MD4748C1 - Terapii imunooncolitice - Google Patents

Terapii imunooncolitice Download PDF

Info

Publication number
MD4748C1
MD4748C1 MDA20180086A MD20180086A MD4748C1 MD 4748 C1 MD4748 C1 MD 4748C1 MD A20180086 A MDA20180086 A MD A20180086A MD 20180086 A MD20180086 A MD 20180086A MD 4748 C1 MD4748 C1 MD 4748C1
Authority
MD
Moldova
Prior art keywords
virus
deletion
oncolytic
mutation
agent
Prior art date
Application number
MDA20180086A
Other languages
English (en)
Russian (ru)
Other versions
MD20180086A2 (ro
MD4748B1 (ro
Inventor
Стефен Ховард ТОРН
Original Assignee
Питтсбургский Университет Содружества Системы Высшего Образования
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Питтсбургский Университет Содружества Системы Высшего Образования filed Critical Питтсбургский Университет Содружества Системы Высшего Образования
Publication of MD20180086A2 publication Critical patent/MD20180086A2/ro
Publication of MD4748B1 publication Critical patent/MD4748B1/ro
Publication of MD4748C1 publication Critical patent/MD4748C1/ro

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/768—Oncolytic viruses not provided for in groups A61K35/761 - A61K35/766
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24132—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24171—Demonstrated in vivo effect

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Invenţia se referă la virusuri oncolitice de vaccin variolic, modificate pentru a stimula imunitatea antitumorală şi/sau a diminua imunitatea gazdei şi/sau răspunsul anticorpilor gazdei împotriva virusului. Invenţia se bazează, cel puţin parţial, pe descoperirea că virusul oncolitic de vaccin variolic (i) purtând o deleţie genomică a genei, care reduce imunitatea celulelor T (proteina de legare a interleukinei-18); (ii) tratat cu enzima sialidază, care se crede că reduce activarea TLR2 şi, astfel, răspunsul anticorpilor; (iii) care poartă gena care amplifică inducerea limfocitelor T citotoxice (de exemplu TRIF) şi/sau (iv) care reduce numărul de celule supresoare de origine mieloidă în tumoare prin reducerea cantităţii de prostaglandină E2, reduce creşterea tumorii. Astfel, prezenta invenţie se referă la virusuri imunooncolitice de vaccin variolic şi la metode de utilizare a acestora în tratamentul tumorilor maligne.

Description

Invenţia se referă la virusuri oncolitice de vaccin variolic, care au fost modificate pentru a stimula imunitatea antitumorală şi/sau pentru a reduce răspunsul anticorpilor gazdei împotriva virusului.
Virusurile oncolitice (OV) reprezintă virusuri cu replicare, care în mod natural este selectivă sau modificată, pentru a fi selectivă pentru celulele tumorale, [1], (Kirn D.H. & Thorne S.H. Targeted and armed oncolytic poxviruses: a novel multi-mechanistic therapeutic class for cancer. Nat. Rev. Cancer, no 9, 2009, p. 64-71; Kirn D., Martuza R.L. & Zwiebel J. Replication-selective virotherapy for cancer: Biological principles, risk management and future directions. Nat. Med., no 7, 2001, p. 781-787). Multiple diferite structuri virale au fost examinate ca OV, inclusiv tulpinile virusului vaccinului variolic (VV), [2], (Kirn D.H., Wang Y., Le Boeuf F., Bell J. & Thorne S.H. Targeting of interferon-beta to produce a specific, multi-mechanistic oncolytic vaccinia virus. PLoS. Med. no 4, 2007, e353; Thorne S.H., Hwang T.H., O'Gorman W.E., Bartlett D.L., Sei S., Kanji F., Brown C., Werier J., Cho J.H., Lee D.E., Wang Y., Bell J. & Kirn D.H. Rational strain selection and engineering creates a broad-spectrum, systemically effective oncolytic poxvirus, JX-963. J. Clin. Invest. no 117, 2007, p. 3350-3358; McCart J.A., Ward J.M., Lee J., Hu Y., Alexander H.R., Libutti S.K., Moss B. & Bartlett D.L. Systemic cancer therapy with a tumor-selective vaccinia virus mutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes. Cancer Res. no 61, 2001, p. 8751-8757; Guo Z.S., Naik A., O'Malley M.E., Popovic P., Demarco R., Hu Y., Yin X., Yang S., Zeh H.J., Moss B., Lotze M.T. & Bartlett D.L. The enhanced tumor selectivity of an oncolytic vaccinia lacking the host range and antiapoptosis genes SPI-1 and SPI-2. Cancer Res. no 65, 2005, 9991-9998; Gnant M.F., Noll L.A., Irvine K.R., Puhlmann M., Terrill R.E., Alexander H.R., Jr. & Bartlett D.L. Tumor-specific gene delivery using recombinant vaccinia virus in a rabbit model of liver metastases. J. Natl. Cancer Inst. no 91, 1999, p. 1744-1750; Zhang Q., Yu Y.A., Wang E., Chen N., Danner R.L., Munson P.J., Marincola F.M. & Szalay A.A. Eradication of solid human breast tumors in nude mice with an intravenously injected light-emitting oncolytic vaccinia virus. Cancer Res. 67, 2007, p. 10038-10046; Yu Y.A., Shabahang S., Timiryasova T.M., Zhang Q., Beltz R., Gentschev I., Goebel W. & Szalay A.A. Visualization of tumors and metastases in live animals with bacteria and vaccinia virus encoding light-emitting proteins. Nat. Biotechnol., no 22, 2004, p. 313-320). Cel puţin pentru trei vectori oncolitici aparte în baza vaccinului variolic s-a finalizat testarea fazei I, incluzând tulpina vvDD (Thorne S.H., Hwang T.H., O'Gorman W.E., Bartlett D.L., Sei S., Kanji F., Brown C., Werier J., Cho J.H., Lee D.E., Wang Y., Bell J. & Kirn D.H. Rational strain selection and engineering creates a broad-spectrum, systemically effective oncolytic poxvirus, JX-963. J. Clin. Invest. no 117, 2007, p. 3350-3358; McCart J.A., Ward J.M., Lee J., Hu Y., Alexander H.R., Libutti S.K., Moss B. & Bartlett D.L. Systemic cancer therapy with a tumor-selective vaccinia virus mutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes. Cancer Res. no 61, 2001, p. 8751-8757). Pentru VV OV, JX-594 [2] (Park B.H., Hwang T., Liu T.C., Sze D.Y., Kim J.S., Kwon H.C., Oh S.Y., Han S.Y., Yoon J.H., Hong S.H., Moon A., Speth K., Park C., Ahn Y.J., Daneshmand M., Rhee B.G., Pinedo H.M., Bell J.C. & Kirn D.H. Use of a targeted oncolytic poxvirus, JX-594, in patients with refractory primary or metastatic liver cancer: a phase I trial. Lancet Oncol. no 9, 2008, p. 533-542) (Jennerex) s-au demonstrat recent răspunsuri extrem de promiţătoare în studiile fazei II pentru carcinomul hepatocelular (HCC), inclusiv livrarea sistemică în tumoare. [3], (Breitbach C.J., Burke J., Jonker D., Stephenson J., Haas A.R., Chow L.Q., Nieva J., Hwang, T.H., Moon A., Patt R., Pelusio A., Le Boeuf F., Burns J., Evgin L., De Silva N., Cvancic S., Robertson T., Je J.E., Lee Y.S., Parato K., Diallo J.S., Fenster A., Daneshmand M., Bell J.C. & Kirn D.H. Intravenous delivery of a multi-mechanistic cancer-targeted oncolytic poxvirus in humans. Nature, no 477, 2011, p. 99-102) . Mai mult decât atât, rezultate promiţătoare în faza III au fost raportate pentru virusul herpetic HSV OV (T-Vec, Amgen, [4], (Senzer N.N., Kaufman H.L., Amatruda T., Nemunaitis M., Reid T., Daniels G., Gonzalez R., Glaspy J., Whitman E., Harrington K., Goldsweig H., Marshall T., Love C., Coffin R. & Nemunaitis J.J. Phase II clinical trial of a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-encoding, second-generation oncolytic herpesvirus in patients with unresectable metastatic melanoma. .J Clin. Oncol., no 27, 2009, 5763-5771) în terapia melanomului (16% răspunsuri, comparativ cu 2% în grupul de control). În legătură cu aceasta, a început să fie determinat adevăratul potenţial al OV în tratamentul tumorilor maligne (adiţional la tulpina iniţială de adenovirus ONYX-015 (H-101), [5], (Khuri F., Nemunaitis J., Ganly I., Gore M., MacDougal M., Tannock I., Kaye S., Hong W. & Kirn D. A controlled trial of Onyx-015, an E1B gene-deleted adenovirus, in combination with chemotherapy in patients with recurrent head and neck cancer. Nature Medicine, no 6, 2000, p. 879-885), care rămâne singurul remediu terapeutic pe bază de OV pe orice piaţă (Garber K. China approves world's first oncolytic virus therapy for cancer treatment. J. Natl. Cancer Inst., no 98, 2006. p. 298-300).
În pofida acestor rezultate promiţătoare, răspunsurile complete cu utilizarea OV rămân a fi rare. Este important de menţionat, că, tulpinile OV de prima şi de a doua generaţie au fost concepute, în primul rând, pentru a distruge celulele tumorale prin replicare selectivă, care conduce direct la liza celulelor. In plus, atât JX-594, cât şi T-Vec exprimă o citokină transgenă (GM-CSF), care, ar fi de aşteptat, stimulează limfocitele gazdei [3], (Park B.H., Hwang T., Liu T.C., Sze D.Y., Kim J.S., Kwon H.C., Oh S.Y., Han S.Y., Yoon J.H., Hong S.H., Moon A., Speth K., Park C., Ahn Y.J., Daneshmand M., Rhee B.G., Pinedo H.M., Bell J.C. & Kirn D.H. Use of a targeted oncolytic poxvirus, JX-594, in patients with refractory primary or metastatic liver cancer: a phase I trial. Lancet Oncol. no 9, 2008, p. 533-542; Liu T.C., Hwang T., Park B.H., Bell J. & Kirn D.H. The targeted oncolytic poxvirus JX-594 demonstrates antitumoral, antivascular, and anti-HBV activities in patients with hepatocellular carcinoma. Mol. Ther., no 16, 2008, p.1637-1642; Kim M.K., Breitbach C.J., Moon A., Heo J., Lee Y.K., Cho M., Lee J.W., Kim S.G., Kang D.H., Bell J.C., Park B.H., Kirn D.H. & Hwang T.H. Oncolytic and immunotherapeutic vaccinia induces antibody-mediated complement-dependent cancer cell lysis in humans. Science translational medicine, no 5, 2013, 185ra63). Cercetările preclinice au demonstrat importanţa critică a răspunsului imun în activitatea terapeutică a VV oncolitic, în care (i) toţi şoarecii erau rezistenţi la provocări repetate, după un răspuns complet după terapia VV, indicând o necesitate absolută de inducere a unei imunităţi adaptive antitumorale (Contag C.H., Sikorski R., Negrin R.S., Schmidt T., Fan A.C., Bachireddy P., Felsher D.W. & Thorne S.H. Definition of an enhanced immune cell therapy in mice that can target stem-like lymphoma cells. Cancer Research, no 70, 2010, p. 9837-9845); (ii) efectele vaccinului VV asigură un beneficiu terapeutic mai mare, decât vaccinurile echivalente DC (Yang Y., Huang C.T., Huang X. & Pardoll D.M. Persistent Toll-like receptor signals are required for reversal of regulatory T cell-mediated CD8 tolerance. Nature immunology, no 5, 2004, p. 508-515); (iii) infecţia tumorii VV produce un profil specific de citokine ("constanta imunologică de respingere" (Worschech A., Chen N., Yu Y.A., Zhang Q., Pos Z., Weibel S., Raab V., Sabatino M., Monaco A., Liu H., Monsurro V., Buller R.M., Stroncek D.F., Wang E., Szalay A.A. & Marincola F.M. Systemic treatment of xenografts with vaccinia virus GLV-1h68 reveals the immunologic facet of oncolytic therapy. BMC genomics, no 10, 2009, p. 301)); (iv) terapia VV reduce numărul de celule imunosupresive în tumoare (MDSC, T-reg şi macrofage M2) (Thorne S.H., Liang W., Sampath P., Schmidt T., Sikorski R., Beilhack A. & Contag C.H. Targeting localized immune suppression within the tumor through repeat cycles of immune cell-oncolytic virus combination therapy. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy, no 18, 2010, p. 1698-705); (v) răspunsul imun, indus de terapia VV, este capabil de eradicarea tumorii reziduale şi a metastazelor cu mult mai târziu după eliminarea virusului, asigurând o supraveghere imunologică pe termen lung pentru a preveni recidiva (Contag C.H., Sikorski R., Negrin R.S., Schmidt T., Fan A.C., Bachireddy P., Felsher D.W. & Thorne S.H. Definition of an enhanced immune cell therapy in mice that can target stem-like lymphoma cells. Cancer Research, no 70, 2010, p. 9837-9845; Thorne S.H., Liang W., Sampath P., Schmidt T., Sikorski R., Beilhack A. & Contag C.H. Targeting localized immune suppression within the tumor through repeat cycles of immune cell-oncolytic virus combination therapy. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy, no 18, 2010, p. 1698-705; Thorne S.H. Enhancing biological therapy through conditional regulation of protein stability. Expert reviews in molecular medicine, no 12, 2010, e2) şi (vi) în unele studii se pare că o replicare virală sigură nu este de fapt necesară pentru un efect terapeutic (Wang L.C., Lynn R.C., Cheng G., Alexander E., Kapoor V., Moon E.K., Sun J., Fridlender Z.G., Isaacs S.N., Thorne S.H. & Albelda S.M. Treating Tumors With a Vaccinia Virus Expressing IFNbeta Illustrates the Complex Relationships Between Oncolytic Ability and Immunogenicity. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy, 2011; Prestwich R.J., Ilett E.J., Errington F., Diaz R.M., Steele L.P., Kottke T., Thompson J., Galivo F., Harrington K.J., Pandha H.S., Selby P.J., Vile R.G. & Melcher A.A. Immune-mediated antitumor activity of reovirus is required for therapy and is independent of direct viral oncolysis and replication. Clin. Cancer Res., no 15, 2009, p. 4374-4381). Astfel, efectele imunoterapeutice ale OV, în particular VV, sunt, cel puţin, la fel de importante ca şi efectele oncolitice directe, şi aceşti vectori, probabil, trebuie să fie luaţi în considerare în primul rând în calitate de remedii imunoterapeutice.
Este necesar de remarcat, că vectorii clinici actuali nu au fost concepuţi ca remedii imunoterapeutice (cu excepţia expresiei unor citokine aparte) şi această zonă a rămas relativ insuficient explorată. De aceea, există un potenţial imens nerealizat pentru îmbunătăţirea vectorilor oncolitici prin optimizarea interacţiunilor lor cu sistemul imun al gazdei şi pentru crearea vectorilor capabili de vaccinare in situ împotriva antigenelor tumorale respective. În mod alternativ, majoritatea metodelor tradiţionale pentru vaccinurile terapeutice împotriva tumorilor maligne au avut un succes limitat în clinică, în special împotriva tumorilor mai mari, în pofida dovezilor de imunizare eficientă (Banchereau J. & Palucka A.K. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nat. Rev. Immunol., no 5, 2005, p. 296-306; Nestle F.O., Tonel G. & Farkas A. Cancer vaccines: the next generation of tools to monitor the anticancer immune response. PLoS. Med., no 2, 2005, e339; Rosenberg S.A., Yang J.C. & Restifo N.P. Cancer immunotherapy: moving beyond current vaccines. Nat. Med., no 10, 2004, p. 909-915). Astfel, sunt necesare, de asemenea, metode noi pentru vaccinuri, care în mod ideal vor media inducerea răspunsurilor împotriva antigenelor respective în fiecare tumoare, care vor depaşi supresia chiar şi în interiorul tumorilor mari şi vor îmbunătăţi homing-ul celulelor T în tumorile-ţintă.
Prezenta invenţie se referă la virusuri "imunooncolitice" de vaccin variolic, care au fost modificate pentru a stimula imunitatea antitumorală şi/sau pentru a reduce răspunsul imun şi răspunsul anticorpilor gazdei împotriva virusului. Aceasta se bazează, cel puţin în parte, pe descoperirea inhibării îmbunătăţite a creşterii tumorii cu virusul oncolitic al vaccinului variolic, care este un remediu tratat cu un agent, care reduce nivelul de glicozilare, şi/sau tratat cu enzima sialidaza (care se consideră, că reduce activarea TLR2 şi reduce răspunsul anticorpilor gazdei împotriva virusului); şi/sau poartă modificări sau deleţii ale acidului nucleic genomic viral, care codifică un produs, care reduce imunitatea celulară T (proteina virală de legare a interleukinei-18); şi/sau poartă acidul nucleic care codifică un produs care (i) amplifică inducţia limfocitelor T citotoxice (TRIF) şi/sau (ii) reduce numărul de celule supresoare, derivate din mieloide, în tumoare (MDSC) prin reducerea cantităţii de prostaglandină E2. Respectiv, prezenta invenţie se referă la virusuri oncolitice de vaccin variolic şi la metode de utilizare a acestora în tratamentul tumorilor maligne.
Invenţia se explică prin desenele din fig. 1-30, care reprezintă:
fig. 1A-C, (A) pentru virusul WR.ΔC12L - selectivitatea pentru tumorile in vivo, comparativ cu virusul WR parental. Şoarecii C57BL/6, purtători de tumori CMT-93, au fost trataţi i/v cu 5e8 PFU de virusuri şi şoarecii au fost sacrificaţi la interval predeterminat de timp după tratament. PFU viral au fost cuantificate în diferite ţesuturi post mortem după omogenizare. (B) Efecte antitumorale îmbunătăţite ale WR.ΔC12L. Şoarecii C57BL/6, purtători de tumori subcutanate CMT-93, au fost trataţi i/v cu o singură doză (1e8 PFU) de virus şi s-a urmărit supravieţuirea (definită ca timp până când volumul tumorii atinge 1000 mm3, determinat prin măsurare cu şublerul). (C) Producţia de IFN-γ (ca un marker al producţiei de celule T efector) din splenocite, recuperate de la şoarecii trataţi în prealabil cu virusul indicat şi după expunerea ex vivo cu WR.
fig. 2A-E, deglicozilarea învelişului virusului variolic. (A) Imunoblotarea, care arată deglicozilarea proteinei învelişului virusului variolic. Virusurile WR purificate şi WR deglicozilat au fost distruse şi supuse bloting-ului folosind un anticorp anti-B5R. Reducerea masei de proteină corespunde deglicozilării proteinei B5R. (B) Deglicozilarea învelişului virusului nu exercită nici un efect asupra infectivităţii virusului variolic. Diferite linii de celule tumorale murine au fost infectate cu TK sau cu versiunea sa deglicozilată la MOI 1 şi exprimarea luciferazei virale a fost măsurată la 3 ore după infectare prin imagistică bioluminescentă. Valorile medii +SD din 3 experimente independente sunt reprezentate pe grafic. (C) Deglicozilarea reduce activarea TLR2 in vitro. Celulele HEK293, care exprimă TLR2 murine au fost transfectate cu pNiFty (o plasmidă reporter pentru transmiterea semnalului TLR). Peste 24 de ore după transfecţie, celulele au fost infectate la MOI 1 cu WR sau WR deglicozilat şi activarea TLR2 a fost cuantificată peste 24 de ore după infectare prin imagistică bioluminescentă. Sunt afişate valorile medii +SD din 3 experimente independente (efectuate în cvadruplicat). (D) Fosforilarea STAT3 este epuizată în limfocitele splenice ale şoarecilor, injectaţi cu virusul variolic deglicozilat. Conţinutul procentual de pSTAT1 -pSTAT3+ în limfocite a fost determinat prin citometrie de flux. PBS şi PAM (3) CSK (4) au fost utilizaţi în calitate de control. Valorile pentru şoareci individuali şi mediile ±SEM pentru diferite tratamente sunt reprezentate grafic. (E) Deglicozilarea membranei virusului vaccinului variolic amplifică expresia genelor virale în tumori in vivo. Şoarecii BALB/c, purtători de xenogrefe subcutanate de celule Renca (adenocarcinom renal murin), au fost aleatoriu randomizaţi şi li s-a injectat o singură doză intravenoasă de 1x108 PFU per şoarece de TK- sau TK- deglicozilate. Cinetica expresiei genelor virale în interiorul tumorii a fost monitorizată prin imagistica bioluminescentă pentru expresia luciferazei virale. Valorile medii pentru 12...13 animale +SD sunt reprezentate grafic. *, P<0,05 concludentă, comparativ cu PBS sau cu controlul. #, P<0,05 concludentă, comparativ cu grupa cu TK- sau WR. φ, P<0,05 concludentă, comparativ cu grupa cu PAM (3) CSK (4).
fig. 3A-D, stoparea activării TLR2 prin deglicozilare conduce la accentuarea efectelor terapeutice. (A) Tratarea tulpinii de vaccin variolic WR cu enzima sialidaza (DS) rezultă cu pierderea activării căii de semnalizare TLR2 într-un model in vitro (activarea NF-kB în celulele HEK293, transfectate pentru a exprima TLR2). (B) Pentru virusul WR DS este arătată o livrare sistemică îmbunătăţită în mod semnificativ în tumorile murine (tumorile subcutanate 4T1 la şoarecii BALB/c cu virusul livrat i/v şi exprimarea transgenei virale a luciferazei în tumoare, determinată peste 24 de ore prin imagistica bioluminiscentă (notă: pentru ţesuturile netumorale nu se relevă deosebiri de absorbţie virală). (C) Efectul antitumoral în acelaşi model a demonstrat un avantaj terapeutic al virusului DS. (D) Pierderea activării TLR2 (la şoarecii transgenici cu knock out TLR2) după infecţie cu vaccin variolic conduce la o inducere semnificativ mai redusă de anticorpi neutralizanţi antivirali (anticorp neutralizant, măsurată ca abilitate a diferitor diluţii de ser de şoarece, colectate peste 14 zile după tratare cu WR, de a împiedica exprimarea luciferazei transgenice virale după amestecare cu WR. TK-Luc+ şi infectarea stratului de celule BSC-1).
fig. 4A-C, (A) diagrama schematică, reprezentând construcţia virusului TK-TRIF şi diagrama schematică, reprezentând construcţia virusului TK-DAI. (B) Analizele ELISA au fost utilizate pentru a determina concentraţiile de TRIF în celule infectate cu TK- şi TK-TRIF. (C) Western blot, care prezintă expresia DAI în controlul TK-DAI.
fig. 5A-C, (A) expresia TRIF de la virusul vaccinului variolic amplifică producerea IFN de tip I in vitro, chiar şi depăşind exprimarea în tulpina B18R-. (B) Expresia TRIF amplifică producerea de CTL in vivo. (C) Un efect terapeutic amplificat suplimentar in vivo după o unică livrare i/v de 1e8 PFU de virus la şoarecii BALB/c, purtători de tumori subcutanate Renca.
fig. 6A-D, virusul oncolitic de vaccine oncolitic, care exprimă proteina TRIF murină, amplifica activarea cailor responsabile de TLR şi eliberarea citokinelor şi chemokinelor proinflamatorii. (A-B) Activarea căilor NF-κβ (A) şi IRF3 (B) după infecţia cu TK-TRIF şi TK-DAI. Testele ELISA au fost utilizate pentru a determina concentraţiile de ρIΚβ şi IRF3 în extracte citoplasmatice şi nucleare, respectiv, de celule 4T1 sau MEF, infectate cu TK-, TK-TRIF sau TK-DAI la MOI 1. Analizele s-au efectuat peste 24 de ore după infecţie. Datele au fost obţinute în cvadruplicat din 2 experimente independente şi reprezentate grafic ca o multiplicitate a modificării, comparativ cu TK- +SD. Linia punctată indică nivelul de activare TK-. (C) Eliberarea de citokine şi chemokine in vitro după infecţie TK-TRIF şi TK-DAI. Concentraţiile de IL-6, IP-10, TNF-α şi IFN-δ în supernatantul celulelor Renca, 4T1, MC38 şi MEF au fost evaluate prin testul Luminex peste 24 de ore după infectare cu TK-, TK-TRIF sau TK-DAI (MOI 1). Datele sunt reprezentate ca multiplicitate a modificării, comparativ cu TK- + SD (2 experimente independente). Linia punctata indică concentraţiile de TK-. (D) Concentraţia intratumorală de citokine şi chemokine in vivo. Şoarecii BALB/c cu xenogrefe subcutanate Renca stabilite au fost aleatoriu randomizaţi şi injectaţi intravenos cu o singură doză 1x108 PFU per şoarece de TK- sau TK-TRIF. Multiplicitatea modificării, comparativ cu TK- pentru 4...5 şoareci, +SD este reprezentată grafic. Linia punctata indică concentraţiile de TK-. *, P<0,05 concludentă, comparativ cu grupa cu TK-. #, P<0,05 concludentă, comparativ cu grupa cu TK-DAI.
fig. 7A-E, testele ELISA au fost utilizate pentru determinarea concentraţiei de NF-κB (A), HMGB1 (B) şi Hsp-70 (C) în celulele infectate cu TK-, TK-TRIF sau TK-DAI la MOI 1. Analizele au fost efectuate peste 24 ore după infectare. Datele au fost obţinute şi reprezentate grafic ca multiplicitate a modificării, comparative cu TK- + SD. Linia punctata indica nivelul de activare pentru TK-. Nivelul de celule T helper (D) şi celule T reglatoare (E) au fost analizate ca răspuns la infecţia cu virusul TK- sau TK-TRIF.
fig. 8A-D, replicarea şi activitatea antitumorală a TK-TRIF şi TK-DAI. (A) Producţia virusurilor TK-TRIF şi TK-DAI în celulele tumorale de şoarece. Diferite linii de celule tumorale au fost infectate la MOI 1 şi producerea virusului a fost măsurată prin analiza rozetelor la diferite intervale de timp. Randamentul viral a fost evaluat în cvadruplicat pentru fiecare linie celulară, prin efectuarea a două experimente independente. Mediile +SD sunt reprezentate grafic. (B) Citotoxicitatea comparativă a TK-TRIF şi TK-DAI. Celulele au fost infectate cu virusurile indicate în doze variind de la 75 până la 0,00025 PFU/celulă. Sunt afişate valorile EC50 (MOI, necesară pentru a produce o reducere de 50% din viabilitatea culturii de celule) în ziua 4 după infectare. Patru replici diferite au fost cuantificate pentru fiecare linie celulară şi este arătată media pentru fiecare MOI. (C-D) Expresia genelor virale şi eficacitatea antitumorală in vivo. Xenogrefele de Renca sau MC38 au fost implantate şoarecilor BALB/c sau C57BL/6, respectiv, şi şoarecii au fost injectaţi cu PBS sau 1x108 PFU de TK-, TK-TRIF sau TK-DAI prin vena caudală. Exprimarea luciferazei virale în tumori (C) şi volumul tumorilor (D) au fost măsurate la momente de timp indicate. n = 12...15 şoareci/grupă + SE. *, P<0,05 concludentă, comparativ cu grupa cu PBS. #, P<0,05 concludentă, comparativ cu grupa cu TK-. φ, P <0,05 concludentă, comparativ cu grupa cu TK-DAI.
fig. 9A-F, (A) expresia genelor virale TK-TRIF şi TK-DAI în celulele tumorale de şoarece. Diferite linii de celule tumorale au fost infectate la MOI 1 şi exprimarea luciferazei virale a fost cuantificată prin imagistica bioluminescentă la diferite momente de timp. Exprimarea luciferazei a fost evaluată în cvadruplicat pentru fiecare linie de celule, prin efectuarea a două experimente independente. Mediile +SD sunt reprezentate grafic. (B) Procentul de celule apoptotice după infectare cu TK-TRIF şi TK-DAI. O grupă de linii de celule tumorale de şoarece a fost infectată cu virusurile indicate folosind MOI 1. Peste 48 de ore după infectare, procentul de celule necrotice şi apoptotice a fost determinat prin citometrie în flux prin colorare cu PI şi anexină V. Au fost efectuate două experimente independente şi mediile +SD sunt reprezentate grafic. (C-D) TK-TRIF îmbunătăţeşte eficacitatea antitumorală a TK-GMCSF într-un model semiortotopic pe glanda mamară. Celulele 4T1 au fost implantate în stratul adipos al glandei mamare la şoarecii BALB/c şi după stabilirea tumorii, şoarecii au fost injectaţi cu PBS sau 1x108 PFU de TK-, TK-TRIF sau TK-GMCSF prin vena caudală. Exprimarea luciferazei virale din interiorul tumorilor (C) şi volumul tumorii (D) au fost măsurate la momente de timp indicate. n = 12...14 şoareci/grupă +SE. (E-F) TK-TRIF îmbunătăţeşte supravieţuirea şoarecilor purtători de tumori. Şoarecii BALB/c sau C57BL/6, purtători de xenogrefe Renca (E) sau MC38 (F), respectiv, au fost trataţi ca în fig. 3d şi punctul final s-a stabilit la un volum al tumorii de ≥750 mm3. Curbele de supravieţuire Kaplan-Meyer sunt reprezentate grafic, n = 12...15 şoareci/grupă. *, P<0,05 concludentă, comparativ cu PBS sau control. #, P<0,05 concludentă, comparativ cu lotul cu -. φ, P<0,05 concludentă, comparativ cu grupa cu TK-GMCSF. Ω, P<0,05 concludentă, comparativ cu grupa cu TK-DAI.
fig. 10A-E, (A) variaţiile masei corporale după administrarea intravenoasă a TK-TRIF deglicozilată. Şoarecilor BALB/C a fost injectat intravenos 1x108 PFU per şoarece de TK-, TK-TRIF sau TK-TRIF deglicozilată. Administrarea tamponului fosfat-salin (PBS) a fost utilizată în grupa de control. Şoarecii injectaţi cu TK- au prezentat o reducere depăşind 10% din masa corporală în ziua a 6 după injectarea virusului, în timp ce şoarecii la care s-a injectat TK-TRIF şi TK-TRIF deglicozilată au prezentat un profil de masă, similar cu profilul pentru şoarecii la care s-a injectat PBS. (B) Expresia genelor virale in vivo după administrarea TK-TRIF deglicozilată. Tumorile RENCA au fost implantate la şoarecii BALB/c şi şoarecii le-a fost injectat PBS sau 1x108 PFU de TK-, TK-TRIF sau TK-TRIF deglicozilată prin vena caudală. Exprimarea luciferazei virale din interiorul tumorilor a fost măsurată la momentele de timp indicate. n = 12...14 şoareci/grupă +SE. (C-D) Supravieţuirea şoarecilor purtători de tumori, trataţi cu TK-TRJF deglicozilată. (C-D) Xenogrefele Renca (C) sau MC38 (D) au fost stabilite la şoarecii BALB/C sau C57BL/6, respectiv, şi au fost trataţi cu o singură doză intravenoasă de 1x108 PFU de virusuri indicate sau PBS. Punctul final a fost stabilit la volumul tumorii de ≥750 mm3 şi curbele de supravieţuire Kaplan-Meyer sunt reprezentate grafic, n = 12...15 şoareci/grupă. (E) TK-TRIF deglicozilată îmbunătăţea supravieţuirea, comparativ cu grupa tratată cu TK-GMCSF. Şoarecii (BALB/c purtători de tumori subcutanate RENCA) au fost trataţi prin injectare în vena caudală a PBS sau a unei doze unice de 1x108 PFU de TK-GMCSF sau TK-TRIF deglicozilată (n = 10...12 per grupă). Curbele de supravieţuire Kaplan-Meyer au fost obţinute după stabilirea unui punct final ≥750 mm3 pentru volumul tumorii. *, P<0,05 concludentă, comparativ cu grupa cu PBS. #, P<0,05 concludentă, comparativ cu lotul cu TK-. φ, P<0,05 concludentă, comparativ cu grupa cu TK-deglicozilată. Ω, P<0,05 concludentă, comparativ cu grupa cu TK-TRIF. ψ, P<0,05 concludentă, comparativ cu grupa cu TK-GMCSF.
fig. 11A-F, combinarea de membrană deglicozilată şi de exprimare TRIF murină stimula marcant răspunsurile celulare antitumorale şi prezenta o eficacitate antitumorală înaltă. (A-B) Răspunsurile imune celulare la virusul vaccinului variolic şi celulele tumorale au fost evaluate prin testul ELISpot IFN-Γ. În ziua a 7 după administrarea virusului, splinele au fost recoltate de la şoarecii injectaţi intravenos cu 1x108 PFU de virusuri indicate sau de PBS (şoareci BALB/c, purtători de xenogrefe Renca) şi a fost estimat numărul de CTL, care recunosc virusul vaccinului variolic sau (A) sau celule Renca (B ). Sunt prezentate valorile pentru şoareci individuali şi mediile ±SEM. (C) Titrele de anticorpi neutralizanţi în ser. Analiza neutralizării s-a efectuat pentru a determina nivelele de anticorpi împotriva virusului variolic pentru şoarecii, l-a care s-au injectat 1x108 PFU TK-, TK-TRIF sau TK-TRIF deglicozilată. Titrele de Nab au fost determinate prin cea mai mare diluţie a serului care a condus la cel puţin 50% de inhibare a infecţiei. Valorile pentru şoareci individuali şi mediile ±SEM sunt reprezentate grafic. (D-E) Activitatea antitumorală in vivo în diferite modele. BALB/c, care poartă xenogrefe de tumori Renca (D) sau C57BL/6 purtând xenogrefe de tumori MC38 (E) au fost trataţi intravenos cu o doză unică de virusuri indicate (1x108 UFP/şoarece). Creşterea tumorii a fost urmărită prin măsurări cu şublerul. Sunt prezentate mediile pentru 12...15 şoareci per grupă +SE. (F) Pentru TK-TRIF deglicozilată s-a înregistrat o activitate antitumorală mai mare, decât pentru TK-GMCSF. Şoarecilor BALB/c, purtători de xenogrefe RENCA, le-a fost injectată intravenos o doză de 1x108 PFU/şoarece de TK-GMCSF sau TK-TRIF deglicozilată. Volumul relativ al tumorii după administrarea virusului este reprezentat grafic (n = 12...15 şoareci/grupă + SE). *, P<0.05 concludentă, comparativ cu grupa cu PBS. #, P<0,05 concludentă, comparativ cu grupa cu TK -. φ, P<0,05 concludentă, comparativ cu grupa cu TK- deglicolizată. Ω, P<0,05 concludentă, comparativ cu grupa cu TK-TRIF.
fig.12A-C, (A) pentru tulpina de vaccin variolic WR cu tratare cu DS, deleţia C12L şi exprimarea mTRIF (denumită UPCI-1812) sunt arătate efectele antitumorale îmbunătăţite la şoarecii BALB/c, purtători de tumori 4T1, comparativ cu tulpinile clinice actuale WR.TK-GM-CSF+ (în calitate de model al tulpinii JX-594). Pentru virusul UPCI-1812 este prezentată, de asemenea, creşterea producerii de citokine imunoterapeutice în micromediul tumorii, inclusiv (B) de gama interferon şi (C) de interleukină-12.
fig. 13A-C, (A) supravieţuirea diferitor linii de celule tumorale a fost analizată după infecţia cu virus TK-. (B) Expresia genelor virale în tumorile, derivate de la şoarecii BALB/c şi C57BL/6 după implantarea anumitor linii de celule tumorale, şi volumul tumorilor obţinute de la BALB/c şi C57BL/6 după implantare cu anumite linii de celule tumorale şi infecţia cu TK -. (C) Detectarea Sp6 fosforilată în celulele mieloide în tumorile, derivate de la şoarecii BALB/c şi C57BL/6 după implantare cu anumite linii de celule tumorale şi tratare cu TK-.
fig. 14A-B, (A) şoarecii care nu poartă tumori sau care poartă tumori subcutanate derivate din celule LLC sau B16 (50-100 mm3) au fost trataţi cu o singură injecţie intravenoasă de 1x107 PFU WR.TK-. Şoarecii (n = 3 per grupă şi perioada de timp) au fost sacrificaţi în perioadele de timp indicate şi au fost prelevate splinele şi serul. Splenocitele au fost fixate rapid şi permeabilizate (conform protocolului inventatorilor prezentei invenţii, publicat anterior) şi apoi colorate pentru phosflow pentru a detecta activarea căilor de semnalizare. Aceasta s-a realizat pentru celule T reglatoare (CD3+ CD4+ CD8-FoxP3+ CD25+) cu analiza pSTAT5, pS6 şi Ki67; pentru celulele T CD4 (CD3+ CD4+ CD8- FOXP3-) cu analiza pS6, Ki67, CD44 şi CD62L şi pentru celulele T CD8 (CD3+ CD4-CD8+ FoxP3-) cu analiza pS6, Ki67, CD44 şi CD62L. (B) Nivelurile de anticorpi neutralizanţi antivirali au fost de asemenea verificate în ser.
fig. 15A-B, (A) concentraţia de celule T reglatoare şi de celule MDSC în diferite modele de tumori la şoarecii infectaţi cu TK-. (B) Concentraţia de celule T reglatoare, celule MDSC şi de celule T CD8+ în modele de tumori 4T1 şi MC38 la şoarecii infectaţi cu TK-.
fig. 16A-B, (A) metodele de selectare pentru detectarea MDSC (stânga) şi celulele T şi T-reg (dreapta) pentru splenocite sau celulele, recuperate din tumori dezagregate. (B) Nivelurile de MDSC şi T-reg în splină sunt prezentate pentru şoarecii purtători de diferite tumori.
fig. 17A-C, (A) pentru tulpina de vaccin variolic TK- este arătată capacitatea foarte redusă de a creşte supravieţuirea mediană (comparativ cu controlul cu PBS) în modele de tumori la şoarecii, care prezintă un nivel ridicat de MDSC la momentul iniţial. De asemenea, terapia TK- virală poate reduce nivelul de (B) T-reg în tumorile tratate, dar nu are nici un impact asupra nivelurilor de MDSC (C).
fig. 18, analiza răspunsului imun la şoarecii cu celule implantate de tumori MC38 după tratare cu tulpini imunogene de vaccin variolic, GM-CSF, WR.TK-GM-CSF, WR.B18R-IFNα+, WR.B18R-IFNβ+ şi WR.B18R -IFNγ+ în comparaţie cu răspunsul imun provocat de infecţie cu TK-.
fig. 19, analiza răspunsului imun la şoarecii cu celule implantate de tumori 4T1 după tratare cu tulpini imunogene de vaccin variolic, GM-CSF, WR.TK-GMCSF şi WR.B18R-IFNβ+ în comparaţie cu răspunsul imun provocat de infecţie cu TK-.
fig. 20, exprimarea COX2 şi HPGD după exprimarea WR-TK-HPGD sau tratare cu inhibitorul Cox 2, celecoxib. Beta-actina a fost detectată ca un control de aplicare. Exprimarea PGE2 a fost determinată în celule RENCA după infecţia cu WR-TK-HPGD sau WR TK- sau tratare cu celecoxib.
fig. 21A-D, expresia HPGD de la virusul oncolitic de vaccin variolic a redus cantitatea de MDSC în tumoare şi a sensibilizat tumorile restante la terapia virală. (A) Efectul expresiei HPGD asupra nivelurilor de T-reg şi MDSC în tumori. Şoarecii purtători de tumori Renca au fost trataţi cu injecţii intratumorale cu o doză mică (1x107 PFU) de virus indicat şi şoarecii erau sacrificaţi în perioadele de timp indicate, tumorile erau recuperate, dezagregate şi analizate prin citometrie de flux, ca şi mai înainte. Expresia HPGD reduce nivelurile de MDSC şi T-reg (*p<0,05, comparativ cu controlul). (B) Activitatea terapeutică amplificată a WR.TK-.HPGD+. Şoarecii purtători de tumori subcutanate Renca sau MC38 au fost trataţi cu o singură injecţie intratumorală de PBS sau 1x107 PFU sau WR.TK- sau WR.TK-HPGD+ şi creşterea ulterioara a tumorii a fost urmărită prin măsurarea cu un şubler (n = 15 per grupă; WR.TK- HPGD+ concludent (p<0,05) reţinea creşterea tumorii din ziua a 3 (RENCA) sau ziua a 7 (MC38), comparativ cu WR.TK-, şi a condus la 3 răspunsuri complete pentru RENCA şi 2 pentru MC38. Nici pentru un şoarece din orice altă grupă nu este arătat CR). (C) Compararea creşterii tumorii şi expresiei genelor virale în tratamentul cu WR.TK-.HPGD+. Creşterea tumorii la şoareci individuali cu tumori Renca şi după tratare cu WR.TK-HPGD+ este reprezentată grafic, comparativ cu controlul cu PBS (bara gri) şi se împarte în cei cu răspuns bun (linie continue) şi cu cel mai bun răspuns (linie punctată). Semnalul bioluminiscenţei (expresia genelor virale) din tumoare în ziua 1 şi 5 s-a normalizat după volumul tumorii şi s-a demonstrat atât pentru cei cu răspuns bun, cât şi pentru cei cu cel mai bun răspuns. (D) Expresia HPGD nu a redus expresia genelor virale. Este prezentată expresia genei luciferazei virale în interiorul tumorii peste 24 de ore după tratare cu WR.TK sau WR.TK-HPGD +.
fig. 22, volumul tumorii în funcţie de zile după tratamentul cu control cu PBS (CTL, cerc), negativ după timidinkinaza Western Reserve VV (WR TK-; pătrate) sau negativ timidinkinaza (TK) Western Reserve VV, purtătoare de HPGD (WR TK- HPGD, triunghiuri) (HPGD reprezintă echivalentul murin de proteină 15-PGDH umană).
fig. 23A-D, procentul de MDSC în (A) splina şoarecilor infectaţi cu WR TK-; (B) splina şoarecilor infectaţi cu WR TK- HPGD; (C) tumoarea şoarecilor infectaţi cu WR TK-; şi (D) tumoarea şoarecilor infectaţi cu WR TK- HPGD.
fig. 24A-D, expresia HPGD amplifică răspunsul imun şi modifica transportul de celule imune la tumoare. (A) Profilul citokinelor şi chemokinelor în tumoare după diferite tratamente. Şoarecii purtători de tumori Renca au fost trataţi, cum a fost indicat, cu 1x107 PFU de diferite tulpini virale IT şi sacrificaţi peste 3 zile. Omogenatele tumorale au fost analizate cu Luminex pentru cuantificarea diferite citokine şi chemokine (*p<0,05). (B) Răspunsul anti-tumoral CTL creşte la expresia HPGD. În splenocitele, colectate de la şoarecii purtători de tumoare RENCA peste 7 zile după tratamentele menţionate, au fost cuantificate răspunsurile antitumorale CTL, determinate prin ELISPOT (*p<0,06). (C) Modificările sistemice ale nivelurilor de chemokine după diferite tratamente. În serul, colectat de la şoarecii purtători de tumori RENCA peste 3 zile după tratamentele menţionate, au fost cuantificate nivelurile de chemokine prin ELISA (p<0,05). (D) Celulele imune activate ţintesc preponderent tumorile, infectate cu virusul care exprimă HPGD. Şoarecilor le-au fost implantate tumori bilaterale RENCA şi când acestea atingeau 50...100 mm3, şoarecilor le-au fost injectate 1x107 PFU WR.TK- pe un flanc şi WR.TK-HPGD+ pe flancul opus, peste 24 de ore 1x107 celule NK T (CIK) activate şi marcate Cy5.5 au fost livrate prin injecţie în vena caudală. Peste 24 de ore pentru şoareci au fost primite imaginile prin bioluminiscenţă (expresia genelor virale) şi fluorescenţă (transportul de celule T NK la tumori) (*p<0,05). Este prezentat un exemplu reprezentativ de imagistică fluorescentă.
fig. 25, expresia COX2 în tumorile infectate cu WR.TK-, comparativ cu tumorile netratate.
fig. 26A-B, (A) supravieţuirea diferitor linii celulare după infecţie cu TK-. (B) Producerea virusului şi expresia genelor virale TK- în diferite linii de celule tumorale.
fig. 27, expresia genelor virale în modele, infectate cu TK-, de tumori MC-38, LLC şi AB12 la şoareci peste 4 zile sau 5 zile după infecţie.
fig. 28, creşterea tumorii în funcţie de zile după tratamentul cu PBS sau infecţie cu WR.TK-TRIF+- deglicozilată (UPCI-1812), Western Reserve TK-, purtătoare de HPGD (VV-HPGD) sau UPCI-1812 în combinaţie cu expresia HPGD.
fig. 29, producerea de EEV ameliorat (mutaţia A34R K151E) conduce la un nivel mai redus de anticorpi neutralizanţi antivirali (14 zile de la livrarea IP a WR sau EEV).
fig. 30, domeniile TRIF. În secvenţa aminoacidă TRIF umană există trei domenii legând TRAF şi domeniul RHIM, care leagă RIP1.
Pentru claritatea descrierii, şi nu pentru a limita, descrierea detaliată a invenţiei este divizată în următoarele subcapitole:
(I) mutaţiile virale ale carcasei virale;
(ii) modificarea glicozilării virale;
(iii) modificarea, care stimulează răspunsul celulelor T;
(iv) modificarea, care inhibă imunosupresia;
(v) modificarea, care îmbunătăţeşte răspândirea şi activitatea virusului;
(vi) virusuri modificate;
(vii) metode de tratament; şi
(viii) kituri.
Termenul "omologie", în contextual prezentei invenţii, se referă la gradul de omologie între secvenţele de acizi nucleic sau secvenţele aminoacide, cum este definit cu utilizarea metodelor cunoscute în domeniu, în calitate de exemple nerestrictive, de software, cum ar fi BLAST sau FASTA.
Mutaţii ale carcasei virale
În anumite realizări nelimitative ale invenţiei, VV conţine una sau mai multe mutaţii ale genomului său, care favorizează replicarea virusului într-o celula de cancer şi/sau care amplifică inducerea unui răspuns imun al limfocitelor T citotoxice (CTL). O mutaţie poate reprezenta o inserţie, deleţie sau substituţie a unuia sau mai multor acizi nucleici ai virusului nativ.
În realizări particulare nelimitative, mutaţia conduce la reducerea exprimării proteinei care leagă funcţional interleukina-18 ("IL-18BP"). Ca exemple nelimitative, (i) mutaţia poate avea ca rezultat o proteină cu legare mai slabă la IL-18, decât proteina nativă VV; (ii) mutaţia poate conduce la exprimarea unei proteine trunchiate cu o activitate funcţională redusă sau absentă sau (iii) mutaţia poate şterge gena IL-18BP. Într-un anumit exemplu nelimitativ mutaţia poate fi o deleţie C12L (de exemplu, (Symons et al. J. Gen.Virol. no 83, 2002, p. 2833-2844). În anumite variante de realizare deleţia C12L poate reprezenta o eliminare totală sau parţială a C12L. În calitate de exemplu nerestrictiv, o eliminare parţială a C12L poate include o mutaţie, care conduce la eliminarea cel puţin aproximativ 10%, cel puţin aproximativ 20%, cel puţin aproximativ 30% sau cel puţin aproximativ 40% sau mai mult din secvenţele aminoacide ale proteinei C12L.
În alte exemple de realizare nelimitative, carcasa virală poate conţine, separat sau adiţional la una sau mai multe mutaţii în (incluzând deleţia) în acidul nucleic care codifică IL-18BP, descris mai sus, o mutaţie în acidul nucleic care codifică B8R (proteina de legare a IFN gama, (Symons J.A., Alcami A. & Smith G.L. Vaccinia virus encodes a soluble type I interferon receptor of novel structure and broad species specificity. Cell, no 81, 1995, p. 551-560), B18R (proteina de legare a IFN tip I, de exemplu, (Colamonici et al. J. Biol. Chem., vol. 270(27), 1995, p. 15974-15978)), A35R (inhibitor al prezentării MHC II, de exemplu, (Rehm et al. Virology., vol. 397(1), 2010, p. 176-186; Roper et al. J. Virol., vol, 80(1), 2006, p. 306-313)), B15R (proteina de legare a IL-1β, de exemplu, (Alcami et al. Chemokine binding proteins (B29R, G3R, H5R), STAT1 inhibitor (H1L); dsRNA of PKR inhibitors such as E3L. Cell, vol. 71(1), 1992, p. 153-167)), proteinele de legare a chemokinei (B29R, G3R, H5R), inhibitorul STAT1 (H1L); inhibitorii ARNdc sau PKR, cum ar fi E3L (de exemplu, (Chang et al. Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 89(11), 1992, p. 4825-4829)) sau K3L (de exemplu, (Davies et al. J. Virol., vol. 67(3), 1993, p. 1688-1692; Langland et al. Virology, vol. 299(1), 2002, p. 133-141)); proteinele similar Bcl-2 (cum ar fi N1, N2, B14, F1, C6, A46 şi K7), sau o combinaţie a acestora.
Modificarea glicozilării virale.
În anumite variante nelimitative de realizare a invenţiei VV este tratat cu un agent care modifică glicozilarea. De exemplu, în celula producătoare de VV poate fi administrat un inhibitor de glicozilare şi/sau ea poate fi cultivată în prezenţa unui inhibitor de glicozilare, sau VV poate fi tratat cu un agent care reduce sau modifică glicozilarea. În variante concrete de realizare VV poate fi supus unui tratament cu acid pentru a reduce glicozilarea virusului. În anumite variante de realizare VV, conform prezentei invenţii, poate fi produs într-o linie celulară care nu are activitate de glicozilare, de exemplu, datorită mutaţiilor în una sau în mai multe enzime de glicozilare.
În variante concrete de realizare VV, tratat cu un agent care reduce sau elimină, sau modifică glicozilarea, de exemplu, un virus deglicozilat, poate avea mai puţin de aproximativ 90%, mai puţin de aproximativ 80%, mai puţin de aproximativ 70%, mai puţin de aproximativ 60%, mai puţin de aproximativ 50%, mai puţin de aproximativ 40%, mai puţin de aproximativ 30%, mai puţin de aproximativ 20% sau mai puţin de aproximativ 10% din glicozilarea unui VV, care nu a fost tratat cu agent care modifică glicozilarea.
În variantele concrete nerestrictive VV, conform prezentei invenţii, poate fi tratat cu enzima sialidaza, care reduce cantităţile de reziduuri sau elimină reziduurile de acid sialic de pe suprafaţa virusului (de exemplu, de înveliş). În exemplele de realizare nelimitative VV este tratat cu enzima sialidaza înainte de administrare la un pacient. Într-o variantă concretă nelimitativă enzima sialidaza reprezintă sialidaza A (Glyko Sialidase A, cod WS0042), de exemplu, ca parte a kitului pentru deglicozilare enzimatică Glycopro (Cod de produs: GK80110, Prozyme). În anumite realizări VV poate fi tratat cu sialidază A în combinaţie cu N- şi O-glicanaze. Alte enzime, care elimină acidul sialic sau scindează reziduurile de glicozil de la virus, pot fi, de asemenea, utilizate în prezenta invenţie, incluzând, dar nefiind exhaustive, neuraminidazele, PNG-azele (de exemplu, PNGază A sau PNGază F), galactozidaza β1-4, β-ν-acetilglucozaminidaza sau utilizarea unor tratamente chimice, cum ar fi b-eliminarea sau hidroliza alcalină sau hidrazinoliza.
Fără legătură cu o anumită teorie, se presupune, că reducerea glicozilării, de exemplu prin tratarea virusului vaccinului cu sialidază, reduce activarea TLR2 şi, astfel, întârzie activarea sistemică a sistemului imunitar în timpul perioadei de livrare a virusului şi/sau reduce producerea de anticorpi de neutralizare virală.
Modificări, care stimulează răspunsul celulelor T
În variante concrete nerestrictive de realizare a invenţiei VV este modificat pentru a include unul sau mai mulţi acizi nucleici, care codifică peptida sau proteina care stimulează răspunsul celulelor T. În anumite realizări peptida sau proteina, care stimulează răspunsul celulelor T poate stimula exprimarea unei sau a mai multor citokine proinflamatorii. De exemplu, şi fără restricţii, citokinele proinflamatorii pot include IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IFN-α, IFN-β, IFN-Γ, CCL5 şi IP-10.
Exemplele nelimitative de peptide sau proteine, care stimulează răspunsul celulelor T includ: adaptorul conţinând domeniul Toll/IL-1R, care induce IFN-β ("TRIF") sau un domeniu funcţional al acestuia. În anumite realizări nelimitative acidul nucleic poate codifica TRIF uman având o secvenţă de aminoacizi, cum este indicat în UniProtKB Nr. Q8IUC6, sau o secvenţă de aminoacizi cel puţin în aproximativ 90%, cel puţin în aproximativ 95% sau cel puţin în aproximativ 98% fiind omoloagă ei, sau TRIF murin având o secvenţă de aminoacizi, cum este indicat în UniProtKB Nr. Q80UF7, sau o secvenţă de aminoacizi cel puţin în aproximativ 90%, cel puţin în aproximativ 95% sau cel puţin în aproximativ 98% fiind omoloagă ei.
În variante concrete nerestrictive de realizare a prezentei invenţii acidul nucleic poate codifica unul sau mai multe domenii TRIF, cum este prezentat în fig. 30. În anumite variante de realizare acidul nucleic, care codifică o peptidă sau o proteină, care stimulează răspunsul celulelor T, de exemplu, TRIF, pot fi clonate în locusul genei timidinkinazei (TK) a virusului, cum este prezentat în fig. 4A. Acidul nucleic, care codifică o peptidă sau o proteină, care stimulează răspunsul celulelor T, poate fi funcţional legat cu orice promotor care poate conduce la exprimarea acidului nucleic. Cum este utilizat în acest context, "funcţional legat" înseamnă, că un promotor este într-o locaţie şi/sau orientare funcţional corectă în raport cu o secvenţă de acid nucleic pentru a controla iniţierea transcripţiei şi/sau expresia acestei secvenţe. In variante concrete de realizare promotorul reprezintă un promotor al virusului vaccinului variolic şi/sau un promotor virusului sintetic al vaccinului variolic. În anumite variante de realizare promotorul reprezintă promotorul pSE/L al virusului sintetic al vaccinului variolic. În anumite realizări acidul nucleic, care codifică o peptidă sau o proteină, care stimulează răspunsul celulelor T este funcţional legat cu promotorul viral p7.5.
În alte realizări nelimitative acidul nucleic poate codifica factorul de stimulare a coloniilor de granulocite-macrofage ("GM-CSF"), IL-12, IFN-Γ sau IL-18. În anumite realizări mai mult de un astfel de acid nucleic poate fi încorporat în VV.
Modificări care inhibă imunosupresia.
În variante concrete nerestrictive de realizare a prezentei invenţii VV este modificat pentru a include unul sau mai mulţi acizi nucleici, care codifică o peptidă sau o proteină, sau acizi ribonucleici sau micro-ARN, care inhibă sau reduc imunosupresie. Exemplele nelimitative de măsurări ale imunosupresiei includ: nivelul de celule supresoare derivate din mieloide ("MDSC"); nivelul macrofagelor M2 şi nivelul celulelor T helper, comparativ cu celulele T reglatoare supresoare. În realizări particulare nelimitative acidul nucleic codifică o peptidă sau o proteină, sau acidul ribonucleic sau micro-ARN reduce activitatea prostaglandinei E2 ("antagonistul PGE2"). În exemplele de realizare concrete nelimitative acidul nucleic codifică o peptidă şi/sau o proteină care este un antagonist al PGE2 (cum acest termen este utilizat în acest context), care degradează PGE2. Într-un exemplu concret nelimitativ proteina, care degradează PGE2, reprezintă 15-PGDH (uman) sau HPGD (murin). De exemplu, şi fără restricţii, 15-PGDH poate avea o secvenţă de aminoacizi, cum este indicat în UniProtKB Nr. P15428, sau o secvenţă de aminoacizi cel puţin în aproximativ 90%, cel puţin în aproximativ 95% sau cel puţin în aproximativ 98% fiind omoloagă acesteia, şi acidul nucleic care codifică 15-PGDH poate avea o secvenţă de acid nucleic, cum este indicat în GenBankAccession Nr. U63296.1, sau o secvenţă de acid nucleic care cel puţin în aproximativ 90%, cel puţin în aproximativ 95% sau cel puţin în aproximativ 98% fiind omoloagă acesteia. În alte exemple de realizare nelimitative un acid nucleic care codifică o versiune secretată şi solubilizată a receptorului extracelular pentru PGE2 poate fi inclus în VV, de exemplu, acidul nucleic care codifică EP1, EP2, EP3 şi/sau EP4, în care EP3 şi 4 posedă o afinitate mai înaltă. În variante concrete de realizare a prezentei invenţii una sau mai multe peptide sau proteine, care inhibă sau reduc imunosupresia, pot conduce la o exprimare redusă a unei sau mai multor chemokine supresive, cum ar fi, dar nefiind exhaustivă, CXCL12. În variante concrete de realizare a invenţiei una sau mai multe peptide sau proteine, care inhibă sau reduc imunosupresia, pot conduce la expresia crescută a unei sau mai multor chemokine imunoactive, cum ar fi, dar nefiind exhaustive, CXCL9, CXCL10 şi CCL5.
În anumite realizări ale prezentai invenţii acidul nucleic, care codifică antagonistul PGE2, poate fi clonat în locusul genei timidinkinazei (TK) a virusului. Acidul nucleic, care codifică o peptidă sau proteină - antagonist al PGE2, poate fi funcţional legată cu orice promotor, care poate conduce la exprimarea acidului nucleic. În variante concrete de realizare a prezentai invenţii acidul nucleic, care codifică o peptidă sau o proteină - antagonist al PGE2, este funcţional legată cu promotorul viral p7.5. În anumite variante de realizare promotorul reprezintă promotorul virusului vaccinului variolic şi/sau promotorul virusului sintetic al vaccinului variolic. În anumite variante de realizare promotorul reprezintă promotorul pSE/L al virusului sintetic al vaccinului variolic. În anumite variante virusul poate include acidul nucleic, care codifică antagonistul PGE2, şi acidul nucleic care codifică o peptidă sau o proteină care stimulează răspunsul celulelor T, ambele fiind funcţional legate cu un promotor, de exemplu, cu promotorul viral p7.5, şi clonate în locusul genei timidinkinazei (TK) a virusului.
În următoarele exemple de realizare nelimitative virusul imunooncolitic al prezentei invenţii poate fi administrat împreună cu un agent care inhibă sau reduce numărul de MDSC, incluzând, de exemplu, dar nefiind exhaustivi, un anticorp care ţinteşte markerul suprafaţă MDSC, cum ar fi anticorpul anti-CD33 sau regiunea variabilă a acestuia; un anticorp anti-CD11b sau regiunea variabilă a acestuia; un inhibitor al COX2, de exemplu, celecoxib; sunitinib şi/sau acidul transretinoic complet (Najjar and Finke. Frontiers in Oncology, vol. 3(49), 2013, p. 1-9).
Modificări care îmbunătăţesc răspândirea şi activitatea virusului.
În variante concrete nerestrictive de realizare a prezentei invenţii VV este modificat pentru a îmbunătăţi răspândirea şi/sau activitatea virusului. În realizări particulare nelimitative VV este modificat pentru a creşte numărul formei de virus extracelular cu înveliş produs, de exemplu, prin introducerea unei sau a mai multe dintre următoarele mutaţii: A34R Lys151 la Glu; eliminarea totală sau parţială a B5R; mutaţia/deleţia A36R şi/sau mutaţia/deleţia A56R. În anumite variante de realizare a prezentei invenţii VV este modificat pentru a include o eliminare totală sau parţială a B5R.
Virusuri modifcate.
În exemplele de realizare nelimitative prezenta invenţie se referă la VV imunooncolitic conţinând una sau mai multe, sau două sau mai multe, sau trei sau mai multe, sau patru sau mai multe dintre următoarele modificări, cum este descris mai sus:
(i) mutaţii ale carcasei virale;
(ii) modificarea glicozilării virale;
(iii) modificarea, care stimulează răspunsul celulelor T;
(iv) modificarea, care inhibă imunosupresia;
(v) modificarea, care îmbunătăţeşte răspândirea şi activitatea virusului.
În exemplele de realizare nelimitative prezenta invenţie se referă la VV conţinând o modificare a glicozilării virale şi una sau mai multe dintre următoarele modificări, cum este descris în subcapitolele de mai sus:
(i) mutaţiile virale ale carcasei virale;
(ii) modificarea, care stimulează răspunsul celulelor T;
(iii) modificarea, care inhibă imunosupresia; şi/sau
(iv) modificarea, care îmbunătăţeşte răspândirea şi activitatea virusului.
În exemplele de realizare nelimitative prezenta invenţie se referă la VV care este tratat cu un agent care reduce nivelul de glicozilare (de exemplu, sialilarea) înainte de administrare la o gazdă şi include sau poartă, sau conţine una sau mai multe dintre următoarele modificări, cum este descris în subcapitolele de mai sus:
(i) mutaţiile virale ale carcasei virale;
(ii) modificarea, care stimulează răspunsul celulelor T;
(iii) modificarea, care inhibă imunosupresia; şi/sau
(iv) modificarea, care îmbunătăţeşte răspândirea şi activitatea virusului.
În exemplele de realizare nelimitative prezenta invenţie se referă la VV care manifestă o glicozilare redusă (de exemplu, sialilare) în raport cu virusul nemodificat şi care include sau poartă, sau conţine una sau mai multe dintre următoarele modificări, cum este descris în subcapitolele de mai sus:
(i) mutaţiile virale ale carcasei virale;
(ii) modificarea, care stimulează răspunsul celulelor T;
(iii) modificarea, care inhibă imunosupresia; şi/sau
(iv) modificarea, care îmbunătăţeşte răspândirea şi activitatea virusului.
În variantele de realizare nelimitative prezenta invenţie se referă la VV care este tratat cu un agent, care reduce nivelul de glicozilare, înainte de administrare la o gazdă sau care într-un alt mod reduce glicozilarea în raport cu virusul nemodificat.
În exemplele de realizare nelimitative prezenta invenţie se referă la VV, care este tratat cu sialidază înainte de administrare la o gazdă sau care într-un alt mod posedă o cantitate redusă de reziduuri ale acidului sialic, în raport cu virusul nemodificat.
În exemplele de realizare nelimitative prezenta invenţie se referă la VV, care include sau poartă, sau conţine un acid nucleic care codifică TRIF.
În exemplele de realizare nelimitative prezenta invenţie se referă la VV, care include sau poartă, sau conţine un acid nucleic, care codifică un antagonist al PGE2 (de exemplu, 15-PGDH sau HPGD).
În exemplele de realizare nelimitative prezenta invenţie se referă la VV, care conţine una sau mai multe modificări, care îmbunătăţesc răspândirea şi activitatea virusului, selectate din grupul de mutaţii A34R Lys151 până la Glu; deleţia totală sau parţială a B5R; mutaţia/deleţia A36R şi/sau mutaţia/deleţia A56R.
În exemplele de realizare nelimitative prezenta invenţie se referă la VV, care conţine una sau câteva modificări ale carcasei virusului selectate din grupul de mutaţii, care reduc expresia IL-18BP funcţională (de exemplu, deleţia C12L), deleţia B8R, deleţia B18R, deleţia A35R, sau o combinaţie a acestora.
În exemplele de realizare nelimitative prezenta invenţie se referă la VV, care este tratat cu un agent care reduce nivelul de glicozilare înainte de administrare la o gazdă sau care într-un alt mod posedă o glicozilare redusă, în raport cu virusul nemodificat şi include suplimentar sau poartă, sau conţine un acid nucleic care codifică TRIF sau un domeniu funcţional al acestuia.
În exemplele de realizare nelimitative prezenta invenţie se referă la VV, care este tratat cu un agent care reduce nivelul de glicozilare (de exemplu, sialilarea) înainte de administrare la o gazdă sau care într-un alt mod posedă o glicozilare redusă (de exemplu, sialilare redusă), în raport cu virusul nemodificat şi include suplimentar sau poartă, sau conţine un acid nucleic care codifică un antagonist al PGE2 (de exemplu, 15-PGDH sau HPGD).
În exemplele de realizare nelimitative prezenta invenţie se referă la VV, care este tratat cu un agent care reduce nivelul de glicozilare (de exemplu, sialilarea) înainte de administrare la o gazdă sau care într-un alt mod posedă o glicozilare redusă (de exemplu, sialilare redusă), în raport cu virusul nemodificat şi include suplimentar sau poartă, sau conţine un acid nucleic care codifică TRIF sau un domeniu funcţional al acestuia şi/sau un acid nucleic care codifică un antagonist al PGE2 (de exemplu, 15-PGDH sau HPGD),
În exemplele de realizare nelimitative prezenta invenţie se referă la VV, care este tratat cu un agent care reduce nivelul de glicozilare (de exemplu, sialilarea) înainte de administrare la o gazdă sau care într-un alt mod posedă o glicozilare redusă (de exemplu, sialilare redusă), în raport cu virusul nemodificat şi conţine suplimentar una sau mai multe modificări care îmbunătăţesc răspândirea şi activitatea virusului, selectate din grupul de mutaţii A34R Lys151 până la Glu; deleţia completă sau parţială B5R; mutaţia/deleţia A36R şi/sau mutaţia/deleţia A56R. În anumite realizări prezenta invenţie se referă la VV deglicozilat, care conţine deleţia totală sau parţială a B5R.
În exemplele de realizare nelimitative prezenta invenţie se referă la VV, care este tratat cu un agent care reduce nivelul de glicozilare (de exemplu, sialilarea) înainte de administrare la o gazdă sau care într-un alt mod posedă o glicozilare redusă (de exemplu, sialilare redusă), în raport cu virusul nemodificat şi conţine suplimentar una sau mai multe modificări ale carcasei virusului, selectate din grupul de mutaţii, care reduc expresia IL-18BP funcţionale (de exemplu, deleţia C12L), deleţia B8R, deleţia B18R, deleţia A35R, sau o combinaţie a acestora. În anumite realizări prezenta invenţie se referă la VV deglicozilat, care cuprinde deleţia C12L.
În exemplele de realizare nelimitative prezenta invenţie se referă la VV, care este tratat cu un agent care reduce nivelul de glicozilare (de exemplu, sialilarea) înainte de administrare la o gazdă sau care într-un alt mod posedă o glicozilare redusă (de exemplu, sialilare redusă), în raport cu virusul nemodificat şi conţine suplimentar una sau mai multe modificări ale carcasei virusului, selectate din grupul de mutaţii, care reduc expresia IL-18BP funcţionale (de exemplu, deleţia C12L), deleţia B8R, deleţia B18R, deleţia A35R, sau o combinaţie a acestora, şi conţine suplimentar una sau mai multe modificări care îmbunătăţesc răspândirea şi activitatea virusului, selectate din grupul de mutaţii A34R Lys151 până la Glu; deleţia completă sau parţială B5R; mutaţia/deleţia A36R şi/sau mutaţia/deleţia A56R. În anumite realizări prezenta invenţie se referă la VV deglicozilat, care conţine deleţia C12L şi deleţia B5R.
În exemplele de realizare nelimitative prezenta invenţie se referă la VV, care este tratat cu un agent care reduce nivelul de glicozilare (de exemplu, sialilarea) înainte de administrare la o gazdă sau care într-un alt mod posedă o glicozilare redusă (de exemplu, sialilare redusă), în raport cu virusul nemodificat şi include suplimentar sau poartă, sau conţine un acid nucleic care codifică TRIF sau un domeniu funcţional al acestuia şi conţine suplimentar una sau mai multe modificări ale carcasei virusului, selectate din grupul de mutaţii, care reduc expresia IL-18BP funcţionale (de exemplu, deleţia C12L), deleţia B8R, deleţia B18R, deleţia A35R, sau o combinaţie a acestora. In anumite variante, virusul conţine deleţia C12L.
În exemplele de realizare nelimitative prezenta invenţie se referă la VV, care este tratat cu un agent care reduce nivelul de glicozilare (de exemplu, sialilarea) înainte de administrare la o gazdă sau care într-un alt mod posedă o glicozilare redusă (de exemplu, sialilare redusă), în raport cu virusul nemodificat şi include suplimentar sau poartă, sau conţine un acid nucleic care codifică un antagonist al PGE2 (de exemplu, 15-PGDH sau HPGD) şi conţine suplimentar una sau mai multe modificări ale carcasei virusului, selectate din grupul de mutaţii, care reduc expresia IL-18BP funcţionale (de exemplu, deleţia C12L), deleţia B8R, deleţia B18R, deleţia A35R, sau o combinaţie a acestora.
În exemplele de realizare nelimitative prezenta invenţie se referă la TK-VV, care este tratat cu un agent care reduce nivelul de glicozilare (de exemplu, sialilarea) înainte de administrare la o gazdă sau care într-un alt mod posedă o glicozilare redusă (de exemplu, sialilare redusă), în raport cu virusul nemodificat şi include suplimentar sau poartă, sau conţine un acid nucleic care codifică TRIF sau un domeniu funcţional al acestuia şi un acid nucleic care codifică un antagonist al PGE2 (de exemplu, 15-PGDH sau HPGD), şi conţine suplimentar una sau mai multe modificări ale carcasei virusului, selectate din grupul de mutaţii, care reduc expresia IL-18BP funcţionale (de exemplu, deleţia C12L), deleţia B8R, deleţia B18R, deleţia A35R, sau o combinaţie a acestora.
În exemplele de realizare nelimitative prezenta invenţie se referă la VV, care este tratat cu un agent care reduce nivelul de glicozilare (de exemplu, sialilarea) înainte de administrare la o gazdă sau care într-un alt mod posedă o glicozilare redusă (de exemplu, sialilare redusă), în raport cu virusul nemodificat şi include suplimentar sau poartă, sau conţine un acid nucleic care codifică TRIF sau un domeniu funcţional al acestuia şi conţine suplimentar una sau mai multe modificări care îmbunătăţesc răspândirea şi activitatea virusului, selectate din grupul de mutaţii A34R Lys151 până la Glu; deleţia completă sau parţială B5R; mutaţia/deleţia A36R şi/sau mutaţia/deleţia A56R.
În exemplele de realizare nelimitative prezenta invenţie se referă la VV, care este tratat cu un agent care reduce nivelul de glicozilare (de exemplu, sialilarea) înainte de administrare la o gazdă sau care într-un alt mod posedă o glicozilare redusă (de exemplu, sialilare redusă), în raport cu virusul nemodificat şi include suplimentar sau poartă, sau conţine un acid nucleic care codifică un antagonist al PGE2 (de exemplu, 15-PGDH sau HPGD) şi conţine suplimentar una sau mai multe modificări care îmbunătăţesc răspândirea şi activitatea virusului, selectate din grupul de mutaţii A34R Lys151 până la Glu; deleţia completă sau parţială B5R; mutaţia/deleţia A36R şi/sau mutaţia/deleţia A56R.
În exemplele de realizare nelimitative prezenta invenţie se referă la VV care este tratat cu un agent care reduce nivelul de glicozilare (de exemplu, sialilarea) înainte de administrare la o gazdă sau care într-un alt mod posedă o glicozilare redusă (de exemplu, sialilare redusă), în raport cu virusul nemodificat şi include suplimentar sau poartă, sau conţine un acid nucleic care codifică TRIF sau un domeniu funcţional al acestuia şi un acid nucleic care codifică un antagonist al PGE2 (de exemplu, 15-PGDH sau HPGD), şi conţine suplimentar una sau mai multe modificări care îmbunătăţesc răspândirea şi activitatea virusului, selectate din grupul de mutaţii A34R Lys151 până la Glu; deleţia completă sau parţială B5R; mutaţia/deleţia A36R şi/sau mutaţia/deleţia A56R.
În exemplele de realizare nelimitative prezenta invenţie se referă la VV care este tratat cu un agent care reduce nivelul de glicozilare (de exemplu, sialilarea) înainte de administrare la o gazdă sau care într-un alt mod posedă o glicozilare redusă (de exemplu, sialilare redusă), în raport cu virusul nemodificat şi include suplimentar sau poartă, sau conţine un acid nucleic care codifică TRIF sau un domeniu funcţional al acestuia şi un acid nucleic care codifică un antagonist al PGE2 (de exemplu, 15-PGDH sau HPGD), şi conţine suplimentar una sau mai multe modificări care îmbunătăţesc răspândirea şi activitatea virusului, selectate din grupul de mutaţii A34R Lys151 până la Glu; deleţia completă sau parţială B5R; mutaţia/deleţia A36R şi/sau mutaţia/deleţia A56R şi conţine una sau mai multe modificări ale carcasei virusului, selectate din grupul de mutaţii, care reduc expresia IL-18BP funcţionale (de exemplu, deleţia C12L), deleţia B8R, deleţia B18R, deleţia A35R, sau o combinaţie a acestora. În anumite variante VV poate conţine deleţia C12L şi deleţia B5R.
Modificările descrise mai sus pot fi produse într-un VV (virus al vaccinului variolic), care este cunoscut în domeniu. Exemple nelimitative include: tulpina Western Reserve, tulpina Copenhagen; tulpina Wyeth (NYCBOH); tulpina Tian Tian sau tulpina USSR. Tulpina de bază VV modificată, cum este indicat în prezentul context, poate cuprinde în sine una sau mai multe mutaţii, comparativ cu tulpina iniţială, de exemplu, dar fără a se limita la acestea, una sau mai multe dintre următoarele: deleţia în TK (adică, notată aici ca "TK-" ); deleţia în VGF; deleţia SPI-1 şi/sau deleţia SPI-2.
În anumite realizări nelimitative prezenta invenţie se referă la VV cu următoarele modificări:
(i) învelişul cu glicozilare redusă (de exemplu, sialilare redusă) în raport cu un virus nemodificat;
(ii) acidul nucleic care codifică TRIF sau un domeniu funcţional al acestuia şi/sau
(iii) acidul nucleic care codifică 15-PGDH, sau un domeniu funcţional al acestuia.
În exemplele de realizare nelimitative prezenta invenţie se referă la VV cu următoarele modificări:
(i) învelişul cu glicozilare redusă (de exemplu, sialilare redusă) în raport cu un virus nemodificat;
(ii) acidul nucleic care codifică TRIF sau un domeniu funcţional al acestuia;
(iii) acidul nucleic care codifică 15-PGDH, sau un domeniu funcţional al acestuia şi/sau
(iv) deleţia C12L.
În exemplele de realizare nelimitative prezenta invenţie se referă la VV cu următoarele modificări:
(i) învelişul cu glicozilare redusă (de exemplu, sialilare redusă) în raport cu un virus nemodificat;
(ii) acidul nucleic care codifică TRIF sau un domeniu funcţional al acestuia;
(iii) acidul nucleic care codifică 15-PGDH, sau un domeniu funcţional al acestuia;
(iv) deleţia C12L; şi/sau
(v) deleţia B5R.
În exemplele de realizare nelimitative prezenta invenţie se referă la VV cu următoarele modificări:
(i) deleţia TK;
(ii) învelişul cu glicozilare redusă (de exemplu, sialilare redusă) în raport cu un virus nemodificat;
(iii) acidul nucleic care codifică TRIF sau un domeniu funcţional al acestuia; şi/sau
(iv) acidul nucleic care codifică 15-PGDH, sau un domeniu funcţional al acestuia.
În exemplele de realizare nelimitative prezenta invenţie se referă la VV cu următoarele modificări:
(i) deleţia TK;
(ii) învelişul cu glicozilare redusă (de exemplu, sialilare redusă) în raport cu un virus nemodificat;
(iii) acidul nucleic care codifică TRIF sau un domeniu funcţional al acestuia;
(iv) acidul nucleic care codifică 15-PGDH, sau un domeniu funcţional al acestuia; şi/sau
(v) deleţia C12L.
În exemplele de realizare nelimitative prezenta invenţie se referă la VV cu următoarele modificări:
(i) deleţia TK;
(ii) învelişul cu glicozilare redusă (de exemplu, sialilare redusă) în raport cu un virus nemodificat;
(iii) acidul nucleic care codifică TRIF sau un domeniu funcţional al acestuia;
(iv) acidul nucleic care codifică 15-PGDH, sau un domeniu funcţional al acestuia;
(v) deleţia C12L; şi/sau
(vi) deleţia B5R.
Metode de tratament
Prezenta invenţie se referă la o metodă de reducere a creşterii celulelor de cancer, care prevede administrarea în celula de cancer a pacientului, a unei cantităţi eficiente de VV imunooncolitic, cum este descris mai sus. Reducerea creşterii unei celule de cancer se poate manifesta, de exemplu, prin moartea celulelor sau o rată mai lentă de replicare sau o rată de creştere redusă a tumorii, care conţine celule tumorale, sau o supravieţuire prelungită a pacientului, care conţine celulele canceroase.
"Subiect" sau "pacient", cum este utilizat interschimbabil aici, se referă la un om sau un subiect neuman. Exemplele nelimitative de subiecţi neumani includ: primate neumane, câini, pisici, şoareci, şobolani, porci de Guineea, iepuri, porci, găini, cai, vaci, capre, oi, etc.
Prezenta invenţie se referă la o metodă de reducere a creşterii unei tumori care prevede administrarea în tumoare a unei cantităţi eficiente de VV imunooncolitic, cum este descris mai sus. Reducerea creşterii unei tumori se poate manifesta, de exemplu, prin rata de creştere redusă sau o supravieţuire prelungită a unui subiect care conţine o tumoare.
Prezenta invenţie se referă la o metodă de tratare a unui pacient, care are o tumoare malignă, care prevede administrarea la subiect, a unei cantităţi eficiente de VV imunooncolitic, cum este descris mai sus.
"Cantitate eficientă" într-o astfel de metodă include o cantitate, care reduce rata de creştere sau răspândirea cancerului sau care prelungeşte supravieţuirea pacientului. În anumite forme de realizare o cantitate eficientă poate include o cantitate, care este suficientă pentru a produce un efect anticanceros la un pacient.
"Efectul anticanceros", cum este utilizat aici, se referă la una sau câteva dintre reducerea agregării masei de celule canceroase, reducerea ratei de creştere a celulelor de cancer, reducerea proliferării celulelor canceroase, reducerea masei tumorale, reducerea volumului tumorii, reducerea proliferării celulelor tumorale, reducerea ratei de creştere a tumorii şi/sau reducerea metastazelor tumorii.
În anumite realizări prezenta invenţie se referă la o metodă de producere a unui efect anticanceros la un pacient care are o tumoare malignă, care prevede administrarea la subiect a unei cantităţi eficiente de VV imunooncolitic, cum este descris mai sus.
În exemplele de realizare concrete nelimitative cantitatea de VV administrată (de exemplu, doza) poate varia între circa 103 şi 1011 unităţi formatoare de plăci (PFU) sau între aproximativ 105 şi 1010 PFU, sau între aproximativ 105 şi 108 PFU, sau între aproximativ 105 şi 1011 PFU, sau între aproximativ 108 şi 1011 PFU (Thorne and Kirn. Nat. Rev. Cancer, vol. 9, 2009, p. 64-71). Este necesar de menţionat, că în prezentul context 10x este exprimat în mod alternativ ca 1eX. În anumite variante de realizare virusul oncolitic poate fi administrat într-o singură doză sau poate fi administrat în doze multiple. În anumite variante, in care virusul se administrează în doze multiple, dozele pot fi administrate consecutiv, de exemplu, cu intervale zilnice, săptămânale sau lunare, sau pentru satisfacerea unei necesităţi concrete a subiectului.
În anumite variante de realizare a prezentei invenţii virusul imunooncolitic poate fi administrat într-o compoziţie farmaceutică, în care virusul este prezent într-o cantitate eficientă şi în combinaţie cu un purtător farmaceutic acceptabil.
"Farmaceutic acceptabil", cum este utilizat aici, include orice purtător care nu interferă cu eficienţa activităţii biologice a ingredientelor active şi/sau care nu este toxic pentru pacientul, la care se administrează. Exemple nelimitative de purtători farmaceutici adecvaţi include: soluţii de tampon salin-fosfat, apă, emulsii, cum ar fi emulsii ulei/apă, diferite tipuri de agenţi de umectare şi soluţii sterile. Alte exemple nelimitative de purtători compatibili farmaceutic pot include: geluri, materiale matrice bioadsorbabile, elemente de implantare cu conţinut de VV oncolitic sau orice alt vehicul adecvat, agenţi sau materiale de livrare sau de dispersare. Asemenea purtători pot fi formulaţi prin metode uzuale şi pot fi administraţi la subiect într-o cantitate eficientă.
VV, conform prezentei invenţii, pot fi produse prin metode cunoscute unui specialist în domeniu. În anumite realizări VV poate fi propagat în celule gazdă potrivite, izolat din celulele gazdă şi depozitat în condiţii care contribuie la stabilitatea şi integritatea virusului, astfel încât pierderea de infectivitate de-a lungul timpului este redusă la minimum. De exemplu, VV poate fi păstrat prin congelare sau uscare, cum ar fi prin liofilizare. În anumite realizări înainte de administrare VV stocat poate fi reconstituit (dacă a fost uscat pentru păstrare) şi diluat într-un purtător farmaceutic acceptabil pentru administrare.
Virusul oncolitic poate fi administrat la pacient folosind metode standard de administrare. În anumite variante nelimitative de realizare virusul oncolitic poate fi administrat sistemic. In mod alternativ sau suplimentar virusul oncolitic poate fi administrat prin injectare în regiunea cancerului, de exemplu, în locul tumorii. În calitate de exemple nerestrictive, calea de administrare poate reprezenta o administrare prin inhalare, intranazală, intravenoasă, intraarterială, intratecală, intratumorală, intraperitoneală, intramusculară, subcutanată, topică, intradermică, locală-regională, orală sau o combinaţie a acestora. În anumite variante de realizare virusul oncolitic poate fi administrat pacientului dintr-o sursă implantată în corpul pacientului. În anumite variante de realizare a prezentei invenţii administrarea virusului oncolitic poate avea loc prin infuzie continua pentru o anumită perioada de timp selectată. În anumite realizări compoziţiile farmaceutice pot fi administrate direct în locul unei tumori, de exemplu, prin injectare directă intratumorală.
Cancerele, care pot fi tratate prin terapie cu VV imunooncolitic, includ, dar nefiind exhaustive, adenocarcinom, osteosarcom, carcinom de col uterin, melanom, carcinom hepatocelular, cancer mamar, cancer pulmonar, cancer de prostată, cancer ovarian, leucemie, limfom, cancer renal, cancer pancreatic, cancer gastric, carcinom de colon, cancer duodenal, glioblastom multiform, astrocitom şi sarcom.
În anumite variante de realizare a prezentei invenţii tratamentul cu utilizarea VV imunooncolitic, cum este descris mai sus, poate fi utilizat separat sau în combinaţie cu unul sau mai mulţi agenţi anti-cancer. "Agent anti-cancer" cum este utilizat aici, poate fi orice moleculă, compus, substanţă chimică sau compoziţie, care exercită un efect anticanceros. Agenţii anti-cancer includ, dar nefiind exhaustivi, agenţi chimioterapeutici, agenţi radioterapeutici, citokine, inhibitori ai punctelor de control imune, agenţi antiangiogeni, agenţi care induc apoptoza, anticorpi anti-cancer şi/sau agenţi împotriva kinazelor ciclin-dependente.
În anumite variante de realizare a prezentei invenţii tratamentul cu utilizarea VV imunooncolitic poate fi utilizat solitar sau în combinaţie cu unul sau câţiva agenţi imunomodulatori. Un agent imunomodulator poate include orice compus, moleculă sau substanţă capabilă de a suprima imunitatea antivirala asociată cu o tumoare sau cu cancer. În anumite realizări ale prezentei invenţii agentul imunomodulator este capabil să suprime imunitatea înnăscută şi/sau imunitatea adaptivă împotriva virusului oncolitic. Exemplele nelimitative de agenţi imunomodulatori include: anticorpi anti-CD33 sau o regiune variabilă a acestuia, un anticorp anti-CD11b sau regiune variabilă a acestuia, un inhibitor al COX2, de exemplu, celecoxib, citokine, cum ar fi IL-12, GM-CSF, IL-2, IFNPβ şi IFNγ şi chemokine, cum ar fi MIP-1, MCP-1 şi IL-8. În anumite realizări agentul imunomodulator include inhibitori ai punctelor de control ale sistemului imun, cum ar fi, dar nefiind exhaustive, anti-CTLA4, anti-PD-1, anti-PDL1 şi agonişti ai TLR (de exemplu, poli 1:C).
"În combinaţie cu", cum este utilizat aici, înseamnă că VV imunooncolitic şi unul sau câţiva agenţi sunt administraţi la un subiect ca parte a unui regim sau a unui plan de tratament. În anumite realizări ale prezentei invenţii utilizarea în combinaţie nu impune ca VV imunooncolitic şi unul sau mai mulţi agenţi să fie combinaţi fizic înainte de administrare sau ca aceştia să fie administraţi în aceleaşi intervale de timp. În calitate de exemplu nerestrictiv, VV imunooncolitic şi unul sau mai mulţi agenţi pot fi administraţi concomitent la subiectul care este tratat, sau pot fi administraţi simultan sau consecutiv în orice ordine sau în diferite momente temporale.
În anumite realizări ale prezentei invenţii o metodă de tratare a unui subiect care are un cancer include administrarea la subiect a unei cantităţi eficiente de VV imunooncolitic care conţine: (i) un înveliş cu glicozilare redusă (de exemplu, sialilare redusă) în raport cu un virus nemodificat; (ii) un acid nucleic care codifică TRIF sau un domeniu funcţional al acestuia şi (iii) un acid nucleic care codifică 15-PGDH sau un domeniu funcţional al acestuia.
În anumite realizări ale prezentei invenţii o metodă de tratare a unui subiect care are un cancer include administrarea la subiect a unei cantităţi eficiente de VV imunooncolitic care conţine: (i) un înveliş cu glicozilare redusă (de exemplu, sialilare redusă) în raport cu un virus nemodificat; (ii) un acid nucleic care codifică TRIF sau un domeniu funcţional al acestuia; (iii) un acid nucleic care codifică 15-PGDH sau un domeniu funcţional al acestuia şi (iv) o deleţie C12L.
În anumite realizări ale prezentei invenţii o metodă de tratare a unui subiect care are un cancer include administrarea la subiect a unei cantităţi eficiente de VV imunooncolitic care conţine: (i) un înveliş cu glicozilare redusă (de exemplu, sialilare redusă) în raport cu un virus nemodificat; (ii) un acid nucleic care codifică TRIF sau un domeniu funcţional al acestuia; (iii) un acid nucleic care codifică 15-PGDH sau un domeniu funcţional al acestuia; (iv) o deleţie C12L şi (v) o deleţie B5R.
În anumite realizări ale prezentei invenţii o metodă de tratare a unui subiect care are un cancer include administrarea la subiect a unei cantităţi eficiente de VV imunooncolitic care conţine: (i) o deleţie TK; (ii) un înveliş cu glicozilare redusă (de exemplu, sialilare redusă) în raport cu un virus nemodificat; (iii) un acid nucleic care codifică TRIF sau un domeniu funcţional al acestuia; (iv) un acid nucleic care codifică 15-PGDH sau un domeniu funcţional al acestuia.
În anumite realizări ale prezentei invenţii o metodă de tratare a unui subiect care are un cancer include administrarea la subiect a unei cantităţi eficiente de VV imunooncolitic care conţine: (i) o deleţie TK; (ii) un înveliş cu glicozilare redusă (de exemplu, sialilare redusă) în raport cu un virus nemodificat; (iii) un acid nucleic care codifică TRIF sau un domeniu funcţional al acestuia; (iv) un acid nucleic care codifică 15-PGDH sau un domeniu funcţional al acestuia şi (v) o deleţie C12L.
În anumite realizări ale prezentei invenţii o metodă de tratare a unui subiect care are un cancer include administrarea la subiect a unei cantităţi eficiente de VV imunooncolitic care conţine: (i) o deleţie TK; (ii) un înveliş cu glicozilare redusă (de exemplu, sialilare redusă) în raport cu un virus nemodificat; (iii) un acid nucleic care codifică TRIF sau un domeniu funcţional al acestuia; (iv) un acid nucleic care codifică 15-PGDH sau un domeniu funcţional al acestuia; (v) o deleţie C12L şi (vi) o deleţie B5R.
În anumite variante de realizare a prezentei invenţii metodele pot include adiţional administrarea la subiect a unei cantităţi eficiente din unul sau mai mulţi agenţi. În calitate de exemplu nerestrictiv, agentul poate fi un agent anticanceros şi/sau un agent imunomodulator, cum este descris mai sus.
Kituri.
Prezenta invenţie adiţional se referă la kituri care furnizează VV imunooncolitic, cum este descris mai sus. În anumite realizări un kit, conform prezentei invenţii, poate include VV imunooncolitic sau o compoziţie farmaceutică care conţine VV imunooncolitic, cum este descris mai sus. În anumite realizări un kit, conform prezentei invenţii, poate include unul sau mai multe componente, cum ar fi instrucţiunile de utilizare, dispozitive şi reagenţi suplimentari şi componente, cum ar fi eprubete, containere şi seringi pentru realizarea metodelor descrise mai sus. În anumite realizări un kit, conform prezentei invenţii, poate include unul sau mai mulţi agenţi, de exemplu, agenţi anticancer şi/sau agenţi imunomodulatori, care poate fi administraţi în combinaţie cu un VV imunooncolitic.
În variante concrete de realizare un kit, conform prezentei invenţii, poate include instrucţiuni de utilizare, un dispozitiv pentru administrarea VV imunooncolitic la un subiect sau un dispozitiv pentru administrarea unui agent sau compus adiţional la un subiect. În calitate de exemple nerestrictive instrucţiunile pot include o descriere a VV imunooncolitic şi, în mod opţional, alte componente incluse în kit, precum şi metodele de administrare, inclusiv metodele de determinare a stării corespunzătoare a subiectului, doza corectă necesară şi metoda de administrare potrivită pentru administrarea VV imunooncolitic. Instrucţiunile pot include, de asemenea, îndrumări pentru monitorizarea pacientului pe durata perioadei de tratament.
În variante concrete de realizare un kit, conform prezentei invenţii, poate include un dispozitiv pentru administrarea VV imunooncolitic la un pacient. Oricare din multitudinea de dispozitive cunoscute în domeniu pentru administrarea medicamentelor şi compoziţiilor farmaceutice pot fi incluse în kiturile prezentei invenţii. În calitate de exemple nerestrictive asemenea dispozitive includ un ac hipodermic, un ac pentru administrare intravenoasă, un cateter, un dispozitiv de injectare fără ac, un inhalator şi un distribuitor de lichid, cum ar fi o pipetă. În anumite realizări ale prezentei invenţii VV imunooncolitic pentru administrare sistemică, de exemplu, prin injectare intravenoasă, în kit poate fi inclus un ac hipodermic şi o seringă.
În anumite realizări un kit, conform prezentei invenţii, include o cantitate eficientă de VV imunooncolitic, care conţine: (i) un înveliş cu glicozilare redusă (de exemplu, sialilare redusă) în raport cu un virus nemodificat; (ii) un acid nucleic care codifică TRIF sau un domeniu funcţional al acestuia; (iii) un acid nucleic care codifică 15-PGDH sau un domeniu funcţional al acestuia.
În anumite realizări un kit, conform prezentei invenţii, include o cantitate eficientă de VV imunooncolitic, care conţine: (i) un înveliş cu glicozilare redusă (de exemplu, sialilare redusă) în raport cu un virus nemodificat; (ii) un acid nucleic care codifică TRIF sau un domeniu funcţional al acestuia; (iii) un acid nucleic care codifică 15-PGDH sau un domeniu funcţional al acestuia şi (iv) o deleţie C 12L.
În anumite realizări un kit, conform prezentei invenţii, include o cantitate eficientă de VV imunooncolitic, care conţine: (i) un înveliş cu glicozilare redusă (de exemplu, sialilare redusă) în raport cu un virus nemodificat; (ii) un acid nucleic care codifică TRIF sau un domeniu funcţional al acestuia; (iii) un acid nucleic care codifică 15-PGDH sau un domeniu funcţional al acestuia; (iv) o deleţie C12L şi (v) o deleţie B5R.
În anumite realizări un kit, conform prezentei invenţii, include o cantitate eficientă de VV imunooncolitic, care conţine: (i) o deleţie TK; (ii) un înveliş cu glicozilare redusă (de exemplu, sialilare redusă) în raport cu un virus nemodificat; (iii) un acid nucleic care codifică TRIF sau un domeniu funcţional al acestuia; (iv) un acid nucleic care codifică 15-PGDH sau un domeniu funcţional al acestuia.
În anumite realizări un kit, conform prezentei invenţii, include o cantitate eficientă de VV imunooncolitic, care conţine: (i) o deleţie TK; (ii) un înveliş cu glicozilare redusă (de exemplu, sialilare redusă) în raport cu un virus nemodificat; (iii) un acid nucleic care codifică TRIF sau un domeniu funcţional al acestuia; (iv) un acid nucleic care codifică 15-PGDH sau un domeniu funcţional al acestuia şi (v) o deleţie C12L.
În anumite realizări un kit, conform prezentei invenţii, include o cantitate eficientă de VV imunooncolitic, care conţine: (i) o deleţie TK; (ii) un înveliş cu glicozilare redusă (de exemplu, sialilare redusă) în raport cu un virus nemodificat; (iii) un acid nucleic care codifică TRIF sau un domeniu funcţional al acestuia; (iv) un acid nucleic care codifică 15-PGDH sau un domeniu funcţional al acestuia; (v) o deleţie C12L şi (vi) o deleţie B5R.
Următoarele exemple sunt prezentate pentru a ilustra mai complet descrierea, dar ele nu trebuie considerate ca o limitare a volumului invenţiei.
Exemplul 1: Efectul mutaţiei carcasei C12L.
Virusul vaccinului variolic cu timidinkinază negativă ("TK-") Western Reserve (VV) a fost modificat pentru deleţia C12L. Tulpina de vaccin variolic Western Reserve a fost furnizată de la BEI Resources (Manassas, VA) şi toate virusurile de vaccin variolic recombinate utilizate sau construite au fost bazate pe această tulpină.
Un virus mutant cu deleţie cu lipsa a 40% din ORF C12L a fost construit folosind selecţia dominantă tranzitorie (Falkner & Moss. J. Virol., vol. 64(6), 1990, p. 3108-3111). Celulele au fost infectate cu virusul vaccinului variolic WR de tip sălbatic şi simultan transfectate cu o plasmidă, care conţine regiunile 3' şi 5' ale genei C 12L. Recombinarea a fost lăsată să se producă şi s-a utilizat un marker de selecţie pentru a determina evenimentele de recombinare. Virusurile au fost titrate prin analiza de formare a plăcilor pe celule BSC-1, au fost izolate şi purificate cum s-a descris anterior pentru utilizare in vivo (Sampath, P et al. Mol. Ther.,vol. 21, 2013, p. 620-628).
Şoarecilor C57BL/6 purtători de tumoare CMT-93 li s-au administrat 5x108 unităţi formatoare de placă ("PFU") fie de virus WR nemodificat, sau de virus care transportă deleţia C12L (WRΔC12L). Pentru a testa specificitatea virusului pentru tumori, cantitatea de virus în creier, ficat, plămân şi tumoare a fost evaluată peste 1, 3 şi 10 zile după infectare. Rezultatele, în fig. 1 A, arată că, deşi s-au găsit cantităţi aproximativ echivalente de virusuri WR şi WRΔC12L în ficat, plămân şi în tumoare peste 1 zi după infectare, peste zece zile foarte puţin virus WRΔC12L a fost detectat în ţesutul netumoral, în raport cu cantitatea detectată în tumoare, cu diferenţă de expresie în tumoare/extratumoral mult mai mică pentru virusul WR nemodificat.
Pentru a evalua efectul mutaţiei C12L asupra supravieţuirii, şoarecii C57BL/6 (achiziţionaţi de la The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME), purtători de tumori subcutanate CMT-93, au fost trataţi intravenos cu o doză unică 1x108 PFU de virus WR sau WRΔC12L şi apoi monitorizaţi. În timp ce toţi şoarecii care au primit virusul WR au murit înainte de 60 de zile după infectare, peste 70 de zile 50% din animale la care s-a administrat WRΔC12L erau încă în viaţă (fig. 1B).
Animalele în primul rând au fost imunizate cu WR sau cu WRΔC12L şi celulele T de la aceşti şoareci (sau şoarecii de control) au fost amestecate cu WR şi nivelurile de producere de IFN-γ obţinute au fost determinate prin ELISA. Rezultatele sunt prezentate în fig. 1C şi indică că deleţia CI 2L conducea la o mai mare producere de CTL sau de splenocite producătoare de IFN-γ.
Exemplul 2. Efectul tratării prin deglicozilare.
Pentru a testa efectul modificării glicozilarea proteinelor de suprafaţă virală, WR TK- VV, glicanii N-legaţi şi glicanii simpli O-legaţi, de exemplu, acidul sialic, au fost eliminaţi din învelişul viral folosind sialidaza A (glicosialidaza A, Cod WS0042 ) sau un cocktail de N- şi O-glicanaze şi sialidază A (kitul pentru deglicozilarea enzimatica Glycopro, Cod produs: GK80110, Prozyme). Metoda nedenaturantă de deglicozilare a unui virus reprezenta o colectare de (i) 20 µl de preparat viral iniţial; (ii) adiţia a 17 µl de apă deionizată; (iii) adiţia a 10 µl de tampon de reacţie 5X; (iv) adiţia a 1 µl de fiecare dintre N-glicanază, sialidaza A şi O-glicanază (sau orice enzimă, utilizată în monoterapie cu 19 µl de apă deionizată) şi (v) incubarea la 37°C, timp de 16 ore înainte de utilizare. Deglicozilarea virusului a fost confirmată prin analiză Western blot (fig. 2A).
Efectul deglicozilării asupra infectivităţii virusului a fost evaluată în diferite linii de celule tumorale murine, infectate cu TK- ("WR" sau "WR.TK-) sau cu versiunea lui deglicozilată ("TK-deglic", "WR-deglic" şi "DS WR.TK-") cu MOI 1. Liniile celulare HeLa (adenocarcinom de col uterin uman), Bsc-1 (celule de rinichi normale de la maimuţă verde), 143B (osteosarcom uman), CV-1 (fibroblaste de rinichi de maimuţă verde), Renca (adenocarcinom renal murin) şi 4T1 (cancer mamar murin) au fost obţinute de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Celulele HEK293-mTLR2 au fost achiziţionate de la InvivoGen (San Diego, CA). Liniile celulare MC38 (adenocarcinom de colon murin) şi MEF (fibroblaste embrionare murine) au fost, respectiv, livrate de Dr. David Bartlett şi Dr. Robert Sobol (University of Pittsburgh Cancer Center). Toate liniile celulare au fost menţinute în medii de cultură recomandate conţinând 5...10% ser bovin fetal şi antibiotice la 37°C, 5% CO2. Infectivitatea virală a fost determinată prin analiza expresiei genelor virale. Expresia genelor virale a fost măsurată peste 3 ore după infectare prin imagistica bioluminiscentă a expresiei luciferazei in vitro. Pentru celulele cultivate s - au adăugat 10 µl de 30 mg/ml D-luciferină (GoldBio, St Louis, MO) la 1 ml de mediu de cultură. După cum se observă în fig. 2B, deglicozilarea învelişului virusului nu a avut un efect asupra infectivităţii virusului.
Efectul deglicozilării asupra activării TLR2 a fost evaluat într-un sistem model, în care s-a măsurat activarea NF-κβ în celulele HEK293, construite pentru a exprima TLR2 (HEK293/mTLR2) şi transfectate cu pMFty, o plasmidă reporter pentru transmiterea semnalului TLR. pMFty (plasmida reporter pentru transmiterea semnalului TLR-luciferază) a fost obţinută din InvivoGen şi transfectată în celulele HEK293/mTLR2 utilizând reactivul de transfecţie FuGENE HD (Promega, Madison, WI). Celulele HEK293/mTLR2 au fost infectate la MOI 1 cu WR sau WR deglicozilat şi activarea TLR2 a fost cuantificată peste 24 de ore după infectare prin imagistică bioluminiscentă. Cum se arată în fig. 2C, deglicozilarea virusului a condus la o activare mai redusă a TLR2 in vitro, comparativ cu virusul, care nu a fost deglicozilat. Mai mult decât atât, cum se poate observa şi în fig. 3A, virusul deglicozilat se asocia cu o activare TLR2 semnificativ mai redusă, decât virusul WR.
Pentru virusul deglicozilat s-a constatat, de asemenea, o mai mare absorbţie de către tumori. Pentru aceste experimente gena luciferazei sub controlul promotorului pSE/L al virusului sintetic al vaccinului variolic (Chakrabarti et. Al. Biotechniques, no 23, 1997, p. 1094-1097) a fost încorporată în virusul vaccinului variolic WR.TK- sau DS WR.TK- ("WR.TK-Luc+" şi "DS WR.TK-Luc+", respectiv) şi s-a introdus intravenos la şoarecii BALB/c (achiziţionate de la The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)) purtători de tumori subcutanate 4T1. Expresia genelor virale în tumori poate fi măsurată prin imagistica bioluminescentă a expresiei luciferazei in vivo. Pentru modelele pe animale o doză de 4,5 mg de D-luciferină a fost injectată intraperitoneal şoarecilor înainte de obţinerea imaginilor. Modelele IVIS 2000 (PerkinElmer, Waltham, MA) au fost utilizate pentru obţinerea imaginilor şi imaginile au fost analizate cu software Livinglmage (PerkinElmer).
În fig. 3B se arată că peste 24 de ore după infectare expresia virusului DS WR.TK-Luc+ a fost semnificativ mai înaltă în tumori, în raport cu echivalentul lui glicozilat. Această diferenţă de absorbţie nu a fost observată în ţesuturile netumorale. În fig. 3C se arată că infecţia cu virusul desializat conduce la un volum mai mic al tumorii. In plus, şoarecii BALB/c cu xenogrefe subcutanate de celule Renca (adenocarcinom renal murin) au fost randomizaţi şi injectaţi cu o singură doză intravenoasă de 1x108 PFU per şoarece de virus TK- sau TK- deglicozilat. Cinetica expresiei genelor virale în interiorul tumorii a fost monitorizată prin imagistica bioluminescentă pentru expresia luciferazei virale. Cum se arată în fig. 2E, deglicozilarea învelişului viral a amplificat expresia genelor in tumori in vivo.
Efectul deglicozilării virusului asupra prezenţei limfocitelor pSTAT1-pSTAT3+ a fost analizat la şoarecii C57BL/6, injectaţi intravenos cu 1x107 PFU de virus WR sau WR deglicozilat. Splinele au fost recoltate de la şoarecii C57BL/6 peste 1 oră după injectarea virusurilor menţionate şi splenocitele au fost izolate, fixate în 1,6% PFA şi permeabilizate cu metanol. Analizele imunocolorării intracelulare bicolore au fost realizate utilizând citometrul de flux LSRFortessa (BD Biosciences, San Jose, California). Splenocitele au fost colorate folosind anticorpii PacificBlue anti-PSTAT1 murini şi anticorpii AlexaFluor647 anti-pSTAT3+ murini (BD Biosciences). Procentul de limfocite pSTAT1-pSTAT3+ a fost determinat prin citometrie în flux, PBS şi PAM(3)CSK(4) fiind utilizaţi în calitate de control. În fig. 2D se arată că fosforilarea STAT3 a fost epuizată în limfocitele splenice de la şoarecii injectaţi cu virusul deglicozilat al vaccinului variolic.
Pentru a determina răspunsul imun împotriva virusului in vivo, s-au efectuat analize ale anticorpilor neutralizanţi. Succint, serul cu conţinut de anticorp a fost obţinut de la şoarecii trataţi, cum este indicat, în ziua 14 după injectarea virusului şi diluţiile în serie de ser (începând de la 1/20) au fost utilizate pentru a neutraliza 1000 PFU de virus TK-al vaccinului variolic. 2x104 celule HeLa au fost placate în fiecare godeu pe o placă cu 96 godeuri şi infectate cu amestec de ser-virus. În ziua 4 postinfectare plăcile au fost spălate cu PBS şi absorbanţa a fost cuantificată după colorarea culturilor folosind un kit pentru analiza neradioactivă a proliferării celulare (Promega, Madison, WI). Valorile IC50 (diluţia serului, necesară pentru neutralizarea virusului vaccinului variolic, capabilă să inducă 50% de inhibare a celulelor) au fost estimate din curbele doză-răspuns prin regresie neliniară standard folosind o ecuaţie Hill adaptată. Cum este prezentat în fig. 3D, cantitatea de anticorpi neutralizanţi împotriva virusului este mai mare la şoarecii C57BL/6 de tip sălbatic, comparativ cu şoarecii care poartă o mutaţie knock-out TLR2. Respectiv, o activare inferioară TLR2 poate fi asociată cu producere mai redusă de anticorpi anti-virus şi un răspuns îmbunătăţit antitumoral.
Exemplul 3. Efectul expresiei TRIF.
Acidul nucleic, care codifică TRIF murin, a fost introdus în virusul WR.TK- şi a fost evaluat efectul asupra celulelor T. TRIF a fost exprimat din locusul timidinkinazei, exprimat din promotorul timpuriu/tardiv p7.5 al virusului vaccinului variolic ("TK-TRIF" sau "WR.TK-.TRIF"; fig. 4A). S-a obţinut virusul A WR.TK-, care conţine acidul nucleic, care codifică DAI murin (DLM-1/ZBP1), exprimat cu p7.5, şi clonat în locusul genei timidinkinazei virale ("TK-DAI"; fig. 4A).
ELISA a fost realizată pentru a confirma exprimarea TRIF din virusul TK-TRIF (fig. 4B). Pentru ELISA, kitul pentru ELISA TRIF a fost utilizat pentru a determina concentraţia de TRIF în supernatant sau în extractele celulare din celule infectate la un MOI 1 (PFU/celulă) de TK-TRIF. Cum este prezentat în fig. 4B, virusul TK-TRIF exprima în mod specific TRIF, comparativ cu TK-. Western blotingul a fost folosit pentru a confirma expresia DAI din virusul TK-DAI (fig. 4C). Pentru analiza Western blotting, culturile de celule au fost cultivate în plăci cu 6 godeuri şi infectate la MOI 5 (PFU/celulă) şi peste 24 de ore după infecţie extractele de proteină din celulele integre au fost incubate în tampon pentru liză celulară (Cell Signaling Technology Inc, Danvers, MA), timp de 1 oră la 4°C. Mostrele transparente (15 µg/bandă) au fost separate cu SDS-PAGE în 10% gel şi transferate pe o membrană de nitroceluloză. Proteina DAI murină a fost detectată prin imunoblottingul membranelor folosind un anticorp primar policlonal anti-DAI (iepure, Abcam, Cambridge, MA) şi un anticorp policlonal anti-iepure conjugat cu HRP (capră, Thermo Scientific, Waltham, MA). Un anticorp monoclonal de şoarece anti-β actină (SantaCruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) şi un anticorp anti-şoarece conjugat cu peroxidază (capră, Thermo Scientific) au fost utilizate pentru imunoblottingul β-actinei în calitate de control de încărcare. Cum este prezentat în fig. 4C, virusul TK-DAI a exprimat în mod specific DAI, comparativ cu TK-.
Cum se arată în fig. 5 A, expresia TRIF a condus la o creştere a producerii de interferon de tip I de limfocite in vitro. Exprimarea TRIF amplifica, de asemenea, producerea de CTL in vivo, cum se arată prin analiza ELISpot (fig. 5B). Pentru testele ELISpot, splenocitele au fost preparate de la şoareci. Splenocitele au fost amestecate cu celule tumorale sau splenocitele, anterior infectate cu virusul inactivat cu UV al vaccinului variolic la un raport de 5:1. Splenocitele native de la fiecare şoarece au fost utilizate în calitate de control. Pentru analize s-au folosit plăcile cu 96 de godeuri de filtrare cu membrană (EMD Millipore, Billerica, MA), acoperite cu 15 µg/ml de anticorp monoclonal anti-IFN-Γ murin AN18 (Mabtech, Inc., Cincinnati, OH). Celulele au fost menţinute timp de 48 ore la 37°C şi petele au fost detectate folosind 1 µg/ml de anticorp biotinilat anti-IFN-γ, de şoarece R4-6A2-biotină (Mabtech). Plăcile au fost developate folosind un kit ABC şi un kit de substrat AEC pentru peroxidază (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Petele specifice au fost numărate şi analizate folosind un analizator şi software ImmunoSpot (CTL, Shaker Heights, OH).
Analiza eliberării citokinelor şi chemokinelor in vitro şi in vivo peste 24 de ore de la infectare cu TK-, TK-TRIF sau TK-DAI (MOI 1) a fost realizată printr-un test Luminex. Pentru supernatantele de cultură de celule, s-a utilizat un kit cu o placă 20-plex de citokine murine (5-plex) de la Milipore (Billerica, MA) şi un kit 2-plex pentru analiza proteinelor murine de la Panomics (Redwood City, CA). Pentru lizatele tumorale, kitul cu placă de 20-plex de citokine murine de la Invitrogen (Carlsbad, CA) s-a utilizat pentru determinarea concentraţiilor în tumorile recoltate în ziua 4 după administrarea virusului vaccinului variolic. Tumorile au fost omogenizate utilizând eprubetele Lysing Matrix D şi dispozitivul FastPrep-24. Aşa cum se arată în fig. 6A şi C, concentraţiile de ρΙΚΚβ, IL-6, IP-10, TNF-α şi IF-β au crescut semnificativ după infecţie cu TK-TRIF, comparativ cu TK- în diferite linii de celule tumorale. În plus, şoarecii BALB/c cu xenogrefe subcutanate stabilite Renca, care au fost injectaţi cu o singură doză intravenoasă 1x108 PFU per şoarece de TK- sau TK-TRIF, au fost analizaţi pentru determinarea concentraţiei intratumorale de citokine şi chemokine in vivo. Peste 4 zile de la injectare, tumorile au fost recoltate şi concentraţia de diferite citokine şi chemokine a fost determinată în lizatele tumorale prin Luminex sau ELISA. În fig. 6D se arată, că concentraţiile intratumorale de INF-γ, IL-12, IP-10, TNF-α, IL-1β, GM-CSF şi KC au crescut semnificativ ca răspuns la TK-TRIF, comparativ cu TK-.
Activarea căilor NF-κβ şi IRF3 au fost analizate după infectare cu TK-TRIF şi TK-DAI. Testele ELISA au fost utilizate pentru a determina concentraţiile de ρΙΚΚβ şi IRF3 în extractele citoplasmatice şi nucleare, respectiv, de celulele 4T1 sau MEF, infectate cu TK-, TK-TRIF sau TK-DAI la MOI 1. Aşa cum se arată în fig. 6A şi B, TK-TRIF amplifica activarea căilor de semnalizare NF-κβ şi IRF3, cum s-a observat printr-o creştere a concentraţiei de ρΙΚΚβ şi IRF3 la exprimare peste 24 de ore de la infectare. În fig. 7A se arată, că fosforilarea NF-κβ a crescut ca urmare a infecţiei cu TK-TRIF şi TK-DAI. Pentru HMGB1 şi Hsp-70, care funcţionează ca regulatori ai NF-κβ, de asemenea, este înregistrată expresie alterată în urma infecţiei cu TK-TRIF (fig. 7B şi 7C). Prezenţa celulelor T helper CD4+ şi celulelor T citotoxice CD8+ au fost analizate după infectare cu TK-, TK-TRIF. Aşa cum se arată în fig. 7D şi E, numărul de celule T citotoxice şi celule T helper a fost mai mare la şoarecii infectaţi cu TK-TRIF.
Analiza activităţii de replicare şi antitumorale a TK-TRIF s-a realizat în diferite celule tumorale murine. Diferite linii de celule tumorale au fost infectate cu MOI 1 şi producţia virusului a fost măsurată prin analiza petelor ELISpot, aşa cum este descris mai sus, la diferite intervale de timp. Aşa cum se arată în fig. 8A, producţia de virus atât TK-TIRF, cât şi TK-DAI, a fost semnificativ mai redusă în celulele RENCA rezistente, comparativ cu TK-, dar producţia de virus atât TK-TIRF, cât şi TK-DAI în celulele MC38 şi 4T1a fost la niveluri similare cu TK- (a vedea de asemenea şi fig. 9A).
Analizele suplimentare ale expresiei virale în tumori şi ale volumelor tumorilor au fost realizate la şoarecii BALB/c sau C57BL/6 implantaţi cu xenogrefe Renca sau MC38, respectiv, şi la şoarecii BALB/c implantaţi cu xenogrefe 4T1. Şoarecilor BALB/c sau C57BL/6 le-a fost injectat PBS sau 1x108 PFU de TK-, TK-TRIF sau TK-DAI prin vena caudală. Pentru modelul semiortotopic 4T1, 2x105 celule 4T1 au fost implantate în stratul adipos al glandei mamare la şoarecii femele BALB/c. În fig. 8C se arată, că expresia genelor virale TK-TRIF şi TK-DAI a fost la un nivel mai redus în tumorile din xenogrefe Renca sau MC38, implantate şoarecilor BALB/c sau C57BL/6, respectiv, comparativ cu expresia genelor virale ale TK-. În fig. 9C se arată, că producţia virală şi expresia virală TK-DAI şi TK-TRIF au fost mai reduse in tumori, comparativ cu expresia virală pentru virusul TK- sau TK-, care exprimă GM-CSF ("TK-GMCSF"). Şoarecii BALB/c cu tumori RENCA, implantate subcutanat, au fost trataţi i/v cu o doză 1x108 PFU imediat ce tumorile atingeau 50...100 mm3. Virusurile utilizate reprezentau WR.TK- şi WR.TK-TRIF+ (sau controlul cu PBS). Răspunsul tumoral ulterior a fost urmărit prin măsurare cu şublerul şi o reducere a creşterii tumorii a fost observată la şoarecii infectaţi cu TK-TRIF (fig. 5C şi fig. 8D). Un răspuns similar a fost observat la şoarecii implantaţi cu tumori MC38 (fig. 8D) şi tumori 4T1, comparativ cu tumorile infectate cu TK-GMCSF (fig. 9D).
Citotoxicitatea virusului modificat, comparativ cu TK-, a fost determinată prin efectuarea analizei citotoxicităţii. Testele de citotoxicitate au fost efectuate prin cultivarea 2x104 celule per godeu în plăci cu 96 de godeuri în DMEM cu 5% FBS. Celulele au fost infectate cu diluţii în serie, începând de la MOI 75 şi, în ziua 4 postinfectare, plăcile au fost spălate cu PBS şi densitatea optică a fost cuantificată după colorarea culturilor folosind un kit pentru analiza neradioactivă a proliferării celulare (Promega, Madison, WI). Valorile IC50 (PFU per celulă, necesară pentru a produce o inhibare de 50%) au fost estimate din curbele doză-răspuns prin regresie neliniară standard folosind o ecuaţie Hill adaptată. În fig. 8B este prezentată citotoxicitatea comparativă a TK-TRIF şi TK-DAI în celulele, infectate cu virusurile menţionate în doze variind de la 750 până la 0,0025 PFU/celulă. Modificarea virusului TK- pentru expresia TRIF sau DAI nu a avut ca rezultat o modificare a citotoxicităţii, comparativ cu TK-. Determinarea numărului de celule apoptotice prin colorare cu anexină V, cum se arată în fig. 9B, indică, că infecţia celulelor Renca şi 4T1 conducea la o creştere a numărului de celule apoptotice. Pentru evaluarea apoptozei/necrozei liniilor celulare, celulele au fost infectate la MOI 1 cu virusurile menţionate şi colorate folosind un kit pentru detecţia apoptozei cu anexină VFITC (Abcam, Cambridge, MA) peste 48 de ore după infectare. Analizele au fost efectuate cu utilizarea citometrului de flux Accuri C6 (BD Biosciences).
Experimentele au fost realizate pentru a determina influenţa TK-TRIF asupra supravieţuirii şoarecilor cu xenogrefe Renca sau MC38, comparativ cu şoarecii trataţi cu TK sau PBS. A fost asigurată stabilirea xenogrefelor Renca sau MC38 la şoarecii BALB/c sau C57BL/6, respectiv, şi au fost trataţi cu o singură doză intravenoasă de 1x108 PFU de virusuri menţionate sau PBS. Aşa cum se arată în fig. 9E şi F, TK-TRIF a îmbunătăţit semnificativ supravieţuirea, comparativ cu tratamentul cu TK-.
Exemplul 4. Efectele expresiei combinate a TRIF şi deglicozilării.
Virusul TK-, modificat pentru a exprima TRIF, aşa cum s-a discutat mai sus, a fost deglicozilat ("TK-TRIF deglic") pentru a analiza efectul, care o astfel de combinaţie ar exercita asupra răspunsurilor antitumorale celulare şi eficacităţii antitumorale a virusului.
Pentru a determina toxicitatea virusului, care exprimă TK-TRIF, a fost analizată masa corporală a şoarecilor BALB/c, injectaţi intravenos cu PBS în calitate de control sau 1x108 PFU per şoarece de TK-, TK-TRIF sau TK-TRIF deglicozilat. În fig. 10A se arată, că şoarecii injectaţi cu TK- au prezentat o pierdere în greutate depăşind 10% în ziua 6 după injectarea virusului, în timp ce şoarecii la care s-a injectat TK-TRIF şi TK-TRIF deglic- au prezentat un profil de greutate, similar cu profilul şoarecilor injectaţi cu PBS, ceea ce indică că TK-TRIF şi TK-TRIF deglic sunt mai puţin toxice, decât TK-.
A fost analizată expresia genelor virale TK-TRIF-deglic in vivo, comparativ cu TK- şi TK-TRIF. Tumorile RENCA au fost implantate la şoareci BALB/c, şi şoarecii au fost injectaţi cu PBS sau 1x108 PFU de TK-, TK-TRIF sau TK-TRIF deglic prin vena caudală. Expresia genelor virale a fost determinată prin detectarea exprimării luciferazei virale din interiorul tumorilor, măsurată la punctele temporale indicate. În fig. 10B se arată, că peste 24 de ore după infectare era prezentă o expresie mai redusă a TK-TRIF şi TK-TRIF deglic în tumori, comparativ cu TK-.
Experimentele au fost efectuate pentru a determina influenţa TK-TRIF sau TK-TRIF deglic asupra supravieţuirii şoarecilor cu xenogrefe Renca sau MC38, comparativ cu şoarecii trataţi cu TK- sau PBS. A fost asigurată stabilirea xenogrefelor Renca sau MC38 la şoarecii BALB/c sau C57BL/6, respectiv, şi au fost trataţi cu o singură doză intravenoasă de 1x108 PFU de virusuri menţionate sau PBS. După cum se arată în fig. 10C şi D, TK-TRIF şi TK-TRIF deglic îmbunătăţea semnificativ supravieţuirea şoarecilor, comparativ cu tratamentul cu TK-. De asemenea, TK-TRIF deglic îmbunătăţea supravieţuirea şoarecilor cu tumori RENCA, comparativ cu tratarea cu TK-GMCSF (fig. 10E).
Răspunsurile imune celulare la virusul vaccinului variolic şi celulele tumorale au fost evaluate prin analiza IFN-γ ELISpot, aşa cum este descris mai sus. În ziua 7 după administrarea virusului, splinele au fost recoltate de la şoarecii injectaţi intravenos cu 1x108 PFU de virusuri menţionate sau cu PBS (şoareci BALB/c purtători de xenogrefe Renca) şi s-a evaluat numărul de CTL, care recunosc virusul vaccinului variolic sau celulele Renca. În fig. 11A se arată, că deglicozilarea şi exprimarea TRIF a condus la o creştere semnificativă a producţiei de CTL, care recunosc virusul vaccinului variolic, comparativ cu unele modificări aparte, de exemplu, TK-TRIF sau TK-deglic. În particular, virusul deglicozilat care exprimă TRIF a condus la o creştere a producţiei CTL, care depăşea creşterea producţiei CTL, observată pentru modificările individuale. În plus, în. fig. 11B se arată, că deglicozilarea şi exprimarea TRIF a condus la o creştere a cantităţii de producţie a CTL, care recunoaşte celulele Renca in vivo, comparativ numai cu modificările aparte, de exemplu, TK-TRIF sau TK-deglic.
Analiza neutralizării s-a realizat pentru a determina nivelurile circulante de anticorpi anti-virus de vaccin variolic la şoarecii injectaţi cu 1x108 PFU de TK-, TK-TRIF sau TK-TRIF deglicozilat. Titrurile de Nabs au fost determinate după cea mai mare diluţie a serului, care a condus la o inhibare a infecţiei de cel puţin 50%. În fig. 11C se arată, că cantitatea de anticorpi de neutralizare este mai mare la şoarecii C57BL/6 în tip sălbatic, infectaţi cu TK-, comparativ cu şoarecii infectaţi cu TK-TRIF, TK-deglic sau TK-TRIF-deglic. Pentru şoarecii, infectaţi cu TK-TRIF-deglic, s-a constatat cea mai mare reducere a cantităţii de anticorpi neutralizanţi în ser.
Efectul virusului deglicozilat, care exprimă TRIF, asupra creşterii tumorii a fost analizată la şoareci BALB/c purtători de xenogrefe tumorale Renca sau la şoarecii C57BL/6 purtători de xenogrefe tumorale MC38. Pentru xenogrefele tumorale RENCA sau MC38, linii de celule tumorale au fost implantate subcutanat la 5x105 celule per şoarece la şoarecii BALB/c sau C57BL/6, respectiv. Când tumoarea a atins ~50...100 mm3, şoarecii au fost trataţi intravenos cu o singură doză de virusuri menţionate (1x108 PFU/şoarece) în vena caudală. Creşterea tumorii a fost monitorizată prin măsurarea cu un şubler şi a fost determinată prin ecuaţia V (mm3) = π/6 x W 2 x L, în care W şi L reprezintă lăţimea şi lungimea tumorii, respectiv. Datele au fost exprimate ca dimensiune relativă a tumorii la începutul terapiei, care a fost stabilită ca 100%. Surprinzător, virusul TK-TRIF deglicozilat a condus la o reducere mai mare a dimensiunii tumorii la şoarecii purtători de xenogrefe RENCA şi MC38, comparativ cu efectul aditiv al modificărilor individuale combinate sau virusul TK- (fig. 11D şi E). În plus, pentru TK-TRIF deglicozilat s-a constatat o activitate antitumorală îmbunătăţită, comparativ cu TK-GMCSF, observată în baza reducerii semnificative a mărimii tumorii la şoarecii BALB/c, purtătoare de xenogrefe RENCA (fig. 11F) sau de tumori subcutanate 4T1 la şoarecii BALB/c (fig. 9D). Respectiv, virusul TK- deglicozilat al vaccinului variolic, care exprimă TRIF, prezintă un răspuns îmbunătăţit în mod semnificativ antitumoral şi conduce la o reducere a producţiei de anticorpi antivirali.
Exemplul 5. Efectul combinat al expresiei TRIF, DE-sialilării şi deleţiei C12L în UPCI-1812.
Modificările descrise mai sus, şi anume deleţia C12L, desialilarea şi introducerea TRIF, au fost încorporate împreună pentru a crea o tulpină nouă W UPCI-1812, şi efectul acestui virus cu modificare triplă a fost evaluat în baza efectelor lui terapeutice şi imunologice. Aşa cum se arată în fig. 12A, infecţia UPCI-1812 a condus la supravieţuirea semnificativ mai bună, decât WR.T-, care codifică GM-CSF. În ceea ce priveşte virusul desialilat cu deleţia C12L ("vvDD"), UPCI-1812 produce niveluri semnificativ mai înalte de interferon gama (IFN-γ) (fig. 12B) şi interleukină-12 (IL-12) (fig. 12C).
Exemplul 6. Efectul ţintării pe PGE2.
Pentru terapiile virale oncolitice au început în cele din urmă să demonstreze eficienţă clinica în studii randomizate, evidenţiind potenţialul real al acestei platforme. Cu toate acestea, printre actuala generaţie de vectori clinici, acei, care au dovedit a fi cei mai de succes, exprimau o citokină care activa sistemul imun (GM-CSF), consolidând o serie de date preclinice, care indică că răspunsul imun este un mediator cheie al eficienţei virusului. Însă, în pofida acestei observaţii, este încă neclar modul şi cauzele din care unii pacienţi răspund bine, iar alţii par rezistenţi la terapia cu virusuri oncolitice.
Experimentele iniţiale au fost realizate pentru a corela sensibilitatea in vitro a unei linii de celule tumorale la infecţia virală şi replicarea cu răspunsuri in vivo ale aceleiaşi linii celulare atunci când sunt utilizate pentru a forma tumori singene la şoarecii imunocompetenţi. 14 linii diferite de celule tumorale murine din diferite tipuri de tumori şi tulpini diferite murine au fost analizate in vitro prin infectarea liniilor celulare cu TK- (fig. 26A). Producţia virusului şi expresia genelor virale a fost observată în cele 14 linii diferite de celule tumorale murine. Producţia virusului a fost analizată prin cultivarea a 2x105 celule în plăci cu 24 de godeuri, cu infectarea ulterioară la MOI 1 (PFU/celule) cu virusurile menţionate de vaccin variolic. Peste patru ore după infectare, culturile au fost spălate de două ori cu PBS şi incubate în mediu proaspăt fără virus. La momentele de timp indicate după infectare, culturile au fost recoltate şi congelate-dezgheţate de trei ori pentru a obţine extract de celule (CE). Titrurile virale s-au determinat prin analiza de formare a plăcilor pe celulele BSC-1.
Şapte din cele 14 linii au fost testate în continuare in vivo folosind injecţia intratumorală directă a TK- (fig. 13A şi B şi fig. 26A şi B). Injecţia intratumorală directă a fost utilizată pentru a reduce variabilitatea, care poate apărea din cauza diferenţelor de livrare a virusului. Cum se arată în fig. 13A şi B, nu s-a observat nici o corelaţie directă fie între replicarea virusului, sau uciderea celulelor mediată de virus, şi efectul antitumoral in vivo, ceea ce indică, că factorii, alţii decât activitatea oncolitică directă, mediază efectele antitumorale.
Virusurile oncolitice de vaccin variolic, care exprimă luciferaza, au fost utilizate în cadrul acestor experimente, pentru a permite analiza expresiei genelor virale pe parcursul timpului la şoareci individuali (în calitate de surogat pentru replicarea şi persistenţa virusului), şi pentru a permite compararea cu răspunsul ulterior. Două modele distincte păreau să rezulte din date. Pentru modelele de tumori mai rezistente, definite ca acele, în care terapie virală creştea supravieţuirea generală globală cu cel mult 2 săptămâni, cum se releva pentru Renca, B16, PAN02 şi 4T1, o corelaţie directă poate fi constatată în cadrul fiecărui model individual de tumoare, astfel încât nivelul de expresie a genelor virale peste 24 ore corespundea răspunsului ulterior (fig. 13B). Astfel, chiar daca in vitro replicarea nu corelează cu activitatea in vivo la compararea modelelor de tumori (probabil datorită influenţei unor aşa factori, cum ar fi celulele ECM şi celulele netumorale din tumoare), în limitele oricărui unui model individual de tumoare există o corelaţie între expresia genelor virale precoce şi răspunsul ulterior. Fără vre-o legătură cu o anumită teorie, se presupune, că replicarea virusului şi activitatea oncolitic directă este mediatorul principal al răspunsului limitat în modelele de tumori mai rezistente. Cu toate acestea, un alt model se observa în tumorile care au răspuns bine la terapia cu virus, care include modelele de tumori AB12, LLC, MC38. În aceste modele pentru tumorile cu cel mai bun răspuns în cadrul fiecărui model s-a demonstrat o eliminare rapidă şi activă a virusului după infecţia iniţială şi replicarea precoce (fig. 13B şi fig. 27). Această eliminare activă sugerează inducerea unui răspuns imun puternic pentru a amplifica efectele virale oncolitice directe în modelele tumorale cu cele mai bune răspunsuri.
Pentru o verificare mai minuţioasă a acestei observaţii, iniţial au fost selectate două modele de tumori cu acelaşi fond genetic, pentru care au fost afişate răspunsuri comparabile după tratare cu virus in vivo, dar pentru unul din care (LLC) sunt relevate indicatori de inducţie activă a imunităţii (eliminarea precoce a virusului) şi uciderea limitată a celulelor mediată de virus in vitro (fig. 13B şi fig. 26A şi B). Celălalt (B16) s-a dovedit a fi mai sensibil la uciderea de către virus in vitro şi orice răspuns in vivo, probabil, corela cu expresia genelor virale precoce (fig. 13B şi fig. 26A şi B). Verificarea completă a activării markerilor imuni sistemici după infecţia cu virus a fost comparată intre şoarecii fără tumori, şoarecii cu tumori B16 şi şoarecii cu tumori LLC. Aceştia au inclus marcherii de activare a transmiterii precoce congenitale a semnalelor, cum ar fi pS6, pSTAT1, pSTAT3, pSTAT5, în diferite populaţii de celule (fig. 13C şi fig. 14A) şi marcherii de proliferare a celulelor T, cum ar fi pS6 şi Ki67 (fig. 14A) şi marcherii de activare, cum ar fi CD44 şi CD62L (fig. 14A) şi răspunsurile anticorpilor neutralizanţi (fig. 14D). Diferenţe minore au fost observate în răspunsul imun sistemic în terapia virală între animalele purtătoare de tumori şi animalele fără tumori, singura excepţie fiind fosforilarea S6 în unele celule mieloide în perioadă precoce după infectare (fig. 13C). S-a observat reducerea nivelurilor de pS6 la animalele purtătoare de tumori, dar reducerea activarea sistemului imunitar a fost cea mai pronunţată la şoarecii purtători de tumori B16 (fig. 13C şi fig. 14A). Aceasta a fost verificată în alte modele de tumori, din nou confirmând, că nivelurile de pS6 erau reduse în modelele de tumori mai rezistente (inclusiv 4T1 şi RENCA), ceea ce indică un defect al răspunsului celulelor dendritice (DC), care poate media rezistenta la aceşti şoareci (fig. 13C ).
Deoarece au existat diferenţe mici, observate în răspunsul imun sistemic, au fost studiate efectele unei imunosupresii mai localizate în interiorul tumorii. Diferite celule ale sistemului imunitar sunt asociate cu un fenotip de supresie, inclusiv celule supresoare derivate din mieloide (MDSC) şi celule T reglatoare (T-reg) (şi M2 mac). S-au analizat nivelurile de aceste tipuri diferite de celule, atât in splină, cât şi în tumoare, pentru toate modelele de tumori, comparativ cu animalele netratate. Pentru evaluarea populaţiilor imune in tumori, tumorile au fost recoltate de la şoarecii trataţi, cum s-a indicat. şi mecanic dezagregate şi scindate cu un amestec de trei enzime (colagenază de tip IV, ADNază de tip IV şi hialuronidază de tip V (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)). Analizele imunocolorării cu patru culori a suprafeţei celulare s-au efectuat cu citometrul de flux Gallios (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA). Celulele tumorale dezagregate au fost colorate folosind anticorpi anti-CD3 murini cu PE-Cy7 (BD Biosciences, San Jose, CA), anticorpi anti-CD4 murini cu FITC, anticorpi anti-CD8 murini cu PerCP-Cy5.5 şi anticorpi anti-CD25 murini cu PE (eBioscience, San Diego, CA).
Nivelul de MDSC, găsit în tumoare pentru modele diferite modele de tumori, corela strâns cu rezistenţa sau sensibilitatea modelului respectiv la terapia cu virus (fig. 15A şi B şi fig. 16). De exemplu, Renca, care prezintă o rezistenţă la terapia cu virus, conducea la tumori cu un nivel înalt de MDSC. În fig. 17A este prezentată cantitatea de MDSC în tumorile netratate în funcţie de creşterea supravieţuirii după tratamentul intravenos cu 1e8 PFU de WR.TK- pentru un şir de sisteme de modele de tumori diferite. Pentru tulpinile de vaccine variolic este relatată o capacitate foarte minoră de creştere a ratei de supravieţuire în modele de tumori murine, care prezintă un nivel înalt de MDSC la momentul iniţial. Celulele din fiecare dintre liniile celulare tumorale enumerate pentru modelele de tumori (fig. 17A) au fost implantate la şoareci imunocompetenţi singenici. Şoarecii au fost apoi fie sacrificaţi în scopul de a determina nivelul mediu de referinţă al MDSC în tumorile rezultate pentru fiecare model, sau şoarecii au fost trataţi cu WR.TK- (sau PBS pentru control) (1e8 PFU, administrate intratumoral) şi creşterea speranţei de viaţă (pentru 50% de supravieţuire) era determinată după tratament (în zile). Graficul reprezintă "cantităţile relative de MDSC în tumori la momentul iniţial" vs "creşterea mediană a supravieţuirii după tratare cu WR.TK- (în raport cu martorul netratat)". O cantitate mai mare de MDSC la momentul iniţial corela cu o eficienţă redusă a terapiei.
Au fost studiate modificările ulterioare, produse în tumoare după terapia cu virus, şi s-a constatat că pentru multiple modele de tumori, cum ar fi 4T1, RENCA şi MC38, adăugarea terapiei cu virusul variolic conducea la pierderea T-reg, dar că nivelurile MDSC nu au fost afectate şi a continuat să crească în timp, cum ele creşteau în grupurile de control (fig. 15A şi B şi fig. 16A şi B). Terapia cu virus a redus nivelurile de T-reg în tumorile tratate, dar nu a avut nici un impact asupra nivelurilor de MDSC. În modelul de tumoare Renca (implantat subcutanat la şoarecii BALB/c), cantităţile relative de T-reg sau MDSC în tumoare/mg de tumoare au fost determinate la diferite momente înainte sau după tratare cu WR.TK- (1e8 PFU administrate intratumoral) (fig. 17B şi C). Astfel, se pare că incapacitatea virusului oncolitic al vaccinului variolic de a ţinta MDSC reducea activitatea terapeutică a acestuia în unele tumori, în care nivelurile de MDSC sunt înalte. S-a mai constatat, că în tumorile cu nivele iniţiale reduse de MDSC (MC38), terapia cu virus a majorat nivelul de celule T CD8+ în tumoare, în timp ce pentru modelele tumorale mai rezistente (4T1) nu a fost înregistrată nici o creştere (fig. 15B) .
S-a efectuat analiza tulpinii imunogene de vaccine variolic GM-CSF, care exprimă citokina factor de stimulare a coloniilor (CSF). Anterior s-a demonstrat, că GM-CSF conduce la răspunsuri clinice mai semnificative, de asemenea s-a asociat cu proliferarea MDSC. În fig. 18 şi 19 se arată că, deşi tulpinile de vaccine variolic mai imunogene (WR.TK-GMCSF şi WR.B18R-IFNβ+) ameliorau suplimentar unele aspecte ale răspunsului imun în modelele tumorale sensibile, cum ar fi reducerea suplimentară a nivelurilor de T-reg şi creşterea nivelurilor de celule T CD8+, nici un astfel de avantaje nu au fost observate în modelele tumorale rezistente altfel. Fără vre-o legătură cu o anumită teorie, se pare că principala diferenţă între tumorile sensibile şi rezistente se referă la incapacitatea virusului de a induce un efect imunoterapeutic puternic in tumorile cu niveluri înalte de imunosupresie mediată de MDSC în micromediul tumorii.
În comunicările recente a fast identificată o producere de prostaglandine PGE2 mediată cu COX2 în calitate de determinantă cheie a infiltraţiei MDSC şi menţinerii fenotipului MDSC. Au fost folosite două abordări pentru a ţinti această cale. O abordare a fost folosirea unui inhibitor al COX2. A doua abordare a fost expresia enzimei HPGD, care realizează degradarea prostaglandinei direct din vectorii virali. Acidul nucleic, care codifică hidroxiprostaglandindehidrogenaza 15 (HPGD), o enzimă murină ,care degradează PGE2, a fost introdus în WR.T - prin introducerea inserţiei în locusul timidinkinazei prin recombinare omoloagă şi sub controlul promotorului p7.5 viral ("TK - HPGD" sau "WR.TK-.HPGD"). Cum este prezentat în fig. 20, HPGD s-a exprimat în mod specific de la TK-HPGD şi a redus semnificativ nivelurile de PGE2 în celulele Renca, infectate cu TK-HPGD. Cum se arată în fig. 25, se pare, că infecţia cu WR.TK- poate modifica expresia COX2 în tumori local la locul infecţiei, fără a produce niveluri semnificative de exprimare a COX2 în tumori în general, sau virusul poate să se reproducă selectiv în regiunile cu niveluri reduse de COX2. În experimentele iniţiale in vitro şi in vivo s-a constatat că, chiar la niveluri toxice, inhibitorii COX-2 erau incapabili să reducă nivelurile de PGE2 într-o măsură oarecare aproape de nivelul atins la expresia HPGD (fig. 20).
Virusurile oncolitice ale vaccinului variolic, care exprimă HPGD, a fost apoi testaţi în mai câteva modele de tumori la şoareci. S-a observat, că numărul de celule MDSC în tumoare s-a redus rapid şi semnificativ în splină şi în tumori după tratamentul numai cu WR-TK-HPGD (fig. 21 şi fig. 23A-D). S-a constatat, de asemenea, că includerea HPGD a redus cantitatea de MDSC în tumoare şi în splină în raport cu virusul WR.TK- nemodificat. Aceasta era specific pentru tumori, fără o toxicitate sistemică observată (fig. 21 A). Interesant, că TK-HPGD, de asemenea, a indus o reducere mai rapidă şi mai semnificativă a numărului de T-reg în tumoare. Cum se arată în fig. 2 B şi C, şi în fig. 22, infecţia cu WR-TK-HPGD corela cu un efect terapeutic îmbunătăţit în câteva modele de tumori la şoareci in vivo şi conducea la volume mai mici ale tumorilor. Este necesar de menţionat, că pentru modelul de tumoare, care anterior era cea mai rezistentă la terapia cu virus, RENCA, cu fenotip "numai oncolitic" afişat şi niveluri iniţiale înalte de MDSC, în mod surprinzător s-a relevat cea mai mare creştere a beneficiului terapeutic după expresia HPGD (fig. 21B).
Tiparele de exprimare a genelor virale au fost comparate, de asemenea, pentru WR.TK- şi WR.TK-HPGD în tumoarea RENCA. S-a relevat, că, în timp ce pentru WR.TK- se observa fenotip "numai oncolitic" (o expresie mai înaltă a genei în ziua 1 corela cu cel mai mare beneficiu terapeutic), pentru WR.T-HPGD+ s-a constatat fenotip "oncolitic şi imunoterapeutic", în care pentru tumorile cu cel mai bun răspuns se arată o eliminare activă şi rapidă a virusului spre ziua a 5 (fig. 21D). Fără legătură cu o anumită teorie, se pare, că expresia HPGD este capabilă de a întoarce activitatea imunoterapeutică a vectorului în aceste modele mai rezistente şi, astfel, poate sensibiliza într-un alt mod tumorile rezistente la terapia cu virus oncolitic. Aceasta se producea în pofida pierderii generale a potenţialului oncolitic al expresiei HPGD.
S-a realizat analiza mecanismelor, care mediază avantajele terapeutice observate pentru WR.T-HPGD+. Peste 3 zile după tratare, timp în care nivelurile de MDSC şi T-reg au fost deja reduse semnificativ în jurul tumorii, s-a remarcat, că au avut loc numai schimbări modeste în nivelurile de citokine şi chemokine în tumoare (fig. 24A). Însă, nivelul de chemokine în ser s-a modificat semnificativ (fig. 24B). În special, chemokinele asociate cu atragerea celulelor T activate, inclusiv CCL5, au fost supuse unei reglări de creştere, în timp ce nivelul de CXCL12 (sdf-1, asociat cu un fenotip imunosupresor şi un prognostic nefavorabil) a fost redus semnificativ (fig. 24A şi B). Această modificare a efectului sistemic al chemokinelor poate fi responsabilă pentru medierea schimbărilor din repertoriul celulelor imune in tumoare. Acestea au fost studiate în continuare utilizând analiza tumorii bilaterale, în care într-o tumoare a fost injectat WR.TK- şi în tumoarea de pe flancul opus s-a injectat WR.TK-HPGD. S-a observat un transport mai semnificativ de celule T activate pentru tumoarea care exprimă HPGD (fig. 24D). Mai mult decât atât, la momente de timp mai tardive s-a observat, că expresia WR.TK-HPGD conducea în splină la niveluri majorate semnificativ de CTL ţintite asupra tumorii. Aceste date indică, că exprimarea HPGD acţionează nu numai pentru a limita mediul supresiv în interiorul tumorii, dar, de asemenea, amplifică atragerea celulelor T, ceea ce conduce la un răspuns imun adaptiv antitumoral mai activ. În plus, încorporarea HPGD în UPCI-1812 a condus la un virus, care inhiba creşterea tumorii mai semnificativ, decât UPCI-1812 ("combinat"; fig. 28). Cum se arată în fig. 28, virusul combinat a dus la o reducere mai marcantă a creşterii tumorii, decât efectul aditiv al virusului UPCI-1812 şi al virusul VV-HPGD. Direcţionarea asupra PGE2, mediată de virus, a fost capabilă să depăşească imunosupresia localizată, conducând la modificări profunde în micromediul tumorii şi, drept rezultat, sensibilizarea tumorilor anterior rezistente la terapia cu virus.
Exemplul 7. Modificarea, care sporeşte activitatea şi răspândirea.
În fig. 29 este prezentat nivelul de anticorpi neutralizanţi împotriva virusului vaccinului variolic, prezenţi în serul şoarecilor vaccinaţi (1e4 PFU) fie cu WR, sau cu WR cu o mutaţie punctiformă EEV de ameliorare în gena virală A34R (Lys151 până la Glu). Tulpina mutantă A34R cauzează o producere a unei cantităţi mai mici de anticorpi neutralizanţi contra virusului vaccinului variolic, comparativ cu WR-.
1. Guo Z.S., Thorne S.H., Bartlett D.L. Oncolytic virotherapy: Molecular targets in tumor-selective replication and carrier cell-mediated delivery of oncolytic viruses. Biochim. Biophys. Acta, 2008
2. Kim J.H., Oh J.Y., Park B.H., Lee D.E., Kim J.S., Park H.E., Roh M.S., Je J.E.,yoon J.H., Thorne S.H., Kirn d., Hwang T.H. Systemic Armed Oncolytic and Immunologic Therapy for Cancer with JX-594, a Targeted Poxvirus Expressing GM-CSF. Mol. Ther. 14, 2006, p. 361-370
3. Schmidt C. Amgen spikes interest in live virus vaccines for hard-to-treat cancers. Nature biotechnology 29, 2011, p. 295-296
4. Coffin R. Clinical Updates with oncolytic HSV. In 7th International Oncolytic Virus meeting , Quebec City, 2013
5. Bischoff J.R., Kirn D.H., Williams A., Heise C., Horn S., Muna M., Ng L., Nye J.A., Sampson-Johannes A., Fattacy A., McCormick F. An adenovirus mutant thatreplicates selectively in p53-deficient human tumor sells. Science 274, 1996, p. 373-376

Claims (38)

1. Virus oncolitic de vaccin variolic, care conţine un acid nucleic, care codifică antagonistul prostaglandinei E2 (PGE2) şi una sau mai multe modificări suplimentare.
2. Virus oncolitic de vaccin variolic, conform revendicării 1, în care antagonistul PGE2 conţine o proteină, o peptidă, un ARN sau un micro ARN.
3. Virus oncolitic de vaccin variolic, conform revendicării 1 sau 2, în care antagonistul PGE2 reprezintă 15-hidroxiprostaglandin dehidrogenază (15-PGDH) sau un domeniu funcţional al acesteia.
4. Virus oncolitic de vaccin variolic, conform revendicării 1, 2 sau 3, în care una sau mai multe din modificările suplimentare conţine o mutaţie în gena timidin-kinazei, în care virusul oncolitic de vaccin variolic este timidin-kinază negativ.
5. Virus oncolitic de vaccin variolic, conform oricăreia din revendicările 1-4, în care una sau mai multe din modificările suplimentare conţine o mutaţie a carcasei virale selectată din grupa constând din: o deleţie completă sau parţială a genei C12L, o mutaţie sau o deleţie a B8R, o mutaţie sau o deleţie a B18R, o mutaţie sau o deleţie a A35R, o mutaţie în B15R sau o combinaţie a acestora.
6. Virus oncolitic de vaccin variolic, conform revendicării 5, în care deleţia B8R reprezintă o deleţie completă sau parţială a genei B8R, deleţia B18R reprezintă o deleţie completă sau parţială a genei B18R, mutaţia în B15R reprezintă o substituţie în gena B15R şi/sau deleţia A35R reprezintă o deleţie completă sau parţială a genei A35R.
7. Virus oncolitic de vaccin variolic, conform revendicării 5, în care una sau mai multe mutaţii ale carcasei virale conţine deleţia completă sau parţială a genei C12L.
8. Virus oncolitic de vaccin variolic, conform oricăreia din revendicările 1-7, în care virusul oncolitic de vaccin variolic conţine suplimentar un acid nucleic care codifică factorul macrofagal-granulocitar de stimulare a coloniei (GM-CSF) sau un domeniu funcţional al acestuia.
9. Virus oncolitic de vaccin variolic, conform oricăreia din revendicările 1-8, în care virusul oncolitic de vaccin variolic conţine suplimentar un înveliş viral cu glicozilare redusă în raport cu un virus nemodificat identic.
10. Virus oncolitic de vaccin variolic, conform oricăreia din revendicările 1-9, în care virusul oncolitic de vaccin variolic conţine suplimentar una sau mai multe din modificările selectate din grupa constând din: substituţia Lys151 până la Glu în A34R, o deleţie completă sau parţială a B5R, o mutaţie sau o deleţie a A36R, o mutaţie sau o deleţie a A56R şi o combinaţie a acestora.
11. Virus oncolitic de vaccin variolic, conform revendicării 10, în care mutaţia A36R este o substituţie aminoacidă în proteina A36R sau o deleţie completă sau parţială a proteinei A36R şi/sau o deleţie a A56R reprezintă o deleţie completă sau parţială în proteina A56R.
12. Virus oncolitic de vaccin variolic, conform oricăreia din revendicările 3-11, în care acidul nucleic care codifică 15-PGDH sau domeniul funcţional al acestuia, acidul nucleic care codifică TRIF sau domeniul funcţional al acestuia, sau acidul nucleic care codifică GM-CSF sau domeniul funcţional al acestuia este clonat în locusul genei timidin-kinazei.
13. Compoziţie cu conţinut de virus oncolitic de vaccin variolic, conform oricăreia din revendicările 1-12.
14. Compoziţie, conform revendicării 13, care conţine suplimentar un agent anticanceros, un agent imunomodulator, un agent care inhibă sau reduce nivelul de celule supresoare derivate din mieloide şi o combinaţie a acestora.
15. Compoziţie, conform revendicării 14, în care agentul imunomodulator cuprinde un agent capabil să suprime imunitatea antivirală.
16. Compoziţie, conform revendicării 14, în care agentul imunomodulator cuprinde un inhibitor al punctului de control imun.
17. Compoziţie, conform revendicării 16, în care inhibitorul punctului de control imun cuprinde anticorpul anti-CTLA4, un anticorp anti-PD-1, un anticorp anti-PDL1 sau un agonist TLR.
18. Compoziţie, conform revendicării 14, în care agentul imunomodulator şi agentul care reduce sau inhibă nivelul celulelor supresoare derivate din mieloide este selectat din grupa constând din: anticorp anti-CD33 sau o regiune variabilă a acestuia, un anticorp anti-CD11b sau o regiune variabilă a acestuia, un inhibitor al COX2, o citokină, o chemokină şi un inhibitor al punctului de control imun.
19. Compoziţie, conform revendicării 18, în care inhibitorul COX2 conţine celecoxib.
20. Compoziţie, conform oricăreia din revendicările 14-19, în care agentul anti-cancer cuprinde un agent chimioterapeutic, un agent radioterapeutic, un agent antiangiogen, un agent de inducere a apoptozei, un anticorp anti-cancer, un agent kinazic dependent de anti-ciclină sau o combinaţie a acestora.
21. Virus oncolitic de vaccin variolic, care conţine un acid nucleic, care codifică antagonistul prostaglandinei E2 (PGE2), în care virusul oncolitic de vaccin variolic este timidin-kinază negativ.
22. Virus oncolitic de vaccin variolic, conform revendicării 21, în care antagonistul PGE2 reprezintă 15-PGDH sau un domeniu funcţional al acestuia.
23. Virus oncolitic de vaccin variolic, conform revendicării 21 sau 22, în care virusul oncolitic de vaccin variolic conţine suplimentar o deleţie completă sau parţială a genei C12L.
24. Virus oncolitic de vaccin variolic, conform revendicării 21, 22 sau 23, în care virusul oncolitic de vaccin variolic conţine suplimentar o mutaţie a carcasei virale selectată din grupa constând din: o mutaţie sau o deleţie a B8R, o mutaţie sau o deleţie a B18R, o mutaţie sau o deleţie a A35R, o mutaţie în B15R sau o combinaţie a acestora.
25. Virus oncolitic de vaccin variolic, conform revendicării 24, în care deleţia B8R reprezintă o deleţie completă sau parţială a genei B8R, deleţia B18R reprezintă o deleţie completă sau parţială a genei B18R, mutaţia în B15R reprezintă o substituţie în gena B15R şi/sau deleţia A35R reprezintă o deleţie completă sau parţială a genei A35R.
26. Virus oncolitic de vaccin variolic, conform oricăreia din revendicările 21-25, în care virusul oncolitic de vaccin variolic conţine suplimentar un acid nucleic care codifică factorul macrofagal-granulocitar de stimulare a coloniei (GM-CSF) sau un domeniu funcţional al acestuia.
27. Virus oncolitic de vaccin variolic, conform oricăreia din revendicările 21-26, în care virusul oncolitic de vaccin variolic conţine suplimentar un înveliş viral cu glicozilare redusă în raport cu un virus nemodificat identic.
28. Virus oncolitic de vaccin variolic, conform oricăreia din revendicările 21-27, în care virusul oncolitic de vaccin variolic conţine suplimentar una sau mai multe din modificările selectate din grupa constând din: substituţia Lys151 până la Glu în A34R, o deleţie completă sau parţială a B5R, o mutaţie sau o deleţie a A36R, o mutaţie sau o deleţie a A56R şi o combinaţie a acestora.
29. Virus oncolitic de vaccin variolic, conform revendicării 28, în care mutaţia A36R este o substituţie aminoacidă în proteina A36R sau o deleţie completă sau parţială a proteinei A36R şi/sau o deleţie a A56R reprezintă o deleţie completă sau parţială în proteina A56R.
30. Virus oncolitic de vaccin variolic, conform oricăreia din revendicările 22-29, în care acidul nucleic care codifică 15-PGDH sau domeniul funcţional al acestuia, acidul nucleic care codifică TRIF sau domeniul funcţional al acestuia, sau acidul nucleic care codifică GM-CSF sau domeniul funcţional al acestuia este clonat în locusul genei timidin-kinazei.
31. Compoziţie cu conţinut de virus oncolitic de vaccin variolic, conform oricăreia din revendicările 21-30.
32. Compoziţie, conform revendicării 31, care conţine suplimentar un agent anticanceros, un agent imunomodulator, un agent care inhibă sau reduce nivelul de celule supresoare derivate din mieloide şi o combinaţie a acestora.
33. Compoziţie, conform revendicării 32, în care agentul imunomodulator cuprinde un agent capabil să suprime imunitatea antivirală.
34. Compoziţie, conform revendicării 32, în care agentul imunomodulator cuprinde un inhibitor al punctului de control imun.
35. Compoziţie, conform revendicării 34, în care inhibitorul punctului de control imun cuprinde anticorpul anti-CTLA4, un anticorp anti-PD-1, un anticorp anti-PDL1 sau un agonist TLR.
36. Compoziţie, conform revendicării 32, în care agentul imunomodulator şi agentul care reduce sau inhibă nivelul celulelor supresoare derivate din mieloide este selectat din grupa constând din: anticorp anti-CD33 sau o regiune variabilă a acestuia, un anticorp anti-CD11b sau o regiune variabilă a acestuia, un inhibitor al COX2, o citokină, o chemokină şi un inhibitor al punctului de control imun.
37. Compoziţie, conform revendicării 32, în care inhibitorul COX2 conţine celecoxib.
38. Compoziţie, conform oricăreia din revendicările 32-37, în care agentul anti-cancer cuprinde un agent chimioterapeutic, un agent radioterapeutic, un agent antiangiogen, un agent de inducere a apoptozei, un anticorp anti-cancer, un agent kinazic dependent de anti-ciclină sau o combinaţie a acestora.
MDA20180086A 2013-08-22 2014-08-22 Terapii imunooncolitice MD4748C1 (ro)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361868978P 2013-08-22 2013-08-22
PCT/US2014/052308 WO2015027163A1 (en) 2013-08-22 2014-08-22 Immuno-oncolytic therapies

Publications (3)

Publication Number Publication Date
MD20180086A2 MD20180086A2 (ro) 2019-03-31
MD4748B1 MD4748B1 (ro) 2021-02-28
MD4748C1 true MD4748C1 (ro) 2021-09-30

Family

ID=52484194

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MD20160027A MD4624C1 (ro) 2013-08-22 2014-08-22 Virusuri oncolitice de vaccin variolic şi terapii imunooncolitice
MDA20180086A MD4748C1 (ro) 2013-08-22 2014-08-22 Terapii imunooncolitice

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MD20160027A MD4624C1 (ro) 2013-08-22 2014-08-22 Virusuri oncolitice de vaccin variolic şi terapii imunooncolitice

Country Status (28)

Country Link
US (2) US11478518B2 (ro)
EP (3) EP4324918A3 (ro)
JP (3) JP6912199B2 (ro)
KR (1) KR102389240B1 (ro)
CN (1) CN105658795B (ro)
AU (1) AU2014308648B2 (ro)
CA (3) CA3213683A1 (ro)
CY (1) CY1126587T1 (ro)
DK (2) DK3778897T3 (ro)
EA (1) EA037582B1 (ro)
ES (2) ES2847305T3 (ro)
FI (1) FI3778897T3 (ro)
HR (1) HRP20240078T1 (ro)
HU (1) HUE066593T2 (ro)
IL (1) IL243996A0 (ro)
LT (1) LT3778897T (ro)
MD (2) MD4624C1 (ro)
MX (1) MX2016002257A (ro)
NZ (1) NZ716825A (ro)
PE (1) PE20160673A1 (ro)
PH (1) PH12016500329A1 (ro)
PL (1) PL3778897T3 (ro)
PT (1) PT3778897T (ro)
RS (1) RS65104B1 (ro)
SG (1) SG11201600960PA (ro)
SI (1) SI3778897T1 (ro)
SM (1) SMT202400047T1 (ro)
WO (1) WO2015027163A1 (ro)

Families Citing this family (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RS65104B1 (sr) * 2013-08-22 2024-02-29 Univ Pittsburgh Commonwealth Sys Higher Education Onkolitičke imunoterapije
CN115300622A (zh) 2015-02-25 2022-11-08 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 使用灭活的修饰的痘苗病毒安卡拉作为实体肿瘤的单一免疫疗法或与免疫检查点阻断剂组合
CN107847534B (zh) 2015-04-17 2022-10-04 纪念斯隆凯特琳癌症中心 Mva或mvaδe3l作为抗实体瘤的免疫治疗剂的应用
WO2017014296A1 (ja) * 2015-07-22 2017-01-26 国立大学法人鳥取大学 ワクシニアウイルスの増殖・伝搬を増強する宿主制御因子
WO2017043815A1 (en) * 2015-09-08 2017-03-16 Sillajen, Inc. Modified oncolytic vaccinia viruses expressing a cytokine and a car- boxylesterase and methods of use thereof
WO2017079746A2 (en) 2015-11-07 2017-05-11 Multivir Inc. Methods and compositions comprising tumor suppressor gene therapy and immune checkpoint blockade for the treatment of cancer
IL261321B2 (en) 2016-02-25 2023-12-01 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Recombinant mva or mvadele3l expressing human flt3l and use thereof as immuno-therapeutic agents against solid tumors
KR20180133395A (ko) 2016-02-25 2018-12-14 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 암 면역요법을 위한, 인간 flt3l 또는 gm-csf의 발현이 있거나 없으며 티미딘 키나제가 결실된 복제 가능 약독화 백시니아 바이러스
CN109152736A (zh) * 2016-03-25 2019-01-04 联邦高等教育系统匹兹堡大学 合成包封病毒
EP3254692A1 (en) * 2016-06-10 2017-12-13 Ceva Sante Animale Multivalent recombinant spv
CA3070146A1 (en) * 2016-07-19 2018-01-25 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Oncolytic viruses targeting stat3
AU2017332367B2 (en) * 2016-09-21 2021-12-23 Stephen H. Thorne High mobility group box i mutant
GB201616365D0 (en) * 2016-09-27 2016-11-09 Helsingin Yliopisto Non-genetic modification of enveloped viruses
KR20190112263A (ko) 2016-12-12 2019-10-04 멀티비르 인코포레이티드 암 및 감염성 질환의 치료 및 예방을 위한 바이러스 유전자 치료요법 및 면역 체크포인트 억제제를 포함하는 방법 및 조성물
JP7724601B2 (ja) 2017-02-03 2025-08-18 ユニバーシティ オブ ピッツバーグ －オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション 腫瘍溶解性ウイルス療法
EP3593136A1 (en) * 2017-03-06 2020-01-15 Talaris Therapeutics, Inc. Methods and compositions for determining the potency of a therapeutic cellular composition
EP4286009A3 (en) * 2017-04-21 2024-04-03 Sillajen, Inc. Oncolytic vaccinia virus and checkpoint inhibitor combination therapy
WO2018209315A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Vaccinia virus mutants useful for cancer immunotherapy
EP3703723A4 (en) 2017-10-31 2021-12-15 KaliVir Immunotherapeutics, Inc. ONCOLYTIC PLATFORM VECTOR FOR SYSTEMS ADMINISTRATION
CA3082961A1 (en) 2017-12-01 2019-06-06 Gerd Sutter Immuno-modulated replication-efficient vaccinia virus strain
SG11202006457YA (en) 2018-01-05 2020-08-28 Ottawa Hospital Res Inst Modified orthopoxvirus vectors
WO2020036635A2 (en) 2018-03-19 2020-02-20 Multivir Inc. Methods and compositions comprising tumor suppressor gene therapy and cd122/cd132 agonists for the treatment of cancer
WO2020018996A2 (en) * 2018-07-20 2020-01-23 Ansun Biopharma, Inc. Delivery of sialidase to cancer cells, immune cells and the tumor microenvironment
MX2021003013A (es) 2018-09-15 2021-08-11 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Poxvirus recombinantes para inmunoterapia contra cáncer.
EP3898997A4 (en) * 2018-12-21 2022-11-16 Ottawa Hospital Research Institute MODIFIED ORTHOPOXVIRUS VECTORS
CA3125020A1 (en) * 2019-01-07 2020-07-16 Kalivir Immunotherapeutics, Inc. Methods of treating cancer
TW202038994A (zh) * 2019-01-14 2020-11-01 美商醫格耐免疫治療公司 重組痘瘡病毒及其使用方法
WO2020165730A1 (en) 2019-02-14 2020-08-20 Ignite Immunotherapy, Inc. Recombinant vaccinia virus and methods of use thereof
CA3150829A1 (en) * 2019-08-26 2021-03-04 Bionoxx Inc. Pharmaceutical composition comprising vaccinia virus and hydroxyurea as active ingredient for treatment of cancer
KR20220082025A (ko) * 2019-10-16 2022-06-16 칼리버 임뮤노쎄라퓨틱스, 인크. 변형된 세포외 외피보유 바이러스
EP4061417A4 (en) * 2019-11-20 2023-10-11 University of Pittsburgh - of the Commonwealth System of Higher Education VACCINIA VIRUSES AND METHOD FOR USING VACCINIA VIRUSES
WO2021113644A1 (en) 2019-12-05 2021-06-10 Multivir Inc. Combinations comprising a cd8+ t cell enhancer, an immune checkpoint inhibitor and radiotherapy for targeted and abscopal effects for the treatment of cancer
WO2021116943A1 (en) * 2019-12-12 2021-06-17 Ignite Immunotherapy, Inc. Variant oncolytic vaccinia virus and methods of use thereof
WO2021140435A1 (en) * 2020-01-09 2021-07-15 Pfizer Inc. Recombinant vaccinia virus
KR20220152250A (ko) * 2020-03-06 2022-11-15 유니버시티 오브 피츠버그-오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션 암을 치료하기 위한 irf 모듈레이터를 발현하는 종양용해성 바이러스
US20230355804A1 (en) * 2020-06-29 2023-11-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Viruses engineered to promote thanotransmission and their use in treating cancer
TW202227621A (zh) 2020-11-19 2022-07-16 美商凱立凡爾免疫治療股份有限公司 重塑腫瘤微環境的溶瘤免疫療法
BR112023022681A2 (pt) 2021-04-30 2024-01-23 Kalivir Immunotherapeutics Inc Vírus oncolíticos para expressão modificada de mhc
AU2022303363A1 (en) * 2021-06-29 2024-01-18 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof
WO2023106839A1 (ko) * 2021-12-07 2023-06-15 재단법인 아산사회복지재단 Il-12를 발현하는 재조합 백시니아 바이러스 및 이의 용도
IL318055A (en) * 2022-07-08 2025-02-01 Viromissile Inc ONCOLYTIC VACCINIA VIRUSES AND RECOMBINANT VIRUSES AND METHODS OF USE THEREOF
WO2025251079A1 (en) * 2024-05-31 2025-12-04 University Of Massachusetts Rna compositions and methods of use thereof in the treatment of cancer

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX9305855A (es) 1992-09-24 1995-01-31 Tadatsugu Taniguchi Factores 1 y 2 reguladores del interferon en el diagnostico de latumorigenicidad.
WO2000073479A1 (en) 1999-05-28 2000-12-07 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services A combined growth factor-deleted and thymidine kinase-deleted vaccinia virus vector
WO2002064159A1 (fr) 2001-02-07 2002-08-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Remedes contre les tumeurs affectant les organes hematopoietiques
KR20120002613A (ko) * 2002-08-12 2012-01-06 제네렉스, 인코포레이티드 폭스바이러스 및 암과 관련된 방법 및 조성물
JPWO2007023725A1 (ja) * 2005-08-25 2009-02-26 公立大学法人横浜市立大学 遺伝子ワクチン
US8980246B2 (en) * 2005-09-07 2015-03-17 Sillajen Biotherapeutics, Inc. Oncolytic vaccinia virus cancer therapy
KR101772375B1 (ko) * 2005-09-07 2017-08-29 신라젠(주) Ｇｍ-ｃｓｆ를 발현하는 폭스바이러스를 사용한 전이성 및/또는 전신 파종성 암의 전신 치료법
AU2012244210B2 (en) * 2005-09-07 2014-10-02 Sillajen Biotherapeutics, Inc. Systemic treatment of metastatic and/or systemically-disseminated cancers using gm-csf-expressing poxviruses
KR20080084528A (ko) * 2007-03-15 2008-09-19 제네렉스 바이오테라퓨틱스 인크. 종양살상형 백시니아 바이러스 암 치료
US20110038843A1 (en) * 2008-03-31 2011-02-17 Kusmartsev Sergei A Tumor Growth Inhibition Via Conditioning of Tumor Microenvironment
ES2848650T3 (es) 2009-09-14 2021-08-11 Sillajen Biotherapeutics Inc Terapia combinada contra el cáncer con virus vaccinia oncolítico
WO2011119925A2 (en) * 2010-03-25 2011-09-29 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Synthetic herpes simplex viruses for treatment of cancers
ES2733211T3 (es) * 2011-04-15 2019-11-28 Genelux Corp Cepas clonales de virus vaccinia atenuados y métodos de uso de las mismas
US20150250837A1 (en) * 2012-09-20 2015-09-10 Morningside Technology Ventures Ltd. Oncolytic virus encoding pd-1 binding agents and uses of the same
RS65104B1 (sr) 2013-08-22 2024-02-29 Univ Pittsburgh Commonwealth Sys Higher Education Onkolitičke imunoterapije

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20240078T1 (hr) 2024-03-29
JP6912199B2 (ja) 2021-08-04
JP2016527920A (ja) 2016-09-15
JP2019205451A (ja) 2019-12-05
DK3036329T3 (da) 2021-01-11
JP7333431B2 (ja) 2023-08-24
EP3036329B1 (en) 2020-10-07
ES2847305T3 (es) 2021-08-02
IL243996A0 (en) 2016-04-21
AU2014308648A1 (en) 2016-03-03
US12514888B2 (en) 2026-01-06
PT3778897T (pt) 2024-02-01
RS65104B1 (sr) 2024-02-29
FI3778897T3 (fi) 2024-01-25
CY1126587T1 (el) 2026-02-25
JP2022062171A (ja) 2022-04-19
HUE066593T2 (hu) 2024-08-28
CA2921041A1 (en) 2015-02-26
EP3036329A1 (en) 2016-06-29
US11478518B2 (en) 2022-10-25
MD4624B1 (ro) 2019-03-31
EA201690444A1 (ru) 2016-08-31
DK3778897T3 (da) 2024-01-29
EP3778897B1 (en) 2023-12-20
EP4324918A2 (en) 2024-02-21
HK1223402A1 (zh) 2017-07-28
NZ716825A (en) 2022-02-25
US20230008089A1 (en) 2023-01-12
MD4624C1 (ro) 2019-10-31
LT3778897T (lt) 2024-02-12
WO2015027163A9 (en) 2016-04-14
PE20160673A1 (es) 2016-07-21
CA3213683A1 (en) 2015-02-26
CN105658795B (zh) 2020-07-03
US20160235793A1 (en) 2016-08-18
KR102389240B1 (ko) 2022-04-20
CA2921041C (en) 2023-10-31
CN105658795A (zh) 2016-06-08
MD20160027A2 (ro) 2016-08-31
MD20180086A2 (ro) 2019-03-31
EP4324918A3 (en) 2024-04-24
EP3036329A4 (en) 2017-08-02
EP3778897A1 (en) 2021-02-17
WO2015027163A1 (en) 2015-02-26
CA3213715A1 (en) 2015-02-26
AU2014308648B2 (en) 2020-11-12
MX2016002257A (es) 2016-11-08
PL3778897T3 (pl) 2024-04-02
SI3778897T1 (sl) 2024-03-29
MD4748B1 (ro) 2021-02-28
PH12016500329A1 (en) 2016-05-02
ES2971528T3 (es) 2024-06-05
JP7021154B2 (ja) 2022-02-16
KR20160044529A (ko) 2016-04-25
SMT202400047T1 (it) 2024-03-13
EA037582B1 (ru) 2021-04-16
SG11201600960PA (en) 2016-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12514888B2 (en) Immuno-oncolytic therapies
US20250332208A1 (en) Oncolytic virus therapy
AU2014308648A2 (en) Immuno-oncolytic therapies
HK40104741A (en) Immuno-oncolytic therapies
HK40045119B (en) Immuno-oncolytic therapies
HK40045119A (en) Immuno-oncolytic therapies
HK40119191A (zh) 抗癌病毒的新用途
HK1223402B (zh) 免疫溶瘤療法

Legal Events

Date Code Title Description
FG4A Patent for invention issued