MD57Y

MD57Y - Micropropagation process of Stevia rebaudiana Bertoni in vitro

Info

Publication number: MD57Y
Application number: MDS20090036A
Authority: MD
Inventors: Iulia SIROMEATNICOV; Anatol Jacota; Stepan Svet; Pavel Chintea; Eugenia Cotenco
Original assignee: Institutul De Genetica Si Fiziologie A Plantelor Al Academiei De Stiinte A Moldovei
Priority date: 2009-03-03
Filing date: 2009-03-03
Publication date: 2009-08-31
Also published as: MD57Z

Abstract

Inventia se refera la biotehnologie, in particular la un procedeu de micropropagare a plantelor de Stevia rebaudiana Bertoni in vitro. Procedeul, conform inventiei, include obtinerea explantelor, sterilizarea, segmentarea si cultivarea lor pemediul nutritiv Murashige-Skoog, ce contine suplimentar glicozide steroidice obtinute din radacini de patlagele vinete Solanum melongena L. prin extractie cu apa la fierbere, prelucrarea extractului obtinut cu butanol-1 si concentrare, in concentratie de (2,5?.3,0)·10-3%, totodata cultivarea se efectueaza la o temperatura de 22?26°C, umiditatea relativa a aerului de 70%, cu o fotoperioada de 16 si 8 ore zi si noapte si intensitatea iluminarii de 3000 lx. Rezultatul inventiei consta in sporirea embriogenezei somatice si regenerarii plantelor.The invention relates to biotechnology, in particular to a process for micropropagation of Stevia rebaudiana Bertoni plants in vitro. The process, according to the invention, includes obtaining explants, sterilizing, segmenting and cultivating them on Murashige-Skoog nutrient medium, which additionally contains steroidal glycosides obtained from the roots of eggplant Solanum melongena L. by extraction with boiling water, processing the extract obtained with butanol-1 and concentration, in a concentration of (2.5?.3.0)·10-3%, at the same time the cultivation is carried out at a temperature of 22?26°C, relative air humidity of 70%, with a photoperiod of 16 and 8 hours day and night and the illumination intensity of 3000 lx. The result of the invention consists in increasing somatic embryogenesis and plant regeneration.

Description

[0001] Invenţia se referă la biotehnologie, în particular la un procedeu de micropropagare a plantelor de Stevia rebaudiana Bertoni in vitro.[0001] The invention relates to biotechnology, in particular to a process for micropropagation of Stevia rebaudiana Bertoni plants in vitro.

[0002] Stevia rebaudiana Bertoni este o specie nouă pentru flora Europei şi a Moldovei în particular. Această specie în prezent este în faza de introducere în cultura in vitro în mai multe ţări ale lumii (SUA, Japonia, Coreia, Brazilia, Italia). Ea provine din America Latină, din Paraguay, unde populaţia băştinaşă o foloseşte în calitate de „iarba mierii” şi plantă medicinală deja de câteva secole. Principala calitate a Steviei rebaudiana este aceea de a furniza substanţe dulci cu un conţinut de calorii foarte scăzut. Natura substanţelor dulci este cunoscută - frunzele conţin glicozide diterpene „stevozid”, dulceaţa cărora depăşeşte dulceaţa zaharozei de circa 300 ori. Datorită calităţii de „superdulceaţă” şi unor proprietăţi curative ea este recomandată pentru nutriţia bolnavilor de diabet. Deoarece la Stevia rebaudiana există o sterilitate completă a seminţelor, pentru sterilizarea materialului iniţial - segmentele explantelor (de tulpină, frunze, noduri, internoduri), prelevate din plantele donatoare de explante, s-a utilizat agent de înălbire pe bază de clor de 10%, timp de 20 minute.[0002] Stevia rebaudiana Bertoni is a new species for the flora of Europe and Moldova in particular. This species is currently in the phase of introduction into in vitro culture in several countries of the world (USA, Japan, Korea, Brazil, Italy). It comes from Latin America, from Paraguay, where the native population has been using it as a "honey herb" and medicinal plant for several centuries. The main quality of Stevia rebaudiana is to provide sweet substances with a very low calorie content. The nature of the sweet substances is known - the leaves contain diterpene glycosides "stevoside", the sweetness of which exceeds the sweetness of sucrose by about 300 times. Due to its "supersweet" quality and some curative properties, it is recommended for the nutrition of diabetics. Since Stevia rebaudiana has complete seed sterility, 10% chlorine bleach was used for 20 minutes to sterilize the initial material - the explant segments (stem, leaves, nodes, internodes), taken from the explant donor plants.

[0003] Este cunoscut procedeul de obţinere a răsadului de Stevia rebaudiana Bertoni, ce constă în multiplicarea plantelor de stevie prin culturi in vitro, secţionarea plantelor multiplicate în butaşi cu 4…6 frunzuliţe, înrădăcinarea şi adaptarea lor la condiţiile mediului înconjurător pe mediul nutritiv Knop timp de 14…15 zile şi plantarea ulterioară în sol deschis [1].[0003] The process of obtaining the Stevia rebaudiana Bertoni seedling is known, which consists of multiplying stevia plants through in vitro cultures, sectioning the multiplied plants into cuttings with 4...6 leaflets, rooting and adapting them to the environmental conditions on the Knop nutrient medium for 14...15 days and subsequent planting in open ground [1].

[0004] Neajunsurile acestui procedeu sunt: coeficientul de micropropagare scăzut, faptul că nu toate explantele asigură iniţierea creşterii meristemoizilor, de la baza cărora pornesc lăstarii şi care au un procent foarte scăzut de înrădăcinare.[0004] The shortcomings of this process are: the low micropropagation coefficient, the fact that not all explants ensure the initiation of meristemoid growth, from the base of which shoots start and which have a very low rooting percentage.

[0005] Problema pe care o rezolvă invenţia constă în sporirea coeficientului de multiplicare a plantelor de Stevia rebaudiana Bertoni pe calea modificării conţinutului mediului nutritiv utilizat pentru micropropagare.[0005] The problem solved by the invention consists in increasing the multiplication coefficient of Stevia rebaudiana Bertoni plants by modifying the content of the nutrient medium used for micropropagation.

[0006] Procedeul, conform invenţiei, include obţinerea explantelor, sterilizarea, segmentarea şi cultivarea lor pe mediul nutritiv Murashige-Skoog, ce conţine suplimentar glicozide steroidice obţinute din rădăcini de pătlăgele vinete Solanum melongena L. prin extracţie cu apă la fierbere, prelucrarea extractului obţinut cu butanol-1 şi concentrare, în concentraţie de (2,5…3,0)·10-3%, totodată cultivarea se efectuează la o temperatură de 22…26°C, umiditatea relativă a aerului de 70%, cu o fotoperioadă de 16 şi 8 ore zi şi noapte şi intensitatea iluminării de 3000 lx.[0006] The process, according to the invention, includes obtaining explants, sterilizing, segmenting and cultivating them on Murashige-Skoog nutrient medium, which additionally contains steroidal glycosides obtained from eggplant roots Solanum melongena L. by extraction with boiling water, processing the extract obtained with butanol-1 and concentration, in a concentration of (2.5…3.0)·10-3%, at the same time the cultivation is carried out at a temperature of 22…26°C, relative air humidity of 70%, with a photoperiod of 16 and 8 hours day and night and illumination intensity of 3000 lx.

[0007] Rezultatul invenţiei constă în sporirea embriogenezei somatice şi regenerării plantelor.[0007] The result of the invention consists in enhancing somatic embryogenesis and plant regeneration.

[0008] Glicozidele steroidice au fost obţinute din rădăcini de pătlăgele vinete Solanum melongena L. prin extracţie cu apă la fierbere, prelucrarea extractului obţinut cu butanol-1 şi concentrare (SU 1473317 A1 1988.12.15).[0008] Steroidal glycosides have been obtained from the roots of eggplant Solanum melongena L. by extraction with boiling water, processing of the obtained extract with butanol-1 and concentration (SU 1473317 A1 1988.12.15).

[0009] Exemplu de realizare a invenţiei[0009] Embodiment of the invention

[0010] Explantele de Stevia rebaudiana Bertoni, obţinute în condiţii sterile, s-au tratat cu agent de înălbire pe bază de clor de 15%, timp de 15 minute, spălându-se de 4…5 ori cu apă distilată sterilă. Explantele obţinute ajungând la mărimea 7…10 cm, s-au segmentat şi cultivat în condiţii aseptice la hota cu flux de aer laminar steril. În vasele de sticlă de 50…100 ml s-au repartizat câte 15…20 ml de mediu nutritiv în fiecare vas. S-au sterilizat prin autoclavare, în faza de vapori 10 minute aerisire şi 15 minute sterilizare în condiţiile de presiune p = 1 atm şi temperatură[0010] The explants of Stevia rebaudiana Bertoni, obtained under sterile conditions, were treated with 15% chlorine bleach for 15 minutes, washed 4-5 times with sterile distilled water. The explants obtained, reaching a size of 7-10 cm, were segmented and cultivated under aseptic conditions in a hood with sterile laminar airflow. In the 50-100 ml glass vessels, 15-20 ml of nutrient medium were distributed in each vessel. They were sterilized by autoclaving, in the vapor phase 10 minutes of aeration and 15 minutes of sterilization under pressure conditions p = 1 atm and temperature

[0011] t = 121°C, pH-ul a fost ajustat la 5,8…5,9.[0011] t = 121°C, pH was adjusted to 5.8…5.9.

[0012] În calitate de material iniţial pentru iniţierea micropropagării explantelor au servit segmentele de hipocotil şi frunze prelevate din plantule, care au fost sterilizate. În vasele de sticlă de 50…100 ml s-au repartizat câte 15…20 ml de mediu nutritiv în fiecare vas. S-au sterilizat prin autoclavare, în faza de vapori 10 minute aerisire şi 15 minute sterilizare în condiţiile de presiune p = 1 atm şi temperatură t = 121°C, pH-ul a fost ajustat la 5,8…5,9.[0012] As initial material for initiation of micropropagation of explants hypocotyl and leaf segments taken from seedlings, which were sterilized, served. In glass vessels of 50…100 ml were distributed 15…20 ml of nutrient medium in each vessel. They were sterilized by autoclaving, in the vapor phase 10 minutes of aeration and 15 minutes of sterilization under conditions of pressure p = 1 atm and temperature t = 121°C, the pH was adjusted to 5.8…5.9.

[0013] Toate operaţiile au fost efectuate în condiţii strict aseptice la hota cu flux de aer laminar steril. În camera de creştere s-a menţinut un regim controlat de creştere constant, caracterizat prin temperatura de 22…26°C, umiditatea relativă a aerului de 70%, cu o fotoperioadă de 16 şi 8 ore zi şi noapte şi intensitatea iluminării de 3000 lx.[0013] All operations were performed under strictly aseptic conditions in a sterile laminar flow hood. A constant controlled growth regime was maintained in the growth chamber, characterized by a temperature of 22…26°C, a relative air humidity of 70%, a photoperiod of 16 and 8 hours day and night and an illumination intensity of 3000 lx.

[0014] O parte de explante (varianta control) s-au inoculat pe mediul de cultură de bază Murashige-Skoog, ce conţinea macroelemente (săruri minerale, mg/l): NH4NO3 - 1650, KNO3 - 1900, MgSO4 · 7H2O - 370, KH2PO4 - 170, CaCl2 ·7H2O - 440; microelemente, mg/l: H3BO3 - 6,2, MnSO4 · 4H2O - 22,3, CoCl2 · 6H2O -0,025, CuSO4 · 5H2O - 0,025, ZnSO4 · 7H2O - 8,6, Na2MoO4 · 2H2O - 0,25, KJ - 0,83, FeSO4 · 7H2O - 27,8, Na2EDTA - 37,3, Inozitol - 100, solidificat cu agar-agar 0,7%, zaharoză 3%.[0014] A part of the explants (control variant) were inoculated on the Murashige-Skoog basic culture medium, which contained macroelements (mineral salts, mg/l): NH4NO3 - 1650, KNO3 - 1900, MgSO4 · 7H2O - 370, KH2PO4 - 170, CaCl2 ·7H2O - 440; microelements, mg/l: H3BO3 - 6.2, MnSO4 · 4H2O - 22.3, CoCl2 · 6H2O -0.025, CuSO4 · 5H2O - 0.025, ZnSO4 · 7H2O - 8.6, Na2MoO4 · 2H2O - 0.25, KJ - 0.83, FeSO4 · 7H2O - 27.8, Na2EDTA - 37.3, Inositol - 100, solidified with agar-agar 0.7%, sucrose 3%.

[0015] Altă parte de explante (cea mai apropiată soluţie) s-a utilizat pe mediul Knop - MgSO4 · 7H2O - 0,2 g/l, KH2PO4 - 0,2 g/l şi Ca(NO3)2 · 4H2O - 0,9 g/l.[0015] Another part of the explants (the closest solution) was used on Knop medium - MgSO4 · 7H2O - 0.2 g/l, KH2PO4 - 0.2 g/l and Ca(NO3)2 · 4H2O - 0.9 g/l.

[0016] A treia parte de explante au fost utilizate pe mediul de cultură de bază Murashige-Skoog, suplimentat cu Somelongozidă în concentraţie de 2,5…3,0·10-3%.[0016] The third part of explants were used on Murashige-Skoog basic culture medium, supplemented with Somelongoside in concentration of 2.5…3.0·10-3%.

[0017] Proliferarea explantelor în varianta martor a fost foarte slabă, creşterea şi dezvoltarea calusului fără zone meristematice, ca rezultat explantele inoculate pe acest mediu s-au necrotizat.[0017] The proliferation of explants in the control variant was very weak, the growth and development of callus without meristematic zones, as a result the explants inoculated on this medium became necrotic.

[0018] Utilizarea mediului MgSO4 · 7H2O - 0,2 g/l, KH2PO4 - 0,2 g/l şi Ca(NO3)2 · 4H2O - 0,8 g/l - cea mai apropiată soluţie, proliferarea explantelor s-a evaluat după 12 zile de la inoculare, la 20 zile s-a observat formarea şi dezvoltarea calusului. Apariţia plantulelor după 25 zile. Creşterea şi dezvoltarea plantulelor s-a observat după 30 zile. În acest caz micropropagarea plantulelor a constituit 2·105 plante anual.[0018] Using the medium MgSO4 · 7H2O - 0.2 g/l, KH2PO4 - 0.2 g/l and Ca(NO3)2 · 4H2O - 0.8 g/l - the closest solution, the proliferation of explants was evaluated after 12 days from inoculation, at 20 days the formation and development of callus was observed. The emergence of seedlings after 25 days. The growth and development of seedlings was observed after 30 days. In this case the micropropagation of seedlings constituted 2·105 plants annually.

[0019] Pe al treilea mediu, conform invenţiei, proliferarea explantelor s-a evaluat la 5 zile de la cultivare, la 8 zile formarea şi dezvoltarea calusului embrionar cu zone meristematice de culoare roz. Apariţia plantulelor regenerate s-a observat la 14 zile. Creşterea şi dezvoltarea plantulelor s-a observat la 20 zile de la momentul cultivării explantelor pe mediul de cultură Murashige-Skoog, suplimentat cu glicozide steroidice, obţinute din rădăcini de pătlăgele vinete Solanum melongena L. prin extracţie cu apă la fierbere, prelucrarea extractului obţinut cu butanol-1 şi concentrare, în concentraţie de (2,5…3,0·10)-3%. În această variantă raportul optimal al ingredientelor prezentate în mediul nutritiv de cultură artificial sporeşte considerabil coeficientul de micropropagare a plantulelor de Stevia rebaudiana Bertoni - cu 4·105 plante anual. În această variantă s-a manifestat formarea structurilor calusale cu un potenţial stimulator de 112,1% (38,6 mg/expl.), masa medie a unui explant regenerant a constituit 41,9…49,7 mg/expl. mugure, în raport procentual cu valori de 117,3…138,8%. În dependenţă de variabilitatea genetică de micropropagare a plantulelor in vitro capacitatea de regenerare de 95,3…98,1%.[0019] On the third medium, according to the invention, the proliferation of explants was evaluated 5 days after cultivation, at 8 days the formation and development of embryonic callus with pink meristematic areas. The appearance of regenerated seedlings was observed at 14 days. The growth and development of seedlings was observed 20 days after the explants were cultivated on Murashige-Skoog culture medium, supplemented with steroid glycosides, obtained from the roots of eggplant Solanum melongena L. by extraction with boiling water, processing of the extract obtained with butanol-1 and concentration, in a concentration of (2.5…3.0·10)-3%. In this variant, the optimal ratio of the ingredients presented in the artificial culture nutrient medium considerably increases the micropropagation coefficient of Stevia rebaudiana Bertoni seedlings - by 4·105 plants annually. In this variant, the formation of callus structures with a stimulatory potential of 112.1% (38.6 mg/expl.) was manifested, the average mass of a regenerating explant constituted 41.9…49.7 mg/expl. bud, in percentage ratio with values of 117.3…138.8%. Depending on the genetic variability of micropropagation of the seedlings in vitro, the regeneration capacity was 95.3…98.1%.

[0020] 1. MD G2 1262 1999.07.311. MD G2 1262 1999.07.31

Claims

1. Micropropagation procedure of Stevia rebaudiana Bertoni in vitro which includes

obtaining explants, sterilizing, segmenting and cultivating them on Murashige-Skoog nutrient medium, which additionally contains steroidal glycosides obtained from eggplant roots Solanum melongena L. by extraction with boiling water, processing the extract obtained with butanol-1 and concentration, in a concentration of (2.5…3.0)·10-3%, at the same time the cultivation is carried out at a temperature of 22…26°C, relative air humidity of 70%, with a photoperiod of 16 and 8 hours day and night and illumination intensity of 3000 lx