RS61825B1 - Anti-tmprss2 antitela i fragmenti koji vezuju antigen - Google Patents

Anti-tmprss2 antitela i fragmenti koji vezuju antigen

Info

Publication number
RS61825B1
RS61825B1 RS20210571A RSP20210571A RS61825B1 RS 61825 B1 RS61825 B1 RS 61825B1 RS 20210571 A RS20210571 A RS 20210571A RS P20210571 A RSP20210571 A RS P20210571A RS 61825 B1 RS61825 B1 RS 61825B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antigen
tmprss2
cdr
binding protein
seq
Prior art date
Application number
RS20210571A
Other languages
English (en)
Inventor
Lisa Purcell
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS61825B1 publication Critical patent/RS61825B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—RNA viruses
    • C07K16/108—Orthomyxoviridae (F), e.g. influenza virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/283—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Opis
[0001] Ova prijava zahteva prioritet U.S. privremene patentne prijave br. 62/622,292, ponete 26. januara 2018.
OBLAST PRONALASKA
[0002] Prikazani pronalazak se odnosi na antitela i fragmente koji vezuju antigen koji se specifično vezuju za TMPRSS2 i postupke za lečenje ili prevenciju virusnih infekcija sa pomenutim antitelima i fragmentima.
STANJE TEHNIKE PRONALASKA
[0003] Virusi influence su stekli otpornost na lekove koji se trenutno koriste koji ciljaju virusnu neuraminidazu (NA) ili protein jonskih kanala, protein matriksa 2 (M2). Pojava otpornosti na lek ističe potrebu za razvojem novih antivirusnih strategija. Ciljanje ćelija domaćina može da smanji ili izbegne javljanje odbeglih mutanata, ali može da stvori "ponor" zbog široko rasprostranjene ekspresije i poveća zabrinutost za toksičnosti. Veliki broj fuzionih proteina respiratornih virusa je dokazano da zahtevaju cepanje sa proteazom(ama) domaćina radi aktivacije (Shirato et al. Clinical Isolates of Human Coronavirus 229E Bypass the Endosome for Cell Entry. Journal of Virology. 91, e01387-16 (2017); Reinke et al., Different residues in the SARS-CoV spike protein determine cleavage and activation by the host cell protease TMPRSS2. PLoS ONE. 12, e0179177 (2017); Zhou et al., Protease inhibitors targeting coronavirus and filovirus entry. Antiviral Research.116, 76-84 (2015); Zmora et al. TMPRSS2 Isoform 1 Activates Respiratory Viruses and Is Expressed in Viral Target Cells. PLoS ONE.10, e0138380 (2015)), uključujući influencu (Zmora et al., Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS ONE.12, e0176597 (2017); Böttcher-Friebertshäuser et al., Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptideconjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology.85, 1554-1562 (2011); Bertram et al., TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology. 84, 10016-10025 (2010); Tarnow et al., TMPRSS2 is a host factor that is essential for pneumotropism and pathogenicity of H7N9 influenza A virus in mice. Journal of Virology (2014), May;88(9):4744-51).
[0004] Prekusor hemaglutinina A influence (HA0) zahteva cepanje domaćinovom serin proteazom, do HA1 i HA2, za aktivaciju. Na primer, transmembranska proteaza, serin 2; TMPRSS2, TMPRSS4 i TMPRSS11D isto kao i humana proteaza slična tripsinu disajnih puteva (HAT) je umešana u HA cepanje (Bertram et al., TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology.84, 10016-10025 (2010); Bottcher et al., Proteolytic Activation of Influenza Viruses by Serine Proteases TMPRSS2 and HAT from Human Airway Epithelium. Journal of Virology.
2006 Oct;80(19):9896-8; International patent application publication no. WO2017/151453). Takođe, TMPRSS2 je meta za terapiju protiv kancera. Videti npr., WO2008127347 i WO2002004953. Fuzija između TMPRSS2 i ERG (TMPRSS2:ERG) je genska fuzija poznata kao glavni pokretač kancerogeneze prostate koja je pokrenuta sa ERα i potisnuta sa ERβ. Bonkhoff, Estrogen receptor signaling in prostate cancer: Implications for carcinogenesis and tumor progression, Prostate 78(1): 2-10 (2018).
[0005] WO 02/04953 opisuje TMPRSS2 kao potencijalnu terapeutsku metu za izvesne kancere i opisuje stvaranje anti-TMPRSS2 monoklonalnih antitela. US 2013/0273070 opisuje postupke za lečenje ili sprečavanje infekcije virusa influence davanjem inhibitora serin proteaze, kap inhibitora TMPRSS2. De Nardis et al. (2017) The Journal of Biological Chemistry vol. 292(3):912-924 odnosi se na proten 1 u vezi sa LDL receptorom 1 (LRP1) i opisuje rekombinantnu ekspresiju ektodomena pune dužine LRP1. Wilson et al. (2005) Biochem J.388:967-972 odnosi se na aktivaciju PAR-2 u ćelija kancera prostate sa TMPRSS2 i opisuje stvaranje poliklonalnog humanog anti-human TMPRSS2 antitela. Shen et al. (2017) Biochimie 142:1-10 daje prikaz uloge TMPRSS2 kao potencijalne mete za lečenje virusa influence. WO 2008/076379 se odnosi na humana antitela na humani delti sličan ligand 4 i njihove sekvence .
SUŠTINA PRONALASKA
[0006] Mada postoje mali molekuli inhibitori TMPRSS2 i istraživana antitela, korisna, na primer, za imunohistohemiju, postoji potreba u stanju tehnike za neutralisanjem terapeutskih anti-TMPRSS2 antitela i njihovom upotrebom u lečenju ili prevenciji virusne infekcije. Videti npr., Shen et al. Biochimie 142: 1-10 (2017), WO2008127347; WO2002004953; US9498529; antitelo ab92323, dostupno kod Abcam (Cambridge, MA) ili antitela sc-515727 i sc-101847 dostupna kod Santa Cruz Biotech (Dallas, TX). Prikazani opis odnosi se na ovu potrebu, delom, obezbeđivanjem humanih anti-humanih TMPRSS2 antitela, kao što su H1H7017N, i njihovih kombinacija uključujući, na primer, antiinfluenca HA antitela (npr., grupe I HA ili grupe II HA) i postupke za njihovu upotrebu za lečenje virusnih infekcija .
[0007] Određenije, prikazani pronalazak se odnosi na humani protein koji vezuje antigen koji se specifično veže za humani TMPRSS2 i koji je antitelo ili fragment koj se vezuje za antigen i gde protein koji se vezuje za antigen sadrži:
promenjivi region teškog lanca imunoglobulina koji sadrži
(a) CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: G F T F S S Y G (SEQ ID NO: 6),
(b) CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: I W N D G S Y V (SEQ ID NO: 8), i
(c) CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: A R E G E W V L Y Y F D Y (SEQ ID NO: 10); i
promenjivi region lakog lanca imunoglobulina koji sadrži
(a) CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: Q S I S S W (SEQ ID NO: 12),
(b) CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: K A S (SEQ ID NO: 14), i
(c) CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: Q Q Y N S Y S Y T (SEQ ID NO: 16).
[0008] Prikazani pronalazak takođe obezbeđuje kompleks koji sadrži protein koji vezuje antigen prema pronalasku vezan za TMPRSS2 polipeptid.
[0009] Takođe prikazanim pronalaskom je obezbeđen postupak za pripremanje proteina koji vezuje antigen prema pronalasku koji obuhvata:
(a) uvođenje u ćeliju domaćina: (i) polinukleotida koji kodira teški lanac imunoglobulina i laki lanac imunoglobulina pomenutog proteina koji vezuje antigen; ili (ii) polinukleotida koji kodira teški lanac imunoglobulina pomenutog proteina koji vezuje antigen, i polinukleotida koji kodira laki lanac imunoglobulina pomenutog proteina koji vezuje antigen;
(b) kultivisanje ćelije domaćina u uslovima pogodnim za ekspresiju polinukleotida; i
(c) opciono, izolovanje proteina koji vezuje antigen iz ćelije domaćina i/ili medijuma u kome je gajena ćelija domaćina.
[0010] Prikazani pronalazak takođe obezbeđuje polinukleotid koji kodira:
teški lanac imunoglobulina koji sadrži:
(a) CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: G F T F S S Y G (SEQ ID NO: 6),
(b) CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: I W N D G S Y V (SEQ ID NO: 8), i
(c) CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: A R E G E W V L Y Y F D Y (SEQ ID NO: 10); i
laki lanac imunoglobulina koji sadrži:
(a) CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: Q S I S S W (SEQ ID NO: 12),
(b) CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: K A S (SEQ ID NO: 14), i
(c) CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: Q Q Y N S Y S Y T (SEQ ID NO: 16).
[0011] Takođe prikazanim pronalaskom je obezbeđen: vektor koji sadrži polinukleotid prema pronalasku; ćelija domaćina koja sadrži protein koji vezuje antigen prema pronalasku, polinukleotid prema pronalasku, ili vektor prema pronalasku; kompozicija ili kit koji sadrži protein koji vezuje antigen prema pronalasku i drugo terapeutsko sredstvo gde kit sadrži protein koji vezuje antigen i drugo terapeutsko sredstvo formulisano kao jedna kompozicija ili odvojeno u dve ili više kompozicija; farmaceutska kompozicija koja sadrži protein koji vezuje antigen prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač i, opciono, drugo terapeutsko sredstvo; i sud ili injekcioni uređaj koji obuhvata protein koji vezuje antigen prema pronalasku ili kompoziciju prema pronalasku (npr. farmaceutsku kompoziciju prema pronalasku).
[0012] Pronalazak takođe obezbeđuje protein koji vezuje antigen prema pronalasku za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije infekcije sa virusom influence kod subjekta kome je to potrebno, koji obuhvata davanje terapeutski efikasne količine pomenutog proteina koji vezuje antigen.
[0013] Takođe je opisan neutralizujući humani protein koji vezuje antigen koji se specifično vezuje za humani TMPRSS2, na primer, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen. U jednom aspektu opisa, protein koji vezuje antigen obuhvata: (a) promenjivi region lakog lanca imunoglobulina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je bar 90% identična sa aminokiselinskom sekvencom datom u SEQ ID NO: 4 ili 18; i/ili (b) promenjivi region teškog lanca imunoglobulina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je bar 90% identična sa aminokiselinskom sekvencom datom u SEQ ID NO: 2, 17 ili 19. Kada je protein koji vezuje antigen protein koji vezuje antigen prema pronalasku, protein koji vezuje antigen je dat u patentim zahtevima i prema tome sadrži promenjivi region teškog lanca imunoglobulina koji sadrži (a) CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: G F T F S S Y G (SEQ ID NO: 6); (b) CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: I W N D G S Y V (SEQ ID NO: 8); (c) CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: A R E G E W V L Y Y F D Y (SEQ ID NO: 10); i promenjivi region lakog lanca imunoglobulina koji sadrži (a) CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: Q S I S S W (SEQ ID NO: 12); (b) CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: K A S (SEQ ID NO: 14); i/ili (c) CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: Q Q Y N S Y S Y T (SEQ ID NO: 16). U izvođenju proteina koji vezuje antigen prema pronalasku, protein koji vezuje antigen sadrži: (a) teški lanac imunoglobulina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 17 ili 19; i/ili (b) laki lanac imunoglobulina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 18.
[0014] Takođe je opisan bilo koji anti-TMPRSS2 protein koji vezuje antigen koji se takmiči sa bilo kojim proteinom koji vezuje antigen koji je prikazan ovde za vezivanje za TMPRSS2 (npr., kako je utvrđeno korišćenjem testa interferometrije biosloja bez obeleživača u realnom vremenu, npr., na Octet RED384 biosenzoru (Pall ForteBio Corp.)); ili koji se vezuje za isti ili preklapajući epitop naTMPRSS2 (ili njegov fragment) kao bilo koji protein koji vezuje antigen koji je ovde prikazan.
[0015] Prikazani opis takođe obezbeđuje višestruko specifične proteine koji vezuju antigene koji se vezuju za TMPRSS2 i drugi antigen ili za TMPRSS2 na različitim epitopima. Na primer, višestrukospecifični molekul sadrži (a) prvi domen za vezivanje antigena koji se specifčno veže za TMPRSS2; i (b) drugi domen koji vezuje antigen koji se specifčno veže za drugi antigen ili za TMPRSS2 ili za epitop koji se razlikuje od onog prvog domena za vezivanje antigena . U jednom izvođenju prema pronalasku, protein koji vezuje antigen prema pronalasku je višestruko specifičan.
[0016] Prikazani opis takođe obezbeđuje bilo koji anti-TMPRSS2 protein koji vezuje antigen (npr., antitelo ili fragment koji vezuje antigen, npr., sadrži sekvencu koja je ovde prikazana ) koji obuhvata jednu ili više sledećih osobina:
• Inhibira rast virusa influence (npr., A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1)) u ćeliji koja eksprimuje TMPRSS2 (npr., Calu-3 cells);
• Vezuje se za površinu ćelija koje eksprimuju TMPRSS- (npr., MDCK/Tet-on), npr., sa EC50vrednošću od 440 pM ili 1.06 nM;
• Ne vezuje se značajno za MDCK/Tet-on ćelije koje ne eksprimuju TMPRSS2;
• Vezuje se za humani TMPRSS2 sa KDod oko 2.81 X 10<-9>M na oko 25°C;
• Vezuje se za humani TMPRSS2 sa KDod oko 9.31 X 10<-9>M na oko 37°C;
• Vezuje se za cinomolguls TMPRSS2 sa KDod oko 5.60 X 10<-8>M na oko 25°C;
• Vezuje se za cinomolguls TMPRSS2 sa KDod oko 1.40 X 10<-7>M na oko 37°C;
• Ograničava raznošenje infekcije virusa influence ćelija in vitro; i/ili
• Štiti genetski modifikovanog miša konstrusanog da eksprimuje humani TMPRSS2 protein od smrti izazvane infekcijom virusa grupa.
[0017] Prikazani opis takođe obezbeđuje kompleks koji sadrži bilo koji protein koji vezuje antigen koji je ovde prikazan da se vezuje za TMPRSS2 polipeptid, npr., in vitro ili u telu subjekta.
[0018] Prikazani opis takođe obezbeđuje postupak pripremanja anti-TMPRSS2 proteina koji vezuje antigen koji je ovde prikazan (npr., H1H7017N) ili njihov imunoglobulinski lanac koji sadrži: (a) uvođenje jednog ili više polinukleotida koji kodira lak i/ili teški lanac imunoglobulina pomenutog proteina koji vezuje antigen; (b) kultivisanje ćelije domaćina (npr., CHO ćelije, Pichia ćelije ili Pichia pastoris ćelije) u uslovima pogodnim za ekspresiju polinukleotida; i (c) opciono, izolovanje proteina koji vezuje antigen ili imunoglobulinskog lanca iz ćelije domaćina i/ili medijuma u kome je gajena ćelija domaćina. Protein koji vezuje antigen ili imunoglobulinski lanac koji je proizvod takvog postupaka je deo prikazanog opisa.
[0019] Prikazani opis takođe obezbeđuje polinukleotid (npr., DNK ili RNK) koji kodira polipeptid prema prikazanom opisu. U jednom aspektu opisa, polinukleotid kodira dva različita imunoglobulinska lanca (npr., teški i laki). U jednom aspektu opisa, jedan polinukleotid kodira laki lanac imunoglobulina i drugi polinukleotid kodira teški lanac imunoglobulina, npr., gde su lanci u ćelijama domaćina ili su u sudu. Na primer, polinukleotid je vektor (npr., a plazmid) i/ili je integrisan u hromozom u ćeliju domaćina. Polinukleotid prema pronalasku je prikazan u patentnim zahtevima.
[0020] Ćelije domaćina (npr., CHO ćelija, Pichia ćelija ili Pichia pastoris ćelija) iz prikazanog opisa mogu uključivati antiTMPRSS2 protein koji vezuje antigen (npr., H1H7017N), njegov polipeptid ili polinukleotid koji kodira takav polipeptid i/ili vektor koji sadrži takav polinukleotid.
[0021] Prikazani opis takođe obezbeđuje kompoziciju ili kit koji sadrži anti-TMPRSS2 protein koji vezuje antigen koji je ovde dat (npr., H1H7017N) zajedno sa drugim terapeutskim sredstvom (npr., antiviralnim lekom i/ili vakcinom). Određenije, u prikazanom pronalasku je obezbeđena kompozicija ili kit koji sadrži protein koji vezuje antigen i drugo terapeutsko sredstvo formulisano kao pojedinačna kompozicija ili podeljena u dve ili više kompozicija. Na primer, kompozicija može biti farmaceutska kompozicija koja sadrži protein koji vezuje antigen i farmaceutski prihvatljiv nosač i, opciono, drugo terapeutsko sredstvo; gde farmaceutska kompozicija je farmaceutska kompozicija prema pronalasku, protein koji vezuje antigen je protein koji vezuje antigen dat u patentnim zahtevima. Drugo terapeutsko sredstvo može biti ledipasvir, sofosbuvir, kombinacija ledipasvira i sofosbuvira, oseltamivir, zanamivir, ribavirin i interferon-alfa2b, interferon-alfa2a i/ili antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se specifično veže za influencu HA. Druga terapeutska sredstva mogu biti antitielo ili njegov fragment koji vezuje antigen izabran iz grupe koju čine H1H14611N2; H1H14612N2; H1H11723P; H1H11729P; H1H11820N; H1H11829N; H1H11829N2; H2aM11829N; H2M11830N; H1H11830N2; H1H11903N; H1H14571N; H2a14571N ; H1H11704P; H1H11711P; H1H11714P; H1H11717P; H1H11724P; H1H11727P; H1H11730P2; H1H11731P2; H1H11734P2; H1H11736P2; H1H11742P2; H1H11744P2; H1H11745P2; H1H11747P2; H1H11748P2; H1H17952B; H1H17953B; H1H17954B; H1H17955B; H1H17956B; H1H17957B; H1H17958B; H1H17959B; H1H17960B; H1H17961B; H1H17962B; H1H17963B; H1H17964B; H1H17965B; H1H17966B; H1H17967B; H1H17968B; H1H17969B; H1H17970B; H1H17971B; H1H17972B; H1H17973B; H1H17974B; H1H17975B; H1H17976B; H1H17977B; H1H17978B; H1H17979B; H1H17980B; H1H17981B; H1H17982B; H1H17983B; H1H17984B; H1H17985B; H1H17986B; H1H17987B; H1H17988B; H1H17989B; H1H17990B; H1H17991B; H1H17992B; H1H17993B; H1H17994B; H1H17995B; H1H17996B; H1H17997B; H1H17998B; H1H17999B; H1H18000B; H1H18001B; H1H18002B; H1H18003B; H1H18004B; H1H18005B; H1H18006B; H1H18007B; H1H18008B; H1H18009B; H1H18010B; H1H18011B; H1H18012B; H1H18013B; H1H18014B; H1H18015B; H1H18016B; H1H18017B; H1H18018B; H1H18019B; H1H18020B; H1H18021B; H1H18022B; H1H18023B; H1H18024B; H1H18025B; H1H18026B; H1H18027B; H1H18028B; H1H18029B; H1H18030B; H1H18031B; H1H18032B; H1H18033B; H1H18034B; H1H18035B; H1H18037B; H1H18038B; H1H18039B; H1H18040B; H1H18041B; H1H18042B; H1H18043B; H1H18044B; H1H18045B; H1H18046B; H1H18047B; H1H18048B; H1H18049B; H1H18051B; H1H18052B; H1H18053B; H1H18054B; H1H18055B; H1H18056B; H1H18057B; H1H18058B; H1H18059B; H1H18060B; H1H18061B; H1H18062B; H1H18063B; H1H18064B; H1H18065B; H1H18066B; H1H18067B; H1H18068B; H1H18069B; H1H18070B; H1H18071B; H1H18072B; H1H18073B; H1H18074B; H1H18075B; H1H18076B; H1H18077B; H1H18078B; H1H18079B; H1H18080B; H1H18081B; H1H18082B; H1H18083B; H1H18084B; H1H18085B; H1H18086B; H1H18087B; H1H18088B; H1H18089B; H1H18090B; H1H18091B; H1H18092B; H1H18093B; H1H18094B; H1H18095B; H1H18096B; H1H18097B; H1H18098B; H1H18099B; H1H18100B; H1H18101B; H1H18102B; H1H18103B; H1H18104B; H1H18105B; H1H18107B; H1H18108B; H1H18109B; H1H18110B; H1H18111B; H1H18112B; H1H18113B; H1H18114B; H1H18115B; H1H18116B; H1H18117B; H1H18118B; H1H18119B; H1H18120B; H1H18121B; H1H18122B; H1H18123B; H1H18124B; H1H18125B; H1H18126B; H1H18127B; H1H18128B; H1H18129B; H1H18130B; H1H18131B; H1H18132B; H1H18133B; H1H18134B; H1H18135B; H1H18136B; H1H18137B; H1H18138B; H1H18139B; H1H18140B; H1H18141B; H1H18142B; H1H18143B; H1H18144B; H1H18145B; H1H18146B; H1H18147B; H1H18148B; H1H18149B; H1H18150B; H1H18151B; H1H18152B; H1H18153B; H1H18154B; H1H18155B; H1H18156B; H1H18157B; H1H18158B; H1H18159B; H1H18160B; H1H18161B; H1H18162B; H1H18163B; H1H18164B; H1H18165B; H1H18166B; H1H18167B; H1H18168B; H1H18169B; H1H18170B; H1H18171B; H1H18172B; H1H18173B; H1H18174B; H1H18175B; H1H18176B; H1H18177B; H1H18178B; H1H18179B; H1H18180B; H1H18181B; H1H18182B; H1H18183B; H1H18184B; H1H18185B; H1H18186B; H1H18187B; H1H18188B; H1H18189B; H1H18190B; H1H18191B; H1H18192B; H1H18193B; H1H18194B; H1H18195B; H1H18196B; H1H18197B; H1H18198B; H1H18199B; H1H18200B; H1H18201B; H1H18202B; H1H18203B; H1H18204B; H1H18205B; H1H18206B; H1H18207B; H1H18208B; H1H18209B; H1H18210B; H1H18211B; H1H18212B; H1H18213B; H1H18214B; H1H18216B; H1H18217B; H1H18218B; H1H18219B; H1H18220B; H1H18221B; H1H18222B; H1H18223B; H1H18224B; H1H18225B; H1H18226B; H1H18227B; H1H18228B; H1H18229B; H1H18230B; H1H18231B; H1H18232B; H1H18233B; H1H18234B; H1H18235B; H1H18236B; H1H18237B; H1H18238B; H1H18239B; H1H18240B; H1H18241B; H1H18242B; H1H18243B; H1H18244B; H1H18245B; H1H18246B; H1H18247B; H1H18248B; H1H18249B; H1H18250B; H1H18251B; H1H18252B; H1H18253B; H1H18254B; H1H18255B; H1H18256B; H1H18257B; H1H18258B; H1H18259B; H1H18261B; H1H18262B; H1H18263B; H1H18264B; H1H18265B; H1H18266B; H1H18267B; H1H18268B; H1H18269B; H1H18270B; H1H18271B; H1H18272B; H1H18274B; H1H18275B; H1H18276B; H1H18277B; H1H18278B; H1H18279B; H1H18280B; H1H18281B; H1H18282B; H1H18283B; H1H18284B; H1H18285B; H1H18286B; H1H18287B; H1H18288B; H1H18289B; H1H18290B; H1H18291B; H1H18292B; H1H18293B; H1H18294B; H1H18295B; H1H18297B; H1H18298B; H1H18299B; H1H18300B; H1H18301B; H1H18302B; H1H18303B; H1H18304B; H1H18305B; H1H18306B; H1H18307B; H1H18308B; H1H18309B; H1H18310B; H1H18311B; H1H18312B; H1H18313B; H1H18314B; H1H18315B; H1H18316B; H1H18317B; H1H18318B; H1H18319B; H1H18320B; H1H18321B; H1H18322B; H1H18323B; H1H18324B; H1H18325B; H1H18326B; H1H18327B; H1H18328B; H1H18329B; H1H18330B; H1H18331B; H1H18332B; H1H18333B; H1H18334B; and H1H18335B.
[0022] U jednom aspektu opisa, drugo terapeutsko sredstvo koje je obezbeđeno zajedno sa anti-TMPRSS2 proteinom koji vezuje antigen je antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji se veže za HA protein influence grupe II, kao što je H1H14611N2; ili antitelo ili fragment koji sadrži VHi VLiz H1H14611N2; ili teški lanac imunoglobulina koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 iz H1H14611N2 (npr., SEQ ID NOs: 25-27) i laki lanac imunoglobulina koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 iz H1H14611N2 (npr., SEQ ID NOs: 29-31).
[0023] U jednom aspektu opisa, drugo terapeutsko sredstvo koje je obezbeđeno zajedno sa anti-TMPRSS2 proteinom koji vezuje antigen je antitelo ili fragment koji vezuje antigen koje se vezuje za HA protein influence grupe II, kao što je H1H14612N2; ili antitelo ili fragment koji sadrži VHi VLiz H1H14612N2; ili teški lanac imunoglobulina koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 CDR-H3 iz H1H14612N2 (npr., SEQ ID NOs: 41-43) i laki lanac imunoglobulina koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 iz H1H14612N2 (npr., SEQ ID NOs: 45-47).
[0024] U jednom aspektu opisa, drugo terapeutsko sredstvo koje je obezbeđeno zajedno sa anti-TMPRSS2 proteinom koji vezuje antigen je antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji se vezuje za protein HA grupe I , kao što je H1H11729P; ili antitelo ili fragment koji sadrži VHi VLiz H1H11729P; ili teški lanac imunoglobulina koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 iz H1H11729P (npr., SEQ ID NOs: 33-35) i laki lanac imunoglobulina koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 iz H1H11729P (npr., SEQ ID NOs: 37-39).
[0025] Prikazani opis takođe obezbeđuje sud ili injekcioni uređaj koji sadrži i anti-TMPRSS2 protein koji vezuje antigen (npr., H1H7017N) ili njegovu kompoziciju (npr., farmaceutsku kompoziciju).
[0026] Prikazani opis takođe obezbeđuje postupak lečenja ili prevencije virusne infekcije koja je drugačija od infekcije virusom influence ili sprečava virusnu infekciju koja je drugačija od infekcije virusa influence, kod subjekta (npr., čoveka) kome je to potrebno, koji obuhvata davanje terapeutski efikasne količine anti-TMPRSS2 proteina koji vezuje antigen koji je ovde dat (npr., H1H7017N).
[0027] Prikazani opis takođe obezbeđuje postupak za lečenje ili prevenciju kancera (npr., kancera prostate) ili infekciju, npr., virusnu infekciju, npr., infekciju sa virusom influence, koronavirusom, SARS-Co virusom, MERS-Co virusom, virusom parainfluenze, human metapneumovirusom ili virusom hepatitisa C (HCV), kod subjekta (npr., čoveka) kome je to potrebno, obuhvata davanje terapeutski efikasne količine anti-TMPRSS2 proteina koji vezuje antigen koji je ovde izložen (npr., H1H7017N). Na primer, protein koji vezuje antigen je davan zajedno sa jednim ili više drugih terapeutskih sredstava (npr., anti-virusni lek i/ili vakcins). U jednom aspektu opisa, drugo terapeutsko sredstvo je član izabran iz grupe koju čine: ledipasvir, sofosbuvir, kombinacija ledipasvir i sofosbuvir, oseltamivir, zanamivir, ribavirin i interferon-alfa2b, interferon-alfa2a i antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se specifično veže za influenzu HA. U jednom aspektu opisa, drugo terapeutsko sredstvo je antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen izabran iz grupe koju čine H1H14611N2; H1H14612N2; H1H11723P; H1H11729P; H1H11820N; H1H11829N; H1H11829N2; H2aM11829N; H2M11830N; H1H11830N2; H1H11903N; H1H14571N; H2a14571N ; H1H11704P; H1H11711P; H1H11714P; H1H11717P; H1H11724P; H1H11727P; H1H11730P2; H1H11731P2; H1H11734P2; H1H11736P2; H1H11742P2; H1H11744P2; H1H11745P2; H1H11747P2; H1H11748P2; H1H17952B; H1H17953B; H1H17954B; H1H17955B; H1H17956B; H1H17957B; H1H17958B; H1H17959B; H1H17960B; H1H17961B; H1H17962B; H1H17963B; H1H17964B; H1H17965B; H1H17966B; H1H17967B; H1H17968B; H1H17969B; H1H17970B; H1H17971B; H1H17972B; H1H17973B; H1H17974B; H1H17975B; H1H17976B; H1H17977B; H1H17978B; H1H17979B; H1H17980B; H1H17981B; H1H17982B; H1H17983B; H1H17984B; H1H17985B; H1H17986B; H1H17987B; H1H17988B; H1H17989B; H1H17990B; H1H17991B; H1H17992B; H1H17993B; H1H17994B; H1H17995B; H1H17996B; H1H17997B; H1H17998B; H1H17999B; H1H18000B; H1H18001B; H1H18002B; H1H18003B; H1H18004B; H1H18005B; H1H18006B; H1H18007B; H1H18008B; H1H18009B; H1H18010B; H1H18011B; H1H18012B; H1H18013B; H1H18014B; H1H18015B; H1H18016B; H1H18017B; H1H18018B; H1H18019B; H1H18020B; H1H18021B; H1H18022B; H1H18023B; H1H18024B; H1H18025B; H1H18026B; H1H18027B; H1H18028B; H1H18029B; H1H18030B; H1H18031B; H1H18032B; H1H18033B; H1H18034B; H1H18035B; H1H18037B; H1H18038B; H1H18039B; H1H18040B; H1H18041B; H1H18042B; H1H18043B; H1H18044B; H1H18045B; H1H18046B; H1H18047B; H1H18048B; H1H18049B; H1H18051B; H1H18052B; H1H18053B; H1H18054B; H1H18055B; H1H18056B; H1H18057B; H1H18058B; H1H18059B; H1H18060B; H1H18061B; H1H18062B; H1H18063B; H1H18064B; H1H18065B; H1H18066B; H1H18067B; H1H18068B; H1H18069B; H1H18070B; H1H18071B; H1H18072B; H1H18073B; H1H18074B; H1H18075B; H1H18076B; H1H18077B; H1H18078B; H1H18079B; H1H18080B; H1H18081B; H1H18082B; H1H18083B; H1H18084B; H1H18085B; H1H18086B; H1H18087B; H1H18088B; H1H18089B; H1H18090B; H1H18091B; H1H18092B; H1H18093B; H1H18094B; H1H18095B; H1H18096B; H1H18097B; H1H18098B; H1H18099B; H1H18100B; H1H18101B; H1H18102B; H1H18103B; H1H18104B; H1H18105B; H1H18107B; H1H18108B; H1H18109B; H1H18110B; H1H18111B; H1H18112B; H1H18113B; H1H18114B; H1H18115B; H1H18116B; H1H18117B; H1H18118B; H1H18119B; H1H18120B; H1H18121B; H1H18122B; H1H18123B; H1H18124B; H1H18125B; H1H18126B; H1H18127B; H1H18128B; H1H18129B; H1H18130B; H1H18131B; H1H18132B; H1H18133B; H1H18134B; H1H18135B; H1H18136B; H1H18137B; H1H18138B; H1H18139B; H1H18140B; H1H18141B; H1H18142B; H1H18143B; H1H18144B; H1H18145B; H1H18146B; H1H18147B; H1H18148B; H1H18149B; H1H18150B; H1H18151B; H1H18152B; H1H18153B; H1H18154B; H1H18155B; H1H18156B; H1H18157B; H1H18158B; H1H18159B; H1H18160B; H1H18161B; H1H18162B; H1H18163B; H1H18164B; H1H18165B; H1H18166B; H1H18167B; H1H18168B; H1H18169B; H1H18170B; H1H18171B; H1H18172B; H1H18173B; H1H18174B; H1H18175B; H1H18176B; H1H18177B; H1H18178B; H1H18179B; H1H18180B; H1H18181B; H1H18182B; H1H18183B; H1H18184B; H1H18185B; H1H18186B; H1H18187B; H1H18188B; H1H18189B; H1H18190B; H1H18191B; H1H18192B; H1H18193B; H1H18194B; H1H18195B; H1H18196B; H1H18197B; H1H18198B; H1H18199B; H1H18200B; H1H18201B; H1H18202B; H1H18203B; H1H18204B; H1H18205B; H1H18206B; H1H18207B; H1H18208B; H1H18209B; H1H18210B; H1H18211B; H1H18212B; H1H18213B; H1H18214B; H1H18216B; H1H18217B; H1H18218B; H1H18219B; H1H18220B; H1H18221B; H1H18222B; H1H18223B; H1H18224B; H1H18225B; H1H18226B; H1H18227B; H1H18228B; H1H18229B; H1H18230B; H1H18231B; H1H18232B; H1H18233B; H1H18234B; H1H18235B; H1H18236B; H1H18237B; H1H18238B; H1H18239B; H1H18240B; H1H18241B; H1H18242B; H1H18243B; H1H18244B; H1H18245B; H1H18246B; H1H18247B; H1H18248B; H1H18249B; H1H18250B; H1H18251B; H1H18252B; H1H18253B; H1H18254B; H1H18255B; H1H18256B; H1H18257B; H1H18258B; H1H18259B; H1H18261B; H1H18262B; H1H18263B; H1H18264B; H1H18265B; H1H18266B; H1H18267B; H1H18268B; H1H18269B; H1H18270B; H1H18271B; H1H18272B; H1H18274B; H1H18275B; H1H18276B; H1H18277B; H1H18278B; H1H18279B; H1H18280B; H1H18281B; H1H18282B; H1H18283B; H1H18284B; H1H18285B; H1H18286B; H1H18287B; H1H18288B; H1H18289B; H1H18290B; H1H18291B; H1H18292B; H1H18293B; H1H18294B; H1H18295B; H1H18297B; H1H18298B; H1H18299B; H1H18300B; H1H18301B; H1H18302B; H1H18303B; H1H18304B; H1H18305B; H1H18306B; H1H18307B; H1H18308B; H1H18309B; H1H18310B; H1H18311B; H1H18312B; H1H18313B; H1H18314B; H1H18315B; H1H18316B; H1H18317B; H1H18318B; H1H18319B; H1H18320B; H1H18321B; H1H18322B; H1H18323B; H1H18324B; H1H18325B; H1H18326B; H1H18327B; H1H18328B; H1H18329B; H1H18330B; H1H18331B; H1H18332B; H1H18333B; H1H18334B; i H1H18335B.
[0028] Prikazani opis takođe obezbeđuje postupak za davanje anti-TMRPSS2 proteina koji vezuje antigen (npr., H1H7017N) prikazan ovde u telo subjekta (npr., čoveka) i obuhvata parenteralno injektovanje proteina koji vezuje antigen u telo subjekta (npr., subkutanozno, intravenski ili intramuskularno).
KRATAK OPIS SLIKA NACRTA
[0029]
Slika 1 (A-B). Napredovanje virusa A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1)-GFP koji se šire u različitim ćelijskim lininijama sa početnim višestrukim infekcijama 0.01 (A) ili 0.001 (B) u odsustvu egzogenog tripsina. Calu3 (krug), A549 (kvadrat), MDCK (trougao) i HepG2 (obrnuti trougao) ćelije.
Slika 2. Primena H1H7017N tokom infekcionog ciklusa smanjuje broj fluorescentnih fokusnih jedinica (FFU) A / Portoriko / 08/1934 (H1N1) 72 sata nakon infekcije u poređenju sa izotipskim kontrolnim antitelom, bez antitela, anti-HA antitelom i neinficiranim kontrolama.
Slika 3 (A-B). Anti-TMPRSS2, H1H7017N, vezuje se za TMPRSS2 humani i cinomolgni majmuna eksprimiran na ćelijama. (A) H1H7017N, vezan za MDCK / Tet-on / hTMPRSS2 i MDCK / Tet-on / mfTMPRSS2 sa vrednostima EC50 od 460 pM i 1,06 nM, i nije pokazivao značajno vezivanje za MDCK / Tet-na ćelijama. (B) Kontrolno mAb1, irelevantno izotipsko kontrolno antitelo izotipa, nije pokazalo vezivanje za bilo koje testirane ćelijske linije.
Slika 4. Kriva preživljavanja genetski modifikovanog miša da eksprimuje humani protein TMPRSS2 tretiran sa 5 mg / kg H1H7017N na dan -1 PI (obrnuti trougao, isprekidana linija) ili dan 0 PI (krug, puna linija) koji pokazuje zaštitu od H1N1 u profilaktičkom modelu . Miševi tretirani kontrolom izotipa H1H1238N (trougao, puna linija) nisu pokazali zaštitu.
Slika 5. Kriva preživljavanja genetski modifikovanog miša da eksprimuje humani protein TMPRSS2 zaražen H1N1, tretiran sa 10 mg / kg H1H7017N koji demonstrira zaštitu. Miševi su tretirani 0. dan (dijamant, isprekidana linija), 1. dan (krug, puna linija), 2. dan (obrnuti trougao, puna linija) ili 3. dan PI (kvadrat, isprekidana linija). Kontrola izotipa H1H1238N (trougao, puna linija) imala je delimičnu zaštitu sa stopom preživljavanja od 25%.
Slika 6. Kriva preživljavanja hTPMRSS2 miševa tretiranih sa 10 mg / kg H1H7017N prvog dana PI (trougao) ili drugog dana PI (krug) koji pokazuju zaštitu od H3N2. Netretirani miševi (kvadrat) nisu pokazali zaštitu.
Slika 7 (A-B). Kriva preživljavanja miševa divljeg tipa (A) ili miševa stvorenih da izraze humani protein TMPRSS2 (B) zaražen sa 150 PFU (trougao), 750 PFU (kvadrat) ili 1.500 PFU (krug) A / Portoriko / 08 / 1934 (H1N1). Miševi su mereni svakodnevno do 14. dana PI.
Slika 8. Kriva preživljavanja genetski modifikovanog miša da eksprimuje humani protein TMPRSS2 zaražen A / Aichi / 2/68 (HA, NA) k A / PR / 8/34 (H3N2) dana 0 i tretiran kombinacijom od 2,5 mg / kg svakim od H1H7017N i H1H14611N2 (dijamant), 10 mg / kg H1H7017N (trougao), 10 mg / kg H1H14611N2 (kvadrat), 5 mg / kg od H1H7017N i H1H14611N2, ili 10 mg / kg hlgG1 kontrolom izotipa (krug). Miševi su mereni svakodnevno do 14. dana PI.
1
Slika 9. Kriva preživljavanja genetski modifikovanog miša da izrazi humani protein TMPRSS2 zaražen A / Portoriko / 08/1934 (H1N1) prvog dana PI i tretiran kombinacijom od 1 mg / kg H1H7017N i 2 mg / kg H1H11729P (krug ), Po 2,5 mg / kg H1H7017N i H1H11729P (obrnuti trougao), 5 mg / kg H1H11729P (dijamant), 5 mg / kg H1H7017N (kvadrat) ili 5 mg / kg hlgG1 izotipske kontrole (trougao). Miševi su mereni svakodnevno do 14. dana PI.
DETALJNI OPIS PREMA PRONALASKU
[0030] Pre opisivanja prikazanih postupka, treba znati da pronalazak nije ogrnaičen na određene postupke, i opisana eksperimentalna stanja, jer takvi postupci i stanja mogu varirati. Takođe se razume da je ovde korišćena terminologija samo za svrhe opisivanja određenih izvođenja i nije namera da su ograničeni, jer obim prikazanog pronalaska će biti ograničen samo na priložene zahteve.
[0031] Osim ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izazi koji su ovde korišćeni imaju uobičajena značenja koje se podrazumevu osobi iz struke iz oblasti iz koje je pronalazak. Mada bilo koji postupci i materijali slični ili ekvivalenti onima ovde opisanim mogu biti korišćeni u primeni ili testiranju prikazanog pronalaska, sada su opisani poželjni postupci i materijali.
[0032] Izraz "hemaglutinin influence", koji se takođe naziva " HA influence" je trimerni glikoprotein nađen na površini virona influence, koji posreduje u virusnom vezivanju (preko HA1 vezivanja za α-2,3-i α-2,6-sijalinske kiseline) i ulasku (preko konformacionoh promena) u ćelije domaćina. HA se sastoji od dva strukturna domena: globularnog domena glave koji sadrži mesto vezivanja receptora (podložno visokoj frekvenci mutacija antigena) i regiona drške (konzervativnog u različitim sojevima virusa influence). Influenca HA je sintetizovana kao prekursor (HA0) koji podleže proteolitičkoj obradi da bi se dobile dve podjedinice (HA1 i HA2) koje se međusobno povezuju jedna sa drugom da bi se obrazovali strukturu drške/globularne glave. Virusni HA je najpromenjiviji antigen na virusu i drške (HA2) je visoko konzervativan u svakoj grupi.
[0033] Izraz "neuraminidaza influence", koja se zove takođe " NA influence" je egzosijalidaza (EC 3.2.1.18) koja seče α-ketozidne veze između sijalinske (N-acetilneuraminske) kiseline i susednih ostataka šećera.
[0034] Aminokiselinska sekvenca HA influence pune dužine je prikazana pomoću aminokiselinske sekvence izolata inflence H1N1 A/California/04/2009 obezbeđenog u GenBank pod pristupnim brojem FJ966082.1. Izraz "influenca-HA" takođe obuhvata proteinske varijante HA influence izolovane iz različitihizolata influence, npr., GQ149237.1, NC_002017, KM972981.1, itd. Izraz "HA- influence" takođe uključuje rekombinantnu HA influence ili njegov fragment. Izraz takođe obuhvata HA influence ili njegov fragment kuplovan za, na primer, histidinski obeleživač, mišji ili humani Fc, ili signalnu sekvencu.
[0035] Anti-TMPRSS2 "protein koji vezuje antigen" je polipeptid ili kompleks više od jednog polipeptida (npr., tetramerno IgG antitelo) koje se specifčno veže za TMPRSS2 polipeptid, na primer, anti-TMPRSS2 antitelo ili fragment koji vezuje antigen bilo monospecifični ili višespecifični.
TMPRSS2
[0036] TMPRSS2 (Transmembranska proteaza serin 2) je protein, smešten na humanom hromozomu 21, koji pripada familiji serin proteaze (tipa II transmembranske serin proteaze (TTSPs)) koji je važan za infektivnost virusa influence. TMPRSS2 je pokazano da posreduje u cepanju virusa influence HA0 do HA1 i HA2.
[0037] Humani TMPRSS2 gen kodira predviđeni protein 492 aminokiselina koji se usidren za plazminu membranu. Protein se konvertuje u njegov zreli oblik preko autokatalitičkog cepanja između Arg255 i Ile256. Posle, zrele proteaze su uglavnom vezane za membranu, ipak njihov deo može biti oslobođen u intracelularnu sredinu.
[0038] U izvođenju prema pronalasku, humani TMPRSS2 (V160M) sadrži aminokiselinsku sekvencu:
(SEQ ID NO: 22; metionin 160 masnim slovima). U izvođenju prema pronalasku, TMPRSS2 polipeptid ne sadrži V160M mutaciju. Videti takođe NM_005656.3.
[0039] U jenom slučaju, Macaca mulatta TMPRSS2 (S129L, N251S, I415V, R431Q, D492G) sadrži aminokiselinsku sekvencu:
(SEQ ID NO: 23). U drugom slučaju, TMPRSS2 polipeptid ne sadrži S129L, N251S, I415V, R431Q i/ili D492G mutaciju.
[0040] U jednom slučaju, Mus musculus TMPRSS2 mRNK sadrži nukleotidnu sekvencu prikazanu u NM_015775.2.
Virusi
[0041] Prikazani opis obuhvata postupke lečenja ili prevencije virusnih infekcija kod subjekta. Izraz "virus" obuhvata bilo koji virus čija infekcija u telu subjekta se leči ili je sprečena davanjem anti-TMPRSS2 antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen (npr., gde je infektivnost virusa bar delom zavisi od TMPRSS2). U jednom aspektu opisa, "virus" je virus koji je eksprimuje HA0 ili drugi supstrat TMPRSS2 čije je proteolitičko cepanje potrebno za potpunu infektivnost virusa protiv ćelije domaćina. Izraz "virus" takođe obuhvata TMPRSS2-zavisan respiratorni virus koji je virus koji inficira respiratorno tkivo subjekta (npr., gornjeg i/ili donjeg respiratornog trakta, traheja, bronhija, pluća) i može se tretirati ili sprečiti davanjem anti-TMPRSS2. Na primer, u jednom aspektu opisa, virus obuhvata virus influence, koronavirus, SARS-Co virus (ozbiljni akutni respiratorni koronavirusa), MERS-Co virus (bliskoistočni respiratorni sindromi (MERS) CoV), virus parainfluence, sendai virus (SeV), humani metapneumovirus i/ili virus hepatitisa C (HCV). "Virusna infekcija" odnosi se na invaziju i umnožavanje virusa u telu subjekta. Prikazani opis obuhvata aspekte uz uslov da "virus" isključuje virus influence, npr., gde virusna infekcija isključuje infekcije virusa influence.
[0042] Postoje dva roda humanog virusa parainfluence (HPIV), respirovirusa (HPIV-1 i HPIV-3) i rubulavirusa (HPIV-2 i HPIV-4). Oba roda (paramiksovirusa) mogu biti odvojeni morfološki od virusa influence.
[0043] Sendai virus, takođe poznat kao mišji virus parainfluence, je tipična vrsta u rodu repirovirusa, koja takođe sadrži vrste humanog virusa 3 parainfluenze, goveđeg virusa 3 parainfluence, i humanog virus 1 parainfluence. TMPRSS2 je aktivirajuća proteaza za respiratorne viruse parainfluence kao što su virusi parainfluence i Sendai virus (SeV). Videti et al. Abe et al., J. Virol.87(21): 11930-11935 (2013).
[0044] Human metapneumovirus (HMPV) je kalsifikovan kao prvi humani član roda Metapneumovirus genus u Pneumovirinae podfamiliji u okviru Paramyxoviridae familije. On je negativno usmereni jednolančani RNK virus sa omotačem. RNK genom obuhvata 8 gena koji kodiraju 9 različitih proteina. HMPV je identičan u rasporedu gena sa ptičijim pneumovirusom (AMPV), koji takođe pripada rodu Metapneumovirus. TMPRSS2 je eksprimovan u humanom epitelu pluća, cepa HMPV F protein efikasno i podržava HMPV multiplikaciju i može biti uključen u razvoj bolesti nižeg respiratornog trakta kod pacijenata inficiranih sa HMPV. Videti et al. Shirogane et al. J Virol.82(17): 8942-8946 (2008).
[0045] Hepatitis C virus (HCV) je mali, pozitivno usmereni jednolančani RNK virus sa omotačem iz familije Flaviviridae. HCV, sa bar 6 genotipova i brojnim subtipovima, je član roda hepacivirus. TMPRSS2 mogu aktivirati HCV infekciju u stupnju posle vezivanja i posle ulaza. Esumi et al., Hepatology 61(2): 437-446 (2015).
[0046] Virusi influence su članovi familije Orthomyxoviridae. Ova familija predstavlja viruse sa omotačem, sa geneom koji je ima segmetirane negativno usmerene jednolančane RNK segmente. Postoji četiri roda ove familije: tipovi A, B, C i Thogotovirus. Klase virusa influence, A, B i C, su zasnovane na proteinu jezgra i dalje su podeljeni u podtipove koji su određeni hemaglutininom (HA) i neuraminidazom (NA) glikoproteina virusnog omotača (npr., podtip A/H1N1). Takođe ima bar 18 proteinskih tipova hemaglutinina influence ("HA") (H1-H18 ili HA1-HA18) i bar 11 podtipova proteina neuraminidaze influence (NA) (N1-N11 ili NA1-NA11) korišćenih da se definišu podtipovi influence. Grupa 1 influence ima podtipove H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, H17 i H18 i podtipove NA8, NA5, Na4 i NA1. Grupa 2 ima podtipove H3, H4, H7, H10, H14 i H15 i podtipove NA6, NA9, NA7, NA2 i NA3. Virusi influence A inficiraju brojne vrste sisara i ptica, gde su tipvovi B i C infekcija u velikoj meri ograničeni na ljude. Osam genomskih segmenata virusa influence A i B je blago inkapsulirano sa nukeloproteinom.
[0047] Korona vironi su sfernog prečnika približno 125 nm. Najistaknutija karakteristika koronavirusa je izbočina u obliku šiljka koja izlazi sa površine viriona. Ovi šiljci su karakteristike koja definiše viron i daju im izgled solarne korone, što podstiče ime koronavirusi . U okviru omotača virona je nukleokapsid. Koronavirusi imaju spiralno simtetričan nukleokapsid, koji nije uobičajen među pozitivno orijetnisanim RNK virusima, ali je mnogo uobičajeni za negativno orijentisane RNK viruse. Oba MERS-CoV (korona virus bliskoistočnog respiratornog sindroma) i SARS-CoV (korona virus ozbilnog akutnog respiratornog
1
sindroma) spadaju u familiju korona virusa. Početno vezivanje virona za ćeliju domaćina je inicirano interakcijama između S proteina i njegovih receptora. Mesta domena koji vezuju receptor (RBD) u okviru S1 regiona proteina S korona virusa variraju od virusa, od kojih neka imaju RBD na C-kraju od S1. Interakcije S-protein/receptor je primarna determinanta za korona virus da inficira vrstu domaćina i takođe upravlja tropizmom virusa u tkivu. Mnogo koronavirusa koriste peptidaze kao njihov ćelijski receptor. Posle vezivanja receptora, virus zatim mora dobiti prilaz citoslu ćelije domaćina. Ovo je generalno pračeno kiselo-zavisnim proteolitičkim cepanjem S proteina sa katepsinom, TMPRRS2 ili drugom proteazom, praćeno fuzijom virusnih i ćelijskih membrana.
Anti-TMPRSS2 antitela i fragmenti koji vezuju antigen
[0048] Prikazani opis obezbeđuje proteine koji vezuju antigene, kao što su antitela i njegovi fragmenti koji vezuju antigen, koja se specifično vežu za TMPRSS2 protein ili njegov antigeni fragment. Proteini koji vezuju antigene prema prikazanom pronalasku su navedeni u patentnim zahtevima.
[0049] Izraz "antitelo", kako je ovde korišćeno, odnosi se na molekule imunoglobulina koji sadrže četiri polipeptidna lanca, dva teška lanca (HCs) i dva laka lanca (LCs) međusobno povezana disulfidnim vezama (tj., "molekuli punog antitela "), kao i njihovi multimerni oblici (npr. IgM)-na primer, H1H7017N. Svaki teški lanac se sastoji od promeljivog regiona ("HCVR" ili "VH") (npr., SEQ ID NO 2) i konstantog regiona teškog lanca (koji sadrži domene CH1, CH2 i CH3). Svaki laki lanac se sastoji od promenjivog regiona lakog lanca ("LCVR ili "VL") (npr., SEQ ID NO 4) i konstantog regiona lakog lanca (CL). Regioni VHi VLmogu biti dalje podeljeni u regione hipervariabilnosti, koji se nazivaju regioni koji određuju komplementarnost (engl. complementarity determining regions - CDR), prošarani sa regionima koji su očuvaniji, koji se nazivaju regioni okvira (FR). Svaki VHi VLsadrže tri CDRs i četiri FRs, raspoređenih od amino kraja do karboksilnog kraja sledećim redom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. U izvesnim izvođenjima prema pronalasku, FRs antitela (ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen) su identična sa humanim germitativnim sekvencama , ili prirodno su ili veštački modifikovane.
[0050] Tipično, promenjivi domeneni oba teškog i lakog lanca imunoglobulina sadrže tri hiperpromenjiva regiona, takođe nazvana regioni koji određuju komplementarnost (CDRs), smeštenih u okviru relativno konzervativnih regiona okvira (FR). Generalno, od N-kraja do C-kraja, promenjivi domeni lakog i teškog lanca sadrže FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Dodeljivanje aminokiselina svakom domenu može biti prema definicijama Sequences of Proteins of Immunological Interest, Kabat, et al.; National Institutes of Health, Bethesda, Md.; 5th ed.; NIH Publ. No.91-3242 (1991); Kabat (1978) Adv. Prot. Chem.32:1-75; Kabat, et al., (1977) J. Biol. Chem.252:6609-6616; Chothia, et al., (1987) J Mol. Biol.196:901-917 or Chothia, et al., (1989) Nature 342:878-883.
[0051] Prikazani opis obuhvata monoklonalni anti-TMPRSS2 proteine koji vezuju antigen, npr., antitela i njegove fragmente koji vezuju antigen, kao i monoklonalne kompozicije koje sadrže višestruke izolovane monoklonalne proteine koji vezuju antigene. Izraz "monoklonalno antitelo", kako je ovde korišćeno, odnosi se na populaciju suštinski homogenih antitela, tj., molekule antitela koji sačinjavaju populaciju su identični u aminokiselinskoj sekvenci osim mogućih prirodnih mutacija koje mogu se mogu javiti u manjim količinama. "Mnoštvo" takvih monoklonalnih antitela i fragmenata u kompoziciji odnosi se na koncentraciju identičnih (tj., kako je gore definisano, u aminokiselinskoj sekvenci osim za moguće mutacije koje se dešavaju u prirodi koje mogu biti prisutne u manjim količinama ) antitela i fragmenata koja je iznad one koja bi se normalno javljala u prirodi , npr., u krvi organizma domaćina kao što je miš ili čovek.
[0052] U jednom aspektu opisa, anti-TMPRSS2 protein koji vezuje antigen, npr., antitelo ili fragment koji vezuje antigen sadrži konstantan region teškog lanca , npr., tipa IgA (npr., IgA1 ili IgA2), IgD, IgE, IgG (npr., IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4) ili IgM. U jednom aspektu opisa, protein koji vezuje antigen, npr., antitelo ili fragment koji vezuje antigen sadrži konstantan domen lakog lanca , npr., tipa kapa ili lambda.
[0053] Izraz "humani" protein koji vezuje antigen, kao što je antitelo, kako je ovde korišćeno, obuhvata antitela koja imaju promenjive i konstantne regione koji potiču iz germinativnih imunoglobulinskih sekvenci bilo u humanoj ćeliji ili presađenih u nehumanu ćeliju, npr., mišju ćeliju. Videti npr., US8502018, US6596541 ili US5789215. Humani mAbs mogu obuhvatati aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani sa humanim germinativnim imunoglobulinskim sekvencama (npr., mutacije unete nasumičnom mutagenezom ili mutagenezom specifičnom za mesto in vitro ili somatskim mutacijama in vivo), na primer u CDRs i posebno u CDR3. Međutim, izraz "humano antitelo", kako je ovde korišćen, nema nameru da obuhvati mAbs u kojima CDR sekvence koje potiču od germinativne linije drugih vrsta sisara (npr., miša) su presađeni na humane FR sekvence. Izraz uključuje rekombinantno proizvedena antitela u nehumanim ćellijama sisara ili u ćelijama nehumanih sisara . Izraz nema nameru da obuhvati antitela izolovana iz ili stvorena u humanom subjektu Videti dole.
[0054] Prikazani opis obuhvata anti-TMPRSS2 himerni protein koji vezuje antigene, npr., antitela i njegove fragmente koji vezuju antigen, i postupke za njihovu upotrebu. Kako je ovde korišćeno, "himerno antitelo" je antitelo koje ima promenjivi domen iz prvog antitela i konstantni domen iz drugog antitela, gde prvo i drugo antitelo su iz različitih vrsta. (US4816567; i Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855).
[0055] Izraz "rekombinantni" proteini koji vezuju antigen, kao što su antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen, odnosi se na molekule nastale, eksprimovane, izolovane ili dobijene tehnologijama ili postupcima poznatim u stanju tehnike kao rekombinantne DNK tehnologije koji uključuju , npr., DNK splajsovanje i transgenu ekspresiju. Izraz obuhvata antitela eksprimovana u nehumanim sisaru (uključujući transgene nehumane sisare, npr., transgene miševe), ili ekspresionom sistemu ćelija (npr., CHO ćelijama) ili izolovane iz rekombinantne kombinatorne humane biblioteke antitela.
[0056] Rekombinantni anti-TMPRSS2 proteini koji vezuju antigene, npr., antitela i fragmenti koji vezuju antigen, ovde opisani mogu biti proizvedeni ekspresionim sistemom u E. coli/T7. U ovom aspektu, nukleinske kiseline koje kodiraju anti-TMPRSS2 antitelo imunoglobulinskih molekula (npr., H1H7017N) mogu biti umetnuti u plazmid na bazi pET-i eksprimovan u sistemu E. coli/T7. Na primer, prikazani opis uključuje postupke za ekspresiju antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen ili njegovog imunoglobulinskog lanca u ćeliji domaćinu (npr., bakterijskoj ćeliji domaćinu kao što je E. coli kao što su BL21 ili BL21DE3) koji obuhvata eksprimovanje T7 RNK polimeraze u ćeliji koja takođe uključuje polinukleotid koji kodira imunoglobulinski lanac koji je operativno vezan za T7 promoter. Na primer, u jednom aspektu opisa, bakterijska ćelija domaćina, kao što je E. coli, obuhvata polinukleotid koji kodira gen T7 RNK polimeraze operativno vezan za lac promoter i ekspresija polimeraze i lanca je indukovana inkubacijom ćelije domaćina sa IPTG (izopropil-beta-D-tiogalaktopiranozid). Videti US4952496 i US5693489 ili Studier & Moffatt, Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective highlevel expression of cloned genes, J. Mol. Biol.1986 May 5;189(1): 113-30.
[0057] Postoji nekoliko postupaka kojima se proizovde rekombinantna antitela koja su poznata u ovoj oblasti tehnike. Jedan primer postupka za rekombinantnu proizvodnju antitela je opisan u US4816567.
1
[0058] Transformacija može biti bilo kojim poznatim postupkom za uvođenje polinukleotida u ćeliju domaćina. Postupci za uvođenje heterolognih polinukleotida u ćelije sisara su dobro poznati u ovoj oblasti i obuhvataju transfekciju posredovanu dekstranom, taloženje klacijum fosfatom, transfekciju posredovanu polibrenom, fuziju protoplasta, elektroporaciju, inkapsulaciju polinukleotida u lipozome, biolističku injekciju i direktnu mikroinjekciju DNK u nukleus. Pored toga, molekuli nukleinske kiseline mogu biti uneti u ćelije sisara sa virusnim vektorima. Postupci transformisanja ćelija su dobro poznati u ovoj oblasti tehnike. Videti, na primer, U.S. Pat. Nos.4,399,216; 4,912,040; 4,740,461 i 4,959,455.
[0059] Prema tome, prikazani opis obuhvata rekombinantne postupke za dobijanje anti-TMPRSS2 proteina koji vezuje antigen, kao što je antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema prikazanom pronalasku, ili njegov imunoglobulinski lanac, koji obuhvata (i) uvođenje jednog ili više polinukleotida (npr., uključujući nukleotidnu sekvencu u jednu ili više SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 ili 15) koji kodiraju laki i/ili teški lanac imunoglobulina proteina koji vezuje antigen, npr., H1H7017N ili H4H7017N, na primer, gde je polinukleotid u vektoru; i/ili integrisan u hromozom ćelije domaćina i/ili je operativno vezan za promoter; (ii) kultivisanje ćelije domaćina (npr., CHO ili Pichia ili Pichia pastoris) pod uslovima koje su pogodni za ekspresiju polinukleotida i , (iii) opciono, izolovanje proteina koji vezuje antigen, (npr., antitelo ili fragment) ili lanac iz ćelije domaćina i/ili medijuma u kome je gajena ćelija domaćina. Kada se priprema protein koji vezuje antigen (npr., antitelo ili fragment koji vezuje antigen) sadrži više od jednog lanca imunoglobulina, npr., antitelo koje sadrži dva teška lanca imunoglobulina i dva laka lanca imunoglobulina, zajednička ekspresija lanaca u jednoj ćeliji domaćinu vodi do udruživanja lanaca, npr., u ćeliji ili na površni ćelije ili van ćelije ukoliko su takvi lanci izlučeni, tako da se obrazuje protein koji vezuje antigen (npr., antitelo ili fragment koji vezuje antigen). Postupci obuhvataju one u kojima samo teški lanac imunoglobulina ili samo laki lanac imunoglobulina (npr., bilo koji od ovde diskutovanih uključuju zrele fragmente i/ili njihove prihvatljive domene) je eksprimovan. Takvi lanci su korisni, na primer, kao intermedijeri u ekspresiji antitela ili fragmenta koji vezuju antigen koji uključuju takav lanac. Na primer, prikazani opis takođe uključuje anti-TMPRSS2 proteine koji vezuje antigene, kao što su antitela i njihove fragmente koji vezuju antigen, koji sadrže teški lanac imunoglobulina (ili njegovog promenjivog domena ili sadrže njegove CDRs) kodirane sa polinukleotidom koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je data kao SEQ ID NO: 1 i laki lanac imunoglobulina (ili njegovog promenjivog domena ili sadrži njegove CDRs) kodiran sa nukleotidnom sekvencom datom u SEQ ID NO: 3 koje su proizvod takvih postupaka dobijanja, i, opciono, postupak prečišćavanja koji je ovde prikazan. Na primer, u izvođenju prema pronalasku, proizvod postupka je anti-TMPRSS2 protein koji vezuje antigen koji je antitelo ili fragment koji sadrži VHkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu datu kao SEQ ID NO: 2 i VLkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 4; ili sadrži HC koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 17 ili 19 i LC koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 18.
[0060] Eukariotske i prokariotske ćelije domaćini, uključujući ćelije sisara, mogu biti korišćene kao domaćini za ekspresiju anti-TMPRSS2 proteina koji vezuje antigen. Takve ćelije domaćni su dobro poznati u ovoj oblasti tehnike i mnoge od njih su dostupne u American Type Culture Collection (ATCC). Ove ćelije domaćini obuhvataju, inter alia, ćelije jajnika kineskog hrčka (engl.Chinese hamster ovary (CHO)), NSO, SP2 ćelije, HeLa ćelije, ćelije bubrega bebe hrčka (engl. baby hamster kidney-(BHK)), ćelije bubrega majmuna (eng.monkey kidney cells-(COS)), ćelije humanog hepatocelularnog karcinoma (npr., Hep G2), A549 ćelije, 3T3 ćelije, HEK-293 ćelije i brojne druge ćelijske linije. Ćelije sisara domaćina uključuju humane, mišje, pacovske, pseće, majmunske, svinjske, kozje, goveđe, konjske i hrčkove ćelije. Ostale ćelijske linije koje mogu biti korišćene su linije ćelija insekata (npr., Spodoptera frugiperda ili
1
Trichoplusia ni), ćelije vodozemaca, bakterijske čelije, ćelije biljaka i ćelije gljiva. Ćelije gljiva obuhvataju kasac i ćelije filametoznih gljiva koje uključuju , na primer, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia minuta (Ogataea minuta, Pichia iindneri), Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Physcomitrella patens i Neurospora crassa. Prikazani opis uključuje izolovanu ćeliju domaćina (npr., CHO ćeliju) koja obuhvata protein koji vezuje antigen, kao što je H1H7017N; ili polinukleotid koji kodira takav njegov polipeptid.
[0061] Izraz "specifično vezuje" odnosi se na one proteine koji vezuju antigene (npr., mAbs) koji imaju afinitet vezivanja za antigen, kao što je TMPRSS2 protein (npr., humani TMPRSS2), izražen kao KD, od bar oko 10<-8>M (npr., 2.81 X 10<-9>M; 9.31 X 10<-9>M; 10<-9>M; 10<-10>M, 10<-11>M, ili 10<-12>M), mereno u realnom vremenu, testom interferometrije u bio-sloju bez obeleživača na primer, na 25°C ili 37°C, npr., Octet® HTX biosenzor, ili površinskom plazmonskom rezonancom, npr., BIACORE™, ili afinitetnom ELISA u rastvoru. Prikazani opis obuhvata proteine koji vezuju antigene koji se specifilno vezuju za TMPRSS2 protein.
[0062] Izrazi "deo koji se vezuje za antigen " ili "fragment koji vezuje antigen" antitela ili proteina koji vezuje antigen, i slično, kako je ovde korišćeno, obuhvata bilo koji polipeptid ili glikoprotein koji se javlja u prirodi, dobijen enzimski, sintetski ili gentski koji se specifično veže za antigen da bi se dobio kompleks. Neograničavajući primeri fragmenta koji vezuju antigen uključuju: (i) Fab fragmente; (ii) F(ab’)2fragmente; (iii) Fd fragmente; (iv) Fv fragmente; (v) jednolančane Fv (scFv) molekule; (vi) dAb fragmente; i (vii) minimalne jedinice prepoznavanja koje se sastoje od aminokisleinksih ostataka koji podražavaju hiperpromenjivi region antitela (npr., izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR) kao što je CDR3 peptid), ili ograničeni FR3-CDR3-FR4 peptid. Ostali konstruisani molekuli , kao što su antitela specifična za domen, himerno antitela, CDR-presađena antitela, diatela, tritela, tetratela, minitela, nanotela (npr., kao što je definisano u WO08/020079 ili WO09/138519) (npr., monovalentna nanotela, bivalentna nanotela, itd.), mali modularni imunofarmaceutici (SMIPs), i promenjivi IgNAR domeni ajkule, su takođe obuhvaćeni izrazom "fragment koji vezuje antigen," kako je ovde korišćen.
[0063] Fragment koji vezuje antigen antitela će, u jednom aspektu opisa, sadržati bar jedan promenjivi domen. Promenjivi domen može biti bilo koje veličine ili aminokiselinskog sastava i generalno će sastojati od bar jednog CDR, koji je susedan ili u okviru sekvenci. U fragmentima koji vezuju antigen koji imaju VHdomen u vezi sa VLdomenom, VHi VLdomeni mogu biti smešteni relativno jedan u odnosu na drugi u bilo kom pogodnom rasporedu. Na primer, promenjivi region može biti dimerni i sadržati VH-VH, VH-VLili VL-VLdimere. Alternativno, fragment koji vezuje antigen iz antitela može sadžati monomerni VHili VLdomen.
[0064] U izvesnim aspektima, fragment koji vezuje antigen antitela može sadržati bar jedan promenjivi domen kovalento vezan za bar jedan konstatan domen. Neograničavajuće, konfiguracije date kao primer promenjivih i konstantih domena mogu se naći u okviru fragmenta koji vezuje antigen uključujući: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; i
1
(xiv) VL-CL. U bilo kom od promenjivih i konstantih domena, uključujući bilo koji primer konfiguracija ovde datih, promenjivi i konstanti domeni mogu biti ili direktno vezani jedan za drugi ili mogu biti vezani punim ili parcijalnim zglobom (eng.hinge) ili regionom za povezivanje. Region zgloba može da se sastoji od bar 2 (npr., 5, 10, 15, 20, 40, 60 ili više) aminokiseline, koji dovode do fleksibilnih ili polufleksibilnih veza između susednih promenjivih i/ili konstantih domena u pojedinačnim polipeptidnim molekulima. Pored toga, fragment koji vezuje antigen antitela može sadžati homo-dimer ili hetero-dimer (ili drugi multimer) gore datih konfiguracija bilo kog promenjivog i konstantnog domena u nekovaletnoj vezi sa jednim drugim i/ili jednim ili više monomerinih VHili VLdomena (npr., sa disulfidnom vezom(ama)).
[0065] Proteini koji vezuju antigene (npr., antitela i fragmente koji vezuju antigen) mogu biti monospecifična ili višespecifična (npr., bi-specifična). Višespecifični proteini koji vezuju antigene su ovde dalje diskutovani.
[0066] U specifičnim izvođenjima, antitelo ili fragmenti antitela prema pronalasku mogu biti konjugovani za deo kao što su ligand ili terapeutski deo ("imunokonjugat"), kao što je antivirusni lek, drugo antitelo protiv influence, ili bilo koji drugi terapeutski deo korisan za lečenje virusnih infekcija, npr., infekcije virusom influence. Videti dole.
[0067] Prikazani opis takođe obezbeđuje kompleks koji sadrži anti-TMPRSS2 proteine koji vezuju antigen, npr., antitelo ili fragment koji vezuje antigen, ovde diskutovane kompleksirane sa TMPRSS2 polipeptidom ili njegovim antigenim fragmentom i/ili sa sekundarnim antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen (npr., sekundarnim antitelom sa obeleživačem koji se detektuje) koji se specifčno veže za anti-TMPRSS2 antitelo ili fragment. U jednom aspektu opisa, antitelo ili fragment je in vitro (npr., je imobilizovan za čvrsti supstrat) ili je u antitelu subjekta. U jednom aspektu opisa, TMPRSS2 je in vitro (npr., je imobilizovan za čvrsti supstrat) ili je na površini ćelije ili je u antitelu subjekta. Imobilizovana anti-TMRPSS2 antitela i njegovi fragmenti koji vezuju antigen koji su kovalento vezani za nerastvorni materijal (npr., staklo ili polisahardi kao što je agaroza ili sefaroza, npr., zrnce ili njegova druga čestica) su takođe deo prikazanog opisa; opciono, gde je imobilizovano antitelo kompleksirano sa TMPRSS2 ili njegovim antigenim fragmentom ili sekundarnim antitelom ili njegovim fragmentom. Kompleksi prema prikazanom pronalasku su prikazani u patentnim zahtevima.
[0068] "Izolovani" proteini koji vezuju antigene, njegova antitela ili fragmenti koji vezuju antigen, polipeptidi, polinukleotidi i vektori, su bar parcijalno slobodni od drugih bioloških molekula iz ćelija ili ćelija kulture u kojoj su dobijeni. Takvi biološki molekuli uključuju nukleinske kiseline, proteine, druga antitela ili fragmente koji vezuju antigen, lipide, ugljenehidrate, ili druge materijale kao što su ćelijski debris i medijum za rast. Izolovano antitelo ili fragment koji vezuje antigen može dalje biti bar parcijalno bez komponenti ekspresionog sistema kao bioloških molekula iz ćelije domaćina ili njihovog medijuma za rast. Generalno, izraz "izolovani" nema nameru da se odnosi na kompletno odsustvo takvih bioloških molekula ili na odsutnost vode, pufera ili soli ili na komponente farmaceutske formulaciji koje uključuju antitela ili fragmente.
[0069] Izraz "epitop" odnosi se na antigenu determinantu (npr., na TMPRSS2 polipeptid) koji je u interakciji sa specifičnim mestom za vezivanje antigena na proteinu koji vezuje antigen, npr., promenjivi region molekula antitela, poznat kao paratop. Pojedinačni antigen može imati više od jednog epitopa. Prema tome, različita antitela mogu se vezati za različite oblasti antigena i mogu imati različite biološke efekte. Izraz "epitop" takođe se odnosi na mesto antigena na koje B i/ili T ćelije
1
odgovaraju. Takođe se odnosi na region antigena koji se veže za antitelo. Epitopi mogu biti definisani kao strukturni ili funkcionalni. Funkcionalni epitopi su generalno podset strukturnih epitopa i imaju one ostatke koji direktno doprinose afinitetu interakcija. Epitopi mogu biti linearni ili konformacioni, to jest, sačinjeni od nelinearnih aminokiselina. U izvesnim izvođenjima, epitopi mogu uključivati determinante koje su hemijski aktivne površinske grupacije molekula kao što su aminokiseline, šećerni bočni lanci, fosforil grupe ili sulfonil grupe, u izvesnim izvođenjima mogu imati specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike , i/ili specifične karakteristike naelektrisanja.
[0070] Postupci za određivanje epitopa proteina koji vezuje antigen, npr., antitelo ili fragment ili polipeptid, uključuju analizu skeniranja mutacije alanina, peptidnu blot analizu (Reineke (2004) Methods Mol. Biol. 248: 443-63), analizu cepanja peptida, kristalografska ispitivanja i NMR analizu. Pored toga, postupci kao što su isecanje epitopa, ekstrakcija epitopa i hemijska modifikacija antigena mogu biti korišćeni (Tomer (2000) Prot. Sci.9: 487-496). Još jedan postupak koji može biti korišćen za identifikovanje aminokiselina u okivru polipeptida sa kojim protein koji vezuje antigen (npr., antitelo ili fragment ili polipeptid) (npr., koverzin) reaguje je detektovana izmena vodonik/deuterijum sa masenom spektormetrijom. U opštem smislu, postupak izmene vodonik/deuterijum uključuje obeležavanje deuterijumom proteina od interesa, praćeno vezivanjem proteina koji vezuje antigen, npr., antitela ili fragmenta ili polipeptida, za protein obeležen deuterijumom. Sledeće, kompleks TMPRSS2 protein/ proteina koji vezuje antigen je premešten u vodi i zamenjivi protoni u okviru aminokiselina koje su zaštićene kompleksom antitela podležu povratnoj izmeni deuterijum-vodonik sporijom brzinom nego zamenjivi protoni u oviru aminokiselina koji nisu deo dodirne površine. Kao rezultat, aminokiseline koje obazuju deo dodirne površine protein/ protein koji vezuje antigen mogu zadržati deuterijum i prema tome pokazati relativno veće mase u odnosu na aminokiseline koje nisu obuhvaćene dodirnog površinom. Posle disocijacije proteina koji vezuje antigen (npr., antitela ili fragmenta ili polipeptida), ciljani protein je podvrgnut cepanju proteazom i masenoj spektormetrijskoj analizi, na taj način otkrivajuči ostatke obeležene deuterijumom koji odgovaraju specifičnim aminokiselinama sa kojima protein koji vezuje antigen reaguje. Videti, npr., Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267: 252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem.73: 256A-265A.
[0071] Izraz "kompetitivan" kako je ovde korišćen, odnosi se na protein koji vezuje antigen (npr., antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen) koji se vezuje za antigen (npr., TMPRSS2) i inhibira ili blokira vezivanje drugog proteina koji vezuje antigen (npr., antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen) za antigen. Izraz takođe uključuje kompeticiju između dva proteina koji vezuju antigene npr., antitela, u obe orijentacije, tj., prvo antitelo koje se veže i blokira vezivanje drugog antitela i vice versa. U izvesnim aspektima, prvi protein koji vezuje antigen (npr., antitelo) i drugi protein koji vezuje antigen (npr., antitelo) može se vezati za isti epitop. Alternativno, prvi i drugi protein koji vezuju antigene (npr., antitela) mogu se vezati za različite, ali, na primer, epitope koji se preklapaju, gde vezivanje jednog inhibira ili blokira vezivanje drugog antitela, npr., pomoću sterne smetnje. Kompeticija između proteina koji vezuje antigene (npr., antitela) može biti merena sa poznatim postupcima u ovoja oblasti, na primer, testom interferometrije u bio-sloju bez obeleživača u realnom vremenu. Kompeticija između prvog i drugog anti-TMPRSS2 proteina koji vezuje antigen (npr., antitelo) može biti određena merenjem sposobnosti imobilizovanog prvog anti-TMPRSS2 proteina koji vezuje antigen (npr., antitela) (neinicijalno kompleskiranog sa TMPRSS2 proteinom) da veže rastvorni TMPRSS2 protein kompleksiran sa drugim anti-TMPRSS2 proteinom koji vezuje antigen (npr., antitelo). Smanjenje sposobnosti prvog anti-TMPRSS2 proteina koji vezuje antigen (npr., antitelo) da veže kompleksirani TMPRSS2 protein, u odnosu na nekompleksirani TMPRSS2 protein, ukazujući da prvi i drugi anti-TMPRSS2 proteini koji
1
vezuju antigene (npr., antitela) se natiču. Stepen kompeticije može biti izražen kao procenat smanjenja vezivanja. Takva kompeticija može biti merena korišćenjem testa interferometrije u biosloju bez obeleživača u realnom vremenu, npr., na Octet RED384 biosenzoru (Pall ForteBio Corp.), ELISA (imunosorbentni test sa vezanim enzimom) ili SPR (rezonanca površinskog plazmona).
[0072] Kompeticija vezivanja između anti-TMPRSS2 proteina koji vezuju antigene (npr., monoklonalna antitela (mAbs)) može biti određena korišćenjem testa interferometrije na bio-sloju bez obeleživača u realnom vremenu na Octet RED384 biosenzoru (Pall ForteBio Corp.). Na primer, da bi se odredila kompeticija između dva anti-humana TMPRSS2 monoklonalna antitela, anti-TMPRSS2 mAb može prvo biti uhvaćeno na vrhovima Octet biosenzora obloženim anti-hFc antitelom (Pall ForteBio Corp., # 18-5060) potapanjem vrhova u rastvor anti-humanog TMPRSS2 mAb (koji se nadalje naziva "mAb1"). Kao pozitivna kontrola za blokiranje, antitelo uhvaćeno na vrhovima biosenzora može zatim biti zasićeno sa poznatim blokirajućim izotipovima kontrolnih mAb (koji se nadalje naziva "blokirajući mAb") uranjanjem u rastvor blokirajućeg mAb. Da bi se odredilo da li postoji kompeticija mAb2 sa mAb1, vrhovi biosenzora mogu zatim biti naknadno uronjeni u zajedno kompleksiran rastvor humanog TMPRSS2 polipeptida i drugog anti-human TMPRSS2 mAb (koji se nadalje naziva "mAb2"), koji je prethodno preinkubiran u određenom vremenu i vezivanje mAb1 za TMPRSS2 polipeptid može biti određeno. Vrhovi biosenzora mogu biti isprani u puferu između svakog koraka eksperimenta. Može biti praćen odgovor vezivanja u realnom vremenu u toku eksperimenta i odgovor vezivanja na kraju svakog zaustavljanja može biti zabeležen.
[0073] Na primer, test kompeticije može biti izvođen na 25°C i pH oko 7, npr., 7.4, npr., u prisustvu pufera, soli, površinski aktivnog sredstva i nespecifičnog proteina (npr., albumina goveđeg seruma).
[0074] Tipično, antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema opisu koji je modifikovan na neki način može zadržati sposobnost da se specifično veže za TMPRSS2, npr., zadržava bar 10% njegove aktivnosti vezivanja TMPRSS2 (kada se poredi sa osnovim antitelom) kada je aktivnost izražena na molarnoj bazi. Poželjno, antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema opisu zadržava bar 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% ili 100% ili više aktivnosti vezivanja TMPRSS2 kao osnovnog antitela. Takođe je namera da antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema opisu može uključiti konzervativne ili nekonzervativne aminokiselinske susptitucije (koje se ovde nazivaju "konzervativne varijante" ili "funkcionalno konzervativne varijante" antitela) koje suštinski ne menjaju njegovu biološku aktivnost.
[0075] "Varijanta" polipeptida, kao što je imunoglobulinski lanac (npr., H1H7017N VH, VL, HC ili LC), odnosi se na polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je bar oko 70-99.9% (npr., 70, 72, 74, 75, 76, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9%) identična ili slična sa referentom aminokiselinskom sekvencom koja je ovde prikazana (npr., SEQ ID NO: 2, 4, 17, 18 ili 19); kada je uporeživanje izvršeno sa BLAST algoritmom u kome parametri algoritma su izabrani da bi se dobilo najveće poklapanje između odgovarajućih sekvenci u odnosu na celokupnu dužinu odgovarajućih referentih sekvenci (npr., expect threshold: 10; word size: 3; max matches in a query range: 0; BLOSUM 62 matrix; gap costs: existence 11, extension 1; conditional compositional score matrix adjustment).
[0076] "Varijanta" polinukleotida odnosi se na polinukleotid koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je bar oko 70-99.9% (npr., 70, 72, 74, 75, 76, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.5, 99.9%) identična sa referentom nukleotidnom sekvencom koja je ovde prikazana (npr., SEQ ID NO: 1 ili 3); gde je upoređivanje izvedeno sa BLAST algoritmom u kome
2
parametri algoritma su izabrani da daju najveće poklapanje između odgovarajućih sekvenci u odnosu na celokupnu dužinu odgovarajuće referente sekvence (npr., expect threshold: 10; word size: 28; max matches in a query range: 0; match/mismatch scores: 1, -2; gap costs: linearni).
[0077] Anti-TMPRSS2 proteini koji vezuju antigene, npr., antitela i njegovi fragmenti koji vezuju antigen prema prikazanom pronalasku, mogu obuhvatati promenjivi region teškog lanca imunoglobulina koji ima bar 70% (npr., 80%, 85%, 90%, 95%, 99%) identičnosti aminokiselinske sekvence sa aminokiselinskim sekvencama prikazanim kao SEQ ID NO: 2, 17 ili19; i/ili promenjivi region lakog lanca imunoglobulina koji imaju bar 70% (npr., 80%, 85%, 90%, 95%, 99%) identičnosti aminokiselinske sekvence sa aminokiselinima prikazanim u SEQ ID NO: 4 ili 18.
[0078] Pored toga, varijanta anti-TMPRSS2 proteina koji vezuje antigen može obuhvatati polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je ovde prikazana osim jedne ili više (npr., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10) mutacija kao što su, na primer, misens mutacije (npr., konzervativne supstitucije), nonsens mutacije, delecije, ili insercije. Na primer, prikazani opis obuhvata proteine koji vezuju antigene koji uključuju varijantu lakog lanca imunoglobulina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 4 ili 18 ali koja ima jednu ili više mutacija i/ili varijantu teškog lanca imunoglobulina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 2, 17 ili 19, ali koja ima jednu ili više takvih mutacija. U jednom aspektu opisa, varijanta anti-TMPRSS2 proteina koji vezuje antigen obuhvata varijantu lakog lanca imunoglobulina koja sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 gde jedan ili više (npr., 1 ili 2 ili 3) takvih CDRs ima jednu ili više takvih mutacija (npr., konzervativne supstitucije) i/ili varijantu teškog lanca imunoglobulina koja sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 gde jedan ili više (npr., 1 ili 2 ili 3) takvih CDRs ima jednu ili više takvih mutacija (npr., konzervativnih supstitucija).
[0079] Opis dalje obezbeđuje varijantu anti-TMPRSS2 proteina koji vezuje antigene, npr., antitela ili njegove fragmente koji vezuju antigen, koji sadrži jednu ili više varijanti CDRs (npr., jedan ili više CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 i/ili CDR-H3) koji su prikazani ovde sa bar 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ili 99.9% identičnosti sekvence ili sličnosti sa, npr., SEQ ID NO: 12, 14, 16, 6, 8 i/ili 10.
[0080] Aspekti prikazanog opisa takođe uključuju varijantne proteine koji vezuju antigene, npr., anti-TMPRSS2 antitela i njegove fragmente koji vezuju antigen, koji sadrže imunoglobuline VHs i VLs; ili HCs i LCs, koji sadrže aminokiselinsku sekvencu koja ima 70% ili više (npr., 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ili 99%) celokupne identičnosti aminokiselinske sekvence ili sličnost sa aminokiselinskim sekvencama odgovarajućih VHs, VLs, HCs ili LCs specifično prikazanih ovde, ali gde CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 takvih imunoglobulina nisu varijante i sadrže i aminokiselinsku sekvencu prikazanu u odgovarajućim SEQ ID NOs: 12, 14, 16, 6, 8 i 10. Prema tome, u takvim aspektima, CDRs u okviru varijante protein koji vezuju antigene nisu sami varijante.
[0081] Takođe ovde su opisane konzervativno modifikovane varijante anti-TMPRSS2 antitela i njegovih fragmenta koji vezuju antigen. "Konzervativno modifikovana varijanta" ili "konzervativna supstitucija" odnosi se na varijantu u kojoj postoji jedna ili više supstitucija aminokiselina u polipeptidu sa drugim aminokisleinima koje imaju slične karakteristike (npr. naelektrisanje, veličinu bočnog lanca, hidrofobnost/hidrofilnost, konformaciju osnovne strukture i krutost, itd.). Takve promene mogu često biti napravljene bez značajnog ometanja biološke aktivnosti antitela ili fragmenta. Stručnjaci iz ove oblasti će znati da, generalno, jedna aminokiselinska supstitucija u neesencijalnim regionima polipeptida suštinski ne menja biološku aktivnost (videti, npr., Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p.224 (4th Ed.)). Pored toga, supstitucije strukturno ili funkcionalno sličnih aminokiselina je manje verovatno da će značajno poremetiti biološku aktivnost.
[0082] Primeri grupa amino kiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim osobinama obuhvataju 1) alifatičke bočne lance: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; 2) alifatičko-hidroksilne bočne lance: serin i treonin; 3) bočne lance koji sadrže amin: asparagin i glutamin; 4) aromatične bočne lance: fenilalanin, tirozin, i triptofan; 5) bazne bočne lance: lizin, arginin, i histidin; 6) kisele bočne lance: aspartat i glutamat, i 7) bočne lance koji sadrže sumpor: cistein i metionin. Poželjne konzervativne aminokiselinske supstitucione grupe su: valin-leucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alaninvalin, glutamat-aspartat, i asparagin-glutamin. Alternativno, konzervativna zamena je bilo koja promenena koja ima pozitivnu vrednst u PAM250 log-likelihood matriksu opisanom kod Gonnet et al. (1992) Science 256: 144345.
[0083] Funkcionalno konzervativne varijante anti-TMPRSS2 antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen su takođe ovde opisani. Bilo koja od varijanti anti-TMPRSS2 antitela i njihovih fragmenta koji vezuju antigen (kako je ovde diskutovano) mogu biti "funkcionalno konzervativne varijante". Takve funkcionalno konzervativne varijante mogu, u nekim slučajevima, takođe biti karakterisane kao konzervativno modifikovane varijante. "Funkcionalno konzervativne varijante," kako je ovde korišćeno, odnosi se na varijante anti-TMPRSS2 antitela ili njihovih fragmenta koji vezuju antigen u kojima jedan ili više aminokiselinskih ostataka je zamenjeno bez značajnog menjanja jedne ili više osobina antitela ili fragmenta. Na primer, funkcionalno konzervativne varijante anti-TMPRSS2 antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen mogu sadržati varijantu aminokiselinska sekvence i pokazivati jedno ili više sledećih funkcionalnih osobina:
• inhibira rast virusa influence (npr., A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1)) u ćelijama koje eksprimuju TMPRSS2 (npr., Calu-3 ćelije);
• vezuje sa za površinu ćelija koje eksprimuju TMPRSS (npr., MDCK/Tet-on), npr., sa EC50vrednošću od 440 pM ili 1.06 nM, tim redom;
• Ne vezuje se značajno za MDCK/Tet-on ćelije koje ne eksprimuju TMPRSS2;
• Vezuje se za humani TMPRSS2 sa KDod oko 2.81 X 10<-9>M na oko 25°C;
• Vezuje se za humani TMPRSS2 sa KDod oko 9.31 X 10<-9>M na oko 37°C;
• Vezuje se za cinomolgus TMPRSS2 sa KDod oko 5.60 X 10<-8>M na oko 25°C;
• Vezuje se za cinomolgus TMPRSS2 sa KDod oko 1.40 X 10<-7>M na oko 37°C;
• Ograničava raznošenje infekcije virusa influence (npr., sa H1_PR34; H1_CA09; H1_Bris; H9N2 ili H3N2 virusa influence) ćelija, npr., Calu-3, in vitro; i/ili
• štiti miša genetski modifikovanog da eksprimuje humani TMPRSS2 protein od smrti izazvane infekcijom virusa influence, npr., H1N1, ili H3N2, na primer, gde su miševi inficirani sa drugom letalnom dozom virusa, opciono kada su kombinovani sa anti-HA antitelom.
[0084] Prikazani opis obuhvata miša genetski modifikovanog da eksprimuje humani TMPRSS2 protein koji obuhvata, u okviru mišjeg tela, anti-TMPRSS2 protein koji vezuje antigen (npr., antitelo ili fragment koji vezuje antigen) kao što je H1H7017N i H4H7017N. Videti International patent application publication br. WO2017/151453.
[0085] "Neutrališući" ili "antagonistički" anti-TMPRSS2 protein koji vezuje antigen, npr., antitelo ili fragment koji vezuje antigen, odnosi se na molekul koji inhibira aktivnost TMPRSS2 u bilo kom detektabilnom stepenu , npr., inhibira proteaznu aktivnost TMPRSS2, na primer, supstrata kao što je HA; Cbz-Gly-Gly-Arg-AMC (Sigma), gde Cbz je benziloksikarbonil i AMC je 7-amino-4-metilkumarin; virus influence HA0; protein S koronavirusa ; ili prekursor TMPRSS2 koji je autokatalitički sečen između Arg255 i Ile256 i/ili inhibira ulaz virusa influence u ćeliju i/ili inhibira reprodukciju virusa influence u telu subjekta .
[0086] "H1H7017N" i "H4H7017N" odnose se na proteine koji vezuju antigene, kao što su antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen, koji sadrže teški lanac ili VH(ili njegovu varijantu) i laki lanac VL(ili njegovu varijantu) kao što je dole dato; ili da sadrži VHkoji sadrži njegov CDRs (CDR-H1 (ili njegovu varijantu), CDR-H2 (ili njegovu varijantu) i CDR-H3 (ili njegovu varijantu)) i VLkoji sadrži njegove CDRs (CDR-L1 (ili njegovu varijantu), CDR-L2 (ili njegovu varijantu) i CDR-L3 (ili njegovu varijantu)), npr., gde lanci imunoglobulina, promenjivi regioni i/ili CDRs sadrže specifične aminokiselinske sekvence dole opisane.
[0087] "H1H7017N" ili "H4H7017N" može se opciono odnositi na antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji sadrži CDR-H1, CDR-H2, i CDR-H3 teškog lanca imunoglobulina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 2, 17 ili 19 i CDR-L1, CDR-L2, i CDR-L3 imunoglobulinskog lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 4 ili 18.
[0088] "H1H7017N" ili "H4H7017N" se mogu opciono odnositi na antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji sadrži VHkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 2; i VLkoji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 4.
[0089] "H1H7017N" može opciono da se odnosi na antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji sadrži teški lanac imunoglobulina koji sadži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 17; i laki lanac imunoglobulina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 18.
[0090] "H4H7017N" može opciono da se odnosi na antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji sadži teški lanac imunoglobulina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 19; i laki lanac imunoglobulina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 18. Izraz "H4H7017N" takođe uključuju izvođenja u kojima VHje spojen sa divljim tipom IgG4, npr., gde je ostatak 108 S.
Anti-TMRPS22 Antitelo ili fragment koji vezuje antigen H1H7017N i H4H7017N promenjivi region teškog lanca (DNK) H1H7017N i H4H7017N
[0091]
Promenjivi region teškog lanca H1H7017N i H4H7017N (Polipeptid)
[0092]
2
Promenjivi region lakog lanca (Polipeptid) H1H7017N i H4H7017N
[0094]
H1H7017N i H4H7017N CDR-H1 (DNK)
[0095] GGA TTC ACC TTC AGT TCC TAT GGC (SEQ ID NO: 5)
H1H7017N i H4H7017N CDR-H1 (Polipeptid)
[0096] G F T F S S Y G (SEQ ID NO: 6 (ili njegova varijanta koja ima 1, 2, 3 ili 4 tačkaste mutacije i/ili tačke delecije))
H1H7017N i H4H7017N CDR-H2 (DNK)
[0097] ATA TGG AAT GAT GGA AGT TAT GTA (SEQ ID NO: 7)
H1H7017N i H4H7017N CDR-H2 (polipeptid)
[0098] IWND GS Y V (SEQ ID NO: 8 (ili njegova varijanta koja ima 1, 2, 3 ili 4 tačke mutacije i/ili tačke delecije))
H1H7017N i H4H7017N CDR-H3 (DNK)
[0099] GCG AGA GAG GGG GAG TGG GTA CTT TAC TAC TTT GAC TAC (SEQ ID NO: 9)
H1H7017N i H4H7017N CDR-H3 (Polipeptid)
[0100] A R E G E WV L Y Y F D Y (SEQ ID NO: 10 (ili njegova varijanta koja ima 1, 2, 3 ili 4 tačke mutacije i/ili tačke delecije))
H1H7017N i H4H7017N CDR-L1 (DNK)
[0101] CAG AGT ATT AGT AGC TGG (SEQ ID NO: 11)
H1H7017N i H4H7017N CDR-L1 (Polipeptid)
[0102] Q S I S S W (SEQ ID NO: 12 (ili njegova varijanta koja ima 1, 2, 3 ili 4 tačke mutacije i/ili tačke delecije))
H1H7017N i H4H7017N CDR-L2 (DNK)
[0103] AAG GCG TCT (SEQ ID NO: 13)
H1H7017N i H4H7017N CDR-L2 (Polipeptid)
[0104] K A S (SEQ ID NO: 14 (ili njegova varijanta koja ima jednu tačku mutacije i/ili tačku delecije))
H1H7017N i H4H7017N CDR-L3 (DNK)
[0105] CAA CAG TAT AAT AGT TAT TCG TAC ACT (SEQ ID NO: 15)
H1H7017N i H4H7017N CDR-L3 (Polipeptid)
[0106] Q QY N S Y S Y T (SEQ ID NO: 16 (ili njegova varijanta koja ima 1, 2, 3 ili 4 tačke mutacije i/ili tačke delecije))
H1H7017N
Puna dužina teškog lanca-humanog IgG1
[0107]
Puna dužina lakog lanca-humani Kapa
[0108]
H4H7017N
Puna dužina teškog lanca-humani IgG4 (S108P)
2
Puna dužina lakog lanca-humani Kapa
[0110]
[0111] Antitela i fragmenti koji vezuju antigen prikazanog opisa sadrže imunoglobulinske lance koji uključuju aminokiselinske sekvecne koje su ovde prikazane kao i ćelijske i in vitro post-translacione modifikacije antitela. Na primer, prikazani opis obuhvata antitela i njegove fragmente koji vezuju antigen koji se specifično vežu za TMPRSS2 koji sadrži teški i/ili laki lanac aminokiselinskih sekvenci ovde datih (npr., CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 i/ili CDR-L3) kao i antitela i fragmenate u kojima jedan ili više aminokiselinskih ostataka je glikozilovano, jedan ili više Asn ostatak je deamidovan, jedan ili više ostataka (npr., Met, Trp i/ili His) je oksidovano, N-terminalni Gln je piroglutamat (piroE) i/ili C-terminal Lizin fali .
[0112] U prikazanom pronalasku, obezbeđen je protein koji vezuje antigen koji je humani protein koji vezuje antigen koji se specifično vezuje za humani TMPRSS2 i koji je antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, i gde protein koji vezuje antigen sadrži:
promenjivi region teškog lanca imunoglobulina koji sadrži
(a) CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: G F T F S S Y G (SEQ ID NO: 6),
(b) CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: I W N D G S Y V (SEQ ID NO: 8), i
(c) CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: A R E G E W V L Y Y F D Y (SEQ ID NO: 10); i
promenjivi region lakog lanca imunoglobulina koji sadrži
(a) CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: Q S I S S W (SEQ ID NO: 12),
(b) CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: K A S (SEQ ID NO: 14), i
(c) CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: Q Q Y N S Y S Y T (SEQ ID NO: 16).
[0113] Prikazani pronalazak takođe obezbeđuje sud (npr., plastičnu ili staklenu fiolu, npr., sa poklopcem ili hromatografsku kolonu, šuplju iglu ili cilinder šprica) koji sadrži anti-TMPRSS2 protein koji vezuje antigen prema prikazanom pronalasku, npr., H1H7017N ili H4H7017N.
2
[0114] Prikazani opis takođe obezbeđuje injekcioni uređaj koji sadrži jedan ili više proteina koji vezuju antigene (npr., antitelo ili fragment koji vezuje antigen) koji se vezuju specifično za TMPRSS2, npr., H4H7017N ili H1H7017N, ili njegovu farmaceutskua kompoziciju. Injekcioni uređaj može biti spakovan u kit. Injekcioni uređaj je uređaj koji unosi supstancu u telo subjekta parenteralnim putem , npr., intramuskularno, subkutanozno ili intravenski. Na primer, injekcioni uređaj može biti špric (npr., prethodno napunjen sa farmaceutskom kompozcijom, kao što je autoinjektor) koji, na primer, obuhvata cilindar ili cev za držanje tečnosti koja se injektuje (npr., sadrži antitelo ili fragment ili njegovu farmaceutsku kompoziciju ), iglu za sastavljanje kože i/ili krvnog suda za injekciju fluida; i klip za guranje tečnosti iz cilindra i kroz otvor igle. Injekcioni uređaj koji sadrži protein koji vezuje antigen, npr., antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, iz kombinacije prema prikazanom opisu, ili njegova farmaceutska kompozicija može biti intravenski (IV) injekcioni uređaj . Takav uređaj može sadržati protein koji vezuje antigen ili njegovu farmaceutsku kompoziciju u kanili ili troakaru/igli koji može biti povezan na cev koja može biti privezana za kesu ili rezervoar koji drži tečnost (npr., fiziološki rastvor soli) koji se unosi u telo subjekta preko kanile ili troakara/igle. Antitelo ili fragment ili njegova farmaceutska kompozicija mogu, u jednom aspektu opisa, biti uneti u jedan uređaj onda kada troakar i kanila su umetnuti u venu subjekta i troakar je uklonjen iz umetnute kanile. IV uređaj može, na primer, biti unet u perifernu venu (npr., u dlan ili ruku); gornja vena cava ili donja vena cava, ili unutar desne pretkomore srca (npr., centralno IV); ili u subkaviju, unutrašnju vratnu, ili femoralnu venu ili, na primer, napred ka srcu dok ne stigne do gornje šuplje vene ili desne predkomore (npr., centralne venske linije). Injekcioni uređaj može biti autoinjektor; injektor pod pritiskom ili spoljašnja infuziona pumpa . Injektor pod pritiskom koristi uski mlaz visokog pritiska tečnosti koja prodire u epidermi da bi ušlo antitelo ili fragment ili njegova farmaceutska kompozicija u telo. Spoljašnje infuzione pumpe su medicinski uređaji koji dostavljaju antitelo ili njegov fragment ili njegovu farmaceutsku kompoziciju u telo subjekta u kontrolisanim količinama. Spoljašnje infuzione pumpe mogu biti pokretane električno ili mehanički . Različite pumpe rade na različite načine, na primer, pumpe šprica zadržavaju tečnost u rezervoaru šprica , i pokretni klip kontroliše davanje tečnosti , elastomerna pumpa zadržava tečnost u rastegljivom balon rezervoaru, i pritisak iz elastični zidova balona pokreće dostavljanje tečnosti. U peristaltičkoj pumpi, set valjaka gura ka dole duž fleksibilnih cevi, gurajući tečnost napred. U višekanalnoj pumpi, tečnosti mogu biti davane iz višestrukih rezervoara pri višestrukim brzinama. Injekcioni uređaji prema prikazanom pronalasku sadrže protein koji vezuje antigen prema prikazanom pronalasku. Injekcioni uređaj prema pronalasku može sadržati kompoziciju prema pronalasku. U jednom izvođenju prema pronalasku, injekcioni uređaj sadrži farmaceutsku kompoziciju prema pronalasku.
[0115] Prikazani opis dalje obezbeđuje postupke za davanje anti-TMPRSS2 proteina koji vezuje antigen prema prikazanom opisu, npr., H4H7017N ili H1H7017N, koji obuhvata uvođenje proteina koji vezuje antigen u telo subjekta (npr., čoveka). Na primer, postupak obuhvata bušenje tela subjekta sa iglom šprica i injektovanje proteina koji vezuje antigen u telo subjekta , npr., u venu, arteriju, tumor, mišićno tkivo ili potokožno tkivo subjekta. U prikazanom pronalasku, obezbeđen je protein koji vezuje antigen prema pronalasku za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije infekcije sa virusom influence kod subjekta kome je to potrebno, koji obuhvata davanje terapeutski efikasne količine pomenutog proteina koji vezuje antigen.
2
Dobijanje humanih antitela
[0116] Postupci za stvaranje humanih antitela u miševima su poznati u oblasti tehnike. Bilo koji takvi postupci mogu biti korišćeni u kontekstu prema prikazanom pronalasku da se dobiju humana antitela koja se specifično vezuju za TMPRSS2. Imunogen koji sadrži bilo koji od sledećih može biti korišćen za stvaranje antitela na TMPRSS2. U izvesnim aspektima prema opisu, antitela prema opisu su dobijena iz miševa imuniziranih sa prirodnim TMPRSS2 lancem pune dužine, ili sa živim atenuiranim ili inaktiviranim virusom, ili sa DNK koji kodira protein ili njegov fragment. Alternativno, TMPRSS2 protein ili njegov fragment mogu biti dobijeni pomoću standarnih biohemijskih tehnika i modifikovani i korišćeni kao imunogeni. U jednom aspeku opisa, imunogen je rekombinanto dobijen TMPRSS2 protein ili njegov fragment . U izvesnim aspektima opisa, imunogen može biti TMPRSS2 polipeptidna vakcina . U izvesnim aspektivma, jedna ili više pomoćnih injekcija može biti dato. U izvesnim aspektima, imunogen može biti rekombinantni TMPRSS2 polipeptid eksprimovan u E. coli ili u bilo kojoj drugog eukariotskoj ćeliji ili ćeliji sisara kao što su ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) .
[0117] Pomoću VELOCIMMUNE® tehnologije (videti, na primer, US 6,596,541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®) ili bilo koji drugi poznati postupak za dobijanje monoklonalnih antitela, visoko afinitetnih himernih antitela na TMPRSS2 mogu biti inicijalno izolovana koja imaju humani promenjivi region i mišji konstanti region. VELOCIMMUNE® tehnologija obuhvata staranje transgenog miša koji ima genom koji sadrži promenjive regione humanog teškog i lakog lanca operativno vezane za endogene mišje konstantre lokuse konstatnog regiona kao odgovor na antigenu stimulaciju. DNK koji kodira promenjive regione teškog lanca i lakog lanca antitela su izolovani i operativno vezana za DNK koji kodira konstantne regione humanog teškog i lakog lanca . DNK je zatim eksprimovan u ćeliji koja je u stanju da eksprimuje potpuno humano antitelo.
[0118] Generalno, VELOCIMMUNE® miš je izazivan sa antigenom od interesa, i limfne ćelije (kao što su B-ćelije) su regenerisane iz miševa koji eksprimuju antitela. Limfne ćelije mogu biti spojene sa ćelijskom linijom mijeloma da bi se dobile besmrtne ćelije linije hibridoma, i takve ćelijske linije hibridoma su odvajane i odabirane da se identifikuju ćelijske linije hibridoma koje proizvode antitela specifičina za antigen od interesa . DNK koji kodira promenjive regione teškog lanca i lakog lanca mogu biti izolovane i vezane za željene konstantne regione izotipa teškog i lakog lanca . Takav protein antitela može biti dobijen u ćeliji, kao što je CHO ćelija. Alternativno, DNK kodira himerna antiela specifična za antigen ili promenjive domene lakog i teškog lanca mogu biti izvolovani direktno uz limfocite specifične za antigen.
[0119] Inicijalno, himerna antitela visokog afiniteta su izolovana i imaju humani promenjivi region i mišji konstanti region. Kao i dole u eksperimentalnom delu, antitela su karakterisana i odabirana prema poželjnim karakteristima, uključujući afinitetet, selektivnost, epitop, itd. Mišji konstantni regioni su zamenjeni sa željenim humanim konstantim regionom da bi se stvori potpuno humano antitelo, na primer prirodni ili modifikovani IgG1 ili IgG4. Dok izabrani konstantni region može varirati prema specifičnoj upotrebu, visokoafinitetno vezivanje antigena i ciljane karakteristike specifičnosti zaostaju u promenjivom regionu .
Anti-TMPRSS2 Antitela koja obuhvataju Fc varijante
[0120] Prema izvesnim aspektima prikazanog opisa, anti-TMPRSS2 proteini koji vezuju antigen, npr., antitela ili fragmenti koji vezuju antigen, su obezbeđenja i sadrže Fc domen koji sadrži jednu ili više
2
mutacija, koje na primer, pospešuju ili smanjuju vezivanje antitela za FcRn receptor, npr., pri kiselom pH pri poređenju sa neutralnim pH. Na primer, prikazani opis obuhvata anti-TMPRSS2 antitela koja sadrže mutaciju u CH2 ili CH3 regionu Fc domena, gde mutacija(e) povećava(ju) afinitet Fc domena za FcRn u kiseloj sredini (npr., u endozomu gde su pH opsezi od oko 5.5 do oko 6.0). Takve mutacije mogu dovesti do povećanja u poluživotu u serumu antitela kada se daje životinji. Neograničavajući primeri takvih Fc modifikacija uključuju, npr., modifikaciju na položaju 250 (npr., E or Q); 250 i 428 (npr., L ili F); 252 (npr., L/Y/F/W or T), 254 (npr., S or T), i 256 (npr., S/R/Q/E/D or T); ili modifikaciju na položaju 428 i/ili 433 (npr., H/L/R/S/P/Q ilir K) i/ili 434 (npr., A, W, H, F ili Y [N434A, N434W, N434H, N434F ili N434Y]); ili modifikaciju na položaju 250 i/ili 428; ili modifikaciju na položaju 307 ili 308 (npr., 308F, V308F), i 434. U jednom slučaju, modifikaciju čine 428L (npr., M428L) i 434S (npr., N434S) modifikacija; 428L, 2591 (npr., V259I), i 308F (npr., V308F) modifikacija; 433K (npr., H433K) i 434 (npr., 434Y) modifikacija; 252, 254, i 256 (npr., 252Y, 254T, i 256E) modifikacija; 250Q i 428L modifikacija (npr., T250Q i M428L); i 307 i/ili 308 modifikacija (npr., 308F ili 308P). U još jednom slučaju, modifikacija sadrži 265A (npr., D265A) i/ili 297A (npr., N297A) modifikaciju.
[0121] Na primer, prikazani opis obuhvata anti-TMPRSS2 proteine koji vezuju antigen, npr., antitela ili fragmente koji vezuju antigen, koja sadrže Fc domen koji sadrži jedan ili više parova ili grupa mutacija izabranih iz grupe koju čine : 250Q i 248L (npr., T250Q i M248L); 252Y, 254T i 256E (npr., M252Y, S254T i T256E); 428L i 434S (npr., M428L i N434S); 2571 i 3111 (npr., P257I i Q311I); 257I i 434H (npr., P257I i N434H); 376V i 434H (npr., D376V i N434H); 307A, 380A i 434A (npr., T307A, E380A i N434A); i 433K i 434F (npr., H433K i N434F).
[0122] Anti-TMPRSS proteini koji vezuju antigen, npr., antitela i njegove fragmente koji vezuju antigen, koji sadrže a VHi/ili VLkoji su ovde dati sadrže bilo koje moguće kombinacije gore navedenig mutacija Fc domena , su obuhvaćene obimom prikazanog opisa.
[0123] Prikazani opis takođe obuhvata anti-TMPRSS2 proteine koji vezuje antigen, antitela ili fragmente koji vezuju antigen, koji sadaže ovde prikazane VHi himerne konstantne regione teškog lanca (CH) , gde himerni CHregion sadrži segmente koji potiču od CHregiona više od jednog izotipa imunoglobulina. Na primer, antitela mogu saržati himerni CHregion koji sadrži deo ili sve CH2 domene koji potiču iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4 molekula, kombinovane sa delom ili svim CH3 domenima koji potiču iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4 molekula. Antitela mogu sadržati himerni CHregion koji ima himerni zglobini region. Na primer, himerni zglob može sadržati aminokiselinsku sekvencu "gornjeg zgloba" (aminokiselinske ostatke od položaja 216 do 227 prema EU obeležavanju brojeva) koji potiču iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4 regiona zgloba, kombinovanog sa sekvencom "donjeg zgloba" (aminokiselinski ostaci iz položaja 228 do 236 prema EU obeležavanju brojeva) izvedenih iz humanog IgG1, humanog IgG2 ili humanog IgG4 regiona zgloba. Prema izvesnim slučajevima, himerni region zgloba sadrži aminokiselinski ostatak koji potiče iz humanog IgG1 ili humane IgG4 gornjeg zgloba i aminokiselinskih ostataka koji potiču iz humanog IgG2 nižeg zgloba. Antitelo koje sadrži himerni CHregion kako je ovde opisan, u izvesnim slučajevima pokazuje modifikovani Fc efektor koji funkcioniše bez da neželjeno utiče na terapeutske ili farmakokinetičke osobine antitela. (Videti, npr., WO2014/022540).
Imunokonjugati
[0124] Opis obuhvata anti-TMPRSS2 proteine koji vezuju antigen, npr., antitela ili fragmente koji vezuju antigen, konjugovane za drugi deo, npr., terapeutski deo ( "imunokonjugat"), kao što je toksoid ili anti-
2
virusni lek za lečenje infekcije virusom influence . Na primer, anti-TMPRSS2 antitelo ili fragment može biti konjugovan sa bilo kojim drugim ovde prikazanim terapeutskih sredstvima . Kako je ovde korišćen, izraz "imunokonjugat" odnosi se na protein koji vezuje antigen, npr., na antitelo ili fragment koji vezuje antigen, koj je hemijski ili biološki povezan sa radioaktivnim sredstvom, citokinom, interferonom, ciljanim ili reporterskim delom, enzimom, peptidom ili proteinom ili terapeutskim sredstvom. Protein koji vezuje antigen može biti vezan za radioaktivno sredstvo, citokin, interferon, ciljani ili reporterski deo, enzim, peptid ili terapeutsko sredstvo na bilo kom mestu duž molekula dokle god je u stanju da se veže za cilj (TMPRSS2). Primeri imunokonjugata uključuju antitelo-lek i fuzione proteine antitelotoksin. U jednom slučaju, sredstvo može biti drugo, različito antitelo koje se specifčno veže za TMPRSS2. Tip terapeutskog dela koji može biti konjugovan za anti-TMPRSS2 protein koji vezuje antigen (npr., antitelo ili fragment) će uzeti u obzir stanje koje se leči i željeni terapeutski efekat koji se postiže. Videti, npr., Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp.243-56 (Alan R. Liss, Inc.1985); Hellstrom et al., "Antitela For Drug Delivery", Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibodies Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", Monoclonal Antibodies 1984: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antitelo In Cancer Therapy", Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp.303-16 (Academic Press 1985), i Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antitelo-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982).
Višespecifična antitela
[0125] Prikazani opis obuhvata anti-TMPRSS2 proteine koji vezuju antigen, npr., antitela i njegove fragmente koji vezuju antigen, kao i postupke za njihovu upotrebu i postupke za dobijanje takvih protena koji vezuju antigen. Izraz "anti-TMPRSS2" proteini koji vezuju antigene, npr., antitela ili fragmenti koji vezuju antigen, uključuje višespecifične (npr., bispecifične ili biparatopne) molekule koji obuhvataju bar jedan prvi domen koji vezuje antigen koji se specifično veže za TMPRSS2 (npr., domen koji vezuje antigen iz H1H7017N ili H4H7017N) i bar jedan drugi domen koji vezuje antigen za različiti antigen ili epitop u TMPRSS2 koji je različit po tome od prvog domena koji vezuje antigen (npr., influenze HA kao što je domen koji vezuje antigen iz H1H14611 N2,H1H14612N2 ili H1H11729P). Opciono, prvi i drugi epitopi se mogu preklapati. Alternativno, prvi i drugi epitopi se ne preklapaju. Na primer, u jednom izvođenju prema pronalasku, višespecifično antitelo je bispecifično IgG antitelo (npr., IgG1 ili IgG4) koje obuhvata prvi domen za vezivanje antigena koji se specifčno veže za TMPRSS2 uključujući teški i laki lanac imunoglobulina iz H1H7017N ili H4H7017N, i drugi domen koji vezuje antigen koji se specifčno veže za influencu HA (koji sadrži različiti laki i teški lanac imunoglobulina kao što je iz H1H14611N2, H1H14612N2 ili H1H11729P).
[0126] "H1H7017N" uključuje višespecifične molekule, npr., antitela ili fragmente koji vezuju antigen, koji uključuju HCDRs i LCDRs, VHi VL, ili HC i LC iz H1H7017N (uključujući njegove varijante koje su ovde prikazane).
[0127] "H4H7017N" uključuje višespecifične molekule, npr., antitela ili fragmente koji vezuju antigen, koji uključuju HCDRs i LCDRs, VHi VL, ili HC i LC iz H4H7017N (uključujući njegove varijante koje su ovde prikazane).
[0128] U jednom izvođenju prema pronalasku, domen koji vezuje antigen koji se specifčno veže za TMPRSS, koji može biti uključen u višespecifični molekul, obuhvata :
(1)
(i) sekvencu promenjivog domena teškog lanca koja sadrži CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 6, CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 8, i CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 10, i
(ii) sekvencu promenjivog domena lakog lanca koja sadrži CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 12, CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 14, i CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 16;
ili,
(2)
(i) sekvencu promenjivog domena teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 2, i
(ii) sekvencu promenjivog domena lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 4;
ili,
(3)
(i) sekvencu teškog lanca imunoglobulina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 17 ili 19, i
(ii) sekvencu lakog lanca imunoglobulina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 18.
[0129] U izvođenju prema pronalasku, višespecifično antitelo ili fragment uključuje više od dva različite specifičnosti vezivanja (npr., trospecifični molekul), na primer, jedan ili više dodatnih domena koji vezuju antigen koji su isti ili različiti od prvog i/ili drugog domena koji se vezuje za antigen.
[0130] Na primer, višespecifični molekul može da sadrži, pored mesta za vezivanje antigena koji se specifično veže za TMPRSS2, mesto vezivanja antigena koje se specifčno veže za influencu HA izabranu iz antitela izabranog iz grupe koju čine: H1H14611N2; H1H14612N2; H1H11723P; H1H11729P; H1H11820N; H1H11829N; H1H11829N2; H2aM11829N; H2M11830N; H1H11830N2; H1H11903N; H1H14571N; H2a14571N ; H1H11704P; H1H11711P; H1H11714P; H1H11717P; H1H11724P; H1H11727P; H1H11730P2; H1H11731P2; H1H11734P2; H1H11736P2; H1H11742P2; H1H11744P2; H1H11745P2; H1H11747P2; H1H11748P2; H1H17952B; H1H17953B; H1H17954B; H1H17955B; H1H17956B; H1H17957B; H1H17958B; H1H17959B; H1H17960B; H1H17961B; H1H17962B; H1H17963B; H1H17964B; H1H17965B; H1H17966B; H1H17967B; H1H17968B; H1H17969B; H1H17970B; H1H17971B; H1H17972B; H1H17973B; H1H17974B; H1H17975B; H1H17976B; H1H17977B; H1H17978B; H1H17979B; H1H17980B; H1H17981B; H1H17982B; H1H17983B; H1H17984B; H1H17985B; H1H17986B; H1H17987B; H1H17988B; H1H17989B; H1H17990B; H1H17991B; H1H17992B; H1H17993B; H1H17994B; H1H17995B; H1H17996B; H1H17997B; H1H17998B; H1H17999B; H1H18000B; H1H18001B; H1H18002B; H1H18003B; H1H18004B;
1
H1H18005B; H1H18006B; H1H18007B; H1H18008B; H1H18009B; H1H18010B; H1H18011B; H1H18012B; H1H18013B; H1H18014B; H1H18015B; H1H18016B; H1H18017B; H1H18018B; H1H18019B; H1H18020B; H1H18021B; H1H18022B; H1H18023B; H1H18024B; H1H18025B; H1H18026B; H1H18027B; H1H18028B; H1H18029B; H1H18030B; H1H18031B; H1H18032B; H1H18033B; H1H18034B; H1H18035B; H1H18037B; H1H18038B; H1H18039B; H1H18040B; H1H18041B; H1H18042B; H1H18043B; H1H18044B; H1H18045B; H1H18046B; H1H18047B; H1H18048B; H1H18049B; H1H18051B; H1H18052B; H1H18053B; H1H18054B; H1H18055B; H1H18056B; H1H18057B; H1H18058B; H1H18059B; H1H18060B; H1H18061B; H1H18062B; H1H18063B; H1H18064B; H1H18065B; H1H18066B; H1H18067B; H1H18068B; H1H18069B; H1H18070B; H1H18071B; H1H18072B; H1H18073B; H1H18074B; H1H18075B; H1H18076B; H1H18077B; H1H18078B; H1H18079B; H1H18080B; H1H18081B; H1H18082B; H1H18083B; H1H18084B; H1H18085B; H1H18086B; H1H18087B; H1H18088B; H1H18089B; H1H18090B; H1H18091B; H1H18092B; H1H18093B; H1H18094B; H1H18095B; H1H18096B; H1H18097B; H1H18098B; H1H18099B; H1H18100B; H1H18101B; H1H18102B; H1H18103B; H1H18104B; H1H18105B; H1H18107B; H1H18108B; H1H18109B; H1H18110B; H1H18111B; H1H18112B; H1H18113B; H1H18114B; H1H18115B; H1H18116B; H1H18117B; H1H18118B; H1H18119B; H1H18120B; H1H18121B; H1H18122B; H1H18123B; H1H18124B; H1H18125B; H1H18126B; H1H18127B; H1H18128B; H1H18129B; H1H18130B; H1H18131B; H1H18132B; H1H18133B; H1H18134B; H1H18135B; H1H18136B; H1H18137B; H1H18138B; H1H18139B; H1H18140B; H1H18141B; H1H18142B; H1H18143B; H1H18144B; H1H18145B; H1H18146B; H1H18147B; H1H18148B; H1H18149B; H1H18150B; H1H18151B; H1H18152B; H1H18153B; H1H18154B; H1H18155B; H1H18156B; H1H18157B; H1H18158B; H1H18159B; H1H18160B; H1H18161B; H1H18162B; H1H18163B; H1H18164B; H1H18165B; H1H18166B; H1H18167B; H1H18168B; H1H18169B; H1H18170B; H1H18171B; H1H18172B; H1H18173B; H1H18174B; H1H18175B; H1H18176B; H1H18177B; H1H18178B; H1H18179B; H1H18180B; H1H18181B; H1H18182B; H1H18183B; H1H18184B; H1H18185B; H1H18186B; H1H18187B; H1H18188B; H1H18189B; H1H18190B; H1H18191B; H1H18192B; H1H18193B; H1H18194B; H1H18195B; H1H18196B; H1H18197B; H1H18198B; H1H18199B; H1H18200B; H1H18201B; H1H18202B; H1H18203B; H1H18204B; H1H18205B; H1H18206B; H1H18207B; H1H18208B; H1H18209B; H1H18210B; H1H18211B; H1H18212B; H1H18213B; H1H18214B; H1H18216B; H1H18217B; H1H18218B; H1H18219B; H1H18220B; H1H18221B; H1H18222B; H1H18223B; H1H18224B; H1H18225B; H1H18226B; H1H18227B; H1H18228B; H1H18229B; H1H18230B; H1H18231B; H1H18232B; H1H18233B; H1H18234B; H1H18235B; H1H18236B; H1H18237B; H1H18238B; H1H18239B; H1H18240B; H1H18241B; H1H18242B; H1H18243B; H1H18244B; H1H18245B; H1H18246B; H1H18247B; H1H18248B; H1H18249B; H1H18250B; H1H18251B; H1H18252B; H1H18253B; H1H18254B; H1H18255B; H1H18256B; H1H18257B; H1H18258B; H1H18259B; H1H18261B; H1H18262B; H1H18263B; H1H18264B; H1H18265B; H1H18266B; H1H18267B; H1H18268B; H1H18269B; H1H18270B; H1H18271B; H1H18272B; H1H18274B; H1H18275B; H1H18276B; H1H18277B; H1H18278B; H1H18279B; H1H18280B; H1H18281B; H1H18282B; H1H18283B; H1H18284B; H1H18285B; H1H18286B; H1H18287B; H1H18288B; H1H18289B; H1H18290B; H1H18291B; H1H18292B; H1H18293B; H1H18294B; H1H18295B; H1H18297B; H1H18298B; H1H18299B; H1H18300B; H1H18301B; H1H18302B; H1H18303B; H1H18304B; H1H18305B; H1H18306B; H1H18307B; H1H18308B; H1H18309B; H1H18310B; H1H18311B; H1H18312B; H1H18313B; H1H18314B; H1H18315B; H1H18316B; H1H18317B; H1H18318B; H1H18319B; H1H18320B; H1H18321B; H1H18322B; H1H18323B; H1H18324B; H1H18325B; H1H18326B;
2
H1H18327B; H1H18328B; H1H18329B; H1H18330B; H1H18331B; H1H18332B; H1H18333B; H1H18334B; i H1H18335B; kao što je prikazano u objavi međunarodne patentne prijave br. WO2016/100807 (npr., CDR-Hs, VHili njegov teški lanac; i CDR-Ls, VLilinjegov laki lanac).
[0131] Višespecifični molekul može sadržati, pored mesta koje vezuje antigen koji se specifčno veže za TMPRSS2, mesto koje vezuje antigen koji se specifično veže za HA protein influence Grupe II , npr., koji sadrži VHi VLiz H1H14611N2 (npr., SEQ ID Nos: 24 i 28); ili teški lanac imunoglobulina koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 iz H1H14611 N2 (npr., SEQ ID NOs: 25-27) i laki lanac imunoglobulina koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 of H1H14611N2 (npr., SEQ ID NOs: 29-31).
[0132] Višespecifični molekul može da sadrži, dodatno mesto koje vezuje antigen koji se specifčno veže za TMPRSS2, mesto koje vezuje antigen koji se specifčno veže za HA protein influence grupe II , npr., koji sadrži VHi VLiz H1H14612N2 (npr., SEQ ID Nos: 40 i 44); ili teški lanac imunoglobulina koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 iz H1H14612N2 (npr., SEQ ID NOs: 41-43) i laki lanac imunoglobulina koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 iz H1H14612N2 (npr., SEQ ID NOs: 45-47).
[0133] Višespecifični molekul može da sadrži, pored mesta koje vezuje antigen koji se specifčno veže za TMPRSS2, mesto koje vezuje antigen koji se specifčno veže za HA protein influence grupe I , npr., koj sadrži VHi VLiz H1H11729P (npr., SEQ ID Nos: 32 i 36); ili teški lanac imunoglobulina koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 iz H1H11729P (npr., SEQ ID NOs: 33-35) i laki lanac imunoglobulina koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 iz H1H11729P (npr., SEQ ID NOs: 37-39).
[0134] U jednom aspektu opisa, bispecifični fragment koji vezuje antigen sadrži prvi scFv (npr., koji sadrži VHi VLizf H1H7017N ili H4H7017N) koji ima specifičnost vezivanja za prvi epitop (npr., TMPRSS2) i drugi scFv (npr., koji sadrži VHi VLanti-influence HA antitela ) koji ima specifičnost vezivanja za drugi, različiti epitop. Na primer, u jednom aspektu opisa, prvi i drugi scFv su vezani sa grupom za povezivanje, npr., peptidnom grupom za povezivanje (npr., GS grupom za povezivanje kao što je (GGGGS)n(SEQ ID NO: 48) gde n je, na primer, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10). Drugi bispecifični fragmenti koji vezuju antigen obuhvataju F(ab)2iz bispecifičnih IgG antitela koja sadrže teški i laki lanac CDRs iz H1H7017N ili H4H7017N i drugo antitelo koje se vezuje za različiti epitop.
Terapeutski postupci
[0135] Prikazani opis obezbeđuje postupke za lečenje ili prevenciju virusnih infekcija ili kancera (npr., kancera prostate) davanjem terapeutski efikasne količine anti-TMPRSS2 proteina koji vezuje antigen, npr., antitela ili fragmenta koji vezuje antigen, (npr., H1H7017N ili H4H7017N) subjektu (npr., čoveku) kome je to potebno takvo lečenje ili prevencija . U poželjnom izvođenju, obezbeđen je protein koji vezuje antigen prema pronalasku za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije infekcije sa virusom influence kod subjekta kome je to potrebno, koji obuhvata davanje terapeutski efikasne količine pomenutog proteina koji vezuje antigen.
[0136] Infekcija virusa influence može biti lečena ili sprečena, kod subjekta, davanjem anti-TMPRSS2 proteina koji vezuje antigen prema prikazanom pronalasku subjektu. Virusi influence su klasifikovani u tipove A, B i C na bazi njihovih proteina jezgra. Podtipovi virusa A influence su određeni pomoću glikopretina omotača koji imaju aktivnost ili hemaglutinina (HA) ili neuraminidaza (NA). Postoji nekoliko potipova HA (npr., HA1, HA2, HA3, HA4, HA5, HA6, HA7, HA8, HA9, HA10, HA11, HA12, HA13, HA14, HA15, HA16, HA17 ili HA18- ovi podtipovi mogu biti obeleženi sa H1, H2, H3, itd.) i NA podtipovi (npr., NA1, NA2, NA3, NA4, NA5, NA6, NA7, NA8, NA9, NA10 ili NA11-ovi podtipovi mogu biti obeleženi kao N1, N2, N3, itd.) virusa A influence koji su korišćeni da se odredi podtip influence A. Na primer, H1N1 i H3N2 virusa A influence su uobčajeno poznati humani patogeni. Ljudi se uobičajeno inficiraju virusima podtipova H1, H2 ili H3, i N1 ili N2. Prikazani opis obuhvata postupke za lečenje ili prevenciju infekcija sa ovde diskutovanim podtipom virusa influence . Višespecifično antitelo i njegovi fragmenti koji vezuju antigen koji se vezuju za TMPRSS2, u jednom aspektu opisa, takođe se vezuju za HA /i/ili za NA, npr., podtipa ovde prikazanog.
[0137] Efikasna ili terapeutski efikasna doza anti-TMPRSS2 proteina koji vezuje antigen, npr., antitela ili fragmenta koji vezuje antigen (npr., H1H7017N ili H4H7017N), za lečenje ili prevenciju virusne infekcije odnosi se na količinu antitela ili fragmenta dovoljnu da ublaži jedan ili više znakova i/ili simptoma infekcije u lečenju subjekta, bilo izazivanjem regresije ili eliminicije takvih znakova i/ili simptoma ili inhibiranjem napredovanja takvih znakova i/ili simptoma. Dozna količina koja se daje može zavisiti od godina i veličine subjekta , ciljane bolesti, stanja, načina davanja, i slično. U izvođenju prema pronalasku, efikasna ili terapeutski efikasna doza antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen prema prikazanom pronalasku, za lečenje ili prevenciju virusne infekcije , npr., kod odraslog humanog subjekta, je oko 0.01 do oko 200 mg/kg, npr., do oko 150 mg/kg. U izvođenju prema pronalasku, doza j do oko 10.8 ili 11 grama (npr.,oko 1,2,3,4,5,6, 7,8,9,10 ili 11 grama). U zavisnosti od ozbiljnosti infekcije , učestalost i trajanje lečenja može biti prilagođeno. U izvesnim izvođenjima, protein koji vezuje antigen prema prikazanom pronalasku može biti davan u početnoj dozi , praćenoj sa jednim ili više sekundarnih doza. U izvesnim izvođenjima, inicijalna doza može biti praćena davanjem druge ili više naknadnih doza antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen u količini koja može biti približno ista ili manja od one inicijalne doze, gde naknadne doze su odvojene bar 1 dan do 3 dana; bar jednom nedeljom, bar 2 nedelje; bar 3 nedelje; bar 4 nedelje; bar 5 nedelja; bar 6 nedelja; bar 7 nedelja; bar 8 nedelja; bar 9 nedelja; bar 10 nedelja; bar 12 nedelja; ili bar 14 nedelja.
[0138] Kako je ovde korišćen, izraz "subjekat" odnosi se na sisara (npr., pacova, miša, mačku, psa, kravu, ovcu, konja, kozu, zeca), poželjno čoveka, na primer, kome je potreba prevencija i/ili lečenje bolesti ili poremećaja kao što je virusna infeckija ili kancer . Subjekat može imati virusnu infekciju, npr., infekciju influence, ili biti predisponiran za razvoj infekcije . Subjekti predisponirani za razvoje infekcije, ili subjekti koji mogu biti u povišenom riziku za dolazak u kontakt sa infekcijom (npr., virusa influence), obuhvataju subjekta sa ugroženim imunim sistemom zbog autoimune bolesti, subjekti koji primaju imunosupresivnu terapiju (na primer, posle transplantacije ograna), subjekti pogođeni sa humanim imunodeficijentnim sindromom (HIV) ili stečenim imunodeficijentnim sindromom (AIDS), subjekti sa oblicima anemije koji troše ili uništavaju bela krvna zrca, subjekti koji primaju terapije zračenja ili hemoterapije, ili subjekti koji su pogođeni sa inflamtornim poremećajem. Dodatno, subjekti koji su veoma mladi (npr., starosti 5 godina ili mlađi) ili stari (npr., starosti 65 godina ili stariji) su u povećanom riziku. Pored toga, subjekat može biti u riziku od dovođenja u kontakt virusne infekcije usled izbijanja bolesti, npr. subjekt živi u gusto naseljenom gradu ili u velikoj blizini subjekta koji imaju potvrđene ili suspektne infekcije virusa, ili izbor zanimanja, npr. radnik u bolnici, farmaceutski istraživač, putnik u zaraženu oblast , ili česti avionsi putnik .
[0139] "Lečenje" ili "tretiranje" označava davanje anti-TMPRSS2 proteina koji vezuje antigen, npr., antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema prikazanom pronalasku (npr., H1H7017N ili H4H7017N), subjektu koji ima jedan ili više znaka ili simptoma bolesti ili infekcije, npr., virusna infekcija, za koju je
4
protein koji vezuje antigen efikasan kada se daje subjektu u efikasnoj ili terapeutski efikasnoj količini ili dozi (kako je ovde diskutovano).
[0140] Prikazani opis takođe obuhvata profilaktično davanje anti-TMPRSS2 proteina koji vezuje antigen, npr., antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema prikazanom pronalasku (npr., H1H7017N or H4H7017N), subjektu koji je u riziku od virusne infekcije tako da sprečava takvu infekciju. Pasivna imunoprofilaksa zasnovana na antitelu je dokazana kao efikasna strategija za sprečavanje virusne infekcije kod subjekta. Videti npr., Berry et al., Passive broad-spectrum influenza immunoprophylaxis. Influenza Res Treat.2014 ;2014:267594. Epub 2014 Sep 22; and Jianqiang et al., Passive immune neutralization strategies for prevention and control of influenza A infections, Immunotherapy. 2012 February ; 4(2): 175-186; Prabhu et al., Antivir Ther. 2009; 14(7):911-21, Prophylactic and therapeutic efficacy of a chimeric monoclonal antibody specific for H5 hemagglutinin against lethal H5N1 influenza. "Sprečiti" ili "sprečavanje" označava davanje anti-TMPRSS2 proteina koji vezuje antigen, npr., antitelo ili fragment koji vezuje antigen prema prikazanom pronalasku (npr., H1H7017N ili H4H7017N), subjektu da bi se inhibirala manifestacija bolesti ili infekcije (npr., virusne infekcije) u telu subjekta, za koji je protein koji vezuje antigen efikasan kada se daje subjektu u efikasnoj ili terapeutskoj količini ili dozi (kako je ovde diskutovano).
[0141] U izvođenju prema pronalasku, znak ili simptom virusne infekcije kod subjekta je opstanak ili proliferacija virusa u telu subjekta, npr., kako je određeno sa testom virusnog titra (npr., propagacija virusne influence u pilećem jajetu sa embrionom ili test hemaglutinacije virusa influence ). Drugi znaci i simptomi virusnih infekcija su ovde diskutovani.
[0142] Prikazani opis obezbeđuje postupak za lečenje ili prevenciju infekcije (npr., virusa influenze ili infekcije virusa korna) ili za izazivanje regresije ili eliminacije ili inhibicije napredovanja bar jednog znaka ili simptoma virusne infekcije kao što je:
• Groznica ili osećaj groznice/jeze ;
• Kašalj;
• Bol u grlu;
• Curenje ili zapušen nos;
• Kijanje;
• Bolovi u mišićima ili telu;
• Glavobolja;
• Umor (malaksalost);
• povraćanje ;
• diareja;
• Infekcija respiratornog trakta;
• Nelagoda u grudnom košu;
• Kratak dah;
• bronhitis; i/ili
• Upala pljuća,
čiji znak ili simptom je sekundaran virusnoj infekciji, kod subjekta kome je to potrebno (npr., čoveka), davanjem terapeutski efikasne količine anti-TMPRSS2 proteina koji vezuje antigen (npr., H1H7017N ili H4H7017N) subjektu, na primer, injekcijom proteina u telo subjekta .
[0143] Prikazani opis takođe obuhvata postupke lečenja ili prevencije kancera , npr., metastatskog kancera , npr., kancera prostate (npr., koji je karakterisan ekspresijom TMPRSS2:ERG fuzije), kancera debelog creva, kancera pluća, kancera pankreasa, kancera urinarnog trakta, kancera grudi, kancera jajnika, adenokarcinoma prostate, karcinoma bubrežnih ćelija, kolorektalnog adenokarcinoma, adenokarcinoma pluća, karcinoma skvamoznih ćelija pluća i/ili pleuralnog mezotelioma, kod subjekta, davanjem terapeutski efikasne količine TMPRSS2 proteina koji vezuje antigen (npr., H1H7017N ili H4H7017N) subjektu, na primer, injekcijom proteina u telo subjekta . U jednom aspektu opisa, subjektu je takođe davan TMPRSS2 protein koji vezuje antigen zajedno sa drugim terapeutskim sredstvom, na primer, terapeutskim sredstvom protiv kancera. U jednom aspektu opisa, kancer je tumor čije ćelije eksprimuju TMPRSS2 ili njegovu varijantu.
Kombinacije i farmaceutske kompozicije
[0144] Da bi se pripremile farmaceutske kompozicije anti-TMPRSS2 proteina koji vezuje antigene, npr., antitela i njegove fragmente koji vezuju antigen (npr., H1H7017N ili H4H7017N), protein koji vezuje antigen je promešan sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili ekscipijentom. Videti, npr., Remington’s Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1984); Hardman, et al. (2001) Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y.; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y. U prikazanom pronalasku, obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja sadrži protein koji vezuje antigen prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač i, opciono, drugo terapeutsko sredstvo. U izvođenju prema pronalasku, farmaceutska kompozicija je sterilna. Takve kompozicije su deo prikazanog pronalaska.
[0145] Obim prikazanog pronalaska obuhvata suve, npr., osušene smrzavanjem, kompozicije koje sadrže anti-TMPRSS2 proteine koji vezuje antigen, npr., antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen (npr., H1H7017N ili H4H7017N), ili njegovu farmaceutsku kompozicija koju uključuje farmaceutski prihvatljiv nosač ali je suštinski bez vode.
[0146] U drugom aspektu opisa, drugo terapeutsko sredstvo koje je davano subjektu zajedno sa anti-TMPRSS2 proteinom koji vezuje antigen, npr., antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen (npr., H1H7017N ili H4H7017N), ovde opisanim je davano subjektu prema the Physicians’ Desk Reference 2003 (Thomson Healthcare; 57th edition (Nov.1, 2002)).
[0147] Način davanja može varirati. Načini davanja obuhvataju oralni, rektalni, transmukozni, intestinalni, parenteralni, intramuskularni, subkutanozni, intradermalni, intramedularni, intratekalni, direktni intraventrikularni, intravenski, intraperitonealni, intranazalni, intraokularni, inhalacioni, lokalni, kutanozni, transdermalni ili intrarterijski.
[0148] Prikazani opis obezbeđuje opise za davanje anti-TMPRSS2 proteina koji vezuje antigen, npr., antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen (npr., H1H7017N ili H4H7017N), koje obuhvata unošenje proteina u telo subjekta . Na primer, postupak obuhvata prodiranje u telo subjekta sa iglom šprica i injektiranje proteina koji vezuje antigen u telo subjekta, npr., u venu, arteriju, tumor, mišićno tkivo ili subkutano subjektu.
[0149] Prikazani opis obezbeđuje (npr., plastičnu ili staklenu fiolu, npr., sa poklopcem ili hromatografsku kolonu, šuplju iglu ili cilinder šprica) koji sadrži bilo koje anti-TMPRSS2 proteine koji vezuju antigen, npr., njegova antitela ili njegove fragmente koji vezuju antigen (npr., H1H7017N ili H4H7017N), polipeptide (npr., HC, LC,VHili VLiz H1H7017N ili H4H7017N) ili polinukleotide ili vektore ovde prikazane ili njihove farmaceutske kompozicije koje sadrže farmaceutski prihvatljiv nosač. Injekcione uređaje prema prikazanom pronalasku koje sadrže protein koji vezuje antigen prema prikazanom pronalasku. Injekcioni uređaj prema pronalasku može sadržati kompoziciju prema pronalasku. U jednom izvođenju, injekcioni uređaj sadrži farmaceutsku kompoziciju prema pronalasku.
[0150] Anti-TMPRSS2 protein koji vezuje antigen, npr., antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema prikazanom pronalasku (npr., H1H7017N ili H4H7017N), može biti u vezi sa jednim ili više drugim terapeutskih sredstava. Na primer, druga terapeutska sredstva mogu biti antivirusni lekovi i/ili vakcina. Kako je ovde korišćen, izraz "anti-virusni lek " odnosi se na antiinfektivno sredstvo ili terapiju korišćenu za lečenje, prevenciju ili ublažavanje virusne infekcije kod subjekta. Izraz "anti-virusni lek" obuhvata, ali nije ograničen na katjonski steroidni antimikrobni, leupeptin, aprotinin, amantadin, rimantadin, oseltamivir, zanamivir, ribavirin, ili interferon-alfa2b. Postupke za lečenje ili prevenciju virusne (npr., influence) infekcije kod subjekta kome je potreban pomenuti tretmen ili prevencija davanjem H 1 H7017N ili H4H7017N zajedno sa drugim terapeutskim sredstvom su deo prikazanog opisa.
[0151] Na primer, drugo terapeutsko sredstvo može biti vakcina, npr., vakcina influence. Opciono, vakcina je vakcina sa inaktiviranim/ mrtvim virusom, vakcina živog atenuiranog virusa ili vakcina podjedinice virusa.
[0152] Na primer, drugo terapeutsko sredstvo može biti:
(kamostat mezilat);
(nafamostat mezilat);
(bromheksin hidrohlorid (BHH));
(4-(2-aminometil)benzensulfonil fluorid hidrohlorid (AEBSF));
ili
(poliamid). Videti Shen et al. Biochimie 142: 1-10 (2017).
[0153] Opciono, anti-virusni lek je antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji se specifčno veže za virus influenze, npr., influenze HA. Na primer, anti-HA antitelo može biti bilo koje od H1H14611N2; H1H14612N2; H1H11723P; H1H11729P; H1H11820N; H1H11829N; H1H11829N2; H2aM11829N; H2M11830N; H1H11830N2; H1H11903N; H1H14571N; H2a14571N ; H1H11704P; H1H11711P; H1H11714P; H1H11717P; H1H11724P; H1H11727P; H1H11730P2; H1H11731P2; H1H11734P2; H1H11736P2; H1H11742P2; H1H11744P2; H1H11745P2; H1H11747P2; H1H11748P2; H1H17952B; H1H17953B; H1H17954B; H1H17955B; H1H17956B; H1H17957B; H1H17958B; H1H17959B; H1H17960B; H1H17961B; H1H17962B; H1H17963B; H1H17964B; H1H17965B; H1H17966B; H1H17967B; H1H17968B; H1H17969B; H1H17970B; H1H17971B; H1H17972B; H1H17973B; H1H17974B; H1H17975B; H1H17976B; H1H17977B; H1H17978B; H1H17979B; H1H17980B; H1H17981B; H1H17982B; H1H17983B; H1H17984B; H1H17985B; H1H17986B; H1H17987B; H1H17988B; H1H17989B; H1H17990B; H1H17991B; H1H17992B; H1H17993B; H1H17994B; H1H17995B; H1H17996B; H1H17997B; H1H17998B; H1H17999B; H1H18000B; H1H18001B; H1H18002B; H1H18003B; H1H18004B; H1H18005B; H1H18006B; H1H18007B; H1H18008B; H1H18009B; H1H18010B; H1H18011B; H1H18012B; H1H18013B; H1H18014B; H1H18015B; H1H18016B; H1H18017B; H1H18018B; H1H18019B; H1H18020B; H1H18021B; H1H18022B; H1H18023B; H1H18024B; H1H18025B; H1H18026B; H1H18027B; H1H18028B; H1H18029B; H1H18030B; H1H18031B; H1H18032B; H1H18033B; H1H18034B; H1H18035B; H1H18037B; H1H18038B; H1H18039B; H1H18040B; H1H18041B; H1H18042B; H1H18043B; H1H18044B; H1H18045B; H1H18046B; H1H18047B; H1H18048B; H1H18049B; H1H18051B; H1H18052B; H1H18053B; H1H18054B; H1H18055B; H1H18056B; H1H18057B; H1H18058B; H1H18059B; H1H18060B; H1H18061B; H1H18062B; H1H18063B; H1H18064B; H1H18065B; H1H18066B; H1H18067B; H1H18068B; H1H18069B; H1H18070B; H1H18071B; H1H18072B; H1H18073B; H1H18074B; H1H18075B; H1H18076B; H1H18077B; H1H18078B; H1H18079B; H1H18080B; H1H18081B; H1H18082B; H1H18083B; H1H18084B; H1H18085B; H1H18086B; H1H18087B; H1H18088B; H1H18089B; H1H18090B; H1H18091B; H1H18092B; H1H18093B; H1H18094B; H1H18095B; H1H18096B; H1H18097B; H1H18098B; H1H18099B; H1H18100B; H1H18101B; H1H18102B; H1H18103B; H1H18104B; H1H18105B; H1H18107B; H1H18108B; H1H18109B; H1H18110B; H1H18111B; H1H18112B; H1H18113B; H1H18114B; H1H18115B; H1H18116B; H1H18117B; H1H18118B; H1H18119B; H1H18120B; H1H18121B; H1H18122B; H1H18123B; H1H18124B; H1H18125B; H1H18126B; H1H18127B; H1H18128B; H1H18129B; H1H18130B; H1H18131B; H1H18132B; H1H18133B; H1H18134B; H1H18135B; H1H18136B; H1H18137B; H1H18138B; H1H18139B; H1H18140B; H1H18141B; H1H18142B; H1H18143B; H1H18144B; H1H18145B; H1H18146B; H1H18147B; H1H18148B; H1H18149B; H1H18150B; H1H18151B; H1H18152B; H1H18153B; H1H18154B; H1H18155B; H1H18156B; H1H18157B; H1H18158B; H1H18159B; H1H18160B; H1H18161B; H1H18162B; H1H18163B; H1H18164B; H1H18165B; H1H18166B; H1H18167B; H1H18168B; H1H18169B; H1H18170B; H1H18171B; H1H18172B; H1H18173B; H1H18174B; H1H18175B; H1H18176B; H1H18177B; H1H18178B; H1H18179B; H1H18180B; H1H18181B; H1H18182B; H1H18183B; H1H18184B; H1H18185B; H1H18186B; H1H18187B; H1H18188B; H1H18189B; H1H18190B; H1H18191B; H1H18192B; H1H18193B; H1H18194B; H1H18195B; H1H18196B; H1H18197B; H1H18198B; H1H18199B; H1H18200B; H1H18201B; H1H18202B; H1H18203B; H1H18204B; H1H18205B; H1H18206B; H1H18207B; H1H18208B; H1H18209B; H1H18210B; H1H18211B; H1H18212B; H1H18213B; H1H18214B; H1H18216B; H1H18217B; H1H18218B; H1H18219B; H1H18220B; H1H18221B; H1H18222B; H1H18223B; H1H18224B; H1H18225B; H1H18226B; H1H18227B; H1H18228B; H1H18229B; H1H18230B; H1H18231B; H1H18232B; H1H18233B; H1H18234B; H1H18235B; H1H18236B; H1H18237B; H1H18238B; H1H18239B; H1H18240B; H1H18241B; H1H18242B; H1H18243B; H1H18244B; H1H18245B; H1H18246B; H1H18247B; H1H18248B; H1H18249B; H1H18250B; H1H18251B; H1H18252B; H1H18253B; H1H18254B; H1H18255B; H1H18256B; H1H18257B; H1H18258B; H1H18259B; H1H18261B; H1H18262B; H1H18263B; H1H18264B; H1H18265B; H1H18266B; H1H18267B; H1H18268B; H1H18269B; H1H18270B; H1H18271B; H1H18272B; H1H18274B; H1H18275B; H1H18276B; H1H18277B; H1H18278B; H1H18279B; H1H18280B; H1H18281B; H1H18282B; H1H18283B; H1H18284B; H1H18285B; H1H18286B; H1H18287B; H1H18288B; H1H18289B; H1H18290B; H1H18291B; H1H18292B; H1H18293B; H1H18294B; H1H18295B; H1H18297B; H1H18298B; H1H18299B; H1H18300B; H1H18301B; H1H18302B; H1H18303B; H1H18304B; H1H18305B; H1H18306B; H1H18307B; H1H18308B; H1H18309B; H1H18310B; H1H18311B; H1H18312B; H1H18313B; H1H18314B; H1H18315B; H1H18316B; H1H18317B; H1H18318B; H1H18319B; H1H18320B; H1H18321B; H1H18322B; H1H18323B; H1H18324B; H1H18325B; H1H18326B; H1H18327B; H1H18328B; H1H18329B; H1H18330B; H1H18331B; H1H18332B; H1H18333B; H1H18334B; ili H1H18335B; kao što je prikazano u objavi međunardone prijave patenta br. WO2016/100807; ili njegov fragment koji vezuje antigen, npr., gde antitelo ili fragment sadrže laki lanac imunoglobulina koji obuhvata CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 (npr., VLili njegov laki lanac); i teški lanac koji uključuje CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 (npr., VHili njegov teški lanac) bilo kog od prethodnih antitela anti-influenza HA .
[0154] Drugo terapeutsko sredstvo može biti antitelo ili fragment koji vezuje antigen koji se vezuje za protein Grupe II HA influenze kao što je H1H14611N2; ili antitelo ili fragment koji sadrži VHi VLiz H1H14611N2; ili teški lanac imunoglobulina koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 iz H1H14611N2 (npr., SEQ ID NOs: 25-27) i laki lanac imunoglobulina koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 iz H1H14611N2 (npr., SEQ ID NOs: 29-31). "H1H14611N2" odnosi se na bilo koje anti-grupe II HA antitelo koje sadrži takve sekvence.
H1H14611N2
Promenjivi region teškog lanca
[0155]
4
CDR-L1: QSLNSNY (SEQ ID NO: 29)
CDR-L2: GAS (SEQ ID NO: 30)
CDR-L3: QQYGNSPLT (SEQ ID NO: 31)
[0157] Drugo terapeutsko sredstvo može biti antitelo ili fragment koji vezuje antigen koje se vezuje za protein Grupe II HA influenze kao što je H1 H14612N2; ili antitelo ili fragment koji sadrži VHi VLiz H1H14612N2; ili teški lanac imunoglobulina koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 iz H1H14612N2 (npr., SEQ ID NOs: 41-43) i laki lanac imunoglobulina koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 iz H1H14612N2 (npr., SEQ ID NOs: 45-47). "H1H14612N2" odnosi se na bilo koje anti-grupe II HA antitelo koje sadrži takve sekvence.
H1H14612N2
Promenjivi region teškog lanca
[0158]
CDR-H1: GFSFSGFS (SEQ ID NO: 41)
CDR-H2: ISTSGNYM (SEQ ID NO: 42)
CDR-H3: ARGGGYNWNLFDY (SEQ ID NO: 43)
Promenjivi region lakog lanca
[0159]
CDR-L1: QSLNSNY (SEQ ID NO: 45)
CDR-L2: GAS (SEQ ID NO: 46)
CDR-L3: QQYGNSPLT (SEQ ID NO: 47)
[0160] Drugo terapeutsko sredstvo može biti antitelo ili fragment koji vezuje antigen koje se vezuje za protein Grupe I HA influenze kao što je H1H11729P; ili antitelo ili fragment koji sadrži VHi VLiz H1H11729P; ili teški lanac imunoglobulina koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 izf H1H11729P (npr., SEQ ID NOs: 33-35) i laki lanac imunoglobulina koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 iz H1H11729P (npr., SEQ ID NOs: 37-39). "H1H11729P" odnosi se na bilo koje anti-grupe I HA antitelo koje sadrži takve sekvence .
H1H11729P
Promenjivi region teškog lanca
[0161]
CDR-H1: GGTFSSYA (SEQ ID NO: 33)
CDR-H2: IIPIFGTP (SEQ ID NO: 34)
CDR-H3: ARQQPVYQYNMDV (SEQ ID NO: 35)
Promenjivi region lakog lanca
[0162]
CDR-L1: QGIRNN (SEQ ID NO: 37)
CDR-L2: AAS (SEQ ID NO: 38)
CDR-L3: LQYNNYPWT (SEQ ID NO: 39)
[0163] Opciono, drugo terpeutsko sredstvo nije amantadin, rimantadin, oseltamivir, zanamivir, aprotinin, leupeptin, katjonski steroidni antimikrobni lek, vakcina protiv influence (npr., vakcine sa mrtvim, živim, umrtvljenim celim virusom ili njegovim delom ), ili antitelo protv virusa influence (npr., anti-hemaglutininsko antitelo).
[0164] Izraz "zajedno sa" ukazuje da komponente, anti-TMPRSS2 proteina koji vezuje antigen, npr., antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema prikazanom pronalasku, zajedno sa drugim sredstvom kao što je oseltamivir, mogu biti formulisane u jednu kompoziciju, npr., za simultano davanje, ili formulisane odvojeno u dve ili više kompozicija (npr., kitova). Svaka komponenta može biti davana subjektu u različito vreme u odnosu na druge davane komponente; na primer, svako davanje može biti dato nesimultano (npr., odvojeno ili sekvenciono) u intervalima u okviru datog vremenskog perioda. Pored toga, odvojene komponente mogu biti davane subjektu istim ili različitim putem (npr., kada anti-TMPRSS2 antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen.
Kitovi
[0165] Dalje su obezbeđeni kitovi koji obuhvataju jednu ili više komponenti koje uključuju, ali nisu ograničena na, anti-TMPRSS2 protein koji vezuje antigen, npr., antitelo ili fragment koji vezuje antigen kako je ovde diskutovano (npr., H1H7017N ili H4H7017N), zajedno sa jednom ili više dodatnih komponenti uključujući, ali bez ograničenja drugo terapeutsko sredstvo, kako je ovde diskutovano.
Protein koji vezuje antigen i/ili drugo terapeutsko sredstvo mogu biti formulsiane kao jedna kompozicija ili odvojeno dve ili više kompozicija , npr., sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, u farmaceutskoj kompoziciji. U prikazanom pronalasku, obezbeđen je kit koji sadrži protein koji vezuje antigen prema pronalasku i drugo terapeutsko sredstvo, gde kit sadrži protein koji vezuje antigen i drugo terapeutsko sredstvo formulisano kao pojedinačna kompozicja ili odvojene dve ili više kompozicije.
[0166] U jednom slučaju, kit obuhvata anti-TMPRSS2 protein koji vezuje antigen, npr., antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema pronalasku (npr., H1H7017N ili H4H7017N), ili njegovu farmaceutsku kompoziciju u jednom sudu (npr., u sterilnoj staklenoj ili plastičnoj fioli) i drugo terapeutsko sredstvo u drugom kontejneru (npr., u sterilnoj staklenoj ili plastičnoj fioli).
[0167] U drugom slučaju, kit sadrži ovde opisanu kombinaciju , uključujući anti-TMPRSS2 protein koji vezuje antigen, npr., antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema pronalasku (npr., H1H7017N ili H4H7017N), ili njegovu farmaceutsku kompoziciju u kombinaciji sa jednim ili više terapeutskih sredstava zajedno formulisanih, opciono u farmacetuskoj kompoziciji u jednom zajedničkom sudu.
[0168] Ukoliko kit obuhvata farmaceutsku kompoziciju za parenteralno davanje subjektu, kit može obuhvatati uređaj (npr., injekcioni uređaj) za izvođenje takvog davanja. Na primer, kit može sadržati jednu ili više hipodermijskih igala ili drugih uređaja za injekciju kako je gore diskutovano koje sadrže anti-TMPRSS2 protein koji vezuje antigen, npr., antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema prikazanom pronalasku (npr., H1H7017N ili H4H7017N).
[0169] Kit može sadržati dodatak za pakovanje koji obuhvata informacije koje se tiču farmaceutskih kompozicija i doznih oblika u kitu. Generalno, takve informacije pomažu pacijentima i lekarima u korišćenju priloženih farmaceutskih kompozicija i doznih oblika efikasno i sigurno . Na primer, sledeće informacije u pogledu kombinacije prema pronalasku mogu biti obezbeđene u dodatku: farmakokinetike, farmakodinamike, kliničko ispitivanje, parametri efikasnosti, indikacije i upotreba, kontraindikacije, upozorenja, mere predostrožnosti, neželjena dejstva, prekomerna doza, ispravno doziranje i davanje, kako se daje, uslovi ispravnog čuvanja, reference, informacija o proizvođaču /distributeru i informacija o patentima.
Dijagnostičke upotrebe i antitela
[0170] Anti-TMPRSS2 proteini koji vezuju antigen, npr., antitela ili njihovi fragmenti koji vezuju antigen prema prikazanom pronalasku (npr., H1H7017N ili H4H7017N), mogu biti korišćeni za detektovanje i/ili merenje TMPRSS2 u uzorku. Primeri testova za TMPRSS2 mogu uključivati, npr., dovođenje u kontakt uzorka sa anti-TMPRSS2 proteinom koji vezuje antigen prema pronalasku, gde anti-TMPRSS2 protein koji vezuje antigen je obeležen sa detektabilnim obeleživačem ili molekulom reporterom ili korišćen za hvatanje liganda da se selektivno izoluje TMPRSS2 iz uzoraka. Prisustvo anti-TMPRSS2 proteina koji vezuje antigen kompleksiran sa TMPRSS2 ukazuje na prisustvo TMRPSS2 u uzorku. Alternativno, neobleženo anti-TMPRSS2 antitelo može biti korišćeno u kombinaciji sa sekundarnim antitelom koje je samo obeleženo da se može detektovati. Obeleživač koji se može detektovati ili molekul reporter može biti radioizotop, kao što je<3>H,<14>C,<32>P,<35>S, ili<125>I; fluorescentni ili hemiluminiscentni deo kao što je fluorescein izotiocijanat, ili rodamin; ili enzim kao što je alkalna fosfataza , β-galaktozidaze, peroksidaza rena ili luciferaza. Specifični testovi koji mogu biti korišćeni za detektovanje ili merenje TMPRSS2 u uzorku uključuju imunosorbentne testove sa vezanim enzimom (ELISA), radioimunotest (RIA), i
4
florescencom aktivirano sortiranje ćelija (FACS). Prema tome, ovde je opisan postupak za detektovanje prisustva TMPRSS2 polipeptida u uzorku koji se sastoji od dovođenja u kontakt uzorka sa anti-TMPRSS2 proteinom koji vezuje antigen i detektovanja prisustva TMPRSS/anti-TMPRSS2 proteina koji vezuje antigen gde prisustvo kompleksa ukazuje na prisustvo TMPRSS2.
[0171] Prikazani opis obuhvata ELISA postupke zasnovane na ćelijama koje koriste anti-TMPRSS2 proteine koji vezuju antigene, npr., antitela i njegove fragmente koji vezuju antigen prema prikazanom pronalasku (npr., H1H7017N), da se detektuje prisustvo TMPRSS2 na ćeliji. Opciono, postupak obuhvata korake :
(i) dovođenja u kontakt ćelija imobiliziranih na čvrstoj površini (npr., mikroploči) da bi se testirale na prisustvo TMPRSS2 sa anti-TMPRSS2 proteinom koji vezuje antigen prema prikazanom pronalasku; (ii) opciono ispiranje smeše da se ukloni nevezani anti-TMPRSS2 protein koji vezuje antigen;
(iii) dovođenje u kontakt anti-TMPRSS2 proteina koji vezuje antigen sa obeleženim sekundarnim antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen koji se veže za anti-TMPRSS2 protein koji vezuje antigen;
(iv) opciono ispiranje kompleksa da se ukloni nevezani protein koji vezuje antigen; i
(v) detektovanje prisustva obeleživača na sekundarnom antitelu ili fragmentu, gde detekcija obeleživača ukazuje da ćelije sadrže TMPRSS2. Na primer, prikazani opis obuhvata takve ELISA postupke zasnovane na ćelijama za identifikovanje TMPRSS2<+>ćelija u uzorku.
[0172] Anti-TMPRSS2 protein koji vezuje antigen prema pronalasku (npr., H1H7017N ili H4H7017N) može biti korišćen u postupku Western blota ili imuno-proteinskom za detektovanje prisustva TMPRSS2 ili njegovog fragmenta u uzorku. Takav postupak obrazuje deo prikazanog opisa i obuhvata korake npr.:
(1) obezbeđivanja membrane ili drugog čvrstog supstrata koji sadrži uzorak koji se testira na prisustvo TMPRSS2, npr., opciono obuhvata korak prenošenja proteina iz uzorka koji se testira na prisustvo TMPRSS2 (npr., iz PAGE ili SDS-PAGE elektroforetskim odvajanjem proteina u uzorku ) na membrani ili drugom čvrstom supstratu korišćenjem postupka poznatog u ovoj oblasti tehnike (npr., polu-suvo blotovanje ili tank blotovanje); i dovođenje membrane ili drugog čvrstog supstrata koji se testira na prisustvo TMPRSS2 ili njegovog fragmenta sa anti-TMPRSS2 proteinom koji vezuje antigen prema pronalasku.
Takva membrana može imati oblik, na primer, nitrocelulozne ili na vinilu zasnovane (npr., poliviniliden fluoridne (PVDF)) membrane za koju proteini koji se testiraju na prisustvo TMPRSS2 u nedenaturišućem PAGE (elektroforezi na poliakrilamidom gelu ) gelu ili SDS-PAGE (elektroforezom na natrijum dodecil sulfat poliakrilamidom gelu) gelu su premešteni (npr., posle elektroforetskog odvajanja na gelu). Pre dovođenja u kontakt membrane sa anti-TMPRSS2 proteinom koji vezuje antigen, membrana je opciono blokirana, npr., sa nemasnim mlekom u prahu ili slično tako da se veže za nespecifične proteinska mesta vezivanja na membrani .
(2) ispiranje membrane jednom ili više puta da se ukloni nevezani anti-TMPRSS2 protein koji vezuje antigen i druge nevezane supstance ; i
(3) detektovanje vezanog anti-TMPRSS2 proteina koji vezuje antigen.
[0173] Detekcija vezanog proteina koji vezuje antigen ukazuje da je TMPRSS2 protein prisutan na membrani ili supstratu i u uzorku. Detekcija vezivanja proteina koji vezuje antigen može biti vezivanjem proteina koji vezuje antigen za sekundarno antitelo (anti-imunoglobulinsko antitelo) koje je obeleženo da se može detektovati i, zatim, detektovanje prisustva obeleživača sekundarnog antitela .
[0174] Anti-TMPRSS2 proteini koji vezuje antigene (npr., antitela i fragmente koji vezuju antigen (npr., H1H7017N ili H4H7017N)) opisani ovde mogu biti korišćeni za imunohistohemiju. Takav postupak obrazuje deo prikazanog opisa i obuhvata, npr.,
(1) dovođenje u kontakt tkiva koje se testira na prisustvo TMPRSS2 proteina sa anti-TMPRSS2 proteina koji vezuje antigen prema pronalasku; i
(2) detektovanje proteina koji vezuje antigen na ili u tkivu .
[0175] Ukoliko protein koji vezuje antigen je sam detektabilno obeležen, može direktno biti detektovan. Alternativno, protein koji vezuje antigen može biti vezan sa detektabilno obeleženim skundarnim antitelom u kome je obeleživač zatim detektovan .
PRIMERI
[0176] Sledeći primeri su dati tako da se obezbede stučnjacima iz ove oblasti sa detaljnim otkrićem i opisom kako pripremiti i koristit postupke i kompozicije prema pronalasku, i nije namera da se ograniči obim onoga što su pronalazači smatrali kao njihov pronalazak. Učinjeni su napori da se obezbedi tačnost u odnosu na korišćene brojeve (npr., količine, temperaturu, itd.) ali neke eksperimentalne greške i devijacije treba uzeti u obzir. Osim ako nije drugačije navedeno, delovi su delovi u odnosu na masu, molekulsaka masa je prosečna molekulska masa, temperatura je u stepenima Celzijusa, sobna temperatura je oko 25°C, i pritisak je ili je blizu atmosferskom.
Primer 1: In vitro replikacija u više ciklusa.
[0177] Procenjivana je sposobnost virusa influenze, A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1)-GFP, da se replicira u Calu3, A549, MDCK i HepG2 ćelijama.
Tabela 1. Korišćeni reagensi.
Eksperimentalni postupak
[0178] Calu-3 ćelije (ATCC HTB55), A549 ćelije (ATCC CCL-185), MDCK ćelije (IRR FR-58) i HepG2 ćelije (ATCC HB-8065) su razblažene na 40,000 ćelija/bunarčiću na ploči sa 96-bunarčića u DMEM:F12 medijumu sa 5% FBS. Sledećeg dana, A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) koji nosi GFP reporter gen u NS
4
segmentu (B. Manicassamy et al., Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 2010 Jun 22;107(25): 11531-6) je pripremljen u MOI (višestrukim infekcijama) od 0.1 i 0.01 u DMEM:F12 sa niskim IgG BSA posle tri ispiranja. Virus je inkubiran na ćelijama u toku 1 h na 37°C posle čega je virus uklonjen i bunarčići su isprani još tri puta. Broj inficiranih ćelija je kvantifikovan 24, 48, 72 i 142 h posle infekcije na CTL-ImmunoSpot® S6 Universal Analyzer (Cellular Technology Limited, Cleveland, OH).
Kratak prikaz rezultata i zaključci
[0179] Calu-3 je imortalizovana ćelijska linija epitela disajnih puteva čoveka je pokazano da omoguća višestruke cikluse replikacije humanog virusa influence bez prisustva egzogenog tripsina (Zeng et al., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type i interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology.81, 12439-12449 (2007)). Pored toga, Calu-3 ćelije je pokazano da eksprimuju oba TMPRSS2 i TMPRSS4, ali ne TMPRSS11D (HAT) bar na nivou mRNK (Bottcher-Friebertshauser et al., Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology.85, 1554-1562 (2011)). Da bi se potvrdilo da Calu-3 ćelije mogu podržati proetolitičku aktivaciju virusa influence koji poseduje hemaglutinin sa monobaznim mestom cepanja, rast H1N1 GFP reporter virusa u Calu-3 ćelijama je analiziran i replikacija u toku vremena sa ćelijama A549 (humanog alveolarnog bazalnog epitela), MDCK (Madin Darby psećeg bubrega) i HepG2 (humanog karcinoma jetre) bez prisustva tripsina je poređena. Ćelije su inficirane pri niskom MOI i, u naznačenoj vremenskoj tački, određivani su virusni titri brojanjem fluorescentih fokusnih tačaka. Tabela 2 i slika 1 pokazuju niske nivoe infekcije u A549, MDCK i HepG2 ćelijama, dok Calu-3 čelije pokazuju značajno povećane titre u svakoj vremenskoj tački. Mada je pokazano da Calu-3 ćelije eksprimuju TMPRSS2 i TMPRSS4 na nivou mRNK, utišavanje TMPRSS2 smanjuje titre virusa influence za 100-do 1,000-puta (Böttcher-Friebertshauser et al., Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptideconjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology. 85, 1554-1562 (2011)). Niski nivo vorusnih titara u A549, MDCK i HepG2 ćelijama bez prisustva tripsina je verovatno usled dodavanja pocepanog virusa sakupljenog iz pilećih jaja sa embrionom ili iz MDCK kulture sa tripsinom), ali prisustvo drugih HA-aktiviranih proteaza može biti objašnjeno.
4
Reference
[0180]
1. K. Shirato, K. Kanou, M. Kawase, S. Matsuyama, Clinical Isolates of Human Coronavirus 229E Bypass the Endosome for Cell Entry. Journal of Virology.91, e01387-16 (2017). PMID: 27733646.
2. L. M. Reinke et al., Different residues in the SARS-CoV spike protein determine cleavage and activation by the host cell protease TMPRSS2. PLoS ONE.12, e0179177 (2017). PMID: 27733646.
3. Y. Zhou et al., Protease inhibitors targeting coronavirus and filovirus entry. Antiviral Research.
116, 76-84 (2015). PMID:25666761.
4. P. Zmora, A.-S. Moldenhauer, H. Hofmann-Winkler, S. Pohlmann, TMPRSS2 Isoform 1 Activates Respiratory Viruses and Is Expressed in Viral Target Cells. PLoS ONE. 10, e0138380 (2015). PMID:26379044.
5. P. Zmora et al., Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS ONE.12, e0176597 (2017). PMID: 28493964.
6. E. Böttcher-Friebertshäuser, D. A. Stein, H.-D. Klenk, W. Garten, Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer
4
targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology.85, 1554-1562 (2011).). PMID: 21123387.
7. S. Bertram et al., TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology.84, 10016-10025 (2010). PMID: 20631123.
8. C. Tarnow et al., TMPRSS2 is a host factor that is essential for pneumotropism and pathogenicity of H7N9 influenza A virus in mice. Journal of Virology (2014), May;88(9):4744-51.doi:10.1128/JVI.03799-13. PMID: 24522916.
9. E. Bottcher et al., Proteolytic Activation of Influenza Viruses by Serine Proteases TMPRSS2 and HAT from Human Airway Epithelium. Journal of Virology.2006 Oct;80(19):9896-8. PMID: 16973594.
10. B. Manicassamy et al., Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 2010 Jun 22; 107(25): 11531-6. doi: 10.1073/pnas.0914994107. PMID: 20534532.
11. H. Zeng et al., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type i interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology.81, 12439-12449 (2007). PMID: 17855549.
Primer 2: Anti-TMPRSS2 antitelo H1H7017N blokira širenje influence in vitro.
[0181] Procenjivana je sposobnost različitih antitela da smanje titre virusa influence virusa A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) u Calu-3 ćelijama.
Tabela 3. Korišćeni reagensi.
Eksperimentalni postupak
[0182] Calu-3 ćelije (ATCC HTB55) su razblažene do 40,000 ćelija/bunarčiću na ploči sa 96-bunarčića u DMEM:F12 medijumu sa 5% FBS. Sledećeg dana, monoklonalna antitela su razblažene do 166.7 nM u DMEM:F12 sa niskim IgG BSA i dodati u ćelije u toku 3 h na 37°C i 5% CO2. mAb rastvor je uklonjen i čelije su inficirane sa A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) sa MOI od 0.001. Virus je inkubiran na ćelijama u toku 1 h na 37°C u 5% CO2posle čega je virus uklonjen i medijum je zamenjen sa DMEM:F12 koji sadrži 166.7 nM mAbs. Posle 24 h i 48 h, Medijum je zamenjen sa svežim medijumom koji sadrži mAb i ćelije su isprane dva puta sa PBS na 72 h. Ćelije su zatim fiksirane sa 4% paraformaldehidom u PBS i virus je detektovan koriščenjem anti-NP primarnog antitela pri 1:1000 razblaženju. Ćelije su inkubirane u toku 1 h i zatim isprane i sekundarno je dodato pri razblaženju 1:2000. Broj inficiranih ćelija je kvantifikovan na CTL-ImmunoSpot® S6 Universal Analyzer (Cellular Technology Limited, Cleveland, OH).
4
Kratak prikaz rezultata i zaključci
[0183] Calu-3 je imortalizovana ćelijska linija humanog epitela disajnih puteva za koju je dokazano da dozvoljava višestruku cikličnu replikaciju humanih virusa influence bez priustva egzogenog tripsina (Zeng et al., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type i interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology.2007 Nov;81 (22): 12439-49). Pored toga, dokazano je da Calu-3 ćelije eksprimuju oba TMPRSS2 i TMPRSS4, ali ne TMPRSS11D (HAT) na nivou mRNK (Bottcher-Friebertshauser et al., Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology. 85, 1554-1562 (2011)). Ranije je dokazano da Calu-3 ćelije podržavaju proteolitičku aktivaciju virusa influence - ali sad je u njima testirana inhibicija TMPRSS2 pomoću TMPRSS2 specifičnog monoklonalnog antitela, H1H7017N. Rast A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) u toku 72 h posle tretiranja ćelija sa 166.7 nM H1H7017N je analiziran. Virusni titri su određeni brojanjem florescentih fokusnih tačaka. Tabela 4 i slika 2 pokazuju smanjene titre posle tretmana sa antitelom H1H7017N. Mada je dokazano da Calu-3 ćelije eksprimuju TMPRSS2 i TMPRSS4 na nivou mRNK, utišavanje TMPRSS2 smanjuje titre virusa influence za 100-do 1,000-puta (Bottcher-Friebertshauser et al., Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology. 85, 1554-1562 (2011)). Nizak nivo postojanja virusnih titara bez prisustva mAb su verovatno bili usled dodavanja isečenog virusa (sakupljenog iz pilećih jaja sa embrionom ili iz MDCK kulture sa tripsinom), ali prisustvo drugih HA-aktvivirajućih proteaza bi takođe objasnilo prisustvo virusa uprkos tretmanu sa anti-TMPRSS2 mAb.
Tabela 4. Pojačavanje H1H7017N u toku pada fluorescentih fokusnih jedinica (FFU) u infektivnom ciklusu A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1) 72 sata posle infekcije.
Reference
[0184]
1. K. Shirato, K. Kanou, M. Kawase, S. Matsuyama, Clinical Isolates of Human Coronavirus 229E Bypass the Endosome for Cell Entry. Journal of Virology.91, e01387-16 (2017). PMID: 27733646.
2. L. M. Reinke et al., Different residues in the SARS-CoV spike protein determine cleavage and activation by the host cell protease TMPRSS2. PLoS ONE.12, e0179177 (2017). PMID: 27733646.
3. Y. Zhou et al., Protease inhibitors targeting coronavirus and filovirus entry. Antiviral Research.
116, 76-84 (2015). PMID:25666761.
4. P. Zmora, A.-S. Moldenhauer, H. Hofmann-Winkler, S. Pohlmann, TMPRSS2 Isoform 1 Activates Respiratory Viruses and Is Expressed in Viral Target Cells. PLoS ONE. 10, e0138380 (2015). PMID:26379044.
5. P. Zmora et al., Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS ONE.12, e0176597 (2017). PMID: 28493964.
4
6. E. Böttcher-Friebertshäuser, D. A. Stein, H.-D. Klenk, W. Garten, Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology.85, 1554-1562 (2011).). PMID: 21123387.
7. S. Bertram et al., TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology.84, 10016-10025 (2010). PMID: 20631123.
8. C. Tarnow et al., TMPRSS2 is a host factor that is essential for pneumotropism and pathogenicity of H7N9 influenza A virus in mice. Journal of Virology (2014), May;88(9):4744-51.doi:10.1128/JVI.03799-13. PMID: 24522916.
9. E. Bottcher et al., Proteolytic Activation of Influenza Viruses by Serine Proteases TMPRSS2 and HAT from Human Airway Epithelium. Journal of Virology.2006 Oct;80(19):9896-8. PMID: 16973594.
10. B. Manicassamy et al., Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA. 2010 Jun 22; 107(25): 11531-6. doi: 10.1073/pnas.0914994107. PMID: 20534532.
11. H. Zeng et al., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type i interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology.81, 12439-12449 (2007). PMID: 17855549.
Primer 3: FACS analiza sa MDCK/Tet-on, MDCK/Tet-on/hTMPRSS2, i MDCK/Tet-on/MfTMPRSS2 ćelijama.
[0185] Procenjivana je sposobnost anti-TMPRSS2 antitela, H1H7017N, da se vežu za MDCK ćelije koje eksprimuju TMPRSS2 ili ne eksprimuju TMPRSS2.
Tabela 5. Korišćeni reagensi.
(nastavak)
Eksperimentalni postupak
[0186] Ćelije linije su razvijene da eksprimuju humani TMPRSS2 i TMPRSS2 cinomolgus majmuna (hTMPRSS2 i mfTMPRSS2) u MDCK (Madin Darby psećim bubrežnim) ćelija posle indukcije sa doksiciklinom. MDCK ćelije su transdukovane da stabilno eksprimuju modifikovani tetraciklinkontrolisani transaktivatorski protein (Clontech) i dobijena ćelijska linija je nazvana MDCK/Tet-on ćelijska linija. MDCK/Tet-on ćelija je transdukovana sa konstruktom koji sadrži hTMPRSS2 (NP_005647.3 sa V160M) ili mfTMPRSS2 (Ref seq XP_015302311.1 sa S129L, N251S, I415V, R431Q, D492G) pod kontrolom iduktibilnog promotera i ćelijske linije su bile nazvane MDCK/Tet-on/hTMPRSS2 i MDCK/Tet-on/mfTMPRSS2. Stabilne ćelijske linije su održavane u medijumu za rast koji sadrži DMEM obogaćen sa 10% FBS, natrijum piruvatom, penicillin/streptomicin/glutaminom, 500 μg/mL G418 sa ili bez 2 μg/mL puromicina.
[0187] Za analize ćelijskog vezivanja sa protočnom citometrijom, ćelije su zasejane na medijum za rast i inkubirane sa doksiciklinom na 1 μg/mL u toku 16 sati da se izazove ekspresija TMPRSS2. Ćelije su odvojene pomoću Accutase i ponovo suspendovane u 1% FBS u PBS. Antitela su serijski razblažena od 500 nM na 25 pM i svaka koncentracija antitela je inkubirana sa 1 X 10<6>ćelija na 4°C u toku 30 minuta. Uključeno je stanje u kojem nijedno antitelo nije dodato ćelijama. Posle inkubacije sa primarnim antitelom, ćelije su bojene sa alofikocijaninom konjugovanim sa anti-human IgG sekundarnim antitelom pri 1:1000 na 4°C u toku 30 minuta. Ćelije su fiksirane pomoču BD CytoFixTM i analizirane pomoću CytoFLEX protočnog citometra. Same kontrole neobojenog i sekundarnog antitela su takođe uključene za sve ćelijske linije. Geometrijska srednja vrednost fluorescence za žive ćelije je određivana pomoću FlowJo softvera i rezultati su analizirani pomoću nelinearne regresije (4-parametra logistike l) sa Prism 7 softverom (GraphPad) da bi se dobile EC50vrednosti ćelijskog vezivanja antitela.
[0188] Kao što je prikazano na slici 3, anti-hTMPRSS2 antitelo prema pronalasku, H1H7017N, vezano za MDCK/Tet-on/hTMPRSS2 i MDCK/Tet-on/mfTMPRSS2 sa odgovarajućim EC50vrednostima 460 pM i 1.06 nM. H1H7017N nije pokazao začajno vezivanje za MDCK/Tet-on ćelije. Kontrolno mAb1, kontrolno antitelo irelevantnog izotipa, nije pokazalo vezivanja za bilo koju testiranu ćelijsku liniju.
Primer 4: Kinetike vezivanja za Biacore anti-TMPRSS2 monoklonalnih antitela koja se vezuju za različite TMPRSS2 reagense merene na 25°C i 37°C.
[0189] Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) za različite TMPRSS2 reagense koji se vezuju za prečišćena anti-TMPRSS2 monoklonalna antitela su određene pomoću površinske plazmonske rezonance u realnom vremenom zasnovanom na Biacore 4000 biosensoru. Sva ispitivanja vezivanja su izvedena u 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, i 0.05% v/v površinski aktivnom Tween-20, pH 7.4 (HBS-ET) tekućem puferu na 25°C i 37°C. Površina Biacore CM5 senzornog čipa je prvo derivatizovana sa aminskim kuplovanjem sa mišjim anti-mišjim Fc specifičnim poliklonalnim antitelom (GE Healthcare Cat#BR100838) da uhvati anti-TMPRSS2 monoklonalna antitela. Ispitivanja vezivanja su izvedena na humanom TMPRSS2 ekstracelularnom domenu eksprimovanom sa C-terminalnim mycmyc-heksahistidiniskom oznakom (hTMPRSS2.mmh), i majmunskim TMPRSS2 ekstracelularnim domenom eksprimovanim sa C-terminalnim myc-myc-heksahistidinskim oznakom (mfTMPRSS2.mmh). Različite koncentracije HMM-hTMPRSS2 i HMM-mfTMPRSS2 (100nM -6.25nM; 4-struko serijsko razblaženje) su prvo pripremljene u HBS-ET tekućem puferu i injektovane su preko površine anti-mišjeg
1
Fc uhvaćenog anti-TMPRSS2 monoklonalnog antitela u toku 2.5 minuta pri brzini protoka 30 μL/minutu, dok disocijacija vezanog monoklonalog antitela za TMPRSS2 reagens je praćena u toku 7 minuta u HBS-ET tekućem puferu. Brzina vezivanja (ka) i brzina disocijacije (kd) su određene uklapanjem u senzorgrame vezivanja u realnom vremenu za model vezivanja 1:1 sa masenim transportnim ograničenjem pomoću softvera Scrubber 2.0c uklapanja u krivu. Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) i poluživota disocijacije (t©) su izračunavane iz kinetičnih brzina kao:
[0190] Parametri kinteičkog vezivanja HMM-hTMPRSS2 ili HMM-mfTMPRSS2 vezivanja za različita anti-TMPRSS2 monoklonalna antitela prema pronalasku na 25°C i 37°C su prikazana u tabelama 6 do 9.
[0191] Na 25°C, anti-TMPRSS2 monoklonalna antitela vezana za HMM-hTMPRSS2 sa KDvrednošću 2.81 nM, kao što je pokazano u Tabeli 6. Na 37°C, anti-HMM-hTMPRSS2 monoklonalna antitela vezana za HMM-hTMPRSS2 sa KDvrednošću 9.31 nM, kao što je prikazano u Tabeli 7.
[0192] Na 25°C, anti-TMPRSS2 monoklonalna antitela vezana za HMM-mfTMPRSS2 sa KDvrednošću 56.0 nM, kao što je prikazano u Tabeli 8. Na 37°C, anti-TMPRSS2 monoklonalna antitela vezana za HMM-mfTMPRSS2 sa KDvrednosti 140nM, kao što je prikazano u Tabeli 9.
TMPRSS2 Proteini
[0193] hTMPRSS2 knob_mmh (W106-R255).mmh:
aminokiseline 1-150: aminokisleine 106 do 255 humanog TMPRSS2 (pristupni broj NP_005647.3 sa V160M)
aminokiseline: 151-178: myc-myc-heksahistidinski obeleživač
(SEQ ID NO: 20; myc obeleživač podvučen, His6 obeleživač dvostruko podvučen)
[0194] mfTMPRSS2 knob_mmh (W106-R255).mmh:
Aminokiseline 1-150: aminokiseline 106-255 majmunskog TMPRSS2 (prisutpni broj XP_005548700.1 sa S129L, N251S)
Aminokiseline 151-178: myc-myc-heksahistidinski obeleživač
(SEQ ID NO: 21; myc tags obeleživač podvučen, His6 obeleživač dvostruko podvučen)
Rezultati
2
Tabela 6. Parametri kinetike vezivanja HMM-hTMPRSS2 vezivanja za TMPRSS2 monoklonalna antitela na 25°C.
Tabela 7. Parametri kinetike vezivanja HMM-hTMPRSS2 vezivanje za TMPRSS2 monoklonalna antitela na 37°C.
Tabela 8. Parametri kinetike vezivanja HMM-mfTMPRSS2 vezivanja za TMPRSS2 monoklonalna antitela na 25°C.
Tabela 9. Parametri kinetike vezivanja HMM-mfTMPRSS2 vezivanja za MSR1 monoklonalna antitela na37°C.
Primer 5: In vitro širenje influence sojeva H1, H3, i FluB.
[0196] U ovom primeru, određivana je sposobnost različitih tipova influenze da se šire duž in vitro kulture Calu-3 ćelija i utičaj anti-TMPRSS2 antitela na širenje.
Table 10. Korišćeni reagensi i serijski brojevi
(nastavak)
Eksperimentalni postupak
[0197] Calu-3 ćelije su zasejane na 40,000 ćelija/bunarčiću na pločama od 96-bunarčiča u DMEM:F12 medijumu sa 5% FBS. Sledećeg dana, sojevi virusa influence su razblaženi do prethodno određenih MOI (videti Tabelu 11) i antitela su razblažene do 100 μg/mL. U ovim eksperimentima, anti-HA i anti-TMPRSS2 antitela imaju različite mehanizme dejstva, prema tome, eksperimentalni postupak je različit za ova antitela u cilju prikladnog njihovog testiranja. Anti-HA antitela su prethodno inkubirana sa pojedinačnim sojem virusa influence u toku jednog sata na 37°C na odvojenim pločama. Posle perioda preinkubacije, smeša antitelo/virus je dodata u Calu-3 ćelij u toku 1 sata. Anti-TMPRSS2 antitelo je preinkubirano sa neinficiranim Calu-3 ćelijama u toku tri sata na 37°C. Posle perioda preinkubacije, virus je dodat u Calu-3 ćelije preinkubirane sa anti-TMPRSS2 antitelom u toku jednog sata. Posle infekcije od jednog sata, ćelije su isprane tri puta sa PBS i sveže antitelo je dodato zajedno sa novim medijumom, u svaki bunar. Dodatno antitelo je dodato 24 i 48 sati posle infekcije. 72 sata posle infekcije, ćelije su obojene sa anti-NP i kvantifikovane na CTL-ImmunoSpot® S6 Universal Analizatoru (Cellular Technology Limited, Cleveland, OH).
Tabela 11A. Eksperiment 1.
Tabela 11B. Eksperiment 2.
Kratak prikaz rezultata i zaključci
[0198] Calu-3 je imoralizovana humana ćelijska linija epitela disajnih puteva koja je pokazana da dozvoljava višecikličnu replikaciju u odsustvu egzogenog tripsina (Zeng et al., Journal of Virology 81:
4
12439-12449 (2007)). Pored toga, pokazano je da Calu-3 ćelije eksprimuju TMPRSS2 (Böttcher-Friebertshäuser et al., Journal of Virology 85: 1554-1562 (2011)) koji je esencijalan za ove eksperimente kao anti-TMPRSS2 antitelo koje se testira. U ovim eskperimentima ispitivano je, da li može ili ne može H1H7017N, anti-TMPRSS2 antitelo, da spreči širenje u različitim sojevima influence. Pored toga, vođeno je odgovarajuće anti-HA antitelo za različite sojeve kao pozitivna kontrola. Kao što je očekivano, bila je početna infekcija u prisustvu anti-TMPRSS2 antitela ali H1 H7017N uspešno sprečava širenje infekcije H1_PR34, H1_CA09, H1_Bris, H9N2, i H3N2. Ovo se može primetiti ispitivanjem razlika u broju inficiranih ćelija između ćelija tretiranih sa anti-TMPRSS2-i inficiranih kontrola (Tabela 12). Zaključeno je da anti-TMPRSS2 antitelo nije bilo u stanju da spreči širenje ni u jedom od sojeva influence B jer je broj inficiranih ćelija u kontroli i tretiranim bunarčičima bio isti. Kao poređenje, anti-HA antitela su prethodno inkubirana sa virusom i sprečena je početna infekcija. Ovo se isto može videti upoređivanjem broja inficiranih ćelija. Brojanje inficirnaih ćelija je izvedeno na CTL mašini i zabeleženo je dole u tabelama.
Tabela 12A. Eksperiment 1.
Tabela 12B. Eksperiment 2.
Reference
[0199]
1. K. Shirato, K. Kanou, M. Kawase, S. Matsuyama, Clinical Isolates of Human Coronavirus 229E Bypass the Endosome for Cell Entry. Journal of Virology.91, e01387-16 (2017). PMID: 27733646.
2. L. M. Reinke et al., Different residues in the SARS-CoV spike protein determine cleavage and activation by the host cell protease TMPRSS2. PLoS ONE.12, e0179177 (2017).PMID: 28636671. 3. Y. Zhou et al., Protease inhibitors targeting coronavirus and filovirus entry. Antiviral Research.116, 76-84 (2015). PMID: 25666761.
4. P. Zmora, A.-S. Moldenhauer, H. Hofmann-Winkler, S. Pöhlmann, TMPRSS2 Isoform 1 Activates Respiratory Viruses and Is Expressed in Viral Target Cells. PLoS ONE. 10, e0138380 (2015). PMID: 26379044.
5. P. Zmora et al., Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS ONE.12, e0176597 (2017). PMID: 28493964.
6. E. Böttcher-Friebertshäuser, D. A. Stein, H.-D. Klenk, W. Garten, Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology. 85, 1554-1562 (2011). PMID: 21123387.
7. S. Bertram et al., TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology.84, 10016-10025 (2010). PMID: 20631123.
8. C. Tarnow et al., TMPRSS2 is a host factor that is essential for pneumotropism and pathogenicity of H7N9 influenza A virus in mice. Journal of Virology (2014), doi:10.1128/JVI.03799-13. PMID: 24522916.
9. E. Bottcher et al., Proteolytic Activation of Influenza Viruses by Serine Proteases TMPRSS2 and HAT from Human Airway Epithelium. Journal of Virology.80, 9896-9898 (2006). PMID: 16973594.
10. Manicassamy et al., Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA.2010 Jun 22;107(25):11531-6. doi: 10.1073/pnas.0914994107. Epub 2010 Jun 7. PMID: 20534532.
11. H. Zeng et al., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type i interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology. 81, 12439-12449 (2007). PMID: 17855549.
Primer 6: Efekat lečenja samo sa H1H7017N kod TMPRS22 humanizovanih miševa .
[0200] Procenjivana je sposobnost anti-TMPRSS2 antitela da štiti genetski modifikovane miševe da eksperimuju humani TMPRSS2 protein od infekcije sa virusom H1N1 influence.
Tabela 13. Korišćeni reagensi i serijski brojevi.
Tabela 14. mAb klon IDs.
Eksperimentalni postupak
[0201] Ovi eksperimenti su izvedeni na muškim i ženskim miševima starim 5-8 nedelja koji su genetski izmenjeni da eksprimuju humani TMPRSS2 protein. Miševi su izazvani sa 150 jedinica koje stvaraju plak (PFUs) H1N1. Miševi su sedirani sa 200 μL Ketamin:ksilazinom (12mg/ml:0.5mg/ml) pomoću intraperitonealne injekcije i zatim inficirani intranazalno sa 20 μL virusom. Antitela su davana ili subkutanozno (SC) jedan dan pre infekcije ili intravenski (IV) različitim danima posle infekcije (PI). Raspored doziranja antitela je varirao između eksperimenata (Tabela 15). Telesne mase su sakupljanje dnevno do 14 dana PI i miševi su žrtvovani kada su izgubili 20% njihove početne telesne mase. Rezultati su zabeleženi kao procentno preživljavanje.
Tabela 15A. Doziranje antitela (Eksperiment 1).
Tabela 15B. Doziranje antitela (Eksperiment 2).
Kratak prikaz rezultata i zaključci
[0202] Dokazano je da genetski modifikovani miševi da eksprimuju humani TMPRSS2 protein mogu biti inficirani sa letalnom dozom influence. Cilj ovih eksperimenata je bio da pokaže da H1H7017N može zaštititi genetski modifikovane miševe da eksprimuju humani TMPRSS2 protein protiv influenze A grupe 1. Antitelo je testirano na profilaktičkim i terapeutskim modelima. Tretiranje sa H1 H7017N dovelo je do većeg preživljavanja nego miševa tretiranih izotipskom kontrolom (H1H1238N) u oba eksperimenta (Slike 4 i 5). U profilaktičkom eksperimentu, preživljavanje je bilo 0% za miševe tretirane sa H1H1238N, 85.7% za miševe tretirane dana -1 PI, i 100% za miševe tretirane dana 0 PI sa H1H7017N. Za terapeutski model, grupa tretirana sa H1H1238N-je dovela do preživljavanja od 25% dok grupe tretirane sa H1H7017N dana 0-3 PI su dovele do 100% preživljavanja. Podaci su ukratko dati u Tabeli 16. H1H7017N pokazuje efikasnost kod miševa koji su genetski izmenjeni da eksprimuju humani TMPRSS2 protein.
Tabela 16A. Sažeti tabelarni prikaz podataka (Eksperiment 1).
Tabela 16B. Sažeti tabelarni prikaz podataka (Eksperiment 2).
Reference
[0203]
1. K. Shirato, K. Kanou, M. Kawase, S. Matsuyama, Clinical Isolates of Human Coronavirus 229E Bypass the Endosome for Cell Entry. Journal of Virology.91, e01387-16 (2017). PMID: 27733646.
2. L. M. Reinke et al., Different residues in the SARS-CoV spike protein determine cleavage and activation by the host cell protease TMPRSS2. PLoS ONE.12, e0179177 (2017). PMID: 28636671. 3. Y. Zhou et al., Protease inhibitors targeting coronavirus and filovirus entry. Antiviral Research.116, 76-84 (2015). PMID: 25666761.
4. P. Zmora, A.-S. Moldenhauer, H. Hofmann-Winkler, S. Pöhlmann, TMPRSS2 Isoform 1 Activates Respiratory Viruses and Is Expressed in Viral Target Cells. PLoS ONE. 10, e0138380 (2015). PMID: 26379044.
5. P. Zmora et al., Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS ONE.12, e0176597 (2017). PMID: 28493964.
6. E. Böttcher-Friebertshäuser, D. A. Stein, H.-D. Klenk, W. Garten, Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology. 85, 1554-1562 (2011). PMID: 21123387.
7. S. Bertram et al., TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology.84, 10016-10025 (2010). PMID: 20631123.
8. C. Tarnow et al., TMPRSS2 is a host factor that is essential for pneumotropism and pathogenicity of H7N9 influenza A virus in mice. Journal of Virology (2014), doi:10.1128/JVI.03799-13. PMID: 24522916.
9. E. Bottcher et al., Proteolytic Activation of Influenza Viruses by Serine Proteases TMPRSS2 and HAT from Human Airway Epithelium. Journal of Virology.80, 9896-9898 (2006). PMID: 16973594.
10. Manicassamy et al., Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA.2010 Jun 22; 107(25):11531-6. doi: 10.1073/pnas.0914994107. Epub 2010 Jun 7. PMID: 20534532.
11. H. Zeng et al., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type i interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology. 81, 12439-12449 (2007). PMID: 17855549.
Primer 7: Anti-TMPRSS2 mAb, H1H7017N, aktivnost na modelu TMPRSS2 humanizovanog miša.
[0204] Procenjivana je sposobnost anti-TMPRSS2 antitela da štite miša koji je genetski izmenjen da eksprimuje humani TMPRSS2 protein od infekcije sa virusom H3N2 influence.
Tabela 17. mAb ID klonova.
Tabela 18. Korišćeni reagensi i serijski brojevi.
Eksperimentalni postupak
[0205] Muški i ženski miševi stari jedanaest nedelja genetski izmenjeni da eksprimuju humani TMPRSS2 protein su izazvani sa 20,000 jedinica koje stvaraju plak (PFUs) iz H3N2. Miševi su sedirani sa 200 μL ketamin:ksilazinom (12mg/ml:0.5mg/ml) pomoću intraperitonealne injekcije i zatim inficirani sa 20 μL virusa intranazalno. Dana 1 ili dana 2 posle infekcije (PI), miševi su intravenski inficirani sa antitelom. Miševi su izmereni i posmatrani dnevno do 14 dana posle infekcije (PI). Bili su žrtvovani kada su izgubili 25% of njihove polazne telesne mase.
Kratak prikaz rezultata i zaključci
[0206] Širina je važan kvalitet kada se razmatra lečenje influence. Već je pokazano da anti-TMPRSS2 antitelo H1H7017N je bilo efikasno protiv influence A grupe 1. Cilj ovog eksperimenta je bio da se pokaže da H1H7017N može štititi miševe koji su genetski modifikovani da eksprimuju humani TMPRSS2 protein protiv influence A grupe 2. Genetski modifikvoani miševi da eksprimuju humani TMPRSS2 protein su inficirani sa letalnom dozom H3N2 i lečeni dana 1 ili dana 2 PI. Obe lečene grupe su imale veće stope preživljavanja od inficirane kontrole. Miševi tretirani dana 1 PI su imale stopu preživljavanja 100% koja je bila viša od grupe lečene dana 2 PI koja je imala preživljavanje 50%, dok nelečeni miševi su imali preživljavanje 0%. Svi miševi su umrli dana 5-6 PI. Grafik preživljavanja je prikazan na slici 6 i % preživljavanje je ukratko prikazan u tabeli 19. Ovi rezultati su prikazali da H1H7017 je poboljšao ishode na letalnom modelu H3N2.
Tabela 19. Sažeti tablarni prikaz podataka.
(nastavak)
Reference
[0207]
1. K. Shirato, K. Kanou, M. Kawase, S. Matsuyama, Clinical Isolates of Human Coronavirus 229E Bypass the Endosome for Cell Entry. Journal of Virology.91, e01387-16 (2017). PMID: 27733646. 2. L. M. Reinke et al., Different residues in the SARS-CoV spike protein determine cleavage and activation by the host cell protease TMPRSS2. PLoS ONE.12, e0179177 (2017). PMID: 28636671. 3. Y. Zhou et al., Protease inhibitors targeting coronavirus and filovirus entry. Antiviral Research.
116, 76-84 (2015). PMID: 25666761.
4. P. Zmora, A.-S. Moldenhauer, H. Hofmann-Winkler, S. Pöhlmann, TMPRSS2 Isoform 1 Activates Respiratory Viruses and Is Expressed in Viral Target Cells. PLoS ONE. 10, e0138380 (2015). PMID: 26379044.
5. P. Zmora et al., Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS ONE.12, e0176597 (2017). PMID: 28493964.
6. E. Böttcher-Friebertshäuser, D. A. Stein, H.-D. Klenk, W. Garten, Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology.85, 1554-1562 (2011). PMID: 21123387.
7. S. Bertram et al., TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology.84, 10016-10025 (2010). PMID: 20631123.
8. C. Tarnow et al., TMPRSS2 is a host factor that is essential for pneumotropism and pathogenicity of H7N9 influenza A virus in mice. Journal of Virology (2014), doi:10.1128/JVI.03799-13. PMID: 24522916.
9. E. Bottcher et al., Proteolytic Activation of Influenza Viruses by Serine Proteases TMPRSS2 and HAT from Human Airway Epithelium. Journal of Virology.80, 9896-9898 (2006). PMID: 16973594.
10. Manicassamy et al., Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA.2010 Jun 22;107(25): 11531-6. doi: 10.1073/pnas.0914994107. Epub 2010 Jun 7. PMID: 20534532.
11. H. Zeng et al., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type i interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology.81, 12439-12449 (2007). PMID: 17855549.
Primer 8: Infekcija genetski modifikovanih miševa da eksprimuju humani TMPRSS2 protein (naspram WT).
[0208] Preživljavanje miševa genetski izmenjenih da eksprimuju humani TMPRSS2 protein inficiranih sa H1N1 virusom influence je procenjeno i poređeno sa divljim tipom (WT) miševa.
Tabela 20. Korišćeni reagensi i brojevi serija.
Eksperimentalni postupak
[0209] Eksperiment je izveden na muškim i ženskim miševima starim 7.5-8 nedelja genetski izmenjenim da eksprimuju humani TMPRSS2 protein ili jedinki legla divljeg tipa . Miševi su izazivani sa 150, 750, ili 1,500 jedinica koje obrazuju plak (PFUs) A/Puerto Rico/08/1934 (H1N1). Miševi su sedirani sa 200 μL Ketamin:ksilazinom (12mg/ml:0.5mg/ml) pomoću intraperitonealne injekcije i zatim inficirani sa 20 μL virusa intranazalno. Telesne mase su sakupljane dnevno do 14 dana PI i miševi su žrtvovani kada su izgubili 20% njihove polazne telesne mase. Rezultati su zabeleženi kao procenat preživljavanja (Slika 7).
Kratak prikaz rezultata i zaključci
[0210] Genetski izmenjeni miševi tako da eksprimuju humani TMPRSS2 protein su dobijeni da bi se testirala terapeutska efikasnost anti-TMPRSS2 antitela na in vivo modelu influence. U ovom eksperimentu, upoređivane su stope preživljavanja miševa genetski modifikovanih da eksprimuju humani TMPRSS2 protein i miševa divljeg tipa inficirani sa 150, 750 ili 1,500 PFUs istorijskog soja H1N1. Bilo je 0% preživljavanja za genetski modifikovane miševe da eksprimuju humani TMPRSS2 protein i miševe divljeg tipa u sve tri inficirane grupe. Svi miševi su umrli između dana 5 i dana 8 PI, pri čemu su oni koji su primili više doze umrli ranije od onih koji su primili niže doze virusa. Obrasci preživljavanja miševa genetski modifikovanih da eksprimuju humani TMPRSS2 protein su bili slični onima miševa divljeg tipa. Ovo pokazuje da miševi koji su genetski izmenjeni da eksprimuju humani TMPRSS2 protein mogu biti korišćeni kao in vivo model influence da se proceni efikasnost TMPRSS2-specifičnih antitela. Videti Tabelu 21.
Tabela 21. Sažeti tablearni podaci.
Reference
[0211]
1. K. Shirato, K. Kanou, M. Kawase, S. Matsuyama, Clinical Isolates of Human Coronavirus 229E Bypass the Endosome for Cell Entry. Journal of Virology.91, e01387-16 (2017). PMID: 27733646. 2. L. M. Reinke et al., Different residues in the SARS-CoV spike protein determine cleavage and activation by the host cell protease TMPRSS2. PLoS ONE.12, e0179177 (2017). PMID: 28636671. 3. Y. Zhou et al., Protease inhibitors targeting coronavirus and filovirus entry. Antiviral Research.
116, 76-84 (2015). PMID: 25666761.
4. P. Zmora, A.-S. Moldenhauer, H. Hofmann-Winkler, S. Pöhlmann, TMPRSS2 Isoform 1 Activates Respiratory Viruses and Is Expressed in Viral Target Cells. PLoS ONE. 10, e0138380 (2015). PMID: 26379044.
5. P. Zmora et al., Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS ONE.12, e0176597 (2017). PMID: 28493964.
6. E. Böttcher-Friebertshäuser, D. A. Stein, H.-D. Klenk, W. Garten, Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology.85, 1554-1562 (2011). PMID: 21123387.
7. S. Bertram et al., TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology.84, 10016-10025 (2010). PMID: 20631123.
8. C. Tarnow et al., TMPRSS2 is a host factor that is essential for pneumotropism and pathogenicity of H7N9 influenza A virus in mice. Journal of Virology (2014), doi:10.1128/JVI.03799-13. PMID: 24522916.
9. E. Bottcher et al., Proteolytic Activation of Influenza Viruses by Serine Proteases TMPRSS2 and HAT from Human Airway Epithelium. Journal of Virology.80, 9896-9898 (2006). PMID: 16973594.
1
10. Manicassamy et al., Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA.2010 Jun 22;107(25):11531-6. doi: 10.1073/pnas.0914994107. Epub 2010 Jun 7. PMID: 20534532.
11. H. Zeng et al., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type i interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology.81, 12439-12449 (2007). PMID: 17855549.
Primer 9: Efekat treatmana kombinacije H1H14611N2 i H1H7017N kod miševa posle infekcije sa H3N2.
[0212] Procenjivana je sposobnost kombinacije anti-TMPRSS2 i anti-influenza antitela da štiti miševe koji su genetski modifikovani da eksprimuju humani TMPRSS2 protein od infekcije virusom H3N2 influenze.
Tabela 22. IDs mAb klona<.>
Tabela 23. Korišćeni reagensi i brojevi serija.
Eksperimentalni postupak
[0213] Muški i ženski miševi stari osam nedelja genetski izmenjeni da eksprimuju humani TMPRSS2 protein su izazivani sa 20,000 jedinica koje stvaraju plak (PFUs) A/Aichi/2/68 (HA, NA) x A/PR/8/34, Re*assorted X-31 (H3N2). Miševi su sedirani sa 200 μL Ketamin:ksilazina (12mg/ml:0.5mg/ml) via intraperitonealom injekcijom i zatim inficirani intranazalno sa 20 μL . Dana 4 posle infekcije (PI), miševima su intravenski injektovana antitela. Telesne mase su sakupljanje dnevno do 14 dana PI i miševi su žrtvovani kada su izgubili 25% njihove polazne telesne mase. Rezultati su zabeleženi kao procentno preživljavanje.
Kratak prikaz rezultata i zaključci
[0214] Dokazano je da, pojedinačno, TMPRSS2 antitelo, H1H7017N, i antitelo širokog spektra influence A grupe 2, H1H14611N2, imaju terapeutsku efikasnost naspram letalnog izazivanja miša sa istorijskim sojem H3N2. Takođe je dokazano da preživljavanje miševa inficiranih letalnim izazivanjem sa H1N1 može biti značajno povećano posle tretmana sa manje ukupnog antitela nego bilo kog ponaosob preko kombinacije H1H7017N i antitela širokog spektra influence A grupe 1 , H1H11729P. Cilj ovog eksperimenta je bi da proceni sinergijski efekat H1H7017N i H1H14611N2 u kombinaciji. Kao što je prikazano na slikama 8, 3 od 4 miša tretirana sa kontrolnim antitelom hlgG1 izotipa dana 4 PI umrlo je do dana 7 PI.3 od 5 životinja je preživelo kada su dozirani sa 10 mg/kg H1H14611N2 i 4 od 5 životinja je preživelo kada je dozirano sa 10 mg/kg H1H7017N. Kada je dozirano u kombinaciji 5 mg/kg svakog
2
antitela, H1H14611N2 i H1H7017N, preživljavanje je bilo 40% . Sto posto miševa tretiranih sa kombinacijom 2.5 mg/kg svakog antitela, H1H14611N2 i H1H7017N, preživelo je izazov. Preživljavanje miševa inficiranih sa letalnim izazivanjem sa H3N2 je povećano preko kombinacije nižih koncentracija H1H7017N i H1H14611N2 u poređenju sa višim koncentracijama kombinovanih antitela ili bilo kog antitela ponaosob. Procenat preživljavanje je ukratko datu u tabeli 24.
Tabela 24. Sažeti tabelarni podaci<.>
(nastavak)
Reference
[0215]
1. K. Shirato, K. Kanou, M. Kawase, S. Matsuyama, Clinical Isolates of Human Coronavirus 229E Bypass the Endosome for Cell Entry. Journal of Virology.91, e01387-16 (2017). PMID: 27733646.
2. L. M. Reinke et al., Different residues in the SARS-CoV spike protein determine cleavage and activation by the host cell protease TMPRSS2. PLoS ONE.12, e0179177 (2017). PMID: 28636671.
3. Y. Zhou et al., Protease inhibitors targeting coronavirus and filovirus entry. Antiviral Research.
116, 76-84 (2015). PMID: 25666761.
4. P. Zmora, A.-S. Moldenhauer, H. Hofmann-Winkler, S. Pöhlmann, TMPRSS2 Isoform 1 Activates Respiratory Viruses and Is Expressed in Viral Target Cells. PLoS ONE. 10, e0138380 (2015). PMID: 26379044.
5. P. Zmora et al., Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS ONE.12, e0176597 (2017). PMID: 28493964
6. E. Böttcher-Friebertshäuser, D. A. Stein, H.-D. Klenk, W. Garten, Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology.85, 1554-1562 (2011). PMID: 21123387.
7. S. Bertram et al., TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology.84, 10016-10025 (2010). PMID: 20631123.
8. C. Tarnow et al., TMPRSS2 is a host factor that is essential for pneumotropism and pathogenicity of H7N9 influenza A virus in mice. Journal of Virology (2014), doi:10.1128/JVI.03799-13. PMID: 24522916.
9. E. Bottcher et al., Proteolytic Activation of Influenza Viruses by Serine Proteases TMPRSS2 and HAT from Human Airway Epithelium. Journal of Virology.80, 9896-9898 (2006). PMID: 16973594.
10. Manicassamy et al., Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA.2010 Jun 22; 107(25):11531-6. doi: 10.1073/pnas.0914994107. Epub 2010 Jun 7. PMID: 20534532.
11. H. Zeng et al., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type i interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology.81, 12439-12449 (2007). PMID: 17855549.
Primer 10: Efekat tretiranja sa kombinacijom H1H11729P i H1H7017N kod miševa posle infekcije sa H1N1.
[0216] Procenjivana je sposobnost kombinacije anti-TMPRSS2 i anti-influenze antitela da štite miševe koji su modifikvani da eksprimuju humani TMPRSS2 protein od infekcije sa virusom H1N1 influenze .
Tabela 25. IDs mAb klonova .
Tabela 26. Korišćeni reagensi i brojevi serija.
(nastavak)
Eksperimentalni postupak
[0217] Muški i ženski miševi stari pet nedelja genetski izmenjeni da eksprimuju humani TMPRSS2 protein su izazivani sa 1,500 jedinica koje stvaraju plak (PFUs) H1N1. Virus je dat sediranjem miševa sa 200 μL Ketamin:ksilazina (12mg/ml:0.5mg/ml) i davanjem intranazalno 20 μL virusa. Dana 3 posle infekcije (PI), miševima je intravenski injektovano antitelo. Telesne mase su sakupljane dnevno do dana 14 PI i miševi su žrtvovani kada su izgubili 25% njihove polazne telesne mase.
Kratak prikaz rezultata i zaključci
[0218] Pokazano je da, pojedinačno, TMPRSS2 antitelo, H1H7017N, i antitela širokog spektra influence A grupe 1, H1H11729P, ima terapeutski efikasnost naspram letalnog izazivanja miša sa istorijskim sojem H1N1. Međutim, cilj ovog eksperimenta je da proceni sinergijski efekat antitela u kombinaciji. Svi miševi tretirani sa kontrolnim antitelom hlgG1 izotipa dana 3 PI umrlo je do dana 6 PI. Kada su životinje primile 5 mg/kg H1H11729P ili H1H7017N, 40% i 0% životinja je preživelo infekciju, respektivno. Međutim, kombinacija 2.5 mg/kg svakog antitela, H1H11729P i H1H7017N, dovela je do preživljavanja 60% . Osam procenata miševa tretirano sa kombinacijom 1 mg/kg H1H7017N i 2 mg/kg H1H11729P (3 mg/kg ukupno) je preživelo izazivanje. Preživljavanje miševa inficirani sa letalnim izazivanjem H1N1 je značajno povećano posle tretiranja sa manje ukupnog antitela nego svakog pojedinačno u odnosu na kombinaciju H1H7017N i H1H11729P (Videti Sliku 9 i Tabela 27).
4
Tabela 27. Sažeti tabelarni prikaz podataka.
Reference
[0219]
1. K. Shirato, K. Kanou, M. Kawase, S. Matsuyama, Clinical Isolates of Human Coronavirus 229E Bypass the Endosome for Cell Entry. Journal of Virology.91, e01387-16 (2017). PMID: 27733646.
2. L. M. Reinke et al., Different residues in the SARS-CoV spike protein determine cleavage and activation by the host cell protease TMPRSS2. PLoS ONE.12, e0179177 (2017). PMID: 28636671.
3. Y. Zhou et al., Protease inhibitors targeting coronavirus and filovirus entry. Antiviral Research.116, 76-84 (2015). PMID: 25666761.
4. P. Zmora, A.-S. Moldenhauer, H. Hofmann-Winkler, S. Pöhlmann, TMPRSS2 Isoform 1 Activates Respiratory Viruses and Is Expressed in Viral Target Cells. PLoS ONE. 10, e0138380 (2015). PMID: 26379044.
5. P. Zmora et al., Non-human primate orthologues of TMPRSS2 cleave and activate the influenza virus hemagglutinin. PLoS ONE.12, e0176597 (2017). PMID: 28493964.
6. E. Böttcher-Friebertshäuser, D. A. Stein, H.-D. Klenk, W. Garten, Inhibition of influenza virus infection in human airway cell cultures by an antisense peptide-conjugated morpholino oligomer targeting the hemagglutinin-activating protease TMPRSS2. Journal of Virology. 85, 1554-1562 (2011). PMID: 21123387.
7. S. Bertram et al., TMPRSS2 and TMPRSS4 facilitate trypsin-independent spread of influenza virus in Caco-2 cells. Journal of Virology.84, 10016-10025 (2010). PMID: 20631123.
8. C. Tarnow et al., TMPRSS2 is a host factor that is essential for pneumotropism and pathogenicity of H7N9 influenza A virus in mice. Journal of Virology (2014), doi:10.1128/JVI.03799-13. PMID: 24522916.
9. E. Bottcher et al., Proteolytic Activation of Influenza Viruses by Serine Proteases TMPRSS2 and HAT from Human Airway Epithelium. Journal of Virology.80, 9896-9898 (2006). PMID: 16973594.
10. Manicassamy et al., Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proc Natl Acad Sci USA.2010 Jun 22;107(25):11531-6. doi: 10.1073/pnas.0914994107. Epub 2010 Jun 7. PMID: 20534532.
11. H. Zeng et al., Highly pathogenic avian influenza H5N1 viruses elicit an attenuated type i interferon response in polarized human bronchial epithelial cells. Journal of Virology. 81, 12439-12449 (2007). PMID: 17855549.
1
2
�
1
�
4
1

Claims (15)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Humani protein koji vezuje antigen koji se specifično vezuje za humani TMPRSS2 i koji je antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, i gde protein koji vezuje antigen obuhvata:
promenjivi region teškog lanca imunoglobulina koji sadrži
(a) CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: G F T F S S Y G (SEQ ID NO: 6),
(b) CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: I W N D G S Y V (SEQ ID NO: 8), i
(c) CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: A R E G E W V L Y Y F D Y (SEQ ID NO: 10); i promenjivi region lakog lanca imunoglobulina koji sadrži
(a) CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: Q S I S S W (SEQ ID NO: 12),
(b) CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: K A S (SEQ ID NO: 14), i
(c) CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: Q Q Y N S Y S Y T (SEQ ID NO: 16).
2. Protein koji vezuje antigen prema zahtevu 1 koji obuhvata:
(a) teški lanac imunoglobulina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 17 ili 19, ili promenjivi region teškog lanca imunoglobulina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 2; i
(b) laki lanac imunoglobulina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 18, ili promenjivi region lakog lanca imunoglobulina koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 4.
3. Protein koji vezuje antigen prema zahtevu 1 ili 2 koji je višestruko specifičan.
4. Kompleks koji sadrži protein koji vezuje antigen prema bilo kom od zahteva 1-3 vezan za TMPRSS2 polipeptid.
5. Postupak za dobijanje proteina koji vezuje antigen prema bilo kom od zahteva 1-3 koji obuhvata: (a) uvođenje u ćeliju domaćina: (i) polinukleotida koji kodira teški lanac imunoglobulina i laki lanac imunoglobulina pomenutog proteina koji vezuje antigen; ili (ii) polinukleotida koji kodira teški lanac imunoglobulina pomenutog proteina koji vezuje antigen, i polinukleotida koji kodira laki lanac imunoglobulina pomenutog proteina koji vezuje antigen;
(b) kultivisanje ćelije domaćina u uslovima pogodnim za ekspresiju polinukleotida; i
(c) opciono, izolovanje proteina koji vezuje antigen iz ćelije domaćina i/ili medijuma u kome je gajena ćelija domaćina.
2
6. Postupak prema zahtevu 5 pri čemu je ćelija domaćina ćelija jajnika kineskog hrčka.
7. Polinukleotid koji kodira:
teški lanac imunoglobulina koji sadrži:
(a) CDR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: G F T F S S Y G (SEQ ID NO: 6),
(b) CDR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: I w N D G S Y V (SEQ ID NO: 8), i
(c) CDR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: A R E G E W V L Y Y F D Y (SEQ ID NO: 10); i laki lanac imunoglobulina koji sadrži:
(a) CDR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: Q S I S S W (SEQ ID NO: 12),
(b) CDR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: K A S (SEQ ID NO: 14), i
(c) CDR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: Q Q Y N S Y S Y T (SEQ ID NO: 16).
8. Vektor koji sadrži polinukleotid prema zahtevu 7.
9. Ćelija domaćina koja sadrži protein koji vezuje antigen prema bilo kom od zahteva 1 do 3, polinukleotid prema zahtevu 7, ili vektor prema zahtevu 8.
10. Kompozicija ili kit koji sadrži protein koji vezuje antigen prema bilo kom od zahteva 1-3 i drugo terapeutsko sredstvo, gde kit sadrži protein koji vezuje antigen i drugo terapeutsko sredstvo formulisano kao jedna kompozicija ili odvojeno u dve ili više kompozicija .
11. Farmaceutska kompozicija koja sadrži protein koji vezuje antigen prema bilo kom od zahteva 1-3 i farmaceutski prihvatljiv nosač i, opciono, drugo terapeutsko sredstvo.
12. Kompozicija ili kit prema zahtevu 10 ili 11, gde: (i) drugo terapeutsko sredstvo je antivirusni lek ili vakcina ; ili (ii) drugo terapeutsko sredstvo je član izabran iz grupe koju čine: oseltamivir, zanamivir, ribavirin i interferon-alfa2b, interferon-alfa2a, i antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koji se specifično veže za influencu HA.
13. Sud ili injekcioni uređaj koji se sastoji od proteina koji vezuje antigen prema bilo kom od zahteva 1-3 ili kompozicije prema bilo kom od zahteva 10-12.
14. Protein koji vezuje antigen prema bilo kom od zahteva 1-3 za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije infekcije sa virusom influence subjekta kome je to potrebno, koja obuhvata davanje terapeutski efikasne količine pomenutog proteina koji vezuje antigen.
15. Protein koji vezuje antigen za upotrebu prema zahtevu 14, gde:
(i) subjektu je dato jedno ili više drugih terapeutskih sredstava ;
(ii) subjektu je dato jedno ili više drugih terapeutskih sredstava koja su antivirusni lek ili vakcina; (iii) subjektu je davano jedno ili više drugih terapeutskih sredstva koja su članovi izabrani iz grupe koju čine : oseltamivir, zanamivir, ribavirin i interferon-alfa2b, interferon-alfa2a i antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen koje se specifično veže za influencu HA; ili
(iv) protein koji vezuje antigen je injektovan u telo subjekta, opciono subkutanozno, intravenski ili intramuskularno.
RS20210571A 2018-01-26 2019-01-24 Anti-tmprss2 antitela i fragmenti koji vezuju antigen RS61825B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862622292P 2018-01-26 2018-01-26
EP19701428.5A EP3638698B1 (en) 2018-01-26 2019-01-24 Anti-tmprss2 antibodies and antigen-binding fragments
PCT/US2019/014978 WO2019147831A1 (en) 2018-01-26 2019-01-24 Anti-tmprss2 antibodies and antigen-binding fragments

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61825B1 true RS61825B1 (sr) 2021-06-30

Family

ID=66102175

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210571A RS61825B1 (sr) 2018-01-26 2019-01-24 Anti-tmprss2 antitela i fragmenti koji vezuju antigen

Country Status (26)

Country Link
US (3) US10941213B2 (sr)
EP (1) EP3638698B1 (sr)
JP (1) JP2024009962A (sr)
KR (2) KR20250133488A (sr)
CN (2) CN111936517B (sr)
AU (2) AU2019211406C1 (sr)
BR (1) BR112020015112A2 (sr)
CA (1) CA3089377A1 (sr)
CY (1) CY1124182T1 (sr)
DK (1) DK3638698T3 (sr)
ES (1) ES2864529T3 (sr)
HR (1) HRP20210876T1 (sr)
HU (1) HUE054403T2 (sr)
IL (2) IL312961A (sr)
LT (1) LT3638698T (sr)
MA (1) MA46731B1 (sr)
MD (1) MD3638698T2 (sr)
MX (2) MX2020007888A (sr)
PL (1) PL3638698T3 (sr)
PT (1) PT3638698T (sr)
RS (1) RS61825B1 (sr)
SG (1) SG11202006898TA (sr)
SI (1) SI3638698T1 (sr)
SM (1) SMT202100307T1 (sr)
WO (1) WO2019147831A1 (sr)
ZA (1) ZA202004494B (sr)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI702229B (zh) * 2014-12-19 2020-08-21 美商再生元醫藥公司 流行性感冒病毒血球凝集素之人類抗體
SMT202100307T1 (it) 2018-01-26 2021-07-12 Regeneron Pharma Anticorpi e frammenti di legame di anti-tmprss2
US12091777B2 (en) 2019-09-23 2024-09-17 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for CRTH2
WO2021061842A1 (en) * 2019-09-23 2021-04-01 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for single domain antibodies
IL294989A (en) 2020-01-24 2022-09-01 Regeneron Pharma Conjugated protein-antiviral compounds
JP7772702B2 (ja) * 2020-02-10 2025-11-18 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 抗ｔｍｐｒｓｓ２抗体および抗原結合断片
WO2021190980A1 (en) 2020-03-22 2021-09-30 Quadrucept Bio Limited Multimers for viral strain evolution
CR20220552A (es) 2020-04-02 2023-01-17 Regeneron Pharma Anticuerpos contra glicoproteína de espícula anti-sars-cov-2 y fragmentos de unión al antígeno
WO2021211402A2 (en) * 2020-04-13 2021-10-21 Maddon Advisors Llc Ace2-targeted compositions and methods for treating covid-19
CA3180508A1 (en) 2020-04-17 2021-10-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Detection assays for coronavirus neutralizing antibodies
WO2021212101A1 (en) 2020-04-17 2021-10-21 Vyriad, Inc. Compositions for treating and/or preventing coronavirus infections
WO2021242815A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-sars-cov-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
JP2023528441A (ja) 2020-06-03 2023-07-04 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質抗体を用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染及びＣＯＶＩＤ－１９を治療又は予防するための方法
US12097212B2 (en) 2020-06-08 2024-09-24 Brigham Young University Use of cationic steroidal antimicrobial compounds to deactivate coronavirus
WO2021255217A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 Heidelberg Pharma Research Gmbh Amatoxin and amatoxin conjugates for use in inhibition of rna virus replication
CN111986818A (zh) * 2020-08-21 2020-11-24 南通大学 一种基于tmprss2的新冠covid-19治疗药物筛选系统
WO2022051549A1 (en) * 2020-09-04 2022-03-10 Rutgers, The State University Of New Jersey Sars-cov-2 vaccines and antibodies
CN112795583A (zh) * 2020-11-16 2021-05-14 上海大学 重组唾液酸外切酶的制备方法、表达基因、重组表达载体及构建方法
WO2022115503A1 (en) 2020-11-25 2022-06-02 Dupont Nutrition Biosciences Aps Treatment and prevention of coronavirus infection
CN112538494A (zh) * 2020-12-08 2021-03-23 武汉华美生物工程有限公司 一种tmprss2突变体蛋白及其表达载体、表达工程菌和制备方法
WO2022133182A1 (en) * 2020-12-18 2022-06-23 Chan Zuckerberg Biohub, Inc. Method of treating coronavirus infection
WO2022184659A1 (en) 2021-03-01 2022-09-09 Quadrucept Bio Limited Antibody domains & multimers
WO2022187626A1 (en) 2021-03-05 2022-09-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-sars-cov-2-variant-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
EP4314075A4 (en) 2021-03-24 2025-04-09 Twist Bioscience Corporation VARIANT NUCLEIC ACID BANKS FOR CD3
CA3225575A1 (en) 2021-07-14 2023-01-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-sars-cov-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
EP4509529A1 (en) * 2022-04-12 2025-02-19 Riken Antibody used to treat coronavirus infection
WO2023220712A1 (en) * 2022-05-13 2023-11-16 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Host proteases essential for parainfluenza spread in the human lung: potential targets for antiviral interventions
CN116003611B (zh) * 2022-08-17 2024-02-27 中南大学湘雅医院 抗tmprss2抗体及其用途
WO2024252183A1 (en) * 2023-06-08 2024-12-12 Institut Pasteur Single domain antibodies directed against human transmembrane- serine protease 2 (tmprss2)
WO2025072792A1 (en) * 2023-09-28 2025-04-03 The Regents Of The University Of California Methods for identifying and treating diseases characterized by allele specific expression

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US4952496A (en) 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
US5693489A (en) 1984-03-30 1997-12-02 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
JP2004511219A (ja) * 2000-07-12 2004-04-15 アジェンシス，インコーポレイテッド 膀胱癌、卵巣癌、肺癌、および腎臓癌の診断および治療に有用な腫瘍抗原
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US8354508B2 (en) 2006-07-21 2013-01-15 Diadexus, Inc. PRO115 antibody compositions and methods of use
AU2007285695B2 (en) 2006-08-18 2012-05-24 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against IL-6R and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with IL-6-mediated signalling
NO347649B1 (no) 2006-12-14 2024-02-12 Regeneron Pharma Humant antistoff eller antistoff fragment som spesifikt binder human deltaliknende ligand 4 (hDII4), nukleinsyremolekyl som koder for slike og vektor og vert-vektorsystemer, samt fremgangsmåte for fremstilling, sammensetning og anvendelse.
AU2009248049B2 (en) 2008-05-16 2015-07-23 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against CXCR4 and other GPCRs and compounds comprising the same
CN104244978A (zh) 2012-04-16 2014-12-24 瑞泽恩制药公司 通过施用丝氨酸蛋白酶抑制剂治疗或预防流感病毒感染的方法
US20150203591A1 (en) 2012-08-02 2015-07-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mutivalent antigen-binding proteins
TWI702229B (zh) 2014-12-19 2020-08-21 美商再生元醫藥公司 流行性感冒病毒血球凝集素之人類抗體
JP6980674B2 (ja) 2016-02-29 2021-12-15 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドRegeneron Pharmaceuticals, Inc. ヒト化ｔｍｐｒｓｓ遺伝子を有する齧歯類
CN110650751A (zh) 2017-03-22 2020-01-03 儿童医学中心公司 Lrp1结合剂及其用途
SMT202100307T1 (it) 2018-01-26 2021-07-12 Regeneron Pharma Anticorpi e frammenti di legame di anti-tmprss2

Also Published As

Publication number Publication date
CA3089377A1 (en) 2019-08-01
CN120290578A (zh) 2025-07-11
IL276164B2 (en) 2024-11-01
IL312961A (en) 2024-07-01
SI3638698T1 (sl) 2021-07-30
CN111936517B (zh) 2025-04-18
US20230265216A1 (en) 2023-08-24
US10941213B2 (en) 2021-03-09
AU2019211406A1 (en) 2020-08-13
CN111936517A (zh) 2020-11-13
MA46731A (fr) 2020-04-22
SG11202006898TA (en) 2020-08-28
US11603413B2 (en) 2023-03-14
AU2019211406B2 (en) 2025-03-06
DK3638698T3 (da) 2021-04-26
AU2025204183A9 (en) 2026-03-19
JP2024009962A (ja) 2024-01-23
IL276164B1 (en) 2024-07-01
PL3638698T3 (pl) 2021-09-06
BR112020015112A2 (pt) 2021-04-06
PT3638698T (pt) 2021-04-06
AU2019211406C1 (en) 2025-07-17
ZA202004494B (en) 2022-05-25
HUE054403T2 (hu) 2021-09-28
EP3638698B1 (en) 2021-03-03
JP2021511058A (ja) 2021-05-06
IL276164A (en) 2020-09-30
LT3638698T (lt) 2021-04-12
MX2024006462A (es) 2024-06-11
MD3638698T2 (ro) 2021-07-31
CY1124182T1 (el) 2022-05-27
SMT202100307T1 (it) 2021-07-12
KR20200115576A (ko) 2020-10-07
MA46731B1 (fr) 2021-06-30
WO2019147831A1 (en) 2019-08-01
US20190300625A1 (en) 2019-10-03
KR102911478B1 (ko) 2026-01-14
EP3638698A1 (en) 2020-04-22
AU2025204183A1 (en) 2025-06-26
MX2020007888A (es) 2020-09-07
ES2864529T3 (es) 2021-10-14
KR20250133488A (ko) 2025-09-05
US20210230303A1 (en) 2021-07-29
US20220081489A9 (en) 2022-03-17
US12065506B2 (en) 2024-08-20
HRP20210876T1 (hr) 2021-07-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12065506B2 (en) Anti-TMPRSS2 antibodies and antigen-binding fragments
EP3889177B1 (en) Anti-sars-cov-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
JP7772702B2 (ja) 抗ｔｍｐｒｓｓ２抗体および抗原結合断片
KR20240046322A (ko) 항-sars-cov-2-스파이크 당단백질 항체 및 항원-결합 단편
JP7834965B2 (ja) 抗ｔｍｐｒｓｓ２抗体および抗原結合断片
HK40027684A (en) Anti-tmprss2 antibodies and antigen-binding fragments
HK40027684B (en) Anti-tmprss2 antibodies and antigen-binding fragments
HK40096787A (en) Anti-sars-cov-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
WO2022187626A1 (en) Anti-sars-cov-2-variant-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
HK40054577A (en) Anti-sars-cov-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments
CN118302440A (zh) 抗sars-cov-2-刺突糖蛋白抗体及抗原结合片段
HK40054577B (en) Anti-sars-cov-2-spike glycoprotein antibodies and antigen-binding fragments