MD3775165T2 - Procese de producție a limfocitelor infiltrante în tumori și utilizările acestora în imunoterapie - Google Patents

Procese de producție a limfocitelor infiltrante în tumori și utilizările acestora în imunoterapie Download PDF

Info

Publication number
MD3775165T2
MD3775165T2 MDE20210111T MDE20210111T MD3775165T2 MD 3775165 T2 MD3775165 T2 MD 3775165T2 MD E20210111 T MDE20210111 T MD E20210111T MD E20210111 T MDE20210111 T MD E20210111T MD 3775165 T2 MD3775165 T2 MD 3775165T2
Authority
MD
Moldova
Prior art keywords
tils
til
population
days
expansion
Prior art date
Application number
MDE20210111T
Other languages
English (en)
Inventor
Seth Wardell
James Bender
Original Assignee
Iovance Biotherapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US15/940,901 external-priority patent/US10918666B2/en
Application filed by Iovance Biotherapeutics Inc filed Critical Iovance Biotherapeutics Inc
Publication of MD3775165T2 publication Critical patent/MD3775165T2/ro

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/10—Preservation of living parts
    • A01N1/12—Chemical aspects of preservation
    • A01N1/122—Preservation or perfusion media
    • A01N1/125—Freeze protecting agents, e.g. cryoprotectants or osmolarity regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/10—Preservation of living parts
    • A01N1/14—Mechanical aspects of preservation; Apparatus or containers therefor
    • A01N1/142—Apparatus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/10—Preservation of living parts
    • A01N1/16—Physical preservation processes
    • A01N1/162—Temperature processes, e.g. following predefined temperature changes over time
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4271—Melanoma antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the cancer treated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/57—Skin; melanoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/59—Reproductive system, e.g. uterus, ovaries, cervix or testes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Thermal Sciences (AREA)

Abstract

Prezenta invenţie prevede metode îmbunătăţite şi/sau simplificate de expansiune TIL-urilor şi producerea de populaţii terapeutice de TIL aşa cum se defineşte în revendicările anexate, inclusiv metode noi de expansiune a limfocitelor infiltrante în tumori (TIL) într-o populaţie terapeutică de TIL, pentru extinderea populaţiilor TIL într-un sistem închis, care conduc la o eficacitate îmbunătăţită, la îmbunătăţirea fenotipului şi la creşterea sănătăţii metabolice a TIL-urilor într-un timp mai scurt, perioadă de timp, permiţând în acelaşi timp reducerea contaminării microbiene, precum şi reducerea costurilor. Astfel de TIL-uri îşi găsesc utilizare în tratament terapeutic.

Description

BAZA INVENŢIEI
Tratamentul cancerelor refractare, masive, folosind transfer adoptiv al limfocitelor infiltrante în tumori (TIL) reprezintă o metodă terapeutică eficace pentru pacienţi cu prognostic slab. Gattinoni, et al., Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 383-393. Este necesar un număr mare de TIL pentru o imunoterapie reuşită, precum şi un proces solid şi fiabil pentru comercializare. Aceasta constituie o provocare din cauza problemelor tehnice, logistice şi normative legate de expansiunea celulelor. Expansiunea TIL bazată pe IL-2, urmată de un "proces de expansiune rapidă" (REP) a devenit o metodă preferată pentru expansiunea TIL datorită vitezei şi eficienţei. Dudley, et al., Science 2002, 298, 850-54; Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-57; Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-39; Riddell, et al., Science 1992, 257, 238-41; Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42. REP poate duce la o expansiune de 1.000 de ori a TIL într-o perioadă de 14 zile, deşi necesită un surplus mare (de ex., de 200 de ori) de celule mononucleare din sângele periferic alogenice iradiate (PBMC, cunoscute şi ca celule mononucleare (MNCs)), adesea de la donatori multipli, ca celule feeder, precum şi anticorp anti-CD3 (OKT3) şi doze mari de IL-2. Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42. TIL care au suferit o procedură REP au dus la o terapie celulară adoptivă reuşită în urma imunosupresiei gazdei la pacienţi cu melanom. Parametrii actuali de acceptare a transferului se bazează pe citirile compoziţiei TIL (de ex., pozitivitate CD28, CD8 sau CD4) şi pe gradul de expansiune şi viabilitatea produsului REP.
Procesele actuale de preparare TIL sunt limitate de lungime, cost, probleme de sterilitate şi alţi factori descrişi în prezenta, astfel încât potenţialul de comercializare a acestor procese este sever limitat din aceste motive şi altele şi, la momentul actual, nu există un proces comercial. Este nevoie urgentă de prevedere a unor procese de preparare TIL şi de terapii bazate pe aceste procese, care să fie adecvate pentru preparare la scară de comercială şi autorizate pentru utilizare la pacienţi umani în centre clinice multiple.
SCURT REZUMAT AL INVENŢIEI
Prezenta invenţie prevede metode îmbunătăţite şi/sau simplificate de expansiune TIL şi de producere a populaţiilor terapeutice de TIL aşa cum se defineşte în revendicările anexate.
Prezenta invenţie prevede metode de expansiune a limfocitelor infiltrante în tumori (TIL) într-o populaţie terapeutică de TIL cuprinzând:
(a) adăugarea fragmentelor tumorale procesate dintr-o tumoare rezecată de la un pacient într-un sistem închis pentru a obţine o primă populaţie de TIL;
(b) efectuarea unei prime expansiuni prin cultivarea primei populaţii de TIL într-un mediu de cultură celulară cuprinzând IL-2, şi opţional OKT-3, pentru a produce o a doua populaţie de TIL, unde prima expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o primă suprafaţă permeabilă la gaz, unde prima expansiune se efectuează timp de circa 3-14 zile pentru a obţine a doua populaţie de TIL, unde tranziţia de la etapa (a) la etapa (b) are loc fără deschiderea sistemului;
(c) efectuarea unei a doua expansiuni prin suplimentarea mediului de cultură celulară al celei de-a doua populaţii de TIL cu IL-2 suplimentar, opţional OKT-3, şi celule de prezentare a antigenului (APC), pentru a produce o a treia populaţie de TIL, unde a doua expansiune se efectuează timp de circa 4 până la 6 zile pentru a obţine a treia populaţie de TIL, unde a doua expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o a doua suprafaţă permeabilă la gaz şi unde tranziţia de la etapa (b) la etapa (c) are loc fără deschiderea sistemului;
(d) împărţirea celei de-a treia populaţii de TIL într-un prim grup de cinci sau mai puţine sub-populaţii de TIL, fiecare sub-populaţie cuprinzând cel puţin 1.0×109 TIL, şi efectuarea unei a treia expansiuni a primului grup de sub-populaţii de TIL prin suplimentarea mediului de cultură celulară al fiecărei sub-populaţii de TIL cu IL-2 suplimentar, opţional OKT-3, pentru a produce un al doilea grup de sub-populaţii de TIL, unde al doilea grup de sub-populaţii de TIL cuprinde o populaţie terapeutică de TIL, unde a treia expansiune se efectuează timp de circa 5 până la circa 7 zile, unde a treia expansiune pentru fiecare sub-populaţie se efectuează într-un recipient închis care asigură o a treia suprafaţă permeabilă la gaz şi unde tranziţia de la etapa (c) la etapa (d) are loc fără deschiderea sistemului;
(e) recoltarea populaţiei terapeutice de TIL obţinute de la etapa (d), unde tranziţia de la etapa (d) la etapa (e) are loc fără deschiderea sistemului; şi
(f) transferul populaţiei TIL recoltate de la etapa (e) într-o pungă de perfuzie, unde transferul de la etapa (e) la (f) are loc fără deschiderea sistemului.
În unele aplicări, a doua populaţie de TIL are un număr de cel puţin 50 de ori mai mare decât prima populaţie de TIL.
În unele aplicări, populaţia terapeutică de TIL recoltată în etapa (e) cuprinde suficiente TIL pentru un dozaj terapeutic eficient al TIL.
În unele aplicări, numărul de TIL suficient pentru un dozaj terapeutic eficient este de la circa 2.3×1010 până la circa 13.7×1010.
În unele aplicări, metoda mai cuprinde etapa de crioconservare a pungii de perfuzie cuprinzând populaţia TIL recoltată folosind un proces de crioconservare.
În unele aplicări, procesul de crioconservare se efectuează folosind un raport 1:1 între populaţia TIL recoltată şi mediul de crioconservare.
În unele aplicări, celulele de prezentare a antigenului sunt celule mononucleare din sângele periferic (PBMC).
În unele aplicări, PBMC sunt iradiate şi alogenice.
Metoda conform revendicării 68, unde PBMC se adaugă în cultura celulară în oricare dintre zilele 9 până la 14 în etapa (c).
În unele aplicări, celulele de prezentare a antigenului sunt celule de prezentare a antigenului artificiale.
În unele aplicări, recoltarea din etapa (d) se efectuează folosind un sistem de procesare celulară LOVO.
În unele aplicări, fragmentele multiple cuprind circa 4 până la circa 50 fragmente, unde fiecare fragment are un volum de circa 27 mm3.
În unele aplicări, fragmentele multiple cuprind circa 30 până la circa 60 fragmente cu un volum total de circa 1300 mm3 până la circa 1500 mm3.
În unele aplicări, fragmentele multiple cuprind circa 50 fragmente cu un volum total de circa 1350 mm3.
În unele aplicări, fragmentele multiple cuprind circa 50 fragmente cu o masă totală de circa 1 gram până la circa 1.5 grame.
În unele aplicări, fragmentele multiple cuprind circa 4 fragmente.
În unele aplicări, al doilea mediu de cultură celulară este prevăzut într-un recipient selectat din grupul constând dintr-un recipient G şi o pungă celulară Xuri.
În unele aplicări, punga de perfuzie în etapa (e) este o pungă de perfuzie conţinând HypoThermosol.
În unele aplicări, prima perioadă în etapa (b) şi a doua perioadă în etapa (c) se efectuează fiecare individual într-o perioadă de 10 zile, 11 zile sau 12 zile.
În unele aplicări, prima perioadă în etapa (b) şi a doua perioadă în etapa (c) se efectuează fiecare individual într-o perioadă de 11 zile.
În unele aplicări, etapele (a) până la (f) se efectuează într-o perioadă de circa 10 zile până la circa 22 zile.
În unele aplicări, etapele (a) până la (f) se efectuează într-o perioadă de circa 10 zile până la circa 20 zile.
În unele aplicări, etapele (a) până la (f) se efectuează într-o perioadă de circa 10 zile până la circa 15 zile.
În unele aplicări, etapele (a) până la (f) se efectuează în 22 zile sau mai puţin.
În unele aplicări, etapele (a) până la (f) şi crioconservarea se efectuează în 22 zile sau mai puţin.
În unele aplicări, etapele (b) până la (f) se efectuează într-un singur recipient, unde efectuarea etapelor (b) până la (f) într-un singur recipient duce la o creştere a producţiei TIL per tumoare rezecată faţă de efectuarea etapelor (b) până la (f) în mai multe recipiente.
În unele aplicări, celulele de prezentare a antigenului se adaugă în TIL în a doua perioadă în etapa (c) fără deschiderea sistemului.
În unele aplicări, a treia populaţie de TIL în etapa (d) este o populaţie terapeutică de TIL cuprinzând o subpopulaţie mărită de celule T efectoare şi/sau celule T de memorie centrală faţă de a doua populaţie de TIL, unde celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală obţinute în populaţia terapeutică de TIL prezintă una sau mai multe caracteristici selectate din grupul constând din expresie CD27+, expresie CD28+, telomeri mai lungi, expresie CD57 mărită şi expresie CD56 scăzută faţă de celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală obţinute din a doua populaţie de celule.
În unele aplicări, celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală obţinute în populaţia terapeutică de TIL prezintă expresie CD57 mărită şi expresie CD56 scăzută faţă de celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală obţinute din a doua populaţie de celule.
În unele aplicări, riscul de contaminare microbiană este redus faţă de un sistem deschis.
În unele aplicări, TIL de la etapa (e) sunt infuzate la un pacient.
În unele aplicări, recipientul închis cuprinde un singur bioreactor.
În unele aplicări, recipientul închis cuprinde un G-REX-10.
În unele aplicări, recipientul închis cuprinde un G-REX -100.
În unele aplicări, la etapa (d) celulele de prezentare a antigenului (APC) sunt adăugate în cultura celulară a celei de-a doua populaţii de TIL la un raport APC:TIL de 25:1 până la 100:1.
În unele aplicări, cultura celulară are un raport de 2.5×109 APC la 100×106 TIL.
În unele aplicări, la etapa (c) celulele de prezentare a antigenului (APC) sunt adăugate în cultura celulară a celei de-a doua populaţii de TIL la un raport APC:TIL de 25:1 până la 100:1.
În unele aplicări, cultura celulară are un raport de 2.5×109 APC la 100×106 TIL.
ALTE OBIECTE
Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, o metodă de expansiune a limfocitelor infiltrante în tumori (TIL) într-o populaţie terapeutică de TIL cuprinzând:
(a) obţinerea unei prime populaţii de TIL dintr-o tumoare rezecată de la un pacient prin procesarea unei probe tumorale obţinute de la pacient în mai multe fragmente tumorale;
(b) adăgarea fragmentelor tumorale într-un sistem închis;
(c) efectuarea unei prime expansiuni prin cultivarea primei populaţii de TIL într-un mediu de cultură celulară cuprinzând IL-2 şi opţional OKT-3, pentru a produce o a doua populaţie de TIL, unde prima expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o primă suprafaţă permeabilă la gaz, unde prima expansiune se efectuează timp de circa 3-14 zile pentru a obţine a doua populaţie de TIL, unde a doua populaţie de TIL are un număr de cel puţin 50 de ori mai mare decât prima populaţie de TIL şi unde tranziţia de la etapa (b) la etapa (c) are loc fără deschiderea sistemului;
(d) efectuarea unei a doua expansiuni prin suplimentarea mediului de cultură celulară al celei de-a doua populaţii de TIL cu IL-2 suplimentar, opţional OKT-3 şi celule de prezentare a antigenului (APC), pentru a produce o a treia populaţie de TIL, unde a doua expansiune se efectuează timp de circa 7-14 zile pentru a obţine a treia populaţie de TIL, unde a treia populaţie de TIL este o populaţie terapeutică de TIL, unde a doua expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o a doua suprafaţă permeabilă la gaz şi unde tranziţia de la etapa (c) la etapa (d) are loc fără deschiderea sistemului;
(e) recoltarea populaţiei terapeutice de TIL obţinute de la etapa (d), unde tranziţia de la etapa (d) la etapa (e) are loc fără deschiderea sistemului; şi
(f) transferul populaţiei TIL recoltate de la etapa (e) într-o pungă de perfuzie, unde transferul de la etapa (e) la (f) are loc fără deschiderea sistemului.
În unele metode divulgate în prezenta, metoda, de asemenea, cuprinde etapa de crioconservare a pungii de perfuzie cuprinzând populaţia TIL recoltată în etapa (f) folosind un proces de crioconservare.
În unele metode divulgate în prezenta, procesul de crioconservare se efectua folosind un raport 1:1 între populaţia TIL recoltată şi mediul de crioconservare.
În unele metode divulgate în prezenta, celulele de prezentare a antigenului sunt celule mononucleare din sângele periferic (PBMC). În unele metode divulgate în prezenta, PBMC sunt iradiate şi alogenice. În unele metode divulgate în prezenta, PBMC sunt adăugate în cultura celulară în oricare dintre zilele 9 - 14 în etapa (d). În unele metode divulgate în prezenta, celulele de prezentare a antigenului sunt celule de prezentare a antigenului artificiale.
În unele metode divulgate în prezenta, recoltarea din etapa (e) se poate efectua folosind un sistem de procesare celulară pe bază de membrană.
În unele metode divulgate în prezenta, recoltarea din etapa (e) se poate efectua folosind un sistem de procesare celulară LOVO.
În unele metode divulgate în prezenta, fragmentele multiple pot cuprinde circa 4 până la circa 50 fragmente, unde fiecare fragment are un volum de circa 27 mm3.
În unele metode divulgate în prezenta, fragmentele multiple pot cuprinde circa 30 până la circa 60 fragmente cu un volum total de circa 1300 mm3 până la circa 1500 mm3.
În unele metode divulgate în prezenta, fragmentele multiple pot cuprinde circa 50 fragmente cu un volum total de circa 1350 mm3.
În unele metode divulgate în prezenta, fragmentele multiple pot cuprinde circa 50 fragmente cu o masă totală de circa 1 gram până la circa 1.5 grame.
În unele metode divulgate în prezenta, mediul de cultură celulară poate fi prevăzut într-un recipient selectat din grupul constând dintr-un recipient G şi o pungă celulară Xuri.
În unele metode divulgate în prezenta, mediul de cultură celulară în etapa (d) mai poate cuprinde IL-15 şi/sau IL-21.
În unele metode divulgate în prezenta, concentraţia IL-2 poate fi circa 10.000 IU/mL până la circa 5.000 IU/mL.
În unele metode divulgate în prezenta, concentraţia IL-15 poate fi circa 500 IU/mL până la circa 100 IU/mL.
În unele metode divulgate în prezenta, concentraţia IL-21 poate fi circa 20 IU/mL până la circa 0.5 IU/mL.
În unele metode divulgate în prezenta, punga de perfuzie în etapa (f) poate fi o pungă de perfuzie conţinând HypoThermosol.
În unele metode divulgate în prezenta, mediul de crioconservare poate cuprinde dimetilsulfoxid (DMSO). În unele metode divulgate în prezenta, mediul de crioconservare poate cuprinde 7% până la 10% dimetilsulfoxid (DMSO).
În unele metode divulgate în prezenta, prima perioadă în etapa (c) şi a doua perioadă în etapa (e) se pot efectua fiecare individual într-o perioadă de 10 zile, 11 zile sau 12 zile.
În unele metode divulgate în prezenta, prima perioadă în etapa (c) şi a doua perioadă în etapa (e) se pot efectua fiecare individual într-o perioadă de 11 zile.
În unele metode divulgate în prezenta, etapele (a) până la (f) se pot efectua într-o perioadă de circa 10 zile până la circa 22 zile.
În unele metode divulgate în prezenta, etapele (a) până la (f) se pot efectua fiecare într-o perioadă de circa 20 zile până la circa 22 zile.
În unele metode divulgate în prezenta, etapele (a) până la (f) se pot efectua fiecare într-o perioadă de circa 15 zile până la circa 20 zile.
În unele metode divulgate în prezenta, etapele (a) până la (f) se pot efectua fiecare într-o perioadă de circa 10 zile până la circa 20 zile.
În unele metode divulgate în prezenta, etapele (a) până la (f) se pot efectua fiecare într-o perioadă de circa 10 zile până la circa 15 zile.
În unele metode divulgate în prezenta, etapele (a) până la (f) se pot efectua fiecare în 22 zile sau mai puţin.
În unele metode divulgate în prezenta, etapele (a) până la (f) se pot efectua fiecare în 20 zile sau mai puţin.
În unele metode divulgate în prezenta, etapele (a) până la (f) se pot efectua fiecare în 15 zile sau mai puţin.
În unele metode divulgate în prezenta, etapele (a) până la (f) se pot efectua fiecare în 10 zile sau mai puţin.
În unele metode divulgate în prezenta, etapele (a) până la (f) şi crioconservarea se pot efectua fiecare în 22 zile sau mai puţin.
În unele metode divulgate în prezenta, Populaţia terapeutică de TIL recoltată în etapa (e) poate cuprinde suficiente TIL pentru un dozaj terapeutic eficient al TIL.
În unele metode divulgate în prezenta, Numărul de TIL suficient pentru un dozaj terapeutic eficient este de la circa 2.3×1010 la circa 13.7×1010.
În unele metode divulgate în prezenta, Etapele (b) până la (e) se pot efectua într-un singur recipient, unde efectuarea etapelor (b) până la (e) într-un singur recipient duce la o creştere a producţiei TIL per tumoare rezecată faţă de efectuarea etapelor (b) până la (e) în mai multe recipiente.
În unele metode divulgate în prezenta, Celulele de prezentare a antigenului se pot adăuga în TIL în a doua perioadă în etapa (d) fără deschiderea sistemului.
În unele metode divulgate în prezenta, A treia populaţie de TIL în etapa (d) poate asigura eficienţă mărită, producţie interferon-gamma mărită, policlonalitate mărită, IP-10 mediu mărit şi/sau MCP-1 mediu mărit la administrare la un subiect.
În unele metode divulgate în prezenta, A treia populaţie de TIL în etapa (d) poate asigura o producţie interferon-gamma de cel puţin cinci ori mai mare sau mai mult la administrare la un subiect.
În unele metode divulgate în prezenta, A treia populaţie de TIL în etapa (d) poate fi o populaţie terapeutică de TIL cuprinzând o subpopulaţie mărită de celule T efectoare şi/sau celule T de memorie centrală faţă de a doua populaţie de TIL, unde celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală din populaţia terapeutică de TIL prezintă una sau mai multe caracteristici selectate din grupul constând din expresie CD27+, expresie CD28+, telomeri mai lungi, expresie CD57 mărită şi expresie CD56 scăzută faţă de celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală obţinute din a doua populaţie de celule.
În unele metode divulgate în prezenta, Celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală obţinute din a treia populaţie de TIL pot prezenta expresie CD57 mărită şi expresie CD56 scăzută faţă de celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală obţinute din a doua populaţie de celule.
În unele metode divulgate în prezenta, Riscul de contaminare microbiană poate fi redus faţă de un sistem deschis.
În unele metode divulgate în prezenta, TIL de la etapa (g) pot fi prevăzute pentru perfuzie într-un pacient.
În unele metode divulgate în prezenta, Fragmentele multiple pot cuprinde circa 4 fragmente.
Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, o metodă de tratare a unui subiect cu cancer, metoda cuprinzând administrarea limfocitelor infiltrante în tumori (TIL) amplificate cuprinzând:
(a) obţinerea unei prime populaţii de TIL dintr-o tumoare rezecată de la un subiect prin procesarea unei probe tumorale obţinute de la pacient în mai multe fragmente tumorale;
(b) adăgarea fragmentelor tumorale într-un sistem închis;
(c) efectuarea unei prime expansiuni prin cultivarea primei populaţii de TIL într-un mediu de cultură celulară cuprinzând IL-2 şi opţional OKT-3, pentru a produce o a doua populaţie de TIL, unde prima expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o primă suprafaţă permeabilă la gaz, unde prima expansiune se efectuează timp de circa 3-14 zile pentru a obţine a doua populaţie de TIL, unde a doua populaţie de TIL are un număr de cel puţin 50 de ori mai mare decât prima populaţie de TIL şi unde tranziţia de la etapa (b) la etapa (c) are loc fără deschiderea sistemului;
(d) efectuarea unei a doua expansiuni prin suplimentarea mediului de cultură celulară al celei de-a doua populaţii de TIL cu IL-2 suplimentar, opţional OKT-3 şi celule de prezentare a antigenului (APC), pentru a produce o a treia populaţie de TIL, unde a doua expansiune se efectuează timp de circa 7-14 zile pentru a obţine a treia populaţie de TIL, unde a treia populaţie de TIL este o populaţie terapeutică de TIL, unde a doua expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o a doua suprafaţă permeabilă la gaz şi unde tranziţia de la etapa (c) la etapa (d) are loc fără deschiderea sistemului;
(e) recoltarea populaţiei terapeutice de TIL obţinute de la etapa (d), unde tranziţia de la etapa (d) la etapa (e) are loc fără deschiderea sistemului; şi
(f) transferul populaţiei TIL recoltate de la etapa (e) într-o pungă de perfuzie, unde transferul de la etapa (e) la (f) are loc fără deschiderea sistemului;
(g) opţional crioconservarea pungii de perfuzie cuprinzând populaţia TIL recoltată de la etapa (f) folosind un proces de crioconservare; şi
(h) administrarea unui dozaj terapeutic eficient din a treia populaţie de TIL din punga de perfuzie în etapa (g) la pacient.
În unele metode divulgate în prezenta, Populaţia terapeutică de TIL recoltată în etapa (e) poate cuprinde suficiente TIL pentru administrarea unui dozaj terapeutic eficient al TIL în etapa (h).
În unele metode divulgate în prezenta, Numărul de TIL suficient for administrarea unui dozaj terapeutic eficient în etapa (h) poate fi de la circa 2.3×1010 până la circa 13.7×1010.
În unele metode divulgate în prezenta, Celulele de prezentare a antigenului (APC) pot fi PBMC.
În unele metode divulgate în prezenta, PBMC pot fi adăugate în cultura celulară în oricare dintre zilele 9 - 14 în etapa (d).
În unele metode divulgate în prezenta, Înaintea administrării unui dozaj terapeutic eficient de celule TIL în etapa (h), poate să fi fost administrat la pacient un regim de limfodepleţie non-mieloablativ.
În unele metode divulgate în prezenta, Regimul de limfodepleţie non-mieloablativ poate cuprinde etapele de administrare a ciclofosfamidei la o doză de 60 mg/m2/zi timp de două zile, urmată de administrarea fludarabinei la o doză de 25 mg/m2/zi timp de cinci zile.
În unele metode divulgate în prezenta, Metoda mai poate cuprinde etapa de tratare a pacientului cu un regim IL-2 în doză mare începând cu ziua de după administrarea celulelor TIL la pacient în etapa (h).
În unele metode divulgate în prezenta, Regimul IL-2 în doză mare poate cuprinde 600.000 sau 720.000 IU/kg administrat ca o perfuzie intravenoasă în bolus în 15 minute din opt în opt ore până la toleranţă.
În unele metode divulgate în prezenta, A treia populaţie de TIL în etapa (d) poate fi o populaţie terapeutică de TIL cuprinzând o subpopulaţie mărită de celule T efectoare şi/sau celule T de memorie centrală faţă de a doua populaţie de TIL, unde celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală din populaţia terapeutică de TIL prezintă una sau mai multe caracteristici selectate din grupul constând din expresie CD27+, expresie CD28+, telomeri mai lungi, expresie CD57 mărită şi expresie CD56 scăzută faţă de celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală obţinute din a doua populaţie de celule.
În unele metode divulgate în prezenta, Celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală din populaţia terapeutică de TIL pot prezenta expresie CD57 mărită şi expresie CD56 scăzută faţă de celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală obţinute din a doua populaţie de celule.
În unele metode divulgate în prezenta, Cancerul poate fi selectat din grupul constând din melanom, cancer ovarian, cancer de col uterin, cancer pulmonar macrocelular (NSCLC), cancer pulmonar, cancer de vezică, cancer mamar, cancer cauzat de papilomavirus uman, cancer la cap şi gât (inclusiv carcinom celular scuamos la cap şi gât (HNSCC)), cancer renal şi carcinom cu celule renale.
În unele metode divulgate în prezenta, Cancerul poate fi selectat din grupul constând din melanom, HNSCC, cancer de col uterins şi NSCLC.
În unele metode divulgate în prezenta, cancerul este melanom.
În unele metode divulgate în prezenta, cancerul este HNSCC. În unele metode divulgate în prezenta, cancerul este un cancer de col uterin. În unele metode divulgate în prezenta, cancerul este NSCLC.
Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, o populaţie de TIL amplificate pentru utilizare în tratarea unui subiect cu cancer, unde populaţia de TIL amplificate este o a treia populaţie de TIL obţinută printr-o metodă cuprinzând:
(a) obţinerea unei prime populaţii de TIL dintr-o tumoare rezecată de la un subiect prin procesarea unei probe tumorale obţinute de la pacient în mai multe fragmente tumorale;
(b) adăgarea fragmentelor tumorale într-un sistem închis;
(c) efectuarea unei prime expansiuni prin cultivarea primei populaţii de TIL într-un mediu de cultură celulară cuprinzând IL-2 pentru a produce o a doua populaţie de TIL, unde prima expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o primă suprafaţă permeabilă la gaz, unde prima expansiune se efectuează timp de circa 3-14 zile pentru a obţine a doua populaţie de TIL, unde a doua populaţie de TIL are un număr de cel puţin 50 de ori mai mare decât prima populaţie de TIL şi unde tranziţia de la etapa (b) la etapa (c) are loc fără deschiderea sistemului;
(d) efectuarea unei a doua expansiuni prin suplimentarea mediului de cultură celulară al celei de-a doua populaţii de TIL cu IL-2 suplimentar, opţional OKT-3 şi celule de prezentare a antigenului (APC), pentru a produce o a treia populaţie de TIL, unde a doua expansiune se efectuează timp de circa 7-14 zile pentru a obţine a treia populaţie de TIL, unde a treia populaţie de TIL este o populaţie terapeutică de TIL, unde a doua expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o a doua suprafaţă permeabilă la gaz şi unde tranziţia de la etapa (c) la etapa (d) are loc fără deschiderea sistemului;
(e) recoltarea populaţiei terapeutice de TIL obţinute de la etapa (d), unde tranziţia de la etapa (d) la etapa (e) are loc fără deschiderea sistemului; şi
(f) transferul populaţiei TIL recoltate de la etapa (e) într-o pungă de perfuzie, unde transferul de la etapa (e) la (f) are loc fără deschiderea sistemului; şi
(g) opţional crioconservarea pungii de perfuzie cuprinzând populaţia TIL recoltată de la etapa (f) folosind un proces de crioconservare.
Populaţia de TIL se utilizează pentru tratarea unui subiect cu cancer conform metodelor descrise mai sus şi în prezenta, unde metoda mai cuprinde una sau mai multe dintre caracteristicile indicate mai sus şi în prezenta. Populaţia de TIL poate fi utilizabilă în tratamentul unui subiect cu cancer conform metodelor descrise mai sus şi în prezenta, unde metoda mai cuprinde una sau mai multe dintre caracteristicile indicate mai sus şi în prezenta.
Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, o metodă de expansiune a limfocitelor infiltrante în tumori (TIL) într-o populaţie terapeutică de TIL cuprinzând:
(a) obţinerea unei prime populaţii de TIL dintr-o tumoare rezecată de la un pacient prin procesarea unei probe tumorale obţinute de la pacient în mai multe fragmente tumorale;
(b) adăugarea fragmentelor tumorale într-un sistem închis;
(c) efectuarea unei prime expansiuni prin cultivarea primei populaţii de TIL într-un mediu de cultură celulară cuprinzând IL-2, opţional OKT-3 şi opţional un agonist al superfamiliei receptorilor factorului de necroză tumorală (TNFRSF), pentru a produce o a doua populaţie de TIL, unde prima expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o primă suprafaţă permeabilă la gaz, unde prima expansiune se efectuează timp de circa 3-14 zile pentru a obţine a doua populaţie de TIL, unde a doua populaţie de TIL are un număr de cel puţin 50 de ori mai mare decât prima populaţie de TIL şi unde tranziţia de la etapa (b) la etapa (c) are loc fără deschiderea sistemului;
(d) efectuarea unei a doua expansiuni prin suplimentarea mediului de cultură celulară al celei de-a doua populaţii de TIL cu IL-2 suplimentar, opţional OKT-3 şi opţional un agonist al superfamiliei receptorilor factorului de necroză tumorală (TNFRSF), şi celule de prezentare a antigenului (APC), pentru a produce o a treia populaţie de TIL, unde a doua expansiune se efectuează timp de circa 7-14 zile pentru a obţine a treia populaţie de TIL, unde a treia populaţie de TIL este o populaţie terapeutică de TIL, unde a doua expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o a doua suprafaţă permeabilă la gaz şi unde tranziţia de la etapa (c) la etapa (d) are loc fără deschiderea sistemului;
(e) recoltarea populaţiei terapeutice de TIL obţinute de la etapa (d), unde tranziţia de la etapa (d) la etapa (e) are loc fără deschiderea sistemului; şi
(f) transferul populaţiei TIL recoltate de la etapa (e) într-o pungă de perfuzie, unde transferul de la etapa (e) la (f) are loc fără deschiderea sistemului.
Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, o metodă de tratare a unui subiect cu cancer, metoda cuprinzând administrarea limfocitelor infiltrante în tumori (TIL) amplificate cuprinzând:
(a) obţinerea unei prime populaţii de TIL dintr-o tumoare rezecată de la un subiect prin procesarea unei probe tumorale obţinute de la pacient în mai multe fragmente tumorale;
(b) adăugarea fragmentelor tumorale într-un sistem închis;
(c) efectuarea unei prime expansiuni prin cultivarea primei populaţii de TIL într-un mediu de cultură celulară cuprinzând IL-2, opţional OKT-3 şi opţional un agonist al superfamiliei receptorilor factorului de necroză tumorală (TNFRSF), pentru a produce o a doua populaţie de TIL, unde prima expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o primă suprafaţă permeabilă la gaz, unde prima expansiune se efectuează timp de circa 3-14 zile pentru a obţine a doua populaţie de TIL, unde a doua populaţie de TIL are un număr de cel puţin 50 de ori mai mare decât prima populaţie de TIL şi unde tranziţia de la etapa (b) la etapa (c) are loc fără deschiderea sistemului;
(d) efectuarea unei a doua expansiuni prin suplimentarea mediului de cultură celulară al celei de-a doua populaţii de TIL cu IL-2 suplimentar, opţional OKT-3 şi opţional un agonist al superfamiliei receptorilor factorului de necroză tumorală (TNFRSF), şi celule de prezentare a antigenului (APC), pentru a produce o a treia populaţie de TIL, unde a doua expansiune se efectuează timp de circa 7-14 zile pentru a obţine a treia populaţie de TIL, unde a treia populaţie de TIL este o populaţie terapeutică de TIL, unde a doua expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o a doua suprafaţă permeabilă la gaz şi unde tranziţia de la etapa (c) la etapa (d) are loc fără deschiderea sistemului;
(e) recoltarea populaţiei terapeutice de TIL obţinute de la etapa (d), unde tranziţia de la etapa (d) la etapa (e) are loc fără deschiderea sistemului; şi
(f) transferul populaţiei TIL recoltate de la etapa (e) într-o pungă de perfuzie, unde transferul de la etapa (e) la (f) are loc fără deschiderea sistemului;
(g) opţional crioconservarea pungii de perfuzie cuprinzând populaţia TIL recoltată de la etapa (f) folosind un proces de crioconservare; şi
(h) administrarea unui dozaj terapeutic eficient din a treia populaţie de TIL din punga de perfuzie în etapa (g) la pacient.
În unele metode divulgate în prezenta, agonistul superfamiliei receptorilor factorului de necroză tumorală (TNFRSF) este un anticorp 4-1BB. Agonistul TNFRSF poate fi un agonist 4-1BB şi agonistul 4-1BB este selectat din grupul constând din urelumab, utomilumab, EU-101, o proteină de fuziune şi fragmente, derivaţi, variante, biosimilari şi combinaţii ale acestora.
Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, o compoziţie de crioconservare cuprinzând o populaţie de TIL descrisă mai sus şi în prezenta, un mediu crioprotector cuprinzând dimetilsulfoxid (DMSO) şi o soluţie de electroliţi.
În unele compoziţii de crioconservare divulgate în prezenta, compoziţia de crioconservare mai conţine unul sau mai mulţi stabilizatori şi unul sau mai mulţi factori de creştere limfocitară. Unul sau mai mulţi stabilizatori pot cuprinde albumină serică umană (HSA) şi unul sau mai mulţi factori de creştere limfocitară cuprind IL-2. Compoziţia poate conţine opţional OKT-3.
În unele compoziţii de crioconservare divulgate în prezenta, DMSO şi soluţia de electroliţi sunt prezente într-un raport de aproximativ 1.1:1 până la aproximativ 1:1.1. DMSO şi soluţia de electroliţi pot fi prezente într-un raport de aproximativ 1:1.
În unele compoziţii de crioconservare divulgate în prezenta, 100 mL de compoziţie de crioconservare cuprinde populaţia de TIL într-o cantitate de aproximativ 1 × 106 până la aproximativ 9 × 1014, mediul crioprotector cuprinzând DMSO într-o cantitate de aproximativ 30 mL până la aproximativ 70 mL, soluţia de electroliţi într-o cantitate de aproximativ 30 mL până la aproximativ 70 mL, HSA într-o cantitate de aproximativ 0.1 g până la aproximativ 1.0 g şi IL-2 într-o cantitate de aproximativ 0.001 mg până la aproximativ 0.005 mg.
În unele compoziţii de crioconservare divulgate în prezenta, 100 mL de compoziţie de crioconservare cuprinde populaţia de TIL într-o cantitate de aproximativ 1 × 107 până la aproximativ 1 × 1011; mediul crioprotector într-o cantitate de aproximativ 30 mL până la aproximativ 70 mL, unde mediul crioprotector cuprinde aproximativ 10% DMSO; soluţia de electroliţi într-o cantitate de aproximativ 30 mL până la aproximativ 70 mL; HSA într-o cantitate de aproximativ 0.3 g până la aproximativ 0.7 g; şi IL-2 într-o cantitate de aproximativ 0.001 mg până la aproximativ 0.003 mg.
În unele compoziţii de crioconservare divulgate în prezenta, 100 mL de compoziţie de crioconservare constă în esenţă din populaţia de TIL într-o cantitate de aproximativ 1 × 107 până la aproximativ 1 × 1011; mediul crioprotector într-o cantitate de aproximativ 30 mL până la aproximativ 70 mL, unde mediul crioprotector constă în esenţă din aproximativ 10% DMSO; soluţia de electroliţi într-o cantitate de aproximativ 30 mL până la aproximativ 70 mL; HSA într-o cantitate de aproximativ 0.3 g până la aproximativ 0.7 g; şi IL-2 într-o cantitate de aproximativ 0.001 mg până la aproximativ 0.003 mg.
În unele compoziţii de crioconservare divulgate în prezenta, compoziţia este utilizabilă în tratarea unui subiect cu cancer.
Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, o compoziţie de crioconservare cuprinzând o populaţie de TIL, un mediu crioprotector cuprinzând dimetilsulfoxid (DMSO) şi o soluţie de electroliţi, unde 100 mL de compoziţie cuprinde populaţia de TIL într-o cantitate de aproximativ 1 × 107 până la aproximativ 1 × 1011; mediul crioprotector într-o cantitate de aproximativ 30 mL până la aproximativ 70 mL, unde mediul crioprotector cuprinde aproximativ 10% DMSO; soluţia de electroliţi într-o cantitate de aproximativ 30 mL până la aproximativ 70 mL; HSA într-o cantitate de aproximativ 0.3 g până la aproximativ 0.7 g; şi IL-2 într-o cantitate de aproximativ 0.001 mg până la aproximativ 0.003 mg.
Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, o compoziţie de crioconservare constând în esenţă dintr-o populaţie de TIL, un mediu crioprotector cuprinzând dimetilsulfoxid (DMSO) şi o soluţie de electroliţi, unde 100 mL de compoziţie constă în esenţă din populaţia de TIL într-o cantitate de aproximativ 1 × 107 până la aproximativ 1 × 1011; mediul crioprotector într-o cantitate de aproximativ 30 mL până la aproximativ 70 mL, unde mediul crioprotector constă în esenţă din aproximativ 10% DMSO; soluţia de electroliţi într-o cantitate de aproximativ 30 mL până la aproximativ 70 mL; HSA într-o cantitate de aproximativ 0.3 g până la aproximativ 0.7 g; şi IL-2 într-o cantitate de aproximativ 0.001 mg până la aproximativ 0.003 mg.
Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, o pungă de perfuzie cuprinzând o compoziţie de crioconservare descrisă mai sus şi în prezenta.
În unele pungi de perfuzie divulgate în prezenta, punga de perfuzie este o pungă de perfuzie ce conţine HypoThermosol.
Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, o pungă de depozitare cuprinzând o compoziţie de crioconservare descrisă mai sus şi în prezenta.
În unele pungi de depozitare divulgate în prezenta, punga de depozitare este conform revendicării 54, unde punga de depozitare este o pungă CryoStore CS750.
Se divulgă de asemenea în prezenta, metodă pentru de expansiune a limfocitelor infiltrante în tumori (TIL) într-o populaţie terapeutică de TIL cuprinzând:
(a) adăugarea fragmentelor tumorale procesate dintr-o tumoare rezecată de la un pacient într-un sistem închis pentru a obţine o primă populaţie de TIL;
(b) efectuarea unei prime expansiuni prin cultivarea primei populaţii de TIL într-un mediu de cultură celulară cuprinzând IL-2 şi opţional OKT-3, pentru a produce o a doua populaţie de TIL, unde prima expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o primă suprafaţă permeabilă la gaz, unde prima expansiune se efectuează timp de circa 3-14 zile pentru a obţine a doua populaţie de TIL, unde a doua populaţie de TIL are un număr de cel puţin 50 de ori mai mare decât prima populaţie de TIL şi unde tranziţia de la etapa (a) la etapa (b) are loc fără deschiderea sistemului;
(c) efectuarea unei a doua expansiuni prin suplimentarea mediului de cultură celulară al celei de-a doua populaţii de TIL cu IL-2 suplimentar, opţional OKT-3 şi celule de prezentare a antigenului (APC), pentru a produce o a treia populaţie de TIL, unde a doua expansiune se efectuează timp de circa 7-14 zile pentru a obţine a treia populaţie de TIL, unde a treia populaţie de TIL este o populaţie terapeutică de TIL, unde a doua expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o a doua suprafaţă permeabilă la gaz şi unde tranziţia de la etapa (b) la etapa (c) are loc fără deschiderea sistemului;
(d) recoltarea populaţiei terapeutice de TIL obţinute de la etapa (c), unde tranziţia de la etapa (c) la etapa (d) are loc fără deschiderea sistemului; şi
(e) transferul populaţiei TIL recoltate de la etapa (d) într-o pungă de perfuzie, unde transferul de la etapa (d) la (e) are loc fără deschiderea sistemului.
SCURTĂ DESCRIERE A FIGURILOR
Figura 1: reprezintă o diagramă a unei aplicări a procesului 2A, un proces de 22 de zile pentru fabricarea TIL.
Figura 2: reprezintă o comparaţie între procesul 1C şi o aplicare a procesului 2A de fabricare TIL.
Figura 3: reprezintă cronologia procesului 1C.
Figura 4: reprezintă procesul dintr-o aplicare a terapiei TIL folosind procesul 2A de fabricare TIL, inclusiv etapele de administrare şi co-terapie, pentru un număr de celule mai mare.
Figura 5: reprezintă procesul dintr-o aplicare a terapiei TIL folosind procesul 2A de fabricare TIL, inclusiv etapele de administrare şi co-terapie, pentru un număr de celule mai mic.
Figura 6: reprezintă o schemă detaliată a unei aplicări a procesului 2A.
Figura 7: reprezintă caracterizarea TIL preparate folosind o aplicare a procesului 2A comparând expresia interferon-gamma (IFN-γ) între TIL proaspete şi TIL decongelate.
Figura 8: reprezintă caracterizarea TIL preparate folosind o aplicare a procesului 2A examinând expresia CD3 în TIL proaspete versus TIL decongelate.
Figura 9: reprezintă caracterizarea TIL preparate folosind o aplicare a procesului 2A examinând recuperarea în TIL proaspete versus TIL decongelate.
Figura 10: reprezintă caracterizarea TIL preparate folosind o aplicare a procesului 2A examinând viabilitatea TIL proaspete versus TIL decongelate.
Figura 11A-11C: indică etapele majore ale unei aplicări a procesului 2A incluzând etapele de crioconservare.
Figura 12: indică numărul celulelor obţinute din procesul 1C şi o aplicare a procesului 2A.
Figura 13: indică viabilitatea procentuală a celulelor obţinute din procesul 1C şi o aplicare a procesului 2A.
Figura 14: indică procentajele celulelor CD45 şi CD3 (i.e., celule T) măsurate prin citometrie în flux pentru TIL obţinute în procesul 1C şi o aplicare a procesului 2A.
Figura 15: indică eliberarea IFN-γ obţinută pentru procesul 1C şi aplicările procesului 2A, măsurată printr-un test diferit de cel folosit pentru generarea datelor din Figurile 80 şi 98.
Figura 16: indică eliberarea IFN-γ obţinută pentru procesul 1C şi aplicările procesului 2A, măsurată printr-un test diferit de cel folosit pentru generarea datelor din Figurile 80 şi 98.
Figura 17: indică procentajele celulelor TCR a/b şi NK obţinute din procesul 1C şi o aplicare a procesului 2A.
Figura 18: indică procentajele celulelor CD8+ şi CD4+ măsurate prin citometrie în flux pentru TIL obţinute în procesul 1C şi o aplicare a procesului 2A, precum şi raportul dintre fiecare subset.
Figura 19: indică procentajele subseturile de memorie măsurate prin citometrie în flux pentru TIL obţinute din procesul 1C şi o aplicare a procesului 2A.
Figura 20: indică procentajele expresiei PD-1, LAG-3 şi TIM-3 prin citometrie în flux pentru TIL obţinute din procesul 1C şi o aplicare a procesului 2A.
Figura 21: indică procentajele expresiei 4-1BB, CD69 şi KLRG1 prin citometrie în flux pentru TIL obţinute din procesul 1C şi o aplicare a procesului 2A.
Figura 22: indică procentajele expresiei TIGIT prin citometrie în flux pentru TIL obţinute din procesul 1C şi o aplicare a procesului 2A.
Figura 23: indică procentajele expresiei CD27 şi CD28 prin citometrie în flux pentru TIL obţinute din procesul 1C şi o aplicare a procesului 2A.
Figura 24: indică rezultatele analizei lungimii telomerilor flow-FISH.
Figura 25: indică rezultatele analizei lungimii telomerilor flow-FISH (după îndepărtarea unui punct de date cu deviaţie extremă).
Figura 26: indică planului testului clinic incluzând grupuri tratate cu procesul 1C şi o aplicare a procesului 2A.
Figura 27: graficul procesului exemplificativ 2A prezentând etapele A - F.
Figura 28A-28C: schema procesului 2A.
Figura 29: schema planului de colectare a datelor procesului 2A
Figura 30: viabilitatea TIL proaspete vs. decongelate
Figura 31: expansiunea TIL proaspete şi decongelate în cultură re-REP
Figura 32: valori de laborator normale ale metaboliţilor în sânge.
Figura 33A-33B: analiza metaboliţilor TIL pre-REP din procesul 2A.
Figura 34: cuantificarea IL-2 cultura celulară TIL pre-REP din procesul 2A.
Figura 35: eliberarea citokinelor citotoxice IFN-γ la stimulare cu anti-CD3, anti-CD28 şi anti-4-1BB a TIL.
Figura 36: eliberarea granzimei B după stimulare anti-CD3, anti-CD28 şi anti-4-1BB a TIL.
Figura 37A-37B: TCR αβ+ TIL. Majoritatea celulelor T CD3+ umane exprimă receptorii formaţi de lanţurile α şi β care recunosc antigene într-o manieră restricţionată de MHC. A) Cu excepţia M1061, produsul TIL proaspete şi decongelate a avut 80% sau mai multe TIL care exprimă TCR αβ+. Atât TIL proaspete, cât şi decongelate au avut expresie comparabilă a TCR αβ (valoare-p - 0.9582). Chiar dacă s-a observat o scădere a TIL care exprimă TCR αβ+ după Re-REP, această scădere nu a fost semnificativă în TIL Re-REP (p = 0.24). B) A existat o scădere de 9.2% şi 15.7% a TIL RE-REP proaspete şi decongelate care exprimă TCR αβ în comparaţie cu TIL proaspete şi decongelate.
Figura 38A-38B: TCRαβ-CD56+. Celulele Natural Killer infiltrante în tumori (NK) şi NKT au de asemenea capacitatea de a liza celule fără expresie MHC, precum şi antigen lipidic prezentat de CD1 şi şi de a furniza citokine imunoregulatoare. Totuşi, o infiltrare celulară NK intensă este asociată cu boală avansată şi ar putea facilita dezvoltarea cancerului. Figura A arată că, în toate cazurile, cu excepţia M1063, a existat o scădere modestă, nesemnificativă, a populaţiei NK în TIL decongelate comparativ cu TIL proaspete, (p = 0.27). Nu s-a observat diferenţă semnificativă între populaţia TIL re-REP (p = 0.88). TIL proaspete, TIL re-REP proaspete şi TIL re-REP decongelate demonstrează expresie similară a CD56 aşa cum se indică în Figura B. Produsul TIL decongelate a avut mai puţine (1.9 ± 1.3) celule care exprimă NK decât TIL proaspete (3.0 ± 2.2) posibil ca rezultat al procedurii de criocongelare.
Figura 39A-39B: Celule CD4+. Nu s-a observat diferenţă substanţială în populaţia CD4 în condiţii individuale. Figura A indică populaţia CD4 medie în fiecare condiţie. Tabelul din Figura B indică valorile SD şi SEM. Există o uşoară scădere a populaţiei CD4 în populaţia re-REP proaspătă, cauzată în cea mai mare parte de o scădere a CD4 în populaţia re-REP proaspătă în EP11001T.
Figura 40A-40B: Celule CD8+. A) În toate situaţiile, cu excepţia EP11001T, atât TIL proaspete, cât şi decongelate au prezentat populaţii CD8+ comparabile (p=0.10, fără diferenţă semnificativă). În majoritatea experimentelor, a existat o uşoară scădere a TIL care exprimă CD8+ în TIL re-REP proaspete (excepţiile au fost M1061T şi M1065T). A existat o scădere de aproximativ 10-30% în populaţia CD8+ în TIL re-REP decongelate. Compararea TIL re-REP din TIL proaspete şi decongelate a prezentat o diferenţă semnificativă (p = 0.03, test t Student). Figura B indică valorile medii ale TIL care exprimă CD8+ în toate condiţiile. TIL proaspete şi decongelate prezintă rezultate similare. A existat însă o scădere de 10.8% în populaţia CD8+ în TIL re-REP decongelate în comparaţie cu TIL re-REP proaspete.
Figura 41A-41B: Celule CD4+CD154+. CD154, cunoscut şi ca CD40L, este un marker pentru celule T activate. Figura A: Nu s-a observat diferenţă substanţială în populaţia CD4+CD154+ în diferitele condiţii, dar s-a observat o scădere de 34.1% în TIL CD4+ re-REP proaspete EP11001T. Expresia CD154 nu s-a măsurat în M1061T şi M1062T fiindcă aceste experimente s-au efectuat înaintea stabilirii grupului extins al fenotipurilor. Figura B: O uşoară scădere a condiţiei TIL decongelate ar putea fi atribuită nemăsurării CD154 în M1061T şi M1062T. Toate condiţiile indică expresie CD154 foarte comparabilă în populaţia CD4, sugerând celule T CD4+ activate.
Figura 42A-42B: Celule CD8+CD154+. S-a analizat şi markerul de activare CD154 exprimat pe TIL CD8+. A) În general, expresia CD154 a fost mai mică în populaţia CD8+ în TIL proaspete şi decongelate. Acest lucru nu este surprinzător fiindcă CD154 este exprimat în pricipal în celule T CD4+ activate. În cazurile în care expresia CD154 s-a măsurat atât în TIL proaspete, cât şi decongelate, fie nu s-a observat nici o diferenţă, fie s-a observat o creştere a expresiei CD154 în TIL decongelate. Testul t Student a arătat că nu există diferenţă semnificativă între cele două condiţii. A existat o creştere a expresiei CD154 în re-REP decongelat în comparaţie cu re-REP proaspăt în toate experimentele (p = 0.02). B) S-a observat o creştere a expresiei CD154 atât în TIL decongelate, cât şi TIL re-REP decongelate în comparaţie cu omologii lor. TIL re-REP decongelate au prezentat o creştere de 29.1% a expresiei CD154 faţă de TIL re-REP proaspete.
Figura 43A-43B: Celule CD4+CD69+. CD69 este markerul de activare timpuriu în celule T în urma stimulării sau activării. A) În toate TIL, cu excepţia EP11001T, re-REP atât proaspete, cât şi decongelate au prezentat o creştere modestă a expresiei CD69, posibil pe baza lungimii re-REP (7 zile în loc de 11 zile). Nu s-a observat nici o diferenţă între TIL proaspete şi decongelate (p = 0.89). Nu s-a observat nici o diferenţă nici între re-REP proaspete şi decongelate (p = 0.82). B) Se observă o creştere minoră a expresiei CD69 în produşii TIL re-REP. (Obs.: nu s-a efectuat colorare CD69 pentru TIL decongelate M1061T şi M1062T. Expresia CD69 a produşilor TIL proaspete M1061T a fost 33.9%).
Figura 44A-44B: Celule CD8+CD69+. Aşa cum s-a observat pentru populaţia CD4+, Figura A indică o creştere a expresiei CD69 în TIL re-REP CD8+. Expresia CD69 nu a prezentat nici o diferenţă semnificativă între TIL proaspete şi decongelate (p = 0.68) sau TIL re-REP proaspete şi decongelate (p = 0.76). Figura B susţine observaţia că există o creştere modestă a expresiei CD69 în produsul TIL re-REP product.
Figura 45A-45B: Celule CD4+CD137+. CD137 (4-11313) este un receptor costimulator T celular indus la activarea TCR. Este activat pe celule T CD4+ şi CD8+. A) Expresia CD137 a prezentat o creştere profundă a populaţiei TIL re-REP după 7 zile de stimulare. Nu s-a observat însă diferenţă între TIL proaspete şi decongelate sau TIL re-REP proaspete şi decongelate (p < 0.05 în ambele vazuri, Figura B susţine această observaţie). De asemenea, TIL decongelate au prezentat o scădere modestă a expresiei CD137. Creşterea expresiei CD137 în TIL re-REP poate fi atribuită celei de-a doua runde de stimulare a re-REP de 7 zile.
Figura 46A-46B: Celule CD8+CD137+. A) Populaţia CD8+ a prezentat o creştere generală a produsului re-REP. B) Produsul re-REP proaspăt a prezentat o creştere de 33.4% a expresiei CD8+CD137+ în comparaţie cu TIL proaspete. Produsul re-REP decongelat a prezentat de asemenea o creştere de 33.15% a expresiei CD137 în populaţia CD8+ comparativ cu TIL decongelate. Nu s-au observat diferenţe semnificative între TIL re-REP proaspete şi decongelate. Se poate vedea o observaţie similară comparând TIL proaspete cu TIL decongelate. Această creştere a expresiei CD137 poate fi atribuită celei de-a doua runde de activare a re-REP. (Se observă că s-au folosit numai 6 TIL pentru analiză, expresia CD137 nefiind măsurată pentru 3 dintre experimente.)
Figura 47A-47B: Celule CD4+CM. Populaţia de memorie centrală (CM) este definită de expresie CD45RA- (negativă) şi CCR7+ (pozitivă). A) S-a observat o creştere a populaţiei CM în condiţiile re-REP. M1063T şi M1064T au prezentat o scădere a expresiei CM în populaţia CD4+ obţinută din TIL decongelate în comparaţie cu TIL proaspete. Nici TIL proaspete şi decongelate (p = 0.1658), nici re-REP proaspăt şi TIL re-REP decongelate (p = 0.5535) nu au prezentat o diferenţă semnificativă a populaţiei CM. B) S-a observat o creştere de 14.4% şi 15.4% a populaţiei CM în TIL re-REP proaspete şi decongelate în comparaţie cu TIL proaspete şi decongelate.
Figura 48A-48B: Celule CD8+CM. A) În populaţia CD8+, s-a observat o creştere dramatică a expresiei CM în TIL proaspete, o observaţie care nu este prezentă în produsul TIL. Această creştere nu a afectat semnificaţia (p = 0.3086), sugerând că nu există diferenţă între TIL proaspete şi decongelate. S-a observat o tendinţă similară şi în produşii TIL re-REP. Figura 48B) S-a observat o creştere generală a populaţiei CM în TIL proaspete în comparaţie cu TIL decongelate. Numărul arată că TIL proaspete şi TIL re-REP au avut o diferenţă de numai -2%; TIL proaspete au prezentat o abatere standard foarte mare, care ar putea fi atribuită M1064T; excluderea expresiei CM în M1064T a dus la expresie CM foarte similară între produşii TIL proaspete şi decongelate (nereprezentat).
Figura 49A-49B: Celule CD4+EM. Populaţia de memorie efectoare (EM) este definită de lipsa expresiei CCR7 şi CD45RA. A) După cum s-a anticipat, populaţia CD4+ din TIL proaspete şi decongelate a avut un nivel ridicat de fenotip de memorie efectoare. S-a determinat o scădere drastică a expresiei memoriei efectoare în populaţia M1056T TIL re-REP. De asemenea, alte 5 experimente au indicat o scădere a fenotipului de memorie efectoare în TIL re-REP atât proaspete, cât şi decongelate. B) Ambele TIL proaspete şi decongelate au prezentat expresie similară a fenotipului de memorie efectoare. Compararea TIL proaspete şi TIL re-REP proaspete a indicat o scădere de 16% în cele din urmă. S-a observat o scădere similară în TIL re-REP decongelate (9%) comparate cu TIL decongelate.
Figura 50A-50B: Celule CD8+EM. A) Un tipar similar de memorie efectoare mărită în TIL proaspete s-a observat şi în populaţia CD8+. S-a observat o excepţie în M1064T, unde TIL proaspete au avut un profil de memorie efectoare de numai 20%; acesta se poate atribui faptului că 73% din aceste TIL au un fenotip CM descris în A şi B. Toate probele care prezintă o scădere a populaţiei de memorie efectoare în TIL CD4+ din produsul re-REP au urmat aceeaşi tendinţă în TIL CD8+. B) Spre deosebire de populaţia TIL CD4+, TIL CD8+ au prezentat un fenotip de memorie efectoare similar în produşi proaspeţi, decongelaţi şi re-REP. (Se observă abatere standard mare în TIL proaspete şi decongelate, atribuibilă populaţiei de memorie efectoare mici în M1064T proaspete şi lipsei expresiei în probe TIL M1061T decongelate.)
Figura 51A-51B: Celule CD4+CD28+. Expresia CD28 se corelează cu TIL tinere, scăzând odată cu vârsta. A) Chiar dacă s-a observat o creştere a populaţiei CM în TIL re-REP, s-a observat o scădere a expresiei CD28 ca o tendinţă sugerând că doar starea CM nu a putut determina soarta TIL. S-a observat o scădere a expresiei CD28 în produsul re-REP, cu excepţia TIL CD4+ M1061T. B) S-a observat o scădere de 8.89% în TIL proaspete şi 5.71% în TIL decongelate comparativ cu produşii TIL proaspeţi şi decongelaţi.
Figura 52A-52B: Celule CD8+CD28+. A) Expresia CD28 în populaţia CD8+ TIL a fost mai mare în TIL proaspete şi decongelate decât produsul re-REP. În majoritatea cazurilor, TIL re-REP decongelate au prezentat o scădere drastică faţă de TIL decongelate şi TIL re-REP proaspete. Totuşu, testul t Student nu a indicat nici o diferenţă semnificativă între TIL proaspete şi decongelate (p = 0.3668), precum şi între produşi re-REP proaspeţi şi decongelaţi (p - =0.7940). B) Aşa cum s-a observat în populaţia TIL CD4+, a existat o scădere a populaţiei CD8+CD28+ în re-REP proaspete (21.5%) şi re-REP decongelate (18.2%) comparativ cu omologii lor nerestimulaţi.
Figura 53A-53B: Celule CD4+PD-1+. Expresia PD-1 în TIL este corelată cu celule T reactive la antigen şi epuizate. Prin urmare nu este surprinzător că se observă un fenotip epuizat în TIL care au suferit REP 11 zile. A) Acest fenotip epuizat s-a menţinut sau a crescut (în mod specific, EP11001T şi M1056T) în produsul TIL decongelat. Nu s-a observat diferenţă semnificativă între produsul TIL proaspete şi decongelate (p = 0.9809). A existat o tendinţă similară în TIL re-REP proaspete comparativ cu cele decongelate (p = 0.0912). B) re-REP proaspăt a prezentat o scădere modestă a expresiei PD-1 în populaţia CD4+ TIL. Toate celelalte condiţii au menţinut un tipar de expresie PD-1 comparabil. S-a observat o scădere sau nici o modificare a expresiei PD-1 în produsul re-REP proaspăt comparativ cu toate celelalte condiţii. S-a observat o creştere a expresiei PD-1 în M1062T, M1063T (CD4+) şi EP11001T (CD8+) în produsul re-REP decongelat. Toţi ceilalţi produşi re-REP decongelaţi au prezentat rezultate comparabile cu produsul dezgheţat.
Figura 54A-54B: Celule CD8+PD-1+. A) Populaţia CD8+ din TIL proaspete a prezentat un fenotip mai epuizat asociat cu expresie PD-1 mărită. O excepţie s-a observat în EP11001T, unde TIL CD8+ decongelate au prezentat o creştere modestă a expresiei PD-1 comparativ cu TIL proaspete. A existat o diferenţă mică,dar nesemnificativă, a expresiei PD-1 în TIL proaspete comparativ cu TIL decongelate (p = 0.3144). B) TIL proaspete au prezentat o uşoară creştere, dar nesemnificativă, a expresiei PD-1 comparativ cu TIL decongelate (6.74% sau de 1.2 ori mai mare decât TIL decongelate), sugerând că TIL decongelate au fost comparabile pe baza tiparului fenotipului.
Figura 55A-55B: Celule CD4+LAG3+. Celulele T epuizate exprimă niveluri mari de receptor inhibitor LAG3 împreună cu PD-1. A) TIL CD4+ decongelate au prezentat niveluri uşor mai mari, dar nesemnificative, ale expresiei LAG3 în comparaţie cu TIL proaspete (p = 0.52). O excepţie a fost observată în M1063T. În experimentele în care s-a măsurat expresia LAG3 în TIL CD4+ proaspete şi TIL re-REP proaspete, s-a observat o scădere a expresiei LAG3+ în probele re-REP proaspete comparativ cu TIL proaspete. B) În general, există o scădere modestă a expresiei LAG3 în TIL re-REP proaspete. Se menţionează că pentru menţinerea consecvenţei Figurii B, M1061T, M1062T şi M1064T s-au exclus fiindcă expresia LAG3 nu a fost măsurată în produs proaspăt.
Figura 56A-56B: Celule CD8+LAG3+. A) TIL care exprimă CD8+ LAG3+ au prezentat o scădere modestă în experimente, cu excepţia M1063T, în care s-a observat o scădere pronunţată a expresiei LAG3 în TIL re-REP proaspete. În general, TIL re-REP decongelate au prezentat o creştere semnificativă de 1.5 ori comparativ cu TIL re-REP proaspete pentru expresia LAG3 (p = 0.0154). Nu s-a observat însă diferenţă semnificativă între TIL proaspete şi TIL decongelate (p = 0.0884). B) S-a observat o scădere aproximativă de 30% a expresiei LAG3 în TIL CD8+ din re-REP proaspăt în comparaţie cu TIL decongelate. TIL atât proaspete, cât şi decongelate au fost comparabile cu TIL decongelate prezentând o creştere modestă. (În această figură, M1061T, M1062T şi M1064T au fost omise fiindcă expresia LAG3 nu s-a măsurat în probele TIL proaspete sau re-REP proaspete.)
Figura 57A-57B: Celule CD4+TIM-3+. A) După cum s-a observat anterior în cazul PD-1 şi LAG3, s-a observat o scădere a expresiei TIM-3 în TIL reREP proaspete comparativ cu TIL re-REP decongelate. Nu a existat însă nici o diferenţă semnificativă între TIL reREP proaspete şi decongelate (p = 0.2007). B) Nu s-au observat modificări majore ale expresiei TIM-3 între produşi TIL reREP proaspeţi şi decongelaţi. S-a observat o scădere modestă de 9.2% a expresiei TIM-3 în TIL reREP proaspete în comparaţie cu produsul reREP decongelat.
Figura 58A-58B: Celule CD8+TIM-3+. A) O tendinţă similară a expresiei TIM-3 observată în populaţia CD4+ a fost observată şi în TIL CD8+. TIL re-REP proaspete au avut cel mai mic fenotip epuizat cu expresie TIM-3 mică, indicând o diferenţă semnificativă în comparaţie cu TIL re-REP decongelate (p = 0.0147). Compararea PD-1, LAG3 şi TIM-3 sugerează că TIL re-REP proaspete au avut un fenotip epuizat mai mic cu fenotip CM mărit. B) În comparaţie cu TIL re-REP decongelate, TIL re-REP proaspete au prezentat o scădere semnificativă de 22% a expresiei TIM-3. TIL proaspete şi decongelate prezintă tipare de expresie TIM-3 similare.
Figura 59: Potenţialul citotoxic al TIL împotriva liniei celulare ţintă P815.
Figura 60A-60F: Profilul respirator metabolic al TIL proaspete, TIL re-REP proaspete şi TIL
re-REP decongelate. OCR de bază (A), SRC clar (B), SRC2DG (C), SRC ascuns (D), ECAR de
bază (E) şi rezerva glicolitică (F).
Figura 61A-61B: S-a folosit tehnologia Flow-FISH pentru a măsura lungimea medie a repetiţiei telomerice în 9 TIL decongelate din procesul 2A post-REP. A) Datele reprezintă lungimea telomerilor măsurată prin qPCR comparând TIL cu celule 1301 B) Datele reprezintă lungimea telomerilor măsurată prin Flow Fish a TIL comparativ cu celule 1301. Datele folosite pentru grafice sunt prevăzute în format de tabel (Tabel 25) în secţiunea 10. În general, a existat o asemănare aproximativă în tiparele rezultatelor celor două teste de lungime a telomerilor, dar experimentele vor continua să determine care metodă reflectă mai exact lungimea reală a telomerilor TIL. Această tehnică se poate aplica probelor clinice viitoare pentru a determina un raport între între lungimea telomerilor şi răspunsul pacienţilor la terapie TIL.
Figura 62A-62B: Selecţia furnizorului de mediu fără ser (înlocuitor de ser). Fiecare fragment s-a cultivat într-un godeu al plăcii G-Rex cu 24 de godeuri în cvadruplicat. În ziua 11, REP s-au iniţiat folosind 45 TIL cu 106 feeder pentru a imita procesul 2A. A) Histogramă care indică numărul mediu al celulelor viabile înregistrat în ziua 11 (preREP) pentru fiecare condiţie. B) Histogramă care indică numărul mediu al celulelor viabile înregistrat în ziua 22 (postREP). Valoarea P s-a calculat folosind testul 't' student. * P <0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001.
Figura 63A-63B: Selecţia furnizorului de mediu fără ser (ser lizat trombocitar). Fiecare fragment s-a cultivat într-un godeu al plăcii G-Rex cu 24 de godeuri în triplicat. În ziua 11, REP s-au iniţiat folosind 4e5 TIL cu 10e6 feeder pentru a imita procesul 2A. A) Histogramă care indică numărul mediu al celulelor viabile înregistrat în ziua 11 (preREP) pentru fiecare condiţie. B) Histogramă care indică numărul mediu al celulelor viabile înregistrat în ziua 22 (postREP). Valoarea P s-a calculat folosind testul 't' student. * P <0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. '#'fragmente tumorale insuficiente.
Figura 64A-64B: Compararea eficienţei CTS Optimizer cu condiţie standard folosind procesul 2A la mini-scară (G-Rex 5M). Două fragmente / G-Rex 5M s-au cultivat în triplicat, REP s-au iniţiat folosind 26 TIL cu 506 feeder pentru a imita procesul 2A. Barele prezentate mai sus au reprezentat numărul mediu de celule viabile obţinut în ziua 11 (A) sau ziua 22 (B).
Figura 65A-65C: Rezumatul pre şi post expansiune TIL extrapolate, comparând condiţia standard şi CTS Optimizer. A) PreREP. B) PostREP. C) Rezumatul expansiunii TIL extrapolate la scară totală (Standard vs CTS Optimizer +SR).
Figura 66: CD8+ a fost activat pe celule vii. 7 din 9 tumori prezintă o creştere în populaţii CD8+ absolute cu condiţia CTS+SR.
Figura 67: Comparabilitatea interferon-gamma. Interferon-gamma ELISA (Quantikine). Producţia IFN-y s-a măsurat folosind kitul Quantikine ELISA de la R&D systems. CTS+SR a produs cantităţi comparabile de IFN-y comparativ cu condiţia noastră standard.
Figura 68: Schema unei aplicări exemplificative a Protocolului de expansiune rapidă (REP). La sosire, tumoarea este fragmentată, aşezată în baloane G-Rex cu IL-2 pentru expansiune TIL (expansiune pre-REP), 11 zile. Pentru studiile cu amestec triplu, IL-2/IL-15/IL-21 se adaugă la iniţierea pre-REP. Pentru Protocolul de expansiune rapidă (REP), TIL se cultivă cu feeder şi OKT3 pentru expansiune REP alte 11 zile.
Figura 69A-69B: TIL provenite din melanom (n=4) şi plămân (n=7) s-au evaluat fenotipic cu privire la celulele CD4+ şi CD8+ folosind citometrie în flux post pre-REP. *Valorile p reprezintă diferenţa între IL-2 şi IL-12/IL-15/IL-21 în celulele CD8+ folosind testul t student neîmperecheat.
Figura 70A-70B: TIL provenite din melanom (n=4) şi plămân (n=7) s-au evaluat fenotipic cu privire la CD27+ şi CD28+ în celulele CD4+ şi CD8+ folosind citometrie în flux post pre-REP.
Figura 71A-71C: TIL s-au evaluat fenotipic cu privire la subseturile efectoare/memorie (CD45RA şi CCR7) în celulele CD8+ şi CD4+ (date nereprezentate) în melanom (n=4) (A) şi plămân (n=8) (B). Expresia CXCR3 s-a folosit în melanom şi plămân. Întreaga expresie fenotipică s-a evaluat folosind citometrie în flux post pre-REP. TCM=memorie centrală, TSCM=memorie celule stem, TEMRA (celule T efectoare), TEM=memorie efectoare.
Figura 72A-72C: TIL provenite din (A) melanom (n=4) şi (B) plămân (n=5) s-au evaluat cu privire la expresia CD107a+ în răspuns la stimulare PMA 4 ore în celule CD4+ şi CD8+, prin citometrie în flux. (C) TIL pre-REP (n=5) au fost stimulate 24 ore cu OKT3 solubil (30ng/ml) şi supernatanţii s-au evaluat cu privire la IPNγ prin ELISA.
Figura 73A-73B: Repertoriul TCRvβ (24 specificităţi) s-a evaluat în TIL din melanom (A) şi plămân (B) folosind kitul Beckman Coulter pentru citometrie în flux.
Figura 74: Proces exemplificativ de producţie a TIL crioconservate (-22 zile).
Figura 75A-75B: În ziua 22, produsul celular redus în volum este colectat şi se prelevează probe pentru a determina performanţa culturii înainte de spălare şi preparare. Probele se analizează pe aparatul de numărare automat NC-200 aşa cum s-a descris anterior. Densitatea totală a celulelor viabile este determinată prin media numărărilor în duplicat din 4 probe independente. Procesul din generaţia 2 (Gen 2) generează un produs TIL cu doză similară generaţiei 1 (Gen 1; medie Gen 1 = 4.10×1010 ± 2.92×1010, medie Gen 2 = 3.12×1010 ± 2.19×1010). B) Gradul de expansiune se calculează pentru faza REP ca deîmpărţit al densităţii finale a celulelor viabile faţă de densitatea de însămânţare a TIL viabile iniţiale. Produşii TIL Gen 2 au o expansiune mai mică faţă de Gen 1 (medie Gen 1 =1.40×103 ± 9.86×102, medie Gen 2 = 5.11×102 ± 2.95×102).
Figura 76: Produşii medicamentoşi preparaţi proaspeţi s-au analizat cu privire la identitate prin citometrie în flux pentru eliberare. Procesele Gen 1 şi Gen 2 produc culturi de celule T de puritate mare definite de fenotip dublu pozitiv CD45, CD3 (Gen1 # ± SD, Gen 2 # ± SD). Valoarea p s-a calculat folosind testul 't' Mann-Whitney.
Figura 77A-77B: Fiolele satelit crioconservate de produs medicamentos preparat s-au decongelat şi s-au evaluat cu privire la fenotipul extins prin citometrie în flux aşa cum s-a descris anterior. Produşii Gen 1 şi Gen 2 exprimă raporturi similare de subtipuri T celulare CD8 - CD4. Valoare p s-a calculat folosind testul 't' Mann-Whitney.
Figura 78A-78B: Fiolele satelit crioconservate de produs medicamentos preparat s-au decongelat şi s-au evaluat cu privire la fenotipul extins prin citometrie în flux aşa cum s-a descris anterior. Produşii Gen 1 şi Gen 2 exprimă niveluri similare de molecule costimulatoare CD27 şi CD28 pe subseturi de celule T. Valoarea P s-a calculat folosind testul 't' Mann-Whitney. Moleculele costimulatoare cum ar fi CD27 şi CD28 sunt necesare pentru a furniza semnalizare secundară şi terţiară necesară pentru proliferarea celulelor efectoare la activarea receptorului T celular.
Figura 79: S-a folosit tehnologia Flow-FISH pentru a măsura lungimea medie a repetiţiei telomerice aşa cum s-a descris anterior. Valoarea RTL de mai sus arată că fluorescenţa telomerică medie per cromozom/genom în Gen 1 (o aplicare a procesului 1C) este # % ± SD% şi Gen 2 este #% ± SD% din fluorescenţa telomerică per cromozom/genom în liniile celulare de control (linia celulară leucemică 1301). Datele arată că produşii Gen 2 în medie au lungime a telomerilor cel puţin comparabilă cu produşii Gen 1. Lungimea telomerilor este o măsurare surogat a duratei culturii celulare ex vivo.
Figura 80: Produşii medicamentoşi Gen 2 (o aplicare a procesului 2A) prezintă capacitate crescută de producere IFN-γ faţă de produşii Gen 1. Capacitatea produsului medicamentos de reactivare şi de secreţie a citokinelor este o măsură surogat a funcţiei in-vivo la legare TCR de antigenul asociat în contextul HLA.
Figura 81A-81B: Diversitatea receptorilor T celulari: ARN din 10x106 TIL din Gen 1 (o aplicare a procesului 1C) şi Gen 2 (o aplicare a procesului 2A) s-au analizat pentru a determina numărul total şi frecvenţa secvenţelor CDR3 unice prezente în fiecare produs. A) Numărul total al secvenţelor CDR3 unice prezente în fiecare produs (Gen 1 n=#, medie ± SD, Gen 2 n =#, medie ± SD). B) Secvenţele CDR3 unice au fost reprezentate faţă de frecvenţă în fiecare produs pentru a produce un punctaj reprezentativ al diversităţii relative a receptorilor T celulari în produs. Produşii TIL din ambele procese sunt alcătuiţi din populaţii policlonale de celule T cu diferite specificităţi şi avidităţi antigenice. Gama repertoriului celular T total poate indica numărul epitopilor care pot acţiona pe celule tumorale.
Figura 82: Reprezintă o diagramă a unei aplicări a procesului 2A, un proces de 22 de zile de fabricare TIL.
Figura 83: Tabel comparativ al Etapelor A - F din aplicările exemplificative ale proceselor 1C şi 2A.
Figura 84: Comparaţie detaliată a unei aplicări a procesului 1C şi a unei aplicări a procesului 2A.
Figura 85: Schemă detaliată a unei aplicări a procesului de terapie TIL.
Figurile 86A-86C: Caracterizarea fenotipică a a produşilor TIL folosind un test de citometrie în flux în 10 culori. (A) Procentajul subseturilor de celule T şi non-T este definit de CD45+CD3+ şi CD45-(non-limfocit)/CD45+CD3- (non-T-limfocit). În total, >99% dintre produşii TIL testaţi au constat din celule T (CD45+CD3+). Se indică o medie a produşilor TIL (n=10). (B) Procentajul a două subseturi de celule T inclusiv CD45+CD3+CD8+ (cerc gol albastru) şi CD45+CD3+CD4+ (cerc gol roz). Nu s-a observat nici o diferenţă statistică în procentajul celor două subseturi folosind testul t student neîmperecheat (P=0.68). (C) Populaţia de celule non-T a fost caracterizată pentru patru subseturi diferite inclusiv: 1) non-limfocit (CD45-), 2) celule NK (CD45+CD3CD16756+), 3) celule B (CD45+CD19+) şi 4) non-NK/B (CD45+CD3-CD16-CD56-CD19-).
Figurile 87A-87B: Caracterizarea subseturilor de celule T în populaţii CD45+CD3+CD4+ şi CD45+CD3+CD8+. Subseturile de celule T naive, de memorie centrală (TCM), memorie efectoare (TEF) şi memorie efectoare RA+(EMRA) s-au definit folosind CD45RA şi CCR7. Figurile indică subseturi de celule T reprezentative de la 10 produşi TIL finali în populaţii CD4+ (A) şi CD8+ (B). Subsetul T de memorie efectoare (cerc gol albastru) este o populaţie majoră (>93%) în ambele subseturi CD4+ şi CD8+ ale produsului final TIL. Mai puţin de 7% dintre produşii TIL este subsetul de memorie centrală (cerc gol roz). Subseturile EMRA (cerc gol gri) şi naive (cerc gol negru) sunt abia detectate în produsul TIL (<0.02%). Valorile p reprezintă diferenţa între EM şi CM cu test t student neîmperecheat.
Figurile 88A-88B: Detecţia expresiei MCSP şi EpCAM în celule tumorale de melanom. Liniile celulare tumorale de melanom (WM35, 526 şi 888), liniile celulare de melanom obţinute de la pacienţi (1028, 1032 şi 1041) şi o linie celulară de adenom colorectal (HT29 ca un control negativ) s-au caracterizat prin colorare pentru markeri MCSP (condroitin sulfat proteoglican asociat cu melanom) şi EpCAM (molecula de adeziune celulară epitelială). (A) În medie 90% dintre celulele tumorale de melanom exprimă MCSP. (B) Expresia EpCAM nu a fost detectată în liniile celulare tumorale de melanom comparativ cu control pozitiv HT29, o linie celulară tumorală EpCAM+.
Figurile 89A-89B: Detecţia controlului pentru determinarea preciziei detecţiei tumorii. Testul s-a efectuat prin adăugarea unor cantităţi cunoscute de celule tumorale în suspensii PBMC (n=10). Celulele tumorale de melanom MCSP+526 s-au diluat la raporturi de 1:10, 1:100 şi 1:1.000, apoi s-au amestecat cu PBMC şi s-au colorat cu anticorpi anti-MCSP şi anti-CD45 şi colorant pentru celule vii/moarte şi s-au analizat prin citometrie în flux. (A) Aproximativ 3000, 300 şi 30 celule s-au detectat în diluţia de 1:10, 1:100, respectiv 1:1000. (B) S-a folosit o medie (AV) şi o abatere standard (SD) de celule din fiecare condiţie pentru a defini limitele de referinţă superioare şi inferioare.
Figurile 90A-90B: Studiul de repetabilitate a limitelor superioare şi inferioare în control. S-au efectuat trei experimente independente în triplicat pentru a determina repetabilitatea testului. (A) Numărul celulelor tumorale MCSP+ detectate s-a încadrat în intervalul limitelor de referinţă superioare şi inferioare. (B) Graficul de regresie liniară demonstrează corelarea între celulele MCSP+ şi diluările de adăugare (R2=0.99), linia neagră indicând cea mai bună ajustare. Liniile verde şi gri întrerupte reprezintă limitele de predicţie de 95% în curba standard şi probe (Exp#1 - 3).
Figurile 91A-91B: Detecţia tumorii de melanom reziduale în produşii TIL. Produşii TIL au fost evaluaţi cu privire la contaminarea tumorală reziduală folosind testul dezvoltat (n=15). (A şi B) Numărul şi procentajul mediu al evenimentelor MCSP+ detectabile a fost 2, respectiv 0.0002%.
Figura 92: Evaluarea de potenţial al produşilor TIL în urma activării celulelor T. Secreţia IFNγ după re-stimulare cu anti-CD3/CD28/CD137 în produşii TIL evaluaţi prin ELISA în duplicat (n=5). Secreţia IFNγ de către produşii TIL a fost semnificativ mai mare faţă de controlul nestimulat folosind testul Wilcoxon (P=0.02) şi constant >1000 pg/ml. Secreţia IFNγ >200 pg/ml
se consideră potentă, valoarea p <0.05 este considerată semnificativă statistic.
Figura 93: Reprezentarea unei aplicări a unui proces de preparare TIL crioconservate (22 zile).
Figura 94: Tabelul îmbunătăţirilor de produs de la Gen 1 la Gen 2.
Figurile 95A-95C: Celule viabile totale, rata de creştere şi viabilitate. În ziua 22 produsul celular redus în volum este colectat şi eşantionat pentru a determina performanţa culturii înainte de spălare şi preparare. (A) probele sunt analizate pe sistemul de numărare automat NC-200 aşa cum s-a descris anterior. Densitatea totală a celulelor viabile este determinată de media numărărilor în duplicat din 4 probe independente. Procesul Gen 2 generează un produs TIL cu doză similară cu Gen 1 (medie Gen 1 = 4.10×1010 ± 2.8×1010, medie Gen 2 = 4.12×1010 ± 2.5×1010). (B) Rata de creştere se calculează pentru faza REP ca gr = ln(N(t)/N(0))/t. (C) Viabilitatea celulelor s-a evaluat din 9 loturi de dezvoltare a procesului folosind Cellometer K2 aşa cum s-a descris anterior. Nu s-a observat scădere semnificativă în viabilitatea celulelor în urma unui singur ciclu de îngheţ-dezgheţ al produsului preparat. Scăderea medie a viabilităţii la decongelare şi eşantionare este 2.19%.
Figurile 96A-96C: Produşii Gen 2 sunt culturi de celule T foarte pure care exprimă molecule costimulatoare la niveluri comparabile cu Gen 1. (A) Produşii medicamentoşi preparaţi proaspeţi s-au analizat cu privire la identitate prin citometrie în flux pentru eliberare. Procesele Gen 1 şi Gen 2 produc culturi de celule T de puritate mare definite de fenotip (dublu pozitiv) CD45+,CD3+. (B & C) Fiolele satelit crioconservate de produs medicamentos preparat s-au decongelat şi s-au analizat cu privire la fenotipul extins prin citometrie în flux aşa cum s-a descris anterior. Produşii Gen 1 şi Gen 2 exprimă niveluri similare de molecule costimulatoare CD27 şi CD28 pe subseturi de celule T. Moleculele costimulatoare cum ar fi CD27 şi CD28 sunt necesare pentru a furniza semnalizare secundară şi terţiară necesară pentru proliferarea celulelor efectoare la activarea receptorului T celular. Valoarea p s-a calculat folosind testul 't' Mann-Whitney.
Figura 97: Produşii Gen 2 prezintă lungimi similare ale telomerilor. Totuşi, unele populaţii TIL pot tinde către telomer relativ mai lung.
Figura 98: Produşii Gen 2 secretă IFNγ în răspuns la activare CD3, CD28 şi CD137.
Figurile 99A-99B: Diversitatea receptorilor T celulari. (A) Secvenţele CDR3 unice au fost reprezentate faţă de frecvenţă în fiecare produs pentru a produce un punctaj reprezentativ pentru diversitatea totală a receptorilor T celulari în produs. (B) Numărul mediu total al secvenţelor CDR3 unice prezente în fiecare produs.
Figura 100: O aplicare unui proces de preparare TIL din prezenta invenţie.
Figura 101: Creşterea expansiunii în timpul pre-REP cu IL-2/IL-15/IL-21 în histologii tumorale multiple.
Figurile 102A-102B: IL-2/IL-15/IL-21 a mărit procentajul celulelor CD8+ în carcinom pulmonar, dar nu în melanom. TIL din (A) melanom (n=4) şi (B) plămân (n=7) s-au evaluat fenotipic cu privire la celulele CD4+ şi CD8+ folosind citometrie în flux post pre-REP.
Figurile 103A-103B: Expresia CD27 a fost uşor crescută în celule CD8+ în culturi tratate cu IL-2/IL-15/IL-21. TIL din (A) melanom (n=4) şi (B) plămân (n=7) s-au evaluat fenotipic cu privire la CD27+ şi CD28+ în celulele CD4+ şi CD8+ folosind citometrie în flux post pre-REP.
Figurile 104A-104B: Subseturile de celule T au fost nemodificate cu adăugarea IL-15/IL-21. TIL s-au evaluat fenotipic cu privire la subseturile de celule efectoare/de memorie (CD45RA şi CCR7) în celulele CD8+ şi CD4+ (date nereprezentate) din (A) melanom (n=4) şi (B) plămân (n=8) prin citometrie în flux post pre-REP.
Figurile 105A-105C: Capacitatea funcţională a TIL a fost mărită diferenţiat cu IL-2/IL-15/IL-21. TIL din (A) melanom (n=4) şi (B) plămân (n=5) s-au evaluat cu privire la expresia CD107a+ în răspuns la stimulare PMA 4 ore în celulele CD4+ şi CD8+ prin citometrie în flux. (C) TIL pre-REP derivate din melanom şi plămân au fost stimulate 24 ore cu anticorp anti-CD3 solubil şi supernatanţii s-au evaluat cu privire la IFNγ prin ELISA.
Figurile 106A-106B: Repertoriul TCRvβ (24 specificităţi) s-a evaluat în TIL derivate din (A) melanom şi (B) tumoare pulmonară folosind kitul Beckman Coulter pentru citometrie în flux.
Figura 107: Schema procesului de preparare a LN-144 crioconservate Gen 2.
Figura 108: Schema studiului clinic faza 2, în centre multiple, a TIL crioconservate noi administrate la pacienţi cu melanom metastatic.
Figura 109: Tabel care ilustrează compararea caracteristicilor pacienţilor din grupul 1 (ASCO 2017) vs grupul 2.
Figura 110: Tabel care ilustrează evenimentele adverse apărute în tratament (≥ 30%).
Figura 111: Eficienţa produsului perfuzabil şi terapiei TIL.
Figura 112: Starea clinică a pacienţilor cu răspuns evaluabil cu SD sau un răspuns mai bun.
Figura 113: Modificarea procentuală a sumei diametrelor.
Figura 114: O creştere a nivelului HMGB 1 s-a observat la tratament cu TIL.
Figura 115: O creştere a biomarkerului IL-10 s-a observat post-perfuzie LN-144.
Figura 116: Caracteristici actualizate ale pacienţilor pentru grupul 2 din studiul clinic faza 2 în melanom metastatic din al doilea subset de date (N = 17 pacienţi).
Figura 117: Evenimentele adverse apărute în tratament pentru grupul 2 (≥ 30%) din al doilea subset de date (N = 17 pacienţi).
Figura 118: Timp până la răspuns pentru pacienţi evaluabili (boală stabilă sau ameliorată) în grupul 2 din al doilea subset de date (N = 17 pacienţi). Din cei 10 pacienţi din setul de eficienţă, un pacient (pacientul 10) nu a fost evaluabil din cauza decesului legat de melanom înainte de prima evaluare a tumorii şi nu este reprezentat în figură.
Figura 119: Date de eficienţă actualizate pentru grupul 2 din al doilea subset de date (N = 17 pacienţi). Numărul mediu al TIL perfuzate este 34 × 109. Numărul mediu al terapiilor anterioare a fost 4.5. Pacienţii cu o mutaţie BRAF au răspuns la fel ca pacienţii cu BRAF de tip sălbatic (* se referă la pacienţi cu o mutaţie BRAF). Un pacient (pacientul 10) nu a fost evaluabil din cauza decesului legat de melanom înainte de prima evaluarea a tumorii, dar a fost luat în considerare în setul de eficienţă. Abrevieri: PR, răspuns parţial; SD, boală stabilă; PD, boală progresivă.
Figura 120: Date de eficienţă actualizate pentru pacienţi evaluabili din grupul 2 din al doilea subset de date (N = 17 pacienţi). * indică un pacient neevaluabil care nu a ajuns la prima evaluare. Toţi pacienţi evaluabili cu privire la eficienţă au primit terapii anterioare cu inhibitori ai punctelor de control anti-PD-1 şi anti-CTLA-4.
Figura 121: Tomografie computerizată reprezentativeă a unui pacient (003-015) cu PR din grupul 2, al doilea subset de date.
Figura 122: Corelarea inducerii IFN-γ de către TIL înainte de perfuzie cu reducere clinică a dimensiunii tumorii în ziua 42 post-perfuzie TIL.
Figura 123: Nivelurile IP-10 (CXCL10) (pg/mL, log10) pre- şi post-perfuzie a unei aplicări a produsului TIL din Gen 2. IP-10 este un marker al adeziunii şi direcţionării celulelor.
Figura 124: Nivelurile IP-10 (CXCL10) (pg/mL, log10) pre- şi post-perfuzie a unei aplicări a produsului TIL din Gen 1.
Figura 125: Nivelurile MCP-1 (pg/mL, log10) pre- şi post-perfuzie a unei aplicări a produsului TIL din Gen 2. MCP-1 este un marker al adeziunii şi direcţionării celulelor.
Figura 126: Nivelurile MCP-1 (pg/mL, log10) pre- şi post-perfuzie a unei aplicări a produsului TIL din Gen 1.
Figura 127: Date din studiile faza 2 în carcinom de col uterin şi carcinom cu celule scuamoase la cap şi gât (HNSCC). SD = boală stabilă. PR = boală progresivă. PR = răspuns parţial.
Figura 128: indică o diagramă a unei aplicări a procesului 2A, un proces de 22 de zile pentru producerea TIL.
Figura 129: indică schematic sudura sterilă (vezi nota de proces 5.11 din exemplul 30) a unui pachet de transfer al suspensiei TIL la partea inferioară (linie simplă) a unui filtru de sânge gravitaţional.
Figura 130: indică schematic sudura sterilă (vezi nota de proces 5.11 din exemplul 30) la linia roşie de îndepărtare a mediului din GRex100MCS în pachetul de transfer "Supernatant".
Figura 131: indică schematic sudura (vezi nota de proces 5.11 din exemplul 30) 4S-4M60 la un CC2 Cell Connect, înlocuind un racord al aparatului Cell Connect (B) cu capătul cu 4 racorduri al tuburilor 4S-4M60 la (G).
Figura 132: indică schematic sudura (vezi nota de proces 5.11 din exemplul 30) setului de transfer al fluidului repetitiv la unul dintre capetele de conector luer exterior ale 4S-4M60.
Figura 133: indică schematic sudura sterilă (vezi nota de proces 5.11 din exemplul 30) la capătul terminal lung al filtrului de sânge gravitaţional la punga sursă LOVO.
Figura 134: indică schematic sudura sterilă (vezi nota de proces 5.11 din exemplul 30) la una dintre cele două linii sursă ale filtrului la punga de colectare "suspensie TIL acumulată".
Figura 135: indică schematic sudura sterilă (vezi nota de proces 5.11 din exemplul 30) 4S-4M60 la un CC2 Cell Connect care înlocuieşte un racord simplu al aparatului Cell Connect (B) cu capătul cu 4 racorduri al tuburilor 4S-4M60 la (G).
Figura 136: indică schematic sudura sterilă (vezi nota de proces 5.11 din exemplul 30) la pungile crio CS750 cu echipamentul pregătit în etapa 8.14.8, înlocuind unul din cele patru capete cu conector luer exterior (E) cu fiecare pungă.
Figura 137: indică schematic sudura (vezi nota de proces 5.11 din exemplul 30) pungilor CS-10 cu racordurile 4S-4M60.
Figura 138: indică schematic sudura (vezi nota de proces 5.11 din exemplul 30) pungii "TIL preparate" cu racordul rămas (A) pe aparatul pregătit în etapa 8.14.10.
Figura 139: indică o diagramă a etanşării termice (vezi nota de proces 5.12 din exemplul 30) la F, îndepărtând punga de reţinere goală şi pungile CS-10.
Figura 140: indică structurile I-A şi I-B, cilindrii se referă la domeniile de legare polipeptidice individuale. Structurile I-A şi I-B cuprind trei domenii de legare TNFRSF legate liniar derivate de ex. din 4-1BBL sau un anticorp care leagă 4-1BB, care se pliază pentru a forma o proteină trivalentă, care este legată apoi de o a doua proteină trivalentă prin IgG1-Fc (inclusiv domeniile CH3 şi CH2). Două dintre proteinele trivalente sunt apoi legate prin legături disulfurice (ovale mici, alungite), stabilizând structura şi furnizând un agonist capabil să unească domeniile de semnalizare intracelulară ale celor şase receptori şi proteinele de semnalizare, formând un complex de semnalizare.
Figura 141: reprezintă un grafic care indică rezumatul celor 3 faze ale experimentului, aşa cum se discută în exemplul 21.
SCURTĂ DESCRIERE A LISTEI SECVENŢELOR
SEQ ID NO:1 este secvenţa aminoacidică a lanţului greu al muromonab.
SEQ ID NO:2 este secvenţa aminoacidică a lanţului uşor al muromonab.
SEQ ID NO:3 este secvenţa aminoacidică a unei proteine umane recombinante IL-2.
SEQ ID NO:4 este secvenţa aminoacidică a aldesleukinei.
SEQ ID NO:5 este secvenţa aminoacidică a unei proteine umane recombinante IL-4.
SEQ ID NO:6 este secvenţa aminoacidică a unei proteine umane recombinante IL-7.
SEQ ID NO:7 este secvenţa aminoacidică a unei proteine umane recombinante IL-15.
SEQ ID NO:8 este secvenţa aminoacidică a unei proteine umane recombinante IL-21.
SEQ ID NO:9 este secvenţa de aminoacizi a 4-1BB uman.
SEQ ID NO:10 este secvenţa de aminoacizi a 4-1BB murin.
SEQ ID NO:11 este lanţul greu pentru anticorpul monoclonal agonist 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
SEQ ID NO:12 este lanţul uşor pentru anticorpul monoclonal agonist 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
SEQ ID NO:13 este regiunea variabilă a lanţului greu (VH) pentru anticorpul monoclonal agonist 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
SEQ ID NO:14 este regiunea variabilă a lanţului uşor (VL) pentru anticorpul monoclonal agonist 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
SEQ ID NO:15 este CDRl a lanţului greu pentru anticorpul monoclonal agonist 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
SEQ ID NO:16 este CDR2 a lanţului greu pentru anticorpul monoclonal agonist 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
SEQ ID NO:17 este CDR3 a lanţului greu pentru anticorpul monoclonal agonist 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
SEQ ID NO:18 este CDR1 a lanţului uşor pentru anticorpul monoclonal agonist 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
SEQ ID NO:19 este CDR2 a lanţului uşor pentru anticorpul monoclonal agonist 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
SEQ ID NO:20 este CDR3 a lanţului uşor pentru anticorpul monoclonal agonist 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
SEQ ID NO:21 este lanţul greu pentru anticorpul monoclonal agonist 4-1BB urelumab (BMS-663513).
SEQ ID NO:22 este lanţul uşor pentru anticorpul monoclonal agonist 4-1BB urelumab (BMS-663513).
SEQ ID NO:23 este regiunea variabilă a lanţului greu (VH) pentru anticorpul monoclonal agonist 4-1BB urelumab (BMS-663513).
SEQ ID NO:24 este regiunea variabilă a lanţului uşor (VL) pentru anticorpul monoclonal agonist 4-1BB urelumab (BMS-663513).
SEQ ID NO:25 este CDRl a lanţului greu pentru anticorpul monoclonal agonist 4-1BB urelumab (BMS-663513).
SEQ ID NO:26 este CDR2 a lanţului greu pentru anticorpul monoclonal agonist 4-1BB urelumab (BMS-663513).
SEQ ID NO:27 este CDR3 a lanţului greu pentru anticorpul monoclonal agonist 4-1BB urelumab (BMS-663513).
SEQ ID NO:28 este CDR1 a lanţului uşor pentru anticorpul monoclonal agonist 4-1BB urelumab (BMS-663513).
SEQ ID NO:29 este CDR2 a lanţului uşor pentru anticorpul monoclonal agonist 4-1BB urelumab (BMS-663513).
SEQ ID NO:30 este CDR3 a lanţului uşor pentru anticorpul monoclonal agonist 4-1BB urelumab (BMS-663513).
SEQ ID NO:46 este o secvenţă de aminoacizi a ligandului 4-1BB (4-1BBL).
SEQ ID NO:47 este o porţiune solubilă a polipeptidei 4-1BBL.
SEQ ID NO:48 este o regiune variabilă a lanţului greu (VH) pentru anticorpul agonist 4-1BB 4B4-1-1 versiunea 1.
SEQ ID NO:49 este o regiune variabilă a lanţului uşor (VL) pentru anticorpul agonist 4-1BB 4B4-1-1 versiunea 1.
SEQ ID NO:50 este o regiune variabilă a lanţului greu (VH) pentru anticorpul agonist 4-1BB 4B4-1-1 versiunea 2.
SEQ ID NO:51 este o regiune variabilă a lanţului uşor (VL) pentru anticorpul agonist 4-1BB 4B4-1-1 versiunea 2.
SEQ ID NO:52 este o regiune variabilă a lanţului greu (VH) pentru anticorpul agonist 4-1BB H39E3-2.
SEQ ID NO:53 este o regiune variabilă a lanţului uşor (VL) pentru anticorpul agonist 4-1BB H39E3-2.
DESCRIERE DETALIATĂ A INVENŢIEI
I. Introducere
Terapia celulară adoptivă care utilizează TIL cultivate ex vivo prin protocolul de expansiune rapidă (REP) a produs o terapie celulară adoptivă de succes în urma imunosupresiei gazdei la pacienţi cu melanom. Parametrii actuali de acceptare a transferului se bazează pe citirile compoziţiei TIL (de ex., pozitivitate CD28, CD8 sau CD4) şi pe gradul numeric de expansiune şi viabilitatea produsului REP.
Protocoalele REP actuale oferă puţine informaţii privind starea de sănătate a TIL care vor fi administrate pacientului. Celulele T suferă o deplasare metabolică profundă în timpul maturizării de la celule naive la celule T efectoare (vezi Chang, et al., Nat. Immunol. 2016,17, 364, în special pentru discuţia referitoare la markerii metabolismului anaerob şi aerob). De exemplu, celulele T naive se bazează pe respiraţia mitocondrială pentru a produce ATP, în timp ce celulele T efectoare mature, sănătoase, cum ar fi TIL, sunt foarte glicolitice, bazându-se pe glicoliza aerobă pentru furnizarea substraturilor bioenergetice necesare pentru înmulţire, migrare, activare şi eficienţa anti-tumorală.
Lucrările anterioare raportează că limitarea glicolizei şi favorizarea metabolismului mitocondrial în TIL înaintea transferului sunt dezirabile fiindcă celulele care se bazează în mare măsură pe glicoliză vor suferi privare de nutrienţi la transferul adoptiv, ducând la moartea celor mai multe dintre celulele transferate. Astfel, se specifică în domeniu că favorizarea metabolismului mitocondrial ar putea susţine longevitatea in vivo şi sugerează folosirea inhibitorilor de glicoliză înaintea inducerii răspunsului imun. Vezi Chang et al. (Chang, et al., Nat. Immunol. 2016, 17(364).
Prezenta invenţie se referă, de asemenea, în unele aplicări la metode de evaluare şi cuantificare a acestei creşteri a sănătăţii metabolice. Astfel, prezenta invenţie oferă metode de testare a sănătăţii relative a unei populaţii TIL folosind una sau mai multe evaluări generale ale metabolismului, inclusiv, dar nelimitativ, ratele şi cantităţile de glicoliză, fosforilare oxidativă, capacitatea respiratorie de rezervă (SRC) şi rezerva glicolitică.
De asemenea, prezenta invenţie se referă, în unele la metode de evaluare şi cuantificare a acestei creşteri a sănătăţii metabolice. Astfel, prezenta invenţie oferă metode metode de testare a sănătăţii relative a unei populaţii TIL folosind una sau mai multe evaluări generale ale metabolismului, inclusiv, dar nelimitativ, ratele şi cantităţile de glicoliză, fosforilare oxidativă, capacitatea respiratorie de rezervă (SRC) şi rezerva glicolitică.
În plus, evaluările suplimentare opţionale includ, nelimitativ, producţia ATP, masa mitocondrială şi absorbţia glucozei.
II. Definiţii
Dacă nu se definesc în alt mod, toţi termenii tehnici şi ştiinţifici folosiţi în prezenta au sensul înţeles în mod uzual în domeniul căruia îi aparţine invenţia.
Termenul "in vivo" se referă la un eveniment care are loc în corpul unui subiect.
Termenul "in vitro" se referă la un eveniment care are loc în exteriorul corpului unui subiect. Testele in vitro includ teste pe bază celulară, în care se folosesc celule vii sau moarte, şi pot include de asemenea un test fără celule, în care nu se utilizează celule intacte.
Termenul "ex vivo" se referă la un eveniment care presupune tratarea sau efectuarea unei proceduri asupra unei celule, unui ţesut şi/sau organ care a fost îndepărtat din corpul unui subiect. În mod corespunzător, celula, ţesutul şi/sau organul poate fi returnat în corpul subiectului într-o metodă chirurgicală sau de tratament.
Termenul "expansiune rapidă" înseamnă o creştere a numărului de TIL antigen-specifice de cel puţin circa 3 ori (sau 4, 5, 6, 7, 8, sau 9 ori) într-o perioadă de o săptămână, mai preferabil cel puţin de circa 10 ori (sau 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 sau 90 de ori) într-o perioadă de o săptămână sau cel mai preferabil cel puţin de circa 100 de ori într-o perioadă de o săptămână. Mai multe protocoale de expansiune rapidă sunt prezentate mai jos.
Prin "limfocite infiltrante în tumori" sau "TIL" se înţelege în prezenta o populaţie de celule obţinute iniţial ca globule albe care au ieşit din fluxul sanguin al unui subiect şi au migrat într-o tumoare. TIL includ, nelimitativ, celule T CD8+ citotoxice (limfocite), celule T Th1 şi Th17 CD4+, celule natural killer, celule dendritice şi macrofage M1. TIL includ TIL primare şi secundare. "TIL primare" sunt cele obţinute din probe tisulare de la pacient, aşa cum se descrie în prezenta (denumite uneori ca fiind "proaspăt recoltate"), iar "TIL secundare" sunt orice populaţii celulare TIL care au fost amplificate sau proliferate aşa cum se discută în prezenta, inclusiv, dar nelimitativ, TIL în masă şi TIL amplificate ("TIL REP" sau "TIL post-REP"). Populaţiile de celule TIL pot include TIL modificate genetic.
Prin "populaţie de celule" (inclusiv TIL) se înţelege în prezenta un număr de celulare având trăsături comune. În general, populaţiile variază de la 1 × 106 la 1 × 1010, diferite populaţii TIL cuprinzând numere diferite. De exemplu, creşterea iniţială a TIL primare în prezenţa IL-2 duce la o populaţie TIL de aproximativ 1 × 108 celule. Expansiunea REP se realizează în general pentru a furniza populaţii de 1.5 × 109 până la 1.5 × 1010 celule pentru transfer.
Prin "TIL crioconservate" se înţelege în prezenta că TIL, primare, în masă sau amplificate (TIL REP) sunt tratate şi depozitate în intervalul de circa -150°C până la -60°C. Metode generale de crioconservare se descriu de asemenea în altă parte în prezenta, inclusiv în Exemple. Pentru claritate, "TIL crioconservate" se disting de probele tisulare congelate care pot fi folosite ca sursă de TIL primare.
Prin "TIL crioconservate decongelate" se înţelege în prezenta o populaţie de TIL care a fost crioconservată anterior şi apoi tratată pentru a reveni la temperatura camerei sau mai mare, inclusiv, dar nelimitativ, temperaturi de cultură celulară sau temperaturi la care TIL se pot administra unui pacient.
TIL pot fi definite în general biochimic, folosind markeri de suprafaţă celulară, sau funcţional, prin capacitatea lor de a se infiltra în tumori şi de a realiza tratamentul. TIL pot fi clasificate în general prin expresia unuia sau mai multora dintre următorii biomarkeri: CD4, CD8, TCR αβ, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45Ra, CD95, PD-1 şi CD25. În plus şi alternativ, TIL pot fi definite funcţional prin capacitatea lor de a se infiltra în tumori solide la reintroducere într-un pacient.
Termenul "mediu de crioconservare" se referă la orice mediu care poate fi folosit pentru crioconservarea celulelor. Aceste medii pot include medii cuprinzând 7% până la 10% DMSO. Mediile exemplificative includ CryoStor CS10, Hyperthermasol, precum şi combinaţii ale acestora. Termenul "CS10" se referă la un mediu de crioconservare obţinut de la Stemcell Technologies sau de la Biolife Solutions. Mediul CS10 poate fi denumit cu marca comercială "CryoStor® CS10". Mediul CS10 este un mediu fără ser, fără componente animale, cuprinzând DMSO.
Termenul "celulă T de memorie centrală" se referă la un subset de celule T care, la om, sunt CD45R0+ şi exprimă constitutiv CCR7 (CCR7hi) şi CD62L (CD62hi). Fenotipul de suprafaţă al celulelor T de memorie centrală include şi TCR, CD3, CD127 (IL-7R) şi IL-15R. Factorii de transcriere pentru celule T de memorie centrală includ BCL-6, BCL-6B, MBD2 şi BMI1. Celulele T de memorie centrală secretă în principal IL-2 şi CD40L ca molecule efectoare după iniţierea TCR. Celulele T de memorie centrală sunt predominante în compartimentul CD4 în sânge şi la om sunt îmbogăţite proporţional în ganglioni limfatici şi amigdale.
Termenul "celulă T de memorie efectoare" se referă la un subset de celule T umane sau de mamifere care, la fel ca celulele T de memorie centrală, sunt CD45R0+, dar şi-au pierdut expresia constitutivă a CCR7 (CCR7lo) şi sunt eterogene sau reduse pentru expresie CD62L (CD62L10). Fenotipul de suprafaţă al celulelor T de memorie centrală include şi TCR, CD3, CD127 (IL-7R) şi IL-15R. Factorii de transcriere pentru celule T de memorie centrală includ BLIMP1. Celulele T de memorie efectoare secretă rapid niveluri mari de citokine inflamatorii în urma stimulării antigenice, inclusiv interferon-y, IL-4 şi IL-5. Celulele T de memorie efectoare sunt predominante în compartimentul CD8 în sânge şi la om sunt îmbogăţite proporţional în plămân, ficat şi intestin. Celulele T de memorie efectoare CD8+ prezintă cantităţi mari de perforină.
Termenul "sistem închis" se referă la un sistem care este închis faţă de mediul exterior. Se poate folosi orice sistem închis corespunzător pentru metodele de cultură celulară utilizabile cu metodele din prezenta invenţie. Sistemele închise includ, de exemplu, nelimitativ, recipiente G închise. După ce se adaugă un segment tumoral în sistemul închis, sistemul nu se mai deschide la exterior până când TIL sunt gata de administrare la pacient.
Termenii "fragmentare", "fragment" şi "fragmentat", în sensul folosit în prezenta pentru a descrie procese de distrugere a unei tumori, include metode de fragmentare mecanice precum sfărâmare, tăiere, secţionare şi fărâmiţare a ţesutului tumoral, precum şi orice altă metodă de distrugere a structurii fizice a ţesutului tumoral.
Termenii "celule mononucleare din sângele periferic" şi "PBMC" se referă la o celulă din sângele periferic având un nucleu rotund, inclusiv limfocite (celule T, celule B, celule NK) şi monocite. De preferinţă, celulele mononucleare din sângele periferic sunt celule mononucleare din sângele periferic alogenice iradiate. PBMC sunt un tip de celulă de prezentare a antigenului.
Termenul "anticorp anti-CD3" se referă la un anticorp sau o variantă a acestuia, de ex., un anticorp monoclonal şi incluzând anticorpi umani, umanizaţi, himerici sau murini direcţionaţi împotriva receptorului CD3 în receptorul antigenic T celular al celulelor T mature. Anticorpii anti-CD3 includ OKT-3, cunoscut şi ca muromonab. Anticorpii anti-CD3 includ de asemenea clona UHCT1, cunoscută şi ca T3 şi CD3ε. Alţi anticorpi anti-CD3 includ, de exemplu, otelixizumab, teplizumab şi visilizumab.
Termenul "OKT-3" (denumit în prezenta şi "OKT3") se referă la un anticorp monoclonal sau biosimilar sau o variantă a acestuia, inclusiv anticorpi umani, umanizaţi, himerici sau murini direcţionaţi împotriva receptorului CD3 în receptorul antigenic T celular al celulelor T mature, şi include formele din comerţ cum ar fi OKT-3 (30 ng/mL, MACS GMP CD3 pur, Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, CA, USA) şi muromonab sau variantele sale, substituţii aminoacidice conservative , glicoforme sau biosimilari. Secvenţele aminoacidice ale lanţurilor grele şi uşoare ale muromonab sunt indicate în Tabelul 1 (SEQ ID NO: 1 şi SEQ ID NO:2). Un hibridom capabil să producă OKT-3 este depus la American Type Culture Collection şi are nr. de referinţă ATCC CRL 8001. Un hibridom capabil să producă OKT-3 este de asemenea depus la European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC) şi are nr. de catalog 86022706.
TABEL 1. Secvenţe aminoacidice ale muromonab.
Denumire Secvenţă (simboluri de aminoacizi de o literă) SEQ ID NO:1 lanţ greu muromonab SEQ ID NO:2 lanţ uşor muromonab
Termenul "IL-2" (denumit în prezenta şi "IL2") se referă la factorul de creştere T celular cunoscut ca interleukina-2 şi include toate formele IL-2, inclusiv forme umane şi de mamifer, substituţii aminoacidice conservative, glicoforme, biosimilari şi variante ale acestora. IL-2 este descris, de ex., în Nelson, J. Immunol. 2004, 172, 3983-88 şi Malek, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79. Secvenţa aminoacidică a IL-2 umane recombinante adecvate pentru utilizare în invenţie este indicată în Tabelul 2 (SEQ ID NO:3). De exemplu, termenul IL-2 include forme umane, recombinante, ale IL-2 cum ar fi aldesleukina (PROLEUKIN, disponibilă în comerţ de la mai mulţi furnizori în 22 de milioane IU per fiole de unică folosinţă), precum şi forma IL-2 recombinantă furnizată în comerţ de CellGenix, Inc., Portsmouth, NH, USA (CELLGRO GMP) sau ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA (nr. cat. CYT-209-b) şi alte echivalenţe comerciale de la alţi vânzători. Aldesleukina (desalanil-1, IL-2 serin-125 umană) este o formă umană recombinantă neglicozilată a IL-2 cu o greutate moleculară de aproximativ 15 kDa. Secvenţa aminoacidică a aldesleukinei adecvate pentru utilizare în invenţie este indicată în Tabelul 2 (SEQ ID NO:4). Termenul IL-2 include şi forme pegilate ale IL-2, descrise în prezenta, inclusiv promedicamentul IL2 pegilat NKTR-214, disponibil de la Nektar Therapeutics, South San Francisco, CA, USA. NKTR-214 şi IL-2 pegilat adecvate pentru utilizare în invenţie se descriu în documentaţia cererii de brevet U.S. nr. US 2014/0328791 A1 şi documentaţia cererii de brevet internaţional nr. WO 2012/065086 A1. Forme alternative ale IL-2 conjugate adecvate pentru utilizare în invenţie se descriu în brevetele U.S. nr. 4,766,106, 5,206,344, 5,089,261 şi 4902,502. Formele IL-2 adecvate pentru utilizare în invenţie se descriu în brevetul U.S. nr. 6,706,289.
TABEL 2. Secvenţele aminoacidice ale interleukinelor.
Denumire Secvenţă (simboluri de aminoacizi de o literă) SEQ ID NO:3 IL-2 umană recombinantă (rhIL-2) SEQ ID NO:4 Aldesleukina SEQ ID NO:5 IL-4 umană recombinantă (rhIL-4) SEQ ID NO:6 IL-7 umană recombinantă (rhIL-7) SEQ ID NO:7 IL-15 umană recombinantă (rhIL-15) SEQ ID NO:8 IL-21 umană recombinantă (rhIL-21)
Termenul "IL-4" (denumit în prezenta şi "IL4") se referă la citokina cunoscută ca interleukina 4, produsă de celule T Th2 şi de eozinofile, bazofile şi mastocye. IL-4 reglează diferenţierea celulelor T helper naive (celule Th0) în celule T Th2. Steinke & Borish, Respir. Res. 2001, 2, 66-70. La activare de către IL-4, celulele T Th2 produc IL-4 suplimentară într-un circuit de feedback pozitiv. IL-4 stimulează şi înmulţirea celulelor B şi expresia MHC clasa II şi induce comutarea clasei în expresie IgE şi IgG1 din celule B. IL-4 umană recombinantă adecvată pentru utilizare în invenţie se găseşte în comerţ de la mai mulţi furnizori, inclusiv ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA (nr. cat. CYT-211) şi ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA (proteina umană IL-15 recombinantă, nr. cat. Gibco CTP0043). Secvenţa aminoacidică a IL-4 umane recombinante adecvate pentru utilizare în invenţie este indicată în Tabelul 2 (SEQ ID NO:5).
Termenul "IL-7" (denumit în prezenta şi "IL7") se referă la o citokină derivată din ţesut glicozilată cunoscută ca interleukina 7, care poate fi obţinută din celule stromale şi epiteliale, precum şi din celule dendritice. Fry & Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904. IL-7 poate stimula dezvoltarea celulelor T. IL-7 se leagă de receptorul IL-7, un heterodimer constând din receptorul lanţului alpha şi gamma comun al receptorului IL-7, într-o serie de semnale importante pentru dezvoltarea celulelor T în timus şi supravieţuire periferică. IL-7 umană recombinantă adecvată pentru utilizare în invenţie se găseşte în comerţ de la mai mulţi furnizori, inclusiv ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA (nr. cat. CYT-254) şi ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA (proteina umană IL-15 recombinantă, nr. cat. Gibco PHC0071). Secvenţa aminoacidică a IL-7 umane recombinante adecvate pentru utilizare în invenţie este indicată în Tabelul 2 (SEQ ID NO:6).
Termenul "IL-15" (denumit în prezenta şi "IL15") se referă la factorul de creştere T celular cunoscut ca interleukina-15 şi include toate formele IL-2, inclusiv forme umane şi de mamifer, substituţii aminoacidice conservative, glicoforme, biosimilari şi variante ale acestora. IL-15 este descrisă, de ex., în Fehniger & Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32. IL-15 are în comun subunităţile receptorilor de semnalizare β şi γ cu IL-2. IL-15 umană recombinantă este un singur lanţ polipeptidic neglicozilat conţinând 114 aminoacizi (şi o metionină N-terminală) cu o masă moleculară de 12.8 kDa. IL-15 umană recombinantă se găseşte în comerţ de la mai mulţi furnizori, inclusiv ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA (nr. cat. CYT-230-b) şi ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA (proteina umană IL-15 recombinantă, nr. cat. 34-8159-82). Secvenţa aminoacidică a IL-15 umană recombinantă adecvată pentru utilizare în invenţie este indicată în Tabelul 2 (SEQ ID NO:7).
Termenul "IL-21" (denumit în prezenta şi "IL21") se referă la proteina citokină pleiotropică cunoscută ca interleukina-21 şi include toate formele IL-21, inclusiv forme umane şi de mamifer, substituţii aminoacidice conservative, glicoforme, biosimilari şi variante ale acestora. IL-21 este descrisă, de ex., în Spolski & Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc. 2014,13, 379-95. IL-21 este produsă în principal de celule T natural killer şi celule T CD4+ umane activate. IL-21 umană recombinantă este un singur lanţ polipeptidic neglicozilat conţinând 132 de aminoacizi cu o masă moleculară de 15.4 kDa. IL-21 umană recombinantă se găseşte în comerţ de la mai mulţi furnizori, inclusiv ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA (nr. cat. CYT-408-b) şi ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA (proteina umană IL-21 recombinantă, nr. cat. 14-8219-80). Secvenţa aminoacidică a IL-21 umane recombinante adecvate pentru utilizare în invenţie este indicată în Tabelul 2 (SEQ ID NO:8).
Când se indică "o cantitate eficientă anti-tumorală", "o cantitate eficientă de inhibare a tumorii" sau "o cantitate terapeutică", cantitatea exactă a compoziţiilor din prezenta invenţie de administrat poate fi determinată de un medic ţinând cont de diferenţele individuale de vârstă, greutate, dimensiunea tumorii, gradul de infecţie sau metastază şi starea pacientului (subiectului). Se poate afirma în general că o compoziţie farmaceutică ce conţine limfocitele infiltrante în tumori (de ex. TIL secundare sau limfocite citotoxice modificate genetic) descrise în prezenta se poate administra la un dozaj de 104 până la 1011 celule/kg de greutate corporală (de ex., 105 până la 106, 105 până la 1010, 105 până la 1011, 106 până la 1010, 106 până la 1011 ,107 până la 1011, 107 până la 1010, 108 până la 1011, 108 până la 1010, 109 până la 1011 sau 109 până la 1010 celule/kg de greutate corporală), inclusiv toate valorile întregi din aceste intervale. Compoziţiile de limfocite infiltrante în tumori (inclusiv, în unele cazuri, limfocite citotoxice modificate genetic) se pot administra de asemenea de mai multe ori la aceste dozaje. Limfocitele infiltrante în tumori (inclusiv, în unele cazuri, cele modificate genetic) se pot administra folosind tehnici de perfuzie cunoscute în imunoterapie (vezi, de ex., Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988). Dozajul optim şi regimul de tratament pentru un anumit pacient se pot determina cu uşurinţă de către persoanele cu competenţe în domeniul medical prin monitorizarea pacient cu privire la semne de boală şi ajustarea tratamentului în consecinţă.
Termenul "malignitate hematologică" se referă la cancere ale mamiferelor şi tumori ale ţesuturilor hematopoietice şi limfoide, inclusiv, dar nelimitativ, ţesuturi sanguine, din măduva osoasă, ganglioni limfatici şi sistemul limfatic. Malignităţile hematologice sunt denumite şi "tumori lichide". Malignităţile hematologice includ, nelimitativ, leucemie limfoblastică acută (ALL), limfom limfocitar cronic (CLL), limfom limfocitar mic (SLL), leucemie mieloidă acută (AML), leucemie mieloidă cronică (CML), leucemie monocitară acută (AMoL), limfom Hodgkin şi limfoame non-Hodgkin. Termenul "malignitate hematologică B celulară" se referă la malignităţi hematologice care afectează celulele B.
Termenul "tumoare solidă" se referă la o masă anormală de ţesut care de obicei nu cuprinde chisturi sau zone lichide. Tumorile solide pot fi benigne sau maligne. Termenul "cancer tumoral solid" se referă la tumori maligne, neoplazice sau canceroase. Cancerele tumorale solide includ, nelimitativ, sarcoame, carcinoame şi limfoame, cum ar fi cancer pulmonar, mamar, de prostată, colon, rect şi vezică. Structura tisulară a tumorilor solide include compartimente tisulare interdependente inclusiv parenchim (celule canceroase) şi celulele stromale de suport în care celulele canceroase sunt dispersate şi care pot asigura un micromediu de susţinere.
Termenul "tumoare lichidă" se referă o masă anormală de celule de natură fluidă. Cancerele tumorale lichide includ, nelimitativ, leucemii, mieloame şi limfoame, precum şi alte malignităţi hematologice. TIL obţinute din tumori lichide pot fi denumite de asemenea în prezenta limfocite infiltrante în măduvă (MIL).
Termenul "micromediu", în sensul folosit în prezenta, se poate referi la micromediul tumorilor solide sau hematologice ca un întreg sau la un subset individual de celule în micromediu. Micromediul tumoral, în sensul folosit în prezenta, se referă la un amestec complex de "celule, factori solubili, molecule de semnalizare, matrice extracelulare şi indicii mecanice care susţin transformarea neoplazică, susţin creşterea şi invazia tumorală, protejează tumoarea de imunitatea gazdei, stimulează rezistenţa la agenţi terapeutici şi asigură nişe în care se pot dezvolta metastazele dominante", aşa cum se descrie în Swartz, et al., Cancer Res., 2012, 72, 2473. Deşi tumorile exprimă antigene care ar trebui să fie recunoscute de celule T, eliminarea tumorii de către sistemul imunitar este rară din cauza imunosupresiei de către micromediu.
Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, o metodă de tratare a unui cancer cu o populaţie de TIL, unde un pacient este pre-treatat cu chimioterapie non-mieloablativă înaintea unei perfuzii de TIL conform invenţiei. Poate fi prevăzută o populaţie de TIL, unde un pacient este pre-tratat cu chimioterapie non-mieloablativă înaintea unei perfuzii de TIL conform prezentei invenţii. Chimioterapia non-mieloablativă constă din ciclofosfamidă 60 mg/kg/zi 2 zile (zilele 27 şi 26 înaintea perfuziei TIL) şi fludarabină 25 mg/m2/zi 5 zile (zilele 27 - 23 înaintea perfuziei TIL). După chimioterapia non-mieloablativă şi perfuzia TIL (ziua 0) conform invenţiei, pacientul primeşte o perfuzie intravenoasă de IL-2 la 720.000 IU/kg din 8 în 8 ore până la toleranţă fiziologică.
Observaţiile experimentale arată că limfodepleţia înaintea transferului adoptiv al limfocitelor T specifice tumorii are un rol esenţial în creşterea eficienţei tratamentului prin eliminarea celulelor T regulatoare şi a elementelor concurente ale sistemului imunitar ("cytokine sinks"). Astfel, unele aplicări ale invenţiei utilizează o etapă de limfodepleţie (denumită uneori "condiţionare imunosupresoare") la pacient înaintea introducerii rTIL din invenţie.
Termenii "co-administrat", "co-administrare", "administrat în combinaţie cu", "administrare în combinaţie cu", "simultan" şi "concomitent", în sensul folosit în prezenta, includ administrarea a două sau mai multe ingrediente farmaceutice active (într-o aplicare preferată a prezentei invenţii, de exemplu, cel puţin un agonist al canalului de potasiu în combinaţie cu mai multe TIL) la un subiect astfel încât ambele ingrediente farmaceutice active şi/sau metaboliţii lor să fie prezenţi în subiect în acelaşi timp. Co-administrarea include administrarea simultană în compoziţii separate, administrare la intervale diferite în compoziţii separate sau administrare într-o compoziţie în care sunt prezente două sau mai multe ingrediente farmaceutice active. Se preferă administrarea simultană în compoziţii separate şi administrarea într-o compoziţie în care sunt prezenţi ambii agenţi.
Termenul "cantitate eficientă" sau "cantitate terapeutic eficientă" se referă la acea cantitate a unui compus sau a unei combinaţii de compuşi descrişi în prezenta care este suficientă pentru a realiza utilizarea prevăzută inclusiv, dar nelimitativ, tratarea bolii. O cantitate terapeutic eficientă poate varia în funcţie de utilizarea prevăzută (in vitro sau in vivo) sau de subiect şi boala tratată (de ex., greutatea, vârsta şi sexul subiectului), gravitatea bolii sau modul de administrare. Termenul se aplică şi unei doze care va induce un anumit răspuns în celule ţintă (de ex., reducerea adeziunii trombocitelor şi/sau a migraţiei celulare). Doza specifică va avria în funcţie de compuşii specifici selectaţi, regimul de dozaj urmat, administrarea compusului în combinaţie cu alţi compuşi, perioada de administrare, ţesutul în care se administrează şi sistemul de livrare fizic în care este conţinut compusul.
Termenii "tratament", "tratare", "trata" etc. se referă la obţinerea unui efect farmacologic şi/sau fiziologic dorit. Efectul poate fi profilactic, prevenind complet sau parţial o boală sau un simptom al acesteia, şi/sau poate fi terapeutic, vindecând parţial sau complet o boală şi/sau un efect advers atribuibil bolii. "Tratament", în sensul folosit în prezenta, acoperă orice tratament al unei boli la un mamifer, în special un om, şi include: (a) prevenirea apariţiei bolii la un subiect care poate fi predispus la boală, dar care nu a fost încă diagnosticat cu aceasta; (b) inhibarea bolii, i.e., oprirea dezvoltării sau înaintării acesteia; şi (c) ameliorarea bolii, i.e., determinând regresia bolii şi/sau ameliorând unul sau mai multe simptome ale acesteia. "Tratament" include de asemenea furnizarea unui agent pentru a asigura un efect farmacologic, chiar şi în absenţa unei boli sau afecţiuni. De exemplu, "tratament" include furnizarea unei compoziţii care poate determina un răspuns imun sau poate conferi imunitate în absenţa unei boli, de ex., în cazul unui vaccin.
Termenul "heterolog", folosit în legătură cu porţiuni ale unui acid nucleic sau ale unei proteine, indică faptul că acidul nucleic sau proteina cuprinde două sau mai multe subsecvenţe care nu se găsesc în acelaşi raport una faţă de cealaltă în natură. De exemplu, acidul nucleic este produs în mod tipic recombinant, având două sau mai multe secvenţe din gene neasociate prevăzute să producă un nou acid nucleic funcţional, de ex., un promotor dintr-o sursă şi o regiune codificatoare dintr-o altă sursă sau regiuni codificatoare din surse diferite. În mod similar, o proteină heterologă indică faptul că proteina cuprinde două sau mai multe subsecvenţe care nu se găsesc în acelaşi raport una faţă de cealaltă în natură (de ex., o proteină de fuziune).
Termenii "omologie secvenţială", "omologie procentuală" şi "omologie secvenţială procentuală" (sau sinonime ale acestora, de ex., "99% identice"), în contextul a doi sau mai mulţi acizi nucleici sau polipeptide, se referă la două sau mai multe secvenţe sau subsecvenţe care sunt identice sau au un procentaj specificat de nucleotide sau reziduuri aminoacidice care sunt identice, la comparare şi aliniere (cu introducere de spaţii, dacă este necesar) pentru corespondenţă maximă, fără a lua în considerare substituţii aminoacidice conservative ca parte din omologia secvenţială. Omologia procentuală poate fi măsurată folosind software sau algoritmi de comparare a secvenţelor sau prin inspecţie vizuală. Se cunosc în domeniu diferiţi algoritmi şi software care se pot folosi pentru a obţine alinieri ale secvenţelor de aminoacizi sau nucleotide. Programele adecvate de determinare a omologiei secvenţiale procentuale includ de exemplu seria de programe BLAST disponibilă pe website-ul U.S. Government's National Center for Biotechnology Information BLAST. Comparaţiile între două secvenţe se pot efectua folosind algoritmul BLASTN sau BLASTP. BLASTN se foloseşte pentru a compara secvenţe de acid nucleic, iar BLASTP se foloseşte pentru a compara secvenţele aminoacidice. ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California) sau MegAlign, disponibile de la DNASTAR, sunt alte programe software public disponibile care se pot folosi pentru alinierea secvenţelor. Persoanele cu competenţe în domeniu pot determina parametrii corespunzători pentru aliniere maximă prin software de aliniere specific. În anumite aplicări, se folosesc parametrii impliciţi ai softului de aliniere.
În sensul folosit în prezenta, termenul "variantă" include, nelimitativ, anticorpi sau proteine de fuziune care cuprind o secvenţă de aminoacizi care se deosebeşte de secvenţa aminoacidică a unui anticorp de referinţă prin una sau mai multe substituţii, deleţii şi/sau adăugiri la numite poziţii în sau lângă secvenţa aminoacidică a anticorpului de referinţă. Varianta poate cuprinde una sau mai multe substituţii conservative în secvenţa sa de aminoacizi faţă de secvenţa aminoacidică a unui anticorp de referinţă. Substituţiile conservative pot cuprinde, de ex., substituirea aminoacizilor încărcaţi similar sau neîncărcaţi. Varianta reţine capacitatea de a se lega specific de antigenul anticorpului de referinţă. Termenul variantă include şi anticorpi sau proteine pegilate.
Prin "limfocite infiltrante în tumori" sau "TIL" se înţelege în prezenta o populaţie de celule obţinute iniţial ca globule albe care au ieşit din fluxul sanguin al unui subiect şi au migrat într-o tumoare. TIL includ, nelimitativ, celule T CD8+ citotoxice (limfocite), celule T Th1 şi Th17 CD4+, celule natural killer, celule dendritice şi macrofage M1. TIL includ TIL primare şi secundare. "TIL primare" sunt cele obţinute din probe tisulare de la pacient, aşa cum se descrie în prezenta (denumite uneori ca fiind "proaspăt recoltate"), iar "TIL secundare" sunt orice populaţii celulare TIL care au fost amplificate sau proliferate aşa cum se discută în prezenta, inclusiv, dar nelimitativ, TIL în masă, TIL amplificate ("TIL REP"), precum şi "TIL reREP", aşa cum se discută în prezenta. TIL reREP pot include de exemplu TIL din a doua expansiune sau TIL din a doua expansiune suplimentară (cum ar fi, de exemplu, cele descrise în în etapa D din Figura 27, inclusiv TIL denumite TIL reREP).
TIL pot fi definite în general biochimic, folosind markeri de suprafaţă celulară, sau funcţional, prin capacitatea lor de a se infiltra în tumori şi de a realiza tratamentul. TIL pot fi clasificate în general prin expresia unuia sau mai multora dintre următorii biomarkeri: CD4, CD8, TCR αβ, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45Ra, CD95, PD-1 şi CD25. În plus şi alternativ, TIL pot fi definite funcţional prin capacitatea lor de a se infiltra în tumori solide la reintroducere într-un pacient. TIL pot fi caracterizate de asemenea prin potenţial - de exemplu, TIL pot fi considerate potente dacă, de exemplu, eliberarea interferon (IFN) este mai mare decât circa 50 pg/mL, mai mare decât circa 100 pg/mL, mai mare decât circa 150 pg/mL sau mai mare decât circa 200 pg/mL.
Termenii "vehicul acceptabil farmaceutic" sau "excipient acceptabil farmaceutic" includ toţi solvenţii, dispersanţii, învelişurile, agenţii antibacterieni şi antifungici, agenţii izotonici şi de întârziere a absorbţiei şi ingredientele inerte. Utilizarea acestor vehicule acceptabile farmaceutic sau a excipienţilor acceptabili farmaceutic pentru ingrediente farmaceutice active este bine cunoscută în domeniu. Cu excepţia situaţiilor în care oricare din vehiculele acceptabile farmaceutic sau excipienţii acceptabili farmaceutic convenţionali este incompatibil cu ingredientului farmaceutic activ, invenţia are în vedere utilizarea sa în compoziţiile terapeutice din invenţie. Pot fi incluse alte ingrediente farmaceutice active, cum ar fi alte medicamente, poate fi de asemenea încorporat în compoziţiile şi metodele descrise.
Termenii "circa" şi "aproximativ" înseamnă într-un interval semnificativ statistic al unei valori. Acest interval poate fi într-un ordin de mărime, de preferinţă în 50%, mai preferabil în 20%, mai preferabil în 10%, încă mai preferabil în 5% dintr-o valoare sau un interval dat. Variaţia permisă inclusă de termenii "circa" sau "aproximativ" depinde de sistemul specific studiat şi poate fi uşor înţeleasă de persoanele cu competenţe în domeniu. În plus, în sensul folosit în prezenta, termenii "circa" şi "aproximativ" înseamnă că dimensiunile, mărimile, formele, parametrii şi alte cantităţi şi caracteristici nu sunt şi nu trebuie să fie exacte, ci pot fi aproximative şi/sau mai mari sau mai mici, după cum se doreşte, reflectând toleranţe, factori de conversie, rotunjire, eroare de măsurare etc., şi alţi factori cunoscuţi în domeniu. În general, o dimensiune, o mărime, o formă, un parametru sau o altă cantitate sau caracteristică este "aproximativă" indiferent dacă este astfel indicată în mod expres sau nu. Se menţionează că aplicările cu dimensiuni, forme şi mărimi foarte diferite ot folosi configuraţiile descrise.
Termenii de tranziţie "cuprinzând", "constând în esenţă din" şi "constând din", folosiţi în
revendicările anexate, în forma originală şi modificată, definesc sfera de acoperire a revendicărilor cu privire la faptul că elementele sau etapele suplimentare neindicate, dacă este cazul, sunt excluse din sfera de acoperire a revendicărilor. Termenul "cuprinzând" este inclusiv sau deschis şi nu exclude alte elemente, metode, etape sau materiale suplimentare, neindicate. Termenul "constând din" exclude orice element, etapă sau material decât cele specificate în revendicare şi, în legătură cu acesta din urmă, impurităţi uzuale asociate cu materialul specificat. Termenul "constând în esenţă din" limitează sfera de acoperire a unei revendicări la elementele, etapele sau materialele specificate şi cele care nu afectează în mod considerabil caracteristicile de bază şi noi ale invenţiei revendicate. Toate compoziţiile, metodele şi kiturile descrise în prezenta, care reprezintă prezenta invenţie pot fi, în aplicări alternative, definite mai specific de oricare dintre termenii de tranziţie "cuprinzând," "constând în esenţă din" şi "constând din".
AGONIŞTI 4-1BB (CD137)
Agonistul TNFRSF poate fi un agonist 4-1BB (CD137). Agonistul 4-1BB poate fi orice moleculă de legare 4-1BB cunoscută în domeniu. Molecula de legare 4-1BB poate fi un anticorp monoclonal sau o proteină de fuziune capabilă să se lege de 4-1BB uman sau de mamifer. Agoniştii 4-1BB sau moleculele de legare 4-1BB pot cuprinde un lanţ greu de imunoglobulină de orice izotip (de ex., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA şi IgY), clasă (de ex., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 şi IgA2) sau subclasă de molecule imunoglobulinice. Agonistul 4-1BB sau molecula de legare 4-1BB poate avea atât un lanţ greu, cât şi unul uşor. În sensul folosit în prezenta, termenul moleculă de legare include şi anticorpi (inclusiv anticorpi în lungime completă), anticorpi monoclonali (inclusiv anticorpi monoclonali în lungime completă), anticorpi policlonali, anticorpi multispecifici (de ex., anticorpi bispecifici), anticorpi umani, umanizaţi sau himerici şi fragmente de anticorpi, de ex. fragmente Fab, fragmente F(ab'), fragmente produse de o bibliotecă de expresie Fab, fragmente de legare la epitop ale oricăreia dintre cele de mai sus şi forme de anticorpi modificate, de ex., molecule scFv, care se leagă de 4-1BB. Agonistul 4-1BB poate fi o proteină de legare a antigenului care este un anticorp complet uman. Agonistul 4-1BB poate fi o proteină de legare a antigenului care este un anticorp umanizat. Agoniştii 4-1BB pentru utilizare în metodele şi compoziţiile divulgate în prezenta pot include anticorpi anti-4-1BB, anticorpi anti-4-1BB umani, anticorpi anti-4-1BB de şoarece, anticorpi anti-4-1BB de mamifer, anticorpi anti-4-1BB monoclonali, anticorpi anti-4-1BB policlonali, anticorpi anti-4-1BB himerici, adnectine anti-4-1BB, anticorpi cu domeniu anti-4-1BB, fragmente anti-4-1BB monocatenare, fragmente anti-4-1BB cu lanţ greu, fragmente anti-4-1BB cu lanţ uşor, proteine de fuziune anti-4-1BB şi fragmente, derivaţi, conjugaţi, variante sau biosimilari ai acestora. Se ştie că anticorpii anti-4-1BB agonişti induc răspunsuri imune puternice. Lee, et al., PLOS One 2013, 8, e69677. Agonistul 4-1BB poate fi un anticorp monoclonal agonist anti-4-1BB umanizat sau complet uman (i.e., un anticorp derivat dintr-o singură linie celulară). Agonistul 4-1BB poate fi EU-101 (Eutilex Co. Ltd.), utomilumab sau urelumab sau un fragment, derivat, conjugat, variantă sau biosimilar al acestora. Agonistul 4-1BB poate fi utomilumab sau urelumab sau un fragment, derivat, conjugat, variantă sau biosimilar al acestora. \tabAgonistul 4-1BB sau molecula de legare 4-1BB poate fi de asemenea o proteină de fuziune. Un agonist 4-1BB mulcronometruic, cum ar fi un agonist 4-1BB trimeric sau hexameric (cu trei sau şase domenii de legare a ligandului), poate induce o grupare superioară a receptorilor (4-1BBL) şi formarea unui complex de semnalizare celular intern comparativ cu un anticorp monoclonal agonist, care are de obicei două domenii de legare a ligandului. Proteinele de fuziune trimerice (trivalente) sau hexamerice (sau hexavalente) sau mai mari cuprinzând trei domenii de legare TNFRSF şi IgG1-Fc şi opţional care leagă două sau mai multe dintre aceste proteine de fuziune sunt descrise, de ex., în Gieffers, et al., Mol. Cancer Therapeutics 2013, 12, 2735-47. Se ştie că anticorpii 4-1BB agonişti şi proteinele de fuziune induc răspunsuri imune puternice. Agonistul 4-1BB poate fi un anticorp monoclonal sau o proteină de fuziune care se leagă specific de antigenul 4-1BB într-o manieră suficientă pentru a reduce toxicitatea. Agonistul 4-1BB poate fi un anticorp monoclonal 4-1BB agonist sau o proteină de fuziune care elimină toxicitatea celulară dependentă de anticorp (ADCC), de exemplu citotoxicitatea celulelor NK. Agonistul 4-1BB poate fi un anticorp monoclonal 4-1BB agonist sau o proteină de fuziune care elimină fagocitoza celulară dependentă de anticorp (ADCP). Agonistul 4-1BB poate fi un anticorp monoclonal 4-1BB agonist sau o proteină de fuziune care elimină citotoxicitatea celulară dependentă de complement (CDC). Agonistul 4-1BB poate fi un anticorp monoclonal 4-1BB agonist sau o proteină de fuziune care elimină funcţionalitatea regiunii Fc. Agonistul 4-1BBs poate fi caracterizat prin legare de 4-1BB uman (SEQ ID NO:9) cu afinitate mare şi activitate agonistă. Agonistul 4-1BB poate fi o moleculă de legare care se leagă de 4-1BB uman (SEQ ID NO:9). Agonistul 4-1BB poate fi o moleculă de legare care se leagă de 4-1BB murin (SEQ ID NO:10). Secvenţele de aminoacizi ale antigenului 4-1BB de care se leagă un agonist sau o moleculă de legare 4-1BB sunt prezentate în tabelul 3.
TABEL 3. Secvenţe de aminoacizi ale antigenelor.
Denumire Secvenţă (simboluri de aminoacizi de o literă) SEQ ID NO:9 4-1BB uman 60 Superfamilia receptorilor factorului de necroză tumorală, membrul 9 (Homo sapiens) 120 180 240 255 SEQ ID NO:10 4-1BB murin 60 Superfamilia receptorilor factorului de necroză tumorală, membrul 9 (Mus musculus) 120 180 240 256
Compoziţiile, procesele şi metodele descrise pot include un agonist 4-1BB care leagă 4-1BB uman sau murin cu o KD de aproximativ 100 pMsau mai mică, leagă 4-1BB uman sau murin cu o KD de aproximativ 90 pMsau mai mică, leagă 4-1BB uman sau murin cu o KD de aproximativ 80 pMsau mai mică, leagă 4-1BB uman sau murin cu o KD de aproximativ 70 pMsau mai mică, leagă 4-1BB uman sau murin cu o KD de aproximativ 60 pMsau mai mică, leagă 4-1BB uman sau murin cu o KD de aproximativ 50 pMsau mai mică, leagă 4-1BB uman sau murin cu o KD de aproximativ 40 pMsau mai mică, sau leagă 4-1BB uman sau murin cu o KD de aproximativ 30 pMsau mai mică.
Compoziţiile, procesele şi metodele descrise pot include un agonist 4-1BB care se leagă de 4-1BB uman sau murin cu o kassoc de aproximativ 7.5 × 105 1/M s sau mai rapidă, se leagă de 4-1BB uman sau murin cu o kassoc de aproximativ 7.5 × 105 1/M s sau mai rapidă, se leagă de 4-1BB uman sau murin cu o kassoc de aproximativ 8 × 105 1/M·s sau mai rapidă, se leagă de 4-1BB uman sau murin cu o kassoc de aproximativ 8.5 × 105 1/M·s sau mai rapidă, se leagă de 4-1BB uman sau murin cu o kassoc de aproximativ 9 × 105 1/M·s sau mai rapidă, se leagă de 4-1BB uman sau murin cu o kassoc de aproximativ 9.5 × 105 1/M s sau mai rapidă sau se leagă de 4-1BB uman sau murin cu o kassoc de aproximativ 1 × 106 1/M s sau mai rapidă.
Compoziţiile, procesele şi metodele descrise pot include un agonist 4-1BB care se leagă de 4-1BB uman sau murin cu o kdissoc de aproximativ 2 × 10-5 1/s sau mai lentă, se leagă de 4-1BB uman sau murin cu o kdissoc de aproximativ 2.1 × 10-5 1/s sau mai lentă , se leagă de 4-1BB uman sau murin cu o kdissoc de aproximativ 2.2 × 10-5 1/s sau mai lentă, se leagă de 4-1BB uman sau murin cu o kdissoc de aproximativ 2.3 × 10-5 1/s sau mai lentă, se leagă de 4-1BB uman sau murin cu o kdissoc de aproximativ 2.4 × 10-5 1/s sau mai lentă, se leagă de 4-1BB uman sau murin cu o kdissoc de aproximativ 2.5 × 10-5 1/s sau mai lentă, se leagă de 4-1BB uman sau murin cu o kdissoc de aproximativ 2.6 × 10-5 1/s sau mai lentă sau se leagă de 4-1BB uman sau murin cu o kdissoc de aproximativ 2.7 × 10-5 1/s sau mai lentă, se leagă de 4-1BB uman sau murin cu o kdissoc de aproximativ 2.8 × 10-5 1/s sau mai lentă, se leagă de 4-1BB uman sau murin cu o kdissoc de aproximativ 2.9 × 10-5 1/s sau mai lentă sau se leagă de 4-1BB uman sau murin cu o kdissoc de aproximativ 3 × 10-5 1/s sau mai lentă.
Compoziţiile, procesele şi metodele descrise pot include un agonist 4-1BB care se leagă de 4-1BB uman sau murin cu o IC50 de aproximativ 10 nMsau mai mică, se leagă de 4-1BB uman sau murin cu o IC50 de aproximativ 9 nMsau mai mică, se leagă de 4-1BB uman sau murin cu o IC50 de aproximativ 8 nMsau mai mică, se leagă de 4-1BB uman sau murin cu o IC50 de aproximativ 7 nMsau mai mică, se leagă de 4-1BB uman sau murin cu o IC50 de aproximativ 6 nMsau mai mică, se leagă de 4-1BB uman sau murin cu o IC50 de aproximativ 5 nMsau mai mică, se leagă de 4-1BB uman sau murin cu o IC50 de aproximativ 4 nMsau mai mică, se leagă de 4-1BB uman sau murin cu o IC50 de aproximativ 3 nMsau mai mică, se leagă de 4-1BB uman sau murin cu o IC50 de aproximativ 2 nMsau mai mică sau se leagă de 4-1BB uman sau murin cu o IC50 de aproximativ 1 nMsau mai mică.
Agonistul 4-1BB poate fi utomilumab, cunoscut şi ca PF-05082566 sau MOR-7480 sau un fragment, derivat, variantă sau biosimilar al acestuia. Utomilumab este disponibil de la Pfizer, Inc. Utomilumab este un anticorp monoclonal imunoglobulinic G2-lambda, anti-[Homo sapiens TNFRSF9 (membrul 9 al superfamiliei receptorilor factorului de necroză tumorală (TNFR), 4-1BB, ILA antigenic T celular, CD137)], Homo sapiens (complet uman). Secvenţele de aminoacizi ale utomilumab sunt indicate în tabelul 4. Utomilumab cuprinde situsuri de glicozilare la Asn59 şi Asn292; punţi disulfurice intracatenare ale lanţului greu la poziţiile 22-96 (VH-VL), 143-199 (CH1-CL), 256-316 (CH2) şi 362-420 (CH3); punţi disulfurice intracatenare ale lanţului uşor la poziţiile 22'-87' (VH-VL) şi 136'-195' (CH1-CL); punţi disulfurice intercatenare lanţ greu-lanţ greu la poziţiile izoformei IgG2A 218-218, 219-219, 222-222 şi 225-225, la poziţiile izoformei IgG2A/B 218-130, 219-219, 222-222 şi 225-225 şi la poziţiile izoformei IgG2B 219-130 (2), 222-222 şi 225-225; şi punţi disulfurice intercatenare lanţ greu-lanţ uşor la poziţiile izoformei IgG2A 130-213' (2), poziţiile izoformei IgG2A/B 218-213' şi 130-213' şi la poziţiile izoformei IgG2B 218-213' (2). Prepararea şi proprietăţile utomilumab şi variantele şi fragmentele sale sunt descrise în brevetele U.S. nr. 8,821,867; 8,337,850; şi 9,468,678 şi dpcumentaţia cererii de brevet internaţional nr. WO 2012/032433 A1. Caracteristicile preclinice ale utomilumab sunt descrise în Fisher, et al., Cancer Immunolog. & Immunother. 2012, 61, 1721-33. Studiile clinice curente ale utomilumab într-o varietate de indicaţii hematologice şi tumorale solide includ U.S. National Institutes of Health clinicaltrials.gov NCT02444793, NCT01307267, NCT02315066 şi NCT02554812.
Un agonist 4-1BB poate cuprinde un lanţ greu dat de SEQ ID NO:11 şi un lanţ uşor dat de SEQ ID NO:12. Un agonist 4-1BB poate cuprinde lanţuri grele şi uşoare având secvenţele indicate în SEQ ID NO:11 şi SEQ ID NO: 12 sau fragmente de legare a antigenului, fragmente Fab, fragmente variabile monocatenare (scFv), variante sau conjugaţi ai acestora. Un agonist 4-1BB poate cuprinde lanţuri grele şi uşoare care sunt cel puţin 99% identice cu secvenţele indicate în SEQ ID NO:11 şi SEQ ID NO: 12. Un agonist 4-1BB poate cuprinde lanţuri grele şi uşoare care sunt cel puţin 98% identice cu secvenţele indicate în SEQ ID NO:11 şi SEQ ID NO: 12. Un agonist 4-1BB poate cuprinde lanţuri grele şi uşoare care sunt cel puţin 97% identice cu secvenţele indicate în SEQ ID NO:11 şi SEQ ID NO:12. Un agonist 4-1BB poate cuprinde lanţuri grele şi uşoare care sunt cel puţin 96% identice cu secvenţele indicate în SEQ ID NO:11 şi SEQ ID NO:12. Un agonist 4-1BB poate cuprinde lanţuri grele şi uşoare care sunt cel puţin 95% identice cu secvenţele indicate în SEQ ID NO:11 şi SEQ ID NO:12.
Agonistul 4-1BB poate cuprinde CDR ale lanţurilor grele şi uşoare sau regiuni variabile (VR) ale utomilumab. Regiunea variabilă a lanţului greu al agonistului 4-1BB (VH) poate cuprinde secvenţa indicată în SEQ ID NO:13 şi regiunea variabilă a lanţului uşor al agonistului 4-1BB (VL) cuprinde secvenţa indicată în SEQ ID NO:14 şi substituţiile sale aminoacidice conservative. Un agonist 4-1BB poate cuprinde regiuni VH şi VL care sunt cel puţin 99% identice cu secvenţele indicate în SEQ ID NO:13 şi SEQ ID NO:14. Un agonist 4-1BB poate cuprinde regiuni VH şi VL regions care sunt cel puţin 98% identice cu secvenţele indicate în SEQ ID NO:13 şi SEQ ID NO:14. Un agonist 4-1BB poate cuprinde regiuni VH şi VL care sunt cel puţin 97% identice cu secvenţele indicate în SEQ ID NO:13 şi SEQ ID NO:14. Un agonist 4-1BB poate cuprinde regiuni VH şi VL care sunt cel puţin 96% identice cu secvenţele indicate în SEQ ID NO:13 şi SEQ ID NO:14. Un agonist 4-1BB poate cuprinde regiuni VH şi VL care sunt cel puţin 95% identice cu secvenţele indicate în SEQ ID NO:13 şi SEQ ID NO:14. Un agonist 4-1BB poate cuprinde un anticorp scFv cuprinzând regiuni VH şi VL care sunt cel puţin 99% identice cu secvenţele indicate în SEQ ID NO:13 şi SEQ ID NO:14.
Un agonist 4-1BB poate cuprinde domenii CDR1, CDR2 şi CDR3 ale lanţului greu având secvenţele indicate în SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 şi SEQ ID NO:17 şi substituţiile lor aminoacidice conservative şi domeniile CDR1, CDR2 şi CDR3 ale lanţului uşor având secvenţele indicate în SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 şi SEQ ID NO:20 şi substituţiile lor aminoacidice conservative.
Agonistul 4-1BB poate fi un anticorp monoclonal biosimilar 4-1BB agonist aprobat de autorităţile de reglementare a medicamentelor în legătură cu utomilumab. Anticorpul monoclonal biosimilar poate cuprinde un anticorp 4-1BB cuprinzând o secvenţă de aminoacizi cel puţin 97%, de ex., 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu secvenţa de aminoacizi a unui produs medicinal de referinţă sau produs biologic de referinţă şi care cuprinde una sau mai multe modificări post-translaţionale comparativ cu produsul medicinal de referinţă sau produsul biologic de referinţă, unde medicamentul de referinţă sau produsul biologic de referinţă este utomilumab. Una sau mai multe modificări post-translaţionale pot fi selectate din una sau mai multe dintre: glicozilare, oxidare, deamidare şi trunchiere. Biosimilarul poate fi un anticorp 4-1BB agonist autorizat sau în curs de autorizare, anticorpul 4-1BB agonist fiind furnizat într-o compoziţie care diferă de compoziţiile unui produs medicinal de referinţă sau unui produs biologic de referinţă, unde produsul medicinal de referinţă sau produsul biologic de referinţă este utomilumab. Anticorpul 4-1BB agonist poate fi autorizat de o autoritate de reglementare a medicamentelor, cum ar fi FDA din SUA şi/sau EMA din Uniunea Europeană. Biosimilarul poate fi furnizat ca o compoziţie care mai cuprinde unul sau mai mulţi excipienţi, aceşti unul sau mai mulţi excipienţi fiind identici sau diferiţi de excipienţii conţinuţi într-un produs medicinal de referinţă sau într-un produs biologic de referinţă, unde produsul medicinal de referinţă sau produsul biologic de referinţă este utomilumab. Biosimilarul poate fi furnizat ca o compoziţie care mai cuprinde unul sau mai mulţi excipienţi, aceşti unul sau mai mulţi excipienţi fiind identici sau diferiţi de excipienţii conţinuţi într-un produs medicinal de referinţă sau într-un produs biologic de referinţă, unde produsul medicinal de referinţă sau produsul biologic de referinţă este utomilumab.
TABEL 4. Secvenţe aminoacidice pentru anticorpii agonişti 4-1BB legaţi de utomilumab.
Denumire Secvenţă (simboluri de aminoacizi de o literă) SEQ ID NO:11 lanţ greu pentru utomilumab 60 120 180 240 300 360 420 441 SEQ ID NO:12 lanţ uşor pentru utomilumab 60 120 180 214 SEQ ID NO:13 lanţ greu EVQLVQSGAE VKKPGESLRT SCKGSGYSFS TYWISWVRQM PGKGLEWMG KIYPGDSYTN 60 regiune variabilă pentru utomilumab YSPSFQGQVT ISADKSISTA YLQWSSLKAS DTAMYYCARG YGIFDYWGQ GTLVTVSS 118 SEQ ID NO:14 regiunea variabilă a lanţului uşor pentru utomilumab 60 108 SEQ ID NO:15 CDR1 a lanţului greu pentru utomilumab STYWIS 6 SEQ ID NO:16 CDR2 a lanţului greu pentru utomilumab KIYPGDSYTN YSPSFQG 17 SEQ ID NO:17 CDR3 a lanţului greu pentru utomilumab RGYGTFDY 8 SEQ ID NO:18 CDR1 a lanţului uşor pentru utomilumab SGDNIGDQYA H 11 SEQ ID NO:19 CDR2 a lanţului uşor pentru utomilumab QDKNRPS 7 SEQ ID NO:20 CDR3 a lanţului uşor pentru utomilumab ATYTGFGSLA V 11
Agonistul 4-1BB poate fi anticorpul monoclonal urelumab, cunoscut şi ca BMS-663513 şi 20H4.9.h4a sau un fragment, derivat, variantă sau biosimilar al acestuia. Urelumab este disponibil de la Bristol-Myers Squibb, Inc., şi Creative Biolabs, Inc. Urelumab este un anticorp monoclonal imunoglobulinic G4-kappa, anti-[Homo sapiens TNFRSF9 (membrul 9 al superfamiliei receptorilor factorului de necroză tumorală, 4-1BB, ILA antigenic T celular, CD137)], Homo sapiens (complet uman). Secvenţele de aminoacizi ale urelumab sunt indicate în tabelul 5. Urelumab cuprinde situsuri de N-glicozilare la poziţiile 298 (şi 298"); punţi disulfurice intracatenare ale lanţului greu la poziţiile 22-95 (VH-VL), 148-204 (CH1-CL), 262-322 (CH2) şi 368-426 (CH3) (şi la poziţiile 22"-95", 148"-204", 262"-322" şi 368"-426"); punţi disulfurice intracatenare ale lanţului uşor la poziţiile 23'-88' (VH-VL) şi 136'-196' (CH1-CL) (şi la poziţiile 23‴-88‴ şi 136‴-196‴); punţi disulfurice intercatenare lanţ greu-lanţ greu la poziţiile 227-227" şi 230-230"; şi punţi disulfurice intercatenare lanţ greu-lanţ uşor la 135-216' şi 135"-216"'. Prepararea şi proprietăţile urelumab şi variantele şi fragmentele sale sunt descrise în brevetele U.S. nr. 7,288,638 şi 8,962,804. Caracteristicile preclinice şi clinice ale urelumab sunt descrise în Segal, et al., Clin. Cancer Res. 2016, disponibil la http:/dx.doi.org/ 10.1158/1078-0432.CCR-16-1272. Studiile clinice curente ale urelumab într-o varietate de indicaţii hematologice şi tumorale solide includ U.S. National Institutes of Health clinicaltrials.gov NCT01775631, NCT02110082, NCT02253992 şi NCT01471210.
Un agonist 4-1BB poate cuprinde un lanţ greu dat de SEQ ID NO:21 şi un lanţ uşor dat de SEQ ID NO:22. Un agonist 4-1BB poate cuprinde lanţuri grele şi uşoare având secvenţele indicate în SEQ ID NO:21 şi SEQ ID NO:22 sau fragmente de legare a antigenului, fragmente Fab, fragmente variabile monocatenare (scFv), variante sau conjugaţi ai acestora. Un agonist 4-1BB poate cuprinde lanţuri grele şi uşoare care sunt cel puţin 99% identice cu secvenţele indicate în SEQ ID NO:21 şi SEQ ID NO:22. Un agonist 4-1BB poate cuprinde lanţuri grele şi uşoare care sunt cel puţin 98% identice cu secvenţele indicate în SEQ ID NO:21 şi SEQ ID NO:22. Un agonist 4-1BB poate cuprinde lanţuri grele şi uşoare care sunt cel puţin 97% identice cu secvenţele indicate în SEQ ID NO:21 şi SEQ ID NO:22. Un agonist 4-1BB poate cuprinde lanţuri grele şi uşoare care sunt cel puţin 96% identice cu secvenţele indicate în SEQ ID NO:21 şi SEQ ID NO:22. Un agonist 4-1BB poate cuprinde lanţuri grele şi uşoare care sunt cel puţin 95% identice cu secvenţele indicate în SEQ ID NO:21 şi SEQ ID NO:22.
Agonistul 4-1BB poate cuprinde CDR ale lanţurilor grele şi uşoare sau regiuni variabile (VR) ale urelumab. Regiunea variabilă a lanţului greu al agonistului 4-1BB (VH) poate cuprinde secvenţa indicată în SEQ ID NO:23 şi regiunea variabilă a lanţului uşor al agonistului 4-1BB (VL) cuprinde secvenţa indicată în SEQ ID NO:24 şi substituţiile lor aminoacidice conservative. Un agonist 4-1BB poate cuprinde regiuni VH şi VL care sunt cel puţin 99% identice cu secvenţele indicate în SEQ ID NO:23 şi SEQ ID NO:24. Un agonist 4-1BB poate cuprinde regiuni VH şi VL care sunt cel puţin 98% identice cu secvenţele indicate în SEQ ID NO:23 şi SEQ ID NO:24. Un agonist 4-1BB poate cuprinde regiuni VH şi VL care sunt cel puţin 97% identice cu secvenţele indicate în SEQ ID NO:23 şi SEQ ID NO:24. Un agonist 4-1BB poate cuprinde regiuni VH şi VL care sunt cel puţin 96% identice cu secvenţele indicate în SEQ ID NO:23 şi SEQ ID NO:24. Un agonist 4-1BB poate cuprinde regiuni VH şi VL care sunt cel puţin 95% identice cu secvenţele indicate în SEQ ID NO:23 şi SEQ ID NO:24. Un agonist 4-1BB poate cuprinde un anticorp scFv cuprinzând regiuni VH şi VL care sunt cel puţin 99% identice cu secvenţele indicate în SEQ ID NO:23 şi SEQ ID NO:24.
Un agonist 4-1BB poate cuprinde domeniile CDR1, CDR2 şi CDR3 ale lanţului greu având secvenţele indicate în SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 şi SEQ ID NO:27 şi substituţiile lor aminoacidice conservative şi domeniile CDR1, CDR2 şi CDR3 ale lanţului uşor având secvenţele indicate în SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 şi SEQ ID NO:30 şi substituţiile lor aminoacidice conservative.
Agonistul 4-1BB poate fi un anticorp monoclonal biosimilar 4-1BB agonist aprobat de autorităţile de reglementare a medicamentelor în legătură cu urelumab. Anticorpul monoclonal biosimilar poate cuprinde un anticorp 4-1BB cuprinzând o secvenţă de aminoacizi cel puţin 97%, de ex., 97%, 98%, 99% sau 100% identică cu secvenţa de aminoacizi a unui produs medicinal de referinţă sau produs biologic de referinţă şi care cuprinde una sau mai multe modificări post-translaţionale comparativ cu produsul medicinal de referinţă sau produsul biologic de referinţă, unde produsul medicinal de referinţă sau produsul biologic de referinţă este urelumab. Una sau mai multe modificări post-translaţionale pot fi selectate din una sau mai multe dintre: glicozilare, oxidare, deamidare şi trunchiere. Biosimilarul poate fi un anticorp 4-1BB agonist autorizat sau în curs de autorizare, anticorpul 4-1BB agonist fiind furnizat într-o compoziţie care diferă de compoziţiile unui produs medicinal de referinţă sau unui produs biologic de referinţă, unde produsul medicinal de referinţă sau produsul biologic de referinţă este urelumab. Anticorpul 4-1BB agonist poate fi autorizat de o autoritate de reglementare a medicamentelor, cum ar fi FDA din SUA şi/sau EMA din Uniunea Europeană. Biosimilarul poate fi furnizat ca o compoziţie care mai cuprinde unul sau mai mulţi excipienţi, aceşti unul sau mai mulţi excipienţi fiind identici sau diferiţi de excipienţii conţinuţi într-un produs medicinal de referinţă sau într-un produs biologic de referinţă, unde produsul medicinal de referinţă sau produsul biologic de referinţă este urelumab. Biosimilarul poate fi furnizat ca o compoziţie care mai cuprinde unul sau mai mulţi excipienţi, aceşti unul sau mai mulţi excipienţi fiind identici sau diferiţi de excipienţii conţinuţi într-un produs medicinal de referinţă sau într-un produs biologic de referinţă, unde produsul medicinal de referinţă sau produsul biologic de referinţă este urelumab.
TABEL 5. Secvenţe aminoacidice pentru anticorpii agonişti 4-1BB legaţi de urelumab.
Denumire Secvenţă (simboluri de aminoacizi de o literă) SEQ ID NO:21 lanţ greu pentru urelumab 60 120 180 240 300 360 420 448 SEQ ID NO:22 lanţ uşor pentru urelumab 60 120 180 216 SEQ ID NO:23 regiunea variabilă a lanţului greu pentru urelumab 60 120 SEQ ID NO:24 regiunea variabilă a lanţului uşor pentru urelumab 60 110 SEQ ID NO:25 CDR1 a lanţului greu pentru urelumab GYYWS 5 SEQ ID NO:26 CDR2 a lanţului greu pentru urelumab EINHGGYVTY NPSLES 16 SEQ ID NO:27 CDR3 a lanţului greu pentru urelumab DYGPGNYDWY FDL 13 SEQ ID NO:28 CDR1 a lanţului uşor pentru urelumab RASQSVSSYL A 11 SEQ ID NO:29 CDR2 a lanţului uşor pentru urelumab DASNRAT 7 SEQ ID NO:30 CDR3 a lanţului uşor pentru urelumab QQRSDWPPAL T 11
Agonistul 4-1BB poate fi selectat din grupul constând din 1D8, 3Elor, 4B4 (BioLegend 309809), H4-1BB-M127 (BD Pharmingen 552532), BBK2 (Thermo Fisher MS621PABX), 145501 (Leinco Technologies B591), anticorpul produs de linia celulară depusă ca ATCC nr. HB-11248 şi divulgat în brevetul U.S. nr. 6,974,863, 5F4 (BioLegend 31 1503), C65-485 (BD Pharmingen 559446), anticorpii divulgaţi în documentaţia cererii de brevet U.S. nr. US 2005/0095244, anticorpii divulgaţi în brevetul U.S. nr. 7,288,638 (cum ar fi 20H4.9-IgGl (BMS-663031)), anticorpii divulgaţi în brevetul U.S. nr. 6,887,673 (cum ar fi 4E9 sau BMS-554271), anticorpii divulgaţi în brevetul U.S. nr. 7,214,493, anticorpii divulgaţi în brevetul U.S. nr. 6,303,121, anticorpii divulgaţi în brevetul U.S. nr. 6,569,997, anticorpii divulgaţi în brevetul U.S. nr. 6,905,685 (cum ar fi 4E9 sau BMS-554271), anticorpii divulgaţi în brevetul U.S. nr. 6,362,325 (cum ar fi 1D8 sau BMS-469492; 3H3 sau BMS-469497; sau 3El), anticorpii divulgaţi în brevetul U.S. nr. 6,974,863 (cum ar fi 53A2); anticorpii divulgaţi în brevetul U.S. nr. 6,210,669 (cum ar fi 1D8, 3B8 sau 3El), anticorpii descrişi în brevetul U.S. nr. 5,928,893, anticorpii divulgaţi în brevetul U.S. nr. 6,303,121, anticorpii divulgaţi în brevetul U.S. nr. 6,569,997, anticorpii divulgaţi în documentaţiile cererilor de brevet internaţional nr. WO 2012/177788, WO 2015/119923, şi WO 2010/042433 şi fragmente, derivaţi, conjugaţi, variante sau biosimilari ai acestora.
Agonistul 4-1BB poate fi o proteină de fuziune 4-1BB agonistă descrisă în documentaţiile cererilor de brevet internaţional nr. WO 2008/025516 A1, WO 2009/007120 A1, WO 2010/003766 A1, WO 2010/010051 A1 şi WO 2010/078966 A1; documentaţiile cererilor de brevet U.S. nr. US 2011/0027218 A1, US 2015/0126709 A1, US 2011/0111494 A1, US 2015/0110734 A1 şi US 2015/0126710 A1; şi brevetele U.S. nr. 9,359,420, 9,340,599, 8,921,519 şi 8,450,460.
Agonistul 4-1BB poate fi o proteină de fuziune 4-1BB agonistă indicată în Structura I-A (proteină de fuziune a fragmentului de anticorp Fc C-terminal) sau Structura I-B (proteină de fuziune a fragmentului de anticorp Fc N-terminal) sau un fragment, derivat, conjugat, variantă sau biosimilar a acesteia:
în structurile I-A şi I-B, cilindrii se referă la domenii de legare polipeptidice individuale (vezi Figura 140). Structurile I-A şi I-B cuprind trei domenii de legare TNFRSF legate liniar derivate de ex. din 4-1BBL sau un anticorp care leagă 4-1BB, care se pliază pentru a forma o proteină trivalentă, care este apoi legată de o a doua proteină trivalentă prin IgG1-Fc (inclusiv domenii CH3 şi CH2), utilizându-se apoi pentru a lega două dintre proteinele trivalente prin legături disulfurice (ovale mici, alungite), stabilizând structura şi furnizând un agonist capabil să unească domeniile de semnalizare intracelulară ale celor şase receptori şi proteinele de semnalizare, formând un complex de semnalizare. Domeniile de legare TNFRSF indicate sub formă de cilindri pot fi domenii scFv cuprinzând, de ex., un lanţ VH şi un lanţ VL conectate printr-un linker care poate cuprinde reziduuri hidrofile şi secvenţe Gly şi Ser pentru flexibilitate, precum şi Glu şi Lys pentru solubilitate. Se poate folosi orice proiectare a domeniilor scFv, cum ar fi cele descrise în de Marco, Microbial Cell Factories, 2011, 10, 44; Ahmad, et al., Clin. & Dev. Immunol. 2012, 980250; sau Monnier, et al., Antibodies, 2013, 2, 193-208. Structurile proteinelor de fuziune de această formă sunt descrise în brevetele U.S. nr. 9,359,420, 9,340,599, 8,921,519 şi 8,450,460.
Secvenţele aminoacidice pentru celelalte domenii polipeptidice ale structurii I-A sunt indicate în tabelul 6. Domeniul Fc cuprinde de preferinţă un domeniu constant complet (aminoacizii 17-230 din SEQ ID NO:31), domeniul de legătură complet (aminoacizii 1-16 din SEQ ID NO:31) sau o porţiune a domeniului de legătură (de ex., aminoacizii 4-16 din SEQ ID NO:31). Linkerii preferaţi pentru conectarea unui anticorp Fc C-terminal pot fi selectaţi dintre cei indicaţi în SEQ ID NO:32 până la SEQ ID NO:41, inclusiv linkeri adecvaţi pentru fuziunea polipeptidelor suplimentare.
TABEL 6. Secvenţele de aminoacizi pentru proteinele de fuziune TNFRSF, inclusiv proteine de fuziune 4-1BB, cu proiectarea proteinei de fuziune a fragmentului de anticorp Fc C-terminal (structura I-A).
Denumire Secvenţă (simboluri de aminoacizi de o literă) SEQ ID NO:31 60 Domeniu Fc 120 180 230 SEQ ID NO:32 linker GGPGSSKSCD KTHTCPPCPA PE 22 SEQ ID NO:33 linker GGSGSSKSCD KTHTCPPCPA PE 22 SEQ ID NO:34 linker GGPGSSSSSS SKSCDKTHTC PPCPAPE 27 SEQ ID NO:35 linker GGSGSSSSSS SKSCDKTHTC PPCPAPE 27 SEQ ID NO:36 linker GGPGSSSSSS SSSKSCDKTH TCPPCPAPE 29 SEQ ID NO:37 linker GGSGSSSSSS SSSKSCDKTH TCPPCPAPE 29 SEQ ID NO:38 linker GGPGSSGSGS SDKTHTCPPC PAPE 24 SEQ ID NO:39 linker GGPGSSGSGS DKTHTCPPCP APE 23 SEQ ID NO:40 linker GGPSSSGSDK THTCPPCPAP E 21 SEQ ID NO:41 linker GGSSSSSSSS GSDKTHTCPP CPAPE 25
Secvenţele de aminoacizi pentru celelalte domenii polipeptidice ale structurii I-B sunt indicate în tabelul 7. Dacă un fragment de anticorp Fc este fuzionat cu capătul N al unei proteine de fuziune TNRFSF ca în structura I-B, secvenţa modulului Fc este de preferinţă cea indicată în SEQ ID NO:42 şi secvenţele linker sunt de preferinţă selectate dintre cele indicate în SED ID NO:43 până la SEQ ID NO:45.
TABEL 7. Secvenţele de aminoacizi pentru proteine de fuziune TNFRSF, inclusiv proteine de fuziune 4-1BB, cu proiectarea proteinei de fuziune a fragmentului de anticorp Fc N-terminal (structura I-B).
Denumire Secvenţă (simboluri de aminoacizi de o literă) SEQ ID NO:42 60 Domeniu Fc 120 180 240 246 SEQ ID NO:43 linker SGSGSGSGSG S 11 SEQ ID NO:44 linker SSSSSSGSGS GS 12 SEQ ID NO:45 linker SSSSSSGSGS GSGSGS 16
O proteină de fuziune 4-1BB agonistă conform structurilor I-A sau I-B poate cuprinde unul sau mai multe domenii de legare 4-1BB selectate din grupul constând dintr-un lanţ greu variabil şi un lanţ uşor variabil ale utomilumab, un lanţ greu variabil şi un lanţ uşor variabil ale urelumab, un lanţ greu variabil şi un lanţ uşor variabil ale utomilumab, un lanţ greu variabil şi un lanţ uşor variabil selectate dintre lanţurile grele variabile şi lanţurile uşoare variabile descrise în tabelul 8, orice combinaţie a unui lanţ greu variabil şi lanţ uşor variabil dintre cele de mai sus şi fragmente, derivaţi, conjugaţi, variante şi biosimilari ai acestora.
O proteină de fuziune 4-1BB agonistă conform structurilor I-A sau I-B poate cuprinde unul sau mai multe domenii de legare 4-1BB cuprinzând o secvenţă 4-1BBL. O proteină de fuziune 4-1BB agonistă conform structurilor I-A sau I-B poate cuprinde unul sau mai multe domenii de legare 4-1BB cuprinzând o secvenţă conform SEQ ID NO:46. O proteină de fuziune 4-1BB agonistă conform structurilor I-A sau I-B poate cuprinde unul sau mai multe domenii de legare 4-1BB cuprinzând o secvenţă 4-1BBL solubilă. O proteină de fuziune 4-1BB agonistă conform structurilor I-A sau I-B poate cuprinde unul sau mai multe domenii de legare 4-1BB cuprinzând o secvenţă conform SEQ ID NO:47.
O proteină de fuziune 4-1BB agonistă conform structurilor I-A sau I-B poate cuprinde unul sau mai multe domenii de legare 4-1BB reprezentând un domeniu scFv cuprinzând regiuni VH şi VL care sunt cel puţin 95% identice cu secvenţele indicate în SEQ ID NO:13 şi SEQ ID NO:14, unde domeniile VH şi VL sunt conectate printr-un linker. O proteină de fuziune 4-1BB agonistă conform structurilor I-A sau I-B poate cuprinde unul sau mai multe domenii de legare 4-1BB reprezentând un domeniu scFv cuprinzând regiuni VH şi VL care sunt cel puţin 95% identice cu secvenţele indicate în SEQ ID NO:23 şi SEQ ID NO:24, unde domeniile VH şi VL sunt conectate printr-un linker. O proteină de fuziune 4-1BB agonistă conform structurilor I-A sau I-B poate cuprinde unul sau mai multe domenii de legare 4-1BB reprezentând un domeniu scFv cuprinzând regiuni VH şi VL care sunt cel puţin 95% identice cu secvenţele VH şi VL indicate în tabelul 8, unde domeniile VH şi VL sunt conectate printr-un linker.
TABEL 8. Domenii polipeptidice suplimentare utile ca domenii de legare 4-1BB în proteine de fuziune sau ca anticorpi agonişti scFv 4-1BB.
Denumire Secvenţă (simboluri de aminoacizi de o literă) SEQ ID NO:46 60 4-1BBL 120 180 240 254 SEQ ID NO:47 60 Domeniu solubil 4-1BBL 120 168 SEQ ID NO:48 lanţ greu variabil 60 118 pentru 4B4-1-1 versiunea 1 SEQ ID NO:49 lanţ uşor variabil pentru 4B4-1-1 versiunea 1 60 107 SEQ ID NO:50 lanţ greu variabil pentru 4B4-1-1 versiunea 2 60 119 SEQ ID NO:51 lanţ uşor variabil pentru 4B4-1-1 versiunea 2 60 108 SEQ ID NO:52 lanţ greu variabil pentru H39E3-2 60 120 SEQ ID NO:53 lanţ uşor variabil pentru H39E3-2 60 110
Agonistul 4-1BB poate fi o polipeptidă de fuziune monocatenară 4-1BB agonistă cuprinzând (i) un prim domeniu de legare 4-1BB solubil, (ii) un prim linker peptidic, (iii) un al doilea domeniu de legare 4-1BB solubil, (iv) un al doilea linker peptidic şi (v) un al treilea domeniu de legare 4-1BB solubil, cuprinzând de asemenea un domeniu suplimentar N-terminal şi/sau C-terminal şi unde domeniul suplimentar este un domeniu de fragment Fab sau Fc. Agonistul 4-1BB poate fi o polipeptidă de fuziune monocatenară 4-1BB agonistă cuprinzând (i) un prim domeniu de legare 4-1BB solubil, (ii) un prim linker peptidic, (iii) un al doilea domeniu de legare 4-1BB solubil, (iv) un al doilea linker peptidic şi (v) un al treilea domeniu de legare 4-1BB solubil, cuprinzând de asemenea un domeniu suplimentar N-terminal şi/sau C-terminal, unde domeniul suplimentar este un domeniu de fragment Fab sau Fc, unde fiecăruia dintre domeniile 4-1BB solubile îi lipseşte o regiune stalk (care contribuie la trimerizare şi asigură o anumită distanţă de membrana celulară, dar nu face parte din domeniul de legare 4-1BB) şi primul şi al doilea linker peptidic au în mod independent o lungime de 3-8 aminoacizi.
Agonistul 4-1BB poate fi o polipeptidă de fuziune monocatenară 4-1BB agonistă cuprinzând (i) un prim domeniu citokinic al superfamiliei factorului de necroză tumorală (TNF) solubil, (ii) un prim linker peptidic, (iii) un al doilea domeniu citokinic al superfamiliei TNF solubil, (iv) un al doilea linker peptidic şi (v) un al treilea domeniu citokinic al superfamiliei TNF solubil, unde fiecărui domeniu citokinic al superfamiliei TNF solubil îi lipseşte o regiune stalk şi primul şi al doilea linker peptidic au în mod independent o lungime de 3-8 aminoacizi şi unde fiecare domeniu citokinic al superfamiliei TNF este un domeniu de legare 4-1BB.
Agonistul 4-1BB poate fi un anticorp scFv 4-1BB agonist cuprinzând oricare dintre domeniile VH anterioare legate de oricare dintre domeniile VL anterioare.
Agonistul 4-1BB poate fi anticorpul agonist 4-1BB BPS Bioscience nr. catalog 79097-2, disponibil în comerţ de la BPS Bioscience, San Diego, CA, USA. Agonistul 4-1BB poate fi anticorpul agonist 4-1BB Creative Biolabs nr. catalog MOM-18179, disponibil în comerţ de la Creative Biolabs, Shirley, NY, USA.
III. Procese de preparare TIL
Un proces TIL exemplificativ cunoscut ca proces 2A cuprinzând câteva din aceste caracteristici este indicat în Figura 1 şi unele dintre avantajele acestei aplicări a prezentei invenţii faţă de procesul 1C sunt descrise în Figura 2, la fel şi în Figura 84. Procesul 1C este indicat comparativ în Figura 3. Două cronologii alternative pentru terapia TIL pe baza procesului 2A sunt indicate în Figura 4 (număr de celule mai mare) şi Figura 5 (număr de celule mai mic). O aplicare a procesului 2A este indicată în Figura 6, precum şi în Figura 27. Figurile 83 şi 84 indică un proces 2A exemplificativ comparativ cu un proces 1C exemplificativ.
Aşa cum se discută în prezenta, prezenta invenţie poate include o etapă legată de restimularea TIL crioconservate pentru a le creşte activitatea metabolică şi astfel sănătatea relativă înaintea transplantului într-un pacient şi metode de testare a sănătăţii metabolice. Aşa cum se prezintă în general în domeniu, TIL sunt prelevate în general dintr-o probă de la un pacient şi manipulate pentru a le amplifica numărul înaintea transplantului într-un pacient. În unele aplicări, TIL pot fi opţional manipulate genetic, aşa cum se discută mai jos.
În unele aplicări, TIL pot fi crioconservate. După decongelare, pot fi de asemenea restimulate pentru a le creşte metabolismul înaintea perfuziei într-un pacient.
În unele metode de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, prima expansiune (inclusiv procesele denumite preREP, precum şi procese indicate în Figura 27 ca etapa A) este scurtată la 3 - 14 zile şi a doua expansiune (inclusiv procesele denumite REP, precum şi procesele indicate în Figura 27 ca etapa B) este scurtată la 7 - 14 zile, aşa cum se discută detaliat mai jos, precum şi în exemple şi figuri. În unele aplicări, prima expansiune (de exemplu, o expansiune descrisă ca etapa B în Figura 27) este scurtată la 11 zile şi a doua expansiune (de exemplu, o expansiune descrisă în etapa D din Figura 27) este scurtată la 11 zile, aşa cum se discută în exemple şi se reprezintă în Figurile 4, 5 şi 27. În unele aplicări, combinaţia dintre prima expansiune şi a doua expansiune (de exemplu, expansiunile descrise ca etapa B şi etapa D din Figura 27) este scurtată la 22 zile, aşa cum se discută detaliat mai jos şi în exemple şi figuri.
Denumirile "etapelor" A, B, C etc. de mai jos se referă la Figura 27 şi în legătură cu anumite aplicări descrise în prezenta. Ordonarea etapelor de mai jos şi în Figura 27 este exemplificativă şi prezenta cerere şi metodele divulgate în prezenta au în vedere orice combinaţie sau ordine a etapelor, precum şi alte etape, repetare a etapelor şi/sau omisiune a etapelor.
A. ETAPA A: Obţinerea probei tumorale de la pacient
În general, TIL se obţin iniţial dintr-o probă tumorală de la un pacient ("TIL primare"), după care sunt amplificate într-o populaţie mai mare pentru manipulare suplimentară descrisă în prezenta, opţional crioconservate, restimulate, aşa cum se indică în prezenta, şi opţional evaluate cu privire la fenotip şi parametrii metabolici ca o indicaţie a sănătăţii TIL.
O probă tumorală de la un pacient poate fi obţinută folosind metode cunoscute în
domeniu, în general prin rezecţie chirurgicală, biopsie cu ac sau alte mijloace de obţinere a unei probe conţinând un amestec de celule tumorale şi TIL. În general, proba tumorală poate fi din orice tumoare solidă, inclusiv tumori primare, invazive sau metastatice. Proba tumorală poate proveni de asemenea dintr-o tumoare lichidă, cum ar fi o tumoare obţinută dintr-o malignitate hematologică. Tumoarea solidă poate fi orice tip de cancer, inclusiv, dar nelimitativ, mamar, pancreatic, de prostată, colorectal, pulmonar, cerebral, renal, stomacal şi de piele (inclusiv, dar nelimitativ, carcinom cu celule scuamoase, carcinom cu celule bazale şi melanom). În unele aplicări, TIL utile se obţin din tumori maligne de melanom, acestea fiind raportate ca având niveluri deosebit de ridicate de TIL.
Termenul "tumoare solidă" se referă la o masă anormală de ţesut care de obicei nu cuprinde chisturi sau zone lichide. Tumorile solide pot fi benigne sau maligne. Termenul "cancer tumoral solid" se referă la tumori maligne, neoplazice sau canceroase. Cancerele tumorale solide includ, nelimitativ, sarcoame, carcinoame şi limfoame, cum ar fi cancer pulmonar, mamar, cancer mamar triplu negativ, de prostată, colon, rect şi vezică. În unele aplicări, cancerul este selectat dintre cancer de col uterin, cancer la cap şi gât (inclusiv, de exemplu, carcinom cu celule scuamoase la cap şi gât (HNSCC)), glioblastom, cancer ovarian, sarcom, cancer pancreatic, cancer de vezică, cancer mamar, cancer mamar tripl negativ şi carcinom pulmonar macrocelular. Structura tisulară a tumorilor solide include compartimente tisulare interdependente inclusiv parenchim (celule canceroase) şi celulele stromale de suport în care celulele canceroase sunt dispersate şi care pot asigura un micromediu de susţinere.
Termenul "malignitate hematologică" se referă la cancere ale mamiferelor şi tumori ale ţesuturilor hematopoietice şi limfoide, inclusiv, dar nelimitativ, ţesuturi sanguine, din măduva osoasă, ganglioni limfatici şi sistemul limfatic. Malignităţile hematologice sunt denumite şi "tumori lichide". Malignităţile hematologice includ, nelimitativ, leucemie limfoblastică acută (ALL), limfom limfocitar cronic (CLL), limfom limfocitar mic (SLL), leucemie mieloidă acută (AML), leucemie mieloidă cronică (CML), leucemie monocitară acută (AMoL), limfom Hodgkin şi limfoame non-Hodgkin. Termenul "malignitate hematologică B celulară" se referă la malignităţi hematologice care afectează celulele B.
După ce s-a obţinut, proba tumorală este în general fragmentată prin disecţie în bucăţi mici între 1 până la circa 8 mm3, fiind utili în special circa 2-3 mm3. TIL sunt cultivate din aceste fragmente folosind digestii tumorale enzimatice. Aceste digestii tumorale pot fi produse prin incubare în medii enzimatice (de ex., soluţie tampon Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, 2 mM glutamat, 10 mcg/mL gentamicină, 30 unităţi/mL DNaza şi 1.0 mg/mL colagenaza), urmată de disociere mecanică (de ex., folosind un disociator tisular). Digestiile tumorale pot fi produse prin aşezarea tumorii în mediu enzimatic şi disocierea mecanică a tumorii aproximativ 1 minut, urmate de incubare 30 de minute la 37°C în 5% CO2, urmată de cicluri repetate de disociere mecanică şi incubare în condiţiile de mai sus până când sunt prezente numai bucăţi mici de ţesut. La sfârşitul acestui proces, dacă suspensia celulară conţine un număr mare de globule roşii sau celule moarte, se poate efectua o separare în gradient de densitate folosind polizaharidă hidrofilă ramificată FICOLL pentru îndepărtarea acestor celule. Se pot folosi metode alternative cunoscute în domeniu, cum ar fi cele descrise în documentaţia cererii de brevet U.S. nr. 2012/0244133 A1. Se poate utiliza oricare dintre metodele anterioare în oricare dintre metodele descrise în prezenta de expansiune TIL sau metodele de tratare a unui cancer.
În general, suspensia celulară recoltată este denumită "populaţie celulară primară" sau populaţie celulară "proaspăt recoltată".
În unele aplicări, fragmentarea include fragmentare fizică, inclusiv de exemplu dizecţie, precum şi digestie. În unele aplicări, fragmentarea este fragmentare fizică. În unele aplicări, fragmentarea este rin disecţie. În unele aplicări, fragmentarea este prin digestie. În unele aplicări, TIL pot fi cultivate iniţial din digestii tumorale enzimatice şi fragmente tumorale obţinute de la pacienţi. Într-o aplicare, TIL pot fi cultivate iniţial din digestii tumorale enzimatice şi fragmente tumorale obţinute de la pacienţi.
În unele aplicări, unde tumoarea este o tumoare solidă, tumoarea suferă fragmentare
fizică după obţinerea probei tumorale, de exemplu, în etapa A (prevăzută în Figura 27). În unele aplicări, fragmentarea are loc înainte de crioconservare. În unele aplicări, fragmentarea are loc după crioconservare. În unele aplicări, fragmentarea are loc după obţinerea tumorii şi în absenţa crioconservării. În unele aplicări, tumoarea este fragmentată şi 10, 20, 30, 40 sau mai multe fragmente sau bucăţi se introduc în fiecare recipient pentru prima expansiune. În unele aplicări, tumoarea este fragmentată şi 30 sau 40 fragmente sau bucăţi se introduc în fiecare recipient pentru prima expansiune. În unele aplicări, tumoarea este fragmentată şi 40 fragmente sau bucăţi se introduc în fiecare recipient pentru prima expansiune. În unele aplicări, fragmentele multiple cuprind circa 4 până la circa 50 fragmente, unde fiecare fragment are un volum de circa 27 mm3. În unele aplicări, fragmentele multiple cuprind circa 30 până la circa 60 fragmente cu un volum total de circa 1300 mm3 până la circa 1500 mm3. În unele aplicări, fragmentele multiple cuprind circa 50 fragmente cu un volum total de circa 1350 mm3. În unele aplicări, fragmentele multiple cuprind circa 50 fragmente cu o masă totală de circa 1 gram până la circa 1.5 grame. În unele aplicări, fragmentele multiple cuprind circa 4 fragmente.
În unele aplicări, TIL se obţin din fragmente tumorale. În unele aplicări, fragmentul tumoral se obţine prin disecţie. În unele aplicări, fragmentul tumoral are între circa 1 mm3 şi 10 mm3. În unele aplicări, fragmentul tumoral are între circa 1 mm3 şi 8 mm3. În unele aplicări, fragmentul tumoral este de circa 1 mm3. În unele aplicări, fragmentul tumoral este de circa 2 mm3. În unele aplicări, fragmentul tumoral este de circa 3 mm3. În unele aplicări, fragmentul tumoral este de circa 4 mm3. În unele aplicări, fragmentul tumoral este de circa 5 mm3. În unele aplicări, fragmentul tumoral este de circa 6 mm3. În unele aplicări, fragmentul tumoral este de circa 7 mm3. În unele aplicări, fragmentul tumoral este de circa 8 mm3. În unele aplicări, fragmentul tumoral este de circa 9 mm3. În unele aplicări, fragmentul tumoral este de circa 10 mm3. În unele aplicări, tumorile au dimensiunile 1-4 mm × 1-4 mm × 1-4 mm. În unele aplicări, tumorile au dimensiunile 1 mm × 1 mm × 1 mm. În unele aplicări, tumorile au dimensiunile 2 mm × 2 mm × 2 mm. În unele aplicări, tumorile au dimensiunile 3 mm × 3 mm × 3 mm. În unele aplicări, tumorile au dimensiunile 4 mm × 4 mm × 4 mm.
În unele aplicări, tumorile sunt rezecate pentru a minimiza cantitatea de ţesut hemoragic, necrotic şi/sau adipos. În unele aplicări, tumorile sunt rezecate pentru a minimiza cantitatea de ţesut hemoragic. În unele aplicări, tumorile sunt rezecate pentru a minimiza cantitatea de ţesut necrotic. În unele aplicări, tumorile sunt rezecate pentru a minimiza cantitatea de ţesut adipos.
În unele aplicări, fragmentarea tumorii se efectuează pentru a menţine structura internă tumorală. În unele aplicări, fragmentarea tumorii se efectuează fără realizarea unei mişcări de tăiere cu un bisturiu. În unele aplicări, TIL se obţin din digestii tumorale. În unele aplicări, digestiile tumorale s-au generat prin incubare în mediu enzimatic, de exemplu, nelimitativ, RPMI 1640, 2 mM GlutaMAX, 10 mg/mL gentamicină, 30 U/mL DNaza şi 1.0 mg/mL colagenază, urmată de disociere mecanică (GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA). După aşezarea tumorii în mediu enzimatic, tumoarea poate fi disociată mecanic aproximativ 1 minut. Soluţia poate fi apoi incubată 30 minute la 37°C în 5% CO2, după care este fragmentată din nou mecanic aproximativ 1 minut. După reincubatere 30 minute la 37°C în 5% CO2, tumoarea poate fi disociată mecanic o a treia oară aproximativ 1 minut. În unele aplicări, după a treia disociere mecanică, dacă sunt prezente bucăţi mari de ţesut, se aplică 1 sau 2 disocieri mecanice suplimentare în probă, cu sau fără alte 30 minute de incubare la 37°C în 5% CO2. În unele aplicări, la sfârşitul incubării finale, dacă suspensia celulară conţine un număr mare de globule roşii sau celule moarte, se poate efectua o separare în gradient de densitate folosind Ficoll pentru a îndepărta aceste celule.
În unele aplicări, suspensia celulară recoltată înainte de prima etapă de expansiune este denumită "populaţie celulară primară" sau populaţie celulară "proaspăt recoltată".
În unele aplicări, celulele pot fi opţional congelate după recoltarea probelor şi depozitate înainte de folosire în expansiunea descrisă în etapa B, care este descrisă detaliat mai jos şi exemplificată în Figura 27.
B. ETAPA B: Prima expansiune
1. TIL tinere
În unele aplicări, metodele din prezenta prevăd obţinerea TIL tinere, capabile de cicluri de replicare mărite la administrarea la un subiect/pacient şi astfel pot asigura beneficii terapeutice suplimentare faţă de TIL mai bătrâne (i.e., TIL care au suferit mai multe runde de replicare înainte de administrare la un subiect/pacient). Caracteristicile TIL tinere au fost descrise în literatură, de exemplu, Donia, et al., Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167 (2012); Dudley et al., Clin Cancer Res, 16:6122-6131 (2010); Huang et al., J Immunother, 28(3):258-267 (2005); Besser et al., Clin Cancer Res, 19(17):OF1-OF9 (2013); Besser et al., J Immunother 32:415-423 (2009); Robbins, et al., J 2004; 173:7125-7130; Shen et al., J Immunother, 30:123-129 (2007); Zhou, et al., J Immunother, 28:53-62 (2005); şi Tran, et al., J Immunother, 31:742-751 (2008).
Diverşii receptori antigenici ai limfocitelor T şi B se produc prin recombinare somatică a unui număr limitat, dar mare, de segmente genice. Aceste segmente genice: V (variabil), D (diversitate), J (juxtapunere), şi C (constant) determină specificitatea de legare şi aplicările în aval ale imunoglobulinelor şi receptorilor T celulari (TCR). Prezenta invenţie prevede o metodă de generare TIL care prezintă şi cresc diversitatea repertoriului celulelor T. În unele aplicări, TIL obţinute prin metoda din prezenta prezintă o creştere a diversităţii repertoriului celulelor T. În unele aplicări, TIL obţinute prin metoda din prezenta prezintă o creştere a diversităţii repertoriului celulelor T faţă de TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, TIL obţinute prin metoda din prezenta prezintă o creştere a diversităţii repertoriului celulelor T faţă de TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind metode denumite procesul 1C, exemplificat în Figura 83. În unele aplicări, TIL obţinute în prima expansiune prezintă o creştere a diversităţii repertoriului celulelor T. În unele aplicări, creşterea diversităţii este o creştere a diversităţii imunoglobulinelor şi/sau a diversităţii receptorilor T celulari. În unele aplicări, diversitatea imunoglobulinică este în lanţul greu al imunoglobulinei. În unele aplicări, diversitatea imunoglobulinică este în lanţul uşor al imunoglobulinei. În unele aplicări, diversitatea este în receptorul T celular. În unele aplicări, diversitatea este în unul dintre receptorii T celulari selectaţi din grupul constând din receptori alpha, beta, gamma şi delta. În unele aplicări, există o creştere a expresiei receptorului T celular (TCR) alpha şi/sau beta. În unele aplicări, există o creştere a expresiei receptorului T celular (TCR) alpha. În unele aplicări, există o creştere a expresiei receptorului T celular (TCR) beta. În unele aplicări, există o creştere a expresiei TCRab (i.e., TCRα/β).
După disecţia sau digestia fragmentelor tumorale, de exemplu aşa cum se descrie în etapa A din Figura 27, celulele rezultate sunt cultivate în ser conţinând IL-2 în condiţii care favorizează creşterea TIL faţă de celule tumorale şi de alt tip. În unele aplicări, digestiile tumorale sunt incubate în godeuri de 2 mL în mediu cuprinzând ser AB uman inactivat cu 6000 IU/mL IL-2. Această populaţie celulară primară este cultivată o perioadă de zile, în general de la 3 la 14 zile, producând o populaţie TIL în masă, în general circa 1 × 108 celule TIL în masă. În unele aplicări, această populaţie celulară primară este cultivată o perioadă de 7 până la 14 zile, producând o populaţie TIL în masă, în general circa 1 × 108 celule TIL în masă. În unele aplicări, această populaţie celulară primară este cultivată o perioadă de 10 până la 14 zile, producând o populaţie TIL în masă, în general circa 1 × 108 celule TIL în masă. În unele aplicări, această populaţie celulară primară este cultivată o perioadă de circa 11 zile, producând o populaţie TIL în masă, în general circa 1 × 108 celule TIL în masă.
Într-o aplicare preferată, expansiunea TIL se poate efectua folosind o etapă iniţială de expansiune TIL în masă (de exemplu aşa cum se descrie în etapa B din Figura 27, care poate include procese denumite pre-REP) descrisă mai jos şi în prezenta, urmată de o a doua expansiune (Etapa D, incluzând procese denumite etape ale protocolului de expansiune rapidă (REP)) descrisă mai jos la Etapa D şi în prezenta, urmată de crioconservare opţională şi urmată de o a doua Etapă D (incluzând procese denumite etape REP de restimulare) descrisă mai jos şi în prezenta. TIL obţinute din acest proces pot fi opţional caracterizate cu privire la caracteristicile fenotipice şi parametrii metabolici descrişi în prezenta.
În aplicări în care culturile TIL sunt iniţiate în plăci cu 24 de godeuri, de exemplu, folosind placa de cultură celulară Costar, cu 24 de godeuri, cu fund plat (Corning Incorporated, Corning, NY), fiecare godeu poate fi însămânţat cu 1 × 106 celule tumorale digerate sau un fragment tumoral în 2 mL de mediu complet (CM) cu IL-2 (6000 IU/mL; Chiron Corp., Emeryville, CA). În unele aplicări, fragmentul tumoral are între circa 1 mm3 şi 10 mm3.
În unele aplicări, mediul de cultură al primei expansiuni este denumit "CM", o abreviere
pentru mediu de cultură. În unele aplicări, CM pentru Etapa B constă din RPMI 1640 cu GlutaMAX, suplimentat cu 10% ser AB uman, 25 mM Hepes şi 10 mg/mL gentamicină. În aplicări în care culturile sunt iniţiate în baloane permeabile la gaz cu o capacitate de 40 mL şi un fund de siliciu permeabil la gaz de 10 cm2 (de exemplu, G-Rex10; Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN) (Fig. 1), s-au introdus în fiecare balon 10-40 × 106 celule tumorale digerate viabile sau 5-30 fragmente tumorale în 10-40 mL de CM cu IL-2. Atât G-Rex10, cât şi plăcile cu 24 de godeuri s-au incubat într-un incubator umidificat la 37°C în 5% CO2 şi, la 5 zile după iniţierea culturii, jumătate din mediu s-a îndepărtat şi s-a înlocuit cu CM şi IL-2 proaspăt şi, după ziua 5, jumătate din mediu s-a schimbat la fiecare 2-3 zile.
După prepararea fragmentelor tumorale, celulele rezultate (i.e., fragmente) sunt cultivate în ser conţinând IL-2 în condiţii care favorizează creşterea TIL faţă de celule tumorale şi de alt tip. În unele aplicări, digestiile tumorale sunt incubate în godeuri de 2 mL în mediu cuprinzând ser AB uman inactivat (sau, în unele cazuri, aşa cum se indică în prezenta, în prezenţa unei populaţii celulare aAPC) cu 6000 IU/mL de IL-2. Această populaţie celulară primară este cultivată o perioadă de zile, în general de la 10 la 14 zile, producând o populaţie TIL în masă, în general circa 1×108 celule TIL în masă. În unele aplicări, mediul de creştere în prima expansiune cuprinde IL-2 sau o variantă a acesteia. În unele aplicări, IL este IL-2 umană recombinantă (rhIL-2). În unele aplicări soluţia de bază IL-2 are o activitate specifică de 20-30×106 IU/mg pentru o fiolă de 1 mg. În unele aplicări soluţia de bază IL-2 are o activitate specifică de 20×106 IU/mg pentru o fiolă de 1 mg. În unele aplicări soluţia de bază IL-2 are o activitate specifică de 25×106 IU/mg pentru o fiolă de 1 mg. În unele aplicări soluţia de bază IL-2 are o activitate specifică de 30×106 IU/mg pentru o fiolă de 1 mg. În unele aplicări, soluţia de bază IL-2 are o concentraţie finală de 4-8×106 IU/mg de IL-2. În unele aplicări, soluţia de bază IL-2 are o concentraţie finală de 5-7×106 IU/mg de IL-2. În unele aplicări, soluţia de bază IL-2 are o concentraţie finală de 6×106 IU/mg de IL-2. În unele aplicări, soluţia de bază IL-2 se prepară aşa cum se descrie în exemplul 4. În unele aplicări, mediul de cultură al primei expansiuni cuprinde circa 10.000 IU/mL de IL-2, circa 9.000 IU/mL de IL-2, circa 8.000 IU/mL de IL-2, circa 7.000 IU/mL de IL-2, circa 6000 IU/mL de IL-2 sau circa 5.000 IU/mL de IL-2. În unele aplicări, mediul de cultură al primei expansiuni cuprinde circa 9.000 IU/mL de IL-2 până la circa 5.000 IU/mL de IL-2. În unele aplicări, mediul de cultură al primei expansiuni cuprinde circa 8.000 IU/mL de IL-2 până la circa 6.000 IU/mL de IL-2. În unele aplicări, mediul de cultură al primei expansiuni cuprinde circa 7.000 IU/mL de IL-2 până la circa 6.000 IU/mL de IL-2. În unele aplicări, mediul de cultură al primei expansiuni cuprinde circa 6.000 IU/mL de IL-2. Într-o aplicare, mediul de cultură celulară mai cuprinde IL-2. În unele aplicări, mediul de cultură celulară cuprinde circa 3000 IU/mL de IL-2. Într-o aplicare, mediul de cultură celulară mai cuprinde IL-2. Într-o aplicare preferată, mediul de cultură celulară cuprinde circa 3000 IU/mL de IL-2. Într-o aplicare, mediul de cultură celulară cuprinde circa 1000 IU/mL, circa 1500 IU/mL, circa 2000 IU/mL, circa 2500 IU/mL, circa 3000 IU/mL, circa 3500 IU/mL, circa 4000 IU/mL, circa 4500 IU/mL, circa 5000 IU/mL, circa 5500 IU/mL, circa 6000 IU/mL, circa 6500 IU/mL, circa 7000 IU/mL, circa 7500 IU/mL sau circa 8000 IU/mL de IL-2. Într-o aplicare, mediul de cultură celulară cuprinde între 1000 şi 2000 IU/mL, între 2000 şi 3000 IU/mL, între 3000 şi 4000 IU/mL, între 4000 şi 5000 IU/mL, între 5000 şi 6000 IU/mL, între 6000 şi 7000 IU/mL, între 7000 şi 8000 IU/mL sau circa 8000 IU/mL de IL-2.
În unele aplicări, mediul de cultură al primei expansiuni cuprinde circa 500 IU/mL IL-15, circa 400 IU/mL IL-15, circa 300 IU/mL IL-15, circa 200 IU/mL IL-15, circa 180 IU/mL IL-15, circa 160 IU/mL IL-15, circa 140 IU/mL IL-15, circa 120 IU/mL IL-15 sau circa 100 IU/mL IL-15. În unele aplicări, mediul de cultură al primei expansiuni cuprinde circa 500 IU/mL IL-15 până la circa 100 IU/mL IL-15. În unele aplicări, mediul de cultură al primei expansiuni cuprinde circa 400 IU/mL IL-15 până la circa 100 IU/mL IL-15. În unele aplicări, mediul de cultură al primei expansiuni cuprinde circa 300 IU/mL IL-15 până la circa 100 IU/mL IL-15. În unele aplicări, mediul de cultură al primei expansiuni cuprinde circa 200 IU/mL IL-15. În unele aplicări, mediul de cultură celulară cuprinde circa 180 IU/mL IL-15. Într-o aplicare, mediul de cultură celulară mai cuprinde IL-15. Într-o aplicare preferată, mediul de cultură celulară cuprinde circa 180 IU/mL IL-15.
În unele aplicări, mediul de cultură al primei expansiuni cuprinde circa 20 IU/mL de IL-21, circa 15 IU/mL de IL-21, circa 12 IU/mL de IL-21, circa 10 IU/mL de IL-21, circa 5 IU/mL de IL-21, circa 4 IU/mL de IL-21, circa 3 IU/mL de IL-21, circa 2 IU/mL de IL-21, circa 1 IU/mL de IL-21 sau circa 0.5 IU/mL de IL-21. În unele aplicări, mediul de cultură al primei expansiuni cuprinde circa 20 IU/mL de IL-21 până la circa 0.5 IU/mL de IL-21. În unele aplicări, mediul de cultură al primei expansiuni cuprinde circa 15 IU/mL de IL-21 până la circa 0.5 IU/mL de IL-21. În unele aplicări, mediul de cultură al primei expansiuni cuprinde circa 12 IU/mL de IL-21 până la circa 0.5 IU/mL de IL-21. În unele aplicări, mediul de cultură al primei expansiuni cuprinde circa 10 IU/mL de IL-21 până la circa 0.5 IU/mL de IL-21. În unele aplicări, mediul de cultură al primei expansiuni cuprinde circa 5 IU/mL de IL-21 până la circa 1 IU/mL de IL-21. În unele aplicări, mediul de cultură al primei expansiuni cuprinde circa 2 IU/mL de IL-21. În unele aplicări, mediul de cultură celulară cuprinde circa 1 IU/mL de IL-21. În unele aplicări, mediul de cultură celulară cuprinde circa 0.5 IU/mL de IL-21. Într-o aplicare, mediul de cultură celulară mai cuprinde IL-21. Într-o aplicare preferată, mediul de cultură celulară cuprinde circa 1 IU/mL de IL-21.
Într-o aplicare, mediul de cultură celulară cuprinde anticorp OKT-3. În unele aplicări, mediul de cultură celulară cuprinde aproximativ 30 ng/mL de anticorp OKT-3. Într-o aplicare, mediul de cultură celulară cuprinde aproximativ 0.1 ng/mL, aproximativ 0.5 ng/mL, aproximativ 1 ng/mL, aproximativ 2.5 ng/mL, aproximativ 5 ng/mL, aproximativ 7.5 ng/mL, aproximativ 10 ng/mL, aproximativ 15 ng/mL, aproximativ 20 ng/mL, aproximativ 25 ng/mL, aproximativ 30 ng/mL, aproximativ 35 ng/mL, aproximativ 40 ng/mL, aproximativ 50 ng/mL, aproximativ 60 ng/mL, aproximativ 70 ng/mL, aproximativ 80 ng/mL, aproximativ 90 ng/mL, aproximativ 100 ng/mL, aproximativ 200 ng/mL, aproximativ 500 ng/mL şi aproximativ 1 µg/mL de anticorp OKT-3. Într-o aplicare, mediul de cultură celulară cuprinde între 0.1 ng/mL şi 1 ng/mL, între 1 ng/mL şi 5 ng/mL, între 5 ng/mL şi 10 ng/mL, între 10 ng/mL şi 20 ng/mL, între 20 ng/mL şi 30 ng/mL, între 30 ng/mL şi 40 ng/mL, între 40 ng/mL şi 50 ng/mL şi între 50 ng/mL şi 100 ng/mL de anticorp OKT-3. În unele aplicări, mediul de cultură celulară nu cuprinde anticorp OKT-3.
În unele aplicări, mediul de cultură celulară cuprinde unul sau mai mulţi agonişti TNFRSF într-un mediu de cultură celulară. În unele aplicări, agonistul TNFRSF cuprinde un agonist 4-1BB. În unele aplicări, agonistul TNFRSF este un agonist 4-1BB şi agonistul 4-1BB este selectat din grupul constând din urelumab, utomilumab, EU-101, o proteină de fuziune şi fragmente, derivaţi, variante, biosimilare şi combinaţii ale acestora. În unele aplicări, agonistul TNFRSF se adaugă la o concentraţie suficientă pentru a obţine o concentraţie în mediul de cultură celulară între 0.1 µg/mL şi 100 µg/mL. În unele aplicări, agonistul TNFRSF se adaugă la o concentraţie suficientă pentru a obţine o concentraţie în mediul de cultură celulară între 20 µg/mL şi 40 µg/mL. \tabÎn unele aplicări, pe lângă unul sau mai mulţi agonişti TNFRSF, mediul de cultură celulară mai cuprinde IL-2 la o concentraţie iniţială de aproximativ 3000 IU/mL şi anticorp OKT-3 la o concentraţie iniţială de aproximativ 30 ng/mL şi unde unul sau mai mulţi agonişti TNFRSF cuprind un agonist 4-1BB. În unele aplicări, mediul de cultură al primei expansiuni este denumit "CM", o abreviere pentru mediu de cultură. În unele aplicări, este denumit CM1 (mediu de cultură 1). În unele aplicări, CM constă din RPMI 1640 cu GlutaMAX, suplimentat cu 10% ser AB uman, 25 mM Hepes şi 10 mg/mL gentamicină. În aplicări în care culturile sunt iniţiate în baloane permeabile la gaz cu o capacitate de 40 mL şi un fund de siliciu permeabil la gaz de 10cm2 (de exemplu, G-Rex10; Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN) (Fig. 1), se introduc în fiecare balon 10-40x 106 celule tumorale digerate viabile sau 5-30 fragmente tumorale în 10-40mL de CM cu IL-2. Atât G-Rex10, cât şi plăcile cu 24 de godeuri s-au incubat într-un incubator umidificat la 37°C în 5% CO2 şi, la 5 zile după iniţierea culturii, jumătate din mediu s-a îndepărtat şi s-a înlocuit cu CM şi IL-2 proaspăt şi, după ziua 5, jumătate din mediu s-a schimbat la fiecare 2-3 zile. În unele aplicări, CM este CM1 descris în exemple, vezi Exemplul 5. În unele aplicări, prima expansiune are loc într-un mediu de cultură celulară iniţial sau un prim mediu de cultură celulară. În unele aplicări, mediul de cultură celulară iniţial sau primul mediu de cultură celulară cuprinde IL-2. În unele aplicări, prima expansiune (incluzând procese precum cele descrise de exemplu în etapa B din Figura 27, care le pot include pe cele denumite uneori pre-REP) poate fi scurtată la 3-14 zile, aşa cum se discută în exemple şi figuri. În unele aplicări, prima expansiune (incluzând procese precum cele descrise de exemplu în etapa B din Figura 27, care le pot include pe cele denumite uneori pre-REP) poate fi scurtată la 7 - 14 zile, aşa cum se discută în exemple şi se reprezintă în Figurile 4 şi 5, incluzând de asemenea, de exemplu, o expansiune descrisă în etapa B din Figura 27. În unele aplicări, prima expansiune din Etapa B poate fi scurtată la 10-14 zile, aşa cum se discută în exemple şi se reprezintă în Figurile 4 şi 5. În unele aplicări, prima expansiune este scurtată la 11 zile, aşa cum se discută în exemple şi se reprezintă în Figurile 4 şi 5, incluzând de asemenea, de exemplu, o expansiune descrisă în etapa B din Figura 27. În unele aplicări, prima expansiune TIL se poate efectua timp de 3 zile, 4 zile, 5 zile, 6 zile, 7 zile, 8 zile, 9 zile, 10 zile, 11 zile, 12 zile, 13 zile sau 14 zile. În unele aplicări, prima expansiune TIL se poate efectua timp de 3 zile până la 14 zile. În unele aplicări, prima expansiune TIL se poate efectua timp de 4 zile până la 14 zile. În unele aplicări, prima expansiune TIL se poate efectua timp de 5 zile până la 14 zile. În unele aplicări, prima expansiune TIL se poate efectua timp de 6 zile până la 14 zile. În unele aplicări, prima expansiune TIL se poate efectua timp de 7 zile până la 14 zile. În unele aplicări, prima expansiune TIL se poate efectua timp de 8 zile până la 14 zile. În unele aplicări, prima expansiune TIL se poate efectua timp de 9 zile până la 14 zile. În unele aplicări, prima expansiune TIL se poate efectua timp de 10 zile până la 14 zile. În unele aplicări, prima expansiune TIL se poate efectua timp de 11 zile până la 14 zile. În unele aplicări, prima expansiune TIL se poate efectua timp de 12 zile până la 14 zile. În unele aplicări, prima expansiune TIL se poate efectua timp de 13 zile până la 14 zile. În unele aplicări, prima expansiune TIL se poate efectua timp de 14 zile. În unele aplicări, prima expansiune TIL se poate efectua timp de 3 zile până la 11 zile. În unele aplicări, prima expansiune TIL se poate efectua timp de 4 zile până la 11 zile. În unele aplicări, prima expansiune TIL se poate efectua timp de 5 zile până la 11 zile. În unele aplicări, prima expansiune TIL se poate efectua timp de 6 zile până la 11 zile. În unele aplicări, prima expansiune TIL se poate efectua timp de 7 zile până la 11 zile. În unele aplicări, prima expansiune TIL se poate efectua timp de 8 zile până la 11 zile. În unele aplicări, prima expansiune TIL se poate efectua timp de 9 zile până la 11 zile. În unele aplicări, prima expansiune TIL se poate efectua timp de 10 zile până la 11 zile. În unele aplicări, prima expansiune TIL se poate efectua timp de 11 zile. În unele aplicări, se utilizează o combinaţie de IL-2, IL-7, IL-15 şi/sau IL-21 ca o combinaţie în prima expansiune. În unele aplicări, IL-2, IL-7, IL-15 şi/sau IL-21, precum şi orice combinaţii ale acestora pot fi incluse în prima expansiune, inclusiv de exemplu în procesele unei Etape B conform Figurii 27, descrise în prezenta. În unele aplicări, se utilizează o combinaţie de IL-2, IL-15 şi IL-21 ca o combinaţie în prima expansiune. În unele aplicări, IL-2, IL-15 şi IL-21, precum şi orice combinaţii ale acestora pot fi incluse în procesele Etapei B din Figura 27 şi descrise în prezenta. În unele aplicări, prima expansiune (incluzând procese denumite pre-REP; de exemplu, Etapa B din Figura 27) poate fi scurtată la 3 - 14 zile, aşa cum se discută în exemple şi figuri. În unele aplicări, prima expansiune din Etapa B poate fi scurtată la 7 - 14 zile, aşa cum se discută în exemple şi se reprezintă în Figurile 4 şi 5. În unele aplicări, prima expansiune din Etapa B poate fi scurtată la 10 - 14 zile, aşa cum se discută în exemple şi se reprezintă în Figurile 4, 5 şi 27. În unele aplicări, prima expansiune este scurtată la 11 zile, aşa cum se discută în exemple şi se reprezintă în Figurile 4, 5, şi 27. În unele aplicări, prima expansiune, de exemplu, Etapa B din Figura 27, se efectuează într-un bioreactor în sistem închis. În unele aplicări, se utilizează un sistem închis pentru expansiunea TIL, aşa cum se descrie în prezenta. În unele aplicări, se utilizează un singur bioreactor. În unele aplicări, bioreactorul unic folosit este de exemplu G-REX -10 sau G-REX -100. În unele aplicări, bioreactorul în sistem închis este un singur bioreactor.
C. ETAPA C: Tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune
În unele cazuri, populaţia TIL în masă obţinută din prima expansiune, inclusiv de exemplu populaţia TIL obţinută de exemplu din Etapa B, aşa cum se indică în Figura 27, poate fi crioconservată imediat, folosind protocoalele discutate în prezenta mai jos. Alternativ, populaţia TIL obţinută din prima expansiune, denumită a doua populaţie TIL, poate fi supusă unei a doua expansiuni (care poate include expansiuni denumite uneori REP) şi apoi crioconservată aşa cum se discută mai jos. În mod similar, în cazul în care se vor folosi TIL modificate genetic în terapie, prima populaţie TIL (denumită uneori populaţia TIL în masă) sau a doua populaţie TIL (care poate include în unele aplicări populaţii denumite populaţii REP TIL) poate fi supusă modificărilor genetice pentru tratamente adecvate înainte de expansiune sau după prima expansiune şi înainte de a doua expansiune.
În unele aplicări, TIL obţinute din prima expansiune (de exemplu, din etapa B aşa cum se indică în Figura 27) sunt depozitate până la obţinerea fenotipului pentru selecţie. În unele aplicări, TIL obţinute din prima expansiune (de exemplu, din etapa B aşa cum se indică în Figura 27) nu sunt depozitate şi sunt utilizate direct în a doua expansiune. În unele aplicări, TIL obţinute din prima expansiune nu sunt crioconservate după prima expansiune şi înainte de a doua expansiune. În unele aplicări, tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune are loc la circa 3 zile, 4, zile, 5 zile, 6 zile, 7 zile, 8 zile, 9 zile, 10 zile, 11 zile, 12 zile, 13 zile sau 14 zile de la fragmentare. În unele aplicări, tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune are loc la circa 3 zile până la 14 zile de la fragmentare. În unele aplicări, tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune are loc la circa 4 zile până la 14 zile de la fragmentare. În unele aplicări, tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune are loc la circa 4 zile până la 10 zile de la fragmentare. În unele aplicări, tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune are loc la circa 7 zile până la 14 zile de la fragmentare. În unele aplicări, tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune are loc la circa 14 zile de la fragmentare.
În unele aplicări, tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune are loc la 1 zi, 2 zile, 3 zile, 4 zile, 5 zile, 6 zile, 7 zile, 8 zile, 9 zile, 10 zile, 11 zile, 12 zile, 13 zile sau 14 zile de la fragmentare. În unele aplicări, tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune are loc 1 zi până la 14 zile de la fragmentare. În unele aplicări, prima expansiune TIL se poate efectua timp de 2 zile până la 14 zile. În unele aplicări, tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune are loc la 3 zile până la 14 zile de la fragmentare. În unele aplicări, tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune are loc la 4 zile până la 14 zile de la fragmentare. În unele aplicări, tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune are loc la 5 zile până la 14 zile de la fragmentare. În unele aplicări, tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune are loc la 6 zile până la 14 zile de la fragmentare. În unele aplicări, tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune are loc la 7 zile până la 14 zile de la fragmentare. În unele aplicări, tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune are loc la 8 zile până la 14 zile de la fragmentare. În unele aplicări, tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune are loc la 9 zile până la 14 zile de la fragmentare. În unele aplicări, tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune are loc la 10 zile până la 14 zile de la fragmentare. În unele aplicări, tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune are loc la 11 zile până la 14 zile de la fragmentare. În unele aplicări, tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune are loc la 12 zile până la 14 zile de la fragmentare. În unele aplicări, tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune are loc la 13 zile până la 14 zile de la fragmentare. În unele aplicări, tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune are loc la 14 zile de la fragmentare. În unele aplicări, tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune are loc la 1 zi până la 11 zile de la fragmentare. În unele aplicări, tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune are loc la 2 zile până la 11 zile de la fragmentare. În unele aplicări, tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune are loc la 3 zile până la 11 zile de la fragmentare. În unele aplicări, tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune are loc la 4 zile până la 11 zile de la fragmentare. În unele aplicări, tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune are loc la 5 zile până la 11 zile de la fragmentare. În unele aplicări, tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune are loc la 6 zile până la 11 zile de la fragmentare. În unele aplicări, tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune are loc la 7 zile până la 11 zile de la fragmentare. În unele aplicări, tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune are loc la 8 zile până la 11 zile de la fragmentare. În unele aplicări, tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune are loc la 9 zile până la 11 zile de la fragmentare. În unele aplicări, tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune are loc la 10 zile până la 11 zile de la fragmentare. În unele aplicări, tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune are loc la 11 zile de la fragmentare.
În unele aplicări, TIL nu sunt depozitate după prima expansiune şi înainte de a doua expansiune şi TIL sunt utilizate direct în a doua expansiune (de exemplu, în unele aplicări, nu există depozitare în timpul tranziţiei de la etapa B la etapa D aşa cum se indică în Figura 27). În unele aplicări, tranziţia are loc în sistem închis, descris în prezenta. În unele aplicări, TIL din prima expansiune, a doua populaţie de TIL, se utilizează direct în a doua expansiune fără perioadă de tranziţie.
În unele aplicări, tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune, de exemplu, Etapa C din Figura 27, se efectuează într-un bioreactor în sistem închis. În unele aplicări, se utilizează un sistem închis pentru expansiunea TIL, aşa cum se descrie în prezenta. În unele aplicări, se utilizează un singur bioreactor. În unele aplicări, bioreactorul unic folosit este de exemplu G-REX -10 sau G-REX -100. În unele aplicări, bioreactorul în sistem închis este un singur bioreactor.
D. ETAPA D: A doua expansiune
În unele aplicări, populaţia celulară TIL este amplificată în număr după recoltare şi procesarea iniţială în masă, de exemplu, după Etapa A şi Etapa B, şi tranziţia indicată ca etapa C, aşa cum se indică în Figura 27). Această expansiune suplimentară este denumită în prezenta a doua expansiune, care poate include procese de expansiune denumite în general în domeniu proces de expansiune rapidă (REP; precum şi procese indicate în etapa D din Figura 27). A doua expansiune se realizează în general folosind un mediu de cultură cuprinzând mai multe componente, inclusiv celule feeder, o sursă de citokine şi un anticorp anti-CD3, într-un recipient permeabil la gaz.
În unele aplicări, a doua expansiune sau a doua expansiune TIL (care poate include expansiuni denumite uneori REP; precum şi procese indicate în etapa D din Figura 27) se poate efectua folosind orice baloane sau recipiente TIL cunoscute în domeniu. În unele aplicări, a doua expansiune TIL se poate efectua timp de 7 zile, 8 zile, 9 zile, 10 zile, 11 zile, 12 zile, 13 zile sau 14 zile. În unele aplicări, A doua expansiune TIL se poate efectua timp de circa 7 zile până la circa 14 zile. În unele aplicări, A doua expansiune TIL se poate efectua timp de circa 8 zile până la circa 14 zile. În unele aplicări, A doua expansiune TIL se poate efectua timp de circa 9 zile până la circa 14 zile. În unele aplicări, A doua expansiune TIL se poate efectua timp de circa 10 zile până la circa 14 zile. În unele aplicări, A doua expansiune TIL se poate efectua timp de circa 11 zile până la circa 14 zile. În unele aplicări, A doua expansiune TIL se poate efectua timp de circa 12 zile până la circa 14 zile. În unele aplicări, A doua expansiune TIL se poate efectua timp de circa 13 zile până la circa 14 zile. În unele aplicări, A doua expansiune TIL se poate efectua timp de circa 14 zile.
Într-o aplicare, a doua expansiune se poate efectua într-un recipient permeabil la gaz folosind metode din prezenta invenţie (inclusiv de exemplu expansiuni denumite REP; precum şi procese indicate în etapa D din Figura 27). De exemplu, TIL pot fi amplificate rapid folosind stimulare nespecifică a receptorului T celular în prezenţa interleukinei-2 (IL-2) sau interleukinei-15 (IL-15). Stimulul nespecific al receptorului T celular poate include, de exemplu, un anticorp anti-CD3, cum ar fi circa 30 ng/ml de OKT3, un anticorp anti-CD3 monoclonal murin (disponibil în comerţ de la Ortho-McNeil, Raritan, NJ sau Miltenyi Biotech, Auburn, CA) sau UHCT-1 (disponibil în comerţ de la BioLegend, San Diego, CA, USA). TIL pot fi amplificate pentru a induce stimulare suplimentară a TIL in vitro incluzând unul sau mai multe antigene în a doua expansiune, inclusiv porţiuni antigenice ale acestora, cum ar fi epitop(i), de cancer, care pot fi opţional exprimate dintr-un vector, cum ar fi o peptidă de legare a antigenului leucocitar uman A2 (HLA-A2), de ex., 0.3 µM MART-1 :26-35 (27 L) sau gpl 00:209-217 (210M), opţional în prezenţa unui factor de creştere a celulelor T, cum ar fi 300 IU/mL IL-2 sau IL-15. Alte antigene adecvate pot include, de ex., NY-ESO-1, TRP-1, TRP-2, antigen canceros de tirozinază, MAGE-A3, SSX-2 şi VEGFR2 sau porţiuni antigenice ale acestora. TIL pot fi de asemenea amplificate rapid prin re-stimulare cu acelaşi antigene ale cancerului încărcate pe celule de prezentare a antigenului care exprimă HLA-A2. Alternativ, TIL pot fi re-stimulate suplimentar, de ex., cu limfocite autologe, iradiate, sau cu limfocite alogenice iradiate HLA-A2+ şi IL-2. În unele aplicări, re-stimularea are loc ca parte din a doua expansiune. În unele aplicări, a doua expansiune are loc în prezenţa limfocitelor autologe iradiate sau cu limfocite alogenice iradiate HLA-A2+ şi IL-2.
Într-o aplicare, mediul de cultură celulară mai cuprinde IL-2. În unele aplicări, mediul de cultură celulară cuprinde circa 3000 IU/mL de IL-2. Într-o aplicare, mediul de cultură celulară cuprinde circa 1000 IU/mL, circa 1500 IU/mL, circa 2000 IU/mL, circa 2500 IU/mL, circa 3000 IU/mL, circa 3500 IU/mL, circa 4000 IU/mL, circa 4500 IU/mL, circa 5000 IU/mL, circa 5500 IU/mL, circa 6000 IU/mL, circa 6500 IU/mL, circa 7000 IU/mL, circa 7500 IU/mL sau circa 8000 IU/mL de IL-2. Într-o aplicare, mediul de cultură celulară cuprinde între 1000 şi 2000 IU/mL, între 2000 şi 3000 IU/mL, între 3000 şi 4000 IU/mL, între 4000 şi 5000 IU/mL, între 5000 şi 6000 IU/mL, între 6000 şi 7000 IU/mL, între 7000 şi 8000 IU/mL sau între 8000 IU/mL de IL-2.
Într-o aplicare, mediul de cultură celulară cuprinde anticorp OKT3. În unele aplicări, mediul de cultură celulară cuprinde circa 30 ng/mL de anticorp OKT3. Într-o aplicare, mediul de cultură celulară cuprinde circa 0.1 ng/mL, circa 0.5 ng/mL, circa 1 ng/mL, circa 2.5 ng/mL, circa 5 ng/mL, circa 7.5 ng/mL, circa 10 ng/mL, circa 15 ng/mL, circa 20 ng/mL, circa 25 ng/mL, circa 30 ng/mL, circa 35 ng/mL, circa 40 ng/mL, circa 50 ng/mL, circa 60 ng/mL, circa 70 ng/mL, circa 80 ng/mL, circa 90 ng/mL, circa 100 ng/mL, circa 200 ng/mL, circa 500 ng/mL şi circa 1 µg/mL de anticorp OKT3. Într-o aplicare, mediul de cultură celulară cuprinde între 0.1 ng/mL şi 1 ng/mL, între 1 ng/mL şi 5 ng/mL, între 5 ng/mL şi 10 ng/mL, între 10 ng/mL şi 20 ng/mL, între 20 ng/mL şi 30 ng/mL, între 30 ng/mL şi 40 ng/mL, între 40 ng/mL şi 50 ng/mL şi între 50 ng/mL şi 100 ng/mL de anticorp OKT3. În unele aplicări, mediul de cultură celulară nu cuprinde anticorp OKT-3.
În unele aplicări, mediul de cultură celulară cuprinde unul sau mai mulţi agonişti TNFRSF într-un mediu de cultură celulară. În unele aplicări, agonistul TNFRSF cuprinde un agonist 4-1BB. În unele aplicări, agonistul TNFRSF este un agonist 4-1BB şi agonistul 4-1BB este selectat din grupul constând din urelumab, utomilumab, EU-101, o proteină de fuziune şi fragmente, derivaţi, variante, biosimilare şi combinaţii ale acestora. În unele aplicări, agonistul TNFRSF se adaugă la o concentraţie suficientă pentru a obţine o concentraţie în mediul de cultură celulară între 0.1 µg/mL şi 100 µg/mL. În unele aplicări, agonistul TNFRSF se adaugă la o concentraţie suficientă pentru a obţine o concentraţie în mediul de cultură celulară între 20 µg/mL şi 40 µg/mL. \tabÎn unele aplicări, pe lângă unul sau mai mulţi agonişti TNFRSF, mediul de cultură celulară mai cuprinde IL-2 la o concentraţie iniţială de aproximativ 3000 IU/mL şi anticorp OKT-3 la o concentraţie iniţială de aproximativ 30 ng/mL şi unde unul sau mai mulţi agonişti TNFRSF cuprind un agonist 4-1BB. În unele aplicări, se utilizează o combinaţie de IL-2, IL-7, IL-15 şi/sau IL-21 ca o combinaţie în a doua expansiune. În unele aplicări, IL-2, IL-7, IL-15 şi/sau IL-21, precum şi orice combinaţii ale acestora pot fi incluse în a doua expansiune, inclusiv de exemplu în procesele unei Etape D din Figura 27, descrise în prezenta. În unele aplicări, se poate utiliza o combinaţie de IL-2, IL-15 şi IL-21 ca o combinaţie în a doua expansiune. În unele aplicări, IL-2, IL-15 şi IL-21, precum şi orice combinaţii ale acestora pot fi incluse în procesele Etapei D din Figura 27, descrise în prezenta. În unele aplicări, a doua expansiune se poate efectua într-un mediu de cultură celulară suplimentat cuprinzând IL-2, OKT-3, celule feeder de prezentare a antigenului, şi opţional un agonist TNFRSF. În unele aplicări, a doua expansiune are loc într-un mediu de cultură celulară suplimentat. În unele aplicări, mediul de cultură celulară suplimentat cuprinde IL-2, OKT-3 şi celule feeder de prezentare a antigenului. În unele aplicări, al doilea mediu de cultură celulară cuprinde IL-2, OKT-3 şi celule de prezentare a antigenului (APC; denumite şi celule feeder de prezentare a antigenului). În unele aplicări, a doua expansiune are loc într-un mediu de cultură celulară cuprinzând IL-2, OKT-3 şi celule feeder de prezentare a antigenului (i.e., celule de prezentare a antigenului). În unele aplicări, mediul de cultură al celei de-a doua expansiuni cuprinde circa 500 IU/mL IL-15, circa 400 IU/mL IL-15, circa 300 IU/mL IL-15, circa 200 IU/mL IL-15, circa 180 IU/mL IL-15, circa 160 IU/mL IL-15, circa 140 IU/mL IL-15, circa 120 IU/mL IL-15 sau circa 100 IU/mL IL-15. În unele aplicări, mediul de cultură al celei de-a doua expansiuni cuprinde circa 500 IU/mL IL-15 până la circa 100 IU/mL IL-15. În unele aplicări, mediul de cultură al celei de-a doua expansiuni cuprinde circa 400 IU/mL IL-15 până la circa 100 IU/mL IL-15. În unele aplicări, mediul de cultură al celei de-a doua expansiuni cuprinde circa 300 IU/mL IL-15 până la circa 100 IU/mL IL-15. În unele aplicări, mediul de cultură al celei de-a doua expansiuni cuprinde circa 200 IU/mL IL-15. În unele aplicări, mediul de cultură celulară cuprinde circa 180 IU/mL IL-15. Într-o aplicare, mediul de cultură celulară mai cuprinde IL-15. Într-o aplicare preferată, mediul de cultură celulară cuprinde circa 180 IU/mL IL-15. În unele aplicări, mediul de cultură al celei de-a doua expansiuni cuprinde circa 20 IU/mL de IL-21, circa 15 IU/mL de IL-21, circa 12 IU/mL de IL-21, circa 10 IU/mL de IL-21, circa 5 IU/mL de IL-21, circa 4 IU/mL de IL-21, circa 3 IU/mL de IL-21, circa 2 IU/mL de IL-21, circa 1 IU/mL de IL-21 sau circa 0.5 IU/mL de IL-21. În unele aplicări, mediul de cultură al celei de-a doua expansiuni cuprinde circa 20 IU/mL de IL-21 până la circa 0.5 IU/mL de IL-21. În unele aplicări, mediul de cultură al celei de-a doua expansiuni cuprinde circa 15 IU/mL de IL-21 până la circa 0.5 IU/mL de IL-21. În unele aplicări, mediul de cultură al celei de-a doua expansiuni cuprinde circa 12 IU/mL de IL-21 până la circa 0.5 IU/mL de IL-21. În unele aplicări, mediul de cultură al celei de-a doua expansiuni cuprinde circa 10 IU/mL de IL-21 până la circa 0.5 IU/mL de IL-21. În unele aplicări, mediul de cultură al celei de-a doua expansiuni cuprinde circa 5 IU/mL de IL-21 până la circa 1 IU/mL de IL-21. În unele aplicări, mediul de cultură al celei de-a doua expansiuni cuprinde circa 2 IU/mL de IL-21. În unele aplicări, mediul de cultură celulară cuprinde circa 1 IU/mL de IL-21. În unele aplicări, mediul de cultură celulară cuprinde circa 0.5 IU/mL de IL-21. Într-o aplicare, mediul de cultură celulară mai cuprinde IL-21. Într-o aplicare preferată, mediul de cultură celulară cuprinde circa 1 IU/mL de IL-21. În unele aplicări, celulele feeder de prezentare a antigenului (APC) sunt PBMC. Într-o aplicare, raportul dintre TIL şi PBMC şi/sau celulele de prezentare a antigenului în expansiunea rapidă şi/sau a doua expansiune este circa 1 până la 25, circa 1 până la 50, circa 1 până la 100, circa 1 până la 125, circa 1 până la 150, circa 1 până la 175, circa 1 până la 200, circa 1 până la 225, circa 1 până la 250, circa 1 până la 275, circa 1 până la 300, circa 1 până la 325, circa 1 până la 350, circa 1 până la 375, circa 1 până la 400 sau circa 1 până la 500. Într-o aplicare, raportul dintre TIL şi PBMC în expansiunea rapidă şi/sau a doua expansiune este între 1 până la 50 şi 1 până la 300. Într-o aplicare, raportul dintre TIL şi PBMC în expansiunea rapidă şi/sau a doua expansiune este între 1 până la 100 şi 1 până la 200. Într-o aplicare, REP şi/sau a doua expansiune se efectuează în baloane cu TIL în masă amestecate cu un excedent de 100 sau 200 de ori de celule feeder inactivate, 30 mg/mL anticorp anti-CD3 OKT3 şi 3000 IU/mL IL-2 în 150 ml de mediu. Mediul se înlocuieşte (în general înlocuire de mediu 2/3 media prin respiraţie cu mediu proaspăt) până la transferul celulelor într-o cameră de creştere alternativă. Camerele de creştere alternative includ baloane şi recipiente permeabile la gaz G-REX discutate detaliat mai jos. În unele aplicări, A doua expansiune (care poate include procese denumite REP) scurtată la 7-14 zile, aşa cum se discută în exemple şi figuri. În unele aplicări, a doua expansiune este scurtată la 11 zile. Într-o aplicare, REP şi/sau a doua expansiune se poate efectua folosind baloane şi recipiente permeabile la gaz T-175 descrise anterior (Tran, et al., J. Immunother. 2008, 31, 742-51; Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42) sau vase de cultură permeabile la gaz (baloane G-Rex). În unele aplicări, a doua expansiune (inclusiv expansiuni denumite expansiuni rapide) se efectuează în baloane T-175 şi se pot adăuga circa 1 × 106 TIL suspendate în 150 mL de mediu în fiecare balon T-175. TIL pot fi cultivate într-un amestec de 1 până la 1 mediu CM şi AIM-V, suplimentat cu 3000 IU per mL IL-2 şi 30 ng per ml anti-CD3. Baloanele T-175 pot fi incubate la 37°C în 5% CO2. Jumătate din mediu poate fi schimbat în ziua 5 folosind 50/50 mediu cu 3000 IU per mL de IL-2. În unele aplicări, în ziua 7, celulele din două baloane T-175 pot fi combinate într-un recipient de 3 L şi s-au adăugat 300 mL AIM V cu 5% ser AB uman şi 3000 IU per mL IL-2 în suspensia TIL de 300 ml. S-au numărat celulele din fiecare recipient în fiecare zi sau la fiecare două zile şi s-a adăugat mediu proaspăt pentru a menţine numărul celulelor între 0.5 şi 2.0 × 106 celule/mL. Într-o aplicare, a doua expansiune (care poate include expansiuni denumite REP, precum şi cele indicate în etapa D din Figura 27) se poate efectua în baloane permeabile la gaz cu capacitate de 500 mL, cu fund de siliciu permeabil la gaz de 100 cm (G-Rex 100, disponibil în comerţ de la Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA), 5 × 106 sau 10 × 106 TIL pot fi cultivate cu PBMC în 400 mL de mediu 50/50, suplimentat cu 5% ser AB uman, 3000 IU per mL de IL-2 şi 30 ng per ml de anti-CD3 (OKT3). Baloanele G-Rex 100 pot fi incubate la 37°C în 5% CO2. În ziua 5, 250 mL de supernatant poate fi îndepărtat şi introdus în flacoane de centrifugă şi centrifugat la 1500 rpm (491 × g) 10 minute. Peletele TIL pot fi re-suspendate cu 150 mL de mediu proaspăt cu 5% ser AB uman, 3000 IU per mL de IL-2 şi s-au adăugat înapoi în baloanele G-Rex 100 iniţiale. Când TIL sunt amplificate în serie în baloane G-Rex 100, în ziua 7, TIL din fiecare G-Rex 100 pot fi suspendate în 300 mL de mediu prezent în fiecare balon şi suspensia celulară poate fi împărţită în 3 părţi alicote de 100 mL care se pot folosi pentru însămânţarea a 3 baloane G-Rex 100. Se pot adăuga apoi 150 mL de AIM-V cu 5% ser AB uman şi 3000 IU per mL de IL-2 în fiecare balon. Baloanele G-Rex 100 pot fi incubate la 37°C în 5% CO2 şi după 4 zile se pot adăuga 150 mL de AIM-V cu 3000 IU per mL de IL-2 în fiecare balon G-REX 100. Celulele pot fi recoltate în ziua 14 de cultură. Într-o aplicare, a doua expansiune (incluzând expansiuni denumite REP) se efectuează în baloane cu TIL în masă amestecate cu un excedent de 100 sau 200 de ori de celule feeder inactivate, 30 mg/mL anticorp anti-CD3 OKT3 şi 3000 IU/mL IL-2 în 150 ml de mediu. În unele aplicări, mediul se înlocuieşte până la transferul celulelor într-o cameră de creştere alternativă. În unele aplicări, se înlocuiesc 2/3 din mediu prin respiraţie cu mediu proaspăt. În unele aplicări, camerele de creştere alternative includ baloane şi recipiente permeabile la gaz G-REX discutate detaliat mai jos. Într-o aplicare, se efectuează a doua expansiune (incluzând expansiuni denumite REP) şi mai cuprinde o etapă în care TIL sunt selectate pentru reactivitate superioară la tumoare. Se poate folosi orice metodă de selecţie cunoscută în domeniu. De exemplu, se pot folosi metodele descrise în documentaţia cererii de brevet U.S. nr. 2016/0010058 A1 pentru selecţia TIL cu reactivitate tumorală superioară. Opţional, se poate efectua un test de viabilitate celulară după a doua expansiune (incluzând expansiuni denumite REP), folosind teste standard cunoscute în domeniu. De exemplu, se poate efectua un test de excludere cu albastru tripan pe o probă de TIL în masă, care marchează selectiv celulele moarte şi permite o evaluare a viabilităţii. În unele aplicări, probele TIL pot fi numărate şi viabilitatea se determină folosind un aparat de numărare automat Cellometer K2 (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA). În unele aplicări, viabilitatea se determină conform protocolului Cellometer K2 Image Cytometer Automatic Cell Counter descris, de exemplu, în Exemplul 15. În unele aplicări, a doua expansiune (incluzând expansiuni denumite REP) a TIL se poate efectua folosind baloane şi recipiente permeabile la gaz T-175 descrise anterior (Tran KQ, Zhou J, Durflinger KH, et al., 2008, J Immunother., 31:742-751 şi Dudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE, et al. 2003, J Immunother., 26:332-342) sau baloane permeabile la gaz G-Rex. În unele aplicări, a doua expansiune se efectuează folosind baloane. În unele aplicări, a doua expansiune se efectuează folosind baloane permeabile la gaz G-Rex. În unele aplicări, a doua expansiune se efectuează în baloane T-175 şi se suspendă circa 1 × 106 TIL în circa 150 mL de mediu, care se adaugă în fiecare balon T-175. TIL sunt cultivate cu PBMC alogenice iradiate (50 Gy) ca celule "feeder" la un raport de 1 până la 100 şi celulele s-au cultivat într-un amestec de 1 până la 1 de mediu CM şi AIM-V (mediu 50/50), suplimentat cu 3000 IU/mL de IL-2 şi 30 ng/mL anti-CD3. Baloanele T-175 sunt incubate la 37°C în 5% CO2. În unele aplicări, jumătate din mediu se schimbă în ziua 5 folosind 50/50 mediu cu 3000 IU/mL de IL-2. În unele aplicări, în ziua 7, celulele din 2 baloane T-175 se combină într-un recipient de 3 L bag şi se adaugă 300 mL de AIM-V cu 5% ser AB uman şi 3000 IU/mL de IL-2 în 300 mL de suspensie TIL. Celulele din fiecare recipient pot fi numărate în fiecare zi sau la două zile şi se poate adăuga mediu proaspăt pentru a menţine numărul celulelor între circa 0.5 şi circa 2.0 × 106 celule/mL. În unele aplicări, a doua expansiune (incluzând expansiuni denumite REP) se efectuează în baloane cu capacitate de 500 mL cu fund de siliciu permeabil la gaz de 100 cm2 (G-Rex 100, Wilson Wolf) (Fig. 1), circa 5 × 106 sau 10 × 106 TIL sunt cultivate cu PBMC alogenice iradiate la un raport de 1 până la 100 în 400 mL de mediu 50/50, suplimentat cu 3000 IU/mL de IL-2 şi 30 ng/ mL de anti-CD3. Baloanele G-Rex 100 sunt incubate la 37°C în 5% CO2. În unele aplicări, în ziua 5, se îndepărtează 250mL de supernatant şi se introduc în flacoane de centrifugă, centrifugat ela 1500 rpm (491g) 10 minute. Peletele TIL pot fi resuspendate apoi cu 150 mL de mediu 50/50 proaspăt cu 3000 IU/ mL de IL-2 şi se adaugă înapoi în baloanele G-Rex 100 iniţiale. În aplicări în care TIL sunt amplificate în serie în baloane G-Rex 100, în ziua 7, TIL din fiecare G-Rex 100 sunt suspendate în 300 mL de mediu prezent în fiecare balon şi suspensia celulară s-a împărţit în trei părţi alicote de 100 mL care se folosesc pentru însămânţarea a 3 baloane G-Rex 100. Se adaugă apoi 150 mL de AIM-V cu 5% ser AB uman şi 3000 IU/mL de IL-2 în fiecare balon. Baloanele G-Rex 100 sunt incubate la 37°C în 5% CO2 şi, după 4 zile, se adaugă 150 mL de AIM-V cu 3000 IU/mL de IL-2 în fiecare balon G-Rex 100. Celulele sunt recoltate în ziua 14 de cultură. Diverşii receptori antigenici ai limfocitelor T şi B se produc prin recombinare somatică a unui număr limitat, dar mare, de segmente genice. Aceste segmente genice: V (variabil), D (diversitate), J (juxtapunere) şi C (constant) determină specificitatea legării şi aplicările în aval ale imunoglobulinelor şi receptorilor T celulari (TCR). Prezenta invenţie prevede o metodă de generare a TIL care prezintă şi cresc diversitatea repertoriului celulelor T. În unele aplicări, TIL obţinute prin metoda din prezenta prezintă o creştere a diversităţii repertoriului celulelor T. În unele aplicări, TIL obţinute în a doua expansiune prezintă o creştere a diversităţii repertoriului celulelor T. În unele aplicări, creşterea diversităţii este o creştere a diversităţii imunoglobulinelor şi/sau a diversităţii receptorilor T celulari. În unele aplicări, diversitatea imunoglobulinică este în lanţul greu al imunoglobulinei. În unele aplicări, diversitatea imunoglobulinică este în lanţul uşor al imunoglobulinei. În unele aplicări, diversitatea este în receptorul T celular. În unele aplicări, diversitatea este în unul dintre receptorii T celulari selectaţi din grupul constând din receptori alpha, beta, gamma şi delta. În unele aplicări, există o creştere a expresiei receptorului T celular (TCR) alpha şi/sau beta. În unele aplicări, există o creştere a expresiei receptorului T celular (TCR) alpha. În unele aplicări, există o creştere a expresiei receptorului T celular (TCR) beta. În unele aplicări, există o creştere a expresiei TCRab (i.e., TCRα/β). În unele aplicări, mediul de cultură al celei de-a doua expansiuni (de ex., denumit uneori CM2 sau al doilea mediu de cultură celulară) cuprinde IL-2, OKT-3, precum şi celule feeder de prezentare a antigenului (APC), aşa cum se discută detaliat mai jos. În unele aplicări, a doua expansiune, de exemplu, Etapa D din Figura 27, se efectuează într-un bioreactor în sistem închis. În unele aplicări, se utilizează un sistem închis pentru expansiunea TIL, descris în prezenta. În unele aplicări, se utilizează un singur bioreactor. În unele aplicări, bioreactorul unic folosit este de exemplu G-REX -10 sau G-REX -100. În unele aplicări, bioreactorul în sistem închis este un singur bioreactor.
1. Celule feeder şi celule de prezentare a antigenului
Într-o aplicare, procedurile celei de-a doua expansiuni descrise în prezenta (de exemplu incluzând expansiune cum ar fi cele descrise în etapa D din Figura 27, precum şi cele denumite REP) necesită un surplus de celule feeder în timpul expansiunii REP TIL şi/sau în a doua expansiune. În multe aplicări, celulele feeder sunt celule mononucleare din sângele periferic (PBMC) obţinute din unităţi de sânge integral standard de la donatori de sânge sănătoşi. PBMC se obţin prin metode standard cum ar fi separare în gradient Ficoll-Paque.
În general, PBMC alogenice sunt inactivate, prin iradiere sau tratament termic, şi utilizate în procedurile REP, aşa cum se descrie în exemple, în special exemplul 14, care asigură un protocol exemplificativ pentru evaluarea incompetenţei de replicare a PBMC alogenice iradiate.
În unele aplicări, PBMC sunt considerate incompetente pentru replicare şi acceptate pentru utilizare în procedurile de expansiune TIL descrise în prezenta dacă numărul total al celulelor viabile în ziua 14 este mai mic decât numărul celulelor viabile iniţiale cultivate în ziua 0 a REP şi/sau ziua 0 a celei de-a doua expansiuni (i.e., ziua debutului celei de-a doua expansiuni). Vezi, de exemplu, Exemplul 14.
În unele aplicări, PBMC sunt considerate incompetente pentru replicare şi acceptate pentru utilizare în procedurile de expansiune TIL descrise în prezenta dacă numărul total al celulelor viabile, cultivate în prezenţa OKT3 şi IL-2, în ziua 7 şi ziua 14, nu a crescut faţă de numărul celulelor viabile iniţiale cultivate în ziua 0 a REP şi/sau ziua 0 a celei de-a doua expansiuni (i.e., ziua debutului celei de-a doua expansiuni). În unele aplicări, PBMC sunt cultivate în prezenţa a 30 ng/ml anticorp OKT3 şi 3000 IU/ml IL-2. Vezi, de exemplu, Exemplul 13.
În unele aplicări, PBMC sunt considerate incompetente pentru replicare şi acceptate pentru utilizare în procedurile de expansiune TIL descrise în prezenta dacă numărul total al celulelor viabile, cultivate în prezenţa OKT3 şi IL-2, în ziua 7 şi ziua 14, nu a crescut faţă de numărul celulelor viabile iniţiale cultivate în ziua 0 a REP şi/sau ziua 0 a celei de-a doua expansiuni (i.e., ziua debutului celei de-a doua expansiuni). În unele aplicări, PBMC sunt cultivate în prezenţa a 5-60 ng/ml anticorp OKT3 şi 1000-6000 IU/ml IL-2. În unele aplicări, PBMC sunt cultivate în prezenţa a 10-50 ng/ml anticorp OKT3 şi 2000-5000 IU/ml IL-2. În unele aplicări, PBMC sunt cultivate în prezenţa a 20-40 ng/ml anticorp OKT3 şi 2000-4000 IU/ml IL-2. În unele aplicări, PBMC sunt cultivate în prezenţa a 25-35 ng/ml anticorp OKT3 şi 2500-3500 IU/ml IL-2.
În unele aplicări, celulele feeder de prezentare a antigenului sunt PBMC. În unele aplicări, celulele feeder de prezentare a antigenului sunt celule feeder de prezentare a antigenului artificiale. Într-o aplicare, raportul dintre TIL şi celulele feeder de prezentare a antigenului în a doua expansiune este circa 1 până la 25, circa 1 până la 50, circa 1 până la 100, circa 1 până la 125, circa 1 până la 150, circa 1 până la 175, circa 1 până la 200, circa 1 până la 225, circa 1 până la 250, circa 1 până la 275, circa 1 până la 300, circa 1 până la 325, circa 1 până la 350, circa 1 până la 375, circa 1 până la 400 sau circa 1 până la 500. Într-o aplicare, raportul dintre TIL şi celulele feeder de prezentare a antigenului în a doua expansiune este între 1 până la 50 şi 1 până la 300. Într-o aplicare, raportul dintre TIL şi celulele feeder de prezentare a antigenului în a doua expansiune este între 1 până la 100 şi 1 până la 200.
Într-o aplicare, procedurile celei de-a doua expansiuni descrise în prezenta necesită un raport de circa 2.5 × 109 celule feeder până la circa 100 × 106 TIL. Într-o altă aplicare, procedurile celei de-a doua expansiuni descrise în prezenta necesită un raport de circa 2.5 × 109 celule feeder până la circa 50 × 106 TIL. Într-o altă aplicare, procedurile celei de-a doua expansiuni descrise în prezenta necesită circa 2.5 × 109 celule feeder până la circa 25 × 106 TIL.
Într-o aplicare, procedurile celei de-a doua expansiuni descrise în prezenta necesită un surplus de celule feeder în a doua expansiune. În multe aplicări, celulele feeder sunt celule mononucleare din sângele periferic (PBMC) obţinute din unităţi de sânge integral standard de la donatori de sânge sănătoşi. PBMC se obţin prin metode standard cum ar fi separare în gradient Ficoll-Paque. Într-o aplicare, se folosesc celule de prezentare a antigenului artificiale (aAPC) în locul PBMC.
În general, PBMC alogenice sunt inactivate, prin iradiere sau tratament termic, şi folosite în procedurile de expansiune TIL descrise în prezenta, inclusiv procedurile exemplificative descrise în Figurile 4, 5, şi 27.
Într-o aplicare, celulele de prezentare a antigenului artificiale se folosesc în a doua expansiune ca înlocuitor sau în combinaţie cu PBMC.
2. Citokine
Metodele de expansiune descrise în prezenta folosesc în general mediu de cultură cu doze mari de citokină, în special IL-2, aşa cum se cunoaşte în domeniu.
Alternativ, este posibilă utilizarea combinaţiilor de citokine pentru expansiunea rapidă şi/sau a doua expansiune TIL, cu combinaţii de două sau mai multe dintre IL-2, IL-15 şi IL-21, aşa cum se indică în general în documentaţia internaţională nr. WO 2015/189356 şi documentaţia internaţională nr. WO 2015/189357. Astfel, combinaţiile posibile includ IL-2 şi IL-15, IL-2 şi IL-21, IL-15 şi IL-21 şi IL-2, IL-15 şi IL-21, aceasta din urmă fiind deosebit de utilă în multe aplicări. Utilizarea combinaţiilor de citokine favorizează în mod specific generarea limfocitelor şi, în mod specific, celule T descrise în prezenta.
3. Anticorpi anti-CD3
În unele aplicări, mediul de cultură folosit în metodele de expansiune descrise în prezenta (inclusiv cele denumite REP, vezi de exemplu Figura 27) include de asemenea un anticorp anti-CD3. Un anticorp anti-CD3 în combinaţie cu IL-2 induce activarea celulelor T şi diviziunea celulară în populaţia TIL. Acest efect poate fi observat cu anticorpi în lungime completă, precum şi fragmente Fab şi F(ab')2, primul fiind în general preferat; vezi, de ex., Tsoukas et al., J. Immunol. 1985, 135, 1719.
După cum se va înţelege în domeniu, există mai mulţi anticorpi anti-CD3 uman adecvaţi utilizabili în invenţie, inclusiv anticorpi policlonali şi monoclonali anti-CD3 uman de la diferite mamifere, inclusiv, dar nelimitativ, anticorpi murini, umani, de primate, şobolan şi canini. În aplicări specifice, se utilizează anticorpul anti-CD3 OKT3 (disponibil în comerţ de la Ortho-McNeil, Raritan, NJ sau Miltenyi Biotech, Auburn, CA).
E. ETAPA E: Recoltarea TIL
După etapa celei de-a doua expansiuni, celulele pot fi recoltate. În unele aplicări TIL sunt recoltate după una, două, trei, patru sau mai multe etape de expansiune, de exemplu prevăzute în Figura 27. În unele aplicări TIL sunt recoltate după două etape de expansiune, de exemplu prevăzute în Figura 27.
TIL pot fi recoltate în orice mod corespunzător şi steril, inclusiv de exemplu prin centrifugare. Metodele de recoltare TIL sunt bine cunoscute în domeniu şi se pot folosi oricare din aceste metode cunoscute în procesul din prezenta. În unele aplicări, TIL sunt recoltate folosind un sistem automat.
Dispozitivele de recoltare celulară şi/sau sistemele de procesare celulară sunt disponibile în comerţ din o varietate de surse, inclusiv, de exemplu, Fresenius Kabi, Tomtec Life Science, Perkin Elmer, şi Inotech Biosystems International, Inc. Se poate folosi orice dispozitiv de recoltare celulară în metodele din prezenta. În unele aplicări, dispozitivul de recoltare celulară şi/sau sistemul de procesare celulară este un dispozitiv de recoltare celulară pe bază de membrană. În unele aplicări, recoltarea celulară se efectuează printr-un sistem de procesare celulară, cum ar fi sistemul LOVO (fabricat de Fresenius Kabi). Termenul "sistem de procesare celulară LOVO" se referă de asemenea la orice instrument sau dispozitiv fabricat de orice furnizor, care poate pompa o soluţie conţinând celule printr-o membrană sau un filtru, cum ar fi o membrană sau filtru de centrifugare într-un mediu de sistem steril şi/sau închis, permiţând fluxul continuu şi procesarea celulară pentru a îndepărta supernatantul sau mediul de cultură celulară fără peletizare. În unele aplicări, dispozitivul de recoltare celulară şi/sau sistemul de procesare celulară poate efectua separarea celulelor, spălare, schimb de fluid, concentrare şi/sau alte etape de procesare celulară într-un sistem steril, închis.
În unele aplicări, recoltarea, de exemplu, Etapa E din Figura 27, se efectuează dintr-un bioreactor în sistem închis. În unele aplicări, se utilizează un sistem închis pentru expansiunea TIL, descris în prezenta. În unele aplicări, se utilizează un singur bioreactor. În unele aplicări, bioreactorul unic folosit este de exemplu G-REX -10 sau G-REX -100. În unele aplicări, bioreactorul în sistem închis este un singur bioreactor.
În unele aplicări, etapa E din Figura 27 se efectuează conform proceselor descrise în exemplul 30. În unele aplicări, sistemul închis este accesat prin intermediul seringilor în condiţii sterile pentru a menţine sterilitatea şi natura închisă a sistemului. În unele aplicări, se foloseşte un sistem închis descris în exemplul 30.
În unele aplicări, TIL sunt recoltate conform metodelor descrise în exemplul 30. În unele aplicări, TIL între zilele 1 şi 11 sunt recoltate folosind metodele descrise în secţiunea 8.5 (indicată ca recoltarea TIL în ziua 11 în exemplul 30). În unele aplicări, TIL între zilele 12 şi 22 sunt recoltate folosind metodele descrise în secţiunea 8.12 (indicată ca recoltarea TIL în ziua 22 în exemplul 30).
F. ETAPA F: Compoziţie finală / transfer în punga de perfuzie
După încheierea Etapelor A - E prevăzute într-o ordine exemplificativă în Figura 27 şi specificate detaliat mai sus şi în prezenta, celulele se transferă într-un recipient utilizabil pentru administrarea la un pacient. În unele aplicări, după ce se obţine un număr terapeutic suficient de TIL folosind metodele de expansiune descrise mai sus, acestea se transferă într-un recipient în vederea administrării la un pacient.
Într-o aplicari, TIL amplificate folosind APC din prezenta invenţie pot fi administrate unui pacient ca o compoziţie farmaceutică. Într-o aplicare, compoziţia farmaceutică este o suspensie de TIL într-un tampon steril. TIL amplificate folosind PBMC din prezenta invenţie se pot administra pe orice cale adecvată cunoscută în domeniu. În unele aplicări, celulele T se administrează ca o singură perfuzie intra-arterială sau intravenoasă, care durează de preferinţă aproximativ 30 până la 60 de minute. Alte căi de administrare adecvate includ calea intraperitoneală, intratecală şi intralimfatică.
1. Compoziţii farmaceutice, dozaje şi regimuri de dozaj
Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, TIL amplificate folosind metodele din prezenta invenţie se administrează unui pacient ca o compoziţie farmaceutică. Compoziţia farmaceutică este o suspensie de TIL într-o soluţie tampon sterilă. TIL amplificate folosind PBMC din prezenta invenţie se pot administra pe orice cale adecvată cunoscută în domeniu. Celulele T se administrează ca o singură perfuzie intra-arterială sau intravenoasă, care durează de preferinţă aproximativ 30 până la 60 de minute. Alte căi de administrare adecvate includ calea intraperitoneală, intratecală şi intralimfatică.
Se poate administra orice doză adecvată de TIL. Se pot administra de la aproximativ 2.3×1010 la aproximativ 13.7×1010 TIL, cu o medie de aproximativ 7.8×1010 TIL, în special dacă cancerul este melanom. Se pot administra aproximativ 1.2×1010 până la aproximativ 4.3×1010 TIL. Se pot administra aproximativ 3×1010 până la aproximativ 12×1010 TIL. Se pot administra aproximativ 4×1010 până la aproximativ 10×1010 TIL. În metodele divulgate în prezenta, se pot administra aproximativ 5×1010 până la aproximativ 8×1010 TIL. În metodele divulgate în prezenta, se pot administra aproximativ 6×1010 până la aproximativ 8×1010 TIL. În metodele divulgate în prezenta, se pot administra aproximativ 7×1010 până la aproximativ 8×1010 TIL. În metodele divulgate în prezenta, dozajul terapeutic eficient poate fi aproximativ 2.3×1010 până la aproximativ 13.7×1010. În metodele divulgate în prezenta, dozajul terapeutic eficient poate fi aproximativ 7.8×1010 TIL, în special dacă cancerul este melanom. În metodele divulgate în prezenta, dozajul terapeutic eficient poate fi aproximativ 1.2×1010 până la aproximativ 4.3×1010 TIL. În metodele divulgate în prezenta, dozajul terapeutic eficient poate fi aproximativ 3×1010 până la aproximativ 12×1010 TIL. În metodele divulgate în prezenta, dozajul terapeutic eficient poate fi aproximativ 4×1010 până la aproximativ 10×1010 TIL. În metodele divulgate în prezenta, dozajul terapeutic eficient poate fi aproximativ 5×1010 până la aproximativ 8×1010 TIL. În metodele divulgate în prezenta, dozajul terapeutic eficient poate fi aproximativ 6×1010 până la aproximativ 8×1010 TIL. În metodele divulgate în prezenta, dozajul terapeutic eficient poate fi aproximativ 7×1010 până la aproximativ 8×1010 TIL.
Numărul TIL prevăzut în compoziţiile farmaceutice din invenţie este circa 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 1×107, 2×107, 3×107, 4×107, 5×107, 6×107, 7×107, 8×107, 9×107, 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×108, 6×108, 7×108, 8×108, 9×108, 1×109, 2×109, 3×109, 4×109, 5×109, 6×109, 7×109, 8×109, 9×109, 1×1010, 2×1010, 3×1010, 4×1010, 5×10, 6×1010, 7×1010, 8×1010, 9×1010, 1×1011, 2×1011, 3×1011, 4×1011, 5×1011, 6×1011, 7×1011, 8×1011, 9×1011, 1×1012, 2×1012, 3×1012, 4×1012, 5×1012, 6×1012, 7×1012, 8×1012, 9×1012, 1×1013, 2×1013, 3×1013, 4×1013, 5×1013, 6×1013, 7×1013, 8×1013, şi 9×1013. Numărul TIL prevăzut în compoziţiile farmaceutice din invenţie este în intervalul de 1×106 până la 5×106, 5×106 până la 1×107 I×107 până la 5×107 5×107 până la 1×108, 1×108 până la 5×108, 5×108 până la 1×109, 1×109 până la 5×109, 5×109 până la 1×1010, 1×1010 până la 5×1010, 5×1010 până la 1×1011, 5×1011 până la 1×1012, 1×1012 până la 5×1012, şi 5×1012 până la 1×1013.
Concentraţia TIL prevăzută în compoziţiile farmaceutice din invenţie este mai mică decât, de exemplu, 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002% sau 0.0001% g/g, g/v sau v/v din compoziţia farmaceutică.
Concentraţia TIL prevăzută în compoziţiile farmaceutice din invenţie este mai mare decât 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19.75%, 19.50%, 19.25% 19%, 18.75%, 18.50%, 18.25% 18%, 17.75%, 17.50%, 17.25% 17%, 16.75%, 16.50%, 16.25% 16%, 15.75%, 15.50%, 15.25% 15%, 14.75%, 14.50%, 14.25% 14%, 13.75%, 13.50%, 13.25% 13%, 12.75%, 12.50%, 12.25% 12%, 11.75%, 11.50%, 11.25% 11%, 10.75%, 10.50%, 10.25% 10%, 9.75%, 9.50%, 9.25% 9%, 8.75%, 8.50%, 8.25% 8%, 7.75%, 7.50%, 7.25% 7%, 6.75%, 6.50%, 6.25% 6%, 5.75%, 5.50%, 5.25% 5%, 4.75%, 4.50%, 4.25%, 4%, 3.75%, 3.50%, 3.25%, 3%, 2.75%, 2.50%, 2.25%, 2%, 1.75%, 1.50%, 125%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002% sau 0.0001% g/g, g/v sau v/v din compoziţia farmaceutică.
Concentraţia TIL prevăzută în compoziţiile farmaceutice din invenţie este în intervalul de la circa 0.0001% până la circa 50%, circa 0.001% până la circa 40%, circa 0.01% până la circa 30%, circa 0.02% până la circa 29%, circa 0.03% până la circa 28%, circa 0.04% până la circa 27%, circa 0.05% până la circa 26%, circa 0.06% până la circa 25%, circa 0.07% până la circa 24%, circa 0.08% până la circa 23%, circa 0.09% până la circa 22%, circa 0.1% până la circa 21%, circa 0.2% până la circa 20%, circa 0.3% până la circa 19%, circa 0.4% până la circa 18%, circa 0.5% până la circa 17%, circa 0.6% până la circa 16%, circa 0.7% până la circa 15%, circa 0.8% până la circa 14%, circa 0.9% până la circa 12% sau circa 1% până la circa 10% g/g, g/v sau v/v din compoziţia farmaceutică.
Concentraţia TIL prevăzută în compoziţiile farmaceutice din invenţie este în intervalul de la circa 0.001% până la circa 10%, circa 0.01% până la circa 5%, circa 0.02% până la circa 4.5%, circa 0.03% până la circa 4%, circa 0.04% până la circa 3.5%, circa 0.05% până la circa 3%, circa 0.06% până la circa 2.5%, circa 0.07% până la circa 2%, circa 0.08% până la circa 1.5%, circa 0.09% până la circa 1%, circa 0.1% până la circa 0.9% g/g, g/v sau v/v din compoziţia farmaceutică.
Cantitatea de TIL prevăzută în compoziţiile farmaceutice din invenţie este egală cu sau mai mică decât 10 g, 9.5 g, 9.0 g, 8.5 g, 8.0 g, 7.5 g, 7.0 g, 6.5 g, 6.0 g, 5.5 g, 5.0 g, 4.5 g, 4.0 g, 3.5 g, 3.0 g, 2.5 g, 2.0 g, 1.5 g, 1.0 g, 0.95 g, 0.9 g, 0.85 g, 0.8 g, 0.75 g, 0.7 g, 0.65 g, 0.6 g, 0.55 g, 0.5 g, 0.45 g, 0.4 g, 0.35 g, 0.3 g, 0.25 g, 0.2 g, 0.15 g, 0.1 g, 0.09 g, 0.08 g, 0.07 g, 0.06 g, 0.05 g, 0.04 g, 0.03 g, 0.02 g, 0.01 g, 0.009 g, 0.008 g, 0.007 g, 0.006 g, 0.005 g, 0.004 g, 0.003 g, 0.002 g, 0.001 g, 0.0009 g, 0.0008 g, 0.0007 g, 0.0006 g, 0.0005 g, 0.0004 g, 0.0003 g, 0.0002 g sau 0.0001 g.
Cantitatea de TIL prevăzută în compoziţiile farmaceutice din invenţie este mai mare decât 0.0001 g, 0.0002 g, 0.0003 g, 0.0004 g, 0.0005 g, 0.0006 g, 0.0007 g, 0.0008 g, 0.0009 g, 0.001 g, 0.0015 g, 0.002 g, 0.0025 g, 0.003 g, 0.0035 g, 0.004 g, 0.0045 g, 0.005 g, 0.0055 g, 0.006 g, 0.0065 g, 0.007 g, 0.0075 g, 0.008 g, 0.0085 g, 0.009 g, 0.0095 g, 0.01 g, 0.015 g, 0.02 g, 0.025 g, 0.03 g, 0.035 g, 0.04 g, 0.045 g, 0.05 g, 0.055 g, 0.06 g, 0.065 g, 0.07 g, 0.075 g, 0.08 g, 0.085 g, 0.09 g, 0.095 g, 0.1 g, 0.15 g, 0.2 g, 0.25 g, 0.3 g, 0.35 g, 0.4 g, 0.45 g, 0.5 g, 0.55 g, 0.6 g, 0.65 g, 0.7 g, 0.75 g, 0.8 g, 0.85 g, 0.9 g, 0.95 g, 1 g, 1.5 g, 2 g, 2.5, 3 g, 3.5, 4 g, 4.5 g, 5 g, 5.5 g, 6 g, 6.5 g, 7 g, 7.5 g, 8 g, 8.5 g, 9 g, 9.5 g sau 10 g.
TIL prevăzute în compoziţiile farmaceutice din invenţie sunt eficiente într-un interval de dozaj larg. Dozajul exact va depinde de calea de administrare, forma în care se administrează compusul, sexul şi vârsta subiectului tratat, greutatea corporală a subiectului tratat şi preferinţa şi experienţa medicului curant. Se pot folosi dozajele stabilite clinic ale TIL dacă se consideră adecvat. Cantităţile compoziţiilor farmaceutice administrate folosind metodele din prezenta, cum ar fi dozajele TIL, vor depinde de omul sau mamiferul tratat, gravitatea bolii sau afecţiunii, rata de administrare, ingredientele farmaceutice active şi decizia medicului.
TIL se pot administra într-o singură doză. Această administrare se poate realiza prin injecţie, de ex., injecţie intravenoasă. În unele aplicări, TIL se pot administra în doze multiple. Dozajul poate fi o dată, de două ori, de trei ori, de patru ori, de cinci ori, de şase ori sau de mai multe ori pe an. Dozajul poate fi o dată pe lună, o dată la două săptămâni, o dată pe săptămână sau o dată la două zile. Administrarea TIL poate continua atâta timp cât este necesar.
Un dozaj eficient al TIL este circa 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 1×107 2×107, 3×107, 4×107, 5×107 6×107, 7×107, 8×107, 9×107, 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×108, 6×108, 7×108, 8×108, 9×108, 1×109, 2×109, 3×109, 4×109, 5×109, 6×109, 7×109, 8×109, 9×109, 1×1010, 2×1010, 3×1010, 4×1010, 5×1010, 6×1010, 7×1010, 8×1010, 9×1010, 1×1011, 2×1011, 3×1011, 4×1011, 5×1011, 6×1011, 7×1011, 8×1011, 9×1011, 1×1012, 2×1012, 3×1012, 4×1012, 5×1012, 6×1012, 7×1012, 8×1012, 9×1012, 1×1013, 2×1013, 3×1013, 4×1013, 5×1013, 6×1013, 7×1013, 8×1013 şi 9×1013. Un dozaj eficient al TIL este în intervalul de 1×106 până la 5×106, 5×106 până la 1×107 1×107 până la 5×107 5×107 până la 1×108, 1×108 până la 5×108, 5×108 până la 1×109, 1×109 până la 5×109, 5×109 până la 1×1010, 1×1010 până la 5×1010, 5×1010 până la 1×1011, 5×1011 până la 1×1012, 1×1012 până la 5×1012 şi 5×1012 până la 1×1013.
Un dozaj eficient al TIL este în intervalul de circa 0.01 mg/kg până la circa 4.3 mg/kg, circa 0.15 mg/kg până la circa 3.6 mg/kg, circa 0.3 mg/kg până la circa 3.2 mg/kg, circa 0.35 mg/kg până la circa 2.85 mg/kg, circa 0.15 mg/kg până la circa 2.85 mg/kg, circa 0.3 mg până la circa 2.15 mg/kg, circa 0.45 mg/kg până la circa 1.7 mg/kg, circa 0.15 mg/kg până la circa 1.3 mg/kg, circa 0.3 mg/kg până la circa 1.15 mg/kg, circa 0.45 mg/kg până la circa 1 mg/kg, circa 0.55 mg/kg până la circa 0.85 mg/kg, circa 0.65 mg/kg până la circa 0.8 mg/kg, circa 0.7 mg/kg până la circa 0.75 mg/kg, circa 0.7 mg/kg până la circa 2.15 mg/kg, circa 0.85 mg/kg până la circa 2 mg/kg, circa 1 mg/kg până la circa 1.85 mg/kg, circa 1.15 mg/kg până la circa 1.7 mg/kg, circa 1.3 mg/kg mg până la circa 1.6 mg/kg, circa 1.35 mg/kg până la circa 1.5 mg/kg, circa 2.15 mg/kg până la circa 3.6 mg/kg, circa 2.3 mg/kg până la circa 3.4 mg/kg, circa 2.4 mg/kg până la circa 3.3 mg/kg, circa 2.6 mg/kg până la circa 3.15 mg/kg, circa 2.7 mg/kg până la circa 3 mg/kg, circa 2.8 mg/kg până la circa 3 mg/kg sau circa 2.85 mg/kg până la circa 2.95 mg/kg.
Un dozaj eficient al TIL este în intervalul de circa 1 mg până la circa 500 mg, circa 10 mg până la circa 300 mg, circa 20 mg până la circa 250 mg, circa 25 mg până la circa 200 mg, circa 1 mg până la circa 50 mg, circa 5 mg până la circa 45 mg, circa 10 mg până la circa 40 mg, circa 15 mg până la circa 35 mg, circa 20 mg până la circa 30 mg, circa 23 mg până la circa 28 mg, circa 50 mg până la circa 150 mg, circa 60 mg până la circa 140 mg, circa 70 mg până la circa 130 mg, circa 80 mg până la circa 120 mg, circa 90 mg până la circa 110 mg sau circa 95 mg până la circa 105 mg, circa 98 mg până la circa 102 mg, circa 150 mg până la circa 250 mg, circa 160 mg până la circa 240 mg, circa 170 mg până la circa 230 mg, circa 180 mg până la circa 220 mg, circa 190 mg până la circa 210 mg, circa 195 mg până la circa 205 mg sau circa 198 până la circa 207 mg.
O cantitate eficientă a TIL se poate administra într-o singură doză sau în doze multiple prin oricare dintre modurile acceptate de administrare a agenţilor având utilităţi similare, inclusiv cale intranazală şi transdermică, prin injecţie intra-arterială, intravenos, intraperitoneal, parenteral, intramuscular, subcutanat, topic, prin transplant sau prin inhalare.
G. Analize opţionale ale viabilităţii celulare
Opţional, se poate efectua o analiză a viabilităţii celulare după prima expansiune din Etapa B, folosind teste standard cunoscute în domeniu. De exemplu, un test de excludere cu albastru tripan poate fi efectuat pe o probă de TIL în masă, care marchează selectiv celulele moarte şi permite o evaluare a viabilităţii. Alte teste utilizabile în testarea viabilităţii pot include nelimitativ testul cu albastru Alamar; şi testul MTT.
1. Număr de celule, viabilitate, citometrie în flux
În unele aplicări, se măsoară numărul şi/sau viabilitatea celulelor. Expresia markerilor cum ar fi, nelimitativ, CD3, CD4, CD8, şi CD56, precum şi alţii divulgaţi sau descrişi în prezenta, poate fi măsurată prin citometrie în flux cu anticorpi, de exemplu, nelimitativ, cei disponibili în comerţ de la BD Bio-sciences (BD Biosciences, San Jose, CA) folosind un citometru în flux FACSCanto™ (BD Biosciences). Celulele pot fi numărate manual folosind un hemocitometru c-chip de unică folosinţă (VWR, Batavia, IL) şi viabilitatea poate fi determinată folosind orice metodă cunoscută în domeniu, inclusiv, dar nelimitativ colorare cu albastru tripan.
În unele aplicări, TIL sunt analizate cu privire la procentajele populaţiei de celule CD3+. În unele aplicări, TIL utilizabile în tratament sunt analizate cu privire la procentajele populaţiei de celule CD3+. În unele aplicări, TIL sunt TIL CD3+/CD45+. În unele aplicări, procentajul CD3+ este între aproximativ 70% şi aproximativ 99.9%. În unele aplicări, procentajul CD3+ este între aproximativ 74% şi aproximativ 99.9%. În unele aplicări, procentajul CD3+ este între aproximativ 74% şi aproximativ 99.9%. În unele aplicări, procentajul CD3+ este între aproximativ 74% şi aproximativ 97.1%. În unele aplicări, procentajul CD3+ este între aproximativ 80% şi aproximativ 99.9%. În unele aplicări, procentajul CD3+ este între aproximativ 85% şi aproximativ 99.9%. În unele aplicări, procentajul CD3+ este între aproximativ 90% şi aproximativ 99.9%. În unele aplicări, procentajul CD3+ este între aproximativ 85% şi aproximativ 95%. În unele aplicări, procentajul CD3+ este între aproximativ 80% şi aproximativ 95%. În unele aplicări, procentajul CD3+ este între aproximativ 95% şi aproximativ 99.9%. În unele aplicări, procentajul CD3+/CD45+ este între aproximativ 70% şi aproximativ 99.9%. În unele aplicări, procentajul CD3+/CD45+ este între aproximativ 74% şi aproximativ 99.9%. În unele aplicări, procentajul CD3+/CD45+ este între aproximativ 74% şi aproximativ 99.9%. În unele aplicări, procentajul CD3+/CD45+ este între aproximativ 74% şi aproximativ 97.1%. În unele aplicări, procentajul CD3+/CD45+ este între aproximativ 80% şi aproximativ 99.9%. În unele aplicări, procentajul CD3+/CD45+ este între aproximativ 85% şi aproximativ 99.9%. În unele aplicări, procentajul CD3+/CD45+ este între aproximativ 90% şi aproximativ 99.9%. În unele aplicări, procentajul CD3+/CD45+ este între aproximativ 85% şi aproximativ 95%. În unele aplicări, procentajul CD3+/CD45+ este între aproximativ 80% şi aproximativ 95%. În unele aplicări, procentajul CD3+/CD45+ este între aproximativ 95% şi aproximativ 99.9%.
În unele cazuri, populaţia TIL în masă poate fi crioconservată imediat, folosind protocoalele discutate mai jos. Alternativ, populaţia TIL în masă poate fi supusă REP şi apoi crioconservată aşa cum se discută mai jos. În mod similar, în cazul în care se vor folosi TIL modificate genetic în terapie, populaţiile TIL în masă sau REP pot fi supuse modificărilor genetice pentru tratamente adecvate.
2. Culturi celulare
Într-o aplicare, o metodă de expansiune TIL poate include folosirea a circa 5.000 mL până la circa 25.000 mL de mediu celular, circa 5.000 mL până la circa 10.000 mL de mediu celular sau circa 5.800 mL până la circa 8.700 mL de mediu celular. Într-o aplicare, amplificarea numărului de TIL utilizează nu mai mult de un tip de mediu de cultură celulară. Se poate folosi orice mediu de cultură celulară adecvat, de ex., mediu AIM-V (L-glutamină, 50 µM streptomicină sulfat şi 10 µM gentamicină sulfat) (Invitrogen, Carlsbad CA). În această privinţă, metodele din invenţie reduc în mod avantajos cantitatea de mediu şi numărul tipurilor de mediu necesare pentru amplificarea numărului de TIL. Într-o aplicare, amplificarea numărului de TIL poate cuprinde adăugarea mediului de cultură celulară proaspăt în celule (denumită şi hrănirea celulelor) nu mai frecvent decât o dată la trei sau patru zile. Amplificarea numărului de celule într-un recipient permeabil la gaz simplifică procedurile necesare pentru amplificarea numărului de celule prin reducerea frecvenţei de hrănire necesare pentru amplificarea celulelor.
Într-o aplicare, mediul celular din primul şi/sau al doilea recipient permeabil la gaz este nefiltrat. Folosirea mediului celular nefiltrat poate simplifica procedurile necesare pentru a amplifica numărul celulelor. Într-o aplicare, mediul celular din primul şi/sau al doilea recipient permeabil la gaz este lipsit de beta-mercaptoetanol (BME).
Într-o aplicare, durata metodei cuprinzând obţinerea unei probe tisulare tumorale de la mamifer; cultivarea probei tisulare tumorale într-un prim recipient permeabil la gaz conţinând mediul celular; obţinerea TIL din proba tisulară tumorală; amplificarea numărului TIL într-un al doilea recipient permeabil la gaz conţinând mediul celular folosind aAPC pe o durată de circa 14 până la circa 42 zile, de ex., circa 28 zile.
Într-o aplicare, TIL sunt amplificate în vase permeabile la gaz. Vasele permeabile la gaz se folosesc pentru amplificarea TIL folosind PBMC prin intermediul metodelor, compoziţiilor şi dispozitivelor cunoscute în domeniu, inclusiv cele descrise în documentaţia cererii de brevet U.S. nr. 2005/0106717 A1. Într-o aplicare, TIL sunt amplificate în recipiente permeabile la gaz. Într-o aplicare, TIL sunt amplificate folosind un sistem de expansiune celulară care amplifică TIL în recipiente permeabile la gaz, cum ar fi Xuri Cell Expansion System W25 (GE Healthcare). Într-o aplicare, TIL sunt amplificate folosind un sistem de expansiune celulară care amplifică TIL în recipiente permeabile la gaz, cum ar fi WAVE Bioreactor System, cunoscut şi ca Xuri Cell Expansion System W5 (GE Healthcare). Într-o aplicare, sistemul de expansiune celulară include un recipient celular permeabil la gaz cu un volum selectat din grupul constând din circa 100 mL, circa 200 mL, circa 300 mL, circa 400 mL, circa 500 mL, circa 600 mL, circa 700 mL, circa 800 mL, circa 900 mL, circa 1 L, circa 2 L, circa 3 L, circa 4 L, circa 5 L, circa 6 L, circa 7 L, circa 8 L, circa 9 L şi circa 10 L. Într-o aplicare, TIL pot fi amplificate în baloane G-Rex (disponibile în comerţ de la Wilson Wolf Manufacturing). Aceste aplicări permit amplificarea populaţiilor celulare de la circa 5x105 celule/cm2 la între 10x106 şi 30x106 celule/cm2. Într-o aplicare, această expansiune se efectuează fără adăugarea mediului de cultură celulară proaspăt în celule (denumită şi hrănirea celulelor). Într-o aplicare, aceasta se efectuează fără hrănire atâta vreme cât mediul persistă la o înălţime de circa 10 cm în balonul G-Rex. Într-o aplicare, aceasta se efectuează fără hrănire, dar cu adăugarea uneia sau mai multor citokine. Într-o aplicare, citokinele pot fi adăugate în bolus fără necesitatea amestecării citokinelor cu mediul. Aceste recipiente, dispozitive şi metode se cunosc în domeniu, se utilizează pentru amplificarea TIL şi le includ pe cele descrise în documentaţia cererii de brevet U.S. nr. US 2014/0377739A1, documentaţia internaţională nr. WO 2014/210036 A1, documentaţia cererii de brevet U.S. nr. us 2013/0115617 A1, documentaţia internaţională nr. WO 2013/188427 A1, documentaţia cererii de brevet U.S. nr. US 2011/0136228 A1, brevetul U.S. nr. US 8,809,050 B2, documentaţia internaţională nr. WO 2011/072088 A2, documentaţia cererii de brevet U.S. nr. US 2016/0208216 A1, documentaţia cererii de brevet U.S. nr. US 2012/0244133 A1, documentaţia internaţională nr. WO 2012/129201 A1, documentaţia cererii de brevet U.S. nr. US 2013/0102075 A1, brevetul U.S. nr. US 8,956,860 B2, documentaţia internaţională nr. WO 2013/173835 A1, documentaţia cererii de brevet U.S. nr. US 2015/0175966 A1. Aceste procese sunt de asemenea descrise în Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292.
Modificarea genetică opţională a TIL
În unele aplicări, TIL sunt opţional modificate genetic pentru a include alte funcţionalităţi, inclusiv, dar nelimitativ, un receptor T celular de mare afinitate (TCR), de ex., un TCR direcţionat la un antigen asociat cu tumoare cum ar fi MAGE-1, HER2 sau NY-ESO-1, sau un receptor antigenic himeric (CAR) care se leagă de o moleculă de suprafaţa celulară asociată cu tumoare (de ex., mezotelina) sau o moleculă de suprafaţa celulară restricţionată de origine (de ex., CD19).
H. Crioconservare opţională TIL
Aşa cum se discută mai sus şi se exemplifică în Etapele A - E prevăzute în Figura 27, crioconservarea poate avea loc în numeroase puncte în cadrul procesului de expansiune TIL. În unele aplicări, populaţia TIL amplificată după a doua expansiune (prevăzută de exemplu conform etapei D din Figura 27) poate fi crioconservată. Crioconservarea se poate realiza în general prin aşezarea populaţiei TIL într-o soluţie de congelare, de ex., 85% ser AB inactivat cu complement şi 15% dimetil sulfoxid (DMSO). Celulele din soluţie se introduc în fiole criogenice şi se depozitează 24 de ore la -80°C, cu transfer opţional în congelatoare cu azot gazos pentru crioconservare. Vezi Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986. În unele aplicări, TIL sunt crioconservate in 5% DMSO. În unele aplicări, TIL sunt crioconservate în mediul de cultură celulară plus 5% DMSO. În unele aplicări, TIL sunt crioconservate conform metodelor prevăzute în Exemplele 8 şi 9.
Când este cazul, celulele se îndepărtează din congelator şi sunt decongelate într-o baie de apă la 37°C până când se dezgheaţă aproximativ 4/5 din soluţie. Celulele sunt în general resuspendate în mediu complet şi opţional spălate o dată sau de mai multe ori. În unele aplicări, TIL decongelate pot fi numărate şi testate cu privire la viabilitate, aşa cum se cunoaşte în domeniu.
I. Caracteristici fenotipice ale TIL amplificate
În unele aplicări, TIL se analizează cu privire la expresia numeroaselor markerilor fenotipici după expansiune, inclusiv cei descrişi în prezenta şi în exemple. Într-o aplicare, se examinează expresia unuia sau mai multor markeri fenotipici. În unele aplicări, caracteristicile fenotipice ale TIL se analizează după prima expansiune în etapa B. În unele aplicări, caracteristicile fenotipice ale TIL se analizează în timpul tranziţiei în etapa C. În unele aplicări, caracteristicile fenotipice ale TIL se analizează în timpul tranziţiei din etapa C şi după crioconservare. În unele aplicări, caracteristicile fenotipice ale TIL se analizează după a doua expansiune conform etapei D. În unele aplicări, caracteristicile fenotipice ale TIL se analizează după două sau mai multe expansiuni conform etapei D. În unele aplicări, markerul este selectat din grupul constând din TCRab (i.e., TCRα/β/), CD57, CD28, CD4, CD27, CD56, CD8a, CD45RA, CD8a, CCR7, CD4, CD3, CD38 şi HLA-DR. În unele aplicări, markerul este selectat din grupul constând din TCRab (i.e., TCRα/β), CD57, CD28, CD4, CD27, CD56 şi CD8a. Într-o aplicare, markerul este selectat din grupul constând din CD45RA, CD8a, CCR7, CD4, CD3, CD38 şi HLA-DR. În unele aplicări, se examinează expresia unuia, a doi, trei, patru, cinci, şase, şapte, opt, nouă, zece, unsprezece, doisprezece, treisprezece sau paisprezece markeri. În unele aplicări, se examinează expresia unuia sau mai multor markeri din fiecare grup. În unele aplicări, una sau mai multe dintre expresia HLA-DR, CD38 şi CD69 se menţin (i.e., nu prezintă o diferenţă statistic semnificativă) în TIL proaspete faţă de TIL decongelate. În unele aplicări, starea de activare TIL se menţine în TIL.
Într-o aplicare, se măsoară expresia unuia sau mai multor markeri regulatori. În unele aplicări, markerul regulator este selectat din grupul constând din CD137, CD8a, Lag3, CD4, CD3, PD-1, TIM-3, CD69, CD8a, TIGIT, CD4, CD3, KLRG1 şi CD154. În unele aplicări, markerul regulator este selectat din grupul constând din CD137, CD8a, Lag3, CD4, CD3, PD-1 şi TIM-3. În unele aplicări, markerul regulator este selectat din grupul constând din CD69, CD8a, TIGIT, CD4, CD3, KLRG1 şi CD154. În unele aplicări, expresia moleculelor regulatoare este scăzută în TIL decongelate faţă de TIL proaspete. În unele aplicări, expresia moleculelor regulatoare LAG-3 şi TIM-3 este scăzută în TIL decongelate faţă de TIL proaspete. În unele aplicări, nu există diferenţă semnificativă în expresia CD4, CD8, NK, TCRαβ. În unele aplicări, nu există diferenţă semnificativă în expresia CD4, CD8, NK, TCRαβ şi/sau a markerilor de memorie în TIL proaspete faţă de TIL decongelate. În unele aplicări, nu există diferenţă semnificativă în expresia CD4, CD8, NK, TCRαβ între TIL produse prin metodele prevăzute în prezenta, exemplificate în Figura 27, şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27.
Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, nu se realizează selecţie a primei populaţii de TIL, a celei de-a doua populaţii de TIL, a celei de-a treia populaţii de TIL, a populaţiei TIL recoltate şi/sau a populaţiei TIL terapeutice pe baza expresiei CD4, CD8 şi/sau NK, TCRαβ în nici o etapă, inclusiv cele discutate mai sus sau prevăzute de exemplu în Figura 27. În unele aplicări, nu se realizează selecţie a primei populaţii de TIL pe baza CD4, CD8 şi/sau NK, TCRαβ. În unele aplicări, nu se realizează selecţie a celei de-a doua populaţii de TIL pe baza expresiei CD4, CD8 şi/sau NK, TCRαβ. În unele aplicări, nu se realizează selecţie a celei de-a treia populaţii de TIL pe baza expresiei CD4, CD8 şi/sau NK, TCRαβ. În unele aplicări, nu se realizează selecţie a populaţiei recoltate de TIL pe baza expresiei CD4, CD8 şi/sau NK, TCRαβ. În unele aplicări, nu se realizează selecţie a populaţiei terapeutice de TIL pe baza expresiei CD4, CD8 şi/sau NK, TCRαβ.
În anumite exemple, nu se realizează selecţie a primei populaţii de TIL, a celei de-a doua populaţii de TIL, a celei de-a treia populaţii de TIL sau a populaţiei TIL recoltate pe baza expresiei CD4, CD8 şi/sau NK, TCRαβ în nici una dintre etapele (a) - (f) ale metodei de expansiune a limfocitelor infiltrante în tumori (TIL) într-o populaţie terapeutică de TIL cuprinzând:
(a) obţinerea unei prime populaţii de TIL dintr-o tumoare rezecată de la un pacient prin procesarea unei probe tumorale obţinute de la pacient în mai multe fragmente tumorale;
(b) adăgarea fragmentelor tumorale într-un sistem închis;
(c) efectuarea unei prime expansiuni prin cultivarea primei populaţii de TIL într-un mediu de cultură celulară cuprinzând IL-2 pentru a produce o a doua populaţie de TIL, unde prima expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o primă suprafaţă permeabilă la gaz, unde prima expansiune se efectuează timp de circa 3-14 zile pentru a obţine a doua populaţie de TIL, unde a doua populaţie de TIL are un număr de cel puţin 50 de ori mai mare decât prima populaţie de TIL şi unde tranziţia de la etapa (b) la etapa (c) are loc fără deschiderea sistemului;
(d) efectuarea unei a doua expansiuni prin suplimentarea mediului de cultură celulară al celei de-a doua populaţii de TIL cu IL-2 suplimentar, OKT-3 şi celule de prezentare a antigenului (APC), pentru a produce o a treia populaţie de TIL, unde a doua expansiune se efectuează timp de circa 7-14 zile pentru a obţine a treia populaţie de TIL, unde a treia populaţie de TIL este o populaţie terapeutică de TIL cuprinzând o subpopulaţie mărită de celule T efectoare şi/sau celule T de memorie centrală faţă de a doua populaţie de TIL, unde a doua expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o a doua suprafaţă permeabilă la gaz şi unde tranziţia de la etapa (c) la etapa (d) are loc fără deschiderea sistemului;
(e) recoltarea populaţiei terapeutice de TIL obţinute de la etapa (d), unde tranziţia de la etapa (d) la etapa (e) are loc fără deschiderea sistemului; şi
(f) transferul populaţiei TIL recoltate de la etapa (e) într-o pungă de perfuzie, unde transferul de la etapa (e) la (f) are loc fără deschiderea sistemului.
Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, nu se realizează selecţie a primei populaţii de TIL, a celei de-a doua populaţii de TIL, a celei de-a treia populaţii de TIL sau a populaţiei TIL recoltate pe baza expresiei CD4, CD8 şi/sau NK, TCRαβ în nici una dintre etapele (a) - (h) ale metodei de tratare a unui subiect cu cancer, metoda cuprinzând administrarea limfocitelor infiltrante în tumori (TIL) amplificate cuprinzând:
(a) obţinerea unei prime populaţii de TIL dintr-o tumoare rezecată de la un subiect prin procesarea unei probe tumorale obţinute de la pacient în mai multe fragmente tumorale;
(b) adăgarea fragmentelor tumorale într-un sistem închis;
(c) efectuarea unei prime expansiuni prin cultivarea primei populaţii de TIL într-un mediu de
cultură celulară cuprinzând IL-2 pentru a produce o a doua populaţie de TIL, unde prima expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o primă suprafaţă permeabilă la gaz, unde prima expansiune se efectuează timp de circa 3-14 zile pentru a obţine a doua populaţie de TIL, unde a doua populaţie de TIL are un număr de cel puţin 50 de ori mai mare decât prima populaţie de TIL şi unde tranziţia de la etapa (b) la etapa (c) are loc fără deschiderea sistemului;
(d) efectuarea unei a doua expansiuni prin suplimentarea mediului de cultură celulară al celei de-a doua populaţii de TIL cu IL-2 suplimentar, OKT-3 şi celule de prezentare a antigenului (APC), pentru a produce o a treia populaţie de TIL, unde a doua expansiune se efectuează timp de circa 7-14 zile pentru a obţine a treia populaţie de TIL, unde a treia populaţie de TIL este o populaţie terapeutică de TIL cuprinzând o subpopulaţie mărită de celule T efectoare şi/sau celule T de memorie centrală faţă de a doua populaţie de TIL, unde a doua expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o a doua suprafaţă permeabilă la gaz şi unde tranziţia de la etapa (c) la etapa (d) are loc fără deschiderea sistemului;
(e) recoltarea populaţiei terapeutice de TIL obţinute de la etapa (d), unde tranziţia de la etapa (d) la etapa (e) are loc fără deschiderea sistemului; şi
(f) transferul populaţiei TIL recoltate de la etapa (e) într-o pungă de perfuzie, unde transferul de la etapa (e) la (f) are loc fără deschiderea sistemului;
(g) opţional crioconservarea pungii de perfuzie cuprinzând populaţia TIL recoltată de la etapa (f) folosind un proces de crioconservare; şi
(h) administrarea unui dozaj terapeutic eficient din a treia populaţie de TIL din punga de perfuzie în etapa (g) la pacient.
În unele aplicări, markerul de memorie este selectat din grupul constând din CCR7 şi CD62L
În unele aplicări, viabilitatea TIL proaspete faţă de TIL decongelate este cel puţin 70%, cel puţin 75%, cel puţin 80%, cel puţin 85%, cel puţin 90%, cel puţin 95% sau cel puţin 98%. În unele aplicări, viabilitatea a TIL atât proaspete, cât şi decongelate este mai mare de 70%, mai mare de 75%, mai mare de 80%, mai mare de 85%, mai mare de 90%, mai mare de 95% sau mai mare de 98%. În unele aplicări, viabilitatea produsului atât proaspăt, cât şi decongelat este mai mare de 80%, mai mare de 81%, mai mare de 82%, mai mare de 83%, mai mare de 84%, mai mare de 85%, mai mare de 86%, mai mare de 87%, mai mare de 88%, mai mare de 89% sau mai mare de 90%. În unele aplicări, viabilitatea produsului atât proaspăt, cât şi decongelat este mai mare de 86%.
Într-o aplicare, TIL restimulate pot fi evaluate de asemenea cu privire la eliberarea citokinelor, folosind teste de eliberare a citokinelor. În unele aplicări, TIL pot fi evaluate cu privire la secreţia interferon-7 (IFN-7) în răspuns la stimulare cu OKT3 sau co-cultură cu digestie tumorală autologă. De exemplu, în aplicările care utilizează stimulare OKT3, TIL sunt bine spălate şi se prepară godeuri în duplicat cu 1 x 105 celule în 0.2 mL CM în plăci cu 96 de godeuri cu fund plat, preacoperite cu 0.1 sau 1.0 µg/mL OKT3 diluat în ser fiziologic tamponat cu fosfat. După incubare peste noapte, supernatanţii sunt recoltaţi şi IFN-7 din supernatant se măsoară prin ELISA (Pierce/Endogen, Woburn, MA). Pentru testul de co-cultură, se introduc 1 x 105 celule TIL într-o placă cu 96 de godeuri cu celule tumorale autologe (raport 1:1). După incubare 24 de ore, supernatanţii sunt recoltaţi şi eliberarea IFN-7 poate fi cuantificată, de exemplu prin ELISA.
Analiza citometrică în flux a biomarkerilor de suprafaţă celulară: probele TIL au fost împărţite în părţi alicote pentru analiza citometrică în flux a markerilor de suprafaţă celulară, de exemplu vezi Exemplele 7, 8 şi 9.
În unele aplicări, TIL sunt evaluate cu privire la diferiţi markeri regulatori. În unele aplicări, markerul regulator este selectat din grupul constând din TCR α/β, CD56, CD27, CD28, CD57, CD45RA, CD45RO, CD25, CD127, CD95, IL-2R-, CCR7, CD62L, KLRG1 şi CD122. În unele aplicări, markerul regulator este TCR α/β. În unele aplicări, markerul regulator este CD56. În unele aplicări, markerul regulator este CD27. În unele aplicări, markerul regulator este CD28. În unele aplicări, markerul regulator este CD57. În unele aplicări, markerul regulator este CD45RA. În unele aplicări, markerul regulator este CD45RO. În unele aplicări, markerul regulator este CD25. În unele aplicări, markerul regulator este CD127. În unele aplicări, markerul regulator este CD95. În unele aplicări, markerul regulator este IL-2R-. În unele aplicări, markerul regulator este CCR7. În unele aplicări, markerul regulator este CD62L. În unele aplicări, markerul regulator este KLRG1. În unele aplicări, markerul regulator este CD122.
Într-o aplicare, TIL amplificate sunt analizate cu privire la expresia diferiţilor markeri fenotipici, inclusiv cei descrişi în prezenta şi în exemple. Într-o aplicare, se examinează expresia unuia sau mai multor markeri fenotipici. În unele aplicări, markerul este selectat din grupul constând din TCRab (i.e., TCRα/β), CD57, CD28, CD4, CD27, CD56, CD8a, CD45RA, CD8a, CCR7, CD4, CD3, CD38 şi HLA-DR. În unele aplicări, markerul este selectat din grupul constând din TCRab (i.e., TCRα/β), CD57, CD28, CD4, CD27, CD56 şi CD8a. Într-o aplicare, markerul este selectat din grupul constând din CD45RA, CD8a, CCR7, CD4, CD3, CD38 şi HLA-DR. În unele aplicări, se examinează expresia unuia, a doi, trei, patru, cinci, şase, şapte, opt, nouă, zece, unsprezece, doisprezece, treisprezece sau paisprezece markeri. În unele aplicări, se examinează expresia unuia sau mai multor markeri din fiecare grup. În unele aplicări, expresia unuia sau mai multora dintre HLA-DR, CD38 şi CD69 se menţine (i.e., nu prezintă diferenţă statistic semnificativă) în TIL proaspete faţă de TIL decongelate. În unele aplicări, starea de activare a TIL se menţine în TIL decongelate.
Într-o aplicare, se măsoară expresia unuia sau mai multor markeri regulatori. În unele aplicări, markerul regulator este selectat din grupul constând din CD137, CD8a, Lag3, CD4, CD3, PD1, TIM-3, CD69, CD8a, TIGIT, CD4, CD3, KLRG1 şi CD154. În unele aplicări, markerul regulator este selectat din grupul constând din CD137, CD8a, Lag3, CD4, CD3, PD1 şi TIM-3. În unele aplicări, markerul regulator este selectat din grupul constând din CD69, CD8a, TIGIT, CD4, CD3, KLRG1 şi CD154. În unele aplicări, expresia moleculelor regulatoare este scăzută în TIL decongelate faţă de TIL proaspete. În unele aplicări, expresia moleculelor regulatoare LAG-3 şi TIM-3 este scăzută în TIL decongelate faţă de TIL proaspete. În unele aplicări, nu există diferenţă semnificativă în expresia CD4, CD8, NK, TCRαβ. În unele aplicări, nu există diferenţă semnificativă în expresia CD4, CD8, NK, TCRαβ şi/sau a markerilor de memorie în TIL proaspete faţă de TIL decongelate.
În unele aplicări markerul de memorie este selectat din grupul constând din CCR7 şi CD62L.
În unele aplicări, viabilitatea TIL proaspete faţă de TIL decongelate este cel puţin 70%, cel puţin 75%, cel puţin 80%, cel puţin 85%, cel puţin 90%, cel puţin 95% sau cel puţin 98%. În unele aplicări, viabilitatea a TIL atât proaspete, cât şi decongelate este mai mare de 70%, mai mare de 75%, mai mare de 80%, mai mare de 85%, mai mare de 90%, mai mare de 95% sau mai mare de 98%. În unele aplicări, viabilitatea produsului atât proaspăt, cât şi decongelat este mai mare de 80%, mai mare de 81%, mai mare de 82%, mai mare de 83%, mai mare de 84%, mai mare de 85%, mai mare de 86%, mai mare de 87%, mai mare de 88%, mai mare de 89% sau mai mare de 90%. În unele aplicări, viabilitatea produsului atât proaspăt, cât şi decongelat este mai mare de 86%.
Într-o aplicare, TIL restimulate pot fi evaluate de asemenea cu privire la eliberarea citokinelor, folosind teste de eliberare a citokinelor. În unele aplicări, TIL pot fi evaluate cu privire la secreţia interferon-7 (IFN-7) în răspuns la stimulare cu OKT3 sau co-cultură cu digestie tumorală autologă. De exemplu, în aplicări care utilizează stimulare OKT3, TIL sunt bine spălate şi se prepară godeuri în duplicat cu 1 x 105 celule în 0.2 mL CM în plăci cu 96 de godeuri cu fund plat, preacoperite cu 0.1 sau 1.0 µg/mL OKT3 diluat în ser fiziologic tamponat cu fosfat. După incubare peste noapte, supernatanţii sunt recoltaţi şi IFN-7 din supernatant se măsoară prin ELISA (Pierce/Endogen, Woburn, MA). Pentru testul de co-cultură, 1 x 105 celule TIL sunt aşezate într-o placă cu 96 de godeuri cu celule tumorale autologe (raport 1:1). După o incubare de 24 de ore, supernatanţii sunt recoltaţi şi eliberarea IFN-7 poate fi cuantificată, de exemplu prin ELISA.
În unele aplicări, caracterizarea fenotipică se examinează după crioconservare.
J. Sănătatea metabolică a TIL amplificate
TIL restimulate se caracterizează prin creşterea semnificativă a glicolizei bazale faţă de TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL post-decongelate. Într-o aplicare, nu se realizează selecţie a primei populaţii de TIL, a celei de-a doua populaţii de TIL, a celei de-a treia populaţii de TIL, a populaţiei TIL recoltate şi/sau a populaţiei TIL terapeutice pe baza expresiei CD8 în nici o etapă, inclusiv cele discutate mai sus sau prevăzute de exemplu în Figura 27. În unele aplicări, nu se realizează selecţie a primei populaţii de TIL pe baza expresiei CD8. În unele aplicări, nu se realizează selecţie a celei de-a doua populaţii de TIL pe baza expresiei CD8. În unele aplicări, nu se realizează selecţie a celei de-a treia populaţii de TIL pe baza expresiei CD8. În unele aplicări, nu se realizează selecţie a populaţiei recoltate de TIL pe baza expresiei CD8. În unele aplicări, nu se realizează selecţie a populaţiei terapeutice de TIL pe baza expresiei CD8.
Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, nu se realizează selecţie a primei populaţii de TIL, a celei de-a doua populaţii de TIL, a celei de-a treia populaţii de TIL sau a populaţiei TIL recoltate pe baza expresiei CD8 în nici una dintre etapele (a) - (f) ale metodei de expansiune a limfocitelor infiltrante în tumori (TIL) într-o populaţie terapeutică de TIL cuprinzând:
(a) obţinerea unei prime populaţii de TIL dintr-o tumoare rezecată de la un pacient prin procesarea unei probe tumorale obţinute de la pacient în mai multe fragmente tumorale;
(b) adăgarea fragmentelor tumorale într-un sistem închis;
(c) efectuarea unei prime expansiuni prin cultivarea primei populaţii de TIL într-un mediu de cultură celulară cuprinzând IL-2 pentru a produce o a doua populaţie de TIL, unde prima expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o primă suprafaţă permeabilă la gaz, unde prima expansiune se efectuează timp de circa 3-14 zile pentru a obţine a doua populaţie de TIL, unde a doua populaţie de TIL are un număr de cel puţin 50 de ori mai mare decât prima populaţie de TIL şi unde tranziţia de la etapa (b) la etapa (c) are loc fără deschiderea sistemului;
(d) efectuarea unei a doua expansiuni prin suplimentarea mediului de cultură celulară al celei de-a doua populaţii de TIL cu IL-2 suplimentar, OKT-3 şi celule de prezentare a antigenului (APC), pentru a produce o a treia populaţie de TIL, unde a doua expansiune se efectuează timp de circa 7-14 zile pentru a obţine a treia populaţie de TIL, unde a treia populaţie de TIL este o populaţie terapeutică de TIL cuprinzând o subpopulaţie mărită de celule T efectoare şi/sau celule T de memorie centrală faţă de a doua populaţie de TIL, unde a doua expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o a doua suprafaţă permeabilă la gaz şi unde tranziţia de la etapa (c) la etapa (d) are loc fără deschiderea sistemului;
(e) recoltarea populaţiei terapeutice de TIL obţinute de la etapa (d), unde tranziţia de la etapa (d) la etapa (e) are loc fără deschiderea sistemului; şi
(f) transferul populaţiei TIL recoltate de la etapa (e) într-o pungă de perfuzie, unde transferul de la etapa (e) la (f) are loc fără deschiderea sistemului.
Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, nu se realizează selecţie a primei populaţii de TIL, a celei de-a doua populaţii de TIL, a celei de-a treia populaţii de TIL sau a populaţiei TIL recoltate pe baza expresiei CD8 în nici una dintre etapele (a) - (h) ale metodei de tratare a unui subiect cu cancer, metoda cuprinzând administrarea limfocitelor infiltrante în tumori (TIL) amplificate cuprinzând:
(a) obţinerea unei prime populaţii de TIL dintr-o tumoare rezecată de la un subiect prin procesarea unei probe tumorale obţinute de la pacient în mai multe fragmente tumorale;
(b) adăgarea fragmentelor tumorale într-un sistem închis;
(c) efectuarea unei prime expansiuni prin cultivarea primei populaţii de TIL într-un mediu de cultură celulară cuprinzând IL-2 pentru a produce o a doua populaţie de TIL, unde prima expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o primă suprafaţă permeabilă la gaz, unde prima expansiune se efectuează timp de circa 3-14 zile pentru a obţine a doua populaţie de TIL, unde a doua populaţie de TIL are un număr de cel puţin 50 de ori mai mare decât prima populaţie de TIL şi unde tranziţia de la etapa (b) la etapa (c) are loc fără deschiderea sistemului;
(d) efectuarea unei a doua expansiuni prin suplimentarea mediului de cultură celulară al celei de-a doua populaţii de TIL cu IL-2 suplimentar, OKT-3 şi celule de prezentare a antigenului (APC), pentru a produce o a treia populaţie de TIL, unde a doua expansiune se efectuează timp de circa 7-14 zile pentru a obţine a treia populaţie de TIL, unde a treia populaţie de TIL este o populaţie terapeutică de TIL cuprinzând o subpopulaţie mărită de celule T efectoare şi/sau celule T de memorie centrală faţă de a doua populaţie de TIL, unde a doua expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o a doua suprafaţă permeabilă la gaz şi unde tranziţia de la etapa (c) la etapa (d) are loc fără deschiderea sistemului;
(e) recoltarea populaţiei terapeutice de TIL obţinute de la etapa (d), unde tranziţia de la etapa (d) la etapa (e) are loc fără deschiderea sistemului; şi
(f) transferul populaţiei TIL recoltate de la etapa (e) într-o pungă de perfuzie, unde transferul de la etapa (e) la (f) are loc fără deschiderea sistemului;
(g) opţional crioconservarea pungii de perfuzie cuprinzând populaţia TIL recoltată de la etapa (f) folosind un proces de crioconservare; şi
(h) administrarea unui dozaj terapeutic eficient din a treia populaţie de TIL din punga de perfuzie în etapa (g) la pacient.
TIL preparate prin metodele descrise în prezenta se caracterizează prin creşterea semnificativă a glicolizei bazale în comparaţie, de exemplu, cu TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. Într-o metodă divulgată în prezenta, nu se realizează selecţie a primei populaţii de TIL, a celei de-a doua populaţii de TIL, a celei de-a treia populaţii de TIL, a populaţiei TIL recoltate şi/sau a populaţiei TIL terapeutice pe baza expresiei CD8 în nici o etapă, inclusiv cele discutate mai sus sau prevăzute de exemplu în Figura 27. Într-o metodă divulgată în prezenta, nu se realizează selecţie a primei populaţii de TIL pe baza expresiei CD8. În unele aplicări, nu se realizează selecţie a celei de-a doua populaţii de TIL pe baza expresiei CD8. Într-o metodă divulgată în prezenta, nu se realizează selecţie a celei de-a treia populaţii de TIL pe baza expresiei CD8. Într-o metodă divulgată în prezenta, nu se realizează selecţie a populaţiei recoltate de TIL pe baza expresiei CD8. Într-o metodă divulgată în prezenta, nu se realizează selecţie a populaţiei terapeutice de TIL pe baza expresiei CD8. Într-o metodă divulgată în prezenta, nu se realizează selecţie a primei populaţii de TIL, a celei de-a doua populaţii de TIL, a celei de-a treia populaţii de TIL sau a populaţiei TIL recoltate pe baza expresiei CD8 în nici una dintre etapele (a) - (h).
Capacitatea respiratorie de rezervă (SRC) şi rezerva glicolitică pot fi evaluate pentru TIL amplificate cu diferite metode din prezenta invenţie. Testul Seahorse XF Cell Mito Stress Test măsoară funcţia mitocondrială prin măsurarea directă a ratei de consum al oxigenului (OCR) a celulelor, folosind modulatori ai respiraţiei care ţintesc componente ale lanţului de transport al electronilor în mitocondrii. Compuşii de testare (oligomicina, FCCP şi un amestec de rotenonă şi antimicina A, aşa cum se descrie mai jos) se injectează în serie pentru a măsura producţia ATP, respiraţia maximă şi respiraţia non-mitocondrială. Se calculează apoi scurgerea protonilor şi capacitatea respiratorie de rezervă folosind aceşti parametri şi respiraţia bazală. Fiecare modulator ţinteşte o componentă specifică a lanţului de transport al electronilor. Oligomicina inhibă ATP sintaza (complexul V) şi scăderea OCR după injecţia cu oligomicină se corelează cu respiraţia mitocondrială asociată cu producţia ATP celulară. Carbonil cianura-4 (trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP) este un agent de decuplare care distruge gradientul protonilor şi potenţialul membranar mitocondrial. Prin urmare, fluxul electronilor prin lanţul de transport al electronilor este neinhibat şi oxigenul este consumat maxim de complexul IV. OCR stimulată de FCCP se poate folosi apoi pentru a calcula capacitatea respiratorie de rezervă, definită ca diferenţa între respiraţia maximă şi respiraţia bazală. Capacitatea respiratorie de rezervă (SRC) măsoară capacitatea celulei de a răspunde la necesar energetic mărit. A treia injecţie este un amestec de rotenonă, un inhibitor de complex I şi antimicina A, un inhibitor de complex III. Această combinaţie opreşte respiraţia mitocondrială şi permite calculul respiraţiei non-mitocondriale activate de procese în afara mitocondriilor. În unele aplicări, compararea se face, de exemplu, cu TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27.
În unele aplicări, testul metabolic este respiraţia bazală. În general, TIL din a doua expansiune au o rată a respiraţiei bazale de cel puţin 50%, cel puţin 55%, cel puţin 60%, cel puţin 65%, cel puţin 70%, cel puţin 75%, cel puţin 80%, cel puţin 85%, cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 97%, cel puţin 98% sau cel puţin 99% din rata respiraţiei bazale a TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, rata respiraţiei bazale este de la circa 50% până la circa 99% din rata respiraţiei bazale a TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, rata respiraţiei bazale este de la circa 60% până la circa 99% din rata respiraţiei bazale a TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, rata respiraţiei bazale este de la circa 70% până la circa 99% din rata respiraţiei bazale a TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, rata respiraţiei bazale este de la circa 80% până la circa 99% din rata respiraţiei bazale a TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, rata respiraţiei bazale este de la circa 90% până la circa 99% din rata respiraţiei bazale a TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, rata respiraţiei bazale este de la circa 95% până la circa 99% din rata respiraţiei bazale a TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, TIL din a doua expansiune sau TIL din a doua expansiune suplimentară (cum ar fi, de exemplu, cele descrise în etapa D din Figura 27, inclusiv TIL denumite TIL reREP) au o rată a respiraţiei bazale care nu este diferită semnificativ statistic de rata respiraţiei bazale a TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, compararea se face, de exemplu, cu TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27.
În unele aplicări, testul metabolic este capacitatea respiratorie de rezervă. În general, TIL din a doua expansiune sau TIL din a doua expansiune suplimentară (cum ar fi, de exemplu, cele descrise în etapa D din Figura 27, inclusiv TIL denumite TIL reREP) au o capacitate respiratorie de rezervă de cel puţin 50%, cel puţin 55%, cel puţin 60%, cel puţin 65%, cel puţin 70%, cel puţin 75%, cel puţin 80%, cel puţin 85%, cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 97%, cel puţin 98% sau cel puţin 99% din rata respiraţiei bazale a TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, capacitatea respiratorie de rezervă este de la circa 50% până la circa 99% din rata respiraţiei bazale a TIL proaspăt recoltate. În unele aplicări, capacitatea respiratorie de rezervă este de la circa 50% până la circa 99% din rata respiraţiei bazale a TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, capacitatea respiratorie de rezervă este de la circa 60% până la circa 99% din rata respiraţiei bazale a TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, capacitatea respiratorie de rezervă este de la circa 70% până la circa 99% din rata respiraţiei bazale a TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, capacitatea respiratorie de rezervă este de la circa 80% până la circa 99% din rata respiraţiei bazale a TIL proaspăt recoltate. În unele aplicări, capacitatea respiratorie de rezervă este de la circa 90% până la circa 99% din rata respiraţiei bazale a TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, capacitatea respiratorie de rezervă este de la circa 95% până la circa 99% din rata respiraţiei bazale a TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, TIL din a doua expansiune sau TIL din a doua expansiune suplimentară (cum ar fi, de exemplu, cele descrise în etapa D din Figura 27, inclusiv TIL denumite TIL reREP) au o capacitate respiratorie de rezervă care nu este diferită semnificativ statistic de rata respiraţiei bazale a TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27.
În general, TIL din a doua expansiune sau TIL din a doua expansiune suplimentară (cum ar fi, de exemplu, cele descrise în etapa D din Figura 27, inclusiv TIL denumite TIL reREP) au o capacitate respiratorie de rezervă de cel puţin 50%, cel puţin 55%, cel puţin 60%, cel puţin 65%, cel puţin 70%, cel puţin 75%, cel puţin 80%, cel puţin 85%, cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 97%, cel puţin 98% sau cel puţin 99% din rata respiraţiei bazale a TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, testul metabolic măsurat este rezerva glicolitică. În unele aplicări, testul metabolic este capacitatea respiratorie de rezervă. Pentru a năsura metabolismul (respirator) celular, celulele au fost tratate cu inhibitori ai respiraţiei mitocondriale şi glicolizei pentru a determina un profil metabolic pentru TIL constând din următoarele măsurători: fosforilarea oxidativă de referinţă (măsurată prin OCR), capacitatea respiratorie de rezervă, activitatea glicolitică de referinţă (măsurată prin ECAR) şi rezerva glicolitică. Profilurile metabolice s-au realizat folosind testul de stres mitocondrial/glicolitic combinat Seahorse (inclusiv kitul disponibil în comerţ de la Agilent®), care permite determinarea capacităţii celulelor de a efectua glicoliza la blocarea producţiei ATP mitocondriale. În unele aplicări, celulele sunt lipsite de glucoză, apoi se injectează glucoză, urmată de un agent de stres. În unele aplicări, agentul de stres este selectat din grupul constând din oligomicina, FCCP, rotenona, antimicina A şi/sau 2-deoxiglucoză (2-DG), precum şi combinaţii ale acestora. În unele aplicări, oligomicina se adaugă la 10 mM. În unele aplicări, FCCP se adaugă la 10 mM. În unele aplicări, rotenona se adaugă la 2.5 mM. În unele aplicări, antimicina A se adaugă la 2.5 mM. În unele aplicări, 2-deoxiglucoza (2-DG) se adaugă la 500 mM. În unele aplicări, se măsoară capacitatea glicolitică, rezerva glicolitică şi/sau acidificarea neglicolitică. În general, TIL au o rezervă glicolitică de cel puţin 50%, cel puţin 55%, cel puţin 60%, cel puţin 65%, cel puţin 70%, cel puţin 75%, cel puţin 80%, cel puţin 85%, cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 97%, cel puţin 98% sau cel puţin 99% din rata respiraţiei bazale a TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, rezerva glicolitică este de la circa 50% până la circa 99% din rata respiraţiei bazale a TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, rezerva glicolitică este de la circa 60% până la circa 99% din rata respiraţiei bazale a TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, rezerva glicolitică este de la circa 70% până la circa 99% din rata respiraţiei bazale a TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, rezerva glicolitică este de la circa 80% până la circa 99% din rata respiraţiei bazale a TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, rezerva glicolitică este de la circa 90% până la circa 99% din rata respiraţiei bazale a TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, rezerva glicolitică este de la circa 95% până la circa 99% din rata respiraţiei bazale a TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27.
În unele aplicări, testul metabolic este glicoliza de bază. În unele aplicări, TIL din a doua expansiune sau TIL din a doua expansiune suplimentară (cum ar fi, de exemplu, cele descrise în etapa D din Figura 27, inclusiv TIL denumite TIL reREP) au o creştere a glicolizei de bază de cel puţin două ori, cel puţin trei ori, cel puţin patru ori, cel puţin cinci ori, cel puţin şase ori, cel puţin 7 ori, cel puţin opt ori, cel puţin nouă ori sau cel puţin zece ori faţă de TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, TIL din a doua expansiune sau TIL din a doua expansiune suplimentară (cum ar fi, de exemplu, cele descrise în etapa D din Figura 27, inclusiv TIL denumite TIL reREP) au o creştere a glicolizei de bază de circa două ori până la circa de zece ori faţă de TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, TIL din a doua expansiune sau TIL din a doua expansiune suplimentară (cum ar fi, de exemplu, cele descrise în etapa D din Figura 27, inclusiv TIL denumite TIL reREP) au o creştere a glicolizei de bază de circa două ori până la circa opt ori faţă de TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, TIL din a doua expansiune sau TIL din a doua expansiune suplimentară (cum ar fi, de exemplu, cele descrise în etapa D din Figura 27, inclusiv TIL denumite TIL reREP) au o creştere a glicolizei de bază de circa trei ori până la circa şapte ori faţă de TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, TIL din a doua expansiune sau TIL din a doua expansiune suplimentară (cum ar fi, de exemplu, cele descrise în etapa D din Figura 27, inclusiv TIL denumite TIL reREP) au o creştere a glicolizei de bază de circa două ori până la circa patru ori faţă de TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, TIL din a doua expansiune sau TIL din a doua expansiune suplimentară (cum ar fi, de exemplu, cele descrise în etapa D din Figura 27, inclusiv TIL denumite TIL reREP) au o creştere a glicolizei de bază de circa două ori până la circa trei ori faţă de TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27.
În general, TIL din a doua expansiune sau TIL din a doua expansiune suplimentară (cum ar fi, de exemplu, cele descrise în etapa D din Figura 27, inclusiv TIL denumite TIL reREP) au o rezervă glicolitică de cel puţin 50%, cel puţin 55%, cel puţin 60%, cel puţin 65%, cel puţin 70%, cel puţin 75%, cel puţin 80%, cel puţin 85%, cel puţin 90%, cel puţin 95%, cel puţin 97%, cel puţin 98% sau cel puţin 99% din rata respiraţiei bazale a TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, rezerva glicolitică este de la circa 50% până la circa 99% din rata respiraţiei bazale a TIL proaspăt recoltate. În unele aplicări, rezerva glicolitică este de la circa 60% până la circa 99% din rata respiraţiei bazale a TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, rezerva glicolitică este de la circa 70% până la circa 99% din rata respiraţiei bazale a TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, rezerva glicolitică este de la circa 80% până la circa 99% din rata respiraţiei bazale a TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, rezerva glicolitică este de la circa 90% până la circa 99% din rata respiraţiei bazale a TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, rezerva glicolitică este de la circa 95% până la circa 99% din rata respiraţiei bazale a TIL proaspăt recoltate.
Producerea granzimei B: Granzima B este o altă măsură a capacităţii TIL de a distruge celule ţintă. Supernatanţii din mediu restimulaţi aşa cum se descrie mai sus folosind anticorpi la CD3, CD28 şi CD137/4-1BB s-au evaluat de asemenea cu privire la nivelurile Granzimei B folosind kitul Human Granzyme B DuoSet ELISA (R & D Systems, Minneapolis, MN) conform instrucţiunilor producătorului. În unele aplicări, TIL din a doua expansiune sau TIL din a doua expansiune suplimentară (cum ar fi, de exemplu, cele descrise în etapa D din Figura 27, inclusiv TIL denumite TIL reREP) au producţie mărită a Granzimei B. În unele aplicări, TIL din a doua expansiune sau TIL din a doua expansiune suplimentară (cum ar fi, de exemplu, cele descrise în etapa D din Figura 27, inclusiv TIL denumite TIL reREP) au activitate citotoxică mărită.
În unele aplicări, se poate folosi lungimea telomerilor pentru a măsura viabilitatea celulelor şi/sau funcţia celulară. În unele aplicări, telomerii au în mod surprinzător aceeaşi lungime în TIL produse prin prezenta invenţie faţă de TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. Măsurarea lungimii telomerilor: se folosesc diverse metode pentru măsurarea lungimii telomerilor în ADN genomic şi preparate citologice. Analiza fragmentelor de restricţie telomerice (TRF) este etalonul de aur al măsurării lungimii telomerilor (de Lange et al., 1990). Totuşi, limitarea majoră a TRF este necesitatea unei cantităţi mari de ADN (1.5 ^g). În prezenta invenţie pot fi folosite două tehnici larg utilizate pentru măsurarea lungimii telomerilor, şi anume hibridizarea fluorescentă in situ (FISH; Agilent Technologies, Santa Clara, CA) şi PCR cantitativă. În unele aplicări, Nu există nici o modificare a lungimii telomerilor între TIL din recoltarea iniţială în etapa A şi TIL amplificate de exemplu din Etapa D prevăzută în Figura 27.
În unele aplicări, sănătatea TIL se măsoară prin secreţia IFN-gamma (IFN-γ). În unele aplicări, secreţia IFN-γ indică TIL active. În unele aplicări, se utilizează un test de potenţial pentru producerea IFN-γ. Producţia IFN-γ este o altă măsură a potenţialul citotoxic. Producţia IFN-γ poate fi măsurată prin determinarea nivelurilor de citokine IFN-γ în mediul TIL stimulate cu anticorpi la CD3, CD28 şi CD137/4-1BB. Nivelurile IFNγ în mediul din aceste TIL stimulate pot fi determinate măsurând eliberarea IFN-γ. În unele aplicări, o creştere a producţiei IFN-γ de exemplu în TIL din Etapa D prevăzută în Figura 27 faţă de TIL recoltate iniţial de exemplu în Etapa A prevăzută în Figura 27 indică o creştere a potenţialului citotoxic a TIL din Etapa D. În unele aplicări, secreţia IFN-γ este mărită o dată, de două ori, trei ori, patru ori sau cinci ori sau de mai multe ori. În unele aplicări, secreţia IFN-γ este mărită o dată. În unele aplicări, secreţia IFN-γ este mărită de două ori. În unele aplicări, secreţia IFN-γ este mărită de trei ori. În unele aplicări, secreţia IFN-γ este mărită de patru ori. În unele aplicări, secreţia IFN-γ este mărită de cinci ori. În unele aplicări, IFN-γ se măsoară folosind un kit Quantikine ELISA. În unele aplicări, IFN-γ se măsoară în TIL ex vivo. În unele aplicări, IFN-γ se măsoară în TIL ex vivo, inclusiv TIL produse prin metodele din prezenta invenţie, inclusiv de exemplu metodele din Figura 27, precum şi TIL proaspăt recoltate sau TIL produse prin alte metode, cum ar fi cele prezăzute de exemplu în Figura 83 (cum ar fi de exemplu TIL din procesul 1C).
În unele aplicări, potenţialul citotoxic al TIL de a liza celule ţintă s-a evaluat folosind un test de co-cultură a TIL cu linia celulară bioluminescentă, P815 (clona G6), conform unui test de liză redirecţionată bioluminescentă (test de potenţial) pentru testul TIL care măsoară citotoxicitatea TIL într-o manieră dependentă de doză foarte sensibilă.
În unele aplicări, metodele din prezenta prevăd un test de evaluare a viabilităţii TIL folosind metodele descrise mai sus. În unele aplicări, TIL sunt amplificate aşa cum se discută mai sus, including de exemplu în Figura 27. În unele aplicări, TIL sunt crioconservate înaintea evaluării viabilităţii. În unele aplicări, evaluarea viabilităţii include decongelarea TIL înainte de efectuarea unei prime expansiuni, a unei a doua expansiuni şi a unei a doua expansiuni suplimentare. În unele aplicări, metodele din prezenta prevăd un test de evaluare a proliferării, toxicităţii, morţii celulare şi/sau alţi termeni referitori la viabilitatea populaţiei TIL. Viabilitatea se poate măsura prin oricare dintre testele metabolice TIL descrise mai sus, precum şi orice metode cunoscute pentru evaluarea viabilităţii celulelor. În unele aplicări, metodele din prezenta prevăd un test de evaluare a proliferării, toxicităţii, morţii celulare şi/sau alţi termeni referitori la viabilitatea TIL amplificate folosind metodele descrise în prezenta, inclusiv cele exemplificate în Figura 27.
Prezenta invenţie prevede, de asemenea metode de testare pentru determinarea viabilităţii TIL. În unele aplicări, TIL au viabilitate egală faţă de TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, TIL au viabilitate crescută faţă de TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. Prezenta invenţie prevede metode de evaluare TIL cu privire la viabilitate prin amplificarea limfocitelor infiltrante în tumori (TIL) într-o populaţie mai mare de TIL cuprinzând:
(i) obţinerea unei prime populaţii de TIL care a fost amplificată anterior;
(ii) efectuarea unei prime expansiuni prin cultivarea primei populaţii de TIL într-un mediu de cultură celulară cuprinzând IL-2 pentru a produce o a doua populaţie de TIL; şi
(iii) efectuarea unei a doua expansiuni prin suplimentarea mediului de cultură celulară al celei de-a doua populaţii de TIL cu IL-2 suplimentar, OKT-3 şi celule de prezentare a antigenului (APC), pentru a produce o a treia populaţie de TIL, unde a treia populaţie de TIL este cel puţin de 100 de ori mai mare în număr decât a doua populaţie de TIL şi unde a doua expansiune se efectuează cel puţin 14 zile pentru a obţine a treia populaţie de TIL, unde a treia populaţie de TIL cuprinde o subpopulaţie mărită de celule T efectoare şi/sau celule T de memorie centrală faţă de a doua populaţie de TIL şi unde a treia populaţie este de asemenea testată cu privire la viabilitate.
În unele aplicări, metoda mai poate cuprinde:
(iv) efectuarea unei a doua expansiuni suplimentare prin suplimentarea mediului de cultură celulară al celei de-a treia populaţii de TIL cu IL-2 suplimentar, OKT-3 suplimentar şi APC suplimentare, unde a doua expansiune suplimentară se efectuează cel puţin 14 zile pentru a obţine o populaţie mai mare de TIL decât cea obţinută în etapa (iii), unde populaţia de TIL mai mare cuprinde o subpopulaţie mărită de celule T efectoare şi/sau celule T de memorie centrală faţă de a treia populaţie de TIL şi unde a treia populaţie este de asemenea testată cu privire la viabilitate.
În unele aplicări, înaintea etapei (i), celulele pot fi crioconservate.
În unele aplicări, celulele pot fi decongelate înainte de efectuarea etapei (i).
În unele aplicări, etapa (iv) poate fi repetată o dată până la de patru ori pentru a obţine TIL suficiente pentru analiză.
În unele aplicări, etapele (i) până la (iii) sau (iv) se pot efectua într-o perioadă de circa 40 zile până la circa 50 zile.
În unele aplicări, etapele (i) până la (iii) sau (iv) se pot efectua într-o perioadă de circa 42 zile până la circa 48 zile.
În unele aplicări, etapele (i) până la (iii) sau (iv) se pot efectua într-o perioadă de circa 42 zile până la circa 45 zile.
În unele aplicări, etapele (i) până la (iii) sau (iv) se pot efectua în circa 44 zile.
În unele aplicări, celulele din etapele (iii) sau (iv) pot exprima CD4, CD8 şi TCR α β la niveluri similare cu celule proaspăt recoltate.
În unele aplicări, celulele de prezentare a antigenului pot fi celule mononucleare din sângele periferic (PBMC).
În unele aplicări, PBMC pot fi adăugate în cultura celulară în oricare dintre zilele 9 - 17 în etapa (iii).
În unele aplicări, celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală din populaţia mai mare de TIL în etapa (iv) pot prezenta una sau mai multe caracteristici selectate din grupul constând din expresie CD27, expresie CD28, telomeri mai lungi, expresie CD57 mărită şi expresie CD56 scăzută, faţă de celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală din a treia populaţie de celule.
În unele aplicări, celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală pot prezenta expresie CD57 mărită şi expresie CD56 scăzută.
În unele aplicări, APC pot fi APC artificial (aAPC).
În unele aplicări, metoda mai poate cuprinde etapa de transducţie a primei populaţii de TIL cu un vector de expresie cuprinzând un acid nucleic care codifică un receptor T celular de mare afinitate.
În unele aplicări, etapa de transducţie poate avea loc înainte de etapa (i).
În unele aplicări, metoda mai poate cuprinde etapa de transducţie a primei populaţii de TIL cu un vector de expresie cuprinzând un acid nucleic care codifică un receptor antigenic himeric (CAR) cuprinzând un anticorp al fragmentului variabil monocatenar fuzionat cu cel puţin un endodomeniu al unei molecule de semnalizare a celulelor T.
În unele aplicări, etapa de transducţie poate avea loc înaintea etapei (i).
În unele aplicări, TIL pot fi analizate cu privire la viabilitate.
În unele aplicări, TIL pot fi analizate cu privire la viabilitate după crioconservare.
În unele aplicări, TIL pot fi analizate cu privire la viabilitate după crioconservare şi după etapa (iv).
Diverşii receptori antigenici ai limfocitelor T şi B se produc prin recombinarea somatică a unui număr limitat, dar mare, de segmente genice. Aceste segmente genice: V (variabil), D (diversitate), J (juxtapunere) şi C (constant) determină specificitatea legării şi aplicările în aval ale imunoglobulinelor şi receptorilor T celulari (TCR). Prezenta invenţie prevede o metodă de generare a TIL care prezintă şi cresc diversitatea repertoriului celulelor T (denumită uneori policlonalitate). În unele aplicări, creşterea diversităţii repertoriului celulelor T este faţă de TIL proaspăt recoltate şi/sau TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, TIL obţinute prin metoda din prezenta prezintă o creştere a diversităţii repertoriului celulelor T. În unele aplicări, TIL obţinute în prima expansiune prezintă o creştere a diversităţii repertoriului celulelor T. În unele aplicări, creşterea diversităţii este o creştere a diversităţii imunoglobulinelor şi/sau a diversităţii receptorilor T celulari. În unele aplicări, diversitatea imunoglobulinică este în lanţul greu al imunoglobulinei. În unele aplicări, diversitatea imunoglobulinică este în lanţul uşor al imunoglobulinei. În unele aplicări, diversitatea este în receptorul T celular. În unele aplicări, diversitatea este în unul dintre receptorii T celulari selectaţi din grupul constând din receptori alpha, beta, gamma şi delta. În unele aplicări, există o creştere a expresiei receptorului T celular (TCR) alpha şi/sau beta. În unele aplicări, există o creştere a expresiei receptorului T celular (TCR) alpha. În unele aplicări, există o creştere a expresiei receptorului T celular (TCR) beta. În unele aplicări, există o creştere a expresiei TCRab (i.e., TCRα/β).
Conform prezentei invenţii, o metodă de testare TIL cu privire la viabilitate şi/sau utilizarea ulterioară în administrare la un subiect. În unele aplicări, metoda de analiză a limfocitelor infiltrante în tumori (TIL) poate cuprinde:
(i) obţinerea unei prime populaţii de TIL;
(ii) efectuarea unei prime expansiuni prin cultivarea primei populaţii de TIL într-un mediu de cultură celulară cuprinzând IL-2 pentru a produce o a doua populaţie de TIL; şi
(iii) efectuarea unei a doua expansiuni prin suplimentarea mediului de cultură celulară al celei de-a doua populaţii de TIL cu IL-2 suplimentar, OKT-3 şi celule de prezentare a antigenului (APC), pentru a produce o a treia populaţie de TIL, unde a treia populaţie de TIL are un număr de cel puţin 50 de ori mai mare decât a doua populaţie de TIL;
(iv) recoltarea, spălarea şi crioconservarea celei de-a treia populaţii de TIL;
(v) depozitarea TIL crioconservate la o temperatură criogenică;
(vi) decongelarea celei de-a treia populaţii de TIL pentru a furniza o a treia populaţie de TIL decongelate; şi
(vii) efectuarea unei a doua expansiuni suplimentare a unei porţiuni din a treia populaţie de TIL decongelate prin suplimentarea mediului de cultură celulară al celei de-a treia populaţii cu IL-2, OKT-3 şi APC pe o perioadă de expansiune suplimentară (denumită uneori perioadă reREP) de cel puţin 3 zile, unde a treia expansiune se efectuează pentru a obţine o a patra populaţie de TIL, unde numărul TIL din a patra populaţie de TIL este comparat cu numărul TIL din a treia populaţie de TIL pentru a obţine un raport;
(viii) determinarea pe baza raportului din etapa (vii) dacă populaţia de TIL decongelate este adecvată pentru administrare unui pacient;
(ix) administrarea unui dozaj terapeutic eficient din a treia populaţie de TIL decongelate la pacient când raportul dintre numărul TIL din a patra populaţie de TIL şi numărul TIL din a treia populaţie de TIL este determinat ca fiind mai mare de 5:1 în etapa (viii).
În unele aplicări, perioada de expansiune suplimentară (denumită uneori perioadă reREP) se efectua până când raportul dintre numărul TIL din a patra populaţie de TIL şi numărul TIL din a treia populaţie de TIL este mai mare de 50:1.
În unele aplicări, numărul de TIL suficient pentru un dozaj terapeutic eficient de la circa 2.3×1010 până la circa 13.7×1010.
În unele aplicări, etapele (i) până la (vii) se efectuează într-o perioadă de circa 40 zile până la circa 50 zile. În unele aplicări, etapele (i) până la (vii) se pot efectua într-o perioadă de circa 42 zile până la circa 48 zile. În unele aplicări, etapele (i) până la (vii) se pot efectua într-o perioadă de circa 42 zile până la circa 45 zile. În unele aplicări, etapele (i) până la (vii) se pot efectua în circa 44 zile.
În unele aplicări, celulele din etapele (iii) sau (vii) pot exprima CD4, CD8 şi TCR α β la niveluri similare cu celulele proaspăt recoltate. În unele aplicări, celulele pot fi TIL.
În unele aplicări, celulele de prezentare a antigenului celule mononucleare din sângele periferic (PBMC). În unele aplicări, PBMC adăugate în cultura celulară în oricare dintre zilele 9 - 17 în etapa (iii).
În unele aplicări, celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală în populaţia mai mare de TIL din etapele (iii) sau (vii) prezenta una sau mai multe caracteristici selectate din grupul constând din expresie CD27, expresie CD28, telomeri mai lungi, expresie CD57 mărită şi expresie CD56 scăzută, faţă de celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală din a treia populaţie de celule.
În unele aplicări, celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală pot prezenta expresie CD57 mărită şi expresie CD56 scăzută.
În unele aplicări, APC pot fi APC artificiale (aAPC).
În unele aplicări, etapa de transducţie a primei populaţii de TIL cu un vector de expresie poate cuprinde un acid nucleic care codifică un receptor T celular de mare afinitate.
În unele aplicări, etapa de transducţie poate avea loc înaintea etapei (i).
În unele aplicări, etapa de transducţie a primei populaţii de TIL cu un vector de expresie poate cuprinde un acid nucleic care codifică un receptor antigenic himeric (CAR) cuprinzând un anticorp al fragmentului variabil monocatenar fuzionat cu cel puţin un endodomeniu al unei molecule de semnalizare a celulelor T.
În unele aplicări, etapa de transducţie poate avea loc înaintea etapei (i).
În unele aplicări, TIL pot fi analizate cu privire la viabilitate după etapa (vii).
Prezenta invenţie prevede de asemenea metode de evaluare a TIL. În unele aplicări, Invenţia prevedea o metodă de evaluare a TIL cuprinzând:
(i) obţinerea unei porţiuni dintr-o primă populaţie de TIL crioconservate;
(ii) decongelarea porţiunii primei populaţii de TIL crioconservate;
(iii) efectuarea unei prime expansiuni prin cultivarea porţiunii primei populaţii de TIL într-un mediu de cultură celulară cuprinzând IL-2, OKT-3 şi celule de prezentare a antigenului (APC) pe o perioadă de expansiune suplimentară (denumită uneori perioadă reREP) de cel puţin 3 zile, pentru a produce o a doua populaţie de TIL, unde porţiunea din prima populaţie de TIL este comparată cu a doua populaţie de TIL pentru a obţine un raport al numărului TIL, unde raportul numărului de TIL în a doua populaţie de TIL la numărul de TIL din porţiunea primei populaţii de TIL este mai mare de 5:1;
(iv) determinarea pe baza raportului din etapa (iii) dacă prima populaţie de TIL este adecvată pentru utilizare în administrarea terapeutică la un pacient;
(v) determinarea că prima populaţie de TIL este adecvată pentru utilizare în administrare
terapeutică atunci când raportul numărului TIL din a doua populaţie de TIL la numărul TIL din prima populaţie de TIL este mai mare de 5:1 în etapa (iv).
În unele aplicări, raportul numărului TIL din a doua populaţie de TIL şi numărul TIL din porţiunea primei populaţii de TIL poate fi mai mare de 50:1.
În unele aplicări, metoda mai poate cuprinde efectuarea expansiunii întregii primei populaţii de TIL crioconservate de la etapa (i) conform metodelor descrise în oricare dintre aplicările prevăzute în prezenta.
În unele aplicări, metoda mai poate cuprinde administrarea întregii primei populaţii de TIL crioconservate de la etapa (i) la pacient.
K. Sisteme închise pentru prepararea TIL
Prezenta invenţie prevede utilizarea sistemelor închise în timpul procesului de cultivare TIL. Aceste sisteme închise permit prevenirea şi/sau reducerea contaminării microbiene, permit utilizarea unor baloane mai puţine şi permit scăderi ale costurilor. În unele aplicări, sistemul închis utilizează două recipiente.
Aceste sisteme închise sunt bine cunoscute în domeniu şi pot fi găsite, de exemplu, la http://www.fda.gov /cber/guidelines.htm şi
https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/
Guidances/Blood/ucm076779.htm.
În unele aplicări, sistemele închise includ conectori luer şi sisteme termoetanşate descrise de exemplu în exemplul 30. În unele aplicări, sistemul închis este accesat prin intermediul seringilor în condiţii sterile pentru a menţine sterilitatea şi natura închisă a sistemului. În unele aplicări, se foloseşte un sistem închis descris în exemplul 30. În unele aplicări, TIL sunt preparate într-un recipient de produs final conform metodei descrise în exemplul 30, secţiunea 8.14 "Compoziţie finală şi umplere".
Aşa cum se prevede pe website-ul FDA, sistemele închise cu metode sterile sunt cunoscute şi descrise.
Vezi ttps://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/ Guidances/Blood/ucm076779.htm, menţionate mai sus şi prevăzute în partea pertinentă de mai jos. Introducere
Dispozitivele de conectare sterilă (STCD) produc suduri sterile între două bucăţi de tuburi compatibile. Această procedură permite conectarea sterilă a unei varietăţi de recipiente şi diametre ale tuburilor. Aceste îndrumări descriu practicile recomandate şi procedurile utilizate pentru aceste dispozitive. Aceste îndrumări nu abordează datele sau informaţiile pe care un producător de dispozitive de conectare sterilă trebuie să le depună la FDA pentru a obţine aprobare sau autorizaţie pentru comercializare. Este de asemenea important de menţionat că utilizarea unui dispozitiv de conectare sterilă aprobat în scopuri care nu sunt autorizate pe etichetă pot cauza considerarea dispozitivului ca fiind contrafăcut şi falsificat în conformitate cu Legea federală privind alimentele, drogurile şi produsele cosmetice.
1. Recomandări FDA
Producătorii produşilor sanguini care propun utilizarea curentă a STCD aprobate de FDA ar trebui să includă informaţii privind această utilizare în manualele de procedură operaţională standard (SOP) pentru fiecare produs sanguin. Aceste informaţii ar trebui să includă evidenţe, urmărirea produsului, controlul calităţii sudurii, numerele de lot pentru software şi consumabile (inclusiv surse ale elementelor de adăugat). Procedurile de control al calităţii ar trebui să includă un test al integrităţii fiecărei suduri.
2. Aplicări ale STCD
Utilizatorul ar trebui să ştie că utilizarea dispozitivului poate crea un produs nou sau poate modifica semnificativ configuraţia unui produs reglementat pentru care siguranţa şi eficienţa nu au fost demonstrate. Pentru aceste "produse noi" care fac obiectul licenţei, cererile sau anexele cererilor trebuie depuse la FDA pe lângă depunerea unei SOP. În general, gruparea sau amestecarea ce implică unele componente celulare reprezintă o modificare a produsului care necesită depunerea şi aprobarea unei cereri sau a unei anexe a cererii de licenţă. Aceste cereri şi anexe ar trebui să cuprindă date şi descrieri ale procedurilor de fabricare care demonstrează că "produsul nou" este sigur şi eficient pentru utilizarea prevăzută în perioada propusă.
Următoarele comentarii sunt prezentate ca o îndrumare privind cele mai frecvente utilizări ale unui STCD aprobat sau autorizat de FDA:
L. Adăugarea unui ac nou sau mai mic într-un set de prelevare sânge
Utilizarea STCD pentru adăugarea unui ac înainte de iniţierea unei proceduri (recoltare de sânge integral, afereza trombocitară sau colectarea plasmei sursă) nu se consideră deschidere a unui sistem funcţional închis. Dacă se adaugă un ac în timpul unei proceduri, ar trebui utilizat numai un STCD aprobat pentru sudarea tuburilor umplute cu lichid. Dacă testul integrităţii sudurii este satisfăcător, folosirea unui STCD nu se consideră deschidere a unui sistem funcţional închis.
Trombocitele de afereză preparate într-un sistem deschis ar trebui marcate cu o dată de expirare de 24 de ore şi produşii trombocite de afereză preparaţi într-un sistem funcţional închis ar trebui marcaţi cu o dată de expirare de cinci zile (vezi Revised Guideline for Collection of Platelets, Pheresis, October 7, 1988).
Sursa şi specificaţiile tuburilor şi acelor adăugate ar trebui indicate în SOP şi evidenţele centrului de sânge. Utilizarea STCD pentru adăugarea acelor nu reprezeintă o modificare majoră de fabricarea pentru care instituţiile licenţiate necesită preaprobare.
M. Utilizarea STCD pentru prepararea componentelor
Când STCD se utilizează pentru ataşarea altor recipiente de preparare a componentelor, trebuie să se păstreze evidenţe corespunzătoare care să identifice sursa pachetelor de transfer şi verificarea adecvată a numărului unităţilor de sânge şi ABO/Rh. Sângele şi componentele sanguine trebuie etichetate în mod adecvat (21 CFR 606.121).
Exemple:
• Adăugarea unui al patrulea recipient într-un pachet triplu de recoltare a sângelui integral pentru producerea AHF crioprecipitat din plasmă proaspătăt congelată. • Conectarea unei soluţii aditive într-o unitate de hematii. • Adăugarea unui filtru aprobat de FDA pentru utilizare în fabricarea componentelor. • Adăugarea unui al treilea recipient de depozitare într-un echipament de afereză trombocitară. • Pentru utilizările indicate mai sus, trebuie să se elaboreze proceduri şi să se ţină evidenţe, însă licenţele nu necesită aprobare FDA pentru instituirea procedurilor.
1. Utilizarea STCD pentru colectarea produşilor sanguini
Utilizarea corespunzătoare a unui STCD pentru colectarea trombocitelor preparate din prelevare de sânge integral poate preveni contaminarea posibilă de la ac şi admisiile folosite de obicei. Colectarea efectuată imediat înaintea transfuziei este un exemplu de o astfel de utilizare corespunzătoare. Trombocitele colectate ar trebui administrate la nu mai mult de 4 ore după colectare (vezi 21 CFR 606.122(1)(2)).
Totuşi, colectarea şi depozitarea ulterioară pot creşte riscul comparativ cu administrarea unităţilor donatorilor aleatorii; dacă o unitate contaminată este colectată cu altele şi depozitată înainte de administrare, inoculul bacterian total administrat poate fi mărit ca urmare a replicării în vilum suplimentar. Astfel, utilizarea propusă a unui STCD pentru colectarea şi depozitarea trombocitelor mai mult de 4 ore ar trebui susţinută de date care să arate în mod satosfăcător dacă o astfel de colectare este asociată cu risc crescut.
Această colectare a trombocitelor constituie fabricare de produs nou.
Colectarea sau amestecarea care include trombocite se consideră fabricare a unui produs nou care necesită depunerea şi aprobarea unei cereri sau anexe de autorizare dacă perioada de depozitare depăşeşte paru ore.
2. Utilizarea STCD pentru prepararea unei părţi alicote pentru uz pediatric şi unităţi separate
Unităţile pediatrice şi unităţile separate pentru sânge integral, hematii şi plasmă proaspătăt congelată preparate folosind un STCD nu se vor considera produs nou pentru care este necesară o suplimentare a cererii de licenţă biologică (BLA) dacă sunt îndeplinite următoarele condiţii:
Producătorul trebuie să deţină o licenţă sau un supliment de licenţă biologică aprobată pentru produsul original (i.e., neseparat), inclusiv aprobare pentru fiecare anticoagulant folosit.
Etichetele trebuie trimise pentru analiză şi aprobare înaintea distribuirii. Trebuie inclusă o notă în conformitate cu secţiunea FDA Form 2567, Transmiterea etichetelor şi prospectelor.
Trebuie folosite recipientele de produs final aprobate pentru depozitarea componentelor preparate.
Trombocitele fabricate sub licenţă trebuie să conţină cel puţin 5.5 x (10)10 trombocite (21 CFR 640.24 (c)). Trombocitele de afereză fabricate sub licenţă trebuie să conţină cel puţin 3.0 x (10)11 trombocite (vezi Revised Guideline for the Collection of Platelets, Pheresis, October 7, 1988).
Procedurile urmate privind utilizarea unui STCD pentru prepararea produşilor separaţi din recoltări de sânge integral şi din plasmă şi trombocite preparate prin proceduri de hemafereză automată ar trebui să includă următoarele descrieri: • modul în care echipamentul de afereză sau recipientul de colectare vor fi modificate cu un STCD aprobat de FDA; • volumul minim al produşilor de plasmă separată sau sâmge integral; • volumul şi concentraţia trombocitelor din produşii de afreză separaţi; • perioada de depozitare a produsului. Produsul trebuie conţinut într-un recipient aprobat în conformitate cu perioada de depozitare de pe eticheta recipientului respectiv; • metoda(ele) utilizată(e) pentru etichetarea şi urmărirea produşilor separaţi în evidenţele centrului de sânge. OBS.: Procedurile de etichetare a părţilor alicote trebuie indicate clar în evidenţele procedurilor pentru a permite urmărirea şi rechemarea componentelor, dacă este necesar.
3. Utilizarea unui STCD pentru a conecta alte linii de ser fiziologic sau anticoagulant în timpul unei proceduri de plasmafereză automată
Procedurile trebuie elaborate şi evidenţele păstrate în conformitate cu instrucţiunile de utilizare ale producătorului instrumentului, dar beneficiarii unei licenţe nu necesită aprobare FDA pentru instituirea procedurilor.
4. Utilizarea STCD pentru ataşarea soluţiilor de procesare
La utilizarea unui STCD pentru ataşarea recipientelor cu soluţii de procesare la hematii spălate sau congelate, perioada de expirare a produşilor rezultaţi este de 24 de ore, cu excepţia situaţiei în care datele sunt prevăzute sub forma cererilor sau anexelor de cerere de licenţă la CBER pentru a susţine o perioadă de valabilitate mai îndelungată (21 CFR 610.53(c)). Excepţiile sau modificările trebuie aprobate în formă scrisă de Director, CBER (21 CFR 610.53(d)).
5. Utilizarea unui STCD pentru adăugarea unui filtru de reducere a leucocitelor aprobat de FDA
Unele filtre de reducere a leucocitelor nu sunt ataşate ca parte integrantă în sistemele de recoltare a sângelui integral. Procedurile de utilizare a unui STCD pentru filtrarea înaintea depozitării trebuie să fie conforme cu instrucţiunile de utilizare ale producătorului filtrului.
Reducerea leucocitelor înainte de ieşire reprezintă o modificare productivă majoră. Prin urmare, pentru produşi noi cu leucocite reduse preparaţi folosind un STCD, producătorii trebuie să depună cereri de licenţă biologică (21 CFR 601.2) sau anexe de cerere pre-aprobare la FDA (21 CFR 601.12).
Folosirea unui STCD pentru extragerea probelor din recipiente de produşi sanguini pentru testare (de ex., folosind un STCD pentru a obţine o probă de trombocite dintr-un recipient de trombocite sau trombocite de afereză pentru teste de compatibilitate).
Dacă volumul şi/sau numărul de celule ale produsului după prelevarea probei diferă de cele specificate pe eticheta originală sau în prospect, eticheta de pe produs trebuie modificată pentru a reflecta volumul şi/sau numărul de celule noi. De exemplu, nu trebuie extrase probe care reduc numărul de trombocite al unei unităţi de trombocite la mai puţin de 5.5 x (10)10 trombocite (21 CFR 640.24 (c)).
6. Alte informaţii din îndrumările FDA
Îndrumările FDA prezintă îndrumări generale, precum şi informaţii şi exemple specifice privind specificaţiile de depunere a cererilor şi anexelor la FDA în legătură cu utilizarea unui STCD. Dacă apar alte întrebări legate de utilizarea adecvată a unui STCD, acestea trebuie adresate la Office of Blood Research and Review, Center for Biologics Evaluation and Research.
În unele aplicări, sistemul închis foloseşte un recipient din momentul în care se obţin fragmentele tumorale până când TIL sunt gata de administrare la pacient sau de crioconservare. În unele aplicări, când se folosesc două recipiente, primul recipient este un recipient G închis şi populaţia de TIL este centrifugată şi transferată într-o pungă de perfuzie fără a deschide primul recipient G închis. În unele aplicări, când se folosesc două recipiente, punga de perfuzie este o pungă de perfuzie conţinând HypoThermosol. Un sistem închis sau un sistem de cultură celulară TIL închis se caracterizează prin aceea că, după ce s-au adăugat proba tumorală şi/sau fragmentele tumorale, sistemul este închis ermetic de la exterior pentru a forma un mediu închis fără pătrunderea bacteriilor, ciupercilor şi/sau orice altă contaminare microbiană.
În unele aplicări, reducerea contaminării microbiene este între circa 5% şi circa 100%. În unele aplicări, reducerea contaminării microbiene este între circa 5% şi circa 95%. În unele aplicări, reducerea contaminării microbiene este între circa 5% şi circa 90%. În unele aplicări, reducerea contaminării microbiene este între circa 10% şi circa 90%. În unele aplicări, reducerea contaminării microbiene este între circa 15% şi circa 85%. În unele aplicări, reducerea contaminării microbiene este circa 5%, circa 10%, circa 15%, circa 20%, circa 25%, circa 30%, circa 35%, circa 40%, circa 45%, circa 50%, circa 55%, circa 60%, circa 65%, circa 70%, circa 75%, circa 80%, circa 85%, circa 90%, circa 95%, circa 97%, circa 98%, circa 99% sau circa 100%.
Sistemul închis permite creşterea TIL în absenţa şi/sau cu o reducere semnificativă a contaminării microbiene.
În plus, pH-ul, presiunea parţială a dioxidului de carbon şi presiunea parţială a oxigenului
ale mediului de cultură celulară TIL variază la cultivarea celulelor. În consecinţă, chiar dacă circulă un mediu adecvat pentru cultura celulară, mediul închis necesită încă menţinere constantlă ca un mediu optim pentru înmulţirea TIL. În acest scop, este dezirabil ca factorii fizici de pH, presiunea parţială a dioxidului de carbon şi presiunea parţială a oxigenului în lichidul de cultură al mediului închis să fie monitorizaţi cu ajutorul unui senzor, al cărui semnal se utilizează pentru a controla un schimbător de gaz montat la admisia în mediul de cultură şi ca presiunea parţială a gazului din mediul închis să fie ajustată în timp real în funcţie de modificările din lichidul de cultură pentru a optimiza mediul de cultură celulară. În unele aplicări, prezenta invenţie prevede un sistem de cultură celulară închis care include la admisia în mediul închis un schimbător de gaz prevăzut cu un dispozitiv de monitorizare care măsoară pH-ul, presiunea parţială a dioxidului de carbon şi presiunea parţială a oxigenului din mediul închis şi optimizează mediul de cultură celulară prin ajustarea automată a concentraţiilor de gaz pe baza semnalelor de la dispozitivul de monitorizare.
În unele aplicări, presiunea din mediul închis este controlată continuu sau intermitent. Aceasta înseamnă că presiunea din mediul închis poate fi variată cu ajutorul unui dispozitiv de menţinere a presiunii de exemplu, asigurând că spaţiul este adecvat pentru creşterea TIL într-o stare de suprapresiune sau susţinând exsudaţia fluidului într-o stare de subpresiune şi favorizând astfel înmulţirea celulelor. În plus, aplicând subpresiune intermitent, este posibilă înlocuirea uniformă şi eficientă a lichidului care circulă în mediul închis printr-o reducere temporară a volumului mediului închis.
În unele aplicări, componentele de cultură optime pentru înmulţirea TIL pot fi înlocuite sau adăugate şi se pot adăuga inclusiv factori cum ar fi IL-2 şi/sau OKT3, precum şi combinaţii.
C. Culturi celulare
Într-o aplicare, o metodă de expansiune TIL, inclusiv cele discutate mai sus şi exemplificate în Figura 27, poate include folosirea a circa 5.000 mL până la circa 25.000 mL de mediu celular, circa 5.000 mL până la circa 10.000 mL de mediu celular sau circa 5.800 mL până la circa 8.700 mL de mediu celular. În unele aplicări, mediul este mediu fără ser, descris de exemplu în Exemplul 21. În unele aplicări, mediul din prima expansiune este lipsit de ser. În unele aplicări, mediul din a doua expansiune este lipsit de ser. În unele aplicări, mediile din prima şi a doua expansiune sunt ambele lipsite de ser. Într-o aplicare, amplificarea numărului TIL utilizează nu mai mult de un tip de mediu de cultură celulară. Se poate folosi orice mediu de cultură celulară adecvat, de ex., mediu celular AIM-V (L-glutamină, 50 µM streptomicină sulfat şi 10 µM gentamicină sulfat) (Invitrogen, Carlsbad CA). În această privinţă, metodele din invenţie reduc în mod avantajos cantitatea de mediu şi numărul tipurilor de mediu necesare pentru amplificarea numărului de TIL. Într-o aplicare, amplificarea numărului de TIL poate cuprinde hrănirea celulelor nu mai frecvent decât o dată la trei sau patru zile. Amplificarea numărului de celule într-un recipient permeabil la gaz simplifică procedurile necesare pentru amplificarea numărului de celule prin reducerea frecvenţei de hrănire necesare pentru amplificarea celulelor.
Într-o aplicare, mediul celular din primul şi/sau al doilea recipient permeabil la gaz este nefiltrat. Folosirea mediului celular nefiltrat poate simplifica procedurile necesare pentru a amplifica numărul celulelor. Într-o aplicare, mediul celular din primul şi/sau al doilea recipient permeabil la gaz este lipsit de beta-mercaptoetanol (BME).
[416] Într-o aplicare, Durata metodei cuprinzând obţinerea unei probe tisulare tumorale de la mamifer; cultivarea probei tisulare tumorale într-un prim recipient permeabil la gaz conţinând mediul celular; obţinerea TIL din proba tisulară tumorală; amplificarea numărului TIL într-un al doilea recipient permeabil la gaz conţinând mediul celular poate fi o durată de circa 7 până la 14 zile, de ex., circa 11 zile. În unele aplicări, pre-REP poate fi circa 7 până la 14 zile, de ex., circa 11 zile. În unele aplicări, REP are circa 7 până la 14 zile, de ex., circa 11 zile.
Într-o aplicare, TIL sunt amplificate în vase permeabile la gaz. Vasele permeabile la gaz
se folosesc pentru amplificarea TIL folosind PBMC prin intermediul metodelor, compoziţiilor şi dispozitivelor cunoscute în domeniu, inclusiv cele descrise în documentaţia cererii de brevet U.S. nr. 2005/0106717 A1. Într-o aplicare, TIL sunt amplificate în recipiente permeabile la gaz. Într-o aplicare, TIL sunt amplificate folosind un sistem de expansiune celulară care amplifică TIL în recipiente permeabile la gaz, cum ar fi Xuri Cell Expansion System W25 (GE Healthcare). Într-o aplicare, TIL sunt amplificate folosind un sistem de expansiune celulară care amplifică TIL în recipiente permeabile la gaz, cum ar fi WAVE Bioreactor System, cunoscut şi ca Xuri Cell Expansion System W5 (GE Healthcare). Într-o aplicare, sistemul de expansiune celulară include un recipient celular permeabil la gaz cu un volum selectat din grupul constând din circa 100 mL, circa 200 mL, circa 300 mL, circa 400 mL, circa 500 mL, circa 600 mL, circa 700 mL, circa 800 mL, circa 900 mL, circa 1 L, circa 2 L, circa 3 L, circa 4 L, circa 5 L, circa 6 L, circa 7 L, circa 8 L, circa 9 L şi circa 10 L.
Într-o aplicare, TIL pot fi amplificate în baloane G-Rex (disponibile în comerţ de la Wilson Wolf Manufacturing). Aceste aplicări permit amplificarea populaţiilor celulare de la circa 5x105 celule/cm2 până la între 10x106 şi 30x106 celule/cm2. Într-o aplicare, aceasta are loc fără hrănire. Într-o aplicare, aceasta are loc fără hrănire atâta vreme cât mediul persistă la o înălţime de circa 10 cm în balonul G-Rex. Într-o aplicare, aceasta are loc fără hrănire, dar adăugând una sau mai multe citokine. Într-o aplicare, citokinele pot fi adăugate în bolus fără a fi necesară amestecarea citokinelor cu mediul. Aceste recipiente, dispozitive şi metode se cunosc în domeniu, se utilizează pentru amplificarea TIL şi le includ pe cele descrise în documentaţia cererii de brevet U.S. nr. US 2014/0377739A1, documentaţia internaţională nr. WO 2014/210036 A1, documentaţia cererii de brevet U.S. nr. us 2013/0115617 A1, documentaţia internaţională nr. WO 2013/188427 A1, documentaţia cererii de brevet U.S. nr. US 2011/0136228 A1, brevetul U.S. nr. US 8,809,050 B2, documentaţia internaţională nr. WO 2011/072088 A2, documentaţia cererii de brevet U.S. nr. US 2016/0208216 A1, documentaţia cererii de brevet U.S. nr. US 2012/0244133 A1, documentaţia internaţională nr. WO 2012/129201 A1, documentaţia cererii de brevet U.S. nr. US 2013/0102075 A1, brevetul U.S. nr. US 8,956,860 B2, documentaţia internaţională nr. WO 2013/173835 A1, documentaţia cererii de brevet U.S. nr. US 2015/0175966 A1. Aceste procese sunt descrise de asemenea în Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292.
D. Modificarea genetică opţională a TIL
În unele aplicări, TIL sunt opţional modificate genetic pentru a include alte funcţionalităţi, inclusiv, dar nelimitativ, un receptor T celular de mare afinitate (TCR), de ex., un TCR direcţionat la un antigen asociat cu tumoare cum ar fi MAGE-1, HER2 sau NY-ESO-1, sau un receptor antigenic himeric (CAR) care se leagă de o moleculă de suprafaţa celulară asociată cu tumoare (de ex., mezotelina) sau o moleculă de suprafaţa celulară restricţionată de origine (de ex., CD19).
E. Crioconservarea opţională a TIL
Populaţia TIL în masă sau populaţia TIL amplificată pot fi opţional crioconservate. În unele aplicări, crioconservarea are loc în populaţia terapeutică TIL. În unele aplicări, crioconservarea are loc în TIL recoltate după a doua expansiune. În unele aplicări, crioconservarea are loc în TIL din Etapa F exemplificativă din Figura 27. În unele aplicări, TIL sunt crioconservate în punga de perfuzie. În unele aplicări, TIL sunt crioconservate înainte de introducerea într-o pungă de perfuzie. În unele aplicări, TIL sunt crioconservate şi nu se introduc într-o pungă de perfuzie. În unele aplicări, crioconservarea se efectuează folosind un mediu de crioconservare. În unele aplicări, mediul de crioconservare conţine dimetilsulfoxid (DMSO). Aceasta se realizează în general prin introducerea populaţiei TIL într-o soluţie de congelare, de ex. 85% ser AB inactivat cu complement şi 15% dimetil sulfoxid (DMSO). Celulele din soluţie se introduc în fiole criogenice şi se depozitează 24 de ore la -80°C, cu transfer opţional în congelatoare cu azot gazos pentru crioconservare. Vezi Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986.
Când este cazul, celulele se îndepărtează din congelator şi sunt decongelate într-o baie de apă la 37°C până când se dezgheaţă aproximativ 4/5 din soluţie. Celulele sunt în general resuspendate în mediu complet şi opţional spălate o dată sau de mai multe ori. În unele aplicări, TIL decongelate pot fi numărate şi testate cu privire la viabilitate, aşa cum se cunoaşte în domeniu.
Într-o aplicare preferată, o populaţie TIL este crioconservată folosind mediul de crioconservare CS10 (CryoStor 10, BioLife Solutions). Într-o aplicare preferată, o populaţie TIL este crioconservată folosind un mediu de crioconservare conţinând dimetilsulfoxid (DMSO). Într-o aplicare preferată, o populaţie TIL este crioconservată folosind un raport 1:1 (vol:vol) de CS 10 la mediul de cultură celulară. Într-o aplicare preferată, o populaţie TIL este crioconservată folosind un raport de circa 1:1 (vol:vol) al CS10 la mediul de cultură celulară, cuprinzând şi IL-2 suplimentară.
Aşa cum se discută mai sus în Etapele A - E, crioconservarea poate avea loc în numeroase puncte în cadrul procesului de expansiune TIL. În unele aplicări, populaţia TIL în masă după prima expansiune conform etapei B sau populaţia TIL amplificată după una sau mai multe din a doua expansiune conform etapei D pot fi crioconservate. Crioconservarea se poate realiza în general prin introducerea populaţiei TIL într-o soluţie de congelare, de ex. 85% ser AB inactivat cu complement şi 15% dimetil sulfoxid (DMSO). Celulele din soluţie se introduc în fiole criogenice şi se depozitează 24 de ore la -80°C, cu transfer opţional în congelatoare cu azot gazos pentru crioconservare. Vezi Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986.
Când este cazul, celulele se îndepărtează din congelator şi sunt decongelate într-o baie de apă la 37°C până când se dezgheaţă aproximativ 4/5 din soluţie. Celulele sunt în general resuspendate în mediu complet şi opţional spălate o dată sau de mai multe ori. În unele aplicări, TIL decongelate pot fi numărate şi testate cu privire la viabilitate, aşa cum se cunoaşte în domeniu.
În unele cazuri, populaţia TIL din Etapa B poate fi crioconservată imediat, folosind protocoalele discutate mai jos. Alternativ, populaţia TIL în masă poate fi supusă Etapei C şi Etapei D şi apoi crioconservată după Etapa D. În mod similar, în cazul în care se vor folosi TIL modificate genetic în terapie, populaţiile TIL din Etapa B sau Etapa D pot fi supuse modificărilor genetice pentru tratamente adecvate.
F. Analize opţionale ale viabilităţii celulelor
Opţional, se poate efectua un test de viabilitate a celulelor după prima expansiune (denumită uneori expansiune iniţială în masă), folosind teste standard cunoscute în domeniu. De exemplu, se poate efectua un test de excludere cu albastru tripan pe o probă de TIL în masă, care marchează selectiv celulele moarte şi permite o evaluare a viabilităţii. Alte teste pentru utilizare în testarea viabilităţii pot include nelimitativ testul cu albastru Alamar; şi testul MTT.
1. Numărul celulelor, viabilitate, citometrie în flux
În unele aplicări, se măsoară numărul şi/sau viabilitatea celulelor. Expresia markerilor cum ar fi, nelimitativ, CD3, CD4, CD8, şi CD56, precum şi alţii divulgaţi sau descrişi în prezenta, poate fi măsurată prin citometrie în flux cu anticorpi, de exemplu, nelimitativ, cei disponibili în comerţ de la BD Bio-sciences (BD Biosciences, San Jose, CA) folosind un citometru în flux FACSCanto™ (BD Biosciences). Celulele pot fi numărate manual folosind un hemocitometru c-chip de unică folosinţă (VWR, Batavia, IL) şi viabilitatea poate fi determinată folosind orice metodă cunoscută în domeniu, inclusiv, dar nelimitativ colorare cu albastru tripan.
În unele cazuri, populaţia TIL în masă poate fi crioconservată imediat, folosind
protocoalele discutate mai jos. Alternativ, populaţia TIL în masă poate fi supusă REP şi apoi crioconservată aşa cum se discută mai jos. În mod similar, în cazul în care se vor folosi TIL modificate genetic în terapie, populaţiile TIL în masă sau REP pot fi supuse modificărilor genetice pentru tratamente adecvate.
2. Culturi celulare
Într-o aplicare, o metodă de expansiune TIL poate include folosirea a circa 5.000 mL până la circa 25.000 mL de mediu celular, circa 5.000 mL până la circa 10.000 mL de mediu celular sau circa 5.800 mL până la circa 8.700 mL de mediu celular. Într-o aplicare, amplificarea numărului TIL utilizează nu mai mult de un tip de mediu de cultură celulară. Se poate folosi orice mediu de cultură celulară adecvat, de ex., mediu celular AIM-V (L-glutamină, 50 µM streptomicină sulfat şi 10 µM gentamicină sulfat) (Invitrogen, Carlsbad CA). În această privinţă, metodele din invenţie reduc în mod avantajos cantitatea de mediu şi numărul tipurilor de mediu necesare pentru amplificarea numărului de TIL. Într-o aplicare, amplificarea numărului de TIL poate cuprinde hrănirea celulelor nu mai frecvent decât o dată la trei sau patru zile. Amplificarea numărului de celule într-un recipient permeabil la gaz simplifică procedurile necesare pentru amplificarea numărului de celule prin reducerea frecvenţei de hrănire necesare pentru amplificarea celulelor.
Într-o aplicare, mediul celular din primul şi/sau al doilea recipient permeabil la gaz este nefiltrat. Folosirea mediului celular nefiltrat poate simplifica procedurile necesare pentru a amplifica numărul celulelor. Într-o aplicare, mediul celular din primul şi/sau al doilea recipient permeabil la gaz este lispit de beta-mercaptoetanol (BME).
Într-o aplicare, durata metodei cuprinzând obţinerea unei probe tisulare tumorale de la mamifer; cultivarea probei tisulare tumorale într-un prim recipient permeabil la gaz conţinând mediul celular; obţinerea TIL din proba tisulară tumorală; amplificarea numărului TIL într-un al doilea recipient permeabil la gaz conţinând mediul celular folosind aAPCs pe o durată de circa 14 până la circa 42 zile, de ex., circa 28 zile.
Într-o aplicare, TIL sunt amplificate în vase permeabile la gaz. Vasele permeabile la gaz se folosesc pentru amplificarea TIL folosind PBMC prin intermediul metodelor, compoziţiilor şi dispozitivelor cunoscute în domeniu, inclusiv cele descrise în documentaţia cererii de brevet U.S. nr. 2005/0106717 A1. Într-o aplicare, TIL sunt amplificate în recipiente permeabile la gaz. Într-o aplicare, TIL sunt amplificate folosind un sistem de expansiune celulară care amplifică TIL în recipiente permeabile la gaz, cum ar fi Xuri Cell Expansion System W25 (GE Healthcare). Într-o aplicare, TIL sunt amplificate folosind un sistem de expansiune celulară care amplifică TIL în recipiente permeabile la gaz, cum ar fi WAVE Bioreactor System, cunoscut şi ca Xuri Cell Expansion System W5 (GE Healthcare). Într-o aplicare, sistemul de expansiune celulară include un recipient celular permeabil la gaz cu un volum selectat din grupul constând din circa 100 mL, circa 200 mL, circa 300 mL, circa 400 mL, circa 500 mL, circa 600 mL, circa 700 mL, circa 800 mL, circa 900 mL, circa 1 L, circa 2 L, circa 3 L, circa 4 L, circa 5 L, circa 6 L, circa 7 L, circa 8 L, circa 9 L şi circa 10 L.
Într-o aplicare, TIL pot fi amplificate în baloane G-Rex (disponibile în comerţ de la Wilson Wolf Manufacturing). Aceste aplicări permit amplificarea populaţiilor celulare de la circa 5x105 celule/cm2 până la între 10x106 şi 30x106 celule/cm2. Într-o aplicare, aceasta are loc fără hrănire. Într-o aplicare, aceasta are loc fără hrănire atâta vreme cât mediul persistă la o înălţime de circa 10 cm în balonul G-Rex. Într-o aplicare, aceasta are loc fără hrănire, dar adăugând una sau mai multe citokine. Într-o aplicare, citokinele pot fi adăugate în bolus fără a fi necesară amestecarea citokinelor cu mediul. Aceste recipiente, dispozitive şi metode se cunosc în domeniu, se utilizează pentru amplificarea TIL şi le includ pe cele descrise în documentaţia cererii de brevet U.S. nr. US 2014/0377739A1, documentaţia internaţională nr. WO 2014/210036 A1, documentaţia cererii de brevet U.S. nr. us 2013/0115617 A1, documentaţia internaţională nr. WO 2013/188427 A1, documentaţia cererii de brevet U.S. nr. US 2011/0136228 A1, brevetul U.S. nr. US 8,809,050 B2, documentaţia internaţională nr. WO 2011/072088 A2, documentaţia cererii de brevet U.S. nr. US 2016/0208216 A1, documentaţia cererii de brevet U.S. nr. US 2012/0244133 A1, documentaţia internaţională nr. WO 2012/129201 A1, documentaţia cererii de brevet U.S. nr. US 2013/0102075 A1, brevetul U.S. nr. US 8,956,860 B2, documentaţia internaţională nr. WO 2013/173835 A1, documentaţia cererii de brevet U.S. nr. US 2015/0175966 A1. Aceste procese sunt descrise de asemenea în Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292.
Modificarea genetică opţională a TIL
În unele aplicări, TIL sunt opţional modificate genetic pentru a include alte funcţionalităţi, inclusiv, dar nelimitativ, un receptor T celular de mare afinitate (TCR), de ex., un TCR direcţionat la un antigen asociat cu tumoare cum ar fi MAGE-1, HER2 sau NY-ESO-1, sau un receptor antigenic himeric (CAR) care se leagă de o moleculă de suprafaţa celulară asociată cu tumoare (de ex., mezotelina) sau o moleculă de suprafaţa celulară restricţionată de origine (de ex., CD19).
IV. Metode de tratare a pacienţilor
Metodele de tratament încep cu colectarea TIL iniţială şi cultivarea TIL. Aceste metode au fost descrise în domeniu, de exemplu, în Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35(3):283-292. Metode de tratament sunt descrise în secţiunile de mai jos, inclusiv în Exemple.
TIL amplificate produse conform metodelor descrise în prezenta, inclusiv de exemplu cele descrise în Etapele A - F de mai sus sau conform Etapele A - F de mai sus (indicate, de exemplu, şi în Figura 27), îşi găsesc utilizare specifică în tratamentul pacienţilor cu cancer (de exemplu, aşa cum se descrie în Goff, et al., J. Clinical Oncology, 2016, 34(20):2389-239, precum şi conţinutul adiţional. În unele aplicări, TIL au fost crescute din depozite rezecate din melanom metastatic descrise anterior (vezi Dudley, et al., J Immunother., 2003, 26:332-342). Tumoarea proaspătă poate fi disecată în condiţii sterile. O probă reprezentativă poate fi colectată pentru analiză patologică. Se pot folosi fragmente individuale de 2 mm3 până la 3 mm3. În unele aplicări, Se pot obţine 5, 10, 15, 20, 25 sau 30 de probe per pacient. În unele aplicări, Se pot obţine 20, 25 sau 30 de probe per pacient. În unele aplicări, Se pot obţine 20, 22, 24, 26 sau 28 de probe per pacient. În unele aplicări, Se pot obţine 24 de probe per pacient. Probele pot fi introduse în godeuri individuale ale unei plăci cu 24 de godeuri, menţinute în mediu de creştere cu IL-2 în doză mare (6.000 IU/mL) şi monitorizate cu privire la distrugerea tumorii şi/sau proliferarea TIL. Orice tumoare cu celule viabile rămase după procesare poate fi digerată enzimatic într-o singură suspensie celulară şi crioconservată, aşa cum se descrie în prezenta.
În unele aplicări, se pot preleva probe din TIL crescute cu succes pentru analiza fenotipului (CD3, CD4, CD8 şi CD56) şi testarea faţă de tumoare autologă, când este disponibilă. TIL pot fi considerate reactive dacă o co-cultură peste noapte a produs niveluri ale interferon-gamma (IFN-γ) > 200 pg/mL şi de dori ori faţă de fond. (Goff, et al., J Immunother., 2010, 33:840-847). În unele aplicări, culturile cu dovezi de reactivitate autologă sau tipare de creştere suficientă pot fi selectate pentru o a doua expansiune (de exemplu, o a doua expansiune prevăzută conform etapei D din Figura 27), inclusiv a doua expansiune care este denumită uneori expansiune rapidă (REP). În unele aplicări, TIL amplificate cu reactivitate autologă mare (de exemplu, proliferare mare în a a doua expansiune), sunt selectate pentru o a doua expansiune suplimentară. În unele aplicări, TIL cu reactivitate autologă mare (de exemplu, proliferare mare în a doua expansiune, prevăzută în etapa D din Figura 27), sunt selectate pentru a doua expansiune suplimentară conform etapei D din Figura 27.
Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, pacientul nu este adus direct la ACT (transfer celular adoptiv), de exemplu, după recoltarea tumorii şi/sau o primă expansiune, celulele nu sunt utilizate imediat. În metodele divulgate în prezenta, TIL pot fi crioconservate şi decongelate cu 2 zile înaintea administrării la un pacient. În metodele divulgate în prezenta, TIL pot fi crioconservate şi decongelate cu 1 zi înaintea administrării la un pacient. În metodele divulgate în prezenta, TIL pot fi crioconservate şi decongelate imediat înaintea administrării la un pacient.
Fenotipurile celulare ale probelor crioconservate de TIL din punga de perfuzie pot fi analizate prin citometrie în flux (de ex., FlowJo) cu privire la markeri de suprafaţă CD3, CD4, CD8, CCR7 şi CD45RA (BD BioSciences), precum şi prin oricare dintre metodele descrise în prezenta. Citokinele serice s-au măsurat folosind tehnici de analiză imunosorbentă enzimatică standard. O creştere a IFN-g seric a fost definită ca >100 pg/mL şi mai mare de 4 3 faţă de nivelurile de referinţă.
În unele aplicări, TIL produse prin metodele prevăzute în prezenta, de exemplu cele exemplificate în Figura 27, asigură o îmbunătăţire semnificativă a eficienţei clinice a TIL. În unele aplicări, TIL produse prin metodele prevăzute în prezenta, de exemplu cele exemplificate în Figura 27, prezintă eficienţă clinică mărită faţă de TIL produse prin alte metode decât cele descrise în prezenta, inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele exemplificate în Figura 27. În unele aplicări, alte metode decât cele descrise în prezenta includ metode denumite procesul 1C şi/sau Generaţia 1 (Gen 1). În unele aplicări, eficienţa mărită se măsoară prin DCR, ORR şi/sau alte răspunsuri clinice. În unele aplicări, TIL produse prin metodele prevăzute în prezenta, de exemplu cele exemplificate în Figura 27, prezintă un timp de răspuns şi profil de siguranţă similare cu TIL produse prin alte metode decât cele descrise în prezenta, inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele exemplificate în Figura 27, de exemplu procesul Gen 1.
În unele aplicări, IFN-gamma (IFN-γ) indică eficienţa tratamentului şi/sau eficienţă clinică mărită. În unele aplicări, IFN-γ din sângele subiecţilor trataţi cu TIL indică TIL active. În unele aplicări, se utilizează un test de potenţial pentru producţia IFN-γ. Producţia IFN-γ este o altă măsură a potenţialului citotoxic. Producţia IFN-γ poate fi măsurată prin determinarea nivelurilor de citokine IFN-γ în sânge, ser sau TIL ex vivo ale unui subiect tratat cu TIL preparate prin metodele din prezenta invenţie, inclusiv cele descrise de exemplu în Figura 27. În unele aplicări, o creştere a IFN-γ indică eficienţa tratamentului la un pacient tratat cu TIL produse prin metodele din prezenta invenţie. În unele aplicări, IFN-γ este mărit o dată, de două ori, trei ori, patru ori sau cinci ori sau de mai multe ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, secreţia IFN-γ este mărită o dată faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, secreţia IFN-γ este mărită de două ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, secreţia IFN-γ este mărită de trei ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, secreţia IFN-γ este mărită de patru ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, secreţia IFN-γ este mărită de cinci ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, IFN-γ se măsoară folosind un kit Quantikine ELISA. În unele aplicări, IFN-γ se măsoară în TIL ex vivo ale unui subiect tratat cu TIL preparate prin metodele din prezenta invenţie, inclusiv cele descrise de exemplu în Figura 27. În unele aplicări, IFN-γ se măsoară în sângele unui subiect tratat cu TIL preparate prin metodele din prezenta invenţie, inclusiv cele descrise de exemplu în Figura 27. În unele aplicări, IFN-γ se măsoară în ser TIL al unui subiect tratat cu TIL preparate prin metodele din prezenta invenţie, inclusiv cele descrise de exemplu în Figura 27.
În unele aplicări, IP-10 mediu mai mare indică eficienţa tratamentului şi/sau eficienţă
clinică mărită. În unele aplicări, IP-10 mediu mai mare în sângele subiecţilor trataţi cu TIL indică TIL active. Producţia IP-10 poate fi măsurată prin determinarea nivelurilor de IP-10 în sângele unui subiect tratat cu TIL preparate prin metodele din prezenta invenţie, inclusiv cele descrise de exemplu în Figura 27. În unele aplicări, IP-10 mediu mai mare indică eficienţa tratamentului la un pacient tratat cu TIL produse prin metodele din prezenta invenţie. În unele aplicări, IP-10 mediu mai mare se corelează cu o creştere o dată, de două ori, trei ori, patru ori sau cinci ori sau de mai multe ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, IP-10 mediu mai mare se corelează cu o creştere o dată faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, IP-10 mediu mai mare se corelează cu o creştere de două ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, IP-10 mediu mai mare se corelează cu o creştere de trei ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, IP-10 mediu mai mare se corelează cu o creştere de patru ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, IP-10 mediu mai mare se corelează cu o creştere de cinci ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, IP-10 se măsoară în sângele unui subiect tratat cu TIL preparate prin metodele din prezenta invenţie, inclusiv cele descrise de exemplu în Figura 27. În unele aplicări, IP-10 se măsoară în ser TIL al unui subiect tratat cu TIL preparate prin metodele din prezenta invenţie, inclusiv cele descrise de exemplu în Figura 27.
În unele aplicări, MCP-1 mediu mai mare indică eficienţa tratamentului şi/sau eficienţă clinică mărită. În unele aplicări, MCP-1 mediu mai mare în sângele subiecţilor trataţi cu TIL indică TIL active. Producţia MCP-1 poate fi măsurată prin determinarea nivelurilor de MCP-1 în sângele unui subiect tratat cu TIL preparate prin metodele din prezenta invenţie, inclusiv cele descrise de exemplu în Figura 27. În unele aplicări, MCP-1 mediu mai mare indică eficienţa tratamentului la un pacient tratat cu TIL produse prin metodele din prezenta invenţie. În unele aplicări, MCP-1 mediu mai mare se corelează cu o creştere o dată, de două ori, trei ori, patru ori sau cinci ori sau de mai multe ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, MCP-1 mediu mai mare se corelează cu o creştere o dată faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, MCP-1 mediu mai mare se corelează cu o creştere de două ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, MCP-1 mediu mai mare se corelează cu o creştere de trei ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, MCP-1 mediu mai mare se corelează cu o creştere de patru ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, MCP-1 mediu mai mare se corelează cu o creştere de cinci ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, MCP-1 se măsoară în sângele unui subiect tratat cu TIL preparate prin metodele din prezenta invenţie, inclusiv cele descrise de exemplu în Figura 27. În unele aplicări, MCP-1 se măsoară în ser TIL al unui subiect tratat cu TIL preparate prin metodele din prezenta invenţie, inclusiv cele descrise de exemplu în Figura 27.
În unele aplicări, TIL prepared prin metodele din prezenta invenţie, inclusiv cele descrise de exemplu în Figura 27, prezintă policlonalitate mărită faţă de TIL produse prin alte metode, inclusiv cele care nu sunt exemplificate în Figura 27, cum ar fi de exemplu, metode denumite procesul 1C. În unele aplicări, policlonalitatea îmbunătăţită semnificativ şi/sau policlonalitatea mărită indică eficienţa tratamentului şi/sau eficienţă clinică mărită. În unele aplicări, policlonalitatea se referă la diversitatea repertoriului celulelor T. În unele aplicări, o creştere a policlonalităţii poate indica eficienţa tratamentului cu privire la administrarea TIL produse prin metodele din prezenta invenţie. În unele aplicări, policlonalitatea este mărită o dată, de două ori, de zece ori, de 100 de ori, de 500 de ori sau de 1000 de ori faţă de TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta, inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, policlonalitatea este mărită o dată faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, policlonalitatea este mărită două ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, policlonalitatea este mărită de zece ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, policlonalitatea este mărită de 100 de ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, policlonalitatea este mărită de 500 de ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, policlonalitatea este mărită de 1000 de ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27.
Măsurătorile eficienţei pot include măsurători ale ratei de combatere a bolii (DCR), precum şi rata răspunsului total (ORR), cunoscute în domeniu şi descrise în exemplele din prezenta, inclusiv Exemplul 28.
1. Metode de tratare a cancerelor şi a altor boli
Compoziţiile şi metodele descrise în prezenta pot fi folosite într-o metodă de tratare a bolilor se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, sunt prevăzute pentru utilizare în tratarea afecţiunilor hiperproliferative. Pot fi folosite de asemenea în tratarea altor afecţiuni descrise în prezenta şi în următoarele paragrafe.
Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, afecţiunea hiperproliferativă poate fi cancer. În compoziţii şi metode se divulga, în prezenta, afecţiunea hiperproliferativă poate fi un cancer tumoral solid. În compoziţii şi metode se divulga, în prezenta, cancerul tumoral solid poate fi selectat din grupul constând din melanom, cancer ovarian, cancer de col uterin, cancer pulmonar macrocelular (NSCLC), cancer pulmonar, cancer de vezică, cancer mamar, cancer cauzat de papilomavirus uman, cancer la cap şi gât (inclusiv carcinom celular scuamos la cap şi gât (HNSCC)), cancer renal şi carcinom cu celule renale. În compoziţii şi metode se divulga, în prezenta, afecţiunea hiperproliferativă poate fi o malignitate hematologică. În compoziţii şi metode se divulga, în prezenta, cancerul tumoral solid poate fi selectat din grupul constând din leucemie limfocitară cronică, leucemie limfoblastică acută, limfom difuz cu celule B mari, limfom non-Hodgkin, limfom Hodgkin, limfom folicular şi limfom cu celule manta.
Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, o metodă de tratare a unui cancer cu o populaţie de TIL, unde un pacient este pre-tratat cu chimioterapie non-mieloablativă înaintea unei perfuzii de TIL conform prezentei invenţii. În metodele divulgate în prezenta, chimioterapia non-mieloablativă poate fi ciclofosfamidă 60 mg/kg/zi timp de 2 zile (zilele 27 şi 26 înaintea perfuziei TIL) şi fludarabină 25 mg/m2/zi timp de 5 zile (zilele 27 până la 23 înaintea perfuziei TIL). În metodele divulgate în prezenta, după chimioterapia non-mieloablativă şi perfuzia TIL (ziua 0) conform prezentei invenţii, pacientul poate primi o perfuzie intravenoasă de IL-2 la 720.000 IU/kg din 8 în 8 ore până la toleranţă fiziologică.
Eficienţa compuşilor şi combinaţiilor de compuşi descrişi în prezenta în tratarea, prevenirea şi/sau controlul bolilor sau afecţiunilor indicate poate fi testată folosind diferite modele cunoscute în domeniu, reprezentând un ghid pentru tratarea bolii umane. De exemplu, modelele de determinare a eficienţei tratamentelor pentru cancer ovarian sunt descrise, de ex., în Mullany, et al., Endocrinology 2012, 153, 1585-92; şi Fong, et al., J. Ovarian Res. 2009, 2, 12. Modelele de determinare a eficienţei tratamentelor pentru cancer pancreatic sunt descrise în Herreros-Villanueva, et al., World J. Gastroenterol. 2012,18, 1286-1294. Modelele de determinare a eficienţei tratamentelor pentru cancer mamar sunt descrise, de ex., în Fantozzi, Breast Cancer Res. 2006, 8, 212. Modelele de determinare a eficienţei tratamentelor pentru melanom sunt descrise, de ex., în Damsky, et al., Pigment Cell & Melanom Res. 2010, 23, 853-859. Modelele de determinare a eficienţei tratamentelor pentru cancer pulmonar sunt descrise, de ex., în Meuwissen, et al., Genes & Development, 2005, 19, 643-664. Modelele de determinare a eficienţei tratamentelor pentru cancer pulmonar sunt descrise, de ex., în Kim, Clin. Exp. Otorhinolaryngol. 2009, 2, 55-60; şi Sano, Head Neck Oncol. 2009, 1, 32.
În unele aplicări, IFN-gamma (IFN-γ) indică eficienţa tratamentului pentru tratarea afecţiunii hiperproliferative. În unele aplicări, IFN-γ în sângele subiecţilor trataţi cu TIL indică TIL active. În unele aplicări, se utilizează un test de potenţial pentru producţia IFN-γ. Producţia IFN-γ este o altă măsură a potenţialului citotoxic. Producţia IFN-γ poate fi măsurată prin determinarea nivelurilor de citokine IFN-γ în sângele unui subiect tratat cu TIL preparate prin metodele din prezenta invenţie, inclusiv cele descrise de exemplu în Figura 27. În unele aplicări, TIL obţinute prin metoda din prezenta asigură IFN-γ mărit în sângele subiecţilor trataţi cu TIL din metoda din prezenta comparativ cu subiecţi trataţi cu TIL preparate folosind metode denumite procesul 1C, exemplificat în Figura 83. În unele aplicări, o creştere a IFN-γ indică eficienţa tratamentului la un pacient tratat cu TIL produse prin metodele din prezenta invenţie. În unele aplicări, IFN-γ este mărit o dată, de două ori, trei ori, patru ori sau cinci ori sau de mai multe ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, secreţia IFN-γ este mărită o dată faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, secreţia IFN-γ este mărită de două ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, secreţia IFN-γ este mărită de trei ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, secreţia IFN-γ este mărită de patru ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, secreţia IFN-γ este mărită de cinci ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, IFN-γ se măsoară folosind un kit Quantikine ELISA. În unele aplicări, IFN-γ se măsoară folosind un kit Quantikine ELISA. În unele aplicări, IFN-γ se măsoară în TIL ex vivo de la un pacient tratat cu TIL produse prin metodele din prezenta invenţie. În unele aplicări, IFN-γ se măsoară în sângele unui pacient tratat cu TIL produse prin metodele din prezenta invenţie. În unele aplicări, IFN-γ se măsoară în serul unui pacient tratat cu TIL produse prin metodele din prezenta invenţie.
În unele aplicări, IP-10 mediu mai mare indică eficienţa tratamentului şi/sau eficienţă clinică mărită pentru tratarea afecţiunii hiperproliferative. În unele aplicări, IP-10 mediu mai mare în sângele subiecţilor trataţi cu TIL indică TIL active. În unele aplicări, TIL obţinute prin metoda din prezenta asigură IP-10 mediu mai mare în sângele subiecţilor trataţi cu TIL din metoda din prezenta comparativ cu subiecţi trataţi cu TIL preparate folosind metode denumite procesul 1C, exemplificat în Figura 83. Producţia IP-10 poate fi măsurată prin determinarea nivelurilor de IP-10 în sângele unui subiect tratat cu TIL preparate prin metodele din prezenta invenţie, inclusiv cele descrise de exemplu în Figura 27. În unele aplicări, IP-10 mediu mai mare indică eficienţa tratamentului la un pacient tratat cu TIL produse prin metodele din prezenta invenţie. În unele aplicări, IP-10 mediu mai mare se corelează cu o creştere o dată, de două ori, trei ori, patru ori sau cinci ori sau de mai multe ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, IP-10 mediu mai mare se corelează cu o creştere o dată faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, IP-10 mediu mai mare se corelează cu o creştere de două ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, IP-10 mediu mai mare se corelează cu o creştere de trei ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, IP-10 mediu mai mare se corelează cu o creştere de patru ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, IP-10 mediu mai mare se corelează cu o creştere de cinci ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27.
În unele aplicări, MCP-1 mediu mai mare indică eficienţa tratamentului şi/sau eficienţă clinică mărită pentru tratarea afecţiunii hiperproliferative. În unele aplicări, MCP-1 mediu mai mare în sângele subiecţilor trataţi cu TIL indică TIL active. În unele aplicări, TIL obţinute prin metoda din prezenta asigură MCP-1 mediu mai mare în sângele subiecţilor trataţi cu TIL din metoda din prezenta comparativ cu subiecţi trataţi cu TIL preparate folosind metode denumite procesul 1C, exemplificat în Figura 83. Producţia MCP-1 poate fi măsurată prin determinarea nivelurilor de MCP-1 în sângele unui subiect tratat cu TIL preparate prin metodele din prezenta invenţie, inclusiv cele descrise de exemplu în Figura 27. În unele aplicări, MCP-1 mediu mai mare indică eficienţa tratamentului la un pacient tratat cu TIL produse prin metodele din prezenta invenţie. În unele aplicări, MCP-1 mediu mai mare se corelează cu o creştere o dată, de două ori, trei ori, patru ori sau cinci ori sau de mai multe ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, MCP-1 mediu mai mare se corelează cu o creştere o dată faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, MCP-1 mediu mai mare se corelează cu o creştere de două ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, MCP-1 mediu mai mare se corelează cu o creştere de trei ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, MCP-1 mediu mai mare se corelează cu o creştere de patru ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, MCP-1 mediu mai mare se corelează cu o creştere de cinci ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27.
În unele aplicări, TIL preparate prin metodele din prezenta invenţie, inclusiv cele descrise de exemplu in Figura 27, prezintă policlonalitate mărită faţă de TIL produse prin alte metode, inclusiv cele care nu sunt exemplificate în Figura 27, cum ar fi de exemplu, metodele denumite procesul 1C. În unele aplicări, policlonalitatea îmbunătăţită semnificativ şi/sau policlonalitatea mărită indică eficienţa tratamentului şi/sau eficienţă clinică mărită pentru tratarea cancerului. În unele aplicări, policlonalitatea se referă la diversitatea repertoriului celulelor T. În unele aplicări, o creştere a policlonalităţii poate indica eficienţa tratamentului cu privire la administrarea TIL produse prin metodele din prezenta invenţie. În unele aplicări, policlonalitatea este mărită o dată, de două ori, de zece ori, de 100 de ori, de 500 de ori sau de 1000 de ori faţă de TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, policlonalitatea este mărită o dată faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, policlonalitatea este mărită de două ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, policlonalitatea este mărită de zece ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, policlonalitatea este mărită de 100 de ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, policlonalitatea este mărită de 500 de ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27. În unele aplicări, policlonalitatea este mărită de 1000 de ori faţă de un pacient netratat şi/sau faţă de un pacient tratat cu TIL preparate folosind alte metode decât cele prevăzute în prezenta inclusiv, de exemplu, alte metode decât cele reprezentate în Figura 27.
2. Metode de co-administrare
Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, TIL produse aşa cum se descrie în prezenta, inclusiv de exemplu TIL obţinute dintr-o metodă descrisă în Etapele A - F din Figura 27, se pot administra în combinaţie cu unul sau mai mulţi regulatori ai punctului de control imun, cum ar fi anticorpii descrişi mai jos. De exemplu, anticorpii care ţintesc PD-1 şi care se pot co-administra cu TIL din prezenta invenţie includ, de ex., nelimitativ nivolumab (BMS-936558, Bristol-Myers Squibb; Opdivo®), pembrolizumab (lambrolizumab, MK03475 sau MK-3475, Merck; Keytruda®), anticorp anti-PD-1 umanizat JS001 (ShangHai JunShi), anticorp anti-PD-1 monoclonal TSR-042 (Tesaro, Inc.), Pidilizumab (anti-PD-1 mAb CT-011, Medivation), anticorp monoclonal anti-PD-1 BGB-A317 (BeiGene) şi/sau anticorp anti-PD-1 SHR-1210 (ShangHai HengRui), anticorp monoclonal uman REGN2810 (Regeneron), anticorp monoclonal uman MDX-1106 (Bristol-Myers Squibb) şi/sau anticorp anti-PD-1 umanizat IgG4 PDR001 (Novartis). În unele metode divulgate în prezenta, anticorpul PD-1 este din clona: RMP1-14 (IgG de şobolan) - BioXcell cat# BP0146. Alţi anticorpi adecvaţi pentru utilizare în metode de co-administrare cu TIL produse conform Etapelor A - F descrise în prezenta sunt anticorpi anti-PD-1 descrişi în brevetul U.S. nr. 8,008,449. În unele metode divulgate în prezenta, anticorpul sau porţiunea sa de legare a antigenului se leagă specific de PD-L1 şi îi inhibă interacţiunea cu PD-1, crescând activitatea imunitară. Orice anticorpi cunoscuţi în domeniu care se leagă de PD-L1 şi perturbează interacţiunea între PD-1 şi PD-L1 şi stimulează un răspuns imun anti-tumoral, sunt adecvaţi pentru utilizare în metode de co-administrare cu TIL produse conform Etapelor A - F descrise în prezenta. De exemplu, anticorpii care ţintesc PD-L1 şi sunt în teste clinice includ BMS-936559 (Bristol-Myers Squibb) şi MPDL3280A (Genentech). Alţi anticorpi adecvaţi care ţintesc PD-L1 sunt descrişi în brevetul U.S. nr. 7,943,743. Se va înţelege că orice anticorp care se leagă de PD-1 sau PD-L1, perturbează interacţiunea PD-1/PD-L1 şi stimulează un răspuns imun anti-tumoral este adecvat pentru utilizare în metode de co-administrare cu TIL produse conform Etapelor A - F descrise în prezenta. În unele metode divulgate în prezenta, Subiectului căruia i se administrează combinaţia de TIL produse conform Etapelor A - F i se poate co-administra un anticorp anti-PD-1 când pacientul are un tip de cancer refractar la administrarea doar a anticorpului anti-PD-1. În unele metode divulgate în prezenta, pacientului i se pot administra TIL în combinaţie şi anti-PD-1 când pacientul are melanom refractar. În unele metode divulgate în prezenta, pacientului i se pot administra TIL în combinaţie şi anti-PD-1 când pacientul are carcinom pulmonar macrocelular (NSCLC).
3. Precondiţionarea cu limfodepleţie opţională a pacienţilor
Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, o metodă de tratare a unui cancer cu o populaţie de TIL, unde un pacient este pre-tratat cu chimioterapie non-mieloablativă înaintea unei perfuzii de TIL conform prezentei invenţii. Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, o populaţie de TIL pentru utilizare în tratamentul cancerului la un pacient care a fost pre-tratat cu chimioterapie non-mieloablativă. În unele metode divulgate în prezenta, populaţia de TIL poate fi administrată prin perfuzie. În unele metode divulgate în prezenta, chimioterapia non-mieloablativă poate fi ciclofosfamidă 60 mg/kg/zi timp de 2 zile (zilele 27 şi 26 înaintea perfuziei TIL) şi fludarabină 25 mg/m2/zi timp de 5 zile (zilele 27 până la 23 înaintea perfuziei TIL). În unele metode divulgate în prezenta, după chimioterapia non-mieloablativă şi perfuzia TIL (ziua 0) conform prezentei invenţii, pacientul poate primi o perfuzie intravenoasă de IL-2 (aldesleukina, disponibilă în comerţ ca PROLEUKIN) la 720.000 IU/kg din 8 în 8 ore până la toleranţă fiziologică. În unele metode divulgate în prezenta, populaţia de TIL poate fi utilizată în tratarea cancerului în combinaţie cu IL-2, unde IL-2 se administrează după populaţia de TIL.
Observaţiile experimentale arată că limfodepleţia înaintea transferului adoptiv al limfocitelor T specifice tumorii are un rol esenţial în creşterea eficienţei tratamentului prin eliminarea celulelor T regulatoare şi a elementelor concurente ale sistemului imunitar ('citokine sinks'). În consecinţă, unele metode divulgate utilizează o etapă de limfodepleţie (uneori denumită şi "condiţionare imunosupresivă") la pacient înainte de introducerea TIL ale invenţiei.
În general, limfodepleţia se obţine folosind administrarea fludarabinei sau ciclofosfamidei (forma activă fiind denumită mafosfamidă) şi combinaţii ale acestora. Aceste metode sunt descrise în Gassner, et al., Cancer Immunol. Immunother. 2011, 60, 75-85, Muranski, et al., Nat. Clin. Pract. Oncol., 2006, 3, 668-681, Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-5239 şi Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-2357.
În metodele divulgate în prezenta, fludarabina se poate administra la o concentraţie de 0.5 µg/mL -10 µg/mL fludarabină. În metodele divulgate în prezenta, fludarabina se poate administra la o concentraţie de 1 µg/mL fludarabină. În metodele divulgate în prezenta, tratamentul cu fludarabină se poate administra timp de 1 zi, 2 zile, 3 zile, 4 zile, 5 zile, 6 zile sau 7 zile sau mai mult. În metodele divulgate în prezenta, fludarabina se poate administra la un dozaj de 10 mg/kg/zi, 15 mg/kg/zi, 20 mg/kg/zi, 25 mg/kg/zi, 30 mg/kg/zi, 35 mg/kg/zi, 40 mg/kg/zi sau 45 mg/kg/zi. În metodele divulgate în prezenta, tratamentul cu fludarabină se poate administra timp de 2-7 zile la 35 mg/kg/zi. În metodele divulgate în prezenta, tratamentul cu fludarabină se poate administra timp de 4-5 zile la 35 mg/kg/zi. În metodele divulgate în prezenta, tratamentul cu fludarabină se poate administra timp de 4-5 zile la 25 mg/kg/zi.
În metodele divulgate în prezenta, mafosfamida, forma activă a ciclofosfamidei, poate fi obţinută la o concentraţie de 0.5 µg/mL -10 µg/mL prin administrarea ciclofosfamidei. În metodele divulgate în prezenta, mafosfamida, forma activă a ciclofosfamidei, poate fi obţinută la o concentraţie de 1 µg/mL prin administrarea ciclofosfamidei. În metodele divulgate în prezenta, tratamentul cu ciclofosfamidă se poate administra timp de 1 zi, 2 zile, 3 zile, 4 zile, 5 zile, 6 zile sau 7 zile sau mai mult. În metodele divulgate în prezenta, ciclofosfamida se poate administra la un dozaj de 100 mg/m2/zi, 150 mg/m2/zi, 175 mg/m2/zi, 200 mg/m2/zi, 225 mg/m2/zi, 250 mg/m2/zi, 275 mg/m2/zi sau 300 mg/m2/zi. În metodele divulgate în prezenta, ciclofosfamida se poate administra intravenos (i.e., i.v.). În metodele divulgate în prezenta, tratamentul cu ciclofosfamidă se poate administra timp de 2-7 zile la 35 mg/kg/zi. În metodele divulgate în prezenta, tratamentul cu ciclofosfamidă se poate administra timp de 4-5 zile la 250 mg/m2/zi i.v. În metodele divulgate în prezenta, tratamentul cu ciclofosfamidă se poate administra timp de 4 zile la 250 mg/m2/zi i.v.
În metodele divulgate în prezenta, limfodepleţia se poate efectua prin administrarea fludarabinei şi ciclofosfamidei împreună unui pacient. În metodele divulgate în prezenta, fludarabina se poate administra la 25 mg/m2/zi i.v. şi ciclofosfamida se administrează la 250 mg/m2/zi i.v. în 4 zile.
În metodele divulgate în prezenta, limfodepleţia se poate efectua prin administrarea ciclofosfamidei la o doză de 60 mg/m2/zi timp de două zile, urmată de administrarea fludarabinei la o doză de 25 mg/m2/zi timp de cinci zile.
4. Regimuri IL-2
Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, regimul IL-2 poate cuprinde un regim IL-2 în doză mare, unde regimul IL-2 în doză mare cuprinde aldesleukina, sau un biosimilar sau o variantă a acesteia, administrată intravenos începând cu ziua de după administrarea unei porţiuni eficiente terapeutic a populaţiei terapeutice de TIL, unde aldesleukina sau un biosimilar sau o variantă a acesteia se administrează la o doză de 0.037 mg/kg sau 0.044 mg/kg IU/kg (masa corporală a pacientului) folosind perfuzie intravenoasă în bolus de 15 minute din opt în opt ore până la toleranţă, pentru un maxim de 14 doze. După 9 zile de pauză, acest program poate fi repetat alte 14 doze, pentru un maxim de 28 de doze în total.
În metodele divulgate în prezenta, regimul IL-2 poate cuprinde un regim IL-2 în scădere. Regimurile IL-2 în scădere au fost descrise în O'Day, et al., J. Clin. Oncol. 1999, 17, 2752-61 şi Eton, et al., Cancer 2000, 88, 1703-9. În metodele divulgate în prezenta, un regim IL-2 în scădere poate cuprinde 18 × 106 IU/m2 administrat intravenos în 6 ore, urmat de 18 × 106 IU/m2 administrat intravenos în 12 ore, urmat de 18 × 106 IU/m2 administrat intravenos în 24 h, urmat de 4.5 × 106 IU/m2 administrat intravenos în 72 de ore. Acest ciclu de tratament poate fi reptat la fiecare 28 de zile pentru un maxim de patru cicluri. În metodele divulgate în prezenta, un regim de IL-2 în scădere cuprinde 18.000.000 IU/m2 în ziua 1, 9.000.000 IU/m2 în ziua 2 şi 4.500.000 IU/m2 în zilele 3 şi 4.
În metodele divulgate în prezenta, regimul IL-2 poate cuprinde administrarea IL-2 pegilat o dată la fiecare 1, 2, 4, 6, 7, 14 sau 21 zile la o doză de 0.10 mg/zi până la 50 mg/zi.
5. Transfer celular adoptiv
Transferul celular adoptiv (ACT) este o formă foarte eficientă de imunoterapie şi presupune transfer de celule imunitare cu activitate antitumorală la pacienţi cu cancer. ACT este o metodă de tratament care presupune identificarea, in vitro, a limfocitelor cu activitate antitumorală, expansiunea in vitro a acestor celule într-un număr mai mare şi introducerea acestora în gazda purtătoare de cancer. Limfocitele folosite pentru transfer adoptiv pot proveni din stroma tumorilor rezecate (limfocite infiltrante în tumori sau TIL). TIL pentru ACT pot fi preparate aşa cum se descrie în prezenta. TIL se prepară, de exemplu, conform unei metode descrise în Figura 27. Pot proveni de asemenea din sânge dacă sunt modificate genetic pentru a exprima receptori T celulari (TCR) sau receptori antigenici himerici (CAR) antitumorali, îmbogăţite cu culturi de celule tumorale limfocitare mixte (MLTC) sau clonate folosind celule de prezentare a antigenului autologe şi peptide derivate din tumoare. ACT în care limfocitele provin din gazda purtătoare a cancerului este denumit ACT autolog. Documentaţia U.S. nr. 2011/0052530 se referă la o metodă de efectuare a terapiei celulare adoptive pentru a favoriza regresia cancerului, în primul rând pentru tratarea pacienţilor care suferă de melanom metastatic. În metodele divulgate în prezenta, TIL se pot administra aşa cum se descrie în prezenta. În metodele divulgate în prezenta, TIL se pot administra intr-o singură doză. Această administrare poate fi prin injecţie, de ex., injecţie intravenoasă. În metodele divulgate în prezenta, TIL şi/sau limfocitele citotoxice se pot administra în doze multiple. Dozajul poate fi o dată, de două ori, de trei ori, de patru ori, de cinci ori, de şase ori sau de mai multe ori pe an. Dozajul poate fi o dată pe lună, o dată la două săptămâni, o dată pe săptămână sau o dată la două zile. Administrarea TIL şi/sau a limfocitelor citotoxice poate continua atât cât este necesar.
6. Tratamente exemplificative
Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, o metodă de tratare a unui cancer cu o populaţie de limfocite infiltrante în tumori (TIL) cuprinzând etapele de (a) obţinere a unei prime populaţii de TIL dintr-o tumoare rezecată de la un pacient; (b) efectuarea unei expansiuni iniţiale a primei populaţii de TIL într-un prim mediu de cultură celulară pentru a obţine o a doua populaţie de TIL, unde a doua populaţie de TIL este cel puţin de 5 ori mai mare în număr decât prima populaţie de TIL şi unde primul mediu de cultură celulară cuprinde IL-2; (c) efectuarea unei expansiuni rapide a celei de-a doua populaţii de TIL folosind o populaţie de celule de prezentare a antigenului mieloide artificiale (aAPC mieloide) într-un al doilea mediu de cultură celulară pentru a obţine o a treia populaţie de TIL, unde a treia populaţie de TIL are un număr de cel puţin 50 de ori mai mare decât a doua populaţie de TIL după 7 zile de la iniţierea expansiunii rapide; şi unde al doilea mediu de cultură celulară cuprinde IL-2 şi OKT-3; (d) administrarea unei porţiuni eficiente terapeutic a celei de-a treia populaţii de TIL la un pacient cu cancer. Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, o populaţie de limfocite infiltrante în tumori (TIL) pentru utilizare în tratarea cancerului, unde populaţia de TIL este obţinută printr-o metodă cuprinzând etapele de (b) efectuare a unei expansiuni iniţiale a unei prime populaţii de TIL obţinute dintr-o tumoare rezecată de la un pacient într-un prim mediu de cultură celulară pentru a obţine o a doua populaţie de TIL, unde a doua populaţie de TIL este cel puţin de 5 ori mai mare în număr decât prima populaţie de TIL şi unde primul mediu de cultură celulară cuprinde IL-2; (c) efectuarea unei expansiuni rapide a celei de-a doua populaţii de TIL folosind o populaţie de celule de prezentare a antigenului mieloide artificiale (aAPC mieloide) într-un al doilea mediu de cultură celulară pentru a obţine o a treia populaţie de TIL, unde a treia populaţie de TIL are un număr de cel puţin 50 de ori mai mare decât a doua populaţie de TIL după 7 zile de la iniţierea a expansiunii rapide; şi unde al doilea mediu de cultură celulară cuprinde IL-2 şi OKT-3; (d) administrarea unei porţiuni eficiente terapeutic a celei de-a treia populaţii de TIL la un pacient cu cancer. În metodele divulgate în prezenta, metoda poate cuprinde o primă etapă (a) de obţinere a primei populaţii de TIL dintr-o tumoare rezecată de la un pacient. În metodele divulgate în prezenta, IL-2 poate fi prezentă la o concentraţie iniţială de circa 3000 IU/mL şi anticorpul OKT-3 este prezent la o concentraţie iniţială de circa 30 ng/mL în al doilea mediu de cultură celulară. În metodele divulgate în prezenta, prima expansiune se poate efectua într-o perioadă nu mai mare de 14 zile. În metodele divulgate în prezenta, prima expansiune se poate efectua folosind un recipient permeabil la gaz. În metodele divulgate în prezenta, A doua expansiune se poate efectua folosind un recipient permeabil la gaz. În metodele divulgate în prezenta, raportul celei de-a doua populaţii de TIL la populaţia de aAPC în expansiunea rapidă poate fi între 1 până la 80 şi 1 până la 400. În metodele divulgate în prezenta, raportul celei de-a doua populaţii de TIL la populaţia de aAPC în expansiunea rapidă poate fi circa 1 până la 300. În metodele divulgate în prezenta, cancerul pentru tratament poate fi selectat din grupul constând din melanom, cancer ovarian, cancer de col uterin, cancer pulmonar macrocelular (NSCLC), cancer pulmonar, cancer de vezică, cancer mamar, cancer cauzat de papilomavirus uman, cancer la cap şi gât (inclusiv carcinom celular scuamos la cap şi gât (HNSCC)), cancer renal şi carcinom cu celule renale. În metodele divulgate în prezenta, cancerul pentru tratament poate fi selectat din grupul constând din melanom, cancer ovarian şi cancer de col uterin. În metodele divulgate în prezenta, cancerul pentru tratament poate fi melanom. În metodele divulgate în prezenta, cancerul pentru tratament poate fi cancer ovarian. În metodele divulgate în prezenta, cancerul pentru tratament poate fi cancer de col uterin. În metodele divulgate în prezenta, metoda de tratare a cancerului mai poate cuprinde etapa de tratare a pacientului cu un regim de limfodepleţie non-mieloablativ înaintea administrării celei de-a treia populaţii de TIL la pacient. În metodele divulgate în prezenta, regimul de limfodepleţie non-mieloablativ poate cuprinde etapele de administrare a ciclofosfamidei la o doză de 60 mg/m2/zi timp de două zile, urmată de administrarea fludarabinei la o doză de 25 mg/m2/zi timp de cinci zile. În metodele divulgate în prezenta, regimul IL-2 în doză mare cuprinde 600.000 sau 720.000 IU/kg de aldesleukină, sau un biosimilar sau o variantă a acesteia, administrată ca o perfuzie intravenoasă în bolus în 15 minute din opt în opt ore până la toleranţă.
Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, o metodă de tratare a unui subiect cu cancer, metoda cuprinzând administrarea limfocitelor infiltrante în tumori (TIL) amplificate cuprinzând:
(a) obţinerea unei prime populaţii de TIL dintr-o tumoare rezecată de la un subiect prin
procesarea unei probe tumorale obţinute de la pacient în mai multe fragmente tumorale;
(b) adăgarea fragmentelor tumorale într-un sistem închis;
(c) efectuarea unei prime expansiuni prin cultivarea primei populaţii de TIL într-un mediu de cultură celulară cuprinzând IL-2 pentru a produce o a doua populaţie de TIL, unde prima expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o primă suprafaţă permeabilă la gaz, unde prima expansiune se efectuează timp de circa 11 zile pentru a obţine a doua populaţie de TIL, unde a doua populaţie de TIL are un număr de cel puţin 50 de ori mai mare decât prima populaţie de TIL şi unde tranziţia de la etapa (b) la etapa (c) are loc fără deschiderea sistemului;
(d) efectuarea unei a doua expansiuni prin suplimentarea mediului de cultură celulară al celei de-a doua populaţii de TIL cu IL-2 suplimentar, OKT-3 şi celule de prezentare a antigenului (APC), pentru a produce o a treia populaţie de TIL, unde a doua expansiune se efectuează timp de circa 11 zile pentru a obţine a treia populaţie de TIL, unde a treia populaţie de TIL este o populaţie terapeutică de TIL, unde a doua expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o a doua suprafaţă permeabilă la gaz şi unde tranziţia de la etapa (c) la etapa (d) are loc fără deschiderea sistemului;
(e) recoltarea populaţiei terapeutice de TIL obţinute de la etapa (d), unde tranziţia de la etapa (d) la etapa (e) are loc fără deschiderea sistemului; şi
(f) transferul populaţiei TIL recoltate de la etapa (e) într-o pungă de perfuzie, unde transferul de la etapa (e) la (f) are loc fără deschiderea sistemului;
(g) crioconservarea pungii de perfuzie cuprinzând populaţia TIL recoltată de la etapa (f) folosind un proces de crioconservare; şi
(h) administrarea unui dozaj terapeutic eficient din a treia populaţie de TIL din punga de perfuzie în etapa (g) la pacient.
În metodele divulgate în prezenta, procesul de crioconservare poate cuprinde crioconservare într-un mediu cuprinzând DMSO. În metodele divulgate în prezenta, mediul de crioconservare poate cuprinde 7% până la 10% DMSO. Mediul de crioconservare poate fi CS10.
În metodele divulgate în prezenta, populaţia terapeutică de TIL recoltată în etapa (e) poate cuprinde suficiente TIL pentru administrarea unui dozaj terapeutic eficient al TIL în etapa (h).
În metodele divulgate în prezenta, numărul de TIL suficient pentru administrarea unui dozaj terapeutic eficient în etapa (h) poate fi de la circa 2.3×1010 până la circa 13.7×1010.
În metodele divulgate în prezenta, celulele de prezentare a antigenului (APC) pot fi PBMC.
În metodele divulgate în prezenta, PBMC pot fi adăugate în cultura celulară în oricare dintre zilele 9 - 11 în etapa (d).
În metodele divulgate în prezenta, înaintea administrării unui dozaj terapeutic eficient de celule TIL în etapa (h), poate să fi fost administrat la pacient un regim de limfodepleţie non-mieloablativ.
În metodele divulgate în prezenta, regimul de limfodepleţie non-mieloablativ poate cuprinde etapele de administrare a ciclofosfamidei la o doză de 60 mg/m2/zi timp de două zile, urmată de administrarea fludarabinei la o doză de 25 mg/m2/zi timp de cinci zile.
În metodele divulgate în prezenta, metoda mai poate cuprinde etapa de tratare a pacientului cu un regim IL-2 în doză mare începând cu ziua de după administrarea celulelor TIL la pacient în etapa (h).
În metodele divulgate în prezenta, regimul IL-2 în doză mare poate cuprinde 600.000 sau 720.000 IU/kg administrat ca o perfuzie intravenoasă în bolus în 15 minute din opt în opt ore până la toleranţă.
În metodele divulgate în prezenta, A treia populaţie de TIL în etapa (d) poate asigura eficienţă mărită, producţie interferon-gamma (IFN-γ) mărită, policlonalitate mărită, IP-10 mediu mărit şi/sau MCP-1 mediu mărit la administrare la un subiect. În metodele divulgate în prezenta, creşterea IFN-γ, IP-10 mediu mărit şi/sau MCP-1 mediu mărit se pot măsura în sângele subiectului tratat cu TIL.
În metodele divulgate în prezenta, cancerul poate fi selectat din grupul constând din melanom, cancer ovarian, cancer de col uterin, cancer pulmonar macrocelular (NSCLC), cancer pulmonar, cancer de vezică, cancer mamar, cancer cauzat de papilomavirus uman, cancer la cap şi gât (inclusiv carcinom celular scuamos la cap şi gât (HNSCC)), cancer renal şi carcinom cu celule renale. În metodele divulgate în prezenta, cancerul poate fi selectat din grupul constând din melanom, HNSCC, cancer de col uterin şi NSCLC. În metodele divulgate în prezenta, cancerul este melanom. În metodele divulgate în prezenta, cancerul HNSCC. În metodele divulgate în prezenta, cancerul poate fi un cancer de col uterin. În metodele divulgate în prezenta, cancerul poate fi NSCLC.
Se divulgă de asemenea în prezenta, o metodă de expansiune a limfocitelor infiltrante în tumori (TIL).
Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, o metodă de expansiune a limfocitelor infiltrante în tumori (TIL) cuprinzând: (a) obţinerea unei probe tumorale de la un pacient, unde proba tumorală respectivă cuprinde o primă populaţie de TIL; (b) procesarea probei tumorale în mai multe fragmente tumorale; (c) adăugarea fragmentelor tumorale într-un recipient închis; (d) efectuarea unei expansiuni iniţiale a primei populaţii de TIL într-un prim mediu de cultură celulară pentru a obţine o a doua populaţie de TIL, unde primul mediu de cultură celulară cuprinde IL-2, unde expansiunea iniţială se efectuează în recipientul închis care asigură cel puţin 100 cm2 de suprafaţă permeabilă la gaz, unde expansiunea iniţială se efectuează într-o primă perioadă de circa 7-14 zile pentru a obţine o a doua populaţie de TIL, unde a doua populaţie de TIL are un număr de cel puţin 50 de ori mai mare decât prima populaţie de TIL şi unde tranziţia de la etapa (c) la etapa (d) are loc fără deschiderea sistemului; (e) amplificarea celei de-a doua populaţii de TIL într-un al doilea mediu de cultură celulară, unde al doilea mediu de cultură celulară cuprinde IL-2, OKT-3 şi celule mononucleare din sângele periferic (PBMC, cunoscute şi ca celule mononucleare (MNC)), unde expansiunea se efectuează într-o a doua perioadă de circa 7-14 zile pentru a obţine o a treia populaţie de TIL, unde a treia populaţie de TIL prezintă o subpopulaţie mărită de celule T efectoare şi/sau celule T de memorie centrală faţă de a doua populaţie de TIL, unde expansiunea se efectuează într-un recipient închis care asigură cel puţin 500 cm2 de suprafaţă permeabilă la gaz şi unde tranziţia de la etapa (d) la etapa (e) are loc fără deschiderea sistemului; (f) recoltarea celei de-a treia populaţii de TIL obţinute de la etapa (e), unde tranziţia de la etapa (e) la etapa (f) are loc fără deschiderea sistemului; şi (g) transferul populaţiei TIL recoltate de la etapa (f) într-o pungă de perfuzie, unde transferul de la etapa (f) la (g) are loc fără deschiderea sistemului. În metodele divulgate în prezenta, metoda poate fi o metodă in vitro sau o metodă ex vivo.
În metodele divulgate în prezenta, metoda mai poate cuprinde recoltarea în etapa (f), printr-un sistem de procesare celulară, cum ar fi sistemul LOVO fabricat de Fresenius Kabi. Termenul "sistem de procesare celulară LOVO" se referă de asemenea la orice instrument sau dispozitiv fabricate de orice furnizor, care poate pompa o soluţie conţinând celule printr-o membrană sau un filtru, cum ar fi o membrană sau filtru de centrifugare într-un mediu de sistem steril şi/sau închis, permiţând fluxul continuu şi procesarea celulară pentru a îndepărta supernatantul sau mediul de cultură celulară fără peletizare. În unele cazuri, sistemul de procesare celulară poate efectua separarea celulelor, spălare, schimb de fluid, concentrare şi/sau alte etape de procesare celulară într-un sistem steril, închis.
În metodele divulgate în prezenta, recipientul închis poate fi selectat din grupul constând dintr-un recipient G şi o pungă celulară Xuri.
În metodele divulgate în prezenta, punga de perfuzie în etapa (g) poate fi o pungă de perfuzie conţinând HypoThermosol.
În metodele divulgate în prezenta, prima perioadă în etapa (d) şi a doua perioadă în etapa (e) se pot efectua fiecare individual într-o perioadă de 10 zile, 11 zile sau 12 zile.
În metodele divulgate în prezenta, prima perioadă în etapa (d) şi a doua perioadă în etapa (e) se pot efectua fiecare individual într-o perioadă de 11 zile.
În metodele divulgate în prezenta, etapele (a) până la (g) se pot efectua într-o perioadă de circa 25 zile până la circa 30 zile.
În metodele divulgate în prezenta, etapele (a) până la (g) se pot efectua într-o perioadă de circa 20 zile până la circa 25 zile.
În metodele divulgate în prezenta, etapele (a) până la (g) se pot efectua într-o perioadă de circa 20 zile până la circa 22 zile.
În metodele divulgate în prezenta, etapele (a) până la (g) se pot efectua în 22 zile sau mai puţin.
În metodele divulgate în prezenta, etapele (c) până la (f) se pot efectua într-un singur recipient, unde efectuarea etapelor (c) până la (f) într-un singur recipient duce la o creştere a producţiei TIL per tumoare rezecată faţă de efectuarea etapelor (c) până la (f) în mai multe recipiente.
În metodele divulgate în prezenta, PBMC se pot adăuga în TIL în a doua perioadă în etapa (e) fără deschiderea sistemului.
În metodele divulgate în prezenta, celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală obţinute din a treia populaţie de TIL pot prezenta una sau mai multe caracteristici selectate din grupul constând din expresie CD27+, expresie CD28+, telomeri mai lungi, expresie CD57 mărită şi expresie CD56 scăzută faţă de celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală obţinute din a doua populaţie de celule.
În metodele divulgate în prezenta, celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală obţinute din a treia populaţie de TIL pot prezenta expresie CD57 mărită şi expresie CD56 scăzută faţă de celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală obţinute din a doua populaţie de celule.
În metodele divulgate în prezenta, riscul de contaminare microbiană poate fi redus faţă de un sistem deschis.
În metodele divulgate în prezenta, TIL de la etapa (g) pot fi administrate prin perfuzie unui pacient.
Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, o metodă de tratare a cancerului la un pacient cu o populaţie de limfocite infiltrante în tumori (TIL) cuprinzând etapele de: (a) obţinere a unei probe tumorale de la un pacient, unde proba tumorală respectivă cuprinde o primă populaţie de TIL; (b) procesarea probei tumorale în mai multe fragmente tumorale; (c) adăugarea fragmentelor tumorale într-un recipient închis; (d) efectuarea unei expansiuni iniţiale a primei populaţii de TIL într-un prim mediu de cultură celulară pentru a obţine o a doua populaţie de TIL, unde primul mediu de cultură celulară cuprinde IL-2, unde expansiunea iniţială se efectuează în recipientul închis care asigură cel puţin 100 cm2 de suprafaţă permeabilă la gaz, unde expansiunea iniţială se efectuează într-o primă perioadă de circa 7-14 zile pentru a obţine o a doua populaţie de TIL, unde a doua populaţie de TIL are un număr de cel puţin 50 de ori mai mare decât prima populaţie de TIL şi unde tranziţia de la etapa (c) la etapa (d) are loc fără deschiderea sistemului; (e) amplificarea celei de-a doua populaţii de TIL într-un al doilea mediu de cultură celulară, unde al doilea mediu de cultură celulară cuprinde IL-2, OKT-3 şi celule mononucleare din sângele periferic (PBMC), unde expansiunea se efectuează într-o a doua perioadă de circa 7-14 zile pentru a obţine o a treia populaţie de TIL, unde a treia populaţie de TIL prezintă o subpopulaţie mărită de celule T efectoare şi/sau celule T de memorie centrală faţă de a doua populaţie de TIL, unde expansiunea se efectuează într-un recipient închis care asigură cel puţin 500 cm2 de suprafaţă permeabilă la gaz şi unde tranziţia de la etapa (d) la etapa (e) are loc fără deschiderea sistemului; (f) recoltarea celei de-a treia populaţii de TIL obţinute de la etapa (e), unde tranziţia de la etapa (e) la etapa (f) are loc fără deschiderea sistemului; (g) transferul populaţiei TIL recoltate de la etapa (f) într-o pungă de perfuzie, unde transferul de la etapa (f) la (g) are loc fără deschiderea sistemului; şi (h) administrarea unei cantităţi eficiente terapeutic de celule TIL din punga de perfuzie în etapa (g) la pacient.
Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, o populaţie de limfocite infiltrante în tumori (TIL) pentru utilizare în tratarea cancerului, unde populaţia de TIL se obţine dintr-o metodă cuprinzând etapele de: (b) procesare a unei probe tumorale obţinute de la un pacient, unde proba tumorală cuprinde o primă populaţie de TIL în mai multe fragmente tumorale; (c) adăugarea fragmentelor tumorale într-un recipient închis; (d) efectuarea unei expansiuni iniţiale a primei populaţii de TIL într-un prim mediu de cultură celulară pentru a obţine o a doua populaţie de TIL, unde primul mediu de cultură celulară cuprinde IL-2, unde expansiunea iniţială se efectuează în recipientul închis care asigură cel puţin 100 cm2 de suprafaţă permeabilă la gaz, unde expansiunea iniţială se efectuează într-o primă perioadă de circa 7-14 zile pentru a obţine o a doua populaţie de TIL, unde a doua populaţie de TIL are un număr de cel puţin 50 de ori mai mare decât prima populaţie de TIL şi unde tranziţia de la etapa (c) la etapa (d) are loc fără deschiderea sistemului; (e) amplificarea celei de-a doua populaţii de TIL într-un al doilea mediu de cultură celulară, unde al doilea mediu de cultură celulară cuprinde IL-2, OKT-3 şi celule mononucleare din sângele periferic (PBMC), unde expansiunea se efectuează într-o a doua perioadă de circa 7-14 zile pentru a obţine o a treia populaţie de TIL, unde a treia populaţie de TIL prezintă o subpopulaţie mărită de celule T efectoare şi/sau celule T de memorie centrală faţă de a doua populaţie de TIL, unde expansiunea se efectuează într-un recipient închis care asigură cel puţin 500 cm2 de suprafaţă permeabilă la gaz şi unde tranziţia de la etapa (d) la etapa (e) are loc fără deschiderea sistemului; (f) recoltarea celei de-a treia populaţii de TIL obţinute de la etapa (e), unde tranziţia de la etapa (e) la etapa (f) are loc fără deschiderea sistemului; (g) transferul populaţiei TIL recoltate de la etapa (f) într-o pungă de perfuzie, unde transferul de la etapa (f) la (g) are loc fără deschiderea sistemului. În metodele divulgate în prezenta, metoda poate cuprinde o primă etapă de (a) obţinere a probei tumorale de la un pacient, unde proba tumorală respectivă cuprinde prima populaţie de TIL. În metodele divulgate în prezenta, populaţia de TIL poate fi prevăzută pentru administrare din punga de perfuzie în etapa (g) într-o cantitate eficientă terapeutic.
În metodele divulgate în prezenta, înaintea administrării unei cantităţi eficiente terapeutic de celule TIL în etapa (h), poate să fi fost administrat la pacient un regim de limfodepleţie non-mieloablativ. În metodele divulgate în prezenta, populaţiile TIL pot fi prevăzute pentru administrare la un pacient care a suferit un regim de limfodepleţie non-mieloablativ.
În metodele divulgate în prezenta, regimul de limfodepleţie non-mieloablativ poate cuprinde etapele de administrare a ciclofosfamidei la o doză de 60 mg/m2/zi timp de două zile, urmată de administrarea fludarabinei la o doză de 25 mg/m2/zi timp de cinci zile.
În metodele divulgate în prezenta, metoda mai poate cuprinde etapa de tratare a pacientului cu un regim IL-2 în doză mare începând cu ziua de după administrarea celulelor TIL la pacient în etapa (h). În metodele divulgate în prezenta, populaţiile TIL pot fi prevăzute pentru administrare înainte de un regim IL-2 în doză mare. În metodele divulgate în prezenta, populaţia TIL poate fi prevăzută pentru administrare cu o zi înaintea debutului regimului IL-2 în doză mare.
În metodele divulgate în prezenta, regimul IL-2 în doză mare poate cuprinde 600.000 sau 720.000 IU/kg administrat ca o perfuzie intravenoasă în bolus în 15 minute din opt în opt ore până la toleranţă.
În metodele divulgate în prezenta, celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală obţinute din a treia populaţie de TIL pot prezenta una sau mai multe caracteristici selectate din grupul constând din expresie CD27+, expresie CD28+, telomeri mai lungi, expresie CD57 mărită şi expresie CD56 scăzută faţă de celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală obţinute din a doua populaţie de celule.
În metodele divulgate în prezenta, celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală obţinute din a treia populaţie de TIL pot prezenta expresie CD57 mărită şi expresie CD56 scăzută faţă de celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală obţinute din a doua populaţie de celule.
Se divulgă de asemenea în prezenta dar fără a se revendica, o metodă de expansiune a limfocitelor infiltrante în tumori (TIL) cuprinzând etapele de (a) adăugare a fragmentelor tumorale procesate într-un sistem închis; (b) efectuarea unei prime expansiuni a primei populaţii de TIL într-un prim mediu de cultură celulară pentru a obţine o a doua populaţie de TIL, unde primul mediu de cultură celulară cuprinde IL-2, unde prima expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o primă suprafaţă permeabilă la gaz, unde prima expansiune se efectuează într-o primă perioadă de circa 3-14 zile pentru a obţine o a doua populaţie de TIL, unde a doua populaţie de TIL are un număr de cel puţin 50 de ori mai mare decât prima populaţie de TIL şi unde tranziţia de la etapa (a) la etapa (b) are loc fără deschiderea sistemului; (c) amplificarea celei de-a doua populaţii de TIL într-un al doilea mediu de cultură celulară, unde al doilea mediu de cultură celulară cuprinde IL-2, OKT-3 şi celulele de prezentare a antigenului, unde expansiunea se efectuează într-o a doua perioadă de circa 7-14 zile pentru a obţine o a treia populaţie de TIL, unde a treia populaţie de TIL prezintă o subpopulaţie mărită de celule T efectoare şi/sau celule T de memorie centrală faţă de a doua populaţie de TIL, unde expansiunea se efectuează într-un recipient închis care asigură o a doua suprafaţă permeabilă la gaz şi unde tranziţia de la etapa (b) la etapa (c) are loc fără deschiderea sistemului; (d) recoltarea celei de-a treia populaţii de TIL obţinute de la etapa (c), unde tranziţia de la etapa (c) la etapa (d) are loc fără deschiderea sistemului; şi (e) transferul populaţiei TIL recoltate de la etapa (d) într-o pungă de perfuzie, unde transferul de la etapa (d) la (e) are loc fără deschiderea sistemului.
În metodele divulgate în prezenta, metoda mai poate cuprinde etapa de crioconservare a pungii de perfuzie cuprinzând populaţia TIL recoltată folosind un proces de crioconservare. În metodele divulgate în prezenta, procesul de crioconservare se poate efectua folosind un raport 1:1 între populaţia TIL recoltată şi mediul CS10.
În metodele divulgate în prezenta, celulele de prezentare a antigenului pot fi celule mononucleare din sângele periferic (PBMC). În metodele divulgate în prezenta, celulele de prezentare a antigenului pot fi celule de prezentare a antigenului artificiale.
În metodele divulgate în prezenta, recoltarea din etapa (d) se poate efectua folosind un sistem de procesare celulară LOVO.
În metodele divulgate în prezenta, fragmentele multiple pot cuprinde circa 50 fragmente, unde fiecare fragment are un volum de circa 27 mm3. În metodele divulgate în prezenta, fragmentele multiple pot cuprinde circa 30 până la circa 60 fragmente cu un volum total de circa 1300 mm3 până la circa 1500 mm3. În metodele divulgate în prezenta, fragmentele multiple pot cuprinde circa 50 fragmente cu un volum total de circa 1350 mm3. În metodele divulgate în prezenta, fragmentele multiple pot cuprinde circa 50 fragmente cu o masă totală de circa 1 gram până la circa 1.5 grame.
În metodele divulgate în prezenta, Al doilea mediu de cultură celulară poate fi prevăzut într-un recipient selectat din grupul constând dintr-un recipient G şi o pungă celulară Xuri.
În metodele divulgate în prezenta, punga de perfuzie în etapa (e) poate fi o pungă de perfuzie conţinând HypoThermosol.
În metodele divulgate în prezenta, prima perioadă în etapa (b) şi a doua perioadă în etapa (c) se pot efectua fiecare individual într-o perioadă de 10 zile, 11 zile sau 12 zile. În metodele divulgate în prezenta, prima perioadă în etapa (b) şi a doua perioadă în etapa (c) se pot efectua fiecare individual într-o perioadă de 11 zile.
În metodele divulgate în prezenta, etapele (a) până la (e) se pot efectua într-o perioadă de circa 25 zile până la circa 30 zile. În metodele divulgate în prezenta, etapele (a) până la (e) se pot efectua într-o perioadă de circa 20 zile până la circa 25 zile. În metodele divulgate în prezenta, etapele (a) până la (e) se pot efectua într-o perioadă de circa 20 zile până la circa 22 zile. În metodele divulgate în prezenta, etapele (a) până la (e) se pot efectua în 22 zile sau mai puţin. În metodele divulgate în prezenta, etapele (a) până la (e) şi crioconservarea se pot efectua în 22 zile sau mai puţin.
În metodele divulgate în prezenta, etapele (b) până la (e) se pot efectua într-un singur sistem închis, unde efectuarea etapelor (b) până la (e) într-un singur recipient duce la o creştere a producţiei TIL per tumoare rezecată faţă de efectuarea etapelor (b) până la (e) în mai multe recipiente.
În metodele divulgate în prezenta, celulele de prezentare a antigenului se pot adăuga în TIL în a doua perioadă în etapa (c) fără deschiderea sistemului.
În metodele divulgate în prezenta, celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală obţinute din a treia populaţie de TIL pot prezenta una sau mai multe caracteristici selectate din grupul constând din expresie CD27+, expresie CD28+, telomeri mai lungi, expresie CD57 mărită şi expresie CD56 scăzută faţă de celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală obţinute din a doua populaţie de celule.
În metodele divulgate în prezenta, celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală obţinute din a treia populaţie de TIL pot prezenta expresie CD57 mărită şi expresie CD56 scăzută faţă de celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală obţinute din a doua populaţie de celule.
În metodele divulgate în prezenta, riscul de contaminare microbiană poate fi redus faţă de un sistem deschis.
În metodele divulgate în prezenta, TIL de la etapa (e) pot fi administrate prin perfuzie unui pacient.
În metodele divulgate în prezenta, recipientul închis poate cuprinde un singur bioreactor. În metodele divulgate în prezenta, recipientul închis poate cuprinde G-REX-10. În metodele divulgate în prezenta, recipientul închis poate cuprinde G-REX-100. În metodele divulgate în prezenta, recipientul închis poate cuprinde G-Rex 500. În metodele divulgate în prezenta, Recipientul închis poate cuprinde un recipient permeabil la gaz Xuri sau Wave.
Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, o metodă de expansiune a limfocitelor infiltrante în tumori (TIL) într-o populaţie terapeutică de TIL cuprinzând:
(b) adăugarea fragmentelor tumorale într-un sistem închis, unde fragmentele tumorale cuprind o primă populaţie de TIL;
(c) efectuarea unei prime expansiuni prin cultivarea primei populaţii de TIL într-un mediu de cultură celulară cuprinzând IL-2 pentru a produce o a doua populaţie de TIL, unde prima expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o primă suprafaţă permeabilă la gaz, unde prima expansiune se efectuează timp de circa 3-14 zile pentru a obţine a doua populaţie de TIL, unde a doua populaţie de TIL are un număr de cel puţin 50 de ori mai mare decât prima populaţie de TIL şi unde tranziţia de la etapa (b) la etapa (c) are loc fără deschiderea sistemului;
(d) efectuarea unei a doua expansiuni prin suplimentarea mediului de cultură celulară al celei de-a doua populaţii de TIL cu IL-2 suplimentar, OKT-3 şi celule de prezentare a antigenului (APC), pentru a produce o a treia populaţie de TIL, unde a doua expansiune se efectuează timp de circa 7-14 zile pentru a obţine a treia populaţie de TIL, unde a treia populaţie de TIL este o populaţie terapeutică de TIL cuprinzând o subpopulaţie mărită de celule T efectoare şi/sau celule T de memorie centrală faţă de a doua populaţie de TIL, unde a doua expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o a doua suprafaţă permeabilă la gaz şi unde tranziţia de la etapa (c) la etapa (d) are loc fără deschiderea sistemului;
(e) recoltarea populaţiei terapeutice de TIL obţinute de la etapa (d), unde tranziţia de la etapa (d) la etapa (e) are loc fără deschiderea sistemului; şi
(f) transferul populaţiei TIL recoltate de la etapa (e) într-o pungă de perfuzie, unde transferul de la etapa (e) la (f) are loc fără deschiderea sistemului.
În metodele divulgate în prezenta, metoda mai poate cuprinde ca o primă etapă:
(a) obţinerea unei prime populaţii de TIL dintr-o tumoare rezecată de la un pacient prin procesarea unei probe tumorale obţinute de la pacient în mai multe fragmente tumorale.
În metodele divulgate în prezenta, metoda poate fi o metodă in vitro sau o metodă ex vivo.
În metodele divulgate în prezenta, o metodă de expansiune a limfocitelor infiltrante în tumori (TIL) într-o populaţie terapeutică de TIL cuprinzând:
(a) obţinerea unei prime populaţii de TIL dintr-o tumoare rezecată de la un pacient prin procesarea unei probe tumorale obţinute de la pacient în mai multe fragmente tumorale;
(b) adăgarea fragmentelor tumorale într-un sistem închis;
(c) efectuarea unei prime expansiuni prin cultivarea primei populaţii de TIL într-un mediu de cultură celulară cuprinzând IL-2 pentru a produce o a doua populaţie de TIL, unde prima expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o primă suprafaţă permeabilă la gaz, unde prima expansiune se efectuează timp de circa 3-14 zile pentru a obţine a doua populaţie de TIL, unde a doua populaţie de TIL are un număr de cel puţin 50 de ori mai mare decât prima populaţie de TIL şi unde tranziţia de la etapa (b) la etapa (c) are loc fără deschiderea sistemului;
(d) efectuarea unei a doua expansiuni prin suplimentarea mediului de cultură celulară al celei de-a doua populaţii de TIL cu IL-2 suplimentar, OKT-3 şi celule de prezentare a antigenului (APC), pentru a produce o a treia populaţie de TIL, unde a doua expansiune se efectuează timp de circa 7-14 zile pentru a obţine a treia populaţie de TIL, unde a treia populaţie de TIL este o populaţie terapeutică de TIL cuprinzând o subpopulaţie mărită de celule T efectoare şi/sau celule T de memorie centrală faţă de a doua populaţie de TIL, unde a doua expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o a doua suprafaţă permeabilă la gaz şi unde tranziţia de la etapa (c) la etapa (d) are loc fără deschiderea sistemului;
(e) recoltarea populaţiei terapeutice de TIL obţinute de la etapa (d), unde tranziţia de la etapa (d) la etapa (e) are loc fără deschiderea sistemului; şi
(f) transferul populaţiei TIL recoltate de la etapa (e) într-o pungă de perfuzie, unde transferul de la etapa (e) la (f) are loc fără deschiderea sistemului.
În metodele divulgate în prezenta, metoda poate fi o metodă in vitro sau o metodă ex vivo.
În metodele divulgate în prezenta, metoda mai poate cuprinde etapa de crioconservare a pungii de perfuzie cuprinzând populaţia TIL recoltată în etapa (f) folosind un proces de crioconservare.
În metodele divulgate în prezenta, procesul de crioconservare se poate efectua folosind un raport 1:1 între populaţia TIL recoltată şi mediul de crioconservare. În metodele divulgate în prezenta, mediul de crioconservare poate cuprinde dimetilsulfoxid. În metodele divulgate în prezenta, mediul de crioconservare poate fi selectat din grupul constând din Cryostor CS10, HypoThermasol sau o combinaţie a acestora.
În metodele divulgate în prezenta, celulele de prezentare a antigenului pot fi celule mononucleare din sângele periferic (PBMC).
În metodele divulgate în prezenta, PBMC pot fi iradiate şi alogenice.
În metodele divulgate în prezenta, PBMC pot fi adăugate în cultura celulară în oricare dintre zilele 9 - 14 în etapa (d).
În metodele divulgate în prezenta, celulele de prezentare a antigenului pot fi celule de prezentare a antigenului artificiale.
În metodele divulgate în prezenta, recoltarea din etapa (e) poate fi efectuată folosind un sistem de procesare celulară LOVO.
În metodele divulgate în prezenta, fragmentele tumorale pot fi fragmente multiple şi cuprind circa 4 până la circa 50 fragmente, unde fiecare fragment are un volum de circa 27 mm3. În metodele divulgate în prezenta, fragmentele multiple pot cuprinde circa 30 până la circa 60 fragmente cu un volum total de circa 1300 mm3 până la circa 1500 mm3. În metodele divulgate în prezenta, fragmentele multiple pot cuprinde circa 50 fragmente cu un volum total de circa 1350 mm3. În metodele divulgate în prezenta, fragmentele multiple pot cuprinde circa 50 fragmente cu o masă totală de circa 1 gram până la circa 1.5 grame.
În metodele divulgate în prezenta, mediul de cultură celulară poate fi prevăzut într-un recipient selectat din grupul constând dintr-un recipient G şi o pungă celulară Xuri.
În metodele divulgate în prezenta, punga de perfuzie în etapa (f) poate fi o pungă de perfuzie conţinând HypoThermosol.
În metodele divulgate în prezenta, prima perioadă în etapa (c) şi a doua perioadă în etapa (e) se pot efectua fiecare individual într-o perioadă de 10 zile, 11 zile sau 12 zile. În metodele divulgate în prezenta, prima perioadă în etapa (c) şi a doua perioadă în etapa (e) se pot efectua fiecare individual într-o perioadă de 11 zile. În metodele divulgate în prezenta, etapele (a) până la (f) se pot efectua într-o perioadă de circa 25 zile până la circa 30 zile. În metodele divulgate în prezenta, etapele (a) până la (f) se pot efectua într-o perioadă de circa 20 zile până la circa 25 zile. În metodele divulgate în prezenta, etapele (a) până la (f) se pot efectua într-o perioadă de circa 20 zile până la circa 22 zile. În metodele divulgate în prezenta, etapele (a) până la (f) se pot efectua în 22 zile sau mai puţin. În metodele divulgate în prezenta, etapele (a) până la (f) şi crioconservarea se pot efectua în 22 zile sau mai puţin.
În metodele divulgate în prezenta, populaţia terapeutică de TIL recoltată în etapa (e) poate cuprinde suficiente TIL pentru un dozaj terapeutic eficient al TIL. În metodele divulgate în prezenta, numărul de TIL suficient pentru un dozaj terapeutic eficient poate fi de la circa 2.3×1010 până la circa 13.7×1010.
În metodele divulgate în prezenta, etapele (b) până la (e) se pot efectua într-un singur recipient, unde efectuarea etapelor (b) până la (e) într-un singur recipient duce la o creştere a producţiei TIL per tumoare rezecată faţă de efectuarea etapelor (b) până la (e) în mai multe recipiente.
În metodele divulgate în prezenta, celulele de prezentare a antigenului se pot adăuga în TIL în a doua perioadă în etapa (d) fără deschiderea sistemului.
În metodele divulgate în prezenta, celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală în populaţia terapeutică de TIL pot prezenta una sau mai multe caracteristici selectate din grupul constând din expresie CD27+, expresie CD28+, telomeri mai lungi, expresie CD57 mărită şi expresie CD56 scăzută faţă de celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală obţinute din a doua populaţie de celule.
În metodele divulgate în prezenta, celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală obţinute din a treia populaţie de TIL pot prezenta expresie CD57 mărită şi expresie CD56 scăzută faţă de celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală obţinute din a doua populaţie de celule.
În metodele divulgate în prezenta, riscul de contaminare microbiană poate fi redus faţă de un sistem deschis.
În metodele divulgate în prezenta, TIL de la etapa (f) pot fi administrate prin perfuzie unui pacient.
În metodele divulgate în prezenta, fragmentele multiple pot cuprinde circa 4 fragmente. În metodele divulgate în prezenta, cele 4 fragmente pot fi introduse într-un G-REX -100. În metodele divulgate în prezenta, cele 4 fragmente pot avea diametru de circa 0.5 cm. În metodele divulgate în prezenta, cele 4 fragmente pot fi introduse într-un G-REX -100. În metodele divulgate în prezenta, cele 4 fragmente pot avea diametru de circa 0.1 cm, 0.2 cm, 0.3 cm, 0.4 cm, 0.5 cm, 0.6 cm, 0.7 cm, 0.8 cm, 0.9 cm sau 1 cm. În metodele divulgate în prezenta, cele 4 fragmente pot avea diametru de circa 0.1 cm, 0.2 cm, 0.3 cm, 0.4 cm, 0.5 cm, 0.6 cm, 0.7 cm, 0.8 cm, 0.9 cm sau 1 cm şi se introduc într-un G-REX -100. În metodele divulgate în prezenta, cele 4 fragmente pot avea diametru de circa 0.1 cm, 0.2 cm, 0.3 cm, 0.4 cm, 0.5 cm, 0.6 cm, 0.7 cm, 0.8 cm, 0.9 cm sau 1 cm şi se pot introduce într-un recipient cu un vomul echivalent cu G-REX -100. În metodele divulgate în prezenta, cele 4 fragmente pot avea diametru de circa 0.5 cm şi se pot introduce într-un G-REX -100. În metodele divulgate în prezenta, cele 4 fragmente pot avea diametru de circa 0.5 cm şi se pot introduce într-un recipient cu un vomul echivalent cu G-REX -100.
Alte detalii privind etapele (a), (b), (c), (d), (e) şi (f) sunt prevăzute mai jos, inclusiv de exemplu, nelimitativ, aplicările descrise în secţiunile "ETAPA A: Obţinerea probei tumorale de la pacient", "ETAPA B: Prima expansiune", "ETAPA C: Tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune", "ETAPA D: A doua expansiune", "ETAPA E: Recoltarea TIL" şi "ETAPA F: Compoziţie finală / transfer în punga de perfuzie".
Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, metode de tratare a unui subiect cu cancer, metoda cuprinzând administrarea limfocitelor infiltrante în tumori (TIL) amplificate cuprinzând:
(a) obţinerea unei prime populaţii de TIL dintr-o tumoare rezecată de la un subiect prin procesarea unei probe tumorale obţinute de la pacient în mai multe fragmente tumorale;
(b) adăgarea fragmentelor tumorale într-un sistem închis;
(c) efectuarea unei prime expansiuni prin cultivarea primei populaţii de TIL într-un mediu de cultură celulară cuprinzând IL-2 pentru a produce o a doua populaţie de TIL, unde prima expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o primă suprafaţă permeabilă la gaz, unde prima expansiune se efectuează timp de circa 3-14 zile pentru a obţine a doua populaţie de TIL, unde a doua populaţie de TIL are un număr de cel puţin 50 de ori mai mare decât prima populaţie de TIL şi unde tranziţia de la etapa (b) la etapa (c) are loc fără deschiderea sistemului;
(d) efectuarea unei a doua expansiuni prin suplimentarea mediului de cultură celulară al celei de-a doua populaţii de TIL cu IL-2 suplimentar, OKT-3 şi celule de prezentare a antigenului (APC), pentru a produce o a treia populaţie de TIL, unde a doua expansiune se efectuează timp de circa 7-14 zile pentru a obţine a treia populaţie de TIL, unde a treia populaţie de TIL este o populaţie terapeutică de TIL cuprinzând o subpopulaţie mărită de celule T efectoare şi/sau celule T de memorie centrală faţă de a doua populaţie de TIL, unde a doua expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o a doua suprafaţă permeabilă la gaz şi unde tranziţia de la etapa (c) la etapa (d) are loc fără deschiderea sistemului;
(e) recoltarea populaţiei terapeutice de TIL obţinute de la etapa (d), unde tranziţia de la etapa (d) la etapa (e) are loc fără deschiderea sistemului; şi
(f) transferul populaţiei TIL recoltate de la etapa (e) într-o pungă de perfuzie, unde transferul de la etapa (e) la (f) are loc fără deschiderea sistemului;
(g) opţional crioconservarea pungii de perfuzie cuprinzând populaţia TIL recoltată de la etapa (f) folosind un proces de crioconservare; şi
(h) administrarea unui dozaj terapeutic eficient din a treia populaţie de TIL din punga de perfuzie în etapa (g) la pacient.
Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, o populaţie terapeutică de limfocite infiltrante în tumori (TIL) pentru utilizare în tratarea cancerului, unde populaţia se obţine dintr-o metodă cuprinzând etapele:
(b) adăugarea fragmentelor tumorale într-un sistem închis, unde fragmentele tumorale cuprind o primă populaţie de TIL;
(c) efectuarea unei prime expansiuni prin cultivarea primei populaţii de TIL într-un mediu de cultură celulară cuprinzând IL-2 pentru a produce o a doua populaţie de TIL, unde prima expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o primă suprafaţă permeabilă la gaz, unde prima expansiune se efectuează timp de circa 3-14 zile pentru a obţine a doua populaţie de TIL, unde a doua populaţie de TIL are un număr de cel puţin 50 de ori mai mare decât prima populaţie de TIL şi unde tranziţia de la etapa (b) la etapa (c) are loc fără deschiderea sistemului;
(d) efectuarea unei a doua expansiuni prin suplimentarea mediului de cultură celulară al celei de-a doua populaţii de TIL cu IL-2 suplimentar, OKT-3 şi celule de prezentare a antigenului (APC), pentru a produce o a treia populaţie de TIL, unde a doua expansiune se efectuează timp de circa 7-14 zile pentru a obţine a treia populaţie de TIL, unde a treia populaţie de TIL este o populaţie terapeutică de TIL cuprinzând o subpopulaţie mărită de celule T efectoare şi/sau celule T de memorie centrală faţă de a doua populaţie de TIL, unde a doua expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o a doua suprafaţă permeabilă la gaz şi unde tranziţia de la etapa (c) la etapa (d) are loc fără deschiderea sistemului;
(e) recoltarea populaţiei terapeutice de TIL obţinute de la etapa (d), unde tranziţia de la etapa (d) la etapa (e) are loc fără deschiderea sistemului; şi
(f) transferul populaţiei TIL recoltate de la etapa (e) într-o pungă de perfuzie, unde transferul de la etapa (e) la (f) are loc fără deschiderea sistemului; şi
(g) opţional crioconservarea pungii de perfuzie cuprinzând populaţia TIL recoltată de la etapa (f) folosind un proces de crioconservare.
În metodele divulgate în prezenta, populaţia poate fi obţinută printr-o metodă cuprinzând de asemenea ca o primă etapă:
(a) obţinerea unei prime populaţii de TIL dintr-o tumoare rezecată de la un pacient prin procesarea unei probe tumorale obţinute de la pacient în mai multe fragmente tumorale.
În metodele divulgate în prezenta, metoda poate fi o metodă in vitro sau o metodă ex vivo.
În metodele divulgate în prezenta, oricare dintre etapele (a) - (f) pot cuprinde una sau mai multe caracteristici divulgate în prezenta, de ex. una sau mai multe caracteristici divulgate în secţiunile «ETAPA A: Obţinerea probei tumorale de la pacient», "ETAPA B: Prima expansiune", "ETAPA C: Tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune", "ETAPA D: A doua expansiune", "ETAPA E:
Recoltarea TIL" şi "ETAPA F: Compoziţie finală / transfer în punga de perfuzie".
În metodele divulgate în prezenta, etapa (g) poate cuprinde una sau mai multe caracteristici divulgate în prezenta, de ex. una sau mai multe caracteristici divulgate în secţiunea "ETAPA H: Crioconservare opţională TIL". În metodele divulgate în prezenta, etapa (h) cuprinde una sau mai multe caracteristici divulgate în prezenta, de ex. una sau mai multe caracteristici divulgate în secţiunea "ETAPA F:1 Compoziţii farmaceutice, dozaje şi regimuri de dozaj".
În metodele divulgate în prezenta, populaţia terapeutică de TIL recoltată în etapa (e) poate cuprinde suficiente TIL pentru administrarea unui dozaj terapeutic eficient al TIL în etapa (h).
În metodele divulgate în prezenta, numărul de TIL suficient pentru administrarea unui dozaj terapeutic eficient în etapa (h) poate fi de la circa 2.3×1010 până la circa 13.7×1010.
În metodele divulgate în prezenta, celulele de prezentare a antigenului (APC) pot fi PBMC.
În metodele divulgate în prezenta, PBMC pot fi adăugate în cultura celulară în oricare dintre zilele 9 - 14 în etapa (d).
În metodele divulgate în prezenta, înaintea administrării unui dozaj terapeutic eficient de celule TIL în etapa (h), poate să fi fost administrat la pacient un regim de limfodepleţie non-mieloablativ.
Se divulgă de asemenea în prezenta o populaţie terapeutică de limfocite infiltrante în tumori (TIL) pentru utilizare în tratarea cancerului şi în combinaţie cu un regim de limfodepleţie non-mieloablativ. Regimul de limfodepleţie non-mieloablativ se poate administra înaintea administrării populaţiei terapeutice de limfocite infiltrante în tumori (TIL).
Regimul de limfodepleţie non-mieloablativ poate cuprinde etapele de administrare a ciclofosfamidei la o doză de 60 mg/m2/zi timp de două zile, urmată de administrarea fludarabinei la o doză de 25 mg/m2/zi timp de cinci zile.
Poate exista o etapă de tratare a pacientului cu un regim IL-2 în doză mare începând cu ziua de după administrarea celulelor TIL la pacient în etapa (h).
Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, o populaţie terapeutică de limfocite infiltrante în tumori (TIL) pentru utilizare în tratarea cancerului şi în combinaţie cu regim IL-2 în doză mare. Regimul IL-2 în doză mare poate începe în ziua de după administrarea populaţiei terapeutice de celule TIL.
Regimul IL-2 în doză mare poate cuprinde 600.000 sau 720.000 IU/kg administrat ca o perfuzie intravenoasă în bolus în 15 minute din opt în opt ore până la toleranţă.
Celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală în populaţia terapeutică de TIL pot prezenta una sau mai multe caracteristici selectate din grupul constând din expresie CD27+, expresie CD28+, telomeri mai lungi, expresie CD57 mărită şi expresie CD56 scăzută faţă de celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală obţinute din a doua populaţie de celule.
Celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală în populaţia terapeutică de TIL pot prezenta expresie CD57 mărită şi expresie CD56 scăzută faţă de celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală obţinute din a doua populaţie de celule.
Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, metode de expansiune a limfocitelor infiltrante în tumori (TIL) într-o populaţie terapeutică de TIL cuprinzând:
(a) adăugarea fragmentelor tumorale procesate dintr-o tumoare rezecată de la un pacient într-un sistem închis pentru a obţine o primă populaţie de TIL;
(b) efectuarea unei prime expansiuni prin cultivarea primei populaţii de TIL într-un mediu de cultură celulară cuprinzând IL-2 pentru a produce o a doua populaţie de TIL, unde prima expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o primă suprafaţă permeabilă la gaz, unde prima expansiune se efectuează timp de circa 3-14 zile pentru a obţine a doua populaţie de TIL, unde a doua populaţie de TIL are un număr de cel puţin 50 de ori mai mare decât prima populaţie de TIL şi unde tranziţia de la etapa (a) la etapa (b) are loc fără deschiderea sistemului;
(c) efectuarea unei a doua expansiuni prin suplimentarea mediului de cultură celulară al celei de-a doua populaţii de TIL cu IL-2 suplimentar, OKT-3 şi celule de prezentare a antigenului (APC), pentru a produce o a treia populaţie de TIL, unde a doua expansiune se efectuează timp de circa 7-14 zile pentru a obţine a treia populaţie de TIL, unde a treia populaţie de TIL este o populaţie terapeutică de TIL cuprinzând o subpopulaţie mărită de celule T efectoare şi/sau celule T de memorie centrală faţă de a doua populaţie de TIL, unde a doua expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o a doua suprafaţă permeabilă la gaz şi unde tranziţia de la etapa (b) la etapa (c) are loc fără deschiderea sistemului;
(d) recoltarea populaţiei terapeutice de TIL obţinute de la etapa (c), unde tranziţia de la etapa (c) la etapa (d) are loc fără deschiderea sistemului; şi
(e) transferul populaţiei TIL recoltate de la etapa (d) într-o pungă de perfuzie, unde transferul de la etapa (d) la (e) are loc fără deschiderea sistemului.
În metodele divulgate în prezenta, populaţia terapeutică de TIL recoltată în etapa (d) poate cuprinde suficiente TIL pentru un dozaj terapeutic eficient al TIL.
În metodele divulgate în prezenta, numărul de TIL suficient pentru un dozaj terapeutic eficient poate fi de la circa 2.3×1010 până la circa 13.7×1010.
În metodele divulgate în prezenta, metoda mai poate cuprinde etapa de crioconservare a pungii de perfuzie cuprinzând populaţia TIL recoltată folosind un proces de crioconservare.
În metodele divulgate în prezenta, procesul de crioconservare se poate efectua folosind un raport 1:1 între populaţia TIL recoltată şi mediul CS10.
Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, metode de tratare a unui subiect cu cancer, metoda cuprinzând administrarea limfocitelor infiltrante în tumori (TIL) amplificate cuprinzând:
(a) obţinerea unei prime populaţii de TIL dintr-o tumoare rezecată de la un subiect prin procesarea unei probe tumorale obţinute de la pacient în mai multe fragmente tumorale;
(b) adăgarea fragmentelor tumorale într-un sistem închis;
(c) efectuarea unei prime expansiuni prin cultivarea primei populaţii de TIL într-un mediu de cultură celulară cuprinzând IL-2 pentru a produce o a doua populaţie de TIL, unde prima expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o primă suprafaţă permeabilă la gaz, unde prima expansiune se efectuează timp de circa 3-14 zile pentru a obţine a doua populaţie de TIL, unde a doua populaţie de TIL are un număr de cel puţin 50 de ori mai mare decât prima populaţie de TIL şi unde tranziţia de la etapa (b) la etapa (c) are loc fără deschiderea sistemului;
(d) efectuarea unei a doua expansiuni prin suplimentarea mediului de cultură celulară al celei de-a doua populaţii de TIL cu IL-2 suplimentar, OKT-3 şi celule de prezentare a antigenului (APC), pentru a produce o a treia populaţie de TIL, unde a doua expansiune se efectuează timp de circa 7-14 zile pentru a obţine a treia populaţie de TIL, unde a treia populaţie de TIL este o populaţie terapeutică de TIL cuprinzând o subpopulaţie mărită de celule T efectoare şi/sau celule T de memorie centrală faţă de a doua populaţie de TIL, unde a doua expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o a doua suprafaţă permeabilă la gaz şi unde tranziţia de la etapa (c) la etapa (d) are loc fără deschiderea sistemului;
(e) recoltarea populaţiei terapeutice de TIL obţinute de la etapa (d), unde tranziţia de la etapa (d) la etapa (e) are loc fără deschiderea sistemului; şi
(f) transferul populaţiei TIL recoltate de la etapa (e) într-o pungă de perfuzie, unde transferul de la etapa (e) la (f) are loc fără deschiderea sistemului;
(g) opţional crioconservarea pungii de perfuzie cuprinzând populaţia TIL recoltată de la etapa (f) folosind un proces de crioconservare; şi
(h) administrarea unui dozaj terapeutic eficient din a treia populaţie de TIL din punga de perfuzie în etapa (g) la pacient,
unde nu se realizează selecţie a populaţiei TIL în nici una dintre etapele (a) - (h). În metodele divulgate în prezenta, nu se realizează selecţie a celei de-a doua populaţii de TIL (populaţia pre-REP) pe baza fenotipului înainte de efectuarea celei de-a doua expansiuni din Etapa (d). În metodele divulgate în prezenta, nu se realizează selecţie a primei populaţii de TIL, a celei de-a doua populaţii de TIL, a celei de-a treia populaţii de TIL sau a populaţiei TIL recoltate pe baza expresiei CD8 în nici una dintre etapele (a) - (h).
Se divulgă de asemenea în prezenta, dar fără a se revendica, metode de tratare a unui subiect cu cancer, metoda cuprinzând administrarea limfocitelor infiltrante în tumori (TIL) amplificate cuprinzând:
(a) obţinerea unei prime populaţii de TIL dintr-o tumoare rezecată de la un subiect prin procesarea unei probe tumorales obţinute de la pacient în mai multe fragmente tumorale;
(b) adăgarea fragmentelor tumorale într-un sistem închis;
(c) efectuarea unei prime expansiuni prin cultivarea primei populaţii de TIL într-un mediu de cultură celulară cuprinzând IL-2 pentru a produce o a doua populaţie de TIL, unde prima expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o primă suprafaţă permeabilă la gaz, unde prima expansiune se efectuează timp de circa 3-14 zile pentru a obţine a doua populaţie de TIL, unde a doua populaţie de TIL are un număr de cel puţin 50 de ori mai mare decât prima populaţie de TIL şi unde tranziţia de la etapa (b) la etapa (c) are loc fără deschiderea sistemului;
(d) efectuarea unei a doua expansiuni prin suplimentarea mediului de cultură celulară al celei de-a doua populaţii de TIL cu IL-2 suplimentar, OKT-3 şi celule de prezentare a antigenului (APC), pentru a produce o a treia populaţie de TIL, unde a doua expansiune se efectuează timp de circa 7-14 zile pentru a obţine a treia populaţie de TIL, unde a treia populaţie de TIL este o populaţie terapeutică de TIL cuprinzând o subpopulaţie mărită de celule T efectoare şi/sau celule T de memorie centrală faţă de a doua populaţie de TIL, unde a doua expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o a doua suprafaţă permeabilă la gaz şi unde tranziţia de la etapa (c) la etapa (d) are loc fără deschiderea sistemului;
(e) recoltarea populaţiei terapeutice de TIL obţinute de la etapa (d), unde tranziţia de la etapa (d) la etapa (e) are loc fără deschiderea sistemului; şi
(f) transferul populaţiei TIL recoltate de la etapa (e) într-o pungă de perfuzie, unde transferul de la etapa (e) la (f) are loc fără deschiderea sistemului;
(g) crioconservarea pungii de perfuzie cuprinzând populaţia TIL recoltată de la etapa (f) folosind un proces de crioconservare, unde procesul de crioconservare cuprinde amestecarea unui mediu de crioconservare cu populaţia TIL recoltată;
(h) administrarea unui dozaj terapeutic eficient din a treia populaţie de TIL din punga de perfuzie în etapa (g) la pacient,
unde nu se realizează selecţie a populaţiei TIL în nici una dintre etapele (a) - (h). În metodele divulgate în prezenta, nu se realizează selecţie a celei de-a doua populaţii de TIL (de exemplu, populaţia pre-REP) pe baza fenotipului înainte de efectuarea celei de-a doua expansiuni din Etapa (d). În metodele divulgate în prezenta, nu se realizează selecţie a primei populaţii de TIL, a celei de-a doua populaţii de TIL, a celei de-a treia populaţii de TIL sau a populaţiei TIL recoltate pe baza expresiei CD8 în nici una dintre etapele (a) - (h). În metodele divulgate în prezenta, regimul de limfodepleţie non-mieloablativ se administrează înaintea administrării populaţiei TIL recoltate. În metodele divulgate în prezenta, regimul de limfodepleţie non-mieloablativ cuprinde etapele de administrare a ciclofosfamidei la o doză de 60 mg/m2/zi timp de două zile, urmată de administrarea fludarabinei la o doză de 25 mg/m2/zi timp de cinci zile.
În metodele divulgate în prezenta, în unele exemple, celulele de prezentare a antigenului sunt celule mononucleare din sângele periferic (PBMC). În metodele divulgate în prezenta, în unele exemple, PBMC sunt iradiate şi alogenice. În metodele divulgate în prezenta, în unele exemple, PBMC sunt adăugate în cultura celulară în oricare dintre zilele 9 - 14 în etapa (c).
În metodele divulgate în prezenta, celulele de prezentare a antigenului pot fi celule de prezentare a antigenului artificiale.
În metodele divulgate în prezenta, recoltarea din etapa (d) se poate efectua folosind un sistem de procesare celulară LOVO.
În metodele divulgate în prezenta, metoda poate cuprinde recoltarea în etapa (d) prin intermediul unui sistem de procesare celulară LOVO, cum ar fi sistemul LOVO fabricat de Fresenius Kabi. Termenul "sistem de procesare celulară LOVO" se referă de asemenea la orice instrument sau dispozitiv fabricat de orice furnizor, care poate pompa o soluţie conţinând celule printr-o membrană sau un filtru, cum ar fi o membrană sau filtru de centrifugare într-un mediu de sistem steril şi/sau închis, permiţând fluxul continuu şi procesarea celulară pentru a îndepărta supernatantul sau mediul de cultură celulară fără peletizare. În unele cazuri, sistemul de procesare celulară poate efectua separarea celulelor, spălare, schimb de fluid, concentrare şi/sau alte etape de procesare celulară într-un sistem steril, închis.
În metodele divulgate în prezenta, fragmentele tumorale pot fi fragmente multiple şi cuprind circa 4 până la circa 50 fragmente, unde fiecare fragment are un volum de circa 27 mm3. În metodele divulgate în prezenta, fragmentele multiple pot cuprinde circa 30 până la circa 60 fragmente cu un volum total de circa 1300 mm3 până la circa 1500 mm3. În metodele divulgate în prezenta, fragmentele multiple pot cuprinde circa 50 fragmente cu un volum total de circa 1350 mm3. În metodele divulgate în prezenta, fragmentele multiple pot cuprinde circa 50 fragmente cu o masă totală de circa 1 gram până la circa 1.5 grame.
În metodele divulgate în prezenta, multiple pot cuprinde circa 4 fragmente. În metodele divulgate în prezenta, cele 4 fragmente pot fi introduse într-un G-REX-100. În metodele divulgate în prezenta, cele 4 fragmente pot avea diametru de circa 0.1 cm, 0.2 cm, 0.3 cm, 0.4 cm, 0.5 cm, 0.6 cm, 0.7 cm, 0.8 cm, 0.9 cm sau 1 cm. În metodele divulgate în prezenta, cele 4 fragmente pot avea diametru de circa 0.1 cm, 0.2 cm, 0.3 cm, 0.4 cm, 0.5 cm, 0.6 cm, 0.7 cm, 0.8 cm, 0.9 cm sau 1 cm şi se introduc într-un G-REX-100. În metodele divulgate în prezenta, cele 4 fragmente pot avea diametru de circa 0.1 cm, 0.2 cm, 0.3 cm, 0.4 cm, 0.5 cm, 0.6 cm, 0.7 cm, 0.8 cm, 0.9 cm sau 1 cm şi se introduc într-un recipient având volum echivalent cu un G-REX-100. În metodele divulgate în prezenta, cele 4 fragmente pot avea diametru de circa 0.5 cm şi se pot introduce într-un G-REX-100. În metodele divulgate în prezenta, cele 4 fragmente pot avea diametru de circa 0.5 cm şi se pot introduce într-un recipient având volum echivalent cu un G-REX-100.
În metodele divulgate în prezenta, mediul de cultură celulară poate fi prevăzut într-un recipient selectat din grupul constând dintr-un recipient G şi o pungă celulară Xuri.
În metodele divulgate în prezenta, punga de perfuzie în etapa (e) poate fi o pungă de perfuzie conţinând HypoThermosol.
În metodele divulgate în prezenta, prima perioadă în etapa (b) şi a doua perioadă în etapa (c) se pot efectua fiecare individual într-o perioadă de 10 zile, 11 zile sau 12 zile. În metodele divulgate în prezenta, prima perioadă în etapa (b) şi a doua perioadă în etapa (c) se pot efectua fiecare individual într-o perioadă de 11 zile. În metodele divulgate în prezenta, etapele (a) până la (e) se pot efectua într-o perioadă de circa 25 zile până la circa 30 zile. În metodele divulgate în prezenta, etapele (a) până la (e) se pot efectua într-o perioadă de circa 20 zile până la circa 25 zile. În metodele divulgate în prezenta, etapele (a) până la (e) se pot efectua într-o perioadă de circa 20 zile până la circa 22 zile. În metodele divulgate în prezenta, etapele (a) până la (e) se pot efectua în 22 zile sau mai puţin. În metodele divulgate în prezenta, etapele (a) până la (e) şi crioconservarea se pot efectua în 22 zile sau mai puţin.
În metodele divulgate în prezenta, etapele (b) până la (e) se pot efectua într-un singur recipient, unde efectuarea etapelor (b) până la (e) într-un singur recipient duce la o creştere a producţiei TIL per tumoare rezecată faţă de efectuarea etapelor (b) până la (e) în mai multe recipiente.
În metodele divulgate în prezenta, celulele de prezentare a antigenului se pot adăuga în TIL în a doua perioadă în etapa (c) fără deschiderea sistemului.
În metodele divulgate în prezenta, celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală obţinute în populaţia terapeutică de TIL pot prezenta una sau mai multe caracteristici selectate din grupul constând din expresie CD27+, expresie CD28+, telomeri mai lungi, expresie CD57 mărită şi expresie CD56 scăzută faţă de celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală obţinute din a doua populaţie de celule.
În metodele divulgate în prezenta, celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală obţinute în populaţia terapeutică de TIL pot prezenta expresie CD57 mărită şi expresie CD56 scăzută faţă de celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală obţinute din a doua populaţie de celule.
În metodele divulgate în prezenta, riscul de contaminare microbiană poate fi redus faţă de un sistem deschis.
În metodele divulgate în prezenta, TIL de la etapa (e) pot fi administrate prin perfuzie unui pacient.
În metodele divulgate în prezenta, recipientul închis poate cuprinde un singur bioreactor. În metodele divulgate în prezenta, recipientul închis cuprinde un G-REX-10. În metodele divulgate în prezenta, recipientul închis cuprinde un G-REX-100.
EXEMPLE
Aplicările incluse în prezenta se descriu acum în legătură cu următoarele exemple. Aceste exemple se prezintă în scop exclusiv ilustrativ şi invenţia nu se va interpreta în nici un fel ca fiind limitată la aceste exemple, ci se va înţelege ca incluzând toate variaţiile evidente ca urmare a specificaţiilor prevăzute în prezenta.
EXEMPLUL 1: TESTE ÎN SISTEM ÎNCHIS
Aşa cum se discută în prezenta, s-au dezvoltat protocoale şi teste de generare TIL din tumori de la pacienţi într-un sistem închis.
Acest exemplu descrie o nouă procedură abreviată pentru generarea numerelor clinic relevante de TIL din ţesut de tumoare rezecată de la pacienţi în dispozitive G-REX şi crioconservarea produsului celular final. Alte aspecte ale acestei proceduri sunt descrise în Exemplele 2 - 8.
Definiţii/abrevieri
BSC - Cabinet de biosecuritate
°C - grade Celsius
CO2 - Dioxid de carbon
CD3 - Grup de diferenţiere 3
CM1 - Mediu complet 1
CM2 - Mediu complet 2
TIWB - Soluţie tampon de spălare şi izolare a tumorii
CM4 - Mediu complet 4
CRF - Congelator cu control al ratei de îngheţ
EtOH - etanol
GMP - Bună practică de producţie
IL-2, rIL-2 -Interleukina-2, interleukina-2 umană recombinantă,
IU - Unitate internaţională
L - Litru
LN2 - azot lichid
mL - mililitru
µl - microlitru
mM - milimolar
µm - micrometru
NA - Inaplicabil
PBMC - Celulă mononucleară din sânge periferic
PPE - Echipament personal de protecţie
Pre-REP - Culturi TIL iniţiale provenite din fragmente tumorale
REP - Protocol de expansiune rapidă
TIL - Limfocite infiltrante în tumori
TIWB - Soluţie tampon de spălare şi izolare TIL
SOP - Procedură operaţională standard
Procedură
1. Preparare în avans: ziua 0 (Efectuată cu până la 36 de ore în avans)
1.1 Se prepară soluţia tampon de spălare şi izolare TIL (TIWB) prin suplimentarea 500 mL oluţie salină echilibrată Hanks cu 50 µg/mL Gentamicină. Pentru soluţie de bază 10 mg/mL Gentamicină se transferă 2.5 mL în HBSS. Pentru soluţie de bază 50 mg/mL se transferă 0.5 mL în HBSS.
1.2. Se prepară mediu CM1 cu GlutaMax™ conform LAB-005 "Prepararea mediului pentru
PreREP şi REP", instrucţiuni CM2". Se depozitează la 4°C până la 24 ore. Se lasă să se încălzească la 37°C cel puţin 1 oră înaintea utilizării.
1.3. Se îndepărtează părţi alicote de IL-2 din congelator la -20°C şi se introduc în frigider la 2-8°C.
2. Recepţia ţesutului tumoral
2.1. Se păstrează toate documentele primite cu ţesutul tumoral şi se obţin fotografii ale recipientului de transport şi ţesutului tumoral.
2.2. Dacă s-a furnizat TempTale, se imprimă şi se salvează documentul asociat; se salvează PDF.
2.3. Se îndepărtează specimenul tumoral şi recipientul secundar (pungi de depozitare) de la transportator şi se depozitează la 4°C până la procesare.
2.4 Se expediază ţesutul nefolosit în HypoThermasol sau sub formă de fragmente congelate în CryoStor CS10 (ambele disponibile în comerţ de la BioLife Solutions, Inc.).
3. Procesare tumoare pentru TIL
3.1. Se transferă aseptic următoarele materiale la BSC, după caz, şi se etichetează conform tabelului 3 de mai jos.
TABEL 3. Materiale pentru izolarea tumorii.
Obiect Cantitate minimă Etichetă proces Tumoare 1 N/A Vas Petri, 150 mm 1 Disecţie Vas Petri, 100 mm 4 Spălare 1, 2, 3, 4 Vas Petri, 100 mm 1 Ţesut nefavorabil Placă cu 6 godeuri 2 Etichetă capac - "Fragmente tumorale" Fund placă - "Ţesut favorabil" Riglă 2 N/A Tampon spălare 1 N/A Forceps 1 N/A Forceps lung 1 N/A Bisturiu După necesitate N/A
3.2. Se marchează cercurile vaselor de fragmente tumorale cu literele A-J. 3.3. Se marchează părţie inferioare ale godeurilor vaselor de ţesut favorabil cu literele A - J. 3.4. Se transferă 5 mL Gentamicină în flaconul HBSS. Se marchează ca TIWB. 3.5. Se amestecă. 3.6. Se introduc cu pipeta 50 mL TIWB în fiecare din următoarele:
1. Vas spălare 1
2. Vas spălare 2
3. Vas spălare 3
4. Vas spălare 4
3.7. Se introduc cu pipeta 2 mL TIWB în godeurile A-J ale vasului cu ţesut favorabil.
3.8. Se acoperă vasele cu ţesut favorabile (fundul plăcii cu 6 godeuri) cu vasul de fragmente tumorale (capacul plăcii cu 6 godeuri).
3.9. Folosind forcepsul lung, se îndepărtează tumoarea(ile) din flaconul de specimen şi se transferă în vasul de spălare 1.
3.10. Se incubează tumoarea la temperatura ambiantă în vasul de spălare 1 3 minute.
3.11. În timpul incubării, se reetichetează flaconul de specimen "Bioburden" şi se depozitează la 2-8°C până la testarea de control al calităţii.
3.12. Se aruncă forcepsul lung şi se utilizează forcepsul scurt pentru alte manipulări. 3.13. Folosind forcepsul, se transferă tumoarea în vasul de spălare 2. 3.14. Se incubează tumoarea la temperatura ambiantă în vasul de spălare 2 3 minute. 3.15. Folosind forcepsul, se transferă tumoarea în vasul de spălare 3. 3.16. Se incubează tumoarea la temperatura ambiantă în vasul de spălare 3 timp de 3 minute. 3.17. Se îndepărtează vasele de fragment tumoral (capacele plăcii cu 6 godeuri) de pe vasele cu ţesut favorabil (fundurile plăcii cu 6 godeuri) şi se aşază vasele de fragmente tumorale cu susul în jos pe suprafaţa BSC. 3.18. Folosind o pipetă de transfer, se adaugă aproximativ 4 picături individuale, echidistante, de TIWB în fiecare cerc al vaselor de fragmente tumorale. 3.19. Se amplasează o riglă sub vasul de disecţie. 3.20. Folosind forcepsul, se transferă tumoarea în vasul de disecţie. 3.21. Folosind rigla sub vasul de disecţie, se măsoară şi se înregistrează lungimea tumorii. 3.22. Pentru tumori mai mari de 1 cm, s-au pregătit alte vase cu ţesut favorabil. 3.23. Se efectuează o disecţie iniţială a bucăţilor de tumoare în vasul de disecţie în 10 bucăţi intermediare, având grijă să se conserve structura tumorală a fiecărei bucăţi intermediare. 3.24. Se transferă toate bucăţile tumorale intermediare care nu au fost disecate activ în fragmente în vasul de spălare 4 pentru a asigura că ţesutul rămâne hidratat pe durata întregii proceduri de disecţie. 3.25. Lucrând cu o singură bucată tumorală intermediară o dată, se taie cu grijă tumoarea în fragmente de până la 3x3x3 mm în vasul de disecţie, folosind rigla de sub vas ca referinţă. Când bisturiul se toceşte, se înlocuieşte cu un bisturiu nou. 3.26. Se continuă disecţia fragmentelor din bucata tumorală intermediară până la evaluarea întregului ţesut din bucata intermediară. 3.27. Se selectează fragmente favorabile şi, folosind o pipetă de transfer, se transferă până la 4 fragmente favorabile în picăturile TIWB într-un cerc din vasul de fragmente tumorale. 3.28. Folosind o pipetă de transfer, se transferă toate fragmentele favorabile rămase din bucata de tumoare, dacă există, în godeul corespunzător al vasului cu ţesut favorabil. 3.29. Folosind o pipetă de transfer, se transferă cât mai mult posibil din ţesutul nefavorabil şi produsul rezidual în vasul de ţesut nefavorabil pentru eliberarea vasului de disecţie. Ţesutul nefavorabil este indicat de ţesut adipos galben sau ţesut necrotic. 3.30. Se continuă procesarea repetând etapa 7.3.25-7.3.30 pentru restul bucăţilor tumorale intermediare, lucrând cu o singură bucată intermediară o dată până la procesarea întregii tumori. 3.31. Dacă sunt disponibile mai puţin de 4 fragmente tumorale în cercul corespunzător al vasului de fragmente tumorale, a fost acceptabilă folosirea fragmentelor disponibile dintr-un godeu necorespunzător al vasului cu ţesut favorabil pentru a atinge obiectivul de 40 de fragmente. Dacă sunt mai puţin de 40 de fragmente, 10-40 s-au aşezat într-un singur balon G-Rex 100M. 4. Însămânţarea balonului G-Rex 100M 4.1. Se transferă aseptic următoarele materiale la BSC, după caz, şi se etichetează conform tabelului 4 de mai jos.
TABEL 4. Alte materiale pentru însămânţarea baloanelor.
Obiect Cantitate minimă Etichetă proces Balon G-Rex 100M După necesitate Lot# CM 1 cald După necesitate Lot# Părţi alicote de IL-2 După necesitate Lot#
4.2. Se suplimentează fiecare litru de CM1 cu 1 mL de soluţie de bază IL-2 (6 × 106 IU/mL). 4.3. Se introduc 1000 mL de CM1 preîncălzit conţinând 6.000 IU/mL de IL-2 în fiecare bioreactor G-REX 100M necesar determinat de tabelul 5 de mai jos.
4.4. Folosind o pipetă de transfer, se transferă numărul corespunzător de fragmente tumorale în fiecare balon G-Rex 100M, distribuind fragmentele conform tabelului 5. 4.5. Când se transferă unul sau mai multe fragmente tumorale în balonul G-Rex 100M, se obţine un fragment tumoral suplimentar, dacă este disponibil, din vasul cu ţesut favorabil şi se transferă în balonul G-Rex 100M.
4.6. Se înregistrează numărul total de fragmente adăugate în fiecare balon. 4.7. Se aruncă vasul de ţesut nefavorabil.
4.8. Se introduce fiecare bioreactor G-REX 100M în incubator la 37°C, 5 % CO2.
4.9. Când sunt disponibile mai mult de 40 de fragmente:
4.9.1. Când se obţin >41 fragmente, se introduc 1000 mL de CM1 complet preîncălzit într-un al doilea bioreactor G-REX 100M.
TABEL 5. Numărul bioreactoarelor necesare.
Număr de fragmente G-REX Număr de G-REX CM1 necesar 1-40 G-REX 100M 1 1000 mL 41-80 distribute între baloane G-REX 100M 2 2000 mL >80 Se congelează fragmente în CS10 după 15 minute preincubare
5. Preparare în avans: ziua 11 (preparare până la 24 ore în avans)
5.1. Se prepară 6 L de CM2 cu GlutaMax. Se utilizează proceduri de laborator de referinţă pentru "Prepararea mediului pentru PreREP şi REP", instrucţiuni CM2". Se încălzeşte la at 37°C 1 oră înaintea utilizării.
5.2. Părţi alicote IL-2 decongelate: Se îndepărtează părţi alicote IL-2 din congelator şi se aşază la 4°C.
6. Recoltare TIL (ziua 11)
6.1. Se îndepărtează cu grijă baloanele G-REX -100M din incubator şi se aşază în BSC2 atent pentru a nu perturba celulele de pe fundul balonului.
6.2. Folosind GatherRex sau pompă peristaltică, se aspiră ∼900 mL de supernatant de cultură celulară din balon(oane).
6.3. Se resuspendă TIL prin agitarea uşoară a balonului. Se observă că toare celulele s-au eliberat din membrană.
6.4. Folosind pompa peristaltică sau GatherRex, se transferă suspensia celulară reziduală într-un pachet de transfer sanguin dimensionat corespunzător (300-1000mL) atent pentru a nu permite transferul fragmentelor în pachetul de transfer sanguin.
6.5. Se adaugă la pachetul de transfer un set de transfer plasmatic 4" (se asigură că pensa este închisă).
6.6. Se masează pachetul pentru a asigura că suspensia celulară este bine amestecată şi, folosind o seringă de 3 mL, se îndepărtează 1 mL de suspensie TIL pentru numărarea celulelor. Se închide tubul şi se reastupă conectorul luer cu un capac luer steril nou.
6.7. Se introduce pachetul de transfer într-un recipient de depozitare din plastic şi se reintroduce în incubator până când este gata de utilizare.
7. Prepararea mediului
7.1. Se lasă mediul să se încălzească la 37°C > 1h.
7.2. Se adaugă 3 mL de 6x106 IU/mL soluţie de bază rhIL-2 în 6 L CM2 pentru a atinge o concentraţie finală de 3.000 IU/mL rhIL-2. Se etichetează "CM2 complet".
7.3. Se îmbină steril un set de transfer plasmatic 4» cu conector luer cu un pachet de transfer de 1L.
7.4. Se transferă 500mL CM2 complet într-un pachet de transfer de 1L. se desprinde setul sau seringa de transfer al fluidului şi se ataşează un dop luer steril pe orificiul luer.
7.5. Se conectează pachetul cu un element de cuplare pentru prelevare.
7.6. Folosind o seringă de 1.0mL cu ac, se extrage 150 µL de 1 mg/mL anti-CD3 (clona OKT3) şi se transferă în 500 mL "CM2 complet" prin elementul de cuplare pentru prelevare. Se extrage înapoi în seringă pentru a asigura spălarea întregului reactiv din linie. Se depozitează la 37°C până la utilizare.
8. Pregătirea balonului
8.1. Se transferă 4.5L "CM2 complet" într-un balon G-REX-500M folosind gradaţiile de pe balon ca referinţă.
8.2. Se introduce balonul în incubator la 37°C până când este gata.
9. Decongelarea celulelor feeder iradiate
9.1. Se utilizează 5.0 × 109 celule feeder alogenice iradiate de la doi sau mai mulţi donatori.
9.2. Se îndepărtează celule feeder din congelator LN2 şi se introduc într-o pungă de transport de pericol biologic.
9.3. Cu celulele feeder în punga de transport de pericol biologic, se decongelează celulele în incubator sau baie la 37°C. Se păstrează pungile statice şi scufundate. Se îndepărtează celulele din baie când sunt aproape complet decongelate, dar încă reci.
9.4. Se pulverizează pungile de celule feeder cu 70% EtOH şi se aşază în BSC2. Se adaugă fiecare pungă feeder direct în G-Rex 500M deschis pentru a asigura un număr suficient de celule iradiate (5x109 celule, +/- 20%).
9.5. Se închid ambele pense pe un conector tip Y fenwal cu sistem de conectare luer lock.
9.6. Se conectează fiecare pungă feeder cu un picior al conectorului Y.
9.7. Se îndepărtează pachetul de transfer de 1L cu 500 mL "CM2 complet" + OKT3 şi se transferă în BSC.
9.8. Se ataşează aseptic o seringă de 60mL de un robinet de închidere cu 3 căi şi se ataşează aseptic pachetul de transfer la capătul exterior al robinetului de închidere.
9.9. Se ataşează aseptic conectorul Y de robinetul de închidere cu 3 căi.
9.10. Se extrage întregul conţinut al pungilor feeder în seringă, se înregistrează volumul şi se distribuie 5.0 × 109 celule feeder alogenice iradiate în pachetul de transfer.
9.11. Se prinde, se detaşează pachetul de transfer de aparat şi se astupă conectorul luer interior cu un dop luer steril nou.
9.12. Folosind un ac şi o seringă de 3 mL, se extrage 1 mL pentru numărarea celulelor din elementul de cuplare pentru prelevare.
9.13. Când se atinge +/- 10% din numărul celulelor ţintă (5.0 × 109) cu viabilitate >70%, se continuă.
9.14. Când se atinge sub 90% din numărul celulelor ţintă (5.0 × 109) cu viabilitate >70%, se decongelează o altă pungă şi se repetă 7.9.4-7.9.12. Când se atinge mai mult de 110% din numărul celulelor ţintă, se calculează volumul corespunzător necesar pentru doza celulară dorită şi se continuă.
10. Co-cultura TIL şi feeder în balonul G-REX 500M
10.1. Se îndepărtează balonul G-REX 500M conţinând mediul preparat din incubator şi se introduce în BSC2.
10.2. Se ataşează pachetul de transfer feeder la G-REX -500M şi se lasă conţinutul pungii să curgă în 500M.
10.3. Se îndepărtează suspensia TIL din incubator şi se introduce în BSC.
10.4. Se calculează volumul suspensiei TIL de adăugat pentru a obţine 200 × 106 celule viabile totale.
(TVC/mL) /200 x 106 = mL
10.5. Când TIL au fost între 5-200 × 106 celule viabile totale, se adaugă toate TIL (volum total) în G-REX-500M. Când numărul TIL a fost mai mare de 200 × 106 celule viabile totale, se adaugă volumul calculat necesar pentru 200 × 106 TIL de distribuit într-un G-REX -500M individual. Restul TIL s-au centrifugat şi s-au congelat în cel puţin două criofiole până la 108/mL în CS10, s-au etichetat cu identificarea TIL şi data congelării.
10.6. Se introduce G-REX -500M într-un incubator la 37°C, 5% CO2 timp de 5 zile.
11. Preparare în avans: ziua 16-18
11.1. Se încălzeşte 1 pungă de 10L de AIM V pentru culturi iniţiate cu mai puţin de 50 × 106 TIL încălzite 2 pentru cele iniţiate cu peste 50 × 106 TIL la 37°C cel puţin 1 h sau până când sunt gata de utilizare. 12. Efectuarea numărului de celule TIL: ziua 16-18
12.1. Se îndepărtează balonul G-REX -500M din incubator şi se introduce în BSC2 atent pentru a nu perturba cultura celulară de pe fundul balonului.
12.2. Se îndepărtează aseptic 4 L de mediu de cultură celulară din balonul G-REX -500M şi se introduce într-un recipient steril.
12.3. Se agită G-REX -500M până când toate TIL s-au resuspendat din membrană.
12.4. Folosind GatherRex sau pompa peristaltică se transferă suspensia celulară într-un pachet de transfer de 2L. Balonul 500M se reţine pentru utilizare viitoare. Se închide orificiul cu elementul de cuplare pentru prelevare pentru a evita pierderea TIL.
12.5. Se conectează pachetul de transfer cu un element de cuplare pentru prelevare şi, folosind o seringă de 3mL şi un ac, se îndepărtează 2×1 mL probe independente pentru numărarea celulelor.
12.6. Se calculează numărul total number al baloanelor necesare pentru subcultură conform următoarei formule. Fracţiile se rotunjesc în sus. Celule viabile totale /1.0 x109 = balon #
13. Se prepară CM4
13.1. Se prepară o pungă de 10L de AIM-V pentru fiecare două 500M baloane necesare. Se încălzeşte mediu suplimentar dacă este necesar.
13.2. Pentru fiecare 10 L de AIM-V necesar, se adaugă 100 mL de GlutaMAX pentru prepararea CM4.
13.3. Se suplimentează mediul CM4 cu rhIL-2 pentru o concentraţie finală de 3.000 IU/mL rhIL-2.
14. Separarea culturii celulare
14.1. Folosind gradaţiile de pe balon, se umple gravitaţional fiecare G-REX -500M la 5 L.
14.2. Se distribuie uniform volumul TIL în numărul calculat de G-REX -500M.
14.3. Se introduc baloanele într-un incubator la 37°C, 5% CO2 până la recoltare în ziua 22 a REP.
15. Preparare în avans: ziua 22-24
15.1. Se prepară 2L de 1% tampon spălare HSA adăugând 40mL de 25% HSA în fiecare din două pungi de 1L de PlasmaLyte A 7.4. Se colectează într-o pungă auxiliară LOVO.
15.2. Se suplimentează 200 mL CS10 cu IL-2 @ 600 IU/mL.
15.3. Se pre-răcesc patru recipiente de congelator de 750 mL din aluminiu la 4°C.
16. Recoltare TIL: ziua 22-24
16.1. Se îndepărtează baloanele G-REX -500M din incubator la 37°C şi se introduc în BSC2 atent pentru a nu perturba cultura celulară de pe fundul balonului.
16.2. Se aspiră şi se îndepărtează 4.5 L din supernatantul de cultură celulară din fiecare balon.
16.3. Se agită balonul G-REX -500M pentru a resuspenda complet TIL.
16.4. Se cântăreşte punga de 3-5L înaintea utilizării.
16.5. Folosind GatherRex sau pompa peristaltică, se recoltează TIL în punga de bioprocesare.
16.6. Se amestecă bine punga şi, folosind o seringă de 3mL, se extrag probe 2×2 mL din orificiul de prelevare pentru numărarea celulelor.
16.7. Se cântăreşte punga şi se determină diferenţa între greutatea iniţială şi finală. Se foloseşte următorul calcul pentru a determina volumul suspensiei celulare.
Greutate netă a suspensiei celulare (mL) /1.03 = volum (mL)
17. Filtrarea TIL şi prepararea pungii sursă LOVO
17.1. Se introduce punga conţinând cultura celulară în BSC2.
17.2. Se introduce un filtru sanguin de 170 µm în BSC2 şi se închid toate pensele.
17.3. Se îmbină steril un suport sursă al filtrului cu suspensia celulară.
17.4. Se cântăreşte o nouă pungă de bioprocesare dimensionată corespunzător (denumită pungă sursă LOVO).
17.5. Se îmbină steril capătul terminal al filtrului cu punga sursă LOVO.
17.6. Se ridică suspensia celulară prin suspendarea celulelor pe un suport IV pentru a asigura un transfer gravitaţional al celulelor.
Notă: (nu se lasă punga sursă să atârne de aparatul de filtrare.)
17.7. Se deschid toate pensele necesare şi şi se lasă TIL să se scurgă din punga de suspensie celulară prin filtru în punga sursă LOVO.
17.8. După ce se transferă toate celulele în punga sursă LOVO, se închid toate pensele şi se închide ermetic tubul pungii sursă LOVO pentru îndepărtarea filtrului.
17.9. Se cântăreşte punga sursă LOVO şi se calculează volumul.
17.10. Punga sursă LOVO este pregătită pentru LOVO.
17.11. Se îndepărtează punga cu produs final LOVO din kit prin etanşarea tubului lângă pungă.
18. Se prepară TIL 1:1 în CS10 rece suplimentat cu 600 IU/mL rhIL-2 18.1. Se calculează numărul necesar de criorecipiente necesare. (volumul produsului celular x 2)/100 = numărul pungilor necesare (rotunjire în jos) 18.2. Se calculează volumul de distribuit în fiecare pungă. (volumul produsului celular x 2) / numărul pungilor necesare = volum de adăugat în fiecare pungă 18.3. Se transferă aseptic următoarele materiale din tabelul 6 în BSC.
TABEL 6. Materiale pentru crioconservare TIL.
Obiect Cantitate minimă Etichetă proces Produs celular 1 Lot# Casetă congelator din aluminiu (750 ml) 1 n/a CS10 rece + IL-2 @600IU/mL După necesitate Lot# Dispozitiv de conectare celulară CC1 1 n/a Criorecipiente de 750 mL calculated Label părţi alicote 1-largest# Seringă de 100 mL #criorecipiente +1 n/a Robinet de închidere cu 3 căi 1 n/a Criofiole 5 TIL Cryo-product satellite vials
19. Compoziţie TIL
19.1. Se închid toate pensele pe Cell Connect CC1.
19.2. La dispozitivul de conectare celulară se ataşează aseptic produsul final LOVO, sistemul de conectare luer lock al pungii CS10 şi numărul corespunzător de criorecipiente. Se înlocuieşte seringa de 60 mL cu o seringă de 100 mL.
19.3. Cantitatea volumului CS10 necesar a fost echivalent cu volumul pungii de produs final LOVO.
19.4. Se deschide calea robinetului de închidere şi se deschide linia dintre punga de produs final LOVO şi seringă pentru extragerea CS10 în seringă, se reînchide calea CS10. Se deschide calea la punga celulară pentru a introduce CS10 în punga de produs final LOVO. Se foloseşte seringa pentru a măsura volumul adăugat în punga de produs final LOVO. Se repetă după necesitate folosind o seringă nouă până când se transferă cantitatea dorită de CS10.
19.5. Se amestecă punga de produs final LOVO prin răsturnare.
19.6. Se înlocuieşte seringa de 100 mL
19.7. Se deschid pensele pe câte un criorecipient de 750 mL
19.8. Se deschid numai pensele direct asociate cu produsul preparat şi criorecipientul în uz.
19.9. Se utilizează seringa de 100 mL pentru a măsura volumul de produs preparat către criorecipient.
19.10. Se transferă 100 mL de produs preparat în fiecare criorecipient.
19.11. După adăugare în fiecare pungă, se extrage din nou în seringă pentru îndepărtarea tuturor bulelor de aer din criorecipiente şi se reînchide linia asociată.
19.12. Din punga finală se extrag 10 mL pentru testare QC.
19.13. Se închide ermetic fiecare criorecipient, lăsând un tub cât mai mic posibil.
19.14. Se îndepărtează seringa conţinând proba reţinută şi se transferă într-un tub conic de 50mL; se transferă 1.5ml în criofiole individuale şi se congelează într-un congelator cu rată controlată de îngheţ.
19.15. Se transferă pungile etanşate la 4°C în timp ce se pregătesc etichetele.
19.16. Se etichetează fiecare criorecipient cu descrierea produsului, numele şi data, volumul, numărul de celule şi viabilitatea.
19.17. Se introduce fiecare criorecipient în casete de aluminiu pre-răcite de congelator.
20. Crioconservarea TIL folosind congelator cu control al ratei de îngheţ (CRF)
20.1. Se urmează procedura standard pentru congelatorul cu rată controlată de îngheţ.
20.2. După folosirea CRF, se depozitează criorecipientele în azot lichid (LN2).
21. Se determină rezultatele estimate şi se măsoară criteriile de acceptare.
EXEMPLUL 2: DESFĂŞURAREA PROCESULULUI PE 8 TUMORI DE LA PACIENŢI
Procesul din Exemplul 1 s-a desfăşurat folosind 8 tumori de la pacienţi pentru a produce 8 loturi de TIL. S-au obţinut o bună recuperare din cultură, viabilitate, număr de celule, CD3+ (indicând conţinutul % de celule T) şi eliberare IFN-gamma (IFN-g sau IFN-γ) bune, aşa cum se indică în Tabelul 7 de mai jos şi în Figura 7 până la Figura 10.
TABEL 7. Rezultatele testului de identitate, potenţial şi viabilitate/recuperarea procesului din Exemplul 1.
IFNg (pg/1e6 celule/24r) CD3 (%) Celule/mL (Viabile+neviabile) % recuperare % viabilitate Proaspete/Lovo M1061T 4570 95.3 1.27E+08 103 88.1 M1062T 3921 99.7 1.65E+08 89 84.5 M1063T 5587 98.7 1.51E+08 112 82.1 M1064T 619 84.5 1.75E+08 83 86.8 M1065T 1363 96.8 3.42E+07 128 76.4 EP11001T 4263 90.4 1.82E+08 92 77.9 M1056T 6065 94.2 2.11E+08 85 84.8 M1058T 1007 99 2.72E+08 89 87.5
EXEMPLUL 3: SCALABILITTEA PROCESULUI TIL MODIFICAT
Studiile prezentate aici s-au efectuat într-un laborator de dezvoltare a procesului (PD) şi apoi s-a efectuat un studiu de calificare a procesului (PQ) utilizând probe tehnice într-o cameră cu atmosferă controlată GMP dintr-o unitate de producţie. S-au realizat trei probe PQ/tehnice în camera cu atmosferă controlată GMP conform unui protocol de calificare şi a unei evidenţe a loturilor pe baza studiilor PD prezentate aici. Criteriile de acceptare pentru probele tehnice au fost stabilite prospectiv. Studiul PQ este prezentat pe scurt mai jos şi rezultatele obţinute pentru
loturile tehnice sunt indicate în secţiunile următoare.
Numărul celulelor generate din culturile pre-protocol de expansiune rapidă (pre-REP) au depăşit adesea 100 × 106 celule viabile. În plus, includerea unui ciclu de îngheţ-dezgheţ între erapele de cultură pre-REP şi REP a redus producţia de celule viabile. Eliminând etapa de crioconservare din proces, REP poate fi iniţiat fiabil şi regulat cu un număr crescut de TIL. Această modificare a permis scăderea duratei REP cu un nivel proporţional al perioadelor de dublare a celulelor la aproximativ 11 zile fără a afecta doza celulară. În plus, perioada de cultură redusă de la activare la recoltare duce la un produs mai puţin diferenţiat şi posibil mai capabil să persiste in-vivo (Tran 2008).
Studiul PD a validat iniţierea culturii REP cu până la 200 × 106 celule cu un număr fix de celule feeder. Timpul optim până la recoltarea culturii REP s-a evaluat în 9 până la 14 zile. Culturile au fost însămânţate la raporturi între feeder şi TIL cuprinse între 100:1 şi 25:1. Optimizarea timpului de recoltare s-a determinat măsurând numărul total al celulelor, viabilitatea, imunofenotipul, consumul de mediu, analiza metaboliţilor, analiza interleukinei-2 (IL-2) şi analizele funcţionale descrise mai jos.
Imunofenotiparea celulelor la sfârşitul culturii REP s-a evaluat pe baza markerilor indicaţi în Tabelul 8 de mai jos. S-au evaluat activarea fenotipică şi starea de diferenţiere a celulelor. Nu s-au observat diferenţe statistice ale fenotipului în nici una din condiţiile experimentale.
TABEL 8. Markeri de activare şi diferenţiere testaţi pe culturi de optimizare a procesului.
Ţintă Marcator pentru detecţie Clonă Grup 1 TCRab (i.e., TCRα/β) PE/Cy7 IP26 CD57 PerCP-Cy5.5 HNK-1 CD28 PE CD28.2 CD4 FITC OKT4 CD27 APC-H7 M-T271 CD56 APC N901 CD8a PB RPA-T8 Grup 2 CD45RA PE/Cy7 HI100 CD3 PerCP/Cy5.5 SP34-2 CCR7 PE 150503 CD8 FITC HIT8 CD4 APC/Cy7 OKT4 CD38 APC HB-7 HLA-DR PB L243
Grup 3 CD137 PE/Cy7 4B4-1 CD3 PerCP/Cy5.5 SP34-2 Lag3 PE 3DS223H CD8 FITC HIT8 CD4 APCCy7 OKT4 PD1 APC EH12.2H7 Tim-3 BV421 F38-2E2
Abrevieri: PE/Cy7=ficoeritrină: Cy-7 conjugat tandem; PerCP-Cy5.5=complex de proteină-peridinină-clorofilă:CY5.5 conjugat; PE= ficoeritrină;
FITC=conjugat izotiocianat fluoresceina; APC-H7=aloficocianina:H7 conjugat tandem; APC= aloficocianina; PB=Pacific Blue™
Consumul de mediu şi producţia metaboliţilor au rămas în limitele tolerabile pentru toate condiţiile testate; şi nivelurile IL-2 au rămas mai mari de 150 IU/mL de supernatant de cultură (date nereprezentate).
Distrugerea celulelor tumorale de către celule T se înţelege ca fiind mediată de activarea receptorului T celular pe celule T efectoare în răspuns la peptide prezentate pe suprafaţa celulelor tumorale. Celulele T amplificate ex vivo trebuie să reţină capacitatea de activare şi proliferare în răspuns la activarea TCR dacă persistă in vivo la perfuzie şi mediază regresia tumorii.
Pentru a evalua potenţialul de activare al celulelor cultivate, TIL recoltate la intervale diferite au fost reactivate cu PBMC alogenice iradiate încărcate cu OKT3. Culturile TIL au fost recoltate după 7 zile şi s-a evaluat cu privire la gradul de amplificare. Rezultatele acestui studiu sunt prezentate pe scurt în Tabelul 9.
TABEL 9. Rezumatul rezultatelor: proliferarea TIL post-REP la re-cultivare cu PBMC alogenice încărcate cu OKT3.
Ziua recoltării Nr. de ori expansiune SD Valoare-p (test 't' Student) Experiment 1 Ziua 9 43 6.088 NA Ziua 10 48 3.105 NA Ziua 11 71 11.137 0.135 Ziua 14 60 6.995 Experiment 2 Ziua 9 44 6.276 NA Ziua 10 27 4.762 NA Ziua 11 72 18.795 0.045 Ziua 14 41 7.050
Experiment 3 Ziua 9 54 5.810 NA Ziua 10 54 9.468 NA Ziua 11 65 1.674 0.071 Ziua 14 50 8.541
Acest studiu a demonstrat că potenţialul pentru TIL activate în acest test a crescut cu fiecare zi de cultură până în ziua 11 (zile de recoltare 9-11). Celulele recoltate în ziua 11 a procesul modificat efectuat în mod similar cu TIL de control s-au menţinut în cultură 14 zile, similar cu procesul actual.
Aceste studii au demonstrat scalabilitatea procesului TIL modificat şi au stabilit un interval acceptabil al raporturilor de însămânţare între TIL şi celulele feeder. În plus, caracteristicile de creştere au persistat până în ziua 14 a culturii, iar condiţiile de cultură au rămas optime până în ziua 11. Condiţiile testate nu au indicat nici un efect măsurabil asupra fenotipului TIL. Celulele recoltate în ziua 11 a culturii REP au demonstrat cea mai bună capacitate de a răspunde la reactivare, în timp ce condiţiile culturii celulare au rămas în limitele toleranţelor. Aceste modificări au fost adoptate şi validate la scară completă, separarea culturii având loc în ziua 5 şi recoltarea în ziua 11.
Probele tehnice au fost implementate în unitatea de dezvoltare a procesului pentru a câştiga experienţă în prepararea şi testarea produsului TIL înainte de fabricarea GMP a produsului TIL autolog pentru administrare la pacienţi. Procedura de preparare folosită pentru probele tehnice a fost la aceeaşi scară precum cea utilizată în prepararea produsului GMP TIL. Experienţa creşterii TIL din diferite tipuri de tumori, inclusiv metastaze, de melanom, mamare, carcinom cu celule scuamoase la cap şi gât (HNSCC), carcinom de col uterin şi cancer pulmonar a determinat că disecţia şi creşterea TIL din probe metastatice tsunt similare pentru aceste cancere (Sethuraman 2016, JITC P42). Dat fiind că izolarea iniţială a fragmentelor tumorale şi creşterea limfocitelor par să fie similare între histologii tumorale, aceste probe tehnice sunt suficiente pentru calificarea procesului de producere a TIL din HNSCC, tumori de col uterin şi melanom.
Tabelul 10 indică sursa şi caracteristicile probelor tumorale folosite pentru probele tehnice.
TABEL 10. Probe tumorale testate pentru probe tehnice.
Proba tumorală Proba tehnică 1 Proba tehnică 2 Proba tehnică 3 ID pacient 1001185 600-D455 40231 Sursă Biotheme Research BioOptions Moffitt Ţesut Plămân stâng Sân, ERPR+Her2- Melanom Data procesării 5 ianuarie 2017 12 ianuarie 2017 26 ianuarie 2017
Testarea eliberării de produs a celor probe tehnice de TIL în unitatea de dezvoltare a procesului a fost realizată (Tabel 11) aşa cum se descrie mai jos. Produsul a fost testat în ziua 16 şi ziua 22. S-a determinat şi secreţia IFN-γ pentru cele trei probe tehnice (Tabel 12) detaliată în altă parte.
TABEL 11. Rezultatele testului de eliberare a produsului pentru probele tehnice la unitatea de dezvoltare a procesului.
Parametru Metoda de testare Criterii de acceptare Probe tehnice Proba 1 Proba 2 Proba 3 Ziua 16 Sterilitate* BacTAlert Fără creştere Fără creştere Fără creştere Fără creştere Micoplasma PCR Negativ din separarea în ziua 7 Negativ Negativ Negativ Ziua 22 Viabilitate (%) AOPI ≥ 70% 82.3% 85.13% 84.6% Celule viabile totale AOPI Rezultate raportate 2.6 x 1010 1 x 1010 1.4 X 1011 Sterilitate Coloraţie Gram Negativ Negativ Negativ Negativ Sterilitate produs final * BacT/Alert Fără creştere Negativ Negativ În aşteptare % CD45+CD3+ Citometrie în flux ≥ 90% 99.3% 96.3% 99.8% Endotoxina EndoSafe ≤ 0.7 EU/mL <0.5 EU/mL <0.5 EU/mL <0.5 EU/mL Micoplasma produs final PCR Negativ Negativ Negativ Negativ Aspect Inspecţie vizuală Pungă intactă fără cocoloaşe Pungă intactă, fără cocoloaşe vizibile Pungă intactă, fără cocoloaşe vizibile Pungă intactă, fără cocoloaşe vizibile *Rezultatele sterilităţii finale pentru ziua 16 şi ziua 22 nu sunt disponibile până după eliberarea produsului final pentru expediere. Se folosesc rezultatele coloraţiei gram din ziua 22 pentru eliberarea în vederea expedierii.
TABEL 12. Caracterizare funcţională suplimentară: măsurarea secreţiei IFN-γ.
Caracterizare funcţională Metoda Rezultate estimate Proba tehnică Proba 1 Proba 2 Proba 3 Stimulare IFN-γ cu anti-CD3, CD28, CD137 (pg/milion celule) ELISA >2 abateri standard faţă de nestimulare 3085 +/- 182 2363 +/- 437 În aşteptare IFN-γ nestimulat (pg/milion celule) ELISA Inaplicabil 34 +/- 5 27 +/- 10 În aşteptare
În concluzie, datele din probele tehnice demonstrează că produsul medicamentos TIL poate fi preparat în scopul administrării autologe la pacienţi.
EXEMPLUL 4: LIMFODEPLEŢIE
Numărarea celulelor se poate realiza în ziua 7 şi înainte de limfodepleţie. Produsul celular final a inclus până la aproximativ 150 × 109 celule viabile preparate într-un minim de 50% HypoThermosol™ în Plasma-Lyte A™ (volum/volum) şi până la 0.5% HSA (compatibil pentru perfuzie umană) conţinând 300 IU/mL IL2. Produsul final a fost disponibil pentru administrare într-unul din două volume pentru perfuzie:
1) 250 mL (într-o pungă de perfuzie cu capacitate de 300-mL) când TIL recoltate totale sunt ≤ 75 × 109
SAU
2) 500 mL (într-o pungă de perfuzie cu capacitate de 600-mL) când TIL recoltate totale sunt < 150 × 109
Nu a putut fi preconizat numărul total al celulelor generate pentru produsul perfuzabil TIL final pentru fiecare pacient din cauza variaţiei între pacienţi a eatelor de expansiune a celulelor T în timpul etapei REP. O limită inferioară a celulelor în ziua 3, 4, 5, 6, 7 ale REP de 3 până la 14 zile este stabilită pe baza numărului minim de celule necesare pentru a lua decizia de realizare a limfodepleţiei pacientului folosind regimul chimioetrapeutic ciclofosfamida plus fludarabina. După ce am început limfodepleţia pe baza acestui număr minim atins de celule, am tratat pacientul cu numărul disponibil de TIL generate în REP în oricare dintre zilele 3 până la 14 şi în multe cazuri ziua 7. Limita superioară a intervalului pentru perfuzie (150 × 109 celule viabile) se bazează pe limita superioară publicată cunoscută ca fiind sigură pentru perfuzie, la care se obţine un răspuns clinic. Radvanyi, et al., Clin Cancer Res 2012, 18, 6758-6770.
EXEMPLUL 5: PROCESUL 2A - ziua 0
Acest exemplu descrie protocolul detaliat din ziua 0 pentru 2A pdescris în Exemplele 1 - 4.
Preparare.
1. Se confirmă mediul de spălare a tumorii, CM1 şi IL-2 sunt în limita de valabilitate.
2. Se introduce CM1 (mediul celular 1) în incubator.
Metodă.
1. Se curăţă cabinetul de biosecuritate (BSC).
2. Se organizează plăcile de monitorizare a procesului şi se lasă în cabinetul de biosecuritate 1-2 ore în timpul procedurii.
3. Se introduce mediul TIL CM1 în cabinetul de biosecuritate.
4. Se prepară mediul TIL CM1 conţinând 6000 IU/mL IL-2:
4.1. 1L CM1
4.2. 1ml IL-2 (6.000.000 IU/mL)
4.3. Se introduc 25ml de CM1+IL2 în tubul conic de 50ml folosit pentru fragmente la adăugare în G-REX.
4.4. Se introduc în incubator la 37°C pentru pre-încălzire
5. Se şterge pachetul G-REX 100MCS cu 70% alcool şi se introduce în cabinetul de biosecuritate. Se închid toate pensele cu excepţia liniei filtrului.
6. Se calibrează pompa Acacia.
7. Se ataşează linia roşie a balonului G-REX 100MCS la linia de ieşire a pompei acacia.
8. Se ataşează sistemul pumpmatic la linia de admisie a pompei şi se introduc în flacon cu mediul. Se eliberează pensele la pompă.
9. Se pompează restul de 975 ml CM1 preîncălzit conţinând 6.000 IU/mL IL-2 în fiecare bioreactor G-REX 100MCS.
10. Se etanşează termic linia roşie, deconectare de la pompă.
11. Se etichetează G-REX .
12. Se introduce G-REX 100MCS în incubator cât este necesar.
Disecţie tisulară
1. Se înregistrează ora de începere a procesării tumorale.
2. Se transferă mediul de spălare a tumorii în BSC.
3. Se introduc 5 vase Petri de 100 mm în cabinetul de biosecuritate, 3 pentru spălări, 1 pentru menţinere şi 1 pentru ţesut nefavorabil. Se etichetează vasele în mod corespunzător. Ţesutul nefavorabil a fost indicat de ţesut adipos galben sau ţesut necrotic.
4. Se introduc trei plăci cu 6 godeuri în cabinetul de biosecuritate.
5. Se introduc cu pipeta 3-5 mL de mediu de spălare a tumorii în fiecare godeu al unei plăci cu şase godeuri pentru bucăţile de tumori în exces.
6. Se introduc cu pipeta 50 mL de mediu de spălare a tumorii în vasele de spălare 1-3 şi vasul de menţinere.
7. Se introduce două vase de disecţie de 150 mm în cabinetul de biosecuritate.
8. Se introduc 3 tuburi conice de 50 mL sterile în BSC.
9. Se etichetează unul ca mediu de spălare pentru forceps, al doilea ca mediu de spălare pentru bisturiu şi al treilea ca mediu de spălare folosit pentru picăturile de pe capac.
10. Se adaugă 5-20 mL de mediu de spălare tumorală în fiecare tub conic. Forcepsurile şi bisturiurile s-au scufundat în mediul de spălare după necesitate în timpul procesului de spălare şi disecţie a tumorii.
11. Se introduc bisturiul şi forcepsul în tuburile corespunzătoare.
12. Folosind forcepsul lung se îndepărtează tumoarea(ile) din flaconul de specimen şi se
transferă în vasul de spălare 1.
13. Se incubează tumoarea la temperatura ambiantă în vasul de spălare 1 timp de ≥3 minute.
14. În timpul incubării, se re-etichetează flaconul de specimen "Bioburden" şi se depozitează la 2-8°C până la recoltarea finală sau până când este necesară altă testare de sterilitate.
15. Folosind forcepsul se transferă tumoarea în vasul de spălare 2.
16. Se incubează tumoarea la temperatura ambiantă în vasul de spălare 2 timp de ≥3 minute.
17. În timpul incubării, folosind o pipetă de transfer, se adaugă aproximativ 4 picături individuale, la distanţă egală, de mediu de spălare a tumorii în fiecare cerc al capacelor plăcii cu 6 godeuri desemnate ca vase de fragmente tumorale.
18. Folosind forcepsul se transferă tumoarea în vasul de spălare 3.
19. Se incubează tumoarea la temperatura ambiantă în vasul de spălare 3 timp de ≥3 minute.
20. Capacul vasului de 150 mm s-a folosit pentru disecţie. Se introduce o riglă dedesubt.
21. Folosind forcepsul se transferă tumoarea în vasul de disecţie, se măsoară şi se înregistrează lungimea tumorii.
22. Se fotografiază tumoarea.
23. Se efectuează o disecţie iniţială a bucăţilor de tumoare în vasul de disecţie în bucăţi intermediare având grijă să se păstreze structura tumorală a fiecărei bucăţi intermediare.
24. Se transferă bucăţile tumorale intermediare care nu au fost disecate activ în fragmente în vasul de menţinere a ţesuturilor pentru a asigura că ţesutul rămâne hidratat pe durata întregii proceduri de disecţie.
25. Se lucrează cu o bucată tumorală intermediară o dată, se taie cu grijă tumoarea în fragmente de aproximativ 3×3×3 mm în vasul de disecţie, folosind rigla de sub vas ca referinţă
26. Se continuă disecţia fragmentelor din bucata tumorală intermediară până la evaluarea întregului ţesut din piesa intermediară.
27. Se selectează fragmente favorabile şi, folosind o pipetă de transfer, se transferă până la 4 fragmente favorabile în picăturile de mediu de spălare într-un cerc în vasul de fragmente tumorale. Folosind o pipetă de transfer, un bisturiu sau un forceps, se transferă cât mai mult posibil din ţesutul nefavorabil şi produsul rezidual în vasul de ţesut nefavorabil pentru a elibera vasul de disecţie. Întregul ţesut rămas s-a introdus într-unul din godeurile plăcii cu şase godeuri. (Ţesutul nefavorabil a fost indicat de ţesut adipos galben sau ţesut necrotic.)
28. Se continuă procesarea repetând etapa 23- 26 pentru restul bucăţilor tumorale intermediare, lucrând cu o singură bucată intermediară o dată, până la procesarea întregii tumori. (Se obţine un bisturiu sau un forceps nou după necesitate, conform deciziei tehnicianului de procesare.)
29. Se deplasează plăcile cu fragmente către spatele capacului.
30. Folosind pipeta de transfer, bisturiul sau forcepsul, se transferă până la 50 dintre cele mai bune fragmente tumorale în tubul conic de 50 mL etichetat de fragmente tumorale conţinând CM1.
31. Se îndepărtează materialele flotante din tubul conic de 50 mL cu pipeta de transfer. Se înregistrează numărul de fragmente şi materiale flotante.
32. Se îndepărtează toate elementele nenecesare de pe capac, reţinând plăcile cu ţesut favorabil dacă acestea conţin fragmente suplimentare. Se şterge capacul cu alcool.
33. Se îndepărtează G-REX 100MCS din incubator, se şterge cu alcool 70% şi se introduce în cabinetul de biosecuritate.
34. Se agită tubul conic cu fragmente tumorale şi se toarnă conţinutul din tubul conic de 50ml în balonul G-Rex 100MCS
35. Dacă se transferă unul sau mai multe fragmente tumorale în balonul G-Rex 100M, se obţine un fragment tumoral suplimentar când este disponibil din vasul cu ţesut favorabil şi se transferă în balonul G-Rex 100M.
36. Se înregistrează numărul incubatoarului şi numărul total de fragmente adăugate în fiecare balon.
37. Se introduce bioreactorul G-REX 100M în incubator la 37°C, 5% CO2
38. Tumorile neutilizate s-au introdus în 100 mL de HypoThermosol şi s-au livrat la laborator.
39. Se înregistrează ora de încheiere a procesării tumorii.
40. Se elimină meniul complt TIL neutilizat conţinând IL-2 şi părţile alicote IL-2 neutilizate.
41. Se curăţă cabinetul de biosecuritate.
42. Se aşază proba Bioburden în condiţii de depozitare adecvate.
43. Se înregistrează data.
44. Se salvează fotografia ca fişier specimen ID#tumoare, data procesului, pentru întocmirea fişierului pacientului.
45. Se comandă şi se asigură livrarea plăcilor de sedimentare în laboratorul de microbiologie.
EXEMPLUL 6: PROCESUL 2A - ziua 11
Acest exemplu descrie protocolul detaliat din ziua 11 pentru procesul 2A descris în Exemplele 1 - 4.
Preparare în avans.
1. Ziua de dinaintea procesării: 1.1. CM2 se poate prepara în ziua de dinaintea procesării. Se aşază la 4°C.
2. Ziua procesării.
2.1. Se pregăteşte echipamentul de celule feeder.
2.1.1. Se închid toate pensele pe CC2 şi seturile de conectori 4S-4M60.
2.1.2. Se îmbină steril 4 racorduri de echipament 4S-4M60 cu linia de adaos pe CC2 cu îndepărtarea adaosului.
2.1.3. se lasă de-o parte pentru colectarea celulelor feeder.
2.2. Se prepară 5 mL de mediu de crioconservare per CTF-FORM-318 şi se aşază la 4°C până la utilizare.
Monitorizarea mediului camerei cu atmosferă controlată - pre-procesare
1. Se înregistrează informaţiile camerei cu atmosferă controlată.
2. Cabinetele de biosecuritate (BSC) s-au curăţat cu şerveţele mari saturate cu alcool sau pulverizare cu alcool.
3. Se verifică numărul de particule cu 10 minute înainte de a începe procesarea.
4. Se organizează plăcile de monitorizare a procesului şi se lasă în cabinetul de biosecuritate 1-2 ore înaintea procedurii.
Se pregăteşte balonul G-Rex 500MCS:
1. Folosind seringa de 10 mL, se transferă aseptic 0.5mL de IL-2 (soluţie de bază 6 × 106 IU/mL) pentru fiecare litru de CM2 (mediu celular 2) în punga de bioprocesare printr-un conector luer steril neutilizat.
2. Se utilizează aerul în exces din seringă pentru curăţarea liniei, se extrage mediu din pungă şi se reintroduce. Se asigură astfel că întreaga IL-2 s-a amestecat cu mediul. Se amestecă bine.
3. Se deschide ambalajul exterior şi se introduce G-Rex 500MCS în BSC. Se închid toate pensele pe dispozitiv cu excepţia liniei filtrului.
4. Se îmbină steril linia de recoltare roşie de la G-Rex 500MCS la linia de ieşire a pompei.
5. Se conectează conectorul luer interior al pungii de bioprocesare cu conectorul luer exterior al pompei.
6. Se atârnă punga de bioprocesare pe suportul IV, se deschid pensele şi se pompează 4.5 litri de mediu CM2 în G-Rex 500MCS. Se curăţă linia, se închide şi se etanşează termic.
7. Se reţine linia de la pompă la mediu. S-a utilizat la prepararea celulelor feeder.
8. Se introduce G-Rex 500MCS în incubator.
Prepararea celulelor feeder iradiate
1. Se închide ermetic şi se îndepărtează adaosul de la IL TP. Se închid ambele linii.
2. Se înregistrează greutatea uscată a unui pachet de transfer (de 1L TP).
3. Se îmbină steril pachetul de transfer de 1L cu pompa acacia -12" de la pungă.
4. Celălalt capăt al tubajului popmpei este conectat încă la labtainer de 10L.
5. Se pompează 500mL CM2 din greutate în TP.
6. Se închide pensa şi se închide ermetic.
7. Introducere în incubator.
8. Se verifică şi se deconectează pungile de celule feeder.
9. Se înregistrează lotul feeder folosit.
10. Se şterg pungile cu alcool.
11. Se introduc în pungi de depozitare.
12. Se decongelează celulele feeder în baie de apă la 37°C (+/- 1°C). Se înregistrează temperatura băii.
13. Se îndepărtează şi usucă cu tifon.
14. Se trec celulele feeder prin deschizătură în camera de preparare.
15. Se transferă în BSC în camera cu atmosferă controlată.
16. Folosind echipamentul feeder pregătit anterior, se îmbină TP 1L cu mediu la una din liniile neutilizate de pe partea orificiului de probe al robinetului de închidere cu 3 căi cât mai aproape posibil de îmbinarea de etanşare, cu pierdere de tubaj cât mai mică.
17. Se aşază echipamentul feeder în BSC.
18. Se conectează fiecare din cele pungi 3 feeder cu adaosul de la echipamentul feeder în singurul orificiu al pungii feeder.
19. Se roteşte robinetul de închidere astfel încât TP 1L să fie în poziţia "OFF".
20. Lucrând cu câte o pungă o dată, se deschid pensele de pe linia la punga feeder, se evacuează aerul din seringă şi se extrage conţinutul pungii feeder în seringă. Aerul evacuat din seringă ajută la recuperarea celulelor. Se închide pensa la punga feeder.
21. Se înregistrează volumul recuperat de celule feeder decongelate în fiecare pungă.
22. Se roteşte robinetul de închidere astfel încât punga feeder este în poziţia «OFF»
23. Se deschide pensa pe TP şi se ditribuie conţinutul seringii în TP.
24. Se asigură că linia este curăţată şi se reînchide TP. Se poate extrage aer în seringă din TP pentru curăţarea liniei.
25. Se amestecă bine celulele.
26. Se închide pensa la punga feeder.
27. Se roteşte robinetul de închidere astfel încât orificiul seringii este în poziţie "OFF'. Se deconectează seringa de 60mL de robinetul de închidere.
28. Se înlocuieşte cu seringă nouă pentru fiecare pungă feeder.
29. Se lasă seringa cuplată după ultima pungă.
30. Se amestecă bine compoziţia feeder finală.
31. Se roteşte robinetul de închidere astfel încât suspensia celulară feeder este în poziţia «OFF».
32. Se amestecă bine celulele şi, folosind o seringă de 5 mL şi un orificiu fără ac, se clăteşte orificiul cu soluţie celulară pentru a asigura prelevare exactă şi se îndepărtează 1ml de celule, se introduc în tub etichetat pentru numărare.
33. Se repetă cu a doua seringă. Se efectuează o singură numărare pentru fiecare din aceste două probe independente.
34. Se roteşte robinetul de închidere astfel încât suspensia feeder este în poziţie "DESCHISĂ" şi, folosind seringa de 60ml, se ataşează la echipament, se evacuează aer în TP pentru curăţarea liniei.
35. Se îndepărtează seringa şi se acoperă orificiul luer cu un capac nou, steril.
36. Se etanşează termic TP pentru închidere, se îndepărtează echipamentul.
37. Se înregistrează masa pachetului de transfer cu suspensia celulară şi se calculează volumul suspensiei celulare.
38. Se introduc în incubator.
39. Se efectuează o singură numărare a celulelor în proba de celule feeder, se înregistrează datele şi se cuplează datele de numărare brute cu evidenţele loturilor.
40. Se documentează programul de numărare Cellometer.
41. Se verifică dacă s-a introdus diluarea corectă în Cellometer.
42. Se calculează densitatea celulelor viabile totale în pachetul de transfer feeder.
43. dacă numărul celulelor este < 5 x109, se decongelează mai multe celule, se numără şi se adaugă în celule feeder.
44. Se cântăreşte din nou punga feeder şi se calculează volumul.
45. Se calculează volumul celulelor de îndepărtat.
Adăugarea feeder în G-REX
1. Se îmbină steril un set de transfer 4" la TP feeder.
2. În BSC se ataşează o seringă dimensionată corespunzător la conectorul luer interior conectat la pachetul de transfer feeder.
3. Se amestecă bine celulele şi se îndepărtează volumul calculat în etapa 40 sau 41 pentru a obţine 5.0x 109 celule. Se elimină celulele neînsămânţate.
4. Folosind o seringă de 1mL şi un ac 18G se extrag 0.150mL OKT3, se îndepărtează acul şi se transferă în TP feeder prin conectorul luer interior.
5. Se clăteşte tubul şi seringa cu celule feeder şi se amestecă bine punga. Se curăţă linia cu aer din seringă.
6. Se îndepărtează G-Rex 500MCS din incubator, se şterge cu alcool şi se aşază lângă SCD.
7. Se îmbină steril punga feeder cu linia roţie pe G-Rex 500MCS. Se deschide linia şi se lasă celulele feeder să curgă în balon gravitaţional.
8. Se asigură că linia fost complet curăţată, apoi se etanşează linia aproape de închiderea iniţială şi se îndepărtează punga feeder.
9. Se reintroduce G-Rex 500MCS în incubator şi se înregistrează ora.
Prepararea TIL: se înregistrează ora iniţierii recoltării TIL
1. Se îndepărtează cu grijă G-Rex 100MCS din incubator şi se închid toate pensele, cu excepţia liniei de filtru.
2. Se conectează un pachet de transfer de 1L la linia roşie de pe G-REX 100MCS.
3. Se închide pensa pe TP de 300ml. Se etanşează termic -12 inci de la pungă, cu îndepărtarea adaosului. Se înregistrează greutatea/masa uscată.
4. Se îmbină steril pachetul de transfer de 300mL cu linia de colectare celulară de pe 100MCS aproape de etanşarea termică. Se închide linia.
5. Se eliberează toate pensele care duc la TP1L.
6. Folosind GatheRex se transferă ∼900mL de supernatant de cultură în pachetul de transfer de 1L. Se opreşte Gatherex când intră aer în linie. Se închide linia şi se etanşează termic.
7. Se agită balonul până când toate celulele s-au desprins de membrană. Se verifică membrana pentru a asigura că toate celulele s-au desprins.
8. Se înclină balonul de la tubul de colectare şi se lasă fragmentele tumorale să se depună pe margine.
9. Se înclină încet balonul către tubul de colectare astfel încât fragmentele rămân pe partea opusă a balonului.
10. Folosind GatheRex se transferă suspensia celulară reziduală în pachetul de transfer de 300mL evitând fragmentele tumorale.
11. Se verifică din nou dacă toate celulele s-au desprins de membrană.
12. Dacă este necesar, se spală, eliberând pensele pe GatheRex, şi se lasă mediu să curgă în balonul G-Rex 100MCS gravitaţional.
13. Se bate puternic balonul pentru a elibera celulele şi se pompează în TP de 300ml.
14. După încheierea colectării, se închide linia roşie şi se etanşează termic.
15. Se etanşează termic linia de colectare lăsând aproximativ aceeaşi lungime de tub ca la înregistrarea greutăţii uscate.
16. Se înregistrează masa (inclusiv masa uscată) TP de 300ml conţinând suspensia celulară şi se calculează volumul suspensiei celulare.
17. În BSC se conectează TP de 300ml cu un set de transfer plasmatic 4". Se amestecă bine celulele. Se ataşează aseptic o seringă de 5mL, se extrage 1mL, se introduce în criofiolă. Se repetă cu a doua seringă. Se folosesc pentru numărarea celulelor, viabilitate.
18. Se reînchide şi se înlocuieşte capacul luer cu un capac luer steril nou.
19. Se introduce în incubator şi se înregistrează ora aşezării în incubator.
20. Se efectuează o singură numărare a celulelor pe fiecare probă, se înregistrează datele şi se conectează datele de numărare brute la evidenţele loturilor.
21. Se documentează programul de numărare Cellometer.
22. Se verifică dacă s-a introdus diluarea corectă în Cellometer.
23. Dacă este necesar, se ajustează densitatea TIL viabile totale la ≤ 2x108 celule viabile.
24. Se calculează volumul de îndepărtata sau se notează că nu este necesară ajustare.
25. În BSC se ataşează aseptic o seringă dimensionată corespunzător în TP de 300ml.
26. Dacă este necesar, se îndepărtează volumul calculat al celulelor în tabelul "Calcul volum de îndepărtat".
27. Se închide şi se etanşează termic TP de 300ml.
28. Se transferă surplusul de celule într-un tub conic dimensionat corespunzător şi se introduce în incubator cu capacul desfăcut pentru crioconservare ulterioară.
29. Se îndepărtează G-Rex 500MCS din incubator şi se aşază lângă SCD.
30. Se îmbină steril TP de 300ml cu linia de admisie a pompei Acacia.
31. Se îmbină steril linia roşie a G-Rex 500MCS cu linia de ieşire a pompei Acacia.
32. Se pompează celulele în balon.
33. Se asigură că linia s-a curăţat complet, apoi se etanşează termic linia roşie aproape de îmbinarea iniţială.
34. Se verifică dacă toate pensele pe G-Rex 500MCS sunt închise, cu excepţia liniei de filtru.
35. Se reintroduce G-Rex 500MCS în incubator şi se înregistrează ora introducerii în incubator.
36. Se comandă şi se asigură livrarea plăcilor de sedimentare la laboratorul de microbiologie.
Crioconservarea surplusului
Se calculează cantitatea de mediu de congelare care se va adăuga în celule:
TABEL 13: Concentraţia celulară ţintă a fost 1 x 108/ml
A. Se îndepărtează celulele totale (de la etapa 15) mL B. Concentraţie celulară ţintă 1 x 108 celule/mL Volum de mediu de congelare de adăugat (A/B) mL
37. Centrifugare TIL la 400 x g 5 min la 20°C cu frânare completă şi acceleraţie completă.
38. Aspirare aseptică supernatant.
39. Lovire uşoară a fundului tubului pentru resuspendarea celulelor în fluidul rămas.
40. Odată cu lovirea uşoară a tubului se adaugă încet mediu de congelare preparat.
41. Împărţire în părţi alicote în criotuburi dimensionate corespunzător şi se înregistrează ora introducerii celulelor la -80°C.
EXEMPLUL 7: PROCESUL 2A - ziua 16
Acest exemplu descrie protocolul detaliat din ziua 16 pentru procesul 2A descris în Exemplele 1 - 4.
Monitorizarea mediului din camera cu atmosferă controlată - pre-procesare.
1. Cabinetele de biosecuritate s-au curăţat cu şerveţele mari saturate cu alcool sau pulverizare cu alcool.
2. Se verifică numărul de particule cu 10 minute înaintea începerii procesării.
3. Se organizează plăcile de monitorizare a procesului şi se lasă în cabinetul de biosecuritate 1-2 ore în timpul procedurii.
Recoltare şi numărare TIL. 1. Se încălzeşte o pungă de 10L de CM4 pentru culturi iniţiate cu mai puţin de 50x106 TIL într-un incubator de 37°C cel puţin 30 minute sau până când este gata de utilizare. 2. În BSC se ataşează aseptic un set de extensie Baxter la o pungă Labtainer de 10 L. 3. Se îndepărtează balonul G-Rex 500MCS din incubator şi se aşază pe banc lângă GatheRex. Se verifică dacă toate pensele sunt închise cu excepţia liniei de filtru. Se deplasează pensa pe linia de conectare rapidă lângă îmbinarea "T". 4. Se îmbină steril Labtainer de 10L cu linia de recoltare roşie pe G-Rex 500MCS prin tubul sudabil de pe extensia Baxter. 5. Se etanşează termic un pachet de transfer 2" de 2L sub "Y cu îndepărtarea adaosului şi se înregistrează greutatea uscată. Se îmbină steril TP 2L cu linia de colectare curată pe G-Rex 500MCS. 6. Se aşază G-Rex 500MCS pe o suprafaţă plană. 7. Se deschid toate pensele care duc la Labtainer10L şi, folosind GatheRex, se transferă -4L de supernatant de cultură în Labtainer10L. 8. Recoltare formform instrucţiunilor de recoltare GatheRex adecvate. 9. Se închide linia roşie şi se înregistrează ora recoltării iniţiale TIL. 10. Se opreşte GatheRex când intră aer în linie. Se închide linia roşie. 11. După îndepărarea supernatantului, se agită balonul până când toate celulele s-au desprins de membrană. Se înclină balonul pentru a asigura că furtunul se află la marginea balonului. 12. Se eliberează toate pensele care duc la TP 2L şi, folosind GatheRex, se transferă suspensia celulară reziduală în TP 2L, menţinând marginea înclinată până când s-au colectat toate celulele. 13. Se inspectează membrana cu privire la celule aderente. 14. Dacă este necesar, se spală prin eliberarea penselor de pe linia roşie şi se lasă mediu să curgă în balon gravitaţional. 15. Se închide linia roşie şi se etanşează termic. 16. Se loveşte puternic balonul pentru a elibera celulele. 17. Se adaugă celule în TP 2L. 18. Se etanşează termic pachetul de transfer de 2 L lăsând aproximativ aceeaşi lungime a tubului ca la înregistrarea greutăţii uscate. 19. Se reţine G-Rex 500MCS, se reutilizează în separare. 20. Se înregistrează masa pachetului de transfer cu suspensia celulară şi se calculează volumul suspensiei celulare. 21. Se determină volumul suspensiei celulare, inclusiv masa uscată. 22. Se îmbină steril un set de transfer 4" cu punga de suspensie celulară. 23. În BSC se amestecă uşor celulele şi, cu seringa de 20cc, se extrag 11ml şi se împart aşa cum se indică în Tabelul 14:
TABEL 14. Parametrii de testare.
Test Volum probă Vas Număr celule şi viabilitate 2 probe de 2mL Criofiole Micoplasma 1 mL Criofiola se depozitează la 4°C până la încheierea testării. Sterilitate 1 mL Se inoculează 0.5mL în câte un flacon de cultură anaerob şi aerob Debit 2 - 2mL Număr celule neutilizate (crioconservate pentru testarea loturilor următoare) Rest celule Se elimină
24. Se etanşează termic. Se închide legătura luer reţinând pensa 25. Se etichetează şi se aşază suspensia celulară în incubator, se înregistrează ora introducerii în incubator. 26. Se calculează volumul nou. 27. Se înregistrează volumul în pachetul de transfer de 2 L pe baza volumului suspensiei celulare şi volumul se îndepărtează pentru QC (11 mL). 28. Se inoculează şi se comandă testarea sterilităţii. 29. Se depozitează proba de micoplasmă la 4°C în suportul de aşteptare pentru testarea micoplasmei. 30. Se lasă de-o parte până la însămânţarea TIL.
Număr celule:
Se efectuează o singură numărare a celulelor, se înregistrează data şi se conectează datele de numărare brute la evidenţele loturilor. Se documentează diluarea. Se documentează programul de numărare Cellometer. Se verifică dacă s-a introdus diluarea corectă în Cellometer.
Continuarea metodei:
31. Se calculează numărul total al baloanelor necesare pentru subcultură **Se reutilizează vasul iniţial şi fracţiile vaselor suplimentare se rotunjesc în sus.
Adăugarea IL-2 în CM
1. Se introduce punga de 10L de Aim V cu Glutamax în BSC.
2. Se conectează punga de mediu cu un set de transfer plasmatic 4».
3. Se ataşează un ac 18G la o seringă de 10mL şi se extrag 5mL de IL-2 în seringă (concentraţia finală este 3000 IU/ml).
4. Se îndepărtează acul şi se ataşează aseptic seringa la set de transfer plasmatic şi se distribuie IL-2 în pungă.
5. Se curăţă linia cu aer, se extrage mediu şi se distribuie în pungă. Se asigură că întreaga IL-2 se află în mediu.
6. Se repetă pentru restul pungilor de Aim V.
Pregătirea baloanelor G-REX500MCS
1. Se determină cantitatea de CM4 de adăugat în baloane. Se înregistrează volumul de celule
adăugat per balon şi volumul CM4 5000mL-A.
2. Se închid toate pensele cu excepţia liniei de filtru.
3. Se îmbină steril linia de admisie a pompei Acacia cu setul de transfer plasmatic 4» de punga de mediu conţinând CM4.
4. Se îmbină steril linia de ieşire a pompei cu G-Rex 500MCS prin linia de colectare roşie.
5. Se pompează cantitatea determinată de CM4 în G-Rex 500MCS folosind liniile de pe balon ca ghid.
6. Se etanşează termic linia roşie G-Rex 500MCS.
7. Se repetă etapele 4-6 pentru fiecare balon. Se pot umple mai multe baloane în acelaşi timp folosind umplere gravitaţională sau mai multe pompe. Se poate ataşa un conector "Y" la linia de ieşire a pompei şi cele două braţe ataşate de două baloane G-Rex 500MCS le umplu pe ambele în acelaşi timp.
8. Se aşază baloanele la 37°C, 5% CO2.
Însămânţarea baloanelor cu TIL
1. Se închid toate pensele pe G-Rex 500MCS cu excepţia liniei de filtru
2. Se îmbină steril punga de produs celular cu linia de admisie a pompei Acacia.
3. Se îmbină steril celălalt capăt al pompei cu linia roşie pe G-Rex 500MCS.
4. Se introduce conducta de pompare în pompă.
5. Se aşază punga de produs celular pe cântarul analitic şi se înregistrează ora adăugării TIL în balonul G-REX.
6. Cântarul este adus la zero.
7. Se deschid liniile şi se pompează volumul necesar de celule în G-Rex 500MCS din greutate presupunând că 1g=1mL.
8. Se întoarce punga cu susul în jos şi se pompează aer pentru curăţarea liniei. Se etanşează termic linia roşie a G-Rex 500MCS. Se introduce balonul în incubator.
9. Se îmbină steril linia de ieşire a pompei cu următorul G-Rex 500MCS prin linia de colectare roşie
10. Se amestecă bine celulele.
11. Se repetă transferul de celule pentru toate baloanele.
12. Se introduc baloanele la 37°C, 5% CO2 şi se înregistrează ora adăugării TIL în balonul G_REX.
13. Se comandă testarea plăcilor de sedimentare în laboratorul de microbiologie.
14. Se înregistrează numerele de referinţă.
15. Se comandă testarea sterilităţii aerobe şi anaerobe.
16. Se asigură livrarea plăcilor şi flacoanelor în laboratorul de microbiologie.
Crioconservarea celulelor în curgere sau în exces:
1. Se calculează cantitatea de mediu de congelare necesar:
a. Concentraţia celulară ţintă a fost 1 x 108/ml; se înregistrează celulele totale îndepărtate. Concentraţia celulară ţintă a fost 1x108 celule/mL. Se calculează volumul total al mediului de congelare de adăugat.
2. Se prepară mediul de crioconservare şi se aşază la 40°C până la utilizare.
3. Centrifugare TIL la 400 x g timp de 5 min at 20°C cu frânare completă şi acceleraţie completă.
4. Aspirare aseptică supernatant.
5. Lovire uşoară a fundului tubului pentru resuspendarea celulelor în fluidul rămas.
6. Odată cu lovirea uşoară a tubului, se adaugă încet mediu de congelare preparat.
7. Se împarte în părţi alicote în criotuburi etichetate dimensionate corespunzător.
8. Se introduce fiola în Mr. Frosty sau echivalent şi se aşază într-un congelator la -80°C.
9. În 72 ore se transferă în locul de depozitare permanentă şi se documentează şi se
înregistrează data şi ora introducerii în congelator la -80°C.
EXEMPLUL 8: PROCESUL 2A - ziua 22
Acest exemplu descrie protocolul detaliat din ziua 22 pentru procesul 2A descris în Exemplele 1 - 4.
Documentarea rezultatelor negative ale sterilităţii procesului
Înaintea începerii recoltării, se obţin rezultatele preliminare ale sterilităţii din ziua 16 de la laboratorul de microbiologie. Se contactează directorul laboratorului sau persoana responsabilă pentru alte instrucţiuni dacă rezultatele sunt positive.
Monitorizarea mediului camerei cu atmosferă controlată - pre-procesare
1. Se verifică numărul de particule cu 10 minute înaintea începerii procesării.
2. Cabinetele de biosecuritate s-au curăţat cu şerveţele mari saturate cu alcool sau pulverizare cu alcool.
3. Se organizează plăcile de monitorizare a procesului şi se lasă în cabinetul de biosecuritate 1-2 ore în timpul procedurii.
Preparare în avans
1. În BSC se ataşează aseptic un set de extensie Baxter la o pungă Labtainer de 10L sau echivalent. Se etichetează punga de filtrat LOVO.
2. Se introduc trei pungi de 1L de PlasmaLyte A în BSC
3. Se prepară colecţia şi se etichetează pungile PlasmaLyte A cu 1% HSA:
3.1. Se închid toate pensele pe un set de conectori 4S-4M60 şi se conectează fiecare dintre pungile PlasmaLyte.
3.2. Se conectează unul dintre conectorii exteriori ai 4S-4M60 la linia de admisie a pompei Acacia.
3.3. Se conectează linia de ieşire a pompei la o pungă de colectare de 3 litri. Se închid toate pensele pe punga de 3L cu excepţia liniei de pompare.
3.4. Se pompează cei 3 litri de Plasmalyte în punga de 3 litri. Dacă este necesar, se îndepărtează aerul din punga de 3L prin inversarea pompei.
3.5. Se închid toate pensele cu excepţia liniei cu conectorul luer interior.
3.6. Folosind două seringi de 100 mL şi ace 16-18G, se încarcă 120 mL de 25% HSA. Seringile se astupă.
3.7. Se ataşează o seringă la conectorul luer interior pe punga de 3 litri şi se transferă HSA în punga de PlasmaLyte 3L. Se amestecă bine.
3.8. Se repetă cu a doua seringă.
3.9. Se amestecă bine.
3.10. Se închid toate pensele.
3.11. Folosind o seringă de 10mL, se îndepărtează 5 mL de PlasmaLyte cu 1%HSA din orificiul fără ac pe punga de 3 litri.
3.12. Se astupă seringa şi se menţine în BSC pentru diluarea IL-2.
3.13. Se închid toate pensele.
3.14. Se etanşează termic, cu îndepărtarea liniei conectorului luer interior de la conducta de pompare.
3.15. Se etichetează tamponul de spălare LOVO şi se datează. Expiră în 24 h la
temperatura ambiantă.
Prepararea IL-2
1. Se distribuie Plasmalyte/1%HSA din seringa de 5 mL într-un tub conic de 50 ml steril etichetat.
2. Se adaugă 0.05mL soluţie IL-2 în tubul conţinând PlasmaLyte.
3. Se etichetează IL-2 6X104
4. Se astupă, se etichetează şi se depozitează la 2-8°C. Se înregistrează volumele.
Prepararea celulelor
1. Se închid toate pensele pe o pungă Labtainer de 10 L. Se ataşează setul de extensie Baxter la punga de 10L prin legătura luer.
2. Se îndepărtează baloanele G-REX 500M de la 37°C
3. Se îmbină steril linia roşie de îndepărtare a mediului din G-Rex 500MCS cu setul de extensie pe punga de bioprocesare de 10L.
4. Se îmbină steril linia de îndepărtare a celulelor curate din G-Rex 500MCS într-o pungă de colectare de 3L şi se etichetează "suspensie celulară colectată".
5. Se deschide linia roşie şi punga de 10L.
6. Se utilizează pompa GatheRex, s-a redus volumul primului balon.
Obs.: dacă se detectează o bulă de aer, pompa se poate opri prematur. Dacă reducerea volumului nu este completă, se reactivează pompa GatheRex.
7. Se închide pensa pe punga de supernatant şi linia roşie.
8. Se agită balonul G-REX 500M până când TIL sunt complet resuspendate, evitând stropirea sau spumarea. Se asigură că s-au desprins toate celulele de membrană.
9. Se deschid pensele pe linia curată şi punga de 3L.
10. Se înclină balonul G-Rex astfel încât suspensia celulară se colectează în partea balonului în care a fost dispus tubul de colectare.
11. GatherRex începe colectarea suspensiei celulare. Obs.: dacă tubul de colectare celulară nu se află la îmbinarea peretelui cu membrana inferioară, lovirea balonului înclinat la un unghi de 45° este de obicei suficientă pentru poziţionare adecvată a tubului.
12. Se asigură că s-au îndepărtat toate celulele din balon.
13. Dacă au rămas celule în balon, se adaugă 100mL de supernatant înapoi în balon, se agită şi se colectează în punga de suspensie celulară.
14. Se închide pensa pe linia la punga de colectare a celulelor. Se eliberează pensele pe GatheRex.
15. Se etanşează termic linia curată a G-Rex 500MCS.
16. Se etanşează termic linia roşie a G-Rex 500MCS.
17. Se repetă etapele 3-16 pentru alte baloane.
18. A fost necesară înlocuirea pungii de supernatant de 10L, după necesitate, după fiecare al doilea balon.
19. Se pot folosi mai multe GatherRex.
20. Se documentează numărul G-Rex 500MCS procesate.
21. Se etanşează termic punga de colectare a celulelor. Se înregistrează numărul G-REX recoltate.
22. Folosind un marker, se face un semn ∼2" de la unul dintre conectorii luer interiori pe o pungă de colectare nouă de 3 litri.
23. Se etanşează termic şi se îndepărtează conectorul luer interior chiar sub semn.
24. Se etichetează punga sursă LOVO
25. Se înregistrează greutatea uscată.
26. Se închid toate pensele unui filtru de sânge de 170 µm.
27. Se îmbină steril capătul terminal al filtrului cu punga sursă LOVO chiar sub semn.
28. Se îmbină steril o linie sursă a filtrului cu punga conţinând suspensia celulară.
29. Se ridică suspensia celulară prin suspendarea celulelor pe un suport IV pentru a iniţia un transfer gravitaţional al celulelor. (Obs.: nu se lasă punga sursă să atârne de la aparatul de filtrare.)
30. Se deschid toate pensele necesare şi se lasă TIL să se scurgă din punga de suspensie celulară prin filtru în punga sursă LOVO.
31. După ce se transferă toate celulele în punga sursă LOVO, se închid toate pensele, se etanşează termic chiar deasupra semnului şi se desface pentru îndepărtarea filtrului.
32. Se amestecă bine punga şi, folosind două seringi de 3mL, se prelevează 2 probe de 2 mL independente din orificiul de prelevare al seringii pentru numărarea celulelor şi viabilitate.
33. Se cântăreşte punga şi se determină diferenţa între greutatea iniţială şi finală.
34. Se înregistrează data şi se introduce în incubator, inclusiv masa uscată.
Numărarea celulelor.
Se efectuează o singură numărare a celulelor pe fiecare probă şi se înregistrează data şi se ataşează datele de numărare brute la evidenţele loturilor. Se documentează programul de numărare Cellometer. Se verifică dacă s-a introdus diluarea corectă în Cellometer. Se determină numărul total al celulelor nucleate. Se determină numărul TNC de îndepărtat pentru a reţine = 1.5 x 1011 celule pentru procesare LOVO. Celulele îndepărtate se introduc într-un recipient cu dimensiune adecvată pentru eliminare.
Recoltarea LOVO
Labtainer de 10L cu setul de extensie Baxter din prepararea anterioară a fost punga de filtrat de înlocuire ataşată la kitul LOVO. Se porneşte LOVO şi se urmează afişările de pe ecran.
Verificarea cântarelor şi senzorului de presiune
Pentru a accesa profilul de operare a instrumentului (Instrument Operation Profile):
1. Se atinge butonul de informaţii.
2. Se atinge fila de setări instrument.
3. Se atinge butonul profilul de operare a instrumentului.
4. Se afişează profilul de operare a instrumentului.
Verificarea cântarelor
1. Se asigură că nu există nimic pe nici un cântar şi se verifică indicaţiile pentru fiecare cântar.
2. Dacă unul dintre cântare indică o valoare în afara unui interval 0 +/- 2 g, se efectuează calibrarea aşa cum se descrie în manualul de calibrare a cântarului de la producător.
3. Dacă toate cântarele sunt în limitele de toleranţă fără greutate pe ele, se aşază o greutate de 1-kg pe fiecare cântar (#1-4) şi se verifică indicaţia.
4. Dacă unul dintre cântare indică o valoare în afara unui interval 1000 +/- 10 g când pe acesta se află o greutate de 1-kg, se efectuează calibrarea descrisă în manualul operatorului LOVO de la producător
Verificarea senzorului de presiune
1. Se verifică indicaţia senzorul de presiune pe ecranul profilului de operare a instrumentului.
2. N/A: dacă indicaţia senzorului de presiune a fost în afara valorii de 0 +/- 10 mmHg, se memorează o nouă setare a presiunii atmosferice în regimul de întreţinere aşa cum se descrie în manualul operatorului LOVO de la producător.
a. Se atinge butonul de verificare pe ecranul profilului de operare a instrumentului.
b. Se atinge butonul de verificare din fila Setări instrument (Instrument Settings).
3. Dacă s-a efectuat calibrarea cântarului sau s-a memorat o nouă setare a presiunii atmosferice, se repetă secţiunile relevante.
Pentru a începe procedura, se selectează protocolul recoltare G-Rex TIL ("TIL G-Rex Harvest") din meniul derulant pe ecranul Selecţie protocol şi se apasă Start.
1. Se afişează ecranul Configurare procedură. 2. Se atinge butonul Informaţii soluţii. 3. Se afişează ecranul Soluţie 1. Se analizează tipul de tampon de spălare necesar pentru Soluţia 1. (ar trebui să fie PlasmaLyte.) 4. Se atinge butonul Next (continuare) pentru a avansa la ecranul Soluţie 2. Se verifică tipul de tampon de spălare necesar pentru Soluţia 2. (ar trebui să indice "NICI UNUL", indicând că protocolul a fost configurat să folosească numai un tip de tampon de spălare, care este PlasmaLyte) 5. Se atinge butonul de verificare de pe ecranul Informaţii soluţia 2 pentru a reveni la ecranul Configurare procedură. 6. Se atinge butonul Informaţii procedură. 7. Se afişează ecranul Informaţii procedură. 8. Se atinge câmpul de introducere a datelor de identificare ale utilizatorului. Se va afişa o tastatură. Se introduc iniţialele operatorului şi cerificatorului. Se atinge butonul de acceptare a datelor introduse. 9. Se atinge câmpul de introducere ID sursă. Se va afişa o tastatură. Se introduce nr. de lot al produsului. Se atinge butonul de acceptare a datelor introduse. 10. Se atinge câmpul de introducere ID procedură. Se va afişa o tastatură. Se introduce "Recoltare TIL". Se atinge butonul de acceptare a datelor introduse. 11. Dacă sunt alte observaţii de înregistrat, se atinge câmpul de introducere Observaţii procedură. Se afişează o tastatură. Se introduc observaţiile. Se atinge butonul de acceptare a datelor introduse. NOTĂ: câmpul de introducere Observaţii procedură este opţional şi poate fi lăsat gol. 12. Se atinge butonul de verificare pe ecranul Informaţii procedură pentru a reveni la ecranul Configurare procedură. 13. Se verifică dacă se afişează o "confirmare" în butonul Informaţii procedură. Dacă nu se afişează nici o "confirmare", se atinge din nou butonul Informaţii procedură şi se asigură că s-au introdus date în toate câmpurile ID utilizator, ID sursă şi ID procedură. 14. Se atinge butonul Configurare parametri. 15. Se afişează ecranul Informaţii generale procedură. 16. Se atinge câmpul de introducere Volum sursă (mL). Se afişează tastatura numerică. Se introduce Volum calculatal suspensiei celulare (mL) din tabelul 1 17. Se atinge butonul de acceptare a datelor introduse. 18. Se atinge câmpul de introducere PCV sursă (%). Se afişează ecranul TIL (viabile+moarte). 19. Se atinge câmpul de introducere Concentraţie celule. Se afişează tastatura numerică. Se introduce Concentraţia celulară totală /mL din tabelul 14 în Sursă produs în unităţi de "x 106/mL". Informaţia poate fi cuprinsă între 00.0 şi 99.9. Se atinge butonul de acceptare a datelor introduse şi se revine în ecranul Informaţii generală procedură. NOTĂ: după ce s-a acceptat Concentraţia celulară, câmpul de introducere PCV sursă (%) pe ecranul Informaţii generale procedură afişează PCV % calculat de LOVO, pe baza valorii concentraţiei celulare introduse de operator. 20. Pe ecranul Procedură generală, se atinge butonul Next pentru a avansa la ecranul 4 din 8, ecranul Volum produs final (volum reţinut). Notă: ecranele 2 şi 3 nu au câmpuri de introducere pentru a fi completate de operator. 21. Se afişează ecranul Volum produs final (volum reţinut). 22. Folosind valoarea Celule nucleate totale (TNC) din tabelul 15, se determină volumul ţintă al produsului final din tabelul de mai jos (tabel 16). Se introduce volumul produsului final (mL) asociat cu intervalul celular din configurarea procedurii LOVO.
TABEL 15. Determinarea volumului ţintă al produsului final.
Interval celular Volum produs final (reţinut) ţintă (mL) 0 < celule totale (viabile + moarte) ≤ 7.1E10 150 7.1E10 < celule totale (viabile + moarte) ≤ 1.1E11 200 1.1E11 < celule totale (viabile + moarte) ≤ 1.5E11 250
TABEL 16. Volum produs ţintă.
Celule nucleate totale (TNC) x106 Volum produs final (reţinut) ţintă (mL)
23. Pentru a obţine volumul specificat din tabelul 16 se atinge câmpul de introducere Volum produs final (mL). Se afişează o tastatură numerică. Se introduce volumul dorit al produsului final în unitate de mL. Se atinge butonul de acceptare a datelor introduse. 24. Se atinge ecranul Volum produs final (volum reţinut) pentru a reveni la ecranul Configurare procedură. Notă: ecranele 5-8 nu au câmpuri de introducere pentru a fi completate de operator. 25. Se verifică dacă se afişează o "confirmare" la butonul Configurare parametri. Dacă nu se afişează "verificare", se atinge din nou butonul Informaţii procedură şi se asigură că s-au completat Volum sursă şi PCV sursă pe pagina 1. Se asigură că s-a bifat căsuţa de confirmare pentru Volum produs final minim ţintă sau Volum produs final (mL) pe pagina 4. 26. Se atinge butonul Estimare în colţul dreapta sus al ecranului. 27. Se afişează ecranul Rezumat estimare. Se confirmă valorile suficiente şi exacte pentru Sursă şi Tampon spălare PlasmaLyte. 28. Se încarcă kitul consumabil: se urmează instrucţiunile de pe ecran pentru încărcarea kitului selectând butonul de asistenţă (help) "(?)". 29. Se notează volumele afişate pentru Filtrat şi Soluţia 1 (PlasmaLyte) 30. Se notează volumele afişate pentru Filtrat şi Soluţia 1 (read PlasmaLyte). 31. Pentru instrucţiuni privind încărcarea kitului consumabil se atinge butonul help sau se urmează instrucţiunile din manualul de utilizare pentru instrucţiuni detaliate. 32. Când s-a încărcat kitul consumabil LOVO standard, se atinge butonul Next. Se afişează ecranul Informaţii recipient şi poziţionare. Se îndepărtează punga de filtrat de pe cântar #3. 33. Pentru acest protocol, recipientul de filtrat este nou şi în afara cântarului 34. Dacă recipientul de filtrat a fost deja indicat ca nou şi în afara cântarului, nu se fac modificări. 35. Dacă recipientul de filtrat este indicat ca Original, se atinge butonul Original pentru a comuta la Nou. 36. Dacă poziţia filtratului este indicată pe cântar, se atinge butonul pe cântar pentru a comuta în afara cântarului. 37. Dacă volumul fltratului de generat este ≤ 2500 mL, poziţionarea recipientului de filtrat este indicată pe cântar pentru constanţă între cicluri, poziţionarea recipientului de filtrat se modifică în afara cântarului şi tipul recipientului este "nou". 38. Se atinge butonul pe cântar pentru a comuta la în afara cântarului. Se ataşează setul de transfer Utilizare tehnică de îmbinare sterilă pentru a înlocui recipientul de filtrat al kitului consumabil LOVO cu o pungă de 10-L. Se deschide îmbinarea. 39. Se aşază recipientul de filtrat pe banc. NU se aşază punga de filtrat pe cântar #3. Cântarul #3 este gol în timpul procedurii. 40. Se deschid pensele de plastic de pe tubul care duce la recipientul de filtrat. NOTĂ: dacă tubul s-a îndepărtat de pensa F în timpul îmbinării, se înlocuieşte pensa. 41. Se atinge câmpul de introducere Capacitate recipient filtrat. Se afişează o tastatură numerică. Se introduce capacitatea totală a filtratului nou (10.000 mL). Se atinge butonul de «confirmare» pentru a accepta datele introduse. 42. Se utilizează tehnica de îmbinare sterilă pentru a înlocui recipientul de filtrat al kitului consumabil LOVO cu o pungă de 10L. Se deschide îmbinarea. NOTĂ: dacă tubul s-a îndepărtat de pensa F în timpul îmbinării, se înlocuieşte pensa. 43. Se aşază recipientul de filtrat nou pe banc. NU se aşază punga de filtrat pe cântar #3. Cântarul #3 este gol în timpul procedurii 44. Se deschid pensele de plastic de pe tubul care duce la recipientul de filtrat. 45. Pentru recipientul de material reţinut, ecranul afişează original şi pe cântar. 46. Nu se fac modificări la recipientul de material reţinut. 47. După ce s-au făcut toate modificările la recipient filtrat şi s-au introdus informaţiile corespunzătoare, se atinge butonul Next. 48. Se afişează segmentul Confirmare kit consumabil. Se verifică dacă kitul a fost încărcat în mod adecvat, apoi se apasă butonul da. 49. Toate pensele mecanice LOVO se închid automat şi se afişează ecranul Verificare instalare kit consumabil. LOVO parcurge o serie de etape de presurizare pentru verificarea kitului. 50. După ce kitul consumabil a trecut cu succes de verificare, se afişează ecranul Soluţii conectare. 51. 3L este volumul de spălare. Se introduce această valoare pe ecran. 52. Se utilizează tehnica de îmbinare sterilă pentru ataşarea pungii de 3-L de PlasmaLyte de tubul care trece prin pensa 1. Se deschide îmbinarea. 53. Se atârnă punga de PlasmaLyte de un suport IV. 54. Se deschid pensele de plastic pe tubul care duce la punga PlasmaLyte. 55. Se verifică dacă s-a introdus valoarea volumului de soluţie de 3000mL. Aceasta s-a introdus anterior. 56. Se atinge butonul Next. Se afişează segmentul Iniţiere kit consumabil. Se verifică dacă s-a ataşat PlasmaLyte şi îmbinările şi pensele de plastic de pe tubul care duce la PlasmaLyte s-au deschis, apoi se atinge butonul da. NOTĂ: deoarece se foloseşte un singur tip de tampon de spălare (PlasmaLyte) în întreaga procedură LOVO, nu se ataşează soluţie la tubul care trece prin pensa 2. Pensa Roberts de pe acest tub rămâne închisă în timpul procedurii. 57. Începe iniţierea kitului consumabil şi se afişează ecranul Iniţiere kit consumabil. Se observă vizual deplasarea PlasmaLyte prin tubul conectat la punga de PlasmaLyte. Dacă nu se deplasează fluid, se apasă butonul Pauză pe ecran şi se determină dacă o pensă sau o îmbinare este încă închisă. După rezolvarea problemei, se apasă butonul Reluare pe ecran pentru a relua iniţierea kitului consumabil. 58. După ce iniţierea kitului consumabil s-a înceheiat cu succes, se afişează ecranul Conectare sursă. 59. Pentru acest protocol, recipientul sursă este nou şi în afara cântarului 60. Dacă recipientul sursă a fost deja indicat ca nou şi în afara cântarului, nu se fac modificări. 61. Dacă poziţia sursă este indicată pe pe cântar, se atinge butonul pe cântar pentru a comuta la în afara cântarului. 62. Se atinge câmpul de introducere Capacitate sursă (mL). Se afişează tastatura numerică. Se introduce capacitatea recipientului care conţine produsul sursă. Se atinge butonul de verificare pentru acceptarea datelor introduse. Notă: valoarea Capacitate sursă introdusă se utilizează pentru a asigura că punga sursă poate conţine soluţia suplimentară adăugată în pungă în timpul fazei de iniţiere a sursei. 63. Se utilizează tehnica de îmbinare sterilă pentru a ataşa recipientul sursă de tubul care ctrece prin pensa S. Se deschide îmbinarea. Se îndepărtează tubul de pe pensă, după necesitate
64. Se asigură înlocuirea tubului sursă în pensa S. 65. Se atinge butonul Next. Se afişează segmentul Iniţiere sursă. Se verifică dacă s-a ataşat sursa la kitul consumabil şi îmbinările şi pensele de plastic de pe tubul care duce la sursă sunt deschise, apoi se atinge butonul da. 66. Începe iniţierea sursei şi se afişează ecranul Iniţiere sursă. Se observă vizual deplasarea PlasmaLyte prin tubul conectat la punga sursă. Dacă nu se deplasează fluid, se apasă butonul Pauză pe ecran şi se determină dacă o pensă sau o îmbinare este încă închisă. După rezolvarea problemei, se apasă butonul Reluare pe ecran pentru a relua iniţierea sursei. 67. După ce iniţierea sursei s-a înceheiat cu succes, se afişează ecranul Start procedură. 68. Se apasă butonul Start. Apara ecranul de pauză "Ciclu pre-spălare 1", cu instrucţiunile "acoperire IP, amestecare sursă". 69. Se acoperă punga IP. 70. Înaintea apăsării butonului Start, se îndepărtează punga IP de pe cântar #2 (se poate îndepărta şi tubul de la ghidajul de la orificiul superior IP) şi se se răstornă manual pentru a permite tamponului de spălare adăugat în etapa de iniţiere a kitului consumabil să acopere toate suprafeţele interioare ale pungii. 71. Se aşază din nou punga IP pe cântar #2 (eticheta de pe pungă este orientată către stânga). Se înlocuieşte tubul de la orificiul superior în ghidaj dacă a fost îndepărtat. 72. Se amestecă punga sursă. 73. Înaintea apăsării butonului Start, se îndepărtează punga sursă de pe cântar #1 şi se răstoarnă de câteva ori pentru a crea o suspensie celulară omogenă. 74. Se reaşază punga sursă pe cântar #1 sau suportul IV. Se asigură că punga nu se leagănă. 75. Se apasă butonul Start. 76. LOVO începe procesarea fluidului din punga sursă şi se afişează ecranul Ciclu spălare 1.
În timpul procedurii LOVO, sistemul se întrerupe automat pentru a-i permite operatorului să interacţioneze cu diferite pungi. Se afişează diferite ecrane în timpul pauzelor diferite. Se urmează instrucţiunile corespunzătoare pentru fiecare ecran.
Pauză de clătire a sursei
După scurgerea pungii sursă, LOVO adaugă tampon de spălare în punga sursă pentru a clăti punga. După ce s-a adăugat volumul configurat de tampon de spălare în punga sursă, LOVO se întrerupe automat şi afişează ecranul Pauză clătire sursă.
Când se afişează ecranul Pauză clătire sursă, operatorul:
1. Îndepărtează punga sursă de pe cântar #1.
2. Întoarce punga sursă de câteva ori pentru a permite tamponului de spălare să atingă întregul interior al pungii.
2. Reaşază punga sursă pe cântar #1. Se asigură că punga sursă nu se leagănă pe cântar #1.
4. Apasă butonul Reluare.
LOVO procesează fluidul de clătire din punga sursă, apoi continuă procedura automată.
Pauză de amestecare a pungii IP
Pentru pregătirea celulelor pentru o altă trecere prin centrifugă, punga IP se diluează cu tampon de spălare. După adăugarea tamponului de spălare în punga IP, LOVO se întrerupe automat şi afişează ecranul Pauză "amestecare pungă IP".
Când se afişează ecranul Pauză "amestecare pungă IP", operatorul:
1. Îndepărtează punga IP de pe cântar #2. Poate îndepărta şi tubul de la ghidajul orificiului superior IP.
2. Întoarce punga IP de câteva ori pentru a amesteca bine suspensia celulară.
3. Reaşază punga IP pe cântar #2. Înlocuieşte de asemenea tubul orificiului superior IP în ghidaj, dacă a fost îndepărtat. Se asigură că punga IP nu se leagănă pe cântar #2.
4. Apasă butonul Reluare. LOVO începe procesarea fluidului din punga IP.
Puază de masare a colţurilor IP
În timpul ciclului de spălare final al procedurii LOVO, celulele se pompează din punga IP, prin centrifugăn în punga de (produs final) reţinut. Când punga IP este goală, se adaugă 10 mL tampon spălare în orificiul inferior al pungii IP pentru a o clăti. După adăugarea fluidului de clătire, LOVO se întrerupe automat şi afişează ecranul de Pauză "masare colţuri IP".
Când se afişează ecranul Pauză "masare colţuri IP", operatorul:
1. Nu îndepărtează punga IP de pe cântar #2.
2. Cu punga IP încă aşezată pe cântar #2, se masează colţurile pungii pentru a aduce celulele reziduale în suspensie.
3. Se asigură că punga IP nu se leagănă pe cântar #2.
4. Apasă butonul Reluare.
5. LOVO începe pomparea fluidului de clătire din punga IP.
La sfârşitul procedurii LOVO, se afişează ecranul Îndepărtare produşi. Când se afişează acest ecran, toate pungile din kitul LOVO pot fi manipulate.
Notă: Nu se atinge nici o pungă până la afişarea ecranului Îndepărtare produşi.
Se introduce o pensă hemostatică pe tub foarte aproape de orificiul de pe punga de material reţinut pentru ca suspensia celulară să nu se depună în tub şi se etanşează termic în trei puncte sub hemostat.
Se îndepărtează punga de produs reţinut prin ruperea sigiliului central şi se transferă în BSC.
Se urmează intrucţiunile de pe ecranul Îndepărtare produşi
Se atinge butonul Next. Toate pensele mecanice LOVO se deschid şi se afişează ecranul Îndepărtare kit.
Se urmează intrucţiunile de pe ecranul Îndepărtare kit, apoi se continuă.
Se atinge butonul Next. Toate pensele mecanice LOVO se înhid şi se afişează ecranul Rezumat rezultate. Se înregistrează datele din ecranul Rezumat rezultate în Tabelul 17. Se închid toate pompele şi se filtrează suportul.
TABEL 17. Rezumatul rezultatelor LOVO.
Timp de procesare scurs (paranteze #) Timp de procesare sursă scurs (paranteze #) Timp pauză Volum sursă (mL) Volum retentat (mL) Volum filtrat (mL) Volum soluţie 1 (mL) A. B. C. D. E. F. G.
Se atinge butonul Next. Se afişează ecranul Selecţie protocol.
Procedura de oprire LOVO
1. Se asigură că toate pensele sunt închise şi suportul filtrului este în poziţie verticală.
2. Se atinge butonul STOP pe partea frontală LOVO.
3. Se afişează segmentul Decizie buton STOP.
4. Se afişează segmentul Confirmare oprire.
5. Se atinge butonul da. Se afişează ecranul Oprire.
6. După câteva secunde, se afişează ecranul Deconectare. Când se afişează acest ecran, se opreşte LOVO folosind comutatorul din stânga spate a instrumentului.
Se înregistrează volumul de produs preparat final într-un tabel.
Calculul cantităţii de IL-2 necesar din tabelul de produs final
A. Se calculează cantitatea de IL-2 neecsară pentru produs final. (300 IU/mL de produs IL-2 final): Volum produs final (ml) [volum produs celular preparat din tabelul de volum al produsului preparat final] x 300IU/mL = IU IL-2 necesar IU IL-2 necesar B. IU IL-2 necesar ÷ diluare soluţie de lucru (concentraţie 6x104 IU/mL) preparată în etapa de preparare IL-2 = volum (ml) IL-2 de adăugat în produs final. _____________IU IL-2 necesar de mai sus ÷ 60.000 IU/mL = ___________ ml soluţie IL-2.
Determinarea numărului de criorecipiente şi a volumului reţinut
Se marchează în tabelul volum ţintă şi reţinut de mai jos numărul pungilor de crioconservare şi volumul probei de reţinere pentru produs.
Calcul volum ţintă/pungă: (volum preparat final - ajustare volum fiindcă nu s-a obţinut recuperare 100% =10 mL)/# pungi.
Preparare celule cu 1:1 (vol:vol) CS10 (CryoStor 10, BioLife Solutions) şi IL-2.
1. Asamblare aparat de conectare
1.1. Se îmbină steril criorecipientele CS750 la aparatul CC2 Cell Connect înlocuind unul din conectorii luer exteriori distali pentru fiecare pungă.
1.2. Se menţin pensele în poziţie închisă.
1.3. Se etichetează pungile 1-4.
2. Se prepară celulele cu IL-2 şi se conectează aparatul.
2.1. În BSC se conectează punga de produs celular cu un set de transfer plasmatic 4» cu conectorul luer interior. Se asigură că pensa este închisă pe setul de transfer.
2.2. Cu o seringă de dimensiune adecvată, se extrage volumul de diluare IL-2 determinat din tabelul de produs final.
2.3. Se distribuie în produsul LOVO.
2.4. Se îmbină steril punga de produs LOVO cu linia CC2, cu îndepărtarea adaosului.
2.5. Se introduc celulele şi aparatul în punga de transport şi se aşază la 2-8°C ≤ 15 min.
3. Adăugarea CS10
3.1. În BSC se ataşează robinetul de închidere cu 3 căi la conectorul luer exterior pe
punga de CS10 rece.
3.2. Se ataşează seringa de dimensiune adecvată la conectorul luer interior al robinetului de închidere.
3.3. Se deschide punga şi se extrage cantitatea de CS 10 determinată în tabelul "Volum produs preparat final".
3.4. Se îndepărtează seringa şi se astupă.
3.5. Se repetă dacă sunt necesare mai multe seringi.
3.6. Se îndepărtează celulele/aparatul CC2 din frigider la 2-8°C şi se introduc în BSC.
3.7. Se ataşează prima seringă conţinând CS10 de conectorul luer central al robinetului de închidere. Se roteşte robinetul de închidere astfel încât linia la pungile CS750 să fie în poziţie "OFF" (închisă).
3.8. Se amestecă încet şi uşor, se adaugă CS10 (1:1, vol:vol) în celule.
3.9. Se repetă pentru seringi suplimentare de CS10.
Adăugarea produsului celular preparat în criorecipiente
1. Se înlocuieşte seringa cu seringă de dimensiune adecvată pentru volumul de celulele de introdus în fiecare criorecipient.
2. Se amestecă produsul celular.
3. Se deschide pensa care duce la punga de produs celular şi se extrage volumul adecvat
4. Se roteşte robinetul de închidere astfel încât punga de produs celular este în poziţia "OFF" şi se distribuie conţinutul seringii în criorecipientul #1. Se curăţă linia cu aer din seringă.
Înregistrarea volumului de produs final
1. Folosind un orificiu fără ac şi seringă de dimensiune adecvată, se extrage cantitatea de prods reţinut determinată anterior.
2. Se introduce produsul reţinut în tub conic de 50 mL etichetat "reţinere"
3. Folosind seringa ataşată la echipament, se îndepărtează tot aerul din pungă, extrăgând celulele până la circa 1" dincolo de pungă în tub. Se închide şi se etanşează termic. Se aşază la 2-8°C.
4. Se roteşte robinetul de închidere astfel încât criorecipientele să fie în poziţie "OFF"
5. Se amestecă celulele în punga de produs celular şi se repetă etapele 3-8 pentru restul pungilor CS750 folosind o seringă nouă pe robinetul de închidere şi o seringă nouă pentru a obţine celulele reţinute.
6. Produsul reţinut se lasă de-o parte pentru procesare când produsul se află în CRF.
Procedura congelatorului cu control al ratei de îngheţ (CRF) (vezi şi Exemplul 9)
1. Se deschide CRF (congelator cu rată controlată de îngheţ CryoMed, model 7454) şi laptopul asociat.
2. Se introduc în computer contul şi parola
3. Se deschide simbolul Congelator cu rată controlată de îngheţ de pe desktop.
4. Se face click pe butonul Run de pe ecranul principal.
5. Se face click pe Deschidere profil, se apasă Deschide.
6. Se introduce numele fişierului de pornire urmat de dată în format: runLLZZAAA.
7. Se introduce eticheta Dată fără linii în format LLZZAAA.
8. Se închide uşa CRF.
9. Se face click pe Start.
10. Se selectează COM 6 pe meniul derulant.
11. Se face click pe Ok. Se aşteaptă circa 30 secunde.
12. Când apare "Descarcă profil", se face click pe OK. Se face click pe Salvează. (vezi Exemplul 9 pentru detalii ale profilului de congelare cu rată controlată de îngheţ.)
13. Se aşteaptă apăsarea butonului verde până când toate probele sunt în CRF. Congelatorul se menţine la 4°C până la adăugare.
14. Se adaugă probele în CRF.
15. Se aşteaptă până când CRF revine la 4°C. După ce se atinge temperatura, se face click pe butonul verde de continuare. Se iniţiază programul pentru continuare la etapa următoare.
16. Se efectuează o inspecţie vizuală a criorecipientelor cu privire la următoarele (Notă: nu se inspectează pentru sub- sau supraumplere): integritate recipient, integritate orificii, integritate sigilii, prezenţa cocoloaşelor şi prezenţa particulelor.
17. Se aşază etichetele aprobate pe fiecare pungă.
18. Se verifică eticheta produsului final inclusiv: număr lot, numele produsului, data de fabricare, volumul produsului, alţi aditivi, temperatura de depozitare şi expirare.
19. Se introduce fiecare criorecipient (cu etichetă) într-o pungă de învelire.
20. Se etanşează termic.
21. Se introduce într-o casetă rece.
22. Se repetă pentru fiecare pungă.
23. Se introduc criorecipientele etichetate în casete precondiţionate şi se transferă în CRF.
24. Se distribuie uniform casetele în raftul din CRF.
25. Se aplică un termocuplu pe caseta centrală sau se aşază o pungă martor în poziţie centrală.
26. Se închide uşa CRF.
27. Când temperatura din cameră ajunge la 4°C +/- 1.5°C, se apasă Run pe software de interfaţă PC.
28. Se înregistrează ora şi temperatura camerei la care produsul se transferă în CRF.
Procesarea probei de control al calităţii
1. Se transferă aseptic următoarele materiale în BSC, după caz, şi se etichetează conform tabelului de mai jos.
2. Se utilizează o pipetă nouă pentru următoarele:
QC şi tabel reţinere
3. Furnizare în QC: 1 - tub numărare celule, 1- tub endotoxină, 1 - tub micoplasmă, 1-tub coloraţie Gram, 1 tub restimulare şi 1- tub curgere la QC pentru testare imediată. Restul tuburilor duplicat s-au introdus în congelatorul cu rată controlată de îngheţ.
4. Se contactează supervizorul QC pentru informarea testării necesare.
5. Vezi tabelul 18 pentru instrucţiuni de testare şi depozitare.
TABEL 18. instrucţiuni de testare şi depozitare.
Test Vas Număr celule şi viabilitate Criofiole. Micoplasma Criofiola se depozitează la 4°C până la încheierea testării. Sterilitate Se inoculează 0.5 mL într-un flacon de cultură anaerob şi 0.5mL în aerob. Coloraţie Gram Criofiola se depozitează la 4°C până la încheierea testării. Endotoxina Criofiola se depozitează la 4°C până la încheierea testării. Flux Criofiola se depozitează la 4°C până la încheierea testării. Reţinere post-preparare Crioconservare pentru testare ulterioară: constă din 5 fiole satelit, 1 - tub numărare celule, 1- tub endotoxină, 1 - tub micoplasmă, 1-tub coloraţie Gram şi 1- tub curgere la QC pentru testare imediată. Restimulare Proba este furnizată la temperatura camerei şi testul trebuie să înceapă în 30 de minute de la rezultatele numărării celulelor.
Numărare celule
Se efectuează o singură numărare a celulelor pe fiecare probă şi se înregistrează data şi se ataşează datele de numărare brute la evidenţele lotului. Se documentează programul de numărare Cellometer. Se verifică dacă s-a introdus diluarea corectă în Cellometer. \tabCrioconservarea celulelor de reţinere post-preparare:
1. Se introduce fiola în CRF.
2. se deplasează la locul de depozitare după încheierea congelării şi se înregistrează data şi ora amplasaării în CFR. Se înregistrează data şi ora aşezării în LN2.
Testare microbiologică
1. Se comandă testarea plăcilor de sedimentare în laboratorul de microbiologie.
2. Se înregistrează numerele de referinţă.
3. Se comandă testarea sterilităţii aerobe şi anaerobe.
4. Se asigură livrarea plăcilor şi flacoanelor în laboratorul de microbiologie.
Post-crioconservarea pungilor de produs celular
1. Se opreşte congelatorul după încheierea ciclului. Ciclul poate fi oprit prin apăsarea butonului Stop sau a tastei Back de pe tastatura congelatorului.
2. Se îndepărtează criorecipientele din casetă
3. Se transferă casetele în LN2 în fază de vapori.
4. Se înregistrează colul de depozitare.
5. Se introduc orice comentarii suplimentare la deschiderea ferestrei de introducere text. Această fereastră apare indiferent de metoda de oprire a ciclului.
6. Se imprimă raportul profilului şi se ataşează la evidenţele lotului etichetat cu numărul de lot.
7. Se încheie Warm Mode şi se închide ecranul Run cu butonul Ieşire.
EXEMPLUL 9: PROCESUL DE CRIOCONSERVARE
Acest exemplu descrie procesul de crioconservare pentru TIL preparate cu procedura abreviată descrisă mai sus în Exemplul 8 folosind congelatorul cu rată controlată de îngheţ CryoMed, model 7454 (Thermo Scientific).
Echipamentul folosit, pe lângă cel descris în Exemplul 9, este următorul: raft de suport al casetelor de aluminiu (compatibil cu pungi CS750), casete de criodepozitare pentru pungi 750 mL, rezervor de azot lichid de joasă presiune (22 psi), frigider, sensor de termocuplu (tip flexibil pentru pungi) şi pungi CryoStore CS750 (OriGen Scientific).
Procesul de congelare asigură o rată de 0.5°C de la formarea nucleelor la -20°C şi 1°C rată de congelare pe minut până la temperatura finală de -80°C. parametrii programului sunt: Etapa 1 - aşteptare la 4°C; Etapa 2: 1.0°C/min (temperatura probei) până la -4°C; Etapa 3: 20.0°C/min (ctemperatura camerei) până la -45°C; Etapa 4: 10.0°C/min (temperatura camerei) până la -10.0°C; Etapa 5: 0.5°C/min (temperatura camerei) până la -20°C; şi Etapa 6: 1.0°C/min (temperatura probei) până la -80°C.
O reprezentare a procedurii din acest exemplu în legătură cu procesul din Exemplele 1 - 8 este indicată în Figura 11.
EXEMPLUL 10: CARACTERIZAREA TIL DIN PROCESUL 2A
Acest exemplu descrie caracterizarea TIL preparate cu procedura descrisă mai sus. Pe scurt, procedura (procesul 2A, descris în Exemplele 1 - 9) a avut avantajele faţă de procesele anterioare de preparare TIL indicate în Tabelul 19. Avantajele Pre-REP pot include: fragmente tumorale mărite per balon, timp de cultură scurtat, număr redus de etape şi/sau adaptare la sistem închis. Avantajele tranziţiei de la Pre-REP la REP pot include: proces pre-REP-REP scurtat, număr redus de etape, selecţie de fenotipare eliminată, şi/sau adaptare la sistem închis. Avantajele REP pot include: număr redus de etape, durată REP mai scurtă, transfer TIL în sistem închis între baloane, şi/sau sistem închis media exchanges. Avantajele Harvest can include: număr redus de etape, spălare celulară automată, sistem închis şi pierdere redusă de produs în timpul spălării. Avantajele compoziţiei şi/sau produsului final pot include flexibilitatea transportului.
TABEL 19. Compararea procesului 1C exemplificativ şi a unei aplicări a procesului 2A.
Etapă proces Proces 1C - aplicare Proces 2A - aplicare Pre-REP • 4 fragmente per 10 G-REX -10 baloane • 40 fragmente per 1 balon G-REX -100M • durată 11-21 zile • durată 11 zile Tranziţie pre-REP în REP • TIL pre-REP sunt congelate până la fenotipare pentru selecţie, apoi se decongelează pentru continuare la REP (-ziua 30) • TIL pre-REP trec direct în REP în ziua 11 • REP necesită >40×106 TIL • REP necesită 25-200×106 TIL REP • 6 baloane G-REX -100M în ziua 0 REP • 1 balon G-REX -500M în ziua 11 • 5 × 106 TIL şi 5 × 108 feeder PBMC per balon în ziua 0 REP • 25-200×106 TIL şi 5x109 feeder PBMC în ziua 11 • Separare în 18-36 baloane în ziua 7 REP • Separare în ≤ 6 baloane G-REX -500M în ziua 16 • durată 14 zile • durată 11 zile Recoltare • TIL recoltate prin centrifugare • TIL recoltate prin sistem de spălare celulară automată LOVO' Compoziţie finală • Produs proaspăt în Hypothermosol • Produs crioconservat în PlasmaLyte-A + 1% HSA şi CS10 depozitat în LN2 • O singură pungă de perfuzie • Părţi alicote multiple • Stabilitate limitată la transport • Stabilitate mai îndelungată la transport Timp total estimat • 43-55 zile • 22 zile
S-au efectuat în total 9 experimente folosind TIL derivate din 9 tumori descrise în Tabelul 20. Toate datele indicate aici s-au măsurat din produs TIL congelat dezgheţat din procesul 1C şi o aplicare a procesului 2A.
TABEL 20. Descrierea donatorilor de tumori, date şi locuri de procesare.
ID tumoare Tip ţesut Sursă Ţesut M1061 Melanom MT group Primar - picior stânga lateral M1062 Melanom Moffitt N/A M1063 Melanom MT group Metastatic C - zona inghinală dreapta M1064 Melanom MT group Metastatic C - gleznă stânga M1065 Melanom Bio Options Metastatic - ganglion limfatic axilar EP11001 ER+PR+ MT group Primar - carcinom ductal invaziv mamar stânga M1056* Melanom Moffitt N/A M1058* Melanom MT group Metastatic - scalp dreapta stadiu IIB M1023* Melanom Atlantic Health Primar - axila dreaptă
Procedurile descrise în prezenta pentru procesul 2A s-au folosit pentru a produce TIL de caracterizare în acest exemplu. Pe scurt, pentru REP, în ziua 11, s-a preparat un balon G-REX -500M conţinând 5 L de CM2 suplimentat cu 3000 IU/ml rhil-2, 30ng/mL anti-CD3 (Clona OKT3) şi 5 × 109 celule feeder PBMC alogenice iradiate. TIL recoltate din balonul G-REX -100M pre-REP după reducerea volumului s-au numărat şi s-au însămânţat în balonul G-REX -500M la o densitate cuprinsă între 5 × 106 şi 200 × 106 celule. Balonul s-a introdus într-un incubator de cultură tisulară umidificat la 37°C, 5% CO2 timp de cinci zile. În ziua 16, s-a redus volumul balonului G-REX -500M, s-au numărat TIL şi s-a determinat viabilitatea. În acest punct, TIL s-au amplificat în baloane G-REX -500M multiple (până la maxim şase baloane), fiecare cu o densitate de însămânţare de 1 × 109 TIL/balon. Toate baloanele s-au introdus în incubatoare de cultură tisulară umidificate la 37°C, 5% CO2 alte şase zile. În ziua 22, ziua recoltării, s-a redus volumul fiecărui balon cu 90%, celulele au fost colectate şi filtrate printr-un filtru sanguin de 170 µm, după care s-au colectat într-o pungă de 3 L Origin EV3000 sau echivalent în vederea spălării automate LOVO. TIL s-au spălat folosind sistemul de procesare celulară automată LOVO care a înlocuit 99.99% din mediul de cultură celulară cu un tampon de spălare constând din PlasmaLyte-A suplimentat cu 1% HSA. LOVO funcţionează folosind tehnologia membranară de filtrare prin centrifugare care recuperează peste 92% din TIL, eliminând practic componentele de cultură tisulară reziduale, inclusiv ser, factori de creştere şi citokine, precum şi alte reziduuri şi particule. După încheierea spălării, se efectuează o numărare a celulelor pentru a determina amplificarea TIL şi viabilitatea acestora la recoltare. S-a adăugat CS10 în TIL spălate la un raport 1:1 volum:volum pentru a obţine compoziţia finală a procesului 2A. Produsul preparat final a fost împărţit în părţi alicote în pungi de criodepozitare, etanşat şi introdus în casete de aluminiu prerăcite. Pungile de criodepozitare conţinând TIL s-au congelat folosind un congelator cu rată controlată de îngheţ CryoMed (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) conform procedurilor descrise în prezenta, inclusiv în Exemplul 9.
Numărul de celule şi viabilitatea procentuală pentru cele nouă probe se compară în Figurile 12 şi 13.
Markerii de suprafaţă celulară indicaţi în rezultatele următoare s-au analizat prin citometrie în flux (citometru Canto II, Becton, Dickinson şi Co., Franklin Lakes, NJ, USA) folosind reactivi adecvaţi din comerţ. Rezultatele pentru markerii de interes sunt indicate în Figura 14 - Figura 23.
S-au folosit diferite metode pentru măsurarea lungimii telomerilor în ADN genomic şi preparate citologice. Analiza fragmentelor de restricţie telomerice (TRF) este etalonul de aur în măsurarea lungimii telomerilor (de Lange et al., 1990). Totuşi, limitarea majoră a TRF este necesitatea unei cantităţi mari de ADN (1.5 µg). Aici s-au aplicat două tehnici larg utilizate pentru măsurarea lungimii telomerilor, şi anume hibridizarea fluorescentă in situ (FISH) şi PCR cantitativă.
Flow-FISH s-a efectuat folosind kitul Dako (K532711-8 RUO Code K5327 Telomere PNA Kit/FITC pentru citometrie în flux, PNA FISH Kit/FITC. Flow, 20 teste) şi s-au urmat instrucţiunile producătorului pentru a măsura lungimea medie a repetiţiei telomerice. Pe scurt, suprafaţa celulelor s-a colorat cu CD3 APC 20 minute la 4°C, urmat de GAM Alexa 546 timp de 20 minute. Complexul antigen-anticorp a fost legat încricuşat cu 2 mM cross-linker chimic BS3 (Fisher Scientific). S-a folosit legarea sondei PNA-telomer într-o populaţie standard de celule T cu telomeri lungi, linia celulară leucemică T Jurkat 1301 (celule 1301) ca standard de referinţă intern în fiecare test. TIL individuale s-au numărat după incubare cu anticorp şi s-au amestecat cu 1301 celule (ATCC) la un raport celular 1:1. 5 × 105 TIL s-au amestecat cu 5 × 105 celule 1301. Hibridizarea in situ s-a efectuat în soluţie de hibridizare (70% formamidă, 1% BSA, 20mM Tris pH 7.0) în duplicat şi în prezenţa şi absenţa unei sonde PNA telomer conjugat cu FITC (Panagene), FITC-00-CCC-TAA-CCC-TAA-CCC-TAA, complementar cu secvenţa repetiţiei telomerice la o concentraţie finală de 60nM. După adăugarea sondei PNA telomer, celulele s-au incubat 10 minute la 81°C într-o baie de apă cu agitare. Celulele s-au aşezat apoi la întuneric la temperatura camerei peste noapte. Dimineaţa următoare, s-a îndepărtat sonda de telomer în exces prin spălare de 2 ori cu PBS pre-încălzit la 40°C. După spălări, s-a adăugat DAPI (Invitrogen, Carlsbad, CA) la o concentraţie finală de 75 ng/mL. S-a folosit colorarea ADN cu DAPI pentru activarea celulelor în populaţia G0/G1. Analiza probelor s-a efectuat folosind citometrul nostru (BD Canto II, Mountain View, CA). Fluorescenţa telomerică a probei testate s-a exprimat ca procentaj al fluorescenţei (fl) celulelor 1301 conform formulei: lungime relativă a telomerilor = [(fl FITC medie celule testate cu sondă - fl FITC medie celule testate fără sondă) × indice ADN celule 1301 × 100] / [(fl FITC medie celule 1301 cu sondă - fl FITC medie celule 1301 fără sondă) × indice ADN celule testate.
S-a folosit şi qPCR în timp real pentru a măsura lungimea relativă a telomerilor (Nucleic Acids Res. 2002 May 15; 30(10): e47., 20, Leukemia, 2013, 27, 897-906). Pe scurt, s-a determinat raportul dintre numărul copiilor repetiţiilor telomerice şi numărul copiilor genice individuale (T/S) folosind un ciclor termic BioRad PCR (Hercules, CA) într-un format cu 96 de godeuri. S-au folosit zece ng de ADN genomic pentru reacţia PCR a telomerilor sau hemoglobinei (hgb) şi primerii utilizaţi au fost: primer Tel-1b (CGG TTT GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT), primer Tel-2b (GGC TTG CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT), primer hgb1 (GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC) şi primer hgb2 (CACCAACTTCATCCACGTTCACC). Toate probele s-au analizat prin reacţii telomerice şi hemoglobinice şi analiza s-a efectuat în triplicat pe aceeaşi placă. Pe lângă probele testate, fiecare placă cu 96 de godeuri a conţinut o curbă standard în cinci puncte de la 0.08 ng la 250 ng folosind ADN genomic izolat din linia celulară 1301. Raportul T/S (-dCt) pentru fiecare probă s-a calculat scăzând valoarea ciclului prag hemoglobinic median (Ct) din valoarea Ct telomeric median. Raportul T/S relativ (-ddCt) s-a determinat scăzând raportul T/S al punctului curbei standard 10.0 ng din raportul T/S al fiecărei probe necunoscute.
Rezultatele Flow-FISH sunt indicate în Figurile 24 şi 25 şi nu se observă diferenţe semnificative între procesul 1C şi procesul 2A, sugerând că proprietăţile surprinzătoare ale TIL produse prin procesul 2A nu au fost previzibile doar din vârsta TIL.
În concluzie, din procesul 2A a rezultat un produs TIL potent cu un fenotip "tânăr" definit de nivelurile mari ale moleculelor co-stimulatoare, nivelurile mici ale markerilor de epuizare şi o capacitate mărită de a secreta citokine la reactivare. Platforma de expansiune de 22 de zile prescurtată permite generarea rapidă a dozelor TIL la scară clinică pentru pacienţi în nevoie urgentă de terapie. Produsul medicamentos crioconservat determină eficienţe logistice esenţiale, care permit fabricarea rapidă şi flexibilitatea distribuţiei. Această metodă de expansiune depăşeşte barierele tradiţionale în aplicarea mai largă a terapiei TIL.
EXEMPLUL 11: UTILIZAREA AMESTECULUI DE CITOKINE IL-2, IL-15 şi IL-21
Acest exemplu descrie utilizarea citokinelor IL-2, IL-15 şi IL-21, care au rol de factori de creştere T celulari suplimentari, în combinaţie cu procesul TIL din Exemplele 1 - 10.
Folosind procesul din Exemplele 1 - 10, TIL au fost crescute din tumori colorectale, melanom, de col uterin, mamare triplu negative, pulmonare şi renale în prezenţa IL-2 într-o ramificaţie a experimentului şi, în locul IL-2, a unei combinaţii de IL-2, IL-15 şi IL-21 într-o altă ramificaţie a iniţierii culturii. La încheierea pre-REP, culturile s-au evaluat cu privire la amplificare, fenotip, funcţie (CD107a+ şi IFN-γ) şi repertoriu TCR Vβ. IL-15 şi IL-21 se descriu în altă parte în prezenta şi în Gruijl, et al., IL-21 susţine amplificarea limfocitelor infiltrante în tumori CD27+CD28+ cu potenţial citotoxic mare şi expansiune colaterală mică a celulelor T regulatoare, Santegoets, S. J., J Transl Med., 2013, 11:37 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/ articles/PMC3626797/).
Rezultatele au arătat că s-a observat expansiune TIL mărită (>20%) în celule CD4+ şi CD8+ în condiţii tratate cu IL-2, IL-15 şi IL-21 în histologii multiple faţă de condiţiile numai cu IL-2. A existat o predilecţie către o populaţie predominant CD8+ cu un repertoriu predilect TCR Vβ în TIL obţinute din culturile tratate cu IL-2, IL-15 şi IL-21 faţă de culturile numai cu IL-2. IFN-γ şi CD107a au fost mărite în TIL tratate cu IL-2, IL-15 şi IL-21 în comparaţie cu TIL tratate numai cu IL-2.
EXEMPLUL 12: STUDIU ÎN MELANOM FAZA 2, ÎN CENTRE MULTIPLE, CU TREI GRUPURI
Acest studiu faza 2, în centre multiple, cu trei grupuri este prevăzut pentru a evalua siguranţa şi eficienţa unei terapii cu TIL preparate conform procesului 1C (descris în prezenta) la pacienţi cu melanom metastatic. Grupurile 1 şi 2 vor include până la câte 30 de pacienţi şi grupul 3 este un grup de re-tratament pentru o a doua perfuzie TIL la până la zece pacienţi. primele două grupuri evaluează două procese de preparare diferite: procesul 1C şi o aplicare a procesului 2A (descris în Exemplele 1 - 10). Pacienţii din primul grup primesc TIL proaspete, non-crioconservate, iar pacienţii din al doilea grup primesc produs preparat prin procesul descris în Exemplele 1 - 10, din care rezultă un produs crioconservat. Modelul studiului este indicat în FIG. 26. Studiul este un studiu faza 2, în centre multiple, cu trei grupuri de evaluare a siguranţei şi eficienţei TIL autologe pentru tratarea subpopulaţiilor de pacienţi cu melanom metastatic. Principalele criterii de includere sunt: melanom metastatic măsurabil şi ≥ 1 leziune rezercabilă pentru generare TIL; cel puţin o linie anterioară de terapie sistemică; vârsta ≥ 18; şi stadiu performanţă ECOG 0-1. Grupurile de tratament includ produs TIL necrioconservat (preparat folosind procesul 1C), produs TIL crioconservat (preparat folosind o aplicare a procesului 2A) şi retratament cu produs TIL pentru pacienţi fără răspuns sau cu avansare după răspunsul iniţial. Obiectivul primar este siguranţa şi obiectivul secundar este eficienţa, definită ca rată de răspuns obiectiv (ORR), rată de remisiune completă (CRR), supravieţuire fără avansare (PFS), durata răspunsului (DOR) şi supravieţuirea totală (OS).
EXEMPLUL 13: CALIFICAREA LOTURILOR INDIVIDUALE DE CELULE MONONUCLEARE PERIFERICE GAMMA-IRADIATE
Acest exemplu descrie o nouă procedură scurtată pentru calificarea loturilor individuale de celule mononucleare periferice gamma-iradiate (PBMC, cunoscute şi ca MNC) pentru utilizare ca celule feeder alogenice în metodele exemplificative descrise în prezenta.
Fiecare lot de MNC feeder iradiate s-a preparat de la un donator individual. Fiecare lot sau donator s-a analizat individual cu privire la capacitatea de a amplifica TIL în REP în prezenţa anticorpului anti-CD3 purificat (clona OKT3) şi interleukinei-2 (IL-2). În plus, fiecare lot de celule feeder s-a testat fără adăugarea TIL pentru a verifica dacă doza primită de radiaţie gamma a fost suficientă pentru a le face incompetente de replicare.
Definiţii/abrevieri
BSC - Cabinet de biosecuritate
CD3 - Grup de diferenţiere 3; limfocite T proteine markeri suprafaţă
CF - Centrifug
CM2 - Mediu complet pentru TIL #
CMO - Organizaţie de fabricare contractuală
CO2 - Dioxid de carbon
EtOH - Alcool etilic
GMP - Bună practică de producţie
IL-2 - Interleukina 2
IU - Unităţi internaţionale
LN2 - Azot lichid
mini-REP - Mini-protocol de expansiune rapidă
ml - Mililitru
MNC - Celule mononucleare
NA - Inaplicabil
OKT3 - anticorp MACS GMP CD3 pur (clona OKT3)
PPE - Echipament personal de protecţie
Pre-REP - Pre-protocol de expansiune rapidă
QS - Quantum Satis; completare până la această cantitate
REP - Protocol de expansiune rapidă
TIL - Limfocite infiltrante în tumori
T25 - Balon de cultură tisulară de 25cm2
µg - Micrograme
µL - Microlitru
PROCEDURĂ
Bază
7.1.1 Celulele feeder MNC gamma-iradiate, cu creştere oprită, au fost necesare pentru REP TIL. Receptorii membranari pe MNC feeder se leagă de anticorp anti-CD3 (clona OKT3) şi se leagă încrucişat de TIL în balonul REP, stimulând amplificarea TIL. Loturile feeder s-au preparat din leucafereza sângelui integral prelevat de la donatori individuali. Produsul de leucafereză a fost supus centrifugării în Ficoll-Hypaque, spălat, iradiat şi crioconservat în condiţii GMP.
7.1.2 Este important ca pacienţii care au primit terapie TIL să nu primească perfuzie cu celule feeder viabile fiindcă aceasta poate provoca boala grefă contra gazdă (GVHD). Celule feeder sunt oprite din creştere prin dozarea celulelor cu radiaţie gamma, ducând la rupturi ADN dublu catenare şi pierderea viabilităţii celulelor MNC la recultivare.
Criterii de evaluare şi organizare experimentală
Loturile feeder s-au evaluat cu privire la două criterii: 1) capacitatea de a amplifica TIL în co-cultură >100 ori şi 2) incompetenţa de replicare.
7.2.2 Loturile feeder au fost testate în format mini-REP folosind două linii TIL pre-REP primare crescute în baloane de cultură tisulară T25 verticale.
7.2.3 Loturile feeder au fost testate faţă de două linii TIL distincte, fiecare linie TIL fiind unică în capacitatea de proliferare în răspuns la activare în REP.
7.2.4 Ca un control, s-a folosit un lot de celule feeder MNC iradiate dovedite istoric că îndeplinesc criteriile de la 7.2.1 pe lângă loturile testate.
7.2.5 Pentru a asigura că toate loturile testate într-un singur experiment sunt testate echivalent, au fost disponibile suficiente stocuri de linii TIL pre-REP identice pentru a testa toate condiţiile şi toate loturile feeder.
7.2.6 Pentru fiecare lot de celule feeder testate, au fost în total şase baloane T25:
7.2.6.1 Linia TIL pre-REP #1 (2 baloane)
7.2.6.2 Linia TIL pre-REP #2 (2 baloane)
7.2.6.3 Control feeder (2 baloane)
NOTĂ: baloanele conţinând liniile TIL #1 şi #2 au evaluat capacitatea lotului feeder de a amplifica TIL. Baloanele de control feeder au evaluat incompetenţa de replicare a lotului feeder.
Protocol experimental
7.3.1 Ziua -2/3, decongelarea liniilor TIL
7.3.1.1 Se prepară mediu CM2.
7.3.1.2 Se încălzeşte CM2 în baie de apă 37°C.
7.3.1.3 Se prepară 40 ml de CM2 suplimentat cu 3000IU/ml IL-2. Se păstrează cald până la utilizare.
7.3.1.4 Se introduc 20 ml de CM2 preîncălzit fără IL-2 în fiecare din cele două tuburi conice de 50ml etichetate cu numele liniilor TIL folosite.
7.3.1.5 Se îndepărtează cele două linii TIL pre-REP desemnate din depozitare LN2 şi se transferă fiolele în camera de cultură tisulară.
7.3.1.6 Se înregistrează identificarea liniei TIL.
7.3.1.7 Se decongelează fiolele prin amplasare într-o pungă de depozitare sigilată într-o baie de apă 37°C până când rămâne o cantitate mică de gheaţă.
7.3.1.8 Se pulverizează sau se şterg fiolele decongelate cu 70% etanol şi se transferă fiolele în BSC.
7.3.1.9 Folosind o pipetă de transfer sterilă, se transferă imediat conţinutul fiolei în 20ml de CM2 în tubul conic de 50ml etichetat.
7.3.1.10 QS până la 40ml folosind CM2 fără IL-2 pentru spălarea celulelor.
7.3.1.11 Se centrifughează la 400 x CF 5 minute.
7.3.1.12 Se aspiră supernatantul şi se resuspendă în 5ml CM2 cald suplimentat cu 3000 IU/ml
IL-2.
7.3.1.13 Se îndepărtează o parte alicotă mică (20µl) în duplicat pentru numărarea celulelor folosind un aparat automat. Se înregistrează numărul.
7.3.1.14 În timpul numărării, se introduce tubul conic de 50ml cu celule TIL într-un incubator umidificat la 37°C, 5% CO2, cu capacul desfăcut pentru a permite schimb de gaz.
7.3.1.15 Se determină concentraţia celulară şi se diluează TIL la 1 x 106 celule/mL în CM2 suplimentat cu IL-2 la 3000 IU/ml.
7.3.1.16 Se cultivă în 2ml/godeu al unei plăci de cultură tisulară cu 24 de godeuri în atâtea godeuri cât sunt necesare într-un incubator umidifcat la 37°C până în ziua 0 a mini-REP.
7.3.1.17 Se cultivă liniile TIL diferite în plăci de cultură tisulară cu 24 de godeuri separate pentru a evita confuzia şi posibila contaminare.
7.3.2 Ziua 0, iniţiere mini-REP
7.3.2.1 Se prepară suficient mediu CM2 pentru numărul loturilor feeder testate (de ex., pentru testarea a 4 loturi feeder o dată, se prepară 800ml de mediu CM2).
7.3.2.2 Se împarte în părţi alicote o porţiune a CM2 preparat la 7.3.2.1 şi se suplimentează cu 3000 IU/ml IL-2 pentru cultivarea celulelor. (de ex., pentru testarea a 4 loturi feeder o dată, se prepară 500ml de mediu CM2 cu 3000 IU/ml IL-2).
7.3.2.3 Restul CM2 fără IL-2 se va folosi pentru spălarea celulelor aşa cum se descrie mai jos.
7.3.2.4 Lucrând cu fiecare linie TIL separat pentru a preveni contaminarea, se îndepărtează placa cu 24 de godeuri cu cultură TIL din incubator şi se transferă în BSC.
7.3.2.5 Folosind o pipetă de transfer sterilă sau Pipettor de 100-1000µl, se îndepărtează circa 1ml de mediu din fiecare godeu TIL folosit şi se aşază într-un godeu neutilizat al plăcii de cultură tisulară cu 24 de godeuri. Acesta se foloseşte pentru spălarea godeurilor.
7.3.2.6 Folosind o pipetă de transfer sterilă nouă sau Pipettor de 100-1000µl, se amestecă restul mediului cu TIL în godeuri pentru a resuspenda celulele, după care se transferă suspensia celulară într-un tub conic de 50ml etichetat cu numele TIL şi se înregistrează volumul.
7.3.2.7 Se spală godeurile cu mediul rezervat şi se transferă acel volum în acelaşi tub conic de 50ml.
7.3.2.8 Se centrifughează celulele la 400 x CF pentru colectarea peletului celular.
7.3.2.9 Se aspiră supernatantul şi se resuspendă peletul celular în 2-5ml de mediu CM2 containing 3000 IU/ml IL-2, volum folosit pe baza numărului de godeuri recoltate şi a dimensiunii peletului - volumul ar trebui să fie suficient pentru a asigura o concentraţie de >1.3 x 106 celule/mL.
7.3.2.10 Folosind o pipetă serologică, se amestecă bine suspensia celulară şi se înregistrează volumul.
7.3.2.11 Se îndepărtează 200µl pentru numărarea celulelor cu un aparat automat.
7.3.2.12 În timpul numărării, se introduce tubul conic de 50ml cu celule TIL într-un incubator umidificat, 5% CO2, 37°C, cu capacul desfăcut pentru a permite schimb de gaz.
7.3.2.13 Se înregistrează numărul.
7.3.2.14 Se îndepărtează tubul conic de 50ml conţinând celulele TIL din incubator şi se resuspendă celulele la o concentraţie de 1.3 x106 celule/mL în CM2 cald suplimentat cu 3000IU/ml IL-2. Se reintroduce tubul conic de 50ml în incubator cu capac desfăcut.
7.3.2.15 Dacă se doreşte, se păstrează placa iniţială cu 24 de godeuri pentru recultivarea TIL reziduale.
7.3.2.16 Se repetă etapele 7.3.2.4 - 7.3.2.15 pentru a doua linie TIL.
7.3.2.17 Chiar înainte de aşezarea TIL în baloanele T25 pentru experiment, TIL s-au diluat la 1:10 pentru o concentraţie finală de 1.3 x 105 celule/mL conform etapei 7.3.2.35 de mai jos.
Prepararea soluţiei de lucru MACS GMP CD3 pur (OKT3)
7.3.2.18 Se extrage soluţie de bază de OKT3 (1mg/ml) din frigider la 4°C şi se introduce în BSC.
7.3.2.19 Se utilizează o concentraţie finală de 30ng/ml OKT3 în mediul mini-REP.
7.3.2.20 Au fost necesare 600ng de OKT3 pentru 20ml în fiecare balon T25 al experimentului; acestea au fost echivalentul a 60µl dintr-o soluţie 10µg/ml pentru fiecare 20ml sau 360µl pentru toate cele 6 baloane testate pentru fiecare lot feeder.
7.3.2.21 Pentru fiecare lot feeder testat, se prepară 400µl dintr-o diluare 1:100 a 1mg/ml OKT3 pentru o concentraţie de lucru de 10µg/ml (de ex., pentru testarea a 4 loturi feeder o dată, se prepară 1600µl dintr-o diluare 1:100 a 1mg/ml OKT3: 16µl de 1mg/ml OKT3 + 1.584ml de mediu CM2 cu 3000IU/ml IL-2.)
Prepararea baloanelor T25
7.3.2.22 Se etichetează fiecare balon cu numele liniei TIL testate, numărul de replicare al balonului, numărul lotului feeder, data şi iniţialele analistului.
7.3.2.23 Se umple balonul cu mediul CM2 înainte de prepararea celulelor feeder.
7.3.2.24 Se introduc baloanele în incubatorul umidificat la 37°C, 5% CO2 pentru a menţine mediul cald în aşteptarea adăugării restului componentelor.
7.3.2.25 După prepararea celulelor feeder, componentele se vor adăuga în CM2 în fiecare balon.
Prepararea soluţiei de lucru MACS GMP CD3 pur (OKT3).
TABEL 21: Soluţii
Componentă Volum în baloane de co-cultură Volum în baloane de control (doar feeder) CM2 + 300 IU/ml IL-2 18ml 19ml MNC: 1.3 x 107/ml în CM2 + 3000IU IL-2 (concentraţie finală 1.3 x 107/balon) 1ml 1ml OKT3: 10µg/ml în CM2 + 3000 IUIL-2 60µl 60µl TIL: 1.3 x 105/ml în CM2 cu 3000IU IL-2 (concentraţie finală 1.3 x 105/balon) 1ml 0
Prepararea celulelor feeder
7.3.2.26 Au fost necesare minim 78 x 106 celule feeder per lot testat pentru acest protocol. Fiecare fiolă de 1ml congelată prin SDBB a avut 100 x 106 celule viabile la congelare. Presupunând o recuperare de 50% la decongelare din depozitare LN2, s-a recomandat decongelarea a cel puţin două fiole de 1ml de celule feeder per lot, obţinând estimativ 100 x 106 celule viabile pentru fiecare REP. Alternativ, dacă s-au furnizat în fiole de 1.8ml, o singură fiolă a asigurat suficiente celule feeder.
7.3.2.27 Înaintea decongelării celulelor feeder, se preîncălzeşte aproximativ 50ml de CM2 fără IL-2 pentru fiecare lot feeder testat.
7.3.2.28 Se îndepărtează fiolele desemnate de lot feeder din depozitarea LN2, se introduc în punga de depozitare şi se aşază pe gheaţă. Se transferă fiolele în camera de cultură tisulară.
7.3.2.29 Se decongelează fiolele în punga de depozitare închisă prin scufundare într-o baie de apă 37°C.
7.3.2.30 Se îndepărtează fiolele din pungă, se pulverizează sau se şterg cu 70% EtOH şi se transferă în BSC.
7.3.2.31 Folosind o pipetă de transfer, se transferă imediat conţinutul fiolelor feeder în 30ml CM2 cald într-un tub conic de 50ml. Se spală fiola cu volum mic de CM2 pentru îndepărtarea celulelor reziduale.
7.3.2.32 Se centrifughează la 400 x CF 5 minute.
7.3.2.33 Se aspiră supernatantul şi se resuspendă în 4ml CM2 cald plus 3000 IU/ml IL-2.
7.3.2.34 Se îndepărtează 200 µl pentru numărarea celulelor folosind Automated Cell Counter. Se înregistrează numărul.
7.3.2.34 Se resuspendă celulele la 1.3 x 107 celule/mL în CM2 cald plus 3000 IU/ml IL-2.
7.3.2.34 Se diluează celulele TIL din 1.3 x 106 celule/mL în 1.3 x 105 celule/mL. Se lucrează cu fiecare linie TIL independent pentru a preveni contaminarea.
Organizarea co-culturii
7.3.2.36 Se diluează celulele TIL de la 1.3 x 106 celule/mL la 1.3 x 105 celule/mL. Se lucrează cu fiecare linie TIL independent pentru a preveni contaminarea.
7.3.2.36.1 Se adaugă 4.5ml de mediu CM2 într-un tub conic de 15ml.
7.3.2.36.2 Se îndepărtează celule TIL din incubator şi se resuspendă godeul folosind o pipetă serologică de 10ml.
7.3.2.36.3 Se îndepărtează 0.5ml de celule din suspensia TIL de 1.3 x 106 celule/mL şi se adaugă în 4.5ml de mediu în tubul conic de 15ml. Se reintroduce fiola TIL în incubator.
7.3.2.36.4 Se amestecă bine.
7.3.2.36.5 Se repetă etapele 7.3.2.36.1 - 7.3.2.36.4 pentru a doua linie TIL.
7.3.2.36.6 Dacă se testează mai mult de un lot feeder o dată, se diluează TIL în concentraţie mai mică pentru fiecare lot feeder chiar înainte de aşezarea TIL în placă.
7.3.2.37 Se transferă baloane cu mediu preîncălzit pentru un singur lot feeder din incubator în BSC.
7.3.2.38 Se amestecă celulele feeder prin extragere şi reintroducere cu pipeta cu vârf de 1ml de câteva ori şi se transferă 1 ml (1.3 x 107 celule) în fiecare balon pentru acel lot feeder.
7.3.2.39 Se adaugă 60µl de soluţie de lucru OKT3 (10µg/ml) în fiecare balon.
7.3.2.40 Se reintroduc cele două baloane de control în incubator.
7.3.2.41 Se transferă 1 ml (1.3 x 105) din fiecare lot TIL în balonul T25 etichetat corespunzător.
7.3.2.42 Se reintroduc baloanele în incubator şi se incubează vertical. Nu se deranjează până în ziua 5.
7.3.2.43 Se repetă 7.3.2.36 - 7.3.2.42 pentru toate loturile feeder testate.
Ziua 5, schimbarea mediului
7.3.3.1 Se prepară CM2 cu 3000 IU/ml IL-2. Sunt necesari 10ml pentru fiecare balon
7.3.3.2 Pentru a preveni contaminarea, se manipulează baloanele pentru un singur lot feeder o dată. Se îndepărtează baloanele din incubator şi se transferă în BSC, atent pentru a nu perturba stratul celular de pe fundul balonului.
7.3.3.3 Se repetă pentru toate baloanele, inclusiv balonul de control.
7.3.3.4 Cu o pipetă de 10ml, se transferă 10ml CM2 cald cu 3000 IU/ml IL-2 în fiecare balon.
7.3.3.5 Se reintroduc baloanele în incubator şi se incubează vertical până în ziua 7. Se repetă 7.3.3.1 - 7.3.3.6 pentru toate loturile feeder testate.
Ziua 7, recoltare
7.3.4.1 Pentru a preveni contaminarea, se manipulează baloanele pentru un singur lot feeder o dată.
7.3.4.2 Se îndepărtează baloanele din incubator şi se transferă în BSC, atent pentru a nu perturba stratul celular de pe fundul balonului.
7.3.4.3 Fără a perturba celulele care cresc pe fundul baloanelor, se îndepărtează 10ml de mediu din fiecare balon de testare şi 15ml de mediu din fiecare dintre baloanele de control.
7.3.4.4 Folosind o pipetă serologică de 10 ml, se resuspendă celulele în mediul rămas şi se amestecă bine pentru spargerea cocoloaşelor.
7.3.4.5 Se înregistrează volumele pentru fiecare balon.
7.3.4.6 După amestecarea suspensiei celulare prin pipetare, se îndepărtează 200µl pentru numărare.
7.3.4.7 Se numără TIL folosind procedura operaţională standard împreună cu un echipament de numărare automat.
7.3.4.8 Se înregistrează numărul în ziua 7.
7.3.4.9 Se repetă 7.3.4.1 - 7.3.4.8 pentru toate loturile feeder testate.
7.3.4.10 Baloanele de control feeder au fost evaluate cu privire la incompetenţa de replicare şi baloanele conţinând TIL au fost evaluate cu privire la gradul de amplificare din ziua 0 conform criteriilor indicate în Tabelul 21 (mai jos).
Ziua 7, continuarea baloanelor de control feeder în ziua 14
7.3.5.1 După încheierea numărării în ziua 7 a baloanelor de control feeder, se adaugă 15ml de mediu CM2 proaspăt conţinând 3000 IU/ml IL-2 în fiecare dintre baloanele de control.
7.3.5.2 Se reintroduc baloanele de control în incubator şi se incubează în poziţie verticală până în ziua 14.
Ziua 14, neproliferare extinsă a baloanelor de control feeder
7.3.6.1 Pentru a preveni contaminarea, se manipulează baloanele pentru un singur lot feeder o dată.
7.3.6.2 Se îndepărtează baloanele din incubator şi se transferă în BSC, atent pentru a nu perturba stratul celular de pe fundul balonului.
7.3.6.3 Fără a perturba celulele care cresc pe fundul baloanelor, se îndepărtează aproximativ 17ml de mediu din fiecare balon de control.
7.3.6.4 Folosind o pipetă serologică de 5 ml, se resuspendă celulele în mediul rămas şi se amestecă bine pentru spargerea cocoloaşelor.
7.3.6.5 Se înregistrează volumele pentru fiecare balon.
7.3.6.6 După amestecarea suspensiei celulare prin pipetare, se îndepărtează 200µl pentru numărare.
7.3.6.7 Se numără TIL folosind procedura operaţională standard împreună cu un echipament de numărare automat.
7.3.6.8 Se înregistrează numărul.
7.3.6.9 Se repetă 7.3.4.1 - 7.3.4.8 pentru toate loturile feeder testate.
REZULTATE ŞI CRITERII DE APROBARE
Rezultate
10.1.1 Doza de radiaţie gamma a fost suficientă pentru a face celulele feeder incompetente de replicare. S-a estimat că toate loturile îndeplinesc criteriile de evaluare şi au demonstrat de asemenea o reducere a numărului viabil total al celulelor feeder rămase în ziua 7 a culturii REP comparativ cu ziua 0.
10.1.2 S-a estimat că toate loturile feeder îndeplinesc criteriile de evaluare ale expansiunii de 100 de ori a creşterii TIL în ziua 7 a culturii REP.
10.1.3 S-a estimat că numărarea din ziua 14 a baloanelor de control feeder continuă tendinţa neproliferativă observată în ziua 7.
Criterii de aprobare
10.2.1 S-au îndeplinit următoarele criterii de aprobare pentru fiecare linie TIL replicată testată pentru fiecare lot de celule feeder
10.2.2 Au existat două niveluri de aprobare, după cum urmează (indicate în tabelul de mai jos).
TABEL 22: Criterii de aprobare
Test Criterii de aprobare Iradierea MNC/Incompetenţa de replicare Fără creştere observată la 7 şi 14 zile Expansiunea TIL O expansiune de cel puţin 100 de ori a fiecărei TIL (minim 1.3 x 107 celule viabile)
10.2.2.1 S-a evaluat dacă doza de radiaţie a fost suficientă pentru a face celulele feeder incompetente la replicare la cultivare în prezenţa a 30ng/ml anticorp OKT3 şi 3000 IU/ml IL-2.
10.2.2.1.1 Incompetenţa de replicare a fost evaluată prin numărul total al celulelor viabile (TVC) determinat prin numărarea automată a celulelor în ziua 7 şi ziua 14 a REP.
10.2.2.1.2 Criteriile de aprobare au fost "Fără creştere", ceea ce înseamnă că numărul total al celulelor viabile nu a crescut în ziua 7 şi ziua 14 faţă de numărul celulelor viabile iniţiale cultivate în ziua 0 a REP.
10.2.2.2 Se evaluează capacitatea celulelor feeder de a susţine expansiunea TIL.
10.2.2.2.1 Creşterea TIL s-a măsurat cu privire la gradul de expansiune a celulelor viabile de la debutul culturii în ziua 0 a REP până în ziua 7 a REP.
10.2.2.2.1 În ziua 7, culturile TIL au obţinut un minim de 100 de ori expansiune, (i.e., mai mult de 100 de ori numărul total al celulelor viabile TIL cultivate în ziua 0 REP), evaluat prin numărarea automată a celulelor.
10.2.2.3 Dacă un lot nu îndeplineşte cele două criterii de mai sus, lotul este retestat conform planului de intervenţie indicat în secţiunea 10.3 de mai jos.
10.2.2.4 În urma retestării unui lot nereuşit, lotul feeder MNC care nu a îndeplinit cele două criterii de aprobare în evaluarea iniţială şi a doua testare a fost exclus.
10.2.2.5 Toate loturile feeder MNC care îndeplinesc criteriile de aprobare, dar care s-au considerat ca având performanţă slabă privind capacitatea de amplificare TIL faţă de alte loturi feeder anterioare testate în paralel cu aceeaşi linie TIL pre-REP au fost excluse.
Testarea secundară a loturilor feeder MNC care nu îndeplinesc criteriile de aprobare
10.3.1 În cazul în care un lot feeder MNC nu a îndeplinit nici unul dintre criteriile de aprobare
indicate în secţiunea 10.2 de mai sus, se vor efectua următoarele etape de retestare a lotului pentru excluderea erorii experimentale ca o posibilă cauză.
10.3.2 Dacă sunt două sau mai multe fiole de testare satelit rămase din lot, lotul se retestează. Dacă rămâne o singură fiolă de testare satelit sau nici una, lotul nu a trecut de criteriile de aprobare indicate în secţiunea 10.2 de mai sus.
10.3.3 Doi operatori calificaţi, inclusiv persoana iniţială care a evaluat lotul respectiv, testează lotul simultan.
10.3.4 Se repetă secţiunea 7.2 - 7.3 pentru re-evaluarea lotului în cauză.
10.3.5 Fiecare persoană testează lotul în cauză, precum şi un lot de control (definit în secţiunea 7.2.4 de mai sus).
10.3.6 Pentru calificare, lotul în cazuă şi lotul de control trebuie să îndeplinească criteriile de aprobare de la secţiunea 10.2 la ambele persoane care efectuează testarea secundară.
10.3.7 La îndeplinirea acestor criterii, lotul se eliberează pentru utilizare CMO conform secţiunii 10.2 de mai sus.
EXEMPLUL 14: CALIFICAREA LOTURILOR INDIVIDUALE DE CELULE MONONUCLEARE DIN SNGELE PERIFERIC GAMMA-IRADIATE
Acest exemplu descrie o nouă procedură scurtată pentru calificarea loturilor individuale de celule mononucleare din sângele periferic (PBMC) gamma-iradiate utilizabile ca celule feeder alogenice în metodele exemplificative descrise în prezenta. Acest exemplu prevede un protocol de evaluare a loturilor de celule PBMC iradiate pentru utilizare în producerea loturilor clinice de TIL. Fiecare lot de PBMC iradiate s-a preparat de la un donator individual. În peste 100 de protocoale de calificare, s-a arătat că, în toate cazurile, loturile PBMC iradiate de la SDBB (San Diego Blood Bank) amplifică TIL >100 de ori în ziua 7 a REP. Acest protocol de calificare modificat a fost prevăzut să se aplice pe loturi PBMC iradiate de la donatori din SDBB, care au fost testate în continuare pentru a verifica dacă doza primită de radiaţie gamma a fost suficientă pentru a le face incompetentela replicare. După ce s-a demonstrat că îşi menţin incompetenţa de replicare pe durata a 14 zile, loturile PBMC de la donatori s-au considerat "calificate" pentru utilizare în producerea loturilor clinice de TIL.
Termeni principali şi definiţii
µg - Microgram
µl - Microlitru
AIM-V - mediu de cultură celulară din comerţ
BSC - Grup de diferenţiere
CD - Mediu complet pentru TIL #2
CM2 - CM2 suplimentat cu 3000 IU/ml IL-2
CM2IL2 - Organizaţie de fabricare contractată
CO2 - Dioxid de carbon
EtOH - Etanol
GMP - Bune practici de producţie
Gy - Gri
IL - Interleukina
IU - Unităţi internaţionale
LN2 - Azot lichid
MI - Mililitru
NA - Inaplicabil
OKT3 - Denumire anticorp monoclonal anti-CD3
P20 - pipetă 2-20µl
P200 - pipetă 20-200µl pipettor
PBMC - celule mononucleare din sângele periferic
P1000 - pipetă 100-1000µl
PPE - Echipament personal de protecţie
REP - Protocol de expansiune rapidă
SDBB - San Diego Blood Bank
TIL - Limfocite infiltrante în tumori
T25 - balon de cultură tisulară de 25cm2
x g - măsură a forţei centrifuge relative
Specimenele includ PBMC de la donatori iradiate (SDBB).
Procedură
Bazp
7.1.1 PBMC gamma-iradiate, cu creştere oprită, au fost necesare pentru REP actual standard TIL. Receptorii membranari de pe PBMC se leagă de anticorp anti-CD3 (clona OKT3) şi şi se leagă încrucişat de TIL în cultură, stimulând amplificarea TIL. Loturile PBMC s-au preparat din leucafereza sângelui integral prelevat de la donatori individuali. Produsul de leucafereză a fost supus centrifugării în Ficoll-Hypaque, spălat, iradiat şi crioconservat în condiţii GMP.
Este important ca pacienţii care au primit terapie TIL să nu primească perfuzie cu PBMC viabile fiindcă aceasta poate provoca boala grefă contra gazdă (GVHD). PBMC de la donatori sunt oprite din creştere prin dozarea celulelor cu radiaţie gamma, ducând la rupturi ADN dublu catenare şi pierderea viabilităţii celulelor PBMC la recultivare.
Criterii de evaluare
7.2.1 Criteriul de evaluare pentru loturile PBMC iradiate a fost incompetenţa de replicare.
Organizare experimentală
7.3.1 Loturile feeder au fost testate în format mini-REP ca şi cum ar fi co-cultivate cu TIL, folosind baloane de cultură tisulară T25 verticale.
7.3.1.1 Lot de control: un lot de PBMC iradiate, dovedite istoric că îndeplinesc criteriul de la 7.2.1, s-a folosit împreună cu loturile experimentale ca un control.
7.3.2 Pentru fiecare dintre PBMC de la donatori iradiate testate, s-au folosit baloane în duplicat.
Protocol experimental
Întreaga activitate de cultură tisulară din acest protocol s-a desfăşurat folosind tehnica sterilă în BSC.
Ziua 0
7.4.1 Se prepară ∼90ml de mediu CM2 pentru fiecare lot de PBMC de la donatori testat. Se menţine CM2 cald în baie de apă 37°C.
7.4.2 Se decongelează o parte alicotă de 6 x 106 IU/ml IL-2.
7.4.3 Se reintroduce mediul CM2 în BSC, se şterge cu 70% EtOH înainte de aşezare în capac. Pentru fiecare lot de PBMC testat, se îndepărtează circa 60ml de CM2 într-un flacon steril separat. Se adaugă IL-2 din soluţia de bază 6 x 106 IU/ml decongelată în acest mediu pentru o concentraţie finală de 3000 IU/ml. Se etichetează flaconul "CM2/IL2" (sau similar) pentru a-l distinge de CM2 nesuplimentat.
7.4.4 Se etichetează două baloane T25 pentru fiecare lot de PBMC testat. Etcheta minimă include:
7.4.4.1 Număr lot
7.4.4.2 Număr balon (1 sau 2)
7.4.4.3 Data iniţierii culturii (ziua 0)
Preparare OKT3
7.4.5 Se îndepărtează soluţia de anti-CD3 (OKT3) din frigider la 4°C şi se introduce în BSC.
7.4.6 Se foloseşte o concentraţie finală de 30ng/ml OKT3 în mediul mini-REP.
7.4.7 Se prepară o soluţie de lucru 10µg/ml de anti-CD3 (OKT3) din 1mg/ml soluţie e bază. Se introduce în frigider până la utilizare.
7.4.7.1 Pentru fiecare lot PBMC testat, se prepară 150µl dintr-o diluare 1:100 de soluţie anti-CD3 (OKT3). De ex., pentru testarea a 4 loturi PBMC simultan, se prepară 600µl de 10µg/ml anti-CD3 (OKT3) adăugând 6µl de soluţie 1mg/ml în 594µl de CM2 suplimentat cu 3000 IU/ml IL-2.
Prepararea baloanelor
7.4.8 Se adaugă 19ml per balon de CM2/IL-2 în baloane T25 etichetate şi se introduc baloanele în oncubator umidificat 37°C, 5% CO2 întimpul preparării celulelor.
Prepararea PBMC iradiate
7.4.9 Se licrează cu fiecare lot PBMC de la donatori individual pentru a evita posibila contaminare între loturi.
7.4.10 Se recuperează fiolele de loturi PBMC testate din depozitare LN2. S-au aşezat la -80°C sau se menţin pe gheaţă uscată înainte de decongelare.
7.4.11 Se introduc 30ml CM2 (fără supliment IL-2) în tuburi conice de 50ml pentru fiecare lot decongelat. Se etichetează fiecare tub cu diferitele numere de lot PBMC decongelat. Se astupă tuburile etanş şi se introduc în baie de apă 37°C înaintea utilizării. După necesitate, se reintroduc tuburile conice de 50ml în BSC, se şterg cu 70% EtOH înainte de aşezare pe capac.
7.4.12 Se îndepărtează o fiolă PBMC din depozitarea la rece şi se aşază pe un suport flotant într-o baie de apă 37°C pentru decongelare. Se lasă să se dezgheţe până rămâne o cantitate mică de gheaţă în fiolă.
7.4.13 Se pulverizează sau se şterge fiola decongelată cu 70% EtOH şi se transferă în BSC.
7.4.14 Folosind o pipetă de transfer sterilă, se transferă imediat conţinutul fiolei în 30ml CM2 în tubul conic de 50ml. Se îndepărtează circa 1ml de mediu din tub pentru clătirea fiolei; se reintroduce fluidul de clătire în tubul conic de 50ml. Se închide etanş şi se agită uşor pentru spălarea celulelor.
7.4.15 Se centrifughează la 400 x g 5min la temperatura camerei.
7.4.16 Se aspiră supernatant şi se resuspendă peletul celular în 1ml CM2 cald/IL-2 folosind o
pipetă de 1000µl. Alternativ, înainte de adăugarea mediului, se resuspendă peletul celular prin tragerea tubului închis de-a lungul unui suport gol. După resuspendarea peletului celular, se aduce volumul la 4ml folosind mediu CM2/IL-2. Se înregistrează volumul.
7.4.17 Se îndepărtează o parte alicotă mică (de ex., 100µl) pentru numărarea celulelor folosind un aparat automat.
7.4.17.1 Se efectuează numărări în duplicat conform SOP al aparatului specific. cel mai probabil este necesară efectuarea unei diluări a PBMC înainte de numărare. O diluare iniţială recomandată este 1:10, însă aceasta variază în funcţie de tipul de aparat folosit.
7.4.17.2 Se înregistrează numărul.
7.4.18 Se ajustează concentraţia PBMC la 1.3 x 107 celule/mL conform etapei 7.4.15.2 folosind mediu CM2/IL-2. Se amestecă bine prin agitare uşoară sau prin aspirare uşoară folosind o pipetă serologică.
Organizarea baloanelor de cultură
7.4.19 Se reintroduc două baloane T25 etichetate în BSC din incubatorul de cultură tisulară.
7.4.20 Se reintroduce fiola de 10µg/ml de anti-CD3/OKT3 în BSC.
7.4.21 Se adaugă 1ml de 1.3 x 107 suspensie celulară PBMC în fiecare balon.
7.4.22 Se adaugă 60µl de 10µg/ml anti-CD3/OKT3 în fiecare balon.
7.4.23 Se reintroduc baloanele închise în incubatoare de cultură tisulară pentru 14 zile de creştere neperturbată.
7.4.24 Se introduce fiola anti-CD3/OKT3 înapoi în frigider până la utilizare pentru lotul următor.
7.4.25 Se repetă etapele 7.4.9 - 7.4.24 pentru fiecare lot PBMC evaluat.
Ziua 14, măsurarea neproliferării PBMC
7.4.26 Lucrând cu fiecare lot independent, se reintroduc cu grijă baloanele T25 duplicat în BSC.
7.4.27 Pentru fiecare balon, folosind o pipetă serologică nouă de 10ml, se îndepărtează ∼17ml din fiecare balon, se extrage cu grijă mediul rămas pentru a măsura volumul rămas în baloane. Se înregistrează volumul.
7.4.28 Se amestecă proba cu pipeta folosind aceeaşi pipetă serologică.
7.4.29 Se îndepărtează o probă de 200µl din fiecare balon pentru numărare.
7.4.30 Se numără celulele folosind un aparat automat.
7.4.31 Se repetă etapele 7.4.26 - 7.4.31 pentru fiecare lot PBMC evaluat.
REZULTATE ŞI CRITERIU DE APROBARE
Rezultate
10.1.1 S-a preconizat că doza de radiaţie gamma este suffcientă pentru a face celulele feeder incompetente de replicare. S-a preconizat că toate loturile îndeplinesc criteriul de evaluare, demonstrând o reducere a numărului total de celule feeder viabile rămase în ziua 14 a culturii REP comparativ cu ziua 0.
Criteriu de aprobare
10.2.1 S-a îndeplinit următorul criteriu de aprobare pentru fiecare lot de PBMC de la donatori iradiate testate:
10.2.2 "Fără creştere" - înseamnă că numărul total al celulelor viabile în ziua 14 a fost mai mic decât numărul celulelor viabile iniţiale cultivate în ziua 0 a REP.
10.2.3 Dacă un lot nu îndeplineşte criteriul de mai sus, lotul este retestat conform procedurii de testare secundară indicate în secţiunea 10.4.
10.2.4 În urma retestării unui lot nereuşit, lotul feeder MNC care nu a îndeplinit criteriul de aprobare în evaluarea iniţială şi a doua testare a fost exclus.
Testarea secundară a loturilor PBMC care nu îndeplinesc criteriul de aprobare.
10.4.1 În cazul în care PBMC de la donatori iradiate nu au îndeplinit criteriul de mai sus, se vor efectua următoarele etape de retestare a lotului pentru excluderea erorii experimentale ca o posibilă cauză.
10.3.2 Dacă sunt două sau mai multe fiole de testare satelit rămase din lot, lotul se retestează. Dacă rămâne o singură fiolă de testare satelit sau nici una, lotul nu a trecut de criteriul de aprobare indicat în secţiunea 10.2 de mai sus.
10.4.3 Când este posibil, doi operatori calificaţi (de preferinţă inclusiv persoana iniţială care a evaluat lotul în cauză) efectuează testarea celor două fiole separate independent. Aceasta este metoda preferată de testare secundară. Pe lângă fiolele separate de PBMC, se pot folosi aceiaşi reactivi de cei doi operatori.
10.4.3.1. Dacă nu sunt disponibili doi operatori, o persoană testează cele două fiole PBMC pentru lotul nereuşit, lucrând cu fiecare fiolă în mod independent.
10.4.4 Se repetă secţiunea 7.4 "Protocol experimental" pentru re-evaluarea lotului în cauză.
10.4.5 Pe lângă lotul în cauză, se testează un lot de control de către fiecare persoană care realizează testarea secundară.
10.4.5.1 Dacă doi operatori efectuează testarea secundară, ambii testează lotul de control independent.
10.4.5.2 Dacă este disponibilă doar o persoană pentru testarea secundară, nu este necesară testarea lotului de control în duplicat.
10.4.5.3 Pentru calificarea unui lot PBMC supus testării secundare, atât lotul de control, cât şi reproducerile lotului în cauză trebuie să îndeplinească criteriul de aprobare de la secţiunea 10.2.
10.4.5.4 La îndeplinirea acestui criteriu, lotul este eliberat pentru utilizare CMO conform secţiunii 10.2.
EXEMPLUL 15: APARAT AUTOMAT CELLOMETER IC2 IMAGE CYTOMETER
Acest exemplu descrie procedura de operare a aparatului de numărare automat Cellometer K2 Image Cytometer.
1. Definiţii
µl Microlitru
AOPI Iodură de propidiu acridină portocalie
BSC Cabinet de biosecuritate
DPBS Ser fiziologic tamponat cu fosfat Dulbecco
ml Mililitru
MNC Celule mononucleare
NA Inaplicabil
PBMC Celule mononucleare din sângele periferic
PPE Echipament personal de protecţie
Pre-REP Cultură TIL iniţială înaintea Protocolului de expansiune rapidă a culturii
REP Protocol de expansiune rapidă
TIL Limfocite infiltrante în tumori
7. Procedură
7.1 Preparare suspensie celulară
7.1.1 Preparare albastru Trypan. Concentraţia finală aşbastru Trypan a fost 0.1%. producătorul a recomandat o soluţie de bază de 0.2%.
7.1.1.1 La folosirea albastru Trypan pe Cellometer K2, se diluează soluţia (0.4 %) cu PBS la 0.2 %.
7.1.1.2 Se filtrează albastru Trypan cu un filtru de 0.2-0.4 microni şi se împarte în volume mici în tuburi închise, etichetate.
7.1.1.3 Se amestecă suspensia celulară la 1:1 cu 0.2 % albastru Trypan.
7.1.2 Preparare AOPI
7.1.2.1 La folosirea AOPI pe Cellometer K2, se obţine soluţia AOPI.
7.1.2.2 Se colorează proba celulară la 1:1 cu soluţie AOPI. NOTĂ: La numărarea culturilor în concentraţie mare, se diluează probele în mediu de cultură celulară înainte de diluarea 1:1 finală cu albastru Trypan sau AOPI. Se utilizează intervalul de numărare sugerat de producător pentru determinarea celei mai bune diluări de folosit.
7.2 Configurare Cellometer K2
7.2.1 Se porneşte echipamentul Cellometer K2.
7.2.2 Se selectează simbolul Cellometer Image Cytometer de pe monitorul computerului asociat.
7.2.3 Din ecranul principal software, se selectează unul din testele indicate în căsuţa derulantă.
7.2.3.1 La selectarea testului adecvat, aoar Tipul celular şi Mod imagine.
7.2.3.2 La secţiunea "Probă", se face click pe ID utilizator/probă pentru deschiderea unui alt ecran de introducere a informaţiilor de operator pentru specimen.
7.2.3.2.1 Se introduce "ID utilizator", constând din trei iniţiale ale utilizatorului.
7.2.3.2.2 Se introduce "ID probă", obţinut din informaţiile de intrare pentru specimen.
7.2.3.3 Se setează parametrii de diluare.
7.2.3.3.1 Dacă nu se efectuează altă diluare pe lângă amestecul 1:1, factorul de diluare a fost 2.
7.2.3.3.2 Dacă se efectuează o diluare înainte de amestecul 1:1 final, factorul de diluare a fost de 2 ori diluarea anterioară.
7.2.3.3.3 Se actualizează factorul de diluare conform amestecului folosit în secţiunea de diluare a ecranului. Se face click pe simbolul creion pentru a apărea ecranul de dialog.
7.2.3.3.4 Se verifică dacă secţiune Imagine F1 şi Imagine F2 sunt identice.
7.2.3.3.5 Se face click pe butonul "Salvează" după încheierea setării.
7.3 Se numără celulele
7.3.1 Se îndepărtează suportul de plastic depe cele două laturi ale unei lame a camerei de numărare Cellometer (SD100) şi se aşază pe un prosop curat, fără scame.
7.3.2 După prepararea suspensiei celulare, se îndepărtează o parte mică de probă şi se transferă într-un godeu al unei plăci de cultură celulară cu mai multe godeuri sau tub.
7.3.3 dacă se diluează proba, se efectuează diluarea folosind mediul de cultură celulară.
7.3.4 Se adaugă 20 I11 de suspensie celulară într-un godeu al plăcii de cultură celulară cu mai multe godeuri sau tub.
7.3.5 Se adaugă 20 111 de 0.2% albastru Trypan sau soluţie AOPI în 20111 de suspensie celulară şi se amestecă bine proba.
7.3.6 Se măsoară 20 IA din soluţie 1:1 şi se transferă într-o parte a camerei de numărare.
NOTĂ: a se evita atingerea zonei curate a lamei.
7.3.7 Dacă este necesar, se repetă proba pe cealală parte a lamei.
7.3.8. Se introduce în cameră în fanta de pe faţa Cellometer.
7.3.8 Pentru numărarea celulelor AOPI, se face click pe "Previzualizare F1" pe cranul principal pentru a previzualiza imaginea fluorescentă verde (celulă vie). Pentru numărarea albastru Trypan, se face click pe "Previzualizare câmp luminos".
7.3.9 Folosind rotiţa de focalizare, se aduce imaginea la focalizare optimă. Celulele au centru luminos şi o margine bine definită.
7.3.10 Se face click pe "Numărare" pentru a începe procesul de numărare.
7.3.11 Rezultatele se afişează într-o căsuţă de numărare care apare pe ecranul computerului, indicând rezultatele procesului de numărare.
EXEMPLUL 16: PREPARAREA SOLUŢIEI DE BAZĂ IL-2 (CELLGENIX)
Acest exemplu descrie procesul de dizolvare a unei interleukine-2 umane recombinante purificate, liofilizate, în probe adecvate pentru utilizare în alte protocoale de cultură tisulară, inclusiv toate cele descrise în prezenta cerere şi în exemple, inclusiv care care utilizează rhIL-2.
3. Definiţii/abrevieri
µL: microlitru
BSC: Cabinet de biosecuritate
BSL2: Nivel de biosecuritate 2
D-PBS: Ser fiziologic tamponat cu fosfat Dulbecco
G: Calibru
GMP: Bună practică de producţie
HAc: Acid acetic
HSA: Albumină serică umană
mL: Mililitru
NA: Inaplicabil
PPE: Echipament personal de protecţie
rhIL-2; IL-2: interleukina-2 umană recombinantă
COA: Certificat de analiză
6. Procedură
6.1 Se prepară 0.2% soluţie de acid acetic (HAc).
6.1.1 Se transferă 29mL apă sterilă într-un tub conic de 50ml.
6.1.2 Se adaugă 1mL IN acid acetic în tubul conic de 50ml.
6.1.3 Se amestecă bine prin întoarcerea tubului de 2-3 ori.
6.1.4 Se sterilizează soluţia HAc prin filtrare folosind un filtru Steriflip.
6.1.5 Se închide, se datează şi se etichetează soluţia "soluţie sterilă de acid acetic 0.2%".
6.1.6 Soluţia expiră după 2 luni. Se depozitează la temperatura camerei.
6.2 Se prepară 1% HSA în PBS.
6.2.1 Se adaugă 4mL de 25% soluţie HSA în 96mL PBS într-o unitate de filtrare sterilă 150mL.
6.2.2 Se filtrează soluţia.
6.2.3 Se închide, se datează şi se etichetează soluţua "1% HSA în PBS."
6.2.4 Soluţia expiră după 2 luni. Se depozitează la 4°C.
6.3 Pentru fiecare fiolă de rhIL-2 preparată, se completează formulare.
6.4 Se prepară o soluţie de bază de rhIL-2 (6 x 106 IU/mL concentraţie finală)
6.4.1 Fiecare lot de rh1L-2 a fost diferit şi a necesitat informaţii din Certificatul de analiză (COA) al producătorului, cum ar fi:
6.4.1.1 Masa rhIL-2 per fiolă (mg)
6.4.1.2 Activitatea specifică a rhIL-2 (IU/mg)
6.4.1.3 Volum de reconstituire 0.2% HAc recomandat (mL)
6.4.2 Se calculează volumul 1% HSA necesar pentru lotul rhIL-2 folosind ecuaţia de mai jos:
Masă fiolă (mg) x Activitate specifică
6.4.2.1 De exemplu, conform COA CellGenix lot rhIL-2 10200121, activitatea specifică pentru fiola de lmg este 25x106 lU/mg. Recomandă reconstituirea rhIL-2 în 2mL 0.2% HAc.
6.4.3 Se şterge dopul de cauciuc al fiolei IL-2 cu alcool.
6.4.4 Folosind un ac 16G ataşat la o seringă de 3mL, se injectează volumul recomandat de 0.2% HAc în fiolă, cu atenţie să se nu se deplaseze dopul la extragerea acului.
6.4.5 Se întoarce fiola de 3 ori şi se agită până când se dizolvă toată pulberea.
6.4.6 Se îndepărtează cu grijă dopul şi se lasă de-o parte pe un tampon cu alcool.
6.4.7 Se adaugă volumul calculat de 1% HSA în fiolă.
6.4.8 Se închide fiola dopul de cauciuc.
6.5 Se depozitează soluţia rhIL-2
6.5.1 Pentru depozitare pe termen scurt (<72h), se depozitează fiola la 4°C.
6.5.2 Pentru depozitare pe termen lung (>72h), se împarte fiola în volume mai mici şi se depozitează în criofiole la -20°C până când este gata de utilizare. Se evită ciclurile îngheţ/dezgheţ. Expiră la 6 luni de la data preparării.
6.5.3 Etichetele Rh-IL-2 au inclus vânzătorul şi numărul de catalog, numărul de lot, data de expirare, iniţialele operatorului, concentraţia şi volumul părţii alicote.
EXEMPLUL 17: PREPARAREA MEDIULUI PENTRU PROCESE PRE-REP ŞI REP
Acest exemplu descrie procedura de preparare a mediului de cultură tisulară pentru utilizare în protocoale cuprinzând cultură de limfocite infiltrante în tumori (TIL) derivate din diferite tipuri tumorale inclusiv, dar nelimitativ, melanom metastatic, carcinom cu celule scuamoase la cap şi gât (HNSCC), carcinom ovarian, carcinom mamar triplu negativ şi adenocarcinom pulmonar. Acest mediu poate fi folosit pentru prepararea oricăror TIL descrise în prezenta cerere şi în exemple.
3. Definiţii
µg microgram
µm micrometru
µM micromolar
AIM-V® mediu de cultură tisulară fără ser (Thermo Fisher Scientific)
BSC Cabinet de biosecuritate
CM1 Mediu complet #1
CM2 Mediu complet #2
CM3 Mediu complet #3
CM4 Mediu complet #4
IU sau U Unităţi internaţionale
ml mililitru
mM milimolar
NA inaplicabil
PPE echipament personal de protecţie
Pre-REP pre-proces de expansiune rapidă
REP proces de expansiune rapidă
rhIL-2, IL-2 Interleukina-2 umană recombinantă
RPMI1640 mediu Roswell Park Memorial Institute, compoziţie 1640
SOP Procedură operaţională standard
TIL limfocite infiltrante în tumori
7. Procedură
7.1 Toate procedurile se efectuează folosind tehnica sterilă în BSC (clasa II, tip A2).
7.1.1 Se pulverizează suprafaţa capacului cu 70% etanol înainte de utilizare.
7.1.2 Se pulverizează toate obiectele şi reactivii cu 70% etanol înainte de amplasare în capacul de cultură tisulară.
7.2 Se împart 200mM L-glutamină
7.2.1 L-glutamina este furnizată în volume mai mari decât sunt necesare pentru prepararea serului (de ex., volume de 100ml sau 500ml).
7.2.2 Se decongelează flaconul de L-glutamină în baie de apă 37°C.
7.2.3 Se amestecă L-glutamina bine după decongelare, fiindcă se precipită după decongelare. Se asigură că toate precipitatele au revenit în soluţie înainte de împărţire.
7.2.4 Se introduc părţi alicote de 5-10ml L-glutamină în tuburi conice de 15ml sterile.
7.2.5 Se etichetează tuburile cu concentraţie, vânzător, număr lot, data adăugării şi data de expirare.
7.2.6 Tuburile se depozitează la -20°C şi se extrag după necesitate pentru prepararea mediului.
7.3 Prepararea CM1
7.3.1 Se îndepărtează următorii reactivi din depozitarea la rece şi se încălzesc într-o baie de apă 37°C:
7.3.1.1 RPMI1640
7.3.1.2 Ser AB uman
7.3.1.3 200mM L-glutamină
7.3.2 Se îndepărtează BME din depozitarea la 4°C şi se aşază în capacul de cultură tisulară.
7.3.3 Se introduce soluţia de gentamicină din depozitare la temperatura camerei în capacul de cultură tisulară.
7.3.4 Se prepară mediul CM1 conform tabelului 23 de mai jos adăugând fiecare ingredient în
secţiunea superioară a unei unităţi de filtrare de 0.2um conform volumului de filtrat.
TABEL 23. Prepararea CM1
Ingredient Concentraţie finală Volum final 500 ml Volum final IL RPMI1640 NA 450 ml 900 ml Ser AB uman, inactivat termic 10% 50 ml 100 ml 200mM L-glutamină 2 mM 5 ml 10 m1 55mM BME 55 µM 0.5 ml 1 ml 50mg/ml gentamicină sulfat 50 µg/ml 0.5 ml 1 ml
7.3.5 Se etichetează flaconul de mediu CM1 cu denumirea sa, iniţialele preparatorului, data filtrării/preparării, data de expirare de două săptămâni şi se depozitează la 4°C până la utilizare pentru cultura tisulară. Mediul poate fi împărţit în flacoane cu volume mai mici, după caz. 7.3.6 RPMI1640, serul AB uman sau L-glutamina rămase se depozitează la 4°C până la următoarea preparare de mediu. 7.3.7 Flaconul de BME se reintroduce la depozitare 4°C. 7.3.8 Flaconul de gentamicină se întoarce la locul de depozitare TC corespunzător. 7.3.9 Dată fiind capacitatea de tamponare limitată a mediului, CM1 a fost aruncat la nu mai mult de două săptămâni după preparare sau când indicatorul pH fenol roşu a indicat deplasare extermă de pH (colorare din roşu deschis în roz). 7.3.10 În ziua utilizării, se preîncălzeşte cantitatea necesară de CM1 în baie de apă 37°C şi se adaugă 6000 IU/ml IL-2. 7.3.11 Suplimentare adiţională - după necesitate 7.3.11.1 CM1 suplimentat cu GlutaMAX® 7.3.11.1.1 CM1 se poate prepara cu 2mM GlutaMAXTM în loc de 2mM glutamină (concentraţie finală, vezi tabelul 2.) În acest caz, se etichetează flaconul cu mediu ca în etapa 7.3.5 de mai sus, adăugând "2mM GlutaMAX" pentru a preveni confuzia cu compoziţia standard de CM1. 7.3.11.2 CM1 suplimentat cu extra antibiotic/antimicotic
7.3.11.2.1 Unele compoziţii CM1 au necesitat antibiotic sau antimicotic suplimentar pentru a preveni contaminarea TIL pre-REP crescute din anumite tipuri de tumori.
7.3.11.2.2 Se adaugă antibiotic/antimicotic la concentraţiile finale indicate în Tabelul 24 de mai jos.
7.3.11.2.3 În acest caz, se etichetează flaconul cu mediu ca în etapa 7.3.1 de mai sus, adăugând denumirea antibioticului/antimicoticului suplimentar pentru a preveni confuzia cu compoziţia standard de CM1.
TABEL 24. Suplimentare adiţională a CM1, după necesitate.
Supliment Concentraţie Diluare Concentraţie finală GlutaMAXTm 200mM 1:100 2mM Penicilină/streptomicină 10.000 U/ml penicilină 10.000µg/ml streptomicină 1:100 100 U/ml penicilină 100 µg/ml streptomicină Amfotericina B 250µg/ml 1:100 2.5µg/ml
7.4 Preparare CM2
7.4.1 Se îndepărtează CM1 preparat din frigider sau se prepară CM1 proaspăt conform
secţiunii 7.3 de mai sus.
7.4.2 Se îndepărtează AIM-V® din frigider.
7.4.3 Se prepară cantitatea de CM2 necesară, amestecând CM1 preparat cu un volum egal de AIM-V® într-un flacon de mediu steril.
7.4.4 Se adaugă 3000 IU/ml IL-2 în mediul CM2 în ziua utilizării.
7.4.5 Se prepară suficientă cantitate de CM2 cu 3000 IU/ml IL-2 în ziua utilizării.
7.4.6 Se etichetează flaconul de mediu CM2 media cu denumirea, iniţialele preparatorului, data filtrării/preparării, data de expirare de două săptămâni şi se depozitează la 4°C până la utilizare pentru cultura tisulară. Mediul este împărţit în flacoane cu volume mai mici, după caz.
7.4.7 Se reintroduce CM2 fără IL-2 în frigider, unde poate fi depozitat până la două săptămâni sau până când indicatorul pH fenol roşu indică deplasare extermă de pH (colorare din roşu deschis în roz).
7.5 Preparare CM3
7.5.1 Se prepară CM3 în ziua utilizării.
7.5.2 CM3 a fost identic cu mediul AIM-V®, suplimentat cu 3000 IU/ml IL-2 în ziua utilizării.
7.5.3 Se prepară o cantitate de CM3 suficientă pentru necesităţile experimentale adăugând soluţie de bază IL-2 direct în flaconul sau punga de AIM-V. Se amestecă bine prin agitare uşoară. Se etichetează flaconul cu "3000 IU/ml IL-2" imediat după adăugare în AIM-V. Dacă a existat surplus de CM3, se depozitează în flacoane la 4°C etichetate cu denumirea mediului, iniţialele preparatorului, data preparării mediului şi data de expirare (7 zile după preparare).
7.5.4 Se elimină mediul suplimentat cu IL-2 după 7 zile depozitare la 4°C.
7.6 Preparare CM4
7.6.1 CM4 a fost identic cu CM3, cu supliment adiţional 2mM GlutaMAXTM (concentraţie finală). 7.6.1.1 Pentru fiecare 1L de CM3, se adaugă 10ml de 200mM GlutaMAXTM.
7.6.2 Se prepară o cantitate de CM4 suficientă pentru necesităţile experimentale adăugând soluţie de bază IL-2 şi soluţie GlutaMAXTM direct în flaconul sau punga de AIM-V. Se amestecă bine prin agitare uşoară.
7.6.3 Se etichetează flaconul cu "3000 IL/nil IL-2 şi GlutaMAX" imediat după adăugare în AIM-V.
7.6.4 Dacă a existat surplus de CM4, se depozitează în flacoane la 4°C etichetate cu denumirea mediului, "GlutaMAX", iniţialele preparatorului, data preparării mediului şi data de expirare (7 zile după preparare).
7.6.5 Se elimină mediul suplimentat cu IL-2 după 7 zile depozitare la 4°C.
EXEMPLUL 18: COLORAREA CU ANTIGEN DE SUPRAFAŢĂ A TIL POST REP
1. OBIECTIV
Exemplul descrie procedura de colorare de suprafaţă a TIL post-REP prin citometrie în flux. Această procedură se poate aplica oricăror TIL descrise în cerere şi în exemple.
TERMENI PRINCIPALI ŞI DEFINIŢII
α: Alpha
β: Beta
µl: Microlitru
APC: Aloficocianina
Ax647: Alex Fluor 647
BD: Becton Dickinson Company
BSA: Albumină serică bovină
BSC: Cabinet de biosecuritate
BV421: Brilliant Violet 421
CD: Grup de diferenţiere
CST: Configurare şi urmărire citometru
Cy: Cianină
DPBS: Ser fiziologic tamponat cu fosfat Dulbecco
FACS: Sortare celulară activată fluorescent
FBS: Ser bovin fetal
FITC: Izotiocianat de fluoresceină
FMO: Fluorescence Minus One
G: Gram
H7: Analog Cy7
Ml: Mililitru
PE: Ficoeritrina
PerCP-Cy5.5: Proteine peridinin-clorofila
PPE: Echipament personal de protecţie
REP: Protocol de expansiune rapidă
SIT: Tub injecţie probe
TCR: Receptor T celular
g/v: Greutate la volum
Anticorpi şi coloranţi pentru citometrie în flux
TABEL 25: Colorant Aqua ThermoFisher Catalog # L34966.
Ţintă Format Clonă Furnizor Număr catalog TCRab (i.e., TCRα/β) PE/Cy7 IP26 BioLegend 306720 CD57 PerCP-Cy5.5 HNK-1 BioLegend 359622 CD28 PE CD28.2 BioLegend 302908 CD4 FITC OKT4 eBioscience 11-0048-42 CD27 APC-H7 M-T271 BD Biosciences 560222 CD56 APC N901 Beckman Coulter IM2474U CD8a PB RPA-T8 BioLegend 301033 CD45R A PE-Cy7 HI100 BD Biosciences 560675 CD8a PerCP/Cy5.5 RPA-T8 BioLegend 301032 CCR7 PE 150503 BD Biosciences 560765 CD3 APC/Cy7 HIT3a BioLegend 300318 CD38 APC HB-7 BioLegend 356606 HLA-DR PB L243 BioLegend 307633 CD69 PE-Cy7 FN50 BD Biosciences 557745 TIGIT PE MBSA43 eBioscience 12-9500-42 KLRG1 Ax647 SA231A2 BioLegend 367704 CD154 BV421 TRAP1 BD Biosciences 563886 CD137 PE/Cy7 4B4-1 BioLegend 309818 Lag3 PE 3DS223H eBioscience 12-2239-42 PD1 APC EH12.2H 7 BioLegend 329908 Tim-3 BV421 F38-2E2 BioLegend 345008
7. PROCEDURĂ
7.1 Preparare reactiv
7.1.1 Tampon spălare FACS
7.1.1.1 Se adaugă 2% (g/v) FBS inactivat termic în DPBS (se adaugă 10ml FBS în 490mL IX dPBS).
7.1.1.2 Se adaugă 0.1% (g/v) NaN3 (76.9ul în flacon de 500mL.)
7.1.1.3 Soluţia se depozitează la 40°C. Se aruncă după 30 zile.
7.1.2 Colorant Aqua
7.1.2.1 Se adaugă 50µl DMSO în fiola de colorant reactiv.
7.1.2.2 Se amestecă bine şi se confirmă vizual dizolvarea întregului colorant.
7.1.2.3 Colorantul neutilizat în procedură a fost împărţit în părţi alicote şi congelat la 20°C până la utilizarea următoare. Nu se congelează/decongelează o a doua oară.
7.1.3 Preparare amestec anticorpi.
7.1.3.1 Amestecurile se prepară în tuburi de polipropilenă cum ar fi un tub Eppendorf
7.1.3.2 Amestecurile se depozitează până la 6 luni.
Tabel 26: Grup de diferenţiere 1 (DF1):
Ţintă Format Clonă Furnizor Număr catalog Titru TCRab (i.e., TCRα/β) PE/Cy7 IP26 BioLegend 306720 3 CD57* PerCP-Cy5.5 HNK-1 BioLegend 359622 2 CD28* PE CD28.2 BioLegend 302908 2 CD4 FITC OKT4 eBioscience 11-0048-42 2 CD27* APC-H7 M-T271 BD Biosciences 560222 3 CD56 APC N901 Beckman Coulter IM2474U 3 CD8a PB RPA-T8 BioLegend 301033 2 soluţie tampon FACS 33
Table 27: Grup de diferenţiere 2 (DF2):
Ţintă Format Clonă Furnizor Număr catalog Titru CD45RA* PE-Cy7 HI100 BD Biosciences 560675 1 CCD3 PerCP/Cy5.5 SP34-2 BD Biosciences 552852 2 CCCR7* PE 150503 BD Biosciences 560765 5 CCD8 FITC HIT8 BioLegend 300906 2 CCD4 APC/Cy7 OKT4 BioLegend 317418 2 CCD38* APC HB-7 BioLegend 356606 1 HHLA-DR PB L243 BioLegend 307633 2 soluţie tampon FACS 35
Table 28: Grup de activare celule T 1 (Tact 1)
Ţintă Format Clonă Furnizor Număr catalog Titru CD137* PE/Cy7 4B4-1 BioLegend 309818 2 CD3 PerCP/Cy5.5 SP34-2 BD Biosciences 552852 2 Lag3* PE 3DS223H eBioscience 12-2239-42 5 CD8 FITC HIT8 BioLegend 300906 2 CD4 APCCy7 OKT4 BioLegend 317418 2 PD1* APC EH12.2H7 BioLegend 329908 2 Tim-3* BV421 F38-2E2 BioLegend 345008 2 soluţie tampon FACS 33
Table 29: Grup de activare celule T 2 (Tact 2)
Ţintă Format Clonă Furnizor Număr catalog Titru CD69* PE-Cy7 FN50 BD Biosciences 557745 3 CD3 PerCP/Cy5.5 SP34-2 BD Biosciences 552852 2 TIGIT* PE MBSA43 eBioscience 12-9500-42 3 CD8 FITC HIT8 BioLegend 300906 2 CD4 APCCy7 OKT4 BioLegend 317418 2 KLRG 1 * Ax647 SA231A2 BioLegend 367704 1 CD154* BV421 TRAP 1 BD Biosciences 563886 3 soluţie tampon FACS 34
7.2 Cerinţe test citometrie în flux
7.2.1 Calibrare citometru
7.2.1.1 Citometrul în flux a fost calibrat în ziua testului folosind sfere CST urmând instrucţiunile producătorului.
7.2.1.2 Operatorul se asigură că citometrul în flux trece calibrarea, verificările de performanţă şi referinţă fiind valide.
7.2.2 Compensare/Control FMO
7.2.2.1 S-au preparat probe de compensare monocrome folosind sfere de compensare BD şi kitul ArCTM Amine Reactive Compensation Bead.
7.2.2.2 Control FMO, probele conţinând celule au fost colorate cu un amestec de anticorpi minus următorul conjugat anticorp individual, CD27, CD28 şi CD57.
7.2.3 Standardizare MFI
7.2.3.1 Tensiunile citometrului s-au determinat zilnic cu un control şi valori de tensiune ţintă.
7.3 Colorare probe
7.3.1 Se etichetează tubul FACS cu proba ID-DF1, proba ID-DF2, proba ID-T1, proba ID-T2.
7.3.2 Se etichetează un set de control FMO cu CD27-APC-H7, CD28-PE, CD57-PerCPCy5.5, CD45RA-PECy7, CCR7-PE, CD38-APC, CD137-PE7, Lag3-PE, PD1 APC, Tim3-BV421, CD69-PE7, TIGIT-PE, KLRG1-Ax647 şi CD154-BV421.
7.3.3 Se adaugă 0.5 - 2 milioane celule în fiecare tub.
7.3.4 QS până la 3mL 1xPBS în fiecare tub.
7.3.5 Se centrifughează tuburile la 400 x g, acceleraţie mare şi frână, 5 minute.
7.3.6 În timp ce tuburile sunt centrifugate, se prepară colorantul Aqua de marcare a celulelor moarte.
7.3.7 Se îndepărtează o parte alicotă de Aqua din congelator şi se diluează 1/200 în PBS. Se păstrează la întuneric. Se adaugă 2uL colorant în 198uL DPBS.
7.3.8 Se descantează sau se aspiră supernatantul de la etapa 7.3.5.
7.3.9 Se adaugă 25uL soluţie Aqua de mai sus în probe şi control FMO.
7.3.10 Se incubează 15 minute la temperatura camerei (TC) în întuneric.
7.3.11 Notă: dacă celulele s-au depozitat iniţial într-un mediu fără proteină, trebuie adăugată o etapă de blocare, cum ar fi 5uL TruStain 10 minute la temperatura camerei.
7.3.12 Se adaugă 50uL de amestecuri de anticorpi în tuburi corespunzătoare.
7.3.13 Se agită suportul de tub pentru a se amesteca.
7.3.14 Se incubează 15 minute la RT în întuneric.
7.3.15 Se înregistrează ora de începere şi de încheiere. Se adaugă 3mL tampon spălare FACS.
7.3.16 Se centrifughează tuburile la 400 x g, acceleraţie mare şi frână, 5 minute.
7.3.17 La încheierea centrifugării, se decantează sau se aspiră supernatantul.
7.3.18 Se resuspendă celulele prin alunecarea tuburilor de-a lungul unui suport gol.
7.3.19 Se adaugă 100uL de 1% paraformaldehidă în fiecare tub.
7.3.20 Se depozitează la 40C în întuneric până la colectare în citometrul în flux. Notă: probele pot fi depozitate până la 72 ore.
7.4 Control compensare L/D Aqua.
7.4.1 Se etichetează tuburile FACS cu control compensare L/D Aqua.
7.4.2 Se adaugă o picătură de sfere Arc în tub.
7.4.3 Se adaugă 3µl L/D Aqua direct în sfere.
7.4.4 Se incubează tuburile la temperatura camerei în întuneric 10 - 30min.
7.4.5 Se înregistrează timpul de începe şi încheiere a incubării pe fişa de lucru
7.4.6 După incubare, se adaugă 3ml tampon spălare FACS în fiecare tub.
7.4.7 Se centrifughează tuburile la 400 x g, acceleraţie mare şi frână, 5 minute.
7.4.8 Se descantează sau se aspiră supernatantul.
7.4.9 Se resuspendă tuburile cu 500µl 1% soluţie PFA. Se adaugă 1 picătură de sfere negative. Se introduce la 40°C în întuneric până la colectare.
7.5 Colorare control de compensare.
7.5.1 Se etichetează tuburile FACS aşa cum se indică în fişa de lucru Fenotip TIL Post-REP.
7.5.2 Se adaugă anticorpii aşa cum se indică în fişa de lucru Fenotip TIL Post-REP.
7.5.3 După incubare, se adaugă 3mL tampon FACS în fiecare tub.
7.5.4 Se centrifughează tuburile la 500g, acceleraţie mare şi frână, 2 minute.
7.5.5 Se descantează sau se aspiră supernatantul.
7.5.6 Se resuspendă tuburile cu 500µl 1% PFA în PBS şi se depozitează la 2-80°C în întuneric.
7.6 Achiziţie date
7.6.1 Deschidere software FACSDiva şi autentificare.
7.6.2 În dialogul citometrului, se face click pe "Utilizare setări CST".
7.6.3 Se creează un experiment nou apăsând pe fila "Experiment" şi selectând şablonul "Fenotip extins".
7.6.4 Se face dublu click pe Valori ţintă experiment şi se ajustează tensiunile pentru a atinge valorile ţintă determinată de operator.
7.6.5 Se copiază setările instrumentului în experimentul nou.
7.6.6 Se creează un Specimen pentru fiecare probă individuală şi se numeşte corespunzător.
7.6.7 Se creează nume pentru probe conform etichetelor de pe tuburi.
7.6.8 Se agită uşor sau se loveşte cu degetul înaintea aşezării tubului în SIT.
7.6.9 Se obţin datele la ÎNREGISTRARE în panoul Achiziţie.
7.6.10 Probele sunt desfăşurate la o viteză mai mică de 7.500 evenimente pe secundă.
7.6.11 Se colectează între 50.000 şi 100.000 evenimente vii excluzând reziduurile.
EXEMPLUL 19: DEZVOLTAREA PROCESULUI DE VERIFICARE A PROCESULUI 2A
Experimentele din acest exemplu s-au efectuat pentru a analiza Procesul 2A de preparare TIL din tumori obţinute de la pacienţi de melanom şi un singur cancer mamar, inclusiv creşterea TIL din tumori într-o procedură pre-REP, urmată de REP modificat. S-a acordat atenţie specială formării unui produs TIL congelat şi comparării performanţei produsul TIL congelat faţă de procesul actual pentru TIL proaspete (Procesul 1C). Acest raport va demonstra că se observă profiluri similare în evaluarea atributelor de calitate critice pentru produse proaspete şi decongelate (număr celule, % viabilitate, % celule T CD3+ şi producţie gamma interferon (IFN-y) stimulată cu sfere), precum şi o procedură a fenotipului extins de restimulare (reREP) cu produs TIL proaspăt sau congelat. Datele prezentate pentru a susţine această concluzie includ proliferare, viabilitate, fenotip, eliberare IFN-y, potenţial, lungimea telomerilor şi activivtate metabolică. Rezultatele caracterizează Procesul 2A, un proces pre-REP/REP scurtat, urmat de crioconservarea TIL, precum şi compararea procesului 2A cu procesul 1C mai lung, descris în prezenta.
Descrierile donatorilor de tumori, datele şi locurile de procesare sunt indicate în Tabelul 1 de mai jos (indică faptul că REP a început folosind o linie TIL pre-REP congelată):
Tabel 30: Descrierea donatorilor de tumori, datele şi locurile de procesare.
ID tumoare Tip ţesut Sursă Ţesut M1061 Melanom MT group Primar - picior stânga lateral M1062 Melanom Moffitt N/A M1063 Melanom MT group Metastatic C - zona inghinală dreapta M1064 Melanom MT group Metastatic C - gleznă stânga M1065 Melanom Bio Options Metastatic - ganglion limfatic axilar EP11001 ER+PR+ MT group Primar - carcinom ductal invaziv mamar stânga M1056* Melanom Moffitt N/A M1058* Melanom MT group Metastatic - scalp dreapta stadiu IIB M1023* Melanom Atlantic Health Primar - axila dreaptă
3. INFORMAŢII DE BAZĂ
3.1 LN-144 este un produs imunoterapeutic pentru tratarea pacienţilor cu melanom metastatic. Produsul a fost alcătuit din limfocite T infiltrante în tumori (TIL) autologe obţinute de la un pacient individual în urma rezecţiei chirurgicale a unei tumore şi amplificate ex vivo prin cultura celulară a fragmentelor tumorale (pre-REP), urmată de expansiunea rapidă a TIL în prezenţa IL-2 în doză mare, anti-CD3 şi APC co-stimulatoare. În urma precondiţionării cu limfodepleţie non-mieloablativă, pacientul a primit o singură perfuzie de TIL proprii şi perfuzii intravenoase ulterioare de aldesleukină (IL-2) din 8 în 8 ore pentru un maxim de 6 doze. Studiile care implică metode alternative de expansiune TIL în condiţia moleculelor de tipar molecular asociat cu deteriorare (DAMP) în micromediul tumoral (TNE) au demonstrat de asemenea expansiune eficientă a celulelor T utile pentru terapie (Donia 2014; Sommerville, 2012). Procesul 1C folosit pentru producerea comercială a TIL presupune un program care poate dura -45-55 zile pentru a produce un produs TIL perfuzabil furnizat unui pacient cu imunodepleţie în 24 de ore. Imunodepleţia pacientului trebuie planificată exact cu recoltarea produsului TIL. Întârzierile de recoltare sau furnizare a produsului proaspăt pot afecta negativ un pacient cu imunodepleţie care aşteaptă perfuzia. Procesul 2A a îmbunătăţit Procesul 1C prin scăderea timpului de producţie şi a materialelor, datorită scurtării procedurilor pre-REP şi REP. În plus, Procesul 2A a crescut flexibilitatea timpului de transport al prodului.Diferenţele între Procesul 1C şi Procesul 2A în pre-REP, REP şi recoltarea procesului (vezi tabelul 2) includ: 3.1.1 Baloane mai mari cu capacitate mărită pentru fragmente tumorale folosite în procedura pre-REP. 3.1.2 Etape care utilizează sistem închis sau sunt adaptabile la un sistem închis. 3.1.3 Număr scăzut de zile în procedurile pre-REP şi REP. 3.1.4 O metodă directă REP, eliminând necesitatea fenotipării populaţiilor pre-REP înainte de selectarea populaţiilor specifice de TIL pre-REP pentru a continua cu REP. 3.1.5 O co-cultură cu un număr predeterminat de APC PBMC alogenice iradiate împreună cu anti-CD3 (clona OKT3) calculat pentru expansiune suficientă a TIL. 3.1.6 Un sistem de spălare celulară automat pentru recoltare. 3.1.7 O compoziţie finală pe bază de CS 10 conservată criogenic înainte de transport.
Tabel 31: Impactul procesului 2A asupra procesului 1C.
Etapă proces Proces 1C Proces 2A Impact ETAPA A: Obţinerea probei tumorale de la pacient • După intervenţia chirurgicală, pot fi congelate după recoltare şi înainte de Etapa B. • După intervenţia chirurgicală, pot fi congelate după recoltare şi înainte de Etapa B. • Identic. ETAPA B: Prima expansiune • Fragmentare fizică • Fragmentare fizică • Fragmente tumorale mărite per balon • 4 fragmente per 10 baloane G-REX -10 • 40 fragmente per 1 balon G-REX -100M Timp de cultură scurtat • durată 11-21 zile • durată 11 zile (interval 3 zile până la 14 zile) • Număr redus de etape • mediul de creştere cuprinde IL-2 • Adaptare la sistem închis • mediul de creştere cuprinde IL-2 ETAPA C: Tranziţia de la prima expansiune la a doua expansiune • TIL din Etapa B sunt congelate până la fenotipare pentru selecţie, apoi se decongelează pentru a continua la etapa D (∼ziua 30) • TIL din Etapa B trec direct la etapa D în ziua 11 a Etapei B • Proces pre-REP- REP scurtat • Etapa D necesită 25-200x106 TIL • Număr redus de etape • Selecţie de fenotipare eliminată • Etapa D necesită >40x106 TIL • Adaptare la sistem închis • 6 baloane G-REX -100M în ziua 0 a Etapei D • 1 balon G-REX -500M în ziua 11 a Etapei B • Număr redus de etape • Durată REP mai scurtă ETAPA D: A doua expansiune • 5x106 TIL şi 5x108 celule feeder de prezentare a antigenului per balon în ziua 0 a Etapei D • 25-200x106 TIL şi 5x109 celule feeder de prezentare a antigenului în ziua 11 a Etapei B • Transfer TIL în sistem închis între baloane • Împărţire în ≤ 6 baloane G-REX - 500M în ziua 16 • Schimb de mediu în sistem închis • Împărţire în 18-36 baloane în ziua 7 a Etapei D • durată 11 zile pentru Etapa D • durată 14 zile pemtru Etapa D • Mediul de creştere cuprinde IL-2, OKT-3 şi celule de prezentare a antigenului • Mediul de creştere cuprinde IL-2, OKT-3 şi celule de prezentare a antigenului ETAPA E: Recoltare TIL • TIL recoltate prin centrifugare • TIL recoltate prin sistem de spălare celulară automat LOVO • Număr redus de etape • Spălare celulară automată • Sistem închis • Pierdere redusă de produs în timpul spălării ETAPA F: Compoziţie finală/transfer în punga de perfuzie Timp total estimat • Produs proaspăt în Hypothermosol • Produs crioconservatîn PlasmaLyte-A + 1% HSA şi CS10 depozitat în LN2 • Flexibilitate de transport • Programare flexibilă pacient • O singură pungă de perfuzie • Multiple părţi alicote • Testare mai rapidă • Stabilitate limitată în timpul transportului • Stabilitate mai îndelungată la transport • 48-55 zile de la etapa A până la Etapa E • 22 zile de la etapa A la Etapa E • Întoarcere mai rapidă la pacient • Tranzit redus în camera cu atmosferă controlată • Cost scăzut al bunurilor
4. ABREVIERI
µg microgram
µl microlitru
µm micrometru
APC Celule de prezentare a antigenului
CD Grup de diferenţiere
CM Memorie centrală
CM1, CM2, Mediu de cultură 1, 2
CO2 Dioxid de carbon
CS10 Mediu de crioconservare CryoStor® CS10 (BioLife Solutions)
Ct Ciclu prag PCR
DAMPs Molecule de tipar molecular asociat cu deteriorare
dCt Diferenţă între valoarea Ct de referinţă şi valoarea Ct testată
ddCt Diferenţă între dCt şi 10ng valoare Ct standard
ECAR Rată de acidificare extracelulară (măsurare glicoliză)
EM Memorie efectoare
ER+/PR+ Receptor estrogen+/Receptor progesteron +
GMP Bune practici de producţie
HBSS Soluţie salină echilibrată Hanks
HAS Albumină serică umană
IFN-γ Interferon gamma
IL Interleukina
IU Unităţi internaţionale
LN2 Azot lichid
Ml mililitru
Mm milimetru
ND nedetrminat
Ng Nanogram
°C grade Celsius
OCR Rată consum oxigen (măsurare fosforilare exidativă)
OKT3 Denumirea clonei anticorpului monoclonal anti-CD3
PBMC Celule mononucleare din sângele periferic
PD Dezvoltarea procesului
REP Protocol de expansiune rapidă
Rh Uman recombinant
SOP Procedură operaţională standard
T/S Raport număr copii repetiţie telomerică la număr copii genice individuale
TIL Limfocit infiltrant tumoral
VDJ Segmente variabile, diversitate şi juxtapuse ale receptorului T celular
Vα, Vβ Segmentele regiunii variabile ale receptorilor T celulari maturi în limfocitul infiltrant tumoral predominant
µg microgram
µl microlitru
µm micrometru
APC Celule de prezentare a antigenului
CD Grup de diferenţiere
CM Memorie centrală
CM1, CM2, Mediu de cultură 1, 2
CO2 Dioxid de carbon
CS10 Mediu de crioconservare CryoStor® CS10 (BioLife Solutions)
Ct Ciclu prag PCR
DAMPs Molecule de tipar molecular asociat cu deteriorare
dCt Diferenţă între valoarea Ct de referinţă şi valoarea Ct testată
ddCt Diferenţă între dCt şi 10ng valoarea Ct standard
ECAR Rată de acidificare extracelulară (măsurare glicoliză)
EM Memorie efectoare
ER+/PR+ Receptor estrogen+/Receptor progesteron +
GMP Bune practici de producţie
HBSS Soluţie salină echilibrată Hanks
HAS Albumină serică umană
IFN-γ Interferon gamma
IL Interleukina
IU Unităţi internaţionale
LN2 Azot lichid
Ml mililitru
Mm milimetru
ND nedeterminat
Ng Nanogram
°C grade Celsius
OCR Rată consum oxigen (măsurare fosforilare exidativă)
OKT3 Denumirea clonei anticorpului monoclonal anti-CD3
PBMC Celule mononucleare din sângele periferic
PD Dezvoltarea procesului
REP Protocol de expansiune rapidă
Rh Uman recombinant
SOP Procedură operaţională standard
T/S Raport număr copii repetiţie telomerică la număr copii genice individuale
TIL Limfocit infiltrant tumoral
VDJ Segmente variabile, diversitate şi juxtapuse ale receptorului T celular
Vα, Vβ Segmentele regiunii variabile ale receptorilor T celulari maturi în limfocitul infiltrant tumoral predominant
5. MODEL EXPERIMENTAL
5.1 Procesul 2A
5.1.1 Pre-REP: la primire, tumoarea se transferă într-un Cabinet de biosecuritate (clasa II, tip A2). Folosind tehnica sterilă, tumoarea se îndepărtează din recipientul de transport şi se spală în HBSS conţinând 50µg/mL gentamicină. Tehnicianul fragmentează tumoarea în 40 fragmente x 3X3X3mm care se transferă într-un balon G-REX - 100M conţinând mediu CM1 preîncălzit suplimentat cu 6000 IU/mL rhIL-2. Balonul se introduce într-un incubator de cultură tisulară umidificat la 37°C, 5% CO2 11 zile. Dacă tumoarea generează mai mult de 40 de fragmente, se pot folosi mai multe G-REX -100M. Celulele sunt recoltate şi preparate pentru REP.
5.1.2 REP: În ziua 11, se prepară un balon G-REX -500M conţinând 5L de CM2 suplimentat cu 3000 IU/mL rhIL-2, 30ng/mL anti-CD3 (Clona OKT3) şi 5 x 109 celule feeder PBMC alogenice iradiate. TIL recoltate din balonul G-REX -100M pre-REP după reducerea volumului s-au numărat şi s-au însămânţat în balonul G-REX -500M la o densitate cuprinsă între 5 × 106 şi 200 × 106 celule. Balonul s-a introdus într-un incubator de cultură tisulară umidificat la 37°C, 5% CO2 timp de cinci zile. În ziua 16, s-a redus volumul balonului G-REX -500M, s-au numărat TIL şi s-a determinat viabilitatea. În acest punct, TIL s-au amplificat în baloane G-REX -500M multiple (până la maxim şase baloane), fiecare cu o densitate de însămânţare de 1 × 109 TIL/balon. Toate baloanele s-au introdus în incubatoare de cultură tisulară umidificate la 37°C, 5% CO2 alte şase zile. În ziua 22, ziua recoltării, s-a redus volumul fiecărui balon cu 90%, celulele au fost colectate şi filtrate printr-un filtru sanguin de 170 µm, după care s-au colectat într-o pungă de 3 L Origin EV3000 sau echivalent în vederea spălării automate LOVO.
5.1.3 Recoltare şi compoziţie finală: TIL se spală folosind sistemul de procesare celulară automat LOVO care înlocuieşte 99.99% din mediul de cultură celulară cu un tampon de spălare constând din PlasmaLyte-A suplimentat cu 1% HSA. LOVO funcţionează folosind tehnologia membranară de filtrare prin centrifugare care recuperează peste 92% din TIL, eliminând practic componentele de cultură tisulară reziduale, inclusiv ser, factori de creştere şi citokine, precum şi alte reziduuri şi particule. După încheierea spălării, se efectuează o numărare a celulelor pentru a determina amplificarea TIL şi viabilitatea acestora la recoltare. Se adaugă CS10 în TIL spălate la un raport 1:1 volum:volum pentru a obţine compoziţia finală a procesului 2A. Produsul preparat final se împarte în părţi alicote în pungi de criodepozitare, se etanşează şi se introduce în casete de aluminiu prerăcite. Pungile de criodepozitare conţinând TIL se congelează folosind un congelator cu rată controlată de îngheţ CryoMed (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) conform SOP LAB-018 Rev 000 Funcţionarea congelatorului cu rată controlată de îngheţ.
5.2 Probe TIL: s-au colectat TIL în patru condiţii pentru caracterizare comparativă.
5.2.1 TIL recoltate proaspete (direct din PlasmaLyte-A cu 1% tampon spălare HSA), TIL decongelate (direct din punga de produs final decongelat)
5.2.2 TIL reREP proaspete cu fenotip extins (TIL recoltate proaspete cultivate 7-14 zile cu IL-2, feeder PBMC şi anti-CD3 clona OKT3)
5.2.3 TIL decongelate cu fenotip extins (TIL decongelate cultivate 7-14 zile cu IL-2, feeder PBMC şi anti-CD3 clona OKT3)
5.3 Prezentarea testării (vezi Figura 2)
5.3.1 Testarea Pre-REP include evaluarea cantităţii de IL-2 şi analiza metaboliţilor din cultura celulară cum ar fi glucoză, acid lactic, L-glutamină şi amoniac în cursul pre-REP.
5.3.1.1 Cuantificare IL-2: mediul a fost îndepărtat periodic din cultura pre-REP şi testat prin ELISA cu privire la cuantificarea IL-2. Trimitere la instrucţiunile producătorului R&D Systems Human IL-2 Quantikine ELISA Kit.
5.3.1.2 Analiza metaboliţilor din cultura celulară: mediul a fost îndepărtat periodic din cultura pre-REP şi testat cu privire la următorii metaboliţi: glucoză, acid lactic, L-glutamină şi amoniac. Trimitere la manualul Roche Cedex Bioanalyzer pentru instrucţiuni.
5.3.2 Testarea REP a inclus teste extinse cum ar fi numărarea celulelor, % viabilitate, analiza citometrică în flux a moleculelor de suprafaţă celulară, potenţial (producţie IFN-γ), test de liză redirecţionată bioluminescentă, producţia de granzimă B, metabolism celular şi măsurarea lungimii telomerilor.
5.3.2.1 Numărarea celulelor şi viabilitate: probele TIL s-au numărat şi viabilitatea s-a
determinat folosind un aparat automat Cellometer K2 (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA)
conform SOP LAB-003 Rev 000 Cellometer K2 Image Cytometer Automatic Cell Counter.
5.3.2.2 Analiza citometrică în flux a biomarkerilor de suprafaţă celulară: probele TIL au fost împărţite în părţi alicote pentru analiza citometrică în flux a markerilor de suprafaţă celulară folosind procedura indicată în WRK LAB-041 Rev 000 Colorarea antigenică de suprafaţă a TIL post REP
5.3.2.3 Test de potenţial (producţia IFN-γ): potenţialul citotoxic s-a măsurat de asemenea determinând nivelurile de citokine IFN-γ în mediul TIL stimulate cu anticorpi la CD3, CD28 şi CD137/4-1BB. Nivelurile IFN-γ în mediul din aceste TIL stimulate s-au determinat folosind WRK LAB-016 Rev 000 Stimularea TIL pentru măsurarea eliberării IFN-γ
5.3.2.4 Test de liză redirecţionată bioluminescentă: potenţialul citotoxic al TIL de a liza celulele ţintă s-a evaluat folosind un test de co-cultură a TIL cu linia celulară bioluminescentă, P815 (clona G6), conform SOP din WRK LAB-040 testul de liză redirecţionată bioluminescentă (test de potenţial) pentru TIL
5.3.2.5 Producţia granzimei B: Granzima B măsoară de asemenea capacitatea TIL de a distruge celulele ţintă. Supernatanţii de mediu restimulaţi aşa cum se descrie în 5.2.5.3 s-au evaluat cu privire la nivelurile de Granzima B folosind kitul Human Granzyme B DuoSet ELISA (R & D Systems, Minneapolis, MN) urmând instrucţiunile producătorului.
5.3.2.6 Metabolismul celular (respirator): celulele au fost tratate cu inhibitori ai respiraţiei mitocondriale şi glicolizei pentru a determina un profil metabolic pentru TIL constând din următoarele măsurători: fosforilare oxidativă de referinţă (măsurată prin OCR), capacitatea respiratorie de rezervă, activitatea glicolitică de referinţă (măsurată prin ECAR) şi rezerva glicolitică. Profilurile metabolice s-au realizat folosind procedura din WRK LAB-029 testul de stres mitocondrial/glicolitic combinat Seahorse.
5.3.2.7 Măsurarea lungimii telomerilor: s-au folosit diferite metode pentru a măsura lungimea telomerilor în ADN genomic şi preparate citologice. Analiza fragmentelor de restricţie telomerice (TRF) este etalonul de aur al măsurării lungimii telomerilor (de Lange et al., 1990). Totuşi, limitarea majoră a TRF este necesitatea unei cantităţi mari de ADN (1.5 ^g). În prezenta invenţie pot fi folosite două tehnici larg utilizate pentru măsurarea lungimii telomerilor, şi anume hibridizarea fluorescentă in situ (FISH; Agilent Technologies, Santa Clara, CA) şi PCR cantitativă.
5.3.3 S-au prelevat probe suplimentare pentru teste următoare şi se pot analiza în viitor, după necesitate:
5.3.3.1 Analiza detaliată a citokinelor
5.3.3.2 Secvenţiere TCR
6. REZULTATE OBŢINUTE
S-au efectuat în total 9 experimente folosind TIL derivate din tumori descrise în secţiunea 2.3 a modelului experimental şi condiţiile de recoltare din secţiunea 5.1. TIL recoltate folosind Procesul 2A au fost supuse testării indicate în secţiunea 5.3.2 în scopul înţelegerii capacităţii lor de amplificare, a viabilităţii, fenotipului, potenţialului citotoxic şi profilului metabolic. Toate măsurătorile s-au efectuat pentru TIL recoltate proaspete şi TIL îngheţate decongelate (Procesul 2A).
6.1 Numărarea celulelor şi viabilitate
6.1.1 S-au efectuat numărări la sfârşitul pre-REP, în ziua 5 sau 6 REP (ziua expansiunii) şi la sfârşitul REP, înainte de spălarea LOVO şi după spălarea LOVO. Numărul celulelor s-a folosit apoi pentru a determina expansiunea TIL în timpul REP şi recuperarea TIL după spălarea LOVO. După decongelare, celulele au fost numărate din nou pentru a determina recuperarea post-decongelare (pe baza concentraţiei la care s-au congelat TIL) şi viabilitatea post-decongelare înaintea trecerii la alte teste analitice. Tabelul 3 prezintă toate aceste rezultate pentru cele nouă efectuări ale Procesului 2A.
Tabel 32: Număr celule, % viabilitate şi expansiunea TIL din Procesul 2A.
M1061T M1062T M1063T M1064T M1065T EP11001T M1056T M1058T M1023T Inocul pre-REP 3.3 x 107 1x108 7.5 x 107 1.8 x 108 4.1 x 106 5.4 x 106 7 x 107 4.7 x 107 4.8 x 107 Numărare ziua 5/6 1.3 x 109 4 x 109 3 x 109 3.6 x 109 6.6 x 108 2.8 x 109 4.0 x 109 3.7 x 109 2.2 x 109 Nr. de ori expansiune din ziua 0 până în ziua 11 898 590 470 130 1900 522 771 1400 850 Recoltare 2.8 x 1010 5.6 x 1010 3.5 x 1010 2.3 x 1010 7.8 x 109 2.63 x 1010 5 x 1010 6.7 x 1010 4.1 x 1010 Recuperare LOVO (%) 68 100 100 92 95 100 90 99 Pungi de criodepozitare 3 x 30ml 2 x 100ml 2 x 100ml 2 x 50ml 3 x 100ml 2 x 65ml 2 x 100ml 2 x 100ml 2 x 100ml Recuperare post-decongelare (%) 103 84 90 88 101 82 82 86 78 Viabilitate post-decongelare (%) 84.75 84.36 77.15 83.48 79.98 74.85 80.28 85.03 89.21
6.1.2 Procesul 2A SOP defineşte numărul iniţial al TIL pentru REP ca un interval de 5 200 x 106 TIL. Intervalul a nouă probe TIL folosite pentru începerea REP din Procesul 2A a fost de la 4.1 x 106 (M1065T) - 1.8 x 108 (M1064T), cu un număr TIL iniţial mediu de 6.58 x 107. În mod interesant, REP cu plăci cu cel mai mic număr de TIL a amplificat în cel mai mare grad la recoltarea REP (interval de expansiune pentru toate cele 9 REP: 130-1900 de ori; expansiune medie, 840 de ori). Numărul mediu al TIL recoltate la sfârşitul acestor nouă REP din Procesul 2A a fost 4.49 x 1010 (interval 7.8 x 109 - 6.7 x 1010). 6.1.3 Pentru statistica comparativă a procesului 1C, vezi Chemistry, Manufacturing and Controls (CMC) Section of Investigational New Drug (IND) Application for LN144/LN-145. 6.1.4 Procesul 1C utilizează manipularea manuală şi centrifugare pentru spălarea produsului TIL. Acestea consumă mult timp, dar, mai important, pot duce la pierdere de până la 25% produs între recoltare şi compoziţia finală. Sistemul de spălare celulară automat LOVO asigură o modalitate de minimizare a pierderii celulare, precum şi o spălare în sistem închis care scade riscul contaminării produsului în timpul etapelor de spălare. Recuperarea produsului după etapa de spălare LOVO a protocolului a prezentat o medie de 93.8 ± 10.4% recuperare de produs TIL care intră în etapa de spălare. Această statistică include produs TIL pentru M1062T, care a avut o recuperare LOVO de 68%, unde o eroare de operator în operarea LOVO a dus la necesitatea centrifugării probei şi apoi a reînceperii procedurii LOVO (vezi secţiunea 7, Abateri şi discrepanţe). Aceasta reprezintă o îmbunătăţire foarte favorabilă a etapei de spălare în Procesul 1C în ziua recoltării REP. 6.1.5 Recuperarea TIL după decongelare este de asemenea o problemă majoră pentru un produs TIL congelat. Recuperarea produsului s-a determinat măsurând numărul de celule recuperate din pungă după decongelare comparativ cu numărul de celule introduse în fiecare pungă de congelare înainte de crioconservare. Intervalul de recuperare din decongelare a fost 78 - 103%, cu o recuperare medie de 88.2 ± 8.6%. 6.1.6 Deşi există o diferenţă semnificativă în viabilitatea probelor înainte sau după decongelare, în medie, există o pierdere de doar 2% a viabilitatăţii la decongelare. Viabilitatea TIL care intră în crioconservare a fost 84.3 ± 4.7% şi aceleaşi TIL, după decongelare, au avut o viabilitate de 82.1 ± 4.4% (p = 0.0742, test t Student împerecheat, non-parametric). Criteriile de eliberare pentru produsul TIL clinic proaspăt din Procesul 1C necesită 70% viabilitate. Indiferent de o mică pierdere de viabilitate la decongelare, toate cele 9 runde ale procesului 2A au îndeplinit acest criteriu de eliberare după decongelarea produsului criogenic. Tabelul 4 şi Figura 3 indică viabilitatea TIL care intră în crioconservare (proaspete + CS10) şi viabilitatea TIL la decongelare.
Tabel 33: Compararea viabilităţii produsului proaspăt şi decongelat.
M1061T M1062 T M1063T M1064T M1065T EP11001T M1056T M1058T M1023T Proaspăt + CS10 88.05 84.45 82.05 86.75 76.35 77.9 84.8 87.5 90.5 Decongelat 84.75 84.36 77.15 83.48 79.98 74.85 80.28 85.03 89.21
6.2 Expansiunea Re-REP a TIL. Pe lângă examinarea capacităţii produsului proaspăt de a se amplifica în REP, s-a evaluat capacitatea TIL atât proaspete, cât şi decongelate de a se amplifica la restimulare cu APC PBMC feeder alogenice iradiate proaspete şi anti-CD3 proaspăt. După 7 zile, produsele TIL restimulate s-au analizat cu privire la capacitatea de a se amplifica din condiţiile de cultură iniţiale. Figura 4 şi Tabelul 5 indică expansiunea medie a celulelor TIL re-REP după 7 zile de creştere în cultură. Analiza datelor folosind un test t Student împerecheat arată că această capacitate a TIL de a se amplifica în re-REP nu este diferită semnificativ între iniţierea REP cu TIL proaspete sau TIL decongelate (p = 0.81).
Tabel 34: Compararea amplificării TIL proaspete şi decongelate în cultură re-REP
M1061T M1062T M1063T M1064T M1065T EP11001T M1056T M1058T M1023T Proaspete 139.67 264 227 60.12 24.67 268.83 176 316.33 202.33 Decongelate 177.33 110.33 220.67 177.6 220.2 302.5 114.77 190.67 73.82
6.3 Metaboliţi de cultură celulară. Una dintre premisele majore ale Lion 2A a fost că un timp tehnologic mai scurt şi transferuri mai puţine ar duce la economii de cost şi limitează variabilitatea. Posibilele consecinţe adverse ar fi creşterea metaboliţilor indezirabili şi scăderi ale surselor de nutrienţi. Aşa cum se indică în Figura 5, valorile sanguine normale ale electroliţilor (sodiu şi potasiu), nutrienţilor (glutamina şi glucoza) şi metaboliţilor (acid lactic şi amoniac) formează un interval de luat în considerare la evaluarea rezultatelor obţinute din pre-REP de 11 zile. Aşa cum se indică în Figura 6, s-au evaluat trei TIL (M1061T, M1062T şi M1064T) succesiv. În această condiţie, potasiul şi sodiul s-au menţinut la valori normale, glucoza a fost la >1.0g/L şi glutamina > 0.3 mmol/L, mult peste valorile sanguine normale inferioare. După cum era de aşteptat, lactatul a crescut la 0.8g/L, aproximativ 5X nivelul normal din sânge şi amoniacul la 3mmol/L, aşa cum era de aşteptat din celulele amplificate rapid şi de asemenea în mare măsură mai mari decât nivelul normal din sânge.
6.4 Cuantificarea IL-2.
6.4.1 Principalulul activator al proliferării TIL în pre-REP, pe lângă glucoza suplimentară, glutamina şi oxigenarea suficientă, este prevederea unor niveluri ridicate de rhIL-2. După adăugare în mediu conţinând ser, nivelurile IL-2 s-au măsurat la 2-3.5x103 IU/ml, scăzând până la circa 1.0x103 IU/ml în cele 11 zile de cultură. Acest nivel a fost mult peste cele 30-100 IU/ml necesare pentru a susţine proliferarea celulelor T. Evaluarea concentraţiilor IL-2 folosind diferite surse de IL-2 (Prometheus, Akron, Cellgenix) se efectuează în prezent în experimente separate (QP-17-010 : Calificarea IL-2 de la Cellgenix, Akron şi Prometheus) la Lion Biotechnologies, Tampa.
6.5 Producţia IFN-γ
6.5.1 După stimulare 24h a TIL cu sfere Dynabeads anti-CD3, CD28 şi 4-1BB magnetice, aşa cum se descrie în secţiunile 5.3.5.3, supernatantul din culturi s-a colectat şi s-a analizat cu privire la IFN-γ folosind kituri ELISA. Toate TIL restimulate au produs mai mult IFN-γ decât omologii lor nestimulaţi, indicând că stimularea TIL a dus la activarea acestora. Figura 8 arată capacitatea celor patru compoziţii TIL diferite (TIL proaspete, decongelate, re-REP proaspete şi re-REP decongelate) testate de a elibera IFN-γ în mediul înconjurător la restimulare.
Tabelele 6 şi 7 indică valorile medii ale secreţiei IFN-γ în cele 9 runde ale Procesului 2A. Secreţia IFN-γ în mediul înconjurător la restimulare nu diferă între TIL proaspete şi TIL crioconservate, decongelate. Tabelul 6 arată că produsul proaspăt a avut o medie de 4143 ± 2285 pg IPN-γ/106 TIL, în timp ce produsul decongelat a avut 3910 ± 1487 pg IPN-γ/106 TIL (p = 0.55 folosind test t Student împerecheat). Dacă se normalizează la produsul TIL total (Tabel 7), în medie, TIL stimulate proaspete au produs 86 ± 61 grame IFN-γ, iar TIL stimulate decongelate au produs 68 ± 40 grame IFN-γ (p = 0.13). Aceste constatări arată că atât TIL proaspete, cât şi decongelate produc IFN-γ şi nu există nici o diferenţă a capacităţii TIL proaspete sau decongelate de a produce IFN-γ la stimulare cu anti-CD3/anti-CD28/anti-4-1BB.
Tabel 35: Secreţia IFN-γ în TIL proaspete şi decongelate (exprimată ca pg/106celule/24h)
M1061T M1062T M1063T M1064T M1065T EP11001 T M1056T M1058T M1023T Proaspete 4570 3921 5589 619 1363 4263 6065 2983 7918 Decongelate 3158 3543 5478 1563 2127 5059 4216 4033 6010 Re-REP proaspete 3638 1732 971 2676 2753 1461 2374 770 3512 Re-REP decongelate 2970 2060 1273 1074 1744 2522 5042 4038 923
Tabel 36: Secreţia IFN-γ în TIL proaspete şi decongelate. Toate valorile sunt în 1012 (exprimate ca grame/106 celule/24h)
M1061T M1062T M1063T M1064T M1065T EP11001 T M1056T M1058T M1023T Proaspete 67.1 78.4 99.6 8.4 4.8 66.1 157.0 109.0 187.0 Decongelate 47.7 59.7 87.9 18.7 7.5 64.4 88.9 127.0 111.0
6.6 Producţia granzimee B
6.6.1 TIL au fost stimulate cu sfere Dynabeads anti-CD3, CD28 şi 4-1BB magnetice 24h aşa cum se descrie în 5.2.5.3 şi supernatantul din culturi s-a colectat după 24h şi s-a analizat cu privire la nivelurile granzima B prin ELISA. Toate TIL restimulate au produs mai multă granzimă B decât omologii lor nestimulaţi, indicând că stimularea TIL a dus la activarea acestora. Figura 9 arată capacitatea TIL proaspete, TIL re-REP proaspete şi TIL re-REP decongelate de a elibera granzima B în mediul înconjurător la restimulare cu amestecul de citokine.
Toate produsele au prezentat producţie de granzimă B între 9190 pg/106 celule viabile şi 262000pg/106 celule viabile (Tabel 8). Tabelul 6 arată că produsul proaspăt a avut o medie de 60644 + 42959, iar re-REP proaspete şi decongelate au produs 93600 + 67558, respectiv 103878 + 84515. Comparaţia între re-REP proaspete şi re-REP decongelate a arătat că nu există nici o diferenţă a capacităţii TIL obţinute din oricare condiţii (p = 0.7). Din cauza lipsei măsurătorii granzimei B în produsul decongelat, nu s-a efectuat analiză statistică folosind TIL proaspete.
Tabel 37: Secreţia de granzimă B în TIL proaspete, TIL reREP proaspete şi TIL reREP decongelate (exprimată ca pg/106celule/24h)
M1061 T M1062T M1063 T M1064 T M1065 T EP11001 T M1056 T M1058 T M1023 T Proaspete 10600 108000 49100 28400 24300 17900 120000 12900 79100 ReREP proaspete 216000 37700 42400 91800 192000 22200 97300 73800 69200 ReREP decongelate 262000 113000 35100 65600 48700 9190 147000 201000 53300
6.7 Analiza citometrică în flux a biomarkerilor de suprafaţă celulară
Profilarea fenotipică TIL: patru grupuri de anticorpi au fost standardizate la LION pentru caracterizarea largă a profilului funcţional al celulelor T. Aceste grupuri s-au folosit pentru a evalua imunofenotiparea TIL proaspete, TIL decongelate, TIL re-REP proaspete şi TIL re-REP decongelate. Toate datele folosite pentru reprezentarea grafică în acestă secţiune sunt indicate şi în format de tabel (Tabele 14-24) în secţiunea anexă 10.
6.8 Test de liză redirecţionată bioluminescentă
6.8.1 Pentru a determina capacitatea posibilă a TIL din Procesul 2A de a distruge celulele tumorale ţintă, am dezvoltat un test care presupune co-cultura TIL cu o linie celulară ţintă surogat bioluminescentă P815, aşa cum se descrie în secţiunea 5.3.2.4. O co-cultură de 4h a diferitelor compoziţii TIL cu P815 în prezenţa stimulării anti-CD3 indică o măsură a potenţialului citotoxic al celulelor TIL exprimat ca LU50, unităţi litice care pot fi definite ca numărul de TIL necesar pentru a distruge 50% din celulele ţintă. Această măsură este exprimată apoi ca LU50/106 TIL. Figura 32 de mai jos indică potenţialul citotoxic al TIL din produsul proaspăt şi din cele două condiţii TIL re-REP, re-REP proaspete şi re-REP decongelate. 6.8.2 Compararea re-REP proaspete cu re-REP decongelate arată că nu există diferenţă semnificativă în capacitatea oricăror TIL de a distruge o celulă ţintă (p = 0.3126). Aceste date susţin concluzia că nu există nici o diferenţă între produsul proaspăt şi decongelat cu privire la potenţialul citotoxic al produsului TIL. Nu s-a efectuat comparare între produsele proaspete fiindcă potenţialul citotoxic nu s-a măsurat imediat după decongelarea TIL. Tabelul 9 indică unităţile litice ale TIL necesare pentru a distruge 50% din linia celulară ţintă P815.
Tabel 38: Unităţi litice produse de TIL împotriva liniei celulare ţintă P815
Proaspete reREP proaspete reREP decongelate M1061T 21.7 42.3 342 M1062T 5.9 17.0 20.9 M1063T 14.2 161 12.5 M10641 22.2 8.7 4.4 M10651 42.6 411 128 8 EP11001 T 1.8 4.3 147 M1056T 25.0 16.6 18.2 M10513T 76.9 13.8 16.6 M1023T 30.8 25.6 30.4 avg ± sd 26.8 ± 22.5 20.6 ± 13.3 31.1 ± 37.6
6.9 Profilul metabolismului celular al TIL
6.9.1 Pentru a evalua sănătatea metabolică a TIL post-REP, am utilizat instrumentele de analiză Seahorse (XFp şi XFe96) de la Agilent Technologies (Santa Clara, CA) urmând protocolul indicat în secţiunea 5.3.2.6. Pe scurt, prin tratarea celulelor cu inhibitori care ţintesc anumite aspecte ale fosforilării oxidative sau glicolizei, celulele sunt stresate astfel încât să permită determinarea SRC şi a rezervei glicolitice. În plus, se pot determina nivelurile de bază pentru fosforilarea oxidativă (OCR de bază) şi glicoliză (ECAR de bază). În sfârşit, fiindcă inhibitorii fosforilării oxidative şi glicolizei se combină în acelaşi test, se poate distinge o posibilă rezervă ascunsă de SRC, vizibilă numai când celulele sunt tratate cu inhibitorul competitiv al glicolizei, 2-deoxiglucoza (2-DG), (etichetat SRC2DG), rezultând o creştere a SRC care altfel ar rămâne ascunsă. Această capacitate respiratorie suplimentară a fost etichetată SRC"ascunsă". Tabelul 9 indică profilurile metabolice ale TIL recoltate proaspete, TIL re-REP proaspete şi TIL re-REP decongelate obţinute din testul de stres metabolic efectuat pe celule.
6.9.2 Figurile 55A - F indică datele din Tabelul 38 în formă grafică. Produsul REP recoltat proaspăt prezintă unele diferenţe statistice faţă de re-REP proaspete şi re-REP decongelate. Acest lucru nu este surprinzător fiindcă produsul re-REP a fost restimulat cu APC PBMC iradiate proaspete şi anticorp anti-CD3 proaspăt imediat după REP sau la decongelare. Totuşi, în toate cazurile, nu există diferenţă semnificativă între produsele proaspete şi decongelate când sunt ambele restimulate într-o procedură re-REP (vezi valorile p din tabelul 9). Aceasta arată că procesul de crioconservare nu dăunează produsului TIL. Cel mai remarcabil, pentru fosforilarea oxidativă, produsele re-REP au SRC mai mare decât produsele REP recoltate proaspete omoloage. Pentru glicoliză, TIL re-REP au niveluri de bază statistic semnificativ mai mari de glicoliză şi, invers, niveluri statistic mai mici ale rezervei glicolitice decât produsul REP proaspăt. Se menţionează că acest lucru ar putea indica faptul că TIL re-REP sunt mai activate decât TIL recoltate proaspete, TIL sănătoase, activate, prezentând niveluri mai mari de activitate glicolitică (Buck et al., JEM 212:1345-1360; 2015).
Tabel 39: Profilul metabolic al TIL din procesul 2A
OCR de bază, pmot/min M1061 M1062 M1063 Moff2 Moff3 Moff4 EP11001 M1064 M1065 medie sd v. p proas pete v. p r REP proaspete PLLA 50.33 33.95 74.89 36.80 38.48 39.89 63.02 55.89 49.16 14.56 re-REP proaspete 38.92 38.48 54.35 25.98 18.68 38.61 37.33 41.04 36.67 10.57 0.03 re-REP decongelate 39.25 43.28 60.05 30.68 57.90 59.08 27.85 52.58 32.82 44.83 12.90 0.48 0.11 SRC evident, pmol/min PLLA 24.74 10.45 101.18 47.32 77.00 35.07 31.39 3.02 41.27 33.22 re-REP proaspete 51.72 36.46 48.24 28.34 37.69 21.02 9.93 99.71 41.64 27.17 0.29 re-REP decongelate 47.38 40.40 121.86 26.04 37.32 86.47 58.45 89.59 56.45 62.66 30.75 0.16 0.12
SRC20G, pmol/min PLLA 14.01 5.72 35.98 29.97 74.62 24.42 31.39 20.70 29.60 20.67 re-REP proaspete 81.80 78.82 52.73 38.69 92.37 42.35 -12.81 137.15 63.89 44.45 0.08 re-REP decongelate 76.97 77.72 177.48 48.27 56.57 69.05 74.14 130.76 85.89 88.54 40.59 0.00 0.25 SRC ascuns, pmol/min PLLA 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 17.68 2.21 6.25 re-REP proaspete 30.08 42.36 4.50 10.35 54.68 21.33 0.00 2.63 20.74 20.13 0.02 re-REP decongelate 29.59 37.32 55.62 22.23 19.25 0.00 15.68 41.16 29.44 27.81 16.10 0.01 0.52 PLLA 53.44 27.55 136.33 48.72 89.80 62.29 108.38 72.07 74.82 35.20 re-REP proaspete 96.48 96.63 171.47 102.87 145.19 153.97 35.60 147.02 118.65 44.19 0.10 re-REP decongelate 143.35 173.93 193.39 149.19 169.21 73.17 98.64 96.37 90.55 131.98 43.15 0.01 0.38 Rezerva glicolitică, mpH/min PLLA 32.11 26.18 52.00 19.09 38.01 39.03 43.14 76.43 40.75 17.61 re-REP proaspete 24.06 8.75 18.17 -8.28 -5.89 10.31 35.34 20.80 12.91 14.85 0.003 re-REP decongelat 15.50 -18.94 13.56 -6.78 11.45 54.84 -21.37 -12.66 -5.47 3.35 23.75 0.01 0.47
6.9.3 O comparare directă între produsele proaspete şi congelate folosind procedura re-REP a permis să se determine că produsul TIL atât proaspăt, cât şi congelat, în condiţii identice de stimulare, obţin profiluri metabolice statistic indistincte. TIL re-REP proaspete şi re-REP decongelate au niveluri similare de respiraţie bazală (Figura 60A, 36.7 ± 10.6 şi 44.8 ± 12.9 pmol/min; p = 0.11), precum şi SRC (evident) similar (Figura 60B, 41.6 ± 27.2 şi 62.7 ± 30.8; p = 0.12). La tratarea acestor celule re-REP cu 2-DG, inhibitorul competitiv cu glucoza, care duce la o inhibare a glicolizei, vedem că ambele TIL re-REP proaspete şi decongelate prezintă o capacitate respiratorie de rezervă suplimentară, "ascunsă" (SRC2DG; SRC ascuns) care este în mare parte mică sau absentă în proba de TIL recoltate proaspete (Figura 60C); numai o probă a avut niveluri mari de SRC2DG (Figura 60C) în TIL recoltate proaspete, şi invers, numai una din şapte probe testate au prezentat o lipsă de SRC ascuns la re-REP. SRC ascuns (Figura 60D) pentru re-REP proaspete a reprezentat o medie de 20.7 ± 20.1, iar SRC ascuns (Figura 60D) pentru re-REP decongelate a fost de 27.8 ± 16.1; p = 0.52).
6.9.4 Indicaţia metabolică cea mai remarcabilă a TIL cu fenotip ascuns (re-REP) sunt nivelurile constant mari ale glicolizei de bază pentru probele cu fenotip ascuns (re-REP). Glicoliza de bază (Figura 60E) este constant mare în probele re-REP, cu o medie de 118.7 ± 44.2 mpH/min în re-REP proaspete şi 132.0 ± 43.2 mpH/min în re-REP decongelate. Aceste probe nu diferă statistic între ele (p = 0.38). Totuşi, după cum s-a menţionat mai sus, proba recoltată proaspătă nu prezintă astfel de niveluri mari de glicoliză de bază. Comparativ cu TIL re-REP proaspete, această diferenţă este substanţială, dar nesemnificativă (p = 0.10); totuşi, comparativ cu probele re-REP decongelate, diferenţa este semnificativă (p 0.01). Aceste celule re-REP se bazează aparent în mare măsură pe glicoliză pentru cerinţelele lor energetice, fiindcă au rezervă glicolitică mică rămasă când sunt stresate în testele metabolice Seahorse (Figura 60F): TIL re-REP proaspete au o medie de 12.9 ± 14.9 mpH/min; TIL re-REP decongelate, 3.35 ± 23.8 mpH/min). Aceste re-REP nu sunt diferite între ele (p = 0.47), dar ambele sunt statistic diferite de rezerva glicolitică din probele TIL recoltate proaspete, cu medie de 40.8 ± 17.6 mpH/min (p = 0.003 şi 0.01 comparativ cu re-REP proaspete şi TIL re-REP decongelate). Ar trebui efectuate alte studii pentru a determina cauza diferenţelor observate cu privire la glicoliză între aceste probe TIL recoltate proaspete şi TIL.
6.10 Măsurarea lungimii telomerilor
6.10.1 Măsurarea lungimii telomerilor TIL post REP prin Flow Fish şi qPCR.
6.10.1.1 Flow-FISH s-a efectuat folosind Dako/Agilent Pathology Solutions (Telomere PNA Kit/FITC pentru citometrie în flux) şi s-au urmat instrucţiunile producătorului pentru a măsura lungimea medie a repetiţiei telomerice. S-a folosit linia celulară leucemică T 1301 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)) ca standard de referinţă intern în fiecare test. TIL individuale au fost numărate şi amestecate cu celule 1301 la un raport celular 1:1. 2 X 106 TIL s-au amestecat cu 2 x 106 celule 1301. Hibridizarea in situ s-a efectuat în soluţie de hibridizare (70% formamidă, 1% BSA, 20mM Tris, pH 7.0) în duplicat şi în prezenţa şi absenţa unei sonde Telomere PNA conjugate cu FITC (FITC-00-CCCTAA-CCC-TAA-CCC-TAA) complementară cu secvenţa repetiţiei telomerice la o concentraţie finală de 60nM. După adăugarea sondei Telomere PNA, celulele s-au incubat 10 minute la 82°C într-un bloc termic. Celulele au fost aşezate în întuneric la temperatura camerei peste noapte. Dimineaţa următoare, s-a îndepărtat surplusul de sondă prin spălare de 2 ori câte 10 minute într-un bloc termic la 40°C cu soluţie de spălare. După spălări, s-a adăugat DAPI (Invitrogen, Carlsbad, CA) la o concentraţie finală de 75ng/ml. S-a folosit colorarea ADN cu DAPI pentru activarea celulelor în populaţia G0/G1. Analiza probelor s-a efectuat folosind un citometru în flux Yeti (Propel-Labs, Fort Collins, CO). Fluorescenţa telomerilor din proba testată a fost exprimată ca un procentaj al fluorescenţei (fl) celulelor 1301 conform următoarei formule: lungimea relativă a telomerilor = [(FITC fl medie celule testate cu sondă- FITC fl medie celule testate fără sondă) X indice ADN al celulelor 1301 X 100] / [(FITC fl medie celule 1301 fără sondă-FITC fl medie celule 1301 fără sondă) x indice ADN al celulelor testate.
6.10.1.2 qPCR: s-a folosit qPCR în timp real pentru a măsura lungimea relativă a telomerilor. Pe scurt, s-a determinat raportul dintre numărul copiilor repetiţiilor telomerice şi numărul copiilor genice individuale (T/S) folosind un ciclor termic BioRad PCR (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) într-un format cu 96 de godeuri. S-au folosit zece nanograme de ADN genomic pentru reacţia PCR a telomerilor (Tel) sau hemoglobinei (hgb) şi primerii utilizaţi au fost: primer Tel-1b (CGG TTT GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT), primer Tel-2b (GGC TTG CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT), primer hgb1 (GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC) şi primer hgb2 (CACCAACTTCATCCACGTTCACC). Toate probele s-au analizat prin reacţii telomerice şi hemoglobinice şi analiza s-a efectuat în triplicat pe aceeaşi placă. Pe lângă probele testate, fiecare placă cu 96 de godeuri a conţinut o curbă standard în cinci puncte de la 0.08 ng la 250 ng folosind ADN genomic izolat din celule 1301. Raportul T/S (-dCt) pentru fiecare probă s-a calculat scăzând valoarea ciclului prag hemoglobinic median (Ct) din valoarea Ct telomeric median. Raportul T/S relativ (-ddCt) s-a determinat scăzând raportul T/S al punctului curbei standard 10 ng din raportul T/S al fiecărei probe necunoscute.
6.10.1.3 Lungimea telomerilor, rezultate şi discuţie: telomerii sunt secvenţe cap (secvenţe nucleotidice repetitive) la capătul cromozomilor liniari care au un rol esenţial în facilitarea replicării cromozomiale complete. Măsurarea telomerilor este un instrument din ce în ce mai proeminent în studiul afecţiunilor cum ar fi boli degenerative, cancer şi îmbătrânire. Studiile anterioare de la NIH (J Immunol. 2005, Nov 15;175(10):7046-52; Clin Cancer Res. 2011, Jul 1; 17(13): 4550- 4557) au arătat că lungimea mai mare a telomerilor TIL este asociată cu răspuns clinic. Invers, grupul Radvanyi nu a găsit nici o diferenţă semnificativă a lungimii telomerilor TIL între subiecţii cu răspuns şi fără răspuns (Clin Cancer Res; 18(24); 6758-70). Nu există până acum dovezi că lungimea telomerilor este asociată cu durata culturii celulelor T in vitro. Este posibil ca TIL post-REP cultivate prin Procesul 2A (cultură de 22 de zile) să aibă lungime mai mare a telomerilor comparativ cu TIL cultivate prin procesul 1C (cultură de 25-36 zile).
7. DISCREPANŢE ŞI ABATERI
7.1 Abateri
7.1.1 M1061T: celulele REP s-au împărţit în ziua 6 în 4 baloane G-Rex500M.
7.1.2 M1062T: celulele REP s-au împărţit în ziua 6 în 4 baloane G-Rex500M. Din cauza unei erori a operatorului în sistemul de filtrare LOVO, a vut loc o oprire de urgenţă în timpul procedurii, fiind nevoie de o colectare manuală a TIL din kitul consumabil. TIL au fost filtrate cu succes în timpul unei a doua runde LOVO.
7.1.3 M1063T: fără abateri M1064T: fără abateri
7.1.4 M1065T: celulele pre-REP au fost sub specificaţie pentru numărul de celule în ziua 11 (<5 x 106 celule), dar au continuat în REP. În ziua 6 REP, celulele au fost numărate şi reintroduse în G-Rex500M şi s-au introdus 4.5L de mediu proaspăt. TIL nu s-au amplificat în această zi din cauza numărului insuficient (<1 x 109 celule în ziua 6 REP).
7.1.5 EP11001T: fără abateri
7.1.6 M1056T: celulele pre-REP s-au cultivat la LION într-un balon G-Rex 100 până la 21 de zile. Fragmentele tumorale au fost filtrate în ziua 11 pre-REP şi TIL au fost congelate în ziua recoltării în 100% CS10 la 30 x 106 celule per fiolă de 1.5 ml. TIL congelate au fost decongelate la Moffitt PD în CM1 suplimentat cu 6000 IU/mL rhIL-2 şi lăsate 3 zile înaintea
zilei 0 a REP. În ziua 6 REP, TIL au fost amplificate în 4 baloane cu recoltare în ziua 11 REP.
7.1.7 M1058T: celulele pre-REP s-au cultivat la LION într-un balon G-Rex 100 până la 21 de zile. Fragmentele tumorale au fost filtrate în ziua 11 pre-REP şi TIL au fost congelate în ziua recoltării în 100% CS10 la 30 x 106 celule per fiolă de 1.5 ml. TIL congelate au fost decongelate la Moffitt PD în CM1 suplimentat cu 6000 IU/mL rhIL-2 şi lăsate 3 zile înaintea zilei 0 a REP. În ziua 6 REP, celulele s-au împărţit în 4 baloane cu recoltare în ziua 11 REP.
7.1.8 M1023T: celulele pre-REP s-au cultivat la LION în baloane G-Rex10 până la 21 de zile. Fragmentele tumorale au fost filtrate în ziua 11 pre-REP şi TIL au fost congelate în ziua recoltării în 100% CS10 la 30 x 106 celule per fiolă de 1.5 ml. TIL congelate au fost decongelate la Moffitt PD în CM1 suplimentat cu 6000 IU/mL rhIL-2 şi lăsate 3 zile înaintea zilei 0 a REP. În ziua 6 REP, celulele au fost amplificate în 4 baloane cu recoltare în ziua 11 REP.
7.2 Abateri de testare
7.2.1 Analiza detaliată a citokinelor şi secvenţierea TCR nu s-au efectuat
8. CONCLUZII ŞI RECOMANDĂRI
8.1 Dezvoltarea unui proces mai fiabil. Provocarea Lion a fost de a transforma Procesul 1C Lion anterior, care a avut un timp de procesare mai îndelungat, într-un Proces 2A Lion posibil mai comercial, care utilizează rafinări ducând la timp de procesare mai scurt şi o compoziţie finală crioconservată a produsului TIL. În acest scop, s-au efectuat nouă runde de dezvoltare a procesului pentru a confirma că procesul nou şi cel vechi demonstrează randamente celulare comparabile şi potenţial şi fenotip TIL comparabile. S-a remarcat complexitatea mult scăzută a întregului proces, ducând la o reducere de 50% a duratei totale a proceselor pre-REP şi REP, având în continuare ca rezultat randamente TIL comparabile (7.8 x 109 - 67 x 109 celule) faţă de Procesul 1C Lion aplicat în prezent la producătorul nostru contractual. Acesta a fost actualizat recent pentru prezentarea ASCO din iunie 2017 (medie: 41.04 x 109 celule cu un interval de 1.2-96 x 109 celule). În plus, Lion a dezvoltat cu succes un produs TIL crioconservat care a demonstrat o recuperare post-decongelare de 78-103% cu > 70% viabilitate TIL, în conformitate cu criteriile de eliberare curente ale Procesului 1C (vezi tabelul 2).
8.2 Rolul analizei fenotipice extinse (Re-REP). Capacitatea de proliferare în răspuns la stimulare mitogenică (la fel ca în re-REP experimentale prezentate în acest raport) este un atribut calitativ critic al TIL. Experimentele prezentate aici arată că 8/9 TIL decongelate s-au amplificat >100 ori într-o săptămână comparativ cu 7/9 TIL proaspete omoloage, susţinând comparabilitatea TIL decongelate cu TIL proaspete (tabel 2). Alte două atribute calitative critice ale TIL sunt capacitatea de a elibera IFN-γ şi/sau Granzima B după stimulare cu citokine (CD3/CD28/4-1BB). Stimularea cu citokine a produsului atât proaspăt, cât şi decongelat a dus la eliberare IFN-γ care depăşeşte 2ng/106 celule/24 ore în 7/9 produse proaspete şi toate produsele decongelate (Figura 35) (vezi secţiunea 6.2 a acestui raport). Eliberarea Granzimei B (Figura 36) s-a observat în toate cele 9 runde ale procesului. Nivelurile CD4 şi CD8 (Figura 39 şi Figura 40) au demonstrat constanţă internă remarcabilă între TIL proaspete şi decongelate. În plus, analiza capacităţii TIL de a distruge o linie celulară ţintă tumorală surogat (P815, Figura 59) a arătat că TIL proaspete şi decongelate au prezentat potenţial citotoxic similar.
8.3 Un test al stresului metabolic al TIL indică bioenergetică solidă. O analiză a profilurilor metabolice ale TIL proaspete şi decongelate stimulate în re-REP a demonstrat că TIL proaspete şi decongelate au răspuns ambele în mod similar la testarea de stres metabolic şi nu au prezentat diferenţe substanţiale într-un grup de caracteristici metabolice (tabel 39). Astfel, TIL crioconservate din Procesul 2A pot fi considerate comparabile cu produsul proaspăt din Procesul 1C pe baza celor patru atribute calitative de omologie, potenţial, număr de celule şi viabilitate prezentate în acest raport. Testele care compară celulele proaspete şi decongelate sunt destul de comparabile în fiecare analiză indicată în acest raport.
8.4 Criterii de aprobare: eterogeneitatea intrinsecă a produselor TIL cu terapie personalizată pentru fiecare pacient reflectă: (1) moleculele unice de restricţie a complexului major de histocompatibilitate (produşii genici cei mai polimorfi din biologia umană); (2) traiectoria evolutivă unică a tumorilor individuale care apar în micromediul tumoral cu instabilitate genomică şi mutaţiile de activare şi pasagere individuale unice; şi (3) eterogeneitatea conferită de variaţia alelică, diversitatea regiunilor N şi reordonările VDJ în segmentele Vα şi Vβ care definesc receptorii T celulari folosiţi pentru recunoaşterea neoepitopilor împart antigene tumorale testiculare şi produşi codificaţi viral. Evaluarea variaţiei suplimentare care apare în urma modificărilor procesului este astfel o activitate dificilă şi necesită evaluarea a cât mai multor parametri posibil pentru a asigura o 'comparabilitate' a unui material intrinsec eterogen. Aceasta s-a realizat prin examinarea exactă a mai multor criterii de aprobare pentru fezabilitate şi comparabilitate, aşa cum se detaliază în tabelul 40 de mai jos.
Tabel 40: Criterii de aprobare pentru fezabilitate şi comparabilitate
Punct prelevare Parametru Metoda de testare Criterii de aprobare pentru fezabilitate Criterii de aprobare pentru comparabilitate Celule viabile totale Aparat numărare automat cu AOPI ≥1.5x109 celule viabile Nici o semnificaţie statistică între ReREP proaspete şi congelate (valoare-p<0.05) % Viabilitate Aparat numărare automat cu AOPI ≥70% viabile Nici o semnificaţie statistică între ReREP proaspete şi congelate (valoare-p<0.05) Puritate Citometrie în flux ≥90% celule T Nici o semnificaţie statistică între ReREP proaspete şi congelate (valoare-p<0.05) Secvenţiere TCR N/A N/A Potenţial IFNI( ELISA ≥2x fond şi ≥400pg/1 x106 celule viabile/24h Nici o semnificaţie statistică între ReREP proaspete şi congelate (valoare-p<0.05) Granzima B ELISA ≥2x fond N/A Test de liză redirecţionată bioluminescentă N/A N/A Respiraţie Test de stres Seahorse N/A N/A
Pe baza criteriilor de fiabilitate indicate în Tabelul 11, TIL se vor evalua cu privire la îndeplinirea cerinţelor. Toate criteriile individuale au fost îndeplinite pentru fiecare experiment şi fiecare linie TIL (n=9). S-a folosit testul t Student pentru analiza statistică. S-a folosit testul t Student non-parametric pentru a calcula valoarea-p pentru % de viabilitate, măsurătorile viabilităţii nefiind o distribuţie Gauss. Vezi tabelul 41 de mai jos.
Tabel 41: Îndeplinirea criteriilor de fezabilitate.
Linie TIL Număr celule % Viabilitate Puritate (citometrie în flux) Potenţial (IFNy ELISA) pg/1x x106 celule/24h Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate M1061T 6.48x109 6.66x109 88.05 84.93 95.3 91.5 4570 3158 M1062T 6.76x109 5.70x109 84.45 83.73 99.7 98.9 3921 3543 M1063T 14.9x109 13.5x109 82.05 77.15 98.7 99.6 5589 5478 M1064T 8.06x109 7.08x109 86.75 83.36 84.5 89.8 619 1563 M1065T 3.06x109 3.10x109 76.35 80.90 96.8 91.4 1363 2127 EP11001T 14.9x109 12.2x109 77.9 74.85 90.4 94.3 4263 5059 M1056T 13.1x109 10.7x109 84.8 80.20 94.2 94.1 6065 4216 M1058T 23.4x109 20.1x109 87.5 85.07 99 96.2 2983 4033 M1023T 18.4x109 144x109 90.5 89.52 96.5 98.8 7918 6010 Valoare P 0.1132 0.0742 0.9855 0.5821 Semnificativ diferite Nu Nu Nu Nu
Pe baza criteriilor de aprobare indicate în Tabelul 40, TIL re-REP proaspete şi congelate s-au evaluat cu privire la îndeplinirea cerinţelor. (Viabilitate neraportată fiindcă durata re-REP a fost 7 zile şi PBMC iradiate reziduale nu au putut fi distinse de TIL.) Numărul din paranteze indică criteriile care nu au fost îndeplinite. Pe baza criteriilor de puritate măsurate folosind expresia CD3+, 6/9 TIL re-REP proaspete au îndeplinit criteriile stringente >90% (M1061, M1065 şi EP11001 nu le-au îndeplinit) şi 8/9 produse decongelate au trecut criteriile de aprobare chiar şi după Re-REP. numărul mic al TIL CD3+ în EP11001T re-REP proaspete poate fi atribuit scăderii extreme a receptorului T celular. Măsurarea TIL CD3+ cu privire la puritate nu s-a determinat pentru TIL re-REP decongelate M1023T. Pentru această compoziţie TIL, puritatea a fost estimată folosind colorarea TCRap şi este indicată de un asterisc (*). S-a folsoit testul t Student pentru analiza statistică. Vezi tabelul 42 de mai jos.
Tabel 42: Îndeplinirea criteriilor de comparabilitate.
Linie TIL Număr celule Puritate (citometrie în flux) Potenţial (IFNy ELISA) pg/1x106celule/24h Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate M1061T 1.40x106 1.77x106 (86.1) 99.3 3638 2970 M1062T 2.64x106 1.10x106 99.3 97.1 1732 2060 M1063T 2.27x106 2.21x106 99.2 97.4 971 1273 M1064T 1.76x106 1.15x106 83.8 37.8 2676 1074 M1065T 3.16x106 1.91x106 (78.1) (75.8) 2753 1744 EP11001T 2.02x106 0.738x106 (18.2) 85.4 1461 2522 M1056T 0.601x106 1.78x106 98.1 96.7 2374 5042 M1058T 0.740x106 2.20x106 98.4 99.2 770 4038 M1023T 2.69x106 3.03x106 97 39.9* 3512 923 Valoare P 0.6815 0.3369 0.7680 Semnificativ diferite Nu Nu Nu
Bibliografie
Goff SL, Dudley ME, Citrin DE, Somerville RP, Wunderlich JR, Danforth DN, Zlott DA, Yang JC, Sherry RM, Kammula US, Klebanoff CA, Hughes MS, Restifo NP, Langhan MM, Shelton TE, Lu L, Kwong ML, Ilyas S, Klemen ND, Payabyab EC, Morton KE, Toomey MA, Steinberg SM, White DE, Rosenberg SA. Randomized, Prospective Evaluation Comparing Intensity of Lymphodepletion Before Adoptive Transfer of Tumor-Infiltrating Lymphocytes for Patients With Metastatic Melanoma. J Clin Oncol. 2016 Jul 10;34(20):2389-97. doi: 10.1200/JCO.2016.66.7220. Epub 2016 May 23. PubMed PMID: 27217459; PubMed Central PMCID: PMC4981979.
Hinrichs CS, Rosenberg SA. Exploiting the curative potential of adoptive T-cell therapy for cancer. Immunol Rev. 2014 Jan;257(1):56-71. doi:10.1111/imr.12132. Review. PubMed PMID: 24329789; PubMed Central PMCID: PMC3920180.
Jin J, Sabatino M, Somerville R, Wilson JR, Dudley ME, Stroncek DF, Rosenberg SA. Simplified method of the growth of human tumor infiltrating lymphocytes in gas-permeable flasks to numbers needed for patient treatment. J Immunother. 2012 Apr;35(3):283-92. d10.1097/CJI.0b013e31824e801f. PubMed PMID: 22421946; PubMed Central PMCID: PMC3315105.
Somerville RP, Devillier L, Parkhurst MR, Rosenberg SA, Dudley ME. Clinical scale rapid expansion of lymphocytes for adoptive cell transfer therapy in the WAVE® bioreactor. J Transl Med. 2012 Apr 4;10:69.
Donia M, Larsen SM, Met O, Svane IM. Simplified protocol for clinical-grade tumor-infiltrating lymphocyte manufacturing with use of the Wave bioreactor. Cytotherapy. 2014 Aug;16(8):1117-20. doi: 10.1016/j.jcyt.2014.02.004; PubMed PMID: 24831841.
Henning AL, Levitt DE, Vingren JL, McFarlin BK. Measurement of T-Cell Telomere Length Using Amplified-Signal FISH Staining and Flow Cytometry. Curr Protoc Cytom. 2017 Jan 5;79:7.47.1-7.47.10. doi: 10.1002/cpcy.11. PubMed PMID 28055115
Kelesidis T, Schmid I. Assessment of Telomere Length, Phenotype, and DNA Content. Curr Protoc Cytom. 2017 Jan 5;79:7.26.1-7.26.23. doi: 10.1002/cpcy.12. PubMed PMID: 28055113.
Gardner M, Bann D, Wiley L, Cooper R, Hardy R, Nitsch D, Martin-Ruiz C, Shiels P, Sayer AA,
Barbieri M, Bekaert S, Bischoff C, Brooks-Wilson A, Chen W, Cooper C, Christensen K, De Meyer T, Deary I, Der G, Diez Roux A, Fitzpatrick A, Hajat A, Halaschek-Wiener J, Harris S, Hunt SC, Jagger C, Jeon HS, Kaplan R, Kimura M, Lansdorp P, Li C, Maeda T, Mangino M, Nawrot TS, Nilsson P, Nordfjall K, Paolisso G, Ren F, Riabowol K, Robertson T, Roos G, Staessen JA, Spector T, Tang N, Unryn B, van der Harst P, Woo J, Xing C, Yadegarfar ME, Park JY, Young N, Kuh D, von Zglinicki T, Ben-Shlomo Y; Halcyon study team.. Gender and telomere length: systematic review and meta-analysis. Exp Gerontol. 2014 Mar;51:15-27. doi:10.1016/j.exger.2013.12.004. Epub 2013 Dec 21. Review. PubMed PMID: 24365661;PubMed Central PMCID: PMC4523138.
Carbonari M, Tedesco T, Fiorilli M. Correlation between terminal restriction fragments and flow-FISH measures in samples over wide range telomere lengths. Cell Prolif. 2014 Feb;47(1):20-7. doi: 10.1111/cpr.12086. PubMed PMID: 24450811.
Rufer N, Dragowska W, Thornbury G, Roosnek E, Lansdorp PM. Telomere length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry. Nat Biotechnol. 1998 Aug;16(8):743-7. PubMed PMID: 9702772.
Li Y, Liu S, Hernandez J, Vence L, Hwu P, Radvanyi L. MART-1-specific melanoma tumor-infiltrating lymphocytes maintaining CD28 expression have improved survival and expansion capability following antigenic restimulation in vitro. J Immunol. 2010 Jan 1;184(1):452-65. doi: 10.4049/jimmunol.0901101. Epub 2009 Nov 30. PubMed PMID: 19949105.
Rosenberg SA, Dudley ME. Adoptive cell therapy for the treatment of patients with metastatic melanoma. Curr Opin Immunol. 2009 Apr;21(2):233-40. doi:10.1016/j.coi.2009.03.002. Epub 2009 Mar 21. Review. PubMed PMID: 19304471; PubMed Central PMCID: PMC3459355.
Shen X, Zhou J, Hathcock KS, Robbins P, Powell DJ Jr, Rosenberg SA, Hodes RJ. Persistence of tumor infiltrating lymphocytes in adoptive immunotherapy correlates with telomere length. J Immunother. 2007 Jan;30(1):123-9. PubMed PMID:17198091; PubMed Central PMCID: PMC2151201.
Zhou J, Shen X, Huang J, Hodes RJ, Rosenberg SA, Robbins PF. Telomere length of transferred lymphocytes correlates with in vivo persistence and tumor regression in melanoma patients receiving cell transfer therapy. J Immunol. 2005 Nov 15;175(10):7046-52. PubMed PMID: 16272366; PubMed Central PMCID: PMC1351312.
Maciejowski J, de Lange T. Telomeres in cancer: tumour suppression and genome instability. Nat Rev Mol Cell Biol. 2017 Mar;18(3): 175-186. doi:10.1038/nrm.2016.171. Epub 2017 Jan 18. Review. PubMed PMID: 28096526.
Erdel F, Kratz K, Willcox S, Griffith JD, Greene EC, de Lange T. Telomere Recognition and Assembly Mechanism of Mammalian Shelterin. Cell Rep. 2017 Jan 3;18(1):41-53. doi: 10.1016/j.celrep.2016.12.005. PubMed PMID: 28052260; PubMed Central PMCID:
PMC5225662.
Cardenas ME, Bianchi A, de Lange T. A Xenopus egg factor with DNA-binding properties characteristic of terminus-specific telomeric proteins. Genes Dev.1993 May;7(5):883-94. PubMed PMID: 7684008.
de Lange T. Activation of telomerase in a human tumor. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Apr 12;91(8):2882-5. Review. PubMed PMID: 8159672; PubMed Central PMCID: PMC43476.
de Lange T, Shiue L, Myers RM, Cox DR, Naylor SL, Killery AM, Varmus HE. Structure and variability of human chromosome ends. Mol Cell Biol. 1990 Feb;10(2):518-27. PubMed PMID: 2300052; PubMed Central PMCID: PMC360828.
9. Alte tabele
Tabel 43 - Figura 39: celule CD4+
ID tumoare M1061 M1062 M1063 M1064 M1065 EP11001 M1056 M1058 M1023 Proaspete 4.85 34 10.5 41.7 64.9 64.7 4.15 12.3 8.38 Decongelate 5.68 33 11.3 49.5 61.7 62.6 3.46 17.9 7.6 ReREP proaspete 8.1 23.5 19.2 39/ 31.9 16.3 6.46 12.9 16.7 ReREP decongelate 11 33 15.3 49.3 39.3 26.7 9.51 17.2 19.1
Tabel 44 - Figura 40: celule CD8+
ID tumoare M1061 M1062 M1063 M1064 M1065 EP11001 M1056 M1058 M1023 Proaspete 45.6 54.7 85.8 38.2 28.6 22.3 93.2 84 88.8 Decongelate 50.8 55.7 76.7 37 22.8 19 92.9 76.6 84.3 ReREP proaspete 63 48.3 72.4 37.9 47.8 5.87 90.3 74.5 74.4 ReREP decongelate 66.3 46.7 47 21.6 19.1 9.23 82.8 63.7 64.3
Tabel 45 - Figura 41: celule CD4+CD154+ şi Figura 105: celule CD8+CD154+
Celulă T Markeri M1061 M1062 M1063 M1064 Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate CD4 CD154+ 78.6 nd nd nd 93.3 62.1 94 76.2 CD8 CD154+ 37.3 nd nd nd 85.8 19.9 89.3 61.1 Celulă T Markeri M1061 M1062 M1063 M1064 Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate CD4 CD154+ 88.9 84 56 82.1 68.2 93.6 97 90.3 CD8 CD154+ 35.6 49 12.5 19 59.1 77.88 0.025 90.1
Celulă T Markeri M1065 EP11001 M1056 M1058 M1203 Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate CD4 CD154+ 91 87.2 79.1 83.1 89.3 92 90.1 92.6 77.9 66.9 CD8 CD154+ 17 20.3 40 36.9 23 27.6 40.5 52.1 17.9 13.7 Celulă T Markeri M1065 EP11001 M1056 M1058 M1203 Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate CD4 CD154+ 0 91.6 52.1 87.1 77 86.4 92.7 85.1 90.7 81.3 CD8 CD154+ 0.00609 61.8 45.3 74.8 47.3 81.7 73.6 78.3 24.2 27.1
Tabel 46 - Figura 43: celule CD4+CD69+ şi Figura 17: celule CD8+CD69+
Celulă T Markeri M1061 M1062 M1063 M1064 Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate CD4 CD69+ 33.9 nd nd nd 82.2 68.8 51.3 84.8 CD8 CD69+ 22.4 nd nd nd 83 78.3 67.8 78.6 Celulă T Markeri M1061 M1062 M1063 M1064 Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate CD4 CD69+ 58.7 69.6 67.6 77.6 77.6 86.7 85.5 78.5 CD8 CD69+ 80.9 80 62.7 73.2 87.6 87.9 92.2 88.3
Celulă T Markeri M1065 EP11001 M1056 M1058 M 1203 Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate CD4 CD69+ 82.7 84.4 78.7 58.3 83.9 84.9 89.7 644.6 33.8 38.7 CD8 CD69+ 78.9 72.3 69.5 54.5 80.3 86 68 77.8 41.3 48.8 Celulă T Markeri M1065 EP11001 M1056 M1058 M 1203 Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate CD4 CD69+ 90.2 93.2 74.7 39.1 96.1 93.8 91.1 93.7 35.3 80.1 CD8 CD69+ 91.3 90.5 87.6 52.9 95.4 94.2 93.1 93.6 71.1 88.1
Tabel 47 - Figura 45: celule CD4+CD137+ şi Figura 19 celule CD8+CD137+
Celulă T Markeri M1061 M1062 M1063 M1064 Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate CD4 CD137+ 19.8 nd nd nd 65.4 30.4 nd 1.31 CD8 CD137+ 19.8 nd nd nd 65.4 30.4 nd 1.31 Celulă T Markeri M1061 M1062 M1063 M1064 Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate CD4 CD137+ 15.4 30.4 73 78.1 62.6 53.2 51.6 64.7 CD8 CD137+ 28.8 43.1 39.3 35.3 84.4 85.7 71.1 81
Celulă T Markeri M1065 EP11001 M1056 M1058 M11203 Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate CD4 CD137+ 524 7.26 7.78 5.4 4.28 3.65 6.89 4.6 4.28 9.67 CD8 CD137+ 3.23 7.26 7.78 5.4 4.28 3.65 6.89 4.6 4.28 9.67 Celulă T Markeri M1065 EP11001 M1056 M1058 M 11203 Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate CD4 CD137+ 31.1 24.6 65.1 47.8 221 18.6 61.6 56.9 49.8 50.8 CD8 CD137+ 50.9 33.8 57.3 54.6 77.3 78.8 76.9 87 58 50.3
Tabel 48 - Figura 47: celule CD4+CM şi Figura 21 celule CD8+CM
Celulă T Markeri M1061 M1062 M1063 M1064 Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate CD4 CM 1.08 n/d 0.59 0.29 10.4 2.08 14.4 0.13 CD8 CM 0.37 n/d 0.9 0.17 3.2 0.66 73.2 0.13 Celulă T Markeri M1061 M1062 M1063 M1064 Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate CD4 CM 2.32 7.71 13.8 12.6 13.4 22.3 15.9 18.6 CD8 CM 1.85 9.38 6.48 14.2 15.7 25.7 24.2 25.8
Celulă T Markeri M1065 EP11001 M1056 M1058 M1203 Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate CD4 CM 0.42 0.53 0.48 1.17 1.83 1.5 1.36 1.8 2.45 1.79 CD8 CM 0.21 0.67 2.65 1.79 0.33 0.72 0.91 0.67 1.99 2.22 Celulă T Markeri M1065 EP11001 M1056 M1058 M 1203 Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate CD4 CM 7.03 2.28 18.9 3.73 49.6 55.6 20.1 12.6 22.1 12.7 CD8 CM 5.05 1.6 11.4 3.37 25.8 26.4 21.6 19.8 11.1 7.59
Tabel 49 - Figura 49: celule CD4+EM şi Figura 23 celule CD8+EM
Celulă T Markeri M1061 M1062 M1063 M1064 Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate CD4 EM 90 n/d 98.3 98.9 83.9 97.2 84.1 99.8 CD8 EM 89.1 n/d 80.6 87.9 92.4 97.8 20.8 98.8 Celulă T Markeri M1061 M1062 M1063 M1064 Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate CD4 EM 95.6 84.4 84.5 83.4 84.3 73.7 80.6 80.4 CD8 EM 97.2 87.9 90.8 82.3 82.5 72.2 74.5 73
Celulă T Markeri M1065 EP11001 M1056 M1058 M1203 Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate CD4 EM 99.4 99.4 96.7 97.4 97.1 97.8 97.4 97.6 9.62 95.3 CD8 EM 98.3 98.6 91.8 95.5 98.8 98.9 98.8 99.2 93.9 95.2 Celulă T Markeri M1065 EP11001 M1056 M1058 M1203 Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate CD4 EM 91.7 97 74.3 90.7 36.2 25.5 73.9 81.8 73.1 76.4 CD8 EM 91.5 96.1 83 90.8 73.2 71.9 77.1 78.2 84.1 85.1
Tabel 50 - Figura 51: celule CD4+CD28+ şi celule Figura 25 CD8+CD28+
Celulă T Markeri M1061 M1062 M1063 M1064 Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate CD4 CD28+ 4.6 5.85 33.2 37 10.5 11.2 31.9 27.6 CD8 CD28+ 30.1 34 24.5 23.1 83.8 49.3 22.5 15.5 Celulă T Markeri M1061 M1062 M1063 M1064 Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate CD4 CD28+ 6.75 7.18 21.6 27.8 18.6 15 23 27.6 CD8 CD28+ 24.6 17.9 10 6.4 28.6 18.9 15.7 11
Celulă T Markeri M1065 EP11001 M1056 M1058 M 1203 Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate CD4 CD28+ 41.7 38.2 63.2 59.8 3.97 3.29 12.2 17.5 8.27 7.48 CD8 CD28+ 13.4 8.52 14.5 12 53 54.4 56.5 62.1 76.5 80.8 Celulă T Markeri M1065 EP11001 M1056 M1058 M 1203 Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate CD4 CD28+ 12.3 15.2 13.3 20 6.22 9.29 12.3 16.5 15.4 17.9 CD8 CD28+ 6.9 2.43 2.07 3.75 24 34 27 36.9 42 43.9
Tabel 51 - Figura 53: celule CD4+PD-1+ şi Figura 27 celule CD8+PD-1+
Celulă T Markeri M1061 M1062 M1063 M1064 Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate CD4 PD-1+ 48.5 nd nd nd 77 40.6 nd 22.4 CD8 PD-1+ 37.1 nd nd nd 56 24.6 nd 14 Celulă T Markeri M1061 M1062 M1063 M1064 Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate CD4 PD-1+ 36.8 34.2 15.7 26.7 43.9 66 32.4 14.5 CD8 PD-1+ 40.4 35.3 6.3 6.21 18 20.4 35.6 23.2
Celulă T Markeri M1065 EP11001 M1056 M1058 M1203 Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate CD4 PD-1+ 7.87 7.23 33.3 28.2 33.9 32.8 41.7 38 22.7 23.8 CD8 PD-1+ 1.61 0.72 19.2 12.5 23.8 24.7 78.4 59.8 42.6 36.1 Celulă T Markeri M1065 EP11001 M1056 M1058 M1203 Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate CD4 PD-1+ 22.4 15.5 40.9 33.4 56 51.3 40.3 32.5 18.9 27.3 CD8 PD-1+ 6.49 5.73 29.8 34.6 18.9 15.2 68.6 47 28.9 36.1
Tabel 52 - Figura 55: celule CD4+LAG3+ şi Figura 29 celule CD8+LAG3+
Celulă T Markeri M1061 M1062 M1063 M1064 Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate CD4 LAG3+ 16.8 nd nd nd 93.5 37.3 nd 6.8 CD8 LAG3+ 74 nd rid nd 98.4 81.5 nd 31.8 Celulă T Markeri M1061 M1062 M1063 M1064 Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete decongelate Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate CD4 LAG3+ 68.3 73.1 35.2 56.9 26.9 27.3 52.6 64 CD8 LAG3+ 98.3 98.7 97.1 97.7 89.6 85.1 92.8 94.7
Celulă T Markeri M1065 EP11001 M1056 M1058 M1203 Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate CD4 LAG3+ 47.2 30.5 35.5 20.1 25 27.4 48.6 38 14.5 7.65 CD8 LAG3+ 85.3 38.7 89.6 64.2 83.4 81.9 93.2 66.3 90.3 71.1 Celulă T Markeri M1065 EP11001 M1056 M1058 M 1203 Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate CD4 LAG3+ 65.8 68.2 40.9 46 44.1 39.1 52.1 51 48.5 17.7 CD8 LAG3+ 95.4 97.8 92.4 92.5 97.5 98.4 98.2 98.3 97.7 78.1
Tabel 53 - Figura 57: celule CD4+TIM-3+ şi Figura 31 celule CD8+TIM-3+
Celulă T Markeri M1061 M1062 M 1063 M1064 Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate CD4 TIM3+ 89.7 nd nd nd 98.3 87.6 nd 43.2 CD8 TIM3+ 99 nd nd nd 99.4 88.1 nd 47 Celulă T Markeri M1061 M1062 M1063 M1064 Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate CD4 TIM3+ 95.3 98 94.5 96.9 90.8 90.2 94.2 82.6 CD8 TIM3+ 98.9 98.9 97.3 96.7 97.1 97.7 98.2 95.7
Celulă T Markeri M1065 EP11001 M1056 M1058 M1203 Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate Proaspete Decongelate CD4 TIM3+ 95 78.8 96.9 91.5 96.4 92.5 88.7 80.1 89.9 82.3 CD8 TIM3+ 96.9 50.6 98.8 83 98.3 92.9 96.5 73.6 98.2 88.5 Celulă T Markeri M1065 EP11001 M1056 M1058 M1203 Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate Re-REP proaspete Re-REP decongelate CD4 TIM3+ 91.1 95.4 94.3 98.7 74 75.4 86.5 87.3 94.4 90.6 CD8 TIM3+ 94.9 96.5 96.3 98.3 98 99 97.3 98.6 99 97.7
Tabel 54 - Figura 61: Determinarea qPCR şi Flow-FISH a lungimii telomerilor
ID tumoare M1061 M1062 M1063 M1064 M1065 EP11001 M1056 M1058 M1023 qPCR 0.111878 0.135842 0.149685 0.179244 0.151774 0.137738 0.134904 0.124137 0.086569 Flow-FISH 9.330236 1215041 8.782231 7.174627 8.961553 6112918 9.010615 7.944534 5.766692
EXEMPLUL 20: NOI LIMFOCITE INFILTRANTE ÎN TUMORI CRIOCONSERVATE (LN-144) ADMINISTRATE PACIENŢILOR CU MELANOM METASTATIC
Noile limfocite infiltrante în tumori crioconservate (LN-144) administrate pacienţilor cu melanom metastatic demonstrează eficienţa şi tolerabilitatea într0un studiu clinic faza 2 în mai multe centre.
INTRODUCERE:
Siguranţa şi eficienţa terapiei celulare adoptive (ACT) cu limfocite infiltrante în tumori (TIL) necrioconservate a fost studiată la sute de pacienţi cu melanom metastatic. Acest studiu clinic în centre centre multiple a fost iniţiat TIL preparate central (LN-144) ca produşi perfuzabili necrioconservaţi şi crioconservaţi. Noul nostru proces de producţie pentru LN-144 necrioconservate se utilizează în grupul 1 şi un proces de LN-144 crioconservate scurtat de 3 săptămâni se utilizează în grupul 2. Prepararea din grupul 2 asigură un proces semnificativ mai scurt, împreună cu un produs TIL crioconservat care permite flexibilitate de programare a pacienţilor şi de dozaj. Procesul de preparare mai scurt reduce timpul de aştepare pentru pacientul care primeşte produsul TIL şi crioconservarea facilitează logistica şi livrarea la destinaţiile clinice.
METODE:
C-144-01 este un studiu prospectiv în centre multiple care evaluează pacienţi cu melanom metastatic care primesc LN-144. În urma unei limfodepleţii non-mieloablative cu regim de condiţionare Cy/Flu, pacienţii primesc o singură perfuzie de LN-144, urmată de administrarea IL-2 (600.000 IU/kg) până la 6 doze. Pacienţii sunt evaluaţi cu privire la răspunsul obiectiv ca un obiectiv primar până la 24 de luni.
REZULTATE:
Caracterizăm LN-144 crioconservate administrate unui al doilea grup de pacienţi, grupul 2 (N=10) în urma aceluiaşi regim de tratament perfuzabil pre- şi post-TIL folosit pentru grupul 1.
Pacienţii din grupul 2 au fost pretrataţi un număr mare de linii de tratament anterioare, toţi pacienţii urmând terapie anti-CTLA-4 şi anti-PD-1 şi încărcătură tumorală mai mare (SOD mediu: 15.3, 10.9 cm pentru grupurile 2, 1). Numărul mediu al terapiilor sistemice anterioare este 4, 3 pentru grupurile 2, respectiv 1. O analiză iniţială a datelor de siguranţă demonstrează tolerabilitatea comparabilă a LN-144 crioconservate. Profilul de siguranţă pentru pacienţii din grupul 1 care primesc LN-144 necrioconservate continuă să fie acceptabil pentru această populaţie de pacienţi în stadiu târziu. TEAE cele mai frecvente observate în ambele grupuri sunt greaţa, anemia, neutropenia febrilă, număr scăzut de neutrofile, număr scăzut de trombocite. Analiza timpurie a datelor de eficienţă indică activitate anti-tumorală, inclusiv PR, a terapiei TIL observate la pacienţii trataţi din grupul 2.
CONCLUZII:
Acesta reprezintă primul studiu clinic în centre multiple cu TIL preparate central care evaluează un proces nou pentru produsul autolog crioconservat cu un proces semnificativ mai scurt (aproximativ 3 săptămâni). Rezultatele preliminare indică LN-144 crioconservate ca o opţiune terapeutică sigură şi tolerabilă pentru pacienţi cu melanom metastatic care nu au prezentat succes în terapiile multiple anterioare, inclusiv inhibitori ai punctelor de control. LN-144 crioconservate asigură o mai mare flexibilitate pentru pacienţi şi personalul medical şi permite un tratament mai imediat al pacienţilor care au încă această necesitate medicală mare. NCT02360579.
EXEMPLUL 21: EVALUAREA MEDIULUI FĂRĂ SER UTILIZAT ÎN PROCESUL 2A
Acest exemplu furnizează date care indică evaluarea eficienţei mediului fără ser ca un înlocuitor pentru CM1, CM2 şi CM4 standard care se utilizează în prezent în procesul 2A. Acest studiu a testat eficienţa mediului fără ser (SFM) disponibil şi a alternativelor fără ser ca înlocuitori în trei faze;
Faza 1: compararea eficienţei expansiunii TIL (n = 3) folosind medii fără ser standard vs CTS Optimizer sau Prime T CDM sau Xvivo-20 cu sau fără înlocuitor de ser sau lizat trombocitar.
Faza 2: testarea mediilor fără ser candidat în procesul 2A la mini scară folosind G-Rex 5M (n=3).
INFORMAŢII DE BAZĂ
Deşi combinaţia curentă de mediu folosită în cultura Pre şi Post REP s-a dovedit eficientă, pot apărea eşecuri REP cu AIM-V. Dacă se identifică o alternativă fără ser eficientă, procesul ar fi mai simplu de efectuat în CMO, reducând numărul tipurilor de mediu folosite de la 3 la 1. În plus, SFM reduce probabilitatea de boală accidentală, eliminând utilizarea serului uman. Acest exemplu furnizează date care susţin utilizarea mediului fără ser procesele 2A.
ABREVIERI
µl microlitru
CM1,2,4 Mediu complet 1,2,4
CTS Op Timizer SFM Mediu fără ser Cell Therapy System OpTimizer
g Grame
Hr Oră
IFU Instrucţiuni de utilizare
IL-2 Citokina interleukina-2
Min Minut
Ml Mililitru
°C grade Celsius
PreREP Pre-Protocol de expansiune rapidă
REP Protocol de expansiune rapidă
RT Temperatura camerei
SR Înlocuitor ser
TIL Limfocite infiltrante în tumori
MODEL EXPERIMENTAL
Pre-REP şi REP au fost iniţiate aşa cum se menţionează în LAB-008. Planul acestor 3 faze ale experimentului este prezentată în figura 150.
După cum se arată în figura 150, proiectul a urmărit să testeze mediul fără ser şi suplimenţii în două etape.
Etapa 1. Selecţia furnizorului de mediu fără ser. preREP şi postREP au fost prevăzute să imite procesul 2A în placa G-Rex cu 24 de godeuri. PreREP s-au iniţiat prin cultivarea fiecărui fragment/godeu al plăcii G-Rex cu 24 de godeuri în triplicat sau cvadruplicat per condiţie. REP au fost iniţiate în ziua 11 prin cultivarea a 4 x 10e5 TIL/godeu al plăcii G-Rex cu 24 de godeuri, separare în ziua 16, recoltare în ziua 22. S-au folosit CTS OpTimizer, X-Vivo 20 şi Prime T-CDM ca posibile medii fără ser alternative pentru utilizare în PreREP şi REP. S-a adăugat înlocuitor de ser CTS Immune SR (Life Technologies) sau lizat trombocitar (SDBB) la 3% în SFM. Fiecare condiţie a fost planificată să se testeze cu cel puţin 3 tumori în preREP şi postREP pentru a imita procesul 2A.
Etapa 2. Candidaţii identificaţi au fost testaţi în procese 2A la mini-scară per protocol (TP-17-007). Pe scurt, preREP s-au iniţiat prin cultivarea a 2 fragmente/balon G-Rex 5M în triplicat per condiţie. REP au fost iniţiate în ziua 11 folosind 2 x 10e6/balon G-Rex 5M, separare în ziua 16, recoltare în ziua 22.
Notă: unele tumori au fost procesate pentru măsurarea mai multor parametri într-un experiment
OBSERVAŢII
Se observă rezultate echivalente sau statistic mai bune în creşterea celulară la compararea unui mediu fără ser cu standardul folosit în procesul 2A
Se observă fenotip, producţie IFN-y şi analiză a metaboliţilor similare din TIL crescute în mediu fără ser în comparaţie cu TIL crescute în mediu standard folosit în procesul 2A.
REZULTATE
Testarea eficienţei mediului fără ser cu privire la amplificarea TIL pre şi post REP.
CTS Optimizer + SR (Serum Replacement) au prezentat amplificare preREP mărită şi amplificare TIL REP comparabilă. CTS OpTimizer, X-Vivo 20 şi Prime T-CDM s-au adăugat cu sau fără 3% CTS Immune CTS SR, s-au testat în condiţii standard. În M1079 şi L4026, CTS OpTimizer + CSR a prezentat expansiune TIL preREP mărită semnificativ (p <0.05) comparativ cu condiţiile standard (CM1, CM2, CM4) (Figura 62A). Invers, CTS Optimizer fără CSR nu a ajutat la expansiunea TIL preREP (Anexa -1,2,3). CTS Optimizer + CSR a prezentat expansiune TIL comparabilă în PostREP în două din cele 3 tumori testate (Figura-2B). A apărut o cantitate mare de variaţie în pre şi post REP cu X-Vivo 20 şi Prime T-CDM, în timp ce CTS Optimizer a fost relativ constant între probele în cvadruplicat. În plus, lizatul trombocitar cu SFM adăugat nu a mărit expansiunea TIL preREP şi postREP comparativ cu standardul (Figura 62A). Aceste observaţii sugerează că înlocuirea serului este cu siguranţă necesară pentru a asigura o creştere comparailă cu standardul nostru, CTS optimizer +CSR poate fi un candidat.
Testarea candidatului în G-Rex 5M la mini-scară (vezi Figura 64).
Analiza fenotipică a TIL post REP. Vezi Figura 66 şi Tabelul 56 de mai jos.
Tabel 56: Predilecţia CD8 cu CTS OpTimizer
%CD8+ mediu Standard CTS M1078 11 34 M1079 29.3 43.85 M1080 33.67 54.37 L4020 0.02 0.17 EP11020 28.67 25.07 L4030 0.13 0.09 L4026 9.45 34.06 M1092 5.75 52.47 T6030 66 52.6
Comparabilitatea interferon-gamma
Interferon-gamma ELISA (Quantikine). Producerea IFN-y s-a măsurat folosind kitul Quantikine ELISA de la R&D systems. CTS+SR a produs cantităţi comparabile de IFN-y comparativ cu condiţia noastră standard. Vezi Figura 67.
EXEMPLUL 22: AMESTECUL FACTORILOR DE CREŞTERE T CELULARI IL-2/IL-15/IL-21 CREŞTE EXPANSIUNEA ŞI FUNCŢIA EFECTOARE A CELULELOR T INFILTRANTE ÎN TUMORI
Terapia adoptivă cu celule T cu limfocite infiltrante în tumori (TIL) autologe a demonstrat eficienţă clinică la pacienţi cu melanom metastatic şi carcinom de col uterin. În unele studii, rezultatele clinice mai bune s-au corelat pozitiv cu numărul total al celulelor introduse şi/sau procentajul celulelor T CD8+. Majoritatea regimurilor de producţie curente utilizează doar IL-2 pentru a favoriza creşterea TIL. Expansiunea mărită a limfocitelor a fost raportată folosind regimuri care conţin IL-15 şi IL-21. Acest studiu descrie efectele pozitive ale adăugării IL-15 şi IL-21 în protocolul IL-2-TIL din a doua generaţie recent implementat în mediul clinic.
Materiale şi metode
Procesul de generare TIL include un pre-Protocol de expansiune rapidă (pre-REP), în care fragmente tumorale de 1-3 mm3 sunt introduse în mediu conţinând IL-2. În timpul pre-REP, TIL ies din fragmentele tumorale şi se amplifică în răspuns la stimulare cu IL-2.
Pentru a stimula şi mai mult creşterea TIL, TIL sunt amplificate printr-o a doua perioadă de cultură denumită Protocol de expansiune rapidă (REP) care include PBMC feeder iradiate, IL-2 şi anti-CD3. În acest studiu, s-a dezvoltat un protocol de expansiune pre-REP şi REP scurtat pentru amplificarea TIL, menţinând atributele fenotipice şi funcţionale ale produsului TIL final.
Acest protocol de producţie TIL scurtat s-a folosit pentru a evalua impactul a IL-2 individual versus o combinaţie de IL2/IL-15/IL-21. Aceste două regimuri de cultură s-au comparat cu privire la producerea TIL crescute din tumori colorectale, melanom, de col uterin, mamare triplu negative, pulmonare şi renale. La încheierea pre-REP, TIL cultivate au fost evaluate cu privire la expansiune, fenotip, funcţie (CD107a+ şi IFNγ) şi repertoriul TCR Vβ.
Culturile pre-REP au fost iniţiate folosind protocolul IL-2 (600 IU/ml) standard sau cu IL-15
(180 IU/ml) şi IL-21 (IU/ml) pe lângă IL-2. Celulele au fost evaluate cu privire la expansiune la încheierea pre-REP. O culture a fost clasificată ca având o creştere a expansiunii faţă de IL-2 dacă creşterea totală a fost mărită cu cel puţin 20%. Sunt prezentate aici studiile fenotipice şi funcţionale de melanom şi pulmonare. Vezi tabelul 57 de mai jos.
Tabel 57: Creşterea expansiunii în timpul pre-REP cu IL-2/IL-15/IL-21 în indicaţii multiple
Histologie tumorală # Studii IL-2 faţă de IL-2/IL-15/IL-21 # Studii care demonstrează >20% mărire a creşterii folosind IL-2/IL-15/IL-21 (faţă de IL-2) Melanom 5 1/5(20%) Pulmonară 8 3/8 (38%) Colorectală 11 7/11 (63%) Col uterin 1 1/1 (100%) Pancreatică 2 2/2 (100%) Glioblastom 1 1/1 (100%) Maamră triplu negativă 1 1/2 (50%)
Aceste date demonstrează o producţie TIL mărită la cultivarea TIL cu IL-2/IL15/IL-21 faţă de IL-2 individual, pe lângă diferenţele fenotipice şi funcţionale în plămân.
Efectul amestecului triplu asupra expansiunii TIL a fost specific afecţiunii, cu cel mai mare beneficiu pentru tumorile cu producţie mică.
Raportul de celule T CD8+/CD4+ a fost mărit de tratament în produsul NSCLC TIL.
Activitatea celulelor T a părut să fie mărită adăugând IL-15 şi IL-21 la IL-2, evaluată prin nivelurile de expresie CD107a în melanom şi NSCLC.
Datele furnizate aici arată că expansiunea TIL folosind un proces mai fiabil şi mai scurt, cum ar fi procesul 2A descris în prezenta cerere şi alte exemple, poate fi adaptată pentru a include amestecul de citokine IL-2/IL-15/IL-21, reprezentând aşadar un mijloc de favorizare a expansiunii TIL în afecţiuni specifice.
Experimentele în derulare evaluează de asemenea efectele IL-2/IL-15/IL-21 asupra funcţiei TIL.
Alte experimente vor evalua efectul amestecului triplu în timpul REP (prima expansiune).
Aceste observaţii sunt deosebit de relevante pentru optimizarea şi standardizarea regimurilor de cultură TIL necesare pentru prepararea la scară mare a TIL cu aplicabilitate şi disponibilitate largă necesară pentru o terapie anti-cancer principală.
EXEMPLUL 23: TIL CRIOCONSERVATE GENERATE CU O METODĂ SCURTATĂ
Bază
Acest exemplu furnizează date legate de un produs limfocitar infiltrant tumoral (TIL) crioconservat pentru LN-144, generat cu o metodă scurtată adecvată pentru prepararea comercială la capacitate mare prezintă atribute calitative favorabile pentru transferul celular adoptiv (ACT).
Metodele existente de generare a produşilor TIL clinici presupun intervenţii ale operatorului, urmate de perioade extinse de incubare pentru a genera un produs terapeutic. procesul din generaţia 1 durează aproximativ 6 săptămâni, rezultând un produs proaspăt. Pentru a aduce terapia TIL la toţi pacienţii care pot beneficia de potenţialul său, s-a dezvoltat o metodă de cultură scurtată de 22 de zile, generaţia 2, adecvată pentru preparare centralizată cu un produs medicamentos crioconservat, care poate fi transportat la distanţă. Generaţia 2 reprezintă un proces de producţie celulară flexibil, solid, închis şi semi-automat, adaptabil la preparare la scară comercială. Produşii medicamentoşi generaţi prin această metodă au atribute calitative comparabile cu cele generate din procesul din
generaţia 1.
Obiectivele studiului:
Produşii medicamentoşi generaţi prin procesele din generaţia 1 (o aplicare a procesului 1C) şi generaţia 2 (o aplicare a procesului 2A) s-au evaluat pentru a determina comparabilitatea privind următoarele atribute calitative:
Doză şi grad de expansiune.
Puritatea celulelor T şi proporţiile de subseturi T celulare.
Expresia fenotipică a moleculelor co-stimulatoare pe subseturi T celulare.
Lungimea relativă medie a repetiţiilor telomerice.
Capacitatea de a secreta citokine în răspuns la reactivare TCR.
Diversitatea receptorilor T celulari.
Prezentarea procesului terapeutic TIL:
EXTRAGERE: TIL ale pacientului se îndepărtează din micromediul tumoral supresor (prin rezecţie chirurgicală a unei leziuni)
EXPANSIUNE: TIL s-au amplificat exponenţial în cultură cu IL-2 pentru a produce 109 - 1011 TIL, înaintea introducerii în pacient
PREPARARE: pacientul primeşte NMA-LD (limfodepleţie non-mieloablativă, ciclofosfamidă: 60 mg/kg, IV x 2 doze şi fludarabină: 25 mg/m2 x 5 doze) pentru eliminarea micromediului tumoral posibil supresor şi maximizarea grefării şi potenţialului terapiei TIL
PERFUZIE: pacientul primeşte TIL proprii amplificate (LN-144) şi o durată scurtă de doză mare de IL-2 (600.000 IU/kg până la 6 doze) pentru a favoriza activarea, proliferarea şi activitatea citolitică anti-tumorală a TIL
Tabel 58: Rezumatul îmbunătăţirilor procesului de preparare din generaţia 2
Etapă proces Gen 1 Gen 2 Impact Cultură fragmente ≤21 zile, bioreactoare multiple, intervenţii multiple operator ≤11 zile, un singur bioreactor închis, fără intervenţie Scurtează cultura, reduce intervenţiile, adaptare la automatizare. Selecţie TIL TIL amplificate cu IL-2 crioconservate, testate, selecţie pe baza fenotipului, decongelare, ≤ 30×106 TIL în co-cultură ≤ 200×106 TIL în masă direct în co-cultură Scurtează procesul permiţând însămânţare mărită a co-culturii, reduce etapele, elimină testarea Expansiune rapidă ≤ 36 bioreactoare, 14 zile ≤ 5 bioreactoare, 11 zile Reduce intervenţiile de operator, sistem închis, scurtează procesul, adaptare la automatizare. Recoltare/spălare Reducere manuală a volumului şi recoltare. Spălare manuală şi concentrare prin centrifugare. Reducere închisă semi-automată a volumului şi recoltare. Spălare automată şi concentrare. Reduce intervenţiile de operator, automat, menţine sistemul închis. Compoziţie Produs hipotermic proaspăt (2-8°C) Produs crioconservat (≤ - 150°C) Flexibilitate transport, programare pacienţi, testare cu eliberare mai rapidă, teste globale Timp preparare 38 zile 22 zile Revenire la pacient, cameră cu atmosferă controlată, COG
Metode de analiză şi instrumente:
Doză şi viabilitate: s-au prelevat probe din produsul final şi s-au testat cu privire la celule nucleate totale, celule viabile totale şi viabilitate, determinate prin contracolorare cu acridină portocalie / DAPI folosind aparatul automat NC-200.
Citometrie în flux: s-au prelevat probe din produşii medicamentoşi şi s-au testat cu privire la identitate prin FACS. S-a determinat procentajul celulelor T ca populaţie CD45, CD3 doublu pozitivă de celule viabile. S-au decongelat probe satelit congelate sau fiole de control pentru fiecare proces şi s-au testat cu privire la markeri fenotipici extinşi inclusiv CD3, CD4, CD8, CD27 şi CD28.
Lungimea relativă medie a repetiţiilor telomerice: s-a folosit tehnologia Flow-FISH pentru a măsura lungimea medie a repetiţiei telomerice. Acest test s-a realizat aşa cum se descrie în kitul DAKO® Telomere PNA/FITC pentru protocolul citometriei în flux. Pe scurt, 2x106 celule TIL s-au combinat cu 2×106 celule leucemice 1301. ADN a fost denaturat la 82°C 10 minute şi sonda PNA-FITC s-a hibridizat în întuneric peste noapte la temperatura camerei. S-a folosit iodură de propidiu pentru identificarea celulelor în faza G0/1.
Imunonalize: s-a măsurat capacitatea produsului medicamentos de a secreta citokine la reactivare în urma co-culturii cu sfere acoperite cu mAb (Life Technologies, anti-CD3, anti-CD28 & anti-CD137). După 24 h supernatanţii de cultură au fost recoltaţi congelaţi, s-au decongelat şi s-au testat prin ELISA folosind kitul Quantikine IFNγ ELISA (R&D systems) urmând instrucţiunile producătorului.
Diversitatea receptorilor T celulari: ARN din produsul final preparat a fost izolat şi supus PCR multiplex cu primeri specifici pentru VDJ. Secvenţele CDR3 exprimate în produsul TIL au fost amplificate semi-cantitativ pentru a determina frecvenţa şi prevalenţa clonelor TIL unice. Secvenţierea s-a efectuat pe aparatul de masă Illumina MiSeq. Valorile sunt centralizate pentru a obţine un punctaj reprezentativ pentru diversitatea relativă a receptorilor T celulari în produs.
Rezultate şi concluzii:
Rezultatele sunt indicate în Figurile 75 - 81.
Procesul din generaţia 2 produce un produs TIL cu atribute calitative comparabile cu generaţia 1.
Generaţia 2 produce cantităţi similare de produşi TIL foarte puri alcătuiţi din proporţii similare de subseturi T celulare care exprimă niveluri comparabile de molecule costimulatoare faţă de Gen 1.
TIL din generaţia 2 TIL prezintă diversitate mărită a receptorilor TCR care iniţiază secreţie mare de citokine.
Produsul medicamentos crioconservat introduce eficienţe logaritmice critice acre permit flexibilitate a distribuţiei.
Spre deosebire de procesele anterioare, platforma de expansiune scurtată de 22 de zile din generaţia 2 este o platformă fezabilă din punct de vedere logistic, cu capacitate de creştere a scării de producţie, permiţând generarea rapidă a dozelor la scară clinică pentru pacienţi care necesită terapie urgent.
Protocolul de producţie TIL din generaţia 2 depăşeşte multe dintre barierele care au împiedicat până acum aplicarea mai largă a terapiei TIL.
EXEMPLUL 24: EVALUAREA UNUI INTERVAL AL RAPORTURILOR DINTRE CELULELE FEEDER ALOGENICE:TIL DE LA 100:1 LA 25:
Acest studiu a testat proliferarea TIL la 25:1 şi 50:1 faţă de control 100:1 celule feeder alogenice:TIL folosite în Procesul 1C.
Studiile publicate de Surgery Branch at the National Cancer Institute au arătat că pragul pentru activarea optimă a TIL în balonul G-Rex 100 la 5×106 celule feeder alogenice per cm2 la iniţierea REP(1). Aceasta s-a confirmat prin modelare matematică şi, cu acelaşi model, s-a estimat că folosind un strat feeder optimizat pentru contact celulă:celulă per suprafaţă unitară, proporţia de celule feeder alogenice faţă de TIL poate fi scăzută la 25:1 cu efect minim asupra activării şi expansiunii TIL.
Acest studiu a stabilit o densitate optimă a celulelor feeder per suprafaţă unitară la iniţierea REP şi a validat intervalul eficient al raporturilor celulelor feeder alogenice la iniţierea REP necesar pentru a scădea şi normaliza cantitatea de celule feeder folosite per lot clinical. Studiul a validat de asemenea iniţierea REP cu mai puţin de 200×106 TIL co-cultivate cu un număr fix de celule feeder.
A. Volum celulă T (diametru 10 µm): V = (4/3) πr3 =523.6 µm3
B. Coloane G-Rex 100 (M) cu înălţime de 40 µm (4 celule): V = (4/3) πr3 = 4×1012 µm3
C. Număr necesar de celule pentru umplerea coloanei B: 4×1012 µm3 / 523.6 µm3 = 7.6x108 µm3 ∗ 0.64 = 4.86x108
D. Număr de celule care pot fi activate optim în spaţiu 4D: 4.86×108 / 24 = 20.25×106
E. Număr feeder şi TIL extrapolat în G-Rex 500: TIL: 100×106 şi Feeder: 2.5×109
Ecuaţia 1. Aproximarea numărului de celule mononucleare neecsar pentru a asigura o geometrie icosaedrală pentru activarea TIL într-un cilindru cu o bază de 100 cm2. Calculul produce rezultatul experimental de ∼5×108 pentru activarea prag a celulelor T care reflectă îndeaproape datele experimentale NCI.(1) (C) Înmulţitorul (0.64) este densitatea de umplere aleatorie pentru sferele echivalente calculată de Jaeger and Nagel in 1992 (2). (D) Împărţitorul 24 este numărul sferelor echivalente care ar putea intra în contact cu un obiect similar în spaţiul 4-dimensional "numărul Newton"(3).
Referinţe
(1) Jin, Jianjian, et.al., Simplified Method of the Growth of Human Tumor Infiltrating Lymphocytes (TIL) in Gas-Permeable Flasks to Numbers Needed for Patient Treatment. J Immunother. 2012 Apr; 35(3): 283-292.
(2) Jaeger HM, Nagel SR. Physics of the granular state. Science. 1992 Mar 20;255(5051):1523-31.
(3) O. R. Musin (2003). "The problem of the twenty-five spheres". Russ. Math. Surv. 58 (4): 794-795.
EXEMPLUL 25: STUDII ALE ATRIBUTELOR CALITATIVE PRINCIPALE PENTRU TIL
Bază
Terapia adoptivă cu celule T cu limfocite infiltrante în tumori (TIL) autologe a demonstrat eficienţa clinică la pacienţi cu melanom metastatic şi alte tumori1-3.
Majoritatea rapoartelor din studiile clinice au inclus analize de explorare a produşilor TIL perfuzaţi cu intenţia de identificare a atributelor calitative cum ar fi sterilitate, identitate, puritate şi potenţial, care pot fi legate de eficienţa şi/sau siguranţa produsului.4,5
Prezentăm aici evaluarea a trei parametri ai produsului TIL care pot contribui la o platformă viitoare de control al calităţii pentru utilizare în prepararea comercială a TIL.
Prezentarea procesului de terapie TIL
1. Tumoarea a fost excizată de la pacient şi transportată la unitatea de producţie GMP.
2. La sosire, tumoarea este fragmentată şi aşezată în baloane cu IL-2 pentru un pre-Protocol de expansiune rapidă (REP).
3. TIL pre-REP au fost amplificate în protocol REP în prezenţa PBMC iradiate, a anticorpului anti-CD3 (30 ng/mL) şi IL-2 (3000 IU/mL).
4. TIL s-au evaluat cu privire la atributele calitative critice inclusiv: (1) identitate, (2) puritate şi (3) potenţial.
5. Înainte de perfuzia TIL amplificate (LN-144), pacientul a primit un regim de limfodepleţie non-mieloablativ constând din ciclofosfamidă şi fludarabină. În urma perfuziei TIL, pacienţii au primit o durată scurtă (până la 6 doze) de IL-2 în doză mare (600.000 IU/kg) pentru a susţine creşterea şi grefarea TIL de transfer.
Obiectivele studiului
Obiectiv: caracterizarea completă a TIL cu privire la identitate, puritate şi potency şi aşadar (a) ghidarea definirii atributelor calitative critice şi (b) susţinerea stabilirii criteriilor de eliberare implementate în producţia comercială a TIL.
Strategie: dezvoltarea următoarelor metodologii analitice pentru a susţine caracterizarea TIL. În mod specific, s-au efectuat următoarele metode: analiza fenotipică prin citometrie în flux pentru evaluarea de identitate şi puritate, testul de detecţie a celulelor tumorale reziduale pentru măsurarea purităţii şi testul de eliberare interferon-gamma pentru evaluarea potenţialului.
Materiale şi metode
Identitate şi puritate
Caracterizarea fenotipică: produşii TIL au fost coloraţi cu anticorpi anti-CD45, anti-CD3, anti-CD8, anti-CD4, anti-CD45RA, anti CCR7, anti CD62L, anti-CD19, anti-CD16 şi anti-CD56 şi analizaţi prin citometrie în flux pentru cuantificarea subseturilor de celule T şi non-T.
Puritate
Test de detecţie a celulelor tumorale reziduale: produşii TIL au fost coloraţi cu anticorpi anti-MCSP (condroitin sulfat proteoglican asociat cu melanom) şi anti-CD45, precum şi cu colorant Live/Dead fixable Aqua, după care s-au analizat prin citometrie în flux pentru detectarea celulelor de melanom. S-a folosit un control pentru evaluarea preciziei detecţiei tumorale şi pentru stabilirea criteriilor pentru analiza datelor.
Potenţial
Test de eliberare IFNγ: produşii TIL au fost re-stimulaţi cu sfere acoperite cu anti-CD3/CD28/CD137 18 - 24 ore, după care s-au recoltat supernatanţii pentru evaluarea secreţiei IFNγ folosind un test ELISA.
Rezultate
Identitate: majoritatea (>99%) produsului TIL din melanom a constat din celule CD45+CD3+.
Figurile 86A-86C prezintă caracterizarea fenotipică a produşilor TIL folosind un test de citometrie în flux în 10 culori. (A) Procentajul subseturilor de celule T şi non-T a fost definit de CD45+CD3+ şi CD45-(non-limfocit)/CD45+CD3- (non-T-limfocit). În total, >99% dintre produşii TIL au constat din celule T (CD45+CD3+). Se indică o medie a produşilor TIL (n=10). (B) Procentajul a două subseturi de celule T inclusiv CD45+CD3+CD8+ (cerc gol albastru) şi CD45+CD3+CD4+ (cerc gol roz). Nu s-a observat nici o diferenţă statistică în procentajul celor două subseturi folosind testul t student neîmperecheat (P=0.68). (C) Populaţia de celule non-T a fost caracterizată pentru patru subseturi diferite inclusiv: 1) non-limfocit (CD45-), 2) celule NK (CD45+CD3-CD16+/56+), 3) celule B (CD45+CD19+) şi 4) non-NK/B (CD45+CD3-CD16-CD56-CD19-).
Identitate: majoritatea produsului TIL din melanom a prezentat fenotip de celule T efectoare sau de memorie, asociat cu funcţia citotoxică a celulelor T.
Figura 87A şi 87B prezintă caracterizarea subseturilor de celule T în populaţii CD45+CD3+CD4+ şi CD45+CD3+CD8+. Subseturile de celule T naive, de memorie centrală (TCM), memorie efectoare (TEF) şi memorie efectoare RA+(EMRA) s-au definit folosind CD45RA şi CCR7. Figurile 87A şi 87B indică subseturi de celule T reprezentative de la 10 produşi TIL finali în populaţii CD4+ (A) şi CD8+ (B). Subsetul T de memorie efectoare (cerc gol albastru) a reprezentat o populaţie majoră (>93%) în ambele subseturi CD4+ şi CD8+ ale produsului final TIL. Mai puţin de 7% dintre produşii TIL au fost subset de memorie centrală (cerc gol roz). Subseturile EMRA (cerc gol gri) şi naive (cerc gol negru) au fost abia detectate în produsul TIL (<0.02%). Valorile p reprezintă diferenţa între EM şi CM cu test t student neîmperecheat.
Puritate: MCSP reprezintă un marker tumoral de melanom pentru testul de puritate.
Figurile 88A şi 88B indică detecţia expresiei MCSP şi EpCAM în celule tumorale de melanom. Liniile celulare tumorale de melanom (WM35, 526 şi 888), liniile celulare de melanom obţinute de la pacienţi au fost generate conform metodelor descrise în prezenta (1028, 1032 şi 1041) şi o linie celulară de adenom colorectal (HT29 ca un control negativ) s-au caracterizat prin colorare pentru markeri MCSP (condroitin sulfat proteoglican asociat cu melanom) şi EpCAM (molecula de adeziune celulară epitelială). (A) În medie 90% dintre celulele tumorale de melanom au exprimat MCSP. (B) Expresia EpCAM nu a fost detectată în liniile celulare tumorale de melanom comparativ cu control pozitiv HT29, o linie celulară tumorală EpCAM+.
Puritate: dezvoltarea unui test de citometrie în flux pentru detectarea celulelor tumorale reziduale în produşii TIL.
Figurile 89A şi 89B ilustrează detecţia controlului pentru determinarea preciziei detecţiei tumorii. Testul s-a efectuat prin adăugarea unor cantităţi cunoscute de celule tumorale în suspensii PBMC (n=10). Celulele tumorale de melanom MCSP+526 s-au diluat la raporturi de 1:10, 1:100 şi 1:1.000, apoi s-au amestecat cu PBMC şi s-au colorat cu anticorpi anti-MCSP şi anti-CD45 şi colorant pentru celule vii/moarte şi s-au analizat prin citometrie în flux. (A) Aproximativ 3000, 300 şi 30 celule s-au detectat în diluţia de 1:10, 1:100, respectiv 1:1000. (B) S-a folosit o medie (AV) şi o abatere standard (SD) de celule din fiecare condiţie pentru a defini limitele de referinţă superioare şi inferioare.
Puritate: calificarea testului de detecţie a tumorii reziduale folosind un control
Figurile 90A şi 90B indică studiul de repetabilitate a limitelor superioare şi inferioare în control. S-au efectuat trei experimente independente în triplicat pentru a determina repetabilitatea testului. (A) Numărul celulelor tumorale MCSP+ detectate s-a încadrat în intervalul limitelor de referinţă superioare şi inferioare. (B) Graficul de regresie liniară demonstrează corelarea între celulele MCSP+ şi diluările de adăugare (R2=0.99), linia neagră indicând cea mai bună ajustare. Liniile verde şi gri întrerupte reprezintă limitele de predicţie de 95% în curba standard şi probe (Exp#1 - 3).
Puritate: contaminanţii celulari de melanom au fost sub limitele de detecţie în produsul TIL final.
Figurile 91A şi 91B indică detecţia tumorii de melanom reziduale în produşii TIL. Produşii TIL au fost evaluaţi cu privire la contaminarea tumorală reziduală folosind testul dezvoltat (n=15). Numărul şi procentajul mediu al evenimentelor MCSP+ detectabile a fost 2, respectiv 0.0002%.
Potenţial: secreţia IFNγ de către TIL (constant > 1000 pg/ml) a demonstrat funcţia efectoare
a produsului TIL.
Figura 92 reprezintă evaluarea de potenţial al produşilor TIL în urma activării celulelor T. Secreţia IFNγ după re-stimulare cu anti-CD3/CD28/CD137 în produşii TIL evaluaţi prin ELISA în duplicat (n=5). Secreţia IFNγ de către produşii TIL a fost semnificativ mai mare faţă de controlul nestimulat folosind testul Wilcoxon (P=0.02) şi constant >1000 pg/ml. Secreţia IFNγ >200 pg/ml a fost considerată potentă. Valoarea p <0.05 este considerată semnificativă statistic.
Concluzie
S-au evaluat parametrii principali de identitate, puritate şi potenţial ai produşilor TIL. Produşii TIL preparaţi conform metodelor descrise în prezenta au constat din peste 99% celule T CD45+CD3+. Majoritatea subseturilor TIL CD4+ şi CD8+ au prezentat un fenotip de memorie efectoare, asociat cu funcţia citotoxică a celulelor T. A fost dezvoltat cu succes un test pe bază de citometrie în flux pentru detectarea celulelor tumorale de melanom contaminante în produsul TIL final. Aplicând acest test, celulele tumorale de melanom contaminante în produsul TIL final au fost sub limitele de detecţie. Secreţia IFNγ de către produsul TIL final în urma restimulării anti-CD3/CD28/CD137 poate avea rol de test de potenţial pentru TIL preparate comercial. Aceste date stau la baza unei platforme de control al calităţii care va susţine dezvoltarea atributelor calitative critice pentru producerea comercială a produşilor TIL.
EXEMPLUL 26: UN PRODUS TIL CRIOCONSERVAT GENERAT CU O METODĂ SCURTATĂ ADECVATĂ PENTRU PRODUCŢIE COMERCIALĂ LA SCARĂ MARE PREZINTĂ ATRIBUTE CALITATIVE FAVORABILE PENTRU TRANSFER CELULAR ADOPTIV
Bază
Metodele clasice de generare a limfocitelor infiltrante în tumori (TIL) pentru transfer celular adoptiv (ACT) presupun etape multiple de incubare ex vivo pentru a obţine un produs proaspăt (necrioconservat).
Procesul din prima generaţie (Gen 1) a produs o doză de TIL proaspete în aproximativ 6 săptămâni. S-a dezvoltat un proces de producţie TIL din a doua generaţie (Gen 2), care scurtează durata culturii ex vivo la 22 de zile (Figura 93).
Procesul Gen 2 este adevat pentru producţie centralizată şi generează un produs TIL crioconservat care îmbunătăţeşte programarea, logistica şi livrarea la unităţile clinice. Produsul TIL crioconservat pentru LN-144 obţinut din procesul Gen 2 are atribute calitative comparabile cu produsul TIL necrioconservat din metoda Gen 1. Metoda de preparare TIL Gen 2 reprezintă un proces flexibil, solid, închis şi semi-automat, adaptabil la producţie TIL la scară comercială.
Obiectivul studiului
Produşii perfuzabili TIL generaţi prin procesele Gen 1 şi Gen 2 s-au evaluat pentru a determina comparabilitatea următoarelor atribute calitative: (1) număr celule (doză), viabilitate, rata de creştere în faza REP, (2) puritatea celulelor T şi expresia fenotipică a moleculelor co-stimulatoare pe subseturi de celule T, (3) lungimea relativă medie a repetiţiilor telomerice, (4) capacitatea de a secreta IFNγ în răspuns la activare CD3, CD28, CD137 şi (5) diversitatea receptorilor T celulari prezenţi în produsul final (Figura 94).
Metode de analiză şi instrumente
Număr de celule şi viabilitate: produşii preparaţi finali au fost eşantionaţi şi analizaţi cu privire la celule nucleate totale, celule viabile totale şi viabilitate determinate prin contracolorare cu acridină portocalie/DAPI folosind aparatul NC-200. Loturile de dezvoltare a procesul s-au analizat pe Nexcellom Cellometer K2 folosind colorare florescentă duală cu acridină portocalie/iodură de propidiu.
Markeri fenotipici : produşii preparaţi au fost eşantionaţi şi analizaţi cu privire la identitate prin colorare imunofluorescentă. Celulele T procentuale s-au determinat ca populaţie CD45+,CD3+ (dublu pozitivă) de celule viabile. Fiolele satelit congelate pentru fiecare proces au fost decongelate şi testate cu privire la markeri fenotipici extinşi inclusiv CD3, CD4, CD8, CD27 şi CD28. Produşii proaspeţi s-au obţinut pe BD FACS Canto II şi markerii fenotipici extinşi pe produşi decongelaţi s-au obţinut pe Bio-Rad ZE5 Cell Analyzer.
Lungimea relativă medie a repetiţiilor telomerice: s-a folosit tehnologia Flow-FISH pentru a măsura lungimea medie a repetiţiei telomerice. Acest test s-a realizat aşa cum se descrie în kitul DAKO® Telomere PNA/FITC pentru protocolul de citometrie în flux. Pe scurt, 2.0×106 celule TIL s-au combinat cu 2.0×106 celule T leucemice din linia celulară umană (1301). ADN a fost denaturată la 82°C 10 minute şi sonda PNA-FITC s-a încrucişat în întuneric peste noapte la temperatura camerei. S-a folosit iodură de propidiu pentru identificarea celulelor în faza G0/1.
Funcţia imună: s-a măsurat capacitatea produsului perfuzabil de a secreta IFNγ la reactivare în urma co-culturii cu sfere acoperite cu anticorp (Life Technologies, anti-CD3, anti-CD28 & anti-CD137). După 24 ore supernatanţii de cultură au fost recoltaţi, congelaţi, decongelaţi şi analizaţi prin ELISA folosind kitul Quantikine IFNγ ELISA (R&D systems) urmând instrucţiunile producătorului.
Diversitatea receptorilor T celulari: ARN din produşi s-a izolat şi a fost supus PCR multiplex cu primeri specifici VDJ. Secvenţele CDR3 exprimate în produsul TIL au fost amplificate semi-cantitativ şi secvenţiate pentru a determina frecvenţa şi prevalenţa clonelor TIL unice. Secvenţierea s-a efectuat pe aparat de masă Illumina MiSeq. Valorile au fost centralizate pentru a obţine un punctaj reprezentativ pentru diversitatea relativă a receptorilor T celulari în produs.
Rezultate
În ziua 22 produsul celular redus în volum a fost colectat şi eşantionat pentru a determina performanţa culturii înainte de spălare şi preparare. Figurile 95A-95C indică celulele viabile totale, rata de creştere şi viabilitate. (A) Probele au fost analizate pe sistemul de numărare automat NC-200 aşa cum s-a descris anterior. Densitatea totală a celulelor viabile este determinată de media numărărilor în duplicat din 4 probe independente. Procesul Gen 2 a generat un produs TIL cu doză similară cu Gen 1 (medie Gen 1 = 4.10x1010 ± 2.8x1010, medie Gen 2 = 4.12x1010 ± 2.5x1010). (B) Rata de creştere s-a calculat pentru faza REP ca. (C) Viabilitatea celulelor s-a evaluat din 9 loturi de dezvoltare a procesului folosind Cellometer K2 aşa cum s-a descris anterior. Nu s-a observat scădere semnificativă în viabilitatea celulelor în urma unui singur ciclu de îngheţ-dezgheţ al produsului preparat. Scăderea medie a viabilităţii la decongelare şi eşantionare a fost 2.19%.
Figurile 96A-96C arată că produşii Gen 2 sunt culturi de celule T foarte pure care exprimă molecule costimulatoare la niveluri comparabile cu Gen 1. (Figura 96A) Produşii medicamentoşi preparaţi proaspeţi s-au analizat cu privire la identitate prin citometrie în flux pentru eliberare. Procesele Gen 1 şi Gen 2 produc culturi de celule T de puritate mare definite de fenotip (dublu pozitiv) CD45+,CD3+. (Figurile 96B şi 96C) Fiolele satelit crioconservate de produs medicamentos preparat s-au decongelat şi s-au analizat cu privire la fenotipul extins prin citometrie în flux aşa cum s-a descris anterior. Produşii Gen 1 şi Gen 2 au exprimat niveluri similare de molecule costimulatoare CD27 şi CD28 pe subseturi de celule T. Moleculele costimulatoare cum ar fi CD27 şi CD28 pot fi necesare pentru a furniza semnalizare secundară şi terţiară necesară pentru proliferarea celulelor efectoare la activarea receptorului T celular. Valoarea p s-a calculat folosind testul 't' Mann-Whitney.
Figura 97 arată că produşii Gen 2 tind către telomer relativ mai lung. Lungimi. S-a folosit tehnologia Flow-FISH pentru a măsura lungimea medie a repetiţiei telomerice aşa cum s-a descris anterior. Valoarea RTL a arătat că fluorescenţa telomerică medie per cromozom/genom în Gen 1 a fost 7.5 % ± 2.1% şi Gen 2 a fost 8.4% ± 1.8% din fluorescenţa telomerică per cromozom/genom în liniile celulare de control (linia celulară leucemică 1301). Datele arată că produşii Gen 2 în medie au lungime a telomerilor comparabilă cu produşii Gen 1. Lungimea telomerilor este o măsurare surogat a duratei culturii celulare ex vivo.
Figura 98 arată că produşii medicamentoşi Gen 2 secretă IFNγ în răspuns la activare CD3, CD28 şi CD137. Produşii medicamentoşi crioconservaţi s-au decongelat şi s-au incubat cu sfere acoperite cu anticorp aşa cum s-a descris anterior. Datele sunt exprimate ca o cantitate de IFNγ produsă de 5×105 celule viabile în 24h. Produşii medicamentoşi Gen 2 au prezentat o capacitate crescută de a produce IFNγ la reactivare faţă de produşii medicamentoşi Gen 1. Capacitatea produsului medicamentos de a fi reactivat şi de a secreta citokine este o măsură surogat a funcţiei in-vivo la legarea TCR de antigenul asociat în contextul HLA.
Figurile 99A şi 99B arată că produşii medicamentoşi Gen 2 au o diversitate mărită a receptorilot T celulari unici. Diversitatea receptorilor T celulari a fost evaluată după cum urmează. ARN din 10x106 TIL din Gen 1 şi Gen 2 s-a analizat pentru a determina numărul total şi frecvenţa secvenţelor CDR3 unice prezente în fiecare produs. (Figura 99A) Secvenţele CDR3 unice au fost reprezentate faţă de frecvenţă în fiecare produs pentru a produce un punctaj reprezentativ al diversităţii totale a receptorilor T celulari în produs. Produşii TIL din ambele procese au fost alcătuiţi din populaţii policlonale de celule T cu diferite specificităţi şi avidităţi antigenice. Gama repertoriului celular T total poate indica numărul epitopilor care pot acţiona pe celule tumorale.
Concluzii
Procesul de producţie Gen 2 a generat un produs TIL (LN-144) cu atribute calitative comparabile cu Gen 1. Gen 2 a produs doze similare de TIL foarte pure. Subseturile de celule T au fost în proporţii similare şi au exprimat molecule costimulatoare la niveluri comparabile faţă de Gen 1. TIL din Gen 2 au avut o tendinţă către lungime relativă mai mare a telomerilor porporţională cu perioada de cultură ex vivo redusă. TIL din Gen 2 au prezentat o diversitate crescută a receptorilor TCR care, la activare, au iniţiat secreţie mare a IFN-γ, o măsură a funcţiei efectoare citolitice. Astfel, procesul de expansiune scurtat de 22 de zile Gen 2 cu produs crioconservat prezintă o platformă de producţie TIL logistic fezabilă şi adaptabilă la scară care permite generarea rapidă a dozelor la scară clinică pentru pacienţi cu cancer care necesită imediat o opţiune de terapie nouă.
Referinţe
1 Dudley, M. E. et al. Adoptive cell transfer therapy following non-myeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma. J Clin Oncol 23, 2346-2357, doi:10.1200/JC0.2005.00.240 (2005).
2 Chandran, S. S. et al. Treatment of metastatic uveal melanoma with adoptive transfer of tumour-infiltrating lymphocytes: a single-centre, two-stage, single-arm, phase 2 study. Lancet Oncol, doi:10.1016/S1470-2045(17)30251-6 (2017).
3 Stevanovic, S. et al. Complete regression of metastatic cervical cancer after treatment with human papillomavirus-targeted tumor-infiltrating T cells. J Clin Oncol 33, doi:10.1200/jco.2014.58.9093 (2015).
4 FDA Reviewers and Sponsors: Content and Review of Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs), 21 CFR 610.3(r), 2008.
5 Richards JO, Treisman J, Garlie N, Hanson JP, Oaks MK. Flow cytometry assessment of residual melanoma cells in tumor-infiltrating lymphocyte cultures. Cytometry A 2012; 81:374-81.
EXEMPLUL 27: AMESTECUL DE FACTORI DE CREŞTERE T CELULARI IL-2/IL-15/IL-21 A CRESCUT EXPANSIUNEA ŞI FUNCŢIA EFECTOARE A CELULELOR T INFILTRANTE ÎN TUMORI ÎNTR-UN PROCES NOU DESCRIS ÎN PREZENTA
Bază
Terapia adoptivă cu celule T cu TIL autologe a demonstrat eficienţa clinică la pacienţi cu melanom metastatic şi carcinom de col uterin. În unele studii, rezultatele clinice mai bune s-au corelat pozitiv cu numărul total al celulelor perfuzate şi/sau procentajul celulelor T CD8+. Majoritatea regmurilor actuale de producţie utilizează doar IL-2 pentru a favoriza creşterea TIL. A fost raportată expansiune limfocitară cronică folosind regimuri cu IL-15 şi IL-21. Acest studiu descrie efectele pozitive şi sinergiile adăugării IL-15 şi IL-21 în aplicări ale procesului 2A şi procesului de producţie TIL din generaţia 2.
Generarea TIL folosind un proces nou descris în prezenta
Tumoarea este excizată de la pacient şi transportată la unitatea de producţie GMP sau la un laborator în scop de cercetare. La sosire, tumoarea a fost fragmentată şi aşezată în baloane cu IL-2 pentru pre-Protocolul de expansiune rapidă (REP) 11 zile. Pentru studiile cu amestec triplu, IL-2, IL-15 şi IL-21 (IL-2/IL-15/IL-21) s-au adăugat la iniţierea pre-REP. Pentru Protocolul de expansiune rapidă (REP), TIL au fost cultivate cu feeder şi anticorp anti-CD3 alte 11 zile (Figura 100).
Materiale şi metode
Procesul de generare TIL a inclus un pre-Protocol de expansiune rapidă (pre-REP), în care fragmentele tumorale cu dimensiune de 1-3 mm3 s-au aşezat în mediu conţinând IL-2. În timpul pre-REP, TIL au ieşit din fragmentele tumorale şi se amplifică în răspuns la stimulare IL-2.
Pentru a stimula şi mai mult creşterea TIL, TIL au fost amplificate printr-o a doua perioadă de cultură denumită Protocol de expansiune rapidă (REP) care a inclus PBMC feeder iradiate, IL-2 şi anticorp anti-CD3. Un protocol de expansiune scurtat pre-REP şi REP s-a dezvoltat pentru amplificarea TIL cu menţinerea atributelor fenotipice şi funcţionale ale produsului TIL final. Acest protocol de generare TIL scurtat s-a folosit pentru a evalua impactul IL-2 individual versus o combinaţie de IL2/IL-15/IL-21 adăugată în etapa pre-REP. Aceste două regimuri de cultură s-au comparat pentru generarea TIL crescute din tumori colorectale, melanom, de col uterin, mamare triplu negative, pulmonare şi renale. La încheierea pre-REP, TIL cultivate s-au evaluat cu privire la expansiune, fenotip, funcţie (CD107a+ şi IFNγ) şi repertoriul TCR Vβ.
Studiul indică creşterea expansiunii în timpul pre-REP cu IL-2/IL-15/IL-21 în histologii tumorale multiple. Culturile Pre-REP au fost iniţiate folosind protocolul IL-2 standard (6000 IU/mL) sau cu IL-15 (180 IU/mL) şi IL-21 (1 IU/mL) pe lângă IL-2 (Figura 101). Celulele s-au evaluat cu privire la expansiune la încheierea pre-REP. O cultură a fost clasificată ca având expansiune mărită faţă de IL-2 dacă creşterea totală a fost mărită cu cel puţin 20%. Studiile fenotipice şi funcţionale cu elanom şi tumoare pulmonară se discută mai detaliat în paragrafele următoare (text îngroşat în Figura 101).
IL-2/IL-15/IL-21 a crescut procentajul de celule CD8+ în carcinom pulmonar, dar nu în melanom. În Figurile 102A şi 102B, TIL din (A) melanom (n=4) şi (B) plămân (n=7) s-au evaluat fenotipic cu privire la celulele CD4+ şi CD8+ folosind citometrie în flux post pre-REP. Valoarea p reprezintă diferenţ dintre condiţiile IL-2 şi IL-12/IL-15/IL-21 folosind testul t student neîmperecheat.
Expresia CD27 a fost uşor mărită în celulele CD8+ din culturi tratate cu IL-2/IL-15/IL-21. În Figurile 103A şi 103B, TIL din (A) melanom (n=4) şi (B) plămân (n=7) s-au evaluat fenotipic cu privire la CD27+ şi CD28+ în celulele CD4+ şi CD8+ folosind citometrie în flux post pre-REP. Expresia CD27, un marker celular asociat cu un fenotip mai tânăr care s-a corelat cu rezultatele terapeiei T celulare adoptive, a fost uşor mărită în TIL CD8+ derivate din cultură cu IL-2/IL-15/IL-21 vs IL-2 individual.
Subseturile de celule T au fost nemodificate cu adăugarea IL-15/IL-21. În Figurile 104A şi 104B, TIL s-au evaluat fenotipic cu privire la subseturile de celule efectoare/memorie (CD45RA şi CCR7) în celulele CD8+ şi CD4+ (date nereprezentate) din (A) melanom (n=4) şi (B) plămân (n=8) prin citometrie în flux post pre-REP. TEM=memorie efectoare (CD45RA-, CCR7-), TCM=memorie centrală (CD45RA-, CCR7+), TSCM= memorie celule stem (CD45RA+, CCR7+), TEMRA=celule T efectoare (CD45RA+ CCR7-).
Capacitatea funcţională a TIL a fost mărită diferenţiat cu IL-2/IL-15/IL-21. În Figurile 105A şi 105B, TIL din (A) melanom (n=4) şi (B) plămân (n=5) s-au evaluat cu privire la expresia CD107a+ în răspuns la stimulare PMA 4 ore în celulele CD4+ şi CD8+ prin citometrie în flux. (C) TIL pre-REP derivate din melanom şi plămân au fost stimulate 24 ore cu anticorp anti-CD3 solubil şi supernatanţii s-au evaluat cu privire la IFNγ prin ELISA.
Frecvenţa relativă a repertoriului TCRvβ a fost modificată în răspuns la IL-2/IL-15/IL-21 în plămân, dar nu în melanom. În Figurile 106A şi 106B, repertoriul TCRvβ (24 specificităţi) s-a evaluat în TIL dintr-un (A) melanom şi (B) o tumoare pulmonară folosind kitul Beckman Coulter pentru citometrie în flux.
Rezumat
Această analiză demonstrează capacitatea amestecului IL-2/IL-15/IL-21 de a creşte numărul TIL comparativ cu IL-2 individual (>20%) în procesul de generare 2, pe lângă impactul asupra caracteristicilor fenotipice şi funcţionale.
Efectul amestecului triplu asupra expansiunii TIL a fost dependent de histologie. Raportul celulelor T CD8+/CD4+ a fost mărit la adăugarea IL-2/IL-15/IL-21 în tumori pulminare. Adăugarea IL-15 şi IL-21 a mărit expresia CD107a şi producţia IFNγ în TIL derivate din tumori pulmonare. Adăugarea IL-2/IL-15/IL-21 a modificat repertoriul TCRvβ în plămân. Procesul de expansiune TIL din generaţia 2 s-a folosit pentru a include amestecul de citokine IL-2/IL-15/IL-21, reprezentând aşadar un mijloc de a favoriza şi mai mult expansiunea TIL în histologii tumorale specifice, cum ar fi tumori pulmonare şi colorectale. Aceste observaţii sunt deosebit de relevante pentru optimizarea şi standardizarea regimurilor de cultură TIL necesare pentru producţia la scară mare a TIL cu aplicabilitatea şi disponibilitatea largă necesară a unei terapii anti-cancer principale.
EXEMPLUL 28: NOILE LIMFOCITE INFILTRANTE ÎN TUMORI (LN-144) CRIOCONSERVATE ADMINISTRATE PACIENŢILOR CU MELANOM METASTATIC AU DEMONSTRAT EFICIENŢĂ ŞI TOLERABILITATE ÎNTR-UN STUDIU CLINIC FAZA 2 ÎN CENTRE MULTIPLE
Bază
Siguranţa şi eficienţa terapiei celulare adoptive (ACT) utilizând limfocite infiltrante în tumori (TIL) au fost studiate la sute de pacienţi cu melanom metastatic şi au demonstrat rate de răspuns obiectiv semnificative şi durabile (ORR).1 Într-un studiu în faza 2 în desfăşurare, C-144-01 care utilizează producţie GMP centralizată a TIL, s-au evaluat procesele de generare TIL necrioconservate generaţia 1 (Gen 1) şi TIL crioconservate generaţia 2 (Gen 2).
Gen 1 are o durată de aproximativ 5-6 săptămâni (administrare în grupul 1 din studiul C-144-01), iar Gen 2 are o durată de 22 de zile (procesul 2A, administrare în grupul 2 din studiul C-144-01). Datele de la pacienţii din grupul 1 care au primit produsul Gen 1 LN-144 au fost încurajatoarea pentru tratarea pacienţilor cu melanom metastatic post-PD-1, terapia TIL producând răspunsuri.2 Beneficiile Gen 2 au inclus: (A) reducerea timpului de aşteptare al pacienţilor şi medicilor pentru administrarea TIL la pacient; (B) crioconservarea permite flexibilitatea programării, distribuţiei şi livrării; şi (C) reducerea costurilor de producţie. Sunt prezentate aici datele preliminare din grupul 2. Figura 107 reprezintă o aplicare a procesului de producţie LN-144 crioconservate Gen 2 (procesul 2A).
Planul studiului: C-144-01 faza 2 în melanom metastatic
Studiu faza 2, în centre multiple, cu 3 grupuri pentru evaluarea eficienţei şi siguranţei limfocitelor infiltrante în tumori (LN-144) autologe pentru tratarea pacienţilor cu melanom metastatic.
Criterii de includere: (1) melanom metastatic măsurabil şi ≥ 1 leziune rezecabilă pentru generarea TIL; (2) avansare cu cel puţin o linie anterioară de terapie sistemică; (3) vârsta ≥ 18; şi (4) ECOG PS 0-1.
Grupuri de tratatment: (1) produs LN-144 necrioconservat; (2) produs LN-144 crioconservat; şi (3) retratament cu LN-144 pentru pacienţi fără rspuns sau cu avansare după răspuns iniţial. Figura 108 indică planul studiului.
Obiective: (1) primar: eficienţa definită ca ORR şi (2) secundar: siguranţa şi eficienţa.
Metode
Set de siguranţă grupul 2: 13 pacienţi care au suferit rezecţie în scopul generării TIL şi au primit orice componentă a tratamentului studiat.
Set de eficienţă grupul 2: 9 pacienţi care au primit precondiţionare NMA-LD, perfuzie LN-144 şi cel puţin o doză de IL-2 şi au avut cel puţin o evaluare a eficienţei. 4 pacienţi nu au avut evaluare de eficienţă la momentul împărţirii subseturilor de date.
S-au indicat datele de biomarkeri pentru toate datele disponibile în subseturile de date.
Rezultate
Figura 109 reprezintă un tabel care ilustrează compararea caracteristicilor pacienţilor din grupul 1 (ASCO 2017) vs grupul 2. Grupul 2: 4 terapii anterioare medii; toţi pacienţii au primit anti-PD-1 şi anti-CTLA-4 anterior; şi au avut încărcătură tumorală mai mare reflectată de suma mai mare a diametrelor (SOD) pentru leziuni ţintă şi medie LDH mai mare la referinţă. Figura 110 prezintă un tabel indicând evenimentele adverse asociate cu tratamentul (≥ 30%).
Pentru grupul 2 (LN-144 crioconservat), caracteristicile produsului şi terapiei TIL au fost (1) număr mediu de celule TIL administrate: 37 × 109 şi (2) număr mediu de administrări de doze IL-2 a fost 4.5. Figura 111 reprezintă eficienţa produsului şi terapiei TIL pentru pacienţii #1 - #8.
Figura 112 reprezintă starea clinică a răspunsului pacienţilor evaluabili cu boală stabilă (SD) sau un răspuns mai bun Un răspuns parţial (PR) pentru pacientul 6 a fost neconfirmat, fiindcă pacientul nu a ajuns încă la a doua evaluare de eficienţă. Un pacient (pacientul 9) a decedat înainte de prima evaluarea (este considerat încă în setul de eficienţă).
Din cei 9 pacienţi din serul de eficienţă, un pacient (pacientul 9) nu a fost evaluabil (NE) din cauza decesului legat de melanom înainte de prima evaluarea tumorală nereprezentată în Figura 112. S-au observat răspunsuri la pacienţi trataţi cu Gen 2. Rata de control al bolii (DCR) a fost 78%. Timpul până la răspuns a fost similar cu grupul 1. Un pacient (pacientul 3) cu boală progresivă (PD) ca cel mai bun răspuns nu a fost inclus în grafic.
Figura 113 reprezintă modificarea procentuală a sumei diametrelor. Pacientul 9 nu a avut evaluare a bolii post-LN-144 din cauza decesului legat de melanom înainte de ziua 42. Ziua -14: modificarea % a sumei diametrelor de la screening la referinţă (ziua -14). Ziua -14 până în ziua 126: modificarea % a SOD de la referinţă. Ziua -14 = referinţă. ziua 0 = perfuzie LN-144.
La tratamentul TIL, s-a observat o creştere a HMGB1 (Figura 114). Nivelurile HMGB1 plasmatice s-au măsurat folosind kitul HMGB1 ELISA (Tecan US, Inc). Datele indicate reprezintă modificarea nivelurilor HMGB1 pre (ziua -7) şi post (ziua 4 şi ziua 14) perfuzie LN-144 la pacienţi din grupul 1 şi grupul 2 (valorile p s-au calculat folosind testul t împerecheat bidimensional pe baza datelor transformate logaritmic). Dimensiunea probelor (aldine şi italice) şi valorile medii (italice) sunt indicate în paranteze pentru fiecare interval. HMGB1 este secretat de celule imune activate şi eliberat de celule tumorale deteriorate. Nivelurile HMGB1 mărite după tratament cu LN-144 sugerează aşadar un mecanism mediat imunitar al activităţii anti-tumorale
Nivelurile IP-10 plasmatice s-au măsurat folosind testul Luminex. Datele indicate în Figura 115 reprezintă modificarea nivelurilor IP-10 pre (ziua -7) şi post (ziua 4 şi ziua 14) perfuzie LN-144 la pacienţii din grupul 1 şi grupul 2 (valorile p s-au calculat folosind testul t împerecheat bidimensional pe baza datelor transformate logaritmic). Dimensiunea probelor (aldine şi italice) şi valorile medii (italice) sunt indicate în paranteze pentru fiecare interval. Creşterea post-LN-144 a IP-10 este monitorizată pentru a înţelege posibila corelare cu persistenţa TIL.
Datele actualizate din grupul 2 (n = 17 pacienţi) sunt raportate în Figura 116 - Figura 121. În comparaţie cu grupul 1 şi o aplicare a procesului Gen 1, care au prezentat DCR de 64% şi o rată generală de răspuns (ORR) de 29% (N = 14), grupul 2 şi o aplicare a procesului Gen 2 au prezentat DCR de 80% şi ORR de 40% (N = 10).
Concluzii
Rezultatele preliminare din datele existente demonstează siguranţă comparabilă între produşii TIL LN-144 Gen 1 şi Gen 2. Administrarea TIL preparate cu procesul Gen 2 (procesul 2A, descris în prezenta) duce la răspunsuri clinice mărite în mod surprinzător observate la pacienţi cu melanom metastatic avansat, toţi prezentând avansare la terapiile anti-PD-1 şi anti-CTLA-4 anterioare. DCR pentru grupul 2 a fost 78%.
Datele de biomarkeri preliminare susţin mecanismul citolitic de acţiune propus pentru terapia TIL.
Aplicarea procesului de producţie Gen 2 descris în prezenta durează 22 de zile. Acest proces scurtează semnificativ durata de aşteptare a unui pacient pentru a primi TIL, conferă flexibilitate în programarea dozajului pacienţilor şi determină o scădere a costului de producţie, asigurând şi alte avantaje faţă de metodele anterioare care permit comercializarea şi autorizarea agenţiilor de reglementare sanitare. Datele clinice preliminare din melanomul metastatic folosind o aplicare a procesului Gen 2 indică de asemenea o îmbunătăţire surprinzătoare a eficienţei clinice a TIL, măsurată prin DCR, ORR şi alte răspunsuri clinice, cu un timp similar de răspuns şi profil de siguranţă similar comparativ cu TIL produse folosind procesul Gen 1. Eficienţa neaşteptat de îmbunătăţită a produsului TIL Gen 2 este demonstrată de asemenea de o creştere de peste cinci ori a producţiei IFN-γ (Figura 98), care se corelează cu eficienţă îmbunătăţită în general (Figura 122), policlonalitate îmbunătăţită semnificativ (Figura 99A şi Figura 99B) şi producţie IP-10 şi MCP-1 medie mai mare (Figura 123 - Figura 126). În mod surprinzător, în ciuda procesului Gen 2 mult mai scurt, multe alte caracteristici esenţiale ale produsului TIL sunt similare cu cele observate folosind procese mai tradiţionale, inclusiv lungimea relativă a telomerilor (Figura 97) şi expresia CD27 şi CD28 (Figura 96B şi Figura 96C).
Referinţe
1 Goff, et al. Randomized, Prospective Evaluation Comparing Intensity of Lymphodepletion Before Adoptive Transfer of Tumor-Infiltrating Lymphocytes for Patients With Metastatic Melanoma. J Clin Oncol. 2016 Jul 10;34(20):2389-97.
2 Sarnaik A, Kluger H, Chesney J, et al. Efficacy of single administration of tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) in heavily pretreated patients with metastatic melanoma following checkpoint therapy. J Clin Oncol. 2017; 35 [suppl; abstr 3045].
EXEMPLUL 29: STUDII HNSCC ŞI CARCINOM DE COL UTERIN FAZA 2
Înscriere în studiul HNSCC (carcinom cu celule scuamoase la cap şi gât; C-145-03) faza 2. 13 pacienţi şi-au dat consimţământul, s-au recoltat TIL de la 10 pacienţi şi în cele din urmă 7 pacienţi au primit tratament, încă unul fiind în curs de tratare.
Înscriere în studiul de carcinom de col uterin faza 2 (C-145-04). 8 pacienţi şi-au dat consimţământul, s-au recoltat TIL de la 4 pacienţi şi în cele din urmă 2 pacienţi au primit tratament, încă doi fiind în curs de tratare.
Datele iniţiale din studiul în desfăşurare sunt indicate în Figura 127. S-a observat boală stabilă (SD) şi/sau răspuns progresiv la pacienţii cu HCNSCC şi cancer de col uterin trataţi cu terapie TIL până la 84 de zile.
EXEMPLUL 30: PRODUCEREA UNEI TERAPII CU CELULE TIL CRIOCONSERVATE
Acest exemplu descrie realizarea procesului de terapie celulară TIL cGMP a Iovance Biotherapeutics, Inc. în baloane G-Rex conform bunelor practici de producţie curente. Acest material va fi realizat conform regulamentelor de bune practici US FDA (21 CFR Part 210, 211, 1270 şi 1271) şi standardelor ICH Q7 aplicabile pentru faza I a materialelor comerciale. 4.0 REFERINŢĂ PROCES Plan de expansiune
Zi estimată (post-însămânţare) Activitate Criterii ţintă Recipiente anticipate 0 Disecţie tumoare ≤ 50 fragmente tumorale dezirabile per G-Rex100MCS Balon G-Rex100MCS 1 11 Însămânţare REP 5 - 200 × 106 celule viabile per G-Rex500MCS Baloane G-Rex500MCS 1 16 Diviziune REP 1 × 109 celule viabile per G-Rex500MCS Baloane G-Rex500MCS ≤5 22 Recoltare Celule totale disponibile Pungi 3-4 CS-750
4.2 Volume balon: volum balon de lucru/balon G-Rex100MCS 1000 G-Rex500MCS 5000 4.3 Procedura de inspecţie
4.3.1 Personalul de producţie va efectua o inspecţie de 100% a pungilor de produs final în timpul procesului de umplere.
4.3.2 Se pregăteşte un recipient etichetat „Inspecţie nereuşită a produsului final».
4.3.3 Se inspectează următoarele atribute de respingere:
4.3.3.1 Particule vizibile mari (fibre, particule care nu au aceeaşi culoare precum suspensia etc.) (NOTĂ: Aglomeratele celulare/tisulare nu se vor considera rebuturi de particule).
4.3.3.2 Defecte ale integrităţii pungii, cum ar fi cusături/orificii de scurgere.
4.3.3.3 Etanşare incompletă a pungii de înveliş.
4.3.3.4 Etanşare deficitară.
4.3.3.5 Semn de cocoloaşe.
4.3.4 Se inspectează următoarele atribute de aspect acceptabile:
4.3.4.1 Pungă intactă
4.3.4.2 Nu există semne de cocoloaşe
4.3.5 Dacă nu se observă atribute de respingere, se returnează punga de produs final în lot.
4.3.6 Dacă se observă anumite atribute de respingere, se etichetează punga cu eticheta „Produs respins», se introduce punga în recipientul de depozitare „Respins».
4.4 Schema de flux a procesului (vezi Figura 128) 5.0 NOTE DE PROCES
5.1 Listele tipărite care conţin rezultatele finale ale datelor raportate trebuie ataşate la această evidenţă a lotului în zona desemnată. Fiecare listă trebuie etichetată cu numărul lotului, numărul etapei (dacă este cazul), iniţialele şi data. Dacă nu sunt disponibile liste tipărite, citirile se vor înregistra manual şi cu referire la comentarii în secţiunea de comentarii. Un al doilea operator va verifica datele.
5.2 Etapele procesului pot fi efectuate concomitent la obţinerea materialelor, în timpul configurării, post-procesare sau aşa cum se menţionează în descrierea etapei.
5.3 În această evidenţă a lotului, se presupune 1.0 mL/L = 1.0 g/kg, dacă nu se specifică altceva.
5.4 Dacă un material/consumabil critic trebuie înlocuit în secţiunea 7.1, se va face un comentariu în secţiunea 10.0 şi se vor contacta persoanele corespunzătoare.
5.5 Toate datele se rotunjesc la cea mai apropiată zecime (xx.x) sau în limitele toleranţei echipamentului utilizat (excluzând datele tipărite), cu excepţia cazului în care se menţionează altceva în evidenţa lotului.
5.6 Dacă echipamentul necesită calibrare pentru mai mult de un parametru, iar acele date de calibrare sunt diferite, se va înregistra cea mai devreme dată scadentă.
5.7 Toate măsurătorile CO2 înregistrate în această evidenţă de lot vor fi citite dintr-un analizor CO2 Vaisala de la League Island 1. Toate măsurătorile CO2 înregistrate în această evidenţă de lot vor fi citite de pe ecranul LED de la Commerce Center 3.
5.8 Toate incubatoarele pentru League Island 1 vor fi umidificate. Toate incubatoarele pentru Commerce Center 3 nu vor fi umidificate.
5.9 După deschidere, se aplică următoarele expirări la 2-8°C: ser uman, tip AB (HI) Gemini, 1 lună; 2-mercaptoetanol, 1 lună. Sulfatul de gentamicină, soluţie 50 mg/ml, poate fi păstrat la temperatura camerei 1 lună. Pungile care conţin 10 L de mediu AIM-V pot fi încălzite la temperatura camerei o singură dată până la 24 de ore înainte de utilizare.
5.10 Numărul de recepţie şi numărul de lot în Great Plains vor fi înregistrate în secţiunea 7.1 Materiale/Consumabile critice în cazul în care numărul de lot WuXi AppTec nu este alocat materialului (materialelor). Combinaţia dintre numărul de recepţie şi numărul de lot va înlocui numărul de lot WuXi AppTec pentru noile materiale achiziţionate, ca parte a implementării şi validării sistemului Great Plains.
5.11 Când se utilizează aparatul de sudare TSCD pentru îmbinări, se urmează instrucţiunile tipărite pe partea din faţă a maşinii. Se asigură că tubul este introdus corect, aşa cum se indică pe maşină. La încărcarea tubului, se asigură că tubul este introdus astfel încât o sudură anterioară să nu fie plasată sub clemele aparatului de sudare (unde este posibil). Se asigură de asemenea că rămâne suficient tub pentru etapele de după sudare. O pensă trebuie amplasată pe fiecare parte a tubului înainte de a începe procesul de sudare. După încheierea sudării, se inspectează sudura pentru a asigura că este etanşă şi uniformă în jurul tubului. Se strânge sau se rulează cu degetele de-a lungul îmbinării pentru a deschide sudura, apoi se îndepărtează pensa.
5.12 Înaintea utilizării în fiecare zi a dispozitivului de etanşare portabil SEBRA®, se curăţă şi se inspectează capul de etanşare pentru a asigura că funcţionează corect. Când se utilizează dispozitivul de etanşare portabil SEBRA® pentru separarea tuburilor, se creează trei etanşări apropiate una de cealaltă. Se asigură că exteriorul tubului este uscat pentru a preveni formarea arcului electric. Se separă sau se desprinde tubul prin ruperea etanşării din mijloc, dacă nu se indică altceva. A nu se aplica forţe opuse pe tub pentru a preveni separarea prematură a tubului în timpul evenimentelor de etanşare. A nu se reetanşa dacă prima încercare eşuează. Dacă este necesar, se efectuează „suduri de testare» utilizând dispozitivul de etanşare portabil şi se evaluează dispozitivul de etanşare portabil, după cum este necesar.
5.13 Se inspectează cu atenţie toate clemele şi pensele cu privire la defecte sau deteriorări care ar putea duce la o capacitate compromisă de a opri fluxul în mod adecvat sau o posibilă deteriorare a tubului.
5.14 Dacă notificarea Nucelocounter arată că numărările 1 şi/sau 2 sunt peste intervalul optim de numărare (5x104 - 5x106 înainte de a lua în calcul diluarea), N/A restul paginii de numărare a celulelor. Se pregăteşte o altă probă de soluţie celulară, diluată cu un factor de diluare adecvat ([factor de diluare nou]=[factor de diluare anterior]×[număr de celule raportat]÷[5×105]) pentru a obţine VCD sau „Celule vii» în intervalul optim. Dacă numărul de celule 1 şi/sau 2 este sub intervalul optim (prea diluat), se contactează managementul local, se înregistrează numărul de „celule vii» şi se realizează calculele. S-a asigurat că documentaţi numărul de celule în afara intervalului optim într-o notă de subsol în orice situaţie.
5.15 5.15 La înregistrarea informaţiilor privind recepţia tumorii, se asigură că ora îndepărtării tumorii de la pacient este convertită în Eastern Standard Time (EST) dacă nu este deja înregistrată ca atare în evidenţa lotului de expediere a tumorii. Timpul scurs de la îndepărtarea tumorii de la pacient până la recepţia tumorii în laborator trebuie calculat în EST.
5.16 În timpul recoltării din ziua 22, se pot utiliza două GatherexTM pentru a recolta TIL din baloanele G-Rex500MCS. Ambele unităţi pot fi utilizate pentru îndepărtarea supernatantului şi una dintre cele două unităţi se utilizează pentru colectarea TIL.
5.17 În timpul tuturor etapelor de procesare, numărul minim de personal permis în cadrul procedurii de procesare de gradul B este doi şi numărul maxim este zece (inclusiv personalul de procesare ambiant).
5.18 La împărţirea reactivilor la volume ≤1.0mL, a se clăti pipeta după distribuire.
5.19 Baloanele vor fi reincubate în timpul încălzirii mediilor şi în orice altă situaţie când nu sunt procesate activ. Etapele de incubare vor fi înregistrate numai la începutul şi la sfârşitul fiecărei secţiuni, atunci când este cazul. În zilele fără procesare programată, baloanele pot fi observate doar cu titlu informativ, conform managementului local sau clientului, fără igienizarea camerei sau monitorizarea echipamentului.
5.20 După finalizarea procesării în ziua 0, disecţia tumorii, însămânţarea şi incubarea baloanelor, toate fragmentele şi bucăţile rămase ale tumorii trebuie eliminate în mod corespunzător.
6.0 ECHIPAMENT
Lista echipamentelor: ziua 0 CM1 Prepararea mediului/prepararea spălăturii tumorale /disecţia tumorii: • Manometru Magnehelic • Cabinet de biosecuritate (BSC) • Incubator • Analizor CO2 • Micropipetă (100-1000µL) • Suport pipetă • Pompă repetitivă Baxa • Aparat de etanşare tuburi Sebra • Frigider 2-8°C • Congelator -80°C • Congelator -20°C • Cronometru Lista echipamentelor: Prepararea CM2/însămânţare REP ziua 11 • Manometru Magnehelic • Cabinet de biosecuritate (BSC) • Incubator • Incubator • Analizor CO2 • Baie uscată • Baie cu apă • CytoTherm • Aparat de sudare • Gatherex • NC200 NucleoCounter • Pompă repetitivă Baxa • Aparat de etanşare tuburi Sebra Lista echipamentelor: Prepararea CM2/însămânţare REP ziua 11 • Centrifugă • Micropipetă (100-1000µL) • Suport pipetă • Cronometru • Frigider 2-8°C • Congelator -80°C • Congelator cu viteză controlată • Congelator de depozitare LN2 (carantină) • Congelator -20°C Lista echipamentelor: Prepararea CM4/ziua 16 • Manometru Magnehelic • Cabinet de biosecuritate (BSC) • Incubator • Incubator • Analizor CO2 • Aparat de sudare • Aparat de sudare • Gatherex • NC200 NucleoCounter • Pompă repetitivă Baxa • Aparat de etanşare tuburi Sebra • Micropipetă (100-1000µL) • Suport pipetă • Frigider 2-8°C • Congelator -80°C Lista echipamentelor: Preparare, umplere, crioconservare ziua 22 • Manometru Magnehelic • Cabinet de biosecuritate (BSC) • Incubator • Incubator • Analizor CO2 • Aparat de sudare • Gatherex • NC200 NucleoCounter • Pompă repetitivă Baxa • Aparat de etanşare tuburi Sebra • Micropipetă (20-200µL) Suport pipetă Lista echipamentelor: Preparare, umplere, crioconservare ziua 22 • Suport pipetă • Frigider 2-8°C • Congelator -80°C • Congelator cu viteză controlată • Congelator de depozitare LN2 • Congelator de depozitare LN2 (carantină) • Sistem de procesare celulară LOVO
7.0 LISTA DE MATERIALE
Materiale: Prepararea mediului CM1/prepararea spălăturii tumorale/disecţie tumorală ziua 0
• Bisturie de unică folosinţă, sterile • Pipete serologice de 50 mL, sterile • Pipetă serologică de plastic de 1 mL, sterilă • Pipetă serologică de 10 mL, sterilă • Tub centrifug, 50mL, 28x114mm, bază conică, capac înşurubat, PP, steril • Pipetă serologică de 25 mL, sterilă • Pipetă serologică de 5 mL, sterilă • Filtru de cultură tisulară de unică folosinţă, seria MF75, 1000 mL, filtru aPES, 0.2 µm, steril • Pipete serologice de 100 mL • 2-mercaptoetanol 1000X, lichid, 55 mM în D-PBS • Soluţie de sare de sodiu echilibrată Hank (1X), lichidă, fără clorură de calciu, clorură de magneziu, magneziu sulfat • GlutaMAX 1-200 mM (100X), lichid • Vârfuri de pipetă ART Barrier, 1000µL, ambalate individual, sterile • Vas Petri de 150mm, extra-adânc, steril • Plăci de ataşare ultra-mici, cu 6 godeuri, suprafaţă de creştere godeu 9.5cm2, PS, sterile • Pipete de transfer universale Thermo Scientific Samco, 7.7mL, sterile • Set de transfer al fluidului cu pompă repetitivă cu conector luer exterior • Forceps lung 8", steril • Gentamicină sulfat, soluţie 50mg/mL • Forceps de unică folosinţă, 4.5", oţel inoxidabil, steril • Vas petri de 100 mm, steril, extra adânc • Sistem de distribuire a lichidului Pumpmatic • Gentamicină sulfat, soluţie 50mg/mL • Capac de seringă cu funcţie duală, roşu • RPMI-1640, flacon 1 L • Sistem închis balon G-Rex 100M • Rigle sterile • IL-2 reconstituit • Probă tumorală umană, cap şi gât □ N/A • Probă tumorală umană, col uterin □ N/A • Ser uman AB GemCell, inactivat termic □ N/A • Probă tumorală umană, melanom • Ser uman AB GemCell, inactivat termic Materiale: Prepararea CM2 /însămânţare REP ziua 11 • Seringă cu conector Luer, 60 mL ac steril 16G × 1.5", sterilă • Pipete serologice de 50 mL, sterile • Pipetă serologică de plastic de 1 mL, sterilă • Crioeprubete cu filet intern Nunc, sterile • Pipetă serologică de 10 mL, sterilă • Tub centrifugă, 15 mL • Tub centrifugă, 50 mL • Pipete serologice 100 mL • Seringă, 1 cc conector Luer steril • Seringă de 3 mL, vârf Luer-Lok, steril • Pipetă serologică de 5 mL, sterilă • Unitate de recepţie filtru Nalgene seria *MF75*, 250mL, sterilă • Unitate de recepţie filtru Nalgene seria MF75, 500mL, steril • Unitate filtru de unică folosinţă, sterilă, cu flux rapid, de 1000mL Nalgene, 0.22 µm PES • CryoStor CS-10 • 2-mercaptoetanol 1000X lichid, 55 mM în D-PBS • GlutaMAX 1-200 mM (100X), lichid • Vârfuri de pipetă sterile de 1,000 µL ART Barrier, ambalaj individual • Casete VIA1 • Recipient Transfer Pack, 1000 mL cu element de conectare, steril • Transfer Pack 300 mL cu element de conectare • Tampoane alcool sterile • Set de transfer al fluidului cu pompă repetitivă cu conector luer exterior • CTS AIM V flacon 1L • MACS GMP CD3 pur (OKT-3) • Gentamicină sulfat, soluţie 50mg/mL • Tub 4" cu ac şi adaptor de seringă • Seringă Luer-Lok 10 mL • Tuburi cu conector luer exterior cu patru ace • Set de administrare sânge gravitaţional tip Y fără situs de injecţie, filtru sânge 170µm • Sistem de distribuire a lichidului Pumpmatic • Pungă Labtainer 3 de 10L • Gentamicină sulfat, soluţie 50mg/mL • Seringă de 100mL • Pungă de cultură de 3000mL • Origen Cell Connect CC2 • Seringă cu capac cu funcţie duală, roşu • RPMI-1640, flacon de 1L • Sistem închis balon G-Rex 500M • IL-2 reconstituit • Celule feeder iradiante alogenice • Celule feeder iradiante alogenice • Ser uman, tip AB(HI) Gemini • Ser uman, tip AB(HI) Gemini Materiale: Prepararea CM4/ziua 16 • Seringă Luer-Lok, 60 mL sterilă • Pipetă serologică de plastic de 1 mL, sterilă • Crioeprubete cu filet interior Nunc, sterile • Pipete serologice 10 mL, sterile • Tub centrifugă, 15mL • Tub centrifugă, 50 mL • Pipete serologice 100 mL • Seringă Luer-Lock, sterilă, 3mL • Pipetă serologică 5 mL, sterilă • Seringă Luer-Lok 10 mL • Nalgene seria *MF75* • Unitate recepţie filtru, 250mL, sterilă • GlutaMAX1-200 mM (100X), lichid • Vârfuri de pipetă ART Barrier, 1000 µL, ambalate individual, sterile • Casete VIA1 Materialw: Prepararea CM4/ziua 16 • Recipient Transfer Pack, 1000 mL, cu element de conectare, steril • Tampoane alcool sterile • Set de transfer al fluidului cu pompă repetitivă cu conector luer exterior • CTS AIM-V 1000mL □ N/A • Tub transfer plasmă 4" cu adaptor conector luer interior • Seringă sterilă Luer-Lok de 30mL • CTS AIM V pungă de 10L • Sistem de distribuire a lichidului Pumpmatic • Pungă Labtainer 3 de 10L • Seringă cu capac cu funcţie duală, roşu • Sistem închis balon G-Rex500M • IL-2 reconstituit Materiale: Preparare, umplere, crioconservare ziua 22 • Seringă Luer-Lok, 60 mL, sterilă • Ac 16G × 1.5" steril • Pipete serologice 50 mL, sterile • Crioeprubete cu filet interior Nunc, sterile • Pipetă serologică de 10 mL, sterilă • Tub centrifugă, 15 mL • Tub centrifugă, 50 mL • Seringă 1cc Luer-Lok sterilă • Seringă 3 mL, vârf Luer-Lok, sterilă • Pipetă serologică de 25 mL, sterilă • Pipetă serologică de 5 mL, sterilă • Seringă Luer-Lok 10 mL • Pipete serologice 100 mL • Vârfuri de pipetă ART Barrier sterile, 200 µL, ambalaj individual • Casete VIA1 • Plasma-Lyte A injecţie 1L • Set de spălare celulară de unică folosinţă LOVO • Kit pungi auxiliare LOVO • Tampoane alcool sterile • Set de transfer al fluidului cu pompă repetitivă cu conector luer exterior • CTS AIM V flacon 1L • Albumină umană 25 % • Tub transfer plasmă 4" cu adaptor conector luer interior • Tuburi cu patru conectori luer exteriori • Administrare sânge gravitaţională • Set tip Y fără situs de injecţie, filtru sânge 170µm • Sistem de distribuire a lichidului Pumpmatic • Pungă Labtainer 3 de 10L • Seringă 100mL • Pungă crio CS750 • Pungă de cultură 3L • Origen Cell Connect CC2 • Seringă cu capac cu funcţie duală, roşu • Cryostor CS10, pungă 100mL • Ac de distribuţie, cu orificiu de evacuare • IL-2 reconstituit
8.0 Proces
DESCRIEREA ETAPELOR - INFORMAŢII PROCES
8.1 Ziua 0 prepararea mediului CM1
8.1.1 Se verifică igienizarea camerei, curăţarea liniilor şi materialele. Se confirmă igienizarea camerei.
8.1.2 Se asigură completarea tabelului de preprocesare.
8.1.3 Monitorizarea mediului. Înainte de procesare, a fost iniţiată monitorizarea mediului pre-procesare.
8.1.4 Mediul RPMI 1640 s-a preparat în BSC, folosind o pipetă de dimensiuni adecvate, s-au îndepărtat 100.0 mL din 1000 mL mediu RPMI 1640 şi s-au introdus într-un recipient de dimensiuni adecvate etichetat „Deşeuri».
8.1.5 În BSC s-au adăugat reactivi în flaconul de mediu RPMI 1640. S-au adăugat următorii reactivi în flaconul de mediu RPMI 1640, aşa cum se indică în tabel. S-au înregistrat volumele adăugate.
Cantitate adăugată per flacon: ser uman AB inactivat termic (100.0 mL); GlutaMax (10.0 mL); sulfat de gentamicină, 50 mg/mL (1.0 mL); 2-mercaptoetanol (1.0 mL)
8.1.6 Amestecarea mediului. Se astupă flaconul de mediu RPMI 1640 cu capac de la etapa 8.1.5 şi se agită flaconul pentru a asigura că reactivii s-au amestecat bine.
8.1.7 S-au filtrat mediile RPMI. S-au filtrat mediile RPMI 1640 de la etapa 8.1.6 prin unitate de filtrare de 0.22 microni 1L.
8.1.8 S-au etichetat mediile filtrate. S-au astupat aseptic mediile filtrate şi s-au etichetat cu următoarele informaţii.
8.1.9 S-au îndepărtat materialele inutile din BSC. S-au distribuit reactivii din BSC, lăsând sulfatul de gentamicină şi HBSS în BSC pentru prepararea mediului de spălare în secţiunea 8.2.
8.1.10 S-au depozitat consumabilele neutilizate. Se transferă toţi reactivii deschişi/decongelaţi rămaşi în condiţii de depozitare adecvate sau se aruncă la gunoi.
NOTĂ: S-a atribuit termenul de expirare corespunzător reactivilor conform Notei de proces 5.9 şi s-a etichetat cu numărul de înregistrare a lotului
8.1.11 S-a decongelată o parte alicotă de IL-2. S-a decongelat o parte alicotă de 1.1 mL IL-2 (6x106 IU/mL) (BR71424) până când toată gheaţa s-a topit. S-a înregistrat IL-2: # lot şi expirare (NOTĂ: se asigură că a fost ataşată eticheta IL-2).
8.1.12 S-a trabsferat soluţia de IL-2 în mediu. În BSC, s-a transferat 1.0 mL de soluţie de IL-2 în flaconul de mediu CM1 ziua 0 preparat în etapa 8.1.8. S-au adăugat mediu CM1 ziua 0 şi IL-2 6×106 IU/mL) 1.0 mL.
8.1.13 S-a amestecat şi s-a reetichetat. S-a acoperit şi s-a agitat flaconul pentru a amesteca mediile conţinând IL-2. S-a reetichetat ca „Mediu CM1 complet ziua 0» şi s-a alocat un număr de lot nou.
8.1.14 Se prelevează probe de mediu conform planului de prelevare. S-au îndepărtat 20.0 mL de mediu folosind o pipetă de dimensiuni adecvate şi s-au distribuit într-un tub conic de 50 mL.
8.1.15 S-a etichetat şi s-a depozitat. Proba a fost etichetată cu eticheta de inventar al planului de prelevare şi s-a depozitat proba „Mediu reţinut» la 2-8°C până când este trimisă la Login pentru testare conform planului de prelevare.
8.1.16 S-a semnat pentru prelevare. S-a asigurat că a fost completată foaia planului de prelevare LIMS pentru îndepărtarea probei.
8.1.17 S-a pregătit tubul conic „Bucăţi de ţesut». În BSC, s-au transferat 25.0 mL de „Mediu complet CM1 ziua 0» (preparat în etapa 8.1.13) într-un tub conic de 50 mL. Tubul a fost etichetat ca „Bucăţi de ţesut» şi numărul de înregistrare a lotului.
8.1.18 S-a introdus G-Rex100MCS în BSC. S-a introdus aseptic G-Rex100MCS (W3013130) în BSC.
8.1.19 S-a pregătit G-Rex100MCS. În BSC, s-au închis toate clemele pe G-Rex100MCS, lăsând clema filtrului de aerisire deschisă.
8.1.20 S-a pregătit G-Rex100MCS. S-a conectat linia roşie a balonului G-Rex100MCS la capătul cu diametrul mai mare al setului de transfer al fluidului cu pompă repetitivă (W3009497) prin conector luer.
8.1.21 S-a pregătit pompa Baxa. S-a montat pompa Baxa lângă BSC. S-a îndepărtat secţiunea de tubaj a setului de transfer al fluidului cu pompă repetitivă din BSC şi s-a instalat în pompa repetitivă.
8.1.22 S-a pregătit pentru pomparea mediului. În cadrul BSC, s-a scos seringa din sistemul de distribuire a lichidului Pumpmatic (PLDS) (W3012720) şi s-a aruncat.
NOTĂ: Se asigură că nu se compromite sterilitatea pipetei PLDS.
8.1.23 S-a pregătit pentru pomparea mediului. S-a conectat pipeta PLDS la capătul cu diametrul mai mic al setului de transfer al fluidului cu pompă repetitivă prin conectorul luer şi s-a introdus vârful pipetei în „Mediu complet CM1 ziua 0» (preparat la etapa 8.1.13) pentru aspiraţie.
S-au deschis toate clemele dintre mediu şi G-Rex100MCS.
8.1.24 S-a pompat mediul CM1 complet în balonul G-Rex100MCS. Viteza pompei s-a setat la „mare» şi „9» şi s-a pompat întregul mediu complet CM1 ziua 0 în balonul G-Rex100MCS. După ce s-a transferat întregul mediu, s-a golit linia şi s-a oprit pompa.
8.1.25 S-a deconectat pompa de la balon. S-a asigurat că toate clemele au fost închise pe balon, cu excepţia filtrului de aerisire. S-a îndepărtat setul de transfer al fluidului cu pompă repetitivă de la linia de mediu roşie şi s-a plasat un capac roşu (W3012845) pe linia de mediu roşie.
8.1.26 Etanşare termică. S-a îndepărtat balonul G-Rex100MCS din BSC, s-a etanşat termic (conform Notei de proces 5.12) de pe capacul roşu de la linia roşie din apropierea conectorului luer.
8.1.27 S-a etichetat G-Rex100MCS. Balon G-Rex100MCS s-a etichetat cu QA din eticheta „Ziua 0». S-a ataşat eticheta „Ziua 0» mai jos.
8.1.28 S-a monitorizat incubatorul. Parametri incubator: afişaj LED temperatură: 37.0±2.0°C; procentaj CO2: 5.0±1.5%CO2
8.1.29 S-a încălzit mediul. S-a aşezat tubul conic de 50 mL etichetat „Fragmente de ţesut» pregătit în etapa 8.1.17 şi G-Rex100MCS pregătit în etapa 8.1.27 în incubator ≥ 30 de minute de încălzire.
S-au înregistrat timpii de încălzire. S-a înregistrat dacă timpul de încălzire a fost ≥ 30 de minute (Da/Nu).
[Tub conic fragmente de ţesut sau GRex100MCS]
8.1.30 S-a revizuit secţiunea 8.1.
8.2 Ziua 0 Prepararea mediului de spălare tumorală
8.2.1 S-a adăugat gentamicină în HBSS. În BSC, s-au adăugat 5.0 ml gentamicină (W3009832 sau W3012735) la 1 flacon de 500 mL mediu HBSS (W3013128). S-au înregistrat volumele. S-a adăugat per flacon: HBSS (500.0 mL); sulfat de gentamicină, 50 mg/ml (5.0 mL)
8.2.2 S-a astupat flaconul HBSS şi s-a agitat. S-a acoperit HBSS conţinând gentamicină preparat în etapa 8.2.1 şi s-a agitat flaconul pentru a asigura că reactivii sunt bine amestecaţi.
8.2.3 S-a filtrat soluţia. S-a filtrat HBSS conţinând gentamicină preparat în etapa 8.2.1 printr-o unitate de filtru 1 L de 0.22 microni (W1218810).
8.2.4 S-a acoperit aseptic mediul filtrat şi s-a etichetat. S-a acoperit aseptic mediul filtrat şi s-a etichetat cu următoarele informaţii. A se continua la SECŢIUNEA 8.3.
8.2.5 S-a revizuit secţiunea 8.2.
8.3 Ziua 0 Procesarea tumorii
8.3.1 S-a obţinut tumoarea. S-a obţinut specimen de tumoare de la QAR şi s-a transferat imediat la 2-8°C pentru procesare. Se asigură că toate informaţiile necesare sunt înregistrate în evidenţa lotului de expediere a tumorilor.
8.3.2 S-au înregistrat informaţiile despre tumoare.
8.3.3 S-a ataşat eticheta tumorii. S-a aplicat adaos tumoare. Autocolant eliberare QAR de mai jos. S-a ataşat evidenţa lotului de expediere a tumorii #5.
8.3.4 S-au introdus în BSC materialele necesare pentru disecţia tumorii.
8.3.5 S-au deschis materialele. S-au deschis toate materialele din interiorul BSC, asigurând că nu se compromite sterilitatea articolelor.
8.3.6 S-au etichetat materialele. S-au etichetat trei tuburi conice de 50 ml: primul ca „Forceps», al doilea ca „Bisturiu» şi al treilea ca „Mediu proaspăt de spălare a tumorii». Vasele Petri de 5 × 100 mm au fost etichetate ca „Spălare 1», „Spălare 2», „Spălare 3», „Menţinere» şi „Nefavorabil». S-a etichetat o placă cu 6 godeuri ca „Fragmente intermediare favorabile».
8.3.7 Mediile de spălare tumorală au fost împărţite în părţi alicote. Folosind o pipetă de dimensiuni adecvate, s-au transferat 5.0 mL de "Mediu de spălare a tumorii" preparat în etapa 8.2.4 în fiecare godeu al unei plăci cu 6 godeuri pentru fragmente tumorale intermediare favorabile (30.0 mL în total). NOTĂ: forcepsurile şi bisturiele au fost depozitate în tuburile conice de mediu de spălare tumorală, după cum a fost necesar, în timpul proceselor de spălare şi disecţie a tumorii.
8.3.8 Mediile de spălare tumorală au fost împărţite în părţi alicote. Folosind o pipetă de dimensiuni adecvate, s-au transferat 50.0 mL de „Mediu de spălare a tumorii» preparat în etapa 8.2.4 în fiecare vas Petri de 100 mm pentru „Spălare 1», „Spălare 2», „Spălare 3» şi „Menţinere» (200.0 mL total).
8.3.9 Mediile de spălare tumorală au fost împărţite în părţi alicote. Folosind o pipetă de dimensiuni adecvate, s-au transferat 20.0 mL de „Mediu de spălare a tumorii» preparat în etapa 8.2.4 în fiecare tub conic de 50 mL (60.0 mL în total).
8.3.10 S-au pregătit capacele pentru bucăţile tumorale. S-au îndepărtat aseptic capacele de pe două plăci cu 6 godeuri. Capacele au fost utilizate pentru bucăţi tumorale selectate. NOTĂ: Pe parcursul procesării tumorii, NU S-AU încrucişat plăci de cultură tisulară şi capace deschise.
8.3.11 S-a introdus tumoarea în BSC. S-a introdus aseptic tumoarea în BSC. S-a înregistrat ora de începere a procesării.
8.3.12 Spălare tumorală 1 folosind forceps de 8" (W3009771), s-a îndepărtat tumoarea din flaconul de specimen şi s-a transferat în vasul "Spălare 1" pregătit în etapa 8.3.8.
NOTĂ: A se păstra soluţia în flaconul de specimen.
8.3.13 Spălare tumorală 1 folosind forceps, s-a spălat cu grijă tumoarea în timpul de la cronometrul de mai jos: specimen şi s-a lăsat ≥ 3 minute. S-a înregistrat timpul de spălare (MM:SS).
8.3.14 S-a pregătit proba de încărcare biologică în conformitate cu planul de prelevare. S-au transferat 20.0 mL (sau volumul disponibil) de soluţie din flaconul de specimen tumoral într-un tub conic de 50 mL conform planului de prelevare.
8.3.15 Proba a fost etichetată şi depozitată. S-a etichetat cu eticheta de inventar al planului de prelevare şi proba de încărcare biologică colectată în etapa 8.3.14 a fost depozitată la 2-8°C până când s-a trimis la testare.
8.3.16 S-a semnat pentru prelevare. S-a asigurat că a fost completată foaia planului de prelevare LIMS pentru îndepărtarea probei.
8.3.17 Spălare tumorală 2. Folosind un set nou de forcepsuri, s-a îndepărtat tumoarea din vasul „Spălare 1» şi s-a transferat în vasul „Spălare 2» pregătit în etapa 8.3.8.
8.3.18 Spălare tumorală 2. Folosind forcepsuri, s-a spălat specimenul tumoral prin agitare uşoară timp de ≥ 3 minute şi s-a lăsat să stea. S-a înregistrat timpul.
8.3.19 S-au pregătit picături de mediu de spălare a tumorii pentru bucăţile tumorale dorite. Folosind o pipetă de transfer, s-au aplicat 4 picături individuale de mediu de spălare a tumorii din tubul conic preparat în etapa 8.3.9 în fiecare dintre cele 6 cercuri de pe capacele răsturnate ale plăcilor cu 6 godeuri (2 capace). S-a aplicat o picătură suplimentară pe două cercuri pentru un total de 50 de picături.
8.3.20 Spălare tumorală 3. Folosind forcepsuri, s-a îndepărtat tumoarea din vasul „Spălare 2» şi s-a transferat în vasul „Spălare 3» pregătit în etapa 8.3.8.
8.3.21 Spălare tumorală 3. Folosind forcepsuri, s-a spălat specimenul tumoral prin agitare uşoară şi s-a lăsat să stea ≥ 3 minute. S-a înregistrat timpul.
8.3.22 S-a pregătit vasul de disecţie tumorală. S-a aşezat o riglă sub capacul vasului de 150 mm.
8.3.23 Tumoarea s-a transferat în placa de disecţie. Folosind forcepsuri, s-a transferat aseptic specimenul tumoral pe capacul vasului de disecţie de 150 mm.
8.3.24 S-a măsurat tumoarea. S-au aşezat toate bucăţile de specimen tumoral cap la cap şi s-au înregistrat lungimea totală aproximativă şi numărul de fragmente. S-a realizat o fotografie clară a fiecărui specimen tumoral.
8.3.25 S-a evaluat tumoarea. S-a evaluat tumoarea cu privire la ţesut necrotic/adipos. S-a evaluat dacă > 30% din întreaga suprafaţă tumorală observată este ţesut necrotic şi/sau adipos; dacă da, s-a contactat managementul local pentru a asigura că tumoarea are dimensiunea adecvată, apoi s-a trecut la etapa 8.3.26. S-a evaluat dacă < 30% din întreaga suprafaţă tumorală este ţesut necrotic sau adipos; dacă da, se continuă la etapa 8.3.27 şi NU a fost efectuată disecţia de curăţare.
8.3.26 Dacă este cazul: Disecţia de curăţare. Dacă tumoarea a fost mare şi s-a observat că > 30% din exteriorul ţesutului este necrotic/adipos, s-a efectuat „disecţia de curăţare» prin îndepărtarea ţesutului necrotic/adipos, păstrând însă structura interioară a tumorii folosind o combinaţie de bisturiu şi/sau forceps. NOTĂ: Pentru a menţine structura internă a tumorii, se foloseşte numai presiune de tăiere verticală. Nu s-a efectuat mişcare de tăiere cu bisturiul. NOTĂ: Ţesutul adipos, necrotic şi neesenţial s-au plasat într-un vas nefavorabil.
8.3.27 Disecţie tumoare. Folosind o combinaţie de bisturiu şi/sau forceps, s-a tăiat specimenul tumoral în fragmente egale, de dimensiuni adecvate (până la 6 fragmente intermediare). NOTĂ: Pentru a menţine structura internă a tumorii, se foloseşte numai presiune de tăiere verticală. c. NOTĂ: Se asigură că fragmentele intermediare nedisecate sunt complet scufundate în „Mediu de spălare a tumori» (preparat la etapa 8.2.4).
8.3.28 Fragmente tumorale intermediare transferate. S-a transferat fiecare fragment intermediar în vasul „de menţinere» de la etapa 8.3.8.
8.3.29 Fragmente tumorale disecate. S-a manipulat câte un fragment intermediar, s-a disecat fragmentul intermediar tumoral în recipientul de disecţie în bucăţi de aproximativ 3x3x3mm, minimizând cantitatea de ţesuturi hemoragice, necrotice şi/sau adipoase de pe fiecare bucată. NOTĂ: Pentru a menţine structura internă a tumorii, se foloseşte numai presiune de tăiere verticală. Nu s-a efectuat mişcare de tăiere cu bisturiul.
8.3.30 Bucăţi tumorale selectate. S-au selectat până la opt (8) bucăţi tumorale fără ţesut hemoragic, necrotic şi/sau adipos. S-a folosit rigla pentru referinţă. S-a continuat disecţia până când s-au obţinut 8 bucăţi favorabile sau a fost disecat întregul fragment intermediar. S-a transferat fiecare bucată selectată într-una dintre picăturile de „Mediu de spălare a tumorii» pregătite în etapa 8.3.19.
8.3.31 Fragmente intermediare depozitate pentru a preveni uscarea. După selectarea a până la opt (8) bucăţi din fragmentul intermediar, resturile fragmentului intermediar s-au plasat într-un singur godeu nou al plăcii cu 6 godeuri „Fragmente intermediare favorabile» pregătite în etapa 8.3.7. NOTĂ: Ţesutul adipos sau necrotic a fost introdus în vasul „Nefavorabil» (pregătit în etapa 8.3.6).
8.3.32 Disecţie repetată a fragmentelor intermediare. Se trece la următorul fragment intermediar, se repetă etapele 8.3.29-8.3.31 până când toate fragmentele intermediare au fost procesate, se iau bisturie şi forcepsuri curate după cum este necesar.
8.3.33 Determinarea numărului de bucăţi colectate. Dacă rămâne ţesut dezirabil, s-au selectat bucăţi de tumori favorabile suplimentare din placa cu 6 godeuri „fragmente intermediare favorabile» pentru a umple picăturile pentru un maxim de 50 de bucăţi. S-a înregistrat numărul total de bucăţi disecate create. NOTĂ: Se asigură menţinerea fragmentelor intermediare tumorale hidratate cu mediu de spălare, după cum este necesar, pe tot parcursul disecţiei. S-a înregistrat cantitatea totală de bucăţi disecate colectate.
8.3.34 Îndepărtarea tubului conic din incubator. S-a îndepărtat tubul conic „Bucăţi de ţesut» de 50 mL din incubator. S-a înregistrat timpul în etapa 8.1.29. Se asigură încălzirea tubului conic timp de ≥30 min.
8.3.35 Pregătirea tubului conic. S-a introdus tubul conic „Bucăţi de ţesut» de 50 mL în BSC, asigurând că nu se compromite sterilitatea suprafeţelor de procesare deschise.
8.3.36 Transferul bucăţilor tumorale în tubul conic de 50 mL. Folosind o pipetă de transfer, un bisturiu, forceps sau o combinaţie, s-au transferat cele mai bune 50 de fragmente tumorale selectate din capacele de vase favorabile în tubul conic „Bucăţi de ţesut» de 50 mL.
NOTĂ: Dacă o bucată de tumoare a fost scăpată în timpul transferului şi rămâne ţesut dezirabil, s-au adăugat bucăţi suplimentare din godeurile de fragmente intermediare tumorale favorabile. S-a înregistrat numărul de bucăţi.
8.3.37 Pregătirea BSC pentru G-REX100MCS. S-au eliminat toate elementele inutile din BSC pentru însămânţarea vasului, reţinând plăcile de ţesut favorabile dacă acestea au conţinut fragmente suplimentare.
8.3.38 Îndepărtarea G-REX100MCS din incubator. S-a îndepărtat din incubator G-Rex100MCS conţinând mediu. S-a finalizat etapa 8.1.29.
8.3.39 Introducerea balonului în BSC. S-a introdus aseptic balonul G-Rex100MCS în BSC. NOTĂ: La transferul balonului, nu se ţine de capacul sau de fundul vasului. S-a transferat vasul prin manipularea părţilor laterale. NOTĂ: S-au folosit doar şerveţele IPA la manipularea baloanelor G-Rex.
8.3.40 Adăugarea fragmentelor tumorale în balonul G-Rex100MCS. În BSC, capacul balonului G-Rex100MCS a fost ridicat, asigurând menţinerea sterilităţii tuburilor interne.
Tubul conic cu bucăţi de tumoare a fost agitat pentru suspensie şi s-a turnat rapid conţinutul în balonul G-Rex100MCS.
8.3.41 Distribuirea uniformă a bucăţilor. S-a asigurat că bucăţile tumorale au fost distribuite uniform pe membrana balonului. S-a înclinat uşor balonul înainte şi înapoi, dacă a fost necesar, pentru a distribui uniform bucăţile tumorale.
8.3.42 Înregistrarea numărului total de fragmente tumorale în vas. S-a înregistrat numărul de fragmente tumorale de pe membrana inferioară a vasului şi numărul observat de bucăţi flotante în vas. NOTĂ: Dacă numărul de fragmente însămânţate NU a fost echivalent cu numărul de fragmente colectate în etapa 8.3.36H, a se contacta managementul local şi a se documenta în secţiunea 10.0.
8.3.43 Incubarea balonului G-Rex. S-a incubat G-Rex100MCS la următorii parametri: balon G-Rex incubat: afişaj LED temperatură: 37.0±2.0°C; procentaj CO2: 5.0±1.5 %CO2
8.3.44 Calcularea ferestrei de incubare. S-au efectuat calcule pentru a determina momentul adecvat pentru îndepărtarea G-Rex100MCS din incubator în ziua 11. Calcule: timp de incubare; limita inferioară = timpul de incubare + 252 ore; limita superioara = timpul de incubare + 276 ore
8.3.45 Monitorizarea mediului. După procesare, s-au efectuat verificarea BSC şi monitorizarea personalului.
8.3.46 Materiale eliminate. Mediul neîncălzit rămas a fost depozitat la 2-8°C şi etichetat. După încheierea procesului, s-au aruncat tot mediul încălzit rămas şi părţile alicote decongelate de IL-2.
8.3.47 Trimiterea probei. Se asigură că toate probele din ziua 0 au fost trimise la Login şi transferate în LIMS.
8.3.48 Revizuire secţiune 8.3.
8.4 Ziua 11 - Prepararea mediului
8.4.1 Verificarea camerei, igienizare, golirea liniei şi materiale. S-a confirmat igienizarea camerei, eliberarea liniei şi că materialele sunt în termenul de valabilitate.
8.4.2 Tabel de preprocesare. Lista echipamentelor: BSC; cântar; aparat de etanşare tuburi Sebra; dispozitiv Gatherex™ pentru îndepărtarea mediului şi recuperarea celulelor; se asigură că placarda furnizată de QA este aşezată pe BSC corespunzător; se asigură că numărul de lot şi ID-ul pacientului furnizate de QA se potrivesc cu numărul de lot şi ID-ul pacientului din această evidenţă a lotului.
8.4.3 Monitorizarea incubatorului. Incubatorul a fost monitorizat. Parametri incubator:
afişaj LED temperatură: 37.0±2.0°C; procentaj CO2: 5.0±1.5 %CO2. NOTĂ: Secţiunea 8.4 poate fi desfăşurată concomitent cu secţiunea 8.5.
8.4.4 Încălzirea mediilor. S-au încălzit 3x flacon 1000 mL RPMI 1640 (W3013112) şi 3x flacon 1000 mL AIM-V (W3009501) într-un incubator timp de ≥ 30 de minute. S-a înregistrat timpul. Medii: RPMI 1640 şi AIM-V NOTĂ: Se ţine un flacon suplimentar 1x1000 ml de AIM-V (W3009501) la temperatura camerei pentru utilizare în etapa 8.5.34. S-a etichetat flaconul „Numai pentru diluări la numărarea celulelor» şi numărul de înregistrare a lotului.
8.4.5 Monitorizarea mediului. Înainte de procesare, a fost efectuată monitorizarea mediului pre-procesare, conform SOP-00344.
8.4.6 Îndepărtarea mediului RPMI 1640 din incubator. S-a îndepărtat mediul RPMI 1640 la atingerea timpului limită. Se înregistrează ora de încheiere a incubării în etapa 8.4.4. Se asigură că mediul a fost încălzit timp de ≥30 min.
8.4.7 Prepararea mediului RPMI 1640. În BSC, s-au îndepărtat 100.0 mL din fiecare dintre cele trei flacoane de 1000 mL de medii RPMI 1640 preîncălzite şi s-au introdus într-un recipient de dimensiuni adecvate etichetat „Deşeuri».
8.4.8 Adăugarea reactivilor în flaconul RPMI 1640 în BSC. În BSC s-au adăugat următorii reactivi în fiecare dintre cele trei flacoane de mediu RPMI 1640. S-au înregistrat volumele adăugate în fiecare flacon. Ser uman GemCell, inactivat termic tip AB (100.0 mL), GlutaMax (10.0 mL), sulfat de gentamicină, 50 mg/ml (1.0 mL), 2-mercaptoetanol (1.0 mL)
8.4.9 Filtrarea mediilor. S-au acoperit flacoanele de la etapa 8.4.8 şi s-au agitat pentru a asigura că reactivii au fost amestecaţi bine. S-a filtrat fiecare flacon de mediu printr-o unitate separată de filtru de 1 L de 0.22 microni.
8.4.10 Etichetarea mediilor filtrate. S-a acoperit aseptic mediul filtrat şi s-a etichetat fiecare flacon cu mediu CM1 ziua 11.
8.4.11 Decongelarea părţii alicote de IL-2. S-au decongelat 3 × 1.1mL părţi alicote de IL-2 (6x106 IU/mL) (BR71424) până când toată gheaţa s-a topit. S-a înregistrat numărul de lot IL 2 şi data de expirare.
NOTĂ: Se asigură că eticheta IL-2 este ataşată.
8.4.12 Îndepărtarea mediului AIM-V din incubator. S-au îndepărtat cele trei flacoane de mediu AIM-V din incubator.S-a înregistrat timpul final de incubare în etapa 8.4.4. Se asigură că mediul a fost încălzit timp de ≥ 30 de minute.
8.4.13 Adăugarea IL-2 în AIM-V. În BSC, folosind o micropipetă, s-au adăugat 3.0 mL de IL-2 decongelat într-un flacon de 1L de mediu AIM-V preîncălzit. Se clăteşte vârful micropipetei cu mediu după distribuirea IL-2. Se utilizează un vârf de micropipetă nou steril pentru fiecare parte alicotă. S-a înregistrat volumul total adăugat. Flaconul a fost etichetat ca „AIM-V conţinând IL-2».
8.4.14 Transferul materialelor. S-au transferat aseptic o pungă Labtainer de 10L şi un set de transfer cu pompă repetitivă în BSC.
8.4.15 Pregătirea pungii Labtainer de 10L. S-au închis toate liniile pe o pungă Labtainer de 10l. S-a ataşat capătul tubului cu diametrul mai mare al unui set de transfer cu pompă repetitivă la portul interior central al pungii Labtainer de 10L prin conectorul luer.
8.4.16 Pregătirea pompei Baxa. S-a montat pompa Baxa lângă BSC. S-a alimentat tubul setului de transfer prin pompa Baxa situată în afara BSC.
Setarea pompei Baxa la „mare» şi „9».
8.4.17 Pregătirea pungii Labtainer de 10L. În BSC, s-a îndepărtat seringa din sistemul de distribuire a lichidului Pumpmatic (PLDS) şi s-a aruncat. NOTĂ: Se asigură că nu se compromite sterilitatea pipetei PLDS.
8.4.18 Pregătirea pungii Labtainer de 10L. S-a conectat pipeta PLDS la capătul cu diametru mai mic al setului de transfer al fluidului cu pompă repetitivă prin conectorul luer şi s-a introdus vârful pipetei în flaconul de mediu AIM-V conţinând IL-2 (preparat în etapa 8.4.13) pentru aspiraţie. S-au deschis toate clemele dintre flaconul de mediu şi Labtainer 10L.
8.4.19 Pomparea mediului în Labtainer 10L. În BSC, folosind PLDS, se transferă mediul AIM-V preîncălzit conţinând IL-2 preparat în etapa 8.4.13, precum şi două flacoane AIM-V suplimentare în punga Labtainer de 10L. S-au adăugat cele trei flacoane de mediu CM1 ziua 11 filtrat din etapa 8.4.10. După adăugarea flaconului final, se goleşte linia către pungă. NOTĂ: Pompa a fost oprită între adăugarea fiecărui flacon de mediu.
8.4.20 Îndepărtarea Pumpmatic din punga Labtainer. S-a îndepărtat PLDS din setul de transfer şi s-a plasat un capac roşu pe conectorul luer al liniei în BSC.
8.4.21 Amestecarea mediilor. S-a masat uşor punga pentru a se amesteca.
8.4.22 Etichetarea mediului. În BSC, s-a etichetat punga cu mediu cu următoarele informaţii. Data expirării a fost 24 de ore de la data preparării.
8.4.23 Prelevarea probelor de mediu conform planului de prelevare. În BSC, s-a ataşat o seringă de 60 mL la portul interior disponibil al pungii „mediu CM2 complet ziua 11» preparat în etapa 8.4.22. S-au îndepărtat 20.0 mL de mediu şi s-au introdus într-un tub conic de 50 mL.
S-a aşezat un capac roşu pe portul interior al pungii „mediu CM2 complet ziua 11».
8.4.24 Etichetarea şi depozitarea probei. S-a etichetat cu eticheta de inventar al planului de prelevare şi s-a depozitat proba de reţinere a mediului la 2-8°C până când se trimite la Login pentru testare.
8.4.25 Semnare pentru prelevare. S-a asigurat că a fost completată foaia planului de prelevare LIMS pentru îndepărtarea probei.
8.4.26 Etanşarea liniei setului de transfer. În afara BSC, s-a etanşat termic (conform Notei de proces 5.12) capacul roşu pe linia setului de transfer. S-a păstrat setul de transfer pe pungă.
8.4.27 Pregătirea tuburilor de diluare pentru numărarea celulelor. În BSC, s-au adăugat 4.5 mL de mediu AIM-V etichetat cu „Pentru diluări de numărare a celulelor» şi numărul de lot în patru tuburi conice de 15 mL. S-au etichetat tuburile cu numărul lotului şi numărul tubului (1-4). 4 criofiole au fost etichetate cu „Feeder» şi numărul fiolei (1-4). Fiolele s-au păstrat sub BSC pentru utilizare în etapa 8.5.30.
8.4.28 Transferul reactivilor din BSC la 2-8°C. S-au transferat orice 2-mercaptoetanol, GlutaMax şi ser uman rămas din BSC la 2-8°C. S-a asigurat că toţi reactivii au fost etichetaţi cu numărul de înregistrare a lotului şi data de expirare corespunzătoare după deschidere conform Notei de proces 5.9.
8.4.29 Pregătirea pachetului de transfer de 1 L. În afara BSC se sudează (conform Notei de proces 5.11) un pachet de transfer de 1 L la setul de transfer ataşat la punga „Mediu CM2 complet ziua 11» pregătită în etapa 8.4.22. Pachetul de transfer a fost etichetat cu „Mediu CM2 celule feeder» şi numărul lotului.
8.4.30 Pregătirea pachetului de transfer de 1 L. S-a realizat un marcaj pe tubul pachetului de transfer de 1 L la câţiva inci de la pungă. S-a aşezat pachetul de transfer gol pe cântar, astfel încât tubul să fie pe cântar până la marcaj.
8.4.31 Aducerea cântarului la zero. Cântarul a fost adus la zero şi s-a lăsat pachetul de transfer gol pe cântar.
8.4.32 Pregătirea pachetului de transfer celule feeder. S-a setat pompa Baxa la „mediu» şi „4». S-au pompat 500.0 ± 5.0 mL de mediu "CM2 complet ziua 11" preparat în etapa 8.4.22 în pachetul de transfer mediu CM2 celular. S-a măsurat în greutate şi s-a înregistrat volumul mediului CM2 complet adăugat în pachetul de transfer.
8.4.33 Etanşarea termică a liniei. După umplere, s-a etanşat termic linia conform Notei de proces 5.12. S-a separat punga cu mediu CM2 ziua 11 cu setul de transfer de pachetul de transfer mediu celule feeder şi s-a păstrat sudată cu pachetul de transfer de 1L.
8.4.34 Dacă este cazul: pachetul de transfer al mediului pentru celule feeder a fost incubat. Când este cazul, se introduce pachetul de transfer „Mediu CM2 celule feeder» în incubator până la utilizare în etapa 8.6.6.
8.4.35 Incubarea mediului CM2 complet ziua 11. S-a introdus „Mediul CM2 complet ziua 11» preparat în etapa 8.4.22 în incubator până la utilizare în etapa 8.7.2.
8.4.36 Revizuire secţiune 8.4.
8.5 Ziua 11 - Recoltarea TIL
8.5.1 Tabel de preprocesare. Incubatorul a fost monitoriza. Parametri incubator: afişaj LED temperatură: 37.0±2.0°C; Procentaj CO2: 5.0±1.5 %CO2.
NOTĂ: Secţiunea 8.5 se poate desfăşura concomitent cu secţiunile 8.4 şi 8.6. 8.5.2 Îndepărtarea G-Rex100MCS din incubator. Se efectuează verificarea de mai jos pentru a asigura că parametrii de incubare sunt îndepliniţi înainte de îndepărtarea G-Rex100MCS din incubator. Limita inferioară de la etapa 8.3.44 B. Limita superioară de la etapa 8.3.44 C.
S-a înregistrat timpul de îndepărtare din incubator. Se determină: Este 8.3.44 B ≤ Timpul de îndepărtare din incubator < etapa 8.3.44 C? *DACĂ NU, A SE ACONTACTA MANAGEMENTUL LOCAL. Se îndepărtează cu grijă G-Rex100MCS din incubator şi se asigură că toate clemele au fost închise, cu excepţia liniei mari de filtru. S-a înregistrat ora de începere a procesării.
8.5.3 Pregătirea pachetului de transfer de 300 mL. S-a etichetat un pachet de transfer de 300 mL „Suspensie TIL».
8.5.4 Pregătirea pachetului de transfer de 300 mL. S-a sudat steril (în conformitate cu Nota de proces 5.11) transferul suspensiei TIL (linie unică) al unui filtru de sânge gravitaţional. Vezi, de exemplu, Figura 129.
8.5.5 Pregătirea pachetului de transfer de 300 mL. S-a aşezat pachetul de transfer de 300 mL pe un cântar şi s-a înregistrat greutatea uscată.
8.5.6 Pregătirea pachetului de transfer de 1 L. Pachetul de transfer de 1L s-a etichetat cu „Supernatant» şi numărul lotului.
8.5.7 Sudarea pachetelor de transfer de G-Rex100MCS. S-a sudat steril (conform Notei de proces 5.11) linia roşie de îndepărtare a mediului din G-Rex100MCS cu pachetul de transfer „Supernatant». S-a sudat steril linia de îndepărtare a celulelor clare din G-Rex100MCS cu una dintre cele două linii de analit de la partea superioară a filtrului de sânge conectat la pachetul de transfer „Suspensie TIL» pregătit în etapa 8.5.4. Vezi, de exemplu, Figura 130.
8.5.8 Configurarea GatheRex. S-a aşezat G-Rex100MCS pe partea stângă a GatheRex şi pachetele de transfer „Supernatant» şi „Suspensie TIL» în partea dreaptă.
8.5.9 Configurarea GatheRex. S-a instalat linia roşie de îndepărtare a mediului de la G Rex100MCS la clema de sus (marcată cu o linie roşie) şi ghidajele tubajului de pe GatheRex. S-a instalat linia de recoltare a celulelor clare de la G-Rex100MCS la clema de jos (marcată cu o linie albastră) şi ghidajele tubajului de pe GatheRex.
8.5.10 Configurarea GatheRex. S-a ataşat linia de gaz de la GatheRex la filtrul steril al balonului G-Rex100MCS. NOTĂ: Înainte de a îndepărta supernatantul din balonul G-Rex100MCS, se asigură că toate clemele de pe liniile de îndepărtare a celulelor au fost închise.
8.5.11 Reducerea volumului G-Rex100MCS. S-au transferat ~900 mL de supernatant de cultură din G-Rex100MCS în pachetul de transfer de 1L. S-a inspectat vizual balonul G-Rex100MCS pentru a asigura că balonul este echilibrat şi mediul a fost redus la capătul tubului de aspirare. NOTĂ: Dacă Gatherex se opreşte prematur, se reporneşte apăsând din nou butonul cu săgeata îndreptată spre dreapta.
8.5.12 Pregătirea balonului pentru recoltarea TIL. După îndepărtarea supernatantului, s-au închis toate clemele la linia roşie.
8.5.13 Iniţierea recoltării TIL. S-a înregistrat ora de începere a recoltării TIL.
8.5.14 Iniţierea recoltării TIL. Balonul a fost lovit puternic şi mediul a fost agitat pentru a elibera celulele. S-a efectuat o inspecţie a balonului pentru a asigura că s-au desprins toate celulele. NOTĂ: A se contacta managementul local dacă celulele nu s-au desprins.
8.5.15 Iniţierea recoltării TIL. S-a înclinat balonul de la tubul de colectare şi bucăţile tumorale au fost lăsate să se depună pe margine. S-a înclinat încet balonul spre tubul de colectare, astfel încât bucăţile să rămână pe partea opusă a balonului. NOTĂ: Dacă tubul de colectare a celulelor nu se află la joncţiunea dintre perete şi membrana inferioară, lovirea balonului în timp ce este înclinat la un unghi de 45° este de obicei suficientă pentru a poziţiona corect tubul.
8.5.16 Recoltarea TIL. S-au eliberat toate clemele care duc la pachetul de transfer Suspensie TIL.
8.5.17 Recoltarea TIL. Folosind GatheRex, s-a transferat suspensia celulară prin filtrul de sânge în pachetul de transfer de 300 mL. NOTĂ: A se asigura că se menţine marginea înclinată până când toate celulele şi mediile sunt colectate.
8.5.18 Recoltarea TIL. Se inspectează membrana cu privire la celule aderente.
8.5.19 Clătirea membranei balonului. S-a clătit partea inferioară a G-Rex100MCS. Se acoperă ~1/4 din membrana schimbătoare de gaz cu mediu de clătire. NOTĂ: Dacă bucăţile tumorale obstrucţionează linia de recoltare, se întrerupe colectarea apăsând „X» pe linia de colectare a celulelor. Se apasă butonul „Eliberare cleme» de pe Gatherex, se ridică pachetul de transfer şi se strânge uşor cu o presiune în creştere până când fragmentul este îndepărtat. A nu se strânge punga prea tare, deoarece acest lucru poate cauza ruperea liniei sau a pungii. Se reia colectarea după ce obstrucţia a fost îndepărtată.
8.5.20 Închiderea clemelor pe G-Rex100MCS. S-a asigurat că toate clemele sunt închise.
8.5.21 Etanşare termică. S-a etanşat termic (conform Notei de proces 5.12) pachetul de transfer suspensie TIL cât mai aproape posibil de sudare, astfel încât lungimea totală a tubului să rămână aproximativ aceeaşi.
8.5.22 Etanşare termică. Pachetul de transfer „Supernatant» a fost etanşat termic conform Notei de proces 5.12. S-a menţinut suficientă linie pentru sudare.
8.5.23 Calculul volumului suspensiei TIL. S-a înregistrat greutatea pachetului de transfer Suspensie TIL şi s-a calculat volumul suspensiei celulare.
8.5.24 Pregătirea pachetului de transfer al supernatantului pentru prelevare. S-a sudat (conform Notei de proces 5.11) un set de transfer plasmă de 4" la pachetul de transfer „supernatant», reţinând conectorul luer pe setul de transfer plasmă de 4", şi s-a transferat în BSC.
8.5.25 Pregătirea pachetului de transfer al suspensiei TIL pentru prelevare. S-a sudat (conform Notei de proces 5.11) un set de transfer plasmă de 4" la pachetul de transfer „Suspensie TIL» de 300 mL, s-a reţinut conectorul luer pe setul de transfer plasmă de 4" şi s-a transferat în BSC.
8.5.26 Extragerea probei Bac-T. În BSC, folosind o seringă de dimensiuni adecvate, se extrag aproximativ 20.0 mL de supernatant din pachetul de transfer „Supernatant» de 1 L şi se distribuie într-un tub conic steril de 50 mL etichetat „Bac-T». Se păstrează în BSC pentru utilizare în etapa 8.5.27.
8.5.27 Inocularea BacT conform planului de prelevare. S-a îndepărtat o probă de 1.0 mL din tubul conic de 50 mL etichetat BacT pregătit în etapa 8.5.26 folosind o seringă de dimensiuni adecvate şi s-a inoculat flaconul anaerob. S-a înregistrat timpul de inoculare a flaconului folosind spaţiul prevăzut pe eticheta flaconului. S-au repetat cele de mai sus pentru flaconul aerob. NOTĂ: Această etapă poate fi efectuat în afara secvenţei.
8.5.28 Etichetarea şi depozitarea probei. S-a etichetat cu eticheta de inventar al planului de prelevare şi s-a depozitat proba Bac-T la temperatura camerei, ferită de lumină, până când s-a trimis la Login pentru testare conform planului de prelevare. NOTĂ: A nu se acoperi codul de bare de pe flacon cu eticheta.
8.5.29 Semnare pentru prelevare probe. S-a asigurat că a fost completată foaia planului de prelevare LIMS pentru îndepărtarea probei.
8.5.30 Probe de numărare a celulelor TIL. S-au etichetat 4 criofiole cu numărul fiolei (1-4).
Folosind seringi de 3 mL separate, s-au extras probe de numărare celule de 4x1.0 mL din pachetul de transfer suspensie TIL folosind conectorul luer şi s-au introdus în criofiole.
8.5.31 Închiderea conectorului luer. S-a aşezat un capac roşu (W3012845) pe linie.
8.5.32 Incubarea TIL. S-a introdus pachetul de transfer TIL în incubator până când a fost necesar.
8.5.33 Numărarea celulelor. Numărarea celulelor şi calculele s-au efectuat folosind NC-200 şi Nota de proces 5.14. Se efectuează numărări iniţiale de celule nediluate.
8.5.34 Înregistrarea volumelor probelor de numărare celule. NOTĂ: Dacă nu este necesară diluarea, „Proba [µL]» = 200, „Diluare [µL]» = 0.
8.5.35 Determinarea factorului de multiplicare. Volumul total al probei de numărare a celulelor: 8.5.34A + 8.5.34B. Factor de multiplicare C ÷ 8.5.34A.
8.5.36 Selectarea protocoalelor şi introducerea factorilor de multiplicare. S-a asigurat că a fost selectat protocolul „Test de numărare a celulelor viabile», s-au introdus toţi factorii de multiplicare şi volumele de probă şi solvent. NOTĂ: Dacă nu este necesară diluare, se introduce „Probă [µL]» = 200, „Diluare [µL]» = 0
8.5.37 Înregistrarea numelui fişierului, a viabilităţii şi numărului de celule din Nucleoview
8.5.38 S-a determinat media concentraţiei de celule viabile şi viabilitatea numărărilor de celule efectuate. Viabilitate (8.5.37A + 8.5.37B) ÷ 2. Concentraţia celulelor viabile (8.5.37C + 8.5.37D) ÷ 2
8.5.39 Determinarea limitei superioare şi inferioare pentru numărări. Limita inferioară: 8.5.38F × 0.9. Limita superioară: 8.5.38F × 1.1.
8.5.40 Ambele numărări au fost în limite acceptabile? Limita inferioară: 8.5.37 C şi D ≥ 8.5.39G. Limita superioară: 8.5.37 C şi D ≤ 8.5.39H. *Dacă oricare dintre rezultate a fost „Nu», a fost efectuat al doilea set de numărări în etapele 8.5.41 - 8.5.48*.
8.5.41 Dacă este cazul: S-au efectuat numărări de celule. Numărările de celule şi calculele s-au efectuat folosind NC-200 şi Nota de proces 5.14. NOTĂ: Diluarea a fost ajustată în funcţie de concentraţia estimată a celulelor
8.5.42 Dacă este cazul: s-au înregistrat volumele de probă pentru numărarea celulelor.
8.5.43 Dacă este cazul: s-a determinat factorul de multiplicare. Volum total al probei de numărare a celulelor: 8.5.42A + 8.5.42B. Factor de multiplicare C ÷ 8.5.42A D
8.5.44 Dacă este cazul: s-au selectat protocoalele şi s-au introdus factori de multiplicare. S-a asigurat că a fost selectat protocolul „Test de numărare a celulelor viabile», s-au introdus toţi factorii de multiplicare şi volumele de probă şi solvent. NOTĂ: Dacă nu este necesară diluare, se introduce „Probă [µL]» = 200, „Diluare [µL]» = 0.
8.5.45 Dacă este cazul: înregistrarea numărului de celule din Nucleoview
8.5.46 Dacă este cazul: determinarea mediei concentraţiei de celule viabile şi a viabilităţii numărărilor de celule efectuate. S-a determinat concentraţia medie a celulelor viabile.
8.5.47 Dacă este cazul: s-au determinat limita superioară şi cea inferioară pentru numărări. Limita inferioară: 8.5.46F x 0.9. Limita superioară: 8.5.46F x 1.1.
8.5.48 Dacă este cazul: numărările au fost în limite acceptabile? Limita inferioară: 8.5.45 C şi D ≥ 8.5.47G. Limita superioară: 8.5.45 C şi D ≤ 8.5.47H. NOTĂ: Dacă oricare dintre rezultate este „Nu», se continuă cu etapa 8.5.49 pentru a determina o medie.
8.5.49 Dacă este cazul: s-a determinat o concentraţie medie a celulelor viabile din toate cele patru numărări efectuate. Concentraţia medie a celulelor viabile (A+B+C+D) ÷ 4 = MEDIE
8.5.50 Ajustarea volumului suspensiei TIL. S-a calculat volumul ajustat al suspensiei TIL după îndepărtarea probelor de numărare a celulelor. Volumul total al celulelor TIL din etapa 8.5.23C (A). Volumul probei îndepărtate de numărare a celulelor (4.0 ml) (B) Volumul total ajustat al celulelor TIL C=A-B.
8.5.51 Calculul celulelor TIL viabile totale. Concentraţie medie de celule viabile*: 8.5.38 F* sau 8.5.46 F* sau *8.5.49E*; Volumul total: 8.5.50; Celule viabile totale: C = A x B. *Se încercuieşte referinţa de etapă folosită pentru a determina concentraţia de celule viabile. NOTĂ: Dacă celulele TIL viabile totale sunt < 5x106 celule, a se contacta managementul local şi se trece la etapa 8.7.1. Dacă celulele TIL viabile totale sunt > 5×106, se continuă la etapa 8.5.52.
8.5.52 Calculul pentru citometrie în flux. Dacă numărul total de celule TIL viabile de la etapa 8.5.51C a fost ≥ 4.0×107, s-a calculat volumul pentru a obţine 1.0 x 107 celule pentru proba de citometrie în flux. *Dacă există <4.0×107 celule, N/A pentru câmpurile rămase din tabel. Se continuă la etapa 8.7.1. Celulele viabile totale necesare pentru citometria în flux: 1.0×107 celule. Volumul de celule necesar pentru citometria în flux: concentraţia celulelor viabile de la 8.5.51 împărţită la 1.0×107 celule A.
8.5.53 Dacă este cazul: s-au îndepărtat TIL din incubator . S-a îndepărtat suspensia TIL din incubator şi s-a înregistrat timpul de încheiere a incubării în etapa 8.5.32.
8.5.54 Dacă este cazul: s-a îndepărtat proba de citometrie în flux conform planului de prelevare. Folosind o seringă de dimensiuni adecvate, s-a îndepărtat volumul calculat (8.5.52 C) pentru proba de fenotipare din pachetul de transfer al suspensiei TIL şi s-a introdus într-un tub conic de 50 mL.
8.5.55 Dacă este cazul: probă de citometrie în flux a fost etichetată şi depozitată. S-a etichetat cu eticheta de inventar al planului de prelevare şi s-a depozitat proba de citometrie în flux la 2-8°C până când s-a trimis la Login pentru testare conform planului de prelevare.
8.5.56 Semnare pentru prelevare. Se asigură că a fost completată foaia planului de prelevare LIMS pentru îndepărtarea probei.
8.5.57 Dacă este cazul: recalcularea celulelor viabile totale şi a fluxului de volum. S-a calculat numărul total de celule viabile rămase şi volumul rămas după îndepărtarea probei de citometrie de mai jos.
Parametru Formula Rezultat TIL viabile totale Etapa 8.5.51C A. celule TIL îndepărtate pentru citometrie în flux 1×107 celule B. 1×107 celule TIL viabile totale rămase C=A-B C. celule Volum TIL Etapa 8.5.50C D. mL Volum TIL îndepărtate Etapa 8.5.52 C E. mL Volum rămas de TIL F=D-E F. mL
8.5.58 Dacă este cazul: Calculul volumului TIL. S-a calculat volumul suspensiei TIL egal cu 2.0×108 celule viabile.
Celule viabile totale necesare Celule viabile Volumul suspensiei TIL conţinând 2.0×108 celule viabile C=A÷B Concentraţie din etapa 8.5.51A A. 2.0×108 celule B. celule/mL C. mL
8.5.59 Dacă este cazul: Calculul volumului TIL pentru a elimina Calculul volumului excesiv de celule TIL de îndepărtat.
Volumul total al suspensiei TIL din etapa 8.5.57F Volumul suspensiei conţinând 2.0×108 TIL din etapa 8.5.58C Volumul TIL în surplus de îndepărtat C=A-B A. mL B. mL C. mL
8.5.60 Dacă este cazul: Îndepărtarea TIL în surplus. În BSC, folosind o seringă de dimensiuni adecvate, se îndepărtează volumul calculat (etapa 8.5.59C) din pachetul de transfer al suspensiei TIL. NOTĂ: A nu se utiliza o seringă de mai multe ori. A se utiliza seringi multiple dacă este cazul. S-a introdus în recipient steril de dimensiuni adecvate şi s-a etichetat cu dată şi numărul lotului. S-a aşezat un capac roşu pe linia pachetului de transfer „Suspensie TIL».
8.5.61 Dacă este cazul: introducerea TIL în incubator. S-a introdus pachetul de transfer al suspensiei TIL în incubator până când a fost necesar. S-a înregistrat timpul.
8.5.62 Dacă este cazul: Calcule. S-a calculat TIL în surplus totale îndepărtate. Etapa 8.5.51A Volum TIL de îndepărtat din etapa 8.5.59C. S-a calculat TIL în surplus totale îndepărtate.
Concentraţie celule viabile din etapa 8.5.51A Volum TIL de îndepărtat din etapa 8.5.59C TIL în surplus totale îndepărtate A. celule/mL B. mL C. celule
8.5.63 Dacă este cazul: Calcule. S-a calculat cantitatea de mediu CS-10 de adăugat în celulele TIL în surplus din etapa 8.5.62C. Concentraţia ţintă a celulelor pentru congelare este 1.0 × 108 celule/ml.
TIL în surplus totale îndepărtate etapa 8.5.62C Concentraţie ţintă pentru congelare Volum CS-10 de adăugat (mL) C=A÷B A. celule B. 1.0×108 celule/mL C. mL
8.5.64 Dacă este cazul: Centrifugarea surplusului de TIL. S-a centrifugat surplusul de suspensie celulară TIL. Viteză: 350 × g. Timp: 10:00 minute. Temperatură: ambiantă. Frânare: totală (9). Acceleraţie: totală (9).
8.5.65 Dacă este cazul: Observarea tubului conic. S-au înregistrat observaţiile: pelet observat? Supernatantul a fost limpede? *NOTĂ: Dacă oricare dintre răspunsuri este nu, se va contacta managementul local.
8.5.66 Dacă este cazul: Adăugarea CS-10. În BSC, se aspiră aseptic supernatantul. Se loveşte uşor fundul tubului pentru a resuspenda celulele în fluidul rămas. 8.5.67 Dacă este cazul: Adăugarea CS 10. Se adaugă încet volumul CS 10 calculat în etapa 8.5.63C
8.5.68 Dacă este cazul: Etichetarea fiolelor. Fiolele au fost etichetate cu etichetele furnizate de QA.
S-a ataşat o etichetă de probă.
8.5.69 Dacă este cazul: Umplerea fiolelor. S-a distribuit 1.0mL de suspensie celulară în criofiole de dimensiuni adecvate. NOTĂ: A nu se umple mai mult de 10 fiole cu surplus de TIL. 8.5.70 Dacă este cazul: Umplerea fiolelor. S-a distribuit volumul rezidual în criofiolă de dimensiuni adecvate conform SOP-00242. Dacă volumul este ≤0.5mL, se adaugă CS10 în fiolă până la un volum de 0.5mL.
8.5.71 Dacă este cazul: Umplerea fiolelor. S-a umplut o fiolă cu 1.0mL de CS 10 şi s-a etichetat "Martor".
8.5.72 Dacă este cazul: Înregistrarea numărului de fiole umplute. S-a înregistrat numărul de fiole umplute, fără a include martorul.
8.5.73 Dacă este cazul: Monitorizarea mediului. După procesare s-a verificat BSC şi s-a monitorizat personalul
TIL Crioconservare of Sample
8.5.74 Dacă este cazul: Calcularea volumului pentru crioconservare. S-a calculat volumul de celule necesar pentru a obţine 1×107 celule pentru crioconservare.
TIL viabile totale necesare pentru crioconservare Concentraţie celule viabile din etapa 8.5.51A Volum celule necesare pentru crioconservare C=A÷B A. 1×107 celule B. celule/mL C. mL
8.5.75 Dacă este cazul: Îndepărtarea probei pentru crioconservare. În BSC, folosind seringa de dimensiuni adecvate, s-a îndepărtat volumul calculat (etapa 8.5.74C) din pachetul de transfer al suspensiei TIL. S-a introdus în tub conic de dimensiuni adecvate şi s-a etichetat „Probă de conservare 1×107 celule», data şi numărul lotului. S-a aşezat un capac roşu (W3012845) pe pachetul de transfer al suspensiei TIL.
8.5.76 Dacă este cazul: Introducerea TIL în incubator. S-a introdus pachetul de transfer al suspensiei TIL în incubator până când este necesar.
8.5.77 Dacă este cazul: Probă de crioconservare. S-a centrifugat „Proba de crioconservare 1×107 celule» conform următorilor parametri: viteză: 350 x g, Timp: 10:00 minute, temperatură: ambiantă, frânare: completă (9). Acceleraţie: completă (9). NOTĂ: Se asigură că unităţile adecvate sunt setate cu privire la viteză şi timp pe centrifugă.
8.5.78 Dacă este cazul: Observarea tubului conic observat. S-au înregistrat observaţiile: pelet observat? Supernatantul a fost limpede? *NOTĂ: Dacă oricare dintre răspunsuri este nu, se va contacta managementul local.
8.5.79 Dacă este cazul: Adăugarea CS-10. În BSC, se aspiră aseptic supernatantul. Se loveşte uşor fundul tubului pentru a resuspenda celulele în fluidul rămas.
8.5.80 Dacă este cazul: Adăugarea CS-10. S-au adăugat încet 0.5 mL de CS10. S-a înregistrat volumul adăugat.
8.5.81 Dacă este cazul: Etichetarea fiolei. Fiola a fost etichetată cu etichetă emisă de QA.
8.5.82 Dacă este cazul: Umplerea fiolei. S-a distribuit volumul resuspendat în criofiola etichetată.
8.5.83 Dacă este cazul: Umplerea martorului. S-a umplut o altă fiolă cu 0.5 mL de CS10 şi s-a etichetat ca „Martor».
8.5.84 Dacă este cazul: S-a înregistrat numărul de fiole umplute, fără a include „martorul». Fiolele cu probă de crioconservare s-au umplut la ~0.5 mL
8.5.85 Dacă este cazul: Monitorizarea mediului. După procesare s-a verificat BSC şi s-a monitorizat personalul.
8.5.86 Revizuire secţiune 8.5
8.6 Ziua 11 - Celulele feeder
8.6.1 Obţinerea celulelor feeder. S-au obţinut 3 pungi de celule feeder cu cel puţin două numere de lot diferite din congelatorul LN2. Celulele s-au păstrat pe gheaţă carbonică până când au fost gata de decongelare. NOTĂ: Secţiunea 8.6 ar putea fi efectuată concomitent cu secţiunea 8.5.
8.6.2 Obţinerea celulelor feeder. S-au înregistrat informaţiile privind celulele feeder. S-a confirmat că s-au obţinut cel puţin două loturi diferite de celule feeder.
8.6.3 Pregătirea băii de apă sau Cryotherm. S-a pregătit baie de apă sau Cytotherm pentru decongelarea celulelor feeder.
8.6.4 Decongelarea celulelor feeder. Pungile de celule feeder s-au introdus în pungi cu fermoar individuale, pe baza numărului de lot, şi s-au decongelat la 37.0 ± 2.0°C în baia de apă sau Cytotherm timp de ~3-5 minute sau până când gheaţa a dispărut. S-au înregistrat timpii de decongelare de la cronometru.
8.6.5 Pregătirea echipamentului pentru celule feeder. S-a sudat (conform Notei de proces 5.11) 4S-4M60 la un CC2 Cell Connect (W3012820), înlocuind un singur racord al aparatului Cell Connect (B) cu capătul cu 4 racorduri al 4S-4M60 la (G). S-a sudat H cu G (vezi, de exemplu, Figura 131).
8.6.6 Dacă este cazul: Îndepărtarea mediului din incubator. S-a îndepărtat din incubator pachetul de transfer al mediului pentru celule feeder CM2 preparat în etapa 8.4.34.
8.6.7 Ataşarea pachetului de transfer al mediului. S-a sudat (conform Notei de proces 5.11) pachetul de transfer „Mediu CM2 pentru celule feeder» la un luer CC2. NOTĂ: Punga va fi ataşată pe partea echipamentului cu port de injecţie fără ac.
8.6.8 Echipament de transfer. S-a transferat ansamblul conţinând mediu CM2 complet ziua 11 în BSC.
8.6.9 Colectarea celulelor feeder decongelate. În BSC, s-au extras 10 mL de aer într-o seringă de 100 mL. Aceasta a înlocuit seringa de 60 mL de pe CC2.
8.6.10 Colectarea celulelor feeder decongelate. S-a şters fiecare port de pe pungile de celule feeder cu un tampon cu alcool înainte de a îndepărta capacul. Se înţeapă cele trei pungi feeder folosind trei dintre acele CC2. NOTĂ: Se menţine presiune constantă la orientarea acului într-o direcţie. Se asigură că nu se perforează partea laterală a portului.
8.6.11 Colectarea celulelor feeder decongelate. S-a deschis robinetul astfel încât linia de la pungile de celule feeder să fie deschisă şi linia către portul de injecţie fără ac să fie închisă.
8.6.12 Colectarea celulelor feeder decongelate. S-a extras conţinutul pungilor de celule feeder în seringă. Toate cele trei pungi s-au golit în acelaşi timp. După golirea pungilor de celule feeder, menţinând presiunea pe seringă, s-a blocat linia la pungile de celule feeder.
8.6.13 Înregistrarea volumului de celule feeder. Nu s-a îndepărtat seringa de la echipament. S-a înregistrat volumul total al celulelor feeder din seringă.
8.6.14 Adăugarea celulelor feeder în pachetul de transfer. S-a rotit robinetul astfel încât linia la pungile de celule feeder să fie închisă şi linia către pachetul de transfer al mediului să fie deschisă. Se asigură că linia la pachetul de transfer al mediului este deblocată.
8.6.15 Adăugarea celulelor feeder în pachetul de transfer. S-au distribuit celulele feeder din seringă în pachetul de transfer „Mediu CM2 celule feeder». S-a blocat linia la pachetul de transfer conţinând celulele feeder, lăsând seringa ataşată la echipament.
8.6.16 Amestecarea celulelor feeder colectate. S-a masat punga pentru a amesteca celulele feeder colectate în pachetul de transfer.
8.6.17 Etichetarea pachetului de transfer. S-a etichetat punga cu „Suspensie de celule feeder» şi numărul de lot.
8.6.18 Calcularea volumului total în pachetul de transfer. S-a calculat volumul total al suspensiei de celule feeder.
8.6.19 Îndepărtarea probelor de numărare a celulelor. Folosind o seringă de 3 mL separată pentru fiecare probă, s-au extras probe de numărare a celulelor de 4 x 1.0 mL din pachetul de transfer al suspensiei de celule feeder folosind portul de injecţie fără ac. S-a distribuit fiecare probă în criofiolele etichetate în etapa 8.4.27. NOTĂ: Se şterge portul de injecţie fără ac cu un tampon steril cu alcool (W3009488) şi se amestecă suspensia de celule feeder între fiecare prelevare de probă de numărare a celulelor.
8.6.20 Efectuarea numărărilor celulelor. S-au efectuat numărări de celule şi calcule folosind NC-200 şi Nota de proces 5.14. Probele de numărare a celulelor au fost diluate adăugând 0.5 mL de suspensie celulară în 4.5 mL de mediu AIM-V etichetat cu numărul de lot şi „Pentru diluări de numărare a celulelor». Acesta va da o diluare de 1:10. Se ajustează dacă este necesar.
8.6.21 Înregistrarea numărului de celule. Volume probe
8.6.22 Determinarea factorului de multiplicare
Parametru Formulă Rezultat Volum total probă de numărare celule 8.6.21A + 8.6.21B C. µL Factor de multiplicare C ÷ 8.6.21A D.
8.6.23 Selectarea protocoalelor şi introducerea factorilor de multiplicare. Se asigură că s-a selectat protocolul «Test de numărare a celulelor viabile», s-au introdus toţi factorii de multiplicare şi volumele de probă şi solvent. 8.6.24 S-au înregistrat numele fişierului, viabilitatea şi numerele de celule din Nucleoview. 8.6.25 S-au determinat media concentraţiei de celule viabile şi viabilitatea celulelor.
Parametru Formula Rezultat Viabilitate (8.6.24A + 8.6.24B) ÷ 2 E. % Concentraţie celule viabile (8.6.24C + 8.6.24D) ÷ 2 F. celule/mL
8.6.26 S-au determinat limita superioară şi cea inferioară pentru numărări.
Parametru Formula Rezultat Limita inferioară 8.6.25F × 0.9 G. celule/mL Limita superioară 8.6.25F × 1.1 H. celule/mL
8.6.27 Ambele numărări au fost în limite acceptabile?
Parametru Formula Rezultat (da/nu) Limita inferioară 8.6.24 C şi D ≥ 8.6.26G Limita superioară 8.6.24 C şi D ≤ 8.6.26H
NOTĂ: Dacă oricare rezultat a fost «nu», s-a efectuat un al doilea set de numărări în etapele 8.6.28 - 8.6.35.
8.6.28 Dacă este cazul: Efectuarea numărărilor de celule. S-au efectuat numărările de celule şi calculele folosind NC-200 conform SOP-00314 şi Nota de proces 5.14
NOTĂ: Diluarea poate fi ajustată pe baza concentraţiei estimate de celule.
8.6.29 Dacă este cazul: S-au înregistrat numărul de celule, volumele probelor. NOTĂ: Dacă nu este necesară diluare, se introduce «Probă [µL]» = 200, «Diluare [µL]» = 0.
8.6.30 Dacă este cazul: S-a determinat factorul de multiplicare.
Parametru Formulă Rezultat Volum total al probei de numărare a celulelor 8.6.29A + 8.6.29B C. mL Factor de multiplicare C ÷ 8.6.29A D.
8.6.31 Selectarea protocoalelor şi introducerea factorilor de multiplicare. Se asigură că s-a selectat protocolul «Test de numărare a celulelor viabile», s-au introdus toţi factorii de multiplicare şi volumele de probă şi solvent. NOTĂ: Dacă nu este necesară diluare, se introduce «Probă [µL]» = 200, «Diluare [µL]» = 0.
8.6.32 Dacă este cazul: S-au înregistrat numerele de celule din Nucleoview
8.6.33 Dacă este cazul: S-au determinat media concentraţiei de celule viabile şi viabilitatea celulelor.
Parametru Formulă Rezultat Viabilitate (8.6.32A + 8.6.32B) ÷ 2 E. % Concentraţie celule viabile (8.6.32C + 8.6.32D) ÷ 2 F. celule/mL
8.6.34 Dacă este cazul: S-au determinat limita superioară şi cea inferioară pentru numărări.
Parametru Formulă Rezultat Limita inferioară 8.6.33F × 0.9 G. celule/mL Limita superioară 8.6.33F × 1.1 H. celule/mL
8.6.35 Dacă este cazul: Numărările au fost în limite acceptabile?
Parametru Formulă Rezultat (da/nu) Limita inferioară 8.6.32 C şi D ≥ 8.6.34G Limita superioară 8.6.32 C şi D ≤ 8.6.34H
NOTĂ: Dacă oricare rezultat a fost «nu» s-a continuat la etapa 8.6.36 pentru a determina o concentraţie medie totală a celulelor viabile şi s-au efectuat calculele. 8.6.36 Dacă este cazul: S-a determinat o concentraţie medie a celulelor viabile din toate cele patru numărări efectuate. 8.6.37 Ajustarea volumului suspensiei de celule feeder. S-a calculat volumul ajustat al suspensiei de celule feeder după îndepărtarea probelor de numărare a celulelor. Volumul total al celulelor feeder din etapa 8.6.18C minus 4.0 mL îndepărtaţi. 8.6.38 S-au calculat celulele feeder viabile totale.
Parametru Formulă Rezultat Concentraţia medie a celulelor viabile* 8.6.25 F* -or-8.6.33 F* or-8.6.36 E* A. celule/mL Volum total 8.6.37 C B. mL Celule viabile totale AxB C. celule
Dacă celulele viabile totale sunt < 5 ×109, se trece la etapa 8.6.39. Dacă celulele viabile totale sunt ≥ 5 ×109, se trece la etapa 8.5.70.
8.6.39 Dacă este cazul: Obţinerea celulelor feeder suplimentare. S-a obţinut o pungă de celule feeder suplimentară din congelatorul LN2. Se păstrează pe gheaţă carbonică până când este gata de decongelare.
8.6.40 Dacă este cazul: Obţinerea celulelor feeder suplimentare. S-au înregistrat informaţiile privind celulele feeder.
8.6.41 Dacă este cazul: Decongelarea celulelor feeder suplimentare. S-a introdus a patra pungă de celule feeder într-o pungă cu fermoar şi s-a decongelat la 37.0 ± 2.0°C într-o baie de apă sau Cytotherm ~3-5 minute sau până când gheaţa a dispărut. S-a înregistrat timpul de decongelare.
8.6.42 Dacă este cazul: Colectarea celulelor feeder suplimentare. In the BSC, În BSC, s-au extras 10 mL de aer într-o seringă de 100 mL nouă. Aceasta a înlocuit seringa de pe echipament. 8.6.43 Dacă este cazul: Colectarea celulelor feeder suplimentare. S-a şters portul de pe punga de celule feeder cu un tampon cu alcool înainte de a îndepărta capacul. S-a înţepat punga de celule feeder folosind unul dintre acele rămase pe echipamentul pregătit în etapa 8.6.7 NOTĂ: Se menţine presiune constantă la orientarea acului într-o direcţie. Se asigură că nu se perforează partea laterală a portului.
8.6.44 Dacă este cazul: Colectarea celulelor feeder suplimentare. S-a deschis robinetul astfel încât linia de la punga de celule feeder să fie deschisă şi linia către portul de injecţie fără ac să fie închisă.
8.6.45 Dacă este cazul: Colectarea celulelor feeder suplimentare. S-a extras conţinutul pungii de celule feeder în seringă. S-a înregistrat volumul.
8.6.46 Dacă este cazul: Măsurarea volumului. S-a măsurat volumul celulelor feeder din seringă şi s-a înregistrat mai jos (B). S-a calculat noul volum total al celulelor feeder.
Volumul celulelor feeder din etapa 8.6.37C Volumul celulelor feeder din etapa 8.6.45 Volumul total al celulelor feeder C=A+B A. mL B. mL C. mL
8.6.47 Dacă este cazul: Adăugarea celulelor feeder în pachetul de transfer. S-a rotit robinetul astfel încât linia la punga de celule feeder să fie închisă şi linia către pachetul de transfer al "suspensiei de celule feeder" să fie deschisă. Se asigură că linia la pachetul de transfer este deblocată. S-au distribuit celulele feeder din seringă în pachetul de transfer al "suspensiei de celule feeder". S-a blocat linia la pachetul de transfer şi seringa a fost lăsată ataşată de echipament.
8.6.48 Dacă este cazul: Adăugarea celulelor feeder în pachetul de transfer. S-a masat punga pentru a amesteca celulele feeder colectate în pachetul de transfer al suspensiei de celule feeder.
8.6.49 Dacă este cazul: Prepararea diluărilor. În BSC, se adaugă 4.5mL de mediu AIM-V etichetat cu «Pentru diluări de numărare a celulelor» şi numărul de lot în patru tuburi conice de 15mL. Se etichetează tuburile cu numărul de lot şi numărul tubului (1-4). S-au etichetat 4 criofiole cu "Feeder suplimentare" şi numărul fiolei (1-4).
8.6.50 Dacă este cazul: Pregătirea numărărilor celulelor. Folosind o seringă de 3mL separată pentru fiecare probă, s-au îndepărtat 4 × 1.0mL probe de numărare a celulelor din pachetul de transfer al suspensiei de celule feeder, folosind portul de injecţie fără ac. S-a distribuit fiecare probă în criofiole etichetate în etapa 8.6.49. NOTĂ: S-a şters portul de injecţie fără ac cu un tampon steril cu alcool şi s-a amestecat suspensia de celule feeder între fiecare prelevare de probe pentru numărarea celulelor.
8.6.51 Dacă este cazul: Efectuarea numărărilor de celule. S-au efectuat numărările de celule şi calculele folosind NC-200 şi Nota de proces 5.14. S-au diluat probele de numărare a celulelor adăugând 0.5mL de suspensie celulară în 4.5mL de mediu AIM-V etichetat cu numărul de lot şi «Pentru diluări de numărare a celulelor». Se va obţine o diluare 1:10. Se ajustează dacă este necesar.
8.6.52 Dacă este cazul: S-au înregistrat volumele probelor de numărare a celulelor.
8.6.53 Dacă este cazul: S-a determinat factorul de multiplicare
Parametru Formulă Rezultat Volum total al probei de numărare a celulelor 8.6.52A + 8.6.52B C. µL Factor de multiplicare C = 8.6.52A D.
8.6.54 Dacă este cazul: Selectarea protocoalelor şi introducerea factorilor de multiplicare. Se asigură că s-a selectat protocolul «Test de numărare a celulelor viabile», s-au introdus toţi factorii de multiplicare şi volumele de probă şi solvent. 8.6.55 Dacă este cazul: S-au înregistrat numele fişierului, viabilitatea şi numerele de celule din Nucleoview. 8.6.56 Dacă este cazul: Se determină media concentraţiei de celule viabile şi viabilitatea celulelor.
Parametru Formulă Rezultat Viabilitate (8.6.55A + 8.6.55B) ÷ 2 E. % Concentraţie celule viabile (8.6.55C + 8.6.SSD) ÷ 2 F. celule/mL
8.6.57 Dacă este cazul: Se determină limita superioară şi cea inferioară pentru numărări.
Parametru Formulă Rezultat Limita inferioară 8.6.56F × 0.9 G. celule/mL Limita superioară 8.6.56F × 1.1 H. celule/mL
Sunt ambele numărări în limite acceptabile? NOTĂ: Dacă oricare rezultat este "nu", se efectuează al doilea set de numărări în etapele 8.5.59 - 8.5.65
8.6.59 Dacă este cazul: Efectuarea numărărilor de celule. S-au efectuat numărările de celule şi calculele folosind NC-200 şi Nota de proces 5.14. NOTĂ: Diluarea poate fi ajustată pe baza concentraţiei estimate de celule.
8.6.60 Dacă este cazul: S-au înregistrat volumele probelor de numărare a celulelor. NOTĂ: Dacă nu a fost necesară diluare, s-a introdus «Probă [µE]» = 200, «Diluare [µL]» = 0
8.6.61 Dacă este cazul: S-a determinat factorul de multiplicare.
Parametru Formulă Rezultat Volum total al probei de numărare a celulelor 8.6.60A + 8.6.60B C. µL Factor de multiplicare C = 8.6.60A D.
8.6.62 Dacă este cazul: Selectarea protocoalelor şi introducerea factorilor de multiplicare. Se asigură că s-a selectat protocolul «Test de numărare a celulelor viabile», s-au introdus toţi factorii de multiplicare şi volumele de probă şi solvent. NOTĂ: Dacă nu a fost necesară diluare, s-a introdus «Probă [µE]» = 200, «Diluare [µL]» = 0 8.6.63 Dacă este cazul: S-au înregistrat numerele de celule din Nucleoview.
8.6.64 Dacă este cazul: S-au determinat media concentraţiei de celule viabile şi viabilitatea celulelor.
Parametru Formulă Rezultat Viabilitate (8.6.63A + 8.6.63B) ÷ 2 E. % Concentraţie celule viabile (8.6.63C + 8.6.63D) ÷ 2 F. celule/mL
8.6.65 Dacă este cazul: S-au determinat limita superioară şi cea inferioară pentru numărări
Parametru Formulă Rezultat Limita inferioară 8.6.64F × 0.9 G. celule/mL Limita superioară 8.6.64F × 1.1 H. celule/mL
8.6.66 Dacă este cazul: Numărările au fost în limite acceptabile?
Parametru Formulă Rezultat (da/nu) Limita inferioară 8.6.63 C şi D ≥ 8.6.65G Limita superioară 8.6.63 C şi D ≤ 8.6.65H
NOTĂ: Dacă oricare rezultat a fost «nu», se continuă la etapa 8.6.67 pentru a determina o concentraţie medie totală a celulelor viabile şi se efectuează calculele.
8.6.67 Dacă este cazul: S-a determinat o concentraţie medie a celulelor viabile din toate cele patru numărări efectuate.
8.6.68 Dacă este cazul: Ajustarea volumului suspensiei de celule feeder. S-a calculat volumul ajustat al suspensiei de celule feeder după îndepărtarea probelor de numărare a celulelor. Volumul total al celulelor feeder din Etapa 8.6.46C minus 4.0 mL îndepărtaţi.
8.6.69 Dacă este cazul: S-au calculat celulele feeder viabile totale.
Parametru Formulă Rezultat Concentraţie medie a celulelor viabile* 8.6.56 F* A. celule/mL -sau- 8.6.64 F* -sau- 8.6.67 E* Volum total 8.6.68 C B. mL Celule viabile totale AxB C. celule *Se încercuieşte referinţa de etapă folosită pentru a determina concentraţia celulelor viabile.
8.6.70 Calculul volumului celulelor feeder. S-a calculat volumul suspensiei de celule feeder necesar pentru a obţine 5×109 celule feeder viabile.
Număr de celule feeder necesare Concentraţie celule viabile din etapa 8.6.38A* sau etapa 8.6.69A* Volum celule feeder = 5×109 celule viabile C=A=B A. 5×109 celule viabile B. celule/mL C. mL *Se încercuieşte etapa aplicabilă
8.6.71 Calculul volumului de celule feeder în exces. S-a calculat volumul celulelor feeder în exces de îndepărtat. Se rotunjeşte la cel mai apropiat număr întreg.
Volum total al celulelor feeder în pachetul de transfer din etapa 8.6.46C* sau etapa 8.6.68C* Volum de celule feeder = 5×109 celule viabile din etapa 8.6.70C Volum de celule feeder în exces de îndepărtat. celule viabile C=A-B A. mL B. mL C. mL *Se încercuieşte etapa aplicabilă
8.6.72 Îndepărtarea celulelor feeder în exces. Într-o seringă nouă de 100 mL, s-au extras 10 mL de aer şi s-a ataşat seringa la echipament.
8.6.73 Îndepărtarea celulelor feeder în exces. S-a deschis linia către pachetul de transfer „Suspensie celule feeder». Folosind seringa, s-a extras volumul de celule feeder calculat în etapa 8.6.71C plus încă 10.0 mL din pachetul de transfer într-o seringă de 100 mL. S-a închis linia la pachetul de transfer al suspensiei de celule feeder după îndepărtarea volumului de celule feeder. Nu s-a îndepărtat seringa finală. NOTĂ: Odată ce o seringă a fost umplută, se înlocuieşte cu o seringă nouă. Se pot folosi mai multe seringi pentru a îndepărta volumul total. Cu fiecare seringă nouă, se extrag 10 mL de aer.
8.6.74 Înregistrarea volumului. S-a înregistrat volumul total (inclusiv cei 10 mL suplimentari) de celule feeder îndepărtate.
8.6.75 Adăugarea OKT3. În BSC, folosind o seringă de 1.0 mL şi un ac 16G, s-au extras 0.15 mL de OKT3.
8.6.76 Adăugarea OKT3. S-a îndepărtat aseptic acul din seringă şi s-a ataşat seringa la portul de injecţie fără ac. S-a injectat OKT3.
8.6.77 Adăugarea OKT3. S-a deschis robinetul la pachetul de transfer „Suspensie celule feeder» şi s-au adăugat 10 mL de celule feeder îndepărtate în etapa 8.6.73 pentru curgerea OKT3 prin linie.
8.6.78 Adăugarea OKT3. S-a întors seringa invers şi s-a împins aer pentru a curăţa linia către pachetul de transfer al suspensiei de celule feeder.
8.6.79 Adăugarea OKT3. S-a lăsat restul de suspensie de celule feeder în seringă. S-au închis toate clemele şi s-a îndepărtat echipamentul din BSC.
8.6.80 Etanşare termică. S-a etanşat termic (conform Notei de proces 5.12) pachetul de transfer al suspensiei de celule feeder, lăsând suficient tub pentru sudare. S-a îndepărtat echipamentul .
8.6.81 Revizuire secţiune 8.6
8.7 Ziua 11 Umplere şi însămânţare G-Rex
8.7.1 Configurare G-Rex500MCS. În exteriorul BSC, s-a scos un G-Rex500MCS din ambalaj şi s-a inspectat balonul cu privire la orice fisuri sau îndoituri în tub. S-a asigurat că toate conexiunile luer şi închiderile au fost etanşe. S-au închis toate clemele de pe liniile G-Rex500MCS, cu excepţia liniei filtrului de aerisire. Folosind un marker, s-a trasat o linie la gradaţia de 4.5 L.
8.7.2 Îndepărtarea mediului din incubator. S-a îndepărtat „Mediul CM2 complet ziua 11» preparat în etapa 8.4.35 din incubator.
8.7.3 Pregătirea pompării mediului. Linia roşie a G-Rex500MCS a fost sudată (conform Notei de proces 5.11) la setul de transfer cu pompă repetitivă ataşat la mediul CM2 complet ziua 11.
8.7.4 Pregătirea pompării mediului. S-a suspendat punga „Mediu CM2 complet ziua 11» pe un suport IV. S-a alimentat tubulatura pompei prin pompa Baxa.
8.7.5 Pomparea mediului în G-Rex500MCS. Pompa Baxa a fost setată la „mare» şi „9». S-au pompat 4.5 L de mediu în G-Rex500MCS, umplând până la linia marcată pe balon în etapa 8.7.1.
8.7.6 Etanşare termică. S-a etanşat termic (conform Notei de proces 5.12) linia roşie a G-Rex500MCS lângă sudura creată în etapa 8.7.3.
8.7.7 Etichetarea balonului. S-a etichetat balonul cu eticheta Ataşare o probă „ziua 11» furnizată de QA.
8.7.8 Dacă este cazul: incubarea balonului. Balonul a fost menţinut în incubator în timp ce se aşteaptă însămânţarea cu TIL.
8.7.9 Sudarea pachetului de transfer al suspensiei de celule feeder la balon. Linia roşie a G-Rex500MCS a fost sudată steril (conform Notei de proces 5.11) la pachetul de transfer „Suspensie de celule feeder».
8.7.10 Adăugarea celulelor feeder în G-Rex500MCS. S-au deschis toate clemele dintre suspensia de celule feeder şi G-Rex500MCS şi s-a adăugat suspensia de celule feeder în balon prin alimentare gravitaţională. Se asigură că linia a fost complet curăţată.
8.7.11 Etanşare termică. S-a etanşat termic (conform Notei de proces 5.12) linia roşie în apropierea sudurii create în etapa 8.7.9.
8.7.12 Sudarea pachetului de transfer al suspensiei TIL la balon. S-a sudat steril (conform Notei de proces 5.11) linia roşie a G-Rex500MCS la pachetul de transfer „Suspensie TIL».
8.7.13 Adăugarea TIL în G-Rex500MCS. S-au deschis toate clemele dintre suspensia TIL şi G-Rex500MCS şi s-a adăugat suspensia TIL în balon prin alimentare gravitaţională. Se asigură că linia a fost complet curăţată.
8.7.14 Etanşare termică. S-a etanşat termic (conform Notei de proces 5.12) linia roşie în apropierea sudurii create în etapa 8.7.12 pentru a îndepărta punga de suspensie TIL.
8.7.15 Incubarea G-Rex500MCS. S-a verificat dacă toate clemele de pe G-Rex500MCS au fost închise, cu excepţia liniei mari de filtru, şi s-a introdus în incubator. Parametrii incubatorului: afişaj LED temperatură: 37.0±2.0°C, procentaj CO2: 5.0±1.5 %CO2.
8.7.16 Calculul ferestrei de incubare. S-au efectuat calcule pentru a determina timpul corespunzător de îndepărtare a G-Rex500MCS din incubator în ziua 16. Timp de incubare (etapa 8.7.15). Limita inferioară: timpul de incubare + 108 ore. Limita superioară: timpul de incubare + 132 ore.
8.7.17 Monitorizarea mediului. După procesare s-a verificat BSC şi s-a monitorizat personalul.
8.7.18 Trimiterea probelor. S-au trimis probe la Login.
8.7.19 Revizuire secţiune 8.7
8.8 Ziua 11 Crioconservarea TIL în exces
8.8.1 Dacă este cazul: congelarea fiolelor TIL în exces. S-a verificat dacă CRF a fost configurat înainte de congelare. S-a efectuat crioconservarea.
8.8.2 Dacă este cazul: pornirea CRF. S-a înregistrat numărul total de fiole introduse în CRF (fără a include martorul). S-a verificat dacă numărul de fiole transferate în CRF se potriveşte cu numărul total de fiole pregătite în etapa 8.5.72 sau etapa 8.5.84
8.8.3 Dacă este cazul: iniţierea porţiunii automate a profilului de congelare. S-a înregistrat ORA DE START pentru iniţierea porţiunii automate a profilului de congelare.
8.8.4 Dacă este cazul: transferul fiolelor din congelatorul cu viteză controlată în depozitul corespunzător. După congelare, s-au transferat fiolele din CRF în recipientul de depozitare corespunzător.
8.8.5 Dacă este cazul: transferul fiolelor în depozitul corespunzător. S-a înregistrat locul de depozitare în LN2.
8.8.6 Revizuire secţiunea 8.8
8.9 Ziua 16 Pregătirea mediului
8.9.1 Preîncălzirea mediului. S-au scos trei pungi de mediu CTS AIM V 10L de la 2-8°C cu cel puţin 12 ore înainte de utilizare şi s-au aşezat la temperatura camerei, ferite de lumină. S-a verificat dacă fiecare pungă a fost în termenul de valabilitate. S-a etichetat fiecare pungă cu numărul pungii (1-3), numărul lotului, data şi „ora de începere a încălzirii OOMM». S-au înregistrat ora şi data de începere a încălzirii.
8.9.2 Calculul timpului. Mediul de la etapa 8.9.1 a fost încălzit. S-a calculat timpul de încălzire al pungilor cu mediu 1, 2 şi 3 de la etapa 8.9.1. S-a asigurat că toate pungile au fost încălzite pe o durată cuprinsă între 12 şi 24 de ore.
8.9.3 Verificarea igienizării camerei, golirea liniei şi materiale. S-au confirmat igienizarea camerei, golirea liniei şi materialele.
8.9.4 S-a asigurat completarea tabelului de preprocesare.
8.9.5 Monitorizarea mediului. Înainte de procesare, s-a asigurat iniţierea monitorizării mediului înainte de procesare.
8.9.6 Configurarea 10L Labtainer pentru supernatant. În BSC s-a ataşat capătul cu diametrul mai mare al unui set de transfer al fluidului la unul dintre porturile interioare ale unei pungi Labtainer de 10 L folosind conectorii luer.
8.9.7 Configurarea 10L Labtainer pentru supernatant. S-a etichetat cu „Supernatant» şi numărul lotului.
8.9.8 Configurarea Labtainer 10L pentru supernatant. S-a asigurat că toate clemele au fost închise înaintea îndepărtării din BSC. NOTĂ: Punga de supernatant a fost utilizată în timpul recoltării TIL (secţiunea 8.10), care poate fi efectuată concomitent cu prepararea mediului.
8.9.9 Decongelarea IL-2. S-au decongelat 5x1.1mL părţi alicote de IL-2 (6×106 IU/mL) (BR71424) per pungă de mediu CTS AIM V până când toată gheaţa s-a topit.
S-au înregistrat numărul lotului IL-2 şi data de expirare. S-au ataşat etichete IL-2.
8.9.10 Distribuirea GlutaMax. În BSC, s-au distribuit 100.0 mL de Glutamax într-un recipient de dimensiuni adecvate. S-a înregistrat volumul adăugat în fiecare recipient NOTĂ: Iniţial s-a preparat o pungă de mediu AIM-V după etapa 8.9.10 - etapa 8.9.28. Pungile suplimentare necesare au fost determinate în etapa 8.10.59.
8.9.11 Etichetarea recipientelor. S-a etichetat fiecare recipient cu „GlutaMax».
8.9.12 Adăugarea IL-2 în GlutaMax. Folosind o micropipetă, s-au adăugat 5.0 mL de IL-2 în fiecare recipient GlutaMax. S-a clătit vârful conform Notei de proces 5.18 şi s-a folosit un vârf de pipetă nou pentru fiecare mL adăugat. S-a înregistrat volumul adăugat în fiecare recipient Glutamax.
8.9.13 Etichetarea recipientelor. S-a etichetat fiecare recipient cu „GlutaMax + IL-2» şi numărul recipientului.
8.9.14 Pregătirea pungii de mediu CTS AIM V pentru preparare. S-a asigurat că punga de mediu CTS AIM V 10L (W3012717) s-a încălzit la temperatura camerei, protejată de lumină timp de 12-24 de ore înainte de utilizare. S-a înregistrat timpul final de incubare în etapa 8.9.2.
8.9.15 Pregătirea pungii de mediu CTS AIM V pentru preparare. În BSC, s-a închis clema pe un set de transfer plasmă 4", apoi s-a conectată la pungă folosind porturile de ac. NOTĂ: Se menţine presiune constantă la orientarea acului într-o direcţie. Se asigură că nu se perforează partea laterală a portului.
8.9.16 Pregătirea pungii de mediu CTS AIM V pentru preparare. S-a conectat capătul cu diametrul mai mare al unui set de transfer al fluidului cu pompă repetitivă la setul de transfer plasmă de 4" prin luer.
8.9.17 Montarea pompei Baxa. S-a montat pompa Baxa langa BSC. S-a îndepărtat secţiunea de tubulatură a pompei din setul de transfer al fluidului cu pompă repetitivă din BSC şi s-a instalat în pompa repetitivă.
8.9.18 Pregătire pentru prepararea mediului. În BSC, s-a îndepărtat seringa din sistemul de distribuire a lichidului Pumpmatic (PLDS) şi s-a aruncat. NOTĂ: Se asigură că nu se compromite sterilitatea pipetei PLDS.
8.9.19 Pregătire pentru prepararea mediului. S-a conectat pipeta PLDS la capătul cu diametru mai mic al setului de transfer al fluidului cu pompă repetitivă prin conectorul luer şi s-a plasat vârful pipetei în „GlutaMax + IL-2» preparat în etapa 8.9.13 pentru aspiraţie. S-au deschis toate clemele dintre recipient şi punga de 10 L.
8.9.20 Pomparea GlutaMax +IL-2 în pungă. S-a setat viteza pompei la „medie» şi „3» şi s-a pompat tot „GlutaMax + IL-2» în punga de mediu CTS AIM V de 10L. După ce nu mai rămâne nici o soluţie, se goleşte linia şi se opreşte pompa. S-a înregistrat volumul de GlutaMax conţinând IL-2 adăugat în fiecare pungă Aim V. Înregistrat!
8.9.21 Îndepărtarea PLDS. S-a asigurat că toate clemele au fost închise şi s-a îndepărtat pipeta PLDS din setul de transfer al fluidului cu pompă repetitivă. S-a îndepărtat setul de transfer al fluidului cu pompă repetitivă şi s-a acoperit cu capac roşu setului de transfer plasmă de 4".
8.9.22 Etichetarea pungilor. S-a etichetat fiecare pungă de „Mediu CM4 complet ziua 16» preparat.
8.9.23 Îndepărtarea probei de reţinere a mediului conform planului de prelevare. Folosind o seringă de 30 mL, s-au îndepărtat 20.0 mL de „mediu CM4 complet ziua 16» prin ataşarea seringii la setul de transfer plasmă de 4" şi s-a distribuit proba într-un tub conic de 50 mL.
NOTĂ: S-a îndepărtat proba de reţinere a mediului doar din prima pungă de mediu preparată. NOTĂ: S-a asigurat că setul de transfer plasmă de 4" a fost blocat sau acoperit cu capac roşu după îndepărtarea seringii.
8.9.24 Ataşarea unui nou set de transfer al fluidului cu pompă repetitivă. S-a ataşat capătul cu diametrul mai mare al unui nou set de transfer al fluidului pe setul de transfer plasmă de 4" care a fost conectat la punga de "mediu CM4 complet ziua 16".
8.9.25 Etichetarea şi depozitarea probei. S-a etichetat cu eticheta de inventar al planului de prelevare şi proba de reţinere a mediului s-a depozitat la 2-8°C până când s-a trimis la Login pentru testare conform planului de prelevare.
8.9.26 Semnare pentru prelevare. S-a asigurat că a fost completată foaia planului de prelevare LIMS pentru îndepărtarea probei.
8.9.27 Monitorizarea incubatorului. S-a monitorizat incubatorul. Dacă este cazul, conform etapei 8.9.10, se monitorizează pungile suplimentare preparate. Parametrii incubatorului: afişaj LED temperatură: 37.0±2.0°C, procentaj CO2: 5.0±1.5%CO2.
8.9.28 Încălzirea mediului CM4 complet ziua 16. S-a încălzit prima pungă de mediu CM4 complet ziua 16 în incubator timp de ≥ 30 de minute până când este gata de utilizare. Dacă este cazul, conform etapei 8.10.59, s-au încălzit pungile suplimentare.
8.9.29 Prepararea diluărilor. În BSC, s-au adăugat 4.5 mL de mediu AIM-V etichetat cu numărul de înregistrare a lotului şi „Pentru diluări de numărare a celulelor» în fiecare tub conic de 4x15 mL. S-au etichetat tuburile conice cu numărul lotului şi numărul tubului (1-4). S-au etichetat 4 criofiole cu numărul fiolei (1-4).
Fiolele au fost păstrate sub BSC pentru a fi utilizate în etapa 8.10.31.
8.9.30 Revizuire secţiune 8.9
8.10 Ziua 16 Clivarea REP
8.10.1 Tabel de preprocesare.
8.10.2 Monitorizarea incubatorului. S-a monitorizat incubatorul. Parametrii incubatorului: afişaj LED temperatură: 37.0±2.0°C, procentaj CO2: 5.0±1.5%CO2
8.10.3 Îndepărtarea G-Rex500MCS din incubator. S-a efectuat verificarea de mai jos pentru a asigura că parametrii de incubare sunt îndepliniţi înainte de îndepărtarea G-Rex500MCS din incubator.
Limita inferioară din etapa 8.7.16B (ZZLLAA OOMM) Limita superioară din etapa 8.7.16C (ZZLLAA OOMM) Timp îndepărtare din incubator (ZZLLAA OOMM) Este 8.7.16B < timpul de îndepărtare din incubator < etapa 8.7.16C Da/nu*
Îndepărtarea G-Rex500MCS din incubator.
8.10.4 Configurarea pachetului de transfer de 1L. S-a etanşat termic un pachet de transfer de 1L (W3006645) conform Notei de proces 5.12, lăsând ~12" de linie.
8.10.5 Pregătirea pachetului de transfer de 1L. S-a etichetat pachetul de transfer de 1L ca suspensie TIL.
8.10.6 Cântărirea pachetului de transfer de 1L. S-a aşezat pachetul de transfer de 1L, inclusiv întreaga linie, pe un cântar şi s-a înregistrat greutatea uscată.
8.10.7 Configurare GatheRex. S-a sudat steril (conform Notei de proces 5.11) linia roşie de îndepărtare a mediului de la G-Rex500MCS la setul de transfer cu pompă repetitivă pe punga labtainer de 10L „Supernatant» pregătită în etapa 8.9.8. S-a sudat steril linia de îndepărtare a celulelor clare de la G-Rex500MCS la pachetul de transfer al suspensiei TIL pregătit în etapa 8.10.5.
8.10.8 Configurare GatheRex. S-a amplasat balonul G-Rex500MCS pe partea stângă a GatheRex. S-au amplasat punga labtainer cu supernatant şi pachetul de transfer al suspensiei TIL în partea dreaptă.
8.10.9 Configurare GatheRex. S-a instalat linia roşie de îndepărtare a mediului de la G-Rex500MCS la clema de sus (marcată cu o linie roşie) şi ghidajele tuburilor de pe GatheRex. S-a instalat linia de recoltare de la G-Rex500MCS la clema de jos (marcată cu o linie albastră) şi ghidajele tuburilor de pe GatheRex.
8.10.10 Configurare GatheRex. S-a ataşat conducta de gaz de la GatheRex la filtrul steril al G-Rex500 MCS. NOTĂ: Înainte de a îndepărta supernatantul din G-Rex500MCS, se asigură că toate clemele de pe liniile de îndepărtare a celulelor au fost închise.
8.10.11 Reducerea volumului G-Rex500MCS. S-au transferat ~4.5L de supernatant de cultură din G-Rex500MCS în Labtainer de 10L conform SOP-01777. S-a inspectat vizual G-Rex500MCS pentru a asigura că balonul este echilibrat şi mediul a fost redus la capătul tubului de aspirare. NOTĂ: Dacă GatheRex se opreşte prematur, acesta poate fi repornit apăsând din nou butonul cu săgeata îndreptată spre dreapta.
8.10.12 Pregătirea balonului pentru recoltarea TIL. După îndepărtarea supernatantului, s-au închis toate clemele pe linia roşie.
8.10.13 Iniţierea recoltării TIL. S-a înregistrat ora de începere a recoltării TIL.
8.10.14 Iniţierea recoltării TIL. S-a lovit puternic balonul şi s-a agitat mediul pentru a elibera celulele. S-a efectuat o inspecţie a balonului pentru a asigura că toate celulele s-au desprins. NOTĂ: A se contacta managementul local dacă celulele nu s-au desprins.
8.10.15 Iniţierea recoltării TIL. S-a înclinat balonul pentru a asigura că furtunul este la marginea balonului. Notă: Dacă tubul de colectare a celulelor nu se află la joncţiunea dintre perete şi membrana inferioară, lovirea balonului în timp ce este înclinat la un unghi de 45° este de obicei suficientă pentru a poziţiona corect tubul.
8.10.16 Recoltarea TIL. S-au eliberat toate clemele care duc la pachetul de transfer al suspensiei TIL.
8.10.17 Recoltarea TIL. Folosind GatheRex, s-a transferat suspensia celulară în pachetul de transfer al suspensiei TIL. NOTĂ: Se asigură că se menţine marginea înclinată până când toate celulele şi mediile sunt colectate.
8.10.18 Recoltarea TIL. S-a inspectat membrane cu privire la celule aderente.
8.10.19 Clătirea membranei balonului. S-a clătit fundul G-Rex500MCS. S-a acoperit ~1/4 din membrana schimbătoare de gaz cu mediu de clătire.
8.10.20 Închiderea clemelor pe G-Rex500MCS. S-a asigurat că toate clemele sunt închise pe G-Rex500MCS.
8.10.21 Etanşare termică. S-a etanşat termic (conform Notei de proces 5.12) pachetul de transfer conţinând TIL cât mai aproape posibil de sudură, astfel încât lungimea totală a tubului să rămână aproximativ aceeaşi.
8.10.22 Etanşare termică. S-a etanşat termic (conform Notei de proces 5.12) Labtainer de 10L conţinând supernatantul şi s-a introdus în BSC pentru colectarea probelor în etapa 8.10.25.
8.10.23 Calculul volumului suspensiei TIL. S-a înregistrat greutatea pachetului de transfer cu suspensie celulară şi s-a calculat volumul suspensiei.
8.10.24 Pregătirea pachetului de transfer pentru îndepărtarea probelor. S-a sudat (conform Notei de proces 5.11) un set de transfer plasmă de 4" la pachetul de transfer al suspensiei TIL de la etapa 8.10.21, lăsând capătul conectorului luer interior ataşat cât mai aproape de pungă.
8.10.25 Îndepărtarea probelor de testare din supernatantul celular. În BSC, s-au îndepărtat 10.0 mL de supernatant din labtainer 10L folosind conectorul luer interior şi seringa de dimensiuni adecvate. S-au introdus într-un tub conic de 15 mL şi s-a etichetat ca „BacT». S-a păstrat tubul pentru proba BacT în etapa 8.10.28.
8.10.26 Îndepărtarea probelor de testare din supernatantul celular. Folosind o seringă separată, s-au îndepărtat 10.0 mL de supernatant şi s-au introdus într-un tub conic de 15 mL. S-a păstrat tubul pentru proba de micoplasmă pentru utilizare în etapa 8.10.32. Tubul a fost etichetat ca „Solvent Mycoplasma»
8.10.27 Închiderea pungii de supernatant. S-a plasat un capac roşu pe portul luer pentru a închide punga şi s-a îndepărtat din BSC.
8.10.28 Prelevare de probe pentru teste de sterilitate şi bacT. În BSC, s-a îndepărtat o probă de 1.0 mL din tubul conic de 15 mL etichetat BacT pregătit în etapa 8.10.25 folosind o seringă de dimensiuni adecvate şi s-a inocula flaconul anaerob.
Se repetă cele de mai sus pentru flaconul aerob. NOTĂ: Această etapă poate fi efectuată în afara secvenţei.
8.10.29 Etichetarea şi depozitarea probelor. S-a etichetat cu eticheta de inventar al planului de prelevare şi proba BacT s-a depozitat la temperatura camerei, ferită de lumină, până când este trimisă la Login pentru testare conform planului de prelevare. NOTĂ: A nu se acoperi codul de bare de pe flacon cu eticheta.
8.10.30 Semnare pentru prelevare. S-a asigurat că foaia planului de prelevare LIMS este completată pentru îndepărtarea probei.
8.10.31 Îndepărtarea probelor de numărare a celulelor. În BSC, folosind seringi de 3 mL separate pentru fiecare probă, s-au îndepărtat 4x1.0 mL probe de numărare a celulelor din pachetul de transfer „Suspensie TIL» folosind conexiunea luer. Probele au fost introduse în criofiole pregătite în etapa 8.9.29.
8.10.32 Îndepărtarea probelor de micoplasmă. Folosind o seringă de 3 mL, s-a îndepărtat 1.0 mL din pachetul de transfer al suspensiei TIL şi s-a introdus în tubul conic de 15 mL etichetat „Solvent Mycoplasma» pregătit în etapa 8.10.26.
8.10.33 Etichetarea şi depozitarea probei. S-a etichetat cu eticheta de inventar al planului de prelevare şi proba de Mycoplasma s-a depozitat la 2-8°C până când s-a trimis la Login pentru testare conform planului de prelevare.
8.10.34 Semnare pentru prelevare. S-a asigurat că a fost completată foaia planului de prelevare LIMS pentru îndepărtarea probei.
8.10.35 Pregătirea pachetului de transfer pentru însămânţare. În BSC, s-a ataşat capătul tubului cu diametru mare al unui set de transfer al fluidului cu pompă repetitivă la adaptorul Luer de pe pachetul de transfer conţinând TIL. S-a blocat linia aproape de pachetul de transfer folosind o pensă. S-a amplasat un capac roşu pe capătul setului de transfer.
8.10.36 Introducerea TIL în incubator. S-a îndepărtat suspensia celulară din BSC şi s-a introdus în incubator până când a fost necesar. S-a înregistrat timpul.
8.10.37 S-au efectuat numărările de celule. S-au efectuat numărările de celule şi calculele folosind NC-200 şi Nota de proces 5.14. S-au diluat probele de numărare a celulelor adăugând iniţial 0.5mL de suspensie celulară în 4.5mL de mediu AIM-V preparat în etapa 8.9.29. S-a obţinut o diluare 1:10.
8.10.38 S-au înregistrat volumele probelor de numărare a celulelor
8.10.39 S-a determinat factorul de multiplicare.
Parametru Formulă Rezultat Volum total al probei de numărare a celulelor 8.10.38A + 8.10.38B C. µL Factor de multiplicare C ÷ 8.10.38A D.
8.10.40 Selectarea protocoalelor şi introducerea factorilor de multiplicare. Se asigură că s-a selectat protocolul «Test de numărare a celulelor viabile», s-au introdus toţi factorii de multiplicare şi volumele de probă şi solvent. 8.10.41 S-au înregistrat numele fişierului, viabilitatea şi numerele de celule din Nucleoview. 8.10.42 S-au determinat media concentraţiei de celule viabile şi viabilitatea celulelor.
Parametru Formulă Rezultat Viabilitate (8.10.41A + 8.10.41B) ÷ 2 F. % Concentraţie celule viabile (8.10.41C + 8.10.41D) ÷ 2 F. celule/mL
8.10.43 S-au determinat limita superioară şi cea inferioară pentru numărări.
Parametru Formulă Rezultat Limita inferioară 8.10.42F x 0.9 G. celule/mL Limita superioară 8.10.42F x 1.1 H. celule/mL
8.10.44 Ambele numărări au fost în limite acceptabile?
Parametru Formulă Rezultat (da/nu) Limita inferioară 8.10.41C şi D ≥ 8.10.43G Limita superioară 8.10.41 C şi D ≤ 8.10.43H
8.10.45 Dacă este cazul: S-au efectuat numărările de celule. S-au efectuat numărările de celule şi calculele folosind NC-200 şi Nota de proces 5.14. NOTĂ: Diluarea poate fi ajustată pe baza concentraţiei estimate de celule. 8.10.46 Dacă este cazul: S-au înregistrat volumele probelor de numărare a celulelor. NOTĂ: Dacă nu a fost necesară diluare, se introduce "Probă [µE]" = 200, «Diluare [µL]» = 0 8.10.47 Dacă este cazul: S-a determinat factorul de multiplicare.
Parametru Formulă Rezultat Volum total al probei de numărare a celulelor 8.10.46A + 8.10.46B C. mL Factor de multiplicare C ÷ 8.10.46A D.
8.10.48 Dacă este cazul: Selectarea protocoalelor şi introducerea factorilor de multiplicare. Se asigură că s-a selectat protocolul «Test de numărare a celulelor viabile», s-au introdus toţi factorii de multiplicare şi volumele de probă şi solvent. NOTĂ: Dacă nu este necesară diluare, se introduce «Probă [µL]» = 200, «Diluare [µL]» = 0 8.10.49 Dacă este cazul: S-au înregistrat numerele de celule din Nucleoview 8.10.50 Dacă este cazul: S-au determinat media concentraţiei de celule viabile şi viabilitatea celulelor.
Parametru Formulă Rezultat Viabilitate (8.10.49A + 8.10.49B) ÷ 2 F. % Concentraţie celule viabile (8.10.49C + 8.10.49D) ÷ 2 F. celule/mL
8.10.51 Dacă este cazul: S-au determinat limita superioară şi cea inferioară pentru numărări.
Parametru Formulă Rezultat Limita inferioară 8.10.50F x 0.9 G. celule/mL Limita superioară 8.10.50F x 1.1 H. celule/mL
8.10.52 Dacă este cazul: Numărările au fost în limite acceptabile?
Parametru Formulă Rezultat (da/nu) Limita inferioară 8.10.49 C şi D ≥ 8.10.51G Limita superioară 8.10.49 C şi D ≤ 8.10.51H
NOTĂ: Dacă oricare rezultat este «nu», se continuă la etapa 8.10.53 pentru a determina o medie a tuturor numerelor de celule colectate. 8.10.53 Dacă este cazul: S-a determinat o concentraţie medie a celulelor viabile din toate cele patru numărări efectuate. 8.10.54 Ajustarea volumului suspensiei TIL. S-a calculat volumul ajustat al suspensiei TIL după îndepărtarea probelor de numărare a celulelor. Volum total celule TIL din etapa 8.10.23C minus 5.0 mL îndepărtaţi pentru testare. 8.10.55 S-au calculat celulele TIL viabile totale.
Parametru Formulă Rezultat Concentraţia medie a celulelor viabile* 8.10.42 F* A. celule/mL -sau- 8.10.50 F* -sau- 8.10.53E* Volum total 8.10.54 C B. mL Celule viabile totale AxB C. celule
8.10.56 Calculul baloanelor pentru subcultură. S-a calculat numărul total de baloane de însămânţat. NOTĂ: S-a rotunjit numărul de baloane G-Rex500MCS la cel mai apropiat număr întreg.
Număr de celule viabile totale din etapa 8.10.55C Ţintă Număr de baloane G-Rex500MCS de însămânţat C=A÷B Celule necesare per balon A B celule 1.0x109 celule/balon baloane
NOTĂ: Numărul maxim al baloanelor G-Rex500MCS de însămânţat a fost cinci. Dacă numărul calculat al baloanelor de însămânţat a depăşit cinci, numai cinci au fost însămânţate FOLOSIND ÎNTREGUL VOLUM DE SUSPENSIE CELULARĂ DISPONIBIL 8.10.57 S-a calculat numărul de baloane pentru subcultură
Criterii Da/nu Număr de baloane G-Rex500MCS de însămânţat etapa 8.10.56C ≤ 5 Dacă da, a se însămânţa numărul de baloane calculat în etapa 8.10.58. Număr de baloane G-Rex500MCS de însămânţat etapa 8.10.56C > 5 Dacă da, a se însămânţa 5 baloane cu TOATE celulele disponibile.
8.10.58 Revizuirea QA a calculelor de numărare a celulelor efectuate în etapele 8.10.38 - 8.10.57. 8.10.59 Determinarea numărului de pungi de mediu suplimentare necesare. S-a calculat numărul de pungi de mediu necesare pe lângă punga preparată în etapa 8.9.28.
Număr de baloane G-Rex500MCS de însămânţat (etapa 8.10.56C) A Număr de pungi de mediu necesare B=A÷2* Număr de pungi preparate în etapa 8.9.22 C Număr de pungi suplimentare de preparat D=B-C 1 *Se rotunjeşte numărul pungilor de mediu necesare la următorul număr întreg.
8.10.60 Dacă este cazul: Prepararea mediului suplimentar. S-a preparat o pungă de 10 L de „Mediu CM4 ziua 16» pentru fiecare două baloane G-Rex-500M necesare calculate în etapa 8.10.59D. S-a continuat cu etapa 8.10.62 şi s-au însămânţat primele baloane GREX-500M în timpul preparării şi încălzirii mediului suplimentar.
8.10.61 Dacă este cazul: Pregătirea pungilor de mediu suplimentare. S-a pregătit şi s-a încălzit numărul calculat de pungi de mediu suplimentare determinat în etapa 8.10.59D, repetând etapa 8.9.10 - etapa 8.9.28.
8.10.62 Umplerea G-Rex500MCS. S-a deschis un G-Rex500MCS pe banc şi s-a inspectat cu privire la fisuri în vas sau îndoituri în tub. S-a asigurat că toate conexiunile luer şi închiderile au fost etanşe. S-a realizat un marcaj la linia de 4500 ml pe exteriorul balonului cu un marker. S-au închis toate clemele de pe G-Rex500MCS, cu excepţia liniei mari de filtru.
8.10.63 Umplerea G-Rex500MCS. S-a sudat steril (conform Notei de proces 5.11) linia roşie de mediu a unui G-Rex500MCS la setul de transfer al fluidului pe punga de mediu pregătită în etapa 8.9.28.
8.10.64 Pregătirea pompării mediului. S-a suspendat „Mediul CM4 ziua 16» pe un suport IV. S-a alimentat tubulatura pompei prin pompa Baxa.
8.10.65 Pomparea mediului în G-Rex500MCS. S-a setat pompa Baxa pe „mare» şi „9» şi s-au pompat 4500 mL de mediu în balon. S-au pompat 4.5 L de „Mediu CM4 ziua 16» în G-Rex500MCS, umplând până la linia marcată pe balon la etapa 8.10.62. După ce s-au fost transferat 4.5 L de mediu, s-a oprit pompa.
8.10.66 Etanşare termică. S-a etanşat termic (conform Notei de proces 5.12) linia roşie de mediu a G-Rex500MCS, lângă sudura creată în etapa 8.10.63, îndepărtând punga de mediu.
8.10.67 Repetarea umplerii. Se repetă etapele 8.10.62-8.10.66 pentru fiecare balon calculat în etapa 8.10.56C în timp ce mediul este încălzit şi pregătit pentru utilizare.
NOTĂ: Pot fi umplute mai multe baloane în acelaşi timp folosind umplerea gravitaţională sau mai multe pompe. NOTĂ: A se umple doar două baloane per pungă de mediu.
8.10.68 Înregistrarea şi etichetarea baloanelor umplute. S-a etichetat fiecare balon în ordine alfabetică pe măsură ce se umplu şi cu etichete „Ziua 16» furnizate de QA.
8.10.69 Etichetarea probei. S-a ataşat o etichetă de probă „Ziua 16».
8.10.70 Dacă este cazul: Incubarea balonului. S-a menţinut balonul în incubator în timp ce se aşteaptă însămânţarea cu TIL.
8.10.71 Verificarea numărului de baloane umplute. S-a înregistrat numărul total de baloane umplute.
8.10.72 Calculul volumului de suspensie celulară de adăugat. S-a calculat volumul ţintă al suspensiei TIL de adăugat în baloanele G-Rex500MCS noi.
Volum total suspensie TIL din etapa 8.10.54C A Număr de baloane umplute din etapa 8.10.71 Volum ţintă de suspensie celulară de transferat în fiecare balon C=A÷B mL mL
8.10.56C Dacă numărul depăşeşte cinci, doar cinci baloane vor fi însămânţate, FOLOSIND ÎNTREGUL VOLUM DE SUSPENSIE CELULARĂ.
8.10.73 Pregătirea baloanelor pentru însămânţare. S-a îndepărtat G-Rex500MCS de la etapa 8.10.70 din incubator.
8.10.74 Pregătirea pompării. S-au închis toate clemele de pe G-Rex500MCS, cu excepţia liniei mari de filtru. S-a alimentat tubulatura pompei prin pompa Baxa.
8.10.75 Îndepărtarea TIL din incubator. S-a îndepărtat pachetul de transfer „Suspensie TIL» din incubator şi s-a înregistrat timpul de încheiere a incubării în etapa 8.10.36.
8.10.76 Pregătirea suspensiei celulare pentru însămânţare. S-a sudat steril (conform Notei de proces 5.11) pachetul de transfer „Suspensie TIL» de la etapa 8.10.75 la conducta de admisie a pompei.
8.10.77 Aducerea cântarului la zero. S-a aşezat punga de suspensie TIL pe un cântar. S-a activat linia de la punga de suspensie TIL la sudură folosind pompa Baxa setată la „mică» şi „2». Cântarul s-a adus la zero.
8.10.78 Însămânţarea baloanelor cu suspensie TIL. S-a setat pompa Baxa la „medie» şi „5». S-a Pompat volumul suspensiei TIL calculat la etapa 8.10.72C în balon. S-a înregistrat volumul de suspensie TIL adăugat în fiecare balon.
8.10.79 Etanşare termică. S-a etanşat termic (conform Notei de proces 5.12) pachetul de transfer „Suspensie TIL», lăsând suficient tub pentru sudare pe următorul balon.
S-a folosit dispozitivul de curăţare a suspensiei TIL reziduale din linia balonului G-Rex în vas.
8.10.80 Umplerea baloanelor rămase. Între fiecare balon însămânţat, s-a asigurat amestecarea pachetului de transfer „Suspensie TIL» şi s-au repetat etapele 8.10.76-8.10.79 pentru a însămânţa toate baloabele rămase. Baloanele au fost umplute în ordine alfabetică.
8.10.81 Monitorizarea incubatorului. NOTĂ: Dacă baloanele trebuie împărţite între două incubatoare, se asigură monitorizarea ambelor. Parametrii incubatorului: afişaj LED temperatură: 37.0±2.0°C, procentaj CO2: 5.0±1.5%CO2.
8.10.82 Incubarea baloanelor. S-a înregistrat timpul în care fiecare balon este introdus în incubator.
8.10.83 Calculul ferestrei de incubare. S-au efectuat calculele de mai jos pentru a determina intervalul de timp de îndepărtare a G-Rex500MCS din incubator în ziua 22.
Balon 8.10.83A Timp incubare (etapa 8.10.82) (ZZLLAA OOMM) 8.10.83B Limita inferioară: 8.10.83C Limita superioară: Timp incubare + 132 ore (ZZLLAA OOMM) Timp incubare + 156 ore (ZZLLAA OOMM)
8.10.84 Monitorizarea mediului. După procesare s-a verificat BSC şi s-a monitorizat personalul.
8.10.85 Trimiterea probei. S-a asigurat că toate probele din ziua 16 au fost trimise la Login.
8.10.86 Revizuire secţiune 8.10.
8.11 Ziua 22 Prepararea tamponului de spălare
8.11.1 S-au verificat igienizarea camerei, golirea liniei şi materialele.
8.11.2 S-a asigurat completarea listei de verificare pre-procesare.
8.11.3 Monitorizarea mediului. Înainte de procesare, s-a asigurat că a fost efectuată monitorizarea mediului pre-procesare.
8.11.4 Pregătirea pungii Labtainer de 10L. În BSC, s-a ataşat un set de transfer plasmă de 4" la o pungă Labtainer de 10L prin conexiune luer.
8.11.5 Pregătirea pungii Labtainer de 10L. S-a etichetat cu „Supernatant», numărul lotului şi iniţiala/data.
8.11.6 Pregătirea pungii Labtainer de 10L. S-au închis toate clemele înaintea transferului din BSC. NOTĂ: S-a pregătit o pungă Labtainer de 10L pentru fiecare două baloane G-Rex500MCS care urmează să fie recoltate. NOTĂ: Pungile de supernatant au fost utilizate în secţiunea 8.12, care ar putea fi desfăşurată concomitent cu secţiunea 8.11.
8.11.7 Sudarea setului de transfer al fluidului. În afara BSC, s-au închis toate clemele pe 4S-4M60. S-a sudat (conform Notei de proces 5.11) setul de transfer al fluidului la unul dintre capetele conectorului luer exterior al 4S-4M60. (Vezi, de exemplu, Figura 132.)
8.11.8 Introducerea materialelor în BSC. S-au introdus Plasmalyte-A şi albumină umană 25% în BSC. S-au introdus 4S-4M60 şi ansamblul setului de transfer al fluidului repetitiv în BSC.
Descrierea componentei Cantitate necesară Plasmalyte-A 3000.0 mL Albumină umană 25% 120.0 mL 4S-4M60 cu set de transfer al fluidului repetitiv 1 aparat Etapa 8.11.7
8.11.9 Pomparea Plasmalyte în pungă de 3000 mL. S-au aplicat trei pungi de Plasmalyte-A la setul de conectori 4S-4M60. NOTĂ: A se şterge capacul portului cu un tampon cu alcool (W3009488) înaintea îndepărtării. NOTĂ: Se menţine presiune constantă la orientarea acului într-o direcţie. Se asigură că nu se perforează partea laterală a portului.
8.11.10 Pomparea Plasmalyte în pungă de 3000 mL. S-a conectat o pungă de colectare Origen de 3000 mL prin conexiune luer la capătul cu diametru mai mare al setului de transfer cu pompă repetitivă.
8.11.11 Pomparea Plasmalyte în pungă de 3000 mL. S-au închis clemele pe liniile neutilizate ale pungii Origen de 3000 mL.
8.11.12 Pomparea Plasmalyte în pungă de 3000 mL. S-a montat pompa Baxa lângă BSC. S-a alimentat tubulatura setului de transfer prin pompa Baxa situată în afara BSC. S-a setat pompa pe „mare» şi „9».
8.11.13 Pomparea Plasmalyte în pungă de 3000 mL. S-au deschis toate clemele de la Plasmalyte-A la punga Origen de 3000 mL.
8.11.14 Pomparea Plasmalyte în pungă de 3000 mL. S-a pompat tot Plasmalyte-A în punga Origen de 3000 mL. După transferul întregului Plasmalyte-A, s-a oprit pompa.
8.11.15 Pomparea Plasmalyte în pungă de 3000 mL. Dacă este necesar, se îndepărtează aerul din punga Origen de 3000 mL inversând pompa şi manipulând poziţia pungii.
8.11.16 Pomparea Plasmalyte în pungă de 3000 mL. S-au închis toate clemele.
Se îndepărtează punga de 3000 mL din setul de transfer al fluidului cu pompă repetitivă prin conexiune luer şi se amplasează un capac roşu (W3012845) pe linia către pungă.
8.11.17Adăugarea albuminei umane 25% în punga de 3000 mL. S-a deschis mini-acul cu orificiu de evacuare. Fără a compromite sterilitatea acului, s-a asigurat fixarea capacului albastru.
8.11.18 Adăugarea albuminei umane 25% în punga de 3000 mL. S-a înţepat membrana unui flacon de albumină umană 25% cu mini-acul cu orificiu de evacuare. NOTĂ: Se asigură că nu se compromite sterilitatea acului.
8.11.19 Adăugarea albuminei umane 25% în punga de 3000 mL. S-a repetat etapa 8.11.17 - etapa 8.11.18 de două ori pentru un total de trei (3) flacoane de albumină umană 25%.
8.11.20Adăugarea albuminei umane 25% în punga de 3000 mL. S-a îndepărtat capacul albastru de pe un mini-ac cu orificiu de evacuare şi s-a ataşat o seringă de 60 mL la flaconul cu albumină serică umană 25%.
8.11.21Adăugarea albuminei umane 25% în punga de 3000 mL. S-au extras 60 mL de albumină serică umană 25%. NOTĂ: Poate fi necesar să se utilizeze mai mult de un flacon de albumină serică umană 25%. Dacă este necesar, se deconectează seringa de la mini-acul cu orificiu de evacuare şi se conectează la următorul mini-ac cu orificiu de evacuare într-un flacon de de albumină serică umană 25%. A nu se îndepărta mini-acul cu orificiu de evacuare din flaconul de albumină serică umană 25%.
8.11.22Adăugarea albuminei umane 25% în punga de 3000 mL. După ce s-au obţinut 60 mL, se îndepărtează seringa de la mini-acul cu orificiu de evacuare.
8.11.23Adăugarea albuminei umane 25% în punga de 3000 mL. S-a ataşat seringa la portul de injecţie fără ac de pe punga Origen de 3000 mL umplută cu Plasmalyte-A în etapa 8.11.16. S-a distribuit toată albumina umană 25%. NOTĂ: S-a şters portul de injecţie fără ac cu un tampon cu alcool înainte de fiecare utilizare.
8.11.24Adăugarea albuminei umane 25% în punga de 3000 mL. S-a repetat etapa 8.11.20 - etapa 8.11.23 pentru a obţine un volum final de 120.0 mL de albumină umană 25%.
8.11.25 Amestecarea pungii. S-a amestecat uşor punga după ce s-a adăugat toată albumina umană 25%.
8.11.26 Etichetarea pungii. S-a etichetat cu „tampon de spălare LOVO» şi numărul de lot şi s-a alocat o perioadă de expirare de 24 de ore.
8.11.27 Prepararea solventului IL-2. Folosind o seringă de 10 mL, s-au îndepărtat 5.0 mL de tampon de spălare LOVO folosind portul de injecţie fără ac de pe punga de tampon de spălare LOVO. S-a distribuit tampon de spălare LOVO într-un tub conic de 50 mL şi s-a etichetat cu „Solvent IL-2» şi numărul lotului. NOTĂ: S-a şters portul de injecţie fără ac cu un tampon cu alcool înainte de fiecare utilizare.
8.11.28 Distribuirea tamponului de spălare LOVO în punga martor CRF. Folosind o seringă de 100 mL, s-au extras 70.0 mL de tampon de spălare LOVO din portul de injecţie fără ac. NOTĂ: S-a şters portul de injecţie fără ac cu un tampon cu alcool înainte de fiecare utilizare.
8.11.29 Distribuirea tamponului de spălare LOVO în punga martor CRF. S-a aşezat un capac roşu pe seringă şi s-a etichetat cu „pungă crio martor» şi numărul lotului. NOTĂ: Se menţine seringa la temperatura camerei până când este necesară în etapa 8.14.3
8.11.30 Pregătirea tamponului de spălare complet. S-au închis toate clemele de pe punga de tampon de spălare LOVO.
8.11.31 Decongelarea IL-2. S-au decongelat 1.1 mL de IL-2 (6×106 IU/mL) până când toată gheaţa s-a topit. S-au înregistrat numărul de lot IL-2 şi data de expirare. NOTĂ: S-a asigurat că este ataşată eticheta IL-2.
8.11.32 Prepararea IL-2. S-au adăugat 50µL soluţie de IL-2 (6×106 IU/mL) în tubul conic de 50mL etichetat „Solvent IL-2».
8.11.33 Prepararea IL-2. S-a reetichetat tubul conic cu „IL-2 6×104», data, numărul lotului şi data de expirare la 24 de ore. Se acoperă si se păstrează la 2-8°C.
8.11.34 Pregătirea crioconservării. S-au plasat 5 criocasete la 2-8°C pentru a le precondiţiona pentru crioconservarea produsului final.
8.11.35 Pregătirea diluărilor de numărare a celulelor. În BSC, s-au adăugat 4.5 mL de mediu AIM-V etichetat cu numărul de lot şi „Pentru diluări de numărare a celulelor» în 4 tuburi conice de 15 mL separate. S-au etichetat tuburile cu numărul de înregistrare a lotului şi numărul tubului (1-4). Se lasă deoparte pentru utilizare la etapa 8.12.34
8.11.36 Pregătirea numărărilor celulelor. S-au etichetat 4 criofiole cu numărul fiolei (1-4). Fiolele s-au păstrat sub BSC pentru a fi utilizate în etapa 8.12.33.
8.11.37 37Revizuire secţiune 8.11
8.12 Ziua 22 Recoltarea TIL
8.12.1 Monitorizarea incubatorului. S-a monitorizat incubatorul. Parametrii incubatorului: afişaj LED temperatură: 37 ± 2.0°C, procentaj CO2: 5%±1.5%. NOTĂ: Secţiunea 8.12 poate fi desfăşurată concomitent cu secţiunea 8.11.
8.12.2 Îndepărtarea baloanelor G-Rex500MCS din incubator. S-a efectuat verificarea de mai jos pentru a asigura că parametrii de incubare au fost îndepliniţi înainte de îndepărtarea G-Rex500MCS din incubator.
Balon Depozitare Limita inferioară din etapa 8.10.83 B (ZZLLAA Limita superioară din etapa 8.10.83 C (ZZLLAA Timp de îndepărtare din incubator (ZZLLAA OOMM) Este 8.10.83 B < Timp de îndepărtare din incubator < etapa 8.10.83 C Da/nu* OOMM) OOMM)
NOTĂ: Această etapă s-a efectuat la îndepărtarea fiecărui balon din incubator.
8.12.3 Pregătirea pungii de colectare TIL. S-a etichetat o pungă de colectare de 3000 mL cu „Suspensie TIL», numărul lotului şi iniţiala/data.
8.12.4 Sigilarea conexiunilor suplimentare. S-au etanşat termic două conexiuni leur de pe punga de colectare, aproape de capătul fiecărei conexiuni, conform Notei de proces 5.12.
8.12.5 Configurare GatheRex. S-a sudat steril (conform Notei de proces 5.11) linia roşie de îndepărtare a mediilor de la G-Rex500MCS la punga labtainer de 10L pregătită în etapa 8.11.5. NOTĂ: Se face referire la Nota de proces 5.16 pentru utilizarea mai multor dispozitive GatheRex.
8.12.6 Configurare GatheRex. S-a sudat steril (conform Notei de proces 5.11) linia de îndepărtare a celulelor clare de la G-Rex500MCS la punga de colectare a suspensiei TIL pregătită în etapa 8.12.3. NOTĂ: Se face referire la Nota de proces 5.16 pentru utilizarea mai multor dispozitive GatheRex.
8.12.7 Configurare GatheRex. S-a amplasat balonul G-Rex500MCS pe partea stângă a GatheRex. S-a amplasat punga Labtainer cu supernatant şi punga de colectare a suspensiei TIL acumulate pe partea dreaptă.
8.12.8 Configurare GatheRex. S-a instalat linia roşie de îndepărtare a mediului de la G-Rex500MCS la clema de sus (marcată cu o linie roşie) şi ghidajele tuburilor de pe GatheRex. S-a instalat linia de recoltare de la G-Rex500MCS la clema de jos (marcată cu o linie albastră) şi ghidajele tuburilor de pe GatheRex.
8.12.9 Configurare GatheRex. S-a ataşat conducta de gaz de la GatheRex la filtrul steril al G-Rex500MCS. NOTĂ: Înainte de a îndepărta supernatantul din G-Rex500MCS, se asigură că toate clemele de pe liniile de îndepărtare a celulelor au fost închise.
8.12.10 Reducerea volumului. S-au transferat ~4.5 L de supernatant din G-Rex500MCS în punga de supernatant. G-Rex500MCS a fost inspectat vizual pentru a asigura că balonul este echilibrat şi mediul a fost redus la capătul tubului de aspirare. Se repetă etapa dacă este necesar. NOTĂ: Dacă GatheRex s-a oprit prematur, acesta poate fi repornit apăsând din nou butonul cu săgeata îndreptată spre dreapta.
8.12.11 Pregătirea baloanelor pentru recoltarea TIL. După îndepărtarea supernatantului, s-au închis toate clemele la linia roşie.
8.12.12 Iniţierea colectării TIL. S-a înregistrat ora de începere a recoltării TIL.
8.12.13 Iniţierea colectării TIL. S-a lovit puternic balonul şi s-a agitat mediul pentru a elibera celulele. S-a efectuat o inspecţie a balonului pentru a asigura că toate celulele s-au desprins. S-a aşezat punga de colectare „Suspensie TIL» de 3000 mL pe şerveţele uscate pe o suprafaţă plană. NOTĂ: A se contacta managementul local dacă celulele nu s-au desprins.
8.12.14 Iniţierea colectării TIL. S-a înclinat balonul pentru a asigura că furtunul este la marginea balonului. NOTĂ: Dacă furtunul de colectare a celulelor nu se află la joncţiunea dintre perete şi membrana inferioară, lovirea balonului în timp ce este înclinat la un unghi de 45° este de obicei suficientă pentru a poziţiona corect furtunul.
8.12.15 Recoltarea TIL. S-au eliberat toate clemele care duc la punga de colectare a suspensiei TIL.
8.12.16 Recoltarea TIL. Folosind GatheRex, s-a transferat suspensia TIL în punga de colectare de 3000 mL. NOTĂ: Se menţine marginea înclinată până când s-au colectat toate celulele şi mediile.
8.12.17 Recoltarea TIL. S-a inspectat membrana cu privire la celule aderente.
8.12.18 Clătirea membranei balonului. S-a clătit fundul G-Rex500MCS. S-a acoperit ~1/4 din membrana schimbătoare de gaz cu mediu de clătire.
8.12.19 Închiderea clemelor pe G- Rex500MCS. Se asigură că toate clemele sunt închise.
8.12.20 Etanşare termică. S-a etanşat termic (conform Notei de proces 5.12) punga de colectare conţinând TIL cât mai aproape posibil de sudură, astfel încât lungimea totală a tubului să rămână aproximativ aceeaşi.
8.12.21 Etanşare termică. S-a etanşat termic (conform Notei de proces 5.12) punga de supernatant.
8.12.22 Încheierea recoltării baloanelor G-Rex 500 MCS rămase. Se repetă etapele 8.12.2 şi 8.12.5 - 8.12.21, colectând toate TIL în aceeaşi pungă de colectare.
NOTĂ: A FOST NECESARĂ ÎNLOCUIREA PUNGII DE SUPERNATANT DE 10L DUPĂ FIECARE AL 2-LEA BALON. NOTĂ: Se face referire la Nota de proces 5.16 pentru utilizarea mai multor dispozitive GatheRex.
8.12.23 Pregătirea pungii sursă LOVO. S-a obţinut o pungă de colectare de 3000 mL nouă. S-a etichetat cu „Pungă sursă LOVO», numărul lotului şi iniţiala/data.
8.12.24 Pregătirea pungii sursă LOVO. S-a etanşat termic (conform Notei de proces 5.12) tubul de pe „punga sursă LOVO», îndepărtând conectorii luer interiori, lăsând suficientă linie pentru sudare.
8.12.25 Cântărirea pungii sursă LOVO. S-a aşezat un recipient de plastic de dimensiuni adecvate pe cântar şi s-a adus cântarul la zero. Se aşază punga sursă LOVO, inclusiv porturile şi liniile, în recipient şi se înregistrează greutatea uscată
8.12.26 Transferul suspensiei celulare în punga sursă LOVO. S-au închis toate clemele unui filtru de sânge gravitaţional de 170 µm.
8.12.27 Transferul suspensiei celulare în punga sursă LOVO. S-a sudat steril (conform Notei de proces 5.11) capătul terminal lung al filtrului de sânge gravitaţional la punga sursă LOVO.
8.12.28 Transferul suspensiei celulare în punga sursă LOVO. S-a sudat steril (conform Notei de proces 5.11) una dintre cele două linii sursă ale filtrului la punga de colectare a „suspensiei TIL acumulate».
8.12.29 Transferul suspensiei celulare în punga sursă LOVO. După încheierea sudării, s-a etanşat termic (conform Notei de proces 5.12) linia nefolosită de pe filtru pentru a o îndepărta.
8.12.30 Transferul suspensiei celulare în punga sursă LOVO. S-au deschis toate clemele necesare şi s-a ridicat suspensia TIL suspendând punga de colectare pe un suport IV pentru a iniţia transferul gravitaţional al TIL prin filtrul de sânge şi în punga sursă LOVO. S-a rotit sau s-a masat uşor punga de suspensie TIL în timpul golirii, pentru a menţine TIL în suspensie uniformă.
Notă: Nu s-a suspendat punga sursă LOVO de aparatul de filtrare. S-a aşezat punga sursă LOVO pe şerveţele uscate pe o suprafaţă plană.
8.12.31 Închiderea tuturor clemelor. După ce s-au transferat toate TIL în punga sursă LOVO, s-au închis toate clemele.
8.12.32 Etanşare termică. S-a etanşat termic (conform Notei de proces 5.12) cât mai aproape de sudură pentru îndepărtarea filtrului de sânge gravitaţional.
8.12.33 Îndepărtarea probelor de numărare a celulelor. În BSC, folosind seringi de 3 mL separate pentru fiecare probă, s-au îndepărtat 4x1.0mL probe de numărare a celulelor din punga sursă LOVO folosind portul de injecţie fără ac. Probele s-au introdus în criofiolele pregătite în etapa 8.11.36. NOTĂ: S-a şters portul de injecţie fără ac cu un tampon cu alcool şi s-a amestecat punga sursă LOVO între fiecare probă.
8.12.34 Efectuarea numărărilor de celule. S-au efectuat numărările de celule şi calculele folosind NC-200 şi Nota de proces 5.14. S-au diluat probele de numărare a celulelor adăugând iniţial 0.5mL de suspensie celulară în 4.5mL de mediu AIM-V preparat în etapa 8.11.35. S-a obţinut o diluare 1:10.
8.12.35 S-au înregistrat volumele probelor de numărare a celulelor. 8.12.36 S-a determinat factorul de multiplicare
Parametru Formulă Rezultat Volum total al probei de numărare a celulelor 8.12.35A + 8.12.35B C. µL Factor de multiplicare C ÷ 8.12.35A D.
8.12.37 Selectarea protocoalelor şi introducerea factorilor de multiplicare. Se asigură că s-a selectat protocolul «Test de numărare a celulelor viabile», s-au introdus toţi factorii de multiplicare şi volumele de probă şi solvent. NOTĂ: Dacă nu este necesară diluare, se introduce «Probă [µL]» = 200, «Diluare [µL]» = 0
8.12.38 Se înregistrează numărul celulelor din Nucleoview
8.12.39 S-au determinat viabilitatea medie, concentraţia de celule viabile şi concentraţia totală a celulelor nucleate.
Parametru Formulă Rezultat Viabilitate (8.12.38A + 8.12.38B) ÷ 2 G. Concentraţie celule viabile (8.12.38C + 8.12.38D) ÷ 2 H. celule/mL Concentraţia totală a celulelor nucleate (8.12.38E + 8.12.38F) ÷ 2 I. celule/mL
8.12.40 S-au determinat limita superioară şi cea inferioară pentru numărări
Parametru Formulă Rezultat Limita inferioară 8.12.39H x 0.9 J. celule/mL Limita superioară 8.12.39I x 1.1 K. celule/mL
8.12.41 Ambele numărări au fost în limite acceptabile?
Parametru Formulă Rezultat (da/nu) Limita inferioară 8.12.38 C şi D ≥ 8.12.40J Limita superioară 8.12.38 C şi D ≤ 8.12.40K
NOTĂ: Dacă oricare rezultat a fost «nu», s-a efectuat un al doilea set de numărări în etapele 8.12.42 - 8.12.49.
8.12.42 Dacă este cazul: S-au efectuat numărările de celule. S-au efectuat numărările de celule şi calculele folosind NC-200 şi Nota de proces 5.14. NOTĂ: Diluarea poate fi ajustată pe baza concentraţiei estimate de celule.
8.12.43 Dacă este cazul: S-au înregistrat volumele probelor de numărare a celulelor 8.12.44 Dacă este cazul: S-a determinat factorul de multiplicare
Parametru Formulă Rezultat Volum total al probei de numărare a celulelor 8.12.43A + 8.12.43B C. µL Factor de multiplicare C ÷ 8.12.43A D.
8.12.45 Dacă este cazul: Selectarea protocoalelor şi introducerea factorilor de multiplicare. Se asigură că s-a selectat protocolul «Test de numărare a celulelor viabile», s-au introdus toţi factorii de multiplicare şi volumele de probă şi solvent.
NOTĂ: Dacă nu este necesară diluare, se introduce «Probă [µL]» = 200, «Diluare [µL]» = 0
8.12.46 Dacă este cazul: Se înregistrează numărul celulelor din Nucleoview
8.12.47 Dacă este cazul: S-au determinat viabilitatea medie, concentraţia de celule viabile şi concentraţia totală a celulelor nucleate.
Parametru Formulă Rezultat Viabilitate (8.12.46A + 8.12.46B) ÷ 2 G. Concentraţie celule viabile (8.12.46C + 8.12.46D) ÷ 2 H. celule/mL Concentraţia totală a celulelor nucleate (8.12.46E + 8.12.46F) ÷ 2 I. celule/mL
8.12.48 Dacă este cazul: S-au determinat limita superioară şi cea inferioară pentru numărări
Parametru Formulă Rezultat Limita inferioară 8.12.47 H x 0.9 J. celule/mL Limita superioară 8.12.47 H x 1.1 K. celule/mL
8.12.49 Dacă este cazul: Numărările au fost în limite acceptabile?
Parametru Formulă Rezultat (da/nu) Limita inferioară 8.12.46 C şi D ≥ 8.12.48J Limita superioară 8.12.46 C şi D ≤ 8.12.48K
NOTĂ: Dacă oricare rezultat a fost «nu», se continuă la etapa 8.12.50 pentru a determina o medie
8.12.50 Dacă este cazul: S-au determinat o concentraţie medie a celulelor viabile şi concentraţia medie totală a celulelor nucleate din toate cele patru numărări.
8.12.51 Revizuirea QA a numărărilor de celule. Personalul QA revizuieşte calculele efectuate în etapele 8.12.38 - 8.12.50.
8.12.52 Cântărirea pungii sursă LOVO. S-a aşezat un recipient din plastic de dimensiuni adecvate pe cântar şi s-a adus cântarul la zero. S-a aşezat punga sursă LOVO plină în recipient şi se înregistrează greutatea uscată. S-a calculat volumul suspensiei celulare.
8.12.53 Calculul celulelor TIL viabile totale.
Parametru Formulă Rezultat Concentraţia medie a celulelor viabile* 8.12.39 H* A. celule/mL -sau- 8.12.47 H* -sau- 8.12.50 E* Volum total 8.12.52 C B. mL Celule viabile totale AxB C. celule Este C ≥ 1.5×109? Da/nu** *Se încercuieşte referinţa de etapă folosită pentru a determina concentraţia celulelor viabile. **Dacă "da", se continuă. Dacă "nu", se contactează managementul local.
8.12.54 Calculul celulelor nucleate totale.
Parametru Formulă Rezultat Concentraţia medie totală a celulelor nucleate * 8.12.39 I* -sau- 8.12.47 I* A. celule/mL -sau- 8.12.50 J* Volum total 8.5.52 C B. mL Celule nucleate totale AxB C. celule *Se încercuieşte referinţa de etapă folosită pentru a determina concentraţia totală a celulelor nucleate.
8.12.55 Prepararea solventului Mycoplasma. În BSC, s-au îndepărtat 10.0 mL dintr-o pungă de supernatant prin portul de probă luer şi s-au introdus într-un tub conic de 15 mL.
S-a etichetat tubul conic de 15 mL „Solvent Mycoplasma» şi s-a păstrat în BSC pentru utilizare în etapa 8.14.69.
8.12.56 Revizuire secţiune 8.12
8.13 LOVO
8.13.1 S-a pornit LOVO folosind comutatorul din partea stângă din spate a instrumentului. NOTĂ: Etapele 8.13.1-8.13.13 pot fi efectuate concomitent cu secţiunile 8.11-8.12.
8.13.2 Verificarea cântarelor şi a senzorului de presiune.
8.13.3 S-a asigurat că nu se află nimic pe nici un cântar şi s-a revizuit citirea pentru fiecare cântar. Valorile au fost înregistrate în etapa 8.13.5. Notă: Dacă un cântar prezintă o citire în afara unui interval 0 +/- 2 g, s-a efectuat calibrarea cântarului
8.13.4 Dacă toate cântarele s-au găsit în intervalul de toleranţă în lipsa greutăţii, s-a aşezat o greutate de 1 kg pe fiecare cântar (#1-4) şi s-a revizuit citirea. Valorile au fost înregistrate în etapa 8.13.5.
8.13.5 Verificarea cântarelor. S-au înregistrat valorile afişate pe fiecare cântar. Dacă valorile au fost în intervalul prevăzut, s-a continuat procesarea. Dacă valorile nu au fost în interval, se efectuează calibrarea.
8.13.6 S-a revizuit şi s-a înregistrat citirea senzorului de presiune pe ecranul Profil operare instrument. Intervalul acceptabil pentru citirea presiunii a fost 0 +/- 10 mmHg. Dacă valoarea afişată a fost în afara acestui interval, s-a stocat o nouă setare a presiunii atmosferice, conform instrucţiunilor instrumentului.
8.13.7 Repetarea etapelor. Dacă a fost efectuată o nouă calibrare a cântarului sau a fost stocată o nouă setare a presiunii atmosferice, se repetă etapele 8.13.3 - 8.13.6.
8.13.8 S-a pornit protocolul „Recoltare TIL G-Rex» din meniul derulant.
8.13.9 Ecranul Soluţie 1 este afişat: citire tip tampon PlasmaLyte
8.13.10-8.13.16 Au fost urmate instrucţiunile de pe ecranul tactil LOVO.
8.13.17 S-a determinat volumul ţintă al produsului final.
NOTĂ: Folosind valoarea celule nucleate totale (TNC) de la etapa 8.12.54 C şi graficul de mai jos, s-a determinat volumul ţintă al produsului final. S-a înregistrat volumul produsului final (mL)
Interval celule Volum ţintă produs final (retentat) (mL) 0 < celule totale (viabile + moarte) ≤ 7.1 ×1010 165 7.1×1010 < celule totale (viabile + moarte) ≤ 1.1×1011 215 1.1×1011 < celule totale (viabile + moarte) ≤ 1.5X1011 265
Notă: Dacă TVC de la etapa 8.12.53 C a fost >1.5×1011, a se contacta managementul local.
8.13.18 - 8.13.22 Au fost urmate instrucţiunile de pe ecranul tactil LOVO.
8.13.23 Încărcarea kitului de unică folosinţă. Înainte de a încărca kitul de unică folosinţă, s-a şters portul senzorului de presiune cu un şerveţel cu alcool, apoi cu o cârpă din fibre. S-a încărcat kitul de unică folosinţă. S-au urmat instrucţiunile de pe ecran la încărcarea kitului de unică folosinţă.
8.13.24 Îndepărtarea pungii de filtrat. După încărcarea kitului de unică folosinţă LOVO standard, s-a atins butonul Pasul următor. Se afişează ecranul Informaţii recipient şi locaţie. S-a îndepărtat punga de filtrat de pe cântar
8.13.25 S-a asigurat că recipientul de filtrare este nou şi nu se află pe cântar
8.13.26 Introducerea capacităţii de filtrat. S-a sudat steril o pungă auxiliară LOVO pe linia de conector luer exterior a pungii de filtrat existente. S-a asigurat că toate clemele sunt deschise şi traiectoria fluidului este liberă. Se atinge câmpul de intrare Capacitate recipient filtrat. Se afişează o tastatură numerică. Se introduce noua capacitate totală de filtrat (5.000 mL). Se atinge butonul de acceptare a valorii introduse. NOTĂ: Volumul estimat al filtratului nu trebuie să depăşească 5000 mL.
8.13.27 Aşezarea recipientului de filtrat pe banc. NOTĂ: Dacă tubul a fost îndepărtată din clema F în timpul sudării, s-a aşezat tubul înapoi în clemă. S-a aşezat noul recipient de filtrat pe banc. NU s-a suspendat punga de filtrat pe cântarul #3. Cântarul #3 va fi gol în timpul procedurii.
8.13.28 S-au urmat instrucţiunile de pe ecranul tactil LOVO după modificările făcute la recipientul de filtrat.
8.13.29 S-a asigurat încărcarea corectă a kitului. Se afişează segmentul Verificări kit de unică folosinţă. S-a verificat dacă kitul a fost încărcat corect şi toate clemele sunt deschise. S-au verificat toate tuburile cu privire la îndoituri sau alte obstrucţiuni şi s-au corectat dacă a fost posibil. S-a asigurat că kitul a fost instalat corect şi s-au verificat toate clemele. S-a apăsat butonul Da. Toate clemele mecanice LOVO s-au închis automat şi se afişează ecranul Verificare instalare kit de unică folosinţă. LOVO efectuează o serie de etape de presurizare pentru verificarea kitului.
8.13.30 Rezultatele verificării kitului. Dacă verificarea kitului s-a realizat cu succes, se trece la etapa următoare. *Dacă Nu, poate fi efectuată o a doua verificare a kitului în urma încheierii verificărilor. *Dacă Nu, se verifică toate tuburile cu privire la îndoituri sau alte obstrucţiuni şi se corectează. *Dacă nu, se asigură că kitul a fost instalat corect şi se verifică toate clemele. Dacă a doua verificare a kitului a eşuat: a se contacta managementul local şi a se pregăti instalarea noului kit în secţiunea 10.0. Se repetă etapele 8.13.23-Pasul 8.13.30.
8.13.31 Ataşarea PlasmaLyte. Se afişează ecranul Conectare soluţii. Valoarea de spălare ar fi întotdeauna 3000 mL. S-a introdus această valoare pe ecran. S-a sudat steril punga de 3000 mL de PlasmaLyte pe tubul care trece prin clema 1 conform Notei de proces 5.11. S-a supendat punga de PlasmaLyte pe un suport IV, plasând ambele agăţători pe cârlig.
8.13.32 Verificarea ataşării PlasmaLyte. S-au deschis clemele de plastic. S-a verificat dacă valoarea introdusă a volumului soluţiei a fost de 3000 mL. S-a atins butonul „Pasul următor». S-a afişat segmentul Iniţiere kit de unică folosinţă. S-a verificat dacă PlasmaLyte a fost ataşat şi dacă toate sudurile şi clemele de plastic de pe tubul care duce la punga de PlasmaLyte au fost deschise, apoi s-a atins butonul Da
8.13.33 Observarea curgerii PlasmaLyte. Începe iniţierea kitului de unică folosinţă şi se afişează ecranul Iniţiere kit de unică folosinţă. S-a observat vizual dacă PlasmaLyte curge prin tubul conectat la punga de PlasmaLyte.
Dacă nu există curgere de fluid, se apasă butonul de pauză de pe ecran şi se determină dacă o clemă sau o sudură este încă închisă. Odată ce problema a fost rezolvată, se apasă butonul Reluare de pe ecran pentru a relua iniţierea kitului de unică folosinţă. Când iniţierea kitului de unică folosinţă s-a încheiat cu succes, se afişează ecranul Conectare sursă.
8.13.34-8.13.35 S-au urmat instrucţiunile de pe ecranul tactil LOVO.
8.13.36 Ataşarea recipientului sursă la tub. S-a sudat steril punga sursă LOVO pregătită în etapa 8.12.31 la tubul care trece prin clema S conform Notei de proces 5.11. Poate fi necesară îndepărtarea tubului din clemă. Notă: Se asigură că se înlocuieşte tubul sursă în clema S dacă este îndepărtat.
8.13.37 Suspendarea recipientului sursă. S-a suspendat recipientul sursă pe suportul IV, plasând ambele agăţători pe cârlig. NU s-a suspendat sursa pe cântarul #1. S-au deschis toate clemele la punga sursă.
8.13.38 Verificarea ataşării recipientului sursă. S-a atins butonul Pasul următor. S-a afişat segmentul Iniţiere sursă. S-a verificat dacă sursa a fost ataşată la kitul de unică folosinţă şi dacă sudurile şi clemele de plastic de pe tubul care duce la sursă au fost deschise. S-a atins butonul Da.
8.13.39 Confirmarea curgerii PlasmaLyte. A început iniţierea sursei şi s-a afişat ecranul Iniţiere sursă. S-a observat vizual dacă PlasmaLyte curge prin tubul ataşat la punga sursă. Dacă nu există curgere de fluid, se apasă butonul de pauză de pe ecran şi se determină dacă o clemă sau o sudură este încă închisă. Odată ce problema a fost rezolvată, se apasă butonul Reluare de pe ecran pentru a relua iniţierea sursei.
8.13.40 Ecranul de start procedură. Când iniţierea sursei se încheie cu succes, se afişează ecranul Start procedură. Dacă se apasă Start, apare imediat ecranul de pauză „Pre-spălare ciclul 1».
8.13.41 Amestecarea pungii din proces. S-a îndepărtat punga de pe cântarul #2 (se poate îndepărta şi tubul portului superior din ghidajul tubului) şi s-a întors manual pentru a permite tamponului de spălare adăugat în timpul etapei de iniţiere a kitului de unică folosinţă să acopere toate suprafeţele interioare ale pungii. Se suspendă din nou punga pe cântarul #2 (cu eticheta de pe pungă orientată spre stânga). Se înlocuieşte tubul portului superior în ghidajul tubului, dacă a fost îndepărtat.
8.13.42 Amestecarea pungii sursă. Înainte de a apăsa butonul Start, s-a amestecat punga sursă fără a o îndepărta de pe suportul IV prin masarea colţurilor pungii şi agitarea uşoară a celulelor pentru a crea o suspensie celulară omogenă.
S-a apăsat butonul Reluare. LOVO a început să proceseze fluidul din punga sursă şi se afişează ecranul Ciclu de spălare 1.
8.13.43 Pauză sursă clătire. Ecranul Pauză sursă clătire a fost afişat după golirea recipientului sursă şi LOVO a adăugat tampon de spălare în punga sursă. Fără a îndepărta punga sursă de pe suportul IV, s-au masat colţurile şi s-a amestecat bine. S-a apăsat Reluare.
8.13.44 Pauză amestecare pungă procesată. Pentru a pregăti celulele pentru o altă trecere prin centrifugă, punga procesată a fost diluată cu tampon de spălare. După adăugarea tamponului de spălare în punga procesată, LOVO se întrerupe automat şi afişează ecranul de pauză „Amestecare pungă procesată». Fără a îndepărta punga de pe cântar, s-a amestecat bine produsul strângând uşor punga. S-a apăsat Reluare.
8.13.45 Pauză masare colţuri. Când punga procesată s-a golit, s-a adăugat tampon de spălare în portul inferior al pungii procesate pentru a clăti punga. După adăugarea fluidului de clătire, LOVO s-a întrerupt automat şi a afişat ecranul de pauză „Masare colţuri IP». Când se afişează ecranul de pauză „Masare colţuri IP», a NU se îndepărta punga de pe cântarul #2. Cu punga încă suspendată pe cântarul #2, se masează colţurile pungii pentru a aduce celulele reziduale în suspensie. Se asigură că punga nu se balansează pe cântar şi se apasă butonul Reluare.
8.13.46 Aşteptarea ecranului Îndepărtare produse. La sfârşitul procedurii LOVO, a fost afişat ecranul Îndepărtare produse. Când se afişează acest ecran, toate pungile din kitul LOVO pot fi manipulate. Notă: a nu se atinge nici o pungă până când nu se afişează Îndepărtare produse.
8.13.47 Îndepărtarea pungii de retentat. S-a aşezat o pensă pe tub foarte aproape de portul de pe punga de retentat pentru a împiedica suspensia celulară să se depună în tub. S-a etanşat termic (conform Notei de proces 5.12) sub pensă, asigurând că se menţine suficientă linie pentru sudurî în etapa 8.13.48. S-a îndepărtat punga de retentat.
8.13.48 Pregătirea pungii de retentat. S-a sudat (conform Notei de proces 5.11) capătul conectorului luer interior al unui set de transfer plasmă de 4" la punga de retentat. S-a transferat punga de retentat în BSC pentru utilizare în etapa 8.14.11.
8.13.49 Îndepărtarea produselor. S-au urmat instrucţiunile de pe ecranul Îndepărtare produse. S-au închis toate clemele de pe kitul LOVO pentru a împiedica mişcarea fluidului.
8.13.50 Îndepărtarea produselor. S-a atins butonul Pasul următor. Toate clemele mecanice LOVO s-au deschis şi a fost afişat ecranul Îndepărtare kit.
8.13.51 Înregistrarea datelor. S-au urmat instrucţiunile de pe ecranul Îndepărtare kit. S-a atins butonul „Pasul următor». Toate clemele mecanice LOVO se închid şi se afişează ecranul Rezumat rezultate. S-au înregistrat datele din ecranul de rezumat al rezultatelor în tabel exact aşa cum sunt afişate. S-au închis toate pompele şi suportul filtrului. S-a îndepărtat kitul la solicitarea LOVO. *NOTĂ: Toate orele înregistrate au fost înregistrate direct din LOVO
Ecranul Rezumat rezultate în format HH:MM:SS, când este aplicabil
8.13.52-8.13.54 Selectarea protocoalelor de oprire LOVO. Se urmează instrucţiunile de pe ecranul LOVO.
8.13.55 Revizuire secţiune 8.13
8.14 Preparare finală şi umplere
8.14.1 Calcularea volumului ţintă/pungă. Din tabelul de mai jos, s-a selectat numărul de pungi CS750 de umplut, volumul ţintă de umplere per pungă, volumul reţinut per pungă şi volumul ţintă final per pungă corespunzând volumului de reentat LOVO de la etapa 8.13.22.
Volum produs LOVO Volum CS10 de adăugat în produs Volum final estimat de produs preparat Număr pungi Volum ţintă de umplere per pungă Volum reţinut per pungă Volum ţintă final per pungă 165mL 165mL 330mL 3 107mL 7mL 100mL 215mL 215mL 430mL 4 105mL 5mL 100mL 265mL 265mL 530mL 4 130mL 5mL 125mL
8.14.2 Prepararea martorului CRF. S-a calculat volumul CS-10 şi al tamponului de spălare LOVO pentru prepararea pungii martor.
Volum ţintă final per pungă 8.14.1E Volum tampon spălare LOVO martor Volum CS-10 martor (mL) A B = A / 2 C = B mL mL mL
8.14.3 Prepararea martorului CRF. În exteriorul BSC, folosind seringa de tampon de spălare LOVO preparat în etapa 8.11.29, s-a adăugat volumul calculat în etapa 8.14.2 B într-o pungă CS750 goală prin conectorul luer. NOTĂ: Prepararea pungii CS750 martor nu trebuie să se efectueze aseptic.
8.14.4 Prepararea martorului CRF. Folosind o seringă de dimensiuni adecvate, s-a adăugat volumul de CS-10 calculat în etapa 8.14.2 în aceeaşi pungă CS750 preparată în etapa 8.14.3. S-a aşezat un capac roşu pe punga CS750.
8.14.5 Prepararea martorului CRF. S-a eliminat cât mai mult aer posibil din punga CS-750. S-a etanşat termic (conform Notei de proces 5.12) punga CS750 cât mai aproape de pungă, îndepărtând tubul.
8.14.6 Prepararea martorului CRF. S-a etichetat punga CS750 cu „Martor CRF», numărul lotului şi iniţiale/data. S-a aşezat martorul CRF pe pachete cu gheaţă până când s-a introdus în CRF.
8.14.7 S-a calculat volumul necesar de IL-2. S-a calculat volumul de IL-2 de adăugat în produsul final
Parametru Formulă Rezultat Volum retentat final Etapa 8.13.51 A. mL Volum preparat final B = A × 2 B. mL Concentraţie IL-2 finală dorită (IU/mL) 300 IU/mL C. 300 IU/mL IU de IL-2 necesare D = B x C D. IU Soluţie de lucru IL-2 din etapa 8.11.33 6 × 104 IU/mL E. 6 × 104 IU/mL Volum IL-2 de adăugat în produsul final F = D ÷ E F. mL
8.14.8 Asamblarea aparatului Connect. S-a sudat steril (conform Notei de proces 5.11) un 4S-4M60 la un CC2 Cell Connect înlocuind un singur racord al aparatului Cell Connect (B) cu capătul cu 4 racorduri al 4S-4M60 la (G). (Vezi, de exemplu, Figura 135.)
8.14.9 Asamblarea aparatului Connect. S-au sudat steril (conform Notei de proces 5.11) pungile crio CS750 la echipamentul pregătit în etapa 8.14.8, înlocuind unul dintre cele patru capete ale conectorului luer exterior (E) cu fiecare pungă. Se consultă etapa 8.14.1 pentru a determina numărul de pungi necesare. (Vezi, de exemplu, Figura 136.)
8.14.10 Asamblarea aparatului Connect. S-au sudat (conform Notei de proces 5.11) pungile CS-10 la racordurile 4S-4M60. CS-10 au fost ţinute la rece aşezând pungile între două pachete cu gheaţă condiţionate la 2-8°C. (Vezi, de exemplu, Figura 137.)
8.14.11 Introducerea materialelor în BSC.
8.14.12 Prepararea TIL cu IL-2. Folosind o seringă de dimensiuni adecvate, s-a îndepărtat cantitatea de IL-2 determinată în etapa 8.14.7 din partea alicotă „IL-2 6×104».
8.14.13 Prepararea TIL cu IL-2. S-a conectat seringa la punga de retentat pregătită în etapa 8.13.48 prin conectorul luer şi s-a injectat IL-2.
8.14.14 Prepararea TIL cu IL-2. S-a curăţat linia împingând aer din seringă prin linie.
8.14.15 Etichetarea pungii TIL preparate. S-a închis clema de pe setul de transfer şi s-a etichetat punga ca „TIL preparate» şi s-a scos punga din BSC.
8.14.16 Dacă este cazul: prelevarea probelor conform planului. Dacă a rămas o parte alicotă „IL-2 6×104» preparată în etapa 8.11.33, se îndepărtează o probă de ~ 5 mL conform planului de prelevare folosind o seringă de dimensiuni adecvate şi se distribuie într-un tub conic de 50 mL.
8.14.17 Dacă este cazul: prelevarea probelor conform planului. Se etichetează cu eticheta de inventar al planului de prelevare şi se păstrează la 2-8°C până când se trimite la Login pentru testare conform planului de prelevare.
Articol # articol sau etapă Cantitate Referinţă Set transfer plasmă 4" 1 Parte alicotă IL-2 (6.0×104) 8.11.33 1 Seringă de dimensiune adecvată pentru adăugare IL2 8.14.7F 1 Pungă retentat LOVO 8.13.48 1 Capace roşii 5
8.14.18 Dacă este cazul: Prelevare probe conform planului de prelevare. S-a asigurat că a fost completată foaia planului de prelevare LIMS pentru îndepărtarea probei.
8.14.19 Adăugarea pungii de TIL preparate în aparat. După adăugarea IL-2, s-a sudat (conform Notei de proces 5.11) punga „TIL preparate» la racordul rămas (A) pe aparatul pregătit în etapa 8.14.10. (Vezi, de exemplu, Figura 138.)
8.14.20 Adăugarea CS 10. S-a introdus aparatul asamblat cu pungile TIL preparate, CS-750 şi CS-10 ataşate în BSC. NOTĂ: Punga CS-10 şi toate pungile CS-750 au fost plasate între două pachete cu gheaţă precondiţionate la 2-8°C. Punga cu TIL preparate nu a fost aşezată pe pachete cu gheaţă.
8.14.21 Adăugarea CS10. Se asigură că toate clemele au fost închise pe aparat.
Se roteşte robinetul astfel încât seringa să fie închisă.
8.14.22 Schimbarea seringilor. S-au extras ~10 mL de aer într-o seringă de 100 mL şi s-a înlocuit seringa de 60 mL de pe aparat.
8.14.23 Adăugarea CS10. S-a rotit robinetul astfel încât linia la pungile CS750 să fie închisă. S-au deschis clemele la pungile CS-10 şi s-a extras volumul calculat la etapa 8.14.1B în seringă. NOTĂ: Se vor folosi mai multe seringi pentru a adăuga volumul adecvat de CS-10. NOTĂ: Se înregistrează volumul din fiecare seringă la etapa 8.14.26
8.14.24 Adăugarea CS10. S-au închis clemele la CS-10 şi s-au deschis clemele la punga TIL preparate şi s-a adăugat CS-10. NOTĂ: Se adaugă primii 10.0mL de CS10 la aproximativ 10.0 mL/minut. Se adaugă restul de CS-10 la o viteză de aproximativ 1.0 mL/sec. NOTĂ: S-au folosit mai multe seringi pentru a adăuga volumul adecvat de CS-10. Nu s-a reutilizat nici o seringă după ce a fost golită.
8.14.25 Adăugarea CS10. S-a înregistrat timpul. NOTĂ: Timpul ţintă de la prima adăugare a CS-10 până la începutul congelării este 30
8.14.26 Adăugarea CS 10. S-au înregistrat volumul fiecărei adăugări de CS 10 şi volumul total adăugat. Volumul total se potriveşte cu volumul calculat de la etapa 8.14.1B
8.14.27 Adăugarea CS10. S-au închis toate clemele la pungile CS10.
8.14.28 Pregătirea pungilor CS-750. S-a rotit robinetul astfel încât seringa să fie deschisă. S-au deschis clemele la punga TIL preparate şi s-a extras suspensia, oprindu-se chiar înainte ca suspensia să ajungă la robinet.
8.14.29 Pregătirea pungilor CS-750. S-au închis clemele la punga de TIL preparate. S-a rotit robinetul astfel încât să se deschidă la pungile de produs final CS750 goale.
8.14.30 Pregătirea pungilor CS-750. Folosind o seringă nouă, s-a îndepărtat cât mai mult aer posibil din pungile de produs final CS750.
În timp ce se menţine presiune pe pistonul seringii, pungile se închid.
8.14.31 Pregătirea pungilor CS-750. S-au extras ~20 mL aer într-o seringă nouă de 100 mL şi s-a conectat la aparat.
NOTĂ: Fiecare pungă de produs final CS-750 trebuie să fie între două pachete cu gheaţă pentru a menţine rece suspensia de TIL preparate.
8.14.32 Distribuirea celulelor. S-a rotit robinetul astfel încât linia la pungile de produs final să fie închisă. S-a extras volumul calculat la etapa 8.14.1 din punga de TIL preparate în seringă. NOTĂ: Se pot utiliza mai multe seringi pentru a obţine volumul corect.
8.14.33 Distribuirea celulelor. S-a rotit robinetul astfel încât linia la punga de TIL preparate să fie închisă. Lucrând cu câte o pungă de produs final o dată, se distribuie celule într-o pungă de produs final. S-a înregistrat volumul de celule adăugate în fiecare pungă CS750 în etapa 8.14.35
8.14.34 Distribuirea celulelor. S-a curăţat linia cu aer din seringă, astfel încât celulele să fie la acelaşi nivel cu partea superioară a portului de racord. S-a închis clema pe punga umplută. S-a repetat etapa 8.14.29 - etapa 8.14.34 pentru fiecare pungă de produs final, amestecând uşor punga de TIL preparate între fiecare.
8.14.35 Distribuirea celulelor. S-a înregistrat volumul TIL introduse în fiecare pungă de produs final.
8.14.36 Îndepărtarea aerului din pungile de produs final şi prelevarea probei de reţinere. După umplerea ultimei pungi de produs final, s-au închis toate clemele.
8.14.37 Îndepărtarea aerului din pungile de produs final şi prelevarea probei de reţinere. S-au extras 10 mL de aer într-o seringă nouă de 100 mL şi s-a înlocuit seringa de pe aparat.
8.14.38 Îndepărtarea aerului din pungile de produs final şi prelevarea probei de reţinere. Manipulând o singură pungă o dată, s-a extras tot aerul din fiecare pungă de produs plus volumul de produs pentru reţinere determinat în etapa 8.14.1D. NOTĂ: După îndepărtarea volumului de probă, s-a întors seringa invers şi s-a folosit aerul pentru a curăţa linia la portul superior al pungii de produs. Se prinde linia de pungă după îndepărtarea volumului reţinut şi a aerului.
8.14.39 Înregistrarea volumului îndepărtat. S-a înregistrat volumul de reţinere îndepărtat din fiecare pungă.
8.14.40 Distribuirea probei de reţinere. S-a distribuit proba de reţinere într-un tub conic de 50 mL şi s-a eticheta tubul cu „Probă de reţinere» şi numărul lotului. Se repetă etapa 8.14.37 - etapa 8.14.39 pentru fiecare pungă.
8.14.41 Pregătirea produsului final pentru crioconservare. Cu o pensă s-au prins liniile aproape de pungi. S-au îndepărtat seringa şi conectorul luer cu capac roşu de pe aparatul pe care s-a aflat seringa. S-a scos aparatul din BSC.
8.14.42 Pregătirea produsului final pentru crioconservare. S-a etanşat termic (conform Notei de proces 5.12) la F, îndepărtând punga de retentat goală şi pungile CS-10.
NOTĂ: Se reţine conectorul luer pentru seringă pe aparat. Se elimină pungile de retentat şi CS-10 goale. (Vezi, de exemplu, Figura 139.)
8.14.43 Efectuarea inspecţiei vizuale. NOTĂ: Etapa 8.14.43 - etapa 8.14.46 se pot efectua concomitent cu etapa 8.14.47 - etapa 8.14.68.
8.14.44 Etichetarea produsului final. S-au etichetat pungile de produs final. S-a ataşat eticheta produsului final mai jos.
8.14.45 Pregătirea produsului final pentru crioconservare. Pungile crio au fost ţinute pe pachet cu gheaţă sau la 2-8°C până la crioconservare.
8.14.46 Pregătirea etichetelor externe. S-a asigurat că etichetele externe emise de QA care vor fi ataşate pe etichetele casetelor se potrivesc cu eticheta corespunzătoare a produsului final. S-au ataşat etichetele externe emise de QA pe casete. S-a ataşat o etichetă externă reprezentativă mai jos:
8.14.47 Îndepărtarea probei de numărare a celulelor. Folosind o pipetă de dimensiuni adecvate, s-au îndepărtat 2.0 mL din proba de reţinere îndepărtată în etapa 8.14.38 şi s-au introdus într-un tub conic de 15 mL pentru a se folosi la numărarea celulelor.
8.14.48 Efectuarea numărărilor celulelor. S-au efectuat numărările de celule şi calculele folosind NC-200 conform SOP-00314 şi Nota de proces 5.14. NOTĂ: S-a diluat doar o probă la dilurea corespunzătoare pentru a verifica dacă diluarea este suficientă. S-au diluat probe suplimentare la factorul de diluare adecvat şi s-a continuat la numărare.
8.14.49 Înregistrarea volumelor probelor de numărare a celulelor. NOTĂ: Dacă nu este necesară diluare, „Probă [µL]» = 200, „Diluare [µL]» = 0
8.14.50 Determinarea factorului de multiplicare
Parametru Formulă Rezultat Volum total al probei de numărare a celulelor 8.14.49A + 8.14.49B C. µL Factor de multiplicare C ÷ 8.14.49A D.
8.14.51 Selectarea protocoalelor şi introducerea factorilor de multiplicare. Se asigură că s-a selectat protocolul «Test de numărare a celulelor viabile», s-au introdus toţi factorii de multiplicare şi volumele de probă şi solvent conform SOP - 00314
NOTĂ: Dacă nu este necesară diluare, se introduce «Probă [µL]» = 200, «Diluare [µL]» = 0
8.14.52 S-au înregistrat numele fişierului, viabilitatea şi numerele de celule din Nucleoview. 8.14.53 S-au determinat media concentraţiei de celule viabile şi viabilitatea celulelor.
Parametru Formulă Rezultat Viabilitate (8.14.52A + 8.14.52B) ÷ 2 E. % Concentraţie celule viabile (8.14.52C + 8.14.52D) ÷ 2 F. celule/mL
8.14.54 S-au determinat limita superioară şi cea inferioară pentru numărări.
Parametru Formulă Rezultat Limita inferioară 8.14.53F x 0.9 G. celule/mL Limita superioară 8.14.53F x 1.1 H. celule/mL
8.14.55 Ambele numărări au fost în limite acceptabile?
Parametru Formulă Rezultat (da/nu) Limita inferioară 8.14.52 C şi D ≥ 8.14.54G Limita superioară 8.14.52 C şi D ≤ 8.14.54H
NOTĂ: Dacă oricare rezultat este «nu», se efectuează al doilea set de numărări în etapele 8.14.56 - 8.14.63 8.14.56 Dacă este cazul: Efectuarea numărărilor celulelor. S-au efectuat numărările de celule şi calculele folosind NC-200 conform SOP-00314 şi Nota de proces 5.14. NOTĂ: Diluarea poate fi ajustată pe baza concentraţiei estimate de celule.
8.14.57 Dacă este cazul: S-au înregistrat volumele probelor de numărare a celulelor.
8.14.58 Dacă este cazul: S-a determinat factorul de multiplicare
Parametru Formulă Rezultat Volum total al probei de numărare a celulelor 8.14.57A + 8.14.57B C. mL Factor de multiplicare C ÷ 8.14.57A D.
8.14.59 Dacă este cazul: Selectarea protocoalelor şi introducerea factorilor de multiplicare. Se asigură că s-a selectat protocolul «Test de numărare a celulelor viabile», s-au introdus toţi factorii de multiplicare şi volumele de probă şi solvent. NOTĂ: Dacă nu este necesară diluare, se introduce «Probă [µL]» = 200, «Diluare [µL]» = 0
8.14.60 Dacă este cazul: S-au înregistrat numerele de celule din Nucleoview 8.14.61 Dacă este cazul: S-au determinat media concentraţiei de celule viabile şi viabilitatea celulelor.
Parametru Formulă Rezultat Viabilitate (8.14.60A + 8.14.60B) ÷ 2 E. % Concentraţie celule viabile (8.14.60C + 8.14.60D) ÷ 2 F. celule/mL
8.14.62 Dacă este cazul: S-au determinat limita superioară şi cea inferioară pentru numărări.
Parametru Formulă Rezultat Limita inferioară 8.14.61F x 0.9 G. celule/mL Limita superioară 8.14.61F x 1.1 H. celule/mL
8.14.63 Dacă este cazul: Numărările au fost în limite acceptabile?
Parametru Formulă Rezultat (da/nu) Limita inferioară 8.14.60 C şi D ≥ 8.14.62G Limita superioară 8.14.60 C şi D ≤ 8.14.62H
NOTĂ: Dacă oricare rezultat este «nu», se continuă la etapa 8.14.64 pentru a determina o medie. 8.14.64 Dacă este cazul: S-a determinat o concentraţie medie a celulelor viabile din toate cele patru numărări efectuate.
8.14.65 Calculul probei de citometrie în flux. S-a efectuat calculul pentru a asigura o concentraţie de celule suficientă pentru prelevarea probelor de citometrie în flux.
Concentraţie celule viabile din Volum ţintă necesar pentru 6×107 TVC Este B ≤ 1.0 mL? (da/nu**) etapa 8.14.53 F* sau etapa 8.14.61 F* sau B = 6x107 celule/ A etapa 8.14.64 E* A celule/mL mL *Se încercuieşte referinţa etapei folosite pentru a determina concentraţia celulelor viabile **NOTĂ: Dacă "nu", a se contacta managementul local.
8.14.66 Calculul probei IFN-γ. S-au efectuat calcule pentru a asigura o concentraţie celulară suficientă pentru prelevarea de probe IFN-γ.
Concentraţie celule viabile din Volum necesar pentru minim 1.5×107 TVC B = 1.5x107 celule / A Este B ≤ 1.0 mL? (da/nu**) etapa 8.14.53 F* sau etapa 8.14.61 F* sau etapa 8.14.64 E* A celule/mL mL *Se încercuieşte referinţa etapei folosite pentru a determina concentraţia celulelor viabile **NOTĂ: Dacă "nu", a se contacta managementul local.
8.14.67 Raportarea rezultatelor. S-au completat formularele de expediere cu probele. 8.14.68 Etanşare termică. După determinarea volumelor probelor, s-au etanşat termic (conform Notei de proces 5.12) pungile de produs final cât mai aproape de pungi posibil pentru îndepărtare din aparat. 8.14.69 Etichetarea şi colectarea probelor conform planului de prelevare.
Probă Număr de recipiente Volum probă de adăugat în fiecare Tip recipient Destinaţie *Mycoplasma 1 1.0 mL Tub conic 15 mL Login Endotoxină 2 1.0 mL Criofiolă 2 mL Login Tulpină Gram 1 1.0 mL Criofiolă 2 mL Login IFN-g 1 1.0 mL Criofiolă 2 mL Login Citometrie în flux 1 1.0 mL Criofiolă 2 mL Login ** Sterilitate Bac-T 2 1.0 mL Flacon Bac-T Login Reţinere QC 4 1.0 mL Criofiolă 2 mL CRF Fiole satelit 10 0.5 mL Criofiolă 2 mL CRF *NOTĂ: Pentru proba de Mycoplasma, se adaugă volum de suspensie celulară preparată în tubul conic de 15mL etichetat "Solvent Mycoplasma" de la etapa 8.12.55. **NOTĂ: Se trece la etapa 8.14.70 pentru inocularea Bac-T.
8.14.70 Prelevare de probe de testare a sterilităţii şi BacT. În BSC, s-a îndepărtat o probă de 1.0 mL din suspensia celulară reţinută colectată în etapa 8.14.38 folosind o seringă de dimensiuni adecvate şi s-a inoculat flaconul anaerob. Se repetă cele de mai sus pentru flaconul aerob. NOTĂ: Flacoanele Bac-T se depozitează la temperatura camerei, protejate de lumină.
8.14.71 Etichetarea şi depozitarea probelor. S-au etichetat toate probele cu etichete de inventar al planului de prelevare şi s-au depozitat în mod corespunzător până la transferul la Login. NOTĂ: Se continuă la secţiunea 8.15 pentru crioconservarea produsului final şi a probelor.
8.14.72 Semnare pentru prelevare. S-a asigurat că foaia planului de prelevare LIMS este completată pentru îndepărtarea probelor.
8.14.73 Trimiterea probei. S-au trimis toate probele de testare din ziua 22 la Login.
8.14.74 Monitorizarea mediului. După procesare s-a verificat BSC şi s-a monitorizat personalul.
8.14.75 Revizuire secţiune 8.14
8.15 Crioconservarea produsului final
8.15.1 Pregătirea congelatorului cu viteză controlată. S-a verificat dacă CRF a fost configurat înainte de congelare. S-au înregistrat echipamentele CRF. Se realizează crioconservarea.
8.15.2 Configurarea sondelor CRF. S-a perforat membrana de pe punga CRF martor. S-a introdus sonda de temperatură a fiolei de 6 mL.
8.15.3 Introducerea produsului final şi a probelor în CRF. S-a introdus punga martor într-o casetă precondiţionată şi s-a transferat aproximativ în mijlocul suportului CRF. Casetele de produs final au fost transferate în suportul CRF, iar fiolele în suportul de fiole CRF.
8.15.4 Introducerea produsului final şi a probelor în CRF. Suporturile cu produse şi suporturile cu fiole au fost transferate în CRF. S-au înregistrat ora la care produsul este transferat în CRF şi temperatura camerei în etapa 8.15.5. NOTĂ: Casetele şi suportul de fiole s-au distribuit uniform în CRF, lăsând cât mai mult spaţiu posibil între fiecare raft.
8.15.5 S-a determinat timpul necesar pentru a ajunge la 4°C ± 1.5 °C şi s-a continuat ciclul CRF. Când temperatura camerei a atins 4°C ± 1.5°C, a început ciclul. S-a înregistrat timpul.
Parametru Formulă Valoare Ora transferului produsului final în CRF (OOMM) Temperatura la care produsul final este transferat în CRF De la monitor °C Oră pornire B. CRF (OOMM) Timp trecut de la preparare la pornire CRF C = B - etapa 8.14.25A min
8.15.6 Finalizarea CRF şi depozitare. CRF s-a oprit după încheierea ciclului. S-au îndepărtat casetele şi fiolele din CRF. Casetele şi fiolele s-au transferat în LN2 în fază de vapori pentru depozitare. S-a înregistrat locul de depozitare
REZUMAT POST PROCESARE
• Post-procesare: Produs medicamentos final
o (ziua 22) Determinarea celulelor CD3+ în REP ziua 22 prin citometrie în flux
o (ziua 22) Metoda de colorare Gram (GMP)
o (ziua 22) Testul endotoxinei bacteriene prin metoda Gel Clot LAL (GMP)
o (ziua 16) Testul de sterilitate BacT (GMP)
o (ziua 16) Detectarea ADN Mycoplasma prin TD-PCR (GMP)
o Atribute de aspect acceptabile (etapa 8.14.43)
o (ziua 22) Testul de sterilitate BacT (GMP)
o (ziua 22) Testul IFN-gamma
Exemplele de mai sus sunt prezentate pentru o divulgare şi o descriere completă a modului de preparare şi utilizare a aplicărilor compoziţiilor, sistemelor şi metodelor din invenţie, fără a limita sfera de acoperire a invenţiei. Modificările modurilor descrise mai sus de implementare a invenţiei, care sunt evidente persoanelor cu competenţe în domeniu, se încadrează în sfera de acoperire a revendicărilor următoare. Toate brevetele şi publicaţiile menţionate în specificaţie indică nivelurile competenţelor în domeniul căruia îi aparţine invenţia.
Titlurile şi secţiunile se utilizează exclusiv pentru claritate şi ca referinţă şi nu se vor considera în nici un fel limitative. De exemplu, persoanele cu competenţe în domeniu vor înţelege utilitatea combinării diferitelor aspecte din paragrafe şi secţiuni diferite în mod corespunzător.
Aplicările specifice şi exemplele descrise în prezenta sunt prezentate exclusiv exemplificativ şi cererea este limitată numai de termenii revendicărilor anexate, împreună cu echivalenţele la care sunt îndreptăţite revendicările.
Secvenţe:
SEQ ID NO:1 este secvenţa aminoacidică a lanţului greu la muromonab. SEQ ID NO:2 este secvenţa aminoacidică a lanţului uşor al muromonab. SEQ ID NO:3 este secvenţa aminoacidică a unei proteine umane recombinante IL-2. SEQ ID NO:4 este secvenţa aminoacidică a aldesleukinei. SEQ ID NO:5 este secvenţa aminoacidică a unei proteine umane recombinante IL-4. SEQ ID NO:6 este secvenţa aminoacidică a unei proteine umane recombinante IL-7. SEQ ID NO:7 este secvenţa aminoacidică a unei proteine umane recombinante IL-15. SEQ ID NO:8 este secvenţa aminoacidică a unei proteine umane recombinante IL-21.
Secvenţele aminoacidice ale muromonab.
Denumire Secvenţă (simboluri de aminoacizi de o litruă) SEQ ID NO:1 lanţul greu muromonab SEQ ID NO:2 lanţul uşor muromonab
Secvenţele aminoacidice ale interleukinelor.
Denumire Secvenţă (simboluri de aminoacizi de o litruă) SEQ ID NO:3 IL-2 umană recombinantă (rhIL-2 ) SEQ ID NO:4 Aldesleukina SEQ ID NO:5 IL-4 umană recombinantă (rhIL-4) SEQ ID NO:6 IL-7 umană recombinantă (rhIL-7) SEQ ID NO:7 IL-15 umană recombinantă (rhIL-15) SEQ ID NO:8 IL-21 umană recombinantă (rhIL-21)

Claims (22)

1. O metodă de expansiune a limfocitelor infiltrante în tumori (TIL) într-o populaţie terapeutică de TIL cuprinzând:
(a) adăugarea fragmentelor tumorale procesate dintr-o tumoare rezecată de la un pacient într-un sistem închis pentru a obţine o primă populaţie de TIL;
(b) efectuarea unei prime expansiuni prin cultivarea primei populaţii de TIL într-un mediu de cultură celulară cuprinzând IL-2, şi opţional OKT-3, pentru a produce o a doua populaţie de TIL, unde prima expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o primă suprafaţă permeabilă la gaz, unde prima expansiune se efectuează timp de 3-14 zile pentru a obţine a doua populaţie de TIL, unde tranziţia de la etapa (a) la etapa (b) are loc fără deschiderea sistemului;
(c) efectuarea unei a doua expansiuni prin suplimentarea mediului de cultură celulară al celei de-a doua populaţii de TIL cu IL-2 suplimentar, opţional OKT-3, şi celule de prezentare a antigenului (APC), pentru a produce o a treia populaţie de TIL, unde a doua expansiune se efectuează timp de 4 până la 6 zile pentru a obţine a treia populaţie de TIL, unde a doua expansiune se efectuează într-un recipient închis care asigură o a doua suprafaţă permeabilă la gaz şi unde tranziţia de la etapa (b) la etapa (c) are loc fără deschiderea sistemului;
(d) împărţirea celei de-a treia populaţii de TIL într-un prim grup de cinci sau mai puţine sub-populaţii de TIL, fiecare sub-populaţie cuprinzând cel puţin 1.0×109 TIL, şi efectuarea unei a treia expansiuni a primului grup de sub-populaţii de TIL prin suplimentarea mediului de cultură celulară al fiecărei sub-populaţii de TIL cu IL-2 suplimentar, opţional OKT-3, pentru a produce un al doilea grup de sub-populaţii de TIL, unde al doilea grup de sub-populaţii de TIL cuprinde o populaţie terapeutică de TIL, unde a treia expansiune se efectuează timp de 5 până la 7 zile, unde a treia expansiune pentru fiecare sub-populaţie se efectuează într-un recipient închis care asigură o a treia suprafaţă permeabilă la gaz şi unde tranziţia de la etapa (c) la etapa (d) are loc fără deschiderea sistemului;
(e) recoltarea populaţiei terapeutice de TIL obţinute de la etapa (d), unde tranziţia de la etapa (d) la etapa (e) are loc fără deschiderea sistemului; şi
(f) transferul populaţiei TIL recoltate de la etapa (e) într-o pungă de perfuzie, unde transferul de la etapa (e) la (f) are loc fără deschiderea sistemului.
2. Metoda conform revendicării 1, unde populaţia terapeutică de TIL recoltată în etapa (e) cuprinde suficiente TIL pentru un dozaj terapeutic eficient al TIL, unde, opţional, numărul de TIL suficient pentru un dozaj terapeutic eficient este de la 2.3×1010 la 13.7×1010.
3. Metoda conform revendicării 2, cuprinzând de asemenea etapa de crioconservare a pungii de perfuzie cuprinzând populaţia TIL recoltată folosind un proces de crioconservare, unde opţional procesul de crioconservare se efectuează folosind un raport 1:1 între populaţia TIL recoltată şi mediul de crioconservare.
4. Metoda conform revendicării 3, unde celulele de prezentare a antigenului sunt celule mononucleare din sânge periferic (PBMC), unde opţional PBMC sunt iradiate şi alogenice.
5. Metoda conform revendicării 1, unde recoltarea din etapa (e) se efectuează folosind un sistem de procesare celulară LOVO.
6. Metoda conform revendicării 1, unde punga de perfuzie din etapa (f) este o pungă de perfuzie conţinând HypoThermosol.
7. Metoda conform revendicării 1, unde etapa (b) se efectuează într-o perioadă de 10 zile, 11 zile sau 12 zile.
8. Metoda conform revendicării 1, unde etapa (b) se efectuează într-o perioadă de 11 zile.
9. Metoda conform revendicării 1, unde etapele (a) până la (f) se efectuează într-o perioadă de 10 zile până la 22 de zile.
10. Metoda conform revendicării 1, unde etapele (a) până la (f) se efectuează într-o perioadă de 10 zile până la 20 de zile.
11. Metoda conform revendicării 1, unde etapele (a) până la (f) se efectuează într-o perioadă de 10 zile până la 15 zile.
12. Metoda conform revendicării 1, unde etapele (a) până la (f) se efectuează în 22 de zile sau mai puţin.
13. Metoda conform revendicării 2, unde etapele (a) până la (f) şi crioconservarea se efectuează în 22 de zile sau mai puţin.
14. Metoda conform oricăreia din revendicările 1 şi 8, unde etapa (c) se efectuează timp de 108 ore până la 132 ore.
15. Metoda conform revendicării 14, unde etapa (c) se efectuează timp de 108 ore, 5 zile sau 132 ore.
16. Metoda conform oricăreia din revendicările 1 şi 8, unde etapa (c) şi etapa (d) se efectuează într-o perioadă de 10 zile până la 12 zile.
17. Metoda conform oricăreia din revendicările 1 şi 8, unde etapa (c) şi etapa (d) se efectuează într-o perioadă de 10 zile, 11 zile sau 12 zile.
18. Metoda conform oricăreia din revendicările de la 1 la 17, unde populaţia terapeutică de TIL cuprinde o subpopulaţie mărită de celule T efectoare şi/sau celule T de memorie centrală faţă de a doua populaţie de TIL, unde celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală obţinute în populaţia terapeutică de TIL prezintă una sau mai multe caracteristici selectate din grupul constând din expresie CD27+, expresie CD28+, telomeri mai lungi, expresie CD57 mărită şi expresie CD56 scăzută faţă de celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală obţinute din a doua populaţie de celule.
19. Metoda conform oricăreia din revendicările de la 1 la 18, unde celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală obţinute în populaţia terapeutică de TIL prezintă expresie CD57 mărită şi expresie CD56 scăzută faţă de celulele T efectoare şi/sau celulele T de memorie centrală obţinute din a doua populaţie de celule.
20. Metoda conform oricăreia din revendicările de la 1 la 19, unde riscul de contaminare microbiană este redus comparativ cu un sistem deschis.
21. Metoda conform oricăreia din revendicările anterioare, unde fiecare recipient închis cuprinde un singur bioreactor.
22. Metoda conform oricăreia din revendicările anterioare, unde a doua populaţie de TIL are un număr cel puţin de 50 de ori mai mare decât prima populaţie de TIL.
MDE20210111T 2018-03-29 2018-06-29 Procese de producție a limfocitelor infiltrante în tumori și utilizările acestora în imunoterapie MD3775165T2 (ro)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US15/940,901 US10918666B2 (en) 2017-03-29 2018-03-29 Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
PCT/US2018/040474 WO2019190579A1 (en) 2018-03-29 2018-06-29 Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MD3775165T2 true MD3775165T2 (ro) 2024-09-30

Family

ID=63013105

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MDE20210111T MD3775165T2 (ro) 2018-03-29 2018-06-29 Procese de producție a limfocitelor infiltrante în tumori și utilizările acestora în imunoterapie

Country Status (24)

Country Link
EP (2) EP4386080A3 (ro)
KR (2) KR20200138329A (ro)
CN (1) CN112513254A (ro)
AU (2) AU2018415814B2 (ro)
BR (1) BR112020019496A2 (ro)
CA (1) CA3094957A1 (ro)
DK (1) DK3775165T3 (ro)
EA (1) EA202092319A1 (ro)
ES (1) ES2982509T3 (ro)
FI (1) FI3775165T3 (ro)
HR (1) HRP20240850T1 (ro)
HU (1) HUE068082T2 (ro)
IL (1) IL277592A (ro)
LT (1) LT3775165T (ro)
MA (1) MA52667B1 (ro)
MD (1) MD3775165T2 (ro)
MX (1) MX2020010264A (ro)
PL (1) PL3775165T3 (ro)
PT (1) PT3775165T (ro)
RS (1) RS65674B1 (ro)
SG (1) SG11202009170UA (ro)
SI (1) SI3775165T1 (ro)
SM (1) SMT202400287T1 (ro)
WO (1) WO2019190579A1 (ro)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201522097D0 (en) 2015-12-15 2016-01-27 Cellular Therapeutics Ltd Cells
GB201700621D0 (en) 2017-01-13 2017-03-01 Guest Ryan Dominic Method,device and kit for the aseptic isolation,enrichment and stabilsation of cells from mammalian solid tissue
US20190284553A1 (en) 2018-03-15 2019-09-19 KSQ Therapeutics, Inc. Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy
KR20220119439A (ko) 2019-12-20 2022-08-29 인스틸 바이오 유케이 리미티드 종양 침윤 림프구를 분리하기 위한 장치 및 방법 및 그것의 용도
US20230106973A1 (en) * 2020-02-17 2023-04-06 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for expansion of tumor infiltrating lymphocytes and use thereof
US12365871B2 (en) 2020-04-28 2025-07-22 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing cells
KR20230135571A (ko) 2020-11-25 2023-09-25 상하이 준셀 테라퓨틱스 컴퍼니 리미티드 종양 침윤 림프구 배지 및 이의 응용
JP2024500748A (ja) * 2020-12-18 2024-01-10 インスティル バイオ （ユーケイ） リミテッド 腫瘍浸潤リンパ球の処理
JP2023554425A (ja) * 2020-12-18 2023-12-27 インスティル バイオ （ユーケイ） リミテッド 腫瘍浸潤リンパ球の処理
CN114686430A (zh) * 2020-12-31 2022-07-01 上海赛比曼生物科技有限公司 一种制备til的方法
JP2024512978A (ja) * 2021-03-30 2024-03-21 ネオジェント コーポレーション 免疫細胞組成物を生成するための方法
AU2022292928A1 (en) * 2021-06-17 2024-01-25 CBio A/S Multistep process for culturing tumor-infiltrating lymphocytes for therapeutic use
WO2023218399A1 (en) * 2022-05-11 2023-11-16 Fundação D. Anna De Sommer Champalimaud E Dr. Carlos Montez Champalimaud - Centro De Investigação Da Fundação Champalimaud Method of preparing and expanding a population of immune cells for cancer therapy, potency assay for tumor recognition, biological vaccine preparation and epitope target for antibodies
EP4743565A2 (en) 2023-07-13 2026-05-20 Iovance Biotherapeutics Inc Lentiviral vectors encoding cytokines and their uses in the production of tumor-infiltrating lymphocytes
WO2025083398A1 (en) 2023-10-16 2025-04-24 Cell Therapy Catapult Limited Co-culture
CN120888499A (zh) * 2025-09-29 2025-11-04 山东第一医科大学附属肿瘤医院(山东省肿瘤防治研究院、山东省肿瘤医院) 一种肿瘤浸润淋巴细胞的扩增培养方法

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US6303121B1 (en) 1992-07-30 2001-10-16 Advanced Research And Technology Method of using human receptor protein 4-1BB
US6362325B1 (en) 1988-11-07 2002-03-26 Advanced Research And Technology Institute, Inc. Murine 4-1BB gene
US4902502A (en) 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5089261A (en) 1989-01-23 1992-02-18 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
DK0766745T3 (da) 1995-04-08 2002-11-25 Lg Chemical Ltd Monoklonalt antistof, som er specifikt for humant 4-1BB samt cellelinje, som producerer dette
IL129138A0 (en) 1996-10-11 2000-02-17 Bristol Myers Squibb Co Methods and compositions for immunomodulation
AU2000202A (en) 2000-10-31 2002-05-15 Pr Pharmaceuticals Inc Methods and compositions for enhanced delivery of bioactive molecules
AU2003259294A1 (en) 2002-07-30 2004-02-16 Bristol-Myers Squibb Company Humanized antibodies against human 4-1bb
CN101120083B (zh) 2003-10-08 2013-03-27 威尔森沃尔夫制造公司 利用透气性材料进行细胞培养的方法及装置
US7288638B2 (en) 2003-10-10 2007-10-30 Bristol-Myers Squibb Company Fully human antibodies against human 4-1BB
PL2161336T5 (pl) 2005-05-09 2017-10-31 Ono Pharmaceutical Co Ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciwko białku Programmed Death 1 (PD-1) oraz sposoby leczenia raka z zastosowaniem samych przeciwciał anty-PD-1 lub w połączeniu z innymi środkami immunoterapeutycznymi
CA2612241C (en) 2005-07-01 2018-11-06 Medarex, Inc. Human monoclonal antibodies to programmed death ligand 1 (pd-l1)
EP1894940A1 (en) 2006-08-28 2008-03-05 Apogenix GmbH TNF superfamily fusion proteins
ES2657801T3 (es) 2007-07-10 2018-03-06 Apogenix Ag Proteínas de fusión de colectina de la superfamilia de TNF
ES2524553T3 (es) 2008-06-17 2014-12-10 Apogenix Gmbh Receptores multiméricos de TNF
EP3103875A1 (en) 2008-07-21 2016-12-14 Apogenix AG Tnfsf single chain molecules
WO2010042433A1 (en) 2008-10-06 2010-04-15 Bristol-Myers Squibb Company Combination of cd137 antibody and ctla-4 antibody for the treatment of proliferative diseases
ES2593049T3 (es) 2009-01-09 2016-12-05 Apogenix Ag Proteínas de fusión que forman trímeros
US8383099B2 (en) 2009-08-28 2013-02-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Adoptive cell therapy with young T cells
US20130115617A1 (en) 2009-12-08 2013-05-09 John R. Wilson Methods of cell culture for adoptive cell therapy
US8956860B2 (en) 2009-12-08 2015-02-17 Juan F. Vera Methods of cell culture for adoptive cell therapy
JP2013512694A (ja) 2009-12-08 2013-04-18 ウィルソン ウォルフ マニュファクチャリング コーポレイション 養子細胞療法のための細胞を培養する方法
SG10201912092VA (en) 2010-09-09 2020-02-27 Pfizer 4-1bb binding molecules
US8962804B2 (en) 2010-10-08 2015-02-24 City Of Hope Meditopes and meditope-binding antibodies and uses thereof
KR102591732B1 (ko) 2010-11-12 2023-10-19 넥타르 테라퓨틱스 Ｉｌ-2 부분 및 중합체의 접합체
US20120244133A1 (en) * 2011-03-22 2012-09-27 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Methods of growing tumor infiltrating lymphocytes in gas-permeable containers
WO2012177788A1 (en) 2011-06-20 2012-12-27 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Modulators of 4-1bb and immune responses
CN102816734A (zh) * 2012-05-09 2012-12-12 阮润生 一种肿瘤抗原特异性t细胞的获取方法
SG11201407226WA (en) 2012-05-18 2014-12-30 Wolf Wilson Mfg Corp Improved methods of cell culture for adoptive cell therapy
IL288241B2 (en) 2012-06-11 2023-10-01 Wilson Wolf Mfg Corporation Improved cell culture methods for stress cell therapy
US20160010058A1 (en) 2013-03-01 2016-01-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Serv Methods of producing enriched populations of tumor-reactive t cells from tumor
SG10201705494YA (en) 2013-06-24 2017-08-30 Wolf Wilson Mfg Corp Closed system device and methods for gas permeable cell culture process
ES2783026T3 (es) 2014-02-04 2020-09-16 Pfizer Combinación de un antagonista de PD-1 y un agonista de 4-1BB para el tratamiento de cáncer
US20170044496A1 (en) * 2014-04-10 2017-02-16 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Enhanced Expansion of Tumor-Infiltrating Lymphocytes for Adoptive Cell Therapy
US20170107490A1 (en) 2014-06-11 2017-04-20 Polybiocept Ab Expansion of lymphocytes with a cytokine composition for active cellular immunotherapy
FR3040396A1 (fr) * 2015-06-30 2017-03-03 Chu Nantes Procede de cryoconservation de lymphocytes infiltrant la tumeur
JOP20190224A1 (ar) * 2017-03-29 2019-09-26 Iovance Biotherapeutics Inc عمليات من أجل إنتاج الخلايا اللمفاوية المرتشحة للأورام واستخداماتها في العلاج المناعي

Also Published As

Publication number Publication date
MA52667A (fr) 2021-02-17
EP4386080A3 (en) 2024-12-04
RS65674B1 (sr) 2024-07-31
CA3094957A1 (en) 2019-10-03
DK3775165T3 (da) 2024-07-08
HRP20240850T1 (hr) 2024-09-27
HUE068082T2 (hu) 2024-12-28
PL3775165T3 (pl) 2024-08-19
AU2018415814A1 (en) 2020-10-22
EP3775165A1 (en) 2021-02-17
KR20200138329A (ko) 2020-12-09
CN112513254A (zh) 2021-03-16
MA52667B1 (fr) 2024-07-31
PT3775165T (pt) 2024-07-17
LT3775165T (lt) 2024-07-10
AU2025256177A1 (en) 2025-11-13
IL277592A (en) 2020-11-30
EP4386080A2 (en) 2024-06-19
AU2018415814B2 (en) 2025-08-14
EP3775165B1 (en) 2024-03-27
KR20250137200A (ko) 2025-09-17
ES2982509T3 (es) 2024-10-16
SG11202009170UA (en) 2020-10-29
WO2019190579A1 (en) 2019-10-03
EA202092319A1 (ru) 2021-03-04
SMT202400287T1 (it) 2024-09-16
FI3775165T3 (fi) 2024-07-01
BR112020019496A2 (pt) 2021-01-12
SI3775165T1 (sl) 2024-09-30
MX2020010264A (es) 2020-11-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7772680B2 (ja) 腫瘍浸潤リンパ球の製造方法及び免疫療法におけるその使用方法
JP7834126B2 (ja) 腫瘍浸潤リンパ球の製造方法及び免疫療法におけるその使用
US12473532B2 (en) Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
ES2982509T3 (es) Procedimientos para la preparación de linfocitos infiltrantes de tumor y usos de los mismos en inmunoterapia
HK40106685A (en) Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
HK40047971A (en) Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy
HK40047971B (en) Processes for production of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy