MD4532C1 - Procedeu de cultivare a tulpinii de fungi Rhizopus arrhizus CNMN FD 03 - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la biotehnologie, în special la un procedeu de cultivare a tulpinii de fungi Rhizopus arrhizus CNMN FD 03 - producătoare de lipaze.Procedeul, conform invenţiei, prevede obţinerea suspensiei de spori a tulpinii crescute timp de 30 zile pe un mediu de malţ-agar înclinat, adăugarea în suspensie a nanoparticulelor de Fe3O4 cu dimensiunea de 70 nm în concentraţie de 0,005…0,01% cu agitare în decurs de 1…2 min, inocularea suspensiei într-un mediu nutritiv în concentraţie de 10% vol. şi cultivarea submersă la temperatura de 28…30°C cu agitare continuă la 180…200 rot/min în decurs de 48 ore.

Description

Invenţia se referă la biotehnologie, în special la un procedeu de cultivare a tulpinii de fungi Rhizopus arrhizus CNMN FD 03 - producătoare de lipaze exocelulare, care reprezintă o grupă unică de enzime ce catalizează atât reacţii de hidroliză, cât şi de sinteză, fiind capabile să asigure hidroliza eficientă a diferitor substraturi lipidocomponente (grăsimi naturale, uleiuri, trigliceride sintetice etc.), dar şi sinteza gliceridelor, acilarea şi alchilarea lipidelor, reacţiile de esterificare etc. şi pot fi aplicate în industria alimentară, chimică (obţinerea sterioizomerilor), de prelucrare a pieilor, precum şi în cercetările ştiinţifice, în producerea caşcavalurilor, detergenţilor biodegradabili, preparatelor medicamentoase destinate profilaxiei şi tratamentului disfuncţiilor tractului gastro-intestinal etc.

Procedeele moderne de cultivare a tulpinilor fungice producătoare de lipaze exocelulare se bazează pe aplicarea rezultatelor cercetărilor clasice îmbinate cu realizările tehnologice şi fizico-chimice moderne. Astfel, în contextul stabilirii parametrilor optimi de cultivare a producătorilor ce asigură explorarea la maxim a potenţialului biosintetic al producătorilor, se realizează studiul particularităţilor de creştere şi sinteză a lipazelor în funcţie de regimul termic, aeraţie, dinamica variaţiei pH-ului mediului, raportul optim al componentelor mediilor nutritive, cantitatatea şi tipul materialului semincer, precum şi screening-ul inductorilor specifici reprezentaţi de ingrediente naturale (făină de soia, porumb, tărâţe de grîu etc.).

În scopul sporirii capacităţii biosintetice a micromicetelor producătoare de lipaze sunt utilizaţi factori de influenţă de natură chimică, precum compuşii coordinativi ai metalelor de tranziţie sau/şi de natură fizică - tratarea cu unde milimetrice de intensitate joasă [1, 2].

O direcţie nouă în sinteza dirijată sporită a substanţelor bioactive de către microorganisme abordează utilizarea în calitate de factori regulatori a nanoparticulelor, caracterizate prin proprietăţi fizice, chimice şi biologice distincte faţă de aceleaşi compozite brute de dimensiuni micro- sau mai mari [3, 4].

În calitate de soluţie proximă serveşte procedeul de cultivare a tulpinii de fungi Rhizopus arrhizus CNMN FD 03, în cultură submersă pe mediul nutritiv selectat ca optimal pentru tulpina dată cu următoarea componenţă (g/L): făină de soia 35,0; K2HPO4 5,0; (NH4)2SO4 1,0; apă potabilă până la 1,0 L, pH-ul iniţial al mediului 8,0, procesul de cultivare fiind realizat în condiţii de agitare continuă (180…200 rot.·min-1), timp de 48 ore, la temperatura de 28…30ºC. La cultivarea submersă în condiţii proxime tulpina Rhizopus arrhizus CNMN FD 03 manifestă o activitate lipolitică de 37 500...40 000 u/ml [5].

Dezavantajul soluţiei proxime constă în faptul că procedeul nu asigură realizarea pe deplin a potenţialului biosintetic al tulpinii, iar biosinteza enzimelor lipolitice nu atinge valoarea maximă.

Problema tehnică pe care o rezolvă prezenta invenţie constă în elaborarea unui procedeu pentru cultivarea submersă a tulpinii de fungi Rhizopus arrhizus CNMN FD 03, care să asigure intensificarea biosintezei enzimelor lipolitice, ceea ce ar contribui semnificativ la sporirea eficienţei tehnologiei de producere a lipazelor şi extinderea sferei de aplicare a preparatelor lipolitice.

Invenţia soluţionează problema prin aceea că se propune un procedeu de cultivare a tulpinii de fungi Rhizopus arrhizus CNMN FD 03, care prevede obţinerea suspensiei de spori a tulpinii crescute timp de 30 zile pe un mediu de malţ-agar înclinat, adăugarea în suspensie a nanoparticulelor de Fe3O4 cu dimensiunea de 70 nm în concentraţie de 0,005…0,01% cu agitare în decurs de 1…2 min, inocularea suspensiei într-un mediu nutritiv în concentraţie de 10% vol. şi cultivarea submersă la temperatura de 28…30°C cu agitare continuă la 180…200 rot./min în decurs de 48 ore, totodată mediul nutritiv conţine, g/L: făină de soia 35,0, K2HPO4 5,0, (NH4)2SO4 1,0, apă potabilă restul, pH-ul iniţial 8,0.

Rezultatul tehnic al invenţiei constă în sporirea biosintezei lipazelor sintetizate de tulpina Rhizopus arrhizus CNMN FD 03 cu 212,5…230,5% (de 3,1...3,3 ori) faţă de soluţia proximă.

Efectul biostimulator poate fi determinat de reactivitatea înaltă a nanoparticulelor datorită dimensiunilor mici ce le asigură capacitate înaltă de a penetra membranele citoplasmatice, a se implica activ în procesele de oxidoreducere din celulă.

Exemple de realizare a invenţiei

Exemplul 1

Pregătirea materialului semincer. Suspensia de spori şi miceliu se obţine prin spălarea cu apă distilată sterilă a culturii de Rhizopus arrhizus CNMN FD 03 crescută timp de 30 zile pe suprafeţe oblice de malţ-agar. În suspensia de spori astfel obţinută se adaugă, în condiţii de sterilitate, soluţia coloidală de nanoparticule de Fe3O4, cu dimensiunea de 70 nm în concentraţie determinată (0,0025…0,015%), dispersate prealabil pe o baie de apă cu ultrasunet tipul DA-968 DADI timp de 1…2 min.

Amestecul obţinut se agită riguros timp de 1..2 min pe agitator şi se inoculează, în cantitate de 10% vol., în mediul nutritiv steril cu următoarea compoziţie, g/L: făină de soia 35,0; K2HPO4 5,0; (NH4)2SO4 1,0; apă potabilă până la 1,0 L; pH-ul iniţial al mediului 8,0. Cultivarea se efectuează în vase Erlenmayer cu capacitatea de 0,75 L ce conţine 0,2 L de mediu nutritiv lichid, în condiţii de agitare continuă la 180…200 rot.·min-1, temperatura de 28ºC, timp de 48 ore (vezi tabelul).

Tabel

Modificarea activităţii lipazelor la cultivarea micromicetei Rhizopus arrhizus CNMN FD 03 în prezenţa diferitor concentraţii de nanoparticule de Fe3O4.

Varianta Concentraţia nanoparticulelor, % Activitatea lipolitică U·ml-1 % faţă de martor Nanoparticule de Fe3O4* 0,0025 97250 256,6 0,005 118450 312,5 0,010 125250 330,5 0,015 70190 185,5 Soluţia proximă - 37900 100,0;* Sinteza nanoparticulelor Fe3O4/PVP prin metoda solvotermală. Nanoparticulele de Fe3O4 /PVP au fost obţinute prin metoda solvotermală, folosind următoarele componente: FeCl3 .6H2O (clorură de fier (III)), NaCH3COO (acetat de sodiu) în prezenţa poli-N-vinilpirolidonului (PVP) cu masa molară Ms=10 000.

Procesul de sinteză constă în: diluarea a 0,460 g de clorură de fier (III) în 35 ml de PEG (polietilenglicol) cu masa molară 3500, se adaugă 3 ml de soluţie alcoolică PVP cu concentraţia molară de 0,01 mol/L şi 3 ml de soluţie saturată de acetat de sodiu. Ingredientele se mixează până la o stare omogenă; soluţia obţinută se plasează în autoclavă Teflon-Lined.

Sinteza durează 12 ore, la temperatura de 185°C. Pulberea neagră de magnetit se separă din soluţie prin spălare cu etanol şi se usucă la 100°C.

S-a determinat (%): Fe (71,59); O (28,05); C (0,19); H (0,054), N (0,14).

S-a calculat (%): Fe (71,01); O (29,15); C (0,13); H (0,068), N (0,13).

Identificarea produselor obţinute - pulberilor (nano Fe3O4/(magnetit)), a fost efectuată prin metodele analizei chimice, XRD, IR -spectroscopie, SEM - microscopie.

Picurile de difracţie observate corespund fazei cubice a nanoparticulelor de Fe3O4 (grupa spaţială Fd3m, a = 8.3952 Å). Picul principal de difracţie corespunde planurilor cristalografice spinel cubic inversat Fe3O4: (111), (220), (311), (222), (400), (333), (440), (533). În acest mod, structura cristalină a materialului sintetizat a fost confirmată. Dimensiunea cristalitelor este de d = (70±5) nm. Această valoare corespunde datelor măsurărilor microscopice.

Comparaţia spectrelor nanoparticulelor de Fe3O4/PVP şi PVP pur dezvăluie benzi de absorbţie similare în regiunile 3600…2400 şi 1650…650 cm-1. Picul observat în spectrul IR al PVP pur la 1645 cm-1 este atribuit legăturii С=О şi este deplasat spre roşu către valoarea 1559.6 cm-1, în rezultatul interacţiunii dintre oxigenul carbonil şi magnetit. În domeniul spectrului de absorbţie 1500…1200 cm-1, benzile de absorbţie ale PVP se suprapun cu benzile oxidului hidratat, are loc interacţiunea dintre ele. A fost observată o bandă lată cu maximumul la 1406.5 cm-1 şi la 1341.3 cm-1. Prima dintre acestea este legată de picul observat pentru nanoparticulele de Fe3O4 la 1448.2 cm-1, care rezultă din oxidul de fier hidratat, dar este deplasată la 1406.5 cm-1, în timp ce picul la 1341.3 cm-1 este aparent atribuit legăturii covalente dintre PVP şi nanoparticulele de Fe3O4. Astfel, studiul FTIR al nanoparticulelor de magnetit şi ale stabilizatorului polimeric a demonstrat că are loc coordinarea PVP la nanoparticulele de magnetit prin legăturile de azot şi oxigen din PVP, cum a fost evidenţiat în referinţă. Deci, PVP este folosit în calitate de stabilizator polimeric al nanoparticulelor de magnetit. Introducerea polimerului în timpul sintezei presupune formarea grupei carbonil încărcate negativ pe suprafaţa nanoparticulelor de magnetit, ceea ce contribuie la formarea unei soluţii coloidale stabile. Prezenţa moleculelor mari de PVP generează apariţia efectului steric şi împiedică agregarea lor. Soluţiile coloidale bazate pe sinteza nanoparticulelor pot fi folosite pentru bioteste.

Nanoparticulele de Fe3O4 /PVP obţinute sunt folosite la pregătirea soluţiei coloidale: se ia cantitatea necesară de nanoparticule de magnetit (50 mg/L) care se plasează într-un balon calibrat, se adaugă solventul - apa distilată; suspensia se omogenizează folosind baia cu ultrasunet. Apoi prin diluare se obţin soluţiile cu concentraţiile necesare. În acest mod, folosirea polivinilpirolidonului în calitate de modificator - (stabilizator) al suprafeţei permite formarea nanoparticulelor solubile în apă, cu formarea unor coloizi stabili (Grażyna Bystrzejewska-Piotrowska, Monika Asztemborska, Romuald Stęborowski, Halina Polkowska-Motrenko, Bożena Danko, Justyna Ryniewicz. Application of neutron activation for investigation of Fe3O4 nanoparticles accumulation by plants, Nukleonika,Vol. 57, №3, 2012, р. 427-430).

Activitatea lipolitică maximă, determinată după gradul de hidroliză a suspensiei de ulei de măsline în alcool polivinilic până la acid oleic, s-a marcat la utilizarea nanoparticulelor de Fe3O4 în concentraţie de 0,005...0,01% şi a constituit 118450 U·ml-1 şi 125250 U·ml-1, alcătuind corespunzător 312,5% şi 330,0% faţă de proba proximă (37 900 U·ml-1), depăşind martorul de 3,1…3,3 ori sau cu 212,5 şi 230,05%.

Exemplul 2

Cultivarea tulpinii Rhizopus arrhizus CNMN FD 03 se efectuează în retorte Erlenmayer cu capacitatea de 0,5 L cu conţinut de 0,1 L de mediu nutritiv lichid, la temperatura de 30ºC, celelalte condiţii fiind echivalente cu cele din exemplul 1.

Activitatea lipolitică maximă, determinată după metoda descrisă în exemplul 1, s-a marcat la utilizarea nanoparticulelor de Fe3O4 în concentraţie de 0,005...0,01% şi a constituit 122 850 U·ml-1 şi 127 920 U·ml-1, corespunzător, alcătuind 315,0 şi 328,0% faţă de proba proximă (39 000 U·ml-1).

1. Рубан Е.Л. Микробные липиды и липазы. Москва, Наука, 1977, р. 132-137

2. MD 2709 F1 2005.02.28

3. Walisko R., Krull R., Wittmann C. Microparticle-based morphology engineering of filamentous microorganisms for industrial bio-production. Biotechnology Letters, 2012, vol. 34, Issue 11, p. 1975-1982

4. Driouch H., Roth A., Dersch P., Wittmann C. Optimized bioprocess for production of fructofuranosidase by recombinant Aspergillus niger. Appl Microbiol Biotechnol. 2010, 87(6) p. 2011-24

5. MD 2458 F1 2004.05.31

Claims (1)

1. Procedeu de cultivare a tulpinii de fungi Rhizopus arrhizus CNMN FD 03, care prevede obţinerea suspensiei de spori a tulpinii crescute timp de 30 zile pe un mediu de malţ-agar înclinat, adăugarea în suspensie a nanoparticulelor de Fe3O4 cu dimensiunea de 70 nm în concentraţie de 0,005…0,01% cu agitare în decurs de 1…2 min, inocularea suspensiei într-un mediu nutritiv în concentraţie de 10% vol. şi cultivarea submersă la temperatura de 28…30°C cu agitare continuă la 180…200 rot/min în decurs de 48 ore, totodată mediul nutritiv conţine, g/L: făină de soia 35,0, K2HPO4 5,0, (NH4)2SO4 1,0, apă potabilă restul, pH-ul iniţial 8,0.