MD57Y

MD57Y - Procedeu de micropropagare a Stevia rebaudiana Bertoni in vitro

Info

Publication number: MD57Y
Application number: MDS20090036A
Authority: MD
Inventors: Iulia SIROMEATNICOV; Anatol Jacota; Stepan Svet; Pavel Chintea; Eugenia Cotenco
Original assignee: Institutul De Genetica Si Fiziologie A Plantelor Al Academiei De Stiinte A Moldovei
Priority date: 2009-03-03
Filing date: 2009-03-03
Publication date: 2009-08-31
Also published as: MD57Z

Abstract

Inventia se refera la biotehnologie, in particular la un procedeu de micropropagare a plantelor de Stevia rebaudiana Bertoni in vitro. Procedeul, conform inventiei, include obtinerea explantelor, sterilizarea, segmentarea si cultivarea lor pemediul nutritiv Murashige-Skoog, ce contine suplimentar glicozide steroidice obtinute din radacini de patlagele vinete Solanum melongena L. prin extractie cu apa la fierbere, prelucrarea extractului obtinut cu butanol-1 si concentrare, in concentratie de (2,5?.3,0)·10-3%, totodata cultivarea se efectueaza la o temperatura de 22?26°C, umiditatea relativa a aerului de 70%, cu o fotoperioada de 16 si 8 ore zi si noapte si intensitatea iluminarii de 3000 lx. Rezultatul inventiei consta in sporirea embriogenezei somatice si regenerarii plantelor.

Description

[0001] Invenţia se referă la biotehnologie, în particular la un procedeu de micropropagare a plantelor de Stevia rebaudiana Bertoni in vitro.

[0002] Stevia rebaudiana Bertoni este o specie nouă pentru flora Europei şi a Moldovei în particular. Această specie în prezent este în faza de introducere în cultura in vitro în mai multe ţări ale lumii (SUA, Japonia, Coreia, Brazilia, Italia). Ea provine din America Latină, din Paraguay, unde populaţia băştinaşă o foloseşte în calitate de „iarba mierii” şi plantă medicinală deja de câteva secole. Principala calitate a Steviei rebaudiana este aceea de a furniza substanţe dulci cu un conţinut de calorii foarte scăzut. Natura substanţelor dulci este cunoscută - frunzele conţin glicozide diterpene „stevozid”, dulceaţa cărora depăşeşte dulceaţa zaharozei de circa 300 ori. Datorită calităţii de „superdulceaţă” şi unor proprietăţi curative ea este recomandată pentru nutriţia bolnavilor de diabet. Deoarece la Stevia rebaudiana există o sterilitate completă a seminţelor, pentru sterilizarea materialului iniţial - segmentele explantelor (de tulpină, frunze, noduri, internoduri), prelevate din plantele donatoare de explante, s-a utilizat agent de înălbire pe bază de clor de 10%, timp de 20 minute.

[0003] Este cunoscut procedeul de obţinere a răsadului de Stevia rebaudiana Bertoni, ce constă în multiplicarea plantelor de stevie prin culturi in vitro, secţionarea plantelor multiplicate în butaşi cu 4…6 frunzuliţe, înrădăcinarea şi adaptarea lor la condiţiile mediului înconjurător pe mediul nutritiv Knop timp de 14…15 zile şi plantarea ulterioară în sol deschis [1].

[0004] Neajunsurile acestui procedeu sunt: coeficientul de micropropagare scăzut, faptul că nu toate explantele asigură iniţierea creşterii meristemoizilor, de la baza cărora pornesc lăstarii şi care au un procent foarte scăzut de înrădăcinare.

[0005] Problema pe care o rezolvă invenţia constă în sporirea coeficientului de multiplicare a plantelor de Stevia rebaudiana Bertoni pe calea modificării conţinutului mediului nutritiv utilizat pentru micropropagare.

[0006] Procedeul, conform invenţiei, include obţinerea explantelor, sterilizarea, segmentarea şi cultivarea lor pe mediul nutritiv Murashige-Skoog, ce conţine suplimentar glicozide steroidice obţinute din rădăcini de pătlăgele vinete Solanum melongena L. prin extracţie cu apă la fierbere, prelucrarea extractului obţinut cu butanol-1 şi concentrare, în concentraţie de (2,5…3,0)·10-3%, totodată cultivarea se efectuează la o temperatură de 22…26°C, umiditatea relativă a aerului de 70%, cu o fotoperioadă de 16 şi 8 ore zi şi noapte şi intensitatea iluminării de 3000 lx.

[0007] Rezultatul invenţiei constă în sporirea embriogenezei somatice şi regenerării plantelor.

[0008] Glicozidele steroidice au fost obţinute din rădăcini de pătlăgele vinete Solanum melongena L. prin extracţie cu apă la fierbere, prelucrarea extractului obţinut cu butanol-1 şi concentrare (SU 1473317 A1 1988.12.15).

[0009] Exemplu de realizare a invenţiei

[0010] Explantele de Stevia rebaudiana Bertoni, obţinute în condiţii sterile, s-au tratat cu agent de înălbire pe bază de clor de 15%, timp de 15 minute, spălându-se de 4…5 ori cu apă distilată sterilă. Explantele obţinute ajungând la mărimea 7…10 cm, s-au segmentat şi cultivat în condiţii aseptice la hota cu flux de aer laminar steril. În vasele de sticlă de 50…100 ml s-au repartizat câte 15…20 ml de mediu nutritiv în fiecare vas. S-au sterilizat prin autoclavare, în faza de vapori 10 minute aerisire şi 15 minute sterilizare în condiţiile de presiune p = 1 atm şi temperatură

[0011] t = 121°C, pH-ul a fost ajustat la 5,8…5,9.

[0012] În calitate de material iniţial pentru iniţierea micropropagării explantelor au servit segmentele de hipocotil şi frunze prelevate din plantule, care au fost sterilizate. În vasele de sticlă de 50…100 ml s-au repartizat câte 15…20 ml de mediu nutritiv în fiecare vas. S-au sterilizat prin autoclavare, în faza de vapori 10 minute aerisire şi 15 minute sterilizare în condiţiile de presiune p = 1 atm şi temperatură t = 121°C, pH-ul a fost ajustat la 5,8…5,9.

[0013] Toate operaţiile au fost efectuate în condiţii strict aseptice la hota cu flux de aer laminar steril. În camera de creştere s-a menţinut un regim controlat de creştere constant, caracterizat prin temperatura de 22…26°C, umiditatea relativă a aerului de 70%, cu o fotoperioadă de 16 şi 8 ore zi şi noapte şi intensitatea iluminării de 3000 lx.

[0014] O parte de explante (varianta control) s-au inoculat pe mediul de cultură de bază Murashige-Skoog, ce conţinea macroelemente (săruri minerale, mg/l): NH4NO3 - 1650, KNO3 - 1900, MgSO4 · 7H2O - 370, KH2PO4 - 170, CaCl2 ·7H2O - 440; microelemente, mg/l: H3BO3 - 6,2, MnSO4 · 4H2O - 22,3, CoCl2 · 6H2O -0,025, CuSO4 · 5H2O - 0,025, ZnSO4 · 7H2O - 8,6, Na2MoO4 · 2H2O - 0,25, KJ - 0,83, FeSO4 · 7H2O - 27,8, Na2EDTA - 37,3, Inozitol - 100, solidificat cu agar-agar 0,7%, zaharoză 3%.

[0015] Altă parte de explante (cea mai apropiată soluţie) s-a utilizat pe mediul Knop - MgSO4 · 7H2O - 0,2 g/l, KH2PO4 - 0,2 g/l şi Ca(NO3)2 · 4H2O - 0,9 g/l.

[0016] A treia parte de explante au fost utilizate pe mediul de cultură de bază Murashige-Skoog, suplimentat cu Somelongozidă în concentraţie de 2,5…3,0·10-3%.

[0017] Proliferarea explantelor în varianta martor a fost foarte slabă, creşterea şi dezvoltarea calusului fără zone meristematice, ca rezultat explantele inoculate pe acest mediu s-au necrotizat.

[0018] Utilizarea mediului MgSO4 · 7H2O - 0,2 g/l, KH2PO4 - 0,2 g/l şi Ca(NO3)2 · 4H2O - 0,8 g/l - cea mai apropiată soluţie, proliferarea explantelor s-a evaluat după 12 zile de la inoculare, la 20 zile s-a observat formarea şi dezvoltarea calusului. Apariţia plantulelor după 25 zile. Creşterea şi dezvoltarea plantulelor s-a observat după 30 zile. În acest caz micropropagarea plantulelor a constituit 2·105 plante anual.

[0019] Pe al treilea mediu, conform invenţiei, proliferarea explantelor s-a evaluat la 5 zile de la cultivare, la 8 zile formarea şi dezvoltarea calusului embrionar cu zone meristematice de culoare roz. Apariţia plantulelor regenerate s-a observat la 14 zile. Creşterea şi dezvoltarea plantulelor s-a observat la 20 zile de la momentul cultivării explantelor pe mediul de cultură Murashige-Skoog, suplimentat cu glicozide steroidice, obţinute din rădăcini de pătlăgele vinete Solanum melongena L. prin extracţie cu apă la fierbere, prelucrarea extractului obţinut cu butanol-1 şi concentrare, în concentraţie de (2,5…3,0·10)-3%. În această variantă raportul optimal al ingredientelor prezentate în mediul nutritiv de cultură artificial sporeşte considerabil coeficientul de micropropagare a plantulelor de Stevia rebaudiana Bertoni - cu 4·105 plante anual. În această variantă s-a manifestat formarea structurilor calusale cu un potenţial stimulator de 112,1% (38,6 mg/expl.), masa medie a unui explant regenerant a constituit 41,9…49,7 mg/expl. mugure, în raport procentual cu valori de 117,3…138,8%. În dependenţă de variabilitatea genetică de micropropagare a plantulelor in vitro capacitatea de regenerare de 95,3…98,1%.

[0020] 1. MD G2 1262 1999.07.31

Claims

1. Procedeu de micropropagare a Stevia rebaudiana Bertoni in vitro care include

obţinerea explantelor, sterilizarea, segmentarea şi cultivarea lor pe mediul nutritiv Murashige-Skoog, ce conţine suplimentar glicozide steroidice obţinute din rădăcini de pătlăgele vinete Solanum melongena L. prin extracţie cu apă la fierbere, prelucrarea extractului obţinut cu butanol-1 şi concentrare, în concentraţie de (2,5…3,0)·10-3%, totodată cultivarea se efectuează la o temperatură de 22…26°C, umiditatea relativă a aerului de 70%, cu o fotoperioadă de 16 şi 8 ore zi şi noapte şi intensitatea iluminării de 3000 lx