MX2013014921A

MX2013014921A - Metodos de infusion de insulina subcutanea continua con una enzima que degrada a hialuronano.

Info

Publication number: MX2013014921A
Application number: MX2013014921A
Authority: MX
Inventors: Edward Vaughn Daniel; Boyer Muchmore Douglas; Ian Frost Gregory
Original assignee: Halozyme Inc
Priority date: 2011-06-17
Filing date: 2012-06-15
Publication date: 2014-02-11
Also published as: EA201400030A1; WO2012174480A3; AU2012271361A1; KR101676543B1; NZ618301A; US20130022592A1; BR112013032265A2; EP2720713A2; JP2014518217A; WO2012174480A2; JP5890516B2; IL229750A0; CN103889443A; MX341448B; AU2012271361B2; CA2839512C; KR20140039304A; CA2839512A1

Abstract

Se proporcionan métodos para infusión de insulina subcutánea continua (CSII) que emplea una enzima que degrada a hialuronano, incluyendo un PH20 humana recombinante (rHuPH20). Los métodos pueden usarse para controlar más consistentemente la glucosa en la sangre durante el curso de CSII. Los métodos pueden usarse para tratar sujetos que tienen diabetes u otra enfermedad o afección asociada con insulina.

Description

MÉTODOS DE INFUSIÓN DE INSULINA SUBCUTÁNEA CONTINUA CON UNA ENZIMA QUE DEGRADA A HIALURONANO CAMPO DE LA INVENCIÓN Se proporcionan métodos para infusión' de insulina subcutánea continua. (CSII, por sus siglas en inglés) que emplean una enzima que degrada a hial.uronano, tal como una PH20 humana recombinante (rHuPH20) .... Los métodos pueden usarse para controlar más consistentemente la glucosa en la sangre durante el curso de CSII. Los métodos pueden usarse para tratar sujetos que tienen diabetes u otra enfermedad o afección asociada con insulina.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La diabetes da por resultado hiperglicemia crónica debido a la incapacidad del páncreas de producir cantidades adecuadas de insulina o debido a la incapacidad de las células de sintetizar y liberar la. insulina apropiadamente. La hiperglicemia también se uede experimentar por pacientes criticamente enfermos, que da por resultado mortalidad y morbilidad incrementada. La insulina se- ha administrado como un producto terapéutico para tratar pacientes que tienen diabetes, incluyendo, por ejemplo, diabetes tipo 1, ' diabetes tipo 2 y diabetes gestacional . La insulina se ha administrado a pacientes críticamente enfermos con hipergliccrr.ia para controlar el nivel de glucosa en la sangre. Típicamente, las insulinas de acción rápida se administran a estos sujetos en respuesta a la. hiperglicemia o . en la anticipación de la hiperglicemia, tal como después del consumo de una comida, que puede dar por resultado el control glicémico. Sin embargo, las formas de acción rápida actuales . de insulina tienen un retraso en la absorción y acción, y por lo tanto no se aproximan a la acción rápida de la insulina endógena. De esta manera, estas formulaciones no actúan suficientemente rápido para detener la producción de glucosa hepática que se presenta poco después .de esta primera fase de . liberación de insulina. Debido al retraso en la acción farmacológica, las preparaciones de-, insulina de . acción . rápida se deben administrar antes de los alimentos a fin de lograr el control glicémico deseado. Además, las dosis que se deben administrar conducen a una duración prolongada de acción que .contribuye a la hipoglicemia, y en muchos casos, a la obesidad. De esta manera, existe una. necesidad para métodos mejorados de terapia de insulina para controlar los niveles de glucosa en la sangre en sujetos diabéticos.

SUMARIO DE LA INVENCION Se proporcionan métodos, composiciones y usos para controlar la glucosa en la sangre en un .sujeto tratado por terapia de infusión dé insulina subcutánea continua (CSII).. Típicamente los sujetos a tratarse tienen diabetes, tales como, pero no limitados a, diabetes mellitus tipo 1, diabetes mellitus tipo 2 y :diabetes gestacional .

Los métodos proporcionados en la presente incluyen administrar al sujeto una composición que contiene una enzima que degrada a hialuronano en una cantidad terapéuticamente efectiva suficiente para catalizar la hidrólisis de ácido hialurónico para incrementar' la permeabilidad del tejido; y realizar terapia de CSII para suministrar .una composición que comprende una insulina de acción rápida al' .sujeto. La administración de la enzima que. degrada a hialuronano generalmente se administra separadamente de la terapia de CSII. Por ejemplo,, la enzima que degrada a hialuronano se administra antes . dé la administración de terapia de. CSII por tecnología de punta. Para practicar estos métodos, la enzima que degrada a hialuronano se proporciona en una cantidad que efectúa una respuesta de insulina ultra-rápida al comienzo de la vida del equipo de infusión del dispositivo CSII. Los métodos pueden corregir cambios o- diferencias en la absorción de insulina y/o acción observada durante la terapia de CSII, que se minimiza . o reduce durante el curso dé la vida del equipo de infusión.; ' Por ejemplo,, proporcionado en la presente es un método para controlar la glucosa en la sangre en un sujeto por terapia de infusión de insulina subcutánea continua. (CSII) al administrar una . composición que contiene urta enzima que degrada a hialuronano al sujeto; y luego infusionar continuamente una insulina de acción rápida por CSII al sujeto, en donde la. diferencia en absorción de insulina se minimiza o reducé . durante el curso de la vida del equipo de infusión comparado con CSII realizado, en ausencia de la enzima que degrada a hialuronano. En los ejemplos de los métodos en la presente, la enzima que degrada a hialuronano puede administrarse en una cantidad que efectúa una . respuesta de insulina ultra-rápida al comienzo de la vida del equipo de inf.üsión en el. sujeto.. En otros ejemplos .¦ en . la ' présente, la enzima que degrada a hialuronano puede administrarse en una cantidad suficiente para, catalizar la hidrólisis de ácido hialurónico para incrementar¦ la permeabilidad del tejido..

Para practicar los métodos, l terapia de CSII se efectúa con. un dispositivo de infusión continuo que incluye una bomba de insulina, un depósito que contiene, la insulina de acción rápida, un monitor de glucosa opcional, y un equipo de infusión para infusión subcutánea de la composición. En algunos ejemplos,, la terapia de CSII se efectúa, con un dispositivo de. infusión continúo que incluye una bomba de insulina, un depósito que contiene la. insulina de acción rápida, un monitor de glucosa, y un equipo de infusión para infusión subcutánea de la composición. ;E1 dispositivo, de infusión continúa puede proporcionar un sistema de circuito abierto o circuito, cerrado.

Al practicar .. los · métodos, la. terapia de la, etapa de CSII, se realiza o continúa durante un tiempo predeterminado. Típicamente, la . composición de enzima que degrada a hialuronano- se administra antes de la infusión de la insulina de acción rápida.- La composición de enzima que degrada a hialuronano. puede administrarse, antes, después o durante el primer intervalo o simultáneamente con el comienzo del primer intervalo. La composición de enzima que degrada a hialuronano se vuelve a infusionar periódicamente. Típicamente la terapia de CSII se realiza durante un intervalo predeterminado; y ál comienzo de cada intervalo, se administra la composición de enzima que degrada a hialuronano. Al final de cada . intervalo el equipo de infusión (o la bomba completa) . puede reemplazarse. El intervalo predeterminado típico generalmente son más de un . día, varios días, tales . como 2 ; días hasta 4 días, o puede ser más tiempo, tal como un semana.

La enzima que degrada a hialuronano puede administrarse en o cerca del sitio de infusión de la composición, de insulina del dispositivo de CSII, incluida a través del mismo sitio de inyección o diferentes 'sitios de inyección.'. La enzima que degrada a hialuronano y la composición de insulina de acción rápida pueden administrarse secuencialmente:, simultáneamente o intermitentemente. La .. enzima . que degrada a hialuronano generalmente es para administrarse antes de que comience la terapia . de CSII o cuando cambiar el dispositivo de CSII o equipo -de inyección. Por lo tanto, la enzima que degrada a hial'uronáno se administra antes de la insulina en cualquier intervalo de la terapia de CSII. El suministro de la. composición de enzima que degrada a hialuronano puede administrarse inmediatamente antes del inicio de la. infusión por CSII o cuando o antes de que inicie un equipo de CSII. ¦Por ejemplo, la infusión de insulina, puede iniciarse .dentro de segundos, o minutos de la administración de la enzima que degrada' a hialuronano. En .algunos casos, la enzima que degrada a hialuronano se administra al menos una hora antes del inicio de la infusión de insulina, tal como al menos 2 horas. Por ejemplo, la enzima que degrada a hialuronano generalmente sé administra alrededor de o aproximadamente de o 15 segundos hasta 1 hora antes de la infusión de . insulina, 30 segundos hasta .30 minutos,. 1 minuto hasta 15 minutos,. .1 minuto hasta 12 horas,, 5 minutos hasta 6 horas/ 30 minutos hasta 3 horas, o 1 hora hasta 2 horas antes del comienzo de CSII. En algunos ejemplos, el suministro de la enzima que degrada a hialuronano. puede ser después de la terapia de CSII, tal como 1 minuto hasta 12 horas, 5 minutos hasta 6 horas, 30 minutos hasta 3 horas, o 1 hora hasta 2· horas después. Ya que la terapia de CSII típicamente es continua, la enzima que degrada a hialuronidasa se administrará en intervalos predeterminados con terapia o puede administrarse como sea necesario si se observan cambios, o diferencia en la absorción de insulina y/o acción . durante la terapia, de CSII. Típicamente, la enzima . que degrada a hialuronano se administra no más de 2 horas antes de la administración de la insulina de acción, rápida .

En estos métodos, la cantidad de enzima que degrada' a hialuronano administrada es equivalente funcionalménte a entre o alrededor de entre 1 Unidad .hasta 200 Unidades, 5 Unidades hasta 150. Unidades , 10 Unidades hasta .150 Unidades , 50 Unidades hasta 150 Unidades o 1 Unidad hasta 50 Unidades de la enzima. Por ejemplo, la cantidad de. enzima que degrada a hialuronano administrada está típicamente entre 8. ng hasta 2 yg, 20 ng hasta 1.6 g, .80 ng hasta 1.25 pg o 2.00 ng hasta 1 yg, particularmente de la enzima producida por expresión de ácido nucleico que. codifica 36-482 aminoácidos en células CHO o cantidades, equivalentes de otras enzimas que degradan a hialuronidasa. ¦ ..

También se proporcionan regímenes de dosificación de infusión de insulina subcutánea. · continua . (CSII). · para controlar la glucosa' en la sangre, particularmente en sujetos tratados con co-formulaciones de . insulina y una enzima que degrada a hialuronano (por ejemplo una composición de insulina de acción super-rápida) ." De; . acuerdo con estos regímenes, insulina extra puede administrarse periódicamente con objeto de contrarrestar cualquier disminución en el. nivel o acción o incremento de la glucosa en la sangre que ocurra cuando se administran la co-formulación de insulinas de acción rápida con. una enzima que degrada a hialuronano, e insulina basal opcional .

Los métodos sé practican por: a) realizar CSII para suministrar una composición que contiene una composición de insulina, de acción súper rápida a un sujeto de acuerdo con una tasa basal programada y dosis en bolo de insulina; y b) al menos una vez durante . el curso del tratamiento., incrementando la cantidad de insulina basal y/o insulina en bolo administrada por al menos 1% comparada con la tasa basal programada y dosis en bolo de insulina administrada en ausencia de una enzima que degrada a hialuronano por ello incrementa la acción de la insulina. La etapa b) puede realizarse al menos una vez por día . En ' algunas, modalidades, la tasa de insulina' basal- se incrementa, y en otras lá' dosis en bolo de insulina' se incrementa, y .. en · otras lá insulina basal y dosis en bolo se incrementan. Para estos regímenes, la dosis en bolo puede ser la dosis prandial¦ para- un medio dado y/o el bolo de corrección para una corrección hiperglicémica dada. La tasa basal y/o dosis n bolo puede incrementarse 1% hasta 50%, 5% hasta. 0%, 10% hasta.20% o 5% hasta 15% .

Para estos regímenes y cualquiera de. los métodos en los cuales se administra una composición- de insulina de .acción súper-rápida (que contiene una insulina de acción rápida y una enzima que degrada a hialuronidasa) tal composición de insulina de acción súper-rápida contiene: una cantidad terapéuticamente efectiva de una insulina de¦ acción rápida para controlar los niveles de glucosa en la sangre; y una cantidad de una enzima que degrada a hialuronano suficiente para hacer la composición una composición de insulina de acción súper rápida. Los ejemplares de . las composiciones son aquellos donde: la cantidad de insulina de acción rápida es desde o desde alrededor de 10 U/mL. hasta 1000 U/mL; y la cantidad suficiente de una enzima que degrada a hialuronano para hacer la composición de . acció súper rápida es equivalente funcionalmente a 1 U/mL hasta 10,000 U/mL, tal como, por ejemplo, donde, la cantidad de una insulina de acción rápida es o es alrededor de ,100 U/mL, y la cantidad suficiente de una. enzima que degrada a hialuronano para hacer la composición de acción súper rápida es equivalente funcionalmente a o alrededor de hasta 600 U/mL una composición donde la cantidad de insulina de acción rápida es desde o desde alrededor de 0.35 mg/mL hasta 35 mg/mL;. y la cantidad suficiente de una enzima que degrada a hialuronano para hacer la composición de. acción súper rápida es equivalente funcionalmente a 8 ng/mL hasta 80 yg/mL..

En todos los métodos proporcionados en la presente la enzima que degrada . a hialuronano puede ser una .hialuronidasa o una . condroitinasa. La enzima que degrada a hialuronano puede ser una hialuronidasa que está activa en pH neutro. En algunas modalidades, la enzima que degrada a hialuronano carece de un anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI) o no se asocia a la membrana cuando se expresa de una célula, tal como una enzima que degrada a hialuronidasa que carece de un anclaje GPI, o uno que normalmente tiene un anclaje GPI, pero tiene truncamientos en el C terminal de uno o más . residuos de aminoácidos para remover todo o parte de un anclaje GPI. Las enzimas que degradan a hialuronidasa incluyen una hialuronidasa que es una PH20, tal como una no humana o una PH20 humana, tal como una PH20 tiene una secuencia de aminoácidos que contiene al menos 36-464 aminoácidos de . SEQ ID NO: 1, o tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con. una. secuencia de aminoácidos que contiene al menos aminoácidos 36-464 de SEQ ID NO: .1 y mantiene la actividad de hialuronidasa, o .una ??2? que contiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 86%, 87%, 88%, .89%, 90%, 91%, 92%, 93%,, 94%, 9.5%, 96%, 97%., 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que contiene al menos ,36-464 aminoácidos de SEQ ID NG: 1, y mantiene la actividad de. hialuronidasa. Lo ejemplar de tales polipéptidos PH20 son aquellos que" tienen una secuencia de. aminoácidos que contiene una truncación en el C terminal después de la posición del aminoácido 465, 466, 467, 468, 469, 4.70,. 471, , 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 o 500 de la secuencia de aminoácidos establecida en. SEQ ID NO: 1, o es una variante de la misma que exhibe al menos 85% de identidad de secuencia con una secuencia de. aminoácidos' que contiene una truncación en el C terminal después de. la posición de los aminoácidos 465, 466, 467, 468, 469, 470, '471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, .479, 480, 481, 482, 483, 484, .485, 486, 487, 488, 489, .490, 491 , ' 492 ,¦ 493 , 494 , 495, 496, 497, 498, 499 o 500 de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1 y mantiene la actividad de hialuronidasa o tiene al menos 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de · identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que contiene que contiene una truncación en el C terminal después de la -posición de los aminoácidos 4.65, 466, 467, 468, 469, 470, .471, 472, 473, 474, 475, 476, . 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 49.4, 495, 496, 497, 498,. 499 o 500 de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1 y mantiene, la actividad de hialuronidasa . Se incluyen enzimas que degradan a. hial.uronanó que son enzimas PH20 truncadas en el C terminal que . comprenden tener una secuencia de amino establecida en cualquiera de SEQ ID NOS: 4-9.

. En . todos los métodos proporcionados en. la presente, donde se administran insulinas de acción rápida, solas o en una composición dé insulina de acción . súper-rápida, pueden ser monoméricas, diméricas o hexaméricas . Estas incluyen, una insulina regular, .. típicamente una insulina humana, pero pueden ser una insulina de cerdo. Las insulinas, incluyen insulinas naturales aisladas de fuentes animales., insulinas recombinantemente producidas e insulinas sintéticas. Las insulinas ejemplares incluyen una insulina regular con una cadena A que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO : 1.03 . . una cadena B que tiene una secuencia de aminoácidos¦ establecida en SEQ ID NO: 104 o una insulina, con una cadena A coa. una secuencia de aminoácidos establecida como posiciones del residuo de aminoácidos 88-108 de SEQ ID NO: 123 y una cadena B con una secuencia de aminoácidos establecida como posición' del residuo de aminoácidos 25-54 de SEQ."ID NO: 123.- .. ..

También entre las insulinas de acción rápida usadas, están los análogos de. insulina y cualesquiera otras insulinas preparadas por ingeniería para ser similares, á la · acción rápida o la acción más rápida. Los análogos de insulina incluyen aquellos referidos como insulina aspart, insulina líspro o insulina glulisina. Los ejemplares de análogos de insulina es el análogo de insulina seleccionado de entre una insulina que tiene una cadena ? con una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ NOS: 103 y una- cadena B que tiene una secuencia de aminoácidos establecida ,en Cualquiera de SEQ NOS: 147-149.

En los métodos proporcionados, en la presente, la composición, de insulina puede contener una cantidad que está entre o alrededor de entre 10 U/mL hasta 1000 U/mL, tal como en o alrededor de 100 U/mL o entre o alrededor de 'entre 0.35 mg/mL hasta 35 mg/mL.

Las composiciones que contienen insulinas pueden ser composiciones de insulina de acción súper rápida, las-.cuales son composiciones que contienen una insulina de acción rápida,, particularmente un análogo de insulina, y una enzima que degrada a hialuronano, tal como cualquiera de aquellas descritas arriba. La cantidad de enzima que degrada a hialuronano es una cantidad que hace qué. la composición de acción súper rápida. Las composiciones ' pueden formularse de manera que son estables, particularmente, de manera que la potencia de la insulina permanece en o arriba de alrededor de 90% de su potencia inicial. Las composiciones de insulina de acción súper rápida ejemplares se formulan con sales apropiadas, pH y conservadores y, si es necesario, agentes estabilizantes de manera que .son estables, durante al menos .3 dias a una temperatura desde o desde alrededor de 32°C hasta 40°C, de manera que, por ejemplo , la enzima que degrada a hialuronano en la composición mantiene al menos 50% de la actividad de hialuronidasa inicial durante al menos 3 días a una temperatura desde o desde alrededor .de 32 °C hasta 40 °C; y la insulina en la composición mantiene: al menos 90% de potencia o recuperación del nivel inicial de insulina en la composición durante al menos 3 días a una temperatura desde o desde alrededor de 32°C hasta 40°C; y/o al menos 90% de la pureza de insulina inicial durante al menos 3 días a una temperatura desdé o desde alrededor.de 32CC hasta 40°C o; y/o menor, que 2% de peso molécula alto (HMWt) de la, especie de insulina durante al menos 3 días a una temperatura desde o desde alrededor de 32°C hasta 40°C.

Los ejemplares de .tales composiciones de insulina de acción súper rápida son aquellas qüe también tienen un pH de entre o alrededor de . entre 6.5 hasta 7.5'; y la composición contiene: NaCl en una concentración entre o¦ alrededor de entre 120 mM hasta. 200 mM; una cantidad efectiva anti-microbiana de un conservador o mezcla de conservadores; y un agentes o agentes estabilizantes. Los agentes estabilizantes incluyen inhibidores de hialuronidasa y otros compuestos que previenen, inhiben o. disminuyen la degradación de la insulina y enzima que degrada la hialuronidasa. Los inhibidores de hialuronidasa ejemplares incluyen, pero no se limitan a, una proteina, un sustrato de una enzima que degrada a hialuronano, polisacáridos , ácido graso, lanostanoides , antibióticos, anti-nemátodos , compuestos orgánicos sintéticos y un componente bioactivo. derivado de planta, particularmente inhibidores que no. forman complejos coválentes con ninguna enzima que degrada a hialuronidasa o ¦ la insulina. Los componentes. bioactivos -derivados de. planta incluyen, . pero no se limitan a, . un alcaloide, antioxidante., polifenol, flavonoides, terpenoides y fármacos anti-inflamatorios . Otros inhibidores de hialuronidasa incluyen, pero no se limitan a, a glicosaminoglicano (GAG) , un inhibidor de hialuronidasa en suero, glicoprpteina dé Withania somnífera (WSG)., hop r i na , sulfato de heparina, sulfato de dermatán, quitosanes, $-(1,4) -galacto-oligosacáridos , verbascosá , sulfatada, planteosa sulfatada, pectina, poli (estiren-4-sulfonato) ·, . sulfato de dextrano, alginato de sodio, polisacárido de Undaria pinnatifida, polímero' de condensación de ácido mandélico, ácido eicosatrienóico, ácido nervónico, ácido leanólico, ácido aristoloquico, . ajmalina,. reserpin , flavona, desmetoxicentauredina, . quercetina, apigenina,. kaempferol , silibina, luteolina, . luteolina-7-glucósido, floretina, apiina, hesperidina, hesperidina .sulfonada, calicosin-7-?-ß-D-glucopiranosido,. flavona-7-sulfato de sodio, flavona 7-fluoro- ' -hidroxiflavona, 4 ' -cloro-4 , 6-dimetoxicalcona, 7-sulfato de 5-hidroxiflavona de sodio, miricetina, rutina, morina, glicirriziná, vitamina C, ácido de D-isoascórbico, l,4^1actona D-sacarina, ácido L-ascórbico-6-hexadecanoato (Vcpal), vitamina 6 6-O-acilada, catequina, ácido nordihidroguaiaretico, curcumina, galato de N-propilo, ácido tánico, ácido elagico, ácido gálico., florofucofuroecol A, diecol, 8,8'-biecol, procianidina, gosipol,, celecoxib, nimesulida, dexametasona, indometicina, fenoprofen.o, fénilbutazona, oxifenbútazona, salicilatos, cromoglicato de sodio, aurotiomalato de sodio, .transilist, traxanox., ivermectina, lincomicina y espectinomicina , sulfametoxazol y trimertoprima, sulfato de neomicina, ácido 3a-acetilpoliporenico A, (25S) - ( +) -12a-hidroxi-3cx-metilcarboxiacetato-24-metilanosta-8 , ácido 24 (31).-dieno-26- oico, lanostanoide, ácido poliporénic.o . C, PS53. (polímero de ácido de hidroquinona-sulfónico-formaldehido) , polímero de poli (stireno-4-sulfonato) , VERSA-TL 502, ácido 1-tetradecano sulfónico, polímero de condensación de ácido mandélico (SAMMA) , 1, 3-diacetilbenzimidazol-2-tiona, binzimidazol-2-tiona N-monoacilada, , benzimidasol-2-tiona N, N ' -diacilada, derivado de alquil-2-fenilindol, 3-propanoilbenzoxazol-2-tiona, derivado de. indol N-alquilado, derivado de indol N-acilado, derivado de benzotiazol, derivados de indol-2- y 3-carboxamida N-sustituidos, análogos halogenados (cloro, y fluoro) de derivados de indol-2 y 3-carboximida N-sustituidos, 2- (4-hidroxifenil) -3-fenilindol , carboxamidas de indol, acetamidas de indol, 3-benzolil-l-metil-4-fenil-4-piperidinol, derivado de benzoil fenil benzoata, derivado de L-arginina, HCL . guanidinio, L-NAME, HCN,. linamarina, amigdalina, hederagenina, aescina, ClS^hinoquires.inol y/o 1 , 3-di-p-hidroxifenil-4-penten-l-ona . ' También se · incluyen inhibidores de hialuronidasa . que son sustratos de hialuronidasa, tales como un oligosacárido de hialuronano (HA), .incluyendo,. por ejemplo, un disacárido o un tetrasacárido . El oligosacárido HA puede contener un extramo reducido reaccionado de manera que no formará complejos. La concentración apropiada de un inhibidor puede determinarse empíricamente. Por ejemplo,-, el HA puede estar entre' o alrededor de entre 1 mg/mL hasta 20 mg/mL.

También se proporcionan composiciones que contiene una enzima que degrada a hialuronano para uso para minimizar el cambio en absorción de insulina que ocurre sobre un curso de infusión de insulina subcutánea continua (CSII) y usos de una composición de . enzima que degrada a . hialuronano para minimizar el cambio en absorción de insulina que ocurre durante un curso de. infusión de insulina subcutánea continua. Los componentes y composiciones para estos usos son como se decriben arriba para los métodos para controlar la glucosa en la sangre en un sujeto tratado por terapia de infusión de insulina subcutánea continua (CSII) .

También se proporcionan usos de una composición y composiciones para uso como una tecnología de punta en terapia de infusión de insulina subcutánea continua (CSII) para tratamiento de diabetes que¦ contiene una- enzima que degrada a hialuronano que se formula para administración directa en una cantidad que minimiza cambios en. absorción de insulina que ocurre durante un curso de infusión de insulina subcutánea continua (CSII), por lo cual un terapéutico de tecnología de punta para terapia de. insulina es una composición que se administra antes de la administración de una composición de insulina por- CSII. En los usos y composiciones proporcionadas en la presente para terapia de tecnología de punta, la enzima que degrada a hialuronano es en una cantidad terapéuticamente efectiva suficiente para catalizar la hidrólisis de ácido hialurónico para incrementar la permeabilidad del tejido.

En ej emplos . particulares de las composiciones y usos para terapia de tecnología de punta, la enzima que degrada. a hialuronano es una hialuronidasa o una . condrüitinasa . Por ejemplo, la enzima que degrada a ¦ .hialuronano es una hialuronidasa que está activa en pH neutro. La enzima que degrada . a hialuronano incluye una que carece de un anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI) o no. está asociada a la membrana cuando ,se expresa de una ..célula. En algunos ejemplos, la enzima que degrada a hialuronano contiene truncamientos en el G terminal de uno o más residuos de aminoácidos y carece de todo o parte de un anclaje GPI.

En los usos y composiciones para terapia., de tecnología de punta proporcionados en la presente, ; la composición puede contener una enzima que degrada a hialuronano que es una hialuronidasa PH20. La. PH20 puede ser una no humana o una PH20 humana. La PH20 puede tener una secuencia de aminoácidos que contiene al menos aminoácidos 36-464 de SE.Q ID NO:. 1, o tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que contiene al menos aminoácidos 36-464 de SEQ ID NO: 1 y mantiene la actividad de hialuronidasa. Por ejemplo, la PH20 en la composición puede tener al menos .86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos que contiene al menos aminoácidos 36- 464 de SEQ ID NO: 1 y mantiene la actividad de hialuronidasa. En algunos ejemplos, le polipéptido EH20 tiene una secuencia de aminoácidos que contiene una tru cación en el C. terminal después de' la posición de los aminoácidos 465, 466, 467, 468, .469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, . 81, 482, 483, 484, 485, 486,. 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, .498, 499 o 500 de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1, o es una variante de la misma que exhibe al menos 85% de identidad dé. secuencia con uña secuencia de aminoácidos que contiene un truncación en el C terminal después de la posición de los aminoácidos 465, 466, 467, 468, 469, 470, 47.1, 472, 473, 474, 475, 476, .477, 478, 479, 480, 481, 482,. 483, 484, 485, ' 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, .494, 495, 496, .497, 498, 499 o 500 de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1 y mantiene la' actividad de hialuronidasa. Por ejemplo, la PH20 tiene, al menos 86%, 87%, 88%', 89%,. 9.0%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de. secuencia con una secuencia de aminoácidos que contiene que contiene una truncación en el C terminal después de la posición de los aminoácidos 465, 466, 467, 468, 469, '470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, .485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 o 500 de la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 1 y mantiene la actividad de hialuronidasa . Lo ejemplar de una enzima que degrada a hialuronano en las composiciones para terapia de tecnología de punta en la presente, la. enzima que degrada a hialuronano es un ??2? truncado en el O terminal que tiene una secuencia de amino establecida en cualquiera' de SEQ ID NOS:. 4-9, o una secuencia de aminoácidos que exhibe al menos 85% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de una de SEQ ID NOS:. 4-9. Por ejemplo, la PH20 tiene una secuencia de aminoácidos, que exhibe al . menos 86%, 87%, 88%, 89%, 90%,¦ 91%, 92%, 93% , 94 % , .95% , 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de una de SEQ ID NOS: 4-9. En ejemplos particulares, la PH20 tiene una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de una de SEQ ID NOS: 4-9.

En los usos y composiciones para terapia de tecnología de punta proporcionados en la presente, la enzima que degrada a hialuronano en la composición es en una cantidad que es equivalente funcionalmente a entre, o alrededor de entre..1 Unidad hasta 200 Unidades, 5 Unidades hasta 150 Unidades, 10 Unidades hasta 150 Unidades, 50 Unidades hasta 150 Unidades or 1 Unidad hasta 50 Unidades. La enzima que degrada a hialuronano en la composición puede ser en una cantidad que está entre o alrededor de entre 8 ng hasta 2 pg, 20 ng hasta 1.6 pg, 80 ng hasta 1.25 pg o 200 ng hasta 1 yg. En ejemplos particulares, la enzima que' degrada a hialuronano en la composición es en una cantidad desde o desde alrededor, de 30 unidades /mL hasta 3000 U/mL, 100 U/mL hasta 1000 U/mL, 300 U/mL hasta 2000 U/mL, 600 U/mL hasta .2000 U/mL o 600 U/mL hasta 1000 U/mL.. Por' ejemplo, la enzima que degrada a hialuronano. en la composición es en una cantidad que . es al menos o alrededor de al menos o 30 U/mL,.35 U/mL, 40 U/mL, 50 U/mL, 100 U/mL, 200 U/mL, 300 U/mL, 400 U/mL, .500 U/mL, .600 U/mL, 700 U/mL, 800 U/mL, 900 U/mL, 1000 U/ml, 2000 U/mL o 3000 U/mL.

En los usos y composiciones proporcionados en la presente para terapia de tecnología de punta, la composición de insulina para uso en terapia de infusión de insulina subcutánea continua (CSII) es una insulina de acción rápida. La insulina de .acción rápida puede ser monomérica, dimérica o hexamérica. La insulina de acción rápida puede ser una insulina humana de acción rápida. En algunos ejemplos, la insulina de acción rápida es una insulina regular. Por ejemplo, la insulina regular es una insulina humana -.o insulina de cerdo., La insulina . regular puede ser un insulina con una cadena A¦ que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en. SEQ ID NO: 103 y una . cadena B que . tiene una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID. NO: 104 o una insulina con una cadena A con una secuencia de aminoácidos establecida, como . posición del residuo de aminoácidos 88-108 de SEQ ID NO: 123 y. una cadena B con una secuencia de aminoácidos establecida como posición del residuo de aminoácidos 25-54 de SEQ ID NO: 123. La insulina de · acción rápida, puede ser una insulina recombinante, está sintetizada o parcialmente sintetizada o está aislada. En . ejemplos particulares, la insulina de acción rápida es .un análogo de insulina. Por ejemplo, el análogo de . insulina puede ser una insulina que tiene Una cadena A con una · secuencia de aminoácidos establecida en SEQ NOS: 103 y una cadena B que tiene una secuencia de aminoácidos establecida ; en cualquiera de SEQ NOS.: 147-149. En cualquiera de las' composiciones para uso en terapia de tecnología de punta proporcionadas en la presente, el análogo de insulina de acción rápida es insulina aspart, insulina lispr.o o insulina glulisina. La. insulina de acción . rápida se .formula en ¦ la composición para infusión subcutánea continua en una cantidad que es desde o desde alrededor de 100 U/mL hasta 1000 U/mL . o 500 U/mL. hasta 1000 U/mL.

También se proporcionan composiciones que contienen insulina para administración por bolo para uso en el alivio de la disminución., en la acción de insulina total provocada por una infusión: de insulina subcutánea continua de. una composición de insulina de acción súper-rápida y usos de una insulina en bolo para aliviar la disminución en la acción de insulina total provocada por una infusión de insulina subcutánea continua de una composición de insulina de acción súper-rápida'. Los componentes y composiciones para estos usos son como se describen arriba para los regímenes de dosificación de infusión de insulina subcutánea- continua ,(CSII) .

' . BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 representa la concentración de insulina inmunoreactivo del suero (IRI en pmol/L) contra el tiempo para el 1er estudio de pinzamiento y el 2 ° estudio de pinzamiento para tanto las condiciones de insulina aspart (Novolog®) como Aspart-PH20. La figura muestra que en presencia de PH20,. la absorción de aspart se acelera comparada con el aspart. solo después de tanto ½ de día de CSII (Ia pinzamiento) y 2½ días de CSII. (2 a pinzamiento) . La figura también muestra que ambos aspartos comerciales (Novolog®) , la absorción de insulina se aceleró después de 2½ días (2a pinzamiento) con relación al ½¦ día (Ia pinzamiento) de CSII. Esta aceleración también se¦ observó para las condiciones de Aspart-PH20, pero se redujo. . La Figura . 2 representa los glucodinámicos de Aspart-PH20 comparados con insulina aspart únicamente (Novolog®). como. , se mide- al determinar la tasa de infusión dé glucosa necesaria para mantener la euglicemia después de la administración de insulina en bolo. .

La figura 3 representa la acción de insulina total (glucosa, acumulativa infusionada (Gtot) ) como se coloca en ensayo por el. método reivindicado euglicémico. La Figura muestra que la acción de insulina total disminuida sobre la via del equipo, de infusión, aunque a un. grado , mayor para la . formulación de insulina aspart-PH20. ,.

La Figura '; A representa los resultados como -.una gráfica de tiempo-acción acumulativa al normalizar la acción de insulina total. La. Figura muestra que el porcentaje (%) de glucosa infusionada acelerada del 1er. pinzamiento al 2a pinzamiento, y que la adición de PH20 resulta en un. perfil, de tiempo-acción más rápido en ambos puntos de tiempo.

La Figura 5. representa el perfil farmacocinético de insulina infusionado por administración subcutánea continua con con o sin preadministración con rHuPH2.0 (tecnología de punta) . Los resultados muestran que la preadministración rHuPH20 acelera la absorción de insulina al inicio de la infusión, y resulta en una variabilidad disminuida en absorción de insulina como se evidencia por diferencias no importantes en la exposición de insulina temprana al inicio del equipo de infusión comparado con el extremo del equipo . de infusión. En ausencia de la preadministración dé rHuPH20, hubo una absorción de insulina de variación cuando el equipo de infusión maduró..

La Figura 6 representa¦. el perfil glucodinámico de la acción de insulina como una función de tiempo, como se evidencia por la tasa de infusión de glucosa necesaria para mantener la éuglicemia después de una infusión de insulina en bolo. Los resultados muestran . que hubo un comienzo acelerado de. acción de insulina (acció mayor y comienzo temprano de la acción) al comienzo de la infusión con pretratamiento. con rHuPH20 (tecnología de punta, y duración más corta de acción) . En. ausencia, de la preadministración rHuPH20, hubo variación incrementada en la acción de insulina cuando el equipo de infusión maduró..

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Introducción A. DEFINICIONES B. TERAPIA DE INSULINA 1. Terapias de insulina, diabetes e insulina existente de acción rápida 2. Infusión subcutánea continua (CSII) C. MÉTODOS DE INFUSIÓN SUBCUTÁNEA CONTINUA (CSII) DE INSULINA CON UNA ENZIMA QUE DEGRADA A HIALURONANO 1. Métodos de régimen de dosificación a. ecnología de Punta b. Método para aliviar la acción de insulina total 2. Bombas de insulina y otros dispositivos de suministro de insulina a . Sistemas de circuito Abierto b. Sistemas de circuito Cerrado c. Dispositivos Ejemplares D. POLIPÉPTIDOS DE INSULINA Insulinas de acción rápida a. Insulina Regular b. Análogos de acción rápida i. Insulina lispro ii. Insulina aspart iii. Insulina glulisina E . ENZIMAS QUE DEGRADAN A HIALURONANO 1. Hialuronidasas a. PH20 de hialuronidasas tipo mamiferas b. Hialuronidasas bacterianas c. Hialuronidasas de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos 2. Otras enzimas que degradan a hialuronano 3. Enzimas que degradan a hialuronano truncadas u otras formas solubles a. PH20 humano truncado en el C terminal b. rHuPH20 4. Glicosilación de enzimas que degradan a hialuronano 5. Modificaciones de enzimas que degradan a hialuronano para mejorar sus propiedades farmacocinéticas F. FORMULACIONES DE INSULINA DE ACCIÓN SÚPER RÁPIDA, Y FORMULACIONES ESTABLES DE LAS MISMAS 1. Co-formulaciones estables a. NaCl y pH b. Inhibidor de hialuronidasa c. Solución amortiguadora d. Conservadores f . Estabilizador i . Tensoactivos ii. Otros estabilizadores 2. Otros excipientes o agentes G. MÉTODOS PARA PRODUCIR ÁCIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN UNA ENZIMA QUE DEGRADA A INSULINA O HIALURONANO Y POLIPÉPTIDOS DE LOS MISMOS 1. Vectores y Células 2. Porciones ligadoras 3. Expresión a . Células procarióticas b . Células de levadura c . Células de insectos d. Células mamiferas e . Plantas 4. Técnicas de purificación H. USOS TERAPÉUTICOS 1. Diabetes Mellitus a. Diabetes tipo 1 b. Diabetes tipo 2 c. Diabetes gestacional 2. Terapia de insulina para pacientes criticamente enfermos I. TERAPIAS DE COMBINACIÓN J. ARTÍCULOS DE FABRICACIÓN Y KITS K. EJEMPLO A. DEFINICIONES A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como es entendido comúnmente por una persona de experiencia en el campo a la cual las invenciones pertenecen. Todas las patentes, solicitudes de patente, solicitudes publicadas y publicaciones, secuencias de GENBAN ,.' sitos de la red y otros materiales publicados referidos por toda la descripción completa en este documento, a menos que se indique de otra manera, se incorporan a manera de referencia en su totalidad. En caso de que exista una pluralidad de definiciones para -. los -términos en la presente, aquellos en esta sección prevalecerán. Donde se hace referencia a una URL u otro identificador o dirección, se entiende que tales identificadores pueden cambiar y la información particular en el internet puede venir e ir, pero la información equivalente puede, encontrarse al buscar en el internet. La referencia a la misma evidencia la disponibilidad y diseminación pública de esta información, Como se usa . en la presente, terapia de. infusión de insulina, subcutánea continua (CSII) se refiere a un régimen de dosificación de insulina mediante el cual la insulina se administra en velocidades programas durante, un .. curso de varios días de. un infusor o bomba pequeñas subcutáneamente/a través de un equipo de infusión conectado a la bomba. Típicamente, la terapia CSII continúa durante 2-4 días antes de. que el equipo de infusión y el depósito . de . bomba .se reemplacen. El tratamiento combina la liberación de insulina de línea base continua (velocidad basal) y la -dosis de bolo de insulina adicional antes de las comidas sin. respuesta a los altos valores dé glicemia (es decir bolo de corrección) . La terapia CSII usa generalmente un accionador de jeringa accionada por batería, bomba de insulina u otro dispositivo similar para administrar una insulina de acción rápida, en particular un análogo de insulina., de acuerdo con el régimen de dosificación. Generalmente, la programación de la liberación de insulina de línea base continua se ajusta por un médico para. 'cada paciente. La dosis de ' bolo, se determina con base en las necesidades, prandiales y las respuestas glicémicas. Por consiguiente la terapia CSII es específica del paciente. Estará dentro del nivel de un médico experto y paciente determinar, el régimen de dosificación de insulina particular para cada paciente dependiendo de las necesidades del paciente y; los otros parámetros específicos, del paciente tales como peso, edad, ejercicio, dieta y síntomas clínicos del paciente.

Como se usa en la presente, un equipo dé infusión se refiere a un sistema unido a una bomba de: insulina que suministra directamente insulina del depósito en. la bomba a debajo de la piel. Generalmente, un equipo de infusión de insulina contiene uno o más de un sistema de tubería; una cánula subcutánea, aguja de acero : u otro dispositivo de inserción para insertar él equipo bajo la piel; una montura adhesiva para montar el dispositivo de inserción al sitio de administración, tal: como la pared abdominal; y/o un conector de cartucho de bomba. El equipo de infusión también, puede contener una desconexión rápida que sale del dispositivo de inserción y montura adhesiva en lugar de permitir al paciente remover convenientemente el dispositivo, por ejemplo mientras realiza actividades tal.es como ducharse o nadar.

Como se usa en la presente, la tasa basal de insulina se refiere al requerimiento de insulina en el cuerpo sin alimento. Generalmente,, es una característica predeterminada o pre-programada , medida en unidades (U/H) . Las tasas básales de insulina pueden cambiar o variar dependiendo de las variaciones del estilo de vida, tal como ejercicio, dieta, o enfermedad, y las necesidades . del paciente..

Como se usa en la presente,, la tasa.de bolo o dosis de insulina se refiere a los requerimientos ·¦ de insulina adicionales para: el recuento de los cambios en , las necesidades de insulina debido a las comidas o para corregir un nivel de glucosa en la sangre elevado. Generalmente, la insulina en bolo se. suministra, por el usuario como sea necesario y/o se programa para dar una dosis de insulina para las. comidas, aperitivos, y/o para corrección de glucosa en la sangre elevada.

Como se usa en . la presente, un . sistema de: circuito cerrado en un sistema integrado para proporcionar un. control glicémico continuo. . Los sistemas de circuitos : cerrados contienen un mecanismo para medir la glucosa en la sangre, un mecanismo para administrar una o más composiciones, incluyendo una composición de insulina, un mecanismo para determinar la cantidad de' insulina necesaria para ser administrada para lograr el control glicémico. Típicamente-, por lo tanto, los. sistemas de circuito cerrado contienen ün sensor de glucosa, un dispositivo de administración de insulina, tal como una bomba de insulina, ' y un controlador que. recibe información del sensor de glucosa y proporciona comandos al dispositivo de administración de insulina. Los comandos se pueden generar por software en el controlador. El software incluye típicamente un algoritmo para, determinar la cantidad de insulina requerida al ser administrada para lograr el control glicémico, con base en los niveles de glucosa en la sangre detectados por el' sensor de glucosa o anticipados por. el usua'rio.

Un sistema dé circuito abierto se refiere a. dispositivos similares, excepto que los dispositivos no miden y responden automáticamente a los niveles de glucosa. Generalmente, en un sistema de circuito abierto una bomba de insulina u otro dispositivo similar se programa para infusionar la insulina continuamente para suministrar la tasa basal de insulina, y donde el paciente. es capaz, por medio de un botón en la bomba u otros medios manuales, para administrar los ¦ bolos de insulina en o cerca- de la hora de. comer. La dosis en bolo administrada está determinada basada en niveles de glucosa esperados o conocidos, que pueden vigilarse manualmente o pueden vigilarse usando un monitor de glucosa que exhibe los resultados de la glucosa en la sangre en tiempo real.

Como se usa en l presente, "insulina" se refiere a una hormona, precursor o análogo sintético o recombinante del mismo que actúa para incrementar la captación y almacenamiento, de glucosa y/o disminuir la producción de glucosa endógena.' Una insulina humana ejemplar se traduce como un polipéptido precursor ' de. . 110 aminoácidos, preproinsulina (SEQ ID NO: 101), que : .contiene un péptido señal de 24 aminoácidos que dirige la proteína ai retículo endoplásmico (ER) en donde la secuencia señal se escinde, danto por resultado la proinsulina (SEQ ID NO: 102). La proinsulina se procesa adicionalmente para liberar el péptido de cadena C- o de conexión de 31 aminoácidos (que corresponde a los residuos de . aminoácido 57 ao 87 del polipéptido de preproinsulina expuesto en SEQ ID NO: 101, y a. los residuos de aminoácido 33 a 63 del polipéptido de proinsulina expuesto en SEQ ID NO: 102) . La insulina resultante .'. contiene una cadena A de 21 aminoácidos (que corresponde a los residuos de aminoácido 90 a 110 del polipéptido ..de preproinsulina expuesto en SEQ ID NO: .101, y a los residuos de aminoácido 66 a 86 del polipéptido de proinsulina expuesto en SEQ ID NO: 102) y una cadena B de 30 aminoácidos, (.que corresponde a los residuos de aminoácido 25 a .54 del polipéptido de preproinsulina expuesto en SEQ ID NO: 101, y a. los residuos de aminoácido 1 a 30 del polipéptido de p.roinsulina .expuesto en SEQ ID NO: 102) que se ligan de manera cruzada por las ligaciones de disulfuro. Una. insulina humana apropiadamente reticulada contiene tres puentes, de disulfuro: uno entre la posición 7 de la cadena A y la posición 7 de la cadena B, una segunda posición 20. entre la cadena A y la posición 19 de la cadena B, y una tercera posición entre 6 y 11 de la cadena A. La referencia a la insulina incluye preproinsulina, proinsulina y polipéptidos de insulina en formas de cadena individual o de dos cadenas, formas truncadas de las mismas que tienen actividad,. e incluyen, variantes alélicas y variantes de especies, variantes codificadas por las variantes de empalme, y otras variantes,, tal como análogos de insulina, incluyendo polipéptidos que tienen por lo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, ,8.5%, 90%, .95%, 96%, 97%, 98%, 99%. o más de identidad de . secuencia al polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 101 o la forma madura, del mismo... Los análogos de insulina ejemplares incluyen aquellos que tienen una cadena A establecida en SEQ ID NO: 1,03 y una cadena B establecida en SÉQ ID NOS.: 147-149, 152, y aquellos que contienen una cadena A expuestos en SEQ ID NOS: 150, 156, .. 158, 160, 162 y 16 y/o una cadena . B expuesta en SEQ ID . NOS : 151, 153-155, 157, 159, 161,. 163 y 165.

Los polipéptidos de insulina ejemplares son aquellos de origen de mamífero,, incluyendo humano. Las secuencias de aminoácidos ejemplares de insulina, de origen humano (cadena A y B) se exponen en SEQ ID NOS: 101-104. Los análogos de insulina ejemplares incluyen aquellos que tienen una cadena A establecida en SEQ ID NO: 103, y una cadena B expuesta en SEQ ID NOS: 147-149,. 152, y aquellos que contienen una cadena ? expuesta en SEQ ID NOS: 150, 156, 158, 160, 162 y 164 y/o una cadena B expuesta en SEQ ID NOS: 151, 153-155, 157,.159, 161, 163. y 165. Los polipéptidos de insulina también, incluyen cualquiera de origen no humano incluyendo, pero no limitado a, cualquiera de los polipéptidos de insulina precursores expuestos en SEQ ID NOS: 105-146. La : referencia a una insulina incluye . insulinas monoméricas y multiméricas , incluyendo insulinas hexaméricas, asi como insulinas humanizadas.

Como se usa en la. presente, "insulina de acción rápida" se refiere a cualquier insulina o composición de insulina de acción rápida para administración aguda a un sujeto diabético en respuesta una condición hiperglicémica actual, percibida o anticipada en. el sujeto que surge en el momento de, o de entre aproximadamente .4 horas después, de la administración de la insulina de acción rápida (tal como una condición hiperglicémica prandial que resulta o . anticipada a resultar de, el consumo de una. comida) , mediante lo cual la insulina de acción rápida es capaz' de prevenir, controlar o mejorar, la condición hiperglicémica aguda. Típicamente una insulina de acción rápida es. una insulina que muestra niveles de insulina pico en o aproximadamente no más' de cuatro horas después de la administración subcutánea- a un sujeto. Las. insulinas, de acción rápida incluyen insulinas recombinantes e . insulinas aisladas (también referidas como insulinas "regulares") tal como la insulina, vendida como Humul.inMR R,. insulinas porcinas e insulinas bovinas, así como análogos de insulina de- acción rápida . (también llamados análogos de insulina de acción rápida en la presente) diseñados para hacer de acción rápida en virtud de cambios de aminoácido. Las preparaciones de insulina regulares ejemplares, incluyen pero no se limitan a, insulinas regulares humanas, tales como aquellas vendidas bajo las marcas comerciales HumulinMR R, N.ovolinMR. R . y VelosulinMR, Insulin Human, USP e Insulin Human Injection, USP, asi como formulaciones acidas de insulina, tales como, por ejemplo, Toronto . Insulin, Oíd Insulin, y Clear Insulin, e insulinas de cerdo regulares, tal como Iletin.IIMR (insulina porcina) . Las insulinas regulares tienen típicamente un inicio de acción de entre 30 minutos a una hora, y un nivel de insulina pico de 2-5 horas post-administración ..

Como se usa en la présente, los. análogos de insulina de acción rápida (también llamados' análogos de insulina de acción rápida) son insulinas que tienen un inicio .rápido de acción. Las insulinas rápidas son típicamente análogos de insulina que se han diseñado, tal como por la introducción de una o más instituciones de aminoácido, para ser más de acción rápida que las insulinas regulares. Los análogos de insulina de acción rápida .tienen típicamente un inicio de acción de 10-30 minutos pos-inyección, con niveles de insulina picos observados 30-90. minutos pos-inyección. Los análogos de insulina de acción rápidá ejemplares incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, insulina lispro (por ejemplo insulina HumalogMR) , insulina aspart (por ejemplo insulina NovoLogMR) , e insulina . glulisina (por ejemplo insulina' ApidraMR) la composición de insulina de acción rápida . vendida como VIAjectMR y VIAtabMR (véase, por ejemplo, Patente de EUA No. 7,279,457). También se incluyen cualquiera de. otras insulinas que tienen un inicio de acción de 30 minutos o menos y un nivel pico antes de 90 ..minutos,, típicamente 30-90 minutos post-inyección . .

Como se usa . en la presente, una insulina humana se refiere a . una insulina que es sintética o producida recombinantemente basada en el polipéptido humano, que incluye variantes alélicos y análogos de los mismos.

Como se usa en la presente, las . insulinas humanas de acción rápida o composiciones de insulina de acción rápida humanas ' incluyen cualquier insulina humana o composición de una insulina humana que sea de acción rápida,, pero excluye las insulinas no humanas, tal como insulina de cerdo regular.

¦ Como se usa en- la presente, los. "insulinas¦ de acción basal,"' o "insulinas básales" se refieren a las insulinas administradas para mantener un nivel de insulina basal como parte de un régimen de tratamiento general para tratar una condición crónica tal como diabetes. Típicamente, la insulina de acción basal se formula para mantener un nivel de insulina de estado aproximadamente permanente por la liberación controlada de insulina cuando se administra periódicamente (una vez o dos veces diarias). Las insulinas d acción basal incluyen insulinas/cristalinas (por ejemplo NPH y LenteM?, insulina protamina, insulina surfen) , análogos de insulina basal (insulina glargina, HOE 901 , . : ÑovoSol Basal) y otras formulaciones químicas de insulina (por ejemplo goma arábiga, lecitina o suspensiones de aceite) que retardan la velocidad de absorción de la insulina regular. Como se usa en la presente, las insulinas de acción basal pueden incluir insulinas que se entienden típicamente como de acción prolongada (típicamente que alcanzan' una concentración pico relativamente baja, mientras que tienen una duración máxima de acción durante ¦ aproximadamente .20-30 horas) o de acción intermedia (que. provocan típicamente concentraciones de insulina pico a aproximadamente 4-12 horas después de la administración) .

Como se usa en la presente, "glicémico" se refiere a niveles de azúcar en la sangre (glucosa).

Como se usa en la presente,., los términos "condición hiperglicémica" o "hiperglicemia" se refieren a una . elevación indeseada en la glucosa en la sangre.

Como se . usa. en la presente el término · "condición hipoglicémica" ,o "hipoglicemia" se refiere a una reducción indeseada en la glucosa en la sangre.

Como se usa en la .presente, el control ' glicémico ,o "controlar los niveles de glucosa en la. sangre" se refiere al mantenimiento de concentraciones de glucosa en la sangre en un nivel deseado, típicamente entre 70-130 mg/dL o 90-110 mg/dL.." Como se usa en la presente, prueba dé hemoglobina glicosilada (HbAlc) se refiere a una prueba de laboratorio que proporciona el porcentaje de un tipo específico de hemoglobina modificada en la sangre. La prueba determina el nivel dé control de glucosa en la sangre diabética durante los tres hasta cuatro meses pasados.

Como se usa . en. la presente, "absorción de insulina" se refiere a la apariencia de insulina libre y total en la sangre después de la inyección. Los métodos para determinar o medir la absorción de insulina son bien conocidos para alguien de experiencia en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, eliminación o desaparición de radioactividad del sitio de inyección . (conteo gamma externo) y/o apariencia de insulina inmunoreactiya . de plasma (IRI)- (ver por ejemplo Fernqvist et al. (1988) Diabetes, 37:694-701; Bowsher (1999) Clinical Chemistry, 45: 104-110). Los métodos para medir la insulina inmunoreactiva de plasma- incluyen rad'ioinmunoensayo competitivo convencional (RIA) usando un trazador de insulina de radioetiqueta para trazar, la absorción de insulina y un anticuerpo anti-insulina . Las concentraciones de insulina libre en el suero pueden determinarse por RIA después de la precipitación con polietilen glicol y las. concentraciones de insulina totales en el suero pueden¦ determinarse con los mismos procedimientos RIA sin precipitación de polietilen glicol Como se usa. en la: presente,, "acción de insulina" es una medición de la actividad de insulina. Puede determinarse al medir la tasa de infusión de glucosa necesaria para mantener la isoglicemia. durante una ' pinzamiento euglicémico. Puede representarse como glucosa total infusionada (g/kg) en un intervalo de tiempo.

Como se usa' en la presente, "acción de insulina total" es una medición de, la acción de insulina durante el curso de un experimento . de, pinzamiento euglicémico. Puede representarse como la glucosa acumulativa infusionada durante el curso del experimento.

Como se usa en la presente, "respuesta de insulina de acción ultra-rápida" se refiere a una respuesta de acción de insulina que exhibe un perfil más rápido, interno/más rápido externo (PK) ' de manera que existe una aceleración en absorción de . insulina y una duración acortada de acción. Como se describe en la presente, una "respuesta de insulina de acción ultra-rápida" se observa con el paso del tiempo durante el curso . de la infusión continua de insulina. También, como se describe en la presente, una "respuesta de insulina de acción ultra-rápida" ' puede generarse por terapia tecnología de punta con, una enzima que degrada a hialuronano. Por ejemplo, una respuesta de insulina de acción ultra-rápida puede generarse dentro de los primeros cuarenta minutos hasta 1 hora después de la administración de una enzima que degrada a hialuronano inmediatamente antes o inmediatamente después de la infusión o inyección de una insulina (por ejemplo dentro de +12 horas) . La administración de una "composición de insulina de acción súper-rápida" también efectúa una "respuesta de insulina, de acción ultra-rápida".

Como se usa en la presente, ."terapia de tecnología de punta" con referencia, a la infusión de. insulina subcutánea continua (CSII) se refiere a la administración de una enzima que degrada a hialuronano antes de la administración de una composición de insulina (por ejemplo una composición de insulina de, acción rápida o una composición de insulina . de acción súper-rápida). durante un equipo de infusión por infusión de insulina subcutánea continua. El diseño de la tecnología de punta prepara la bomba en el sitio de infusión, por ello incrementa la tasa de absorción de insulina al inicio de la vida del equipo de. infusión para , por ello disminuir la variabilidad en absorción de insulina que ocurre como el equipo de infusión envejecido. Con referencia a la terapia de tecnología de punta generalmente sólo se refiere a un intervalo sencillo o curso de terapia de CSII con un equipo de infusión, que puede repetirse, durante el curso del tratamiento con equipos de infusión, posteriores. En cada intervalo, antes, de la infusión de insulina, puede administrarse un tratamiento de la tecnología de punta con enzima que degrada a hialuronano.. La administración de tecnología de punta generalmente se da. dentro de 12 (doce horas) antes de la administración dé insulina, y generalmente dentro de 2 horas de administración o menos.

Como se usa en la presente, "composición de insulina de acción. súper rápida" se refiere a una composición de insulina que contiene una insulina de acción rápida, típicamente un análogo ' de insulina de. acción rápida, y una enzima degradadora de hialuronano (tal como una, pero no limitado a, preparaciones de' rHuPH20) , tal que la composición de insulina, durante los primeros cuarenta minutos después de la administración . parentera.l a un sujeto proporciona una exposición de insulina sistémica cumulativa en el sujeto que es mayor que la exposición de insulina sistémica cumulativa administrada al sujeto durante el. mismo período después de la administración de la misma dosificación de una insulina de acción rápida, por la misma vía, en ausencia de la enzima degradadora de hialuronano. La composición de insulina de acción súper rápida puede incluir opcionalmente una insulina de acción basal .

Como se usa en la presente, régimen de dosificación se refiere a la cantidad de insulina administrada y la frecuencia de administración. El- régimen de dosificación es una función de la enfermedad o condición que se trata, y de esta manera puede variar.

Como se usa en la presente, una enzima degradadora de hialuronano se refiere: a una enzima, que; cataliza la escisión de un polímero de. hialurano (también referido como.. un ácido hialurónico o HA) en fragmentos, de peso molecular . más pequeños. Ejemplares de las enzimas degradadoras de hialuronano son las hialuronidasas, y en particulár condroitinasas y., liasas que tienen la capacidad de despolarizar el hialuronano. Las condroitinasas . ejemplares que son enzimas degradadoras de hialuronano incluyen, pero no se limitan a, condroitina ABC liasa (también conocida como condroitinasa ABC), condroitina AC liasa. (también conocida como condroitina sulfato liasa o ; condroitina sulfato eliminase) y . condroitina C liasa. La . Condroitina ABC liasa contienen dos enzimas, condroitina-sulfato-ABC endoliasa.. (EC 4.2.2.20) y condroitina-sulfato-ABC exoliasa (EC 4.2.2.21)..

Una condroitina-sulfato-ABC éndoliasas ejemplares y condroitina-sulfato-ABC exoliasas incluyen, pero no se limitan . a, aquellas de Proteus vulgaris y Flavobacterium heparinum (la condroitina-sulfato AB endoliasa de Proteus vulgaris se expone en SEQ ID NO: 98; Sato y colaboradores; (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41 (1) : 39-46) . Las enzimas condroitinasa AC ejemplares de las bacterias incluyen, pero no se limitan a, aquellas de Flavobacterium heparinum, expuesta, en SEQ ID NO:99, Victivallis vadensis, expuesta en SEQ ID NO: .· 1.00 y. Arthrobacter auresc.ens (Tkalec ;'y colaboradores (2.0.00.) Applied and Environmental Mícrobiology 66 (1) : 29-35; Ernst y colaboradores (1995) Critical Reviews in Biochemistry and . Molecular Biology 30(5) : 387-444) . Las enzimas condroitinasas C ejemplares de las bacterias incluyen, pero no .se limitan a, aquellas. de Streptococcus y Flavobacterium (Hibi y colaboradores (1989) FEMS-Microbiol-Lett. 48(2): 121-4; Michelacci y colaboradores (1976) J. Biol. Chem. 251: 1154-8; Tsuda y colaboradores (1999) Eur. J. Biochem. 262:127-133). .

. . Como se usa en- la . presente, la. hialuronidasa se refiere a una clase de.. enzimas degradadoras de hialuronano. Las hialuronidasas incluyen hialuronidasas bactrianas (EC 4.2.2..1 o EC 4.2.99.1), hialuronidasas de sangui uelas, otros parásitos y crustáceos (EC 3.2.1.36), e hialuronidasas de tipo mamífero (EC 3.2.1.35). Las Hialuronidasas incluyen cualquiera de origen no humano incluyendo, pero no limitado a, murino, canino, felino, leporino, aviar, bovino, ovino., porcino, equino, piscino, ranino, bacteriano, y cualquiera de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos. Hialuronidasa rio humanas, ejemplares incluyen, hialuronidasas de vacas (SEQ ID NOS:10, 11, 64 y BH55. (Números de Patente de EUA, 747 , 027 y 5,827,721), avispa de chaqueta amarilla (SEQ ID NOS:12 y 13), abeja de la miel (SEQ ID N0:I4), avispón de clara blanca (SEQ ID NO: 15) , avispa de papel (SEQ ID NO : 16) ,. ratón (SEQ ID NOS: 17-19, 32) , cerdo (SEQ ID NOS : 20-21) , rata (SEQ ID NOS:22-24, 31), conejo (SEQ ID NO:25), oveja (SEQ ID NOS: 26, ' 27 , 63 y 65), orangután (SEQ ID NO:28), mono cynomolgus . (SEQ ID NO:29), cobayo (SEQ ID. NO: 30), chimpancé (SEQ ID. NO:185), mono Rhesus (SEQ ID NO:186), Arthrobacter sp. (cepa FB24) (SEQ ID NO:67), Bóellovibric bacteriovorus (SEQ ID. NO:68), Propionibacterium¦ acnés (SEQ ID NO: 69), . Streptococus agalactiae (SEQ ID NO:70); 18RS21 (SEQ ID NO: 71); serotipo la (SEQ ID NO: 72) ,· serotipo III (SEQ ID NO: 73), Stafilococus aureus (cepa COL) (SEQ ID NO:74);- cepa MRSA252 (SEQ ID NOS : 7-5 y 76) ; cepa SSA476 (SEQ .ID NO:77) ; cepa NCTC 8325 (SEQ ID NO:78); cepa RF122 de- bovino (SEQ ID NOS: 79· y 80); cepa USA300 (SEQ ID ,NO:81), Streptococus pneumoniae . (SEQ ID NO: 82) ; cepa ATCC BAA-255 / R6 (SEQ ID NO: 83) ; serotipo 2, cepa. D39 / NCTC.7466 (SEQ ID NO:84), Streptococus piogenes (serotipo MI) (SEQ ID NO: 85); serotipo M2, cepa ' MGAS10270 (SEQ ID NO:86); serotipo M4 , cepa MGAS10750 ' (SEQ ID NO: 87-),; serotipo M6 (SEQ ID NO:88); serotipo M1.2, cepa MGAS2096 (SEQ ID NOS:89 y 90); serotipo' M12, cepa MGAS9429 (SEQ ID NO:91); serotipo M28 (SEQ .ID NO: 92) ; Streptococus suis (SEQ. ID NGS:93-95); Vibrio f-ischeri (cepa ATCC 700601/ ESI 14 (SEQ ID NO: 96)), y la . enzima de hialurónidasa de Streptomyces hialuronoliticus, que es especifica para el ácido hialurónieo y no escinde la condroitina o el sulfato de condroitina ( (Ohya, T.. y Kaneko, Y. (1970) Bioc'him. Biophys. Acta 198:607). Las hialuronidasas también incluyen aquellas de origen humano. Hialuronidasas humanas ejemplares incluyen HYAL1 (SEQ ID NO: 36) , ' HYAL2 (SEQ ID NO:37), HYAL3 (SEQ ID NO:38), HYAL4 ( SEQ ID NO :'39 ) , y ??2? (SEQ ID NO: lj. también se ..incluyen entre . las ¦ hialuronidasas las hialuronidasas solubles, incluyendo, .PH20 humana y de bovino, PH20 humana soluble y rHuPH20.. Ejemplos de hialuronidasas solubles bovinas u ovinas comercialmente disponibles VitraseMR (hialurónidasa ovina) y AmphadaseMR (hialurónidasa bovina) .

La referencia a. las enzimas degradadoras de hialüronano incluye polipéptidos de enzima degradadora de hialüronano precursores y polipéptidos de ' enzima degradadora de hialuronanos maduros (tales como aquellos en los cuales una secuencia señal se . ha removido) formas truncadas de los mismos que tienen actividad, e incluye variantes alélicas y variantes de especie, variantes codificadas por variantes de empalme, y otros variantes, incluyendo' polipéptidos que tienen por lo menos .40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad .de secuencia a los polipéptidos precursores expuestos en SEQ ID NOS: 1 y 10-48,. 63-65, 67-100, o la forma madura de. los mismos. Por ejemplo, la referencia a la enzima degradadora de hialuronano (por ejemplo PH20) incluye la PH20 humana madura expuesta en SEQ ID .NO: 2 y formas truncadas de la misma que tienen actividad, e incluyen variantes alélicas¦ y variantes de especie, variantes- codificadas con variantes de. empalme. y otras variantes incluyendo polipéptidos que tienen por lo menos 40%, 45%, 50.%.,. 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia a SEQ ID NO:2¿ Por ejemplo, la referencia a la enzima degradadora de hialuronano también¦ incluye las variantes del polipéptido precursor PH20 humano expuestas en SEQ ID NOS : 50-51.¦¦ Las enzimas degradadorás de hialuronano también incluyen aquellas que contienen modificaciones químicas o pos-traduccionales y aquellas que no contienen modificaciones químicas o . pos-traduccionales . Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan. a, . pegilación', albúminación, glicosilación, farnesilación, cárboxilación, hidroxilación, fosforilación, y otras modificaciones de polipéptido conocidas en la técnica..

Como se usa en la presente, la PH20 se refiere a un tipo de hialuronidasa que se presenta, en el esperma' y es neutra-activa. La pH-20 se presenta sobre la superficie de los espermatozoides, y en · el acrosoma derivado del . lisosomá, donde se liga a la membrana acrosomal interna. La PH20 incluye aquellas de. cualquier origen . incluyendo, pero no limitado a, humano, chimpancé, mono Cynomolgus, mono Rhesus, murino,. bovino, ovino.,: cobayo, conejo y de origen de rata. Las proteínas PH20 ejemplares incluyen, pero no. se limitan a, polipéptidos de PH20 de humano (polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 1, polipéptido maduro expuesto en SEQ ID NO: 2), bovino (SEQ ID NOS: 1.1 y ' 64) , ..conejo (SEQ ID NO: 25)., PH20 de. ovino (SEQ ID NOS: 27, 63 y 65), mono cynomolgus (SEQ ID NO: 29), cobayo (SEQ ID NO: 3.0), rata (SEQ ID NO: 31), ratón (SEQ ID NO: 32) , chimpancé (SEQ ID NO: 185) " y mono Rhesus (SEQ ID NO:: 186) polipéptidos PH20. La referencia a la PH20 incluye polipéptidos PH20 precursores y' polipéptidos PH20 maduros (teles :como aquellos en los cuales se ha removido una secuencia señal) , formas truncadas, de los mismos que tienen actividad, e incluye variantes alélicas y variantes de especie, variantes codificadas por variantes de empalme, y otras ' variantes, incluyendo, polipéptidos que tienen. por lo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 55%, 70%, 75%, .80%, 85%, 90%, - 95%, 96%, 97%; 98%, 99% o más de identidad de secuencia a los polipéptidos precursores expuestos en SEQ ID NO: 1, 10, 25, 27, 30-31, 63-65, 185-186, o las formas maduras de los mismos.. Los polipéptidos PH20 también incluyen aquellos que contienen modifi'caciones químicas o pos-traduccionales y aquellos que no contienen modificaciones químicas pos-traduccionales . Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, PEGilación, albúminación, glicosilación, farnesilación, carboxilación, , hidroxilación, fosforilación, y. otras modificaciones de polipéptidos conocidas en la técnica. Ejemplos de hialuronidasas solubles de bovino u ovino comercialmente disponibles son hialuronidasa VitraseMR (hialuronidasa de ovino) e hialuronidasa AmfadasaMR (hialuronidasa de bovino) .

Como se usa en la presente, una hialuronidasa soluble se refiere a un polipéptido que se secreta de células y. no se ancla o se asocia a la membrana, y por consiguiente se puede caracterizar por su. solubilidad . bajo condiciones fisiológicas. Las. hialuronidasas solubles se ¦ pueden distinguir, por ejemplo, por su particionamiento en la fase acuosa de una solución Tritón X-114 calentada a 37 °C (Bordier y colaboradores (1981) J. Biol. Chem. , 256: 1604-7) . Las hialuronidasasa ancladas a la membrana, tal como hialuronidasas ancladas á lípidos, se dividirán en la fase rica en detergente, pero se dividirá en la fase deficiente del tratamiento o acuosa después del tratamiento con la Fosfolipasa-C . Incluidas entre la hialuronidasas solubles son las hialuronidasas ancladas en la membrana en las cuales una o más regiones asociadas con el anclaje.de la hialuronidasa a la membrana se ha .removido o modificado, donde la forma soluble retiene . la , actividad de hialuronidasa.. Las hialuronidasas ' solubles incluyen ' hialuronidasas solubles recombinantes aquellas obtenidas en o purificadas en fuentes naturales, tales como por' ejemplo, extractos de testículos de ovejas o vacas. Ejemplar de estas hialuronidasas solubles son la PH20 humana. Otras, hialuronidasas . solubles incluyen PH20 de ovino (SEQ ID NOS: 27, 63, 65) y de bovino (SEQ ID NOS: 11, 64) PH20.

Como se usa en la presente, PH20 o sHuPH20 humano soluble incluyen polipéptidos PH20 maduros que carecen de todo o una .porción del sitio de . . unión de glicosilfosfatidilinositol (GPI) e la C-terminal tal que la en la expresión, los polipéptidos no se asocian con la membrana de una célula hospedera en la cual se producen de modo que están secretados y, de esta manera solubles en el medio de cultivo celular. Por consiguiente, la PH20 humana soluble incluye, polipéptidos PH20 . humanos truncados C- terminales. Los polipéptidos PH20 solubles o truncados C-terminal ejemplares incluyen polipéptidos. maduros que tienen una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 4-9, 47-4.8, 234-254', y 267-273, o un polipéptido que muestra, por lo menos 70%,. 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, .99% o más de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 4-9, 47-48, 234-254, y 267-273. Los polipéptidos sHuPH20 incluyen polipéptidos maduros que tienen .una secuencia de aminoácido expuesta en. cualquiera de SEQ ID . NOSr-4-9 y .47-48. Los polipéptidos precursores tales como polipéptidos sHuPH20 ejemplares incluyen una secuencia señal. Ejemplares de los precursores son aquellos expuestos en SEQ ID NOS : 3 y 40-46, cada uno de cual contiene ' una secuencia señal de 35 aminoácidos en las posiciones de aminoácido 1-35. Los polipéptidos HuPH20 solubles también incluyen aquellos degradados durante o después de los métodos de producción y purificación descritos en la presente.

Como se usa en la presente, una PH20 humana recombinante preferida, como rHuPH20 se refiere .a una forma soluble secretada de PH20 humana que se expresa recombinantemente en células de Ovario .de Hámster Chino (CHO) . La rHuPH20 soluble es el producto producido por el ácido nucleico que codifica una secuencia señal, tal como la secuencia señal nativa, . e incluye ácido nucleico que codifica los. aminoácidos 36-482. y por el cual una. secuencia ejemplar, que incluye el ácido nucleico que codifica la secuencia señal nativa se expone en SEQ ID -NO: 4-9. También se incluyen moléculas de ADÑ que son variantes alélicas de las mismas y otras variantes solubles. El ácido nucleico .que codifica la rHuPH20 soluble se. expresa en células CHO, que secretan el polipéptido maduro.. Como es producido en el medio de cultivo, existe heterogeneidad en la C-terminal de . modo ¦ que el producto incluye una mezcla de especies que pueden incluir cualquiera o más de SEQ ID. OS: 4-9 ¦ en. abundancia. variada. Las variantes alélicas correspondientes . y otras' variantes también ' se incluyen, incluyendo aquellas que corresponden a los polipéptidos PH20 humanos precursores expuestos en SEQ ID NOS: 50-51. Otras variantes pueden .tener 60%,- 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, .96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con cualquiera de SEQ ID NOS: 4-9 y 47-48 siempre., y cuando retengan una actividad de hialuronidasa y sean solubles .

. Como se usa en la1 presente, una formulación se refiere a una composición que contiene por lo menos, un agente activo o farmacéutico y uno .o más excipientes.

Como se usa en la :presente, un co-formulación se refiere a una composición que contiene dos. o más agentes activos , o farmacéuticos y uno ' o más excipientes. Por ejemplo, una co-formulación de una insulina de acción rápida y una enzima degradadora de hialuronano contiene una insulina de acción rápida, una enzima degradadora de . ialuronano y uno o más excipientes .

Como se usa en la presente, una composición se dice que es estable bajo .condiciones definidas si los. ingredientes activos en. la misma retiene por lo menos un nivel requerido de actividad y/o pureza y/o potencia o recuperación comparada con la actividad inicial y/o pureza y/o potencia o recuperación. Para propósitos en la presente, una composición es estable si retiene por lo menos 50% de la actividad de la enzima degradadora de hialuronano y/o si retiene por lo menos 90% de la potencia o recuperación de insulina y/o por lo menos 90% de la pureza de insulina.

. Como se usa en la presente, una co-formulación estable, que ' contiene por lo menos dos ingredientes activos,- .es estable, si cada ingrediente activo tiene por. lo menos el nivel requerido de actividad y/o pureza y/o potencia o recuperación comparado, con la actividad inicial y/o pureza y/o potencia o recuperación. Para propósitos en la. presente, una co-formulación es estable si retiene por lo menos.50% de la enzima degradadora de hialuronano. y se retiene por lo menos 90% de la potencia o recuperación de la . insulina y/o por lo menos 90% de. la pureza de la insulina.

Como se usa en la presente, condiciones definidas se refiere a las condiciones de almacenamiento y/o uso.

Como se usa en la presente-, las condiciones '.definidas para almacenamiento o uso. bajo las cuales la estabilidad se mide incluyen condiciones de temperatura, tiempo de condiciones de almacenamiento y/o condiciones de . uso. Por ejemplo, las condiciones de temperatura definidas- incluyen temperaturas bajas o refrigeradas de 2 o . C ¾ 8 o C, temperaturas ambientales de 20° C a 30° C o temperaturas elevadas de 32° C a 40° C. En otro ejemplo, condiciones de tiempo definidas se refiere a la longitud de almacenamiento bajo condiciones., de temperaturas variadas,. tal como almacenamiento durante días (por- lo menos. 3 días, 4 días, ' -5 días, 6 días o 7 días), semanas (por lo menos una semana, por lo menos dos semanas, ' por lo menos tres semanas o por lo menos cuatro semanas) o meses (por lo menos¦ 1 meses, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses., 12 meses, 18 meses, 24 meses o más) , ¦ En . un ejemplo adicional, condiciones de. uso definidas se refiere a las condiciones que interrumpen o alteran la mezcla de composición, tal como condiciones de agitación.

Como se usa. en la presente, "almacenamiento" significa que la formulación no se administra inmediatamente a un sujeto una vez preparada, sino se mantiene por un periodo de tiempo bajo condiciones particulares (por ejemplo temperatura particular; tiempo, . forma líquida iiofilizada) antes del uso. Por ejemplo, una formulación líquida se puede mantener durante días, semanas, meses o años, antes de la administración a un sujeto bajo temperaturas variadas tal como refrigerada (0o a 10° C, tal como 2o C a 8o C)., ¦ temperatura ambiente (por ejemplo .temperatura hasta -32° C, tal como 18° C ¿ aproximadamente o a 32° C) , o temperatura elevada (por ejemplo. 30° C a 42° C, tal como 32° C a 37° C o 35° C a 37° C) .

Como se usa en la presente, "uso" con referencia a una condición asociada a la estabilidad se refiere al acto de emplear la formulación para un propósito específico. Las aplicaciones particulares pueden influir en la actividad, o propiedades de una proteína o agente. Por ejemplo, ciertas aplicaciones pueden requerir que la formulación se someta. ciertas temperaturas durante ciertos períodos de tiempo, se somete, a fluctuaciones a temperatura y o se somete ..a agitación, u otro, movimiento similar que puede afectar la estabilidad (por ejemplo actividad y/o solubilidad), de los agentes activos.. Ejemplares de una condición son los métodos de infusión continuos, mediante los cuales los agentes activos se infunden continuamente de un sujeto desde una bomba asociada al usuario o infusor sobre un curso de varios días. Tal condición se puede asociar con agitación y fluctuaciones en temperatura.

Como se usa en la presente, una formulación de dosificación individual se refiere formulación o co-formulación para administración directa.. Generalmente, una formulación de dosificación individual, es una formulación que contiene una sola dosis de agente terapéutico para administración directa'. Las formulaciones de dosificación individual no contienen generalmente ningún conservador.

Como se usa en la presente, una formulación de múltiples dosis se refiere . a la formulación que contiene múltiples dosis de un agente' terapéutico y que se puede administrar directamente para proporcionar varias dosis individuales del agente terapéutico . , Las dosis se pueden administrar durante el curso de minutos,, horas, semanas, días o- meses. Las formulaciones de múltiples dosis pueden permitir el ajuste de las dosis, agrupación de la dosis y/o separación de la: dosis. Debido a que las formulaciones de múltiples dosis se usan a través . del tiempo, contienen en general uno o más conservadores para¦ prevenir el crecimiento microbiano. Las formulaciones de múltiples dosis se . pueden formular para inyección o infusión . (por ejemplo infusión continua),.

Como se usa en la presente, una. "co-formulación de inyección de múltiples dosis estable" se refiere a una co-formulación estable que es estable durante por lo. menos. 6 meses a una temperatura de o de aproximadamente 2 °C a 8°C y/o durante por lo menos 14 días a una temperatura de o de aproximadamente 20°C a 30°C, tal que el nivel requerido de actividad y/o pureza y/o potencia o recuperación se retiene durante el tiempo definido y la temperatura comparada con la actividad inicial y/o pureza y/o potencia o recuperación. Por ejemplo,, una formulación de inyección de múltiples estable retiene por lo menos 50% de la¦ actividad de la enzima degradadora de hialuronano y por lo menos 90% de la potencia o recuperación de la insulina y/o por lo menos 9.0% de la pureza de la insulina durante por lo . menos 6 meses a una temperatura de o de. aproximadamente 2°C a 8°C y/o durante por lo menos 14 dias a. una temperatura de o ,de aproximadamente 20°C a 30°C.

Como se usa en la presente, una "formulación de infusión de . insulina continua estable" se refiere a una co-formulación estable que es estable durante por lo menos .3 dias a una temperatura de o de aproximadamente 32°C a 40°C, tal que el nivel requerido de actividad y/o pureza y/o potencia o recuperación se retiene ' durante el tiempo definido y -la temperatura comparada con. la actividad inicial y/o pureza y/o potencia o recuperación. Por ejemplo, una formulación de infusión de insulina continua estable retiene .por . lo menos 50% de la actividad de .la enzima degradado.ra de hialuronano y por 90% de la potencia o recuperación de la insulina y/o por lo menos 90% de la pureza de la insulina durante, por lo menos 3 días..en una temperatura de o de aproximadamente 32°C a 40°C.

Como se usa en la presente, un agente estabilizante se refiere al compuesto agregado a la formulación para proteger ya sea la enzima degradadora de hialuronano o insulina o ambas de la degradación, como bajo las condiciones de sal, p.H y temperatura en las cuales las. co-formulaciones en la presente se almacenan o se usan. De esta manera, se incluyen agentes que previenen a las proteínas de la degradación de otros componentes en las composiciones. Por lo tanto, son agentes, estabilizantes de proteína. Los ejemplares de tales agentes, son los aminoácidos, derivados de aminoácido, aminas, azúcares, pol'ioles, sales y soluciones amortiguadoras, surfactantes, inhibidores o sustratos y otros agentes como se describe en la presente.

Como se usa en la presente, una prueba de efectividad anti-microbiana muestra la efectividad del sistema conservador en, un producto. Un producto se inocula con una cantidad controlada de organismos específicos. La prueba luego compara el nivel de los microorganismos encontrados en la muestra de control versus la muestra de prueba durante su periodo de .28 días. Los parámetros para llevar a cabo una prueba de efectividad anti-microbiana son conocidos por una persona de experiencia en el campo como . se describe en la presente .

Como se usa en la presente, una cantidad 'antimicrobianamente efectiva o efectiva anti-microbiana de un conservador se refiere . a una cantidad del conservador que extermina o inhibe, la propagación de organismos microbianos en una muestra que se puede introducir del almacenamiento .o uso. Por ejemplo,- para recipientes de múltiples dosis, una cantidad antimicrobianamente efectiva de un conservador inhibe el crecimiento de microorganismos que se pueden introducir de extraer repetidamente las dosis individuales. US.P y EP (EPA y EPB) tienen requisitos anti-microbianos que determinan la efectividad conservadora, y que '. varían un rigor. Por ejemplo, una cantidad efectiva anti-microbiana de un conservador es una cantidad tal que por lo menos una reducción unitaria de 1.0 logio en los organismos bacterianos se presenta a 7 días después de la inoculación .en una prueba de efectividad conservadora anti-microbiana (????) . En un ejemplo particular, una cantidad efectiva anti-microbiana de un conservador es una cantidad tal que por lo menos una reducción unitaria, de 1.0 logio en los organismos bacterianos se presenta .7 días después de la inoculación,, por lo menos una reducción unitaria 'de 3.0 log10 de organismos bacterianos se presenta 14 días después de la inoculación por lo menos ningún incremento adicional de los organismos bacterianos se presenta después de. 28 días después de la . inoculación; y por 10 menos ningún incremento en los organismos fúngicos se presenta, después dé 7 días después de la inoculación. En un ejemplo adicional, una cantidad efectiva antimicrobiana de un conservador es una cantidad tal que por lo menos una reducción unitaria de 1.0 logio de organismos bacterianos se presenta, a 24 horas . después . de la inoculación, por lo menos una reducción unitaria 'de 3.0 logio de organismos bacterianos se presenta 7 días después de la inoculación, ningún incremento adicional en los organismos bacterianos se presenta después de 28 días después de la inoculación, por lo menos una reducción unitaria de 1.0 logio de organismos fúngicos se presenta 14 días después de la inoculación, y por lo menos ningún incremento adicional en . los organismos fúngicos se presenta . después de 28 días después de la inoculación. En un ejemplo adicional, una cantidad efectiva microbiana, dé un conservador es una cantidad tal que por lo menos una reducción Unitaria de 2.0 logio de organismos bacterianos a 6 horas después de la inoculación, por lo menos una reducción unitaria de 3.0 logro de organismos, bacterianos se presenta 24 horas después de- la. inoculación, ninguna recuperación de organismos bacterianos se presenta después -de 28 días después de la inoculación de la composición con el inoculo microbiano, por lo menos una reducción de 2.0 logio unidades de organismos fúngicos se presenta a 7 días después de la inoculación, y al menos ningún incremento adicional en los organismos fúngicos se. presenta después de 28 días siguientes a la inoculación.

Como se usa en la, presente, el "excipiente" se refiere a un compuesto en. una formulación del' agente activo que no proporciona el efecto biológico del agente activo cuando se administra en la ausencia del agente activo. Los excipientes ejemplares incluyen,' pero no se limitan a, sales, soluciones amortiguadoras, estabilizantes, modificadoras de tonicidad, metales, polímeros,, surfactantes , conservadoras, aminoácidos y azúcares .

Como se usa en la presente, una "solución amortiguadora" se refiere a una sustancia, generalmente una solución, que puede mantener su pH constante, a. pesar de la adición de ácidos potentes o bases potentes, e influencias externas de temperatura, presión, volumen o potencial redox . La solución amortiguadora previene el cambio en la concentración de otra sustancia química,, por ejemplo,. sistemas donadores' y aceptores de protones que previenen los cambios marcados en la concentración de ion de hidrógeno. (pH) . Los valores de pH de todas las soluciones amortiguadoras son independientes de temperatura y concentración. La elección de. la solución amortiguadora' para mantener . un valor o intervalo de pH se puede determinar¦ empíri-camente por una persona de experiencia en el campo basado en la capacidad de amortiguamiento conocido de las soluciones amortiguadoras conocidas. Las soluciones amortiguadoras ejemplares incluyen pero no se limitan a, solución amortiguadora de bicarbonato,, solución amortiguadora de .¦ cacódilato, solución amortiguadora de fosfato o solución amortiguadora Tris.. Por' ejemplo, la solución amortiguadora Tris ( trometamina) es una solución amortiguadora basada en amina que tiene una pKa de .8.06 y tiene un. intervalo de pH efectivo entre 7.9 y 9.2. Para estas soluciones amortiguadoras de Tris, el. pH se incrementa a aproximadamente 0 -J 03¦ unidades por disminución de temperatura de °C y disminuye 0.03 a 0.05 de unidades por dilución de diez veces . . . . ·;¦¦ . Como se usa en la presente, la actividad, se refiere a una actividad funcional o actividades¦ de un . polipéptido .' o porción del mismo asociado con una proteiná. de longitud completa (completa) Las actividades funcionales incluyen, pero no se limitan a, actividad catalítica o enzimática, antigenicidad (capacidad de ligarse ' o competi con. un 6b polipéptido para¦ ligarse a un anticuerpo, anti . polipéptido)., inmunogenicidad, habilidad de formar multímeros, .y la capacidad de ligarse específicamente a un. receptor o ligando para el polipéptido..

Como se usa en la presente, . la actividad de hialuronidasa se .refiere a la . capacidad de catalizar enzimáticamente la escisión del ácido hialurónico . · El ensayo XXII de la Farmacopea de Estados Unidos (USP) para la hialuronidasa determina la actividad de la hialuronidasa directamente al medir la cantidad de ácido hialurónico ' de peso molecular más alto y sustrato de hialuronano (HA) permanece después de que la enzima.se deja reaccionar con el AH durante 30 minutos a 37°C (USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 United States Pharmacopeia Convention, Inc, Rockville, MD) . Una Solución Estándar de Referencia se puede usar en un ensayo para determinar la actividad relativa, en unidades, de cualquier hialuronidasa. Los ensayos in vitro para determinar la actividad de la hialuronidasa de ialuronidasas, tal como rHuPH20 soluble, son conocidos en la técnica y se describen en la presente. Los ensayos ejemplares incluyen el ensayo de micro turbiedad descrito a continuación (véase por ejemplo el Ejemplo 2) que mide la escisión del ácido hialurónico por la hialuronidasa . directamente al detectar el precipitado insoluble formado cuando el ácido hialurónico' escindido se liga con la albúmina de suero. Se pueden : usar estándares de referencia, por ejemplo, para generar una curva de estándar para determinar la . actividad en Unidades, de la hialuronidasa que se somete a prueba.

Como se usa en la presente, "cantidad funcionalmente equivalente" o variaciones gramáticas de la misma, con referencia a , una enzima degradadora. de hialuronano,' se refiere a la cantidad de enzima degradadora de hialuronano que logra el mismo efecto como una cantidad (tal como un número conocido de actividad de hialuronidasa) de una enzima de . referencia, tal como una hialuronidasa. La actividad de cualquier enzima degradadora de hialuronidasa se .puede comparar con la .actividad de rHuPH20.. para determinar la cantidad funcionalmente equivalente de. una enzima degradadora de hialuronano que lograría el mismo efecto como, una cantidad conocida de rHuPH20. Por ejemplo, la. capacidad.de Una enzima degradadora de hialuronano para actuar como un agente, de propagación o difusión se puede evaluar al inyectarlo en la piel lateral de ratones con azul de triparto (véase por ejemplo la Publicación de Patente. de EUA. No. 20050260186), ya la cantidad de enzima degradadora de hiáluronano . requerida para, lograr la misma cantidad de difusión como,, por ejemplo, 100 unidades de un . Estándar de Referencia de hialuronidasa, sé puede determinar. La cantidad de. enzima degradadora de hialuronano requerida es por lo tanto, funcionalmente equivalente a 100 unidades. En otro ejemplo, la capacidad de una enzima degradadora de hialuronano para incrementar, el nivel y velocidad' de absorción de una insulina coadministrada se puede evaluar en los sujetos . humanos', tal como se describe posteriormente, en el. Ejemplo .1, y la cantidad de enzima, degradadora de hialuronano requerida para lograr el mismo incremento en el. nivel y velocidad de absorción de la insulina como,' como por ejemplo, la cantidad administrada de rHuPH20,. se puede determinar (tal como al evaluar la concentración de insulina máxima en la sangre (Cmax, ) el tiempo requerido para lograr la concentración de insulina máxima en la sangre (tmax) y la exposición de la insulina sistémica y acumulativa durante un periodo de tiempo dado (AUC) .

Como se usa en · la presente, las. ácidos .nucleicos incluyen D A, RNA y análogos de los mismos, incluyendo ácidos nucleicos peptídicos. (PNA) y mezclas de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden ser de hebra individual o doble. Cuando se refieren a ' sondas o cebadores, que se etiquetan opcionalmente , tal como con una etiqueta detectable, tal como una fluorescente o radio etiqueta, se pueden contemplar moléculas de hebra individual, , Tales moléculas son típicamente de una longitud .tal que., su objetivo es estadísticamente, único o de número de copias bajo (típicamente menor que 5, generalmente, meno que 3) para someter a prueba o cebar una biblioteca. Generalmente una sonda o cebador contiene por lo menos 14, 16 o 30 nucleótidos contiguos de secuenciá complementaria a o idéntica a un gen de interés. Las sondas y cebadores pueden ser 10, 2.0,. 30, 50, 100 o más de ácidos nucleicos de largo.

Como se usa en la presente, un péptido se refiere a un polipéptido que . es mayor- que o igual a dos aminoácidos en longitud, y menor qüe o igual a 40 aminoácidos en longitud...

Como se usa . en la presente, los . aminoácidos que se presentan en varias secuencias de aminoácidos proporcionadas en la presente se identifican de acuerdo con. sus abreviaciones de tres letras o una letra, conocidas (Tabla.1) . Los nucleótidos que se presentan en varios fragmentos de ácido nucleico se designan con las designaciones de.¦ una · letra estándares usadas rutinariamente en la técnica.

Como se usa en la presente, un "aminoácido" es un compuesto orgánico que contiene un grupo de aminoácidos y un grupo de ácido carboxílicp . Un polipéptido contiene uno o dos aminoácidos. Para propósitos en la presente, los aminoácidos incluyen los veinte aminoácidos de origen natural., aminoácidos no naturales y análogos de aminoácido (es decir, aminoácidos en donde el a-carbono tiene una cadena natural) .

Como se usa en la presente, "residuos de aminoácido" se refiere-, a un aminoácido formado en la digestión química (hidrólisis) de un ' polipéptido en sus ligaciones de péptido. Los residuos de aminoácido descritos en la presente se presumen que están en la forma isomérica "L". Los residuos en la forma isomérica "D" que se designan de esta manera, se pueden sustituir por cualquier- residuo ... de L-amino ácido siempre y cuando la propiedad funcional deseada, se retenga por el polipéptido. NH2 se refiere al grupo amino libre presente en la amino terminal de un polipéptido.. CÓOH se refiere al , grupo- .carboxi libre presente en el carboxilo terminal de un polipéptido. En el mantenimiento, con la nomenclatura de polipéptido de estándar descrita en J. Biol . Chem. , 243: 3557-3559 (1968), y adoptada 37 C . F . R . §§ 1.821-1.822, las abreviaciones para los residuos de aminoácidos se muestran en la Tabla 1: Tabla 1 - Tabla de Correspondenc Todas las secuencias de residuos de aminoácido representadas en la presente por las formulas tienen una orientación de izquierda a derecha en la dirección convencional del amino-terminal al . carboxilo-terminal . Además, la frase " "residuo de aminoácido" se define ampliamente para incluir los aminoácidos listados en la Tabla de Correspondencia (Tabla 1) y. aminoácidos modificado e inusuales, tales .como, aquellos referidos en 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822, e incorporados en l presente a manera de referencia. Adicionalmente, un guión en el inicio o final de una secuencia de . residuos de aminoácido indica un; péptido ligado a una secuencia adicional de uno o más residuos de aminoácido, a un grupo amino-terminal tal como NH2 a un grupo carboxilo-terminal tal como COOH .

Como se. usa en la presente,, "aminoácidos de origen natural" se refiere a los 20 L-ami'noácidos que se presentan en los polipéptidos .

Como se usa en la presente, "aminoácido no natural" se refiere a un compuesto orgánico que . tiene una estructura similar a un ' aminoácido natural pero . se ha modificado naturalmente para imitar la estructura y reactividad de un aminoácido natural. Los aminoácidos de origen no natural incluyen de esta .manera, por ejemplo, aminoácidos o análogos de . aminoácidos diferentes a los 20 aminoácidos de origen natural . e incluyen, : pero no se limitan, a, los D-isosteréómeros de aminoácidos. Aminoácidos no naturales ejemplares se describen en este' documento y se conocen., por aquellos de experiencia en la técnica.

Como se usa en la presente, un constructo de ADN es una molécula de ADN de hebra individual o doble hebra, lineal o circular que contiene segmentos de ADN combinados y yuxtapuestos en una manera no encontrada en la naturaleza. Los constructos . de ADN existen como resultado de la manipulación humana, e. incluyen clones y otras copias de moléculas manipuladas. ¦ Como se usa. en. la presente, un segmento de ADN es una porción de una molécula de ADN más grande que tiene atributos especificados. Por ejemplo, un segmento de AD que codifica un polipéptido especificado es una porción de una molécula de ADN más larga, tal como un plásmido o fragmento de . plásmido, que, cuando se lee de la dirección 5' a 3', codifica- la secuencia de aminoácidos del polipéptido especificado.

Como se usa en la presente, el. término polinucléótido significa un polímero de hebra individual o doble hebra de bases de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos leídos del extremo 5' al. 3'. Eos polipéptidos incluyen RNA y DNA, y se pueden aislar de fuentes naturales, sintetizadas ir¡. vitro, o preparadas a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas. La longitud de una molécula de polinucléótido sé proporciona en la presente en términos de nucleótidos (abreviada "nt") o pares base (abreviada "bp") . El término nucleótido se usa para, moléculas de hebra individual y doble hebra donde el contexto lo permita.. Cuando el término se aplica a moléculas . de ' hebra doble se usa para indicar una longitud completa, y se entenderá que es equivalente, al término pares base.. Se reconocerá por aquellas personas en la técnica que dos obras- de un polinucléótido de hebra doble puede diferir ligeramente en longitud y que los extremos del mismo se pueden, escalonar; de esta manera todos los nucleótidos dentro de una molécula de p.olinucleótido de hebra doble no se pueden parear. Tales extremos no pareados, en general, no excederán 20 nucleótidos en longitud.

Como se usa en la . presente, "similitud" entre dos proteínas o ácidos, nucleicos se refiere a. la relación entre la . secuencia de aminoácidos de las proteínas o las secuencias dé nucleótidos de los ácidos nucleicos. Similarmente se puede basar en el grado .de identidad y/o homología de la secuencia de los residuos y los; residuos contenidos en la misma... Los métodos para evaluar el grado de similitud entre las proteínas o ácidos nucleicos son bien conocidos por. aquellas de experiencia en .la técnica. Por ejemplo, en un método para evaluar la similitud de secuencia, dos secuencias de aminoácidos, o nucleótidos se alinean de una manera que produce un nivel máximo' de identidad entre las secuencias.

Como se usa en la presente, "identidad" se refiere al grado al cual las secuencias de aminoácidos o nucleótidos son invariantes. La alineación de las secuencias de aminoácidos, y algún grado las secuencias de nucleótidos, también toman en Cuenta diferencias conservadoras y/o sustituciones frecuentes en los aminoácidos (o nucleótidos) . Las diferencias conservadoras son aquellas que conservan las propiedades físico-químicas de los residuos implicados. Las alineaciones pueden ser. globales (la alineación , de las " secuencias comparadas sobre la longitud completa de las secuencias incluyen todos los residuos) o local (la alineación de una porción de . las secuencias que incluye .solo la región o regiones más similares). "Identidad" per se .tiene un significado reconocido en la técnica y se puede, calcular usando las técnicas publicadas.. (véase,. por ejemplo: Computational Molecular Biology, Lesk,. ?.?., ed. , Oxford University Press,. New York, 1988; Biocomputíng: Informatics and Genome Projects, Smith, D. ., ed., Academic Press, . New York, .1993; Computer 'Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and' Griffin, H.G., eds. , Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and . Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J. , eds., M Stockton Press, New York, 1991) . Aunque existe un número de. métodos para medir la identidad entre . dos polinucleótidos o polipéptidos, el término "identidad" es bien conocido por los técnicos expertos (Carillo, H. & .Lipton, D., SIAM J Applied Math 48 : 1073 (1988) ) .

Como se usa en la 'presente, homólogo (con respecto a las secuencias de ácidos nucleicos y/o aminoácidos) significa aproximadamente mayor que o igual a 25% de homología de secuencia, típicamente mayor que o igual: a 25%, 40%, 50%, 60%, .70%, 80%, 85%, '90% o 95% homología de secuencia; el porcentaje preciso se puede especificar si es necesario. Para propósito en la presente los términos "homología" y "identidad" se usan: frecuentemente de manera intercambiable, a menos que se indique de otra manera. En general, para la determinación del porcentaje' de homología o identidad, las secuencias se alinean de modo que se obtiene la comparación de orden más alto (véase, por ejemplo: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed.,. Oxford University Press, New York, 1988;:.. Biocomputing: Informatics and Genom.e Projects, Smith, D. ., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis óf Sequence Data,¦ Part I Griffin, ?. ., arid Griffin, H.G., eds . , Humana Press, New . Jersey, 1994; [Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, . G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo y colaboradores (1988) SIAM J -Applied. Math .48:1073). Por homología de . secuencia, el número de aminoácidos .conservados se determina por programas de algoritmos de alineación estándares, y se pueden usar con penalizaciones de espacio por omisiones, establecidas para cada proveedor . Las¦ moléculas de ácido nucleico sustancialmente homologas se hibridarán típicamente a la severidad moderada o en la severidad alta todas juntas a la longitud del ácido nucleico de interés. También se contemplas las moléculas de ácido nucleico que contienen codones degenerados en lugar de los codones en la hibridación de la molécula de ácido nucleico.

Si cualquiera de las dos moléculas tienen secuencias de nucleótidos o secuencias de aminoácidos que son por lo menos 5 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% "idénticas" u "homologas" se . pueden determinar usando . algoritmo de computadora conocidos , tal como el programa "FASTA", q e usa por ejemplo., los parámetros por' omisión como en Pearson y colaboradores (19.88) Proc. Nati. Acad. Sci.-. USA 55:2444 10 (otros programas incluyen el paquete de programa GCG (Devereux, J., y colaboradores , Nucleic Acids Research .12 (I).:. 387 (1984))/ BLASTP, BLASTN, FASTA. (Atschul, S.F., y colaboradores, JMolec .Biol 215:403 (1990)); Guide · to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed. , Academic Press, San Diego, 15 1994, y Carillo y colaboradores (1988) SIAM J Applied Math 48: 1013). Por ejemplo., la función BLAST de la base de datos del Centro Nacional para Información de Biotecnología se puede usar para determinar la identidad. Otros programas comercial o públicamente disponibles incluyen, el programa •-',20 "MegAlign" de DNAStar (Madison, WI) y el programa "Gap" de Wisconsin Genetics Computer Group (UWG) (Madison WI). El porcentaje de homología o identidad de las proteínas y/o moléculas de .ácido nucleico se . pueden determinar, ·. por ejemplo, al comparar, la información de secuencia que usa un programa de computadora GAP (por ejemplo, Needleman y colaboradores (1970) J. Mol. Biol. 48:443.,· como es revisado por Smith y Waterman (1981) Adv. ' Appl . Math. 2:482) . Brevemente, el programa GAP define la similitud., como el número de símbolos alineados (es decir, nucleótidos . p aminoácidos), que son similares, divididos por el número total de símbolos de en lo más corto de las dos secuencias. Los parámetros por omisión para¦ el programa. GAP pueden incluir: (1) una matriz, de comparación unitaria, (qué contiene un valor de 1 para .. identidad de 0 para no identidades) y la matriz de . comparación ponderada de¦ Gribskov y colaboradores (1986) Nucí. Acids Res. 14:6745, como se describe por Schwartz and.. Dayhoff, eds . , ATLAS OF PROTEIN. SEQUENCE AND STRUCTURE, National Bipmedical Research Foundation, . pp . .353-358 (1979); (2) una penalizacion de 3.0 para cada .espacio y una penalizacion de 0.10 adicional para cada símbolo en cada espacio; y (3) sin penalizacion para espacios finales.

Por lo tanto, como se usa en la presente, el término "identidad" u "homología" representa una comparación entre un polipéptido o polinucleótido de prueba o de referencia. Como se usa en la presente, el término, por lo menos "90% idéntico a" se refiere a los porcentajes de identidades de 90 a 100% relativo con. la secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos de referencia del polipéptido. La identidad de un nivel en un nivel de 90% o más indicativo del hecho que, asumiendo para propósitos de ej emplificación se .compare una longitud de polipéptido de prueba y de referencia de 100 aminoácidos. No más de 10% (es decir, 10 de 100) .de los aminoácidos en el polipéptido de prueba difiere de aquel del polipéptido dé referencia. Se pueden Hacer comparaciones similares entre los nucleótidos de prueba y de referencia.: Tales diferencias se pueden representar como mutaciones puntuales aleatoriamente distribuidas sobre la longitud completa de un polipéptido se pueden agrupar en una o más ubicaciones de longitud variante de hasta el máximo permisible, por ejemplo 10/100 diferencias de aminoácidos (aproximadamente .90% de identidad) . Las diferencias se definen como sustituciones, inserciones o supresiones de ácido nucleico o aminoácido. En el nivel de las¦ homologías de identidades por arriba de 85-90%, .el resultado debe ser independiente del conjunto ;de parámetros de programa y espacio; estos altos niveles de' identidad se pueden evaluar fácilmente, de manera' frecuente por la alineación manual sin depender de un software.

Como se usa en la presente, una secuencia alineada se refiere al uso de homología ( similitud . y/o identidad) para alinear posiciones correspondientes en una secuencia de nucleótidos o aminoácidos. Típicamente, se alinean 2.o más secuencias que se relacionan por 50 o más de identidad. Un conjunto de secuencias alineados se refiere a 2 o más secuencias que se alinean en posiciones correspondientes se pueden incluir secuencias de alineación derivadas . de RNAs, tal como ESTs y . otros . cDNAs , alineados con la secuencia de ADN genómico . ' '¦ Como se usa. en la presente, sustancialmente. idéntico -.a un producto significa suficientemente similar de modo qué la propiedad de intereses está suficientemente sin cambio de modo que el producto sustancialmente idéntico se puede usar en lugar del producto.

Como se usa en la presente, también, se entiende que los términos "sustancialmente idéntico" o "similar" ' varían con el contexto como es entendido por aquellas personas en la técnica relevante. .

Como se usa .en la presente,' una variante alélica . o variación alélica se refiere a cualquiera de dos. o más formas alternativas de. un .gen que ocupa el mismo sitio cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de la mutación, y puede dar por resultado polimorfismo fenótípico dentro de las poblaciones . Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambio en el' polipéptido codificado) o puede codificar polipéptidos que tienen, la secuencia de aminoácidos alterada. El. término "variante alélica" también se usa. en la presente para indicar una proteína codificada .. por una variante alélica de un gen. Típicamente la forma de referencia del gen codifica una forma de tipo natural y/o forma predominante de un polipéptido. de una población o miembro . de referencia es singular de una . ' especie . Típicamente, las variantes alélicas,. que . incluyen variantes entre especies tienen típicamente por lo menos 80%, 90% o mayor identidad de aminoácido con una forma de. tipo natural y/o . predominante dé la misma especie; el grado de identidad depende, del. gen. y si la comparación, es ínter especie o intra especie. Generalmente, las variantes alélicas intra especie tienen por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90% o 95% o mayor con una forma de tipo natural y/o. predominante, incluyendo 96%, 97%, 98% 99% o mayor identidad con una forma de tipo, natural y/o predominante de. un polipéptido. La referencia a una. variante' alélica en la presente se refiere generalmente a variaciones en las proteínas entre los miembros de la misma especie.

.. Como se usa en la presente, "alelo,", que se usa intercambiablemente en -la presente con "variante alélica" se refiere a formas, alternativas de un gen o .porciones del mismo. Los alelos ocupan el mismo sitio o posición en los cromosomas homólogos. Cuando un sujeto., tiene dos alelos idénticos de un gen, el sujeto se dice que es homocigoto. para ese gen o alelo. Cuando un sujeto tiene dos diferentes alelos de un gen, el sujeto se dice que es homocigoto . para el gen. Los ale.los de un gen especifico pueden diferir entre si en un nucleótido individual o varios nucleótidos, y pueden incluir modificaciones tales como ¦ sustituciones, supresiones e inserciones de nucleótidos. Un alelo de un gen ' también puede ser una forma de un gen que contiene una mutación.' Como se usa en la presente, las variantes de especies se refieren a variantes en los polipéptidos entre las diferentes especies, incluyendo especies de mamíferos diferentes, tales como ratón y humano.

Como se usa en la presente, la modificación es en referencia a la modificación de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido : o una secuencia de nucleótidos en una molécula de . ácido nucleico e incluye .'. supresiones, inserciones, y reemplazos de aminoácidos y nucleótidos.. Respectivamente. Los métodos para modificar un polipéptido son de rutina para . aquellas personas expertas en lá técnica, tal como al usar metodologías de ADN recombinante .

Como se usa en la presente, . polipéptido o proteína aislada., o purificada o porción biológicamente activa del mismo está sustancialmente libre del material celular u otras proteínas recombinante.s de la célula o tejido del cual Ta proteína se deriva, sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos cuando se sintetizan . químicamente .

Las . preparaciones. se . pueden determinar . para estar sustancialmente libres si se .' presentan sin impurezas fácilmente detectables como se determina por los métodos estándares de análisis, tal como cromatografía de capa delgada' (TLC)., electroforesis en gel y cromatografía liquida de alto desempeño (HPLC) , usadas por aquellos de experiencia en el campo para evaluar la pureza, o suficientemente puro tal que la purificación adicional no alteraría detectablemente las propiedades físicas y químicas, tal como actividades enzimáticas y biológicas,, de la sustancia. Los métodos para la purificación de los compuestos, para producir compuestos sustancialmente de manera química puros son conocidos por aquellas personas expertas en el campo. Un compuesto sustancialmente de manera química puro, sin embargo, puede' ser una mezcla de estereoisómeros . En estos casos, la purificación adicional podría incrementar, la actividad específica del compuesto.

El término sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones .de proteínas en las cuales la proteína se separa de los componentes celulares de las células de las cuales se aisla o se produce recomb.inantemente . En una modalidad, el término sustancialmente libre del material celular, incluye preparaciones de proteínas enzimáticas que tiene menor que ' aproximadamente 30% ' (en peso seco) de proteínas enzimáticas (también referidas en la. presente- como una proteína contaminante), generalmente menor que aproximadamente 20% dé proteínas no enzimáticas o 10% de proteínas no enzimáticas o menor que aproximadamente 5% de proteínas no enzimáticas. Cuando la proteína enzimática se produce recombinantemente, también esta sustancialmente libre del medio, de cultivó, es decir, el medio de cultivo representa menor que aproximadamente o. a 20%, 10% y 5% del volumen de las preparaciones de proteínas enzimáticas.

Como se usa en la presente, el término sustancialmente libre . de precursores químicos u otros químicos incluye preparaciones de proteínas enzimáticas en las cuales la proteína se separa de los precursores químicos u otros químicos que se implican en la síntesis de la. proteína. El término incluye preparaciones de proteínas enzimáticas que tienen menor que aproximadamente 30% (en. peso seco) , 20%, 1.0% 5% o menos de precursores químicos o químicos o componentes no enzimáticos.

Como se usa en la presente, sintético, con referencia a, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico sintética o. un gen sintético o un . péptido sintético se refiere . a una molécula ' de ácido, nucleico o molécula de . polipéptido que se produce por métodos recombinantes . y/o por métodos de síntesis química .

Como se usa en la presente, producción por medios recombinantes al usar métodos de ADN . reeombinantes significa el uso de los métodos bien conocidos de . biología molecular para expresar proteínas codificadas por, el ADN clonado. ' Como se usa en la presente, . vector (o plásmido) se refiere a elementos discretos que se usan para introducir un ácido nucleico heterólogo en las células para ya sea expresión o replicación de' las mismas. Los . vectores permanecen típicamente'"¦ episomal, pero se pueden diseñar para efectuar la integración de un gen o porción del mismo en un cromosoma del genoma. También se contemplan vectores que son cromosomas artificiales, tales como cromosomas artificiales de. levadura y cromosomas artificiales, de mamífero. La selección y uso de estos, vehículos son bien conocidos por aquellas personas de experiencia en el campo.

Como se usa en la presente, un vector de expresión incluye vectores capaces de expresar ADN que se diga de manera operativa, consecuencia reguladoras, tales como regiones promotoras, que son capaces de efectuar la expresión de estos fragmentos de DNA. Estos segmentos adicionales pueden incluir secuencias promotoras y terminadoras, y opcionalmente pueden incluir uno o más orígenes de replicación, uno . o más marcadores . seleccionables, un potenciador, una señal de. poliadenilación, y similares. Los . ' . : · 85 vectores de expresión se derivan generalmente de.. ADN plásmido o viral, o pueden contener elementos de ambos. De esta manera, un vector de expresión se refiere a un constructo de ADN. o RNA recombinante, tal como un plásmido, un fago, virus recombinante u otro vector que, en la, introducción en una célula hospedera apropiada, da por resultado la . expresión del ADN clonado. Los. vectores de expresión- apropiados son bien conocidos por aquellas personas de experiencia en el campo e incluyen aquellos que son replicables en células eucarióticas y/ o células procar'ióticas y aquellos que permanecen episomales o aquellos que se integran, en el genoraa de la célula hospedera.

Como se usa en' la presente, el vector también incluye "vectores de virus" o "vectores virales." Los vectores virales son virus .diseñados que se ligan operativamente a los genes exógenos para transferir (como vehículos o lanzaderas), los genes exógenos en las células.

Como se usa en la presente, de manera operable o de manera operativa ligada cuando se. refiere a segmentos de ADN significa que los segmentos se arreglan de modo ;que funcionan al unisono para sus propósitos, intencionados, por ejemplo, la transcripción inicial cadena abajo del promotor y cadena arriba ,: de cualquiera de las secuencias transcritas.. El promotor es usualmente el dominio al cual la maquina transcripcional .sé liga para iniciar la transcripción' '.''y procede a través del segmento codificador al terminador.

Como se usa en la presente, el término evaluar se propone para incluir una determinación cuantitativa y cualitativa en el sentido de' obtener, un valor absoluto para la actividad de una proteasa, o un dominio de la misma, presente en la muestra, y también para obtener . un índice, relación, porcentaje, valor visual u otro indicativo de nivel de la actividad. La evaluación puede ser directa o indirecta y la especie, química detectada actualmente no necesita pór supuesto ser el producto de proteólisis mismo pero por ejemplo puede ser: un derivado del mismo o alguna sustancia adicional. La detección de un producto de escisión de una proteína de complemento, tal como por SDS-PAGE y tinción de proteínas con azul de Coomassie.

, Como se usa en la presente/ la actividad biológica se refiere a las actividades in vivo de un . compuesto :o respuestas fisiológicas' que resultan en la administración in vivo de un compuesto, composición u otra mezcla. La actividad biológica, de esta manera, abarca ' efectos terapéuticos y actividad farmacéutica de estos compuestos, composiciones y mezclas . Las actividades biológicas . se pueden observar en los sistemas in vítro diseñados para probar o usar estas actividades. De esta manera, para propósitos en la presente 67 una actividad biológica de una proteasa es una actividad catalítica en la cual .se hidroliza un polipéptido.

Como se usa en 1a presente equivalente, cuando se refiere, a dos secuencias de ácido nucleicos, significa que las dos secuencias en cuestión codifican la misma secuencia de aminoácidos . o proteínas equivalentes.. Cuando equivalentes se usa en referencia a dos proteínas o .péptidos, significa que las dos proteínas o péptidos tienen sustancialmente la misma secuencia de. aminoácidos con únicamente sustituciones de aminoácido que no altera sustancialmente la actividad , o función de la proteína o péptido.. Cuando equivalente se refiere, á una propiedad, la- propiedad no necesita, estar presente al mismo ¦. grado (por ejemplo, dos péptidos pueden mostrar diferentes velocidades del mismo tipo de actividades enzimáticas ) , pero las actividades son usualmente de manera sustancial las mismas. ' Como se usa en la presente, una composición se refiere a cualquier mezcla. Puede ser una solución, suspensión, líquido, polvo, pasta, acuosa, no acuosa, o cualquier combinación de los. mismos.

Como se usa en la presente, una combinación se . refiere ;-a cualquiera sucesión entre dos o más artículos, ta combinación puede ser dos o más: artículos separados, tal ¦ como dos composiciones o dos colecciones, pueden ser una. mezcla de las mismas, tal ' como una mezcla individual de los dos o más artículos, o cualquier variación de los .mismos. Los. elementos de una combinación sé asocian o se relacionan generalmente de manera, funcional . . .

Como se usa en la presente, "enfermedad o trastorno" se refiere a una condición patológica en un organismo que resulta de la causa o condición que incluye, pero no se limita a, infecciones, condiciones adquiridas, condiciones genéticas, y caracterizadas por síntomas identificables . Las enfermedades y trastornos de interés, en la presente incluyen diabetes mellitus.. , Como se usa en la presente, "tratar" a un sujeto con una enfermedad o condición significa que los síntomas del sujeto se alivian parcial o- totalmente, . o permanecen estáticos después del tratamiento. Por consiguiente el tratamiento abarca profilaxis, terapia y/o cura. Profilaxis se refiere a la prevención de una enfermedad potencial y/o prevención del empeoramiento de síntomas o progresión de una enfermedad. El tratamiento también abarca cualquier uso farmacéutico de una co-formulación , de, insulina y enzima degradadora de hialuronano proporcionado . en la presente..

Como se usa en. la presente, un agenté farmacéuticamente efectiva, incluye cualquier agente terapéutico o agentes bioactivos, que. incluyen, pero no se limitan a,, por .ejemplo, anestésicos, vasos constructores, agentes de dispersión, fármacos terapéuticos convencionales,, incluyendo fármacos de moléculas pequeñas y proteínas terapéuticas.

Como se usa en . la presente, tratamiento ' significa cualquier . manera en . la cual los síntomas' de una condición, trastorno o enfermedad u otra indicación, se alivian o de otra manera se alteran benéficamente ..

Como se usa en la presente, un efecto ' terapéutico significa un efecto que resulta del tratamiento de un sujeto que altera,, mejora típicamente o alivia los síntomas de una enfermedad, o condición o que cura una enfermedad o condición. Una cantidad terapéuticamente efectiva se refiere a la cantidad de una composición, molécula o compuesto que .da por resultado un efecto terapéutico después de la administración a un suj eto .

Como se usa en la presente, el. término "sujeto" se refiere a un animal., incluyendo un mamífero, tal como un ser humano . .

Como se usa en la presente, un paciente se refiere a un sujeto humano que muestra síntomas de una enfermedad . o trastorno Como se usa en la presente,' mejora de los síntomas de una enfermedad o trastorno particular por un tratamiento, tal como por la administración de una composición farmacéutica.·', u otro producto terapéutico, se' refiere al cualquier reducción, ya sea permanente o temporal, de larga. duración . ;o transciente, de los síntomas que se pueden atribuir a ::o asociar con la administración de. la composición o producto terapéutico .

Como se usa en la presente, prevención o . profilaxis se refiere a los métodos a los cuales se reduce el riesgo de desarrollar enfermedad o condición. .

Como se usa en la presente, una "cantidad terapéuticamente efectiva" o una "dosis terapéuticamente efectivas" se refiere a una cantidad de Un. agente, compuesto, material, o composición que contiene un compuesto . que es por lo menos suficiente para producir ün efecto terapéutico. Por consiguiente, es la cantidad necesaria para prevenir, curar, mejorar, detener o detener parcialmente un síntoma de una enfermedad o trastorno.: Como se usa en la presente, una dosificación de insulina terapéuticamente efectiva es la cantidad de;. insulina requerida o suficiente ' para lograr el control glicémico. Esta cantidad se puede determinar empíricamente, tal como estimulación por glucosa o comida. Las composiciones proporcionadas en la presente . contienen una · cantidad terapéuticamente efectiva o concentración de insulina de modo que se administran dosificaciones terapéuticamente efectivas.

Como se usa en la presente, forma de dosis, unitaria se refiere a unidades' físicamente discretas adecuadas para sujetos humanos y animales y empacada individualmente como es conocido en la . técnica.

Como se . usa en. la presente, una formulación de dosificación sencilla . se refiere a una formulación para administración directa.

Como se usa en la presente, un . "artículo de fabricación" es un producto . que se' fabrica y se vende. Como se usa por toda esta solicitud, el término se propone para abarcar una composición de insulina de acción rápida y composición de enzima degradadora de hialuronano contenida en los mismos o artículos separados de' empaquetado'.

Como se usa en la presenté, fluidos se refiere a cualquier composición que puede fluir. Los fluidos abarcan de esta manera composiciones que están, en la forma de semi-solidos, pastas, soluciones, mezclas acuosas, .geles, lociones, cremas y otras de estas composiciones.

Como se usa en la' presente, un "kit" se refiere a' una combinación de composiciones proporcionadas en la presente y a otro artículo para un propósito que incluye,, pero no se limita a, reconstitución, -: activación, instrumentos/dispositivos para administración, diagnosis, y evaluación de una. actividad o propiedad . biológica . Los kits incluyen opcionalmente. instrucciones para el uso.

Como se usa en la presente, animal incluye cualquier animal, tal como, pero no limitado a primates incluyendo humanos, gorilas y monos; roedores, tales como ratones y ratas; aves de corral, tales como pollos; rumiantes, tales como cabras, vacas, venado, oveja; . cerdos y otros animales. Animales no humanos se excluyen humanos como el animal contemplado. Las enzimas proporcionadas en la presente son cualquier fuente, animal, planta, procariótica y . fúngíca. La mayoría de las enzimas son de origen animal, incluyendo origen de mamífero..

Como se usa. en. la presente, un . control se refiere a una muestra . que es sustancialmente idéntica a la muestra de prueba, excepto que no se trata con un parámetro de prueba, o que, si es una muestra de plasma, puede ser de un voluntario normal afectado con la condición, de interés. Un control también puede ser un control interno.

Como se usa en la. presente, las formas singulares "un", "una",' "la" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto lo indique claramente. de otra manera.' De ésta manera, por ejemplo,' la referencia a un compuesto, que comprende "un dominio extracelular" incluye compuestos con uno o una pluralidad de dominios extracelulares .

Como se usa en la presente, intervalos y cantidades se pueden expresar como "aproximadamente" un valor o intervalo particular.. Aproximadamente también incluye, la cantidad exacta. Por consiguiente "aproximadamente 5 bases", significa "aproximadamente 5 bases" y también "5 bases." Como se usa en la presente, "opcional" u "opcionalmente" significa el evento o circunstancia subsecuentemente descrita que se presenta o- no, y que la descripción incluye casos donde el evento o . circunstancia no se presenta y casos donde se presentan. Por ejemplo, un grupo opcionalmente sustituido significa que el grupo está sin sustituir o está sustituido.

Como se usa en la presente, las abreviaciones para cualquiera de los. grupos protectores, aminoácidos y otros compuestos, son, a . menos que se indique de otra manera, de acuerdo con su uso común, abreviaciones reconocidas, o la Comisión IUPAC-IUB ¦ en la Nomenclatura Bioquímica (véase, (1972) Biochemistry 11: 1726).

B. TERAPIA DE INSULINA Acelerar la. absorción y acción de productos de insulina prandial para tanto inyección multidosis . (MDI) y administración de infusión de insulina subcutánea continua (CSII) se desea, con objeto de imitar, más cercanamente la liberación de insulina post-prandial endógena (esto es natural) de un sujeto no diabético. Se ha mostrado que la insulina de acción rápida co-formulada o co-mezclada (por ejemplo un análogo . de insulina) con una enzima que ' degrada a hialuronanos, tal como. PH20, actúa para. acelerar la absorción y acción comparada con insulina sola cuando se administra por infusión subcutánea, o. infusión por bomba, y por ello resulta en mejoras en control glicémico (ver por ejemplo Pub de patente de E.U.A. No. US20090304665) .

. También., la infusión subcutánea continua (CSII). de una insulina también es. un mecanismo que se conoce para acelerar la exposición y/o acción a insulina¦ durante el periodo de uso usual (3-4) días del equipo de infusión de CSII (ver por ejemplo Swan et al . (2009) Diabetes Care, 32:240-244; Liu et al. Diabetes Res. .y. Clin. Prac. (1991) 12 : 19-24 ; Olsson et ai. Diabetic Medicine (1993) 10:477-80; y Clausen et al. Diabetes Tech Therapéutics (2009) 11 : 57,5-580 ).' Los estudios previos, sin embargo, han demostrado inconsistencia en tanto la exposición a como acción, de la insulina del análogo . de acción rápida ya que el equipo de infusión, de insulina envejece (Swan et al. (2009) Diabetes- Care, 32:240-244; Clausen et al. Diabetes Tech Therapéutics :' (2009) 11:575-5801. Aunque existe una absorción más rápida interna/más - rápida externa tardía en la vida del equipo de infusión, la absorción de insulina no¦ es consistente debido, a que pronto en la vida del equipo de infusión la .absorción de insulina que se observa es mucho menor que la que ocurre después en la vida del equipo de infusión. Esto resulta en una variabilidad en exposición a la insulina durante la terapia CSI'I, ya que la absorción de insulina únicamente, incrementa o acelera después, en la vida del equipo de infusión. Por ejemplo,- se ha observado el tiempo/para la concentración de insulina máxima para variar desde 55±3' hasta 45±4 min (p= .019) durante '4 días de la vida del equipo de infusión. De manera correspondiente, el comienzo de la acción de insulina varia por 25% y la duración de la acción de insulina por 40 minutos a través de la vida del equipo de infusión.

Este grado de variabilidad en la exposición insulina y acción son factores desconocidos importantes en el control de diabetes. Ciertamente, . un estudio de un brazo sencillo del control, deglucosa . sobre el uso del equipo de infusión evaluado por monitorización de glucosa continua ha mostrado disminuicones dramáticas en el control glicémico, con niveles de glucosa diarios promedio elevados desde 122.7 mg/dL hasta 163.9 mg/dL (p<.05) después de 5 días del uso del equipo de infusión . (Thethi et al. (2.010) J., Diab. and its Compl.ication.s, 24, 73-78). Consistente con el aumento, en la glucosa diaria, media, el porcentaje de los valores en exceso de 180 mg/dL se eleva desde 14.5% hasta 38.3% (p<.05).. También, se encuentra . en la presente que el suministro de insulina solo por CSII también disminuye la . acción de la insulina total con. el paso del tiempo de la vida del equipo de infusión. El efecto.de este fenómeno es variabilidad para el paciente en. el. perfil de exposición a la insulina.

Son proporcionados en la presente métodos del régimen de dosificación de infusión de insulina subcutánea continua (CSII) para minimizar él efecto de aceleración de insulina a través de la vida del equipo de infusión, (esto es con el paso del tiempo de la infusión) con objeto de . suministrar consistentemente un perfil de acción y exposición de insulina de acción súper rápida sobre la duración del uso del equipo de infusión. Se encuentra ' en la presente que cuando una insulina co-formulada con una .enzima que degrada ..a hialuronano (po ejemplo PH20) . se infunde por CSII, el fenómeno de aceleración de infusión CSII se reduce, pero .no se. elimina, aunque la pérdida de acción de insulina total se incrementa (ver .por ejemplo Ejemplo 2). Para compensar la pérdida de la acción de insulina total, aunque ¦ toma ventaja del efecto más consistente de PH20 en la exposición a la insulina y/o acción, proporcionado en la presente es. un método por ello la administración de insulina se incrementa sistemáticamente, con el paso del tiempo en la vida del equipo de infusión, por ello mejora el. control de glucosa con el paso del tiempo por' terapia de bomba de infusión, incluido por tanto sistemas de circuito abierto como circuito cerrado.

También proporcionado en la presente, es un método para controlar la exposición y/o acción de insulina, por ello la enzima que degrada a hialuronano se administra al inicio del uso del equipo de infusión en un régimen de dosificación de tecnología de punta antes de la infusión con una insulina en una terapia CSII. El efecto de la preadministración de una enzima que degrada á hialuronano antes de la infusión es una reducción en la variabilidad de la exposición a insulina que ocurre con el paso del tiempo de la vida del equipo de infusión. Como se discute en cualquier lugar en la presente, se cree que al' inicio de la' infusión, el hialuronano actúa como una barrera para el flujo de. fluido en volumen, por ello limita la absorción de la insulina. Ya que el equipo de infusión envejece, el cuerpo naturalmente restaura la barrera de hialuronano para el. flujo de fluido en volumen durante el curso del uso del equipo de infusión. Al administrar una enzima que degrada un hialuronano antes del . inicio de la infusión con insulina,: la barrera inicial para el flujo de fluido en volumen se .reduce. Por lo tanto, en los métodos proporcionados en la presente, la enzima que degrada a hialuronano (por ejemplo ??2?) puede, reducir la aceleración de la exposición y/o acción a -insulina .sobre la . vida del eguipo de infusión y proporcionar. un suministro más consistente, de una insulina de acción súper rápida que imita la liberación de insulina post-prandial endógena de un sujeto no diabético . 1. Terapias de insulina, diabetes e insulina de acción rápida existente La insulina es una hormona de polipéptido que se presenta naturalmente secretada por el páncreas. La insulina se requiere por las células del cuerpo para tomar y usar efectivamente la . glucosa de la sangre.. La glucosa es el sustrato de energía predominante para llevar a cabo las funciones celulares. Además de ser el modulador primario de la homeostasis de ' los carbohidratos, la insulina tiene efectos sobre el metabolismo de la grasa. Puede cambiar la capacidad del hígado y tejido adiposo,, entre otros, para liberar las reservas de grasa.. La insulina tiene varios efectos farmacodinámicos a través. del cuerpo, incluyendo pero no limitado para incremento en la síntesis' del lípido, reducción en la descomposición del lípido, incremento en la síntesis de la. proteína, regulación de .las enzimas clave y procesos en el- metabolismo de . glucosa (incluyendo estimulación de absorción de . glucosa, estimulación de oxidación de glucosa, síntesis del glicógeno incrementada y descomposición del glicógeno reducida) .

Aunque la insulina se secreta basálmente, ¦usualmenté en el intervalo de 0.5 hasta.1.0 unidad por hora, sus niveles se incrementan después: de una comida. Después de una comida, el páncreas secreta un bolo de insulina en respuesta a una elevación en glucosa. La insulina estimula la absorción de glucosa en las células, y señala el hígado para reducir la producción de glucosa; esto resulta en un regreso de la glucosa en la sangre a .niveles normales. En adultos normales, hubieron dos fases de liberación de insulina en respuesta , a una comida. La primera fase es un pico de liberación de insulina que ocurre dentro de '2-15. minutos de la comida. La liberación de la última fase se extiende alrededor de 2 horas. La primera fase es responsablie para cerrar la producción de glucosa hepática, por ello reduce los niveles de glucosa en la sangre y sensibiliza o . señaliza los tejidos periféricos para incrementar la .absorción, de glucosa. En el músculo, se. almacenan cantidades grandes de glucosa como glicógeno.' Algo del glicógeno se fragmenta en lactato, qüe circula al hígado y puede convertirse de . nuevo en glucosa y almacenarse como . glicógeno. Entre las comidas el hígado fragmenta este glicógeno almacenado para proporcionar glucosa al cerebro y otros tejidos.

La^ diabetes, resulta en hiperglicemia crónica debido a la incapacidad o capacidad reducida del páncreas para producir cantidades adecuadas de insulina o debido ' a la incapacidad o capacidad reducida de células para sintetizar y/o liberar la insulina requerida. En diabéticos, la efectividad de la respuesta de la primera fase descrita arriba se disminuye o está ausente, llevando a niveles, de glucosa postprandiales elevados. Por ejemplo, el área de glucosa, en la sangre bajo la curva (AUC) durante las primeras cuatro horas postprandiales (esto es primeras cuatro horas después de . la comida), es 2.5 hasta 3.0 veces mayor en diabéticos que en no diabéticos. Las excursiones de glucosa postprandiales contribuyen a hiperglicemia general y niveles HbAlc. elevados, y estas excursiones son los contribuidores primerios para las eleviaciones, HbAlc apreciadas en etapas previas de diabetes tipo 2.

Muchos pacientes diabéticos . requieren tratamiento con insulina cuando el. páncreas produce cantidades inadecuadas de insulina, o no pueden usar la insulina producida, para mantener el control glicémico adecuado. Se ha administrado insulina como un . terapéutico para tratar pacientes que tienen diabetes, incluyendo, por ejemplo, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2 y diabetes gestacional, con objeto de imitar la respuesta de insulina endógena que ocurre en individuos normales. También, se ha administrado la. insulina a pacientes criticamente enfermos con hiperglicemia para controlar' los niveles de glucosa en la sangre.

La terapia de reemplazo de insulina .involucra tanto reemplazo de insular en . bolo y basal. El reemplazo de insulina basal, o insulina de fondo, se usa. para controlar el azúcar en la sangre durante, el ayuno, por ejemplo, durante la noche o entré las comidas, y' se administra usualmente en una dosis día a día constante-. El reemplazo de insulina en bolo se cuenta para carbohidratos, esto es, ingesta alimenticia, y también corrección 'de azúcar en la sangre alta, también conocida como factor de sensibilidad de. insulina. La dosis en bolo para cobertura de . los alimentos se prescribe como una relación de insulina a carbohidrato., o relación de cobertura de carbohidrato. La relación de insulina a carbohidrato representa cuantos gramos., de carbohidrato se cubren: o colocan por 1 unidad de insulina. Generalmente, una unidad, .de insulina de acción rápida se colocará- de 12-15 gramos de carbohidrato. Este intervalo puede variar desde ' 4-30 gramos o más de carbohidrato dependiendo de una sensibilidad del individuo a- la insulina. La sensibilidad a la insulina puede variar de acuerdo al momento del dia, de persona a persona, y se afecta por la actividad física y estrés. La dosis, en bolo para corrección de azúcar en la . sangre alta se define como una unidad de. insulina de acción rápida qué reducirá el azúcar en la sangre. Generalmente, para corregir un azúcar en la sangre alta, una unidad, de insulina se necesita para reducir la glucosa en la sangre por 50 .mg/dl. Esta reducción de azúcar en la sangre, puede estar en el intervalo desde 15-100 mg/dl o más, dependiendo de las. sensibilidades a la insulina individuales, y otras circunstancias. Los pacientes con sobrepeso requieren dosis superiores de insulina debido. a la deficiencia y resistencia de insulina mayor,. Los ajustes de dosis también pueden requerirse si el paciente está tomando medicamentos que puedan afectar el metabolismo del carbohidrato o las respuestas a la insulina. La enfermedad renal o hepática también puede afectar lós farmacocinéticos de insulina.. Además, el ejercicio, . enfermedad, estrés, patrones alimenticios aberrantes, alcohol, y caminar también pueden necesitar ajustes de dosis.

Los algoritmos usados para estimar las dosis dé insulina varían, y se conocen para alguien de experiencia', en la técnica (ver, por ejemplo,. Hi.rsch et .al., (2005)' Clinical Diabetes 23:78-86; Global Guide.line for Type 2 - Diabetes ,. Capítulo 10: Glucose control: insulin therapy, International Diabetes Federation, . (2005) pp. 39-42; Zisser et ah, (2009) J Diabetes Sci Technol 3 (3) : 487-491) . Un. régimen de partida se determina principalmente por el grado de hiperglicemia como se mide por el monitoreo de glucosa en la sangre y él- valor A1C. El peso corporal también . se usa para calcular la dosis de insulina de partida apropiada. El monitoreo de. glucosa en la sangre es esencial para evaluación de un régimen de la dosificación. Típicamente, al menos se miden y registran un valor de glucosa en la sangre postprandial y uno en ayuno. La frecuencia y sincronización de la prueba de glucosa en la sangre depende principalmente en el régimen ' de insulina . Aquellos que usan terapia de inyección diaria múltiple (MDÍ) a menudo necesitan verificar el nivel de. glucosa en la 'sangre antes de cada comida, ocasionalmente 2 horas postprandial, y a la hora de acostarse cada día. Los piquetes en los dedos pueden hacerse antes y: después de una comida para determinar el impacto de. la. dosis.de insulina previo a la comida, y los ajustes a hacerse 'en consecuencia. La comida seleccionada debe variar de manera que al final del periodo de evaluación, cada comida se estudie al menos una vez. La prueba durante la noche y a la mañana siguiente proporciona información con respecto al impacto de la insulina basal.

. Para calcular una dosis de insulina basal., o dosis de insulina de fondo, primero se debe estimar o calcular una dosis de insulina diaria total. El requerimiento de insulina diaria total, (en unidades) se define generalmente como el peso del paciente .en pulgadas dividido por 4,. o alternativamente, ei peso del paciente en kilogramos multiplicado por 0.55. Por ejemplo, si un paciente pesa 160 pulgadas, el requerimiento de insulina diaria total deber ser 40 unidades de insulina por día (160/4). Los pacientes con sensibilidad a..insulina pueden requerir una dosis de insulina diaria total superior, o alternativamente, un paciente que es sensible a la insulina puede requerir una dosis de insulina diaria total inferior. La dosis.de insulina basal luego se calcula basada en la dosis de insulina diaria total. (TDI) . La dosis de insulina basal es aproximadamente 40-50% de la dosis de insulina diaria . total . De esta manera, para un paciente anterior con un TDI de 40 unidades,, la dosis, de insulina basal o de fondo es 20 unidades.

Una relación de cubierta de carbohidratos,,' o los gramos de carbohidratos cubierto por una unidad de. insulina,, se calcula por la fórmula 500/Dosis de insulina diaria total. De esta manera, si su TDI es 40 unidades, su relación de cubierta de carbohidrato es 12 g . de carbohidratos por unidad de . insulina (igual a 500/40) . Un factor de corrección de azúcar en la sangre alta, o la cantidad de. 1 unidad de insulina disminuirá el azúcar en la sangre (en mg/dl.) se calcula al dividir, 1800. por la dosis de. insulina diaria total .. De esta manera, si su TDI es 4.0 unidades, su factor de corrección es 45 mg/dl (igual a 1800/40) .

Para, calcular una dosis de. insulina .en bolo para carbohidratos, o ingesta alimenticia,, los gramos totales de carbohidratos en la comida se dividen .entre los gramos de carbohidrato colocados por 1 unidad dé insulina, esto es, relación de. cubierta . de carbohidrato descrita arriba. Por ejemplo, 1 unidad de un análogo que actúa, rápido puede darse para cada 10 hasta 15 .gramos de carbohidrato consumido.. Por lo tanto una comida, que contiene 90 gramos de. carbohidrato requerirá una dosis en bolo de 6 unidades de insulina (relación 1:15). Para calcular una dosis de insulina en bolo para corrección de azúcar en la sangre alta, ' se toma la diferencia entre, el azúcar en la sangre actual y el. 'azúcar . en la sangre objetivo (esto es, el azúcar, en la sangre actual menos el azúcar en . la sangre objetivo) , y se divide por un factor . de corrección. En general, 1 unidad, de insulina reducirá su azúcar en la sangre a 50 puntos (mg/dl) y por lo tanto el factor, de corrección de azúcar en la sangre alto es 50. De esta manera,, si un nivel de glucosa en la sangre medido del paciente fue 220 mg/dl y su objetivo de azúcar en la sangre previo a . la comida es 120 mg/dl, la dosis requerida para la corrección de azúcar en la sangre alta es (220-120 mg/dl) /50, resultando en una dosis. de 2, unidades de. insulina-Típicamente , los pacientes que usan MDIs o una bomba de insulina pueden ajustar la dosis de insulina al momento de la comida basada en el. contenido de carbohidrato estimado .de una comida así como una lectura de glucosa en la sangre. Por ejemplo,, suponiendo que un paciente está a punto de comer una comida ' la cual se estima que . contiene 90 gramos de carbohidrato y el objetivo de glucosa en . la sangre previo a la comida del paciente es 100 mg/dL, pero , el nivel de glucosa en la sangre medido fue 200 mg/d, puede determinarse' la dosis de insulina en bolo. De esta manera, usando una insulina: relación de carbohidrato de 1:15, el paciente . tomará 6 unidades de insulina aspart para cubrir los .90 gramos de carbohidrato (90 gramos de carbohidrato/15) más otras 2 unidades de insulina aspart para corrección siendo 100 mg/dL sobre el nivel de glucosa objetivo. Su dosis de insulina en bolo total será 8 unidades.

Diferentes fuentes de insulinas se usan dependiendo de la necesidad del .paciente . Las preparaciones de insulina comerciales pueden clasificarse dependiendo de su duración de la actividad (ver por ejemplo, DeFelippis et al. (2002) Insulin Chemistry. and Pharmacokinetics . In Ellenberg and Rifkin's Diabetes Mellitus (pp. 481-500) McGraw-Hi'll Professional ) . Por ejemplo, se proporciona la insulina en formulaciones de acción rápida, asi como formulaciones de acción intermedia o prolongada, las 'últimas dos clasificaciones se refieren en la presente como insulinas que actúan con basal. Las formas de acción rápida tienen un comienzo rápido, ' típicamente exhibiendo los niveles de insulina pico en 2-3 horas o menos, y no, más de cuatro horas. Por lo tanto, las formas de acción rápida de insulina se usan en regulación de glucosa prandial. Otras formas dé insulina incluyen de acción intermedia, que logran concentración de insulina pico en aproximadamente 4-12 horas después de la administración subcutánea-, e insulinas de acción prolongada que- logran un pico relativamente modesto y tienen una duración máxima de acción de 20-30 horas. Las formas de acción intermedia y prolongada a menudo están compuestas de preparaciones de insulina amorfas y/o cristalinas, y se usan predominantemente en terapias básales.

El objetivo de la administración . prandial de composiciones de insulina, de acción rápida es alcanzar un nivel de glucosa en, la' sangre estable, con e.l paso del tiempo por administración parenteral de la insulina de acción. rápida antes, durante o poco después de la. hora de comer. De esta manera,, los niveles de . insulina en la -sangre se elevan temporalmente para. (a) cerrar la producción de glucosa hepática y ¦ (b) incrementar la. absorción de glucosa; de esta - manera manteniendo el. control glicémico durante la elevación en la glucosa en la sangre asociada . con digestión de- la comida . . .

Se , usa insulina humana recombinante (también- nombrada insulina regular; por ejemplo, insulina Humulin®. R) para auto administración por . inyección antes de la hora -de la comida. Desafortunadamente, la insulina humana recombinante debe dosificarse por inyección aproximadamente una media hora o más antes de la hora de la comida con objeto de asegurar que un una elevación en . la glucosa e la. sangre no . ocurra sin oposición por niveles' de insulina exógenos. Una de las razones para la absorción lenta de insulina humana recombinante es debido a que la insulina forma complejos hexaméricos en presencia de iones de zinc tanto in .vivo como in vitro. Tales complejos que contienen zinc hexaméricos son más estables que el zinc que carece de insulina monomérica. Durante la inyección, estos hexámeros de insulina deben disociarse en dimeros o monómeros más pequeños antes de que puedan absorberse a través de perlas capilares . y pasar en la circulación sistémica. La disociación de hexámeros para dimeros y monómeros es' dependiente de la concentración, que ocurre únicamente- en concentraciones inferiores ya que la insulina se . difunde del sitio de inyección. De esta manera, un depósito de. ..insulina local existe en el sitio de inyección,, proporcionando una concentración alta inicial de insulina hexamérica en el sitio de inyección que no puede absorberse hasta que la concentración de insulina disminuya (Soeborg et al., (.2009) Eur. J. Pharm. Sci.. 36:78-90) . Ya que la insulina lentamente .se difunda del, sitio de inyección, la concentración de insulina disminuye ya que la distancia del sitio de inyección incrementa, resultando en disociación de los hexámeros y absorción de los monómeros y. dimeros de insulina insulin. De' esta manera, aunque la dispersión de los complejos de insulina hexaméricos ocurre naturalmente en el cuerpo, puede tomar algo de tiempo para que . ocurra, retardando la disponibilidad sistémica de insulina. Además, debido a esta absorción dependiente de la concentración, las concentraciones de insulina superiores y dosis . superiores se absroben. más lentamente (Soeborg et al., (2009). Eur. .J. Pharm. Sci . 36: 8-90) . ' Ya que la insulina en forma monomérica se absorbe más rápidamente, aunque las insulinas en el estado hexamérico son más estables, las formas del análogo de acción rápida (también llamado que actúa rápido) de insulina se han desarrollado que . exhiben una disociación más rápida de hexamérica a monomérica durante la administración. Tales insulinas se modifican, tales como por cambio de aminoácidos, para, incrementar la tasa de disociación, por, ello imparte actividad farmacodinámica más rápida durante la inyección. Cómo sé describe en la Sección D, las formas del análogo de acción rápida de insulina incluyen pero no se limitan a., insulina glulisina, insulina aspart, y insulina' lispro . .

Las formas de acción rápida de insulinas, incluyendo análogos de acción rápida, tienen un retraso en absorción¦¦; y acción, y por lo tanto no se aproximan a la insulina endógena que tiene una fase previa que ocurre alrededor, de 10 minutos después de comer. De esta manera, tales formulaciones no actúan con suficiente rapidez para cortar la producción de glucosa hepática que ocurre pronto después de esta primera fase de liberación . de insulina. Por esta razón, aún las preparaciones de análogo de insulina de acción rápida .deben darse en antes de las comidas con objeto de lograr cualquier cambio de control . glicémico deseado . Aunque es más '. f cil estimar el tiempo para comer dentro de 15 minutos que dentro de 30-60 minutos requerido para regular la insulina, .existe el riesgo de que un . paciente pueda comer demasiado temrano o demasiado tarde para proporcionar el mejor control de glucosa en la sangre.

Además, uno de los principales efectos colaterales de tratamiento con cualquier terapia de insulina, incluyendo terapias insulina de acción rápida, es la hipoglicemia. La hipoglicemia se define como glucosa en la sangre baja y está asociada con una variedad de morbilidades que pueden estar en el intervalo de hambre hasta síntomas más molestos tal como temblor, sudoración, confusión · o llegar hasta un ataque, coma y muerte. La hipoglicemia puede ocurrir por falta de comer lo suficiente, saltarse las comidas, ejercicio más del usual . o tomar demasiada insulina o usando una preparación de insulina prandial que tiene' una duración inapropiadamente prolongada de exposición y acción.. Por ejemplo, ya que muchas terapias de insulina de acción rápida deben darse antes de una comida,, existe un riesgo de que un paciente pueda renunciar o saltarse la comida, llevando a hipoglicemia. Adicionalmente, durante la administración de una insulina de acción rápida, los niveles de insulina en el suero .y la acción de insulina (medidos, por ejemplo, como tasa, de infusión de glucosa (GIR) ) típicamente permanecen elevados después de que la carga de glucosa prandial ha . reducido, hipoglicemia amenazante. Los intentos para mejorar las cargas de glucosa pico de control al. incrementar la dosis de insulina además incrementa este daño. También, debido a que la hipoglicemia postprandial es un resultado común de terapia de insulina,, a menudo provoca o necesita que los pacientes coman bocadillos entre las comidas. Esto contribuye a la ganancia en peso y obesidad a menudo asociado con terapias de. insulina.

. Los estudios previos de insulina coadministrada con una enzima que degrada a hialuronano (por ejemplo PH20. tai como rHuPH20) han demostrado la farmacocinética de insulina que replica mejor la respuesta de insulina, natural para una comida en individuos : saludables (ver por ejemplo Pub de patente de E.U.A.. No.. US20090304665; Vaug n et al. (2009) Diabetes Technol . Ther . , 11:345-52;. Muchmore and Vaughn (2010) J. Diabetes Sci . Technol.., ¦ 1:419- 428). Específicamente, la coadministración de insulina . con PH20 acelera el comienzo de la .acción de insulina (antes t5o%max) / el tiempo de concentración' de insulina pico (tmax) , y la compensación de¦ -la acción de insulina (después ' tso%max) -coadministración PH20 también incrementa la concentración de insulina pico, incrementa la exposición de insulina previa, .y reduce la exposición de insulina postprandial posterior.. En voluntarios saludables, esta aceleración de exposición' a la insulina resulta en. metabolismo de glucosa acelerada, como se mide por tasas de infusión de glucosa durante una pinzamiento euglicémico. En sujetos con Diabetes mellitus tipo, l.y tipo 2, la aceleración de la exposición a. insulina se ha mostrado para reducir la hiperglicemi'a postprandial, como se mide por glucosa en la. sangre pico, glucosa, post-prandial de ' dos horas, y área total de excursiones de glucosa >150 mg/d que ocurren en respuesta, a una comida . de prueba líquida estandarizada. 2. Infusión subcutánea continua (CSII) Se ha usado . clínicamente la infusión . de , insulina subcutánea continua (CSIÍ) para el tratamiento, de diabetes durante las últimas tres décadas y los sistemas de "páncreas artificial" de . circuito cerrado usando C'SII para el componente de control, eferente · están en desarrollo. CSI permite administrar . el control de la terapia de insulina que no puede lograrse por inyecciones subcutáneas. Por ejemplo, las bombas de insulina pueden contar para acción de insulina residual en. el software acompañante para, prevenir la hipogli'cemia relacionada con dosis en bolo múltiples dadas durante un periodo corto.

La terapia de bomba de CSII se asocia con variabilidad de glucosa incrementada ya que el sitio, de infusión envejece, lo que puede ser ..un problema en la administración (Swan et al. ¦ (2009) Diabetes . Care, 32:240-244) .. Por ejemplo, uso prolongado de . un sitio de infusión (por ejemplo hasta 4 días) resulta en acción de pico más temprana' y. duración más corta de acción de una dosis en bolo estándar, lo que es similar para los diferentes análogos de insulina de acción rápida. Este efecto puede contribuir a la variabilidad día a- día. y la responsabilidad de glucosa en el plasma en pacientes diabéticos. Este efecto se ha observado en diversos estudios.

Por ejemplo, un documento por Liu et al. (Diabetes Res. and Clin. Prac. (1991). 12: 19-24) demuestra aceleración de la exposición a insulina sin ningún' cambio en la exposición de insulina total que ocurre · entre el día 1 y el día 4 del uso del equipo de infusión de insulina. ¦ Notablemente, la prueba realizada en el Día 1 se condujo inmediatamente (dentro de 10 minutos) después de cambiar . el equipo de infusión. El cambio en la sincronización de la exposición de insulina se asoció con una disminución más rápida y mayor en los niveles de glucosa en la sangre después del suministro de una dosis en bolo . ( 1. unidad/10 kg de peso corporal) en el Día 4 Como se compara con el Día 1. La conclusión fue que la- tasa de absorción . de . insulina incrementa ya que la edad establece la infusión, y que el cambio en absorción se asocia con acción de insulina más rápida como se evalúa por la disminución de glucosa en la sangre después . de la administración en bolo de insulina y comida posterior..

Un estudio ..similar se reportó por Olsson et al. {Diabetic Medicine (1993) 10:477-80) y falló para mostrar cualquier diferencia importante en la sincronización- . de la exposición a insulina cuando se compara con estudios realizados en los. Días 1, 3. y' 5 del uso establecido .'de infusión. Como en el estudio por Liu et' al., la exposición a la insulina total fue comparable a través de los días del estudio. Notablemente, en este estudio,, el bolo' de insulina en el Día 1 se .administró aproximadamente 12 horas después de cambiar el equipo de infusión. Los autores evalúan la acción de insulina al seguir, los niveles de glucosa en 'la sangre después de una comida estándar dada después del bolo en la mañana diariamente de insulina, los cuales se encontraron para ser equitativamente constante. No: hubo diferencias estadísticamente importante en la glucosa en la sangre aunque se notó que hubo una tendencia para azúcar en la sangre para elevarse progresivamente más rápidamente en los Días 1, 3 "y 5, respectivamente, y la glucosa en la sangre en ayuno tiende a ser mayor en el. Día 5 que en los Días 1 o 3.

En el estudio más reciente por Swah et al.- . (Diabetes Care (2009) 32 : 240-244 ) , la acción de insulina en el Día 1 (12 horas después, del cambio establecido de -infusión) se comparó con el Día 4 (84 horas después del cambio establecido de infusión) . La acción de insulina se evaluó al medir la tasa de infusión de glucosa con el paso del tiempo que se requirió para mantener la euglicemia después de una dosis en bolo de insulina. Los niveles en la. sangre de insulina no se midieron en esté estudio. Los autores encuentran una aceleración importante de. acción de insulina que ocurre como el equipo de infusión envejecido. Los autores concluyen que la acción de insulina total, medida por glucosa total infusionada durante el experimento, no .fue diferente cuando se compara el Día 4 con el Día 1, aunque los datos muestran una tendencia modesta pero no importante para , la acción de insulina reducida cuando se compara el Día 4 con el Día 1. En contraste a los. dos estudios previos el sitio de infusión fue gluteal, no abdominal, y los sujetos fueron adolescentes.

Un estudio reportado por Clausen et al. (Diabetes Tech Therapeutics (2009) 11:575-580) evalúa el flujo sanguíneo subcutáneo y la farmacocinética de . insulina suministrada por CSII en voluntarios machos saludables diariamente durante cuatro días (Días 0-3). El bolo de insulina se dio 90 minutos después de la inserción del equipo, de . infusión; después de que el bolo se suministró los sujetos . reciben infusión continua de solución salina hasta el siguiente bolo programado. Los resultados confirman aquellos de Liu et al., con aceleración progresiva de exposición a la insulina sin cambio en la exposición total durante la vida del equipo de infusión. No se realizaron evaluaciones de la acción de insulina.

Estos hallazgos generalmente soportan la idea de que la exposición a la insulina y la acción se aceleran sistemáticamente durante la vida .del equipo de infusión. Generalmente, después de infusionarse o inyectarse en el tejido subcutáneo, , la insulina construye un depósito, que últimamente se difunde a través del espacio intersticial para el lecho vascular donde los dímeros.o monómeros disociados al hexámero se absorben en el lecho vascular. Las razones para el comienzo previo y duración más corta de dosis en bolo en las últimas veces, de infusión pueden ser debido a una variedad de factores, tal como flujo sanguíneo- incrementado sobre el sitio . de infusión debido: a cambios en el microambiente vascular, (por ejemplo provocado por reacciones inflamatorias en el sitio de infusión),, pérdida de insulina debido a la 'precipitación en el equipo u oclusión parcial del equipo de infusión por la insulina (Swan et al.. (2009) Diabetes Care, 32:240-244). También, . el transporte de insulina a través de la membrana en momentos previos también · puede limitarse por construcción de un depósito de insulina, capacidad de difusión o' flujo sanguíneo. Por ejemplo, la aceleración puede ser debido a la barrera de hialuronano para flujo de fluido en volumen al comienzo, de la infusión. Esta barrera para el flujo, de fluido en volumen no puede existir, o se compensa por los otros factores, en tiempos de infusión posteriores. En los métodos . proporcionados en la presente, las diferencias en la exposición de insulina y/o acción con el paso, del tiempo pueden minimizarse por un tratamiento de tecnología de punta, por ello una enzima que degrada ..a hialuronano se administra al inicio del uso establecido de infusión, seguido por ' CSII con insulina - sola o una combinación de insuli.na-PH20 . o co-formulación . En tiempos posteriores durante el curso del uso del equipo de infusión, ¦el cuerpo naturalmente restaura la barrera de hialuronano para el flujo de fluido en volumen a fin de reducir la aceleración.

Tanto los sistemas de circuito cerrado como de circuito abierto se benefician, del desarrollo de preparaciones de insulina que contienen PH20, que tienen un tiempo de retraso reducido entre la inyección y la acción. La presencia de PH20 en combinación con . insulina reduce la aceleración de la exposición a insulina con el paso del. tiempo del equipo de infusión. Los regímenes de dosificación : que usan PH20 y/o insulina reducen además la variabilidad en la aceleración de la exposición de. insulina, y por ello controlan la variablidad . en la exposición a la insulina que ocurre .con el paso del tiempo de la infusión.

Son proporcionados en la presente métodos, de régimen . de dosificación CSII que minimizan el efecto de la aceleración de insulina a través de la vida del equipo de infusión (esto es con. el paso del tiempo de la infusión) con objeto de suministrar consistentemente una exposición a la insulina de acción súper rápida y perfil de acción sobre la duración del uso establecido de la infusión. Los métodos para controlar la exposición y/o acción a insulina pueden usarse en métodos CSII y usos para 'tratamiento de diabetes y/o para . controlar más... consistentemente los niveles de glucosa en la sangre en un suj eto . ·. ' . ' ."¦ C. Métodos de infusión subcutánea continua (CSII) de insulina con una enzima que degrada a hialuronano Son proporcionados en la presente métodos del régimen de dosificación de infusión subcutánea continua . (CSII) para controlar los niveles de glucosa en la sangre en un sujeto. Los métodos pueden . usarse para tratar un paciente que tiene diabetes u otra enfermedad o afección asociada con. insulina. Los métodos proporcionados en la presente están basados en el hallazgo de que un régimen de' dosificación incluye una enzima que degrada a hialuronano consistemente suministra una exposición a la insulina ultra-rápida y el perfil de acción durante la duración del uso establecido de infusión. Por lo tanto, los métodos, en. la presente que usan una enzima que degrada a hialuronano, en particular en una administración de tecnología de . punta, pueden usarse para minimizar la diferencia en absorción de insulina con el paso del tiempo de la' infusión de insulina en un sujeto.

En cualquiera de los métodos en la presente, si la infusión subcutánea continua se interrumpe o - detiene, por ejemplo debido al cierre de una .bomba debido la falla de la bomba, oclusión del catéter o error del usuario, la acción de la insulina . puede detenerse más rápido que cuando una insulina actúa más. lento. Esto puede acelerar el tiempo de la hiperglicemia y eventualmente la cetoacidosis diabética. Por lo tanto, en cualquiera de los métodos, proporcionados en la presente es una etapa opcional, como sea · necesario, administrar una insulina de acción .prolongada (a . k . a . basal ) en un intervalo apropiado. Típicamente, la insulina de acción prolongada debe ser una con una duración de acción de al menos alrededor de- 12 horas. . Las insulinas de acción prolongada ejemplares conocidas en la técnica incluyen, pero no se limitan a, Levemir, detemir, insulina NPH o degludec. La insulina de acción prolongada puede administrarse desde alrededor de entre hasta alrededor de 5% hasta 50% de. la dosis.de insulina diaria total para los. acientes, tales- como alrededor de 1/3 o 33% de las dosis de insulina diaria¦ total de los pacientes. La insulina basal. puede suministrarse en un intervalo apropiado, tal como al menos una vez por el equipo de infusión dependiendo ¦ de la duración de acción de la insulina particular y preferencia del paciente. Por ejemplo, la insulina basal puede suministrarse al. menos una vez o dos veces por semana o al menos una vez o dos veces por día. 1. Métodos del régimen de dosificación a. Tecnología de punta En un ejemplo,, los métodos proporcionados en 'la presente incluyen administrar a enzima que degrada a hia.luronano, tal como una hialuronidasa por ejemplo a ??2?, a un. sujeto antes del inicio de CSII de una insulina de acción rápida. El hialuronano en el espacio intersticial sirve como una barrera para el flujo de fluido en volumen, por ello se contabiliza para la tasa más baja de acción de la exposición, a insulina al comienzo de la infusión. Esta barrera para el. flujo de fluido en volumen, no puede existir, o está compensada por otros factores, en. tiempos de infusión posteriores. Por lo tanto, como se muestra en la presente, durante el curso del equipo de infusión existe una acción acelerada de ^insulina posterior en la vida del equipo de infusión comparada con veces previas de infusión, de manera que la acción de insulina posterior en la vida del equipo de infusión exhibe una respuesta de insulina de acción súper rápida. Durante la vida útil del equipo de. infusión, esto hace la acción y absorción de insulina variable e inconsistente. En los métodos proporcionados en la presente, las diferencias en la exposición y/o acción, de insulina, con el paso del tiempo puede minimizarse , al administrar una enzima que degrada a hialuronano en o cerca del inicio del uso establecido de infusión, seguido ' por CSII con insulina sola o una composición de acción súper-rápida de insulina-PH20. Por ejemplo, la enzima que degrada a hialuronano se administra por un tratamiento de . tecnología de punta. En los últimós tiempos durante. el curso del uso establecido de infusión, el cuerpo naturalmente restaura la barrera de hialuronano para el flujo de fluido en volumen a fin de reducir la diferencia en la aceleración de insulina ya el equipo de infusión envejece. Esto reduce o minimiza la variabilidad en la exposición y acción de insulina que ocurre en un. paciente durante el curso de la terapia CSII..

En el método, ¦ una composición que contiene una enzima que degrada a hialuronano se administra a un sujeto en una cantidad terapéuticamente efectiva .suficiente para catalizar la hidrólisis . de ácido hialurónico para incrementar la permeabilidad del tejido. La cantidad de enzima que degrada a hialuronano es una cantidad que efectúa una respuesta de insulina ultra-rápida al comienzo de la : vida de infusión. Después de la administración de la enzima que degrada a hialuronano, una insulina de acción rápida se suministra al sujeto usando CSII. Con la práctica. del método de infusión de insulina subcutánea continua, la diferencia en absorción de insulina se minimiza o reduce durante el curso de lá vida del equipo de infusión. Por lo tanto, también proporcionados n la presente son usos, procesos o composiciones que contienen una enzima que degrada a hialuronano para, uso para minimizar la diferencia en absorción de insulina que ocurre durante un curso de infusión de' insulina subcutánea continua (CSII).

El régimen de dosificación y cantidad particular -de insulina, incluyendo tasa basal y dosis en bolo, que se suministra por terapia de CSII está, de acuerdo con un protocolo especifico del paciente que es dependiente de las características particulares y necesidades del paciente. La terapia de CSII es bien, conocida para alguien de experiencia en la técnica (Bolánd et al. (1999)- Diabetes Care, 22: .1779-1784). Está bien dentro de la experiencia de un métido experimentado para tratar un paciente usando CSII de acuerdo con protocolos y recomendaciones conocidas y existentes. Dependiendo . del . protocolo particular y dispositivo, de infusión continuo que' se usa, la terapia de CSII puede efectuarse por infusión de insulina, generalmente · '.por medió de una bomba, tal como una bomba de circuito abierto o circuito cerrado. Típicamente, el CSII se., realiza durante un intervalo predeterminado que limita la vida del equipo de infusión, o desempeño del dispositivo de infusión continúo que se está usando. Para bombas de insulina que. contienen un equipo de infusión que contiene un sistema de tubería y dispositivo de inserción tal como una cánula, el intervalo es generalmente únicamente varios días, tales como cada . 2-4 días. Por ejemplo,, el e'quipo de infusión se reemplaza cada 2-4 días. En un ejemplo, el equipo de infusión se reemplaza dos veces semanalmente .

En tales métodos, cualquier enzima que degrada a hialuronáno, tal como cualquiera descrita, en la Sección. E a continuación, puede , usarse. En los ejemplos en. la presente, la cantidad de enzima que degrada, a. hialuronáno .que se administra para catalizar' la hidrólisis de ácido hialurónico para incrementar la permeabilidad, del tejido puede determinarse empíricamente. La actividad de- una enzima degradadora de hialuronáno se puede evaluar usando métodos bien conocidos en el campo. Por ejemplo, el ensayo USP XXII para la hialuronidasa determina la actividad indirectamente al medir la. cantidad de ácido hialurónico no. degradado, y sustrato de hialuronáno (HA) que permanece después de que enzima se deja reaccionar con él HA durante. 30 minutos a 37° C (USP XXII-NF XVII (1990) 644-645 United States. Pharmacopeia Convention, Inc, Rockvillé, MD) . Un Estándar de Referencia de Hialuronidasa (USP) . o Solución de Hialuronidasa Estándar de National Formulary (NF) se puede usar en un ensayo para evaluar la actividad, . en unidades de cualquier hialuronidasa'. En un ejemplo, la actividad se mide usando un ensayo de micro turbiedad o un ensayo de microtitulación usando un ácido hialurónico biotinilado (ver por ejemplo Frost and Stern (1997) Anal. Biochem. 251:263-269, Publicación de Patente de E.U.A. No. 20050260186). Otros ensayos también se conocen (ver por ejemplo Delpech et ah, (1995) Anal. Biochem. 229:3.5-41; Ta.kahashi et al., (2003) Anal. Biochem. 322:257-263). La capacidad de enzima que degrada a hialuronano para actuar como un agente de exestrés o difusión para por ello incrementar la permeabilidad también puede evaluarse'. Por ejemplo, pigmento de azul tripano puede inyectarse subcutáneamente con o sin una enzima que degrada a hialuronano en la: piel lateral en cada lado de ratones sin pelo. El área del pigmento luego se mide, tal como con un microcalibrador, para determinar la capacidad de la enzima que degrada a hialuronano para actuar como un agente de exestrés (Pub. de Patente de E.U.A. No. 20060104968) . Pueden realizarse experimentos .similares en otros sujetos.

Típicamente, la enzima que degrada, a hialuronano se administra en una cantidad que es equivalente funcionalmente a entre o alrededor de entre 0.5 Unidades hasta 500 Unidades, , 1 Unidad hasta 200 Unidades, 5 Unidades hasta 150 Unidades, 10 Unidades . hasta. 150 Unidades, . 50 ; Unidades hasta 150 Unidades o 1 Unidad hasta 50 Unidades. Por ejemplo, la enzima que degrada a hialuronano se administra en una cantidad, que es al menos 1 Unidad, 5 Unidades, 10 Unidades, 50 Unidades, 100 Unidades, 150 Unidades, 200 Unidades, 300 Unidades, 400 Unidades, 500 Unidades o más. En otros ejemplos, la enzima que degrada a hialuronano se administra en una cantidad que está entre o alrededor de .entre 1 ng hasta 10 ]ig, 8 ng hasta 2 pg, 20 ng hasta 1.6 pg, 80 ng hasta 1.25 g o 200 ng hasta 1 yg. Por ejemplo,, la enzima que degrada a hialuronano se administra en una cantidad que es al menos 1 ng, 8 ng, 80 ng, 1.0 yg 1.25 yg, 1.6 yg, 2 yg, 3 yg, 4 yg, 5 yg, 6 yg, 7 yg, ,8 yg, 9 yg, 10 yg o más.. El volumen de la enzima que degrada a hialuronano que se administra es generalmente 0.1 mL hasta 50 mL, tal como 0.5 mL hasta 5 mL, generalmente entre .o alrededor de entre 0.5 mL hasta 2.0 mL tal como, al menos" o alrededor de o 0.20. mL,. 0.50 mL, 1.0 mL, 1.5 mL, 2.0 mL, 3.0 mL, 4.0 mL, .5.0 mL,. 6.0 mL, 7.0 mL, 8.0 mL, 9.0 ,mL, 10.0 mL o más, por ejemplo, al menos o alrededor de al menos o.1.0 mL.

En los métodos, en la presente, la enzima que degrada a hialuronano típicamente se administra inmediatamente antes del inicio de CSII. Generalmente, sin embargo, . sólo se administra una vez durante el intervalo dé. la vida del .equipo de infusión. De esta manera, en los métodos en' la presente, la enzima que degrada a hialuronano se administra una vez al inicio de CSII.. ; Típicamente, después del final de cada intervalo, el equipo de. infusión se 'reemplaza y las etapas de administrar una enzima; que degrada a hialuronano a un sujeto se repiten. Por ejemplo, la enzima que degrada a hialuronano puede administrarse secuencialmente, simultáneamente o intermitentemente, de la composición de insulina de acción rápida suministrada por CSII .durante el curso de los intervalos establecidos de infusión. ·.

En ejemplos particulares, en cada intervalo establecido de infusión, la enzima que degrada a hiáluronano se administra antes del inicio de la infusión en un régimen de dosificación destacado. Luego, después . de la administración de la enzima que degrada a hiáluronano, una insulina dé acción rápida se suministra al sujeto usando CSII. La enzima que degrada a hiáluronano puede administrarse entre o alrededor de entre o aproximadamente 10 segundos hasta 1 hora antes del inicio de la infusión, 30. segundos hasta 30 minutos antes del inicio de . l infusión, 1 minuto hasta 15 minutos antes del inicio de la infusión, 1 minuto hasta 12 horas antes del inicio de la. infusión, tal como 5 minutos hasta 6 horas antes del inicio de la infusión, 30 minutos hasta 30 horas antes del inicio de la infusión, o 1 hora antes del inicio de la infusión de una insulina de acción rápida por CSII. Típicamente, la enzima que degrada a hiáluronano se administra no más de 2 horas antes del inicio de la infusión de una insulina dé acción- rápida por CSII. En otras- palabras, la enzima que degrada a hiáluronano se administra dentro de 2 horas antes del inicio de la infusión de uña insulina de acción rápida. Por ejemplo, la enzima que degrada a hiáluronano se administra al menos 10 segundos, al menos 30 segundos, al menos ? minuto, al menos 2. minutos, al menos 3 minutos, al menos 5. minutos, al menos 10 minutos, al menos 20 minutos, al menos 30 minutos, al menos 40 minutos,- al menos 50 minutos, al menos 1 hora o al menos 2 horas antes de infusión de un análogo de insulina de acción rápida.

En otros ejemplos, en cada intervalo establecido de infusión, la enzima que. degrada a hialurónano se administra simultáneamente o casi simultáneamente con el inicio de CSII. Por ejemplo, la , enzima que degrada a hialurónano puede administrarse entre, o alrededor de entre 0 hasta 1 minutos antes del inicio de la infusión o entre o alrededor de entre 0 hasta 1 minuto después del inicio de la infusión.

Se entiende que .en algunos ejemplos, una enzima . que degrada a hialurónano, tal como una hialuronidasa por ejemplo un PH20, puede administrarse a un sujeto inmediatamente después del inicio de CSII de una insulina de acción rápida. En tales ejemplos, la · sincronización de la administración de la enzima que degrada a hialurónano es de tal manera qüe efectúa . suficientemente absorción de insulina incrementada pronta en la vida, del equipo de infusión, por ello disminuye la variabilidad que ocurre en pacientes que. experimentan terapia de CSII en ausencia de la administración de un hialurónano. degradado. De esta manera,. aunque- la administración de la enzima que degrada a hialurónano no precede la infusión de insulina,, la enzima que degrada a hialurónano todavía efectúa un efecto de tecnología de punta debido a. que es capaz de remover el ' hialuronano-- para- permitir la absorción incrementada de insulina pronta en la vida' del equipo de infusión.

De esta . manera., en ejemplos, adicionalés, . en cada intervalo establecido de infusión, la enzima que degrada a hialuronano puede administrarse después del inicio de la infusión. De esta manera, antes de la . administración de la enzima que degrada a. hialuronano, una insulina de acción rápida se suministra al sujeto usando CSII. La enzima que degrada a hialuronano puede administrarse entre o alrededor de entre 1 minuto hasta ' 12 horas después del inicio¦ de la infusión, tal como. entre entre. o alrededor de entre .5 minutos hasta 6 horas después del inicio de- la infusión, entre o alrededor de entre. 30 minutos hasta ' 3 horas después del inicio de la infusión, o entre o alrededor de. entre 1 hora hasta 2 horas después del inicio de la infusión. Típicamente, en tales ejemplos, la enzima que degrada a hialuronano se administra no más. de. 2 horas después ; del inicio de la infusión de una insulina de acción rápida por CSII.

La enzima que. degrada a hialuronano puede .administrarse por . cualquier ruta adecuada, tal como, por ejemplo, admiistración parenteral, incluyendo administración subcutánea, intramuscular, intraperitonéal , intravenosa, e intradérmica . La enzima que degrada, a hialuronano también puede administrarse, intravenosamente. Típicamente, la enzima que degrada a hialuronano se administra subcutáneamente. La enzima que degrada a hialuronano puede administrarse en o cerca del sitio de infusión de la insulina de acción rápida. En algunos ejemplos, la enzima que degrada a hialuronano se administra a travels del mismo sitio de inyección como el CSII de insulina de acción rápida. En otros, ejemplos, la enzima que degrada a hialuronano se administra en un sitio de inyección diferente, que el CSII' dé una insulina de acción rápida . .

Cualquier insulina de acción rápida, tal como cualquiera descrita en la Sección D a continuación., puede .usarse en los métodos en la presente para suministra por CSII. Típicamente, el depósito, contiene una composición de insulina de acción rápida que contiene una cantidad de una insulina, de acción rápida que está entre o alrededor de entre 10 U./mL hasta 1000 U/mL, 50 U/mL hasta- 500 U/mL, 100 U/mL hasta 250 U/mL, por ejemplo al menos o alrededor de al menos o 25 U/mL, 50 U/mL, 100 U/mL, 200 U/mL, 300 U/mL, 400 U/mL, 500 U/mL. o más, tal como al menos . o alrededor de al menos 100 U/mL. En' algún ejemplo, la cantidad de insulina en la composición está entre o alrededor de entre 0.35 mg/mL hasta 35 mg/mL, .0.7. mg/mL hstata 20 mg/mL, 1 mg/mL hasta 15 mg/mL, 5 mg/mL hasta 10 mg/mL, - tal como al menos o alrededor de al menos 0.5' mg/mL, 1 mg/mL, 1.5 mg/mL, 2.0 mg/mL, 3.0 mg/mL, 4.0 mg/mL, 5.0 mg/mL, 10.0 mg/mL, 15 mg/mL, 2.0 mg/mL, 30 mg/mL o. más. Generalmente, la insulina de acción rápida es un análogo de insulina de acción rápida (también nombrado análogo de acción . rápida) . En algunos., ejemplos,'-, la . insulina de acción rápida que se suministra por CSII es una composición de insul.ina.de acción súper rápida que contiene una insulina de acción: rápida o análogo de insulina de acción rápida y una enzima que degrada a hialuronano suficiente para hacer la composición de acción súper-rápida (publicado como Publicación de E.U.A. No.. US20090304665 ) . Las composiciones de insulina de acción súper rápida se describen en en la presente a . continuación en la Sección F. En ejemplos adicionales, las composiciones de insulina de acción súper rápida son composiciones estables que son estables durante al menos 3 días a 32°C hasta 40 °C como se describe además, a continuación y en' la solicitud provisional No. 61/520, 962.

Cualquier dispositivo de infusión continúo puede usarse en los métodos en la presnete para suministrar, una insulina de acción . rápida por CSII. Generalmente,, el dispositivo de infusión de insulina . continuo incluye una bomba de insulina, un depósito que contiene la insulina, de acción . rápida o composición de insulina de acción súper-rápida y un equipo de infusión para infusión subcutánea del dispositivo. El dispositivo puede ser' un dispositivo de circuito abierto o circuito, cerrado. Las bombas de insulina ejemplares y .otros dispositivos de . suministro de insulina para infusión de insulina continua . se describen en la Sección C.2 a continuación.

En un ejemplo ejemplar del método, un depósito de bomba nueva de un dispositivo de infusión continuo se rellena con una concentración . efectiva de una insulina de acción rápida, por ejemplo una composición de análogo de insulina de acción rápida. La. cantidad de insulina en la composición es generalmente alrededor' de o al menos o 100 U/mL. El paciente luego se inserta con un nuevo equipo de infusión, típicamente en un sitio abdominal. La cánula o aguja de inserción se fija con una almohadilla adhesiva. El equipo de infusión luego se une al depósito de bomba rellenado. El equipo de infusión luego se prepara con insulina. Antes de iniciar la infusión de insulina por medio de la bomba en el paciente, unos 1.0 mL de enzima que degrada a hialurpnano, tal como una hialuronidasa por ejemplo una composición de PH20 (por ejemplo rHuPH20) que' contiene enzima que está en una cantidad que es al menos o alrededor de o 100. U/mL, 150 U/mL, 200 U/mL, 300 U/mL, .400 U/mL, 500 U/mL o 600 U/mL ' se- inyecta én el paciente en . o cerca del sitio de. infusión. Por ejemplo, la enzima que degrada a hialuronano. se introduce por. medio de una jerina u otro dispositivo similar ó tubo típicamente que contiene una aguja para inyección. El otro dispositivo puede ser adaptador que es compatible para inserción a través de la cánula o sitio de infusión. Generalmente, la. enzima se administra en el mismo- sitio de inyección y por medio de la misma cánula como se usará para la infusión. La enzima que degrada a hialuronano se administra lentamente, generalmente no menos de 20 segundos hasta 30 segundos, para el paciente. Inmediatamente después: de la inyección de una enzima que degrada a hialuronano, el equipo de infusión .de enzima que degrada ¦ a hialuronano se remueve de la cánula u otro dispositivo de inserción similar y . se reemplaza con la bomba que contiene la insulina/equipo de infusión. La bomba luego se programa para suministrar una infusión principal fijada dependiendo del tamaño · de la cánula (por ejemplo 0.2U hasta 1.0 U dependiendo del tamaño de la cánula; por ejemplo, 0.4U para una cánula de 6 mm y 0.6 U para una cánula' dé 9 mm)' y luego una tasa de infusión basal programada especifica del paciente predeterminado de insulina se suministra continuamente. Por. lo tanto, en métodos ejemplares en la presente, la enzima que degrada a hialuronano se administra generalmente dentro de o aproximadamente de o alrededor de.5 segundos hasta 20 minutos, tal como .1 minuto hasta 15 minutos de infusión de insulina. b. Método para mejorar la acción de insulina total Se encuentra en la presente que cuando se administra una composición de insulina de acción súper-rápida en un régimen de dosificación CSII que existe una acción de insulina total disminuida durante la vida del equipo de infusión. Esta disminución en. la acción de insulina total con el paso del tiempo del equipo dé infusión es mayor en formulaciones de insulina de acción súper rápida que contienen una enzima que degrada a hialuronano que en formulaciones de acción rápida. La administración, de insulina sistemáticamente; incrementada con el paso del tiempo compensará la pérdida de¦ la acción de insulina y mejora el control de glucosa por tanto control de circuito abierto como circuito cerrado. Por lo tanto, los métodos son proporcionados en la presente por lo que la dosis basal o en bolo de insulina en una composición de insulina de acción súper-rápida se incrementa, sobre la vida de un equipo de infusión con objeto' de compensar la reducción observada en el efecto de insulina total apreciado con el paso del tiempo.

Proporcionado en la presente es un método de régimen de dosificación de infusión de insulina : . subcutánea continua (CSII) para controlar la glucosa .en la sangre que se proporciona para un perfil de insulina ultra-rápido más consistente durante el curso del equipo de- infusión. En tales ejemplos, CSII se realiza para suministrar una composición de insulina de acción súper-rápid'a a un paciente de acuerdo con una tasa basal programada y dosis en bolo de' insulina. La sección F describe/ las composiciones de insulina de acción súper-rápida . En algunos ejemplos, una co-formulación estable se emplea en el método. Cualquier dispositivo de suministro de insulina para infusión continua puede emplearse en el método, incluyendo un dispositivo que proporciona, un sistema de circuito abierto o circuito cerrado.. Lo ejemplar de tales dispositivos se describe en la Sección C.2 a continuación.

En el método, durante el curso del régimen de dosificación, la cantidad de insulina de acción, súper-rápid , basal y/o en bolo, que se administra se incrementa al menos 1% comparado con el régimen de dosificación programado normal para el paciente usando una composición de insulina de acción rápida que no contiene una enzima que degrada a hialuronano. En ejemplos particulares, la tasa basal y/o dosis en bolo de insulina se incrementa 1% .hasta 50%, 5% hasta 40%'., 10% hasta 20% o 5% hasta 15% comparado con el régimen de dosificación programado normal .para el paciente usando una composición de insulina de acción rápida que no . contiene una ' enzima que degrada a hialuronano. En la práctica del método, la acción de insulina total; se incrementa comparada con el régimen de dosificación que no incluye un incremento sistemático en suministro de insulina durante el curso del equipo de infusión. Por ejemplo, la acción de; insulina total como se mide por una infusión de glucosa acumulativa (U/kg) en . un experimento de pinzamiento euglicémico, puede incrementar por al menos o alrededor de o 1.1 veces,. 1.2 veces, 1.3 veces, 1.4 veces, 1.5 veces, 1.6 veces, 1.7 veces, 1.8 veces, 1,9 veces, 2.0 veces, 3.0 veces, 4.0 veces, 5.0 veces o más.

En algunos ejemplos, la insulina basal y/o insulina en bolo se incrementan al. menos una vez por día durante, el curso de la vida del equipo de infusión. La insulina en bolo que puede incrementarse incluye la dosis prandial para un. medio dado y/? bolo . de. corrección para unna corrección hiperglicémica ' dada. y bolo en board .quantity dé insulina. .

En ejemplos adicionales, antes de realizar. CSII con una insulina de acción: súper-rápida, una enzima que degrada a hialuronano se administra al paciente inmediatamente antes de o inmediatamente después del- inicio de la infusión del CSII como, se . describe en C.1.a de arriba. Las enzimas que degradan a hialuronano son bien conocidas para alguien de experiencia en la técnica, y se describen en la Sección E a continuación. Cualquiera de tales enzimas que degradan a hialuronano puede emeplearse en la práctica del método al. administrar inmediatamente antes de ó inmediatamente después del inicio de un CSII de una ..composición de insulina de acción súper-rápida en el método en la presente. 2. Bombas de insulina y otros dispositivos de administración de insulina .

El dispositivo de administración de insulina usado en los métodos en la presente incluyen una bomba de insulina u otro dispositivo de infusión continua similar. Los dispositivos de administració de insulina contienen típicamente por lo menos un depósito desechable que contiene una formulación de insulina, una bomba . (que incluye cualquiera de los controles, software, módulos dé procesamiento y/o. baterías) y urv conjunto , de infusión desechable, que incluye una cánula o aguja para la inyección subcutánea y un. tubo que conecta la cánula o aguja .al depósito de insulina. Para el uso en los métodos en la presente, el dispositivo de administración de insulina puede contener un depósito que contiene ya: sea una insulina de acción rápida o una co-formulación de insulina de acción súper rápida de insulina y una enzima degradadora . de hialuronano .

Las co-formulaciones de insulina o de acción súper rápida se pueden administrar continuamente y/o en inyecciones de bolo. Los usuarios ajustan la bomba para proporcionar una cantidad dé goteo constante o "basal" de formulación de insulina, continuamente por todo el día. .Las bombas también liberan dosis adicionales ("bolo") de formulación de insulina en las comidas y en los tiempos cuando el azúcar en la . sangre es demasiada alta basada en una entrada de usuario. La supervisión de la glucosa en la sangre frecuente es esencial para determinar las ; dosificaciones de insulina y para asegurar que la insulina se administré apropiadamente. Esto se puede lograr por supervisión manual, un monitor de glucosa separado contenido. Además, un usuario del dispositivo de administración de insulina tiene la capacidad de influir en el perfil de la .insulina al formar el bolo. Por. ejemplo, se puede administrar un bolo estándar, que es una infusión similar a una inyección discreta en que toda . la dosis se bombea inmediatamente. Un bolo prolongado es una infusión lenta a través del tiempo que evita una dosis inicial alta y prolonga la acción de la composición. Un bolo de combinación que contiene tanto, un bolo estándar y como un bolo prolongado también se puede administrar usando una. bomba de insulina, u otro sistema de administración continua.

Los dispositivos de administración de insulinas son conocidos en el campo y se describen en cualquier lugar, incluyendo, pero no limitado a,' en las Patentes, de E.U.A. Nos. 6, 554, 79.8, 6, 641, 533, 6, 744 , 350 , 6, 852 , 104 , 6, 872,200, 6, 936, 029,. 6, 979, 326., 6, 999, 854, .7, 025, 713 y 7, 109, 878. Los dispositivos de administración de insulina también se conectan a un monitor : o sensor de glucosa, por ejemplo, un sistema de circuito cerrado y/o puede contener. un medio para calcular la dosis de insulina recomendada con base en los niveles de glucosa en la sangre, contenidos, de carbohidratos de una comida, u otra entrada. Los dispositivos de administración de insulina adicionales pueden . ser implementables o pueden ser externos al sujeto. El uso. de bombas de infusión de insulina externas requiere una selección cuidadosa de individuos, supervisión meticulosa, . y educación completa y seguimiento permanente a largo plazo. Este cuidado se proporciona generalmente por un equipo multidisciplinario de profesionales de la salud . con pericia y experiencia especifica en el manejo. de; individuos en el tratamiento de bomba de insulina. a. Sistemas de Circuito Abierto Los sistemas, de circuito abierto se pueden ' usar con las co-formulaciones . proporcionadas en la presente. Los sistemas de circuito, abierto contienen típicamente por lo menos un depósito desechable que contiene una formulación de insulina, una bomba. (incluyendo cualquiera de controles, software, módulos de procesamiento y/o baterías) y un conjunto de infusión desechable, que incluye una cánula . o aguja para^ inyección subcutánea y un tubo que conecta la cánula o. aguja al depósito de insulina. El sistema de circuito abierto infunde en dosis pequeñas (básales) cada cinco minutos, y dosis grandes (bolo) que el paciente ajusta , manualmente. Pero, un sistema de circuito abierto no contiene un . monitor .o sensor de glucosa y por lo tanto no puede responder a los cambios en los niveles de glucosa en suero del paciente.. Varios métodos y. dispositivos usados para medir los niveles de glucosa en la sangre son conocidos, pór una persona de experiencia en el campo. La técnica convencional usada por muchos diabéticos para supervisar personalmente sus niveles de glucosa en la sangre incluye la extracción periódica de sangre, la aplicación de la sangre a una tira de prueba, y · la determinación del nivel de glucosa en la sangre, usando detección calorimétrica, electroquímica o fotométrica. Se han desarrollado una variedad de dispositivos para supervisión continua .o automática de analitos, tales como, glucosa, en el torrente sanguíneo o. fluido intersticial. Algunos de estos dispositivos usan sensores ¦ electroquímicos que se implantan directamente en un vaso sanguíneo o en tejido subcutáneo de un paciente. Los métodos y dispositivos ejemplares para., supervisar los niveles de glucosa incluyen, pero no .se limitan a,- aquellos des.critós en las Patentes de E.U.A. Nos . .5 , 001 , 054 , 5 , 009 , 230 , 5, 713 , 353 , ¦ 6,560, 417 , 6,574 , 490,. 6, 892, 085, 6, 958, 809, 7, 29.9, 081, 7,774,145, 7,826,879, 7,857,760 y ,7,885,699, que se incorporan en la presente a manera de referencia.

Los sistemas de administración de insulina, tales . como bombas de insulina, son , conocidos en el campo y se pueden usar en los sistemas de circuito abierto. Los dispositivos de administración de insulina de circuito abierto ejemplares (tales como aquellos descritos en lo anterior) incluyen, pero no se limitan a, aquellos^ descritos en las' Patentes de E . U A. Nos. 4, 562, 751, 4, 678, 438, 4, 685, 903,. ,4, 373, 527, 4, 573, 994, ¦6,554, 798, 6,64.1, 533,. 6, 744 , 350 , 6,852 , 10 , d, 872, 200, 6,936, 029, . 6, 979, 326, 6, 999, 854, 7, 109, 878, . 7, 938,797 .y 7,959,598, que. se incorporan a manera de referencia en la presente. Estos sistemas similares, identificables fácilmente por una persona experta en el campo, se pueden usar para administrar las eo-formulaciones proporcionadas en la ¦ presente. Los ' dispositivos de administración, de' insulina contienen típicamente uno o más depósitos, que generalmente son desechables, que contienen una preparación.' de insulina, tal como una co-formulación de una insulina de . acción rápida y enzima degradadora de hialuronano descrita en la presente'. En algunos, ejemplos, las co-formulaciones se administran usando ' un tubo de infusión y una cánula y aguja. En otros ejemplos, el dispositivo de infusión se une directamente a la piel y las co-formulaciones fluyen del dispositivo de infusión, a través; de una cánula o. aguja directamente en el cuerpo sin el uso de un tubo. En ejemplos adicionales, el dispositivo de infusión está interno al cuerpo y se puede usar un tubo de infusión opcionaimente para administrar las co-formulaciones . · . ' .- ' . b . Sistemas de Circuito Cerrado Los sistemas de circuito cerrado, algunas veces referidos como un páncreas artificial son de interés particular con para el uso con las co-formulaciones proporcionadas en: la presente. Los sistemas de circuitos cerrados se refieren a sistemas con un monitor de glucosa continuo integrado, una bomba de insulina u otro sistema de administración .. controlador que incluye un algoritmo matemático que calcula constantemente la infusión dé insulina requerida para el control . glicémico basado en las- mediciones del tiempo real de los niveles de glucosa en la sangre. Estos sistemas, cuando se optimizan, pueden facilitar el control glicémico constante y muy estrecho, similar a la respuesta de insulina natural ,y el control glicémico observado en. los sujetos no diabéticos sanos. Para ser efectivos, sin embargo, los sistemas de circuito cerrado requieren tanto supervisión de glucosa continua confiable y precisa, y la administración de una insulina con una acción muy rápida. Por ejemplo, los retrasos en la . absorción de insulina y la acción asociada con la administración subcutánea de las insulinas de acción rápida se pueden conducir a excursiones glicémicas pos- prandiales grandes (Hovorka y colaboradores (2006) Diabetic Med. 23:1-12). El retraso debido a la absorción de insulina, la. acción de. la insulina, cinética de glucosa intersticial, y tiempo de transporte para los sistemas de .supervisión basados en ex vivo, tales como aquellos basados en la técnica de micro diálisis, pueden dar por resultado un lapso de .. tiempo de 100 minutos o más total del tiempo de la administración de insulina al pico de. su efecto reductor . de glucosa detectabie (Hovorka y colaboradores (2006) Diabetic Med.. 23 : 1-12 ) . De esta manera, una vez administrada, la. insulina continuará incrementando su efecto medible por casi 2 horas. Esto puede complicar la reducción efectiva de . la concentración de glucosa después de la ingestión de la comida usando un ' sistema de circuito cerrado. Primero, tiene que ser detectado un incremento de glucosa. Sin' embargo, esto sucede típicamente solo después de un lapso de 10-40 minutos aproximados. El sistema débe determinar que se ha digerido la comida - y administrar . una dosis de . insulina apropiada. La capacidad del sistema . para compensarse secuencialmente una dosis de insulina, "mal calculada" ' es comprometida por retrasos largos y. la incapacidad de "extraer" la insulina una vez administrada. Estos problemas , por lo menos en parte, se pueden superar al usar las co-formulaciones de una insulina de acción rápida y la enzima degradadora de hialuronano, tales como aquellas proporcionadas en la', presente, que pueden mostrar una velocidad y nivel incrementado de absorción y una mejora asociada en' la farmacodinámica (véase por ejemplo Publicación de E.U.A. No US2009030 665 y Publicación PCT No. WO2009134380) . Las co-formulaciones de la insulina de acción rápida y una enzima degradadora de hialuronano tienen una tmax reducida (es decir logran una concentración máxima más rápida) que las . insulinas de acción rápida sola y que. están controlando los niveles de glucosa- en lá. sangre más rápido que las insulinas de 'acción rápidas solas. Esta velocidad incrementada de absorbancia e inicio de acción reduce el lapso entre lá acción de la insulina y la supervisión de la glucosa y la entrada, dando por resultado un sistema de circuito cerrado más efectivo que pueda controlar estrechamente los niveles de glucosa en la sangre, reduciendo las excursiones glicémicas.

Los sistemas de circuito cerrado son bien, conocidos en el campo y se han descrito en cualguier lugar, incluyendo, pero no limitado a, Patentes de E.U.A. Nos. 5,279,54.3, 5,569, 186, ¦ 6, 558, 351, ' 6,558,345, 6, 589,229, 6, 669, 663, 6,740,072, 7,267,665, 7,354,420 y 7,850,674, que se incorporan a manera de referencia en la presente. Estos sistemas similares, identificables fácilmente por una. persona de experiencia en el campo, se pueden usar para administrar las co-formulaciones proporcionadas en : la presenté. Los sistemas de circuito cerrado incluyen un sistema sensor para medir los niveles de glucosa en la sangre, un ·¦ control-ador.'.; y un sistema de administración. Este sistema¦. integrado' se diseña para un modelo de células beta, pancreáticas (célula ß), tal que . controla un dispositivo de infusión para administrar, la insulina en un sujeto en un perfil de concentración similar como seria creado por las células ß humanas totalmente en función cuando responden, a cambios en las concentraciones de . glucosa en la sangre en el cuerpo. De esta manera, el sistema simula la.¦ respuesta - de insulina natural del cuerpo a los niveles de. glucosa en la sangre y no solo hacen eficiente el uso de la insulina, sino también toma en cuenta otras funciones corporales también puesto que la insulina tiene efectos tanto metabólicos como mitogénicos. Además, el control glicémico logrado usando un sistema de circuito cerrado se logra sin requeri ninguna información acerca del tamaño y tiempo de. una comida u otros factores. El sistema puede depender solamente en las .mediciones de¦ glucosa en la sangre en tiempo real. El sensor de' glucosa genera una señal del sensor . representativa de los niveles de glucosa en la sangre en el cuerpo, y proporciona la señal del sensor al controlador. El controlador recibe la señal del sensor y genera comandos que se comunican al sistema de administración de insulina.' El sistema de administración, de insulina recibe los comandos, e infunde la insulina en el cuerpo en respuesta a los comandos.

Se proporcionan a continuación descripciones de los componentes ejemplares, de los sistemas, de circuito cerrado que se pueden usar para administrar las co-formulaciones · de la insulina de acción rápida y. una enzima degradadora de hialuronano proporcionada en la presente. Se entiende que uno de experiencia en el campo puede identificar fácilmente sistemas de circuito cerrado para las co-formulaciones . Estos sistemas se han descrito en la técnica, incluyendo, pero no limitado a, aquellos descritos en la. Patente de E.U.A. Nos. 5, 279, 543, 5,569, 186,· 6, 558, 351, . 6, 558, 345, 6, 589, 229, 6,669,663, 6,740,072, 7,267,665 y 7,354,420. Los componentes individuales de los sistemas también se han descrito en el campo, individualmente y en el contexto de ún sistema de circuito cerrado para el uso . en el logro¦ del . control glicémico. Se entiende que los ejemplos proporcionados en la presente son ejemplares solamente, y que otros sistemas de circuito cerrado o componentes individuales se pueden usar para administrar las co-formulac'io'nes proporcionadas en. el presente .

Los sistemas de circuito cerrado contiene un sensor .o monitor de glucosa que funciona continuamente. Estos dispositivos pueden contener, sensores de tipo aguja que se insertan bajo la piel y se unen a un transmisor pequeño que comunica los datos de glucosa inalámbricamente por telemetría de radio frecuencia a un receptor pequeño. En algunos ejemplos, el sensor se inserta a través de la piel del sujeto usando, una aguja de inserción que se remueve y se elimina una vez, que el sensor se. coloca en. el tejido subcutáneo.. La aguja de; inserción tiene una punta aguda y una ranura abierta para contener el sensor durante la inserción en la piel (véase por ejemplo Patente de E.U.A. Nos. 5,586,553 y 5,954,643). El sensor usado en el sistema de. circuito cerrado puede contener opcionalmente . tres . electrodos que se exponen al fluido intersticial (ISF) en el tejido, subcutáneo. Los . tres electrodos incluyen un electrodo de trabajo, un electrodo de referencia y contra electrodo que se. usan para formar un circuito. Cuando se suministra un voltaje apropiado a través del electrodo de trabajo y el electrodo de referencia, el ISF proporciona impedancia entre los electrodos. 'Una señal de corriente análoga ;fluye desde el electrodo de trabajo , a través del cuerpo y al contra electrodo. El voltaje . en é;l electrodo de trabajo se mantiene generalmente a tierra, y el voltaje en el electrodo de referencia se mantiene en un voltaje predeterminado Vset, tal como,, por ejemplo entre 300 y 700 mV. La reacción más prominente estimulada' por la diferencia de voltaje entre los electrodos" es la reducción de glucosa ya que el primero reacciona con la enzima glucosa oxidase (GOX) para generar el ácido glucónico y peróxido de hidrogeno (H202) . Luego el H202 sé reduce a agua (H20) y (0T) en la superficie del electrodo de trabajo. El. O"- extrae una carga positiva de - los componentes eléctricos del sensor, repeliendo de esta manera un electrón y provocando un flujo de corriente, eléctrica. Esto da por resultado la señal de corriente análoga que es proporcional . a la concentración de glucosa en el ISF que está en contacto con los electrodos del sensor (véase por ejemplo Patente de E.U.A. No . 7 , 354 , 420 ) .

En algunos ejemplos, más de un sensor se usa para medir la glucosa en la sangre. Por ejemplo, se pueden usar sensores redundantes y al sujeto se le ' puede notificar cuando un sensor falla por . la electrónica del transmisor de monitor característica de telemetría. Un indicador también puede indicar, al sujeto de cuál de los. sensores aún está funcionando y/o el número de sensores que aún están funcionando. En otros .ejemplos, las señales del sensor se combinan a través de. pre-promedio u otros medios. .Además, se pueden usar diferentes tipos de sensores.. Por. ejemplo, un sensor de glucosa interior y un sensor de glucosa externo se pueden usar para medir la glucosa en la sangre al mismo tiempo .

Los sensores de glucosa que se pueden usar en un sistema de circuito cerrado . son bien conocidos y se pueden identificar fácilmente y/o opcionalmente , modificar adicionalmente, . por una persona de experiencia' en el campo. Los sensores, de glucosa internos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en las Patentes de E.U.Á. Nos. 5,497, 772, 5, 660,163, 5, 791, 344, 5, 569, 186, 6,895,265 ' y 7,949,382. Ejemplar de un sensor de glucosa que usa fluorescencia es aquel ' descrito en la de E.U.A. No. 6,011,984. Los sistemas del sensor de glucosa también pueden usar otras tecnologías de detección, incluyendo/haces, de luz, ¦conductividad, muestreo por chorro, micro diálisis., microporación, muestreo ultra sónico, iontoforesis inversa, . u otro método (por ejemplo Patentes de E.U.Á. Nos. 5,433,197 y 5,945,676, y Publicación de Patente Internacional WO 199929230) ,. En algunos . e emplos , solo el electrodo de trabajo se sitúa en el tejido subcutáneo y en contacto con el ISF, . y los contra-electrodos y los electrodos de referencia se localizan externos al cuerpo y en contacto con la. piel. .El contra-electrodo y el electrodo de referencia se pueden situar sobre la superficie de un alojamiento del monitor y se puede mantener a la piel como parte de. un monitor característico de. telemetría. En ejemplos adicionales, el contra-electrodo y el electrodo de referencia se mantienen en la piel usando, otros dispositivos, tal como corriendo un alambr a los .electrodos y adhiriendo los electrodos a la piel, incorporando los electrodos en la parte inferior de un reloj que toca la piel. Además, más de un trabajo se puede colocar el tejido subcutáneo para redundancia. El fluido intersticial también se puede recolectar del cuerpo de un sujeto y hacer fluir sobre un sensor externo que no se implanta en el. cuerpo. .

El controlador recibe la entrada del sensor de glucosa. El controlador se diseña para modelar una célula beta pancreática (célula ß) y proporciona comandos a dispositivos de administración de 'insulina para infundir la cantidad requerida de insulina para el control glicémico. El controlador usa software con algoritmos para calcular la cantidad requerida.de insulina con base en los niveles de glucosa detectados por el sensor de glucosa. Los algoritmos ejemplares incluyen aquellos que modelan las ¦ células ß estrechamente, puesto que los algoritmos que se diseñan para minimizar las . excursiones de glucosa en el. cuerpo, sin considerar que tanta insulina se administra, pueden provocar ganancia de peso excesivo, hipere.strés, . y arterosclerosis . Típicamente, el sistema se propone para emular el patrón de insulina in vivo y para a ustar un patrón consistente con la adaptación de células- ß in vivo experimentadas por los individuos sanos normales. Los algoritmos de control para los sistemas de circuitos cerrado incluyen aquellos usados por un controlador de. derivado integral proporcional (PID) . Los controladores derivados proporcionales y los algoritmos de control predictivo .de modelo (MPC) también se pueden usar en algunos sistemas (Hovorka y colaboradores (2006) Diabetic Med. .23:1-12) . Los algoritmos' ejemplares incluyen, pero no se limitan a, a aquellos descritos .por Hovorka y colaboradores {Diabetic Med. (2006) 23: 1-12), S imoda y colaboradores, (Front Med . Biol Eng (1997) 8:. 197-211),. Shichiri y colaboradores (Artif. Organs (1998) 22:32-42), . Steil -y colaboradores, {Diabetes. Technol Ther (2003) 5: 953- 964), Kaletz y colaboradores, (Acta Diab&tol. (1999) .36:215) y las Patentes de E.U.A. Nos. 5,279,543, 5,569,186, 6,558,351, 6, 558, 345, 6, 589, 229, 6, 740 , 042 , 6, 669 , 663 , 6, 740, 07.2, 7,267,665 y 7,354,420 y la Publicación de Patente de E.U.A. No. 2.0070243567. .

En un ejemplo, un . controlador PID se usa en el sistema de circuito cerrado. Un controlador PID ajusta continuamente la infusión de insulina al evaluar las excursiones de glucosa desde tres, puntos de vista a: la salida de la glucosa objetivo (el componente proporcional), el área bajo la curva entre la glucosa .ambiental y objetivo (el componente integral), y el cambio . en la glucosa ambiental (el componente derivado). Generalmente, la respuesta de células ß in vivo a los cambios en la glucosa se caracteriza por las respuestas de insulina de "primera"' y "segunda" fase. La^ respuesta de insulina bifásica de. una célula ß se puede modelar usando los componentes de un controlador proporcional, más , integral , más derivado (PID) {véase por ejemplo Patente de E.U.A. No. 7, 354, 420) El controlador genera comandos para la administración de insulina deseada.. Los sistemas de administración de insulina, tales como, bombas de insulina, son conocidos en el campo y se pueden usar en los sistemas de circuito cerrado. Los dispositivos de administración de insulina ejemplares .·¦; (tales como aquellos descritos en lo anterior) incluyén, pero no .se limitan a, aquellos descritos en las Patentes de E.U.A. Nos. ' 4 562, 751, 4, 678, 408,. 4, 685, 903, 4, 373, 527,,. 4, 573, 994, 6,554,798, 6,641, 533, 6, 744 , 350 , . ¦ / 6, 852 , 104', 6,872,200, 6, 936, 029, . 6, 979, 326, 6, 999, 854, y 7, 109, 878.. Los dispositivos de administración de insulina contienen típicamente uno o más depósitos, que generalmente son desechables, que contienen una preparación de insulina,' tal como una co-formulación de una insulina de acción rápida y enzima degradadora de hialuronano descrita en la presente. En algunos ejemplos, las co-formulaciones se. administran usando un tubo de infusión o una cánula o aguja. En otros . ej emplos , el dispositivo de infusión se une directamente a la piel y las co-formulaciones fluyen del dispositivo de infusión, .a través de una cánula o aguja directamente en el cuerpo sin el uso de un tubo. En ejemplos adicionales, el dispositivo de infusión, está interno al cuerpo y. el tubo de infusión se puede usar opcionaimente para administrar las ·. co-formulaciones . Los sistemas de circuito cerrado también pueden contener componentes adicionales, incluyendo, pero no limitado a, filtros,- calibradores y transmisores. c. Dispositivos ejemplares La tecnología de. bomba de insulina externa incluye bombas alimentadas por batería sencilla así como bombas capaces de conectividad inalámbrica para separar partes del dispositivo de bomba o para otros tipos de . dispositivos .

Tal bomba,. el ' Insulet OmniPod®, involucra dos dispositivos separados con conexión de radiofrecuencia inalámbrica. La primera parte de este dispositivo, referido como "Pod", es una unidad auto-adhesiva desechable que incorpora un depósito de insulina, una bomba de insulina controlada por microcomputadora, . y un dispositivo ¦ de canulación. La porción "Pod" del dispositivo se rellena con insulina por el individuo y luego se adhiere a la piel con una inserción de cánula automática. La "Pod" se usa durante hasta 72 horas . y luego se reemplaza. La.. segunda porción del dispositivo, referido como el "PDM", o. "Administrador de Diabetes Personal", es una unidad de control portátil que se comunica inalámbricamente con el "Pod" para controlar la tasa basal y administración, de insulina en bolo. Este PDM también contiene un monitor de glucosa en la sangre (sin un monitor intesticial continúo) que se integra en el sistema de control del Pod, permitiendo a los individuos usar estos datos en cálculos de dosificación. El PDM incorpora un metro de glucosa en la sangre FreeStyle™ que trabaja similarmente para un monitor de glucosa en la sangre independiente, requiriendo el método, de pinchazo en el dedo tradicional de la adquisición de la muestra de sangre . Una vez que el "Pod" se activa y programa, no es necesario, para . el ..PDM para permanecer con el . individuo hasta que se usa de nuevo para verificar los niveles de la glucosa en la sangre, dosificaciones en bolo dadas b ajusfar la tasa de infusión basal .

Otro tipo de dispositivo de bomba . de ¦ insulina inalámbrica involucra la conexión entre una bomba de insulina externa y un sensor/transmisor de. glucosa continuo'. Tal dispositivo es el.; Medtronic MiniMed Paradigm REAL-Time System, que incorpora la bomba de insulina del modelo de paradigma MiniMed (modelos 522, 722 y nuevos) con' el sensor de glucosa continuo MiniMed y Transmisor MiniLink (TM). REAL-Time. Con este sistema, el sensor-transmisor de glucosa continuo transmite inalámbricamente los datos de concentración de glucosa intersticial (288 lecturas en un periodo de 24 horas) para la unidad de bomba, que .se exhibe en "tiempo real". Sin embargo, los . datos transmitidos por medio de la alimentación inalámbrica no pueden usarse de forma homogénea para los cálculos de ¦ dosificación. Tales cálculos requieren las mediciones de glucosa en la sangre. Un dispositivo de sensor/transmisor de. glucosa también puede integrarse inalámbricamente con un receptor/monitor de glucosa continuo gastado externamente (por ejemplo, Sistema de . Monitoreo. de Glucosa Continuo en Tiempo Real Guardian®) .

D. POLIPEPTIDOS DE INSULINA Los métodos CSII proporcionados en la presente usan una formulación de insulina de acción rápida o una insulina de acción rápida y combinación de PH20 o co-formulación, (esto es una composición de insulina de acción súper-rápida como se describe en la Sección F) . Las insulinas de acción rápida incluyen una insulina regular o un análogo de . insulina (por ejemplo nombrado un análogo de acción veloz o un análogo de acción rápida, usado intercambiablemente en la presente) que se modifica (por ejemplo por' el reemplazo de aminoácidos) para reducir la auto-asociación de insulina y resulta en disociación más rápida. de hexámeros.

La insulina es un polipéptido compuesto de 51 residuos de aminoácidos que es de 580'8 Dalton.s en peso molecular. Se produce en los islotes de Langerhans de . célula beta en él páncreas. Una insulina ejemplar humana se traduce como un polipéptido precursor de 110 aminoácidos, pre-proinsulina (SEQ ID NO: 101)·, que contiene un péptido señal de 24 aminoácidos a ER, la secuencia señal de escinde, dando por resultado de proinsulina (SÉQ ID NO: 102).. La , molécula proinsulina se convierte subsecuentemente en una .insulina madura por las acciones de las enzimas proteoliticas , conocidas como pro-hormonas convertasas (PCI y PC2) y por las acciones de la exoproteasa carboxipeptidasa E. esto da por resultado la remoción de 4 residuos de aminoácidos básicos y C-péptido de 31 aminoácidos restante o que conecta la . cadena (que corresponde, a los residuos de aminoácidos 57 a 87 del polipéptido de pre-proinsulina expuesta en SEQ ID NO: 101) . La insulina, resultante contiene . una cadena A de 21 aminoácidos (que. corresponde a los residuos de aminoácido 66 a 86 del polipéptido pro-insulina expuesta en SEQ ID NO: 102) y una cadena B de 30 aminoácidos' (que corresponde a los residuos de aminoácido 1 a 30 del polipéptido de pro-insulina expuesto en SEQ ID NO:' 102), que se retícula por las ligaciones de disulfuro. Típicamente, la insulina madura contiene tres puentes de disulfuro: uno entre ,1a posición 7 de la cadena A y la posición 7 de la cadena B, un segundo entre la posición 20 de la cadena A y ..la posición 19 de la cadena B, y un tercero entre las posiciones 6 y 11 de la cadena A. La secuencia de la cadena A de una insulina' madura se expone en SEQ ID NO: 10 y la secuencia de la cadena B se expone en SEQ ID NO: 104.

La referencia, a la insulina incluye pre-proinsulina, proinsulina y polipéptidos de insulina en formas de cadena individual ó de dos cadenas, formas truncadas de las mismas que tienen actividad,, e incluye, variantes a'lélicas y de especies, variantes codificadas por 'variantes de empalme y otras variantes, tales como análogo de insulina u otras formas derivadas, incluyendo, polipéptidos que tienen por lo menos 40%, 45%, 50%,· 55%, 60%, 65%, 70%., 75%, 80%, .85%, 90%, 95%, 96%, . 97%, 98%, 99% o más de. identidad de secuencia polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 101 o la forma madura del mismo,, siempre y cuando la insulina se ligue al receptor de insulina humana para iniciar una cascada de señalización que da . por resultado un incremento de la captación y de almacenamiento de glucosa y/o una disminución de la producción ,de glucosa endógena. Por . , ej emplo, las insulinas incluyen variantes de especies de insulina. Estas incluyen pero no sé limitan a, insulinas derivadas .de bovino (expuesta en SEQ ID NO: 133) y porcina : (SEQ ID NO: 123). La insulina bovina, difiere de la insulina humana en. los aminoácidos 8 y 10 de la cadena A, y el aminoácido 30 de la cadena B. La insulina porcina difiere solamente de la insulina humana en. el aminoácido 30 en la cadena¦ B donde, similar a la secuencia bovina existe una sustitución de alanina en lugar de . treonina. Otras, variantes de especies ejemplares de insulina, se exponen en cualquiera de .SEQ ID NOS: 105-146.

También se incluyen entre las variantes de insulina los análogos de insulina que contienen una' o. más modificaciones de aminoácido comparadas con una insulina humana expuesta . en SEQ ID NO: 103 y. 104 (cadenas A y. B) . Estas variantes incluyen análogos de insulina de acción rápida o acción prolongada (todos designados en la presente como un análogo de insulina de acción rápida, aunque se entiende que. para propósitos en la presente esta ' influye formas análogas de insulina de acción . rápida¦ y acción prolongada) . Los análogos de' insulina ejemplares (cadenas A y B) , incluyendo formas análogas de. acción rápida y acción prolongada, se exponen en SEQ ID NOS: 147-165, 182- 184). Por ejemplo, los análogos de insulina incluyen, pero no se limitan a, glulisina · (LysB3, GluB29; expuesta en SEQ ID NO: 103 (cadena A) y SEQ ID NO: 149 (cadena B) ) , H R-1153 (LysB3 , IleB28 ;' expuesta en SEQ ID NO: 103 (cadena A) y SEQ ID NO: 182 (cadena B) ) , HMR-1423 (GlyA21, HisB31, HisB32; expuesta en SEQ ID NO: 183 (cadena A) y SEQ ID NO: 184 (cadena . B) ), insulina aspart (AspB28; expuesta en SEQ ID NO: 103 (cadena A) y SEQ ID NO: 147 (cadena B) ) , e insulina lispro (LysB28, ProB29; expuesta en SEQ ID NO: 103 (cadena A) y SEQ ID NO: 148 (cadena B) ) . En cada caso anterior, la nomenclatura de los análogos se basa en una descripción, de la sustitución de aminoácidos en las posiciones específicas, o en la cadena' A o B de. la insulina, numerada de la N-terminal de la cadena, en la cual el resto de la secuencia es aquella de la insulina humana natural.

Por consiguiente, la insulina regular usada en ios métdos de infusión en la presente es proporcionada en las co-formulaciones en la presente es una insulina madura que contiene una secuencia de aminoácidos-expuesta en SEQ ID NOS: 103 y 104. Ejemplar de una insulina humana regular . es la insulina humana . recombinant.e designada HumulinMR R. Las insulinas regulares también incluyen variantes de especies de insulina madura que tienen una cadena A y B, .. por. ejemplo, ¦ ' : .'· ¦ · 160 formas maduras de . cualquiera de SEQ ID, NOS: 105-146. Otros análogos de insulina ejemplares incluidos en las co-formulaciones en la presente incluyen, pero no se limitan a, una . insulina que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 10.3 (cadena A) y SEQ ID NO: 149 (cadena B) ; una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ . ID NO: 103 (cadena A) y SEQ ID NO: 147 (cadena B) ; o una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 103 (cadena A) y SEQ ID NO: 148 (cadena B) .. .

Cualquiera de los' polipéptidos de.. insulina anteriores incluyen aquellos, que se producen, por el páncreas de cualquiera de las especies, tales como un humano, también incluyen insulinas que se producen sintéticamente o usando técnicas recombinantes . Por ejemplo, como se describe en cualquier lugar en la presente, la insulina se puede producir sintéticamente al expresar genes sintéticos para las cadenas A y B de insulina, al expresar la proinsulina completa y al exponerla a los método enzimáticos y químicos apropiados para generar una insulina madura, o al expresar las cadenas A y, B conectadas por un péptido ligador .(véase por ejemplo DeFelippis y colaboradores (2002) Insulin Chemistry and Pharmacokinetics . En Diabetes Mellitus de Ellenberg y Rifkin (pp. 481-500) McGraw-Hill Professional ) .

Las insulinas también incluyen formas monoméricas ..y oligoméricas, tales, como formas hexaméricas .. La , insulina puede existir como un monómero conforme circula en el plasma, y también se liga a su receptor mientras está, en una forma monomérica. La insulina, sin embargo, tiene una propensión a auto asociarse en. los dimeros, y en presencia de iones de metal tal como Zn2+ puede asociarse . fácilmente, en las estructuras de orden más a.lto tal como .hexámeros . Existen dos sitios de ligación de afinidad alta simétricos para Zn, aunque otros sitios de ligación a zinc más débiles también se han reportado (véase por ejemplo, D.eFelippis y colaboradores (2002) Insulin Chemistry and Pharmacokinetics-. En. Diabetes Mellitus de Ellenberg: Rifkin (pp. 481-500) McGraw-Hill Professional) . El auto asociación es importante para la estabilidad de la molécula para prevenir la degradación química y la desnaturalización física. De esta manera, en las vesículas de almacenamiento en las células beta pancreáticas, la insulina existe como un hexámero. En la liberación, en el espacio extracelular, sin embargo, se cree que los hexámeros de insulina pueden experimentar un cambio en el pH a condiciones más neutras y los hexámeros que contienen ion de zinc se diluyen,, lo cual estabiliza el hexámero. Puede haber otras razones que contribuyen a la desestabilización, del hexámero de insulina en el espacio extracelular. La insulina de esta manera se encuentra predominantemente en la sangre r ¦ ¦ ¦ ¦ ¦· ' iD¿ como un monómero. Para . tomar ventaja de los efectos de estabilización, las formulaciones más comerciales de insulina contienen iones- de zinc y cantidades suficientes para promover la. auto-asociación en los hexámeros. La estructura hexamérica, sin embargo, desacelera la velocidad de absorción de estas formulaciones en la administración subcutánea.

La insulina se usa como un. agente terapéutico para el control glicémico, tal como en pacientes diabéticos. Existen varios tipos de formulaciones de insulina que existen, dependiendo de si la insulina está siendo administrada para controlar la glucosa para la terapia basal, . para terapia prandial, o para una. combinación de las . mismas. Las formulaciones de insulina se pueden proporcionar solamente como formulaciones de acción rápida, solamente . como formulaciones de acción basal (es decir formas de acción intermedia y/o acción prolongada), o como mezclas de las mismas (véase por ejemplo, Tabla 2). Típicamente, las mezclas contienen una insulina de acción rápida e intermediario de acción prolongada. Por ejemplo,, las insulinas de acción rápida se puede combinar con una insulina NPH . (una insulina de acción intermedia ejemplar como se plantea pósteriormente) en varias relaciones de mezcla incluyendo ,10:90, 20; 80, 30:70, 40:60, .'y .50:50. Estas preparaciones ^pre-m'ezcladas pueden reducir el número de inyecciones de insulina diarias al proporcionar convencionalmente . requisitos de¦ insulina tanto relacionados con las comidas como básales en una sola formulación .

Las preparaciones de insulina incluyen un polipéptido de insulina o variante (es decir análogo) del mismo formulado en una manera especifica. En algunos casos, son los componentes y sustancias en la formulación que imparten diferentes propiedades en la insulina, tal como duración de acción diferente. Por ejemplo, la mayoría de preparaciones de insulina contienen un ión de metal, tal como'' zinc, . en la formulación, que . estabiliza la insulina al promover la auto-asociación de la molécula. La autoasociación en las formas hexaméricas pueden afectar la absorción; de la insulina en la administración. Además,, las formulaciones de insulina básales de¦ acción más prolongada se preparan al precipitar la insulina de una solución amortiguadora dé acetato (en lugar de fosfato) por la adición de zinc. Los cristales grandes de insulina con el contenido de zinc alto, cuando se colectan y se re-süspenden en. una. solución de acetato de. sodio-cloruro de sodio (pH 7.2 a 7.5), se absorben lentamente , después de la inyección subcutánea y ejercen, una. acción de''"' duración prolongada. Esta ' preparación de cristal es ¦ nombrada suspensión de zinc : de insulina prolongada' ¦ (insulina ultraleñta) . Otras preparaciones de insulina que contienen zinc incluyen, por ejemplo, insulina , . semi-lentas (suspensiones de. zinc de insulina rápida) e insulinas lentas (suspensiones de . zinc de insulina) , que difieren predominantemente en la concentración de zinc usada. Las preparaciones de insulina que contienen zinc también incluyen aquella que. se modifican por protamina, tal como insulina NPH.

En otro ejemplo, un agente de precipitación, tal como protamina, se pueden agregar a un polipéptidó de insulina para genera una suspensión microcristalina . Típicamente, las insulinas cristalinas, tienen una duración prolongada de acción comparadas con las insulinas que no existen en forma cristalina. Una insulina de zinc de protamina, cuando se inyecta subcutáneamente en una suspensión acuosa, se disuelve solo lentamente en , el sitio de deposición, y Ta insulina se absorbe en una velocidad retardada. La insulina .de suspensión de zinc de protamina se ha reemplazado¦ en gran medida o Ta suspensión de insulina de isofano, también conocida como insulina NPH. Es una suspensión de insulina, de zinc, de protamina modificada que es cristalina. Las concentraciones de insulina, protamina, y zinc se arreglan de esta manera que la preparación tiene .un inicio y una duración de acción intermedia entre aquella de insulina regular y suspensión de insulina de zinc.de protamina.

Además, las di'férencias de pH en las preparaciones también incluyen en el .tipo y propiedad de la insulina. La mayoría de insulina se formula en pH neutro. Una excepción es la insulina glargina, que se proporciona como una formulación comercial a pH 4.0. En virtud de la adición de , dos argininas a la C-terminal de la cadena B, el punto- . isoeléctrico de .la insulina glargina se . cambia haciéndola más soluble en un pH ácido. Existe un cambio de aminoácido adicional- en la cadena A (N21G) para prevenir la desamidación y dimerización que resultan de una aspa'ragina sensible al ácido. La secuencia de la cadena A de la insulina glargina se expone en SEQ. ID NO: 150 y la cadena B sé expone en SEQ ID NO: 151. Puesto que la exposición al pH fisiológico ¦ se presenta en la administración,, se forman microprecipitados , que .hacen la glargina similar a una insulina de acción prolongada, cristalina .

La Tabla .·' 2 a continuación resume varios tipos ' de insulina, su inicio de acción y su aplicación.

Las insulinas más comúnmente usadas son las insulinas de acción rápida, que incluyen insulina regular (es decir insulina nativa, o de. tipo natural, incluyendo variantes alélicas y de especies de la misma) y análogos de insulina de acción rápida. Para propósitos en la. presente, la referencia en la insulina es una insulina de acción rápida, a menos que se indique específicamente de otra manera.

Insulinas de Acción Rápida Las insulinas de acción rápida que se pueden usar en los métodos de infusión CSII proporcionados en la presente incluyen insulina regular, que es la insulina de tipo natural nativa, "y análogos, de insulina de acción rápida. En virtud de su velocidad de absorción rápida comparada con las ' insulinas de. acción basal, las insulinas de acción rápidá se usan predominantemente para propósitos de control pos-prandial . Las insulinas de acción rápida ejemplares se exponen en la Tabla 3 a continuación. Las insulinas de acción rápida también incluyen cualquiera conocido en el campo, tal como, pero no limitado a, ' cualquiera de las preparaciones de insulina y dispositivos dados a conocer en la Patente de E.U.A. No. 7, 279,457 y Publicación de Patente de E.U.A. Pub . Nos. 20070235365,. 20080039368, 20080039365, 20070086952, 20070244467, y 20070191757. Cualquiera, insulina de acción rápida se puede preparar como una formulación ya sea solo o en combinación o co-formulada con PH20 para uso en los métodos CSII en la presente. Esta formulación también, puede incluir además una mezcla de una insulina de acción rápida con . una insulina intermediaria o de acción prolongada, además de una enzima degradadora de hialuronano.

TABLA 3. Insulinas de Acción Rápida a. Insulina Regular Las insulinas regulares incluyen el polipéptido de insulina nativo de tipo natural. Estas incluyen, insulina humana, asi . como . insulinas de bovino, porcino y otras especies. Las insulinas humanas regulares se comercializan como HumulinMR R, NovolinMR R and VelosulinMR. La insulina porcina' se comercializa como IIMR. Generalmente, la insulina regular, cuando se administra subcutáneamente sola,, tiene un inicio de acción. de 30 minutos. Los niveles de plasma máximos se observan en 1-3 horas y la duración . de la . intensidad se incrementa con la dosificación. La vida media del plasma después de la administración subcutánea, es de aproximadamente 1.5 horas . b. Análogos de Acción Rápida (también llamadas insulinas de acción rápida) Los análogos de, insulina de., acción rápida, que son llamadas frecuentemente insulinas de acción rápida . en el campo, son formas modificas de insulina que contienen típicamente uno o más cambios de aminoácido. Los análogos se diseñan para reducir la auto-asociación . de la molécula de insulina para el propósito de incrementar la velocidad de absorción y el inicio de acción como es comparado con la insulina regular. Generalmente, estos análogos se formulan en presencia de zinc, y. de esta manera existen como hexámeros de zinc estables . Debido . a la modificación, sin embargo, tienen una disociación más rápida del estado hexamérico después de la administración subcutánea comparada con la insulina regular . i. Insulina Lispro La insulina ' lispro humana es una formulación de polipéptido de insulina que contiene, cambios de aminoácido . en la posición 28 y 29 de la cadena B tal que el Pro-Lys en esta posición en la cadena B de insulina de tipo natural expuesta en SEQ ID NO: 104 se invierte a Lys-Pro. La secuencia de la insulina lispro se expone en SEQ ID NO: 103 (cadena A) y SEQ ID NO: 148 (cadena B) . Se comercializa bajo él nombre HumalogMR (insulina . lispro, origen de rDNA) . El resultado de la inversión de estos dos aminoácidos es un polipéptido con una propensión disminuida a asociarse, lo cual permite un inicio de acción más rápido. Específicamente, la inversión de secuencia en la cadena B da por resultado la eliminación de dos interacciones hidrofóbicas y debilitamiento '.de .las dos ligaciones de hidrógeno de hojas beta-plegada que estabiliza el dímero (véase - por ejemplo, DeFel'ippis y colaboradores (2002)' Insulin Chemistry and Pharmacokinetics . En Diabetes ellitus de Ellenberg and Rifkin (páginas 481-500.) McGraw-Hill Professional ) . El polipéptido. se auto-asocia y forma hexámeros como resultado de los excipientes proporcionados en la formulación, tal como agentes antimicrobianos (por ejemplo m-cresol) y zinc para la estabilización. No obstante, debido a la modificación de aminoácidos, la insulina lispro es de acción más rápida que la insulina regular, ii . Insulina Aspart La insulina aspart humana es una formulación de polipéptido y de insulina que contiene una sustitución de aminoácido en la posición 28 de la cadena B de la, insulina humana expuesta en SEQ ID NO: 104 de una prolina a un ácido aspártico. La secuencia de la insulina aspart se expone en SEQ ID NO : 103 (cadena A) y SEQ ID NO : 147 (cadena B) . Se comercializa bajo el nombre NovologMR (inyección, de insulina aspart [origen rDNA] ) . La modificación en. la insulina aspart confiere un grupo carboxilo de cadena lateral negativamente cargado para crear . la repulsión de carga y desestabilizar la interacción de monómero-monómero . Además, la remoción .de la prolina elimina una interacción hidrofóbica clave entre los monómeros (véase por ejemplo, DeFelippis y colaboradores (2002) Insulin Chemistry and Pharmac.okinetics . En- Diabetes Mellitus de Ellenberg and Rifkin (páginas 481-500) McGraw-Hill Professional ). El¦ análogo existe- en gran' medida como un monómero, y es menos propenso a agregarse comparado' con' otros análogos de acción- rápida tal como lispro. Generalmente,, la insulina aspart y. la insulina lispro son similares en sus propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas respectivas .. iii . Insulina Glullsina La insulina giulisina humana es . una formulación de polipéptido de insulina que contiene una sustitución de aminoácido en la cadena B en la posición :B3 de asparagina a lisina y en el aminoácido B29 de li.sina: a ¦ ácido glutámic.o comparado con la secuencia de la cadena B de la insulina humana expuesta en SEQ¦· ID NO: 10.4. La secuencia de la insulina giulisina se expone en SEQ ID. NO: 103 (cadena A)- y SEQ ID NO: 149 (cadena B) . Se comercializa bajo el nombre ApidraMR (inyección de. insulina, giulisina [origen de rD Aj ) . Las modificaciones hacen la molécula de polipéptido menos propensa a la auto-asociación comparada con. la insulina humana. Diferente a otros análogos de insulina,. el polipéptido se formula comercialmente en ausencia del zinc promotor de hexámeros (Becker y colaboradores (2008) Clinical Pharmacokinetics, 47:7-20). Por consiguiente, la insulina glulisina tiene una velocidad más rápida de inicio que la insulina lispro y la insulina aspart.

E. ENZIMAS QUE DEGRADAN A HIALURONANO Las enzimas que degrada a hialuronano, tal como una hialuronidasa por ejemplo una PH20 (por ejemplo. rHuPH20) pueden usarse en los métodos CSII en la presente. La enzima que degrada a hialurona,no puede formularse separadamente para uso, por ejemplo, en modalidades de tecnología de punta.. En otros ejemplos, la enzima que degrada a hialuronano puede formularse junta como una co-formulación con una insulina de acción rápida para CSII..

Las enzimas degradadoras de . hialuronano actúan para degradar el hialuronano¦ al escindir los polímeros de hialuronano, que se-, componen de unidades de disacáridos de repetición, ácido D-glucurónico (GlcÁ) y N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc) , ligados juntos a . través, de ligaciones glicosídicas ß-1-?4 y . ß-1?3 alternantes. Las cadenas, de hialuronano pueden . alcanzar de aproximadamente 25,000 repeticiones de disacárido o más en longitud y los polímeros de hialuronano pueden variar en tamaño de aproximadamente 5,000 a 20,000,000 Da in vivo. El . hialuronano, también llamado ácido . hialurónico . o hialuronato, es un glicosaminoglicanó no sulfatado que se distribuye ampliamente por todos los tejidos conjuntivos, epiteliales y neuralés. El hialuronano es un componente esencial de la matriz extracelular y un constituyente' principal de la barrera intersticial. Al catalizar la hidrólisis del hialuronano, las enzimas degradadoras de hialuronano reducen la viscosidad del hialuronano, incrementando de esta manera la permeabilidad del tejido e incrementando la velocidad de absorción de los fluidos administrados parenteralmente . Como tal, las enzimas degradadoras de hialuronano, tales como hialuronidasas, . se han usado, por ejemplo, como agentes de dispersión o de propagación en conjunción con otros agentes, fármacos y proteínas para potenciar su dispersión y administración..

Por consiguiente, las enzimas degradadoras de hialuronano incluyen cualquier enzima que tenga la capacidad de catalizador la escisión de una cadena o. polímero de disacárido de hialuronano. En algunos ejemplos la enzima degradadora escinde la ligación glicosídica · ß-1—4 en la cadena o polímero de hialuronano. . En otros ' ejemplos, la enzima . degradadora. cataliza · la escisión dé la ligación glicosídica ß-1?3 en :la cadena o polímero de, hialuronano. Ejemplar de las enzimas degradadoras de hialuronano en la:s co-formulaciones proporcionadas en la presente. son hialuronidasas que se secretan en el medio cando se expresán de un sistema de expresión celular, incluyendo hialuronidasas naturales que no contienen un ancla glicosilfosfatidilinositol (GPI) o hialuronidasas ' truncadas que carecen de uno o más aminoácidos del ancla GPI o hialuronidasas que de otra manera no se asocian con la membrana celular cuando se expresan de la misma. . Estas hialuronidasas se pueden producir recombinante o sintéticamente, otras enzimas degradadoras de hialuronano ejemplares incluyen, pero no se limitan a condroitinasas particulares y liasas que tienen la capacidad de escindir el hialuronano. ¦ ' ' ¦ ¦ · ¦ Las enzimas, degradadoras de hialuronano proporcionadas en los métodos en la presente también incluyen variantes alélicas o de especies u otras variantes, de una enzima degradadora de hialuronano como se describe en la presente. Por ejemplo, las enzimas degradadoras de hialuronano pueden contener una o más variaciones en su secuencia primaria, tales como sustituciones, adiciones y/o supresiones de aminoácido. Una variante de la enzima degradadora de hialuronano muestra generalmente por lo menos d aproximadamente 60%, 70%, 80%, 90%, .91%, 92%, .93%, 94%, 95%, 9.6%, 9.7%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia comparada con la enzima degradadora de hialuronano que no contiene la variación. Cualquier variación se puede; incluir' en la enzima degradadora de hialuronano para los propósitos en la presente que proporcionan la enzima que retiene la actividad de hialuronidasa, tal como por lo menos o aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 2.5%,. 30%, .35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, .85%, 90%, 95% o más de la actividad de la enzima degradadora de hialuronano que no contiene la variación (como es medida por ensayos in. vitro y/o in vivo bien conocidos en la técnica y descritos en la presente.

Varias formas de enzimas degradadora de hialuronano, incluyendo hialuronidasas se han preparado y aprobado para uso terapéutico en sujetos, incluyendo humanos. Por ejemplo, las preparaciones de hialuronidasa . derivada de animal incluyen VitraseMR (ISTA Pharm'aceuticals ) , una hialuronidasa testicular de ovino purificada, y AmphadaseMR (Amphastar Pharmaceuticals ) ., una hialuronidasa testieular .de bovino. La HylenexMR (Baxter) es una hialuronidasa recombinante humana producida por células de Ovario, de Hámster Chino (CHO) genéticamente diseñadas que contienen ácido nucleico que codifica un polipéptido ' PH20 humano truncado (designado rHuPH20) . Se entiende que cualquier enzima degradadora de hialuronano, tal como cualquier hialuronidasa se puede incluir en las co-formulaciones estables proporcionadas en la presente (véase, por ejemplo, Patente de, E.U.A. NO. 7, 767, 429, y Publicación de Patentes de E'.Ü.A. .Nos. 20040268425 y 20100143457, que se incorporan . a manera de referencia en su totalidad) .

Típicamente, para uso en la. presente,. una enzima degradadora de hialuronano humana, tal como una PH20 humana: y en particular una PH20 humana truncada C-terminal como se describe en la presente, es usada. Aunque las enzimas degradadoras de hialuronano, tal como PH20, de otros animales se . pueden ' usar, estas preparaciones son potencialmente inmunogénicas , puesto que son proteínas animales. Por ejemplo, una proporción significativa de pacientes muestra sensibilización previa secundaria a los alimentos ingeridos, y puesto que estas son proteínas animales, todos los pacientes tienen un riesgo de sensibilización subsecuente. De esta manera, las , preparaciones no humanas no pueden ser adecuadas para el uso crónico. Si las preparaciones no humanas son deseadas, se pueden, preparar para .¦ tener inmunogenicidad reducida. Estas modificaciones están dentro del nivel de una persona experta en el campo y pueden incluir, por ejemplo, remoción y/o reemplazo de uno o más epítopos antigénicos en la molécula.

Las enzimas degradadoras de ' hialuronano, . incluyendo hialuronidasas (por ejemplo, PH20), . usadas en. · las co-formulaciones proporcionadas en la presente se pueden producir recombinantemente o se pueden . purificar o purificar parcialmente de fuentes naturales ,.. tales como, por ejemplo, de extractos de testículos'. Los métodos para la producción de proteínas recombina.ntes , incluyendo enzimas degradadoras de hialuronano recombinantes , se proporcionan en cualquier lugar en este documento y. son bien conocidos en el campo. 1. Hialuronidasas Las hialuronidasas son miembros de una gran familia de enzimas degradadoras de hialuronano. Existen tres clases generales de hialuronidasas: hialuronidasas de tipo mamífero, hialuronidasas bacterianas e hialur.onidasás de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos. Tales enzimas se pueden usar en las co-formulaciónes proporcionadas en la presente. a . Hialuronidasas de Tipo Mamífero Las hialuronidasas de tipo mamífero (EC 3.2.1.35) son e5do-?-N-a.cetil-hexosaminidasas que hidrolizan la ligación glicosídica ß-1?4 del hialuronano en : varias longitudes de oligosacáridcs tales como tetrasacáridos y hexasacáridos . Estas enzimas tienen actividades tanto ; hidrolíticas como transglicosidasa , y pueden degradar el hialuronano y los sulfatos de condroiti'na (CS) , generalmente C4-S y .C6-S. Las hialuronidasas . de este tipo incluyen, pero no se limitan a, hialuronidasas de vacas (bovino) (SEQ ID NOS: 10, 11 y 64 y BH55 (Patente de E.U.A. Nos. 5,747,027 ya 5,827,721)), oveja (Ovis aries) (SEQ ID NO: 26, '27, 63. y. 65), avispa de chaqueta amarilla (SEQ ID NOS: .12 y 13),· abeja de miel (SEQ ID NO: 14), abejorro de cara blanca (SEQ ID NO: 15), avispa de papel (SEQ ID NO: 16), ratón (SEQ ID NOS: .17-19, 32), cerdo (SEQ ID NOS:20-21), rata (SEQ ID NOS:22-24, 31), conejo. (SEQ ID NO:25), orangután (SEQ ID NO:28), mono cynomolgus (SEQ ID NO:29), cobayo (SEQ ID NO:30), chimpancé (SEQ. ID NO: 185), mono Rhesus (SEQ ID NO: 186) y hialuronidasas humanas.

Las hialuronidasas de mamífero se pueden subdividir adicionalmente en aquellos que son activos neutros, encontrados predominantemente en los extractos de testículos, y activos en ácido, predominantemente encontrados en órganos tales ..como el hígado. Las hialuronidasas activas neutras ejemplares incluyen PH20, que incluye . pero no se limita a, PH20 derivada de especies diferentes tal como de ovino, (SEQ ID NO:27), bovino (SEQ . ID NO: 11) y humana (SEQ. ID NO: 1). La PH20 humana . (también conocida como SPAM1 o : proteína superficial de esperma PH20) , se. une generalmente a la membrana plasmática a través de un ancla de glicosilfosfatidil inositol (GPI). Se implica naturalmente en la adhesión del espermatozoide-óvulo y ayuda la penetración por el espermatozoide de la capa de las células del cumulus al digerir el ácido hialurónico . Ejemplares . de las hialuronidasas usadas . en las co-formulaciones en este- punto son las hialuronidasas activas neutras.

Además de la PH20 humana (también .llamada SPAM1) , cinco genes similares a hialuronidasa se . han identificado' en el genoma humano, HYALl, HYAL2, HYAL3 , HYAL4 y HYALPl . El HYALP1 es un pseudogen, y el HYAL3 (polipéptido precursor establecido en SEQ ID NO: 38) no ha mostrado que posee actividad enzimátioa hacia ninguno de. los ' substratos conocidos. El HYAL4 (polipéptido precursor expuesto en. SEQ ID NO: 39) es '. una condroitinasa y muestra poca actividad hacia el hialuronano. El HYAL1 (polipéptido . precursor expuesto en SEQ ID NO: 36) es la enzima activa en ácido prototipica.. y PH20 (polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 1) es la enzima activa neutra prototipica.. Las hialuronidasas activas en ácido, tales como HYALl y HYAL2 (polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 37) carecen generalmente de actividad, catalítica en pH neutro (es decir pH 7) . Por ejemplo, el HYAL1. tiene poca actividad catalítica in vitro en pH 4.5 (Frost y colaboradores (1997) Anal. Biochem. 251:263- 269). El HYAL2 es una enzima activa en ácido con una actividad específica muy baja in vitro. Las enzimas similares . a. hialuronidasa ' también se pueden caracterizar por aquellas que se unen generalmente a la membrana plasmática a .través de un ancla de glicosilfcsfatidil-inositol (GPI) tal como HYAL2 humana' y PH20 humana.. (Danilkov.itch-Miagkova, y colaboradores (2003) Proc Nati Acad Sci EUA 100 (8) : 4580-5) , y aquellas , que . son generalmente solubles tal como HYAL1 (Frost y colaboradores (1997) Biochem Biophys Res Commun. 236(1): 10-5)..

PH20 La PH20, similar a otras hialuronidasas de mamífero, es una endo-p-N-acetil-hexosaminidasa que hidroliza la ligación glicosídica. ß1->4 del ácido hialurónico en varias longitudes dé .oligosacárido tal como . tetrasacáridos y hexasacáridos . Tienen actividades ¦ tanto hidroliticas cómo de transglicosidasa y pueden degradar el . ácido hialurónico . y sulfatos de condroitina, tales como C4-S y C6-S. La PH20 se implica naturalmente en la adhesión del espermatozoide-óvulo y ayuda a la penetración por el espermatozoide.de la capa de las células del cúmulo al digerir el ácido. La PH20 se localiza en la superficie del espermatozoide, y en el acrosoma derivado de lisosoma, donde se liga a la membrana acrosomal interior. La. membrana, plasmática- PH20 ¦ tiene actividad de hialurónidasa solo en pH neutro, mientras que la membrana acrosomal intérior PH20 tiene actividad en pH tanto neutro como ácido ... Además de ser una hialurónidasa', la PH20 también parece que es un receptor para la señalización de células inducidas por HA, y un receptor para la zona pelúcida que circunda el ovocito.

Las proteínas PH20 ejemplares incluyen,, pero no se limitan a, polipéptidós PH20 humanos . (polipéptido precursor expuesto en SEQ ID. O: 2, polipéptido maduro expuesto en SEQ ID NO: 2), de bovino (SEQ ID NOS: 11 y 64), de conejo (SEQ ID NO: 25), PH20 de ovino (SEQ ID NOS: 27, 63 y 65), monos cynomolgus (SEQ ID NO:. 29), de -cobayo .(SEQ ID NO: 30), de rata (SEQ ID. NO: 31), ratón (SEQ ID NO: 32), chimpancé (SEQ ID NO: 185) y mono Rhesus (SEQ ID NO: 186) .

La PH20 de bovino es un polipéptido precursor de 553 aminoácidos (SEQ ID. NO: 11). La alineación día PH20 de bovino con la PH20 humano muestra solo una homología débil, con múltiples espacios que existen del aminoácido 470 a través de las carboxi terminales respectivas debido a la ausencia de un ancla GPI en el polipéptido de bovino {véase por, ejemplo, Frost GI (2007) Expert Opin. Drug. Deliv. 4 : 427-440) De hecho, las anclas GPI claras no se. predicen en muchas otras especies de PH20 además de los humanos. De esta manera, los polipéptidós PH20 producidos de ovino y bovino existen naturalmente como formas solubles. Aunque la PH20 de bovino existe unido muy sueltamente a la membrana plasmática, no se anclan a través de un ancla sensible a la fosfólipasa (Lalancette y colaboradores (2001). Biol Reprod' . 65 (2) :,628-36). Este factor único de la hialuronidasa de bovino ha permitido el uso de. la enzima de hialuronidasa de testículos de bovino soluble como . un extracto para el uso clínico (WydaseMR, HyalaseMR) El transcripto PH20 mRNA humano se traduce normalmente para generar un polipéptido precursor de 509 aminoácidos (SEQ ID NO: 1) que contiene una secuencia señal de 35. aminoácidos en la N-terminal (posiciones del residuos de aminoácido 1-35) y . una secuencia señal de unión de ancla de glicosilfosfatidilinositol (GPI) de 19 aminoácidos . en la C-terminal (posiciones de residuos de aminoácido 491-509). La PH20 maduro es, por. lo tanto, un polipéptido de 474 aminoácidos expuesto en SEQ ID NO: 2. Después del transporte del polipéptido precursor al ER y . remoción, del péptido señal, el péptido señal de unión a GPI C-terminal se escinde para facilitar la unión covalente de un ancla GPI al aminoácidos C-terminal recientemente formado en la posición' de aminoácido que corresponde a la posición 490 del polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 1. De esta manera, se produce un polipéptido maduro anclado a. GPI de 474 aminoácidos . con una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2.' Aunque la PH20 humano es una . hialuronidasa activa neutra cuando existe en la membrana plasmática a través dé un ancla GPI, muestra actividad en pH tanto neutro, como ácido cuando se expresa en la membrana, acrosomal interior. Parece que ' la PH20 contiene dos sitios catalíticos en . distintas regiones del polipéptido: las regiones Péptida 1 y Péptida 3 (Cherr y colaboradores, (2001) Matrix Biology. 20:515-5251. La evidencia sugiere que la región Péptida 1 día PH20, que corresponde a . las posiciones de. aminoácido- 107-137 del polipéptido maduro . expuesto en SEQ ID NO:2 y las posiciones 142-172 del polipéptido precursor expuesto en SEQ .ID NO: 1, es requerida para la actividad enzimática en el pH neutro . Los aminoácidos en las posiciones 111 y 11.3 (que corresponden al ' polipéptido PH20 expuesta en SEQ ID N0:2) dentro de esta región parece que es importante para la actividad, ya que la mutagénesis por el reemplazo del aminoácido da . por ..resultado polipéptidos PH20 , con 3% de actividad de hialuronidasa o actividad de hialuronidasa no detectable, respectivamente, comparado con. la PH20 dé tipo natural (Arming y colaboradores, (1997) Eur. J. Biochem. 247 : 810-81 ) .

La región . de.,1 Péptido 3, que corresponde a las posiciones de aminoácido 242-262 del polipéptido maduro expuesto en SEQ ID NO: 2, y las posiciones 277-297 del polipéptido precursor expuesto en. SEQ ID NO: 1, parece que es importante para la .actividad enzimática en el. pH ácido. Dentro de esta, región, los aminoácidos en las posiciones 249 y 252 del polipéptido PH20 maduro parece que son esenciales para la actividad, y la. mutagénesis de¦ cualquiera de uno da por resultado un polipéptido esencialmente sin actividad (Arming y colaboradores, (1997) Sur.. J. Biochem. 247:810-814) .

. Además de los sitios catalíticos, la PH20 también contiene un sitio de ligación a hialuronano . ,' La evidencia experimental muestra que este sitio se localiza en la región Péptida 2, que corresponde a las posiciones de aminoácido 205-235 de polipéptido precursor expuesto en SEQ ID NO: 1 y las posiciones 170-200 del polipéptido maduro expuesto en SEQ ID. NO:2. Esta región se conserva altamente entre las hialuronidasas y es similar al motivo de ligación a heparina. La mutación del residuo de arginina en . la posición 176 (que corresponde al polipéptido PH20 maduro expuesto en SEQ ID NO : 2 ) a una glicina da por resultado . un polipéptido con solo aproximadamente 1% de la actividad de hialuronidasa del polipéptido de tipo natural (Arming y . colaboradores, (1997) Eur. J. Biochem. 247:810-814).

Existen siete sitios de glicosilación ligados a . N potenciales en la PH20 humano en N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490 del polipéptido ejemplificado en SEQ ID NO: 1. Debido a que los aminoácidos 36 a 464 de SEQ ID NO: 1 parece que contienen el dominio de hialuronidasa PH20 humana mínimamente activa, el sitio de glicosilación N.-ligado N-490 no se- requiere para la actividad de la hialuronidasa apropiada. Existen seis ligaciones de . disulfuro en la PH20 humano. Dos ligaciones de disulfuro entre los residuos de cisterna C60 y C351 y entre C224 y C238 del polipéptido ejemplificado en SEQ ID. NO: 1 (que corresponde a laso residuos C25 y 0316, y C189 y C203 del polipéptido maduro expuesto en SEQ ID N0:2, respectivamente). Cuatro ligaciones de disulfuro adicionales se forman entre los residuos de cisteina 0376. y 03.87; entre C381 y C435; entre 0437 y 0443; y entre C458 y C464 del polipéptido ejemplificado en SEQ ID NO: 1 (que corresponde a los residuos C341 y C352; entre C346 :y C400; entre 0402 y C408; y entre C423 y 0429 del polipéptido maduro expuesto en SEQ, ID NO: 2, respectivamente) . b. Hialuronidasas Bacterianas Las hialuronidasas bacterianas ,(EC 4.2.2.1 . o EC 4.2.99.1) degradan el. hialuronano y, a varios grados, los sulfatos de condroitina y los sulfatos de dermatán . Las liasas . de hialuronano aisladas de bacterias difieren de las hialuronidasas (de otras fuentes, por ¦¦ ejemplo, hialuronoglucosaminidasas , EC 3.2.1.35) por su modo, de acción. Son endo^-N-acetilhexosaminidasas que catalizan urta reacción de eliminación, antes que de hidrólisis, de la ligación glicosidica >ß1?4 entre los residuos de N-acetil-beta-D-glucosamina y ácido D-glucurónico en el hialuronano, produciendo . 3- ( -desoxi^-D-gluc-4-enurono.siI) -N-acétil- - glucosamina tetra y hexasacáridos , y productos finales de disacárido. La reacción da por resultado la. formación de oligosacáridos con residuos de ácido hexurónico insaturados en sus extremos no reductores.

Las hialuronidasas ejemplares de bacterias para co-formulaciones proporcionadas en la presente incluyen, pero no se limitan a, enzimas degradadora de hialuronano en los microorganismos, incluyendo cepas de Arthrobacter, Bdellovibrio, Clostridium, . Micrococcus, Streptococcus, Péptococcus, Propionibacterium, Bacteroides, y . Streptomyces . Ejemplos particulares de estas enzimas incluyen, per no se limitan a Arthrobacter sp. (cepa FB24) (SEQ ID NO: 67), Bdellovibrio bacteriovorus (SEQ ID NO: 68), Propionibacterium acnés (SEQ. ID NO:. 69), Streptococcus. agalactiae ((SEQ ID NO:70); 18RS21 (SEQ ID NO:71); serotipo la (SEQ ID NO:72); serotipo III (SEQ ID NO:73)), Staphylococcus aureus (cepa COL) (SEQ ID NO: 74 ),; cepa MRSA252 (SEQ. ID NOS : 7.5 y 76) ,· cepa MSSA476 (SEQ ID NO:77); cepa NCTC 8325 (SEQ ID NO:78)'; cepa de bovino RF122 (SEQ ID NOS: 79 y 80); cepa USA300 (SEQ ID N0:81), Streptococcus pneumoniae ((SEQ ID NO: 8.2); cepa ATCC BAA- 255 / R6 (SEQ ID NO:83); serotipo 2, cepa D39 ¦/ NCTC 7466 (SEQ ID NO:84), Streptococcus pyogenes (serotipo MI) (SEQ ID NO: 85); serotipo M2, cepa MGAS10270 (SEQ ID NO:86),; serotipo M4 , cepa MGAS10750 (SEQ ID NO:87); serotipo M6 (SEQ ID NO:88); serotipo M12, cepa MGAS2096 (SEQ ID NOS:89 y 90); serotipo MI2, cepa MGAS9429 (SEQ ID NO : 91 ); serotipo M28 (SEQ ID NO: 92); Streptococcus suis (SEQ ID NOS: 93-95); Vibrio fischeri (cepa ATGC 700601/ES114 (SEQ ID NO: 96).), ya enzima de hialuronidasa de Streptomyces hyaluronolyticus, que es especifica para el ácido hialurónico y no escinde la condroitina o sulfato de condroitina (Ohya, T. y Kaneko, Y. (1970) Biochim. Biophys . Acta 198 :.607 ).. c. Hialuronidasas de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos Las hialuronidasas de sanguijuelas, otros parásitos y crustáceos (EC 3.2.1.36) son endo^-glucuronidasa.s que generan productos finales de tetra y hexasacárido . Estas enzimas catalizan .la hidrólisis de las ligaciones 1?3 entre los residuos de ß-D-glucuronato y N-acetil-D-glucosamina en el hialuronato. Las hialuronidasas ejemplares de sanguijuelas incluyen, pero, no se limitan a, hialuronidasa de Hirudinidae (por ejemplo, Hirudo medicinalis) , Erpobdellidae (por ejemplo,- Nephelopsis . obscura y Erpobdella punctata)', Glossiphoniidae (por ejemplo, Desserobdella picta, Helobdella stagnalis, Glossíphonia complanata, Placobdella ornata y Theromyzon sp.) y Haemopidae {Haemopis marmorata) (Hovingh . colaboradores (1999). Comp Biochem Physiol B Bióchem Mol Biol. 124 (3) : 319-26) . Una hialuronidasa ejemplar de bacterias que tienen el mismo mecanismo de acción como la hialuronidasa de sanguijuela es aquel de la cianobacteria, Synechococcus sp. (cepa RCC307, SEQ ID NO: 97). 2. Otras enzimas degradadoras de hialuronano Además de la. familia de. hialuronidasa, otras enzimas degradadoras de hialuronano se pueden usar en los. métodos CSII proporcionados en la presente. Por ejemplo, las enzimas que incluyen condroitinasas particulares y liasas, que tiene la capacidad de escindir el. hialuronano se pueden emplear. Las condroitinasas ejemplares que pueden ; degradar el hialuronano incluyen, pero no se limitan ; a, condroitina ABC liasa (también conocida como condroitinasa ABC)-, condroitina AC liasa (también conocida como condroitina sulfato-liasa o condroitina sulfato-eliminasa) y condroitina C liasa. Los métodos para la producción y purificación de tales enzimas para el uso en las composiciones, combinaciones, y. métodos proporcionados son conocidos en el. campo (por ejemplo, Patente de E.U.A. No. 6,054,569; Yamagata, y colaboradores (1968) J. Biol. Chem. 243 (7) :¦ 1523-1535; Yang y colaboradores (1985) J. Biol. Chem-. 160 (30): 1849-1857).

La condroitina ABC liasa contiene dos . enzimas, condroitina-sulfato-ABC. endoliasa (EC 4.2.2.20) y condroitina-sulfato-ABC exoliasa. (EC 4.2.2.21) (Hamai ..y colaboradores (1997) J Biol Chem., . 272 ( 14 ): 9123-30) , que degradan una variedad de glicosaminoglicanos del tipo de condroitina-sulfato y dermatári-s.ulfato . El sulfato de condroitina, proteoglicano de condroitina-sulfato y sulfato de dermatán son . los substratos preferidos para la condroitina-sulfato-ABC-endoliasa, pero la enzima también puede actuar en el hialuronano en una velocidad más baja. La condroitina-sulfato-ABC. endoliasa degrada una variedad de glicosaminoglicano del tipo condroitina-sulfato y , dermatán-sulfato, produciendo una mezcla de oligosacáridos ?4-insaturados de diferentes tamaños que se degradan finalmente a tetra y disacáridos ?4 -insaturados . La condroitina-sulfato-ABC exoliasa tiene . la misma especificidad de substrato pero remueve ' los residuos de disacárido de los extremos no reductores de tanto los sulfatos de condroitina polimérica como, sus fragmentos de oligosacáridos producidos por la condroitina-sulfato-ABC endoliasa (Hamai., A. y colaboradores (1997) J. Biol. Chem. 272:9123-9130).. Las ; condroitina-sulfato-ABC endoliasás ejemplares y las condroitina-sulfato-ABC exoliasas incluyen, pero no se limitan á, aquellas de Proteus , vulgaris y Flavobacterium heparinum (la condroitina-sulfato-ABC endoliasa de Proteus vulgaris se expone en, SEQ ID NO: 98 (Sato, y colaboradores (1994) Appl. Microbiol. Biotechnol. 41 (1) :39-46) .

La condroitina AC liasa (EC .4.2.2.5). está activa en los sulfatos de condroitina A y C, condroitina y ácido hialurónicó, pero no es activa en el sulfato de dermatán (sulfato de condroitina B) . Las enzimas condroitinasa AC ejemplares de las bacterias incluyen, pero no se limitan a, aquellas de Flavobacterium heparinum y ?/ictivallis vadensis, expuestos en SEQ ID NOS:99 y 100, respectivamente, y Arthrobacter aurescens (Tkalec y colaboradores (2000) Applied and Environmental Microbiology 66(l):29-35; Ernst 'y colaboradores (1995) Crltical Reviews in Bióchemistry and Molecular Biology 3.0 ( 5) : 387-444 ) .

La condroitinasa C escinde el tetrasacárido que produce sulfato de condroitina C más un disacárido 6-sulfatado insaturado (delta Di-6S) . También escinde el disacárido no sulfatado insaturado que produce ácido hialurónicó. (delta Di-OS) . Las enzimas condroitinasa C ejemplare de las bacterias incluyen, pero no se limitan a, aquellas de Streptococcus - y Flavobacterium (Hibi y colaboradores (1989) FEMS-Microbiól-Lett. 48(2): 12.1-4; Michelacci y colaboradores (1976) J. Biol. Chem. 251:1154-8; Tsuda y colaboradores (1999) Eur. J. Bioche . 262:127-133) 3. Enzimas degradadoras de hlaluronano truncadas u otras formas solubles Las enzimas degradadoras de hialuronano pueden existir en forma ligada a .la membrana o asociada a la membrana, b se puede secretar en el medio cuando se expresan de células y existen en consecuencia en forma soluble ... Para propósitos en la presente, las enzimas degradadoras de hialuronano incluyen cualquiera de las enzimas degradadoras de hialuronano que cuando se expresan y secretan de las células no se asocian con la membrana .celular, y existen en consecuencia en forma soluble . Las enzimas degradadoras . de hialuronano solubles incluyen, pero no se limitan a hialuronidasas , incluyendo hialuronidasas no humanas (por ejemplo hialuronidasas animales o bacterianas), tal como PH20 .de bovino o PH20 de ovino, e hialuronidasas humanas tales como Hyall, o formas truncadas de hialuronidasas asociadas a la membrana no humanas o humanas, n particular formas de. PH20 humana, variantes alélicas de la misma y otras variantes de.. la misma . Ejemplares de las enzimas degradadoras de. hialuronano en las co-formulaciones en la presente son formas truncadas de una enzima degradadora de hialuronano que carece de uno. o más residuos de . aminoácido de un ancla de glicosilfosfatidilinosi'tol (GPI) y que retiene la actividad de la hialuronidasa.' En un ejemplo, la hialuronidasa humana PH20, que se ancla normalmente a la membrana a través de un ancla GPI, se puede' hacer soluble por el. truncamiento de y remoción de todo o una porción del . ancla GPI en . la G- terminal .

De esta manera, en algunos casos, una enzima degradadora de hialuronano que es normalmente anclada a GPI (tal como, por ejemplo, PH20. humana) se vuelve soluble por el truncamiento en la . C-terminal. Este truncamiento . puede remover toda la secuencia señal de unión al ancla GPI o puede remover solamente, algo, de la secuencia señal de unión de ancla GPI. El polipéptido resultante, sin embargo, es soluble.. En casos donde la enzima degradadora de hialuronano soluble retiene una porción de la secuencia señal dé unión de ancla GPI, 1 , 2 , , 4, .5, 6, 7, 8, 9, 10 o más de residuos.de aminoácido en la secuencia señal de unión de . ancla GPI se puede retener, con la condición de que el polipéptido sea soluble (es decir, secretado cuando se expresa de células) yu activo. Una persona de experiencia en la técnica puede determinar si un polipéptido se ' ancla a GPI usando métodos bien conocidos, en el campo. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, el uso.de algoritmos conocidos para predecir la presencia y ubicación de la secuencia señal de unión de ancla GPI. y sitio a, y llevar a cabo análisis de solubilidad antes y, después de la digestión con la fosfolipasa C, (PI-PLC) o D (PI-PLD) especifica.de fosfatidilincsitol .

Ejemplar de una hialuronidasa soluble es la PH20 de cualquier especie, tal como cualquiera expuesta en SEQ ID NOS: 1, 2, 11, 25, 27, 30-32, 63-65 y 185-186, ' o formas truncadas de la misma que carece de todo- o una porción del ancla GPI C-terminal, siempre y cuando la hialuronidasa sea soluble y retenga la actividad de hialuronidasa. Las hialuronidasas solubles ejemplares que están C-terminalmente truncadas y carecen de todo o una porción de. la secuencia señal de unión de ancla GPI incluyen, pero no se limitan a, polipéptidos PH20 de origen de primate;, tales como,, por ejemplo, polipéptidos PH20 humanas y de chimpancé. Por ejemplo, los polipéptidos PH20 solubles se pueden hacer por el . runcamiento C-terminal de cualquiera de los polipéptidos maduros o precursores expuestos en SEQ ID NOS: .1, 2 o 185,- o alélicos u otra" variación del mismo., incluyendo fragmento ¦activo del mismo, . en donde el polipéptido resultante es soluble y carece de todo o una porción de los residuos de aminoácido de la secuencia . señal de . unión de ancla GPI . También se . incluyen entre las hialuronidasas solubles, variantes alélicas u otras variantes de cualquiera de SEQ ID NOS: 1, 2, 11, 25, 27, 30-32, 63-65 y 185-186, o formas truncadas de las mismas. Las variantes alélicas otras variantes son conocidas por una persona de experiencia en el campo, e incluyen polipéptidos que tiene sesenta 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 o más de identidad de secuencia a cualquiera de SEQ ID NOS: 1, 2, 11 :, 25, 27, 30-32, 63-65 y 185-186, o formas truncadas de los mismos. Las variantes de aminoácido, incluyen mutaciones conservadoras y no conservadoras. Se . entiende que los residuos que los residuos que son importantes s· de otra manera requeridos para la actividad de una hialuronidasa, tal como cualquiera descrito en lo anterior, o conocida por una persona experta en el campo, son generalmente invariantes y no se pueden cambiar. Estos incluyen, .por ejemplo, residuos de sito activo. De esta manera, por ejemplo, los residuos de aminoácido 111, 113 y 176 ' (que corresponde a los residuos en el polipéptido PH20 maduro expuesto en SEQ ID NO : 2 ) de un polipéptido PH20 humano, o forma soluble de.l mismo, son generalmente invariantes y no se alteran. Otros residuos que contienen glicosilación y formación de ligaciones' de disulfuro requeridos, para el plegamiento apropiado también pueden ser invariantes. a. PH20 Humana Truncada en C-terminal Ejemplar de una hialuronidasa- soluble es una PH20 humana truncada C-terminal. Las formas truncadas C-terminal de la PH20 humana recombinante se han producido y se pueden usar en las co-formulaciones descritas en la presente, la producción de estas formas solubles de PH20 se describe en . la Patente de E.U...A. No. 7, 767, 429 y Solicitud de Patente de E..U.A. Nos. US20040.26842.5, US200502-60186, US2006.0104968 y US20100143457.

Por ejemplo, los polipéptidos . PH20. truncados en C-terminal incluyen polipéptidos que contiene po lo menos 36-464 aminoácidos (la porción mínima requerida para la actividad de ialuronidasa) , o incluyen una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 85%, por ejemplo al menos 86%, 87%, 88%, 8.9%, 90%, .91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% de identidad de secuencia a una secuencia de aminoácidos que incluye por lo menos los aminoácidos 36-464 de SEQ ID NO: 1 y retienen la actividad dé hialuronidasa. Incluidos entre estos polipéptidos están los polipéptidos PH20 humanos que carecen completamente de toda la secuencia señal de unión de ancla GPI . También incluidos entre estos polipéptidos están los polipéptidos PH20 humanos que carecen de una porción de los residuos de aminoácido contiguos de la secuencia señal de unión de ancla . GPI ( llamada PH20 soluble extendida (esPH20 )' ; véase, por ejemplo US20100143457) . Los polipéptidos PH20 C-terminalmente truncados pueden estar C-terminalmente truncados por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 o más aminoácidos comparados con el polipéptido .de tipo natural de longitud completa, tal como el polipéptido de tipo natural de tipo natural de longitud completa con una^ secuencia expuesta en SEQ ID NOS: 1 o 2 , o variantes alélieas o de especies 'u otras variantes ade los, mismos. De esta manera, en lugar de tener un ancla GPI covalentemente unida a la C-terminal de la proteína, en el ER y que se ancle a la valva extracelular de la membrana plasmática,, estos polipéptidos. se secretan · cuando se expresan de células .y son solubles.

Los polipéptidos PH20 humanos . C-terminalmente . truncados ejemplares proporcionadas en la presente incluyen . cualquiera que incluyan por lo menos los aminoácidos 36-464 de SEQ ID NO: 1 y están C-terminalmente truncados después de la posición del aminoácido 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474,. 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484,. 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494,;.495, 496, 497-, 498, 499 o .500 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ·. ID NO.: 1, o una variante de . la misma que muestra por lo menos 85% de identidad de secuencia, tal como por lo menos 86%, 87%, 88%, 89%, .90%, 91%, 92%, :93%, 94%, 95%,· 96%, 97%, .98% de identidad .de secuencia a la misma y retiene la actividad dé hialuronidasa . La Tabla 4 proporciona ejemplos no limitantes de polipéptidos . PH20 c-terminalníente truncados ejemplares. En la Tabla 4 a continuación, la longitud (en aminoácidos) de los polipéptidos precursores y maduros, y el identificador se secuencia (SEQ. ID NO) en el cual la secuencia de aminoácidos ejemplares , de los polipéptidos precursores y maduros .de las proteínas PH20 C-terminalmente truncadas se exponen, se proporcionan. El 1 o, 7 polipéptido PH20 de' tipo natural también se incluye en la Tabla 4 para comparación.

. Tabla 4. Polipéptidos PH20 C-terminalmente truncados ejemplares b. rHuPH20 Ejemplar de una forma truncada C-terminal de SEQ ID NO: 1 es un polipéptido del mismo que se trunca después del aminoácido 482 de la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1. Este polipéptido se puede generar de una. molécula de ácido nucleico que codifica los aminoácidos 1-482 (expuestos en SEQ ID NO: 3)'. Esta molécula de ácido nucleico ejemplar se expone en SEQ' ID NÓ:49. El procesamiento . pos-traduccional remueve la secuencia señal de 35 aminoácidos, dejando un PH20. humano recombinante soluble de 447 aminoácidos (SEQ ID. NO: 4) . 'Ya que se produce éñ el medio de. cultivo existe heterogeneidad en la C-terminal tal que el producto, designado rHuPH20, incluye una mezcla de especies que es pueden incluir en cualquiera, o una o más de SEQ ID NOS: 4.-9 en abundancia diversa. Típicamente, la rHuPH20 se produce en células que facilitan la. N-glicosilación correcta para retener actividad,, tales como células CHO (por ejemplo células DG44; CHO) .. 4. Glicosilación de las enzimas degradadoras de hialuronano La glicosilación, q e incluye glicosilación N y Coligada, de algunas enzimas, degradadoras de hialuronano, incluyendo . hialuronidasas, puede ser ', importante para su actividad y estabilidad catalítica. Mientras que. se altera el tipo de glicano que modifica una glicoproteína puede tener efecto notables en la antigenicidad de la proteína, plegamiento estructural, solubilidad, y estabilidad, la mayoría de enzimas no se cree que requieran glicosilación para la actividad enzimática óptima. Para . algunas hialuronidasas, la¦ remoción de la glicosilación. N-ligada puede dar por resultado una inactivación casi completa de la actividad de hialuronidasa .. De esta manera, para estas hialuronidasas, la presencia de glicanos N-ligados es crítica para la generación de una enzima activa.

Los oligosacáridos N-ligados se encuentran · en varios tipos principales (oligomanosa, . ¦ complejo, híbrido, sulfatado) , todos de los cuales tienen núcleos (Man) 3-GlcNAc-GlcNAc a través de. nitrógeno de amida de los residuos de Asn que se encuentran" dentro de las secuencias -As.n-Xaa-Thr/Ser (donde Xaa no es Pro) . La glicosilación en un sitio -Asn-Xaa-Cys- se . ha reportado para la proteína de coagulación . C . En algunos casos, una enzima degradadora de hialuronano, tal 200 . .· .. . ' como una hialuronidasa, puede contener ligaciones tanto N-glicosidicas como O-glicosídicas . Por ejemplo, la PH20 tiene oligosacáridos O-ligados asi como oligosacáridos .N-ligados. Existen siete sitios de glicosilación N-ligados potenciales en N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490 de la PH20 humana ejemplificados en SEQ- ID NO: 1. Los residuos de aminoácido N82, NI 6.6 y N254 se ocupan por los glicánbs de tipo complejo mientras gue los residuos de aminoácido N3.68 y N393 se ocupan por los glicanos . de tipo mañosa alta. El residuo de aminoácido N235 se ocupa por aproximadamente 80% de glicanos de tipo mañosa alta y 20% de glicanos de tipo complejo. Como se indica en lo anterior, la glicosilación N-ligadas a N490 no se requiere para la actividad de la hialuronidasa.

En algunos ejemplos, las . enzimas degradadoras de hialuronano para el uso en la presente están glicos'iladas en uno o todos los sitios de glicosilación. Por ejemplo, para la PH20 humana, o una forma soluble de la misma, 2, 3, -.4, 5, o, 6 de los sitios de N-glicosilación que' corresponden a lós aminoácidos N82, N166, N235, N254, N368, y N393 de SEQ ID NO: 1 se glicosilan. En algunos ejemplos las enzimas degradadoras de .hialuronano se . glicosilan en. uno o más sitios, de glicosilación nativos. 'Generalmente las formas solubles de la PH20 se producen .usando sistemas de expresión. , de ' proteínas que facilitan la N-glicosilación correcta para asegurar que el polipéptido retenga . la actividad, puesto ' que la glicosilación es importante para la actividad catalítica y la estabilidad de las hialuronidasas . Estas células incluyen, por ejemplo células de Ovario de Hámster Chino' (CHO) (por ejemplo células DG44 CHO).

En otros ejemplos, las enzimas degradadoras de hialuronano se modifican en uno más sitios de¦ glicosilación no nativos para conferir la glicosilación del polipéptido en uno o más sitios . adicionales . En estos ejemplos,, la unión de las porciones de ' azúcar adicionales puede potenciar las propiedades farraacocinéticas de la molécula, tal' como la vida media mejorada y/o actividad mejorada.

En otros ejemplos, las enzimas degradadoras de hialuronano,. tales como una PH20 o EH20 humana, usadas en los métodos' proporcionados en la presente se desglicosilan parcialmente (o polipéptidos N-parcialmente glicosilados ) (véase por ejemplo Publicación de Patente de E.U.A. No. US20100143457 ) . Las glicosidasas, o gli.cósido-hidrolasas , son enzimas que catalizan la hidrólisis , de la ligación glicosídica para generare dos azúcares más pequeñas. Los tipos' principales de Ñ-glicanos en los vertebrados incluyen glicanos de alta mañosa, glicanos híbridos y glicanos complejos. Existen varias glicosidasas que dan por resultado solo la . desglicosilación de la proteína; parcial, incluyendo : EndoFl, que escinde los glicanos de tipo de alta mañosa e híbridos; EndoF2 , . que escinde los glicanos de tipo complejo biantenario; EndoF3, . que escinde- los glicanos complejos biantenario y más ' ramificados; y EnddH, que escinde los glicanos de tipo de alta mañosa en híbridos. Por ejemplo, el tratamiento de la PH20 .(por ejemplo una PH2.0 recombinante designada rHuPH20). con una o todas las glicosidasas .anteriores (por ejemplo EndoFl, EndoF2 EndoF3 y/o EndoH) da por resultado la desglicosilación parcial. Estos polipéptidos PH20 parcialmente desglicosilados pueden1 mostrar actividad enzimática de hialuronidasa que es comparable con los ¦polipéptidos completamente glicosilados ... En contraste, el tratamiento de PH20. con PNGaseF, una glicos.idasa que escinde todos los N-glicános, o con el inhibidor de , GlcNAc fosfotransferasa (GPT) tunicamicina, . da por . resultado la desglicosilación completa de todos los N-glicaños y por consiguiente los hace PH20 enzimáticamente inactivos. De esta manera, aunque los sitios de glicosilación N-ligados (tal como, por ejemplo, aquellos en los aminoácidos N82, -N166, N235, N254, N368, y N393 de la PH20 humana, ejemplificados en SEQ 'ID NO: .1) se pueden glicosilar, el tratamiento con una o más glicosidasas puede hacer el grado de glicosilación reducido comparado con una hialuronidasa: que no se digiere con una o más glicosidásas .

Por consiguiente, las enzimas degradadoras de hialuronano parcialmente desglicosiladas, tales como hialuronidasas solubles parcialmente desglicosiladas, se pueden producir por digestión con una o más glicosidasas , generalmente una. glicosidasa que no remueve todos los Ñ-glicanos pero desglicosila solo parcialmente la proteina. Las enzimas degradadoras de hialuronano parcialmente desglicosiladas,. incluyendo los polipéptidos PH20 , solubles parcialmente desglicosilados, pueden tener 10%, '20%, .30%, 40%, 50%, 60%, 70%; o 80% del nivel de glicosilación de un polipéptido completamente glicosilado. En un ejemplo, 1, 2, 3, 4 , 5 o 6 de los. sitios de N-glicosilación que corresponden a los aminoácidos Ñ82, N166, N235, N254,. N368, y 393 de SEQ ID NO:. 1 se desglicosilan parcialmente, tai que ya no contienen glicanos de tipo de ala mañosa o compiejos, sino más bien contienen por lo menos una porción de N-acetilglucosaminá . En algunos ejemplos, 1, 2 o .3 de los sitos de N-glicosilación que, corresponden a los aminoácidos ,N82, N166 y N254 de SEQ ID NO: 1 se desglicosilan, es ,decir., no contienen una porción de azúcar. En otro ejemplos, 3, 4, 5, .o 6 de los sitios de N-glicosilación que corresponden a los aminoácidos N82, N166,, N235, N254,. N368, 'y. N393 de SEQ ID NO: 1 se glicosilan. .Los residuos de aminoácido glicosilado.s contienen mínimamente una porción de . N-acetiiglucosamina.

Típicamente, las. enzimas degradadoras de... hialuronano parcialmente desglicosiladas , incluyendo los polipéptid s PH20 solubles parcialmente desglicosilados, muestran actividad de hialuronidasa que es 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, .90%, 100%, 110%, 120%, 13.0%, 140%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 1000% o má de . la '.actividad de hialuronidasa mostrada por el polipéptidp totalmente glicosilado. 5. Modificaciones de enzimas degradadoras de hialuronano para mejorar sus propiedades farmacociné icas Las enzimas degradadoras de hialuronano. se pueden modificar para mejorar sus propiedades farmacocinéticas , tal como al incrementar su vida media in vivo y/o actividades. La modificación de las enzimas degradadoras de hialuronano para el uso en los. métodos proporcionados en la presente o en cualquiera de las composiciones,, combinaciones y/o métodos proporcionados pueden incluir unir, directa o indirectamente a través de un ligador, tal como covalentemente o por otra ligación estable, un' polímero, tal como dextrano, un polietilenglicol (pegilación (PEG) ) o. porción de sialilo, u otro de estos polímeros tales como polímeros naturales o de azúcar , La pegilación de los productos terapéuticos se sabe que incrementa la resistencia a la proteólisis, incrementa la vida media en plasma, y disminuye la antigenicidad -. e inmunogenicidad . La unión covalente u otra estable (conjugación) de las moléculas polimérica, tal como porción de polietilenglicol . (PEG) , a la enzima degradadora de hialuronano de esta manera puede¦ impartir propiedades benéficas a la composición de enzima-polímero resultante. Estas propiedades . . incluyen biocompátibilidad mejorada, exestrés de la vida media de la proteína (y actividad enzimática) en la sangre, células y/o en otros tejidos dentro de un. sujeto, protección efectiva de la pro/teína de . las proteasas e hidrólisis, biodis.tribución mejorada, farmacocinética y/o farmacodinámica- potenciadas, y solubilidad en agua incrementada.

Los polímeros ejemplares que se pueden conjugar a la enzima degradadora de hialuronano, incluyen los homppolímeros naturales y sintéticos, tales como polioles (es decir poli-OH) , poliaminas (es decir poli-NH2) y ácidos policarboxilo (es decir poli-COOH) , y heteropolímeros. adicionales es decir polímeros que comprenden uno o más grupos de acoplamiento diferentes por ejemplo un grupo hidroxilo y grupos amina. Ejemplos de moléculas poliméricas adecuadas, incluyen moléculas poliméricas seleccionadas d entre óxidos de polialquileno .(PAO.).,- tales como polialquilenglicoles (PAG) , incluyendo polipropilenglicoles (PEG) , metoxipolietilenglicoles (mPEG) y polipropilenglicoles, éteres PEG-glicidí icos (Epox-PEG) , poli'etilenglicoles (PEGs) ramificados a. . EG-oxicarbonilimidazol ¦ (CDI-PEG) ¿ alcohol polivinilico (PVA) , policarboxilatos , polivinilpirrolídona, poli-D, L-aminoácidos , anhídrido de ácido polietilen-co-maleico, anhídrido de ácido poliestiren-co-maleico, dextranos incluyendo carboximetil-dextranos., ' héparina, . albúmina homologa, celulosas, incluyendo metil celulosas-, incluyen metilcelulosa, . carboximetilcelulosa, . etilcelulosa, hidroxietilcelulosa carboxi.e.tilcelulosa . \e hidroxipropilcelulosa, hidrolisados' de quitosan, almidones tales como almidón .de hidroxipropilo, glicógeno, agarosas y derivados de los. mismos, goma de guar, pululan, inulina, goma de xantano, carragenano, pectina, hidrolisados de . ácido algínico y biopolímeros .

Típicamente, los polímeros son óxidos de polialquileno (PAO) , tal como " óxido de polietilenó., tal como PEG, típicamente mPEG, que,, en comparación co los ¦ polisacáridós tales como dextrano, pululano y similares, tiene pocos grupos reactivos capaces de reticulación. Típicamente, los polímeros son moléculas poliméricas" no tóxicas tal como (m) polietilenglicol. (mPEG) que se puede conjugar covalentemente a' la enzima degradadora de hialuronano (por ejemplo, a los grupos de unión o sobre la superficie de la proteina) usando química relativamente simple.

Las moléculas polimé.ricas adecuadas para ..la unión a la enzima degradador.a de hialuronano incluyen, '. pero' no se limitan a, polietiíenglicol (PEG) y derivados de PEG tales como metoxi-polietilenglicoles . (mPEG) , éteres . PEG- glicidílicos (Epox-PEG) , PEG-oxicarbonilimidazol (CDI-PEG) , PEGs. ramificados, y óxido de polietileno (PEO) (véase por ejemplo.' Roberts y colaboradores, Advanced Drug Delivery Review 2002, 54: .459-476; Harris ..y. Zalipsky, s (eds.) "Poly (ethylen glycol) , Chemistry and .Biologxcal ; Applications" ACS Symposium Series 680, 1997; Mehvar y colaboradores, J. Pharm. Pharmaceut. Sci. , .3(1): 125-136,. 2000; .Harris, Na ture Reviews 2(3; -214-221 (2003); y Tsubery, J Biol. Chem 279 (37) : 38118-24,. '2004), . La molécula . polimérica puede ser de ¦ un peso molecular que varía típicamente de aproximadamente 3 kDa a aproximadamente 60 kDa. En algunas modalidades la molécula polimérica que se conjuga a una proteina, tal como rHuPH20, tiene un peso molecular de 5,' 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 o más de 60 kDa.

Varios métodos para modificar polipéptidos al unir covalentemente ( conj ugar) ' un PEG o derivado de PEG (es decir, "PEGilación" ) son . conocidos en el campo (véase: por. ejemplo, Publicación dé Patentes de E.U.A. Nos. 20060104968 y 20040235734; Patentes de E.U.A. Nos. 5,672, 662 y 6, 737,505),. Las técnicas para pegilacion incluyen, p.ero no .se limitan a, ligadores especializados y químicas de acoplamiento' (véase por ejemplo Harris, Adv. Drug Deliv. Rev.. 54:459-476, 2002)., unión de múltiples porciones de PEG a. un solo .sitio de conjugación (tal como a través del uso de PEG ramificados; véase por ejemplo, Veronese y colaboradores, .Bioorg. Med. Chem. Lett. 12: 177-180, 2002), PEGilación específica de sitio y/o mono-PEGilación (véase por ejemplo, Chapman y colaboradores, Nature Biotech. 17:780-783,· 1999), .' y PEGilación enzimática dirigida al sitio (véase por ejemplo, Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., '54:487-504, 2002) (véase, también, por ejemplo, Lu y Félix (1994.) Int. J. Peptide Protein Res.. 43: 127-138; Lu y Félix. (1993) Peptide Res. 6: 142-6, 1993; Félix y -colaboradores (1.995) Int. J. Peptide Res. 46:253-64; Bénhar.y colaboradores (1994) J. Biol. Chem.. 269: 13398-404; Brumeanu y colaboradores (1995) J Immunol. 154:3088-95; véase también, Cáliceti y colaboradores (2003) Adv. Drug Deliv.' Rev. 55(10): 1261-77 y Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8. ?t 2 ) : 3S-8S) . Los métodos y técnicas descritos en el campo pueden producir proteínas que tienen 1, 2, 3, 4, 5, 6, '7, 8, 9, 10 o más de. 10 PEG o derivados de PEG unidos a una sola molécula de proteína (véase por. ejemplo, Publicación de Patente de E.U.A. No. 20060104968)..

Numeroso reactivos de PEGilación se han descrito en él campo. Estos reactivos incluyen, pero no se limitan a, PEG activado por N-hidroxisuccinimidilo. (NHS) , mPEG succinimidilo, mPEG2-N-hldroxisuccinimida, mPEG succinimidilo alfa-metilbutanoato, mPEG succinimidil propionato, mPEG succinimidilo butanoato, éster succinimidilico de ácido- mPEG carboximetil 3-hidroxibutanoico, PEG-succinimidil propionato homobifuncional , PEG propionaldehido homobifuncional , PEG butiraldehido homobifuncional, PEG .maleimida, PEG hidrácid.a, PEG de; p-nitrofenil-car'bonato, carbonato de PEG-benzotrazole , PEG de ¦ , propionaldehido, mPEG butiraldehido, mPEG2 butiraldehido ramificado, mPEG acetilo, mPEG piperidona, mPEG metilcetona, mPEG ' "sin ligador" maleimida, mPEG vinil sulfona, mPEG tiol, mPEG ortopiridiltioester, . mPEG ortopiridil disulfuro, '. Fmoc-PEG-NHS, Boc-PEG-NHS ,.. PEG-NHS-vinil sulfona,. PEG-NHS de acrilato,. PEG-NHS de fluorescein.a, y PEG-NHS de biotina {véase por ejemplo, Monfardini "y colaboradores, Bioconjugate Che . 6:62-69, 199.5; Veronese. y colaboradores , J. Bioactive Compatible, Polimers 12: 197-20.7, 1997; Ü.S. 5 , 672 ,.662.; 'U.S. 5, 932,462; U.S. 6, 495, 659; U.S. 6,737, 505; U.S. 4,002,531; U.S. 4, 179, 337; U.S. 5,122,614.; U.S. 5,324, 844; U.S. 5,446,090; U.S. 5,612,460; U.S. 5,643, 575; U.S. 5, 766, 581; U.S. 5, 795,' 569; U.S. 5, 808,096; U.S. 5, 900, 461; U.S. 5,919,4.55; U.S. 5,985,263; U . S .. 5 , 990, 237; U.S. 6,113,9.06; U.S. 6, 214, 966; U.S. 6,258,351; U.S. 6, 340, 742; U.S. 6/413, 507; U.S. 6, 420,339; U.S. 6,-437, 025; U.S. 6, 448,369; U.S. 6, 461, 802; U. S . 6, 828, 401; U.S. 6,858,736; U.S. 2001/0021763; U.S.. 2001/0044526; U.S. 2001/0046481; U.S.. 2002/0052430; U.S. 2002/0072573;. U.S. 2002/0156047; U.S.. 2003/0114647,· U . S .'. -2003/.0143596 ; U.S.. 2003/0158333; . U.S.. 2003/0220447; U.S.. 2004/0013637; US 2004/0235734; U.S. . 2005/0114037;. U.S. 2005/0171328; U.S. 2005/0209416; EP 01064951; EP 0822199; WO 00176640; WO 0002017;. WO 0249673; WO 0500360; WO 9428.024; y WO 0187925) .

F. Formulaciones de insulina de acción súper rápida, y formulaciones estables de los mismos Las composiciones de insulina de acción súper-rápida son co-formulaciones que contienen una insulina de acción rápida, tal como un análogo de insulina de. acción rápida, (o análogo de acción rápida), y una · enzima que degrada a hialuronano. Tales composiciones pueden usarse en los métodos CSII en la presente. Una composición de insulina de acción súper-rápida proporciona una respuesta de insulina ultra-rápida que imita más cercanamente la liberación de insulina post-prandial endógena (esto es natural) de un sujeto no diabético comparado con insulinas de acción rápida convencionales, tales como análogos de insulina. Tales composiciones de insulina, de acción súper-rápida se conocen en la técnica (ver por ejemplo Publicación de ?.?,?. No . US20090304665) .

Unas composiciones de insulina de acción súper-rápida contienen una cantidad terapéuticamente efectiva de una insulina de acción rápida para controlar los niveles de glucosa en la sangre y una cantidad de una; enzima que degrada a hialuronano suficiente para hacer de la composición una composición de insulina de acción súper rápida. Cualquier insulina de acción rápida descrita en la Sección D 'y cualquier enzima que degrada a hialuronano descrita . en .la Sección E puede combinarse en una co-formulación para generar una. composición de insulina de acción súper rápida siempre que la composición resultante efectúe una respuesta de insulina ultra-rápida cuando se administra.

Generalmente, la cantidad de una insulina de acción rápida en una composición de. insulina de acción súper-rápida es desde o desde, alrededor de 10 U/mL hasta 1000 U/mL, y la cantidad de una . enzima que degrada a hialuronano es equivalente funcionalmente hasta 1 U/mL hasta 10,000 U/mL/. Por ejemplo, la cantidad de una insulina de acción rápida es o es. alrededor de o al menos 100 U/mL y la cantidad de una enzima. que degrada a hialuronano es ¦ equivalente funcionalmente hasta o alrededor de .¦ hasta o ¦ al menos 600 U/mL. En algunos, ejemplos donde la insulina de acción rápida es una insulina regular/ insulina lispro, insulina aspart o insulina glulisina' *u otra insulina de acción rápida.' de tamaño similar,- la cantidad de insulin en la composición de acción súper-rápida es. desde o desde alrededor de 0.35 mg/mL hasta 35 mg/mL.

En ejemplos particulares, la enzima que degrada .a hialuronano es una . co-formulación estable como.se describe en la solicitud provisional de E.U.A. No. 61/520,962 y titulada "Stable co-formu.lations of a hyaluronan-dégrading. enzyme and insulin." En ejemplos particulares, para propósitos de infusión subcutánea, continua, una composición de insulina de acción súper-rápida está estable durante al menos 3 .días a una temperatura desde o desde alrededor de 32°G hasta 40°C. 1. Co-formulaciones Estables Las co-for ulaciones proporcionadas en. la presente cotienen una cantidad terapéuticamente efectiva de una insulina de acción rápida, tal como un análogo de insulina de acción rápida (por ejemplo insulina lispró, insulina aspart o insulina glulisina) . Por ejemplo, las co-formulaciones contienen una insulina de acción rápida en una cantidad entre o alrededor de entre 10 U/mL hasta 1000 U/mL, 100 U/mL hasta 1000 U/mL, or 500 Ü/rr.L hasta 1000 Ú/mL, tal como al menos o alrededor de al- menos 10 U/mL, 20 U/mL, .30 U/mL, 40' U/mL, 50 U/mL, 60 U/mL, 70 U/mL, 80 U/mL, 90. U/mL, .100 U/mL, 150 U/mL, 200 U/mL, 250 U/mL, 300 U/mL, 350 U/mL, 400 U/mL, 450 U/ml, 500 U/mL o 1000 U/mL. Por ejemplo, las co-formulaciones proporcionadas en la presente contienen una . insulina de acción rápida,, tal como un análogo de insulina de acción rápida (por ej emplo : insulina lispro, insulina aspart o insulina glulisina) en una cantidad que es al menos o al menos alrededor de 100 U/mL.

La cantidad de enzima 'que degrada a hialuronano, tal como una hialuronidasa por ejemplo un . PH20 (por ejemplo rHuPH20), en las co-formulaciones estables es una cantidad que hace la composición de acción súper-rápida . Por ejemplo, la enzima que degrada a hialuronano es en una cantidad que es equivalente funcionalmente a al menos o alrededor de al menos 30 Unidades/mL. Por ejemplo, las co-formulaciones. estables contienen una enzima que degrada a hialuronano, tal como una hialuronidasa por ejemplo un PH20 (por ejemplo rHuPH20) en una cantidad entre o alrededor de entre 30 Unidades/mL hasta 3000 U/mL, 300 U/mL hasta 2000 U/mL. o 600 U/mL hasta 2000 U/mL o 600 U/mL hasta 1000 U/mL, tal. como menos o alrededor de al menos 30 U/mL, 35 U/mL, 40 U/mL/ 5.0 U/mL, 100 U/mL, 200 U/mL, 300 U/mL, 400 U/mL,. 500 U/mL, 600 U/mL, 700 U/mL, 800 U/mL, 900 U/mL, 1000 U/ml, 2000. U/mL or 3000 U/mL. Por ejemplo, las. co-formulaciones proporcionadas en la presente contienen un PH20 (por ejemplo rHuPH20) que está en una cantidad que es al . menos 100 U/mL hasta 1000.-.U/mL, por ejemplo al menos o alrededor de al. menos, or alrededor de - o 600 U/mL.

El volumen de las co-formulaciones estables puede ser cualquier volumen adecuado para el recipiente en el cual .se proporciona. En . algunos ejemplos, " las co-formulaciones se proporcionan en un vial, jeringa, pluma, depósito para una bomba o un sistema de circuito cerrado, o cualquier, otro recipiente adecuado. Por ejemplo, las co-formulaciones proporcionados en la presente están entre o alrededor de entre 0.1 mL hasta 500 mL, tal como- 0.1 inL hasta 100 mL, 1 mL hasta 100 mL, 0.1 mL hasta 50. mL, tal como al menos o alrededor de al menos or alrededor de o 0.1 mL, .1 mL, 2. mL, .3 mL, .4 mL, 5 mL, 10 mL, 15 mL, 20 mL, 30 mL, 4.0 mL, 50 mL. o más : .

En las co-formulaciones estables, la estabilidad de ' la insulina, incluyendo análogos de insulina, en las formulaciones es una función de la recuperación, pureza y/o actividad de la insulina bajo almacenamiento a temperaturas de al menos. o alrededor de 32°C hasta 40°C. Las formulaciones proporcionadas en la presente mantienen la recuperación, pureza y/o actividad de insulina de manera que' las formulaciones son adecuadas para uso terapéutico', como se describe en la presente. Por ejemplo,, en las formulaciones proporcionadas en., la presente, la pureza de insulina (por ejemplo como se evalúa por RP-HPLC u otro método similar) con el paso del tiempo y bajo almacenamiento o condiciones . de uso como se describe en la presente es al menos 90% de la pureza, potencia o recuperación de insulina en la formulación antes de almacenamiento o uso, por ejemplo, al menos .90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o ' más . Generalmente, para pureza de insulina (por ejemplo . por RP-HPLC) .la especificación aceptable objetivo es al menos o alrededor de 90% de pureza o alrededor de o mayor que 90% de pureza. En otros ejemplos, la pureza dé insulina puede evaluarse como una función de agregación de la insulina, por ejemplo, usando cromatografía por exclusión de tamaño desnaturalizada; o sin desnaturalización. (SEC) . En tales ejemplos, en las co-formul.aciones proporcionadas en la presente contienen menos de 2% de especie de insulina en peso molecular alto (HMWt) por área en pico,, por, ejemplo, menos de 1.9%-, 1.8%, 1.7%, 1.6%, 1.5%, 1.4%, 1.3%, '1.2%, 1.1%, 1.0% ó rnenos.

En las co-formulaciones estables, la estabilidad de una enzima que degrada a hialuronano, incluyendo una hialuronidasa tal como un ??2? (por ejemplo rHuPH20) , .en las formulaciones es una función de la recuperación- y/o actividad de la enzima bajo almacenamiento a temperaturas de al menos o alrededor de 32°G hasta 40°C. Las formulaciones proporcionadas en la presente mantienen la recuperación y/o actividad de hialuronidasa de manera que las . formulaciones son adecuadas para, uso terapéutico como se describe en la presente. En las eo-formulaciones estables proporcionados en la presente, la actividad de la enzima que ¦ degrada .a hialurónano, tal como una hialuronidasa, por ejemplo un ??2?, típicamente es mayor que 50% de la actividad de ' hialuronidasa inicial . durante al . menos 3 días a una temperatura desde o desde alrededor dé 32°C hasta 40°C, tal como al .menos o mayor que 55%, 60%, 65%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, .94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%. o más. Generalmente, para actividad de hialuronidasa la especificación aceptable objetivo para estabilidad es al menos 62% de la actividad de la enzima. De esta manera, por ejemplo, en una solución formulada con 600 U/mL de una enzima que degrada a hialurónano, por ejemplo rHuPH20, al menos o alrededor de al menos 360 Unidades/mL, 365 U/mL, 370.U/mL, 37,5 U/mL, 380 U/mL, 390 U/mL, 420 U/mL, 480 U/mL, 540 U/mL,. 546 U/mL, ¦ 552 U/mL, 558 U/mL, 564. U/mL, 570 U/mL, 576 U/mL, -582 U/mL, 588 U/mL, 594- U/mL o más actividad se mantiene con el paso del tiempo y bajo almacenamiento o condiciones de uso. En otros' ejemplos, la estabilidad puede evaluarse como una función de recuperación de la enzima, por ejemplo, usando. RP-HPLC. En tales ejemplos., la recuperación : de e.nzima de hialuronidasa' en · las co-formulaciones estables proporcionadas en la presente es desde entre o alrededor de entre 60% hasta 140%. Por ejemplo, en las formulaciones.. proporcionadas en la . presente la recuperación de enzima de hialuronidasa ' es desde entre o alrededor de entre 3-7 µs/mL .

. Típicamente, los compuestos se formulan en composiciones farmacéuticas usando. técnicas y procedimientos bien conocidos en el . campo (véase por ejemplo Ansel Introduction a Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126). Las composiciones farmacéuticamente aceptables en vista de. las aprobaciones por : una agencia reguladora u otra agencia preparada de acuerdo con la farmacopea . generalmente reconocida para el uso en animales y en. humanos . La formulación se debe adaptar al modo de administración.

Las formulaciones estables se: pueden proporcionar como una preparación farmacéutica en. forma líquida- como soluciones, jarabes . o. suspensiones'. En forma líquida, las preparaciones farmacéuticas se pueden proporcionar como una preparación concentrada que se diluye a una- concentración terapéuticamente efectiva antes del uso. Generalmente, . las preparaciones se proporcionan en una forma de dosificación que no requiere dilución para el uso. Estas .' preparaciones líquidas se pueden.¦ preparar por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sórbitol, derivados .de celulosa o grasas ,. comestibles hidrogenadas) ; . agentes emulsificantes (por ejemplo lecitina o acacia); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceites de almendras, esteres aceitosos, o aceites vegetales fraccionados) ; , conservadores (por- ejemplo,, metilo o propil-p-hidroxibenzoatos o' ácido sórbico) . En otro ejemplo, las preparaciones farmacéuticas se pueden presentar . en forma liofilizada para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes del uso.

. Proporcionada a continuación es una descripción de los componentes adicionales, además de. la enzima que degrada a hialuronano e insulina, que se proporcionan', en las co-formula.ciones estables en la presente. El equilibrio particular de requerimientos para maximinar la estabilidad de ambas proteínas contenidas en las co.-formulacione.s proporcionadas en la presente de infusión subcutánea continua de la co-formulación .durante al menos 3 días alcanzable, mientras que mantiene ,1a estabilidad de .las proteínas. Una descripción de cada uno de los componentes o condiciones, tales como excipientes, estabilizadores . o. pH, s . proporciona a continuación.

Típicamente, la composición de ¦ co-formulación estable tiene un pH de entre o alrededor de entre 6.5 hasta 7.5. y también contiene NaCl en una concentración entre o ' alrededor de entre 120 mM hasta 200 mM, una cantidad efectiva antimicrobiana de un conservador o mezcla de conservadores, un agente. o agentes estabilizantes . . a. NaCl y pH En particular, .se encuentra en la presente que aunque la insulina se cristaliza a 2°C hasta 8°C en concentraciones de sal altas ni pH bajo, no se cristaliza en concentraciones.de sal altas ni pH bajo a temperaturas superiores de 32°C hasta 40°C. En consecuencia, el requerimiento opuesto de la concentración de sal alta y pH bajo requerido por las enzimas que degradan a hialuronano (por ejemplo ??20)· para mantener su estabilidad en temperaturas altas de 32°C .hasta 40°C es mas compatible en temperaturas superiores durante al menos un periodo de tiempo corto de al menos 3 días. También, las mismas formulaciones de sal alta y pH bajo confieren estabilidad similar entre y en medio de los análogos de insulina, a pesar de las diferencias en solubilidad aparente que afecta la. estabilidad de insulina a las temperaturas inferiores.

Por ejemplo, . las co-formulaciones proporcionadas, en la presente, que. están estables a temperatura elevada de 32°C hasta 4.0°C durante al menos 3 dias contienen NaCl 120\mM hasta 200 mM, tal como NaCl 150 mM hasta NaCl 200 mM o NaCl 160 mM hasta NaCl 180 mM, por ejemplo en o alrededor de NaCl 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, 155 mM, 160 mM, 165 mM, 170 mM, 175 mM, 180 mM, 185 mM, 190 mM, 195 rnM o 200 mM. También, las co-formulaciones proporcionadas en la presente que están establés bajo temperatura elevada de 32°C hasta 40°C durante al menos 3 días contienen un pH de 6.5 hasta 7.5 o 6.5 hasta 7.2, tal como o alrededor de un pH de 6.5 ± 0.2, 6.6 ± 0.2, 6.7 ± 0.2, 6.8 ± 0.2, 6.9 ± 0.2 7.0 ± 0.2, 7.1. 0. ± 0.2, 7.2 .0 ± 0.2, 7..3 ± 0.2, 7.4 ± 0.2 o 7.5 ± 0.2. .La. solubilidad de .insulina, particularmente en temperaturas refrigeradas, disminuye en estas condiciones de sal incrementadas y pH reducido. De esta manera tales formulaciones típicamente no se almacenan 'a temperaturas refrigeradas o ambiente . antes del uso. b. Inhibidor de Hialuronidasa En otro ejemplo, las co-formulaciones estables que contienen como un agente estabilizante un inhibidor de hialuronidasa para- estabilizar la enzima qüe degrada a hialuronano en la co-formulación . En ejemplos, particulares, el inhibidor de hialuronidasa es uno que reacciona con la insulina o la enzima degradadora de hialuronano en una manera asociada y no covalente, y no forma complejos covalentes con la . insulina, .o una enzima degradadora; de hialuronano. Él inhibidor de hialuronidasa se proporciona por lo menos- en su concentración de equilibrio. Una persona de experiencia en el campo está familiarizado con varias clases de inhibidores de hialuronidasa (véase por ejemplo Girish y colaboradores (2009) Current - Medicinal Chemistry, 16:2261-2288, y referencias, citadas, en las presentes). Una persona de experiencia en el campo conoce o puede determinar por métodos estándares en el campo la concentración de equilibrio, dé un inhibidor de hialuronidasa en una . composición de reacción no estable en. la presente. La elección ..del inhibidor de hialuronidasa dependerá en la enzima degradadora de hialuronano particular usada en la composición. Por ejemplo, el hialuronano es un inhibidor de hialuronidasa ej emplar para el uso en las composiciones estables en la presente cuando la enzima degradadora de hialuronano es una PH20.

Los' inhibidores de hialuronidasa ejemplares para el. uso como agentes estabilizantes en la presente incluyen, pero · no se limitan a, una proteína, glicosaminoglicano (GAG) ,' polisacáridos , ácido graso, lanostanoides, antibióticos, anti-nematodos , compuestos orgánicos .sintéticos o un componente bioactivo derivado de plantas. Por ejemplo, un componente bioactivo derivado de plantas de hialuronidasa puede ser un alcaloide,.' antioxidante, poli-fenol",' flavoñoides, terpenoides y fármacos : anti-inflamatorios . Los inhibidores de hialuronidasa ejemplares incluyen, por ejemplo, inhibidor de hialuronidasa en suero, glicoproteina de Withania (WSG) , heparina, sulfato de heparina, sulfato de dermatán, quitosanes, ß- (1 , ) -galacto-oligosacáridos, . verbascosa sulfatada, planteosa sulfatada, pectina, poli (estireno-4-sulfonato) , sulfato ¦ de dextrano, alginato de sodio, polisacárido de Undaria pinnatifida, polímero de condensación de ácido mandélico, ácidos sicosatrienoico, ácido nervónico, ácido oleanólico, ácido aristoloquico, ajmalina, reserpina, flavona, desmetoxicentauredina, quercetina, apigenina, kaempferol , silibina., luteolina, luteolin-7-glucosido, floretina, apinina, hesperidina, . hesperidina sulfonada, calicosin-7-0-p-D-glucopiranosido-, flavona-7-sulfato de sodio, flavona 7-fluoro- ' -hidroxiflavona, 4 V-cloro- , 6-dimetoxicalcona, 5-hidroxiflavona 7-sulfato de sodio, miricetina, rutina-, morina, glicirricina,-. vitamina C, ácido D-isoascorbic.o, 1,4-lactona D-sacarina, ácido L-ascórbico -6-hexadecanoato (Vcpal) , vicamina C 6-O-acilada, catequina, ácido nordihidroguaiaretico, curcumina, galato de N-propilo, ácido tánico, ácido elagico, ácido gálico, florofucofuroecol A, diecol, 8,8'-biecol, procianidina,. gosipol, celecoxib, nimesulida, dexametasona, indometrina, fenoprofen, fenilbutazona,' oxifenbutazona, salicilatos, cromogilicato de disodio, aurotiomalato de sodio, transilist, traxanox, ivermictina, linocomicina y espectinomicina, sulfametoxazol y trimertoprima, sulfato de neomicina, ácido 3a-acetilpoliporenico ' A, ácido (25S) -.( +) -12a-hidroxi-3 -metilcarboxiacetato-24-metilanosta-8 , 24 (31) -dieno-26-oico, lanostanoide, ácido poliporénico C, ' PS.53 (ácido hidroquinona-sulfónico-polímero formaldehido) , . polímero de poli (estiren.o-4-sulfonato) , VERSÁ--TL 502, acido 1-tetradecano sulfónico, polímero de condensación- de ácido- mandélico (SAMMA) ,· 1,3-diacetilbenzimidazol-2-tiona, bencimidazol 2-tiona N-monoacilada, . bencimidazol-2tiona, .. . N, N 1 -diacilada bencimidazol-2-tioná, derivado de alquil-2-fenilindol , 3-propanoilbenzoxazol-2-tiona, derivado de indol N-alquilado, derivado de indol N-acilado, derivado de', benzotiazol, derivado de iridol-2- y 3-carboxamida N-sustituido, análoqos halogenados (cloro y fluoro) de derivado de indol-2- · y 3-carboxamida N-sustituido, 2- ( 4-hidroxifenil ) -3-fenilindol , indol carboxamidas ,. indol acetamidas , 3-benzolil-l-metil- -fenil-4-piperidinol, derivado de benzoato de benzoil fenilo, derivado de .1-arginina, guanidinio . HCL, .. L-NAME, HCN, linamarina, amigdalina, hederagenina,. aescina, CIS-hinoquiresinol y 1, 3-di-p- hidroxifenil-4-penten^l-ona ..

Por ejemplo, el hialuronano (HA) se incluye en las co-formulaciones proporcionadas en la presente que están estables en. condiciones de estrés de temperaturas elevadas de 32°C hasta 40°C durante al' menos 3 días. Ya que los oligóme.ros HA son el sustrato/producto de la reacción enzimática de una ; enzima que degrada a hialuronano con hialuronano, los oligómeros de hialuronáno pueden enlazar al sitio activo de la enzima y provoca el efecto estabilizante. En los ejemplos en la presente, las co-formulaciones estables contienen . hialuronano (ácido hialurónico; HA) que tiene un peso molecular de 5 kDa hasta 5,000 kDa, 5 kDa hasta o hasta alrededor de 1, 000. kDa, 5 kDa hasta o hasta alrededor de 20.0 kDa, ó 5 kDa hasta o hasta alrededor de 50 kDa. En particular, el peso molecular de HA es menor qüe 10 kDa. El HA. puede ser un oligos cárido, compuesto de disacáridos, tal como un 2mero hasta 30mero o un 4mero hasta 16mero. Las co-formulaciones de insulina y una enzima que degrada a hialuronano tal como una hialuronidasa, por ejemplo, un PH20 (por ejemplo rHuPH20) contiene HA en una concentración de entre o alrededor de entre 1 mg/mL hasta 20 mg/mL, tal como al menos o alrededor de 1 mg/mL, 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7. mg/mL, 8 mg/mL, 9 mg/mL, 10 mg/mL, 11 mg/mL,' 12 mg/mL, 13 mg/mL, 14 mg/mL, 15 mg/mL, 16 mg/mL, 17 mg/mL, 18 mg/mL., 19 mg/mL o 20 mg/mL o más. HA.. Las có-formulaciones ejemplares estables . incluyen desde o desde alrededor de 8 mg/mL hasta o hasta alrededor de 12 mg/mL HA, tal como, por ejemplo 10 mg/mL o alrededor de 10 mg/mL. En 22c algunos ejemplos, la relación molar de HA para enzima que degrada . a hialuronanó es . o es alrededor .de .100,000:1, 95,000:1, 90, 000:1, 85-,000:l, 80,000:1,. 75,000:1, '7.0,00.0:1, 65,000:1, 60,000:1, 55,000:1, 50,000:1,, 45, 000 : 1, ..40, 000 :.l, 35,000:1, 30,000:1, 25,000:1, 20,000 : 1, 15, 000 : 1, 10,000:1, 5,000:1, 1,000:1, 900:1, 800:1, 700:1, 600:1, 500:1, 400:1, 300:1, 200:1, o 100:1 o menos.

No obstante,, también se descubrió que a través del tiempo bajo condiciones, de estrés de temperaturas elevadas de 32°C a 40°C, tales, como mayor que 1 semana o 2 semanas a 37 °C, la presencia de un inhibidor de hialuronidasa , tal como HA, .¦ en la co-formuiación puede, dar por resultado, la degradación . de la insulina, dando por resultado de esta manera en aductos de^ análogos de HA-insulina covalentes. Por ejemplo, la presencia de altas concentraciones' de HA en las co-formulaciones proporcionadas en la presente a mostrado por la cromatografía líquida dé alto desempeño dé fase inversa (RP-HPLC) que provocan la degradación de la insulina AspartMR después de. 1 semana a 37°C.y la insulina GlulisinaMR después de 2 Semanas a .30 °C . El análisis de espectrometría de masas-cromatografía líquida (LC-MS) indicó que algunos de los productos de degradación son aductos de glicación análogos de HA-insülina covalentes ' formados por la . reacción de insulina con el extremo reductor del HA. Por ejemplo, se determinó un pico que es el producto de la insulina AspartMR y una HA de 7mer mientras que otro pico fue el producto de la insulina AspartMR y un HA de traer.

La presencia de un inhibidor de hialuronidasa, tal como HA, también puede tener efectos en la. precipitación y cambio de color de la co-fqrmulación . Por consiguiente, mientras que el HA mejora la estabilidad de la enzima degradadora de hialuronano en las condiciones de estrés de temperaturas elevadas de 32°C a 40°C, también puede tener ;efectos en la degradación . de la insulina, precipitación y color de cambio de la co-formulación . Está dentro del nivel de una persona experta en el campo supervisar estas . condiciones dentro de los parámetros de seguridad y farmacológicos . deseados y directrices. Generalmente, las co-formulaciónes estables proporcionadas en la presente que contienen un, inhibidor de hialuronidasa, tal : como HA, son estables a temperaturas elevadas., tales como bajo condiciones de estrés de temperaturas de 32 °C a 40 °C durante por lo menos 3 horas pero no más de 7 días debido a los efectos en estos parámetros.

En algunos ejemplos proporcionados en la . resente, se usa un inhibidor, de hialuronidasa. que no es capaz de formar complejos covalentes con la insulina o enzimas degradadoras de hialuronano. Por consiguiente, . los inhibidores no covalentes que actúan por la .' ligación asociativa se contemplan en las formulaciones en la presente. Por ejemplo, las co-formulaciones estables que contienen HA con un extremo reductor reaccionado de modo que ya no es posible formar aductos- de glicación con la insulina. Por ejemplo, en algunos ejemplos, el. HA usado en las co-formulaciones proporcionadas en la presente se han modificado por aminación reductiva. La aminación reductiva implica la formación de una base Schiff entre un aldehido y un amina, que luego se reduce para formar la amina más estable. El extremo reductor de un azúcar, es decir, HA, existe como una mezcla de equilibrio de la forma hemiacetal cíclica y l forma de aldehido, de cadena abierta. Bajo condiciones, adecuadas conocidas de una . persona experta en el campo, los grupos amina se condensarán con el aldehido de azúcar para formar un ión de iminio que se puede, reducir a una. amina, con un agente reductor tal como cianoborohidruro de sodio (véase, por 'ejemplo Gildersleeve y colaboradores, (2008) Bioconjug Chem 19 (7) : 1485-1490)';.. El HA resultante no es reactivo a la insulina y es incapaz de formar aductos de glicación de insulina. c. Solución amortiguadora . . Cualquier solución amortiguadora se puede usar en có-formulaciones proporcionadas en la presente siempre y cuando no afecten adversamente la capacidad de la formulación, y soporte el requisito de intervalo de pH requerido. Ejemplos de soluciones amortiguadoras particularmente .adecuadas incluyen Tris, succ'inato, acetato, soluciones amortiguadoras de fosfato, histidina, citrato, aconitato, malato y carbonato. Aquellas personas de experiencia en el campo, sin embargo, reconocerán que las formulaciones proporcionadas en la presente no se limitan a una solución amortiguadora particular, siempre y cuando . la solución amortiguadora proporcione un grado aceptable de estabilidad de pH, o "capacidad amortiguadora" en el intervalo indicado. Generalmente, una solución amortiguadora, tiene una capacidad amortiguadora adecuada dentro de . aproximadamente 1 unidad de pH de pK (Lachman y colaboradores .1986) . La idoneidad, de la solución amortiguadora- se puede evaluar con base en las tabulaciones pK ¦¦ publicadas o se . puede determinar empíricamente por los métodos bien conocidos en el campo. El pH de la solución , se puede ajustar ai punto final deseado dentro .del intervalo como se describen en lo anterior, por ejemplo usando cualguiera ácido aceptable o base.

Las soluciones amortiguadoras que se pueden incluir en las co-formulaciones proporcionadas en la. presente incluyen, pero no se limitan a Tris . (Trometamina) , histidina, soluciones amortiguadoras de fosfato, tal como . fosfato ele sodio dibásico, y soluciones amortiguadoras y de citrato. Por ejemplo, la solución amortiguadora . puede ser- una solución amortiguadora de clorhidrato de histidina (histidina/HCl) . Generalmente, el agente amortiguador está presente en una cantidad en la presente para mantener el intervalo de pH de la co-formulación entre o aproximadamente entre 7.0 hasta 7.6, por ejemplo entre o aproximadamente entre 6.8 a 7.8 tal como entre o aproximadamente entre 7.0 a 7.6. Estos agentes amortiguadores pueden estar presentes, en. las formulaciones en concentraciones entre o aproximadamente entre 1 mM a 100 mM, tal como 10 mM a 50. mM o 20 mM a 40 mM, tal como en . o aproximadamente 30 mM. Por ejemplo, esos agentes amortiguadores pueden estar presentes en las co-formulacionés en una concentración de o aproximadamente o por lo ' menos 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, .14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45- mM, 50 mM, 55 mM, .60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, o más.

Ejemplares, de las soluciones amortiguadoras en las cp-formulacionés en la presente son las soluciones amortiguadoras de.' ligación no de metal tal como Tris, que reducen la precipitación de la insulina comparadas con las soluciones amortiguadoras de ligación, a metal, tal como soluciones amortiguadoras de fosfato. La inclusión de Tris como una solución amortiguadora, en las co-formulacionés proporcionadas en, la presente tiene beneficios, adicionales. Por ejemplo, el pH de una solución que se amortigua con Tris es afectado por la temperatura en la cual la solución se mantiene. De esta, manera, cuando las co-formulaciones de insulina y enzima degradadora dé hialuronano se preparan a temperatura ambiente a pH 7.3, en refrigeración, el . pH se incrementa a aproximadamente pH 7.6. Este pH promueve ¦ la solubilidad de la. insulina en una temperatura donde la insulina es de otra manera probable que' sea insoluble. A la inversa, en temperaturas incrementadas, el pH de la formulación disminuye aproximadamente pH 7.1, 1?· cual promueve la . estabilidad de la enzima degradadora de hialuronano en una .temperatura en la cual la enzima de otra manera es probable, que sea inestable. De esta manera, la solubilidad y estabilidad de insulina y una enzima degradadora de hialuronano, tal como una hialuronidasa por ejemplo PH20 (por ejemplo rHuPH20) se maximiza cuando las co-formulaciones contienen Tris como una solución ': amortiguadora comparada con las- otras soluciones amortiguadoras. Además, debido a que el Tris es un ión positivo, la adición de NaCl en la solución como un contraión no se requiere. Esto también es benéfico a la estabilidad global de. la co-formulación debido a que el NaCl en altas¦ concentraciones es perjudicial a la solubilidad de. la insulina.

Típicamente,. Tris sé incluye en las co-formulaciones proporcionadas en. la presente en una . concentración de o alrededor de 10 mM hasta 50 mM, tal como, por ejemplo, .10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM,. 30 mM, .35 mM, 40 mM, 45 mM o..50 mM. En ejemplos particulares,- las co-formulaciones. contienen o contienen alrededor de Tris 20 mM hasta.30 mM, tal como Tris 21 mM, 22 mM, 23 mM, 24 mM, 25 mM,. 26 mM, 27 mM-, 28 mM, 29 mM o 30 mM. En ejemplos particulares, las co-formulaciones proporcionadas en la presente contienen Tris a- una concentración de o alrededor de 30 mM. d. Conservadores Los conservadores pueden tener un efecto prejudicial en la solubilidad de . la . insulina y la estabilidad y actividad de las enzimas degradadora de hialuronano, tal como PH20 ' (por ejemplo rHuPH20 ),¦'.. mientras que al mismo tiempo estabilizan las moléculas ' de insulina hexaméricas y son necesarios como un agente antimicrobiano en formulaciones de múltiples dosis. De esta manera, uno o más conservadores presentes en la co-formulación no pueden, desestabilizar sustancialmente la enzima degradadora de hialuronano, tal como una . hialurónidasa por ejemplo una PH20 (por ejemplo rHuPH20),; de modo que pierde su actividad durante las condiciones de almacenamiento (por ejemplo a través del tiempo, y en temperatura variada) .

Además, estos conservadores deben, estar- presentes en una concentración suficiente para estabilizar los hexámeros de insulina y ejercer el efecto antimicrobiano requerido, pero no estar tan concentrados como para disminuir la solubilidad de la insulina. De manera importante, los conservadores deben estar presentes en una concentración suficiente para proporcionar los requisitos antimicrobianos de, por ejemplo, la Farmacopea de los Estrados Unidos (USP) y la Farmacopea Europea (EP) . Típicamente, las formulaciones que cumplen con los requisitos antimicrobianos EP (EPA o EPB) contienen más conservador que aquellos formulados solo para cumplir con los requisitos antimicrobianos. USP .

Por consiguiente, las co-formulaciones estables contienen conservadores en una cantidad que muestra la actividad anti-microbiana al exterminar o al inhibir la propagación de organismos microbianos en una .muestra de la composición como' es evaluado en una prueba de efectividad conservadora antimicrobiana (APET) . Una persona de experiencia en el campo está familiarizada con la prueba de eficacia de conservadora antimicrobiana y los estándares que se cumplen bajo el. USP- y EPA o EPB a . fin-de cumplir con los requisitos mínimos.. En general, la prueba de efectividad de conservadora antimicrobiana implica ' estimular una composición, por ejemplo, una co-formulación proporcionada en la presente con inóculos pre-escritos de microorganismos adecuados, es decir, bacteria, levadura y hongos, almacenar la preparación inoculada en una temperatura prescrita, retirar las muestras a' intervalos especificados de. tiempo y contar los organismos en la muestra, (véase, Sutton and Porter, (2002) PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology 56 ( 11 ) ;.300-311 ; The United States . Pharmacopeial Convention, Inc., (effective January 1, 2002)·, The United States Pharmacopeia 25th Revisión, RoCkville, MD, Capitulo <51> Antimicrobial Effectiveness Testing; and European Pharmacopoeia , Capitulo 5.1.3, Efficacy of Antimicrobial Preservation) . Los microorganismos usados en. el estimulo incluyen generalmente tres cepas de . bacterias, particularmenté E. coli (ATCC No. . 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC No. 9027) y Staphylococcus aureus (ATCC No. 6538),. levadura (Candida albicans ATCC No. 10231) y hongos (Aspergillus nige , ATCC No. 1.6404), . todos de ·¦ los cuales se agregan tal que la composición inoculada contiene 105 o 106 de unidades formadoras de colonias (cfu) de microorganismos por mi de composición. Las propiedades conservadoras de la composición se consideran adecuadas si, bajo las condiciones de la prueba, existe una falla significativa o- ningún incremento, como se especifica en la Tabla 5, a continuación, en el número de microorganismos en la composición inoculada después de los tiempos y en las temperaturas prescritas. Los criterios para la evaluación se proporcionan en términos de reducción logarítmica .en. el número de microorganismos viables como es comparado con. la muestra inicial o el punto de tiempo previo .

Tabla 5. Requisitos USP y EP para la prueba de efectividad antimicrobiana ÜSP Criterios para aprobación Bacteria No' menor que 1.0 de reducción logarítmica del conteo calculado inicial a 7 días, no menor que 3.0. de reducción logarítmica del conteo inicial a 14 días, y ningún incremento del conteo de 14 días a 28 días. Se define sin incremento como no más de 0.5· logio unidades más altas que el valor medido previo.

Levadura Ningún incremento del conteo calculado inicial' moho a 7, 14 y 28 días. Ningún incremento se define como no más de 0.5. logio unidades más altas que el valor medido previo.

EPA Criterios para aprobación.

Bacterias Reducción ' de 2 log en el¦ número de. microorganismos viables contra el valor obtenido para el inoculo a 6 horas, una reducción de 3 log. en el número de microorganismos viables contra . el valor obtenido para el inoculo a 24 horas y sin. ninguna recuperación a 28 días.

Levadura o Reducción de 2 log en el número de moho microorganismos viables. contra el valor obtenido para el . inoculo a 7 días y ningún Específicamente, la composición, . por ejemplo, la có-formulación, se reparte en alícuotas, en por lo' menos. 5 recipientes, uno cada uno' para cada, una de las bacterias :u hongos (Escherichia. coli (ATCC No. 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC No. .9027), Staphylococcus aureus (ATCC No. 653.8), Candida albicans (ATCC No. 10231) y Aspergillus niger (ATCC No. 16404)) . Cada recipiente luego se inocula con- uno de los organismos; de prueba para proporcionar un inoculo de 105 o 106 microorganismos por mL de la composición, con él inoculo que no excede 1% del volumen de la composición. Las composiciones inoculadas se mantienen; en una temperatura entre 20 y 25°C durante un periodo de 28 días, y las. muestras se removieron a 6 horas, 24 horas, 7 días, 14 dias y 28 días, dependiendo de los criterios expuestos en la Tabla 6 anterior. El número de microorganismos viables (cfu) en cada muestra se determina por el conteo de placas por filtración con membrana. Finalmente, la cfu para cada muestra, se compara a ya sea el inoculo de la muestra previa y . la reducción logaritmica.se determina.

Bajo los estándares USP, la velocidad o nivel de la actividad antimicrobiana de los conservadores en las muestras inoculadas con los organismos microbianos es por lo menos. 1.0 logio de unidad de reducción de los organismos bacterianos a.7 dias después de la inoculación; por lo menos 3.0 logio de unidad de reducción . de los organismos bacterianos a 14 dias después de la inoculación; y por lo menos ningún incremento adicional, es decir, no más de 0.5.1ogio unidad de incremento., en los organismos bacterianos desde el día 14 hasta -el- día 28 después de la inoculación de la composición con el inoculo microbiano. Para los organismos fúngicos de acuerdo con los estándares USP, la velocidad o .nivel, de la actividad antimicrobiana de los conservadores en las muestras inoculadas con los organismos microbianos es por. lo menos ningún incremento de la cantidad inicial después de 7, 14 : y 28 días después de la inoculación de la composición con el inoculo microbiano. Bajo los estándares EPB, o EP mínimos, la velocidad o nivel de la actividad antimicrobiana de los conservadores en las muestras inoculadas con los organismos microbianos es por lo menos 1 logio unidad de reducción de organismos bacterianos a 24 horas después de la inoculación; por lo menos a 3 logio unidad de reducción de organismo bacterianos, a 7 días después de la inoculación; y por lo menos ningún incremento adicional, es decir, no . más de 0.5 logio unidad de incremente, en ios organismos bacterianos 28 días después de la inoculación de la composición con el inoculo microbiano. Los estándares ??? requieren por lo menos una. reducción de 2 logio unidades de organismos bacterianos .a 6 horas después de la inoculación, con por lo menos una reducción de 3 iogio unidades de organismos bacterianos a 24 horas después de la inoculación, y ninguna recuperación de los organismo bacterianos 28 días después de la inoculación. Para los organismos fungióos de acuerdo con los estándares EPB mínimos, la velocidad o nivel de la actividad antimicrobiana de los conservadores en las muestras inoculadas con los organismos microbianos es por lo menos 1 logio unidad de reducción de organismos fúngicos en 14 días después de la inoculación y ningún incremento en los organismos fúngicos a 28 días después de la inoculación de la composición, y los estándares EPA incrementados /requieren una reducción de 2 logio unidad a 7 días después de la inoculación y ningún incremento en los organismos fúngicos a 28 días después de la. inoculación de la composición.

Los ejemplos no limitantes de conservadores que se pueden incluir en.. as : co-formulaciones proporcionadas en la presente incluyen, pero no se limitan a,' fenol, meta-cresol (m-cresol) , metilparabeno, alcohol bencílico, timerosal, cloruro de benzalconio, 4-cloro-l-butanol, diclo.rohidrato de clorhexidina, digluconato de clorhexidina, L-fenilalanina, EDTA, bronopol (2-bromo-2-nitropropano-l , 3-diol ) , acetato fenilmercúrico, glicero'l (glicerina) , imidurea, clorhexidina, dehidroacetato de sodio, orto-cresol (o-cresol) , para-cresol (p-cresol) , . clorocresol, cetrimida, cloruro benzetonío, etilparábeno, propilparabeno o butilparabeno y cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, las co-formulaciones proporcionadas en la presente pueden contener un solo conservador. En otros ejemplos, las co-formulacionés contienen por lo menos dos diferentes conservadores o por lo menos tres diferentes conservadores.. Por ejemplo, las co-formulaciones proporcionadas en la presente pueden contener dos conservadores tales como L-fenilalanina y m-cresol, L-fenilalanina y metilparabeno, L-fenilalanina y fenol, m-cresol y metilparabeno, fenol y metilparabeno, m-cresol y fenol u otras combinaciones similares. En un ejemplo, el conservador en la formulación contiene ^ por . lo ' menos ün conservador fenólico. Por ejemplo, la. co-formulación contiene fenol, m-cresol o fenol y m-cresol..

En las co-formulaciones proporcionadas en la presente, la cantidad total del uno^ o más agentes' conservadores como un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) en la formulación puede ser, por ejemplo, . entre de. o . entre aproximadamente de 0.1% a 0.4%, tal como. 0.1% a.0.3%, 0.15%. a 0.325%, ¦ 0.15% a 0.25%, 0.1% a 0.2%, 0.2% a 0.3%), o 0.3%) a 0.4%) . Generalmente,, las co-formulaciones contienen menor que 0.4% (p/v) de conservador. Por ejemplo, las co-formulaciones proporcionadas en la presente contienen por lo menos o aproximadamente por lo menos 0.1%,· ,0.12%, 0.125%, -!0.13%, 0.14%,. 0.15%, 0.16%, 0.17%, 0.175%, 0.18%, .0.19%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.325%, 0.35% pero menor que 0.4% de conservador ¦ total .

En algunos ejemplos, las co-formulaciones estables proporcionadas en la presente contienen entre o \ entre aproximadamente 0.1% a 0·.25% · de fenol, . y entre o aproximadamente entre 0.05% a 0.2%) m-cresol, tal como entre o aproximadamente .entre 0.10% a 0.2% de fenol, y. entre o aproximadamente entre 0.06% a 0.18% m-cresol o entre ,o aproximadamente entre 0.1%) a 0.15%) de fenol y entre o aproximadamente entre 0.08% a 0.15% de m-cresol. Por ejemplo, las co-formulaciones estables proporcionadas en la presente contienen o contienen aproximadamente 0.1%. de fenol y 0.075%) de m-cresol; . 0.1% de. fenol y 0.15% de m-cresol; . 0.125%) de fenol y 0.075% de m-cresol; 0.13% de fenol y 0.075% de m-cresol; 0.13% de fenol y 0.08% de m-cresol; 0.15% de fenol y 0.175% de m-cresol';. o 0.17% de fenol, y 0.13% de m-cresol. e. Estabilizadores Incluidos entre los tipos de estabilizadores que se pueden contener en' las formulaciones proporcionadas en la presente son · los aminoácidos, derivados de . aminoácido, aminas, azúcares, polioles, sales.. y soluciones amortiguadoras, surfactan.tes, y otros agentes. Las cp-formulaciones proporcionadas en la presente contienen por lo meso un estabilizador. Por ejemplo, las co-formulaciones proporcionadas- en : la presente contienen por lo menos uno, dos, tres, cuatro.,' cinco, seis o más estabilizadores. Por consiguiente, cualquiera o más de aminoácidos, derivados de aminoácido, aminas, azúcares, polioles, sales y soluciones amortiguadoras, surfactantes , y otros agentes se pueden incluir en las co-formulaciones en la presente. Generalmente, las co-formulaciones en. la presente contienen por lo menos un surfactante y una solución amortiguadora apropiada- Opcionalmente, . las. co-formulaciones proporcionadas .en la presente pueden contener otros estabilizadores adicionales. .

Los estabilizadores de aminoácido ejemplares, derivados de aminoácido, o aminas incluyen, pero '. no se limitan a, L-Arginina, Glutamina, glicina, Lisina, Metionina, ' 'Prolina, Lys-Lys, Gly-Gly, Óxido de Trimetilamina (TMAO) o betaina. Ejemplares de azúcares y polioles incluyen, . pero [no se limitan a glicerol, sorbitol, manitol, inositó.l, sacarosa. - o trehalosa/ Ejemplares, de sales y soluciones amortiguadoras incluyen, pero no¦ se limitan a, cloruro de magnesio, sulfato de sodio, Tris tal como Tris (100 mM) , o benzoato de sodio. Surfactantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, poloxámero 188 (por ejemplo PluronicMR¦ F68) , polisorbato 80 (PS80) , polisorbato 20 (PS20) . Otros' conservadores incluyen, pero no se limitan a, ácido hialurónico (HA),, albúmina de suero, humana (HSA) ,¦ ácido' fenil-butirico , ácido' taurocólico, polivinilpirrolidona (PVP) o zinc. i . Surfactante En algunos ejemplos, las co-formulacio'nes .estables contienen uno o más surfactantes. Estos surfactantes inhiben la agregación de la enzima degradadora de hialuronano, tal como una hialuronidasa por ejemplo una PH20: (por ejemplo rHuPH20) y minimizan la pérdida absorbente. Los surfactantes son generalmente, surfactantes no iónicos. Los Surfactantes que se pueden incluir en las co-formulaciones en la presente incluyen, pero no se limitan a, ésteres parciales y de ácido graso y éteres de alcoholes polihidricos tal como glicerol, o sorbitol, poloxámeros y polisorbatos . Por ejemplo., los surfactantes ejemplares en las . co-formulaciones en la presente incluyen cualquiera de uno o más del poloxámero 188 (PLURONICSMB tal como. PLURONICMR F68) , TETRONICSMR, polisorbato 20, polisorbato 80, PEG 400, PEG 3000,. TweenMR (por ejemplo TweenMR 20 o TweenMR.80) , TritonMR X-100, SPANMR, , MYRJMR, BRIJMR, CREMOPHÓRMR, polipropilengliccles o polietilenglicoles En algunos. ejemplos, las co-formulaciones en la presente contienen poloxámero 188, polisorbato 20, polisorbato 80, generalmente poloxámero 188 (pluronic F68) . Las co-formulaciones proporcionadas en la presente contienen generalmente por lo menos un surfactante, tal como 1, 2 o 3 surfactantes.

En las co-formulaciones estables, la cantidad total del uno o. más surfactantes como un . porcentaje. (%) dé concentración de masa (p/v) en la formulación puede ser, por ejemplo, entre de o entre aproximadamente de 0.0005% a 1.0%, tal como entre de o entre aproximadamente de 0.0005% a 0.005%, 0.001% a 0.01%, 0.01% a 0.5%, tal como .0.01% a 0.1% o 0.01% a 0.02%. Generalmente, las co-formulaciones contienen por lo menos 0.01% de surfactante y contienen menos que 1.0%, tal como menor que 0.5% o menor que .0.1% de surfactante. Por ejemplo, las co-formulaciones proporcionadas en la presente pueden contener en o aproximadamente 0.001%, 0/005%, 0.01%., 0.015%, 0.0.2%, 0.025%, 0.03%, 0.035%, 0.04%, 0.045%, 0.05%, 0.055%, 0.06%, 0.065%, 0.07%, 0.08%, o 0.09%. En ejemplos particulares, las co-formulaciones proporcionadas en la presente contienen, o contienen aproximadamente. 0.01% a o a aproximadamente 0.05% de surfactante.

La oxidación de la enzima puede incrementarse con los niveles de incremento' del surfactante. También, el surfactante poloxámero 188 provoca menos' oxidación que los pólisorbatos . Por consiguiente, las co-formulaciones en la •presente contienen generalmente poloxámero 188. De esta manera, aunque los surfactantes son estables para estabilizar una enzima degradadora de . hialuronano,' la inclusión de surfactantes .en las co-formulaciones proporcionadas en la presente pueden dar por resultado la oxidación de la enzima degradadora de hialuronano en altas concentraciones-. De esta manera, las concentraciones generalmente . menores de surfactantes se usan en las co-formulaciones en la presente, por ejemplo, como un porcentaje (%) de concentración de masa (p/v) ¦'. de menor que 1.0% y generalmente . entre o aproximadamente entre 0.01% o 0,05%. También, , como se proporciona . en la presente a continuación, opcionalmente un agente anti-oxidación se puede incluir en la formulación para reducir o prevenir la oxidación.

Las co-formulaciones ejemplares . proporcionadas en la presente contienen poloxámero 188. El poloxámero ,188 tiene una concentración de micelas critica más alta (eme) . De esta manera, el uso del poloxámero 188 puede reducir la formación de micelas en la formulación, que. a su vez puede reducir la efectividad de los conservadores. De esta' manera,, entre las co-formulaciones proporcionadas en la presente, son aquellas que contienen o. contienen aproximadamente 0.01% o 0.05% poloxámero 188. ii . Otros estabilizadores Las co-formulaciónes estables pueden opcionalmente contener otros componentes que, cuando se combinan con los conservadores, sal y. estabilizadores en el pH apropiado, como se plantea en lo anterior, dan por resultado una co-formulación . estable . Otros componentes incluyen por ejemplo, uno. o más modificadores de- tonicidad, uno o más agentes antioxidación, zinc u otro, estabilizador.

Por ejemplo, '.'.'los. modificadores de tonicidad se pueden incluir en la formulación para producir una solución con la osmolaridad deseada. Las co-formulaciones estables tienen, una osmolaridad de entre o' aproximadamente' entre 245 mOsm/kg a 305 mOsm/kg. ' Por ejemplo, la ' osmolaridad es o es aproximadamente 245 mOsm/kg, 250 mOsm/kg, 255 mOsm/kg, 2.60 mOsm/kg, 265 mOsm/kgf 270' mOsm/kg, 275 mOsm/kg, 280 mOsm/kg, 285. mOsm/kg, 290 mOsm/kg, 295 mOsm/kg, 300 mOsm/kg o '.305 mOsm/kg. En algunos ejemplos, las co-'formulaciones de una insulina y una enzima, degradadora de hialuronano, tal como una hialuronidasa por ejemplo una PH20 (por ejemplo rHuPH20) tiene una osmolaridad de o de. aproximadamente 275 mOsm/kg.

Los modificadores de tonicidad incluyen,, pero no se limitan a, glicerina., NaCl, aminoácidos, poli'al'coholes , trehalosa, y otras sales y/o azúcares. En otros, casos, la glicerina (glicerol) se incluye en . las co-formulaciones . Por ejemplo, las co-formulaciones proporcionadas en la presente contienen típicamente menor que 60 mM de glicerina, tal como menor que 55 mM, menor que 50 mM, menor que 45. mM, menor que ¦40 mM, menor que 35 mM, menor que 30 mM, menor que 25 mM, menor que 2.0 mM, menor que 15 mM, 10 mM. o menos. La cantidad de glicerina depende típicamente en la cantidad de NaCl presente: mientras . más NaCl está presente en la co-' formulación , se requiere menos glicerina para, lograr la osmolaridad deseada. De esta manera, por ejemplo, en las co- formulaciones que. contienen mayores concentraciones de. NaCl, tal ' como aquellas formuladas con insulinas con mayor solubilidad evidente (por ejemplo insulina glulisina) , poco o nada de glicerina se necesita incluir en la formulación. En contraste, ' en las co-formulaciones que contienen concentraciones de NaCl ligeramente menores, tales como aquellas formuladas cón insulinas con solubilidad evidente más baja (por ejemplo insulina aspart) , :ia glicerina se puede incluir. Por ejemplo, las co-formulaciones proporcionadas en la presente que contienen insulina aspart contienen . glicerina en una concentración menor que 50 m , tal como 20 mM a 50 mM, por ejemplo en o. aproximadamente 50 mM. En las co-formulaciones que contienen una concentración de NaCl más baja uniforme, tales como aquellas formuladas con las insulinas con la solubilidad evidente más baja (por ejemplo insulina lispro o insulina regular) , la glicerina se incluye en una concentración de o de aproximadamente, por ejemplo, .40 mM a 60 mM.

Las co-formulaciones también pueden contener antioxidantes para, reducir o prevenir la oxidación, en particular oxidación de la enzima degradadora de hialuronano. Los antioxidantes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, cisteina, triptofano y metionina. En ejemplos particulares, el anti-oxidante es' metionina. Las' co-formulaciones proporcionadas . en . la presente que contienen una insulina y una enzima degradadora de hialuronano, tal como una hialuronidasa por ejemplo una PH20 (por ejemplo rHuPH20) puede incluir un antioxidante- en una concentración de entre o de aproximadamente . entre 5 mM a o a aproximadamente 50 mM, tal como 5 mM a 40 mM, 5 mM a 20 mM o 10 mM ,a 20 mM. Por ejemplo, la metionina se puede proporcionar en las co-formulaciones en la presente en una concentración de entre.. o de aproximadamente entre 5 mM a o a aproximadamente 50 mM, tal como 5 mM a 40 mM, 5 mM a 20 mM o 10 mK a 20 mM. Por ejemplo, un antioxidante, por ejemplo metionina, se puede incluir, en una concentración que es. o es · aproximadamente 5 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, "15 mM, 16 mM, .17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 21 mM, -22 mM, 23 mM, 24 mM, 25 mM, 2.6 mM, 27 mM, 28 mM, 29 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM o 50 m . En algunos ejemplos, las co-formulaciones contienen 10 mM a 20 mM de metionina, tal como o aproximadamente 10 mM o '20 mM metionina .

En algunos , casos, el zinc se. incluye . en las co-formulaciones como un estabilizador para los hexámeros de insulina. Por ejemplo, las formulaciones que contienen insulina regular, insulina lispro o insulina aspart. contienen típicamente zinc, . mientras que las formulaciones que contienen insulina glulisina. no contienen zinc. El zinc se puede proporcionar, por ejemplo, como óxido de zinc, acetato de zinc o cloruro de zinc. El zinc puede star presente e una composición proporciona en la presente en, . entre . o aproximadamente entre 0.001 a 0.1 mg por 100 unidades de insulina (mg/100 U) ,. 0.001 a 0.05 mg por 100U o 0.01 a 05 mg por 100 U. Por ejemplo, las co-formulaciones proporcionadas en la presente pueden contener ' zinc en o aproximadamente 0.002 miligramos por 100 · unidades de insulina (mg/100 ü);, 0.005 mg/100 U, 0.01 mg/100 U, 0.012 mg/100 U, 0.014 mg/100 U, 0.016 mg/100 U, 0.017 mg/100 U, 0.018 mg/100 U, 0.02 mg/100 U, 0.022 mg/100 U, 0.024 mg/100 U, 0.026 mg/100 U, 0.028 mg/100 U, 0.03 mg/100 U, 0.04. mg/100 U, 0..05 mg/100. U, 0.06 mg/100 U, 0.07. mg/100 U, 0.08 mg/100 U o 0.1 mg/100 U..

La co-formulación estable también puede contener un estabilizador de aminoácido, que contribuye, a .la estabilidad de la preparación. El estabilizador puede se aminoácidos no polares y básicos. Los aminoácidos no polares y básicos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, alanina, histidina, arginina, lisina, ornitina, . isoleucina, valina, metionina, glicina y prolina. Por ejemplo, el .estabilizador de aminoácido es glicina o prolina, típicamente glicina. El estabilizador- puede ser un solo aminoácido o puede ser-, una combinación de 2 o más de estos aminoácidos. Los estabilizadores de aminoácido . pueden ser aminoácidos naturales, análogos de aminoácido, aminoácidos modificados o equivalentes de aminoácido. Generalmente, él aminoácido es un L-aminoácido . Por. ejemplo, cuando la prolina se usa como el estabilizador, es . generalmente L-prolina. También es posible usar equivalentes ¦ de . aminoácido, por ejemplo,' análogos de prolina. La concentración del estabilizador de aminoácido, por ejemplo glicina, incluida en la co-fórmulación varia de 0.1 M a 1. M aminoácido, típicamente 0.1 M a 0.75 M, generalmente 0.2 M a 0.5 M, por ejemplo, por lo menos en o aproximadamente 0.1. M, 0.15 M, 0.2 M, 0.25 M, 0.3 M, 0.35 , 0.4 M, 0.45 M, 0.5 . M, 0.6 M, 0.7 M, 0.75 M o más. El aminoácido, por ejemplo glicina, se puede usar, en una forma de una sal farmacéuticamente aceptable, tal como clorhidrato bromhidrato, sulfato, acetato, etc. La pureza del aminoácido, por ejemplo glicina, debe ser por lo . menos 98%, por lo menos 99%, o por lo menos 99.5% o más. 2. Otros Excipientes o Agentes Opcionalmente, las co-formulaciones pueden incluir portadores tal como un diluyente, adyuvante, excipiente, o vehículo con los cuales la co-fórmulación se administra. Ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se describen en . "Remington 1 s Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin. Estas .composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente •efectiva del compuesto, generalmente en forma purificada o forma parcialmente purificada, junto, con una cantidad adecuada del portador para proporcionar la forma de la administración apropiada al paciente. Estos portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales . como agua y aceite, incluyendo aquellos de petróleo, de origen animal., vegetal o sintético, tal como aceite de cacahuate, aceite de soja, aceite mineral, y aceite de ajonjolí. El agua es un portador típico cuando la composición farmacéutica se administra intravenosamente. Las soluciones salinas y las soluciones de dextrosa y glicerol acuosas también se pueden emplear como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables.

Por ejemplo, los portadores farmacéuticamente aceptables usados en las . preparaciones parenterales incluyen vehículos acuosos, vehículos no . acuosos, agentes anti-microbianos , agentes isotónicos, soluciones amortiguadoras, antioxidantes, anestésicos locales, agentes de suspensión y dispersión, agentes emulsificantes , agentes secuestrantes ó quelantes y otras sustancias farmacéuticamente aceptables. Ejemplos de vehículos acuosos incluyen inyección de Cloruro de Sodio', Inyección de Ringer, Inyección de Dextrosa Isotónicá, Inyección de Agua Estéril, Inyección de. Dextrosa y Ringer Lactada. Los vehículos parenterales . no acuosos incluyen aceites fijos de. origen vegetal, aceite de algodón, aceite de maíz, aceite de ajonjolí y aceite de cacahuate. Los agentes anti-microbianos en concentraciones bacteriostáticas o fungistáticas se pueden agregar a las preparaciones parenterales empacadas en recipientes de. múltiples dosis, que incluyen fenoles o cresoles, mercuriales,, alcohol bencílico, clorobutanol, ásteres de ácido metil y propil p-hidroxibenzóico, timerosal, cloruro, de benzalconio ' y cloruro de bencetonio. Los agentes isotónicos incluyen cloruro dé sodio y dextrosa.-. Las soluciones amortiguadoras incluyen fosfato y citrato. Los antioxidantes incluyen bisulfato de sodio. Los anestésicos locales incluyen clorhidrato de procaina. Los agentes de suspensión y dispersión incluyen carboximetilcelulosa de sodio, hidroxipropil metilcelulosa y polivinilpirrolidona . Los agentes emulsificantes¦. incluyen Polisorbato 80 (Tween 80). Un agente secuestrante o quelante de iones de metal incluye EDTA. Los portadores . farmacéuticos también' incluyen alcohol etílico, polietilenglicol y pr.opilenglicol para vehículos visibles en agua e hidróxido de sodio, ácido clorhídrico, ácido cítrico o ácido; láctico para el ajuste del pH .

Las composiciones pueden ¦ contener junto con un ingrediente activo: un diluyente tal como . lactosa, sacarosa, fosfato de dicalcio, o carboximetilcelulosa; un lubricante, tal como estearato de magnesio, estearato de calcio y talco; y un aglutinante tal como almidón, .gomas naturales, tal como goma de. acacia, gelatina, ' glucosa,' melazas., polivinilpirrolidona, celulosa y derivado de los mismos, povidona, crospovidonas y otros aglutinantes conocidos por aquellas personas de experiencia en el campo.

Por ejemplo, -una proteína excipiente.se puede, agregar a la co-formulación que puede ser cualquiera de una variedad de proteínas o péptidos farmacéuticamente aceptables. Generalmente, la proteína excipiente se selecciona por su capacidad para ser administrada a un sujeto mamífero ¦ sin provocar una respuesta inmune. Por ejemplo, la albúmina de suero humana es bien adecuada para el usó en las formulaciones farmacéuticas. Otros excipientes de proteínas farmacéuticos conocidos incluyen, pero, no se limitan, a, almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de . sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro, de sodio, . leche descremada deshidratada, glicerol, propileno, glicol, agua y etanol . El excipiente se- incluye en la formulación en una concentración ..suficiente . para prevenir la absorción de. la proteína al recipiente o al vial de contención. La concentración del excipiente variará ¦ de acuerdo con el carácter del excipiente y la concentración de la proteína en la co-formulación.

Una composición, . si desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsificantes, o agentes, amortiguadores de pH, por ejemplo, acetato,' citrato de sodio, derivado .de ciclodextrina, monolaurato de sorbitan, acetato de sodio de trietanolamina, oleato de trietanolamina, y otros agentes.

G. Métodos para producir ácidos nucleicos que codifican una insulina o enzima degradadora de hialuronano y polipéptidos de los mismos Los polipéptidos . de una insulina y una enzima degradadora de hialuronano expuestos en la presente se pueden obtener por los métodos bien conocidos en el campo para purificación dé . proteínas y expresión de proteínas recombinantes . Los polipéptidos también se pueden sintetizar químicamente. Por ejemplo, la cadena A y . la cadena B de la insulina se pueden sintetizar químicamente y luego reticular por las ligaciones de disu.lfuro a través, por ejemplo, de una reacción de reducción-reoxidación.; Cuando los polipéptidos se producen por medios recombinantes, se puede usar cualquier método conocido por aquellas personas de experiencia en el campo para la. identificación de ácidos nucleicos . que codifican los genes deseados. Cualquier método disponible en la . 'técnica se puede usar para obtener un cDNA de longitud completa (es decir que abarca la región de codificación completa) o clon, de DNA genómico que codifica una hialuronidasa, tal como de una fuente de células, o tejido. Las insulinas modificadas o variantes o. enzimas degradadoras de hialuronano se; pueden diseñar de un polipéptido de tipo natural, tal como por mutagénesis dirigida al sitio.

Los polipéptidos se pueden clonar, o aislar usando cualquiera de los métodos disponibles conocidos ' en el campo para clonar o aislar moléculas de ácido nucleico. Estos métodos incluyen . amplificación por PCR de. ácidos nucleicos .y clasificación . de . bibliotecas, incluyendo clasificación de hibridación de ácido nucleico, clasificación basada en anticuerpos y clasificación basada en actividad..

Los métodos ."¦ para la amplificación de los ácidos nucleicos se pueden usar para aislar, moléculas . de ácido nucleico que codifican un polipéptido deseado, incluyendo por ejemplo, métodos de reacción en cadena, de la polimerasa (PCR) . Un material que contiene ácido nucleico se puede usar material de partida del. cuál una molécula de ácido nucleico que codifica el. polipéptido deseado se . puede aislar. Por ejemplo, la preparaciones de DNA y mRNA, extractos de células, extractos de tejidos, muestras de fluido (por ejemplo sangre, suero, saliva) y muestras de sujetos sanos y/o enfermos se pueden ' usar en los métodos de amplificación. Las bibliotecas de. ácido nucleico también se pueden usar como una fuente de material. Los cebadores se pueden diseñar para amplificar un polipéptido deseado. Por ejemplo, los cebadores se pueden diseñar con base en las secuencias expresadas en las cuales se genera un polipéptido deseado. Los cebadores se pueden, diseñar con base en la traducción posterior de una •secuencia de aminoácidos de polipéptido. Las moléculas de ácido nucleico generadas por la amplificación se pueden secuenciar y confirmar para codificar un polipéptido deseado.

Las secuencias, de nucleótidos adicionales se pueden unir a una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido, incluyendo secuencias ligadoras que contienen sitios de endonucleasa de restricción para propósito de clonar el gen sintético en un vector, por ejemplo, un vector de expresión de proteínas o un vector diseñado para ia amplificación . de las secuencias de DNA de codificación de proteína, núcleo. Además, las secuencias de nucleótidos adicionales que especifican, los elementos de DNA funcionales se pueden ligar relativamente a una molécula- de ácido nucleico; que codifica el polipéptido. Ejemplos de estas secuencias incluyen, pero no se limitan a, secuencias promotoras diseñadas para facilitar la expresión de la proteína intracelular , y las secuencias de secreción, por . ejemplo' secuencias señal heterólogas diseñadas para facilitar la secreción .de proteínas. Estas . secuencias son conocidas por aquellas personas de. experiencia en el campo. Las secuencias de residuos de nucleótidos adicionales tales , como' . secuencias de bases que se especifican en las regiones de ligación .a proteina también se pueden enlazar, a las moléculas de ácido nucleico que codifican enzimas. Estas regiones incluyen, pero no se limitan a, secuencias, de residuos que facilitando codifican las proteínas que facilitan la captación de la enzima en las células objetivo específicas, o de otra .manera alteran la farmacocinética de un producto, de un gen sintético. Por. ejemplo, las . enzimas se pueden ligar a las porciones de PEG .

Además, se pueden, agregar etiquetas u otras porciones, por ejemplo, para ayudar en la detección o purificación por afinidad del polipéptido. Por ejemplo, las secuencias de residuos de nucleótidos adicionales tales como secuencias de bases que especifican una^ etiqueta de epítopo u .otro. marcador detectable también se pueden ligar a las moléculas de ácido •nucleico que codifican enzimas. . Ejemplares de estas secuencias incluyen secuencias de ácidos nucleicos que codifican una etiqueta His {.por ejemplo, 6xHis, HHHHHH; SEQ ID NO : 54 ) o. etiqueta . Flag (DYKDDDDK; SEQ. ID NO:55).

Los ácidos nucleicos identificados y aislados . luego se pueden insertar en un vector de clonación apropiado. Una gran variedad de sistemas de vector . hospedero conocidas . en el campo se pueden usar. Los vectores posibles incluyen, pero no se limitan a, plásmidos o virus modificados, pero el sistema del vector debe se compatible con la célula hospedera usada. Estos vectores incluyen pero no se limitan a, bacteriófagos tales como derivados lambda, o plásmidos tales como pCMV4, pBR322 o pUC derivados de plásmido o el vector Bluescript (Stratagene, . La Jolla, CA) . Otros vectores de expresión incluyen el vector de. expresión HZ24 e emplificado en la presenté. La inserción en un vector de clonación puede,' por ejemplo, ser lograda por la ligación del- fragmento de DNA en un vector de clonación que tiene terminales cohesivas complementarias. La inserción se puede efectuar usando los vectores de clonación TOPO ( Invitrogen-, Carlsbad, CA) . Si los sitios de restricción complementarios usados para fragmentar el DNA no están presentes en el vector de clonación, los extremos de las moléculas de DNA se pueden modificar enzimáticamente . Alternativamente, cualquier sitio deseado se puede producir, al ligar las secuencias de nucleótidos (ligadores) en las terminales de DNA; estos ligadores ligados pueden contener oligonucleótidos químicamente sintetizados específicos que codifican las secuencias de reconocimiento de endonucleasa de restricción. En un método alternativo, el vector y el gen de . proteínas escindidos se pueden . modificar por la- cola homopolimérica . Las moléculas recombinantes también se. pueden introducir, en las células 'hospederas ;a través, por ejemplo, de transformación, transíección , infección, electropóración y sonoporación, de modo que se generan muchas copias de la secuencia de genes.

La insulina se puede producir usando una variedad de técnicas (véase, por ejemplo Ladisch y colaboradores (1992) Biotechnol. Prog. 8:469-478). En algunos ejemplos,, el ácido nucleico que codifica un polipéptido de preproinsulina o proinsulina se inserta en un vector . de- expresión. En la expresión, el polipéptido de preproinsulina o proinsülina se convierte a insulina por métodos enzimáticos o químicos que escinden la secuencia, de señal y/o el péptido G, dando por resultado las cadenas A y B que se reticulan por las ligaciones de disulfuro a través de, por ejemplo, una reacción de reducción - reoxidación . (véase, por ejemplo Cousens y colaboradores, (1987) . Gene 61:2.65-275, Chance y colaboradores, (1993) Diabetes Care 4:147-15.4) . En otro ejemplo, el ácido nucleico que codifica la cadena A y la cadena B de una insulina se inserta en uno o dos vectores de expresión para la co-expresión como un. solo polipéptido de un vector de expresión o expresión como dos polipéptidos de uno o dos vectores de expresión. De esta manera, los polipéptidos de cadena A y B se pueden expresar separadamente y luego combinar para generar una insulina, o se pueden co-exprésar, en ausencia de una cadena C. En casos donde las cadenas A y B se co-expresan como un solo poüpéptido, el ácido nucleico que codifica las sübünidades también puede codificar un ligador o espaciador entre la cadena B y la cadena A, tal como un ligador o espaciador descrito posteriormente. El ácido nucleico insertado en el . vector de expresión puede contener, por ejemplo, ácido nucleico que .. codifica la .cadena B de insulina, un ligador, tal como por ejemplo, un ligador de alanina-alanina-lisina, y la cadena A, dando por resultado la expresión de, por . ejemplo, "cadena B de insulina-Ala-Ala-Lys-cadena A de insulina".

En. modalidades especificas,, la transformación de las células hospederas con las moléculas de DNA recombinante que incorporan el gen de proteina aislado, cDNA, o la secuencia de DNA sintetizado permite la generación de múltiples copias del gen. De esta manera, el gen .se. puede . obtener en grandes cantidades al desarrollar transformantes, al aislar las moléculas de DNA recombinante de los transformantes . y, cuando sea necesario, recuperar el gen insertado . del DNA recombinante aislado. 1. Vectores y células Para la expresión recombinante de una o más. de las proteínas deseadas, tal como cualquiera descrita en el presente, el ácido nucleico que contiene todo o una porción de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína se puede insertar, en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que, contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia de codificación de proteína insertada. . Las señales transcripcionales y traduccionales necesarias también se pueden suministrar por el promotor nativo para los genes de. enzimas, y/o sus regiones de flanqueo.

También se proporcionan vectores que . contienen un. ácido nucleico que codifica la enzima. Las células que contienen los vectores también se proporcionan. Las. células incluyen células eucarióticas y procarióticas, y los vectores son cualquier adecuado para el uso en la presente.

Se proporcionan células procarióticas y eucarióticas, incluyendo células . endoteliales , que contienen los vectores. Estas células incluyen células bacterianas, células de levadura, células fúngicas, Archea, células de planta, células de insecto y células animales. Las células se usan para producir una proteína de la misma al desarrollar las células descritas en lo anterior bajo, condiciones mediante las cuales la proteína codificada se expresa por la. célula, y al recuperar la proteína expresada. Para propósitos en la presente, por ejemplo, la enzima se puede secretar en él medio .

Se proporcionan vectores que contienen una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de hialuronidasa soluble acoplado a la secuencia de señal nativa .o heteróloga, así como múltiples copias' de la misma. Los vectores se pueden seleccionar para la expresión de la proteína enzimática en la célula o tal que la proteína enzimática se expresa como una proteína secretada.

Se puede usar una variedad de sistemas de hospedero-vector para expresar la .secuencia de codificación de proteína. Estos incluyen, pero no se limitan a sistemas de células de, mamífero infectadas con virus (por ejemplo, virus de va.ccinia, adenóvirus y otros virus) ; sistemas . de células de insecto infectados con virus (por ejemplo, baculovirus ) ; microorganismos tales como levaduras que contienen vectores de levadura, o bacterias transformadas con bacteriófagos, DNA, DNA plásmido, . o DNA cósmido. Los. elementos.' de expresión de los vectores varían en sus resistencias y especificidades. Dependiendo, del sistema de hospedero-vector usado, se puede usar cualquiera de una variedad de elementos de/transcripción y traducción adecuados.

Cualquiera de los métodos conocidos por aquellas personas de experiencia en el campo para la inserción de fragmentos de DNA en un vector se pueden usar para construir vectores de expresión que contienen un gen quimérico que 2.62 contiene señales' ' de control transcripcionales .y/o traduccionales apropiadas y secuencias de codificación de proteínas. Estos métodos pueden incluir DNA recombinante in vitro y técnicas sintéticas y - recombinantes in vivo (recombinación genética) . La expresión de las secuencias de ácidos nucleicos codifica- la proteína, o dominios, derivados, fragmentos u homólogos de los mismos, se pueden regular por una segunda secuencia de ácido nucleico de modo que los genes o fragmentos de los. mismos se expresan en un hospedero transformado con las. moléculas, de DNA recombinante. Por ejemplo, la expresión de las proteínas se puede controlar por cualquier promotor/potenciador conocido en el campo. En una ¦modalidad específica, el promotor no es. .nativo a 'los genes para una proteína deseada. Los promotores que se pueden usar incluyen, pero no se limitan al promotor temprano SV40 (Bernoist y Chambón, Nature 290:304-310 (1981))., el. promotor contenido en la repetición terminal larga 3'. del virus, de sarcoma Rous . (Yamarnoto y colaboradores Cell 22:787-797 (1980) ), el promotor de herpes de timidina cinasa (Wagner y colaboradores, Prcc. Nati. Acad. Sci. EUA 78:1441-1445 (1981) ), las secuencias reguladoras del gen de metalotioneína (Brinster et al, Nature 296:39-42 (.1982)); los vectores de expresión procarió.ticos tales como el promotor de ß-lactamasa (Jay et al, (1981) Proc Nati Acad Sci ¦ EUA 78:5543) o el promotor tac (DeBoer. y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Ciencia. EUA. 80:21-25 (1983)), véase también . "U-seful Proteins from Recombinan.t Bacteria": in Scientific American 242:79-94 (1980)); vectores de expresión de plantas que contienen el promotor de nopalina sintetasa (Herrera-Estrella et al, Nature. 303 : 209-213 (1984)) o el promotor de 35S de RNA del virus de mosaico de la coliflor (Gardner y colaboradores, Nucleic Acids.. Res. 9:2871 (1981) ) , y el promotor de la enzima fotosintética ribulosa bifosfato carboxilasa (Herrera-Estrella y colaboradores, Nature 310:115-120 (1984)); elementos promotores de. levaduras y otros hongos tales como el promotor Gal4, el promotor de alcohol deshidrogenasa, el promotor de fosfoglicerol cinasa, el promotor de fosfatasa alcalina, y las siguientes regiones de control transcripcional animal que muestran especificidad de tejido y se han usado en animales transgénicos : .región de control del gen elastasa I que es activo en las células acinares pancreáticas (Swift y colaboradores, Cell 38:639-646 (1984); Ornitz. y colaboradores, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonáld, Hepatology 7:425-515 (1987)); región de control del- gen de insulina que es activo en células beta pancreáticas, (Hanahan y colaboradores, Nature 315 : 115-122 (1985) ) ,. región de control del gen de inmunoglobulina que. es activo en las células linfoides (Grosschedl et al, Cell. .38:6.47-658.. (1984) (Grosschedl y¦ colaboradores, Cell 38:647-658 (1984);· Adams y colaboradores, Nature 318:533-538 (1985); Alexander y colaboradores, Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987) ),' región de control del virus de tumor mamario de ratón que es activo en las células testiculares , de mama, linfoides y mastocitos (Leder y colaboradores, Cell 45:485-495 (1986) ), región de control del gen de albúmina que es activo en el hígado (Pinckert y colaboradores, Genes and. Devel. 1:268-276 (1987))., región dé control del gen de .alfa-fetoproteína que es activo en el hígado (Krumlauf y colaboradores , Mol. Cell. Biol. .5:1639-1648 (1985); Hammer y colaboradores, Science 235:53-58 1987)),. región de control del gen de alfar-1 antitripsina que es activo en el . hígado (Kelsey y colaboradores, Genes, and Devel. 1:161-171 (1987)), región de beta globina que es activo en las células (Magram y colaboradores, Nature 315:338-3.4.0 (1985); Kollias y colaboradores, Cell 46:89-94 (1986)), Kollias et al, Cell 46:89-94 (1986)) región de control del gen de proteína básica de mielina que es. activo en las células de oligodendrocitos del. cerebro (Readhead y colaboradores,. Cell 48:703-712 (1987)), región de control del gen de cadena. 2 ligera de miocina que es activa en el músculo esquelético (Shani, Nature 314 : 283-286 (1985) ) , y región de control de gen de la hormona de liberación, gonadotrópica que . es activa en los gonadotrofos del hipotálamo (Masón y colaboradores, Science 234 : 1372-1378 (1986) ) .

En. una modalidad, especifica, se usa un vector que contiene un promotor ligado operablemente a ácidos nucleicos que codifican una . protéína deseada, o un dominio, fragmento, derivado u homólogo, del mismo, uno o más orígenes de replicación, y opcionalmente, · uno o más marcadores seleccionables (por ejemplo, un gen de resistencia a antibióticos). Los vectores plásmidos ejemplares para la transformación de células de E. coli, incluyen, pór ejemplo, los vectores de expresión pQE (disponibles de Qiagen, Valencia, CA, véase también literatura¦ ublicada por Qiagen que describe el. sistema). Los vectores pQE tienen un promotor T5 '. fago (reconocido por la RNA polimerasa de ?. coli) y un módulo de represión operador lac doble para proporcionar la expresión de alto nivel estrechamente regulada de proteínas recombinantes en E. coli, ún sitio de ligación ribosomal sintético (RBS II) para la .traducción eficiente, una secuencia de. codificación de etiqueta 6XHis, terminádores transcripcionales t0 y TI, origen de replicación ColEl, y un gen beta-lactamasa para conferir resistencia a la ampicilina. Los vectores pQE permiten la colocación de una etiqueta 6xHis en. el ya sea la N- o C-terminal de la proteína, recombinante.

Estos plásmidos incluyen pQE 32, pQE 30, y pQE 31 que proporcionan múltiple sitios de clonación para . los tres marcos de lectura y proporcionan la . expresión de las proteínas N-terminalmente etiquetadas a 6xHis. Otros vectores plásmidos ejemplares para, la transformación de células de E. coli incluyen, por ejemplo, los. vectores de expresión pET (véase, Patente de EUA 'No . 4, 952, 496; disponibles de Novagen, Madison, WI; véase, también la literatura publicada por Novagen que describe el sistema) . Estos plásmidos incluyen pET lia, que contiene el promotor T71ac, el terminador T7, el operador lac de E. coli inducible, y el' gen represor lac; pET 12a-c, que contiene el promotor T7, el terminador. T7, y la señal de secreción ompT de E. coli, y pET 15b y pET1.9b (Novagen, Madison, WI), que contiene una secuencia líder His-TagMR para el uso en la purificación con una columna His y un sitio de escisión de trombina que permite la escisión después dé la purificación sobre la columna, la .región promotora T7-lac y el terminador T7.

Ejemplar de un vector para la expresión de células de mamífero es el vector de expresión HZ24. El vector, de expresión HZ24 se derivó de la cadena' principal del. vector pCI (Promega) . Contiene DNA que . codifica el gen de resistencia a beta-lactamasa (AmpR) , un origen El de replicación, una región' potenciadora/promotora inmediata- temprana de oitomegalovirus (CMV) , y una señal de poliadenilación posterior SV40 (SV40) . El vector de expresión también tiene un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) del virus ECMV (Clontech) y el gen de dihidrofolato reductas.a de. ratón (DRFR) . 2. Porciones Ligadoras En algunos ejemplos, la insulina se . prepara al generar los polipéptidos¦ de cadena A y cadena B con un. ligador, tal que, por ejemplo, la C-terminal de la cadena B se une a la N-terminal de la cadena A por un ligador corto. La cadena A y la cadena B se pueden expresar de un solo polipéptido que contiene un' ligador, o pueden expresar separadamente y luego unir por un ligador. La porción ligadora se selecciona dependiendo de las propiedades deseadas'. La porción ligadora debe ser suficientemente larga y suficientemente flexible para permitir que la¦ cadena A y la cadena B imiten la conformación natural de la insulina.

Los ligadores: pueden ser cualquier porción adecuada a la cadena A y cadena 3 de' la insulina. Estas porciónes incluyen, pero no se limitan- a., ligaciones peptidicas; ligaciones de aminoácido y péptido, que contienen típicamente entre uno. y aproximadamente 60 aminoácidos; ligadores químicos, tal como reticuladores escindibies 'heterobifuncionales, ligadores fotoescindiblés y ligadores escindibies.

Las porciones ligadoras . pueden ser péptidos . El péptido tiene tipicamente.de aproximadamente 2 a aproximadamente 60 residuos de aminoácidos, por ejemplo de aproximadamente 5 a aproximadamente 40, o de aproximadamente¦ 10 a aproximadamente 30 residuos, de aminoácidos. Los ligado.res peptidicos se pueden codificar convenientemente por ácido nucleico . e incorporar en proteínas de fusión en la expresión en la célula hospedera,, tal como E. coli. En un ejemplo, el ligador de alanina-alaniná-lisina (AAK) ' (SÉQ. ID NO: 178) se codificada en un ácido nucleico entre el ácido nucleico que codifica la cadena B de insulina y el ácido nucleico, que codifica la cadena A, tal que en la expresión, se produce un polipéptido de "cadena B de insulina-AAK-cadena A de insulina". Los ligadores peptidicos pueden ser una secuencia de aminoácidos espaciadora flexible, tal como aquella conocida en la investigación del anticuerpo de cadena individual. Ejemplos de. estas porciones ligadoras. conocidas incluyen, pero, no .se limitan a, R.PPPPC .(SEQ .ID NO:166) -o SSPPPPC ( SEQ ID NO : 167), GGGGS (SEQ ID NO:168), 15 (GGGGS). (SEQ ID NO: 169), GKSSGSGSESKS (SEQ ID. NO: 170), GSTSGSGKSSEGKG (SEQ ID NO: 171), . GSTSGSGKSSEGSGSTKG (SEQ ID NO: 172) , GSTSGSGKSSEGKG (SEQ ID NO : 173) , GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 174) , . EGKSSGSGSESKEF (SEQ ID NO:175), SRSSG (SEQ ID NO:176) y SGSSC (SEQ ID NO:177) .

Alternativamente, la porción ligadora de péptido puede ser VM (SEQ ID NO: 179) o AM (SEQ ID NO: 180), o tiene la estructura descrita por. lá fórmula: AM (G2 a 4S)Xam en donde¦: X es un número entero de 1 a 11 .(SEQ ID NO: 181) ..Las porciones de ligación adicionales se describen, por ejemplo, en Huston y colaboradores. (198.8) Proc. Nati. . Acad. Sel. U.S. A. 85:5879-588.3; Whitlow, M., y colaboradores (1993) Protein Engineering 6:989-995; Newton ¦ y colaboradores (1996) Biochemistry 35:545-553; A. J. Cumber y .colaboradores (1992) Bioconj . Chem.. 3:397-401; Ladurner y . colaboradores (1997) J. Mol. Blol. 273:330-337; y Patente de. EUA No . 4, 894, 443.

En algunos ejemplos, los ligadores de péptido se codifican por el '/ácido nucleico y se incorporan entre la cadena B y la cadena A en la expresión en una célula hospedera, tal como E. coli o S.. cerevisiae. . En otros ejemplos, un ligador de péptido se sintetiza por métodos químicos. Esto, se puede llevar a cabo en un protocolo separado a la síntesis de una o más de la cadena A y B, después de. lo cual: los componentes se unen, tal cómo con el uso de ligadores heterobifuncionales . Alternativamente, un ligador de péptido se puede sintetizar, en la N- o C-terminal de una de las cadenas de insulina, que luego . se liga a .la otra cadena a través del ligador de péptido, tal como con. un ligador heterobifuncional .

Cualquier ligador conocido ' por . aquellas personas de experiencia en el campo se puede usa en el presente para ligar la cadena A y . la cadena B de insulina. Los ligadores y ligaciones que son adecuados para ligar químicamente las cadenas incluyen, . pero no se limitan . a, ligaciones de disulfuro, ligaciones .de tioéter, ligaciones de disulfuro impedidas y ligaciones' covalentes entre . los grupos , reactivos libres, tales como grupos amina y tiol. Estas ligaciones se producen usando reactivos heterobifuncionales para producir grupos tiol reactivos en uno o ambos de los polipéptidos · y luego hacer reaccionar los grupos tiol en un polipéptido cón grupos tiol reactivos o grupos amina en lo cual ' los grupos maleimido reactivos o los grupos tiol se pueden unir uno al otro. Otros ligadores incluyen, ligadores escindibles de ácido, tales, como bismaleimideotoxi propano, conjugados de lábil-transferrina. ácidos y dihidrazida de ácido adípico, se escindirían en compartimentos intracelulares . más ácidos; reticuladores que se escinden en la exposición a UV o luz visible y ligadores,. tales como los diversos dominios, tales como CH1, CH2, y CH3, de la región constante de la IgGl humana (véase, . Batra y colaboradores (1993) Molecular Immunol. 30:379-386').. En algunas modalidades, varios ligadores se' pueden, incluir a fin de tomar ventaja de las propiedades deseadas de cada ligador. Los ligadores químicos y., los¦· ligadores de péptido se pueden insertar al . acoplar covalentemente el. ligador a la cadena A y cadena B de la insulina. Los agentes heterobifuncionales , descritos posteriormente, se. pueden usar para efectuar tal acoplamiento covalente. Los. ligadores de péptido también se pueden' ligar por el DNA de expresión que codifica, el ligador. entre la cadena' B y la cadena A.

Otros ligadores que. se pueden usar para unirse a la cadena A y cadena. B de la insulina incluyen:, sustratos de enzimas, . tales como, sustrato de catepsina B, sustrato de catepsina D, sustrato - de tripsina, sustrato.. de trombina, sustrato de subtilisina, un sustrato de Factor Xa, y sustrato de enterocinasa; ligadores que incrementan la solubilidad, flexibilidad y/o capacidad de escisión intracelular incluyen ligadores, tales como (glymser)n y (sermgly)n, en los cuales m es 1 a .6, de manera preferente de 1 a 4, de .'manera más preferente 2 a 4, y" n es 1 a 30, de manera preferente de l a 10, de manera . más. preferente de 1 a 4 (véase, por ejemplo, solicitud de PCT Internacional . No. WO 96/06641,. que proporciona ligadores ejemplares). En algunas modalidades, se pueden incluir varios 'ligadores a fin de tomar ventajas de las propiedades deseadas de cada ligador.. . 3. Expresión Los polipéptidos .de insulina y enzima degradadora de hialurona.no se pueden producir por cualquier método conocido por aquellas personas de experiencia en el campo, incluyendo métodos in vivo e in vitro. Las proteínas deseadas se pueden expresar en cualquier, organismo adecuado para producir las cantidades requeridas ..y formas de las proteínas, tal como, por ejemplo, necesarios para la administración y tratamiento. Los hospederos de expresión incluyen organismos procarióticos y éucarióticos tales como E. coli, levadura, plantas, células de insecto, células de mamífero, incluyendo líneas de células humanas' y animales transgénicos . Los hospederos. de .expresión pueden diferir en siis niveles de producción de proteínas, así como los tipos de . modificaciones pos-traduccionales que están presentes en las ' proteínas expresadas. La elección del hospedero de expresión, se puede hacer con base en estos y otros factores, tales como consideraciones regulatorias y de seguridad, costos de producción y la necesidad y método para la purificación.

Muchos vectores de expresión están disponibles y conocidos por aquellas personas de experiencia en el campo y se pueden usar para la expresión de. proteínas. La elección del vector de expresión se influirá por la elección del sistema de expresión hospedero. En general, los vectores de expresión pueden incluir promotores transcripcionales .y, opcionalmente, potenciadores, señales de traducción, y señales de terminación de transcripción y traduccionales. Los vectores de expresión que se usan para transformación estable tienen típicamente un marcador seleccionable que permite la selección y mantenimiento de las células transformadas. En algunos casos, un origen de replicac.ión se puede usar para amplificar el número de copias del vector.

Los polipéptidos de hialuronidasa . solubles también se pueden usar o expresar como fusiones, de proteínas. Por ejemplo, una fusión de enzima se puede generar para agregar funcionalidad adicional a una enzima. Ejemplos de proteínas de fusión de enzima incluyen, pero no se limitan a, fusiones de una secuencia señal, una etiqueta, tal como para la localización, por . ejemplo, una etiqueta . His6 o una etiqueta myc o una etiqueta para purificación, por ejemplo, una fusión GST, y una secuencia para dirigir la secreción de .proteínas y/o .asociación de membranas, a. Células Procarióticas Las procariotas, especialmente E. coli, proporcionan un sistema para producir grandes cantidades de proteínas. La transformación de E. coli es una técnica simple y rápida bien conocida por aquellas personas de experiencia . en ' el campo. Los .. vectores de expresión para E. coli pueden contener •promotores inducibles, que incluyen promotores que son útiles para inducir . altos . niveles de expresión de proteínas y para expresar proteínas que muestran alguna toxicidad a , las células hospederas. Ejemplos de promotores inducibles incluyen el promotor lac, el promotor trp, el promotor tac híbrido, los promotores T7 y SP6 RNA y el promotor ???; regulado por temperatura.

Las, proteínas, tal como cualquier, proporcionada en el presente, se pueden, expresar en el entorno citoplásmico de E. coli. El citoplasma es un entorno reductor y para algunas moléculas, esto puede dar por resultado la formación de cuerpos de inclusión insolubles . Los agentes de. reducción tales como ditio'treitol y ' ß-mercaptoetanol y desnaturalizantes, . tales como guanidina-HCl y urea" se pueden usar para resolubílizar las proteínas. Un procedimiento alternativo es la ' expresión de proteínas en el espacio periplásmico de las bacterias que proporciona un entorno oxidante e isomerasas similares a chaperonina y disulfuro y puede conducir a la producción de proteína soluble. Típicamente, una secuencia líder se fusiona a la proteína que se expresa que dirige la proteína al periplasma. El/ líder luego se remueve por las peptidasas de. señal dentro del periplasma. Los ejemplos de secuencias, líder orientadas periplásmicas incluyen el líder pelB del gen de pectato, lias.a y el líder derivado del gen de alcalina fosfatasa. En algunos casos, la. expresión periplásmica permite la, fuga de la proteina expresada en el medio de cultivo. La secreción de proteínas permite una purificación rápida y simple del sobrenadante de cultivo. Las proteínas que no se secretan se pueden obtener del. periplasma¦ por lisis osmótica. Similar a la- expresión citoplásmica, en algunos casos las proteínas pueden ser insolubles y se pueden usar desnaturalizantes y agentes reductores, para facilitar la solubilización -y replegamiento . La temperatura de la inducción y el crecimiento también puede influir en los niveles de expresión y solubilidad, se usan típicamente temperaturas . entre 25°C y 37°C. Típicamente, las bacterias producen proteínas aglicosiladas . De. esta manera, si las proteínas requieren glicosilación para la función, se puede agregar glicosilación in vitro después de . la purificación .de células hospederas.' b. Células de levaduras Las levaduras : tales como Saccharomyces. cerevisiae, Schizosaccharomyces. pombe, Yarrowia lipolytica , Klúyveromyces lactis y Pichia pastoris son .hospederos de expresión de levadura bien conocidos que se pueden usar para la producción de proteínas, tal como cualquiera descrita en la presente. La levadura se puede transformar con vectores de replicación episomales . o por integración cromosómica estable por ¦ recombinación homologa. Típicamente, los promotores inducibles se usan para regular la expresión génica. Ejemplos de estos promoLor.es · incluyen GAL1, GAL7 y GAL5 y promotores de metalotioneíná, tales como C0P1, AÓX1 u' otra Pichia u otro promotor, de levadura. Los vectores de expresión' incluyen frecuentemente, un marcador seleccionable tales como LEU2, TRP1, HIS3 y URA3 para selección y mantenimiento del DNA transformado. Las proteínas expresadas en la. levadura son frecuentemente solubles. La co-expresión con chaperoninas tales ¦ como . Bip . y proteína de disulfuro isomeras.a puede mejorar los niveles de expresión y ,. solubilidad. Adicionalmente , las proteínas expresadas en la levadura se pueden : dirigir para¦ la secreción usando fusiones de péptido señal de secreción, tal como la señal de secreción del factor alfa del tipo.de acoplamiento de levadura de Saccharomyces cerevisiae y se fusiona con las proteínas de superficie de las células de levadura, tal como el receptor de adhesión de acoplamiento Aga2p o la glucoamilasa de Arxula adeninivorans . Un sitio de. escisión de proteasa tal como para la Kex-2 proteasa, se' puede diseñar para remover las secuencias fusionadas de los . polipéptidos expresados conforme' salen de la ruta de secreción. La levadura también es capaz de la glicosilación en los motivos Asn-X-Ser/Thr..

C . Células de Insecto Las células, de. insecto, particularmente usando la expresión de. baculovirus, son útiles para ' expresar polipéptidos tales .como polipéptidos de hialuronidasa . Las células de insecto . expresan altos niveles de proteina y son capaces de la mayoría de la mayoría de las modificaciones pos-traduccionales ¦ usada. por eucariotas superiores. El baculovirus tiene un intervalo de hospedero restrictivo que mejora la seguridad y reduce las preocupaciones reguladoras de. la expresión eucariótica . Los vectores de expresión típicos usan un promotor para la expresión de altó nivel tál como el promotor de polihedrina de baculovirus/ Los sistemas de baculovirus comúnmente usados incluyen los baculovirus tales como virus de polihedrosis nuclear de Autographa cali fornica (AcNPV) , y el virus, de polihedrosis nuclear de Bombyx mori (BmNPV) y. una línea de células de insecto tal como Sf-9 derivada de Spodoptera frugiperda , Pseudaletia unípuncta (A7S) y Danaus plexippus . (DpNl). Para la expresión de alto nivel, la secuencia de nucleótidos. de la molécula que se expresa fusiona' inmedia amente cadena abajo del codón de iniciación, de polihedrina del virus. La señal dé secreción del mamífero se procesan con precisión en las células de insecto y se pueden usar para secretar la proteína expresada en el medio de cultivo. Además, las líneas de células Pseudaletia unipunctá (A7S) y Danaus plexippus. (DpNl) producen proteínas con patrones de glicosilación similares a los sistemas de células de mamífero.

Un sistema de expresión alternativo en las células de insecto es el uso de células establemente transformadas. Las líneas de células tales como células Schneider 2 (S2) y Kc (Drosophila melanogaster) y C7 (Aedes albopictus) se pueden usar para la expresión. El promotor ; de metálotionina de Drosophila se puede usar para inducir altos niveles de expresión en la presencia de la. inducción del metal pesado con cadmio o cobre.' Los vectores de expresión se mantienen típicamente por el uso de marcadores¦ seleccionadles tales como neomicina e hidromicina. d. Células de Mamífero Los sistemas de expresión de mamíferos se. pueden usar para. expresar proteínas que incluyen polipéptidó.s de hialuronidasas solubles.. Los constructos de expresión se pueden transferir las células de mamífero por infección viral tales como adenovirus o por- transferencia de DNA directa tales como liposomas, . fosfato de calcio, DEAE-dextrano y por medios físicos tales como electroporación y micro inyección. Los vectores de expresión para las células de mamífero incluyen típicamente un sitio de terminación mRNA, una recuadro TATA, una secuencia de iniciación traduccional (secuencia consenso Kozak) y elementos de poliadenilación . Los elementos IRES también se pueden agregar para permitir la expresión bicis.trónica con otro gen, tal como un marcador, seleccionable . Estos . vectores incluyen frecuentemente prómotor-potenciadores transcripcionales para la expresión de .alto nivel, por ejemplo el' . promotor-potenciador SV40,. el promotor de citomegalovirus humano . (CMV) y la repetición terminal larga del virus de sarcoma Rous (RSV) . Estos promotores-potenciadores son activos .en muchos tipos de células. Los promotores de tipo tejido y célula y regiones peteneiadoras también se pueden usar para, la expresión. Las regiones promotoras-potenciadoras ejemplares incluyen, pero no se limitan a, aquellas de genes tales como elastasa I, insulina-, inmunoglobulina, virus de tumor mamario de ratón, albúmina, alfa feto proteína, alfa 1 anti-tripsina, beta globina, protéína básica de mielina, . cadena 2 ligera de miocina,' y control del gen de la hormona de liberación gonadotrópica . Los marcadores seleccionables se pueden usar para seleccionar y mantener las células con el consulto de expresión. Ejemplos .de genes marcadores seleccionables . que incluyen, pero. . no ' se limitan a, higromicina B fosfotransferasa, . adenosina desaminasa, xantina-guániná fosforibosil transferasa, aminoglicósido fosfotransferasa, dihidrofolato redüctasa (DHFR) y timidina cinasa. Por ejemplo, la expresión sé puede llevar a cabo en presencia de metotrexato para, seleccionar solo aquellas, células que expresan el gen- de DHFR. La fusión con las moléculas de señalización de ..superficie celular tal como TCR- ? FCsRI-y pueden dirigir la expresión de las proteínas en un estado activo en la superficie celular.

Muchas líneas de células son disponibles para la expresión de mamíferos incluyendo ratón, rata, humano, mono, pollo y células de, hámster. Las líneas de células, ejemplares incluyen pero no se. limitan a CHO, Balb/3T3, HéLa, MT2, NSO de ratón (no secretora)' y otras líneas de células de mieloma, líneas de células de hibridoma y heterohibridoma, linfocitos, fibroblastos,. Sp2/0, COS, NIH3T3,. HEK293, 293S, . 2B8, y células HKB. Las ..líneas de células también son disponibles adaptadas al medio sin suero lo cual facilita la purificación de. las proteínas secretadas del medio de cultivo celular. Ejemplos incluyen células CHO-S (Invitrogen, Carlsbad, CÁ, cat # 11619-012) y. la línea de células EBNA-1 sin suero (Pham y colaboradores, (2003) Biotechnol.. Bioeng. 84:332-42.). también están disponibles las líneas . de células que se adaptan para desarrollarse en medios especiales optimizados para la expresión- 'máxima . Por ejemplo, las células DG44 CHO se . adaptan para desarrollarse en un cultivo de . suspensión en un medio sin producto animal, químicamente definido. e . Plantas .

Células de plantas transgénicas y plantas se pueden usar para expresar las . proteínas tal como cualquiera descrito en la presente. Los constructos de expresión se transfieren típicamente a las plantas usando transferencia de DNA directa ti como bombardeo de .micro-proyectiles y transferencia mediada por PEG de los protoplastos y con transformación mediada por agrobacterium. Los vectores de expresión pueden incluir secuencias promotoras y secuenciadoras, elementos de terminación transcripcionales y elementos de control traduccionales . Los vectores de expresión, y las técnicas de transformación se liberan usualmente entre hospederos dicotiledóneos, tales como Arabidopsis y tabaco, y hospederos monocotiledóneas , tales como maíz y arroz. Ejemplos de promotores de plantas usados para la expresión incluyen el promotor del virus del mosaico de la coliflor, él promotor de nopalina sintasa, el promotor de ribosa bifosfato carboxilasa y los ' promotores de ubiquitina y UBQ3. Los marcadores seleccionables tales como higromicina, fosfomanosa isomerasa y neomicina fosfotransferasa se usan frecuentemente, para facilitar la selección y mantenimiento de . las células transformadas. Las células de plantas transformadas se. pueden mantener en el cultivo como células,. . agregados (tejido calloso) o regeneradas en plantas¦ enteras. Las células de plantas transgénicas también pueden incluir algas diseñadas para producir polipéptidos de hialuronidasa. Debido que las plantas tienen diferentes patrones de glicosilación que las células de mamífero, esto puede influir en la elección' de la proteína producida en estos hospederos. 4. Técnicas de Purificación.

El método para purificación de los polipéptidos, que incluyen insulina y polipéptidos. de enzima degradadora de hialuronano u otras proteínas, de célulás hospederas dependerá de . las' células hospederas elegidas y los sistemas de expresión. Para las moléculas secretadas, las proteínas se purifican generalmente del medio de cultivo después de la remoción de las células. Para la expresión intercelular, las células se pueden lisar y las proteínas se purifican del extracto. Cuando . ios organismos transgénicos tales como plantas transgénicas y. animales se usan para . la . expresión, ios . tejidos u órganos se pueden usar como material de partida para hacer un extracto de células . íisadas. Adicionalmente, la producción de animales transgénicos puede incluir la producción de polipéptidos en leche o huevos,..que se pueden recolectar, y si. es necesario, las proteínas se pueden extraer y purificar adicionalmente usando métodos estándares en la técnica.

Las proteínas, tales como polipéptidos de insulina o polipéptidos de enzima degradadora de hialuronano, se pueden purificar usando técnicas de purificación de. proteínas estándares conocidas en. el campo incluyen pero no limitado a, SDS-PAGE, fraccionamiento de, tamaño y' cromatografía de exclusión de tamaño, precipitación de. sulfato, de amonio y cromatografía de intercambio iónico, tal como intercambio de aniones. Las técnicas de purificación por afinidad también se pueden usar para mejorar la eficiencia y pureza de las preparaciones. Por .ejemplo, los anticuerpos, receptores, y otras moléculas que digan¦ las enzimas de hialur.onidas.as se pueden usar. en la purificación por afinidad. Los constructos de expresión también se pueden diseñar para agregar una etiqueta de afinidad a una proteína tal como un epítopo myc, fusión. GST o HÍS6 y se purifican por afinidad con el anticuerpo myc, resina de glutationa y resina . de Ni, respectivamente. La pureza se puede evaluar por cualquier método conocido en el campo incluyendo electroforesis en gel, métodos' de HPLC ortogonales, técnicas de tinción y espectrofotométricas .

H. Usos terapéuticos Los métodos CSII, incluyendo métodos CSII.de tecnología de punta de. enzima que degrada a hialuronano, proporcionados en la presente se pueden usar para el tratamiento de cualquier condición por lo cual se emplea una insulina de acción rápida. Esta sección proporciona, usos terapéuticos ejemplares desde la insulina de acción rápida.. Los usos terapéuticos descritos' posteriormente son ejemplares, y no limitan las aplicaciones de los métodos descritos en la presente. Los usos terapéuticos incluyen, pero.no se limitan a, tratamiento para diabetes mellitus '. tipo . 1, . diabetes mellitus tipo 2 , diabetes gestacional, . y para el control glicémico en pacientes criticamente enfermos. Esta dentro de la experiencia de un médico que trata de identificar estas enfermedades o condiciones.

Como se plantea en lo anterior, las dosificaciones particulares y protocolos del tratamiento se individualizan típicamente para. cada sujeto.. ¦ Si es necesario,. una dosificación y duración particular y protocolo del tratamiento se pude determinar o extra polar empíricamente. Por ejemplo, las dosis ejemplares de la insulina de acción rápida sin una enzima degradadora de hialuronano se puede usar como un punto de partida para determinar las dosificaciones apropiadas en los métodos, proporcionados . en la presente. Los niveles de dosificación se pueden determinar con base a una variedad de factores, tal como . peso corporal del individuo, salud general, edad,. la actividad del compuesto especifico empleado,. sexo, dieta, actividad metabólica, concentraciones de glucosa en la sangre, . tiempo de administración, velocidad de excreción, combinación de fármaco, la gravedad, y curso de la enfermedad, y la disposición del paciente a la enfermedad y la evaluación del médico que trata. En particular, los niveles de glucosa en la sangre, tal como es medido por .un sensor de glucosa en la sangre, se pueden medir y se usa para determinar la cantidad de insulina y una enzima degradadora de hialuronano que se administra para lograr el control glicémico. Los algoritmos son conocidos en el campo que se pueden usar para determinar una dosis basada en la velocidad de absorción y el nivel de absorción de las co-fOrmulaciones de una insulina de acción rápida y una enzima degradadora de hialuronano. proporcionada en la presente, también basado en los niveles de glucosa en la sangre. Las dosificaciones de la insulina para el control glicémico post-prandial también se pueden calcular y ajustár, por ejemplo, al determinar el contenido de carbohidratos de una comida (véase, por ejemplo, Bergenstal y colaboradores, (2008) Diabetes Cáre 31: 1305-1310, Lowe y colaboradores, (2008) Diabetes Res. Clin. Pract. 80:439-443, Chiesa y colaboradores, (2005) Acta Biornad. 76:44-48). 1. Diabetes Méllitus La diabetes mellitus (o diabetes) se caracteriza por un metabolismo de glucosa deteriorado. La glucosa en la sangre se deriva de carbohidratos absorbidos en los intestinos y producidos en el hígado. El incremento de los niveles de glucosa en la sangre estimula la liberación de- insulina. El influjo de glucosa . post-prandial puede ser de 20 o. 30 vec.es más alta que la .producción hepática de la glucosa observada entre comidas. La liberación de insulina de fase temprana, que dura 10 minutos o aproximadamente, suprime 1.a producción de glucosa hepática y procede a una fase más prolongada (tardía) de liberación, la cual dura dos horas o más y cubre el influjo de carbohidratos en el tiempo de la comida. Entre comidas, un nivel de insulina continua, o bajo, insulina basal, cubre los ¦ requisitos metabólicos en curso, en particular para regular la producción de glucosa hepática así como la utilización de glucosa por el tejido liposo, tejido muscular y otros, sitios de objetivo. Los pacientes con diabetes se presentan con niveles de glucosa en la sangre elevados (hiperglicemia) . La diabetes se puede clasificar en dos grupos principales: diabetes tipo 1 y diabetes tipo 2. La diabetes tipo 1, o diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM), se caracteriza por una pérdida- de las células ß productoras de insulina de los islotes de Langerhans en el páncreas, conduciendo a una deficiencia de insulina. La causa primaria de la deficiencia de células ß es la, auto.inmunid.ad mediada por células T. La diabetes, tipo 2, o diabetes mellitus no dependiente de insulina (NIDDM) , sé presenta en pacientes con una función de células deterioradas.. Estos pacientes tienen resistencia a la insulina o sensibilidad a la insulina reducida, combinada con la secreción de insulina reducida. La diabetes tipo .2 se puede desarrollar eventualmente en la diabetes tipo 1. También se incluye en la diabetes la diabetes, gestacional. A; los pacientes con diabetes se les. puede/ administrar insulina para mantener tanto los niveles ; de insulina básales como para prevenir, las excursiones giicémicas, tal como después de una comida . a. Diabetes Tipo 1 La diabetes tipo 1 es una enfermedad autoinmune dependiente, de células T caracterizada por infiltración de los . islotes de Langerhans,- la unidad endocrina- del páncreas, y la destrucción de células ß, que conduce a una deficiencia en la producción de insulina e hiperglicemia . La diabetes tipo 1 se diagnostica más comúnmente . en niños y adultos jóvenes pero se puede, diagnosticar en cualquier edad. Los pacientes con diabetes tipo 1 pueden . presentar, además de bajos niveles de insulina y . altos niveles de glucosa en la sangre, poliuria, polidipsia, polifagia, visión borrosa y fatiga. Los pacientes se pueden diagnosticar al presentarse con niveles de glucosa en plasma en ayunas en o aproximadamente 126 mg/dL (7.0 mmol/l) , niveles de glucosa en plasma en o arriba, de 200 mg/dL (11.1 mmol/l) dos horas después, de 75 g de una carga de glucosa oral, tal como en una prueba de tolerancia a la glucosa, y/o niveles de glucosa en plasma aleatorios en o arriba de 200 mg/dL (11.1 mmol/1) .

El tratamiento primario para pacientes con/diabetes tipo 1 es la administración de insulina como terapia de reemplazo, que se' lleva a ' cabo típicamente en conjunción con la supervisión de . glucosa en la sangre. Sin insulina de reemplazo suficiente, se puede desarrollar cetoacidosis diabética, que puede dar por resultado, en coma, o muerte. A los pacientes se les pueden administrar inyecciones subcutáneas de insulina de acción rápida usando por ejemplo, una jeringa o pluma de insulina, o una bomba de insulina para mantener, los niveles de glucosa en la sangre apropiados por todo el día y también para controlar los niveles de glucosa post-prandiales . En algunos casos, una bomba de insulina, que incluye en el contexto de un sistema de circuito cerrado, se puede usar para administrar insulina intra-peritonealmente. De esta manera, los pacientes con diabetes tipo 1 se les puede administrar las co-formulaciones, de una. insulina de acción rápida y enzima degradadora de hialuronano descrita en la presente subcutáneamente o intra-peritonealmente a través de una jeringa, pluma de insulina, o bomba de insulina, o cualquier otro medio útil para la administración de insulina, para controlar, más rápidamente los niveles de glucosa' e insulina en la sangre. b. Diabetes Tipo 2 .. La diabetes tipo 2 se asocia con- resistencia a la insulina y, en algunas -poblaciones, también por insul.inopenia (menos de la función de las células ß) . En la . diabetes tipo 2, la liberación de fase 1 de la insulina está ausente, y la liberación de fase 2 se retrasa y es inadecuada. El fuerte repunte de la liberación de insulina que se presenta en los sujetos sanos antes y después de una comida se retrasa, se prolonga, y es insuficiente en cantidad en pacientes con diabetes tipo 2, dando por resultado hiperglicemia . Los pacientes con diabetes tipo 2 se les puede administrar insulina para controlar los niveles de glucosa en. la sangre (Mayfield y. colaboradores (2004) Am Fam Physican 70:489-500) . Esto se puede hacer en combinación con otros tratamientos . y regímenes de tratamiento, incluyendo dieta, ejercicio y otras terapias anti-diabéticas (por ejemplo sulfonilureas , biguanidas, meglitinidas, tiazolidinadionas e inhibidores de alfa-glucosidasa) . De esta manera, a los pacientes con diabetes tipo. 2. se. les pueden administrar las c.o-formulaciones de una . insulina de acción rápida y enzima degradadora de hialuronano descrita . en la presente subcutánea o intra-peritoneaimente a través, de', jeringa, pluma, de insulina o. bomba de . insulina, o cualquier otro medio útil para administrar la insulina, para controlar más rápidamente los niveles de glucosa e insulina en la sangre.

C. Diabetes Gestacional Mujeres embarazadas quienes nunca han tenido diabetes antes pero que tienen altos niveles de glucosa en la' sangre durante el embarazo son diagnosticadas con . diabetes gestacional. Esto tipo de diabetes afecta aproximadamente .1-14% de todas las mujeres embarazadas, dependiendo de la población estudiada (Carr y colaboradores, (1998). Clinical Diabetes. 16). Mientras que la causa subyacente permanece desconocida, parece probable que las hormonas producidas durante el embarazo reducen la sensibilidad a la insulina de la mujer embarazada. El mecanismo de la; resistencia de la insulina es probablemente un defecto post-recéptor , puesto que se ha mostrado la ligación de la insulina normal por las células sensibles a la insulina. El páncreas libera 1.5-2.5 veces más insulina a fin de responder al incremento resultante en la resistencia a la insulina. Los' pacientes con función, pancreática normal son capaces . de cumplir estas demandas.. Los pacientes con su función pancreática al limite tienen dificultad de incrementar la secreción de insulina y consecuentemente producir niveles inadecuados de insulina.' La diabetes gestacional resulta de esta manera cuando existe una secreción de insulina retardada o insuficiente ' en presencia del incremento a la resistencia a la insulina periférica.

A los pacientes con diabetes gestacional se les puede administrar insulina para controlar el nivel de glucosa en la sangre. De esta. · manera, los pacientes con diabetes gestacional se. les puede administrar las co-formulaciones de una insulina de. .acción rápida y enzima degradadora de hialuronano descrita en la presente subcutáneamente a través de jeringa, pluma, de insulina, bomba de. insulina o páncreas artificial, . o cualquier otro medio para controlar más rápidamente los niveles de glucosa e insulina en la. sangre. 2. Terapia de insulina para pacientes criticamente enfermos .

La hiperglicemia y la resistencia a la insulina se presenta frecuentemente en pacientes médica y/o quirúrgicamente, criticamente enfermos y se ha asociado con la morbilidad y mortalidad incrementada en pacientes diabéticos como . no diabéticos y en pacientes con lesión traumática, apoplejía,, lesión cerebral anóxica, infarto al miocardio agudo, cirugía, post-cardiaca, y otras causas de enfermedad critica . (McCo en y colaboradores¦'.'.(2001) Crit. Clin. Care 17: 107- 124') . Los pacientes críticamente enfermos con hiperglicemia se han tratado con insulina para controlar los niveles de glucosa en la sangre. Este tratamiento pude reducir la morbilidad y mortalidad entre este grupo (Van den Berghe y colaboradores (2006) N. Eng. J Med. 35.4 : 449-461) . La insulina típicamente : se administra intravenosamente al paciente, tal como por inyección con una jeringa por un profesional médico o'; por infusión usando una bomba de insulina. En algunos ejemplos, los algoritmos y software se usan para calcular la dosis. De esta manera, los pacientes críticamente enfermos con hiperglicemia se . les puede administrar una co-formulación de una . insulina . de acción rápida , y enzima de.gradadora de hialuronano descrita en la presente para controlar los niveles de glucosa en la sangre, aliviando de esta manera la hiperglicemia y reduciendo la morbilidad y mortalidad.

J. Terapias de combinación Los métodos descritos en la presente pueden incluir además '. una etapa para administrar, antes de, intermitentemente con, o subsecuentemente a, otros agentes terapéuticos que incluyen, pero, no se limitan a, . otros productos biológicos y compuestas' de moléculas pequeñas. Para cualquier enfermedad o condición, incluyendo todas aquellas ejemplificadas en lo anterior, por lo cual una insulina de acción rápida se indica o se ha usado y por el cual otros agentes y tratamientos son disponibles, que pueden usarse además , en los métodos, en la presente. Dependiendo de la enfermedad o condición que se trata,, los otros agentes terapéuticos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, otros fármacos anti-diabéticos, que incluyen, pero no se limitan a, sulfonilureas , bigüanidas, meglitinidás , tiazdlidinedionas-, inhibidores de : alfá-glucosidasa, . análogos de ¦ péptido, incluyendo análogos de péptidos similar a glucagón ..(GLP), y, análogos de péptido inhibidor gástrico (GIP) e inhibidores de DPP- . En otro ejemplo, los métodos pueden incluir además administrar en combinación con, antes de, intermitentemente con, o subsecuente a, con una o más de otras insulinas, incluyendo insulina de acción rápida, e insulinas de acción basal .

K. EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se incluyen para propósitos ilustrativos solamente y no se proponen para limitar el alcance de. la invención.

Ejemplo 1 Formulaciones de Insulina e Insulina-PH20 A. Insulina aspart El insulina aspart usado en estos estudios fue . el aspart de insulina de producto comercial: Novo Nordisk, NovoRapid® (Insulina aspart, que se designa NovoLog® en los Estados Unidos; Lote.. XS60195) . Este producto contiene 100 U/mL de insulina aspart ,, 0'.1096 mg/mL de zinc, 1.25 mg/mL (7 mM) de dihiclrato fosfato ácido de disodio, 0.58 mg/mL (10 mM) de NaCl, 16 mg/mL (170 mM) de glicerina, 1.5 mg/mL (0.15%) de fenol y 1.72 mg/mL (0.1.72%) de m-cresol .

B. Formulación de insulina aspart-PH20 El. producto . de fármaco de Asparto-PH20 es una formulación conservada de. dosis múltiploe, estéril del aspart de insulina recombinánte de ingrediente farmacéutico activo con hialuronidasa humana recombinánte (rHuPH20, ver Ejemplos 5-7) en un pH neutro, solución acuosa isotónica amortiguada. Cada mL de solución acuosa contiene aspart de insulina (aspart de insulina recombinánte) 3.50 mg; rHuPH20 (hialuronidasa humana recombinánte) 5.0 ug; trometamina (base Tris) 3.63 mg; cloruro de sodio 2.92 mg; metionina 14.9 mg; poloxámero 188. (F68 plurónico) 0.10 mg; metacresol 0.78 mg; fenol 1.34 mg; e hidróxido de sodio y/o ácido clorhídrico para ajuste de pH . hasta. pH 7.4.. En¦ algunas formulaciones, cada mL de solución acuosa contiene aspart de insulina (aspart de insulina recombinánte) 3.50 ' mg; rHuPH20 (hialuronidasa humana recombinánte) 5.0 ug; trometamina (base Tris) 3.63 mg; cloruro de sodio .2.92 mg; .metionina 14.9 mg; poloxámero 188 (F68 plurónico) 0.10 mg; metacresol' 0.75 mg; fenol 1.25 mg; e hidróxido de sodio y/o ácido clorhídrico para ajuste de pH hasta pH 7. .

Ejemplo 2 Farmacocinética (PK) y glucodinámica de insulina aspart y formulación PH20 por infusión de insulina subcutánea continua (CSII) La formulación de insulina aspart (Aspart-PH20) con hialuronidasa humana (rHuPH20) descrita en el Ejemplo 1 se comparó con la formulación de aspart de insulina ' comercial (NovoLog®) durante tres, días de ' tratamiento de diabetes cuando se suministra por infusión subcutánea continua en un entorno hospitalario. Dieciséis sujetos con diabetes tipo. 1 que ya han usando infusión de insulina subcutánea continua (CSII) reciben cada estudio de fármaco por CSII en orden aleatorio en cualquiera de las dos visitas. Los sujetos se confinaron a un entorno hospitalario durante tres días de estudio .

A. Protocolo de estudio En la tarde del primer día (día 1). usando' un sistema de bomba Medtronic Paradigm, los sujetos tienen un nuevo sitio de infusión colocado y . los depósitos se rellenaron con ya sea asparto-PH20 o Novolog®. El diseño del estudio permite la comparación del desempeño establecido de infusión durante . un periodo de observación de aproximadamente 72 horas.

Doce hasta catorce (12-14) horas después de la inserción del nuevo juego de. catéter de infusión de insulina,' un experimento de . pinzamiento de glucosa euglicémica se condujo (Ia pinzamiento; ½ día después de la colocación de infusión) . Los pinzamientos dé- 'glucosa euglicémica se condujeron con un Biostator para proporcionar mediciones de glucosa continua y ajuste de infusión intravenosa de tasa variable de glucosa -al 20% en agua para . mantener los niveles de la glucosa en la sangre constantes- (Heinemann L, Anderson JH, Jr. Measurement of insülin absorption and insulin¦ action . Diabetes echnol Ther 2004;6:698-718); una infusión de insulina intravenosa basal no se empleó en 'este estudio. La glucosa en la sangre se fijó en 90% del nivel de ayuno para suprimir la liberación de insulina endógena durante el estudio. Un bolo de 0.15 U/kg se administró a través de la bomba de insulina; y la tasa basal individual usual se continuó durante los pinzamientos .y los resultados- PK son de esta manera sustraídos en la línea base .

Durante el experimento de pinzamiento. de. glucosa euglicémica, los sujetos se siguieron durante seis ( 6). horas durante, las cuales se retiró sangre y. se determinaron los niveles de insulina libre y tasas' de infusión de glucosa requeridas para mantener la euglicemia. Se usó un método de radioinmunoensayo competitivo convencional validado. (RIA) para determinar las concentraciones de, insulina aspart en muestras de. suero, humano. El trazador y anticuerpo primario usado en el RIA fueron : trazador de [125I] -insulina (Millipore, Catálogo # 9011) y un antisuero de anti-insulina de conejillo de indias (Millipore, Catálogo # 1013-K) (que . reacciona cruzado al 100%) con insulina humana,' insulina de rata, insulina de perros, · e insulina lispro) . Las concentraciones IRI en las muestras de prueba se estimaron por interpolación de una curva estándar de insulina aspart que está en el intervalo en concentración' desde 10 hasta 5,000 pM.

Aproximadamente 60 horas después de la colocación del equipo de infusión en el dia 4, y aproximadamente 48 horas después del. ,1er. pinzamiento, el experimento .de pinzamiento de glucosa euglicémica · se repitió (2a pinzamiento; '2 ½ días después de la colocación de infusión) . Los sujetos' se siguieron durante seis (6) horas durante las cuales se retiró sangre . y se determinaron los niveles de insulina libre y tasas de infusión de- glucosa requeridas para mantener la euglicernia como se describe arriba.

B. Resultados 1. Farmacocinética de insulina ... Los. resultados para el 1er y 2° estudio de pinzamiento se . representan como concentración de insulina inmuno.reac.tiva de suero '.(IRI en. pmol/L) contra tiempo en la„ Tabla.6. La Tabla 7 representa los resultados de insulina inmunoreactivos en el suero (media+/-SD) . Los resultados también se representan en la Figura 1.

En presencia de rfíuPH20, se acelera la absorción de aspart comparada, con aspart solo después de tanto ½ día de CSII (1er. pinzamiento) como 2 ½ días de CSII. (2 o. pinzamiento) (ver Figura 1) . Por ejemplo, los resultados de ½ día de CSII muestran que la exposición., a insulina en la primera hora para la formulación de insulina a.spart-PH20 fue 35% de AUC total, y- para aspart solo fue 21% de . AUC total, mientras que la exposición más allá de 2 horas fue 29 y 48%, respectivamente, . de . AUC total. Los resultados de 2 ½ días de CSII muestran que la exposición a insulina en la primera hora para la¦ formulación . de insulina aspart-PH20 fue 51% de. AUC total y para aspart solo fue 33% de AUC total, mientras que la exposición más allá de 2 horas, fue . 17 y 34%, respectivamente, de AUC total. Esto es consistente con estudios previos que muestran que rHuPH20 acelera la exposición a la insulina.

Para el aspart comercial (Ndvolog®) , la absorción de insulina se aceleró después de 2 ½ días con relación a ¦½ día de CSII, con la exposición a la insulina en la primera hora incrementando desde 21 .hasta 33%) de AUC total, y la exposición más allá de 2 horas disminuye desde .48 hasta 34%. Para la formulación de 'insulina aspart-PH20, la exposición a la insulina también incrementa después, de 2 ½ -días de CSII comparado con ¾ día, con la exposición a la insulina en la primera hora incrementando desde 35 hasta 51) y la exposición más allá de 2 horas disminuye desde . 29 hasta 17% de exposición total. La exposición a la ' insulina absoluta en la primera hora . también incrementa para insulina aspart desde 11.4 nM*Min en el día ½ hasta 21.4 nM*Min en el día 2- ½. ..Esto corresponde a un incremento al 67% en la relación media geométrica. Además del incremento en la exposición en la primera hora en el día 2 ½, la variabilidad entre pacientes en la exposición también se incrementó, ya que el coeficiente de variación (CV) incrementa desde 33% hasta. 63%. Para la formulación de insulina aspart-rHuPH20 , la exposición a la insulina en la primera hora incrementa menos, desde 22.4 nM* in en el día ½ hasta 30.0 nM* in en elo día 2 ½. Esto corresponde a un incremento al 39% en la relación media geométrica. La formulación de insulina aspart-rHuPH20 tampoco exhibe incremento en variabilidad entre pacientes, con el CV actualmente disminuido ligeramente desde 35% hasta 28%.

La exposición de .insulina total (desde 0 hasta 6 horas) fue generalmente la misma (sin 'diferencia estadísticamente importante) - para cualquier insulina aspart solo o formulado con rHuPH20. cuando, se compara con ½ día hasta 2 ½ días de desgaste establecido de infusión. 2. Glucodinámica La glucodinámica, se midió al determinar la tasa de infusión de glucosa necesaria para mantener .'la , euglicemia después de. la administración de insulina en bolo. Los resultados, glucodinámicos para cada uno., de los grupos de tratamiento se resumen en la Tabla 8. Las tasas de infusión GIR también se representan en la Figura .2. Los . resultados son consistentes . con . la . aceleración en la f armacodinámica descrita arriba. ' ; GIRmax: Tasa pico de. infusión de glucosa; G (0-1., 0-2, 0-3, 0- 4) : glucosa total infundida (g/kg). en intervalo de tiempo Además del comienzo más rápido y . duración más corta de acción apreciada durante el curso de la vida .del equipo de infusión (Ia pinzamiento comparado con el 2 a pinzamiento)", los resultados también muestran que. la acción . de insulina total (Gtot; glucosa acumulativa- infundida durante, el curso del experimento) como se. coloca en ensayo por - el método de pinzamiento euglicémico disminuido sobre la vida del equipo de infusión. Por' ejemplo, tanto aspart comercial solo (Novolog®) como : formulación de . insulina áspart-rHuPH20 exhiben la misma. acción de insulina total al momento del 1er. pinzamiento, 2.0 g/kg. Dos días después en la 2a pinzamiento, sin embargo, la acción¦ de insulina total se redujo para ambos fármacos de estudio, aunque a un grado mayor . para la formulación de insulina aspart-rHuPH20 (ver Figura 3). Ambos tratamientos (insulina aspart comercial solo o formulación de insulina aspart-rHuPH20 ) acelerados del Ia pinzamiento para la 2a pinzamiento, y la adición de rHuPH20 para insulina aspart resulta en un perfil de tiempo-acción más rápido como se compara con el insulina aspart comercial solo en ambos puntos de tiempo .¦ (ver Figura 4) . 3. Respuesta a la glucosa en la sangre para la comida La respuesta a la glucosa en la sangre para la comida se describe en la Tabla 9.

Tabla 9: Parámetros a la Respuesta de Glucosa Postprandial (media) Con asparto-rHuPH20 . las excursiones comida se controlaron consistentemente bien y ;. la iperglicemia postprandial fue mejor que sin ella. 4. Eventos adversos Los eventos adversos se evaluaron durante el curso, o tratamiento de infusión. La Tabla 10 establece eventos adversos observados. Los resultados no muestran . que lós eventos adversos moderdos o severos se asociaron con exposición de rHuPH20. 5. Resumen Los resultados muestran, que rHuPH20 cuando se ¦ coadministra con insulina reduce, pero no elimina, la aceleración de la absorción de insulina con el paso del tiempo después de 2 ½ días con relación a 1/2 día de CSII. Esto está correlacionado a una reducción en la variabilidad día a día en. la exposición y acción de insulina como una función de la' vida del equipo de. infusión.. Con rHuPH20 presente, los datos muestran mayor consistencia en la exposición de tiempo y perfiles de¦ tiempo-acción normaliados pór la acción de la insulina total.

Ejemplo 3 Administración de Insulina aspart con y sin Pretratamiento de PH20 por Infusión de Insulina Subcutánea Continua (CSII) La formulación de insulina aspart comercial (NoyoLog®) se suministró durante tres días de tratamiento de diabetes por infusión subcutánea continua en un entorno hospitalario. Inicialmente cuatro sujetos con diabetes, tipo 1 que ya' han usado infusión de insulina subcutánea continua (CSII) reciben NovoLog® por GSII ya sea con o sin pretratamiento con 150 unidades (U) de rHuPH20 (preparado como se describe en los Ejemplos 5-7) en orden, aleatorio en cualquiera de las dos visitas. El estudio se continuó para incluir 15 sujetos que completan el protocolo de estudio., y se continuó además para incluir 17 sujetos qué completan el protocolo de estudio. Los sujetos se confinaron a un entorno hospitalario, durante tres días dé estudio.. .

A. Protocolo de estudio En la mañana del primer día, los sujetos tienen una nueva cánula en el sitio de infusión colocada (Medtronic Quick-set) y reciben ya sea una inyección falsa o. una inyección de 1 mL de rHuPH20 (150 U/mL de hialuronidas.a humana recombinante formulada en solución salina amortiguadora de fosfato · con 1 mg/mL de albúmina' de. suero humana) a través ¦ del equipo de infusión y cánula. Inmediatamente después (por ejemplo dentro de unos pocos minutos), de la administración del rHuPH20, el depósito se rellenó con NovoLog® y . los pacientes reciben la insulina por CSII (sistema de . bomba . Medtronic Paradigm) durante un periodo de observación de aproximadamente 3.días.

Aproximadamente. 2 horas después de la inserción . del nuevo catéter . del equipo de infusión de insulina, un experimento de pinzamiento de glucosa euglicémica se condujo (ler. pinzamiento). Los pinzamientos de glucosa, euglicémica se condujeron con un Biostator para proporcionar mediciones de glucosa continua y ajuste de la infusión intravenosa de tasa variable de glucosa al 20% en . agua para , mantener constante los niveles de glucosa en la sangre . (Heinemann L, Anderson JH, Jr. Measurement of insulin absorption and insulin action .. .Diabetes . Technol Ther 200 ; 6 : 698-718 ) ; una infusión de insulina intravenosa basal no. se empleó en este estudió. La glucosa en 'la sangre se -fijó, .en 90% del nivelo de ayuno para suprimir la liberación . de insulina1 endógena durante el estudio. Un bolo de 0.15 U/kg se administró a través de la bomba de insulina; y la tasa basal individual usual se continuó durante los pinzamientos y los resultados PK de esta manera son sustraídos con línea base.

Durante el . experimento de .pinzamiento de glucosa euglicémica, los sujetos se siguieron, durante seis (6) horas durante las cuales se retiró sangre y se determinaron los niveles de insulina libre y tasas de infusión de glucosa requeridas para mantener la euglicemia. Se usó un método de radioinmunoensayo competitivo convencional validado (RIA) para determinar las concentraciones de insulina aspart en muestras de suero humano. El trazador y anticuerpo, primario usados en el RIA fueron trazador de [125I] -insulina (Millipore, Catálogo # 9011) y un antisuero anti-insulina de conejillo de indias- (Millipore, Catálogo # ,1013-K) (que reacciona cruzado 100% con insulina humana, insulina de. rata., insulina de perro, y insulina lispro) . Las concentraciones IRI en las muestras de prueba se estimaron por , interpolación de una curva estándar de insulina aspart que está, en el intervalo en concentración desde 10 hasta 5,000' pM.

Aproximadamente 26 horas después de la colocación del equipo, de infusión, y aproximadamente 24 horas después del ler.. pinzamiento, el experimento de pinzamiento de glucosa euglicémica se. repitió (2°. pinzamiento) . Aproximadamente 14 horas después de ..la colocación del equipo de infusión, y aproximadamente 48 horas después del 2°. pinzamiento, el experimento de pinzamiento de glucosa euglicémica se repitió de nuevo ( 3er . pinzamiento) . En cada experimento, los sujetos se. siguieron durante seis (6) horas durante las cuales se retiró sangre y se determinaron los niveles de insulina libre y tasas de infusión de glucosa requeridas para mantener la euglicemia como se. describe arriba. ¦.

Los pacientes también reciben comidas . en la noche sólidas estandarizadas (CHO al 45-50%, proteína al 18-22%, grasa al 30-34%) en cada uno de los cuatro días consecutivos (aproximadamente 2 . horas después de un nuevo equipo de infusión sin rHuPH2.0, y después de aproximadamente ½, 1 ½, . y 2 ½ días del uso. establecido de infusión con o sin rHuPH20) . Inmediatamente antes de cada comida, los pacientes reciben una infusión en bolo específic por comida y paciente de NovoLog® por medio' de la bomba de insulina, y se determinó la respuesta de glucosa en la sangre para la comida.

B. Resultados 1. Farmacocinética de insulina Los resultados de cada experimento , de pinzamiento se representan en la Tabla 11, con resultados resumidos para los 15 completadores . (Tabla lia) y los 17 completadores completos (Tabla 11b). Los resultados también se representan en la Figura 5·.

Tabla 11a. Parámetros de farmacocinética (media) se representa como . media geométrica Tabla 11 b. Parámetros de farmacocinética (media) Con el pretr.atamiento rHuPH20, la insulina se absorbió rápidamente a través de la vida del sitio de infusión. Con relación al 1er. pinzamiento sin rH.uPH20, todas los pinzamientos con rHuPH20 tienen perfiles ultrarápidos característicos, con mayor exposición en la Ia hora, mayor .y temprana exposición pico, ' y menos exposición más allá . de 2 horas .

Cada uno de los pinzamientos después del pretratamiento rHuPH20 tien.é perfiles ultrarápidos similares, mientras que cada uno de los pinzamientos sin rHuPH20 demuestra una variación sistemática en absorción. de insulina como. el equipo de infusión envejecido. 2. Glucodinámica El perfil de .acción de insulina como una función de tiempo,, o glucodinámica, se midió al determinar la' tasa de infusión de glucosa, necesaria para mantener la euglicemia después de la infusión de insulina en bolo. Los resultados de cada experimento de pinzamiento se presentan en la Tabla 12, con resultados, resumidos para los 15 completadores (Tabla 12a) y los 17 completadores completos' (Tabla 12b).. La Figura 6 también representa los resultados. .

Con pretratamient rHuPH20, la absorción de .insulina rápida se reflejó con un perfil de . acción de. insulina ultrarápido a través de la vida del sitio de infusión. Con relación a la Ia pinzamiento sin . rHuPH20, todas los pinzamientos con rHuPH20 tienen perfiles ultrarápidos característicos, con acción mayor en las primeras 1-2 horas, y el comienzo temprano dé la acción (temprano t50%) , duración más corta de acción, y menos acción más allá de. 4 horas.

Cada uno de ios pinzamientos después del pretratamiento . rHuPH.20 tiene perfiles ultraráp.idos similares, mientras que cada uno de los pinzamientos. sin rHuPH20 demuestra una variación sistemática en la acción de insulina como el. equipo de infusión envejecido. 3. Respuesta de glucosa en la sangre para la comida La respuesta : dé glucosa en la sangre para la comida se describe en la Tabla 13, con los resultados resumidos para los 15 completadores (Tabla 13a) y los 17 completadorés completos (Tabla 13b) .

Con pretratamiento de rHuPH20 las excursiones .de comida fueron controladas · consistentemente bien . y la hiperglicemia postprandial fue mejor .que sin ella. 4. Eventos adversos Los eventos adversos se evaluaron durante el curso o tratamiento de infusión. La Tabla 1.4 . establece eventos adversos observados, con resultados resumidos por los 15 completadores (Tabla 14a) y los 17 completadores completos (Tabla 14b) . Los resultados muestran que de los eventos adversos relacionados con sitios . de infusión CSII, dos sujetos tienen eventos ' asociados con la exposición a rHuPH20 (dolor del sitio ...de infusión y hemorragia del ' sitio de infusión) y un sujeto tiene un evento asociado con insulina aspart sola . (dolor del sitio de infusión) sanguíneo7 Trastornos de 1 (5.3%). 0 nutrición y metabolismo8 dolor del sitio dé infusión CSII (n= 2); hemorragia de sitio de infusión. CSII (n=l); edema periférico (n=2) ; los otros eventos todos se . relacionarán con sitios de infusión IV usados para procedimientos de pinzamiento euglicémico 2 principalmente dolor de cabeza; mareo (n=l) , temblor (n=l)., 3 infección del .'¦ sitio ' de infusión IV :(n=l) , · infección' por hongos (n=l), orzuela (n=l) , celulitis : del sitio de infusión IV (n=l) 4 Nausea (n=2) , Dispepsia (n=l) 5 dolor de cuello (n=l), dolor en las extremidades (n=l) 6 piel seca (n=l ) ,·. hiperhidrosis (n=l) 7 Anemia' (n=l) 8 Hipocalemia (n=l) dolor del sitio ..de infusión CSII (n=2); hemorragia del sitio de infusión CSII (n=l) ; edema periférico (n=2) ; los otros eventos todos .se relacionarán--, con . sitios de infusión IV usados para procedimientos' de pinzami.ento euglicémico 2. dolor de cabeza; mareo (n=8), temblor (n=l) 3 infección del sitio de infusión IV (n=2) , infección por hongos (n=l) ,- orzuela (n=l) , celulitis del sitio de infusión IV (n=l.) , infección vag-inal (n=l) 4 Nausea (n=2) , Dispepsia (n=l) ¦ . 5 dolor de cuello (n=l) , dolor en las extremidades (n=l) 6 piel seca (n=l),. equimosis (n=l) , hiperhidrosis (n=l) 7 Anemia (n=2 ) 8 Quemadura, Io grado (n=l) 9 Hipocalemia (n=l) 5. Resumen de los Resultados Consistente con' reportes previos, la absorción y acción de insulina varia significativamente durante tres días de uso establecido de infusión. Por ejemplo, para los pacientes tratados sin rHuPH20, desde el principio al final de tres días de infusión, los resultados de 15 completadores muestran exposición a la insulina . temprana, variada desde 15 hasta 2.7% (p=.0004),. el comienzo de la acción variada desde 60 min hasta 30 min (p<,0001),' y duración de la acción variada desde 180 hasta .156 minutos (p=.0005) . Los resultados de 17 completadores muestran que desde el inicio hasta, el final de tres días de infusión, la exposición de. insulina temprana varia . desde 16 hasta 27% (p<.0001), el comienzo de la. acción varia desde 59 min . hasta 27 min (p< .0001 ) , y la duración de la acción varia desde 180 hasta. 156 minutos (p=.0001). El pretratamiento . con rHuPH20 elimina esta variabilidad ya que no hubo diferencias importantes en la exposición, a la insulina temprana, el comienzo ?· duración de la acción durante tres días de infusión continua . , El prétretamiento de rHuPH20 también acelera la . absorción ¦ de insulina.. Por ejemplo, un resumen de los resultados de 15 completadores muestran el rHuPH20 que resulta en 56% de la exposición a la insulina más temprana (P<..0001), un. comienzo más rápido de 9 minutos de la acción. (p=.037), y una duración más corta de 27 minutos de. la acción. ('?<.0001), y para los 17-¦ completadores que resultan en una exposición de insulina más temprana al 55% (P<.0001), un cominezo más rápido de 9 minutos de la acción (p= .018 ) , y una duración más corta de 27 minutos de la acción (p< 0001) . Este perfil ultrarápido y consistente traducido en excursiones postprándiales consistentemente reducidas. Por. ejemplo, un resumen, de los resultados de 15 completadores muestra que la glucosa postprandi.al de 2. horas (PPG) fue 117 mg/dL y 133 mg/dL sin (p=.073) y para los 17 completadores fue 112 mg/dL con rHuPH20 y 126 mg/dL. sin (p=.098). También,, la reducción en la excursión glicémica de 2 horas de 21 mg/dL fue importante. : (p= .017 ) . para los 15 completadores. Similarmente, la reducción en la excursión glicémica de 2 horas' para los 17 completadores completos o 19 de mg/dL también fue. importante (p=.020) . La infusión de insulina aspart con y sin rHuPH20 se toleró bien ..de manera similar.

De esta manera, los resultados muestran . que la preadministración. con 150 U de rHuPH20 produce un perfil ultrarápido consistente para 3 ½ días de infusión continua, que proporciona control postprandial consistente de comidas de la cena mezcladas y permite a más pacientes lograr consistentemente niveles objetivos de control PPG.

Ejemplo 4 Administración de Insulina aspart con y sin Pretratamiento PH20 por Infusión de Insulina Subcutánea Continua (CSII) Los pacientes con diabetes tipo .1 participan eri un estudio clínico de diseño reticulado de 2 vías, doble ciego, aleatorio que compara la administración de una inyección de hialuronidasa sencilla en cada cambio establecido de infusión para fingir las inyecciones en una terapia CSII.. Los puntos finales de pinzamiento; euglicémico comparados en el estudio al inicio final, de. 3 días de respuesta glicémica e infusión continua para una serie de cuatro pruebas de estimulación de comida sólida en el desayuno. Los resultados se representan a continuación para los primeros tres sujetos que completan el estudio. Además, también se evaluó el. monitoreo de glucosa continuo de los tres sujetos para comparar el control de glucosa en el cuidado de diabetes para el paciente externo de rutnia.

A. Protocolo de estudio Los pacientes se . colocaron aleatoriamente, para recibir ya sea inyección . falsa o. inyección, de hialuronidasa rHuPH20 (preparada como se describe en los Ejemplos 5-7) durante. dos periodos de tratamiento de aproximadamente 16 días. En cada periodo, los sujetos primero se presentan para la unidad de de búsqueda clínica (CRU) para recibir un nuevo equipo de infusión como se describe en el Ejemplo 3. Brevemente, los sujetos tienen una nueva cánucla en el sitio de infusión colocada y que recibe ya sea una inyección falsa o una inyección de l . mL; de rHuPH20 (Hylenex®;; 150 USP unidades de hialuronidasa humana recombinante formulada con 8.5 ..mg de cloruro de sodio, 1.4 mg de fosfato de sodio dibásico, 1.0 mg de albúmina humana, 0.9 mg de edetato de disodio, .0.3 mg de cloruro de calcio,. pH 7.4). Inmediatamente . después, (por ejemplo dentro de. unos pocos minutos) de la administración del rHuPH20, los pacentes reciben' insulina por CSII para infusión durante '3 días. Dentro de . 4 horas después., de la inserción del catéter de infusión establecido, .se realizó un experimento de pinzamiento euglicémico como se describe en el Ejemplo 3. Los sujetos se liberan del CRU el mismo día.

Los sujetos regresan 3 días después para un segundo pinzamiento euglicémico después de 3 días de infusión continua. Después el equipo de infusión del experimento de pinzamiento se cambió y los pacientes se dieron' de alta. Durante . ' los siguientes 12 días, los sujetos, trataron su diabetes normalmente con monitoreo. de: glucosa continuo desenmascarado por el sensor CSII. aumentado que cubre ' 4 ciclos del equipo de infusión cada uno. Los sujetos regresan al CRU aproximadamente cada ·.3 dias hasta recibir un nuevo equipo de infusión y recibir una comida de desayuno. y bolo de insulina estandarizada especifica, para el paciente. Una administración sencilla de 1 mL de 150 Unidadés de rHuPH20 (Hylenex) se administró al momento de cada cambio establecido de infusión. Para mantener el diseño de estudio de doble ciego, un profesional entrenado de otra manera no involucrado en el estudio administra ya sea rHuPH20 o una inyección falsa mientras que el . paciente miraba a otro lado. Después de Ta terminación de la Ia fase, los pacientes regresan al CRU dentro de 21 dias hasta la repetición de estas¦ etapas con el tratamiento alterno. Durante el estudio los pacientes usan su bomba de insulina' regular, equipo de infusión -y análogo de insulina de acción rápida, menos incompatible con el procedimiento de administración de hialuronidasa (por ejemplo bomba Omnipod, equipo de infusión de seguro-T) en cuyo caso se intercambiaron para, una alternativa compatible para la duración del estudio. ; B. Resultados 1. Glucodinámica El perfil de acción de insulina como una función de tiempo, , o glucodinámica, se midió al determinar la tasa · de infusión de glucosa necesaria para mantener la euglicemia después, de la infusión de insulina en bolo.. Los resultados de cada experimento de pinzamiento se presentan en la Tabla 15.'.

Con pretratamiento rHuPH20, hubo un. perfil, de acción de insulina ultrarápido a través .de la vida del sitio de infusión. Con relación a la Ia pinzamiento sin rHuPH20, todos los pinzamientos con rHuPH20 tienen perfiles ultrarápidos característicos, con mayor acción en las primeras 1-2 horas., y. comienzo temprano de la acción (temprano t50%) ,. duración más corta de acción, y menos acción más allá de 4 horas-.

Cada uno de los pinzamientos después del pretratamiento rHuPH20 tienen perfiles ultrarápidos similares, mientras que cada uno de los pinzamientos sin rHuPH20 demuestra una variación sistemática en la acción de insulina como el ' equipo de infusión envejecido. 2. Respuesta a la glucosa en la sangre para la comida La- respuesta a la . glucosa en la- sangre para la comida sé describe en la Tabla 16.

Con pretratamien.to rHuPH20. las excursiones de comida fueron consistentemente bien controladas y la hiperglicemia postprandial. fue mejor que sin el pretratamiento rHuPH20. 3. Puntos finales de la administración de Diabetes de rutina ¦ Los primeros tres sujetos que completan que completan el estudio representan la experiencia clínica inicial usando la preadministración rHuPH20 para control, del paciente externo de glucosa en la sangre, a través de . aproximadamente 2 semanas de tratamiento, que cubren ciclos del. equipo de infusión cada uno.. Los tres pacientes fueron capaces de lograr control a. la glucosa más. hermético disminuyendo su glucosa CGM media y variabilidad de glucosa, principalmente al disminuir la iperglicemia .

Los eventos hipoglicémicos (déterminados de los síntomas y registros SMBG con valores <70 mg/dL) fueron leves, y de frecuencia similar, con 6 episodios durante el análogo solo y 7 episodios después del pretratamiento de rHuPH20. Estos resultados se resumen en la Tabla 17. 4. Eventos adversos Los eventos adversos se evaluaron durante el curso o tratamiento de infusión. Dieciocho (18) eventos adversos se observaron en seis . de los once sujetos evaluables. Todos fueron suaves y se resolvieron sin secuelas. El evento más común fue dolor de cabeza (n=4).' Las reacciones en el sitio local potencial incluyen dos (2) casos de. pruritis (falsos), una contusión abdominal (rHuPH20) , dolor en. el sitio de infusión (rHuPH20). y . una sensación de punzante durante la infusión (r.HuPH20) . 5. Resumen de los Resultados Consistente con reportes previos, y el Ejemplo 3 de arriba,, la acción de insulina variada . significativamente durante tres días del uso del equipo de infusión en ausencia del pretratamiento rHuPH20. Por ejemplo, desde el inicio al infal de tres días de infusión, el comienzo 1 de la acción variada desde 66' min hasta 41 min (?=.?1) , y. duración de la acción variada desde 160 hasta 132 minutos (p=.0.02) .

.. El .pretratamiento con rHuPH20 elimina esta variabilidad ya que no hubo diferencias importantes en el comienzo o duración de la acción durante tres días de infusión continua. El pretratamiento rHuPH20 también acelera la acción de insulina resultante en un comienzo más rápido de 21 minutos de la acción (p=.005), y una duración más corta de 30 minutos de la acción (p<.0001 ). Este perfil consistente y ültrarápido traducido en excursiones postprandiales consistentemente reducidas.; Por ejemplo, la glucosa postprandial de ' 2 horas (PPG) fue 131 mg/dL con rHuPH20 y 162 mg/dL sin (p=.001).

De esta manera, los resultados muestran que la preadministración con. 150 U de rHuPH20 produce un perfil ultrarápido consistente durante 3 días de infusión continua, que proporciona control postprandial consistente de comidas de desayuno mezcladas. Las mejoras en los parámetros de cuidado de diabetes de rutina también se observaron para los tres sujetos iniciales.

Ejemplo 5 Generación de una linea de células que expresan rHuPH20 soluble El plásmido HZ24 (expuesto en SEQ · ID NO : 52 ) se usó para transfectar células, de Ovario de Hámster Chino (CHO) (véase por ejemplo Patentes' de E.U.A. Nos. 7,76,429 y 7,78: ,607 y Publicación de de E.U.A. No. 2006-010 968 ) . El vector plásmido HZ24 para la expresión de la rHuPH20 soluble contiene, una. cadena principal del vector pCI ¦ (Promega) , DNA que codifica los aminoácidos 1-482 de la hialuronidasa PH20 humana (SEQ ID NO.: 49·), un sitio de entrada ribosomal interno (IRES) del virus ECMV (Clontech) , . y el gen de. dihidrofolato reductasa de ratón . (DHFR) . La cadena principal del vector pCI también incluye DNA que codifica el. gen de resistencia- a Beta-lactamasa (AmpR) , un origen . fl de replicación, una región potenciadora/promotora temprana intermedia de Citomegalovirus (CMV) ,'· un intrón quimérico, y .una señal de poliadenilación posterior SV40 (SV40) . El DNA que codifica el constructo de rHuPH20 soluble contiene un sitio Nhel y una secuencia consenso Kozak antes del DNA que. codifica la metionina en la posición del aminoácido 1 de ' . la secuencia señal de 35 aminoácido, nativa de PH20 humana, y un codón de detección después del DNA que codifica la tirosina que corresponde a la posición de aminoácido '¦ ..482 de la hialuronidasa PH20 .expuesta en SEQ .'ID NO: 1, seguido por · un sitio de restricción BamHI . El constructo pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa (HZ24) , por lo tanto, da por resultado, una sola especie de mRNA accionada por el promotor CMV que codifica los aminoácidos 1-482 de la PH20 humana, (expuesta en SEQ ID NO: 3) y los aminoácidos 1-186 de la dihidrofolato-reductas.a de ratón (expuesta en SEQ ID NO: 53.),. separados por el sitio de entrada ribosomal interno (IRES) .

Las células DG44 CHO no transíectadas que se desarrollan en un medio CD-CHO Modificado GIBCO para células. DHFR (-) , complementadas . con- .' Glutamina 4 m y 18 ml/L de Plurionic F68/L (Gibco) , se sembraron a 0.5 x 106 células/ml en un matraz agitador en la preparación para la transíección . Las células se. desarrollaron a 37°C en C02 al. 5% en una incubadora humidifi.cada, agitándose a 120 rpm. El crecimiento exponencial de las células DG44 CHO no transfectadas .se sometió a prueba para la viabilidad antes de la transfección..

Sesenta millones . de células viables del cultivo de células. DG44 CHO. no transfectadas se, colocaron en placas y se resuspendieron a una densidad de 2 x 107 células en 0.7. 'mL de solución amortiguadora de transfección 2x (2x HeBS: Hepes 4,0 mM, pH 7.0, NaCl 274 mM, KC1 10 mM, Na2HP04 1.4 mM,, dextrosa 12 mM) . A cada alícuota de las células re-suspendidas, se agregaron 0.09 . mL' (250 pg) del plásmido HZ24 lineal (linealizado mediante digestión durante la noche con Cía ; I (New England Biolabsl, y la soluciones de células/DNA se transfirieron en cubetas de electroporación BTX (Gentronics) de 0.4 cm de espacio a temperatura ambiente. Se llevó a cabo una electroporación: de control negativo' con DNA no plásmido mezclado con las células. Las mezclas de células/plásmido se electroporaron con una descarga dé capacitor de 330 V y 960 µ? o en 350 V y 960 µ?.

Las células se removieron de las cubetas después de la electroporación y sé transfirieron en 5 mL del medio CD-CHO modificado para las células DHFR(-), complementadas con glutamina Glutamina 4 mM y 18 ml/L Plurionic F68./L (Gibco) , .y se dejaron desarrollar en un pocilio de una placa de cultivo de tejido de 6 pocilios sin selección durante 2 días a 37 °C en CO2 al 5%. en una incubadora humidificada .

Dos días pos-electroporación, . 0..5 mL del medio de cultivo de tejido se removió de cada pocilio y se sometió a prueba para la presencia de actividad de hialuronidasa, usando el ensayo dé microturbiedad descrito en el Ejemplo 2.

Las células de. Transfección 2 (350V) se recolectaron del pocilio de cultivo de tejido, se contaron : y- se diluyeron a .1. x 10" a 2 x 104 de células viables por mL. Una alícuota :de 0.1 mL de la suspensión de células se transfirió á cada pocilio de cinco, placas de cultivo de tejido de fondo redondo, de '96 pocilios. Cien microlitros de medio. CD-CHO (GIB.CO) que contiene un suplemento GlutaMAXMR-l 4. mM (GIBCOMR, Invitrogen Corporation) y sin suplementos de hipoxantina y timidina se agregaron a los pocilios que. contienen las células (volumen final 0.2 mL) .. . .

Se identificaron. diez clones de las . 5 placas desarrolladas sin metotrexato.

Seis clones HZ'24 se expandieron en el cultivo y. se transfirieron en los matraces agitadores como suspensiones de células ¦individuales. Os clones 3D3, 3E5, 2G8, 2D9, 1E11, y 4D10 se colocaron en placas en placas de cultivo de tejido de fondo redondo de . 96 pocilios usando una estrategia de dilución infinita bidimensional en la cual las células se diluyeron 1:2 abajo de la placa, y 1:3.a través de la placa, comenzando a 5000. células en el pocilio izquierdo superior. Los clones diluidos se desarrollaron ; en un fondo de 50.0 células DG44 CHO no transfectadas por pocilio, . para proporcionar factores de crecimiento necesarios . para los días iniciales en el cultivo. Se hicieron diez placas por. sub-clon, con 5 placas que contienen metotrexato 50 nM y 5 placas sin metotrexato.'' El clon 3D3 produjo 24 subclones visuales (13 del tratamiento sin metotrexato, y 11 del tratamiento con metotrexato 50 nM.. La actividad de la . hialuronidasa significativa se midió en los sobrenadantes de 8 de los .24 subclones (>50 Unidades/mL) , y. - -', estos 8 subclones se expandieron¦ en . T-25 matraces de cultivo de tejido. Los clones aislados del protocolo de tratamiento de metotrexato se expandieron en presencia de metotrexato 50 nM. .El clon.3D35M se expandió adicionalmente en metotrexato 500 nM dando origen a. clones que se ' producen en exceso, de .1,000 Unidades/mi en los matraces agitadores (clon 3D35M; o Geni 3D35M.)..' después se preparó un banco de células maestras (MCB) de las células 3D35M. . . · Ejemplo 6 Producción de Células Gen2 que contienen PH20 humana soluble (rHuPH20) La linea de células Geni 3D35M descritas en el Ejemplo 20 ..se adaptaron a niveles de metotrexato más altos para producir clones, de generación 2 (Gen2) . Las células 3D35M se sembraron de cultivos que contiene metotrexato, establecidos en el medio CD CHO que contiene GlutaMAX-lMR 4 mM y 1.0 µ? de metotrexato... Las ; células se adaptaron a un niel de metotrexato más alto al desarrollar y al pasar las 9 veces durante un período de 46 días en una incubadora humidificada 37°C, 7% de CO2. La población amplificada de las células se clonó al limitar la. dilución en las .placas de cultivo de tejido de 96 pocilios que contienen un medio con metotrexato 2.0 µ?. Después de . aproximadamente 4 semanas, los clones se identificaron y el clon 3E10B se¦ seleccionó para expansión. Las células 3E10B se- desarrollaron, en el medio CD CHO que contiene Gluta AX-iMR 4 mM y 2.0 µ?. de metotrexato para 20 pasajes. Un banco de células maestras (MCB) de la línea de células 3E10B se secretó y se congeló y- se usó .para estudios subsecuentes.

La. amplificación -de la línea, de . células continuó al cultivar células 3E10B en medio CD CHO que contiene . GlutáMAX-1,MR 4 mM y 4.0 µ? de metotrexato.. Después del. 12 paso, las células se congelaron en viales como un banco de células de investigación (RCB) . Un vial del RCB se descongeló y se cultivó en un. medio que contiene 8.0 µ? de metotrexato. Después de 5 días, la concentración de . metotrexato en el medio se incrementó a 16.0 µ?, luego 20.0 µ? 18 días después. Las células. del 8 pasaje en el medio que contiene 20.0 µ? de metotrexato se clonaron al limitar la dilución en placas de cultivo de tejido de 96 pocilios que contienen el medio CD CHO que contiene ClutaMAX-lMR 4 mM y 20.0, µ? de . metotrexato . Los clones se identificaron 5-6 semanas después y el clon 2B2 se seleccionó para expansión en el medio que contiene 20.0 µ? de metotrexato. Después del 11° pasaje, las células 2B2 se congelaron en viales ' como un banco de células de investigación (RCB) . .

Las células 2B2 resultantes son células DG44 ¦ CHO deficientes de dihidrofolato-reductasa (dhfr-) que expresan PH20 humana recombinante soluble (rHuPH20) . La PH20 soluble está presente en las células 2B2 en un número de copias de aproximadamente .206 copias/célula. . El análisis de Southern blo.t del DNA de célula 2B2 genómica diferida con Spe I-, Xba I- y BamH I/HindIII que usa una sonda especifica de rHuPH20 reveló el siguiente perfil de digestión de restricción: una banda de hibridación mayor de ~7.7. kb y cuatro bandas de hibridación . menores (-13.9, -6.6, -5.7 y -4.6 kb) con el DNA digerido con Spe I; una banda de hibridación mayor de -5.0 kb y dos bandas de hibridación menores (-13.9 y -6.5 kb) con DNA digerido con Xba I; y una banda de hibridación individual de -1.4 kb observador usando DNA 2B2 digerido con BamH I/Hind III. El análisis de. secuencia del transcripto de mRNA indicó que el cDNA derivado (SEQ ID NO: .56) fue idéntico .a la secuencia de referencia (SEQ ID NO:49)- excepto para una diferencia de par . base en la posición 1131, que se observó que . es una . timidina (T) en. lugar de la citocina . esperadas (C) . Esto es una mutación silenciosa,, sin efecto en la secuencia de aminoácidos.

Ejemplo 7 A. Producción de la rHuPH20 soluble en Gen2 en Cultivo de Células en Bioreactor de 300 L Un vial de HZ24-2B2 se descongeló y se expandió de los matraces agitadores a través de matraces agitadores de 36L en un medio CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA) complementado con 20 µ? de metotrexato y GlutaMAX-lMR (Invitrogen) . Brevemente, el vial de células se descongeló en un baño de agua a 37 °C, el medio se agregó y las células se centrifugaron. Las células se re-suspendieron en un matraz de agitación de 125 mL con 20 mL de medio reciente y se, colocó en una incubadora a 37°C, CO2 al 7%. Las células se expandieron hasta. 40 mL en el matraz de .agitación, de 125 mL. Cuando la densidad, celular alcanzó mayor que 1.5 x 106 células/mL, el cultivo se expandió en un matraz de agitación, de 125 mL en 100 mL de volumen de cultivo . El matraz se incubó a 37 °C, C02 al 7%. Cuando la densidad celular alcanzó mayor que 1.5 x 106 células/mL, el cultivo se expandió en un matraz de agitación de 250 mL en 200 mL de volumen de cultivo, y el matraz, se incubó a 37°C, C02 al 7%. Cuando la densidad celular alcanzó mayor que 1.5 x 106 células/mL, el cultivo se expandió en un matraz de agitación de 1 L en 800 mL de volumen de cultivó y se incubó a 37 °c, . C02 al .7%. Cuando la densidad celular ..alcanzó mayor que 1.5 x 106 células/mL el cultivo se expandió en un matraz de agitación de 6 L en 5000 mL de volumen, de cultivo y se incubó a 37 °C, C02 al 7%. Cuando la densidad celular alcanzó mayor que 1.5 x 106 células/mL el cultivo, se expandió en un matraz de . agitación de 36 L en 32 L de volumen de cultivo y se incubó a 37°C, CO2 al 7% .

Se esterilizó un reactor de 400 L y se agregaron 230 mL dé medio CD-CHO. Antes del uso, el reactor de' verificó por contaminación. Aproximadamente 30 L de células . se transfirieron de: los matraces de agitación, de 36L al bioreáctor de 400 L (Braun) en una- densidad de inoculación de 4.0 x 105 de células viables por mi y un volumen total de 260L. Los parámetros fueron el punto de ajuste de temperatura, 37°C; Velocidad del Impulsor. 40-55 RPM; Presión del' Recipiente: 3 psi; Burbujeo del Aire 0.5-1.5 L/Min. ; Superposición . del Aire: 3L/min. El reactor se muestreó diariamente, para conteo. de células, verificación de pH análisis, de medio, . producción y retención de .proteínas. También, durante, la corrida se agregaron alimentaciones de nutrientes. A 120 hrs (día 5), se agregaron 10. L de Medio de Alimentación #1 (4 x CD-CHO + 33 g/L de Glucosa +. 160 mL/L de Glutamax-1MR . + 83 ' mL/L de Yeastolato + 33 mg/L de rHuInsulina) . ? 168 horas (día 7), se agregaron 10.8. L de Alimentación #2' (2 x CD-CHO + 33 g/L de Glucosa + 80 mL/L de Glutamax-1MR + 167. m / - de Yeastolato + .0.92 g/L de Butirato de Sodio), y la temperatura del cultivo se cambión .a 36.'5°C. A 216 horas (día 9), se agregaron. 10.8 L de Alimentación #3 (1 x CD-CHO. + 50. g/L de Glucosa + 50 mL/L de Glutamax-1MR + 250 mL/L de Yeastolato + 1.80 g/L de Butirato de Sodio) y la temperatura del cultivó se cambió a 36°C. A 264 horas, (día 11), se agregaron 1.0.8 L de Alimentación #4 (1 x CD-CHO. + 33 g/L de Glucosa , + 33 mL/L de Glutamax-1MR . + '¦ 250 mL/L de Yeastolato + 0.92 g/L de Butirato de Sodio), y la temperatura del . cultivo se cambió a 35.5°C. La adición del . medio de alimentación se', observó para potenciar notablemente, la producción de la rHuPH20 soluble en las etapas finales de la producción. El reactor se cosechó a 14 o 15 días o cuando la viabilidad de . las células descendió por., abajo de 40%. El proceso dio por resultado una productividad final de 17,000 Unidades, por mi . con una densidad celular máxima de 12 millones de células/mL. En la cosecha, el cultivo se muestreó para micoplasma, . bi.ocarga, endotoxina y viral in vitro e in vivo, Microscopía Electrónica de Transmisión . (TEM) y actividad enzimática.

El cultivo .· se.' bombeó por una bomba peristáltica a través de cuatro módulos del sistema de ; filtración illistak (Millipore) en paralelo, conteniendo cada uno una capa de tierra diatomácea de grado 4-8 µp?¦ y una capa de tierra diatomácea de grado 1.4-1.1 \m, seguido por una membrana de celulosa, luego a través de un segundo sistema de filtración Millistak individual ..(Millipore) que. contiene una capa de tierra diatomácea de grado 0.4-0.11..µ?? y una capa de tierra diatomácea de grado a <0.1 im, seguido por una membrana de celulosa, y luego a través de un filtro final de 0.22 µ?t? en una bolsa flexible .de un solo uso estéril con una . capacidad de 350 L. El fluido de cultivo, celular cosechado se complementó , con EDTA 10 mM y Tris 10 mM a un pH de 7.5. El cultivo se concentró 10 x con un aparato de . filtración de flu o ¦ tangencial (TFF) usando cuatro filtros de poliéter sulfona (PES) de .corte de peso molecular (M CO) 30 ' kDa Sartoslice TFF (Sartorius) , seguido por un intercambio de solución amortiguadora lOx con Tris..10 mM, Na2SC>4 .20 mM, pH 7.5 en . un filtro final de 0.22 m en una bolsa de almacenamiento estéril de 50 L.

La cosecha diafiltrada, concentrada se inactivo para el virus. Antes de - la inactivación viral, se preparó' una solución de 10% de Tritón X-100, 3% de tri (n-butil) fosfato (TNBP) . La cosecha diafiltrada, concentrada se expuso á 1% de Tritón X-100, 0.3% de TNBP durante 1 hora en un recipiente de reacción de vidrio de '36 L inmediatamente antes de la purificación, en la columna Q.

B. Purificación de la rHuPH20 soluble en Gen2 Se preparó una columna de intercambio' iónico Q.Sepharose (Pharmacia) (9 L de resina, H= 29 cm, D= 20 era) . Las muestras de lavado se recolectaron para una' determinación del ensayo de '??,- conductividad y . eridotoxina (.LAL) . La columna', se equilibró con 5 volúmenes de columna de : Tris 10 mM, Na2SÓ4 20 mM, pH 7.5. Después , de la inactivación viral, la cosecha diafiltrada, concentrada se recolectó en la columna Q en una velocidad de flujo de 100 cm/hr.. La columna se lavó con 5 volúmenes de columna de Tris 10 mM,. Na2S0 20 mM, pH 7.5 y Hepes 10 mM, NaCl, 50 mM, pH 7.0. La proteina se eluyó con Hepes. 10 mM, NaCl 400 mM, pH 7.0 en un . filtro final de' 0.22 µp? en una bolsa estéril. Se sometió a prueba la bolsa de eluato para biocarga, concentración de proteínas y actividad de la hialuronidasa .. Una lectura de . absorbancia A280 se tomó en el inicio y al final del intercambio.

Después se llevó a cabo una cromatografía de interacción hidrofóbica. Fenil-Sepharose (Pharmacia) . Se preparó una columna de Fenil-Sepharose (PS) (19-21 L de resina, H=29 cm, D= 30 cm) .. El lavado se recolectó y se muestreó para pH, conductividad y endotoxina (ensayo LAL) . La columna se equilibró con 5 volúmenes de columna de fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0.5 M, CaC12 .0.1. mM, pH 7.0. El eluato de proteína de la columna Q sepharose se complementó cón soluciones madre de sulfato de amonio 2M, sulfato de potasio 1 M y CaCl2 1 M para producir concentraciones finales de 5 mM, 0.5 M y 0.1 .mM, respectivamente. La proteína, se cargó sobre la columna PS en una velocidad de flujo de 100 cm/hr.. y el flujo de la columna se recolectó a través de la misma. La columna se lavó con fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0.5. M y GaC12 0.1 mM pH 7.0 a 100 cm/hr y el lavado ,se agregó, al flujo . recolectado . Combinado · con el lavado de la columna, el. flujo pasante se hizo pasar a través de un filtro final de 0.22 im en una bolsa estéril. El flujo a través se muestreó para biocarga, concentración de proteínas. y actividad enzimática.

Se preparó una columna de boronato de aminofenilo (ProMedics) . El lavado se recolectó y se' muestreó para pH, conductividad .y- endotoxina (ensayo . LAL) . La columna se equilibró con 5 volúmenes- de columna de fosfato de potasio 5 mM, sulfato de amonio 0.5 M. El flujo P.S. pasante que contiene proteína purificada se cargó en la columna de boronato de aminofenilo en una velocidad de flujo de 100 cm/hr. La columna se lavó con fosfato de. potasio 5 mM, sulfato de amonio 0.5 M, pH 7.0. La columna se lavó con bici.na 20 mM, sulfato de amonio 0.5 M, pH 9.0. La columna se lavó con bicina 20 mM, cloruro de sodio 100 mM, . pH 9.0. La proteína se diluyó con Hepés 50; mM, NaCl 100 mM, pH 6.9 y se hizo pasar a través de un filtro, estéril en una bolsa estéril. La muestra eluida se sometió a prueba para biocarga, concentración de proteínas y actividad enzimática.

Se preparó la .columna de hidroxiapatita (HAP) . (Biorad)..

Se recolectó el lavado y se sometió a prueba para pH, conductividad y. .endot.oxina (ensayo LAL) . La' columna se equilibró con fosfato de potasio 5 mM, NaCl 100 mM, CaCl2 0.1 mM, pH 7.0. La proteina purificada con . boronato de aminofenilo se complementó a concentraciones finales de fosfato de potasio .5 mM y CaCl2 0.1 mM y se cargó sobre una columna. HAP en una velocidad de .flujo . de 100 cm/hr. La columna se lavó con fosfato de potasio 5 mM, pH 7, NaCl 100 mM, CaCl2 0.1 mM.. La columna luego se lavó con fosfato, de potasio 10 mM, pH 7, NaCl 100 mM, CaCl2 0.1 mM. La proteina se eluyó con fosfato de potasio 70 mM, pH 7.0 y se hizo pasar a través de un filtro estéril 0.22 µ?t? en una bolsa estéril. La muestra eluida ¦ se sometió a prueba para biocarga, concentración de .proteínas y actividad, enzimática .

¦ ¦ La .proteína purificada HAP luego se hizo pasar a -través de un filtro . dé.' remoción viral. El filtro Viosart esterilizado (Sartorius) primero se preparó al lavar con 2 L de fosfato de potasio 70 mM, pH 7.0. Antes del uso, la solución amortiguadora filtrada se muestreó. para pH y conductividad.. La proteína purificada HAP. se bombeó a través de una .bomba peristáltica a través del filtro de remoción viral de 20 nM. La .proteína filtrada en fosfato de potasio 70 mM, pH 7.0 se hizo pasar a través de. un filtro final de 0.22 µ?t? en una bolsa estéril. La muestra filtrada viral se sometió a "prueba para la concentración de proteínas, actividad enzimática, oligosacáridos , monosacáridos. y perfil- de ácido siálico. La muestra también se sometió a prueba para impurezas relacionadas con el proceso.

La proteína en el material filtrado luego se concentróla 10 mg/mL usando un sistema de filtración de flujo tangencial (TFF) Sartocon . Siice de corte de peso molecular de 10 kD (MWCO) (Sartorius) .. El ; filtro se preparó primero al lavar con histidina 10 mM,. NaCl ,130 mM, pH 6.0 y el material permeado se muestreó para pH y conductividad. Después de la concentración, ' la proteína 'concentrada se muestreó y se sometió a prueba para concentración de proteína y actividad enzimática.. Se llevó a cabo un intercambio de solución amortiguadora 6x en la proteína concentrada en la solución amortiguadora final: histidina 10 mM, NaCl 130 mM, pH 6.0. Después del intercambio de soluciones amortiguadoras, 1 proteína concentrada se hizo pasar a través de un filtro de 0.22 u'm en una bolsa de almacenamiento estéril de 20 L. La proteína se muestreó y , se sometió a prueba para, concentración de proteínas, actividad enzimática, .' grupos' sulfhidrilo libres, perfil de oligosacáridos y osmolaridad.

La proteína . en . volumen filtrada estéril luego se dispensó asépticamente en viales de Teflon estériles de 20 mL en^ 30 mL (Nalgene) . Los viales luego se congelaron instantáneamente y se almacenaron a -20 ± 5°C.

Ejemplo 8 Determinación de la actividad de hialuronidasa de rHuPH20 La actividad de. hialuronidasa de rHuPH20 (obtenida por la expresión y secreción en las células CHO de un ácido nucleico gue codifica los aminoácidos 36-482 de SEQ .ID NO: 1.) se determinó usando, un ensayo turbidimétrico . En los primeros dos ensayos (A y B) > la actividad de hialuronidasa de rHuPH20 sé '. midió al incubar la rHuPH20 con hialuronato de sodio (ácido hialurónico)/ y luego al precipitar el hialuronato de sodio no digerido por la adición de albúmina de suero acidificada. En el tercer ensayo . (C) , ¦ la actividad de la hialuronidasa rHuPH20 se midió con base en. la formación de un precipitado insoluble cuando el ácido hialurónico (HA) se liga con el cloruro de cetilpiridinio (CPC) . En todos los ensayos gue contienen 600 U/mL de rHuPH20 (5 g/mL) , los criterios de aceptación, fueron la actividad enzimática por arriba de 375 U/mL.

A. Ensayo de Microturbiedad En este ensayo, la actividad, de la hialuronidasa de rHuPH20 al incubar . rHuPH20 soluble con hialuronato de sodio (ácido hialurónico) para un periodo de tiempo establecido (10 minutos) y luego al precipitar el hialuronato. de sodio ño digerido con la adición de albúmina de suero acidificada. La turbiedad de la muestra resultante se midió a 640 nm después de un periodo de desarrollo de 30 minutos. La disminución en la turbiedad que resulta de la actividad enzimática es sustrato de hialuronato de sodio fue una. medición de en la actividad de la hialuronidasa .de rHuPH20 de soluble. El método se llevó a cabo usando una curva de calibración generada con diluciones de un estándar de referencia de trabajo de ensayo de rHuPH20 soluble,, y se hicieron mediciones de la actividad de la muestra relativas, con esta curva de calibración. Las diluciones de la muestra se prepararon en Soluciones Diluyentes de Enzimas. La Solución Diluyente de Enzimas se preparó al disolver 33.0 ± 0.05 mg de gelatina hidrolizada en 25.0 mL de solución amortiguadora de reacción PIPES 50 mM (NaCl 140 mM., PIPES 50 mM, pH 5.5) . y 25.0 mL de Agua Estéril para Inyección (SWFI; Braun, número de producto R5000-1) . y' al diluirse 0.2 mL de una .Solución de Albúmina de Suero Humana al 25% (US Biologicals) en la mezcla y con agitación vo.rticial durante 20 minutos. Esto se llevó a cabo dentro de 2 horas de uso y se almacenó sobre hielo hasta que fue necesario. Las muestras se diluyeron . a 1-2 U/mL estimado. Generalmente, la dilución máxima por etapa no excedió 1: 100 y el tamaño de la muestra inicial para la primera dilución, no fue menor que 20 ]iL. Los volúmenes mínimos de la muestra necesitaron llevar, a cabo el ensayo donde: , muestras en proceso, Fracciones FPLC : 80 L; Sobrenadantes del Cultivo de Tejido: 1 mL; ¦, Material Concentrado 80 pL; Material Purificado o de Etapa Final.: 80 \iL" . Las diluciones se hicieron en triplicado en una placa de 96 pocilios de Ligación Bajas de Proteínas, y 30 uL de cada dilución se transfirió a placas de fondo negro/transparente Optilux (BD Biosciences) .

Las diluciones de la rHuPH20 soluble conocida con la concentración de 2.5. U/mL se prepararon en Solución Diluyente de Enzimas para generar una curva estándar y se agregaron, a la placa Optilux en triplicado. Las diluciones incluyeron .0 U/mL, 0.25 U/mL,. 0.5 U/mL, 1.0 U/mL, .1.5 U/mL, 2.0 U/mL, · y 2.5 U/mL. Los pocilios de "Blanco de Reactivo" contuvieron -60 ]1 de Solución Diluyente de Enzimas se incluyeron en la placa como un control negativo. La placa luego se cubrió y calentó sobre un bloque térmico durante 5 minutos a 37 °C. La cubierta se removió y la placa se agito durante 10 segundos . Después de la agitación, la placa se regresó al bloque térmico, y el Dispositivo de Manejo, de Liquido MULTIDROP 38 se cebó con 0.25 mg/mL' de la solución de hialuronato de sodio caliente (preparada al disolver 100 mg de. hialuronato de sodio (LifeCore Biomedical) en 20.0 mL- de SWFI . Esto se mezcló al hacerlo girar y/u oscilar suavemente a 2-8°C durante 2-4 horas, o hasta que se disolvió completamente) ; La placa de reacción se transfirió al MULTIDROP 384 y la. reacción se inició al presionar la tecla dé inicio para ¦ dispensar 30 \i de hialuronato dé sodio en cada pocilio. La placa luego se removió del MULTIDROP, 384 y se agitó durante 10. ségundos antes de ser transferida a un bloque térmico con la cubierta de la placa colocada ... La placa se incubó a 37,°C durante 10 minutos . . ¦ El MULTIDROP 384 se preparó para detener la reacción al cebar la máquina con Solución de Trabajo en Suero y al cambiar el ajuste del volumen a 240 (25 mL de Solución Madre en Suero [1. volumen de Suero d Caballo. (Sigma) se diluyó con 9 volúmenes de Solución Amortiguadora de Acetato 500 mM y el pH se ajustó a 3.1 con ácido clorhídrico 75 mL de Solución Amortiguadora de Acetato '500 mM) . '. La placa se removió. del bloque térmico y se colocó sobre el MULTIDROP¦ 384 y 240 de las Soluciones de Trabajo en Suero se dispensaron en los pocilios. La placa se removió y . se agitó sobre un lector de placas durante: 10 segundos. Después de 15 minutos adicionales, la turbiedad de la muestra se midió a 640 nm. y la actividad de la hialuronidasa (en U/mL)' de cada muestra se determinó por el. ajuste a., la curva estándar.

La actividad especifica (Unidades./mg) se calculó- al dividir la actividad 'de la hialuronidasa (ü/ml) por la concentración de proteínas (mg/mL) .

B. Ensayo de Turbiedad para la Actividad Enzimatica de la rHuPH20 Las muestras se diluyeron con Diluyentes de Enzimas [6.6 mg de hidrolizado de gelatina (Sigma #G0262) disuelto en 50 mL de Solución Amortiguadora de Fosfato (fosfato 25 mM, pH 6.3, NaCl 140) y 50 mL de Agua des-ionizada (DI)] para lograr una . concentración de enzimas esperada de entre 0.3.y 1.5 U/mL. ¦ Cada uno de los dos tubos de prueba se etiquetó 1, 2, 3, 4, 5, o 6 Estándar, y los tubos de prueba duplicada para cada muestra al ser analizada (etiquetada por consiguiente) se colocaron en un calentador de bloque a 37 °C. Los volúmenes de Diluyente de Enzima mostrados en la- siguiente Tabla se -agregaron en duplicado a los tubos de prueba estándares. 0.50 mL de Solución de Sustrato de HA {1.0 mL de 5 mg/mL ácido hialurónico (ICN # 362421) en agua DI,- 9 mL de agua -de.. DI, 10 mL de Solución Amortiguadora] se dispenso en todos los ' tubos de prueba estándares y de muestra. Los .. volúmenes de 1.5 U/mL USP de Estándar . de . Hialuronidasa USP .(USP # 31200) en el Diluyente de Enzimas se dispensaron en los tubos de prueba estándares duplicados como se indica en la Tabla 12 a continuación. Cuando todos los tubos de- prueba estándares se habían, completado, 0.50 mL de cada muestra sé dispensó en cada uno de los tubos de prueba- de muestra duplicados. Después de una incubación de 30 minutos a 37°C, 4.0 mL de Solución de Trabajo en Suero {50 mL de Solución. Madre en suero [1 volumen de suero de caballo (manada donadora, cultivó celular sometido a. prueba, cultivo de hibridoma sometido a prueba, origen USA) , 9 volumen de Solución Amortiguadora de Acetato 500 mM, ajusfar -a pH 3.1,. permitir reposar a temperatura ambiente 18-2 -horas, almacenar a 4°C] más 150 mL de Solución Amortiguadora de Acetato 500 mM } se agregó, a los tubos . de prueba estándares que luego .se removieron del calentador de bloque, se mezcló y se colocó a temperatura ambiente... Los tubos de prueba de muestra se procesaron de esta manera hasta que todos los tubos de prueba estándares y de muestra se procesaron.

Una solución "blanco" se preparó al combinar 0.5 mL de Diluyente de Enzimas-, 0.25 mL de Agua DI, 0.25 mL de Solución Amortiguadora de Fosfato y 4.0 mL de Solución de- Trabajo de Suero. La solución se mezcló y una alícuota se transfirió. a una cubeta desechable. Esta muestra se usó para poner' a cero el espectrofotómetrp a 640 nm.

Después una incubación- de 30 minutos a temperatura ambiente una alícuota de cada tubo de prueba estándar se transfirió a su vez a una cubeta desechable y se midió la absorbancia a 640 nm. Este procedimiento se repitió para los tubos de prueba de muestras duplicados.

Una curva de calibración lineal se construyó al graficar la concentración de hialuronidasa (U/mL) versus la absorbancia observada .. El análisis de regresión .lineal se usó para ajustar los datos (excluyendo .los datos para 0.0 U/mL del .estándar de calibración) y para determinar el coeficiente de inclinación,, intersección y correlación (r2) . Una ecuación de regresión de curva estándar y la absorbancia de la muestra observada se usaron para determinar . las concentraciones de la muestra .

C. Ensayo de Turbiedad para la Actividad Enzimática rHuPH20 método, turbidimétrico para ,1a determinación de actividad de la hialuronidasa y . la concentración de enzimas se basó en la formación de un precipitado insoluble' cuando el ácido hialurónico (HA) se liga con el cloruro de cetilpiridinio (CPC) . La actividad se midió al incubar la hialuronidasa con hialuronano para un periodo de tiempo establecido (30 minutos) y luego al precipitar el hialuronano no digerido por la visión de CPC. La turbiedad de ía muestra resultante se mide, a 640 nm y la disminución de la turbiedad que resultó de la . actividad enzimátiea en el sustrato HA fue una medición de. la potencia de' la hialuronidasa.. El método se lleva a cabo usando una curva de calibración generada con diluciones del estándar de referencia de trabajo de ensayo de rHuPH20, y las mediciones de la actividad de las muestras se hicieron relativas con la curva de . calibración . El método se propuso para el análisis de la .actividad de la rHuPH20 en soluciones después de la dilución a una concentración, de ~2 U/mL. El intervalo cuantitativo fue. de 0.3 a 3 U/mL, aunque para el desempeño óptimo de prueba de rutina se obtuvo en el intervalo de l a 3 U/mL..

El diluyente.de enzima se preparó fresco al disolver 100 mg ± 10 mg de hidrolizado de gelatina (Sigma #G0262) en 75 ;mL de la Solución Amortiguadora de Reacción (NaCl 140 mM, PIPES 50 rnM (1, -piperazina-bis- (ácido 2-etanosulfónico) ) , pH 5.3) ácido libre. (Mallinckrodt #V249) y 74.4. mL de. Agua Estéril para Irrigación (SWFI)' y¦ al agregar 0.6 mL Albúmina de Suero Humana al 25%. (HSA) . Un blanco de espectrofotómetro se preparó al agregar 1.0 mL de Diluyente de Enzimas a un tubo de prueba y se colocó en un bloque térmico precalentado a 37 °C. Se preparó un Estándar de Referencia Diluido al hacer, una dilución. 1:25 del Estándar de Referencia de Trabajo de Ensayo rHuPH20 en triplicado al agregar 120 L del Estándar de Referencia de Trabajo de Ensayo a 29.880 mL del Diluyente de Enzimas. Las diluciones apropiadas de cada muestra se prepararon en triplicado para producir ~2 U/mL de una solución.

Los volúmenes del Diluyente de Enzimas se dispensaron en triplicado en tubos: de prueba Estándares . de acuerdo con la Tabla 13. 500 de una solución de 1.0 mg/mL de hialuronato de sodio (Lifecore, #81, con un peso molecular promedio de 20-50 kDa) en SWFI se dispensó en . todos los tubos de prueba , excepto en el blanco, y los tubos se colocaron en el bloque térmico a 37°C durante 5 minutos. La cantidad del Estándar de Referencia Diluido indicado en la Tabla 13 se agregó a los tubos de prueba Estándares apropiados, se mezcló y se regresó al bloque térmico. 500 ]iL de cada muestra se agregaron a los tubos apropiados en triplicado. 30 minutos después de que. se inició el primer tubo Estándar, 4.0 mL de Solución de Detención (5.0 mg/mL de cloruro de cetilpiridinio (Sigma, Cat # C-5460) se disolvió en SWFI y se hizo pasar a través de un filtro de 0.22 mieras) a todos los tubos (incluyendo el Blanco), que luego se mezclaron, y se colocaron a temperatura ambiente.

El espectr.ofotómetro se "blanqueó" a 640 nm de longitud -de onda fija. Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente. Aproximadamente 1 mL de Estándar o Muestra se transfirió a una cubeta desechable y la absorbancia se leyó . a 640 nm.. Los valores de datos sin procesar del Estándar, y Muestra de referencia se analizaron empleando el software.de computadora GRAPHPAD PRISMMR (Hearne Scientific Software) usando una función de descomposición exponencial limitada a 0 en la descomposición completa. Se determinó y se usó la curva estándar mejor ajustada para, calcular las concentraciones de muestra correspondierite.

Puesto que las modificaciones . serán evidentes .' para aquellas personas de experiencia en este campo, se propone que esta invención se limité solamente por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

¦ . J'J-I NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: ¦5 REIVINDICACIONES

1.. Un método para controlar la glucosa en . la : sangre en un sujeto por terapia de infusión de insulina subcutánea continua (CSII):, caracterizado porque comprende: 0 a) administrar una composición que comprende una enzima que degrada a hialuronano al sujeto antes del inicio de la terapia CSII; y luego b) infundir continuamente una insulina de acción rápida por CSII para un intervalo predeterminado al sujeto, en 5 donde : la enzima que degrada a hialuronano se administra separadamente y antes de la infusión de la insulina de acción rápida, por ello la diferencia en absorción de insulina se minimiza o reduce durante el curso . de infusión comparado con 0 CSII realizado en ausencia para, administrar la enzima que degrada a hialuronano. antes del inicio de infusión.

2. El método de conformidad con la- reivindicación 1, caracterizado porque: la enzima que; degrada a hialuronano está en una cantidad que efectúa una respuesta' de insulina ultra-rápida al comienzo de la vida del equipo de. infusión, en el sujeto; o la enzima que degrada a hialuronano está en una cantidad suficiente para catalizar la hidrólisis, de ácido hialurónico para incrementar la permeabilidad del tejido.

3. El método, de conformidad con la reivindicación 1 o reivindicación 2, caracterizado porque en la, etapa ' b) la infusión continua se efectúa por un dispositivo de ^infusión continuo que comprende¦ una bomba de insulina, un depósito que contiene la insulina de acción rápida, un monitor de glucosa opcional, y un equipo de infusión para infusión subcutánea de la composición.

4. El método de conformidad con. la reivindicación 3, caracterizado porque el dispositivo de infusión continuo comprende una bomba de insulina, un depósito que contiene la insulina de acción rápida, un monitor de glucosa, y un equipo de infusión para infusión subcutánea de la composición.

5. El método de conformidad con cualquiera de. la reivindicación 3 o reivindicación 4, caracterizado porque él dispositivo de infusión continuo proporciona un sistema de circuito abierto o., circuito cerrado.

6. El método, de. conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque: la etapa b)'.. de. infundir continuamente una insulina de acción rápida por CSII continua durante un intervalo predeterminado; y al final dé cada una de las etapas de intervalo a) y b) se repiten.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque después del fin de cada, intervalo él equipo de infusión se reemplaza.

8. El método, de. conformidad co la reivindicación 6 o reivindicación . 7, caracterizado porque cada intervalo predeterminado es más de un día o es varios días.

9. El método de conformidad con la- reivindicación 8, caracterizado porque varios días es 2 días hasta 4 días.

10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque en la etapa a) la enzima que degrada a hialuronano se administra en .o cerca del sitio de infusión de la- composición en la etapa b) .

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque la enzima que degrada . a hialuronano en la etapa a) y la composición de insulina de acción rápida en la etapa b) se administran a través del mismo sitio de inyección.

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones . 1-10, caracterizado porque la. enzima que degrada a hialuronano en la etapa a) ' y. la composición de insulina de acción rápida en la etapa b) se administran a través de diferentes . sitios de inyección.

13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1.-12, caracterizado porque la enzima que degrada a hialuronano se administra 1 minuto hasta 12 horas, 5 minutos hasta. 6 horas, 30 minutos hasta 3 horas, 1 hora hasta 2. horas, 15 segundos' hasta 1 hora, 30 segundos hasta 30 minutos o 1 minuto hasta 15 minutos antes de la infusión de la insulina de acción rápida.

14. El método de conformidad, con cualquiera de las reivindicaciones 1-13,¦ caracterizado porque la enzima que degrada a hialuronano en la etapa a) se administra, no más de 2 horas antes de la infusión de la. insulina de acción rápida.

15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, caracterizado porque la enzima que degrada a hialuronano es una hialuronidasa.

¦ 16. El método de conformidad . con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, caracterizado porque la enzima que degrada a hialuronano es una hialuronidasa que está.- activa en pH neutro .

17.. El. método de conformidad con cualquierá . de . las reivindicaciones 1-16, caracterizado porque: la enzima que degrada a hialuronano carece, de un anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI) o no se asocia a la membrana, cuando se expresa de una célula; o la enzima . que . degrada a hialuronano . contiene truncaciones en el C terminal de uno. o más residuos de aminoácidos . para remover todo o parte de un anclaje :GPI .

.18. El método- . de conformidad con cualquiera de . las reivindicaciones . 1-17, · caracterizado porque la enzima que degrada a hialuronano es una hialuronidasa que. es un PH20. o un fragmento truncado en el C terminal de la misma.

19. El. método- de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-18, caracterizado porque la enzima que degrada a hialuronano es un polipéptido PH20. que-, tiene la secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de SEQ ID NOS: 4-9, 47-48, 234-254, y 267-273, o una secuencia de aminoácidos que exhibe, al. menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%,. 89%, 90%, 91%,¦ 92%, 93%, 94%., .95%, .96%, 97%, 98%, 99%. o más identidad de. secuencia a cualquiera, de SEQ ID NOS: '4-9, 47-48, 234-254, y 2.67-273.

20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-19, caracterizado porque la enzima que degrada a hialuronano' es un PH20 truncado en el G terminal que comprende un secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de SEQ ID NOS: 4-9.

21. El método- ' de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, caracterizado porque: la enzima que degrada a hialuronano en la etapa a) se administra en una cantidad que es equivalente funcionalmente a entre o alrededor de entre 1 Unidad hasta 200 Unidades, 5 Unidades hasta 150 Unidades, 10" Unidades hasta 150. Unidades.., 50 Unidades hasta' 150 Unidades o 1 Unidad hasta 50 Unidades; o la enzima qué degrada a hialuronano en la etapa a) se administra en una .. cantidad que está entre o alrededor de entre 8 ng hasta 2 jag, .20 ng hasta 1.6 pg' 80 ng hasta .1.25. g o 200 ng hasta 1 µs.

22·'.· El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-21, caracterizado, porque la insulina de acción rápida es una insulina regular.

23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la insulina regular es una insulina humana o insulina de cerdo.

24. El método , de conformidad con la reivindicación 22 : o reivindicación 23, caracterizado porque la insulina es una insulina con una . cadena A que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 103 y una cadena B que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 104 o una insulina . con una cadena A con una secuencia de aminoácidos establecida como posición^ del residuo de aminoácidos 88-108 de SEQ ID NO: 123. y . una cadena B con una secuencia de aminoácidos establecida como posición del residuo de aminoácidos 25-54 de SEQ ID NO: 123.

25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-24, caracterizado porque la insulina de acción rápida es un análogo de insulina.

26. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1.-25, caracterizado porque la insulina de acción rápida es . un análogo de insulina .seleccionado de entre insulina lispro, insulina asparto o. insulina glulisina.

27. El método .de conformidad con la reivindicación 25 o reivindicación 26, caracterizado porque el análogo de insulina se selecciona de entre una insulina que tiene una cadena A con una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ NOS: 103 y una cadena B que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de SEQ NOS: 147-149.

28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1.-27,. caracterizado porque: la composición de insulina comprende insulina en una cantidad que está entre o alrededor de entre 10. U/mL hasta 1000 U/mL; o la. composición de insulina, comprende insulina en una cantidad que está entre o alrededor de entre 0.35 mg/mL hasta 35 mg/mL.

29. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-28, caracterizado porque la insulina en la composición es al menos o es alrededor de al menos o es 100 U/mL.

30. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-29, caracterizado porque la composición en la etapa b) comprende un análogo de. insulina de acción rápida y una enzima que degrada a hialuronano. ' .

31. El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque: la cantidad de análogo de insulina de. acción rápida en la composición está entre o alrededor de entre 10 U/mL hasta 1000 U/mL; y la. cantidad¦ de una enzima que . degrada a hialuronano en la composición es equivalente funcionalmente a- entre o alrededor de entre 1 U/mL hasta 10,000 U/mL.

32. Un método de régimen de dosificación de. infusión de insulina subcutánea continua (CSII) para controlar la glucosa en la sangre en un sujeto,. que comprende: a) realizar CSII para suministrar una composición que comprende una composición de insulina de acción súper rápida a un sujeto de acuerdo con una tasa, basar programada y dosis en. bolo de insulina; y b) al. menos una vez durante el curso del tratamiento, incrementando la cantidad de insulina basal y/o insulina en bolo administrada pór al menos 1% comparada con la tasa basal programada y dosis en bolo de insulina administrada en ausencia de. una enzima que degrada a hialuronano- por ello incrementa la acción de la insulina.

33. El método . de conformidad con la reivindicación. 32, caracterizado porque la insulina basal y/o insulina en bolo administrada se incrementan al menos una vez por día..

34. El método- de conformidad con la reivindicación 32 o reivindicación 33,. caracterizado porque la composición de insulina de acción súper-rápida comprende: .. . una cantidad terapéuticamente efectiva de un análogo de insulina de acción rápida para controlar los niveles de glucosa en la sangre; y una cantidad de una enzima que degrada a hialuronano suficiente para hacer la composición una composición de insulina de acción súper rápida.

35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque: la cantidad de insulina .de' acción -rápida es desde o desde alrededor de . 10 U/mL hasta 1000. U/mL; y la cantidad suficiente de una enzima que degrada a hialuronano para hacer la composición de acción súper rápida es equivalente funcionalmente hasta 1 U/mL hasta 10,000' U/mL; o la cantidad, de insulina de acción rápida es- desde o desde alrededor de 0.35 mg/mL hasta 35. mg/mL; y la cantidad suficiente de una enzima que degrada a hialuronano para hacer la composición ¦ de acción súper rápida es equivalente funcionalmente hasta 8 ng/mL hasta 80 pg/mL.

36. El método de conformidad con cualquiera' de las reivindicaciones. 1-35, 'caracterizado porque el sujeto tiene diabetes .

37. El método de conformidad- con la reivindicación 36, caracterizado porque la diabetes se selecciona de entre diabetes mellitus tipo' 1, diabetes mellitus tipo 2 y diabetes gestacional .

38. Una composición, caracterizada porque comprende una enzima que degrada a hialuronano . para uso para minimizar el cambio en absorción de insulina que ocurre durante un curso de. ' infusión de insulina subcutánea continua (CSII) para tratamiento de diabetes.

39. El. uso de una composición de enzima que degrada a hialuronano para minimizar el cambio en absorción de insulina que ocurre sobre un 'curso de infusión de insulina subcutánea continua para tratamiento de diabetes.

40. La composición para uso como urta ;tecnologia de punta en terapia de infusión de insulina subcutánea continua (CSII.) para tratamiento de '¦ diabetes , en donde: . . un terapéutico de tecnología de punta para terapia de insulina es una composición que se administra antes de la infusión de una composición de insulina por CSII; y la . composición comprende una enzima que degrada a hialuronano que se formula para administración directa en una cantidad que minimiza los cambios en absorción de insulina que ocurre sobre un cursó de infusión de insulina subcutánea continua (CSII).

41. El uso de una composición como una tecnología de punta en terapia. dé. infusión de insulina subcutánea continua (CSII) para . tratamiento de diabetes, en donde: un terapéutico de tecnología de punta para terapia de insulina es una composición que se administra antes de la infusión de una composición de insulina por CSII; y la composición comprende una enzima que degrada a hialuronano que se formula para administración directa- en una cantidad que minimiza los cambios en absorción de insulina que. ocurre sobre un curso de infusión de insulina subcutánea continua (CSII) .

42. La composición o uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 38-41, caracterizada porque la enzima que degrada a hialuronano es .en una cantidad terapéuticamente efectiva suficiente . para catalizar la hidrólisis dé ácido hialurónico para incrementar ia permeabilidad del tejido..

43. La composición o use de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 38-42, caracterizado porque la enzima que degrada a hialuronano es una hialuronidasa .

44. La composición o uso de conformidad con cualquiera de una de las . reivindicaciones 38-43, caracterizada porque la enzima que degrada' a hialuronano es una hialuronidasa que está activa en pH neutro.

45. La composición o uso de conformidad con cualquiera de una.de las reivindicaciones 38-44, caracterizada porque:. la enzima que .degrada a hialuronano carece de un anclaje de glicosilfosfatidilinositol (GPI) o no se asocia con la membrana cuando se expresa de una célula; o la enzima que degrada a hialuronano contiene truncaciones en el C terminal de uno o más residuos' de aminoácidos y carece de todo o parte de un anclaje GPI.

46. La composición o uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 38-45, caracterizada porque la enzima que degrada a hialuronano es una hialuronidasa que es un ??20 o un fragmento truncado en el C terminal del mismo..

47.. La composición o uso - de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 38-46, caracterizada porque la enzima que degrada a hialuronano es. un pplipéptido PH20 que tiene la secuencia . de aminoácidos establecida en cualquiera de SEQ ID NOS: . 4-9, 47-48, 234-254,. y 267-273, o una secuencia dé aminoácidos que exhibe al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89.%, 90%, 91 %,. 92%, 93%, 94%, .95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más' identidad de secuencia con cualquiera de de. SEQ ID NOS: 4-9, 47-48, 234-254, y 267-273.

48. La composición o uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 38-47, caracterizada porque Ta enzima que degrada . a hialuronano · es^ un PH20 truncado en el C terminal que comprende una secuencia de amino establecida en cualquiera de SEQ ID. NOS: 4-9, o una secuencia de aminoácidos que exhibe al menos 85% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos establecida en. cualquiera de una de SEQ ID NOS: 4-9. .

49. La composición ó uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 38-48, caracterizada porque la PH20 tiene una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de una ' de SEQ. ID NOS:4-9.

50. La composición o uso de conformidad con. cualquiera de una de las . reivindicaciones 38-49, caracterizada porque: la enzima que. degrada a hialuronano en la composición está en una cantidad que es equivalente funcionalmente hasta entre o. alrededor de entre 1 Unidad hasta 200 Unidades, 5 Unidades hasta 150 Unidades, 10 Unidades hasta 150 Unidades, 50 Unidades hasta 150 Unidades o 1 Unidad hasta 50. Unidades; o la enzima que degrada a hialuronano en la composición está en una cantidad que está entre o alrededor de entre 8 ng hasta 2 µg, 20 ng hasta 1.6 g, 80 ng hasta 1.25 pg o .200 ng hasta 1 ug .

51. La composición o uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 38-50, caracterizada porgue la enzima que degrada a hialuronano en la composición está en una cantidad entre o alrededor de entre 10 Unidades/mL hasta 20,000 Unidades/mL, 30 Unidades/mL hasta 3000 U/mL, 10Q U/mL hasta 1000 U/mL, ,300 U/mL hasta 2000 U/mL, 600 U/mL hasta 2000 U/mL o 600 U/mL hasta 1000 U/mL.

52. El uso o composición de. conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 38-51, en donde la composición de insulina para . uso en terapia de infusión de insulina subcutánea continua . (CSII) comprende una insulina de acción rápida .

53. El uso o composición de conformidad con la reivindicación 52, en donde la insulina, de acción rápida es una insulina regular.

54. El uso. o composición de. ..conformidad con la reivindicación 53, en donde la insulina, regular es una insulina humana o insulina de cerdo.

55. El uso o composición de conformidad con la reivindicación 53 o reivindicación 54,. en donde la insulina regular es una insulina con una cadena A que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 103 y una cadena B que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en. SEQ ID NO: 104 o una insulina con- una cadena A con una secuencia de . aminoácidos establecida, como posición del residuo de aminoácidos 88-108 de SEQ ID NO: 123 y una cadena B con una secuencia de aminoácidos establecida como posición del residuo de aminoácidos 25-54 de SEQ ID. NO: 123..

56. El uso o composición de conformidad con la reivindicación 52, en donde la insulina de acción rápida es un análogo. de insulina.

57. El uso o composición de conformidad con la reivindicación 56, en donde el análogo de. insulina de acción rápida es insulina aspart, insulina lispro o insulina glulisina.

' 58. El uso o composición de conformidad con la reivindicación 57,. en donde el análogo de insulina se selecciona de entre; una insulina que tiene una cadena A con una secuencia de aminoácidos establecida en SEQ NOS: 103 y una cadena B que tiene una secuencia de aminoácidos establecida en cualquiera de SEQ NOS: 147-, 149.

59. El uso o composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones- 52-58, en donde la insulina de acción rápida se formula en la composición en una cantidad que es desde o desde alrededor de 100 U/mL hasta 1000 U/mL o 500 U/mL hasta 1000. U/mL.

60. La composición o uso de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 38-59 para'. uso en 15 segundos hasta 1 hora, 30 segundos hasta 30 minutos, 1 minuto hasta 15 minutos, 1 minuto hasta 12 horas, 5 minutos hasta 6 horas, '30 minutos, hasta 3 horas,, o 1 hora hasta 2 horas antes, de · la infusión de la composición de insulina.

61. El uso . o composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 38-60 para uso no más de 2 horas antes de la infusión de la composición de insulina.

62. Una composición, caracterizada porque comprende una insulina en bolo para uso al aliviar la disminución en .acción de insulina total provocada por una infusión de insulina subcutánea continua de una composición de. insulina de acción súper-rápida .

63.¦ El uso de una insulina en bolo para aliviar la disminución en la . acción de insulina total provocada por una infusión de insulina subcutánea continua de una composición de insulina de acción súper-rápida.

64. La composición o' uso . de conformidad con la reivindicación 62 o reivindicación 63, en donde la composición de insulina de acción súper-rápida comprende: una. cantidad terapéuticamente efectiva de un análogo de insulina de acción rápida para controlar los niveles de glucosa en la sangre; y una cantidad de una enzima que degrada a hialuronano suficiente para ' hacer la composición una composición de insulina de acción súper rápida.

65. El uso o composición de . conformidad con la reivindicación 64, en donde: la cantidad de insulina de acción rápida es desde o desde alrededor, de 10 U/mL hasta 1000 U/mL; y la. cantidad suficiente de una enzima que degrada a hialuronano para hacer, la composición de acció súper rápida es equivalente funcionalmente hasta 1 U/mL hasta 10,000 U/mL.

66. El uso o composición de conformidad con cualquiera de una de las reivindicaciones 62-65, en donde: la cantidad de insulina de acción rápida es desde .o desde alrededor de 0.35· mg/mL hasta ,35 mg/mL; y. la cantidad .suficiente de una enzima que degrada a hialuronano para hacer la composición de acción súper rápida es equivalente funcionalmente hasta 8 ng/mL hasta 80, pg/mL.

67. El uso o composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 62-66, en donde el bolo de insulina de acción rápida es una insulina de acción rápida.

68. El uso., o composición . de conformidad con la reivindicación 67, en donde el bolo de .insulina de acción rápida es una insulina regular o un análogo de insulina.

69. El uso o composición de conformidad con cualquiera de. las reivindicaciones 62-68, en donde la cantidad de insulina en bolo en la composición se incrementa al. menos 1% comparado con la . dosis de insulina programada . de insulina administrada bajo las mismas condiciones prandiales y/o para corrección para un evento- hiperglicémico en ausencia de una enzima que degrada a hialuronano.