a., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type i interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology. 81, 12439-12449 (2007). PMID: 17855549.
Exemplul 2: Anticorpul anti-TMPRSS2 H1H7017N blochează in vitro răspândirea gripei.
A fost evaluată capacitatea diferiţilor anticorpi de a reduce titrurile virusului gripal A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) în celulele Calu-3.
Tabelul 3. Reactivi utilizaţi.
Descriere Vânzător Celule Calu-3 ATCC F12 Gibco FBS Life Technologies A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) ATCC DMEM Gibco Pen/Strep Gibco IgG BSA scăzută Sigma PBS Life Technologies Paraformaldehidă (16% g/v aq.) Alfa Aesar Triton X-100 EMD Anticorp anti-NP Anticorp anti-gripal A, nucleoproteină, clone A1, amestec A3 Millipore Conjugat IgG AF488 de capră anti-şoarece Life Technologies
Procedura experimentala
Celulele Calu-3 (ATCC HTB55) au fost diluate la 40.000 celule/godeu într-o placă cu 96 de godeuri în mediu DMEM:F12 cu 5% FBS. A doua zi, anticorpii monoclonali au fost diluaţi la 166,7 nM în DMEM: F12 cu IgG BSA scăzut şi s-au adăugat la celule timp de 3 ore la 37°C şi 5% CO2. Soluţia de mAb a fost îndepărtată şi celulele au fost infectate cu A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) la un MOI de 0,001. Virusul a fost incubat pe celule timp de 1 oră la 37°C în 5% CO2 după care virusul a fost îndepărtat şi mediul înlocuit cu DMEM:F12 care conţine 166,7 nM mAbs. După 24 h şi 48 h, mediul a fost înlocuit cu mediu proaspăt care conţine mAb şi celulele au fost spălate de două ori cu PBS la 72 h. Celulele au fost apoi fixate cu paraformaldehidă 4% în PBS şi virusul a fost detectat folosind anticorpul primar anti-NP la o diluţie 1:1000. Celulele au fost incubate timp de 1 h şi apoi spălate şi s-a adăugat soluţia secundară la diluţia 1:2000. Numărul de celule infectate a fost cuantificat pe un analizor universal CTL-ImmunoSpot® S6 (Cellular Technology Limited, Cleveland, OH).
Rezumatul rezultatelor şi concluziile
Calu-3 este o linie celulară epitelială a căilor respiratorii umane imortalizată, care s-a dovedit a permite replicarea multiciclică a virusurilor gripale umane în absenţa tripsinei exogene (Zeng ş.a., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type i interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology. 2007 Nov;81 (22): 12439-49). În plus, s-a demonstrat că celulele Calu-3 exprimă atât TMPRSS2, cât şi TMPRSS4, dar nu TMPRSS11D (HAT) cel puţin la nivelul mARN (Bottcher-Friebertshauser ş.a., Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology. 85, 1554-1562 (2011)). S-a demonstrat anterior că celulele Calu-3 au susţinut activarea proteolitică a virusului gripal, dar aici s-a testat inhibarea TMPRSS2 utilizând anticorpul monoclonal specific TMPRSS2, H1H7017N. A fost analizată creşterea A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) peste 72 h după tratarea celulelor cu 166,7 nM de H1H7017N. Titrurile virale au fost determinate prin numărarea punctelor de focalizare fluorescente. Tabelul 4 şi Figura 2 arată titruri scăzute după tratamentul cu anticorpul H1H7017N. Deşi s-a demonstrat că celulele Calu-3 exprimă TMPRSS2 şi TMPRSS4 la nivelul mARN, cokapsul TMPRSS2 a redus titrurile virusului gripal de 100 până la 1.000 de ori (Bottcher-Friebertshauser ş.a., Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology. 85, 1554-1562 (2011)). Nivelul scăzut al titrurilor virale existente în absenţa mAb s-a datorat probabil adăugării de virus scindat (recoltat din ouă de pui embrionate sau din cultura MDCK cu tripsină), dar prezenţa unei alte proteaze care activează HA ar putea explica, de asemenea, prezenţa de virus în ciuda tratamentului cu anti-TMPRSS2 mAb.
Tabelul 4. Aplicarea H1H7017N în timpul ciclului de infecţie scade numărul de unităţi de focalizare fluorescente (FFU) din A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) la 72 h după infecţie.
Tratament Descriere FFU H1H7017N Anti-TMPRSS2 mAb 259 H1H11729P Grup 1 anti-gripal A martor pozitiv 18 anti-hlgG4 cu o IgG2a Fc de şoarece Martor izotip IgG1 2338 Fără mAb Martorulinfecţiei 2656 Neinfectat Martor al liniei de bază 6
Referinţe
1. K. Shirato, K. Kanou, M. Kawase, S. Matsuyama, Clinical Isolates of Human Coronavirus 229E Bypass the Endosome for Cell Entry. Journal of Virology. 91, e01387-16 (2017). PMID: 27733646.
2. L. M. Reinke ş.a., Different residues in the SARS-CoV spike protein determine cleavage and activation by the host cell protease TMPRSS2. PLoS ONE. 12, e0179177 (2017). PMID: 27733646.
3. Y. Zhou ş.a., Protease inhibitors targeting coronavirus and filovirus entry. Antiviral Research. 116, 76-84 (2015). PMID:25666761.
4. P. Zmora, A.-S. Moldenhauer, H. Hofmann-Winkler, S. Pohlmann, TMPRSS2 Isoform 1 Activates Respiratory Viruses and Is Expressed in Viral Target Cells. PLoS ONE. 10, e0138380 (2015). PMID:26379044.
5. P. Zmora ş.a., Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS ONE. 12, e0176597 (2017). PMID: 28493964.
6. E. Bцttcher-Friebertshдuser, D. A. Stein, H.-D. Klenk, W. Garten, Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology. 85, 1554-1562 (2011).). PMID: 21123387.
7. S. Bertram ş.a., TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology. 84, 10016-10025 (2010). PMID: 20631123.
8. C. Tarnow ş.a., TMPRSS2 is a host factor that is essential for pneumotropism and pathogenicity of H7N9 influenza A virus in mice. Journal of Virology (2014), May;88(9):4744-51.doi:10.1128/JVI.03799-13. PMID: 24522916.
9. E. Bottcher ş.a., Proteolytic Activation of Influenza Viruses by Serine Proteases TMPRSS2 and HAT from Human Airway Epithelium. Journal of Virology. 2006 Oct;80(19):9896-8. PMID: 16973594.
10. B. Manicassamy ş.a., Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 2010 Jun 22; 107(25): 11531-6. doi: 10.1073/pnas.0914994107. PMID: 20534532 .
11. H. Zeng ş.a., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type i interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology. 81, 12439-12449 (2007). PMID: 17855549.
Exemplul 3: Analiza FACS cu celule MDCK/Tet-on, MDCK/Tet-on/hTMPRSS2 şi MDCK/Tet-on/MfTMPRSS2.
A fost evaluată capacitatea anticorpului anti-TMPRSS2, H1H7017N, de a se lega de celulele MDCK care exprimă TMPRSS2, sau care nu exprimă TMPRSS2.
Tabelul 5. Reactivi utilizaţi.
Reactiv Sursă MDCK ATCC pLVX-EF1α-Tet3G Clontech pLVX Tight hTMPRSS2 Puro pLVX Tight MfTMPRSS2 Puro DMEM Irvine Scientific FBS Seradigm Pen/strep/glut Invitrogen Piruvat de sodiu 100mM (100X) Specialty Media Antibiotic selectiv Geneticin™ (G418 sulfat) Invitrogen Puromicină Sigma Doxiciclină Sigma PBS fără Ca++/Mg++ Irvine Scientific Accutază Millipore Plăci filtrante 96- godeuri Pall BD CytoFix ™ Becton Dickinson Aloficocianină (APC) AffiniPure F(ab')2 Fragment IgG anti-uman de capră, fragment specific Fcγ Jackson Immuno Martor mAb1 (martor izotip hlgG1) Citoflex Beckman Coulter FlowJo 10.1r5 FlowJo Prisma 7 Graphpad
Procedura experimentala
Liniile celulare au fost dezvoltate pentru a exprima TMPRSS2 (hTMPRSS2 şi mfTMPRSS2) umane şi de maimuţă cynomolgous în celulele MDCK (rinichi canin Madin Darby) la inducerea cu doxiciclină. Celulele MDCK au fost transduse pentru a exprima stabil o proteină transactivatoare controlată de tetraciclină modificată (Clontech) şi linia celulară rezultată a fost denumită linia celulară MDCK/Tet-on. Linia celulară MDCK/Tet-on a fost transdusă cu un construct care conţine hTMPRSS2 (NP_005647.3 cu un V160M) sau mfTMPRSS2 (Ref seq XP_015302311.1 cu S129L, N251S, I415V, R431Q, D492G) sub controlul promotorului inducibil şi liniile au fost denumite MDCK/Tet-on/hTMPRSS2 şi MDCK/Tet-on/mfTMPRSS2. Liniile celulare stabile au fost menţinute în medii de creştere care conţin DMEM suplimentate cu 10% FBS, piruvat de sodiu, penicilină/streptomicină/glutamină, 500µg/mL G418 cu sau fără 2µg/mL puromicină.
Pentru analiza legării celulelor prin citometrie în flux, celulele au fost placate în mediu de creştere şi incubate cu doxiciclină la 1µg/mL timp de 16 ore pentru a induce expresia TMPRSS2. Celulele sunt detaşate folosind Accutase şi resuspendate în 1% FBS în PBS. Anticorpii au fost diluaţi în serie de la 500 nM la 25 pM şi fiecare concentraţie de anticorp a fost incubată cu 1 X 106 celule la 4°C timp de 30 de minute. A fost inclusă o afecţiune în care nu s-a adăugat anticorp la celule. După incubare cu anticorpi primari, celulele au fost colorate cu anticorp secundar IgG anti-uman conjugat cu aloficocianină la 1:1000 la 4 ° C timp de 30 de minute. Celulele au fost fixate folosind BD CytoFixTM şi analizate folosind citometrul de flux CytoFLEX. S-au inclus, de asemenea, doar anticorpi necoloraţi şi secundari martoripentru toate liniile celulare. Valorile medii geometrice ale fluorescenţei pentru celulele viabile s-au determinat utilizând software-ul FlowJo şi rezultatele au fost analizate folosind regresia neliniară (logistică cu 4 parametri) cu software-ul Prism 7 (GraphPad) pentru a obţine valorile EC50 ale legării celulare de către anticorpi.
Aşa cum se arată în Figura 3, anticorpul anti-hTMPRSS2 al invenţiei, H1H7017N, s-a legat de MDCK/Tet-on/hTMPRSS2 şi MDCK/Tet-on/mfTMPRSS2 cu valori EC50 de 460 pM şi respectiv 1,06 nM. H1H7017N nu a prezentat legare semnificativă la celulele MDCK/Tet-on. Martorul mAb1, un anticorp martor al izotipului irelevant, nu a arătat legarea la niciuna dintre liniile celulare testate.
Exemplul 4: Cinetica legării biacore a anticorpilor monoclonali anti-TMPRSS2 care se leagă la diferiţi reactivi TMPRSS2 măsurată la 25°C şi 37°C.
Constanta de disociere la echilibru (KD) pentru diferiţi reactivi TMPRSS2 care se leagă de anticorpii monoclonali anti-TMPRSS2 purificaţi s-a determinat utilizând un biosenzor Biacore 4000 pe bază de rezonanţă plasmonică de suprafaţă în timp real. Toate studiile de legare au fost efectuate în 10 mM HEPES, 150 mM NaCI, 3 mM EDTA şi 0,05% v/v Surfactant Tween-20, pH 7,4 (HBS-ET) care rulează tampon la 25°C şi 37°C. Suprafaţa cipului senzorului Biacore CM5 a fost mai întâi derivatizată prin cuplarea aminei cu anticorpul policlonal specific Fc iepure anti-şoarece (GE Healthcare Cat#BR100838) pentru a captura anticorpii monoclonali anti-TMPRSS2. Studiile de legare au fost efectuate pe domeniul extracelular TMPRSS2 umană exprimat cu o etichetă C-terminală myc-myc-hexahistidină (hTMPRSS2.mmh) şi cu un domeniu extracelular de maimuţă TMPRSS2 exprimat cu o etichetă C-terminală myc-myc-hexahistidină (mfTMPRSS2.mmh). Au fost mai întâi preparate diferite concentraţii de HMM-hTMPRSS2 şi HMM-mfTMPRSS2 (100nM - 6,25nM; diluţie în serie de 4 ori) în tampon de rulare HBS-ET şi au fost injectate pe suprafaţa anticorpului monoclonal anti-TMPRSS2 capturat Fc anti-şoarece timp de 2,5 minute la un debit de 30 µL/minut, în timp ce disocierea reactivului TMPRSS2 legat de anticorpul monoclonal a fost monitorizată timp de 7 minute în tampon de rulare HBS-ET. Rata de asociere (ka) şi rata de disociere (kd) au fost determinate prin montarea senzorgramelor de legare în timp real la un model de legare 1:1 cu limitare a transportului de masă utilizând software-ul Scrubber 2.0c curbă-fixare. Constanta de disociere la echilibru (KD) şi timpul de înjumătăţire plasmatică disociativă (t1⁄2) au fost calculate din ratele cinetice ca:
Parametrii cinetici de legare pentru legarea HMM-hTMPRSS2 sau HMM-mfTMPRSS2 la diferiţi anticorpi monoclonali anti-TMPRSS2 conform invenţiei la 25°C şi 37°C sunt prezentaţi în Tabelele 6-9.
La 25°C, anticorpii monoclonali anti-TMPRSS2 s-au legat de HMM-hTMPRSS2 cu valoarea KD 2,81 nM, aşa cum se prezintă în Tabelul 6. La 37°C, anticorpii monoclonali anti-HMM-hTMPRSS2 s-au legat de HMM-hTMPRSS2 cu valoarea KD 9,31 nM, aşa cum se prezintă în Tabelul 7.
La 25°C, anticorpii monoclonali anti-TMPRSS2 s-au legat de HMM-mfTMPRSS2 cu valoarea KD 56,0 nM, aşa cum se prezintă în Tabelul 8. La 37°C, anticorpii monoclonali anti-TMPRSS2 s-au legat de HMM-mfTMPRSS2 cu valoarea KD 140nM, aşa cum se prezintă în Tabelul 9.
Proteine TMPRSS2
hTMPRSS2 knob_mmh (W106-R255).mmh:
aminoacizi 1-150: aminoacizi 106 până la 255 ai TMPRSS2 umană (număr de acces NP_005647.3 cu un V160M)
Aminoacizi: 151-178: eticheta myc-myc-hexahistidină
(SECV ID NR: 20; etichete myc subliniate, eticheta His6 subliniată dublu)
mfTMPRSS2 knob_mmh (W106-R255).mmh:
Aminoacizi 1-150: aminoacizi 106-255 ai TMPRSS2 de maimuţă (număr de acces XP_005548700.1 cu S129L, N251S)
Aminoacizi 151-178: eticheta myc-myc-hexahistidină
(SECV ID NR: 21; etichete myc subliniate, eticheta His6 subliniată dublu)
Rezultate
Tabelul 6. Parametrii cinetici de legare a legării HMM-hTMPRSS2 la anticorpii monoclonali TMPRSS2 la 25°C.
mAb Capturat Nivel de captură mAb (RU) 100nM Ag legat(RU) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) tЅ (min) H2aM7017N 510 ± 5,3 103 2,65E+05 7,45E-04 2,81 E-09 15,5
* H2aM7017N este un anticorp cu domeniile variabile H1H7017N prezentate aici şi un IgG2a Fc de şoarece. ;Tabelul 7. Parametrii cinetici de legare a legării HMM-hTMPRSS2 la anticorpii monoclonali TMPRSS2 la 37°C. ; mAb Capturat Nivel de captură mAb (RU) 100nM Ag legat (RU) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) tЅ (min) H2aM7017N 587 ± 4,5 117 3,47E+05 3,23E-03 9,31E-09 3,6;Tabelul 8. Parametrii cinetici de legare a legării HMM-mfTMPRSS2 la anticorpii monoclonali TMPRSS2 la 25°C. ; mAb Capturat Nivel de captură mAb (RU) 100nM Ag legat (RU) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) tЅ (min) H2aM7017N 484 ± 1,8 67 2,80E + 05 1,57E-02 5,60E-08 0,7;Tabelul 9. Parametrii cinetici de legare a legării HMM-mfTMPRSS2 la anticorpii monoclonali MSR1 la 37°C. ; mAb Capturat Nivel de captură mAb (RU) 100nM Ag legat (RU) ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) tЅ (min) H2aM7017N 569 ± 1,6 48 3,66E + 05 5,12E-02 1,40E-07 0,2;Exemplul 5: Răspândirea gripală in vitro a tulpinilor gripale H1, H3 şi FluB. ;În acest exemplu, a fost determinată capacitatea diferitelor tipuri de gripă de a se răspândi într-o cultură in vitro de celule Calu-3 şi efectul anticorpilor anti-TMPRSS2 asupra acestei răspândiri. ;Tabelul 10. Reactivi utilizaţi şi numere de lot. ; Cat# Descriere Vânzător HTB55 Celule Calu-3 ATCC (American Type Culture Collection) 11995-073 DMEM Gibco 211703 F12 Gibco 15140-122 Pen/Strep Gibco A033650ML IgG BSA scăzută Sigma 10010-023 PBS Life Technologies 26140079 Ser fetal bovin Life Technologies VR-1469 Gripa A A/Puerto Rico/08/1934 (H1_PR34) ATCC NR-13658 H1N1 A/CaliforniaA/04/2009 (H1_CA09) Resurse BEI FR-28 Gripa A/Brisbane/59/2007 (H1_Bris) Influenza Reagent Resource FR-1068 Gripa A/Hong Kong/38982/2009 (H9N2) Influenza Reagent Resource 3483 Gripa A A H3N2 Kilbourne F108 A/Aichi/2/68 (HA, NA) x A/PR/8/34, Re-asortată X-31 Resurse BEI NR-41795 Gripa B/Florida/04/2006 (Florida) ATCC NR-12280 Gripa B Malaezia (Malaezia) ATCC MAB8251 Anticorp anti-gripal A, nucleoproteină, clone A1, amestec A3 Millipore Ab20711 Anticorpul nucleoproteic al virusului anti-gripal B [B017] Abcam A-11001 Anticorp secundar absorbit încrucişat IgG (H+L) de capră, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific;Procedura experimentala ;Celulele Calu-3 au fost însămânţate la 40.000 celule/godeu într-o placă cu 96 de godeuri în mediu DMEM: F12 cu 5% FBS. A doua zi, tulpinile de virus gripal au fost diluate la un MOI determinat anterior (vezi Tabelul 11) şi anticorpii au fost diluaţi la 100 µg/mL. În aceste experimente, anticorpii anti-HA şi anti-TMPRSS2 au avut mecanisme de acţiune diferite, prin urmare, procedura experimentală a fost diferită pentru aceşti anticorpi pentru a-i testa în mod corespunzător. Anticorpii anti-HA au fost pre-incubaţi cu o tulpină individuală de virus gripal timp de o oră la 37°C într-o placă separată. După perioada de preincubare, amestecul anticorp/virus a fost adăugat la celulele Calu-3 timp de o oră. Anticorpul anti-TMPRSS2 a fost preincubat cu celule Calu-3 neinfectate timp de trei ore la 37°C. După perioada de preincubare, virusul a fost adăugat la celulele Calu-3 preincubate cu anticorpi anti-TMPRSS2 timp de o oră. După infecţia de o oră, celulele au fost spălate de trei ori cu PBS şi a fost adăugat anticorp proaspăt împreună cu un mediu nou în fiecare godeu. A fost adăugat anticorp suplimentar la 24 şi 48 de ore după infecţie. La 72 de ore după infecţie, celulele au fost colorate cu un anti-NP şi cuantificate pe un analizor universal CTL-ImmunoSpot® S6 (Cellular Technology Limited, Cleveland, OH). ;Tabelul 11A. Experimentul 1. ; Tulpina gripală MOI final H1_PR34 0,001 H1_CA09 0,001 H1_Bris 0,001 H9N2 0,01 H3N2 0,001;Tabelul 11B. Experimentul 2. ; Tulpina gripală MOI final H1_PR34 0,01 Florida 0,01 Malaezia 0,001;Rezumatul rezultatelor şi concluziile ;Calu-3 este o linie celulară epitelială a căilor respiratorii umane imortalizată, care s-a dovedit a permite replicarea multiciclică a virusurilor gripale umane în absenţa tripsinei exogene Zeng ş.a., Journal of Virology 81: 12439-12449 (2007)). În plus, s-a demonstrat că celulele Calu-3 exprimă TMPRSS2 (Bцttcher-Friebertshдuser ş.a., Journal of Virology 85: 1554-1562 (2011)) ceea ce este esenţial pentru aceste experimente, deoarece va fi testat un anticorp anti-TMPRSS2. În aceste experimente, a fost examinat sau nu H1H7017N, un anticorp anti-TMPRSS2, care poate preveni răspândirea în diferite tulpini de gripă. În plus, s-a rulat anticorpul anti-HA corespunzător pentru diferite tulpini ca martor pozitiv. Aşa cum era de aşteptat, a existat o infecţie iniţială în prezenţa anticorpului anti-TMPRSS2, dar H1 H7017N a împiedicat cu succes răspândirea infecţiei cu H1_PR34, H1_CA09, H1_Bris, H9N2 şi H3N2. Acest lucru poate fi observat prin examinarea diferenţelor în numărul de celule infectate între celulele tratate anti-TMPRSS2 şi martorii infectaţi (Tabelul 12). S-a ajuns la concluzia că anticorpul anti-TMPRSS2 nu a fost capabil să prevină răspândirea în niciuna dintre tulpinile de gripă B, deoarece numărul de celule infectate din godeurile martor şi tratate a fost acelaşi. În comparaţie, anticorpii anti-HA au fost pre-incubaţi cu virusul şi au prevenit infecţia iniţială. Acest lucru poate fi văzut şi prin compararea numărului de celule infectate. Numărarea celulelor infectate a fost efectuată pe aparatul CTL şi sunt raportate în tabelele de mai jos. ;Tabelul 12A. Experimentul 1. ; Tulpina gripală Martor neinfectat Martor infectat Celule infectate tratate cu anticorp HA specific grupului Celulele infectate tratate cu anticorp anti-TMPRSS2 H1H7017N H1_PR34 10 3847.5 3 1496 H1_CA09 3,5 4645.4 1,5 17 H1_Bris 15,5 3882 0,5 1005 H9N2 4,5 4172 4,5 196,5 H3N2 7,5 3922 9 754,5;Tabelul 12B. Experimentul 2. ; Tulpina gripală Martor neinfectat Martor infectat Celule infectate tratate cu anticorp HA specific grupului Celulele infectate tratate cu anticorp anti-TMPRSS2 H1H7017N H1_PR34 1 2848 18 60 Florida 4 1339 229 1234 Malaezia 10 1184 758 1451;Referinţe ;1. K. Shirato, K. Kanou, M. Kawase, S. Matsuyama, Clinical Isolates of Human Coronavirus 229E Bypass the Endosome for Cell Entry. Journal of Virology. 91, e01387-16 (2017). PMID: 27733646. ;2. L. M. Reinke ş.a., Different residues in the SARS-CoV spike protein determine cleavage and activation by the host cell protease TMPRSS2. PLoS ONE. 12, e0179177 (2017).PMID: 28636671. ;3. Y. Zhou ş.a., Protease inhibitors targeting coronavirus and filovirus entry. Antiviral Research. 116, 76-84 (2015). PMID: 25666761. ;4. P. Zmora, A.-S. Moldenhauer, H. Hofmann-Winkler, S. Pцhlmann, TMPRSS2 Isoform 1 Activates Respiratory Viruses and Is Expressed in Viral Target Cells. PLoS ONE. 10, e0138380 (2015). PMID: 26379044. ;5. P. Zmora ş.a., Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS ONE. 12, e0176597 (2017). PMID: 28493964. ;6. E. Bцttcher-Friebertshдuser, D. A. Stein, H.-D. Klenk, W. Garten, Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology. 85, 1554-1562 (2011). PMID: 21123387. ;7. S. Bertram ş.a., TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology. 84, 10016-10025 (2010). PMID: 20631123. ;8. C. Tarnow ş.a., TMPRSS2 is a host factor that is essential for pneumotropism and pathogenicity of H7N9 influenza A virus in mice. Journal of Virology (2014), doi:10.1128/JVI.03799-13. PMID: 24522916. ;9. E. Bottcher ş.a., Proteolytic Activation of Influenza Viruses by Serine Proteases TMPRSS2 and HAT from Human Airway Epithelium. Journal of Virology. 80, 9896-9898 (2006). PMID: 16973594. ;10. Manicassamy ş.a., Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 2010 22 Iunie;107(25):11531-6. doi: 10.1073/pnas.0914994107. Epub 2010 7 Iunie. PMID: 20534532. ;11. H. Zeng ş.a., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type i interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology. 81, 12439-12449 (2007). PMID: 17855549. ;Exemplul 6: Efectul tratamentului doar cu H1H7017N la şoareci umanizaţi TMPRS22. ;A fost evaluată capacitatea anticorpilor anti-TMPRSS2 de a proteja şoarecii proiectaţi pentru a exprima proteina umană TMPRSS2 de infecţia cu virusul gripal H1N1. ;Tabelul 13. Reactivi utilizaţi şi numere de lot. ; Cat# Descriere Vânzător VR-1469 Gripa A A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) ATCC 20012-043 PBS Gibco Ketamină: Xilazină ;Tabelul 14. IDs clonelor mAb. ; AbPID Descriere H1H7017N anti-TMPRSS2 mAb H1H1238N IgG1 izotip martor;Procedura experimentala ;Aceste experimente au fost efectuate la şoareci masculi şi femele de 5-8 săptămâni proiectaţi pentru a exprima proteina TMPRSS2 umană. Şoarecii au fost provocaţi cu 150 de unităţi formatoare de plăci (PFUs) de H1N1. Şoarecii au fost sedaţi cu 200µL de Ketamină: Xilazină (12 mg/ml:0,5 mg/ml) prin injecţie intraperitoneală şi apoi infectaţi cu 20µL de virus intranazal. Anticorpii au fost eliberaţi fie subcutanat (SC) cu o zi înainte de infectare, fie intravenos (IV) în diferite zile după infectare (PI). Programul de dozare a anticorpilor a variat între experimente (Tabelul 15). Greutăţile corporale au fost colectate zilnic până în ziua 14 PI şi şoarecii au fost sacrificaţi când au pierdut 20% din greutatea corporală iniţială. Rezultatele sunt raportate ca procent de supravieţuire. ;Tabelul 15A. Dozarea anticorpilor (Experiment 1). ; Anticorp Zilele PI Doza Livrare H1H1238N -1 5 mg/kg SC H1H7017N -1, 0 5 mg/kg SC, IV;Tabelul 15B. Dozarea anticorpilor (Experimentul 2). ; Anticorp Zilele PI Doza Livrare H1H1238N 0 10 mg/kg IV H1H7017N 0, 1, 2, 3 10 mg/kg IV;Rezumatul rezultatelor şi concluziile ;S-a demonstrat că şoarecii proiectaţi pentru a exprima proteina TMPRSS2 umană pot fi infectaţi cu o doză letală de gripă. Scopul acestor experimente a fost să demonstreze că H1H7017N poate proteja şoarecii proiectaţi pentru a exprima proteina umană TMPRSS2 împotriva grupei gripale A 1. Anticorpul a fost testat în modele profilactice şi terapeutice. Tratamentul cu H1 H7017N a avut ca rezultat o supravieţuire mai mare decât la şoarecii trataţi cu izotip martor (H1H1238N) în ambele experimente (Figurile 4 şi 5). În experimentul profilactic, supravieţuirea a fost 0% pentru şoarecii trataţi cu H1H1238N, 85,7% pentru şoarecii trataţi în ziua -1 PI şi 100% pentru şoarecii trataţi în ziua 0 PI cu H1H7017N. Pentru modelul terapeutic, grupul tratat cu H1H1238N a rezultat o supravieţuire de 25%, în timp ce grupurile tratate cu H1H7017N în ziua 0-3 PI au dus la supravieţuire 100%. Datele sunt rezumate în Tabelul 16. H1H7017N arată eficacitatea la şoareci proiectaţi pentru a exprima proteina TMPRSS2 umană. ;Tabelul 16A. Rezumatul datelor tabelate (Experimentul 1). ; ID grup Număr de şoareci pe grup Procent de supravieţuire (numărul de şoareci supravieţuitori/numărul total de şoareci din grup) H1H1238N, Ziua -1 PI, SC 4 0 (0/4) H1H7017N, Ziua -1 PI, SC 7 85,7 (6/7) H1H7017N, Ziua 0 PI, IV 6 100 (6/6);Tabelul 16B. Rezumatul datelor tabelate (Experimentul 2). ; ID grup Număr de şoareci per grup Procent de supravieţuire (numărul de şoareci supravieţuitori/numărul total de şoareci din grup) H1H1238N, Ziua 0 PI, IV 4 25 (1/4) H1H7017N, Ziua 0 PI, IV 5 100 (5/5) H1H7017N, Ziua 1 PI, IV 5 100 (5/5) H1H7017N, Ziua 2 PI, IV 5 100 (5/5) H1H7017N, Ziua 3 PI, IV 5 100 (5/5);Referinţe ;1. K. Shirato, K. Kanou, M. Kawase, S. Matsuyama, Clinical Isolates of Human Coronavirus 229E Bypass the Endosome for Cell Entry. Journal of Virology. 91, e01387-16 (2017). PMID: 27733646. ;2. L. M. Reinke ş.a., Different residues in the SARS-CoV spike protein determine cleavage and activation by the host cell protease TMPRSS2. PLoS ONE. 12, e0179177 (2017). PMID: 28636671. ;3. Y. Zhou ş.a., Protease inhibitors targeting coronavirus and filovirus entry. Antiviral Research. 116, 76-84 (2015). PMID: 25666761. ;4. P. Zmora, A.-S. Moldenhauer, H. Hofmann-Winkler, S. Pцhlmann, TMPRSS2 Isoform 1 Activates Respiratory Viruses and Is Expressed in Viral Target Cells. PLoS ONE. 10, e0138380 (2015). PMID: 26379044. ;5. P. Zmora ş.a., Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS ONE. 12, e0176597 (2017). PMID: 28493964. ;6. E. Bцttcher-Friebertshдuser, D. A. Stein, H.-D. Klenk, W. Garten, Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology. 85, 1554-1562 (2011). PMID: 21123387. ;7. S. Bertram ş.a., TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology. 84, 10016-10025 (2010). PMID: 20631123. ;8. C. Tarnow ş.a., TMPRSS2 is a host factor that is essential for pneumotropism and pathogenicity of H7N9 influenza A virus in mice. Journal of Virology (2014), doi:10.1128/JVI.03799-13. PMID: 24522916. ;9. E. Bottcher ş.a., Proteolytic Activation of Influenza Viruses by Serine Proteases TMPRSS2 and HAT from Human Airway Epithelium. Journal of Virology. 80, 9896-9898 (2006). PMID: 16973594. ;10. Manicassamy ş.a., Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 2010 Jun 22; 107(25):11531-6. doi: 10.1073/pnas.0914994107. Epub 2010 Jun 7. PMID: 20534532. ;11. H. Zeng ş.a., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type i interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology. 81, 12439-12449 (2007). PMID: 17855549. ;Exemplul 7: Activitatea anti-TMPRSS2 mAb, H1H7017N în modelul de şoarece umanizat TMPRSS2. ;A fost evaluată capacitatea anticorpilor anti-TMPRSS2 de a proteja un şoarece conceput pentru a exprima proteina umană TMPRSS2 de infecţia cu virusul gripal H3N2. ;Tabelul 17. IDs clonelor mAb. ; AbPID Descriere H1H7017N Anticorp anti-TMPRSS2;Tabelul 18. Reactivi utilizaţi şi numere de lot. ; Cat# Descriere Vânzător 3483 Gripa A H3N2 Kilbourne F108 A/Aichi/2/68 (HA, NA) x A/PR/8/34, Reasortată X-31 BEI Resources 20012-043 PBS Gibco Ketamină:Xilazină ;Procedura experimentala ;Şoarecii masculi şi femele de unsprezece săptămâni proiectaţi pentru a exprima proteina TMPRSS2 umană au fost provocaţi cu 20.000 de unităţi formatoare de plăci (PFUs) de H3N2. Şoarecii au fost sedaţi cu 200µL de Ketamină:Xilazină (12 mg/ml: 0,5 mg/ml) prin injecţie intraperitoneală şi apoi infectaţi cu 20µL de virus intranazal. În ziua 1 sau ziua 2 postinfecţie (PI), şoarecii au fost injectaţi intravenos cu anticorp. Şoarecii au fost cântăriţi şi observaţi zilnic până în ziua 14 postinfecţie (PI). Au fost sacrificaţi când au pierdut 25% din greutatea corporală iniţială. ;Rezumatul rezultatelor şi concluziile ;Amploarea este o calitate importantă atunci când se ia în considerare o terapie antigripală. S-a demonstrat deja că anticorpul anti-TMPRSS2 H1H7017N a fost eficient împotriva grupului gripal A 1. Scopul acestui experiment a fost să demonstreze că H1H7017N poate proteja şoarecii proiectaţi pentru a exprima proteina TMPRSS2 umană împotriva grupului gripal A 2. Şoarecii proiectaţi pentru a exprima proteinele umane TMPRSS2 au fost infectaţi cu o doză letală de H3N2 şi trataţi în ziua 1 sau în ziua 2 PI. Ambele grupuri de tratament au avut rate de supravieţuire mai mari decât martorul infectat. Şoarecii trataţi în ziua 1 PI au avut o rată de supravieţuire de 100% care a fost mai mare decât a grupului tratat în ziua 2 PI care a avut o supravieţuire de 50%, în timp ce şoarecii netrataţi au avut 0% supravieţuire. Toţi şoarecii au murit între zilele 5-6 PI. Graficul de supravieţuire este prezentat în Figura 6 şi % de supravieţuire este rezumat în Tabelul 19. Aceste rezultate au demonstrat că H1H7017 a îmbunătăţit rezultatele într-un model letal H3N2. ;Tabelul 19. Rezumatul datelor tabelate. ; ID grup Număr de şoareci per grup Procent de supravieţuire (numărul de şoareci supravieţuitori/numărul total de şoareci din grup) Netratat 5 0 (0/5) H1H7017N, Ziua 1 PI 5 100 (5/5) H1H7017N, Ziua 0 PI, IV 4 50 (2/4);Referinţe ;1. K. Shirato, K. Kanou, M. Kawase, S. Matsuyama, Clinical Isolates of Human Coronavirus 229E Bypass the Endosome for Cell Entry. Journal of Virology. 91, e01387-16 (2017). PMID: 27733646. ;2. L. M. Reinke ş.a., Different residues in the SARS-CoV spike protein determine cleavage and activation by the host cell protease TMPRSS2. PLoS ONE. 12, e0179177 (2017). PMID: 28636671. ;3. Y. Zhou ş.a., Protease inhibitors targeting coronavirus and filovirus entry. Antiviral Research. 116, 76-84 (2015). PMID: 25666761. ;4. P. Zmora, A.-S. Moldenhauer, H. Hofmann-Winkler, S. Pцhlmann, TMPRSS2 Isoform 1 Activates Respiratory Viruses and Is Expressed in Viral Target Cells. PLoS ONE. 10, e0138380 (2015). PMID: 26379044. ;5. P. Zmora ş.a., Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS ONE. 12, e0176597 (2017). PMID: 28493964. ;6. E. Bцttcher-Friebertshдuser, D. A. Stein, H.-D. Klenk, W. Garten, Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology. 85, 1554-1562 (2011). PMID: 21123387. ;7. S. Bertram ş.a., TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology. 84, 10016-10025 (2010). PMID: 20631123. ;8. C. Tarnow ş.a., TMPRSS2 is a host factor that is essential for pneumotropism and pathogenicity of H7N9 influenza A virus in mice. Journal of Virology (2014), doi:10.1128/JVI.03799-13. PMID: 24522916. ;9. E. Bottcher ş.a., Proteolytic Activation of Influenza Viruses by Serine Proteases TMPRSS2 and HAT from Human Airway Epithelium. Journal of Virology. 80, 9896-9898 (2006). PMID: 16973594. ;10. Manicassamy ş.a., Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 2010 22 Iunie;107(25): 11531-6. doi: 10.1073/pnas.0914994107. Epub 2010 7 Iunie. PMID: 20534532. ;11. H. Zeng ş.a., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type i interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology. 81, 12439-12449 (2007). PMID: 17855549. ;Exemplul 8: Infecţia şoarecilor proiectaţi pentru a exprima proteina umană TMPRSS2 (versus WT). ;Supravieţuirea şoarecilor proiectaţi pentru a exprima proteina TMPRSS2 umană infectată cu virusul gripei H1N1 a fost evaluată şi comparată cu cea a şoarecilor de tip sălbatic (WT). ;Tabelul 20. Reactivi utilizaţi şi numere de lot. ; Cat# Descriere Vânzător VR-1469 Gripa A A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) ATCC 20012-043 PBS Gibco Ketamină:Xilazină ;Procedura experimentala ;Experimentul a fost efectuat la şoareci masculi şi femele în vârstă de 7,5-8 săptămâni proiectaţi pentru a exprima proteina umană TMPRSS2 sau codescendenţi de tip sălbatic. Şoarecii au fost provocaţi cu 150, 750 sau 1.500 de unităţi formatoare de plăci (PFUs) din A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1). Şoarecii au fost sedaţi cu 200µL de Ketamină:Xilazină (12 mg/ml: 0,5 mg/ml) prin injecţie intraperitoneală şi apoi infectaţi cu 20µL de virus intranazal. Greutăţile corporale au fost colectate zilnic până în ziua 14 PI şi şoarecii au fost sacrificaţi când au pierdut 20% din greutatea corporală iniţială. Rezultatele sunt raportate ca procent de supravieţuire (Figura 7). ;Rezumatul rezultatelor şi concluziile ;Şoarecii proiectaţi pentru a exprima proteina TMPRSS2 umană au fost generaţi pentru a testa eficacitatea terapeutică a anticorpilor anti-TMPRSS2 într-un model de gripă in vivo. În acest experiment, au fost comparate ratele de supravieţuire ale şoarecilor proiectaţi pentru a exprima proteina umană TMPRSS2 şi şoarecii de tip sălbatic infectaţi cu 150, 750 sau 1.500 PFUs dintr-o tulpină istorică de H1N1. A existat 0% de supravieţuire pentru şoareci proiectaţi pentru a exprima proteina umană TMPRSS2 şi şoarecii de tip sălbatic în toate cele trei grupuri de infecţie. Toţi şoarecii au murit între ziua 5 şi ziua 8 PI, cei care au primit o doză mai mare de virus au murit mai devreme decât cei care au primit o doză mai mică de virus. Modelele de supravieţuire ale şoarecilor proiectate pentru a exprima proteina TMPRSS2 umană au fost similare cu cele ale şoarecilor de tip sălbatic. Acest lucru arată că şoarecii proiectaţi pentru a exprima proteina TMPRSS2 umană pot fi folosiţi ca model de gripă in vivo pentru a evalua eficacitatea anticorpilor specifici TMPRSS2. Vezi Tabelul 21. ;Tabelul 21. Rezumatul datelor tabelate. ; ID grup Număr de şoareci pe grup Procent de supravieţuire (numărul de şoareci supravieţuitori/numărul total de şoareci din grup) Genul sălbatic; 150 PFUs H1N1 4 0 (0/4) Genul sălbatic; 750 PFUs H1N1 4 0 (0/4) Genul sălbatic; 1.500 PFUs H1N1 3 0 (0/3) Şoareci proiectaţi pentru a exprima proteina TMPRSS2 umană; 150 PFUs H1N1 4 0 (0/4) Şoareci proiectaţi pentru a exprima proteina TMPRSS2 umană; 750 PFUs H1N1 3 0 (0/3) Şoareci proiectaţi pentru a exprima proteina TMPRSS2 umană; 1.500 PFUs H1N1 3 0 (0/3);Referinţe ;1. K. Shirato, K. Kanou, M. Kawase, S. Matsuyama, Clinical Isolates of Human Coronavirus 229E Bypass the Endosome for Cell Entry. Journal of Virology. 91, e01387-16 (2017). PMID: 27733646. ;2. L. M. Reinke ş.a., Different residues in the SARS-CoV spike protein determine cleavage and activation by the host cell protease TMPRSS2. PLoS ONE. 12, e0179177 (2017). PMID: 28636671. ;3. Y. Zhou ş.a., Protease inhibitors targeting coronavirus and filovirus entry. Antiviral Research. 116, 76-84 (2015). PMID: 25666761. ;4. P. Zmora, A.-S. Moldenhauer, H. Hofmann-Winkler, S. Pцhlmann, TMPRSS2 Isoform 1 Activates Respiratory Viruses and Is Expressed in Viral Target Cells. PLoS ONE. 10, e0138380 (2015). PMID: 26379044. ;5. P. Zmora ş.a., Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS ONE. 12, e0176597 (2017). PMID: 28493964. ;6. E. Bцttcher-Friebertshдuser, D. A. Stein, H.-D. Klenk, W. Garten, Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology. 85, 1554-1562 (2011). PMID: 21123387. ;7. S. Bertram ş.a., TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology. 84, 10016-10025 (2010). PMID: 20631123. ;8. C. Tarnow ş.a., TMPRSS2 is a host factor that is essential for pneumotropism and pathogenicity of H7N9 influenza A virus in mice. Journal of Virology (2014), doi:10.1128/JVI.03799-13. PMID: 24522916. ;9. E. Bottcher ş.a., Proteolytic Activation of Influenza Viruses by Serine Proteases TMPRSS2 and HAT from Human Airway Epithelium. Journal of Virology. 80, 9896-9898 (2006). PMID: 16973594. ;10. Manicassamy ş.a., Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 2010 Jun 22;107(25):11531-6. doi: 10.1073/pnas.0914994107. Epub 2010 7 Iunie. PMID: 20534532. ;11. H. Zeng ş.a., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type i interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology. 81, 12439-12449 (2007). PMID: 17855549. ;Exemplul 9: Efectul tratamentului cu combinaţia de H1H14611N2 şi H1H7017N la şoareci după infecţia cu H3N2. ;A fost evaluată capacitatea unei combinaţii de anticorpi anti-TMPRSS2 şi anti-gripali de a proteja şoarecii proiectaţi pentru a exprima proteina umană TMPRSS2 de infecţia cu virusul gripal H3N2. ;Tabelul 22. IDs clonelor mAb. ; AbPID Descriere H1H7017N Anticorp anti-TMPRSS2 H1H14611N2 Anticorp anti-gripal A grupa 2 H1H1238N IgG1 martor izotip;Tabelul 23. Reactivi utilizaţi şi numere de lot. ; Descriere Vânzător Gripa A H3N2 Kilbourne F108 A/Aichi/2/68 (HA, NA) x A/PR/8/34, Reasortată X-31 BEI Resources PBS Gibco Ketamină:Xilazină ;Procedura experimentala ;Şoarecii masculi şi femele de opt săptămâni proiectaţi pentru a exprima proteina TMPRSS2 umană au fost provocaţi cu 20.000 de unităţi formatoare de plăci (PFUs) de A/Aichi/2/68 (HA, NA) x A/PR/8/34, Re*assorted X-31 (H3N2). Şoarecii au fost sedaţi cu 200µL de Ketamină:Xilazină (12 mg/ml: 0,5 mg/ml) prin injecţie intraperitoneală şi apoi infectaţi cu 20µL de virus intranazal. În ziua 4 postinfecţie (PI), şoarecii au fost injectaţi intravenos cu anticorp. Greutăţile corporale au fost colectate zilnic până în ziua 14 PI şi şoarecii au fost sacrificaţi când au pierdut 25% din greutatea corporală iniţială. Rezultatele sunt raportate ca procent de supravieţuire.
Rezumatul rezultatelor şi concluziile
S-a demonstrat că, în mod individual, anticorpul TMPRSS2, H1H7017N şi anticorpul gripal larg A din grupa 2, H1H14611N2, au eficacitate terapeutică împotriva unei provocări letale la şoarece cu o tulpină istorică de H3N2. De asemenea, s-a arătat că supravieţuirea şoarecilor infectaţi cu o provocare letală cu H1N1 poate fi semnificativ crescută după tratamentul cu mai puţin anticorp total decât fie singur, prin combinaţia H1H7017N şi anticorp gripal larg A grupa 1, H1H11729P. Scopul acestui experiment a fost de a evalua efectul sinergic al H1H7017N şi H1H14611N2 în combinaţie. Aşa cum se arată în Figura 8, 3 din 4 şoareci trataţi cu anticorpul martor izotip hlgG1 în ziua 4 PI au murit până în ziua 7 PI. 3 din 5 animale au supravieţuit când au fost dozate cu 10 mg/kg de H1H14611N2 şi 4 din 5 animale au supravieţuit când au fost dozate cu 10 mg/kg de H1H7017N. Când a fost administrat într-o combinaţie de 5 mg/kg din fiecare anticorp, H1H14611N2 şi H1H7017N, a existat o supravieţuire de 40%. Sută la sută dintre şoarecii trataţi cu combinaţia de 2,5 mg/kg din fiecare anticorp, H1H14611N2 şi H1H7017N, au supravieţuit provocării. Supravieţuirea şoarecilor infectaţi cu o provocare letală de H3N2 a fost crescută prin combinaţia de concentraţii mai mici de H1H7017N şi H1H14611N2 comparativ cu concentraţii mai mari de anticorpi combinaţi sau din oricare dintre anticorpi singuri. Procentul de supravieţuire este rezumat în Tabelul 24.
Tabelul 24. Rezumatul datelor tabelate.
ID grup Număr de şoareci per grup Procent de supravieţuire (numărul de şoareci supravieţuitori/numărul total de şoareci din grup) 10 mg/kg hlgG1 martor izotip 5 20 (1/5) 10 mg/kg H1H14611N2 5 60 (3/5) 10 mg/kg H1H7017N 5 80 (4/5) 5 mg/kg H1H7017N + 5 mg/kg H1H14611N2 5 40 (2/5) 2,5 mg/kg H1H7017N + 2,5 mg/kg H1H14611N2 5 100 (5/5)
Referinţe
1. K. Shirato, K. Kanou, M. Kawase, S. Matsuyama, Clinical Isolates of Human Coronavirus 229E Bypass the Endosome for Cell Entry. Journal of Virology. 91, e01387-16 (2017). PMID: 27733646.
2. L. M. Reinke ş.a., Different residues in the SARS-CoV spike protein determine cleavage and activation by the host cell protease TMPRSS2. PLoS ONE. 12, e0179177 (2017). PMID: 28636671.
3. Y. Zhou ş.a., Protease inhibitors targeting coronavirus and filovirus entry. Antiviral Research. 116, 76-84 (2015). PMID: 25666761.
4. P. Zmora, A.-S. Moldenhauer, H. Hofmann-Winkler, S. Pцhlmann, TMPRSS2 Isoform 1 Activates Respiratory Viruses and Is Expressed in Viral Target Cells. PLoS ONE. 10, e0138380 (2015). PMID: 26379044.
5. P. Zmora ş.a., Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS ONE. 12, e0176597 (2017). PMID: 28493964
6. E. Bцttcher-Friebertshдuser, D. A. Stein, H.-D. Klenk, W. Garten, Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology. 85, 1554-1562 (2011). PMID: 21123387.
7. S. Bertram ş.a., TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology. 84, 10016-10025 (2010). PMID: 20631123.
8. C. Tarnow ş.a., TMPRSS2 is a host factor that is essential for pneumotropism and pathogenicity of H7N9 influenza A virus in mice. Journal of Virology (2014), doi:10.1128/JVI.03799-13. PMID: 24522916.
9. E. Bottcher ş.a., Proteolytic Activation of Influenza Viruses by Serine Proteases TMPRSS2 and HAT from Human Airway Epithelium. Journal of Virology. 80, 9896-9898 (2006). PMID: 16973594.
10. Manicassamy ş.a., Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 2010 Jun 22; 107(25):11531-6. doi: 10.1073/pnas.0914994107. Epub 2010 7 Iunie. PMID: 20534532.
11. H. Zeng ş.a., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type i interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology. 81, 12439-12449 (2007). PMID: 17855549.
Exemplul 10: Efectul tratamentului cu combinaţia de H1H11729P şi H1H7017N la şoareci după infecţia cu H1N1.
A fost evaluată capacitatea unei combinaţii de anticorpi anti-TMPRSS2 şi anti-gripali de a proteja şoarecii proiectaţi pentru a exprima proteina TMPRSS2 umană de infecţia cu virusul gripei H1N1.
Tabelul 25. IDs clonelor mAb.
AbPID Descriere H1H7017N Anticorp anti-TMPRSS2 H1H11729P Anticorp anti-gripal A grupa 1 H1H1238N IgG1 martor izotip
Tabelul 26. Reactivi utilizaţi şi numere de lot.
Cat# Descriere Vânzător VR-1469 Gripa A A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) ATCC 20012-043 PBS Gibco Ketamină:Xilazină
Procedura experimentala
Şoarecii masculi şi femele de cinci săptămâni proiectaţi pentru a exprima proteina umană TMPRSS2 au fost provocaţi cu 1.500 de unităţi formatoare de plăci (PFUs) de H1N1. Virusul a fost eliberat prin sedarea şoarecilor cu 200µL de Ketamină:Xilazină (12 mg/ml: 0,5 mg/ml) şi eliberarea a 20µL de virus intranazal. În ziua 3 post-infecţie (PI), şoarecii au fost injectaţi intravenos cu anticorp. Greutăţile corporale au fost colectate zilnic până în ziua 14 PI şi şoarecii au fost sacrificaţi când au pierdut 25% din greutatea corporală iniţială.
Rezumatul rezultatelor şi concluziile
S-a demonstrat că, în mod individual, anticorpul TMPRSS2, H1H7017N şi anticorpul gripal larg A din grupa 1, H1H11729P, au eficacitate terapeutică împotriva unei provocări letale de şoarece cu o tulpină istorică de H1N1. Cu toate acestea, scopul acestui experiment a fost de a evalua efectul sinergic al anticorpilor în combinaţie. Toţi şoarecii trataţi cu anticorp de hlgG1 martor izotip în ziua 3 PI au murit până în ziua 6 PI. Când animalele au primit 5 mg/kg de H1H11729P sau H1H7017N, 40% şi respectiv 0% dintre animale au supravieţuit infecţiei. Cu toate acestea, combinaţia a 2,5 mg/kg din fiecare anticorp, H1H11729P şi H1H7017N, a dus la o supravieţuire de 60%. Optzeci la sută dintre şoarecii trataţi cu combinaţia de 1 mg/kg de H1H7017N şi 2 mg/kg de H1H11729P (3 mg/kg în total) au supravieţuit provocării. Supravieţuirea şoarecilor infectaţi cu o provocare letală cu H1N1 a fost semnificativ crescută după tratamentul cu mai puţini anticorpi totali decât fie doar singuri prin combinaţia H1H7017N şi H1H11729P (vezi Figura 9 şi Tabelul 27).
Tabelul 27. Rezumatul datelor tabelate.
ID grup Număr de şoareci pe grup Procent de supravieţuire (numărul de şoareci supravieţuitori/numărul total de şoareci din grup) 5 mg/kg hlgG1 martor izotip 3 0 (0/3) 5 mg/kg H1H11729P 5 40 (2/5) 5 mg/kg H1H7017N 5 0 (0/5) 2,5 mg/kg H1H7017N + 2,5 mg/kg H1H11729P 5 60 (3/5) 1 mg/kg H1H7017N + 2 mg/kg H1H11729P 5 80 (4/5)
Referinţe
1. K. Shirato, K. Kanou, M. Kawase, S. Matsuyama, Clinical Isolates of Human Coronavirus 229E Bypass the Endosome for Cell Entry. Journal of Virology. 91, e01387-16 (2017). PMID: 27733646.
2. L. M. Reinke ş.a., Different residues in the SARS-CoV spike protein determine cleavage and activation by the host cell protease TMPRSS2. PLoS ONE. 12, e0179177 (2017). PMID: 28636671.
3. Y. Zhou ş.a., Protease inhibitors targeting coronavirus and filovirus entry. Antiviral Research. 116, 76-84 (2015). PMID: 25666761.
4. P. Zmora, A.-S. Moldenhauer, H. Hofmann-Winkler, S. Pцhlmann, TMPRSS2 Isoform 1 Activates Respiratory Viruses and Is Expressed in Viral Target Cells. PLoS ONE. 10, e0138380 (2015). PMID: 26379044.
5. P. Zmora ş.a., Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS ONE. 12, e0176597 (2017). PMID: 28493964.
6. E. Bцttcher-Friebertshдuser, D. A. Stein, H.-D. Klenk, W. Garten, Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology. 85, 1554-1562 (2011). PMID: 21123387.
7. S. Bertram ş.a., TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology. 84, 10016-10025 (2010). PMID: 20631123.
8. C. Tarnow ş.a., TMPRSS2 is a host factor that is essential for pneumotropism and pathogenicity of H7N9 influenza A virus in mice. Journal of Virology (2014), doi:10.1128/JVI.03799-13. PMID: 24522916.
9. E. Bottcher ş.a., Proteolytic Activation of Influenza Viruses by Serine Proteases TMPRSS2 and HAT from Human Airway Epithelium. Journal of Virology. 80, 9896-9898 (2006). PMID: 16973594.
10. Manicassamy ş.a., Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 2010 Jun 22;107(25):11531-6. doi: 10.1073/pnas.0914994107. Epub 2010 7 Iunie. PMID: 20534532.
11. H. Zeng ş.a., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type i interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology. 81, 12439-12449 (2007). PMID: 17855549.
LISTA DE SECVENŢE
<110> Purcell , Lisa
<120> ANTICORPI ANTI-TMPRSS2 ŞI FRAGMENTE DE LEGARE LA ANTIGEN
<130> 10378-WO
<140> Pentru a fi atribuit
<141> 2019-01-24
<150> 62/622,292
<151> 2018-01-26
<160> 48
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 360
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220> <221> CDS
<222> (1)..(360)
<400> 1
<210> 2
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3
<211> 321
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220> <221> CDS
<222> (1)..(321)
<400> 3
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
<210> 5
<211> 24
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220> <221> CDS
<222> (1)..(24)
<400> 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
<210> 7
<211> 24
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220> <221> CDS
<222> (1)..(24)
<400> 7
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
<210> 9
<211> 39
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220> <221> CDS
<222> (1)..(39)
<400> 9
<210> 10
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
<210> 11
<211> 18
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220> <221> CDS
<222> (1)..(18)
<400> 11
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
<210> 13
<211> 9
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 13
aaggcgtct 9
<210> 14
<211> 3
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
<210> 15
<211> 27
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220> <221> CDS
<222> (1)..(27)
<400> 15
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
<210> 17
<211> 450
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
<210> 18
<211> 214
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
<210> 19
<211> 447
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
<210> 20
<211> 178
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
<210> 21
<211> 178
<212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 21
<210> 22
<211> 492
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
<210> 23
<211> 492
<212> PRT
<213> Macaca mulatta
<400> 23
<210> 24
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
<210> 28
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
<210> 30
<211> 3
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
<210> 32
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
<210> 35
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
<210> 36
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
<210> 37
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
<210> 38
<211> 3
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
<210> 40
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
<210> 41
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 41
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
<210> 43
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
<210> 44
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 45
<210> 46
<211> 3
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 47
<210> 48
<211> 5
<212> PRT
<213> Secvenţă Artificială
<220>
<223> Linker GS
<400> 48

Claims (15)

1. Proteină care leagă antigenul uman care se leagă în mod specific la TMPRSS2 umană şi care este un anticorp sau un fragment de legare a antigenului al acestuia şi în care proteina care leagă antigenul cuprinde:
o regiune variabilă a lanţului greu al imunoglobulinei care cuprinde
(a) un CDR-H1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: G F T F S S Y G (SECV ID NR: 6),
(b) un CDR-H2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: I W N D G S Y V (SECV ID NR: 8), and
(c) un CDR-H3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: A R E G E W V L Y Y F D Y (SECV ID NR: 10); and
o regiune variabilă a lanţului uşor al imunoglobulinei care cuprinde
(a) a CDR-L1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: Q S I S S W (SECV ID NR: 12),
(b) a CDR-L2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: K A S (SECV ID NR: 14), and
(c) a CDR-L3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: Q Q Y N S Y S Y T (SECV ID NR: 16).
2. Proteină care leagă antigenul conform revendicării 1 care cuprinde:
(a) un lanţ greu de imunoglobulină care cuprinde secvenţa de aminoacizi stabilită în SECV ID NR:2
şi
(b) un lanţ uşor de imunoglobulină care cuprinde secvenţa de aminoacizi stabilită în SECV ID NR: 18 sau o regiune variabilă a lanţului uşor de imunoglobulină care cuprinde secvenţa de aminoacizi prezentată în SECV ID NR: 4.
3. Proteină care leagă antigenul conform revendicării 1 sau 2, care este multispecifică.
4. Complex care cuprinde o proteină care leagă antigenul conform oricăreia dintre revendicările 1-3 legată de o polipeptidă TMPRSS2.
5. Metodă pentru obţinerea unei proteine care leagă antigenul conform oricăreia dintre revendicările 1-3 care cuprinde:
(a) introducerea într-o celulă gazdă: (i) o polinucleotidă care codifică un lanţ greu de imunoglobulină şi un lanţ uşor de imunoglobulină al proteinei care leagă antigenul; sau (ii) o polinucleotidă care codifică un lanţ greu de imunoglobulină al respectivei proteine care leagă antigenul şi o polinucleotidă care codifică un lanţ uşor de imunoglobulină al respectivei proteine care leagă antigenul;
(b) cultivarea celulei gazdă în condiţii favorabile exprimării polinucleotidelor; şi
(c) opţional, izolarea proteinei de legare a antigenului de celula gazdă şi/sau mediu în care este cultivată celula gazdă.
6. Metodă conform revendicării 5, în care celula gazdă este o celulă ovariană de hamster chinezesc.
7. Polinucleotidă care codifică:
un lanţ greu de imunoglobulină care cuprinde:
(a) un CDR-H1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: G F T F S S Y G (SECV ID NR: 6),
(b) un CDR-H2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: I w N D G S Y V (SECV ID NR: 8), şi
(c) un CDR-H3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: A R E G E W V L Y Y F D Y (SECV ID NR: 10); şi
un lanţ uşor de imunoglobulină care cuprinde:
(a) un CDR-L1 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: Q S I S S W (SECV ID NR: 12),
(b) un CDR-L2 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: K A S (SECV ID NR: 14), and
(c) un CDR-L3 care cuprinde secvenţa de aminoacizi: Q Q Y N S Y S Y T (SECV ID NR: 16).
8. Vector care cuprind polinucleotida conform revendicării 7.
9. Celulă gazdă care cuprind proteina care leagă antigenul conform oricăreia dintre revendicările 1 la 3, polinucleotida conform revendicării 7, sau vectorul conform revendicării 8.
10. Compoziţie sau kit care cuprinde proteina care leagă antigenul conform oricăreia dintre revendicările 1-3 şi un alt agent terapeutic, în care trusa cuprinde proteina care leagă antigenul şi agentul terapeutic suplimentar formulat ca o singură compoziţie, sau separat în două sau mai multe compoziţii.
11. Compoziţie farmaceutică care cuprinde proteina care leagă antigenul conform oricăreia dintre revendicările 1-3 şi un purtător acceptabil farmaceutic şi, opţional, un alt agent terapeutic.
12. Compoziţie sau kit conform revendicării 10 sau 11, în care: (i) agentul terapeutic suplimentar este un medicament antiviral, sau un vaccin; sau (ii) agentul terapeutic suplimentar este un membru selectat din grupul format din: oseltamivir, zanamivir, ribavirină şi interferon-alfa2b, interferon-alfa2a şi un anticorp sau fragment de legare a antigenului al acestuia care se leagă în mod specific de HA gripal.
13. Vas sau dispozitiv de injecţie care cuprind proteina care leagă antigenul conform oricăreia dintre revendicările 1-3, sau compoziţia oricăreia dintre revendicările 10-12.
14. Proteină care leagă antigenul conform oricăreia dintre revendicările 1-3 pentru utilizare într-o metodă pentru tratarea sau prevenirea infecţiei cu un virus gripal la un subiect care are nevoie de acesta, care cuprinde administrarea unei cantităţi eficiente terapeutic din proteina menţionată care leagă antigenul.
15. Proteină care leagă antigenul pentru utilizare conform revendicării 14, în care:
(i) subiectului i se administrează unul sau mai mulţi agenţi terapeutici suplimentari;
(ii) subiectului i se administrează unul sau mai mulţi agenţi terapeutici suplimentari care sunt un medicament antiviral, sau un vaccin;
(iii) subiectului i se administrează unul sau mai mulţi agenţi terapeutici care sunt un membru selectat din grupul format din: oseltamivir, zanamivir, ribavirină şi interferon-alfa2b, interferon-alfa2a şi un anticorp sau fragment de legare a antigenului al acestuia care se leagă în mod specific de HA gripal; sau
(iv) proteina care leagă antigenul este injectată în corpul subiectului, opţional, subcutanat, intravenos sau intramuscular.
MDE20200454T 2018-01-26 2019-01-24 Anticorpi anti-TMPRSS2 și fragmente de legare al antigenului MD3638698T2 (ro)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862622292P 2018-01-26 2018-01-26
PCT/US2019/014978 WO2019147831A1 (en) 2018-01-26 2019-01-24 Anti-tmprss2 antibodies and antigen-binding fragments

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MD3638698T2 true MD3638698T2 (ro) 2021-07-31

Family

ID=66102175

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MDE20200454T MD3638698T2 (ro) 2018-01-26 2019-01-24 Anticorpi anti-TMPRSS2 și fragmente de legare al antigenului

Country Status (26)

Country Link
US (3) US10941213B2 (ro)
EP (1) EP3638698B1 (ro)
JP (2) JP7834965B2 (ro)
KR (2) KR102911478B1 (ro)
CN (2) CN111936517B (ro)
AU (2) AU2019211406C1 (ro)
BR (1) BR112020015112A2 (ro)
CA (1) CA3089377A1 (ro)
CY (1) CY1124182T1 (ro)
DK (1) DK3638698T3 (ro)
ES (1) ES2864529T3 (ro)
HR (1) HRP20210876T1 (ro)
HU (1) HUE054403T2 (ro)
IL (2) IL276164B2 (ro)
LT (1) LT3638698T (ro)
MA (1) MA46731B1 (ro)
MD (1) MD3638698T2 (ro)
MX (2) MX2020007888A (ro)
PL (1) PL3638698T3 (ro)
PT (1) PT3638698T (ro)
RS (1) RS61825B1 (ro)
SG (1) SG11202006898TA (ro)
SI (1) SI3638698T1 (ro)
SM (1) SMT202100307T1 (ro)
WO (1) WO2019147831A1 (ro)
ZA (1) ZA202004494B (ro)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI702229B (zh) * 2014-12-19 2020-08-21 美商再生元醫藥公司 流行性感冒病毒血球凝集素之人類抗體
LT3638698T (lt) 2018-01-26 2021-04-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antikūnai prieš tmprss2 ir antigeną surišantys fragmentai
JP2022548309A (ja) 2019-09-23 2022-11-17 ツイスト バイオサイエンス コーポレーション Ｃｒｔｈ２のバリアント核酸ライブラリー
WO2021061842A1 (en) * 2019-09-23 2021-04-01 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for single domain antibodies
AU2021210987A1 (en) 2020-01-24 2022-08-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Protein-antiviral compound conjugates
MX2022009476A (es) 2020-02-10 2022-08-22 Regeneron Pharma Anticuerpos anti-tmprss2 y fragmentos de union a antigeno.
WO2021190980A1 (en) 2020-03-22 2021-09-30 Quadrucept Bio Limited Multimers for viral strain evolution
CR20220552A (es) 2020-04-02 2023-01-17 Regeneron Pharma Anticuerpos contra glicoproteína de espícula anti-sars-cov-2 y fragmentos de unión al antígeno
CN115398006A (zh) * 2020-04-13 2022-11-25 麦登顾问有限责任公司 用于治疗covid-19的ace2靶向组合物和方法
MX2022013030A (es) 2020-04-17 2023-03-09 Regeneron Pharma Ensayos de deteccion para anticuerpos neutralizantes de coronavirus.
US20230149536A1 (en) 2020-04-17 2023-05-18 Vyriad, Inc. Compositions for treating and/or preventing coronavirus infections
JP2023527352A (ja) 2020-05-26 2023-06-28 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 抗ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２－スパイク糖タンパク質抗体及び抗原結合断片
CA3181026A1 (en) 2020-06-03 2021-12-09 Samit GANGULY Methods for treating or preventing sars-cov-2 infections and covid-19 with anti-sars-cov-2 spike glycoprotein antibodies
US12097212B2 (en) * 2020-06-08 2024-09-24 Brigham Young University Use of cationic steroidal antimicrobial compounds to deactivate coronavirus
WO2021255217A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 Heidelberg Pharma Research Gmbh Amatoxin and amatoxin conjugates for use in inhibition of rna virus replication
CN111986818A (zh) * 2020-08-21 2020-11-24 南通大学 一种基于tmprss2的新冠covid-19治疗药物筛选系统
CA3192526A1 (en) 2020-09-04 2022-03-10 Rutgers, The State University Of New Jersey Sars-cov-2 vaccines and antibodies
CN112795583A (zh) * 2020-11-16 2021-05-14 上海大学 重组唾液酸外切酶的制备方法、表达基因、重组表达载体及构建方法
WO2022115503A1 (en) 2020-11-25 2022-06-02 Dupont Nutrition Biosciences Aps Treatment and prevention of coronavirus infection
CN112538494A (zh) * 2020-12-08 2021-03-23 武汉华美生物工程有限公司 一种tmprss2突变体蛋白及其表达载体、表达工程菌和制备方法
WO2022133182A1 (en) * 2020-12-18 2022-06-23 Chan Zuckerberg Biohub, Inc. Method of treating coronavirus infection
WO2022184659A1 (en) 2021-03-01 2022-09-09 Quadrucept Bio Limited Antibody domains & multimers
WO2022187626A1 (en) 2021-03-05 2022-09-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-sars-cov-2-variant-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
EP4314075A4 (en) 2021-03-24 2025-04-09 Twist Bioscience Corporation VARIANT NUCLEIC ACID BANKS FOR CD3
IL310012A (en) 2021-07-14 2024-03-01 Regeneron Pharma Antibodies against SARS-COV-2 spike glycoprotein and antigen-binding fragments
EP4509529A1 (en) * 2022-04-12 2025-02-19 Riken Antibody used to treat coronavirus infection
WO2023220712A1 (en) * 2022-05-13 2023-11-16 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Host proteases essential for parainfluenza spread in the human lung: potential targets for antiviral interventions
CN116003611B (zh) * 2022-08-17 2024-02-27 中南大学湘雅医院 抗tmprss2抗体及其用途
EP4724502A1 (en) * 2023-06-08 2026-04-15 Institut Pasteur Single domain antibodies directed against human transmembrane- serine protease 2 (tmprss2)
WO2025072792A1 (en) * 2023-09-28 2025-04-03 The Regents Of The University Of California Methods for identifying and treating diseases characterized by allele specific expression

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US4952496A (en) 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
US5693489A (en) 1984-03-30 1997-12-02 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
EP2075582A3 (en) 2000-07-12 2010-01-06 Agensys, Inc. Novel tumor antigen useful in diagnosis and therapy of bladder, ovary, lung and kidney cancers
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US8354508B2 (en) 2006-07-21 2013-01-15 Diadexus, Inc. PRO115 antibody compositions and methods of use
EP2057191A1 (en) 2006-08-18 2009-05-13 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of deseases and disorders associated with il-6-mediated signalling
NO347649B1 (no) * 2006-12-14 2024-02-12 Regeneron Pharma Humant antistoff eller antistoff fragment som spesifikt binder human deltaliknende ligand 4 (hDII4), nukleinsyremolekyl som koder for slike og vektor og vert-vektorsystemer, samt fremgangsmåte for fremstilling, sammensetning og anvendelse.
NZ589036A (en) 2008-05-16 2012-07-27 Ablynx Nv AMINO ACID SEQUENCES DIRECTED AGAINST CXCR4 AND OTHER GPCRs AND COMPOUNDS COMPRISING THE SAME
EP3453723B1 (en) * 2012-01-31 2021-08-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-asic1 antibodies and uses thereof
HK1202817A1 (en) * 2012-04-16 2015-10-09 瑞泽恩制药公司 Methods for treating or preventing influenza virus infection by administering a serine protease inhibitor
US20150203591A1 (en) 2012-08-02 2015-07-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mutivalent antigen-binding proteins
TWI702229B (zh) 2014-12-19 2020-08-21 美商再生元醫藥公司 流行性感冒病毒血球凝集素之人類抗體
CN106589127A (zh) * 2015-10-16 2017-04-26 钜川生物医药 一种pcsk9抗体及其制备方法和应用
CN109068621B (zh) 2016-02-29 2021-07-20 再生元制药公司 具有人源化的tmprss基因的啮齿类动物
WO2018175749A2 (en) * 2017-03-22 2018-09-27 Children's Medical Center Corporation Lrp1 binding agents and uses thereof
LT3638698T (lt) 2018-01-26 2021-04-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antikūnai prieš tmprss2 ir antigeną surišantys fragmentai

Also Published As

Publication number Publication date
ES2864529T3 (es) 2021-10-14
HUE054403T2 (hu) 2021-09-28
SG11202006898TA (en) 2020-08-28
IL276164A (en) 2020-09-30
WO2019147831A1 (en) 2019-08-01
DK3638698T3 (da) 2021-04-26
RS61825B1 (sr) 2021-06-30
SMT202100307T1 (it) 2021-07-12
CY1124182T1 (el) 2022-05-27
US10941213B2 (en) 2021-03-09
KR102911478B1 (ko) 2026-01-14
CA3089377A1 (en) 2019-08-01
SI3638698T1 (sl) 2021-07-30
IL276164B1 (en) 2024-07-01
JP7834965B2 (ja) 2026-03-25
IL276164B2 (en) 2024-11-01
AU2025204183A1 (en) 2025-06-26
AU2019211406A1 (en) 2020-08-13
CN111936517B (zh) 2025-04-18
MA46731B1 (fr) 2021-06-30
US20190300625A1 (en) 2019-10-03
US20220081489A9 (en) 2022-03-17
US11603413B2 (en) 2023-03-14
IL312961A (en) 2024-07-01
JP2021511058A (ja) 2021-05-06
EP3638698A1 (en) 2020-04-22
PL3638698T3 (pl) 2021-09-06
KR20200115576A (ko) 2020-10-07
HRP20210876T1 (hr) 2021-07-09
EP3638698B1 (en) 2021-03-03
JP2024009962A (ja) 2024-01-23
MA46731A (fr) 2020-04-22
AU2019211406B2 (en) 2025-03-06
BR112020015112A2 (pt) 2021-04-06
MX2024006462A (es) 2024-06-11
US20230265216A1 (en) 2023-08-24
US12065506B2 (en) 2024-08-20
AU2019211406C1 (en) 2025-07-17
US20210230303A1 (en) 2021-07-29
PT3638698T (pt) 2021-04-06
ZA202004494B (en) 2022-05-25
AU2025204183A9 (en) 2026-03-19
KR20250133488A (ko) 2025-09-05
CN120290578A (zh) 2025-07-11
MX2020007888A (es) 2020-09-07
CN111936517A (zh) 2020-11-13
LT3638698T (lt) 2021-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12065506B2 (en) Anti-TMPRSS2 antibodies and antigen-binding fragments
EP3889177B1 (en) Anti-sars-cov-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
JP7772702B2 (ja) 抗ｔｍｐｒｓｓ２抗体および抗原結合断片
HK40027684A (en) Anti-tmprss2 antibodies and antigen-binding fragments
HK40027684B (en) Anti-tmprss2 antibodies and antigen-binding fragments
WO2022187626A1 (en) Anti-sars-cov-2-variant-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
HK40096787A (en) Anti-sars-cov-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
HK40054577A (en) Anti-sars-cov-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
HK40054577B (en) Anti-sars-cov-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments