MD4489C1 - Derivaţi de 1,4-benzotiazepină, procedeu de sinteză a lor, compoziţii farmaceutice care le conţin şi utilizarea acestora pentru tratarea sau prevenirea afecţiunilor care implică modularea receptorilor de rianodină - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la derivaţi ai 1,4-benzotiazepinei reprezentaţi prin formula structurală (I):(I)unde R este COOH, şi la sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora.Se descrie utilizarea compuşilor menţionaţi pentru tratarea stărilor, tulburărilor şi a bolilor asociate cu receptorii rianodinei (RyRs), care reglează funcţionarea canalelor de calciu în celule.Invenţia dezvăluie, de asemenea, compoziţii farmaceutice care conţin compuşii descrişi şi utilizarea acestora pentru tratarea bolilor şi a stărilor asociate cu RyRs, în special a tulburărilor sistemului cardiac, osteomuscular şi nervos central.

Description

DOMENIUL INVENŢIEI

Prezenta invenţie se referă la derivaţi ai 1,4-benzotiazepinei şi utilizarea lor în tratarea tulburărilor şi bolilor asociate cu receptorii rianodinei (RyRs), care reglează funcţionarea canalelor de calciu în celule. Invenţia dezvăluie, de asemenea, compoziţii farmaceutice care conţin aceşti compuşi şi utilizările acestora pentru tratarea bolilor şi stărilor asociate cu RyRs, în special tulburările sistemului cardiac, muscular-osos şi nervos central (SNC).

PREMISELE INVENŢIEI

Reticulul sarcoplasmic (RS) este o structură în celule care funcţionează, printre altele, ca un depozit specializat de calciu (Ca2+) intracelular. RyRs sunt canale în RS, care se deschid şi se închid pentru a regla eliberarea Ca2+ din RS în citoplasma intracelulară a celulei. Eliberarea Ca2+ în citoplasmă din RS sporeşte concentraţia de Ca2+ citoplasmic. Probabilitatea de deschidere a RyRs se referă la probabilitatea că un RyR este deschis în orice moment, şi, prin urmare, este capabil să elibereze Ca2+ în citoplasmă din RS.

Există trei tipuri de RyR, toate fiind foarte omoloage: RyR1, RyR2 şi RyR3. RyR1 se găseşte predominant în muşchii scheletici, precum şi în alte ţesuturi, RyR2 se găseşte predominant în inimă, precum şi în alte ţesuturi, şi RyR3 se găseşte în creier, precum şi în alte ţesuturi. RyR este un tetramer. O parte a complexului RyR este formată de patru polipeptide RyR în asociere cu patru proteine de legare FK506 (FKBP) (calstabin), în mod specific FKBP12 (calstabin1) şi FKBP12.6 (calstabin2). Calstabin1 se leagă de RyR1 şi RyR3, în timp ce calstabin2 se leagă de RyR2. Proteinele calstabin se leagă de RyR (o moleculă per subunitate RyR), stabilizează funcţia RyR, facilitează deschiderea cuplată dintre RyRs învecinaţi şi previn activarea anormală (scurgerea Ca2+) a canalului prin stabilizarea stării închise a canalului.

Receptorul 2 al rianodinei şi bolile cardiace

În muşchiul striat cardiac, RyR2 este cel mai mare canal de eliberare a Ca2+ necesar pentru cuplarea de excitaţie-contracţie (EC) şi contracţia musculară. În timpul cuplării EC, depolarizarea membranei celulare cardiaco-musculare în timpul fazei zero a potenţialului de acţiune activează canalele de Ca2+ voltaj-dependente. În schimb, influxul de Ca2+ prin canalele voltaj-dependente deschise iniţiază eliberarea Ca2+ din RS prin RyR2. Acest proces este cunoscut ca eliberarea Ca2+ indusă de Ca2+. Eliberarea Ca2+ indusă de Ca2+ şi mediată de RyR2 activează ulterior proteinele contractile în celula cardiacă, ceea ce duce la contracţia musculară cardiacă.

Fosforilarea RyR2 de kinaza proteică A (PKA) este o parte importantă a reacţiei "luptă sau zboară", care sporeşte cuplarea EC cardiacă prin mărirea cantităţii de Ca2+eliberat pentru un anumit declanşator. Această cale de semnalizare oferă un mecanism prin care activarea sistemului nervos simpatic (SNS), ca răspuns la stres, duce la creşterea debitului cardiac. Fosforilarea RyR2 de PKA duce la disocierea parţială a calstabin2 din canal, care la rândul său, duce la creşterea probabilităţii de deschidere, precum şi la creşterea eliberării de Ca2+ din RS în citoplasma intracelulară.

Insuficienţa cardiacă (IC) se caracterizează printr-o stare hiperadrenergică susţinută, în care nivelurile de catecolamine serice sunt ridicate cronic. O consecinţă a acestei stări hiperadrenergice cronice este hiperfosforilarea persistentă a RyR2 de PKA, astfel încât 3-4 din cele patru Ser2808 în fiecare canal homotetrameric RyR2 sunt fosforilate cronic (Marx SO, et al. Cell, 2000;101(4):365-376). În special, hiperfosforilarea cronică a RyR2 de PKA este asociată cu eliminarea subunităţii canal-stabilizare calstabin2 din complexul macromolecular al canalului RyR2. Eliminarea proteinei calstabin duce la o "scurgere" diastolică a Ca2+ din RS din complexul RyR, ceea ce contribuie la contractilitate redusă (Marx et al., 2000). Datorită activării curenţilor de depolarizare spre interior, această "scurgere" diastolică a Ca2+ din RS este asociată, de asemenea, cu aritmii cardiace fatale (Lehnart et al, J Clin Invest. 2008;118(6):2230-2245). Într-adevăr, şoarecii creaţi cu RyR2 fără site de fosforilare de PKA sunt protejaţi de progresia IC după infarctul miocardic (IM) (Wehrens XH et al. Proc Natl Acad Sci SUA. 2006;103(3):511-518). În plus, hiperfosforilarea cronică de PKA a RyR2 în IC este asociată cu remodelarea complexului macromolecular RyR2 care include eliminarea fosfatazelor (Marx et al. 2000) PP1 şi PP2a (defosforilarea defectuoasă Ser2808) şi fosfodiesterazei (PDE4D3) de tip 4 specifică adenozin monofosfatului ciclic (AMPc) din complexul RyR2. Eliminarea PDE4D3 din complexul RyR2 cauzează creşterea durabilă a nivelurilor locale de AMPc (Lehnart SE, et al., Cell 2005;123(1):25-35). Astfel, scurgerea diastolică a Ca2+ din RS contribuie la progresia IC şi aritmie. Mai mult decât atât, un raport recent a demonstrat că şoarecii activaţi cu RyR2-S2808D+/+ (acid aspartic înlocuind serina 2808), care imită hiperfosforilarea constitutivă a RyR2 de PKA, arată eliminarea calstabin2 şi RyR2 neetanş. Şoarecii cu RyR2-S2808D+/+ dezvoltă cardiomiopatie dependentă de vârstă, demonstrează oxidarea şi nitrozilarea sporită a RyR2, un conţinut redus al depozitului de Ca2+ în RS, şi scurgere diastolică crescută a Ca2+ din RS. După infarctul miocardic, şoarecii cu RyR2-S2808D+/+ demonstrează o mortalitate sporită comparativ cu puii WT. Tratamentul cu S107, un derivat al 1,4-benzotiazepinei care stabilizează interacţiunile dintre RyR2 şi calstabin2 (WO 2007/024717 [1]), a inhibat scurgerea diastolică a Ca2+ din RS mediată de RyR2 şi a redus progresia IC atât în şoarecii WT, cât şi cei RyR2-S2808D+/+ (Shan et al., J Clin Invest. 2010 Dec 1;120(12):4375-87).

Mai mult decât atât, RyR2 conţine circa 33 de reziduuri de tiol libere, fapt ce îl face foarte sensibil la starea celulară de oxidoreducere. Oxidarea cistinei facilitează deschiderea RyR şi scurgerea Ca2+ din RS. Shan et al, 2010, a demonstrat că oxidarea şi nitrozilarea RyR2 şi disocierea subunităţii de stabilizare calstabin2 din RyR2 induce scurgerea Ca2+ din RS.

Tahicardia ventriculară polimorfă catecolaminergică (TVPC) este o tulburare ereditară la persoanele cu inima cu o structură normală. S-a stabilit că peste 50 de mutaţii diferite ale RyR2 sunt legate de TVPC. Pacienţii cu TVPC suferă de sincopă şi moarte subită cardiacă (MSC), de la vârstă timpurie până la adultă, şi la 35 de ani mortalitatea este de până la 50%. Persoanele cu TVPC au aritmii ventriculare atunci când sunt supuşi la efort fizic, însă nu dezvoltă aritmii în timpul odihnei. Mutaţiile RyR2 asociate cu TVPC duc la canale RyR2 "neetanşe" din cauza legării reduse a subunităţii calstabin2 (Lehnart et al., 2008). Şoarecii heterozigoţi pentru mutaţia R2474S în RyR2 (şoareci RyR2-R2474S) prezintă convulsii spontane tonico-clonice generalizate (care au apărut în absenţa aritmiilor cardiace), aritmii ventriculare induse prin efort fizic, şi MSC. Tratamentul cu S107 a sporit legarea calstabin2 de canalul mutant RyR2-R2474S, a inhibat scurgerea canalului, a prevenit aritmiile cardiace şi a ridicat pragul de convulsii (Lehnart et al., 2008).

Receptorul 1 al rianodinei şi bolile musculoscheletice

Contracţia muşchilor scheletici este activată prin eliberarea Ca2+ din RS prin RyR1. Depolarizarea membranei (T)-tubulare transversale activează senzorul de tensiune (Cav1.1) al receptorului dihidropiridină, care la rândul sau activează canalele RyRl printr-o interacţiune directă proteină-proteină cauzând eliberarea depozitelor de Ca2+ din RS. Ca2+ se leagă de troponina C permiţând apariţia punţilor transversale de actină-miozină şi scurtarea sarcomerului.

În condiţii de stres muscular prelungit (de ex., în timpul alergării maratonului) sau de o boală, cum ar fi insuficienţa cardiacă, ambele fiind caracterizate prin activarea cronică a SNS, funcţia musculaturii scheletice este afectată, probabil din cauza cuplării CE modificate. În special, cantitatea de Ca2+ eliberat din RS în timpul fiecărei contracţii a muşchiului este redusă, pot avea loc eliberări anormale de Ca2+, şi recaptarea Ca2+este încetinită (Reiken, S, et al. 2003. J. Cell Biol. 160:919-928). Aceste observaţii sugerează că efectele nocive ale activării cronice a SNS pe musculatura scheletică pot fi din cauza, cel puţin în parte, defectelor în semnalizarea Ca2+.

Complexul macromolecular RyRl constă dintr-un tetramer al subunităţii RyRl 560-kDa care formează un eşafodaj pentru proteinele care reglează funcţia canalelor, inclusiv PKA şi fosfodiesteraza 4D3 (PDE4D3), fosfataza proteică 1 (PP1) şi calstabin1. Proteina de ancorare a kinazei A (mAKAP) fixează PKA şi PDE4D3 de RyR1, în timp ce spinofilina fixează PP1 de canal (Marx et al. 2000; Brillantes et al., Cell, 1994, 77, 513-523; Bellinger et al. J. Clin. Invest. 2008, 118, 445-53). Subunităţile catalitice şi de reglementare ale PKA, PP1, şi PDE4D3 reglează fosforilarea RyRl mediată de PKA la Ser2843 (Ser2844 în şoarece). S-a demonstrat că fosforilarea RyR1 mediată de PKA la Ser2844 creşte sensibilitatea canalului faţă de Ca2+ citoplasmatic, reduce afinitatea de legare a calstabin1 pentru RyR1, şi destabilizează starea închisă a canalului (Reiken et al., 2003; Marx, S.O. et al., Science, 1998, 281:818-821). Concentraţiile de calstabin1 în musculatura scheletică sunt de circa 200 nM şi fosforilarea RyRl de PKA reduce afinitatea de legare a calstabin1 pentru RyR1 de la circa100-200 nM până la peste 600 nM. Astfel, în condiţii fiziologice, reducerea afinităţii de legare a calstabin1 pentru RyR1, care rezultă din fosforilarea RyR1 de PKA la Ser2843, este suficientă pentru a reduce substanţial cantitatea de calstabin1 prezentă în complexul RyRl. Hiperfosforilarea cronică a RyRl de PKA la Ser2843 (definită ca fosforilarea PKA a 3 sau 4 situsuri din cele 4 situsuri PKA Ser2843 prezente în fiecare homotetramer RyR1) duce la canale "neetanşe" (adică, canale predispuse la deschidere în repaus), care contribuie la disfuncţia musculaturii scheletice asociată cu stări hiperadrenergice persistente, cum sunt cele care apar la persoanele cu insuficienţă cardiacă (Reiken et al., 2003).

Mai mult decât atât, reglarea RyR1 prin modificări posttranslaţionale, altele decât fosforilare, cum ar fi de nitrozilarea grupărilor de sulfhidril liber pe reziduuri de cistină (S-nitrozilare), precum şi oxidarea canalelor, au dus la creşterea activităţii canalelor RyR1. S-a constatat că S-nitrozilarea şi oxidarea RyR1 reduc legarea calstabin1 de RyR1.

Anterior Bellinger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 2008, 105(6):2198-2002) au raportat că în timpul efortului fizic excesiv la şoareci şi oameni, RyR1 este hiperfosforilat progresiv de PKA, S-nitrozilat şi epuizat de PDE4D3 şi calstabin1, ducând la canale "neetanşe" care cauzează scăderea capacităţii fizice la soareci. Tratamentul cu S107 a împiedicat eliminarea calstabin1 din complexul RyR1, a îmbunătăţit generarea de forţe şi capacitatea fizică, şi a redus activitatea calpainei de protează neutră dependentă de Ca2+- şi concentraţiile plasmatice de creatin kinază.

Distrofia musculară Duchenne (DMD) este una dintre principalele boli genetice letale a copilăriei. DMD este X-linkat, afectând 1 din 3500 de băieţi noi-născuţi şi de obicei duce la moartea până la vârsta de ~30 ani din cauza insuficienţei respiratorii sau cardiace. Mutaţiile distrofinei asociate cu DMD duc la pierderea completă a proteinei de distrofină, perturbând astfel legătura dintre citoscheletul subsarcolemei şi matricea extracelulară. Această legătură este esenţială pentru protejarea şi stabilizarea musculaturii contra leziunilor induse de contracţie. În prezent, nu există nici un remediu pentru DMD şi majoritatea tratamentelor în clinică sunt paliative. Intervenţiile emergente în studiile clinice din Faza Ι/II reprezintă ignorarea exonului, inhibarea miostatinei, şi suprareglarea utropinei. Cu toate acestea, există probleme legate de livrarea sistemică, susţinerea ignorării exonului, şi suprareglarea utropinei. În plus, în studiile clinice din Faza Ι/II, inactivarea miostatinei pentru creşterea dimensiunii musculare nu a dus la îmbunătăţirea forţei sau funcţiei musculare. Instabilitatea sarcolemei din cauza mutaţiilor în distrofină are un efect de cascadă. Un efect major este concentraţia crescută de Ca2+ citosolic, ceea ce duce la activarea proteazelor dependente de Ca2+- (calpaine). Un alt efect este inflamaţia si activitatea sporită iNOS, care poate provoca oxidarea/nitrozilarea proteinelor, lipidelor, şi ADN-ului. Patologia musculară DMD este progresivă şi depăşeşte cu mult instabilitatea sarcolemei. Astfel patologia este conformă cu instabilitatea sarcolemei sporind susceptibilitatea la o altă leziune. S-a demonstrat recent că oxidarea sau nitrozilarea excesivă a RyR1 poate perturba interacţiunea calstabin1 cu complexul RyR1, ceea ce duce la neetanşietatea RyR1 şi slăbiciune musculară într-un model de şoarece cu distrofie musculara (mdx), şi că tratamentul cu S107 îmbunătăţeşte indicii funcţiei musculare în acest model de şoarece(../Users/slevitchi/AppData/Local/Microsoft/Windows/Temporary Internet Files/Content.Outlook/7BLR3JCL/IN220 121807 Filing-ROM.doc" \\l "_ENREF_12" \\o "Bellinger, 2009 #5 A. et al. 2009, Nature Medicine, 15:325-330).

Pierderea masei musculare şi a forţei (sarcopenie) legată de vârstă contribuie la invaliditate şi creşterea mortalităţii. Andersson, D. et al. (Cell Metab. 2011 Aug 3;14(2):196-207) au raportat că RyR1 de la şoarecii în vârstă (24 de luni) este oxidat, nitrozilat cu cisteină, şi epuizat de calstabin1, comparativ cu RyR1 de la adulţii mai tineri (3-6 luni). Această remodelare a complexului de canale RyR1 a dus la canale "neetanşe" cu probabilitate crescută de deschidere, ceea ce duce la scurgerea calciului intracelular în muşchii scheletici. Tatarea şoarecilor în vârstă cu S107 a stabilizat legarea calstabin1 de RyR1, a redus scurgerea calciului intracelular, a diminuat speciile reactive de oxigen (SRO), şi a îmbunătăţit eliberarea Ca2+ tetanic, forţa specifică musculaturii, precum şi capacitatea fizică.

Publicaţiile internaţionale de brevet PCT WO 2005/094457 [2], WO 2006/101496 [3] şi WO 2007/024717 dezvăluie derivaţi ai 1,4-benzotiazepinei şi utilizarea lor în tratamentul tulburărilor cardiace, musculare scheletice şi cognitive, printre altele.

Publicaţia internaţională de brevet PCT WO 2008/060332 [4] se referă la utilizarea derivaţilor 1,4-benzotiazepinei pentru tratarea oboselii musculare la subiecţii care suferă de diverse patologii, cum ar fi distrofia musculară, sau la subiecţii care suferă de oboseală musculară ca urmare a efortului fizic durabil, prelungit şi/sau extenuant, sau stresului cronic.

Publicaţia internaţională de brevet PCT WO 2008/021432 [5] se referă la utilizarea derivaţilor 1,4-benzotiazepinei pentru tratamentul şi/sau prevenirea bolilor, tulburărilor şi stărilor care afectează sistemul nervos.

Publicaţia internaţională de brevet PCT WO 2012/019076 [6] se referă la utilizarea derivaţilor 1,4-benzotiazepinei pentru tratamentul şi/sau prevenirea leziunii de ischemie/reperfuzie cardiacă. Fauconnier et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(32): 13258-63 a relatat că scurgerea RyR mediată de activarea caspazei-8 duce la leziunea ventricului stâng după ischemia-reperfuzia miocardică, şi că tratamentul cu S107 a inhibat scurgerea Ca2+ din RS, a redus aritmiile ventriculare, mărimea infarctului, şi remodelarea ventricului stâng peste 15 de zile după reperfuzie.

Publicaţia internaţională de brevet PCT WO 2012/019071 [7] se referă la utilizarea derivaţilor 1,4-benzotiazepinei pentru tratamentul şi/sau prevenirea sarcopeniei.

Publicaţia internaţională de brevet PCT WO 2012/037105 [8] se referă la utilizarea derivaţilor 1,4-benzotiazepinei pentru tratamentul şi/sau prevenirea tulburărilor şi bolilor neuronale induse de stres.

Există necesitatea de a identifica noi compuşi eficienţi pentru tratarea tulburărilor şi bolilor asociate cu RyRs, inclusiv tulburările şi bolile musculare scheletice şi cardiace. Mai exact, rămâne necesitatea de a identifica noi substanţe care pot fi utilizate pentru tratarea tulburărilor asociate cu RyR, de exemplu, prin repararea scurgerii în canalele RyR, şi sporirea legării proteinelor calstabin de RyRs fosforilaţi de PKA/oxidaţi/nitrozilaţi, şi de RyRs mutanţi care altminteri au redus afinitatea pentru, sau nu se leagă de, calstabin.

ESENŢA INVENŢIEI

Prezenta invenţie propune noi derivaţi ai 1,4-benzotiazepinei, şi sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora. În unele variante de executare, compuşii din prezenta invenţie sunt stabilizatori ai canalelor de calciu ai receptorului rianodinei (RyR), denumiţi uneori "RycalsTM". Prezenta invenţie propune, de asemenea, procedee de utilizare a acestor compuşi pentru tratarea tulburărilor şi bolilor asociate cu RyRs.

Compuşii prezentei invenţii reprezintă o selecţie dintre derivaţii 1,4-benzotiazepinei descrişi în WO 2007/024717. WO 2007/024717 descrie compuşi cu o structură similară, cu toate acestea, după cum se descrie în continuare în prezenta, s-a constatat că aceşti compuşi sunt foarte instabili şi astfel utilitatea lor terapeutică în calitate de medicamente este limitată. Problema care stă la baza prezentei cereri este, aşadar, furnizarea derivaţilor alternativi ai 1,4-benzotiazepinei care nu sunt doar farmacologic activi, ci şi posedă proprietăţi favorabile, cum ar fi stabilitate metabolică înaltă, şi astfel sunt adecvaţi în calitate de medicamente în tratarea bolilor şi stărilor asociate cu RyR, de exemplu tulburările cardiace, musculare scheletice şi ale sistemului nervos central (SNC). S-a descoperit în mod neaşteptat că compuşii cu formula (I) sunt stabili, precum şi farmacologic activi, oferind astfel o soluţie tehnică problemei care stă la baza prezentei invenţii.

Compuşii prezentei invenţii sunt reprezentaţi prin structura cu formula (I):

(I)

unde

R este COOH;

şi sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora.

Compuşii cu Formula (I) pot fi prezenţi sub formă de sare cu un acid sau bază acceptabilă farmaceutic. Astfel de săruri sunt selectate, de preferinţă, din grupul ce constă din săruri de sodiu, potasiu, magneziu, hemifumarat, hidroclorură şi hidrobromură, fiecare posibilitate reprezentând o variantă de executare separată a prezentei invenţii. O sare preferată în prezent este sarea de sodiu. O altă sare preferată în prezent este sarea de hemifumarat.

În unele variante de executare specifice, compusul este selectat din grupul ce constă din compusul 1, compusul 4 şi compusul 6, şi sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora. Structurile acestor compuşi sunt descrise mai jos.

Într-o variantă de executare preferată, compusul este reprezentat prin structura compusului (1):

(1)

sau sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora.

În unele variante de executare, compusul 1 este furnizat ca compusul de bază. Totuşi, în alte variante de executare compusul 1 este furnizat sub formă de sare cu un acid sau bază acceptabilă farmaceutic. De preferinţă, o asemenea sare este selectată din grupul ce constă din săruri de sodiu, potasiu, magneziu, hemifumarat, hidroclorură şi hidrobromură, fiecare posibilitate reprezentând o variantă de executare separată a prezentei invenţii. O sare preferată în prezent este sarea de sodiu. O altă sare preferată în prezent este sarea de hemifumarat.

Prezenta invenţie propune, de asemenea, procedee de sinteză a compuşilor invenţiei, precum şi sărurilor acestora.

Prezenta invenţie propune, de asemenea, compoziţii farmaceutice care cuprind unul sau mai mulţi compuşi ai invenţiei, şi cel puţin un aditiv sau excipient, de ex., substanţe de umplere, diluanţi, lianţi, agenţi de dezintegrare, soluţii tampon, coloranţi, emulgatori, agenţi de îmbunătăţire a aromei, gelifianţi, agenţi de alunecare, conservanţi, agenţi de solubilizare, stabilizatori, agenţi de suspendare, îndulcitori, agenţi de tonicitate, agenţi de umectare, emulgatori, agenţi de dispersare, agenţi de umflare, agenţi de întârziere, lubrifianţi, absorbanţi, şi agenţi de creştere a vâscozităţii. Compoziţiile pot fi prezentate în capsule, granule, pulberi, soluţii, pliculeţe, suspensii, sau formă de dozare comprimat.

Prezenta invenţie propune, de asemenea, procedee de tratare sau prevenire a diverselor tulburări, boli şi stări asociate cu RyRs, cum ar fi tulburările şi bolile cardiace, cognitive musculo-scheletice , ale SNC şi neuromusculare, care includ administrarea unui subiect, care are nevoie de un astfel de tratament, a unei cantităţi de un compus cu Formula (I) sau o sare a acestuia, eficientă pentru a preveni sau trata o tulburare sau boală asociată cu un RyR. Prezenta invenţie propune, de asemenea, un procedeu de prevenire sau tratare a unei scurgeri în RyR (inclusiv RyR1, RyR2 şi RyR3) la un subiect, inclusiv administrarea subiectului a unei cantităţi de un compus cu Formula (I) sau o sare a acestuia, eficientă pentru prevenirea sau tratarea unei scurgeri în RyR.

În plus, prezenta invenţie propune un procedeu de modulare a legării RyRs şi proteinelor calstabin la un subiect, inclusiv administrarea subiectului respectiv a unei cantităţi de un compus cu Formula (I) sau o sare a acestuia, eficientă pentru a modula cantitatea de calstabin legată de RyR.

Prezenta invenţie se referă în continuare la utilizarea unui compus cu Formula (I) pentru fabricarea unui medicament pentru tratamentul şi/sau prevenirea tulburărilor, bolilor şi stărilor asociate cu RyRs, cum ar fi tulburările şi bolile cardiace, musculo-scheletice şi cognitive/SNC. Într-o altă variantă de executare, prezenta invenţie se referă la utilizarea unui compus cu Formula (I) pentru fabricarea unui medicament pentru prevenirea sau tratarea unei scurgeri în RyR. Într-o altă variantă de executare, prezenta invenţie se referă la utilizarea unui compus cu Formula (I) pentru fabricarea unui medicament pentru modularea cantităţii de proteine calstabin legate de RyR.

Procedeele invenţiei pot fi aplicate într-un sistem in vitro (de ex., culturi de celule sau ţesuturi) sau in vivo (de ex., într-un animal neuman sau om).

În unele variante de executare, compuşii invenţiei sunt furnizaţi în combinaţie cu terapia de ignorare a exonului, de ex. oligonucleotide antisens (OA), astfel încât să sporească ignorarea exonului într-un ARNm de interes, de ex., gena DMD, aşa cum este descris mai jos. Alte trăsături caracteristice şi avantaje ale prezentei invenţii vor deveni evidente din următoarea descriere detaliată şi figuri.

DESCRIEREA SUCCINTĂ A FIGURILOR

Figura 1A Imunoblot cu anticorp calstabin2 ce arată legarea calstabin2 de RyR2 fosforilat de PKA în absenţa (-) sau prezenţa a 100 nM de compus 1. (+): calstabin ce se leagă de RyR2 nefosforilat de PKA. S36 (US 7,544,678 [9]), este utilizat ca martor pozitiv.

Figura 1B Imunoblot cu anticorp calstabin2 ce arată legarea calstabin2 de RyR2 fosforilat de PKA în absenţa (-) sau prezenţa a 100 nM de compus 2, compus 3, compus 4. (+): calstabin ce se leagă de RyR2 nefosforilat de PKA. S36 este utilizat ca martor pozitiv.

Figura 1C Imunoblot cu anticorp calstabin1 ce arată legarea calstabin1 de RyR1 fosforilat de PKA în absenţa (Neg) sau prezenţa concentraţiilor indicate de compus 1 sau compus 4. (Poz): calstabin ce se leagă de RyR1 nefosforilat de PKA. S36 este utilizat ca martor pozitiv.

Figura 2 Figura 2A: Imunoblot cu anticorp calstabin1 ce arată concentraţiile de calstabin1 în complexele RyR1 imunoprecipitate din lizatele tibiale la şoareci cărora li s-a administrat vehiculul (50:50 DMSO/PEG), izoproterenol de unul singur (ISO) sau izoproterenol împreună cu concentraţiile indicate de compus 1 în pompe osmotice. S36 este utilizat ca martor la 3.6 mM. Figura 2B: cuantificarea % calstabin1 care se leagă din nou de RyRl.

Figura 3 Model de insuficienţă cardiacă cronică la şobolani indusă de leziunea de ischemie-reperfuzie (I/R). Pentru protocolul I/R, artera coronară descendentă anterioară stângă (DAS) a fost astupată timp de 1 oră.

Figura 4 Volumele ventriculului stâng (VS) şi fracţia de ejecţie (FE) la şobolanii trataţi cu compusul 1 în doză de 5 mg/kg/zi (5MK) sau 10 mg/kg/zi (10MK) în apa de băut comparativ cu animalele tratate cu vehiculul (H2O) şi operate fals. Insuficienţa cardiacă cronică a fost indusă de leziunea de ischemie-reperfuzie (I/R). Artera DAS a fost astupată timp de 1 oră; tratamentul a început peste o săptămână după reperfuzie şi a continuat timp de 3 luni. Parametrii ecocardiografici au fost obţinuţi peste 1, 2 sau 3 luni de tratament. Figura 4A: VS Volumul diastolic final; Figura 4B: VS Volumul sistolic final; Figura 4BC: FE. Figurile 4A şi 4B: § P <0,001 faţă de animalele operate fals; * P <0,05 faţă de vehicul; † P <0,001 faţă de vehicul. Figura 4C: § P <0,001 faţă de animalele operate fals; † P <0,001 faţă de vehicul.

Figura 5 Figurile 5A-C ilustrează greutatea corporală (GC) (5A), mărimea infarctului (5B), şi greutatea VS (5C), şi Figura 5D prezintă conţinutul de colagen la şobolanii trataţi cu compusul 1 în doză de 5 mg/kg/zi (5MK) şi 10mg/kg/zi (10MK) în apă de băut comparativ cu animalele tratate cu vehicul (H2O) şi operate fals. Insuficienţa cardiacă cronică a fost indusă de leziunea de ischemie-reperfuzie (I/R). Artera DAS a fost astupată timp de 1 oră; tratamentul a început peste o săptămână după reperfuzie şi a continuat timp de 3 luni. Parametrii au fost măsuraţi după 3 luni de tratament. Figurile 5A-C: nesemnificativ. Figura 5D: ††† P <0,001 faţă de animalele operate fals; * P <0,05 faţă de vehicul.

Figura 6 Hemodinamica invazivă: Tensiunea sistolică a ventriculului stâng (TS VS) (6A), dP/dtmax (6B); şi dP/dtmin (6C) la şobolanii trataţi cu compusul 1 în doză de 5 mg/kg/zi (5MK) sau 10mg/kg/zi (10MK) în apa de băut comparativ cu animalele tratate cu vehicul (H2O) şi operate fals. Insuficienţa cardiacă cronică a fost indusă de leziunea de ischemie-reperfuzie (I/R). Artera DAS a fost astupată timp de 1 oră; tratamentul a început peste o săptămână după reperfuzie şi a continuat timp de 3 luni. Parametrii hemodinamici au fost măsuraţi după 3 luni de tratament. Figura 6A: nesemnificativ. Figura 6B: § P <0,05 faţă de animalele operate fals; * P <0,05 faţă de vehicul. Figura 6C: † P <0,01 faţă de animalele operate fals; * P <0,05 faţă de vehicul.

Figura 7 Concentraţiile plasmatice din compusul 1 (µµ) faţă de perioada zilei.

Figura 8 FE la şobolanii trataţi cu compusul 1 sau compusul A în doză de 5 mg/kg/zi (5MK) în apă de băut comparativ cu animalele tratate cu vehiculul (H2O) şi operate fals. Artera DAS a fost astupată timp de 1 oră; tratamentul a început peste o săptămână după reperfuzie şi a continuat timp de 3 luni. Parametrii ecocardiografici au fost obţinuţi după 1, 2 sau 3 luni de tratament. § P <0,001 faţă de animalele operate fals; * P <0,05 faţă de vehicul; † P <0,001 faţă de vehicul.

Figura 9 Efectul compusului 1 asupra activităţii fizice spontane a şoarecilor mdx şi WT comparativ cu martorii trataţi cu vehicul (H2O). P<0,001 pentru zilele 1 -19 de activitate la şoarecii mdx cărora li s-au administrat doze de 10 şi 50 mg/kg/zi (doza ţintă) în apa de băut, comparativ cu grupul de control căruia i s-a administrat vehiculul.

Figura 10 Raportul specific forţă-frecvenţă a muşchiului EDL. (A) Şoarecii mdx trataţi cu compusul 1 (5, 10 şi 50 mg/kg/zi (doză ţintă)) administrat în apa de băut, comparativ cu martorii trataţi cu vehiculul (H2O) (n=5). p<0,05, pentru doza de 50 mg/kg/zi, la frecvenţe de 150 Hz şi mai mult. (B) WT, C57BL/6, şoarecii trataţi cu compusul 1 (50 mg/kg/zi (doză ţintă) administrat în apa de băut, comparativ cu martorii trataţi cu vehiculul (H2O) (n=4)

Figura 11 Greutatea corporală medie (12A) şi consumul de apă mediu (12B) al şoarecilor mdx şi WT trataţi cu vehiculul (H2O) sau compusul 1 (50 mg/kg/zi (doza ţintă) administrat în apa de băut.

DESCRIEREA DETALIATĂ A INVENŢIEI

Se va înţelege că descrierea detaliată şi exemplele specifice, cu indicarea diverselor variante de executare ale invenţiei sunt prezentate doar cu titlu de ilustrare, deoarece diverse schimbări şi modificări în spiritul şi domeniul de aplicare a invenţiei vor deveni evidente specialiştilor în domeniu din această descriere detaliată.

Aşa cum este utilizat aici şi în revendicările anexate, formele de singular "un", "o" includ referiri de plural, dacă conţinutul nu indică clar altfel. Toate publicaţiile, cererile de brevet, brevetele şi alte referinţe menţionate aici sunt incluse prin referire în totalitatea lor.

Termenul "RycalsTM" se referă la stabilizatori ai canalelor de calciu ai receptorului rianodinei, reprezentaţi prin compuşi cu Formula generală (I) sau (IA) aşa cum este prevăzut de invenţie, precum şi prin compuşi specifici desemnaţi prin numere numerice aşa cum este prevăzut de invenţie, şi denumiţi în mod colectiv în prezenta ca "compus(şi) al(ai) invenţiei".

Compuşi

În unele variante de executare, compuşii din prezenta invenţie sunt reprezentaţi prin structura cu Formula (IA):

(IA)

unde

R este COOH sau un bioizoster al acestuia, COOR1 sau CN; şi

R1 este un alchil C1-C4;

şi sărurile acceptabile farmaceutic ale acestora.

În unele variante de executare preferenţiale, R în Formula (IA) este un acid carboxilic (COOH). În alte variante de executare preferenţiale, R în Formula (IA) este un bioizoster al acidului carboxilic, de exemplu tetrazol. În mod alternativ, bioizosterul acidului carboxilic poate fi un heterociclu acid cum ar fi 1,2,4-oxadiazol-5(4H)-onă, 1,2,4-tiadiazol-5(4H)-onă, 1,2,4-oxadiazol-5(4H)-tionă, 1,3,4-oxadiazol-2(3H)-tionă, 4-metil-1H-1,2,4-triazol-5(4H)-tionă, acidul 5-fluoroorotic, şi altele. Bioizosteri suplimentari ai acidului carboxilic sunt descrişi, de ex., în Hamada, Y. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006; 16:4354-4359; Herr, R.J. et al., Bioorg. Med. Chem. 2002; 10: 3379-3393; Olesen, P.H., Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 2001; 4: 471; Patani. G.A. et al., J. Chem. Rev. 1996; 96:3147; Kimura, T. et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006; 16: 2380-2386; and Kohara, Y. et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1995; 5(17): 1903-1908. Conţinutul fiecăreia dintre referinţele sus-menţionate este inclus aici prin referinţă.

Într-o variantă de executare preferenţială, compuşii prezentei invenţii sunt reprezentaţi prin structura cu Formula (IA), unde R este COOH şi săruri acceptabile farmaceutic ale acestuia (şi anume, un compus cu formula (I)).

În alte variante de executare preferenţiale, R în Formula (IA) este la poziţia 4 a inelului fenil (de ex., poziţia 7 a inelului benzotiazepinei). Fiecare posibilitate reprezintă o variantă de executare separată a prezentei invenţii. Compuşii cu Formula (IA) sau (I) pot fi prezenţi sub formă de sare cu un acid sau o bază acceptabilă farmaceutic. Astfel de săruri sunt selectate, de preferinţă, din grupul ce constă din săruri de sodiu, potasiu, magneziu, hemifumarat, hidroclorură şi hidrobromură, fiecare posibilitate reprezentând o variantă de executare separată a prezentei invenţii. O sare preferată în prezent este sarea de sodiu. O altă sare preferată în prezent este sarea de hemifumarat.

În unele variante de executare specifice, compusul este selectat din grupul ce constă din compusul 1, compusul 2, compusul 3, compusul 4, compusul 5, compusul 6, compusul 7, compusul 8, compusul 9, compusul 10, compusul 11, şi compusul 12, precum şi săruri acceptabile farmaceutic ale acestora. Aceşti compuşi sunt reprezentaţi prin următoarele structuri:

;

(1)

;

(2)

;

(3)

;

(4)

;

(5)

;

(6)

;

(7)

;

(8)

;

(9)

;

(10)

; şi

(11)

.

(12)

Definiţii chimice:

Termenul "alchil", în modul utilizat în prezenta, se referă la o hidrocarbură saturată, liniară sau ramificată având de la 1 până la 4 atomi de carbon ("alchil C1-C4"). Grupări alchil reprezentative includ, dar nu se limitează la metil, etil, propil, izopropil, butil, sec-butil, şi terţ-butil. Gruparea alchil poate fi nesubstituită sau substituită cu una sau mai multe grupări selectate dintre halogen, haloalchil, hidroxi, alcoxi, haloalcoxi, cicloalchil, aril, heterociclil, heteroaril, amido, alchilamido, dialchilamido, nitro, amino, ciano, N3, oxo, alchilamino, dialchilamino, carboxil, tio, tioalchil şi tioaril.

Compuşii prezentei invenţii pot exista sub forma lor tautomeră. Toate aceste forme tautomere sunt examinate aici ca parte a prezentei invenţii.

Toţi stereoizomerii compuşilor prezentei invenţii (de exemplu, cei care pot exista datorită atomilor de carbon asimetrici pe diverşi substituenţi), inclusiv formele enantiomerice şi formele diastereomerice, sunt examinate în cadrul domeniului de aplicare al acestei invenţii. Stereoizomerii individuali ai compuşilor invenţiei pot fi, de exemplu, substanţial liberi de alţi izomeri (de ex., ca un izomer optic pur sau substanţial pur având o activitate specificată), sau pot fi amestecaţi, de exemplu, ca racemaţi, sau ca amestecuri îmbogăţite cu un stereoizomer. Centrele chirale din prezenta invenţie pot avea configuraţia S sau R aşa cum este definit de Recomandările IUPAC 1974. Formele racemice pot fi descompuse prin metode fizice, cum ar fi, de exemplu, cristalizarea fracţionată, separarea sau cristalizarea derivaţilor diastereomerici sau separarea prin cromatografia pe coloană chirală. Izomerii optici individuali pot fi obţinuţi din racemaţi prin orice metodă adecvată, inclusiv, fără limitare, metode convenţionale, cum ar fi, de exemplu, formarea sării cu un acid sau bază optic activă, urmată de cristalizare.

Compuşii prezentei invenţii sunt, după prepararea lor, de preferinţă izolaţi şi purificaţi pentru a obţine o compoziţie care conţine o cantitate în greutate egală sau mai mare de circa 90% de compus, circa 95% de compus, şi chiar mai preferabil mai mare de circa 99% de compus (compus "substanţial pur"), care apoi este utilizat sau preparat conform descrierii din prezenta. Astfel de compuşi "substanţial puri" ai prezentei invenţii sunt, de asemenea, examinaţi aici ca parte a prezentei invenţii.

Utilizarea terapeutică

Prezenta invenţie propune compuşi care sunt capabili să trateze stări, tulburări şi boli asociate cu RyRs. Mai concret, prezenta invenţie propune compuşi care sunt capabili să oprească o scurgere în canalele RyR, care pot fi canale RyR1, RyR2 şi/sau canale RyR3. Într-o variantă de executare, compuşii invenţiei sporesc asocierea şi/sau inhibă disocierea RyR şi calstabin (de ex., RyR1 şi calstabin1; RyR2 şi calstabin2; şi RyR3 şi calstabin1). "Stări, tulburări şi boli asociate cu RyRs" înseamnă tulburări şi boli care pot fi tratate şi/sau prevenite prin modularea RyRs şi includ, fără limitare, tulburări şi boli cardiace, oboseală musculară, tulburări şi boli musculoscheletice, tulburări şi boli ale SNC, disfuncţii cognitive, boli şi tulburări neuromusculare, îmbunătăţirea funcţiei cognitive, tulburări şi boli osoase, caşexia legată de cancer, hipertermie malignă, diabet, moarte cardiacă subită, şi sindromul morţii subite a sugarului.

Astfel, într-o variantă de executare, prezenta invenţie se referă la un procedeu de tratare sau prevenire a unei stări selectate din grupul ce constă din tulburări şi boli cardiace, oboseală musculară, tulburări şi boli musculoscheletice, tulburări şi boli ale SNC, disfuncţii cognitive, boli şi tulburări neuromusculare, tulburări şi boli osoase, caşexie legată de cancer, hipertermie malignă, diabet, moarte cardiacă subită, şi sindromul morţii subite a sugarului, sau pentru îmbunătăţirea funcţiei cognitive, procedeul respectiv cuprinzând etapa de administrare unui subiect care are nevoie de aceasta a unei cantităţi eficiente terapeutic de un compus cu Formula (I) sau (IA) aşa cum este descris aici, sau o sare a acestuia, pentru a efectua un astfel de tratament. Un compus preferat în prezent este un compus cu Formula (1).

În altă variantă de executare, prezenta invenţie se referă la utilizarea unei cantităţi eficiente de compus cu Formula (I) sau (IA), aşa cum este descris aici, sau o sare a acestuia, pentru fabricarea unui medicament pentru tratarea sau prevenirea unei stări selectate din grupul ce constă din tulburări şi boli cardiace, oboseală musculară, tulburări şi boli musculoscheletice, tulburări şi boli ale SNC, boli şi tulburări neuromusculare, disfuncţii cognitive, tulburări şi boli osoase, caşexie legată de cancer, hipertermie malignă, diabet, moarte cardiacă subită, şi sindromul morţii subite a sugarului, sau pentru îmbunătăţirea funcţiei cognitive. Un compus preferat în prezent este un compus cu Formula (1).

În altă variantă de executare, prezenta invenţie se referă la un compus cu Formula (I) sau (IA), aşa cum este descris aici, sau o sare a acestuia, pentru utilizarea în fabricarea unui medicament pentru tratarea sau prevenirea unei stări selectate din grupul ce constă din tulburări şi boli cardiace, oboseală musculară, tulburări şi boli musculoscheletice, tulburări şi boli ale SNC, disfuncţii cognitive, boli şi tulburări neuromusculare, tulburări şi boli osoase, caşexie legată de cancer, hipertermie malignă, diabet, moarte cardiacă subită, şi sindromul morţii subite a sugarului, sau pentru îmbunătăţirea funcţiei cognitive. Un compus preferat în prezent este un compus cu Formula (1).

Într-o variantă de executare, starea, tulburarea sau boala este asociată cu o funcţie anormală a RyR1. În altă variantă de executare, starea, tulburarea sau boala este asociată cu o funcţie anormală a RyR2. În altă variantă de executare, starea, tulburarea sau boala este asociată cu o funcţie anormală a RyR3. Fiecare posibilitate reprezintă o variantă de executare separată a prezentei invenţii.

Tulburări şi boli cardiace includ, dar nu se limitează la, tulburări şi boli ale bătăilor neregulate ale inimii, tulburări şi boli ale bătăilor neregulate ale inimii induse prin efort fizic, insuficienţă cardiacă, insuficienţă cardiacă congestivă, insuficienţă cardiacă cronică, insuficienţă cardiacă acută, insuficienţă cardiacă sistolică, insuficienţă cardiacă diastolică, insuficienţă cardiacă acută decompensată, leziune de ischemie/reperfuzie (I/R) cardiacă (inclusiv leziune I/R ca urmare a angioplastiei coronariene sau ca urmare a trombolizei în timpul infarctului miocardic (IM)), boala pulmonară obstructivă cronică, precum şi hipertensiunea arterială. Tulburări şi boli ale bătăilor neregulate ale inimii includ, dar nu se limitează la aritmia atrială şi ventriculară, fibrilaţia atrială şi ventriculară, tahiaritmia atrială şi ventriculară, tahicardia atrială şi ventriculară, tahicardia ventriculară polimorfă catecolaminergică (TVPC), şi variantele acestora induse prin efort fizic.

Compuşii invenţiei sunt, de asemenea, utili în tratarea oboselii musculare, care se poate datora efortului fizic prelungit sau efortului fizic de mare intensitate, sau poate fi cauzat de boli musculoscheletice. Exemple de tulburări şi boli musculare includ, dar nu se limitează la oboseala muşchilor scheletici, bolile miezului central, oboseala muşchilor scheletici indusă de efortul fizic, tulburările vezicii urinare, incontinenţă, oboseala musculară asociată cu vârsta, sarcopenie, miopatii congenitale, miopatii şi/sau atrofii ale muşchilor scheletici, caşexie legată de cancer, miopatie rod-core, miopatii mitocondriale [de ex., sindromul Kearns-Sayre, sindromul MELAS (miopatia mitocondrială, encefalopatia, acidoza lactică, şi accidentul vascular cerebral), şi sindromul MERRF (epilepsia mioclonică cu fibre roşii rugoase)], miopatii endocrine, boli cu stocare de glicogen muscular [de ex., boala Pompe, boala Andersen, şi bolile Cori], mioglobinurii [de ex., boala McArdle, boala Tarui, şi boala DiMauro], dermatomiozită, miozită osificantă, paralizie periodică familială, polimiozită, miozita cu corpi de incluziune, neuromiotonie, sindromul omului înţepenit, hipertermie malignă, crampe musculare comune, tetanie, myasthenia gravis, atrofia musculară spinală (AMS), atrofia musculară spinală şi bulbară (AMSB, cunoscută, de asemenea, sub denumirea de atrofie musculară spinobulbară, atrofie bulbo-spinală, neuropatie bulbospinală X-linkată (NBSX), atrofie musculară spinală X-linkată tip 1 (AMSX), şi boala Kennedy (KD)), şi distrofia musculară. Tulburări preferate ale muşchilor scheletici includ, dar nu se limitează la oboseala muşchilor scheletici indusă de efort fizic, miopatia congenitală, distrofia musculară, oboseala musculară legată de vârstă, sarcopenie, boala miezului central, caşexia legată de cancer, tulburările vezicii urinare, şi incontinenţa.

Exemple de distrofie musculară includ, dar nu se limitează la, distrofia musculară Duchenne (DMD), distrofia musculară Becker (DMB), distrofia musculară la nivelul membrelor-brâu (DMMB), distrofia musculară congenitală (DMC), distrofia musculară distală, distrofia facio-scapulo-humerală, distrofia musculară miotonică, distrofia musculară Emery-Dreifuss, şi distrofia musculară oculo-faringiană, DMD fiind preferată în prezent.

Distrofia musculară congenitală, aşa cum este utilizată în prezenta, se referă la distrofia musculară prezentă la naştere. DMC se clasifică conform mutaţiilor genetice: 1) gene care codifică proteinele structurale alemembranei bazale saumatricei extracelulare afibrelor musculaturii scheletice; 2) gene care codifică glicoziltransferazele presupuse sau demonstrate , care la rândul lor afectează http://en.wikipedia.org/wiki/Glycosylation" \\o "Glicozilare http://en.wikipedia.org/wiki/Dystroglycan" \\o "Distroglican, o proteină a membranei externe a membranei bazale; şi 3) altele. Exemple de DMC includ, dar nu se limitează la DMC cu deficit de laminina-α2 (MDC1A), Ullrich CMG (UCMDs 1, 2 şi 3), sindromul Walker-Warburg (SWW), boala muşchi-ochi-creier (MOB), DMC Fukuyama (DMCF), DMC plus deficit al laminei secundare 1 (MDC1B), DMC plus deficit al laminei secundare 2 (MDC1C), DMC cu şi http://en.wikipedia.org/wiki/Pachygyria" \\o "Pahigirie (MDC1D), şi coloană vertebrală rigidă cu distrofie musculară tip1 (RSMD1).

Disfuncţia cognitivă poate fi asociată cu sau include, dar nu se limitează la pierderea memoriei, pierderea memoriei dependente de vârstă, tulburarea de stres post-traumatic (TSPT), tulburarea de hiperactivitate şi deficit de atenţie (THDA), tulburarea din spectrul autismului (TSA), tulburarea de anxietate generalizată (TAG), tulburarea obsesiv-compulsivă (TOC), schizofrenia, tulburarea bipolară, sau depresia majoră.

Tulburările şi bolile SNC includ, dar nu se limitează la boala Alzheimer (BA), neuropatie, convulsii, boala Parkinson (BP), şi boala Huntington (BH).

Tulburările şi bolile neuromusculare includ, dar nu se limitează la ataxie spinocerebelară (ASC), şi scleroza laterală amiotrofică (SLA, boala Lou Gehrig).

În unele variante de executare, compuşii prezentei invenţii îmbunătăţesc funcţia cognitivă, care poate fi selectată din memoria de scurtă durată, memoria de lungă durată, atenţie, învăţare, precum şi orice combinaţie a acestora.

În unele variante de executare, compuşii prezentei invenţii sunt utili în tratamentul caşexiei legate de cancer, şi anume slăbiciunea musculară care este asociată cu cancerul în general, şi, de preferinţă, slăbiciunea musculară în cancerul metastatic, cum ar fi metastazele osoase. Slăbiciunea musculară şi atrofia musculară (caşexia) sunt simptome paraneoplastice obişnuite la bolnavii de cancer. Aceste stări cauzează oboseală semnificativă şi reduce dramatic calitatea vieţii pacienţilor. Prezenta invenţie propune un procedeu pentru tratarea şi prevenirea slăbiciunii musculare la un pacient ce suferă de cancer, bazat, în parte, pe descoperirea că, în anumite tipuri de cancer, de ex., cancer de prostată şi de sân cu metastaze osoase, RyR1 este oxidat, ceea ce îl determină să devină "neetanş". S-a constatat, de asemenea, că prevenirea scurgerii prin administrarea compuşilor Rycal îmbunătăţeşte funcţia musculară. Exemple de tipuri de cancer includ, dar nu se limitează la, cancerul de sân, cancerul de prostată, cancerul osos, cancerul pancreatic, cancerul pulmonar, cancerul de colon, şi cancerul gastrointestinal.

Terapia cu ignorarea exonului:

În unele variante de executare, compuşii prezentei invenţii modulează (de ex. sporesc) matisarea (splicing-ul) mARN-ului prin consolidarea ignorării exonului antisens mediat. Această modulare a matisării se realizează în prezenţa oligonucleotidelor antisens (OA) care sunt specifice pentru secvenţele de matisare ce prezintă interes. În unele variante de executare a invenţiei, compusul cu formula (I) sau (IA) şi OA pot acţiona sinergic, unde compusul cu formula (I) sau (IA) sporeşte ignorarea exonului mediat de OA. Astfel, în unele variante de executare, prezenta invenţie se referă la o compoziţie farmaceutică pentru utilizarea în tratamentul sau prevenirea oricărora dintre stările descrise în prezenta care sunt asociate cu RyR neetanş, care cuprinde în plus utilizarea unei OA antisens, care este specifică pentru o secvenţă de matisare într-o secvenţă mARN, pentru sporirea ignorării exonului în ARNm de interes.

O variantă de executare deosebită pentru sporirea ignorării exonului de compuşii prezentei invenţii se referă la distrofia musculară Duchenne (DMD). DMD este o boală recesivă letală X-linkată caracterizată prin slăbiciune musculară progresivă de-a lungul vieţii unui pacient. DMD este cauzată în primul rând de eliminările multi-exon în afara cadrului în gena DMD care îndepărtează producerea de proteine distrofin. Pierderea expresiei distrofinei de sine stătător nu explică fiziopatologia DMD. Perturbarea complexului distrofină-glicoproteină (CDG), de asemenea, duce la stresul oxidativ, supraîncărcarea cu Ca2+ mitocondrial şi apoptoză, influx crescut de Ca2+ în muşchi, şi semnalizarea Ca2+ patologic. Nu există terapii curative pentru DMD, şi unicul tratament farmacologic demonstrat este corticosteroizii, care pot prelungi capacitatea de deplasare, însă au efecte secundare semnificative. Ignorarea exonului mediat de oligonucleotide antisens reprezintă o abordare terapeutică promiţătoare care vizează restabilirea cadrului de citire DMD şi care permite expresia unui complex distrofină-glicoproteină intact. Până în prezent, concentraţii reduse de proteină distrofină au fost produse în oameni prin metoda dată. Kendall et al. (Sci Transl Med, 2012, 4(164), p. 164ra160) a relatat că anumite molecule mici, cum ar fi Dantrolen şi alţi modulatori RyR, potenţează ignorarea exonului ghidată de oligomeri antisens pentru a spori ignorarea exonului pentru restabilirea cadrului de citire ARNm, proteinei distrofină a sarcolemei, şi complexului distrofină-glicoproteină în muşchii scheletici ai şoarecilor mdx, un model de şoarece DMD.

Astfel, într-o variantă de executare, prezenta invenţie se referă la un procedeu de tratare a DMD, prin administrarea unui subiect, care are nevoie de aceasta, a unui compus cu formula (I) sau (IA) conform prezentei invenţii, în combinaţie cu o oligonucleotidă antisens (OA) care este specifică pentru o secvenţă de matisare a unuia sau mai mulţi exoni ai genei DMD, de exemplu exonul 23, 45, 44, 50, 51, 52 şi/sau 53 al genei DMD. OA preferate includ, dar nu se limitează la OA care au ca ţintă exonul DMD 23, 50 şi/sau 51 al genei DMD, cum ar fi OA 2'-O-metil (2' OMe) fosforotioat sau fosforodiamidat morfolino (PMO). Exemple de astfel de OA includ, dar nu se limitează la Pro051/GSK2402968, AVI4658/Eteplirsen, şi PMO E23 morfolino (5′-GGCCAAACCTCGGCTTACCTGAAAT-3′).

Termenul "cantitate eficientă", "cantitate suficientă" sau "cantitate eficientă terapeutic" de un agent, aşa cum este utilizat în prezenta în mod alternativ, este acea cantitate suficientă pentru efectuarea rezultatelor benefice sau dorite, inclusiv rezultatele clinice şi, ca atare, o "cantitate eficientă" sau variantele ei depind de contextul în care aceasta se aplică. Reacţia este profilactică în unele variante de executare, în altele terapeutică, iar în altele o combinaţie a acestora. Termenul "cantitate eficientă" include, de asemenea, cantitatea de un compus al invenţiei, care este "eficientă terapeutic" şi care evită sau atenuează substanţial efectele secundare nedorite.

Aşa cum se utilizează în prezenta şi precum este bine înţeles în domeniu, "tratament" este o abordare pentru obţinerea rezultatelor benefice sau dorite, inclusiv a rezultatelor clinice. Rezultatele clinice benefice sau dorite pot include, dar nu se limitează la atenuarea sau ameliorarea unuia sau mai multor simptome sau stări, diminuarea extinderii bolii, starea stabilizată (adică, neînrăutăţirea) a bolii, prevenirea răspândirii bolii, întârzierea sau încetinirea progresiei bolii, ameliorarea sau alinarea stării bolii şi remisiunea (fie parţială sau totală), detectabilă sau nedetectabilă. "Tratament" poate însemna, de asemenea, prelungirea supravieţuirii comparativ cu supravieţuirea aşteptată, dacă nu se primeşte tratament.

Compoziţii farmaceutice

Compuşii invenţiei sunt preparaţi sub formă de compoziţii farmaceutice pentru administrarea subiecţilor umani într-o formă compatibilă biologic adecvată pentru administrarea in vivo. Conform unui alt aspect, prezenta invenţie propune o compoziţie farmaceutică care cuprinde compuşi ai invenţiei în amestec cu un diluant şi/sau vehicul acceptabil farmaceutic. Vehiculul acceptabil farmaceutic este, de preferinţă, "acceptabil" în sensul că este compatibil cu celelalte ingrediente ale compoziţiei şi nu este dăunător pentru cel care îl primeşte.

Compusul poate fi administrat de unul singur, dar, de preferinţă, este administrat cu unul sau mai multe vehicule acceptabile farmaceutic. Vehiculul acceptabil farmaceutic utilizat în prezenta poate fi selectat din diverse materiale organice sau anorganice care sunt utilizate ca materiale pentru preparate farmaceutice şi care sunt introduse ca oricare sau mai multe dintre substanţele de umplere, diluanţi, lianţi, agenţi de dezintegrare, soluţii tampon, coloranţi, emulgatori, agenţi de îmbunătăţire a aromei, gelifianţi, agenţi de alunecare, conservanţi, agenţi de solubilizare, stabilizatori, agenţi de suspendare, îndulcitori, agenţi de tonicitate, agenţi de umectare, emulgatori, agenţi de dispersare, agenţi de umflare, agenţi de întârziere, lubrifianţi, absorbanţi, şi agenţi de creştere a vâscozităţii.

Compuşii prezentei invenţii sunt administraţi unui subiect uman sau animal prin proceduri cunoscute, inclusiv, fără limitare, prin administare orală, sublinguală, bucală, parenterală (intravenoasă, intramusculară sau subcutanată), transdermică, per- sau transcutanată, intranazală, intravaginală, rectală, oculară, şi respiratorie (prin inhalare). Compuşii invenţiei pot fi administraţi, de asemenea, unui subiect prin livrarea către muşchii subiectului, inclusiv, dar nu limitat la, muşchii cardiaci sau scheletici ai subiectului. Într-o variantă de executare, compusul se administrează subiectului prin livrarea orientată către celulele musculare cardiace printr-un cateter introdus în inima subiectului. În alte variante de executare, compuşii pot fi administraţi direct în SNC, de exemplu prin injectarea intralombară sau infuzia intreventriculară a compuşilor direct în lichidul cerebrospinal (LCS), sau prin administrare intraventriculară, intratecală sau interstiţială. Administrarea orală este preferată în prezent.

Compoziţiile farmaceutice conform invenţiei pentru administrare orală solidă includ în special comprimate sau drajeuri, comprimate sublinguale, pliculeţe, capsule inclusiv capsule gelatinoase, pulberi, şi granule, şi cele pentru administrarea orală lichidă, nazală, bucală sau oculară includ în special emulsii, soluţii, suspensii, picături, siropuri şi aerosoli. Compuşii pot fi administraţi, de asemenea, sub formă de suspensie sau soluţie prin apa de băut sau cu hrană. Exemple de purtători farmaceutici acceptabili includ, dar nu se limitează la, derivaţi ai celulozei inclusiv carboximetilceluloză, metilceluloză, hidroxipropilceluloză, hidroxipropilmetilceluloză, etilceluloză şi celuloză microcristalină; zaharuri cum ar fi manitol, zaharoză, sau lactoză; glicerină, gumă arabică, stearat de magneziu, stearil fumarat de sodiu, soluţie salină, alginat de sodiu, amidon, talc şi apă, printre altele.

Compoziţiile farmaceutice conform invenţiei pentru injecţii parenterale includ în special soluţii sterile, care pot fi apoase sau neapoase, dispersii, suspensii sau emulsii şi, de asemenea, pulberi sterili pentru reconstituirea soluţiilor sau dispersiilor injectabile. Compuşii invenţiei pot fi combinaţi cu o soluţie apoasă sterilă, care este izotonică cu sângele subiectului. Un astfel de preparat se prepară prin dizolvarea unui ingredient activ solid în apă care conţine substanţe fiziologic compatibile, cum ar fi clorura de sodiu, glicina şi altele, şi având un pH tamponat compatibil cu condiţiile fiziologice, astfel încât să producă o soluţie apoasă, apoi să facă sterilă soluţia respectivă. Preparatul este prezentat în recipiente unitare sau cu doze multiple, cum ar fi fiole sau flacoane sigilate. Preparatul este livrat prin orice mod de injectare, inclusiv, fără limitare, epifascial, intracapsular, intracranian, intracutanat, intratecal, intramuscular, intraorbital, intraperitoneal, intraspinal, intrasternal, intravascular, intravenos, parenchimatos, subcutanat, sau sublingual sau prin intermediul cateterului în inima subiectului.

Compoziţiile farmaceutice pentru administrare rectală sau vaginală sunt, de preferinţă, supozitoare, şi cele pentru administrarea per- sau transcutanată includ, în special, pulberi, aerosoli, creme, unguente, geluri şi plasturi.

Pentru administrarea transdermică, compuşii invenţiei sunt combinaţi cu potenţiatori de penetrare a pielii, cum ar fi propilenglicol, polietilenglicol, izopropanol, etanol, acid oleic, N-metilpirolidonă şi altele, care sporesc permeabilitatea pielii pentru compuşii invenţiei şi permit compuşilor să penetreze prin piele şi în fluxul sanguin. Compoziţiile din compus/potenţiator pot fi, de asemenea, combinate cu o substanţă polimerică, cum ar fi etilceluloza, hidroxipropilceluloza, etilenă/vinilacetat, polivinilpirolidonă, şi alte substanţe similare, pentru a furniza compoziţia sub formă de gel, care este dizolvat într-un solvent, evaporat până la vâscozitatea dorită şi apoi aplicat pe un material suport pentru a furniza un plasture.

Preparatele farmaceutice ale prezentei invenţii sunt preparate prin metode bine cunoscute în domeniul farmaceutic, inclusiv, dar fără a se limita la metode de granulare umedă şi uscată, sau prin comprimare directă. Selectarea vehiculului se determină prin solubilitatea şi natura chimică a compuşilor, calea de administrare selectată şi practica farmaceutică standard.

Compoziţiile farmaceutice sus-menţionate ilustrează invenţia, dar nu o limitează în nici un fel.

În conformitate cu procedeele prezentei invenţii, oricare dintre aceşti compuşi pot fi administraţi subiectului (sau sunt puşi în contact cu celulele subiectului) într-o cantitate eficientă pentru a limita sau preveni o scădere a nivelului de calstabin RyR-legat în subiect, în special în celulele subiectului. Această cantitate este determinată cu uşurinţă de un specialist în domeniu, pe baza procedurilor cunoscute, inclusiv analiza curbelor de titrare stabilite in vivo şi procedeele şi testele descrise în prezenta. O cantitate adecvată de compuşi ai invenţiei eficientă pentru a limita sau preveni o scădere a nivelului de calstabin RyR-legată în subiect variază de la circa 0,01 mg/kg/zi până la circa 100 mg/kg/zi (de ex., 1, 2 , 5, 10, 20, 25, 50 sau 100 mg/kg/zi), şi/sau este o cantitate suficientă pentru a atinge concentraţiile plasmatice variind de la circa 300 ng/ml până la circa 5000 ng/ml. Alternativ, cantitatea de compuşi din invenţie variază de la circa 1 mg/kg/zi până la circa 50 mg/kg/zi. Alternativ, cantitatea de compuşi din invenţie variază de la circa 10 mg/kg/zi până la circa 20 mg/kg/zi. De asemenea, sunt incluse cantităţi de la circa 0,01 mg/kg/zi sau 0,05 mg/kg/zi până la circa 5 mg/kg/zi sau circa 10 mg/kg/zi care pot fi administrate.

Procedee de sinteză

Prezenta invenţie propune, într-un alt aspect, procedee pentru prepararea unui compus al invenţiei, şi a sărurilor acestuia. Mai concret, prezenta invenţie propune procedee de preparare a compuşilor cu Formula (I) sau (IA), de ex. compusul 1, compusul 2, compusul 3, compusul 4, compusul 5, compusul 6, compusul 7, compusul 8, compusul 9, compusul 10, compusul 11, şi compusul 12, sau sărurilor acestora. În exemple se descriu diverse căi de sinteză a compuşilor. Calea generală de sinteză este prezentată în Schema 1 de mai jos:

Schema 1

În Schema 1, Ra este COOR1 sau CN; R1 este un alchil C1-C4, şi L este o grupare înlocuibilă, care este, cu titlu de exemplificare, un halogen, un sulfonat (OSO2R' unde R' este alchil sau aril, de ex., OMs (mesilat), OTs (tosilat)), şi altele. Materialul iniţial de amină se supune reacţiei cu agentul de alchilare (derivatul de benzil prezentat anterior), de preferinţă, în prezenţa unei baze, pentru a se obţine produsul dorit sau un precursor al acestuia (R=Ra). Dacă se doreşte, un astfel de precursor poate fi supus ulterior reacţiei pentru a transforma gruparea Ra în gruparea R aşa cum este exemplificat în secţiunea experimentală de mai jos, sau prin orice altă metodă cunoscută de către un specialist în domeniu. De exemplu, un precursor al esterului (Ra =COOR1 unde R1 este un alchil C1-C4), poate fi transformat în acidul carboxilic corespunzător (R = COOH) prin hidroliză în condiţii acide sau bazice, în conformitate cu metodele cunoscute. Alternativ, un precursor al nitrilului (Ra = CN) poate fi transformat într-un tetrazol (un izoster al acidului carboxilic) prin reacţia cu azidă de sodiu în condiţii adecvate, sau într-un acid carboxilic (R = COOH) prin hidroliză.

Materialul iniţial de amină poate fi preparat în conformitate cu metodele descrise în WO 2009/111463 [10] sau WO 2007/024717, sau prin orice altă metodă cunoscută unui specialist în domeniu. Conţinutul tuturor referinţelor sus-menţionate sunt incluse prin referinţă în prezenta. Natura bazei nu este extrem de limitativă. Baze preferate includ, dar nu se limitează la hidruri (de ex., hidrură de sodiu sau de potasiu) şi N,N-diizopropiletilamină. Alte baze adecvate includ, dar nu se limitează la o bază organică cum ar fi o amină terţiară, selectată din grupul ce constă din amine aciclice (de ex., trimetilamină, trietilamină, dimetilfenilamină diizopropiletilamină şi tributilamină), amine ciclice (de ex., N-metilmorfolină) şi amine aromatice (dimetilanilină, dimetilaminopiridină şi piridină).

Reacţia poate fi condusă în prezenţa sau absenţa unui solvent. Natura solventului, atunci când este folosit, nu este extrem de limitativă, cu exemple ce includ solvenţi cum ar fi un ester (de ex., acetat de etil), un eter (de ex., THF), un solvent clorurat (de ex., diclormetan sau cloroform), dimetilformamidă (DMF ), şi alţi solvenţi, cum ar fi acetonitril sau toluen sau amestecuri ale acestor solvenţi unul cu altul sau cu apă.

Sărurile compuşilor cu formula (I) în care R=COOH pot fi preparate prin reacţia moleculei iniţiale cu o bază adecvată, de ex., NaOH sau KOH pentru a se obţine sărurile de metale alcaline corespunzătoare, de ex., sărurile de sodiu sau de potasiu. Alternativ, esterii (R = COOR1) pot fi transformaţi direct în săruri prin reacţii cu baze adecvate.

Sărurile compuşilor cu formula (I) pot fi, de asemenea, preparate prin punerea în reacţie a moleculei iniţiale cu un acid adecvat, de ex., HCl, acid fumaric, sau acid para-toluensulfonic pentru a se obţine sărurile corespunzătoare, de ex., hidroclorură, tosilat sau semi-fumarat.

EXEMPLE

Următoarele exemple sunt prezentate în calitate de ilustrare a unor variante de executare preferenţiale conform invenţiei.

EXEMPLUL 1: Sinteză

Instrumente:

RMN: Bruker AVANCE III 400 sau Varian Mercury 300

LC/MS: Waters Delta 600 dotat cu Dispozitiv de prelevare automată a probelor 717Plus, Detector cu sistem de fotodiode 2996, şi Detector de masă 3100, sau Shimadzu 210

Procedura generală pentru alchilarea 7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidrobenzo[f][1,4]tiazepinei (“Amină”).

Amină

Amina (structura prezentată mai sus) (1 mmol) a fost dizolvată în 3 ml de diclorometan. La soluţie s-a adăugat reactivul de alchilare (1 mmol), urmat de N,N-diizopropiletilamină (0,34 ml, 2 mmol). Amestecul a fost agitat la temperatura camerei timp de o noapte. Soluţia a fost încărcată pe coloană direct şi eluată cu hexan/EtOAc (2:1, v/v).

Compusul 2

Metil 3-((7-metoxi-2,3-dihidrobenzo[f][1,4]tiazepin-4(5H)-il)metil)benzoat: RMN 1H (300 MHz, CDCl3): 7,96 (m, 2H), 7,46 (m, 3H), 6,70 (dd, J =8,4 Hz, 3,0 Hz, 1H), 6,50 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 4,09 (s, 2H), 3,90 (s, 3H), 3,72 (s, 3H), 3,57 (s, 2H), 3,35 (m, 2H), 2,72 (m, 2H). MS: 344(M+1)

Compusul 3

Metil 4-((7-metoxi-2,3-dihidrobenzo[f][1,4]tiazepin-4(5H)-il)metil)benzoat: RMN1H (300 MHz, CDCl3): 7,99 (d, J= 8,4 Hz, 2H), 7,46 (d, J= 8,4 Hz, 1H), 7,37 (d, J= 8,7 Hz, 2H), 6,70 (dd, J =8,4 Hz, 3,0 Hz, 1H), 6,50 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 4,09 (s, 2H), 3,90 (s, 3H), 3,72 (s, 3H), 3,57 (s, 2H), 3,35 (m, 2H), 2,72 (m, 2H). MS: 344(M+1)

Compusul 5

Metil 2-((7-metoxi-2,3-dihidrobenzo[f][1,4]tiazepin-4(5H)-il)metil)benzoat: Compusul a fost transformat în sare de hidroclorură cu HCl 2M în eter. RMN1H (300 MHz, DMSO-d6): 10,33(br, 1H), 8,08 (d, J= 7,5Hz, 1H), 7,80-7,65 (m, 3H), 7,51 (d, J=8,1Hz, 1H), 7,14 (s, 1H), 6,99 (dd, J= 8,4, 2,1Hz, 1H), 4,90-4,40 (m, br, 4H), 3,88 (s, 3H), 3,78 (s, 3H), 3,40 (m, 2H), 3,26 (m, 1H), 3,11 (m, 1H). MS: 344 (M+1)

Compusul 7

2-((7-Metoxi-2,3-dihidrobenzo[f][1,4]tiazepin-4(5H)-il)metil)benzonitril: RMN1H (300 MHz, CDCl3): 7,67-7,26 (m, 5H), 6,73 (d, J= 2,7 Hz, 1H), 6,74 (dd, J= 2,7,8,4 Hz, 1H), 4,14 (s, 2H), 3,78(s, 3H), 3,70 (s, 2H), 3,36 (m, 2H), 2,76 (m, 2H). MS : 311 (M+1)

Compusul 8

3-((7-Metoxi-2,3-dihidrobenzo[f][1,4]tiazepin-4(5H)-il)metil)benzonitril: RMN1H (300 MHz, CDCl3): 7,64-7,42 (m, 5H), 6,74 (dd, J= 2,7,8,4 Hz, 1H), 6,48 (d, J= 2,7 Hz, 1H), 4,08 (s, 2H), 3,75(s, 3H), 3,57 (s, 2H), 3,36 (m, 2H), 2,76 (m, 2H). MS : 311 (M+1)

Compusul 9

4-((7-Metoxi-2,3-dihidrobenzo[f][1,4]tiazepin-4(5H)-il)metil)benzonitril: RMN1H (300 MHz, CDCl3): 7,64 (d, J= 7,2Hz, 2H), 7,42 (m, 3H), 6,74 (dd, J= 2,7,8,4 Hz, 1H), 6,48 (d, J= 2,7 Hz, 1H), 4,08 (s, 2H), 3,75(s, 3H), 3,58 (s, 2H), 3,36 (m, 2H), 2,76 (m, 2H). MS: 311 (M+1)

Hidroliza esterului (procedură generală)

S-a dizolvat ester metilic (3 mmol) în 30 ml de THF/metanol/NaOH 1 M (1:1:1, v/v). Amestecul a fost agitat timp de 8 ore şi TLC (cromatografia în strat subţire) a arătat dispariţia completă a esterului. S-a adăugat 1 ml HClconc. pentru a ajusta până la pH acid. Solventul organic a fost înlăturat şi solidul format a fost colectat prin filtrare. Solidul a fost uscat cu aer.

Compusul 4

3-((7-Metoxi-2,3-dihidrobenzo[f][1,4]tiazepin-4(5H)-il)metil)acid benzoic: Acesta s-a obţinut prin extragerea cu EtOAc în calitate de solvent. RMN1H (300 MHz, CDCl3): 8,10 (s, 1H), 8,04 (d, J= 8,4 Hz, 1H), 7,80 (br, 1H), 7,46 (m, 2H), 6,80 (m, 2H), 4,40 (s, 2H), 3,90 (s, 2H), 3,76 (s, 3H), 3,42 (s, 2H), 2,86 (s, 2H). MS: 330 (M+1), 328 (M-1).

Compusul 1

4-((7-Metoxi-2,3-dihidrobenzo[f][1,4]tiazepin-4(5H)-il)metil)acid benzoic: Acesta s-a obţinut prin extragerea cu EtOAc în calitate de solvent. RMN1H (300 MHz, CDCl3): 8,02 (d, J= 8,4 Hz, 2H), 7,46 (d, J= 8,4 Hz, 1H), 7,42 (d, J= 8,7 Hz, 2H), 6,70 (dd, J =8,4 Hz, 3,0 Hz, 1H), 6,50 (d, J = 3,0 Hz, 1H), 4,11 (s, 2H), 3,72 (s, 3H), 3,62 (s, 2H), 3,35 (m, 2H), 2,76 (m, 2H). MS: 330 (M+1), 328 (M-1).

Compusul 1, sare de sodiu:

Sarea de sodiu a compusului 1 a fost preparată din molecula iniţială utilizând 1 echivalent de NaOH în EtOH (p.t. a sării: > 290°C).

RMN1H (DMSO-D6, 600MHz), δ (ppm): 7,77 (2H, m), 7,41 (1H, d), 7,13 (2H, m), 6,75 (1H, dd), 6,63 (1H, d), 4,00 (2H, s), 3,70 (3H, s), 3,49 (2H, s), 3,18 (2H, m), 2,70 (2H, m).

Compusul 1, sarea de hemifumarat:

S-au introdus 1,6 g de compus 1 (formă neutră) şi 265 mg de acid fumaric într-un balon cu fund rotund. După adăugarea a 18 ml de acetonă şi 2 ml de apă, amestecul de reacţie a fost încălzit la reflux. S-a observat o solubilizare parţială (dar nu o limpezire completă) urmată de precipitare. Amestecul de reacţie a fost apoi încălzit la reflux timp de noapte. După răcire, solidul rezidual a fost izolat prin filtrare, spălat cu 3 ml de acetonă şi uscat sub vid (40°C / 10 mbari) timp de 4 ore.

RMN1H (DMSO-D6, 600MHz), δ (ppm): 12,97 (2H, bs), 7,90 (2H, m), 7,43 (1H, d), 7,40 (2H, m), 6,77 (1H, dd), 6,64 (1H, d), 6,62 (1H, s), 4,03 (2H, s), 3,70(3H, s), 3,58 (2H, s), 3,20 (2H, m), 2,72 (2H, m).

Compusul 6

2-((7-Metoxi-2,3-dihidrobenzo[f][1,4]tiazepin-4(5H)-il)metil)acid benzoic: Compusul a fost transformat în sare de hidroclorură cu HCl 2M în eter. RMN1H (300 MHz, DMSO-d6): 10,10(br, 1H), 8,08 (d, J= 7,5Hz, 1H), 7,66-7,51 (m, 4H), 7,17 (d, J= 2,1Hz, 1H), 6,99 (dd, J= 8,4, 2,1Hz, 1H), 4,80-4,40 (m, br, 4H), 3,78 (s, 3H), 3,46 (m, 2H), 3,13 (m, 2H). MS: 330(M+1), 328 (M-1).

Sinteza tetrazolului (procedură generală)

S-a agitat precursorul nitrilului (3,22 mmol), azida de sodiu (830 mg, 12,9 mmol) şi hidroclorura de trietilamină (1,72 g, 12,9 mmol) în 40 ml DMF anhidru la 100°C timp de 5 zile. DMF a fost înlăturat sub vid înalt şi reziduul a fost amestecat cu apă. Soluţia apoasă a fost extrasă cu diclormetan (3 x 100 ml). Compusul pur a fost purificat prin cromatografie pe coloană (EtOAc/metanol).

Compusul 10

4-(2-(1H-Tetrazol-5-il)benzil)-7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidrobenzo[f][1,4]tiazepină: RMN1H (300 MHz, CDCl3 şi o picătură de CD3OD): 8,30 (d, J= 8,7Hz, 1H), 7,53 (m, 2H). 7,14 (t, J= 7,8Hz, 1H), 7,20 (d, J= 7,5Hz,1H), 6,84 (dd, J= 2,7,8,4 Hz, 1H), 6,69 (d, J= 2,7 Hz, 1H), 4,46 (s, 2H), 3,80(s, 2H), 3,75 (s, 2H), 3,43 (m, 2H), 2,96 (m, 2H). MS: 354(M+1), 352(M-1)

Compusul 11

4-(3-(1H-Tetrazol-5-il)benzil)-7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidrobenzo[f][1,4]tiazepină: RMN1H (300 MHz, CDCl3): 8,16 (s, 1H), 7,90 (d, J=7,5Hz, 1H), 7,40 (d, J= 8,4Hz, 1H),7,20 (m, 2H), 6,74 (dd, J= 2,7,8,4 Hz, 1H), 6,58 (d, J= 2,7 Hz, 1H), 4,18 (s, 2H), 3,75(s, 5H), 3,36 (m, 2H), 2,76 (m, 2H). MS: 354(M+1), 352(M-1)

Compusul 12

4-(4-(1H-Tetrazol-5-il)benzil)-7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidrobenzo[f][1,4]tiazepină: RMN1H (300 MHz, CDCl3 şi o picătură de CD3OD): 7,99 (d, J= 7,2Hz, 2H), 7,42 (m, 3H), 6,74 (dd, J= 2,7,8,4 Hz, 1H), 6,53 (d, J= 2,7 Hz, 1H), 4,10 (s, 2H), 3,71(s, 3H), 3,58 (s, 2H), 3,36 (m, 2H), 2,76 (m, 2H). MS: 354(M+1), 352(M-1)

Sinteza 7-metoxi-2,3,4,5-tetrahidrobenzo[f][1,4]tiazepină (“Amină”).

2-(4-Metoxifeniltio)etanamină (1)

S-au amestecat 4-metoxitiofenol (50 g, 0,357 mol), monoclorhidrat de 2-cloroetilamină (39,8 g, 0,343 mol.), K2CO3 (78,8 g, 0,57 mol) şi diizopropiletilamină (32 ml, 0,178 mol) în 200 ml de THF. Amestecul a fost degazat timp de 5 min. sub presiune redusă şi încălzit la reflux sub argon timp de o noapte. Solventul a fost înlăturat şi s-a adăugat apă (300 ml) în balon. Amestecul a fost extras cu diclormetan (3 x 200 ml). Substanţele organice au fost colectate, diclormetanul a fost înlăturat şi s-a adăugat 50 ml de HCl conc., urmat de 200 ml de apă. Soluţia a fost extrasă cu 1: 1 EtOAc/hexan (3 x 200 ml). Stratul apos a fost ajustat până la pH 10 cu NaOH 2 M şi a fost extras cu diclormetan (3 x 200 ml). Soluţia organică combinată a fost uscată pe sulfat de sodiu anhidru. În urma înlăturării solventului s-au obţinut 61 g de compus ţintă sub formă de lichid incolor, cu un randament de 97%.

RMN-1H (300 MHz, CDCl3): 7,35(d, J = 8,7 Hz, 2H), 6,81 (d, J= 8,7 Hz, 2H), 3,77 (s, 3H), 2,88-2,80 (m, 4H), 1,44 (s, 2H).

2-(4-metoxifeniltio)etilcarbamat de benzil (2)

Procedeul întâi

Într-un balon care conţine compusul 1 (8,0 g, 43,7 mmol), bicarbonat de sodiu (12,1 g, 144 mmol), apă (100 ml) şi diclormetan (200 ml) s-a adăugat cloroformiat de benzil (8,2 g, 48,1 mmol, diluat în 100 ml de diclormetan) prin picurare la 0°C. După adăugare, amestecul a fost agitat la t.c. timp de 5 ore. Stratul organic a fost colectat şi soluţia apoasă a fost extrasă cu 100 ml de diclormetan. Soluţia organică combinată a fost uscată pe sulfat de sodiu. Solventul a fost înlăturat şi solidul rezultat a fost triturat cu 200 ml de THF/hexan (1:10). Solidul a fost colectat şi uscat lăsând produsul ţintă (12,9 g) cu un randament de 93%.

Procedeu alternativ

La soluţia de compus 1 (10 g, 54,6 mmol) şi trietilamină (15 ml, 106 mmol) în 200 ml de diclormetan s-a adăugat cloroformiat de benzil (7,24 mL, 51,5 mmol, diluat în 100 ml de diclormetan) prin picurare la 0°C. După adăugare, soluţia a fost agitat la t.c. timp de o oră. Solidul a fost înlăturat prin filtrare. Soluţia a fost extrasă cu 100 ml de HCl 0,1 M şi 100 ml de carbonat de sodiu sat., şi s-a uscat pe sulfat de sodiu anhidru. După înlăturarea solventului s-a obţinut un solid de culoare albă, care a fost agitat în 200 ml de THF/hexan (1:20) timp de trei ore. Solidul a fost colectat prin filtrare pentru a oferi 14,2 g de compus-ţintă cu un randament de 87%.

RMN-1H (300 MHz, CDCl3): 7,35(m, 7H), 6,83 (d, J= 8,7 Hz, 2H), 5,07 (m, 3H), 3,77 (s, 3H), 3,10 (q, J = 6,3 Hz, 2H), 2,92 (t, J= 6.3 Hz, 2H).

7-Metoxi-2,3-dihidrobenzo[f][1,4]tiazepină-4(5H)-carboxilat de benzil (3)

Un amestec de compus 2 (7,3 g, 23 mmol), paraformaldehidă (6,9 g 0,23 mol) şi acid p-toluensulfonic (1,45 g, 7,6 mmol) în 250 ml de toluen a fost agitat la 70°C timp de o noapte. După răcire la t.c., solidul a fost filtrat. Soluţia a fost extrasă cu carbonat de sodiu sat. (100 ml), iar stratul organic a fost uscat pe sulfat de sodiu anhidru. Produsul ţintă (7,4 g) a fost obţinut sub formă de lichid după înlăturarea solventului cu un randament de 97%.

RMN-1H (300 MHz, CDCl3): 7,44 (d, J= 8,1 Hz, 0,77H), 7,32 (m, 5,60H), 7,07 (d, J= 2,7 Hz, 0,33H), 6,68 (m, 1,30H), 5,04 (s, 2H), 4,59 (ss, 2H), 3,96 (br, 1,80), 3,80 (ss, 1,23 H), 3,55 (s, 1,97H), 2,76 (m, 2H).

7-Metoxi-2,3,4,5-tetrahidrobenzo[f][1,4]tiazepină hidrobromură (Amină) (4 sare de HBr)

Procedeul întâi

S-a adăugat o soluţie de HBr (33% în acid acetic, 10 ml) la compusul 3 (4,2 g, 12,8 mmol). După adăugare, dioxidul de carbon a început să se dezvolte şi s-a format un solid de culoare albă. Amestecul s-a lăsat sa stea la t.c. timp de încă 2 ore. S-a adăugat eter dietilic (150 ml) la amestec, şi s-a agitat timp de 30 min. Solidul a fost colectat prin filtrare şi spălat cu eter dietilic. Solidul a fost uscat sub vid pentru a oferi 3,40 g de compus ţintă cu randament de 91,8%.

RMN-1H (300 MHz, DMSO-d6): 9,02 (br, 2H), 7,52 (d, J= 8,1 Hz, 1H), 7,27 (d, J= 3,3 Hz, 1H), 6,92 (dd, J= 8,4, 2,7 Hz, 1H), 4,41 (s, 2H), 3,77 (s, 3H), 3,53 (m, 2H), 2,96 (m, 2H).

Metoda alternativă (bază liberă 4a)

Compusul 3 (10 g, 30 mmol) a fost amestecat cu 50 ml de HCl conc., 50 ml de apă şi 30 ml de dioxan. Amestecul a fost agitat la 100°C timp de o noapte. După răcire până la temperatura camerei, majoritatea solventului şi HCl a fost eliminat sub presiune redusă. S-a adăugat apă (100 ml) la soluţie şi solidul a fost filtrat. Soluţia apoasă a fost extrasă cu EtOAc/hexan (1:1, 3 x100 ml) şi a fost bazificată prin adăugarea a 15 g de NaOH. Amestecul a fost extras cu diclormetan (3 x 150 ml). Soluţia combinată a fost uscată pe sulfat de sodiu anhidru. În urma înlăturării solventului s-a obţinut un lichid care s-a solidificat după ce s-a aflat la t.c. oferind 6,2 g de compus ţintă.

RMN-1H (300 MHz, CDCl3): 7,42 (d, J= 8,1 Hz, 1H), 6,78 (d, J= 2,7 Hz, H), 6,68 (dd, J= 2,7, 8,1 Hz, 1H), 4,08 (s, 2H), 3,96 (br, 1,80), 3,76 (s, 3 H), 3,38 (m, 2H), 2,68 (m, 2H).

EXEMPLUL 2: Legarea calstabin2 de RyR2 fosforilat de PKA

Membranele RS cardiace au fost preparate aşa cum s-a descris anterior (Marx et al., 2000; Kaftan et al., Circ. Res., 1996, 78:990-97). Immunoblotting-ul microzomilor (50 µg) a fost realizat aşa cum s-a descris, cu anticorp anti-calstabin (1:1000) (Jayaraman et al., J. Biol. Chem., 1992, 267:9474-77) timp de o oră la temperatura camerei (Reiken et al., Circulation, 107:2459-66, 2003). După incubare cu IgG anti-iepure HRP-marcată (diluţie 1:5000; Transduction Laboratories, Lexington, KY.), analizele blot au fost elaborate cu ajutorul ECL (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ.) şi detectate pe peliculă de raze X, sau expuse anticorpilor secundari marcaţi cu colorant infraroşu şi vizualizate pe echipamente de la Li-Cor Biosciences (modelul Odyssey). Dacă nu se specifică altfel, compuşii au fost testaţi la o concentraţie de 100 nM. Mai jos este prezentat un test de legare a unei proteine calstabin2 reprezentative.

A. Fosforilarea PKA a reticulului sarcoplasmic cardiac (RSC)

Amestecul de reacţie a fost creat într-un microtub de 1,5 ml. 200µg de RS cardiac au fost adăugate la un amestec de reacţie de soluţie tampon de kinază, PKA şi ATP până la un volum final de 100 µl (Amestecul de reacţie de mai jos). S-a adăugat ATP la sfârşit pentru a iniţia reacţia.

Amestecul de reacţie:

20µl = Probă (RS cardiac, 2 sau 10 µg/µl)

10µl = 10x soluţie tampon de kinază (80 mM MgCl2, 100 mM EGTA, 500 mM Tris/PIPES), pH=7,0

20µl = PKA (2unităţi/ul) (Sigma # P2645)

10µl = 10x ATP (1.0 mM) (Sigma A 9187)

40µl = H2O distilat

1. Tuburile au fost incubate la 30°C timp de 30 de minute.

2. Amestecul de reacţie a fost apoi transferat în tuburi din sticlă cu pereţii groşi de 0,5 ml.

3. Tuburile din sticlă cu amestecul de reacţie au fost centrifugate timp de 10 minute la 50,000xg în Centrifugă Sorvall RCM120EX utilizând rotor S120AT3. Centrifugarea la 50,000 x g timp de 10 min este suficientă pentru izolarea microzomilor.

4. Peletul rezultat a fost spălat de 4 ori cu soluţie tampon de legare (10mM Imidazol 300mM zaharoză, pH =7.4). De fiecare dată s-a adăugat 100µl de 1x soluţie tampon de legare în tub pentru a spăla peletul. Peletul a fost resuspendat prin spălare în sus şi în jos utilizând vârful pipetei. După ultima rotire 50µl de soluţie tampon de legare s-au adăugat şi peleţii din toate tuburile au fost uniţi. Reacţia a fost menţinută la -20°C.

5. Fosforilarea a fost confirmată prin separarea a circa 10 µg de RSC prin electroforeză în gel de poliacrilamid (PAGE) de 6% şi analiza imunoblotelor atât pentru RyR total (5029 Ab, diluţie 1:3000 sau Monoclonal Ab de la Affinity Bioreagents, Cat # MA3-916, diluţie 1:2000) şi RyR2 fosforilat de PKA (P2809 Ab, diluţie 1:10000).

6. Părţile alicote pot fi păstrate la -80°C.

B. Test de relegare a proteinei calstabin

1. RSC fosforilat de PKA (circa 20µg) a fost incubat cu 250nM Calstabin 2 în 100µl de soluţie tampon de legare (aşa cum s-a descris mai sus) cu sau fără compuşi.

2. Reacţia a fost iniţiată într-un tub din sticlă cu pereţii gros (Hitachi Centrifuge ware, Catalog # B4105).

3. S-a adăugat Calstabin2 ca ultim reactiv în amestecul de reacţie. Reacţia a fost realizată la temperatura camerei timp de 30 minute.

4. După reacţie, tuburile au fost centrifugate timp de 10 min la 100.000 g. (Sorvall RCM120EX centrifuge with S120AT3 rotor).

5. Peletul rezultat a fost spălat de 4 ori în 1x soluţie tampon de legare la 4 °C. După fiecare spălare tuburile au fost centrifugate la 50.000 g timp de 10 minute la 4 °C.

6. După spălarea finală, supernatantul a fost înlăturat.

7. S-a adăugat 20µl de soluţie tampon de probă (2x) [6x soluţie tampon de probă descrisă mai jos] şi peletul a fost resuspendat cu vârful şi/sau printr-o agitare scurtă. Suspensia a fost transferată într-o eprubetă de 1,5 ml pentru microcentrifugă.

8. Eprubetele au fost încălzite la 90°C timp de 4min.

9. Proteinele au fost separate cu ajutorul SDS/PAGE 15%.

10. Legarea calstabin2 a fost detectată cu anticorp primar şi anticorp secundar corespunzător anti-FKBP (Jayaraman et al., J. Biol. Chem. 1992;267:9474-77, 1:2000).

6x Soluţie tampon de probă

7,0 ml 4x Tris-HCl/SDS, pH6.8

3,0 ml glicerol (concentraţia finală 30%)

1,0 g SDS (concentraţia finală 10%)

0,93 g DTT (0,6 M final)

1mg bromofenol albastru (concentraţia finală 0,001%)

Apă distilată până la volum final de 10 ml.

Se păstrează în părţi alicote de 1 ml la -70°C.

Rezultatele:

Figura 1A ilustrează un imunoblot cu anticorp calstabin2 ce arată legarea calstabin2 de RyR2 fosforilat de PKA în absenţa (-) sau prezenţa a 100 nM de compus 1. (+): calstabin ce se leagă de RyR2 nefosforilat de PKA. S36, o benzotiazepină descrisă în US 7,544,678, este utilizată în calitate de martor. După cum s-a arătat, compusul 1, într-o concentraţie de 100 nM, a împiedicat disocierea calstabin2 de RyR2 fosforilat de PKA şi/sau a îmbunătăţit (re)legarea calstabin2 de RyR fosforilat de PKA.

Aşa cum se arată în Figura 1B, s-a constatat că următorii compuşi reprezentativi, de asemenea, împiedică disocierea calstabin2 de RyR2 fosforilat de PKA, şi/sau îmbunătăţesc (re)legarea calstabin2 de RyR2 fosforilat de PKA când au fost testaţi în testul sus-menţionat de relegare a calstabin2 la 100 nM: compusul 2, compusul 3 şi compusul 4.

EXEMPLUL 3: Legarea calstabin1 de RyR1 fosforilat de PKA

Membranele RS din muşchii scheletici au fost preparate într-un mod similar celui din Exemplul 2, şi aşa cum se descrie în continuare în publicarea cererii de brevet USA nr. 2004/0224368 [11], conţinutul căreia este inclus prin referinţă aici. Immunoblotting-ul microzomilor (50 µg) a fost realizat aşa cum s-a descris, cu anticorpul anti-calstabin1 (Zymed) (1: 1,000). Analizele blot au fost elaborate şi cuantificate aşa cum este descris în Exemplul 2.

Figura 1C ilustrează un imunoblot cu anticorp calstabin1 ce arată legarea calstabin1 de RyR1 fosforilat de PKA în absenţa (Neg) sau prezenţa concentraţiilor indicate de compus 1 sau compus 4. (Pos): legarea calstabin de RyR1 nefosforilat de PKA. S36 este utilizat în calitate de martor. Aşa cum s-a demonstrat, compusul 1 şi compusul 4 a împiedicat disocierea calstabin1 de RyR1 fosforilat de PKA şi/sau a îmbunătăţit (re)legarea calstabin1 de RyR1 fosforilat de PKA într-un mod dependent de doză, cu un CE50 estimat de circa 100nM şi, respectiv, 150 nM.

EXEMPLUL 4: Relegarea calstabin1 de RyR1 în şoarecii trataţi cu izoproterenol

Izoproterenolul, un agonist al receptorului beta-adrenergic, induce insuficienţă cardiacă în şoareci prin hiperstimularea receptorului beta-adrenergic. Simultan cu aceasta este activarea PKA, fosforilarea RyR2 pe RS, şi interacţiunea redusă a calstabin2 (FKBP12.6) cu RyR2. O cascadă similară de evenimente are loc în muşchii scheletici, unde RyR1 este fosforilat, ceea ce duce la scăderea legării calstabin1 (FKBP12) de RyRl.

Aşa cum s-a descris în detaliu în publicaţia internaţională nr. WO2008/064264, conţinutul căreia este inclus aici prin referinţă, tratamentul cronic cu izoproterenol la un şoarece de tip sălbatic oferă o metodă rapidă şi sigură pentru inducerea modificărilor în biochimia RyR, care ar putea fi uşor cuantificată. Aceste modificări includ creşterea fosforilării RyR şi scăderea concomitentă a legării calstabin.

Animale şi reactivi

Şoarecii C57B1/6 au fost menţinuţi şi examinaţi conform protocoalelor aprobate. Agonistul sintetic beta-adrenergic, izoproterenolul (ISO) a fost obţinut de la Sigma (I65627) şi preparat sub formă de amestec de 100 mg/ml în apă. Soluţia tampon Lysis a fost preparată prin adăugarea zaharozei (1 mM), ditiotreitolului (320 mM), şi 1 tabletă inhibitoare de protează (10X) la o soluţie iniţială de 10 ml (10 mM HEPES, 1 mM EDTA, 20 mM NaF, 2 mM Na3VO4).

Prepararea pompei osmotice şi implantarea chirurgicală

Şoarecilor li s-a injectat continuu timp de cinci zile 10 mg/ml de izoproterenol (1 µl/oră) printr-o pompă osmotică de perfuzie implantată subcutanat (Alzet MiniOsmotic pump, Model 2001, Durect Corporation, Cupertino, CA).

Pentru încărcarea medicamentului, pompa osmotică a fost ţinută vertical şi în pompă s-au injectat 200 µl de soluţie de medicament printr-o seringă de 1 ml (ataşat la o canulă) care conţinea un exces de soluţie de medicament (~ 250-300 µl). Soluţia de medicament a fost injectată lent în jos, în timp ce seringa a fost ridicată lent, până când pompa a fost supraîncărcată. Revărsarea lichidului substituit peste învelişul pompei a confirmat că pompa a fost umplută corect.

Pompele osmotice încărcate au fost implantate subcutanat prin următorii paşi. Şoarecele a fost anesteziat cu 1,5-2% izofluran în O2 administrat la 0,6 l/min, iar greutatea sa a fost apoi măsurată şi înregistrată. Şoarecele a fost apoi plasat cu pieptul în jos pe polistiren, faţa sa în conul frontal. Blana a fost prinsă la ceafă, fiind întinsă după urechi spre partea de sus a capului. Zona a fost ştearsă uşor cu alcool de 70% , şi s-a făcut o mică incizie la linia mediană pe ceafa capului/gâtului. Un suport de sutură a fost impregnat cu alcool, introdus în tăietură, şi deschis pentru a elibera pielea de ţesutul de dedesubt. Pentru a aranja pompa, acest orificiu a fost extins spre picioarele din spate. Pompa încărcată a fost introdusă în orificiu, cu partea de evacuare poziţionată departe de incizie, şi a fost lăsată să intre sub piele cu tensiune minimă. Incizia a fost închisă cu sutură de nailon 5.0, fiind necesare aproximativ 5-6 suturi, iar zona a fost ştearsă uşor cu alcool de 70%. După operaţia chirurgicală, şoarecii au fost plasaţi în cuşti individuale, pentru a minimiza leziunea şi posibila activare a sistemului nervos simpatic.

Izolarea muşchilor scheletici

Ţesutul muscular scheletic al şoarecelui a fost izolat după cum urmează. Muşchii picioarelor au fost expuşi prin tăierea pielii la gleznă şi tragerea în sus. Ţesutul a fost menţinut umed cu soluţie tampon Tyrode (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 0,42 mM Na2HPO4, 1,7 mM MgCl2, 11,9 mM NaHCO3, 5 mM glucoză, 1,8 mM CaCl2, preparată prin adăugarea a 20 mg de CaCl2 până la 100 ml 1X soluţie tampon preparată dintr-o soluţie 10X fără CaCl2). Următorii muşchii au fost izolaţi şi congelaţi în azot lichid. Muşchiul extensor lung al degetelor (EDL) a fost izolat prin inserarea foarfecelor între tendonul lateral şi X format de tendoanele EDL şi Tibial, tăind în sus spre genunchi; prin tăierea muşchiului fibularis pentru a expune tendonul în formă de evantai al muşchiului gastrocnemian; prin introducerea pensetei sub X şi sub muşchi pentru a slăbi tendonul EDL; prin tăierea tendonului EDL şi tragerea în sus a muşchiului; şi în cele din urmă prin eliberarea EDL. Muşchiul solear a fost izolat prin îndepărtarea muşchiului fibularis din partea superioară a muşchiului gastrocnemian; expunerea muşchiului solear pe partea inferioară a muşchiului gastrocnemian prin tăierea şi ridicarea tendonului lui Achile; tăierea muşchiul solear în partea superioară a muşchiului după genunchi; şi în cele din urmă tragerea muşchiului solear şi tăierea lui din muşchiul gastrocnemian. Muşchiul tibial a fost izolat prin tăierea tendonului tibial de pe partea frontală a gleznei, trăgând tendonul în sus, şi tăindu-l de pe tibie. Muşchiul vast (muşchiul coapsei) a fost izolat de pe ambele picioare, prin tăierea muşchiului chiar deasupra genunchiului şi îndepărtarea fasciculului muscular. Probele au fost congelate în azot lichid.

Imunoprecipitarea RyR1 din lizatele tisulare

RyR1 fost imunoprecipitat din probe prin incubarea a 200-500 µg de omogenat cu 2 µl anticorp anti-RyRl (Zymed) în 0,5 ml de soluţie tampon RIPA modificată (50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,9% NaCI, 5,0 mM NaF, 1,0 mM Na3VO4, Triton-X100 0,5%, şi inhibitori de protează), la 4°C timp de 1,5 ore. Probele au fost apoi incubate cu mărgele de sefaroză Proteina A (Amersham Pharmacia Biotech, Piscatawy, NJ) la 4°C timp de 1 oră, după care mărgelele au fost spălate de trei ori cu RIPA rece ca gheaţa. Probele au fost încălzite până la 95°C şi fracţionate după mărime prin SDS-PAGE (SDS-PAGE de15% pentru calstabin). Imunoblotele au fost elaborate folosind un anticorp anti-FKBP (FKBP12/12.6, Jayaraman et al., J. Biol. Chem. 1992;267:9474-77) la o diluţie de 1:2,000. Anticorpii au fost diluaţi în lapte de 5% sau TBS-T (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 M NaCl, Tween® 20 0,05%, Triton X-100 0,5%).

Rezultatele

Pompele osmotice ce conţin izoproterenol cu sau fără compusul de testat au fost implantate în şoareci aşa cum este descris mai sus. Şoarecii au fost perfuzaţi osmotic timp de cinci zile fie doar cu vehiculul (DMSO/PEG), doar izoproterenolul (ISO) (0,5 mg/kg/hr), sau o combinaţie de izoproterenol (0,5 mg/kg/oră) şi compusul 1 în concentraţiile indicate. În ziua a 6-a, fiecare şoarece a fost sacrificat, şi ţesutul muscular scheletic a fost izolat şi folosit pentru a analiza legarea calstabin1 în imunoprecipatele RyRl.

Efectul compusului 1 asupra îmbunătăţirii legării calstabin1 de RyRl în muşchii scheletici izolaţi din şoarecii trataţi cu izoproterenol este descris în Figurile 2A (imunoblot) şi 2B (cuantificarea grafică). După cum s-a demonstrat, compusul 1 a sporit nivelurile de calstabin1 legat de RyRl în membranele musculare scheletice până la un nivel similar celui observat prin administrarea a 3,6 mM S36, un alt derivat al benzotiazepinei utilizat ca martor pozitiv (WO2008/064264 [12]). Rezultate similare au fost obţinute pentru compusul 4 (datele nu sunt prezentate).

EXEMPLUL 5: Efectul Compusului 1 într-un model de insuficienţă cardiacă post-ischemică cronică la şobolani

Obiectivul

Obiectivul acestui studiu a fost de a testa capacitatea compusului 1 de a reduce disfuncţia cardiacă şi atenua remodelarea ventriculară într-un model de insuficienţă cardiacă indusă de ischemie-reperfuzie.

Metodologia

Insuficienţa cardiacă cronică a fost indusă la şobolanii masculi de rasă wistar (224-240 g, vârsta de 10-11 săptămâni) prin leziunea ischemie-reperfuzie (IR). Pentru protocolul I/R, artera coronară descendentă anterioară stângă (DAS) a fost astupată timp de 1 oră. Tratamentul medicamentos (5 mg/kg/zi sau 10 mg/kg/zi în apa de băut) a fost iniţiat peste o săptămână după reperfuzie şi a fost continuat pentru o perioadă de studiu de 3 luni. Eficacitatea compusului 1 a fost evaluată prin ecocardiografie peste o lună, două şi trei luni după începerea tratamentului, şi prin hemodinamică invazivă peste 3 luni în comparaţie cu animalele tratate cu vehicul şi fals operate. Specimene cardiace au fost, de asemenea, analizate pentru evaluarea hipertrofiei şi conţinutului de colagen. S-a colectat sânge de la fiecare şobolan în ziua finală a studiului pentru evaluarea concentraţiilor plasmatice ale medicamentelor aşa cum este arătat în Figura 3. Schema studiului este ilustrată în Figura 3. Experimentele au fost realizate într-o manieră oarbă.

Metode statistice

Pe parametrii măsuraţi în timp, compararea animalelor operate fals faţă de cele tratate cu vehicul şi compararea tratamentelor medicamentoase sunt analizate prin 2 căi ANOVA cu măsurări repetate. Pe parametrii măsuraţi la sacrificare şi morfometrie, comparaţiile animalelor operate fals faţă de cele tratate cu vehicul sunt analizate prin testul t şi comparaţiile tratamentelor medicamentoase prin ANOVA pe o singură cale urmată de testul Dunnett.

Rezultatele

Animalele I/R tratate cu vehicul, comparativ cu animalele operate fals, au demonstrat volume sistolice finale (VSF VS) şi volume diastolice finale (VDF VS) crescute ale ventriculului stâng (VS) (Figurile 4 A şi B), funcţie cardiacă micşorată masurată prin reducerea Fracţiunii de Ejecţie (FE) (Figura 4C) şi creşterea conţinutului de colagen interstiţial (Figura 5D). Compusul 1, administrat în doză de 5 şi 10 mg/kg/zi a sporit semnificativ FE, precum şi a redus atât VSF VS şi VDF VS comparativ cu vehiculul, de la una până la trei luni (Figurile 4A-C), precum şi a redus conţinutul de colagen interstiţial (Figura 5D).

Studiul hemodinamic invaziv (după 3 luni) a arătat o conservare a dP/dt max VS şi dP/dt min VS la animalele tratate cu compusul 1 în doză de 5 şi 10 mg/kg/zi comparativ cu vehiculul (Figurile 6B şi C), fără nicio modificare statistică semnificativă a tensiunii arteriale sistolice VS asupra tratamentului (Figura 6A).

Nu au fost observate efecte asupra greutăţii corporale (GC), mărimii infarctului sau hipertrofiei (greutatea VS) după tratament (Figurile 5A-C). Concentraţiile plasmatice ale medicamentelor sunt prezentate în Figura 7.

Rezultatele arată că compusul 1, în concentraţii de 5 mg/kg/zi, exercită un efect benefic asupra funcţiei cardiace sistolice şi diastolice într-un model de insuficienţă cardiacă postishemică cronică la şobolani.

Compusul 1 a fost semnificativ şi surprinzător mai activ în comparaţie cu compusul A, un derivat al benzotiazepinei cu o structură înrudită descris în WO 2007/024717. Aşa cum se arată în Figura 8, compusul A, administrat într-o concentraţie de 5 mg/kg/zi timp de 3 luni, nu a reuşit să îmbunătăţească funcţia cardiacă sistolică şi diastolică în comparaţie cu compusul 1 în modelul de şobolani cu insuficienţă cardiacă post-ischemică cronică la sfârşitul studiului. Astfel, efectele benefice ale compusului 1, dar nu a compusului A, au fost observate în doză de 5 mg/kg/zi, după 3 luni de tratament în modelul de şobolani CHF.

Compusul A

EXEMPLUL 6: Efectul Compusului 1 asupra funcţiei musculare într-un model de distrofie musculară la şoarece (mdx)

Obiectivul

Obiectivul acestui studiu a fost de a testa dacă tratamentul cu compusul 1 îmbunătăţeşte funcţia musculară într-un model de şoareci cu deficit de distrofină (mdx).

Metodologia

Şoarecii C57BL/10ScSn-DMDmdx/J (abreviat mdx, n=5 per grup), 6 săptămâni şi circa 20 de grame în momentul iniţierii studiului, au fost aclimatizaţi la cuştile pe roţi timp de şase zile, înainte de selectarea aleatorie în grupuri care primesc tratament fie cu vehicul (H2O) sau doze ţintă de 5 mg/kg/zi, 10 mg/kg/zi, sau 50 mg/kg/zi (doze efective: 7,9 mg/kg/zi; 12,8 mg/kg/zi; şi, respectiv, 61,5 mg/kg/zi, determinate de consumul de soluţie medicamentoasă măsurată săptămânal împărţită la greutatea corporală) de sare de sodiu a compusului 1 (raportat la greutatea medicamentului de bază; sarea de sodiu este denumită, în continuare, în acest Exemplu ca "compusul 1") administrată în apa de băut la discreţie timp de 4 săptămâni. Şoarecii C57BL/6 de aceeaşi vârstă (abreviat ca WT, n=4 per grup), au fost selectaţi aleator în grupuri care primesc tratament cu vehicul (H2O) sau o doză ţintă de 50 mg/kg/zi (doză efectivă: 67,7 mg/kg/zi) de sare de sodiu a compusului 1.

Activitatea voluntară pe roată, greutatea corporală şi consumul mediu de apă au fost măsurate în primele 3 săptămâni. Forţa musculară specifică a fost măsurată după 4 săptămâni de tratament, la sfârşitul studiului.

Distanţa parcursă (km/zi) pe o perioadă de 24 de ore a fost analizată ca un indice al activităţii funcţionale îmbunătăţite (a se vedea DMD_M.2.1.002 SOP la http://www.treat-nmd.eu/). La sfârşitul studiului, muşchiul extensor lung al degetelor (EDL) a fost izolat pentru analiza forţei musculare conform descrierii de mai jos. Sângele a fost colectat de la fiecare şoarece prin sângerări retro-orbitale la sfârşitul studiului (după terminarea ciclului de întuneric - aproximativ ora 7) pentru evaluarea concentraţiilor plasmatice ale medicamentelor. Experimentele au fost "oarbe".

Măsurările forţei

La sfârşitul studiului, muşchiul EDL a fost disecat de la membrele posterioare pentru analiza forţei izometrice utilizând Sistemul de testare musculară 407A de la Aurora Scientific (Aurora, Ontario, Canada). O sutură 6-0 a fost legată de fiecare tendon şi întregul muşchi EDL, tendon la tendon, a fost transferat într-o baie Ragnoti de soluţie barbotată Tyrode O2/CO2 (95%/5%) (în mM: NaCl 121, KCl 5.0, CaCl2 1.8, MgCl2, NaH2PO4, NaHCO3 24, şi glucoză 5.5). Cu ajutorul suturilor, un tendon a fost legat vertical de un cârlig din oţel inoxidabil conectat la un traductor de forţă. Celălalt tendon suturat a fost prins într-un braţ mobil pe sistemul Aurora. Muşchiul EDL a fost stimulat să se contracteze cu ajutorul unui câmp electric între doi electrozi de platină. La începutul fiecărui experiment, lungimea muşchiului a fost ajustată pentru a se obţine forţa maximă. Raporturile forţă-frecvenţă au fost determinate prin contracţia de declanşare utilizând frecvenţe de stimulare treptate (5-250 Hz pentru 200 ms la tensiunea supra-prag). Între stimulări muşchiul a fost lăsat să se relaxeze ~ 3 min. La sfârşitul măsurării forţei, lungimea (Lo) muşchiului EDL, în timp ce era suturat în sistemul Aurora, a fost măsurată cu excepţia tendoanelor. Muşchiul EDL a fost apoi îndepărtat din sistem şi cântărit după tăierea tendoanelor finale şi suturilor. Muşchiul EDL a fost apoi congelat în azot lichid. Secţiunea transversală (mm2) a muşchiului EDL a fost calculată prin împărţirea greutăţii muşchiului EDL la lungimea muşchiului EDL şi constanta densităţii musculare a mamiferelor de 1,056 mg/m3 (Yamada, T., et al. Arthritis and rheumatism 60:3280-3289). Pentru a determina forţa specifică EDL (kN/m2 ), forţa tetanică absolută a fost împărţită la secţiunea transversală a muşchiului EDL.

Metode statistice

Pentru a determina semnificaţia statistică, s-a utilizat testul-t Student pentru compararea a doua grupe. Toate datele acumulate au fost exprimate ca medie +/- ESM (eroarea standard a mediei).

Rezultatele

S-a testat capacitatea compusului 1 de a îmbunătăţi efortul fizic voluntar la şoarecii mdx. După aclimatizarea şoarecilor la cuşca pe roţi voluntară, activitatea şoarecilor pe roţile voluntare a fost monitorizată de un computer 24/7. Datele colectate au fost transcrise la distanţa parcursă pe zi timp de 3 săptămâni. Şoarecii mdx trataţi cu 10 şi 50 mg/kg/zi (doza ţintă) de compus 1 au parcurs distanţe semnificativ mai lungi pe roată comparativ cu şoarecii mdx trataţi doar cu vehicul (H2O) (P <0,001 din ziua 1 până în ziua 19). Efectul tratamentului s-a observat încă din primele 2-3 zile de la iniţierea tratamentului, şi a continuat de-a lungul perioadei de monitorizare a activităţii. Nu s-a observat nici un efect al compusului 1 pe distanţa de parcurs la şoarecii WT trataţi cu 50 mg/kg/zi de compus 1 (Figura 9). În plus, aşa cum s-a determinat prin măsurările de forţă in vitro în muşchiul EDL (Figura 10), tratamentul cu compusul 1 a sporit forţa specifică în muşchiul mdx în funcţie de doză. La frecvenţe de stimulare de 150 Hz şi mai mult şoarecii mdx trataţi cu 50 mg/kg/zi au demonstrat o sporire semnificativă statistic a forţei musculare specifice (P <0,05). Nu s-a observat nici un efect al tratamentului cu compusul 1 asupra forţei musculare specifice la şoarecii WT.

După cum se prezintă în Figura 11, tratamentul cu compusul 1 nu a afectat greutatea corporală. Nu au fost observate efecte dependente de doză asupra consumului de apă. Expunerea sangvină dimineaţa a compusului 1 a fost de (± ESM medie) 3,3 ± 0,4 µµ pentru şoarecii mdx cărora li s-a administrat o doză de 5 mg/kg/zi, 10,7 ± 0,9 µµ pentru şoarecii mdx cărora li s-a administrat o doză de 10 mg/kg/zi, 52,8 ± 1,7 µµ pentru şoarecii mdx cărora li s-a administrat o doză de 50 mg/kg/zi, şi 72,8 ± 7,0 µµ pentru şoarecii WT cărora li s-a administrat o doză de 50 mg/kg/zi. Luate împreună, rezultatele arată că, în comparaţie cu martorii trataţi cu vehicul, tratamentul cu compusul 1 în doză de 10 mg/kg/zi şi 50 mg/kg/zi (doza ţintă) a îmbunătăţit efortul fizic voluntar pe roată după 3 săptămâni şi forţa musculară specifică după 4 săptămâni la şoarecii mdx, un model murin de distrofie musculară Duchenne (DMD), demonstrând astfel utilitatea compusului 1 şi analogilor acestuia precum s-a revendicat în prezenta, în tratamentul distrofiei musculare.

EXEMPLUL 7: Stabilitatea metabolică

Stabilitatea metabolică a compusului 1, un RycalTM reprezentativ conform prezentei invenţii, a fost comparată cu cea a compusului B şi compusului C, un derivat cu o structură înrudită a benzotiazepinei descris în WO 2007/024717.

A. Stabilitatea metabolică în microzomi hepatici umani

Metode:

Solubilizarea compuşilor: Soluţiile iniţiale (stoc) au fost preparate în DMSO, şi soluţiile de lucru în apă conţinând 1 mg/ml BSA.

Prezicerea biodisponibilităţii metabolice: Prezicerile biodisponibilităţii metabolice (MF%) au fost bazate pe măsurările stabilităţii metabolice in vitro cu microzomi hepatici, presupunând absorbţia totală. Pe scurt, medicamente nemodificate au fost cuantificate prin LC-MS-MS după incubarea (10-7M) cu microzomi de şobolani şi umani hepatici (0,33 mg proteină/ml) după 0, 5, 15, 30 şi 60 de minute de incubare în prezenţa a NADPH (1mM). Reacţia enzimatică a fost oprită cu metanol (v/v) şi proteinele au fost precipitate prin centrifugare. Clearance-urile intrinseci in vitro (Clint_mic) exprimate ca ml/min/g proteină au fost panta (după liniarizarea LN) concentraţiei rămase a medicamentului nemodificat faţă de timpul de incubare. Clint in vitro au fost apoi extinse până la întregul corp in vivo (vivoClint) utilizând 0,045 mg prot/kg de ficat şi greutatea ficatului de 11 g pentru şobolan şi 1,2 kg pentru om. Clint in vivo au fost apoi transformate în clearance-uri hepatice (HepCl), utilizând modelul bine agitat (HepCl=vivoClint*FSH/ (vivoClint + FSH) în care FSH (fluxul sanguin hepatic) au fost preluate ca 22 ml/min pentru şobolan şi 1500 ml/min pentru om. MF% au fost apoi deduse din raportul de extracţie cu următoarea ecuaţie (MF%=l-HepCl/FSH). Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 1:

Tabelul 1: Stabilitatea în microzomii umani

Compusul Structura Microzomi de şobolani Microzomi umani Clint_mic rat ml/min/gprot MF mic % Clasa Clint_mic man ml/min/gprot MF mic % Clasa B 823 5 foarte scăzută 285 6 foarte scăzută C 1926 2 foarte scăzută 1326 2 foarte scăzută 1 101 30 Intermediară 9,1 75 înaltă

.a. Clint_mic: clearance intrisec in vitro în ml/min/gproteină

b. MF%: biodisponibilitatea metabolică în %

B. Stabilitatea metabolică în hepatocite de şobolan şi hepatice umane

Solubilizarea compuşilor: Soluţiile iniţiale au fost preparate în DMSO, şi soluţiile de lucru în mediul William conţinând 1/10 plasmă de şobolani sau 1/4 plasmă umană.

Determinarea stabilităţii metabolice: Compuşii au fost incubaţi la 10-7 M cu hepatocitele izolate (6E+5 celule/ml pentru hepatocite de şobolan şi 4E+5 celule/ml pentru hepatocite umane) la 37°C în plasmă de la aceleaşi specii diluate în mediul Wiliams (1/10 diluţie pentru şobolani şi 1⁄4 diluţie pentru oameni). Probele au fost prelevate la 0, 10, 20, 30, 60 şi 120 de minute şi reacţia enzimatică s-a oprit cu metanol (v/v). Proteinele au fost precipitate prin centrifugare şi supernatantul a fost analizat prin LC/MS/MS. Clint exprimat ca ml/min/g proteină au fost calculate ca pentru microzomi hepatici folosind un raport de 0,134 mg proteină/ml pentru 4E+5 celule/ml pentru oameni şi 0,201 mg proteină/ml pentru 6E+5 celule/ml pentru şobolani. Prezenţa medicamentului de referinţă şi metabolitului potenţial a fost verificată prin LC/MS/MS în timpul testului în fiecare probă. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 2:

Tabelul 2: Stabilitatea în hepatocite umane şi de şobolan

Compusul Hepatocite de şobolan Hepatocite umane Clint (ml/min/gprot) MF şobolan % Celule Q /ml Clint (ml/min/gprot) MF uman % Celule Q /ml B 1334 3 6.00E+05 693 3 4.00E+05 1 5 90 6.00E+05 0 100 4.00E+05 C 2610 2 6.00E+05 100 16 4.00E+05

.a. Clint_mic: clearance intrisec in vitro în ml/min/gproteină

b. MF%: biodisponibilitatea metabolică în %

c. Q: cantitatea celulelor per ml

C. Stabilitatea metabolică în microzomi de şoarece şi de şobolan

Materiale şi procedee

Soluţie tampon de diluare: 0,1M soluţie tampon Tris HCl la pH 7.4 conţinând 5 mM EDTA.

Soluţie cofactor NADPH: Într-o eprubetă falcon de 50 ml care conţine 2,79 ml soluţie tampon de diluare s-au adăugat 0,429 ml de sol. de regenerare NADPH A şi 0,079 ml de sol. de regenerare NADPH B

Prepararea microzomilor: (soluţie 1,5 mg/ml) O eprubetă falcon de 50 ml conţinând 3,32 ml de soluţie tampon de diluare a fost preîncălzită la 37 °C timp de 15 min. (cel puţin 10 min.) 0,178 ml de microzomi (24,6 mg/ml) s-a adăugat la soluţia tampon de diluare preîncălzită. Concentraţia proteică a acestui preparat de microzomi a fost de 1,25 mg/ml.

Probă (Compusul de testare) - Soluţii de bază iniţiale şi intermediare: S-a preparat o soluţie de 1 mg/ml (0,5 mg/ml s-a utilizat pentru compusul 1) de compusul de testare în metanol. S-a preparat 100 µµ de soluţie intermediară de compus de testare din soluţia de bază iniţială utilizând soluţia tampon de diluare. O soluţie de 5 µµ a fost preparată prin diluarea a 100 µµ de soluţie intermediară utilizând soluţia tampon de diluare.

Experiment:

(Experimentele au fost conduse în eprubete eppendorf pentru microcentrifugă de 1,5 ml).

0 minute incubare. Procedura:

a. Se adaugă 100 µl de microzomi preîncălziţi

b. Se adaugă 50 µl de soluţie 5 µm de compus de testare.

c. Se adaugă 500 µl de soluţie rece pentru stopare (metanol rece ca gheaţa)

d. Se adaugă 100 µl de soluţie cofactor de NADPH în eprubetă eppendorf.

a. Se amestecă intensiv eprubeta eppendorf.

“t” minute incubare

b. Se adaugă 100 µl de soluţie cofactor de NADPH în eprubeta eppendorf.

c. Se adaugă 50 µl de soluţie 5 µm de compus de testare.

d. Se adaugă 100 µl de microzomi preîncălziţi

e. Se incubează eprubeta eppendorf la 37ºC 300 rpm timp de 't' min. pe un termomixer.

f. Se înlătură eprubeta eppendorf din termomixer.

g. Se adaugă 500 µl de soluţie rece pentru stopare (metanol rece ca gheaţa)

h. Se amestecă intensiv eprubeta eppendorf.

Probele incubate la "0" şi "t" minute au fost centrifugate la 15,000 rcf la 4°C timp de 15 min. 500 µl de soluţie de supernatant s-a înlăturat şi supus analizei LC/MS (MIS - Monitorizarea Ionilor Selectaţi)

Rezultatele sunt exprimate ca % compusului de testare rezidual = (MS Zona de răspuns a probei 't' min / MS Zona de răspuns a probei "0" min) * 100. Zona MS utilizată este o medie de injecţii în duplicat.

Intervalele de timp = 0, 15, 30 şi 60 min. pentru fiecare compus de testare

Martorul pozitiv:

În calitate de martor pozitiv s-a utilizat incubarea a 2 µµ Imipramină - 5 min. şi 2 µµ Imipramină - 15 min. pentru experimentele de stabilitate a microzomilor în ficatul de şobolan şi de şoarece.

Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 3:

Tabelul 3: Stabilitatea în microzomii de şoarece şi şobolan

Compusul (1) Compusul (B) Compusul (C) Stabilitatea metabolică in vitro Microzomii de şobolan (% rezidual) 15min 54% 1% 0% 30min 17% 0% 0% 1h 2% 0% 0% Microzomii de şoarece (% rezidual) 15min 99% 0% 0% 30min 98% 0% 0% 1h 82% 0% 0%

În mod surprinzător, după cum se vede în Tabelele 1-3, compusul 1 a fost semnificativ mai stabil în microzomii de şoarece, de şobolan şi cei umani, precum şi în hepatocitele de şobolan şi cele umane, comparativ cu analogii structurali compuşii B şi C dezvăluiţi în WO 2007/024717. S-a constatat că ambii compuşi sus-menţionaţi posedă o stabilitate metabolică in vitro slabă în sistemele testate, ceea ce face ca aceşti compuşi să fie neadecvaţi pentru elaborarea lor în calitate de candidaţi de medicamente. În mod surprinzător şi neaşteptat, substituirea fragmentelor H sau OH în compuşii din stadiul tehnicii cu un fragment COOH a dus la compusul 1, care a demonstrat o stabilitate metabolică înaltă în toate sistemele testate. Stabilitatea metabolică înaltă a Compusului 1 comparativ cu analogii săi structurali a fost cu adevărat surprinzătoare şi dovedeşte beneficiile neaşteptate ale acestui compus faţă de compuşii cunoscuţi în domeniu.

Toate publicaţiile, referinţele, brevetele şi cererile de brevet citate în prezenta sunt incluse prin referinţă în întregime, în aceeaşi măsură ca şi cum fiecare cerere individuală, brevet sau cerere de brevet ar fi fost indicată în mod specific şi individual pentru a fi inclusă prin referinţă în întregime.

Descrierea anterioară a variantelor de executare specifice va dezvălui atât de integral natura generală a invenţiei încât persoanele terţe pot, prin aplicarea cunoştinţelor actuale, modifica şi/sau adapta uşor pentru diverse utilizări astfel de variante de executare specifice, fără experimente necuvenite şi fără a se îndepărta de la conceptul generic şi, prin urmare, astfel de adaptări şi modificări trebuie şi sunt destinate de a fi înţelese în sensul şi domeniul de echivalente ale variantelor de executare dezvăluite. Se va înţelege că frazeologia sau terminologia utilizată în prezenta este cu scopul de ilustrare şi nu de limitare. Mijloacele, materialele şi etapele pentru realizarea diverselor funcţii dezvăluite pot lua o varietate de forme alternative fără a se îndepărta de la invenţie.

Descrierea se publică în redacţia solicitantului

1. WO2007024717 A2 2007.03.01

2. WO2005094457 A2 2005.10.13

3. WO2006101496 A1 2006.09.28

4. WO2008060332 A2 2008.05.22

5. WO2008021432 A2 2008.02.21

6. WO2012019076 A1 2012.02.09

7. WO2012019071 A1 2012.02.09

8. WO2012037105 A1 2012.03.22

9. US7544678 B2 2009.06.09

10. WO2009111463 A1 2009.09.11

11. US2004224368 A1 2004.11.11

12. WO2008064264 A2 2008.05.29

Claims (27)

1. Compus reprezentat prin formula structurală (I):

(I) unde R este COOH; şi sărurile sale acceptabile farmaceutic.

2. Compus, conform revendicării 1, sub formă de o sare cu un acid sau o bază acceptabilă farmaceutic.

3. Compus, conform revendicării 2, unde sarea este selectată din grupul ce constă din sodiu, potasiu, magneziu, hemifumarat, hidroclorură şi hidrobromură, de preferinţă, unde sarea este de sodiu sau hemifumarat.

4. Compus, conform revendicării 1, care este selectat din grupul ce constă din: ; (1) ; şi (4) . (6)

5. Compus, conform revendicării 1, care este reprezentat prin formula structurală (1):

(1) sau sărurile sale acceptabile farmaceutic.

6. Compus, conform revendicării 5, sub formă de o sare cu un acid sau o bază acceptabilă farmaceutic.

7. Compus, conform revendicării 6, unde sarea este selectată din grupul ce constă din sodiu, potasiu, magneziu, hemifumarat, hidroclorură şi hidrobromură.

8. Compus, conform revendicării 7, unde sarea este sare de sodiu.

9. Compus, conform revendicării 7, unde sarea este sare de hemifumarat.

10. Compoziţie farmaceutică care cuprinde un compus, conform oricăreia dintre revendicările 1-9, în combinaţie cu unul sau mai mulţi excipienţi sau purtători acceptabili farmaceutic.

11. Compoziţie farmaceutică, conform revendicării 10, pentru utilizarea în tratamentul sau prevenirea unei stări selectate din grupul ce cuprinde tulburări şi boli cardiace, oboseală musculară, tulburări şi boli musculoscheletice, tulburări şi boli ale SNC, disfuncţii cognitive, tulburări şi boli neuromusculare, tulburări şi boli osoase, caşexie legată de cancer, hipertermie malignă, diabet, moarte cardiacă subită şi sindromul morţii subite a sugarului sau pentru îmbunătăţirea funcţiei cognitive.

12. Metodă de tratare sau prevenire a unei stări selectate din grupul ce cuprinde tulburări şi boli cardiace, oboseală musculară, tulburări şi boli musculoscheletice, tulburări şi boli ale SNC, disfuncţii cognitive, tulburări şi boli neuromusculare, tulburări şi boli osoase, caşexie legată de cancer, hipertermie malignă, diabet, moarte cardiacă subită şi sindromul morţii subite a sugarului sau pentru îmbunătăţirea funcţiei cognitive, metoda cuprinde etapa de administrare unui subiect, care are nevoie de aceasta, a unei cantităţi eficiente terapeutic de un compus conform oricăreia dintre revendicările 1-9 sau de o compoziţie farmaceutică conform revendicării 10.

13. Compoziţie farmaceutică, conform revendicării 10 pentru utilizarea în tratamentul sau prevenirea unei stări conform revendicării 11, sau metodă conform revendicării 12, unde starea este asociată cu o funcţie anormală a receptorului rianodinei 1 (RyR1), a receptorului rianodinei de tip (RyR2), a receptorului rianodinei de tip 3 (RyR3) sau o combinaţie a acestora.

14. Compoziţie farmaceutică, conform revendicării 10 pentru utilizarea în tratamentul sau prevenirea unei stări conform revendicării 11, sau metodă conform revendicării 12, unde tulburările şi bolile cardiace sunt selectate din grupul ce cuprinde tulburări şi boli ale bătăilor neregulate ale inimii, cum sunt tulburări şi boli ale bătăilor neregulate selectate din grupul ce cuprinde aritmie atrială şi ventriculară, fibrilaţie atrială şi ventriculară, tahiaritmie atrială şi ventriculară, tahicardie atrială şi ventriculară, tahicardie ventriculară polimorfă catecolaminergică (TVPC) şi variantele acestora induse prin efort fizic; tulburări şi boli ale bătăilor neregulate ale inimii induse prin efort fizic; insuficienţă cardiacă; insuficienţă cardiacă congestivă; insuficienţă cardiacă cronică; insuficienţă cardiacă acută; insuficienţă cardiacă sistolică; insuficienţă cardiacă diastolică; insuficienţă cardiacă acută decompensată; leziune ischemică/de reperfuzie (I/R) cardiacă; boală pulmonară obstructivă cronică; leziune I/R ca urmare a angioplastiei coronariene sau ca urmare a trombolizei pentru tratamentul infarctului miocardic (IM) şi hipertensiune arterială.

15. Compoziţie farmaceutică, conform revendicării 10 pentru utilizare în tratamentul sau prevenirea conform revendicării 11, sau metodă conform revendicării 12, unde oboseala musculară este cauzată de o boală, tulburare sau stare a muşchilor scheletici.

16. Compoziţie farmaceutică, conform revendicării 10 pentru utilizarea în tratamentul sau prevenirea conform revendicării 11, sau metodă conform revendicării 12, unde boala, tulburarea sau starea musculoscheletică este selectată din grupul ce cuprinde oboseala musculară scheletică indusă de efort fizic; oboseala musculară indusă de efort fizic prelungit sau efort fizic de intensitate înaltă; miopatia congenitală; distrofia musculară, cum este distrofia musculară Duchenne (DMD), distrofia musculară Becker (DMB), distrofia musculară la nivelul membrelor-brâu (DMMB), distrofia facio-scapulo-humerală, distrofia musculară miotonică, distrofia musculară congenitală (DMC), distrofia musculară distală, distrofia musculară Emery-Dreifuss şi distrofia musculară oculo-faringiană; atrofia musculară spinală (AMS), atrofia musculară spinală şi bulbară (AMSB), oboseala musculară legată de vârstă; sarcopenia, boala miezului central; caşexia legată de cancer; tulburările vezicii urinare şi incontinenţa.

17. Compoziţie farmaceutică conform revendicării 10 pentru utilizarea în tratamentul sau prevenirea conform revendicării 11, sau metodă conform revendicării 12, unde tulburările şi bolile SNC sunt selectate din grupul ce cuprinde boala Alzheimer (BA), neuropatie, convulsii, boala Parkinson (BP) şi boala Huntington (BH); iar tulburările şi bolile neuromusculare sunt selectate din grupul ce cuprinde ataxia spinocerebelară (ASC) şi scleroza laterală amiotrofică (SLA, boala Lou Gehrig).

18. Compoziţie farmaceutică, conform revendicării 10 pentru utilizarea în tratamentul sau prevenirea conform revendicării 11, sau metodă conform revendicării 12, unde disfuncţia cognitivă este legată de stres sau de vârstă, sau unde funcţia cognitivă ce trebuie îmbunătăţită este memoria de scurtă durată, memoria de lungă durată, atenţia sau învăţarea, sau unde disfuncţia cognitivă este asociată cu o boală sau tulburare selectată din grupul ce cuprinde boala Alzheimer (BA), tulburarea de hiperactivitate şi deficit de atenţie (THDA), tulburarea din spectrul autismului (TSA), tulburarea de anxietate generalizată (TAG), tulburarea obsesiv-compulsivă (TOC), boala Parkinson (BP), tulburarea de stres posttraumatic (TSPT), schizofrenia, tulburarea bipolară şi depresia majoră.

19. Compoziţie farmaceutică, conform revendicării 10 pentru utilizarea în tratamentul sau prevenirea conform revendicării 11, sau metodă conform revendicării 12, unde starea este caşexia legată de cancer, preferabil cauzată de o formă de cancer cu metastaze osoase.

20. Compoziţie farmaceutică, conform revendicării 10 pentru utilizarea în tratamentul sau prevenirea conform revendicării 11, sau metodă conform revendicării 12, unde compusul este utilizat într-o doză suficientă pentru a restabili sau îmbunătăţi legarea calstabin2 de RyR2.

21. Compoziţie farmaceutică, conform revendicării 10 pentru utilizarea în tratamentul sau prevenirea conform revendicării 11, sau metodă conform revendicării 12, unde compusul este utilizat într-o doză suficientă pentru a restabili sau îmbunătăţi legarea calstabin1 de RyR1.

22. Compoziţie farmaceutică, conform revendicării 10 pentru utilizarea în tratamentul sau prevenirea conform revendicării 11, sau metodă conform revendicării 12, unde compusul este utilizat într-o doză suficientă pentru a micşora scurgerea Ca2+ printr-un canal RyR.

23. Compus, conform oricăreia dintre revendicările 1-9, sau o sare a acestuia, pentru utilizarea în tratamentul sau prevenirea unei stări selectate din grupul ce cuprinde tulburări şi boli cardiace, oboseală musculară, tulburări şi boli musculoscheletice, tulburări şi boli ale SNC, disfuncţii cognitive, tulburări şi boli neuromusculare, tulburări şi boli osoase, caşexie legată de cancer, hipertermie malignă, diabet, moarte cardiacă subită şi sindromul morţii subite a sugarului sau pentru îmbunătăţirea funcţiei cognitive.

24. Compoziţie farmaceutică, conform revendicării 10 pentru utilizarea în tratamentul sau prevenirea conform revendicării 11, sau metodă conform revendicării 12, cuprinzând în plus utilizarea unei oligonucleotide antisens (OA), care este specifică pentru o secvenţă de matisare într-un ARNm de interes, pentru sporirea ignorării exonului în ARNm respectiv de interes.

25. Compoziţie farmaceutică, conform revendicării 24, pentru utilizarea în tratamentul distrofiei musculare Duchenne (DMD), unde oligonucleotida antisens (OA) este specifică pentru o secvenţă de matisare a, cel puţin, unui exon al genei DMD, de preferinţă o secvenţă de matisare a exonului 23, 45, 44, 50, 51, 52 şi/sau 53 al genei DMD.

26. Metodă de tratare a unui subiect care suferă de distrofie musculară Duchenne (DMD), cuprinzând etapa de administrare subiectului respectiv a unui compus conform oricăreia dintre revendicările 1-9, sau o compoziţie farmaceutică conform revendicării 10, în combinaţie cu o oligonucleotidă antisens (OA) care este specifică pentru o secvenţă de matisare a, cel puţin, unui exon al genei DMD, de preferinţă o secvenţă de matisare a exonului 23, 45, 44, 50, 51, 52 şi/sau 53 al genei DMD.

27. Procedeu de preparare a unui compus conform oricăreia dintre revendicările 1-9, cuprinzând etapa de conducere a reacţiei dintre compusul cu formula structurală:

şi un compus cu formula structurală:

unde Ra este COOR1 sau CN, R1 este un alchil C1-C4 şi L este o grupă înlocuibilă pentru a se obţine un compus cu formula structurală:

şi transformând gruparea Ra în gruparea R pentru a se obţine un compus cu formula structurală (I).