ES2982509T3 - Procedimientos para la preparación de linfocitos infiltrantes de tumor y usos de los mismos en inmunoterapia - Google Patents

Procedimientos para la preparación de linfocitos infiltrantes de tumor y usos de los mismos en inmunoterapia Download PDF

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Abstract

La presente invención proporciona métodos mejorados y/o abreviados para expandir TIL y producir poblaciones terapéuticas de TIL, incluidos métodos novedosos para expandir poblaciones de TIL en un sistema cerrado que conducen a una eficacia mejorada, un fenotipo mejorado y una mayor salud metabólica de los TIL en un período de tiempo más corto, al tiempo que permiten una contaminación microbiana reducida así como una reducción de los costos. Dichos TIL encuentran uso en regímenes de tratamiento terapéutico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimientos para la preparación de linfocitos infiltrantes de tumor y usos de los mismos en inmunoterapia
Antecedentes de la invención
El tratamiento de cánceres voluminosos y refractarios usando la transferencia adoptiva de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) representa una estrategia terapéutica poderosa para pacientes con mal pronóstico. Gattinoni, et al., Nat. Rev. Immunol. 2006, 6, 383-393. Se requiere una gran cantidad de TIL para una inmunoterapia exitosa, y se necesita un procedimiento robusto y confiable para su comercialización. Esto ha sido un desafío a lograr debido a problemas técnicos, logísticos y regulatorios con la expansión celular. La expansión de TIL basada en IL-2 seguida de un "procedimiento de expansión rápida" (REP) se ha convertido en un procedimiento preferido para la expansión de TIL debido a su velocidad y eficiencia. Dudley, et al., Science 2002, 298, 850-54; Dudley, et al., J. Clin. Oncol.
2005, 23, 2346-57; Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-39; Riddell, et al., Science 1992, 257, 238-41; Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42. El REP puede resultar en una expansión de 1000 veces de TIL durante un período de 14 días, aunque requiere un gran exceso (por ejemplo, 200 veces) de células mononucleares de sangre periférica alogénicas irradiadas (PBMC, también conocidas como células mononucleares (MNC)), a menudo de múltiples donantes, como células alimentadoras, así como anticuerpos anti-CD3 (OKT3) y altas dosis de IL-2. Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42. Los TIL que se han sometido a un procedimiento REP han producido una terapia celular adoptiva exitosa después de la inmunosupresión del huésped en pacientes con melanoma. Los parámetros de aceptación de la infusión actuales se basan en lecturas de la composición de TIL (por ejemplo, positividad para CD28, CD8 o CD4) y en la expansión múltiple y viabilidad del producto REP.
Los procedimientos actuales de fabricación de TIL están limitados por la duración, el coste, las preocupaciones de esterilidad y otros factores descritos en el presente documento, de modo que el potencial para comercializar dichos procedimientos está severamente limitado y, por estas y otras razones, en la actualidad no se dispone de ningún procedimiento comercial. Existe una necesidad urgente de proporcionar procedimientos de fabricación y terapias de TIL basados en dichos procedimientos que sean apropiados para la fabricación a escala comercial y la aprobación regulatoria para su uso en pacientes humanos en múltiples centros clínicos.
Breve resumen de la invención
La presente invención proporciona procedimientos mejorados y/o abreviados para expandir TIL y producir poblaciones terapéuticas de TIL como se define en las reivindicaciones anexas.
La presente invención proporciona procedimientos para expandir linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) en una población terapéutica de TIL que comprende:
(a) agregar fragmentos de tumor procesados de un tumor resecado de un paciente en un sistema cerrado para obtener una primera población de TIL;
(b) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2, y opcionalmente OKT-3, para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado que proporciona una primera área superficial permeable al gas, en donde la primera expansión se realiza durante aproximadamente 3-14 días para obtener la segunda población de TIL en donde la transición de la etapa (a) a la etapa (b) ocurre sin abrir el sistema;
(c) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2 adicional, opcionalmente OKT-3, y células presentadoras de antígenos (APC), para producir una tercera población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza durante aproximadamente 4 a 6 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado que proporciona una segunda área superficial permeable a los gases, y en donde ocurre la transición de la etapa (b) a la etapa (c) sin abrir el sistema;
(d) dividir la tercera población de TIL en una primera pluralidad de cinco o menos subpoblaciones de TIL, comprendiendo cada subpoblación al menos 1,0 x 109 TIL, y realizar una tercera expansión de la primera pluralidad de subpoblaciones de TIL suplementando el medio de cultivo celular de cada subpoblación de TIL con IL-2 adicional, opcionalmente OKT-3, para producir una segunda pluralidad de subpoblaciones. de TIL, en donde la segunda pluralidad de subpoblaciones de TIL comprende una población terapéutica de TIL, en donde la tercera expansión se realiza durante aproximadamente 5 a aproximadamente 7 días, en donde la tercera expansión para cada subpoblación se realiza en un recipiente cerrado que proporciona una tercera área superficial permeable a los gases, y en la que la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema;
(e) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (d), en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (e) al (f) se produce sin abrir el sistema.
En algunas realizaciones, la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL.
En algunas realizaciones, la población terapéutica de TIL recolectada en la etapa (e) comprende suficientes TIL para una dosis terapéuticamente eficaz de los TIL.
En algunas realizaciones, el número de TIL suficientes para una dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 2,3 x 1010 a aproximadamente 13,7 * 1010.
En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además la etapa de criopreservar la bolsa de infusión que comprende la población de TIL recolectada usando un proceso de criopreservación.
En algunas realizaciones, el proceso de criopreservación se realiza utilizando una relación de 1:1 de población de TIL recolectada y medio de criopreservación.
En algunas realizaciones, las células presentadoras de antígenos son células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
En algunas realizaciones, las PBMC están irradiadas y son alogénicas.
El procedimiento según la reivindicación 68, en el que las PBMC se añaden al cultivo celular en cualquiera de los días 9 a 14 en la etapa (c).
En algunas realizaciones, las células presentadoras de antígenos son células presentadoras de antígenos artificiales.
En algunas realizaciones, la recolección en la etapa (e) se realiza usando un sistema de procesamiento de células LOVO.
En algunas realizaciones, los múltiples fragmentos comprenden de aproximadamente 4 a aproximadamente 50 fragmentos, en donde cada fragmento tiene un volumen de aproximadamente 27 mm.3.
En algunas realizaciones, los múltiples fragmentos comprenden de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 fragmentos con un volumen total de aproximadamente 1300 mm3 a aproximadamente 1500 mm3.
En algunas realizaciones, los múltiples fragmentos comprenden aproximadamente 50 fragmentos con un volumen total de aproximadamente 1350 mm.3.
En algunas realizaciones, los múltiples fragmentos comprenden aproximadamente 50 fragmentos con una masa total de aproximadamente 1 gramo a aproximadamente 1,5 gramos.
En algunas realizaciones, los múltiples fragmentos comprenden aproximadamente 4 fragmentos.
En algunas realizaciones, el segundo medio de cultivo celular se proporciona en un recipiente seleccionado del grupo que consiste en un recipiente G y una bolsa de células Xuri.
En algunas realizaciones, la bolsa de infusión de la etapa (e) es una bolsa de infusión que contiene HypoThermosol. En algunas realizaciones, el primer período en la etapa (b) y el segundo período en la etapa (c) se realizan cada uno individualmente dentro de un período de 10 días, 11 días o 12 días.
En algunas realizaciones, el primer período en la etapa (b) y el segundo período en la etapa (c) se realizan cada uno individualmente dentro de un período de 11 días.
En algunas realizaciones, las etapas (a) a (f) se realizan en un período de aproximadamente 10 días a aproximadamente 22 días.
En algunas realizaciones, las etapas (a) a (f) se realizan dentro de un período de aproximadamente 10 días a aproximadamente 20 días.
En algunas realizaciones, las etapas (a) a (f) se realizan en un período de aproximadamente 10 días a aproximadamente 15 días.
En algunas realizaciones, las etapas (a) a (f) se realizan en 22 días o menos.
En algunas realizaciones, las etapas (a) a (f) y la criopreservación se realizan en 22 días o menos.
En algunas realizaciones, las etapas (b) a (f) se realizan en un solo recipiente, en donde realizar las etapas (b) a (f) en un solo recipiente da como resultado un aumento en el rendimiento de TIL por tumor resecado en comparación con realizar las etapas (b) a (f) en más de un contenedor.
En algunas realizaciones, las células presentadoras de antígenos se añaden a los TIL durante el segundo período de la etapa (c) sin abrir el sistema.
En algunas realizaciones, la tercera población de TIL en la etapa (d) es una población terapéutica de TIL que comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en donde las células T efectoras y /o las células T de memoria central obtenidas en la población terapéutica de TIL exhiben una o más características seleccionadas del grupo que consiste en expresar CD27, expresar CD28, telómeros más largos, expresión aumentada de CD57 y expresión disminuida de<c>D56 en relación con las células T efectoras, y/o células T de memoria central obtenidas de la segunda población de células.
En algunas realizaciones, las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas en la población terapéutica de TIL exhiben una expresión de CD57 aumentada y una expresión de CD56 disminuida en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de la segunda población de células.
En algunas realizaciones, el riesgo de contaminación microbiana se reduce en comparación con un sistema abierto.
En algunas realizaciones, los TIL de la etapa (e) se infunden en un paciente.
En algunas realizaciones, el recipiente cerrado comprende un único biorreactor.
En algunas realizaciones, el contenedor cerrado comprende un G-REX-10.
En algunas realizaciones, el contenedor cerrado comprende un G-REX-100.
En algunas realizaciones, en la etapa (d) las células presentadoras de antígeno (APC) se añaden al cultivo celular de la segunda población de TIL en una relación APC:TIL de 25:1 a 100:1.
En algunas realizaciones, el cultivo celular tiene una relación de 2,5 x 109 APC a 100*10® TIL.
En algunas realizaciones, en la etapa (c) las células presentadoras de antígeno (APC) se añaden al cultivo celular de la segunda población de TIL en una relación APC:TIL de 25:1 a 100:1.
En algunas realizaciones, el cultivo celular tiene una relación de 2,5 x 109 APC a 100*10® TIL.
OTRO ASUNTO OBJETO
También se divulga en el presente documento, aunque no se reivindica, un procedimiento para expandir linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) en una población terapéutica de TIL que comprende:
(a) obtener una primera población de TIL de un tumor extirpado de un paciente convirtiendo una muestra de tumor obtenida del paciente en múltiples fragmentos de tumor;
(b) agregar los fragmentos de tumor a un sistema cerrado;
(c) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado lo cual proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, donde la primera expansión se realiza durante aproximadamente 3-14 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y donde la transición desde la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema;
(d) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, opcionalmente OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en la que la segunda expansión es realizada durante aproximadamente 7-14 días para obtener la tercera población de TIL, en la que la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL, en la que la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una segunda área superficie permeable a los gases, y en la que la la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema;
(e) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (d), en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (e) a la (f) ocurre sin abrir el sistema.
El procedimiento puede comprender además la etapa de crioconservar la bolsa de infusión que comprende la población de TIL recolectada en la etapa (f) usando un procedimiento de crioconservación.
El procedimiento de crioconservación se puede realizar usando una relación 1:1 de población de TIL recolectada con respecto a los medios de crioconservación.
Las células presentadoras de antígenos pueden ser células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Las PBMC pueden irradiarse y ser alogénicas. Las PBMC se pueden agregar al cultivo celular en cualquiera de los días 9 a 14 en la etapa (d). Las células presentadoras de antígenos pueden ser células presentadoras de antígenos artificiales.
La recolección en la etapa (e) se puede realizar usando un sistema de tratamiento celular basado en membranas. La recolección en la etapa (e) se puede realizar usando un sistema de tratamiento de células LOVO.
Los múltiples fragmentos pueden comprender de aproximadamente 4 a aproximadamente 50 fragmentos, en los que cada fragmento tiene un volumen de aproximadamente 27 mm3
Los múltiples fragmentos pueden comprender de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 fragmentos con un volumen total de aproximadamente 1300 mm3 a aproximadamente 1500 mm3.
Los múltiples fragmentos pueden comprender aproximadamente 50 fragmentos con un volumen total de aproximadamente 1350 mm3.
Los múltiples fragmentos pueden comprender aproximadamente 50 fragmentos con una masa total de aproximadamente 1 gramo a aproximadamente 1.5 gramos.
El medio de cultivo celular se puede proporcionar en un recipiente seleccionado del grupo que consiste en un recipiente G y una bolsa de células Xuri.
El medio de cultivo celular en la etapa (d) puede comprender además IL-15 y/o IL-21.
La concentración de IL-2 puede ser de aproximadamente 10,000 UI/mL a aproximadamente 5,000 UI/mL.
La concentración de IL-15 puede ser de aproximadamente 500 UI/mL a aproximadamente 100 UI/mL.
La concentración de IL-21 puede ser de aproximadamente 20 UI/mL a aproximadamente 0.5 UI/mL.
La bolsa de infusión de la etapa (f) puede ser una bolsa de infusión que contenga HypoThermosol.
Los medios de crioconservación pueden comprender dimetilsulfóxido (DMSO). Los medios de crioconservación pueden comprender del 7% al 10% de dimetilsulfóxido (DMSO).
El primer período en la etapa (c) y el segundo período en la etapa (e) pueden realizarse cada uno individualmente dentro de un período de 10 días, 11 días o 12 días.
El primer período en la etapa (c) y el segundo período en la etapa (e) pueden realizarse cada uno individualmente dentro de un período de 11 días.
Las etapas (a) a (f) se pueden realizar dentro de un período de aproximadamente 10 días a aproximadamente 22 días.
Las etapas (a) a (f) se pueden realizar cada una dentro de un período de aproximadamente 20 días a aproximadamente 22 días.
Las etapas (a) a (f) pueden realizarse cada una dentro de un período de aproximadamente 15 días a aproximadamente 20 días.
Las etapas (a) a (f) pueden realizarse cada una dentro de un período de aproximadamente 10 días a aproximadamente 20 días.
Las etapas (a) a (f) pueden realizarse cada una dentro de un período de aproximadamente 10 días a aproximadamente 15 días.
Las etapas (a) a (f) pueden realizarse cada una en 22 días o menos.
Las etapas (a) a (f) pueden realizarse cada una en 20 días o menos.
Las etapas (a) a (f) pueden realizarse cada uno en 15 días o menos.
Las etapas (a) a (f) pueden realizarse cada uno en 10 días o menos.
Las etapas (a) a (f) y la crioconservación pueden realizarse cada uno en 22 días o menos.
La población terapéutica de TIL recolectada en la etapa (e) puede comprender suficientes TIL para una dosificación terapéuticamente eficaz de los TIL.
El número de TIL suficientes para una dosis terapéuticamente eficaz es de aproximadamente 2.3x1010 a aproximadamente 13.7x1010
Las etapas (b) a (e) se pueden realizar en un solo recipiente, en donde realizar las etapas (b) a (e) en un solo recipiente da como resultado un aumento en el rendimiento de TIL por tumor extirpado en comparación con la realización de las etapas (b) a (e) en más de un recipiente.
Las células presentadoras de antígeno se pueden agregar a los TIL durante el segundo período en la etapa (d) sin abrir el sistema.
La tercera población de TIL en la etapa (d) puede proporcionar una mayor eficacia, una mayor producción de interferón-gamma, una mayor policlonalidad, un promedio incrementado de IP-10 y/o un promedio incrementado de MCP-1 cuando se administra a un sujeto.
La tercera población de TIL en la etapa (d) puede proporcionar al menos una producción de interferón gamma cinco veces o más cuando se administra a un sujeto.
En algunos procedimientos divulgados en el presente documento, la tercera población de TIL en la etapa (d) puede ser una población terapéutica de TIL que comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en la que las células T efectoras y/o las células T de memoria central en la población terapéutica de TIL exhiben una o más características seleccionadas del grupo que consiste en la expresión de CD27+, la expresión de CD28+, telómeros más largos, expresión aumentada de CD57 y expresión disminuida de CD56 en relación con las células T efectoras y/o células T de memoria obtenidas de la segunda población de células.
En algunos procedimientos divulgados en el presente documento, las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de la tercera población de TIL pueden exhibir una expresión de CD57 aumentada y una expresión de CD56 disminuida en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de la segunda población de células.
En algunos procedimientos divulgados en el presente documento, la el riesgo de contaminación microbiana se reduce en comparación con un sistema abierto.
En algunos procedimientos divulgados en el presente documento, los TIL de la etapa (g) son infusionados en un paciente.
En algunos procedimientos divulgados en el presente documento, los múltiples fragmentos comprenden aproximadamente 4 fragmentos.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un procedimiento para tratar a un sujeto con cáncer; el procedimiento comprende la administración de linfocitos infiltrantes de tumores expandidos (TIL) que comprende:
(a) obtener una primera población de TIL de un tumor extirpado de un sujeto convirtiendo una muestra de tumor obtenida del paciente en múltiples fragmentos de tumor;
(b) agregar los fragmentos de tumor a un sistema cerrado;
(c) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 y opcionalmente OKT-3 para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, donde la primera expansión se realiza durante aproximadamente 3-14 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y donde la transición desde la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema;
(d) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, opcionalmente OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en la que la segunda expansión es realizada durante aproximadamente 7-14 días para obtener la tercera población de TIL, en la que la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL, en la que la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una segunda área de superficie permeable a los gases, y en la que la la transición de la etapa (c) a la etapa (d) ocurre sin abrir el sistema;
(e) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (d), en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (e) al (f) ocurre sin abrir el sistema;
(g) opcionalmente crioconservar la bolsa de infusión que comprende la población de TIL recolectada de la etapa (f) usando un procedimiento de crioconservación; y
(h) administrar una dosis terapéuticamente eficaz de la tercera población de TIL de la bolsa de infusión en la etapa (g) al paciente.
En algunos procedimientos divulgados en el presente documento, la población terapéutica de TIL recolectada en la etapa (e) comprende suficientes TIL para administrar una dosis terapéuticamente eficaz de los TIL en la etapa (h) .
En algunos procedimientos divulgados en el presente documento, el número de TIL suficientes para administrar una dosis terapéuticamente eficaz en la etapa (h) es de aproximadamente 2.3x1010 a aproximadamente 13.7x1010
En algunos procedimientos descritos en el presente documento, las células presentadoras de antígenos (APC) son PBMC.
En algunos procedimientos descritos en el presente documento, las PBMC se añaden al cultivo celular en cualquiera de los días 9 a 14 en la etapa (d).
En algunos procedimientos descritos en el presente documento, antes de administrar una dosis terapéuticamente eficaz de células TIL en la etapa (h), se ha administrado al paciente un régimen de linfodepleción no mieloablativo.
En algunos procedimientos divulgados en el presente documento, el régimen de linfodepleción no mieloablativo comprende las etapas de administración de ciclofosfamida a una dosis de 60 mg/m2/día durante dos días seguido de la administración de fludarabina a una dosis de 25 mg/m2/día durante cinco días.
En algunos procedimientos descritos en el presente documento, el procedimiento comprende además la etapa de tratar al paciente con un régimen de dosis alta de IL-2 comenzando el día después de la administración de las células TIL al paciente en la etapa (h).
En algunos procedimientos descritos en el presente documento, el régimen de dosis alta de IL-2 comprende 600.000 o 720.000 UI/kg administradas como una infusión intravenosa en bolo de 15 minutos cada ocho horas hasta la tolerancia.
En algunos procedimientos divulgados en el presente documento, la tercera población de TIL en la etapa (d) es una población terapéutica de TIL que comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en la que las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas en la población terapéutica de TIL exhiben una o más características seleccionadas del grupo que consiste en la expresión de CD27+, la expresión de CD28+, telómeros más largos, expresión aumentada de CD57 y expresión disminuida de CD56 en relación con las células T efectoras, y/o células T de memoria central obtenidas de la segunda población de células.
En algunos procedimeitos divulgados en el presente documento, las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas en la población terapéutica de TIL exhiben una expresión de CD57 aumentada y una expresión de CD56 disminuida en relación con las células T efectoras y/o células T de memoria central obtenidas de la segunda población de células.
En algunos procedimientos divulgados en el presente documento, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en melanoma, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer causado por el virus del papiloma humano, cáncer de cabeza y cuello (incluido el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), cáncer de riñón y carcinoma de células renales.
En algunos procedimientos descritos en el presente documento, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en melanoma, HNSCC, cánceres de cuello uterino y NSCLC.
En algunos procedimientos descritos en el presente documento, el cáncer es melanoma.
En algunos procedimientos descritos en el presente documento, el cáncer es HNSCC. En los procedimientos descritos en el presente documento, el cáncer es un cáncer de cuello uterino. En los procedimientos descritos en el presente documento, el cáncer es NSCLC.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, una población de TIL expandidos para su uso en el tratamiento de un sujeto con cáncer, en donde la población de TIL expandidos es una tercera población de TIL que se puede obtener mediante un procedimiento que comprende:
(a) obtener una primera población de TIL de un tumor extirpado de un sujeto convirtiendo una muestra de tumor obtenida del paciente en múltiples fragmentos de tumor;
(b) agregar los fragmentos de tumor a un sistema cerrado;
(c) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL, en la que la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, donde la primera expansión se realiza durante aproximadamente 3-14 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y donde la transición desde la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema;
(d) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, opcionalmente OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en la que la segunda expansión es realizada durante aproximadamente 7-14 días para obtener la tercera población de TIL, en la que la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL, en la que la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una segunda área de superficie permeable a los gases, y en la que la la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema;
(e) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (d), en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (e) a la (f) ocurre sin abrir el sistema; y
(g) opcionalmente crioconservar la bolsa de infusión que comprende la población de TIL recolectada de la etapa (f) usando un procedimiento de crioconservación.
La población de TIL puede usarse para tratar a un sujeto con cáncer de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente y en el presente documento, en donde el procedimiento comprende además una o más de las características citadas anteriormente y en el presente documento. La población de TIL puede usarse en el tratamiento de un sujeto con cáncer según los procedimientos descritos anteriormente y en el presente documento, en donde el procedimiento comprende además una o más de las características citadas anteriormente y en el presente documento.
También se describe en el presente documento, pero no se reivindica, un procedimiento para expandir linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) en una población terapéutica de TIL que comprende:
(a) obtener una primera población de TIL de un tumor resecado de un paciente procesando una muestra de tumor obtenida del paciente en múltiples fragmentos de tumor;
(b) añadir los fragmentos del tumor en un sistema cerrado;
(c) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2, opcionalmente OKT-3 y opcionalmente un agonista de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFRSF), para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado que proporciona una primera área superficial permeable al gas, en donde la primera expansión se realiza durante aproximadamente 3-14 días para obtener la segunda población de TIL, en donde la segunda población de TIL es al menos 50- veces mayor en número que la primera población de TIL, y en donde la transición de la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema;
(d) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2 adicional, opcionalmente OKT-3 y opcionalmente un agonista de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFRSF) y células presentadoras de antígenos (APC), para producir una tercera población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza durante aproximadamente 7-14 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL, en donde la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado que proporciona una segunda área superficial permeable a los gases, y en el que la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema;
(e) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (d), en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (e) al (f) se produce sin abrir el sistema.
También se describe en el presente documento, pero no se reivindica, un procedimiento para tratar a un sujeto con cáncer, comprendiendo el procedimiento administrar linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) expandidos que comprende:
(a) obtener una primera población de TIL de un tumor resecado de un sujeto procesando una muestra de tumor obtenida del paciente en múltiples fragmentos de tumor;
(b) añadir los fragmentos del tumor en un sistema cerrado;
(c) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2, opcionalmente OKT-3 y opcionalmente un agonista de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFRSF), para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado que proporciona una primera área de superficie permeable al gas, en donde la primera expansión se realiza durante aproximadamente 3-14 días para obtener la segunda población de TIL, en donde la segunda población de TIL es al menos 50-14 días veces mayor en número que la primera población de TIL, y en donde la transición de la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema;
(d) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2 adicional, opcionalmente OKT-3 y opcionalmente un agonista de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFRSF) y células presentadoras de antígenos (APC), para producir una tercera población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza durante aproximadamente 7-14 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL, en donde la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado que proporciona una segunda área superficial permeable a los gases, y en el que la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema;
(e) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (d), en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (e) al (f) se produce sin abrir el sistema;
(g) opcionalmente criopreservar la bolsa de infusión que comprende la población de TIL recolectada de la etapa (f) usando un proceso de criopreservación; y
(h) administrar una dosis terapéuticamente eficaz de la tercera población de TIL de la bolsa de infusión en la etapa (g) al paciente.
En algunos procedimientos descritos en el presente documento, el agonista de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFRSF) es un anticuerpo 4-1BB. El agonista de TNFRSF puede ser un agonista de 4-1BB, y el agonista de 4-1BB se selecciona del grupo que consiste en urelumab, utomilumab, EU-101, una proteína de fusión y fragmentos, derivados, variantes, biosimilares y combinaciones de los mismos.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, una composición de criopreservación que comprende una población de TIL como se describe anteriormente y en el presente documento, un medio crioprotector que comprende dimetilsulfóxido (DMSO) y una solución de electrolito.
En algunas composiciones de criopreservación descritas en el presente documento, la composición de criopreservación comprende además uno o más estabilizadores y uno o más factores de crecimiento de linfocitos. El uno o más estabilizadores pueden comprender albúmina sérica humana (HSA) y el uno o más factores de crecimiento de linfocitos comprenden IL-2. La composición puede comprender opcionalmente OKT-3.
En algunas composiciones de criopreservación descritas en el presente documento, el DMSO y la solución electrolítica están presentes en una relación de aproximadamente 1,1:1 a aproximadamente 1:1,1. El DMSO y la solución electrolítica pueden estar presentes en una relación de aproximadamente 1:1.
En algunas composiciones de criopreservación descritas en el presente documento, 100 mL de la composición de criopreservación comprenden la población de TIL en una cantidad de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 9 * 1014, el medio crioprotector que comprende DMSO en una cantidad de aproximadamente 30 mL a aproximadamente 70 mL, la solución de electrolito en una cantidad de aproximadamente 30 mL a aproximadamente 70 mL, HSA en una cantidad de aproximadamente 0,1 g a aproximadamente 1,0 gy IL-2 en una cantidad de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 0,005 mg.
En algunas composiciones de criopreservación descritas en el presente documento, 100 mL de la composición de criopreservación comprenden la población de TIL en una cantidad de aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 * 1011; el medio crioprotector en una cantidad de aproximadamente 30 mLa aproximadamente 70 mL, en el que el medio crioprotector comprende aproximadamente 10 % de DMSO; la solución de electrolito en una cantidad de aproximadamente 30 mL a aproximadamente 70 mL; HSA en una cantidad de aproximadamente 0,3 g a aproximadamente 0,7 g; e IL-2 en una cantidad de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 0,003 mg.
En algunas composiciones de criopreservación descritas en el presente documento, 100 mL de la composición de criopreservación consisten esencialmente en la población de TIL en una cantidad de aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 * 1011; el medio crioprotector en una cantidad de aproximadamente 30 mLa aproximadamente 70 mL, en el que el medio crioprotector consiste esencialmente en aproximadamente 10 % de DMSO; la solución de electrolito en una cantidad de aproximadamente 30 mL a aproximadamente 70 mL; HSA en una cantidad de aproximadamente 0,3 g a aproximadamente 0,7 g; e IL-2 en una cantidad de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 0,003 mg.
En algunas composiciones de criopreservación descritas en el presente documento, la composición es para uso en el tratamiento de un sujeto con cáncer.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, una composición de criopreservación que comprende una población de TIL, un medio crioprotector que comprende dimetilsulfóxido (DMSO) y una solución de electrolitos, en donde 100 mL de la composición comprenden la población de TIL en una cantidad de aproximadamente 1 x 107 a aproximadamente 1 * 1011; el medio crioprotector en una cantidad de aproximadamente 30 mL a aproximadamente 70 mL, en el que el medio crioprotector comprende aproximadamente 10 % de DMSO; la solución de electrolito en una cantidad de aproximadamente 30 mL a aproximadamente 70 mL; HSA en una cantidad de aproximadamente 0,3 g a aproximadamente 0,7 g; e IL-2 en una cantidad de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 0,003 mg.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, una composición de criopreservación que consiste esencialmente en una población de TIL, un medio crioprotector que comprende dimetilsulfóxido (DMSO) y una solución de electrolito, en donde 100 mL de la composición consisten esencialmente en la población de TIL en una cantidad de aproximadamente 1*107 a aproximadamente 1 * 1011; el medio crioprotector en una cantidad de aproximadamente 30 mL a aproximadamente 70 mL, en el que el medio crioprotector consiste esencialmente en aproximadamente 10 % de DMSO; la solución de electrolito en una cantidad de aproximadamente 30 mL a aproximadamente 70 mL; HSA en una cantidad de aproximadamente 0,3 g a aproximadamente 0,7 g; e IL-2 en una cantidad de aproximadamente 0,001 mg a aproximadamente 0,003 mg.
También se describe en el presente documento, pero no se reivindica, una bolsa de infusión que comprende una composición de criopreservación como se describe anteriormente y en el presente documento.
En algunas bolsas de infusión descritas en el presente documento, la bolsa de infusión es una bolsa de infusión que contiene HypoThermosol.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, una bolsa de almacenamiento que comprende una composición de criopreservación como se describe anteriormente y en el presente documento.
55. En algunas bolsas de almacenamiento descritas en el presente documento, la bolsa de almacenamiento de la reivindicación 54, en la que la bolsa de almacenamiento es una bolsa de congelación CryoStore CS750.
También se describe en el presente documento un procedimiento para expandir linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) en una población terapéutica de TIL que comprende:
(a) agregar fragmentos de tumor procesados de un tumor resecado de un paciente en un sistema cerrado para obtener una primera población de TIL;
(b) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2, y opcionalmente OKT-3, para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado que proporciona una primera área superficial permeable al gas, en donde la primera expansión se realiza durante aproximadamente 3-14 días para obtener la segunda población de TIL, en donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y en donde la transición de la etapa (a) a la etapa (b) se produce sin abrir el sistema;
(c) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2 adicional, opcionalmente OKT-3, y células presentadoras de antígenos (APC), para producir una tercera población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza durante aproximadamente 7-14 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL, en donde la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado que proporciona una segunda área superficial permeable a los gases, y en donde la transición de la etapa (b) a la etapa (c) se produce sin abrir el sistema;
(d) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (c), en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) ocurre sin abrir el sistema; y
(e) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (d) a una bolsa de infusión,
en el que la transferencia de la etapa (d) al (e) se produce sin abrir el sistema.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: muestra un diagrama de una forma de realización del procedimiento 2A, un procedimiento de 22 días para la fabricación de TIL.
Figura 2: muestra una comparación entre el procedimiento 1C y una forma de realización del procedimiento 2A para la fabricación de TIL.
Figura 3: muestra la línea de tiempo del procedimiento 1C.
Figura 4: muestra el procedimiento de una forma de realización de la terapia TIL que utiliza el procedimiento 2A para la fabricación de TIL, que incluye las etapas de administración y co-terapia, para recuentos de células más altos.
Figura 5: muestra el procedimiento de una forma de realización de la terapia TIL que utiliza el procedimiento 2A para la fabricación de TIL, que incluye las etapas de administración y co-terapia, para recuentos de células más bajos.
Figura 6: muestra un esquema detallado para una forma de realización del procedimiento 2A.
Figura 7: muestra la caracterización de TIL preparados usando una forma de realización del procedimiento 2A comparando la expresión de interferón-gamma (IFN-y) entre TIL frescos y TIL descongelados.
Figura 8: muestra la caracterización de TIL preparados usando una forma de realización del procedimiento 2A examinando la expresión de CD3 en TIL frescos frente a TIL descongelados.
Figura 9: muestra la caracterización de TIL preparados usando una forma de realización del procedimiento 2A examinando la recuperación en TIL frescos frente a TIL descongelados.
Figura 10: muestra la caracterización de TIL preparados usando una forma de realización del procedimiento 2A examinando la viabilidad de TIL frescos frente a TIL descongelados.
Figura 11A-11C: Representa las etapas principales de una forma de realización del procedimiento 2A que incluye las etapas de crioconservación.
Figura 12: Representa los recuentos de células obtenidos del procedimiento 1C y una forma de realización del procedimiento 2A
Figura 13: Representa el porcentaje de viabilidad celular obtenido del procedimiento 1C y una forma de realización del procedimiento 2A.
Figura 14: Representa los porcentajes de células CD45 y CD3 (es decir, células T) medidos por citometría de flujo para TIL obtenidos para el procedimiento 1C y una forma de realización del procedimiento 2A.
Figura 15: Representa la liberación de IFN-y obtenida para el procedimiento 1C y formas de realización del procedimiento 2A, medida mediante un ensayo diferente al utilizado para generar los datos en las Figuras 80 y 98. Figura 16: Representa la liberación de IFN-<y>obtenida para el procedimiento 1C y las formas de realización del procedimiento 2A, medida mediante un ensayo diferente al utilizado para generar los datos en las Figuras 80 y 98. Figura 17: Representa los porcentajes de células TCR a/b y NK obtenidas del procedimiento 1C y una forma de realización del procedimiento 2A.
Figura 18: Representa los porcentajes de células CD8+ y CD4+ medidos por citometría de flujo para TIL obtenidos mediante el procedimiento 1C y una forma de realización del procedimiento 2A, así como la relación entre cada subconjunto.
Figura 19: Representa porcentajes de subconjuntos de memoria medidos por citometría de flujo para TIL obtenidos del procedimiento 1C y una forma de realización del procedimiento 2A.
Figura 20: Representa los porcentajes de expresión de PD-1, LAG-3 y TIM-3 mediante citometría de flujo para TIL obtenidos del procedimiento 1C y una forma de realización del procedimiento 2A.
Figura 21: Representa los porcentajes de expresión de 4-1BB, CD69 y KLRG1 por citometría de flujo para TIL obtenidos del procedimiento 1C y una forma de realización del procedimiento 2A.
Figura 22: Representa los porcentajes de expresión de TIGIT por citometría de flujo para TIL obtenidos del procedimiento 1C y una forma de realización del procedimiento 2A.
Figura 23: Representa los porcentajes de expresión de CD27 y CD28 por citometría de flujo para TIL obtenidos del procedimiento 1C y una forma de realización del procedimiento 2A.
Figura 24: Representa los resultados del análisis de la longitud de los telómeros de flujo-FISH.
Figura 25: Representa los resultados del análisis de la longitud de los telómeros de flujo-FISH (después de eliminar un punto de datos atípico).
Figura 26: Representa el diseño del ensayo clínico, incluidas las cohortes tratadas con el procedimiento 1C y una forma de realización del procedimiento 2A.
Figura 27: Diagrama de procedimiento ejemplar 2A que ofrece una descripción general de las etapas A a F.
Figura 28A-28C: Diagrama de flujo del procedimiento del procedimiento 2A.
Figura 29: Diagrama de flujo del procedimiento en el plan de recopilación de datos del procedimiento 2A
Figura 30: Viabilidad de TIL fresco frente a descongelado
Figura 31: Expansión de TIL fresco y descongelado en cultivo re-REP
Figura 32: Valores normales de laboratorio de metabolitos sanguíneos.
Figura 33A-33B: Análisis de metabolitos del TIL pre-REP de procedimiento 2A.
Figura 34: Cuantificación de IL-2 en cultivo de células TIL pre-REP del procedimiento 2A.
Figura 35: Liberación de citocinas citotóxicas IFN-y tras la estimulación anti-CD3, anti-CD28 y anti-4-1BB de TIL.
Figura 36: Liberación de Granzima B después de la estimulación anti-CD3, anti-CD28 y anti-4-1BB de TIL.
Figura 37A-37B: TCR ap TIL. La mayoría de las células T CD3+ humanas expresan los receptores formados por cadenas a y p que reconocen antígenos de una manera restringida por MHC. A) Excepto en M1061, el producto TIL fresco y descongelado tenía 80% o más de TCR ap+ que expresan TIL. Tanto el TIL fresco como el descongelado tenían una expresión comparable de TCR ap (valor p - 0.9582). A pesar de que se observó una disminución en el TCR ap+ que expresa TIL después del Re-REP, esta disminución no fue significativa dentro del Re-REP TIL (p = 0.24). B) Hubo una disminución del 9.2% y del 15.7% en el RE-REP TIL fresco y descongelado que expresa TCR ap en comparación con el TIL fresco y descongelado, respectivamente.
Figura 38A-38B: TCRap-CD56+. Las células Natural Killer (NK) y NKT que se infiltran en el tumor también tienen la capacidad de lisar las células que carecen de expresión de MHC, así como el antígeno lipídico presentado por CD1 y de proporcionar citocinas inmunorreguladoras. Sin embargo, una infiltración intensa de células NK se asocia con una enfermedad avanzada y podría facilitar el desarrollo del cáncer. La Figura A muestra que, en todos los casos, excepto en M1063, hubo una disminución modesta, aunque no significativa, en la población de NK en TIL descongelado en comparación con TIL fresco, (p = 0.27). No se observaron diferencias significativas entre la población re-REP TIL (p = 0.88). TIL fresco, re-REP TIL fresco y re-REP TIL descongelado demuestran una expresión similar de CD56 como se muestra en la Figura B. El producto TIL descongelado tenía menos (1.9 ± 1.3) células que expresan NK que TIL fresco (3.0 ± 2.2) posiblemente como como resultado del procedimiento de congelación criogénica.
Figura 39A-39B: Células CD4+. No se observaron diferencias sustanciales en la población de CD4 en condiciones individuales. La Figura A representa la población CD4 promedio en cada condición. La tabla de la Figura B muestra los valores SD y SEM. Hay una ligera disminución en la población de CD4 en la población de re-REP fresco que se debe principalmente a una disminución de CD4 en la población de re-REP fresco en EP11001T.
Figura 40A-40B: Células CD8+. A) En todos, excepto EP11001T, tanto el TIL fresco como el descongelado mostraron poblaciones CD8+ comparables (p = 0.10, sin diferencia significativa). En la mayoría de los experimentos, hubo una ligera disminución en el CD8+ que expresa TIL en el producto fresco re-REP TIL (las excepciones fueron M1061T y M1065T). Hubo aproximadamente una disminución del 10-30% en la población de CD8+ en el re-REP TIL descongelado. La comparación del re-REP TIL de TIL fresco y descongelado mostró una diferencia significativa (p = 0.03, prueba t de Student). La Figura B muestra los valores medios de CD8+ que expresa TIL en todas las condiciones. Tanto el TIL fresco como el descongelado muestran resultados similares. Sin embargo, hubo una disminución del 10.8% en la población CD8+ en el producto descongelado re-REP TIL en comparación con el re-REP TIL fresco.
Figura 41A-41B: Células CD4+CD154+. CD154, también conocido como CD40L, es un marcador de células T activadas. Figura A: No se observó una diferencia sustancial en la población CD4+CD154+ en las diferentes condiciones; sin embargo, se observó una disminución del 34,1% en los re-REP CD4+ TIL frescos de EP11001T. La expresión de CD154 no se midió en M1061T y M1062T ya que estos experimentos se llevaron a cabo antes de tener lugar el panel de fenotipo extendido. Figura B: Una ligera disminución en la condición de TIL descongelado podría atribuirse a CD154 no medido en M1061T y M1062T. Todas las condiciones muestran una expresión de CD154 muy comparable en la población de CD4, lo que sugiere células T CD4+ activadas.
Figura 42A-42B: células CD8+CD154+. También se analizó el marcador de activación CD154 expresado en CD8+ TIL. A) En general, la expresión de CD154 fue menor en la población CD8+ en el producto TIL fresco y descongelado. Esto no es sorprendente ya que CD154 se expresa principalmente en las células T CD4+ activadas. En los casos en los que se midió la expresión de CD154 tanto en el producto TIL fresco como en el descongelado, no se observó diferencia o un aumento en la expresión de CD154 en los productos TIL descongelados. La prueba t de Student mostró que no había diferencias significativas entre las dos condiciones. En todos los experimentos se mostró un aumento en la expresión de CD154 en el re-REP descongelado en comparación con el re-REP fresco (p = 0.02). B) Se observó un aumento en la expresión de CD154 en los productos TIL descongelados y re-REP TIL descongelados en comparación con sus contrapartes. El re-REP TIL descongelado mostró un aumento del 29.1% en la expresión de CD154 en comparación con el re-REP TIL fresco.
Figura 43A-43B: células CD4+CD69 . CD69 es el marcador de activación temprana en las células T después de la estimulación o activación. A) En todos los TIL excepto en EP11001T, tanto el re-REP fresco como el descongelado mostraron un aumento modesto en la expresión de CD69, posiblemente debido a la duración del re-REP (7 días en lugar de 11 días). No se observaron diferencias entre TIL fresco y descongelado (p = 0.89). Tampoco se observó una diferencia entre re-REP fresco y descongelado (p = 0.82). B) Se observa un aumento menor en la expresión de CD69 en los productos re-REP TIL. (Nota: No se realizó tinción con CD69 para el producto TIL descongelado M1061T y M1062T. La expresión de CD69 del producto TIL fresco M1061T fue del 33.9%).
Figura 44A-44B: células CD8+CD69+. Como se observa para la población de CD4+, la Figura A muestra un aumento en la expresión de CD69 en el CD8+ re-REP TIL. La expresión de CD69 no mostró diferencias significativas entre el TIL fresco y descongelado (p = 0.68) o el re-REP TIL fresco y descongelado (p = 0.76). La Figura B apoya la observación de que hay un aumento modesto en la expresión de CD69 en el producto re-REP TIL.
Figura 45A-45B: células CD4+CD137+. CD137 (4-11313) es un receptor coestimulador de células T inducido tras la activación de TCR. Se activa en las células T CD4+ y CD8+. A) La expresión de CD137 mostró un profundo aumento en la población re-REP TIL después de 7 días de estimulación. Sin embargo, no se observaron diferencias entre el TIL fresco y descongelado o el re-REP TIL fresco y descongelado (p < 0.05 en ambos casos, la Figura B apoya esta observación). Además, el TIL descongelado mostró una modesta disminución en la expresión de CD137. El aumento en la expresión de CD137 en re-REP TIL podría atribuirse a la segunda ronda de estimulación del re-REP de 7 días.
Figura 46A-46B: células CD8+CD137+. A) La población de CD8+ mostró un aumento general en el producto re-REP. B) El producto re-REP fresco tuvo un aumento del 33.4% en la expresión de CD8+ CD137+ en comparación con el producto TIL fresco. El producto re-REP descongelado también mostró un aumento del 33.15% en la expresión de CD137 en la población CD8 en comparación con TIL descongelado. No se observaron diferencias significativas entre re-REP TIL fresco y descongelado. Se puede ver una observación similar comparando el TIL fresco con el producto TIL descongelado. Este aumento en la expresión de CD137 podría deberse a la segunda ronda de activación del re-REP. (Nótese que solo se usaron 6 TIL para el análisis ya que la expresión de CD137 no se midió para 3 de los experimentos).
Figura 47A-47B: células CD4+CM. La población de memoria central (CM) se define por la expresión de CD45RA-(negativo) y CCR7+ (positivo). A) Se observó un aumento en la población de CM en las condiciones de re-REP. M1063T y M1064T mostraron una disminución en la expresión de CM en la población de CD4+ obtenida de TIL descongelado en comparación con el producto de TIL fresco. Ni el producto TIL fresco y descongelado (p = 0.1658) ni el re-REP fresco y re-REP TIL descongelado (p = 0.5535) mostraron una diferencia significativa en la población de CM. B) Se observó un aumento del 14.4% y del 15.4% en la población de CM en el Re-REP TIL fresco y descongelado en comparación con el TIL fresco y descongelado, respectivamente.
Figura 48A-48B: células CD8+CM. A) En la población CD8+, se observó un aumento drástico en la expresión de CM en el producto TIL fresco, una observación que no estaba presente en el producto TIL. Este aumento no afectó la significación (p = 0.3086), lo que sugiere que no hay diferencia entre el TIL fresco y descongelado. También se observó una tendencia similar en los productos re-REP TIL. Figura 48B). Se observó un aumento general de la población de CM en el TIL fresco en comparación con el TIL descongelado. Los números muestran que TIL y re-REP TIL frescos tenían solo una diferencia de -2%; el TIL fresco mostró una desviación estándar muy alta que podría atribuirse a M1064T; excluir la expresión de CM en M1064T dio como resultado una expresión de CM muy similar entre el producto TIL fresco y descongelado (no mostrado).
Figura 49A-49B: células CD4+EM. La población de memoria efectora (EM) se define por la falta de expresión de CCR7 y CD45RA. A) Como se esperaba, la población CD4+ de TIL fresco y descongelada tenía un alto nivel de fenotipo de memoria efectora. Se encontró una disminución drástica en la expresión de la memoria efectora en la población M1056T re-REP TIL. Además, otros 5 experimentos mostraron una disminución en el fenotipo de memoria efectora en re-REP TIL tanto fresco como descongelado. B) Tanto el TIL fresco como el descongelado mostraron una expresión similar del fenotipo de memoria efectora. La comparación de Re-REP TIL fresco y fresco mostró una disminución del 16% en este último. Se observó una disminución similar en el Re-REP TIL descongelado (9%) en comparación con el TIL descongelado.
Figura 50A-50B: células CD8+EM. A) También se observó un patrón similar de aumento de la memoria efectora en el TIL fresco en la población CD8+. Se observó una excepción en el M1064T en donde el TIL fresco solo tenía un perfil de memoria efectora del 20%; esto se debe a que el 73% de estos TIL tienen un fenotipo CM como se describe en A y B. Todas las muestras que muestran una disminución en la población de memoria efectora en su CD4+ TIL del producto re-REP siguieron la misma tendencia en su CD8+ TIL. B) A diferencia de la población de CD4+ TIL, CD8+ TIL mostró un fenotipo de memoria efectora similar en productos frescos, descongelados y re-REP. (Nótese la alta desviación estándar en el TIL fresco y descongelado, que se debe a la población de memoria efectora baja en M1064T fresco y a la ausencia de expresión en las muestras de TIL descongelados de M1061T).
Figura 51A-51B: células CD4+CD28+. La expresión de CD28 se correlaciona con la disminución de TIL joven con la edad. A) Aunque se observó un aumento en la población de CM en el re-REP TIL, una disminución en la expresión de CD28 se vio como una tendencia que sugiere que el estado de CM por sí solo no podría determinar el destino de TIL. Se observó una disminución en la expresión de CD28 en el producto -re-REP, excepto para M1061T CD4+TIL. B) Se observó una disminución del 8.89% en el TIL fresco y del 5.71% en el TIL descongelado en comparación con el producto TIL fresco y descongelado, respectivamente.
Figura 52A-52B: células CD8+ CD28+. A) La expresión de CD28 en la población de TIL CD8+ fue mayor en el producto TIL fresco y descongelado que en el producto re-REP. En la mayoría de los casos, el re-REP TIL descongelado mostró una disminución drástica en comparación con el TIL descongelado y el re-REP TIL fresco. Sin embargo, la prueba t de Student no mostró diferencias significativas entre TIL fresco y descongelado (p = 0.3668) y también entre los productos re-REP frescos y descongelados (p - = 0.7940). B) Como se ve en la población TIL CD4+, hubo una disminución en las poblaciones de CD8+ CD28+ en el re-REP fresco (21.5%) y el re-REP descongelado (18.2%) en comparación con sus contrapartes no reestimuladas.
Figura 53A-53B: células CD4+PD-1+. La expresión de PD-1 en TIL se correlaciona con células T agotadas y reactivas al antígeno. Por tanto, no es de extrañar que se observe un fenotipo agotado en TIL que se han sometido a un REP durante 11 días. A) Este fenotipo agotado se mantuvo o aumentó (específicamente, EP11001T y M1056T) en el producto TIL descongelado. No se observaron diferencias significativas entre el producto TIL fresco y descongelado (p = 0.9809). Se mostró una tendencia similar en el re-REP TIL fresco en comparación con el descongelado (p = 0.0912). B) El re-REP fresco mostró una modesta disminución en la expresión de PD-1 en la población de TIL CD4+. Todas las demás condiciones mantuvieron un patrón de expresión de PD-1 comparable. Se observó una disminución o ningún cambio en la expresión de PD-1 en el producto re-REP fresco en comparación con todas las demás condiciones. Se observó un aumento en la expresión de PD-1 en M1062T, M1063T (CD4+) y EP11001T (CD8+) en el producto re-REP descongelado. Todos los demás productos descongelados re-REP mostraron resultados comparables a los del producto descongelado.
Figura 54A-54B: células CD8+ PD-1+. A) La población de CD8+ del producto TIL fresco mostró un fenotipo más agotado asociado con un aumento de la expresión de PD-1. Se observó una excepción en EP11001T donde el producto TIL descongelado CD8+ tuvo un aumento modesto en la expresión de PD-1 en comparación con el producto TIL fresco. Hubo una diferencia pequeña, aunque no significativa, en la expresión de PD-1 en el TIL fresco en comparación con el TIL descongelado (p = 0.3144). B) El producto TIL fresco mostró un ligero aumento, pero una expresión de PD-1 no significativa en comparación con TIL descongelado (6.74%, o 1,2 veces más alto que TIL descongelado), lo que sugiere que el producto TIL descongelado era comparable en base al patrón de fenotipo.
Figura 55A-55B: células CD4+LAG3+. Las células T agotadas expresan altos niveles de receptor inhibidor LAG3 junto con PD-1. A) El TIL descongelado CD4+ mostró niveles ligeramente más altos, pero no significativos, de expresión de LAG3 en comparación con el TIL fresco (p = 0.52). Se observó una excepción en M1063T. En experimentos en los que se midió la expresión de LAG3 en CD4+ fresco y re-REP TIL fresco, se observó una disminución en la expresión de LAG3+ en las muestras de re-REP fresco en comparación con TIL fresco. B) En general, hay una modesta disminución en la expresión de LAG3 en el producto fresco re-REP TIL. Nótese que para que la Figura B se mantenga consistente, se excluyeron M1061T, M1062T y M1064T ya que la expresión de LAG3 no se midió en el producto fresco.
Figura 56A-56B: células CD8+LAG3+. A) CD8+LAG3+ que expresa TIL mostró una modesta disminución en los experimentos, con la excepción de M1063T en donde se observó una marcada disminución en la expresión de LAG3 en el re-REP TIL fresco. En general, el re-REP TIL descongelado mostró un aumento significativo de 1.5 veces en comparación con el re-REP TIL fresco para la expresión de LAG3 (p = 0.0154). Sin embargo, no se observaron diferencias significativas entre los productos TIL frescos y descongelados (p = 0.0884). B) Se observó una disminución de aproximadamente el 30% en la expresión de LAG3 en el CD8+ TIL de re-REP fresco en comparación con el producto TIL descongelado. Tanto el TIL fresco como el descongelado fueron comparables al TIL descongelado que mostró un modesto aumento. (En esta figura, se omitieron M1061T, M1062T y M1064T ya que la expresión de LAG3 no se midió en las muestras frescas o de re-REP TIL fresco).
Figura 57A-57B: células CD4+TIM-3+. A) Como se observó previamente en el caso de PD-1 y LAG3, se observó una disminución en la expresión de TIM-3 en el reREP TIL fresco en comparación con el re-REP TIL descongelado. Independientemente, no existieron diferencias significativas entre reREP TIL fresco y descongelado (p = 0.2007). B) No se observaron cambios importantes en la expresión de TIM-3 entre los productos reREP TIL frescos, descongelados y descongelados. Se observó una modesta disminución del 9.2% en la expresión de TIM-3 en el reREP TIL fresco en comparación con el producto reREP descongelado.
Figura 58A-58B: células CD8+TIM-3+. A) Una tendencia similar en la expresión de TIM-3 que se observó en la población CD4+ también se observó en el CD8+ TIL. Re-REP TIL fresco tuvo el fenotipo menos agotado con baja expresión de TIM-3, que mostró una diferencia significativa en comparación con re-REP TIL descongelado (p = 0.0147). La comparación de PD-1, LAG3 y TIM-3 sugiere que el REP TIL fresco tenía un fenotipo menos exhaustivo con un fenotipo de CM aumentado. B) En comparación con el producto re-REP TIL descongelado, el re-REP TIL fresco mostró una disminución significativa del 22% en la expresión de TIM-3. Tanto el TIL fresco como el descongelado muestran patrones de expresión TIM-3 similares.
Figura 59: Potencial citotóxico de TIL contra la línea celular diana P815.
Figura 60A-60F: Perfil de respiración metabólica de TIL fresco, Re-REP TIL fresco y Re-REP TIL descongelado. OCR basal (A), SRC abierta (B), SRC2DG (C), SRC encubierta (D), ECAR basal (E) y reserva glicolítica (F).
Figura 61A-61B: Se usó la tecnología Flow-FISH para medir la longitud promedio de la repetición del telómero en 9 productos TIL descongelados de procediiento post-REP 2A. A) Los datos representan la longitud de los telómeros medida por qPCR comparando TIL con 1301 células. B) Los datos muestran la longitud de los telómeros medida por el ensayo Flow Fish de TIL en comparación con 1301 células. Los datos utilizados para los gráficos se proporcionan en formato de tabla (Tablas 25) en la sección 10 del apéndice. En general, hubo una similitud aproximada en los patrones de los resultados de los dos ensayos de longitud de telómeros, pero los experimentos continuarán determinando qué procedimiento refleja con mayor precisión la longitud real de los telómeros del TIL. Esta técnica podría aplicarse a futuras muestras clínicas para determinar una relación entre la longitud de los telómeros y la respuesta del paciente a la terapia TIL.
Figura 62A-62B: Selección del proveedor de medios sin suero (reemplazo de suero). Cada fragmento se cultivó en un solo pocillo de una placa de 24 pocillos G-Rex en cuadruplicados. En el día 11, se iniciaron REP usando 45 TIL con 106 alimentadores para imitar el procedimiento 2A. A) Gráfico de barras que muestra el recuento medio de células viables registrado el día 11 (preREP) para cada condición. B) Gráfico de barras que muestra el recuento medio de células viables registrado el día 22 (postREP). El valor de p se calculó mediante la prueba t de Student. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 respectivamente.
Figura 63A-63B: Selección del proveedor de medios libres de suero (suero de lisado de plaquetas). Cada fragmento se cultivó en un solo pocillo de una placa de 24 pocillos G-Rex por triplicado. El día 11 se iniciaron REP usando 4e5 TIL con 10e6 alimentadoras para imitar el procedimiento 2A. A) Gráfico de barras que muestra el recuento medio de células viables registrado el día 11 (preREP) para cada condición. B) Gráfico de barras que muestra el recuento medio de células viables registrado el día 22 (postREP). El valor de p se calculó mediante la prueba t de Student. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 respectivamente. '#' No hay suficientes fragmentos tumorales.
Figura 64A-64B: Comparar la eficacia del CTS Optimizer con la condición estándar usando el procedimiento 2A a mini escala (G-Rex 5M). Se cultivaron dos fragmentos/G-Rex 5M por triplicado, se iniciaron REP usando 26 TIL con 506 alimentadoras para imitar el procedimiento 2A. Las barras presentadas anteriormente fueron el recuento promedio de células viables obtenido el día 11 (A) o el día 22 (B).
Figura 65A-65C: Resumen de la expansión previa y posterior a TIL extrapolada comparando la condición estándar y el Optimizador de CTS. A) PreREP. B) PostREP. C) Resumen de la expansión de TIL extrapolada a la ejecución a escala completa (Estándar vs CTS Optimizer SR).
Figura 66: CD8+ se activó en células vivas. 7 de los 9 tumores muestran un aumento en las poblaciones absolutas de CD8+ con la condición CTS+SR.
Figura 67: Comparabilidad de interferón-gamma. ELISA de interferón-gamma (Quantikine). La producción de IFN-Y se midió utilizando el kit Quantikine ELISA mediante sistemas de R&D. CTS+SR produjo cantidades comparables de IFN-<y>en comparación con nuestra condición estándar.
Figura 68: Esquema de una forma de realización ejemplar del Protocolo de expansión rápida (REP). A su llegada, el tumor se fragmenta, se coloca en matraces de G-Rex con IL-2 para la expansión de TIL (expansión pre-REP), durante 11 días. Para los estudios de triple cóctel, se agrega IL-2/IL-15/IL-21 al inicio del pre-REP. Para el Protocolo de expansión rápida (REP), se cultivan TIL con alimentadores y OKT3 para la expansión de REP durante 11 días adicionales.
Figura 69A-69B: TIL derivado de melanoma (n=4) y pulmón (n=7) se evaluaron fenotípicamente para células CD4+ y CD8+ usando citometría de flujo post pre-REP. Los valores *p representan la diferencia entre IL-2 e IL-12/IL-15/IL-21 en las células CD8+ utilizando la prueba t para datos no apareados de Student.
Figura 70A-70B: TIL derivado de melanoma (n=4) y pulmón (n=7) se evaluaron fenotípicamente para CD27+ y CD28+ en las células CD4+ y CD8+ usando citometría de flujo post pre-REP.
Figura 71A-71C: TIL se evaluó fenotípicamente para subconjuntos efector/memoria (CD45RA y CCR7) en las células CD8+ y CD4+ (datos no mostrados) en melanoma (n=4) (A) y pulmón (n=8) (B). Se evaluó la expresión de CXCR3 en melanoma y pulmón. Toda la expresión fenotípica se evaluó mediante citometría de flujo post-REP. TCM=memoria central, TSCM=memoria de células madre, TEMRA (células T efectoras), TEM=memoria efectora.
Figura 72A-72C: Se evaluó la expresión de CD107a+ de TIL derivada de (A) melanoma (n=4) y (B) pulmón (n=5) en respuesta a la estimulación de PMA durante 4 horas en las células CD4+ y CD8+, mediante citometría de flujo. (C) pre-REP TIL (n=5) se estimularon durante 24 horas con OKT3 soluble (30 ng/mL) y los sobrenadantes se evaluaron para IPN<y>mediante ELISA.
Figura 73A-73B: Se evaluó el repertorio de TCRvp (24 especificidades) en el TIL derivado de melanoma (A) y pulmón (B) usando el kit Beckman Coulter para citometría de flujo.
Figura 74: Procedimiento de fabricación ejemplar de TIL crioconservado (-22 días).
Figura 75A-75B: el día 22, el producto celular de volumen reducido se agrupa y se toman muestras para determinar el rendimiento del cultivo antes del lavado y la formulación. Las muestras se analizan en el contador celular automático NC-200 como se describió anteriormente. La densidad de células viables total se determina mediante la gran media de recuentos duplicados de 4 muestras independientes. El procedimiento de Generación 2 (Gen 2) produce un producto TIL de dosis similar a la Generación 1 (Gen 1; la media de Gen 1 = 4.10*101° ± 2.92*1010, media de Gen 2 = 3.12^101°± 2.19*101°). B) La expansión múltiple se calcula para la fase REP como el dividendo de la densidad de células viables final sobre la densidad de siembra de TIL viable inicial. Los productos TIL Gen 2 tienen una expansión menor en relación con Gen 1 (media de Gen 1 =1.40*103 ± 9.86*102, media de Gen 2 = 5.11*102 ± 2.95*102).
Figura 76: Se ensayó la identidad de productos farmacéuticos recién formulados mediante citometría de flujo para su liberación. Los procedimientos Gen 1 y Gen 2 producen cultivos de células T de alta pureza según lo definido por el fenotipo CD45, CD3 doble positivo (Gen1 # ± SD, Gen 2 # ± SD). El valor de p se calculó utilizando la prueba 't' de Mann-Whitney.
Figura 77A-77B: Los viales satélites crioconservados del producto farmacéutico formulado se descongelaron y se analizaron para determinar el fenotipo extendido mediante citometría de flujo como se describió anteriormente. Los productos Gen 1 y Gen 2 expresan relaciones similares de subtipos de células T CD8 a CD4. El valor de p se calculó utilizando la prueba 't' de Mann-Whitney.
Figura 78A-78B: Los viales satélites crioconservados del producto farmacéutico formulado se descongelaron y se analizaron para determinar el fenotipo extendido mediante citometría de flujo como se describió anteriormente. Los productos Gen 1 y Gen 2 expresan niveles similares de moléculas coestimuladoras CD27 y CD28 en subconjuntos de células T. El valor de p se calculó mediante la prueba t de Mann-Whitney. Se requieren moléculas coestimuladoras tales como CD27 y CD28 para suministrar la señalización secundaria y terciaria necesaria para la proliferación de células efectoras en el acoplamiento del receptor de células T.
Figura 79: Se utilizó la tecnología Flow-FISH para medir la longitud promedio de la repetición del telómero como se describió anteriormente. El valor de RTL anterior indica que la fluorescencia de telómero promedio por cromosoma/genoma en Gen 1 (una forma de realización del procedimiento 1C) es # % ± SD%, y Gen 2 es #% ± SD% de la fluorescencia de telómero por cromosoma/genoma en la línea de células de control (línea de células de leucemia 1301). Los datos indican que los productos Gen 2 en promedio tienen al menos longitudes de telómero comparables a las de los productos Gen 1. La longitud de los telómeros es una medida sustituta de la longitud del cultivo celular ex vivo.
Figura 80: Los productos farmacéuticos Gen 2 (una forma de realización del procedimiento 2A) exhiben una mayor capacidad de producir IFN-y en relación con los productos farmacéuticos Gen 1. La capacidad del fármaco para reactivarse y secretar citocinas es una medida sustituta de la función in vivo tras la unión del TCR al antígeno afín en el contexto de HLA.
Figura 81A-81B: Diversidad del receptor de células T: se analizaron ARN de 10x106 TIL de Gen 1 (una forma de realización del procedimiento 1C) y Gen 2 (una forma de realización del procedimiento 2A) para determinar el número total y la frecuencia de secuencias de CDR3 únicas presentes en cada producto. A) El número total de secuencias CDR3 únicas presentes en cada producto (Gen 1 n=#, media ± SD, Gen 2 n =#, media ± SD). B) Se indexaron secuencias únicas de CDR3 en relación con la frecuencia en cada producto para producir una clasificación representativa de la diversidad relativa de receptores de células T en el producto. Los productos TIL de ambos procedimientos están compuestos por poblaciones policlonales de células T con diferentes especificidades de antígenos y avideces. La amplitud del repertorio total de células T puede ser indicativa del número de epítopos accionables sobre las células tumorales.
Figura 82: muestra un diagrama de una forma de realización del procedimiento 2A, un procedimiento de 22 días para la fabricación de TIL.
Figura 83: Tabla comparativa de las etapas A a F de las formas de realización ejemplares del procedimiento 1C y el procedimiento 2A.
Figura 84: Comparación detallada de una forma de realización del procedimiento 1C y una forma de realización del procedimiento 2A.
Figura 85: Esquema detallado de una forma de realización de un procedimiento de terapia TIL.
Figuras 86A-86C: Caracterización fenotípica de productos TIL usando un ensayo de citometría de flujo de 10 colores. (A) El porcentaje de subconjuntos de células T y no células T se define por CD45+CD3+ y CD45- (no linfocitos) /CD45+CD3- (linfocitos de células no T), respectivamente. En general, > 99% de los productos TIL probados consistieron en células T (CD45+CD3+). Se muestra un promedio de productos TIL (n=10). (B) Porcentaje de dos subconjuntos de células T que incluyen CD45+CD3+CD8+ (círculo abierto azul) y CD45+CD3+CD4+ (círculo abierto rosa). No se observa ninguna diferencia estadística en el porcentaje de ambos subconjuntos utilizando la prueba T para datos no apareados de Student (P=0.68). (C) La población que no es de células T se caracterizó para cuatro subconjuntos diferentes que incluyen: 1) No linfocitos (CD45-), 2) Células NK (CD45+CD3CD16756+), 3) Células B (CD45+CD19+) y 4) células no NK/B (CD45+CD3-CD16-CD56-CD19-).
Figuras 87A-87B: Caracterización de subconjuntos de células T en poblaciones de células CD45+CD3+CD4+ y CD45+CD3+CD8+. Los subconjuntos de células T naive, de memoria central (TCM), de memoria efectora (TEF) y de memoria efectora RA+(EMRA) se definieron utilizando CD45RA y CCR7. Las figuras muestran subconjuntos de células T representativos de 10 productos TIL finales en poblaciones de células CD4+ (A) y de células CD8+ (B). El subconjunto de células T de memoria efectora (círculo azul abierto) es una población importante (>93%) en los subconjuntos CD4+ y CD8+ del producto final TIL. Menos del 7% de las células de productos TIL es un subconjunto de memoria central (círculo rosado abierto). Los subconjuntos EMRA (círculo gris abierto) y naive (círculo negro abierto) apenas se detectan en el producto TIL (<0.02%). Los valores p representan la diferencia entre EM y CM utilizando la prueba T para datos no apareados de Student
Figuras 88A-88B: detección de la expresión de MCSP y EpCAM en células tumorales de melanoma. Las líneas celulares de tumor de melanoma (WM35, 526 y 888), las líneas celulares de melanoma derivadas del paciente (1028, 1032 y 1041) y una línea celular de carcinoma de adenoma colorrectal (HT29 como control negativo) se caracterizaron mediante tinción para MCSP (proteoglicano de sulfato de condroitina asociado a melanoma) y marcadores EpCAM (molécula de adhesión de células epiteliales). (A) El promedio del 90% de las células tumorales de melanoma expresan MCSP. (B) La expresión de EpCAM no se detectó en líneas de células tumorales de melanoma en comparación con el control positivo HT29, una línea de células tumorales EpCAM+.
Figuras 89A-89B: Detección de controles enriquecidos para la determinación de la precisión de detección de tumores. El ensayo se realizó agregando cantidades conocidas de células tumorales a suspensiones de PBMC (n=10). Se diluyeron células tumorales de melanoma MCSP+526 en relaciones de 1:10, 1:100 y 1:1000, luego se mezclaron con PBMC y se tiñeron con anticuerpos anti-MCSP y anti-CD45 y colorante vivo/muerto y se analizaron por citometría de flujo. (A) Se detectaron aproximadamente 3000, 300 y 30 células en la dilución de 1:10, 1: 100 y 1: 1000, respectivamente. (B) Se utilizó un promedio (AV) y una desviación estándar (DE) de las células adquiridas en cada condición para definir los límites de referencia superior e inferior.
Figuras 90A-90B: Estudio de repetibilidad de los límites superior e inferior en controles enriquecidos. Se realizaron tres experimentos independientes por triplicado para determinar la repetibilidad del ensayo de adición. (A) El número de células tumorales detectadas por MCSP+ estaba de modo consistente dentro del rango de los límites de referencia superior e inferior. (B) El gráfico de regresión lineal demuestra la correlación entre las células MCSP+ y las diluciones de adición (R2=0.99) con la línea sólida negra que muestra el mejor ajuste. Las líneas discontinuas verdes y grises representan los límites de predicción del 95% en la curva estándar y las muestras (Exp#1 a 3), respectivamente.
Figuras 91A-91B: Detección de tumor de melanoma residual en productos TIL. Los productos TIL se evaluaron para determinar la contaminación residual del tumor usando el ensayo desarrollado (n=15). (A y B) La mediana del número y el porcentaje de eventos MCSP+ detectables fue 2 y 0.0002%, respectivamente.
Figura 92: Evaluación de la potencia de los productos TIL después de la activación de las células T. Secreción de IPN<y>después de la reestimulación con anti-CD3/CD28/CD137 en productos TIL evaluados por ELISA por duplicado (n=5). La secreción de IPNy por parte de los productos TIL fue significativamente mayor que los controles no estimulados usando la prueba de grado con signo de Wilcoxon (P = 0.02), y consistentemente > 1000 pg/mL.
La secreción de IPNy > 200 pg/mL se considera potente, el valor de p <0.05 se considera estadísticamente significativo.
Figura 93: Representación de una forma de realización de un procedimiento de fabricación de TIL crioconservado (22 días).
Figura 94: Tabla de mejoras de procedimientos de Gen 1 a Gen 2.
Figuras 95A-95C: células viables totales, tasa de crecimiento y viabilidad. El día 22, el producto celular de volumen reducido se agrupa y se toman muestras para determinar el rendimiento del cultivo antes de lavado y formulación. (A) Las muestras se analizan en el contador de células automatizado NC-200 como se describió anteriormente. La densidad de células viables total se determina mediante la gran media de recuentos duplicados de 4 muestras independientes. El procedimiento de Gen 2 produce un producto TIL de dosis similar a Gen 1 (media de Gen 1 = 4.10x1010 ± 2.8x1010, media de Gen 2 = 4.12x1010 ± 2.5x1010). (B) La tasa de crecimiento se calcula para la fase REP como gr = ln(N(t)/N(0))/t. (C) La viabilidad celular se evaluó a partir de 9 lotes de desarrollo de procedimientos utilizando el Cellometer K2 como se describió anteriormente. No se observó una disminución significativa en la viabilidad celular después de un único ciclo de congelación-descongelación del producto formulado. Elpromedio de reducción de la viabilidad tras el deshielo y el muestreo es del 2.19%.
Figuras 96A-96C: Los productos Gen 2 son cultivos de células T altamente puros que expresan moléculas coestimuladoras a niveles comparables a los de Gen 1. (A) Se ensayó la identidad de productos farmacéuticos recién formulados mediante citometría de flujo para su liberación. Los procedimientos de Gen 1 y Gen 2 producen cultivos de células T de alta pureza según lo definido por el fenotipo CD45+, CD3+ (doble positivo). (B & C) Se descongelaron viales satélites crioconservados de producto farmacéutico formulado y se ensayó el fenotipo extendido mediante citometría de flujo como se describió previamente. Los productos Gen 1 y Gen 2 expresan niveles similares de moléculas coestimuladoras CD27 y CD28 en subconjuntos de células T. Se requieren moléculas coestimuladoras tales como CD27 y CD28 para suministrar la señalización secundaria y terciaria necesaria para la proliferación de células efectoras en el acoplamiento del receptor de células T. El valor de p se calculó utilizando la prueba 't' de Mann-Whitney.
Figura 97: Los productos Gen 2 exhiben longitudes de telómero similares. Sin embargo, algunas poblaciones de TIL pueden tender hacia un telómero relativo más largo.
Figura 98: Los productos farmacológicos Gen 2 secretan IFNy en respuesta al acoplamiento de CD3, CD28 y CD137.
Figuras 99A-99B: diversidad de receptores de células T. (A) Se indexaron secuencias de CDR3 únicas en relación con la frecuencia en cada producto para producir una clasificación representativa de la diversidad general de receptores de células T en el producto. (B) El número total promedio de secuencias de CDR3 únicas presentes en cada producto de infusión.
Figura 100: una forma de realización de un procedimiento de fabricación de TIL de la presente invención.
Figura 101: Mejora de la expansión durante el pre-REP con IL-2/IL-15/IL-21 en múltiples histologías tumorales.
Figuras 102A-102B: IL-2/IL-15/IL-21 aumentó el porcentaje de células CD8+ en el carcinoma de pulmón, pero no en el melanoma. TIL derivado de (A) melanoma (n=4), y (B) pulmón (n=7) fueron evaluados fenotípicamente para células CD4+ y CD8+ usando citometría de flujo post pre-REP.
Figuras 103A-103B: la expresión de CD27 se incrementó ligeramente en células CD8+ en cultivos tratados con IL-2/IL-15/IL-21. TIL derivado de (A) melanoma (n=4) y (B) pulmón (n=7) se evaluaron fenotípicamente para CD27+ y CD28+ en las células CD4+ y CD8+ usando citometría de flujo post pre-REP.
Figuras 104A-104B: los subconjuntos de células T no se modificaron con la adición de IL-15/IL-21. Los TIL se evaluaron fenotípicamente para los subconjuntos efector/de memoria (CD45RA y CCR7) en las células CD8+ y CD4+ (datos no mostrados) de (A) melanoma (n=4) y (B) pulmón (n=8) mediante citometría de flujo pos-pre-REP.
Figuras 105A-105C: La capacidad funcional de TIL se mejoró diferencialmente con IL-2/IL-15/IL-21. Se evaluó la expresión de CD107a+ de TIL derivada de (A) melanoma (n=4) y (B) pulmón (n=5) en respuesta a la estimulación de PMA durante 4 horas en las células CD4+ y CD8+, mediante citometría de flujo. (C) Pre-REP TIL derivado de melanoma y pulmón se estimularon durante 24 horas con anticuerpo anti-CD3 soluble y los sobrenadantes se evaluaron para IPNy mediante ELISA.
Figuras 106A-106B: Se evaluó el repertorio de TCRvp (24 especificidades) en el TIL derivado de un (A) melanoma y (B) tumor de pulmón usando el kit Beckman Coulter para citometría de flujo.
Figura 107: Esquema del procedimiento de fabricación de LN-144 crioconservado Gen 2.
Figura 108: Esquema del diseño del estudio de un ensayo clínico multicéntrico de fase 2 de nuevos TIL crioconservados administrados a pacientes con melanoma metastásico.
Figura 109: Tabla que ilustra la comparación de las características de los pacientes de la cohorte 1 (ASCO 2017) frente a la cohorte 2.
Figura 110: Tabla que ilustra los eventos adversos emergentes del tratamiento (> 30%).
Figura 111: Eficacia del producto de infusión y la terapia TIL.
Figura 112: Estado clínico de respuesta evaluable de los pacientes con SD o mejor respuesta.
Figura 113: Cambio porcentual en la suma de diámetros.
Figura 114: Se observó un aumento del nivel de HMGB1 con el tratamiento con TIL.
Figura 115: Se observó un aumento en el biomarcador IL-10 después de la infusión de LN-144.
Figura 116: Características actualizadas de los pacientes para la Cohorte 2 del ensayo clínico de fase 2 en melanoma metastásico del segundo corte de datos (N=17 pacientes).
Figura 117: Eventos adversos emergentes del tratamiento para la cohorte 2 (> 30%) del segundo corte de datos (N=17 pacientes).
Figura 118: Tiempo de respuesta para pacientes evaluables (enfermedad estable o mejor) en la Cohorte 2 desde el segundo corte de datos (N=17 pacientes). De los 10 pacientes en el conjunto de eficacia, un paciente (Paciente 10) no fue evaluable debido a una muerte relacionada con el melanoma antes de la primera evaluación del tumor no representada en la figura.
Figura 119: Datos de eficacia actualizados para la cohorte 2 del segundo corte de datos (N=17 pacientes). El número medio de TIL infundidos es 34 * 109. La mediana del número de terapias previas fue de 4:5. Los pacientes con una mutación BRAF respondieron tan bien como los pacientes con BRAF de tipo silvestre (* se refiere a pacientes con una mutación BRAF). Un paciente (Paciente 10) no fue evaluable debido a una muerte relacionada con el melanoma antes de la primera evaluación del tumor, pero aún se consideró en el conjunto de eficacia. Abreviaturas: RP, respuesta parcial; SD: enfermedad estable; EP, enfermedad progresiva.
Figura 120: Datos de eficacia actualizados para pacientes evaluables de la Cohorte 2 del segundo corte de datos (N=17 pacientes). El * indica un paciente no evaluable que no alcanzó la primera evaluación. Todos los pacientes evaluables en cuanto a eficacia habían recibido terapias previas con inhibidores de puntos de control anti-PD-1 y anti-CTLA-4.
Figura 121: Tomografía computarizada representativa de un paciente (003-015) con un RP de la cohorte 2, segundo corte de datos.
Figura 122: Correlación de la inducción de IFN-<y>por el producto TIL antes de la infusión con la reducción clínica del tamaño del tumor el día 42 después de la infusión de TIL.
Figura 123: Niveles de IP-10 (CXCL10) (pg/mL, log-^) antes y después de la infusión de una forma de realización del producto Gen 2 TIL. IP-10 es un marcador de adhesión celular y dirigido.
Figura 124: Niveles de IP-10 (CXCL10) (pg/mL, log-^) antes y después de la infusión de una forma de realización del producto Gen 1 TIL.
Figura 125: Niveles de MCP-1 (pg/mL, logio) antes y después de la infusión de una forma de realización del producto Gen 2 TIL. MCP-1 es un marcador de adhesión celular y dirigido.
Figura 126: Niveles de MCP-1 (pg/mL, logio) antes y después de la infusión de una forma de realización del producto Gen 1 TIL.
Figura 127: Datos de estudios de fase 2 en carcinoma de cuello uterino y carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC). SD=enfermedad estable. PR=enfermedad progresiva. PR=respuesta parcial.
Figura 128: Muestra un diagrama de una realización del proceso 2A, un proceso de 22 días para la fabricación de TIL.
Figura 129: Muestra un esquema de la soldadura estéril (consulte la Nota de proceso 5.11 en el Ejemplo 30) del paquete de transferencia de suspensión TIL al fondo (línea única) de un filtro de sangre por gravedad.
Figura 130: Muestra un esquema de la soldadura estéril (consulte la Nota de proceso 5.11 en el Ejemplo 30), la línea de eliminación de medios rojos del GRex100MCS al paquete de transferencia "Sobrenadante".
Figura 131: Muestra un esquema de la soldadura (consulte la Nota de proceso 5.11 en el Ejemplo 30) 4S-4M60 a un Cell Connect CC2, reemplazando un solo pico del aparato Cell Connect (B) con el extremo de 4 picos del colector 4S-4M60 en (GRAMO).
Figura 132: Muestra un esquema de la transferencia de fluido del repetidor de soldadura (consulte la Nota de proceso 5.11 en el Ejemplo 30) establecida en uno de los extremos luer macho de 4S-4M60.
Figura 133: Muestra un esquema de la soldadura estéril (consulte la Nota de proceso 5.11 en el Ejemplo 30) del extremo terminal largo del filtro de sangre por gravedad a la bolsa fuente LOVO.
Figura 134: Muestra un esquema de la soldadura estéril (consulte la Nota de proceso 5.11 en el Ejemplo 30) de una de las dos líneas de origen del filtro a la bolsa de recolección de "suspensión TIL agrupada".
Figura 135: Muestra un esquema de la soldadura estéril (consulte la Nota de proceso 5.11 en el Ejemplo 30) de un 4S-4M60 a un Cell Connect CC2 reemplazando una única punta del aparato Cell Connect (B) con el extremo de 4 puntas del colector 4S-4M60. en (G).
Figura 136: Muestra un esquema de la soldadura estéril (consulte la Nota de proceso 5.11 en el Ejemplo 30) de las Cryobags CS750 al arnés preparado en la Etapa 8.14.8, reemplazando uno de los cuatro extremos luer macho (E) con cada bolsa.
Figura 137: Muestra un esquema de la soldadura (ver Nota de Proceso 5.11 en el Ejemplo 30) de bolsas CS-10 a púas del 4S-4M60.
Figura 138: Muestra un esquema de la soldadura (consulte la Nota de proceso 5.11 en el Ejemplo 30) de la bolsa "TIL formulada" al pico restante (A) en el aparato preparado en la Etapa 8.14.10.
Cifra 139: Muestra un diagrama del sellado térmico (ver Nota de proceso 5.12 en el Ejemplo 30) en F, retirando la bolsa de retenido vacía y las bolsas CS-10.
Figura 140: Muestra las estructuras I-A y I-B, los cilindros se refieren a dominios de unión de polipéptidos individuales. Las estructuras IA y IB comprenden tres dominios de unión a TNFRSF unidos linealmente derivados dep.ej.,4-1BBL o un anticuerpo que se une a 4-1BB, que se pliegan para formar una proteína trivalente, que luego se une a una segunda proteína triavelenta a través de IgG1-Fc (incluidos dominios C<h>3 y C<h>2) se usa luego para unir dos de las proteínas trivalentes a través de enlaces disulfuro (pequeños óvalos alargados), estabilizando la estructura y proporcionando agonistas capaces de unir los dominios de señalización intracelular de los seis receptores y las proteínas de señalización para formar un complejo de señalización.
Figura 141: Proporciona un cuadro que muestra la descripción general de las 3 fases del experimento, como se analiza en el Ejemplo 21.
Breve descripción del listado de secuencias
de aminoácidos de la cadena pesada de muromonab. de aminoácidos de la cadena ligera de muromonab. de aminoácidos de una proteína IL-2 humana recombinante. La SEQ ID NO:4 es la secuencia de aminoácidos de la aldesleucina.
de aminoácidos de una proteína IL-4 humana recombinante. de aminoácidos de una proteína IL-7 humana recombinante. de aminoácidos de una proteína IL-15 humana recombinante. de aminoácidos de una proteína IL-21 humana recombinante. La SEQ ID NO:9 es la secuencia de aminoácidos del 4-1BB humano.
La SEQ ID NO:10 es la secuencia de aminoácidos de 4-1BB murino.
La SEQ ID NO: 11 es la cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB utomilumab (PF-05082566). La SEQ ID NO: 12 es la cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB utomilumab (PF-05082566). La SEQ ID NO:13 es la región variable de cadena pesada (V<h>) para el anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
La SEQ ID NO:14 es la región variable de cadena ligera (V<l>) para el anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
La SEQ ID NO: 15 es la CDR1 de cadena pesada para el anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
La SEQ ID NO: 16 es la CDR2 de cadena pesada para el anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
La SEQ ID NO: 17 es la CDR3 de cadena pesada para el anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
La SEQ ID NO: 18 es la cadena ligera CDR1 para el anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
La SEQ ID NO:19 es la cadena ligera CDR2 para el anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
La SEQ ID NO:20 es la cadena ligera CDR3 para el anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB utomilumab (PF-05082566).
La SEQ ID NO:21 es la cadena pesada del anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB urelumab (BMS-663513). La SEQ ID NO:22 es la cadena ligera del anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB urelumab (BMS-663513).
La SEQ ID NO:23 es la región variable de cadena pesada (V<h>) para el anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB urelumab (BMS-663513).
La SEQ ID NO:24 es la región variable de cadena ligera (V<l>) para el anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB urelumab (BMS-663513).
La SEQ ID NO:25 es la CDR1 de cadena pesada para el anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB urelumab (BMS-663513).
La SEQ ID NO:26 es la CDR2 de cadena pesada para el anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB urelumab (BMS-663513).
La SEQ ID NO:27 es la CDR3 de cadena pesada para el anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB urelumab (BMS-663513).
La SEQ ID NO:28 es la cadena ligera CDR1 para el anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB urelumab (BMS-663513).
La SEQ ID NO:29 es la cadena ligera CDR2 para el anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB urelumab (BMS-663513).
La SEQ ID NO:30 es la cadena ligera CDR3 para el anticuerpo monoclonal agonista 4-1BB urelumab (BMS-663513).
La SEQ ID NO:46 es una secuencia de aminoácidos del ligando 4-1BB (4-1BBL).
La SEQ ID NO:47 es una porción soluble del polipéptido 4-1BBL.
La SEQ ID NO:48 es una región variable de cadena pesada (V<h>) para el anticuerpo agonista 4-1BB 4B4-1-1 versión 1.
La SEQ ID NO:49 es una región variable de cadena ligera (V<l>) para el anticuerpo agonista 4-1BB 4B4-1-1 versión 1.
La SEQ ID NO:50 es una región variable de cadena pesada (V<h>) para el anticuerpo agonista 4-1BB 4B4-1-1 versión 2.
La SEQ ID NO:51 es una región variable de cadena ligera (V<l>) para el anticuerpo agonista 4-1BB 4B4-1-1 versión 2.
La SEQ ID NO:52 es una región variable de cadena pesada (V<h>) para el anticuerpo agonista 4-1BB H39E3-2. La SEQ ID NO:53 es una región variable de cadena ligera (V<l>) para el anticuerpo agonista 4-1BB H39E3-2. Descripción detallada de la invención
I. Introducción
La terapia celular adoptiva que utiliza TIL cultivados ex vivo mediante el Protocolo de expansión rápida (REP) ha producido una terapia celular adoptiva exitosa después de la inmunosupresión del huésped en pacientes con melanoma. Los parámetros actuales de aceptación de la infusión se basan en lecturas de la composición de los TIL (por ejemplo, positividad para CD28, CD8 o CD4) y en los múltiples numéricos de expansión y viabilidad del producto REP.
Los protocolos actuales de REP dan poca información sobre la salud del TIL que se infundirá al paciente. Las células T experimentan un cambio metabólico profundo durante el curso de su maduración de células T naive a efectoras (véase Chang, et al., Nat. Immunol. 2016,17, 364, y en particular para la discusión y marcadores de metabolismo anaeróbico y aeróbico). Por ejemplo, las células T naive dependen de la respiración mitocondrial para producir ATP, mientras que las células T efectoras maduras y sanas como TIL son altamente glucolíticas y dependen de la glucólisis aeróbica para proporcionar los sustratos bioenergéticos que necesitan para la proliferación, migración, activación y eficacia antitumoral.
Los trabajos anteriores informan que es deseable limitar la glucólisis y promover el metabolismo mitocondrial en los TIL antes de la transferencia, ya que las células que dependen en gran medida de la glucólisis sufrirán privación de nutrientes tras la transferencia adoptiva, lo que da como resultado la muerte de la mayoría de las células transferidas. Por tanto, la técnica enseña que la promoción del metabolismo mitocondrial podría promover la longevidad in vivo y, de hecho, sugiere el uso de inhibidores de la glucólisis antes de la inducción de la respuesta inmune. Véase Chang et al. (Chang et al., Nat. Immunol. 2016, 17(364):,
La presente invención se dirige además en algunas realizaciones a procedimientos para evaluar y cuantificar este aumento en la salud metabólica. Por lo tanto, la presente invención proporciona procedimientos para analizar la salud relativa de una población TIL usando una o más evaluaciones generales del metabolismo, que incluyen, pero no se limitan a, tasas y cantidades de glucólisis, fosforilación oxidativa, capacidad respiratoria adicional (SRC) y reserva glicolítica.
Además, la presente invención se dirige además en algunas realizaciones a procedimientos para evaluar y cuantificar este aumento en la salud metabólica. Por lo tanto, la presente invención proporciona procedimientos para analizar la salud relativa de una población TIL usando una o más evaluaciones generales del metabolismo, que incluyen, pero no se limitan a, tasas y cantidades de glucólisis, fosforilación oxidativa, capacidad respiratoria adicional (SRC) y reserva glicolítica.
Además, las evaluaciones adicionales opcionales incluyen, pero no se limitan a, producción de ATP, masa mitocondrial y absorción de glucosa.
II. Definiciones
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.
El término "in vivo" se refiere a un evento que tiene lugar en el cuerpo de un sujeto.
El término "in vitro" se refiere a un evento que tiene lugar fuera del cuerpo de un sujeto. Los ensayos in vitro abarcan ensayos basados en células en los que se emplean células vivas o muertas y también pueden abarcar un ensayo sin células en donde no se emplean células intactas.
El término "ex vivo" se refiere a un evento que implica tratar o realizar un procedimiento en una célula, tejido y/u órgano que se ha eliminado del cuerpo de un sujeto. Acertadamente, la célula, tejido y/u órgano pueden devolverse al cuerpo del sujeto en un procedimiento de cirugía o tratamiento.
El término "expansión rápida" significa un aumento en el número de TIL específicos de antígeno de al menos aproximadamente 3 veces (o 4, 5, 6, 7, 8 o 9 veces) por un período de una semana, más preferiblemente al menos aproximadamente 10 veces (o 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 o 90 veces) por un período de una semana, o lo más preferiblemente al menos aproximadamente 100 veces por un período de una semana. A continuación se describen varios protocolos de expansión rápida.
Por "linfocitos que se infiltran en el tumor" o "TIL" en el presente documento se entiende una población de células obtenidas originalmente como glóbulos blancos que han abandonado el torrente sanguíneo de un sujeto y han migrado a un tumor. Los TIL incluyen, pero no se limitan a, células T citotóxicas CD8+ (linfocitos), células T Th1 y Th17 CD4+, células asesinas naturales, células dendríticas y macrófagos M1. Los TIL incluyen tanto los TIL primarios como los secundarios. Los "TIL primarios" son aquellos que se obtienen de muestras de tejido del paciente como se describe en este documento (a veces denominado "recién recolectado"), y los "TIL secundarios" son cualquier población de células TIL que se han expandido o proliferado como se discute en este documento, incluyendo, pero no limitado a TIL a granel y TIL expandidos ("REP TIL" o "post-REP TIL"). Las poblaciones de células TIL pueden incluir TIL modificadas genéticamente.
Por "población de células" (incluidas las TIL) en el presente documento se entiende un número de células que comparten rasgos comunes. En general, las poblaciones varían generalmente de 1 X 106 a 1 X 1010 en número, con diferentes poblaciones de TIL que comprenden diferentes números. Por ejemplo, el crecimiento inicial de TIL primarios en presencia de IL-2 da como resultado una población de TIL a granel de aproximadamente 1 x 108 células. La expansión de REP se realiza generalmente para proporcionar poblaciones de 1.5 x 109 a 1.5 x 1010 células para infusión.
Por "TIL crioconservados" en el presente documento se entiende que los TIL, primarios, a granel o expandidos (REP TIL), se tratan y almacenan en el intervalo de aproximadamente -150°C a -60°C. Los procedimientos generales para la crioconservación también se describen en otra parte de este documento, incluidos los Ejemplos. Para mayor claridad, los "TIL crioconservados" se distinguen de las muestras de tejido congeladas que pueden usarse como fuente de TIL primarios.
Por "TIL descongelados crioconservados" en el presente documento se entiende una población de TIL que se crioconservó previamente y luego se trató para volver a temperatura ambiente o superior, incluidas, entre otras, temperaturas de cultivo celular o temperaturas en las que se pueden administrar TIL a un paciente.
Los TIL generalmente se pueden definir bioquímicamente, usando marcadores de superficie celular, o funcionalmente, por su capacidad para infiltrar tumores y efectuar el tratamiento. Los TIL generalmente se pueden clasificar expresando uno o más de los siguientes biomarcadores: CD4, CD8, TCR ap, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45Ra, CD95, PD-1 y CD25. Además, y alternativamente, los TIL pueden definirse funcionalmente por su capacidad para infiltrar tumores sólidos tras la reintroducción en un paciente.
El término "medios de crioconservación" o "medio de crioconservación" se refiere a cualquier medio que pueda usarse para la crioconservación de células. Dichos medios pueden incluir medios que comprenden del 7% al 10% de DMSO. Los medios ejemplares incluyen CryoStor CS10, Hyperthermasol, así como combinaciones de los mismos. El término "CS10" se refiere a un medio de crioconservación que se obtiene de Stemcell Technologies o de Biolife Solutions. El medio CS10 puede denominarse con el nombre comercial "CryoStor® CS10". El medio CS10 es un medio libre de componentes animales y sin suero que comprende DMSO.
El término "célula T de memoria central" se refiere a un subconjunto de células T que en el ser humano son CD45R0+ y expresan constitutivamente CCR7 (CCR7hi) y CD62L (CD62hi). El fenotipo de superficie de las células T de memoria central también incluye TCR, CD3, CD127 (IL-7R) e IL-15R. Los factores de transcripción para las células T de memoria central incluyen BCL-6, BCL-6B, MBD2 e BMI1. Las células T de memoria central secretan principalmente IL-2 y CD40L como moléculas efectoras después de la activación del TCR. Los linfocitos T de memoria central predominan en el compartimento CD4 de la sangre, y en el ser humano están proporcionalmente enriquecidos en los ganglios linfáticos y las amígdalas.
El término "célula T de memoria efectora" se refiere a un subconjunto de células T humanas o de mamífero que, como las células T de memoria central, son CD45R0+, pero han perdido la expresión constitutiva de CCR7 (CCR7lD) y son heterogéneas o bajas para la expresión de CD62L (CD62U°). El fenotipo de superficie de las células T de memoria central también incluye TCR,<c>D3, CD127 (IL-7R) e IL-15R. Los factores de transcripción para las células T de memoria central incluyen BLIMP1. Las células T de memoria efectora secretan rápidamente altos niveles de citocinas inflamatorias después de la estimulación antigénica, que incluyen interferón-y, IL-4 e IL-5. Las células T de memoria efectora predominan en el compartimento CD8 de la sangre y, en el ser humano, se enriquecen proporcionalmente en los pulmones, el hígado y el intestino. Las células T de memoria efectora CD8+ transportan grandes cantidades de perforina.
El término "sistema cerrado" se refiere a un sistema que está cerrado al entorno exterior. Se puede emplear cualquier sistema cerrado apropiado para procedimientos de cultivo celular con los procedimientos de la presente invención. Los sistemas cerrados incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a contenedores G cerrados. Una vez que se agrega un segmento tumoral al sistema cerrado, el sistema no se abre al ambiente exterior hasta que los TIL estén listos para ser administrados al paciente.
Los términos "fragmentación", "fragmento" y "fragmentado", como se usan en el presente documento para describir procedimientos para afectar un tumor, incluyen procedimientos de fragmentación mecánica tales como triturar, cortar, dividir y morcelar tejido tumoral, así como cualquier otro procedimiento para alterar la estructura física del tejido tumoral.
Los términos "células mononucleares de sangre periférica" y "PBMC" se refieren a una célula de sangre periférica que tiene un núcleo redondo, que incluye linfocitos (células T, células B, células NK) y monocitos. Preferiblemente, las células mononucleares de sangre periférica son células mononucleares de sangre periférica alogénicas irradiadas. Las PBMC son un tipo de célula presentadora de antígenos.
El término "anticuerpo anti-CD3" se refiere a un anticuerpo o una variante del mismo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal y que incluye anticuerpos humanos, humanizados, quiméricos o murinos que se dirigen contra el receptor CD3 en el receptor del antígeno de células T de células T maduras. Los anticuerpos anti-CD3 incluyen OKT-3, también conocido como muromonab. Los anticuerpos anti-CD3 también incluyen el clon UHCT1, también conocido como T3 y CD3e. Otros anticuerpos anti-CD3 incluyen, por ejemplo, otelixizumab, teplizumab y visilizumab.
El término "OKT-3" (también denominado en el presente documento "OKT3") se refiere a un anticuerpo monoclonal 0 biosimilar o variante del mismo, incluidos anticuerpos humanos, humanizados, quiméricos o murinos, dirigidos contra el receptor CD3 en el receptor de antígeno de célula T de células T maduras, e incluye formas disponibles comercialmente como OKT-3 (30 ng/mL, MACS GMP CD3 pure, Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, CA, USA) y muromonab o variantes, sustituciones conservadoras de aminoácidos, glicoformas o biosimilares de las mismas. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de muromonab se dan en la Tabla 1 (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO:2). Un hibridoma capaz de producir OKT-3 se deposita en la Colección Americana de Cultivos Tipo y se le asigna el número de acceso ATCC CRL 8001. Un hibridoma capaz de producir OKT-3 también se deposita en la Colección Europea de Cultivos Celulares Autenticados (ECACC) y se le asigna el número de catálogo 86022706.
TABLA 1. Secuencias de aminoácidos de muromonab.
El término "IL-2" (también denominado en el presente documento como "IL2") se refiere al factor de crecimiento de células T conocido como interleucina-2, e incluye todas las formas de IL-2, incluidas las formas humanas y de mamíferos, sustituciones conservadoras de aminoácidos, glicoformas, biosimilares y variantes de los mismos. La IL-2 se describe, por ejemplo, en Nelson, J. Immunol. 2004, 172, 3983-88 and Malek, Annu. Rev. Immunol. 2008, 26, 453-79. La secuencia de aminoácidos de IL-2 humana recombinante adecuada para su uso en la invención se proporciona en la Tabla 2 (SEQ ID NO:3). Por ejemplo, el término IL-2 abarca formas humanas recombinantes de IL-2 como la aldesleucina (PROLEUKIN, disponible comercialmente en múltiples proveedores en 22 millones de UI por viales de un solo uso), así como la forma de IL-2 recombinante suministrada comercialmente por CellGenix, Inc., Portsmouth, NH, USA (CELLGRO GMP) o ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA (Cat. No. CYT-209-b) y otros equivalentes comerciales de otros proveedores. La aldesleucina (desalanil-1, serina-125 IL-2 humana) es una forma recombinante humana no glicosilada de IL-2 con un peso molecular de aproximadamente 15 kDa. La secuencia de aminoácidos de la aldesleucina adecuada para su uso en la invención se proporciona en la Tabla 2 (SEQ ID NO:4). El término IL-2 también abarca formas pegiladas de IL-2, como se describe en el presente documento, incluido el profármaco de IL2 pegilado NKTR-214, disponible en Nektar Therapeutics, South San Francisco, CA, USA. La NKTR-214 y la IL-2 pegilada adecuadas para su uso en la invención se describen en la publicación de solicitud de patente estadounidense No. US 2014/0328791 A1 y la publicación de solicitud de patente internacional No. WO 2012/065086 A1. Las formas alternativas de IL-2 conjugada adecuadas para su uso en la invención se describen en las Patentes de Estados Unidos Nos. 4,766,106, 5,206,344, 5,089,261 y 4902,502. Las formulaciones de IL-2 adecuadas para su uso en la invención se describen en la patente de EE.UU. No. 6,706,289.
TABLA 2. Secuencias de aminoácidos de interleucinas.
El término "IL-4" (también denominado en el presente documento "IL4") se refiere a la citocina conocida como interleucina 4, que es producida por células T Th2 y por eosinófilos, basófilos y mastocitos. IL-4 regula la diferenciación de células T colaboradoras naive (células Th0) a células T Th2. Steinke y Borish, Respir. Res. 2001, 2, 66-70. Tras la activación por IL-4, las células T Th2 producen posteriormente IL-4 adicional en un circuito de retroalimentación positiva. IL-4 también estimula la proliferación de células B y la expresión del MHC de clase II e induce el cambio de clase a la expresión de IgE e IgG<1>de las células B. La IL-4 humana recombinante adecuada para su uso en la invención está disponible comercialmente por múltiples proveedores, incluidos ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, EUA (Cat. No. CYT-211) y ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EUA (proteína recombinante IL-15 humana, cat. No. Gibco CTP0043). La secuencia de aminoácidos de IL-4 humana recombinante adecuada para su uso en la invención se proporciona en la Tabla 2 (SEQ ID NO:5).
El término "IL-7" (también denominado en el presente documento "IL7") se refiere a una citocina derivada de tejido glicosilada conocida como interleucina 7, que puede obtenerse de células estromales y epiteliales, así como de células dendríticas. Fry y Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904. IL-7 puede estimular el desarrollo de células T. La IL-7 se une al receptor de IL-7, un heterodímero formado por el receptor alfa de IL-7 y el receptor de cadena gamma común, que en una serie de señales importantes para el desarrollo de las células T dentro del timo y la supervivencia dentro de la periferia. La IL-7 humana recombinante adecuada para su uso en la invención está disponible comercialmente por múltiples proveedores, incluidos ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, EUA (Cat. No. CYT-254) y ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EUA (proteína recombinante IL-15 humana, No. de cat. Gibco PHC0071). La secuencia de aminoácidos de IL-7 humana recombinante adecuada para su uso en la invención se proporciona en la Tabla 2 (SEQ ID NO:6).
El término "IL-15" (también denominado en el presente documento como "IL15") se refiere al factor de crecimiento de células T conocido como interleucina-15, e incluye todas las formas de IL-2, incluidas las formas humanas y de mamíferos, sustituciones conservadoras de aminoácidos, glicoformas, biosimilares y variantes de los mismos. La IL-15 se describe, por ejemplo, en Fehniger y Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32. IL-15 comparte subunidades de receptores de señalización p y<y>con IL-2. La IL-15 humana recombinante es una cadena polipeptídica única no glicosilada que contiene 114 aminoácidos (y una metionina N-terminal) con una masa molecular de 12.8 kDa. La IL-15 humana recombinante está disponible comercialmente por múltiples proveedores, incluidos ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, EUA (Cat. No. CYT-230-b) and ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EUA (proteína recombinante IL-15 humana, No. de catálogo 34-8159-82). La secuencia de aminoácidos de IL-15 humana recombinante adecuada para su uso en la invención se proporciona en la Tabla 2 (SEQ ID NO:7).
El término "IL-21" (también denominado en el presente documento "IL21") se refiere a la proteína citocina pleiotrópica conocida como interleucina-21, e incluye todas las formas de IL-21, incluidas las formas humanas y de mamíferos, sustituciones conservadoras de aminoácidos, glicoformas, biosimilares y variantes de los mismos. IL-21 se describe, por ejemplo, en Spolski y Leonard, Nat. Rev. Drug. Disc. 2014,13, 379-95. La IL-21 es producida principalmente por células T asesinas naturales y células T CD4+ humanas activadas. La IL-21 humana recombinante es una cadena polipeptídica única no glicosilada que contiene 132 aminoácidos con una masa molecular de 15.4 kDa. La IL-21 humana recombinante está disponible comercialmente por múltiples proveedores,
incluidos ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, EUA (Cat. No. CYT-408-b) and ThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EUA (proteína recombinante IL-21 humana, No. de cat. 14-8219-80). La secuencia
de aminoácidos de IL-21 humana recombinante adecuada para su uso en la invención se proporciona en la Tabla
2 (SEQ ID NO:8).
Cuando se indica "una cantidad eficaz antitumoral", "una cantidad eficaz inhibidora de tumores" o "cantidad terapéutica", un médico puede determinar la cantidad precisa de las composiciones de la presente invención a administrar teniendo en cuenta las diferencias individuales de edad, peso, tamaño del tumor, extensión de la
infección o metástasis y estado del paciente (sujeto). En general, se puede afirmar que una composición farmacéutica que comprende los linfocitos que infiltran el tumor (por ejemplo, TIL secundarios o linfocitos citotóxicos modificados genéticamente) descrita en el presente documento puede administrarse en una dosis de
104 a 1011 células/kg de peso corporal (por ejemplo, 105 a 106, 105 a 1010, 105 a 1011, 106 a 1010, 106 1011, 107 a 1010, 108 a 1011, 108 a 1010, 109 a 1011, o 109 a 1010 células/kg de peso corporal), incluidos todos los
valores enteros dentro de esos intervalos. Las composiciones de linfocitos infiltrantes de tumores (incluidos en
algunos casos, linfocitos citotóxicos modificados genéticamente) también se pueden administrar múltiples veces a
estas dosis. Los linfocitos que infiltran el tumor (incluidos en algunos casos, genéticamente) pueden administrarse
usando técnicas de infusión que se conocen comúnmente en inmunoterapia (véase, por ejemplo, Rosenberg et
al., New Eng. J. of Med. 319: 1676, 1988). Un experto en la técnica de la medicina puede determinar fácilmente la dosificación y el régimen de tratamiento óptimos para un paciente en particular controlando al paciente para
detectar signos de enfermedad y ajustando el tratamiento en consecuencia.
El término "malignidad hematológica" se refiere a cánceres de mamíferos y tumores de los tejidos hematopoyéticos
y linfoides, que incluyen, pero no se limitan a tejidos de la sangre, médula ósea, ganglios linfáticos y sistema
linfático. Las neoplasias malignas hematológicas también se denominan "tumores líquidos". Las neoplasias malignas hematológicas incluyen, entre otras, leucemia linfoblástica aguda (LLA), linfoma linfocítico crónico (LLC),
linfoma linfocítico pequeño (SLL), leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia monocítica aguda (LMA), linfoma de Hodgkin y linfomas no Hodgkin. El término "neoplasia hematológica de células
B" se refiere a neoplasias hematológicas que afectan a las células B.
El término "tumor sólido" se refiere a una masa anormal de tejido que normalmente no contiene quistes o áreas
líquidas. Los tumores sólidos pueden ser benignos o malignos. El término cáncer de tumor sólido se refiere a
tumores sólidos malignos, neoplásicos o cancerosos. Los cánceres de tumor sólido incluyen, pero no se limitan a, sarcomas, carcinomas y linfomas, tales como cánceres de pulmón, mama, próstata, colon, recto, y vejiga. La estructura tisular de los tumores sólidos incluye compartimentos de tejido interdependientes que incluyen el parénquima (células cancerosas) y las células estromales de soporte en las que se dispersan las células cancerosas y que pueden proporcionar un microambiente de soporte.
El término "tumor líquido" se refiere a una masa anormal de células que es de naturaleza fluida. Los cánceres de
tumores líquidos incluyen, pero no se limitan a, leucemias, mielomas y linfomas, así como otras neoplasias malignas hematológicas. Los TIL obtenidos de tumores líquidos también pueden denominarse en el presente documento linfocitos infiltrantes de médula (MIL).
El término "microambiente", como se usa en este documento, puede referirse al microambiente tumoral sólido o hematológico como un todo o a un subconjunto individual de células dentro del microambiente. El microambiente
tumoral, como se usa en este documento, se refiere a una mezcla compleja de "células, factores solubles, moléculas de señalización, matrices extracelulares y señales mecánicas que promueven la transformación neoplásica, apoyan el crecimiento e invasión tumoral, protegen el tumor de la inmunidad del huésped, fomentan la resistencia terapéutica y proporcionan nichos para que prosperen las metástasis dominantes", como se describe
en Swartz, et al., Cancer Res., 2012, 72, 2473. Aunque los tumores expresan antígenos que deberían ser reconocidos por las células T, la eliminación del tumor por parte del sistema inmunológico es poco común debido
a la inmunosupresión del microambiente.
También se divulga en el presente documento pero no se reivindica es un procedimiento para tratar un cáncer con
una población de TIL, en donde un paciente se trata previamente con quimioterapia no mieloablativa antes de una
infusión de TIL según la invención. Se puede proporcionar la población de TIL en la que un paciente se trata previamente con quimioterapia no mieloablativa antes de una infusión de TIL de acuerdo con la presente invención.
La quimioterapia no mieloablativa puede ser ciclofosfamida 60 mg/kg/d durante 2 días (días 27 y 26 antes de la
infusión de TIL) y fludarabina 25 mg/m2/d durante 5 días (días 27 a 23 antes de la infusión de TIL). Después de la quimioterapia no mieloablativo y la infusión de TIL (en el día 0), el paciente puede recibir una infusión intravenosa
de IL-2 por vía intravenosa a 720,000 UI/kg cada 8 horas hasta tolerancia fisiológica.
Los hallazgos experimentales indican que el agotamiento de linfocitos (linfodepleción) antes de la transferencia
adoptiva de linfocitos T específicos de tumor desempeña un papel clave en la mejora de la eficacia del tratamiento
al eliminar las células T reguladoras y los elementos competidores del sistema inmunológico ("sumideros de citocinas"). Por consiguiente, una etapa de linfodepleción (a veces también denominada "acondicionamiento ¡nmunosupresor") puede ser utilizada en el paciente antes de la introducción de las rTIL de la invención.
Los términos "coadministración", "coadministrar", "administrado en combinación con", "administrar en combinación con", "simultáneo" y "concurrente", como se usan en este documento, abarcan la administración de dos o más ingredientes farmacéuticos activos (en una forma de realización preferida de la presente invención, por ejemplo, al menos un agonista del canal de potasio en combinación con una pluralidad de TIL) a un sujeto de modo que ambos ingredientes farmacéuticos activos y/o sus metabolitos estén presentes en el sujeto al mismo tiempo. La coadministración incluye la administración simultánea en composiciones separadas, la administración en diferentes momentos en composiciones separadas o la administración en una composición en la que están presentes dos o más ingredientes farmacéuticos activos. Se prefiere la administración simultánea en composiciones separadas y la administración en una composición en la que están presentes ambos agentes.
El término "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de un compuesto o combinación de compuestos como se describe en el presente documento que es suficiente para efectuar la aplicación pretendida que incluye, pero no se limita a, el tratamiento de enfermedades. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede variar según la aplicación prevista (in vitro o in vivo), o el sujeto y la condición patológica que se está tratando (por ejemplo, el peso, la edad y el sexo del sujeto), la gravedad de la condición patológica, o la forma de administración. El término también se aplica a una dosis que inducirá una respuesta particular en las células diana (por ejemplo, la reducción de la adhesión plaquetaria y/o la migración celular). La dosis específica variará dependiendo de los compuestos particulares elegidos, el régimen de dosificación a seguir, si el compuesto se administra en combinación con otros compuestos, el momento de administración, el tejido al que se administra y el sistema de administración física en donde se transporta el compuesto.
Los términos "tratamiento", "tratar", "trato" y similares, se refieren a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevención completa o parcial de una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de curación parcial o completa de una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", como se usa en este documento, cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente en un ser humano, e incluye: (a) prevenir que la enfermedad ocurra en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero que aún no ha sido diagnosticado con tenerla; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo o progresión; y (c) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad y/o aliviar uno o más síntomas de la enfermedad. "Tratamiento" también pretende abarcar la administración de un agente para proporcionar un efecto farmacológico, incluso en ausencia de una enfermedad o afección. Por ejemplo, "tratamiento" abarca la administración de una composición que puede provocar una respuesta inmune o conferir inmunidad en ausencia de una enfermedad, por ejemplo, en el caso de una vacuna.
El término "heterólogo" cuando se usa con referencia a porciones de un ácido nucleico o proteína indica que el ácido nucleico o proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza. Por ejemplo, el ácido nucleico se produce típicamente de forma recombinante, teniendo dos o más secuencias de genes no relacionados dispuestos para producir un nuevo ácido nucleico funcional, por ejemplo, un promotor de una fuente y una región codificante de otra fuente, o regiones codificantes de diferentes fuentes. De manera similar, una proteína heteróloga indica que la proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí en la naturaleza (por ejemplo, una proteína de fusión).
Los términos "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad" y "porcentaje de identidad de secuencia" (o sinónimos de los mismos, por ejemplo, "99% idéntico") en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje específico de nucleótidos o residuos de aminoácidos que son iguales, cuando se comparan y alinean (introduciendo espacios, si es necesario) para una correspondencia máxima, sin considerar ninguna sustitución conservadora de aminoácidos como parte de la identidad de secuencia. El porcentaje de identidad se puede medir utilizando software o algoritmos de comparación de secuencias o mediante inspección visual. Se conocen en la técnica diversos algoritmos y software que pueden usarse para obtener alineamientos de secuencias de aminoácidos o nucleótidos. Los programas adecuados para determinar el porcentaje de identidad de secuencia incluyen, por ejemplo, el conjunto de programas BLAST disponibles en el sitio web BLAST del Centro Nacional de Información Biotecnológica del Gobierno de EE. UU. Las comparaciones entre dos secuencias se pueden realizar utilizando el algoritmo BLASTN o BLASTP. BLASTN se usa para comparar secuencias de ácidos nucleicos, mientras que BLASTP se usa para comparar secuencias de aminoácidos. ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California) o MegAlign, disponibles en DNASTAR, son programas de software adicionales disponibles públicamente que pueden usarse para alinear secuencias. Un experto en la técnica puede determinar los parámetros apropiados para la alineación máxima mediante un software de alineación particular. En determinadas formas de realización, se utilizan los parámetros predeterminados del software de alineación.
Como se usa en este documento, el término "variante" abarca, pero no se limita a anticuerpos o proteínas de fusión que comprenden una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de referencia por medio de una o más sustituciones, deleciones y/o adiciones en ciertas posiciones dentro o adyacentes a la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de referencia. La variante puede comprender una o más sustituciones conservadoras en su secuencia de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de referencia. Las sustituciones conservadoras pueden implicar, por ejemplo, la sustitución de aminoácidos cargados de manera similar o no cargados. La variante conserva la capacidad de unirse específicamente al antígeno del anticuerpo de referencia. El término variante también incluye anticuerpos o proteínas pegilados.
Por "linfocitos infiltrantes de tumores" o "TIL" se entiende en la presente una población de células obtenidas originalmente como glóbulos blancos que han abandonado el torrente sanguíneo de un sujeto y migrado a un tumor. Los TIL incluyen, pero no se limitan a, células T citotóxicas CD8+ (linfocitos), células T Th1 y Th17 CD4+, células asesinas naturales, células dendríticas y macrófagos M1. Los TIL incluyen tanto los TIL primarios como los secundarios. Los "TIL primarios" son aquellos que se obtienen de muestras de tejido de pacientes como se describe en este documento (a veces denominadas "recién recolectadas"), y los "TIL secundarios" son cualquier población de células TIL que se hayan expandido o proliferado como se discute en la presente, que incluyen, pero no se limitan a TIL a granel, TIL expandidos ("REP TIL") así como "reREP TIL" como se discuten en el presente documento. Los reREP TIL pueden incluir, por ejemplo, TIL de segunda expansión o TIL de segunda expansión adicional (como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 27, incluidos los TIL denominados reREP TIL).
Los TIL generalmente se pueden definir bioquímicamente, usando marcadores de superficie celular, o funcionalmente, por su capacidad para infiltrar tumores y efectuar el tratamiento. Los TIL generalmente se pueden clasificar expresando uno o más de los siguientes biomarcadores: CD4, CD8, TCR ap, CD27, CD28, CD56, CCR7, CD45Ra, CD95, PD-1 y CD25. Además, y de forma alternativa, los TIL pueden definirse funcionalmente por su capacidad para infiltrar tumores sólidos tras la reintroducción en un paciente. Los TIL pueden caracterizarse además por su potencia; por ejemplo, los TIL pueden considerarse potentes si, por ejemplo, la liberación de interferón (IFN) es mayor que aproximadamente 50 pg/mL, mayor que aproximadamente 100 pg/mL, mayor que aproximadamente 150 pg/mL o superior a aproximadamente 200 pg/mL.
Los términos "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "excipiente farmacéuticamente aceptable" pretenden incluir todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción e ingredientes inertes. El uso de tales vehículos farmacéuticamente aceptables o excipientes farmacéuticamente aceptables para ingredientes farmacéuticos activos es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable convencional sea incompatible con el ingrediente farmacéutico activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas de la invención. Ingredientes farmacéuticos activos adicionales, como otros medicamentos, también se pueden incorporar a las composiciones y métodos descritos.
Los términos "alrededor de" y "aproximadamente" significan que están dentro de un rango estadísticamente significativo de un valor. Tal intervalo puede estar dentro de un orden de magnitud, preferiblemente dentro del 50%, más preferiblemente dentro del 20%, más preferiblemente todavía dentro del 10%, e incluso más preferiblemente dentro del 5% de un valor o intervalo dado. La variación permisible abarcada por los términos "alrededor de" o "aproximadamente" depende del sistema particular en estudio y puede ser fácilmente apreciada por un experto en la técnica. Además, como se usa en este documento, los términos "alrededor de" y "aproximadamente" significan que las dimensiones, tamaños, formulaciones, parámetros, formas y otras cantidades y características no son y no necesitan ser exactos, pero pueden ser aproximados y/o mayores o menores. según se desee, reflejando tolerancias, factores de conversión, redondeo, error de medición y similares, y otros factores conocidos por los expertos en la técnica. En general, una dimensión, tamaño, formulación, parámetro, forma u otra cantidad o característica es "aproximada" si se indica expresamente o no que sea así. Se observa que las formas de realización de tamaños, formas y dimensiones muy diferentes pueden emplear las disposiciones descritas.
Los términos transitorios "que comprende", "que consiste esencialmente en" y "que consiste en", cuando se usan en las reivindicaciones adjuntas, en forma original y enmendada, definen el alcance de la reivindicación con respecto a los elementos o etapas adicionales de la reivindicación no citados, si los hubiera, están excluidos del alcance de la (s) reivindicación (es). El término "que comprende" pretende ser inclusivo o ilimitado y no excluye ningún elemento, método, etapa o material adicional no mencionado. El término "que consiste en" excluye cualquier elemento, etapa o material que no sean los especificados en la reivindicación y, en este último caso, las impurezas ordinarias asociadas con el o los materiales especificados. El término "que consiste esencialmente en" limita el alcance de una reivindicación a elementos, etapas o material(es) especificados y aquellos que no afecten materialmente a las características básicas y nuevas de la invención reivindicada. En formas de realización alternativas, todas las composiciones, procedimientos y kits descritos en el presente documento pueden definirse más específicamente mediante cualquiera de los términos de transición "que comprende", "que consiste esencialmente en" y "que consiste en".
AGONISTAS 4-1BB (CD137)
El agonista de TNFRSF puede ser un agonista de 4-1BB (CD137). El agonista de 4-1BB puede ser cualquier molécula de unión a 4-1BB conocida en la técnica. La molécula de unión a 4-1BB puede ser un anticuerpo monoclonal o una proteína de fusión capaz de unirse a 4-1BB humano o de mamífero. Los agonistas de 4-1BB o las moléculas de unión de 4-1BB pueden comprender una cadena pesada de inmunoglobulina de cualquier isotipo(p.ej,IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase(p.ej,IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina. El agonista de 4-1BB o la molécula de unión a 4-1BB puede tener una cadena pesada y una ligera. Como se usa en el presente documento, el término molécula de unión también incluye anticuerpos (incluidos anticuerpos de longitud completa), anticuerpos monoclonales (incluidos anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos(p.ej.,anticuerpos biespecíficos), anticuerpos humanos, humanizados o quiméricos, y fragmentos de anticuerpos,p.ej.,fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos producidos por una biblioteca de expresión Fab, fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores y formas modificadas de anticuerpos,p.ej.,moléculas scFv, que se unen a 4-1BB. El agonista de 4-1BB puede ser una proteína de unión a antígeno que es un anticuerpo completamente humano. El agonista de 4-1BB puede ser una proteína de unión a antígeno que es un anticuerpo humanizado. Los agonistas de 4-1BB para uso en los procedimientos y composiciones actualmente divulgados pueden incluir anticuerpos anti-4-1BB, anticuerpos anti-4-1BB humanos, anticuerpos anti-4-1BB de ratón, anticuerpos anti-4-1BB de mamífero, anticuerpos anti-4-1BB monoclonales, anticuerpos anti-4-1BB policlonales, anticuerpos anti-4-1BB quiméricos, adnectinas anti-4-1BB, anticuerpos de dominio anti-4-1BB, fragmentos anti-4-1BB de cadena sencilla, fragmentos anti-4-1BB de cadena pesada Fragmentos 1BB, fragmentos anti-4-1BB de cadena ligera, proteínas de fusión anti-4-1BB y fragmentos, derivados, conjugados, variantes o biosimilares de los mismos. Se sabe que los anticuerpos anti-4-1BB agonistas inducen fuertes respuestas inmunitarias. Lee et al., PLOS One 2013, 8, e69677. El agonista de 4-1BB puede ser un anticuerpo monoclonal agonista, anti-4-1BB humanizado o totalmente humano(es decir,un anticuerpo derivado de una única línea celular). El agonista de 4-1BB puede ser EU-101 (Eutilex Co. Ltd.), utomilumab o urelumab, o un fragmento, derivado, conjugado, variante o biosimilar del mismo. El agonista de 4-1BB puede ser utomilumab o urelumab, o un fragmento, derivado, conjugado, variante o biosimilar de los mismos.
El agonista de 4-1BB o la molécula de unión a 4-1BB también puede ser una proteína de fusión. Un agonista multimérico de 4-1BB, como un agonista de 4-1BB trimérico o hexamérico (con tres o seis dominios de unión a ligando), puede inducir una agrupación superior del receptor (4-1BBL) y la formación de un complejo de señalización celular interno en comparación con un anticuerpo monoclonal agonista. que normalmente posee dos dominios de unión a ligando. Se describen proteínas de fusión triméricas (trivalentes) o hexaméricas (o hexavalentes) o mayores que comprenden tres dominios de unión a TNFRSF e IgG1-Fc y opcionalmente uniendo además dos o más de estas proteínas de fusión.p.ej,en Gieffers et al., Mol. Cáncer Therapeutics 2013, 12, 2735 47.
Se sabe que los anticuerpos agonistas 4-1BB y las proteínas de fusión inducen fuertes respuestas inmunitarias. El agonista de 4-1BB puede ser un anticuerpo monoclonal o una proteína de fusión que se une específicamente al antígeno 4-1BB de una manera suficiente para reducir la toxicidad. El agonista de 4-1BB puede ser un anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB o una proteína de fusión que anula la toxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), por ejemplo, la citotoxicidad de las células NK. El agonista de 4-1BB puede ser un anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB o una proteína de fusión que anula la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP). El agonista de 4-1BB puede ser un anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB o una proteína de fusión que anula la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). El agonista de 4-1BB puede ser un anticuerpo monoclonal agonista de 4-1BB o una proteína de fusión que anula la funcionalidad de la región Fc.
Los agonistas de 4-1BB pueden caracterizarse por unirse a 4-1BB humano (SEQ ID NO:9) con alta afinidad y actividad agonista. El agonista de 4-1BB puede ser una molécula de unión que se une al 4-1BB humano (SEQ ID NO:9). El agonista de 4-1BB puede ser una molécula de unión que se une a 4-1BB murino (SEQ ID NO:10). Las secuencias de aminoácidos del antígeno 4-1BB al que se une un agonista o molécula de unión de 4-1BB se resumen en la Tabla 3.
TABLA 3. Secuencias de aminoácidos de los antígenos 4-1BB.
Las composiciones, procesos y procedimientos descritos pueden incluir un agonista de 4-1BB que se une a 4-1BB humano o murino con una K<d>de aproximadamente 100 pM o menos, se une a 4-1BB humano o murino con una Kd de aproximadamente 90 pM o menos, se une a 4-1BB humano o murino con una Kd de aproximadamente 80 pM o menos, se une a 4-1BB humano o murino con una K<d>de aproximadamente 70 pM o menos, se une a 4-1BB humano o murino con una K<d>de aproximadamente 60 pM o menos, se une a 4-1BB humano o murino con una K<d>de aproximadamente 50 pM o menos, se une a 4-1BB humano o murino con una K<d>de aproximadamente 40 pM o menos, o se une a 4-1B<b>humano o murino con una K<d>de aproximadamente 30 pM o menos.
Las composiciones, procesos y procedimientos descritos pueden incluir un agonista de 4-1BB que se une a 4-1BB humano o murino con una kasoc de aproximadamente 7,5 * 1051/M s o más rápido, se une a 4-1BB humano o murino con una kasoc de aproximadamente 7,5 * 1051/M s o más rápido, se une a 4-1BB humano o murino con una kasoc de aproximadamente 8 * 1051/Ms o más rápido, se une a 4-1BB humano o murino con una kasoc de aproximadamente 8,5 * 105 1/M s o más rápido, se une a 4-1BB humano o murino con una kasoc de aproximadamente 9 * 1051/M s o más rápido, se une a 4-1BB humano o murino con una kasoc de aproximadamente 9,5 * 1051/M s o más rápido, o se une a 4-1BB humano o murino con una kasoc de aproximadamente 1 * 1061/Ms o más rápido.
Las composiciones, procesos y procedimientos descritos pueden incluir un agonista de 4-1BB que se une a 4-1BB humano o murino con una k.disociac de aproximadamente 2 * 10-51/s o más lento, se une a 4-1BB humano o murino con una kdisociac de aproximadamente 2,1 * 10-51/s o más lento, se une a 4-1BB humano o murino con una kdisociac de aproximadamente 2,2 * 10<-5>■/s o más lento, se une a 4-1BB humano o murino con una kdisociacde aproximadamente 2,3<*>10<-5>1/s o más lento, se une a 4-1BB humano o murino con una kdisociacde aproximadamente 2,4<*>10<-5>1/s o más lento, se une a 4-1BB humano o murino con una kdisociacde aproximadamente 2,5<*>10<-5>1/s o más lento, se une a 4-1BB humano o murino con una kdisociacde aproximadamente 2,6<*>10<-5>1/s o más lento o se une a 4-1BB humano o murino con una kdisociacde aproximadamente 2,7<*>10<-5>1/s o más lento, se une a 4-1BB humano o murino con una kdisociacde aproximadamente 2,8<*>10<-5>1/s o más lento, se une a 4-1BB humano o murino con una kdisociacde aproximadamente 2,9<*>10<-5>1/s o más lento, o se une a 4-1BB humano o murino con una kdisociacde aproximadamente 3 * 10-51/s o más lento.
Las composiciones, procesos y procedimientos descritos pueden incluir un agonista de 4-1BB que se une a 4-1BB humano o murino con una IC<50>de aproximadamente 10 nM o menos, se une al 4-1BB humano o murino con una IC<50>de aproximadamente 9 nM o menos, se une al 4-1BB humano o murino con una IC<50>de aproximadamente 8 nM o menos, se une al 4-1BB humano o murino con una IC<50>de aproximadamente 7 nM o menos, se une al 4-1BB humano o murino con una IC<50>de aproximadamente 6 nM o menos, se une al 4-1BB humano o murino con una IC<50>de aproximadamente 5 nM o menos, se une al 4-1BB humano o murino con una IC<50>de aproximadamente 4 nM o menos, se une al 4-1BB humano o murino con una IC<50>de aproximadamente 3 nM o menos, se une al 4-1BB humano o murino con una IC<50>de aproximadamente 2 nM o menos, o se une a 4-1BB humano o murino con una IC<50>de aproximadamente 1 nM o menos.
El agonista de 4-1BB puede ser utomilumab, también conocido como PF-05082566 o MOR-7480, o un fragmento, derivado, variante o biosimilar del mismo. Utomilumab está disponible en Pfizer, Inc. Utomilumab es una inmunoglobulina G2-lambda,anti-[Homo sapiensTNFRSF9 (miembro 9 de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR), 4-1BB, antígeno de células T ILA, CD137)], anticuerpo monoclonalHomo sapiens(completamente humano). Las secuencias de aminoácidos de utomilumab se exponen en la Tabla 4. Utomilumab comprende sitios de glicosilación en Asn59 y Asn292; puentes disulfuro intracadena de cadena pesada en las posiciones 22-96 (V<h>-V<l>), 143-199 (C<h>1-C<l>), 256-316 (C<h>2) y 362-420 (C<h>3); puentes disulfuro intracadena de cadena ligera en las posiciones 22'-87' (V<h>-V<l>) y 136'-195' (C<h>1-C<l>); puentes disulfuro entre cadenas pesadas y cadenas pesadas en las posiciones de isoformas de IgG2A 218-218, 219-219, 222-222 y 225-225, en las posiciones de isoformas de IgG2A/B 218-130, 219-219, 222-222 y 225-225, y en las posiciones de isoforma IgG2B 219-130 (2), 222-222 y 225-225; y puentes disulfuro entre cadenas pesadas y cadenas ligeras en las posiciones de isoforma de IgG2A 130-213' (2), en las posiciones de isoforma de IgG2A/B 218-213' y 130-213', y en las posiciones de isoforma de IgG2B 218-213' (2). La preparación y propiedades de utomilumab y sus variantes y fragmentos se describen en Patentes de EE. UU. Nos. 8.821.867; 8.337.850; y 9.468.678, y Publicación de Solicitud de Patente Internacional No. WO 2012/032433 A1. Las características preclínicas de utomilumab se describen en Fisher et al., Cancer Immunolog. & Inmunother. 2012, 61, 1721-33. Los ensayos clínicos actuales de utomilumab en una variedad de indicaciones hematológicas y de tumores sólidos incluyen los identificadores de Clinicaltrials.gov de los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. NCT02444793, NCT01307267, NCT02315066 y NCT02554812.
Un agonista de 4-1BB puede comprender una cadena pesada proporcionada por SEQ ID NO:11 y una cadena ligera proporcionada por SEQ ID NO:12. Un agonista de 4-1BB puede comprender cadenas pesadas y ligeras que tienen las secuencias mostradas en SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO: 12, respectivamente, o fragmentos de unión a antígeno, fragmentos Fab, fragmentos variables monocatenarios (scFv), variantes o conjugados de los mismos. Un agonista de 4-1BB puede comprender cadenas pesadas y ligeras que son cada una de ellas al menos 99% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO: 12, respectivamente. Un agonista de 4-1BB puede comprender cadenas pesadas y ligeras que son cada una de ellas al menos 98% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO: 12, respectivamente. Un agonista de 4-1BB puede comprender cadenas pesadas y ligeras que son cada una de ellas al menos 97% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO:12, respectivamente. Un agonista de 4-1BB puede comprender cadenas pesadas y ligeras que son cada una de ellas al menos 96% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO:12, respectivamente. Un agonista de 4-1BB puede comprender cadenas pesadas y ligeras que son cada una de ellas al menos 95% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO:12, respectivamente.
El agonista de 4-1BB puede comprender las CDR de cadena pesada y ligera o regiones variables (VR) de utomilumab. La región variable de la cadena pesada del agonista 4-1BB (V<h>) puede comprender la secuencia mostrada en SEQ ID NO:13, y la región variable de la cadena ligera del agonista 4-1BB (V<l>) comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO:14 y sus sustituciones conservadoras de aminoácidos. Un agonista de 4-1BB puede comprender regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos 99% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID NO:13 y SEQ ID NO:14, respectivamente. Un agonista de 4-1BB puede comprender regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos 98% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID NO:13 y SEQ ID NO:14, respectivamente. Un agonista de 4-1BB puede comprender regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos 97% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID NO:13 y SEQ ID NO:14, respectivamente. Un agonista de 4-1BB puede comprender regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos 96% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID NO:13 y SEQ ID NO:14, respectivamente. Un agonista de 4-1BB puede comprender regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos 95% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID NO:13 y SEQ ID NO:14, respectivamente. Un agonista de 4-1BB puede comprender un anticuerpo scFv que comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos 99% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID NO:13 y SEQ ID NO:14.
Un agonista de 4-1BB puede comprender dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que tienen las secuencias expuestas en SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 y SEQ ID NO:17, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de los mismos, y dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera que tienen las secuencias expuestas en SEQ ID NO:18, Se Q ID NO:19 y SEQ ID NO:20, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de los mismos.
El agonista de 4-1BB puede ser un anticuerpo monoclonal biosimilar agonista de 4-1BB aprobado por las autoridades reguladoras de medicamentos con referencia a utomilumab. El anticuerpo monoclonal biosimilar puede comprender un anticuerpo 4-1BB que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97 % de identidad de secuencia.p.ej.,97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia, con la secuencia de aminoácidos de un medicamento de referencia o producto biológico de referencia y que comprende una o más modificaciones postraduccionales en comparación con el medicamento de referencia o producto biológico de referencia. producto, donde el medicamento de referencia o producto biológico de referencia es utomilumab. La una o más modificaciones postraduccionales se pueden seleccionar de uno o más de: glicosilación, oxidación, desamidación y truncamiento. El biosimilar puede ser un anticuerpo agonista de 4-1BB autorizado o presentado para autorización, en el que el anticuerpo agonista de 4-1BB se proporciona en una formulación que difiere de las formulaciones de un medicamento de referencia o producto biológico de referencia, en el que el medicamento de referencia o el producto biológico de referencia El producto biológico es utomilumab. El anticuerpo agonista 4-1BB puede estar autorizado por una autoridad reguladora de medicamentos, como la FDA de<e>E. UU. y/o la EMA de la Unión Europea. El biosimilar se puede proporcionar como una composición que comprende además uno o más excipientes, en donde el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un medicamento de referencia o producto biológico de referencia, en donde el medicamento de referencia o producto biológico de referencia es utomilumab. El biosimilar se puede proporcionar como una composición que comprende además uno o más excipientes, en donde el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un medicamento de referencia o producto biológico de referencia, en donde el medicamento de referencia o producto biológico de referencia es utomilumab.
TABLA 4. Secuencias de aminoácidos de anticuerpos agonistas 4-1BB relacionados con utomilumab.
EVQLVQSGAEVKKPGESLRTSCKGSGYSFSTYWISWVRQMPGKGLEWMGKTYPGDSYTNY 60 SPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGYGIFDYWGQGTLVTVSSASTK<120>
180 GPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS240SEQ ID NO:11 c LSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPP 300 para utomilumab KPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSV<360>LTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL<420>
441 TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC
SVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
SEQ ID NO: 12 cadena ligera SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDNIGDQYAHWYQQKPGQSPVLVIYQDKNRPSGIPER 60 para utomilumab FSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCATYTGFGSLAVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLF<120>
180 PPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYL214 SLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
SEQ ID NO:13 cadena pesada EVQLVQSGAE VKKPGESLRT SCKGSGYSFS TYWISWVRQM 60 PGKGLEWMG KIYPGDSYTN
región variable para utomilumab
YSPSFQGQVT ISADKSISTA YLQWSSLKAS DTAMYYCARG YGIFDYWGQ 118 GTLVTVSS
SEQ ID NO: 14 región variable SYELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDNIGDQYAHWYQQKPGQSPVLVIYQDKNRPSGIPER 60 de cadena ligera para FSGSNSGNTATLTISGTQAMDEADYYCATYTGFGSLAVFGGGTKLTVL 108 utomilumab
SEQ ID NO: 15 CDR1 de STYWIS 6 cadena pesada para
utomilumab
SEQ ID NO: 16 CDR2 de KIYPGDSYTN YSPSFQG 17 cadena pesada para
utomilumab
SEQ ID NO: 17 CDR3 de RGYGTFDY 8 cadena pesada para
utomilumab
SEQ ID NO: 18 cadena ligera SGDNIGDQYA H 11 CDR1 para utomilumab
SEQ ID NO: 19 cadena ligera QDKNRPS 7 CDR2 para utomilumab
SEQ ID NO: 20 cadena ligera ATYTGFGSLAV 11 CDR3 para utomilumab
El agonista de 4-1BB puede ser el anticuerpo monoclonal urelumab, también conocido como BMS-663513 y 20H4.9.h4a, o un fragmento, derivado, variante o biosimilar del mismo. Urelumab está disponible en Bristol-Myers Squibb, Inc. y Creative Biolabs, Inc. Urelumab es una inmunoglobulina G4-kappa, anti-[HomosapiensTNFRSF9 (miembro 9 de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral, 4-1BB, antígeno de células T ILA, CD137)], anticuerpo monoclonalHomo sapiens(completamente humano). Las secuencias de aminoácidos de urelumab se exponen en la Tabla 5. Urelumab comprende sitios de N-glicosilación en las posiciones 298 (y 298"); puentes disulfuro intracadena de cadena pesada en las posiciones 22-95 (V<h>-V<l>), 148-204 (C<h>1-C<l>), 262-322 (C<h>2) y 368-426 (C<h>3) (y en las posiciones 22"-95", 148"-204", 262"-322" y 368"-426"); puentes disulfuro intracadena de cadena ligera en las posiciones 23'-88' (Vh-Vl) y 136'-196' (Ch1-Cl) (y en las posiciones 23"'-88"' y 136"'-196"'); puentes disulfuro entre cadenas pesadas y cadenas pesadas en las posiciones 227-227" y 230-230"; y puentes disulfuro entre cadenas pesadas y cadenas ligeras en 135-216' y 135"-216"'. La preparación y propiedades de urelumab y sus variantes y fragmentos se describen en Patentes de EE. UU. Nos. 7.288.638 y 8.962.804. Las características preclínicas y clínicas de urelumab se describen en Segal et al., Clin. Res. Cáncer. 2016, disponible en http://dx.doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-16-1272. Los ensayos clínicos actuales de urelumab en una variedad de indicaciones de tumores sólidos y hematológicos incluyen los identificadores de Clinicaltrials.gov de los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. NCT01775631, NCT02110082, NCT02253992 y NCT01471210.
Un agonista de 4-1BB puede comprender una cadena pesada proporcionada por SEQ ID NO:21 y una cadena ligera proporcionada por SEQ ID NO:22. Un agonista de 4-1BB puede comprender cadenas pesadas y ligeras que tienen las secuencias mostradas en SEQ ID NO:21 y SEQ ID NO:22, respectivamente, o fragmentos de unión a antígeno, fragmentos Fab, fragmentos variables monocatenarios (scFv), variantes o conjugados de los mismos. Un agonista de 4-1BB puede comprender cadenas pesadas y ligeras que son cada una de ellas al menos 99% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID NO:21 y SEQ ID NO:22, respectivamente. Un agonista de 4-1BB puede comprender cadenas pesadas y ligeras que son cada una de ellas al menos 98% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID NO:21 y SEQ ID NO:22, respectivamente. Un agonista de 4-1BB puede comprender cadenas pesadas y ligeras que son cada una de ellas al menos 97% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID NO:21 y SEQ ID NO:22, respectivamente. Un agonista de 4-1BB puede comprender cadenas pesadas y ligeras que son cada una de ellas al menos 96% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID NO:21 y SEQ ID NO:22, respectivamente. Un agonista de 4-1BB puede comprender cadenas pesadas y ligeras que son cada una de ellas al menos 95% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID NO:21 y SEQ ID NO:22, respectivamente.
El agonista de 4-1BB puede comprender las CDR de cadena pesada y ligera o regiones variables (VR) de urelumab. La región variable de la cadena pesada del agonista 4-1BB (V<h>) puede comprender la secuencia mostrada en SEQ ID NO:23, y la región variable de la cadena ligera del agonista 4-1BB (Vl) comprende la secuencia mostrada en SEQ ID NO:24 y sus sustituciones conservadoras de aminoácidos. Un agonista de 4-1BB puede comprender regiones Vh y Vl que son cada una de ellas al menos 99% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24, respectivamente. Un agonista de 4-1BB puede comprender regiones Vh y Vl que son cada una al menos 98% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24, respectivamente. Un agonista de 4-1BB puede comprender regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos 97% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24, respectivamente. Un agonista de 4-1BB puede comprender regiones V<h>y V<l>que son cada una de ellas al menos 96% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24, respectivamente. Un agonista de 4-1BB puede comprender regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos 95% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24, respectivamente. Un agonista de 4-1BB puede comprender un anticuerpo scFv que comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos 99% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24.
Un agonista de 4-1BB puede comprender dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada que tienen las secuencias expuestas en SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:27, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de los mismos, y dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera que tienen las secuencias expuestas en SEQ ID NO:28, S<e>Q ID NO:29 y SEQ ID NO:30, respectivamente, y sustituciones conservadoras de aminoácidos de los mismos.
El agonista de 4-1BB puede ser un anticuerpo monoclonal biosimilar agonista de 4-1BB aprobado por las autoridades reguladoras de medicamentos con referencia a urelumab. El anticuerpo monoclonal biosimilar puede comprender un anticuerpo 4-1BB que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97 % de identidad de secuencia.p.ej.,97%, 98%, 99% o 100% de identidad de secuencia, con la secuencia de aminoácidos de un medicamento de referencia o producto biológico de referencia y que comprende una o más modificaciones postraduccionales en comparación con el medicamento de referencia o producto biológico de referencia. producto, donde el medicamento de referencia o producto biológico de referencia es urelumab. La una o más modificaciones postraduccionales se pueden seleccionar de uno o más de: glicosilación, oxidación, desamidación y truncamiento. El biosimilar puede ser un anticuerpo agonista de 4-1BB autorizado o presentado para autorización, en el que el anticuerpo agonista de 4-1BB se proporciona en una formulación que difiere de las formulaciones de un medicamento de referencia o producto biológico de referencia, en el que el medicamento de referencia o el producto biológico de referencia El producto biológico es urelumab. El anticuerpo agonista 4-1BB puede estar autorizado por una autoridad reguladora de medicamentos, como la FDA de EE. UU. y/o la EMA de la Unión Europea. El biosimilar se puede proporcionar como una composición que comprende además uno o más excipientes, en donde el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un medicamento de referencia o producto biológico de referencia, en donde el medicamento de referencia o producto biológico de referencia es urelumab. El biosimilar se puede proporcionar como una composición que comprende además uno o más excipientes, en donde el uno o más excipientes son iguales o diferentes a los excipientes comprendidos en un medicamento de referencia o producto biológico de referencia, en donde el medicamento de referencia o producto biológico de referencia es urelumab.
TABLA 5. Secuencias de aminoácidos de anticuerpos agonistas 4-1BB relacionados con urelumab.
El agonista de 4-1BB se puede seleccionar del grupo que consiste en 1D8, 3Elor, 4B4 (BioLegend 309809), H4-1BB-M127 (BD Pharmingen 552532), BBK2 (Thermo Fisher MS621PABX), 145501 (Leinco Technologies B591) el anticuerpo producido por línea celular depositada como ATCC No. HB-11248 y divulgada en Patente de EE.UU n° 6.974.863, 5F4 (BioLegend 31 1503), C65-485 (BD Pharmingen 559446), anticuerpos descritos en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. Estados Unidos 2005/0095244, anticuerpos divulgados en Patente de EE.UU. n° 7.288.638 (tal como 20H4.9-IgGl (BMS-663031)), anticuerpos divulgados en Patente de EE.UU. n° 6.887.673 (como 4E9 o BMS-554271), anticuerpos descritos en Patente de EE.UU. n° 7.214.493, anticuerpos divulgados en Patente de EE.UU. n° 6.303.121, anticuerpos divulgados en Patente de EE.UU. n° 6.569.997, anticuerpos divulgados en Patente de EE.UU. n° 6.905.685 (como 4E9 o BMS-554271), anticuerpos descritos en Patente de EE.UU. n° 6.362.325 (tales como 1D8 o BMS-469492; 3H3 o BMS-469497; o 3El), anticuerpos divulgados en Patente de EE.UU. n° 6.974.863 (como 53A2); anticuerpos divulgados en la Patente de EE.UU. n° 6.210.669 (tales como 1D8, 3B8 o 3El), anticuerpos descritos en la Patente de EE.UU. n° 5.928.893, anticuerpos divulgados en la Patente de EE.UU. n° 6.303.121, anticuerpos divulgados en la Patente de EE.UU. n° 6.569.997, anticuerpos descritos en las Publicaciones de Solicitudes de Patentes Internacionales Nos. WO 2012/177788, WO 2015/119923, y WO 2010/042433 y fragmentos, derivados, conjugados, variantes o biosimilares de los mismos.
El agonista de 4-1BB puede ser una proteína de fusión agonista de 4-1BB descrita en las Publicaciones de Solicitudes de Patentes Internacionales Nos. Documento WO 2008/025516 A1, Documento WO 2009/007120 A1, Documento WO 2010/003766 A1, WO 2010/010051 A1, y Documento WO 2010/078966 A1; Publicaciones de solicitudes de patente de EE. UU. Nos. Estados Unidos 2011/0027218 A1, Estados Unidos 2015/0126709 A1, Estados Unidos 2011/0111494 A1, Estados Unidos 2015/0110734 A1, y Estados Unidos 2015/0126710 A1; y Patentes de EE. UU. Nos. 9.359.420, 9.340.599, 8.921.519, y 8.450.460.
El agonista de 4-1BB puede ser una proteína de fusión agonista de 4-1BB como se representa en la Estructura IA (proteína de fusión de fragmento de anticuerpo Fc C-terminal) o la Estructura IB (proteína de fusión de fragmento de anticuerpo Fc N-terminal), o un fragmento, derivado, conjugado, variante o biosimilar del mismo:
En las estructuras IA y IB, los cilindros se refieren a dominios de unión de polipéptidos individuales(ver,Figura 140). Las estructuras IA y IB comprenden tres dominios de unión a TNFRSF unidos linealmente derivados dep.ej.,4-1BBL o un anticuerpo que se une a 4-1BB, que se pliegan para formar una proteína trivalente, que luego se une a una segunda proteína triavelenta a través de IgG1-Fc (incluida Ch3 y Ch2 dominios) se usa luego para unir dos de las proteínas trivalentes a través de enlaces disulfuro (pequeños óvalos alargados), estabilizando la estructura y proporcionando agonistas capaces de unir los dominios de señalización intracelular de los seis receptores y las proteínas de señalización para formar un complejo de señalización. Los dominios de unión a TNFRSF indicados como cilindros pueden ser dominios scFv que comprenden,p.ej.,una cadena V<h>y una V<l>conectada por un conector que puede comprender residuos hidrófilos y secuencias Gly y Ser para flexibilidad, así como Glu y Lys para solubilidad. Se puede utilizar cualquier diseño de dominio scFv, como los descritos en de Marco, Microbial Cell Factories, 2011 10, 44; Ahmad et al., Clin. & Dev. Inmunol. 2012, 980250; or Monnier, et al., Antibodies, 2013, 2, 193-208. Las estructuras de proteínas de fusión de esta forma se describen en las Patentes de EE. UU. Nos.
9.359.420, 9.340.599, 8.921.519, y 8.450.460.
Las secuencias de aminoácidos para los otros dominios polipeptídicos de estructura IA se dan en la Tabla<6>. El dominio Fc comprende preferiblemente un dominio constante completo (aminoácidos 17-230 de SEQ ID NO:31), el dominio bisagra completo (aminoácidos 1-16 de SEQ ID NO:31) o una porción del dominio bisagra(p.ej.,aminoácidos 4-16 de s Eq ID NO:31). Los conectores preferidos para conectar un anticuerpo Fc C-terminal se pueden seleccionar entre los proporcionados en SEQ ID NO:32 a SEQ ID NO:41, incluidos conectores adecuados para la fusión de polipéptidos adicionales.
TABLA<6>. Secuencias de aminoácidos para proteínas de fusión TNFRSF, incluidas las proteínas de fusión 4-1BB, con diseño de proteína de fusión de fragmento de anticuerpo Fc C-terminal (estructura I-A).
Las secuencias de aminoácidos para los otros dominios polipeptídicos de estructura IB se dan en la Tabla 7. Si un fragmento de anticuerpo Fc se fusiona al extremo N de una proteína de fusión TNRFSF como en la estructura I-B, la secuencia del módulo Fc es preferentemente la que se muestra en SEQ ID NO:42, y las secuencias enlazadoras se seleccionan preferentemente entre las expuestas en SED ID NO:43 a SEQ ID NO:45.
TABLA 7. Secuencias de aminoácidos para proteínas de fusión TNFRSF, incluidas las proteínas de fusión 4-1BB, con diseño de proteína de fusión de fragmento de anticuerpo Fc N-terminal (estructura I-B).
Una proteína de fusión agonista de 4-1BB según las estructuras I-A o I-B puede comprender uno o más dominios de unión de 4-1BB seleccionados del grupo que consiste en una cadena pesada variable y una cadena ligera variable de utomilumab, una cadena pesada variable y una cadena ligera variable de urelumab, una cadena pesada variable y una cadena ligera variable de utomilumab, una cadena pesada variable y una cadena ligera variable seleccionadas de las cadenas pesadas variables y cadenas ligeras variables descritas en la Tabla<8>, cualquier combinación de una cadena pesada variable y una cadena ligera variable de las anteriores, y fragmentos, derivados, conjugados, variantes y biosimilares de los mismos.
Una proteína de fusión agonista de 4-1BB según las estructuras I-A o I-B puede comprender uno o más dominios de unión de 4-1BB que comprenden una secuencia de 4-1BBL. Una proteína de fusión agonista de 4-1BB según las estructuras I-A o I-B puede comprender uno o más dominios de unión a 4-1BB que comprenden una secuencia según SEQ ID NO:46. Una proteína de fusión agonista de 4-1BB según las estructuras I-A o I-B puede comprender uno o más dominios de unión de 4-1BB que comprenden una secuencia de 4-1BBL soluble. Una proteína de fusión agonista de 4-1BB según las estructuras I-A o I-B puede comprender uno o más dominios de unión a 4-1BB que comprenden una secuencia según SEQ ID NO:47.
Una proteína de fusión agonista de 4-1BB según las estructuras I-A o I-B puede comprender uno o más dominios de unión de 4-1BB que es un dominio scFv que comprende regiones Vh y Vl que son cada una al menos 95% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID NO:13 y SEQ ID NO:14, respectivamente, en donde los dominios V<h>y V<l>están conectados por un enlazador. Una proteína de fusión agonista de 4-1BB según las estructuras I-A o I-B puede comprender uno o más dominios de unión de 4-1BB que es un dominio scFv que comprende regiones Vh y Vl que son cada una al menos 95% idénticas a las secuencias mostradas en SEQ ID NO:23 y SEQ ID NO:24, respectivamente, en donde los dominios Vh y Vl están conectados por un enlazador. Una proteína de fusión agonista de 4-1BB según las estructuras I-A o I-B puede comprender uno o más dominios de unión de 4-1BB que es un dominio scFv que comprende regiones V<h>y V<l>que son cada una al menos 95% idénticas a la V<h>y V<l>secuencias dadas en la Tabla<8>, en donde los dominios Vh y Vl están conectados por un enlazador.
TABLA<8>. Dominios polipeptídicos adicionales útiles como dominios de unión de 4-1BB en proteínas de fusión o como anticuerpos agonistas de scFv 4-1BB.
El agonista de 4-1BB puede ser un polipéptido de fusión monocatenario agonista de 4-1BB que comprende (i) un primer dominio de unión de 4-1BB soluble, (ii) un primer conector peptídico, (iii) un segundo dominio de unión de 4-1BB soluble, (iv) un segundo conector peptídico, y (v) un tercer dominio de unión 4-1BB soluble, que comprende además un dominio adicional en el extremo N-terminal y/o C-terminal, y en el que el dominio adicional es un dominio de fragmento Fab o Fc. El agonista de 4-1BB puede ser un polipéptido de fusión monocatenario agonista de 4-1BB que comprende (i) un primer dominio de unión de 4-1BB soluble, (ii) un primer conector peptídico, (iii) un segundo dominio de unión de 4-1BB soluble, (iv) un segundo conector peptídico, y (v) un tercer dominio de unión 4-1BB soluble, que comprende además un dominio adicional en el extremo N-terminal y/o C-terminal, en el que el dominio adicional es un dominio de fragmento Fab o Fc, en el que cada uno de los dominios 4-1BB solubles carece de una región de tallo (que contribuye a la trimerización y proporciona una cierta distancia a la membrana celular, pero no es parte del dominio de unión 4-1BB) y el primer y segundo enlazadores peptídicos de forma independiente tienen una longitud de 3-8 aminoácidos.
El agonista de 4-1BB puede ser un polipéptido de fusión monocatenario agonista de 4-1BB que comprende (i) un primer dominio de citocina de la superfamilia del factor de necrosis tumoral (TNF) soluble, (ii) un primer conector peptídico, (iii) una segunda superfamilia de TNF soluble dominio de citocina, (iv) un segundo conector peptídico y (v) un tercer dominio de citocina de la superfamilia de TNF soluble, en el que cada uno de los dominios de citocina de la superfamilia de TNF soluble carece de una región de tallo y el primer y el segundo conector peptídico tienen independientemente una longitud de 3<- 8>aminoácidos, y en el que cada dominio de citocina de la superfamilia de TNF es un dominio de unión 4-1BB.
El agonista de 4-1BB puede ser un anticuerpo scFv agonista de 4-1BB que comprende cualquiera de los dominios V<h>anteriores vinculados a cualquiera de los dominios V<l>anteriores.
El agonista agonista 4-1BB puede ser el catálogo de anticuerpos agonista 4-1BB de BPS Bioscience no. 79097-2, disponible comercialmente en BPS Bioscience, San Diego, CA, EE. UU. El agonista agonista 4-1BB puede ser el catálogo de anticuerpos agonista 4-1BB de Creative Biolabs no. MOM-18179, disponible comercialmente en Creative Biolabs, Shirley, NY, EE. UU.
III. Procedimientos de fabricación de TIL
Un ejemplo de procedimiento de TIL conocido como procedimiento 2A que contiene algunas de estas características se representa en la Figura 1, y algunas de las ventajas de esta forma de realización de la presente invención sobre el procedimiento 1C se describen en la Figura 2, al igual que la Figura 84. El procedimiento 1C se muestra a modo de comparación en la Figura 3. En la Figura 4 (recuentos de células más altos) y en la Figura 5 (recuentos de células más bajos) se muestran dos líneas de tiempo alternativas para la terapia TIL basadas en el procedimiento 2A. En la Figura<6>y en la Figura 27 se muestra una forma de realización del procedimiento 2A. Las figuras 83 y 84 proporcionan además un procedimiento 2A ejemplar en comparación con un procedimiento 1C ejemplar.
Tal como se discute en el presente documento, la presente invención puede incluir una etapa relacionada con la reestimulación de TIL crioconservados para aumentar su actividad metabólica y, por tanto, su salud relativa antes del trasplante en un paciente, y procedimientos para probar dicha salud metabólica. Como se describe en general en el presente documento, los TIL generalmente se toman de una muestra de paciente y se manipulan para expandir su número antes del trasplante a un paciente. En algunas formas de realización, los TIL pueden manipularse genéticamente opcionalmente como se discute a continuación.
En algunas formas de realización, los TIL se pueden crioconservar. Una vez descongelados, también pueden reestimularse para aumentar su metabolismo antes de la infusión a un paciente.
En algunos procedimientos divulgados en el presente documento pero no reivindicados, la primera expansión (incluidos los procedimientos denominados preREP, así como los procedimientos que se muestran en la Figura 27 como Etapa A) se acorta a 3 a 14 días y la segunda expansión (incluidos los procedimientos denominados REP, así como los procedimientos que se muestran en la Figura 27 como Etapa B) se acorta a 7 a 14 días, como se discute en detalle a continuación, así como en los ejemplos y figuras. En algunas formas de realización, la primera expansión (por ejemplo, una expansión descrita como Etapa B en la Figura 27) se acorta a 11 días y la segunda expansión (por ejemplo, una expansión como se describe en la etapa D en la Figura 27) se acorta a 11 días, como se discute en los Ejemplos y se muestra en las Figuras 4, 5 y 27. En algunas formas de realización, la combinación de la primera expansión y la segunda expansión (por ejemplo, las expansiones descritas como Etapa B y Etapa D en la Figura 27) se acorta a 22 días, como se explica en detalle a continuación y en los ejemplos y figuras.
Las denominaciones de "etapa" A, B, C, etc., más adelante, se refieren a la figura 27 y a determinadas formas de realización descritas en el presente documento. El orden de las etapas a continuación y en la Figura 27 es ejemplar y cualquier combinación u orden de etapas, así como etapas adicionales, repetición de etapas y/u omisión de etapas está contemplada por la presente solicitud y los procedimientos descritos en este documento.
A. ETAPA A: Obtener una muestra de tumor del paciente
En general, los TIL se obtienen inicialmente de una muestra de tumor del paciente ("TIL primarios") y luego se expanden a una población más grande para su manipulación adicional como se describe en este documento, opcionalmente crioconservados, reestimulados como se describe en este documento y opcionalmente evaluados para fenotipo y parámetros metabólicos como una indicación de la salud de TIL.
Puede obtenerse una muestra de tumor de un paciente usando procedimientos conocidos en la técnica, generalmente mediante extirpación quirúrgica, biopsia con aguja u otros medios para obtener una muestra que contiene una mezcla de células tumorales y TIL. En general, la muestra de tumor puede ser de cualquier tumor sólido, incluidos tumores primarios, tumores invasores o tumores metastásicos. La muestra de tumor también puede ser un tumor líquido, como un tumor obtenido de una neoplasia maligna hematológica. El tumor sólido puede ser de cualquier tipo de cáncer, incluidos, entre otros, mama, páncreas, próstata, colorrectal, pulmón, cerebro, riñón, estómago y piel (incluidos, entre otros, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales y melanoma). En algunas formas de realización, se obtienen TIL útiles a partir de tumores de melanoma malignos, ya que se ha informado que estos tienen niveles particularmente altos de TIL.
El término "tumor sólido" se refiere a una masa anormal de tejido que generalmente no contiene quistes o áreas líquidas. Los tumores sólidos pueden ser benignos o malignos. El término "cáncer de tumor sólido" se refiere a tumores sólidos malignos, neoplásicos o cancerosos. Los cánceres de tumores sólidos incluyen, pero no se limitan a, sarcomas, carcinomas y linfomas, tales como cánceres de pulmón, mama, cáncer de mama triple negativo, próstata, colon, recto y vejiga. En algunas formas de realización, el cáncer se selecciona entre cáncer de cuello uterino, cáncer de cabeza y cuello (que incluye, por ejemplo, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)) glioblastoma, cáncer de ovario, sarcoma, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer de mama triple negativo y carcinoma de pulmón de células no pequeñas. La estructura tisular de los tumores sólidos incluye compartimentos de tejido interdependientes que incluyen el parénquima (células cancerosas) y las células estromales de soporte en las que se dispersan las células cancerosas y que pueden proporcionar un microambiente de soporte.
El término "neoplasia maligna hematológica" se refiere a cánceres de mamíferos y tumores de los tejidos hematopoyéticos y linfoides, que incluyen, pero no se limitan a, tejidos de la sangre, médula ósea, ganglios linfáticos y sistema linfático. Las neoplasias malignas hematológicas también se denominan "tumores líquidos". Las neoplasias malignas hematológicas incluyen, entre otras, leucemia linfoblástica aguda (LLA), linfoma linfocítico crónico (LLC), linfoma linfocítico pequeño (SLL), leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia monocítica aguda (LMA), linfoma de Hodgkin y linfomas no Hodgkin. El término "neoplasia hematológica de células B" se refiere a neoplasias hematológicas que afectan a las células B.
Una vez obtenida, la muestra de tumor se fragmenta generalmente usando disección aguda en pequeños trozos de entre 1 y aproximadamente<8>mm3, siendo particularmente útil de aproximadamente 2-3 mm3. Los TIL se cultivan a partir de estos fragmentos utilizando digestiones tumorales enzimáticas. Tales digestiones tumorales pueden producirse mediante incubación en medio enzimático (por ejemplo, regulador de pH 1640 del Roswell Park Memorial Institute (RPMI), glutamato de 2 mM, gentamicina de 10 mcg/mL, 30 unidades/mL de DNasa y 1.0 mg/mL de colagenasa) seguido de disociación mecánica (por ejemplo, utilizando un disociador de tejidos). Se pueden producir digestiones tumorales colocando el tumor en medios enzimáticos y disociando mecánicamente el tumor durante aproximadamente 1 minuto, seguido de incubación durante 30 minutos a 37 °C en CO<2>al 5%, seguido de ciclos repetidos de disociación mecánica e incubación en las condiciones anteriores hasta que solo queden pequeños trozos de tejido. Al final de este procedimiento, si la suspensión celular contiene una gran cantidad de glóbulos rojos o células muertas, se puede realizar una separación en gradiente de densidad utilizando polisacárido hidrófilo ramificado FICOLL para eliminar estas células. Pueden usarse procedimientos alternativos conocidos en la técnica, tales como los descritos en la Publicación de Solicitud de Patente de Estados Unidos No. 2012/0244133 A1. Cualquiera de los procedimientos anteriores puede usarse en cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento de expansión de TIL o procedimientos para tratar un cáncer.
En general, la suspensión de células recolectadas se denomina "población de células primarias" o población de células "recién recolectadas".
En algunas formas de realización, la fragmentación incluye la fragmentación física que incluye, por ejemplo, disección y digestión. En algunas formas de realización, la fragmentación es una fragmentación física. En algunas formas de realización, la fragmentación es disección. En algunas formas de realización, la fragmentación se realiza por digestión. En algunas formas de realización, los TIL pueden cultivarse inicialmente a partir de digestiones enzimáticas de tumores y de fragmentos tumorales obtenidos de pacientes. En una forma de realización, los TIL se pueden cultivar inicialmente a partir de digestiones tumorales enzimáticas y fragmentos tumorales obtenidos de pacientes.
En algunas formas de realización, donde el tumor es un tumor sólido, el tumor se somete a fragmentación física después de que se obtiene la muestra de tumor, por ejemplo, en la etapa A (como se proporciona en la Figura 27). En algunas formas de realización, la fragmentación se produce antes de la crioconservación. En algunas formas de realización, la fragmentación se produce después de la crioconservación. En algunas formas de realización, la fragmentación se produce después de obtener el tumor y en ausencia de cualquier crioconservación. En algunas formas de realización, el tumor se fragmenta y se colocan 10, 20, 30, 40 o más fragmentos o piezas en cada recipiente para la primera expansión. En algunas formas de realización, el tumor se fragmenta y se colocan 30 o 40 fragmentos o piezas en cada recipiente para la primera expansión. En algunas formas de realización, el tumor se fragmenta y se colocan 40 fragmentos o piezas en cada recipiente para la primera expansión. En algunas formas de realización, los múltiples fragmentos comprenden aproximadamente 4 a aproximadamente 50 fragmentos, en los que cada fragmento tiene un volumen de aproximadamente 27 mm3. En algunas formas de realización, los fragmentos múltiples comprenden aproximadamente 30 a aproximadamente 60 fragmentos con un volumen total de aproximadamente 1300 mm<3>a aproximadamente 1500 mm3. En algunas formas de realización, los múltiples fragmentos comprenden aproximadamente 50 fragmentos con un volumen total de aproximadamente 1350 mm3. En algunas formas de realización, los fragmentos múltiples comprenden aproximadamente 50 fragmentos con una masa total de aproximadamente 1 gramo a aproximadamente 1.5 gramos. En algunas formas de realización, los múltiples fragmentos comprenden aproximadamente 4 fragmentos.
En algunas formas de realización, los TIL se obtienen a partir de fragmentos tumorales. En algunas formas de realización, el fragmento de tumor se obtiene mediante disección aguda. En algunas formas de realización, el fragmento de tumor tiene entre aproximadamente 1 mm<3>y 10 mm3. En algunas formas de realización, el fragmento de tumor tiene entre aproximadamente 1 mm<3>y<8>mm3. En algunas formas de realización, el fragmento de tumor es de aproximadamente 1 mm3. En algunas formas de realización, el fragmento de tumor mide aproximadamente 2 mm3. En algunas formas de realización, el fragmento de tumor mide aproximadamente 3 mm3. En algunas formas de realización, el fragmento de tumor mide aproximadamente 4 mm3. En algunas formas de realización, el fragmento de tumor mide aproximadamente 5 mm3. En algunas formas de realización, el fragmento de tumor mide aproximadamente<6>mm3. En algunas formas de realización, el fragmento de tumor mide aproximadamente 7 mm3. En algunas formas de realización, el fragmento de tumor mide aproximadamente<8>mm3. En algunas formas de realización, el fragmento de tumor mide aproximadamente 9 mm3. En algunas formas de realización, el fragmento de tumor tiene aproximadamente 10 mm3. En algunas realizaciones, los tumores miden 1-4 mm x 1-4 mm x 1-4 mm. En algunas realizaciones, los tumores miden 1 mm x 1 mm x 1 mm. En algunas realizaciones, los tumores son de 2 mm x 2 mm x 2 mm. En algunas realizaciones, los tumores miden 3 mm x 3 mm x 3 mm. En algunas realizaciones, los tumores son de 4 mm x 4 mm x 4 mm.
En algunas realizaciones, los tumores se resecan para minimizar la cantidad de tejidos hemorrágicos, necróticos y/o grasos en cada pieza. En algunas realizaciones, los tumores se resecan para minimizar la cantidad de tejido hemorrágico en cada pieza. En algunas realizaciones, los tumores se resecan para minimizar la cantidad de tejido necrótico en cada pieza. En algunas realizaciones, los tumores se resecan para minimizar la cantidad de tejido graso en cada pieza.
En algunas realizaciones, la fragmentación del tumor se realiza para mantener la estructura interna del tumor. En algunas realizaciones, la fragmentación del tumor se realiza sin realizar un movimiento de sierra con un escalpelo. En algunas formas de realización, los TIL se obtienen a partir de digestiones de tumor. En algunas formas de realización, los digeridos tumorales se generaron mediante incubación en medio enzimático, por ejemplo, pero sin limitarse a RPMI 1640, GlutaMAX de 2 mM, gentamicina de 10 mg/mL, DNasa de 30 U/mL y colagenasa de 1.0 mg/mL, seguido de disociación mecánica (GentleMACS, Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Después de colocar el tumor en medio enzimático, el tumor se puede disociar mecánicamente durante aproximadamente 1 minuto. Luego, la solución se puede incubar durante 30 minutos a 37 °C en CO<2>al 5% y luego se puede romper mecánicamente nuevamente durante aproximadamente 1 minuto. Después de incubarse nuevamente durante 30 minutos a 37 °C en CO<2>al 5%, el tumor puede romperse mecánicamente por tercera vez durante aproximadamente 1 minuto. En algunas formas de realización, después de la tercera rotura mecánica, si estaban presentes grandes trozos de tejido, se aplicaron 1 o 2 disociaciones mecánicas adicionales a la muestra, con o sin 30 minutos adicionales de incubación a 37 °C en CO<2>a l<5>%. En algunas formas de realización, al terminare la incubación final, si la suspensión celular contenía un gran número de glóbulos rojos o células muertas, se puede realizar una separación en gradiente de densidad usando Ficoll para eliminar estas células.
En algunas formas de realización, la suspensión de células recolectadas antes de la primera etapa de expansión se denomina "población de células primarias" o población de células "recién recolectadas".
En algunas formas de realización, las células pueden congelarse opcionalmente después de la recolección de la muestra y almacenarse congeladas antes de pasar a la expansión descrita en la etapa B, que se describe con más detalle más adelante, así como se ejemplifica en la Figura 27.
B. ETAPA B: Primera expansión
1. TIL jóvenes
En algunas formas de realización, los presentes procedimientos proporcionan la obtención de TIL jóvenes, que son capaces de aumentar los ciclos de replicación tras la administración a un sujeto/paciente y, como tales, pueden proporcionar beneficios terapéuticos adicionales sobre los TIL más antiguos (es decir, TIL que se han sometido además a más rondas de replicación antes de la administración a un sujeto/paciente). Las características de los TIL jóvenes se han descrito en la literatura, por ejemplo, Donia, at al., Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167 (2012); Dudley et al., Clin Cancer Res, 16:6122-6131 (2010); Huang et al., J Immunother, 28(3):258-267 (2005); Besser et al., Clin Cancer Res, 19(17):OF1-OF9 (2013); Besser et al., J Immunother 32:415-423 (2009); Robbins, et al., J 2004; 173:7125-7130; Shen et al., J Immunother, 30:123-129 (2007); Zhou, et al., J Immunother, 28:53-62 (2005); and Tran, et al., J Immunother, 31:742-751 (2008).
Los diversos receptores de antígenos de los linfocitos T y B se producen por recombinación somática de un número limitado, pero grande, de segmentos de genes. Estos segmentos de genes: V (variable), D (diversidad), J (unión) y C (constante), determinan la especificidad de enlace y las aplicaciones posteriores de inmunoglobulinas y receptores de células T (TCR). La presente invención proporciona un procedimiento para generar TIL que exhiben y aumentan la diversidad del repertorio de células T. En algunas formas de realización, los TIL obtenidos por el presente procedimiento exhiben un aumento en la diversidad del repertorio de células T. En algunas formas de realización, los TIL obtenidos mediante el presente procedimiento exhiben un aumento en la diversidad del repertorio de células T en comparación con los TIL recién recolectados y/o TIL preparados utilizando otros procedimientos distintos a los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura. 27. En algunas formas de realización, los TIL obtenidos mediante el presente procedimiento exhiben un aumento en la diversidad del repertorio de células T en comparación con los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando procedimientos denominados procedimiento 1C, como se ejemplifica en la Figura 83. En algunas formas de realización, los TIL obtenidos en la primera expansión exhiben un aumento en la diversidad del repertorio de células T. En algunas formas de realización, el aumento de la diversidad es un aumento de la diversidad de inmunoglobulinas y/o la diversidad del receptor de células T. En algunas formas de realización, la diversidad está en la inmunoglobulina; está en la cadena pesada de inmunoglobulina. En algunas formas de realización, la diversidad está en la inmunoglobulina; está en la cadena ligera de inmunoglobulina. En algunas formas de realización, la diversidad está en el receptor de células T. En algunas formas de realización, la diversidad está en uno de los receptores de células T seleccionados del grupo que consiste en receptores alfa, beta, gamma y delta. En algunas formas de realización, hay un aumento en la expresión del receptor de células T (TCR) alfa y/o beta. En algunas formas de realización, hay un aumento en la expresión del receptor alfa de células T (TCR). En algunas formas de realización, hay un aumento en la expresión del receptor de células T (TCR) beta. En algunas formas de realización, hay un aumento en la expresión de TCRab (es decir, TCRa/p).
Después de la disección o digestión de los fragmentos tumorales, por ejemplo, como se describe en la etapa A de la Figura 27, las células resultantes se cultivan en suero que contiene IL-2 en condiciones que favorecen el crecimiento de TIL sobre el tumor y otras células. En algunas formas de realización, los digeridos tumorales se incuban en pocillos de 2 mL en un medio que comprende suero AB humano inactivado con 6000 UI/mL de IL-2. Esta población de células primarias se cultiva durante un período de días, generalmente de 3 a 14 días, dando como resultado una población de TIL a granel, generalmente alrededor de 1 x 10<8>células TIL a granel. En algunas realizaciones, esta población de células primarias se cultiva durante un período de 7 a 14 días, dando como resultado una población de TIL a granel, generalmente alrededor de 1 x 10<8>células de TIL a granel. En algunas realizaciones, esta población de células primarias se cultiva durante un período de 10 a 14 días, lo que da como resultado una población de TIL a granel, generalmente aproximadamente 1 x 10<8>células de TIL a granel. En algunas formas de realización, esta población de células primarias se cultiva durante un período de aproximadamente 11 días, lo que da como resultado una población de TIL a granel, generalmente alrededor de 1 x 10<8>células de TIL a granel.
En una forma de realización preferida, la expansión de TIL se puede realizar utilizando una etapa de expansión de TIL a granel inicial (por ejemplo, como los descritos en la etapa B de la Figura 27, que puede incluir procedimientos denominados pre-REP) como se describe más adelante y en el presente documento, seguido por una segunda expansión (Etapa D, incluidos los procedimientos denominados etapas del protocolo de expansión rápida (REP)) como se describe más adelante en la etapa D y en este documento, seguido de una crioconservación opcional, y seguida de una segunda Etapa D (incluidos los procedimientos denominados etapas de reestimulación REP) como se describe más adelante y en este documento. Los TIL obtenidos de este procedimiento se pueden caracterizar opcionalmente por características fenotípicas y parámetros metabólicos como se describe en el presente documento.
En formas de realización en las que los cultivos de TIL se inician en placas de 24 pocilios, por ejemplo, usando un grupo de cultivo celular Costar de 24 pocillos, fondo plano (Corning Incorporated, Corning, NY, cada pocillo se puede sembrar con 1 x 10<6>células de digestión tumoral o un fragmento de tumor en 2 mL de medio completo (CM) con IL-2 (6000 UI/mL; Chiron Corp., Emeryville, CA). En algunas formas de realización, el fragmento de tumor está entre aproximadamente<1>mm<3>y<10>mm<3>
En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión se denomina "CM", una abreviatura de medios de cultivo. En algunas formas de realización, CM para la etapa B consiste en RPMI 1640 con GlutaMAX, suplementado con suero AB humano al 10%, Hepes de 25 mM y gentamicina de 10 mg/mL. En formas de realización en las que los cultivos se inician en matraces permeables al gas con una capacidad de 40 mL y un fondo de silicio permeable al gas de 10 cm<2>(por ejemplo, G-Rex10; Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN) (figura 1), cada matraz se cargó con 10-40 x 10<6>células de digestión tumoral viables o 5-30 fragmentos tumorales en 10-40 mL de CM con IL-2. Tanto las placas de G-Rex10 como las de 24 pocillos se incubaron en una incubadora humidificada a 37°C en CO<2>al 5% y 5 días después del inicio del cultivo se retiró la mitad del medio y se reemplazó con CM e IL-2 frescos y después del día 5 la mitad de los medios se cambió cada 2-3 días.
Después de la preparación de los fragmentos tumorales, las células resultantes (es decir, los fragmentos) se cultivan en suero que contiene IL-2 en condiciones que favorecen el crecimiento de TIL sobre el tumor y otras células. En algunas formas de realización, los digeridos tumorales se incuban en pocillos de 2 mL en medios que comprenden suero AB humano inactivado (o, en algunos casos, como se describe en este documento, en presencia de una población de células APC) con 6000 UI/mL de IL-2. Esta población de células primarias se cultiva durante un período de días, generalmente de 10 a 14 días, dando como resultado una población de TIL a granel, generalmente alrededor de 1 x 10<8>células de TIL a granel. En algunas formas de realización, los medios de crecimiento durante la primera expansión comprenden IL-2 o una variante de la misma. En algunas formas de realización, la IL es IL-2 humana recombinante (rhIL-2). En algunas formas de realización, la solución madre de IL-2 tiene una actividad específica de 20-30 x 10<6>UI/mg para un vial de 1 mg. En algunas formas de realización, la solución madre de IL-2 tiene una actividad específica de 20 x 10<6>UI/mg para un vial de 1 mg. En algunas formas de realización, la solución madre de IL-2 tiene una actividad específica de 25 x 10<6>UI/mg para un vial de 1 mg. En algunas formas de realización, la solución madre de IL-2 tiene una actividad específica de 30 x 10<6>UI/mg para un vial de 1 mg. En algunas formas de realización, la solución madre de IL-2 tiene una concentración final de 4-8 x 10<6>UI/mg de IL-2. En algunas formas de realización, la solución madre de IL-2 tiene una concentración final de 5 7 x 10<6>UI/mg de IL-2. En algunas formas de realización, la solución madre de IL-2 tiene una concentración final de<6>x 10<6>UI/mg de IL-2. En algunas formas de realización, la solución madre de IL-2 se prepara como se describe en el Ejemplo 4. En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 10,000 UI/mL de IL-2, alrededor de 9,000 UI/mL de IL-2, alrededor de 8,000 UI/mL de IL-2, alrededor de 7,000 UI/mL de IL-2, alrededor de 6000 UI/mL de IL-2 o alrededor de 5,000 UI/mL de IL-2. En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 9,000 UI/mL de IL-2 a alrededor de 5,000 UI/mL de IL-2. En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 8,000 UI/mL de IL-2 a alrededor de 6,000 UI/mL de IL-2. En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 7,000 UI/mL de IL-2 a alrededor de 6,000 UI/mL de IL-2. En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 6,000 UI/mL de IL-2. En una forma de realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-2. En algunas formas de realización, el medio de cultivo celular comprende alrededor de 3000 UI/mL de IL-2. En una forma de realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-2. En una forma de realización preferida, el medio de cultivo celular comprende alrededor de 3000 UI/mL de IL-2. En una forma de realización, el medio de cultivo celular comprende alrededor de 1000 UI/mL, alrededor de 1500 UI/mL, alrededor de 2000 UI/mL, alrededor de 2500 UI/mL, alrededor de 3000 UI/mL, alrededor de 3500 UI/mL, alrededor de 4000 UI/mL, alrededor de 4500 UI/mL, alrededor de 5000 UI/mL, alrededor de 5500 UI/mL, alrededor de 6000 UI/mL, alrededor de 6500 UI/mL, alrededor de 7000 UI/mL, alrededor de 7500 UI/mL o alrededor de 8000 UI/mL de IL-2. En una forma de realización, el medio de cultivo celular comprende entre 1000 y 2000 UI/mL, entre 2000 y 3000 UI/mL, entre 3000 y 4000 UI/mL, entre 4000 y 5000 UI/mL, entre 5000 y 6000 UI/mL, entre 6000 y 7000 UI/mL, entre 7000 y 8000 UI/mL, o alrededor de 8000 UI/mL de IL-2.
En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 500 UI/mL de IL-15, alrededor de 400 UI/mL de iL-15, alrededor de 300 UI/mL de IL-15, alrededor de 200 UI/mL de IL-15, alrededor de 180 UI/mL de IL-15, alrededor de 160 UI/mL de IL-15, alrededor de 140 UI/mL de IL-15, alrededor de 120 UI/mL de IL-15 o alrededor de 100 UI/mL de IL-15. En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 500 UI/mL de IL-15 a alrededor de 100 UI/mL de IL-15. En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión comprende de alrededor de 400 UI/mL de IL-15 a alrededor de 100 UI/mL de IL-15. En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 300 UI/mL de IL-15 a alrededor de 100 UI/mL de IL-15. En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 200 UI/mL de IL-15. En algunas formas de realización, el medio de cultivo celular comprende alrededor de 180 UI/mL de IL-15. En una forma de realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-15. En una forma de realización preferida, el medio de cultivo celular comprende alrededor de 180 UI/mL de IL-15.
En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 20 UI/mL de IL-21, alrededor de 15 UI/mL de IL-21, alrededor de 12 UI/mL de IL-21, alrededor de 10 UI/mL de IL-21, alrededor de 5 UI/mL de IL-21, alrededor de 4 UI/mL de IL-21, alrededor de 3 UI/mL de IL-21, alrededor de 2 UI/mL de IL-21, alrededor de 1 UI/mL de IL-21, o alrededor de 0.5 UI/mL de IL-21. En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 15 UI/mL de IL-21 a alrededor de 0.5 UI/mL de IL-21. En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 12 UI/mL de IL-21 a alrededor de 0.5 UI/mL de IL-21. En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 10 UI/mL de IL-21 a alrededor de 0.5 UI/mL de IL-21. En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 5 UI/mL de IL-21 a alrededor de 1 UI/mL de IL-21. En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 2 UI/mL de IL-21. En algunas formas de realización, el medio de cultivo celular comprende alrededor de 1 UI/mL de IL-21. En algunas formas de realización, el medio de cultivo celular comprende alrededor de 0.5 UI/mL de IL-21. En una forma de realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-21. En una forma de realización preferida, el medio de cultivo celular comprende alrededor de 1 UI/mL de IL-21.
En una realización, el medio de cultivo celular comprende el anticuerpo OKT-3. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 30 ng/mL de anticuerpo OKT-3. En una realización, el medio de cultivo celular comprende aproximadamente 0,1 ng/mL, aproximadamente 0,5 ng/mL, aproximadamente 1 ng/mL, aproximadamente 2,5 ng/mL, aproximadamente 5 ng/mL, aproximadamente 7,5 ng/mL, aproximadamente 10 ng/mL, aproximadamente 15 ng/mL, aproximadamente 20 ng/mL, aproximadamente 25 ng/mL, aproximadamente 30 ng/mL, aproximadamente 35 ng/mL, aproximadamente 40 ng/mL, aproximadamente 50 ng/mL, aproximadamente 60 ng/mL, aproximadamente 70 ng/mL, aproximadamente 80 ng/mL, aproximadamente 90 ng/mL, aproximadamente 100 ng/mL, aproximadamente 200 ng/mL, aproximadamente 500 ng/mL y aproximadamente 1 pg/mL de anticuerpo OKT-3. En una realización, el medio de cultivo celular comprende entre 0,1 ng/mL y 1 ng/mL, entre 1 ng/mL y 5 ng/mL, entre 5 ng/mL y 10 ng/mL, entre 10 ng/mL y 20 ng /mL, entre 20 ng/mL y 30 ng/mL, entre 30 ng/mL y 40 ng/mL, entre 40 ng/mL y 50 ng/mL, y entre 50 ng/mL y 100 ng/mL de OKT-3 anticuerpos. En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular no comprende el anticuerpo OKT-3.
En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende uno o más agonistas de TNFRSF en un medio de cultivo celular. En algunas realizaciones, el agonista de TNFRSF comprende un agonista de 4-1BB. En algunas realizaciones, el agonista de TNFRSF es un agonista de 4-1BB, y el agonista de 4-1BB se selecciona del grupo que consiste en urelumab, utomilumab, EU-101, una proteína de fusión y fragmentos, derivados, variantes, biosimilares y combinaciones. del mismo. En algunas realizaciones, el agonista de TNFRSF se añade a una concentración suficiente para lograr una concentración en el medio de cultivo celular de entre 0,1 pg/mL y 100 pg/mL. En algunas realizaciones, el agonista de TNFRSF se añade a una concentración suficiente para lograr una concentración en el medio de cultivo celular de entre 20 pg/mL y 40 pg/mL.
En algunas realizaciones, además de uno o más agonistas de TNFRSF, el medio de cultivo celular comprende además IL-2 en una concentración inicial de aproximadamente 3000 UI/mL y anticuerpo OKT-3 en una concentración inicial de aproximadamente 30 ng/mL, y en el que el uno o más agonistas de TNFRSF comprende un agonista de 4-1BB.
En algunas formas de realización, el primer medio de cultivo de expansión se denomina "CM", una abreviatura de medios de cultivo. En algunas formas de realización, se denomina CM1 (medio de cultivo 1). En algunas formas de realización, CM consta de RPMI 1640 con GlutaMAX, suplementado con suero AB humano al 10%, Hepes de 25 mM y gentamicina de 10 mg/mL. En formas de realización en las que los cultivos se inician en matraces permeables al gas con una capacidad de 40 mL y un fondo de silicio permeable al gas de 10 cm<2>(por ejemplo, G-Rex10; Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN) (figura 1), cada matraz se cargó con 10-40 x 10<6>células de digestión tumoral viables o 5-30 fragmentos tumorales en 10-40 mL de CM con IL-2. Tanto las placas de G-Rex10 como las de 24 pocillos se incubaron en una incubadora humidificada a 37°C en CO<2>al 5% y 5 días después del inicio del cultivo se retiró la mitad del medio y se reemplazó con CM e IL-2 frescos y después del día 5 la mitad de los medios se cambió cada 2-3 días. En algunas formas de realización, el CM es el CM1 descrito en los Ejemplos, ver Ejemplo 5. En algunas formas de realización, la primera expansión ocurre en un medio de cultivo celular inicial o en un primer medio de cultivo celular. En algunas formas de realización, el medio de cultivo celular inicial o el primer medio de cultivo celular comprende IL-2.
En algunas realizaciones, el primer procedimiento de expansión (que incluye procedimientos como, por ejemplo, los descritos en la etapa B de la Figura 27, que puede incluir los que a veces se denominan pre-REP) puede acortarse a 3-14 días, como se explica en los ejemplos y figuras. En algunas realizaciones, la primera expansión (incluidos los procedimientos como, por ejemplo, los descritos en la etapa B de la Figura 27, que pueden incluir los que a veces se denominan pre-REP) se puede acortar a 7 a 14 días, como se explica en los Ejemplos y se muestra en las Figuras. 4 y 5, además de incluir, por ejemplo, una expansión como se describe en la etapa B de la Figura 27. En algunas realizaciones, la primera expansión de la etapa B se acorta a 10-14 días, como se explica en los Ejemplos y se muestra en las Figuras 4 y 5. En algunas formas de realización, la primera expansión se acorta a 11 días, como se describe en los Ejemplos y se muestra en las Figuras 4 y 5, además de incluir, por ejemplo, una expansión como se describe en la etapa B de la Figura 27.
En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede continuar durante 3 días, 4 días, 5 días,<6>días, 7 días,<8>días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días o 14 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede continuar durante 3 a 14 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede continuar durante 4 a 14 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede continuar durante 5 a 14 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede continuar durante<6>a 14 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede continuar durante 7 días a 14 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede continuar durante<8>días a 14 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede continuar durante 9 días a 14 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede continuar durante 10 a 14 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede continuar durante 11 a 14 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede continuar durante 12 a 14 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede continuar durante 13 a 14 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede continuar durante 14 días. En algunas realizaciones, la primera expansión de TIL puede continuar durante 1 día a 11 días. En algunas formas de realización, la primera expansión de TIL puede continuar durante 3 días a 11 días. En algunas formas de realización, la primera expansión de TIL puede continuar durante 4 días a 11 días. En algunas formas de realización, la primera expansión de TIL puede continuar durante 5 días a 11 días. En algunas formas de realización, la primera expansión de TIL puede continuar durante<6>días a 11 días. En algunas formas de realización, la primera expansión de TIL puede continuar durante 7 días a 11 días. En algunas formas de realización, la primera expansión de TIL puede continuar durante<8>días a 11 días. En algunas formas de realización, la primera expansión de TIL puede continuar durante 9 días a 11 días. En algunas formas de realización, la primera expansión de TIL puede continuar durante 10 días a 11 días. En algunas formas de realización, la primera expansión de TIL puede continuar durante 11 días.
En algunas formas de realización, se emplea una combinación de IL-2, IL-7, IL-15 y/o IL-21 como combinación durante la primera expansión. En algunas formas de realización, IL-2, IL-7, IL-15 y/o IL-21, así como cualquier combinación de los mismos, pueden incluirse durante la primera expansión, incluyendo, por ejemplo, durante los procedimientos de la etapa B según la Figura 27, así como se describe en este documento. En algunas formas de realización, se emplea una combinación de IL-2, IL-15 e IL-21 como combinación durante la primera expansión. En algunas formas de realización, IL-2, IL-15 e IL-21, así como cualquier combinación de las mismas, pueden incluirse durante los procedimientos de la Etapa B según la Figura 27 y como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, el primer procedimiento de expansión (incluidos los procedimientos denominados pre-REP; por ejemplo, Etapa B según la Figura 27) se acorta de 3 a 14 días, como se explica en los ejemplos y figuras. En algunas realizaciones, la primera expansión de la etapa B se acorta de 7 a 14 días, como se explica en los Ejemplos y se muestra en las Figuras 4 y 5. En algunas realizaciones, la primera expansión de la etapa B se acorta de 10 a 14 días, como se explica en los Ejemplos y se muestra en las Figuras 4, 5 y 27. En algunas formas de realización, la primera expansión se acorta a 11 días, como se explica en los Ejemplos y se muestra en las Figuras 4, 5 y 27.
En algunas formas de realización, la primera expansión, por ejemplo, la etapa B según la Figura 27, se realiza en un biorreactor de sistema cerrado. En algunas formas de realización, se emplea un sistema cerrado para la expansión de TIL, como se describe en el presente documento. En algunas formas de realización, se emplea un solo biorreactor. En algunas formas de realización, el único biorreactor empleado es, por ejemplo, un G-REX -10 o un G-REX -100. En algunas formas de realización, el biorreactor de sistema cerrado es un solo biorreactor.
C. ETAPA C: Transición de la primera expansión a la segunda expansión
En algunos casos, la población de TIL a granel obtenida de la primera expansión, incluida, por ejemplo, la población de TIL obtenida de, por ejemplo, la etapa B como se indica en la Figura 27, se puede crioconservar inmediatamente, utilizando los protocolos que se describen más adelante en el presente documento. Alternativamente, la población de TIL obtenida de la primera expansión, denominada segunda población de TIL, puede someterse a una segunda expansión (que puede incluir expansiones a veces denominadas REP) y luego crioconservarse como se describe más adelante. De manera similar, en el caso de que en terapia se utilicen TIL modificados genéticamente, la primera población de TIL (a veces denominada población de TIL a granel) o la segunda población de TIL (que en algunas formas de realización puede incluir poblaciones denominadas poblaciones de TIL de REP) puede someterse a modificaciones genéticas para tratamientos adecuados antes de la expansión o después de la primera expansión y antes de la segunda expansión.
En algunas formas de realización, los TIL obtenidos de la primera expansión (por ejemplo, de la etapa B como se indica en la Figura 27) se almacenan hasta que se fenotipifican para la selección. En algunas formas de realización, los TIL obtenidos de la primera expansión (por ejemplo, de la etapa B como se indica en la Figura 27) no se almacenan y proceden directamente a la segunda expansión. En algunas formas de realización, los TIL obtenidos de la primera expansión no se crioconservan después de la primera expansión y antes de la segunda expansión. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre a alrededor de los 3 días, 4 días, 5 días,<6>días, 7 días,<8>días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, o 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre a alrededor de 3 a 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre a alrededor de 4 días y 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre a alrededor de 4 días y<10>días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre a alrededor de 7 días y 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión se produce a alrededor de los 14 días desde que se produce la fragmentación.
En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre en 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días,<6>días, 7 días,<8>días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días o 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 1 día a 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la primera expansión de TIL puede continuar durante 2 días a 14 días. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 3 a 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 4 a 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 5 a 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de<6>a 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 7 a 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de<8>a 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 9 a 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 10 a 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 11 a 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 12 a 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 13 a 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre a los 14 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 1 día a 11 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de<2>a<11>días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 3 a 11 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 4 a 11 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 5 a 11 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de<6>a 11 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 7 a 11 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de<8>a<11>días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de 9 a 11 días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre de<10>a<11>días desde que ocurre la fragmentación. En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión ocurre a los<11>días desde que ocurre la fragmentación.
En algunas formas de realización, los TIL no se almacenan después de la primera expansión y antes de la segunda expansión, y los TIL proceden directamente a la segunda expansión (por ejemplo, en algunas formas de realización, no hay almacenamiento durante la transición de la etapa B a la etapa D). como se muestra en la Figura 27). En algunas formas de realización, la transición se produce en un sistema cerrado, como se describe en el presente documento. En algunas formas de realización, los TIL de la primera expansión, la segunda población de TIL, procede directamente a la segunda expansión sin período de transición.
En algunas formas de realización, la transición de la primera expansión a la segunda expansión, por ejemplo, la etapa C según la Figura 27, se realiza en un biorreactor de sistema cerrado. En algunas formas de realización, se emplea un sistema cerrado para la expansión de TIL, como se describe en el presente documento. En algunas formas de realización, se emplea un solo biorreactor. En algunas formas de realización, el único biorreactor empleado es, por ejemplo, un G-REX -10 o un G-REX -100. En algunas formas de realización, el biorreactor de sistema cerrado es un solo biorreactor.
D. ETAPA D: Segunda expansión
En algunas formas de realización, la población de células TIL se expande en número después de la recolección y el tratamiento a granel inicial, por ejemplo, después de la etapa A y la etapa B, y la transición se denomina Etapa C, como se indica en la Figura 27). Esta expansión adicional se denomina en el presente documento segunda expansión que puede incluir procedimientos de expansión generalmente referidos en la técnica como un procedimiento de expansión rápida (REP; así como procedimientos como se indica en la etapa D de la Figura 27). La segunda expansión se logra generalmente usando un medio de cultivo que comprende varios componentes que incluyen células alimentadoras, una fuente de citocina y un anticuerpo anti-CD3, en un recipiente permeable a los gases.
En algunas formas de realización, la segunda expansión o la segunda expansión de TIL (que puede incluir expansiones a veces denominadas REP; así como los procedimientos indicados en la etapa D de la Figura 27) de TIL se puede realizar utilizando cualquier matraz o recipiente TIL conocido por los expertos en la técnica. En algunas formas de realización, la segunda expansión de TIL puede continuar durante 7 días,<8>días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días o 14 días. La segunda expansión de TIL puede continuar durante alrededor de 7 días a alrededor de 14 días. La segunda expansión de TIL puede continuar durante alrededor de<8>días a alrededor de 14 días. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede continuar durante alrededor de 9 días a alrededor de 14 días. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede continuar durante alrededor de 10 días a alrededor de 14 días. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede continuar durante alrededor de 11 días a alrededor de 14 días. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede continuar durante alrededor de 12 días a alrededor de 14 días. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede continuar durante alrededor de 13 días a alrededor de 14 días. En algunas realizaciones, la segunda expansión de TIL puede continuar durante unos 14 días.
En una forma de realización, la segunda expansión se puede realizar en un recipiente permeable al gas usando los procedimientos de la presente divulgación (que incluyen, por ejemplo, expansiones denominadas REP; así como procedimientos como se indican en la etapa D de la Figura 27). Por ejemplo, los TIL se pueden expandir rápidamente usando la estimulación del receptor de células T inespecíficas en presencia de interleucina-2 (IL-2) o interleucina-15 (IL-15). El estímulo inespecífico del receptor de células T puede incluir, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD3, tal como alrededor de 30 ng/mL de OKT3, un anticuerpo anti-CD3 monoclonal de ratón (disponible comercialmente en Ortho-McNeil, Raritan, NJ o Miltenyi Biotech, Auburn, CA) o UHCT-1 (disponible comercialmente en BioLegend, San Diego, CA, EE. UU.). Los TIL se pueden expandir para inducir una estimulación adicional de los TIL in vitro al incluir uno o más antígenos durante la segunda expansión, incluidas porciones antigénicas de los mismos, como epítopo(s), del cáncer, que pueden expresarse opcionalmente a partir de un vector, como como péptido de unión al antígeno leucocitario humano A2 (HLA-A2), por ejemplo, 0.3 pM MART-1: 26-35 (27 L) o gpl 00: 209-217 (210 M), opcionalmente en presencia de un crecimiento de células T factor, como 300 UI/mL de IL-2 o IL-15. Otros antígenos adecuados pueden incluir, por ejemplo, NY-ESO-1, TRP-1, TRP-2, antígeno de cáncer de tirosinasa, MAGE-A3, SSX-2 y VEGFR2, o porciones antigénicas de los mismos. TIL también se puede expandir rápidamente mediante reestimulación con el mismo o los mismos antígenos del cáncer pulsados sobre células presentadoras de antígeno que expresan HLA-A2. Alternativamente, los TIL se pueden volver a estimular con, por ejemplo, linfocitos autólogos irradiados o con linfocitos alogénicos HLA-A2+ irradiados e IL-2. En algunas formas de realización, la reestimulación se produce como parte de la segunda expansión. En algunas formas de realización, la segunda expansión se produce en presencia de linfocitos autólogos irradiados o con linfocitos alogénicos HLA-A2+ irradiados e IL-2.
En una forma de realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-2. En algunas formas de realización, el medio de cultivo celular comprende alrededor de 3000 UI/mL de IL-2. En una forma de realización, el medio de cultivo celular comprende alrededor de 1000 UI/mL, alrededor de 1500 UI/mL, alrededor de 2000 UI/mL, alrededor de 2500 UI/mL, alrededor de 3000 UI/mL, alrededor de 3500 UI/mL, alrededor de 4000 UI/mL, alrededor de 4500 UI/mL, alrededor de 5000 UI/mL, alrededor de 5500 UI/mL, alrededor de 6000 UI/mL, alrededor de 6500 UI/mL, alrededor de 7000 UI/mL, alrededor de 7500 UI/mL o alrededor de 8000 UI/mL de IL-2. En una forma de realización, el medio de cultivo celular comprende entre 1000 y 2000 UI/mL, entre 2000 y 3000 UI/mL, entre 3000 y 4000 UI/mL, entre 4000 y 5000 UI/mL, entre 5000 y 6000 UI/mL, entre 6000 y 7000 UI/mL, entre 7000 y 8000 UI/mL, o entre 8000 UI/mL de IL-2.
En una forma de realización, el medio de cultivo celular comprende anticuerpo OKT-3. En algunas formas de realización, el medio de cultivo celular comprende alrededor de 30 ng/mL de anticuerpo OKT-3. En una forma de realización, el medio de cultivo celular comprende alrededor de 0.1 ng/mL, alrededor de 0.5 ng/mL, alrededor de 1 ng/mL, alrededor de 2.5 ng/mL, alrededor de 5 ng/mL, alrededor de 7.5 ng/mL, alrededor de 10 ng/mL, alrededor de 15 ng/mL, alrededor de 20 ng/mL, alrededor de 25 ng/mL, alrededor de 30 ng/mL, alrededor de 35 ng/mL, alrededor de 40 ng/mL, alrededor de 50 ng/mL, alrededor de 60 ng/mL, alrededor de 70 ng/mL, alrededor de 80 ng/mL, alrededor de 90 ng/mL, alrededor de 100 ng/mL, alrededor de 200 ng/mL, alrededor de 500 ng/mL y alrededor de 1 pg/mL de anticuerpo OKT-3. En una forma de realización, el medio de cultivo celular comprende entre 0.1 ng/mL y 1 ng/mL, entre 1 ng/mL y 5 ng/mL, entre 5 ng/mL y 10 ng/mL, entre 10 ng/mL y 20 ng/mL, entre 20 ng/mL y 30 ng/mL, entre 30 ng/mL y 40 ng/mL, entre 40 ng/mL y 50 ng/mL, y entre 50 ng/mL y 100 ng/mL de anticuerpo En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular no comprende el anticuerpo OKT-3.
En algunas realizaciones, el medio de cultivo celular comprende uno o más agonistas de TNFRSF en un medio de cultivo celular. En algunas realizaciones, el agonista de TNFRSF comprende un agonista de 4-1BB. En algunas realizaciones, el agonista de TNFRSF es un agonista de 4-1BB, y el agonista de 4-1BB se selecciona del grupo que consiste en urelumab, utomilumab, EU-101, una proteína de fusión y fragmentos, derivados, variantes, biosimilares y combinaciones. del mismo. En algunas realizaciones, el agonista de TNFRSF se añade a una concentración suficiente para lograr una concentración en el medio de cultivo celular de entre 0,1 pg/mL y 100 |jg/mL En algunas realizaciones, el agonista de TNFRSF se añade a una concentración suficiente para lograr una concentración en el medio de cultivo celular de entre 20 jg/m L y 40 jg/mL.
En algunas realizaciones, además de uno o más agonistas de TNFRSF, el medio de cultivo celular comprende además IL-2 en una concentración inicial de aproximadamente 3000 UI/mL y anticuerpo OKT-3 en una concentración inicial de aproximadamente 30 ng/mL, y en el que el uno o más agonistas de TNFRSF comprende un agonista de 4-1BB.
En algunas formas de realización, se emplea una combinación de IL-2, IL-7, IL-15 y/o IL-21 como combinación durante la segunda expansión. En algunas formas de realización, IL-2, IL-7, IL-15 y/o IL-21, así como cualquier combinación de los mismos, pueden incluirse durante la segunda expansión, incluyendo, por ejemplo, durante un procedimiento de la etapa D según la Figura 27, así como se describe en este documento. En algunas formas de realización, se emplea una combinación de IL-2, IL-15 e IL-21 como combinación durante la segunda expansión. En algunas formas de realización, IL-2, IL-15 e IL-21, así como cualquier combinación de las mismas, pueden incluirse durante los procedimientos de la Etapa D según la Figura 27 y como se describe en el presente documento.
En algunas formas de realización, la segunda expansión se puede realizar en un medio de cultivo celular suplementado que comprende IL-2, OKT-3, células alimentadoras presentadoras de antígeno, y opcionalmente un agonista TNFRSF. En algunas formas de realización, la segunda expansión se produce en un medio de cultivo celular suplementado. En algunas formas de realización, el medio de cultivo celular suplementado comprende IL-2, OKT-3 y células alimentadoras presentadoras de antígeno. En algunas formas de realización, el segundo medio de cultivo celular comprende IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC; también denominadas células alimentadoras presentadoras de antígeno). En algunas formas de realización, la segunda expansión se produce en un medio de cultivo celular que comprende IL-2, OKT-3 y células alimentadoras presentadoras de antígeno (es decir, células presentadoras de antígeno).
En algunas formas de realización, el segundo medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 500 UI/mL de IL-15, alrededor de 400 UI/mL de IL-15, alrededor de 300 UI/mL de IL-15, alrededor de 200 UI/mL de IL-15, alrededor de 180 UI/mL de IL-15, alrededor de 160 UI/mL de IL-15, alrededor de 140 UI/mL de IL-15, alrededor de 120 UI/mL de IL-15 o alrededor de 100 UI/mL de IL-15. En algunas formas de realización, el segundo medio de cultivo de expansión comprende de alrededor de 500 UI/mL de IL-15 a alrededor de 100 UI/mL de IL-15. En algunas formas de realización, el segundo medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 400 UI/mL de IL-15 a alrededor de 100 UI/mL de IL-15. En algunas formas de realización, el segundo medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 300 UI/mL de IL-15 a alrededor de 100 UI/mL de IL-15. En algunas formas de realización, el segundo medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 200 UI/mL de IL-15. En algunas formas de realización, el medio de cultivo celular comprende alrededor de 180 UI/mL de IL-15. En una forma de realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-15. En una forma de realización preferida, el medio de cultivo celular comprende alrededor de 180 UI/mL de IL-15.
En algunas formas de realización, el segundo medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 20 UI/mL de IL-21, alrededor de 15 UI/mL de IL-21, alrededor de 12 UI/mL de IL-21, alrededor de 10 UI/mL de IL-21, alrededor de 5 UI/mL de IL-21, alrededor de 4 UI/mL de IL-21, alrededor de 3 UI/mL de IL-21, alrededor de 2 UI/mL de IL-21, alrededor de 1 UI/mL de IL-21, o alrededor de 0.5 UI/mL de IL-21. En algunas formas de realización, el segundo medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 20 UI/mL de IL-21 a alrededor de 0.5 UI/mL de IL-21. En algunas formas de realización, el segundo medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 15 UI/mL de IL-21 a alrededor de 0.5 UI/mL de IL-21. En algunas formas de realización, el segundo medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 12 UI/mL de IL-21 a alrededor de 0.5 UI/mL de IL-21. En algunas formas de realización, el segundo medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 10 UI/mL de IL-21 a alrededor de 0.5 UI/mL de IL-21. En algunas formas de realización, el segundo medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 5 UI/mL de IL-21 a alrededor de 1 UI/mL de IL-21. En algunas formas de realización, el segundo medio de cultivo de expansión comprende alrededor de 2 UI/mL de IL-21. En algunas formas de realización, el medio de cultivo celular comprende alrededor de 1 UI/mL de IL-21. En algunas formas de realización, el medio de cultivo celular comprende alrededor de 0.5 UI/mL de IL-21. En una forma de realización, el medio de cultivo celular comprende además IL-21. En una forma de realización preferida, el medio de cultivo celular comprende alrededor de 1 UI/mL de IL-21.
En algunas formas de realización, las células alimentadoras presentadoras de antígenos (APC) son PBMC. En una forma de realización, la relación de TIL a PBMC y/o células presentadoras de antígeno en la expansión rápida y/o la segunda expansión es de alrededor de 1 a 25, alrededor de 1 a 50, alrededor de 1 a 100, alrededor de 1 a 125, alrededor de 1 a 150, alrededor de 1 a 175, alrededor de 1 a 200, alrededor de 1 a 225, alrededor de 1 a 250, alrededor de 1 a 275, alrededor de 1 a 300, alrededor de 1 a 325, alrededor de 1 a 350, alrededor de 1 a 375, alrededor de 1 a 400, o alrededor de 1 a 500. En una forma de realización, la relación de TIL a PBMC en la expansión rápida y/o la segunda expansión está entre 1 a 50 y 1 a 300. En una forma de realización, la relación de TIL a PBMC en la expansión rápida y/o la segunda expansión está entre 1 a 100 y 1 a 200.
En una forma de realización, REP y/o la segunda expansión se realiza en matraces con los TIL a granel que se mezclan con un exceso de 100 o 200 veces de células alimentadoras inactivadas, 30 mg/mL de anticuerpo antiCD3 OKT3 y 3000 UI/mL de IL-2 en 150 mL de medio. Se realiza el reemplazo de los medios (generalmente 2/3 de los medios mediante la respiración con medios frescos) hasta que las células se transfieren a una cámara de crecimiento alternativa. Las cámaras de crecimiento alternativas incluyen matraces G-REX y recipientes permeables al gas, como se expllica con más detalle más adelante.
En algunas realizaciones, la segunda expansión (que puede incluir procedimientos denominados procedimiento REP) se acorta a 7-14 días, como se explica en los ejemplos y figuras. En algunas formas de realización, la segunda expansión se acorta a<11>días.
En una forma de realización, REP y/o la segunda expansión se pueden realizar usando matraces T-175 y bolsas permeables al gas como se describió previamente (Tran, et al., J. Immunother. 2008, 31, 742-51; Dudley, et al., J. Immunother. 2003, 26, 332-42) o material de cultivo permeable a los gases (matraces G-Rex). En algunas formas de realización, la segunda expansión (incluidas las expansiones denominadas expansiones rápidas) se realiza en matraces T-175, y se pueden agregar alrededor de 1 x 10<6>TIL suspendidos en 150 mL de medio a cada matraz T-175. Los TIL se pueden cultivar en una mezcla 1 a 1 de medio CM y AIM-V, suplementado con 3000 UI por mL de IL-2 y 30 ng por mL de anti-CD3. Los matraces T-175 se pueden incubar a 37° C en CO<2>al 5%. La mitad del medio puede intercambiarse el día 5 usando medio 50/50 con 3000 UI por mL de IL-2. En algunas formas de realización, el día 7, las células de dos matraces T-175 pueden combinarse en una bolsa de 3 l y 300 mL de AIM V con suero AB humano al 5% y se agregaron 3000 UI por mL de IL-2 a los 300 mL de suspensión de TIL. Se contó el número de células en cada bolsa cada uno o dos días y se añadió medio fresco para mantener el recuento de células entre 0.5 y 2.0 x 10<6>células/mL.
En una forma de realización, la segunda expansión (que puede incluir expansiones denominadas REP, así como las referidas en la etapa D de la Figura 27) se puede realizar en matraces permeables al gas de 500 mL de capacidad con fondos de silicio permeables al gas de 100 cm (G -Rex 100, disponible comercialmente en Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, EUA), 5 x 10<6>o 10 x 10<6>TIL se puede cultivar con PBMC en 400 mL de medio 50/50, suplementado con suero AB humano al 5%, 3000 UI por mL de IL-2 y 30 ng por mL de anti-CD3 (OKT3). Los matraces G-Rex 100 se pueden incubar a 37°C en CO<2>al 5%. El día 5 se pueden retirar 250 mL de sobrenadante y colocar en botellas de centrífuga y centrifugar a 1500 rpm (491 x g) durante 10 minutos. Los sedimentos de TIL se pueden resuspender con 150 mL de medio fresco con suero AB humano al 5%, 3000 UI por mL de IL-2 y se pueden volver a agregar a los matraces G-Rex 100 originales. Cuando los TIL se expanden en serie en matraces G-Rex 100, el día 7 el TIL de cada G-Rex 100 se puede suspender en los 300 mL de medio presentes en cada matraz y la suspensión celular se puede dividir en 3 alícuotas de 100 mL que pueden utilizarse para sembrar 3 matraces G-Rex 100. Luego, a cada matraz se pueden agregar 150 mL de AIM-V con suero AB humano al 5% y 3000 UI por mL de IL-2. Los matraces G-Rex 100 se pueden incubar a 37°C en CO<2>al 5% y después de 4 días a cada matraz G-REX 100 se pueden agregar 150 mL de AIM-V con 3000 UI por mL de IL-2. Las células se pueden recolectar el día 14 de cultivo.
En una forma de realización, la segunda expansión (incluidas las expansiones denominadas REP) se realiza en matraces con los TIL a granel mezclados con un exceso de 100 o 200 veces de células alimentadoras inactivadas, 30 mg/mL de anticuerpo anti-CD3 OKT3 y 3000 IL-2 UI/mL en 150 mL de medio. En algunas formas de realización, el reemplazo del medio se realiza hasta que las células se transfieren a una cámara de crecimiento alternativa. En algunas formas de realización, 2/3 del medio se reemplaza por respiración con medio fresco. En algunas formas de realización, las cámaras de crecimiento alternativas incluyen matraces G-REX y recipientes permeables a los gases, como se describe más detalladamente más adelante.
En una forma de realización, se realiza la segunda expansión (incluidas las expansiones denominadas REP) y comprende además una etapa en la que los TIL se seleccionan para una reactividad tumoral superior. Puede usarse cualquier procedimiento de selección conocido en la técnica. Por ejemplo, los procedimientos descritos en la Publicación de Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2016/0010058 A1, pueden usarse para la selección de TIL para una reactividad tumoral superior.
Opcionalmente, se puede realizar un ensayo de viabilidad celular después de la segunda expansión (incluidas las expansiones denominadas expansión REP), usando ensayos estándar conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede realizar un ensayo de exclusión con azul tripán en una muestra de TIL a granel, que marca selectivamente las células muertas y permite una evaluación de viabilidad. En algunas formas de realización, las muestras de TIL se pueden contar y la viabilidad se puede determinar usando un contador celular automatizado Cellometer K2 (Nexcelom Bioscience, Lawrence, m A). En algunas formas de realización, la viabilidad se determina de acuerdo con el protocolo del Contador de Células Automático del Citómetro de Imagen Cellometer K2 descrito, por ejemplo, en el Ejemplo 15.
En algunas formas de realización, la segunda expansión (incluidas las expansiones denominadas REP) de TIL se puede realizar utilizando matraces T-175 y bolsas permeables al gas como se describió anteriormente (Tran KQ, Zhou J, Durflinger KH, et al., 2008, J Immunother., 31:742-751, and Dudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE, et al.
2003, J Immunother., 26:332-342) o matraces G-Rex permeables al gas. En algunas formas de realización, la segunda expansión se realiza utilizando matraces. En algunas formas de realización, la segunda expansión se realiza utilizando matraces G-Rex permeables al gas. En algunas formas de realización, la segunda expansión se realiza en matraces T-175, y se suspenden alrededor de 1 x 10<6>TIL en alrededor de 150 mL de medio y esto se agrega a cada matraz T-175. Los TIL se cultivan con PBMC alogénicas irradiadas (50 Gy) como células "alimentadoras" en una relación de 1 a 100 y las células se cultivan en una mezcla 1 a 1 de medio CM y AIM-V (medio 50/50), suplementado con 3000 UI/mL de IL-2 y 30 ng/mL de anti-CD3. Los matraces T-175 se incuban a 37°C en CO<2>al 5%. En algunas formas de realización, la mitad del medio se cambia el día 5 usando medio 50/50 con 3000 UI/mL de IL-2. En algunas formas de realización, el día 7, las células de 2 matraces T-175 se combinan en una bolsa de 3 l y 300 mL de AIM-V con suero AB humano al 5% y se agregan 3000 UI/mL de IL-2 a los 300 mL de suspensión de TIL. El número de células en cada bolsa se puede contar cada día o dos y se pueden agregar medios frescos para mantener el recuento de células entre alrededor de 0.5 y alrededor de 2.0 x 10<6>células/mL.
En algunas formas de realización, la segunda expansión (incluidas las expansiones denominadas REP) se realiza en matraces de 500 mL de capacidad con fondos de silicona de 100 cm<2>permeables al gas (G-Rex 100, Wilson Wolf) (figura 1), se cultivan alrededor de 5x10<6>o 10x10<6>TIL con PBMC alogénicas irradiadas en una relación de 1 a 100 en 400 mL de medio 50/50, suplementado con 3000 UI/mL de IL-2 y 30 ng/mL de anti-CD3. Los matraces G-Rex 100 se incuban a 37°C en CO<2>al 5%. En algunas formas de realización, el día 5 se retiran 250 mL de sobrenadante y se colocan en botellas de centrífuga y se centrifugan a 1500 rpm (491 g) durante 10 minutos. Los gránulos de TIL se pueden resuspender luego con 150 mL de medio fresco 50/50 con 3000 UI/mL de IL-2 y se pueden volver a agregar a los matraces G-Rex 100 originales. En las formas de realización en las que los TIL se expanden en serie en matraces de G-Rex 100, el día 7 los TIL de cada G-Rex 100 se suspenden en los 300 mL de medio presente en cada matraz y la suspensión celular se divide en tres alícuotas de 100 mL que son utilizados para sembrar 3 matraces G-Rex 100. Más adelante, a cada matraz se agregan 150 mL de AIM-V con suero AB humano al 5% y 3000 UI/mL de IL-2. Los matraces G-Rex 100 se incuban a 37°C en CO<2>al 5% y después de 4 días a cada matraz G-Rex 100 se agregan 150 mL de AIM-V con 3000 UI/mL de IL-2. Las células se recogen el día 14 de cultivo.
Los diversos receptores de antígenos de los linfocitos T y B se producen por recombinación somática de un número limitado, pero grande, de segmentos de genes. Estos segmentos de genes: V (variable), D (diversidad), J (unión) y C (constante), determinan la especificidad de enlace y las aplicaciones posteriores de inmunoglobulinas y receptores de células T (TCR). La presente invención proporciona un procedimiento para generar TIL que exhiben y aumentan la diversidad del repertorio de células T. En algunas formas de realización, los TIL obtenidos por el presente procedimiento exhiben un aumento en la diversidad del repertorio de células T. En algunas formas de realización, los TIL obtenidos en la segunda expansión exhiben un aumento en la diversidad del repertorio de células T. En algunas formas de realización, el aumento de la diversidad es un aumento de la diversidad de inmunoglobulinas y/o la diversidad del receptor de células T. En algunas formas de realización, la diversidad está en la inmunoglobulina, está en la cadena pesada de inmunoglobulina. En algunas formas de realización, la diversidad está en la inmunoglobulina, está en la cadena ligera de inmunoglobulina. En algunas formas de realización, la diversidad está en el receptor de células T. En algunas formas de realización, la diversidad está en uno de los receptores de células T seleccionados del grupo que consiste en receptores alfa, beta, gamma y delta. En algunas formas de realización, hay un aumento en la expresión del receptor de células T (TCR) alfa y/o beta. En algunas formas de realización, hay un aumento en la expresión del receptor de células T (TCR) alfa. En algunas formas de realización, hay un aumento en la expresión del receptor de células T (TCR) beta. En algunas formas de realización, hay un aumento en la expresión de TCRab (es decir, TCRa/p).
En algunas formas de realización, el segundo medio de cultivo de expansión (por ejemplo, a veces denominado CM2 o el segundo medio de cultivo celular), comprende IL-2, OKT-3, así como las células alimentadoras presentadoras de antígeno (APC), como se analiza en más detalles más adelante.
En algunas formas de realización, la segunda expansión, por ejemplo, la etapa D según la Figura 27, se realiza en un biorreactor de sistema cerrado. En algunas formas de realización, se emplea un sistema cerrado para la expansión de TIL, como se describe en el presente documento. En algunas formas de realización, se emplea un solo biorreactor. En algunas formas de realización, el único biorreactor empleado es, por ejemplo, un G-REX -10 o un G-REX -100. En algunas formas de realización, el biorreactor de sistema cerrado es un solo biorreactor.
1. Células alimentadoras y células presentadoras de antígeno
En una forma de realización, los segundos procedimientos de expansión descritos en este documento (por ejemplo, incluida una expansión como las descritas en la etapa D de la Figura 27, así como las denominadas REP) requieren un exceso de células alimentadoras durante la expansión REP TIL y/o durante la segunda expansión. En muchas formas de realización, las células alimentadoras son células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas de unidades de sangre entera estándar de donantes de sangre sanos. Las PBMC se obtienen utilizando procedimientos estándar como la separación por gradiente Ficoll-Paque.
En general, las PBMC alogénicas se inactivan, ya sea mediante irradiación o tratamiento térmico, y se utilizan en los procedimientos de REP, como se describe en los ejemplos, en particular el ejemplo 14, que proporciona un protocolo ejemplar para evaluar la incompetencia de replicación de las PBMC alogénicas irradiadas.
En algunas formas de realización, las PBMC se consideran incompetentes para la replicación y se aceptan para su uso en los procedimientos de expansión de TIL descritos en este documento si el número total de células viables el día 14 es menor que el número de células viables inicial puestas en cultivo el día 0 del REP y/o día 0 de la segunda expansión (es decir, el día de inicio de la segunda expansión). Véase, por ejemplo, el Ejemplo 14.
En algunas formas de realización, las PBMC se consideran incompetentes para la replicación y se aceptan para su uso en los procedimientos de expansión de TIL descritos en este documento si el número total de células viables, cultivadas en presencia de OKT3 e IL-2, el día 7 y el día 14 no ha aumentado desde el número de células viables inicial puestas en cultivo el día 0 del REP y/o el día 0 de la segunda expansión (es decir, el día de inicio de la segunda expansión). En algunas formas de realización, las PBMC se cultivan en presencia de 30 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 3000 UI/mL de IL-2. Véase, por ejemplo, el Ejemplo 13.
En algunas formas de realización, las PBMC se consideran incompetentes para la replicación y se aceptan para su uso en los procedimientos de expansión de TIL descritos en este documento si el número total de células viables, cultivadas en presencia de OKT3 e IL-2, el día 7 y el día 14 no ha aumentado desde el número de células viables inicial puestas en cultivo el día 0 del REP y/o el día 0 de la segunda expansión (es decir, el día de inicio de la segunda expansión). En algunas formas de realización, las PBMC se cultivan en presencia de 5-60 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 1000-6000 UI/mL de IL-2. En algunas formas de realización, las PBMC se cultivan en presencia de 10-50 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 2000-5000 UI/mL de IL-2. En algunas formas de realización, las PBMC se cultivan en presencia de 20-40 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 2000-4000 UI/mL de IL-2. En algunas formas de realización, las PBMC se cultivan en presencia de 25-35 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 2500-3500 UI/mL de IL-2.
En algunas formas de realización, las células alimentadoras presentadoras de antígeno son PBMC. En algunas formas de realización, las células alimentadoras presentadoras de antígeno son células alimentadoras presentadoras de antígeno artificiales. En una forma de realización, la relación de TIL a las células alimentadoras presentadoras de antígeno en la segunda expansión es alrededor de 1 a 25, alrededor de 1 a 50, alrededor de 1 a 100, alrededor de 1 a 125, alrededor de 1 a 150, alrededor de 1 a 175, alrededor de 1 a 200, alrededor de 1 a 225, alrededor de 1 a 250, alrededor de 1 a 275, alrededor de 1 a 300, alrededor de 1 a 325, alrededor de 1 a 350, alrededor de 1 a 375, alrededor de 1 a 400, o alrededor de 1 a 500. En una forma de realización, la relación de TIL a células alimentadoras presentadoras de antígeno en la segunda expansión es de 1 a 50 y de 1 a 300. En una forma de realización, la relación de TIL a células alimentadoras presentadoras de antígeno en la segunda expansión es de<1>a<100>y<1>a<2 0 0>.
En una forma de realización, los segundos procedimientos de expansión descritos en el presente documento requieren una relación de alrededor de 2.5 x 10<9>células alimentadoras a alrededor de 100 x 10<6>TIL. En otra realización, los segundos procedimientos de expansión descritos en el presente documento requieren una relación de alrededor de 2.5 x 10<9>células alimentadoras a alrededor de 50 x 10<6>TIL. En otra realización más, los segundos procedimientos de expansión descritos en el presente documento requieren de alrededor de 2.5 x 10<9>células alimentadoras a alrededor de 25 x 10<6>TIL.
En una forma de realización, los segundos procedimientos de expansión descritos en este documento requieren un exceso de células alimentadoras durante la segunda expansión. En muchas formas de realización, las células alimentadoras son células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas de unidades de sangre entera estándar de donantes de sangre sanos. Las PBMC se obtienen utilizando procedimientos estándar como la separación por gradiente Ficoll-Paque. En una forma de realización, se utilizan células presentadoras de antígenos artificiales (aAPC) en lugar de PBMC.
En general, las PBMC alogénicas se inactivan, ya sea mediante irradiación o tratamiento térmico, y se usan en los procedimientos de expansión de TIL descritos en este documento, incluidos los procedimientos ejemplares descritos en las Figuras 4, 5 y 27.
En una forma de realización, las células presentadoras de antígenos artificiales se utilizan en la segunda expansión como reemplazo de, o en combinación con, PBMC.
2. Citocinas
Los procedimientos de expansión descritos en este documento generalmente usan medios de cultivo con altas dosis de una citocina, en particular IL-2, como se conoce en la técnica.
Alternativamente, también es posible usar combinaciones de citocinas para la expansión rápida y/o la segunda expansión de TIL, con combinaciones de dos o más de IL-2, IL-15 e IL-21 como se describe generalmente en la Publicación Internacional No. WO 2015/189356 y Publicación Internacional W No. WO 2015/189357. Por lo tanto, las posibles combinaciones incluyen IL-2 e IL-15, IL-2 e IL-21, IL-15 e IL-21 e IL-2, IL-15 e IL-21, y esta última encuentra un uso particular en muchas formas de realización. El uso de combinaciones de citocinas favorece específicamente la generación de linfocitos y, en particular, de células T como se describe allí.
3. Anticuerpos anti-CD3
En algunas formas de realización, los medios de cultivo usados en los procedimientos de expansión descritos en el presente documento (incluidos los denominados REP, véase, por ejemplo, la Figura 27) también incluyen un anticuerpo anti-CD3. Un anticuerpo anti-CD3 en combinación con IL-2 induce la activación de las células T y división celular en la población TIL. Este efecto puede observarse con anticuerpos de longitud completa, así como con fragmentos Fab y F (ab')2, y generalmente se prefiere el primero; véase, por ejemplo, Tsoukas et al., J. Immunol. 1985, 135, 1719.
Como apreciarán los expertos en la técnica, hay varios anticuerpos CD3 anti-humanos adecuados que encuentran uso en la invención, incluidos anticuerpos policlonales y monoclonales CD3 anti-humanos de varios mamíferos, incluidos, entre otros, anticuerpos de murinos, humanos, primates, ratas y caninos. En formas de realización particulares, se usa el anticuerpo anti-CD3 OKT3 (disponible comercialmente en Ortho-McNeil, Raritan, NJ o Miltenyi Biotech, Auburn, CA).
E. ETAPA E: Recolectar TIL
Después de la segunda etapa de expansión, se pueden recolectar las células. En algunas formas de realización, los TIL se recolectan después de uno, dos, tres, cuatro o más etapas de expansión, por ejemplo, como se proporciona en la Figura 27. En algunas formas de realización, los TIL se recolectan después de dos etapas de expansión, por ejemplo, como se muestra en la Figura 27.
Los TIL se pueden recolectar de cualquier manera apropiada y estéril, incluyendo, por ejemplo, por centrifugación. Los procedimientos para la recolección de TIL son bien conocidos en la técnica y cualquier procedimiento conocido puede emplearse con el presente procedimiento. En algunas formas de realización, los TIL se recolectan usando un sistema automatizado.
Los recolectores de células y/o los sistemas de tratamiento de células están disponibles comercialmente en una variedad de fuentes, que incluyen, por ejemplo, Fresenius Kabi, Tomtec Life Science, Perkin Elmer e Inotech Biosystems International, Inc. Cualquier recolector de células puede emplearse con los procedimientos presentes. En algunas formas de realización, el recolector de células y/o los sistemas de tratamiento de células es un recolector de células basado en membrana. En algunas formas de realización, la recolección de células se realiza mediante un sistema de tratamiento de células, como el sistema LOVO (fabricado por Fresenius Kabi). El término "sistema de tratamiento de células LOVO" también se refiere a cualquier instrumento o dispositivo fabricado por cualquier proveedor que pueda bombear una solución que comprende células a través de una membrana o filtro, como una membrana giratoria o un filtro giratorio, en un entorno de sistema cerrado y/o estéril, lo que permite flujo continuo y tratamiento celular para eliminar el sobrenadante o los medios de cultivo celular sin formación de pellas. En algunas formas de realización, el recolector de células y/o el sistema de tratamiento de células puede realizar la separación de células, lavado, intercambio de fluidos, concentración y/u otras etapas de tratamiento de células en un sistema estéril cerrado.
En algunas formas de realización, la recolección, por ejemplo, la etapa E según la Figura 27, se realiza desde un biorreactor de sistema cerrado. En algunas formas de realización, se emplea un sistema cerrado para la expansión de TIL, como se describe en el presente documento. En algunas formas de realización, se emplea un solo biorreactor. En algunas formas de realización, el único biorreactor empleado es, por ejemplo, un G-REX -10 o un G-REX -100. En algunas formas de realización, el biorreactor de sistema cerrado es un solo biorreactor.
En algunas realizaciones, la Etapa E según la Figura 27 se realiza según los procesos descritos en el Ejemplo 30. En algunas realizaciones, se accede al sistema cerrado mediante jeringas en condiciones estériles para mantener la esterilidad y la naturaleza cerrada del sistema. En algunas realizaciones, se emplea un sistema cerrado como se describe en el Ejemplo 30.
En algunas realizaciones, los TIL se recolectan según los procedimientos descritos en el Ejemplo 30. En algunas realizaciones, los TIL entre los días 1 y 11 se recolectan utilizando los procedimientos descritos en la Sección 8.5 (denominados recolección de TIL del día 11 en el Ejemplo 30). En algunas realizaciones, los TIL entre los días 12 y 22 se recolectan usando los procedimientos descritos en la Sección 8.12 (denominados recolección de TIL del día 22 en el Ejemplo 30).
F. ETAPA F: Formulación final/ Transferencia a la bolsa de infusión
Después de que las etapas A a E como se proporcionan en un orden ejemplar en la Figura 27 y como se describe en detalle anteriormente y en el presente documento estén completos, las células se transfieren a un recipiente para su uso en la administración a un paciente. En algunas formas de realización, una vez que se obtiene un número terapéuticamente suficiente de TIL usando los procedimientos de expansión descritos anteriormente, se transfieren a un recipiente para su uso en la administración a un paciente.
En una realización, los TIL expandidos usando APC de la presente divulgación se proporcionan para la administración a un paciente como una composición farmacéutica. En una forma de realización, la composición farmacéutica es una suspensión de TIL en un regulador de pH estéril. Los TIL expandidos usando PBMC de la presente divulgación pueden ser para administración mediante cualquier ruta adecuada como se conoce en la técnica. En algunas formas de realización, las células T son para administración como una única infusión intraarterial o intravenosa, que preferiblemente dura alrededor de de 30 a 60 minutos. Otras vías de administración adecuadas incluyen intraperitoneal, intratecal e intralinfática.
1. Composiciones farmacéuticas, dosis y regímenes de dosificación
También se divulgan en el presente documento pero no se reivindican, los TIL expandidos usando los procedimientos de la presente divulgación son para la administración a un paciente como una composición farmacéutica. La composición farmacéutica puede ser una suspensión de TIL en un regulador de pH estéril. Los
TIL expandidos usando PBMC de la presente divulgación pueden administrarse mediante cualquier ruta adecuada
como se conoce en la técnica. Las células T pueden ser se administradas como una única infusión intraarterial o intravenosa, que preferiblemente dura alrededor de de 30 a 60 minutos. Otras vías de administración adecuadas
incluyen la administración intraperitoneal, intratecal e intralinfática.
Cualquier dosis adecuada de TIL puede ser para administración. Desde aproximadamente 2,3*10<10>a aproximadamente 13,7 * 10<10>TIL se pueden administrar, con una media de alrededor de 7,8*10<10>TIL, especialmente si el cáncer es melanoma. Aproximadamente 1,2*10<10>a aproximadamente 4,3 * 10<10>TIL pueden
ser administrados. Alrededor de 3*10<10>a aproximadamente 12*10<10>TIL se pueden administrar. Aproximadamente
4*10<10>a aproximadamente 10*10<10>TIL se pueden administrar. En los procedimientos descritos en el presente documento, aproximadamente 5*10<10>a aproximadamente 8*10<10>TIL se pueden administrar. En los procedimientos descritos en el presente documento, aproximadamente 6*10<10>a aproximadamente 8*10<10>TIL se
pueden administrar. En los procedimientos descritos en el presente documento, aproximadamente 7*10<10>a aproximadamente 8*10<10>TIL se pueden administrar. En los procedimientos descritos en el presente documento,
la dosis terapéuticamente eficaz puede ser de aproximadamente 2,3 x 10<10>a aproximadamente 13,7 * 1010. En los procedimientos descritos en el presente documento, la dosis terapéuticamente eficaz puede ser aproximadamente
7,8 x<10 10>TIL, particularmente del cáncer es el melanoma. En los procedimientos descritos en el presente documento, la dosis terapéuticamente eficaz puede ser aproximadamente 1,2 x 10<10>a aproximadamente 4,3 *
10<10>TIL. En los procedimientos descritos en el presente documento, la dosis terapéuticamente eficaz puede ser aproximadamente 3x10<10>a aproximadamente 12*10<10>TIL. En los procedimientos descritos en el presente documento, la dosis terapéuticamente eficaz puede ser aproximadamente 4x10<10>a aproximadamente 10*10<10>TIL.
En los procedimientos descritos en el presente documento, la dosis terapéuticamente eficaz puede ser aproximadamente 5 x 10<10>a aproximadamente 8*10<10>TIL. En los procedimientos descritos en el presente documento, la dosis terapéuticamente eficaz puede ser aproximadamente<6>x 10<10>a aproximadamente 8*10<10>TIL.
En los procedimientos descritos en el presente documento, la dosis terapéuticamente eficaz puede ser aproximadamente 7 x 10<10>a aproximadamente 8*10<10>TIL.
El número de TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención puede ser de alrededor de
1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106,<6>* 106, 7 * 106,<8>* 106, 9 * 106, 1 * 107, 2 * 107, 3 * 107, 4 * 107, 5 *
107,<6>* 107, 7 * 107,<8>* 107, 9 * 107, 1 * 108, 2 * 108, 3 * 108, 4 * 108, 5 * 108,<6>* 108, 7 * 108,<8>* 108, 9 * 108,
1 * 109, 2 *109, 3 * 109, 4 * 109, 5 * 109,<6>* 109, 7 * 109,<8>* 109, 9 * 109, 1 * 1010, 2 * 1010, 3 * 1010, 4 * 1010, 5
* 1010,<6>* 1010, 7 * 1010,<8>* 1010, 9 * 1010, 1 * 1011, 2 * 1011, 3 * 1011, 4 * 1011, 5 * 1011,<6>* 1011, 7 * 1011,<8>*
1011, 9 * 1011, 1 * 1012, 2 * 1012, 3 * 1012, 4 * 1012, 5 * 1012,<6>* 1012, 7 * 1012,<8>* 1012, 9 * 1012, 1 * 1013, 2 *
1013, 3 * 1013, 4 * 1013, 5 * 1013,<6>* 1013, 7 * 1013,<8>* 10<13>y 9 * 1013. El número de TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención puede estar en el rango de 1 x 10<6>a S x 106, 5 x 10<6>a 1 x 107, 1 *
10<7>a 5 * 107, 5 * 10<7>a 1 * 108, 1 * 10<8>a 5 * 108, 5 * 10<8>a 1 * 109, 1 * 10<9>a 5 * 109, 5 * 10<9>a 1 * 1010, 1 * 10<10>
a 52 * 1010, 5 * 10<10>a 1 * 1011, 5 * 10<11>a 1 * 1012, 1 * 1012a 5 * 1012y 5 * 1012a 1 * 1013.
La concentración de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención puede ser menor
que, por ejemplo, 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%,
12%, 11%, 10%, 9%,<8>%, 7%,<6>%, 5%, 4%, 3 %, 2%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%,
0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009%, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%,
0.002%, 0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002% o 0.0001% p/p,
p/v o v/v de la composición farmacéutica.
La concentración de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención puede ser superior
al 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 19,75%, 19,50%, 19,25% 19%, 18,75%, 18,50%, 18,25% 18%,
17,75%, 17,50%, 17,25% 17%, 16,75%, 16,50%, 16,25% 16%, 15,75%, 15,50%, 15,25% 15%, 14,75 %, 14,50%,
14,25% 14%, 13.75%, 13.50%, 13.25% 13%, 12.75%, 12.50%, 12.25% 12%, 11,75%, 11,50%, 11,25% 11%,
10.75%, 10.50%, 10.25 % 10%, 9,75%, 9,50%, 9,25% 9%, 8,75%, 8,50%, 8,25%<8>%, 7,75%, 7,50%, 7,25% 7%,
6,75%, 6,50%, 6,25%<6>%, 5,75%, 5.50%, 5.25% 5%, 4.75%, 4.50%, 4.25%, 4%, 3.75%, 3.50%, 3.25%, 3%, 2.75%,
2.50%, 2.25%, 2%, 1.75%, 1.50%, 125%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%,
0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 0.01%, 0.009 %, 0.008%, 0.007%, 0.006%, 0.005%, 0.004%, 0.003%, 0.002%,
0.001%, 0.0009%, 0.0008%, 0.0007%, 0.0006%, 0.0005%, 0.0004%, 0.0003%, 0.0002% o 0.0001% p/p, p/v o v/v
de la composición farmacéutica.
La concentración de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención puede estar en el
intervalo de alrededor de 0.0001% a alrededor de 50%, alrededor de 0.001% a alrededor de 40%, alrededor de
0.01% a alrededor de 30%, alrededor de 0.02% a alrededor de 29%, alrededor de 0.03% a alrededor de 28%, alrededor de 0.04% a alrededor de 27%, alrededor de 0.05% a alrededor de 26%, alrededor de 0.06% a alrededor de 25%, alrededor de 0.07% a alrededor de 24%, alrededor de 0.08% a alrededor de 23%, alrededor de 0.09% a alrededor de<2 2>%, alrededor de<0>.<1>% a alrededor de<2 1>%, alrededor de<0>.<2>% a alrededor de<2 0>%, alrededor de 0.3% a alrededor de 19%, alrededor de 0.4% a alrededor de 18%, alrededor de 0.5% a alrededor de 17%, alrededor de 0.6% a alrededor de 16%, alrededor de 0.7% a alrededor de 15%, alrededor de 0.8% a alrededor de 14%, alrededor de 0.9% a alrededor de 12% o alrededor de 1% a alrededor de 10% p/p, p/v o v/v de la composición farmacéutica.
La concentración de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención puede estar en el intervalo de alrededor de 0.001% a alrededor de 10%, alrededor de 0.01% a alrededor de 5%, alrededor de 0.02% a alrededor de 4.5%, alrededor de 0.03% a alrededor de 4%, alrededor de 0.04% a alrededor de 3.5%, alrededor de 0.05% a alrededor de 3%, alrededor de 0.06% a alrededor de 2.5%, alrededor de 0.07% a alrededor de 2%, alrededor de 0.08% a alrededor de 1.5%, alrededor de 0.09% a alrededor de 1 %, alrededor de 0.1% a alrededor de 0.9% p/p, p/v o v/v de la composición farmacéutica.
La cantidad de los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención puede ser igual o menor que 10 g, 9.5 g, 9.0 g, 8.5 g, 8.0 g, 7.5 g, 7.0 g, 6.5 g, 6.0 g, 5.5 g, 5.0 g, 4.5 g, 4.0 g, 3.5 g, 3.0 g, 2.5 g, 2.0 g, 1.5 g, 1.0 g, 0.95 g, 0.9 g, 0.85 g, 0.8 g, 0.75 g, 0.7 g, 0.65 g, 0.6 g, 0.55 g, 0.5 g, 0.45 g, 0.4 g, 0.35 g, 0.3 g, 0.25 g, 0.2 g, 0.15 g, 0.1 g, 0.09 g, 0.08 g, 0.07 g, 0.06 g, 0.05 g, 0.04 g, 0.03 g, 0.02 g, 0.01 g, 0.009 g, 0.008 g, 0.007 g, 0.006 g, 0.005 g, 0.004 g, 0.003 g, 0.002 g, 0.001 g, 0.0009 g, 0.0008 g, 0.0007 g, 0.0006 g, 0.0005 g, 0.0004 g, 0.0003 g, 0.0002 g o 0.0001 g.
La cantidad de TIL proporcionada en las composiciones farmacéuticas de la invención puede ser más de 0.0001 g, 0.0002 g, 0.0003 g, 0.0004 g, 0.0005 g, 0.0006 g, 0.0007 g, 0.0008 g, 0.0009 g, 0.001 g, 0.0015 g, 0.002 g, 0.0025 g, 0.003 g, 0.0035 g, 0.004 g, 0.0045 g, 0.005 g, 0.0055 g, 0.006 g, 0.0065 g, 0.007 g, 0.0075 g, 0.008 g, 0.0085 g, 0.009 g, 0.0095 g, 0.01 g, 0.015 g, 0.02 g, 0.025 g, 0.03 g, 0.035 g, 0.04 g, 0.045 g, 0.05 g, 0.055 g, 0.06 g, 0.065 g, 0.07 g, 0.075 g, 0.08 g, 0.085 g, 0.09 g, 0.095 g, 0.1 g, 0.15 g, 0.2 g, 0.25 g, 0.3 g, 0.35 g, 0.4 g, 0.45 g, 0.5 g, 0.55 g, 0.6 g, 0.65 g, 0.7 g, 0.75 g, 0.8 g, 0.85 g, 0.9 g, 0.95 g, 1 g, 1.5 g, 2 g, 2.5, 3 g, 3.5, 4 g, 4.5 g, 5 g, 5.5 g,<6>g, 6.5 g, 7 g, 7.5 g,<8>g, 8.5 g, 9 g, 9.5 g o 10 g.
Los TIL proporcionados en las composiciones farmacéuticas de la invención son eficaces en un amplio intervalo de dosis. La dosis exacta dependerá de la vía de administración, la forma en la que se administra el compuesto, el sexo y la edad del sujeto a tratar, el peso corporal del sujeto a tratar y la preferencia y experiencia del médico tratante. Las dosis clínicamente establecidas de los TIL también pueden usarse si es apropiado. Las cantidades de las composiciones farmacéuticas administradas utilizando los procedimientos del presente documento, como las dosis de TIL, dependerán del ser humano o mamífero que se esté tratando, la gravedad del trastorno o afección, la velocidad de administración y la disposición de los ingredientes farmacéuticos activos. y la discreción del médico que prescribe.
Los TIL pueden ser administrados en una sola dosis. Tal administración puede ser mediante inyección, por ejemplo, inyección intravenosa. En algunas formas de realización, los TIL pueden ser administrados en múltiples dosis. La dosificación puede ser una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de seis veces al año. La dosificación puede ser una vez al mes, una vez cada dos semanas, una vez a la semana o una vez cada dos días. La administración de TIL puede continuar tanto tiempo como sea necesario.
Una dosis eficaz de TIL puede ser de alrededor de 1 x 106, 2 x 106, 3 x 106, 4 x 106, 5 x 106,<6>x 106, 7 * 106,<8>* 106, 9 * 106, 1 * 107, 2 * 107, 3 * 107, 4 * 107, 5 * 107,<6>* 107, 7 * 107,<8>* 107, 9 * 107, 1 * 108, 2 * 108, 3 * 108, 4 * 108, 5 * 108,<6>* 108, 7 * 108,<8>* 108, 9 * 108, 1 * 109, 2 * 109, 3 * 109, 4 * 109, 5 * 109,<6>* 109, 7 * 109,<8>* 109, 9 * 109, 1 * 1010, 2 * 1010, 3 * 1010, 4 * 1010, 5 * 1010,<6>* 1010, 7 * 1010,<8>* 1010, 9 * 1010, 1 * 1011, 2 * 1011,<3>*<1 0>11, 4 * 1011, 5 * 1011,<6>* 1011, 7 * 1011,<8>* 1011, 9 * 1011, 1 * 1012, 2 * 1012, 3 * 1012, 4 * 1012, 5 * 1012,<6>* 1012, 7 * 1012,<8>* 1012, 9 * 1012, 1 * 1013, 2 * 1013, 3 * 1013, 4 * 1013, 5 * 1013,<6>* 1013, 7 * 1013,<8>* 10<13>y 9 * 1013. Una dosificación eficaz de TIL puede estar en el intervalo de 1 x 10<6>a S x 106, 5 x 10<6>a 1 x 107, 1 x 10<7>a 5 x 107, 5 x 10<7>a 1 * 108, 1 * 10<8>a 5 * 108, 5 * 10<8>a 1 * 109, 1 * 10<9>a 5 * 109, 5 * 10<9>a 1 * 1010, 1 * 10<10>a 5 * 1010, 5 * 10<10>a 1 * 1011, 5 * 10<11>a 1 * 1012, 1 * 10<12>a 5 * 10<12>y 5 * 10<12>a 1 * 1013.
Una dosis eficaz de TIL puede estar en el intervalo de alrededor de 0.01 mg/kg a alrededor de 4.3 mg/kg, alrededor de 0.15 mg/kg a alrededor de 3.6 mg/kg, alrededor de 0.3 mg/kg a alrededor de 3.2 mg/kg, alrededor de 0.35 mg/kg a alrededor de 2.85 mg/kg, alrededor de 0.15 mg/kg a alrededor de 2.85 mg/kg, alrededor de 0.3 mg a alrededor de 2.15 mg/kg, alrededor de 0.45 mg/kg a alrededor de 1.7 mg/kg, alrededor de 0.15 mg/kg a alrededor de 1.3 mg/kg, alrededor de 0.3 mg/kg a alrededor de 1.15 mg/kg, alrededor de 0.45 mg/kg a alrededor de 1 mg/kg, alrededor de 0.55 mg/kg a alrededor de 0.85 mg/kg, alrededor de 0.65 mg/kg a alrededor de 0.8 mg/kg, alrededor de 0.7 mg/kg a alrededor de 0.75 mg/kg, alrededor de 0.7 mg/kg a alrededor de 2.15 mg/kg, alrededor de 0.85 mg/kg a alrededor de 2 mg/kg, alrededor de 1 mg/kg a alrededor de 1.85 mg/kg, alrededor de 1.15 mg/kg a alrededor de 1.7 mg/kg, alrededor de 1.3 mg/kg mg a alrededor de 1.6 mg/kg, alrededor de 1.35 mg/kg a alrededor de 1.5 mg/kg, alrededor de 2.15 mg/kg a alrededor de 3.6 mg/kg, alrededor de 2.3 mg/kg a alrededor de 3.4 mg/kg, alrededor de 2.4 mg/kg a alrededor de 3.3 mg/kg, alrededor de 2.6 mg/kg a alrededor de 3.15 mg/kg, alrededor de 2.7 mg/kg a alrededor de 3 mg/kg, alrededor de 2.8 mg/kg a alrededor de 3 mg/kg, o alrededor de 2.85 mg/kg hasta alrededor de 2.95 mg/kg.
Una dosis eficaz de TIL puede estar en el intervalo de alrededor de 1 mg a alrededor de 500 mg, alrededor de 10 mg a alrededor de 300 mg, alrededor de 20 mg a alrededor de 250 mg, alrededor de 25 mg a alrededor de 200 mg, alrededor de 1 mg a alrededor de alrededor de 50 mg, alrededor de 5 mg a alrededor de 45 mg, alrededor de 10 mg a alrededor de 40 mg, alrededor de 15 mg a alrededor de 35 mg, alrededor de 20 mg a alrededor de 30 mg, alrededor de 23 mg a alrededor de 28 mg, alrededor de 50 mg a alrededor de 150 mg, alrededor de 60 mg a alrededor de 140 mg, alrededor de 70 mg a alrededor de 130 mg, alrededor de 80 mg a alrededor de 120 mg, alrededor de 90 mg a alrededor de 110 mg, o alrededor de 95 mg a alrededor de 105 mg, alrededor de 98 mg a alrededor de 102 mg, alrededor de 150 mg a alrededor de 250 mg, alrededor de 160 mg a alrededor de 240 mg, alrededor de 170 mg a alrededor de 230 mg, alrededor de 180 mg a alrededor de 220 mg, alrededor de 190 mg a alrededor de 210 mg, alrededor de 195 mg a alrededor de 205 mg, o alrededor de 198 a alrededor de 207 mg.
Se puede administrar una cantidad eficaz de TIL en dosis únicas o múltiples mediante cualquiera de los modos aceptados de administración de agentes que tienen utilidades similares, incluidas las vías intranasal y transdérmica, mediante inyección intraarterial, intravenosa, intraperitoneal, parenteral, intramuscular, subcutánea, por vía tópica, por trasplante o por inhalación.
G. Análisis de viabilidad celular opcional
Opcionalmente, se puede realizar un ensayo de viabilidad celular después de la primera expansión de la etapa B, usando ensayos estándar conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede realizar un ensayo de exclusión con azul tripán en una muestra de TIL a granel, que marca selectivamente las células muertas y permite una evaluación de viabilidad. Otros ensayos para usar en las pruebas de viabilidad pueden incluir, entre otros, el ensayo de azul de Alamar; y el ensayo MTT.
1. Recuento celular, viabilidad, citometría de flujo
En algunas formas de realización, se miden los recuentos de células y/o la viabilidad. La expresión de marcadores como, entre otros, CD3, CD4, CD<8>y CD56, así como cualquier otro divulgado o descrito en el presente documento, se puede medir mediante citometría de flujo con anticuerpos, por ejemplo, pero sin limitarse a los disponibles comercialmente en BD Bio- ciencias (BD Biosciences, San José, CA) utilizando un citómetro de flujo FACSCanto™ (BD Biosciences). Las células se pueden contar manualmente usando un hemocitómetro de chip c desechable (VWR, Batavia, IL) y la viabilidad se puede evaluar usando cualquier procedimiento conocido en la técnica, que incluye, entre otros, la tinción con azul tripán.
En algunas realizaciones, los TIL se analizan para determinar los porcentajes de población de células CD3+. En algunas realizaciones, los TIL para uso en el tratamiento se analizan para determinar los porcentajes de población de células CD3+. En algunas realizaciones, los TIL son TIL CD3+/CD45+. En algunas realizaciones, el porcentaje de CD3+ está entre aproximadamente el 70 % y aproximadamente el 99,9 %. En algunas realizaciones, el porcentaje de CD3+ está entre aproximadamente el 74 % y aproximadamente el 99,9 %. En algunas realizaciones, el porcentaje de CD3+ está entre aproximadamente el 74 % y aproximadamente el 99,9 %. En algunas realizaciones, el porcentaje de CD3+ está entre aproximadamente el 74 % y aproximadamente el 97,1 %. En algunas realizaciones, el porcentaje de CD3+ está entre aproximadamente el 80 % y aproximadamente el 99,9 %. En algunas realizaciones, el porcentaje de CD3+ está entre aproximadamente el 85 % y aproximadamente el 99,9 %. En algunas realizaciones, el porcentaje de CD3+ está entre aproximadamente el 90 % y aproximadamente el 99,9 %. En algunas realizaciones, el porcentaje de CD3+ está entre aproximadamente el 85 % y aproximadamente el 95 %. En algunas realizaciones, el porcentaje de CD3+ está entre aproximadamente el 80 % y aproximadamente el 95 %. En algunas realizaciones, el porcentaje de CD3+ está entre aproximadamente el 95 % y aproximadamente el 99,9 %. En algunas realizaciones, el porcentaje de CD3+/CD45+ está entre aproximadamente el 70 % y aproximadamente el 99,9 %. En algunas realizaciones, el porcentaje de CD3+/CD45+ está entre aproximadamente el 74 % y aproximadamente el 99,9 %. En algunas realizaciones, el porcentaje de CD3+/CD45+ está entre aproximadamente el 74 % y aproximadamente el 99,9 %. En algunas realizaciones, el porcentaje de CD3+/CD45+ está entre aproximadamente el 74 % y aproximadamente el 97,1 %. En algunas realizaciones, el porcentaje de CD3+/CD45+ está entre aproximadamente el 80 % y aproximadamente el 99,9 %. En algunas realizaciones, el porcentaje de CD3+/CD45+ está entre aproximadamente el 85 % y aproximadamente el 99,9 %. En algunas realizaciones, el porcentaje de CD3+/CD45+ está entre aproximadamente el 90 % y aproximadamente el 99,9 %. En algunas realizaciones, el porcentaje de CD3+/CD45+ está entre aproximadamente el 85 % y aproximadamente el 95 %. En algunas realizaciones, el porcentaje de CD3+/CD45+ está entre aproximadamente el 80 % y aproximadamente el 95 %. En algunas realizaciones, el porcentaje de CD3+/CD45+ está entre aproximadamente el 95 % y aproximadamente el 99,9 %.
En algunos casos, la población de TIL a granel se puede crioconservar inmediatamente, utilizando los protocolos que se describen más adelante. Alternativamente, la población de TIL a granel puede someterse a<r>E<p>y luego crioconservarse como se describe más adelante. De manera similar, en el caso de que en terapia se utilicen TIL modificados genéticamente, las poblaciones de REP TIL a granel pueden someterse a modificaciones genéticas para tratamientos adecuados.
2. Cultivos celulares
En una forma de realización, un procedimiento para expandir TIL puede incluir el uso de alrededor de 5,000 mL a alrededor de 25,000 mL de medio celular, de alrededor de 5,000 mL a alrededor de 10,000 mL de medio celular o de alrededor de 5,800 mL a alrededor de 8,700 mL de medio celular. En una forma de realización, expandir el número de TIL no usa más de un tipo de medio de cultivo celular. Puede usarse cualquier medio de cultivo celular adecuado, por ejemplo, medio celular AIM-V (L-glutamina, sulfato de estreptomicina de 50 pM y sulfato de gentamicina de 10 pM) medio de cultivo celular (Invitrogen, Carlsbad CA). A este respecto, los procedimientos de la invención reducen ventajosamente la cantidad de medio y el número de tipos de medio requeridos para expandir el número de TIL. En una forma de realización, expandir el número de TIL puede comprender agregar medio de cultivo celular fresco a las células (también denominado alimentación de las células) no más frecuentemente que cada tercer o cuarto día. La expansión del número de células en un recipiente permeable al gas simplifica los procedimientos necesarios para expandir el número de células al reducir la frecuencia de alimentación necesaria para expandir las células.
En una forma de realización, el medio celular en el primer y/o segundo recipiente permeable a los gases no está filtrado. El uso de medio celular sin filtrar puede simplificar los procedimientos necesarios para expandir el número de células. En una forma de realización, el medio celular en el primer y/o segundo recipiente permeable a los gases carece de beta-mercaptoetanol (BME).
En una forma de realización, la duración del procedimiento comprende obtener una muestra de tejido tumoral del mamífero; cultivar la muestra de tejido tumoral en un primer recipiente permeable al gas que contiene medio celular; obtener TIL de la muestra de tejido tumoral; expandir el número de TIL en un segundo recipiente permeable al gas que contiene medio celular usando aAPC durante una duración de alrededor de 14 a alrededor de 42 días, por ejemplo, alrededor de 28 días.
En una forma de realización, los TIL se expanden en contenedores permeables a los gases. Se han utilizado recipientes permeables a los gases para expandir TIL utilizando PBMC utilizando procedimientos, composiciones y dispositivos conocidos en la técnica, incluidos los descritos en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. No. 2005/0106717 A1. En una forma de realización, los TIL se expanden en bolsas permeables a los gases. En una forma de realización, los TIL se expanden utilizando un sistema de expansión celular que expande los TIL en bolsas permeables al gas, como el Xuri Cell Expansion System W25 (GE Healthcare). En una forma de realización, los TIL se expanden usando un sistema de expansión celular que expande los TIL en bolsas permeables al gas, como el WAVE Bioreactor System, también conocido como Xuri Cell Expansion System W5 (Ge Healthcare). En una forma de realización, el sistema de expansión celular incluye una bolsa celular permeable a los gases con un volumen seleccionado del grupo que consta de alrededor de 100 mL, alrededor de 200 mL, alrededor de 300 mL, alrededor de 400 mL, alrededor de 500 mL, alrededor de 600 mL, alrededor de 700 mL, alrededor de 800 mL, alrededor de 900 mL, alrededor de 1 L, alrededor de 2 L, alrededor de 3 L, alrededor de 4 L, alrededor de 5 L, alrededor de<6>L, alrededor de 7 L, alrededor de<8>L, alrededor de 9 L y alrededor de 10 L. En una forma de realización, los TIL se pueden expandir en matraces G-Rex (disponibles comercialmente en Wilson Wolf Manufacturing). Tales formas de realización permiten que las poblaciones de células se expandan desde alrededor de 5x10<5>células/cm<2>a entre 10x10<6>y 30x106 células/cm2. En una forma de realización, esta expansión se lleva a cabo sin agregar medio de cultivo celular fresco a las células (también denominado alimentación de las células). En una forma de realización, esto es sin alimentación siempre que el medio resida a una altura de alrededor de 10 cm en el matraz G-Rex. En una forma de realización, esto es sin alimentación, pero con la adición de una o más citocinas. En una forma de realización, la citocina se puede agregar como un bolo sin necesidad de mezclar la citocina con el medio. Dichos contenedores, dispositivos y procedimientos son conocidos en la técnica y se han utilizado para expandir los TIL, e incluyen los descritos en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US 2014/0377739A1, publicación internacional No. WO 2014/210036 A1, publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US 2013/0115617 A1, publicación internacional No. WO 2013/188427 A1, solicitud de patente de EE. UU. No. US 2011/0136228 A1, patente de EE. UU. No. US 8.809,050 B2, publicación internacional No. WO 2011/072088 A2, publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US 2016/0208216 A1, publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US 2012/0244133 A1, publicación internacional No. WO 2012/129201 A1, publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US 2013/0102075 A1, patente de EE. UU. No. US 8,956,860 B2, publicación internacional No. WO 2013/173835 A1, publicación de solicitud de patente estadounidense No. US 2015/0175966 A1. Dichos procedimientos también se describen en Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35:283-292. Optional Genetic Engineering of TILs.
En algunas formas de realización, los TIL se diseñan opcionalmente genéticamente para incluir funcionalidades adicionales que incluyen, entre otras, un receptor de células T de alta afinidad (TCR), por ejemplo, un TCR dirigido a un antígeno asociado a un tumor como MAGe-1, HER2 o NY-ESO-1, o un receptor de antígeno quimérico (CAR) que se une a una molécula de la superficie celular asociada a un tumor (por ejemplo, mesotelina) o una molécula de la superficie celular de linaje restringido (por ejemplo, CD19).
H. Crioconservación opcional de TIL
Como se discutió anteriormente, y se ejemplificó en las etapas A a E como se proporciona en la Figura 27, la crioconservación puede ocurrir en numerosos puntos a lo largo del procedimiento de expansión de TIL. En algunas formas de realización, la población expandida de TIL después de la segunda expansión (como se proporciona, por ejemplo, según la etapa D de la Figura 27) se puede crioconservar. La crioconservación generalmente se puede lograr colocando la población de TIL en una solución de congelación, por ejemplo, suero AB inactivado con suplemento al 85% y dimetilsulfóxido (DMSO) al 15%. Las células en solución se colocan en viales criogénicos y se almacenan durante 24 horas a -80°C, con transferencia opcional a congeladores de nitrógeno gaseoso para crioconservación. Véase Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986. En algunas formas de realización, los TIL se crioconservan en DMSO al 5%. En algunas formas de realización, los TIL se crioconservan en medio de cultivo celular más DMSO al 5%. En algunas formas de realización, los TIL se crioconservan de acuerdo con los procedimientos proporcionados en los Ejemplos<8>y 9.
Cuando sea apropiado, las células se sacan del congelador y se descongelan en un baño de agua a 37°C hasta que alrededor de 4/5 de la solución se descongelan. Las células generalmente se resuspenden en medio completo y opcionalmente se lavan una o más veces. En algunas formas de realización, los TIL descongelados pueden contarse y evaluarse para determinar su viabilidad como se conoce en la técnica.
I. Características fenotípicas de los TIL expandidos
En alguna forma de realización, los TIL se analizan para determinar la expresión de numerosos marcadores fenotípicos después de la expansión, incluidos los descritos en el presente documento y en los Ejemplos. En una forma de realización, se examina la expresión de uno o más marcadores fenotípicos. En algunas formas de realización, las características fenotípicas de los TIL se analizan después de la primera expansión en la etapa B. En algunas formas de realización, las características fenotípicas de los TIL se analizan durante la transición en la etapa C. En algunas formas de realización, las características fenotípicas de los TIL son analizados durante la transición según la etapa C y después de la crioconservación. En algunas formas de realización, las características fenotípicas de los TIL se analizan después de la segunda expansión según la etapa D. En algunas formas de realización, las características fenotípicas de los TIL se analizan después de dos o más expansiones según la etapa D. En algunas formas de realización, el marcador es seleccionado del grupo que consiste en TCRab (es decir, TCRa/p/), CD57, CD28, CD4, CD27, CD56, CD<8>a, CD45RA, CD<8>a, CCR7, CD4, CD3, CD38 y HLA-DR. En algunas formas de realización, el marcador se selecciona del grupo que consiste en TCRab (es decir, TCRa/p), CD57, CD28, CD4, CD27, CD56 y CD<8>a. En una forma de realización, el marcador se selecciona del grupo que consiste en CD45RA, CD<8>a, CCR7, CD4, CD3, CD38 y HLA-DR. En algunas formas de realización, se examina la expresión de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece o catorce marcadores. En algunas formas de realización, se examina la expresión de uno o más marcadores de cada grupo. En algunas formas de realización, se mantiene la expresión de uno o más de HLA-DR, CD38 y CD69 (es decir, no muestra una diferencia estadísticamente significativa) en TIL frescos en comparación con TIL descongelados. En algunas formas de realización, el estado de activación de los TIL se mantiene en los TIL descongelados.
En una forma de realización, se mide la expresión de uno o más marcadores reguladores. En algunas formas de realización, el marcador regulador se selecciona del grupo que consiste en CD137, CD<8>a, Lag3, CD4, CD3, PD-1, TIM-3, CD69, CD<8>a, TIGIT, CD4, CD3, KLRG1 y CD154. En algunas formas de realización, el marcador regulador se selecciona del grupo que consiste en CD137, CD<8>a, Lag3, CD4, CD3, PD-1 y TIM-3. En algunas formas de realización, el marcador regulador se selecciona del grupo que consiste en CD69, CD<8>a, TIGIT, CD4, CD3, KLRG1 y CD154. En algunas formas de realización, la expresión de la molécula reguladora disminuye en los TIL descongelados en comparación con los TIL frescos. En algunas formas de realización, la expresión de las moléculas reguladoras LAG-3 y TIM-3 disminuye en los TIL descongelados en comparación con los TIL frescos. En algunas formas de realización, no hay una diferencia significativa en la expresión de CD4, CD<8>, NK, TCRap. En algunas formas de realización, no hay una diferencia significativa en la expresión de CD4, CD<8>, NK, TCRap y/o marcadores de memoria en TIL frescos en comparación con TIL descongelados. En algunas formas de realización, no hay una diferencia significativa en la expresión de CD4, CD<8>, NK, TCRap entre los TIL producidos por los procedimientos proporcionados en este documento, como se ejemplifica, por ejemplo, en la Figura 27, y/o los TIL preparados utilizando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento que incluyen, por ejemplo, procedimientos distintos a los incorporados en la Figura 27.
En algunas formas de realización, no se realiza ninguna selección de la primera población de TIL, la segunda población de TIL, la tercera población de TIL, la población de TIL recolectada y/o la población de TIL terapéutica basada en la expresión de CD4, CD<8>y/o NK, TCRap durante ninguna de las etapas, incluidos los descritos anteriormente o los que se proporcionan, por ejemplo, en la Figura 27. En algunas formas de realización, no se realiza ninguna selección de la primera población de TIL basada en CD4, CD<8>y/o NK, TCRap. En algunas formas de realización, no se realiza ninguna selección de la segunda población de TIL basada en la expresión de CD4, CD<8>y/o NK, TCRap. En algunas formas de realización, no se realiza ninguna selección de la tercera población de TIL basada en la expresión de CD4, CD<8>y/o NK, TCRap. En algunas formas de realización, no se realiza ninguna selección de la población recolectada de TIL basada en la expresión de CD4, CD<8>y/o NK, TCRap. En algunas formas de realización, no se realiza ninguna selección de la población terapéutica de TIL basada en la expresión de CD4, CD<8>y/o NK, TCRap.
También se describe en el presente documento, pero no se reivindica, que no se puede realizar ninguna selección de la primera población de TIL, la segunda población de TIL, la tercera población de TIL o la población de TIL recolectada basada en la expresión de CD4, CD<8>y/o NK, TCRap durante cualquiera de las etapas (a) a (f) del procedimiento para expandir linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) en una población terapéutica de TIL que comprende:
(a) obtener una primera población de TIL de un tumor extirpado de un paciente convirtiendo una muestra de tumor obtenida del paciente en múltiples fragmentos de tumor
(b) agregar los fragmentos de tumor a un sistema cerrado;
(c) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, donde la primera expansión se realiza durante alrededor de 3-14 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y donde la transición desde la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema;
(d) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza durante alrededor de 7-14 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL que comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una segunda área superficial permeable al gas, y en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema;
(e) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (d), en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (e) al (f) ocurre sin abrir el sistema.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, que no se puede realizar ninguna selección de la primera población de TIL, la segunda población de TIL, la tercera población de TIL o la población de TIL recolectada basada en la expresión de CD4, CD<8>y/o NK, TCRap durante cualquiera de las etapas (a) a (h) del procedimiento para tratar a un sujeto con cáncer, el procedimiento que comprende administrar linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) expandidos que comprende:
(a) obtener una primera población de TIL de un tumor extirpado de un sujeto convirtiendo una muestra de tumor obtenida del paciente en múltiples fragmentos de tumor;
(b) agregar los fragmentos de tumor a un sistema cerrado;
(c) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, donde la primera expansión se realiza durante alrededor de 3-14 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y donde la transición desde la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema;
(d) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza durante alrededor de 7-14 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL que comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una segunda área superficial permeable al gas, y en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema;
(e) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (d), en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (e) al (f) ocurre sin abrir el sistema;
(g) opcionalmente crioconservar la bolsa de infusión que comprende la población de TIL recolectada de la etapa (f) usando un procedimiento de crioconservación; y
(b) administrar una dosis terapéuticamente eficaz de la tercera población de TIL de la bolsa de infusión en la etapa (g) al paciente.
En algunas formas de realización, el marcador de memoria se selecciona del grupo que consiste en CCR7 y CD62L
En algunas formas de realización, la viabilidad de los TIL frescos en comparación con los TIL descongelados es al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos el 98%. En algunas formas de realización, la viabilidad de los TIL tanto frescos como descongelados es mayor al 70%, mayor al 75%, mayor al 80%, mayor al 85%, mayor al 90%, mayor al 95% o mayor al 98%. En algunas formas de realización, la viabilidad tanto del producto fresco como descongelado es mayor al 80%, mayor al 81%, mayor al 82%, mayor al 83%, mayor al 84%, mayor al 85%, mayor al<8 6>%, mayor más del 87%, mayor al<8 8>%, mayor al 89% o mayor al 90%. En algunas formas de realización, la viabilidad del producto tanto fresco como descongelado es mayor al<8 6>%.
En una forma de realización, los TIL reestimulados también pueden evaluarse para la liberación de citocinas, usando ensayos de liberación de citocinas. En algunas formas de realización, los TIL pueden evaluarse para la secreción de interferón-7 (IFN-7) en respuesta a la estimulación con OKT3 o cocultivo con digestión de tumor autólogo. Por ejemplo, en las formas de realización que emplean estimulación con OKT3, los TIL se lavan extensamente y se preparan pocillos duplicados con 1 x 10<5>células en 0.2 mL de CM en placas de fondo plano de 96 pocillos recubiertas previamente con 0.1 o 1.0 pg/mL de OKT3 diluido en solución salina con pH regulado con fosfato. Después de la incubación durante la noche, se recogen los sobrenadantes y se mide el IFN-7 en el sobrenadante mediante ELISA (Pierce/Endogen, Woburn, MA). Para el ensayo de cocultivo, se colocan 1 x 10<5>células de TIL en una placa de 96 pocillos con células tumorales autólogas. (Relación 1:1). Después de una incubación de 24 horas, se recogen los sobrenadantes y se puede cuantificar la liberación de IFN-7, por ejemplo, mediante ELISA.
Análisis de citometría de flujo de biomarcadores de superficie celular: Se tomaron alícuotas de muestras de TIL para análisis de citometría de flujo de marcadores de superficie celular; véase, por ejemplo, Ejemplos 7,<8>y 9.
En algunas formas de realización, los TIL se están evaluando para varios marcadores reguladores. En algunas formas de realización, el marcador regulador se selecciona del grupo que consiste en TCR a/p, CD56, CD27, CD28, CD57, CD45RA, CD45RO, CD25, CD127, CD95, IL-2R-, CCR7, CD62L, KLRG1 y CD122. En algunas formas de realización, el marcador regulador es TCR a/p. En algunas formas de realización, el marcador regulador es CD56. En algunas formas de realización, el marcador regulador es CD27. En algunas formas de realización, el marcador regulador es CD28. En algunas formas de realización, el marcador regulador es CD57. En algunas formas de realización, el marcador regulador es CD45RA. En algunas formas de realización, el marcador regulador es CD45RO. En algunas formas de realización, el marcador regulador es CD25. En algunas formas de realización, el marcador regulador es CD127. En algunas formas de realización, el marcador regulador es CD95. En algunas formas de realización, el marcador regulador es IL-2R-. En algunas formas de realización, el marcador regulador es CCR7. En algunas formas de realización, el marcador regulador es CD62L. En algunas formas de realización, el marcador regulador es KLRG1. En algunas formas de realización, el marcador regulador es CD122.
En una forma de realización, los TIL expandidos se analizan para la expresión de numerosos marcadores fenotípicos, incluidos los descritos en el presente documento y en los Ejemplos. En una forma de realización, se examina la expresión de uno o más marcadores fenotípicos. En algunas formas de realización, el marcador se selecciona del grupo que consiste en TCRab (es decir, TCRa/p), CD57, CD28, CD4, CD27, CD56, CD<8>a, CD45RA, CD<8>a, CCR7, CD4, CD3, CD38 y HLA-DR. En algunas formas de realización, el marcador se selecciona del grupo que consiste en TCRab (es decir, TCRa/p), CD57, CD28, CD4, CD27, CD56 y CD<8>a. En una forma de realización, el marcador se selecciona del grupo que consiste en CD45RA, CD<8>a, C<c>R7, CD4, CD3, CD38 y HLA-DR. En algunas formas de realización, se examina la expresión de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece o catorce marcadores. En algunas formas de realización, se examina la expresión de uno o más marcadores de cada grupo. En algunas formas de realización, se mantiene la expresión de uno o más de HLA-DR, CD38 y CD69 (es decir, no muestra una diferencia estadísticamente significativa) en TIL frescos en comparación con TIL descongelados. En algunas formas de realización, el estado de activación de los TIL se mantiene en los TIL descongelados.
En una forma de realización, se mide la expresión de uno o más marcadores reguladores. En algunas formas de realización, el marcador regulador se selecciona del grupo que consiste en CD137, CD<8>a, Lag3, CD4, CD3, PD1, TIM-3, CD69, CD<8>a, TIGIT, CD4, CD3, KLRG1 y CD154. En algunas formas de realización, el marcador regulador se selecciona del grupo que consiste en CD137, CD<8>a, Lag3, CD4, CD3, PD1 y TIM-3. En algunas formas de realización, el marcador regulador se selecciona del grupo que consiste en CD69, CD<8>a, TIGIT, CD4, CD3, KLRG1 y CD154. En algunas formas de realización, la expresión de la molécula reguladora disminuye en los TIL descongelados en comparación con los TIL frescos. En algunas formas de realización, la expresión de las moléculas reguladoras LAG-3 y TIM-3 disminuye en los TIL descongelados en comparación con los TIL frescos. En algunas formas de realización, no hay una diferencia significativa en la expresión de CD4, CD<8>, NK, TCRap. En algunas formas de realización, no hay una diferencia significativa en la expresión de CD4, CD<8>, NK, TCRap y/o marcadores de memoria en TIL frescos en comparación con TIL descongelados.
En algunas formas de realización, el marcador de memoria se selecciona del grupo que consiste en CCR7 y CD62L.
En algunas formas de realización, la viabilidad de los TIL frescos en comparación con los TIL descongelados es al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos el 98%. En algunas formas de realización, la viabilidad de los TIL tanto frescos como descongelados es mayor al 70%, mayor al 75%, mayor al 80%, mayor al 85%, mayor al 90%, mayor al 95% o mayor al 98%. En algunas formas de realización, la viabilidad tanto del producto fresco como descongelado es mayor al 80%, mayor al 81%, mayor al 82%, mayor al 83%, mayor al 84%, mayor al 85%, mayor al<8 6>%, mayor al 87%, mayor al<8 8>%, mayor al 89% o mayor al 90%. En algunas formas de realización, la viabilidad del producto tanto fresco como descongelado es mayor al<8 6>%.
En una forma de realización, los TIL reestimulados también pueden evaluarse para la liberación de citocinas, usando ensayos de liberación de citocinas. En algunas formas de realización, los TIL pueden evaluarse para la secreción de interferón-7 (IFN-7) en respuesta a la estimulación con OKT3 o cocultivo con digestión de tumor autólogo. Por ejemplo, en las formas de realización que emplean estimulación con OKT3, los TIL se lavan extensamente y se preparan pocillos duplicados con 1 x 10<5>células en 0.2 mL de CM en placas de fondo plano de 96 pocillos recubiertas previamente con 0.1 o 1.0 pg/mL de OKT3 diluido en solución salina con pH regulado con fosfato. Después de la incubación durante la noche, se recogen los sobrenadantes y se mide el IFN-7 en el sobrenadante mediante ELISA (Pierce/Endogen, Woburn, MA). Para el ensayo de cocultivo, se colocan 1 x 10<5>células TIL en una placa de 96 pocillos con células tumorales autólogas. (Relación 1:1). Después de una incubación de 24 horas, se recogen los sobrenadantes y se puede cuantificar la liberación de IFN-7, por ejemplo, mediante ELISA.
En algunas formas de realización, la caracterización fenotípica se examina después de la crioconservación.
J. Salud metabólica de los TIL expandidos
Los TIL reestimulados se caracterizan por una mejora significativa de la glucólisis basal en comparación con los TIL recién recolectados y/o los TIL post-descongelados. En una forma de realización, no se realiza ninguna selección de la primera población de TIL, la segunda población de TIL, la tercera población de TIL, la población de TIL recolectada y/o la población de TIL terapéutica basada en la expresión de CD<8>durante ninguna de las etapas, incluidas las discutidas anteriormente o como se proporciona, por ejemplo, en la Figura 27. En algunas formas de realización, no se realiza ninguna selección de la primera población de TIL basada en la expresión de CD<8>. En algunas formas de realización, no se realiza ninguna selección de la segunda población de TIL basada en la expresión de CD<8>. En algunas formas de realización, no se realiza ninguna selección de la tercera población de TIL basada en la expresión de CD<8>. En algunas formas de realización, no se realiza ninguna selección de la población recolectada de TIL basada en la expresión de CD<8>. En algunas formas de realización, no se realiza ninguna selección de la población terapéutica de TIL basada en la expresión de CD<8>.
También se divulga en el presente documento pero no se reivindica, no se puede realizar ninguna selección de la primera población de TIL, la segunda población de TIL, la tercera población de TIL o la población de TIL recolectada basada en la expresión de CD<8>durante ninguna de las etapas (a) a (f) del procedimiento para expandir los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) en una población terapéutica de TIL que comprende:
(a) obtener una primera población de TIL de un tumor extirpado de un paciente convirtiendo una muestra de tumor obtenida del paciente en múltiples fragmentos de tumor;
(b) agregar los fragmentos de tumor a un sistema cerrado;
(c) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, donde la primera expansión se realiza durante alrededor de 3-14 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y donde la transición desde la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema;
(d) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza durante alrededor de 7-14 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL que comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una segunda área superficial permeable al gas, y en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema;
(e) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (d), en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (e) a la (f) ocurre sin abrir el sistema.
También se divulga en el presente documento pero no se reivindica, no se puede realizar ninguna selección de la primera población de TIL, la segunda población de TIL, la tercera población de TIL o la población de TIL recolectada basada en la expresión de CD<8>durante ninguna de las etapas (a) a (h) del procedimiento. para el tratamiento de un sujeto con cáncer; el procedimiento comprende administrar linfocitos infiltrantes de tumores expandidos (TIL) y comprende:
(a) obtener una primera población de TIL de un tumor extirpado de un sujeto convirtiendo una muestra de tumor obtenida del paciente en múltiples fragmentos de tumor;
(b) agregar los fragmentos de tumor a un sistema cerrado;
(c) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, donde la primera expansión se realiza durante alrededor de 3-14 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y donde la transición desde la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema;
(d) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza durante alrededor de 7-14 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL que comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una segunda área superficial permeable al gas, y en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema;
(e) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (d), en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (e) a la (f) ocurre sin abrir el sistema;
(g) opcionalmente crioconservar la bolsa de infusión que comprende la población de TIL recolectada de la etapa (f) usando un procedimiento de crioconservación; y
(b) administrar una dosis terapéuticamente eficaz de la tercera población de TIL de la bolsa de infusión en la etapa (g) al paciente.
Los TIL preparados mediante los procedimientos descritos en este documento se caracterizan por una mejora significativa de la glucólisis basal en comparación con, por ejemplo, los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos a los que se proporcionan en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En un procedimiento divulgado en el presente documento, no se realiza ninguna selección de la primera población de TIL, la segunda población de TIL, la tercera población de TIL, la población de TIL recolectada y/o la población de TIL terapéutica basada en la expresión de CD<8>durante ninguna de las etapas, incluidas las discutidas anteriormente o como se proporcionan, por ejemplo, en la Figura 27. En algunos procedimientos divulgados en el presente documento, no se realiza ninguna selección de la primera población de TIL basada en la expresión de CD<8>. En algunas formas de realización, no se realiza ninguna selección de la segunda población de TIL basada en la expresión de CD<8>. En algunos procedimientos divulgados en el presente documento, no se realiza ninguna selección de la tercera población de TIL basada en la expresión de CD<8>. En algunos procedimientos divulgados en el presente documento, no se realiza ninguna selección de la población recolectada de TIL basada en la expresión de CD<8>. En algunos procedimientos divulgados en el presente documento, no se realiza ninguna selección de la población terapéutica de TIL basada en la expresión de CD<8>. En un procedimiento divulgado en el presente documento, no se realiza ninguna selección de la primera población de TIL, la segunda población de TIL, la tercera población de TIL o la población de TIL recolectada basada en la expresión de CD<8>durante ninguna de las etapas (a) a (h).
La capacidad respiratoria de reserva (SRC) y la reserva glucolítica pueden evaluarse para los TIL expandidos con diferentes procedimientos de la presente divulgación. La prueba de estrés Seahorse XF Cell Mito mide la función mitocondrial midiendo directamente la tasa de consumo de oxígeno (OCR) de las células, utilizando moduladores de la respiración que se dirigen a los componentes de la cadena de transporte de electrones en las mitocondrias. Los compuestos de prueba (oligomicina, FCCP y una mezcla de rotenona y antimicina A, descritos más adelante) se inyectan en serie para medir la producción de ATP, la respiración máxima y la respiración no mitocondrial, respectivamente. Más adelante, se calculan la fuga de protones y la capacidad respiratoria de reserva utilizando estos parámetros y la respiración basal. Cada modulador se dirige a un componente específico de la cadena de transporte de electrones. La oligomicina inhibe la ATP sintasa (complejo V) y la disminución de OCR después de la inyección de oligomicina se correlaciona con la respiración mitocondrial asociada con la producción de ATP celular. El carbonilcianuro-4 (trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP) es un agente desacoplador que colapsa el gradiente de protones y altera el potencial de la membrana mitocondrial. Como resultado, el flujo de electrones a través de la cadena de transporte de electrones se desinhibe y el complejo IV consume al máximo el oxígeno. El OCR estimulado por FCCP se puede utilizar para calcular la capacidad respiratoria de reserva, definida como la diferencia entre la respiración máxima y la respiración basal. La capacidad respiratoria de reserva (SRC) es una medida de la capacidad de la célula para responder al aumento de la demanda de energía. La tercera inyección es una mezcla de rotenona, un inhibidor del complejo I, y antimicina A, un inhibidor del complejo III. Esta combinación detiene la respiración mitocondrial y permite el cálculo de la respiración no mitocondrial impulsada por procesos fuera de las mitocondrias. En algunas formas de realización, la comparación es, por ejemplo, con TIL recién recolectados y/o TIL preparados usando otros procedimientos distintos a los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados a la Figura 27.
En algunas formas de realización, el ensayo metabólico es la respiración basal. En general, los TIL de segunda expansión tienen una tasa de respiración basal de al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% de la tasa de respiración basal de TIL recién recolectados y/o TIL recién preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento incluyendo, por ejemplo, procedimientos distintos a los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la tasa de respiración basal es de alrededor de el 50% a alrededor de el 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados utilizando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la tasa de respiración basal es de alrededor del 60% a alrededor del 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la tasa de respiración basal es de alrededor de el 70% a alrededor del 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la tasa de respiración basal es de alrededor del 80% a alrededor del 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados utilizando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la tasa de respiración basal es de alrededor del 90% a alrededor del 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la tasa de respiración basal es de alrededor del 95% a alrededor del 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos que los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, los TIL de segunda expansión o los TIL de segunda expansión adicional (como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 27, incluidos los TIL denominados reREP TIL) tienen una tasa de respiración basal que no es estadísticamente significativa distinto de la tasa de respiración basal de TIL recién recolectados y/o TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la comparación es, por ejemplo, con TIL recién recolectados y/o TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados a la Figura 27.
En algunas formas de realización, el ensayo metabólico es capacidad respiratoria de reserva. En general, los TIL de segunda expansión o los TIL de segunda expansión adicional (como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 27, incluidos los TIL denominados reREP TIL) tienen una capacidad respiratoria de reserva que es al menos del 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 97%, al menos el 98%, o al menos el 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la capacidad respiratoria de reserva es de alrededor del 50% a alrededor del 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados. En algunas formas de realización, la capacidad respiratoria de reserva es de alrededor del 50% a alrededor del 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la capacidad respiratoria de reserva es de alrededor del 60% a alrededor del 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o TIL preparados utilizando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la capacidad respiratoria de reserva es de alrededor del 70% a alrededor del 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados utilizando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la capacidad respiratoria de reserva es de alrededor de un 80% a alrededor de un 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados. En algunas formas de realización, la capacidad respiratoria de reserva es de alrededor de 90% a alrededor de 99% de la tasa de respiración basal de TIL recién recolectados y/o TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la capacidad respiratoria de reserva es de alrededor del 95% a alrededor del 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados utilizando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, los TIL de segunda expansión o los TIL de segunda expansión adicional (como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 27, incluidos los TIL denominados reREP TIL) tienen una capacidad respiratoria de reserva que no es diferente de manera estadísticamente significativa de la tasa de respiración basal de TIL recién recolectados y/o TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27.
En general, los TIL de segunda expansión o los TIL de segunda expansión adicional (como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la figura 27, incluidos los TIL denominados reREP TIL) tienen una capacidad respiratoria de reserva que es al menos de al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de la tasa de respiración basal de TIL recién recolectados y/o TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento incluyendo, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, el ensayo metabólico medido es la reserva glucolítica. En algunas formas de realización, el ensayo metabólico es capacidad respiratoria de reserva. Para medir el metabolismo celular (respiratorio), las células se trataron con inhibidores de la respiración mitocondrial y la glucólisis para determinar un perfil metabólico para el TIL que consta de las siguientes medidas: fosforilación oxidativa basal (medida por OCR), capacidad respiratoria de reserva, actividad glucolítica de línea base (como se mide por ECAR) y reserva glucolítica. Los perfiles metabólicos se realizaron utilizando el Ensayo de Prueba de Estrés de Glicólisis/Mitocondrial Combinado Seahorse (incluido el kit disponible comercialmente en Agilent®), que permite determinar la capacidad de las células para realizar glucólisis tras el bloqueo de la producción de ATP mitocondrial. En algunas formas de realización, las células carecen de glucosa, luego se inyecta glucosa, seguida de un agente de estrés. En algunas formas de realización, el agente de estrés se selecciona del grupo que consiste en oligomicina, FCCP, rotenona, antimicina A y/o 2-desoxiglucosa (2-DG), así como combinaciones de las mismas. En algunas formas de realización, se agrega oligomicina a 10 mM. En algunas formas de realización, se agrega FCCP a 10 mM. En algunas formas de realización, se agrega rotenona a 2.5 mM. En algunas formas de realización, se agrega antimicina A a 2.5 mM. En algunas formas de realización, se agrega 2-desoxiglucosa (2-DG) a 500 mM. En algunas formas de realización, se miden la capacidad glucolítica, la reserva glucolítica y/o la acidificación no glucolítica. En general, los TIL tienen una reserva glucolítica de al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados utilizando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la reserva glucolítica es de alrededor del 50% a alrededor del 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la reserva glucolítica es de alrededor del 60% a alrededor del 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la reserva glucolítica es de alrededor de un 70% a alrededor de un 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la reserva glucolítica es de alrededor de un 80% a alrededor de un 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la reserva glucolítica es de alrededor del 90% a alrededor del 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la reserva glucolítica es de alrededor del 95% a alrededor del 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27.
En algunas formas de realización, el ensayo metabólico es la glucólisis basal. En algunas formas de realización, los TIL de segunda expansión o los TIL de segunda expansión adicional (como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 27, incluidos los TIL denominados reREP TIL) tienen un aumento en la glucólisis basal de al menos dos veces, de al menos tres veces, al menos cuatro veces, al menos cinco veces, al menos seis veces, al menos 7 veces, al menos ocho veces, al menos nueve veces o al menos diez veces en comparación con TIL recién recolectados y/o TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, los TIL de segunda expansión o los TIL de segunda expansión adicional (tales como, por ejemplo, las descritas en la etapa D de la Figura 27, incluidos los TIL denominados reREP TIL) tienen un aumento en la glucólisis basal de alrededor de dos veces a alrededor de diez veces en comparación con los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, los TIL de segunda expansión o los TIL de segunda expansión adicional (tales como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 27, incluidos los TIL denominados reREP TIL) tienen un aumento en la glucólisis basal de alrededor de dos veces a alrededor de ocho veces en comparación con los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, los TIL de la segunda expansión o los TIL de la segunda expansión adicional (como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 27, incluidos los TIL denominados reREP TIL) tienen un aumento en la glucólisis basal de alrededor de tres veces a alrededor de siete veces en comparación con los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, los TIL de segunda expansión o los TIL de segunda expansión adicional (tales como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 27, incluidos los TIL denominados reREP TIL) tienen un aumento en la glucólisis basal de alrededor de dos veces a alrededor de cuatro veces en comparación con los TIL recién recolectadas y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, los TIL de segunda expansión o los TIL de segunda expansión adicional (tales como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 27, incluidos los TIL denominados reREP TIL) tienen un aumento en la glucólisis basal de alrededor de dos veces a alrededor de tres veces en comparación con los TIL recién recolectadas y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27.
En general, los TIL de segunda expansión o los TIL de segunda expansión adicional (como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la figura 27, incluidos los TIL denominados reREP TIL) tienen una reserva glucolítica de al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 97%, al menos el 98%, o al menos el 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la reserva glucolítica es de alrededor del 50% a alrededor del 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados. En algunas formas de realización, la reserva glucolítica es de alrededor del 60% a alrededor del 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la reserva glucolítica es de alrededor de un 70% a alrededor de un 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la reserva glucolítica es de alrededor de un 80% a alrededor de un 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la reserva glucolítica es de alrededor del 90% a alrededor del 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados y/o TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la reserva glucolítica es de alrededor de un 95% a alrededor de un 99% de la tasa de respiración basal de los TIL recién recolectados.
Producción de granzima B: la granzima B es otra medida de la capacidad de TIL para destruir células diana. Los sobrenadantes de los medios reestimulados como se describió anteriormente usando anticuerpos para CD3, CD28 y CD137/4-1BB también se evaluaron para sus niveles de Granzima B usando el Kit ELISA Human Granzyme B DuoSet (R & D Systems, Minneapolis, MN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En algunas formas de realización, los TIL de segunda expansión o los TIL de segunda expansión adicional (tales como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 27, incluidos los TIL denominados reREP TIL) han aumentado la producción de Granzima B. En algunas formas de realización, los TIL de segunda expansión o los TIL de segunda expansión adicional (tales como, por ejemplo, los descritos en la etapa D de la Figura 27, incluidos los TIL denominados reREP TIL) tienen una actividad citotóxica aumentada.
En algunas formas de realización, la longitud de los telómeros se puede usar como una medida de la viabilidad celular y/o función celular. En algunas formas de realización, los telómeros tienen sorprendentemente la misma longitud en los TIL producidos por la presente invención en comparación con los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. Medición de la longitud de los telómeros: se han utilizado diversos procedimientos para medir la longitud de los telómeros en preparaciones citológicas y de ADN genómico. El análisis de fragmentos de restricción de telómeros (TRF) es el estándar de oro para medir la longitud de los telómeros (de Lange et al., 1990). Sin embargo, la principal limitación de TRF es el requisito de una gran cantidad de ADN (1,5 A g). Con la presente invención se pueden emplear dos técnicas ampliamente utilizadas para la medición de la longitud de los telómeros, a saber, la hibridación de fluorescencia in situ (FISH; Agilent Technologies, Santa Clara, CA) y la PCR cuantitativa. En algunas formas de realización, no hay cambio en la longitud de los telómeros entre los TlL inicialmente recolectados en la etapa A y los TIL expandidos de, por ejemplo, la etapa D como se proporciona en la Figura 27.
En algunas formas de realización, la salud de TIL se mide mediante la secreción de IFN-gamma (IFN-y). En algunas formas de realización, la secreción de IFN-y es indicativa de TIL activos. En algunas formas de realización, se emplea un ensayo de potencia para la producción de IFN-y. La producción de IFN-y es otra medida del potencial citotóxico. La producción de IFN-y puede medirse determinando los niveles de la citocina IFN-y en el medio de TIL estimulado con anticuerpos a CD3, CD28 y CD137/4-1BB. Los niveles de IFN-y en los medios de estos TIL estimulados pueden determinarse midiendo la liberación de IFN-y. En algunas formas de realización, un aumento en la producción de IFN-y en, por ejemplo, TIL de la etapa D como se proporciona en la Figura 27 en comparación con los TIL recolectados inicialmente en, por ejemplo, la etapa A como se proporciona en la Figura 27, es indicativo de un aumento en el potencial citotóxico de TIL de la etapa D. En algunas formas de realización, la secreción de IFN-y aumenta una, dos, tres, cuatro o cinco veces o más. En algunas formas de realización, la secreción de IFN-Y aumenta una vez. En algunas formas de realización, la secreción de IFN-y aumenta al doble. En algunas formas de realización, la secreción de IFN-y se triplica. En algunas formas de realización, la secreción de IFN-y aumenta cuatro veces. En algunas formas de realización, la secreción de IFN-y aumenta cinco veces. En algunas formas de realización, el IFN-y se mide usando un kit de ELISA Quantikine. En algunas formas de realización, el IFN-y se mide en TIL ex vivo. En algunas formas de realización, el IFN-<y>se mide en TIL ex vivo, incluidos los TIL producidos por los procedimientos de la presente invención, incluidos, por ejemplo, los procedimientos de la Figura 27, así como los TIL recién recolectados o los TIL producidos por otros procedimientos, como los proporcionados, por ejemplo, en la Figura 83 (como, por ejemplo, el procedimiento 1C TIL).
En algunas formas de realización, el potencial citotóxico de TIL para lisar células diana se evaluó usando un ensayo de cocultivo de TIL con la línea celular bioluminiscente, P815 (Clon G<6>), de acuerdo con un ensayo de lisis redirigida bioluminiscente (ensayo de potencia) para ensayo de TIL que mide la citotoxicidad de TIL de una manera dependiente de la dosis altamente sensible.
En algunas formas de realización, los presentes procedimientos proporcionan un ensayo para evaluar la viabilidad de TIL, utilizando los procedimientos descritos anteriormente. En algunas formas de realización, los TIL se expanden como se discutió anteriormente, incluyendo, por ejemplo, lo que se proporciona en la Figura 27. En algunas formas de realización, los TIL se crioconservan antes de evaluar su viabilidad. En algunas formas de realización, la evaluación de viabilidad incluye descongelar los TIL antes de realizar una primera expansión, una segunda expansión y una segunda expansión adicional. En algunas formas de realización, los presentes procedimientos proporcionan un ensayo para evaluar la proliferación celular, la toxicidad celular, la muerte celular y/u otros términos relacionados con la viabilidad de la población de TIL. La viabilidad se puede medir mediante cualquiera de los ensayos metabólicos de TIL descritos anteriormente, así como con cualquier procedimiento conocido para evaluar la viabilidad celular que se conoce en la técnica. En algunas formas de realización, los presentes procedimientos proporcionan un ensayo para la evaluación de la proliferación celular, toxicidad celular, muerte celular y/u otros términos relacionados con la viabilidad de los TIL expandidos usando los procedimientos descritos en este documento, incluidos los ejemplificados en la Figura 27.
La presente invención tambiém proporciona procedimientos de ensayo para determinar la viabilidad de TIL. En algunas formas de realización, los TIL tienen la misma viabilidad en comparación con los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, los TIL tienen una viabilidad incrementada en comparación con los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. La presente divulgación proporciona procedimientos para analizar la viabilidad de TIL mediante la expansión de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) a una población más grande de TIL, que comprende:
(i) obtención de una primera población de TIL previamente expandida;
(ii) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL; y
(iii) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es al menos 100 veces mayor que la segunda población de TIL, y en donde la segunda expansión se realiza durante al menos 14 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, y en las que la tercera población se analiza adicionalmente para determinar su viabilidad.
En algunas realizaciones, el procedimiento comprende, además:
(iv) realizar una segunda expansión adicional suplementando el medio de cultivo celular de la tercera población de TIL con IL-2 adicional, OKT-3 adicional y APC adicionales, en donde la segunda expansión adicional se realiza durante al menos 14 días para obtener una mayor población de TIL que la obtenida en la etapa (iii), en donde la población más grande de TIL comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la tercera población de TIL, y en donde la tercera población se analiza adicionalmente para viabilidad.
En algunas realizaciones, antes de la etapa (i), las células se criopreservan.
En algunas realizaciones, las células se descongelan antes de realizar la etapa (i).
En algunas realizaciones, la etapa (iv) se repite de una a cuatro veces para obtener suficientes TIL para el análisis. En algunas realizaciones, las etapas (i) a (iii) o (iv) se realizan dentro de un período de aproximadamente 40 días a aproximadamente 50 días.
En algunas realizaciones, las etapas (i) a (iii) o (iv) se realizan dentro de un período de aproximadamente 42 días a aproximadamente 48 días.
En algunas realizaciones, las etapas (i) a (iii) o (iv) se realizan dentro de un período de aproximadamente 42 días a aproximadamente 45 días.
En algunas realizaciones, las etapas (i) a (iii) o (iv) se realizan en aproximadamente 44 días.
En algunas realizaciones, las células de las etapas (iii) o (iv) expresan CD4, CD<8>y TCR a p a niveles similares a las células recién recolectadas.
En algunas realizaciones, las células presentadoras de antígenos son células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
En algunas realizaciones, las PBMC se añaden al cultivo celular en cualquiera de los días 9 a 17 en la etapa (iii). En algunas realizaciones, las células T efectoras y/o las células T de memoria central en la población más grande de TIL en la etapa (iv) exhiben una o más características seleccionadas del grupo que consiste en expresión de CD27, expresión de CD28, telómeros más largos, expresión aumentada de CD57 y expresión disminuida de CD56, en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central en la tercera población de células. En algunas realizaciones, las células T efectoras y/o las células T de memoria central exhiben una expresión de CD57 aumentada y una expresión de CD56 disminuida.
En algunas realizaciones, las APC son APC artificiales (aAPC).
En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además la etapa de transducir la primera población de TIL con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un receptor de células T de alta afinidad. En algunas realizaciones, la etapa de transducción ocurre antes de la etapa (i).
En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además la etapa de transducción de la primera población de TIL con un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un anticuerpo de fragmento variable de cadena única fusionado con al menos un endodominio de una molécula de señalización de célula T.
En algunas realizaciones, la etapa de transducción ocurre antes de la etapa (i).
En algunas realizaciones, se analiza la viabilidad de los TIL.
En algunas realizaciones, se analiza la viabilidad de los TIL después de la criopreservación.
En algunas realizaciones, se analiza la viabilidad de los TIL después de la criopreservación y después de la etapa (iv).
Los diversos receptores de antígenos de los linfocitos T y B se producen por recombinación somática de un número limitado, pero grande, de segmentos de gen. Estos segmentos de genes: V (variable), D (diversidad), J (unión) y C (constante), determinan la especificidad de enlace y las aplicaciones posteriores de inmunoglobulinas y receptores de células T (TCR). La presente invención proporciona un procedimiento para generar TIL que exhiben y aumentan la diversidad del repertorio de células T (a veces denominado policlonalidad). En algunas formas de realización, el aumento en la diversidad del repertorio de células T se compara con los TIL recién recolectados y/o los TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, los TIL obtenidos por el presente procedimiento exhiben un aumento en la diversidad del repertorio de células T. En algunas formas de realización, los TIL obtenidos en la primera expansión exhiben un aumento en la diversidad del repertorio de células T. En algunas formas de realización, el aumento de la diversidad es un aumento de la diversidad de inmunoglobulinas y/o la diversidad del receptor de células T. En algunas formas de realización, la diversidad está en la inmunoglobulina; está en la cadena pesada de inmunoglobulina. En algunas formas de realización, la diversidad está en la inmunoglobulina; está en la cadena ligera de inmunoglobulina. En algunas formas de realización, la diversidad está en el receptor de células T. En algunas formas de realización, la diversidad está en uno de los receptores de células T seleccionados del grupo que consiste en receptores alfa, beta, gamma y delta. En algunas formas de realización, hay un aumento en la expresión del receptor de células T (TCR) alfa y/o beta. En algunas formas de realización, hay un aumento en la expresión del receptor de células T (TCR) alfa. En algunas formas de realización, hay un aumento en la expresión del receptor de células T (TCR) beta. En algunas formas de realización, hay un aumento en la expresión de TCRab (es decir, TCRa/p).
De acuerdo con la presente divulgación, un procedimiento para analizar la viabilidad de los TIL y/o su uso adicional en la administración a un sujeto. En algunas realizaciones, el procedimiento para analizar los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) comprende:
(i) obtener una primera población de TIL;
(ii) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL; y
(iii) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la segunda población de TIL;
(iv) recolección, lavado y crioconservación de la tercera población de TIL;
(v) almacenar los TIL crioconservados a una temperatura criogénica;
(vi) descongelar la tercera población de TIL para proporcionar una tercera población descongelada de TIL; y
(vii) realizar una segunda expansión adicional de una porción de la tercera población descongelada de TIL suplementando el medio de cultivo celular de la tercera población con IL-2, OKT-3 y APC durante un período de expansión adicional (a veces denominado período reREP) de al menos 3 días, en donde la tercera expansión se realiza para obtener una cuarta población de TIL, en donde el número de TIL en la cuarta población de TIL se compara con el número de TIL en la tercera población de TIL para obtener un relación;
(viii) determinar basándose en la relación en la etapa (vii) si la población descongelada de TIL es adecuada para la administración a un paciente;
(ix) administrar una dosis terapéuticamente eficaz de la tercera población descongelada de TIL al paciente cuando se determina que la relación entre el número de TIL en la cuarta población de TIL y el número de TIL en la tercera población de TIL es superior a 5:1 en la etapa (viii).
En algunas realizaciones, el período de expansión adicional (a veces denominado período reREP) se realiza hasta que la relación entre el número de TIL en la cuarta población de TIL y el número de TIL en la tercera población de TIL sea mayor que 50:1.
En algunas realizaciones, el número de TIL suficientes para una dosificación terapéuticamente eficaz es de alrededor de 2.3 x 10<10>a alrededor de 13.7 x 1010.
En algunas realizaciones, las etapas (i) a (vii) se realizan dentro de un período de alrededor de 40 días a alrededor de 50 días. En algunas realizaciones, las etapas (i) a (vii) se realizan dentro de un período de alrededor de 42 días a alrededor de 48 días. En algunas realizaciones, las etapas (i) a (vii) se realizan dentro de un período de alrededor de 42 días a alrededor de 45 días. En algunas realizaciones, las etapas (i) a (vii) se realizan en alrededor de 44 días.
En algunas realizaciones, las células de las etapas (iii) o (vii) expresan CD4, CD<8>y TCR a p a niveles similares a las células recién recolectadas. En algunas realizaciones, las células son TIL.
En algunas realizaciones, las células presentadoras de antígeno son células mononucleares de sangre periférica (PBMC). En algunas realizaciones, las PBMC se agregan al cultivo celular en cualquiera de los días 9 a 17 en la etapa (iii).
En algunas realizaciones, las células T efectoras y/o las células T de memoria central en la población más grande de TIL en las etapas (iii) o (vii) exhibien una o más características seleccionadas del grupo que consiste en expresión de CD27, expresión de CD28, telómeros más largos, aumento de la expresión de CD57 y disminución de la expresión de CD56, en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central en la tercera población de células.
En algunas realizaciones, las células T efectoras y/o las células T de memoria central exhiben una expresión de CD57 aumentada y una expresión de CD56 disminuida.
En algunas realizaciones, las APC son APC artificiales (aAPC).
En algunas realizaciones, las etapa de transducción de la primera población de TIL con un vector de expresión comprende un ácido nucleico que codifica un receptor de células T de alta afinidad.
En algunas realizaciones, las etapa de transducción ocurren antes de la etapa (i).
En algunas realizaciones, las etapa de transducción de la primera población de TIL con un vector de expresión comprende un ácido nucleico que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un anticuerpo de fragmento variable de cadena única fusionado con al menos un endodominio de una molécula de señalización de células T.
En algunas realizaciones, las etapa de transducción ocurre antes de la etapa (i).
En algunas realizaciones, se analiza la viabilidad de los TIL después de la etapa (vii).
La presente divulgación también proporciona procedimientos adicionales para analizar TIL. En algunas realizaciones, la divulgación proporciona un procedimiento para analizar TIL que comprende:
(i) obtener una porción de una primera población de TIL crioconservados;
(ii) descongelar la porción de la primera población de TIL crioconservados;
(iii) realizar una primera expansión cultivando la porción de la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) durante un período de expansión adicional (a veces denominado período de reREP) de al menos 3 días, para producir una segunda población de TIL, en donde la porción de la primera población de TIL se compara con la segunda población de TIL para obtener una relación del número de TIL, donde la relación del número de TIL en la segunda población de TIL al número de TIL en la porción de la primera población de TIL es mayor que 5:1;
(iv) determinar basándose en la relación en la etapa (iii) si la primera población de TIL es adecuada para su uso en la administración terapéutica a un paciente;
(v) la determinación de la primera población de TIL es adecuada para su uso en la administración terapéutica cuando se determina que la relación entre el número de TIL en la segunda población de TIL y el número de TIL en la primera población de TIL es superior a 5:1 en la etapa (iv).
En algunas realizaciones, la relación entre el número de TIL en la segunda población de TIL y el número de TIL en la porción de la primera población de TIL es superior a 50:1.
En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además realizar la expansión de la primera población completa de TIL crioconservados de la etapa (i) según los procedimientos descritos en cualquiera de las formas de realización proporcionadas en el presente documento.
En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además administrar la primera población completa de TIL crioconservados desde la etapa (i) al paciente.
K. Sistemas cerrados para la fabricación de TIL
La presente invención proporciona el uso de sistemas cerrados durante el procedimiento de cultivo de TIL. Dichos sistemas cerrados permiten prevenir y/o reducir la contaminación microbiana, permiten el uso de menos matraces y permiten reducir los costes. En algunas formas de realización, el sistema cerrado usa dos contenedores.
Estos sistemas cerrados son bien conocidos en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en http://www.fda.gov/cber/guidelines.htm y https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm0 76779.htm.
En algunas realizaciones, los sistemas cerrados incluyen sistemas luer lock y termosellados como se describe, por ejemplo, en el Ejemplo 30. En algunas realizaciones, se accede al sistema cerrado mediante jeringas en condiciones estériles para mantener la esterilidad y la naturaleza cerrada del sistema. En algunas realizaciones, se emplea un sistema cerrado como se describe en el Ejemplo 30. En algunas realizaciones, los TIL se formulan en un recipiente de formulación de producto final según el procedimiento descrito en el Ejemplo 30, sección 8.14 "Formulación y llenado final".
Como se proporciona en el sitio web de la FDA, los sistemas cerrados con procedimientos estériles son conocidos y están bien descritos. Véase https://www.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/Blood/ucm0 76779.htm, como se menciona anteriormente y se proporciona en la parte pertinente más adelante. Introducción
Los dispositivos de conexión estériles (STCD) producen soldaduras estériles entre dos piezas de tubería compatible. Este procedimiento permite la conexión estéril de una variedad de recipientes y diámetros de tubo. Esta guía describe las prácticas y los procedimientos recomendados para el uso de estos dispositivos. Esta guía no aborda los datos o la información que un fabricante de un dispositivo de conexión estéril debe enviar a la FDA para obtener la aprobación o autorización para su comercialización. También es importante tener en cuenta que el uso de un dispositivo de conexión estéril aprobado o autorizado para fines no autorizados en el etiquetado puede hacer que el dispositivo se considere adulterado y etiquetado incorrectamente según la Ley Federal de Alimentos, Medicamentos y Cosméticos.
1. Recomendaciones de la FDA
Los fabricantes de productos sanguíneos que proponen usar rutinariamente un STCD autorizado por la FDA deberían incorporar información sobre dicho uso en los manuales de procedimientos operativos estándar (POE) para cada producto sanguíneo. Estas entradas deben incluir mantenimiento de registros, seguimiento de productos, control de calidad de soldadura de tubos, números de lote de software y desechables (incluidas las fuentes de los elementos que se agregarán). Los procedimientos de control de calidad deben incluir una prueba de la integridad de cada soldadura.
2. Aplicaciones del STCD
El usuario debe ser consciente de que el uso del dispositivo puede crear un nuevo producto o modificar significativamente la configuración de un producto regulado para el que no se ha demostrado seguridad y eficacia. Para aquellos "nuevos productos" sujetos a licencia, las solicitudes o suplementos de solicitud deben enviarse a la FDA además de la presentación de un POE. En general, la combinación o mezcla que involucra componentes celulares representa un cambio en el producto que requiere la presentación y aprobación de una solicitud de licencia o un suplemento de solicitud. Dichas aplicaciones y suplementos de aplicación deben contener datos y descripciones de los procedimientos de fabricación que demuestren que el "nuevo producto" es seguro y eficaz para el uso previsto durante el período de datación propuesto.
Los siguientes comentarios se proporcionan como orientación sobre los usos más comunes de una STCD autorizada o aprobada por la FDA:
L. Agregar una aguja nueva o más pequeña a un equipo de extracción de sangre
No se considera que el uso del STCD para agregar una aguja antes del inicio de un procedimiento (extracción de sangre entera, plaquetaféresis o recolección de plasma fuente) abra un sistema funcionalmente cerrado. Si se agrega una aguja durante un procedimiento, solo se debe usar un STCD aprobado para soldar tubos llenos de líquido. Si la prueba de integridad de la soldadura es satisfactoria, no se considera que el uso de un STCD abra un sistema funcionalmente cerrado.
Las plaquetas, la feresis preparada en un sistema abierto deben etiquetarse con una fecha de vencimiento de 24 horas y las plaquetas, los productos de feresis preparados en un sistema funcionalmente cerrado deben etiquetarse con una fecha de vencimiento de cinco días (véase Revised Guideline for Collection of Platelets, Pheresis, October 7, 1988).
La fuente y las especificaciones de los tubos y agujas añadidos deben abordarse en los POE y los registros del centro de sangre. El uso del STCD para agregar agujas no representa un cambio importante en la fabricación para el cual los establecimientos autorizados necesitan aprobación previa.
M. Uso del STCD para preparar componentes
Cuando se usa el STCD para unir bolsas de preparación de componentes adicionales, se deben mantener registros de modo apropiado identificando la fuente de los paquetes de transferencia y la verificación apropiada del número de unidad de sangre y ABO/Rh. Toda la sangre y los componentes sanguíneos deben estar debidamente etiquetados (21 CFR 606.121).
Ejemplos:
• Adición de una cuarta bolsa a un paquete triple de recolección de sangre entera para la producción de AHF crioprecipitado a partir de plasma fresco congelado.
• Conexión de una solución aditiva a una unidad de glóbulos rojos.
• Adición de un filtro en línea que ha sido aprobado por la FDA para su uso en la fabricación de componentes.
• Adición de un tercer contenedor de almacenamiento a un arnés de plaquetaféresis.
• Para los usos indicados anteriormente, se deben desarrollar procedimientos y mantener registros, pero los titulares de licencias no necesitan la aprobación de la FDA para establecer los procedimientos.
1. Uso del STCD para agrupar productos hemoderivados
El uso apropiado de un STCD para agrupar las plaquetas preparadas a partir de la extracción de sangre entera puede evitar la contaminación potencial de las entradas de intensificación y puertos que se usan comúnmente. La combinación realizada inmediatamente antes de la transfusión es un ejemplo de este uso apropiado. Las plaquetas combinadas deben administrarse no más de 4 horas después de la combinación (véase 21 CFR 606.122 (I) (2)). Sin embargo, la combinación y el almacenamiento posterior pueden aumentar el riesgo en comparación con la administración de unidades de donantes al azar; si una unidad contaminada se combina con otras y se almacena antes de la administración, el inóculo bacteriano total administrado puede aumentar como resultado de la replicación en el volumen adicional. Por consiguiente, el uso propuesto de un STCD para agrupar y almacenar plaquetas durante más de 4 horas debería estar respaldado por datos que aborden satisfactoriamente si tal agrupación está asociada con un mayor riesgo.
Tal agrupación de plaquetas constituye la fabricación de un nuevo producto.
El agrupamiento o mezcla que involucra plaquetas se considera la fabricación de un nuevo producto que requiere la presentación y aprobación de una solicitud de licencia o suplemento de solicitud si el período de almacenamiento debe exceder las cuatro horas.
2. Uso del STCD para preparar una alícuota para uso pediátrico y unidades divididas
Las unidades pediátricas y las unidades divididas de sangre entera, glóbulos rojos y plasma fresco congelado preparadas con un STCD no se considerarán un producto nuevo para el que se requiere un suplemento de solicitud de licencia biológica (BLA) siempre que se cumplan las siguientes condiciones:
El fabricante debe tener una licencia biológica aprobada o un suplemento de licencia para el producto original (es decir, no dividido), incluida la aprobación de cada anticoagulante utilizado.
Las etiquetas deben enviarse para su revisión y aprobación antes de su distribución. Se debe hacer una anotación en la sección de comentarios del Formulario 2567 de la FDA, Transmisión de etiquetas y circulares.
Deben utilizarse envases de producto final aprobados para el almacenamiento del componente que se está preparando.
Las plaquetas fabricadas bajo licencia deben contener al menos 5,5 X (10)<10>plaquetas (21 CFR 640.24 (c)). Plaquetas, féresis fabricada bajo licencia debe contener al menos 3.0 X (10)<11>plaquetas (véase Revised Guideline forthe Collection of Platelets, Pheresis, October 7, 1988).
Los procedimientos a seguir con respecto al uso de un STCD para preparar productos divididos de recolecciones de sangre entera y de plasma y plaquetas preparados mediante procedimientos de hemaféresis automatizados deben incluir descripciones de:
• cómo se modificará el arnés de aféresis o el recipiente de recolección con un STCD aprobado por la FDA; • el volumen mínimo del plasma fraccionado o de los productos hemoderivados;
• el volumen y la concentración de plaquetas de los productos de plaquetaféresis dividida;
• tiempo de almacenamiento del producto. El producto debe estar en un recipiente aprobado y debe ser consistente con el tiempo de almacenamiento que figura en la etiqueta de dicho recipiente;
• procedimiento (s) que se utilizarán para etiquetar y rastrear productos divididos en los registros del centro de sangre.
NOTA: Los procedimientos para etiquetar las alícuotas deben establecerse claramente en el procedimiento, el mantenimiento de registros debe ser adecuado para permitir el seguimiento y la retirada de todos los componentes, si es necesario.
3. Uso de un STCD para conectar líneas adicionales de solución salina o anticoagulante durante un procedimiento de plasmaféresis automatizado
Se deben desarrollar procedimientos y mantener registros consistentes con las instrucciones de uso del fabricante del instrumento, pero los titulares de licencia no necesitan tener la aprobación de la FDA para establecer los procedimientos.
4. Uso del STCD para adjuntar soluciones de tratamiento
Cuando se usa un STCD para unir contenedores con soluciones de tratamiento a productos de glóbulos rojos lavados o congelados, el período de datación para los productos resultantes es de 24 horas, a menos que los datos se proporcionen en forma de solicitudes de licencia o suplementos de solicitud al CBER para respaldar un período de datación más largo (21 CFR 610.53 (c)). Las exenciones o modificaciones deben ser aprobadas por escrito por el Director, CBER (21 CFR 610.53 (d)).
5. Uso de un STCD para agregar un filtro de reducción de leucocitos aprobado por la FDA
Algunos filtros de leuco-reducción no están unidos integralmente a los sistemas de recolección de sangre entera. Los procedimientos de uso de un STCD para la filtración previa al almacenamiento deben ser consistentes con las instrucciones de uso de los fabricantes de filtros.
La reducción de leucocitos antes de la emisión constituye un cambio de fabricación importante. Por lo tanto, para los nuevos productos con contenido reducido de leucocitos preparados con un STCd , los fabricantes deben presentar solicitudes de licencia de productos biológicos (21 CFR 601.2) o suplementos de solicitud de aprobación previa a la FDA (21 CFR 601.12).
Usar un STCD para extraer muestras de recipientes de productos sanguíneos para su análisis (por ejemplo, usar un STCD para obtener una muestra de plaquetas de un recipiente de plaquetas o plaquetas, féresis para comparación cruzada).
Si el volumen y/o recuento de células del producto después de la extracción de la muestra difieren de lo que se indica en la etiqueta original o en la circular de información, la etiqueta del producto debe modificarse para reflejar el nuevo volumen y/o recuento celular. Por ejemplo, es posible que no se extraigan muestras que reduzcan el recuento de plaquetas de una unidad de plaquetas a menos de 5.5 x (10)<10>plaquetas (21 CFR 640.24 (c)).
<6>. Información adicional de la guía de la FDA
La guía de la FDA presenta una guía general, así como información específica y ejemplos relacionados con las especificaciones para la presentación de solicitudes y suplementos de solicitud a la FDA que abordan el uso de un STCD. Si surgen más preguntas sobre el uso apropiado de un STCD, las inquietudes deben dirigirse a la Oficina de Investigación y Revisión de Sangre, Centro de Evaluación e Investigación Biológica.
En algunas formas de realización, el sistema cerrado usa un recipiente desde el momento en que se obtienen los fragmentos tumorales hasta que los TIL están listos para la administración al paciente o la crioconservación. En algunas formas de realización, cuando se utilizan dos recipientes, el primer recipiente es un recipiente G cerrado y la población de TIL se centrifuga y se transfiere a una bolsa de infusión sin abrir el primer recipiente G cerrado. En algunas formas de realización, cuando se utilizan dos recipientes, la bolsa de infusión es una bolsa de infusión que contiene HypoThermosol. Un sistema cerrado o un sistema de cultivo de células TIL cerrado se caracteriza porque una vez que se han agregado la muestra del tumor y/o los fragmentos del tumor, el sistema se sella herméticamente desde el exterior para formar un ambiente cerrado libre de la invasión de bacterias, hongos y/o o cualquier otra contaminación microbiana.
En algunas formas de realización, la reducción de la contaminación microbiana está entre alrededor de un 5% y alrededor de un 100%. En algunas formas de realización, la reducción de la contaminación microbiana está entre alrededor de un 5% y alrededor de un 95%. En algunas formas de realización, la reducción de la contaminación microbiana está entre alrededor de un 5% y alrededor de un 90%. En algunas formas de realización, la reducción de la contaminación microbiana está entre alrededor de un 10% y alrededor de un 90%. En algunas formas de realización, la reducción de la contaminación microbiana está entre alrededor del 15% y alrededor del 85%. En algunas formas de realización, la reducción de la contaminación microbiana es alrededor del 5%, alrededor del 10%, alrededor del 15%, alrededor del 20%, alrededor del 25%, alrededor del 30%, alrededor del 35%, alrededor del 40%, alrededor del 45%, alrededor del 50%, alrededor del 55%, alrededor del 60%, alrededor del 65%, alrededor del 70%, alrededor del 75%, alrededor del 80%, alrededor del 85%, alrededor del 90%, alrededor del 95%, alrededor del 97%, alrededor del 98%, alrededor del 99% o alrededor de 100%.
El sistema cerrado permite el crecimiento de TIL en ausencia y/o con una reducción significativa de la contaminación microbiana.
Además, el pH, la presión parcial de dióxido de carbono y la presión parcial de oxígeno del entorno de cultivo de células TIL varían cada uno a medida que se cultivan las células. En consecuencia, aunque se haga circular un medio apropiado para el cultivo celular, el entorno cerrado todavía necesita mantenerse constantemente como un entorno óptimo para la proliferación de TIL. Para ello, es deseable que los factores físicos de pH, presión parcial de dióxido de carbono y presión parcial de oxígeno dentro del líquido de cultivo del ambiente cerrado sean monitoreados por medio de un sensor, cuya señal se utiliza para controlar un intercambiador de gas instalado en la entrada del entorno de cultivo y la presión parcial de ese gas del entorno cerrado se ajustan en tiempo real de acuerdo con los cambios en el líquido de cultivo para optimizar el entorno de cultivo celular. En algunas formas de realización, la presente invención proporciona un sistema de cultivo de células cerradas que incorpora en la entrada al ambiente cerrado un intercambiador de gas equipado con un dispositivo de monitoreo que mide el pH, la presión parcial de dióxido de carbono y la presión parcial de oxígeno del ambiente cerrado, y optimiza el entorno de cultivo celular ajustando automáticamente las concentraciones de gas en función de las señales del dispositivo de monitorización.
En algunas formas de realización, la presión dentro del entorno cerrado se controla de forma continua o intermitente. Es decir, la presión en el ambiente cerrado se puede variar por medio de un dispositivo de mantenimiento de presión, por ejemplo, asegurando así que el espacio sea adecuado para el crecimiento de TIL en un estado de presión positiva, o promoviendo la exudación de fluido en un estado de presión negativa y promoviendo así la proliferación celular. Aplicando presión negativa de manera intermitente, además, es posible reemplazar uniforme y eficientemente el líquido circulante en el ambiente cerrado por medio de una contracción temporal en el volumen del ambiente cerrado.
En algunas formas de realización, pueden sustituirse o agregarse componentes de cultivo óptimos para la proliferación de los TIL, y que incluyen factores tales como IL-2 y/o OKT3, así como puede agregarse una combinación.
C. Cultivos celulares
En una forma de realización, un procedimiento para expandir los TIL, incluidos los discutidos anteriormente y los ejemplificados en la Figura 27, puede incluir el uso de alrededor de 5,000 mL a alrededor de 25,000 mL de medio celular, alrededor de 5,000 mL a alrededor de 10,000 mL de medio celular, o alrededor de 5,800 mL a alrededor de 8,700 mL de medio celular. En algunas formas de realización, el medio es un medio sin suero, como se describe, por ejemplo, en el Ejemplo 21. En algunas formas de realización, el medio en la primera expansión está libre de suero. En algunas formas de realización, el medio en la segunda expansión está libre de suero. En algunas formas de realización, los medios de la primera expansión y la segunda están libres de suero. En una forma de realización, expandir el número de TIL no usa más de un tipo de medio de cultivo celular. Puede usarse cualquier medio de cultivo celular adecuado, por ejemplo, medio celular AIM-V (L-glutamina, sulfato de estreptomicina de 50 pM y sulfato de gentamicina de 10 pM) medio de cultivo celular (Invitrogen, Carlsbad CA). A este respecto, los procedimientos de la invención reducen ventajosamente la cantidad de medio y el número de tipos de medio requeridos para expandir el número de TIL. En una forma de realización, expandir el número de TIL puede comprender alimentar a las células con una frecuencia no mayor a cada tercer o cuarto día. La expansión del número de células en un recipiente permeable al gas simplifica los procedimientos necesarios para expandir el número de células al reducir la frecuencia de alimentación necesaria para expandir las células.
En una forma de realización, el medio celular en el primer y/o segundo recipiente permeable a los gases no está filtrado. El uso de medio celular sin filtrar puede simplificar los procedimientos necesarios para expandir el número de células. En una forma de realización, el medio celular en el primer y/o segundo recipiente permeable a los gases carece de beta-mercaptoetanol (BME).
En una realización, la duración del procedimiento que comprende obtener una muestra de tejido tumoral del mamífero; cultivar la muestra de tejido tumoral en un primer recipiente permeable al gas que contiene medio celular; obtener TIL de la muestra de tejido tumoral; expandir el número de TIL en un segundo recipiente permeable al gas que contiene medio celular puede ser de alrededor de 7 a 14 días, por ejemplo, alrededor de 11 días. En algunas formas de realización, el pre-REP es de alrededor de 7 a 14 días, por ejemplo, alrededor de 11 días. En algunas formas de realización, REP es de alrededor de 7 a 14 días, por ejemplo, alrededor de 11 días.
En una forma de realización, los TIL se expanden en contenedores permeables a los gases. Se han utilizado recipientes permeables a los gases para expandir TIL utilizando PBMC, utilizando procedimientos, composiciones y dispositivos conocidos en la técnica, incluidos los descritos en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. No. 2005/0106717 A1. En una forma de realización, los TIL se expanden en bolsas permeables a los gases. En una forma de realización, los TIL se expanden utilizando un sistema de expansión celular que expande los TIL en bolsas permeables al gas, como el Xuri Cell Expansion System W25 (GE Healthcare). En una forma de realización, los TIL se expanden usando un sistema de expansión celular que expande los TIL en bolsas permeables al gas, como el WAVE Bioreactor System, también conocido como Xuri Cell Expansion System W5 (Ge Healthcare). En una forma de realización, el sistema de expansión celular incluye una bolsa celular permeable a los gases con un volumen seleccionado del grupo que consta de alrededor de 100 mL, alrededor de 200 mL, alrededor de 300 mL, alrededor de 400 mL, alrededor de 500 mL, alrededor de 600 mL, alrededor de 700 mL, alrededor de 800 mL, alrededor de 900 mL, alrededor de 1 L, alrededor de 2 L, alrededor de 3 L, alrededor de 4 L, alrededor de 5 L, alrededor de<6>L, alrededor de 7 L, alrededor de<8>L, alrededor de 9 L y alrededor de 10 L.
En una forma de realización, los TIL se pueden expandir en matraces G-Rex (disponibles comercialmente en Wilson Wolf Manufacturing). Tales formas de realización permiten que las poblaciones de células se expandan desde alrededor de 5x10<5>células/cm<2>a entre 10x10<6>y 30x106 células/cm<2>En una forma de realización, esto es sin alimentación. En una forma de realización, esto es sin alimentación siempre que el medio resida a una altura de alrededor de 10 cm en el matraz G-Rex. En una forma de realización, esto es sin alimentación, pero con la adición de una o más citocinas. En una forma de realización, la citocina se puede agregar como un bolo sin necesidad de mezclar la citocina con el medio. Dichos contenedores, dispositivos y procedimientos son conocidos en la técnica y se han utilizado para expandir los TIL, e incluyen los descritos en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US 2014/0377739A1, la publicación internacional No. WO 2014/210036 A1, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US 2013/0115617 A1, la publicación internacional No. WO 2013/188427 A1, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US 2011/0136228 A1, la patente de EE. UU. No. US 8,809,050 B2, la publicación internacional No. WO 2011/072088 A2, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US 2016/0208216 A1, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US 2012/0244133 A1, la publicación internacional No. WO 2012/129201 A1, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US 2013/0102075 A1, la patente de EE. UU. No. US 8,956,860 B2, la publicación internacional No. WO 2013/173835 A1, la publicación de solicitud de patente estadounidense No. US 2015/0175966 A1. Dichos procedimientos también se describen en Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35: 283-292.
D. Ingeniería genética opcional de TIL
En algunas formas de realización, opcionalmente los TIL se diseñan genéticamente para incluir funcionalidades adicionales que incluyen, entre otras, un receptor de células T de alta afinidad (TCR), por ejemplo, un TCR dirigido a un antígeno asociado a un tumor como MAGE-1, HER2 o NY-ESO-1, o un receptor de antígeno quimérico (CAR) que se une a una molécula de superficie celular asociada a un tumor (por ejemplo, mesotelina) o una molécula de superficie celular de linaje restringido (por ejemplo, CD19).
E. Crioconservación opcional de TIL
Opcionalmente, se puede crioconservar o bien la población de TIL a granel o la población expandida de TIL. En algunas formas de realización, la crioconservación se produce en la población terapéutica de TIL. En algunas formas de realización, la crioconservación se produce en los TIL recolectados después de la segunda expansión. En algunas formas de realización, la crioconservación se produce en los TIL en la etapa F ejemplar de la Figura 27. En algunas formas de realización, los TIL se crioconservan en la bolsa de infusión. En algunas formas de realización, los TIL se crioconservan antes de colocarlos en una bolsa de infusión. En algunas formas de realización, los TIL se crioconservan y no se colocan en una bolsa de infusión. En algunas formas de realización, la crioconservación se realiza utilizando un medio de crioconservación. En algunas formas de realización, el medio de crioconservación contiene dimetilsulfóxido (DMSO). Esto generalmente se logra poniendo la población de TIL en una solución de congelación, por ejemplo, 85% de suero AB inactivado con suplemento y 15% de dimetilsulfóxido (DMSO). Las células en solución se colocan en viales criogénicos y se almacenan durante 24 horas a -80°C, con transferencia opcional a congeladores de nitrógeno gaseoso para crioconservación. Véase, Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986.
Cuando sea apropiado, las células se retiran del congelador y se descongelan en un baño de agua a 37°C hasta que se descongelan alrededor de 4/5 de la solución. Las células generalmente se resuspenden en medio completo y opcionalmente se lavan una o más veces. En algunas formas de realización, los TIL descongelados pueden contarse y evaluarse para determinar su viabilidad como se conoce en la técnica.
En una forma de realización preferida, una población de TIL se crioconserva usando medio de crioconservación CS10 (CryoStor 10, BioLife Solutions). En una forma de realización preferida, una población de TIL se crioconserva usando un medio de crioconservación que contiene dimetilsulfóxido (DMSO). En una forma de realización preferida, una población de TIL se crioconserva usando una relación 1:1 (vol: vol) de CS 10 y medio de cultivo celular. En una forma de realización preferida, una población de TIL se crioconserva usando una relación de alrededor de 1:1 (vol: vol) de CS10 y medio de cultivo celular que comprende además IL-2 adicional.
Como se discutió anteriormente en las etapas A a E, la crioconservación puede ocurrir en numerosos puntos a lo largo del procedimiento de expansión de TIL. En algunas formas de realización, se pueden crioconservar la población de TIL a granel después de la primera expansión de acuerdo con la etapa B o la población expandida de TIL después de una o más segundas expansiones de acuerdo con la etapa D. La crioconservación generalmente se puede lograr colocando la población de TIL en una solución de congelación, por ejemplo, suero AB inactivado con suplemento al 85% y dimetilsulfóxido (DMSO) al 15%. Las células en solución se colocan en viales criogénicos y se almacenan durante 24 horas a -80°C, con transferencia opcional a congeladores de nitrógeno gaseoso para crioconservación. Véase Sadeghi, et al., Acta Oncologica 2013, 52, 978-986.
Cuando sea apropiado, las células se retiran del congelador y se descongelan en un baño de agua a 37°C hasta que se descongelan alrededor de 4/5 de la solución. Las células generalmente se resuspenden en medio completo y opcionalmente se lavan una o más veces. En algunas formas de realización, los TIL descongelados pueden contarse y evaluarse para determinar su viabilidad, tal como se conoce en la técnica.
En algunos casos, la población de TIL de la Etapa B se puede crioconservar inmediatamente, utilizando los protocolos que se explican más adelante. Alternativamente, la población de TIL a granel puede someterse a la etapa C y a la etapa D y luego crioconservarse después de la etapa D. De manera similar, en el caso de que se utilicen TIL modificados genéticamente en terapia, las poblaciones de TIL de la etapa B o de la etapa D pueden someterse a modificaciones para tratamientos adecuados.
F. Análisis de viabilidad celular opcionales
Opcionalmente, se puede realizar un ensayo de viabilidad celular después de la primera expansión (a veces denominada expansión inicial a granel), usando ensayos estándar conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede realizar un ensayo de exclusión con azul tripán en una muestra de TIL a granel, que marca selectivamente las células muertas y permite una evaluación de viabilidad. Otros ensayos para usar en las pruebas de viabilidad pueden incluir, entre otros, el ensayo de azul de Alamar; y el ensayo MTT.
1. Recuento celular, viabilidad, citometría de flujo
En algunas formas de realización, se miden los recuentos y/o la viabilidad de células. La expresión de marcadores tales como, pero no limitados a, CD3, CD4, CD<8>y CD56, así como cualquier otro divulgado o descrito en el presente documento, se puede medir mediante citometría de flujo con anticuerpos, por ejemplo, pero sin limitarse a los disponibles comercialmente en BD Bio-sciences (BD Biosciences, San José, CA) utilizando un citómetro de flujo FACSCanto™ (BD Biosciences). Las células se pueden contar manualmente usando un hemocitómetro de chip c desechable (VWR, Batavia, IL) y la viabilidad se puede evaluar usando cualquier procedimiento conocido en la técnica, que incluye, entre otros, la tinción con azul tripán.
En algunos casos, la población de TIL a granel se puede crioconservar inmediatamente, usando los protocolos que se explican más adelante. Alternativamente, la población de TIL a granel puede someterse a REP y luego crioconservarse como se explica más adelante. De manera similar, en el caso de que en terapia se utilicen TIL modificados genéticamente, las poblaciones de TIL a granel o REP pueden someterse a modificaciones genéticas para tratamientos adecuados.
2. Cultivos celulares
En una forma de realización, un procedimiento para expandir TIL puede incluir el uso de alrededor de 5,000 mL a alrededor de 25,000 mL de medio celular, de alrededor de 5,000 mL a alrededor de 10,000 mL de medio celular o de alrededor de 5,800 mL a alrededor de 8,700 mL de medio celular. En una forma de realización, expandir el número de TIL no usa más de un tipo de medio de cultivo celular. Puede usarse cualquier medio de cultivo celular adecuado, por ejemplo, medio celular AIM-V (L-glutamina, sulfato de estreptomicina de 50 pM y sulfato de gentamicina de 10 pM) medio de cultivo celular (Invitrogen, Carlsbad CA). A este respecto, los procedimientos de la invención reducen ventajosamente la cantidad de medio y el número de tipos de medio requeridos para expandir el número de TIL. En una forma de realización, expandir el número de TIL puede comprender alimentar a las células con una frecuencia no mayor a cada tercer o cuarto día. La expansión del número de células en un recipiente permeable al gas simplifica los procedimientos necesarios para expandir el número de células al reducir la frecuencia de alimentación necesaria para expandir las células.
En una forma de realización, el medio celular en el primer y/o segundo recipiente permeable a los gases no está filtrado. El uso de medio celular sin filtrar puede simplificar los procedimientos necesarios para expandir el número de células. En una forma de realización, el medio celular en el primer y/o segundo recipiente permeable a los gases carece de beta-mercaptoetanol (BME).
En una realización, la duración del procedimiento comprende obtener una muestra de tejido tumoral del mamífero; cultivar la muestra de tejido tumoral en un primer recipiente permeable al gas que contiene medio celular; obtener TIL de la muestra de tejido tumoral; expandir el número de TIL en un segundo recipiente permeable al gas que contiene medio celular usando aAPC por una duración de alrededor de 14 a alrededor de 42 días, por ejemplo, alrededor de 28 días.
En una forma de realización, los TIL se expanden en recipientes permeables a los gases. Se han utilizado recipientes permeables a los gases para expandir TIL utilizando PBMC, utilizando procedimientos, composiciones y dispositivos conocidos en la técnica, incluidos los descritos en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. No. 2005/0106717 A1. En una forma de realización, los TIL se expanden en bolsas permeables a los gases. En una forma de realización, los TIL se expanden utilizando un sistema de expansión celular que expande los TIL en bolsas permeables al gas, como el Xuri Cell Expansion System W25 (GE Healthcare). En una forma de realización, los TIL se expanden usando un sistema de expansión celular que expande los TIL en bolsas permeables al gas, como el WAVE Bioreactor System, también conocido como Xuri Cell Expansion System W5 (G<e>Healthcare). En una forma de realización, el sistema de expansión celular incluye una bolsa celular permeable a los gases con un volumen seleccionado del grupo que consta de alrededor de 100 mL, alrededor de 200 mL, alrededor de 300 mL, alrededor de 400 mL, alrededor de 500 mL, alrededor de 600 mL, alrededor de 700 mL, alrededor de 800 mL, alrededor de 900 mL, alrededor de 1 L, alrededor de 2 L, alrededor de 3 L, alrededor de 4 L, alrededor de 5 L, alrededor de<6>L, alrededor de 7 L, alrededor de<8>L, alrededor de 9 L y alrededor de 10 L.
En una forma de realización, los TIL se pueden expandir en matraces G-Rex (disponibles comercialmente en Wilson Wolf Manufacturing). Tales formas de realización permiten que las poblaciones de células se expandan desde alrededor de 5x10<5>células/cm<2>a entre 10x10<6>y 30x106 células/cm<2>En una forma de realización, esto es sin alimentación. En una forma de realización, esto es sin alimentación siempre que el medio resida a una altura de alrededor de 10 cm en el matraz G-Rex. En una forma de realización, esto es sin alimentación, pero con la adición de una o más citocinas. En una forma de realización, la citocina se puede agregar como un bolo sin necesidad de mezclar la citocina con el medio. Dichos contenedores, dispositivos y procedimientos son conocidos en la técnica y se han utilizado para expandir los TIL, e incluyen los descritos en la publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US 2014/0377739A1, la publicación internacional No. WO 2014/210036 A1, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US 2013/0115617 A1, la publicación internacional No. WO 2013/188427 A1, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US 2011/0136228 A1, la patente de EE. UU. No. US 8.809,050 B2, la publicación internacional No. WO 2011/072088 A2, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US 2016/0208216 A1, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US 2012/0244133 A1, la publicación internacional No. WO 2012/129201 A1, la publicación de solicitud de patente de EE. UU. No. US 2013/0102075 A1, la patente de EE. UU. No. US 8,956,860 B2, la publicación internacional No. WO 2013/173835 A1, la publicación de solicitud de patente estadounidense No. US 2015/0175966 A1. Dichos procedimientos también se describen en Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35: 283-292.
Ingeniería genética opcional de TIL
En algunas formas de realización, opcionalmente los TIL se diseñan genéticamente para incluir funcionalidades adicionales, que incluyen, entre otras, un receptor de células T de alta afinidad (TCR), por ejemplo, un TCR dirigido a un antígeno asociado a tumores como MAGE-1, HER2 o NY-ESO-1, o un receptor de antígeno quimérico (CAR) que se une a una molécula de superficie celular asociada a un tumor (por ejemplo, mesotelina) o una molécula de superficie celular de linaje restringido (por ejemplo, CD19).
IV. Procedimientos de tratamiento de pacientes
Los procedimientos de tratamiento comienzan con la recolección inicial de TIL y el cultivo de TIL. Ambos procedimientos han sido descritos en la técnica, por ejemplo, por Jin et al., J. Immunotherapy, 2012, 35 (3): 283 292. Se describen procedimientos de tratamiento a lo largo de las secciones siguientes, incluidos los Ejemplos.
Los TIL expandidos producidos de acuerdo con los procedimientos descritos en este documento, incluidos, por ejemplo, los descritos en las etapas A a F anteriores o de acuerdo con las etapas A a F anteriores (también como se muestra, por ejemplo, en la Figura 27) encuentran un uso particular en el tratamiento de pacientes con cáncer (por ejemplo, como se describe en Goff, et al., J. Clinical Oncology, 2016, 34 (20): 2389-239, así como el contenido suplementario. En algunas formas de realización, se cultivaron TIL a partir de depósitos extirpados del melanoma metastásico como se describió anteriormente (véase, Dudley, et al., J Immunother., 2003,<2 6>: 332-342). El tumor fresco se puede diseccionar en condiciones estériles. Se puede recolectar una muestra representativa para un análisis patológico formal. Fragmentos individuales de 2 mm<3>a 3 mm3. En algunas realizaciones, se obtienen 5, 10, 15, 20, 25 o 30 muestras por paciente. En algunas realizaciones, se obtienen 20, 25 o 30 muestras por paciente. En algunas realizaciones, se obtienen 20, 22, 24, 26 o 28 muestras por paciente. En algunas realizaciones, se obtienen 24 muestras por paciente. Las muestras se pueden colocar en pocillos de una placa de 24 pocillos, mantenerse en medio de crecimiento con IL-2 en dosis altas (6,000 UI/mL) y controlarse para detectar la destrucción del tumor y/o la proliferación de TIL. Cualquier tumor con células viables que queden después del tratamiento se puede digerir enzimáticamente en una suspensión de células individuales y crioconservarse, como se describe en el presente documento.
En algunas formas de realización, se puede tomar una muestra de TIL cultivada con éxito para el análisis de fenotipo (CD3, CD4, CD<8>y CD56) y ensayar contra un tumor autólogo cuando esté disponible. El TIL puede considerarse reactivo si el cocultivo durante la noche produjo niveles de interferón-gamma (IFN-y) > 200 pg/mL y el doble de fondo. (Goff et al., J Immunother., 2010, 33: 840-847). En algunas formas de realización, se pueden seleccionar cultivos con evidencia de reactividad autóloga o patrones de crecimiento suficientes para una segunda expansión (por ejemplo, una segunda expansión como se proporciona de acuerdo con la etapa D de la Figura 27), incluidas las segundas expansiones que a veces se denominan expansión rápida (REP). En algunas formas de realización, los TIL expandidos con alta reactividad autóloga (por ejemplo, alta proliferación durante una segunda expansión), se seleccionan para una segunda expansión adicional. En algunas formas de realización, los TIL con alta reactividad autóloga (por ejemplo, alta proliferación durante la segunda expansión como se proporciona en la etapa D de la Figura 27), se seleccionan para una segunda expansión adicional según la etapa D de la Figura 27.
También se fivulga en el presente documento pero no se reivindica, el paciente no se puede trasladar directamente a ACT (transferencia celular adoptiva); por ejemplo, después de la recolección del tumor y/o una primera expansión, las células no se pueden utilizar inmediatamente. En procedimientos divulgados en el presente documento, los TIL se pueden crioconservar y descongelar 2 días antes de la administración a un paciente. En procedimientos divulgados en el presente documento, los TIL se pueden crioconservar y descongelar 1 día antes de la administración a un paciente. En procedimientos divulgados en el presente documento, los TIL se pueden crioconservar y descongelar inmediatamente antes de la administración a un paciente.
Los fenotipos celulares de muestras crioconservadas de bolsa de infusión TIL se pueden analizar mediante citometría de flujo (por ejemplo, FlowJo) para los marcadores de superficie CD3, CD4, CD<8>, CCR7 y CD45RA (BD BioSciences), así como mediante cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento. Las citocinas séricas se midieron usando técnicas estándar de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas. Un aumento de IFN-g sérico se definió como > 100 pg/mL y superior a 43 niveles basales.
En algunas formas de realización, los TIL producidos por los procedimientos proporcionados en este documento, por ejemplo, los ejemplificados en la Figura 27, proporcionan una mejora sorprendente en la eficacia clínica de los TIL. En algunas formas de realización, los TIL producidos por los procedimientos proporcionados en este documento, por ejemplo, los ejemplificados en la Figura 27, exhiben una mayor eficacia clínica en comparación con los TIL producidos por procedimientos distintos de los descritos en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los ejemplificados en la Figura 27. En algunas formas de realización, los procedimientos distintos de los descritos en este documento incluyen procedimientos denominados procedimiento 1C y/o Generación 1 (Gen 1). En algunas formas de realización, la eficacia aumentada se mide mediante DCR, ORR y/u otras respuestas clínicas. En algunas formas de realización, los TIL producidos por los procedimientos proporcionados en este documento, por ejemplo, los ejemplificados en la Figura 27, exhiben un tiempo de respuesta similar y un perfil de seguridad en comparación con los TIL producidos por procedimientos distintos de los descritos en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los ejemplificado en la Figura 27, por ejemplo, el procedimiento Gen 1.
En algunas formas de realización, IFN-gamma (IFN-<y>) es indicativo de la eficacia del tratamiento y/o eficacia clínica aumentada. En algunas formas de realización, el IFN-y en la sangre de sujetos tratados con TIL es indicativo de TIL activos. En algunas formas de realización, se emplea un ensayo de potencia para la producción de IFN-y. La producción de IFN-y es otra medida del potencial citotóxico. La producción de IFN-y se puede medir determinando los niveles de la citocina IFN-<y>en la sangre, suero o TIL ex vivo de un sujeto tratado con TIL preparado por los procedimientos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 27. En algunas formas de realización, un aumento de IFN-y es indicativo de la eficacia del tratamiento en un paciente tratado con los TIL producidos por los procedimientos de la presente invención. En algunas formas de realización, el IFN-y aumenta una, dos, tres, cuatro o cinco veces o más en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los que se proporcionan en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la secreción de IFN-<y>aumenta una vez en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la secreción de IFN-<y>aumenta dos veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la secreción de IFN-y aumenta tres veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la secreción de IFN-<y>aumenta cuatro veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la secreción de IFN-<y>aumenta cinco veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados utilizando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, el IFN-<y>se mide usando un kit de ELISA Quantikine. En algunas formas de realización, el IFN-<y>se mide en TIL ex vivo de un sujeto tratado con TIL preparado mediante los procedimientos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 27. En algunas formas de realización, el iFN-y se mide en la sangre de un sujeto tratado con TIL preparados mediante los procedimientos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 27. En algunas formas de realización, el IFN-y se mide en el suero de TIL de un sujeto tratado con TIL preparado mediante los procedimientos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 27.
En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-10 es indicativo de la eficacia del tratamiento y/o la eficacia clínica aumentada. En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-10 en la sangre de los sujetos tratados con TIL es indicativo de TIL activos. La producción de IP-10 puede medirse determinando los niveles de IP<- 10>en la sangre de un sujeto tratado con TlL preparados por los procedimientos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 27. En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-10 es indicativo de la eficacia del tratamiento en un paciente tratado con los TlL producidos por los procedimientos de la presente invención. En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-10 se correlaciona con un aumento de una, dos, tres, cuatro o cinco veces o más en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TlL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-10 se correlaciona con un aumento de una vez en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los encarnados en la Figura 27. En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-10 se correlaciona con un aumento de dos veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los encarnados en la Figura 27. En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-10 se correlaciona con un aumento de tres veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los encarnados en la Figura 27. En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-10 se correlaciona con un aumento de cuatro veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los encarnados en la Figura 27. En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-10 se correlaciona con un aumento de cinco veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los encarnados en la Figura 27. En algunas formas de realización, IP-10 se mide en la sangre de un sujeto tratado con TIL preparados mediante los procedimientos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 27. En algunas formas de realización, IP-10 se mide en suero de TIL de un sujeto tratado con TIL preparado mediante los procedimientos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 27.
En algunas formas de realización, un promedio más alto de MCP-1 es indicativo de la eficacia del tratamiento y/o eficacia clínica incrementada. En algunas formas de realización, el promedio más alto de MCP-1 en la sangre de sujetos tratados con TIL es indicativo de TIL activos. La producción de MCP-1 se puede medir determinando los niveles de MCP-1 en la sangre de un sujeto tratado con TIL preparados por los procedimientos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 27. En algunas formas de realización, el promedio más alto de MCP-1 es indicativo de la eficacia del tratamiento en un paciente tratado con los TIL producidos por los procedimientos de la presente invención. En algunas formas de realización, el promedio más alto de MCP-1 se correlaciona con un aumento de una, dos, tres, cuatro o cinco veces o más en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, un promedio más alto de MCP-1 se correlaciona con un aumento de una vez en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los encarnados en la Figura 27. En algunas formas de realización, un promedio más alto de MCP-1 se correlaciona con un aumento de dos veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los encarnados en la Figura 27. En algunas formas de realización, un promedio más alto de MCP-1 se correlaciona con un aumento de tres veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los encarnados en la Figura 27. En algunas formas de realización, un promedio más alto de MCP-1 se correlaciona con un aumento de cuatro veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los encarnados en la Figura 27. En algunas formas de realización, un promedio más alto de MCP-1 se correlaciona con un aumento de cinco veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los encarnados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la MCP-1 se mide en la sangre de un sujeto tratado con TIL preparados mediante los procedimientos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 27. En algunas formas de realización, la MCP-1 se mide en el suero de TIL de un sujeto tratado con TIL preparado mediante los procedimientos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 27.
En algunas formas de realización, los TIL preparados por los procedimientos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 27, exhiben una mayor policlonalidad en comparación con los TIL producidos por otros procedimientos, incluidos los no ejemplificados en la Figura 27, tales como, por ejemplo, procedimientos denominados procedimientos de proceso 1C. En algunas formas de realización, una policlonalidad significativamente mejorada y/o una policlonalidad aumentada es indicativa de la eficacia del tratamiento y/o la eficacia clínica aumentada. En algunas formas de realización, la policlonalidad se refiere a la diversidad del repertorio de células T. En algunas formas de realización, un aumento en la policlonalidad puede ser indicativo de la eficacia del tratamiento con respecto a la administración de los TIL producidos por los procedimientos de la presente invención. En algunas formas de realización, la policlonalidad aumenta una vez, dos veces, diez veces, 100 veces, 500 veces o 1000 veces en comparación con los TIL preparados utilizando procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la policlonalidad aumenta una vez en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la policlonalidad aumenta dos veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la policlonalidad aumenta diez veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la policlonalidad aumenta 100 veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la policlonalidad aumenta 500 veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la policlonalidad se incrementa<1 00 0>veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27.
Las medidas de eficacia pueden incluir las mediciones de la tasa de control de la enfermedad (DCR) así como la tasa de respuesta global (ORR), como se conoce en la técnica, así como se describe en los Ejemplos proporcionados en este documento, incluido el Ejemplo 28.
1. Procedimientos de tratamiento de cánceres y otras enfermedades
Las composiciones y procedimientos descritos en este documento se pueden utilizar en un procedimiento para tratar enfermedades. Se divulga en el presente documento pero no se reivindica, pueden ser para el uso en el tratamiento de trastornos hiperproliferativos. También se pueden usar para tratar otros trastornos como se describen en el presente documento y en los siguientes párrafos.
También se divulga en el presente documento pero no se reivindica, el trastorno hiperproliferativo puede ser cáncer. En las composiciones y procedimientos divulgados en el presente documento, el trastorno hiperproliferativo puede ser un cáncer de tumor sólido. En las composiciones y procedimientos divulgados en el presente documento, el cáncer de tumor sólido puede seleccionarse del grupo que consiste en melanoma, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer causado por el virus del papiloma humano, cáncer de cabeza y cuello (incluido el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), cáncer renal y carcinoma de células renales. En las composiciones y procedimientos divulgados en el presente documento, erastorno hiperproliferativo puede ser una neoplasia maligna hematológica. En las composiciones y procedimientos divulgados en el presente documento, el cáncer de tumor sólido puede seleccionarse del grupo que consiste en leucemia linfocítica crónica, leucemia linfoblástica aguda, linfoma difuso de células B grandes, linfoma no Hodgkin, linfoma de Hodgkin, linfoma folicular y linfoma de células del manto.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un procedimiento para tratar un cáncer con una población de TIL, en donde un paciente se trata previamente con quimioterapia no mieloablativa antes de una infusión de TIL de acuerdo con la presente divulgación. En procedimientos divulgados en el presente documento, la quimioterapia no mieloablativa puede ser ciclofosfamida de 60 mg/kg/d durante 2 días (días 27 y 26 antes de la infusión de TIL) y fludarabina de 25 mg/m2/d durante 5 días (días 27 a 23 antes de la infusión de TIL). En procedimientos divulgados en el presente documento, después de la quimioterapia no mieloablativa y la infusión de TIL (en el día 0) según la presente divulgación, el paciente puede recibir una infusión intravenosa de IL-2 por vía intravenosa a 720,000 UI/kg cada<8>horas hasta tolerancia fisiológica.
La eficacia de los compuestos y combinaciones de compuestos descritos en el presente documento para tratar, prevenir y/o manejar las enfermedades o trastornos indicados se puede probar usando diversos modelos conocidos en la técnica, que proporcionan una guía para el tratamiento de enfermedades humanas. Por ejemplo, se describen modelos para determinar la eficacia de los tratamientos para el cáncer de ovario, por ejemplo, en Mullany, et al., Endocrinology 2012, 153, 1585-92; y Fong, et al., J. Ovarian Res. 2009, 2, 12. Models for determining efficacy of treatments for pancreatic cancer are described en Herreros-Villanueva, et al., World J. Gastroenterol. 2012, 18, 1286-1294. Los modelos para determinar la eficacia de los tratamientos para el cáncer de mama se describen, por ejemplo, en Fantozzi, Breast Cancer Res.2006,<8>, 212. Los modelos para determinar la eficacia de los tratamientos para el melanoma se describen, por ejemplo, en Damsky, et al., Pigment Cell & Melanoma Res. 2010, 23, 853 859. Los modelos para determinar la eficacia de los tratamientos para el cáncer de pulmón se describen, por ejemplo, en Meuwissen, et al., Genes & Development, 2005, 19, 643-664. Los modelos para determinar la eficacia de los tratamientos para el cáncer de pulmón se describen, por ejemplo, en Kim, Clin. Exp. Otorrinolaringol. 2009, 2, 55-60; y Sano, Head Neck Oncol. 2009, 1, 32.
En algunas formas de realización, IFN-gamma (IFN-y) es indicativo de la eficacia del tratamiento para el tratamiento del trastorno hiperproliferativo. En algunas formas de realización, el IFN-<y>en la sangre de sujetos tratados con TIL es indicativo de TIL activos. En algunas formas de realización, se emplea un ensayo de potencia para la producción de IFN-y. La producción de IFN-y es otra medida del potencial citotóxico. La producción de IFN-y puede medirse determinando los niveles de la citocina IFN-<y>en la sangre de un sujeto tratado con TIL preparados mediante los procedimientos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 27. En algunas formas de realización, los TIL obtenidos mediante el presente procedimiento proporcionan un aumento de IFN-<y>en la sangre de sujetos tratados con los TIL del presente procedimiento en comparación con sujetos tratados con TIL preparados utilizando procedimientos denominados proceso 1C, como se ejemplifica en la Figura 83. En algunas formas de realización, un aumento de IFN-y es indicativo de la eficacia del tratamiento en un paciente tratado con los TIL producidos por los procedimientos de la presente invención. En algunas formas de realización, el IFN-y aumenta una, dos, tres, cuatro o cinco veces o más en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los que se proporcionan en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la secreción de IFN-<y>aumenta una vez en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la secreción de IFN-<y>aumenta dos veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la secreción de IFN-<y>aumenta tres veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la secreción de IFN-y aumenta cuatro veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la secreción de IFN-<y>aumenta cinco veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados utilizando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, el IFN-<y>se mide usando un kit de ELIISA Quantikine. En algunas formas de realización, el IFN-<y>se mide usando un kit de ELISA Quantikine. En algunas formas de realización, el IFN-y se mide en TIL ex vivo de un paciente tratado con los TIL producidos por los procedimientos de la presente invención. En algunas formas de realización, el IFN-<y>se mide en sangre en un paciente tratado con los TIL producidos por los procedimientos de la presente invención. En algunas formas de realización, el IFN-y se mide en suero en un paciente tratado con los TIL producidos por los procedimientos de la presente invención.
En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-10 es indicativo de la eficacia del tratamiento y/o la eficacia clínica aumentada para el tratamiento del trastorno hiperproliferativo. En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-l0 en la sangre de los sujetos tratados con TIL es indicativo de TIL activos. En algunas formas de realización, los TIL obtenidos por el presente procedimiento proporcionan un promedio más alto de IP-10 en la sangre de los sujetos tratados con los TIL del presente procedimiento en comparación con los sujetos tratados con los TIL preparados usando procedimientos denominados proceso 1C, como se ejemplifica en la Figura. 83. La producción de IP-10 puede medirse determinando los niveles de IP-10 en la sangre de un sujeto tratado con TIL preparados por los procedimientos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 27. En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-10 es indicativo de la eficacia del tratamiento en un paciente tratado con los TIL producidos por los procedimientos de la presente invención. En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-10 se correlaciona con un aumento de una, dos, tres, cuatro o cinco veces o más en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en el presente documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-10 se correlaciona con un aumento de una vez en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-10 se correlaciona con un aumento de dos veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-10 se correlaciona con un aumento de tres veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-10 se correlaciona con un aumento de cuatro veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, el promedio más alto de IP-10 se correlaciona con un aumento de cinco veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27.
En algunas formas de realización, el promedio más alto de MCP-1 es indicativo de la eficacia del tratamiento y/o la eficacia clínica aumentada para el tratamiento del trastorno hiperproliferativo. En algunas formas de realización, el promedio más alto de MCP-1 en la sangre de sujetos tratados con TIL es indicativo de TIL activos. En algunas formas de realización, los TIL obtenidos por el presente procedimiento proporcionan un promedio más alto de MCP-1 en la sangre de sujetos tratados con los TIL del presente procedimiento en comparación con sujetos tratados con TIL preparados usando procedimientos denominados proceso 1C, como se ejemplifica en la Figura 83. La producción de MCP-1 se puede medir determinando los niveles de MCP-1 en la sangre de un sujeto tratado con TIL preparados por los procedimientos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 27. En algunas formas de realización, el promedio más alto de MCP-1 es indicativo de la eficacia del tratamiento en un paciente tratado con los TIL producidos por los procedimientos de la presente invención. En algunas formas de realización, el promedio más alto de MCP-1 se correlaciona con un aumento de una, dos, tres, cuatro o cinco veces o más en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, un promedio más alto de MCP-1 se correlaciona con un aumento de una vez en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, un promedio más alto de MCP-1 se correlaciona con un aumento de dos veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, un promedio más alto de MCP-1 se correlaciona con un aumento de tres veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, un promedio más alto de MCP-1 se correlaciona con un aumento de cuatro veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, un promedio más alto de MCP-1 se correlaciona con un aumento de cinco veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27.
En algunas formas de realización, los TIL preparados mediante los procedimientos de la presente invención, incluidos los descritos, por ejemplo, en la Figura 27, exhiben una mayor policlonalidad en comparación con los TIL producidos por otros procedimientos, incluidos los no ejemplificados en la Figura 27, tales como, por ejemplo, procedimientos denominados procedimientos de proceso 1C. En algunas formas de realización, una policlonalidad significativamente mejorada y/o una policlonalidad aumentada es indicativa de la eficacia del tratamiento y/o la eficacia clínica aumentada para el tratamiento del cáncer. En algunas formas de realización, la policlonalidad se refiere a la diversidad del repertorio de células T. En algunas formas de realización, un aumento en la policlonalidad puede ser indicativo de la eficacia del tratamiento con respecto a la administración de los TIL producidos por los procedimientos de la presente invención. En algunas formas de realización, la policlonalidad aumenta una vez, dos veces, diez veces, 100 veces, 500 veces o 1000 veces en comparación con los TIL preparados utilizando procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la policlonalidad aumenta una vez en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la policlonalidad aumenta dos veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la policlonalidad aumenta diez veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la policlonalidad aumenta<100>veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la policlonalidad aumenta 500 veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27. En algunas formas de realización, la policlonalidad se incrementa<10 00>veces en comparación con un paciente no tratado y/o en comparación con un paciente tratado con TIL preparados usando otros procedimientos distintos de los proporcionados en este documento, incluidos, por ejemplo, procedimientos distintos de los incorporados en la Figura 27.
2. Procedimientos de coadministración
También se divulgan en el presente documento pero no se reivindican, En algunas formas de realización, los TIL producidos como se describe en este documento, incluidos, por ejemplo, los TIL derivados de un procedimiento descrito en las etapas A a F de la Figura 27, pueden ser administrados en combinación con uno o más reguladores de puntos de control inmunitarios, tales como los anticuerpos descritos más adelante. Por ejemplo, los anticuerpos que se dirigen a PD-1 y que pueden coadministrarse con los TIL de la presente invención incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a nivolumab (BMS-936558, Bristol-Myers Squibb; Opdivo®), pembrolizumab (lambrolizumab, MK03475 o MK-3475, Merck; Keytruda®), anticuerpo anti-PD-1 humanizado JS001 (ShangHai JunShi), anticuerpo monoclonal anti-PD-1 TSR-042 (Tesaro, Inc.), pidilizumab (anti-PD-1 mAb CT-011, Medivation), anticuerpo monoclonal anti-PD-1 BGB-A317 (BeiGene) y/o anticuerpo anti-PD-1 SHR-1210 (ShangHai HengRui), anticuerpo monoclonal humano REGN2810 (Regeneron), anticuerpo monoclonal humano MDX-1106 (Bristol-Myers Squibb) y/o anticuerpo IgG4 anti-PD-1 humanizado PDR001 (Novartis). En algunos procedimientos divulgados en el presente documento, el anticuerpo PD-1 es del clon: RMP1-14 (IgG de rata) - BioXcell cat#BP0146. Otros anticuerpos adecuados, que son adecuados para usar en procedimientos de coadministración con TIL producidos de acuerdo con las Etapas A a F como se describen en el presente documento, son los anticuerpos anti-PD-1 descritos en la Patente de Estados Unidos No. 8,008,449. En algunos procedimientos divulgados en el presente documento, el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo se une específicamente a PD-L1 e inhibe su interacción con PD-1, aumentando así la actividad inmunitaria. Cualquier anticuerpo conocido en la técnica que se una a PD-L1 y afecte la interacción entre PD-1 y PD-L1, y estimule una respuesta inmune antitumoral, es adecuado para usar en procedimientos de coadministración con TIL producidos de acuerdo con las etapas A a F, tal como se describe en este documento. Por ejemplo, los anticuerpos que se dirigen a PD-L1 y que se encuentran en ensayos clínicos incluyen BMS-936559 (Bristol-Myers Squibb) y MPDL3280A (Genentech). Otros anticuerpos adecuados que se dirigen a PD-L1 se divulgan en la patente de E<e>.UU. No. 7,943,743. Un experto en la materia entenderá que cualquier anticuerpo que se una a PD-1 o PD-L1, afecte la interacción PD-1/PD-L1 y estimule una respuesta inmunitaria antitumoral, es adecuado para su uso en procedimientos de co-administración con TIL producidos de acuerdo con las etapas A a F como se describe en el presente documento. En algunos procedimientos divulgados en el presente documento, el sujeto al que se le administra la combinación de TIL producida de acuerdo con las etapas A a F es coadministrado con un y anticuerpo anti-PD-1 cuando el paciente tiene un tipo de cáncer que es refractario a la administración del anticuerpo anti-PD-1 solo. En algunos procedimientos divulgados en el presente documento, al paciente se le administra TIL en combinación con y anti-PD-1 cuando el paciente tiene melanoma refractario. En algunos procedimientos divulgados en el presente documento, al paciente se le administra TIL en combinación con y anti-PD-1 cuando el paciente tiene carcinoma de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).
3. Acondicionamiento previo opcional de los pacientes por linfodepleción
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un procedimiento para tratar un cáncer con una población de TIL, en donde un paciente se trata previamente con quimioterapia no mieloablativa antes de una infusión de TIL de acuerdo con la presente divulgación. También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, una población de TIL para su uso en el tratamiento del cáncer en un paciente que ha sido tratado previamente con quimioterapia no mieloablativa. En algunos procedimientos divulgados en el presente documento, la población de TIL es para administración por infusión. En algunos procedimientos divulgados en el presente documento, la quimioterapia no mieloablativa es ciclofosfamida de 60 mg/kg/d durante 2 días (días 27 y 26 antes de la infusión de TIL) y fludarabina de 25 mg/m2/d durante 5 días (días 27 a 23 antes de la infusión de TIL). En algunos procedimientos divulgados en el presente documento, después de la quimioterapia no mieloablativa y la infusión de TIL (en el día 0) de acuerdo con la presente divulgación, el paciente recibe una infusión intravenosa de IL-2 (aldesleucina, disponible comercialmente como PROLEUKIN) por vía intravenosa a 720,000 UI/kg cada<8>horas hasta tolerancia fisiológica. En algunos procedimientos divulgados en el presente documento, la población de TIL es para usarse en el tratamiento del cáncer en combinación con IL-2, en donde la IL-2 se administra después de la población de TIL.
Los hallazgos experimentales indican que la linfodepleción antes de la transferencia adoptiva de linfocitos T específicos de tumor desempeña un papel clave en la mejora de la eficacia del tratamiento al eliminar las células T reguladoras y los elementos competidores del sistema inmunológico ("sumideros de citocinas"). Por consiguiente, algunos procedimientos divulgados utilizan una etapa de linfodepleción (a veces también denominada "acondicionamiento inmunosupresor") en el paciente antes de la introducción de los TIL de la invención.
En general, la linfodepleción se logra usando la administración de fludarabina o ciclofosfamida (la forma activa se denomina mafosfamida) y combinaciones de las mismas. Dichos procedimientos se describen en Gassner, et al., Cancer Immunol. Immunother. 2011,60, 75-85, Muranski, et al., Nat. Clin. Pract. Oncol., 2006, 3, 668-681, Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2008, 26, 5233-5239, y Dudley, et al., J. Clin. Oncol. 2005, 23, 2346-2357.
En procedimientos divulgados en el presente documento, la fludarabina se puede administrar a una concentración de 0.5 |jg/mL -10 jg/m L de fludarabina. En procedimientos divulgados en el presente documento, la fludarabina se puede administrar a una concentración de 1 jg/m L de fludarabina. En procedimientos divulgados en el presente documento, el tratamiento con fludarabina se puede administrar durante 1 día,<2>días, 3 días, 4 días, 5 días,<6>días o 7 días o más. En procedimientos divulgados en el presente documento, la fludarabina se puede administrar en dosis de 10 mg/kg/día, 15 mg/kg/día, 20 mg/kg/día, 25 mg/kg/día, 30 mg/kg/día, 35 mg/kg/día, 40 mg/kg/día o 45 mg/kg/día. En procedimientos divulgados en el presente documento, el tratamiento con fludarabina se puede administrar durante 2-7 días a 35 mg/kg/día. En procedimientos divulgados en el presente documento, el tratamiento con fludarabina se puede administrar durante 4-5 días a 35 mg/kg/día. En procedimientos divulgados en el presente documento, el tratamiento con fludarabina se puede administrar durante 4-5 días a 25 mg/kg/día.
En procedimientos divulgados en el presente documento, la mafosfamida, la forma activa de ciclofosfamida, se puede obtener a una concentración de 0.5 jg/m L -10 jg/m L mediante la administración de ciclofosfamida. En procedimientos divulgados en el presente documento, la mafosfamida, la forma activa de ciclofosfamida, se puede obtener a una concentración de 1 jg/m L mediante la administración de ciclofosfamida. En procedimientos divulgados en el presente documento, el tratamiento con ciclofosfamida se puede administrar durante<1>día,<2>días, 3 días, 4 días, 5 días,<6>días o 7 días o más. En procedimientos divulgados en el presente documento, la ciclofosfamida se puede administrar a una dosis de 100 mg/m<2>/día, 150 mg/m<2>/día, 175 mg/m<2>/día, 200 mg/m<2>/día, 225 mg/m<2>/día, 250 mg/m<2>/día, 275 mg/m2/día o 300 mg/m<2>/día. En procedimientos divulgados en el presente documento, la ciclofosfamida se puede administrar por vía intravenosa (es decir, i.v.) En procedimientos divulgados en el presente documento, el tratamiento con ciclofosfamida se puede administrar durante 2-7 días a 35 mg/kg/día. En procedimientos divulgados en el presente documento, el tratamiento con ciclofosfamida se puede administrar durante 4-5 días a 250 mg/m2/día i.v. En procedimientos divulgados en el presente documento, el tratamiento con ciclofosfamida se puede administrar durante 4 días a 250 mg/m2/día i.v.
En procedimientos divulgados en el presente documento, la linfodepleción se puede realizar administrando la fludarabina y la ciclofosfamida juntas a un paciente. En procedimientos divulgados en el presente documento, la fludarabina se puede administrar a 25 mg/m2/día i.v. y la ciclofosfamida se administra a 250 mg/m2/día i.v. por 4 días.
En procedimientos divulgados en el presente documento, la linfodepleción puede realizarse mediante la administración de ciclofosfamida a una dosis de 60 mg/m2/día durante dos días, seguida de la administración de fludarabina a una dosis de 25 mg/m2/día durante cinco días.
4. Regímenes de IL-2
También se divulga en el presente documento pero no se reivindica, el régimen de IL-2 puede comprender un régimen de IL-2 de dosis alta, en donde el régimen de IL-2 de dosis alta comprende aldesleucina, o un biosimilar o una variante de la misma, administrada por vía intravenosa comenzando el día después de administrar una porción terapéuticamente eficaz de la población terapéutica de TIL, en donde la aldesleucina o un biosimilar o una variante de la misma se administra a una dosis de 0.037 mg/kg o 0.044 mg/kg Ul/kg (masa corporal del paciente) mediante infusiones intravenosas en bolo de 15 minutos cada ocho horas hasta la tolerancia, para un máximo de 14 dosis. Después de 9 días de reposo, este programa puede repetirse para otras 14 dosis, hasta un máximo de 28 dosis en total.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el régimen de IL-2 puede comprender un régimen de IL-2 decreciente. Se han descrito regímenes de IL-2 decreciente en O'Day, et al., J. Clin. Oncol. 1999, 17, 2752-61 y Eton, et al., Cancer 2000,<8 8>, 1703-9. En procedimientos divulgados en el presente documento, un régimen decreciente de IL-2 puede comprender 18 x 10<6>UI/m<2>administrados por vía intravenosa durante<6>horas, seguidos de 18 x 10<6>UI/m<2>administrados por vía intravenosa durante 12 horas, seguidos de 18 x 10<6>UI/m<2>administrados por vía intravenosa durante 12 horas, seguidos de 18 x 10<6>UI/m<2>administradas por vía intravenosa durante 24 horas, seguidas de 4.5 x 10<6>UI/m<2>administradas por vía intravenosa durante 72 horas. Este ciclo de tratamiento puede repetirse cada 28 días durante un máximo de cuatro ciclos. En procedimientos divulgados en el presente documento, un régimen decreciente de IL-2 puede comprender 18,000,000 UI/m<2>el día 1, 9,000,000 UI/m<2>el día 2 y 4,500.000 UI/m<2>los días 3 y 4.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el régimen de IL-2 puede comprender la administración de IL-2 pegilada cada 1,2, 4,<6>, 7, 14 o 21 días a una dosis de 0.10 mg/día a 50 mg/día.
5. Transferencia de células adoptivas
La transferencia de células adoptivas (ACT) es una forma muy eficaz de inmunoterapia e implica la transferencia de células inmunes con actividad antitumoral a pacientes con cáncer. ACT es un enfoque de tratamiento que implica la identificación, in vitro, de linfocitos con actividad antitumoral, la expansión in vitro de estas células a grandes cantidades y su infusión en el huésped portador del cáncer. Los linfocitos utilizados para la transferencia adoptiva se pueden derivar del estroma de tumores extirpados (linfocitos infiltrantes de tumores o TIL). Los TIL para ACT se pueden preparar como se describe en el presente documento. Los TIL se pueden preparar, por ejemplo, de acuerdo con un procedimiento como se describe en la Figura 27. También se pueden derivar o de la sangre si están diseñados genéticamente para expresar receptores de células T antitumorales (TCR), o de receptores de antígenos quiméricos (CAR), enriquecidos con cultivos mixtos de células tumorales de linfocitos (MLTC) o clonados utilizando células presentadoras de antígenos autólogas y péptidos derivados de tumores. La ACT en la que los linfocitos se originan en el huésped portador del cáncer que se va a infundir se denomina ACT autóloga. La publicación de Estados Unidos No. 2011/0052530 se refiere a un procedimiento para realizar terapia celular adoptiva para promover la regresión del cáncer, principalmente para el tratamiento de pacientes que padecen melanoma metastásico. En procedimientos divulgados en el presente documento, los TIL pueden administrarse como se describe en el presente documento. En procedimientos divulgados en el presente documento, los TIL se pueden administrar en una sola dosis. Tal administración puede ser mediante inyección, por ejemplo, inyección intravenosa. En procedimientos divulgados en el presente documento, se pueden administrar TIL y/o linfocitos citotóxicos en múltiples dosis. La dosificación puede ser una, dos, tres, cuatro, cinco, seis o más de seis veces al año. La dosificación puede ser una vez al mes, una vez cada dos semanas, una vez a la semana o una vez cada dos días. La administración de TIL y/o linfocitos citotóxicos puede continuar tanto tiempo como sea necesario.
<6>. realizaciones de tratamiento ejemplar
También se divulga en el presente documento pero no se reivindica, es un procedimiento para tratar un cáncer con una población de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) que comprende las etapas de (a) obtener una primera población de TIL de un tumor extirpado de un paciente; (b) realizar una expansión inicial de la primera población de TIL en un primer medio de cultivo celular para obtener una segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es al menos 5 veces mayor en número que la primera población de TIL, y en donde el primer medio de cultivo celular comprende IL-2; (c) realizar una expansión rápida de la segunda población de TIL utilizando una población de células presentadoras de antígenos artificiales mieloides (aAPC mieloides) en un segundo medio de cultivo celular para obtener una tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es de al menos 50 veces mayor en número que la segunda población de TIL después de 7 días desde el inicio de la rápida expansión; y en donde el segundo medio de cultivo celular comprende IL-2 y OKT-3; (d) administrar una porción terapéuticamente eficaz de la tercera población de TIL a un paciente con cáncer. También se divulga en el presente documento pero no se reivindica, es una población de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde la población de TIL se puede obtener mediante un procedimiento que comprende las etapas de (b) realizar una expansión inicial de una primera población de TIL obtenida de un tumor extirpado de un paciente en un primer medio de cultivo celular para obtener una segunda población de TIL, en donde la segunda población de TIL es al menos 5 veces mayor en número que la primera población de TIL, y en donde el primer medio de cultivo celular comprende IL-2; (c) realizar una expansión rápida de la segunda población de TIL utilizando una población de células presentadoras de antígenos artificiales mieloides (aAPC mieloides) en un segundo medio de cultivo celular para obtener una tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es de al menos 50 -se multiplicó en número que la segunda población de TIL después de 7 días desde el inicio de la rápida expansión; y en donde el segundo medio de cultivo celular comprende IL-2 y OKT-3; (d) administrar una porción terapéuticamente eficaz de la tercera población de TIL a un paciente con cáncer. La presente divulgación también incluye una población de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde la población de TIL se puede obtener mediante un método que comprende las etapas de (b) realizar una expansión inicial de una primera población de TIL obtenidos a partir de un tumor extirpado de un paciente en un primer medio de cultivo celular para obtener una segunda población de TIL, en donde la segunda población de TIL es al menos 5 veces mayor en número que la primera población de TIL, y en donde el primer medio de cultivo celular comprende IL-2; (c) realizar una expansión rápida de la segunda población de TIL utilizando una población de células presentadoras de antígenos artificiales mieloides (aAPC mieloides) en un segundo medio de cultivo celular para obtener una tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es de al menos 50 veces mayor en número que la segunda población de TIL después de 7 días desde el inicio de la rápida expansión; y en donde el segundo medio de cultivo celular comprende IL-2 y OKT-3; (d) administrar una porción terapéuticamente eficaz de la tercera población de TIL a un paciente con cáncer. En procedimientos divulgados en el presente documento, el procedimiento puede comprender una primera etapa (a) de obtener la primera población de TIL de un tumor extirpado de un paciente. En procedimientos divulgados en el presente documento, la IL-2 puede estar presente a una concentración inicial de alrededor de 3000 UI/mL y el anticuerpo OKT-3 está presente a una concentración inicial de alrededor de 30 ng/mL en el segundo medio de cultivo celular. En procedimientos divulgados en el presente documento, la primera expansión se puede realizar durante un período no mayor de 14 días. En procedimientos divulgados en el presente documento, la primera expansión se puede realizar utilizando un recipiente permeable a los gases. En procedimientos divulgados en el presente documento, la segunda expansión se puede realizar utilizando un recipiente permeable a los gases. En procedimientos divulgados en el presente documento, la relación de la segunda población de TIL a la población de aAPC en la rápida expansión puede estar entre 1 a 80 y 1 a 400. En procedimientos divulgados en el presente documento, la relación de la segunda población de TIL a la población de aAPC en la rápida expansión puede ser de alrededor de 1 a 300. En procedimientos divulgados en el presente documento, el cáncer para el tratamiento puede seleccionarse del grupo que consiste en melanoma, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP), cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer causado por el virus del papiloma humano, cáncer de cabeza y cáncer de cuello (incluido el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), cáncer renal y carcinoma de células renales. En procedimientos divulgados en el presente documento, el cáncer para el tratamiento puede seleccionarse del grupo que consiste en melanoma, cáncer de ovario y cáncer de cuello uterino. En procedimientos divulgados en el presente documento, el cáncer para el tratamiento puede ser el melanoma. En procedimientos divulgados en el presente documento, el cáncer para el tratamiento puede ser cáncer de ovario. El cáncer para el tratamiento puede ser cáncer de cuello uterino. En procedimientos divulgados en el presente documento, el procedimiento de tratamiento del cáncer puede comprender además la etapa de tratar al paciente con un régimen de linfodepleción no mieloablativa antes de administrar la tercera población de TIL al paciente. En procedimientos divulgados en el presente documento, el régimen de linfodepleción no mieloablativa puede comprender las etapas de administración de ciclofosfamida a una dosis de 60 mg/m2/día durante dos días, seguida de la administración de fludarabina a una dosis de 25 mg/m2/día durante cinco días. En procedimientos divulgados en el presente documento, el régimen de dosis alta de IL-2 puede comprender 600,000 o 720,000 UI/kg de aldesleucina, o un biosimilar o una variante de la misma, administrado como una infusión intravenosa en bolo de 15 minutos cada ocho horas hasta la tolerancia.
También se divulga en el presente documento pero no se reivindica, es un procedimiento para tratar a un sujeto con cáncer, y el procedimiento comprende la administración de linfocitos infiltrantes de tumores expandidos (TIL), que comprende:
(a) obtener una primera población de TIL de un tumor extirpado de un sujeto convirtiendo una muestra de tumor obtenida del paciente en múltiples fragmentos de tumor;
(b) agregar los fragmentos de tumor a un sistema cerrado;
(c) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, donde la primera expansión se realiza durante alrededor de 11 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y donde la transición de la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema;
(d) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en donde la segunda expansión es realizada durante alrededor de<11>días para obtener la tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL, en donde la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una segunda área de superficie permeable a los gases, y en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) ocurre sin abrir el sistema;
(e) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (d), en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (e) a la (f) ocurre sin abrir el sistema;
(g) crioconservar la bolsa de infusión que comprende la población de TIL recolectada de la etapa (f) usando un procedimiento de crioconservación; y
(h) administrar una dosis terapéuticamente eficaz de la tercera población de TIL de la bolsa de infusión en la etapa (g) al paciente.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el procedimiento de crioconservación puede comprender la crioconservación en un medio que comprende DMSO. En procedimientos divulgados en el presente documento, los medios de crioconservación pueden comprender de un 7% a un 10% de DMSO. En algunos procedimientos divulgados en el presente documento, el medio de crioconservación en CS10.
En procedimientos divulgados en el presente documento, la población terapéutica de TIL recolectados en la etapa (e) puede comprender suficientes TIL para administrar una dosis terapéuticamente eficaz de los TIL en la etapa (h) .
En procedimientos divulgados en el presente documento, el número de TIL suficientes para administrar una dosis terapéuticamente eficaz en la etapa (h) puede ser de alrededor de 2.3 x 10<10>a alrededor de 13.7 x 1010.
En procedimientos divulgados en el presente documento, las células presentadoras de antígeno (APC) pueden ser PBMC.
En procedimientos divulgados en el presente documento, las PBMC se pueden agregar al cultivo celular en cualquiera de los días 9 a 11 en la etapa (d).
En procedimientos divulgados en el presente documento, antes de administrar una dosis terapéuticamente eficaz de células TIL en la etapa (h), se puede haber administrado al paciente un régimen de linfodepleción no mieloablativa.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el régimen de linfodepleción no mieloablativa puede comprender las etapas de administración de ciclofosfamida a una dosis de 60 mg/m2/día durante dos días seguido de la administración de fludarabina a una dosis de 25 mg/m2/día durante cinco días.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el procedimiento puede comprender además la etapa de tratar al paciente con un régimen de IL-2 de dosis alta comenzando el día después de la administración de las células TIL al paciente en la etapa (h).
En procedimientos divulgados en el presente documento, el régimen de IL-2 de dosis alta puede comprender 600,000 o 720,000 UI/kg administrados como una infusión intravenosa en bolo de 15 minutos cada ocho horas hasta la tolerancia.
En procedimientos divulgados en el presente documento, la tercera población de TIL en la etapa (d) puede proporcionar mayor eficacia, producción aumentada de interferón-gamma (IFN-<y>), policlonalidad aumentada, promedio aumentado de IP-10 y/o promedio aumentado de MCP-1 cuando se administra a un sujeto. En procedimientos divulgados en el presente documento, el aumento de IFN-y, IP-10 de promedio aumentado y/o MCP-1 de promedio aumentado pueden medirse en la sangre del sujeto tratado con los TIL.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el cáncer puede seleccionarse del grupo que consiste en melanoma, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer causado por el virus del papiloma humano, cáncer de cabeza y cuello (incluido el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC)), cáncer de riñón y carcinoma de células renales. En procedimientos divulgados en el presente documento, el cáncer se puede seleccionar del grupo que consiste en melanoma, HNSCC, cánceres de cuello uterino y NSCLC. En procedimientos divulgados en el presente documento, el cáncer puede ser melanoma. En procedimientos divulgados en el presente documento, el cáncer puede ser HNSCC. El cáncer puede ser un cáncer de cuello uterino. El cáncer puede ser NSCLC.
Se divulga en el presente documento un procedimiento para expandir linfocitos infiltrantes de tumores (TIL).
También se divulga en el presente documento pero no se reivindica, un procedimiento para expandir linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) que comprende: (a) obtener una muestra de tumor de un paciente, en donde dicha muestra de tumor comprende una primera población de TIL; (b) convertir dicha muestra de tumor en múltiples fragmentos de tumor; (c) agregar dichos fragmentos de tumor a un recipiente cerrado; (d) realizar una expansión inicial de dicha primera población de TIL en un primer medio de cultivo celular para obtener una segunda población de TIL, en donde dicho primer medio de cultivo celular comprende IL-2, en donde dicha expansión inicial se realiza en dicho recipiente cerrado que proporciona al menos<100>cm<2>de área superficial permeable al gas, en donde dicha expansión inicial se realiza dentro de un primer período de alrededor de 7-14 días para obtener una segunda población de TIL, en donde dicha segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que dicha primera población de TIL, y en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema; (e) expandir dicha segunda población de TIL en un segundo medio de cultivo celular, en donde dicho segundo medio de cultivo celular comprende IL-2, OKT-3 y células mononucleares de sangre periférica (PBMC, también conocidas como células mononucleares (MNC)), donde dicha expansión se realiza dentro de un segundo período de alrededor de 7-14 días para obtener una tercera población de TIL, en donde dicha tercera población de TIL exhibe una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en donde dicha expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona al menos 500 cm<2>de área de superficie permeable a los gases, y en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) se produce sin abrir el sistema; (f) recolectar dicha tercera población de TIL obtenida de la etapa (e), en donde la transición de la etapa (e) a la etapa (f) ocurre sin abrir el sistema; y (g) transferir dicha población de TIL recolectada de la etapa (f) a una bolsa de infusión, en donde dicha transferencia de la etapa (f) a (g) ocurre sin abrir el sistema. En procedimientos divulgados en el presente documento, el procedimiento puede ser in vitro o ex vivo.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el procedimiento comprende además la recolección en la etapa (f) a través de un sistema de tratamiento celular, tal como el sistema LOVO fabricado por Fresenius Kabi. El término "sistema de tratamiento de células LOVO" también se refiere a cualquier instrumento o dispositivo fabricado por cualquier proveedor, que pueda bombear una solución que comprende células a través de una membrana o filtro, como una membrana giratoria o un filtro giratorio, en un entorno de sistema cerrado y/o estéril, lo que permite flujo continuo y tratamiento celular para eliminar el sobrenadante o los medios de cultivo celular sin formación de pellas. En algunos casos, el sistema de tratamiento celular puede realizar la separación celular, lavado, intercambio de fluidos, concentración y/u otras etapas de tratamiento celular en un sistema cerrado y estéril.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el recipiente cerrado se puede seleccionar del grupo que consta de un recipiente G y una bolsa de células Xuri.
En procedimientos divulgados en el presente documento, la bolsa de infusión en la etapa (g) puede ser una bolsa de infusión que contenga HypoThermosol.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el primer período en la etapa (d) y dicho segundo período en la etapa (e) pueden realizarse cada uno individualmente dentro de un período de<10>días,<11>días o<12>días.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el primer período en la etapa (d) y dicho segundo período en la etapa (e) pueden realizarse individualmente cada uno dentro de un período de<11>días.
En procedimientos divulgados en el presente documento, las etapas (a) a (g) se pueden realizar dentro de un período de alrededor de 25 días a alrededor de 30 días.
En procedimientos divulgados en el presente documento, las etapas (a) a (g) se pueden realizar dentro de un período de alrededor de 20 días a alrededor de 25 días.
En procedimientos divulgados en el presente documento, las etapas (a) a (g) se pueden realizar dentro de un período de alrededor de<2 0>días a alrededor de<2 2>días.
En procedimientos divulgados en el presente documento, las etapas (a) a (g) se pueden realizar en 22 días o menos.
En procedimientos divulgados en el presente documento, las etapas (c) a (f) se pueden realizar en un solo recipiente, en donde realizar las etapas (c) a (f) en un solo recipiente da como resultado un aumento en el rendimiento de TIL por tumor extirpado en comparación con la realización de las etapas (c) a (f) en más de un recipiente.
En procedimientos divulgados en el presente documento, las PBMC se pueden agregar a los TIL durante el segundo período en la etapa (e) sin abrir el sistema.
En procedimientos divulgados en el presente documento, las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de dicha tercera población de TIL pueden exhibir una o más características seleccionadas del grupo que consiste en la expresión de CD27+, la expresión de CD28+, telómeros más largos, expresión aumentada de CD57 y expresión disminuida de CD56. en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de dicha segunda población de células.
En procedimientos divulgados en el presente documento, las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de dicha tercera población de TIL pueden exhibir una expresión de CD57 aumentada y una expresión de CD56 disminuida con respecto a las células T efectoras y/o células T de memoria central obtenidas de dicha segunda población de células.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el riesgo de contaminación microbiana se puede reducir en comparación con un sistema abierto.
En procedimientos divulgados en el presente documento, los TIL de la etapa (g) se pueden infundir a un paciente.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, un procedimiento para tratar el cáncer en un paciente con una población de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) que comprende las etapas de: (a) obtener una muestra de tumor de un paciente, en donde dicha muestra de tumor comprende un primera población de TIL; (b) convertir dicha muestra de tumor en múltiples fragmentos de tumor; (c) agregar dichos fragmentos de tumor a un recipiente cerrado; (d) realizar una expansión inicial de dicha primera población de TIL en un primer medio de cultivo celular para obtener una segunda población de TIL, en donde dicho primer medio de cultivo celular comprende IL-2, en donde dicha expansión inicial se realiza en dicho recipiente cerrado que proporciona al menos<10 0>cm<2>de área superficial permeable al gas, en donde dicha expansión inicial se realiza dentro de un primer período de alrededor de 7-14 días para obtener una segunda población de TIL, en donde dicha segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que dicha primera población de TIL, y en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema; (e) expandir dicha segunda población de TIL en un segundo medio de cultivo celular, en donde dicho segundo medio de cultivo celular comprende IL-2, OKT-3 y células mononucleares de sangre periférica (PBMC), en donde dicha expansión se realiza dentro de un segundo período de alrededor de 7-14 días para obtener una tercera población de TIL, en donde dicha tercera población de TIL exhibe una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en donde dicha expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona al menos 500 cm<2>de área superficial permeable a los gases, y en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) se produce sin abrir el sistema; (f) recolectar dicha tercera población de TIL obtenida de la etapa (e), en donde la transición de la etapa (e) a la etapa (f) ocurre sin abrir el sistema; (g) transferir dicha población de TIL recolectada de la etapa (f) a una bolsa de infusión, en donde dicha transferencia de la etapa (f) a (g) ocurre sin abrir el sistema; y (b) administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de células TIL de dicha bolsa de infusión en la etapa (g) a dicho paciente.
También se divulga en el presente documento, pero no se reivindica, una población de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde la población de TIL se puede obtener a partir de un procedimiento que comprende las etapas de: (b) tratar una muestra de tumor obtenida de un paciente en donde dicha muestra de tumor comprende una primera población de TIL en múltiples fragmentos de tumor; (c) agregar dichos fragmentos de tumor a un recipiente cerrado; (d) realizar una expansión inicial de dicha primera población de TIL en un primer medio de cultivo celular para obtener una segunda población de TIL, en donde dicho primer medio de cultivo celular comprende IL-2, en donde dicha expansión inicial se realiza en dicho recipiente cerrado que proporciona al menos<100>cm<2>de área superficial permeable al gas, en donde dicha expansión inicial se realiza dentro de un primer período de alrededor de 7-14 días para obtener una segunda población de TIL, en donde dicha segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que dicha primera población de TIL, y en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema; (e) expandir dicha segunda población de TIL en un segundo medio de cultivo celular, en donde dicho segundo medio de cultivo celular comprende IL-2, OKT-3 y células mononucleares de sangre periférica (PBMC), en donde dicha expansión se realiza dentro de un segundo período de alrededor de 7-14 días para obtener una tercera población de TIL, en donde dicha tercera población de TIL exhibe una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en donde dicha expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona al menos 500 cm<2>de área superficial permeable a los gases, y en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) se produce sin abrir el sistema; (f) recolectar dicha tercera población de TIL obtenida de la etapa (e), en donde la transición de la etapa (e) a la etapa (f) ocurre sin abrir el sistema; (g) transferir dicha población de TIL recolectada de la etapa (f) a una bolsa de infusión, en donde dicha transferencia de la etapa (f) a (g) ocurre sin abrir el sistema. En procedimientos divulgados en el presente documento, el procedimiento puede comprender una primera etapa de (a) obtener la muestra de tumor de un paciente, en donde dicha muestra de tumor comprende la primera población de TIL. En procedimientos divulgados en el presente documento, la población de TIL puede ser para administración desde dicha bolsa de infusión en la etapa (g) en una cantidad terapéuticamente eficaz.
En procedimientos divulgados en el presente documento, antes de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de células TIL en la etapa (h), se puede haber administrado a dicho paciente un régimen de linfodepleción no mieloablativa. En procedimientos divulgados en el presente documento, las poblaciones de TIL pueden ser para administración a un paciente que se ha sometido a un régimen de linfodepleción no mieloablativa.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el régimen de linfodepleción no mieloablativa puede comprender las etapas de administración de ciclofosfamida a una dosis de 60 mg/m2/día durante dos días, seguida de la administración de fludarabina a una dosis de 25 mg/m2/día durante cinco días.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el procedimiento puede comprender además la etapa de tratar a dicho paciente con un régimen de IL-2 de dosis alta comenzando el día después de la administración de dichas células TIL a dicho paciente en la etapa (h). En procedimientos divulgados en el presente documento, las poblaciones de TIL pueden ser para administración antes de un régimen de IL-2 de dosis alta. En procedimientos divulgados en el presente documento, la población de TIL puede ser para la administración un día antes del inicio del régimen de dosis alta de IL-2.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el régimen de IL-2 de dosis alta puede comprender 600,000 o 720,000 UI/kg administrados como una infusión intravenosa en bolo de 15 minutos cada ocho horas hasta la tolerancia.
En procedimientos divulgados en el presente documento, las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de dicha tercera población de TIL pueden exhibir una o más características seleccionadas del grupo que consiste en la expresión de CD27+, la expresión de CD28+, telómeros más largos, expresión de CD57 aumentada y expresión de CD56 disminuida. en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de dicha segunda población de células.
En procedimientos divulgados en el presente documento, Las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de dicha tercera población de TIL pueden exhibir una expresión de CD57 aumentada y una expresión de CD56 disminuida con respecto a las células T efectoras y/o células T de memoria central obtenidas de dicha segunda población de células.
También se divulga en el presente documento pero no se reivindica un procedimiento para expandir linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) que comprende las etapas de (a) agregar fragmentos de tumor tratados aun sistema cerrado; (b) realizar una primera expansión de dicha primera población de TIL en un primer medio de cultivo celular para obtener una segunda población de TIL, en donde dicho primer medio de cultivo celular comprende IL-2, en donde dicha primera expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una primera área superficial permeable a los gases, en donde dicha primera expansión se realiza dentro de un primer período de alrededor de 3-14 días para obtener una segunda población de TIL, en donde dicha segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que dicha primera población de TIL, y en donde la transición de la etapa (a) a la etapa (b) se produce sin abrir el sistema; (c) expandir dicha segunda población de TIL en un segundo medio de cultivo celular, en donde dicho segundo medio de cultivo celular comprende IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno, en donde dicha expansión se realiza dentro de un segundo período de alrededor de 7- 14 días para obtener una tercera población de TIL, en donde dicha tercera población de TIL exhibe una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central con respecto a la segunda población de TIL, en donde dicha expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona un segunda área superficial permeable a los gases, y en donde la transición de la etapa (b) a la etapa (c) se produce sin abrir el sistema; (d) recolectar dicha tercera población de TIL obtenida de la etapa (c), en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) ocurre sin abrir el sistema; y (e) transferir dicha población de TIL recolectada de la etapa (d) a una bolsa de infusión, en donde dicha transferencia de la etapa (d) a (e) ocurre sin abrir el sistema.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el procedimiento puede comprender además la etapa de crioconservar la bolsa de infusión que comprende la población de TIL recolectada usando un procedimiento de crioconservación. En procedimientos divulgados en el presente documento, el procedimiento de crioconservación se puede realizar usando una relación 1:1 de población de TIL recolectada a medio CS10.
En procedimientos divulgados en el presente documento, las células presentadoras de antígenos pueden ser células mononucleares de sangre periférica (PBMC). En procedimientos divulgados en el presente documento, las células presentadoras de antígenos pueden ser células presentadoras de antígenos artificiales.
En procedimientos divulgados en el presente documento, la recolección en la etapa (d) se puede realizar usando un sistema de tratamiento de células LOVO.
En procedimientos divulgados en el presente documento, los fragmentos múltiples pueden comprender alrededor de 50 fragmentos, en los que cada fragmento tiene un volumen de alrededor de 27 mm<3>En procedimientos divulgados en el presente documento, los múltiples fragmentos pueden comprender desde alrededor de 30 a alrededor de 60 fragmentos con un volumen total de alrededor de 1300 mm<3>a alrededor de 1500 mm3. En procedimientos divulgados en el presente documento, los múltiples fragmentos pueden comprender alrededor de 50 fragmentos con un volumen total de alrededor de 1350 mm3. En procedimientos divulgados en el presente documento, los múltiples fragmentos pueden comprender alrededor de 50 fragmentos con una masa total de alrededor de 1 gramo a alrededor de 1.5 gramos.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el segundo medio de cultivo celular se puede proporcionar en un recipiente seleccionado del grupo que consiste en un recipiente G y una bolsa de células Xuri.
En procedimientos divulgados en el presente documento, la bolsa de infusión en la etapa (e) puede ser una bolsa de infusión que contenga HypoThermosol.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el primer período en la etapa (b) y dicho segundo período en la etapa (c) pueden realizarse cada uno individualmente dentro de un período de 10 días, 11 días o 12 días. En procedimientos divulgados en el presente documento, el primer período en la etapa (b) y dicho segundo período en la etapa (c) pueden realizarse cada uno individualmente dentro de un período de<11>días.
En procedimientos divulgados en el presente documento, las etapas (a) a (e) se pueden realizar dentro de un período de alrededor de 25 días a alrededor de 30 días. En procedimientos divulgados en el presente documento, las etapas (a) a (e) se pueden realizar dentro de un período de alrededor de 20 días a alrededor de 25 días. En procedimientos divulgados en el presente documento, las etapas (a) a (e) se pueden realizar dentro de un período de alrededor de 20 días a alrededor de 22 días. En procedimientos divulgados en el presente documento, las etapas (a) a (e) se pueden realizar en 22 días o menos. En procedimientos divulgados en el presente documento, las etapas (a) a (e) y la crioconservación se pueden realizar en<2 2>días o menos.
En procedimientos divulgados en el presente documento, las etapas (b) a (e) se pueden realizar en un único sistema cerrado, en donde la realización de las etapas (b) a (e) en un solo recipiente da como resultado un aumento en el rendimiento de TIL por tumor extirpado en comparación con la realización de las etapas (b) a (e) en más de un recipiente.
En procedimientos divulgados en el presente documento, las células presentadoras de antígeno se pueden agregar a los TIL durante el segundo período en la etapa (c) sin abrir el sistema.
En procedimientos divulgados en el presente documento, las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de dicha tercera población de TIL pueden exhibir una o más características seleccionadas del grupo que consiste en la expresión de CD27+, la expresión de CD28+, telómeros más largos, la expresión de CD57 aumentada y la expresión de CD56 disminuida. en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de dicha segunda población de células.
En procedimientos divulgados en el presente documento, las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de dicha tercera población de TIL pueden exhibir expresión de CD57 aumentada y expresión de CD56 disminuida en relación con las células T efectoras y/o células T de memoria central obtenidas de dicha segunda población de células.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el riesgo de contaminación microbiana se puede reducir en comparación con un sistema abierto.
En procedimientos divulgados en el presente documento, los TIL de la etapa (e) se pueden infundir a un paciente.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el recipiente cerrado puede comprender un solo biorreactor. En procedimientos divulgados en el presente documento, el recipiente cerrado puede comprender un G-REX-10. El recipiente cerrado puede comprender un G-REX-100. En procedimientos divulgados en el presente documento, el recipiente cerrado puede comprender un G-Rex 500. En procedimientos divulgados en el presente documento, el recipiente cerrado puede comprender una bolsa permeable al gas del biorreactor Xuri o Wave.
También se divulga en el presente documento pero no se reivindica un procedimiento para expandir linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) a una población terapéutica de TIL que comprende:
(b) agregar fragmentos tumorales a un sistema cerrado en donde los fragmentos tumorales comprenden una primera población de TIL;
(c) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, donde la primera expansión se realiza durante alrededor de 3-14 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y donde la transición desde la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema;
(d) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza durante alrededor de 7-14 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL que comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una segunda área superficial permeable al gas, y en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema;
(e) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (d), en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (e) a la (f) ocurre sin abrir el sistema.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el procedimiento también puede comprender como primera etapa:
(a) obtener una primera población de TIL de un tumor extirpado de un paciente convirtiendo una muestra de tumor obtenida del paciente en múltiples fragmentos de tumor.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el procedimiento puede ser un procedimiento in vitro o ex vivo.
También se divulga en el presente documento pero no se reivindica, un procedimiento para expandir linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) a una población terapéutica de TIL, que comprende:
(a) obtener una primera población de TIL de un tumor extirpado de un paciente convirtiendo una muestra de tumor obtenida del paciente en múltiples fragmentos de tumor;
(b) agregar los fragmentos de tumor a un sistema cerrado;
(c) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, donde la primera expansión se realiza durante alrededor de 3-14 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y donde la transición desde la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema;
(d) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza durante alrededor de 7-14 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL que comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una segunda área superficial permeable al gas, y en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema; (e) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (d), en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (e) a la (f) ocurre sin abrir el sistema.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el procedimiento puede ser in vitro o ex vivo.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el procedimiento puede comprender además la etapa de crioconservar la bolsa de infusión que comprende la población de TIL recolectada en la etapa (f) usando un procedimiento de crioconservación.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el procedimiento de crioconservación se puede realizar usando una relación 1:1 de población de TIL recolectada al medio de crioconservación. En procedimientos divulgados en el presente documento, los medios de crioconservación pueden comprender dimetilsulfóxido. En procedimientos divulgados en el presente documento, los medios de crioconservación se pueden seleccionar del grupo que consiste en Cryostor CS10, HypoThermasol o una combinación de los mismos.
En procedimientos divulgados en el presente documento, las células presentadoras de antígenos pueden ser células mononucleares de sangre periférica (PBMC).
En procedimientos divulgados en el presente documento, las PBMC pueden irradiarse y ser alogénicas.
En procedimientos divulgados en el presente documento, las PBMC se pueden agregar al cultivo celular en cualquiera de los días 9 a 14 en la etapa (d).
En procedimientos divulgados en el presente documento, las células presentadoras de antígenos pueden ser células presentadoras de antígenos artificiales.
En procedimientos divulgados en el presente documento, la recolección en la etapa (e) puede realizarse usando un sistema de tratamiento de células LOVO.
En procedimientos divulgados en el presente documento, los fragmentos tumorales pueden ser múltiples fragmentos y comprender de alrededor de 4 a alrededor de 50 fragmentos, en los que cada fragmento tiene un volumen de alrededor de 27 mm<3>En procedimientos divulgados en el presente documento, los múltiples fragmentos pueden comprender de alrededor de 30 a alrededor de 60 fragmentos con un volumen total de alrededor de 1300 mm<3>a alrededor de 1500 mm3. En procedimientos divulgados en el presente documento, los múltiples fragmentos pueden comprender alrededor de 50 fragmentos con un volumen total de alrededor de 1350 mm3. En procedimientos divulgados en el presente documento, los múltiples fragmentos pueden comprender alrededor de 50 fragmentos con una masa total de alrededor de 1 gramo a alrededor de 1.5 gramos.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el medio de cultivo celular puede proporcionarse en un recipiente seleccionado del grupo que consiste en un recipiente G y una bolsa de células Xuri.
En procedimientos divulgados en el presente documento, la bolsa de infusión en la etapa (f) puede ser una bolsa de infusión que contenga HypoThermosol.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el primer período en la etapa (c) y el segundo período en la etapa (e) pueden realizarse cada uno individualmente dentro de un período de 10 días, 11 días o 12 días. En procedimientos divulgados en el presente documento, el primer período en la etapa (c) y el segundo período en la etapa (e) pueden realizarse cada uno individualmente dentro de un período de 11 días. En procedimientos divulgados en el presente documento, las etapas (a) a (f) se pueden realizar dentro de un período de alrededor de 25 días a alrededor de 30 días. En procedimientos divulgados en el presente documento, las etapas (a) a (f) se pueden realizar dentro de un período de alrededor de 20 días a alrededor de 25 días. Las etapas (a) a (f) se pueden realizar dentro de un período de alrededor de 20 días a alrededor de 22 días. En procedimientos divulgados en el presente documento, las etapas (a) a (f) se pueden realizar en 22 días o menos. En procedimientos divulgados en el presente documento, las etapas (a) a (f) y la crioconservación se pueden realizar en<2 2>días o menos.
En procedimientos divulgados en el presente documento, la población terapéutica de TIL recolectada en la etapa (e) puede comprender suficientes TIL para una dosificación terapéuticamente eficaz de los TIL. En procedimientos divulgados en el presente documento, el número de TIL suficiente para una dosificación terapéuticamente eficaz puede ser de alrededor de 2.3 x 10<10>a alrededor de 13.7 x 1010.
En procedimientos divulgados en el presente documento, las etapas (b) a (e) se pueden realizar en un solo recipiente, en donde realizar las etapas (b) a (e) en un solo recipiente da como resultado un aumento en el rendimiento de TIL por tumor extirpado en comparación con la realización de las etapas (b) a (e) en más de un recipiente.
En procedimientos divulgados en el presente documento, las células presentadoras de antígeno se pueden agregar a los TIL durante el segundo período en la etapa (d) sin abrir el sistema.
En procedimientos divulgados en el presente documento, las células T efectoras y/o las células T de memoria central en la población terapéutica de TIL pueden exhibir una o más características seleccionadas del grupo que consiste en la expresión de CD27+, la expresión de CD28+, telómeros más largos, la expresión de CD57 aumentada y la expresión de CD56 disminuida relativa a células T efectoras y/o células T de memoria central obtenidas de la segunda población de células.
En procedimientos divulgados en el presente documento, las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de la tercera población de TIL pueden exhibir una expresión de CD57 aumentada y una expresión de CD56 disminuida en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de la segunda población de células.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el riesgo de contaminación microbiana se puede reducir en comparación con un sistema abierto.
En procedimientos divulgados en el presente documento, los TIL de la etapa (f) se pueden infundir a un paciente.
En procedimientos divulgados en el presente documento, los múltiples fragmentos pueden comprender alrededor de 4 fragmentos. En procedimientos divulgados en el presente documento, los 4 fragmentos se pueden colocar en un G-REX -100. En procedimientos divulgados en el presente documento, los 4 fragmentos pueden tener alrededor de 0.5 cm de diámetro. Los 4 fragmentos se pueden colocar en un G-REX -100. En procedimientos divulgados en el presente documento, los 4 fragmentos pueden tener alrededor de 0.1 cm, 0.2 cm, 0.3 cm, 0.4 cm, 0.5 cm, 0.6 cm, 0.7 cm, 0.8 cm, 0.9 cm o 1 cm de diámetro. En procedimientos divulgados en el presente documento, los 4 fragmentos pueden tener alrededor de 0.1 cm, 0.2 cm, 0.3 cm, 0.4 cm, 0.5 cm, 0.6 cm, 0.7 cm, 0.8 cm, 0.9 cm o 1 cm de diámetro y se colocan en un G-REX -100. En procedimientos divulgados en el presente documento, los 4 fragmentos pueden tener alrededor de 0.1 cm, 0.2 cm, 0.3 cm, 0.4 cm, 0.5 cm, 0.6 cm, 0.7 cm, 0.8 cm, 0.9 cm o 1 cm de diámetro y se colocan en un recipiente con un volumen equivalente a un G-REX -100. En procedimientos divulgados en el presente documento, los 4 fragmentos pueden tener alrededor de 0.5 cm de diámetro y pueden colocarse en un G-REX -100. En procedimientos divulgados en el presente documento, los 4 fragmentos pueden tener alrededor de 0.5 cm de diámetro y se colocan en un recipiente con un volumen equivalente a un G-REX-100.
Más detalles de las etapas (a), (b), (c), (d), (e) y (f) se proporcionan más adelante en el presente documento, que incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, las formas de realización descritas bajo los títulos "ETAPA A: Obtener la muestra de tumor del paciente", "ETAPA B: Primera expansión", "ETAPA C: Primera expansión a la segunda transición de expansión", "ETAPA D: Segunda expansión", "ETAPA E: Recolección de TIL y "ETAPA F: Formulación final/Transferir a bolsa de infusión".
También se divulgan en el presente documento pero no se reivindican, procedimientos para tratar a un sujeto con cáncer, y el procedimiento comprende la administración de linfocitos infiltrantes de tumores expandidos (TIL), que comprenden:
(a) obtener una primera población de TIL de un tumor extirpado de un sujeto convirtiendo una muestra de tumor obtenida del paciente en múltiples fragmentos de tumor;
(b) agregar los fragmentos de tumor a un sistema cerrado;
(c) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, donde la primera expansión se realiza durante alrededor de 3-14 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y donde la transición desde la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema;
(d) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza durante alrededor de 7-14 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL que comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una segunda área superficial permeable al gas, y en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema;
(e) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (d), en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (e) a la (f) ocurre sin abrir el sistema;
(g) opcionalmente crioconservar la bolsa de infusión que comprende la población de TIL recolectada de la etapa (f) usando un procedimiento de crioconservación; y
(h) administrar una dosis terapéuticamente eficaz de la tercera población de TIL de la bolsa de infusión en la etapa (g) al paciente.
También se divulgan en el presente documento pero no se reivindica una población terapéutica de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde la población se puede obtener a partir de un procedimiento que comprende las etapas de:
(b) agregar fragmentos tumorales a un sistema cerrado en donde los fragmentos tumorales comprenden una primera población de TIL;
(c) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, donde la primera expansión se realiza durante alrededor de 3-14 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y donde la transición desde la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema;
(d) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza durante alrededor de 7-14 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL que comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una segunda área superficial permeable al gas, y en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema;
(e) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (d), en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (e) a la (f) ocurre sin abrir el sistema; y
(g) opcionalmente crioconservar la bolsa de infusión que comprende la población de TIL recolectada de la etapa (f) usando un procedimiento de crioconservación.
En procedimientos divulgados en el presente documento, la población puede obtenerse mediante un procedimiento que también comprende como primera etapa:
(a) obtener una primera población de TIL de un tumor extirpado de un paciente convirtiendo una muestra de tumor obtenida del paciente en múltiples fragmentos de tumor.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el procedimiento puede ser in vitro o ex vivo.
En procedimientos divulgados en el presente documento, cualquiera de las etapas (a) a (f) puede comprender una o más características descritas en el presente documento, por ejemplo, una o más características divulgadas bajo los títulos "ETAPA A: Obtener una muestra de tumor del paciente", "ETAPA B: Primera expansión", "ETAPA C: Primera expansión a la segunda transición de expansión", "ETAPA D: Segunda expansión", "ETAPA E: Recolectar TIL y "ETAPA F: Formulación final/Transferencia a la bolsa de infusión".
En procedimientos divulgados en el presente documento, la etapa (g) puede comprender una o más características descritas en el presente documento, por ejemplo, una o más características descritas bajo el título "ETAPA H: Crioconservación opcional de TIL". En procedimientos divulgados en el presente documento, la etapa (h) pueden comprender una o más características descritas en el presente documento, por ejemplo, una o más características divulgadas bajo el título "ETAPA F: 1 Composiciones farmacéuticas, dosis y regímenes de dosificación".
En procedimientos divulgados en el presente documento, la población terapéutica de TIL recolectada en la etapa (e) puede comprender suficientes TIL para administrar una dosis terapéuticamente eficaz de los TIL en la etapa (h) .
En procedimientos divulgados en el presente documento, el número de TIL suficientes para administrar una dosis terapéuticamente eficaz en la etapa (h) puede ser de alrededor de 2.3 x 10<10>a alrededor de 13.7 x 1010.
En procedimientos divulgados en el presente documento, las células presentadoras de antígeno (APC) pueden ser PBMC.
En procedimientos divulgados en el presente documento, las PBMC se pueden agregar al cultivo celular en cualquiera de los días 9 a 14 en la etapa (d).
En procedimientos divulgados en el presente documento, antes de administrar una dosis terapéuticamente eficaz de células TIL en la etapa (h), se puede haber administrado al paciente un régimen de linfodepleción no mieloablativa.
También se divulga en el presente documento una población terapéutica de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) para su uso en el tratamiento del cáncer y en combinación con un régimen de linfodepleción no mieloablativa. El régimen de linfodepleción no mieloablativa se puede administrar antes de administrar la población terapéutica de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL).
El régimen de linfodepleción no mieloablativa puede comprender las etapas de administración de ciclofosfamida a una dosis de 60 mg/m2/día durante dos días seguido de la administración de fludarabina a una dosis de 25 mg/m<2>/día durante cinco días.
La etapa de tratar al paciente con un régimen de IL-2 de dosis puede comenzar el día después de la administración de las células TIL al paciente en la etapa (h).
También se divulga en el presente documento pero no se reivindica una población terapéutica de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) para su uso en el tratamiento del cáncer y en combinación con un régimen de IL-2 de dosis alta. El régimen de dosis alta de IL-2 puede comenzar el día después de la administración de la población terapéutica de células TIL.
El régimen de IL-2 de dosis alta comprende 600,000 o 720,000 UI/kg que se puede administrar como una infusión intravenosa de bolo de 15 minutos cada ocho horas hasta la tolerancia.
Las células T efectoras y/o las células T de memoria central en la población terapéutica de TIL pueden exhibir una o más características seleccionadas del grupo que consiste en la expresión de CD27+, la expresión de CD28+, telómeros más largos, expresión aumentada de CD57 y expresión disminuida de CD56 en relación con células T efectoras y/o células T de memoria central obtenidas de la segunda población de células.
Las células T efectoras y/o las células T de memoria central en la población terapéutica de TIL pueden exhibir una expresión de CD57 aumentada y una expresión de CD56 disminuida en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de la segunda población de células.
También se divulgan en el presente documento pero no se reivindican, procedimientos para expandir linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) a una población terapéutica de TIL que comprende:
(a) agregar fragmentos de tumor tratados de un tumor extirpado de un paciente a un sistema cerrado para obtener una primera población de TIL;
(b) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, donde la primera expansión se realiza durante alrededor de 3-14 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y donde la transición de la etapa (a) a la etapa (b) ocurre sin abrir el sistema;
(c) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza durante alrededor de 7-14 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL que comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una segunda área superficial permeable al gas, y en donde la transición de la etapa (b) a la etapa (c) se produce sin abrir el sistema;
(d) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (c), en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) ocurre sin abrir el sistema; y
(e) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (d) a una bolsa de infusión,
en donde la transferencia de la etapa (d) al (e) ocurre sin abrir el sistema.
En procedimientos divulgados en el presente documento, la población terapéutica de TIL recolectada en la etapa (d) puede comprender suficientes TIL para una dosificación terapéuticamente eficaz de los TIL.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el número de TIL suficiente para una dosificación terapéuticamente eficaz puede ser de alrededor de 2.3 x 10<11>a alrededor de 13.7 x 1010.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el procedimiento puede comprender además la etapa de crioconservar la bolsa de infusión que comprende la población de TIL recolectada usando un procedimiento de crioconservación.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el procedimiento de crioconservación se puede realizar usando una relación 1:1 de población de TIL recolectada a medio CS10.
También se divulgan en el presente documento pero no se reivindican, procedimientos para tratar a un sujeto con cáncer y los procedimientos comprenden la administración de linfocitos infiltrantes de tumores expandidos (TIL), que comprenden:
(a) obtener una primera población de TIL de un tumor extirpado de un sujeto convirtiendo una muestra de tumor obtenida del paciente en múltiples fragmentos de tumor;
(b) agregar los fragmentos de tumor a un sistema cerrado;
(c) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, donde la primera expansión se realiza durante alrededor de 3-14 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y donde la transición desde la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema;
(d) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza durante alrededor de 7-14 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL que comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una segunda área superficial permeable al gas, y en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema;
(e) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (d), en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (e) a la (f) ocurre sin abrir el sistema;
(g) opcionalmente crioconservar la bolsa de infusión que comprende la población de TIL recolectada de la etapa (f) usando un procedimiento de crioconservación; y
(h) administrar al paciente una dosis terapéuticamente eficaz de la tercera población de TIL desde la bolsa de infusión en la etapa (g),
en donde no se realiza ninguna selección de la población de TIL durante ninguna de las etapas (a) a (h). En procedimientos divulgados en el presente documento, no se puede realizar ninguna selección de la segunda población de TIL (la población pre-REP) basada en el fenotipo antes de realizar la segunda expansión de la etapa (d). En procedimientos divulgados en el presente documento, no se puede realizar ninguna selección de la primera población de TIL, la segunda población de TIL, la tercera población de TIL o la población de TIL recolectada basada en la expresión de CD<8>durante ninguna de las etapas (a) a (h).
También se divulgan en el presente documento pero no se reivindican, procedimientos para tratar a un sujeto con cáncer, y el procedimiento comprende la administración de linfocitos infiltrantes de tumores expandidos (TIL), que comprende:
(a) obtener una primera población de TIL de un tumor extirpado de un sujeto convirtiendo una muestra de tumor obtenida del paciente en múltiples fragmentos de tumor;
(b) agregar los fragmentos de tumor a un sistema cerrado;
(c) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2 para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una primera área de superficie permeable a los gases, donde la primera expansión se realiza durante alrededor de 3-14 días para obtener la segunda población de TIL, donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL, y donde la transición desde la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema;
(d) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2, OKT-3 y células presentadoras de antígeno (APC) adicionales, para producir una tercera población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza durante alrededor de 7-14 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la tercera población de TIL es una población terapéutica de TIL que comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado, lo que proporciona una segunda área superficial permeable al gas, y en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema;
(e) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (d), en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión, en donde la transferencia de la etapa (e) a la (f) ocurre sin abrir el sistema;
(g) crioconservar la bolsa de infusión que comprende la población de TIL recolectada de la etapa (f) usando un procedimiento de crioconservación, en donde el procedimiento de crioconservación comprende mezclar un medio de crioconservación con la población de TIL recolectada;
(h) administrar al paciente una dosis terapéuticamente eficaz de la tercera población de TIL desde la bolsa de infusión en la etapa (g),
en donde no se realiza ninguna selección de la población de TIL durante ninguna de las etapas (a) a (h). En procedimientos divulgados en el presente documento, no se puede realizar ninguna selección de la segunda población de TIL (por ejemplo, la población pre-REP) basada en el fenotipo antes de realizar la segunda expansión de la etapa (d). En procedimientos divulgados en el presente documento, no se puede realizar ninguna selección de la primera población de TIL, la segunda población de TIL, la tercera población de TIL o la población de TIL recolectada basada en la expresión de CD<8>durante ninguna de las etapas (a) a (h). En procedimientos divulgados en el presente documento, el régimen de linfodepleción no mieloablativa se puede administrar antes de administrar la población de TIL recolectada. En procedimientos divulgados en el presente documento, el régimen de linfodepleción no mieloablativa puede comprender las etapas de administración de ciclofosfamida a una dosis de 60 mg/m2/día durante dos días seguida de la administración de fludarabina a una dosis de 25 mg/m2/día durante cinco días.
En procedimientos divulgados en el presente documento, las células presentadoras de antígenos pueden ser células mononucleares de sangre periférica (PBMC). En procedimientos divulgados en el presente documento, las PBMC se pueden irradiar y son alogénicas. En procedimientos divulgados en el presente documento, las PBMC se pueden agregar al cultivo celular en cualquiera de los días 9 a 14 en la etapa (c).
En procedimientos divulgados en el presente documento, las células presentadoras de antígenos pueden ser células presentadoras de antígenos artificiales.
En procedimientos divulgados en el presente documento, la recolección en la etapa (d) se puede realizar usando un sistema de tratamiento de células LOVO.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el procedimiento puede comprender la recolección en la etapa (d) mediante un sistema de tratamiento de células LOVO, tal como el sistema LOVO fabricado por Fresenius Kabi. El término "sistema de tratamiento de células LOVO" también se refiere a cualquier instrumento o dispositivo que pueda bombear una solución que comprende células a través de una membrana o filtro, como una membrana giratoria o un filtro giratorio, en un entorno de sistema estéril y/o cerrado, lo que permite un flujo continuo y tratamiento celular para eliminar el sobrenadante o el medio de cultivo celular sin formación de pellas. En algunos casos, el sistema de tratamiento celular puede realizar la separación celular, lavado, intercambio de fluidos, concentración y/u otras etapas de tratamiento celular en un sistema cerrado y estéril.
En procedimientos divulgados en el presente documento, los fragmentos tumorales pueden ser múltiples fragmentos y comprender de alrededor de 4 a alrededor de 50 fragmentos, en los que cada fragmento tiene un volumen de alrededor de 27 mm<3>En procedimientos divulgados en el presente documento, los múltiples fragmentos pueden comprender de alrededor de 30 a alrededor de 60 fragmentos con un volumen total de alrededor de 1300 mm<3>a alrededor de 1500 mm3. En procedimientos divulgados en el presente documento, los múltiples fragmentos pueden comprender alrededor de 50 fragmentos con un volumen total de alrededor de 1350 mm3. En procedimientos divulgados en el presente documento, los múltiples fragmentos pueden comprender alrededor de 50 fragmentos con una masa total de alrededor de 1 gramo a alrededor de 1.5 gramos.
En procedimientos divulgados en el presente documento, los fragmentos múltiples pueden comprender alrededor de 4 fragmentos. En procedimientos divulgados en el presente documento, los 4fragmentos se pueden colocar en un G-REX-100. En procedimientos divulgados en el presente documento, los 4fragmentos pueden tener alrededor de 0.1 cm, 0.2 cm, 0.3 cm, 0.4 cm, 0.5 cm, 0.6 cm, 0.7 cm, 0.8 cm, 0.9 cm o 1 cm de diámetro. En procedimientos divulgados en el presente documento, los 4fragmentos pueden tener alrededor de 0.1 cm, 0.2 cm, 0.3 cm, 0.4 cm, 0.5 cm, 0.6 cm, 0.7 cm, 0.8 cm, 0.9 cm o 1 cm de diámetro y se colocan en un G-REX-100. En procedimientos divulgados en el presente documento, los 4fragmentos pueden tener alrededor de 0.1 cm, 0.2 cm, 0.3 cm, 0.4 cm, 0.5 cm, 0.6 cm, 0.7 cm, 0.8 cm, 0.9 cm o 1 cm de diámetro y se colocan en un recipiente con un volumen equivalente a un G-REX-100. En procedimientos divulgados en el presente documento, los 4fragmentos pueden tener alrededor de 0.5 cm de diámetro y se colocan en un G-REX-100. En procedimientos divulgados en el presente documento, los 4fragmentos pueden tener alrededor de 0.5 cm de diámetro y se colocan en un recipiente con un volumen equivalente a un G-REX-<1 0 0>.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el medio de cultivo celular puede proporcionarse en un recipiente seleccionado del grupo que consiste en un recipiente G y una bolsa de células Xuri.
En procedimientos divulgados en el presente documento, la bolsa de infusión en la etapa (e) puede ser una bolsa de infusión que contiene HypoThermosol.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el primer período en la etapa (b) y el segundo período en la etapa (c) pueden realizarse cada uno individualmente dentro de un período de 10 días, 11 días o 12 días. En procedimientos divulgados en el presente documento, el primer período en la etapa (b) y el segundo período en la etapa (c) pueden realizarse individualmente dentro de un período de 11 días. En procedimientos divulgados en el presente documento, las etapas (a) a (e) se pueden realizar dentro de un período de alrededor de 25 días a alrededor de 30 días. En procedimientos divulgados en el presente documento, las etapas (a) a (e) se pueden realizar dentro de un período de alrededor de 20 días a alrededor de 25 días. En procedimientos divulgados en el presente documento, las etapas (a) a (e) se pueden realizar dentro de un período de alrededor de<20>días a alrededor de 22 días. En procedimientos divulgados en el presente documento, las etapas (a) a (e) se pueden realizar en 22 días o menos. En procedimientos divulgados en el presente documento, las etapas (a) a (e) y la crioconservación se pueden realizar en<2 2>días o menos.
En procedimientos divulgados en el presente documento, las etapas (b) a (e) se pueden realizar en un solo recipiente, en donde realizar las etapas (b) a (e) en un solo recipiente da como resultado un aumento en el rendimiento de TIL por tumor extirpado en comparación con la realización de las etapas (b) a (e) en más de un recipiente.
En procedimientos divulgados en el presente documento, las células presentadoras de antígeno se pueden agregar a los TIL durante el segundo período en la etapa (c) sin abrir el sistema.
En procedimientos divulgados en el presente documento, las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas en la población terapéutica de TIL pueden exhibir una o más características seleccionadas del grupo que consiste en la expresión de CD27+, la expresión de CD28+, telómeros más largos, expresión aumentada de CD57 y expresión disminuida de CD56. en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de la segunda población de células.
En procedimientos divulgados en el presente documento, las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas en la población terapéutica de TIL pueden exhibir una expresión aumentada de CD57 y una expresión disminuida de CD56 en relación con las células T efectoras y/o células T de memoria central obtenidas de la segunda población de células.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el riesgo de contaminación microbiana puede reducirse en comparación con un sistema abierto.
En procedimientos divulgados en el presente documento, los TIL de la etapa (e) se pueden infundir a un paciente.
En procedimientos divulgados en el presente documento, el recipiente cerrado puede comprender un solo biorreactor. En procedimientos divulgados en el presente documento, el recipiente cerrado comprende un G-REX-10. En procedimientos divulgados en el presente documento, el recipiente cerrado puede comprender un G-REX-100.
EJEMPLOS
Las formas de realización abarcadas en el presente documento se describen ahora con referencia a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos se proporcionan solo con el propósito de ilustrar y la divulgación abarcada en este documento no debe interpretarse de ninguna manera como limitada a estos ejemplos, sino que debe interpretarse para que abarque todas y cada una de las variaciones que se hacen evidentes como resultado de las enseñanzas proporcionadas en este documento.
EJEMPLO 1:ENSAYOS DEL SISTEMA CERRADO
Como se analiza en el presente documento, se desarrollaron protocolos y ensayos para generar TIL a partir de tumores de pacientes en un sistema cerrado.
Este ejemplo describe un nuevo procedimiento abreviado para generar números clínicamente relevantes de TIL a partir de tejido tumoral extirpado de pacientes en dispositivos G-REX y crioconservación del producto celular final. En los Ejemplos 2 a<8>se describen aspectos adicionales de este procedimiento.
Definiciones/Abreviaturas
BSC - Cabina de seguridad biológica
°C - grados Celsius
CO<2>- Dióxido de carbono
CD3 - Clúster de diferenciación 3
CM1 - Medio completo 1
CM2 - Medio completo 2
TIWB - Regulador de pH de lavado para aislamiento de tumores
CM4 - Medio completo 4
CRF - Congelador con velocidad de control
EtOH - etanol
GMP - Buenas prácticas de fabricación
IL-2, rIL-2 -Interleucina-2, Interleucina-2 humana recombinante,
IU - Unidad Internacional
L - Litro
LN2 - nitrógeno líquido
mL - mililitro
|jl - microlitro
mM - milimolar
jm - micrómetro
NA - No aplica
PBMC - Célula mononuclear de sangre periférica
PPE - Equipo de protección personal
Pre-REP: cultivos de TIL iniciales que se originan a partir de fragmentos de tumor
REP - Protocolo de expansión rápida
TIL - Linfocitos infiltrantes de tumores
TIWB - Regulador de pH de lavado de aislamiento TIL
POE - Procedimiento operativo estándar
Procedimiento
1. Preparación avanzada: Día 0 (Realizado hasta 36 horas antes)
1.1 Se preparó el regulador de pH de lavado de aislamiento de TIL (TIWB) suplementando 500 mL de solución salina equilibrada de Hanks con 50 jg/m L de gentamicina. Para obtener una solución madre de gentamicina de 10 mg/mL, se transfirieron 2.5 mL a HBSS. Para obtener 50 mg/mL de solución madre, se transfirieron 0.5 mL a HBSS.
1.2. Medios CM1 preparados con GlutaMax™ según LAB-005 "Preparación de medios para PreREP y REP" para instrucciones de C<m>2". Almacenar a 4°C hasta 24 horas. Dejar calentar a 37°C durante al menos 1 hora antes de usar.
1.3. Se retiraron las alícuotas de IL-2 del congelador a -20°C y se colocaron las alícuotas en el refrigerador a 2-8°C.
2. Recepción de tejido tumoral
2.1. Se conservó toda la documentación recibida con el tejido tumoral y se obtuvieron fotos del contenedor de transporte y del tejido tumoral.
2.2. Si TempTale se proporcionó impreso y se guardó el documento asociado; se guardo el PDF.
2.3. Se retiró la muestra de tumor y el recipiente secundario (bolsa con cierre de cremallera) del expedidor y se almacenó a 4°C hasta estar listo para su tratamiento.
2.4 Tumor no utilizado se envió en HypoThermasol o como fragmentos congelados en CryoStor CS10 (ambos disponibles comercialmente en BioLife Solutions, Inc.).
3. Tratamiento de tumores para TIL
3.1. Se transfirieron asépticamente los siguientes materiales al BSC, según fuera necesario, y se etiquetaron de acuerdo con la Tabla 3 más adelante.
TABLA 3. Materiales para el aislamiento de tumores.
3.2. Se etiquetaron los círculos de las placas de Fragmentos de Tumores con las letras A-J.
3.3. Se etiquetó la parte inferior de los pocillos de las placas de tejidos favorables con las letras A - J.
3.4. Se transfirieron 5 mL de gentamicina al matraz de HBSS. Se etiquetó como TIWB.
3.5. Se arremolinó para mezclar.
3.6. Se pipetearon 50 mL TIWB a cada uno de los siguientes:
1. Placa de lavado 1
2. Placa de lavado 2
3. Placa de lavado 3
4. Placa de lavado 4
3.7. Se pipetearon 2 mL de TIWB a los pocillos A-J de la placa de tejido favorable.
3.8. Se cubrieron las placas de tejidos favorables (parte inferior de la placa de<6>pocillos) con la placa de fragmentos tumorales correspondiente (tapa de la placa de<6>pocillos).
3.9. Con unas pinzas largas, se extrajo el tumor o los tumores del matraz de muestras y se transfirieron a la placa de lavado<1>.
3.10. Se incubó el tumor a temperatura ambiente en la placa de lavado 1 durante 3 minutos.
3.11. Durante la incubación, se volvió a etiquetar el matraz de muestras como "Carga biológica" y se almacéno a 2-8°C hasta que se envío al control de calidad para su análisis.
3.12. Se desecharon las pinzas largas y se utilizaron pinzas cortas para manipulaciones posteriores.
3.13. Con unas pinzas se transfirió el tumor a la placa de lavado 2.
3.14. Se incubó el tumor a temperatura ambiente en la placa de lavado 2 durante 3 minutos.
3.15. Con unas pinzas se transfirió el tumor a la placa de lavado 3.
3.16. Se incubó el tumor a temperatura ambiente en la placa de lavado 3 durante 3 minutos.
3.17. Se retiraron las placas de fragmentos tumorales (tapas de placa de<6>pocillos) de las placas de tejidos favorables (fondos de placa de<6>pocillos) y se colocaron las placas de fragmentos tumorales boca abajo sobre la superficie de la BSC.
3.18. Con una pipeta de transferencia, se agregaron alrededor de 4 gotas individuales espaciadas uniformemente de TIWB a cada círculo de las placas de fragmentos tumorales.
3.19. Se colocó una regla debajo de la placa de disección.
3.20. Con unas pinzas se transfirió el tumor a la placa de disección.
3.21. Usando la regla debajo de la placa de disección, se midió y se registró la longitud del tumor.
3.22. Para los tumores de más de 1 cm se hicieron placas de tejido favorable adicionales.
3.23. Se realizó una disección inicial de las piezas tumorales en la placa de disección en 10 piezas intermedias y se tuvo cuidado de conservar la estructura tumoral de cada pieza intermedia.
3.24. Se transfirieron las piezas de tumor intermedias que no se diseccionaron activamente en fragmentos a la placa de lavado 4 para garantizar que el tejido permaneciera hidratado durante todo el procedimiento de disección.
3.25. Trabajando con una pieza de tumor intermedia a la vez, se cortó cuidadosamente el tumor en fragmentos de hasta 3x3x3 mm en la placa de disección, usando la regla debajo de la placa como referencia. Cuando el bisturí se desafiló, se reemplazó por un bisturí nuevo.
3.26. Se continuó diseccionando fragmentos de la pieza de tumor intermedia hasta que se evaluó todo el tejido de la pieza intermedia.
3.27. Se seleccionaron los fragmentos favorables y usando una pipeta de transferencia se transfirieron hasta 4 fragmentos favorables a las gotas de TIWB en un círculo en la placa de Fragmentos de Tumores.
3.28. Con una pipeta de transferencia, se transfirieron los fragmentos favorables restantes de la pieza tumoral, cuando estuvieron disponibles, al pocillo correspondiente en la placa de tejido favorable.
3.29. Con una pipeta de transferencia, se transfirieron la mayor cantidad posible del tejido desfavorable y el producto de desecho a la placa de tejido desfavorable para limpiar la placa de disección. El tejido desfavorable se indicó mediante tejido adiposo amarillo o tejido necrótico.
3.30. Se continuó el tratamiento repitiendo la etapa 7.3.25-7.3.30 para las piezas tumorales intermedias restantes, trabajando una pieza intermedia a la vez hasta que se hubo tratado todo el tumor.
3.31. Si estaban disponibles menos de 4 fragmentos tumorales en el círculo correspondiente de la placa de fragmentos tumorales, era aceptable usar fragmentos de un pocillo no correspondiente de la placa de tejido favorable como disponibles para lograr el objetivo de 40 fragmentos. Cuando fueron menos de 40 fragmentos, se colocaron 10-40 en un matraz G-Rex 100M individual.
4. Matraz de siembra G-Rex 100M
4.1. Se transfirieron asépticamente los siguientes materiales al BSC, según fuera necesario, y se etiquetaron de acuerdo con la Tabla 4 más adelante.
TABLA 4. Materiales adicionales para matraces de siembra.
4.2. Se suplementó cada litro de CM1 con 1 mL de solución madre de IL-2<( 6>x 10<6>UI/mL).
4.3. Se colocaron 1000 mL de CM1 precalentado que contenía 6000 UI/mL de IL-2 en cada biorreactor G-REX 100M necesario según lo determinado en la Tabla 5 más adelante.
4.4. Con una pipeta de transferencia, se transfirió el número apropiado de fragmentos de tumor a cada matraz G-Rex 100M, distribuyendo los fragmentos según la Tabla 5.
4.5. Cuando uno o más fragmentos de tumor se transfirieron al flote en el matraz G-Rex 100M, se obtuvo un fragmento de tumor adicional, si estaba disponible, en la placa de tejido favorable y se transfirió al matraz G-Rex 100M.
4.6. Se registró el número total de fragmentos agregados a cada matraz.
4.7. Se desechó la placa de tejido desfavorable.
4.8. Se colocó cada biorreactor G-REX 100M en una incubadora de CO<2>al 5% a 37°C.
4.9. Cuando hubo más de 40 fragmentos disponibles:
4.9.1. Cuando se obtuvieron > 41 fragmentos, se colocaron 1000 mLde CM1 completo precalentado en un segundo biorreactor G-REX 100M.
TABLA 5. Número de biorreactores G-REX necesarios.
5. Preparación avanzada: día 11 (preparada con hasta 24 horas de anticipación)
5.1. Se prepararon<6>L de CM2 con GlutaMax. Se utilizaron procedimientos de laboratorio de referencia para "Preparación de medios para PreREP y REP" para instrucciones de CM2". Se calentó a 37°C 1 hora antes de su uso.
5.2. Alícuotas de IL-2 descongeladas: se retiraron las alícuotas de IL-2 del congelador y se colocaron a 4°C.
<6>. Recolección de TIL (día 11)
6.1. Se retiraron con cuidado los matraces G-REX -100M de la incubadora y se colocaron en BSC2. Se tuvo cuidado de no perturbar las células del fondo del matraz.
6.2. Utilizando GatherRex o una bomba peristáltica, se aspiró alrededor de 900 mL de sobrenadante de cultivo celular del (los) matraz(ces).
6.3. Los TIL se resuspendieron agitando suavemente el matraz. Se observó que todas las células se habían liberado de la membrana.
6.4. Usando una bomba peristáltica o GatherRex se transfirió la suspensión de células residuales a un paquete de transferencia de sangre del tamaño adecuado (300-1000 mL). Se tuvo cuidado de no permitir que los fragmentos se transfirieran al paquete de transferencia de sangre.
6.5. Se agarró el paquete de transferencia con un conjunto de transferencia de plasma de 4" (se aseguró de que la abrazadera estuviera cerrada).
<6>.<6>. Se masajeó el paquete para asegurarse de que la suspensión de células se hubiera mezclado bien y, con una jeringa de 3 mL, se eliminó 1 mL de suspensión de TIL para el recuento de células. Se sujetó el tubo y se volvió a tapar el conector luer hembra con una nueva tapa luer estéril.
6.7. Se colocó el paquete de transferencia en una bolsa de plástico con cierre de cremallera y se volvió a colocarlo en la incubadora hasta estar listo para usar.
7. Preparación de los medios
7.1. Se dejó que el medio se calentara a 37°C durante > 1 hora.
7.2. Se agregaron 3 mL de solución madre de rhIL-26x10<6>UI/mL a<6>L de CM2 para alcanzar una concentración final de 3000 UI/mL de rhIL-2. Se etiqutó como "CM2 completo".
7.3. Se unió estéril un equipo de transferencia de plasma de 4" con luer hembra a un paquete de transferencia de 1L.
7.4. Se transfirieron 500 mL de CM2 completo a un paquete de transferencia de 1 L. Se separó el equipo de transferencia de fluido o la jeringa y se conectó un tapón luer estéril al puerto luer hembra.
7.5. Se agarró el paquete con un acoplador de sitio de muestra.
7.6. Usando una jeringa de 1.0 mL con aguja, se extrajo 150 pL de 1 mg/mL de anti-CD3 (clon OKT3) y se transfirió a 500 mL de "CM2 completa" a través del acoplador del sitio de la muestra. Se retiró la jeringa para asegurarse de que todo el reactivo se hubiera eliminado de la línea. Se almacenó a 37°C hasta su uso.
<8>. Preparación del matraz
8.1. Se transfirieron 4.5L de "CM2 completo" a un matraz G-REX -500M usando las graduaciones en el matraz como referencia.
8.2. Se colocó el matraz en una incubadora a 37°C hasta estar listo.
9. Descongelar alimentadores irradiados
9.1. Se utilizaron 5,0 x 10<9>alimentadores irradiados alogénicos de dos o más donantes para su uso.
9.2. Se retiraron los alimentadores del congelador LN2 y se colocaron en una bolsa de transporte de riesgo biológico.
9.3. Con las bolsas de alimentación en la bolsa de transporte de riesgo biológico, los alimentadores se descongelaron en una incubadora a 37°C o en un baño de cuentas. Las bolsas se mantuvieron estáticas y sumergidas. Se retiraron los alimentadores del baño cuando estaban casi completamente descongelados, pero aún estaban fríos.
9.4. Se rociaron o se limpiaron las bolsas de alimentación con EtOH al 70% y se colocaron en BSC2. Se agregó cada bolsa de alimentación directamente al G-Rex 500M abierto para asegurar un número suficiente de células irradiadas (5x10<9>células, /- 20%).
9.5. Ambas abrazaderas se cerraron en un conector tipo Y fenwal con cierre luer macho.
9.6. Cada bolsa de alimentación se agarró con una pata del conector en Y.
9.7. Se retiró el paquete de transferencia de 1 l con 500 mL de "CM2 completo" OKT3 y se transfirió a BSC. 9.8. Se conectó asépticamente una jeringa de 60 mL a una llave de paso de 3 vías y se conectó asépticamente el paquete de transferencia al extremo macho de la llave de paso.
9.9. Se acopló asépticamente el conector en Y a la llave de paso de 3 vías.
9.10. Se extrajo todo el contenido de las bolsas de alimentación a la jeringa, se registró el volumen y se despacharon 5.0 x 10<9>alimentadores irradiados alogénicos al paquete de transferencia.
9.11. Se sujetó y se separó el paquete de transferencia del aparato y se conectó el cierre luer hembra con un nuevo tapón luer estéril.
9.12. Usando una jeringa de aguja y 3 mL se extrajo 1 mL para el recuento de células del acoplador del sitio de la muestra.
9.13. Se procedió cuando se alcanzó /-10% del número de células diana (5.0 x 109) con > 70% de viabilidad.
9.14. Cuando se alcanzó menos del 90% del número de células diana (5.0 * 109) con > 70% de viabilidad, se descongeló otra bolsa y se repitió 7.9.4-7.9.12. Cuando se alcanzó más de 110% del número de células diana, se calculó el volumen adecuado requerido para la dosis de células deseada y se procedió.
10. Cocultivar TIL y alimentadores en matraz G-REX 500M
10.1. Se retiró el matraz G-REX 500M que contenía el medio preparado de la incubadora y se colocó en la BSC2.
10.2. Se adjuntó el paquete de transferencia del alimentador al G-REX -500M y se permitió que el contenido de la bolsa drenara en el 500M.
10.3. Se retiró la suspensión de TIL de la incubadora y se colocó en la BSC.
10.4. Se calculó el volumen de suspensión de TIL a agregar para conseguir 200 x 10<6>células viables totales.(TVC/mL) /200 x 106=mL
10.5. Cuando los TIL estuvieron entre 5-200 x 10<6>células viables totales, se añadieron todos los TIL (volumen total) al G-REX -500M. Cuando el recuento de TIL fue superior a 200 x 10<6>células viables totales, se añadió el volumen calculado necesario para que 200 x 10<6>TIL se distribuyeran a un G-REX -500M individual. Los TIL restantes se centrifugaron y congelaron en al menos dos crioviales hasta 108/mL en CS10, se etiquetaron con la identificación de los TIL y la fecha de congelación.
10.6. Se colocó el G-REX -500M en una incubadora de CO<2>al 5% a 37°C durante 5 días.
11. Preparación avanzada: día 16-18
11.1. Se calentó 1 bolsa de 10 L de AIM V para cultivos iniciados con menos de 50 * 10° TIL calentado 2 para aquellos iniciados con más de 50 * 10° TIL a 37°C al menos 1 hora o hasta que estén listos para usar.
12. Realizar el recuento de células TIL: días 16-18
12.1. Se retiró el matraz G-REX -500M de la incubadora y se colocó en BSC2. Se tuvo cuidado de no alterar el cultivo celular en el fondo del matraz.
12.2. Se retiraron asépticamente 4 L de medio de cultivo celular del matraz G-REX -500M y se colocaron en un recipiente estéril.
12.3. Se hizo girar el G-REX -500M hasta que todo el TIL se hubiera resuspendido de la membrana.
12.4. Ussando GatherRex o una bomba peristáltica se transfirió la suspensión de células a un paquete de transferencia de 2 litros. Se conservó el matraz de 500M para su uso posterior. Se selló el puerto con el acoplador del sitio de muestreo para evitar la pérdida de TIL.
12.5. Se agarró el paquete de transferencia con un acoplador para el lugar de la muestra y, utilizando una jeringa de 3 mL y una aguja, se extrajeron 2 muestras independientes de 1 mL para realizar un recuento de células. 12.6. Se calculó el número total de matraces necesarios para el subcultivo de acuerdo con la siguiente fórmula. Fracciones redondeadas hacia arriba.
Células viables totales/1.0 x10<9>= matraz #
13. Preparar CM4
13.1. Se preparó una bolsa de 10L de AIM-V por cada dos matraces de 500M necesarios. Medios adicionales calentados según sea necesario.
13.2. Por cada 10 L de AIM-V necesarios, se agregaron 100 mL de GlutaMAX para hacer CM4.
13.3. Medio CM4 suplementado con rhIL-2 para una concentración final de 3.000 UI/mL de rhIL-2.
14. Dividir el cultivo celular
14.1. Usando las graduaciones en el matraz, se llenó a gravedad cada G-REX -500M a 5 L.
14.2. Se distribuyó uniformemente el volumen TIL entre el número calculado de G-REX -500Ms.
14.3. Se colocaron los matraces en una incubadora de CO<2>al 5% a 37°C hasta la recolección el día 22 de REP.
15. Preparación avanzada: día 22-24
15.1. Se prepararon 2 l de regulador de pH de lavado de HSA al 1% agregando 40 mL de HSA al 25% a cada una de las dos bolsas de 1 l de PlasmaLyte A 7.4. Se agruparon en una bolsa auxiliar LOVO.
15.2. Se suplementaron 200 mL CS10 con IL-2 a 600 UI/mL.
15.3. Se nfriaron previamente cuatro botes de aluminio para congelador de 750 mL a 4°C.
16. Recolectar TIL: Día 22-24
16.1. Se retiraron los matraces G-REX -500M de la incubadora a 37°C y se colocaron en la BSC2. Se tuvo cuidado de no alterar el cultivo celular en el fondo del matraz.
16.2. Se aspiraron y descartaron 4.5 L de sobrenadante de cultivo celular de cada matraz.
16.3. Se giró el matraz G-REX -500M para resuspender completamente los TIL.
16.4. Se pesó la bolsa de bioprocedimientos de 3-5 L antes de su uso.
16.5. Usando GatherRex o una bomba peristáltica, se recolectó TIL en la bolsa de bioprocedimientos.
16.6. Se mezcó bien la bolsa y con una jeringa de 3 mL se tomaron 2 muestras de 2 mL del puerto de muestra de la jeringa para el recuento de células.
16.7. Se pesó la bolsa y se encontró la diferencia entre el peso inicial y final. Se usó el siguiente cálculo para determinar el volumen de suspensión celular.
Peso neto de la suspensión celular (mL) /1.03 = volumen (mL)
17. Filtrar TIL y preparar la bolsa de fuente LOVO
17.1. Se colocó la bolsa que contiene el cultivo celular en la BSC2.
17.2. Se colocó un filtro de sangre de 170 pm en la BSC2 y se cerraron todas las abrazaderas.
17.3. Se unió estéril una extremidad fuente del filtro a la suspensión celular.
17.4. Se pesó una nueva bolsa de bioprocedimientos de tamaño apropiado (a esto se le denominó bolsa fuente LOVO).
17.5. Se unió estéril el extremo terminal del filtro a la bolsa de fuente LOVO.
17.6. Se elevó la suspensión celular colgando las células en un portasueros IV para establecer una transferencia de células por flujo de gravedad.
Nota: (No se permitió que la bolsa de la fuente cuelgue del aparato de filtración).
17.7. Se abrieron todas las abrazaderas necesarias y se permitió que los TIL drenaran de la bolsa de suspensión celular a través del filtro y a la bolsa fuente LOVO.
17.8. Una vez que todas las células se transfirieron a la bolsa de la fuente de LOVO, se cerraron todas las abrazaderas y se selló el tubo de la bolsa de la fuente de LOVO para quitar el filtro.
17.9. Se pesó la bolsa de origen LOVO y se calculó el volumen.
17.10. La bolsa de origen LOVO estaba lista para LOVO.
17.11. Se retiró la bolsa de producto final LOVO del kit desechable sellando el tubo cerca de la bolsa.
18. Formular TIL 1:1 en CS10 frío suplementado con 600 UI/mL de rhIL-2
18.1. Se calculó el número requerido de bolsas criogénicas necesarias.
(volumen de producto celular x<2>)</ 1 0 0>= número de bolsas requeridas (redondeo hacia abajo)
18.2. Se calculó el volumen a despachar en cada bolsa.
(volumen de producto celular x<2>)/número de bolsas requeridas=volumen para agregar a cada bolsa
18.3. Se transfirieron asépticamente los siguientes materiales de la Tabla<6>al BSC.
TABLA<6>. Materiales para la crioconservación de TIL.
19. Formulación de TIL
19.1. Se cerraron todas las abrazaderas en conexión celular CC1.
19.2. Al dispositivo de conexión celular se adjunta asépticamente el producto final LOVO, el cierre luer de la bolsa CS10 y el número apropiado de bolsas criogénicas. Se reemplazó la jeringa de 60 mL con una jeringa de 100 mL.
19.3. La cantidad de volumen de CS10 necesaria era equivalente al volumen de la bolsa de producto final LOVO.
19.4. Se abrió la ruta de la llave de paso y se desenganchó la línea entre la bolsa de producto final LOVO y la jeringa para tirar de CS10 a la jeringa, volvió a sujetar la vía de CS10. Se abrió la vía hacia la bolsa de la célula para empujar CS10 dentro de la bolsa de producto final LOVO. Se usó la jeringa para medir el volumen agregado a la bolsa de producto final LOVO. Se repitió según fue necesario con una jeringa nueva hasta que se transfirió la cantidad deseada de CS10.
19.5. Se mezcló bolsa de producto final LOVO por inversión.
19.6. Se reemplazó la jeringa de 100 mL
19.7. Una a la vez se abrieron las abrazaderas en bolsas criogénicas de 750 mL
19.8. Solo se abrieron las abrazaderas que están directamente asociadas con el producto formulado y la bolsa criogénica en uso.
19.9. Se usó la jeringa de 100 mL para medir el volumen de producto formulado que conduce a la bolsa criogénica.
19.10. Se transfirieron 100 mL de producto formulado a cada bolsa criogénica.
19.11. Después de la adición a cada bolsa, se retiró la jeringa para eliminar todas las burbujas de aire de las bolsas criogénicas y se volvió a sujetar la línea asociada.
19.12. En la última bolsa, se retiró un retenedor de 10 mL para la prueba de CC.
19.13. Se selló cada bolsa criogénica, dejando la menor cantidad de tubos posible.
19.14. Se retiró la jeringa que contenía la muestra retenida y se transfirió a un tubo cónico de 50 mL; se transfirieron 1,5 mL a crioviales individuales y se congeló en un congelador de velocidad controlada.
19.15. Se transfirieron las bolsas selladas a 4°C mientras se preparaban las etiquetas.
19.16. Se etiquetó cada bolsa criogénica con la descripción del producto, el nombre y la fecha, el volumen, el recuento de células y la viabilidad.
19.17. Se colocó cada bolsa criogénica en botes preenfriados de aluminio para congelador.
20. Crioconservación de TIL usando congelador de velocidad controlada (CRF)
20.1. Se siguió el procedimiento estándar para el congelador de velocidad controlada.
20.2. Después de usar el CRF, se almacenaron las bolsas criogénicas en nitrógeno líquido (LN<2>).
21. Resultados esperados determinados y criterios de aceptación de la medida.
EJEMPLO 2:PROCEDIMIENTO EJECUTADO EN<8>TUMORES DE PACIENTE
El procedimiento del Ejemplo 1 se ejecutó usando<8>tumores de pacientes para producir<8>lotes de TIL. Se obtuvo una buena recuperación del cultivo, viabilidad, recuentos celulares, liberación de CD3+ (que indica el % de contenido de células T) e IFN-gamma (IFN-g o IFN-y), como se muestra en la Tabla 7 más adelante y en la Figura 7 a la Figura 10.
TABLA 7. Resultados de las pruebas de identidad, potencia y viabilidad/recuperación del procedimiento del ejemplo 1.
EJEMPLO 3:ESCALABILIDAD DEL PROCEDIMIENTO TIL MODIFICADO
Los estudios presentados aquí se realizaron en un laboratorio de desarrollo de procedimientos (PD) y, posteriormente, se realizó un estudio de calificación de procedimientos (PQ) utilizando ejecuciones de ingeniería en la suite de sala limpia de GMP en una instalación de fabricación. Se completaron tres ejecuciones de PQ/ingeniería en la sala limpia de la instalación de GMP de acuerdo con un protocolo de calificación y un registro de lote basado en los estudios de DP presentados aquí. Los criterios de aceptación para las ejecuciones de ingeniería se establecieron de manera prospectiva. El estudio PQ se resume con más detalle más adelante, y los resultados de las pruebas obtenidos para los lotes de ingeniería se proporcionan en las siguientes secciones.
El número de células generadas a partir de cultivos del protocolo de expansión rápida previa (pre-REP) a menudo excedía de 100 x 10<6>células viables. Además, la inclusión de un ciclo de congelación-descongelación entre las etapas de cultivo Pre-REP y REP redujo el rendimiento de células viables. Al eliminar la etapa de crioconservación en desarrollo, el REP podría iniciarse de manera confiable y regular con un mayor número de TIL. Este cambio permitió que la duración del REP se redujera en una cantidad proporcional de tiempos de duplicación celular a alrededor de 11 días sin afectar la dosis celular. Además, el tiempo de cultivo reducido desde la activación hasta la recolección da como resultado un producto menos diferenciado y potencialmente más capaz de persistir in vivo (Tran 2008).
El estudio de PD validó el inicio del cultivo de REP con hasta 200 x 10<6>células con un número fijo de células alimentadoras. Más adelante, se evaluó el momento óptimo para recolectar el cultivo REP durante 9 a 14 días. Los cultivos se sembraron en relaciones de alimentador a TIL en el intervalo de 100:1 a 25:1. La optimización del tiempo de recolección se determinó midiendo el recuento celular total, la viabilidad, el inmunofenotipo, el consumo de medios, el análisis de metabolitos, el análisis de interleucina-2 (IL-2) y los análisis funcionales que se describen más adelante.
Se evaluó la inmunofenotipificación de células al final del cultivo de REP sobre la base de los marcadores enumerados en la Tabla<8>más adelante. Se evaluó el estado de activación y diferenciación fenotípica de las células. No se observaron diferencias estadísticas en el fenotipo entre ninguna de las condiciones experimentales.
TABLA<8>. Marcadores de activación y diferenciación ensayados en cultivos de optimización de procedimientos.
Diana Etiqueta para detección Clon
Panel 1
Panel 2
CD45RA PE/Cy7 HI100
CD3 PerCP/Cy5.5 SP34-2
CCR7 PE 150503
CD<8>FITC HIT<8>
CD4 APC/Cy7 OKT4
CD38 APC HB-7
HLA-DR PB L243
Panel 3
CD137 PE/Cy7 4B4-1
CD3 PerCP/Cy5.5 SP34-2
Lag3 PE 3DS223H
CD<8>FITC HIT<8>
CD4 APCCy7 OKT4
PD1 APC EH12.2H7
Tim-3 BV421 F38-2E2
Abreviaturas: PE/Cy7= ficoeritrina: Cy-7 conjugado en tándem; PerCP-Cy5.5= peridinina-clorofila-proteína Complejo: CY5.5 Conjugado; PE= ficoeritrina; FITC= conjugado fluoresceína isotiocianato; APC-H7= aloficocianina: H7 conjugado en tándem; APC= aloficocianina; PB=Pacific Blue™
El consumo de medios y la producción de metabolitos se mantuvieron dentro de los límites tolerables para todas las condiciones analizadas; y los niveles de IL-2 permanecieron por encima de 150 UI/mL de sobrenadante de cultivo (datos no mostrados).
Se entiende que la destrucción de las células tumorales por las células T está mediada por la activación del receptor de las células T en la célula T efectora en respuesta a los péptidos presentados en la superficie de las células tumorales. Las células T expandidas ex vivo deben conservar la capacidad de activarse y proliferar en respuesta a la activación de TCR si han de persistir in vivo tras la infusión y mediar la regresión del tumor.
Para evaluar el potencial de activación de las células cultivadas, los TIL recolectados en diferentes puntos de tiempo se reactivaron con PBMC alogénicas irradiadas cargadas con OKT3. Los cultivos de TIL se recogieron después de 7 días y se ensayaron para determinar la expansión múltiple. Los resultados de este estudio se resumen en la TABLA 9.
TABLA 9. Resumen de resultados: Proliferación de post-REP TIL tras re-cultivo con PBMC alogénicas cargadas con OKT3.
Día de recolección Expansión múltiple SD Valor p (prueba 't' de Student)
Experimento 1
Día 9 43 6.088 NA
Día 10 48 3.105 NA
Día 11 71 11.137 0.135
Día 14 60 6.995
Día de recolección Expansión múltiple SD Valor p (prueba 't' de Student)
Experimento 2
Día 9 44 6.276 NA
Día 10 27 4.762 NA
Día 11 72 18.795 0.045
Día 14 41 7.050
Experimento 3
Día 9 54 5.810 NA
Día 10 54 9.468 NA
Día 11 65 1.674 0.071
Día 14 50 8.541
Este estudio demostró que el potencial de activación de TIL en este ensayo aumentó con cada día de cultivo hasta el día 11 (días de recolección 9-11). Las células recolectadas el día 11 del procedimiento modificado se realizaron de manera similar al control TIL mantenido en cultivo durante 14 días similar al procedimiento actual.
Estos estudios demostraron la escalabilidad del procedimiento de TIL modificado y establecieron un intervalo aceptable de relaciones de siembra de TIL a células alimentadoras. Además, se encontró que las características de crecimiento persistían hasta el día 14 de cultivo, mientras que las condiciones de cultivo permanecieron óptimas hasta el día 11. Las condiciones ensayadas no mostraron ningún efecto medible sobre el fenotipo TIL. Las células recolectadas en el día<11>del cultivo r Ep demostraron la mejor capacidad para responder a la reactivación mientras las condiciones del cultivo celular permanecieron dentro de las tolerancias. Estos cambios se adoptaron y validaron a escala completa con la división del cultivo que se produjo el día 5 y la recolección el día 11.
Se pusieron en práctica ejecuciones de ingeniería en la instalación de desarrollo de procedimientos con el fin de ganar experiencia en la fabricación y prueba del producto TIL antes de la fabricación con GMP del producto TIL autólogo para su administración a pacientes. El procedimiento de fabricación utilizado para las ejecuciones de ingeniería fue a la misma escala que el que se utilizará en la fabricación del producto TIL con GMP. La experiencia en el cultivo de TIL de diversos tipos de tumores, incluidas metástasis de melanoma, carcinoma de células escamosas de mama, cabeza y cuello (HNSCC), carcinoma de cuello uterino y cáncer de pulmón ha determinado que la disección y el crecimiento de TIL de muestras de tumores metastásicos es similar para estos cánceres. (Sethuraman 2016, JITC P42). Debido a que el aislamiento inicial de fragmentos tumorales y el crecimiento de linfocitos parece ser similar entre las histologías tumorales, estas ejecuciones de ingeniería son suficientes para calificar el procedimiento para la producción de TIL a partir de HNSCc , tumores cervicales y melanoma.
La Tabla 10 muestra la fuente y las características de las muestras tumorales utilizadas para las ejecuciones de ingeniería.
TABLA 10. Muestras de tumores analizadas para ejecuciones de ingeniería.
Se completaron las pruebas de liberación de las tres ejecuciones de ingeniería de TIL en la instalación de desarrollo de procedimientos (Tabla 11) como se describe más adelante. El producto se probó el día 16 y el día 22. También se determinó la secreción de IFN-y para las tres ejecuciones de ingeniería (Tabla 12) como se detalla en otra parte.
TABLA 11. Resultados de las pruebas de liberación de productos para ejecuciones de ingeniería en la instalación de desarrollo de procedimientos.
TABLA 12. Caracterización funcional adicional: medición de la secreción de IFN-<y>.
En conclusión, los datos de las ejecuciones de ingeniería demuestran que el producto farmacéutico de TIL puede fabricarse con el propósito de la administración autóloga a pacientes.
EJEMPLO 4:LINFODEPLECIÓN
Los recuentos de células se pueden tomar el día 7 y antes de la linfodepleción. El producto celular final incluía hasta alrededor de 150 * 10<9>células viables formuladas en un mínimo de 50% de HypoThermosol™ en Plasma-Lyte A™ (volumen/volumen) y hasta un 0.5% de HSA (compatible para infusión humana) que contenía 300 UI/mL de IL2. El producto final estaba disponible para la administración en uno de dos volúmenes para infusión:
1) 250 mL (en una bolsa de infusión de 300 mL de capacidad) cuando el total de TIL recolectado es < 75 * 10<9>O
2) 500 mL (en una bolsa de infusión de 600 mL de capacidad) cuando el total de TIL recolectado es <150 * 10<9>No se puede predecir el número total de células que podrían generarse para el producto de infusión de TIL final para cada paciente debido a la variación de paciente a paciente en las tasas de expansión de células T durante la etapa de REP. Se establece un límite inferior de células en los días 3, 4, 5,<6>, 7 del REP de 3 a 14 días en función del número mínimo de células necesarias para tomar la decisión de practicar una linfodepleción en el paciente usando el régimen de quimioterapia con ciclofosfamida más fludarabina. Una vez que hemos comenzado la linfodepleción en función de este número mínimo de células alcanzado, nos comprometemos a tratar al paciente con el número disponible de TIL que generamos en el REP en cualquiera de los días 3 a 14, y en muchos casos el día 7. El límite superior del intervalo para la infusión (150 * 10<9>células viables) se basa en el límite superior conocido, publicado, infundido de forma segura cuando se ha alcanzado una respuesta clínica. Radvanyi, et al., Clin Cancer Res 2012, 18, 6758-6770.
EJEMPLO 5:PROCEDIMIENTO 2A - DÍA 0
Este ejemplo describe el protocolo detallado del día 0 para el procedimiento 2A descrito en los Ejemplos 1 a 4. Preparación.
1. El medio de lavado de tumores confirmado, CM1 e IL-2 están dentro de la fecha de vencimiento.
2. Se colocó CM1 (medio celular 1) en la incubadora.
Procedimiento.
1. Se limpió la cabina de seguridad biológica (BSC).
2. Se colocaron placas de vigilancia en desarrollo y se dejaton en la cabina de bioseguridad durante 1-2 horas durante el procedimiento.
3. Se colocó el medio TIL CM en la cabina de seguridad biológica.
4. Se preparó el medio de TIL CM1 que contiene 6000 UI/mL de IL-2:
4.1. 1L CM1
4.2. 1 mL de IL-2 (6,000,000 UI/mL)
4.3. Se colocaron 25 mL de CM1 IL2 en cono de 50 mL para usarlos en los fragmentos al agregarlos a G-REX.
4.4. Se colocaron en una incubadora a 37°C para precalentar
5. Se limpió el paquete G-REX 100MCS con alcohol al 70% y se colocó en una cabina de bioseguridad. Se cerraron todas las abrazaderas excepto la línea de filtro.
<6>. Se realizó la calibración de la bomba Acacia.
7. Se conectó la línea roja del matraz G-REX 100MCS a la línea de salida de la campana de la bomba de acacia.
<8>. Se colocó el pumpmatic en la línea de entrada de la campana de la bomba y lo colocó en la botella con el medio. Se liberaon las abrazaderas para la campana de la bomba.
9. Se bombearon los 975 mL restantes de CM1 precalentado que contenían 6,000 UI/mL de IL-2 en cada biorreactor G-REX 100MCS.
10. Se calentó la línea roja del sello, se desconectó de la campana de la bomba.
11. Se colocó la etiqueta en G-REX.
12. Se colocó G-REX 100MCS en la incubadora hasta que sea necesario.
Disección de tejido
1. Se registró la hora de inicio del tratamiento del tumor.
2. Se transfirió medio de lavado tumoral a BSC.
3. Se colocaron 5 placas de Petri de 100 mm en la cabina de bioseguridad, 3 para lavados, 1 para retención y 1 para tejido desfavorable. Las placas se etiquetearon de manera correspondiente. El tejido desfavorable se indicó por tejido adiposo amarillo o tejido necrótico.
4. Se colocaron las tres placas de<6>pocillos en una cabina de bioseguridad.
5. Se pipetearon 3-5 mL de medio de lavado tumoral en cada pocillo de una placa de seis pocillos para detectar el exceso de piezas tumorales.
<6>. Se pipetearon 50 mL de medio de lavado tumoral para lavar las placas 1-3 y la placa de retención.
7. Se colocaron dos placas de disección de 150 mm en una cabina de bioseguridad.
<8>. Se colocaron 3 tubos cónicos estériles de 50 mL en la BSC.
9. Se etiquetó uno como medio de lavado de tumores con pinzas, el segundo como medio de lavado de tumores de bisturí y el tercero como medio de lavado de tumores usado para gotas de tapa.
10. Se agregaron de 5 a 20 mL de medio de lavado de tumores a cada cono. Las pinzas y los bisturís se sumergieron en el medio de lavado del tumor según fue necesario durante el lavado y procedimiento de disección del tumor.
11. Se colocaron el bisturí y las pinzas en tubos apropiados.
12. Con unas pinzas largas, se extrajeron los tumores del matraz de muestras y se transfirieron a la placa de Lavado 1.
13. Se incubó el tumor a temperatura ambiente en la placa de Lavado 1 durante > 3 minutos.
14. Durante la incubación, se volvió a etiquetar el matraz de muestras como "Carga biológica" y se le almacenó a 2-8°C hasta la recolección final o se requieran más pruebas de esterilidad.
15. Utilizando unas pinzas, se transfirió el tumor a la placa de lavado 2.
16. Se incubó el tumor al ambiente en la placa de lavado 2 durante >3 minutos.
17. Durante la incubación, usando una pipeta de transferencia, se agregaron alrededor de 4 gotas individuales espaciadas uniformemente de medio de lavado tumoral a cada círculo de las tapas de las placas de<6>pocillos designadas como placas de fragmentos tumorales.
18. Utilizando unas pinzas, se transfirió el tumor a la placa de lavado 3.
19. Se incubó el tumor al ambiente en la placa de lavado 3 durante >3 minutos.
20. La tapa de la placa de 150 mm se utilizó para la disección. Se colocó una regla debajo.
21. Con unas pinzas se transfirió el tumor a la placa de disección, se midió y se registró la longitud del tumor. 22. Se tomó una fotografía del tumor.
23. Se realizó una disección inicial de las piezas tumorales en la placa de Disección en piezas intermedias cuidando de conservar la estructura tumoral de cada pieza intermedia.
24. Se transfirieron las piezas de tumor intermedias que no se diseccionaban activamente en fragmentos a la placa de retención de tejido para garantizar que el tejido permaneciera hidratado durante todo el procedimiento de disección.
25. Se trabajó con una pieza de tumor intermedia a la vez, se cortó cuidadosamente el tumor en fragmentos de alrededor de 3*3*3 mm en la placa de disección, usando la regla debajo de la placa como referencia
26. Se continuó diseccionando fragmentos de la pieza de tumor intermedia hasta que se evaluó todo el tejido de la pieza intermedia.
27. Se seleccionaron fragmentos favorables y usando una pipeta de transferencia se transfirieron hasta 4 fragmentos favorables en las gotas del medio de lavado en un círculo en la placa de Fragmentos tumorales. Con una pipeta de transferencia, bisturí o pinzas, se transfirió la mayor cantidad posible del tejido desfavorable y el producto de desecho a la placa de tejido desfavorable para limpiar la placa de disección. Todo el tejido restante se colocó en uno de los pocilios de la placa de seis pocilios. (El tejido desfavorable se indicó por tejido adiposo amarillo o tejido necrótico).
28. Se continuó el tratamiento repitiendo las etapas 23-26 para las piezas intermedias restantes del tumor, trabajando una pieza intermedia a la vez hasta que se hubo tratado todo el tumor. (Se obtuvieron un bisturí nuevo o unas pinzas según era necesario, por decisión del técnico de tratamiento).
29. Las placas de fragmentos se movieron hacia la parte trasera del extractor.
30. Con una pipeta de transferencia, el bisturí o las pinzas, se transfirieron hasta 50 de los mejores fragmentos tumorales a los fragmentos tumorales etiquetados con tubo cónico de 50 mL que contenían el CM1.
31. Se retiraron los flotadores del cono de 50 mL con una pipeta de transferencia. Se registró el número de fragmentos y flotadores.
32. Se retiraron todos los elementos innecesarios del extractor, conservando las placas de tejido favorables si contenían fragmentos adicionales. El extractor se limpió con una toallita con alcohol.
33. Se sacó el G-REX 100MCS de la incubadora, se limpió con alcohol al 70% y se colocó en una cabina de bioseguridad.
34. La forma cónica se agitó con fragmentos de tumor y se vertió el contenido del cono de 50 mL en el matraz G-Rex 100MCS
35. Si uno o más fragmentos tumorales se transfirieron al matraz G-Rex 100M flotador, se obtuvo un fragmento tumoral adicional cuando estuvo disponible en la placa de tejido favorable y se transfirió al matraz G-Rex 100M.
36. Se registraron # (s) de incubadora y número total de fragmentos añadidos a cada matraz.
37. Se colocó el biorreactor G-REX 100M en una incubadora de CO<2>al 5% a 37°C
38. Cualquier tumor no utilizado se colocó en 100 mL de HypoThermosol y se envió al laboratorio.
39. Se registró el tiempo de parada del tratamiento del tumor.
40. Se desechó cualquier medio completo TIL no utilizado que contenía IL-2 y cualquier alícuota no utilizada de IL-2.
41. La cabina de seguridad biológica se limpio.
42. Se colocó la muestra de Bioburden (biocarga) en las condiciones adecuadas de almacenamiento.
43. Se registraron los datos.
44. Se guardó la imagen como número de identificación de la muestra de archivo, fecha del procedimiento del tumor en el archivo preparado del paciente.
45. Se ordenó y se aseguró la entrega de placas de sedimentación al laboratorio de microbiología.
EJEMPLO 6:PROCEDIMIENTO 2A - DÍA 11
Este ejemplo describe el protocolo detallado del día 11 para el procedimiento 2A descrito en los Ejemplos 1 a 4. Preparación previa.
1. Día antes del tratamiento:
1.1. CM2 podría prepararse el día antes de que ocurriera el tratamiento. Colocar a 4°C.
2. Día de tramitación.
2.1. Se preparó el arnés de la célula de alimentación.
2.1.1. Se cerraron todas las abrazaderas en un juego de conectores CC2 y 4S-4M60.
2.1.2. Se soldaron 4 espigas estériles del arnés 4S-4M60 a la línea de espigas en el CC2 quitando la espiga. 2.1.3. Se reservo para la agrupación de células de alimentación.
2.2. Se prepararon 5 mL de medio de crioconservación según CTF-FORM-318 y se colocaron a 4°C hasta necesitarse.
Monitoreo ambiental de sala limpia - Pretratamiento
1. Se registro la Información de la sala limpia.
2. Las cabinas de bioseguridad (BSC) se limpiaron con toallitas grandes con alcohol saturado o aerosol con alcohol.
3. Recuentos de partículas verificados durante 10 minutos antes de comenzar el tratamiento.
4. Se coloqaron las placas de vigilancia en desarrollo y se dejaron en la cabina de bioseguridad durante 1-2 horas durante el procedimiento.
Preparar el matraz G-Rex 500MCS:
1. Con una jeringa de 10 mL, se transfirió asépticamente 0.5 mL de IL-2 (solución madre es<6>* 10<6>UI/mL) por cada litro de CM2 (medio celular 2) a la bolsa de bioprocedimiento a través de un conector luer hembra estéril sin usar.
2. Se usó el exceso de aire en la jeringa para despejar la línea, se extrajo un poco de medio de la bolsa y se expulsó hacia atrás. Esto aseguró que toda la IL-2 se hubiera mezclado con el medio. Se mezcló bien.
3. Se abrió el embalaje exterior y se colocó el G-Rex 500MCS en la BSC. Se cerraron todas las abrazaderas sobre el dispositivo, excepto la línea de filtro grande.
4. Se unió de modo estéril la línea de recolección roja del G-Rex 500MCS a la línea de salida de la tubería de la bomba.
5. Se conectó el luer hembra de la bolsa de bioprocedimientos al luer macho de la campana de la bomba.
<6>. Se colgó la bolsa de bioprocedimientos en el portasueros IV, se abrieron las abrazaderas y se bombearon 4.5 litros del medio CM2 en el G-Rex 500MCS. Se despejaron la línea, la abrazadera y el sello térmico.
7. Se retuvo la línea de la bomba al medio. Se utilizó para preparar células alimentadoras.
<8>. Se colocó G-Rex 500MCS en la incubadora.
Preparar las células de alimentación irradiadas
1. Se selló (sellaron) las espiga (s) de TP de IL. Se sujetaron ambas líneas.
2. Se registró el peso seco de un paquete de transferencia (TP) de 1L.
3. Se unió estérilmente el paquete de transferencia de 1L a la campana de la bomba de acacia -12" desde la bolsa.
4. El otro extremo del tubo de la bomba todavía estaba conectado al recipiente para laboratorio de 10 litros. 5. Se bombearon 500 mL de CM2 por peso al TP.
<6>. Se cerró la abrazadera y se selló cerca de la junta unida.
7. Se colocó en la incubadora.
<8>. Se verificaron y se desconectaron las bolsas de células de alimentación.
9. Se registró el lote de alimentador usado.
10. Las bolsas se limpiaron con alcohol.
11. Se colocaron en bolsas con cierre hermético.
12. Células de alimentación se descongelaron en el baño de agua a 37°C (+/-1°C). Se registró la temperatura del baño de agua.
13. Se retiraron y se secaron con gasa.
14. Las células de alimentación se pasaron a través de la sala de preparación.
15. Se transfirieron a BSC en sala limpia.
16. Usando el arnés del alimentador preparado previamente, se unió el 1L TP con medio a una de las líneas no utilizadas en el lado del puerto de muestra de la llave de paso de 3 vías lo más cerca posible de la unión del sello, perdiendo la menor cantidad de tubería posible.
17. Se colocó el arnés del alimentador en la BSC.
18. Se agarró cada una de las 3 bolsas de alimentación con la espiga del arnés del alimentador en el puerto único de la bolsa de alimentación.
19. Se giró la válvula de la llave de paso para que el 1L TP estuviera en la posición "APAGADO" ("OFF").
20. Trabajando con una bolsa a la vez, se abrieron las pinzas en la línea a la bolsa de alimentación, se expulsó el aire en la jeringa y se extrajo el contenido de la bolsa de alimentación a la jeringa. El aire expulsado de la jeringa ayudó a recuperar las células. Abrazadera cerrada a la bolsa de alimentación.
21. Se registró el volumen recuperado de células de alimentación descongeladas en cada bolsa.
22. Se giró la válvula de la llave de paso para que la bolsa de alimentación esté en la posición "APAGADO". 23. Se abrió la pinza del TP y se despachó el contenido de la jeringa al TP.
24. Se aseguró de que la línea se haya despejado y se volvió a sujetar el TP. Es posible que se haya tenido que sacar un poco de aire a la jeringa desde el TP para despejar la línea.
25. Se mezclaron bien las células.
26. Se cerró la abrazadera a la bolsa de alimentación.
27. Se giró la llave de paso para que el puerto de la jeringa esté en la posición “APAGADO”. Se desconectó la jeringa de 60 mL de la llave de paso.
28. Se reemplazó con una nueva jeringa para cada bolsa de alimentación.
29. La jeringa se dejó puesta después de la última bolsa.
30. Se mezcló bien la formulación final del alimentador.
31. Se giró la llave de paso para que la suspensión de la célula de alimentación estuviera en la posición "APAGADO".
32. Se mezclaron las células y utilizando una jeringa de 5 mL y un puerto sin agujas, se enjuagó el puerto con un poco de solución de células para garantizar un muestreo preciso y se extrajó 1 mL de células, se colocó en un tubo etiquetado para el recuento.
33. Se repitió con la segunda jeringa. Cada una de estas dos muestras independientes tuvo un recuento de células individuales.
34. Se giró la llave de paso para que la suspensión del alimentador estuviera en la posición "ABIERTA" y se usó la jeringa de 60 mL unida al aire expulsado del arnés hacia el TP para despejar la línea.
35. Se quitó la jeringa y se cubrió el puerto luer con una nueva tapa estéril.
36. Se selló con calor el TP cerca de la junta soldada, se retiró el arnés.
37. Se registró la masa del paquete de transferencia con la suspensión celular y se calculó el volumen de la suspensión celular.
38. Se colocó en incubadora.
39. Se realizó un recuento de una sola célula en la muestra de la célula de alimentación y se registraron los datos y se adjuntaron los datos primarios de recuento al registro de lote.
40. Se documentó el programa de recuento de Cellometer.
41. Se verificó que hubiera ingresado la dilución correcta en el Cellometer.
42. Se calculó la densidad celular viable total en el paquete de transferencia del alimentador.
43. Si el recuento de células era < 5 x109, se descongelaron más células, se contaron y se agregaron a las células de alimentación.
44. Se pesó nuevamente la bolsa de alimentación y se calculó el volumen.
45. Se calculó el volumen de células para eliminar.
Adición de alimentador a G-REX
1. Se unió estérilmente un juego de transferencia de 4" al TP del alimentador.
2. En la BSC se adjuntó una jeringa de tamaño apropiado al luer hembra unido al paquete de transferencia del alimentador.
3. Se mezclaron bien las células y se eliminó el volumen calculado en la etapa 40 o 41 para conseguir 5.0x10<9>células. Se desecharon las células innecesarias.
4. Con una jeringa de 1 mL y una aguja de 18 G, se extrajeron 0.150 mL de OKT3, se retiró la aguja y se transfirió al TP del alimentador a través del luer hembra.
5. Se enjuagaron bien el tubo y la jeringa con la célula de alimentación y la bolsa mixta. Se limpió la línea con aire de la jeringa.
<6>. Se retiró el G-Rex 500MCS de la incubadora, se limpió con toallitas con alcohol y se colocó al lado del SCD.
7. Se unió estérilmente la bolsa de alimentación a la línea roja del G-Rex 500MCS. Se soltó la línea y se permitió que las células de alimentación fluyeran al matraz por gravedad.
<8>. Se aseguró de que la línea se hubiera limpiado por completo, luego se selló con calor la línea cerca de la soldadura original y se retiró la bolsa de alimentación.
9. Se devolvió el G-Rex 500MCS a la incubadora y se registró el tiempo.
Preparar TIL: registro del tiempo de inicio de la recolección de TIL
1. Se retiró con cuidado el G-Rex 100MCS de la incubadora y se cerraron todas las abrazaderas excepto la línea de filtro grande.
2. Se unió un paquete de transferencia de 1L a la línea roja en el G-REX 100MCS.
3. Se cerró la abrazadera en un TP de 300ml. Se selló con calor a -12 pulgadas de la bolsa quitando la espiga. Se registró peso/masa seca.
4. Se unió estérilmente el paquete de transferencia de 300 mL a la línea de recolección de células en el 100MCS cerca del sello térmico. La línea se sujetó con abrazadera.
5. Se soltaron todas las abrazaderas que conducen al TP de 1L.
<6>. Con GatheRex se transfirieron ~900 mL del sobrenadante del cultivo al paquete de transferencia de 1 L. Gatherex se detuvo cuando el aire entró en la línea. Se sujetó la línea y el sello térmico.
7. Se agitó el matraz hasta que todas las células se hubieron desprendido de la membrana. Se verificó la membrana para asegurarse de que todas las células estaban desprendidas.
<8>. Se iInclinó el matraz alejándolo del tubo de recogida y se dejó que los fragmentos tumorales se depositaran en el borde.
9. Se inclinó lentamente el matraz hacia el tubo de recolección de modo que los fragmentos qquedaron en el lado opuesto del matraz.
10. Usando GatheRex se transfirió la suspensión de células residuales al paquete transferido de 300 mL evitando fragmentos tumorales.
11. Se volvió a comprobar que se habían eliminado todas las células de la membrana.
12. Si era necesario, se lavar de nuevo soltando las abrazaderas de GatheRex y se dejó que un poco de medio fluyera al matraz G-Rex 100MCS por gravedad.
13. Se golpeó vigorosamente el matraz para liberar las células y se bombeó a 300 mL de TP.
14. Una vez completada la recolección, se cerró la línea roja y se selló con calor.
15. Se selló con calor la línea de recolección dejando aproximadamente la misma longitud de tubería que cuando se registró el peso seco.
16. Se registró la masa (incluida la masa seca) del TP de 300 mL que contenía la suspensión celular y se calculó el volumen de la suspensión celular.
17. En la BSC se sujetó el TP de 300 mL con un conjunto de transferencia de plasma de 4". Las células se mezclaron bien. Se adjuntó asépticamente una jeringa de 5 mL, se extrajó 1 mL, se colocó en un vial criogénico. Se repitió con una segunda jeringa. Se utilizaron para el recuento, la viabilidad de las células.
18. Se volvió a sujetar y se reemplazó la tapa luer con una nueva tapa luer estéril.
19. Se colocó en la incubadora y se registró el tiempo y lugar en la incubadora.
20. Se realizó un solo recuento de células en cada muestra y se registraron los datos y se adjuntaron los datos brutos de recuento al registro del lote.
21. Se documentó el programa de recuento de Cellometer.
22. se verificó que se hubiera ingresado la dilución correcta en el Cellometer.
23. Cuando fue necesario, se ajustó la densidad de TIL viables totales a < 2x10*8 células viables.
24. Se calculó el volumen para eliminar o anotar que ajuste innecesario.
25. En la BSC, se conectó asépticamente una jeringa del tamaño adecuado al TP de 300 mL.
26. Si se requirió, se eliminó el volumen calculado de células calculadas en la tabla "Calcular volumen para eliminar".
27. Se sujetó y se selló con calor el TP de 300 mL.
28. Se transfirió el exceso de células a un tubo cónico de tamaño adecuado y se colocó en la incubadora con la tapa aflojada para su posterior crioconservación.
29. Se sacó el G-Rex 500MCS de la incubadora y se colocó al lado del SCD.
30. Se unió estérilmente el TP de 300 mL a la línea de entrada de la bomba Acacia.
31. Se unió estérilmente la línea roja del G-Rex 500MCS a la línea de salida de la bomba Acacia.
32. Se bombearon las células a un matraz.
33. Se asegúró de que la línea se haya despejado por completo y luego se selló con calor la línea roja cerca de la soldadura original.
34. Se verificó que todas las abrazaderas del G-Rex 500MCS estuvieran cerradas, excepto la línea de filtro grande.
35. Se devolvió el G-Rex 500MCS a la incubadora y se registró el tiempo colocado en la incubadora G-Rex. 36. Se ordenó y se aseguró la entrega de placas de sedimentación al laboratorio de microbiología.
Crioconservación del exceso
Cantidad calculada de medio de congelación para agregar a las células:
TABLA 13: La concentración de células diana fue de 1 x 108/mL
37. Se centrifugaron los TIL a 400 x g durante 5 min a 20°C con freno total y aceleración total.
38. Se aspiró asépticamente el sobrenadante.
39. Se golpeó suavemente el fondo del tubo para resuspender las células en el líquido restante.
40. Mientras se golpeaba suavemente el tubo, se agregó lentamente el medio de congelación preparado.
41. Se tomaron alícuotas en tubos criogénicos de tamaño apropiado y se registró el tiempo de colocación de las células a -80°C.
EJEMPLO7:PROCEDIMIENTO 2A - DÍA 16
Este ejemplo describe el protocolo detallado del día 16 para el procedimiento 2A descrito en los Ejemplos 1 a 4. Monitoreo ambiental de sala limpia - Pretratamiento.
1. Las cabinas de bioseguridad se limpiaron con toallitas grandes con alcohol saturado o spray de alcohol.
2. Se verificaron recuentos de partículas durante 10 minutos antes de comenzar el tratamiento.
3. Se colocaron las placas de vigilancia en desarrollo y se dejaron en la cabina de bioseguridad durante 1-2 horas durante el procedimiento.
Recolección y recuento de TIL.
1. Se calentó una bolsa de 10 L de CM4 para cultivos iniciados con menos de 50x106 TIL en una incubadora a 37°C durante al menos 30 minutos o hasta estar listos para usar.
2. En la BSC, se conectó asépticamente un juego de extensión Baxter a una bolsa Labtainer de 10 litros.
3. Se retiró el matraz G-Rex 500MCS de la incubadora y se colocó en la mesa junto al GatheRex. Se verificó que todas las abrazaderas estuvieran cerradas excepto la línea de filtro grande. Se movió la abrazadera de la línea de conexión rápida cerca de la unión en "T".
4. Se unió estérilmente un Labtainer de 10L a la línea de recolección roja en el G-Rex 500MCS a través del tubo soldable en la extensión Baxter.
5. Se selló con calor un paquete de transferencia de 2L 2" por debajo de la "Y, retirando la espiga y se registró el peso seco. Se unió estérilmente el TP de 2L a la línea de recolección despejada en el G-Rex 500MCS.
<6>. Se colocó el G-Rex 500MCS en una superficie a nivel.
7. Se soltaron todas las abrazaderas que conducen al Labtainer de 10L y utilizando GatheRex se transfirió -4L de sobrenadante de cultivo al Labtainer de 10L.
<8>. Se recolectó de acuerdo con las instrucciones de recolección apropiadas de GatheRex.
9. Se fijó la línea roja y se registró la hora en que se inició la recolección de TIL.
10. GatheRex se detuvo cuando entró aire en la línea. Se sujetó la línea roja.
11. Después de eliminar el sobrenadante, se agitó el matraz hasta que todas las células se hubieron desprendido de la membrana. Se inclinó el matraz para asegurarse de que la manguera estuviera en el borde del matraz. 12. Se soltaron todas las abrazaderas que conducen al TP de 2L y usando GatheRex se transfirió la suspensión de células residuales al TP de 2L manteniendo el borde inclinado hasta que se hubieron recolectado todas las células.
13. Se inspeccionó la membrana en busca de células adherentes.
14. Si es necesario, se volvió a lavar soltando las abrazaderas en la línea roja y se dejó que algo de medio fluyera al matraz por gravedad.
15. Se cerró la línea roja y se termoselló de modo triple.
16. Se golpeó el matraz vigorosamente para liberar células.
17. Se agregaron células a TP de 2L.
18. Se selló con calor el paquete de transferencia de 2 L dejando aproximadamente la misma longitud de tubo que cuando se registró el peso seco.
19. Se retuvó G-Rex 500MCS, se reutilizó en la división.
20. Se registró la masa del paquete de transferencia con la suspensión celular y se calculó el volumen de la suspensión celular.
21. Se determinó el volumen de suspensión celular, incluida la masa seca.
22. Se unió estérilmente un juego de transferencia de 4" a la bolsa de suspensión celular.
23. En la BSC se mezclaron las células suavemente y con una jeringa de 20 cc se extrajeron 11 mL y se tomaron alícuotas como se muestra en la Tabla 14:
TABLA 14. Parámetros de prueba.
24. Se selló al calor. Se cerró la conexión luer reteniendo la abrazadera
25. Se etiquetó y se colocó la suspensión celular en la incubadora y se registró el tiempo que se colocó en la incubadora.
26. Se calculó nuevo volumen.
27. Se registró el volumen en el paquete de transferencia de 2 L basado en el volumen de suspensión celular y el volumen extraído para CC (11 mL).
28. Se inocularon y se ordenaron pruebas de esterilidad.
29. Se guardó la muestra de micoplasma a 4°C en el estante pendiente para la prueba de micoplasma.
30. Se dejó a un lado hasta que se sembró TIL.
Recuento de células:
Se realizaron recuentos de células individuales y se registraron datos y se adjuntaron los datos brutos de recuento al registro por lotes. Se documentó la dilución. Se documentó el programa de recuento de Cellometer. Se verificó que la dilución correcta se hubiera ingresado al Cellometer.
Continuación del procedimiento:
31. Se calculó el número total de matraces necesarios para el subcultivo **Se reutilizó el recipiente original y se redondearon hacia arriba las fracciones de los recipientes adicionales.
Adición de IL-2 a CM
1. Se colocó una bolsa de 10 litros de Aim V con Glutamax en la BSC.
2. Se agarró la bolsa de medios con un equipo de transferencia de plasma de 4".
3. Se conectó una aguja de 18G a una jeringa de 10 mL y se sacaron 5 mL de IL-2 a la jeringa (la concentración final es de 3000 UI/mL).
4. Se quitó la aguja y se conectó asépticamente la jeringa al equipo de transferencia de plasma y se dispachó IL-<2>a la bolsa.
5. Se purgó la línea con aire, se saco un poco de medio y se despachó a la bolsa. Esto aseguró que toda la IL-2 esté en los medios.
<6>. Se repitió para las bolsas restantes de Aim V.
Preparar matraces G-REX500MCS
1. Se determinó la cantidad de CM4 para agregar a los matraces. Se registró el volumen de células agregadas por matraz y volumen de CM45000mL-A.
2. Se cerraron todas las abrazaderas excepto la línea de filtro grande.
3. Se unió estérilmente la línea de entrada de la bomba Acacia al equipo de transferencia de plasma de 4" en la bolsa de medios que contiene CM4.
4. Se unió estérilmente la línea de salida de la bomba al G-Rex 500MCS a través de la línea de recolección roja.
5. Se bombeó determinada cantidad de CM4 al G-Rex 500MCS usando las líneas del matraz como guía.
<6>. Se selló con calor la línea roja del G-Rex 500MCS.
7. Se repitieron las etapas 4-6 para cada matraz. Se pudieron llenar múltiples matraces al mismo tiempo usando llenado por gravedad o bombas múltiples. Se podría soldar un conector en "Y" a la línea de salida de la bomba y soldar los dos brazos a dos matraces G-Rex 500MCS llenando ambos al mismo tiempo.
<8>. Se colocaron los matraces a 37°C, CO<2>al 5%.
Sembrar matraces con TIL
1. Se cerraron todas las abrazaderas en G-Rex 500MCS excepto la línea de filtro grande
2. Se unió estérilmente la bolsa de producto de célula a la línea de entrada de la bomba Acacia.
3. Se unió estérilmente el otro extremo de la bomba a la línea roja del G-Rex 500MCS.
4. Se colocó la campana de la bomba en la bomba.
5. Se colocó la bolsa de producto celular en la balanza analítica y se registró el tiempo TIL agregado al matraz G-REX.
<6>. Se puso a cero la balanza.
7. Se soltaron las abrazaderas de las líneas y se bombeó el volumen requerido de células en G-Rex 500MCS por peso, suponiendo que 1 g=1 mL.
<8>. Se colocó la bolsa de célula boca abajo y se bombeó aire para despejar la línea. Se selló en caliente la línea roja de G-Rex 500MCS. Se colocó el matraz en incubadora.
9. Se unió estérilmente la línea de salida de la bomba al siguiente G-Rex 500MCS a través de la línea de recolección roja.
10. Se mezclaron bien las células.
11. Se repitió la transferencia celular para todos los matraces.
12. Se colocaron los matraces a 37°C, 5% de CO<2>y se registró el tiempo de TIL añadido a matraz G_REX. 13. Se solicitarón pruebas para placas de sedimentación al laboratorio de microbiología.
14. Se registraron números de acceso.
15. Se ordenaron pruebas de esterilidad aeróbica y anaeróbica.
16. Se aseguró la entrega de placas y matraces al laboratorio de microbiología.
Crioconservación de flujo o exceso de células:
1. Se calculó la cantidad de medio de congelación necesaria:
a. La concentración de células diana fue de 1 x 10<8>/mL; se registró el total de células eliminadas. La concentración de células diana fue de 1 x 10<8>células/mL. Se calculó el volumen total de medios de congelación para agregar.
2. Se preparó el medio de crioconservación y se colocó a 40°C hasta necesitarse.
3. Se centrifugó TIL a 400 x g durante 5 min a 20°C con freno y aceleración total.
4. Sobrenadante aspirado asépticamente.
5. Se golpeó suavemente el fondo del tubo para resuspender las células en el líquido restante.
<6>. Mientras golpea suavemente el tubo, se agregó lentamente el medio de congelación preparado.
7. Se reparten alícuotas en tubos criogénicos etiquetados de tamaño apropiado.
<8>. Se colocó el vial en un Mr. Frosty o equivalente y se colocó en un congelador a -80°C.
9. Dentro de las 72 horas se transfirió a un lugar de almacenamiento permanente y se documentaron y registraron la fecha y la hora en que fueron colocadas en un congelador a -80°C.
EJEMPLO 8:PROCEDIMIENTO 2A - DÍA 22
Este ejemplo describe el protocolo detallado del día 22 para el procedimiento 2A descrito en los Ejemplos 1 a 4. Documentar los resultados negativos de esterilidad en desarrollo
Antes de comenzar la recolección, se obtuvieron los resultados preliminares de esterilidad del día 16 del laboratorio de microbiología. Se comunicó con el director del laboratorio o su designado para obtener más instrucciones si los resultados fueron positivos.
Monitoreo ambiental de sala limpia - Pretratamiento
1. Se verificaron recuentos de partículas durante 10 minutos antes de comenzar el tratamiento.
2. Las cabinas de bioseguridad se limpiaron con toallitas grandes con alcohol saturado o en aerosol con alcohol.
3. Se colocaron las placas de vigilancia en desarrollo y se dejaron en la cabina de bioseguridad durante 1-2 horas durante el procedimiento.
Preparación avanzada
1. En BSC, se conectó asépticamente un juego de extensión Baxter a una bolsa de contenedor de laboratorio de 10 Lo equivalente. Se etiqueteó la bolsa de filtrado LOVO.
2. Se colocaron tres bolsas de 1 litro de PlasmaLyte A en la BSC
3. Se preparó la agrupación y se etiquetearon las bolsas PlasmaLyte A con 1% de HSA:
3.1. Se cerraron todas las abrazaderas en un juego conector 4S-4M60 y se agarró cada una de las bolsas PlasmaLyte.
3.2. Se unió uno de los extremos macho del 4S-4M60 a la línea de entrada de la campana de la bomba Acacia.
3.3. Se unió la línea de salida de la campana de la bomba a una bolsa de recogida de 3 litros. Se cerraron todas las abrazaderas en la bolsa de 3L excepto la línea para bombear.
3.4. Se bombearon 3 litros de Plasmalito a la bolsa de 3 litros. Si es necesario, se elimina el aire de la bolsa de 3 litros invirtiendo la bomba.
3.5. Se cerraron todas las abrazaderas excepto la línea con luer hembra.
3.6. Usando dos jeringas de 100 mL y agujas de 16-18G, se cargaron 120 mL de HSA al 25%. Jeringas con tapón rojo.
3.7. Se conectó una jeringa al luer hembra en la bolsa de 3 litros y se transfirió HSA a la bolsa PlasmaLyte de 3 litros. Mezclar bien.
3.8. Se repitió con una segunda jeringa.
3.9. Se mezcló bien.
3.10. Se cerraron todas las abrazaderas.
3.11. Usando una jeringa de 10 mL, se quitaron 5 mL de PlasmaLyte con HSA al 1% del puerto sin agujas de la bolsa de 3 litros.
3.12. La jeringa se tapó y se guardó en BSC para dilución de IL-2.
3.13. Se cerraron todas las abrazaderas.
3.14. Se selló con calor quitando la línea luer hembra de la campana de la bomba.
3.15. Se etiquetó el regulador de pH de lavado LOVO y se fechó. Caducó en 24 horas a temperatura ambiente. Preparación de IL-2
1. Se despachó Plasmalito/1% de HSA desde una jeringa de 5 mL en un tubo cónico estéril de 50 mL etiquetado.
2. Se agregaron 0.05 mL de solución madre de IL-2 al tubo que contenía PlasmaLyte.
3. Se etiquetó IL-26X10<4>
4. Se tapó con la etiqueta y se almacenó a 2-8°C. Se registraron los volúmenes.
Preparación de células
1. Se cerraron todas las abrazaderas en una bolsa Labtainerbag de 10 litros. Se conectó el juego de extensión Baxter a la bolsa de 10 litros mediante una conexión luer.
2. Se retiraron los matraces G-REX 500M de la temperatura de 37°C.
3. Se unió en condiciones estériles la línea roja de eliminación de medios del G-Rex 500MCS al juego de extensión en la bolsa de bioprocedimiento de 10L.
4. Se unió en condiciones estériles la línea de eliminación de células despejada del G-Rex 500MCS a una bolsa de recolección de 3 litros y se etiquetó como "suspensión de células agrupadas".
5. Se quitó la abrazadera de la línea roja y bolsa de 10L.
<6>. Se utilizó la bomba GatheRex, se redujó el volumen de primer matraz.
Nota: Si se detecta una burbuja de aire, la bomba podría detenerse prematuramente. Si la reducción de volumen total no fue completa, se reactivó la bomba GatheRex.
7. Se cerró la abrazadera de la bolsa de sobrenadante y la línea roja.
<8>. Se agitó el matraz G-REX 500M hasta que los TIL se resuspendieran por completo evitando salpicaduras o espuma. Se aseguró de que todas las células se hayan desprendido de la membrana.
9. Se abrieron las abrazaderas en la línea despejada y bolsa de célula de 3L.
10. Se inclinó el matraz G-Rex de manera que la suspensión celular se agrupara en el costado del matraz donde estaba ubicada la extracción de recolección.
11. Se inició GatherRex para recolectar la suspensión celular. Nota: Si la extracción de recolección de células no estaba en la unión de la pared y la membrana del fondo, golpear el matraz mientras estaba inclinado en un ángulo de 45 ° generalmente era suficiente para posicionar correctamente la extracción.
12. Se aseguró de que se hubieran sacado todas las células del matraz.
13. Si quedaron células en el matraz, se agregaron 100 mL de sobrenadante nuevamente al matraz, se agitó y se recogió en la bolsa de suspensión celular.
14. Se cerró la abrazadera en la línea a la bolsa de recolección de células. Se liberaron Alas abrazaderas en GatheRex.
15. Se selló en caliente la línea despejada de G-Rex 500MCS.
16. Se selló en caliente la línea roja de G-Rex 500MCS.
17. Se repitieron las etapas 3-16 para matraces adicionales.
18. Fue necesario reemplazar la bolsa de sobrenadante de 10 l según fuera necesario después de cada 2° matraz.
19. Se pueden utilizar múltiples GatherRex.
20. Se documentó el número de G-Rex 500MCS tratados.
21. Se selló a calor la bolsa recolectora de célula. Se registró el número de G-REX recolectados.
22. Con un marcador, se hizo una marca de ~2" desde uno de los conectores luer hembra de una nueva bolsa de recolección de 3 litros.
23. Se selló con calor y se quitó el luer hembra justo debajo de la marca.
24. Se etiquetó como bolsa de fuente LOVO
25. Se registró el peso seco.
26. Se cerraron todas las abrazaderas del filtro de sangre de 170 |jm.
27. Se unió estérilmente el extremo terminal del filtro a la bolsa de la fuente LOVO justo debajo de la marca. 28. Se unió estérilmente una línea fuente del filtro a la bolsa que contiene la suspensión celular.
29. Se elevó la suspensión celular colgando las células en un portasueros IV para iniciar la transferencia de células por flujo de gravedad. (Nota: No se permitió que la bolsa de la fuente colgara del aparato de filtración).
30. Se abrieron todas las abrazaderas necesarias y se permitió que TIL drenaran de la bolsa de suspensión celular a través del filtro y dentro de la bolsa de fuente LOVO.
31. Una vez que se transfirieron todas las células a la bolsa de la fuente LOVO, se cerraron todas las abrazaderas, se selló con calor justo por encima de la marca y se desconectó para quitar el filtro.
32. Se mezcló bien la bolsa y usando dos jeringas de 3 mL se tomaron 2 muestras independientes de 2 mL del puerto de muestra de la jeringa para el recuento y la viabilidad de las células.
33. Se pesó la bolsa y se determinó la diferencia entre el peso inicial y final.
34. Se registraron los datos y lugar en incubadora, incluida la masa seca.
Recuento de células.
Se realizó un recuento individual de células en cada muestra y se registraron los datos y se adjuntaron los datos brutos de recuento al registro del lote. Se documentó el programa de recuento de Cellometer. Se verificó que la dilución correcta hubiera ingresado en el Cellometer. Se determinó el número total de células nucleadas. Se determinó el número de TNC a eliminar para retener = 1.5 X 10<11>células para el tratamiento de LOVO. Se colocó la célula extraída en un recipiente de tamaño adecuado para su eliminación.
Recolección de LOVO
El Labtainer de 10L con juego de extensión Baxter en Preparación previa fue la bolsa de filtrado de repuesto soldada al kit LOVO más adelante. Se encendió LOVO y se siguieron las pantallas.
Verificar básculas y el sensor de presión.
Para acceder al perfil de operación del instrumento:
1. Se tocó el botón de información.
2. Se tocó la pestaña de configuración del instrumento.
3. Se tocó el botón Perfil de funcionamiento del instrumento.
4. Se muestra el perfil de funcionamiento del instrumento.
Revisar las básculas
1. Se aseguró de que no hubiera nada colgado en ninguna de las básculas y se revisó la lectura de cada báscula.
2. Si alguna de las escalas se leyó fuera de un intervalo de 0 /- 2 g, se realizó la calibración de la báscula como se describe en el Manual de calibración de la báscula del fabricante.
3. Si todas las básculas estaban en tolerancia sin peso colgando, se procedió a colgar un peso de 1 kg en cada báscula (# 1-4) y se revisó la lectura.
4. Si alguna de las básculas se leyó fuera de un intervalo de 1000 /- 10 g cuando colgaba un peso de 1 kg, se realizó la calibración de la báscula como se describe en el Manual del operador de LOVO del fabricante.
Verificar el sensor de presión
1. Se revisó la lectura del sensor de presión en la pantalla Perfil de operación del instrumento.
2. N/A: Si la lectura del sensor de presión estaba fuera de 0 /-10 mmHg, se almacenó un nuevo ajuste de presión atmosférica en el modo de servicio como se describe en el Manual del operador de LOVO del fabricante. a. Se tocó el botón de verificación en la pantalla Perfil de operación del instrumento.
B. Se tocó el botón de verificación en la pestaña Configuración del instrumento.
3. Si se realizó la calibración de la báscula o se ha almacenado un nuevo ajuste de presión atmosférica, se repitieron las secciones pertinentes.
Para iniciar el procedimiento, se seleccionó el protocolo "Resolección de TIL G-Rex" del menú desplegable en la pantalla de selección de protocolo y se presionó Iniciar.
1. Apareció la pantalla de configuración del procedimiento.
2. Se tocó el botón Información de soluciones.
3. Apareció la pantalla Solución 1. Se revisó el tipo de regulador de pH de lavado requerido para la Solución 1. (Debía leerse PlasmaLyte).
4. Se tocó el botón Siguiente para avanzar a la pantalla Solución 2. Se revisó el tipo de regulador de pH de lavado requerido para la Solución 2. (Debía leerse "NINGUNO", lo que indicaba que el protocolo se había configurado para usar solo un tipo de regulador de pH de lavado, que era PlasmaLyte)
5. Se tocó el botón de verificación en la pantalla de información de la solución 2 para volver a la pantalla de configuración del procedimiento.
<6>. Se tocó el botón de información del procedimiento.
7. Se mostró la pantalla de información del procedimiento.
<8>. Se tocó el campo de entrada de ID de usuario. Debía aparecer un teclado. Se ingresaron las iniciales del ejecutante y el verificador. Se tocó el botón para aceptar la entrada.
9. Se tocó el campo de entrada ID de fuente. Debió aparecer un teclado. Se ingresó el número de lote del producto. Se tocó el botón para aceptar la entrada.
10. Se tocó el campo de entrada ID del procedimiento. Debía aparecer un teclado. Se ingresó a "Recolección de TIL". Se tocó el botón para aceptar la entrada.
11. Si hubo notas adicionales para registrar, se tocó el campo de entrada Nota de procedimiento. Apareció un teclado. Se ingresó cualquier nota. Se tocó el botón para aceptar la entrada.
NOTA: El campo de entrada Nota de procedimiento es opcional y puede dejarse en blanco.
12. Se tocó el botón de verificación en la pantalla de información del procedimiento para volver a la pantalla de configuración del procedimiento.
13. Se verificó que apareció una "verificación" en el botón Información del procedimiento. Si no apareció ninguna "marca de verificación", se tocó nuevamente el botón Información del procedimiento y se aseguró de que los campos ID de usuario, ID de fuente e ID de procedimiento tuvieran entradas.
14. Se tocó el botón de configuración de parámetros.
15. Apareció la pantalla de información del procedimiento general.
16. Se tocó el campo de entrada Volumen de la fuente (mL). Apareció un teclado numérico. Se ingresó el volumen calculado de suspensión celular (mL) de la Tabla 1
17. Se tocó el botón para aceptar la entrada.
18. Se tocó el campo de entrada Origen PCV (%). Apareció la pantalla TIL (viable muerto).
19. Se tocó el campo de entrada Cell Concentration. Apareció un teclado numérico. Se ingresó la concentración celular total/mL de la Tabla 14 en el producto fuente en unidades de "x 10<6>/mL". La entrada puede oscilar entre 00.0 y 99.9. Se tocó el botón para aceptar la entrada y regresar a la pantalla de información del procedimiento general. NOTA: Después de que se aceptó la concentración de células, el campo de entrada de PCV de origen (%) en la pantalla de información del procedimiento general mostró el % de PCV calculado por el LOVO, basado en la entrada de concentración de células realizada por el operador.
20. En la pantalla Procedimiento general, se tocó el botón Siguiente para avanzar a la pantalla 4 de<8>, la pantalla Volumen del producto final (Volumen retenido). Nota: Las pantallas 2 y 3 no tenían ningún campo de entrada para que el operador los completara.
21. Apareció la pantalla Volumen de producto final (volumen de retención).
22. Utilizando el valor de células nucleadas totales (TNC) de la Tabla 15, se determinó el volumen objetivo del producto final en la siguiente tabla (Tabla 16). Se ingresó el volumen de producto final (mL) asociado con ese intervalo de células durante la configuración del procedimiento LOVO.
TABLA 15. Determinación del volumen objetivo del producto final.
TABLA 16. Volumen objetivo del producto.
23. Para dirigirse al volumen especificado de la Tabla 16, se tocó el campo de entrada Volumen de producto final (mL). Apareció un teclado numérico. Se ingresó el Volumen de producto final deseado en unidades de mL. Se tocó el botón para aceptar la entrada.
24. Se tocó la pantalla Volumen del producto final (Volumen retenido) para volver a la pantalla Configuración del procedimiento. Nota: Las pantallas 5-8 no tenían ningún campo de entrada para que el operador los completara.
25. Se verificó que apareciera una "Verificación" en el botón Configuración de parámetros. Si no apareció ninguna "verificación", se tocó el botón Información del procedimiento nuevamente y se aseguró de que el Volumen de la fuente y el PCV de la fuente en la página 1 tuvieran entradas. También se aseguró de que la casilla de verificación Volumen de producto final mínimo objetivo estuviera marcada O que el campo Volumen de producto final (mL) tuviera una entrada en la página 4.
26. Se tocó el botón de estimación en la esquina superior derecha de la pantalla.
27. Se mostró la pantalla Resumen de estimación. Se confirmaron valores suficientes y precisos para regulador de pH de lavado Fuente y PlasmaLyte.
28. Se cargó el kit desechable: se siguieron las instrucciones de la pantalla para cargar el kit seleccionando el botón de ayuda "(?)".
29. Se tomó nota de los volúmenes mostrados para el filtrado y la solución 1 (léase PlasmaLyte)
30. Se tomó nota de los volúmenes mostrados para el filtrado y la solución 1 (léase PlasmaLyte).
31. Para obtener instrucciones sobre cómo cargar el kit desechable, se tocó el botón de ayuda o se siguieron las instrucciones del manual del operador para obtener instrucciones detalladas.
32. Cuando se hubo cargado el kit desechable estándar de LOVO, se tocó el botón Siguiente. Apareció la pantalla de información y ubicación del contenedor. Se quitó la bolsa de filtrado de la escala # 3.
33. Para este protocolo, el contenedor de filtrado era nuevo y fuera de báscula
34. Si el contenedor de filtrado ya se mostraba como Nuevo y Fuera de báscula, no se realizaron cambios.
35. Si el tipo de contenedor de filtrado se mostró como Original, se tocó el botón Original para cambiar a Nuevo.
36. Si la ubicación del filtrado se mostró como Sobre báscula, se tocó el botón Sobre báscula para cambiar a Fuera de báscula.
37. Si el volumen de filtrado a generar era < 2500 mL, la ubicación del recipiente de filtrado se mostró como Sobre báscula Para lograr coherencia entre las ejecuciones, la ubicación del recipiente de filtrado se cambió a Fuera de báscula y el tipo de recipiente era "nuevo".
38. Se tocó el botón En-escala para cambiar a fuera de báscula. Se conectó el equipo de transferencia adjunto. Se usó una técnica de soldadura estéril para reemplazar el recipiente de filtrado del equipo desechable LOVO por una bolsa de 10 litros. Se abrió la soldadura.
39. Se colocó el recipiente de filtrado en la mesa. NO se colgó la bolsa de filtrado en la báscula # 3. La báscula No. 3 estuvo vacía durante el procedimiento.
40. Se abrieron las abrazaderas de plástico de la tubería que conduce al recipiente de filtrado. NOTA: Si se quitó el tubo de la abrazadera F durante la soldadura, se volvió a colocarlo en la abrazadera.
41. Se tocó el campo de entrada Capacidad del contenedor de filtrado. Apareció un teclado numérico. Se ingresó la nueva capacidad total de filtrado (10,000 mL). Se tocó el botón "verificar" para aceptar la entrada.
42. Se utilizó una técnica de soldadura estéril para reemplazar el recipiente de filtrado del kit desechable LOVO por una bolsa de 10 litros. Se abrió la soldadura. Nota: Si se quitó el tubo de la abrazadera F durante la soldadura, volvió a ponerse en la abrazadera.
43. Se colocó el nuevo recipiente de filtrado en la mesa. NO se colgó la bolsa de filtrado en la báscula # 3. La báscula # 3 estuvo vacía durante el procedimiento.
44. Se abrieron las abrazaderas de plástico de la tubería que conduce al recipiente de filtrado.
45. Para el contenedor de retenido, la pantalla mostraba Original y Sobre báscula.
46. No se realizaron cambios en el contenedor de retenido.
47. Cuando se realizaron todos los cambios en el contenedor de filtrado y se ingresó la información adecuada, se tocó el botón Siguiente.
48. Apareció la superposición de verificaciones en seco del kit desechable. Se verificó que el kit se habubiera cargado correctamente y luego se tocó el botón Sí.
49. Todas las abrazaderas mecánicas LOVO se cerraron automáticamente y se mostró la pantalla Comprobación de la instalación del kit desechable. El LOVO pasó por una serie de etapas de presurización para revisar el kit.
50. Después de que la verificación del kit desechable se hubiera aprobado correctamente, se mostró la pantalla Soluciones de conexión.
51. 3 l fue el volumen de lavado. Se ingresó este valor en la pantalla.
52. Se utilizó una técnica de soldadura estéril para unir la bolsa de 3 L de PlasmaLyte al tubo que pasa por la abrazadera 1. Se abrió la soldadura.
53. Se colgó la bolsa PlasmaLyte en un portasueros,
54. Se abrieron las abrazaderas de plástico del tubo que conduce a la bolsa PlasmaLyte.
55. Se verificó que la entrada de Volumen de solución fuera 3000 mL. Esto fue ingresado previamente.
56. Se tocó el botón Siguiente. Se mostró la superposición del cebado de kit desechable de. Se verificó que PlasmaLyte estuviera conectado y todas las soldaduras y abrazaderas de plástico en la tubería que conduce al PlasmaLyte estuvieran abiertas, luego se tocó el botón Sí. NOTA: Debido a que solo se usó un tipo de regulador de pH de lavado (PlasmaLyte) durante el procedimiento LOVO, no se adjuntó ninguna solución al tubo que pasaba a través de la abrazadera 2. La abrazadera de Roberts en este tubo permaneció cerrada durante el procedimiento.
57. Se inició el cebado del kit desechable y se mostró la pantalla Cebado del kit desechable. Se observó visualmente que PlasmaLyte se movía a través del tubo conectado a la bolsa de PlasmaL Lyte. Si no se movía fluido, se tocó el botón de pausa en la pantalla y determinó si una abrazadera o soldadura todavía estaba cerrada. Una vez que se resolvió el problema, se tocó el botón Reanudar en la pantalla para reanudar el cebado de kit desechable.
58. Cuando el cebado del kit desechable finalizó correctamente, se mostró la pantalla Conectar fuente.
59. Para este protocolo, el contenedor de fuente era nuevo y fuera de báscula
60. Si el contenedor de fuente ya se mostraba como nuevo y fuera de báscula, no se realizaron cambios.
61. Si la ubicación de la Fuente se mostró como Sobre báscula, se tocó el botón Sobre báscula para cambiar a Fuera de báscula.
62. Se tocó el campo de entrada Capacidad de la fuente (mL). Apareció un teclado numérico. Se ingresó la capacidad del contenedor que contenía el producto de fuente. Se tocó el botón de verificación para aceptar la entrada. Nota: La entrada Capacidad de la fuente se utilizó para asegurarse de que la bolsa de la fuente pudiera contener la solución adicional que se agregó a la bolsa durante la fase de cebado de la fuente.
63. Se utilizó una técnica de soldadura estéril para unir el contenedor de la fuente a la tubería que pasa por la abrazadera S. Se abrió la soldadura. Se retiró el tubo de la abrazadera según fuera necesario.
64. Se aseguró de volver a colocar el tubo de la fuente en la abrazadera en S.
65. Se tocó el botón Siguiente. Se mostró la superposición de cebado de fuente. Se verificó que la Fuente estuviera conectada al kit desechable y que las soldaduras y abrazaderas de plástico en el tubo que conduce a la Fuente estuvieran abiertas, luego se tocó el botón Sí.
<6 6>. Se inició el cebado de la fuente y se mostró la pantalla de cebado de la fuente. Se observó visualmente que PlasmaLyte se movía a través del tubo conectado a la bolsa de la fuente. Si no se movía fluido, se tocó el botón de pausa en la pantalla y se determinó si una abrazadera o soldadura todavía estaba cerrada. Una vez que se resolvió el problema, se tocó el botón Reanudar en la pantalla para reanudar el Cebado de la fuente.
67. Cuando el cebado de fuente finalizó correctamente, se mostró la pantalla de procedimiento de inicio.
<6 8>. Se pulsó el botón Iniciar. Apareció la pantalla de pausa "Ciclo 1 de pre-lavado", con las instrucciones para "Recubrir IP, mezclar fuente".
69. Recubrimiento previo de la bolsa IP.
70. Antes de presionar el botón de inicio, se retiró la bolsa de IP de la báscula de pesaje #2 (también se podría quitar el tubo de la guía de tubo del puerto superior de IP) y se invirtió manualmente para permitir que el regulador de pH de lavado agregado durante la etapa de cebado del kit desechable cubriera todas las superficies interiores de la bolsa.
71. Se volvió a colgar la bolsa de IP en la báscula # 2 (etiqueta en la bolsa hacia la izquierda). Se reemplazó el tubo del puerto superior en la guía del tubo, si se había retirado.
72. Se mezcló la bolsa de fuente.
73. Antes de presionar el botón Inicio, se retiró la bolsa de la fuente de la báscula #1 y se invirtió varias veces para crear una suspensión celular homogénea.
74. Se volvió a colgar la bolsa de la fuente en la báscula #1 o en el portasueros. Se aseguró de que la bolsa no oscilara.
75. Se pulsó el botón Iniciar.
76. El LOVO comenzó a procesar el fluido de la bolsa de la fuente y se mostró la pantalla del ciclo de lavado 1. Durante el procedimiento LOVO, el sistema se detuvo automáticamente para permitir al operador interactuar con diferentes bolsas. Se mostraron diferentes pantallas durante diferentes pausas. Se siguieron las instrucciones correspondientes para cada pantalla.
Pausa de enjuague de fuente
Después de drenar la bolsa Fuente, LOVO agregó regulador de pH de lavado a la bolsa Fuente para enjuagar la bolsa. Después de que se hubi agregado el volumen configurado de regulador de pH de lavado a la bolsa de la fuente, el LOVO se pausó automáticamente y se mostró la pantalla Pausa de enjuague de la fuente.
Cuando se mostró la pantalla Pausa de enjuague de fuente, el operador:
1. Quitó la bolsa de la fuente de la báscula # 1.
1. Invirtió la bolsa Fuente varias veces para permitir que el regulador de pH de lavado tocara todo el interior de la bolsa.
2. Volvió a colgar la bolsa de la fuente en la báscula # 1. Se aseguró de que la bolsa de la fuente no oscilara en la báscula n. °<1>.
3. Tocó el botón Reanudar.
El LOVO procesó el fluido de enjuague de la bolsa Fuente, luego continuó con el procedimiento automatizado.
Pausa de bolsa de mezcla IP
Para preparar las células para otro paso a través del centrifugador, la bolsa de IP se diluyó con regulador de pH de lavado. Después de agregar el regulador de pH de lavado a la bolsa de IP, el LOVO se detuvo automáticamente y mostró la pantalla de pausa "Mezclar bolsa de IP".
Cuando se mostró la pantalla de pausa "Mezclar bolsa IP", el operador:
1. Quitó la bolsa de IP de la báscula # 2. También podría quitar el tubo de la guía de tubo del puerto superior IP.
2. Invirtió la bolsa de IP varias veces para mezclar bien la suspensión celular.
3. Volvió a colgar la bolsa de IP en la báscula # 2. También reemplazó el tubo del puerto superior IP en la guía del tubo, si se había retirado. Se aseguró de que la bolsa de IP no oscilara en la báscula # 2.
4. Se tocó el botón Reanudar. El LOVO comenzó a procesar el fluido de la bolsa IP.
Pausa de esquinas de IP de masaje
Durante el ciclo de lavado final del procedimiento LOVO, las células se bombearon desde la bolsa IP, a través del centrifugador, y hacia la bolsa de Retenido (Producto final). Cuando la bolsa de IP estuvo vacía, se agregaron 10 mL de reguladores de pH de lavado al puerto inferior de la bolsa de IP para enjuagar la bolsa. Después de agregar el líquido de enjuague, el LOVO se detuvo automáticamente y mostró la pantalla de pausar "Esquinas de IP de masaje".
Cuando se mostró la pantalla de pausar "Esquinas de IP de masaje", el operador:
1. NO retiró la bolsa de IP de la báscula # 2.
2. Con la bolsa de IP todavía colgando en la báscula # 2, masajeó las esquinas de la bolsa para poner en suspensión las células residuales.
3. Se aseguró de que la bolsa de IP no oscilara en la báscula # 2.
4. Presionó el botón Reanudar.
5. El LOVO comenzó a bombear el líquido de enjuague de la bolsa IP.
Al final del procedimiento LOVO, se mostró la pantalla Eliminar productos. Cuando se mostró esta pantalla, se pudieron manipular todas las bolsas del kit LOVO.
Nota: No se tocó ninguna bolsa hasta que apareciera la pantalla Retirar productos.
Se colocó una pinza hemostática en el tubo muy cerca del puerto de la bolsa de Retenido para evitar que la suspensión celular se asentara en el tubo y se selló con triple calor debajo de la pinza hemostática.
Se retiró la bolsa de retenido rompiendo el sello del medio y se transfirió a la BSC.
Se siguieron las instrucciones de la pantalla Retirar productos.
Se tocó el botón Siguiente. Se abrieron todas las abrazaderas mecánicas LOVO y se mostró la pantalla Retirar kit. Se siguieron las instrucciones de la pantalla Retirar kit. Cuando terminó, se procedió.
Tocó el botón Siguiente. Se cerraron todas las pinzas mecánicas LOVO y se mostró la pantalla de resumen de resultados. Se registraron los datos de la pantalla de resumen de resultados en la Tabla 17. Se cerraron todas las bombas y se filtró el soporte.
TABLA 17. Tabla resumen de resultados LOVO.
Se tocó el botón Siguiente. Se mostró la pantalla de selección de protocolo.
Procedimiento de apagado de LOVO
1. Se aseguró de que todas las abrazaderas estuvieran cerradas y que el soporte del filtro estuviera en posición vertical.
2. Se tocó el botón DETENER en la parte delantera del LOVO.
3. Se mostró la superposición de decisiones del botón DETENER.
4. Se mostró la superposición de confirmación de apagado.
5. Se tocó el botón Sí. Apareció la pantalla de apagado.
<6>. Después de unos segundos, se mostró la pantalla de apagado. Cuando se mostró esta pantalla, se apagó el LOVO usando el interruptor en la parte posterior izquierda del instrumento.
Se registró en una tabla el volumen de producto formulado final.
Se calculó la cantidad de IL-2 requerida de la tabla de producto final
Se determinó la cantidad de bolsas criogénicas y el volumen de retención
Se marcó en el volumen objetivo y la tabla de retención más adelante el número de bolsas de crioconservación y el volumen de la muestra de retención para el producto.
Cálculo de volumen objetivo /bolsa: (Volumen formulado final - ajuste de volumen debido a que no se obtuvo una recuperación del 100% = 10 mL)/# bolsas.
Células preparadas con 1:1 (vol:vol) CS10 (CryoStor 10, BioLife Solutions) e IL-2.
1. Montar y conectar el aparato
1.1. Se soldaron en condiciones estériles las bolsas criogénicas CS750 al aparato CC2 Cell Connect reemplazando uno de los extremos luer macho distales de cada bolsa.
1.2. Las abrazaderas se mantuvieron en la posición cerrada.
1.3. Se etiquetaron las bolsas 1-4.
2. Células preparadas con IL-2 y aparato conectado.
2.1. En la espiga de BSC se colocó la bolsa de producto celular con un equipo de transferencia de plasma de 4" con conector luer hembra. Se aseguró de que la abrazadera estuviera cerrada en el equipo de transferencia. 2.2. Con una jeringa de tamaño apropiado, se extrajo el volumen de dilución de trabajo de IL-2 determinado a partir de la Tabla de Producto Final.
2.3. Se despachó a producto LOVO.
2.4. Bolsa de producto LOVO soldada estéril a la línea de espiga simple CC2 quitando la espiga.
2.5. Se colocaron las células y el aparato en una bolsa de transporte y se colocaron a 2-8°C durante < 15 min. 3. Adición de CS10
3.1. En BSC se adjunta una llave de paso de 3 vías al luer macho en una bolsa de CS10 fría.
3.2. Se adjunta una jeringa del tamaño adecuado a la llave hembra de la llave de paso.
3.3. Se desprendió la bolsa y se extrajo la cantidad de CS 10 determinada en la tabla "Volumen de producto formulado final".
3.4. Se retiró la jeringa y se tapó en rojo.
3.5. Cuando se requirieron varias jeringas, se repitió.
3.6. Se retiró el aparato de célula/CC2 del refrigerador a 2-8°C y se colocó en BSC.
3.7. Se adjuntó la primera jeringa que contenía CS10 al luer medio de la llave de paso. Se giró la llave de paso para que la línea a las bolsas CS750 estuviera en la posición "APAGADO".
3.8. Lentamente y mezclando suavemente, se añadió CS10 (1:1, vol:vol) a las células.
3.9. Se repitió para jeringas adicionales de CS10.
Adición de producto celular formulado en bolsas criogénicas
1. Se reemplazó la jeringa con jeringa de tamaño apropiado para el volumen de células que se colocarán en cada bolsa criogénica.
2. Se mezcló producto de células.
3. Se abrió la abrazadera que conduce a la bolsa del producto celular y se extrajo el volumen apropiado.
4. Se giró la llave de paso para que la bolsa de producto celular estuviera en la posición "APAGADO" y se despachó el contenido de la jeringa en la bolsa criogénica # 1. Se despejó la línea con aire de la jeringa.
Se registró el volumen del producto final
1. Utilizando un puerto sin agujas y una jeringa de tamaño apropiado, se extrajo la cantidad de retención determinada previamente.
2. Se colocó lo retenido en un tubo cónico de 50 mL con la etiqueta "Retener"
3. El uso de la jeringa unida al arnés se eliminó todo el aire de la bolsa que extrajo las células hasta alrededor de 1 "más allá de la bolsa en el tubo. Se sujetó con abrazaderas y se selló con calor. Se colocó a 2-8°C.
4. Se giró la llave de paso para que las bolsas criogénicas estuvieran en la posición "APAGADO"
5. Se mezclaron las células en la bolsa de producto celular y se repitieron las etapas 3-8 para las bolsas CS750 restantes usando una nueva jeringa en la llave de paso y una nueva jeringa para obtener la retención de células.
<6>. El producto retenido debe reservarse para su tratamiento una vez que el producto estuviera en CRF.
Procedimiento de congelador de velocidad controlada (CRF) (véase también el Ejemplo 9)
1. Se encendió el CRF (congelador de velocidad controlada CryoMed, modelo 7454) y el ordenador portátil asociado.
2. Se conectó a el ordenador con una cuenta y una contraseña.
3. Se abrió ícono de congelador de velocidad controlada ubicado en el escritorio.
4. Se hizo clic en el botón Ejecutar en la pantalla principal.
5. Se hizo clic en Abrir perfil, se hizo clic en Abrir.
<6>. Se ingresó el nombre del archivo de ejecución seguido de la fecha en este formato: runMMDDYYYE.
7. Se ingresó la etiqueta de datos como fecha sin guiones como MMDDYYE.
<8>. Puerta cerrada al CRF.
9. Se hizo clic en Iniciar ejecución.
10. Seleccionado COM<6>en el menú desplegable.
11. Hizo clic en Aceptar. Esperó unos 30 segundos.
12. Cuando apareció "Descarga de perfil", se hizo clic en Aceptar. Se hizo clic en Guardar. (Véase el Ejemplo 9 para obtener detalles del perfil de congelación de velocidad controlada).
13. Se esperó para presionar el botón verde hasta que las muestras estuvieron en el CRF. El congelador se mantuvo a 4°C hasta que estuvo listo para agregarlos.
14. Se agregaron muestras a CRF.
15. Se esperó hasta que CRF se volvió a 4°C. Una vez que se alcanzó la temperatura, se hizo clic en el botón verde de continuar. Este programa inició para ir a la siguiente etapa del programa.
16. Se realizó una inspección visual de las bolsas criogénicas para lo siguiente (Nota: no inspeccionó el llenado excesivo o insuficiente): integridad del contenedor, integridad del puerto, integridad del sello, presencia de grumos de células y presencia de partículas.
17. Se colocó etiquetas colgantes aprobadas en cada bolsa.
18. Se verificó etiqueta del producto final que incluía: número de lote, nombre del producto, fecha del fabricante, volumen del producto, otros aditivos, temperatura de almacenamiento y vencimiento.
19. Se colocó cada bolsa criogénica (con etiqueta colgante) en una bolsa superior.
20. Se selló al calor.
21. Se colocó en un casete frío.
22. Se repitió para cada bolsa.
23. Se colocaron las bolsas criogénicas etiquetadas en casetes preacondicionados y se transfirieron al CRF. 24. Se distribuyó uniformemente los casetes en el bastidor del CRF.
25. Se aplicó un termopar de cinta al casete central o se colocó la bolsa falsa en la posición central.
26. Se cerró la puerta del CRF.
27. Una vez que la temperatura de la cámara alcanzó los 4°C /- 1.5°C, se tocó Ejecutar en el software de interfaz de PC.
28. Se registró el tiempo y la temperatura de la cámara en que el producto se transfiere al CRF.
Tratamiento de muestra de control de calidad
1. Transferir asépticamente los siguientes materiales a la BSC, según fuera necesario, y etiquetarlos de acuerdo con la siguiente tabla:
2. Se utilizó una pipeta nueva para pipetear lo siguiente:
Tabla de retención y control de calidad
3. Se entregó al control de calidad: 1 tubo de recuento de células, 1 tubo de endotoxina, 1 tubo de micoplasma, 1 tubo de tinción de gramo, 1 tubo de tubo de reestimulación y 1 tubo de flujo al control de calidad para una prueba inmediata. Los tubos duplicados restantes se colocaron en el congelador de velocidad controlada.
4. Se comunicó con el supervisor de control de calidad para notificarle las pruebas requeridas.
5. Véase la Tabla 18 para obtener instrucciones de prueba y almacenamiento.
TABLA 18. Instrucciones de prueba y almacenamiento.
Recuento de células
Se realizó un solo recuento de células en cada muestra y se registraron datos y se adjuntaron los datos brutos de recuento al registro por lotes. Se documentó el programa de recuento del Cellometer. Se verificó que se hubiera ingresado la dilución correcta al Cellometer.
Crioconservación de células de retención posteriores a la formulación:
1. Se colocó vial en CRF.
2. Se trasladó a la ubicación de almacenamiento después de completar la congelación y se registraron la fecha y la hora de colocación en CFR. La fecha y la hora registradas se trasladaron a LN<2>.
Pruebas de microbiología
1. Solicitud de pruebas para placas de sedimentación al laboratorio de microbiología.
2. Números de acceso registrados.
3. Pruebas ordenadas de esterilidad aeróbica y anaeróbica.
4. Entrega garantizada de placas y matraces al laboratorio de microbiología.
Crioconservación posterior de bolsas de productos celulares
1. Se detuvo el congelador después de completar la ejecución. La ejecución se pudo detener haciendo clic en el botón Detener o presionando la tecla Atrás en el teclado del congelador.
2. Se retiraron las bolsas criogénicas del casete
3. Se transfirieron casetes a la fase de vapor LN<2>.
4. Ubicación de almacenamiento registrada.
5. Se ingresaron comentarios adicionales cuando la ventana de ingreso de texto se abrió nuevamente. Esta ventana apareció independientemente del procedimiento de detener ejecución.
<6>. Se imprimió el informe de perfil y se adjuntó al registro de lote etiquetado con el número de lote para la ejecución.
7. Finalizó el modo de calentamiento y se cerró la pantalla Ejecutar con el botón Salir.
EJEMPLO 9:PROCEDIMIENTO DE CRIOCONSERVACIÓN
Este ejemplo describe el procedimiento del proceso de crioconservación para TIL preparados con el procedimiento cerrado abreviado descrito anteriormente en el Ejemplo<8>usando el congelador de velocidad controlada CryoMed, modelo 7454 (Thermo Scientific).
El equipo utilizado, además del descrito en el Ejemplo 9, es el siguiente:
Estante de soporte de casetes de aluminio (compatible con las bolsas para congelador CS750), casetes de almacenamiento criogénico para bolsas de 750 mL, tanque de nitrógeno líquido de baja presión (22 psi), refrigerador, sensor de termopar (tipo cinta para bolsas) y bolsas de congelación CryoStore CS750 (OriGen Scientific).
El procedimiento de congelación proporciona una velocidad de 0.5°C desde la nucleación hasta -20°C y una velocidad de enfriamiento de 1°C por minuto hasta la temperatura final de -80°C. Los parámetros del programa son los siguientes:
Etapa 1: espere a 4°C; Etapa 2: 1.0°C/min (temperatura de la muestra) a -4°C; Etapa 3: 20.0°C/min (temperatura de la cámara) a -45°C; Etapa 4: 10.0°C/min (temperatura de la cámara) a -10.0°C; Etapa 5: 0.5°C/min (temperatura de la cámara) a -20°C; y Etapa<6>: 1,0°C/min (temperatura de la muestra) a -80°C.
En la Figura 11 se mostró una descripción del procedimiento de este ejemplo junto con el procedimiento de los Ejemplos 1 a<8>.
EJEMPLO 10:CARACTERIZACIÓN DEL PROCEDIMIENTO 2A TILS
Este ejemplo describe la caracterización de los TIL preparados con el procedimiento cerrado abreviado descrito anteriormente. En resumen, el procedimiento cerrado abreviado (procedimiento 2A, descrito en los Ejemplos 1 a 9) tenía las ventajas sobre los procedimientos de fabricación de<t>I<l>anteriores que se indican en la Tabla 19. Las ventajas para el Pre-REP pueden incluir: mayor cantidad de fragmentos tumorales por matraz, menor tiempo de cultivo, número reducido de etapas y/o ser susceptible a un sistema cerrado. Las ventajas para la transición de Pre-REP a REP pueden incluir: procedimiento pre-REP-a-REP abreviado, número reducido de etapas, selección de fenotipado eliminada y/o susceptible a sistema cerrado. Las ventajas para el REP pueden incluir: número reducido de etapas, duración del REP más corta, transferencia del sistema cerrado de TIL entre matraces y/o intercambios de medios del sistema cerrado. Las ventajas para la recolección pueden incluir: número reducido de etapas, lavado de célula automatizado, sistema cerrado y menor pérdida de producto durante el lavado. Las ventajas para la formulación y/o producto final pueden incluir flexibilidad de envío.
TABLA 19. Comparación del procedimiento ejemplar 1C y una forma de realización del procedimiento 2A.
Se realizaron un total de 9 experimentos usando TIL derivados de 9 tumores descritos en la Tabla 20. Todos los datos mostrados aquí se midieron a partir del producto TIL congelado descongelado del proceso 1C y una forma de realización del procedimiento 2A.
TABLA 20. Descripción de donantes de tumores, fechas de tratamiento y ubicaciones de tratamiento.
Los procedimientos descritos en el presente documento para el procedimiento 2A se utilizaron para producir los TIL para la caracterización en este ejemplo. Brevemente, para el REP, el día 11, un matraz de G-REX-500M que contiene 5 L de CM2 suplementado con 3000 UI/mL de rhil-2, 30ng/mL de anti-CD3 (clon OKT3) y 5 * 10<9>irradiado se prepararon células PBMC alimentadoras alogénicas. Los TIL recogidos del matraz pre-REP G-REX -100M después de la reducción de volumen se contaron y se sembraron en el matraz G-REX -500M a una densidad que varió entre 5 x 106y 200 x 10<6>células. Más adelante, el matraz se colocó en una incubadora humidificada de cultivo de tejidos con CO<2>al 5% a 37°C durante cinco días. El día 16, se redujo el volumen del matraz G-REX -500M, se contaron los TIL y se determinó su viabilidad. En este punto, los TIL se expandieron en múltiples matraces G-REX -500M (hasta un máximo de seis matraces), cada uno con una densidad de siembra de 1 x 10<9>TIL/matraz. Más adelante, todos los matraces se colocaron en incubadoras de cultivo de tejidos con CO<2>al 5% y 37°C humidificadas durante seis días más. El día 22, el día de la recolección, se redujo el volumen de cada matraz en un 90%, se juntaron las células y se filtraron a través de un filtro de sangre de 170 pm, y luego se recogieron en una bolsa Origin EV3000 de 3 L o equivalente en preparación para el lavado automático el LOVO. Los TIL se lavaron usando el sistema de tratamiento celular automatizado LOVO que reemplazó el 99.99% de los medios de cultivo celular con un regulador de pH de lavado que consistía en PlasmaLyte-A suplementado con HSA al 1%. El LOVO opera utilizando tecnología de membrana de filtración giratoria que recupera más del 92% del TIL al tiempo que elimina virtualmente los componentes residuales del cultivo de tejidos, incluidos el suero, los factores de crecimiento y las citocinas, así como otros desechos y partículas. Una vez completado el lavado, se realizó un recuento de células para determinar la expansión de los TIL y su viabilidad tras la recolección. Se añadió CS10 al TIL lavado en una relación volumen: volumen de 1:1 para lograr la formulación final del Procedimiento 2A. El producto final formulado se dividió en alícuotas en bolsas de almacenamiento criogénico, se selló y se colocó en casetes de aluminio preenfriados. Las bolsas de almacenamiento criogénico que contenían TIL se congelaron luego usando un congelador de velocidad controlada CryoMed (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) de acuerdo con los procedimientos descritos en este documento, incluido el Ejemplo 9.
En las Figuras 12 y 13 se compararon los recuentos de células y el porcentaje de viabilidad de las nueve ejecuciones.
Los marcadores de superficie celular que se mostraron en los siguientes resultados se analizaron usando citometría de flujo (citómetro de flujo Canto II, Becton, Dickinson, and Co., Franklin Lakes, NJ, EE.UU.) usando reactivos adecuados disponibles comercialmente. Los resultados de los marcadores de interés se mostraron en la Figura 14 a la Figura 23.
Se han utilizado diversos procedimientos para medir la longitud de los telómeros en preparaciones citológicas y de ADN genómico. El análisis de fragmentos de restricción de telómeros (TRF) es el estándar de oro para medir la longitud de los telómeros (de Lange et al., 1990). Sin embargo, la principal limitación de TRF es el requisito de una gran cantidad de ADN (1.5 pg). Aquí, se aplicaron dos técnicas ampliamente utilizadas para la medición de la longitud de los telómeros, a saber, hibridación in situ de fluorescencia (FISH) y PCR cuantitativa.
Flow-FISH se realizó utilizando el kit Dako kit (K532711-8 RUO Code K5327 Telomere PNA/FITC para citometría de flujo, kit PNA FISH/FITC. Flujo, 20 pruebas) y se siguieron las instrucciones del fabricante para medir la longitud media de repetición del telómero. Brevemente, la superficie de las células se tiñó con CD3 APC durante 20 minutos a 4°C, seguido de GAM Alexa 546 durante 20 minutos. Más adelante, el complejo antígeno-anticuerpo se reticuló con reticulante químico BS3 (Fisher Scientific) de 2 mM. La unión de la sonda de PNA-telómero en una población estándar de células T con telómeros largos, línea celular de leucemia Jurkat 1301 T (células 1301), se usó como patrón de referencia interno en cada ensayo. Los TIL individuales se contaron después de la incubación del anticuerpo y se mezclaron con 1301 células (ATCC) en una relación de células 1:1. Se mezclaron 5 x 10<5>TIL con 5 x 10<5>células 1301. La hibridación in situ se realizó en solución de hibridación (formamida al 70%, BSA al 1%, Tris 20 mM pH 7.0) por duplicado y en presencia y ausencia de una sonda de PNA de telómero conjugado con FITC (Panagene), FITC-00-CCC-TAA-CCC-TAA-CCC-TAA, suplementaria a la secuencia de repetición del telómero a una concentración final de 60 nM. Después de la adición de la sonda Telomere PNA, las células se incubaron durante 10 minutos a 81°C en un baño de agua con agitación. Más adelante, las células se colocaron en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche. A la mañana siguiente, se eliminó el exceso de sonda de telómero lavando 2 veces con PBS precalentado a 40°C. Después de los lavados, se añadió DAPI (Invitrogen, Carlsbad, CA) a una concentración final de 75 ng/mL. La tinción de ADN con DAPI se usó para bloquear células en la población G0/G1. El análisis de la muestra se realizó utilizando nuestro citómetro de flujo (BD Canto II, Mountain View, CA). La fluorescencia del telómero de la muestra de prueba se expresó como un porcentaje de la fluorescencia (fl) de las células 1301 según la siguiente fórmula: Longitud relativa del telómero = [(células de prueba FITC fl media con sonda - células de prueba FITC fl medias sin sonda) * índice de ADN células 1301 * 100]/[(células FITC fl 1301 promedio con sonda - células FITC fl 1301 promedio sin sonda) * célula de prueba de índice de ADN.
También se usó qPCR en tiempo real para medir la longitud relativa de los telómeros (Nucleic Acids Res. 2002 May 15; 30(10): e47., 20, Leukemia, 2013, 27, 897-906). Brevemente, se determinó la relación entre el número de copias repetidas de telómeros y el número de copias de un solo gen (T/S) usando un termociclador BioRad PCR (Hercules, CA) en un formato de 96 pocillos. Se utilizaron diez ng de ADN genómico para la reacción de PCR de telómero o hemoglobina (hgb) y los cebadores utilizados fueron los siguientes: cebador Tel-1b (CGG TTT GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT), cebador Tel-2b (GGC TTG CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT), cebador hgb1 (GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC), y cebador hgb2 (CACCAACTTCATCCACGTTCACC). Todas las muestras se analizaron mediante las reacciones de los telómeros y la hemoglobina, y el análisis se realizó por triplicado en la misma placa. Además de las muestras de prueba, cada placa de 96 pocillos contenía una curva estándar de cinco puntos de 0.08 ng a 250 ng utilizando ADN genómico aislado de la línea celular 1301. La relación T/S (-dCt) para cada muestra se calculó restando el valor mediano del ciclo umbral de hemoglobina (Ct) del valor mediano de Ct del telómero. La relación T/S relativa (-ddCt) se determinó restando la relación T/S del punto de curva estándar de 10.0 ng de la relación T/S de cada muestra desconocida.
Los resultados de Flow-FISH se mostraron en las Figuras 24 y 25, y no se observaron diferencias significativas entre el proceso 1C y el procedimiento 2A, lo que sugiere que las propiedades sorprendentes de los TIL producidos por el procedimiento 2A no eran predecibles a partir de la edad de los TIL solos.
En conclusión, el procedimiento 2A produjo un potente producto TIL con un fenotipo "joven" definido por altos niveles de moléculas coestimuladoras, bajos niveles de marcadores de agotamiento y una mayor capacidad para secretar citocinas tras la reactivación. La plataforma de expansión abreviada del día 22 permite la generación rápida de dosis a escala clínica de TIL para pacientes con necesidad urgente de terapia. El producto farmacéutico crioconservado introduce eficiencias logísticas críticas que permiten una fabricación rápida y flexibilidad en la distribución. Este procedimiento de expansión supera las barreras tradicionales para la aplicación más amplia de la terapia TIL.
EJEMPLO 11:USO DE CÓCTEL DE CITOCINA DE IL-2, IL-15 E IL-21
Este ejemplo describe el uso de citocinas IL-2, IL-15 e IL-21, que sirven como factores de crecimiento de células T adicionales, en combinación con el procedimiento TIL de los Ejemplos 1 a 10.
Usando el procedimiento de los Ejemplos 1 a 10, se cultivaron TIL a partir de tumores colorrectales, de melanoma, cervicales, de mama triple negativo, pulmón y renales en presencia de IL-2 en un brazo del experimento y, en lugar de IL-2, una combinación de IL-2, IL-15 e IL-21 en otro brazo al inicio del cultivo. Al finalizar el pre-REP, se evaluaron los cultivos para determinar la expansión, el fenotipo, la función (CD107a+ e IFN-y) y el repertorio de TCR Vp. IL-15 e IL-21 se describen en otra parte de este documento y en Gruijl, et al., IL-21 promueve la expansión de linfocitos infiltrantes de tumores CD27+ CD28+ con alto potencial citotóxico y baja expansión colateral de células T reguladoras, Santegoets, S. J., J Transl Med., 2013, 11:37 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3626797/).
Los resultados mostraron que la expansión de TIL mejorada (>20%), tanto en células CD4+ como CD<8>+ en las condiciones tratadas con<i>L-2, IL-15 e IL-21 se observó en múltiples histologías relativas en las condiciones de solo IL-2. Hubo un sesgo hacia una población predominantemente de CD<8>+* con un repertorio TCR Vp sesgado en los TIL obtenidos de los cultivos tratados con IL-2, IL-15 e IL-21 en relación con los cultivos de solo IL-2. IFN-y y CD107a estaban elevados en los TIL tratados con IL-2, IL-15 e IL-21, en comparación con los TIL tratados solo con IL-2.
EJEMPLO 12:FASE 2, MULTICENTRO, ESTUDIO DE TRES COHORTES EN MELANOMA
Este estudio de fase 2, multicéntrico, de tres cohortes está diseñado para evaluar la seguridad y eficacia de una terapia TIL fabricada de acuerdo con el proceso 1C (como se describe en el presente documento) en pacientes con melanoma metastásico. Las cohortes uno y dos inscribirán hasta 30 pacientes cada una y la cohorte tres es una cohorte de retratamiento para una segunda infusión de TIL en hasta diez pacientes. Las dos primeras cohortes están evaluando dos procedimientos de fabricación diferentes: los procedimientos 1C y una forma de realización del procedimiento 2A (descrito en los Ejemplos 1 a 10, respectivamente. Los pacientes de la cohorte uno (1) reciben TIL frescos no crioconservados y los pacientes de la cohorte dos (2) reciben el producto fabricado a través del procedimiento descrito en los Ejemplos 1 a 10, produciendo un producto crioconservado. El diseño del estudio se mostró en la Figura 26. El estudio es un estudio de fase 2, multicéntrico, de tres cohortes para evaluar la seguridad y eficacia de los TIL autólogos para el tratamiento de subpoblaciones de pacientes con melanoma metastásico. Los criterios de inclusión clave incluyen: melanoma metastásico medible y > 1 lesión resecable para la generación de TIL; al menos una línea previa de terapia sistémica; edad > 18; y estado funcional ECOG de 0-1. Las cohortes de tratamiento incluyen productos TIL no crioconservados (preparados usando el procedimiento 1C), producto TIL crioconservado (preparado usando una forma de realización del procedimiento<2>A) y re-tratamiento con producto TIL para pacientes sin respuesta o que progresan después de la respuesta inicial. El criterio de valoración principal es la seguridad y el criterio de valoración secundario es la eficacia, definida como tasa de respuesta objetiva (TRG), tasa de remisión completa (CRR), supervivencia libre de progresión (SLP), duración de la respuesta (DOR) y supervivencia global (SG).
EJEMPLO 13:LOTES INDIVIDUALES DE CALIFICACIÓN DE CÉLULAS MONONUCLEARES PERIFÉRICAS IRRADIADAS CON GAMMA
Este ejemplo describe un procedimiento abreviado nuevo para calificar lotes individuales de células mononucleares periféricas irradiadas con rayos gamma (PBMC, también conocidas como MNC) para su uso como células alimentadoras alogénicas en los procedimientos ejemplares descritos en este documento.
Cada lote de alimentador de MNC irradiado se preparó a partir de un donante individual. Cada lote o donante se seleccionó individualmente para determinar su capacidad para expandir TIL en el REP en presencia de anticuerpo anti-CD3 (clon OKT3) purificado e interleucina-2 (IL-2). Además, cada lote de células alimentadoras se probó sin la adición de TIL para verificar que la dosis recibida de radiación gamma era suficiente para hacer que su replicación fuera incompetente.
Definiciones/Abreviaturas
BSC - Cabina de seguridad biológica
CD3 - Clúster de diferenciación 3; linfocitos T de proteína marcadora de superficie
CF - Centrífuga
CM2 - Medio completo para TIL #
CMO - Organización de fabricación por contrato
CO<2>- Dióxido de carbono
EtOH - alcohol etílico
GMP - Buenas prácticas de fabricación
IL-2: interleucina 2
IU - Unidades internacionales
LN2 - Nitrógeno líquido
mini-REP - Protocolo de expansión mini-rápida
mL - mililitro
MNC - Células mononucleares
NA - No aplica
OKT3 - Anticuerpo MACS GMP CD3 puro (clon OKT3)
EPI - Equipo de protección personal
Pre-REP: antes del protocolo de expansión rápida
QS - Quantum Satis; llenar a esta cantidad
REP - Protocolo de expansión rápida
TIL - Linfocitos infiltrantes de tumores
T25 - Matraz de cultivo de tejidos de 25 cm<2>A {2}
|jg - Microgramo
|jL - Microlitro
PROCEDIMIENTO
Antecedentes
7.1.1 Se requirieron células alimentadoras de MNC irradiadas con rayos gamma y detenidas en su crecimiento para REP de TIL. Los receptores de membrana en las MNC del alimentador se unen al anticuerpo anti-CD3 (clon OKT3) y se reticulan con TIL en el matraz de REP, que estimulan la expansión de TIL. Los lotes de alimentación se prepararon a partir de la leucaféresis de sangre entera extraída de donantes individuales. El producto de leucaféresis se sometió a centrifugación sobre Ficoll-Hypaque, se lavó, se irradió y se crioconservó en condiciones de GMP.
7.1.2 Es importante que los pacientes que recibieron terapia con TIL no reciban una infusión de células alimentadoras viables, ya que esto puede provocar la enfermedad de injerto contra huésped (EICH). Por tanto, el crecimiento de las células alimentadoras se detiene mediante la dosificación de las células con irradiación gamma, lo que da como resultado roturas del ADN bicatenario y la pérdida de la viabilidad celular de las células MNC tras el recultivo.
Criterios de evaluación y configuración experimental
Los lotes de alimentación se evaluaron según dos criterios: 1) su capacidad para expandir TIL en cocultivo > 100 veces y<2>) su incompetencia de replicación.
7.2.2 Los lotes de alimentación se probaron en formato mini-REP utilizando dos líneas pre-REP TIL primarias cultivadas en matraces de cultivo de tejidos T25 verticales.
7.2.3 Los lotes de alimentación se probaron frente a dos líneas TIL distintas, ya que cada línea TIL es única en su capacidad de proliferar en respuesta a la activación en un REP.
7.2.4 Como control, junto con los lotes de prueba se ejecutó un lote de células alimentadoras MNC irradiadas que históricamente se ha demostrado que cumplen con los criterios de 7.2.1.
7.2.5 Para asegurar que todos los lotes probados en un solo experimento reciban pruebas equivalentes, se dispuso de suficientes existencias de las mismas líneas pre-REP TIL para probar todas las condiciones y todos los lotes de alimentadoras.
7.2.6 Para cada lote de células de alimentación analizadas, hubo un total de seis matraces T25:
7.2.6.1 Línea # 1 de Pre-REP TIL (2 matraces)
7.2.6.2 Línea # 2 de Pre-REP TIL (2 matraces)
7.2.6.3 Control de alimentadoras (2 matraces)
NOTA: Los matraces que contienen las líneas TIL # 1 y # 2 evaluaron la capacidad del lote alimentador para expandir TIL. Los matraces de control de alimentadoras evaluaron la incompetencia de replicación del lote de las alimentadoras.
Protocolo experimental
7.3.1 Día -2/3, Descongelamiento de líneas TIL
7.3.1.1 Medio CM2 preparado.
7.3.1.2 CM2 calentado en baño de agua a 37°C.
7.3.1.3 Se prepararon 40 mL de CM2 suplementado con 3000 UI/mL de IL-2. Mantener caliente hasta su uso. 7.3.1.4 Se colocaron 20 mL de CM2 precalentado sin IL-2 en cada uno de los dos tubos cónicos de 50 mL etiquetados con los nombres de las líneas TIL utilizadas.
7.3.1.5 Se retiraron las dos líneas pre-REP TIL designadas del almacenamiento de LN2 y se transfirieron los viales a la sala de cultivo de tejidos.
7.3.1.6 Identificación de la línea TIL registrada.
7.3.1.7 Matraces descongelados colocándolos dentro de una bolsa de almacenamiento con cremallera sellada en un baño de agua a 37°C hasta que quede una pequeña cantidad de hielo.
7.3.1.8 Viales descongelados rociados o limpios con etanol al 70% y se transfirieron los viales a BSC.
7.3.1.9 Con una pipeta de transferencia estéril, se transfirieron inmediatamente el contenido del vial a los 20 mL de CM2 en el tubo cónico de 50 mL preparado y etiquetado.
7.3.1.10 QS a 40 mL usando CM2 sin IL-2 para lavar las células.
7.3.1.11 Centrifugado a 400 x CF durante 5 minutos.
7.3.1.12 Se aspiró el sobrenadante y se resuspendió en 5 mL de CM2 tibio suplementado con 3000 UI/mL de IL-2.
7.3.1.13 Se eliminó una pequeña alícuota (20 j l ) por duplicado para el recuento celular utilizando un contador celular automático. Se registró los recuentos.
7.3.1.14 Mientras se realiza el recuento, Se colocó el tubo cónico de 50 mL con células TIL en una incubadora humidificada de 37°C con CO<2>al 5%, con la tapa aflojada para permitir el intercambio de gases.
7.3.1.15 Concentración celular determinada y TIL diluido a 1 x 10<6>células/mL en CM2 suplementado con IL-2 a 3000 UI/mL.
7.3.1.16 Se cultivó en 2 mL/pocillo de una placa de cultivo tisular de 24 pocillos en tantos pocillos como fuera necesario en una incubadora humidificada a 37°C hasta el día 0 del mini-REP.
7.3.1.17 Se cultivaron las diferentes líneas TIL en placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos independientes para evitar confusiones y una posible contaminación cruzada.
7.3.2 Día 0, iniciar Mini-REP
7.3.2.1 Se preparó suficiente medio CM2 para la cantidad de lotes de alimentadores que se analizarán (por ejemplo, para analizar 4 lotes de alimentadores a la vez, se prepararon 800 mL de medio CM2).
7.3.2.2 Se dividió en alícuotas una porción del CM2 preparado en 7.3.2.1 y se suplementó con 3000 UI/mL de IL-2 para el cultivo de las células. (por ejemplo, para analizar 4 lotes de alimentadores a la vez, preparar 500 mL de medio CM2 con 3000 UI/mL de IL-2).
7.3.2.3 El resto del CM2 sin IL-2 se utilizará para el lavado de células como se explica más adelante.
7.3.2.4 Trabajando con cada línea TIL por separado para evitar la contaminación cruzada, se retiró la placa de 24 pocillos con cultivo TIL de la incubadora y se transfirió al BSC.
7.3.2.5 Con una pipeta de transferencia estéril o una pipeta de 100-1000 j l y una punta, se extrajo alrededor de 1 mL de medio de cada pocillo de TIL que se utilizará y colóquelo en un pocillo no utilizado de la placa de cultivo tisular de 24 pocillos. Esto se usó para lavar pozos.
7.3.2.6 Utilizando una pipeta de transferencia estéril nueva o una pipeta de 100-1000 j l y una punta, se mezcló el medio restante con TIL en los pocillos para resuspender las células y luego se transfirieron la suspensión celular a un tubo cónico de 50 mL etiquetado con el nombre TIL y se registró el volumen.
7.3.2.7 Se lavaron los pocillos con el medio reservado y se transfirió ese volumen al mismo tubo cónico de 50 mL.
7.3.2.8 Se centrifugaron las células a 400 x CF para recoger el sedimento celular.
7.3.2.9 Se aspiró el sobrenadante del medio y se resuspendió el sedimento celular en 2-5 mL de medio CM2 que contiene 3000 UI/mL de IL-2, volumen que se utilizará según el número de pocillos recolectados y el tamaño del sedimento; el volumen debe ser suficiente para asegurar una concentración de > 1.3 x 10<6>células/mL.
7.3.2.10 Con una pipeta serológica, se mezcló bien la suspensión celular y se registró el volumen.
7.3.2.11 Se retiraron 200 j l para un recuento celular utilizando un contador celular automático.
7.3.2.12 Mientras se cuenta, se colocó el tubo cónico de 50 mL con células TIL en una incubadora humidificada con CO<2>al 5% a 37°C, con la tapa aflojada para permitir el intercambio de gases.
7.3.2.13 Registro de los recuentos.
7.3.2.14 Se retiró el tubo cónico de 50 mL que contenía las células TIL de la incubadora y se resuspendieron las células a una concentración de 1.3 x 10<6>células/mL en CM2 caliente suplementado con 3000 UI/mL de IL-2. Se devolvió el tubo cónico de 50 mL a la incubadora con la tapa aflojada.
7.3.2.15 Si se desea, se conserva la placa original de 24 pocillos para volver a cultivar cualquier TIL residual. 7.3.2.16 Se repitieron etapas 7.3.2.4 - 7.3.2.15 para la segunda línea TIL.
7.3.2.17 Justo antes de plaquear el TIL en los matraces T25 para el experimento, TIL se diluyó 1:10 para una concentración final de 1.3 x 10<5>células/mL según la etapa 7.3.2.35 más adelante.
Preparar la solución de trabajo MACS GMP CD3 puro (OKT3)
7.3.2.18 Se sacó la solución madre de OKT3 (1 mg/mL) del refrigerador a 4°C y se colocó en BSC.
7.3.2.19 Se utilizó una concentración final de 30 ng/mL de OKT3 en el medio del mini-REP.
7.3.2.20 Se necesitaron 600 ng de OKT3 para 20 mL en cada matraz T25 del experimento; esto fue el equivalente a 60 |jl de una solución de 10 jg/m L por cada 20 mL, o 360 j l para todos los<6>matraces analizados para cada lote de alimentadoras.
7.3.2.21 Para cada lote de alimentadoras analizado, se prepararon 400 j l de una dilución 1:100 de 1 mg/mL de OKT3 para una concentración de trabajo de 10 jg/m L (por ejemplo, para probar 4 lotes de alimentadoras a la vez, se prepararon 1600 j l de una dilución de 1 mg/mL de O<k t>3:<16>j l de una dilución 1:100 de 1 mg/mL de OKT3 1.584 mL de medio CM2 con 3000 UI/mL de IL-2.)
Preparar matraces T25
7.3.2.22 Se etiquetó cada matraz con el nombre de la línea TIL probada, el número de réplica del matraz, el número de lote de las alimentadoras, la fecha y las iniciales del analista.
7.3.2.23 Se llenó el matraz con el medio CM2 antes de preparar las células alimentadoras.
7.3.2.24 Se colocaron los matraces en una incubadora de CO<2>al 5% humidificada a 37°C para mantener el medio caliente mientras se esperaba agregar los componentes restantes.
7.3.2.25 Una vez preparadas las células de alimentación, los componentes se agregarían al CM2 en cada matraz. Preparar solución de trabajo MACS GMP CD3 pura (OKT3).
TABLA 21: Soluciones
Preparar las células de alimentación
7.3.2.26 Se necesitaba un mínimo de 78 x 10<6>células de alimentación por lote probado para este protocolo. Cada vial de 1 mL congelado por SDBB tenía 100 x 10<6>células viables tras la congelación. Suponiendo una recuperación del 50% tras la descongelación del almacenamiento de LN2, se recomendó descongelar al menos dos viales de 1 mL de células alimentadoras por lote dando un estimado de 100 x 10<6>células viables para cada REP. Alternativamente, si se suministra en viales de 1.8 mL, solo un vial proporcionó suficientes células alimentadoras.
7.3.2.27 Antes de descongelar las células alimentadoras, precalentar alrededor de 50 mL de CM2 sin IL-2 para cada lote de alimentadoras a analizar.
7.3.2.28 Se retiraron los viales del lote de alimentadoras designados del almacenamiento de LN2, se colocaron en una bolsa de almacenamiento con cierre y se colocaron en hielo. Viales transferidos a la sala de cultivo de tejidos.
7.3.2.29 Viales descongelados dentro de una bolsa de almacenamiento con cremallera cerrada sumergiéndolos en un baño de agua a 37°C.
7.3.2.30 Se retiraron los viales de la bolsa con cierre, se roció o se limpió con EtOH al 70% y se transfirieron los viales al BSC.
7.3.2.31 Utilizando una pipeta de transferencia, se transfirió inmediatamente el contenido de los viales de alimentadoras a 30 mL de CM2 caliente en un tubo cónico de 50 mL. Vial lavado con un pequeño volumen de CM2 para retirar las células residuales en el vial.
7.3.2.32 Centrifugado a 400 x CF durante 5 minutos.
7.3.2.33 Se aspiró el sobrenadante y se resuspendió en 4 mL de CM2 caliente más 3000 UI/mL de IL-2.
7.3.2.34 Se retiraron 200 pl para el recuento celular mediante el contador celular automatizado. Registrados los recuentos.
7.3.2.34 Células resuspendidas a 1.3 x 10<7>células/mL en CM2 caliente más 3000 UI/mL de IL-2.
7.3.2.34 Células TIL diluidas de 1.3 x 10<6>células/mL a 1.3 x 10<5>células/mL. Se trabajó con cada línea TIL de forma independiente para evitar la contaminación cruzada.
Configurar co-cultivo
7.3.2.36 Células TIL diluidas de 1.3 x 10<6>células/mL a 1.3 x 10<5>células/mL. Se trabajó con cada línea TIL de forma independiente para evitar la contaminación cruzada.
7.3.2.36.1 Se agregaron 4.5 mL de medio CM2 a un tubo cónico de 15 mL.
7.3.2.36.2 Se retiraron las células TIL de la incubadora y se resuspendieron bien con una pipeta serológica de 10 mL.
7.3.2.36.3 Se retiraron 0.5 mL de células de la suspensión de TIL 1.3 x 10<6>células/mL y se añadieron a los 4.5 mL de medio en el tubo cónico de 15 mL. Se devolvió el vial de solución madre de TIL a la incubadora.
7.3.2.36.4 Se mezcló bien.
7.3.2.36.5 Se repitieron etapas 7.3.2.36.1 - 7.3.2.36.4 para la segunda línea TIL.
7.3.2.36.6 Si se prueba más de un lote de alimentadoras a la vez, se diluye el TIL a la concentración más baja para cada lote de alimentadoras justo antes de sembrar el TIL.
7.3.2.37 Matraces transferidos con medios precalentados para un solo lote de alimentadoras desde la incubadora a la BSC.
7.3.2.38 Se mezclaron las células alimentadoras pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces con una punta de pipeta de 1 mL y transfiriendo 1 mL (1.3 x 10<7>células) a cada matraz para ese lote de alimentadoras.
7.3.2.39 Se agregaron 60 pl de solución madre de trabajo de OKT3 (10 pg/mL) a cada matraz.
7.3.2.40 Se devolvieron los dos matraces de control a la incubadora.
7.3.2.41 Se transfirió 1 mL (1.3 x 105) de cada lote de TIL al matraz T25 correspondientemente etiquetado.
7.3.2.42 Los matraces se devolvieron a la incubadora y se incubaron en posición vertical. No se molestó hasta el día 5.
7.3.2.43 Se repitieron 7.3.2.36 - 7.3.2.42 para todos los lotes de alimentadoras probados.
Día 5, cambio de medios
7.3.3.1 CM2 preparado con 3000 UI/mL de IL-2. Se necesitan 10 mL para cada matraz
7.3.3.2 Para evitar la contaminación cruzada, se manipularon los matraces para un solo lote de alimentadoras a la vez. Se retiraron los matraces de la incubadora y se transfirieron a la BSC, se tuvo cuidado de no alterar la capa celular en el fondo del matraz.
7.3.3.3 Se repitió para todos los matraces, incluido el matraz de control.
7.3.3.4 Con una pipeta de 10 mL, se transfirieron 10 mL de CM2 caliente con 3000 UI/mL de IL-2 a cada matraz.
7.3.3.5 Se devolvieron los matraces a la incubadora y se incubaron en posición vertical hasta el día 7. Se repitieron 7.3.3.1 - 7.3.3.6 para todos los lotes de alimentadores analizados.
Día 7, Recolección
7.3.4.1 Para evitar la contaminación cruzada, manipular los matraces para un solo lote de alimentadoras a la vez.
7.3.4.2 Se retiraron los matraces de la incubadora y se transfirieron a la BSC, teniendo cuidado de no alterar la capa de células en el fondo del matraz.
7.3.4.3 Sin alterar las células que crecen en el fondo de los matraces, se extrajeron 10 mL de medio de cada matraz de prueba y 15 mL de medio de cada uno de los matraces de control.
7.3.4.4 Con una pipeta serológica de 10 mL, se resuspendieron las células en el medio restante y se mezclaron bien para disolver los grumos de células.
7.3.4.5 Se registraron los volúmenes de cada matraz.
7.3.4.6 Después de mezclar bien la suspensión celular mediante pipeteo, se extraen 200 pl para el recuento celular.
7.3.4.7 Contar el TIL usando el procedimiento operativo estándar apropiado junto con el equipo contador celular automático.
7.3.4.8 Recuentos registrados en el día 7.
7.3.4.9 Se repitieron 7.3.4.1 - 7.3.4.8 para todos los lotes de alimentadores probados.
7.3.4.10 Se evaluó la incompetencia de replicación de los matraces de control de alimentadoras y se evaluó la expansión múltiple de los matraces que contenían TIL desde el Día 0 de acuerdo con los criterios enumerados en la Tabla 21 (más adelante).
Día 7, continuación de los matraces de control de alimentadoras hasta el día 14
7.3.5.1 Después de completar los recuentos del día 7 de los matraces de control de alimentadoras, se agregaron 15 mL de medio CM2 fresco que contenía 3000 UI/mL de IL-2 a cada uno de los matraces de control.
7.3.5.2 Se devolvieron los matraces de control a la incubadora y se incubaron en posición vertical hasta el día 14. Día 14, no proliferación extendida de matraces de control de alimentadoras
7.3.6.1 Para evitar la contaminación cruzada, los matraces se manipularon para un solo lote de alimentadoras a la vez.
7.3.6.2 Se retiraron los matraces de la incubadora y se transfirieron a la BSC; se tuvo cuidado de no alterar la capa de células en el fondo del matraz.
7.3.6.3 Sin alterar las células que crecen en el fondo de los matraces, se extrajo alrededor de 17 mL de medio de cada matraz de control.
7.3.6.4 Con una pipeta serológica de 5 mL, se resuspendieron las células en el medio restante y se mezclaron bien para disolver los grumos de células.
7.3.6.5 Se registraron los volúmenes de cada matraz.
7.3.6.6 Después de mezclar a fondo la suspensión celular mediante pipeteo, se extrajeron 200 pl para el recuento celular.
7.3.6.7 Se contaron los TIL usando el procedimiento operativo estándar apropiado junto con el equipo contador celular automático.
7.3.6.8 Recuentos registrados.
7.3.6.9 Se repitieron 7.3.4.1 - 7.3.4.8 para todos los lotes de alimentadoras probados.
RESULTADOS Y CRITERIOS DE ACEPTACIÓN
Resultados
10.1.1 La dosis de irradiación gamma fue suficiente para que la replicación de las células alimentadoras fuera incompetente. Se esperaba que todos los lotes cumplieran los criterios de evaluación y también demostraron una reducción en el número total viable de células alimentadoras restantes en el día 7 del cultivo de REP en comparación con el día<0>.
10.1.2 Se esperaba que todos los lotes de alimentadoras cumplieran con los criterios de evaluación de expansión de 100 veces el crecimiento de TIL para el día 7 del cultivo REP.
10.1.3 Se esperaba que los recuentos del día 14 de matraces de control de alimentadoras continuaran la tendencia no proliferativa observada en el día 7.
Criterios de aceptación
10.2.1 Se cumplieron los siguientes criterios de aceptación para cada línea TIL replicada probada para cada lote de células alimentadoras
10.2.2 La aceptación fue doble, como se indica más adelante (que se describe en la tabla siguiente).
TABLA 22: Criterios de aceptación
10.2.2.1 Se evaluó si la dosis de radiación era suficiente para hacer que la replicación de las células alimentadoras MNC fuera incompetente cuando se cultivaba en presencia de 30 ng/mL de anticuerpo OKT3 y 3000 UI/mL de IL-2.
10.2.2.1.1 La incompetencia de replicación se evaluó mediante el recuento total de células viables (TVC) según se determinó mediante el recuento celular automatizado el día 7 y el día 14 del REP.
10.2.2.1.2 El criterio de aceptación fue "Sin crecimiento", lo que significa que el número total de células viables no ha aumentado el día 7 y el día 14 desde el número de células viables inicial puesto en cultivo el día 0 del REP. 10.2.2.2 Se evaluó la capacidad de las células alimentadoras para soportar la expansión de TIL.
10.2.2.2.1 El crecimiento de TIL se midió en términos de expansión múltiple de células viables desde el inicio del cultivo en el día 0 del REP hasta el día 7 del REP.
10.2.2.2.1 El día 7, los cultivos de TIL lograron una expansión mínima de 100 veces, (es decir, más de 100 veces el número de células TIL viables totales puestas en cultivo el día 0 de REP), según se evaluó mediante el recuento celular automatizado.
10.2.2.3 Si un lote no cumpliera con los dos criterios anteriores, el lote se volvió a analizar de acuerdo con el plan de contingencia descrito en la Sección 10.3 más adelante.
10.2.2.4 Después de repetir la prueba de un lote fallido, se excluyó cualquier lote de alimentadoras de MNC que no cumpliera con los dos criterios de aceptación tanto en la evaluación original como en la prueba de contingencia.
10.2.2.5 Se excluyó cualquier lote de alimentadoras de MNC que cumpliera con los criterios de aceptación pero que se considerara que tenía un rendimiento deficiente en cuanto a la capacidad de expandir TIL en relación con otros lotes de alimentadoras anteriores probados en paralelo con las mismas líneas de TIL pre-REP.
Pruebas de contingencia de lotes de alimentadoras MNC que no cumplen con los criterios de aceptación 10.3.1 En el caso de que un lote de alimentadoras de MNC no cumpliera con ninguno de los criterios de aceptación descritos en la Sección 10.2 anterior, se tomarán las siguientes etapas para volver a probar el lote y descartar un error simple del experimentador como su causa.
10.3.2 Si quedan dos o más viales de prueba satélite del lote, el lote se volvió a analizar. Si había uno o ningún matraz de prueba satélite restante del lote, entonces el lote falló de acuerdo con los criterios de aceptación enumerados en la Sección 10.2 anterior.
10.3.3 Dos personas capacitadas, incluida la persona original que evaluó el lote en cuestión, probaron ambas el lote al mismo tiempo.
10.3.4 Se repitió la Sección 7.2 - 7.3 para reevaluar el lote en cuestión.
10.3.5 Cada persona analizó el lote en cuestión, así como un lote de control (como se define en la Sección 7.2.4 anterior).
10.3.6 Para ser calificado, el lote en cuestión y el lote de control tenían que cumplir con los criterios de aceptación de la Sección 10.2 para el personal que realizaba las pruebas de contingencia.
10.3.7 Una vez cumplidos estos criterios, el lote se entregó para uso de CMO como se describe en la Sección 10.2 anterior.
EJEMPLO 14:LOTES INDIVIDUALES DE CALIFICACIÓN DE CÉLULAS MONONUCLEARES DE SANGRE PERIFÉRICA IRRADIADA CON GAMMA
Este ejemplo describe un procedimiento abreviado nuevo para calificar lotes individuales de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) irradiadas con rayos gamma para su uso como células alimentadoras alogénicas en los procedimientos ejemplares descritos en el presente documento. Este ejemplo proporciona un protocolo para la evaluación de lotes de células PBMC irradiadas para su uso en la producción de lotes clínicos de TIL. Cada lote de PBMC irradiado se preparó a partir de un donante individual. En el transcurso de más de 100 protocolos de calificación, se demostró que, en todos los casos, los lotes de PBMC irradiados de SDBB (Banco de sangre de San Diego) se expanden TIL > 100 veces el día 7 de un REP. Este protocolo de calificación modificado estaba destinado a aplicarse a lotes de PBMC de donantes irradiados de SDBB que luego se sometieron a pruebas adicionales para verificar que la dosis recibida de radiación gamma era suficiente para hacerlos incompetentes para la replicación. Una vez que se demostró que mantuvieron la incompetencia de replicación durante el transcurso de 14 días, los lotes de PBMC de donantes se consideraron "calificados" para su uso en la producción de lotes clínicos de TIL.
Términos y definiciones clave
|jg - Microgramo
|jl - Microlitro
AIM-V - cabina de seguridad biológica de medio de cultivo celular disponible comercialmente
BSC - Clúster de diferenciación
CD - Medio completo para TIL # 2
CM2 - CM2 suplementado con 3000 UI/mL de IL-2
CM2IL2 - Organización de fabricación por contrato
CO<2>- Dióxido de carbono
EtOH - Etanol
GMP - Buenas prácticas de fabricación
Gy - Gris
IL - Interleucina
IU - Unidades internacionales
LN2 - Nitrógeno líquido
MI - mililitro
NA - No aplica
OKT3: designación de anticuerpo monoclonal anti-CD3
P20 - pipeta 2-20jl
P200 - pipeta de 20-200 |jl
PBMC - células mononucleares de sangre periférica
P1000 - pipeta de 100-1000jl
EPI - Equipo de protección personal
REP - Protocolo de expansión rápida
SDBB - Banco de sangre de San Diego
TIL - Linfocitos infiltrantes de tumores
T25 - Matraz de cultivo de tejidos de 25cm2
x g - "multiplicado por la gravedad" - medida de la fuerza centrífuga relativa
Las muestras incluyen PBMC de donantes irradiados (SDBB).
Procedimiento
Antecedentes
7.1.1 Se requirieron PBMC irradiadas con rayos gamma, con crecimiento detenido para el REP estándar actual de TIL. Los receptores de membrana en las PBMC se unen al anticuerpo anti-CD3 (clon OKT3) y se reticulan con TIL en cultivo, lo que estimula la expansión de TIL. Se prepararon lotes de PBMC a partir de la leucaféresis de sangre entera extraída de donantes individuales. El producto de leucaféresis se sometió a centrifugación sobre Ficoll-Hypaque, se lavó, se irradió y se crioconservó en condiciones de GMP.
Es importante que los pacientes que recibieron terapia con TIL no reciban una infusión de PBMC viables, ya que esto podría provocar la enfermedad de injerto contra huésped (EICH). Por lo tanto, el crecimiento de las PBMC de donantes se detiene mediante la dosificación de las células con irradiación gamma, lo que da como resultado roturas del ADN bicatenario y la pérdida de la viabilidad celular de las PBMC tras el recultivo.
Criterios de evaluación
7.2.1 El criterio de evaluación para lotes de PBMC irradiados fue su incompetencia de replicación.
Configuración experimental
7.3.1 Los lotes de alimentadoras se probaron en formato mini-REP como si fueran a co-cultivarse con TIL, utilizando matraces de cultivo de tejidos T25 verticales.
7.3.1.1 Lote de control: Un lote de PBMC irradiadas, que se había demostrado históricamente que cumplían con el criterio de 7.2.1, se ejecutó junto con los lotes experimentales como control.
7.3.2 Para cada lote de PBMC de donantes irradiados analizados, se ejecutaron matraces por duplicado.
Protocolo experimental
Todo el trabajo de cultivo de tejidos en este protocolo se realizó utilizando una técnica estéril en una BSC.
Día 0
7.4.1 Se prepararon ~90 mL de medio CM2 para cada lote de PBMC del donante que debe analizarse. Mantener CM2 caliente en un baño de agua a 37°C.
7.4.2 Se descongeló una alícuota de<6>x 10<6>UI/mL de IL-2.
7.4.3 Se devolvió el medio CM2 a la BSC, limpiando con EtOH al 70% antes de colocarlo en la campana. Para cada lote de PBMC analizado, se extrajo alrededor de 60 mL de CM2 a una botella estéril separada. Se agregó IL-2 de la solución madre descongelada de<6>x 10<6>UI/mL a este medio para una concentración final de 3000 UI/mL. Se etiquetó esta botella como "CM2/IL2" (o similar) para distinguirla del CM2 sin suplementar.
7.4.4 Etiquetados dos matraces T25 por cada lote de PBMC que se va a analizar. Etiqueta mínima incluida:
7.4.4.1 Número de lote
7.4.4.2 Número de matraz (1 o 2)
7.4.4.3 Fecha de inicio del cultivo (día 0)
Preparar OKT3
7.4.5 Se extrajo la solución madre de anti-CD3 (OKT3) del refrigerador a 4°C y se colocó en la BSC.
7.4.6 Se utilizó una concentración final de 30 ng/mL de OKT3 en el medio del mini-REP.
7.4.7 Se preparó una solución de trabajo de 10 pg/mL de anti-CD3 (OKT3) a partir de la solución madre de 1 mg/mL. Colocar en el refrigerador hasta necesitarse.
7.4.7.1 Para cada lote de PBMC analizado, preparar 150 pl de una dilución 1:100 de la solución madre anti-CD3 (OKT3)
Por ejemplo, para analizar 4 lotes de PBMC a la vez, preparar 600 pl de 10 pg/mL de anti-CD3 (OKT3) agregando<6>pl de la solución madre de 1 mg/mL a 594 pl de CM2 suplementado con 3000 UI/mL de IL-2.
Preparar matraces
7.4.8 Se añadieron 19 mL por matraz de CM2/IL-2 a los matraces T25 etiquetados y se colocaron los matraces en una incubadora de CO<2>al 5% humidificada a 37°C mientras se preparaban las células.
Preparar PBMC irradiadas
7.4.9 Se trabajó con cada lote de PBMC de donante individualmente para evitar la posible contaminación cruzada de los lotes.
7.4.10 Viales recuperados de lotes de PBMC que se analizarán a partir del almacenamiento de LN2. Estos se colocaron a -80°C o se mantuvieron en hielo seco antes de descongelarlos.
7.4.11 Se colocan 30 mL de CM2 (sin suplemento de IL-2) en tubos cónicos de 50 mL para cada lote a descongelar. Se etiquetó cada tubo con los diferentes números de lote de PBMC a descongelar. Se taparon de manera ajustada los tubos y se colocaron en un baño de agua a 37°C antes de usarlos. Según era necesario, se devolvieron los tubos cónicos de 50 mL a la BSC, limpiando con EtOH al 70% antes de colocarlos en la campana.
7.4.12 Se extrajo un vial de PBMC del almacenamiento en frío y se colocó en un estante de tubos flotantes en un baño de agua a 37°C para descongelarlo. Se dejó que continúe la descongelación hasta que quede una pequeña cantidad de hielo en el vial.
7.4.13 Vial descongelado rociado o limpiado con EtOH al 70% y transferido a BSC.
7.4.14 Con una pipeta de transferencia estéril, se transfirieron inmediatamente el contenido del vial a los 30 mL de CM2 en el tubo cónico de 50 mL. Se retiró alrededor de 1 mL de medio del tubo para enjuagar el vial; volvió a enjuagar al tubo cónico de 50 mL. Se tapó herméticamente y se agitó suavemente para lavar las células.
7.4.15 Se centrifuga a 400 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
7.4.16 Se aspiró el sobrenadante y se resuspendió el sedimento celular en 1 mL de CM2/IL-2 caliente usando una punta de pipeta de 1000 pl. Alternativamente, antes de agregar el medio, se resuspendió el sedimento celular arrastrando el tubo tapado a lo largo de una gradilla de tubos vacía. Después de resuspender el sedimento celular, se llevó el volumen a 4 mL usando medio CM2/IL-2. Volumen grabado.
7.4.17 Se eliminó una pequeña alícuota (por ejemplo, 100 pl) para el recuento celular usando un contador celular automatizado.
7.4.17.1 Recuentos realizados por duplicado de acuerdo con el POE del contador celular automatizado particular. Lo más probable es que fuera necesario realizar una dilución de las PBMC antes de realizar los recuentos de células. Una dilución inicial recomendada era<1>:<1 0>, pero variaba según el tipo de contador de células utilizado.
7.4.17.2 Registrados los recuentos.
7.4.18 Concentración ajustada de PBMC a 1.3 x 10<7>células/mL según la hoja de trabajo en la etapa 7.4.15.2 usando medio CM2/IL-2. Mezclar bien agitando suavemente o aspirando suavemente hacia arriba y hacia abajo con una pipeta serológica.
Configurar matraces de cultivo
7.4.19 Se devolvieron dos matraces T25 etiquetados a la BSC desde la incubadora de cultivo de tejidos.
7.4.20 Se devolvió el vial de 10 pg/mL de anti-CD3/OKT3 a la BSC.
7.4.21 Se agregó 1 mL de la suspensión de células de PBMC 1.3 x 10<7>a cada matraz.
7.4.22 Se agregaron 60 |jl de anti-CD3/OKT3 de 10 jg/m L a cada matraz.
7.4.23 Se devolvieron los matraces tapados a las incubadoras de cultivo de tejidos durante 14 días de crecimiento sin alteraciones.
7.4.24 Se volvió a colocar el vial de anti-CD3/OKT3 en el refrigerador hasta necesitarse para el siguiente lote. 7.4.25 Se repitieron las etapas 7.4.9 - 7.4.24 para cada lote de PBMC a evaluar.
Día 14, Medición de la no proliferación de PBMC
7.4.26 Trabajando con cada lote de forma independiente, se devolvieron cuidadosamente los matraces T25 duplicados a la BSC.
7.4.27 Para cada matraz, utilizando una pipeta serológica nueva de 10 mL, se extrajo ~17 mL de cada uno de los matraces y, más adelante, se extrajo con cuidado el medio restante para medir el volumen restante en los matraces. Volumen registrado.
7.4.28 Muestra bien mezclada pipeteando hacia arriba y hacia abajo usando la misma pipeta serológica.
7.4.29 Se extrajo una muestra de 200 j l de cada matraz para el recuento.
7.4.30 Células contadas usando un contador de células automatizado.
7.4.31 Se repitieron las etapas 7.4.26 - 7.4.31 para cada lote de PBMC que se evalúa.
RESULTADOS Y CRITERIO DE ACEPTACIÓN
Resultados
10.1.1 Se esperaba que la dosis de irradiación gamma fuera suficiente para hacer que la replicación de las células alimentadoras fuera incompetente. Se esperaba que todos los lotes cumplieran con el criterio de evaluación, que demostró una reducción en el número total viable de células alimentadoras restantes en el día 14 del cultivo de REP en comparación con el día 0.
Criterio de aceptación
10.2.1 Se cumplieron los siguientes criterios de aceptación para cada lote de PBMC donante irradiado analizado: 10.2.2 "Sin crecimiento" - significaba que el número total de células viables el día 14 era menor que el número de células viables inicial puesto en cultivo el día 0 del REP.
10.2.3 Si un lote no cumple con el criterio anterior, el lote se volvió a analizar según el Procedimiento de prueba de contingencia descrito en la sección 10.4.
10.2.4 Después de repetir la prueba de un lote fallido, se excluyó cualquier lote de alimentadoras de MNC que no cumpliera con el criterio de aceptación tanto en la evaluación original como en la prueba de contingencia.
Pruebas de contingencia de lotes de PBMC que no cumplen con el criterio de aceptación.
10.4.1 En el caso de que un lote de PBMC de un donante irradiado no cumpliera con el criterio de aceptación anterior, se tomaron las siguientes etapas para volver a analizar el lote y descartar un error simple del experimentador como la causa de su falla.
10.4.2 Si quedaban dos o más viales satélite del lote, el lote se volvió a analizar. Si hay uno o ningún vial satélite restante del lote, entonces el lote falló de acuerdo con el criterio de aceptación de la sección<10 . 2>anterior.
10.4.3 Siempre que fuera posible, dos personas capacitadas (preferiblemente incluida la persona original que evaluó el lote en cuestión) realizaron las pruebas de los dos viales separados de forma independiente. Este fue el procedimiento preferido de prueba de contingencia. Aparte de los viales separados de PBM<c>, ambos miembros del personal podrían utilizar los mismos reactivos.
10.4.3.1. Si no había dos miembros del personal disponibles, una persona realizaba la prueba de los dos viales de PBMC para el lote fallido, trabajando con cada vial de forma independiente.
10.4.4 Se repitió la sección 7.4 "Protocolo experimental" para reevaluar el lote en cuestión.
10.4.5 Además del lote en cuestión, cada persona que realizaba las pruebas de contingencia probó un lote de control.
10.4.5.1 Si dos miembros del personal realizan pruebas de contingencia, ambos miembros del personal probaron el lote de control de forma independiente.
10.4.5.2 Si solo hay una persona disponible para realizar las pruebas de contingencia, no es necesario que el lote de control se ejecute por duplicado.
10.4.5.3 Para ser calificado, un lote de PBMC que pasa por pruebas de contingencia tenía el lote de control y ambas réplicas del lote en cuestión lograron que pasara el criterio de aceptación de la Sección 10.2.
10.4.5.4 Una vez cumplido este criterio, el lote se entregó para uso de CMO como se describe en la sección 10.2.
EJEMPLO 15:CITÓMETRO DE IMAGEN CONTADOR CELULAR AUTOMÁTICO CELLOMETER IC2
Este ejemplo describe el procedimiento para el funcionamiento del contador celular automático del citómetro de imagen Cellometer K2.
1. Definiciones
pl: microlitro
AOPI: yoduro de propidio de naranja acridina
BSC: Cabina de seguridad biológica
DPBS: solución salina con pH regulado con fosfato de Dulbecco
mL: mililitro
MNC: células sanguíneas mononucleares
NA: No aplica
PBMC: células mononucleares de sangre periférica
EPI: equipo de protección personal
Pre-REP: cultivo TIL inicial antes del Protocolo de expansión rápida del cultivo
REP: Protocolo de expansión rápida
TIL: linfocitos infiltrantes de tumores
7. Procedimiento
7.1 Preparación de la suspensión celular
7.1.1 Preparación de azul de tripán
La concentración final de azul de tripán fue del 0.1%. El fabricante recomendó preparar una solución madre al<0>.<2>%.
7.1.1.1 Cuando utilice azul tripán en el Cellometer K2, diluir la solución madre (0.4%) con PBS al 0.2%.
7.1.1.2 Se filtró el azul tripán con un filtro de 0.2 a 0.4 micrones y se colocaron alícuotas en pequeños volúmenes en tubos con tapa y etiquetados.
7.1.1.3 Se mezcló la suspensión celular a 1:1 con azul tripán al 0.2%.
7.1.2 Preparación de AOPI
7.1.2.1 Al usar AOPI en el Cellometer K2, se obtuvo la solución de AOPI.
7.1.2.2 Muestra de células teñidas a 1: 1 con solución de AOPI.
NOTA: Al contar cultivos de alta concentración, diluir las muestras de células en medio de cultivo celular antes de la dilución final 1:1 con azul de tripán o AOPI. Se utilizó el intervalo de recuento sugerido por el fabricante para determinar la mejor dilución a utilizar.
7.2 Configuración del Cellometer K2
7.2.1 Encendido del equipo Cellometer K2.
7.2.2 Se seleccionó el icono Citómetro de imagen de Cellometer en el monitor de ordenador asociado.
7.2.3 En la pantalla principal del software, seleccionar uno de los ensayos enumerados en el cuadro desplegable.
7.2.3.1 Al seleccionar el ensayo apropiado, el tipo de célula y el modo de imagen se autocompletan.
7.2.3.2 En la sección "Muestra", se hizo clic en Establecer ID de usuario/muestra para abrir otra pantalla para ingresar la información del operador para la muestra.
7.2.3.2.1 Ingresó de "ID de usuario". Consistirá en las iniciales de tres letras del usuario.
7.2.3.2.2 Ingresó de "ID de muestra". La identificación de la muestra se deriva de la información de la muestra entrante.
7.2.3.3 Configurar los parámetros de dilución.
7.2.3.3.1 Si no se hizo ninguna otra dilución además de la mezcla 1: 1, el factor de dilución fue 2.
7.2.3.3.2 Si se hizo una dilución antes de la mezcla final 1: 1, el factor de dilución fue 2 veces mayor que la dilución anterior.
7.2.3.3.3 Factor de dilución actualizado según la mezcla utilizada en la sección de dilución de la pantalla. Se hizo clic en el icono del lápiz para que aparecieran las pantallas de diálogo.
7.2.3.3.4 Se verificó que las secciones Imagen F1 e Imagen F2 son idénticas entre sí.
7.2.3.3.5 Se hizo clic en el botón "Guardar" después de que se hubiera completado la configuración.
7.3 Recuento de células
7.3.1 Se quito el respaldo de plástico de ambos lados de un portaobjetos de la cámara de recuento del Cellometer (SD100) y se colocó sobre una toallita limpia que no suelte pelusa.
7.3.2 Después de preparar la suspensión celular, se extrajo una pequeña alícuota de la muestra y se transfirió a un pocillo de una placa o tubo de cultivo celular multipocillo.
7.3.3 Si se diluye la muestra, se realizó la dilución con medio de cultivo celular.
7.3.4 Se agregaron 20 l11 de suspensión celular en un pocillo de la placa o tubo de cultivo celular multipocillo. 7.3.5 Se agregaron 20 111 de azul de tripán al 0.2% o la solución de AOPI a la suspensión celular 20111 y se mezcló la muestra a fondo.
7.3.6 Se midieron 20 IA de la solución 1:1 y se transfirieron a un lado de la cámara de recuento.
NOTA: Evitar tocar el área despejada de la diapositiva.
7.3.7 Si es necesario, repetir la muestra en el otro lado del portaobjetos. 7.3.8. Se insertó la cámara en la ranura en la parte frontal del Cellometer.
7.3.8 Para el recuento de células AOPI, se hizo clic en "Vista previa F1" en la pantalla principal para obtener una vista previa de la imagen verde fluorescente (célula viva). Para el recuento de azul tripán, se hizo clic en "Vista previa Brightfield".
7.3.9 Usando la rueda de enfoque, se llevó la imagen a un enfoque óptimo. Las células tenían un centro brillante y un borde claramente definido.
7.3.10 Se hizo clic en "Contar" para comenzar el procedimiento de recuento.
7.3.11 Los resultados se mostraron en un cuadro emergente de resultados de recuento en la pantalla de el ordenador que mostraba los resultados del procedimiento de recuento.
EJEMPLO 16:PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN MADRE DE IL-2 (CELLGENIX)
Este ejemplo describe el procedimiento de disolución de interleucina-2 humana recombinante liofilizada purificada en muestras de solución madre adecuadas para su uso en protocolos de cultivo de tejidos adicionales, incluidos todos los descritos en la presente solicitud y los ejemplos, incluidos los que implican el uso de rhIL-2.
3. Definiciones/Abreviaturas
|jL: microlitro
BSC: Cabina de seguridad biológica
BSL2: Nivel de bioseguridad 2
D-PBS: solución salina con pH regulado con fosfato de Dulbecco
G: calibre
GMP: Buenas prácticas de manufactura
HAc: ácido acético
HSA: Albúmina de suero humano
mL: mililitro
NA: No aplica
EPI: equipo de protección personal
rhIL-2; IL-2: Interleucina-2 humana recombinante
COA: Certificado de análisis
<6>. Procedimiento
6.1 Preparar una solución de ácido acético al 0.2% (HAc).
6.1.1 Se transfirieron 29 mL de agua estéril a un tubo cónico de 50 mL.
6.1.2 Se agregó 1 mL de ácido acético de IN al tubo cónico de 50 mL.
6.1.3 Se mezcló bien invirtiendo el tubo 2-3 veces.
6.1.4 Se esterilizó la solución de HAc mediante filtración con un filtro Steriflip.
6.1.5 Tapar, fechar y etiquetar la solución "Solución estéril de ácido acético al 0.2%".
6.1.6 La solución caducó a los 2 meses. Almacenada a temperatura ambiente.
6.2 Preparar HSA al 1% en PBS.
6.2.1 Se agregaron 4 mL de solución madre de HSA al 25% a 96 mL de PBS en una unidad de filtro estéril de 150 mL.
6.2.2 Solución filtrada.
6.2.3 Tapar, fechar y etiquetar la solución "HSA al 1% en PBS".
6.2.4 La solución caducó a los 2 meses. Conservar a 4°C.
6.3 Por cada vial de rhIL-2 preparado, completar los formularios.
6.4 Solución madre de rhIL-2 preparada (concentración final de<6>x 10<6>UI/mL)
6.4.1 Cada lote de rh1L-2 era diferente y la información requerida se encontraba en el Certificado de análisis (COA) del fabricante, como:
6.4.1.1 Masa de rhIL-2 por vial (mg)
6.4.1.2 Actividad específica de rhIL-2 (UI/mg)
6.4.1.3 Volumen de reconstitución recomendado de HAc al 0.2% (mL)
6.4.2 Se calculó el volumen de HSA al 1% requerido para el lote de rhIL-2 utilizando la siguiente ecuación:
6.4.2.1 Por ejemplo, según el COA rhIL-2 lote 10200121 de CellGenix, la actividad específica para el vial de 1 mg es de 25 x 10<6>lU/mg. Se recomienda reconstituir el rhIL-2 en 2 mL de HAc al 0.2%.
6.4.3 Tapón de goma limpiado del vial de IL-2 con una toallita con alcohol.
6.4.4 Con una aguja de 16G conectada a una jeringa de 3 mL, inyectar el volumen recomendado de 0.2% de HAc en el vial. Tener cuidado de no sacar el tapón al retirar la aguja.
6.4.5 Vial invertido 3 veces y agitado hasta que todo el polvo se disuelva.
6.4.6 Se retiró con cuidado el tapón y se dejó a un lado sobre una toallita con alcohol.
6.4.7 Se agregó el volumen calculado de HSA al 1% al vial.
6.4.8 Tapar el vial con el tapón de goma.
6.5 Almacenamiento de solución de rhIL-2
6.5.1 Para almacenamiento a corto plazo (<72 horas), vial almacenado a 4°C.
6.5.2 Para almacenamiento a largo plazo (> 72 horas), el vial se dividió en alícuotas en volúmenes más pequeños y se almacenó en crioviales a -20°C hasta que estar listo para usar. Ciclos de congelación/descongelación evitados. Caducó<6>meses después de la fecha de preparación.
6.5.3 Las etiquetas de Rh-IL-2 incluyeron el número de proveedor y de catálogo, el número de lote, la fecha de vencimiento, las iniciales del operador, la concentración y el volumen de la alícuota.
EJEMPLO 17:PREPARACIÓN DE MEDIOS PARA PROCEDIMIENTOS PRE-REP Y REP
Este ejemplo describe el procedimiento para la preparación de medios de cultivo de tejidos para su uso en protocolos que implican el cultivo de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) derivados de varios tipos de tumores que incluyen, entre otros, melanoma metastásico, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello. (HNSCC), carcinoma de ovario, carcinoma de mama triple negativo y adenocarcinoma de pulmón. Este medio puede usarse para la preparación de cualquiera de los TIL descritos en la presente solicitud y en los Ejemplos.
3. Definición
|jg: microgramo
|jm: micrómetro
jM: micromolar
AIM-V®: medio de cultivo de tejidos sin suero (Thermo Fisher Scientific)
BSC: Cabina de seguridad biológica
CM1: Medio completo No.1
CM2: Medio completo No.2
CM3: Medio completo No.3
CM4: Medio completo No.4
IU o U: Unidades internacionales
mL: mililitro
mM: milimolar
NA: no aplica
EPI: equipo de protección personal
Pre-REP: procedimiento de expansión rápida previa
REP: Procedimiento de expansión rápida
rhIL-2, IL-2: interleucina-2 humana recombinante
RPMI1640: Medio del Roswell Park Memorial Institute, formulación 1640
POE: procedimiento operativo estándar
TIL: linfocitos infiltrantes de tumores
7. Procedimiento
7. Procedure
7.1 Todos los procedimientos se realizan utilizando una técnica estéril en una BSC (Clase II, Tipo A2).
7.1.1 Rociar la superficie de la campana con etanol al 70% antes de su uso.
7.1.2 Rociar todos los elementos y reactivos con etanol al 70% antes de colocarlos en la campana de cultivo de tejidos.
7.2 Alícuota de L-glutamina 200 mM
7.2.1 Se suministró L-glutamina en volúmenes mayores que los necesarios para la preparación de suero (por ejemplo, volúmenes de 100 mLo 500 mL).
7.2.2 Botella descongelada de L-glutamina en baño de agua a 37°C.
7.2.3 Mezclar bien L-glutamina después de descongelar, ya que precipita después de descongelar. Se aseguró de que todos los precipitados hubieran vuelto a la solución antes de la alícuota.
7.2.4 Colocar alícuotas de 5-10 mL de L-glutamina en tubos cónicos estériles de 15 mL.
7.2.5 Tubos etiquetados con concentración, proveedor, número de lote, fecha de alícuota y fecha de vencimiento.
7.2.6 Más adelante, los tubos se almacenaron a -20°C y se extrajeron según fuera necesario para la preparación del medio.
7.3 Preparación de CM1
7.3.1 Se sacaron los siguientes reactivos del almacenamiento en frío y se calentaron en un baño de agua a 37°C: 7.3.1.1 RPMI1640
7.3.1.2 Suero AB humano
7.3.1.3 L-glutamina 200 mM
7.3.2 Se retiró el BME del almacenamiento a 4°C y se colocó en una campana de cultivo de tejidos.
7.3.3 Se colocó la solución madre de gentamicina almacenada a temperatura ambiente en una campana de cultivo de tejidos.
7.3.4 Se preparó el medio CM1 de acuerdo con la Tabla 23 más adelante, agregando cada uno de los ingredientes en la sección superior de una unidad de filtro de<0 . 2>um apropiado para el volumen a filtrar.
TABLA 23. Preparación de CM1
7.3.5 Se etiquetó el matraz del medio CM1 con su nombre, las iniciales del preparador, la fecha en que se filtró/preparó, la fecha de vencimiento de dos semanas y se almacenó a 4°C hasta que fuera necesario para el cultivo de tejidos. Los medios se pueden dividir en alícuotas en botellas de menor volumen según fuera necesario.
7.3.6 Cualquier RPMI1640 restante, suero AB humano o L-glutamina se almacenó a 4°C hasta la siguiente preparación del medio.
7.3.7 La botella de reserva de BME se volvió a almacenar a 4°C.
7.3.8 La botella de reserva de gentamicina se devolvió a su ubicación adecuada de almacenamiento a temperatura ambiente.
7.3.9 Debido a la limitada capacidad amortiguadora del medio, el CM1 se descartó no más de dos semanas después de la preparación, o cuando el indicador de pH con rojo fenol mostró un cambio extremo en el pH (coloración de rojo brillante a rosa).
7.3.10 El día de uso, precalentar la cantidad requerida de CM1 en un baño de agua a 37°C y agregar 6000 UI/mL de IL-2.
7.3.11 Suplementación adicional, según fuera necesario
7.3.11.1 CM1 suplementado con GlutaMAX®
7.3.11.1.1 CM1 podría prepararse sustituyendo 2 mM GlutaMAXTM por 2 mM de glutamina (concentración final, véase la Tabla 2.) Si se hizo esto, se etiquetaron la botella de medio como en la etapa 7.3.5 anterior agregando "2 mM GlutaMAX" para evitar confusiones con la formulación estándar de CM1.
7.3.11.2 CM1 suplementado con antibiótico/antimicótico adicional
7.3.11.2.1 Algunas formulaciones de CM1 requieren antibióticos o antimicóticos adicionales para evitar la contaminación de TIL pre-REP que crecen a partir de ciertos tipos de tumores.
7.3.11.2.2 Se agregó antibiótico/antimicótico a las concentraciones finales que se mostraron en la Tabla 24 más adelante.
7.3.11.2.3 Si se hizo esto, se etiquetó el matraz del medio como en la etapa 7.3.1 anterior agregando el nombre o los nombres del antibiótico/antimicótico adicional para evitar confusión con la formulación estándar de CM1.
TABLA 24. Suplementación adicional de CM1, según fuera necesario.
7.4 Preparación de CM2
7.4.1 Retirar el CM1 preparado del refrigerador o preparar CM1 fresco como se indica en la Sección 7.3 anterior.
7.4.2 Retirado AIM-V® del refrigerador.
7.4.3 Se preparó la cantidad de CM2 necesaria mezclando el CM1 preparado con un volumen igual de AIM-V® en una botella de medio estéril.
7.4.4 Se agregaron 3000 UI/mL de IL-2 al medio CM2 el día de su uso.
7.4.5 Se preparó una cantidad suficiente de CM2 con 3000 UI/mL de IL-2 el día de su uso.
7.4.6 Se etiquetó la botella de medio CM2 con su nombre, las iniciales del preparador, la fecha en que se filtró/preparó, la fecha de vencimiento de dos semanas y almacénela a 4°C hasta que se necesite para el cultivo de tejidos. Los medios se dividieron en alícuotas en botellas de volumen más pequeño según se requirió.
7.4.7 Se devolvió cualquier CM2 sin IL-2 al refrigerador donde se puede almacenar hasta por dos semanas, o hasta que el indicador de pH rojo fenol muestre un cambio extremo en el pH (coloración de rojo brillante a rosa).
7.5 Preparación de CM3
7.5.1 Se preparó CM3 el día en que se requirió su uso.
7.5.2 CM3 era el mismo que el medio AIM-V®, suplementado con 3000 UI/mL de IL-2 el día de su uso.
7.5.3 Se preparó una cantidad de CM3 suficiente para las necesidades experimentales agregando la solución madre de IL-2 directamente a la botella o bolsa de AIM-V. Se mezcló bien con una suave agitación. Se etiquetaron el matraz con "3000 UI/mL de IL-2" inmediatamente después de agregarlo al AIM-V. Si hubo exceso de CM3, guárdelo en matraces a 4°C etiquetados con el nombre del medio, las iniciales del preparador, la fecha en que se preparó el medio y su fecha de caducidad (7 días después de la preparación).
7.5.4 Medios desechados suplementados con IL-2 después de 7 días de almacenamiento a 4°C.
7.6 Preparación de CM4
7.6.1 CM4 era igual que CM3, con el suplemento adicional de GlutaMAXTM 2 mM (concentración final).
7.6.1.1 Por cada 1 litro de CM3, se agregaron 10 mL de GlutaMAXTM 200 mM.
7.6.2 Se preparó una cantidad de CM4 suficiente para las necesidades experimentales agregando solución madre de IL-2 y solución madre de GlutaMAXTM directamente a la botella o bolsa de AIM-V. Se mezcló bien con una suave agitación.
7.6.3 Matraz etiquetado con "3000 IL/nil de IL-2 y GlutaMAX" inmediatamente después de agregarlo al AIM-V. 7.6.4 Si hubo exceso de CM4, guardar en botellas a 4°C etiquetadas con el nombre del medio, "GlutaMAX", las iniciales del preparador, la fecha en que se preparó el medio y su fecha de caducidad (7 días después de la preparación).
7.6.5 Medios desechados suplementados con IL-2 después de 7 días de almacenamiento a 4°C.
EJEMPLO 18:TINCIÓN SUPERFICIAL CON ANTÍGENO DE POST REP TIL
1. PROPÓSITO
El ejemplo describe el procedimiento para la tinción de la superficie celular de post-REP TIL mediante citometría de flujo. Este procedimiento se puede aplicar a cualquier TIL descrito en la aplicación y los Ejemplos.
TÉRMINOS Y DEFINICIONES CLAVE
a: Alfa
p: Beta
pl: Microlitro
APC: Aloficocianina
Ax647: Alex Fluor 647
BD: Becton Dickinson Company
BSA: Albúmina de suero bovino
BSC: Cabina de seguridad biológica
BV421: Violeta brillante 421
CD: Clúster de diferenciación
CST: configuración y seguimiento del citómetro
Cy: cianina
DPBS: Solución salina con pH regulado con fosfato de Dulbecco
FACS: Clasificador de células activado por fluorescencia
FBS: Suero fetal bovino
FITC: Isotiocianato de fluoresceína
FMO: Fluorescencia menos uno
G: gramo
H7: Análogo de Cy7
mL: mililitro
PE: Ficoeritrina
PerCP-Cy5.5: Proteínas peridinina-clorofila
EPI: Equipo de protección personal
REP: Protocolo de expansión rápida
SIT: Tubo de inyección de muestra
TCR: Receptor de células T
p/v: peso a volumen
Anticuerpos y tinciones de citometría de flujo
TABLA 25: ThermoFisher de tinción de agua viva/muerta, catálogo n.o L34966.
7. PROCEDIMIENTO
7.1 Preparación de reactivos
7.1.1 Regulador de pH de lavado FACS
7.1.1.1 Se agregó FBS inactivado por calor al 2% (p/v) a DPBS (se agregaron 10 mL de FBS a 490 mL de IX dPBS).
7.1.1.2 Se agregó N aN al 0.1% (p/v) (botella de 76,9 ul a 500 mL).
7.1.1.3 La solución se almacenó a 40°C. Desechar después de 30 días.
7.1.2 Tinte de agua
7.1.2.1 Se agregaron 50 j l de DMSO al vial de colorante reactivo.
7.1.2.2 Mezclar bien y confirmar visualmente que todo el tinte se hubiera disuelto.
7.1.2.3 El tinte que no se utilizó para el procedimiento se dividió en alícuotas y se congeló a 20°C hasta el siguiente uso. No se congeló/descongeló por segunda vez.
7.1.3 Preparación del cóctel de anticuerpos.
7.1.3.1 Los cócteles se prepararon en tubos de polipropileno como un tubo Eppendorf
7.1.3.2 Los cócteles se almacenaron hasta por<6>meses.
Tabla 26: Panel de diferenciación 1 (DF1):
Tabla 27: Panel de diferenciación 2 (DF2):
Tabla 28: Panel de activación de células T (Tact 1)
Tabla 29: Panel de activación de células T (Tact 2)
7.2 Requisitos del ensayo de citometría de flujo
7.2.1 Calibración del citómetro de flujo
7.2.1.1 El citómetro de flujo se calibró el día del ensayo utilizando perlas de CST siguiendo las instrucciones del fabricante.
7.2.1.2 El operador se aseguró de que el citómetro de flujo hubiera pasado la calibración, donde las comprobaciones de rendimiento y de referencia son válidas.
7.2.2 Controles de compensación/FMO
7.2.2.1 Se prepararon muestras de compensación de un solo color utilizando las perlas de compensación BD y el kit de perlas de compensación reactiva de amina ArCTM.
7.2.2.2 Control de FMO, las muestras que contienen células se tiñeron con un cóctel de anticuerpos menos el siguiente conjugado de anticuerpo único, CD27, CD28 y CD57.
7.2.3 Estandarización de IMF
7.2.3.1 Los voltajes del citómetro se determinaron diariamente con un control de perlas y valores de voltaje objetivo.
7.3 Tinción de la muestra
7.3.1 Tubo FACS etiquetado con la muestra ID-DF1, muestra ID-DF2, muestra ID-T1, muestra ID-T2.
7.3.2 Etiquetado un conjunto de controles FMO con CD27-APC-H7, CD28-PE, CD57-PerCPCy5.5, CD45RA-PECy7, CCR7-PE, CD38-APC, CD137-PE7, Lag3-PE, PD1 APC, Tim3-BV421, CD69-PE7, TIGIT-PE, KLRG1-Ax647, y CD154-BV421.
7.3.3 Se agregaron de 0.5 a 2 millones de células a cada tubo.
7.3.4 QS a 3 mL de 1xPBS en cada tubo.
7.3.5 Hacer girar los tubos a 400 x g, alta aceleración y frenado, durante 5 minutos.
7.3.6 Mientras se centrifugaban las muestras, se preparó el tinte Aqua de etiquetado de células muertas.
7.3.7 Se retiró una alícuota de Aqua del congelador y se diluyó 1/200 en PBS. Mantener oscuro. Se agregaron 2 ul de tinte a 198 ul de DPBS.
7.3.8 Se decantó o aspiró el sobrenadante de la etapa 7.3.5.
7.3.9 Se agregaron 25 ul de la solución Aqua de arriba a las muestras y controles de FMO.
7.3.10 Se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT) en la oscuridad.
7.3.11 Nota: Si las células se almacenaron inicialmente en un medio libre de proteínas, se debe agregar una etapa de bloqueo, como 5 ul de TruStain durante 10 minutos a temperatura ambiente.
7.3.12 Se agregaron 50 ul de cócteles de anticuerpos a los tubos correspondientes.
7.3.13 Se agitó la rejilla de tubos para mezclar.
7.3.14 Se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
7.3.15 Registro de horas de inicio y finalización. Se agregaron 3 mL de regulador de pH de lavado FACS.
7.3.16 Tubos centrifugados a 400 x g, alta aceleración y frenado, durante 5 minutos.
7.3.17 Cuando se completó el centrifugado, se decantó o aspiró el sobrenadante.
7.3.18 Células resuspendidas deslizando los tubos a lo largo de una gradilla vacía.
7.3.19 Se agregaron 100 uL de paraformaldehído al 1% a cada tubo.
7.3.20 Almacenado a 40°C en la oscuridad hasta que estuviera listo para recolectarse en el citómetro de flujo. Nota: Las muestras se pueden almacenar hasta 72 horas.
7.4 Control de compensación L/D Aqua.
7.4.1 Tubos FACS etiquetados como control de compensación L/D Aqua.
7.4.2 Se agregó una gota de cuentas Arc al tubo.
7.4.3 Se agregaron 3 pl de L/D Aqua directamente a las perlas.
7.4.4 Se incubaron los tubos a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 a 30 minutos.
7.4.5 Tiempo de incubación inicial y final registrado en la hoja de trabajo
7.4.6 Después de la incubación, se agregaron 3 mL de FACS Wash a cada tubo.
7.4.7 Tubos centrifugados a 400 x g, alta aceleración y frenado, durante 5 minutos.
7.4.8 Decantado o aspirado el sobrenadante.
7.4.9 Se resuspendieron los tubos con 500 j l de solución de PFA al 1%. Se agregó 1 gota de cuenta negativa. Colocar a 40°C en oscuridad hasta su recogida.
7.5 Tinción de control de compensación.
7.5.1 Tubos FACS etiquetados como se mostró en la hoja de trabajo Post-REP TIL Fenotipo.
7.5.2 Se agregaron los anticuerpos como se mostró en la hoja de trabajo Post-REP TIL Fenotipo.
7.5.3 Después de la incubación, se agregaron 3 mL de regulador de pH FACS a cada tubo.
7.5.4 Tubos centrifugados a 500 g, alta aceleración y frenado, durante 2 minutos.
7.5.5 Decantado o aspirado el sobrenadante.
7.5.6 Se resuspendieron los tubos con 500 j l de PFA al 1% en PBS y se almacenaron a 2-80°C en la oscuridad.
7.6 Adquisición de datos
7.6.1 Software FACSDiva abierto e inicio de sesión.
7.6.2 En el cuadro de diálogo de discrepancia del citómetro, se hizo clic en "Usar configuración de CST".
7.6.3 Se creó un nuevo experimento haciendo clic en la pestaña "Experimento" y seleccionando la plantilla "Fenotipo extendido".
7.6.4 Se hizo doble clic en el experimento de valores objetivo y se ajustaron los voltajes para alcanzar los valores objetivo determinados por el operador del núcleo de flujo.
7.6.5
7.6.6 Se creó un espécimen para cada individuo y se nombró apropiadamente.
7.6.7 Se crearon nombres para las muestras de acuerdo con las etiquetas de sus tubos.
7.6.8 Se agitó suavemente con vórtex o se movió el dedo antes de colocar el tubo en el SIT.
7.6.9 Adquirir los datos bajo REGISTRO en el tablero de Adquisición.
7.6.10 Analizar las muestras a una velocidad de menos de 7,500 eventos por segundo.
7.6.11 Recopilar entre 50,000 y 100,000 eventos en vivo, excluidos los escombros.
EJEMPLO 19:PROCEDIMIENTO 2A DESARROLLO DEL PROCEDIMIENTO DE VERIFICACIÓN
Los experimentos de este ejemplo se completaron para analizar el procedimiento 2A para la fabricación de TIL a partir de tumores de melanoma derivados del paciente y un solo cáncer de mama que incluye el brote de TIL a partir de tumores en un procedimiento pre-REP, seguido de un REP modificado. Se hizo especial hincapié en el establecimiento de un producto TIL congelado y una comparación del rendimiento del producto TIL congelado con el procedimiento actual del producto TIL fresco (Procedimiento 1C). Este informe demostrará que se observan perfiles similares en la evaluación de atributos de calidad críticos frescos y descongelados (número de células, % de viabilidad, % de células T CD3+ y producción de interferón gamma estimulado por perlas (IFN-y)), así como un procedimiento fenotípico de reestimulación extendida (reREP) si el mismo producto TIL es fresco o congelado. Los datos presentados para apoyar esta conclusión incluyen proliferación, viabilidad, fenotipo, liberación de IFN-y, potencia, longitud de los telómeros y actividad metabólica. Los resultados caracterizan el Procedimiento 2A, un procedimiento pre-REP/REP abreviado seguido de la crioconservación de TIL y comparan el procedimiento 2A con el procedimiento 1C más largo, como se describe en el presente documento.
Las descripciones de los donantes de tumores, las fechas de tratamiento y las ubicaciones de tratamiento se pueden encontrar en la Tabla 1 más adelante (* indica que el REP se inició usando una línea de pre-REP TIL congelada):
Tabla 30: Descripción de donantes de tumores, fechas de tratamiento y ubicaciones de tratamiento.
3. INFORMACION DE ANTECEDENTES
3.1 LN-144 es un producto inmunoterapéutico para el tratamiento de pacientes con melanoma metastásico. El producto estaba compuesto por linfocitos T autólogos infiltrantes de tumores (TIL) obtenidos de un paciente individual después de la resección quirúrgica de un tumor y expandidos ex vivo mediante cultivo celular de fragmentos tumorales morcelados (pre-REP) seguido de expansión rápida de TIL en presencia de dosis altas de IL-2, anti-CD3 y APC coestimuladora. Después de un preacondicionamiento por depleción linfática no mieloablativa, el paciente recibió una única infusión de su TIL y posteriores infusiones intravenosas de aldesleucina (IL-2) cada<8>horas hasta un máximo de<6>dosis. El estudio que involucra procedimientos alternativos de expansión de TIL en la configuración de moléculas de patrón molecular asociado al daño (DAMP) dentro del microambiente tumoral (TNE) también ha demostrado una expansión eficaz de las células T útiles para la terapia (Donia 2014; Sommerville, 2012).
El Procedimiento 1C que se ha utilizado para la producción comercial de TIL implica un programa de producción que puede tardar entre -45 y 55 días en producir un producto de TIL infundible que se administra a un paciente inmunodeprimido en 24 horas. La inmunodepleción del paciente receptor debe sincronizarse con precisión con la recolección del producto TIL actual. Los retrasos en la recolección o la entrega del producto fresco pueden afectar negativamente a un paciente inmunodeprimido que espera la infusión. El procedimiento 2A mejoró tras el procedimiento 1C al reducir el plazo y los materiales de fabricación, debido a la reducción de la duración de los procedimientos de pre-REP y REP. Además, el Procedimiento 2A aumentó la flexibilidad para el tiempo de envío del producto. Las diferencias entre el Procedimiento 1C y el Procedimiento 2A en el pre-REP, REP y recolección del procedimiento (véase Tabla 2) incluyen:
3.1.1 Matraces más grandes con mayor capacidad de fragmentos tumorales utilizados en el procedimiento pre-REP.
3.1.2 Etapas que hicieron uso de un sistema cerrado o que son susceptibles de adaptación futura a un sistema cerrado.
3.1.3 Disminución del número de días en los procedimientos pre-REP y REP.
3.1.4 Un enfoque directo a REP, que eliminó la necesidad de fenotipar poblaciones pre-REP antes de seleccionar poblaciones específicas de pre-REP TIL para proceder a REP.
3.1.5 Un cocultivo con un número preestablecido de APC PBMC alogénicas irradiadas junto con anti-CD3 (clon OKT3) calculado para una expansión suficiente de TIL.
3.1.6 Un sistema de lavado celular automatizado para la recolección.
3.1.7 Una formulación final basada en CS10 que se conservó criogénicamente antes del envío.
Tabla 31: Impacto del procedimiento 2A en el procedimiento 1C.
ABREVIATURAS
|jg: microgramo
jl: microlitro
jm : micrómetro
APC: células presentadoras de antígeno
CD: Clúster de diferenciación
CM: memoria central
CM1, CM2: Medios de cultivo 1, 2
CO2: dióxido de carbono
CS10: medio de crioconservación CryoStor® CS10 (BioLife Solutions)
Ct: ciclo umbral de PCR
DAMP: moléculas de patrón molecular asociado al daño
dCt: diferencia entre el valor Ct de referencia y el valor Ct de prueba
ddCt: diferencia entre dCt y valor de Ct estándar largo
ECAR: tasa de acidificación extracelular (medida de glucólisis) EM: memoria efectora
ER+/PR+: Receptor de estrógeno+/Receptor de progesterona+
GMP: Buenas prácticas de fabricación
HBSS: solución salina equilibrada de Hanks
HSA: Albúmina de suero humano
IFN-y: interferón gamma
IL: interleucina
UI: unidades internacionales
LN2: nitrógeno líquido
Ml: mililitro
Mm: milímetro
ND: No determinado
Ng: Nanograma
°C: grados Celsius
OCR: tasa de consumo de oxígeno (medida de fosforilación oxidativa)
OKT3: designación de clon de anticuerpo monoclonal anti-CD3
PBMC: células mononucleares de sangre periférica
PD: Desarrollo de procedimientos
REP: Protocolo de expansión rápida
Rh: humano recombinante
POE: procedimiento operativo estándar
T/S: relación de número de copias repetidas de telómeros a número de copias de un solo gen
TIL: linfocito infiltrante de tumor
VDJ: segmentos variables, de diversidad y de unión del receptor de células T
Va, Vp: los segmentos de la región variable del receptor de células T maduras en el linfocito infiltrante de tumor predominante
|jg: microgramo
|jl: microlitro
jm : micrómetro
APC: células presentadoras de antígeno
CD: Clúster de diferenciación
CM: memoria central
CM1, CM2: Medios de cultivo 1, 2
CO2: dióxido de carbono
CS10: medio de crioconservación CryoStor® CS10 (BioLife Solutions)
Ct: ciclo umbral de PCR
DAMP: moléculas de patrón molecular asociado al daño
dCt: diferencia entre el valor Ct de referencia y el valor Ct de prueba
ddCt: diferencia entre dCt y valor de Ct estándar largo
ECAR: tasa de acidificación extracelular (medida de glucólisis)
EM: memoria efectora
ER+/PR+: Receptor de estrógeno+/Receptor de progesterona+
GMP: Buenas prácticas de fabricación
HBSS: solución salina equilibrada de Hanks
HSA: Albúmina de suero humano
IFN-<y>: interferón gamma
IL: interleucina
UI: unidades internacionales
LN2: nitrógeno líquido
Ml: mililitro
Mm: milímetro
ND: No determinado
Ng: Nanograma
°C: grados Celsius
OCR: tasa de consumo de oxígeno (medida de fosforilación oxidativa)
OKT3: designación de clon de anticuerpo monoclonal anti-CD3
PBMC: células mononucleares de sangre periférica
PD: Desarrollo de procedimientos
REP: Protocolo de expansión rápida
Rh: humano recombinante
POE: procedimiento operativo estándar
T/S: relación de número de copias repetidas de telómeros a número de copias de un solo gen
TIL: linfocito infiltrante de tumor
VDJ: segmentos variables, de diversidad y de unión del receptor de células T
Va, Vp: los segmentos de la región variable del receptor de células T maduras en el linfocito infiltrante de tumor predominante
5. DISEÑO EXPERIMENTAL
5.1 Procedimiento 2A
5.1.1 Pre-REP: Una vez recibido, el tumor se transfirió a una cabina de seguridad biológica (Clase II, Tipo A2). Utilizando una técnica estéril, el tumor se extrae del contenedor de envío y se lava en HBSS que contiene 50 pg/mL de gentamicina. El técnico morcela el tumor en 40 fragmentos de 3X3X3 mm que se transfieren a un matraz G-REX - 100M que contiene medio CM1 precalentado suplementado con 6000 UI/mL de rhIL-2. El matraz se coloca en una incubadora de cultivo de tejidos humidificada con CO<2>al 5% a 37°C durante 11 días. Si el tumor genera más de 40 fragmentos, entonces se puede configurar más de un G-REX -100M. Más adelante, las células se recogen y se preparan para el REP.
5.1.2 REP: El día 11, se prepara un matraz G-REX -500M que contiene 5L de CM2 suplementado con 3000 UI/mL de rhIL-2, 30ng/mL anti-CD3 (Clon OKT3) y 5 x 10<9>células alimentadoras PBMC alogénicas irradiadas. Los TIL recolectados del matraz pre-REP G-REX -100M después de la reducción de volumen se cuentan y se siembran en el matraz G-REX -500M a una densidad que puede oscilar entre 5 x 106 y 200 x 106 células. Más adelante, el matraz se coloca en una incubadora humidificada de cultivo de tejidos con CO<2>al 5% a 37°C durante cinco días.
El día 16, se reduce el volumen del matraz G-REX -500M, se cuentan los TIL y se determina su viabilidad. En este punto, los TIL se expanden en múltiples matraces G-REX -500M (hasta un máximo de seis matraces), cada uno con una densidad de siembra de 1 x 109 TIL/matraz. Más adelante, todos los matraces se colocan en incubadoras humidificadas de cultivo de tejidos con CO2 al 5% a 37°C durante seis días más. El día 22, el día de la recolección, el volumen de cada matraz se reduce en un 90%, las células se agrupan y se filtran a través de un filtro de sangre de 170 |jm, y luego se recogen en una bolsa Origin EV3000 de 3 l o equivalente en preparación para el lavado automático usando el LOVO.
5.1.3 Recolección y formulación final: se lavan los TIL utilizando el sistema de tratamiento celular automatizado LOVO que reemplaza el 99.99% de los medios de cultivo celular con un regulador de pH de lavado que consiste en PlasmaLyte-A suplementado con 1% de HSA. El LOVO opera utilizando tecnología de membrana de filtración giratoria que recupera más de 92% de los TIL al tiempo que elimina virtualmente los componentes residuales del cultivo de tejidos, incluidos el suero, los factores de crecimiento y las citocinas, así como otros desechos y partículas. Una vez completado el lavado, se realiza un recuento de células para determinar la expansión del TIL y su viabilidad tras la recolección. Se agrega CS10 al TIL lavado en una relación volumen: volumen de 1:1 para lograr la formulación final del Procedimiento 2A. El producto formulado final se divide en alícuotas en bolsas de almacenamiento criogénico, se sella y se coloca en casetes de aluminio preenfriados. Las bolsas de almacenamiento criogénico que contienen TIL se congelan luego usando un congelador de velocidad controlada CryoMed (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) de acuerdo con POE LAB-018 Rev 000 Operación del congelador de velocidad controlada.
5.2 Muestras de TIL: Se recolectaron cuatro condiciones de TIL para la comparación de caracterización.
5.2.1 TIL recién recolectados (directo de PlasmaLyte-A con regulador de pH de lavado HSA al 1%) TIL descongelados (directo de la bolsa de producto final descongelado)
5.2.2 ReREP TIL de fenotipo extendido fresco (TIL recién recolectado cultivado durante 7-14 días con IL-2, alimentadoras de PBMC y clon anti-CD3 OKT3)
5.2.3 TIL de fenotipo extendido descongelado (TIL descongelado cultivado durante 7-14 días con IL-2, alimentadoras de PBMC y clon anti-CD3 OKT3)
5.3 Descripción general de la prueba (véase la figura 2)
5.3.1 Las pruebas previas al REP incluyen la evaluación de la cantidad de IL-2 y el análisis de los metabolitos del cultivo celular como glucosa, ácido láctico, L-glutamina y amoníaco durante todo el período previo al REP.
5.3.1.1 Cuantificación de IL-2: el medio se extrajo periódicamente del cultivo pre-REP y se analizó mediante ELISA para la cuantificación de IL-2. Véanse las instrucciones del fabricante del kit de ELISA de IL-2 Quantikine humana de R&D Systems.
5.3.1.2 Análisis de metabolitos del cultivo celular: el medio se extrajo periódicamente del cultivo pre-REP y se analizó para los siguientes metabolitos: glucosa, ácido láctico, L-glutamina y amoníaco. Véase el manual del usuario de Roche Cedex Bioanalyzer para obtener instrucciones.
5.3.2 Las pruebas de REP incluyeron ensayos extendidos como recuentos de células, % de viabilidad, análisis de citometría de flujo de moléculas de superficie celular, potencia (producción de IFN-y), ensayo de lisis redirigida bioluminiscente, producción de granzima B, metabolismo celular y medición de la longitud de los telómeros.
5.3.2.1 Recuentos celulares y viabilidad: Se contaron las muestras de TIL y se determinó la viabilidad usando un contador celular automatizado Cellometer K2 (Nexcelom Bioscience, Lawrence, MA) de acuerdo con POE LAB-003 Rev 000 contador de células con citómetro automático de imagen Cellometer K2.
5.3.2.2 Análisis de citometría de flujo de biomarcadores de superficie celular: las muestras de TIL se dividieron en alícuotas para el análisis de citometría de flujo de marcadores de superficie celular utilizando el procedimiento descrito en WRK LAB-041 Rev 000 Tinción de antígeno de superficie de Post REP TIL
5.3.2.3 Ensayo de potencia (producción de IFN-<y>): se midió otra medida del potencial citotóxico determinando los niveles de la citocina IFN-y en el medio de TIL estimulado con anticuerpos contra CD3, CD28 y CD137/4-1BB. Los niveles de IFN-<y>en los medios de estos TIL estimulados se determinaron utilizando WRK LAB-016 Rev 000 estimulación de TIL para medir la liberación de IFN-y
5.3.2.4 Ensayo de lisis redirigida bioluminiscente: El potencial citotóxico de TIL para lisar las células diana se evaluó mediante un ensayo de cocultivo de TIL con la línea celular bioluminiscente, P815 (clon G6), de acuerdo con el POE descrito en WRK LAB-040 Ensayo de lisis redirigido bioluminiscente (ensayo de potencia) para TIL
5.3.2.5 Producción de granzima B: La granzima B es otra medida de la capacidad de TIL para matar las células diana. Los sobrenadantes del medio reestimulados como se describe en 5.2.5.3 también se evaluaron para sus niveles de Granzima B usando el Kit ELISA Human Granzyme B DuoSet ELISA (R & D Systems, Minneapolis, MN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
5.3.2.6 Metabolismo celular (respiratorio): las células se trataron con inhibidores de la respiración mitocondrial y la glucólisis para determinar un perfil metabólico del TIL que consta de las siguientes medidas: fosforilación oxidativa basal (medida por OCR), capacidad respiratoria de reserva, actividad glucolítica basal (medido por ECAR) y reserva glucolítica. Los perfiles metabólicos se realizaron usando el procedimiento descrito en WRK LAB-029 Ensayo de Prueba de Estrés Mitocondrial/Glucólisis de Combinación de Seahorse.
5.3.2.7 Medición de la longitud de los telómeros: Se han utilizado diversos procedimientos para medir la longitud de los telómeros en preparaciones citológicas y de ADN genómico. El análisis de fragmentos de restricción de telómeros (TRF) es el estándar de oro para medir la longitud de los telómeros (de Lange et al., 1990). Sin embargo, la principal limitación de TRF es el requisito de una gran cantidad de ADN (1.5 Ag). Dos técnicas ampliamente utilizadas para la medición de la longitud de los telómeros, a saber, la hibridación fluorescente in situ (FISH; Agilent Technologies, Santa Clara, CA) y la PCR cuantitativa.
5.3.3 Se tomaron muestras adicionales para las siguientes pruebas y podrían analizarse en el futuro según fuera necesario:
5.3.3.1 Análisis de citocinas en profundidad
5.3.3.2 Secuenciación de TCR
6. RESULTADOS ALCANZADOS
Se realizaron un total de 9 experimentos utilizando los TIL derivados de los tumores descritos en la sección 2.3, el diseño experimental y las condiciones de recolección en la sección 5.1. Los TIL recolectados mediante el Procedimiento 2A se sometieron a las pruebas divulgadas en la sección 5.3.2 con el fin de comprender su capacidad para expandirse, su viabilidad, fenotipo, potencial citotóxico y perfil metabólico. Se tomaron todas las medidas para el producto TIL recién recolectado y el producto TIL congelado descongelado (Procedimiento 2A).
6.1 Recuento celular y viabilidad
6.1.1 Los recuentos de células se tomaron al final del pre-REP, el día 5 o 6 del REP (día de expansión) y al final del REP, tanto antes del lavado LOVO como después del lavado LOVO. Más adelante, se utilizaron los recuentos de células para determinar la expansión de TIL durante el REP y la recuperación de TIL después de lavar con LOVO. Después de la descongelación, las células se contaron nuevamente para determinar la recuperación posterior a la descongelación (basada en la concentración a la que se congelaron los TIL) y la viabilidad posterior a la descongelación antes de proceder con otro ensayo analítico. La Tabla 3 resume todos estos resultados para las nueve ejecuciones del Procedimiento 2A.
6.1.2 Procedimiento 2A POE define el número inicial de TIL para un REP como un intervalo de 5200 x 106 TIL. El intervalo de nueve muestras TIL utilizadas para iniciar los<r>E<p>del Procedimiento 2A fue de 4.1 x 106 (M1065T) -1.8 x 108 (M1064T), con un número TIL inicial promedio de 6.58 x 107. Curiosamente, el REP sembrado en placa con el número más bajo de TIL se expandió al mayor grado en la recolección de REP (intervalo de expansión para los 9 REP: 130-1900 veces; expansión promedio, 840 veces). El número medio de TIL recolectados al final de estos nueve REP del Procedimiento 2A fue 4.49 x 1010 (intervalo 7.8 x 109 - 6.7 x 1010).
6.1.3 Para obtener estadísticas comparativas del Procedimiento 1C, véase la Sección de Química, Fabricación y Controles (CMC) de la Solicitud de nuevo fármaco en investigación (IND) para LN144/LN-145.
6.1.4 El procedimiento 1C utiliza manipulación manual y centrifugación para lavar el producto TIL. Esto lleva mucho tiempo, pero lo que es más importante, puede resultar en la pérdida de hasta un 25% del producto entre la recolección y la formulación final. El sistema LOVO de lavado automático de células proporciona una manera de minimizar la pérdida de células y también introduce un sistema de lavado cerrado que disminuye el riesgo de contaminación del producto durante las etapas de lavado. La recuperación del producto que siguió a la etapa de lavado LOVO del protocolo y mostró una recuperación promedio de 93.8 ± 10.4% del producto TIL entrando en la etapa de lavado. Esta estadística incluye el producto TIL para M1062T, que tuvo una recuperación de LOVO del 68%, durante el cual un error del operador en la operación del LOVO resultó en la necesidad de centrifugar la muestra y luego reiniciar el procedimiento LOVO (véase la Sección 7, Desviaciones y discrepancias). Esto representa una mejora muy favorable con respecto a la etapa de lavado del Procedimiento 1C el día de la recolección de REP.
6.1.5 La recuperación de TIL después de la descongelación también es una preocupación importante para un producto TIL congelado. La recuperación del producto se determinó midiendo el número de células recuperadas de la bolsa después de la descongelación en comparación con el número de células colocadas en cada bolsa de congelación antes de la crioconservación. El intervalo de recuperación del deshielo fue de 78 a 103%, con una recuperación promedio de 88.2 ± 8.6%.
6.1.6 Aunque existe una diferencia significativa en la viabilidad de las muestras antes o después de la descongelación, en promedio, solo hay una pérdida de viabilidad del 2% después de la descongelación. La viabilidad del TIL que entró en crioconservación fue de 84.3 ± 4.7%, y la misma TIL después de la descongelación tuvo una viabilidad de 82.1 ± 4.4% (p=0.0742, prueba t de Student pareada, no paramétrica). Los criterios de liberación para el producto clínico TIL Procedimiento 1C fresco requieren un mínimo del 70% de viabilidad. Independientemente de una pequeña pérdida de viabilidad tras la descongelación, las 9 ejecuciones del Procedimiento 2A cumplieron este criterio de liberación después de la descongelación del producto criogénico. La Tabla 4 y la Figura 3 muestran la viabilidad del TIL que entra en crioconservación (Fresh CS10) y la viabilidad del TIL tras la descongelación.
Tabla 33: Comparación de viabilidad de producto fresco y descongelado.
6.2 Expansión Re-REP de TIL. Además de examinar la capacidad del producto fresco para expandirse en un REP, se evaluó la capacidad del producto TIL fresco y descongelado para expandirse tras la reestimulación con APC alimentadoras de PBMC alogénicas irradiadas frescas y anti-CD3 fresco. Después de 7 días, estos productos TIL reestimulados se analizaron para determinar su capacidad para expandirse desde las condiciones de cultivo iniciales. La Figura 4 y la Tabla 5 muestran la expansión media de las células re-REP TIL después de 7 días de crecimiento en cultivo. El análisis de los datos utilizando una prueba emparejada t de Student muestra que la capacidad del TIL para expandirse en un re-REP no es significativamente diferente si se inicia el REP con TIL frescos o un producto TIL descongelado (p=0.81).
Tabla 34: Comparación de expansión de TIL frescos y descongelados en cultivo re-REP
Fresco 139.67 264 227 60.12 24.67 268.83 176 316.33 202.33
Descongelado 177.33 110.33 220.67 177.6 220.2 302.5 114.77 190.67 73.82
6.3 Metabolitos del cultivo celular. Una de las principales premisas de Lion 2A era que menos tiempo de tecnología y transferencias de procedimientos generarían ahorros de costes y limitarían la variabilidad. Las posibles consecuencias adversas de esto fueron el aumento de metabolitos indeseables y la disminución de las fuentes de nutrientes. Como se mostró en la Figura 5, los valores sanguíneos normales de electrolitos (sodio y potasio), nutrientes (glutamina y glucosa) y metabolitos (ácido láctico y amoníaco) proporcionan un intervalo a considerar al evaluar los resultados que salen de pre-REP del día 11. Como se mostró en la Figura 6, se evaluaron secuencialmente tres TIL (M1061T, M1062T y M1064T). En esta configuración, el potasio y el sodio se mantuvieron en niveles normales, la glucosa estaba en > 1.0 g/L y la glutamina > 0.3 mmol/L, muy por encima de los valores sanguíneos normales más bajos. Como se esperaba, el lactato se elevó hasta 0.8 g/L, alrededor de 5 veces el nivel que se encuentra en la sangre normalmente y el amoníaco hasta 3 mmol/L, como se esperaba de las células expandidas rápidamente y también sustancialmente más alto que lo que se encuentra normalmente en la sangre.
6.4 Cuantificación de IL-2.
6.4.1 El principal impulsor de la proliferación de TIL en el pre-REP, además de glucosa suplementaria, glutamina y oxigenación suficiente, es la provisión de altos niveles de rhIL-2. Después de su adición al medio que contenía suero, los niveles de IL-2 se midieron a 2-3.5 x 103 UI/mL, cayendo sólo hasta alrededor de 1.0 x 103 UI/mL durante los 11 días de cultivo. Esto está muy por encima de las 30-100 UI/mL necesarias para mantener la proliferación de células T. La evaluación de las concentraciones de IL-2 utilizando diferentes fuentes de IL-2 (Prometheus, Akron, Cellgenix) se está probando actualmente en experimentos separados (QP-17-010: Calificación de IL-2 a partir de Cellgenix, Akron y Prometheus) de Lion Biotechnologies, Tampa.
6.5 Producción de IFN-y
6.5.1 Después de 24 horas de estimulación de TIL con Dynabeads magnéticos anti-CD3, CD28 y 4-1BB como se describe en las secciones 5.3.5.3, se recogió el sobrenadante de los cultivos y se analizó el IFN-y usando kits de ELISA. Todos los TIL reestimulados produjeron más IFN-<y>que sus contrapartes no estimuladas, lo que demuestra que la estimulación del TIL dio como resultado su activación. La Figura 8 muestra la capacidad de las cuatro composiciones de TIL diferentes (fresca, descongelada, de re-REP frescos y re-REP TIL descongelados) probadas para liberar IFN-y en el medio circundante tras la reestimulación.
Las Tablas 6 y 7 muestran los valores medios de la secreción de IFN-<y>en las 9 ejecuciones del Procedimiento 2A. La secreción de IFN-<y>en el medio circundante tras la reestimulación no es diferente entre el producto TIL fresco y el TIL descongelado y crioconservado. La Tabla 6 muestra que el producto fresco produjo un promedio de 4143 ± 2285 pg IPN-<y>/106 TIL mientras que el producto descongelado produjo 3910 ± 1487 pg I<p>N-<y>/106 TIL (p=0.55 usando la prueba t de Student pareada). Si se normaliza al producto TIL total (Tabla 7), en promedio, el TIL fresco estimulado produjo 86 ± 61 gramos de IFN-<y>, mientras que el TIL estimulado descongelado produjo 68 ± 40 gramos de IFN-y (p=0.13). Estos hallazgos indican que tanto los productos TIL frescos como los descongelados producen IFN-y y que no hay diferencia en la capacidad del TIL coincidente fresco o descongelado para producir IFN-y tras la estimulación con anti-CD3/anti-CD28/anti-4- 1BB.
Tabla 35: Secreción de IFN-<y>en TIL fresco y descongelado (expresado como pg/106 células/24 horas)
M1061T M1062T M1063T M1064T M1065T EP11001 T M1056T M1058T M1023T
Fresco 4570 3921 5589 619 1363 4263 6065 2983 7918
Descongelado 3158 3543 5478 1563 2127 5059 4216 4033 6010
Re- REP 3638 1732 971 2676 2753 1461 2374 770 3512 fresco
Re- REP 2970 2060 1273 1074 1744 2522 5042 4038 923 descongelado
Tabla 36: Secreción de IFN-y en TIL fresco y descongelado. Todos los valores están en 1012 (expresados en gramos/106 células/24 horas)
M106 M1062T M1063T M1064T M1065T EP11001T M1056T M1058T M1023T 1T
Fresco 67.1 78.4 99.6 8.4 4.8 66.1 157.0 109.0 187.0
Descongelado 47.7 59.7 87.9 18.7 7.5 64.4 88.9 127.0 111.0
6.6 Producción de granzima B
6.6.1 Se estimularon TIL con anti-CD3, CD28 y Dynabeads 4-1BB magnéticos durante 24 horas como se describe en 5.2.5.3, y se recogió el sobrenadante de los cultivos después de 24 horas y se analizaron los niveles de Granzima B mediante ELISA. Todos los TIL reestimulados produjeron más Granzima B que sus contrapartes no estimuladas, lo que demuestra que la estimulación de TIL dio como resultado su activación. La Figura 9 muestra la capacidad del TIL fresco, la re-REP TIL fresco y la re-REP TIL descongelado para liberar Granzima B en el medio circundante tras la reestimulación con el cóctel de citocinas.
Todos los productos mostraron una producción de granzima B en el intervalo de 9190 pg/106 células viables a 262000 pg/106 células viables (Tabla 8). La Tabla 6 muestra que el producto fresco produjo un promedio de 60644 42959, mientras que el re-REP fresco y descongelado produjo 93600 67558 y 103878 84515 respectivamente. La comparación entre el re-REP fresco y el re-REP descongelado mostró que no hay diferencia en la capacidad del TIL obtenido de ninguna de las condiciones (p=0.7). Debido a la falta de medición de Granzima B en el producto descongelado, no se realizó ningún análisis estadístico utilizando el producto TIL fresco.
���6.7 Análisis de citometría de flujo de biomarcadores de superficie celular
Perfiles fenotípicos de TIL: se han estandarizado cuatro paneles de anticuerpos en LION para caracterizar ampliamente el perfil funcional de las células T. Estos paneles se utilizaron para evaluar la inmunofenotipificación de TIL fresco, TIL descongelado, Re-REP TIL fresco y Re-REP TIL descongelado. Todos los datos utilizados para la representación gráfica en esta sección también se proporcionan en formato de tabla (Tablas 14-24) en la sección 10 del apéndice.
6.8 Ensayo de lisis bioluminiscente redirigida
6.8.1 Para determinar la capacidad potencial de TIL del procedimiento 2A para matar sus células tumorales diana, desarrollamos un ensayo de potencia que implica el cocultivo de TIL con una línea celular diana sustituta bioluminiscente P815, como se describe en la sección 5.3.2.4. Un co-cultivo de 4 horas de las diferentes composiciones de TIL con P815 en presencia de estimulación anti-CD3 da una medida del potencial citotóxico de las células TIL expresadas como LU50, unidades líticas que pueden definirse como el número de TIL necesarios para matar 50% de las células diana. Esta medida se expresa luego como LU50/106 TIL. La Figura 32 más adelante muestra el potencial citotóxico del TIL del producto fresco y de las dos condiciones de re-REP TIL, re-REP fresco y re-REP descongelado.
6.8.2 La comparación del re-REP fresco con el re-REP descongelado muestra que no hay una diferencia significativa en la capacidad de cualquiera de los TIL para matar una célula diana (p=0.3126). Estos datos apoyan la conclusión de que no hay diferencia entre el producto fresco y descongelado en términos del potencial citotóxico del producto TIL. No se realizó ninguna comparación entre fresco ya que no se midió el potencial citotóxico inmediatamente después de descongelar TIL. La Tabla 9 muestra las unidades líticas de TIL necesarias para matar el 50% de la línea celular diana P815.
Tabla 38: Unidades líticas producidas por TIL contra la línea celular diana P815
6.9 Perfil de metabolismo celular de TIL
6.9.1 Para evaluar la salud metabólica de TIL post-REP, utilizamos los instrumentos analizadores de metabolismo de Seahorse (XFp y XFe96) de Agilent Technologies (Santa Clara, CA) siguiendo el protocolo descrito en la sección 5.3.2.6. Brevemente, al tratar las células con inhibidores que se dirigen a ciertos aspectos de la fosforilación oxidativa o la glucólisis, las células se estresan de tal manera que permiten la determinación de su SRC y reserva glucolítica. Además, se pueden determinar los niveles basales de fosforilación oxidativa (OCR basal) y glucólisis (ECAR basal). Finalmente, debido a que los inhibidores de la fosforilación oxidativa y la glucólisis se combinan en la misma prueba, se puede discernir una reserva oculta potencial de SRC que solo es aparente cuando las células se tratan con el inhibidor competitivo de la glucólisis, 2-desoxiglucosa (2-DG), (etiquetado como SRC2DG), lo que da como resultado un aumento de SRC que de otro modo permanecería oculto. Esta capacidad respiratoria adicional ha sido etiquetada como SRC "cubierta". La Tabla 9 muestra los perfiles metabólicos de TIL recién recolectado, Re-REP TIL fresco y Re-REP TIL descongelado derivados de la prueba de estrés metabólico realizada en las células.
6.9.2 Las Figuras 55A - F muestran los datos de la Tabla 38 en forma gráfica. El producto REP recién recolectado muestra algunas diferencias estadísticas con los productos re-REP fresco y descongelado. Esto no es sorprendente, ya que el producto re-REP se ha reestimulado con PBMC APC recién irradiado y anticuerpo anti-CD3 fresco, ya fuera inmediatamente después del REP o después de descongelarlo. Sin embargo, en todos los casos, no hay una diferencia significativa entre los productos frescos y descongelados cuando ambos se reestimulan en un procedimiento de re-REP (véanse valores de p de la Tabla 9). Esto indica que el procedimiento de crioconservación no afecta negativamente al producto TIL. En particular, para la fosforilación oxidativa, los productos re-REP tienen un SRC más alto que sus productos REP de recolección fresca correspondientes. Para la glucólisis, el re-REP TIL tiene niveles basales de glucólisis estadísticamente significativamente más altos y, a la inversa, niveles estadísticamente más bajos de reserva glucolítica que el producto REP fresco. Vale la pena señalar que esto podría indicar que los Re-REP TIL están más altamente activados que los TIL recién recolectados, ya que se informa que los TIL sanos y activados poseen altos niveles de actividad glucolítica (Buck et al., JEM 212:1345-1360; 2015).
6.9.3 Una comparación directa de productos frescos con congelados utilizando el procedimiento re-REP nos ha permitido determinar que tanto los productos TIL frescos como congelados, en condiciones de estimulación idénticas, dan como resultado perfiles metabólicos que son estadísticamente indistintos. Tanto el re-REP fresco como el re-REP TIL descongelado tienen niveles similares de respiración basal (Figura 60A, 36.7 ± 10.6 y 44.8 ± 12.9 pmol/min, respectivamente; p=0.11) así como SRC similar (encubierto) (Figura 60B, 41.6 ± 27,2 y 62.7 ± 30.8; p=0.12). Tras el tratamiento de estas células re-REP con 2-DG, el inhibidor competitivo de la glucosa, que da como resultado una inhibición de la glucólisis, vemos que tanto el re-REP TIL fresco como el descongelado muestran una capacidad respiratoria de reserva extra, "oculta" (SRC2DG; SRC encubierto) que es mayormente bajo o ausente en la muestra de TIL recién recolectado (Figura 60C); sólo una muestra tenía altos niveles de SRC2DG (Figura 60C) en el TIL recién recolectado, mientras que, a la inversa, sólo una de las siete muestras analizadas mostró una falta de SRC encubierta al re-REP. El SRC encubierto (Figura 60D) para re-REP fresco promedió 20.7 ± 20.1 mientras que el SRC encubierto (Figura 60D) para re-REP descongelado varió de 27.8 ± 16.1; p=0.52).
6.9.4 La lectura metabólica más sorprendente del fenotipo extendido (re-REP) TIL son los niveles consistentemente altos de glucólisis basal de las muestras de fenotipo extendido (re-REP). La glucólisis basal (Figura 60E) es consistemente alta en las muestras de re-REP, con un promedio de 118.7 ± 44.2 mpH/min en el re-REP fresco y 132.0 ± 43.2 mpH/min en el re-REP descongelado. Estas muestras no son estadísticamente diferentes entre sí (p=0.38). Sin embargo, como se mencionó anteriormente, la muestra recién recolectada no posee niveles basales tan altos de glucólisis. En comparación con el REP TIL fresco, esta diferencia es sustancial, pero no significativa (p=0.10); sin embargo, en comparación con las muestras descongeladas re-REP, la diferencia es significativa (p 0.01). Estas células re-REP aparentemente dependen en gran medida de la glucólisis para sus necesidades energéticas, ya que tienen poca reserva glucolítica restante cuando se estresan en las pruebas metabólicas de Seahorse (Figura 60F): promedio de Re-REP TIL fresco 12.9 ± 14.9 mpH/min; Re-REP descongelado TIL, 3.35 ± 23.8 mpH/min). Estos re-REP no son diferentes entre sí (p=0.47) pero ambos son estadísticamente diferentes de la reserva glucolítica encontrada en muestras de TIL recolectados frescos, que promedia 40.8 ± 17.6 mpH/min (p=0.003 y 0.01 en comparación con las muestras frescas de TIL) REP y re-REP TIL descongelado, respectivamente). Se deben realizar más estudios para determinar la causa detrás de las diferencias observadas en la glucólisis entre estas muestras de recolección fresca y re-REP TIL.
6.10 Medición de la longitud de los telómeros
6.10.1 Medición de la longitud de los telómeros de pos-REP TIL mediante Flow Fish y qPCR.
6.10.1.1 Flow-FISH se realizó utilizando el kit Dako/Agilent Pathology Solutions (Telomere PNA Kit/FITC para citometría de flujo) y se siguieron las instrucciones del fabricante para medir la longitud promedio de la repetición del telómero. Se utilizó la línea celular de leucemia de células T 1301 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)) como patrón de referencia interno en cada ensayo. Se contaron los TIL individuales y se mezclaron con 1301 células en una relación de células 1:1. Se mezclaron 2 X 106 TIL con 2 X 1061301 células. La hibridación in situ se realizó en solución de hibridación (formamida al 70%, BSA al 1%, Tris 20 mM, pH 7.0) por duplicado y en presencia y ausencia de una sonda PNA de telómero conjugada con FITC (FITC-00-C<c>C<t>AA-C<c>C-<t>A<a>- CCC-T<a>A) suplementaria a la secuencia de repetición del telómero a una concentración final de 60 nM. Después de la adición de la sonda PNA de telómero, las células se incubaron durante 10 minutos a 82°C en un bloque de calor. Más adelante, las células se colocaron en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche. A la mañana siguiente, se eliminó el exceso de sonda de telómero lavando 2 veces durante 10 minutos cada una en un bloque de calor a 40°C con solución de lavado. Después de los lavados, se agregó DAPI (Invitrogen, Carlsbad, CA) a una concentración final de 75 ng/mL. La tinción de ADN con DAPI se utilizó para bloquear células en la población GO/G1. El análisis de la muestra se realizó utilizando un citómetro de flujo Yeti (Propel-Labs, Fort Collins, CO). La fluorescencia del telómero de la muestra de prueba se expresó como un porcentaje de la fluorescencia (fl) de las células 1301 según la siguiente fórmula: Longitud relativa del telómero = [(células de prueba FITC fl media con sonda - células de prueba FITC fl media sin sonda) X índice de ADN de 1301 células X 100]/[(media de 1301 células FITC fl con sonda - media de células FITC fl 1301 sin sonda) X índice de ADN de las células de prueba.
6.10.1.2 qPCR: Se utilizó qPCR en tiempo real para medir la longitud relativa de los telómeros. Brevemente, se determinó la relación de número de copias repetidas de telómeros a número de copias de un solo gen (T/S) usando un termociclador de PCR Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) en un formato de 96 pocillos. Se utilizaron diez nanogramos de ADN genómico para la reacción de PCR de telómero (Tel) o hemoglobina (hgb) y los cebadores utilizados fueron los siguientes: cebador Tel-1b (CGG TTT GTT T<g>G<g>T<t>TGG GTT TGG G<t>T TGG GTT TGG GTT), cebador Tel- 2b (GGC TTG CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT), cebador hgb1 (GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC), y cebador hgb2 (CACCAACTTCATCCACGTTCACC). Todas las muestras se analizaron mediante las reacciones de los telómeros y la hemoglobina, y el análisis se realizó por triplicado en la misma placa. Además de las muestras de prueba, cada placa de 96 pocillos contenía una curva estándar de cinco puntos de 0.08 ng a 250 ng utilizando<a>D<n>genómico aislado de 1301 células. La relación T/S (-dCt) para cada muestra se calculó restando el valor mediano del ciclo umbral de hemoglobina (Ct) del valor mediano de Ct del telómero. La relación T/S relativa (-ddCt) se determinó restando la relación T/S del punto de curva estándar de 10 ng de la relación T/S de cada muestra desconocida.
6.10.1.3 Resultados y discusión de la longitud de los telómeros: Los telómeros son tapas (secuencias repetitivas de nucleótidos) al final de los cromosomas lineales que desempeñan un papel fundamental para facilitar la replicación completa de los cromosomas. La medición de los telómeros es una herramienta emergente en el estudio de afecciones tales como enfermedades degenerativas, cáncer y envejecimiento. Estudios previos de los NIH (J Immunol. 2005, Nov 15;175(10):7046-52; Clin Cancer Res. 2011, Jul 1; 17(13): 4550-4557) han demostrado que una mayor longitud de los telómeros de TIL está asociada con respuesta clínica. Por el contrario, el grupo de Radvanyi no encontró diferencias significativas en la longitud de los telómeros de TIL entre respondedores y no respondedores (Clin Cancer Res; 18 (24); 6758-70). Hasta el momento, no hay evidencia que demuestre que la longitud de los telómeros estuviera asociada con la longitud del cultivo de células T in vitro. Es posible que el post-REP TIL cultivado por el procedimiento 2A (cultivo de 22 días) tenga una longitud de telómero más larga en comparación con el TIL cultivada por el procedimiento del procedimiento 1C (cultivo de 25-36 días).
7. DISCREPANCIAS Y DESVIACIONES
7.1 Desviaciones del procedimiento
7.1.1 M1061T: Las células REP se dividieron el día 6 en 4 matraces G-Rex500M.
7.1.2 M1062T: Las células REP se dividieron el día 6 en 4 matraces G-Rex500M. Debido a un error del operador en el sistema de filtración LOVO, se produjo una parada de emergencia durante el procedimiento que requirió una recolección manual de los TIL desde el kit desechable. Los TIL se filtraron con éxito durante una segunda ejecución de LOVO.
7.1.3 M1063T: Sin desviaciones M1064T: Sin desviaciones
7.1.4 M1065T: Las células pre-REP estaban por debajo de la especificación para el recuento de células el día 11 (<5 x 106 células) pero continuaron en el REP. En el día 6 de REP, las células se contaron y se volvieron a colocar en el G-Rex500M y se alimentaron con 4.5 l de medio fresco. Los TIL no se expandieron en este día debido a un recuento celular insuficiente (<1 x 109 células en el día 6 de REP).
7.1.5 EP11001T: Sin desviaciones
7.1.6 M1056T: Se cultivaron células pre-REP en LION en un matraz G-Rex 100 durante hasta 21 días. Los fragmentos de tumor se filtraron el día 11 de pre-REP y los TIL se congelaron el día de la recolección en CS10 al 100% a 30 x 106 células por vial de 1.5 mL. Los TIL congelados se descongelaron en Moffitt PD en CM1 suplementado con 6000 UI/mL de rhIL-2 y se dejaron reposar durante 3 días antes de iniciar el Día 0 del REP. El día 6 de REP, se expandieron TIL en 4 matraces que procedieron a recolectarse el día 11 de REP.
7.1.7 M1058T: Se cultivaron células pre-REP en LION en un matraz G-Rex 100 durante hasta 21 días. Los fragmentos de tumor se filtraron el día 11 de pre-REP y los TIL se congelaron el día de la recolección en CS10 al 100% a 30 x 106 células por vial de 1.5 mL. Los TIL congelados se descongelaron en Moffitt PD en CM1 suplementado con 6000 UI/mL de rhIL-2 y se dejaron reposar durante 3 días antes de iniciar el Día 0 del REP. El día 6 de REP, las células se dividieron en 4 matraces que procedieron a recolectarse el día 11 de REP.
7.1.8 M1023T: Se cultivaron células pre-REP en LION en matraces G-Rex10 durante hasta 21 días. Los fragmentos tumorales se filtraron el día 11 de pre-REP y los TIL se congelaron el día de la recolección en CS10 al 100% a 30 x 106 células por vial de 1.5 mL. Los TIL congelados se descongelaron en Moffitt PD en CM1 suplementado con 6000 UI/mL de rhIL-2 y se dejaron reposar durante 3 días antes de iniciar el Día 0 del REP. El día 6 de REP, las células se expandieron en 4 matraces que procedieron a recolectarse el día 11 de REP.
7.2 Prueba de desviaciones
7.2.1 No se realizaron análisis en profundidad de citocinas ni secuenciación de TCR
8. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
8.1 Desarrollo de un procedimiento más robusto. El desafío para Lion era convertir el procedimiento 1C Lion anterior, que tenía un largo tiempo de tratamiento, en un procedimiento 2A Lion potencialmente más comercializable que utiliza refinamientos que resultan en un tiempo de tratamiento más corto y una formulación final crioconservada del producto TIL. Con este fin, se llevaron a cabo nueve ejecuciones de desarrollo de procedimientos para confirmar que los procedimientos antiguos y nuevos demostraron rendimientos celulares comparables y potencia y fenotipo de TIL comparables. De particular interés fue la complejidad marcadamente disminuida del procedimiento general, lo que resultó en una reducción del 50% en la duración total de los procedimientos pre-REP y REP, pero aún así resultó en rendimientos de TIL comparables (7.8 x 109 - 67 x 109 células) en comparación al histórico procedimiento 1C Lion que se practica actualmente por nuestro fabricante contratado. Esto se actualizó recientemente para la presentación ASCO de junio de 2017 (Media: 41.04 x 109 células con un intervalo de 1.2-96 x 109 células). Además, Lion ha desarrollado con éxito un producto TIL crioconservado que demostró una recuperación posterior a la descongelación del 78-103% con una viabilidad de TIL > 70%, de acuerdo con los criterios de liberación actuales del Procedimiento 1C (véase la Tabla 2).
8.2 El papel del análisis fenotípico extendido (Re-REP). La capacidad de proliferar en respuesta a la estimulación mitogénica (como en los re-REP experimentales presentados en este informe) es un atributo de calidad crítico de TIL. Los experimentos presentados aquí muestran que 8/9 productos TIL descongelados pudieron expandirse > 100 veces en una semana en comparación con 7/9 productos TIL frescos emparejados, lo que respalda la comparabilidad del producto TIL descongelado con el producto TIL fresco (Tabla 2). Dos atributos de calidad críticos adicionales de TIL son su capacidad para liberar IFN-y y/o Granzima B después de la estimulación con citocinas (CD3/CD28/4-1BB). La estimulación de citocinas de los productos frescos y descongelados resultó en una liberación de IFN-y superior a 2 ng/106 células/24 horas en 7/9 productos frescos y todos los productos descongelados (Figura 35) (véase la sección 6.2 de este informe). Se observó liberación de granzima B (Figura 36) en las 9 ejecuciones del procedimiento. Los niveles de CD4 y CD8 (Figura 39 y Figura 40) demostraron una consistencia interna notable entre los productos TIL frescos y descongelados. Además, el análisis de la capacidad del TIL para destruir una línea celular diana tumoral sustituta (P815, Figura 59) mostró que el TIL fresco y descongelado poseía un potencial citotóxico similar.
8.3 Una prueba de estrés metabólico de TIL revela una bioenergética robusta. Un análisis de los perfiles metabólicos de productos TIL frescos y descongelados estimulados en un re-REP demostró que tanto TIL fresco como descongelado respondieron de manera similar a las pruebas de estrés metabólico y no mostró diferencias sustanciales en un panel de características metabólicas (Tabla 39). Por lo tanto, el producto TIL del Procedimiento 2A crioconservado puede considerarse comparable al producto del Procedimiento 1C fresco en función de los cuatro atributos de calidad de identidad, potencia, número de células y viabilidad presentados en este informe. Los ensayos que comparan células frescas y descongeladas emparejadas fueron bastante comparables en todos los ensayos descritos en este informe.
8.4 Criterios de aceptación: La heterogeneidad intrínseca de los productos TIL con terapia personalizada para cada paciente refleja: (1) sus moléculas restrictivas del complejo de histocompatibilidad principal único (la mayoría de los productos génicos polimórficos en biología humana); (2) la trayectoria evolutiva única de los tumores individuales que surgen en el microambiente tumoral con inestabilidad genómica y mutaciones únicas de impulsadores y pasajeros individuales; y (3) la heterogeneidad conferida por la variación alélica, la diversidad de la región N y los reordenamientos de VDJ en los segmentos Va y Vp que definen los receptores de células T usados para el reconocimiento de neoepítopos, antígenos de tumor-testicular compartidos y productos codificados viralmente. Evaluar la variación adicional que se produce como resultado de cambios en el procedimiento es, por lo tanto, una tarea abrumadora y requiere la evaluación de tantos parámetros como sea posible para asegurarse de que la "comparabilidad" de un material intrínsecamente heterogéneo sea posible. Esto se ha logrado examinando fielmente varios criterios de aceptación de viabilidad y comparabilidad, como se detalla en la Tabla 40 más adelante.
Tabla 40: Criterios de aceptación para viabilidad y comparabilidad
En base a los criterios de viabilidad enumerados en la Tabla 11, se evaluará TIL sobre si se cumplieron o no los requisitos. Se cumplieron todos los criterios individuales para cada experimento y cada línea TIL (n=9). Se utilizó la prueba t de Student para el análisis estadístico. Se utilizó la prueba T de Student no paramétrica para calcular el valor p para el % de viabilidad, ya que las medidas de viabilidad no serán una distribución gaussiana. Véase la Tabla 41 más adelante.
Tabla 41: Criterios de aceptación de factibilidad de cumplimiento.
En base a los criterios de aceptación enumerados en la Tabla 40, se evaluaron re-REP TIL frescos y congelados para determinar si se cumplían o no los requisitos. (No se informó la viabilidad ya que la duración del re-REP fue de 7 días y las PBMC residuales irradiadas no pudieron distinguirse de TIL). Los números entre paréntesis indican los criterios que no se cumplieron. Según los criterios de pureza medidos con la expresión de CD3+, 6/9 productos frescos de Re-REP TIL cumplieron con los estrictos criterios > 90% (M1061, M1065 y EP11001 no lo hicieron) y 8/9 productos descongelados pasaron los criterios de aceptación incluso después de Re-REP. El bajo número de CD3+ TIL en EP11001T re-REP fresco podría atribuirse a una regulación negativa extrema del receptor de células T. La medición de CD3+ TIL como medida de pureza no se determinó para M1023T re-REP TIL descongelado. Para esta composición de TIL, la pureza se estimó usando tinción con TCRap y se indica con un asterisco (*). Se utilizó la prueba t de Student para el análisis estadístico. Véase la Tabla 42 más adelante.
Tabla 42: Cumplimiento de los criterios de aceptación de comparabilidad.
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9. Tablas adicionales
Tabla 43 - Figura 39: Células CD4+
Tabla 44 - Figura 40: Células CD8+
EJEMPLO 20: NUEVOS LINFOCITOS INFILTRANTES DE TUMOR CRIOCONSERVADOS (LN-144) ADMINISTRADOS A PACIENTES CON MELANOMA METASTÁSICO
Los nuevos linfocitos infiltrantes de tumores crioconservados (LN-144) administrados a pacientes con melanoma metastásico demuestran eficacia y tolerabilidad en un ensayo clínico multicéntrico de fase 2
INTRODUCCIÓN:
Se ha estudiado la seguridad y eficacia de la terapia celular adoptiva (ACT) con linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) no crioconservados en cientos de pacientes con melanoma metastásico. Este ensayo clínico multicéntrico se inició con TIL de fabricación centralizada (LN-144) como productos de infusión no crioconservados y crioconservados. Nuestro nuevo procedimiento de fabricación para el LN-144 no crioconservado se utiliza en la Cohorte 1, y un LN-144 crioconservado acortado de 3 semanas se utiliza en la Cohorte 2. La fabricación de la Cohorte 2 ofrece un procedimiento significativamente más corto, junto con un producto TIL crioconservado lo que permite la flexibilidad de la programación y la dosificación del paciente. El procedimiento de fabricación más corto reduce el tiempo de espera para que el paciente reciba su producto TIL y la crioconservación agrega comodidad a la logística y la entrega a los sitios clínicos.
PROCEDIMIENTOS:
El C-144-01 es un estudio multicéntrico prospectivo que evalúa a pacientes con melanoma metastásico que reciben LN-144. Después de una linfodepleción no mieloablativa con el régimen de preacondicionamiento de Cy/Flu, los pacientes reciben una única infusión de LN-144 seguida de la administración de IL-2 (600,000 UI/kg) hasta 6 dosis. Se evalúa la respuesta objetiva de los pacientes como criterio de valoración principal durante un período de hasta 24 meses.
RESULTADOS:
Caracterizamos el LN-144 crioconservado administrado a una segunda cohorte de pacientes, Cohorte 2 (N=10) siguiendo el mismo régimen de tratamiento de infusión antes y después de TIL que se usó para la Cohorte 1.
Los pacientes de la cohorte 2 fueron tratados previamente en gran medida con un mayor número de líneas previas con todos los pacientes con terapias anti-CTLA-4 y anti-PD-1, y una mayor carga tumoral (media SOD: 15.3, 10.9 cm para las cohortes 2, 1). La mediana del número de terapias sistémicas previas es 4, 3 para las cohortes 2, 1, respectivamente. Un análisis inicial de los datos de seguridad demuestra una tolerabilidad comparable de LN-144 crioconservado. El perfil de seguridad para los pacientes de la Cohorte 1 que reciben LN-144 no crioconservado sigue siendo aceptable para esta población de pacientes en etapa avanzada. Los TEAE más comunes observados en ambas cohortes por frecuencia son náuseas, anemia, neutropenia febril, disminución del recuento de neutrófilos y disminución del recuento de plaquetas. La revisión temprana de los datos de eficacia indica actividad antitumoral, incluida la RP, para la terapia TIL observada en pacientes tratados en la Cohorte 2.
CONCLUSIONES:
Esto representa el primer ensayo clínico en un entorno multicéntrico con TIL fabricado centralmente que evalúa un procedimiento nuevo para un producto autólogo crioconservado con un procedimiento significativamente más corto (alrededor de 3 semanas). Los resultados preliminares indican que el LN-144 crioconservado es una opción terapéutica segura y tolerable para los pacientes con melanoma metastásico que han fallado en múltiples terapias anteriores, incluidos los inhibidores de puntos de control. El LN-144 crioconservado proporciona una mayor flexibilidad para los pacientes y los cuidadores y permite un tratamiento más inmediato para los pacientes con una necesidad médica insatisfecha tan alta. NCT02360579.
EJEMPLO 21:EVALUACIÓN DE MEDIOS SIN SUERO PARA USO EN EL PROCEDIMIENTO 2A
Este ejemplo proporciona datos que muestran la evaluación de la eficacia de los medios sin suero como reemplazo de los medios estándar CM1, CM2 y CM4 que se utilizan actualmente en el procedimiento 2A. Este estudio evaluó la eficacia de los medios sin suero (SFM) disponibles y las alternativas sin suero como reemplazo en tres fases;
Fase -1: se comparó la eficacia de la expansión de TIL (n=3) usando medios sin suero estándar frente a CTS Optimizer o Prime T CDM o Xvivo-20 con o sin reemplazo de suero o lisado de plaquetas.
Fase-2: se probó la condición de medio libre de suero candidato en un procedimiento 2A a pequeña escala usando G-Rex 5M (n=3).
INFORMACIÓN DE ANTECEDENTES
Aunque la combinación de medios actual utilizada en el cultivo Pre y Post REP ha demostrado ser eficaz, pueden producirse fallos de REP con el AIM-V. Si se identificara una alternativa efectiva sin suero, el procedimiento sería más directo y simple de realizar en los CMO al reducir el número de tipos de medios utilizados de 3 a 1. Además, SFM reduce la posibilidad de enfermedad inesperada al eliminando el uso de suero humano. Este ejemplo proporciona datos que demostraron que respaldan el uso de medios sin suero en los procedimientos 2A.
ABREVIATURAS
pl: microlitro
CM1,2,4: Medios completos 1,2,4
CTS OpTimizer SFM: Sistema de terapia celular, medios sin suero OpTimizer
g: gramos
Hr: Hora
IFU: Instrucciones de uso
IL-2: citocina interleucina-2
Min: Minuto
mL: mililitro
°C: grados Celsius
PreREP: Protocolo de expansión rápida previa
REP: Protocolo de expansión rápida
RT: temperatura ambiente
SR: Reemplazo de suero
TIL: linfocitos infiltrantes de tumores
DISEÑO DE EXPERIMENTO
Los Pre-REP y REP se iniciaron como se menciona en LAB-008. La descripción general de estas 3 fases del experimento se muestran en la Figura 150:
Como se indica en la Figura 150, el proyecto se sugirió para probar los medios y suplementos sin suero en dos etapas.
Etapa 1. Selección del proveedor de medios sin suero. preREP y postREP se configuraron para imitar el procedimiento 2A en una placa de 24 pocillos G-Rex. PreREP se inició cultivando cada fragmento/pocillo de placa G-Rex de 24 pocillos por triplicado o cuatriplicado según las condiciones. REP se inició el día 11 cultivando 4 x 10e5 TIL/pocillo de G-Rex 24 pocillo; dividido el día 16, recolección el día 22. Se utilizaron CTS OpTimizer, X-Vivo 20 y Prime T-CDM como alternativas de medios sin suero potenciales para usar en PreREP y REP. Reemplazo de suero SR Inmune CTS (Life Technologies) o suero de lisado de plaquetas (SDBB) se añadieron al 3% a SFM. Se planificó que cada condición se probara con al menos 3 tumores tanto en preREP como en postREP para imitar el procedimiento 2A.
Etapa 2. Los candidatos identificados se probaron adicionalmente en procedimientos 2A a pequeña escala por protocolo (TP-17-007). Brevemente, los preREP se iniciaron cultivando 2 fragmentos/matraz G-Rex 5M por triplicado por condición. Los REP se iniciaron el día 11 usando 2 x 10e6/matraz G-Rex 5M; divididos el día 16, recolección el día 22.
Nota: Algunos tumores se procesaron y configuraron para medir múltiples parámetros en un experimento.
OBSERVACIONES
Resultados equivalentes o estadísticamente mejores fueron observados en el crecimiento celular cuando se comparó un medio sin suero con el estándar utilizado en el procedimiento 2A
Se observó un fenotipo, una producción de IFN-y y un análisis de metabolitos similares de los TIL cultivados en medio libre de suero en comparación con los TIL cultivados en el medio estándar usado en el procedimiento 2A. RESULTADOS
Prueba de la eficacia de los medios sin suero en la expansión pre y pos REP TIL.
CTS Optimizer SR (reemplazo de suero) mostró una expansión preREP TIL mejorada y una expansión REP TIL comparable. Se agregaron CTS OpTimizer, X-Vivo 20 y Prime T-CDM con o sin 3% de CTS Immune CTS SR, se probaron contra condiciones estándar. En M1079 y L4026, la condición CTS OpTimizer CSR mostró una expansión TIL preREP significativamente mejorada (p <0.05) en comparación con las condiciones estándar (CM1,<c>M2, CM4) (Figura 62A). Por el contrario, CTS Optimizer sin CSR no ayudó a la expansión previa a REP TIL (Apéndice -1,2,3). CTS Optimizer CSR mostró una expansión de TIL comparable en PostREP en los dos tumores de 3 probados (Figura-2B). Se produjo una gran variación en el REP antes y después de las condiciones de X-Vivo 20 y Prime T-CDM, mientras que CTS Optimizer fue relativamente consistente entre los cuatriplicados. Además, el lisado de plaquetas agregado SFM no mejoró la expansión de TIL preREP y postREP en comparación con los estándares (Figura 62A). Estos hallazgos sugieren que el reemplazo de suero ciertamente es necesario para proporcionar un crecimiento comparable a nuestro estándar; optimizador de CTS CSR puede ser un candidato.
Probar la condición de candidato en la mini báscula G-Rex 5M (véase Figura 64).
Análisis fenotípico de Post REP TIL. Véase la Figura 66 y la Tabla 56 más adelante.
Tabla 56: Inclinación de CD8 con CTS OpTimizer
Comparabilidad de interferón-gamma
ELISA de interferón-gamma (Quantikine). La producción de IFN-y se midió utilizando el kit Quantikine ELISA mediante sistemas de R&D. CTS SR produjo cantidades comparables de IFN-y en comparación con nuestra condición estándar. Véase la Figura 67.
EJEMPLO 22:CÓCTEL FACTOR DE CRECIMIENTO DE CÉLULAS T IL-2/IL-15/IL-21 MEJORA LA FUNCIÓN DE EXPANSIÓN Y EFECTORA DE LAS CÉLULAS T INFILTRANTES DE TUMOR
La terapia de células T adoptivas con linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) autólogos ha demostrado eficacia clínica en pacientes con melanoma metastásico y carcinoma cervical. En algunos estudios, los mejores resultados clínicos se han correlacionado positivamente con la cantidad total de células infundidas y/o el porcentaje de células T CD8+. La mayoría de los regímenes de producción actuales utilizan únicamente IL-2 para promover el crecimiento de TIL. Se ha informado una mayor expansión de linfocitos utilizando regímenes que contienen IL-15 e IL-21. Este estudio describe los efectos positivos de agregar IL-15 e IL-21 al protocolo IL-2-TIL de segunda generación implementado recientemente en la clínica.
Materiales y procedimientos
El procedimiento de generación de TIL incluye un protocolo de expansión rápida previa (pre-REP), en donde se colocan fragmentos tumorales de 1-3 mm3 de tamaño en medios que contienen IL-2. Durante el pre-REP, TIL emigra fuera de los fragmentos tumorales y se expande en respuesta a la estimulación de IL-2.
Para estimular aún más el crecimiento de TIL, TIL se expande a través de un período de cultivo secundario denominado Protocolo de Expansión Rápida (REP) que incluye alimentadoras de PBMC irradiadas, IL-2 y antiCD3. En este estudio, se desarrolló un protocolo de expansión pre-REP y REP abreviado para expandir TIL mientras se mantienen los atributos fenotípicos y funcionales del producto TIL final.
Este protocolo de producción de TIL abreviado se utilizó para evaluar el impacto de IL-2 sola frente a una combinación de IL2/IL-15/IL-21. Estos dos regímenes de cultivo se compararon para la producción de TIL cultivada a partir de tumores colorrectales, melanomas, cervicales, de mama triple negativo, pulmón y renales. Una vez completado el pre-REP, se evaluó la expansión, el fenotipo, la función (CD107a+ e iENy) y el repertorio de TCR Vp de los TIL cultivados.
Los cultivos pre-REP se iniciaron usando el protocolo estándar de IL-2 (600 UI/mL), o con IL-15 (180 UI/mL) e IL-21 (UI/mL) además de IL-2. Se evaluó la expansión de las células al completar el pre-REP. Un cultivo se clasificó como con un aumento de la expansión sobre la IL-2 si el crecimiento general se mejoraba en al menos un 20%. En este documento se presentan los estudios fenotípicos y funcionales de melanoma y pulmón. Véase la Tabla 57 más adelante.
Tabla 57: Mejora de la expansión durante el pre-REP con IL-2/IL-15/IL-21 en múltiples indicaciones
Estos datos demuestran un aumento del rendimiento del producto TIL cuando se cultivaron TIL con IL-2/IL15/IL-21 en comparación con IL-2 sola, además de diferencias fenotípicas y funcionales en el pulmón.
El efecto del cóctel triple sobre la expansión de TIL fue específico de la indicación y benefició a la mayoría de los tumores de bajo rendimiento.
La relación de células T CD8+/CD4+ aumentó mediante el tratamiento en el producto TIL de NSCLC.
La actividad de las células T pareció potenciada por la adición de IL-15 e IL-21 a IL-2, según lo evaluado por los niveles de expresión de CD107a tanto en melanoma como en NSCLC.
Los datos proporcionados aquí muestran que la expansión de TIL usando un procedimiento más corto y robusto, como el procedimiento 2A descrito aquí en la solicitud y otros ejemplos, se puede adaptar para abarcar el cóctel de citocinas IL-2/IL-15/IL-21, lo que proporciona un medio para promover aún más la expansión de TIL en particular en indicaciones específicas.
Los experimentos en curso están evaluando adicionalmente los efectos de IL-2/IL-15/IL-21 sobre la función de TIL.
Experimentos adicionales evaluarán el efecto del cóctel triple durante el REP (primera expansión).
Estas observaciones son especialmente relevantes para la optimización y estandarización de los regímenes de cultivo de TIL necesarios para la fabricación a gran escala de TIL con la amplia aplicabilidad y disponibilidad requeridas de una terapia anticáncer de corriente principal.
EJEMPLO 23:UN TIL CRIORESERVADO GENERADO CON UN PROCEDIMIENTO ABREVIADO
Antecedentes
Este ejemplo proporciona datos relacionados con un producto de linfocitos infiltrantes de tumores crioconservados (TIL) para LN-144, generado con un procedimiento abreviado adecuado para la fabricación comercial de alto rendimiento que presenta atributos de calidad favorables para la transferencia de células adoptivas (ACT).
Los procedimientos existentes para generar productos de TIL clínicos implican intervenciones abiertas del operador seguidas de períodos de incubación prolongados para generar un producto terapéutico. El procedimiento de Generación 1 toma alrededor de 6 semanas y produce un producto fresco. Para llevar la terapia TIL a todos los pacientes que puedan beneficiarse de su potencial, se desarrolló un procedimiento de cultivo abreviado de 22 días, Generación 2, adecuado para la fabricación centralizada con un producto farmacológico crioconservado capaz de enviarse a sitios clínicos distantes. La Generación 2 representa un procedimiento de producción de células flexible, robusto, cerrado y semiautomatizado que se adapta a la fabricación de alto rendimiento a escala comercial. Los productos farmacéuticos generados por este procedimiento tienen atributos de calidad comparables a los generados por el procedimiento de Generación 1.
Objetivos del estudio:
Los productos farmacéuticos generados por los procedimientos de Generación 1 (una forma de realización del procedimiento 1C) y Generación 2 (una forma de realización del procedimiento 2A) se ensayaron para determinar la comparabilidad en términos de los siguientes atributos de calidad:
Dosis y expansión múltiple.
Pureza de células T y proporciones de subconjuntos de células T.
Expresión fenotípica de moléculas coestimuladoras en subconjuntos de células T.
Longitud relativa media de las repeticiones de los telómeros.
Capacidad para secretar citocinas en respuesta a la reactivación de TCR.
Diversidad de receptores de células T.
Descripción general del procedimiento de terapia TIL:
EXTRACCIÓN: Los TIL del paciente se eliminan del microambiente tumoral supresor (mediante extirpación quirúrgica de una lesión)
EXPANSIÓN: TIL se expandió exponencialmente en cultivo con IL-2 para producir 109 - 1011 TIL, antes de infundirlos en el paciente.
PREPARACIÓN: El paciente recibe NMA-LD (linfodepleción no mieloablativa, ciclofosfamida: 60 mg/kg, IV x 2 dosis y fludarabina: 25 mg/m2 x 5 dosis) para retirar el microambiente tumoral potencialmente supresor y maximizar el injerto y la potencia de Terapia TIL
INFUSIÓN: Se infunde al paciente con su TIL expandido (LN-144) y una dosis alta de IL-2 de corta duración (600,000 UI/kg para hasta 6 dosis) para promover la activación, proliferación y actividad citolítica antitumoral de TIL
Tabla 58: Resumen de las mejoras del procedimiento en la fabricación de segunda generación
Procedimientos analíticos e instrumentación:
Dosis y viabilidad: Se tomaron muestras de los productos formulados finales y se analizaron las células nucleadas totales, las células viables totales y la viabilidad determinada por contratinción de naranja de acridina/DAPI usando el contador celular automático NC-200.
Citometría de flujo: Se tomaron muestras de los productos farmacéuticos formulados y se ensayó su identidad mediante FACS. El porcentaje de células T se determinó como la población CD45, CD3 doble positiva de células viables. Los viales satélite o centinela congelados para cada procedimiento se descongelaron y se analizaron en busca de marcadores fenotípicos extendidos, incluidos CD3, CD4, CD8, CD27 y CD28.
Longitud relativa media de las repeticiones de los telómeros: se utilizó la tecnología Flow-FISH para medir la longitud media de las repeticiones de los telómeros. Este ensayo se completó como se describe en el protocolo DAKO® Telomere PNA Kit/FITC para citometría de flujo. Brevemente, se combinaron 2 x 106 células TIL con 2 x 106 células de leucemia 1301. El A d N se desnaturalizó a 82°C durante 10 minutos y la sonda PNA-FITC se hibridó en la oscuridad durante la noche a temperatura ambiente. Se utilizó yoduro de propidio para identificar las células en la fase G0/1.
Inmunoensayos: se midió la capacidad del producto farmacológico para secretar citocinas tras la reactivación después de un cocultivo con perlas recubiertas de mAb (Life Technologies, anti-CD3, anti-CD28 & anti-CD137). Después de 24 horas, los sobrenadantes del cultivo se recogieron, se congelaron, se descongelaron y se ensayaron mediante ELISA usando el kit Quantikine IFNy ELISA (sistemas de R&D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Diversidad del receptor de células T: se aisló el ARN de los productos formulados finales y se sometió a una PCR multiplex con cebadores específicos de VDJ. Las secuencias de CDR3 expresadas dentro del producto de TIL se amplificaron semicuantitativamente para determinar la frecuencia y prevalencia de clones de TIL únicos. La secuenciación se realizó en el secuenciador de sobremesa Illumina MiSeq. Los valores se indexaron para producir una clasificación representativa de la diversidad relativa de receptores de células T en el producto.
Resultados y Conclusiones:
Los resultados se proporcionan en las Figuras 75 a 81.
El procedimiento de Generación 2 produce un producto TIL con atributos de calidad comparables a los de Generación 1.
La Generación 2 produce cantidades similares de productos TIL altamente puros que se componen de porciones similares de subconjuntos de células T que expresan niveles comparables de moléculas coestimuladoras en relación con Gen 1.
Los TIL de generación 2 muestran una mayor diversidad de receptores de TCR que, cuando se activan, inician una secreción robusta de citocinas.
El producto farmacéutico crioconservado introduce eficiencias logísticas críticas que permiten flexibilidad en la distribución.
A diferencia de los procedimientos anteriores, la plataforma de expansión de 22 días abreviada de Generación 2 presenta una plataforma de fabricación de TIL escalable y logísticamente factible que permite la generación rápida de dosis a escala clínica para pacientes que necesitan terapia urgente.
El protocolo de fabricación de TIL de Generación 2 aborda muchas de las barreras que hasta ahora han obstaculizado la aplicación más amplia de la terapia TIL.
EJEMPLO 24:EVALUACIÓN DE UNA GAMA DE CÉLULAS ALIMENTADORAS ALOGÉNICAS: RELACIONES de TIL DE 100:1 A 25:1
Este estudio probó la proliferación de TIL a 25:1 y 50:1 frente al control de células alimentadoras alogénicas a TIL de 100: 1 actualmente utilizadas en el Procedimiento 1C.
Los estudios publicados por la División de Cirugía del Instituto Nacional del Cáncer han demostrado el umbral para la activación óptima de TIL en el matraz G-Rex 100 a 5 * 106 células alimentadoras alogénicas por cm2 al inicio del REP(1). Esto se ha verificado mediante modelos matemáticos y, con el mismo modelo, se predijo que con una capa de alimentadoras optimizada para el contacto célula: célula por unidad de área, la relación de células alimentadoras alogénicas en relación con TIL puede reducirse a 25:1 con un efecto mínimo en la activación y la expansión de TIL.
Este estudio estableció una densidad óptima de células alimentadoras por unidad de área al inicio de REP y validó el intervalo efectivo de relaciones de alimentadoras alogénicas al inicio de REP necesarias para disminuir y normalizar la cantidad de células alimentadoras utilizadas por lote clínico. El estudio también validó el inicio del REP con menos de 200 * 106 TIL cocultivados con un número fijo de células alimentadoras.
A. Volumen de una célula T (10 pm de diámetro): V = (4/3) n r3 =523.6 pm3
B. Columna de G-Rex 100 (M) con una altura de 40 pm (4 células): V = (4/3) n r3=4 * 1012 pm3
C. Número de célula requerida para llenar la columna B: 4 * 1012 pm3/523.6 pm3= 7.6x108 pm3 * 0.64 = 4.86x108 D. Número de células que se pueden activar de manera óptima en el espacio 4D: 4.86 * 108/24 = 20.25 * 106 E. Número de alimentadoras y TIL extrapolados a G-Rex 500: TIL: 100 * 106 y alimentador: 2.5 * 109 Ecuación 1. Aproximación del número de células mononucleares necesarias para proporcionar una geometría icosaédrica para la activación de TIL en un cilindro con una base de 100 cm2. El cálculo deriva el resultado experimental de ~5 * 108 para la activación del umbral de células T que refleja de cerca los datos experimentales del NCI. (1) (C) El multiplicador (0.64) es la densidad de empaquetamiento aleatoria para esferas equivalentes como fue calculado por Jaeger y Nagel en 1992 (2). (D) El divisor 24 es el número de esferas equivalentes que podrían entrar en contacto con un objeto similar en un espacio de 4 dimensiones "el número de Newton."(3) Referencias
(1) Jin, Jianjian, et.al., Simplified Procedimiento of the Growth of Human Tumor Infiltrating Lymphocytes (TIL) in Gas- Permeable Flasks to Numbers Needed for Patient Treatment. J Immunother. 2012 Apr; 35(3): 283-292. (2) Jaeger HM, Nagel SR. Physics of the granular state. Science. 1992 Mar 20;255(5051):1523-31.
(3) O. R. Musin (2003). "The problem of the twenty-five spheres". Russ. Math. Surv. 58 (4): 794-795.
EJEMPLO 25:ESTUDIOS DE ATRIBUTOS CLAVE DE CALIDAD PARA EL PRODUCTO TIL Antecedentes
La terapia adoptiva de células T con linfocitos infiltrantes de tumores autólogos (TIL) ha demostrado eficacia clínica en pacientes con melanoma metastásico y otros tumores1'3.
La mayoría de los informes de estudios clínicos han incluido análisis exploratorios de los productos TIL infundidos con la intención de identificar atributos de calidad como esterilidad, identidad, pureza y potencia que podrían relacionarse con la eficacia y/o seguridad del producto.45
Aquí presentamos la evaluación de tres parámetros clave de producto, del producto TIL, que pueden contribuir a una futura plataforma de control de calidad para su uso en la fabricación comercial de TIL.
Descripción general del procedimiento de terapia TIL
1. El tumor fue extirpado del paciente y transportado a las instalaciones de fabricación con GMP.
2. A su llegada, el tumor se fragmenta y se coloca en matraces con IL-2 para un Protocolo de Expansión Rápida (REP).
3. Se propagaron adicionalmente pre-REP TIL en un protocolo REP en presencia de PBMC irradiadas, anticuerpo anti-CD3 (30 ng/mL) e IL-2 (3000 UI/mL).
4. Los productos TIL se evaluaron para determinar los atributos de calidad críticos que incluyen: (1) Identidad (2) Pureza y (3) Potencia.
5. Antes de la infusión de TIL expandido (LN-144), el paciente recibió un régimen de linfodepleción no mieloablativa que consistía en ciclofosfamida y fludarabina. Después de la infusión de TIL, los pacientes recibieron una duración corta (hasta 6 dosis) de IL-2 en dosis altas (600,000 UI/kg) para apoyar el crecimiento y el injerto de TIL transferido.
Objetivos del studio
Objetivo: caracterizar completamente los productos TIL en cuanto a identidad, pureza y potencia, y por lo tanto (a) orientar la definición de atributos de calidad críticos y (b) apoyar el establecimiento de criterios formales de liberación que se implementarán en la producción comercial de productos TIL.
Estrategia: Desarrollar las siguientes metodologías analíticas para apoyar la caracterización del producto TIL. En particular, se realizaron los siguientes procedimientos: análisis fenotípico por citometría de flujo para una evaluación de identidad y pureza, ensayo de detección de células tumorales residuales para una medida de pureza y ensayo de liberación de interferón gamma para evaluar la potencia.
Materiales y procedimientos
Identidad y Pureza
Caracterización fenotípica: los productos TIL se tiñeron con anticuerpos anti-CD45, anti-CD3, anti-CD8, anti-CD4, anti-CD45RA, anti CCR7, anti CD62L, anti-CD19, anti-CD16 y anti-CD56 y se analizaron por citometría de flujo para la cuantificación de subconjuntos de células T y no T.
Pureza
Ensayo de detección de tumores residuales: los productos TIL se tiñeron con anticuerpos anti-MCSP (sulfato de condroitina proteoglicano asociado a melanoma) y anti-CD45, así como un colorante Aqua fijable Viva/Muerta, luego fueron analizados por citometría de flujo para la detección de células de melanoma. Se utilizaron controles enriquecidos para evaluar la precisión de la detección de tumores y para establecer criterios de activación para el análisis de datos.
Potencia
Ensayo de liberación de IFNy: los productos TIL se reestimularon con perlas recubiertas con anti-CD3/CD28/CD137 durante 18 a 24 horas, después de lo cual se recogieron los sobrenadantes para evaluar la secreción de IFNy usando un ensayo ELISA.
Resultados
Identidad: La mayoría (> 99%) del producto TIL de melanoma estaba compuesto por células CD45+CD3+
Las Figuras 86A-86C proporcionan una caracterización fenotípica de productos TIL usando un ensayo de citometría de flujo de 10 colores. (A) El porcentaje de subconjuntos de células T y no células T se definió mediante CD45+CD3+ y CD45-(no linfocitos) /CD45+CD3'(linfocitos no T), respectivamente. En general, > 99% de los productos TIL probados consistieron en células T (CD45+CD3+). Se mostró un promedio de productos TIL (n=10). (B) Porcentaje de dos subconjuntos de células T que incluyen CD45+ CD3+CD8+ (círculo abierto azul) y CD45+CD3+CD4+ (círculo abierto rosa). No se observó ninguna diferencia estadística en el porcentaje de ambos subconjuntos utilizando la prueba T para datos no apareados de Student (P=0.68). (C) La población que no es de células T se caracterizó por cuatro subconjuntos diferentes que incluyen: 1) No linfocitos (CD45‘), 2) Células NK (CD45+CD3-CD16+/56+), 3) Célula B (CD45+CD19+), y 4) Célula no NK/B (CD45+CD3-CD16'CD56-CD19-).
Identidad: la mayoría del producto TIL de melanoma exhibió un fenotipo de células T efectoras o de memoria, asociado con la función citotóxica de las células T.
Las Figuras 87A y 87B muestran la caracterización de subconjuntos de células T en poblaciones de células CD45+CD3+CD4+ y CD45+CD3+CD8+. Los subconjuntos de células T naives, de memoria central (TCM), memoria efectora (TEF) y memoria efectora RA+(EMRA) se definieron utilizando CD45RA y CCR7. Las Figuras 87A y 87B muestran subconjuntos de células T representativos de 10 productos TIL finales en poblaciones de células CD4+ (A) y CD8+ (B). El subconjunto de células T de memoria efectora (círculo azul abierto) fue una población importante (> 93%) en ambos subconjuntos CD4+ y CD8+ del producto final TIL. Menos del 7% de las células de productos TIL eran un subconjunto de memoria central (círculo abierto rosa). Los subconjuntos EMRA (círculo gris abierto) y naive (círculo negro abierto) apenas se detectaron en el producto TIL (<0.02%). Los valores p representan la diferencia entre EM y CM utilizando la prueba T para datos no apareados de Student.
Pureza: MCSP representa un marcador de tumor de melanoma apropiado para el ensayo de pureza.
Las Figuras 88A y 88B muestran la detección de la expresión de MCSP y EpCAM en células tumorales de melanoma. Se generaron líneas de células tumorales de melanoma (WM35, 526 y 888), líneas celulares de melanoma derivadas de pacientes de acuerdo con los procedimientos descritos en este documento (1028, 1032 y 1041) y una línea celular de carcinoma de adenoma colorrectal (HT29 como control negativo) se caracterizaron por tinción para marcadores MCSP (proteoglicano de sulfato de condroitina asociado a melanoma) y EpCAM (molécula de adhesión de células epiteliales). (A) El promedio del 90% de las células tumorales de melanoma expresaron MCSP. (B) La expresión de EpCAM no se detectó en líneas de células tumorales de melanoma en comparación con el control positivo HT29, una línea de células tumorales EpCAM+.
Pureza: Desarrollo de un ensayo basado en citometría de flujo para la detección de células tumorales residuales en productos TIL.
Las Figuras 89A y 89B ilustran la detección de controles enriquecidos para la determinación de la precisión de detección de tumores. El ensayo se realizó agregando cantidades conocidas de células tumorales en suspensiones de PBMC (n=10). Se diluyeron células tumorales de melanoma MCSP+526 en relaciones de 1:10, 1:100 y 1:1.000, luego se mezclaron con PBMC y se tiñeron con anticuerpos anti-MCSP y anti-CD45 y colorante vivo/muerto y se analizaron por citometría de flujo. (A) Se detectaron alrededor de 3000, 300 y 30 células en la dilución de 1:10, 1:100 y 1:1000, respectivamente. (B) Se utilizó un promedio (AV) y una desviación estándar (DE) de las células adquiridas en cada condición para definir los límites de referencia superior e inferior.
Pureza: Calificación del ensayo de detección de tumores residuales utilizando controles enriquecidos
Las Figuras 90A y 90B muestran el estudio de repetibilidad de los límites superior e inferior en controles enriquecidos. Se realizaron tres experimentos independientes por triplicado para determinar la repetibilidad del ensayo de adición. (A) El número de células tumorales detectadas por MCSP+ estaba constantemente dentro del intervalo de los límites de referencia superior e inferior. (B) El gráfico de regresión lineal demuestra la correlación entre las células MCSP+ y las diluciones de adición (R2=0.99) con la línea sólida negra que muestra el mejor ajuste. Las líneas discontinuas verdes y grises representan los límites de predicción del 95% en la curva estándar y las muestras (Exp. No. 1 a 3), respectivamente.
Pureza: los contaminantes de células tumorales de melanoma estaban por debajo de los límites de detección del ensayo en el producto TIL final.
Las Figuras 91A y 91B muestran la detección de tumor de melanoma residual en productos TIL. Los productos TIL se evaluaron para determinar la contaminación residual del tumor usando el ensayo desarrollado (n=15). La mediana del número y el porcentaje de eventos detectables de MCSP+ fue 2 y 0.0002%, respectivamente.
Potencia: la secreción de IFNy por TIL (consistentemente> 1000 pg/mL) demostró la función efectora del producto TIL.
La Figura 92 muestra la evaluación de la potencia de los productos TIL después de la activación de las células T. Secreción de IFN<y>después de la reestimulación con anti-CD3/CD28/CD137 en productos TIL evaluados por ELISA por duplicado (n=5). La secreción de IFNy por los productos TIL fue significativamente mayor que los controles no estimulados usando la prueba de intervalo con signo de Wilcoxon (P=0.02), y consistentemente > 1000 pg/mL. La secreción de IFN<y>>200 pg/mL se consideró potente. Un valor de p <0.05 se considera estadísticamente significativo.
Conclusión
Se evaluaron los parámetros clave del producto de identidad, pureza y potencia de los productos TIL. Los productos TIL fabricados de acuerdo con los procedimientos descritos en el presente documento consistían en más del 99% de células T CD45+CD3+. La mayoría de los subconjuntos de TIL CD4+ y CD8+ exhibieron un fenotipo de memoria efectora, asociado con la función citotóxica de las células T. Se desarrolló y calificó con éxito un ensayo basado en citometría de flujo para detectar células tumorales de melanoma contaminantes en el producto final de TIL. Aplicando este ensayo, se demostró que las células tumorales de melanoma contaminantes en el producto TIL final estaban por debajo de los límites de detección del ensayo. La secreción de IFNy por el producto TIL final después de la reestimulación anti-CD3/CD28/CD137 puede servir como ensayo de potencia para TIL fabricado comercialmente. Estos datos proporcionan la base de una plataforma de control de calidad que respaldará un mayor desarrollo de los atributos de calidad críticos para la producción comercial de productos TIL.
EJEMPLO 26:UN PRODUCTO DE TIL CRIOCONSERVADO GENERADO CON UN PROCEDIMIENTO ABREVIADO ADECUADO PARA LA FABRICACIÓN COMERCIAL DE ALTO RENDIMIENTO EXHIBE ATRIBUTOS DE CALIDAD FAVORABLES PARA LA TRANSFERENCIA DE CÉLULAS ADOPTIVAS
Antecedentes
Los procedimientos clásicos de generación de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) para transferencia de células adoptivas (ACT) implican múltiples etapas de incubación ex vivo para producir un producto de infusión fresco (no crioconservado).
El procedimiento de primera generación (Gen 1) produjo una dosis de TIL fresco en alrededor de 6 semanas. Se desarrolló un procedimiento de fabricación de TIL de segunda generación (Gen 2) que abrevia la duración del cultivo ex vivo a 22 días (Figura 93).
El procedimiento Gen 2 es adecuado para la fabricación centralizada y produce un producto de infusión de TIL crioconservado que brinda comodidad en la programación, logística y entrega a los sitios clínicos. El producto de infusión de TIL crioconservado para LN-144 producido por el procedimiento Gen 2 tiene atributos de calidad comparables al producto de infusión de TIL no crioconservado para TIL generado por el procedimiento Gen 1. El procedimiento de fabricación de TIL Gen 2 representa un procedimiento de producción de célula flexible, robusto, cerrado y semiautomático que se adapta a la fabricación de TIL de alto rendimiento a escala comercial.
Objetivo del studio
Se evaluaron los productos de infusión de TIL generados por los procedimientos de fabricación de Gen 1 y Gen 2 para determinar la comparabilidad en términos de los siguientes atributos de calidad: (1) Recuento de células (dosis), viabilidad, tasa de crecimiento de la fase REP, (2) pureza de células T y expresión fenotípica de moléculas coestimuladoras en subconjuntos de células T, (3) Longitud relativa promedio de las repeticiones de telómeros, (4) Capacidad para secretar IFNy en respuesta al acoplamiento de CD3, CD28, CD137 y (5) Diversidad de receptores de células T presentes en el producto de infusión final (Figura 94).
Procedimientos analíticos e instrumentación
Recuento de células y viabilidad: se tomaron muestras de los productos de infusión formulados finales y se analizaron las células nucleadas totales, las células viables totales y la viabilidad fue determinada mediante contratinción de naranja de acridina/DAPI usando el contador celular automático NC-200. Los lotes de desarrollo del procedimiento se ensayaron en el contador de viabilidad celular Nexcellom Cellometer K2 usando tinción fluorescente dual con naranja de acridina/yodo de propidio.
Marcadores fenotípicos: se tomaron muestras de los productos de infusión formulados y se ensayó su identidad mediante tinción inmunofluorescente. El porcentaje de células T se determinó como la población de células viables CD45+, CD3+ (doble positiva). Los viales satélite o centinela congelados para cada procedimiento se descongelaron y se analizaron en busca de marcadores fenotípicos extendidos, incluidos CD3, CD4, CD8, CD27 y CD28. Los productos de infusión frescos se adquirieron en el BD FACS Canto II, y los marcadores fenotípicos extendidos en los productos de infusión descongelados se adquirieron en el analizador de células Bio-Rad ZE5.
Longitud relativa promedio de las repeticiones de los telómeros: se utilizó la tecnología Flow-FISH para medir la longitud promedio de las repeticiones de los telómeros. Este ensayo se completó como se describe en el protocolo DAKO® Telomere PNA Kit/FITC para citometría de flujo. Brevemente, 2.0 x 106 células TIL se combinaron con 2.0 x 106 células T de leucemia de la línea celular humana (1301). El ADN se desnaturalizó a 82°C durante 10 minutos y la sonda PNA-FITC se hibridó en la oscuridad durante la noche a temperatura ambiente. Se utilizó yoduro de propidio para identificar las células en la fase G0/1.
Función inmunológica: se midió la capacidad del producto de infusión para secretar IFNy tras la reactivación después de un cocultivo con perlas recubiertas de anticuerpo (Life Technologies, anti-CD3, anti-CD28 & anti-CD137). Después de 24 horas, los sobrenadantes del cultivo se recolectaron, congelaron, descongelaron y ensayaron mediante ELISA usando el kit Quantikine IFN<y>ELISA (sistemas de R&D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Diversidad del receptor de células T: se aisló el ARN de los productos de infusión y se sometió a una PCR multiplex con cebadores específicos de VDJ. Las secuencias de<c>DR3 expresadas en el producto de TIL se amplificaron semicuantitativamente y se secuenciaron en profundidad para determinar la frecuencia y prevalencia de clones de TIL únicos. La secuenciación se realizó en el secuenciador de sobremesa Illumina MiSeq. Los valores se indexaron para producir una clasificación representativa de la diversidad relativa de receptores de células T en el producto.
Resultados
El día 22, el producto celular de volumen reducido se combinó y se tomaron muestras para determinar el rendimiento del cultivo antes del lavado y la formulación. Las Figuras 95A-95C muestran células viables totales, tasa de crecimiento y viabilidad. (A) Las muestras se analizaron en el contador de células automatizado NC-200 como se describió anteriormente. La densidad de células viables total se determina mediante la gran media de recuentos duplicados de 4 muestras independientes. El procedimiento de Gen 2 produjo un producto TIL de dosis similar a Gen 1 (media de Gen 1=4.10 * 1010 ± 2.8 * 1010, media de Gen 2=4.12 * 1010 ± 2.5 * 1010). (B) La tasa de crecimiento se calculó para la fase REP como. (C) La viabilidad celular se evaluó a partir de 9 lotes de desarrollo de procedimientos utilizando el Cellometer K2 como se describió anteriormente. No se observó una disminución significativa en la viabilidad celular después de un único ciclo de congelación-descongelación del producto formulado. La reducción media de la viabilidad tras el deshielo y el muestreo fue del 2.19%.
Las Figuras 96A-96C muestran que los productos Gen 2 son cultivos de células T altamente puros que expresan moléculas coestimuladoras a niveles comparables a los de Gen 1. (Figura 96A) Se ensayó la identidad de productos farmacéuticos recién formulados mediante citometría de flujo para su liberación. Los procedimientos de Gen 1 y Gen 2 producen cultivos de células T de alta pureza según lo definido por el fenotipo CD45+, CD3+ (doble positivo). (Figuras 96B y 96C) Se descongelaron viales satélite crioconservados de producto farmacológico formulado y se ensayó el fenotipo extendido mediante citometría de flujo como se describió previamente. Los productos Gen 1 y Gen 2 expresaron niveles similares de moléculas coestimuladoras CD27 y CD28 en subconjuntos de células T. Es posible que se requieran moléculas coestimuladoras como CD27 y CD28 para suministrar la señalización secundaria y terciaria necesaria para la proliferación de células efectoras tras el acoplamiento del receptor de células T. El valor de p se calculó utilizando la prueba 't' de Mann-Whitney.
La Figura 97 muestra que los productos Gen 2 tienden hacia un telómero relativo más largo. Longitudes. La tecnología Flow-FISH se utilizó para medir la longitud promedio de la repetición de los telómeros como se describió anteriormente. El valor RTL indicó que la fluorescencia media de los telómeros por cromosoma/genoma en Gen 1 fue del 7.5% ± 2.1%, y Gen 2 fue del 8.4% ± 1.8% de la fluorescencia del telómero por cromosoma/genoma en la línea de células de control (línea celular de leucemia 1301). Los datos indican que los productos Gen 2 tienen, en promedio, longitudes de telómero comparables a las de los productos Gen 1. La longitud de los telómeros es una medida sustituta de la longitud del cultivo celular ex vivo.
La Figura 98 muestra que los productos farmacológicos Gen 2 secretan IFN<y>en respuesta al acoplamiento de CD3, CD28 y CD137. Los productos farmacológicos crioconservados se descongelaron y se incubaron con perlas recubiertas de anticuerpo como se describió anteriormente. Los datos se expresan como la cantidad de IFNy producida por 5 x 105 células viables en 24 horas. Los productos farmacéuticos Gen 2 mostraron una mayor capacidad para producir IFN<y>tras la reactivación en relación con los productos farmacéuticos Gen 1. La capacidad del fármaco para reactivarse y secretar citocinas es una medida sustituta de la función in vivo tras la unión del TCR al antígeno similar en el contexto de HLA.
Las Figuras 99A y 99B muestran que los productos farmacológicos Gen 2 tienen una mayor diversidad de receptores únicos de células T. La diversidad del receptor de células T se evaluó como sigue. Se ensayó el ARN de 10x106 TIL de los productos de infusión de Gen 1 y Gen 2 para determinar el número total y la frecuencia de secuencias de CDR3 únicas presentes en cada producto. (Figura 99A) Se indexaron secuencias únicas de CDR3 en relación con la frecuencia en cada producto para producir una clasificación representativa de la diversidad global de receptores de células T en el producto. (Figura 99B) El número total promedio de secuencias de CDR3 únicas presentes en cada producto de infusión. Los productos TIL de ambos procedimientos se componían de poblaciones policlonales de células T con diferentes especificidades y avidez de antígenos. La amplitud del repertorio total de células T puede ser indicativa del número de epítopos procesables presentados en las células tumorales.
Conclusiones
El procedimiento de fabricación de Gen 2 produjo un producto de infusión de TIL (LN-144) con atributos de calidad comparables a los de Gen 1. Gen 2 produjo dosis similares de TIL de alta pureza. Los subconjuntos de células T estaban en proporciones similares y expresaron moléculas coestimuladoras en niveles comparables de Gen 1. Gen 2 TIL tendió hacia una longitud relativa más larga de los telómeros proporcional al período de cultivo ex vivo reducido. TIL Gen 2 mostró una mayor diversidad de receptores de TCR que, cuando se activaron, iniciaron una secreción robusta de IFN-y, una medida de la función efectora citolítica. Por lo tanto, el procedimiento de expansión cerrado de 22 días abreviado de Gen 2, con producto de infusión crioconservado, presenta una plataforma de fabricación de TIL escalable y logísticamente factible que permite la generación rápida de dosis a escala clínica para pacientes con cáncer que necesitan de inmediato una nueva opción de terapia.
Referencias
1 Dudley, M. E. et al. Adoptive cell transfer therapy following non-myeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma. J Clin Oncol 23, 2346-2357, doi:10.1200/JC0.2005.00.240 (2005).
2 Chandran, S. S. et al. Treatment of metastatic uveal melanoma with adoptive transfer of tumour-infiltrating lymphocytes: a single-centre, two-stage, single-arm, phase 2 study. Lancet Oncol, doi:10.1016/S1470-2045(17)30251-6 (2017).
3 Stevanovic, S. et al. Complete regression of metastatic cervical cáncer after treatment with human papillomavirustargeted tumor-infiltrating T cells. J Clin Oncol 33, doi:10.1200/jco.2014.58.9093 (2015).
4 FDA Reviewers and Sponsors: Content and Review of Chemistry, Manufacturing, and Control (CMC) Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications (INDs), 21 CFR 610.3(r), 2008.
5 Richards JO, Treisman J, Garlie N, Hanson JP, Oaks MK. Flow cytometry assessment of residual melanoma cells in tumor-infiltrating lymphocyte cultures. Cytometry A 2012; 81:374-81.
EJEMPLO 27:EL CÓCTEL DE FACTOR DE CRECIMIENTO DE CÉLULAS T IL-2/IL-15/IL-21 MEJORÓ LA FUNCIÓN DE EXPANSIÓN Y EFECTORA DE LAS CÉLULAS T INFILTRANTES DE TUMORES EN UN NUEVO PROCEDIMIENTO DESCRITO AQUÍ
Antecedentes
La terapia de células T adoptivas con TIL autólogos ha demostrado eficacia clínica en pacientes con melanoma metastásico y carcinoma cervical. En algunos estudios, los mejores resultados clínicos se han correlacionado positivamente con la cantidad total de células infundidas y/o el porcentaje de células T CD8+. La mayoría de los regímenes de producción actuales utilizan únicamente IL-2 para promover el crecimiento de TIL. Se ha informado una mayor expansión de linfocitos utilizando regímenes que contienen IL-15 e IL-21. Este estudio describe los efectos positivos y las sinergias de la adición de IL-15 e IL-21 a las formas de realización del procedimiento 2A y los procedimientos de fabricación de TIL de generación 2.
Generación de TIL usando un procedimiento nuevo descrito en este documento
El tumor se extirpa del paciente y se transporta a la instalación de fabricación con GMP o un laboratorio con fines de investigación. A su llegada, el tumor se fragmenta y se coloca en matraces con IL-2 para el protocolo de expansión previa (pre-REP) durante 11 días. Para los estudios de triple cóctel, se agregan iL-2, IL-15 e IL-21 (IL-2/IL-15/IL-21) al inicio del pre-REP. Para el Protocolo de expansión rápida (REP), se cultivan TIL con alimentadoras y anticuerpo anti-CD3 durante 11 días adicionales (Figura 100).
Materiales y procedimientos
El procedimiento de generación de TIL incluyó un protocolo de expansión previa rápida (pre-REP), en donde se colocaron fragmentos tumorales de 1-3 mm3 de tamaño en medio que contenía IL-2. Durante el pre-REP, TIL emigró de los fragmentos tumorales y se expandió en respuesta a la estimulación de IL-2.
Para estimular aún más el crecimiento de TIL, los TIL se expandieron durante un período de cultivo secundario denominado Protocolo de Expansión Rápida (REP) que incluía alimentadoras de PBMC irradiadas, IL-2 y anticuerpo anti-CD3. Se desarrolló un protocolo de expansión pre-REP y REP abreviado para expandir TIL mientras se mantenían los atributos fenotípicos y funcionales del producto TIL final. Este protocolo de generación de TIL abreviado se utilizó para evaluar el impacto de IL-2 sola frente a una combinación de IL2/IL-15/IL-21 añadida a la etapa pre-REP. Estos dos regímenes de cultivo se compararon para la generación de TIL cultivada a partir de tumores colorrectales, melanomas, cervicales, de mama triple negativo, pulmón y renales. Al finalizar el pre-REP, se evaluó la expansión, el fenotipo, la función (CD107a+ e Ip Ny) y el repertorio de TCR Vp de TIL cultivados.
El estudio muestra una mejora en la expansión durante el pre-REP con IL-2/IL-15/IL-21 en múltiples histologías tumorales. Los cultivos pre-REP se iniciaron utilizando el protocolo estándar de IL-2 (6000 UI/mL) o con IL-15 (180 UI/mL) e IL-21 (1 UI/mL) además de IL-2 (Figura 101). Se evaluó la expansión de las células al completar el pre-REP. Un cultivo se clasificó como con mayor expansión sobre la IL-2 si el crecimiento general se incrementó en al menos un 20%. Los estudios fenotípicos y funcionales del melanoma y del pulmón se analizan con más detalle en los siguientes párrafos (texto en negrita en la Figura 101).
La IL-2/IL-15/IL-21 aumentó el porcentaje de células CD8+ en el carcinoma de pulmón, pero no en el melanoma. En las Figuras 102A y 102B, TlL derivado de (A) melanoma (n=4) y (B) pulmón (n=7) se evaluaron fenotípicamente para células CD4+ y CD8+ usando citometría de flujo post pre-REP. El valor p representa la diferencia entre las condiciones de IL-2 e IL-12/IL-15/IL-21 utilizando la prueba t para datos no apareados de Student.
La expresión de CD27 mejoró ligeramente en células CD8+ en cultivos tratados con IL-2/IL-15/IL-21. En las Figuras 103A y 103B, los TlL derivados de (A) melanoma (n=4) y (B) pulmón (n=7) se evaluaron fenotípicamente para CD27+ y CD28+ en las células CD4+ y CD8+ usando citometría de flujo post pre-REP. La expresión de CD27, un marcador celular asociado con un fenotipo más joven que se ha correlacionado con los resultados de la terapia de células T adoptivas, mejoró ligeramente en CD8+ TlL derivados de cultivo con IL-2/IL-15/IL-21 frente a IL-2 sola.
Los subconjuntos de células T no se alteraron con la adición de IL-15/IL-21. En las Figuras 104A y 104B, los TlL se evaluaron fenotípicamente para los subconjuntos efector/memoria (CD45RA y CCR7) en las células CD8+ y CD4+ (datos no mostrados) de (A) melanoma (n=4) y (B) pulmón (n=8) mediante citometría de flujo post-REP.
TEM=memoria efectora (CD45RA-, CCR7-), TCM=memoria central (CD45RA-, CCR7+), TSCM=memoria de células madre (CD45RA+, CCR7+), TEMRA=células T efectoras (CD45RA+ CCR7-).
La capacidad funcional de los TIL se mejoró diferencialmente con IL-2/IL-15/IL-21. En las Figuras 105A y 105B, se evaluó la expresión de CD107a+ de los TIL derivados de (A) melanoma (n=4) y (B) pulmón (n=5) en respuesta a la estimulación de PMA durante 4 horas en las células CD4+ y CD8+, por citometría de flujo. (C) Se estimularon los TIL pre-REP derivados de melanoma y pulmón durante 24 horas con anticuerpo anti-CD3 soluble y se evaluó el IFNy en los sobrenadantes mediante e LiSa .
La frecuencia relativa del repertorio de TCRvp se alteró en respuesta a IL-2/IL-15/IL-21 en el pulmón, pero no en el melanoma. En las Figuras 106A y 106B, se evaluó el repertorio de TCRvp (24 especificidades) en los TIL derivados de un (A) melanoma y (B) tumor de pulmón usando el kit Beckman Coulter para citometría de flujo.
Resumen
Este trabajo demuestra la capacidad del cóctel IL-2/IL-15/IL-21 para mejorar los números de TIL en comparación con IL-2 sola (> 20%) en el procedimiento de Generación 2, además de impactar las caracteristicas fenotípicas y funcionales.
El efecto del cóctel triple sobre la expansión de TIL dependía de la histología. La relación de células T CD8+/CD4+ aumentó con la adición de IL-2/IL-15/IL-21 en tumores de pulmón. La adición de IL-15 e IL-21 aumentó la expresión de CD107a y la producción de IFN<y>en TIL derivados de tumores pulmonares. La adición de IL-2/IL-15/IL-21 alteró el repertorio de TCRvp en el pulmón. El procedimiento de expansión de TIL de Generación 2 se utilizó para abarcar el cóctel de citocinas IL-2/IL-15/IL-21, proporcionando así un medio para promover aún más la expansión de TIL en histologías tumorales específicas, como tumores pulmonares y colorrectales. Estas observaciones son especialmente relevantes para la optimización y estandarización de los regímenes de cultivo de TIL necesarios para la fabricación a gran escala de TlL con la amplia aplicabilidad y disponibilidad requeridas de una terapia contra el cáncer de corriente principal.
EJEMPLO 28:NUEVOS LINFOCITOS INFILTRANTES DE TUMOR CRIOCONSERVADOS (LN-144) ADMINISTRADOS A PACIENTES CON MELANOMA METASTÁSICO EFICACIA Y TOLERABILIDAD DEMOSTRADAS EN UN ENSAYO CLÍNICO MULTICENTRO FASE 2
Antecedentes
La seguridad y eficacia de la terapia celular adoptiva (ACT) que utiliza linfocitos infiltrantes de tumores (TlL) se ha estudiado en cientos de pacientes con melanoma metastásico y ha demostrado tasas de respuesta objetiva (TRO)1 significativas y duraderas. En un ensayo de fase 2 en curso, C-144-01 que utiliza la fabricación centralizada con GMP de TlL, se evaluaron tanto los procedimientos de fabricación de TlL de Generación 1 (Gen 1) no crioconservados como los de Generación 2 (Gen 2) crioconservados.
Gen 1 tiene alrededor de 5-6 semanas de duración de fabricación (administrado en la Cohorte 1 del estudio C-144-01), mientras que Gen 2 tiene 22 días de duración de fabricación (procedimiento 2A, administrado en Cohorte 2 de estudio C-144-01). Los datos preliminares de los pacientes de la Cohorte 1 infundidos con el producto fabricado Gen 1 LN-144 fueron alentadores en el tratamiento de pacientes con melanoma metastásico post-PD-1 ya que la terapia TlL produjo respuestas.2 Los beneficios de Gen 2 incluyeron: (A) reducción en el tiempo que los pacientes y los médicos esperan para infundir TlL al paciente; (B) la crioconservación permite flexibilidad en la programación, distribución y entrega; y (C) reducción de los costes de fabricación. Los datos preliminares de la Cohorte 2 se presentan en este documento. La Figura 107 muestra una forma de realización del procedimiento de fabricación de LN-144 crioconservado Gen 2 (procedimiento 2A).
Diseño de estudio: Ensayo de fase 2 C-144-01 en melanoma metastásico
Estudio de fase 2, multicéntrico, de 3 cohortes para evaluar la eficacia y seguridad de linfocitos infiltrantes de tumores autólogos (LN-144) para el tratamiento de pacientes con melanoma metastásico.
Criterios de inclusión clave: (1) Melanoma metastásico medible y > 1 lesión extirpable para la generación de TlL; (2) Progresión en al menos una línea previa de terapia sistémica; (3) Edad > 18; y (4) ECOG PS 0-1.
Cohortes de tratamiento: (1) producto LN-144 no crioconservado; (2) producto LN-144 crioconservado; y (3) Re tratamiento con LN-144 para pacientes sin respuesta o que progresan después de la respuesta inicial. La Figura 108 muestra el diseño del estudio.
Criterios de valoración: (1) Primario: Eficacia definida como ORR y (2) Secundario: Seguridad y eficacia.
Procedimientos
Conjunto de seguridad de la cohorte 2: 13 pacientes que se sometieron a extirpación con el propósito de generar TlL y recibieron cualquier componente del tratamiento del estudio.
Conjunto de eficacia de la cohorte 2: 9 pacientes que recibieron el preacondicionamiento de NMA-LD, la infusión de LN-144 y al menos una dosis de IL-2, y tuvieron al menos una evaluación de eficacia. 4 pacientes no tenían una evaluación de la eficacia en el momento del corte de datos.
Se han mostrado datos de biomarcadores para todos los datos disponibles leídos en la fecha del corte de datos.
Resultados
La figura 109 proporciona una tabla que ilustra las características de los pacientes de comparación de la cohorte 1 (ASCO 2017) frente a la cohorte 2. La cohorte 2 tiene: 4 terapias previas medianas; todos los pacientes han recibido previamente anti-PD-1 y anti-CTLA-4; y tenía una mayor carga tumoral reflejada por una mayor suma de diámetros (SOD) para las lesiones diana y una LDH media más alta al inicio del estudio. La Figura 110 proporciona una tabla que muestra los eventos adversos emergentes del tratamiento (> 30%).
Para la Cohorte 2 (LN-144 crioconservado), el producto de infusión y las características de la terapia TIL fueron (1) número medio de células TIL infundidas: 37 * 109, y (2) número mediano de administraciones de dosis de IL-2 fue 4.5. La Figura 111 muestra la eficacia del producto de infusión y la terapia TIL para los pacientes # 1 a #<8>.
La Figura 112 muestra el estado clínico de la respuesta de los pacientes evaluables con enfermedad estable (SD) o una mejor respuesta. No se confirmó una respuesta parcial (RP) para el Paciente<6>ya que el paciente aún no alcanzó la segunda evaluación de eficacia. Un paciente (Paciente 9) falleció antes de la primera evaluación (todavía se considera en el conjunto de eficacia).
De los 9 pacientes en el conjunto de eficacia, un paciente (Paciente 9) no fue evaluable (NE) debido a la muerte relacionada con el melanoma antes de la primera evaluación del tumor no representada en la Figura 112. Se observaron respuestas en pacientes tratados con Gen 2. La tasa de control de la enfermedad (DCR) fue del 78%. El tiempo de respuesta fue similar al de la Cohorte 1. Un paciente (Paciente 3) con enfermedad progresiva (EP) en calidad de mejor respuesta no se incluyó en el gráfico de carriles de natación.
La Figura 113 muestra el cambio porcentual en la suma de diámetros. El paciente 9 no tuvo una evaluación de la enfermedad posterior a LN-144 debido a la muerte relacionada con el melanoma antes del día 42. Día -14: % de cambio de la suma de diámetros desde el cribado hasta la línea de base (día -14). Día -14 al día 126: % de cambio de SOD desde el inicio. Día -14=Línea de base. Día 0=infusión de LN-144.
Tras el tratamiento con TIL, se observó un aumento de HMGB1 (Figura 114). Los niveles plasmáticos de HMGB1 se midieron usando el kit ELISA HMGB1 (Tecan US, Inc). Los datos mostrados representan el cambio de veces en los niveles de HMGB1 antes (día -7) y después (día 4 y día 14) de la infusión de LN-144 en pacientes de la Cohorte 1 y Cohorte 2 (los valores de p se calcularon usando la prueba t de dos colas emparejada basada en datos log transformados). El tamaño de la muestra (en negrita y en cursiva) y los valores medios (en cursiva) se muestran entre paréntesis para cada punto en el tiempo. La HMGB1 es secretada por células inmunitarias activadas y liberada por células tumorales dañadas. Los niveles aumentados de HMGB1 observados después del tratamiento con LN-144 sugieren, por lo tanto, un mecanismo de actividad antitumoral mediado por el sistema inmunitario.
Se midieron los niveles de IP-10 en plasma usando el ensayo Luminex. Los datos que se mostraron en la Figura 115 representan el cambio de veces en los niveles de IP-10 antes (día -7) y después (día 4 y día 14) de la infusión de LN-144 en pacientes de la Cohorte 1 y Cohorte 2 (los valores de p se calcularon usando prueba t emparejada de dos colas, basada en datos transformados logarítmicamente). El tamaño de la muestra (en negrita y en cursiva) y los valores medios (en cursiva) se mostraron entre paréntesis para cada punto en el tiempo. El aumento posterior a la infusión de LN-144 en IP-10 se está monitoreando para comprender la posible correlación con la persistencia de TIL.
Los datos actualizados de la cohorte 2 (n=17 pacientes) se informan en la Figura 116 a la Figura 121. En comparación con la Cohorte 1 y una forma de realización del procedimiento Gen 1, que mostró un DCR del 64% y una tasa de respuesta general (ORR) del 29% (N=14), la Cohorte 2 y una forma de realización del procedimiento Gen 2 mostraron una DCR del<8 0>% y ORR del 40% (N=10).
Conclusiones
Los resultados preliminares de los datos existentes demuestran una seguridad comparable entre los productos de TIL LN-144 de Gen 1 y Gen 2. La administración de TIL fabricados con el procedimiento Gen 2 (procedimiento 2A, como se describe en este documento) conduce a respuestas clínicas sorprendentemente aumentadas, observadas en pacientes con melanoma metastásico de enfermedad avanzada; todas habían progresado con terapias anteriores anti-PD-1 y anti-CTLA-4. La DCR para la cohorte 2 fue del 78%.
Los datos preliminares de biomarcadores apoyan el mecanismo de acción citolítico propuesto para la terapia con TIL.
La forma de realización del procedimiento de fabricación Gen 2 descrito en este documento dura 22 días. Este procedimiento acorta significativamente el tiempo que un paciente tiene que esperar para recibir su TIL, ofrece flexibilidad en el momento de la dosificación de los pacientes y conduce a una reducción del coste de fabricación, al tiempo que proporciona otras ventajas sobre los enfoques anteriores que permiten la comercialización y registro en las agencias reguladoras de la salud. Los datos clínicos preliminares en el melanoma metastásico utilizando una forma de realización del procedimiento de fabricación Gen 2 también indican una mejora sorprendente en la eficacia clínica de los TIL, medida por DCR, ORR y otras respuestas clínicas, con un tiempo de respuesta similar y un perfil de seguridad en comparación con TIL fabricados mediante el procedimiento Gen 1. La eficacia inesperadamente mejorada del producto TIL de Gen 2 también se demuestra por un aumento de más de cinco veces en la producción de IFN-<y>(Figura 98), que se correlaciona con una eficacia mejorada en general (Figura 122), una policlonalidad significativamente mejorada (Figura 99A y Figura 99B), y una producción promedio más alta de IP-1o y MCP-1 (Figura 123 a Figura 126). Sorprendentemente, a pesar del procedimiento mucho más corto de Gen 2, muchas otras características críticas del producto TIL son similares a las observadas usando procedimientos de fabricación más tradicionales, incluida la longitud relativa de los telómeros (Figura 97) y la expresión de CD27 y CD28 (Figura 96B y Figura 96C).
Referencias
1Goff, et al. Randomized, Prospective Evaluation Comparing Intensity of Lymphodepletion Before Adoptive Transfer of Tumor-Infiltrating Lymphocytes for Patients With Metastatic Melanoma. J Clin Oncol. 2016 Jul 10;34(20):2389-97.
2Sarnaik A, Kluger H, Chesney J, et al. Efficacy of single administration of tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) in heavily pretreated patients with metastatic melanoma following checkpoint therapy. J Clin Oncol. 2017; 35 [suppl; abstr 3045].
EJEMPLO 29:ESTUDIOS DE FASE 2 DE HNSCC Y CARCINOMA CERVICAL
Inscripción para el estudio de fase 2 del HNSCC (carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello; C-145-03).
13 pacientes dieron su consentimiento para el estudio, se recolectaron TIL de 10 pacientes y, finalmente, se infundió a 7 pacientes con 1 más en curso.
Inscripción en el estudio de fase 2 del carcinoma de cuello uterino (C-145-04). Ocho pacientes dieron su consentimiento para el estudio, se recolectaron TIL de 4 pacientes y finalmente se infundieron 2 pacientes y 2 más en desarrollo.
Los datos iniciales del estudio en curso se proporcionan en la Figura 127. Se observó enfermedad estable (SD) y/o respuesta progresiva tanto en pacientes con HCNSCC como en pacientes con cáncer de cuello uterino tratados con la terapia TIL hasta por 84 días.
EJEMPLO 30: PRODUCCIÓN DE UNA TERAPIA CELULAR DE TIL CRIOCONSERVADA
Este ejemplo describe la fabricación cGMP del proceso de terapia celular TIL de Iovance Biotherapeutics, Inc. en matraces G-Rex de acuerdo con las buenas prácticas de tejidos y las buenas prácticas de fabricación actuales.
Este material se fabricará según las normas de buenas prácticas de fabricación de la FDA de EE. UU. (21 CFR, partes 210, 211, 1270 y 1271) y las normas ICH Q7 aplicables desde la fase I hasta el material comercial.
4.0 REFERENCIA DEL PROCESO Plan de Expansión
4.2 Volúmenes de los matraces: Tipo de matraz de trabajo Volumen/matraz G-Rex100MCS 1000 G-Rex500MCS 5000
4.3 Procedimiento de inspección
4.3.1 El personal de fabricación realizará una inspección del 100% de las bolsas del producto final durante el proceso de llenado.
4.3.2 Preparar un recipiente rotulado "Falling Final Product Inspection".
4.3.3 Inspeccionar los siguientes atributos rechazables:
4.3.3.1 Partículas visibles gruesas (fibras, partículas que no son del mismo color que la suspensión, etc.) (NOTA: Las aglomeraciones celulares/tejidas no se consideran rechazos de partículas).
4.3.3.2 Defectos en la integridad de la bolsa, como costuras/puertos con fugas.
4.3.3.3 Sellado incompleto de la bolsa envolvente.
4.3.3.4 Sello con fugas.
4.3.3.5 Signo de grumos.
4.3.4 Inspeccionar los siguientes atributos de apariencia aceptables:
4.3.4.1 Bolsa intacta
4.3.4.2 No hay signos de grumos
4.3.5 Si no se observan atributos rechazables, devolver la bolsa del producto final al lote.
4.3.6 Si se observa algún atributo rechazable, etiquete la bolsa con la etiqueta "Producto rechazado" y coloque la bolsa en el contenedor de almacenamiento "Rechazado".
4.4 Diagrama de flujo del proceso (ver Figura 128)
5.0 NOTAS DEL PROCESO
5.1 Las impresiones que contengan los resultados finales de los datos informados deben adjuntarse a este Registro de lote en el área designada. Cada impresión debe estar etiquetada con el número de lote, el número de paso (si corresponde), las iniciales y la fecha. Si las impresiones no están disponibles, las lecturas deben registrarse manualmente en lugar de imprimirlas y con referencia a los comentarios en la sección de comentarios. Un segundo asociado deberá verificar los datos.
5.2 Los pasos del proceso se pueden realizar simultáneamente al obtener materiales, durante la configuración, las actividades posteriores al proceso o como se indique en la descripción de la etapa.
5.3 A lo largo de este Registro de lote, suponga que 1,0 mL/l = 1,0 g/kg, a menos que se especifique lo contrario.
5.4 Si se debe sustituir un material/consumible crítico en la sección 7.1, se hará un comentario en la sección 10.0 y se contactará a las personas apropiadas.
5.5 Redondee todos los datos a la décima de punto decimal más cercana (xx.x) o dentro de la tolerancia del equipo utilizado (excluye los datos impresos) a menos que se indique lo contrario en el registro del lote.
5.6 Si el equipo requiere calibración para más de un parámetro y esas fechas de vencimiento de calibración son diferentes, se registrará la fecha de vencimiento más temprana.
5.7 Todas las mediciones de CO2 registradas en este registro de lote se leerán desde un analizador de CO2 de Vaisala en League Island 1. Todas las mediciones de CO2 registradas en este registro de lote se leerán en la pantalla LED del Commerce Center 3.
5.8 Todas las incubadoras de League Island 1 serán humidificadas. Todas las incubadoras del Commerce Center 3 no serán humidificadas.
5.9 Una vez abierto, se aplican los siguientes vencimientos a 2-8 oC: Suero Humano, tipo AB (HI) Gemini, 1 mes; 2-mercaptoetanol, 1 mes. El sulfato de gentamicina, 50 mg/mL, se puede conservar a temperatura ambiente durante 1 mes. Las bolsas que contienen 10 litros de medio AIM-V se pueden calentar a temperatura ambiente una sola vez durante un máximo de 24 horas antes de su uso.
5.10 El número de recibo y el número de lote en Great Plains se registrarán en la Sección 7.1 Materiales/consumibles críticos en caso de que el número de lote de WuXi AppTec no esté asignado a los materiales. La combinación del número de recibo y el número de lote reemplazará el número de lote de WuXi AppTec para los nuevos materiales adquiridos en el futuro, como parte de la implementación y validación del sistema Great Plains.
5.11 Cuando utilice la soldadora TSCD para conexiones, siga las instrucciones impresas en el frente de la máquina. Asegúrese de que el tubo esté insertado correctamente como se indica en la máquina. Al cargar el tubo, asegúrese de que el tubo esté insertado de manera que no quede una soldadura anterior debajo de las abrazaderas del soldador (cuando sea posible). Además, asegúrese de que quede suficiente tubo para las etapas posteriores a la soldadura. Se debe colocar un hemostato a cada lado del tubo antes de comenzar el proceso de soldadura. Una vez finalizada la soldadura, inspeccione la soldadura para asegurarse de que esté sellada y uniforme alrededor del tubo. Pellizque o gire los dedos a lo largo de la conexión para abrir la soldadura y luego retire los hemostáticos.
5.12 Antes de utilizar el SEBRA® Sellador de tubos de mano todos los días, limpie e inspeccione el cabezal de sellado para garantizar un funcionamiento adecuado. Al utilizar el SEBRA® Sellador de tubos de mano para separar los tubos y crear tres sellos muy cerca uno del otro. Asegúrese de que el exterior del tubo esté seco para evitar arcos eléctricos. Separe o separe el tubo rompiendo el sello central, a menos que se indique lo contrario. No aplique fuerzas opuestas sobre el tubo para evitar la separación prematura del tubo durante los eventos de sellado. No intente volver a sellar un sello si el primer intento no tiene éxito. Si es necesario, realice "soldaduras de prueba" utilizando el sellador manual y evalúe el sellador manual según sea necesario.
5.13 Inspeccione minuciosamente todas las abrazaderas y hemostáticos en busca de fallas o daños que puedan resultar en una capacidad comprometida para detener adecuadamente el flujo o la posibilidad de dañar los tubos.
5.14 Si la notificación de Nucelocounter muestra que los recuentos 1 y/o 2 están por encima del rango de recuento óptimo (5x104 - 5x106 antes de contabilizar la dilución), N/A el resto de la página de recuento celular. Prepare otra muestra de solución celular, diluida con un factor de dilución apropiado ([nuevo factor de dilución] = [factor de dilución anterior] * [recuento de células informado] [5 * 105]) para obtener el VCD o "Células vivas" dentro del nivel óptimo. rango. Si los recuentos de células 1 y/o 2 están por debajo del rango óptimo (demasiado diluidos), se contactó con la administración del área, se registraron los recuentos de "células vivas" y se procedió con los cálculos. Asegúrese de documentar los recuentos de células fuera del rango óptimo en una nota a pie de página en cualquier situación.
5.15 Al registrar la información de recepción del tumor, asegúrese de que la hora de extirpación del tumor del paciente se convierta a la hora estándar del este (EST), si aún no está registrada, registrada como tal en el registro del lote de envío de tumores. El tiempo transcurrido desde la extracción del tumor del paciente hasta la recepción del tumor en el laboratorio debe calcularse en EST.
5.16 Durante la recolección del día 22, se pueden usar dos GatherexTM para recolectar el TIL de los matraces G-Rex500MCS. Ambas unidades pueden usarse para eliminar el sobrenadante y una de las dos unidades puede usarse para recolectar el TIL.
5.17 Durante todos las etapas del procesamiento, la cantidad mínima de personal permitida dentro de la sala de procesamiento de Grado B es dos y la cantidad máxima es diez (incluido el personal de procesamiento ambiental).
5.18 Al repartir alícuotas de reactivos de medios en volúmenes <1,0 mL, enjuague la pipeta después de la dispensación.
5.19 Los matraces se volverán a incubar durante el calentamiento del medio y en cualquier otro caso cuando no se estén procesando activamente. Los pasos de incubación sólo se registrarán al principio y al final de cada sección, cuando corresponda. En los días de procesamiento no programados, se podrá observar los matraces únicamente a título informativo, según gerencia del área o cliente, sin sanitizar la sala ni monitorear los equipos.
5.20 Una vez finalizado el procesamiento del día 0, disección del tumor, siembra e incubación del matraz, todos los fragmentos y piezas restantes del tumor deben descartarse de forma adecuada.
6.0 EQUIPO
Lista de equipo: Día 0 CM1 Preparación de medios/Preparación de lavado de tumores/Disección de tumores:
• Medidor magnético helicoidal
• Gabinete de Seguridad Biológica (BSC)
• Incubadora
• Analizador de CO2
Micropipeta (100-1000 j L)
Ayuda para pipetas
Bomba Repetidora Baxa
Sellador de tubos Sebra
Refrigerador de 2 a 8 °C
-80°C Congelador
-20°C Congelador
Temporizador
Lista de equipo: Preparación CM2/Día 11 Semilla REP
Medidor magnético helicoidal
Gabinete de Seguridad Biológica (BSC)
Incubadora
Incubadora
Analizador de CO2
Baño Seco
Baño de agua
citotermo
Soldador
Reunirex
NC200 NucleoContador
Bomba Repetidora Baxa
Equilibrio del sellador de tubos Sebra
Lista de equipo: Preparación CM2/Día 11 Semilla REP
Centrífugo
Micropipeta (100-1000 j L)
Ayuda para pipetas
Temporizador
Refrigerador de 2 a 8°C
-80°C Congelador
Congelador de tasa controlada
Congelador de almacenamiento de LN2 (cuarentena)
-20°C Congelador
Lista de equipo: Preparación CM4/Día 16
Medidor magnético helicoidal
Gabinete de Seguridad Biológica (BSC)
Incubadora
Incubadora
Analizador de CO2
Soldador
Soldador
Reunirex
NC200 NucleoContador
Bomba Repetidora Baxa
Equilibrio del sellador de tubos Sebra
Micropipeta (100-1000<j>L)
Ayuda para pipetas
Refrigerador de 2 a 8°C
-80°C Congelador
Lista de equipo: Día 22 Formulación, llenado, criopreservación
Medidor magnético helicoidal
Gabinete de Seguridad Biológica (BSC)
Incubadora
Incubadora
Analizador de CO2
Soldador
Reunirex
NC200 NucleoContador
Bomba Repetidora Baxa
Equilibrio del sellador de tubos Sebra
Micropipeta (20-200<j>L) Pipet-Aid
Lista de equipo: Día 22 Formulación, llenado, criopreservación
Ayuda para pipetas
Refrigerador de 2 a 8°C
-80°C Congelador
Congelador de tasa controlada
Congelador de almacenamiento LN2
Congelador de almacenamiento de LN2 (cuarentena)
Sistema de procesamiento celular LOVO
7.0 LISTA DE MATERIALES
Materiales: Día 0 CM1 Preparación del medio/Preparación del lavado del tumor/Tumor
Disección
Bisturíes desechables, estériles
Pipetas serológicas de 50 mL, estériles
Pipeta plástica serológica de 1 mL, estéril
Pipeta serológica de 10 mL, estéril
Tubo de Centrífuga, 50mL, 28x114mm, Base Cónica, Tapón de Rosca, PP, Estéril
Pipeta serológica de 25 mL, estéril
Pipeta serológica de 5 mL, estéril
Serie MF75, Filtro de cultivo de tejidos desechable, 1000 mL, Filtro aPES, 0,2 pm, Estéril
Pipetas Serológicas 100 mL
2-mercaptoetanol 1000X, líquido, 55 mM en D-PBS
Solución equilibrada de sal de sodio de Hank (1X), líquida, sin cloruro de calcio, cloruro de magnesio y sulfato de magnesio
GlutaMAX 1-200 mM (100X), líquido
Puntas de pipeta de barrera ART, 1000 pL, envueltas individualmente, estériles
Placa de Petri de 150 mm, extra profunda, estéril
Placas de fijación ultrabajas de 6 pocillos, área de crecimiento de pocillos de 9,5 cm2, PS, estériles Pipetas de transferencia de uso general Thermo Scientific Samco. 7,7 mL, estéril
Bomba repetidora Juego de transferencia de fluido Extremo Luer Lock macho
Pinzas largas de 8", estériles
Sulfato de gentamicina, caldo de 50 mg/mL
Pinzas científicas desechables, 4.5", acero inoxidable, estériles
Placa de Petri de 100 mm, profundidad extra estéril
Sistema dispensador de líquidos Pumpmatic
Sulfato de gentamicina, caldo de 50 mg/mL
Tapa de jeringa de doble función, roja
RPMI-1640, botella de 1 litro
Sistema cerrado de matraz G-Rex 100M
Reglas estériles
IL-2 reconstituida
Muestra de tumor humano, cabeza y cuello □ N/A
Muestra de tumor humano, cervical □ N/A
GemCell Human Serum AB, inactivado por calor □ N/A
Muestra de tumor humano, melanoma
GemCell Human Serum AB, inactivado por calor
Materiales: Preparación CM2/Día 11 Semilla REP
Jeringa Luer-Lok, aguja estéril de 60 mL, 16 G * 1,5" estéril
Pipetas serológicas de 50 mL, estériles
Plástico serológico de 1 mL, pipeta, estéril
Viales criotubos con rosca interna Nunc, estériles
Pipeta serológica de 10 mL, estéril
Tubo de centrífuga, 15 mL
Tubo de centrífuga, 50 mL
Pipetas Serológicas 100 mL
Jeringa, 1 cc Luer-Lok estéril
Jeringa de 3 mL, punta Luer-Lok, estéril
Pipeta serológica de 5 mL, estéril
Receptor de unidad de filtro serie Nalgene *MF75*, 250 mL, estéril
Receptor de unidad de filtro Nalgene serie MF75, 500 mL, estéril
Unidad de filtro desechable estéril de flujo rápido Nalgene de 1000 mL, PES de 0,22 pm CrioStor CS-10
2-mercaptoetanol 1000X Líquido, 55 mM en D-PBS
GlutaMAX 1-200 mM (100X), líquido
Puntas de pipeta estériles de barrera ART de 1000 pL, envoltorio individual Casetes VIA1
Contenedor de paquete de transferencia, 1000 mL con acoplador, estéril Paquete de transferencia de 300 mL con acoplador
Almohadillas estériles con alcohol
Juego de transferencia de fluido con bomba repetidora, extremos macho Luer Lock Botella CTS AIM V 1L
MACS GMP CD3 puro (OKT-3)
Sulfato de gentamicina, caldo de 50 mg/mL
Tubo de 4" con pasador perforador y adaptador de jeringa
Jeringa Solo Luer-Lok 10 mL
Tubería, colector Luer macho de cuatro puntas
Set de administración de sangre por gravedad tipo Y sin lugar de inyección, filtro de sangre de 170 |jm Sistema dispensador de líquidos Pumpmatic
Bolsa Labtainer de 3 puertos de 10 litros
Sulfato de gentamicina, stock de 50 mg/mL
Jeringa de 100 mL
Bolsa de cultivo de 3000 mL
Origen Cell Connect CC2
Tapa de jeringa doble función roja
RPMI-1640, botella de 1 litro
Sistema cerrado de matraz G-Rex 500M
IL-2 reconstituida
Células alimentadoras irradiadas alogénicas
Células alimentadoras irradiadas alogénicas
Suero Humano, tipo AB(HI) Géminis
Suero Humano, tipo AB(HI) Géminis
Materiales: Preparación CM4/Día 16
Jeringa Luer-Lok, 60 mL estéril
Pipeta plástica serológica de 1 mL, estéril
Viales de cirotubo con rosca interna Nunc, estériles
Pipetas serológicas de 10 mL, estériles
Tubo de centrífuga, 15 mL
Tubo de centrífuga, 50 mL
Pipetas Serológicas 100 mL
Jeringa con Luer-Lock, estéril, 3 mL
Pipeta serológica de 5 mL, estéril
Solo jeringa Luer-Lok 10 mL
Serie Nalgene *MF75*
Receptor de unidad de filtro, 250 mL, estéril
GlutaMAX1-200 mM (100X), líquido
Puntas de pipeta de barrera ART, 1000 jL , envueltas individualmente, estériles
Casetes VIA1
Materiales: Preparación CM4/Día 16
Contenedor de paquete de transferencia, 1000 mL con acoplador, estéril
Almohadillas estériles con alcohol
Juego de transferencia de fluido con bomba repetidora, extremos macho Luer Lock CTS AIM-V 1000 mL □ N/A
Juego de transferencia de plasma Tubo de 4" con adaptador Luer hembra Jeringa estéril Luer-Lok de 30 mL
Bolsa CTS AIM V 10L
Sistema dispensador de líquidos Pumpmatic
Bolsa Labtainer de 10L y 3 puertos
Tapa de jeringa doble función roja
Sistema cerrado de matraz G-Rex500M
IL-2 reconstituida
Materiales: Día 22 Formulación, llenado, criopreservación
Jeringa Luer-Lok, 60 mL estéril
Aguja 16G * 1,5" Estéril
Pipetas serológicas de 50 mL, estériles
Viales de criotubos con rosca interna Nunc, estériles
Pipeta serológica de 10 mL, estéril
Tubo de centrífuga, 15 mL
Tubo de centrífuga, 50 mL
Jeringa, Luer-Lok estéril de 1 cc
Jeringa de 3 mL, punta Luer-Lok, estéril
Pipeta serológica de 25 mL, estéril
Pipeta serológica de 5 mL, estéril
Solo jeringa Luer-Lok 10 mL
Pipetas Serológicas 100 mL
Puntas de pipeta estériles ART Barrier, envoltura individual de 200 pL
VIA1-Casettes
Plasma-Lyte A Inyección 1L
Juego desechable para lavado de células LOVO
Kit de bolsa auxiliar LOVO
Almohadillas estériles con alcohol
Juego de transferencia de fluido con bomba repetidora, extremos macho Luer Lock Botella CTS AIM V 1L
Albúmina humana 25 %
Juego de transferencia de plasma Tubo de 4" con adaptador Luer hembra Tubería, colector Luer de cuatro machos
Administración de sangre por gravedad
Conjunto tipo Y sin lugar de inyección, filtro de sangre de 170 |jm
Sistema dispensador de líquidos Pumpmatic
Bolsa Labtainer de 3 puertos de 10 litros
Jeringa de 100 mL
Bolsa criogénica CS750
Bolsa de cultivo de 3 litros
Origen Cell Connect CC2
Tapa de jeringa doble función roja
Cryostor CS10, bolsa de 100 mL
Pico dispensador, ventilado
IL-2 reconstituida
8.0 Proceso
PASO DESCRIPCIÓN INFORMACIÓN DEL PROCESO PRIMARIO
8.1 Preparación del medio CM1 del día 0
8.1.1 Se revisó la higienización de la sala, la limpieza de líneas y los materiales. Higienización de habitaciones confirmada,
8.1.2 Aseguró la finalización de la mesa de preprocesamiento.
8.1.3 Monitoreo Ambiental. Antes del procesamiento, se había iniciado un monitoreo ambiental previo al proceso.
8.1.4 Medio RPMI 1640 preparado En el BSC, utilizando una pipeta del tamaño adecuado, se extrajeron 100,0 mL de 1000 mL de medio RPMI 1640 y se colocaron en un recipiente del tamaño adecuado con la etiqueta "Residuos".
8.1.5 En el BSC se agregaron reactivos a la botella de medio RPMI 1640. Se agregaron los siguientes reactivos a la botella de medio RPMI 1640 como se muestra en la tabla. Se agregaron volúmenes grabados.
Cantidad agregada por botella: suero AB humano inactivado por calor (100,0 mL); GlutaMax (10,0 mL); Sulfato de gentamicina, 50 mg/mL (1,0 mL); 2-mercaptoetanol (1,0 mL)
8.1.6 Técnica mixta. Se tapó la botella de medio RPMI 1640 de la etapa 8.1.5 y se agitó la botella para garantizar que los reactivos se mezclaran completamente.
8.1.7 Medios RPMI filtrados. Medio filtrado RPMI 1640 desde el paso 8.1.6 hasta la unidad de filtro de 1 litro de 0,22 micrones.
8.1.8 Medios filtrados etiquetados. Se tapó asépticamente el medio filtrado y se etiquetó con la siguiente información.
8.1.9 Se eliminaron materiales innecesarios del BSC. Se repartieron los reactivos de los medios del BSC, se dejaron el sulfato de gentamicina y el HBSS en el BSC para la preparación del medio de lavado formulado en la Sección 8.2.
8.1.10 Consumibles no utilizados almacenados. Se transfirieron los reactivos de medios abiertos/descongelados restantes a condiciones de almacenamiento adecuadas o se eliminaron como residuos.
NOTA: Se le asignó la fecha de vencimiento abierta adecuada a los reactivos de medios según la Nota de proceso 5.9 y se le asignó el número de lote de registro de lote.
8.1.11 Alícuota de IL-2 descongelada. Descongelar una alícuota de IL-2 de 1,1 mL (6x106 UI/mL) (BR71424) hasta que todo el hielo se haya derretido. IL-2 grabado: Número de lote y vencimiento (NOTA: Se aseguró que la etiqueta IL-2 estuviera adjunta).
8.1.12 Se transfirió la solución madre de IL-2 al medio. En el BSC, transfirió 1,0 mL de solución madre de IL-2 al frasco de medio CM1 Día 0 preparado en el paso 8.1.8. Se agregó CM1 Día 0 Medio 1 frasco e IL-2 (6*10® UI/mL) 1,0 mL.
8.1.13 Mezclado y Reetiquetado. Se tapó y se agitó la botella para mezclar los medios que contenían IL-2. Se volvió a etiquetar como "Medio CM1 completo del día 0" y se le asignó un nuevo número de lote.
8.1.14 Medios de muestra por plan de muestra. Se retiraron 20,0 mL de medio con una pipeta del tamaño adecuado y se dispensaron en un tubo cónico de 50 mL.
8.1.15 Etiquetado y almacenado. Muestra etiquetada con la etiqueta de inventario del plan de muestra y muestra almacenada como "Retención de medios" a 2-8 °C hasta que se envíe a Iniciar sesión para realizar pruebas según el plan de muestra.
8.1.16 Firmado para muestreo. Se aseguró de que se completara la hoja del plan de muestra de LIMS para la extracción de la muestra.
8.1.17 Tubo cónico "Piezas de tejido" preparado. En BSC, transfirió 25,0 mL de "Medio completo CM1 día 0" (preparado en el paso 8.1.13) a un tubo cónico de 50 mL. Etiquetó el tubo como "Piezas de tejido" y registró el número de lote.
8.1.18 Se pasó G-Rex100MCS al BSC. Se pasó asépticamente G-Rex100MCS (W3013130) al BSC.
8.1.19 G-Rex100MCS preparado. En el BSC, cierre todas las abrazaderas del G-Rex100MCS, dejando abierta la abrazadera del filtro de ventilación.
8.1.20 G-Rex100MCS preparado. Conectó la línea roja del matraz G-Rex100MCS al extremo de mayor diámetro del conjunto de transferencia de fluido de la bomba repetidora (W3009497) mediante una conexión luer.
8.1.21 Bomba Baxa preparada. Bomba Baxa en escena junto al BSC. Se quitó la sección de tubería de la bomba del conjunto de transferencia de fluido de la bomba repetidora del BSC y se instaló en la bomba repetidora. 8.1.22 Preparado para bombear medios. Dentro del BSC, extrajo la jeringa del sistema dispensador de líquidos Pumpmatic (PLDS) (W3012720) y la descartó.
NOTA: Garantizado para no comprometer la esterilidad de la pipeta PLDS.
8.1.23 Preparado para bombear medios. Se conectó la pipeta PLDS al extremo de menor diámetro del conjunto de transferencia de fluido de la bomba repetidora mediante una conexión luer y se colocó la punta de la pipeta en "Medio completo CM1 Día 0" (preparado en el paso 8.1.13) para la aspiración.
Se abrieron todas las abrazaderas entre los medios y el G-Rex100MCS.
8.1.24 Se bombeó medio CM1 completo al matraz G-Rex100MCS. Establezca la velocidad de la bomba en "Alta" y "9" y bombee todos los medios completos CM1 Día 0 al matraz G-Rex100MCS. Una vez que se transfirieron todos los medios, limpió la línea y detuvo la bomba.
8.1.25 Bomba desconectada del matraz. Se aseguró de que todas las abrazaderas del matraz estuvieran cerradas, excepto el filtro de ventilación. Se quitó el conjunto de transferencia de fluido de la bomba repetidora de la línea de medio roja y se colocó una tapa roja (W3012845) en la línea de medio roja.
8.1.26 Sello calentado. Se retiró el matraz G-Rex100MCS del BSC, se calentó el sello (según la Nota de proceso 5.12) de la tapa roja de la línea roja cerca del terminal luer.
8.1.27 Etiquetado G-Rex100MCS. Matraz G-Rex100MCS etiquetado con control de calidad proporcionado durante el proceso con la etiqueta "Día 0". Adjuntamos una etiqueta de muestra del "Día 0" a continuación.
8.1.28 Incubadora monitoreada. Parámetros de la incubadora: Pantalla LED de temperatura: 37,0 ± 2,0 °C; Porcentaje de CO2: 5,0±1,5 %CO2
8.1.29 Medios calentados. Colocó el tubo cónico de 50 mL con la etiqueta "Fragmentos de tejido" preparado en el paso 8.1.17 y el G-Rex100MCS preparado en el paso 8.1.27 en la incubadora durante > 30 minutos de calentamiento.
Tiempos de calentamiento registrados a continuación. Se registra si el tiempo de calentamiento fue > 30 minutos (Sí/No).
[Fragmentos de Tejido Cónicos o GRex100MCS]
8.1.30 Se revisó la Sección 8.1.
8.2 Preparación del medio de lavado de tumores del día 0
8.2.1 Se agregó gentamicina al HBSS. En el BSC, se agregaron 5,0 mL de gentamicina (W3009832 o W3012735) a 1 botella de medio HBSS de 500 mL (W3013128). Volúmenes grabados. Añadido por botella: HBSS (500,0 mL); Sulfato de gentamicina, 50
mg/mL (5,0 mL)
8.2.2 Botella de HBSS tapada y agitada. HBSS tapado que contiene gentamicina preparado en la Etapa 8.2.1 y frasco agitado para garantizar que los reactivos se mezclen bien.
8.2.3 Solución filtrada. HBSS filtrado que contiene gentamicina preparado en la Etapa 8.2.1 a través de una unidad de filtro de 1 litro de 0,22 micras (W1218810).
8.2.4 Tapar asépticamente el medio filtrado y etiquetarlo. Se tapó asépticamente el medio filtrado y se etiquetó con la siguiente información. Continuó con la SECCIÓN 8.3.
8.2.5 Sección revisada 8.2.
8.3 Procesamiento del tumor del día 0
8.3.1 Tumor obtenido. Se obtuvo una muestra de tumor de QAR y se transfirió a la suite a 2-8 °C inmediatamente para su procesamiento. Se aseguró de que toda la información necesaria esté registrada en el Registro de lote de envío de tumores.
8.3.2 Información del tumor registrada.
8.3.3 Etiqueta de tumor adherida. Adjunto tumoral fijado. Etiqueta de lanzamiento QAR a continuación. Adjunto registro de lote de envío de tumores como n.° 5.
8.3.4 Se pasan los materiales necesarios para la disección del tumor al BSC.
8.3.5 Materiales abiertos. Se abrieron todos los materiales dentro del BSC, asegurándose de no comprometer la esterilidad de los artículos.
8.3.6 Materiales etiquetados. Se etiquetaron tres tubos cónicos de 50 mL: el primero como "Pinzas", el segundo como "Bisturí" y el tercero como "Medio de lavado de tumores frescos". Placas de Petri de 5 * 100 mm etiquetadas como "Lavado 1", "Lavado 2", "Lavado 3", "Retención" y "Desfavorable". Se etiquetó una placa de 6 pocillos como "Fragmentos intermedios favorables".
8.3.7 Medios de lavado de tumores en alícuotas. Utilizando una pipeta del tamaño adecuado, transfirió 5,0 mL de "Medio de lavado de tumores" preparado en el paso 8.2.4 a cada pocillo de una placa de 6 pocillos para obtener fragmentos tumorales intermedios favorables (30,0 mL en total). NOTA: Las pinzas y los bisturíes se almacenaron en sus respectivos medios cónicos de lavado de tumores según fuera necesario durante los procesos de disección y lavado de tumores.
8.3.8 Medios de lavado de tumores en alícuotas. Utilizando una pipeta del tamaño adecuado, transfirió 50,0 mL de "Medio de lavado de tumores" preparado en la Etapa 8.2.4 a cada placa de Petri de 100 mm para "Lavado 1", "Lavado 2", "Lavado 3" y "Retención" (200,0 mL total).
8.3.9 Medios de lavado de tumores en alícuotas. Usando una pipeta del tamaño adecuado, transfiera 20,0 mL de "Medios de lavado de tumores" preparado en el paso 8.2.4 a cada 50 mL cónico (60,0 mL en total).
8.3.10 Tapas preparadas para piezas tumorales. Se retiraron asépticamente las tapas de dos placas de 6 pocillos. Las tapas se utilizaron para piezas tumorales seleccionadas. NOTA: Durante el procesamiento del tumor, NO cruzó placas ni tapas de cultivo de tejidos abiertas.
8.3.11 Pasó el tumor al BSC. Pasó asépticamente el tumor al BSC. Hora de inicio del procesamiento registrada.
8.3.12 Lavado de tumor 1 Con unas pinzas de 8" (W3009771), extrajo el tumor del frasco de muestra y lo transfirió al plato de "Lavado 1" preparado en la Etapa 8.3.8.
NOTA: Se retuvo la solución en el frasco de muestra.
8.3.13 Lavado de tumores 1 Con unas pinzas, lave suavemente la muestra del tumor del cronómetro siguiente: y déjela reposar durante > 3 minutos. Tiempo de lavado registrado (MM:SS).
8.3.14 Muestra de carga biológica preparada según plan de muestreo. Se transfirieron 20,0 mL (o volumen disponible) de solución del frasco de muestra de tumor a un plan cónico de 50 mL por muestra.
8.3.15 Muestra etiquetada y almacenada. Etiquetado con la etiqueta del inventario del plan de muestreo y muestra de carga biológica almacenada recolectada en la Etapa 8.3.14 a 2-8 °C hasta que se envíe para su análisis.
8.3.16 Firmado para muestreo. Se aseguró de que se completara la hoja del plan de muestra de LIMS para la extracción de la muestra.
8.3.17 Lavado de tumores 2. Usando un nuevo juego de fórceps se eliminó el tumor del plato "Lavado 1" y se transfirió al plato "Lavado 2" preparado en la Etapa 8.3.8.
8.3.18 Lavado de tumores 2. Con unas pinzas, lavó la muestra del tumor agitando suavemente durante > 3 minutos y la dejó reposar. Tiempo grabado.
8.3.19 Gotas preparadas de Tumor Wash Media para las piezas de tumor deseadas. Usando una pipeta de transferencia, coloque 4 gotas individuales de Tumor Wash Media del cónico preparado en la Etapa 8.3.9 en cada uno de los 6 círculos en las tapas volteadas hacia arriba de las placas de 6 pocillos (2 tapas). Coloqué una gota adicional en dos círculos para un total de 50 gotas.
8.3.20 Lavado de tumores 3. Con unas pinzas, se extrajo el tumor del plato "Lavado 2" y se transfirió al plato "Lavado 3" preparado en la Etapa 8.3.8.
8.3.21 Lavado de tumores 3. Con unas pinzas, se lavó la muestra del tumor agitándola suavemente y se dejó reposar durante > 3 minutos. Tiempo grabado.
8.3.22 Plato de disección de tumores preparado. Coloqué una regla debajo de la tapa del plato de 150 mm.
8.3.23 Tumor transferido al plato de disección. Usando fórceps, transfirió asépticamente la muestra del tumor a la tapa del plato de disección de 150 mm.
8.3.24 Tumor medido. Se dispusieron todas las piezas de la muestra de tumor de extremo a extremo y se registró la longitud total aproximada y el número de fragmentos. Tomó una imagen clara de cada muestra de tumor.
8.3.25 Tumor evaluado. Se evaluó el tumor en busca de tejido necrótico/graso. Se evaluó si se observaba que > 30 % de toda el área del tumor era tejido necrótico y/o graso; En caso afirmativo, se comunicó con la administración del área para asegurarse de que el tumor tuviera el tamaño adecuado y luego procedió al Etapa 8.3.26. Se evaluó si se observó que <30 % de toda el área del tumor era tejido necrótico o graso; En caso afirmativo, procedió al Etapa 8.3.27 y NO se realizó la disección de limpieza.
8.3.26 Si corresponde: Disección de limpieza. Si el tumor era grande y se observó que >30 % del exterior del tejido era necrótico/graso, se realizó una "disección de limpieza" eliminando el tejido necrótico/graso mientras se preservaba la estructura interna del tumor utilizando una combinación de bisturí y/o fórceps. NOTA: Para mantener la estructura interna del tumor, se utiliza únicamente presión de corte vertical. No cortó con un movimiento de sierra con bisturí. NOTA: Se colocaron tejidos grasos, necróticos y extraños en un plato desfavorable.
8.3.27 Diseccion del tumor Utilizando una combinación de bisturí y/o fórceps, corte la muestra del tumor en fragmentos uniformes y de tamaño adecuado (hasta 6 fragmentos intermedios). NOTA: Para mantener la estructura interna del tumor, utilice únicamente presión de corte vertical. No cortó con un movimiento de sierra con bisturí. NOTA: Se aseguró de mantener los fragmentos intermedios no disecados completamente sumergidos en "Medios de lavado de tumores" (preparados en el paso 8.2.4).
8.3.28 Fragmentos tumorales intermedios transferidos. Se transfirió cada fragmento intermedio al plato de "retención" de la Etapa 8.3.8.
8.3.29 Fragmentos de tumor disecados. Manipuló un fragmento intermedio a la vez, diseccionó el fragmento intermedio del tumor en el plato de disección en trozos de aproximadamente 3x3x3 mm de tamaño, minimizando la cantidad de tejidos hemorrágicos, necróticos y/o grasos en cada trozo. NOTA: Para mantener la estructura interna del tumor, se utiliza únicamente presión de corte vertical. No cortó con un movimiento de sierra con bisturí.
8.3.30 Piezas de tumor seleccionadas. Se seleccionan hasta ocho (8) piezas tumorales sin tejido hemorrágico, necrótico y/o graso. Usé la regla como referencia. Continuar con la disección hasta obtener 8 piezas favorables o disecar todo el fragmento intermedio. Transfirió cada pieza seleccionada a una de las gotas de "Tumor Wash Media" preparada en la Etapa 8.3.19.
8.3.31 Fragmentos intermedios almacenados para evitar el secado. Después de seleccionar hasta ocho (8) piezas del fragmento intermedio, se colocaron los restos del fragmento intermedio en un nuevo pocillo único de la placa de 6 pocillos "Fragmentos intermedios favorables" preparada en el paso 8.3.7. NOTA: Se colocó tejido graso o necrótico en el plato "Desfavorable" (preparado en el paso 8.3.6).
8.3.32 Disección repetida de fragmentos intermedios. Se procedió al siguiente fragmento intermedio, se repitieron las etapas 8.3.29-8.3.31 hasta que se procesaron todos los fragmentos intermedios y se obtuvieron bisturís y fórceps nuevos según fuera necesario.
8.3.33 Número determinado de piezas recolectadas. Si queda tejido deseable, seleccione Piezas de tumor favorables adicionales de la placa de 6 pocillos "fragmentos intermedios favorables" para llenar las gotas hasta un máximo de 50 piezas. Se registró el número total de piezas disecadas creadas. NOTA: Asegurarse de mantener los fragmentos intermedios del tumor hidratados con medio de lavado según sea necesario durante la disección. Registrada Cantidad total de piezas disecadas recolectadas.
8.3.34 Se retiró el tubo cónico de la incubadora. Se retiró el tubo cónico de 50 mL "Piezas de tejido" de la incubadora. Tiempo registrado en la Etapa 8.1.29. Se aseguró que el tubo cónico se calentara durante >30 min.
8.3.35 Tubo cónico preparado. Se pasaron "piezas de tejido" cónicas de 50 mL al BSC, asegurando no comprometer la esterilidad de las superficies de procesamiento abiertas.
8.3.36 Piezas de tumor transferidas a un tubo cónico de 50 mL. Usando una pipeta de transferencia, bisturí, fórceps o una combinación, transfirió los 50 mejores fragmentos de tumores seleccionados de las tapas de los platos favorables al tubo cónico de 50 mL "Piezas de tejido".
NOTA: Si se cayó un trozo de tumor durante la transferencia y queda tejido deseable, se agregaron trozos adicionales de los pocillos de fragmentos intermedios del tumor favorables. Números registrados de piezas.
8.3.37 BSC preparado para G-REX100MCS. Se eliminaron todos los elementos innecesarios del BSC para la semilla de recipientes, conservando las placas de tejido favorables si contenían fragmentos adicionales.
8.3.38 Se eliminó el G-REX100MCS de la incubadora. Se eliminó el medio que contenía G-Rex100MCS de la incubadora. Etapa 8.1.29 completado.
8.3.39 Se pasó el matraz al BSC. Se pasó asépticamente el matraz G-Rex100MCS al BSC. NOTA: Al transferir el matraz, no lo sujete por la tapa ni por el fondo del recipiente. Transfirió el barco manipulando los costados. NOTA: Solo se utilizaron toallitas IPA al manipular matraces G-Rex.
8.3.40 Se agregaron fragmentos de tumor al matraz G-Rex100MCS. En el BSC, se levantó la tapa del matraz G-Rex100MCS, asegurando que se mantuviera la esterilidad del tubo interno.
Se agitó el tubo cónico con trozos de tumor para suspender y se vertió rápidamente el contenido en el matraz G-Rex100MCS.
8.3.41 Piezas distribuidas uniformemente. Se aseguró de que los trozos de tumor se distribuyeran uniformemente a través de la membrana del matraz. Inclinó suavemente el matraz hacia adelante y hacia atrás si era necesario para distribuir uniformemente las piezas del tumor.
8.3.42 Número total registrado de fragmentos de tumor en el recipiente. Número registrado de fragmentos de tumor en la membrana inferior del recipiente y número de fragmentos observados flotando en el recipiente. NOTA: Si la cantidad de fragmentos sembrados NO fue equivalente a la cantidad de fragmentos recolectados en la Etapa 8.3.36H, comuníquese con la Gerencia del Área y documente en la Sección 10.0.
8.3.43 Incubar el matraz G-Rex G-Rex100MCS incubado con los siguientes parámetros: Matraz G-Rex incubado: Pantalla LED de temperatura: 37,0 ± 2,0 °C; Porcentaje de CO2: 5,0±1,5 %CO2
8.3.44 Ventana de incubación calculada. Se realizaron cálculos para determinar el momento adecuado para retirar la incubadora G-Rex100MCS el día 11. Cálculos: Tiempo de incubación; límite inferior = tiempo de incubación 252 horas; límite superior = tiempo de incubación 276 horas
8.3.45 Monitoreo Ambiental. Después del procesamiento, se realizó un BSC verificado y un seguimiento del personal.
8.3.46 Materiales desechados. Los medios restantes sin calentar se almacenaron a 2-8 °C y se etiquetaron. Una vez completado el proceso, se descartó cualquier medio calentado restante y se descongelaron alícuotas de IL-2.
8.3.47 Envío de muestras. Se aseguró de que todas las muestras del día 0 se enviaran al inicio de sesión y se transfirieran a LIMS.
8.3.48 Revisar la Sección 8.3.
8.4 Día 11: Preparación de los medios
8.4.1 Sala revisada, sanitización, limpieza de líneas y materiales. Se confirmó la sanitización de la habitación, la limpieza de líneas y que los materiales están dentro de plazo de caducidad.
8.4.2 Tabla de preprocesamiento. Lista de equipo: BSC; Balance; Sellador de tubos Sebra; Reunirex™ Dispositivo de eliminación de medios y recuperación de células; Asegúrese de que el cartel proporcionado por Q<a>esté colocado en el BSC correspondiente; Asegúrese de que el número de lote del cartel proporcionado por QA y la identificación del paciente coincidan con el número de lote y la identificación del paciente en este registro de lote.
8.4.3 Incubadora monitoreada. Incubadora monitoreada. Parámetros de la incubadora:
Pantalla LED de temperatura: 37,0 ± 2,0 °C; Porcentaje de CO2: 5,0±1,5 %CO2. NOTA: La sección 8.4 puede ejecutarse simultáneamente con la sección 8.5.
8.4.4 Medios calentados. Se calentaron 3 frascos de medio RPMI 1640 de 1000 mL (W3013112) y 3 frascos de AIM-V (W3009501) de 1000 mL en una incubadora durante > 30 minutos. Tiempo grabado. Medios de comunicación: RPMI 1640 y AIM-V NOTA: Colocó una botella adicional de 1x1000 mL de AlM-V Media (W3009501) a temperatura ambiente para su uso en la Etapa 8.5.34. Etiquetó la botella como "Solo para diluciones de recuento celular" y el número de lote del registro del lote.
8.4.5 Monitoreo ambiental. Antes del procesamiento, se realizó un monitoreo ambiental previo al proceso garantizado según SOP-00344.
8.4.6 Se eliminó el medio RPMI 1640 de la incubadora. Se eliminó el medio RPMI 1640 cuando llegó el tiempo. Registre el tiempo de incubación final en la Etapa 8.4.4. Asegúrese de que los medios se hayan calentado durante >30 min.
8.4.7 Medios RPMI 1640 preparados. En el BSC, se retiraron 100,0 mL de cada una de las tres botellas de medio RPMI 1640 de 1000 mL precalentadas y se colocaron en un recipiente del tamaño adecuado con la etiqueta "Residuos".
8.4.8 En BSC, agregue reactivos a la botella de medio RPMI 1640. En el BSC se agregaron los siguientes reactivos a cada una de las tres botellas de medio RPMI 1640. Volúmenes registrados agregados a cada botella. Suero humano GemCell, tipo AB inactivado por calor (100,0 mL), GlutaMax (10,0 mL), sulfato de gentamicina, 50 mg/mL (1,0 mL), 2-mercaptoetanol (1,0 mL)
8.4.9 Medios filtrantes. Se taparon los frascos de la Etapa 8.4.8 y se agitaron para garantizar que los reactivos se mezclaran completamente. Filtró cada botella de medio a través de una unidad de filtro separada de 1 litro y 0,22 micras.
8.4.10 Medios filtrados etiquetados. Se tapó asépticamente el medio filtrado y se etiquetó cada botella con Medio CM1 Día 11.
8.4.11 Alícuota de IL-2 descongelada. Se descongeló 3 alícuotas de 1,1 mL de IL-2 (6 x 106 UI/mL) (BR71424) hasta que todo el hielo se derritió. Se registró el n.° de lote de IL 2 y su caducidad.
NOTA: Asegúrese de que la etiqueta IL-2 esté adherida.
8.4.12 Se eliminó el medio AIM-V de la incubadora. Se retiraron las tres botellas de AIM-V Media de la incubadora. Tiempo de incubación final registrado en la Etapa 8.4.4. Se aseguró que los medios se hubieran calentado durante > 30 minutos.
8.4.13 Agregar IL-2 a AIM-V. En el BSC, utilizando una micropipeta, se agregaron 3,0 mL de IL-2 descongelada en una botella de 1 litro de medio AIM-V precalentado. Enjuague la punta de la micropipeta con el medio después de dispensar IL-2. Utilice una nueva punta de micropipeta estéril para cada alícuota. Se registró el volumen total añadido. Frasco etiquetado como "AIM-V que contiene IL-2".
8.4.14 Materiales transferidos. Se transfirió asépticamente una bolsa Labtainer de 10 litros y un conjunto de transferencia de bomba repetidora al BSC.
8.4.15 Bolsa de medios Labtainer de 10 litros preparada. Cerré todas las líneas en una bolsa Labtainer de 10L. Se conectó el extremo del tubo de mayor diámetro de un conjunto de transferencia de bomba repetidora al puerto hembra central de la bolsa Labtainer de 10 litros mediante una conexión luer lock.
8.4.16 Prepare la bomba Baxa. Instaló la bomba Baxa junto al BSC. Alimente el tubo del conjunto de transferencia a través de la bomba Baxa situada fuera del BSC.
Configure la bomba Baxa en "Alto" y "9".
8.4.17 Bolsa de medios Labtainer de 10 litros preparada. En BSC, se retiró la jeringa del sistema dispensador de líquidos Pumpmatic (PLDS) y se descartó. NOTA: Garantizado para no comprometer la esterilidad de la pipeta PLDS.
8.4.18 Bolsa de medios Labtainer de 10 litros preparada. Se conectó la pipeta PLDS al extremo de menor diámetro del conjunto de transferencia de fluido de la bomba repetidora mediante una conexión luer y se colocó la punta de la pipeta en un medio AIM-V que contiene una botella de IL-2 (preparada en el paso 8.4.13) para la aspiración. Se abrieron todas las abrazaderas entre la botella de medio y el Labtainer de 10 litros.
8.4.19 Medio bombeado en Labtainer de 10 litros. En el BSC, utilizando el PLDS, transfiera el medio AIM-V precalentado que contenga IL-2 preparado en la Etapa 8.4.13, así como dos botellas AIM-V adicionales a la bolsa Labtainer de 10 litros. Se agregaron las tres botellas de medio CM1 día 11 filtrado de la etapa 8.4.10. Después de agregar la última botella, limpie la línea hacia la bolsa. NOTA: Detuvo la bomba entre la adición de cada botella de medio.
8.4.20 Se eliminó el pumpmatic de la bolsa Labtainer. Se quitó el PLDS del conjunto de transferencia y se colocó una tapa roja en el luer de la línea en el BSC.
8.4.21 Técnica mixta. Masajee suavemente la bolsa para mezclar.
8.4.22 Medios etiquetados. En el BSC, se etiquetó la bolsa de medios con la siguiente información. La fecha de caducidad era de 24 horas desde la fecha de preparación.
8.4.23 Medios de muestra por plan de muestra. En el BSC, conectó una jeringa de 60 mL al puerto hembra disponible de la bolsa "Complete CM2 Day 11 Media" preparada en el paso 8.4.22. Se retiraron 20,0 mL de medio y se colocaron en un tubo cónico de 50 mL.
Se colocó una tapa roja en el puerto hembra de la bolsa "Complete CM2 Day 11 Media".
8.4.24 Muestra etiquetada y almacenada. Se etiqueta con la etiqueta de inventario del plan de muestra y se almacena la muestra de retención de medios a 2-8 °C hasta que se envía al inicio de sesión para realizar pruebas.
8.4.25 Señal para muestreo. Se aseguró de que se completara la hoja del plan de muestra LIMS para la extracción de la muestra.
8.4.26 Sellado de la línea del set de transferencia. Fuera del BSC, selle térmicamente (según la Nota de proceso 5.12) la tapa roja en la línea del conjunto de transferencia, cerca de la tapa roja. Mantuvo el juego de transferencia en la bolsa.
8.4.27 Tubos de dilución de recuento celular preparados En el BSC, se agregaron 4,5 mL de medio AIM-V que había sido etiquetado con "Para diluciones de recuento celular" y el número de lote a cuatro tubos cónicos de 15 mL. Etiquetó los tubos con el número de lote y el número de tubo (1-4). 4 crioviales etiquetados como "Alimentador" y número de vial (1-4). Los viales se mantuvieron bajo BSC para usarse en la Etapa 8.5.30.
8.4.28 Reactivos transferidos del BSC a 2-8°C. Se transfirió el 2-mercaptoetanol, GlutaMax y suero humano restantes del BSC a 2-8 °C. Se aseguró de que todos los reactivos estuvieran etiquetados con el número de lote del registro del lote y la fecha de vencimiento abierta adecuada según la Nota de proceso 5.9.
8.4.29 Paquete de transferencia de 1 litro preparado. Fuera de la soldadura BSC (según la Nota de proceso 5.11), coloque un paquete de transferencia de 1 litro en el conjunto de transferencia adjunto a la bolsa "Medio completo CM2 Día 11" preparada en el paso 8.4.22. Paquete de transferencia etiquetado como "Medio CM2 de celda alimentadora" y número de lote.
8.4.30 Paquete de transferencia de 1 litro preparado. Hizo una marca en el tubo del paquete de transferencia de 1 litro a unos centímetros de la bolsa. Coloque el paquete de transferencia vacío en la báscula de modo que el tubo quede en la báscula hasta el punto de la marca.
8.4.31 Balanza tarada. Taró la báscula y dejó el paquete de transferencia vacío en la báscula.
8.4.32 Paquete de transferencia de celdas alimentadoras preparado. Configure la bomba Baxa en "Medio" y "4". Se bombearon 500,0 ± 5,0 mL de medio "Complete CM2 Day 11" preparado en el paso 8.4.22 al paquete de transferencia Cell CM2 Media. Se midió por peso y se registró el volumen de medio CM2 completo agregado al paquete de transferencia.
8.4.33 Línea de sellado calentado. Una vez llena, selle con calor la línea según la Nota de proceso 5.12. Se separó la bolsa de medios CM2 Día 11 con el juego de transferencia del paquete de transferencia de medios de la celda alimentadora y se mantuvo soldada hacia el paquete de transferencia de 1 litro.
8.4.34 Si corresponde: Paquete de transferencia de medios de células alimentadoras incubadas. Cuando corresponda, coloque el paquete de transferencia "Feeder Cell CM2 Media" en la incubadora hasta su uso en la Etapa 8.6.6.
8.4.35 Medio CM2 completo incubado el día 11. Se colocaron los "Medios completos CM2 Día 11" preparados en la Etapa 8.4.22 en la incubadora hasta su uso en la Etapa 8.7.2.
8.4.36 Sección revisada 8.4.
8.5 Día 11 - A la cosecha
8.5.1 Tabla de preprocesamiento. Incubadora monitoreada. Parámetros de la incubadora: Pantalla LED de temperatura: 37,0 ± 2,0 °C; Porcentaje de CO2: 5,0±1,5 %CO2.
NOTA: La Sección 8.5 puede ejecutarse simultáneamente con las Secciones 8.4 y 8.6.
8.5.2 Se eliminó el G-Rex100MCS de la incubadora. Realice la verificación a continuación para garantizar que se cumplan los parámetros de incubación antes de retirar el G-Rex100MCS de la incubadora. Límite inferior de la Etapa 8.3.44 B. Límite superior de la Etapa 8.3.44 C.
Tiempo registrado de retirada de la incubadora. Determinado: ¿Es 8.3.44 B < Tiempo de retirada de la incubadora < Etapa 8.3.44 C? *SI NO CONTACTA CON LA GESTIÓN DEL ÁREA. Retire con cuidado el G-Rex100MCS de la incubadora y asegúrese de que todas las abrazaderas estuvieran cerradas excepto la línea de filtro grande. Hora de inicio del procesamiento registrada.
8.5.3 Paquete de transferencia de 300 mL preparado. Un paquete de transferencia de 300 mL está etiquetado como "Suspensión TIL".
8.5.4 Paquete de transferencia de 300 mL preparado. Soldó de forma estéril (según la Nota de proceso 5.11) la transferencia de suspensión TIL (línea única) de un filtro de sangre por gravedad. Véase, por ejemplo, la Figura 129.
8.5.5 Paquete de transferencia de 300 mL preparado. Coloque el paquete de transferencia de 300 mL en una báscula y registre el peso seco.
8.5.6 Paquete de transferencia de 1 litro preparado. Paquete de transferencia de 1 litro etiquetado como "Sobrenadante" y número de lote.
8.5.7 Paquetes de transferencia soldados al G-Rex100MCS. Soldó de forma estéril (según la Nota de proceso 5.11) la línea de extracción de medios roja del G-Rex100MCS al paquete de transferencia "Sobrenadante". Sterile soldó la línea de eliminación de células transparentes del G-Rex100MCS a una de las dos líneas de púas en la parte superior del filtro de sangre conectada al paquete de transferencia "TIL Suspensión" preparado en la Etapa 8.5.4. Véase, por ejemplo, la Figura 130.
8.5.8 Configuración de GatheRex. Se colocó G-Rex100MCS en el lado izquierdo de GatheRex y los paquetes de transferencia "Sobrenadante" y "TIL Suspensión" en el lado derecho.
8.5.9 Configuración de GatheRex. Instale la línea roja de extracción de medios desde el G Rex100MCS hasta la abrazadera superior (marcada con una línea roja) y las guías de tubos en el GatheRex. Instalé la línea de recolección transparente desde el G-Rex100MCS hasta la abrazadera inferior (marcada con una línea azul) y las guías de tubos en el GatheRex.
8.5.10 Configuración de GatheRex. Conectó la línea de gas del GatheRex al filtro estéril del matraz G-Rex100MCS. NOTA: Antes de retirar el sobrenadante del matraz G-Rex100MCS, asegúrese de que todas las abrazaderas de las líneas de extracción de células estuvieran cerradas.
8.5.11 Reducción de volumen de G-Rex100MCS. Se transfirieron ~900 mL de sobrenadante de cultivo del G-Rex100MCS al paquete de transferencia de 1 litro. Inspeccione visualmente el matraz G-Rex100MCS para asegurarse de que esté nivelado y que el medio se haya reducido hasta el final del tubo de inmersión de aspiración. NOTA: Si el Gatherex se detiene prematuramente, se reinició presionando nuevamente el botón con la flecha apuntando hacia la derecha.
8.5.12 Prepare el matraz para Recolección de TIL. Después de retirar el sobrenadante, se cerraron todas las pinzas hasta la línea roja.
8.5.13 Inicio de la Recolección de TIL. Se registró la hora de inicio de la cosecha TIL.
8.5.14 Inicio de la Recolección de TIL. Se golpeó vigorosamente el matraz y se agitó el medio para liberar las células. Realizó una inspección del matraz para garantizar que todas las células se hayan desprendido. NOTA: Se contactó a la gerencia del área si las células no se desprendían.
8.5.15 Inicio de la Recolección de TIL. Incline el matraz lejos del tubo de recolección y permita que las piezas del tumor se asienten a lo largo del borde. Lentamente inclinó el matraz hacia el tubo de recolección de modo que las piezas quedaran en el lado opuesto del matraz. NOTA: Si la pajita de recolección de células no está en la unión de la pared y la membrana inferior, generalmente es suficiente golpear el matraz mientras está inclinado en un ángulo de 450 para colocar correctamente la pajita.
8.5.16 TIL Recolectado. Soltó todas las abrazaderas que conducen al paquete de transferencia de suspensión TIL.
8.5.17 TIL Recolectado. Usando GatheRex, transfirió la suspensión celular a través del filtro de sangre al paquete de transferencia de 300 mL. NOTA: Asegúrese de mantener el borde inclinado hasta que se recojan todas las células y los medios.
8.5.18 TIL Recolectado. Inspeccione la membrana en busca de células adherentes.
8.5.19 Membrana del matraz enjuagada. Enjuagó la parte inferior del G-Rex100MCS. Cubra ~1/4 de la membrana de intercambio de gases con medio de enjuague. NOTA: Si las piezas del tumor obstruyen la línea de recolección, pausar la recolección presionando la "X" en la línea de recolección de células. Presione el botón "Liberar abrazaderas" en Gatherex, levante el paquete de transferencia y apriételo suavemente con presión creciente hasta que se retire el fragmento. No apriete la bolsa con demasiada fuerza, ya que esto puede provocar que la línea o la bolsa se rompan. Reanude la recolección una vez que se haya eliminado la obstrucción.
8.5.20 Abrazaderas cerradas en G-Rex100MCS. Asegúrese de que todas las abrazaderas estén cerradas. 8.5.21 Sellado térmicamente. Selle térmicamente (según la Nota de proceso 5.12) el paquete de transferencia de suspensión TIL lo más cerca posible de la soldadura para que la longitud total del tubo permanezca aproximadamente igual.
8.5.22 Sellado térmico. Selló térmicamente el paquete de transferencia "Sobrenadante" según la Nota de proceso 5.12. Se mantuvo suficiente línea para soldar.
8.5.23 Volumen calculado de suspensión de TIL. Se registró el peso del paquete de transferencia de suspensión TIL y se calculó el volumen de la suspensión celular.
8.5.24 Paquete de transferencia de sobrenadante preparado para muestreo. Se soldó (según la Nota de proceso 5.11) un conjunto de transferencia de plasma de 4" al paquete de transferencia de "sobrenadante", conservando la conexión luer en el conjunto de transferencia de plasma de 4", y se transfirió al BSC.
8.5.25 Paquete de transferencia de suspensión TIL preparado para muestreo. Se soldó (según la Nota de proceso 5.11) un conjunto de transferencia de plasma de 4" a un paquete de transferencia de "suspensión TIL" de 300 mL, se conservó la conexión luer en el conjunto de transferencia de plasma de 4" y se transfirió al BSC.
8.5.26 Muestra Bac-T extraída. En el BSC, utilizando una jeringa del tamaño adecuado, extraig a aproximadamente 20,0 mL de sobrenadante del paquete de transferencia "Sobrenadant" de 1 litro y dispense en un tubo cónico estéril de 50 mL con la etiqueta "Bac-T". Guárdelo en BSC para usarlo en la Etapa 8.5.27.
8.5.27 BacT inoculado según plan de muestra. Se extrajo una muestra de 1,0 mL del BacT cónico etiquetado de 50 mL preparado en el paso 8.5.26 utilizando una jeringa del tamaño adecuado e inoculó la botella anaeróbica. Se registró la hora en que se inoculó el frasco utilizando el espacio provisto en la etiqueta del frasco. Repitió lo anterior para la botella aeróbica. NOTA: Este paso puede realizarse fuera de secuencia.
8.5.28 Muestra etiquetada y almacenada. Etiquetado con la etiqueta de inventario del plan de muestra y muestra de Bac-T almacenada a temperatura ambiente, protegida de la luz, hasta que se envíe a Login para su análisis según el Plan de muestra. NOTA: No cubrió el código de barras de la botella con la etiqueta.
8.5.29 Firmado para muestreo. Se aseguró de que se completara la hoja del plan de muestra de LIMS para la extracción de la muestra.
8.5.30 Muestras de recuento de células TIL. 4 crioviales etiquetados con el número de vial (1-4).
Usando jeringas separadas de 3 mL, extrajo muestras de recuento de células de 4 x 1,0 mL del paquete de transferencia de suspensión TIL usando la conexión luer y las colocó en los crioviales respectivos.
8.5.31 Cerró la conexión luer. Se colocó una gorra roja (W3012845) en la línea.
8.5.32 TIL incubado. Colocó el paquete de transferencia TIL en la incubadora hasta que fuera necesario.
8.5.33 Realizar recuentos de células Realice recuentos de células y cálculos utilizando NC-200 y la Nota de proceso 5.14. Realice recuentos celulares iniciales sin diluir.
8.5.34 Volúmenes de muestra de recuento celular registrado. NOTA: Si no se necesita dilución, "Muestra [<|j>L]" = 200, "Dilución [<j>L]" = 0.
8.5.35 Factor de multiplicación determinado. Volumen de muestra de recuento celular total: 8.5.34A 8.5.34B. Factor de multiplicación C 8.5.34A.
8.5.36 Protocolos seleccionados y factores de multiplicación ingresados. Se aseguró de que se hubiera seleccionado el protocolo "Ensayo de recuento de células viables", de que se hubieran ingresado todos los factores de multiplicación y los volúmenes de muestra y diluyente. NOTA: Si no se necesita dilución, ingrese "Muestra [<|j>L]" = 200, "Dilución [j L]" = 0
8.5.37 Nombre del archivo registrado, viabilidad y recuentos de células de Nucleoview 8.5.38 Se determinó el promedio de la concentración de células viables y la viabilidad de los recuentos de células realizados. Viabilidad (8.5.37A 8.5.37B) 2. Concentración de células viables (8.5.37C 8.5.37D) 2
8.5.39 Límite superior e inferior determinado para los recuentos. Límite inferior: 8.5.38F * 0,9. Limite superior: 8.5.38F * 1.1.
8.5.40 ¿Estuvieron ambos recuentos dentro de límites aceptables? Límite inferior: 8.5.37 C y D > 8.5.39G. Limite superior: 8.5.37 C y D < 8.5.39H. *Si alguno de los resultados fue "No", se realizó una segunda serie de recuentos en las etapas 8.5.41 - 8.5.48*.
8.5.41 Si corresponde: Conteos celulares realizados. Realicé recuentos de células y cálculos utilizando NC-200 y la Nota de proceso 5.14. NOTA: La dilución se ajustó según la concentración esperada de células. Realizado
8.5.42 Si corresponde: Volúmenes de muestra de recuento celular registrados.
8.5.43 Si corresponde: Factor de multiplicación determinado. Volumen de muestra de recuento celular total: 8.5.42A 8.5.42B. Factor de multiplicación C 8.5.42A D
8.5.44 Si corresponde: Protocolos seleccionados y factores de multiplicación ingresados. Se aseguró de que se seleccionara el protocolo "Ensayo de recuento de células viables", se ingresaron todos los factores de multiplicación y los volúmenes de muestra y diluyente. NOTA: Si no se necesita dilución, ingrese "Muestra [<j>L]" = 200, "Dilución [j L]" = 0.
8.5.45 Si corresponde: Recuentos de células registrados desde Nucleoview 8.5.46, si corresponde: Se determinó el Promedio de Concentración de Células Viables y la Viabilidad de los conteos celulares realizados. Se determinó la concentración promedio de células viables.
8.5.47 Si corresponde: Límite superior e inferior determinado para los recuentos. Límite inferior: 8.5.46F x 0.9. Limite superior: 8.5.46F x 1.1.
8.5.48 Si corresponde: ¿Estuvieron los recuentos dentro de límites aceptables? Límite inferior: 8.5.45 C y D > 8.5.47G. Limite superior: 8.5.45 C y D < 8.5.47H. NOTA: Si alguno de los resultados es "No", continúe con la Etapa 8.5.49 para determinar un promedio.
8.5.49 Si corresponde: Se determinó una concentración promedio de células viables a partir de los cuatro recuentos realizados. Concentración promedio de células viables (A+B+C+D) 4 = PROMEDIO
8.5.50 Volumen ajustado de suspensión de TIL Calcule el volumen ajustado de suspensión de TIL después de retirar las muestras de recuento celular. Volumen total de celda TIL de la etapa 8.5.23<c>(A). Volumen de muestra de recuento de células extraída (4,0 mL) (B) Volumen de células TIL total ajustado C=A-B.
8.5.51 Total de células TIL viables calculadas. Concentración promedio de células viables*: 8.5.38 F* o 8.5.46 F* o *8.5.49E*; Volumen total: 8.5.50; Células viables totales: C = A x B. *Marque con un círculo la referencia de la etapa utilizada para determinar la concentración de células viables. NOTA: Si el total de células TIL viables es < 5x106 células, comuníquese con el área
Gestión y continúe con la Etapa 8.7.1. Si el total de células TIL viables es> 5 * 106, continúe con la Etapa 8.5.52.
8.5.52 Cálculo para citometría de flujo. Si el recuento total de células TIL viables de la Etapa 8.5.51C fue > 4,0 * 107, calculó el volumen para obtener 1,0x107 células para la muestra de citometría de flujo. *Si hay <4.0*107 celdas, N/A los campos restantes de la tabla. Continúe con el paso 8.7.1. Total de células viables necesarias para la citometría de flujo: 1.0*107 células. Volumen de células necesario para la citometría de flujo: Concentración de células viables de 8.5.51 dividida por 1,0*107 células a.
8.5.53 Si corresponde: Se eliminó TIL de la incubadora. Se eliminó la suspensión TIL de la incubadora y se registró el tiempo final de incubación en la Etapa 8.5.32.
8.5.54 Si corresponde: Se eliminó la muestra de citometría de flujo según el plan de muestra. Con una jeringa del tamaño adecuado, extraiga el volumen calculado (8,5,52 C) para la muestra de fenotipado del paquete de transferencia de suspensión TIL y colóquelo en un tubo cónico de 50 mL.
8.5.55 Si corresponde: Muestra de citometría de flujo etiquetada y almacenada. Etiquete con la etiqueta de inventario del plan de muestra y almacene la muestra de citometría de flujo a 2-8 °C hasta que se envíe al inicio de sesión para realizar pruebas según el plan de muestreo.
8.5.56 Firmado para muestreo. Asegúrese de que se haya completado la hoja del plan de muestra LIMS para la extracción de la muestra.
8.5.57 Si corresponde: Células viables totales y flujo volumétrico recalculados. Calculó el total de células viables restantes y el volumen restante después de la extracción de la muestra de citometría a continuación.
8.5.58 Si corresponde: Volumen TIL calculado. Calculó el volumen de suspensión de TIL igual a 2,0 * 108 células viables.
8.5.59 Si corresponde: Volumen de TIL calculado para eliminar Calcule el exceso de volumen de células TIL para eliminar.
8.5.60 Si corresponde: Se eliminó el exceso de TIL. En el BSC, utilizando una jeringa del tamaño adecuado, retire el volumen calculado (Etapa 8.5.59C) del paquete de transferencia de suspensión TIL. NOTA: No utilice una jeringa más de una vez. Utilice varias jeringas si corresponde. Se coloca en un recipiente estéril del tamaño adecuado y se etiqueta con la fecha y el número de lote. Se colocó una tapa roja en la línea del paquete de transferencia "TIL Suspensión".
8.5.61 Si corresponde: Colocó TIL en la incubadora. Se colocó el paquete de transferencia de suspensión TIL en la incubadora hasta que sea necesario. Tiempo grabado.
8.5.62 Si corresponde: Cálculos. Exceso total calculado de TIL eliminado.
Etapa 8.5.51A Volumen de TIL para eliminar de la Etapa 8.5.59C. Exceso total calculado de TIL eliminado.
8.5.63 Si corresponde: Cálculos. Cantidad calculada de medio CS-10 para agregar al exceso de celdas TIL de la Etapa 8.5.62C. La concentración de células objetivo para la congelación es 1,0 * 108 células/mL.
8.5.64 Si corresponde: Exceso de TIL centrifugado. Se centrifugó el exceso de suspensión de células TIL. Velocidad: 350 * g. Tiempo: 10:00 minutos. Temperatura: Freno ambiental: Completo (9). Aceleración: Completo (9).
8.5.65 Si corresponde: Tubo cónico observado. Observaciones registradas: ¿Pellet observado? ¿El sobrenadante estaba claro? *NOTA: Si alguna de las respuestas fue negativa, comuníquese con la Gerencia del Área.
8.5.66 Si corresponde: Se agregó CS-10. En BSC, aspirar asépticamente el sobrenadante.
Golpee suavemente el fondo del tubo para resuspender las células en el líquido restante.
8.5.67 Si corresponde: Se agregó CS 10. Agregue lentamente el volumen de CS 10 calculado en la Etapa 8.5.63C 8.5.68 Si corresponde: Viales etiquetados. Viales etiquetados con etiquetas proporcionadas por control de calidad. Adjunto una etiqueta de muestra.
8.5.69 Si corresponde: Viales llenos. Se repartieron alícuotas de 1,0 mL de suspensión celular en crioviales del tamaño adecuado. NOTA: No llenó más de 10 viales de Exceso de TIL.
8.5.70 Si corresponde: Viales llenos. Distribuya el volumen residual en alícuotas en un criovial del tamaño adecuado según SOP-00242. Si el volumen es <0,5 mL, agregue CS10 al vial hasta que el volumen sea 0,5 mL.
8.5.71 Si corresponde: Viales llenos. Llenó un vial con 1,0 mL de CS 10 y lo etiquetó como "En blanco".
8.5.72 Si corresponde: Número registrado de viales llenos. Número registrado de viales llenos a continuación, sin incluir el blanco.
8.5.73 Si corresponde: Monitoreo ambiental. Después del procesamiento, se realizó el BSC verificado y el monitoreo del personal.
Criopreservación TIL de muestra
8.5.74 Si corresponde: Columna calculada para criopreservación. Calculó el volumen de células necesarias para obtener 1*107 Células para criopreservación.
8.5.75 Si corresponde: Muestra eliminada para criopreservación. En el BSC, utilizando la jeringa del tamaño adecuado, extrajo el volumen calculado (Etapa 8.5.74C) del paquete de transferencia de suspensión TIL. Se coloca en un tubo cónico del tamaño adecuado y se etiqueta como "Muestra de criopreservación 1*107 celdas", fecha y número de lote. Se colocó una tapa roja (W3012845) en el paquete de transferencia de suspensión TIL.
8.5.76 Si corresponde: Colocó TIL en la incubadora. Se colocó el paquete TIL SuspensionTransfer en la incubadora hasta que sea necesario.
8.5.77 Si corresponde: Muestra de criopreservación. Centrifugada la “Muestra de Criopreservación 1*107 celdas" según los siguientes parámetros: Velocidad: 350 x g, Tiempo: 10:00 minutos, Temperatura: Ambiente, Freno: Completo (9)
Aceleración: Completo (9). NOTA: Asegúrese de que las unidades adecuadas estén configuradas para la velocidad y el tiempo en la centrífuga.
8.5.78 Si corresponde: Tubo cónico observado. Observaciones registradas: ¿Pellet observado? ¿El sobrenadante es claro? *NOTA: Si alguna de las respuestas es no, comuníquese con la Gerencia del Área.
8.5.79 Si corresponde: Se agregó CS-10. En BSC, aspirar asépticamente el sobrenadante. Golpee suavemente el fondo del tubo para resuspender las células en el líquido restante.
8.5.80 Si corresponde: Se agregó CS-10. Añadido lentamente. 0,5 mL de CS10. Se agregó el volumen de edición récord.
8.5.81 Si corresponde: Vial etiquetado. Vial etiquetado con etiqueta emitida por control de calidad.
8.5.82 Si corresponde: Viales llenos. Distribuya en alícuotas el volumen resuspendido en un criovial etiquetado.
8.5.83 Si corresponde: Lleno en blanco. Llenó otro vial con 0,5 mL de CS10 y etiquételo como "En blanco". 8.5.84 Si corresponde: Número registrado de viales llenos, sin incluir los "en blanco". Viales de muestras para criopreservación llenos a ~0,5 mL
8.5.85 Si corresponde: Monitoreo ambiental. Después del procesamiento, verifique que se haya realizado el BSC y el monitoreo del personal.
8.5.86 Revisar la Sección 8.5
8.6 Día 11 - Células alimentadoras
8.6.1 Células alimentadoras obtenidas. Se obtuvieron 3 bolsas de células alimentadoras con al menos dos números de lote diferentes del congelador LN2. Se mantuvieron las células en hielo seco hasta que estuvieran listas para descongelarse. NOTA: La Sección 8.6 podría realizarse simultáneamente con la Sección 8.5.
8.6.2 Células alimentadoras obtenidas. Información registrada de la celda alimentadora. Confirmó que se obtuvieron al menos dos lotes diferentes de células alimentadoras.
8.6.3 Baño María preparado o Cryotherm. Baño María preparado o Cytotherm para descongelación de Feeder Cell.
8.6.4 Celdas alimentadoras descongeladas. Se colocaron las bolsas de células alimentadoras en bolsas individuales con cierre hermético, según el número de lote, y se descongeló en un baño de agua o citotermo a 37,0 ± 2,0 °C durante ~3-5 minutos o hasta que el hielo desaparezca. Los tiempos de descongelación registrados a continuación desde el temporizador.
8.6.5 Preparación del arnés de la celda alimentadora. Soldé (según la Nota de proceso 5.11) 4S-4M60 a un Cell Connect CC2 (W3012820), reemplazando un solo pico del aparato Cell Connect (B) con el extremo de 4 picos del colector 4S-4M60 en (G). Soldado H a G (ver, por ejemplo, Figura 131).
8.6.6 Si corresponde: Medios retirados de la incubadora. Se retiró el paquete de transferencia de medios Feeder Cell CM2 preparado en el paso 8.4.34 de la incubadora.
8.6.7 Paquete de transferencia de medios adjunto Suelde (según la Nota de proceso 5.11) el paquete de transferencia "Feeder Cell CM2 Media" a un luer CC2. NOTA: La bolsa se sujetará al costado del arnés con el puerto de inyección innecesaria.
8.6.8 Arnés de transferencia. Se transfirió el conjunto que contiene los medios completos CM2 día 11 al BSC. 8.6.9 Celdas alimentadoras descongeladas de la piscina. Dentro del BSC, se introducen 10 mL de aire en una jeringa de 100 mL. Usé esto para reemplazar la jeringa de 60 mL en el CC2.
8.6.10 Celdas alimentadoras descongeladas de la piscina. Limpie cada puerto de las bolsas de las celdas alimentadoras con una gasa con alcohol antes de retirar la cubierta. Clave las tres bolsas de alimentación usando tres de las púas del CC2. NOTA: Mantuvo una presión constante mientras giraba la púa en una dirección. Asegúrese de no perforar el costado del puerto.
8.6.11 Celdas alimentadoras descongeladas de la piscina. Abrió la llave de paso de modo que la línea desde las bolsas de células alimentadoras esté abierta y la línea hacia el puerto de inyección innecesaria esté cerrada. 8.6.12 Celdas alimentadoras descongeladas de la piscina. Extrajo el contenido de las bolsas de células alimentadoras en la jeringa. Las tres bolsas se vaciaron al mismo tiempo. Una vez que se drenaron las bolsas de células alimentadoras, mientras se mantenía la presión sobre la jeringa, se sujetó la línea a las bolsas de células alimentadoras.
8.6.13 Volumen registrado de celdas alimentadoras. No se separó la jeringa de abajo. la jeringa del arnés. Se registró el volumen total de células alimentadoras en la jeringa.
8.6.14 Se agregaron celdas de alimentación al paquete de transferencia. Giró la llave de paso de modo que la línea hacia la bolsa de celdas de alimentación estuviera cerrada y la línea hacia el paquete de transferencia de medios estuviera abierta. Asegúrese de que la línea al paquete de transferencia de medios esté desbloqueada.
8.6.15 Se agregaron células alimentadoras al paquete de transferencia. Dispensó las células alimentadoras de la jeringa en el paquete de transferencia "Medio Feeder Cell CM2". Sujete la línea al paquete de transferencia que contiene las células alimentadoras y deje la jeringa unida al arnés.
8.6.16 Celdas alimentadoras agrupadas mixtas. Bolsa masajeada para mezclar las células alimentadoras agrupadas en el paquete de transferencia.
8.6.17 Paquete de transferencia etiquetado. Bolsa etiquetada como "Suspensión de células alimentadoras" y número de lote.
8.6.18 Volumen total calculado en Transfer Pack Calculó el volumen total de la suspensión de células alimentadoras.
8.6.19 Muestras de recuento de células eliminadas. Usando una jeringa de 3 mL separada para cada muestra, extrajo 4 muestras de recuento de células de 1,0 mL del paquete de transferencia de suspensión de células alimentadoras utilizando el puerto de inyección innecesario. Se repartieron alícuotas de cada muestra en los crioviales etiquetados en la Etapa 8.4.27. NOTA: Limpie el puerto de inyección innecesario con una gasa con alcohol estéril (W3009488) y mezcle la suspensión de células alimentadoras entre cada muestreo para realizar el recuento de células.
8.6.20 Conteos celulares realizados. Realicé recuentos de células y cálculos utilizando NC-200 y la Nota de proceso 5.14. Muestras de recuento de células diluidas añadiendo 0,5 mL de suspensión celular en 4,5 mL de medio AIM-V etiquetado con el número de lote y "Para diluciones de recuento de células". Esto dará una dilución de 1:10. Ajustado si es necesario.
8.6.21 Conteo de células registradas. Volúmenes de muestra
8.6.22 Determinar el factor de multiplicación
8.6.23 Protocolos seleccionados y factores de multiplicación ingresados. Se aseguró de que se hubiera seleccionado el protocolo "Ensayo de recuento de células viables", de que se hubieran ingresado todos los factores de multiplicación y los volúmenes de muestra y diluyente.
8.6.24 Nombre del archivo registrado, viabilidad y recuento de células de Nucleoview.
8.6.25 Se determinó el Promedio de Concentración de Células Viables y Viabilidad de los conteos celulares realizados.
8.6.26 Límite superior e inferior determinado para los recuentos.
8.6.27 ¿Estuvieron ambos recuentos dentro de límites aceptables?
NOTA: Si alguno de los resultados fue "No", realizó una segunda serie de recuentos en las etapas 8.6.28 - 8.6.35.
8.6.28 Si corresponde: Recuentos de células realizados Realice recuentos de células y cálculos utilizando NC-200 según SOP-00314 y la Nota de proceso 5.14
NOTA: La dilución podría ajustarse según la concentración esperada de células.
8.6.29 Si corresponde: Recuento de células registrado, volúmenes de muestra. NOTA: Si no se necesita dilución, ingrese "Muestra [<|j>L]" = 200, "Dilución [<|j>L]" = 0.
8.6.30 Si corresponde: Factor de multiplicación determinado.
8.6.31 Seleccionar protocolos e ingresar factores de multiplicación. Asegúrese de que se haya seleccionado el protocolo "Ensayo de recuento de células viables", de que se hayan introducido todos los factores de multiplicación y los volúmenes de muestra y diluyente. NOTA: Si no se necesita dilución, ingrese "Muestra [<j>L]" = 200, "Dilución [<j>L]" = 0.
8.6.32 Si corresponde: Recuentos de células registrados desde Nucleoview 8.6.33, si corresponde: Se determinó el Promedio de Concentración de Células Viables y la Viabilidad de los conteos celulares realizados.
8.6.34 Si corresponde: Límite superior e inferior determinado para los recuentos.
8.6.35 Si corresponde: ¿Estuvieron los recuentos dentro de límites aceptables?
NOTA: Si alguno de los resultados fue "No", continúe con el paso 8.6.36 para encontrar una concentración promedio de células viables total y continuar con los cálculos.
8.6.36 Si corresponde: Se determinó una concentración promedio de células viables a partir de los cuatro recuentos realizados.
8.6.37 Volumen ajustado de suspensión de células alimentadoras. Calculó el volumen ajustado de la suspensión de células alimentadoras después de retirar las muestras de recuento celular. Volumen total de células alimentadoras de la etapa 8.6.18C minutos: 4,0 mL eliminados.
8.6.38 Calcular dTotal de células alimentadoras viables.
Si el total de células viables es <5 * 109, continúe con la Etapa 8.6.39. Si el total de células viables es > 5 * 109, continúe con la Etapa 8.5.70.
8.6.39 Si corresponde: Se obtuvieron células alimentadoras adicionales. Obtuve una bolsa adicional de células alimentadoras del congelador LN2. Se mantuvieron las células en hielo seco hasta que estuvieran listas para descongelarse.
8.6.40 Si corresponde: Se obtuvieron células alimentadoras adicionales. Información registrada de la celda alimentadora.
8.6.41 Si corresponde: Células alimentadoras adicionales descongeladas. Coloque la cuarta bolsa de células alimentadoras en una bolsa con cierre hermético y descongélela en un baño de agua a 37,0 ± 2,0 °C o en un citotermo durante aproximadamente 3 a 5 minutos o hasta que el hielo haya desaparecido. Tiempo de descongelación registrado.
8.6.42 Si corresponde: Células alimentadoras adicionales agrupadas. En el BSC, extrajo 10 mL de aire en una jeringa nueva de 100 mL. Usé esto para reemplazar la jeringa en el arnés.
8.6.43 Si corresponde: Células alimentadoras adicionales agrupadas. Limpie el puerto de la bolsa de células alimentadoras con una gasa con alcohol antes de retirar la cubierta. Clavó la bolsa de la celda alimentadora usando uno de los clavos restantes del arnés preparado en la Etapa 8.6.7 NOTA: Mantuvo una presión constante mientras giraba la púa en una dirección. Se aseguró de no perforar el costado del puerto.
8.6.44 Si corresponde: Células alimentadoras adicionales agrupadas. Abrió la llave de paso de modo que la línea desde la bolsa de la celda alimentadora estuviera abierta y la línea hacia el puerto de inyección innecesaria estuviera cerrada.
8.6.45 Si corresponde: Células alimentadoras adicionales agrupadas. Extraiga el contenido de la bolsa de células alimentadoras en la jeringa. Volumen grabado.
8.6.46 Si corresponde: Volumen medido. Se midió el volumen de las células alimentadoras en la jeringa y se registró a continuación (B). Calculó el nuevo volumen total de células alimentadoras.
8.6.47 Si corresponde: Se agregaron celdas de alimentación al paquete de transferencia. Giró la llave de paso de modo que la línea a la bolsa de células alimentadoras estuviera cerrada y la línea al paquete de transferencia "Suspensión de células alimentadoras" estuviera abierta. Me aseguré de que la línea al paquete de transferencia estuviera desbloqueada. Dispensó las células alimentadoras de la jeringa en el paquete de transferencia "Suspensión de células alimentadoras". Sujetó la línea al paquete de transferencia y dejó la jeringa unida al arnés.
8.6.48 Si corresponde: Se agregaron celdas de alimentación al paquete de transferencia. Bolsa masajeada para mezclar las células alimentadoras agrupadas en el paquete de transferencia de suspensión de células alimentadoras.
8.6.49 Si corresponde: Diluciones preparadas. En el BSC, agregue 4,5 mL de medio AIM-V etiquetado con "Para diluciones de recuento celular" y el número de lote a cuatro tubos cónicos de 15 mL. Etiquete los tubos con el número de lote y el número de tubo (1-4). 4 crioviales etiquetados como "Alimentador adicional" y número de vial (1-4).
8.6.50 Si corresponde: Recuentos celulares preparados. Usando una jeringa de 3 mL separada para cada muestra, extrajo 4 muestras de recuento de células de 1,0 mL del paquete de transferencia de suspensión de células alimentadoras, utilizando el puerto de inyección innecesario. Se repartieron alícuotas de cada muestra en crioviales etiquetados en la Etapa 8.6.49. NOTA: Limpie el puerto de inyección innecesario con una gasa con alcohol estéril y mezcle la suspensión de células alimentadoras entre cada muestreo para realizar el recuento de células.
8.6.51 Si corresponde: Conteos celulares realizados. Realicé recuentos de células y cálculos utilizando NC-200 y la Nota de proceso 5.14. Muestras de recuento de células diluidas añadiendo 0,5 mL de suspensión celular en 4,5 mL de medio AIM-V etiquetado con el número de lote y "Para diluciones de recuento de células". Esto dará una dilución de 1:10. Ajustado si es necesario.
8.6.52 Si corresponde: Volúmenes de muestra de recuento celular registrados.
8.6.53 Si corresponde: Factor de multiplicación determinado
8.6.54 Si corresponde: Protocolos seleccionados y factores de multiplicación ingresados. Se aseguró de que se hubiera seleccionado el protocolo "Ensayo de recuento de células viables", de que se hubieran ingresado todos los factores de multiplicación y los volúmenes de muestra y diluyente.
8.6.55 Si corresponde: Nombre del archivo registrado, viabilidad y recuento de células de Nucleoview.
8.6.56 Si corresponde: Determine el promedio de concentración de células viables y la viabilidad de los recuentos celulares realizados.
8.6.57 Si corresponde: Determine el límite superior e inferior para los recuentos.
¿Están ambos recuentos dentro de límites aceptables? NOTA: Si alguno de los resultados es "No", realice una segunda serie de conteos en las etapas 8.5.59 - 8.5.65
8.6.59 Si corresponde: Conteos celulares realizados. Realicé recuentos de células y cálculos utilizando NC-200 y la Nota de proceso 5.14. NOTA: La dilución podría ajustarse según la concentración esperada de células.
8.6.60 Si corresponde: Volúmenes de muestra de recuento celular registrados. NOTA: Si no se necesitaba dilución, ingrese "Muestra [<|j>E]" = 200, "Dilución [<|j>L]" = 0
8.6.61 Si corresponde: Factor de multiplicación determinado.
8.6.62 Si corresponde: Seleccione protocolos e ingrese factores de multiplicación. Se aseguró de que se haya seleccionado el protocolo "Ensayo de recuento de células viables", de que se hayan ingresado todos los factores de multiplicación y los volúmenes de muestra y diluyente.
NOTA: Si no se necesitaba dilución, ingrese "Muestra [<j>E]" = 200, "Dilución [<j>L]" = 0
8.6.63 Si corresponde: Recuentos de células registrados de Nucleoview.
8.6.64 Si corresponde: Se determinó el Promedio de Concentración de Células Viables y la Viabilidad de los conteos celulares realizados.
8.6.65 Si corresponde: Límite superior e inferior determinado para los recuentos
8.6.66 Si corresponde: ¿Estuvieron los recuentos dentro de límites aceptables?
NOTA: Si alguno de los resultados fue "No", continúe con la Etapa 8.6.67 para encontrar una concentración promedio total de células viables y continúe con los cálculos.
8.6.67 Si corresponde: Se determinó una concentración promedio de células viables a partir de los cuatro recuentos realizados.
8.6.68 Si corresponde: Volumen ajustado de suspensión de células alimentadoras. Calculó el volumen ajustado de la suspensión de células alimentadoras después de retirar las muestras de recuento celular. Volumen total de células alimentadoras de la etapa 8.6.46C minutos: 4,0 mL eliminados.
8.6.69 Si corresponde: Células alimentadoras viables totales calculadas.
8.6.70 Volumen calculado de las celdas alimentadoras. Calculó el volumen de suspensión de células alimentadoras que se requirió para obtener 5*109 células alimentadoras viables.
8.6.71 Volumen excedente de celda alimentadora calculado. Calculó el volumen de exceso de células alimentadoras a eliminar. Redondea hacia abajo al número entero más cercano.
8.6.72 Se eliminó el exceso de células alimentadoras. En una jeringa nueva de 100 mL, extrajo 10 mL de aire y conectó la jeringa al arnés.
8.6.73 Se eliminó el exceso de células alimentadoras. Se abrió la línea al paquete de transferencia "Suspensión de células alimentadoras". Usando la jeringa, extraiga el volumen de células alimentadoras calculado en la Etapa 8.6.71C más 10,0 mL adicionales del paquete de transferencia en una jeringa de 100 mL. Se cerró la línea al paquete de transferencia de suspensión de células alimentadoras una vez que se retiró el volumen de las células alimentadoras. No quitó la última jeringa. NOTA: Una vez que se haya llenado una jeringa, reemplácela con una jeringa nueva. Se podrían utilizar varias jeringas para eliminar el volumen total. Con cada jeringa nueva, se aspiran 10 mL de aire.
8.6.74 Volumen grabado. Se registró el volumen total (incluidos los 10 mL adicionales) de células alimentadoras extraídas.
8.6.75 Se agregó OKT3. En el BSC, utilizando una jeringa de 1,0 mL y una aguja de 16 G, se extrajeron 0,15 mL de OKT3.
8.6.76 Se agregó OKT3. Retire asépticamente la aguja de la jeringa y conecte la jeringa al puerto de inyección innecesaria. Inyectado el OKT3.
8.6.77 Se agregó OKT3. Abrió la llave de paso del paquete de transferencia "Suspensión de células alimentadoras" y añadió 10 mL de células alimentadoras extraídas en el paso 8.6.73 para eliminar OKT3 a través de la línea.
8.6.78 Se agregó OKT3. Voltee la jeringa y empuje el aire para despejar la línea hacia el paquete de transferencia de suspensión de células alimentadoras.
8.6.79 Se agregó OKT3. Dejó la suspensión de células alimentadoras restante en la jeringa. Cerró todas las abrazaderas y retire el arnés del BSC.
8.6.80 Sellado térmicamente. Selló térmicamente (según la Nota de proceso 5.12) el paquete de transferencia de suspensión de la celda alimentadora, dejando suficiente tubo para soldar. Desechado el arnés.
8.6.81 Revisar la Sección 8.6
8.7 Día 11 Relleno y semilla de G-Rex
8.7.1 Configurar G-Rex500MCS. Fuera del BSC, sacó un G-Rex500MCS del embalaje e inspeccionó el matraz en busca de grietas o torceduras en el tubo. Se aseguró de que todas las conexiones y cierres luer estuvieran apretados. Cerré todas las abrazaderas en las líneas del G-Rex500MCS excepto la línea del filtro de ventilación. Usando un marcador dibujó una línea en la gradación de 4,5 L.
8.7.2 Medios retirados de la incubadora. Se eliminaron los "Medios CM2 completos del día 11", preparados en el paso 8.4.35, de la incubadora.
8.7.3 Preparado para bombear medios. Soldé (según la Nota de proceso 5.11) la línea roja del G-Rex500MCS al conjunto de transferencia de la bomba repetidora conectado al medio CM2 Día 11 completo.
8.7.4 Prepárese para bombear medios. Colgó la bolsa "Complete CM2 Day 11 Media" en un portasueros. Alimente el tubo de la bomba a través de la bomba Baxa.
8.7.5 Medio bombeado al G-Rex500MCS. Configure la bomba Baxa en "Alto" y "9". Bombeó 4,5 litros de medio en el G-Rex500MCS, llenándolo hasta la línea marcada en el matraz en la Etapa 8.7.1.
8.7.6 Sellado térmico. Selló térmicamente la línea roja (según la Nota de proceso 5.12) del G-Rex500MCS cerca de la soldadura creada en la Etapa 8.7.3.
8.7.7 Matraz etiquetado. Se etiquetó el matraz con la etiqueta Adjunte una muestra del "Día 11", que el control de calidad proporcionó en el proceso "Día 11".
8.7.8 Si corresponde: Matraz incubado. Mantuvo el matraz en la incubadora mientras esperaba sembrar con TIL.
8.7.9 Soldadura de la celda alimentadora: Paquete de transferencia de suspensión al matraz. Soldado estéril (según la Nota de proceso 5.11) la línea roja del G-Rex500MCS al paquete de transferencia "Suspensión de células alimentadoras".
8.7.10 Se agregaron celdas alimentadoras al G-Rex500MCS. Se abrieron todas las abrazaderas entre la suspensión de células alimentadoras y el G-Rex500MCS y se añadió la suspensión de células alimentadoras al matraz mediante alimentación por gravedad. Se aseguró de que la línea haya sido completamente despejada. 8.7.11 Sellado térmico. Sellé térmicamente (según la Nota de proceso 5.12) la línea roja cerca de la soldadura creada en la Etapa 8.7.9.
8.7.12 Soldó el paquete de transferencia de suspensión TIL al matraz. Suelde de forma estéril (según la Nota de proceso 5.11) la línea roja del G-Rex500MCS al paquete de transferencia "TIL Suspensión".
8.7.13 Se agregó TIL a G-Rex500MCS. Se abrieron todas las abrazaderas entre la suspensión TIL y el G-Rex500MCS y se agregó la suspensión TIL al matraz mediante alimentación por gravedad. Se aseguró de que la línea haya sido completamente despejada.
8.7.14 Sellado térmico. Sellé térmicamente (según la nota de proceso 5.12) la línea roja cerca de la soldadura creada en la Etapa 8.7.12 para quitar la bolsa de suspensión TIL.
8.7.15 G-Rex500MCS incubado. Verificó que todas las abrazaderas del G-Rex500MCS estuvieran cerradas, excepto la línea de filtro grande, y que se colocaran en la incubadora. Parámetros de la incubadora: Pantalla LED de temperatura: 37,0±2,0 °C, porcentaje de CO2: 5,0±1,5 %CO2.
8.7.16 Ventana de incubación calculada. Se realizaron cálculos para determinar el momento adecuado para retirar el G-Rex500MCS de la incubadora el día 16. Tiempo de incubación (Etapa 8.7.15). Límite inferior: Tiempo de incubación 108 horas. Limite superior: Tiempo de incubación 132 horas.
8.7.17 Monitoreo Ambiental. Después del procesamiento, se realizó el BSC verificado y el seguimiento del personal.
8.7.18 Enviar muestras. Envíe muestras para iniciar sesión.
8.7.19 Revisar la Sección 8.7
8.8 Día 11 Exceso de criopreservación de TIL
8.8.1 Si corresponde: Congeló el exceso de viales de TIL. Verificó que el CRF se haya configurado antes de la congelación. Realizar criopreservación.
8.8.2 Si corresponde: CRF iniciado. Se registró el número total de viales colocados en el CRF (sin incluir el blanco). Verifique que la cantidad de viales transferidos al CRF coincida con la cantidad total de viales preparados en la Etapa 8.5.72 o la Etapa 8.5.84
Etapa 8.5.72C o Etapa 8.5.84
8.8.3 Si corresponde: Parte automatizada iniciada del perfil de congelación. HORA DE INICIO registrada para el inicio de la parte automatizada del perfil de congelación.
8.8.4 Si corresponde: Se transfirieron los viales del congelador de velocidad controlada al lugar de almacenamiento adecuado. Al finalizar la congelación, transfiera los viales del CRF al recipiente de almacenamiento adecuado. 8.8.5 Si corresponde: Se transfirieron los viales al almacenamiento adecuado. Ubicación de almacenamiento registrada en LN2.
8.8.6 Revisar la Sección 8.8
8.9 Día 16 Preparación de los medios
8.9.1 Medio AIM-V precalentado. Se retiraron tres bolsas de medios CTS AIM V 10L de 2 a 8 °C al menos 12 horas antes de su uso y se colocaron a temperatura ambiente protegidas de la luz. Verifique que cada bolsa esté a punto de caducar. Se etiquetó cada bolsa con el número de bolsa (1-3), el número de lote, la fecha y la "hora de inicio del calentamiento HHMM". Registre la hora y fecha de inicio del calentamiento.
8.9.2 Tiempo calculado Se calentó el medio de la etapa 8.9.1. Calculó el tiempo de calentamiento de las bolsas de medios 1, 2 y 3 de la etapa 8.9.1. Asegúrese de que todas las bolsas se hayan calentado durante un período de entre 12 y 24 horas.
8.9.3 Se revisó la higienización de la sala, la limpieza de líneas y los materiales. Sanitización de habitaciones, limpieza de líneas y materiales confirmados.
8.9.4 Aseguró la finalización de la tabla de preprocesamiento.
8.9.5 Monitoreo Ambiental. Antes del procesamiento, se había iniciado un monitoreo ambiental previo al proceso.
8.9.6 Configuración del Labtainer de 10 litros para el sobrenadante. En el BSC, se conectó el extremo de mayor diámetro de una bomba de transferencia de fluido a uno de los puertos hembra de una bolsa Labtainer de 10 litros mediante conectores Luer.
8.9.7 Configuración del Labtainer de 10 l para sobrenadante Etiquete como "Sobrenadante" y número de lote. 8.9.8 Configuración del Labtainer de 10 l para sobrenadante Asegúrese de que todas las abrazaderas estuvieran cerradas antes de retirarlas del BSC. NOTA: Se utilizó una bolsa de sobrenadante durante la recolección TIL (Sección 8.10), que puede realizarse simultáneamente con la preparación del medio.
8.9.9 IL-2 descongelada. Alícuotas descongeladas de 5 x 1,1 mL de IL-2 (6 x 106 UI/mL) (BR71424) por bolsa de medio CTS AIM V hasta que todo el hielo se haya derretido.
Número de lote y vencimiento de IL-2 registrados. Etiquetas de IL-2 adjuntas.
8.9.10 GlutaMax en alícuotas. En BSC, se repartieron alícuotas de 100,0 mL de Glutamax en un receptor del tamaño adecuado. Registró el volumen agregado a cada receptor NOTA: Inicialmente preparó una bolsa de medios AIM-V siguiendo la Etapa 8.9.10 - Etapa 8.9.28. Las bolsas adicionales requeridas se determinaron en la Etapa 8.10.59.
8.9.11 Receptores etiquetados. Etiqueté cada receptor como "GlutaMax".
8.9.12 Se agregó IL-2 a GlutaMax. Usando una micropipeta, se agregaron 5,0 mL de IL-2 a cada receptor GlutaMax. Se aseguró de enjuagar la punta según la nota de proceso 5.18 y se utilizó una punta de pipeta nueva por cada mL agregado. Volumen grabado agregado a cada receptor de Glutamax a continuación.
8.9.13 Receptores etiquetados. Etiquetó cada receptor como "GlutaMax IL-2" y número de receptor.
8.9.14 Bolsa de medio CTS AIM V preparada para formulación. Se aseguró de que la bolsa de medios CTS AIM V de 10 litros (W3012717) se calentara a temperatura ambiente y se protegiera de la luz durante 12 a 24 horas antes de su uso. Tiempo de incubación final registrado en la Etapa 8.9.2.
8.9.15 Bolsa de medio CTS AIM V preparada para formulación. En el BSC, cierre la abrazadera de un conjunto de transferencia de plasma de 4" y luego conéctelo a la bolsa mediante los puertos de púas. NOTA: Mantuvo una presión constante mientras giraba la púa en una dirección. Se aseguró de no perforar el costado del puerto. 8.9.16 Bolsa de medio CTS AIM V preparada para formulación. Conectó el extremo de mayor diámetro de un conjunto de transferencia de fluido con bomba repetidora al conjunto de transferencia de plasma de 4" mediante luer.
8.9.17 Bomba Baxa Etapa. Bomba Stage Baxa junto al BSC. Se quitó la sección de tubería de la bomba del conjunto de transferencia de fluido de la bomba repetidora del BSC y se instaló en la bomba repetidora.
8.9.18 Preparado para formular medios. En BSC, se retiró la jeringa del sistema dispensador de líquidos Pumpmatic (PLDS) y se descartó. NOTA: Garantizado para no comprometer la esterilidad de la pipeta PLDS. 8.9.19 Preparado para formular medios. Se conectó la pipeta PLDS al extremo de menor diámetro del conjunto de transferencia de fluido de la bomba repetidora mediante una conexión luer y se colocó la punta de la pipeta en "GlutaMax IL-2" preparado en la Etapa 8.9.13 para la aspiración. Abra todas las abrazaderas entre el receptor y la bolsa de 10 litros.
8.9.20 GlutaMax IL-2 bombeado en una bolsa. Establezca la velocidad de la bomba en "Media" y "3" y bombee todo "GlutaMax IL-2" en una bolsa de medios CTS AIM V de 10 litros. Una vez que no quede solución, limpie la línea y detenga la bomba. Registró el volumen de GlutaMax que contiene IL-2 agregado a cada bolsa de Aim V a continuación. ¡Grabado!
8.9.21 Se eliminó el PLDS. Se aseguró de que todas las abrazaderas estuvieran cerradas y retiró la pipeta PLDS del conjunto de transferencia de fluido de la bomba repetidora. Se quitó el conjunto de transferencia de fluido de la bomba repetidora y la tapa roja del conjunto de transferencia de plasma de 4".
8.9.22 Bolsas etiquetadas. Se etiquetó cada bolsa de "medio CM4 completo día 16" preparada.
8.9.23 Retención de medios eliminados según el plan de muestra. Con una jeringa de 30 mL, extrajo 20,0 mL de "medio CM4 completo día 16" conectando la jeringa al conjunto de transferencia de plasma de 4" y dispensó la muestra en un tubo cónico de 50 mL.
NOTA: Solo se extrajo la muestra de retención de medios de la primera bolsa de medios preparada. NOTA: Asegúrese de que el equipo de transferencia de plasma de 4" esté sujeto con abrazaderas o con tapa roja después de retirar la jeringa.
8.9.24 Se adjuntó un nuevo conjunto de transferencia de fluido con bomba repetidora. Adjuntó el extremo de mayor diámetro de un nuevo conjunto de transferencia de bomba de fluido al conjunto de transferencia de plasma de 4" que estaba conectado a la bolsa "Complete CM4 Day 16 media".
8.9.25 Muestra etiquetada y almacenada. Etiquetado con la etiqueta de inventario del plan de muestra y los medios almacenados retienen la muestra a 2-8 °C hasta que se envíe a Iniciar sesión para realizar pruebas según el plan de muestra.
8.9.26 Firmado para muestreo. Se aseguró de que se completara la hoja del plan de muestra de LIMS para la extracción de la muestra.
8.9.27 Monitorear la Incubadora. Incubadora monitoreada. Si corresponde, según la Etapa 8.9.10, controle si se han preparado bolsas adicionales. Parámetros de la incubadora:
Pantalla LED de temperatura: 37,0±2,0 °C, porcentaje de CO2: 5,0±1,5 %CO2.
8.9.28 Medio CM4 completo calentado día 16. Se calentó la primera bolsa de medio Complete CM4 Day 16 en una incubadora durante > 30 minutos hasta que esté lista para su uso. Si corresponde, según la Etapa 8.10.59, calenté bolsas adicionales.
8.9.29 Diluciones preparadas. En el BSC, se agregaron 4,5 mL de medio AIM-V que había sido etiquetado con el número de lote de registro de lote y "Para diluciones de recuento celular" a cada tubo cónico de 4x15 mL. Etiqueté los tubos cónicos con el número de lote y el número de tubo (1-4). 4 crioviales etiquetados con el número de vial (1-4).
Los viales se mantuvieron bajo BSC para usarse en la Etapa 8.10.31.
8.9.30 Sección revisada 8.9
8.10 Día 16 REP jugado
8.10.1 Tabla de preprocesamiento.
8.10.2 Incubadora monitoreada. Incubadora monitoreada. Parámetros de la incubadora: Pantalla LED de temperatura: 37,0±2,0 °C, porcentaje de CO2: 5,0±1,5 %CO2
8.10.3 Se eliminó el G-Rex500MCS de la incubadora. Realice la verificación a continuación para garantizar que se cumplan los parámetros de incubación antes de retirar el G-Rex500MCS de la incubadora.
Se eliminó el G-Rex500MCS de la incubadora.
8.10.4 Configuración del paquete de transferencia de 1 litro. Selló térmicamente un paquete de transferencia de 1 litro (W3006645) según la Nota procesada 5.12, dejando ~12" de línea.
8.10.5 Paquete de transferencia de 1 litro preparado. Paquete de transferencia de 1 litro etiquetado como TIL Suspensión.
8.10.6 Paquete de transferencia de 1 litro pesado Coloque el paquete de transferencia de 1 litro, incluida toda la línea, en una báscula y registre el peso seco.
8.10.7 Configuración de GatheRex. Soldado estéril (según la Nota de proceso 5.11) la línea roja de eliminación de medios del G-Rex500MCS al conjunto de transferencia de la bomba repetidora en la bolsa labtainer de 10 litros "Sobrenadante" preparada en la Etapa 8.9.8. Estéril soldó la línea de eliminación de células transparentes del G-Rex500MCS al paquete de transferencia de suspensión TIL preparado en la Etapa 8.10.5.
8.10.8 Configuración de GatheRex. Se colocó el matraz G-Rex500MCS en el lado izquierdo del GatheRex. Colocó la bolsa labtainer de sobrenadante y el paquete de transferencia de suspensión TIL en el lado derecho.
8.10.9 Configuración de GatheRex. Instalé la línea roja de extracción de medios desde el G-Rex500MCS hasta la abrazadera superior (marcada con una línea roja) y las guías de tubos en el GatheRex. Instalé la línea de recolección transparente desde el G-Rex500MCS hasta la abrazadera inferior (marcada con una línea azul) y las guías de tubos en el GatheRex.
8.10.10 Configuración de GatheRex. Conectó la línea de gas del GatheRex al filtro estéril del G-Rex500 MCS. NOTA: Antes de retirar el sobrenadante del G-Rex500MCS, asegúrese de que todas las abrazaderas de las líneas de extracción de células estuvieran cerradas.
8.10.11 Reducción de volumen de G-Rex500MCS. Se transfirieron ~4,5 litros de sobrenadante de cultivo del G-Rex500MCS al Labtainer de 10 litros según SOP-01777. Inspeccione visualmente el G-Rex500MCS para asegurarse de que el nivel del matraz y el medio se hayan reducido hasta el final del tubo de inmersión de aspiración. NOTA: Si el GatheRex se detiene prematuramente, se podría reiniciar presionando nuevamente el botón con la flecha apuntando hacia la derecha.
8.10.12 Matraz preparado para Recolección de TIL. Después de retirar el sobrenadante, se cerraron todas las pinzas hasta la línea roja.
8.10.13 Inicio de Recolección de TIL. Se registró la hora de inicio de la cosecha TIL.
8.10.14 Inicio de Recolección de TIL. Golpee vigorosamente el matraz y agite el medio para liberar las células. Realizó una inspección del matraz para garantizar que todas las células se hayan desprendido. NOTA: Comuníquese con la gerencia del área si las células no se desprendieron.
8.10.15 Inicio de Recolección de TIL. Inclinó el matraz para asegurarse de que la manguera esté en el borde del matraz. Nota: Si la pajita de recolección de células no está en la unión de la pared y la membrana inferior, generalmente es suficiente golpear el matraz mientras está inclinado en un ángulo de 450 para colocar correctamente la pajita.
8.10.16 Recolección de TIL. Soltó todas las abrazaderas que conducen al paquete de transferencia de suspensión TIL.
8.10.17 Recolección de TIL. Usando GatheRex transfirió la suspensión celular al paquete de transferencia de suspensión TIL. NOTA: Asegúrese de mantener el borde inclinado hasta que se recojan todas las células y los medios.
8.10.18 Recolección de TIL. Membrana inspeccionada en busca de células adherentes.
8.10.19 Enjuague la membrana del matraz. Enjuague la parte inferior del G-Rex500MCS. Cubra ~1/4 de la membrana de intercambio de gases con medio de enjuague.
8.10.20 Abrazaderas cerradas en G-Rex500MCS. Asegúrese de que todas las abrazaderas estén cerradas en el G-Rex500MCS.
8.10.21 Sellado térmicamente. Selló térmicamente (según la Nota de proceso 5.12) el paquete de transferencia que contiene el TIL lo más cerca posible de la soldadura para que la longitud total del tubo permaneciera aproximadamente igual.
8.10.22 Sellado térmicamente. Se selló térmicamente el Labtainer de 10 litros que contiene el sobrenadante (según la Nota de proceso 5.12) y se pasó al BSC para la recolección de muestras en la Etapa 8.10.25.
8.10.23 Volumen calculado de suspensión de TIL. Se registra el peso del Transfer Pack con suspensión celular y se calcula el volumen de la suspensión.
8.10.24 Paquete de transferencia preparado para la extracción de muestras. Soldé (según la Nota de proceso 5.11) un conjunto de transferencia de plasma de 4" al paquete de transferencia de suspensión TIL de la etapa 8.10.21, dejando el extremo luer hembra conectado lo más cerca posible de la bolsa.
8.10.25 Se eliminaron las muestras de prueba del sobrenadante celular. En el BSC, retire 10,0 mL de sobrenadante del labtainer de 10 l utilizando un puerto luer hembra y una jeringa del tamaño adecuado. Colocado en un tubo cónico de 15 mL y etiquetado como "BacT". Conserve el tubo para la muestra BacT en la Etapa 8.10.28.
8.10.26 Se eliminaron las muestras de prueba del sobrenadante celular. Con una jeringa separada, se extrajeron 10,0 mL de sobrenadante y se colocaron en un tubo cónico de 15 mL. Conservó el tubo para la muestra de micoplasma para su uso en la Etapa 8.10.32. Tubo etiquetado como "Diluyente de Mycoplasma"
8.10.27 Bolsa de sobrenadante cerrada. Se colocó una tapa roja en el puerto luer para cerrar la bolsa y sacarla del BSC.
8.10.28 Muestreo de pruebas de esterilidad y BacT. En el BSC, extraiga una muestra de 1,0 mL del BacT cónico etiquetado de 15 mL preparado en el paso 8.10.25 utilizando una jeringa del tamaño adecuado e inocule la botella anaeróbica.
Repita lo anterior para la botella aeróbica. NOTA: Este paso puede realizarse fuera de secuencia.
8.10.29 Muestras etiquetadas y almacenadas. Etiquete con la etiqueta de inventario del plan de muestra y almacene la muestra BacT a temperatura ambiente, protegida de la luz, hasta que se envíe a Iniciar sesión para su análisis según el Plan de muestra. NOTA: No cubrió el código de barras de la botella con la etiqueta.
8.10.30 Firmado para muestreo. Se aseguró de que se complete la hoja del plan de muestra de LIMS para la extracción de la muestra.
8.10.31 Muestras de recuento de células eliminadas. En el BSC, utilizando jeringas separadas de 3 mL para cada muestra, se retiraron muestras de recuento de células de 4 x 1,0 mL del paquete de transferencia "TIL Suspensión" utilizando la conexión luer. Muestras colocadas en crioviales preparados en la Etapa 8.9.29.
8.10.32 Muestras de micoplasma eliminadas. Con una jeringa de 3 mL, extraiga 1,0 mL del paquete de transferencia de suspensión TIL y colóquelo en un "diluyente de Mycoplasma" cónico de 15 mL preparado en el paso 8.10.26.
8.10.33 Etiquete y almacene la muestra. Etiquetado con la etiqueta de inventario del plan de muestra y muestra de Mycoplasma almacenada a 2-8 °C hasta que se envíe a Iniciar sesión para realizar pruebas según el plan de muestra.
8.10.34 Firmado para muestreo. Se aseguró de que se completara la hoja del plan de muestra de LIMS para la extracción de la muestra.
8.10.35 Paquete de transferencia preparado para la siembra. En el BSC, conectó el extremo del tubo de gran diámetro de un conjunto de transferencia de fluido con bomba repetidora al adaptador Luer en el paquete de transferencia que contiene el TIL. Sujetó la línea cerca del paquete de transferencia usando un hemostato. Coloqué una gorra roja en el extremo del juego de transferencia.
8.10.36 Se colocó TIL en la incubadora. Se retiró la suspensión celular del BSC y se colocó en la incubadora hasta que sea necesario. Tiempo grabado.
8.10.37 Recuentos de células realizadas. Realicé recuentos de células y cálculos utilizando NC-200 y la Nota de proceso 5.14. Muestras de recuento de células diluidas inicialmente añadiendo 0,5 mL de suspensión celular en 4,5 mL de medio AIM-V preparado en el paso 8.9.29. Esto dio una dilución de 1:10.
8.10.38 Volúmenes de muestra de recuento celular registrado
8.10.39 Factor de multiplicación determinado.
8.10.40 Protocolos seleccionados e ingreso de factores de multiplicación. Se aseguró de que se hubiera seleccionado el protocolo "Ensayo de recuento de células viables", de que se hubieran ingresado todos los factores de multiplicación y los volúmenes de muestra y diluyente.
8.10.41 Nombre del archivo registrado, viabilidad y recuento de células de Nucleoview.
8.10.42 Se determinó el Promedio de Concentración de Células Viables y Viabilidad de los conteos celulares realizados.
8.10.43 Límite superior e inferior determinado para los recuentos.
8.10.44 ¿Estuvieron ambos recuentos dentro de límites aceptables?
8.10.45 Si corresponde: Conteos celulares realizados. Realicé recuentos de células y cálculos utilizando NC-200 y la Nota de proceso 5.14. NOTA: La dilución se puede ajustar según la concentración esperada de células. 8.10.46 Si corresponde: Volúmenes de muestra de recuento celular registrados. NOTA: Si no se necesita dilución, ingrese "Muestra [<|j>E]" = 200, "Dilución [<|j>L]" = 0
8.10.47 Si corresponde: Factor de multiplicación determinado.
8.10.48 Si corresponde: Seleccione protocolos e ingrese factores de multiplicación. Asegúrese de que se haya seleccionado el protocolo "Ensayo de recuento de células viables", que se hayan ingresado todos los factores de multiplicación y los volúmenes de muestra y diluyente.
NOTA: Si no se necesita dilución, ingrese "Muestra [j L]" = 200, "Dilución [j L]" = 0
8.10.49 Si corresponde: Recuentos de células registrados desde Nucleoview
8.10.50 Si corresponde: Se determinó el Promedio de Concentración de Células Viables y la Viabilidad de los conteos celulares realizados.
8.10.51 Si corresponde: Límite superior e inferior determinado para los recuentos.
8.10.52 Si corresponde: ¿Estuvieron los recuentos dentro de límites aceptables?
NOTA: Si cualquiera de los resultados es "No", continúe con la Etapa 8.10.53 para determinar un promedio de todos los recuentos de células recopilados.
8.10.53 Si corresponde: Se determinó una concentración promedio de células viables a partir de los cuatro recuentos realizados.
8.10.54 Volumen ajustado de suspensión TIL. Calculó el volumen ajustado de suspensión de TIL después de la extracción de las muestras de recuento celular. Volumen total de células TIL de la etapa 8.10.23C menos 5,0 mL eliminados para la prueba.
8.10.55 Total de células TIL viables calculadas.
8.10.56 Matraces calculados para subcultivo. Calculó el número total de matraces a sembrar. NOTA: Redondeó el número de matraces G-Rex500MCS para ver hasta el número entero más cercano.
NOTA: El número máximo de matraces G-Rex500MCS para sembrar fue cinco. Si el número calculado de matraces a sembrar excedía los cinco, solo se sembraron cinco UTILIZANDO TODO EL VOLUMEN DE SUSPENSIÓN CELULAR DISPONIBLE
8.10.57 Calcular el número de matraces para el subcultivo.
8.10.58 Revisión de control de calidad de los cálculos del recuento de células realizados en las etapas 8.10.38 -8.10.57.
8.10.59 Se determinó la cantidad de bolsas de medios adicionales necesarias. Calculó la cantidad de bolsas de medios necesarias además de la bolsa preparada en la Etapa 8.9.28.
8.10.60 Si corresponde: Medios adicionales preparados. Preparó una bolsa de 10 litros de "CM4 Día 16 Medios" por cada dos matraces G-Rex-500M necesarios calculados en la Etapa 8.10.59D. Continuó con la Etapa 8.10.62 y sembró los primeros matraces GREX-500M mientras se preparan y calientan medios adicionales.
8.10.61 Si corresponde: Bolsas de medios adicionales preparadas. Se preparó y calentó el número calculado de bolsas de medios adicionales determinadas en la Etapa 8.10.59D, repitiendo la Etapa 8.9.10 - Etapa 8.9.28. 8.10.62 G-Rex500MCS relleno. Abrí un G-Rex500MCS en la mesa de trabajo y lo inspeccioné en busca de grietas en el recipiente o torceduras en los tubos. Se aseguró de que todas las conexiones y cierres luer estuvieran apretados. Hizo una marca en la línea de 4500 mL en el exterior del matraz con un marcador. Cerré todas las abrazaderas del G-Rex500MCS excepto la línea de filtro grande.
8.10.63 G-Rex500MCS relleno. Soldado estéril (según la Nota de proceso 5.11) la línea roja de medios de un G-Rex500MCS al conjunto de transferencia de fluido en la bolsa de medios preparada en la Etapa 8.9.28.
8.10.64 Preparado para bombear medios. Colgué "CM4 Day 16 Media" en un portasueros. Alimente el tubo de la bomba a través de la bomba Baxa.
8.10.65 Bombee el medio al G-Rex500MCS. Configure la bomba Baxa en "Alto" y "9" y bombee 4500 mL de medio en el matraz. Bombeó 4,5 litros de "Medio CM4 Día 16" en el G-Rex500MCS, llenándolo hasta la línea marcada en el matraz en la Etapa 8.10.62. Una vez transferidos 4,5 litros de medio, detuvo la bomba.
8.10.66 Sellado térmicamente. Sellé térmicamente (según la Nota de proceso 5.12) la línea de medio roja del G-Rex500MCS, cerca de la soldadura creada en la Etapa 8.10.63, retirando la bolsa de medio.
8.10.67 Llenado repetido. Repita las etapas 8.10.62-8.10.66 para cada matraz calculado en el paso 8.10.56C a medida que el medio se calienta y se prepara para su uso.
NOTA: Se pueden llenar varios matraces al mismo tiempo utilizando llenado por gravedad o bombas múltiples. NOTA: Llene sólo dos matraces por bolsa de medio.
8.10.68 Matraces registrados y etiquetados llenos. Se etiquetó cada matraz alfabéticamente a medida que se llenaba y se proporcionaron etiquetas de control de calidad del "Día 16" durante el proceso.
8.10.69 Muestra etiquetada. Adjunto una etiqueta de muestra del "Día 16" a continuación.
8.10.70 Si corresponde: Matraz incubado. Mantuvo el matraz en la incubadora mientras esperaba sembrar con TIL.
8.10.71 Número verificado de matraces llenos. Se registró el número total de matraces llenos.
8.10.72 Volumen calculado de suspensión celular a agregar. Calculó el volumen objetivo de suspensión de TIL para agregar a los nuevos matraces G-Rex500MCS.
8.10.56C excede cinco solo se sembrarán cinco, UTILIZANDO TODO EL VOLUMEN DE SUSPENSION CELULAR.
8.10.73 Frascos preparados para la siembra. Se eliminó G-Rex500MCS de la etapa 8.10.70 de la incubadora. 8.10.74 Preparado para bombeo. Cerré todas las abrazaderas en G-Rex500MCS excepto la línea de filtro grande. Alimente el tubo de la bomba a través de la bomba Baxa.
8.10.75 Se eliminó TIL de la incubadora. Se eliminó el paquete de transferencia "TIL Suspensión" de la incubadora y se registró la hora de finalización de la incubación en la Etapa 8.10.36.
8.10.76 Suspensión celular preparada para siembra. Paquete de transferencia de "suspensión TIL" soldado estéril (según la Nota de proceso 5.11) desde el paso 8.10.75 a la línea de entrada de la bomba.
8.10.77 Báscula tarada. Bolsa de suspensión TIL colocada en una báscula. Cebe la línea desde la bolsa de suspensión TIL hasta la soldadura usando la bomba Baxa configurada en "Bajo" y "2". Taré la báscula.
8.10.78 Matraz sembrado con suspensión TIL. Configure la bomba Baxa en "Medio" y "5". Bombee el volumen de suspensión de TIL calculado en la Etapa 8.10.72C al matraz. Registre el volumen de suspensión TIL agregado a cada matraz.
8.10.79 Sellado térmicamente. Selló térmicamente (según la Nota de proceso 5.12) el paquete de transferencia "Suspensión TIL", dejando suficiente tubo para soldar en el siguiente matraz.
Se utilizó el separador de líneas para eliminar la suspensión de TIL residual en la línea del matraz G-Rex en el recipiente.
8.10.80 Matraces restantes llenos. Entre cada matraz sembrado, asegúrese de mezclar el paquete de transferencia "TIL Suspensión" y repita las etapas 8.10.76-8.10.79 para sembrar todos los copos restantes. Matraz(es) lleno(s) en orden alfabético.
8.10.81 Incubadora monitoreada. NOTA: Si los matraces deben dividirse entre dos incubadoras, asegúrese de monitorear ambas. Parámetros de la incubadora: Pantalla LED de temperatura: 37,0±2,0 °C, porcentaje de CO2: 5,0±1,5 %CO2.
8.10.82 Matraces incubados. Se registró el tiempo que cada matraz se colocó en la incubadora.
8.10.83 Ventana de incubación calculada. Se realizaron los cálculos a continuación para determinar el rango de tiempo para retirar el G-Rex500MCS de la incubadora el día 22.
8.10.84 Monitoreo Ambiental. Después del procesamiento, se realizó el BSC verificado y el seguimiento del personal.
8.10.85 Envío de muestra. Se aseguró de que todas las muestras del día 16 se enviaran al inicio de sesión. 8.10.86 Se revisó la Sección 8.10.
8.11 Preparación del tampón de lavado del día 22
8.11.1 Se revisó la desinfección de la habitación, la limpieza de líneas y los materiales.
8.11.2 Se aseguró la finalización de la lista de verificación previa al procesamiento.
8.11.3 Monitoreo ambiental. Antes del procesamiento, se aseguró que se hubiera realizado un monitoreo ambiental previo al proceso.
8.11.4 Bolsa Labtainer de 10 L preparada En BSC, conecte un juego de transferencia de plasma de 4" a una bolsa Labtainer de 10 L mediante una conexión luer.
8.11.5 Bolsa Labtainer de 10 L preparada Etiquete como "Sobrenadante", número de lote e inicial/fecha.
8.11.6 Bolsa Labtainer de 10 L preparada. Cerró todas las abrazaderas antes de transferirlas fuera del BSC. NOTA: Se preparó una bolsa Labtainer de 10 litros por cada dos matraces G-Rex500MCS que se iban a recolectar. NOTA: Se utilizaron bolsas de sobrenadante en la Sección 8.12, que podrían ejecutarse al mismo tiempo que la Sección 8.11.
8.11.7 Conjunto de transferencia de fluido soldado. Fuera del BSC, cerramos todas las abrazaderas del 4S-4M60. Conjunto repetidor de transferencia de fluido soldado (según la Nota de proceso 5.11) a uno de los extremos luer macho de 4S-4M60. (Ver, por ejemplo, la Figura 132.)
8.11.8 Materiales pasados al BSC. Pasó plasmalito A y albúmina humana al 25 % al BSC. Pase el conjunto 4S-4M60 y el conjunto repetidor de transferencia de fluido al BSC.
8.11.9 Plasmalito bombeado en una bolsa de 3000 mL. Se conectaron tres bolsas de Plasmalito-A al conjunto de conectores 4S-4M60. NOTA: Limpie la cubierta del puerto con un hisopo con alcohol (W3009488) antes de retirarla. NOTA: Mantenga una presión constante mientras gira la púa en una dirección. Asegúrese de no perforar el costado del puerto.
8.11.10 Plasmalito bombeado en una bolsa de 3000 mL. Se conectó una bolsa recolectora Origen de 3000 mL mediante una conexión luer al extremo de mayor diámetro del conjunto de transferencia de la bomba repetidora.
8.11.11 Plasmalito bombeado en una bolsa de 3000 mL. Pinzas cerradas en las líneas no utilizadas de la Bolsa Origen de 3000mL.
8.11.12 Plasmalito bombeado en una bolsa de 3000 mL. Instaló la bomba Baxa junto al BSC. Alimente el tubo del conjunto de transferencia a través de la bomba Baxa situada fuera del BSC. Configure la bomba en "Alto" y "9".
8.11.13 Plasmalito bombeado en una bolsa de 3000 mL. Se abrieron todas las abrazaderas desde Plasmalito-A hasta la bolsa Origen de 3000 mL.
8.11.14 Plasmalito bombeado en una bolsa de 3000 mL. Bombeó todo el Plasmalito-A en la bolsa Origen de 3000 mL. Una vez transferido todo el Plasmalito-A, detuvo la bomba.
8.11.15 Plasmalito bombeado en una bolsa de 3000 mL. Si es necesario, elimine el aire de la bolsa Origen de 3000 mL invirtiendo la bomba y manipulando la posición de la bolsa.
8.11.16 Plasmalito bombeado en una bolsa de 3000 mL. Cerré todas las abrazaderas.
Retire la bolsa de 3000 mL del conjunto de transferencia de fluido de la bomba repetidora mediante una conexión luer y coloque una tapa roja (W3012845) en la línea que va a la bolsa.
8.11.17 Se agregó albúmina humana al 25% a una bolsa de 3000 mL. Mini pico ventilado abierto. Sin comprometer la esterilidad de la punta, asegúrese de que la tapa azul esté bien sujeta.
8.11.18 Se agregó albúmina humana al 25% a una bolsa de 3000 mL. Se pinchó el tabique de una botella de albúmina humana al 25 % con la mini púa ventilada. NOTA: Garantizado para no comprometer la esterilidad de la punta.
8.11.19 Se agregó albúmina humana al 25% a una bolsa de 3000 mL. Repitió el paso 8.11.17 - Etapa 8.11.18 dos veces para un total de tres (3) frascos de albúmina humana al 25% enriquecidos.
8.11.20 Se agregó albúmina humana al 25% a una bolsa de 3000 mL. Quitó la tapa azul de una mini púa ventilada y conecte una jeringa de 60 mL al frasco de albúmina sérica humana al 25 %.
8.11.21 Se agregó albúmina humana al 25% a una bolsa de 3000 mL. Extraer 60 mL de albúmina sérica humana al 25 %. NOTA: Puede ser necesario utilizar más de un frasco de Albúmina de Suero Humano al 25%. Si es necesario, desconecte la jeringa de la minipúa ventilada y conéctela a la siguiente minipúa ventilada en una botella de albúmina sérica humana al 25 %. No retire la minipúa ventilada del frasco de albúmina sérica humana al 25 %.
8.11.22 Se agregó albúmina humana al 25% a una bolsa de 3000 mL. Una vez obtenidos 60 mL, retire la jeringa del mini pico ventilado.
8.11.23 Se agregó albúmina humana al 25% a una bolsa de 3000 mL. Conecte la jeringa al puerto de inyección sin aguja en la bolsa Origen de 3000 mL llena de Plasmalito-A en el paso 8.11.16. Dispensó toda la albúmina humana al 25%. NOTA: Limpie el puerto de inyección innecesario con una gasa con alcohol antes de cada uso.
8.11.24 Se agregó albúmina humana al 25% a una bolsa de 3000 mL. Se repitió la Etapa 8.11.20 - Etapa 8.11.23 para obtener un volumen final de 120,0 mL de Albúmina Humana al 25%.
8.11.25 Bolsa Mixta. Mezclé suavemente la bolsa después de agregar toda la albúmina humana al 25 %.
8.11.26 Bolsa etiquetada. Etiquetado como "LOVOWash Buffer" y número de lote, y se le asigna una caducidad de 24 horas.
8.11.27 Diluyente de IL-2 preparado. Con una jeringa de 10 mL, extraiga 5,0 mL de Tampón de Lavado LOVO utilizando el puerto de inyección sin aguja de la bolsa de Tampón de Lavado LOVO. Dispensó el tampón de lavado LOVO en un tubo cónico de 50 mL y etiquételo como "Diluyente IL-2" y el número de lote. NOTA: Limpie el puerto de inyección innecesario con una gasa con alcohol antes de cada uso.
8.11.28CRF Bolsa en blanco Tampón de lavado LOVO en alícuotas. Con una jeringa de 100 mL, extrajo 70,0 mL de tampón de lavado LOVO del puerto de inyección sin aguja. NOTA: Limpie el puerto de inyección innecesario con una gasa con alcohol antes de cada uso.
8.11.29CRF Bolsa en blanco Tampón de lavado LOVO en alícuotas. Se colocó una tapa roja en la jeringa y se etiquete como "bolsa criogénica en blanco" y número de lote. NOTA: Mantenga la jeringa a temperatura ambiente hasta que la necesite en la Etapa 8.14.3
8.11.30 Preparación del tampón de lavado completada. Cerré todas las abrazaderas de la bolsa Tampón de Lavado LOVO.
8.11.31 IL 2 descongelado. Descongelado 1,1 mL de IL-2 (6*10® UI/mL) ), hasta que todo el hielo se haya derretido. Registre el número de lote y la caducidad de IL-2. NOTA: Asegúrese de que la etiqueta IL-2 esté adherida. 8.11.32 Preparación de IL-2. Se agregaron 50 pl de stock de IL-2 (6 * 10® UI/mL) al tubo cónico de 50 mL etiquetado como "Diluyente IL-2".
8.11.33 Preparación de IL-2. Cónico reetiquetado como "IL-2 ®*104", la fecha, el número de lote y el vencimiento de 24 horas. Tape y almacene a 2-8°C.
8.11.34 Preparación para la criopreservación. Se colocaron 5 criocasetes a 2-8 °C para preacondicionarlos para la criopreservación del producto final.
8.11.35 Diluciones de recuento celular preparadas. En el BSC, se agregaron 4,5 mL de medio AIM-V etiquetado con el número de lote y "Para diluciones de recuento celular" a 4 tubos cónicos de 15 mL separados. Se etiquetaron los tubos con el número de lote del registro del lote y el número de tubo (1-4). Reservar para usar en la Etapa 8.12.34
8.11.3® Recuentos celulares preparados. 4 crioviales etiquetados con el número de vial (1-4). Los viales se mantuvieron bajo BSC para usarse en la Etapa 8.12.33.
8.11.37 Sección revisada 8.11
8.12 Día 22 A Cosecha
8.12.1 Monitorear la Incubadora. Supervisó la incubadora. Parámetros de la incubadora Pantalla LED de temperatura: 37 ± 2,0°C, Porcentaje de CO2: 5%±1,5%. NOTA: La Sección 8.12 podría ejecutarse simultáneamente con la Sección 8.11.
8.12.2 Se retiraron los matraces G-Rex500MCS de la incubadora. Realicé la verificación a continuación para garantizar que se cumplieran los parámetros de incubación antes de retirar el G-Rex500MCS de la incubadora.
NOTA: Este paso debe realizarse cuando se retira cada matraz de la incubadora.
8.12.3 Bolsa recolectora de TIL preparada Se etiquete una bolsa recolectora de 3000 mL como "Suspensión TIL", número de lote e inicial/fecha.
8.12.4 Conexiones adicionales selladas. Se sellaron con calor dos conexiones de leur en la bolsa de recolección cerca del final de cada conexión según la Nota de proceso 5.12.
8.12.5 Configuración de GatheRex. Soldado estéril (según la Nota de proceso 5.11) la línea de eliminación de medios roja del G-Rex500MCS a la bolsa labtainer de 10 litros preparada en la Etapa 8.11.5. NOTA: Se hace referencia a la Nota de proceso 5.1® para el uso de múltiples dispositivos GatheRex.
8.12.® Configuración de GatheRex. Soldado estéril (según la Nota de proceso 5.11) la línea de eliminación de células transparentes del G-Rex500MCS a la bolsa de recolección de suspensión TIL preparada en la Etapa 8.12.3. NOTA: Consulte la Nota de proceso 5.1® para el uso de múltiples dispositivos GatheRex.
8.12.7 Configuración de GatheRex. Colocó el matraz G-Rex500MCS en el lado izquierdo del GatheRex. Colocó la bolsa Labtainer sobrenadante y la bolsa recolectora de suspensión TIL agrupada en el lado derecho.
8.12.8 Configuración de GatheRex. Instalé la línea roja de extracción de medios desde el G-Rex500MCS hasta la abrazadera superior (marcada con una línea roja) y las guías de tubos en el GatheRex. Instalé la línea de recolección transparente desde el G-Rex500MCS hasta la abrazadera inferior (marcada con una línea azul) y las guías de tubos en el GatheRex.
8.12.9 Configuración de GatheRex. Conectó la línea de gas del GatheRex al filtro estéril del G-Rex500MCS. NOTA: Antes de retirar el sobrenadante del G-Rex500MCS, asegúrese de que todas las abrazaderas de las líneas de extracción de células estuvieran cerradas.
8.12.10 Reducción de volumen. Se transfirieron ~4,5 litros de sobrenadante del G-Rex500MCS a la bolsa de sobrenadante. Inspeccionó visualmente el G-Rex500MCS para garantizar que el matraz esté nivelado y que el medio se haya reducido hasta el final del tubo de inmersión de aspiración. Repita el paso si es necesario. NOTA: Si GatheRex se detuvo prematuramente, se puede reiniciar presionando nuevamente el botón con la flecha apuntando hacia la derecha.
8.12.11 Matraz preparado para Recolección de TIL. Después de retirar el sobrenadante, se cerraron todas las pinzas hasta la línea roja.
8.12.12 Cobro iniciado de TIL. Se registró la hora de inicio de la cosecha TIL.
8.12.13 Cobro iniciado de TIL. Golpee vigorosamente el matraz y agite el medio para liberar las células. Realizó una inspección del matraz para garantizar que todas las células se hayan desprendido. Se colocó la bolsa recolectora de 3000 mL "TIL Suspensión" sobre toallitas secas sobre una superficie plana. NOTA: Se contactó a la gerencia del área si las células no se desprendían.
8.12.14 Cobro iniciado de TIL. Inclinó el matraz para asegurarse de que la manguera esté en el borde del matraz. NOTA: Si la manguera de recolección de células no estaba en la unión de la pared y la membrana inferior, generalmente es suficiente golpear el matraz mientras está inclinado en un ángulo de 45° para colocar correctamente la manguera.
8.12.15 Recolección de TIL. Soltó todas las abrazaderas que conducen a la bolsa recolectora de suspensión TIL.
8.12.16 Recolección de TIL. Usando GatheRex, transfirió la suspensión TIL a la bolsa recolectora de 3000 mL. NOTA: Se mantuvo el borde inclinado hasta que se recogieron todas las células y medios.
8.12.17 Recolección de TIL. Inspeccione la membrana en busca de células adherentes.
8.12.18 Membrana del matraz enjuagada. Enjuagó la parte inferior del G-Rex500MCS. Se cubrió ~1/4 de la membrana de intercambio de gases con medio de enjuague.
8.12.19 Cierre las abrazaderas del G-Rex500MCS. Asegúrese de que todas las abrazaderas estén cerradas. 8.12.20 Sellado térmicamente. Selle térmicamente (según la Nota de proceso 5.12) la bolsa de recolección que contiene el TIL lo más cerca posible de la soldadura para que la longitud total del tubo permanezca aproximadamente igual.
8.12.21 Sellado térmicamente. Se selló térmicamente (según la Nota de proceso 5.12) la bolsa de sobrenadante.
8.12.22 Cosecha completa de los matraces G-Rex 500 MCS restantes. Repita las etapas 8.12.2 y 8.12.5 - 8.12.21, agrupando todos los TIL en la misma bolsa recolectora.
NOTA: ERA NECESARIO REEMPLAZAR LA BOLSA DE UPERNATANTE DE 10L DESPUÉS DE CADA 2° MATRAZ. NOTA: Consulte la Nota de proceso 5.16 para el uso de múltiples dispositivos GatheRex.
8.12.23 Bolsa de fuente LOVO preparada. Se obtuvo una nueva bolsa recolectora de 3000 mL. Etiquetado como "Bolsa de origen LOVO", número de lote e inicial/fecha.
8.12.24 Bolsa de fuente LOVO preparada. Selló térmicamente (según la Nota de proceso 5.12) el tubo en la "bolsa LOVO Source", retirando los luers hembra, dejando suficiente línea para soldar.
8.12.25 Bolsa de fuente LOVO pesada. Coloque un recipiente de plástico del tamaño adecuado en la báscula y tara. Coloque la bolsa LOVO Source, incluidos los puertos y líneas, en el contenedor y registre el peso seco 8.12.26 Se transfirió la suspensión celular a la bolsa fuente LOVO. Cerró todas las abrazaderas de un filtro de sangre por gravedad de 170 m.
8.12.27 Se transfirió la suspensión celular a la bolsa fuente LOVO. Soldó de forma estéril (según la Nota de proceso 5.11) el extremo terminal largo del filtro de sangre por gravedad a la bolsa fuente LOVO.
8.12.28 Se transfirió la suspensión celular a la bolsa fuente LOVO. Soldó de forma estéril (según la Nota de proceso 5.11) una de las dos líneas de origen del filtro a la bolsa recolectora de "suspensión TIL agrupada".
8.12.29 Se transfirió la suspensión celular a la bolsa fuente LOVO. Una vez completada la soldadura, selle térmicamente (según la Nota de proceso 5.12) la línea no utilizada en el filtro para retirarla.
8.12.30 Transfiera la suspensión de células a la bolsa fuente LOVO. Abrió todas las abrazaderas necesarias y elevó la suspensión de TIL colgando la bolsa de recolección en un portasueros para iniciar la transferencia de flujo por gravedad de TIL a través del filtro de sangre y hacia la bolsa de fuente LOVO. Gire o amase suavemente la bolsa de suspensión TIL mientras la drena para mantener el TIL en suspensión uniforme.
Nota: No permitió que la bolsa de fuente LOVO colgara del aparato de filtración. Coloque la bolsa de fuente LOVO sobre toallitas secas sobre una superficie plana.
8.12.31 Cerró todas las abrazaderas. Una vez que todos los TIL se transfirieron a la bolsa de origen LOVO, se cerraron todas las abrazaderas.
8.12.32 Sellado térmicamente. Sellado térmicamente (según la Nota de proceso 5.12) lo más cerca posible de la soldadura para eliminar el filtro de sangre por gravedad.
8.12.33 Muestras de recuentos celulares eliminadas. En el BSC, utilizando jeringas de 3 mL separadas para cada muestra, se retiraron muestras de recuento de células de 4 x 1,0 mL de la bolsa de origen LOVO utilizando el puerto de inyección innecesario. Muestras colocadas en los crioviales preparados en la Etapa 8.11.36. NOTA: Limpie el puerto de inyección innecesario con una gasa con alcohol y mezcle la bolsa de fuente LOVO entre cada muestra.
8.12.34 Conteos celulares realizados. Realicé recuentos de células y cálculos utilizando NC-200 y la Nota de proceso 5.14. Muestras de recuento de células diluidas inicialmente añadiendo 0,5 mL de suspensión celular en 4,5 mL de medio AIM-V preparado en el paso 8.11.35. Esto dio una dilución de 1:10.
8.12.35 Volúmenes de muestra de recuento celular registrado.
8.12.36 Factor de multiplicación determinado
8.12.37 Protocolos seleccionados e ingreso de factores de multiplicación. Se aseguró de que se hubiera seleccionado el protocolo "Ensayo de recuento de células viables", de que se hubieran ingresado todos los factores de multiplicación y los volúmenes de muestra y diluyente. NOTA: Si no se necesita dilución, ingrese "Muestra [<|j>L]" = 200, "Dilución [<j>L]" = 0
8.12.38 Registro de recuentos de células desde Nucleoview
8.12.39 Se determinó la viabilidad promedio, la concentración de células viables y la concentración de células nucleadas totales de los recuentos de células realizados.
8.12.40 Límite superior e inferior determinado para los recuentos
8.12.41 ¿Estuvieron ambos recuentos dentro de límites aceptables?
NOTA: Si alguno de los resultados fue "No", realizó una segunda serie de recuentos en las etapas 8.12.42 -8.12.49.
8.12.42 Si corresponde: Conteos celulares realizados. Realicé recuentos de células y cálculos utilizando NC-200 y la Nota de proceso 5.14. NOTA: La dilución se puede ajustar según la concentración esperada de células. 8.12.43 Si corresponde: Volúmenes de muestra de recuento celular registrado
8.12.44 Si corresponde: Factor de multiplicación determinado
8.12.45 Si corresponde: Protocolos seleccionados e ingreso de factores de multiplicación. Asegúrese de que se haya seleccionado el protocolo "Ensayo de recuento de células viables", que se hayan ingresado todos los factores de multiplicación y los volúmenes de muestra y diluyente.
NOTA: Si no se necesita dilución, ingrese "Muestra [<|j>L]" = 200, "Dilución [<|j>L]" = 0
8.12.46 Si corresponde: Registro de recuentos de células desde Nucleoview
8.12.47 Si corresponde: Determine la viabilidad promedio, la concentración de células viables y la concentración de células nucleadas totales de los recuentos de células realizados.
8.12.48 Si corresponde: Límite superior e inferior determinado para los recuentos
8.12.49 Si corresponde: ¿Estuvieron los recuentos dentro de límites aceptables?
NOTA: Si alguno de los resultados fue "No", continúe con la Etapa 8.12.50 para determinar un promedio 8.12.50 Si corresponde: Se determinó una concentración promedio de células viables y una concentración promedio de células nucleadas totales de
se realizaron los cuatro conteos.
8.12.51 Revisión de control de calidad de los recuentos de células. El personal de control de calidad revisa los cálculos realizados en las etapas 8.12.38 - 8.12.50.
8.12.52 Bolsa de fuente LOVO pesada. Coloque un recipiente de plástico del tamaño adecuado en la báscula y tara. Coloque la bolsa de fuente LOVO llena en el contenedor y registre el peso. Calculó el volumen de suspensión celular.
8.12.53 Calcular el total de células TIL viables.
8.12.54 Calcular el total de células nucleadas.
8.12.55 Diluyente de micoplasma preparado. En el BSC, se extrajeron 10,0 mL de una bolsa de sobrenadante a través del puerto de muestra luery se colocaron en un recipiente cónico de 15 mL.
Etiquete 15 mL de "diluyente de micoplasma" cónico y guárdelo en el BSC para su uso en el paso 8.14.69.
8.12.56 Revisar la Sección 8.12
8.13 LOVO
8.13.1 Encendí el LOVO usando el interruptor en la parte posterior izquierda del instrumento. NOTA: Los pasos 8.13.1-8.13.13 se pueden realizar simultáneamente con las Secciones 8.11-8.12.
8.13.2 Básculas y sensor de presión revisados.
8.13.3 Se aseguró de que no hubiera nada colgado en ninguna de las básculas y revisó la lectura de cada báscula. Valores registrados en la Etapa 8.13.5. Nota: Si alguna de las básculas lee fuera del rango de 0 /- 2 g, se realiza la calibración de la báscula.
8.13.4 Si todas las básculas estaban dentro de la tolerancia sin ningún peso colgando, se procedió a colgar un peso de 1 kg en cada báscula (#1-4) y se revisó la lectura. Valores registrados en el paso 8.13.5.
8.13.5 Báscula revisada. Se registraron los valores mostrados para cada escala. Si los valores estaban dentro del rango, continúe el procesamiento. Si los valores no estaban dentro del rango, realice la calibración.
8.13.6 Se revisó la lectura del sensor de presión en la pantalla de perfil de operación del instrumento y se registró. El rango aceptable para la lectura de presión fue 0 /-10 mmHg. Si el valor mostrado estaba fuera de este rango, se almacenó una nueva configuración de presión atmosférica, según las instrucciones de la máquina.
8.13.7 Etapas repetidos. Si se había realizado una nueva calibración de la báscula o se había almacenado una nueva configuración de presión atmosférica, se repitieron los Etapas 8.13.3 - 8.13.6.
8.13.8 Inició el protocolo "Recolección TIL G-Rex" desde el menú desplegable.
8.13.9 Se muestra la pantalla Solución 1: Tipo de búfer leído PlasmaLyte
8.13.10-8.13.16 Se siguieron las indicaciones de la pantalla táctil de LOVO.
8.13.17 Se determinó el volumen objetivo del producto final.
NOTA: Utilizando el valor total de células nucleadas (TNC) de la Etapa 8.12.54 C y el cuadro a continuación, se determinó el volumen objetivo del producto final. Se registró el volumen del producto final (mL)
Nota: Si el TVC de la etapa 8.12.53 C era >1,5*1011 contactado con la Gerencia del Área.
13.8.18 -13.8.22 Se siguieron las indicaciones de la pantalla táctil de LOVO.
8.13.23 Kit desechable cargado. Antes de cargar el kit desechable, limpie el puerto del sensor de presión con una toallita con alcohol y luego con una toallita sin pelusa. Cargue el kit desechable. Siga las instrucciones en pantalla para cargar el kit desechable.
8.13.24 Se retiró la bolsa de filtrado. Cuando se haya cargado el kit desechable estándar LOVO, toque el botón Siguiente. Se muestra la pantalla de información y ubicación del contenedor. Bolsa de filtrado retirada de la báscula.
8.13.25 Se aseguró que el contenedor de filtrado fuera nuevo y fuera de escala
8.13.26 Capacidad de filtrado ingresada. Sterile soldó una bolsa auxiliar LOVO a la línea luer macho de la bolsa de filtrado existente. Asegúrese de que todas las abrazaderas estén abiertas y que el camino del fluido esté despejado. Toque el campo de entrada Capacidad del contenedor de filtrado. Aparece un teclado numérico. Ingrese la capacidad total de filtrado nuevo (5000 mL). Toque el botón para aceptar la entrada. NOTA: El volumen de filtrado estimado no debe exceder los 5000 mL.
8.13.27 Se colocó el recipiente de filtrado sobre la mesa. NOTA: Si se quitó el tubo de la abrazadera F durante la soldadura, vuelva a colocar el tubo en la abrazadera. Colocó el nuevo contenedor de filtrado en la mesa de trabajo. NO colgó la bolsa de filtrado en la báscula n.° 3. La báscula número 3 estará vacía durante el procedimiento.
8.13.28 Se siguieron las indicaciones de la pantalla táctil de LOVO después de realizar cambios en el recipiente de filtrado.
8.13.29 Se aseguró de que el kit estuviera cargado correctamente. Se muestra la superposición de controles secos del kit desechable. Comprobó que el kit estaba cargado correctamente y que todas las abrazaderas estaban abiertas. Revise todos los tubos en busca de torceduras u otras obstrucciones y corríjalos si es posible. Me aseguré de que el kit estuviera correctamente instalado y revisé todas las abrazaderas de Robert. Presionó el botón Sí. Todas las abrazaderas mecánicas LOVO se cerraron automáticamente y aparece la pantalla Comprobación de la instalación del kit desechable. El LOVO pasó por una serie de pasos de presurización para comprobar el kit.
8.13.30 Resultados de la verificación del kit. Si pasó la verificación del kit, continúe con el siguiente paso. *En caso negativo, se podría realizar una segunda verificación del kit después de que se hayan completado las comprobaciones. *Si no, verifique que todos los tubos no estén torcidos u otras obstrucciones y corríjalos. *Si no, se aseguró de que el kit estuviera instalado correctamente y verifique todas las abrazaderas de Robert. Si la verificación del segundo kit falló: Comuníquese con la gerencia del área y prepárese para la instalación del nuevo kit en la Sección 10.0. Repita el paso 8.13.23; es necesario el paso 8.13.30.
8.13.31 PlasmaLyte adjunto. Se muestra la pantalla Conectar soluciones. El valor de lavado siempre sería de 3000 mL. Ingresó este valor en la pantalla. Sterile soldó la bolsa de 3000 mL de PlasmaLyte al tubo pasando a través de la abrazadera 1 según la Nota de proceso 5.11. Colgó la bolsa PlasmaLyte en un portasueros colocando ambos bucles de la bolsa en las esquinas del gancho.
8.13.32 Verificó que PlasmaLyte estuviera conectado. Abrió las abrazaderas de plástico. Verificó que la entrada del volumen de la solución fuera de 3000 mL. Tocó el botón "Siguiente". Se muestra la superposición del kit desechable Prime. Verificó que PlasmaLyte estuviera conectado y que todas las soldaduras y abrazaderas de plástico en el tubo que conduce a la bolsa PlasmaLyte estuvieran abiertas, luego presionó el botón Sí.
8.13.33 Se observó que PlasmaLyte se está moviendo. Se inicia el cebado del kit desechable y aparece la pantalla Cebado del kit desechable. Observé visualmente que PlasmaLyte se movía a través del tubo conectado a la bolsa de PlasmaLyte.
Si no se movía ningún fluido, presionó el botón de pausa en la pantalla y determinó si una abrazadera o soldadura aún estaba cerrada. Una vez solucionado el problema, presione el botón Reanudar en la pantalla para reanudar el Kit Desechable Prime. Cuando el cebado del kit desechable finalizó exitosamente, se mostró la pantalla Conectar fuente.
8.13.34-8.13.35 Seguí las indicaciones de la pantalla táctil de LOVO.
8.13.36 Contenedor de fuente conectado al tubo. Suelde de forma estéril la bolsa fuente LOVO preparada en el paso 8.12.31 al tubo que pasa a través de la abrazadera S según la nota de proceso 5.11. Podría ser necesario retirar el tubo de la abrazadera. Nota: Asegúrese de volver a colocar el tubo fuente en la abrazadera S si se retira.
8.13.37 Contenedor de fuente colgado. Colgó el contenedor Source en el portasueros colocando ambos bucles de la bolsa de las esquinas en el gancho. NO colgó la Fuente en la báscula n.° 1. Abrió todas las abrazaderas de la bolsa de origen.
8.13.38 Se adjuntó el contenedor de fuente verificada. Tocó el botón Siguiente. Se muestra la superposición de Source Prime. Verificó que la Fuente estuviera conectada al kit desechable y que todas las soldaduras y abrazaderas de plástico en el tubo que conduce a la Fuente estuvieran abiertas. Tocó el botón Sí.
8.13.39 Confirme que PlasmaLyte se estaba moviendo. Se inició el cebado de fuente y se muestra la pantalla de cebado de fuente. Observó visualmente que PlasmaLyte se mueve a través del tubo conectado a la bolsa Source. Si no se mueve ningún fluido, presione el botón de pausa en la pantalla y determine si una abrazadera o soldadura aún está cerrada. Una vez resuelto el problema, presione el botón Reanudar en la pantalla para reanudar Source Prime.
8.13.40 Pantalla Procedimiento iniciado. Cuando Source Prime finaliza exitosamente, aparece la pantalla Iniciar procedimiento. Al presionar Inicio, aparece la pantalla de pausa "Ciclo de prelavado 1" inmediatamente después de presionar Inicio.
8.13.41 Bolsa de proceso invertida. Se quitó la bolsa en proceso de la báscula n.° 2 (también se pueden quitar los tubos de la guía de tubos del puerto superior en proceso) y se invirtió manualmente para permitir que el tampón de lavado agregado durante el paso de cebado del kit desechable cubra todas las superficies interiores de la bolsa. Vuelva a colgar la bolsa en proceso en la báscula n.° 2 (la etiqueta de la bolsa mira hacia la izquierda). Vuelva a colocar el tubo del puerto superior en la guía del tubo, si se quitó.
8.13.42 Bolsa de fuente invertida. Antes de presionar el botón Iniciar, mezcle la bolsa Source sin retirarla del portasueros masajeando las esquinas de la bolsa y agitando suavemente las células para crear una suspensión celular homogénea.
Presioné el botón Reanudar. El LOVO comenzó a procesar el fluido de la bolsa de origen y aparece la pantalla del ciclo de lavado 1.
8.13.43 Pausa de enjuague de fuente. La pantalla Rinse Source Pause se muestra una vez que se drena el contenedor de fuente y LOVO ha agregado tampón de lavado a la bolsa de fuente. Sin quitar la bolsa Source del portasueros, masajee las esquinas y mezcle bien. Reanudar presionado.
8.13.44 Pausa en la bolsa del proceso de mezcla. Para preparar las células para otro paso por el centrifugador, la bolsa en proceso se diluyó con tampón de lavado. Después de agregar el tampón de lavado a la bolsa en proceso, LOVO se detiene automáticamente y muestra la pantalla de pausa "Mezclar en bolsa en proceso". Sin retirar la bolsa de la báscula, mezcle bien el producto apretando suavemente la bolsa. Presione Reanudar.
8.13.45 Masaje En Proceso Esquinas Pausa. Cuando la bolsa en proceso estaba vacía, se añadió tampón de lavado al puerto inferior de la bolsa en proceso para enjuagar la bolsa. Después de agregar el líquido de enjuague, LOVO se detuvo automáticamente y mostró la pantalla de pausa "Masaje de esquinas IP". Cuando aparezca la pantalla de pausa "Masaje de esquinas IP", NO retire la bolsa de la báscula n.° 2. Con la bolsa en proceso aún colgada de la báscula n.° 2, masajee las esquinas de la bolsa para suspender las células residuales. Me aseguré de que la bolsa no se balanceara en la báscula y presioné el botón Reanudar.
8.13.46 Espere a que aparezca la pantalla Eliminar productos. Al final del procedimiento LOVO, se muestra la pantalla Eliminar productos. Cuando aparece esta pantalla, todas las bolsas del kit LOVO se pueden manipular. Nota: No toqué ninguna bolsa hasta que apareció el mensaje Quitar productos.
8.13.47 Se eliminó la bolsa de retenido. Colocó un hemostato en el tubo muy cerca del puerto de la bolsa de retenido para evitar que la suspensión celular se asiente en el tubo. Sellado térmicamente (según la Nota de proceso 5.12) debajo del hemostato, asegurándose de mantener suficiente línea para soldar en la Etapa 8.13.48. Se retiró la bolsa de retenido.
8.13.48 Bolsa de retenido preparada para formulación. Soldó (según la Nota de proceso 5.11) el extremo hembra con cierre luer de un equipo de transferencia de plasma de 4" a la bolsa de retenido. Se transfirió la bolsa de retenido al BSC para usarla en la Etapa 8.14.11.
8.13.49 Productos eliminados. Siguió las instrucciones en la pantalla Eliminar productos. Cerré todas las abrazaderas del kit LOVO para evitar el movimiento del fluido.
8.13.50 Productos eliminados. Tocó el botón Siguiente. Todas las abrazaderas mecánicas LOVO se abrieron y se mostró la pantalla Quitar kit.
8.13.51 Datos registrados. Siguió las instrucciones en la pantalla Quitar kit. Tocó el botón "Siguiente". Todas las abrazaderas mecánicas LOVO se cierran y aparece la pantalla Resumen de resultados. Registró los datos de la pantalla de resumen de resultados en la tabla exactamente como se muestran. Cerré todas las bombas y el soporte del filtro. Se eliminó el kit cuando LOVO se lo solicitó. *NOTA: Todos los tiempos grabados fueron grabados directamente desde LOVO.
Pantalla de resumen de resultados en formato HH:MM:SS y formato (HH:MM:SS) cuando corresponda
8.13.52-8.13.54 Selección de protocolo mediante apagado LOVO. Siga las indicaciones en pantalla de LOVO.
8.13.55 Revisar la Sección 8.13
8.14 Formulación final y llenado
8.14.1 Cálculo del volumen/bolsa objetivo. De la siguiente tabla, seleccione la cantidad de bolsas CS750 que se llenarán, el volumen de llenado objetivo por bolsa, el volumen eliminado para retener por bolsa y el volumen objetivo final por bolsa que correspondió al volumen de retenido LOVO de la Etapa 8.13.22.
8.14.2 CRF en blanco preparado. Volumen calculado de CS-10 y tampón de lavado LOVO para formular la bolsa en blanco.
8.14.3 CRF en blanco preparado. Fuera del BSC, usando la jeringa de Tampón de Lavado LOVO preparada en la Etapa 8.11.29, agregó el volumen calculado en la Etapa 8.14.2 B a una bolsa CS750 vacía mediante una conexión luer. Nota: No es necesario realizar la formulación de la bolsa CS750 en blanco de forma aséptica.
8.14.4 Blanco CRF preparado Usando una jeringa del tamaño adecuado, agregue el volumen de CS-10 calculado en la Etapa 8.14.2 a la misma bolsa CS750 preparada en la Etapa 8.14.3. Coloqué una tapa roja en la bolsa CS750.
8.14.5 CRF en blanco preparado. Se eliminó la mayor cantidad de aire posible de la bolsa CS-750. Selle con calor (según la Nota de proceso 5.12) la bolsa CS750 lo más cerca posible de la bolsa, retirando el tubo.
8.14.6 CRF Blank preparado. Etiquete la bolsa CS750 con "CRF Blank", número de lote e inicial/fecha. Se colocó el CRF Blank en compresas frías hasta que se colocó en el CRF.
8.14.7 Volumen requerido calculado de IL-2. Calculó el volumen de IL-2 para agregar al producto final.
8.14.8 Aparato Connect ensamblado. Soldado estéril (según la Nota de proceso 5.11) un 4S-4M60 a un Cell Connect CC2 reemplazando un solo pico del aparato Cell Connect (B) con el extremo de 4 picos del colector 4S-4M60 en (G). (Ver, por ejemplo, la Figura 135.)
8.14.9 Aparatos conectados ensamblados. Soldó de forma estéril (según la Nota de proceso 5.11) las Cryobags CS750 al arnés preparado en la Etapa 8.14.8, reemplazando uno de los cuatro extremos luer macho (E) con cada bolsa. Consulte la Etapa 8.14.1 para determinar la cantidad de bolsas necesarias. (Ver, por ejemplo, la Figura 136.) 8.14.10 Aparatos conectados ensamblados. Bolsas CS-10 soldadas (según la Nota de proceso 5.11) a las púas del 4S-4M60. Se mantuvo frío el CS-10 colocando las bolsas entre dos compresas frías acondicionadas a 2-8°C. (Ver, por ejemplo, la Figura 137.)
8.14.11 Materiales pasados al BSC.
8.14.12 TIL preparado con IL-2. Usando una jeringa del tamaño apropiado, eliminó la cantidad de IL-2 determinada en la Etapa 8.14.7 del "IL-26*104" alícuota.
8.14.13 TIL preparado con IL-2. Conecte la jeringa a la bolsa de retenido preparada en la Etapa 8.13.48 mediante la conexión Luer e inyecte IL-2.
8.14.14 Prepare TIL con IL-2 Limpie la línea empujando aire de la jeringa a través de la línea.
8.14.15 Bolsa TIL forlada etiquetada. Cerró la abrazadera del conjunto de transferencia y etiquetó la bolsa como "TIL formulado" y sacó la bolsa del BSC.
8.14.16 Si corresponde: Muestra por plan de muestra. Si quedara "IL-2 6*104" alícuota preparada en el paso 8.11.33, retire una muestra de ~5 mL retenida de acuerdo con el plan de muestra utilizando una jeringa del tamaño adecuado y dispense en un tubo cónico de 50 mL.
8.14.17 Si corresponde: Muestreado por plan de muestra. Etiquetado con una etiqueta de inventario del plan de muestra y almacenado a 2-8 °C hasta que se envíe al inicio de sesión para realizar pruebas según el plan de muestra.
8.14.18 Si corresponde: Muestreado por plan de muestra. Se aseguró de que se completara la hoja del plan de muestra de LIMS para la extracción de la muestra.
8.14.19 Se agregó la bolsa TIL formulada al aparato. Una vez que se agregó IL-2, soldó (según la Nota de proceso 5.11) la bolsa "TIL formulada" al pico restante (A) en el aparato preparado en la Etapa 8.14.10. (Ver, por ejemplo, la Figura 138.)
14.08.20 Se agregó CS 10. Se pasó el aparato ensamblado con TIL formulado, bolsas CS-750 y CS-10 adjuntos al BSC. NOTA: La bolsa CS-10 y todas las bolsas CS-750 se colocaron entre dos compresas frías preacondicionadas a 2-8°C. No colocó la bolsa TIL formulada sobre compresas frías.
8.14.21 Se agregó CS10. Se aseguró de que todas las abrazaderas estuvieran cerradas en el aparato.
Gire la llave de paso para cerrar la jeringa.
8.14.22 Jeringas cambiadas. Extrajo ~10 mL de aire en una jeringa de 100 mL y reemplazó la jeringa de 60 mL en el aparato.
8.14.23 Se agregó CS10. Llave de paso girada para que se cierre la línea a las bolsas CS750. Abra las abrazaderas de las bolsas CS-10 y extraiga el volumen calculado en la Etapa 8.14.1B hacia la jeringa. NOTA: Se utilizarán varias jeringas para agregar el volumen adecuado de CS-10. NOTA: Registre el volumen de cada jeringa en la Etapa 8.14.26
8.14.24 Se agregó CS10. Abra las abrazaderas al CS-10 y abra las abrazaderas a la bolsa TIL formulada y agregue el CS-10. Nota: Agregue los primeros 10,0 mL de CS10 a aproximadamente 10,0 mL/minuto. Agregue el CS-10 restante a una velocidad aproximada de 1,0 mL/seg. Nota: Se usaron múltiples jeringas para agregar el volumen apropiado de CS-10. No reutilizó una jeringa una vez dispensada.
8.14.25 Se agregó CS10. Tiempo grabado. NOTA: El tiempo objetivo desde la primera adición de CS-10 hasta el inicio de la congelación es 30
8.14.26 Se agregó CS 10. Se registró el volumen de cada adición de CS 10 y el volumen total agregado. El volumen total coincide con el volumen calculado de la Etapa 8.14.1B
8.14.27 Se agregó CS10. Cerré todas las abrazaderas de las bolsas CS10.
8.14.28 Bolsas CS-750 preparadas. Giró la llave de paso para que la jeringa quedara abierta. Abrió las abrazaderas de la bolsa Formulated TIL y elevó la suspensión deteniéndose justo antes de que la suspensión llegue a la llave de paso.
8.14.29 Bolsas CS-750 preparadas. Abrazaderas cerradas a la bolsa TIL formulada. Se giró la llave de paso para que quedara abierta a las bolsas vacías del producto final CS750.
14.8.30 Bolsas CS-750 preparadas. Usando una jeringa nueva, eliminó la mayor cantidad de aire posible de las bolsas del producto final CS750 extrayendo el aire.
Mientras mantenía presión sobre el émbolo de la jeringa, cerró las bolsas con abrazaderas.
8.14.31 Bolsas CS-750 preparadas. Extraiga ~ 20 mL de aire en una jeringa nueva de 100 mL y conéctela al aparato.
NOTA: Cada bolsa de producto final CS-750 debe estar entre dos compresas frías para mantener fría la suspensión TIL formulada.
8.14.32 Celdas dispensadas. Giró la llave de paso para cerrar la línea hacia las bolsas del producto final. Sacó el volumen calculado en la Etapa 8.14.1 de la bolsa de TIL formulado a la jeringa. NOTA: Se podrían utilizar varias jeringas para obtener el volumen correcto.
8.14.33 Celdas dispensadas. Gire la llave de paso para cerrar la línea a la bolsa TIL formulada. Trabajando con una bolsa de producto final a la vez, dispense las células en una bolsa de producto final. Volumen registrado de células agregadas a cada bolsa CS750 en la Etapa 8.14.35
8.14.34 Celdas dispensadas. Limpie la línea con aire de la jeringa para que las células queden niveladas con la parte superior del puerto de punta. Cerró la abrazadera de la bolsa llena. Repita el paso 8.14.29-paso 8.14.34 para cada bolsa de producto final, mezclando suavemente la bolsa TIL formulada entre cada una.
8.14.35 Celdas dispensadas. Registre el volumen de TIL colocado en cada bolsa de producto final a continuación.
8.14.36 Se eliminó el aire de las bolsas del producto final y se retuvo. Una vez llena la última bolsa de producto final, cerrar todas las abrazaderas.
8.14.37 Se eliminó el aire de las bolsas del producto final y se retuvo. Extraiga 10 mL de aire en una jeringa nueva de 100 mL y vuelva a colocar la jeringa en el aparato.
8.14.38 Se eliminó el aire de las bolsas del producto final y se retuvo. Manipulando una sola bolsa a la vez, extrajo todo el aire de cada bolsa de producto más el volumen de producto a retener determinado en la Etapa 8.14.1 D. NOTA: Al retirar el volumen de muestra, se invirtió la jeringa y se utilizó aire para limpiar la línea hasta el puerto superior de la bolsa del producto. Sujetó la línea a la bolsa una vez que se eliminó el volumen retenido y el aire.
8.14.39 Volumen grabado eliminado. Volumen registrado de retención retirado de cada bolsa.
8.14.40 Retención dispensada. Dispense el retenedor en un tubo cónico de 50 mL y etiquete el tubo como "Retenedor" y el número de lote. Repita la Etapa 8.14.37-Etapa 8.14.39 para cada bolsa.
8.14.41 Producto final preparado para criopreservación. Con un hemostato, sujetó las líneas cerca de las bolsas. Se quitó la jeringa y la conexión luer de la tapa roja del aparato en donde estaba la jeringa. Aparato aprobado fuera del BSC.
8.14.42 Producto final preparado para criopreservación. Sellado térmicamente (según la Nota de proceso 5.12) en F, retirando la bolsa de retenido vacía y las bolsas CS-10.
NOTA: Conexión luer retenida para jeringa en el aparato. Eliminación del retenido vacío y de las bolsas CS-10. (Ver, por ejemplo, la Figura 139.)
8.14.43 Inspección visual realizada. NOTA: Etapa 8.14.43 - Etapa 8.14.46 se puede realizar simultáneamente con Etapa 8.14.47 - Etapa 8.14.68.
8.14.44 Muestra de etiqueta del producto final. Bolsas de producto final etiquetadas. Adjunto etiqueta de muestra del producto final a continuación.
8.14.45 Producto final preparado para criopreservación. Se mantuvieron las bolsas criogénicas en una compresa fría o a 2-8°C hasta la criopreservación.
8.14.46 Etiquetas externas preparadas. Se aseguró de que las etiquetas externas emitidas por el control de calidad que se adjuntarán a las etiquetas de los casetes coincidan con la etiqueta del producto final correspondiente. Adjunto control de calidad emitió etiquetas externas a los casetes. Adjunto una etiqueta externa de muestra a continuación:
8.14.47 Muestra de recuento de células eliminada. Con una pipeta del tamaño adecuado, retire 2,0 mL del retenedor eliminado en la Etapa 8.14.38 y colóquelo en un tubo cónico de 15 mL que se utilizará para el recuento de células.
8.14.48 Conteos celulares realizados. Realicé recuentos de células y cálculos utilizando el NC-200 según SOP-00314 y la Nota de proceso 5.14. NOTA: Diluyó solo una muestra hasta la dilución adecuada para verificar que la dilución sea suficiente. Diluya muestras adicionales al factor de dilución apropiado y continúe con los recuentos.
8.14.49 Volúmenes de muestra de recuento celular registrado. NOTA: Si no se necesita dilución, "Muestra [<|j>L]" = 200, "Dilución [j L]" =0
8.14.50 Factor de multiplicación determinado
8.14.51 Seleccionar protocolos e ingresar factores de multiplicación. Asegúrese de que se haya seleccionado el protocolo "Ensayo de recuento de células viables", que se hayan ingresado todos los factores de multiplicación y los volúmenes de muestra y diluyente según el SOP - 00314
NOTA: Si no se necesita dilución, ingrese "Muestra [j L]" = 200, "Dilución [j L]" = 0
8.14.52 Nombre del archivo registrado, viabilidad y recuento de células de Nucleoview.
14.8.53 Se determinó el Promedio de Concentración de Células Viables y Viabilidad de los conteos celulares realizados.
8.14.54 Límite superior e inferior determinado para los recuentos.
8.14.55 ¿Estuvieron ambos recuentos dentro de límites aceptables?
NOTA: Si alguno de los resultados es "No", realice una segunda serie de conteos en las etapas 8.14.56 - 8.14.63 8.14.56 Si corresponde: Conteos celulares realizados. Realicé recuentos de células y cálculos utilizando NC-200 según SOP-00314 y la Nota de proceso 5.14. NOTA: La dilución se puede ajustar según la concentración esperada de células.
8.14.57 Si corresponde: Volúmenes de muestra de recuento celular registrados.
8.14.58 Si corresponde: Factor de multiplicación determinado
8.14.59 Si corresponde: Protocolos seleccionados y factores de multiplicación ingresados. Se aseguró de que se hubiera seleccionado el protocolo "Ensayo de recuento de células viables", de que se hubieran ingresado todos los factores de multiplicación y los volúmenes de muestra y diluyente. NOTA: Si no se necesita dilución, ingrese "Muestra [<|j>L]" = 200, "Dilución [<|j>L]" = 0
8.14.60 Si corresponde: Recuentos de células registrados desde Nucleoview
8.14.61 Si corresponde: Se determinó el Promedio de Concentración de Células Viables y la Viabilidad de los conteos celulares realizados.
8.14.62 Si corresponde: Límite superior e inferior determinado para los recuentos.
8.14.63 Si corresponde: ¿Estuvieron los recuentos dentro de límites aceptables?
NOTA: Si cualquiera de los resultados es "No", continúe con la Etapa 8.14.64 para determinar un promedio. 8.14.64 Si corresponde: Se determinó una concentración promedio de células viables a partir de los cuatro recuentos realizados.
8.14.65 Flujo calculado. Muestra de Citometría. Cálculo realizado para garantizar una concentración celular suficiente para el muestreo de citometría de flujo.
8.14.66 IFN-<y>calculado. Muestra Cálculo realizado para garantizar una concentración celular suficiente para el muestreo de IFN-y.
8.14.67 Resultados informados. Formularios completos para envío con muestras.
8.14.68 Sellado térmicamente. Una vez que se determinaron los volúmenes de muestra, se sellaron térmicamente las bolsas de producto final (según la Nota de proceso 5.12) lo más cerca posible de las bolsas para retirarlas del aparato.
8.14.69 Muestras etiquetadas y recolectadas según plan de muestreo.
8.14.70 Esterilidad y BacT. Muestreo de prueba. En el BSC, retire una muestra de 1,0 mL de la suspensión celular retenida recogida en el paso 8.14.38 utilizando una jeringa del tamaño adecuado e inocule la botella anaeróbica. Repita lo anterior para la botella aeróbica. NOTA: Guarde los frascos Bac-T a temperatura ambiente y protéjalos de la luz.
8.14.71 Muestras etiquetadas y almacenadas. Etiquete todas las muestras con etiquetas de inventario del plan de muestra y guárdelas adecuadamente hasta que se transfieran al inicio de sesión. NOTA: Se pasó a la Sección 8.15 para la criopreservación del producto final y las muestras.
8.14.72 Firmado para muestreo. Se aseguró de que se complete la hoja del plan de muestra de LIMS para la extracción de las muestras.
8.14.73 Envío de muestra. Envió todas las muestras de prueba del día 22 para iniciar sesión.
8.14.74 Monitoreo Ambiental. Después del procesamiento, se realizó el BSC verificado y el seguimiento del personal.
8.14.75 Revisar la Sección 8.14
8.15 Criopreservación del producto final
8.15.1 Congelador de tasa controlada preparado. Verificó que el CRF se había configurado antes de la congelación. Registro de equipos CRF. Se realiza criopreservación.
8.15.2 Configurar las sondas CRF. Perforó el tabique de la bolsa en blanco del CRF. Se insertó la sonda de temperatura del vial de 6 mL.
8.15.3 Producto final colocado y muestras en CRF. Se colocó la bolsa en blanco en un casete preacondicionado y se transfirió aproximadamente al centro del bastidor CRF. Se transfirieron los casetes del producto final a la gradilla CRF y los viales a la gradilla CRF.
8.15.4 Producto final colocado y muestras en CRF. Se transfirieron las gradillas de productos y las gradillas de viales al CRF. Se registró el tiempo que el producto se transfiere al CRF y la temperatura de la cámara en la Etapa 8.15.5. NOTA: Distribuyó uniformemente los casetes y el bastidor de viales en el CRF, dejando el mayor espacio posible entre cada estante.
8.15.5 Se determinó el tiempo necesario para alcanzar 4 °C ± 1,5 °C y proceder con la ejecución del CRF. Una vez que la temperatura de la cámara alcanzó 4 °C ± 1,5 °C, se inició la ejecución. Tiempo grabado.
8.15.6 CRF completado y almacenado. Detuvo el CRF después de completar la ejecución. Retire los casetes y viales del CRF. Se transfirieron los casetes y viales a la fase de vapor LN2 para su almacenamiento. Ubicación de almacenamiento grabado
RESUMEN POSTPROCESAMIENTO
• Postprocesamiento: Producto farmacológico final
o (Día 22) Determinación de células CD3+ el día 22 REP mediante citometría de flujo
o (Día 22) Método de tinción de Gram (GMP)
o (Día 22) Prueba de endotoxina bacteriana mediante ensayo LAL de coágulo de gel (GMP)
o (Día 16) Ensayo de esterilidad BacT (GMP)
o (Día 16) Detección de ADN de micoplasma mediante TD-PCR (GMP)
o Atributos de apariencia aceptables (Etapa 8.14.43)
o (Día 22) Ensayo de esterilidad BacT (GMP)
o (Día 22) Ensayo de IFN-gamma
Los ejemplos expuestos anteriormente se proporcionan para dar a los expertos en la técnica una divulgación y descripción completas de cómo hacer y usar las formas de realización de las composiciones, sistemas y procedimientos de la invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención. Se pretende que las modificaciones de los modos descritos anteriormente para llevar a cabo la invención que sean obvias para los expertos en la técnica estuvieran dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones. Todas las patentes y publicaciones mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas de los niveles de habilidad de los expertos en la técnica a la que pertenece la invención.
Todos los títulos y designaciones de secciones se utilizan únicamente con fines de claridad y referencia y no deben considerarse limitantes de ninguna manera. Por ejemplo, los expertos en la técnica apreciarán la utilidad de combinar diversos aspectos de diferentes títulos y secciones según corresponda de acuerdo con el alcance de la invención descrita en el presente documento.
Se pueden realizar muchas modificaciones y variaciones de esta solicitud sin apartarse de su alcance, como resultará evidente para los expertos en la técnica. Las formas de realización específicas y los ejemplos descritos en este documento se ofrecen solo a modo de ejemplo, y la aplicación debe limitarse únicamente por los términos de las reivindicaciones adjuntas, junto con el alcance completo de equivalentes a los que tienen derecho las reivindicaciones.
Secuencias:
SEQ ID NO:1 es la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de muromonab.
SEQ ID NO:2 es la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de muromonab.
SEQ ID NO:3 es la secuencia de aminoácidos de una proteína IL-2 humana recombinante. SEQ ID NO:4 es la secuencia de aminoácidos de la aldesleucina.
SEQ ID NO:5 es la secuencia de aminoácidos de una proteína IL-4 humana recombinante. SEQ ID NO:6 es la secuencia de aminoácidos de una proteína IL-7 humana recombinante. SEQ ID NO:7 es la secuencia de aminoácidos de una proteína IL-15 humana recombinante. SEQ ID NO:8 es la secuencia de aminoácidos de una proteína IL-21 humana recombinante. Secuencias de aminoácidos de muromonab.
Secuencias de aminoácidos de interleucinas.

Claims (22)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para expandir linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) en una población terapéutica de TIL que comprende:
(a) agregar fragmentos de tumor procesados de un tumor extirpado de un paciente en un sistema cerrado para obtener una primera población de TIL;
(b) realizar una primera expansión cultivando la primera población de TIL en un medio de cultivo celular que comprende IL-2, y opcionalmente OKT-3, para producir una segunda población de TIL, en donde la primera expansión se realiza en un recipiente cerrado que proporciona una primera área de superficie permeable al gas, en donde la primera expansión se realiza durante 3-14 días para obtener la segunda población de TIL en donde la transición de la etapa (a) a la etapa (b) ocurre sin abrir el sistema;
(c) realizar una segunda expansión suplementando el medio de cultivo celular de la segunda población de TIL con IL-2 adicional, opcionalmente OKT-3, y células presentadoras de antígenos (APC), para producir una tercera población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza durante 4 a 6 días para obtener la tercera población de TIL, en donde la segunda expansión se realiza en un recipiente cerrado que proporciona una segunda área superficial permeable a los gases, y en donde la transición de la etapa (b) a la etapa (c) ocurre sin abrir el sistema; (d) dividir la tercera población de TIL en una primera pluralidad de cinco o menos subpoblaciones de TIL, comprendiendo cada subpoblación al menos 1,0 x 109 TIL, y realizar una tercera expansión de la primera pluralidad de subpoblaciones de TIL suplementando el medio de cultivo celular de cada subpoblación de TIL con IL-2 adicional, opcionalmente OKT-3, para producir una segunda pluralidad de subpoblaciones de TIL, en donde la segunda pluralidad de subpoblaciones de TIL comprende una población terapéutica de TIL, en donde la tercera expansión se realiza durante 5 a 7 días, en donde la tercera expansión para cada subpoblación se realiza en un recipiente cerrado que proporciona una tercera área superficial permeable a los gases, y en donde la transición de la etapa (c) a la etapa (d) se produce sin abrir el sistema;
(e) recolectar la población terapéutica de TIL obtenida de la etapa (d), en donde la transición de la etapa (d) a la etapa (e) ocurre sin abrir el sistema; y
(f) transferir la población de TIL recolectada de la etapa (e) a una bolsa de infusión,
en donde la transferencia de la etapa (e) a la (f) se produce sin abrir el sistema.
2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la población terapéutica de TIL recolectada en la etapa (e) comprende suficientes TIL para una dosis terapéuticamente eficaz de los TIL, en donde opcionalmente el número de TIL suficientes para una dosis terapéuticamente eficaz es de 2,3 x 1010 a 13,7*1010
3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende además la etapa de criopreservar la bolsa de infusión que comprende la población de TIL recolectada usando un proceso de criopreservación, en donde opcionalmente el proceso de criopreservación se realiza usando una relación de 1:1 de población de TIL recolectada a medio de criopreservación.
4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en donde las células presentadoras de antígenos son células mononucleares de sangre periférica (PBMC), en donde opcionalmente las PBMC están irradiadas y son alogénicas.
5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la recolección en la etapa (e) se realiza usando un sistema de procesamiento de células LOVO.
6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la bolsa de infusión de la etapa (f) es una bolsa de infusión que contiene HypoThermosol.
7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la etapa (b) se realiza dentro de un período de 10 días, 11 días o 12 días.
8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la etapa (b) se realiza en un período de 11 días.
9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las etapas (a) a (f) se realizan en un período de 10 días a 22 días.
10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las etapas (a) a (f) se realizan en un período de 10 días a 20 días.
11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las etapas (a) a (f) se realizan en un período de 10 días a 15 días.
12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde las etapas (a) a (f) se realizan en 22 días o menos.
13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en donde las etapas (a) a (f) y la criopreservación se realizan en 22 días o menos.
14. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 8, en donde la etapa (c) se realiza durante 108 horas a 132 horas.
15. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la etapa (c) se realiza durante 108 horas, 5 días o 132 horas.
16. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 8, en donde la etapa (c) y la etapa (d) se realizan en un periodo de 10 días a 12 días.
17. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 8, en donde la etapa (c) y la etapa (d) se realizan en un período de 10 días, 11 días o 12 días.
18. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde la población terapéutica de TIL comprende una subpoblación aumentada de células T efectoras y/o células T de memoria central en relación con la segunda población de TIL, en donde las células T efectoras y/o células T de memoria central obtenidas en la población terapéutica de TIL exhiben una o más características seleccionadas del grupo que consiste en expresar CD27+, expresar CD28+, telómeros más largos, aumento de la expresión de CD57 y disminución de la expresión de CD56 en relación con las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas de la segunda población de células.
19. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en donde las células T efectoras y/o las células T de memoria central obtenidas en la población terapéutica de TIL exhiben una expresión de CD57 aumentada y una expresión de CD56 disminuida en relación con las células T efectoras y/o células T de memoria central T obtenidas de la segunda población de células.
20. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en donde el riesgo de contaminación microbiana se reduce en comparación con un sistema abierto.
21. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde cada recipiente cerrado comprende un único biorreactor.
22. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la segunda población de TIL es al menos 50 veces mayor en número que la primera población de TIL.
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